CN114901817A

CN114901817A - 引物组及使用其检测目标核酸的方法

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Publication number: CN114901817A
Application number: CN202080090734.7A
Authority: CN
Inventors: 宫本重彦
Original assignee: Kaneka Corp
Current assignee: Kaneka Corp
Priority date: 2019-12-27
Filing date: 2020-12-25
Publication date: 2022-08-12
Also published as: JP7651477B2; JPWO2021132596A1; WO2021132596A1; US20230067733A1; EP4083202A1; EP4083202A4

Abstract

本发明的一个以上实施方式的目的在于解决用于制备能够在固相载体上检测的目标核酸的扩增产物的、使用添加了多核苷酸标签的引物的核酸扩增反应中的反应效率的降低。本发明的一个以上实施方式涉及一种引物组，其包含第1引物、第2引物及第3引物，所述第1引物包含第1多核苷酸和第1多核苷酸标签，所述第1多核苷酸在3’末端包含能够与目标核酸的5’末端的部分多核苷酸A’的互补链进行杂交的多核苷酸A，所述第1多核苷酸标签为相对于核酸扩增反应独立的多核苷酸，所述第2引物包含第2多核苷酸，所述第2多核苷酸在3’末端包含能够与目标核酸的3’末端的部分多核苷酸B’进行杂交的多核苷酸B，所述第3引物包含第3多核苷酸、且不包含相对于核酸扩增反应独立的多核苷酸，所述第3多核苷酸与上述第1引物的上述多核苷酸A竞争性地对目标核酸的互补链进行杂交。

Description

引物组及使用其检测目标核酸的方法

技术领域

本发明的一个以上实施方式涉及用于通过核酸扩增反应制备能够在固相载体上进行检测的目标核酸的扩增产物的引物组。

另外，本发明的一个以上实施方式涉及包含上述引物组的用于检测目标核酸的试剂盒。

另外，本发明的一个以上实施方式涉及包括使用上述引物组进行核酸扩增反应的目标核酸的检测方法。

另外，本发明的一个以上实施方式涉及包含2个以上上述引物组的多重引物组。

背景技术

近年来，作为操作性优异、迅速且简便的目标核酸的检测方法，基于色谱法的基因检测方法备受关注(例如参照专利文献1)。该方法的概要如下所述。通过使用添加了对核酸扩增反应独立的多核苷酸标签的多核苷酸引物的核酸扩增反应，对目标核酸进行扩增，生成添加了多核苷酸标签的目标核酸片段。另一方面，将与上述多核苷酸标签结合的探针(例如上述多核苷酸标签的互补多核苷酸)预先固定于色谱仪用的测试条。然后，将包含添加了标签的目标核酸片段的试样施加于该测试条，利用毛细管现象在测试条中展开，将目标核酸片段捕获于上述探针，进行检测。

另一方面，作为核酸扩增方法，与为了试样的温度变化而需要热循环仪的PCR方法不同，开发了在恒温下对目标基因进行扩增的等温核酸扩增法。等温核酸扩增法具有能够用简便的装置实施、反应时间短且检测灵敏度高等适于POC(Point of Care)检查的应用的特性。作为等温核酸扩增法，已知有RPA法(Recombinase Polymerase Amplification)、TRIAmp法(Tandem Repeat-mediated Isothermal Amplification)、LAMP法(Loop-mediated isothermal amplification)、HDA法(Helicase-dependent amplification)等方法。

作为公开将添加了多核苷酸标签的多核苷酸引物用于等温核酸扩增法的现有技术文献，可以举出专利文献2及专利文献3。

在专利文献2中记载了在LAMP法所使用的6个引物中对给定的2个添加标签序列和标记物质结合物质、以及在固相载体上捕捉使用其进行扩增得到的扩增产物并进行检测。

在专利文献3中记载了在基于新原理的等温核酸扩增法中对引物添加与核酸扩增反应独立的标签。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开2016-73312号公报

专利文献2：WO2017/43114

专利文献3：WO2018/038232

专利文献4：日本专利第5688702号公报

非专利文献

非专利文献1：(Frontiers in Microbiology.vol.8，Article192)

发明内容

发明要解决的课题

本发明人等发现，在PCR法、等温核酸扩增法等核酸扩增反应中，与使用未添加标签的引物的情况相比，使用添加了多核苷酸标签的引物的情况下，有时核酸扩增反应的效率降低。另外发现，在使用链置换型聚合酶的等温扩增反应中，有时使用添加多核苷酸标签的引物所导致的核酸扩增反应的效率降低特别明显。

因此，在本发明的一个以上的实施方式中，将用于制备能够在固相载体上检测的目标核酸的扩增产物的、使用添加了多核苷酸标签的引物的核酸扩增反应的反应效率降低作为待解决的课题。

解决课题的方法

在本说明书中，作为上述解决课题的方法，公开了以下的发明。

(1)一种引物组，其用于通过核酸扩增反应制备能够在固相载体上检测的目标核酸的扩增产物，其中，

上述引物组包含第1引物、第2引物及第3引物，

上述第1引物包含第1多核苷酸和第1多核苷酸标签，所述第1多核苷酸在3’末端包含能够与目标核酸的5’末端的部分多核苷酸A’的互补链进行杂交的多核苷酸A，所述第1多核苷酸标签为连接于上述第1多核苷酸的5’末端的相对于核酸扩增反应独立的多核苷酸，

上述第2引物包含第2多核苷酸，所述第2多核苷酸在3’末端包含能够与上述目标核酸的3’末端的部分多核苷酸B’进行杂交的多核苷酸B，

上述第3引物包含第3多核苷酸、且不包含相对于核酸扩增反应独立的多核苷酸，所述第3多核苷酸在3’末端包含能够与上述第1引物的上述多核苷酸A竞争性地对上述目标核酸的互补链进行杂交的多核苷酸C。

(2)根据(1)所述的引物组，其中，上述第3引物的上述多核苷酸C能够与上述目标核酸的上述部分多核苷酸A’的互补链中包含的50％以上的碱基数的多核苷酸进行杂交。

(3)根据(1)或(2)所述的引物组，其中，相对于上述第1引物和上述第3引物的总量，上述第3引物的比率为1摩尔％以上且90摩尔％以下。

(4)根据(3)所述的引物组，其中，相对于上述第1引物和上述第3引物的总量，上述第3引物的比率为2.5摩尔％以上且75摩尔％以下。

(5)根据(1)～(4)中任一项所述的引物组，其中，在上述第1引物中，上述第1多核苷酸标签的3’末端与上述第1多核苷酸的5’末端经由抑制核酸扩增反应的抑制物质连接在一起。

(6)根据(1)～(5)中任一项所述的引物组，其中，上述第2引物进一步包含连接于上述第2多核苷酸的标记物质。

(7)根据(6)所述的引物组，其中，上述标记物质为生物素、荧光色素或半抗原。

(8)根据(1)～(5)中任一项所述的引物组，其中，上述引物组进一步包含第4引物，

上述第2引物进一步包含第2多核苷酸标签，所述第2多核苷酸标签是连接于上述第2多核苷酸的5’末端的相对于核酸扩增反应独立的多核苷酸，

上述第4引物包含第4多核苷酸、且不包含相对于核酸扩增反应独立的多核苷酸，所述第4多核苷酸在3’末端包含能够与上述第2引物的上述多核苷酸B竞争性地对上述目标核酸进行杂交的多核苷酸D。

(9)根据(8)所述的引物组，其中，上述第4引物的上述多核苷酸D能够与上述目标核酸的上述部分多核苷酸B’中包含的50％以上的碱基数的多核苷酸进行杂交。

(10)根据(8)或(9)所述的引物组，其中，相对于上述第2引物和上述第4引物的总量，上述第4引物的比率为1摩尔％以上且90摩尔％以下。

(11)根据(10)所述的引物组，其中，相对于上述第2引物和上述第4引物的总量，上述第4引物的比率为2.5摩尔％以上且75摩尔％以下。

(12)根据(8)～(11)中任一项所述的引物组，其中，在上述第2引物中，上述第2多核苷酸标签的3’末端与上述第2多核苷酸的5’末端经由抑制核酸扩增反应的抑制物质连接在一起。

(13)一种试剂盒，其包含(1)～(7)中任一项所述的引物组、和包含固相载体的核酸检测器件，

上述固相载体包含捕捉物质保持部，所述捕捉物质保持部包含能够与上述第1多核苷酸标签结合的捕捉物质，

所述试剂盒用于检测目标核酸。

(14)一种试剂盒，其包含(8)～(12)中任一项所述的引物组、和包含固相载体的核酸检测器件，

上述固相载体包含捕捉物质保持部和标记物质保持部，所述捕捉物质保持部包含能够与上述第1多核苷酸标签结合的捕捉物质，所述标记物质保持部包含能够与上述第2多核苷酸标签结合的标记物质，

所述试剂盒用于检测目标核酸。

(15)根据(13)或(14)所述的试剂盒，其中，上述核酸检测器件进一步包含试样容纳部，所述试样容纳部用于容纳包含核酸扩增产物的试样。

(16)一种检测目标核酸的方法，该方法包括：

核酸扩增工序，该工序包括将可能包含目标核酸的受试物质供于使用了(1)～(12)中任一项所述的引物组的核酸扩增反应；以及

检测工序，对上述核酸扩增工序中得到的反应产物中的目标核酸进行检测。

(17)根据(16)所述的方法，其中，在上述检测工序中，使用固相载体进行上述目标核酸的检测。

(18)根据(16)或(17)所述的方法，其中，上述核酸扩增工序中的上述核酸扩增反应使用链置换型聚合酶进行。

(19)根据(18)所述的方法，其中，上述核酸扩增工序中的上述核酸扩增反应通过RPA法、TRIamp法、LAMP法或HDA法进行。

(20)根据(16)或(17)所述的方法，其中，上述核酸扩增工序中的上述核酸扩增反应通过PCR法进行。

(21)一种多重引物组，其包含2个以上的(1)～(12)中任一项所述的引物组，

通过使用了上述2个以上的引物组的核酸扩增反应而被扩增的目标核酸相互不同。

本说明书包含作为本申请的优先权基础的日本专利申请号2019-239045号的公开内容。

发明的效果

通过使用了本发明的一个以上实施方式的引物组的核酸扩增反应，能够高效地制备可在固相载体上检测的添加了多核苷酸标签的目标核酸的扩增产物。

附图说明

图1-1在图1-1(a)中示意性地示出了包含目标核酸1和目标核酸1的互补链2的受试核酸3、第1引物10、第2引物20、第3引物30的一例。图1-1(b1)示意性地示出了以受试核酸3作为模板的基于第1引物10和第2引物20的等温核酸扩增反应。图1-1(b2)示意性地示出了以受试核酸3作为模板的基于第3引物30和第2引物20的等温核酸扩增反应。

图1-2的图1-2(c1)示出了在作为此前的核酸扩增反应所得到的扩增产物的目标核酸1和互补链2的双链，第1引物10与第2引物20进行杂交而开始聚合酶延伸反应的反应。图1-2(c2)示意性地示出了以目标核酸1和互补链2的双链作为模板的基于第3引物30和第2引物20的等温核酸扩增反应。图1-2(d)示出了检测用核酸7，其是在5’末端连接有第1多核苷酸标签12的目标核酸1与在5’末端连接有标记物质23的互补链2的双链核酸。

图2的图2(a)示意性地示出了包含目标核酸1和目标核酸1的互补链2的受试核酸3、第1引物10、第2引物20、第3引物30、第4引物40的一例。图2(b)示出了检测用核酸8，其是在5’末端连接有第1多核苷酸标签12的目标核酸1与在5’末端连接有第2多核苷酸标签22的互补链2的双链核酸。

图3示出了横向流动型核酸检测器件700的示意图。71：固相载体、72：结合垫(标记物质保持部)、73：样品垫(试样容纳部)、74：吸收垫、75：基材、76：捕捉物质保持部。

图4示出了在实施例2中，作为正向引物及反向引物，使用添加有DNA标签的引物与未添加的引物的比率不同的引物，进行通过阶段性稀释得到的不同浓度的目标核酸的基于TRIAmp法的核酸扩增的结果。

图5示出了实施例4中通过实时PCR装置对使用了未添加DNA标签的正向引物与反向引物的引物混合物1、添加有DNA标签的正向引物与添加了生物素的反向引物的引物混合物2、添加有DNA标签的正向引物、未添加DNA标签的正向引物及添加有生物素的反向引物的引物混合物3的目标核酸的基于TRIAmp法的核酸扩增反应进行测定的结果。

具体实施方式

以下，对本发明的一个以上实施方式进行详细说明。

＜用语＞

在本发明的一个以上实施方式中，核酸及多核苷酸这样的用语是指DNA或RNA，代表性地为DNA。另外，核酸及多核苷酸这样的用语对碱基数没有特别限定，也包括寡核苷酸。在本发明的一个以上实施方式中，成为核酸扩增反应的模板的目标核酸、目标核酸的互补链及多核苷酸代表性地为天然的核苷酸的聚合物。天然的核苷酸是由天然的腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶的碱基、以及脱氧核糖或核糖的糖部分、以及磷酸基团构成的核苷酸，是各部分未经过人工修饰的核苷酸。天然的核苷酸通常为D型核苷酸。D型核苷酸表示糖部分包含D型的脱氧核糖或核糖的核苷酸。

多核苷酸可以是相对长的多核苷酸的一部分所包含的部分多核苷酸。“包含多核苷酸P1的多核苷酸P2”或者“多核苷酸P2包含多核苷酸P1”的情况包括多核苷酸P1为多核苷酸P2整体(即，多核苷酸P1与多核苷酸P2一致)的情况和多核苷酸P1为多核苷酸P2的部分多核苷酸的情况这两者。

在本发明的一个以上实施方式中，“目标核酸”是指包含想要检测和/或扩增的碱基序列的核酸、或者包含与想要检测和/或扩增的碱基序列的互补碱基序列的核酸。目标核酸可以与其互补链一起以双链的形式存在。也可以将以双链的形式存在的目标核酸的一条链称为“目标核酸”。可以将想要检测的核酸和其互补链中的任一者称为“目标核酸”。即，在本发明的一个以上实施方式中，“对目标核酸进行检测”或“对目标核酸进行扩增”包括：以目标核酸本身为目标对目标核酸进行检测或扩增；以目标核酸的互补链或目标核酸和互补链的双链核酸的检测或扩增为目标对目标核酸、目标核酸的互补链、或目标核酸和互补链的双链核酸进行检测或扩增这两者。

本发明的一个以上实施方式中的目标核酸的全长没有特别限定，通常为20个碱基以上、40个碱基以上或100个碱基以上的长度。目标核酸的全长的上限没有特别限定，通常为1000个碱基以下、500个碱基以下或400碱基以下的长度。

在本发明的一个以上实施方式中，成为核酸扩增反应的模板的核酸只要在一部分包含目标核酸和/或其互补链即可，可以为DNA，也可以为RNA，优选为DNA。通常，成为核酸扩增反应的模板的核酸是至少一部分包含目标核酸的多核苷酸链和该多核苷酸链的互补链的双链DNA。

成为模板的核酸可以是天然的核酸，也可以是人工合成的核酸。例如，可以是从生物体试样提取出的天然的核酸，也可以是通过PCR等扩增的核酸、通过逆转录反应合成的cDNA等。

在本发明的一个以上实施方式中，多核苷酸X对多核苷酸Y“进行杂交”是指，多核苷酸X(特别是DNA)在严格条件下对多核苷酸Y(特别是DNA)进行杂交，而不与不具有多核苷酸Y的碱基序列的多核苷酸进行杂交。即，进行杂交是指特异性地进行杂交。这里，“严格条件”是指，形成所谓的特异性的杂交体而不形成非特异性的杂交体的条件，例如，可以参照Green and Sambrook,Molecular Cloning,4th Ed(2012),Cold Spring HarborLaboratory Press而适当确定。具体而言，可以根据Southern杂交时的温度、溶液中包含的盐浓度、以及Southern杂交的清洗工序时的温度、溶液中包含的盐浓度而设定严格条件。更详细而言，作为严格条件，例如，在杂交工序中，钠浓度为25～500mM、优选为25～300mM，温度为40～68℃、优选为40～65℃。更具体而言，杂交可以在1～7×SSC(saline-sodiumcitrate buffer)、0.02～3％SDS、温度40℃～60℃的条件下进行。另外，可以在杂交之后进行清洗工序，清洗工序例如可以在0.1～2×SSC、0.1～0.3％SDS、温度50～65℃的条件下进行。其中，后述的第1多核苷酸标签(固定化用标签)与添加了多核苷酸的固相载体的杂交、以及后述的第2多核苷酸标签(标记用标签)与添加了多核苷酸的标记物质的杂交并不需要在这里列举的严格条件下进行，可以通过后述的条件进行。

在多核苷酸X对多核苷酸Y进行杂交的情况下，多核苷酸X(特别是DNA)和多核苷酸Y(特别是DNA)可以是为了在核酸扩增反应的退火条件下进行杂交来形成稳定的双链而能够形成足够的氢键的组合，不需要是相互完全互补的碱基序列。例如，在多核苷酸X的碱基序列(在以下的说明中称为“碱基序列X”)与多核苷酸Y的碱基序列(在以下的说明中称为“碱基序列Y”)之间，可以在10个碱基中存在1个以下错配、20个碱基中存在1个以下错配、或在30个碱基中存在1个以下错配等若干错配。

在多核苷酸X对多核苷酸Y进行杂交的情况下，通常满足以下的(A)～(C)的1个以上的关系。

(A)碱基序列X的互补碱基序列与碱基序列Y相同。需要说明的是，在碱基序列X的互补碱基序列和碱基序列Y的一者为DNA的碱基序列、另一者为RNA的碱基序列的情况下，将一者中的胸腺嘧啶和另一者中的尿嘧啶视为相同的碱基。

(B)碱基序列Y是碱基序列X的互补序列中缺失、置换、添加和/或插入了1个或数个碱基的碱基序列。

(C)碱基序列Y是与碱基序列X的互补序列具有80％以上同一性的碱基序列。

在上述(B)中，“1个或数个”优选为1～5个，更优选为1～4个，更优选为1～3个，特别优选为1个或2个，最优选为1个。

在上述(C)中，同一性的值表示使用计算多个碱基序列间的同一性的软件(例如，FASTA、DANASYS及BLAST)以默认设定计算出的值。对于碱基序列的同一性的值而言，以达到一致度最大的方式将一对碱基序列进行比对时，计算出一致的碱基的数量，以该一致的碱基的数量相对于进行比较的碱基序列的全部碱基数的比例的形式计算。这里，在存在空位的情况下，上述的全部碱基数是将以1个空位计数为1个碱基的碱基数。同一性的确定方法的详细情况参照例如Altschul et al,Nuc.Acids.Res.25,3389-3402,1977及Altschul etal,J.Mol.Biol.215,403-410,1990。

在上述(C)中，同一性更优选为90％以上、更优选为95％以上、更优选为96％以上、更优选为97％以上、更优选为98％以上、更优选为99％以上的同一性。

在上述(A)～(C)中，特别优选为上述(A)。

“多核苷酸X与多核苷酸Y杂交”以与“碱基序列X对碱基序列Y进行杂交”这样的表达相同的含义使用。

在本发明的一个以上实施方式中，构成引物组的多核苷酸的制造方法没有特别限定，可以利用多核苷酸合成装置制造，也可以利用委托合成服务制造。

在本说明书中，“相对于核酸扩增反应独立的”多核苷酸也可以表述为“与核酸扩增反应无关的”多核苷酸。“相对于核酸扩增反应独立的”多核苷酸是无法用作核酸扩增反应的模板的多核苷酸，是不会通过核酸扩增反应而双链化的多核苷酸。

＜核酸扩增反应＞

使用本发明的一个以上实施方式的引物组的核酸扩增反应可以是使用耐热性聚合酶的核酸扩增反应，也可以是使用链置换型聚合酶的核酸扩增反应。聚合酶是指核酸聚合酶，是DNA聚合酶或RNA聚合酶，优选为DNA聚合酶。

作为使用耐热性聚合酶的核酸扩增反应，可以举出聚合酶链式反应法(PCR法)。作为耐热性聚合酶，可以利用市售的DNA聚合酶，可以优选利用例如TaKaRa Ex Taq(注册商标)等。另外，温度、时间、缓冲液的组成等可以根据使用的DNA聚合酶、各引物的浓度等而适当选择。PCR法中的变性、退火、延长的各工序的时间、温度、缓冲液组成、基质核苷酸浓度、循环数等各条件可以考虑到选择的DNA聚合酶、引物序列、目标核酸的碱基数、模板浓度等因素而适当设定。

链置换型聚合酶是将包含目标核酸的双链核酸的氢键自身离解的同时合成新的DNA链的酶，可以列举例如：φ29 DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶、DNA聚合酶I的Klenow片段、Vent DNA聚合酶、Vent(Exo-)DNA聚合酶、DeepVent DNA聚合酶、DeepVent(Exo-)DNA聚合酶、96-7 DNA聚合酶、Aac DNA聚合酶及Csa DNA聚合酶等。链置换型聚合酶由于不需要用于双链离解的热变性，因此能够进行等温下的核酸扩增。

作为使用链置换型聚合酶的核酸扩增反应，优选为等温核酸扩增法，可以示例出RPA法(Recombinase Polymerase Amplification)、TRIAmp法(Tandem Repeat-mediatedIsothermal Amplification)、LAMP法(Loop-mediated isothermal amplification、HDA法(Helicase-dependent amplification)等方法。

在RPA法及TRIAmp法中，为了扩增目标核酸，使用至少一对引物组。这里，作为一对引物组中的一个引物，在本发明的一个以上实施方式中使用引物组的第1引物及第3引物，作为另一个引物，在本发明的一个以上实施方式中可以使用引物组的第2引物、或第2引物及第4引物。

在LAMP法中，为了扩增1个目标核酸，使用4种以上的引物。在LAMP法中的4种以上的引物中，作为一个引物，在本发明的一个以上实施方式中可以使用引物组的第1引物及第3引物，作为另一个引物，在本发明的一个以上实施方式中可以使用引物组的第2引物、或第2引物及第4引物。优选上述一个引物及上述另一个引物中的一者或两者为环引物。

对于使用链置换型聚合酶的等温核酸扩增法而言，使包含目标核酸的模板核酸、引物、链置换型聚合酶、及基质核苷酸、以及根据需要加入的酶(例如，在RPA法中，作为其它酶，使用重组酶及单链DNA结合蛋白质(SSB))共存，在扩增引物能够与模板核酸形成稳定的碱基对键、且能够发挥酶活性的温度下进行温育，由此进行。基于等温核酸扩增法的核酸扩增反应的温度、缓冲液组成、基质核苷酸浓度、反应时间等各条件可以考虑选择的链置换型聚合酶、引物序列、目标核酸的碱基数、模板核酸浓度等因素而适当设定。作为用于RPA法的重组酶，可以举出例如：UvsX、RecA及它们的类似物。

＜引物组＞

包含第1引物、第2引物及第3引物的本发明的一个以上实施方式的引物组是如下的引物组，其在想要分析的受试物质包含了含有目标核酸的碱基序列的核酸的情况下，能够通过以受试物质中的目标核酸作为模板的核酸扩增反应，从而制备包含在一端连接有第1多核苷酸标签的目标核酸的检测用核酸。

以下，对各引物的结构进行说明，接着，对引物组的优选实施方式进行说明。

(第1引物)

第1引物包含第1多核苷酸和第1多核苷酸标签，所述第1多核苷酸在3’末端包含能够与目标核酸的5’末端的部分多核苷酸A’的互补链进行杂交的多核苷酸A，第1多核苷酸标签是连接于上述第1多核苷酸的5’末端的相对于核酸扩增反应独立的多核苷酸。

部分多核苷酸A’是包含目标核酸的5’末端的碱基、且由连续的多个碱基构成的目标核酸的部分多核苷酸。部分多核苷酸A’的碱基数没有特别限定，可以设为例如8个碱基以上、10个碱基以上、12个碱基以上、15个碱基以上、17个碱基以上、或20个碱基以上，可以设为40个碱基以下、30个碱基以下、27个碱基以下、或25个碱基以下。

多核苷酸A只要是能够与部分多核苷酸A’的互补链进行杂交的多核苷酸即可。在多核苷酸A的优选实施方式中，多核苷酸A的3’末端的连续的1个碱基以上、优选为2个碱基以上、优选为3个碱基以上、更优选为个5碱基以上、最优选为整个碱基序列与部分多核苷酸A’的相对应的部分碱基序列相同。多核苷酸A的碱基数没有特别限定，可以根据部分多核苷酸A’的碱基数而适当确定，可以设为例如8个碱基以上、10个碱基以上、12个碱基以上、15个碱基以上、17个碱基以上、或20个碱基以上，可以设为40个碱基以下、30个碱基以下、27个碱基以下、或25个碱基以下。

第1多核苷酸的碱基序列只要在其3’末端包含多核苷酸A的碱基序列即可，可以在多核苷酸A的碱基序列的5’末端侧进一步添加有其它的碱基序列，也可以仅由多核苷酸A的碱基序列构成。即，多核苷酸A可以是包含第1多核苷酸的3’末端的部分多核苷酸，也可以是第1多核苷酸的整体。第1多核苷酸的碱基数可以根据多核苷酸A的碱基数而适当确定，可以设为例如8个碱基以上、10个碱基以上、12个碱基以上、15个碱基以上、17个碱基以上、或20个碱基以上，可以设为40个碱基以下、30个碱基以下、27个碱基以下、或25个碱基以下。

第1引物包含第1多核苷酸和连接于其5’末端的第1多核苷酸标签，第1多核苷酸标签是相对于核酸扩增反应独立的多核苷酸。第1多核苷酸标签有时称为“第1标签”或“固定化用标签”。对于第1多核苷酸标签中包含的多核苷酸而言，只要不对基于本发明的一个以上实施方式的引物组的核酸扩增反应造成实质上的妨害即可，没有特别限定，是碱基数例如为5～50、优选为10～35的多核苷酸，可以示例出包含例如Anal.Biochem.364(2007)78-85中记载的碱基序列的多核苷酸为优选的。

第1多核苷酸标签可以与后述的固相载体中包含的捕捉物质结合。包含添加了第1多核苷酸标签的目标核酸的检测用核酸可以固定于固相载体的捕捉物质保持部进行检测。

第1多核苷酸的5’末端和第1标签通过核酸扩增反应中的延长而以第1标签与作为引物发挥功能的第1多核苷酸不一起双链化的方式连接在一起。第1多核苷酸的5’末端与第1标签的3’末端可以连接在一起，第1多核苷酸的5’末端与第1标签的5’末端可以连接在一起，优选第1多核苷酸的5’末端与第1标签的3’末端连接在一起。

在一个以上的实施方式中，第1多核苷酸的5’末端与第1标签经由抑制核酸扩增反应的抑制物质(以下有时也称为“间隔物”)而连接在一起。

在其它的实施方式中，第1标签可以是如包含LNA(锁定核酸，Locked NucleicAcid)、L型核酸、2’-O-甲基化核苷酸等修饰核酸的多核苷酸那样，不成为基于聚合酶的反应的模板，不会通过核酸扩增反应中的延长而双链化的多核苷酸。在该情况下，第1多核苷酸与第1标签可以不经由上述的间隔物而直接连接在一起。

作为上述间隔物，只要能够抑制或停止核酸扩增反应中的聚合酶反应的进行、防止第1标签的双链化即可，可以列举例如：具有牢固的发夹结构、假结结构的核酸序列、L型核酸、肽核酸(PNA)、交联化核酸(Bridged Nucleic Acid(BNA)或Locked Nucleic Acid(LNA))、荧光素、Cy3、Cy5、包含下述式I表示的偶氮苯结构的二价基团、脂肪链(亚烷基链或聚氧化烯链)、包含5’-5’键、3’-3’键这样的倒位序列结构的二价基团等，但并不限定于此。通过这样的间隔物，第1多核苷酸可以与第1标签以同一方向连接。即，可以将第1标签的3’末端与第1多核苷酸的5’末端经由上述间隔物连接。

[化学式1]

在经由式I所示的二价基团连接2个多核苷酸分子的情况下，该二价基团的一个3’末端的磷酸基团是指一个多核苷酸分子的5’末端的核苷酸的磷酸基团，另一个5’端的氧原子与另一个多核苷酸分子的3’末端的核苷酸的磷酸基团形成磷酸酯键。

作为脂肪链的间隔物，例如，可以举出以下的式(IV)表示的间隔物。

5’-O-C_mH_2m-O-3’ 式(IV)

(式中，5’表示5’侧的磷酸二酯键的氧原子，3’表示3’侧的磷酸二酯键的氧原子，m表示1以上且40以下的整数。H任选被取代基所取代。)

在式(IV)中，m优选为2以上且36以下，更优选为3以上且16以下。式(IV)中的H任选被取代基所取代，作为取代基，代表性地可以列举烷基、烷氧基、羟基等。作为取代基的烷基及烷氧基的碳原子数优选为1～8，更优选为1～4。另外，在具有2个以上的取代基的情况下，取代基可以相同，也可以不同。另外，优选不具有取代基。

另外，作为其它间隔物，可以举出以下的式(V)表示的间隔物。

5’-(OC_nH_2n)_L-O-3’ 式(V)

(式中，5’表示5’侧的磷酸二酯键的氧原子，3’表示3’侧的磷酸二酯键的氧原子，n表示2以上且4以下的整数，L表示1以上、且使(n+1)×L为40以下的整数。H任选被取代基所取代。)

在式(V)中，(n+1)×L优选为2以上且36以下，更优选为3以上且16以下。式(V)中的H的取代基可适用与式(IV)中的取代基相同的方式。

另外，在2个多核苷酸分子5’-5’结合的情况下，可以使用上述的式(IV)或式(V)表示的脂肪链的间隔物。

作为其它的脂肪链的间隔物，可以举出例如以下的二价基团。

[化学式2]

在经由这些二价基团连接2个多核苷酸分子的情况下，各二价基团的一端的磷酸基团是指一个多核苷酸分子的3’末端或5’末端的核苷酸的磷酸基团，另一端的氧原子与另一个多核苷酸分子的5’末端或3’末端的核苷酸的磷酸基团形成磷酸酯键。

(第2引物)

第2引物包含第2多核苷酸，所述第2多核苷酸在3’末端包含能够与目标核酸的3’末端的部分多核苷酸B’进行杂交的多核苷酸B。

部分多核苷酸B’是包含目标核酸的3’末端的碱基、且由连续的多个碱基构成的目标核酸的部分多核苷酸。部分多核苷酸B’的碱基数没有特别限定，可以设为例如8个碱基以上、10个碱基以上、12个碱基以上、15个碱基以上、17个碱基以上、或20个碱基以上，可以设为40个碱基以下、30个碱基以下、27个碱基以下、或25个碱基以下。

多核苷酸B只要是能够与部分多核苷酸B’进行杂交的多核苷酸即可。在多核苷酸B的优选实施方式中，多核苷酸B的3’末端的连续的1个碱基以上、优选为2个碱基以上、优选为3个碱基以上、更优选为5个碱基以上、最优选为整个碱基序列与部分多核苷酸B’的互补链相对应的部分的碱基序列相同。多核苷酸B的碱基数没有特别限定，可以根据部分多核苷酸B’的碱基数而适当确定，可以设为例如8个碱基以上、10个碱基以上、12个碱基以上、15个碱基以上、17个碱基以上、或20个碱基以上，可以设为40个碱基以下、30个碱基以下、27个碱基以下、或25个碱基以下。

第2多核苷酸的碱基序列只要在其3’末端包含多核苷酸B的碱基序列即可，可以在多核苷酸B的碱基序列的5’末端侧进一步添加有其它的碱基序列，也可以仅由多核苷酸B的碱基序列构成。即，多核苷酸B可以是包含第2多核苷酸的3’末端的部分多核苷酸，也可以是第2多核苷酸整体。第2多核苷酸的碱基数可以根据多核苷酸B的碱基数而适当确定，可以设为例如8个碱基以上、10个碱基以上、12个碱基以上、15个碱基以上、17个碱基以上、或20个碱基以上，可以设为40个碱基以下、30个碱基以下、27个碱基以下、或25个碱基以下。

在本发明的一个以上实施方式中，第2引物可以包含第2多核苷酸和连接于第2多核苷酸的标记物质。基于包含该实施方式的第2引物的引物组的目标核酸的扩增产物、即检测用核酸在一端包含第1多核苷酸标签，在另一端包含标记物质。该检测用核酸能够通过在固相载体上捕捉而以标记物质作为指标进行检测，所述固相载体具备包含能够与第1多核苷酸标签结合的捕捉物质的捕捉物质保持部。

这里，作为标记物质，只要是不抑制核酸扩增反应的标记物质即可。另外，标记物质可以是其本身能够检测的标记物质，也可以是能够通过二次反应而与其它可检测的物质结合的标记物质。

作为不抑制核酸扩增反应的标记物质，可以列举：生物素、色素、半抗原、含有放射性同位素元素的物质等。作为色素，可以示例出荧光色素(异硫氰酸荧光素(FITC)等荧光素、花青等)。作为半抗原，可以示例出异羟洋地黄毒苷配基(DIG)、异硫氰酸荧光素(FITC)。

生物素可以通过与连接有亲和素或链霉亲和素的可检测的物质的二次反应来检测。半抗原可以通过与连接有抗体的可检测的物质的二次反应来检测。作为这里所谓的可检测的物质，除了色素、放射性物质以外，还可以为着色粒子、酶(过氧化物酶、碱性磷酸酶、萤光素酶等)等，优选为着色粒子。“着色粒子”可以使用金属(例如，金、银、铜、铂等)粒子、金属棒、经着色的胶乳粒子、包含色素的二氧化硅纳米粒子等。

标记物质与第2多核苷酸的结合位置只要是不抑制核酸扩增反应的位置即可，没有特别限定，通常为第2多核苷酸的5’末端。

在本发明的另外的一个以上的实施方式中，第2引物包含第2多核苷酸和第2多核苷酸标签，所述第2多核苷酸标签是连接于第2多核苷酸的5’末端的相对于核酸扩增反应独立的多核苷酸。基于包含该实施方式的第2引物的引物组的目标核酸的扩增产物、即检测用核酸在一端包含第1多核苷酸标签，在另一端包含第2多核苷酸标签。该检测用核酸能够通过在固相载体上捕捉并与能够结合第2多核苷酸标签的标记物质结合，从而以标记物质作为指标进行检测，所述固相载体具备包含能够与第1多核苷酸标签结合的捕捉物质的捕捉物质保持部。优选预先使能够与第2多核苷酸标签结合的标记物质包含于固相载体的标记物质保持部，在应用于固相载体的包含检测用核酸的试样与标记物质保持部接触时，使上述检测用核酸的第2多核苷酸标签与标记物质结合。

第2多核苷酸标签有时称为“第2标签”或“标记用标签”。对于第2多核苷酸标签中包含的多核苷酸而言，只要不对基于本发明的一个以上实施方式的引物组的核酸扩增反应造成实质上的妨害即可，没有特别限定，是碱基数例如5～50、优选为10～35的多核苷酸，可以示例出包含例如Anal.Biochem.364(2007)78-85中记载的碱基序列的多核苷酸为优选的。

第2多核苷酸的5’末端和第2标签通过核酸扩增反应中的延长而以第2标签与作为引物发挥功能的第2多核苷酸不一起双链化的方式连接在一起。第2多核苷酸的5’末端与第2标签的3’末端可以连接在一起，第2多核苷酸的5’末端与第2标签的5’末端可以连接在一起，优选第2多核苷酸的5’末端与第2标签的3’末端连接在一起。

在一个以上的实施方式中，第2多核苷酸的5’末端与第2标签经由抑制核酸扩增反应的抑制物质(间隔物)而连接在一起。连接第2多核苷酸的5’末端与第2标签的间隔物可以从与作为连接第1多核苷酸的5’末端与第1标签的间隔物而记载的间隔物同样的范围中选择。

在另一个实施方式中，第2标签可以是如包含LNA(Locked Nucleic Acid)、L型核酸、2’-O-甲基化核苷酸等修饰核酸的多核苷酸那样，不成为基于聚合酶的反应的模板，不会通过核酸扩增反应中的延长而双链化的多核苷酸。在该情况下，第2多核苷酸与第2标签可以不经由上述的间隔物而直接连接在一起。

能够与第2标签结合的标记物质优选为能够与第2标签进行杂交的多核苷酸(例如，包含与第2标签的碱基序列互补的序列的多核苷酸)所连接的标记物质。包含第2标签的检测用核酸与能够和第2标签进行杂交的多核苷酸所连接的标记物质的杂交的条件只要是可发生杂交的条件即可，没有特别限定，例如，可以通过在20℃～40℃下，于包含10mM～50mM的磷酸的缓冲液(pH6～7)中发生反应而进行。为了提高杂交效率，可以在缓冲液中进一步包含氯化钠等盐。

作为能够与第2标签进行杂交的多核苷酸所连接的标记物质，除了作为连接于第2多核苷酸的标记物质的上述的标记物质以外，还可以为着色粒子、酶(过氧化物酶、碱性磷酸酶、萤光素酶等)等，优选为着色粒子。“着色粒子”可以使用金属(例如，金、银、铜、铂等)粒子、金属棒、经着色的胶乳粒子、包含色素的二氧化硅纳米粒子等。

(第3引物)

第3引物包含第3多核苷酸、且不包含相对于核酸扩增反应独立的多核苷酸，所述第3多核苷酸在3’末端包含能够与第1引物的多核苷酸A竞争性地对目标核酸的互补链进行杂交的多核苷酸C。

第3引物优选仅由第3多核苷酸构成。

“能够与第1引物的多核苷酸A竞争性地对目标核酸的互补链进行杂交的多核苷酸C”是指，在第1引物的多核苷酸A及第3引物的多核苷酸C的一者对目标核酸的互补链进行了杂交的情况下，另一者无法对同一目标核酸的互补链进行杂交的关系。例如，在第3引物的多核苷酸C能够与目标核酸的部分多核苷酸A’的互补链(能够与第1引物的多核苷酸A进行杂交的部分)中包含的50％以上、60％以上、80％以上、90％以上、95％以上或100％的碱基数的多核苷酸进行杂交的情况下，多核苷酸C能够与第1引物的多核苷酸A竞争性地对目标核酸的互补链进行杂交。

在多核苷酸C的优选实施方式中，多核苷酸C的3’末端的连续的1个碱基以上、优选为2个碱基以上、优选为3个碱基以上、更优选为5个碱基以上、最优选为整个碱基序列与部分多核苷酸A’的相对应的部分的碱基序列相同。多核苷酸C的碱基数没有特别限定，可以根据部分多核苷酸A’的碱基数而适当确定，可以设为例如8个碱基以上、10个碱基以上、12个碱基以上、15个碱基以上、17个碱基以上、或20个碱基以上，可以设为40个碱基以下、30个碱基以下、27个碱基以下、或25个碱基以下。多核苷酸C特别优选与多核苷酸A相同。

第3多核苷酸的碱基序列只要在其3’末端包含多核苷酸C的碱基序列即可，可以在多核苷酸C的碱基序列的5’末端侧进一步添加有其它的碱基序列，也可以仅由多核苷酸C的碱基序列构成。即，多核苷酸C可以是包含第3多核苷酸的3’末端的部分多核苷酸，也可以是第3多核苷酸的整体。第3多核苷酸的碱基数可以根据多核苷酸C的碱基数而适当确定，可以设为例如8个碱基以上、10个碱基以上、12个碱基以上、15个碱基以上、17个碱基以上、或20个碱基以上，可以设为40个碱基以下、30个碱基以下、27个碱基以下、或25个碱基以下。第3多核苷酸特别优选与第1多核苷酸相同。

(使用了引物组的核酸扩增反应的机制)

在使用本发明的一个以上实施方式的引物组通过等温核酸扩增法对目标核酸进行扩增的反应的一例中，参照图1-1及图1-2，对于将第3引物和第1引物组合使用作为目标核酸的正向引物的意义进行说明。

图1-1(a)示意性地示出了包含目标核酸1和目标核酸1的互补链2的受试核酸3、第1引物10、第2引物20、第3引物30的一例。

受试核酸3为双链DNA，在其一部分包含相互杂交的目标核酸1和互补链2。目标核酸1在5’末端包含部分多核苷酸A’4，在3’末端包含部分多核苷酸B’5。目标核酸1的互补链2在3’末端包含部分多核苷酸A’4的互补链6。

第1引物10包含第1多核苷酸11和第1多核苷酸标签12，所述第1多核苷酸11在3’末端包含能够与部分多核苷酸A’4的互补链6进行杂交的多核苷酸A，所述第1多核苷酸标签12连接于第1多核苷酸11的5’末端且对于核酸扩增反应是独立的。

第2引物20包含第2多核苷酸21和标记物质23，所述第2多核苷酸21在3’末端包含能够与部分多核苷酸B’5进行杂交的多核苷酸B。

第3引物30包含第3多核苷酸31、且不包含相对于核酸扩增反应独立的多核苷酸，所述第3多核苷酸31在3’末端包含能够与第1引物11的第1多核苷酸11中包含的多核苷酸A竞争性地对目标核酸1的互补链2进行杂交的多核苷酸C。

通过使用上述的引物组和链置换型聚合酶的等温核酸扩增法对受试核酸3中的目标核酸1进行扩增时，作为初期的反应，推测发生：图1-1(b1)所示的第1引物10和第2引物20与受试核酸3进行杂交而开始聚合酶延伸反应的反应、以及图1-1(b2)所示的第3引物30和第2引物20与受试核酸3进行杂交而开始聚合酶延伸反应的反应。

由于第1引物10包含不参与核酸扩增反应的第1多核苷酸标签12，因此可以认为，如图1-1(b1)所示，与受试核酸3中的目标核酸1的互补链2进行杂交时空间位阻大。而且，使用链置换型聚合酶的核酸扩增反应不包括利用高温条件将双链的受试核酸3的氢键离解的工序，因此可以认为，上述的空间位阻的影响比在PCR法中更大。与此相对，由于第3引物30不包含不参与核酸扩增反应的多核苷酸，因此可以认为，如图1-1(b2)所示，与受试核酸3中的目标核酸1的互补链2易于进行杂交。因此，在核酸扩增反应的初期阶段，如图1-1(b2)所示的基于第3引物30和第2引物20的目标核酸1的扩增反应容易进行，如图1-1(b1)所示的第1引物10参与的扩增反应难以进行。

随着核酸扩增反应进行，如图1-2(c1)及图1-2(c2)所示，以作为先前的核酸扩增反应的扩增产物的片段化的目标核酸1和其互补链2作为模板的扩增反应占据主导。对于作为扩增产物的片段化的目标核酸1和其互补链2的双链，第1引物10的空间位阻的影响小，因此，利用第1引物10作为正向引物的图1-2(c1)所示的反应和利用第3引物30的图1-2(c2)所示的反应同时进行。需要说明的是，虽然未图示，但以在5’末端连接有第1多核苷酸标签12的目标核酸1的片段为模板的扩增反应也进行。

最终的扩增产物包含如图1-2(d)所示的检测用核酸7，其是在5’末端连接有第1多核苷酸标签12的目标核酸1和在5’末端连接有标记物质23的互补链2的双链核酸。该检测用核酸7可以固定于固相载体，能够以标记物质23作为指标进行检测，所述固相载体包含保持与第1多核苷酸标签12结合的捕捉物质的捕捉物质保持部。需要说明的是，虽然未图示，但扩增产物也包含在5’末端未连接第1多核苷酸标签12的目标核酸1和在5’末端连接有标记物质20的互补链2的双链核酸。

本发明人等发现，在本说明书所记载的实验中仅使用了第1引物10而没有组合使用第3引物30作为正向引物、且使用了第2引物10作为反向引物的基于PCR法及等温核酸扩增法的目标核酸1的扩增中，反应效率低，与此相对，在组合使用了第1引物10和第3引物30作为正向引物的情况下，反应效率显著提高。与PCR法相比，在使用链置换型聚合酶的等温核酸扩增法中，该倾向特别显著。实验结果证明了，在核酸扩增反应的初期阶段，空间位阻大的第1引物10所参与的扩增反应难以进行，因此，仅使用第1引物10作为正向引物的情况的扩增反应效率低这样的上述推定是妥当的。与此相对，在组合使用第1引物10和第3引物30的本实施方式中，在核酸扩增反应的初期主要进行基于第3引物30和第2引物20的目标核酸1的扩增反应，随着目标核酸1的生成的进行，基于第1引物10和第2引物20的目标核酸1的扩增反应也进行，因此，可以更高效地得到能够用固相载体检测的检测用核酸7。

(第1引物与第3引物的量比)

在本发明的一个以上实施方式的引物组中，第1引物与第3引物的量比没有特别限定，可以适当调整。例如，相对于第1引物和第3引物的总量，第3引物的比率优选为1摩尔％以上、更优选为2.5摩尔％以上、更优选为10摩尔％以上、更优选为25摩尔％以上、最优选为40摩尔％以上，可以优选为90摩尔％以下、更优选为75摩尔％以下。

(进一步包含第4引物的引物组的实施方式)

如上所述，第2引物除了第2多核苷酸以外，还可以进一步包含第2多核苷酸标签，所述第2多核苷酸标签是连接于第2多核苷酸的5’末端的相对于核酸扩增反应独立的多核苷酸。在仅使用了包含第2多核苷酸标签的第2引物作为反向引物的情况下，与仅使用了第1引物作为正向引物的情况相同，具有因包含第2多核苷酸标签的第2引物的立体结构影响而使初期的核酸扩增反应的效率降低的倾向。

因此，在使用包含第2多核苷酸标签的第2引物作为反向引物的情况下，优选进一步组合使用第4引物，所述第4引物包含第4多核苷酸、且不包含相对于核酸扩增反应独立的多核苷酸，所述第4多核苷酸在3’末端包含能够与第2引物的多核苷酸B竞争性地对目标核酸进行杂交的多核苷酸D。

第4引物优选仅由第4多核苷酸构成。

“能够与第2引物的多核苷酸B竞争性地对目标核酸进行杂交的多核苷酸D”是指，在第2引物的多核苷酸B及第4引物的多核苷酸D的一者对目标核酸进行了杂交的情况下，另一者无法对同一目标核酸的互补链进行杂交的关系。例如，在第4引物的多核苷酸D能够与目标核酸的部分多核苷酸B’(能够与第2引物的多核苷酸B进行杂交的部分)中包含的50％以上、60％以上、80％以上、90％以上、95％以上或100％的碱基数的多核苷酸进行杂交的情况下，多核苷酸D能够与第2引物的多核苷酸B竞争性地对目标核酸进行杂交。

在多核苷酸D的优选实施方式中，多核苷酸D的3’末端的连续的1个碱基以上、优选为2个碱基以上、优选为3个碱基以上、更优选为5个碱基以上、最优选为整个碱基序列与部分多核苷酸B’的互补链的相对应的部分的碱基序列相同。多核苷酸D的碱基数没有特别限定，可以根据部分多核苷酸B’的碱基数而适当确定，可以设为例如8个碱基以上、10个碱基以上、12个碱基以上、15个碱基以上、17个碱基以上、或20个碱基以上，可以设为40个碱基以下、30个碱基以下、27个碱基以下、或25个碱基以下。多核苷酸D特别优选与多核苷酸B相同。

第4多核苷酸的碱基序列只要在其3’末端包含多核苷酸D的碱基序列即可，可以在多核苷酸D的碱基序列的5’末端侧进一步添加有其它的碱基序列，也可以仅由多核苷酸D的碱基序列构成。即，多核苷酸D可以是包含第4多核苷酸的3’末端的部分多核苷酸，也可以是第4多核苷酸的整体。第4多核苷酸的碱基数可以根据多核苷酸D的碱基数而适当确定，可以设为例如8个碱基以上、10个碱基以上、12个碱基以上、15个碱基以上、17个碱基以上、或20个碱基以上，可以设为40个碱基以下、30个碱基以下、27个碱基以下、或25个碱基以下。第4多核苷酸特别优选与第2多核苷酸相同。

在该实施方式中，第2引物与第4引物的量比没有特别限定，可以适当调整。例如，相对于第2引物和第4引物的总量，第4引物的比率优选为1摩尔％以上、更优选为2.5摩尔％以上、更优选为10摩尔％以上、更优选为25摩尔％以上、最优选为40摩尔％以上，可以优选为90摩尔％以下、更优选为75摩尔％以下。

图2(a)示意性地示出了包含目标核酸1和目标核酸1的互补链2的受试核酸3、第1引物10、第2引物20、第3引物30、第4引物40的一例。图2所示的例子中的目标核酸1、互补链2、受试核酸3、第1引物10及第3引物30的特征与图1-1及图1-2所示的相同，因此省略说明。

在本实施方式中，第2引物20包含第2多核苷酸21和第2多核苷酸标签22，所述第2多核苷酸21在3’末端包含能够与部分多核苷酸B’5进行杂交的多核苷酸B，所述第2多核苷酸标签22连接于第2多核苷酸21的5’末端且对核酸扩增反应是独立的。

第4引物40包含第4多核苷酸41、且不包含相对于核酸扩增反应独立的多核苷酸，所述第4多核苷酸41在3’末端包含能够与第2引物20的第2多核苷酸21中包含的多核苷酸B竞争性地对目标核酸1进行杂交的多核苷酸D。

在使用图2(a)所示的实施方式的第1引物10、第2引物20、第3引物30、第4引物40以受试核酸3作为模板进行核酸扩增反应而制备的最终的扩增产物中包含如图2(b)所示的检测用核酸8，其是在5’末端连接有第1多核苷酸标签12的目标核酸1和在5’末端连接有第2多核苷酸标签22的互补链2的双链核酸。该检测用核酸8能够通过在固相载体上捕捉而以标记物质作为指标进行检测，所述固相载体具备包含能够与第1多核苷酸标签12结合的捕捉物质的捕捉物质保持部。

＜目标核酸扩增产物的检测＞

另外，本发明的一个以上实施方式涉及一种检测目标核酸的方法，该方法包括：

核酸扩增工序，将可能包含目标核酸的受试物质供于使用了本发明的一个以上实施方式的引物组的核酸扩增反应；以及

对上述核酸扩增工序中得到的反应产物中的目标核酸进行检测的检测工序。

在本发明的一个以上实施方式中，包含受试物质的分析对象试样没有特别限定，可以代表性地列举包含饮料食品、动物植物等生物体的一部分(器官、组织、细胞、血液、体液等)、粪便、微生物、病毒等的试样。

可以将从分析对象试样取得的受试物质用于核酸扩增反应。受试物质可以是从分析对象试样提取出的经纯化的核酸，也可以是从分析对象试样提取出的经粗纯化的核酸。在受试物质为核酸的情况下，有时称为受试核酸。或者，如果是细胞、组织的一部分等以较高浓度包含受试核酸的试样，也可以将分析对象试样本体直接供于核酸扩增反应。另外，由分析对象试样制备的cDNA也可以用作模板。作为模板使用的受试物质优选为DNA。

以下，对上述核酸扩增工序及上述检测工序、以及根据需要进行的标记化工序的优选实施方式进行说明。

(1.核酸扩增工序)

核酸扩增工序中的核酸扩增反应的优选实施方式如上述所述。

通过在核酸扩增工序中使用本发明的一个以上实施方式的引物组，在受试物质中包含目标核酸的情况下，可以得到包含一端连接有第1多核苷酸标签的目标核酸的检测用核酸。

在对2种以上的不同的目标核酸进行检测的情况下，可以使用设计为能够扩增2种以上目标核酸的2组以上的上述引物组的组合、即多重引物组，对从分析对象试样取得的受试物质进行核酸扩增反应。对于多重引物组，另行在后面说明。

(2.检测工序)

检测工序是对核酸扩增工序中得到的反应产物中的目标核酸进行检测的工序，优选为使反应产物与固相载体接触、并在固相载体的捕捉物质保持部对上述检测用核酸进行检测的工序，所述固相载体包含含有能够与第1多核苷酸标签结合的捕捉物质的捕捉物质保持部。

核酸扩增工序中得到的反应产物是指可能含有上述检测用核酸作为扩增产物的核酸扩增反应的反应液、由该反应液进一步将扩增产物高浓度化而得到的试样等。

在核酸扩增工序所使用的引物组包含连接有标记物质的第2引物的实施方式的情况下，由于上述检测用核酸连接有标记物质，因此，能够以标记物质作为指标对检测用核酸进行检测。

在核酸扩增工序所使用的引物组包含连接有第2多核苷酸标签的第2引物的实施方式的情况下，由于上述检测用核酸连接有第2多核苷酸标签，因此，可以进一步进行使标记物质与第2多核苷酸标签结合的标记工序。

固相载体没有特别限定，可以利用由树脂、金属、多糖类、矿物等制成的载体，可以制成膜片、膜、无纺布、板、凝胶等形式。优选固相载体具有多孔结构，以便能够使溶液中的扩增产物、标记物质展开。作为可以利用的固相载体，可以列举例如：滤纸、硝酸纤维素膜片、聚醚砜膜片、尼龙膜片、干燥的各种凝胶(二氧化硅凝胶、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、明胶凝胶)、硅、玻璃、塑料等。固相载体的大小及形态可以根据各种操作、检测而适当选择适宜的方式。

作为固相载体的捕捉物质保持部中保持的捕捉物质，只要能够与第1多核苷酸标签结合即可，没有特别限，优选为能够与第1多核苷酸标签进行杂交的多核苷酸。能够与第1多核苷酸标签进行杂交的多核苷酸特别优选为包含第1多核苷酸标签的互补碱基序列的多核苷酸。由于第1多核苷酸标签的碱基序列和用作捕捉物质的多核苷酸的碱基序列能够容易地进行改变，因此易于控制结合特异性。例如，在1个固相载体上对包含含有不同目标核酸的多个检测用核酸的试样进行展开并检测的情况下，可以针对各个上述的多个检测用核酸，以添加碱基序列不同的第1多核苷酸标签的方式设计第1引物，并且在固相载体上的多个不同位置设置捕捉物质保持部，所述捕捉物质保持部保持能够与各检测用核酸的第1多核苷酸标签特异性杂交的多核苷酸。

捕捉物质可以经由化学键合而保持于固相载体的捕捉物质保持部，也可以通过含浸于多孔的固相载体的捕捉物质保持部而保持。

对于反应产物与固相载体的捕捉物质保持部的接触而言，在上述反应产物中包含有上述检测用核酸的情况下，可以在适当调节为上述检测用核酸的第1多核苷酸标签能够与上述捕捉物质保持部结合的条件(例如形成上述的特异性杂交的条件、或pH5～9左右的缓冲液条件)下进行。

对于包含目标核酸的检测用核酸的检测而言，在被固相载体的捕捉物质保持部捕捉的上述检测用核酸包含标记物质的情况下，可以通过对标记物质进行检测、优选为进行肉眼观察检测来进行。

(3.标记工序)

标记工序是在上述引物组的第2引物包含第2多核苷酸标签的情况、或者在上述引物组的第2引物包含能够与可通过二次反应另行检测的物质结合的标记物质的情况下进行的工序。在该情况下，包含目标核酸的检测用核酸中添加有第2多核苷酸标签或标记物质。在标记工序中，通过使反应产物与标记物质或可检测的物质接触，使标记物质或可检测的物质与包含目标核酸的检测用核酸中的第2多核苷酸标签结合。标记工序可以在使上述反应产物与固相载体接触之前进行，也可以在与接触之后进行，还可以在接触的同时进行。

能够与第2多核苷酸标签结合的标记物质的具体如例如在第2引物的说明中的说明所述。

＜本发明的一个以上实施方式试剂盒＞

另外，本发明的一个以上实施方式涉及一种试剂盒，其用于用于检测目标核酸，

所述试剂盒包含本发明的一个以上实施方式的引物组和含有固相载体的核酸检测器件，

上述固相载体包含捕捉物质保持部，所述捕捉物质保持部包含能够与上述第1多核苷酸标签结合的捕捉物质。

在上述引物组包含连接有第2多核苷酸标签的第2引物的实施方式中，上述固相载体优选除了上述捕捉物质保持部以外还进一步包含标记物质保持部，所述标记物质保持部包含能够与上述第2多核苷酸标签结合的标记物质。

本发明的一个以上实施方式的试剂盒中还可以包含PCR用缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶、核酸色谱展开溶液等。

上述固相载体的特征如上所述。

通过利用上述包含固相载体的核酸检测器件，可以检测/判断反应产物中有无上述检测用核酸，能够简便且迅速地得到结果。

图3示出了本发明的一个以上实施方式中可利用的核酸检测器件的一个实施方式的示意图，但核酸检测器件并不限定于本实施方式。需要说明的是，在以下的说明中，对各构件赋予的符号与图3中所示的符号相对应。

图3的核酸检测器件700以在基材75上使以下构件相互依次接触的方式配置而形成，所述构件为：作为用于容纳上述核酸扩增工序的反应产物的试样容纳部的样品垫73、作为保持标记物质的标记物质保持部的结合垫72、在一部分包含捕捉物质保持部76的多孔固相载体71、以及吸收垫74，所述捕捉物质保持部76保持有能够与上述检测用核酸中包含的第1多核苷酸结合的捕捉物质。固相载体71的捕捉物质保持部76是限定上述捕捉物质，对其进行配置/固定化的部分。样品垫73、结合垫72、固相载体71及吸收垫74可以由能够用作上述固相载体的具有多孔结构的构件而构成。它们可以由相同构件构成，也可以由不同构件构成。基材75只要是能够支撑配置在其上的各种构件且易于核酸检测器件700的操作即可，可以利用例如由纸、树脂、金属、矿物等制成的基材。在将标记物质混合在展开溶液中的情况、对基于包含预先添加了标记物质的第2引物的实施方式的引物组所得到的扩增产物进行检测的情况下，可以省略结合垫72。为了预防污染、防止试验中液体从固相载体表面挥发，核酸检测器件700的一部分可以用聚酯等膜包覆。

将包含通过核酸扩增工序得到的核酸扩增反应的反应产物的试样添加于样品垫73。作为上述试样，可以直接添加核酸扩增反应的反应产物，也可以与适当的展开溶液(例如，磷酸缓冲液、Tris缓冲液、Good’s缓冲液、SSC缓冲液)一起添加。展开溶液中可以根据需要进一步含有表面活性剂、盐、蛋白质、核酸等。添加于样品垫73的试样沿着图3中的箭头所示的方向从上游向下游通过毛细现象而展开。

另外，作为其它的方式，也可以通过使核酸检测器件700的样品垫73浸渍于容器(例如，PCR管、Eppendorf管、96孔板等)中容纳的上述检测用试样和/或展开溶液的方法进行展开。

另外，对于浸渍在保持有包含核酸扩增反应的反应产物的试样和/或展开溶液的容器中使用的核酸检测器件而言，可以从图3所图示的核酸检测器件700中省略样品垫73。进一步，可以制成基材75上的固相载体71的未配置吸收垫74一侧的端部直接浸渍于上述试样和/或展开溶液的形态。

在对基于包含添加有第2多核苷酸标签的第2引物的实施方式的引物组所得到的扩增产物进行检测的情况下，上述检测用核酸在通过结合垫72时与标记物质结合而被标记，所述结合垫72是保持有能够与第2多核苷酸标签结合的标记物质的标记物质保持部。

接着，上述检测用核酸在通过固相载体71时，与捕捉物质保持部76的捕捉物质接触，被捕捉/结合于捕捉物质保持部76。

在上述反应产物中存在上述检测用核酸的情况下，可检测与被捕捉/结合于固相载体71的捕捉物质保持部76的上述检测用核酸结合的标记物质。只要标记物质能够通过肉眼观察而确认，则捕捉物质保持部76会因标记物质而显色。以有无该标记物质的检测(显色)作为指标，可以判断有无上述检测用核酸，基于此，可以判断受试物质中有无目标核酸。

＜多重引物组＞

本发明的另外的一个以上的实施方式涉及一种多重引物组，其包含2个以上的上述本发明的一个以上实施方式的引物组，

在该实施方式中，2个以上的引物组中包含的第1引物的第1多核苷酸标签优选碱基序列彼此不同，与不同的捕捉物质结合。

用于对由使用了多重引物组的核酸扩增反应得到的反应产物进行检测的固相载体优选在固相载体的不同位置具有保持有相互不同的捕捉物质的2个以上的捕捉物质保持部。在该实施方式中，优选各捕捉物质为能够与2个以上引物组所包含的第1引物的第1多核苷酸标签之一进行杂交的多核苷酸。

实施例

＜实施例1＞

(1)引物的设计

TRIAmp反应所使用的引物参考以专利文献4中记载的结核菌的重复序列作为目标核酸的正向引物DRa21(序列号1)和反向引物DRb19(序列号2)而制备。

制备了DRa21-Tag1，所述DRa21-Tag1是在正向引物DRa21的5’末端侧经由以包含偶氮苯结构作为聚合酶抑制物质的上述式I表示的二价基团连接核酸色谱的膜片捕捉用的DNA标签序列(Tag1)(序列号3)的3’末端侧而成的。

Tag1：5’-ATGCTACCGTATGCCCAGTG-3’(序列号3)

制备了DRb19-Tag2，所述DRb19-Tag2是在反向引物DRb19的5’末端侧经由以包含偶氮苯结构作为聚合酶抑制物质的上述式I表示的二价基团连接胶体金标记用的DNA标签序列(Tag2)(序列号4)的3’末端侧而成的。

Tag2：5’-GACAACGGAGACAGAGCCAA-3’(序列号4)

将使用的引物示于表1。

表1

引物名	序列(5’-3’)	序列号
			DRa21	CGGGGTTTTGGGTCTGACGAC	1
DRb19	CCCGAGAGGGGACGGAAAC	2
			DRa21-Tag1	Tag1-CGGGGTTTTGGGTCTGACGAC
DRb19-Tag2	Tag2-CCCGAGAGGGGACGGAAAC

(2)寡核苷酸结合胶体金的制备

将Gold Colloid(40nm，9.0×10¹⁰(粒子数/ml)、British Biocell International公司制造)与以下述的序列号5表示的含有硫醇基的寡核苷酸混合，在50℃下温育16小时。以6000rpm离心分离15分钟，去除上清，添加0.05M氯化钠、5mM磷酸缓冲液(pH7)，进行混和后，再次在50℃下温育40小时。

在温育后进行离心(6000rpm,15分钟)，去除上清，添加了5mM磷酸缓冲液(pH7)。再次进行了该缓冲液置换。

将制备的胶体金溶液均匀地添加于玻璃纤维制垫后，在真空干燥机中使其干燥，制成了结合垫。

(含有硫醇基的寡核苷酸)：5’-TTGGCTCTGTCTCCGTTGTC-SH-3’(序列号5)

序列号5所示的含有硫醇基的寡核苷酸是3’末端的胞嘧啶核苷酸3’位的磷酸基团与HO-(CH₂)_m-SH(m为6)表示的化合物的羟基通过磷酸酯键结合而成的。

(3)保持标签捕捉物质的膜片的制作

作为标签捕捉物质，使用分配器将包含以下述的序列号6表示的寡核苷酸探针的溶液在Merck Millipore公司制造的硝酸纤维素膜片(Hi-Flow180)上涂布成与展开方向正交的宽度1mm的线状。然后，在40℃下干燥30分钟，由此制成了具备标签捕捉物质保持部的膜片。

(寡核苷酸探针)：5’-CACTGGGCATACGGTAGCAT-3’(序列号6)

(4)横向流动型核酸检测器件的制作

制作的横向流动型核酸检测器件按照图3的示意图所示的检测器件制作。

即，将作为基材75的聚丙烯制衬背板(Lohmann公司)、作为结合垫72的上述(2)中制作的结合垫、作为具备捕捉物质保持部76的固相载体71的上述(3)中制作的具备标签捕捉物质保持部的膜片、作为样品垫73的玻璃纤维制的样品垫、作为吸收垫74的纤维素制的吸收垫分别如图7所示彼此叠合地贴合，制作了横向流动型核酸检测器件700。

(5)TRIAmp反应

使用上述(1)所述的引物制作了表2所示的引物混合物。

表2

接下来，制备了包含40mM Tris缓冲液(pH8.8)、20mM氯化钾、20mM硫酸铵、0.2％吐温20、1.8M甜菜碱、1.6mM三磷酸脱氧核苷酸、12mM硫酸镁的2x TRIAmp缓冲液混合物。

接着，在TRIAmp缓冲液混合物12.5μL、各引物混合物2μL、8单位的Bst DNA聚合酶、1万倍稀释的SYBR GreenI溶液5μL中添加DNA试样2μL，制备了总量25μL的TRIAmp反应液。DNA试样使用了从Mycobacterium bovis BCG株提取并经过纯化的DNA溶液(100pg/μL)。

反应使用Roche公司制造的实时PCR装置(LightCycler96)在68℃下进行1小时反应，经时地测定了荧光。

在反应后，将反应液5μL添加于横向流动型的核酸检测器件的样品垫，添加80μL的展开液，通过肉眼观察对着色线进行判定。将能够确认到非常强着色的情况作为“+++”，将能够确认到着色的情况作为“++”，将能够确认到微弱着色的情况作为“+”，将无法确认到着色的情况作为“－”。

将结果示于表3。

表3

	时间*	肉眼观察判定
			引物混合物1	20分	－
引物混合物2	21分	+
			引物混合物3	25分	++
引物混合物4	36分	++
			引物混合物5	46分	+++

*荧光值达到0.2的时间

在使用了利用全部量的添加有DNA标签的引物的引物混合物5的情况下，虽然TRIAmp反应进行，但与不包含添加有DNA标签的引物的引物混合物1相比，显示出反应速度明显降低。与此相对，对于将引物混合物5的引物的一部分置换为未添加DNA标签的引物的引物混合物2～4而言，与引物混合物5相比，显示出更快的反应速度。特别是对于置换了整体的半数以上的引物混合物3及2而言，判定阳性所需要的时间缩短至引物混合物5的约一半。包含添加有DNA标签的引物的任意引物混合物均能够基于横向流动型的核酸检测器件的着色线进行检测。

以上的结果表明，虽然使用添加有DNA标签的引物时，TRIAmp反应受到抑制，但通过向其中加入未添加DNA标签的引物，能够大幅改善该抑制。

＜实施例2＞

实施例1表明，使用添加有DNA标签的引物时，TRIAmp反应的反应速度降低。另外还表明，通过将添加有DNA标签的引物的一部分置换为未添加DNA标签的引物，能够抑制速度降低。但是，由于实施例1通过SYBR GreenI的荧光测定了扩增产物量，因此，无法确认能够用核酸检测器件检测的添加有DNA标签的扩增产物量实际上是否增加。

因此，在添加有DNA标签的引物中以各种比例混合未添加DNA标签的引物，使用从Mycobacterium bovis BCG株提取出的DNA的连续稀释液进行了检测下限试验。引物使用了与实施例1相同的引物。将未添加包含目标核酸的上述DNA试样的实验作为阴性对照实验(Nega)。将引物混合物的组成示于表4。作为比较例，制备了由全部量的添加有DNA标签的引物构成的引物混合物(比较例1)。

表4

对于TRIAmp反应而言，除了未添加SYBR GreenI以外，与实施例1同样地实施。在反应后，将反应液5μL添加至横向流动型的核酸检测器件的样品垫，添加80μL的展开液，通过肉眼观察判定了着色线。将能够确认到非常强着色的情况作为“+++”，将能够确认到着色的情况作为“++”，将能够确认到微弱着色的情况作为“+”，将无法确认到着色的情况作为“－”。

将结果示于图4及表5。在使用了仅由添加有DNA标签的引物构成的引物混合物的比较例中，能够检测至50pg，与此相对，含有未添加DNA标签的引物的引物混合物1能够检测至5pg，引物混合物2能够检测至500fg，引物混合物3～5能够检测至5fg。在标签添加率25％以下的引物混合物4及5中，确认到了着色线变浅的倾向。从检测下限和着色线的色深的观点考虑，标签添加率50％的引物混合物3显示出最良好的性能。

表5

＜比较例2＞

制备由未添加DNA标签的正向引物DRa21(序列号1)及反向引物DRb19(序列号2)构成的引物混合物，与实施例1同样地利用实时PCR装置实施了反应和荧光的测定。DNA试样使用了从Mycobacterium bovis BCG株提取出的DNA的连续稀释液。将未添加包含目标核酸的上述DNA试样的实验作为阴性对照实验(Nega)。

将结果示于表6。未添加DNA标签的引物时的检测下限为100fg。上述实施例2的引物混合物3～5时的检测下限为5fg。表明通过使用本发明的一个以上实施方式的构成的引物混合物，能够在不使用实时PCR装置的情况下比现有方法更高灵敏度地检测。

表6

*荧光值达到0.2的时间

＜实施例3＞

除了使用了表7的引物混合物以外，与实施例2同样地实施。

表7

将结果示于表8。标签含有率(添加有DNA标签的引物占全部引物量的比例)99％的引物混合物1虽然显示出与比较例3同等的检测下限，但确认到检测下限浓度5p的线着色强度提高。在标签含有率97.5％及95％的引物混合物的情况下，能够进行500fg的检测，表明检测下限性能提高。

表8

＜实施例4＞

使用通过常规方法在DRb19引物的5’末端以生物素作为标记物质进行了修饰的DRb19-biotin来代替DRb19-Tag2，制备了表9所示的引物混合物。另外，在横向流动型核酸检测器件的结合垫的制作中，使用了链霉亲和素结合胶体金作为能够与生物素结合的可检测物质。除此以外，通过与实施例1相同的方法实施。

表9

将实时PCR装置的荧光测定结果示于图5。与包含未添加DNA标签的正向引物的引物混合物1相比，在将正向引物的全部量置换为添加有DNA标签的引物的引物混合物2中，扩增的起始大幅延迟。在将正向引物的一半置换为未添加DNA标签的引物的引物混合物3中，扩增速度大幅改善。

＜实施例5＞

使用实施例4的引物混合物2及3实施了与实施例3相同的检测下限试验。

将结果示于表10。标签添加率100％的引物混合物2的检测下限为500fg，与此相对，标签添加率50％的引物混合物3能够检测50fg。根据该实验可以确认使用本发明的一个以上实施方式的构成的引物混合物所带来的敏化效果。

表10

＜实施例6＞

对于由本发明的一个以上实施方式的构成的引物混合物所带来的敏化效果能否通过RPA法也获得，实施了验证。

(1)引物的设计

作为RPA反应所使用的引物，设计了与Staphylococcus aureus的ftsY基因特异性结合的正向引物ftsY-1F(序列号7)和反向引物ftsY-1R(序列号8)。

制备了ftsY-1F-Tag3，所述ftsY-1F-Tag3在正向引物ftsY-1F的5’末端侧经由以包含偶氮苯结构作为聚合酶抑制物质的上述式I表示的二价基团连接核酸色谱的膜片捕捉用的DNA标签序列(Tag3)的3’末端侧。

Tag3：5’-TCGAGTGACAGCTAATGTGTGAT-3’(序列号9)

制备了ftsY-1R-Tag2，所述ftsY-1R-Tag2在反向引物ftsY-1R的5’末端侧经由以包含偶氮苯结构作为聚合酶抑制物质的上述式I表示的二价基团连接胶体金标记用的DNA标签序列(Tag2)(序列号4)。

将实施例6中使用的引物示于表11。

表11

引物名	序列(5’-3’)	序列号
			ftsY-1F	GAACAAGGTCAAGACAAATTAGA	7
ftsY-1R	TCCTGCGTTGAACCTTCAGA	8
			ftsY-1F-Tag3	Tag3-GAACAAGGTCAAGACAAATTAGA
ftsY-1F-Tag2	Tag2-CCCGAGAGGGGACGGAAAC

(2)保持标签捕捉物质的膜片的制作

作为标签捕捉物质，使用分配器将包含以下述的序列号10表示的寡核苷酸探针的溶液在Merck Millipore公司制造硝酸纤维素膜片(Hi-Flow180)上涂布成与展开方向正交的宽度1mm的线状。然后，在40℃下干燥30分钟，由此制成了具备标签捕捉物质保持部的膜片。

(寡核苷酸探针)：5’-ATCACACATTAGCTGTCACTCGA-3’(序列号10)

(3)横向流动型核酸检测器件的制作

除了使用了具备上述(2)中制备的标签捕捉物质保持部的膜片作为固相载体71以外，通过与实施例1相同的方法制作了横向流动型核酸检测器件。

(4)RPA反应

RPA反应使用TwistDx公司的TwistAmp Basic试剂盒实施。引物混合物中使用了将添加有DNA标签的引物和未添加的引物以表12所示的比例混合而成的混合物。另外，制备了仅由添加有DNA标签的引物构成的引物混合物作为比较例4。

将引物混合物4.8μL、Primer Free Rehydration Buffer29.5μL、从Staphylococcus aureus(ATCC25923)提取出的DNA的连续稀释液(5ng/μL～50fg/μL)2μL、灭菌蒸馏水11.2μL混合，制备了再溶解液。将再溶解液添加于装入了冷冻干燥RPA反应颗粒的管中，将试剂再溶解。然后，添加280mM的乙酸镁2.5μL，在混合后于37℃下进行了20分钟反应。

表12

将结果示于表13。使用了仅由添加有DNA标签的引物构成的引物混合物的比较例4的检测下限为10ng，与此相对，引物混合物1～3能够检测至1pg～10pg，可以确认到由未添加DNA标签的引物的共存所带来的检测下限性能的提高。

表13

＜实施例7＞

对于由本发明的一个以上实施方式的构成的引物混合物所带来的敏化效果能否通过LAMP法而获得，实施了验证。

(1)引物的设计

LAMP反应所使用的引物使用了非专利文献1(Frontiers inMicrobiology.vol.8,Article192)中记载的扩增Staphylococcus aureus的Nuc基因的引物组。将使用的引物示于表14。

表14

引物名	序列(5’-3’)	序列号
			Sau-F3	ATGCAAAGAAAATTGAAGTCGA	11
Sau-B3	GCGTTGTCTTCGCTCCAAAT	12
			Sau-FIP	CGTTTACCATTTTTCCATCAGCATAGTTTGACAAAGGTCAAAGAACT	13
Sau-BIP	TCAAGGCTTGGCTAAAGTTGCTTATTTTCGCTTGTGCTTCACTT	14
			Sau-LF	TACGCTAAGCCACGTCCATA	15
Sau-LB	CCTAACAATACACATGAACAAC	16

制备了Sau-LF-Tag1，所述Sau-LF-Tag1在环引物Sau-LF(序列号15)的5’末端侧经由以包含偶氮苯结构作为聚合酶抑制物质的上述式I表示的二价基团连接核酸色谱的膜片捕捉用的DNA标签序列(Tag1)(序列号3)的3’末端侧。

制备了Sau-Tag2，所述Sau-Tag2在环引物Sau-LB(序列号16)的5’末端侧经由以包含偶氮苯结构作为聚合酶抑制物质的上述式I表示的二价基团连接胶体金标记用的DNA标签序列(Tag2)(序列号4)的3’末端侧。

(2)LAMP反应

使用了包含20mM Tris缓冲液(pH8.8)、10mM氯化钾、10mM硫酸铵、0.1％吐温20、0.9M甜菜碱、0.8mM三磷酸脱氧核苷酸、6mM硫酸镁、8单位的Bst DNA聚合酶、1.6μM的Sau-FIP、1.6μM的Sau-BIP、0.8μM的Sau-F3、0.8μM的Sau-B3、0.4μM的Sau-LF、0.4μM的Sau-LB、0.4μM的Sau-LF-Tag1、0.4μM的Sau-LB-Tag2的组成的反应液。作为比较例，制备了使用0.8μM的Sau-LF及0.8μM的Sau-LB作为上述反应液的环引物的反应液。在该反应液中添加DNA试样2μL，在62℃下使其反应1小时。

在反应后，将反应液5μL添加于与实施例2相同的横向流动型的核酸检测器件的样品垫，添加了80μL的展开液。在干燥后，使用Hamamatsu Photonics公司制造的免疫色谱读取仪测定了线的着色强度。

将全部量环引物设为添加有DNA标签的引物的比较例的线着色强度为25mAbs，相比之下，在将环引物的一半量置换为未添加DNA标签的引物的条件下为50mAbs，可以确认到标签添加产物量的增加。

＜实施例8＞

对于由本发明的一个以上实施方式的构成的引物混合物所带来的敏化效果能否通过PCR法获得，实施了验证。

(1)PCR反应

PCR反应的验证中使用与实施例6相同的引物，制备了表15所示的引物混合物。作为比较例5，制备了仅由添加有DNA标签的引物构成的引物混合物。

表15

按照2xHSTaq perfect Mix UNG plus(Takara Bio公司)的手册制备了反应液。在10μL的2xHSTaq perfect Mix中混合1μM的引物混合物2μL、从Staphylococcus aureus提取出的DNA试样2μL(100pg/μL～10fg/μL)、灭菌蒸馏水6μL，制备了20μL的PCR反应液。

将PCR反应液设置于热循环仪(Bior公司、LifeEco)，在94℃下反应3分钟后，进行了35次94℃-5秒/58℃-5秒/72℃-15秒的循环。

将结果示于表16。使用了仅由添加有DNA标签的引物的引物混合物的比较例5的检测下限为20pg，与此相对，引物混合物1～3均能够检测至2pg，确认到了由未添加DNA标签的引物的共存所带来的检测下限性能的提高。

表16

本说明书中引用的全部出版物、专利及专利申请通过直接引用而引入本说明书。

序列表

<110> 株式会社钟化（KANEKA CORPORATION）

<120> 引物组及使用其检测目标核酸的方法

<130> B190545

<150> JP 2019-239045

<151> 2019-12-27

<160> 16

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 1

cggggttttg ggtctgacga c 21

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 2

cccgagaggg gacggaaac 19

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 标签

<400> 3

atgctaccgt atgcccagtg 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 标签

<400> 4

gacaacggag acagagccaa 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 标签

<400> 5

ttggctctgt ctccgttgtc 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 探针

<400> 6

cactgggcat acggtagcat 20

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 7

gaacaaggtc aagacaaatt aga 23

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 8

tcctgcgttg aaccttcaga 20

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 标签

<400> 9

tcgagtgaca gctaatgtgt gat 23

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 探针

<400> 10

atcacacatt agctgtcact cga 23

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 11

atgcaaagaa aattgaagtc ga 22

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 12

gcgttgtctt cgctccaaat 20

<210> 13

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 13

cgtttaccat ttttccatca gcatagtttg acaaaggtca aagaact 47

<210> 14

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 14

tcaaggcttg gctaaagttg cttattttcg cttgtgcttc actt 44

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 15

tacgctaagc cacgtccata 20

<210> 16

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 16

cctaacaata cacatgaaca ac 22

Claims

1.一种引物组，其用于通过核酸扩增反应制备能够在固相载体上检测的目标核酸的扩增产物，其中，

所述引物组包含第1引物、第2引物及第3引物，

所述第1引物包含第1多核苷酸和第1多核苷酸标签，所述第1多核苷酸在3’末端包含能够与目标核酸的5’末端的部分多核苷酸A’的互补链进行杂交的多核苷酸A，所述第1多核苷酸标签为连接于所述第1多核苷酸的5’末端的相对于核酸扩增反应独立的多核苷酸，

所述第2引物包含第2多核苷酸，所述第2多核苷酸在3’末端包含能够与所述目标核酸的3’末端的部分多核苷酸B’进行杂交的多核苷酸B，

所述第3引物包含第3多核苷酸、且不包含相对于核酸扩增反应独立的多核苷酸，所述第3多核苷酸在3’末端包含能够与所述第1引物的所述多核苷酸A竞争性地对所述目标核酸的互补链进行杂交的多核苷酸C。

2.根据权利要求1所述的引物组，其中，

所述第3引物的所述多核苷酸C能够与所述目标核酸的所述部分多核苷酸A’的互补链中包含的50％以上的碱基数的多核苷酸进行杂交。

3.根据权利要求1或2所述的引物组，其中，

相对于所述第1引物和所述第3引物的总量，所述第3引物的比率为1摩尔％以上且90摩尔％以下。

4.根据权利要求3所述的引物组，其中，

相对于所述第1引物和所述第3引物的总量，所述第3引物的比率为2.5摩尔％以上且75摩尔％以下。

5.根据权利要求1～4中任一项所述的引物组，其中，

所述第2引物进一步包含连接于所述第2多核苷酸的标记物质。

6.根据权利要求1～4中任一项所述的引物组，其中，

所述引物组进一步包含第4引物，

所述第2引物进一步包含第2多核苷酸标签，所述第2多核苷酸标签是连接于所述第2多核苷酸的5’末端、且相对于核酸扩增反应独立的多核苷酸，

所述第4引物包含第4多核苷酸、且不包含相对于核酸扩增反应独立的多核苷酸，所述第4多核苷酸在3’末端包含能够与所述第2引物的所述多核苷酸B竞争性地对所述目标核酸进行杂交的多核苷酸D。

7.根据权利要求6所述的引物组，其中，

所述第4引物的所述多核苷酸D能够与所述目标核酸的所述部分多核苷酸B’中包含的50％以上的碱基数的多核苷酸进行杂交。

8.根据权利要求6或7所述的引物组，其中，

相对于所述第2引物和所述第4引物的总量，所述第4引物的比率为1摩尔％以上且90摩尔％以下。

9.根据权利要求8所述的引物组，其中，

相对于所述第2引物和所述第4引物的总量，所述第4引物的比率为2.5摩尔％以上且75摩尔％以下。

10.一种用于检测目标核酸的试剂盒，其包含权利要求1～5中任一项所述的引物组、和包含固相载体的核酸检测器件，

所述固相载体包含捕捉物质保持部，所述捕捉物质保持部包含能够与所述第1多核苷酸标签结合的捕捉物质。

11.一种用于检测目标核酸的试剂盒，其包含权利要求6～9中任一项所述的引物组、和包含固相载体的核酸检测器件，

所述固相载体包含捕捉物质保持部和标记物质保持部，所述捕捉物质保持部包含能够与所述第1多核苷酸标签结合的捕捉物质，所述标记物质保持部包含能够与所述第2多核苷酸标签结合的标记物质，

所述试剂盒用于检测目标核酸。

12.一种检测目标核酸的方法，该方法包括：

核酸扩增工序，该工序包括将可能包含目标核酸的受试物质供于使用了权利要求1～9中任一项所述的引物组的核酸扩增反应；以及

检测工序，对经所述核酸扩增工序得到的反应产物中的目标核酸进行检测。

13.根据权利要求12所述的方法，其中，

在所述检测工序中，使用固相载体进行所述目标核酸的检测。

14.根据权利要求12或13所述的方法，其中，

所述核酸扩增工序中的所述核酸扩增反应使用链置换型聚合酶进行。

15.一种多重引物组，其包含2个以上的权利要求1～9中任一项所述的引物组，

通过使用了2个以上的所述引物组的核酸扩增反应而被扩增的目标核酸相互不同。