JP7030051B2 - ２以上の標的核酸を検出するためのプライマーセット、キット及び方法 - Google Patents

Description

本発明は、２以上の標的核酸を、連結された１つの増幅産物として増幅するためのプライマーセットに関する。

本発明はまた、２以上の標的核酸を検出する方法に関する。

本発明はまた、２以上の標的核酸を検出するためのキットに関する。

分子生物学の研究分野、遺伝子検査等の臨床応用分野、食品や環境衛生を検査する分野において、標的核酸を特異的に増幅する方法は非常に重要な技術となっている。核酸増幅法により得られた増幅産物を特異的に検出する方法の一つとして、標的核酸を含む増幅産物を固相に固定して検出する方法がある。この方法では、標的核酸を特異的に固相に捕捉することで、洗浄等により非特異的な核酸配列を容易に除去し、検出特異性を上げることが可能である。

この際、標的核酸を固相に捕捉する方法としては、標的核酸を含む増幅産物の一端に一本鎖化されたタグ領域を導入し、タグ領域と相補的な配列を有するポリヌクレオチドからなるプローブを固相上に固定化し、タグ領域とプローブとのハイブリダイゼーションを介して、標的核酸を固相に間接的に固定化する方法がある。

固相に固定された標的核酸を検出する方法として、特許文献１には、標的核酸に更に標識物質を結合させ目視検出する技術が開示されている。

特開２０１６－７３３１２号公報

標的核酸を特異的に増幅し検査する技術分野では、検査対象によっては、単一の標的核酸の増幅を確認するだけではなく、複数の標的核酸の増幅のパターンの確認が必要な場合がある。

複数の標的核酸の増幅産物を固相に固定し標識物質を指標に解析する場合の一例を図２に示す。例えば標的核酸Ａ、Ｂ、Ｃを全て含む核酸試料を鋳型とする所謂マルチプレックスＰＣＲによる増幅産物を固相担体上に展開し標識すると、図２Ａに示すように、固相担体上の３箇所に標識される。これに対して核酸試料が標的核酸Ｂを含まない場合（図２Ｂ１）、標的核酸Ａを含まない場合（図２Ｂ２）、標的核酸Ｂ及びＣを含まない場合（図２Ｂ３）はそれぞれ異なる標識結果となる。しかしながら、このように標識される領域の位置や数を指標にする解析方法は、対象となる標的核酸が多数の場合や、複数の標的核酸の個々の増幅産物が固相担体上で分離され難い場合などに判別性が低い場合がある。

また、複数の標的核酸の増幅産物をゲル電気泳動により展開し、バンドの数や移動度に基づき複数の標的核酸を検出する場合にも、同様に判別性が低い場合がある。

そこで本発明は、２以上の標的核酸を検出するための改善された手段を提供する。

本発明は、上記課題を解決する手段として以下の発明を開示する。
（１）固相担体上での検出が可能な核酸増幅産物を調製するためのプライマーセットであって、
第１標的核酸の塩基配列の相補配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列を３’末端部に含むポリヌクレオチドを含む、末端プライマーＡと、
５’末端側で連結された２つのポリヌクレオチドを含み、前記２つのポリヌクレオチドの一方が、第ｋ標的核酸の塩基配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列を３’末端部に含み、前記２つのポリヌクレオチドの他方が、第（ｋ＋１）標的核酸の塩基配列の相補配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列を３’末端部に含む、第ｋ双頭プライマーと、
第Ｎ標的核酸の塩基配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列を３’末端部に含むポリヌクレオチドを含む、末端プライマーＢと、
を含み、
Ｎは２以上の整数であり、
ｋは１からＮ－１までの整数であり、
前記第ｋ双頭プライマーとして、ｋが１の場合からｋがＮ－１の場合までを含み、
前記末端プライマーＡ及び前記末端プライマーＢの一方が、標識物質である又は標識物質と結合可能なタグである標識部を更に含み、他方が、固相担体と結合可能なタグである結合部を更に含む、
プライマーセット。
（２）固相担体上での検出が可能な核酸増幅産物を調製するためのプライマーセットであって、
第１標的核酸の塩基配列の相補配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列を３’末端部に含むポリヌクレオチドを含む、末端プライマーＡと、
第ｋ標的核酸の塩基配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列Ａ_ｋを３’末端部に含み、前記塩基配列Ａ_ｋの５’末端側に塩基配列Ｂ_ｋを更に含むポリヌクレオチドを含む、第ｋリバースプライマーと、
第（ｋ＋１）標的核酸の塩基配列の相補配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列Ｃ_ｋ＋１を３’末端部に含み、前記塩基配列Ｃ_ｋ＋１の５’末端側に、前記塩基配列Ｂ_ｋとハイブリダイズする塩基配列Ｄ_ｋ＋１を更に含むポリヌクレオチドを含む、第（ｋ＋１）フォワードプライマーと、
第Ｎ標的核酸の塩基配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列を３’末端に含むポリヌクレオチドを含む、末端プライマーＢと
を含み、
Ｎは２以上の整数であり、
ｋは１からＮ－１までの整数であり、
前記第ｋリバースプライマー及び前記第（ｋ＋１）フォワードプライマーとして、それぞれ、ｋが１の場合からｋがＮ－１の場合までを含み、
前記末端プライマーＡ及び前記末端プライマーＢの一方が、標識物質である又は標識物質と結合可能なタグである標識部を更に含み、他方が、固相担体と結合可能なタグである結合部を更に含む、
プライマーセット。
（３）固相担体上での検出が可能な核酸増幅産物を調製するためのプライマーセットであって、
第１標的核酸の塩基配列の相補配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列を３’末端部に含むポリヌクレオチドを含む、末端プライマーＡと、
第ｋ標的核酸の塩基配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列Ｅ_ｋを３’末端部に含むポリヌクレオチドと、前記塩基配列Ｅ_ｋを含む前記ポリヌクレオチドの５’末端側に連結された、核酸増幅反応において二本鎖化されない塩基配列Ｆ_ｋを含むポリヌクレオチドとを含む、第ｋリバースプライマーと、
第（ｋ＋１）標的核酸の塩基配列の相補配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列Ｇ_ｋ＋１を３’末端部に含むポリヌクレオチドと、前記塩基配列Ｇ_ｋ＋１を含む前記ポリヌクレオチドの５’末端側に連結された、核酸増幅反応において二本鎖化されない、前記塩基配列Ｆ_ｋとハイブリダイズする塩基配列Ｈ_ｋ＋１を含むポリヌクレオチドとを含む、第（ｋ＋１）フォワードプライマーと、
第Ｎ標的核酸の塩基配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列を３’末端に含むポリヌクレオチドを含む、末端プライマーＢと
を含み、
Ｎは２以上の整数であり、
ｋは１からＮ－１までの整数であり、
前記第ｋリバースプライマー及び前記第（ｋ＋１）フォワードプライマーとして、それぞれ、ｋが１の場合からｋがＮ－１の場合までを含み、
前記末端プライマーＡ及び前記末端プライマーＢの一方が、標識物質である又は標識物質と結合可能なタグである標識部を更に含み、他方が、固相担体と結合可能なタグである結合部を更に含む、
プライマーセット。
（４）固相担体上での検出が可能な核酸増幅産物を調製するためのプライマーセットであって、
第１標的核酸の塩基配列の相補配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列を３’末端部に含むポリヌクレオチドを含む、末端プライマーＡと、
第ｋ標的核酸の塩基配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列Ｉ_ｋを３’末端部に含むポリヌクレオチドと、前記塩基配列Ｉ_ｋを含む前記ポリヌクレオチドの５’末端側に連結された、核酸増幅反応において二本鎖化されない塩基配列Ｊ_ｋを含むポリヌクレオチドとを含む、第ｋリバースプライマーと、
第（ｋ＋１）標的核酸の塩基配列の相補配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列Ｌ_ｋ＋１を３’末端部に含むポリヌクレオチドと、前記塩基配列Ｌ_ｋ＋１の５’末端側に連結された、核酸増幅反応において二本鎖化されない塩基配列Ｍ_ｋ＋１を更に含むポリヌクレオチドとを含む、第（ｋ＋１）フォワードプライマーと、
前記塩基配列Ｊ_ｋとハイブリダイズする塩基配列を含むポリヌクレオチドと、前記塩基配列Ｍ_ｋ＋１とハイブリダイズする塩基配列とを含むポリヌクレオチドとを含む、第ｋ連結用ポリヌクレオチドと、
第Ｎ標的核酸の塩基配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列を３’末端に含むポリヌクレオチドを含む、末端プライマーＢと
を含み、
Ｎは２以上の整数であり、
ｋは１からＮ－１までの整数であり、
前記第ｋリバースプライマー、前記第（ｋ＋１）フォワードプライマー及び前記第ｋ連結用ポリヌクレオチドとして、それぞれ、ｋが１の場合からｋがＮ－１の場合までを含み、
前記末端プライマーＡ及び前記末端プライマーＢの一方が、標識物質である又は標識物質と結合可能なタグである標識部を更に含み、他方が、固相担体と結合可能なタグである結合部を更に含む、
プライマーセット。
（５）前記結合部が、前記固相担体と結合可能なポリヌクレオチドを含むタグである、（１）～（４）のいずれかに記載のプライマーセット。
（６）２以上の標的核酸を検出する方法であって、
連結された、２以上の標的核酸と、標識物質である又は標識物質と結合可能なタグである標識部と、固相担体と結合可能なタグである結合部とを含む検出用核酸、を含む可能性のある検出用試料を、前記結合部と結合可能な部分を少なくとも一部に含む固相担体に接触させ、前記標識部を指標として前記固相担体の前記部分での前記検出用核酸を検出する検出工程
を含む方法。
（７）分析対象試料から取得された核酸を鋳型とし、（１）～（５）のいずれかに記載のプライマーセットを用いて核酸増幅反応を行うことを含む検出用試料調製工程を更に含み、
前記検出工程において、前記検出用試料調製工程で得られた核酸増幅反応の生成物を前記検出用試料として用いる、
（６）に記載の方法。
（８）前記検出用試料調製工程が、含まれる２以上の標的核酸の組み合わせが異なり、且つ、前記固相担体の異なる位置に結合可能な前記結合部を備えた２以上の前記検出用核酸を調製できるよう設計された２セット以上の、（１）～（５）のいずれかに記載のプライマーセットを用い、分析対象試料から取得された核酸を鋳型として核酸増幅反応を行うことを含み、
前記検出工程が、前記検出用試料調製工程で得られた前記検出用試料を前記固相担体に接触させ、前記標識部を指標として前記固相担体において前記２以上の検出用核酸の各々を検出することを含む
（７）に記載の方法。
（９）分析対象試料中での２以上の標的核酸を検出するためのキットであって、
（１）～（５）のいずれかに記載のプライマーセットと、
前記結合部と結合可能な部分を少なくとも一部に含む固相担体と
を含むキット。
（１０）前記固相担体を、前記固相担体と、核酸増幅反応の生成物を受容するための反応系受容部とを備える、核酸検出デバイスとして含む、（９）に記載のキット。
（１１）前記標識部が、標識物質と結合可能なタグであり、
前記標識部の前記タグと結合可能な標識物質を更に含む、（９）又は（１０）に記載のキット。
（１２）前記標識物質及び前記固相担体を、前記固相担体と、前記標識物質を保持する標識物質保持部と、核酸増幅反応の生成物を受容するための反応系受容部とを備える核酸検出デバイスとして含む、（１１）に記載のキット。
（１３）核酸増幅産物を調製するためのプライマーセットであって、
第１標的核酸の塩基配列の相補配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列を３’末端部に含むポリヌクレオチドを含む、末端プライマーＡと、
５’末端側で連結された２つのポリヌクレオチドを含み、前記２つのポリヌクレオチドの一方が、第ｋ標的核酸の塩基配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列を３’末端部に含み、前記２つのポリヌクレオチドの他方が、第（ｋ＋１）標的核酸の塩基配列の相補配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列を３’末端部に含む、第ｋ双頭プライマーと、
第Ｎ標的核酸の塩基配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列を３’末端部に含むポリヌクレオチドを含む、末端プライマーＢと、
を含み、
Ｎは２以上の整数であり、
ｋは１からＮ－１までの整数であり、
前記第ｋ双頭プライマーとして、ｋが１の場合からｋがＮ－１の場合までを含む、
プライマーセット。
（１４）２以上の標的核酸を検出する方法であって、
分析対象試料から取得された核酸を鋳型とし、（１３）に記載のプライマーセットを用いて核酸増幅反応を行う核酸増幅工程と、
前記核酸増幅工程での核酸増幅反応の生成物中の前記核酸増幅産物を検出する検出工程と
を含む方法。

本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号２０１６－１３２０６６号の開示内容を包含する。

本発明のプライマーセットを用いることにより、２以上の標的核酸が直列に連結した増幅産物を得ることができる。このような増幅産物の検出は、２以上の標的核酸を個別に検出することと比較して容易である。

本発明の方法により３つの標的核酸が直列に連結した増幅産物を標識し、固相担体上に結合させて検出する場合、固相担体上に標識が検出されれば陽性と判断でき（Ａ）、固相担体上に標識が検出されなければ陰性と判断できる（Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３）。このため判別性が高い。 ３つの標的核酸を個別に増幅した増幅産物を標識し、固相担体上に結合させて検出する場合、固相担体上の３箇所に標識が検出されれば陽性と判断し（Ａ）、固相担体上に標識が検出されない、或いは、１又は２か所に標識が検出されれば陰性と判断する（Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３）。標識の数や位置によっては判別が容易でない場合がある。 本発明の実施形態１のプライマーセットの働きを説明するための図である（Ｎ＝３）。 本発明の実施形態２のプライマーセットの働きを説明するための図である（Ｎ＝２）。 本発明の実施形態３のプライマーセットの働きを説明するための図である（Ｎ＝２）。 本発明の実施形態４のプライマーセットの働きを説明するための図である（Ｎ＝２）。 図７はラテラルフロー型核酸検出デバイス７００の模式図を示す。７１：固相担体、７２：コンジュゲートパッド（標識物質保持部）、７３：サンプルパッド（反応系受容部）、７４：吸収パッド、７５：基材、７６：固相担体７１の、タグ捕捉手段を含む部分。 実施例１の増幅産物のゲル電気泳動の結果を示す。 実施例１の増幅産物の核酸クロマトグラフィーの結果を示す。 実施例１の増幅産物の核酸クロマトグラフィーの結果を示す。 ３つの標的核酸を個別に増幅する従来法による増幅産物のゲル電気泳動の結果を示す。 上段は、実施例２の増幅産物の核酸クロマトグラフィーの結果を示す。下段は、実施例２の増幅産物のゲル電気泳動の結果を示す。

以下、本発明を詳細に説明する。

本発明において核酸及びポリヌクレオチドという用語は、ＤＮＡ又はＲＮＡを指し、典型的にはＤＮＡである。また核酸及びポリヌクレオチドという用語は、塩基数は特に限定するものではなくオリゴヌクレオチドも包含する。本発明において、核酸増幅反応の鋳型となる標的核酸又は標的核酸の相補鎖とハイブリダイズして伸長するオリゴヌクレオチドは、特に限定しない限り、核酸増幅反応において二本鎖化され得るオリゴヌクレオチドを指し、典型的には、天然のヌクレオチドの重合体である。天然のヌクレオチドとは、天然のアデニン、チミン、グアニン、シトシン、ウラシルの塩基、および、デオキシリボース、リボースの糖部、および、リン酸基から構成されるヌクレオチドのことであり、各部分が人工的な修飾を受けていないヌクレオチドのことである。天然のヌクレオチドは通常はＤ型ヌクレオチドである。Ｄ型ヌクレオチドとは、糖部分がＤ型のデオキシリボースもしくはリボースからなるヌクレオチドを示す。

本発明において「標的核酸」とは、検出及び／又は増幅しようとする塩基配列を有する核酸そのものだけでなく、これに相補的な塩基配列を有する核酸も包含する。このため本発明において「標的核酸を検出する」又は「標的核酸を増幅する」とは、標的核酸自体を目的として行う検出又は増幅だけでなく、標的核酸の検出又は増幅を通じて、標的核酸の相補鎖や、標的核酸の二本鎖核酸を検出又は増幅することも包含する。

本発明において「標的核酸の塩基配列」又は「標的配列」とは、検出及び／又は増幅しようとする塩基配列だけでなく、これに相補的な塩基配列も包含する。

標的核酸が二本鎖の形態である場合、「標的核酸の塩基配列」又は「標的配列」とは、どちらか一方の鎖に含まれる塩基配列を指す。また、二本鎖の標的核酸の一方の鎖を指して「標的核酸」と言う場合がある。

本発明における標的核酸の全長は特に限定されず、通常は２０塩基以上、４０塩基以上、又は１００塩基以上の長さである。標的核酸の全長の上限は特に限定されないが通常は１０００塩基以下、５００塩基以下又は４００塩基以下の長さである。

本発明において核酸増幅反応の鋳型となる核酸は、ＤＮＡであってもよく、ＲＮＡであってもよい。また、二本鎖核酸であってもよく、一本鎖核酸であってもよい。二本鎖核酸である場合には、変性処理により一本鎖化することができる。

鋳型となる核酸は、天然のものであってもよく、人工的に合成されたものであってもよい。例えば、生体試料から抽出された天然の核酸であってもよく、ＰＣＲ等により増幅されたものや、逆転写反応により合成されたｃＤＮＡ等であってもよい。

本発明において、塩基配列Ｘが塩基配列Ｙに「ハイブリダイズする」とは、塩基配列Ｘを含むポリヌクレオチド（特にＤＮＡ）が、ストリンジェント条件で、塩基配列Ｙを含むポリヌクレオチド（特にＤＮＡ）にハイブリダイズし、塩基配列Ｙを含まないポリヌクレオチドにはハイブリダイズしないことを意味する。すなわちハイブリダイズするとは、特異的にハイブリダイズすることを指す。ここで、「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件を意味し、例えばGreen and Sambrook, Molecular Cloning, 4th Ed (2012), Cold Spring Harbor Laboratory Press を参照して適宜決定することができる。具体的には、サザンハイブリダイゼーションの際の温度や溶液に含まれる塩濃度、及びサザンハイブリダイゼーションの洗浄工程の際の温度や溶液に含まれる塩濃度によりストリンジェントな条件を設定することができる。より詳細には、ストリンジェントな条件としては、例えば、ハイブリダイゼーション工程では、ナトリウム濃度が２５～５００ｍＭ、好ましくは２５～３００ｍＭであり、温度が４０～６８℃、好ましくは４０～６５℃である。より具体的には、ハイブリダイゼーションは、１～７×ＳＳＣ、０．０２～３％ＳＤＳ、温度４０℃～６０℃で行うことができる。また、ハイブリダイゼーションの後に洗浄工程を行っても良く、洗浄工程は、例えば０．１～２×ＳＳＣ、０．１～０．３％ＳＤＳ、温度５０～６５℃で行うことができる。ただし、後述する標識用タグと、ポリヌクレオチドが付加された標識物質とのハイブリダイゼーション、及び、後述する固定化用タグと、ポリヌクレオチドが付加された固相担体とのハイブリダイゼーションは、ここで挙げたストリンジェントな条件で行う必要はなく、後述する条件で行うことができる。

塩基配列Ｘが塩基配列Ｙにハイブリダイズする場合、塩基配列Ｘを含むポリヌクレオチド（特にＤＮＡ）と塩基配列Ｙを含むポリヌクレオチド（特にＤＮＡ）とが、核酸増幅反応のアニーリング条件においてハイブリダイズして安定な二本鎖を形成するのに十分な水素結合を形成することができる組み合わせであればよく、相互に完全な相補塩基配列である必要はない。例えば、塩基配列Ｘを含むポリヌクレオチドと、塩基配列Ｙを含むポリヌクレオチドとが、１０ヌクレオチド中に１ミスマッチ、２０ヌクレオチド中に１ミスマッチ、または３０ヌクレオチド中に１ミスマッチなど、いくつかのミスマッチが存在していてもよい。

塩基配列Ｘが塩基配列Ｙにハイブリダイズする場合、通常は以下の（Ａ）～（Ｃ）の１以上の関係を満たす。

（Ａ）塩基配列Ｘの相補配列と塩基配列Ｙとが同一である。なお、塩基配列Ｘの相補配列と塩基配列Ｙの一方がＤＮＡの塩基配列であり、他方がＲＮＡの塩基配列である場合、一方におけるチミンと他方におけるウラシルとは同一の塩基であるとみなす。

（Ｂ）塩基配列Ｙが、塩基配列Ｘの相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、付加及び／又は挿入された塩基配列である。

（Ｃ）塩基配列Ｙが、塩基配列Ｘの相補配列と７０％以上の同一性を有する塩基配列である。

前記（Ｂ）において「１若しくは数個」とは好ましくは１～５個、より好ましくは１～４個、より好ましくは１～３個、特に好ましくは１個又は２個を指し、最も好ましくは１個である。

前記（Ｃ）において、同一性の値は、複数の塩基配列間の同一性を演算するソフトウェア（例えば、FASTA、DANASYS、及びBLAST）を用いてデフォルトの設定で算出した値を示す。塩基配列の同一性の値は、一致度が最大となるように一対の塩基配列をアライメントした際に一致する塩基の数を算出し、当該一致する塩基の数の、比較した塩基配列の全塩基数に対する割合として算出される。ここで、ギャップがある場合、上記の全塩基数は、１つのギャップを１つの塩基として数えた塩基数である。同一性の決定方法の詳細については、例えばAltschul et al, Nuc. Acids. Res. 25, 3389-3402, 1977及びAltschul et al, J. Mol. Biol. 215, 403-410, 1990を参照されたい。

前記（Ｃ）において、同一性はより好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性である。

本発明においてプライマーセットを構成するポリヌクレオチド、並びに、ポリヌクレオチドを含むプライマー類及び連結用ポリヌクレオチドの製造方法は特に限定されず、ポリヌクレオチド合成装置を利用して製造してもよいし、受託合成サービスを利用して製造してもよい。

本発明においてある塩基配列又はポリヌクレオチドの「３’末端部」とは、該塩基配列又はポリヌクレオチドの３’末端の塩基を含む、連続した複数の塩基からなる部分塩基配列又は該部分塩基配列を含むポリヌクレオチドの領域を指す。
＜１．本発明のプライマーセット＞
本発明のプライマーセットは、分析対象試料が、所定の２以上の標的核酸を含んでいる場合に、分析対象試料から取得した核酸を鋳型とする核酸増幅反応により、前記所定の２以上の標的核酸と、標識物質である又は標識物質と結合可能なタグである標識部と、固相担体と結合可能なタグである結合部とを、連結された形態で含む検出用核酸を生成することができるプライマーセットである。

このような機能を実現するためのプライマーセットとして、本明細書では、４つの実施形態を開示する。

以下の説明では、２以上の標的核酸を、第１標的核酸から第Ｎ標的核酸までのＮ個の標的核酸とする。ここでＮは２以上の整数である。Ｎの上限は特に限定されず、３、４、５、６、７、８、９、１０又はより大きい数であることができる。

各プライマーセットを構成する各成分に含まれるポリヌクレオチドの塩基配列は、他の成分に含まれるポリヌクレオチドによる目的とする核酸増幅反応を阻害しないように設計することができる。
（１．１．プライマーセットの実施形態１）
本発明のプライマーセットの実施形態１は、
第１標的核酸の塩基配列の相補配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列を３’末端部に含むポリヌクレオチドを含む、末端プライマーＡと、
５’末端側で連結された２つのポリヌクレオチドを含み、前記２つのポリヌクレオチドの一方が、第ｋ標的核酸の塩基配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列を３’末端部に含み、前記２つのポリヌクレオチドの他方が、第（ｋ＋１）標的核酸の塩基配列の相補配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列を３’末端部に含む、第ｋ双頭プライマーと、
第Ｎ標的核酸の塩基配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列を３’末端部に含むポリヌクレオチドを含む、末端プライマーＢと、
を含み、
Ｎは２以上の整数であり、
ｋは１からＮ－１までの整数であり、
前記第ｋ双頭プライマーとして、ｋが１の場合からｋがＮ－１の場合までを含み、
前記末端プライマーＡ及び前記末端プライマーＢの一方が、標識物質である又は標識物質と結合可能なタグである標識部を更に含み、他方が、固相担体と結合可能なタグである結合部を更に含む、プライマーセットに関する。

末端プライマーＡにおいて、「第１標的核酸の塩基配列の相補配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列」は、その長さは特に限定されないが、例えば８塩基以上、１２塩基以上、又は１５塩基以上とすることができ、４０塩基以下、３０塩基以下、又は２５塩基以下とすることができる。末端プライマーＡに含まれるポリヌクレオチド（末端プライマーＡが、後述する標識部又は結合部としてポリヌクレオチドを含む場合には、標識部又は結合部以外のポリヌクレオチド）は、第１標的核酸の塩基配列の相補配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列をその３’末端部に含んでいればよく、その５’末端側には更に他の塩基配列が付加されたものであってもよい。末端プライマーＡに含まれるポリヌクレオチドの全長は特に限定されないが、例えば８塩基以上、１２塩基以上、又は１５塩基以上とすることができ、４０塩基以下、３０塩基以下、又は２５塩基以下とすることができる。

第ｋ双頭プライマーにおいて「５’末端側で連結された２つのポリヌクレオチド」とは、２つのポリヌクレオチドの各ポリヌクレオチドの３’末端が解放された形態であり、それぞれの５’末端側で連結されていることを指す。２つのポリヌクレオチドがそれぞれの５’末端同士で連結されている場合、５’末端同士を連結する構造は特に限定されず、適当な二価基により構成することができる。最も簡単な構造としては、２つのポリヌクレオチドのそれぞれの５’末端ヌクレオチドの糖の５’位同士がリン酸基を介して結合している５’－５’結合が挙げられるが、これには限定されない。二価基は長鎖の構造であってもよい。

第ｋ双頭プライマーにおいて２つのポリヌクレオチドの５’末端同士を連結する他の構造としては、以下の脂肪鎖のスペーサーが例示できる。

脂肪鎖のスペーサーとしては、例えば、以下の式（ＩＩ）で表されるスペーサーが挙げられる。
５’－Ｏ－Ｃ_ｍＨ_２ｍ－Ｏ－５’ 式（ＩＩ）
（式中、５’は、各ポリヌクレオチドの５’末端のリン酸ジエステル結合の酸素原子を表し、ｍは１以上４０以下の整数を表す。Ｈは、置換基により置換されていてもよい。）
式（ＩＩ）においてｍは、好ましくは２以上３６以下であり、より好ましくは３以上１６以下である。式（ＩＩ）中のＨは、置換基により置換されていてもよく、置換基としては、典型的には、アルキル基、アルコキシ基、水酸基等が挙げられる。置換基としてのアルキル基及びアルコキシ基の炭素数は１～８であることが好ましく、より好ましくは１～４である。また、２以上の置換基を有する場合には、置換基は同一であっても異なっていてもよい。さらに、置換基を有していないことも好ましい。

また、他のスペーサーとしては、以下の式（ＩＩＩ）で表されるスペーサーが挙げられる。
５’－（ＯＣ_ｎＨ_２ｎ）_Ｌ－Ｏ－５’ 式（ＩＩＩ）
（式中、５’は、各ポリヌクレオチドの５’ 末端のリン酸ジエステル結合の酸素原子を表し、ｎは２以上４以下の整数を表し、Ｌは、１以上の整数であって、（ｎ＋１）×Ｌが４０以下となる整数を表す。Ｈは、置換基により置換されていてもよい。）
式（ＩＩＩ）において（ｎ＋１）×Ｌは、好ましくは２以上３６以下であり、より好ましくは３以上１６以下である。式（ＩＩＩ）中のＨの置換基は、式（ＩＩ）中の置換基と同様の態様が適用される。

他の脂肪鎖のスペーサーとしては、例えば、以下の二価基が挙げられる。

これらの二価基を介して２つのポリヌクレオチド分子を５’末端同士で接続する場合、各二価基の一方の端のリン酸基は、一方のポリヌクレオチド分子の５’末端のヌクレオチドのリン酸基を指し、他方の端の酸素原子は、他方のポリヌクレオチド分子の５’末端のヌクレオチドのリン酸基とリン酸エステル結合を形成する。

第ｋ双頭プライマーに含まれる２つのポリヌクレオチドの全長は特に限定されないが、例えば、それぞれが、８塩基以上、１２塩基以上、又は１５塩基以上とすることができ、４０塩基以下、３０塩基以下、又は２５塩基以下とすることができる。

第ｋ双頭プライマーに含まれる２つのポリヌクレオチドの一方が、第ｋ標的核酸の塩基配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列を３’末端に含む。ここで「第ｋ標的核酸の塩基配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列」は、その長さは特に限定されないが、例えば８塩基以上、１２塩基以上、又は１５塩基以上とすることができ、４０塩基以下、３０塩基以下、又は２５塩基以下とすることができる。「第ｋ標的核酸の塩基配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列」を３’末端に含むポヌクレオチドは、当該塩基配列をその３’末端部に含んでいればよく、その５’末端側には更に他の塩基配列が付加されたものであってもよい。

第ｋ双頭プライマーに含まれる２つのポリヌクレオチドの他方が、第（ｋ＋１）標的核酸の塩基配列の相補配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列を３’末端に含む。ここで「第（ｋ＋１）標的核酸の塩基配列の相補配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列」は、その長さは特に限定されないが、例えば８塩基以上、１２塩基以上、又は１５塩基以上とすることができ、４０塩基以下、３０塩基以下、又は２５塩基以下とすることができる。「第（ｋ＋１）標的核酸の塩基配列の相補配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列」を３’末端に含むポヌクレオチドは、当該塩基配列をその３’末端部に含んでいればよく、その５’末端側には更に他の塩基配列が付加されたものであってもよい。

末端プライマーＢにおいて、「第Ｎ標的核酸の塩基配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列」は、その長さは特に限定されないが、例えば８塩基以上、１２塩基以上、又は１５塩基以上とすることができ、４０塩基以下、３０塩基以下、又は２５塩基以下とすることができる。末端プライマーＢに含まれるポリヌクレオチド（末端プライマーＡが、後述する標識部又は結合部としてポリヌクレオチドを含む場合には、標識部又は結合部以外のポリヌクレオチド）は、第Ｎ標的核酸の塩基配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列をその３’末端部に含んでいればよく、その５’末端側には更に他の塩基配列が付加されたものであってもよい。末端プライマーＢに含まれるポリヌクレオチドの全長は特に限定されないが、例えば８塩基以上、１２塩基以上、又は１５塩基以上とすることができ、４０塩基以下、３０塩基以下、又は２５塩基以下とすることができる。

上記のポリヌクレオチドに加えて、末端プライマーＡ及び末端プライマーＢの一方は、前記標識部を更に含み、他方は、前記結合部を更に含む。

末端プライマーＡ及び末端プライマーＢは、それぞれ、前記標識部及び前記結合部の一方を有し、前記標識部及び前記結合部の一方は、前記ポリヌクレオチドと、必要に応じて後述する適当なスペーサーを介して化学的に連結されている。末端プライマーＡ及び末端プライマーＢにおいて、前記標識部及び前記結合部の一方が前記ポリヌクレオチドに連結される位置は、前記ポリヌクレオチドと標的核酸との又は標的核酸に相補的な核酸とのアニーリング及びポリメラーゼ反応による伸長を阻害しない位置であれば特に限定されないが、好ましくは、前記ポリヌクレオチドの５’末端である。

以下、本発明で用いる標識部と結合部について詳述する。

標識部は、標識物質と結合可能なタグ又は標識物質のいずれかであり、好ましくは標識物質と結合可能なタグである。本明細書では、標識物質と結合可能なタグを標識用タグと呼ぶ場合がある。標識部が標識用タグである場合、核酸増幅反応の増幅産物と標識物質とを接触させることにより増幅産物の一端に含まれるタグを標識することができる。標識部が標識物質である場合、核酸増幅反応の増幅産物として標識物質を一端に含む増幅産物を得ることができる。

標識物質は増幅産物の検出を可能とするものであればよく特に限定はされないが、好ましくは増幅産物の目視検出を可能とするものである。このような標識物質としては、着色粒子、色素、酵素（ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ等）等が挙げられるが、好ましくは着色粒子である。「着色粒子」とは、金属（例えば、金、銀、銅、白金等）粒子、金属ロッド、着色されたラテックス粒子、色素を包含するシリカナノ粒子等が挙げられるが、これらに限定はされない。標識物質の大きさは増幅産物を後述する固相担体に捕捉するのを妨げるものでなければよい。標識物質は検出の際に発色の良いものであることが好ましく、後述する固相担体や核酸検出デバイスの各種多孔質部材の孔径よりも小さなサイズとなるように、適宜選択することができる。例えば、標識物質の大きさはおよそ５００ｎｍ以下、好ましくはおよそ０．１ｎｍ～２５０ｎｍ、より好ましくはおよそ１ｎｍ～１００ｎｍの粒径とすることができる。色素として、蛍光色素（フルオロセイン、シアニン等）等も使用可能であるが、その場合は各蛍光色素の励起波長光を照射し、検出することが好ましい。

標識部として利用可能な標識用タグは、標識物質と結合可能であり、且つ、核酸増幅反応での伸長により二本鎖化されないものであればよく、標識物質の構造に応じて適宜選択すればよく特に限定されないが、例えばポリヌクレオチド（ＤＮＡ、ＲＮＡなど）、タンパク質、ペプチド、もしくは他の化合物（例えば、ビオチン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）等の低分子化合物）、またはそれらの組合せからなるものを利用することができる。

標識用タグの一つの好ましい形態としては、ポリヌクレオチドを含むか、ポリヌクレオチドからなるものである。標識用タグに含まれ得る該ポリヌクレオチドは、本発明のプライマーセットによる核酸増幅反応の実質的な支障とならないものであれば特に限定されないが、塩基数が例えば５～５０、好ましくは１０～３５であるポリヌクレオチドであり、例えば、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３６４（２００７）７８－８５に記載されている塩基配列を含むポリヌクレオチドが好ましいものとして例示できる。標識用タグのもう一つの好ましい形態としては、ビオチン、ＦＩＴＣ、ＤＩＧ等の低分子化合物からなるものである。

標識部が上記の標識用タグである場合、標識物質と標識用タグとの結合は、直接的結合であっても、間接的結合であってもよく、結合手段は利用する標識物質と標識用タグとの組合せに応じて適宜好適なものを選択することができる。例えば、標識用タグがポリヌクレオチドを含む場合、標識物質を当該ポリヌクレオチドにハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド（例えば、当該ポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な配列を含むポリヌクレオチド）に結合させ、両者のポリヌクレオチドをハイブリダイゼーションさせることによって、標識物質と標識用タグとを間接的に結合することができる。標識物質とポリヌクレオチドとの結合はペプチド、タンパク質、核酸などを介して行ってもよいし、適当な官能基を介して行ってもよい。ハイブリダイゼーションの条件は、ハイブリダイゼーションが生じる条件であればよく特に限定はされないが、例えば２０℃～４０℃にて、１０ｍＭ～５０ｍＭのリン酸を含む緩衝液（ｐＨ６～７）中で反応させることにより行うことができる。ハイブリダイゼーション効率を高めるべく、緩衝液にはさらに塩化ナトリウム等の塩を含めることができる。

また、標識用タグが低分子化合物の場合、それと特異的に結合するタンパク質（例えばビオチンに結合するアビジン、ＦＩＴＣに結合するタンパク質）、抗体（例えば抗ＤＩＧ抗体）、アプタマー等の結合性物質と連結した標識物質により標識することができる。この場合、標識用タグと結合性物質とは、各種中性付近の緩衝液を用いて結合させることができる。

標識部（標識用タグ又は標識物質）と、末端プライマーＡ又はＢに含まれるポリヌクレオチドとは任意の手段により結合することができ、直接的に、又は間接的に結合することができる。ただし、標識部のうち少なくとも前記ポリヌクレオチドと接続する部分がポリヌクレオチドよりなる場合、当該部分は、核酸増幅反応での伸長により二本鎖化されない構造とする。

核酸増幅反応により二本鎖化されない、標識部に含まれるポリヌクレオチドとして、ＤＮＡポリメラーゼによる反応の鋳型となり得るポリヌクレオチド（通常は、天然のヌクレオチドからなるもの）を用いる場合、標識部に含まれるポリヌクレオチドと、末端プライマーＡ又はＢにおいてプライマーとして機能するポリヌクレオチドとは、ポリメラーゼ反応を阻害するスペーサーを介して、前記ポリヌクレオチドと標識部とが結合される。このような「スペーサー」としては、ＤＮＡポリメラーゼ等の核酸増幅反応におけるポリメラーゼ反応の進行を抑制または停止することができ、標識部の二本鎖化を防ぐものであればよく、例えば、強固なヘアピン構造やシュードノット構造を有する核酸配列、Ｌ型核酸、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、架橋化核酸（Ｂｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（ＢＮＡ）もしくはＬｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（ＬＮＡ））、フルオレセイン、Ｃｙ３、Ｃｙ５、下記式Ｉで表されるアゾベンゼン構造を含む二価基、脂肪鎖（アルキレン鎖又はポリオキシアルキレン鎖）、５’－５’結合、３’－３’結合のような逆位配列構造を含む二価基等が挙げられるがこれらに限定はされない。上記のスペーサーにより連結されている場合、標識部に含まれるポリヌクレオチドと、末端プライマーＡ又はＢにおいてプライマーとして機能するポリヌクレオチドとは、同一方向に連結することができる。すなわち、標識部に含まれるポリヌクレオチド３’末端側と、末端プライマーＡ又はＢにおいてプライマーとして機能するポリヌクレオチドの５’末端側とを上記スペーサーを介して連結できる。

式Ｉで表される二価基を介して２つのポリヌクレオチド分子を接続する場合、該二価基の一方の３’端のリン酸基は、一方のポリヌクレオチド分子の５’末端のヌクレオチドのリン酸基を指し、他方の５’端の酸素原子は、他方のポリヌクレオチド分子の３’末端のヌクレオチドのリン酸基とリン酸エステル結合を形成する。

脂肪鎖のスペーサーとしては、例えば、以下の式（ＩＶ）で表されるスペーサーが挙げられる。
５’－Ｏ－Ｃ_ｍＨ_２ｍ－Ｏ－３’ 式（ＩＶ）
（式中、５’は、５’側のリン酸ジエステル結合の酸素原子を表し、３’は、３’側のリン酸ジエステル結合の酸素原子を表し、ｍは１以上４０以下の整数を表す。Ｈは、置換基により置換されていてもよい。）
式（ＩＶ）においてｍは、好ましくは２以上３６以下であり、より好ましくは３以上１６以下である。式（ＩＶ）中のＨは、置換基により置換されていてもよく、置換基としては、典型的には、アルキル基、アルコキシ基、水酸基等が挙げられる。置換基としてのアルキル基及びアルコキシ基の炭素数は１～８であることが好ましく、より好ましくは１～４である。また、２以上の置換基を有する場合には、置換基は同一であっても異なっていてもよい。さらに、置換基を有していないことも好ましい。

また、他のスペーサーとしては、以下の式（Ｖ）で表されるスペーサーが挙げられる。
５’－（ＯＣ_ｎＨ_２ｎ）_Ｌ－Ｏ－３’ 式（Ｖ）
（式中、５’は、５’側のリン酸ジエステル結合の酸素原子を表し、３’は、３’側のリン酸ジエステル結合の酸素原子を表し、ｎは２以上４以下の整数を表し、Ｌは、１以上の整数であって、（ｎ＋１）×Ｌが４０以下となる整数を表す。Ｈは、置換基により置換されていてもよい。）
式（Ｖ）において（ｎ＋１）×Ｌは、好ましくは２以上３６以下であり、より好ましくは３以上１６以下である。式（Ｖ）中のＨの置換基は、式（ＩＶ）中の置換基と同様の態様が適用される。

また、２つのポリヌクレオチド分子が５’－５’結合される場合は上記の式（ＩＩ）又は式（ＩＩＩ）で表される脂肪鎖のスペーサーを用いることができる。

他の脂肪鎖のスペーサーとしては、例えば、以下の二価基が挙げられる。

これらの二価基を介して２つのポリヌクレオチド分子を接続する場合、各二価基の一方の端のリン酸基は、一方のポリヌクレオチド分子の３’末端又は５’末端のヌクレオチドのリン酸基を指し、他方の端の酸素原子は、他方のポリヌクレオチド分子の５’末端又は３’末端のヌクレオチドのリン酸基とリン酸エステル結合を形成する。

一方、標識部に含まれるポリヌクレオチドとして、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）、Ｌ型核酸、２’－Ｏ－メチル化ヌクレオチドなどの修飾核酸を含むポリヌクレオチドのように、ＤＮＡポリメラーゼによる反応の鋳型にならず核酸増幅反応での伸長により二本鎖化されないポリヌクレオチドを用いる場合には、上記の、ポリメラーゼ反応を阻害するスペーサーは省略することも可能である。

次に、本発明で用いる結合部について説明する。

結合部は、後述する固相担体と結合可能なタグである。本明細書では、固相担体と結合可能なタグを固定化用タグと呼ぶ場合がある。

結合部として利用可能な固定化用タグは、固相担体と結合可能なものであればよく、固相担体の構造に応じて適宜選択すればよく特に限定されないが、例えばポリヌクレオチド（ＤＮＡ、ＲＮＡなど）、タンパク質、ペプチド、もしくは他の化合物（例えば上記のような低分子化合物）、またはそれらの組合せからなるものを利用することができる。固定化用タグは、好ましくは、ポリヌクレオチドを含むか、ポリヌクレオチドからなるものである。固定化用タグに含まれ得る該ポリヌクレオチドは、本発明のプライマーセットによる核酸増幅反応の実質的な支障とならないものであれば特に限定されないが、塩基数が例えば５～５０、好ましくは１０～３５であるポリヌクレオチドであり、例えば、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３６４（２００７）７８－８５に記載されている塩基配列を含むポリヌクレオチドが好ましいものとして例示できる。

固定化用タグとしてポリヌクレオチドを用いる場合、固相担体の側に配置される、該ポリヌクレオチドとハイブリダイズする塩基配列を含むポリヌクレオチドとの組み合わせを、塩基配列を改変することにより容易に変更することができ、結合特異性を制御することが容易であるため好ましい。例えば、１つの固相担体上で複数の核酸増幅産物を結合させそれぞれを識別する場合、核酸増幅産物毎に、固定化用タグと、固相担体側のポリヌクレオチドとの異なる組み合わせが必要である。ポリヌクレオチドの塩基配列は変更が容易であり、ポリヌクレオチド間のハイブリダイゼーションは高い結合特異性を有するため、固定化用タグとしてポリヌクレオチドを用いることで、核酸増幅産物毎に固定化用タグと、固相担体側のポリヌクレオチドとの異なる組み合わせを設けることが容易である。

固相担体は特に限定はされないが、樹脂、金属、多糖類、鉱物等からなるものを利用することができ、メンブレン、フィルム、不織布、プレート、ゲル等の形状とすることができる。好ましくは固相担体は、溶液中の増幅産物や標識物質が展開できるように多孔質構造を有するものである。本発明において利用可能な固相担体としては、例えば、ろ紙、ニトロセルロースメンブレン、ポリエーテルスルフォンメンブレン、ナイロンメンブレン、乾燥させた各種ゲル（シリカゲル、アガロースゲル、デキストランゲル、ゼラチンゲル）、シリコン、ガラス、プラスチック等が挙げられる。固相担体の大きさ及び形態は、各種操作や検出に適切なものを適宜選択することができる。

固相担体は、少なくとも一部の部分が固定化用タグと結合可能なように構成されていればよく、より好ましくは一部の部分のみが固定化用タグと結合可能なように構成されている。固相担体の特定の部分のみを固定化用タグと結合可能なように構成することによって、固相担体に捕捉された増幅産物は前記部分のみに限局して検出されるため、陽性又は陰性の判別を容易にすることができる。

固相担体と固定化用タグとの結合は、直接的結合であっても、間接的結合であってもよく、結合手段は利用する固相担体と固定化用タグとの組合せに応じて適宜好適なものを選択することができる。例えば、固定化用タグがポリヌクレオチドを含む場合、当該ポリヌクレオチドにハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド（例えば、当該ポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な配列を含むポリヌクレオチド）を固相担体に固定化してタグ捕捉手段とし、両者のポリヌクレオチドをハイブリダイゼーションさせることによって、固相担体と固定化用タグとを間接的に結合することができる。固相担体へのポリヌクレオチドの固定化はペプチド、タンパク質、核酸などを介して行ってもよいし、適当な官能基を介して行ってもよい。ハイブリダイゼーションの条件は、標識用タグと標識物質との結合に関して上記した条件により行うことができる。ポリヌクレオチドを固相担体に固定化する場合、特定の部分に限局して固定化することによって、捕捉された増幅産物は所定の部分のみに限局して検出されるため、陽性又は陰性の判別を容易にすることができる。

結合部（固定化用タグ）と、末端プライマーＡ又はＢに含まれるプライマーとして機能するポリヌクレオチドとは任意の手段により結合することができ、直接的に、又は間接的に結合することができる。ただし、固定化用タグのうち少なくとも前記ポリヌクレオチドと接続する部分が、ＤＮＡポリメラーゼによる反応の鋳型となり得るポリヌクレオチドよりなる場合、核酸増幅反応での伸長により当該部分が、プライマーとして機能する前記ポリヌクレオチドと共に二本鎖化されないように、ポリメラーゼ反応を阻害する「スペーサー」を介して、前記ポリヌクレオチドと固定化用タグとが結合される。ＤＮＡポリメラーゼによる反応の鋳型となり得るポリヌクレオチドを含む結合部と、末端プライマーＡ又はＢに含まれるポリヌクレオチドとの間に設けるスペーサーの具体例は、ポリヌクレオチドを含む標識部とポリヌクレオチドとの間に設けるスペーサーに関して上述したものと同様である。一方、固定化用タグに含まれるポリヌクレオチドとして、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）、Ｌ型核酸、２’－Ｏ－メチル化ヌクレオチドなどの修飾核酸を含むポリヌクレオチドのように、ＤＮＡポリメラーゼによる反応の鋳型にならず核酸増幅反応での伸長により二本鎖化されないポリヌクレオチドを用いる場合には、上記の、ポリメラーゼ反応を阻害するスペーサーは省略することも可能である。

第１標的核酸１１、第２標的核酸２１、第３標的核酸３１の３つを標的核酸とする場合（すなわちＮ＝３）を例に挙げ、実施形態１のプライマーセットの働きを図３を参照して説明する。

図３に示す例では第１標的核酸１１はその相補鎖である第１標的核酸相補鎖１２とともに二本鎖の形態の第１標的核酸（二本鎖第１標的核酸）１０を形成する。第１標的核酸１１と第１標的核酸相補鎖１２のどちらを増幅及び検出の目的としてもよい。

同様に、第２標的核酸２１はその相補鎖である第２標的核酸相補鎖２２とともに二本鎖第２標的核酸２０を形成する。

同様に、第３標的核酸３１はその相補鎖である第３標的核酸相補鎖３２とともに二本鎖第３標的核酸３０を形成する。

末端プライマーＡ１００は、第１標的配列１１（第１標的核酸１１の塩基配列を指す）の相補配列１２（第１標的核酸相補鎖１２の塩基配列を指す）の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列を３’末端部に含むポリヌクレオチド１０１を含む。末端プライマーＡ１００は、ポリヌクレオチド１０１に加えて、更に末端プライマーＡ付加部分１０２を備える。末端プライマーＡ付加部分１０２は、前記標識部又は結合部のいずれか一方である。

図３の例では、Ｎ＝３であるため、第ｋ双頭プライマーとして、第１双頭プライマー１１０と、第２双頭プライマー１２０を含む。

第１双頭プライマー１１０は、互いの５’末端側で連結された２つのポリヌクレオチドである第１双頭プライマー第１ポリヌクレオチド１１１と、第１双頭プライマー第２ポリヌクレオチド１１２とを含む。第１双頭プライマー第１ポリヌクレオチド１１１は、第１標的核酸１１の塩基配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列を３’末端部に含む。第１双頭プライマー第２ポリヌクレオチド１１２は、第２標的核酸２１の相補鎖２２の塩基配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列を３’末端部に含む。

第２双頭プライマー１２０は、互いの５’末端側で連結された２つのポリヌクレオチドである第２双頭プライマー第１ポリヌクレオチド１２１と、第２双頭プライマー第２ポリヌクレオチド１２２とを含む。第２双頭プライマー第１ポリヌクレオチド１２１は、第２標的核酸２１の塩基配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列を３’末端部に含む。第２双頭プライマー第２ポリヌクレオチド１２２は、第３標的核酸３１の相補鎖３２の塩基配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列を３’末端部に含む。

末端プライマーＢ１３０は、第３標的核酸３１の塩基配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列を３’末端部に含むポリヌクレオチド１３１を含む。末端プライマーＢ１３０は、ポリヌクレオチド１３１に加えて、更に末端プライマーＢ付加部分１３２を備える。末端プライマーＢ付加部分１３２は、前記標識部又は結合部のいずれか一方である。

図３（Ｂ）に示す通り、前記核酸を鋳型として末端プライマーＡ１００、第１双頭プライマー１１０、第２双頭プライマー１２０及び末端プライマーＢ１３０を含む第１実施形態のプライマーの存在下で核酸増幅反応を行うとき、末端プライマーＡ１００のポリヌクレオチド１０１は、変性とアニーニングを経て、第１標的核酸相補鎖１２の３’末端にハイブリダイズし、ポリメラーゼによる伸長反応により、５’末端に末端プライマーＡ付加部分１０２が連結された第１標的核酸１１の増幅断片３０１が合成される。また、第１双頭プライマー第１ポリヌクレオチド１１１は、変性とアニーニングを経て、第１標的核酸１１の３’末端にハイブリダイズし、ポリメラーゼによる伸長反応により、第１標的核酸相補鎖１２の増幅断片が合成される。この第１標的核酸相補鎖１２の増幅断片は、その５’末端に、後述する、第１双頭プライマー第２ポリヌクレオチド１１２が伸長して合成される第２標的核酸２１の増幅断片の５’末端が連結されており、一体となって１つの増幅断片３０２を構成する。

同様に、図３（Ｂ）に示す通り、第１双頭プライマー第２ポリヌクレオチド１１２は、変性とアニーニングを経て、第２標的核酸相補鎖２２の３’末端にハイブリダイズし、ポリメラーゼによる伸長反応により、第２標的核酸２１の増幅断片が合成され、この増幅断片が上記の増幅断片３０２の一部を構成する。また、第２双頭プライマー第１ポリヌクレオチド１２１は、変性とアニーニングを経て、第２標的核酸２１の３’末端にハイブリダイズし、ポリメラーゼによる伸長反応により、第２標的核酸相補鎖２２の増幅断片が合成される。この第２標的核酸相補鎖２２の増幅断片は、その５’末端に、後述する、第２双頭プライマー第２ポリヌクレオチド１２２が伸長して合成される第３標的核酸３１の増幅断片の５’末端が連結されており、一体となって１つの増幅断片３０３を構成する。

同様に、図３（Ｂ）に示す通り、第２双頭プライマー第２ポリヌクレオチド１２２は、変性とアニーニングを経て、第３標的核酸相補鎖３２の３’末端にハイブリダイズし、ポリメラーゼによる伸長反応により、第３標的核酸３１の増幅断片が合成され、この増幅断片が上記の増幅断片３０３の一部を構成する。また、末端プライマーＢ１３０のポリヌクレオチド１３１は、変性とアニーニングを経て、第３標的核酸３１の３’末端にハイブリダイズし、ポリメラーゼによる伸長反応により、５’末端に末端プライマーＢ付加部分１３２が連結された第３標的核酸相補鎖３２の増幅断片３０４が合成される。

更に変性とアニーリングを行うと、増幅産物として、図３（Ｃ）に示すように、第１標的核酸１１を含む二本鎖第１標的核酸１０と、第２標的核酸２１を含む二本鎖第２標的核酸２０と、第３標的核酸３１を含む二本鎖第３標的核酸３０とが直列に連結され、第１標的核酸１１の５’末端側に末端プライマーＡ付加部分１０２が連結され、第３標的核酸相補鎖３２の５’末端側に末端プライマーＢ付加部分１３２が連結された核酸増幅産物１が得られる。核酸増幅産物１は、末端プライマーＡ付加部分１０２と末端プライマーＢ付加部分１３２との一方に含まれる前記結合部を介して固相担体に固定することができ、他方に含まれる前記標識部を指標として検出することが可能である。

核酸増幅産物１は、第１標的核酸１１（または第１標的核酸相補鎖１２）、第２標的核酸２１（または第２標的核酸相補鎖２２）、第３標的核酸３１（または第３標的核酸相補鎖３２）が３つとも鋳型中に存在する場合にのみ増幅される。鋳型中にこれらのうち１つまたは２つが存在しない場合、存在する標的核酸又はその相補鎖は増幅されるが、前記結合部と前記標識部とを併せ持つ核酸増幅産物は生じず、前記標識部を指標とした検出では陰性であることが明らかであるため、偽陽性判定のリスクが極めて低い。

上記の説明は、Ｎ＝３の場合には限定されずＮが２以上の全ての場合に妥当する。

以上の通り、本発明の実施形態１に係るプライマーセットを用いた核酸増幅反応により、
第１標的核酸の増幅断片と、
第ｋ標的核酸の相補鎖の部分と第（ｋ＋１）標的核酸の部分とが、互いの５’末端の間で連結された増幅断片と、
第Ｎ標的核酸の相補鎖の増幅断片とを含み、
第１標的核酸から第Ｎ標的核酸までのそれぞれがその相補鎖とハイブリダイズして二本鎖を形成し、
第１標的核酸の増幅断片及び第Ｎ標的核酸の相補鎖の増幅断片の一方では、５’末端に前記標識部が連結されており、
第１標的核酸の増幅断片及び第Ｎ標的核酸の相補鎖の増幅断片の他方では、５’末端に前記結合部が連結されている、
核酸増幅産物が生成される。ここでＮは２以上の整数であり、ｋは１からＮ－１までの整数である。この核酸増幅産物において、第ｋ標的核酸を含む二本鎖核酸と、第（ｋ＋１）標的核酸を含む二本鎖核酸との前記の連結の構造は、第ｋ双頭プライマーにおける２つのポリヌクレオチド間の連結の構造と同様である。
（１．２．プライマーセットの実施形態２）
本発明のプライマーセットの実施形態２は、
第１標的核酸の塩基配列の相補配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列を３’末端部に含むポリヌクレオチドを含む、末端プライマーＡと、
第ｋ標的核酸の塩基配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列Ａ_ｋを３’末端部に含み、前記塩基配列Ａ_ｋの５’末端側に塩基配列Ｂ_ｋを更に含むポリヌクレオチドを含む、第ｋリバースプライマーと、
第（ｋ＋１）標的核酸の塩基配列の相補配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列Ｃ_ｋ＋１を３’末端部に含み、前記塩基配列Ｃ_ｋ＋１の５’末端側に、前記塩基配列Ｂ_ｋとハイブリダイズする塩基配列Ｄ_ｋ＋１を更に含むポリヌクレオチドを含む、第（ｋ＋１）フォワードプライマーと、
第Ｎ標的核酸の塩基配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列を３’末端に含むポリヌクレオチドを含む、末端プライマーＢと
を含み、
Ｎは２以上の整数であり、
ｋは１からＮ－１までの整数であり、
前記第ｋリバースプライマー及び前記第（ｋ＋１）フォワードプライマーとして、それぞれ、ｋが１の場合からｋがＮ－１の場合までを含み、
前記末端プライマーＡ及び前記末端プライマーＢの一方が、前記標識部を更に含み、他方が、前記結合部を更に含む、
プライマーセットに関する。

実施形態２のプライマーセットにおいて、末端プライマーＡ及び末端プライマーＢ、前記標識部及び前記結合部、並びにそれらを連結する構造は、実施形態１と同じであるため説明を省略する。

第ｋリバースプライマーにおいて、塩基配列Ａ_ｋ及び塩基配列Ｂ_ｋはそれぞれ、その長さは特に限定されないが、例えば８塩基以上、１２塩基以上、又は１５塩基以上とすることができ、４０塩基以下、３０塩基以下、又は２５塩基以下とすることができる。塩基配列Ａ_ｋと塩基配列Ｂ_ｋを含むポリヌクレオチドは、その３’末端部に塩基配列Ａ_ｋを含み、塩基配列Ａ_ｋの５’末端塩基よりも５’末端側に塩基配列Ｂ_ｋを含んでいればよく、塩基配列Ａ_ｋと塩基配列Ｂ_ｋとの間、及び、塩基配列Ｂ_ｋよりも５’末端側には、それぞれ、更に他の塩基配列が付加されていてもよい。第ｋリバースプライマーに含まれるポリヌクレオチドの全長は特に限定されないが、例えば８０塩基以下、６０塩基以下、又は５０塩基以下とすることができる。

第ｋリバースプライマーを構成するポリヌクレオチドは、塩基配列Ａ_ｋと塩基配列Ｂ_ｋと（存在する場合は上記の他の塩基配列と）を同一方向となるように含み、５’末端から３’末端までの全体が、相補塩基配列を含むポリヌクレオチドにハイブリダイズすることが可能であり、ポリメラーゼ反応を阻害する構成を含んでいない。このため第ｋリバースプライマーを構成するポリヌクレオチドはその全体が、核酸増幅反応での伸長により二本鎖化されることができる。

第（ｋ＋１）フォワードプライマーにおいて、塩基配列Ｃ_ｋ＋１及び塩基配列Ｄ_ｋ＋１はそれぞれ、その長さは特に限定されないが、例えば８塩基以上、１２塩基以上、又は１５塩基以上とすることができ、４０塩基以下、３０塩基以下、又は２５塩基以下とすることができる。塩基配列Ｃ_ｋ＋１と塩基配列Ｄ_ｋ＋１を含むポリヌクレオチドは、その３’末端部に塩基配列Ｃ_ｋ＋１を含み、塩基配列Ｃ_ｋ＋１の５’末端塩基よりも５’末端側に塩基配列Ｄ_ｋ＋１を含んでいればよく、塩基配列Ｃ_ｋ＋１と塩基配列Ｄ_ｋ＋１との間、及び、塩基配列Ｃ_ｋ＋１よりも５’末端側には、それぞれ、更に他の塩基配列が付加されていてもよい。第（ｋ＋１）フォワードプライマーに含まれるポリヌクレオチドの全長は特に限定されないが、例えば８０塩基以下、６０塩基以下、又は５０塩基以下とすることができる。

第（ｋ＋１）フォワードプライマーを構成するポリヌクレオチドは、塩基配列Ｃ_ｋ＋１と塩基配列Ｄ_ｋ＋１と（存在する場合は上記の他の塩基配列と）を同一方向となるように含み、５’末端から３’末端までの全体が、相補塩基配列を含むポリヌクレオチドにハイブリダイズすることが可能であり、ポリメラーゼ反応を阻害する構成を含んでいない。このため第（ｋ＋１）フォワードプライマーを構成するポリヌクレオチドはその全体が、核酸増幅反応での伸長により二本鎖化されることができる。

第ｋリバースプライマーの塩基配列Ｂ_ｋと第（ｋ＋１）フォワードプライマーの塩基配列Ｄ_ｋ＋１はハイブリダイズ可能なように設計されている。

第１標的核酸１１、第２標的核酸２１の２つを標的核酸とする場合（すなわちＮ＝２）を例に挙げ、実施形態２のプライマーセットの働きを図４を参照して説明する。

末端プライマーＡ２００は、第１標的核酸１１の相補鎖１２の塩基配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列を３’末端部に含むポリヌクレオチド２０１を含む。末端プライマーＡ２００は、ポリヌクレオチド２０１に加えて、更に末端プライマーＡ付加部分２０２を備える。末端プライマーＡ付加部分２０２は、前記標識部又は結合部のいずれか一方である。

図４の例では、Ｎ＝２であるため、第ｋリバースプライマーとして、第１リバースプライマー２１０が含まれ、第（ｋ＋１）フォワードプライマーとして、第２フォワードプライマー２２０が含まれる。

第１リバースプライマー２１０は、第１標的核酸１１の塩基配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列Ａ_１２１１（第１リバースプライマー２１０に含まれるポリヌクレオチドのうち、塩基配列Ａ_１を含む部分ポリヌクレオチド２１１を指す）を３’末端部に含み、塩基配列Ａ_１２１１の５’末端側に塩基配列Ｂ_１２１２（第１リバースプライマー２１０に含まれるポリヌクレオチドのうち、塩基配列Ｂ_１を含む部分ポリヌクレオチド２１２を指す）を更に含むポリヌクレオチドを含む。

第２フォワードプライマー２２０は、第２標的核酸２１の相補鎖２２の塩基配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列Ｃ_２２２１（第２フォワードプライマー２２０に含まれるポリヌクレオチドのうち、塩基配列Ｃ_２を含む部分ポリヌクレオチド２２１を指す）を３’末端部に含み、前記塩基配列Ｃ_２２２１の５’末端側に、塩基配列Ｂ_１２１１とハイブリダイズする塩基配列Ｄ_２２２２（第２フォワードプライマー２２０に含まれるポリヌクレオチドのうち、塩基配列Ｄ_２を含む部分ポリヌクレオチド２２２を指す）を更に含むポリヌクレオチドを含む。

末端プライマーＢ２３０は、第２標的核酸２１の塩基配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列を３’末端部に含むポリヌクレオチド２３１を含む。末端プライマーＢ２３０は、ポリヌクレオチド２３１に加えて、更に末端プライマーＢ付加部分２３２を備える。末端プライマーＢ付加部分２３２は、前記標識部又は結合部のいずれか一方である。

図４（Ａ）に示す通り、前記核酸を鋳型として末端プライマーＡ２００、第１リバースプライマー２１０、第２フォワードプライマー２２０及び末端プライマーＢ２３０を含む第２実施形態のプライマーの存在下で核酸増幅反応を行うとき、末端プライマーＡ２００のポリヌクレオチド２０１は、変性とアニーニングを経て、第１標的核酸相補鎖１２の３’末端にハイブリダイズし、ポリメラーゼによる伸長反応により、５’末端に末端プライマーＡ付加部分２０２が連結された第１標的核酸１１の増幅断片４０１が合成される。また、第１リバースプライマー２１０は、変性とアニーニングを経て、第１標的核酸１１の３’末端にハイブリダイズし、ポリメラーゼによる伸長反応により、５’末端部に塩基配列Ｂ_１２１２が位置しその３’末端側に第１標的核酸相補鎖１２が位置する増幅断片４０２が合成される。

同様に、図４（Ａ）に示す通り、第２フォワードプライマー２２０は、変性とアニーニングを経て、第２標的核酸相補鎖２２の３’末端にハイブリダイズし、ポリメラーゼによる伸長反応により、５’末端部に塩基配列Ｄ_２２２２が位置しその３’末端側に第２標的核酸２１が位置する増幅断片４０３が合成される。

同様に、図４（Ａ）に示す通り、末端プライマーＢ２３０のポリヌクレオチド２３１は、変性とアニーニングを経て、第２標的核酸２１の３’末端にハイブリダイズし、ポリメラーゼによる伸長反応により、５’末端に末端プライマーＢ付加部分２３２が連結された第２標的核酸相補鎖２２の増幅断片４０４が合成される。

更に変性とアニーリングを行うと、図４（Ｂ）に示すように、前記増幅断片４０１の第１標的核酸１１の部分が、前記増幅断片４０２の第１標的核酸相補鎖１２の部分にハイブリダイズし、ポリメラーゼによる伸長反応により、３’末端部に塩基配列Ｄ_２２２２が位置し、その５’末端側に第１標的核酸１１が位置し、５’末端に末端プライマーＡ付加部分２０２が連結された増幅断片４０５が合成される。

同様に、図４（Ｂ）に示すように、前記増幅断片４０４の第２標的核酸相補鎖２２の部分が、前記増幅断片４０３の第２標的核酸２１の部分にハイブリダイズし、ポリメラーゼによる伸長反応により、３’末端部に塩基配列Ｂ_１２１２が位置し、その５’末端側に第２標的核酸相補鎖２２が位置し、５’末端に末端プライマーＢ付加部分２３２が連結された増幅断片４０６が合成される。

更に変性とアニーリングを行うと、図４（Ｃ）に示すように、前記増幅断片４０５の３’末端部の塩基配列Ｄ_２２２２と、前記増幅断片４０６の３’末端部の塩基配列Ｂ_１２１２とがハイブリダイズする。次いで、ポリメラーゼによる伸長反応により、前記増幅断片４０５の３’末端を起点に第２標的核酸２１が合成され、前記増幅断片４０６の３’末端を起点に第１標的核酸相補鎖２２が合成される。

上記反応の結果、増幅産物として、図４（Ｄ）に示すように、第１標的核酸１１の塩基配列と塩基配列Ｄ_２２２２と第２標的核酸２１の塩基配列とがこの順で５’末端から３’末端に配置された増幅断片４０７と、第２標的核酸２１の相補鎖２２の塩基配列と塩基配列Ｂ_１２１２と第１標的核酸１１の相補鎖１２の塩基配列とがこの順で５’末端から３’末端に配置された増幅断片４０８とがハイブリダイズし、前記増幅断片４０７の５’末端に末端プライマーＡ付加部分２０２が連結し、前記増幅断片４０８の５’末端に末端プライマーＢ付加部分２０３が連結している、増幅産物２が生成される。

核酸増幅産物２は、第１標的核酸１１（または第１標的核酸相補鎖１２）、第２標的核酸２１（または第２標的核酸相補鎖２２）が２つとも鋳型中に存在する場合にのみ増幅される。鋳型中にこれらのうち１つが存在しない場合、存在する標的核酸又はその相補鎖は増幅されるが、前記結合部と前記標識部とを併せ持つ核酸増幅産物は生じず、前記標識部を指標とした検出では陰性であることが明らかであるため、偽陽性判定のリスクが極めて低い。

なお、図４（Ｃ）に示す前記増幅断片４０５と前記増幅断片４０６とのハイブリダイズは、反応系中に第１リバースプライマー２１０又は第２フォワードプライマー２２０が過剰に存在する場合は進みにくい。このため、本実施形態のプライマーセットでは、第１リバースプライマー２１０及び第２フォワードプライマー２２０に対して、末端プライマーＡ２００及び末端プライマーＢ２３０のモル比を高めた条件で核酸増幅反応を行うことが好ましい。

上記の説明は、Ｎ＝２の場合には限定されずＮが２以上の全ての場合に妥当する。

以上の通り、本発明の実施形態２に係るプライマーセットを用いた核酸増幅反応により、
５’末端から３’末端に向けて、第１標的核酸の塩基配列から、第Ｎ標的核酸の塩基配列までを順に含む第１の増幅断片と、
５’末端から３’末端に向けて、第Ｎ標的核酸の相補鎖の塩基配列から、第１標的核酸の相補鎖の塩基配列までを順に含む第２の増幅断片とを含み、
前記第１の増幅断片と前記第２の増幅断片がハイブリダイズして二本鎖を形成し、
前記第１の増幅断片と前記第２の増幅断片の一方では、５’末端に前記標識部が連結されており、
前記第１の増幅断片と前記第２の増幅断片の他方では、５’末端に前記結合部が連結されている、
核酸増幅産物が生成される。ここでＮは２以上の整数である。この核酸増幅産物において、前記第１の増幅断片は、第ｋ標的核酸の塩基配列と第（ｋ＋１）標的核酸の塩基配列との間には、第（ｋ＋１）フォワードプライマーの塩基配列Ｄ_ｋ＋１を含む。前記第２の増幅断片は、第ｋ標的核酸の相補鎖の塩基配列と第（ｋ＋１）標的核酸の相補鎖の塩基配列との間には、第ｋリバースプライマーの塩基配列Ｂ_ｋを含む。ｋは１からＮ－１までの整数である。
（１．３．プライマーセットの実施形態３）
本発明のプライマーセットの実施形態３は、
第１標的核酸の塩基配列の相補配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列を３’末端部に含むポリヌクレオチドを含む、末端プライマーＡと、
第ｋ標的核酸の塩基配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列Ｅ_ｋを３’末端部に含むポリヌクレオチドと、前記塩基配列Ｅ_ｋを含む前記ポリヌクレオチドの５’末端側に連結された、核酸増幅反応において二本鎖化されない塩基配列Ｆ_ｋを含むポリヌクレオチドを含む、第ｋリバースプライマーと、
第（ｋ＋１）標的核酸の塩基配列の相補配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列Ｇ_ｋ＋１を３’末端部に含むポリヌクレオチドと、前記塩基配列Ｇ_ｋ＋１を含む前記ポリヌクレオチドの５’末端側に連結された、核酸増幅反応において二本鎖化されない、前記塩基配列Ｆ_ｋとハイブリダイズする塩基配列Ｈ_ｋ＋１を含むポリヌクレオチドとを含む、第（ｋ＋１）フォワードプライマーと、
第Ｎ標的核酸の塩基配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列を３’末端に含むポリヌクレオチドを含む、末端プライマーＢと
を含み、
Ｎは２以上の整数であり、
ｋは１からＮ－１までの整数であり、
前記第ｋリバースプライマー及び前記第（ｋ＋１）フォワードプライマーとして、それぞれ、ｋが１の場合からｋがＮ－１の場合までを含み、
前記末端プライマーＡ及び前記末端プライマーＢの一方が、前記標識部を更に含み、他方が、前記結合部を更に含む、
プライマーセットに関する。

実施形態３のプライマーセットにおいて、末端プライマーＡ及び末端プライマーＢ、前記標識部及び前記結合部、並びにそれらを連結する構造は、実施形態１と同じであるため説明を省略する。

第ｋリバースプライマーにおいて、塩基配列Ｅ_ｋは、その長さは特に限定されないが、例えば８塩基以上、１２塩基以上、又は１５塩基以上とすることができ、４０塩基以下、３０塩基以下、又は２５塩基以下とすることができる。塩基配列Ｅ_ｋを含むポリヌクレオチドは、その３’末端部に塩基配列Ｅ_ｋを含んでいればよく、塩基配列Ｅ_ｋよりも５’末端側に他の塩基配列を更に含んでいてもよい。塩基配列Ｅ_ｋを含むポリヌクレオチドの全長は特に限定されないが、例えば４０塩基以下、３０塩基以下又は２５塩基以下とすることができる。

第ｋリバースプライマーにおいて、塩基配列Ｆ_ｋは、その長さは特に限定されないが、例えば８塩基以上、１２塩基以上、又は１５塩基以上とすることができ、４０塩基以下、３０塩基以下、又は２５塩基以下とすることができる。塩基配列Ｆ_ｋを含むポリヌクレオチドは、塩基配列Ｆ_ｋよりも３’末端側及び／又は５’末端側に他の塩基配列を更に含んでいてもよい。塩基配列Ｆ_ｋを含むポリヌクレオチドの全長は特に限定されないが、例えば４０塩基以下、３０塩基以下又は２５塩基以下とすることができる。

第ｋリバースプライマーにおいて、塩基配列Ｅ_ｋを含むポリヌクレオチドと、塩基配列Ｆ_ｋを含むポリヌクレオチドとは、後者が核酸増幅反応での伸長により前者と共に二本鎖化されないよう構成されている。塩基配列Ｆ_ｋを含むポリヌクレオチドがＤＮＡポリメラーゼによる反応の鋳型となり得るポリヌクレオチド（通常は、天然のヌクレオチドからなるもの）である場合、塩基配列Ｅ_ｋを含むポリヌクレオチドと、塩基配列Ｆ_ｋを含むポリヌクレオチドとはポリメラーゼ反応を阻害するスペーサーを介して連結される。このような「スペーサー」としては、プライマーセットの実施形態１の末端プライマーＡ又はＢに含まれるポリヌクレオチドと標識部又は結合部との間の、ポリメラーゼ反応を阻害するスペーサーとして既述の構造が採用できる。この場合、塩基配列Ｅ_ｋを含むポリヌクレオチドと、塩基配列Ｆ_ｋを含むポリヌクレオチドとは一方向に連結することができる。一方、塩基配列Ｆ_ｋを含むポリヌクレオチドとして、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）、Ｌ型核酸、２’－Ｏ－メチル化ヌクレオチドなどの修飾核酸を含むポリヌクレオチドのように、ＤＮＡポリメラーゼによる反応の鋳型にならず核酸増幅反応での伸長により二本鎖化されないポリヌクレオチドを用いる場合には、上記の、ポリメラーゼ反応を阻害するスペーサーは省略することも可能である。

第（ｋ＋１）フォワードプライマーにおいて、塩基配列Ｇ_ｋ＋１は、その長さは特に限定されないが、例えば８塩基以上、１２塩基以上、又は１５塩基以上とすることができ、４０塩基以下、３０塩基以下、又は２５塩基以下とすることができる。塩基配列Ｇ_ｋ＋１を含むポリヌクレオチドは、その３’末端部に塩基配列Ｇ_ｋ＋１を含んでいればよく、塩基配列Ｇ_ｋ＋１よりも５’末端側に他の塩基配列を更に含んでいてもよい。塩基配列Ｇ_ｋ＋１を含むポリヌクレオチドの全長は特に限定されないが、例えば４０塩基以下、３０塩基以下又は２５塩基以下とすることができる。

第（ｋ＋１）フォワードプライマーにおいて、塩基配列Ｈ_ｋ＋１は、その長さは特に限定されないが、例えば８塩基以上、１２塩基以上、又は１５塩基以上とすることができ、４０塩基以下、３０塩基以下、又は２５塩基以下とすることができる。塩基配列Ｈ_ｋ＋１を含むポリヌクレオチドは、塩基配列Ｈ_ｋ＋１よりも３’末端側及び／又は５’末端側に他の塩基配列を更に含んでいてもよい。塩基配列Ｈ_ｋ＋１を含むポリヌクレオチドの全長は特に限定されないが、例えば４０塩基以下、３０塩基以下又は２５塩基以下とすることができる。

第（ｋ＋１）フォワードプライマーにおいて、塩基配列Ｇ_ｋ＋１を含むポリヌクレオチドと、塩基配列Ｈ_ｋ＋１を含むポリヌクレオチドとは、後者が核酸増幅反応での伸長により前者と共に二本鎖化されないよう構成されている。塩基配列Ｈ_ｋ＋１を含むポリヌクレオチドがＤＮＡポリメラーゼによる反応の鋳型となり得るポリヌクレオチド（通常は、天然のヌクレオチドからなるもの）である場合、塩基配列Ｇ_ｋ＋１を含むポリヌクレオチドと、塩基配列Ｈ_ｋ＋１を含むポリヌクレオチドとはポリメラーゼ反応を阻害するスペーサーを介して連結される。このような「スペーサー」としては、プライマーセットの実施形態１の末端プライマーＡ又はＢに含まれるポリヌクレオチドと標識部又は結合部との間の、ポリメラーゼ反応を阻害するスペーサーとして既述の構造が採用できる。この場合、塩基配列Ｇ_ｋ＋１を含むポリヌクレオチドと、塩基配列Ｈ_ｋ＋１を含むポリヌクレオチドとは一方向に連結することができる。一方、塩基配列Ｈ_ｋ＋１を含むポリヌクレオチドとして、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）、Ｌ型核酸、２’－Ｏ－メチル化ヌクレオチドなどの修飾核酸を含むポリヌクレオチドのように、ＤＮＡポリメラーゼによる反応の鋳型にならず核酸増幅反応での伸長により二本鎖化されないポリヌクレオチドを用いる場合には、上記の、ポリメラーゼ反応を阻害するスペーサーは省略することも可能である。

第ｋリバースプライマーの塩基配列Ｆ_ｋと、第（ｋ＋１）フォワードプライマーの塩基配列Ｈ_ｋ＋１とは、相互にハイブリダイズし、プライマーセットに含まれる各プライマーによる核酸増幅を阻害しないように適宜設計することができる。

第１標的核酸１１、第２標的核酸２１の２つを標的核酸とする場合（すなわちＮ＝２）を例に挙げ、実施形態３のプライマーセットの働きを図５を参照して説明する。

末端プライマーＡ５００は、第１標的核酸１１の相補鎖１２の塩基配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列を３’末端部に含むポリヌクレオチド５０１を含む。末端プライマーＡ５００は、ポリヌクレオチド５０１に加えて、更に末端プライマーＡ付加部分５０２を備える。末端プライマーＡ付加部分５０２は、前記標識部又は結合部のいずれか一方である。

図５の例では、Ｎ＝２であるため、第ｋリバースプライマーとして、第１リバースプライマー５１０が含まれ、第（ｋ＋１）フォワードプライマーとして、第２フォワードプライマー５２０が含まれる。

第１リバースプライマー５１０は、第１標的核酸の塩基配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列Ｅ_１を３’末端部に含むポリヌクレオチド５１１と、前記塩基配列Ｅ_１を含む前記ポリヌクレオチド５１１の５’末端側に連結された、塩基配列Ｆ_１を含むポリヌクレオチド５１２とを含む。

第２フォワードプライマー５２０は、第２標的核酸２１の塩基配列の相補配列２２の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列Ｇ_２を３’末端部に含むポリヌクレオチド５２１と、前記塩基配列Ｇ_２を含むポリヌクレオチド５２１の５’末端側に連結された、前記塩基配列Ｆ_１とハイブリダイズする塩基配列Ｈ_２を含むポリヌクレオチド５２２とを含む。

末端プライマーＢ５３０は、第２標的核酸２１の塩基配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列を３’末端部に含むポリヌクレオチド５３１を含む。末端プライマーＢ５３０は、ポリヌクレオチド５３１に加えて、更に末端プライマーＢ付加部分５３２を備える。末端プライマーＢ付加部分５３２は、前記標識部又は結合部のいずれか一方である。

図５（Ａ）に示す通り、前記核酸を鋳型として末端プライマーＡ５００、第１リバースプライマー５１０、第２フォワードプライマー５２０及び末端プライマーＢ５３０を含む第３実施形態のプライマーの存在下で核酸増幅反応を行うとき、末端プライマーＡ５００のポリヌクレオチド５０１は、変性とアニーニングを経て、第１標的核酸相補鎖１２の３’末端にハイブリダイズし、ポリメラーゼによる伸長反応により、５’末端に末端プライマーＡ付加部分５０２が連結された第１標的核酸１１の増幅断片５５１が合成される。

同様に、図５（Ａ）に示す通り、第１リバースプライマー５１０の塩基配列Ｅ_１を含むポリヌクレオチド５１１は、変性とアニーニングを経て、第１標的核酸１１の３’末端にハイブリダイズし、ポリメラーゼによる伸長反応により、塩基配列Ｆ_１を含むポリヌクレオチド５１２が５’末端側に連結された第１標的核酸相補鎖１２の増幅断片５５２が合成される。

同様に、図５（Ａ）に示す通り、第２フォワードプライマー５２０の塩基配列Ｇ_２を含むポリヌクレオチド５２１は、変性とアニーニングを経て、第２標的核酸相補鎖２２の３’末端にハイブリダイズし、ポリメラーゼによる伸長反応により、塩基配列Ｈ_２を含むポリヌクレオチド５２２が５’末端側に連結された第２標的核酸２１の増幅断片５５３が合成される。

同様に、図５（Ａ）に示す通り、末端プライマーＢ５３０のポリヌクレオチド５３１は、変性とアニーニングを経て、第２標的核酸２１の３’末端にハイブリダイズし、ポリメラーゼによる伸長反応により、５’末端に末端プライマーＢ付加部分５３２が連結された第２標的核酸相補鎖２２の増幅断片５５４が合成される。

更に変性とアニーリングを行うと、図５（Ｂ）に示すように、前記増幅断片５５１の第１標的核酸１１の部分と、前記増幅断片５５２の第１標的核酸相補鎖１２の部分とがハイブリダイズし、前記増幅断片５５２の塩基配列Ｆ_１を含むポリヌクレオチド５１２の部分と、前記増幅断片５５３の塩基配列Ｈ_２を含むポリヌクレオチド５２２の部分とがハイブリダイズし、前記増幅断片５５３の第２標的核酸２１の部分と、前記増幅断片５５４の第２標的核酸相補鎖２２の部分とがハイブリダイズした、核酸増幅産物３が生成される。

核酸増幅産物３は、鋳型中に、第１標的核酸１１（または第１標的核酸相補鎖１２）、第２標的核酸２１（または第２標的核酸相補鎖２２）が２つとも鋳型中に存在する場合にのみ増幅される。鋳型中にこれらのうち１つが存在しない場合、存在する標的核酸又はその相補鎖は増幅されるが、前記結合部と前記標識部とを併せ持つ核酸増幅産物は生じず、前記標識部を指標とした検出では陰性であることが明らかであるため、偽陽性判定のリスクが極めて低い。

なお、図５（Ｂ）に示す前記増幅断片５５１～５５４の間のハイブリダイズは、反応系中に第１リバースプライマー５１０又は第２フォワードプライマー５２０が過剰に存在する場合は進みにくい。このため、本実施形態のプライマーセットでは、第１リバースプライマー５１０及び第２フォワードプライマー５２０に対して、末端プライマーＡ５００及び末端プライマーＢ５３０のモル比を高めた条件で核酸増幅反応を行うことが好ましい。

上記の説明は、Ｎ＝２の場合には限定されずＮが２以上の全ての場合に妥当する。

以上の通り、本発明の実施形態３に係るプライマーセットを用いた核酸増幅反応により、
第１標的核酸から第Ｎ標的核酸までの標的核酸のそれぞれとその相補鎖とがハイブリダイズした二本鎖増幅断片と、
第２標的核酸から第Ｎ標的核酸の標的核酸のそれぞれの５’末端側に一本鎖ポリペプチドが連結されており、
第１標的核酸から第（Ｎ－１）標的核酸の標的核酸のそれぞれの相補鎖の５’末端側に一本鎖ポリペプチドが連結されており、
第ｋ標的核酸の二本鎖増幅断片における、第ｋ標的核酸の相補鎖の５’末端側に連結した一本鎖ポリペプチドと、第（ｋ＋１）標的核酸の二本鎖増幅断片における、第（ｋ＋１）標的核酸の５’末端側に連結した一本鎖ポリペプチドとが、相互にハイブリダイズしており、
第１標的核酸の増幅断片と第Ｎ標的核酸の相補鎖の増幅断片の一方では、５’末端に前記標識部が連結されており、
第１標的核酸の増幅断片と第Ｎ標的核酸の相補鎖の増幅断片の他方では、５’末端に前記結合部が連結されている、
核酸増幅産物が生成される。ここでＮは２以上の整数であり、ｋが１～Ｎ－１の整数である。
（１．４．実施形態４）
本発明のプライマーセットの実施形態４は、
第１標的核酸の塩基配列の相補配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列を３’末端部に含むポリヌクレオチドを含む、末端プライマーＡと、
第ｋ標的核酸の塩基配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列Ｉ_ｋを３’末端部に含むポリヌクレオチドと、前記塩基配列Ｉ_ｋを含む前記ポリヌクレオチドの５’末端側に連結された、核酸増幅反応において二本鎖化されない塩基配列Ｊ_ｋを含むポリヌクレオチドとを含む、第ｋリバースプライマーと、
第（ｋ＋１）標的核酸の塩基配列の相補配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列Ｌ_ｋ＋１を３’末端部に含むポリヌクレオチドと、前記塩基配列Ｌ_ｋ＋１の５’末端側に連結された、核酸増幅反応において二本鎖化されない塩基配列Ｍ_ｋ＋１を更に含むポリヌクレオチドとを含む、第（ｋ＋１）フォワードプライマーと、
前記塩基配列Ｊ_ｋとハイブリダイズする塩基配列を含むポリヌクレオチドと、前記塩基配列Ｍ_ｋ＋１とハイブリダイズする塩基配列とを含むポリヌクレオチドとを含む、第ｋ連結用ポリヌクレオチドと、
第Ｎ標的核酸の塩基配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列を３’末端に含むポリヌクレオチドを含む、末端プライマーＢと
を含み、
Ｎは２以上の整数であり、
ｋは１からＮ－１までの整数であり、
前記第ｋリバースプライマー、前記第（ｋ＋１）フォワードプライマー及び前記第ｋ連結用ポリヌクレオチドとして、それぞれ、ｋが１の場合からｋがＮ－１の場合までを含み、
前記末端プライマーＡ及び前記末端プライマーＢの一方が、前記標識部を更に含み、他方が、前記結合部を更に含む、
プライマーセットに関する。

実施形態４のプライマーセットにおいて、末端プライマーＡ及び末端プライマーＢ、前記標識部及び前記結合部、並びにそれらを連結する構造は、実施形態１と同じであるため説明を省略する。

実施形態４の第ｋリバースプライマーにおいて、塩基配列Ｉ_ｋは、その長さは特に限定されないが、例えば８塩基以上、１２塩基以上、又は１５塩基以上とすることができ、４０塩基以下、３０塩基以下、又は２５塩基以下とすることができる。塩基配列Ｉ_ｋを含むポリヌクレオチドは、その３’末端部に塩基配列Ｉ_ｋを含んでいればよく、塩基配列Ｉ_ｋよりも５’末端側に他の塩基配列を更に含んでいてもよい。塩基配列Ｉ_ｋを含むポリヌクレオチドの全長は特に限定されないが、例えば４０塩基以下、３０塩基以下又は２５塩基以下とすることができる。

第ｋリバースプライマーにおいて、塩基配列Ｊ_ｋは、その長さは特に限定されないが、例えば８塩基以上、１２塩基以上、又は１５塩基以上とすることができ、４０塩基以下、３０塩基以下、又は２５塩基以下とすることができる。塩基配列Ｊ_ｋを含むポリヌクレオチドは、塩基配列Ｊ_ｋよりも３’末端側及び／又は５’末端側に他の塩基配列を更に含んでいてもよい。塩基配列Ｊ_ｋを含むポリヌクレオチドの全長は特に限定されないが、例えば４０塩基以下、３０塩基以下又は２５塩基以下とすることができる。

第ｋリバースプライマーにおいて、塩基配列Ｉ_ｋを含むポリヌクレオチドと、塩基配列Ｊ_ｋを含むポリヌクレオチドとは、後者が核酸増幅反応での伸長により前者と共に二本鎖化されないように構成されている。塩基配列Ｊ_ｋを含むポリヌクレオチドがＤＮＡポリメラーゼによる反応の鋳型となり得るポリヌクレオチド（通常は、天然のヌクレオチドからなるもの）である場合、塩基配列Ｉ_ｋを含むポリヌクレオチドと、塩基配列Ｊ_ｋを含むポリヌクレオチドとは、ポリメラーゼ反応を阻害するスペーサーを介して連結される。このような「スペーサー」としては、プライマーセットの実施形態１の末端プライマーＡ又はＢに含まれるポリヌクレオチドと標識部又は結合部との間の、ポリメラーゼ反応を阻害するスペーサーとして既述の構造が採用できる。この場合、塩基配列Ｉ_ｋを含むポリヌクレオチドと、塩基配列Ｊ_ｋを含むポリヌクレオチドとは一方向に連結することができる。一方、塩基配列Ｊ_ｋを含むポリヌクレオチドとして、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）、Ｌ型核酸、２’－Ｏ－メチル化ヌクレオチドなどの修飾核酸を含むポリヌクレオチドのように、ＤＮＡポリメラーゼによる反応の鋳型にならず核酸増幅反応での伸長により二本鎖化されないポリヌクレオチドを用いる場合には、上記の、ポリメラーゼ反応を阻害するスペーサーは省略することも可能である。

第（ｋ＋１）フォワードプライマーにおいて、塩基配列Ｌ_ｋ＋１は、その長さは特に限定されないが、例えば８塩基以上、１２塩基以上、又は１５塩基以上とすることができ、４０塩基以下、３０塩基以下、又は２５塩基以下とすることができる。塩基配列Ｌ_ｋ＋１を含むポリヌクレオチドは、その３’末端部に塩基配列Ｌ_ｋ＋１を含んでいればよく、塩基配列Ｌ_ｋ＋１よりも５’末端側に他の塩基配列を更に含んでいてもよい。塩基配列Ｌ_ｋ＋１を含むポリヌクレオチドの全長は特に限定されないが、例えば４０塩基以下、３０塩基以下又は２５塩基以下とすることができる。

第（ｋ＋１）フォワードプライマーにおいて、塩基配列Ｍ_ｋ＋１は、その長さは特に限定されないが、例えば８塩基以上、１２塩基以上、又は１５塩基以上とすることができ、４０塩基以下、３０塩基以下、又は２５塩基以下とすることができる。塩基配列Ｍ_ｋ＋１を含むポリヌクレオチドは、塩基配列Ｍ_ｋ＋１よりも３’末端側及び／又は５’末端側に他の塩基配列を更に含んでいてもよい。塩基配列Ｍ_ｋ＋１を含むポリヌクレオチドの全長は特に限定されないが、例えば４０塩基以下、３０塩基以下又は２５塩基以下とすることができる。

第（ｋ＋１）フォワードプライマーにおいて、塩基配列Ｌ_ｋ＋１を含むポリヌクレオチドと、塩基配列Ｍ_ｋ＋１を含むポリヌクレオチドとは、後者が核酸増幅反応での伸長により前者と共に二本鎖化されないように構成されている。塩基配列Ｍ_ｋ＋１を含むポリヌクレオチドがＤＮＡポリメラーゼによる反応の鋳型となり得るポリヌクレオチド（通常は、天然のヌクレオチドからなるもの）である場合、塩基配列Ｌ_ｋ＋１を含むポリヌクレオチドと、塩基配列Ｍ_ｋ＋１を含むポリヌクレオチドとはポリメラーゼ反応を阻害するスペーサーを介して連結される。このような「スペーサー」としては、プライマーセットの実施形態１の末端プライマーＡ又はＢに含まれるポリヌクレオチドと標識部又は結合部又は結合部との間の、ポリメラーゼ反応を阻害するスペーサーとして既述の構造が採用できる。この場合、塩基配列Ｌ_ｋ＋１を含むポリヌクレオチドと、塩基配列Ｍ_ｋ＋１を含むポリヌクレオチドとは一方向に連結することができる。一方、塩基配列Ｍ_ｋ＋１を含むポリヌクレオチドとして、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）、Ｌ型核酸、２’－Ｏ－メチル化ヌクレオチドなどの修飾核酸を含むポリヌクレオチドのように、ＤＮＡポリメラーゼによる反応の鋳型にならず核酸増幅反応での伸長により二本鎖化されないポリヌクレオチドを用いる場合には、上記の、ポリメラーゼ反応を阻害するスペーサーは省略することも可能である。

第ｋ連結用ポリヌクレオチドにおいて、塩基配列Ｊ_ｋとハイブリダイズする塩基配列を含むポリヌクレオチドは、塩基配列Ｊ_ｋとハイブリダイズする塩基配列の５’末端側及び／又は３’末端側に更に他の塩基配列を含んでもよい。

第ｋ連結用ポリヌクレオチドにおいて、塩基配列Ｍ_ｋ＋１とハイブリダイズする塩基配列を含むポリヌクレオチドは、塩基配列Ｍ_ｋ＋１とハイブリダイズする塩基配列の５’末端側及び／又は３’末端側に更に他の塩基配列を含んでもよい。

第ｋ連結用ポリヌクレオチドに含まれる、塩基配列Ｊ_ｋとハイブリダイズする塩基配列を含むポリヌクレオチドと、塩基配列Ｍ_ｋ＋１とハイブリダイズする塩基配列を含むポリヌクレオチドとは、１つながりのポリヌクレオチド分子であってもよいし、間に適当な化学構造を介して連結されたものであってもよい。このような化学構造としては、例えば、プライマーセットの実施形態１の末端プライマーＡ又はＢに含まれるポリヌクレオチドと標識部又は結合部との間の構造として既述の構造が採用できる。第ｋ連結用ポリヌクレオチドは、好ましくは、ＤＮＡポリメラーゼによる反応において鋳型とならない構造を有する。例えば、塩基配列Ｊ_ｋとハイブリダイズする塩基配列を含むポリヌクレオチドと、塩基配列Ｍ_ｋ＋１とハイブリダイズする塩基配列を含むポリヌクレオチドとが、それぞれ３’末端側で連結されたものであってもよいし、塩基配列Ｊ_ｋとハイブリダイズする塩基配列を含むポリヌクレオチドと、塩基配列Ｍ_ｋ＋１とハイブリダイズする塩基配列を含むポリヌクレオチドの一方又は両方が、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）、Ｌ型核酸、２’－Ｏ－メチル化ヌクレオチドなどの修飾核酸を含むポリヌクレオチドのように、ＤＮＡポリメラーゼによる反応の鋳型にならず核酸増幅反応での伸長により二本鎖化されないポリヌクレオチドにより構成されていてもよい。

第ｋリバースプライマーの塩基配列Ｊ_ｋ、第（ｋ＋１）フォワードプライマーの塩基配列Ｍ_ｋ＋１、第ｋ連結用ポリヌクレオチドに含まれるこれらの塩基配列とハイブリダイズする塩基配列は、プライマーセットに含まれる各プライマーによる核酸増幅を阻害しないように適宜設計することができる。

第１標的核酸１１、第２標的核酸２１の２つを標的核酸とする場合（すなわちＮ＝２）を例に挙げ、実施形態４のプライマーセットの働きを図６を参照して説明する。

末端プライマーＡ６００は、第１標的核酸１１の相補鎖１２の塩基配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列を３’末端部に含むポリヌクレオチド６０１と、末端プライマーＡ付加部分６０２とを備える。

図６の例では、Ｎ＝２であるため、第ｋリバースプライマーとして、第１リバースプライマー６１０が含まれ、第（ｋ＋１）フォワードプライマーとして、第２フォワードプライマー６２０が含まれ、第ｋ連結用ポリヌクレオチドとして、第１連結用ポリヌクレオチド６４０が含まれる。

第１リバースプライマー６１０は、塩基配列Ｉ_１を３’末端部に含むポリヌクレオチド６１１と、ポリヌクレオチド６１１の５’末端側に連結された、塩基配列Ｊ_１を含むポリヌクレオチド６１２とを含む。

第２フォワードプライマー６２０は、塩基配列Ｌ_２を３’末端部に含むポリヌクレオチド６２１と、ポリヌクレオチド６２１の５’末端側に連結された、塩基配列Ｍ_２を含むポリヌクレオチド６２２とを含む。

末端プライマーＢ６３０は、第２標的核酸２１の塩基配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列を３’末端部に含むポリヌクレオチド６３１と、末端プライマーＢ付加部分６３２を備える。

第１連結用ポリヌクレオチド６４０は、塩基配列Ｊ_１を含むポリヌクレオチド６１２とハイブリダイズする塩基配列を含むポリヌクレオチド６４１と、塩基配列Ｍ_２を含むポリヌクレオチド６２２とハイブリダイズする塩基配列を含むポリヌクレオチド６４２を含む。

図６（Ａ）に示す通り、前記核酸を鋳型として末端プライマー６００、第１リバースプライマー６１０、第２フォワードプライマー６２０及び末端プライマーＢ６３０を含む第４実施形態のプライマーの存在下で核酸増幅反応を行うとき、末端プライマーＡ６００からは、５’末端に末端プライマーＡ付加部分６０２が連結された第１標的核酸１１の増幅断片６５１が合成される。

第１リバースプライマー６１０からは、塩基配列Ｊ_１を含むポリヌクレオチド６１２が５’末端側に連結された第１標的核酸相補鎖１２の増幅断片６５２が合成される。

第２フォワードプライマー６２０からは、塩基配列Ｍ_２を含むポリヌクレオチド６２２が５’末端側に連結された第２標的核酸２１の増幅断片６５３が合成される。

末端プライマーＢ６３０からは、５’末端に末端プライマーＢ付加部分６３２が連結された第２標的核酸相補鎖２２の増幅断片６５４が合成される。

第１連結用ポリヌクレオチド６４０は核酸増幅反応には直接関与しない。

核酸増幅反応後の増幅産物を変性しアニーリングすると、図５（Ｂ）に示すように、前記増幅断片６５１の第１標的核酸１１の部分と、前記増幅断片６５２の第１標的核酸相補鎖１２の部分とがハイブリダイズし、前記増幅断片６５２のポリヌクレオチド６１２の部分と、第１連結用ポリヌクレオチド６４０のポリペプチド６４１の部分とがハイブリダイズし、第１連結用ポリヌクレオチド６４０のポリペプチド６４２の部分と、前記増幅断片６５３のポリヌクレオチド６２２の部分とがハイブリダイズし、前記増幅断片６５３の第２標的核酸２１の部分と、前記増幅断片６５４の第２標的核酸相補鎖２２の部分とがハイブリダイズした、核酸増幅産物４が生成される。

核酸増幅産物４は、鋳型中に、第１標的核酸１１（または第１標的核酸相補鎖１２）、第２標的核酸２１（または第２標的核酸相補鎖２２）が２つとも鋳型中に存在する場合にのみ増幅される。鋳型中にこれらのうち１つが存在しない場合、存在する標的核酸又はその相補鎖は増幅されるが、前記結合部と前記標識部とを併せ持つ核酸増幅産物は生じず、前記標識部を指標とした検出では陰性であることが明らかであるため、偽陽性判定のリスクが極めて低い。

なお、図６（Ｂ）に示す前記増幅断片６５１～６５４及び第１連結用ポリヌクレオチド６４０の間のハイブリダイズは、反応系中に第１リバースプライマー６１０又は第２フォワードプライマー６２０が過剰に存在する場合は進みにくい。このため、本実施形態のプライマーセットでは、第１リバースプライマー６１０及び第２フォワードプライマー６２０に対して、末端プライマーＡ６００及び末端プライマーＢ６３０のモル比を高めた条件で核酸増幅反応を行うことが好ましい。

なお、第ｋ連結用ポリヌクレオチドは核酸増幅反応には直接関与しないため、核酸増幅反応後に反応系中に添加し、その後に、反応系を変性しアニーリングしてもよい。

上記の説明は、Ｎ＝２の場合には限定されずＮが２以上の全ての場合に妥当する。

以上の通り、本発明の実施形態４に係るプライマーセットを用いた核酸増幅反応により、
第１標的核酸から第Ｎ標的核酸までの標的核酸のそれぞれとその相補鎖とがハイブリダイズした二本鎖増幅断片と、
第１連結用ポリヌクレオチドから第（Ｎ－１）連結用ポリヌクレオチドまでのＮ－１個の連結用ポリヌクレオチドを含み
第２標的核酸から第Ｎ標的核酸の標的核酸のそれぞれの５’末端側に一本鎖ポリペプチドが連結されており、
第１標的核酸から第（Ｎ－１）標的核酸の標的核酸のそれぞれの相補鎖の５’末端側に一本鎖ポリペプチドが連結されており、
第ｋ標的核酸の相補鎖の５’末端側に連結した一本鎖ポリペプチドと、第ｋ連結用ポリヌクレオチドの一部とが、相互にハイブリダイズしており、
第（ｋ＋１）標的核酸の５’末端側に連結した一本鎖ポリペプチドと、第ｋ連結用ポリヌクレオチドの他の一部とが、相互にハイブリダイズしており、
第１標的核酸の増幅断片と第Ｎ標的核酸の相補鎖の増幅断片の一方では、５’末端に前記標識部が連結されており、
第１標的核酸の増幅断片と第Ｎ標的核酸の相補鎖の増幅断片の他方では、５’末端に前記結合部が連結されている、
核酸増幅産物が生成される。ここでＮは２以上の整数であり、ｋが１～Ｎ－１の整数である。
＜２．本発明の検出方法＞
本発明はまた、２以上の標的核酸を検出する方法であって、
連結された、２以上の標的核酸と、標識物質である又は標識物質と結合可能なタグである標識部と、固相担体と結合可能なタグである結合部とを含む検出用核酸を含む可能性のある検出用試料を、前記結合部と結合可能な部分を少なくとも一部に含む固相担体に接触させ、前記標識部を指標として前記固相担体の前記部分での前記検出用核酸を検出する検出工程
を含む方法に関する。

図２に基づいて説明した通り、各々に結合部と標識部とを結合させた２以上の標的核酸の混合物を、各結合部に応じた複数の結合部位を含む１つの固相担体に接触させる場合は判別性が悪いという問題がある。

本発明では、２以上の標的核酸と、前記標識部と、前記結合部とが連結された核酸を検出用核酸とし、該検出用核酸を含む可能性のある検出用試料を、前記結合部と結合可能な部分を少なくとも一部に含む固相担体に接触させ、前記標識部を指標として前記固相担体の前記部分での前記検出用核酸を検出する。前記固相担体の前記部分での前記検出用核酸の検出は、前記部分での前記標識部の有無に基づいて判断することができる。図１Ａに示すように、前記固相担体の前記部分で前記検出用核酸が検出された場合に、前記検出用試料には、所定の２以上の標的核酸が含まれていると判断することができる。このため、各々に結合部と標識部とを結合させた２以上の標的核酸の混合物を、各結合部に応じた複数の結合部位を含む１つの固相担体に接触させる方法と比較して、判別性が顕著に高い。

本発明では、２以上の標的核酸を１つの検出用核酸とすることができるため、固相担体上には、前記結合部と結合する部位を１つ設ければよく、固相担体の構成が単純化できることも利点の一つである。

ここで前記検出用核酸は、好ましくは、直列に連結された２以上の標的核酸と、該２以上の標的核酸の列の両端の一方に連結された前記標識部と、他方に連結された前記結合部とを含む。この場合、前記標識部と前記結合部は、所定の２以上の標的配列が全て含まれる場合にのみ１つの核酸中に共存することができ、図１Ｂ１～Ｂ３に示すように、前記２以上の標的核酸が存在しない場合には、固相担体上に前記標識部による標識は検出されないため、偽陽性のリスクを低減することができる。

本発明の検出方法はより好ましくは、
２以上の標的核酸を検出する方法であって、
分析対象試料から取得された核酸を鋳型とする核酸増幅反応によって前記検出用核酸を含む可能性のある検出用試料を調製する検出用試料調製工程を更に含み、
前記検出工程において、前記検出用試料調製工程で得られた核酸増幅反応の生成物を前記検出用試料として用いる。

前記検出工程において、前記検出用核酸が、前記核酸増幅反応による核酸増幅産物である。

本発明の検出方法はより好ましくは、前記検出用試料調製工程が、分析対象試料から取得された核酸を鋳型とし、本発明の各実施形態に係るプライマーセットを用いて核酸増幅反応を行うことを含む。本発明の各実施形態に係るプライマーセットを用いることで、鋳型となる核酸中に第１標的核酸から第Ｎ標的核酸までが全て含まれている場合、核酸増幅産物として、直列に連結された、第１標的核酸から第Ｎ標的核酸までの標的核酸と、該２以上の標的核酸の列の両端の一方に連結された前記標識部と、他方に連結された前記結合部とを含む前記検出用核酸を得ることができる。一方、標的核酸のうち一部が存在しない場合は、核酸増幅反応の生成物には、前記検出用核酸が含まれないだけでなく、前記標識部と前記結合部とが共に含まれる核酸種が含まれない。例えば、図１Ｂ１～Ｂ３に示すように、標的核酸Ａと標的核酸Ｂと標的核酸Ｃのうち１つまたは２つが存在しない場合には、固相担体上に前記標識部による標識は検出されないため、偽陽性のリスクを低減することができる。

本発明において、分析対象試料は特に限定されないが、典型的には、飲食品、動物植物等の生体の一部（器官、組織、細胞、血液、体液等）、糞便、微生物、ウイルス等を含む試料が挙げられる。

分析対象試料から取得された核酸を核酸増幅反応に鋳型として利用することができる。該核酸は、分析対象試料から抽出され精製された形態であってもよいし、分析対象試料から抽出され粗精製された形態であってもよい。あるいは、細胞や組織の一部等の比較的高濃度で核酸を含む試料であれば、分析対象試料自体をそのまま核酸増幅反応に含めることもできる。また分析対象試料から調製されたｃＤＮＡも鋳型として利用可能である。鋳型として用いる核酸は好ましくはＤＮＡである。

以下、検出用試料調製工程、検出工程、標識工程の好ましい実施形態について説明する。
（２．１．検出用試料調製工程）
検出用試料調製工程として、分析対象試料から取得された核酸を鋳型とし、上述した本発明のプライマーセットを用いて核酸増幅反応を行う場合の好ましい態様を以下に説明する。

核酸増幅反応は、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ法）に従って行うことができる。すなわち、標的核酸を含む鋳型核酸に対し本発明のプライマーセットを用いてＰＣＲを行った場合に、所望の核酸増幅産物が増幅されるＰＣＲ条件にて行うことができる。また、適切な場合は、ＰＣＲ法以外の核酸増幅反応を用いてもよい。

ＰＣＲに用いるＤＮＡポリメラーゼは、耐熱性のＤＮＡポリメラーゼであればよく、特に限定はされない。本発明においては、市販のＤＮＡポリメラーゼを利用することが可能であり、例えばＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（登録商標）等を好適に利用することができる。また、温度、時間、緩衝液の組成等は、用いるＤＮＡポリメラーゼや、各プライマーの濃度等に応じて、適宜選択することができる。

ホットスタートＰＣＲ法は、プライマーダイマーの形成を抑制する効果が期待できることから有用である。ホットスタートＰＣＲ法は、ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（登録商標）Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｖｅｒｓｉｏｎ（タカラバイオ）等の市販のホットスタートＰＣＲ用試薬を用いて行うことができる。また、ＴａＫａＲａ Ｔａｑ ＨＳ ＰＣＲ Ｋｉｔ， ＵＮＧ ｐｌｕｓ（登録商標）を使用することもでき、このキットを用いることで核酸増幅産物のキャリーオーバーコンタミネーションを抑制する効果も期待できる。

ＰＣＲ法での変性、アニーリング、伸長の各工程の時間、温度、緩衝液組成、ｄＮＴＰ濃度、サイクル数等の各条件は選択したＤＮＡポリメラーゼ、プライマー配列、標的核酸の塩基数、鋳型濃度等の要素を考慮して適宜設定することができる。

ＰＣＲ法でのサイクル数は特に限定されないが、例えば２５～６０サイクルの範囲内である。

ＰＣＲ法での反応系中の開始時の各プライマー濃度は特に限定されず、鋳型となる核酸量等に応じて適宜調整することができる。反応系中の反応開始時の好ましいプライマー濃度としては、各プライマーが各々０．０５μＭ以上、１．０μＭ以下という濃度が挙げられる。０．０５μＭ未満の場合、検出感度が低下して基準となる検出感度の低下が生じる可能性がある。また、プライマー濃度の上限は特に限定されないが、好ましくは１.０μＭである。

本発明の実施形態１～４のプライマーセットを用いる核酸増幅反応では、鋳型核酸中に標的核酸が含まれている場合、増幅産物として、前記の核酸増幅産物１～４が反応系中に形成される。

２以上の標的核酸の組み合わせを２組以上検出する場合には、含まれる２以上の標的核酸の組み合わせが異なり、且つ、固相担体の異なる位置に結合可能な前記結合部を備えた２以上の検出用核酸を調製できるよう設計された２セット以上の、本発明のプライマーセットを用い、分析対象試料から取得された核酸を鋳型として、上記の条件において核酸増幅反応を行うことができる。この場合、下記の検出工程では、核酸増幅反応で得られた検出用試料を前記固相担体に接触させ、前記標識部を指標として前記固相担体において前記２以上の検出用核酸の各々を検出する。
（２．２．検出工程）
検出工程は、前記検出用試料調製工程における核酸増幅反応の生成物等の検出用試料を、結合部と結合可能な部分を少なくとも一部に含む固相担体に接触させ、標識部を指標として固相担体の前記部分での検出用核酸を検出する工程である。

核酸増幅反応の生成物とは、増幅産物として前記検出用核酸を含んでいる可能性のある核酸増幅反応の反応液や、該反応液から増幅産物を更に高濃度化した試料等を指す。

標識部が上述の標識用タグである場合には、標識物質を標識用タグに結合させる標識工程を更に行えばよい。標識部が上述の標識物質である場合には標識工程は不要である。検出工程において「標識部を指標として」とは、標識部が標識用タグである場合には標識工程を経て結合した標識物質を指標として前記検出用核酸を検出することを指し、標識部が標識物質である場合には該標識物質を指標として前記検出用核酸を検出することを指す。

固相担体は既に詳述した通りである。

固相担体の、結合部と結合可能な部分への検出用試料の接触は、固相担体と結合部との組合せに応じて、前記検出用試料中に前記検出用核酸が含まれていた場合に前記部分に前記検出用核酸の結合部が結合するように適宜調節された条件（例えば結合部に関して詳述したハイブリダイゼーションの条件、もしくはｐＨ５～９程度の緩衝液条件）で行えばよい。

前記検出用核酸の検出は、固相担体に捕捉された前記検出用核酸に結合した前記標識物質を検出、好ましくは目視検出することにより行うことができる。前記検出用核酸が存在する場合には、固相担体に捕捉・結合された前記検出用核酸の標識物質が検出される。当該検出の有無を指標にして、検出用試料中の前記検出用核酸の有無を判別することができる。検出用試料が、前記検出用試料調製工程における核酸増幅反応の生成物である場合には、当該検出の有無を指標にして、分析対象試料中の２以上の標的核酸の有無を判別することができる。
（２．３．標識工程）
標識工程は、前記検出用核酸に含まれる前記標識部が上述の標識用タグである場合に行う工程であり、前記検出用試料と標識物質とを接触させ、標識用タグに標識物質に結合させることにより行う。標識工程は、前記検出用試料を固相担体に接触させる前に行ってもよいし、接触させた後に行ってもよいし、接触させると同時に行ってもよい。

標識物質と前記検出用試料との接触は、標識物質と標識用タグとの組合せに応じて、前記検出用試料中に前記標的核酸が含まれていた場合に標識物質と前記検出用試料の標識用タグとが結合するように適宜調節された条件（例えば結合部に関して説明したハイブリダイゼーションの条件、もしくはｐＨ５～９程度の緩衝液条件）で行えばよい。
＜３．本発明のキット＞
本発明はまた、分析対象試料中での２以上の標的核酸を検出するためのキットであって、本発明のプライマーセットと、前記結合部と結合可能な部分を少なくとも一部に含む固相担体とを含むキットを提供する。該キットは本発明の検出方法において利用することができる。

本発明のプライマーセットにおける標識部が標識用タグである場合には、本発明のキットは、標識物質を更に含むことができる。

固相担体及び標識物質は、後述する核酸検出デバイスの形態とすることができる。

本発明のキットにはさらに、ＰＣＲ用緩衝液、ｄＮＴＰｓ、ＤＮＡポリメラーゼ、核酸クロマトグラフィー展開溶液等を含めることができる。
＜４．核酸検出デバイス＞
上述の検出工程及び標識工程は、核酸クロマトグラフィーを利用する核酸検出デバイスを用いて行うことができる。当該核酸検出デバイスを利用することにより、検出用試料中の前記検出用核酸の有無を、特殊な装置を必要とすることなく検出・判別することができ、簡便かつ迅速に結果を得ることができる。

核酸検出デバイスは、核酸クロマトグラフィー法により、標識された前記検出用核酸を検出するために利用される公知の核酸検出デバイス（ＷＯ２０１２／０７０６１８）を利用することができる。

本発明にて利用可能な核酸検出デバイスの一実施形態の模式図を図７に示すが、核酸検出デバイスは本実施形態に限定されるものではない。なお、以下の説明において、各部材に付された符号は、図７中に示される符号に対応する。

図７の核酸検出デバイス７００は、基材７５の上に、前記検出用試料を受容するための反応系受容部であるサンプルパッド７３、標識物質を保持するコンジュゲートパッド７２、前記検出用核酸に含まれる結合部と結合可能な部分７６を一部に含む多孔質固相担体７１、及び吸収パッド７４を互いがこの順に接触するように配置して形成される。固相担体７１の部分７６は、前記検出用核酸を捕捉するための手段（捕捉手段）（例えば、上記オリゴヌクレオチド等）が限局して配置・固定化された部分である。サンプルパッド７３、コンジュゲートパッド７２、固相担体７１及び吸収パッド７４は上記固相担体として利用可能な多孔質構造を有する部材により構成することができる。これらは同一の部材より構成されていてもよいし、異なる部材より構成されていてもよい。基材７５はその上に配置された各種部材を支持することができ、核酸検出デバイスの操作を容易にするものであればよく、例えば樹脂、金属、鉱物等からなるものを利用することができる。標識物質を展開溶液中に混合する場合や、標識部が標識物質である場合には、コンジュゲートパッド７２は省略することができる。核酸検出デバイス７００一部はコンタミネーションの予防や試験中の固相担体表面からの液体の揮発を防止するため、ポリエステルなどのフィルムで覆われていてもよい。

核酸増幅工程により得られた核酸増幅反応の反応系等の前記検出用試料をサンプルパッド７３に添加する。前記検出用試料としては前記反応系をそのまま添加してもよいし、適当な展開溶液（例えば、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、グッド緩衝液、ＳＳＣ緩衝液）と共に添加してもよい。展開溶液には必要に応じて、界面活性剤、塩、タンパク質、核酸等をさらに含めることができる。サンプルパッド７３に添加された前記検出用試料は、図７中の矢印で示す方向に上流から下流に向かってキャピラリー現象により展開する。

また別の態様としては、前記検出用試料及び／又は展開溶液を保持した容器（例えば、ＰＣＲチューブ、エッペンチューブ、９６穴プレート等）に、当該核酸検出デバイスのサンプルパッド７３を前記検出用試料及び／又は展開溶液に浸漬させる方法で展開することもできる。その場合、前記検出用試料及び／又は展開溶液を保持した容器にサンプルパッド７３が入るように、サンプルパッド７３の幅は２.０～１０．０ｍｍにすることが好ましく、２.０～５．０ｍｍにすることがより好ましい。

また、前記検出用試料及び／又は展開溶液を保持した容器に浸漬して用いられる核酸検出デバイスでは、図７に図示する核酸検出デバイス７００からサンプルパッド７３を省略することができる。更に、標識部として標識物質を用いる場合等で不要な場合は、コンジュゲートパッド７２も省略することができ、基材７５上の固相担体７１の吸収パッド７４が配置されていない側の端部が前記検出用試料及び／又は展開溶液に直接浸漬される形態とすることができる。

前記標識部が標識用タグである実施形態の１つでは、前記検出用核酸は標識物質が保持されたコンジュゲートパッド７２を通過する際に、標識物質と接触し、標識用タグを介して標識物質により標識される。

次いで、前記検出用試料中の前記検出用核酸は、固相担体７１を通過する際に、部分７６に固定された捕捉手段と接触し、固定化用タグを介して固相担体７１に捕捉・結合される。

前記検出用試料中の前記検出用核酸が存在する場合には、捕捉手段を含む固相担体７１の部分７６に捕捉・結合された前記検出用核酸に結合した標識物質が部分７６に検出される。標識物質が目視確認できるものであれば、標識物質に起因して部分７６が呈色する。当該標識物質の検出（呈色）の有無を指標にして、前記検出用核酸の有無を判別することができ、それに基づいて、分析対象試料中の標的核酸の有無を判別することができる。
＜４．本発明のプライマーセットの更なる実施形態＞
本発明の上記の実施形態１のプライマーセットの更なる実施形態では、末端プライマーＡ及び末端プライマーＢの一方に結合する前記標識部及び他方に結合する前記結合部は必ずしも必要ではない。

すなわち本発明のプライマーセットの更なる実施形態は、
前記末端プライマーＡと、
前記第ｋ双頭プライマーと、
末端プライマーＢとを含み、
Ｎは２以上の整数であり、ｋは１からＮ－１までの整数であり、
前記第ｋ双頭プライマーとして、ｋが１の場合からｋがＮ－１の場合までを含むプライマーセットに関する。

このプライマーセットを用いた核酸増幅反応では、鋳型核酸中に第１標的核酸から第Ｎ標的核酸までが含まれる場合、
第１標的核酸の増幅断片と、
第ｋ標的核酸の相補鎖の部分と第（ｋ＋１）標的核酸の部分とが、互いの５’末端の間で連結された増幅断片と、
第Ｎ標的核酸の相補鎖の増幅断片とを含み、
第１標的核酸から第Ｎ標的核酸までのそれぞれがその相補鎖とハイブリダイズして二本鎖を形成している核酸増幅産物が生成される。

この核酸増幅産物は、核酸増幅反応の生成物を分析することにより検出することができる。検出の方法は固相担体上へ固定化して検出する方法だけでなく、他の検出方法であってもよく、例えば,、核酸増幅反応の生成物をゲル電気泳動等の方法で分子量等を指標として検出する方法であってもよい。

本発明を以下の実験結果に基づき具体的に説明するが本発明はこれらによって限定されるものではない。
［実施例１］
＜１．Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ検出用プライマーセットの設計＞
実施形態１に係るプライマーセットの一例（標的核酸数Ｎ＝３）として、３つの標的核酸の存在を指標としてＳａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍを検出するためのプライマーセットを設計した。

サルモネラは生化学的性状、ＤＮＡの相同性等から１属２菌種６亜種に分類されている。また、この分類とは別に、菌体抗原（Ｏ抗原）と鞭毛抗原（Ｈ抗原）の組み合せによる血清型分類が確立しており、現在までに２，５００以上の血清型が報告されている。人や家畜に感染症を引き起こす１，５００以上の血清型が亜種Ｉに分類され、互いに遺伝的類似度が極めて高く、単一遺伝子の塩基配列の違いを利用した血清型判定を困難にしている。

これに対し、特開２０１１－２３４７３９号公報では、特定の血清型に対して特異的な３つの遺伝子の組み合わせにより、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｉｎｆａｎｔｉｓなどの血清型判別を可能にしている。この方法では、３つの血清型特異的な遺伝子をマルチプレックスＰＣＲで増幅後、ゲル電気泳動で分析し、３つ全ての増幅産物が確認できた場合に陽性と判定する。

例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍを検出するためのプライマーセットとして以下（配列番号１～６）が開示されている。

本実施例では、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｔｙｐｉｍｕｒｉｕｍを検出するための、本発明の実施形態１のプライマーセット（Ｎ＝３）として、配列番号１～６をベースに下記の各プライマーの組み合わせを設計した。

表２に示すこのプライマーセットは、図３に示すＮ＝３の本発明の実施形態１のプライマーセットの例において、第１標的核酸１１がＴＭＰ１のセンス鎖であり、第２標的核酸２１がＴＭＰ２のセンス鎖であり、第３標的核酸３１がＴＭＰ３のアンチセンス鎖である場合に該当する。

本プライマーセットのＴＭＰ１Ｆ－Ｍｅｍが図３の末端プライマーＡ１００に相当する。ＴＭＰ１Ｆ－Ｍｅｍでは、ＴＭＰ１ＦのＤＮＡ鎖（配列番号１）がポリヌクレオチド１０１に相当し、表２で下線で示すタグ配列（配列番号９）が、末端プライマーＡ付加部分１０２に相当する。このタグ配列（配列番号９）は、固相担体であるメンブレンに固定された固相側タグ配列（配列番号１１）の相補配列であり、実施形態１のプライマーセットにおける結合部（固定化用タグ）に相当する。ＴＭＰ１Ｆ－Ｍｅｍにおいて、タグ配列（配列番号９）とＴＭＰ１Ｆ（配列番号１）とは５’末端から３’末端へ同一方向に配置されており、表２に示すＸは、ポリメラーゼ反応による伸長を停止するアゾベンゼン修飾核酸を表し、具体的には、上記の式Ｉで表される二価基である。

本プライマーセットのＴＭＰ１Ｒ－２Ｆが図３の第１双頭プライマー１１０に相当する。ＴＭＰ１Ｒ－２Ｆでは、ＴＭＰ１ＲのＤＮＡ鎖（配列番号２）が第１双頭プライマー第１ポリヌクレオチド１１１に相当し、ＴＭＰ２ＦのＤＮＡ鎖（配列番号３）が第１双頭プライマー第２ポリヌクレオチド１１２に相当する。ＴＭＰ１ＲのＤＮＡ鎖（配列番号２）と、ＴＭＰ２ＦのＤＮＡ鎖（配列番号３）とは、互いに逆方向に配置され、それぞれの５’末端ヌクレオチドの糖の５’位同士がリン酸基を介して結合している５’－５’結合により連結されている。ＴＭＰ１ＲのＤＮＡ鎖（配列番号２）と、ＴＭＰ２ＦのＤＮＡ鎖（配列番号３）は、互いの５’末端側で結合されており、３’末端が解放され、それぞれの３’末端から鋳型の存在下でＤＮＡポリメラーゼ反応により伸長可能である。

本プライマーセットのＴＭＰ２Ｒ－３Ｒが図３の第２双頭プライマー１２０に相当する。ＴＭＰ２Ｒ－３Ｒでは、ＴＭＰ２ＲのＤＮＡ鎖（配列番号４）が第２双頭プライマー第１ポリヌクレオチド１２１に相当し、ＴＭＰ３ＲのＤＮＡ鎖（配列番号６）が第２双頭プライマー第２ポリヌクレオチド１２２に相当する。ＴＭＰ２ＲのＤＮＡ鎖（配列番号４）と、ＴＭＰ３ＲのＤＮＡ鎖（配列番号６）とは、互いに逆方向に配置され、それぞれの５’末端ヌクレオチドの糖の５’位同士がリン酸基を介して結合している５’－５’結合により連結されている。ＴＭＰ２ＲのＤＮＡ鎖（配列番号４）と、ＴＭＰ３ＲのＤＮＡ鎖（配列番号６）は、互いの５’末端側で結合されており、３’末端が解放され、それぞれの３’末端から鋳型の存在下でＤＮＡポリメラーゼ反応により伸長可能である。

本プライマーセットのＴＭＰ３Ｆ－Ａｕが図３の末端プライマーＢ１３０に相当する。ＴＭＰ３Ｆ－Ａｕでは、ＴＭＰ３ＦのＤＮＡ鎖（配列番号５）がポリヌクレオチド１３１に相当し、表２で下線で示すタグ配列（配列番号１０）が、末端プライマーＢ付加部分１３２に相当する。このタグ配列（配列番号１０）は、標識物質である金コロイドに固定された標識物質側タグ配列（配列番号１２）の相補配列であり、実施形態１のプライマーセットにおける標識部（標識用タグ）に相当する。ＴＭＰ３Ｆ－Ａｕにおいて、タグ配列（配列番号１０）とＴＭＰ３Ｆ（配列番号５）とは５’末端から３’末端へ同一方向に配置されており、表２に示すＸは、ポリメラーゼ反応による伸長を停止するアゾベンゼン修飾核酸を表し、具体的には、上記の式Ｉで表される二価基である。

標識物質として用いるオリゴヌクレオチド結合金コロイドを次の手順で調製した。

Ｇｏｌｄ Ｃｏｌｌｏｉｄ（４０ｎｍ，９．０×１０^１０（粒子数／ｍｌ）、Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｂｉｏｃｅｌｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製）と下記の配列番号１２で表されるチオール基含有オリゴヌクレオチドを混合し、５０℃で１６時間インキュベートした。６０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上清を除去し、０．０５Ｍ塩化ナトリウム、５ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７）を添加し混和後、再度５０℃で４０時間インキュベートした。

インキュベート後、遠心（６０００ｒｐｍ、１５分間）を行い、上清を除去し、５ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７）を添加した。このバッファー置換を再度行った。

調製した金コロイド溶液をグラスファイバー製パッドに均一になるように添加した後、真空乾燥機にて乾燥させ、コンジュゲートパッドとした。

（チオール基含有オリゴヌクレオチド）：５’－ＴＴＧＧＣＴＣＴＧＴＣＴＣＣＧＴＴＧＴＣ－ＳＨ－３’（配列番号１２）
配列番号１２で示すチオール基含有オリゴヌクレオチドは、３’末端のシトシンヌクレオチドの３’位のリン酸基と、ＨＯ－（ＣＨ_２）_ｍ－ＳＨ（ｍは６）で表される化合物の水酸基とがリン酸エステル結合により結合したものである。

また、前記固定化用タグ配列（配列番号９）と結合するタグ捕捉手段を固定化した固相担体（メンブレン）を次の手順で作製した。

タグ捕捉手段として、下記配列番号１１で表されるオリゴヌクレオチドプローブを含む溶液を、メルクミリポア社製ニトロセルロースメンブレン（Ｈｉ－Ｆｌｏｗ１８０）に、ディスペンサーを用いて、展開方向と直交する幅１ｍｍのライン状に塗布した。その後４０℃で３０分間乾燥させることでタグ捕捉手段を備えたメンブレンとした。

（オリゴヌクレオチドプローブ）：５’－ＣＡＣＴＧＧＧＣＡＴＡＣＧＧＴＡＧＣＡＴ－３’（配列番号１１）
核酸クロマトグラフィーによる検出のために、以下の手順でラテラルフロー型核酸検出デバイスを作製した。

作製したラテラルフロー型核酸検出デバイスは、図７の模式図の検出デバイスに準拠して作製した。

すなわち、基材７５としてポリプロピレン製バッキングシート（Ｌｏｈｍａｎｎ社）、コンジュゲートパッド７２として上記で作製したオリゴヌクレオチド結合金コロイド保持コンジュゲートパッド、部分７６を備えるメンブレン（固相担体）７１として、上記で作製した、タグ捕捉手段としてオリゴヌクレオチドプローブ（配列番号１１）を備えるメンブレン、サンプルパッド７３としてグラスファイバー製のサンプルパッド、吸収パッド７４としてセルロース製の吸収パッドを、それぞれ図７に示すように互いに重なり合わせて貼り合わせ、ラテラルフロー型核酸検出デバイス７００を作製した。
＜２．ＰＣＲによる核酸増幅＞
プライマーセットとして表２に示すプライマー、鋳型にＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ＴｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍのゲノムＤＮＡを用いて、下記表３に従い、試験区１～６のＰＣＲ反応液を調製した。

上記の各試験区のＰＣＲ反応液を、サーマルサイクラー（Ｂｉｏｒ社、ＬｉｆｅＥｃｏ）にセットし、９５℃で２分間反応後、９８℃－１０秒／６０℃－３０秒／７２℃－３０秒のサイクルを３０回行なった。

ＰＣＲ産物の確認は、ゲル電気泳動および核酸クロマトグラフィーで行なった。

ゲル電気泳動による解析は、５μｌの反応液を２％アガロースゲルで分離後、エチジウムブロマイドで染色し、バンドを検出することで行なった。

核酸クロマトによる解析は、５μｌの反応液を、上記の手順で作製した図７に示す構造を有するラテラルフロー型核酸検出デバイス７００のサンプルパッド７３に添加後、６０μｌの展開バッファーをサンプルパッド７３に添加して展開し、５分後に、メンブレン１の部分６でのライン着色を確認した。
＜３．結果＞
ゲル電気泳動の結果を図８に示す。実施形態１のプライマーセットを全て用いた条件（試験区６）では、標的核酸１～３が連結した増幅産物を確認することができた。試験区６では、標的核酸１～３が連結した増幅産物に加えて、標的核酸１～３のうちの１つの増幅産物及び２つが連結した増幅産物も確認された。試験区１～５では、プライマーの組み合わせに応じた増幅産物が生成したことが確認された。

試験区１～６の各ＰＣＲ反応液を、ラテラルフロー型核酸検出デバイス７００による核酸クロマトに供した結果を図９に示す。３種の増幅産物が連結した６のみライン着色を示した。

以上の結果から、標的核酸１～３を全て含むＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ＴｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍのゲノムＤＮＡを鋳型とし、実施形態１のプライマーセットを用いた試験区６で得られたＰＣＲ反応液では、図３（Ｃ）に示す核酸増幅産物１が得られたことが確認された。
＜４．特異性の確認＞
ＴＭＰ１Ｆ－Ｍｅｍ、ＴＭＰ１Ｒ－２Ｆ、ＴＭＰ２Ｒ－３Ｒ及びＴＭＰ３Ｆ－Ａｕからなる本発明の実施形態１のプライマーセットを用いたＳａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍの判別方法の特異性を評価するため、複数のサルモネラ属菌を用いて検出評価を行なった。鋳型として複数のサルモネラ属菌から抽出したゲノムＤＮＡを使用した以外は、上記試験区６の条件で評価した。

ラテラルフロー型核酸検出デバイス７００を用いた核酸クロマトグラフィーの結果を図１０に示す。本発明の実施形態１のプライマーセットと核酸クロマトグラフィーを用いた本法は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍを鋳型にした場合にのみライン着色を示し、十分な特異性を有していることが示された。

核酸クロマトグラフィーは、ＰＣＲ反応液と展開バッファーをチップ上に加えるだけで検出可能であり操作が簡便であることに加え、ゲルの準備やエチジウムブロマイドなどの危険な試薬の処理が不要であるなどの利点がある。また。検出時間もゲル電気泳動の約６０分と比較して約５分と検査時間の短縮が可能である。
＜比較例＞
比較例として、配列番号１～６のプライマーを使用した以外は、上記４と同様の操作を行なった。

ＰＣＲ反応後にゲル電気泳動を行い、バンドパターンの解析を行なった。

結果を図１１に示す。鋳型にＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ＴｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍのゲノムＤＮＡを用いた場合のみ、３種類のバンドが検出された特異的な検出が可能であった。

本発明の実施形態１のプライマーセットと核酸クロマトグラフィーを用いたタンデム増幅産物の検出では、図１０に示すように、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍの場合にのみライン着色を示したのに対し、図１１に示すゲル電気泳動による解析では１または２本のバンドが検出されるものがあり、解析が困難になる場合が考えられた。
［実施例２］
実施形態２に係るプライマーセットを用いて、２つの標的ＤＮＡを含む核酸試料を鋳型としＰＣＲを行い、ＰＣＲ反応液に含まれる増幅産物を核酸クロマトグラフィー及びゲル電気泳動により確認した。

病原性微生物のＤＮＡに含まれる、塩基数２０８の領域を第１標的領域とし、塩基数１３１の領域を第２標的領域とした。各標的領域の一方のＤＮＡ鎖を標的核酸とした。

以下、図４に示す符号を参照して説明する。

末端プライマーＡ２００として、第１標的核酸の５’末端の２４塩基の領域と同一の塩基配列２０１と、塩基配列２０１の５’末端側に、上記の式Ｉで表される二価基を介してその３’末端が結合された標識用タグ配列（配列番号１０）とからなるＤＮＡを用いた。標識用タグ配列（配列番号１０）は、標識物質である金コロイドに固定された標識物質側タグ配列（配列番号１２）の相補配列である。

第１リバースプライマー２１０として、第１標的核酸の相補鎖の５’末端の２５塩基の領域と同一の塩基配列２１１と、塩基配列２１１の５’末端側に、その３’末端が結合された塩基数２０の塩基配列Ｂ_１２１２とを含むＤＮＡを用いた。

第２フォワードプライマー２２０として、第２標的核酸の５’末端の２０塩基の領域と同一の塩基配列２２１と、塩基配列２２１の５’末端側に、その３’末端が結合された塩基数２０の塩基配列Ｄ_２２２２とを含むＤＮＡを用いた。塩基配列Ｂ_１２１２と塩基配列Ｄ_２２２２とは互いに相補配列である。

末端プライマーＢ２３０として、第２標的核酸の相補鎖の５’末端の２０塩基の領域と同一の塩基配列２３１と、塩基配列２３１の５’末端側に、上記の式Ｉで表される二価基を介してその３’末端が結合された固定化用タグ配列（配列番号９）とからなるものを用いた。固定化用タグ配列（配列番号９）は、固相担体であるメンブレンに固定された固相側タグ配列（配列番号１１）の相補配列である。

鋳型ＤＮＡとして、第１標的領域を含むが第２標的領域を含まないＤＮＡを用いた試験区（鋳型１）、第２標的領域を含むが第１標的領域を含まないＤＮＡを用いた試験区（鋳型２）、第１標的領域と第２標的領域を含むＤＮＡを用いた試験区（鋳型１＋２）、鋳型ＤＮＡを含まない試験区（Ｎ）を用意した。

上記表２に示すＰＣＲ反応液において、プライマー成分として、上記の末端プライマーＡ２００、第１リバースプライマー２１０、第２フォワードプライマー２２０、末端プライマーＢ２３０を用い、鋳型ＤＮＡとして上記の各試験区に応じた鋳型ＤＮＡを用い、最終容量が２０．０μＬとなるよう滅菌蒸留水を用いた以外は、表２と同様のＰＣＲ反応液を調製した。

各試験区について、末端プライマーＡ２００：第１リバースプライマー２１０：第２フォワードプライマー２２０：末端プライマーＢ２３０のモル比を１：１：１：１としたＰＣＲ反応液と、１：０．１：０．１：１としたＰＣＲ反応液を調製した。

ＰＣＲ、核酸クロマトグラフィー、ゲル電気泳動は実施例１と同様の条件で行った。

核酸クロマトグラフィーの結果を図１２上段に、ゲル電気泳動の結果を図１２下段に示す。

鋳型１＋２試験区において、末端プライマーＡ２００：第１リバースプライマー２１０：第２フォワードプライマー２２０：末端プライマーＢ２３０のモル比を１：０．１：０．１：１としたＰＣＲ反応液を用いた場合、第１標的核酸と第２標的核酸とが連結した増幅産物が十分量生成し、核酸クロマトグラフィーにおいて一つの着色バンドとして検出することができた。

本発明のプライマーセット方法及びキットは核酸の検出に有用である。

本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (12)

1. 固相担体上での検出が可能な核酸増幅産物を調製するためのプライマーセットであって、
   第１標的核酸の塩基配列の相補配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列を３’末端部に含むポリヌクレオチドを含む、末端プライマーＡと、
   ５’末端側で連結された２つのポリヌクレオチドを含み、前記２つのポリヌクレオチドの一方が、第ｋ標的核酸の塩基配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列を３’末端部に含み、前記２つのポリヌクレオチドの他方が、第（ｋ＋１）標的核酸の塩基配列の相補配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列を３’末端部に含む、第ｋ双頭プライマーと、
   第Ｎ標的核酸の塩基配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列を３’末端部に含むポリヌクレオチドを含む、末端プライマーＢと、
   を含み、
   Ｎは２以上の整数であり、
   ｋは１からＮ－１までの整数であり、
   前記第ｋ双頭プライマーとして、ｋが１の場合からｋがＮ－１の場合までを含み、
   前記末端プライマーＡ及び前記末端プライマーＢの一方が、標識物質である又は標識物質と結合可能なタグである標識部を更に含み、他方が、固相担体と結合可能なタグである結合部を更に含む、
   プライマーセット。
2. 固相担体上での検出が可能な核酸増幅産物を調製するためのプライマーセットであって、
   第１標的核酸の塩基配列の相補配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列を３’末端部に含むポリヌクレオチドを含む、末端プライマーＡと、
   第ｋ標的核酸の塩基配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列Ｅ_ｋを３’末端部に含むポリヌクレオチドと、前記塩基配列Ｅ_ｋを含む前記ポリヌクレオチドの５’末端側に連結された、核酸増幅反応において二本鎖化されない塩基配列Ｆ_ｋを含むポリヌクレオチドとを含む、第ｋリバースプライマーと、
   第（ｋ＋１）標的核酸の塩基配列の相補配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列Ｇ_ｋ＋１を３’末端部に含むポリヌクレオチドと、前記塩基配列Ｇ_ｋ＋１を含む前記ポリヌクレオチドの５’末端側に連結された、核酸増幅反応において二本鎖化されない、前記塩基配列Ｆ_ｋとハイブリダイズする塩基配列Ｈ_ｋ＋１を含むポリヌクレオチドとを含む、第（ｋ＋１）フォワードプライマーと、
   第Ｎ標的核酸の塩基配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列を３’末端に含むポリヌクレオチドを含む、末端プライマーＢと
   を含み、
   Ｎは２以上の整数であり、
   ｋは１からＮ－１までの整数であり、
   前記第ｋリバースプライマー及び前記第（ｋ＋１）フォワードプライマーとして、それぞれ、ｋが１の場合からｋがＮ－１の場合までを含み、
   前記末端プライマーＡ及び前記末端プライマーＢの一方が、標識物質である又は標識物質と結合可能なタグである標識部を更に含み、他方が、固相担体と結合可能なタグである結合部を更に含む、
   プライマーセット。
3. 固相担体上での検出が可能な核酸増幅産物を調製するためのプライマーセットであって、
   第１標的核酸の塩基配列の相補配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列を３’末端部に含むポリヌクレオチドを含む、末端プライマーＡと、
   第ｋ標的核酸の塩基配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列Ｉ_ｋを３’末端部に含むポリヌクレオチドと、前記塩基配列Ｉ_ｋを含む前記ポリヌクレオチドの５’末端側に連結された、核酸増幅反応において二本鎖化されない塩基配列Ｊ_ｋを含むポリヌクレオチドとを含む、第ｋリバースプライマーと、
   第（ｋ＋１）標的核酸の塩基配列の相補配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列Ｌ_ｋ＋１を３’末端部に含むポリヌクレオチドと、前記塩基配列Ｌ_ｋ＋１の５’末端側に連結された、核酸増幅反応において二本鎖化されない塩基配列Ｍ_ｋ＋１を更に含むポリヌクレオチドとを含む、第（ｋ＋１）フォワードプライマーと、
   前記塩基配列Ｊ_ｋとハイブリダイズする塩基配列を含むポリヌクレオチドと、前記塩基配列Ｍ_ｋ＋１とハイブリダイズする塩基配列とを含むポリヌクレオチドとを含む、第ｋ連結用ポリヌクレオチドと、
   第Ｎ標的核酸の塩基配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列を３’末端に含むポリヌクレオチドを含む、末端プライマーＢと
   を含み、
   Ｎは２以上の整数であり、
   ｋは１からＮ－１までの整数であり、
   前記第ｋリバースプライマー、前記第（ｋ＋１）フォワードプライマー及び前記第ｋ連結用ポリヌクレオチドとして、それぞれ、ｋが１の場合からｋがＮ－１の場合までを含み、
   前記末端プライマーＡ及び前記末端プライマーＢの一方が、標識物質である又は標識物質と結合可能なタグである標識部を更に含み、他方が、固相担体と結合可能なタグである結合部を更に含む、
   プライマーセット。
4. 前記結合部が、前記固相担体と結合可能なポリヌクレオチドを含むタグである、請求項１～３のいずれか１項に記載のプライマーセット。
5. ２以上の標的核酸を検出する方法であって、
   分析対象試料から取得された核酸を鋳型とし、請求項１～４のいずれか１項に記載のプライマーセットを用いて核酸増幅反応を行うことを含む検出用試料調製工程、及び、
   連結された、２以上の標的核酸と、標識物質である又は標識物質と結合可能なタグである標識部と、固相担体と結合可能なタグである結合部とを含む検出用核酸、を含む可能性のある、前記検出用試料調製工程で得られた核酸増幅反応の生成物である、検出用試料を、前記結合部と結合可能な部分を少なくとも一部に含む固相担体に接触させ、前記標識部を指標として前記固相担体の前記部分での前記検出用核酸を検出する検出工程
   を含む方法。
6. 前記検出用試料調製工程が、含まれる２以上の標的核酸の組み合わせが異なり、且つ、前記固相担体の異なる位置に結合可能な前記結合部を備えた２以上の前記検出用核酸を調製できるよう設計された２セット以上の、請求項１～４のいずれか１項に記載のプライマーセットを用い、分析対象試料から取得された核酸を鋳型として核酸増幅反応を行うことを含み、
   前記検出工程が、前記検出用試料調製工程で得られた前記検出用試料を前記固相担体に接触させ、前記標識部を指標として前記固相担体において前記２以上の検出用核酸の各々を検出することを含む
   請求項５に記載の方法。
7. 分析対象試料中での２以上の標的核酸を検出するためのキットであって、
   請求項１～４のいずれか１項に記載のプライマーセットと、
   前記結合部と結合可能な部分を少なくとも一部に含む固相担体と
   を含むキット。
8. 核酸検出デバイスを含み、
   前記核酸検出デバイスが、前記固相担体と、核酸増幅反応の生成物を受容するための反応系受容部とを備える、請求項７に記載のキット。
9. 前記標識部が、標識物質と結合可能なタグであり、
   前記標識部の前記タグと結合可能な標識物質を更に含む、請求項７に記載のキット。
10. 核酸検出デバイスを含み、
    前記核酸検出デバイスが、前記固相担体と、前記標識物質を保持する標識物質保持部と、核酸増幅反応の生成物を受容するための反応系受容部とを備える、請求項９に記載のキット。
11. 核酸増幅産物を調製するためのプライマーセットであって、
    第１標的核酸の塩基配列の相補配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列を３’末端部に含むポリヌクレオチドを含む、末端プライマーＡと、
    ５’末端側で連結された２つのポリヌクレオチドを含み、前記２つのポリヌクレオチドの一方が、第ｋ標的核酸の塩基配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列を３’末端部に含み、前記２つのポリヌクレオチドの他方が、第（ｋ＋１）標的核酸の塩基配列の相補配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列を３’末端部に含む、第ｋ双頭プライマーと、
    第Ｎ標的核酸の塩基配列の３’末端部にハイブリダイズする塩基配列を３’末端部に含むポリヌクレオチドを含む、末端プライマーＢと、
    を含み、
    Ｎは２以上の整数であり、
    ｋは１からＮ－１までの整数であり、
    前記第ｋ双頭プライマーとして、ｋが１の場合からｋがＮ－１の場合までを含む、
    プライマーセット。
12. ２以上の標的核酸を検出する方法であって、
    分析対象試料から取得された核酸を鋳型とし、請求項１１に記載のプライマーセットを用いて核酸増幅反応を行う核酸増幅工程と、
    前記核酸増幅工程での核酸増幅反応の生成物中の前記核酸増幅産物を検出する検出工程と
    を含む方法。

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