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WO1998012343A1 - Processes for producing sugar nucleotides and complex carbohydrates - Google Patents

Processes for producing sugar nucleotides and complex carbohydrates Download PDF

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Publication number
WO1998012343A1
WO1998012343A1 PCT/JP1997/003226 JP9703226W WO9812343A1 WO 1998012343 A1 WO1998012343 A1 WO 1998012343A1 JP 9703226 W JP9703226 W JP 9703226W WO 9812343 A1 WO9812343 A1 WO 9812343A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
microorganism
gene encoding
sugar
dna
production method
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP1997/003226
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Satoshi Koizumi
Katsutoshi Sasaki
Tetsuo Endo
Kazuhiko Tabata
Akio Ozaki
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
KH Neochem Co Ltd
Original Assignee
Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd filed Critical Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
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Priority to JP51450098A priority patent/JP3403205B2/ja
Priority to AU42203/97A priority patent/AU4220397A/en
Priority to CA002237849A priority patent/CA2237849C/en
Priority to US09/068,528 priority patent/US6821756B2/en
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Priority to US10/940,026 priority patent/US8435763B2/en
Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C12P19/28—N-glycosides
    • C12P19/30—Nucleotides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a glycoconjugate useful for defense against infection of bacteria, viruses, etc., adaptation to cardiovascular disorders, immunotherapy, and the like, and production of a sugar nucleotide which is important as a synthetic substrate for the glycoconjugate.
  • a glycoconjugate useful for defense against infection of bacteria, viruses, etc., adaptation to cardiovascular disorders, immunotherapy, and the like, and production of a sugar nucleotide which is important as a synthetic substrate for the glycoconjugate.
  • the method 1) requires expensive nucleoside derivatives of 5′-phosphate (hereinafter abbreviated as NMP), sugar phosphates, and the like, and the method 2) requires nucleoside monosaccharides.
  • NMP 5 '-diphosphoric acid
  • NTP nucleoside-5'-triphosphate
  • expensive raw materials such as phosphoenorubyruvic acid, sugar phosphate, pyruvate kinase, etc.
  • a large number of enzymes are required, and the method 3) requires drying of the cells.
  • expensive nucleotides and sugar phosphates are used as raw materials, and mass production is difficult to operate. No production method has been established on an industrial scale.
  • glycoconjugates examples include: 1) Chemical synthesis method [Methods in Enzymol., 247, 193 (1994), Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 21, 155 (1982), Carbohydr. Res. 211, cl (1991)], 2) a method using a hydrolase [Anal.
  • method 1) the introduction of a protecting group is essential for stereoselective synthesis.
  • method 2) the yield and selectivity are not sufficient.
  • method 3 NDP, NTP, It requires expensive raw materials, such as suhonorbirubic acid, sugar phosphate, or sugar nucleotides, and a large number of enzymes, such as pyruvate kinase, and any of these methods has established an inexpensive industrial method for producing complex saccharides. Absent. Also, there is no known method for industrially directly producing complex carbohydrates using only inexpensive nucleotide precursors and sugars and complex carbohydrate precursors as raw materials.
  • An object of the present invention is to provide a method for producing glycoconjugates useful for protection against infection with bacteria, viruses, etc., adaptation to cardiovascular disorders, immunotherapy, etc., and the use of sugar nucleotides that are important as synthetic substrates for the glycoconjugates.
  • An object of the present invention is to provide an inexpensive and efficient manufacturing method.
  • the present inventors have conducted intensive studies on the production of glycoconjugates and sugar nucleotides using a precursor of a nucleotide as a raw material using a microorganism, and as a result, it has been found that a sugar nucleotide can be obtained using only a precursor and a sugar of a nucleotide as a raw material. It enhances the efficiency of production and enhances the expression of genes involved in the production of sugar nucleotides, thereby improving the productivity.
  • microorganisms capable of producing the sugar nucleotides Using microorganisms, animal cells or insect cells capable of producing glycoconjugates from sugar nucleotides and glycoconjugate precursors, using only nucleotide precursors and sugar and glycoconjugate precursors as raw materials The inventors have found that glycoconjugates can be efficiently produced, and have completed the present invention.
  • the present invention relates to a) a culture of a microorganism capable of producing NTP from a nucleotide precursor or a processed product of the culture; b) culture of a microorganism capable of producing a sugar nucleotide from sugar and NTP. Or a treated product of the culture solution, and :)) a culture solution of a microorganism, an animal cell or an insect cell, or a treated product of the culture solution, which has the ability to produce a glycoconjugate from a sugar nucleotide and a glycoconjugate precursor.
  • a method for producing a glycoconjugate which comprises collecting a glycoconjugate, a) a culture of a microorganism capable of producing NTP from a nucleotide precursor, or a processed product of the culture, and b) a sugar And NTP
  • a culture solution of a microorganism having the ability to produce sugar nucleotides or a processed product of the culture solution is used as an enzyme source, and the enzyme source, the precursor of the nucleotide and the sugar are present in an aqueous medium
  • a method for producing a sugar nucleotide comprising producing and accumulating a sugar nucleotide in a medium and collecting the sugar nucleotide from the aqueous medium, and an ability to produce a complex carbohydrate from a sugar nucle
  • the enzyme source Using a culture solution of microorganisms, animal cells or insect cells or a processed product of the culture solution as an enzyme source, the enzyme source, the complex carbohydrate precursor and the sugar nucleotide obtained by the method for producing a sugar nucleotide described above are used as an enzyme source. Characterized by being present in an aqueous medium, producing and accumulating complex carbohydrates in the aqueous medium, and collecting complex carbohydrates from the aqueous medium. And a method for producing a glycoconjugate.
  • a culture solution of a microorganism having a strong galactokinase activity or a processed product of the culture solution is used as an enzyme source, and the enzyme source and N-acetyldarcosamine are allowed to exist in an aqueous medium.
  • N-acetylglucosamine-1-phosphate is produced and accumulated, and N-acetylglucosamine-1-phosphate is collected from the aqueous medium.
  • FIG. 1 shows the construction steps of the expression plasmids pPA31 and pPAC31.
  • FIG. 2 shows the steps for constructing galU, ppa gene expression plasmids pNT12 and pNT32.
  • FIG. 3 shows the construction process of the ga1T and galk gene expression plasmid ⁇ 25.
  • FIG. 4 shows the construction process of plasmid ⁇ 7 that expresses the ga1T and galk genes in Corynebacterium ammoniagenes.
  • FIG. 5 shows the step of constructing the g1 mU, ppa gene expression plasmid pNT14 ⁇ FIG. 6 shows the step of constructing the pgm gene expression plasmid pNT24.
  • FIG. 7 shows the construction process of the g1 mM gene expression plasmid pNT44.
  • FIG. 8 shows the steps for constructing the g1k gene expression plasmid pNT46.
  • FIG. 9 shows the process of constructing the pfkB gene expression plasmid pNT47.
  • FIG. 10 shows the process of constructing the g a1K gene expression plasmid ⁇ ⁇ ⁇ 54.
  • FIG. 11 shows a process for constructing a plasmid pNK7 expressing manga B and manga C gene.
  • FIG. 12 shows the steps of constructing the pgm and pikB gene expression plasmid pNT55.
  • FIG. 13 shows the step of constructing the gmd, wcaG gene expression plasmid pNK8.
  • FIG. 14 shows the step of constructing the neuA gene expression plasmid pTA14.
  • FIG. 15 shows the construction process of the 1 gtC gene expression plasmid pGT3.
  • FIG. 16 shows a process for constructing the 1gtB gene expression plasmid pNT60.
  • Tables 11 (1) and 11 (2) list abbreviations used in the present invention and descriptions of the abbreviations.
  • Examples of the sugar nucleotide produced by the production method of the present invention include a compound having a general structure in which a terminal phosphate group of a nucleoside-5′-diphosphate residue and a reducing group of the sugar residue are ester-linked. Further, those having a nucleoside residue of cytidine mono 5′-phosphate and those having a sugar residue of a polyol are also included in the sugar nucleotide produced by the present invention.
  • the glycoconjugates produced by the production method of the present invention include monosaccharides, oligosaccharides, monosaccharides or oligosaccharides bonded to carriers, proteins, peptides, lipids, glycoproteins, glycolipids, and glycopeptides.
  • a compound in which a saccharide is bound to a steroid compound or the like can be given.
  • any microorganism capable of producing NTP from a nucleotide precursor can be used.
  • a microorganism belonging to the genus Escherichia Or microorganisms belonging to Corynebacterium can be used.
  • microorganisms belonging to the genus Escherichia include Escherichia coli.
  • Examples of microorganisms belonging to the genus Corynebacterium include Corynebacterium ammonagenes.
  • any microorganism having an activity of producing a target sugar nucleotide can be used.
  • microorganism having a strong enzyme activity of (4) It is preferable to use a microorganism having a strong enzyme activity of (4).
  • microorganisms belonging to the genus Escherichia and microorganisms belonging to the genus Corynebacterium.
  • Preferred specific examples include Escherichia coli and Corynebacterium ammoniagenes.
  • a transformant in which the activity of one or more enzymes selected from (1), (2), (3) and (4) is enhanced by gene recombination technology can also be used.
  • Escherichia coli KY8415 harboring a recombinant DNA (pNT12) containing ga1U and ppa genes derived from Escherichia coli
  • microorganisms belonging to the genus Escherichia and microorganisms belonging to the genus Corynebacterium.
  • Preferred specific examples include Escherichia coli and Corynebacterium ammoniagenes .
  • transformants include Escherichia coli E. coli NM522 and Escherichia coli derived from Escherichia coli harboring a recombinant DNA (pNT25) containing ga1T and ga1K genes derived from Escherichia coli.
  • pNT25 a recombinant DNA
  • microorganisms belonging to the genus Escherichia and Corynebacterium can be used, and preferred specific examples include Escherichia coli and Corynebacterium-ammoniumgenes.
  • transformant in which the activity of one or more enzymes selected from (4), (7), (8), (9), (10), and (13) is enhanced by genetic recombination technology is Can also be used.
  • specific examples of the transformants include Escherichia coli NM522, Escherichia coli E.
  • coli harboring recombinant DNA containing a g1 mM gene derived from Escherichia coli, g1 mU and ppa Escherichia harboring recombinant DNA containing the gene (pNT14) 'Escherichia harboring recombinant DNA (pNT46) containing the g1k gene derived from Escherichia coli and Escherichia coli KY8415 strain' E. coli NM522 strain, Escherichia.
  • a group containing the ga1K gene derived from E. coli Escherichia coli NM522 harboring the recombinant DNA pNT54
  • a recombinant harboring a recombinant DNA (pNT24) containing a pgm gene derived from Escherichia coli is: 1 Escherichia coli NM522, Escherichia coli.
  • the phosphodarcosami of (8) can be obtained.
  • the method for enhancing the expression of mutase activity is the method disclosed for the first time in the present invention.
  • the method for producing G1cNAc-1-P from G1cNAc using the galactokinase (EC 2.7.1.6) of (13) is the production method disclosed for the first time in the present invention. It is possible to produce G1cNAc-1_P using the production method. That is, a culture solution of a microorganism having a strong galactokinase activity, for example, a microorganism having a recombinant DNA of a vector and a DNA fragment containing a gene encoding ga1K, or a treatment of the culture solution. Using the chemical as an enzyme source, the enzyme source and GicNAc are present in an aqueous medium to produce and accumulate G1cNAc-11P in the aqueous medium. G1cNAc-1-P can be produced by collecting G1cNAc-1-P.
  • microorganisms belonging to the genus Escherichia and Corynebacterium can be mentioned, and preferred specific examples include Escherichia coli and Corynebacterium ammoniagenes.
  • microorganisms belonging to the genus Escherichia and Corynebacterium can be used, and preferred specific examples include Escherichia coli and Corynebacterium ammoniagenes.
  • transformant in which the activity of one or more enzymes selected from (1), (2), (3), (4) and (15) is enhanced by genetic recombination technology can also be used.
  • microorganisms belonging to the genus Escherichia or Corynebacterium can be used, and preferred specific examples include Escherichia coli or Corynebacterium ammoniagenes.
  • a transformant in which the activity of one or more enzymes selected from (16), (17) and (18) is enhanced by genetic recombination technology can also be used.
  • the transformants include man B and man C genes derived from Escherichia coli.
  • Escherichia coli NM522 harboring recombinant DNA (NK7) containing E. coli NM522, and Escherichia coli E. coli NM522 harboring recombinant DNA (pNT46) containing g1k gene derived from Escherichia coli Stocks and the like can be given.
  • the expression and enhancement of the phosphomannommutase activity of (17) by the genetic recombination technique requires the addition of G1c-1,6-P2, the forces 5 ', (11) and (1).
  • G-6-P and F-6-P could be converted without adding Glc-1,6-P2.
  • G lc-1, 6-P 2 can be supplied.
  • Specific examples of such a transformant include Escherichia coli NM522 harboring a recombinant DNA (pNT24) containing a pgm gene derived from Escherichia coli, and pfkB derived from Escherichia coli.
  • Escherichia coli NM522 harboring the recombinant DNA (pNT47) containing the gene, and recombinant DNA (pNT55) containing the pgm and pikB genes derived from Escherichia coli Escherichia coli NM522, etc. to be held.
  • the method for enhancing the expression of phosphomannomnidase activity is the method disclosed for the first time in the present invention.
  • microorganisms belonging to the genus Escherichia or Corynebacterium are identified.
  • Preferred examples include Escherichia coli or Corynebacterium ammoniagenes.
  • transformant in which the activity of one or more enzymes selected from (16), (17), (18), (19) and (20) is enhanced by genetic recombination technology.
  • the transformant include Escherichia coli NM522 strain carrying a recombinant DNA (pK7) containing man B and man C genes derived from Escherichia coli, and gmd derived from Escherichia coli.
  • Such transformants include the Escherichia coli NM522 strain, which has a recombinant DNA (pNT24) containing the pgm gene derived from Escherichia coli, and the pfkB gene derived from Escherichia coli.
  • Escherichia coli NM522 harboring a recombinant DNA (pNT47) containing the recombinant DNA A (pNT47) and pgm derived from Escherichia coli and a recombinant DNA (pNT55) containing the p pkB gene Escherichia coli NM522, etc., which we own.
  • microorganisms belonging to the genus Escherichia or Corynebacterium can be used, and preferable examples include Escherichia coli or Corynebacterium ammoniagenes.
  • a transformant in which the activity of one or more enzymes selected from (21), (22), (23), (24) and (25) is enhanced by genetic recombination technology.
  • Escherichia coli C600 strain carrying a recombinant DNA (pNAL1) containing a nanA gene derived from Escherichia coli '[Appl. Environ. Microbiol., 51, 562 (1986) )], And a Escherichia coli NM522 strain having a recombinant DNA (pTA14) containing a neuII gene derived from Escherichia coli.
  • the microorganism has the properties of the microorganism described in 1) and the properties of the microorganism described in 2) at the same time, it is possible to produce a sugar nucleotide from a nucleotide precursor and a sugar using the microorganism. It is.
  • the microorganism has the property of the microorganism described in 1) and the property K described in 2) -1
  • the microorganism is used to determine the properties of the microorganism described in 1) and 2) —2 from UDP-Glc from UTP precursor such as orotic acid and glucose. If they have the same properties, the microorganism is used to obtain UDP-Gal from UTP precursors such as orotic acid and galactose, the properties of the microorganism described in 1) and the properties described in 2)-3.
  • the UTP precursor such as orotic acid and glucosamine or N-acetylglucosamine are used to obtain UDP-GlcNAc.
  • the microorganism uses the microorganism and use UDP-GaI NAc from UTP precursor such as orotic acid and glucosamine or N-acetylacetylglucosamine. Simultaneously the properties of the microorganism described in 1) and the properties described in 2) —5 In this case, the microorganism is used to have UDP-G1c UA from glucose and a UTP precursor such as orotic acid at the same time as having the properties of the microorganism described in 1) and the properties described in 2) -6.
  • UTP precursor such as orotic acid and glucosamine or N-acetylacetylglucosamine.
  • microorganisms include Corynebacterium ammonaussies that expresses the ga1T and ga1K genes derived from Escherichia coli.
  • the microorganism having the property described in 1) does not need to be one kind of microorganism, and even if two or more kinds constitute the property described in 1), the microorganism may have the property described in 1). Available. Specifically, a combination of Escherichia coli with Corynebacterium ammoniagenes, which expresses a pyrG gene derived from Escherichia coli, can be exemplified (JP-A-5-276974).
  • the microorganism having the property described in 2) need not be one kind, but can be composed of two or more kinds. By appropriately combining the microorganism groups, a target sugar nucleotide can be produced.
  • UDP-Glc is obtained from glucose and UTP precursor such as orotic acid.
  • UDP-Gal is obtained from a UTP precursor such as orotic acid and galactose, and 1)
  • UTP precursors such as orotic acid and UDP from glucosamine or N-acetylglucosamine are used.
  • —G 1 c NA c is determined by using a microorganism having the properties described in 1) and 2) one or more microorganisms having the properties described in 4, and using a UTP precursor such as orotic acid and dalcosamine or N — UDP from acetyl glucosamine — G a 1 NA c is described in 1) Using UDP-G1cUA from glucose and UTP precursor such as orotic acid and glucose using microorganisms having properties and 2) one or more microorganisms having properties described in 1), the properties described in 1) 2) Using one or more types of microorganisms having the properties described in (1)-(1), using a GTP precursor such as GMP and a mannose to produce GDP-Man, the microorganisms having the properties described in 1) and 2) Using one or more types of microorganisms having the properties described in-GDP, GTP precursors such as GMP and GDP-Fuc from mannose, microorganisms having the properties described in 1) and 2)- It is possible
  • the DNA-containing DNA fragment is converted into a DNA fragment of an appropriate length containing the gene with restriction enzymes or PCR, and inserted into the expression vector downstream of the promoter, and then the DNA fragment is inserted into the DNA fragment.
  • This can be achieved by introducing an expression vector into which the expression vector has been introduced into a host suitable for the expression vector.
  • c can be used, for example all as it can express the gene of interest, Eshierihia, Serratia, Corynebacterium, Burebipakuteri ⁇ beam genus Shiyudomonasu genus other microorganisms belonging to the genus Bacillus, etc., Yeasts belonging to the genus Saccharomyces, Candida and the like can be mentioned.
  • An expression vector that is capable of autonomous replication or integration into a chromosome in the above-described host, and that contains a promoter at a position where a gene involved in sugar nucleotide production can be transcribed is used.
  • an expression vector for a gene involved in the production of a sugar nucleotide can replicate autonomously in the microorganism, and at the same time, a promoter, a liposome binding sequence, a gene involved in the production of a sugar nucleotide, It is preferably composed of a transcription termination sequence.
  • a gene that controls a promoter may be included.
  • expression vectors include pBT rp2, pBT acl, pBT ac2 (all manufactured by Boehringer Mannheim), pKYP IO (JP-A-58-110600), pKYP200 [Agric Biol. Chem., 48, 669 (1984)], pLSAl [Agric. Biol. Chem., 53, 277 (1989)], pGELl [Proc. Natl. Acad. Sc USA., 82.
  • any promoter can be used as long as it can be expressed in the above-mentioned host.
  • trp promoter lac promoter
  • P promoter 1 Promoters derived from Escherichia coli phage, such as the PR promoter, and the like.
  • a promoter in which two trp promoters are connected in tandem a promoter artificially designed and modified like a tac promoter, or the like can be used.
  • Any ribosome-binding sequence can be used as long as it can be expressed in the above-mentioned host, but a suitable distance (for example, 6 to 18 bases) between the ribosome-binding sequence and the initiation codon is required. It is preferred to use a regulated plasmid.
  • a transcription termination sequence is not necessarily required for expression of a gene involved in the production of a sugar nucleotide, it is desirable to arrange a transcription termination sequence downstream of a structural gene.
  • any cow can be used as long as it can express the recombinant DNA and can react to the sugar nucleotide production reaction by Icheon, specifically, Escherichia col i XL1-Blue, Escherichia col l XL2-Blue Escherichia coli i DH1, Escherichia coli MCI 000, Escherichia coli KY3276, Escherichia coli W1485,
  • yeast strain capable of opening Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870, Microbacterium ammoniaphilum ATCC15354, Pseudomonas putida, Serratia marcescens, etc.
  • an expression vector such as YEp13 (ATCC37115) , YEp24 (ATCC37051), YCp50 (ATCC37419) and the like.
  • Any promoter can be used as long as it can be expressed in a yeast strain host. It may be something.
  • promoters of glycolytic genes such as hexokinase, ga11 promoter, gal10 promoter, heat shock protein promoter, and MF. Promoters such as one promoter and one CUP promoter can be provided.
  • any yeast can be used as long as it can express recombinant DNA and can be used for sugar nucleotide production reaction.
  • Saccharorayces cerevisiae > Candida utilis, Canaida parapsi losis, Candida krusei,
  • Candida versat i 1 is ⁇ Candida lipolytica, Candida zeylanoides, Candida gui 11 iermonai l, Candida albicans> Candida humicola, Pichia farinosa, Pichia ohmer i> Torulopsis candida, Torulopsis sphaerica, Torulopsis roslin, versa, tropsi, roulos, omas Debaryomyces cantarel 1 L Debaryomyces globosus,
  • Debaryomyces hanse i Debaryomyces j aponicus, Zygosaccharomyces rouxii, Zygosaccharorayces bai 1 ⁇ Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces marxianus, Hansenula anomala, Hansenula jadini Brettanomyces larabicus,
  • the cultivation of the microorganism used in the present invention can be performed according to a usual culturing method.
  • the medium for culturing the microorganism may be any of a natural medium and a synthetic medium as long as the medium contains a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, and the like that can be assimilated by the microorganism and can efficiently culture the microorganism.
  • the carbon source may be any one that can be assimilated by each microorganism, such as darcos, fructos, sucrose, lactose, maltose, mannitol, sorbitol, molasses, starch or starch.
  • Carbohydrates such as hydrolysates, various organic acids such as pyruvic acid, lactic acid, citric acid and fumaric acid, various amino acids such as glutamic acid, methionine and lysine, and alcohols such as ethanol, propanol and glycerol are used.
  • Shiranuka, Cassava, Bagasse, Corn Stipp 'Liquor And other natural organic nutrients can also be used.
  • Nitrogen sources include various inorganic and organic ammonium salts, such as ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium carbonate, ammonium acetate, ammonium phosphate, and the like, amino acids such as glutamate, glutamin, methionine, and the like.
  • ammonia ammonium chloride
  • ammonium sulfate ammonium carbonate
  • ammonium acetate ammonium phosphate
  • amino acids such as glutamate, glutamin, methionine, and the like.
  • Peptone, NZ amine, corn steep liquor, meat extract, yeast extract, malt extract, casein hydrolyzate, soybean meal, soybean meal hydrolyzate, fish meal or digestion thereof Objects are used.
  • inorganic substances there are monolithium phosphate, dipotassium phosphate, sodium monophosphate, sodium sodium phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, magnesium chloride, sodium chloride. , Calcium chloride, ferrous sulfate, manganese sulfate, copper sulfate, zinc sulfate, calcium carbonate, etc. are used. Vitamin, amino acids, nucleic acids, etc. may be added as necessary.
  • the cultivation is performed under aerobic conditions such as shaking culture or aeration and stirring culture.
  • the culture temperature is preferably 15 to 45 ° C, and the culture time is usually 5 to 96 hours.
  • the pH is maintained at 3.0 to 9.0.
  • the pH is adjusted by using an inorganic or organic acid, an alkaline solution, urea, calcium carbonate, ammonia, or the like. If necessary, an antibiotic such as ampicillin, kanamycin or chloramphenicol may be added to the medium during the culture.
  • an inducer may be added to the medium, if necessary.
  • an inducer may be added to the medium, if necessary.
  • an inducer For example, when culturing a microorganism transformed with an expression vector using the lac promoter, isopropyl-1 ⁇ -D-thiogalactopyranoside (IPTG) or the like is transformed with an expression vector using the trp promoter.
  • IPTG isopropyl-1 ⁇ -D-thiogalactopyranoside
  • IAA indoleacrylic acid
  • each of the microorganisms may be individually cultured and used for the production of the sugar nucleotide using the culture solution, or may be used in one incubator. Simultaneously inoculate and mix culture, then use the culture May be used for the production of sugar nucleotides. Further, the remaining microorganism may be inoculated during or after the cultivation of any of the microorganisms, and the resulting culture may be used to produce sugar nucleotides. Furthermore, a microorganism having the property described in 1) and a microorganism having the property described in 2) may be separately cultured, and the resulting culture solution may be used to produce a sugar nucleotide.
  • a culture solution of a microorganism obtained by the culture and a processed product of a culture solution obtained by variously treating the culture solution can be used as an enzyme source for production of a sugar nucleotide in an aqueous medium.
  • Examples of the processed product of the culture solution include a concentrate of the culture solution, a dried product of the culture solution, a culture supernatant obtained by centrifuging the culture solution, a concentrate of the culture supernatant, and an enzyme preparation obtained from the culture supernatant.
  • Cells obtained by centrifuging a culture solution including bacterial cells); dried products of the cells; freeze-dried products of the cells; surfactant-treated products of the cells; ultrasound-treated products of the cells; Mechanically milled product of the above, a solvent-processed product of the cell, an enzyme-processed product of the cell, a protein fraction of the cell, an immobilized product of the cell, or an enzyme preparation obtained by extraction from the cell. be able to.
  • the amount of the enzyme source used in the production of the sugar nucleotide is 1 to 500 g Z1 as wet cells, preferably 5 to 300 g Z1.
  • the total wet bacterial mass of the microorganisms in the aqueous medium is 2 to 500 g Zl, and preferably 5 to 500 g Zl.
  • Aqueous media used in the production of sugar nucleotides include water, phosphates, carbonates, acetates, borates, citrates, buffers such as tris, alcohols such as methanol and ethanol, and ethyl acetate. And the like, esters such as acetone, amides such as acetoamide and the like.
  • a culture solution of the microorganism used as the enzyme source can be used as the aqueous medium.
  • Precursors of nucleotides used in the production of sugar nucleotides include orotic acid, peracyl, orotidine, peridine, cytosine, cytidine, adenine, adenosine, guanine, guanosine, hypoxanthine, inosine, xanthine, Xanthosine, Inosine-5 '-— Phosphoric acid, Xanthosine-15' -— Phosphoric acid, Guanosine-15,11-phosphate, Peridine-15,11-L- and Cytidine-15,1-- Phosphoric acid and the like can be mentioned, and preferably, orotic acid and guanosine 15′-monophosphate can be mentioned.
  • the precursor of the nucleotide As the precursor of the nucleotide, a pure product, a culture solution containing the precursor fermented and produced by a microorganism, and a crudely purified product of the precursor are used as long as the salt of the precursor and impurities do not inhibit the reaction. be able to.
  • the nucleotide precursor is used at a concentration of between 0.1 lmM and 1.0M, preferably between 0.01 and 0.3M.
  • sugars used in the production of sugar nucleotides include glucose, fructos, galactose, glucosamine, N-acetylglucosamine, N-acetyl galactosamine, mannose, fucose, and N-a Cetyl mannosamine, acetyl neuraminic acid, derivatives thereof, and the like can be given.
  • the saccharide may be a pure product or may contain any of these, as long as the saccharide does not inhibit the reaction.
  • Sugars can be added all at once at the beginning of the reaction, or can be added in portions during the reaction or continuously, resulting in 0.1 ml! Used at a concentration of ⁇ 2.0M.
  • chelating agents such as coenzymes, phosphate ions, magnesium ions, phytic acid, surfactants, and organic solvents are added. You may.
  • Energy donors include carbohydrates such as glucose, fructose, sucrose, lactose, maltose, mannitol, and sorbitol; organic acids such as pyruvic acid, lactic acid, and acetic acid; glycine, alanine, aspartic acid, and gluta. Examples include amino acids such as phosphoric acid, molasses, and starch hydrolysates, and are used at a concentration of 1.0 mM to 2.0 () M.
  • ion phosphate examples include orthophosphoric acid, pyrophosphoric acid, tripolyphosphoric acid, tetrapolyphosphoric acid, polyphosphoric acid, metaphosphoric acid, trimetaphosphoric acid, ---- potassium phosphate, dipotassium phosphate, monosodium phosphate, and diphosphate Inorganic phosphates such as sodium It can be used at a concentration of 1. OmM to 1.0%.
  • magnesium ion examples include inorganic magnesium salts such as magnesium sulfate, magnesium nitrate, magnesium chloride, and the like, and organic magnesium salts such as magnesium citrate.
  • the magnesium ion is generally used at a concentration of 1 to 10 OmM.
  • the surfactant examples include non-ionic surfactants such as polyoxyethylene octadecylamine (for example, Nimeen S-215, manufactured by NOF Corporation), cetyl trimethylammonium ⁇ bromide alkyldimethyl benzylammonium chloride (Eg, cation F2-40E, manufactured by NOF CORPORATION), anionic surfactants such as lauroyl-sarcosine, and tertiary amines such as alkyldimethylamine (eg, Any of those that promote the production of various sugar nucleotides, such as tertiary amine FB and Nippon Yushi Co., Ltd., may be used alone or in combination of one or more.
  • non-ionic surfactants such as polyoxyethylene octadecylamine (for example, Nimeen S-215, manufactured by NOF Corporation), cetyl trimethylammonium ⁇ bromide alkyldimethyl benzylammonium chloride (E
  • the surfactant is usually used at a concentration of 0.1 to 50 g / 1.
  • the organic solvent include xylene, toluene, aliphatic alcohol, acetate, and ethyl acetate, which are usually used at a concentration of 0.1 to 50 m 1/1.
  • the reaction for producing the sugar nucleotide is carried out in an aqueous medium under the conditions of pH 5 to 10, preferably pH 6 to 9, and 20 to 50 for 2 to 96 hours.
  • a sugar nucleotide can be produced by the method, and examples thereof include peridine diphosphate compounds, guanosine diphosphate compounds, and cytidine-monophosphate compounds. Specifically, UDP-Glc, UDP-Gal, UDP-G1cNAc, UDP-GalNAc, UDP-GlcUA, GDP-Man, GDP-Fuc, CMP-Neu And sugar nucleotides selected from Ac and derivatives thereof.
  • Quantification of sugar nucleotides formed in an aqueous medium can be performed according to a known method.
  • separation and quantification of UDP-G1c and UDP-Gal can be performed by Anal. Biochem., 216, 188 (1994).
  • Quantitation Calculated by comparing absorbance values of standards
  • the sugar nucleotide generated in the reaction solution can be collected by a usual method using activated carbon, an ion exchange resin, or the like.
  • activated carbon an ion exchange resin
  • UDP—G 1 c NAc can be performed according to the method described in J. Org. Chem., 57, 146 (1992).
  • Microorganisms or animal cells or insect cells capable of ffl production of the glycoconjugate of the present invention include microorganisms and animals capable of producing glycoconjugates from sugar nucleotides and glycoconjugate precursors. Any cells or insect cells can be used.
  • glucosyltransferase for example, glucosyltransferase, galactosyltransferase, N-acetylglucosaminyltransferase, N-acetylgalactosaminyltransferase, glucuronosyltransferase, mannosyltransferase, sialyltransferase And microorganisms having an activity such as fucosyltransferase and the like, animal cells or insect cells.
  • microorganisms, animal cells, or insect cells constructed by gene recombination technology can also be used.
  • the microorganism When a microorganism is used for producing the glycoconjugate of the present invention, the microorganism is cultured in the same medium and under the same culture conditions as those for culturing a microorganism capable of producing a sugar nucleotide from a nucleotide precursor and sugar. be able to.
  • the medium for culturing the animal cells may be a commonly used medium such as RPM11640 medium, Eagle's MEM medium, or fetal bovine serum. A medium or the like to which is added. The culturing is carried out such 5% C0 2 presence.
  • the culture temperature is preferably 20 to 40, and the culture time is usually 3 to 14 days. If necessary, antibiotics may be added to the medium.
  • insect cells When insect cells are used for producing the glycoconjugate of the present invention, the insect cells can be cultured according to a known method [J. Biol. Chem., 268, 12609 (1993)].
  • a culture solution of microorganisms or animal cells or insect cells obtained by the culture and a treated product of a culture solution obtained by variously treating the culture solution are used as an enzyme source to produce glycoconjugates in an aqueous medium.
  • Examples of the processed product of the culture solution include a concentrate of the culture solution, a dried product of the culture solution, a culture supernatant obtained by centrifuging the culture solution, a concentrate of the culture supernatant, and an enzyme preparation obtained from the culture supernatant.
  • Cells obtained by centrifuging a culture solution including bacterial cells); dried cells; freeze-dried cells; surfactant-treated cells; ultrasonic-treated cells; A mechanically milled cell, a solvent-treated cell, an enzyme-treated cell, a protein fraction of the cell, an immobilized product of the cell, or an enzyme preparation obtained by extraction from the cell And the like.
  • the amount of enzyme source used in the production of glycoconjugates is defined as the activity of the enzyme, which is defined as the activity that can produce 1 mole of glycoconjugates per minute at 37, as 1 unit (U). It can be used at a concentration of from lmUZl to 10000UZl, preferably from lmU / l to 1000UU / 1.
  • Aqueous media used in the production of glycoconjugates include water, phosphates, carbonates, acetates, borates, citrates, buffers such as tris, methanol, ethanol, etc. Alcohols, esters such as ethyl acetate, ketones such as acetate, and amides such as acetoamide. Further, a culture solution of microorganisms, animal cells or insect cells used as an enzyme source can be used as an aqueous medium. In the production of the complex carbohydrate, optionally, a chelating agent such as phytic acid, inorganic salts such as Mn C 1 2, / -? May be added mercaptoethanol.
  • a chelating agent such as phytic acid, inorganic salts such as Mn C 1 2, / -? May be added mercaptoethanol.
  • the reaction solution obtained in the production of the above sugar nucleotide or the sugar nucleotide purified from the reaction solution can be used. Can be used.
  • a sugar nucleotide can be supplied by generating a sugar nucleotide by the above-described method in a complex sugar production reaction solution.
  • Glycoconjugate precursors used in the formation of glycoconjugates include monosaccharides, oligosaccharides, monosaccharides and oligosaccharides bonded to carriers, proteins, peptides, lipids, glycoproteins, glycolipids, Any substance such as a glycopeptide or a steroid compound that can serve as a substrate for a glycosyltransferase can be used. Specifically, glucose, galactose, mannose, sialic acid, N-acetyl glucosamine, N-acetyl galactosamine, lactose, N-acetyl lactosamine, lactate N-biose, GlcNA c /?
  • the complex carbohydrate precursor can be used at a concentration of 0.01 mM to 2.0 M.
  • the complex carbohydrate of the present invention includes glucose, galactose, N-acetylglucosamine, and N-acetylgalactosami. , Glucuronic acid, mannose, N-acetylmannosamine, fucose, sialic acid, lactose, N-acetylethyl lactosamine, lactone N-biose, GlcNAc /? L—3G a1 / 9 1— 4 G lc, G lc NA c /?
  • NA c Ma no 1-6 Man, Man «1-3 Man, Mana 1-2 Man, G 1 c UA ⁇ 1-4 G 1 c N, G 1 c UA ⁇ 1-3 G a then G 1 c UA /? 1-3 G 1 c NAc, G lc UA /? l-3 G a I NA c, N eu A co 2-3 G a N eu A c «2-
  • NA c F uca l-4 G lc NA c
  • the glycoconjugate or said glycoconjugate comprising a sugar having a bond selected from F uc ⁇ 2 G a 1 and F uc ⁇ 1- 6 G 1 c NA c
  • the number of sugars contained in the complex carbohydrate having the sugars may be 10 or less or 6 or less.
  • a culture solution of a microorganism having the ability to produce glycerol or a processed product of the culture solution as an enzyme source from orotic acid, galactose, and N-acetyl glucosamine to N-acetyl lactosamine.
  • Chem., 271, 28271 (1996)] has the ability to produce C ⁇ ⁇ ⁇ from C ⁇ ⁇ ⁇ precursors.
  • Orotic acid by performing an enzymatic reaction using a culture solution of a microorganism having the ability to produce CMP-NeAc from CTP and a microorganism having the ability to produce CMP-NeAc from a CTP.
  • N-acetyl mannosamine, pyruvate and lactose can produce 3,-sialyl lactose.
  • C0S-7 cells expressing chicken 2,6-sialyltransferase [Eur. J. Biochem., 219. 375 (1994)], a precursor of C C Performs an enzyme reaction using a microorganism having the ability to produce C C ⁇ , a culture solution of a microorganism having the ability to produce CMP—NeuAc from sugar and CTP, or a processed product of the culture solution as an enzyme source.
  • 6'-sialyl-1-N-acetylsilactosamin can be produced from orotic acid, N-acetylmethyl mansosamin, pyruvic acid and N-acetylsilactosamin.
  • ⁇ 1,3-p-acetylacetylglucosaminyltransferase W096 / 10086
  • microorganisms capable of producing UTP from UTP precursors, UDP from sugars and UTP
  • a culture solution of a microorganism capable of producing UTP from a precursor of UTP a culture solution of a microorganism capable of producing UDP-Ga1 from sugar and UTP, or a culture solution of the culture solution
  • lactone _N-tetraose can be obtained from orotic acid, galactose, and GlcNAc /? 1-3Gal /? 1-4G1c. Can be generated.
  • lactate N-neo is converted from orotic acid, galactose, and GicNAc /? 1-3Gal /? 1-4G1c. It can produce tetraose.
  • Microorganisms capable of producing UT ⁇ ⁇ from precursors of UT UT microorganisms capable of producing UDP-G 1 c NAc from sugar and UTP, UDP-G a 1 from sugar and UTP Performing an enzymatic reaction using a culture solution of a microorganism having a production ability or a processed product of the culture solution as an enzyme source.
  • lactose N-neotetraose can be produced from orotic acid, N-acetylglucosamine, galactose and lactose.
  • microorganism capable of producing UTP from a precursor of UTP
  • culture medium of microorganism capable of producing UDP-Ga1 from sugar and UTP
  • processed product of the culture solution By performing an enzymatic reaction using the above as an enzyme source, globotrioose can be generated from orotic acid, galactose, and lactose.
  • a microorganism expressing Neisseria-derived ⁇ 1,4-galactosyltransferase (W096 / 10086), a Neisseria-derived microorganism expressing 1,4-galactosyltransferase (W0% / 10086), Enzymatic reaction using a microorganism capable of producing UTP from a precursor of UTP, a culture solution of a microorganism capable of producing UDP-Ga1 from sugar and UTP, or a processed product of the culture solution as an enzyme source
  • globotriose can be produced from orotic acid, galactose and glucose.
  • Ga 1 a 1-4 G a 1/9 1-4 G 1 c NAc is obtained from orotic acid, galactose and N-acetylsilactosamine. Can be generated.
  • a microorganism expressing ⁇ 2,3-sialyltransferase from Neisseria [J. Biol. Chem., 271, 28271 (1996)], which has the ability to produce CTP from CTP precursors Orotic acid and N can be obtained by performing an enzymatic reaction with a culture of a microorganism having the ability to produce CMP-NeuAc from microorganisms, sugars and CTP, or a processed product of the culture as an enzyme source.
  • glycoconjugates are not limited to the examples described above.
  • Glycosyltransferases that can be combined with the sugar nucleotide production method described in this patent, and substrate specificities that the enzymes allow Any sugar chain can be industrially produced using only precursors of nucleotides, sugars and complex carbohydrates as raw materials.
  • glycoconjugates produced by the production method of the present invention for example,
  • glycoconjugates involved in infection with pathogenic microorganisms and viruses for example, glycoconjugates recognized as receptors for pathogenic microorganisms and viruses,
  • glycoconjugates recognized as receptors for toxins produced by pathogenic microorganisms and viruses (2) glycoconjugates recognized as receptors for toxins produced by pathogenic microorganisms and viruses; (3) In vivo, glycoconjugates involved in cell adhesion, recognition of foreign substances, binding of various lymphokines, etc.
  • Sugars such as glucose, galactose, N-acetylglucosamine, N-acetylgalactosamine, glucuronic acid, mannose, N-acetylmannosamine, fucose, and sialic acid.
  • a complex carbohydrate containing a plurality of carbohydrates in a chemically acceptable binding form can be mentioned, and more specifically,
  • complex carbohydrates contained in human milk that are involved in the protection of infants against microbial infection for example, complex carbohydrates such as lact-1N-tetraose and lact-1N-neotetraose ,
  • Escherichia coli, Propionibacterium granulosium ⁇ Mycobacterium tuberculosis, Moraxel la catarahl is> Candida Staphylococcus saprophyticus, Streptococcus pneumoniae ⁇ Streptococcus agalact iae ⁇ Pseudomonas aeruginosa ⁇ Actinomyces naeslundi ⁇ Neisseria gonorrhoeae, Helicobacter pylori, Haemophilus influenzae, etc.
  • virus receptor glycoconjugates such as influenza virus, coronavirus, Sendai virus, Newcastle disease virus, leovirus, rotavirus, AIDS virus, etc.
  • Receptor complex carbohydrates of protozoa such as cryptosporidium and trypanosomes
  • Cancer-related complex carbohydrates such as gangliosides such as GD3 and GM3, and globo glycolipids,
  • complex carbohydrates such as sialyl Lewis X sugar chain, which are involved in adhesion of leukocytes to inflamed sites and functional modification
  • glycoconjugates related to autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis and IgA nephropathy
  • Glycoconjugates recognized by various lectin-like substances involved in foreign body recognition and cancer cell recognition can be exemplified.
  • Quantification of glycoconjugates formed in the aqueous medium can be performed according to a known method.
  • the glycoconjugate formed in the reaction solution can be collected by a usual method using activated carbon, an ion exchange resin or the like.
  • activated carbon for example, in the case of N-acetylsilactosamin, J. Org. Chem., 47. 5416 ( 1982).
  • LB medium Bacillo-Trypton (Difco 10 g / l, yeast extract (manufactured by Difco) 5 g / l, NaC 15 g
  • pTrS30, pP A1 and pPAC1 plasmid DNA were isolated and purified.
  • the 3.4 kb fragment and the 1.0 kb fragment were subjected to a ligation reaction at 16 for 16 hours using a LAIGESHION KIT (TAKARA ligation Kit, manufactured by Takara Shuzo).
  • LAIGESHION KIT TAKARA ligation Kit, manufactured by Takara Shuzo.
  • Escherichia coli NM522 strain was transformed according to the above-mentioned known method, and the transformant was spread on an LB agar medium containing 50 gZm1 of ampicillin. Cultured overnight.
  • Plasmid was extracted from the thus grown colonies of the transformant according to the above-mentioned known method to obtain pPA31, an expression vector based on the P promoter.
  • the structure of the plasmid was confirmed by restriction enzyme digestion (FIG. 1).
  • the 3.4 kb fragment and the 2.3 kb fragment were subjected to a ligation reaction at 16 for 16 hours using a Ligation kit.
  • Escherichia coli NM522 strain was transformed according to the above-mentioned known method, and the transformant was applied to an LB agar medium containing 50 g / m1 of ampicillin, and then the solution was cultured at 37 ° C. Cultured overnight at C.
  • a plasmid was extracted from the grown transformant colonies according to the above-mentioned known method, and the expression vector was expressed by P, a promoter containing cI857 repressor. P P AC 31 was obtained. The structure of the plasmid was confirmed by restriction enzyme digestion (FIG. 1).
  • the chromosomal DNA of Escherichia coli W3110 strain was isolated and purified by a known method [eg, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons Inc. (1994)].
  • the sense strand DNA primer described in SEQ ID NO: 1 and the antisense strand DNA primer described in SEQ ID NO: 2 were synthesized using a 380 A DNA synthesizer manufactured by Applied Biosystems.
  • PCR was performed using the synthetic DNA as a primer and the chromosomal DNA of the W3110 strain as type ⁇ .
  • W3110 chromosomal DNA 0.04 ⁇ g, each primer 0.5 ⁇ , TA KAR AE x Taq (Takara Shuzo) 1.0 unit, 10 XE x Taq buffer (Takara Shuzo) 4 1.
  • Deoxy NTP Using a reaction solution 4 O 1 containing 200 M each, repeating the steps of 94 11 minutes, 42 2 minutes, and 72 2 13 minutes was repeated 30 times. .
  • DNA was digested with restriction enzymes HindIII and BamHI, and the DNA was analyzed by agarose gel electrophoresis. After separating the NA fragment, a 0.9 kb fragment was recovered using GeneClean Kit, and 0.2 ⁇ g of the pPA31 DNA obtained in Example 1-1) was used as a restriction enzyme. After digestion with HindIII and BamHI, DNA fragments were separated by agarose gel electrophoresis, and a 4.2 kb fragment was recovered in the same manner.
  • the 0.9 kb fragment and the 4.2 kb fragment were ligated with a ligation kit at 16 to 16 hours.
  • Escherichia coli KY8415 strain is transformed according to the above-mentioned known method, and the transformant is applied to an LB agar medium containing 50 gZm1 of ampicillin, and then cultured overnight at 30. did.
  • Plasmid was extracted from the thus grown colonies of the transformant in accordance with the above-mentioned known method to obtain pNT9, which is a ga1U-expressing plasmid.
  • the structure of the plasmid was confirmed by restriction enzyme digestion (Fig. 2).
  • the sense strand DNA primer shown in SEQ ID NO: 3 and the antisense strand DNA primer shown in SEQ ID NO: 4 were synthesized. PCR was performed.
  • a precipitate of DNA was obtained by an ethanol precipitation method.
  • the precipitate was dissolved in 20 ⁇ 1 TE.
  • DNA was digested with restriction enzymes BamHI and Sa''I, DNA fragments were separated by agarose gel electrophoresis, and a 1.0 kb fragment was separated by GeneClean Kit. Collected. 0.2 g of pNT9 DNA obtained in Example 1-2) was replaced with restriction enzymes BamHI and Sa1.
  • the DNA fragment was separated by agarose gel electrophoresis, and a 4.9 kb fragment was recovered in the same manner.
  • the 1. Okb fragment and the 4.9 kb fragment were subjected to ligation reaction for 16 hours at 16 for 16 hours using a Stanford kit.
  • Escherichia coli KY8415 strain was transformed according to the above-mentioned known method, and the transformant was applied to LB agar medium containing 50 gZm1 of ampicillin, and cultured overnight at 30. did.
  • Plasmid was obtained from the grown transformant colonies according to the known method described above. Was extracted to obtain pNT12, a plasmid for co-expression of ga1U and ppa. The structure of the plasmid was confirmed by restriction enzyme digestion (FIG. 2).
  • the 2.2 kb fragment and the 3.0 kb fragment were subjected to a ligation reaction at 16 for 16 hours using a Leigeshock kit.
  • the ligation reaction mixture was used to transform Escherichia coli orchid 522 strain according to a conventional method, and the transformant was applied to an LB agar medium containing 10 g / m 1 of Kuguchi-ramf-nicole, followed by 3 Ot. : It was cultured.
  • Plasmid was extracted from the grown transformant colonies according to a conventional method to obtain pNT32, which is a plasmid for expressing g a1 U and ppa gene.
  • the structure of the plasmid was confirmed by restriction enzyme digestion (FIG. 2).
  • Example 2 Production of UDP-G1c
  • the Escherichia coli KY8415 / pNT12 strain obtained in Example 1 was inoculated into a 1-L baffled Erlenmeyer flask containing 125 ml of LB medium containing 50 g / m1 of ampicillin and 30 °. C. The cells were cultured at 220 rpm for 17 hours.
  • the pH of the culture was maintained at 7.0 by ffling 28% aqueous ammonia. Glucose was added as needed during the culturing. Centrifuging the culture, Wet cells were obtained. The wet cells can be stored at 20 "C if necessary, and can be thawed before use.
  • Corynebacterium ammonia ammonia ATCC21170 strain glucose 50 g / 1, polypeptone (Nippon Pharmaceutical) 10 gZ1, yeast extract (Oriental Yeast Co., Ltd.) 10 g / l, urea 5 gZl, (NH 4) 2 S 0 4 5 g / KH 2 P0 4 1 gZ l, K 2 HP0 4 3 gZ l, Mg SO 7 ⁇ 2 0 lg / UC aC l 2 - 2 H 2 0 0.
  • Inoculate a 5 L culture tank containing 25 L Culture was performed for 24 hours under the conditions of 600 m and an aeration rate of 2.5 L / min. In culture, with 28% ⁇ Nmonia water to maintain P H of the culture solution to 6.8.
  • the culture was centrifuged to obtain wet cells.
  • the wet cells can be removed as needed. It can be stored in a box and can be thawed before use.
  • FIG. 3 A method for constructing a recombinant plasmid pNT25 expressing ga1T and galK is described below (FIG. 3).
  • a sense strand DNA primer described in SEQ ID NO: 5 and an antisense strand DNA primer described in SEQ ID NO: 6 are synthesized, and the synthesized DNA is used as a primer under the same conditions as described above, using the chromosome DNA of W3110 strain as type III. PCR was performed.
  • a precipitate of DNA was obtained by an ethanol precipitation method.
  • the DNA precipitate was dissolved in 201 D.
  • the DNA was digested with the restriction enzymes Hind ffl and Hinc II, the DNA fragment was separated by agarose gel electrophoresis, and the 2.3 kb fragment was analyzed by GeneClean Kit. Was recovered.
  • 0.2 ⁇ g of pBluescript ⁇ SK + DNA was digested with restriction enzymes Hind ⁇ and EcoRV, DNA fragments were separated by agarose gel electrophoresis, and a 3.0 kb fragment was recovered in a similar manner.
  • the 2.3 kb fragment and the 3.0 kb fragment were ligated using a ligation kit.
  • the ligation reaction was performed at 16 for 16 hours.
  • Escherichia coli E. coli NM522 was transformed according to the above-mentioned known method, and the transformant was applied to an LB agar medium containing 50 gZm1 of ampicillin. Cultured overnight.
  • the 2.3 kb fragment and the 5.5 kb fragment were subjected to ligation reaction at 16 ° C. for 16 hours using a ligation kit.
  • Escherichia coli NM52 strain was transformed according to the above-mentioned known method, and the transformant was applied to an LB agar medium containing 50 g / m1 of ampicillin, and then applied to an LB agar medium containing 30 g / m1. Cultured overnight at ° C.
  • Plasmid was extracted from the thus grown colonies of the transformant in accordance with the above-mentioned known method to obtain pNT25, which is a plasmid co-expressing ga1T and galK.
  • the structure of the plasmid was confirmed by restriction enzyme digestion (FIG. 3).
  • Example 4 Production of UD P-G a 1
  • the Escherichia coli '522 / pNT25 strain was transformed according to a conventional method, and the transformant was treated with 50 g of ampicillin and 10 g of chloramphenicilol. After plating on LB agar medium containing / ml, the cells were cultured at 30 overnight. By selecting the grown transformants, g al T, gal K :, gal U, ppa expression strain Escherichia coli
  • the Escherichia coli NM522 / pNT25 / pNT32 strain obtained in Example 4-1) was cultured in the same manner as in Example 2, and each of the resulting cultures was centrifuged to obtain wet cells. Further, Corynebacterium ammogenes ATCC21170 strain was cultured in the same manner as in Example 2, and the obtained culture was centrifuged to obtain wet cells. The wet cells can be stored at 120 if necessary, and can be thawed before use.
  • Escherichia coli E. coli NM522 / pNT25 / pNT32 strain wet cells 50 g Z. Corynebacterium.Ammoniagenes ATCC21170 strain wet cells 150 g / l, glucose 80 gZl, galactose 20 gZ and KH 2 P 0 4 1 5 g / U Mg S 0 4 ⁇ 7 H 2 ⁇ 5 g / and phytic acid 5 g / Oro' preparative acid (potassium Umushio) 2 1.
  • FIG. 4 A method for constructing a recombinant plasmid ⁇ 7 that expresses ga1T, ga1 ⁇ derived from Escherichia hya-coli in Corynebacterium ammoniagenes is described below (FIG. 4).
  • Plasmid p CG11 1 Japanese Patent Publication 6-918257 0.5 g of DNA was digested with restriction enzymes PstI and StuI, DNA fragments were separated by agarose gel electrophoresis, and GeneClean kit was used. As a result, a 6.5 kb fragment was recovered.
  • plasmid pUC19DNA was digested with restriction enzyme ⁇ coRI, and then blunt-ended with DNA Blunting K (Takara Shuzo). After the blunt-ended DNA was cut with PstI, the DNA fragment was separated by agarose gel electrophoresis, and a 43 bp fragment was recovered using a MERmid Kit (manufactured by Bio101).
  • the 6.5 kb fragment and the 43 bp fragment were subjected to ligation reaction at 161: 16 for 16 hours using a ligation kit.
  • the ligation reaction solution was used to transform Corynebacterium ammoniagenes ATCC21170 strain by the electoral poration method [FEMS Microbiol. Lett., 65, 299 (1989)], and the transformant was spectinomycin. After coating on LB agar medium containing 100 ⁇ g / 1, the cells were cultured at 30 for 2 minutes.
  • Plasmid was extracted from the thus grown colonies of the transformant according to a known method [J. Bacteriol., 159 306 (1984)] to obtain a plasmid pCG116.
  • the structure of the plasmid was confirmed by restriction enzyme digestion (Fig. 4).
  • the plasmid pCG116DNA0.5 ⁇ g created in Example 5-1) was cleaved with restriction enzymes Sa1I and BamHI, followed by separation of DNA fragments by agarose gel electrophoresis. Similarly, a 6.5 kb fragment was recovered.
  • the 3.5 kb fragment and the 6.5 kb fragment were ligated using a ligation kit.
  • the ligation reaction was performed at 16 for 16 hours.
  • the ligation reaction mixture was used to transform Corynebacterium hammonagenes ATCC21170 strain by the electroporation method, and the transformant was applied to LB agar medium containing 100 ⁇ g / m1 of spectinomycin. , 30 days for 2 days.
  • Plasmid was extracted from the thus grown colonies of the transformant according to a known method to obtain pTK7, a plasmid co-expressing galT and galK. The structure of the plasmid was confirmed by restriction enzyme digestion (Fig. 4).
  • Fig. 4 The structure of the plasmid was confirmed by restriction enzyme digestion (Fig. 4).
  • the Corynebacterium ammogenes ATCC21170 / pTK7 strain obtained in Example 5 was cultured at 32 ° C. for 20 hours in the same manner as in Example 2, and then cultured at 40 for 4 hours. The material was centrifuged to obtain wet cells. The wet cells can be stored at 120 if necessary, and can be thawed before use.
  • reaction solution having a composition of 1: 1 was transferred to a 200-m1 beaker, and the reaction solution was stirred (900 rpm) with a magnetic mixer. Reaction was performed at 22 ° C. for 22 hours.
  • a sense strand DNA primer shown in SEQ ID NO: 7 and an antisense strand DNA primer shown in SEQ ID NO: 8 were synthesized. PCR was performed using the synthetic DNA as a primer and the chromosome DNA of the W3110 strain as type III under the same conditions as described above.
  • DNA precipitate was obtained by an ethanol precipitation method.
  • the DNA precipitate was dissolved in 2 O 1 TE.
  • DNA was cleaved with restriction enzymes HindIII and BamHI, then DNA fragments were separated by agarose gel electrophoresis, and 1.4 kb fragments were recovered by Geneclean kit.
  • Example 1 After 0.5 g of pPA31DNA obtained in 1) was cut with restriction enzymes Hi-ndII and BamHI, DNA fragments were separated by agarose gel electrophoresis.
  • the 1.4 kb fragment and the 4.2 kb fragment were combined at 16 using a Leige Schott kit; The ligation reaction was performed for 6 hours.
  • Escherichia coli KY8415 strain was transformed according to the above-mentioned known method, and the transformant was applied to an LB agar medium containing 50 g / m1 of ampicillin. Cultured overnight.
  • Plasmid was extracted from the thus grown colonies of the transformant according to the above-mentioned known method to obtain pNT10, a g1mU-expressing plasmid.
  • the structure of the plasmid was confirmed by restriction enzyme digestion (Fig. 5).
  • the 1. Okb fragment and 5.3 kb fragment were subjected to ligation reaction at 16 for 16 hours using a ligation kit.
  • Escherichia coli KY8415 was isolated according to the above-mentioned known method. The transformant was applied to an LB agar medium containing ampicillin 50 / gZm1, and then cultured at 30 overnight.
  • Plasmid was extracted from the thus grown colonies of the transformant according to the above-mentioned known method to obtain pNT14, a plasmid co-expressing glmU and ppa.
  • the structure of the plasmid was confirmed by restriction enzyme digestion (FIG. 5).
  • a sense strand DNA primer described in SEQ ID NO: 9 and an antisense strand DNA primer described in SEQ ID NO: 10 were synthesized. PCR was performed using the synthetic DNA as a primer and the chromosome DNA of the W3110 strain as type III under the same conditions as described above.
  • a precipitate of DNA was obtained by an ethanol precipitation method.
  • the precipitate was dissolved in 20 ⁇ l of water.
  • the DN ⁇ fragment was separated by agarose gel electrophoresis, and the 1.8 kb fragment was separated by GeneClean kit. Collected.
  • Example 11 After 0.2 g of pPAC31DNA1 obtained in 1) was cut with aI and BamHI with restriction enzyme C, DNA fragments were separated by agarose gel electrophoresis, and The 5 kb fragment was recovered.
  • the 1.8 kb fragment and the 5.5 kb fragment were subjected to ligation reaction at 16 for 16 hours using a ligation kit.
  • Escherichia coli NM522 strain was transformed according to the above-mentioned known method, and the transformant was applied to an LB agar medium containing 50 g / m1 of ampicillin, and then the mixture was incubated at 30 ° C. It was cultured.
  • Plasmid was extracted from the thus grown colonies of the transformant in accordance with the above-mentioned known method to obtain pNT24, which is a pGM-expressing plasmid.
  • the structure of the plasmid was confirmed by restriction enzyme digestion (Fig. 6).
  • a sense strand DNA primer described in SEQ ID NO: 11 and an antisense strand DNA primer described in SEQ ID NO: 12 were synthesized.
  • the synthetic DNA was used as a primer, and PCR was performed using the chromosome DNA of the H. coli W3110 strain as type I under the same conditions as described above.
  • a precipitate of DNA was obtained by an ethanol precipitation method.
  • the precipitate was dissolved in 20 ⁇ l of ⁇ .
  • DNA was cleaved with restriction enzymes C 1-a I and BamHI, then the DNA fragment was separated by agarose gel electrophoresis, and 1.6 times using GeneClean Kit. A kb fragment was recovered.
  • Example 1 After 0.2 ⁇ g of pPAC31 DNA obtained in 1) was cut with restriction enzymes C1aI and BamHI, the DNA fragment was separated by agarose gel electrophoresis, and the same procedure as in 5. A 5 kb fragment was recovered.
  • the 1.6 kb fragment and the 5.5 kb fragment were subjected to a ligation reaction at 16 for 16 hours using a Leige Schott kit.
  • Escherichia coli NM522 was transformed according to a conventional method, and the transformant was applied to an LB agar medium containing ampicillin 501, and then cultured overnight at 30.
  • Plasmid was extracted from the thus grown colonies of the transformant in accordance with a conventional method to obtain pNT44, a g1 expression plasmid.
  • the structure of the plasmid was confirmed by restriction enzyme digestion (FIG. 7).
  • the sense strand DNA primer described in SEQ ID NO: 13 and the antisense strand DNA primer described in SEQ ID NO: 14 were synthesized. PCR was performed under the same conditions as above using the synthetic DNA as a primer and the chromosome DNA of Escherichia coli W3110 strain as type III.
  • DNA precipitate was obtained by the ethanol precipitation method, and the precipitate was dissolved in 20 ⁇ l of ⁇ .
  • DNA was digested with restriction enzymes Hind in and BamHI, followed by separation of DNA fragments by agarose gel electrophoresis and recovery of 0.5 kb fragments by GeneClean Kit. .
  • P PA31 DNA 0. obtained in Example 1-1) was replaced with the restriction enzyme Hind. After digestion with HI and BamHI, the DNA fragment was separated by agarose gel electrophoresis, and a 4.2 kb fragment was recovered in the same manner.
  • the 0.5 kb fragment and the 4.2 kb fragment were subjected to ligation reaction at 6 * C for 16 hours using a ligation kit.
  • Escherichia coli NM522 was transformed according to a conventional method. The transformant was applied to an LB agar medium containing 50 gZ1 of ampicillin, and cultured at 30 overnight.
  • Plasmid was extracted from the grown colonies of the transformant according to a conventional method to obtain pNT45 which is a plasmid having a part of g1k.
  • the structure of the plasmid was confirmed by restriction enzyme digestion (FIG. 8).
  • the 0.5 kb fragment and the 4.7 kb fragment were subjected to a ligation reaction at 16 for 16 hours using a Ligation kit.
  • Escherichia coli NM522 was transformed according to a conventional method, and the transformant was applied to an LB agar medium containing 50 g / 1 of ampicillin, and cultured at 30 overnight.
  • Plasmid was extracted from the thus grown transformant colonies according to a conventional method to obtain pNT46, a plasmid expressing g1k. The structure of the plasmid was confirmed by restriction enzyme digestion (FIG. 8).
  • a sense strand DNA primer described in SEQ ID NO: 15 and an antisense strand DNA primer described in SEQ ID NO: 16 were synthesized.
  • PCR was carried out under the same conditions as above using the synthetic DNA as a primer and the chromosome DNA of the W3110 strain as type III.
  • a precipitate of DNA was obtained by an ethanol precipitation method. The precipitate was dissolved in 20 ⁇ l of ⁇ .
  • DN DN was digested with restriction enzymes Hi_nd d and EcoRV, the DNA fragment was separated by agarose gel electrophoresis, and the 1.3 kb fragment was separated by GeneClean Kit. Collected.
  • After digesting 0.2 ⁇ g of pBluescript ⁇ SK + DNA with restriction enzymes Hind ⁇ and Ec0RV the DNA fragment was separated by agarose gel electrophoresis, and a 3.0 kb fragment was recovered in the same manner.
  • the 1.3 kb fragment and the 3.0 kb fragment were subjected to a ligation reaction at 16 for 16 hours using a Leigeshock kit.
  • Escherichia coli NM522 was transformed according to a conventional method, and the transformant was applied to an LB agar medium containing 50 g / m 1 of ampicillin, and then cultured overnight at 30.
  • Plasmid was extracted from the thus grown colonies of the transformant according to a conventional method to obtain a plasmid pNT43 having a pfkB gene.
  • the structure of the plasmid was confirmed by restriction enzyme digestion (Fig. 9).
  • the DNA was cleaved with restriction enzymes C1aI and SacI, and the DNA fragment was separated by agarose gel electrophoresis, and a 1.3 kb fragment was recovered in the same manner.
  • Example 1 0.2 / g of pPAC31 DNA obtained in 1) was replaced with restriction enzyme C1a.
  • the 1.3 kb fragment and the 5.7 kb fragment were ligated at 16 * C for 16 hours using a ligation kit.
  • the ligation reaction mixture was used to transform Escherichia coli NM522 according to a conventional method.
  • the transformant was spread on an LB agar medium containing 50 gZ1 of ampicillin, and cultured at 30 ° C. overnight.
  • Plasmid was extracted from the grown transformant colonies according to a standard method. pNT47, an fkB expression plasmid, was obtained. The structure of the plasmid was confirmed by restriction enzyme digestion (Fig. 9).
  • Example 8 Production of UDP—G 1 c NA c
  • the Escherichia coli KY8415 / pNT14 strain, NM522 / pNT24 strain, thigh 522 / pNT44 strain, and NM522 / pNT47 strain obtained in Example 7 were cultured in the same manner as in Example 2, and each obtained culture was subjected to culture. Centrifugation was performed to obtain wet cells. The wet cells can be stored at 120 if necessary, and can be thawed before use.
  • the Escherichia coli KY8415 / pNT14, NM522 / pNT24, NM522 / pNT44, NM522 / pNT46, and NM522 / pNT47 strains obtained in Example 7 were cultured in the same manner as in Example 2 and obtained. Each culture was centrifuged to obtain wet cells. Also, Corynebacte Lithium ammoniagenes ATCC21170 strain was cultured in the same manner as in Example 2, and the resulting culture was centrifuged to obtain wet cells. The wet cells can be stored in one for 20 as needed, and can be thawed before use.
  • the pH of the reaction solution was maintained at 7.2 using 4 N NaOH, and fructus and KH 2 P 04 were added as necessary.
  • 0.5 p £ of p NT25 DNA obtained in Example 3-1) was digested with restriction enzymes C1aI and Ec0RV, and the DNA fragment was separated by agarose gel electrophoresis.
  • the kit recovered a 6.7 kb fragment. After blunting the recovered DNA with the DNA Blunting Kit, use a ligation kit
  • the ligation reaction was performed at 6 "for 16 hours.
  • Escherichia coli NM522 was transformed according to a conventional method, and the transformant was spread on an LB agar medium containing 50 gZm1 of ampicillin, and then cultured overnight at 30.
  • the Escherichia coli NM522 / pNT54 strain obtained in Example 10 was cultured in the same manner as in Example 2, and the obtained culture was centrifuged to obtain wet cells. Further, Corynebacterium ammonia ammonia ATCC21170 strain was cultured in the same manner as in Example 2, and the obtained culture was centrifuged to obtain wet cells. The wet cells can be stored in a single unit as needed, and can be thawed before use.
  • a magnetic stirrer 900 The reaction was carried out at 32 for 27 hours.
  • the NM522 / pNT25 strain obtained in Example 3 was cultured in the same manner as in Example 2, and the obtained culture was centrifuged to obtain wet cells.
  • Corynebacterium ammoniagenes ATCC21170 strain was cultured in the same manner as in Example 2, and the obtained culture was centrifuged to obtain wet cells.
  • the wet cells can be stored at a temperature of 20 ° C. if necessary. Thawed before use.
  • the pH of the reaction solution was maintained at 7.2 using 4 N NaOH, and KH 2 P ⁇ 4 was added as necessary.
  • a sense strand DNA primer described in SEQ ID NO: 17 and an antisense strand DNA primer described in SEQ ID NO: 18 were synthesized. PCR was performed under the same conditions as above using the synthetic DNA as a primer and the Escherichia coli W3110 strain chromosome DNA as type III.
  • a precipitate of DNA was obtained by an ethanol precipitation method.
  • the precipitate was dissolved in 20 ⁇ l of ⁇ .
  • DNA was digested with restriction enzymes Hind in and ⁇ amHI, then the DNA fragment was separated by agarose gel electrophoresis, and a 3.0 kb fragment was recovered using GeneClean Kit. did.
  • digesting 0.2 g of pBluescript ⁇ SK + DNA with restriction enzymes Hind ⁇ and BamHI DNA fragments were separated by agarose gel electrophoresis, and a 3.Okb fragment was recovered in the same manner.
  • Both fragments of the 3.0 kb were ligated at 16 for 16 hours using a ligation kit.
  • Escherichia coli NM522 was subjected to a standard method. The transformant was applied to an LB agar medium containing 50 gZm1 of ampicillin, and cultured at 30 overnight.
  • Plasmid was extracted from the thus grown colonies of the transformant in accordance with a conventional method to obtain plasmid pNK6 containing manC and manB.
  • the structure of the plasmid was confirmed by restriction enzyme digestion (FIG. 11).
  • pNK6 DNA 0.5 g was cleaved with restriction enzymes C1aI and BamHI, followed by separation of the DNA fragment by agarose gel electrophoresis to recover a 3.0 kb fragment.
  • Example 11-1 After digesting 0.2 g of pPAC31 DNA obtained in Step 1 with restriction enzymes C1aI and BamHI, the DNA fragment was separated by agarose gel electrophoresis, and a 5.5 kb fragment was recovered in the same manner. .
  • the 3. Okb fragment and the 5.5 kb fragment were subjected to ligation reaction at 16 for 16 hours using a ligation kit.
  • the ligation reaction mixture was used to transform Escherichia coli NM522 according to a conventional method.
  • the transformant was applied to an LB agar medium containing 50 g / m 1 of ampicillin, and cultured at 30 overnight.
  • Plasmid was extracted from the grown transformant colonies according to a conventional method to obtain pNK7, which is a plasmid expressing manC and manB. The structure of the plasmid was confirmed by restriction enzyme digestion (FIG. 11).
  • Both fragments of the 3.0 kb were subjected to a ligation reaction at 16 for 16 hours using a ligation kit.
  • the ligation reaction mixture was used to transform Escherichia coli NM522 according to a conventional method, and the transformant was transformed into an LB containing 10 g / m 1 of chloramphenicol. After coating on an agar medium, the cells were cultured at 30 ° C.
  • Plasmid was extracted from the grown transformant colonies according to a conventional method to obtain pNT53, which is a plasmid having the pgm gene.
  • the structure of the plasmid was confirmed by restriction enzyme digestion (FIG. 12).
  • the sense strand DNA primer of SEQ ID NO: 19 was synthesized, and the plasmid pNT4 obtained in Example 7 was synthesized using the sense strand DNA primer and the antisense strand DNA primer of SEQ ID NO: 16. PCR was performed under the same conditions as above using 7 DNAs as type III.
  • a precipitate of DNA was obtained by an ethanol precipitation method.
  • the precipitate was dissolved in 20 ⁇ l of ⁇ .
  • DNA was digested with restriction enzymes EcoRV and Bg1 1, and DN DN fragments were separated by agarose gel electrophoresis. Similarly, a 1.3 kb fragment was recovered.
  • digesting 0.2 g of pNT53 DNA with the restriction enzymes Smal and BamHI the DNA fragment was separated by agarose gel electrophoresis, and the 6.0 kb fragment was recovered in the same manner.
  • the 1.3 kb fragment and the 6.0 kb fragment were subjected to a ligation reaction at 16 for 16 hours using a ligation kit.
  • the ligation reaction solution was transformed in accordance with a conventional method Eshierihia 'coli NM522 strain was used to after applying the transformant in LB agar medium containing chlorambucil Muhu We Nicole 1 0 ⁇ gZm 1, were over ⁇ cultured at 30 .
  • Plasmid was extracted from the grown transformant colonies according to a conventional method to obtain pNT55 which is a plasmid expressing pgm and pfKB. The structure of the plasmid was confirmed by restriction enzyme digestion (FIG. 12).
  • NM522 / pNK7 strain was transformed according to a conventional method, and the transformant was treated with 50 g of ampicillin. After coating on LB agar medium containing / m 1 and 10 ⁇ g / 1 of chloramphenicol, the cells were cultured at 30 overnight. By selecting transformants that have grown, Escherichia coli, which is a strain expressing manB, manC, pgm, and pfkB, is selected.
  • NM522 / pNK7 / pNT55 strain was obtained.
  • the Escherichia coli NM522 / pNK7 / pNT55 strain obtained in 1) above and the Escherichia coli NM522 / pNT46 obtained in Example 7 were cultured in the same manner as in Example 2, and each obtained culture was centrifuged. Wet cells were obtained. Also, Corynebacterium 'ammonigenes ATCC21170 strain was cultured in the same manner as in Example 2, and the obtained culture was centrifuged to obtain wet cells. The wet cells can be stored at 120 if necessary, and can be thawed before use.
  • Escherichia coli NM522 / pNK7 / pNT55 strain wet cells 25 g / sh NM522 / pNT46 strain wet cells 25 g / Corynebacterium ammoniagenes ATCC21170 strain wet cells 150 gZl, fructoose 60 gZ l, mannose 5 0 gZ l, KH 2 P 0, 1 5 g / M g S 0 4 - 7 H 2 0 5 gZ l, phytic acid 5 gZ l, GMP (2 N a, 7 H 2 0 salt) Add 60 gZ to Nai Mean S—2154 g / l, xylene 100 m1 Z1. Was stirred (900 rpm) with a magnetic stirrer and reacted for 24 hours.
  • the sense strand DNA primer described in SEQ ID NO: 20 and the antisense strand DNA primer described in SEQ ID NO: 21 were synthesized. Using the synthetic DNA as a primer, PCR was performed under the same conditions as described above, using the chromosome DNA of the H. coli W3110 strain chromosome DNA.
  • a precipitate of DNA was obtained by an ethanol precipitation method.
  • the precipitate was dissolved in 20 ⁇ l of water.
  • DNA was digested with restriction enzymes Hi_nd X and XhoI, DNA fragments were separated by agarose gel electrophoresis, and a 2.3 kb fragment was separated by Gene Clean Kit. Collected.
  • pPA31 DNA obtained in Example 1 0.2 pg of pPA31 DNA obtained in Example 1 1) was cut with restriction enzymes Hind in and Sa1I, and then DNA fragments were separated by agarose gel electrophoresis. Similarly, 3.9 kb was recovered.
  • the 2.3 kb and 3.9 kb fragments were subjected to a ligation reaction at 16 for 16 hours using a ligation kit.
  • Escherichia coli NM522 was transformed according to a conventional method, and the transformant was applied to an LB agar medium containing 50 / g / m 1 of ampicillin, and cultured at 30 overnight. .
  • Plasmid was extracted from the thus grown colonies of the transformant according to a conventional method to obtain pNK8, a plasmid containing gmd and wcaG. The structure of the plasmid was confirmed by restriction enzyme digestion (FIG. 13).
  • Example 1 Production of GDP-Fuc
  • the Escherichia coli NM522 / pNK7 / pNT55 strain obtained in Example 14 and the NM522 / pNK8 strain obtained in Example 15 and ⁇ 522 / pNT46 obtained in Example 7 were cultured in the same manner as in Example 2. Each of the obtained cultures was centrifuged to obtain wet cells. In addition, Corynebacterium ammogenes ATCC21170 strain was cultured in the same manner as in Example 2, and the obtained culture was centrifuged to obtain wet cells. The wet cells can be stored at 12 Ot: if necessary, and can be thawed before use.
  • Escherichia coli NM522 / pNK7 / pNT55 strain wet cells 25 g / l, Escherichia coli-NM522 / pNK8 strain wet cells 25 g g. Escherichia coli NM522 / DNT46 strain wet cells Body 2 5 g / l, Korinebakuteri ⁇ arm 'ammonia monocytogenes ATCC21170 strain wet cells 1 to 50 g / Fourques toast 4 0 gZ mannose 6 0 gZ l, H, P 0 4 1 5 g / l, Mg SO, - 7 H 2 0 5 g / l, phytic acid 5 gZ l, GMP (2 N a / 7 H 2 0 salt) 60 gZ l, Nai Mi one emission S- 2 1 5 4 gZ l, xylene 1 0 m 1/1 Reaction solution 3
  • Om 1 consisting of the following composition
  • Escherichia coli K235 (ATCC13027) chromosome DNA was prepared in the same manner as in Example 1.
  • a sense strand DNA primer described in SEQ ID NO: 22 and an antisense strand DNA primer described in SEQ ID NO: 23 were synthesized.
  • the synthetic DNA was used as a primer, and PCR was performed under the same conditions as described above, using the chromosome DNA of Escherichia coli K235 (ATCC13027) chromosome as type III.
  • a precipitate of DNA was obtained by an ethanol precipitation method.
  • the precipitate was dissolved in 20 ⁇ l of water.
  • DN ⁇ was digested with restriction enzymes EcoRI and BamHI, then the DNA fragment was separated by agarose gel electrophoresis, and a 1.3 kb fragment was recovered using GeneClean Kit. did.
  • pBluescript pSK + DNA 0.2 / g was cleaved with restriction enzymes EcoRI and BamHI, the DNA fragment was separated by agarose gel electrophoresis, and the 3.Okb fragment was recovered in the same manner.
  • the 1.3 kb and 3.0 kb fragments were ligated in 16 using a Ligation kit. For 16 hours. Using the ligation reaction solution, Escherichia coli NM522 was transformed according to a conventional method, and the transformant was applied to an LB agar medium containing 50 / g / m1 of ampicillin, and then incubated at 30 overnight. Cultured.
  • Plasmid was extracted from the thus grown colonies of the transformant according to a conventional method to obtain pTA12, which is a plasmid containing the neuA gene.
  • the structure of the plasmid was confirmed by restriction enzyme digestion (Fig. 14).
  • the 1.3 kb fragment and the 5.5 kb fragment were subjected to ligation reaction at 16 to 16 hours using a ligation kit.
  • Escherichia coli NM522 was transformed according to a conventional method, and the transformant was applied to an LB agar medium containing 50 g / m 1 of ampicillin, and then cultured overnight at 30 "C. .
  • Plasmid was extracted from the grown transformant colonies according to a conventional method to obtain pTA14, which is a neuA-expressing plasmid. The structure of the plasmid was confirmed by restriction enzyme digestion (FIG. 14).
  • Example 1 Production of CMP—NeuAc
  • Escherichia coli NM522 / pTA14 strain, C600 / pNALl strain [Appl. Environ. Micribiol., 51 562 (1986)] and JF646 / pMW5 strain [J. Biol. Chem., 261, 5568 (obtained in Example 17) 1986)] was cultured in the same manner as in Example 2, and each of the obtained cultures was centrifuged to obtain wet cells.
  • Corynebacterium ammogenes ATCC21170 strain was cultured in the same manner as in Example 2, and the obtained culture was centrifuged to obtain wet cells. The wet cells can be stored at 1:01 as needed. Thaw before use.
  • Escherichia coli NM522 / pTA14 strain wet cells 50 g / l, Escherichia's coli C600 / pNAL1 strain wet cells 15 gZ and Escherichia coli JF646 / pMW5 strain wet cells 25 g / corynebacterium '' Ammoniagenes ATCC21170 strain wet cells 150 g / orotic acid (calidium salt) 10 g / pyruvic acid (Na salt) 20 g / 1, fructos 40 g /, N-a Sechiruman'nosami down 1 0 g / and KH 2 P 0 4 1 5 g / U Mg S0 4 - 7 H 2 0 5 g / U phytic acid 5 g Roh and Na Imin S- 2 1 5 4 g / U xylene Add 30 ml of the reaction solution having the composition of l Oml Zl to a 200 ml volume, stir the
  • Namalba KJ II transformed with plasmid pAMoERSAWl Japanese Unexamined Patent Publication No. 6-181759
  • I TP SGF media 30 m l to 5 xl 0 4 ce 1 1 s / ml, - a share G 4 1 8 a (Gibco) 0.
  • 5 mg / m 1 includes R PM I 640 (cultured between 8 E1 in ⁇ 2 in I Nkyubeta one 3 7 ° C.
  • the cells were removed from the culture by centrifugation, and the supernatant was recovered.
  • the supernatant can be stored at 180 for necessity, and can be thawed before use.
  • a final concentration of 0.1% sodium azide was added to the culture supernatant in which a fusion protein of the IgG binding region of protein A and ⁇ 1,3-galactosyltransferase was generated. Then, 50 l of IgG Sepharose (manufactured by Pharmacia) pretreated according to the product instructions was added, and the mixture was gently stirred overnight at 4 t :.
  • IgG Sepharose manufactured by Pharmacia
  • the IgG sepharose bound to ⁇ 1,3-galactosyltransferase was collected by centrifugation, washed three times with 1 ml of RPMI640-ITPSGF medium, and then washed with the Ig.
  • G Sepharose was used as the enzyme source for 1,3-galactosyltransferase.
  • lact-N-neotetraose (Oxford 'Glyco Systems, Inc.) was fluorescently labeled with 2 -aminoviridine according to a known method [Agric. Biol. Chem., 54, 2169 (1990)].
  • 0.1 U /?-Galactosidase (manufactured by Seikagaku Corporation) was added, and the mixture was reacted at 37 for 16 hours to remove non-reducing terminal galactose.
  • the reaction was heated at 100 for 5 minutes to inactivate the galactosidase.
  • G1cNAc /? 1-3Gal /? 1-4G1c obtained by the reaction was used as a glycoconjugate precursor.
  • Fluorescence detector (excitation wavelength 320 nm, emission wavelength 400 nm) The products were identified by comparing the elution times of lactose N-tetraose labeled with aminopyridine and the labeled product.
  • G1cNAc ⁇ 1-3Gal /? 1-4G1c was prepared from lact-N-neotetraose and used as a glycoconjugate precursor. .
  • Reaction solution 6 containing 0.5 mM of the glycoconjugate precursor, 0.5 U of 1,4-galactosyltransferase (manufactured by Sigma), 0.5 U, and UDP-Ga1 obtained in Example 4.
  • ⁇ 1 5 mM
  • 1 0mM Mn C l 2 the 2 mM main mercaptoethyloleates reaction 36 1 having a composition of ethanol, 6 in 32 5 The reaction was left for a period of time.
  • the product accumulated in the reaction solution was determined using HPLC under the same conditions as in Example 19-12).
  • the elution of the product was determined by comparing the elution times of lactose-neotetraose labeled with aminopyridine and the product.
  • a IgG Sepharose bound to 1,3-fucosyltransferase encodes a fusion protein of the IgG binding region of protein A and ⁇ 1,3-fucosyltransferase.
  • the amount of the product accumulated in the reaction solution was quantified using a sugar analyzer (DX-500) manufactured by Dionex.
  • the product was identified by comparing the elution time of the product with Lacto N-Fucopena Aus II (Oxford Glyco Systems).
  • Example 2 Construction of a plasmid for expressing 1,4 galactosyltransferase (1 g t C)
  • Neisseria gonorrhoeae ATCC 33084 strain
  • Chromosome DNA was prepared in the same manner as in Example 1.
  • the sense strand DNA primer described in SEQ ID NO: 24 and the antisense strand DNA primer described in SEQ ID NO: 25 were synthesized. Using the synthetic DNA as a primer,
  • Neisseria gonorrhoeae ATCC 33084 strain
  • the chromosome DNA was subjected to PCR under the same conditions as described above using type III.
  • a precipitate of DNA was obtained by an ethanol precipitation method.
  • the precipitate was dissolved in 20 ⁇ l of ⁇ .
  • DN ⁇ was cut with restriction enzymes Hind ⁇ and BamHI, then the DNA fragment was separated by agarose gel electrophoresis, and the 1.0 kb fragment was separated by Gene Clean Kit. The fragments were recovered.
  • 0.2 / g of pPA31 DNA obtained in Example 11) was cleaved with restriction enzymes H __nd ⁇ and Bam HI, and then DNA fragments were separated by agarose gel electrophoresis. A 2 kb fragment was recovered.
  • the 1. O kb fragment and the 4.2 kb fragment were ligated using a ligation kit.
  • the ligation reaction was performed at 16 for 16 hours.
  • the ligation reaction mixture was used to transform Escherichia coli NM522 according to a conventional method, and the transformant was transformed into 50 gZm of ampicillin.
  • the cells After spreading on LB agar medium containing I, the cells were cultured at 30 overnight.
  • Plasmid was extracted from the thus grown colonies of the transformant according to a conventional method to obtain pGT3, a 1gtC expressing plasmid. The structure of the plasmid was confirmed by restriction enzyme digestion (FIG. 15).
  • Example 23 Production of globotriose
  • the Escherichia coli NM522 / pNT25 / pNT32 strain obtained in Example 4 and the Escherichia coli NM522 / pGT3 strain obtained in Example 22 were cultured in the same manner as in Example 2 to obtain the respective cultures. Was centrifuged to obtain wet cells.
  • Corynebacterium 'ammonigenes ATCC21170 strain was cultured in the same manner as in Example 2, and the obtained culture was centrifuged to obtain wet cells.
  • the wet cells can be stored at 120 if necessary, and can be thawed before use.
  • Escherichia coli NM522 / pNT25 / pNT32 strain wet cells 50 g / 1, Escherichia coli NM522 / pGT3 strain wet cells 50 g / corynebacterium Ammoniagenes ATCC21170 strain wet cells 1 50 g Z l, fructos 100 g / l, galactose 100 g, lactose 100 g / l, KH 2 PO 4 15 g / l, M g S 0 4 ⁇ 7 H 2 0 5 g / l, phytic acid 5 g / l, orotic acid (potassium salt) 10 g, Niimin S—214 5 4 gZ and xylene l Oml Zl put 1 to 200 m 1 Yobi one car, the reaction mixture Maguneti click.
  • Example 4 Eshiwerihia obtained in Example 4 a 'coli NM522 / P NT25 / pNT32 strain
  • Example 2 2 obtained in Eshiwerihia' coli NM522 / pGT3 strain was cultured in the same manner as in Example 2, the culture of each obtained was centrifuged to obtain wet cells.
  • Corynebacterium ammoniagenes ATCC21170 strain was cultured in the same manner as in Example 2, and the obtained culture was centrifuged to obtain wet cells.
  • the wet cells can be stored at 120 ° C. if necessary, and can be thawed before use.
  • Escherichia coli NM522 / pNT25 / pNT32 strain wet cells 50 gZl, Escherichia coli NM522 / pGT3 strain wet cells 50 g /, corynebacterium ammonia ammonia ATCC21170 strain wet cells 1 50 g Bruno 1, Fourques toast 5 0 gZ and galactosyl bets - scan 5 0 gZ l, N-Asechiruraku Tosami emissions 96 g / and KH 2 P_ ⁇ 4 1 5 g 1, Mg S 0 4 ⁇ 7 H 2 0 5 g / 1, 30 g of a reaction solution consisting of 5 g of phytic acid, 10 g of zirconic acid (potassium salt), 10 g of nymein S—2, 150 g of xylene, and 10 ml of xylene The reaction solution was stirred in a magnetic stirrer (900 rpm) (00
  • the sense strand DNA primer described in SEQ ID NO: 26 and the antisense A single strand DNA primer was synthesized.
  • the synthetic DNA was used as a primer, and.
  • gonorrhoeae ATCC 33084 strain
  • PCR was performed using chromosome DNA as type III under the same conditions as described above.
  • a precipitate of DNA was obtained by an ethanol precipitation method.
  • the precipitate was dissolved in 20 ⁇ l of water.
  • DNA was digested with restriction enzymes HindIII and BamHI, then the DNA fragment was separated by agarose gel electrophoresis, and the 0.8 kb fragment was separated by GeneClean Kit. Was recovered.
  • digesting 0.2 g of pBluescriptll SK + DNA with the restriction enzymes H-indII and BamHI the DNA fragment was separated by agarose gel electrophoresis, and a 3.Okb fragment was recovered in the same manner.
  • the 0.8 kb and 3.0 kb fragments were ligated at 16 for 16 hours using a ligation kit.
  • Escherichia coli NM522 was transformed according to a conventional method, and the transformant was applied to an LB agar medium containing 5 Og / m 1 of ampicillin, and then cultured at 30 overnight.
  • Plasmid was extracted from the thus grown colonies of the transformant according to a conventional method to obtain pNT60P, a plasmid containing 1 gtB of the gene. The structure of the plasmid was confirmed by restriction enzyme digestion (FIG. 16).
  • Example 1 - p P AC 3 cleaved with 1 DN A 0. 2 ⁇ g restriction enzyme C 1 a I and B a mH I obtained in 1), separating the DN A fragment by Agarosugeru electrophoresis similarly The 5.5 kb fragment was recovered.
  • the 0.8 kb fragment and the 5.5 kb fragment were subjected to a ligation reaction for 16 hours at 16 by using a Ligation kit.
  • Escherichia coli NM522 strain was transformed according to a conventional method. The transformant was applied to an LB agar medium containing 50 gZm1 of ampicillin, and then cultured at 30 overnight.
  • the Escherichia coli NM522 / pNT60 strain obtained in Example 25 and the Escherichia coli NM522 / pNT25 strain obtained in Example 3 were cultured in the same manner as in Example 2, and each of the resulting cultures was cultured. Centrifugation was performed to obtain wet cells.
  • Corynebacterium ammoniagenes ATCC21170 strain was cultured in the same manner as in Example 2, and the obtained culture was centrifuged to obtain wet cells. The wet cells can be stored at -20 if necessary, and can be thawed before use.
  • Escherichia coli NM522 / pNT25 strain wet cells 50 gZl, Escherichia Hia 'coli NM522 / pNT60 strain wet cells 50 g / sh Corynepacterimu' ammoniagenes ATCC21170 strain wet cells 150 g / sh Doo acid (potassium ⁇ unsalted) 1 0 gZ and off torque preparative Ichisu 1 0 0 g /, N- ⁇ cetyl Darco Sami down 1 0 0 g, galactokinase bets - scan 1 00 g Bruno 1, KH 2 P 0 4 1 5 g / Mg S 0 4 - 7 H 2 0 5 g / U phytic acid 5 gZ l, Nai Mean S- 2 1 5 4 g / l , the reaction solution 3 0 m having the composition of xylene 1 0 ml / 1 1 was placed in a 200
  • the Escherichia coli NM522 / pNT60 strain obtained in Example 5 and the Escherichia coli NM522 / pNT25 strain obtained in Example 3 were cultured in the same manner as in Example 2 to obtain each of the obtained strains. The culture was centrifuged to obtain wet cells. Further, Corynebacterium ammoniagenes ATCC21170 strain was cultured in the same manner as in Example 2, and the obtained culture was centrifuged to obtain wet cells. The wet cells can be stored at 120 ° C. if necessary, and can be thawed before use.
  • Escherichia Hia coli NM522 / pNT25 strain wet cells 50 g / 1, Escherichia Hia coli NM522 / pNT60 strain wet cells 50 g / cell Corynebacterium ammonia ammonia ATCC21170 strain cells 150 gZ Oro' Doo acid (potassium salt) 1 0 gZ to glucose 1 1 5 gZ l, galactosamine preparative Ichisu 1 1 5 gZ and KH 2 P0 4 1 5 gZ and Mg S 0 4 - 7 H 2 0 5 g / 1, A reaction solution 3 Om1 consisting of phytic acid 5 g / l, nitromin S—2154 g 1 and xylene lOmlZl was placed in a 20 Om1 beaker, and this reaction solution was added. The mixture was stirred with a magnetic stirrer (900 rpm) and reacted at 32 with the mixture for 15 hours.
  • Example 2 Escherichia coli 'NM522 / pNT60 strain obtained in Example 5, Escherichia coli' NM522 / pNT25 strain obtained in Example 3 and Escherichia coli 'NM522 / pGT3 obtained in Example 2 were used in the same manner as in Example 2. Each of the obtained cultures was centrifuged to obtain wet cells. Further, Corynebacterium's ammoniagenes ATCC21170 strain was cultured in the same manner as in Example 2, and the obtained culture was centrifuged to obtain wet cells. The wet cells can be stored at -20 ° C if necessary, and can be thawed before use.
  • Escherichia coli NM522 / pNT25 strain wet cells 50 g / 1, Escherichia coli NM522 / pNT60 strain wet cells 50 gZ, and Escherichia coli NM522 / pGT3 strain wet cells 5
  • the reaction produced 51 globotriose in the reaction solution.
  • a sugar nucleotide can be produced industrially and efficiently from a sugar nucleotide and a complex carbohydrate precursor using only the nucleotide precursor and the sugar as raw materials.
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type other nucleic acids, synthetic DNA
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Description

明 細 書
糖ヌクレオチド類および複合糖質の製造法 技術分野
本発明は、 細菌， ウィ ルス等の感染防御、 心血管障害への適応および免疫治療 等に有用な複合糖質の製造方法および該複合糖質の合成基質として重要である糖 ヌク レオチ ドの製造方法に関する。 背景技術
糖ヌク レオチドの製造方法として、 1 ) 化学合成法 [Adv. Carbohydr. Chem. Biochem. , 28， 307 (1973)、 Bull. Chem. Soc. Japan, 46， 3275 (1973)、 J. Org. Chem. , 57, 146 (1992)、 Carbohydr. Res. , 242, 69 (1993)] 、 2 ) 酵素 を用いた製造方法 [J. Org. Chem. , 55, 1834 (1990)、 J. Org. Chem. , 57， 152 (1992)、 J. Am. Chem. Soc. , 110, 7159 (1988)、 特表平 7- 508413、 特表平 7- 500248、 W096/27670] 、 3 ) 酵母等の微生物菌体を用いる方法 （特公昭 45-2073、 特公昭 46-40756、 特公昭 47-1837、 特公昭 47- 26703、 特公昭 49- 8278 、 特開平 2-268692) 4 ) 耐塩性酵母の微生物菌体からの抽出法 （特開平 8-23993) 等が知 られている。
1 ) の方法においては、 高価なヌク レオシド一 5 ' ——リン酸 （以下、 NMP と略す） のモルフオ リデート誘導体や糖リン酸等が必要であり、 2 ) の方法にお いては、 ヌクレオシド一 5 ' —ニリン酸 （以下、 ND Pと略す） 、 ヌクレオシド - 5 ' —三リン酸 （以下、 NT Pと略す） 、 ホスホエノ一ルビルビン酸、 糖リ ン 酸等の高価な原料やピルビン酸キナーゼ等多数の酵素が必要であり、 3 ) の方法 においては菌体の乾燥処理等が必要である。 4 ) の方法を含め、 上記いずれの方 法においても、 原料として高価なヌクレオチドゃ糖リン酸等が用いられていたり、 操作的に大量生産が困難であるため、 今日に至るまで、 糖ヌクレオチドの工業的 規模での製造法は確立されていない。
訂正された用紙 (規則 91) 複合糖質の製造法としては、 1 ) 化学合成法 [Methods in Enzymol. , 247, 193 (1994)、Angew. Chem. Int. Ed. Engl. , 21, 155 (1982)、Carbohydr. Res.， 211, cl (1991)] 、 2 ) 加水分解酵素 [Anal. Biochem. , 202, 215 (1992)、 Trends Biotechnol., 6, 256 (1988)] を用いる方法、 および 3) 糖転移酵素 （特開平 7 - 79792、 特表平 7-500248、 特公平 5- 82200、 W094/25614, 特表平 9- 503905、 USP 5,583,042) を利用した方法が知られている。
1 ) の方法では立体選択的合成のためには保護基の導入が必須であり、 2 ) の 方法では収率 '選択性が十分でなく、 3) の方法においては ND P、 NT P、 ホ スホエノ一ルビルビン酸、 糖リ ン酸、 あるいは糖ヌクレオチド等の高価な原料や ピルビン酸キナーゼ等多数の酵素が必要であり、 いずれの方法においても複合糖 質の安価な工業的製造方法は確立されていない。 また、 安価なヌク レオチドの前 駆物質および糖および複合糖質前駆物質のみを原料として、 直接複合糖質を工業 的に製造する方法は知られていない。
コリネバクテリゥム属に属する微生物において、 ォロッ ト酸を添加することに より UMPが生産されるとの報告がある [Amino Acid Nucleic Acid, 23， 107 (1971)] 。 また、 ォロッ ト酸を原料にしてシチジン二リン酸コリンを生成する方 法も知られている （特開平 5- 276974) 。 発明の開示
本発明の目的は、 細菌 · ウィ ルス等の感染防御、 心血管障害への適応および免 疫治療等に有用な複合糖質の製造方法および該複合糖質の合成基質として重要で ある糖ヌクレオチドの安価で効率的な製造方法を提供することにある。
本発明者らは、 微生物を用いて、 ヌク レオチ ドの前駆物質を原料とした複合糖 質および糖ヌクレオチドの生産について鋭意検討を行った結果、 ヌクレオチドの 前駆物質および糖のみを原料として糖ヌクレオチドが効率的に生産できること、 糖ヌクレオチドの生成に関与する遺伝子の発現を強化することにより、 その生産 性が向上することを兌いだし、 さらに、 該糖ヌク レオチ ドを生産可能な微生物、 および、 糖ヌクレオチドと複合糖質前駆物質から複合糖質を生産する能力を有す る微生物あるいは動物細胞あるいは昆虫細胞を利用し、 ヌク レオチドの前駆物質 および糖および複合糖質前駆物質のみを原料として効率的に複合糖質を生産でき ることを見いだし本発明を完成するに至った。
本発明は、 a ) ヌクレオチドの前駆物質から N T Pを生産する能力を有する微 生物の培養液または該培養液の処理物、 b ) 糖と N T Pから糖ヌク レオチドを生 産する能力を有する微生物の培養液または該培養液の処理物、 および::） 糖ヌク レオチドと複合糖質前駆物質から複合糖質を生産する能力を有する微生物、 動物 細胞あるいは昆虫細胞の培養液または該培養液の処理物、 を酵素源として用い、 これら酵素源、 ヌク レオチドの前駆物質、 糖および複合糖質前駆物質を水性媒体 中に存在せしめ、 該水性媒体中に複合糖質を生成蓄積させ、 該水性媒体中から複 合糖質を採取することを特徴とする複合糖質の製造法、 a ) ヌク レオチ ドの前駆 物質から N T Pを生産する能力を有する微生物の培養液または該培養液の処理物、 および b ) 糖と N T Pから糖ヌクレオチドを生産する能力を有する微生物の培養 液または該培養液の処理物、 を酵素源として用い、 これら酵素源、 ヌ ク レオチ ド の前駆物質および糖を水性媒体中に存在せしめ、 該水性媒体中に糖ヌク レオチド を生成蓄積させ、 該水性媒体中から糖ヌクレオチドを採取することを特徴とする 糖ヌクレオチドの製造法、 および糖ヌクレオチドと複合糖質前駆物質から複合糖 質を生産する能力を有する微生物、 動物細胞あるいは昆虫細胞の培養液または該 培養液の処理物を酵素源として用い、 該酵素源、 複合糖質前駆物質および上記に 記載の糖ヌクレオチドの製造法により得られた糖ヌクレオチドを水性媒体中に存 在せしめ、 該水性媒体中に複合糖質を生成蓄積させ、 該水性媒体中から複合糖質 を採取することを特徴とする複合糖質の製造法を提供する。 更に、 ガラク トキナ —ゼ活性の強い微生物の培養液または該培養液の処理物を酵素源として用い、 該 酵素源および N—ァセチルダルコサミ ンを水性媒体中に存在せしめ、 該水性媒体 中に N—ァセチルグルコサミ ンー 1—リン酸を生成蓄積させ、 該水性媒体中から N—ァセチルグルコサミ ン一 1 ーリ ン酸を採取することを特徴とする N—ァセチ ルグルコサミ ン— 1—リン酸の製造法を提供する。 図面の簡単な説明
第】図は発現プラスミ ド p PA 3 1および p PAC 3 1の造成工程を示す。 第 2図は g a l U、 p p a遺伝子発現プラスミ ド p N T 1 2および p N T 32 の造成工程を示す
第 3図は g a 1 T、 g a l K遺伝子発現プラスミ ド ρ ΝΤ 2 5の造成工程を示 す。
第 4図は g a 1 T、 g a l K遺伝子をコリネバクテリ ゥム · アンモニアゲネス で発現するプラスミ ド ρ ΤΚ 7の造成工程を示す。
第 5図は g 1 mU、 p p a遺伝子発現プラスミ ド p NT 1 4の造成工程を示す < 第 6図は p g m遺伝子発現ブラスミ ド p N T 24の造成工程を示す。
第 7図は g 1 mM遺伝子発現ブラスミ ド p N T 44の造成工程を示す。
第 8図は g 1 k遺伝子発現ブラスミ ド pNT 4 6の造成工程を示す。
第 9図は p f k B遺伝子発現ブラスミ ド pNT 4 7の造成工程を示す。
第 1 0図は g a 1 K遺伝子発現ブラスミ ド ρ Ν Τ 54の造成工程を示す。
第 1 1図は m a n B、 m a n C遗伝子発現ブラス ミ ド p N K 7の造成工程を示 す。
第 1 2図は p gm、 p i k B遺伝子発現プラスミ ド p NT 5 5の造成工程を示 す。
第 1 3図は gmd、 w c a G遺伝子発現ブラス ミ ド p N K 8の造成工程を示す < 第 1 4図は n e u A遺伝子発現プラスミ ド p TA 1 4の造成工程を示す。
第 1 5図は 1 g t C遺伝子発現プラスミ ド p GT 3の造成工程を示す。
第 1 6図は 1 g t B遺伝子発現プラスミ ド pNT 60の造成工程を示す。 第 1一（1)表および第 1一（2)表に本発明に用いる略号および該略号の説明を記 す。
第 1 一（1) 表
Figure imgf000007_0001
訂正された用紙 (規則 91) 第 1—(2) 表
UD P-G 1 C ； ゥ リ ンン一 5 ―一 リ ノ酸クルコース
UD P -G a 1 i ゥ リ ンン一 5 —一-リ ノ酸カフク ト一ス ジン一 5， 一二リ ン酸 N
UD P-G 1 c N A c 1ゥ リ —ァセチル
i グルコサミ ン
ゥ リ ジン一 5， 一二リ ン酸 N ァセチル
UDP-G a 1 N A c
ガラク トサミ ン
UDP-G 1 c U A ゥ リ ジン一 5 , —二リ ン酸グルクロン酸
G D P -M a n グアノシン一 5' —二リ ン酸マンノース
G D P— F u c グアノシン一 5， 一二リ ン酸フコース iシチジン一 5' ——リ ン酸 N ァセチル し IV丄 丄、 6 A c
i ノ イ ラ ミ ン酸
グルコース一 1一リ ン酸ゥ リ ジル ト ラン g a 1 U
！ スフエラーゼ
P P a 1 (イ ノーガニッ ク） ピロホスファ タ一ゼ g a 1 K 1 ガラク トキナーゼ
ガラク ト一ス一 1一リ ン酸ゥ リ ジル ト ラ σ a 1 T
！ ンスフェラ一ゼ
！ N-ァセチルク レコサミン- 1-リン酸ゥリシ レトランスフェラ- g 1 m U
：ク'、ルコサミン一 1 リン酸ァセチルトランスフェラーセ
P g m 1ホスホグルコムターゼ
p f k B ホスホフルク トキナーゼ
g 1 mM ！ ホスホグルコサミ ンムターゼ
1 k ； グルコキナーゼ
m a n B ホスホマンノムタ一ゼ
iマンノース一 1—リ ン酸グァニル ト ラ ン m a n C
スフェラ一ゼ
g m d ！ GDP—マノノ—ス- 4 , t> -ァヒ ト フターセ
GDP- 4-ケ ト - 6—ァォキンマンノ—スェヒ w c a G
l メ フ一セ /レタ ク夕ーセ
1： C U M/( V r> - " INNT / フ ノ Iしレ ノノ ノ z 5 、ノ、 z て* n e u A
ターゼ
n e u B N ァセチルノ イラ ミ ン酸シン夕ーゼ n a n A N ァセチルノイラ ミ ン酸アル ドラ一ゼ
P y r G ； シチジン一 5 ' —三リ ン酸シンセターゼ
1 t B ί β 1 4-ガラク ト シル ト ラ ンスフェラ一ゼ
1 t C 1 a 1 4-ガラク トシル ト ラ ンスフェラ一ゼ u g d UDP-グルコース デヒ ドロゲナ一ゼ 本発明によれば、 1 ) N T Pや糖リン酸等の高価な原料を必要とせず、 ォロッ ト酸等の安価なヌクレオチドの前駆物質および糖のみを原料とする、 2 ) N M P あるいは N D Pから N T Pへの転換において高価なホスホェノールピルビン酸と ピルビン酸キナーゼの添加を必要としない、 さらに、 3 ) 酵素の単離操作を必要 としない等の特徴を有する糖ヌクレオチドの新規な製造法および該糖ヌクレオチ ド製造法を利用した新規な複合糖質の製造法を提供できる。
本発明の製造法で製造される糖ヌクレオチドとしては、 ヌクレオシド一 5 ' - ニリン酸残基の末端リン酸基と糖残基の還元基とがエステル結合をした一般構造 を有する化合物をあげることができ、 更に、 ヌクレチド残基がシチジン一 5 ' — ーリン酸のもの、 糖残基がポリオールのものも本発明により製造される糖ヌクレ ォチドに含まれる。
本発明の製造法で製造される複合糖質としては、 単糖、 オリゴサッカライ ド、 担体等に結合した単糖またはオリゴサッカライ ド、 蛋白質、 ペプチド、 脂質、 糖 蛋白質、 糖脂質、 グリコペプチドあるいはステロイ ド化合物等に糖質が結合した 化合物をあげることができる。
以下に本発明を詳細に説明する。
1 ) 本発明で用いられるヌクレオチドの前駆物質から N T Pを生産する能力 を有する微生物としては、 ヌクレオチドの前駆物質から N T Pを生産する能力を 有する微生物であればいずれも用いることができ、 例えば、 ェシヱリヒア属また はコリネバクテリゥム厲に属する微生物等をあげることができる。
ェシエリヒア属に属する微生物としてはェシエリヒア ' コリ等をあげることが できる。
コリネバクテリゥム属に属する微生物としてはコリネバクテリゥム . アンモニ ァゲネス等をあげることができる。
2 ) 本発明で用いられる糖と N T Pから糖ヌクレオチドを生産する能力を有す る微生物としては、 目的とする糖ヌクレオチドを生成する活性を有する生物であ ればいずれでも用いることができ、 例えば、
訂正された用紙 (規則 91) 2) —① UDP— G l cの生産に関しては、 下記、 式 1 に示した （ 1 ) から
(4) の酵素活性の強い微生物を用いることが好ましい。
具体的には、 ェシヱリヒア属に属する微生物およびコリネバクテリゥム属に属 する微生物をあげることができ、 好ましい具体例としては、 ェシヱリヒア ' コリ またはコリネバクテリゥム · アンモニアゲネスをあげることができる。
また、 （ 1 ) 、 （2) 、 （3) および （4 ) から選ばれる一つ以上の酵素の活 性を遣伝子組換え技術により増強した形質転換株を用いることもできる。 該形質 転換体の具体例として、 ェシヱリヒア ' コリ由来の g a 1 Uおよび p p a遺伝子 を含む組換え体 DN A ( p NT 1 2 ) を保有するェシヱリ ヒア ' コリ KY8415
(FERM BP- 408) 株等をあげることができる。
(1) (2) (3)
グルコース ― G— 6—P ― G - 1 - P → UDP— G l c
(式 1 )
(4)
ピロリ ン酸 — 2 Xリン酸
(1) :へキソキナーゼ（EC 2.7.1.1)あるいはグルコキナーゼ（EC 2.7.1.2)
(2) :ホスホグルコムターゼ（EC 2.7.5.1)
(3)：グルコース一 1ーリ ン酸ゥリジル トランスフェラ一ゼ（EC 2.7.7.9)
(4)： (イ ノ一ガニック） ピロホスファタ一ゼ（EC 3.6.1.1)
2) —② UDP— G a 1の生産に関しては、 下記、 式 2に示した （5) および (6) の酵素活性の強い微生物を、 また、 好ましくは、 式 1に示した （ 1 ) から (4 ) の酵素活性の強い性質をもあわせ持つような微生物を用いることが好まし い o
具体的には、 ェシヱリヒァ属に属する微生物およびコリネバクテリゥム属に属 する微生物をあげることができ、 好ましい具体例と しては、 ェシエリヒア ' コリ およびコリネバクテリゥム · アンモニアゲネスをあげることができる。
また、 （ 5) および （6) から選ばれる -つ以上の酵素の活性を、 あるいは、 ( 5) および （6) から選ばれる一つ以上の酵素と （ 1 ) から （4) から選ばれ る一つ以上の酵素の活性を、 遺伝子組換え技術により増強した形質転換株を用い ることもできる。 該形質転換体の具体例として、 ェシヱリヒア ' コリ由来の g a 1 Tおよび g a 1 K遺伝子を含む組換え体 DN A (p NT 2 5) を保有するェシ エリヒア ' コリ NM522株およびェシヱリヒア ' コリ由来の g a 1 Tおよび g a 1 K遺伝子を含む組換え体 DN A (p TK 7) を保有するコリネバクテリウム - ァ ンモニァゲネス ATCC21170をあげることができる。
(5) (6)
ガラク トース G a 1 - 1 - Ρ UDP-G a 1 (式 2)
(5)：ガラク トキナ一ゼ（EC 2.7.1.6)
(6) :ガラク ト一ス-レリン酸ゥリジルトランスフェラ一ゼ（EC 2.7.7.12)
2) —③ UD P— G l c NA cの生産に関しては、 下記、 式 3に示した （ 7) から （ 1 2) および式 1に示した （4 ) の酵素活性の強い微生物、 あるいは式 3 に示した （ 1 3) および （ 1 0) の酵素活性の強い微生物を用いることが好まし い o
具体的には、 ェシヱリヒァ属ぉよびコリネバクテリゥム属に属する微生物をあ げることができ、 好ましい具体例としては、 ェシエリヒア ' コリおよびコリネバ クテリゥム - アンモニアゲネスをあげることができる。
また、 （4) 、 （7) 、 （8) 、 （9) 、 （ 1 0) 、 および （ 1 3) から選ば れる一つ以上の酵素の活性を遺伝子組換え技術により増強した形質転換株を用い ることもできる。 該形質転換体の具体例として、 エシュリヒア . コリ由来の g 1 mM遺伝子を含む組換え体 DN A ( p NT 4 4 ) を保有するェシヱリヒア ' コリ NM522株、 ェシヱリヒア ' コリ由来の g 1 mUおよび p p a遺伝子を含む組換え 体 DNA (p NT 1 4 ) を保有するェシェリヒア ' コリ KY8415株、 ェシェリヒ ァ - コリ由来の g 1 k遺伝子を含む組換え体 DNA (p NT 4 6 ) を保有するェ シエリヒア ' コリ NM522株、 ェシエリヒア . コリ由来の g a 1 K遺伝子を含む組 換え体 DN A (p NT 54 ) を保有するェシヱリヒア ' コリ NM522株等をあげる ことができる。
遺伝子組換えによる （ 8 ) のホスホダルコサミ ンムターゼ活性の発現および增 強には、 G 1 c— 1， 6— P 2の添加が必要とされる力？[J. Biol. Chem.， 271， 32 (19%)]、 （ 1 1 ) および （ 1 2 ) の酵素の活性を遺伝子組換え技術により增 強した形質転換株を用いることにより、 G l c— 1， 6 - P 2を添加することな く、 G— 6— Pおよび F— 6— Pから G l c— 1 , 6—P 2を供給することが可 能である。
このような形質転換体の具体例として、 ェシヱリヒア ' コリ由来の p gm遺伝 子を含む組換え体 DN A ( p NT 2 4 ) を保有するェシ： 1 リヒア · コリ NM522株、 ェシヱリ ヒア . コリ由来の p f k B遺伝子を含む組換え体 DN A ( p NT 4 7) を保有するェシェリヒア ' コリ NM522株、 ェシエリ ヒア ' コリ出来の p gmおよ び p ί k B遺伝子を含む組換え体 DN A ( NT 5 5) を保有するェシヱリ ヒ ァ - コリ NM522株等をあげることができる。
( 1 1 ) および （ 1 2 ) の酵素活性を用いて G— 6— Pおよび F— 6— Pから G l c— 1 , 6— P 2を供給するこ と によ り 、 （8) のホスホダルコサミ ンムタ ーゼ活性の発現を増強する方法は本発明で初めて開示された方法である。
( 1 3 ) のガラク トキナーゼ（EC 2.7.1.6)を用い G 1 c N A cから G 1 c N A c - 1 -Pを製造する方法は本発明で初めて開示された製造法である。 該製造法 を用いて G 1 c NA c— 1 _Pを製造することが可能である。 即ち、 ガラク トキ ナ一ゼ活性の強い微生物、 例えば、 g a 1 Kをコードする遗伝子を含む DNA断 片とベクタ—との組換え体 D N Aを保有する微生物の培養液または該培養液の処 理物を酵素源として用い、 該酵素源および G i c N A cを水性媒体中に存在せし め、 該水性媒体中に G 1 c N A c— 1一 Pを生成蓄積させ、 該水性媒体中から G 1 c NA c - 1 - Pを採取することにより G 1 c NA c - 1 - Pを製造すること ができる。
水性媒体より、 G 1 c N A c - 1一 Pの採取は、 活性炭ゃィォン交換樹脂等を 用いる通常の方法によって行うことができる。
(7) (8) (9) (10)
グルコサミ ン → GlcN-6-Ρ → GlcN-1-Ρ ― GlcNAc-1-Ρ → UDP-GlcNAc
(13) (10)
G 1 c N A c → G 1 c NA c— 1— P ― U D P - G 1 c A c
(式 3)
(11) (12)
F - 6 - P F— 1， 6 - P 2 G - 6 - P → G 1一 P
(12)
G— 1一 P + F— 1， 6 - P 2 G— 1， 6 - P 2
(7)：へキソキナーゼ（EC 2.7.1· 1)あるいはグルコキナーゼ（EC 2.7.1.2)
(8)：ホスホグルコサミ ンムタ一ゼ
(9) :グルコサミ ン- 1-リ ン酸ァセチルトランスフェラ一ゼ
(10) :N-ァセチルグルコサミ ン- 1-リ ン酸ゥリジルトランスフェラ一ゼ
(EC 2.7.7.23)
(11) :ホスホフルク トキナ一ゼ（EC 2.7.1.11)
(12)：ホスホグルコムターゼ（EC 2.7.5.1)
(13) :ガラク トキナーゼ（EC 2.7.1.6)
2) —④ UDP— G a l NA cの生産に関しては、 式 3に示した （ 7) から ( 1 2) 、 式 4に示した （ 1 4 ) および式 1に示した （4 ) の酵素活性の強い微 生物、 あるいは式 3に示した （ 1 0) 、 （ 1 3) および式 4に示した （ 1 4) の 酵素活性の強い微生物を用いることが好ましい。
具体的には、 ェシヱリヒァ属およびコリネバクテリゥム属に属する微生物をあ げることができ、 好ましい具体例としては、 ェシェリヒア ' コリおよびコリネバ クテリゥム · アンモニアゲネスをあげることができる。
また、 （7) から （ 1 4 ) および （4 ) から選ばれる一つ以上の酵素の活性を 遺伝子組換え技術により増強した形質転換株を用いることもできる。 UDP -G 1 c NA c o U D P G a 1 N A c (式 4)
(14):UDP-G 1 c N A c 4—ェピメラーゼ（EC 5.1.3.7)
2 ) —⑤ UD P— G 1 c U Aの生産に関しては、 式 1に示した （ 1 ) から (4) および式 5に示した （ 1 5) の酵素活性の強い微生物を用いることが好ま しい。
具体的には、 ェシエリヒア属およびコリネバクテリゥム属に属する微生物をあ げることができ、 好ましい具体例としては、 ェシヱリヒア · コリおよびコリネバ クテリゥム . アンモニアゲネスをあげることができる。
また、 （ 1 ) 、 （2 ) 、 （3 ) 、 （4 ) および （ 1 5) から選ばれる一つ以上 の酵素の活性を遺伝子組換え技術により増強した形質転換株を用いることもでき る。
(15)
U D P - G 1 c UDP-G 1 c UA (式 5)
(15) :U D P— G 1 cデヒ ドロゲナーゼ（EC 1.1.1.22)
2 ) —⑥ G D P— M a ηの生産に関しては、 下記、 式 6に示した （ 1 6) から ( 1 8) および式 3に示した （ 1 1 ) および （ 1 2) の酵素活性の強い微生物を 用いることが好ましい。
具体的には、 ェシヱリヒア属またはコリネバクテリゥム属に属する微生物をあ げることができ、 好ましい具体例としては、 ェシエリヒア ' コリまたはコリネバ クテリゥム . アンモニアゲネスをあげることができる。
また、 （ 1 6) 、 （ 1 7 ) および （ 1 8 ) から選ばれる一つ以上の酵素の活性 を遺伝子組換え技術により増強した形質転換株を用いることもできる。 該形質転 換体の具体例として、 ェシエリヒア ' コリ由来の m a n Bおよび m a n C遺伝子 を含む組換え体 DN A ( NK 7) を保有するェシヱリヒア ' コリ NM522株、 ェ シヱリヒア · コリ由来の g 1 k遺伝子を含む組換え体 DN A (p NT 4 6) を保 有するェシエリヒア ' コリ NM522株等をあげることができる。
遺伝子組換え技術による （ 1 7) のホスホマンノムタ—ゼ活性の発現および増 強には、 G 1 c— 1， 6— P 2の添加が必要とされる力5'、 （ 1 1 ) および （ 1 2) の酵素の活性を遺伝子組換え技術により増強した形質転換株を用いることに より、 G l c— 1， 6 - P 2を添加することなく、 G— 6— Pおよび F— 6— P から G l c— 1 , 6 - P 2を供給することが可能である。 このような形質転換体 の具体例として、 ェシエリヒア ' コリ由来の p g m遺伝子を含む組換え体 DN A (p NT 2 4 ) を保有するェシエリ ヒア ' コリ NM522株、 ェシヱリ ヒア · コリ由 来の p f k B遺伝子を含む組換え体 DN A (p NT 4 7) を保有するェシヱリヒ ァ · コリ NM522株、 ェシヱリヒア · コリ由来の p gmおよび p i k B遺伝子を含 む組換え体 DN A ( p NT 5 5 ) を保有するェシエリヒア ' コリ NM522株等をあ げることができる。
( 1 1 ) および （ 1 2) の酵素活性を用いて G— 6— Pおよび F— 6— Pから G 1 c - 1 , 6— P 2を供給することによ り、 （ 1 7) のホスホマンノムタ一ゼ 活性の発現を増強する方法は本発明で初めて開示された方法である。
(16) (17) (18)
マンノース a n - 6 - P M a n - 1 - P G D P— M a n (式 6)
(16) :へキソキナーゼ（EC 2.7.1.1)あるいはグルコキナーゼ（EC 2.7.1.2)
(17) :ホスホマンノムタ一ゼ（EC 2.7.5.7)
(18)：マンノース- 1-リ ン酸グァニルトランスフェラ一ゼ（EC 2.7.7.13)
2) —⑦ GDP— F u cの生産に関しては、 下記、 式 7に示した （ 1 9) およ び （ 2 0 ) および式 6に示した （ 1 6) から （ 1 8) および式 3に示した （ 1 1 ) および （ 1 2) の酵素活性の強い微生物を用いることが好ましい。
具体的には、 ェシヱリヒァ属またはコリネバクテリゥム属に属する微生物をあ げることができ、 好ましい具体例としては、 ェシヱリヒア · コリまたはコリネバ クテリゥム · アンモニアゲネスをあげることができる。
また、 （ 1 6) 、 （ 1 7) 、 （ 1 8) 、 （ 1 9) および （2 0 ) から選ばれる 一つ以上の酵素の活性を遺伝子組換え技術により增強した形質転換株を用いるこ ともできる。 該形質転換体の具体例として、 エシュリヒア · コリ由来の m a n B および m a n C遺伝子を含む組換え体 DN A (p K 7 ) を保有するェシヱリ ヒ ァ ' コリ NM522株、 ェシヱリ ヒア · コリ由来の g m dおよび w c a G遺伝子を含 む組換え体 DN A (p NK 8 ) を保有するェシエリ ヒア ' コリ NM522株、 ェシヱ リヒア . コリ由来の g 1 k遺伝子を含む組換え体 DN A ( p NT 4 6 ) を保有す るェシエリ ヒア ' コリ NM522株等をあげることができる。
遺伝子組換え技術による （ 1 7 ) のホスホマンノムタ一ゼ活性の発現および増 強には、 G l c — 1， 6— P 2の添加が必要とされる力 ( 1 1 ) および （ 1 2 ) の酵素の活性を遣伝子組換え技術により増強した形質転換株を用いることに よ り、 G l c — 1 , 6— P 2を添加することなく、 G— 6— Pおよび F— 6— P から G l c — 1 , 6— P 2を供給することが可能である。
このような形質転換体の具体例として、 ェシエリヒア ' コリ由来の p g m遺伝 子を含む組換え体 DNA ( p N T 2 4 ) を保有するェシヱ リ ヒア · コリ NM522株、 ェシヱリヒア . コリ由来の p f k B遺伝子を含む組換え体 DN A ( p NT 4 7 ) を保有するェシェリヒア ' コリ NM522株、 ェシエリヒア ' コリ由来の p g mおよ び p ί k B遺伝子を含む組換え体 DN A ( p NT 5 5 ) を保有するェシヱリ ヒ ァ - コリ NM522株等をあげることができる。
(19) (20)
G D P— M a n → GDP-4-keto-6-deoxyMan → G D P— F u c (式 7)
(19) :GDP- Man- 4,6-デヒ ドラターゼ（EC4.2· 1.47)
(20)： GDP- 4-keto- 6 - deoxymanrmoseェピメラ一ゼ /レダクターゼ 2) —⑧ CMP— N e u A cの生産に関しては、 下記、 式 8に示した （2 1 ) 、 (2 2) または （2 3) 、 （2 4) および （2 5) の酵素活性の強い微生物を用 いることが好ましい。
具体的には、 ェシヱリヒア属またはコリネバクテリゥム属に属する微生物をあ げることができ、 好ましい具体例としては、 ェシエリヒア ' コリまたはコリネバ クテリゥム · アンモニアゲネスをあげることができる。
また、 （2 1 ) 、 （2 2) 、 （2 3) 、 （2 4 ) および （2 5) から選ばれる 一つ以上の酵素の活性を遺伝子組換え技術により増強した形質転換株を用いるこ ともできる。 該形質転換体の具体例として、 ェシヱリヒア ' コリ由来の n a n A 遺伝子を含む組換え体 DN A ( p N A L 1 ) を保有するェシヱリヒア · コリ C600 株 [Appl. Environ. Microbiol. , 51, 562 (1986)] 、 ェシエリヒア ' コリ由来 の n e u Α遺伝子を含む組換え体 DN A ( p T A 1 4 ) を保有するエシュリ ヒ ァ ' コリ NM522株等をあげることができる。
(21) (22)または（23) (24)
GlcNAc → ManNAc — NeuAc ― CMP-NeuAc
(式 8)
(25)
UTP → CTP
(21)： GlcNAc 2-ェピメラーゼ（EC 5.1.3.8)
(22) :NeuAcアルドラーゼ（EC 4.1.3.3)
(23) :NeuAcシンセタ一ゼ（EC 4.1.3.19)
(24)： CMP-NeuAcシンセタ一ゼ（EC 2.7.7.43)
(25) :CTPシンセタ一ゼ（EC 6.3.4.2)
微生物が 1 ) に記載の微生物の性質および 2 ) に記載の微生物の性質を同時に 有する場合には、 該微生物を利用し、 ヌク レオチドの前駆物質と糖より糖ヌ クレ ォチドを生産することが可能である。
微生物が 1 ) に記載の微生物の性質および 2) —①に記載の性 Kを「。1時に有す る場合には、 該微生物を利用し、 ォロッ ト酸等の UT P前駆物質とグルコースよ り UDP— G l cを、 1 ) に記載の微生物の性質および 2 ) —②に記載の微生物 の性質を同時に有する場合には、 該微生物を利用し、 ォロッ ト酸等の UT P前駆 物質とガラク ト一スより UDP— G a l を、 1 ) に記載の微生物の性質および 2) —③に記載の性質を同時に有する場合には該微生物を利用し、 ォロッ ト酸等 の U T P前駆物質とグルコサミンまたは N—ァセチルグルコサミ ンより UD P— G l c NA cを、 1 ) に記載の微生物の性質および 2) —④に記載の性質を同時 に有する場合には該微生物を利用し、 ォロッ ト酸等の UT P前駆物質とグルコサ ミ ンまたは N—ァセチルグルコサミ ンよ り UDP— G a I NA cを、 1 ) に記載 の微生物の性質および 2) —⑤に記載の性質を同時に冇する場合には該微生物を 利用し、 ォロッ ト酸等の U T P前駆物質とグルコースよ り UD P— G 1 c UAを、 1 ) に記載の微生物の性質および 2) —⑥に記載の性質を同時に有する場合には、 該微生物を利用し、 GMP等の G TP前駆物質とマンノースより GDP— M a n を、 1 ) に記載の微生物の性質および 2 ) —⑦に記載の性質を同時に有する場合 には、 該微生物を利用し、 GMP等の G T P前駆物質とマンノースよ り GD P— F u cを、 1 ) に記載の微生物の性質および 2) —⑧に記載の性質を同時に有す る場合には、 該微生物を利 fflし、 ォロッ ト酸等の C T P前駆物質と N—ァセチル グルコサミ ンまたは N—ァセチルマンノサミ ンょ り CMP— N e u A cを生産す ることが可能である。
このような微生物の具体例としては、 ェシヱリヒア ' コリ由来の g a 1 Tおよ び g a 1 K遺伝子を発現するコリ ネバクテリ ウム ' ァンモニァゲネスをあげるこ とができる。
また、 上記の菌株とは異なり、 1菌株中に糖ヌク レオチ ドの製造に必要な活性 の一部しか有していない微生物の場合、 それぞれの活性を冇する微生物を適宜組 み合わせ、 糖ヌク レオチ ドの製造を行うことができる。
1 ) に記載の性質を有する微生物も 1種類である必要はなく、 2種類以上で 1 ) に記載する性質を構成する場合にも 1 ) に記載の性質をおする微生物として 利用できる。 具体的には、 ェシヱリヒア · コリ由来の p y r G遺伝子を発現する ェシエリヒア · コリとコリネバクテリゥム · アンモニアゲネスとの組み合わせを 例示することができる （特開平 5-276974) 。
同様に 2) に記載の性質を有する微生物も 1種類である必要はなく、 2種類以 上で構成することができる。 該微生物群を適宜組み合わせることにより、 目的と する糖ヌクレオチドを生産することができる。
例えば、 1 ) に記載の性質を有する微生物および 2) —①に記載の性質を有す る一種類以上の微生物を用い、 ォロッ ト酸等の UTP前駆物質とグルコースより UDP-G l cを、 1 ) に記載の性質を有する微生物および 2) —②に記載の性 質を有する一種類以上の微生物を用い、 ォロッ ト酸等の UTP前駆物質とガラク ト一スより UDP— G a l を、 1 ) に記載の性質を有する微生物および 2 ) —③ に記載の性質を有する一種類以上の微生物を用い、 ォロッ ト酸等の UT P前駆物 質とグルコサミ ンまたは N—ァセチルグルコサミ ンよ り UDP—G 1 c NA cを、 1 ) に記載の性質を有する微生物および 2) —④に記載の性質を有する一種類以 上の微生物を用い、 ォロッ ト酸等の UT P前駆物質とダルコサミンまたは N—ァ セチルグルコサミ ンよ り UDP— G a 1 NA cを、 1 ) に記載の性質を有する微 生物および 2) —⑤に記載の性質を有する一種類以上の微生物を用い、 ォロッ ト 酸等の UTP前駆物質とグルコースよ り UDP— G 1 c UAを、 1 ) に記載の性 質を有する微生物および 2) —⑥に記載の性質を有する一種類以上の微生物を用 い、 GMP等の GTP前駆物質とマンノースよ り GDP— Ma nを、 1 ) に記載 の性質を有する微生物および 2) —⑦に記載の性質を有する一種類以上の微生物 を用い、 GMP等の GTP前駆物質とマンノースよ り GDP— F u cを、 1 ) に 記載の性質を有する微生物および 2 ) —⑧に記載の性質を有する一種類以上の微 生物を用い、 ォロッ ト酸等の C TP前駆物質と N—ァセチルグルコサミ ンまたは N—ァセチルマンノサミンより CMP— N e uA cを生産することが可能である c 上述のように、 糖ヌクレオチドの製造において、 遺伝子組換え微生物を利用す ることが可能である力 該製造に関与する、 第 2表に記載した遺伝子は、 ェシェ リヒア · コリの染色体よりクローン化され、 その全塩基配列が決定されている
第 1 表 遺伝子 参考文献
g a 1 u遺伝了- J. Biochem.， ' 【15， 965 (1994)
P P a遺 ίム十 J. Bacteriol . 170, 5901 (1988)
g a 1 Κ遺伝子 Nucleic Ac ids Res. , 13, 1841 (1985) g a 1 Τ遺伝子 Nucleic Acids Res. , 14, 7705 (1986) g 1 mU遺伝子 J. Bacteriol . 175, 6150 (1993)
P g m遺 卞 J. Bacteriol . 176, 5847 (1994)
P f k B遺伝子 Gene, 28， 337 (1984)
g 1 mM¾iz- J. Biol . Chem , 271, 32 (1996)
g 1 k遺伝子 J. Bacteriol . , 179， 1298 (1997)
m a n B遺伝子 J. Bacteriol . 178, 4885 (1996)
m a n C遺は子 J. Bacteriol . 178, 4885 (1996)
g m d遺伝子 J. Bacteriol . 178， 4885 (1996)
w c a G遺伝子 J. Bacteriol . 178, 4885 (1996)
n e u A遺伝子 J. Biol . Chem , 264, 14769 (1989) n e u B遣伝子 J. Bacteriol . 177, 312 (1995)
n a n A遺伝子 Nucleic Acids Res. , 13, 8843 (1985)
P y r G遺伝子 J. Biol . Chem , 261, 5568 (1986)
u d遺伝子 J- Bacteriol . 177, 4562 (1995) 該遺伝子を含有するプラスミ ドを保有するェシェリヒア ' コリからのブラスミ ド DN Aの単離精製、 プラスミ ド DN Aの制限酵素による切断、 切断した DNA 断片の単離精製、 DNA断片の酵素的結合、 組換え体 DNAを用いたェシエリヒ ァ ■ コリの形質転換等、 遺伝子組換えに関する種々の操作は公知の方法 [例えば J. iambrook Ό ( b ； Molecular し lomng, A Laboratory Manual Second edition Cold Spring Harbor Laboratory (1989)] に準じて行うことができる。 また ポリメラーゼ · チェイン . リアクション （以下、 P C Rと略す） はパーキ ン .エルマ一 ' シ一タス社製のサーマル 'サイクラ一等を用いて行うことができ る。
糖ヌクレオチドの製造に関与する遣伝子を宿主中で発現させるためには、 該遗 伝子を含む DN A断片を、 制限酵素類あるいは PC Rで、 該遺伝子を含む適当な 長さの DN A断片とした後に、 発現べクタ一中プロモーターの下流に挿入し、 次 いで上記 DN Aを揷入した発現ベクターを、 発現べクターに適合した宿主中に導 入することによ り達成できる。
宿主としては、 目的とする遺伝子を発現できるものは全て用いることができる c 例えば、 ェシエリヒア属、 セラチア属、 コリネバクテリウム属、 ブレビパクテリ ゥム属、 シユードモナス属、 バチルス属、 等に属する微生物の他、 サッカロマイ セス属、 キャンディダ属等に属する酵母等をあげることができる。
発現べクタ一としては、 上記宿主に於いて自立複製可能ないしは染色体中への 組込みが可能で、 糖ヌクレオチドの製造に関与する遺伝子を転写できる位置にプ 口モータ一を含有しているものが用いられる。
上記の微生物を宿主として用いる場合は、 糖ヌクレオチドの製造に関与する遺 伝子の発現ベクターは微生物中で自立複製可能であると同時に、 プロモーター、 リポソーム結合配列、 糖ヌクレオチドの製造に関与する遺伝子、 転写終結配列よ り構成されていることが好ましい。 プロモーターを制御する遺伝子が含まれてい てもよい。
発現べクタ一としては、 例えば、 p BT r p 2、 p BT a c l、 p B T a c 2 (いずれもベーリ ンガーマンハイム社製） 、 p KYP I O (特開昭 58- 110600) 、 p K Y P 2 00 [Agric. Biol. Chem. , 48, 669 (1984)] 、 p L SA l [Agric. Biol. Chem. , 53, 277 (1989)] 、 p GE L l [Proc. Natl. Acad. Sc USA. , 82, 4306 (1985)] 、 pBluescript Π SK+ (STRATAGENE社製） 、 p T r S 30 [ェシヱリヒア · コリ JM109/pTrS30 (FERM BP- 5407) より調製] および p T r S 32 [ェシエリヒア ' コリ JM109/pTrS32 (FERM BP- 5408) より調製] 、 p U C 1 9 [Gene, 33， 103 (1985)] 、 p S T V 28 (宝酒造社製 ） 、 p PA l (特開 昭 63-233798) 、 p C G 1 1 (特公平 6- 91827) 等を例示することができる。
プロモータ一としては、 上記の宿主中で発現できるものであればいかなるもの でもよい。 例えば、 t r pプロモータ一、 l a cプロモータ一、 Pしプ ロモータ 一、 PRプロモータ一等の、 ェシエリヒア ' コリゃファージ等に由来するプロモ —夕一をあげることができる。 また t r pプロモーターを 2つ直列させたプロモ —夕一、 tacプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモータ一等も用 いることができる。
リボソーム結合配列と しては、 上記の宿主中で発現できるものであればいかな るものでもよいが、 リボソーム結合配列と開始コ ドンとの間を適 な距離 （例え ば 6〜 1 8塩基） に調節したプラスミ ドを用いることが好ましい。
糖ヌクレオチドの製造に関与する遺伝子の発現には転写終結配列は必ずしも必 要ではないが、 好適には構造遺伝子の下流に転写終結配列を配置することが望ま しい。
宿主としては、 組換え体 DN Aが発現でき、 糖ヌ ク レオチ ドの生成反応に利川 できるものならいかなる微牛.物も使用でき、 具体的には、 Escherichia col i XL1 - Blue、 Escherichia col ι XL2-Blue Escherichia col i DH1、 Escherichia coli MCI 000, Escherichia coli KY3276、 Escherichia coli W1485,
Escherichia coli JM109> Escherichia coli HB101、 Escherichia col i No.49、 Escherichia col i W3110、 Escherichia col i NY49、 Escherichia col i KY8415、 Escherichia coli NM522、 Bacillus subtilis、 Bacillus brevis、 Bacillus amylol iquefacines, Brevibacterium i画 ar iophi lum ATCC14068、
Brevibacter ium saccharolyt icum ATCC14066、 Brevibacterium f I avum
ATCC14067, Brevibacterium lactofermentum ATCC13869、 Corynebacterium ammoniagenes ATCC21170、 Corynebacterium glutamicum ATCC13032、
Corynebacterium acetoacidophi lum ATCC13870、 Microbacter ium ammoniaphi lum ATCC15354、 Pseudomonas putida、 Serrat ia marcescens等をあけ'ることカできる 酵母菌株を宿主として用いる場合には、 発現ベクターと して、 例えば、 YE p 1 3 (ATCC37115) 、 YE p 24 (ATCC37051) 、 Y C p 50 (ATCC37419) 等を 例示することができる。
プロモーターとしては、 酵母菌株の宿主中で発現できるものであればいかなる ものでもよい。 例えば、 へキソキナーゼ等の解糖系の遺伝子のプロモーター、 g a 1 1プロモータ一、 g a l 1 0プロモータ一、 ヒー トショ ック蛋白質プロモ —ター、 MF。 1プロモータ一、 CUP 1プロモータ一等のプロモーターをあ げることができる。
宿主としては、 組換え体 DN Aが発現でき、 糖ヌクレオチドの生成反応に利用 できるものならいかなる酵母も使用でき、 具体的には、 Saccharorayces cerevisiae> Candida utilis、 Canaida parapsi losis, Candida krusei、
Candida versat i 1 is^ Candida lipolytica、 Candida zeylanoides, Candida gui 11 iermonai l、 Candida albicans> Candida humicola、 Pichia farinosa、 Pichia ohmer i > Torulopsis candida、 Torulopsis sphaerica、 Torulopsis xylinus、 rorulopsi s famata、 rorulopsis versatilis、 Debaryomyces subglobosus、 Debaryomyces cantarel 1 L Debaryomyces globosus、
Debaryomyces hanse i、 Debaryomyces j aponicus, Zygosaccharomyces rouxii、 Zygosaccharorayces bai 1 ι Kluyveromyces lactis、 Kluyveromyces marxianus, Hansenula anomala、 Hansenula jadini Brettanomyces larabicus、
Brettanomyces anomalus, Schi zosaccharomyces pombe、 Trichosporon pul lulansおよび Schwann iomyces al luvius等をあけ ^ "ることカ で、きる。
本発明に用いる微生物の培養は、 通常の培養方法に従って行うことができる。 該微生物を培養する培地は、 該微生物が資化し得る炭素源、 窒素源、 無機塩類等 を含有し、 該微生物の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、 合成培地の いずれでもよい。
炭素源としては、 それぞれの微生物が資化し得るものであればよ く、 ダルコ一 ス、 フルク ト一ス、 シュ一クロース、 ラク トース、 マル ト一ス、 マンニ トール、 ソルビトール、 糖蜜、 澱粉あるいは澱粉加水分解物等の炭水化物、 ピルビン酸、 乳酸、 クェン酸、 フマル酸等の各種有機酸、 グルタ ミ ン酸、 メチォニン、 リ ジン 等の各種アミノ酸、 エタノール、 プロパノール、 グリセロール等のアルコール類 が用いられる。 また、 白糠、 キヤッサバ、 バガス、 コーン · スティ一プ ' リカー 等の天然有機栄養源も用いることができる。
窒素源としては、 アンモニア、 塩化アンモニゥム、 硫酸アンモニゥム、 炭酸ァ ンモニゥム、 酢酸アンモニゥム、 リ ン酸アンモニゥム等の各種無機および有機ァ ンモニゥム塩類、 グルタ ミ ン酸、 グルタ ミ ン、 メチォニン等のアミ ノ酸、 ぺプト ン、 NZァミ ン、 コーン · スティープ · リカ一、 肉エキス、 酵母エキス、 麦芽ェキ ス、 カゼイ ン加水分解物、 大豆粕、 大豆粕加水分解物、 フィ ッシュ ミールあるい はその消化物等が用いられる。
無機物としては、 リ ン酸一カ リウム、 リ ン酸二カリ ウム、 リ ン酸一ナ ト リ ウム リ ン酸ニナ ト リ ウム、 リ ン酸マグネシウム、 硫酸マグネシウム、 塩化マグネシゥ ム、 塩化ナ ト リ ウム、 塩化カルシウム、 硫酸第一鉄、 硫酸マンガン、 硫酸銅、 硫 酸亜鉛、 炭酸カルシウム等が用いられる。 ビタ ミ ン、 アミノ酸、 核酸等を必要に 応じて添加してもよレ、。
培養は、 振盪培養または通気攪拌培養等の好気的条件下で行う。 培養温度は 1 5〜 4 5 °Cがよく、 培養時間は、 通常 5〜 9 6時間である。 培養中 p Hは、 3 . 0〜 9 . 0に保持する。 p Hの調整は、 無機あるいは有機の酸、 アルカリ溶液、 尿素、 炭酸カルシウム、 アンモニア等を用いて行う。 また培養中必要に応じてァ ンピシリ ン、 カナマイシンまたはクロラムフエ二コール等の抗生物質を培地に添 力 11してもよレ^
プロモーターとして誘導性のプロモータ一を用いた発現べクターで形質転換し た微生物を培養するときには、 必要に応じてィンデューサ一を培地に添加しても よい。 例えば、 lacプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を 培養すると きにはイ ソプロピル一 ^ 一 D—チォガラク ト ピラノシ ド （ I P T G ) 等を、 trpプロモータ一を用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する ときにはイン ドールアクリル酸 （ I A A ) 等を培地に添加してもよい。
本発明の糖ヌクレオチドの製造において、 2種以上の微生物を用いる場合、 該 微生物それぞれを個別に培養し、 該培養液を利用して糖ヌクレオチドの製造に用 いてもよいし、 一つの培養器に同時に植菌し、 混合培養した後、 該培養液を利用 して糖ヌク レオチドの製造に用いてもよい。 また、 いずれかの微生物の培養中も しくは培養終了時に残りの微生物を植菌し、 培養した後、 該培養液を利用して糖 ヌク レオチ ドの製造に用いてもよい。 更に、 上述 1 ) に記載の性質を有する微生 物と 2 ) に記載の性質を有する微生物とを別々に培養し、 各々の培養液を利用し て糖ヌクレオチドの製造に用いてもよい。
該培養によ り得られた微生物の培養液および該培養液を種々処理した培養液の 処理物を酵素源として用い、 水性媒体中で糖ヌクレオチドの生成に用いることが できる。
培養液の処理物としては、 培養液の濃縮物、 培養液の乾燥物、 培養液を遠心分 離して得られる培養上清、 該培養上清の濃縮物、 培養上清から得られる酵素標品、 培養液を遠心分離して得られる細胞 （菌体を含む） 、 該細胞の乾燥物、 該細胞の 凍結乾燥物、 該細胞の界面活性剤処理物、 該細胞の超音波処理物、 該細胞の機械 的摩砕処理物、 該細胞の溶媒処理物、 該細胞の酵素処理物、 該細胞の蛋白質分画 物、 該細胞の固定化物あるいは該細胞より抽出して得られる酵素標品等を挙げる ことができる。
糖ヌク レオチ ドの生成において用いられる酵素源の量は、 湿菌体として、 1 〜 5 0 0 g Z 1であり、 好ましくは 5〜 3 0 0 g Z 1である。 また、 同時に 2種以 上の微生物を用いて水性媒体中で反応を行う場合には、 水性媒体中の該微生物の 全湿菌体量は 2 〜 5 0 0 g Z lであり、 好ましくは 5〜 4 0 0 £ 1である。 糖ヌクレオチ ドの生成において用いられる水性媒体としては、 水、 リン酸塩、 炭酸塩、 酢酸塩、 ホウ酸塩、 クェン酸塩、 トリス等の緩衝液、 メタノール、 エタ ノール等のアルコール類、 酢酸ェチル等のエステル類、 アセ ト ン等のケ ト ン類、 ァセトアミ ド等のアミ ド類等をあげることができる。 また、 酵素源として用いた 微生物の培養液を水性媒体として用いることができる。
糖ヌクレオチドの生成において用いられるヌクレオチドの前駆物質と しては、 ォロッ ト酸、 ゥラシル、 ォロチジン、 ゥリジン、 シ トシン、 シチジン、 アデニン、 アデノシン、 グァニン、 グアノシン、 ヒポキサンチン、 イノシン、 キサンチン、 キサン トシン、 イノシン一 5 ' ——リン酸、 キサン トシン一 5 ' ——リ ン酸、 グ ァノシン一 5， 一一リ ン酸、 ゥリジン一 5， 一一リ ン酸およびシチジン一 5， 一 ―リン酸等をあげることができ、 好ましくはォロッ ト酸およびグアノシン一 5 ' 一一リン酸をあげることができる。 該ヌクレオチドの前駆物質は、 純品および該 前駆物質の塩並びに夾雑物が反応を阻害しない限り、 微生物により発酵生産され た該前駆物質含有培養液および該培養液の該前駆物質粗精製物を用いることがで きる。 ヌクレオチドの前駆物質は 0 . l m M〜 l . 0 M、 好ましくは 0 . 0 1 〜 0 . 3 Mの濃度で用いられる。
糖ヌク レオチ ドの生成において用いられる糖としては、 グルコース、 フルク ト —ス、 ガラク ト一ス、 グルコサミ ン、 N—ァセチルグルコサミ ン、 N—ァセチル ガラク トサミ ン、 マンノース、 フコース、 N—ァセチルマンノサミ ン、 ァセチル ノィラミ ン酸およびこれらの誘導体等をあげることができる。 該糖は、 純品を用 いてもよいし、 これらを含有するもので、 夾雑物が反応を阻害しないものであれ ばいずれも用いることができる。 糖は、 反応開始時に一括して添加しても いし、 あるいは反応中分割して、 あるいは連続して添加することもでき、 0 . i m lV！〜 2 . 0 Mの濃度で用いられる。
糖ヌク レオチドの生成において、 必要に応じて、 A T P再生に必要なエネルギ 一供与体、 補酵素、 リ ン酸イオン、 マグネシウムイオン、 フィチン酸等のキレー ト剤、 界面活性剤および有機溶剤を添加してもよい。
エネルギー供与体としては、 グルコース、 フルク トース、 シュ一クロース、 ラ ク トース、 マルト一ス、 マンニトール、 ソルビトール等の炭水化物、 ピルビン酸、 乳酸、 酢酸等の有機酸、 グリ シン、 ァラニン、 ァスパラギン酸、 グルタ ミ ン酸等 のアミノ酸、 糖蜜、 澱粉加水分解物等をあげることができ、 1 . 0 m M〜 2 . () Mの濃度で用いられる。
リン酸ィオンとしては、 正リン酸、 ピロリン酸、 トリポリリ ン酸、 テトラポリ リン酸、 ポリリン酸、 メタリン酸、 トリメタリン酸、 リン酸-- -カリウム、 リン酸 二カリウム、 リン酸一ナトリウム、 リン酸ニナトリウム等の無機のリン酸塩等を あげることができ、 1. OmM〜 l . 0 Μの濃度で用いることができる。
マグネシウムイオンとしては、 硫酸マグネシウム、 硝酸マグネシウム、 塩化マ グネシゥム等の無機のマグネシゥム塩、 クェン酸マグネシウム等の有機のマグネ シゥム塩等をあげることができ、 通常 1〜 1 0 OmMの濃度で用いられる。
界面活性剤としては、 ポリオキシエチレン . ォクタデシルァミ ン等の非ィォン 系界面活性剤 （例えばナイミーン S- 215、 日本油脂社製） 、 セチル ト リメチルァ ンモニゥム ■ ブロマイ ドゃアルキルジメチル . ベンジルアンモニゥムクロライ ド 等のカチオン系界面活性剤 （例えばカチオン F2- 40E、 日本油脂社製） 、 ラウロイ ル - ザルコシネ一 ト等のァニォン系界面活性剤、 アルキルジメチルァミ ン等の三 級ァミ ン類 （例えば三級アミン FB、 日本油脂社製） 等、 各種糖ヌク レオチ ドの生 成を促進するものであればいずれでも良く、 1種または数種を混合して使用する こともできる。 界面活性剤は、 通常 0. 1〜 50 g/ 1の濃度で用いられる。 有機溶剤と しては、 キシレン、 トルエン、 脂肪族アルコール、 アセ ト ン、 酢酸 ェチル等が挙げられ、 通常 0. 1〜 50 m 1 / 1の濃度で用いられる。
糖ヌクレオチドの生成反応は、 水性媒体中、 p H 5〜 l 0、 好ましくは p H 6〜 9、 2 0〜 50 の条件で 2〜 96時間行う。
該方法により糖ヌクレオチドを生成することができ、 例えば、 ゥリジン二リン 酸化合物、 グアノシンニリン酸化合物およびシチジン-一リン酸化合物等をあげる ことができる。 具体的には、 UDP— G l c、 UDP— G a l、 UDP-G 1 c NA c、 UDP - G a l NA c、 UDP— G l c UA、 GDP - Ma n、 GDP 一 F u c、 CMP-N e u A cおよびこれらの誘導体から選ばれる糖ヌクレオチ ド等をあげることができる。
水性媒体中に生成した糖ヌクレオチドの定量は公知の方法に じて行うこと力 f でき、 例えば、 UDP— G 1 cと UDP— G a 1の分離定量は Anal. Biochem.， 216, 188 (1994)記載の高速液体クロマトグラフィー （以下、 HP L Cと略す） による方法で行うことができる。 また、 U D P— G 1 c N A c、 G D P— M a n、 GDP— F u c、 CMP- N e uA cの分離^ ¾は以下の条件の H P L Cにより 行うことができる。
溶出液： 0. 1 M KH2P〇4 (H3P04を用いて p H 3. 2に調整） 流速 ： 1 m 1 / m i n
カラム ： Partisi 10 SAX (ヮッ トマン社製）
検出 ： UV 2 6 2 n m
定量 ： スタンダードの吸光度値の比較により算出
反応液中に生成した糖ヌクレオチドの採取は、 活性炭やイオン交換樹脂等を用 いる通常の方法によって行うことができ、 例えば、 UD P— G a 1 および U D P — G 1 cにおいては J. Org. Chem.， 57, 152 (1992)、 U D P— G 1 c NA cに おいては J. Org. Chem. , 57， 146 (1992)に記載の方法に準じて行うことができ
本発明の複合糖質の製造に fflいることのできる微生物あるいは動物細胞あるい は昆虫細胞と しては、 糖ヌクレオチドと複合糖質前駆物質から複合糖質を生産す る能力を有する微生物あるいは動物細胞あるいは昆虫細胞であればいずれも用い ることができる。 例えば、 グルコシルトランスフェラーゼ、 ガラク ト シルト ラン スフエラ一ゼ、 N—ァセチルグルコサミニル トランスフェラ—ゼ、 N—ァセチル ガラク トサミニルトランスフェラーゼ、 グルクロノシル トランスフェラーゼ、 マ ンノシルトランスフェラ—ゼ、 シァリルトランスフェラ一ゼおよびフコシルトラ ンスフェラ一ゼ等の活性を有する微生物あるいは動物細胞あるいは昆虫細胞をあ げることができる。
また、 前述の糖ヌク レオチドの製造の場合と同様に、 遣伝子組換え技術により 造成された微生物あるいは動物細胞あるいは昆虫細胞を利用することもできる。 例えば、 ヒ ト · メラノ一マ細胞 SK- Me卜 28細胞山来のセラミ ドグルコシル トラン スフヱラ一ゼ遣伝子を発現するェシエリ ヒア ' コリ [Pro Natl. Acad. Sci. USA. , 93, 4638 (1996)] 、 1， 3-ガラク トシル トランスフヱラーゼを産生する ヒト ' メラノーマ細胞 WM266 - 4株 （ATCC CRL1676) 、 およびヒ ト ' メラノ一マ細 胞 WM266- 4由来/? 1,3-ガラク トシルトランスフヱラ一ゼ遺伝子を含有するナマル バ細胞 KJM- 1株等の組換え株 （特開平 6-181759) 、 ヒ ト H e 1 a細胞由来の/? 1，4-ガラク トシルトランスフェラーゼ遺伝子を発現するェシェリ ヒア ' コリ
[EMBO j . , 9， όΐίΐ (1990)] あるレ、は Saccharomyces cerevisiae [Biochem. Biophys. Res. Commun. , 201, 160 (1994)] 、 ラッ ト由来の 1,6- N-ァセチルダ ルコサミニルトランスフヱラーゼ遺伝子を発現する CO S— 7細胞 （ATCC CRL1651) [J. Biol. Chem. , 268， 15381 (1993)] 、 ヒ ト由来の Ν-ァセチルガラ ク トサミニルトランスフヱラーゼ遺伝子を発現する S f 9細胞 [J. Biochem. ( 118, 568 (1995)] 、 ヒ ト由来のグルクロノシル トランスフェラーゼを発現する ェシエリ ヒア ' コリ [Biochem. Biophys. Res. Commun. , 196, 473 (1993)] 、 ヒ ト由来の α 1,3-フコシルトランスフェラ一ゼを発現するナマルバ細胞 [J. Biol. Chem.， 269, 14730 (1994)] 、 ヒ ト由来のひ 1.3/1, 4-フコシル トランスフ エラーゼを発現する C◦ S— 1細胞 [Genes Dev.， 4, 1288 (1990)] 、 ヒ ト由来 の α 1,2-フコシルトランスフェラーゼを発現する COS— 1細胞 [Pro Natl. Acad. Sci. USA.， 87， 6674 (1990)] 、 チキン由来の α 2, 6-シァリル トランスフ エラーゼを発現する CO S— 7細胞 [Eur. J. Biochem., 219， 375 (1994)] 、 ヒ ト由来のひ 2， 8 -シァリルトランスフェラ一ゼを発現する CHO細胞 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA. , 91， 7952 (1994)] 、 ナイセリア由来の/? 1， 3- N -ァセチ ルグルコサミニルトランスフエラーゼあるいは β 1,4-ガラク トシルトランスフエ ラ一ゼあるいは/? 1， 3- Ν-ァセチルガラク トサミニルトランスフェラーゼあるいは a 1,4-ガラク トシルトランスフエ ラ一ゼを発現するェシェリ ヒア ' コリ
(W096/10086)、 ナイセリァ由来の fl 2， 3-シァリルトランスフエラ一ゼを発現する ェシエリヒア ' コリ [J, Biol. Chera. , 271, 28271 (1996)] 、 ヘリコバクタ 一 - ピロリ由来の" 1，3-フコシルトランスフェラ一ゼを発現するェシェリヒア - コリ [J. Biol. Chem. , 272， 21349および 21357 (1997)] 、 酵母由来のひ 1, 2- マンノシルトランスフェラ一ゼを発現するェシエリ ヒア ' コリ [J. Org. Chem. , 58, 3985 (1993)] 等の微生物あるいは動物細胞あるいは昆虫細胞をあげること ができる。
本発明の複合糖質の製造に微生物を用いる場合には、 該微生物を、 上記ヌクレ ォチドの前駆物質と糖から糖ヌクレオチドを生産する能力を有する微生物の培養 と同様の培地、 培養条件により培養することができる。
本発明の複合糖質の製造に動物細胞を用いる場合には、 該動物細胞を培養する 培地として、 一般に使用されている R PM 1 1640培地、 E a g l eの MEM 培地またはこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等が用いられる。 培養は、 5 %C02存在下等の条件下で行う。 培養温度は 20〜40でがよ く、 培養時間 は、 通常 3〜 14日間である。 また必要に応じて、 抗生物質を培地に添加しても よレ、。
本発明の複合糖質の製造に昆虫細胞を用いる場合には、 該昆虫細胞の培養を公 知の方法 [J. Biol. Chem. , 268, 12609 (1993) ]に準じて行うことができる。
該培養によ り得られた微生物あるは動物細胞あるいは昆虫細胞の培養液および 該培養液を種々処理した培養液の処理物を酵素源と して用い、 水性媒体中で複合 糖質の生成に用いることができる。 培養液の処理物としては、 培養液の濃縮物、 培養液の乾燥物、 培養液を遠心分離して得られる培養上淸、 該培養上清の濃縮物、 培養上清から得られる酵素標品、 培養液を遠心分離して得られる細胞 （菌体を含 む） 、 該細胞の乾燥物、 該細胞の凍結乾燥物、 該細胞の界面活性剤処理物、 該細 胞の超音波処理物、 該細胞の機械的摩砕処理物、 該細胞の溶媒処理物、 該細胞の 酵素処理物、 該細胞の蛋白質分画物、 該細胞の固定化物あるいは該細胞よ り抽出 して得られる酵素標品等を挙げることができる。
複合糖質の生成において用いられる酵素源の量は、 酵素の活性を、 37でで 1 分間に 1 moleの複合糖質を生成することのできる'活性を 1単位 （U) と して、 0. lmUZ l〜 10000UZ lであり、 好ましくは l mU/ l〜 1 000U / 1の濃度で用いることができる。
複合糖質の生成において用いられる水性媒体としては、 水、 リン酸塩、 炭酸塩、 酢酸塩、 ホウ酸塩、 クェン酸塩、 トリス等の緩衝液、 メ タノール、 エタノール等 のアルコール類、 酢酸ェチル等のエステル類、 アセ ト ン等のケトン類、 ァセトァ ミ ド等のアミ ド類等をあげることができる。 また、 酵素源として用いた微生物、 動物細胞あるいは昆虫細胞の培養液を水性媒体として用いることができる。 複合糖質の生成において、 必要に応じて、 フィチン酸等のキレート剤、 Mn C 12等の無機塩、 /?—メルカプトエタノール等を添加することができる。
複合糖質の生成において用いられる糖ヌクレオチドとしては、 上記糖ヌクレオ チドの生成で得られた反応液あるいは該反応液から精製した糖ヌクレオチドを用 いることができ、 0. 0 1 mM〜 2. 0Mの濃度で用いることができる。
また、 複合糖質の生成反応液中で、 上述の方法により糖ヌク レオチ ドを生成さ せることにより、 糖ヌクレオチドを供給することもできる。
複合糖質の生成において用いられる複合糖質前駆物質としては、 単糖、 オリゴ サッカライ ド、 担体等に結合した単糖およびオリゴサッカライ ド、 蛋白質、 ぺプ チド、 脂質、 糖蛋白質、 糖脂質、 グリコペプチドあるいはステロイ ド化合物等糖 転移酵素の基質となるものであればいかなるものでも用いることができる。 具体的にはグルコース、 ガラク ト一ス、 マンノース、 シアル酸、 N—ァセチル グルコサミ ン、 N—ァセチルガラク トサミ ン、 ラク ト一ス、 N—ァセチルラク ト サミ ン、 ラク ト一N—ビオース、 G l c NA c /? l— 3 G a l /? l— 4 G l c、 G 1 c N A c /? 1-4 G a 1 /? 1-4 G 1 c グロボト リオース、 G a 1 α 1- 4 G a 1 1-4 G 1 c N A c、 2' -フコシルラク ト一ス、 3-フコシルラク ト一ス、 3，-シァリ ルラク トース、 6，-シァリルラク トース、 3'-シァリル一 N—ァセチルラク トサミ ン、 6，-シァリル一 N—ァセチルラク トサミ ン、 シァリルラク トー N—ビオース、 ルイス X、 ルイス a、 ラク トー N—テ トラオース、 ラク ト一 N—ネオテ トラオ一 ス、 ラク トジフコテ トラオース、 3，-シァリル -3 -フコシルラク トース、 シァリル ルイス X、 シァリルルイス a、 ラク トー N—フコペン夕オース I、 ラク トー N— フコペン夕オース Π、 ラク トー Ν—フコペン夕オース ΙΠ、 ラク トー Ν—フコペン 夕オース V、 LS-テ トラサッカライ ド a、 LS-テ トラサッカライ ド b、 LS-テ トラ サッカライ ド c、 ( a 2 , 3) シァリルラク トー N—ネオテ トラオースおよびこ れらの誘導体、 セリ ン、 スレオニン、 ァスパラギンおよび該アミノ酸を含有する ペプチドおよびその誘導体、 セラミ ドおよびその誘導体等を例示することができ る。 該複合糖質前駆物質は 0. 0 1 mM〜 2. 0Mの濃度で用いることができる c 本発明の複合糖質としては、 グルコース、 ガラク ト一ス、 N—ァセチルグルコ サミ ン、 N—ァセチルガラク トサミ ン、 グルクロン酸、 マンノース、 N—ァセチ ルマンノサミ ン、 フコース、 シアル酸、 ラク トース、 N—ァセチルラク トサミ ン、 ラク ト一 N—ビオース、 G l c NA c /? l— 3 G a 1 /9 1—4 G l c、 G l c NA c /? 1一 4 G a 1 1一 4 G 1 c、 グロボトリオース、 G a 1 ひ 1一 4 G a 1 /? 1 - 4 G 1 c N A c、 2，_フコシルラク トース、 3-フコシルラク ト一ス、 3'-シァリルルラク トース、 6'-シァリルルラク ト—ス、 3'-シァリル一 N—ァセチルラク トサミ ン、 6'—シァリル一N—ァセチルラク トサミ ン、 シァリルラク トー N—ピオ一ス、 ル イス X、 ルイス a、 ラク ト一 N—テ トラオース、 ラク ト _N—ネオテ トラオース, ラク トジフコテ トラオース、 3'-シァリル 3-フコシルラク ト—ス、 シァリルルイ ス X、 シァリルルイス a、 ラク ト _N—フコペンタオース I、 ラク ト一 N—フコ ペンタオース Π、 ラク ト一 Ν—フコペン夕オース ΙΠ、 ラク トー Ν—フコペンタォ 一ス V、 LS-テ トラサッカライ ド a、 LS-テ トラサッカライ ド b、 LS-テ トラサッ カライ ド c、 （ ひ 2， 3) シァリルラク ト一 N—ネオテ トラオース、 ラク トー N 一ジフコへキサオース I、 ラク ト一N—ジフコへキサオース Π、 ラク ト一N—へ キサオース、 ラク ト一N—ネオへキサオース、 ジシァリ ルラク ト一N—テ トラオ ースおよびこれらの誘導体から選ばれる糖を 1あるいはそれ以上含有する複合糖 質または該複合糖質を含む複合糖質をあげることができ、 例えば、 G a 1 /3 1- 3 G l c、 G a 1 ? 1-4 G 1 c , G a l /? 1 - 3 G l c NA c、 G a 1 /3 1-4 G 1 c NA c、 G a 1 /? 1-3 G a U G a l 1-4 G a l、 G a l /3 1- 3 G a l NA c , G a l /31-4 G a l NA c , G a l " l- 3 G l c、 G a l " - 4 G l c、 G a l a 1-3 G l c NA c, G a l « 1-4 G l c NA c , G a l a 1-3 G a l、 G a l « 1- 4 G a l、 G 1 « 1-3 G a 1 N A c , G a l a l- 4 G a l NA c、 G 1 c N A c /? 1-3 G a G l c NA c /9 1- 4 G a l、 G 1 c N A c ^ 1-6 G a U G l c NA c /? l— 3 G l c、 G l c NA c /? l— 4 G l c、 G 1 c N A c 91-3 G l c NA c、 G l c NA c /3 1- 4 G l c NA c、 G l c NA c /3 1-6 G a l NA c , G l c NA c ? l— 2Ma n、 G l c NA c i— 4Ma n、 G 1 c N A c /? 1-
6Ma n、 G a 1 N A c /? 1-3 G a U G a l NA c /3 1— 4 G a l、 G a 1 N A c /3 1-4 G 1 c NA c、 G a 1 A c a 1-3 G a l NA c、 M a n 31-4 G 1 c
NA c , Ma n o 1-6 Ma n, M a n « 1-3 M a n , M a n a 1-2 M a n , G 1 c U A ^ 1-4 G 1 c N、 G 1 c U A ^ 1-3 G a し G 1 c U A /? 1-3 G 1 c N A c、 G l c UA/? l-3 G a I NA c , N e u A c o 2-3 G a N e u A c « 2-
6 G a N e uA c « 2 - 3 G l c NA c、 N e u A c a 2-6 G l c NA c , N e uA c ひ 2 - 3 G a l NA c、 N e uA c a 2-6 G a I NA c , N e u A c « 2-
8 N e u A c、 F u c ひ 1— 3 G I c、 F u c ひ 1一 4 G l c、 F u c ひ 1— 3 G l c
N A c、 F u c a l-4 G l c NA c , F u c α 2 G a 1および F u c α 1- 6 G 1 c NA cから選ばれる結合を有する糖を含む複合糖質または該複合糖質を含む 複合糖質をあげることができる。 また、 該糖を有する複合糖質に含まれる糖の数 としては、 1 0個以下あるいは 6個以下のものをあげることができる。
具体的な複合糖質製造法としては、
( 1 ) ナイセリア由来の/? 1，4 -ガラク トシルトランスフェラ一ゼ （W096/10086) を発現する微生物、 UT Pの前駆物質から UT Pを生産する能力を有する微生物、 糖と UTPから UD P— G a 1 を生産する能力を有する微生物の培養液または該 培養液の処理物とを酵素源とした酵素反応を行うことにより、 ォロッ ト酸とガラ ク トースとグルコースからラク ト一スを生成させることができる。
( 2 ) ナイセリァ由来の 1,4-ガラク トシルトランスフェラ一ゼ （W096/10086) を発現する微生物、 U T Pの前駆物質から U T Pを生産する能力を有する微生物、 糖と UTPから UD P— G a 1 を生産する能力を有する微生物の培養液または該 培養液の処理物とを酵素源と した酵素反応を行うことにより、 ォロッ ト酸とガラ ク ト一スと N—ァセチルグルコサミンから N—ァセチルラク トサミ ンを生成させ ることができる。 ( 3 ) ナイセリァ由来の α 2,3-シァリルトランスフェラーゼ [J. Biol. Chem. , 271, 28271 (1996)] を発現する微生物、 C Τ Ρの前駆物質から C Τ Ρを生産す る能力を有する微生物、 糖と CTPから CMP— N e uA cを生産する能力を有 する微生物の培養液または該培養液の処理物とを酵素源とした酵素反応を行うこ とによ り、 ォロッ ト酸と N—ァセチルマンノサミ ンと ピルビン酸とラク トースカ ら 3，-シァリルラク トースを生成させることができる。
(4) ナイセリア由来の α 2,3-シァリルトランスフェラーゼ [J. Biol. Chem. , 271, 28271 (1996)] を発現する微生物、 C Τ Ρの前駆物質から C Τ Ρを生産す る能力を有する微生物、 糖と CTPから CMP— N e u A cを生産する能力を有 する微生物の培養液または該培養液の処理物とを酵素源とした酵素反応を行うこ とによ り、 ォロッ ト酸と N—ァセチルマンノサミ ンとピルビン酸と N—ァセチル ラク トサミ ンから 3'-シァリル一N—ァセチルラク トサミ ンを生成させること力；' できる。
( 5 ) チキン由来のひ 2,6-シァリルトランスフエラ一ゼを発現する C 0 S— 7細 胞 [Eur. J. Biochem. , 219. 375 (1994)] 、 C Τ Ρの前駆物質から C Τ Ρを生 産する能力を有する微生物、 糖と CTPから CMP— N e u A cを生産する能力 を有する微生物の培養液または該培養液の処理物とを酵素源とした酵素反応を行 う ことによ り、 ォロッ ト酸と N—ァセチルマンノサミ ンとピルビン酸と N—ァセ チルラク トサミ ンから 6'-シァリル一N—ァセチルラク トサミ ンを生成させるこ とができる。
(6) ナイセリァ由来の β 1，3-Ν—ァセチルグルコサミニル トランスフェラーゼ (W096/10086) を発現する微生物、 UTPの前駆物質から UT Pを生産する能力 を有する微生物、 糖と UTPから UDP— G l c NA cを生産する能力を有する 微生物の培養液または該培養液の処理物とを酵素源とした酵素反応を行うことに よ り、 ォロッ ト酸と N—ァセチルダルコサミ ンとラク トースから G l c N A c ^ 1-3 G a 1 β 1-4 G 1 cを生成させることができる。
( 7 ) β 1,3-ガラク ト シルトランスフエラーゼを産生するヒ ト ' メラノーマ細胞 WM266 - 4株 （ATCC CRL1676) 、 あるレ、はヒ ト · メラノ一マ細胞 WM266-4由来/? 1， 3-ガラク トシルトランスフヱラ一ゼ遺伝子を発現するナマルバ細胞 KJM-1株等 の組換え株 （特開平 6-181759) 、 UTPの前駆物質から UT Pを生産する能力 を有する微生物、 糖と UT Pから UDP— G a 1 を生産する能力を有する微生物 の培養液または該培養液の処理物とを酵素源とした酵素反応を行うことにより、 ォロッ ト酸とガラク トースと G l c N A c /? 1-3 G a 1 /? 1-4 G 1 cからラク ト _N—テトラオ一スを生成させることができる。
(8) ヒ ト H e 1 a細胞由来の/? 1,4 -ガラク トシル トランスフヱラーゼ遺伝子を 発現するェシエリヒア ' コリ [EMB0 J., 9， 3171 (1990) ]あるいは Saccharomyces cerevisiae [Biochem. Biophys. Res. Commun. , 201. 160 (1994)] 、 UTPの 前駆物質から UT Pを生産する能力を有する微生物、 糖と UTPから UDP— G a 1 を生産する能力を有する微生物の培養液または該培養液の処理物とを酵素源 とした酵素反応を行うことにより、 ォロッ ト酸とガラク トースと G i c NA c /? 1-3 G a 1 /? 1-4 G 1 cからラク トー N—ネオテトラオースを生成させるこヒが できる。
(9) ナイセリア由来の^ 1,4」ガラク トシルトランスフヱラ一ゼ （W096/10086) を発現する微生物、 U T Pの前駆物質から U T Pを生産する能力を有する微生物、 糖と UTPから UDP— G a 1 を生産する能力を有する微生物の培養液または該 培養液の処理物とを酵素源とした酵素反応を行うことにより、 ォロッ ト酸とガラ ク トースと G 1 c N A c /? 1-3 G a 1 β 1-4 G 1 cからラク トー N—ネオテトラ オースを生成させることができる。
( 1 0) ナイセリァ由来の β 1,3- Ν—ァセチルグルコサミニルトランスフェラ一 ゼ （W096/10086) を発現する微生物、 ナイセリア由来の 1,4-ガラク トシルトラ ンスフヱラーゼ （W096/10086) を発現する微生物、 UT Ρの前駆物質から UT Ρ を生産する能力を有する微生物、 糖と UTPから UDP— G 1 c NA cを生産す る能力を有する微生物、 糖と UT Pから UDP— G a 1 を生産する能力を有する 微生物の培養液または該培養液の処理物とを酵素源とした酵素反応を行うことに よ り、 ォロッ ト酸と N—ァセチルグルコサミ ンとガラク ト一スとラク トースから ラク トー N—ネオテトラオ一スを生成させることができる。
( 1 1 ) ナイセリァ由来のひ 2， 3-シァリル トランスフェラ一ゼ [J. Biol. Chem. , 271, 28271 (1996)] を発現する微生物、 C Τ Ρの前駆物質から C Τ Ρを生産す る能力を有する微生物、 糖と CTPから CMP— N e u A cを生産する能力を有 する微生物の培養液または該培養液の処理物とを酵素源とした酵素反応を行うこ とによ り、 ォロッ ト酸と N—ァセチルマンノサミ ンとピルビン酸とラク トー N— ネオテ トラオースから （ ひ 2， 3) シァリ ルラク トー N—ネオテ トラオースを生 成させることができる。
( 1 2) ヒ ト由来の a 1,3-フコシルトランスフエラーゼを発現するナマルバ細胞 [J. Biol. Chem. , 269. 14730 (1994)] 、 G Τ Ρの前駆物質から G Τ Ρを生産 する能力を有する微生物、 糖と GTPから GDP— F u cを生産する能力を有す る微生物の培養液または該培養液の処理物とを酵素源とした酵素反応を行うこと により、 GMPとマンノースとラク トー N—ネオテ トラオースからラク ト一 N— フコペンタオース IIIを生成させることができる。
(1 3 ) へリ コパクター ■ ピロリ由来の a 1,3 -フコシルトランスフェラーゼ [J. Biol. Chem. , 272, 21349および 21357 (1997)] を発現する微生物、 GTPの前 駆物質から G Τ Ρを生産する能力を有する微生物、 糖と GT Pから GDP— F u cを生産する能力を有する微生物の培養液または該培養液の処理物とを酵素源と した酵素反応を行うことにより、 GMPとマンノースとラク トー N—ネオテトラ オースからラク トー N—フコペンタオース ΠΙを生成させることができる。
( 1 4 ) ナイセリァ由来のひ 1,4 -ガラク トシルトランスフェラーゼ
(W096/10086) を発現する微生物、 UTPの前駆物質から UTPを生産する能力 を有する微生物、 糖と UTPから UDP— G a 1 を生産する能力を有する微生物 の培養液または該培養液の処理物とを酵素源とした酵素反応を行うことにより、 ォロッ ト酸とガラク ト一スとラク トースからグロボト リオースを生成させること ができる。 ( 1 5) ナイセリァ由来の β 1,4-ガラク トシルトランスフエラ一ゼ (W096/10086) を発現する微生物、 ナイセリア由来のひ 1，4-ガラク トシルトラン スフヱラーゼ （W0%/10086) を発現する微生物、 UT Pの前駆物質から UT Pを 生産する能力を有する微生物、 糖と UTPから UDP— G a 1 を生産する能力を 有する微生物の培養液または該培養液の処理物とを酵素源とした酵素反応を行う ことにより、 ォロッ ト酸とガラク ト一スとグルコースからグロボトリオースを生 成させることができる。
( 1 6) ナイセリァ由来の。 1,4-ガラク トシル トランスフェラ一ゼ
(W096/10086) を発現する微生物、 UTPの前駆物質から UT Pを生産する能力 を有する微生物、 糖と UTPから UDP— G a 1 を生産する能力を有する微生物 の培養液または該培養液の処理物とを酵素源とした酵素反応を行うことによ り、 ォロッ ト酸とガラク トースと N—ァセチルラク トサミ ンから G a 1 a 1-4 G a 1 /9 1-4 G 1 c N A cを生成させることができる。
( 1 7) ヒ ト由来の β 1，3-ガラク トシルトランスフヱラーゼ （特開平 6 - 181759) を発現する動物細胞、 UTPの前駆物質から UT Pを生産する能力を有 する微生物、 糖と UT Pから UDP— G a 1 を生産する能力を有する微生物の培 養液または該培養液の処理物とを酵素源とした酵素反応を行うことによ り、 ォロ ッ ト酸とガラク トースと N—ァセチルグルコサミ ンからラク トー N—ビオースを 生成させることができる。
( 1 8) ナイセリァ由来の α 2，3-シァリルトランスフエラーゼ [J. Biol. Chem.， 271, 28271 (1996)] を発現する微生物、 C T Pの前駆物質から C T Pを生産す る能力を有する微生物、 糖と CT Pから CMP— N e u A cを生産する能力を有 する微生物の培養液または該培養液の処理物とを酵素源と した酵素反応を行うこ とにより、 ォロッ ト酸と N—ァセチルマンノサミ ンと ピルビン酸とラク トー N— ビオースからシァリルラク トー N—ピオ一スを生成させることができる。
( 1 9) ヒ ト由来の。 1,3-フコシルトランスフェラーゼ [J. Biol. Chem.， 269, 14730 (1994)] を発現する動物細胞、 G T Pの前駆物質から G T Pを生産する能 力を有する微生物、 糖と GT Pから GD P— F u cを生産する能力を有する微生 物の培養液または該培養液の処理物とを酵素源とした酵素反応を行うことにより、 GMPとマンノースと 3' -シァリル N—ァセチルラク トサミ ンからシァリルルイ ス Xを生成させることができる。
(2 0) ヒ ト由来の" 1,3/1， 4-フコシルトランスフェラーゼ [Carbohydrate Research, 190, 1 (1989)] 、 G T Pの前駆物質から G T Pを生産する能力を有す る微生物、 糖と GT Pから GDP— F u cを生産する能力を有する微生物の培養 液または該培養液の処理物とを酵素源とした酵素反応を行うことによ り、 GMP とマンノースとシァリルラク トー N—ビオースからシァリルルイス aを生成させ ることができる。
(2 1 ) 酵母由来の α 1， 2 -マンノシルトランスフエラ一ゼを発現するェシェリ ヒア ' コリ [J. Org. Chem. , 58， 3985 (1993)] 、 GT Pの前駆物質から GT Pを生産する能力を有する微生物、 糖と GT Pから GDP— Ma nを生産する能 力を有する微生物の培養液または該培養液の処理物とを酵素源とした酵素反応を 行うことによ り、 GMPとマンノースから M a n a 1-2 M a nを生成させること ができる。
等をあげることができる。
複合糖質の製造法は、 上記に記載された例に限定されるものではなく、 本特許 に記載された糖ヌクレオチド製造法と組み合わせることができる糖転移酵素、お よび該酵素が許容する基質特異性の範囲において、 どのような糖鎖でも、 ヌクレ ォチドの前駆物質、 糖、 複合糖質前駆物質のみを原料として工業的に製造するこ とが可能である。
本発明の製造方法により製造される複合糖質として、 例えば、
( 1 ) 病原性微生物やウィルスの感染に関与する複合糖質類、例えば、 病原性微 生物やウイルスの受容体として認識される複合糖質類、
(2 ) 病原性微生物やウイルスが生産する毒素の受容体として認識される複合糖 質類、 (3) 生体内で、 細胞接着、異物の認識、各種リ ンフォカインの結合等に関与する 複合糖質類、
等の、 グルコース、 ガラク ト一ス、 N—ァセチルグルコサミ ン、 N—ァセチルガ ラク トサミ ン、 グルクロン酸、 マンノース、 N—ァセチルマンノサミ ン、 フコー ス、 シアル酸等の糖を、単独あるいは複数、 化学的に許容される結合形式で含有 する複合糖質をあげることができ、 より具体的には、
( 1 ) ヒ トゃ動物のミルク中に含有される乳幼児の微生物感染防御に関与する複 合糖質類、 例えば、 ラク ト一 N—テトラオース、 ラク ト一 N—ネオテトラオース 等の複合糖質、
(2) Escherichia coli、 Propionibacterium granulosium^ Mycobacterium tuberculosis, Moraxel la catarahl i s> Candida
Figure imgf000039_0001
Staphylococcus saprophyticus, Streptococcus pneumoniae^ Streptococcus agalact iae^ Pseudomonas aeruginosa^ Actinomyces naeslundi ι Neisseria gonorrhoeae、 Helicobacter pylori、 Haemophilus influenzae等の微生物を認識する受容体複 合糖質、
(3) イ ンフルエンザウイルス、コロナウィルス、センダイウィルス、 ニューカツ スル病ウィ ルス、 レオウィ ルス、 ロタウ ィルス、 エイズウイ ルス、 等のウ ィ ルス の受容体複合糖質、
(4) クリプトスポリジゥム、 トリパノゾーマなどの原虫の受容体複合糖質
(5) コレラ毒素、 大腸菌易熱性毒素、 ボツリヌス毒素、 クロス ト リジゥム S毒 素、 クロストリジゥム A毒素、 志賀毒素、ベロ毒素、 志賀毒素様毒素、 腸炎ビブ リオ耐熱性毒素、 破傷風毒素、 等の毒素が結合する受容体複合糖質、
(6) GD 3， GM 3等のガングリオシドゃグロボ系糖脂質等の、 ガン関連複合 糖質、
( 7 ) シァリルルイス X糖鎖等の、 白血球の炎症部位への接着や機能修飾に関- - する複合糖質類、
( 8 ) 慢性関節リュウマチや IgA腎症等の自己免疫疾患に関^する複合糖質類、 (9) 異物認識やガン細胞の認識に関与する各種のレクチン様物質が認識する複 合糖質類等をあげることができる。
水性媒体中に生成した複合糖質の定量は公知の方法に準じて行うことができる。
[Pro atl. Acad. Sci. USA. , 85, 3289 (1988)、 Anal. Biochem. , 174， 459 (1988)] o
反応液中に生成した複合糖質の採取は、 活性炭やイオン交換樹脂等を用いる通常 の方法によって行うことができ、 例えば、 N—ァセチルラク トサミ ンにおいては J. Org. Chem. , 47. 5416 (1982)記載の方法に準じて行うことができる。
以下に本発明の实施例を示すが、 本発明はこれら実施例に限定されるものではな レ、。
以下に本発明の実施例を示す。 発明を実施するための最良の形態
実施例 1. g a l U、 p p aを発現する組換え体プラスミ ドの造成
g a 1 U、 p p aを発現する組換え体プラスミ ド p NT 1 2の造成方法につい て以下に述べる （図 1、 図 2 ) 。
1 ) P ,プロモーターを含む発現ベクターの造成
PLプロモータ一を含む発現べクターである p P A 3 1および p P AC 3 1は 以下に示す方法で造成した （図 1 ) 。
トリブトファ ンプロモータ一を含むプラスミ ド p T r S 3 0を保有するェシェ リヒア ' コリ JM109/pTrS30 (FERM BP- 5407) および PLプ 口モータ—を含むブラ スミ ド p PA l (特開昭 63- 233798) 、 P Lプロモータ一および c I 8 5 7リプレ ッサ一を含むプラスミ ド p P AC 1 (FERM BP- 6054) を保有するェシエリヒア ' コリを、 それぞれ L B培地 [バク ト トリプトン （ディフコ社製） 1 0 g / 1、 酵 母エキス （ディフコ社製） 5 g/ l 、 N a C 1 5 g/ l 、 p Hを 7. 2 ] に植 菌し、 3 0でで 1 8時間培養した。
該培養により得られた菌体から前述の公知の方法により、 p T r S 3 0、 p P A 1および p P AC 1プラスミ ド DN Aを単離精製した。
精製した p T r S 3 0 DNA 0. 2 gを制限酵素 P s t Iおよび C 1 a I で切断後、 ァガロースゲル電気泳動により DN A断片を分離し、 ジーンクリーン Πキッ ト （B i 0 1 0 1社製） により 3. 4 k bの断片を回収した。 精製した p P A 1 DNA 0. 5 gを制限酵素 P s t Iおよび C 1 a I で切断後、 ァガロ ースゲル電気泳動により DNA断片を分離し、 同様に 1. O k bの断片を回収し た。
該 3. 4 k bの断片および 1. 0 k bの断片をライゲ一シヨンキッ ト （TAKARA ligation Kit, 宝酒造社製） を用いて、 1 6でで 1 6時間、 連結反応を行った。 該連結反応液を用いてェシエリヒア ' コリ NM522株を前述の公知の方法に従つ て形質転換し、 該形質転換体をアンピシリン 5 0 gZm 1 を含む L B寒天培地 に塗布後、 3 7でで一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーより前述の公知の方法に従ってプラスミ ド を抽出し、 P プロモーターによる発現べクターである p P A 3 1 を得た。 該プ ラスミ ドの構造を制限酵素消化によ り確認した （第 1図） 。
精製した p P A 3 1 DNA 0. 2 μ 制限酵素 P s t Iおよび C 1 _a Iで 切断後、 ァガロースゲル電気泳動により DN A断片を分離し、 ジーンクリーン Π キッ トにより 3. 4 k bの断片を回収した。 精製した p P A C 1 DNA 0. 5 μ gを制限酵素 P s t Iおよび C 1 a Iで切断後、 ァガロースゲル電気泳動によ り DNA断片を分離し、 同様に 2. 3 k bの断片を回収した。
該 3. 4 k bの断片および 2. 3 k bの断片をライゲ一シヨンキッ トを用いて、 1 6でで 1 6時間連結反応を行った。
該連結反応液を用いてェシヱリヒア ' コリ NM522株を前述の公知の方法に従つ て形質転換し、 該形質転換体をアンピシリン 5 0 g/m 1 を含む L B寒天培地 に塗布後、 3 7 °Cで一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーより前述の公知の方法に従ってブラスミ ド を抽出し、 c I 8 5 7リブレッサーを含む P,プロモータ一による発現べクター である p P AC 3 1 を取得した。 該プラスミ ドの構造を制限酵素消化により確認 した （第 1図） 。
2 ) g a 1 U発現プラスミ ドの造成
ェシヱリヒア · コリ W3110株の染色体 DN Aを公知の方法 [例えば Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons Inc. (1994)] により単 離精製した。
配列番号 1記載のセンス鎖 DN Aプライマ一と、 配列番号 2記載のアンチセン ス鎖 DN Aプライマーをアプライ ド ·バイオシステムズ （Applied Biosystems) 社製 3 8 0 A · DNA合成機を用いて合成した。
該合成 DN Aをプライマーとして、 W3110株の染色体 DN Aを铸型として P C Rを行った。 P C Rは W3110染色体 DNA 0. 0 4 ^ g , プライマー各 0. 5 μ Μ、 T A KAR A E x T a q (宝酒造社製） 1 . 0 u n i t、 1 0 X E x T a q緩衝液 （宝酒造社製） 4 1 、 deoxy N T P各 2 0 0 Mを含む反応液 4 O 1 を用い、 9 4 一 1分、 4 2で一 2分、 7 2で一 3分の工程を 3 0回繰り 返すことにより行った。
該反応液の 1ノ 1 0量をァガロースゲル電気泳動にかけ、 Π的の断片が増幅さ れていることを確認後、 残りの反応液と等量の T E ( 1 O mM ト リス塩酸緩衝 液 （ p H 8. 0 ) 、 1 mM E D T A〕 飽和フエノール/クロロホ ルム （ 1 v o 1 / 1 v o 1 ) を添加し、 混合した。 該混合液を遠心分離後、 得られた上層に 2 倍容量の冷エタノールを加えて混合し、 — 8 0でに 3 0分放置した。 該放置液を 遠心分離し DN Aの沈殿を得た。 該沈殿を 7 0 %冷エタノールで洗浄し、 真空乾 燥して沈殿を得た。 以後、 T E飽和フヱノール Zクロ口ホルムを添加し、 ェ夕ノ —ルで洗浄した DN Aの沈殿を得るまでの操作をエタノール沈殿法と呼ぶ。 該 DNAの沈殿を 2 0 1 の T Eに溶解した。 該溶解液 5 1 を用い、 DNA を制限酵素 H i n d ΙΠおよび B a mH Iで切断し、 ァガロースゲル電気泳動によ り DN A断片を分離した後、 ジーンクリーン Πキッ トによ り 0. 9 k bの断片を 回収した。 実施例 1 — 1 ) で取得した p P A 3 1 DNA 0. 2 μ gを制限酵素 H i n d ΙΠおよび B a mH Iで切断後、 ァガロースゲル電気泳動により DN A断 片を分離し、 同様に 4. 2 k bの断片を回収した。
該 0. 9 k bの断片および 4. 2 k bの断片をライゲーシヨ ンキッ トを用いて 1 6 で 1 6時間、 連結反応を行った。
該連結反応液を用いてェシェリヒア ' コリ KY8415株を前述の公知の方法に従 つて形質転換し、 該形質転換体をアンピシリン 50 gZm 1 を含む LB寒天培 地に塗布後、 3 0 で一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーより前述の公知の方法に従ってプラスミ ド を抽出し、 g a 1 U発現プラスミ ドである p NT 9を得た。 該プラスミ ドの構造 を制限酵素消化によ り確認した （第 2図） 。
3) g a 1 U, p p a同時発現プラスミ ドの造成
配列番号 3記載のセンス鎖 DNAプライマーと、 配列番号 4記載のアンチセン ス鎖 DN Aプライマ一を合成し、 該合成 DN Aをプライマーとして、 W3110株の 染色体 DN Aを銬型として前述と同一の条件で P C Rを行った。
PCR終了後、 エタノール沈殿法により、 DN Aの沈殿を取得した。 該沈殿を 20 ^ 1の TEに溶解した。 該溶解液 5 1 を用い、 DNAを制限酵素 B a mH Iおよび S a」 Iで切断し、 ァガロースゲル電気泳動により DNA断片を分離し た後、 ジーンクリーン Πキッ トにより 1. 0 k bの断片を回収した。 実施例 1― 2 ) で取得した pNT 9 DN A 0. 2 gを制限酵素 B a m H Iおよび S a 1
Iで切断後、 ァガロースゲル電気泳動によ り D N A断片を分離し、 同様に 4. 9 k bの断片を回収した。
該 1. O k bの断片および 4. 9 k bの断片をライゲ一シヨ ンキッ トを用いて 1 6 で 1 6時間、 連結反応を行った。
該連結反応液を用いてェシエリヒア · コリ KY8415株を前述の公知の方法に従 つて形質転換し、 該形質転換体をアンピシリ ン 50 gZm 1 を含む L B寒天培 地に塗布後、 30 で一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーよ り前述の公知の方法に従ってプラスミ ド を抽出し、 g a 1 U， p p a同時発現プラスミ ドである p NT 1 2を得た。 該プ ラスミ ドの構造を制限酵素消化により確認した （第 2図） 。
該 p NT 1 2 DNA 0. 5 gを制限酵素 E c o R Iお よび S a 1 Iで切 断後、 ァガロースゲル電気泳動により D N A断片を分離しジーンクリーン Πキッ トにより 2. 2 k bの断片を回収した。 一方、 p S TV 2 8 DN A (宝酒造社 製） 0. 2 μ を制限酵素 E c 0 R Iおよび S a 1 Iで切断後、 ァガロースゲル 電気泳動によ り DN A断片を分離し、 同様に 3. O k bの断片を回収した。
該 2. 2 k bの断片および 3. 0 k bの断片をライゲ一シヨ ンキッ トを用いて 1 6 で 1 6時間連結反応を行った。 該連結反応液を用いてェシエリヒア · コリ 蘭 522株を常法に従つて形質転換し、 該形質転換体をク口ラムフ ニコ—ル 10 g/m 1 を含む L B寒天培地に塗布後、 3 Ot:でー晚培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーより常法に従ってプラスミ ドを抽出し、 g a 1 U, p p a遺伝子発現プラスミ ドである p NT 3 2を得た。 該プラスミ ドの 構造を制限酵素消化により確認した （図 2 ) 。 実施例 2. U D P - G 1 cの生産
実施例 1 で得たェシエリ ヒア ' コリ KY8415/pNT12株を、 アンピシリ ン 5 0 g/m 1 を含む L B培地 1 2 5 m 1 の入った 1 L容バッフル付き三角フラスコに 接種し、 3 0°Cで 2 2 0 r p mの条件で 1 7時間培養した。 該培養液 1 2 5 m l をグルコース 1 0 g Z 1 、 ノくク ト ト リプト ン （ディ フコ社製） 1 2 g Z 1 、 酵母 エキス （ディフコ社製） 2 4 g 、 KH2 P 04 2. 3 g/ 1 (別殺菌） 、 K2 Η Ρ 04 1 2. 5 g/ 1 (別殺菌） 、 アンピシリ ン 5 0〃 g Zm 1 の組成から なる液体培地 （p H無調整） 2. 5 Lの入った 5 L容培養槽に接種し、 3 0 °Cで 4時間、 更に、 4 0でで 3時間、 6 0 0 r p m、 通気量 2. 5 LZ分の条件で培 養 y行った。
該培養中、 2 8 %アンモニア水を fflいて、 培養液の p Hを 7. 0に維持した。 また、 培養途中で必要に応じてグルコースを添加した。 該培養液を遠心分離し、 湿菌体を取得した。 該湿菌体は必要に応じて一 20 "Cで保存することが可能で、 使用前に解凍して用いることができる。
コリネバクテリウム · アンモニアゲネス ATCC21170株を、 グルコース 50 g / 1、 ポリぺプトン （日本製薬社製） 10 gZ 1、 酵母エキス （オリエンタル酵 母社製） 10 g/ l、 尿素 5 gZ l、 (NH4)2S 04 5 g/ KH2P04 1 gZ l、 K2HP04 3 gZ l、 Mg SO 7Η20 l g/ U C aC l 2 - 2 H20 0. 1 / U F e S 04 · 7 H20 10 m g / Z n S 04 · 7 H20 1 0mgZ l、 Mn SO4 ' 4〜6H2〇 20 m g / 1 , L—システィ ン 20m / U D—パン トテン酸カルシウム 10mg/ 、 ビタ ミ ン B 1 5 m g/ 1 , ニコチン酸 5mgZ l 、 およびピオチン ( I ON Na OHで p H 7. 2に調整） の組成からなる液体培地 20 m 1の入った 300 m 1容バッフ ル付き三角フラスコに接種し、 28でで 220 r p mの条件で、 24時間培養し た。
該培養液 20 m 1を上記と同一組成の液体培地 250 m 1の入った 2 L容バッ フル付き三角フラスコに接種し、 28 °Cで 220 r p mの条件で、 24時間培養 した。 得られた培養液を種培養液と して用いた。
該種培養液 250 m 1を、 グルコース 1 50 1、 肉エキス （極東製薬社 製） 5 g/ l、 KH2P04 1 O g/ 1 , K2HP04 1 0 g/ 1 、 Mg S〇 4 · 7Η20 1 0 g/ C a C 12 · 2 H20 0. l g/ l、 F e S 04 · 7 H2 0 20 m g/ 1 , Z n S 04 · 7 H20 l OmgZ L Mn SC^ ' Si^O 2 Omg/ 1 (別殺菌） 、 β -了ラニン 1 5mg/ l (別殺菌） 、 L—システ イン 20mg 、 ピオチン 1 00/i g/ l、 尿素 2 gZし およびビタ ミ ン B 1 5 m g/ 1 (別殺菌） （l ON NaOHで pH7. 2に調整） の組成か らなる液体培地 2. 25 Lの入った 5 L容培養槽に接種し、 3213で600 m、 通気量 2. 5 L/m i nの条件で 24時間培養を行った。 培養中、 28%ァ ンモニァ水を用いて、 培養液の PHを 6. 8に維持した。
該培養液を遠心分離し、 湿菌体を取得した。 該湿菌体は必要に応じて一 2 or で保存することが可能で、 使用前に解凍して用いることができる。
ェシエリヒア ' コリ KY8415/pNT12株湿菌体 4 0 g / 1 、 コリネバクテリウ ム - アンモニアゲネス ATCC21170株湿菌体 1 5 0 g/し グルコ —ス 1 0 0 %/ 1 , KH2 P 04 2 0 g/ U M g S 04 · 7 H20 5 g/ U フィチン酸 5 g/ ォロッ ト酸 （カリ ゥム塩） 2 1. 2 g/ l 、 ナイ ミーン S— 2 1 5 4 g/ U キシレン l O m l Z l の組成からなる反応液 3 O m l を 2 0 0 m l 容ビ一力一に入れ、 該反応液をマグネティ ック · スターラーにて攪拌 （9 0 0 r p m) し、 3 2でで 2 1時間反応を行った。
反応中、 4 N N a OHを用いて、 該反応液の p Hを 7. 2に維持し、 必要に 応じてグルコース、 KH2 P 04を添加した。
該反応により、 反応液中に 4 3. 9 gノ 1 の U D P— G I c ( 2 N a塩） が生 成した。 実施例 3. g a i T、 g a 1 Kを発現する組換え体プラス ミ ドの造成
g a 1 T、 g a l Kを発現する組換え体プラスミ ド p NT 2 5の造成方法につ いて以下に述べる （第 3図） 。
配列番号 5記載のセンス鎖 DNAプライマーと、 配列番兮 6記載のアンチセン ス鎖 DNAプライマーを合成し、 該合成 DNAをプライマ一として、 W3110株の 染色体 DN Aを錡型として前述と同一の条件で P C Rを行った。
P C R終了後、 エタノール沈殿法により DN Aの沈殿を取得した。 該 DNA沈 殿を 2 0 1 の丁 Eに溶解した。 該溶解液 5 μ 1 を用い、 DNAを制限酵素 H i n d fflおよび H i n c IIで切断後、 ァガロースゲル電気泳動によ り DN A断片を 分離した後、 ジーンクリーン Πキッ トにより 2. 3 k bの断片を回収した。 pBluescript Π SK+ DNA 0. 2 μ gを制限酵素 H i n d ΠΙおよび E c o R V で切断し、 ァガロースゲル電気泳動により DNA断片を分離し、 问様に 3. O k bの断片を回収した。
該 2. 3 k bの断片および 3. 0 k bの断片をライゲーシヨ ンキッ トを用いて 1 6 で 1 6時間連結反応を行った。
該連結反応液を用いてェシエリヒア ■ コリ NM522株を前述の公知の方法に従つ て形質転換し、 該形質転換体をアンピシリン 5 0 gZm 1 を含む L B寒天培地 に塗布後、 3 0でで一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーより前述の公知の方法に従ってプラスミ ド を抽出し、 g a 1 T、 g a l K遺伝子を含むブラスミ ドである p NT 1 9を得た c 該プラスミ ドの構造を制限酵素消化により確認した （第 3図） 。
該 p NT 1 9 DNA 0. 5 ^ gを制限酵素 C 1 a Iおよび B a m H Iで切断 後、 ァガロースゲル電気泳動により DN A断片を分離し、 同様に 2. 3 k bの断 片を回収した。 実施例 1 — 1 ) で取得した p P AC 3 1 DNA 0. 2 gを制 限酵素 C 1 a Iおよび B a mH Iで切断後、 ァガロースゲル電気泳動によ り DN A断片を分離し、 同様に 5. 5 k bの断片を回収した。
該 2. 3 k bの断片および 5. 5 k bの断片をライゲーシヨ ンキッ トを用いて 1 6 °Cで 1 6時間、 連結反応を行った。
該連結反応液を用いてェシエリヒア ' コリ NM52株を前述の公知の方法に従つ て形質転換し、 該形 ¾転換体をアンピシリン 5 0 g/m 1 を含む L B寒天培地 に塗布後、 3 0 °Cで一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーより前述の公知の方法に従ってプラスミ ド を抽出し、 g a 1 T、 g a l K同時発現プラスミ ドである p NT 2 5を得た。 該 プラスミ ドの構造を制限酵素消化により確認した （第 3図） 。 実施例 4. UD P - G a 1 の生産
1 ) g a l T、 g a l K、 g a l U、 p p a発現株の造成
実施例 1 一 3 ) で得た p NT 3 2 DNAを用いてェシエリヒア ' コリ 刚 522/pNT25株を常法に従って形質転換し、 該形質転換体をアンピシリン 5 0 gZm lおよびクロラムフエニコ一ル 1 0 g/m l を含む L B寒天培地に塗布 後、 3 0でで一晩培養した。 生育してきた形質転換体を選択することにより、 g a l T、 g a l K：、 g a l U、 p p a発現株であるェシエリヒア ' コリ
NM522/pNT25/pNT32株を得た。
2) UDP-G a 1の生産
実施例 4— 1 ) で得たェシヱリヒア ' コリ NM522/pNT25/pNT32株を実施例 2 と 同様の方法で培養し、 得られた各々の培養物を遠心分離し、 湿菌体を取得した。 また、 コリネバクテリ ゥム · アンモニアゲネス ATCC21170株を実施例 2 と同様の 方法で培養し、 得られた培養物を遠心分離し、 湿菌体を取得した。 該湿菌体は必 要に応じて一 2 0でで保存することが可能で、 使用前に解凍して用いることがで きる。
ェシエリヒア ' コリ NM522/pNT25/pNT32株湿菌体 5 0 g Zし コリネバクテ リ ウム . アンモニアゲネス ATCC21170株湿菌体 1 5 0 g/ l 、 グルコース 8 0 gZ l、 ガラク ト一ス 2 0 gZし KH2 P 04 1 5 g/ U Mg S 04 · 7 H2 〇 5 g/ し フィチン酸 5 g/ ォロッ ト酸 （カリ ウム塩） 2 1. 2 g/ 1、 ナイ ミーン S— 2 1 5 4 gZ l 、 キシレン 1 0 m し 1の組成からなる反 応液 2 Lを 5 L容培養槽に入れ、 該反応液を 6 00 r p mにて攪拌し、 1 LZm i nにて通気し、 3 2 で 2 6時間反応を行った。
反応屮、 4 N N a OHを用いて、 該反応液の p H 7. 2に維持し、 必要に応 じて、 グルコース、 ガラク トース、 1：112 ? 04を添加した。
該反応により、 反応液中に 4 7. 4 g/ lの UD P— G a l (2 N a塩） が生 成した。 実施例 5. g a 1 T、 g a 1 Κをコリネバクテリゥム ' アンモニアゲネスで発現 する組換え体プラスミ ドの造成
ェシエリ ヒア - コリ由来の g a 1 T、 g a 1 Κをコリネバクテリ ゥム ' アンモ ニァゲネスで発現する組換え体プラスミ ド ρ ΤΚ 7の造成方法について以下に述 ベる （第 4図） 。
1 ) p C G 1 1 6の造成 コリネバクテリ ゥム · アンモニアゲネスで複製できるプラスミ ド p C G 1 1 6 の造成を以下のように行った。
プラスミ ド p C G 1 1 (特公平 6- 91827) DNA 0. 5 gを制限酵素 P s t I および S t u Iで切断後、 ァガロースゲル電気泳動によ り DN A断片を分離し、 ジーンクリーン Πキッ トによ り 6. 5 k bの断片を回収した。
一方、 プラスミ ド p U C 1 9 DN A 1. 0 μ gを制限酵素 Ε c o R Iで 切断 後、 DNA Blunting K （宝酒造社製）により平滑末端化した。 平滑末端化した該 D N Aを P s t I で切断後、 ァガロースゲル電気泳動によ り DNA断片を分離し、 MERm id Kit (B i o 1 0 1社製） により 4 3 b pの断片を回収した。
該 6. 5 k bの断片および 4 3 b pの断片をラィゲ一シヨンキッ トを用いて、 1 61：で 1 6時間、 連結反応を行った。
該連結反応液を用いてコリネバクテリゥム · アンモニアゲネス ATCC21170 株を エレク ト口ポーレーシヨ ン法 [FEMS Microbiol. Lett. , 65, 299 (1989)]で形質 転換し、 該形質転換体をスぺクチノマイシン 1 0 0 μ g/ 1 を含む L B寒天培 地に塗布後、 3 0でで 2 Π間培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーより公知の方法 [J. Bacteriol., 159 306 (1984)]に従ってプラスミ ドを抽出し、 プラスミ ド p C G 1 1 6を得た。 該プラ スミ ドの構造を制限酵素消化によ り確認した （第 4図） 。
2 ) g a l T、 g a 1 Kを発現するプラスミ ド p T K 7の造成
実施例 3で造成した g a l T、 g a 1 Kを発現するプラスミ ド p NT 2 5 DN A 1. 0 gを制限酵素 X h o Iおよび B a mH Iで切断後、 ァガロースゲル電 気泳動により D N A断片を分離し、 ジーンクリーン IIキッ トによ り 3. 5 k bの 断片を回収した。
一方、 実施例 5— 1 ) で造成したプラスミ ド p C G 1 1 6 DN A 0. 5 ^ g を制限酵素 S a 1 Iおよび B a mH Iで切断後、 ァガロースゲル電気泳動により DNA断片を分離し、 同様に 6. 5 k bの断片を回収した。
該 3. 5 k bの断片および 6. 5 k bの断片をライゲーシヨンキッ トを用いて 1 6 で1 6時間、 連結反応を行った。
該連結反応液を用いてコリネバクテリウム ' ァンモニァゲネス ATCC21170株を エレク ト口ポーレーション法で形質転換し、 該形質転換体をスぺクチノマイシン 1 0 0 μ g/m 1 を含む L B寒天培地に塗布後、 3 0 で 2日間培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーより公知の方法に従ってプラスミ ドを抽出 し、 g a l T、 g a 1 K同時発現プラスミ ドである p T K 7を得た。 該プラスミ ドの構造を制限酵素消化によ り確認した （第 4図） 。 実施例 6. U D P - G a 1の生産
実施例 5で得たコリネバクテリ ゥム · アンモニアゲネス ATCC21170/pTK7株を 実施例 2 と同様の方法で 3 2 °Cで 2 0時間培養した後、 4 0でで 4時間培養し、 得られた培養物を遠心分離し、 湿菌体を取得した。 該湿菌体は必要に応じて一 2 0でで保存することが可能で、 使用前に解凍して用いることができる。
コリネバクテリゥム · アンモニアゲネス ATCC21170/pTK7株湿菌体 1 5 ϋ g/ 1、 フルク ト一ス 4 0 gZし ガラク ト一ス 2 0 g l 、 KH2 P〇4 1 5 g ノ l 、 M g S 04 ' 7 H2〇 5 gZ l 、 フィチン酸 5 gZ l 、 ォロッ ト酸 （カリ ゥム塩） 1 0. 6 gZ l 、 ナイ ミーン S— 2 1 5 4 g/ l 、 キシレン 1 0 m l / 1の組成からなる反応液 3 0 m 1 を 2 0 0 m 1容ビーカーに人れ、 該反応液を マグネティ ック · ス夕一ラ一にて攪拌 （9 0 0 r p m) し、 3 2 °Cで 2 2時間反 応を行つた。
反応中、 4 N N a OHを用いて、 該反応液の p H 7. 2に維持し、 必要に応 じて、 フルク トース、 ガラク ト一ス、 KH2 P〇4を添加した。
該反応により、 反応液中に 7. 2 g/ l の U D P— G a l ( 2 N a塩） が生成 した。 実施例 7. g l mU、 p p a、 p g m、 g I mM、 g 1 k、 p f k B発現プラス ミ ドの造成 1 ) g l mU、 p p a発現プラス ミ ドの造成
配列番号 7記載のセンス鎖 DNAプライマーと、 配列番号 8記載のアンチセン ス鎖 DN Aプライマーを合成した。 該合成 DN Aをプライマーとして、 W3110株 の染色体 DN Aを铸型として前述と同一の条件で P C Rを行った。
PC R終了後、 エタノール沈殿法により DN Aの沈殿を取得した。 該 DNA沈 殿を 2 O 1の TEに溶解した。 該溶解液 5 1 を用い、 DNAを制限酵素 H i n d ΙΠおよび B a mH Iで切断後、 ァガロースゲル電気泳動により DNA断片を 分離し、 ジーンクリーン Πキッ トにより 1. 4 k bの断片を回収した。 実施例 1 一 1 ) で取得した p PA3 1 DN A 0. 5 gを制限酵素 H i— n d ΠΙおよび B a mH Iで切断後、 ァガロースゲル電気泳動により DNA断片を分離し、 同様に
4. 2 k bの断片を回収した。
該 1. 4 k bの断片および 4. 2 k bの断片をライゲ一シヨ ンキッ トを用いて 1 6でで ;！ 6時間、 連結反応を行った。
該連結反応液を用いてェシエリヒア · コリ KY8415株を前述の公知の方法に従 つて形質転換し、 該形質転換体をアンピシリ ン 50 g/m 1 を含む L B寒天培 地に塗布後、 30でで一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーより前述の公知の方法に従ってプラスミ ド を抽出し、 g 1 mU発現ブラスミ ドである p NT 1 0を得た。 該プラスミ ドの構 造を制限酵素消化により確認した （第 5図） 。
実施例 1一 3 ) で取得した p NT 1 2 DN A 0. 5 / gを制限酵素 B a m H Iおよび S a 1 Iで切断後、 ァガロースゲル電気泳動により DNA断片を分離し 同様に 1. O k bの断片を回収した。 上記 p NT I O DNA 0. 2 gを制限 酵素 B a mH Iおよび S a_l Iで切断後、 ァガロースゲル電気泳動により D N A 断片を分離し、 同様に 5. 3 k bの断片を回収した。
該 1. O k bの断片および 5. 3 k bの断片をライゲーシヨ ンキッ トを用いて 1 6でで1 6時間、 連結反応を行った。
該連結反応液を用いてェシエリヒア ' コリ KY8415株を前述の公知の方法に従 つて形質転換し、 該形質転換体をアンピシリン 5 0 /ノ gZm 1 を含む L B寒天培 地に塗布後、 3 0 で一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーより前述の公知の方法に従ってプラスミ ド を抽出し、 g l mU、 p p a同時発現プラスミ ドである p NT 1 4を得た。 該プ ラスミ ドの構造を制限酵素消化により確認した （第 5図） 。
2 ) p gm発現プラスミ ドの造成
配列番号 9記載のセンス鎖 DNAプライマーと、 配列番号 1 0記載のアンチセ ンス鎖 DNAプライマーを合成した。 該合成 DN Aをプライマーとして、 W3110 株の染色体 DN Aを铸型として前述と同一の条件で P C Rを行った。
P C R終了後、 エタノール沈殿法によ り、 DN Aの沈殿を取得した。 該沈殿を 2 0 μ 1 の Τ Εに溶解した。 該溶解液 5 / l を用い、 DNAを制限酵素 C 1 a I および B a mH Iで切断後、 ァガロースゲル電気泳動により DN Α断片を分離し, ジーンクリーン Πキッ トにより 1. 8 k bの断片を回収した。 実施例 1 一 1 ) で 取得した p P AC 3 1 DN A 0. 2 gを制限酵素 Cに a Iおよび B a mH I で切断後、 ァガロースゲル電¾泳動により DNA断片を分離し、 同様に 5. 5 k bの断片を回収した。
該 1. 8 k bの断片および 5. 5 k bの断片をライゲーシヨ ンキッ トを用いて 1 6でで 1 6時間、 連結反応を行った。
該連結反応液を用いてェシエリヒア ' コリ NM522株を前述の公知の方法に従つ て形質転換し、 該形質転換体をアンピシリン 5 0 g/m 1 を含む L B寒天培地 に塗布後、 3 0ででー晚培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーより前述の公知の方法に従ってプラスミ ド を抽出し、 p g m発現プラスミ ドである p NT 2 4を得た。 該プラスミ ドの構造 を制限酵素消化によ り確認した （第 6図） 。
3 ) g 1 mM発現プラスミ ドの造成
配列番号 1 1記載のセンス鎖 D N Aプライマ一と配列番号 1 2記載のアンチ七 ンス鎖 DN Aプライマ一を合成した。 該合成 DN Aをプライマ一とし、 ェシエリ ヒア · コリ W3110株の染色体 DN Aを銬型として前述と同--の条件で P C Rを行 つた。
P C R終了後、 エタノール沈殿法により DN Aの沈殿を取得した。 該沈殿を 2 0 μ 1 の ΤΕに溶解した。 該溶解液 5 μ 1 を用い、 DNAを制限酵素 C 1—a Iお よび B a mH Iで切断後、 ァガロースゲル電気泳動により DN A断片を分離し、 ジーンクリーン Πキッ トによ り 1. 6 k bの断片を回収した。 実施例 1 一 1 ) で 取得した p P AC 3 1 DNA 0. 2 μ gを制限酵素 C 1 a Iおよび B a m H I で切断後、 ァガロースゲル電気泳動により DN A断片を分離し、 同様に 5. 5 k bの断片を回収した。
該 1. 6 k bの断片および 5. 5 k bの断片をライゲ一シヨ ンキッ トを用いて 1 6 で 1 6時間連結反応を行った。
該連結反応液を用いてェシヱリ ヒア · コリ NM522株を常法に従って形質転換し、 該形質転換体をアンピシリン 5 0 1 を含む L B寒天培地に塗布後、 3 0で で一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーよ り常法に従ってプラスミ ドを抽出し、 g 1 発現プラスミ ドである p NT 4 4を得た。 該プラスミ ドの構造を制限酵素 消化により確認した （第 7図） 。
4 ) g 1 k発現プラスミ ドの造成
配列番号 1 3記載のセンス鎖 DNAプライマ一と配列番号 1 4記載のアンチセ ンス鎖 DN Aプライマ一を合成した。 該合成 DN Aをプライマーとし、 ェシエリ ヒア · コリ W3110株の染色体 DN Aを铸型として前述と同一の条件で P C Rを行 つた。
P C R終了後、 エタノール沈殿法により DNAの沈殿を取得し、 該沈殿を 2 0 μ 1 の ΤΕに溶解した。 該溶解液 5 μ 1 を用い、 DNAを制限酵素 H i n d ΙΠお よび B a m H Iで切断後、 ァガロースゲル電気泳動により D N A断片を分離し、 ジーンクリーン Πキッ トにより 0. 5 k bの断片を回収した。
実施例 1 — 1 ) で取得した p P A 3 1 DNA 0. を制限酵素 H i n d HIおよび B a mH Iで切断後、 ァガロースゲル電気泳動により DN A断片を分離 し、 同様に 4. 2 k bの断片を回収した。
該 0. 5 k bの断片および 4. 2 k bの断片をライゲーシヨ ンキッ トを用いて 】 6*Cで 1 6時間連結反応を行った。 該連結反応液を用いてェシヱリ ヒア · コリ NM522株を常法に従って形質転換し、 該形質転換体をアンピシリン 50 gZ 1 を含む L B寒天培地に塗布後、 30でで一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーより常法に従ってプラスミ ドを抽出し、 g 1 kの一部を有するプラスミ ドである p NT 4 5を得た。 該プラスミ ドの構造を 制限酵素消化により確認した （第 8図） 。
上述と同一の条件で PCRを行い、 得られた DN A溶解液 5 /ノ 1 を用い、 DN Aを制限酵素 H i n d fflで切断後、 ァガロースゲル電気泳動により DNA断片を 分離し、 同様に 0. 5 k bの断片を回収した。 上に § した方法で取得した p NT 4 5 DNA 0. 2 Λ gを制限酵素 H i n d ΙΠで切断後アルカリホスファタ一ゼ によ り脱リン酸化処理を行い、 ァガロースゲル電気泳動によ り DN A断片を分離 し、 同様に 4. 7 k bの断片を回収した。
該 0. 5 k bの断片および 4. 7 k bの断片をライゲ一シヨンキッ トを用いて 1 6でで 1 6時間連結反応を行った。
該連結反応液を用いてェシヱリヒア ' コリ NM522株を常法に従って形質転換し、 該形質転換体をアンピシリ ン 50 g/ 1 を含む L B寒天培地に塗布後、 30 で一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーより常法に従ってプラスミ ドを抽出し、 g 1 kを発現するプラスミ ドである p NT 46を得た。 該プラスミ ドの構造を制限 酵素消化によ り確認した （第 8図） 。
5) p f k B発現プラスミ ドの造成
配列番号 1 5記載のセンス鎖 DN Aプライマーと配列番号 1 6記載のアンチセ ンス鎖 DN Aプライマーを合成した。 該合成 DN Aをプライマ一とし、 W3110株 の染色体 DN Aを铸型として前述と同一の条件で P C Rを行った。 P C R終了後、 エタノール沈殿法によ り DN Aの沈殿を取得した。 該沈殿を 2 0 μ 1 の ΤΕに溶解した。 該溶解液 5 1 を用い、 DN Αを制限酵素 H i _n d ΠΙ および E c o R Vで切断後、 ァガロースゲル電気泳動により DN A断片を分離し、 ジーンクリーン Πキッ トにより 1 . 3 k bの断片を回収した。 pBluescript Π SK+ DNA 0. 2 μ gを制限酵素 H i n d ΠΙ および E c 0 R Vで切断後、 ァガ ロースゲル電気泳動により DN A断片を分離し、 同様に 3. O k bの断片を回収 した。
該 1. 3 k bの断片および 3. 0 k bの断片をライゲ一シヨ ンキッ トを用いて 1 6でで 1 6時間連結反応を行った。
該連結反応液を用いてエシュリヒア · コリ NM522株を常法に従って形質転換し、 該形質転換体をアンピシリン 5 0 g/m 1 を含む L B寒天培地に塗布後 3 0 で一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーより常法に従ってプラスミ ドを抽出し、 p f k B遺伝子を保有するプラスミ ド p NT 4 3を得た。 該プラスミ ドの構造を制 限酵素消化によ り確認した （第 9図） 。
p NT 4 3 DNA 0. μ gを用い、 DNAを制限酵素 C 1 a Iおよび S a c Iで切断後、 ァガロースゲル電気泳動により DNA断片を分離し、 同様に 1 . 3 k bの断片を回収した。
実施例 1 一 1 ) で取得した p P AC 3 1 DNA 0. 2 / gを制限酵素 C 1 a
Iおよび S a c Iで切断後、 ァガロースゲル電気泳動によ り DN A断片を分離し 同様に 5. 7 k bの断片を回収した。
該 1. 3 k bの断片および 5. 7 k bの断片をライゲーシヨ ンキッ トを用いて 1 6 *Cで 1 6時間連結反応を行った。
該連結反応液を用いてェシエリヒア · コリ NM522株を常法に従って形質転換し. 該形質転換体をアンピシリン 5 0 gZ 1 を含む L B寒天培地に塗布後、 3 0 °C で一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーより常法に従ってプラスミ ドを抽出し、 p f k B発現プラスミ ドである p NT 4 7を得た。 該プラスミ ドの構造を制限酵素 消化によ り確認した （第 9図） 。 実施例 8. U D P— G 1 c N A cの生産
実施例 7で得たェシエリ ヒア · コリ KY8415/pNT14株、 NM522/pNT24株、 腿 522/pNT44株、 NM522/pNT47株を実施例 2と同様の方法で培養し、 得られた 各々の培養物を遠心分離し、 湿菌体を取得した。 該湿菌体は必要に応じて一 2 0でで保存することが可能で、 使用前に解凍して用いることができる。
ェシヱリ ヒア · コリ NM522/pNT24株湿菌体 6 g / 1 、 522/pNT47株湿菌体 6 g /し 1 0 0 mM トリス塩酸緩衝液 （p H 8. 0) 、 6 mM M g C 1 2 · 6 H20 、 1 0 mM グルコース - 6-リ ン酸、 2. 5 mM フルク ト一ス 6-リ ン酸、 2. 5 mM AT P、 ナイミーン S— 2 1 5 4 g Z 1 の組成からなる反応液 0. l m l を 1. 5 m l容チューブに入れ、 3 7 °Cで 1時問反応を行った。 反応液を 6 5 t:で 5分間処理後、 ェシヱリ ヒア · コリ ΚΥ8415/ρΝΤ14株湿菌体 0. 3 gノ 1、 NM522/pNT44株湿菌体 6 gZ 1、 5 mM グルコサミ ン- 6-リン酸、 5mM ァ セチル C o A、 5 mM UT Pとなるように菌体および基 Kを添加し、 さらに 3 7でで 3 0分間反応させたところ、 反応液中に 2. 5 mM ( 1. 6 g/ ) の U DP-G 1 c NA c (2 N a塩） が生成した。 この際、 ェシエリヒア ' コリ NM522/pNT24株湿菌体あるいは NM522/pNT47株湿菌体を添加しなかった場合の U D P _ G 1 c N A c生成量はそれぞれ 0. 08mM、 0. 1 6 mMであった。 このことは、 p g m発現株と p f k B発現株の組み合わせにより、 g 1 mMの 活性発現に必要な G 1 c - 1 , 6— P 2が供給できることを示している。 実施例 9. UDP -G 1 c NA cの生産
実施例 7で得たェシヱリ ヒア ' コリ KY8415/pNT14株、 NM522/pNT24株、 NM522/pNT44株、 NM522/pNT46株、 NM522/pNT47株を ¾施例 2 と同様の方法で培養 し、 得られた各々の培養物を遠心分離し湿菌体を取得した。 また、 コリネバクテ リウム ' アンモニアゲネス ATCC21170株を実施例 2と同様の方法で培養し、 得ら れた培養物を遠心分離し湿菌体を取得した。 該湿菌体は必要に応じて一 20でで 保存することが可能で、 使用前に解凍して用いることができる。
ェシエリ ヒア · コリ KY8415/pNT14株、 蘭 522/pNT24株、 NM522/pNT44株、 NM522/pNT47株、 NM522/pNT46株湿菌体を各 1 0 gノし コリネバクテリウム - アンモニアゲネス ATCC21170株湿菌体 1 50 gZ l、 フルク トース 50 gZ l、 グルコサミン塩酸塩 8 O gZ l、 KH2 P 04 1 5 gZ l、 Mg S 04 · 7 H20
5 g/ U フィチン酸 5 gZし ォロッ ト酸 （カリゥム塩） 1 0 g / 1、 ナイ ミ一ン S— 2 1 5 4 g/ キシレン 1 0m lノ 1の組成からなる反応液 3 0 m 1 を 2 00m 1容ビーカ一に入れ、 この反応液をマグネティ ック · スターラ一 にて攪拌 （900 r pm) し、 3 2でで 1 0時間反応を行った。
反応中 4 N N a OHを用いて、 該反応液の p Hを 7. 2に維持し、 必要に応 じてフルク ト一ス、 K H 2 P 04を添加した。
該反応によ り、 反応液中に 6. 2 g< lの UDP— G l c NA c ( 2 N a 塩） が生成した。 実施例 1 0. g a l K発現プラスミ ドの造成
実施例 3— 1 ) で取得した p NT 2 5 DN A 0. 5 £を制限酵素 C 1 a I および E c 0 R Vで切断後、 ァガロースゲル電気泳動によ り D N A断片を分離し、 ジーンクリーン Πキッ トにより 6. 7 k bの断片を回収した。 回収した DNAを DNA Blunting Kitにより平滑末端化した後、 ライゲ一ションキッ トを用いて 1
6 " で 1 6時間連結反応を行った。
該連結反応液を用いてエシ リヒア ' コリ NM522株を常法に従って形質転換し、 該形質転換体をアンピシリン 50 gZm 1 を含む L B寒天培地に塗布後 3 0 で一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーより常法に従ってプラスミ ドを抽出し、 g a I K発現プラスミ ドである p NT 54を得た。 該プラスミ ドの構造を制限酵素 消化により確認した （第 1 0図） 。 実施例 1 1. UDP— G l c NA cの生産
実施例 1 0で得たェシヱリヒア ' コリ NM522/pNT54株を实施例 2と同様の方法 で培養し、 得られた培養物を遠心分離し湿菌体を取得した。 また、 コリネバクテ リウム · アンモニアゲネス ATCC21170株を実施例 2と同様の方法で培養し、 得ら れた培養物を遠心分離し湿菌体を取得した。 該湿菌体は必要に応じて一 2 で 保存することが可能で、 使用前に解凍して用いることができる。
ェシエリ ヒア · コリ 匪 522/pNT54株湿菌体 50 g / 1、 コリ ネノ クテリ ウム ' アンモニアゲネス ATCC21170株湿菌体 1 50 g /し フルク トース 40 g/ l、 N—ァセチルグルコサミ ン 6 7 gノし KH2 P 0, 1 5 g/ 1 , M g S 04 - 7 H20 5 gZ l、 フィチン酸 5 gZ l、 ォロッ ト酸 （カリ ゥム塩） 1 0 gZ 1、 ナイ ミーン S— 2 1 5 4 g/ l、 キシレン 1 0m l / lの組成からなる反応液 30m l を 2 00m l容ビーカ一に入れ、 この反応液をマグネティ ック ' スター ラ一にて攪拌 （900 r pm) し、 32 で 2 7時間反応を行った。
反応中 4 N N a OHを用いて、 該反応液の p Hを 7. 2に維持し、 必要に応 じてフルク ト一ス、 1!2?04を添加した。
該反応により、 反応液中に 1 7. l g/ 1の UDP— G l c NA c ( 2 N a 塩） が生成した。 実施例 1 2. U D P— G 1 c N A cと U D P— G a 1の同時生産
実施例 3で得た NM522/pNT25株を実施例 2と同様の方法で培養し、 得られた培 養物を遠心分離し湿菌体を取得した。 また、 コリネパクテリ ゥム ' アンモニアゲ ネス ATCC21170株を実施例 2と同様の方法で培養し、 得られた培養物を遠心分離 し湿菌体を取得した。 該湿菌体は必要に応じて一 20 °Cで保存することが可能で . 使用前に解凍して用いることができる。
ェシエリ ヒア ' コリ NM522/pNT25株湿菌体 2 5 g /し コリネバクテリ ウム ' アンモニアゲネス ATCC21170株湿菌体 1 50 gZし フルク トース 60 gノし N—ァセチルグルコサミ ン 5 0 gZ l、 ガラク トース 4 0 g/ l、 KH2P04 1 5 g/ Mg S 04 - 7 H20 5 g/ フィチン酸 5 gZ l、 ォロッ ト酸 (力リゥム塩） 1 0 gZ l、 ナイ ミ一ン S— 2 1 5 4 gZし キシレン 1 0 m 1 / 1の組成からなる反応液 3 0 m 1 を 200m l容ビ一カーに入れ、 この反 応液をマグネティ ック · ス夕一ラーにて攪拌 （900 r pm) し、 32でで 24 時間反応を行った。
反応中 4 N N a OHを用いて、 該反応液の p Hを 7. 2に維持し、 必要に応 じて KH2 P〇4を添加した。
該反応により、 反応液中に 1 1. 4 gZ lの UDP— G l c NA c ( 2 N a 塩） および 1 8 gZ lの UDP— G a l (2 N a塩） が生成した。 実施例 1 3. m a n B、 ma n C、 p gm、 p f k B発現プラスミ ドの造成 1 ) m a n B、 m a n C発現プラスミ ドの造成
配列番号 1 7記載のセンス鎖 DNAプライマ一と配列番号 1 8記載のアンチセ ンス鎖 DN Aプライマーを合成した。 該合成 DN Aをプライマーとし、 ェシエリ ヒア · コリ W3110株染色体 DN Aを铸型として前述と同一の条件で P C Rを行つ た。
P C R終了後、 エタノール沈殿法によ り D N Aの沈殿を取得した。 該沈殿を 2 0 μ Iの ΤΕに溶解した。 該溶解液 5 1 を用い、 DNAを制限酵素 H i n d ΠΙ および Β amH Iで切断後、 ァガロースゲル電気泳動によ り DN A断片を分離し、 ジーンクリーン Πキッ トにより 3. 0 k bの断片を回収した。 pBluescript Π SK+ DNA 0. 2 gを制限酵素 H i n d ΠΙお よび B amH Iで切断後、 ァガ ロースゲル電気泳動により DNA断片を分離し、 同様に 3. O k bの断片を回収 した。
該 3. O k bの両断片をライゲ一ションキッ トを用いて 1 6でで1 6時間連結 反応を行った。 該連結反応液を用いてェシヱリヒア ' コリ NM522株を常法に従つ て形質転換し、 該形質転換体をアンピシリ ン 5 0 gZm 1 を含む L B寒天培地 に塗布後、 3 0でで一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーより常法に従ってプラスミ ドを抽出し、 m a n Cおよび m a n Bを含むプラスミ ドである p NK 6を得た。 該プラスミ ドの 構造を制限酵素消化により確認した （第 1 1図） 。
該 p NK 6 DN A 0. 5 gを制限酵素 C 1 a Iおよび B a mH Iで切断後 ァガロースゲル電気泳動により DN A断片を分離し 3. 0 k bの断片を回収した 実施例 1 一 1 ) で取得した p P AC 3 1 DNA 0. 2 gを制限酵素 C 1 a I および B a mH Iで切断後、 ァガロースゲル電気泳動により DN A断片を分離し 同様に 5. 5 k bの断片を回収した。
該 3. O k bの断片および 5. 5 k bの断片をライゲーシヨ ンキッ トを用いて 1 6でで 1 6時間連結反応を行った。 該連結反応液を川いてェシエリヒア ' コリ NM522株を常法に従って形質転換し、 該形質転換体をアンピシリン 5 0 g/m 1 を含む L B寒天培地に塗布後、 3 0でで一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーより常法に従ってプラスミ ドを抽出し、 m a n Cおよび m a n B発現プラスミ ドである p NK 7を得た。 該プラスミ ドの構 造を制限酵素消化により確認した （第 1 1図） 。
2 ) p gm、 p f k B同時発現プラスミ ドの造成
実施例 7で取得した p NT 2 4 DNA 0. 5 gを制限酵素 X h o Iおよび B a mH Iで切断後、 ァガロースゲル電気泳動により DN A断片を分離しジーン クリーン Πキッ トにより 3. 0 k bの断片を回収した。 一方、 p S TV 2 8 D N A (宝酒造社製） 0. 2 gを制限酵素 S a 1 Iおよび B a mH Iで切断後、 ァガロースゲル電気泳動により DN A断片を分離し、 同様に 3. O k bの断片を 回収した。
該 3. O k bの両断片をライゲ一ションキッ トを用いて 1 6でで 1 6時間連結 反応を行った。 該連結反応液を用いてェシヱリヒア ' コリ NM522株を常法に従つ て形質転換し、 該形質転換体をクロラムフエ二コール 1 0 g/m 1 を含む L B 寒天培地に塗布後、 30°Cでー晚培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーより常法に従ってプラスミ ドを抽出し、 p gm遺伝子を有するプラスミ ドである pNT 53を得た。 該プラスミ ドの構造を 制限酵素消化によ り確認した （第 1 2図） 。
配列番号 1 9記載のセンス鎖 DN Aプライマ一を合成し、 該センス鎖 DN Aプ ライマーおよび配列番号 1 6記載のアンチセンス鎖 DNAプライマーを用い、 実 施例 7で取得したプラスミ ド p NT 4 7 DNAを铸型として前述と同一の条件 で P C Rを行った。
PC R終了後、 エタノール沈殿法により DN Aの沈殿を取得した。 該沈殿を 2 0 μ 1の ΤΕに溶解した。 該溶解液 5 1 を用い、 DNAを制限酵素 E c o R V および B g 1 Πで切断後、 ァガロースゲル電気泳動により DN Α断片を分離し、 同様に 1. 3 k bの断片を回収した。 pNT 53 DNA 0. 2 gを制限酵素 Sma lおよび B amH Iで切断後、 ァガロースゲル電気泳動により DN A断片 を分離し、 同様に 6. O k bの断片を回収した。
該 1. 3 k bの断片および 6. 0 k bの断片をライゲーシヨ ンキッ トを用いて 1 6でで 1 6時間連結反応を行った。
該連結反応液を用いてェシエリヒア ' コリ NM522株を常法に従って形質転換し、 該形質転換体をクロラムフヱニコール 1 0 Λ gZm 1 を含む L B寒天培地に塗布 後、 30ででー晚培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーより常法に従ってプラスミ ドを抽出し、 p gmおよび p f k B発現プラスミ ドである p NT 55を得た。 該プラスミ ドの構 造を制限酵素消化により確認した （第 1 2図） 。
実施例 1 4. G DP— Ma nの生産
1 ) ma n B、 m a n C、 p gm, p f k B発現株の造成
実施例 1 3— 2) で得た p NT 55 DNAを用いてェシェリヒア . コリ
NM522/pNK7株を常法に従って形質転換し、 該形質転換体をアンピシリン 50 g /m 1 およびクロラムフヱニコール 1 0 μ g/ 1 を含む L B寒天培地に塗布後、 3 0でで一晩培養した。 生育してきた形質転換体を選択することによ り、 m a n B、 m a n C、 p gm、 p f k B発現株であるェシェリヒア ' コリ
NM522/pNK7/pNT55株を得た。
2 ) G D P -M a nの生産
上記 1 ) で得たェシヱリヒア · コリ NM522/pNK7/pNT55株および実施例 7で得 たエシュリヒア · コリ NM522/pNT46を実施例 2 と同様の方法で培養し、 得られた 各々の培養物を遠心分離し湿菌体を取得した。 また、 コリネバクテリウム ' アン モニァゲネス ATCC21170株を実施例 2と同様の方法で培養し、 得られた培養物を 遠心分離し湿菌体を取得した。 該湿菌体は必要に応じて一 2 0でで保存すること が可能で、 使用前に解凍して用いることができる。
ェシヱリ ヒア · コリ NM522/pNK7/pNT55株湿菌体 2 5 g /し NM522/pNT46株湿 菌体 2 5 g/ コリネバクテリ ゥム · アンモニアゲネス ATCC21170株湿菌体 1 5 0 gZ l 、 フルク トース 6 0 gZ l 、 マンノース 5 0 gZ l、 KH2 P 0, 1 5 g/ M g S 04 - 7 H20 5 gZ l 、 フィチン酸 5 gZ l 、 GMP ( 2 N a , 7 H20塩） 6 0 gZし ナイ ミーン S— 2 1 5 4 g/ l 、 キシレ ン 1 0 m 1 Z 1の組成からなる反応液 3 0 m 1 を 2 0 0 m 1容ビ一カーに入れ、 この反応液をマグネティ ック · スターラ一にて攪拌 （9 0 0 r p m) し、 2 4時 間反応を行った。
反応中 4 N N a OHを用いて、 該反応液の p Hを 7. 2に維持し、 必要に応 じて KH2 P 04を添加した。
該反応によ り、 反応液中に 1 4. 6 g/ l の G D P— M a n ( 2 N a , 1 H2 0塩） が生成した。 実施例 1 5. gm d、 w c a G発現プラスミ ドの造成
配列番号 2 0記載のセンス鎖 DN Aプライマーと配列番号 2 1記載のアンチセ ンス鎖 DN Aプライマーを合成した。 該合成 DNAをプライマ一とし、 ェシエリ ヒア · コリ W3110株染色体 DN Aを铸型として前述と同一の条件で P C Rを行つ た。
P C R終了後、 エタノール沈殿法により DNAの沈殿を取得した。 該沈殿を 2 0 μ 1 の Τ Εに溶解した。 該溶解液 5 1 を用い、 DNAを制限酵素 H i _n d ΙΠ および X h o Iで切断後、 ァガロースゲル電気泳動により DN A断片を分離しジ —ンクリーン Πキッ トにより 2. 3 k bの断片を回収した。
実施例 1 一 1 ) で取得した p P A 3 1 DNA 0. 2 ^ gを制限酵素 H i n d ΙΠおよび S a 1 Iで切断後、 ァガロースゲル電気泳動により DNA断片を分離し. 同様に 3. 9 k bの断片を回収した。
該 2. 3 k bおよび 3. 9 k bの断片をライゲーシヨ ンキッ トを用いて、 1 6 で 1 6時間連結反応を行った。
該連結反応液を用いてェシヱリヒア · コリ NM522株を常法に従って形質転換し、 該形質転換体をアンピシリン 5 0 / g/m 1 を含む L B寒天培地に塗布後、 3 0でで一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーより常法に従ってプラスミ ドを抽出し、 g m dおよび w c a Gを含むプラスミ ドである p NK 8を得た。 該プラスミ ドの構 造を制限酵素消化により確認した （第 1 3図） 。 実施例 1 6. G D P— F u cの生産
実施例 1 4で得たェシヱリ ヒア · コリ NM522/pNK7/pNT55株、 実施例 1 5で得 た NM522/pNK8株および実施例 7で得た刚 522/pNT46を実施例 2と同様の方法で 培養し得られた各々の培養物を遠心分離し湿菌体を取得した。 また、 コリネパク テリゥム · アンモニアゲネス ATCC21170株を実施例 2 と同様の方法で培養し、 得 られた培養物を遠心分離し湿菌体を取得した。 該湿菌体は必要に応じて一 2 O t: で保存することが可能で、 使用前に解凍して用いることができる。
ェシエリヒア ' コリ NM522/pNK7/pNT55株湿菌体 2 5 g/ l 、 ェシヱリ ヒア - コリ NM522/pNK8株湿菌体 2 5 gZし ェシヱリ ヒア ' コリ NM522/DNT46株湿菌 体 2 5 g/ l、 コリネバクテリ ゥム ' アンモニアゲネス ATCC21170株湿菌体 1 50 g/ フルク トース 4 0 gZし マンノース 6 0 gZ l、 H, P 04 1 5 g/ l , Mg SO, - 7 H20 5 g/ l、 フィチン酸 5 gZ l、 GMP ( 2 N a/7 H20塩） 60 gZ l、 ナイ ミ一ン S— 2 1 5 4 gZ l、 キシレン 1 0 m 1 / 1の組成からなる反応液 3 Om 1 を 2 00 m 1容ビーカ一に入れ、 この反 応液をマグネティ ック · ス夕一ラーにて攪拌 （900 r pm) し、 3 2°Cで 24 時間反応を行った。
反応中 4 N N a OHを用いて、 該反応液の p Hを 7. 2に維持し、 必要に応 じて KH2 P 04を添加した。
該反応により、 反応液中に 1. O gZ lの GDP— F u c (2. 5 N a , 1 H 20塩） が生成した。 実施例 1 7. n e u A発現ブラスミ ドの造成
ェシヱリ ヒア . コリ K235株 （ATCC13027) 染色体 D N Aを実施例 1 と同様の方 法で調製した。
配列番号 22記載のセンス鎖 DNAプライマーと配列番号 2 3記載のアンチセ ンス鎖 DNAプライマ一を合成した。 該合成 DNAをプライマ一とし、 ェシエリ ヒア . コリ K235株 （ATCC13027) 染色体 D N Aを铸型として前述と同一の条件で P C Rを行った。
P CR終了後、 エタノール沈殿法により DN Aの沈殿を取得した。 該沈殿を 2 0 μ 1の Τ Εに溶解した。 該溶解液 5 1 を用い、 DN Αを制限酵素 E c o R I および B a mH Iで切断後、 ァガロースゲル電気泳動により DN A断片を分離し、 ジーンクリーン Πキッ トにより 1. 3 k bの断片を回収した。 pBluescript Π SK+ DNA 0. 2 / gを制限酵素 E c o R Iおよび B a mH Iで切断後、 ァガ ロースゲル電気泳動により DN A断片を分離し、 同様に 3. O k bの断片を回収 した。
該 1. 3 k bおよび 3. 0 k bの断片をライゲ一シヨ ンキッ トを用いて 1 6で で 1 6時間連結反応を行った。 該連結反応液を用いてエシュリヒア . コリ NM522 株を常法に従って形質転換し、 該形質転換体をアンピシリン 5 0 // g/m 1 を含 む L B寒天培地に塗布後、 3 0でで一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーより常法に従ってプラスミ ドを抽出し、 n e u A遺伝子を含むプラスミ ドである p T A 1 2を得た。 該プラスミ ドの構造を 制限酵素消化によ り確認した （第 1 4図） 。
該 p TA 1 2 DN A 0. 5 gを制限酵素 C 1 _a Iおよび B a m H Iで切断 後、 ァガ口一スゲル電気泳動により DN A断片を分離し、 同様に 3 k bの断 片を回収した。 実施例 1 — 1 ) で取得した p P AC 3 1 DN A 0. 2 gを制 限酵素 C I— a lおよび B a mH Iで切断後、 ァガロースゲル電気泳動により D N A断片を分離し、 同様に 5. 5 k bの断片を回収した。
該 1. 3 k bの断片および 5. 5 k bの断片をライゲーシヨ ンキッ トを用いて 1 6 で 1 6時間連結反応を行った。
該連結反応液を用いてェシェリヒア ' コリ NM522株を常法に従って形質転換し、 該形質転換体をアンピシリン 5 0 g/m 1 を含む L B寒天培地に塗布後、 3 0 "Cで一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーより常法に従ってプラスミ ドを抽出し、 n e u A発現プラスミ ドである p TA l 4を得た。 該プラスミ ドの構造を制限酵素 消化により確認した （第 1 4図） 。 実施例 1 8. CMP— N e u A cの生産
実施例 1 7で得たェシヱリヒア . コリ NM522/pTA14株、 C600/pNALl株 [Appl. Environ. Micribiol. , 51 562 (1986)] および JF646/pMW5株 [J. Biol. Chem. , 261, 5568 (1986)] を実施例 2 と同様の方法で培養し、 得られた各々の培養物を 遠心分離し湿菌体を取得した。 また、 コリ ネパクテリ ゥム . アンモニアゲネス ATCC21170株を実施例 2と同様の方法で培養し、 得られた培養物を遠心分離し湿 菌体を取得した。 該湿菌体は必要に応じて一 2 01：で保存することが可能で、 使 用前に解凍して用いることができる。
ェシエリ ヒア · コリ NM522/pTA14株湿菌体 50 g/ l、 ェシエリ ヒア ' コリ C600/pNALl株湿菌体 1 5 gZし ェシヱリ ヒア ' コリ JF646/pMW5株湿菌体 2 5 g/ コリネバクテリゥム ' アンモニアゲネス ATCC21170株湿菌体 1 50 g /し ォロッ ト酸 （カリゥム塩） 1 0 g /し ピルビン酸 （N a塩） 2 0 g / 1、 フルク ト一ス 4 0 g/ 、 N—ァセチルマンノサミ ン 1 0 g /し KH 2 P 04 1 5 g/ U Mg S04 - 7 H20 5 g/ U フィチン酸 5 gノし ナ イミーン S— 2 1 5 4 g/ U キシレン l Om l Z lの組成からなる反応液 3 0m l を 2 00m l容ビ一力一に入れ、 この反応液をマグネティ ック · スターラ —にて攪拌 （ 900 r p m) し、 32 X：で 2 4時間反応を行った。
反応中 4 N N a OHを用いて、 該反応液の p Hを 7. 2に維持し、 必要に応 じて KH2 P 04を添加した。
該反応によ り、 反応液中に 2. 7 g/ 1の CMP— N e u A c (N a塩） が生 成した。 実施例 1 9. ラク ト一 N—テトラオースの生産
1 ) /3 1,3-ガラク トシル トランスフェラ—ゼの調製
プロテイ ン Aの I g G結合領域と β 1,3-ガラク トシル トランスフェラーゼとの 融合蛋白質をコー ドしている遺伝子を含むプラスミ ド pAMoERSAWl (特開 ψ 6- 181759) で形質転換したナマルバ K J Μ— 1株を G 4 1 8 (ギブコ社製） を 0. 5 m g/m 1含む R PM I 640 - I TP S G F培地 30m lに 5 x l 04 c e 1 1 s/m l になるように懸濁し、 （ 〇2ィ ンキュベータ一中で 3 7°Cで 8 E1間 培養した。
該培養液から遠心分離により細胞を除き上清を问収した。 該上清は、 必耍に応 じて一 80でで保存可能であり、 使用前に解凍して使用することができる。
該プロティン Aの I g G結合領域と β 1,3-ガラク トシルトランスフェラ一ゼと の融合蛋白質が生成された培養上清にアジ化ナトリゥムを最終濃度 0. 1 %にな るように添加した後、 製品説明書に従って前処理した I g Gセファロ一ス （ファ ルマシア社製） を 50 l添加し、 4 t:で一晩緩やかに攪拌した。
攪拌後、 遠心分離により β 1,3-ガラク トシルトランスフヱラ一ゼの結合した I g Gセファロースを回収し、 R PM I 64 0 - I T P S G F培地 1 m 1で 3回洗 浄後、 該 I g Gセファロースを 1， 3 -ガラク トシルトランスフヱラーゼの酵素源 として用いた。
2 ) ラク ト一N—テ トラオースの生産
ラク ト一 N—ネオテ トラオース （オッ クスフォー ド ' グライコシステムズ社 製） を公知の方法により [Agric. Biol. Chem. , 54， 2169 (1990)] に従って 2 —アミ ノビリジンによ り蛍光標識した後、 0. 1 Uの/?—ガラク トシダ一ゼ （生 化学工業社製） を加えて 3 7でで 1 6時間反応させ、 非還元末端のガラク ト一ス を除去した。
該反応液を、 5分問、 1 00 で加熱し、 ?一ガラク トシダ一ゼを失活させた。 該反応により得られた G 1 c N A c /? 1-3 G a 1 /? 1-4 G 1 cを複合糖質前駆 体と して用いた。
該複合糖質前駆物質 0. 5mM、 上記 1 ) で取得した I g Gセファロ—ス結 合 1，3 -ガラク トシルトランスフェラーゼ 0. 5 U、 実施例 4で取得した U D P— G a 1 を含む反応液 6 i (5mM) 、 1 00 mM トリス塩酸緩衝液 （p H 7. 9 ) 1 0 mM M n C 12、 2 mM /?—メルカプトエタノールの組成から なる反応液 36 1 を、 32でで 6 5時間放置し、 反応を行った。
反応終了後、 該反応液に蓄積された生成物を下記条件で H P L Cを用いて定量 した。
カラム ： TSKgel 0DS-80TMカラム（4.6mm x 30cm、 T0S0H社製） 液相 ： 0. 02 M酢酸アンモニゥム緩衝液 （p H 4. 0) 温度 ： 50
WILJI ： 1 m 1 z m i n
検出 ：蛍光検出器 （励起波長 320 nm、 放射波長 4 00 nm) 生成物の同定はァミノピリジンで標識したラク トー N—テトラオースと標識さ れた生成物の溶出時間を比較することにより行った。
該反応によ り 0. 1 7mM (0. 1 2 gZ l ) のラク ト一 N—テトラオースが生 成した。 実施例 20. ラク ト一N—ネオテトラオースの生産
実施例 1 9と同様な方法で、 ラク ト一 N—ネオテ トラオースから G 1 c NA c ^ 1-3 G a 1 /? 1-4 G 1 cを調製し、 複合糖質前駆体として用いた。
該複合糖質前駆体 0. 5mM、 1,4 -ガラ ク ト シル ト ラ ンスフヱラ一ゼ （シグ マ社製） 0. 5 U、 実施例 4で取得した UDP— G a 1 を含む反応液 6 ^ 1 ( 5 mM) 、 1 00 mM トリス塩酸緩衝液 （p H 7. 9) 、 1 0mM Mn C l 2、 2 mM メ ルカプトエタノールの組成からなる反応液 36 1 を、 32でで 6 5時間放置し、 反応を行った。
反応終了後、 該反応液に蓄積された生成物を、 実施例 1 9一 2 ) と同様の条件 で、 H P L Cを用いて定 」した。 なお、 生成物の 1ロ1定はァミ ノピリジンで標識し たラク トー Ν—ネオテトラオースと生成物の溶出時間を比較することによ り行つ た。
該反応により、 0. 1 5mM (0. l l g/ 1 ) のラク トー N—ネオテ ト ラオ ースが生成した。 実施例 2 1. ラク ト一N—フコペンタオース IDの生産
a 1,3-フコシル ト ラ ンスフェラ一ゼの結合した I g Gセフ ァ ロ一スはプロティ ン Aの I g G結合領域と α 1，3 -フコシルトランスフヱラーゼとの融合蛋白質をコ —ドしている遺伝子を含むプラスミ ド pAMoA- FT6 [J. Biol. Chem. , 269, 14730 (1994)] で形質転換したナマルバ K J M— 1株から実施例 1 9— 1 ) と同様な方 法で調製し、 a 1,3-フコシルトランスフェラ一ゼの酵素源と して用いた。
ラク トー N—ネオテト ラオース （オッ クスフォー ド ' グライコシステムズ社 製） 0. 2 5mM、 I g Gセファロース結合 a 1，3-フコシルトランスフェラ一ゼ 1. 0 U、 実施例 1 6で取得した GDP— F u cを含む反応液 6 1 ( 0. 2 5 mM) 、 1 00 mM トリス塩酸緩衝液 （p H 7. 9) 、 1 0mM Mn C l 2の 組成からなる反応液 50 1 を、 3 7 で 24時間放置し、 反応を行った。
反応終了後、 該反応液に蓄積された生成物をダイォネックス社製の糖分析装置 (DX- 500 ) にて定量した。 なお、 生成物の同定はラク トー N—フコペン夕 オース ΠΙ (オックスフォード ' グライコシステムズ社製） と生成物の溶出時問を 比較することにより行った。
該反応により、 0. 2 1 mM (0. 1 8 gZ I ) のラク トー N—フコペンタ才 ース HIが生成した。 実施例 2 2. a 1,-4ガラク トシルトランスフェラ一ゼ （ 1 g t C) 発現プラス ミ ドの造成
Neisseria gonorrhoeae (ATCC33084株） 染色体 D N Aを実施例 1と同一の方法 で調製した。
配列番号 24記載のセンス鎖 D N Aプライマーと、 配列番号 2 5記載のアンチ センス鎖 DN Aプライマーを合成した。 該合成 DN Aをプライマーとし、
Neisseria gonorrhoeae (ATCC33084株） 染色体 D N Aを鍩型として前述と同一の 条件で P C Rを行った。
P C R終了後、 エタノール沈殿法により DNAの沈殿を取得した。 該沈殿を 2 0 μ 1の ΤΕに溶解した。 該溶解液 5 μ 1 を用い、 DN Αを制限酵素 H i n d ΠΙ および B a mH Iで切断後、 ァガロースゲル電気泳動により DN A断片を分離し、 ジーンク リーン Πキッ トによ り 1. 0 k bの断片を回収した。 実施例 1一 1 ) で 取得した p PA 3 1 DNA 0. 2 / gを制限酵素 H __n d ΠΙおよび B a m H I で切断後、 ァガロースゲル電気泳動によ り DNA断片を分離し、 同様に 4. 2 k bの断片を回収した。
該 1. O k bの断片および 4. 2 k bの断片をライゲーシヨンキッ トを用いて 1 6でで 1 6時間連結反応を行った。 該連結反応液を用いてェシヱリヒア ' コリ NM522株を常法に従って形質転換し、 該形質転換体をアンピシリ ン 50 gZm
I を含む L B寒天培地に塗布後、 3 0でで一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーより常法に従ってプラスミ ドを抽出し、 1 g t C発現プラスミ ドである p G T 3を得た。 該プラスミ ドの構造を制限酵素消 化により確認した （第 1 5図） 。 実施例 23. グロボトリオースの生産
実施例 4で得たェシヱリヒア · コリ NM522/pNT25/pNT32株、 実施例 2 2で得た ェシヱリヒア . コリ NM522/pGT3株を実施例 2と间様の方法で培養し、 得られた 各々の培養物を遠心分離し湿菌体を取得した。 また、 コリネパクテリゥム ' アン モニァゲネス ATCC21170株を実施例 2と同様の方法で培養し、 得られた培養物を 遠心分離し湿菌体を取得した。 該湿菌体は必要に応じて一 2 0 で保存すること が可能で、 使用前に解凍して用いることができる。
ェシエリ ヒア · コリ NM522/pNT25/pNT32株湿菌体 50 g / 1、 ェシヱリ ヒ ァ ' コリ NM522/pGT3株湿菌体 50 g /し コリネバクテリゥム ' アンモニアゲ ネス ATCC21170株湿菌体 1 50 g Z l、 フルク ト一ス 1 00 g/ l、 ガラク トース 1 00 g 、 ラク ト一ス 1 00 g/ l、 KH2PO4 1 5 g/ l、 M g S 04 · 7 H20 5 g/ l、 フィチン酸 5 g/ l、 ォロッ ト酸 （カリ ゥム塩） 1 0 g 、 ナイミ一ン S— 2 1 5 4 gZし キシレン l Om l Z lの組成か らなる反応液 30 m 1 を 200 m 1容ビ一カーに入れ、 この反応液をマグネティ ック . スターラーにて攪拌 （ 900 r p m) し、 32でで 36時間反応を行った c 反応中は 4 N N a OHを用いて該反応液の p Hを 7. 2に維持し、 必要に応 じてガラク トース、 ラク ト一ス、 フルク トース、 KH2P 04を添加した。
該反応により、 反応液中に 1 88 gZ 1のグロボトリオースが生成した。
該反応液から遠心分離により菌体を除去し、 得られた上清 1 Om lから、 活性 炭を用いる方法により精製を行い、 グロボトリオースの白色粉末 1. 5 gを得た ( 実施例 2 4. G a 1 " レ 4 G a 1 /? 1- 4 G 1 c N A cの生産
実施例 4で得たェシヱリヒア ' コリ NM522/PNT25/pNT32株、 実施例 2 2で得た ェシヱリヒア ' コリ NM522/pGT3株を実施例 2と同様の方法で培養し、 得られた 各々の培養物を遠心分離し湿菌体を取得した。 また、 コリネパクテリゥム . アン モニァゲネス ATCC21170株を実施例 2と同様の方法で培養し、 得られた培養物を 遠心分離し湿菌体を取得した。 該湿菌体は必要に応じて一 2 0°Cで保存すること が可能で、 使用前に解凍して用いることができる。
ェシヱリ ヒア ' コリ NM522/pNT25/pNT32株湿菌体 5 0 gZ l、 ェシヱリ ヒ ァ ' コリ NM522/pGT3株湿菌体 5 0 g / 、 コリネバクテリ ゥム ' アンモニアゲ ネス ATCC21170株湿菌体 1 5 0 g ノ 1 、 フルク トース 5 0 gZし ガラク ト —ス 5 0 gZ l 、 N—ァセチルラク トサミ ン 96 g /し KH2 P〇4 1 5 g 1、 Mg S 04 · 7 H20 5 g/ 1 , フィチン酸 5 g 、 ォロッ ト酸 （カリ ゥム塩） 1 0 gZ l、 ナイ ミーン S— 2 1 5 4 g/ 1 , キシレン 1 0m lノ 1の組成からなる反応液 3 0m 1 を 2 00 m 1容ビーカーに入れ、 この反応液を マグネティ ック · スターラ一にて攪拌 （ 9 00 r pm) し、 3 2 °Cで 2 3時問反 λじ、 ¾r fiつた。
反応中は 4 N N a 0Hを用いて該反応液の p Hを 7. 2に維持し、 必要に応 じてガラク ト一ス、 フルク ト一ス、 KH2P 04を添加した。
該反応によ り、 反応液中に l O gZ lの G a 1 α 1-4 G a 1 /? 1-4 G 1 c N A cが生成した。
該反応液から遠心分離により菌体を除去し、 得られた上清 3 O m 1から、 活性 炭を用いる方法により生成物を精製し、 G a 1 。 1 - 4 G a 1 /3 1- 4 G 1 c N A c の白色粉末 0. 2 gを得た。 実施例 2 5· /? 1，4-ガラク トシル トランスフェラ一ゼ （ 1 g t B) 発現プラスミ ドの造成
配列番号 2 6記載のセンス鎖 DNAプライマーと配列番号 2 7記載のアンチセ ンス鎖 DN Aプライマ一を合成した。 該合成 DN Aをプライマ一とし、 .
gonorrhoeae (ATCC33084株） 染色体 D N Aを铸型として前述と同一の条件で P C Rを行った。
P C R終了後、 エタノール沈殿法により DN Aの沈殿を取得した。 該沈殿を 2 0 μ 1の Τ Εに溶解した。 該溶解液 5 / 1 を用い、 DNAを制限酵素 H i n d ΙΠ および B a mH Iで切断後、 ァガロースゲル電気泳動により DN A断片を分離し、 ジーンクリーン Πキッ トによ り 0. 8 k bの断片を回収した。 pBluescriptll SK+ DNA 0. 2 gを制限酵素 H— i n d ΠΙおよび B a mH I で切断後、 ァガロ ースゲル電気泳動によ り DNA断片を分離し、 同様に 3. O k bの断片を回収し た。
該 0. 8 k bおよび 3. 0 k bの断片をライゲーシヨ ンキッ トを用いて 1 6で、 1 6時間連結反応を行った。 該連結反応液を用いてェシヱリヒア · コリ NM522株 を常法に従って形質転換し、 該形質転換体をアンピシリン 5 O g/m 1 を含む L B寒天培地に塗布後、 3 0でで一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーより常法に従ってプラスミ ドを抽出し、 1 g t B遺伝了-を含むプラスミ ドである p NT 6 0 Pを得た。 該プラスミ ドの構造 を制限酵素消化により確認した （第 1 6図） 。
該 p NT 6 0 P DN A 0. 5 gを制限酵素 C に a Iおよび B a m H Iで切 断後、 ァガロースゲル電気泳動により DN A断片を分離し 0. 8 k bの断片を回 収した。 実施例 1 — 1 ) で取得した p P AC 3 1 DN A 0. 2 μ gを制限酵素 C 1 a Iおよび B a mH Iで切断後、 ァガロースゲル電気泳動により DN A断片 を分離し、 同様に 5. 5 k bの断片を回収した。
該 0. 8 k bの断片および 5. 5 k bの断片をライゲ一シヨ ンキッ トを用いて 1 6で、 1 6時間連結反応を行った。 該連結反応液を用いてェシエリヒア ' コリ NM522株を常法に従って形質転換し、 該形質転換体をアンピシリ ン 5 0 gZm 1 を含む L B寒天培地に塗布後、 3 0でで一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーより常法に従ってプラスミ ドを抽出し、 1 g t B発現プラスミ ドである p NT 6 0を得た。 該プラスミ ドの構造を制限酵素 消化により確認した （第 1 6図） 。 实施例 2 6. N—ァセチルラク トサミ ンの生産
実施例 2 5で得たェシヱリ ヒア · コリ NM522/pNT60株、 実施例 3で得たェシェ リヒア ' コリ NM522/pNT25株を実施例 2 と同様の方法で培養し、 得られた各々の 培養物を遠心分離し湿菌体を取得した。 また、 コリネバクテリウム · アンモニア ゲネス ATCC21170株を実施例 2 と同様の方法で培養し、 得られた培養物を遠心分 離し湿菌体を取得した。 該湿菌体は必要に応じて— 2 0でで保存することが可能 で、 使用前に解凍して用いることができる。
ェシエリ ヒア · コリ NM522/pNT25株湿菌体 5 0 gZ l、 ェシエリ ヒア ' コリ NM522/pNT60株湿菌体 5 0 g /し コリネパクテリ ゥム ' アンモニアゲネス ATCC21170株湿菌体 1 5 0 g /し ォロッ ト酸 （カリ ゥム塩） 1 0 gZし フ ルク ト一ス 1 0 0 g/ 、 N—ァセチルダルコサミ ン 1 0 0 g 、 ガラク ト —ス 1 00 gノ 1 、 KH2P 04 1 5 g/ Mg S 04 - 7 H20 5 g/ U フィチン酸 5 gZ l、 ナイ ミーン S— 2 1 5 4 g/ l、 キシレン 1 0 m l / 1の組成からなる反応液 3 0 m 1 を 2 0 0 m 1容ビーカ一に入れ、 この反応液を マグネティ ック · スターラ一にて攪拌 （9 0 0 r p m) し、 3 21：で 3 4時間反 ¾r つた。
反応中 4 N N a OHを用いて、 該反応液の p Hを 7. 2に維持し、 必要に応 じてガラク ト一ス、 フルク トース、 1：112? 04を添加した。
該反応により、 反応液中に 1 1 4 gZ 1の N—ァセチルラク トサミンが生成し た。 実施例 2 7. ラク ト一スの生産
実施例 2 5で得たェシヱリヒア · コリ NM522/pNT60株、 実施例 3で得たェシヱ リヒア . コリ NM522/pNT25株を実施例 2と同様の方法で培養し、 得られた各々の 培養物を遠心分離し湿菌体を取得した。 また、 コリネバクテリゥム ' アンモニア ゲネス ATCC21170株を実施例 2 と同様の方法で培養し、 得られた培養物を遠心分 離し湿菌体を取得した。 該湿菌体は必要に応じて一 2 0°Cで保存することが可能 で、 使用前に解凍して用いることができる。
ェシエリ ヒア ' コリ NM522/pNT25株湿菌体 5 0 g / 1、 ェシヱリ ヒア ' コリ NM522/pNT60株湿菌体 5 0 g /し コリネバクテリゥム ' アンモニアゲネス ATCC21170株湿菌体 1 5 0 gZし ォロッ ト酸 （カリウム塩） 1 0 gZし グ ルコース 1 1 5 gZ l 、 ガラク ト一ス 1 1 5 gZし KH2 P04 1 5 gZし Mg S 04 - 7 H20 5 g/ 1 , フィチン酸 5 g/ l、 ナイ ミ一ン S— 2 1 5 4 gノ 1 、 キシレン l Om l Z l の組成からなる反応液 3 Om 1 を 2 0 O m 1 容ビーカーに入れ、 この反応液をマグネティ ック · スターラーにて攪拌 （ 9 00 r p m) し、 3 2でで 1 5時間反応を行った。
反応中 4 N N a OHを用いて、 該反応液の p Hを 7. 2に維持し、 必要に応 じて KH2P 04を添加した。
該反応により、 反応液中に 4 9 g/ lのラク ト一スが生成した。 実施例 2 8. グロボトリオースの生産
実施例 2 5で得たェシエリ ヒア ' コリ NM522/pNT60株、 実施例 3で得たェシェ リ ヒア ' コリ NM522/pNT25株および実施例 2 で得たェシエリヒア ' コリ NM522/pGT3を実施例 2と同様の方法で培養し、 得られた各々の培養物を遠心分離 し湿菌体を取得した。 また、 コリネパクテリゥム ' アンモニアゲネス ATCC21170 株を実施例 2と同様の方法で培養し、 得られた培養物を遠心分離し湿菌体を取得 した。 該湿菌体は必要に応じて _ 2 0°Cで保存することが可能で、 使用前に解凍 して用いることができる。
ェシエリヒア · コリ NM522/pNT25株湿菌体 5 0 g / 1 、 ェシエリ ヒア ' コリ NM522/pNT60株湿菌体 5 0 gZし ェシヱリ ヒア ' コリ NM522/pGT3株湿菌体 5
0 g/ U コリ ネバクテリ ゥム ' アンモニアゲネス ATCC21170株湿菌体 1 5 0 g/ l、 ォロッ ト酸 （カリ ウム塩） 1 0 g/ l、 グルコース 1 1 5 g /し ガ ラク トース 1 1 5 g/ 、 KH2P 04 1 5 gZ l、 Mg S 04 ' 7 H20 5 g /し フィチン酸 5 g/ l、 ナイ ミーン S— 2 1 5 4 gZ l、 キシレン 1 0 m 1 / 1の組成からなる反応液 3 0m 1 を 200 m 1容ビーカーに入れ、 この反 応液をマグネティ ック · スターラーにて攪拌 （900 r pm) し、 32でで 1 3 時間反応を行った。
反応中 4 N N a OHを用いて、 該反応液の p Hを 7. 2に維持し、 必要に応 じて KH2P04を添加した。
該反応により、 反応液中に 5 1のグロボトリオースが生成した。 産業上の利用可能性
本発明により、 ヌクレオチドの前駆物質および糖のみを原料にして糖ヌクレオ チドを、 該糖ヌクレオチドおよび複合糖質前駆物質から複合糖質を工業的に効率 よ く製造できる。
配 列 表
配列番号： 1
配列の長さ ： 31
配列の型：核酸
トポロジー ： 一本鎖
配列の種類：他の核酸、 合成 DNA
配列
GGAGAAAGCT TATGGCTGCC ATTAATACGA A 31 配列番号： 2
配列の長さ ： 30
配列の型：核酸
トポロジ一 ： 一本鎖
配列の種類：他の核酸、 合成 DNA
配列
AACACGGATC CGGATGHAC TTCTTAATGC 30 配列番号： 3
配列の長さ ： 28
配列の型：核酸
トポロジ— ：一本鎖
配列の種類：他の核酸、 合成 DNA
配列
ATGGAGGATC CTGCTCTGTA TACCGTCT 28 配列番号： 4
配列の長さ ： 20 配列の型：核酸
トポロジー ：一本鎖
配列の種類：他の核酸、 合成 DNA
配列
TGCTGGTCGA CCTGCGCTTG 20 配列番号： 5
配列の長さ ： 31
配列の型：核酸
トポロジ— ： -一本鎖
配列の種類：他の核酸、 合成 DNA
配列
AAGGAAAGCT TATGACGCAA TTTAATCCCG T 31 配列番号： 6
配列の長さ ： 20
配列の型：核酸
トポロジー ： 一本鎖
配列の種類：他の核酸、 合成 DNA
配列
GCAAAGTTAA CAGTCGGTAC 20 配列番号： 7
配列の長さ ： 31
配列の型：核酸
トポロジー ： 一本鎖
配列の種類：他の核酸、 合成 DNA 配列
TCAGGAAGCT TATGHGAAT AATGCTATGA G 31 配列番号： 8
配列の長さ ： 27
配列の型：核酸
トポロジ一 ： 一本鎖
配列の種類：他の核酸、 合成 DNA
配列
TCTCCGGATC CCATGTGACC GGGHAG 27 配列番号： 9
配列の長さ ： 28
配列の型：核酸
トポロジ一 ： 一本鎖
配列の種類：他の核酸、 合成 DNA
配列
TCTAAATCGA TGCAGACAAA GGACAAAG 28 配列番号： 10
配列の長さ ： 27
配列の型：核酸
トポロジー ：一本鎖
配列の種類：他の核酸、 合成 DNA
配列
TTGCAGGATC CTCGTAGGCC TGATAAG 27 配列番号： 11
配列の長さ ： 20
配列の型：核酸
トポロジー ：一本鎖
配列の種類：他の核酸、 合成 DNA
配列
TGATATCCGC TCCCTTTCCG 20 配列番号： 12
配列の長さ ： 26
配列の型：核酸
トポロジー ： 一本鎖
配列の種類：他の核酸、 合成 DNA
配列
ACAGCGGATC CGATGTGTTC GCTGAG 26 配列番号： 13
配列の長さ ： 29
配列の型：核酸
トポロジー ： 一本鎖
配列の種類：他の核酸、 合成 DNA
配列
ACAGCAAGCT THGACTTTA GCGGAGCAG 29 配列番号： 14
配列の長さ ： 29
配列の型：核酸 トポロジー ：一本鎖
配列の種類：他の核酸、 合成 DNA
配列
GAG GGATC CCGATATAAA AGGAAGGAT 29
配列番号： 15
配列の長さ ： 25
配列の型：核酸
トポロジ— ： 一本鎖
配列の種類：他の核酸、 合成 DNA
配列
TTTTTAAGCT TCATTTATCA AGAGT 28
配列番号： 16
配列の長さ ： 31
配列の型：核酸
トポロジ— ： 一本鎖
配列の種類：他の核酸、 合成 DNA
配列
TTTnGATAT CCCCAATGCT GGGGGTTTTT G 31
配列番号： 17
配列の長さ ： 31
配列の型：核酸
トポロジー ：一本鎖
配列の種類：他の核酸、 合成 DNA
配列 CGTCAAAGCT TAAATGATAT TCGGGGATAA T 31
配列番号： 18
配列の長さ ： 25
配列の型：核酸
トポロジ— ： 一本鎖
配列の種類：他の核酸、 合成 DNA
配列
AGGGAGGATC CGACATTACT CGTTC 25 配列番号： 19
配列の長さ ： 33
配列の型：核酸
トポロジー ： 一本鎖
配列の種類：他の核酸、 合成 DNA
配列
CCGCAAGATC TCGTAAAAAG GGTATCGATA AGC 33 配列番号： 20
配列の長さ ： 27
配列の型：核酸
トポロジー ： 一本鎖
配列の種類：他の核酸、 合成 DNA
配列
TTGGGAAGCT TCCGGCAAAT GTGGTTT 27 配列番号： 21 配列の長さ ： 25
配列の型：核酸
トポロジー ： 一本鎖
配列の種類：他の核酸、 合成 DNA
配列
ATAAACTCGA GAGAGACAAG CGGAG 25 配列番号： 22
配列の長さ ： 27
配列の型：核酸
トポロジー ： 一本鎖
配列の種類：他の核酸、 合成 DNA
配列
TAHATCGAT GAATTAATAA TTCATAG 27 配列番号： 23
配列の長さ ： 25
配列の型：核酸
トポロジー ：一本鎖
配列の種類：他の核酸、 合成 DNA
配列
CTCTGGATCC AGHACGTAT ΑΛΤΑΤ 25 配列番号： 24
配列の畏さ ： 30
配列の型：核酸
トポロジー ： 一本鎖 配列の種類：他の核酸、 合成 DNA
配列
CGGCAAGCTT ATTGTGCCTT TCCAATAAAA 30 配列番号： 25
配列の長さ ： 28
配列の型：核酸
トポロジー ：一本鎖
配列の種類：他の核酸、 合成 DNA
配列
ACTTGGATCC CCGTCAATAA ATCTTGCG 28 配列番号： 26
配列の長さ ： 30
配列の型：核酸
トポロジー ：一本鎖
配列の種類：他の核酸、 合成 DNA
配列
GGTAAAGCH ATGCAAAACC ACGTTATCAG 30 配列番号： 27
配列の長さ ： 29
配列の型：核酸
トポロジ一 ：一本鎖
配列の種類：他の核酸、 合成 DNA
配列
AAACGGATCC TTAHGGAAA GGCACAATA 29

Claims

請求の範囲
1 . a ) ヌクレオチドの前駆物質からヌクレオシドー 5 ' —三リン酸 （以 下、 N T Pと略す） を生産する能力を有する微生物の培養液または該培養液の処 理物、 および b ) 糖と N T Pから糖ヌク レオチドを生産する能力を有する微生物 の培養液または該培養液の処理物、 を酵素源として用い、 これら酵素源、 ヌク レ ォチドの前駆物質および糖を水性媒体中に存在せしめ、 該水性媒体中に糖ヌクレ ォチドを生成蓄積させ、 該水性媒体中から糖ヌクレオチドを採取することを特徴 とする糖ヌクレオチドの製造法。
2 . a ) ヌクレオチ ドの前駆物質からヌクレオシド _ 5， 一三リン酸 （以 下、 N T Pと略す） を生産する能力を有する微生物の培養液または該培養液の処 理物、 b ) 糖と N T Pから糖ヌ ク レオチドを生産する能力を有する微生物の培養 液または該培養液の処理物、 および c ) 糖ヌ クレオチ ドと複合糖質前駆物質から 複合糖質を生産する能力を有する微生物、 動物細胞あるいは昆虫細胞の培養液ま たは該培養液の処理物、 を酵素源として用い、 これら酵素源、 ヌク レオチ ドの前 駆物質、 糖および複合糖質前駆物質を水性媒体屮に存在せしめ、 該水性媒体中に 複合糖質を生成蓄積させ、 該水性媒体中から複合糖質を採取することを特徴とす る複合糖質の製造法。
3 . 糖ヌクレオチドと複合糖質前駆物質から複合糖質を生産する能力を有 する微生物、 動物細胞あるいは昆虫細胞の培養液または該培養液の処理物を酵素 源として用い、 該酵素源、 複合糖質前駆物質および請求 Φ 1記載の製造法により 得られた糖ヌクレオチドを水性媒体中に存在せしめ、 該水性媒体中に複合糖質を 生成蓄積させ、 該水性媒体中から複合糖質を採取することを特徴とする複合糖質 の製造法。
4 . 培養液の処理物が、 培養液の濃縮物、 培養液の乾燥物、 培養液を遠心 分離して得られる培養上清、 該培養上清の濃縮物、 培養上清から得られる酵素標 品、 培養液を遠心分離して得られる細胞、 該細胞の乾燥物、 該細胞の凍結乾燥物. 該細胞の界面活性剤処理物、 該細胞の超音波処理物、 該細胞の機械的摩碎処理物.
-82- 訂正された用紙 (規則 91) 該細胞の溶媒処理物、 該細胞の酵素処理物、 該細胞の蛋白質分画物、 該細胞の固 定化物あるいは該細胞より抽出して得られる酵素標品であることを特徴とする、 請求項 1、 2または 3記載の製造法。
5 . ヌクレオチドの前駆物質が、 ォロッ ト酸、 ゥラシル、 ォロチジン、 ゥ リジン、 シ トシン、 シチジン、 アデニン、 アデノシン、 グァニン、 グアノシン、 ヒポキサンチン、 イノシン、 キサンチン、 キサン トシン、 イノシン一 5， ——リ ン酸、 キサン トシンー 5， ——リ ン酸、 グアノシン一 5， ——リ ン酸、 ゥリジン 一 5， 一一リン酸またはシチジン一 5， 一一リン酸である請求項 1 または 2記載 の製造法。
6 . 糖ヌクレオチド力 ゥリジン二リン酸化合物、 グアノシン二リン酸化 合物またはシチジン一リン酸化合物である、 請求項 1、 2または 3記載の製造法
7 . ゥリジン二リ ン酸化合物、 グアノシン二リ ン酸化合物およびシチジン 一リン酸化合物が、 ゥリジン二リ ン酸グルコース、 ゥリジン二リン酸ガラク トー ス、 ゥリジン二リ ン酸一 N—ァセチルグルコサミ ン、 ゥリジン二リ ン酸一 N—ァ セチルガラク トサミ ン、 ゥリ ジン二リ ン酸グルクロン酸、 グアノシンニリ ン酸マ ンノース、 グアノシン二リ ン酸フコース、 シチジン一リ ン酸一 N—ァセチルノィ ラミン酸およびこれらの誘導体から選ばれる化合物である、 請求項 6記載の製造 法。
8 . 糖力？、 グルコース、 フルク ト一ス、 ガラク ト一ス、 グルコサミ ン、 N —ァセチルグルコサミ ン、 N—ァセチルガラク トサミ ン、 マンノース、 フコース、 N—ァセチルマンノサミ ン、 ァセチルノイラ ミ ン酸およびこれらの誘導体から選 ばれる糖である、 請求項 1 または 2記載の製造法。
9 . 複合糖質が、 グルコース、 ガラク トース、 N—ァセチルグルコサミ ン、 N—ァセチルガラク トサミ ン、 グルクロン酸、 マンノース、 N—ァセチルマンノ サミ ン、 フコース、 シアル酸、 ラク ト一ス、 N—ァセチルラク トサミ ン、 ラク ト —N—ビオース、 G l c N A c /? l— 3 G a l /? l— 4 G l c、 G 1 c N A c /? 1-4 G a 1 β 1-4 G 1 c、 グロボト リオース、 G a 1 a 1-4 G a 1 β 1-4 G 1 c N A c , 2，-フコシルラク トース、 3-フコシルラク ト—ス、 3，-シァリ ルルラク トース、 6'—シァリ ルルラク トース、 3'-シァリ ル一 N—ァセチルラク トサミ ン、 6， -シァリ ルー N—ァセチルラク トサミ ン、 シァリルラク ト 一 N—ビオース、 ルイ ス X、 ル イス a、 ラク ト一 N—テ トラオース、 ラク ト一 N—ネオテ ト ラオース、 ラ ク トジ フコテ ト ラオース、 3，-シァリ ル 3-フコシルラク ト—ス、 シァリ ルルイス X、 シ ァリ ルルイス a、 ラク ト一 N—フコペン夕オース I、 ラク ト 一 N—フコペン夕ォ —ス Π、 ラク トー Ν—フコペン夕オース ΠΙ、 ラク ト 一N—フコペン夕オース V、 LS-テ ト ラサッ カライ ド a、 LS-テ ト ラサッ カライ ド b、 LS-テ ト ラサッ カライ ド (： 、 （α 2， 3) シァリ ルラ ク ト 一 Ν_ネオテ ト ラオース、 ラク ト一 Ν—ジフコ へキサオース I、 ラク ト _Ν—ジフコへキサオース Π、 ラク ト一Ν—へキサォ一 ス、 ラク トー Ν—ネオへキサオース、 ジシァリ ルラク ト一 Ν—テ ト ラオースおよ びこれらの誘導体から選ばれる糖を 1あるいはそれ以上含有する複合糖質または 該複合糖質を含む複合糖質である、 請求項 2または 3記載の製造法。
1 0. 複合糖質が、 G a l /? 1 - 3 G l c、 G a l ^ l - 4 G l c、 G a l /? 1— 3 G 1 c N A c、 G a 1 /? 1-4 G 1 c N A c , G a 1 /? 1-3 G a G a l /? 1一 4 G a l、 G a 1 β 1-3 G a I NA c , G a l ^ l-4 G a l NA c , G a l ひ 1- 3 G 1 c、 G a 1 a 1-4 G 1 c , G a 1 a 1-3 G l c NA c , G a l a 1-4 G l c NA c、 G a l a 1—3 G a l 、 G a 1 a 1-4 G a 1 , G a 1 a 1-3 G a 1 N A c、 G a l a 1-4 G a l NA c , G l c NA c ^ 1-3 G a G l c NA c /3 1-4 G a し G l c NA c /? l-6 G a l、 G l c NA c /3 1-3 G l c、 G l c N A c 1- 4 G 1 c、 G 1 c N A c /? 1- 3 G 1 c N A c、 G 1 c N A c /? 1- 4 G 1 c NA c、 G l c NA c /? l— 6 G a l NA c、 G l c NA c /3 1— 2 Ma n、 G l c NA c l - 4M a n、 G l c NA c /? l-6Ma n, G a l NA c /? l— 3 G a l、 G a l NA c ^ l-4 G a l , G a l NA c /3 1- 4 G l c NA c、 G a 1 N A c a 1-3 G a l NA c、 Ma n 1-4 G 1 c NA c、 Ma nひ 1—6 Ma n, M a n " 1-3 Ma n, M a n a 1-2 M a n , G l c UA 1-4 G l c N、 G 1 c U A /? 1- 3 G a U G 1 c U A /? 1-3 G 1 c N A c , G l c UA /? 1-3 G a I NA c , N e u A c 2-3 G a 1 , N e u A c c 2-6 G a 1 , N e u A c a 2-3 G l c NA c、 N e u A c a 2-6 G l c NA c , N e u A c a -3 G a l NA c, N e u A c a 2-6 G a 1 A c ^ N e u A c ひ 2- 8 N e u A c、 F u c a 1-3 G 1 c , F u c ひ 1一 4 G l c、 F u c ひ l-3 G l c NA c、 F u c ひ l-4 G l c NA c、 F u c ひ 1-2 G a 1および F u c a 1-6 G 1 c N A cから選ばれる結合を有する糖 を含む複合糖質または該複合糖質を含む複合糖質である、 請求項 2または 3記載 の製造法。
1 1. 複合糖質に含まれる糖が 1 0個以下である、 請求項 9または 1 0記 載の方法。
1 2. 複合糖質に含まれる糖が 6個以下である、 請求項 9または 1 0記載 の方法。
1 3. 複合糖質前駆物質が、 単糖、オリゴサッカライ ド、 蛋白質、 ぺプチ ド、 脂質、 糖蛋白質、 糖脂質、 グリコペプチドおよびステロイ ド化合物から選ば れる複合糖質前駆物質である、 請求項 2または 3記載の製造法。
1 4. 複合糖質前駆物質が、 グルコース、 ガラク トース、 マンノース、 シ アル酸、 N—ァセチルダルコサミ ン、 N—ァセチルガラク トサミ ン、 ラク ト一ス、 N—ァセチルラク トサミ ン、 ラク ト一 N—ビオース、 G l c N A c /3 1-3 G a 1 1— 4 G 1 c、 G 1 c N A c ^ 1-4 G a 1 ^ 1-4 G 1 c Λ グロボト リ オース、 G a 1 ひ 1— 4 G a 1 /? 1— 4 G 1 c N A c、 2，ーフコシルラク ト一ス、 3—フコシルラク トース、 3， -シァリ ルラク ト—ス、 6，-シァリ ルラク ト—ス、 3，-シァリ ル一 N—ァ セチルラク トサミ ン、 6，-シァリ ル一 N—ァセチルラク トサミ ン、 シァリ ルラ ク トー N—ビオース、 ルイス X、 ルイス a、 ラク トー N—テ ト ラオース、 ラク トー N—ネオテ ト ラオース、 ラク ト ジフコテ ト ラオース、 3，-シァリ ル- 3-フコシルラ ク トース、 シァリ ルルイス X、 シァリ ルルイス a、 ラク ト 一 N—フコペンタォー ス I、 ラク ト 一N—フコペン夕オース Π、 ラク トー N—フコペンタオース ΠΙ、 ラ ク ト 一 Ν—フコペン夕オース V、 LS-テ ト ラサッ カライ ド a、 LS-テ ト ラサッカラ イ ド b、 LS -テ ト ラサッ カライ ド（： 、 （ な 2 , 3 ) シァリルラク ト一 N—ネオテ トラオースおよびこれらの誘導体、 セリ ン、 スレオニン、 ァスパラギンおよび該 アミノ酸を含有するペプチドおよびその誘導体、 セラミ ドおよびその誘導体から 選ばれる複合糖質前駆物質または該複合糖質前駆物質を含む複合糖質前駆物質で ある、 請求項 1 3記載の製造法。
1 5. ヌクレオチドの前駆物質から NT Pを生産する能力を有する微生物 力 ί、 コリネバクテリゥム属に属する微生物から選ばれる微生物であることを特徴 とする、 請求項 1または 2記載の製造法。
1 6. コリネパクテリゥム属に属する微生物力;、 コリネバクテリウム - ァ ンモニァゲネスであることを特徴とする諮-求頃 1 5記載の製造法。
1 7. 糖と ΝΤΡから糖ヌクレオチドを生産する能力を有する微生物が、
1種類ないしそれ以上の微生物より構成されることを特徴とする、 請求項 1 また は 2記載の製造法。
1 8. 微生物が、 ェシエリヒア属およびコリネパクテリゥム厲に属する微 生物から選ばれる 1種類ないしそれ以上の微生物であることを特徴とする、 請求 項 1 7記載の製造法
1 9. ェシエリヒァ属に属する微生物がェシヱリ ヒア ' コリである、 請求 項 1 8記載の製造法。
20. コリネバクテリウム属に属する微生物力 コリネバクテリゥム ' ァ ンモニァゲネスである、 請求頃 1 8記載の製造法。
2 1. 糖と NT Ρから糖ヌクレオチドを生産する能力を有する微生物が、 グルコキナーゼ （以下、 g I kと略す） 、 ホスホグルコムタ一ゼ （以下、 p gm と略す） 、 グルコース一 1一リン酸ゥリジルトランスフェラーゼ （以下、 g a 1 Uと略す） およびピロフォスファターゼ （以下、 p p aと略す） から選ばれる 1 つ以上の酵素の活性の強い微生物であることを特徴とする、 請求項 1または 2記 載の製造法。
22. 微生物が、 g 1 kをコードする遺伝子、 p gmをコー ドする遺伝子、 g a 1 Uをコードする遣伝子および P p aをコ一ドする遺伝子から選ばれる 1種 類以上の遺伝子を含む DN A断片とベクタ一との組換え体 DN Aを保有する 1種 類以上の微生物から構成されることを特徴とする、 請求項 2 1記載の製造法。
23. g 1 kをコ一ドする遺伝子、 p gmをコードする遺伝子、 g a 1 U をコードする遺伝子および p p aをコードする遺伝子が、 ェシエリヒア ' コリ由 来の遺伝子であることを特徴とする、 請求項 22記載の製造法。
24. 糖ヌクレオチドがゥリジンニリン酸グルコースである、 請求項 2 1 記載の製造法。
2 5. 微生物がゥリジン二リン酸グルコースデヒ ドロゲナ一ゼ活性の強い 微生物であり、 糖ヌクレオチドがゥリジン二リン酸グルクロン酸である、 請求項 2 1記載の製造法。
26. 糖と NTPから糖ヌクレオチドを生産する能力を有する微生物が、 ガラク トキナーゼ （以下、 g a 1 Kと略す） 活性の強い微生物であることを特徴 とする、 請求項 1または 2記載の製造法。
2 7. 請求項 26記載の g a 1 K活性の強い微生物により、 N—ァセチル グルコサミ ンを基質にして N—ァセチルグルコサミン一 1—リン酸が供給される ことを特徴とする、 請求項 26記載の製造法。
2 8. 微生物が、 g a 1 Kをコードする遺伝子を含む DNA断片とベクタ —との組換え体 DN Aを保有する 1種類以上の微生物から構成されることを特徴 とする、 請求項 26記載の製造法。
29. g a l Kをコードする遺伝子がェシヱリヒア ' コリ由来の遺伝子で あることを特徴とする、 請求項 28記載の製造法。
30. 糖と NTPから糖ヌクレオチドを生産する能力を有する微生物が、 ガラク ト一ス一 1—リン酸ゥリジルトランスフェラーゼ （以下、 g a 1 Tと略 す） 活性の強い微生物であることを特徴とする、 請求項 26記載の製造法。
3 1. 微生物が、 g a 1 Τをコードする遺伝子を含む DN Α断片とベクタ 一との組換え体 DN Aを保有する 1種類以上の微生物から構成されることを特徴 とする、 請求項 3 0記載の製造法。
32. g a l Tをコードする遺伝子がェシヱリヒア · コリ由来の遺伝子で あることを特徴とする、 請求項 3 1記載の製造法。
33. 糖と NT Pから糖ヌクレオチドを生産する能力を有する微生物が、 グルコキナーゼ （以下、 g 1 kと略す） 、 ホスホグルコムタ一ゼ （以下、 p gm と略す） 、 グルコース一 1—リ ン酸ゥリジル トランスフェラーゼ （以下、 g 1 Uと略す） およびピロフォスファタ一ゼ （以下、 p p aと略す） から選ばれる 1 つ以上の酵素の活性の強い微生物であることを特徴とする、 請求項 30記載の製 造法。
34. 微生物が、 g 1 kをコードする遣伝子、 p gmをコードする遺伝子、 g a 1 Uをコ一 ドする遣伝子および p p aをコ一 ドする遺伝子から選ばれる 1種 類以上の遺伝子を含む DN A断片とべクタ一との組換え体 DN Aを保有する 1種 類以上の微生物から構成されることを特徴とする、 請求頃 33記載の製造法。
3 5. g 1 kをコードする遗伝子、 p g mをコードする遺伝子、 g a 1 U をコ一ドする遺伝子および p p aをコードする遺伝子ェシェリヒア ' コリ由来の 遺伝子であることを特徴とする、 請求項 34記載の製造法。
36. 糖ヌクレオチドがゥリジン二リン酸ガラク トースである、 請求項 3 0または 3 3記載の製造法。
37. 糖と NT Pから糖ヌクレオチドを生産する能力を有する微生物が、 N—ァセチルグルコサミ ン一 1—リ ン酸ゥリ ジルトランスフェラ—ゼ （以下、 g l mUと略す） 活性の強い微生物であることを特徴とする、 請求項 26記載の製 造法。
38. 微生物が、 g 1 mUをコードする遺伝了-を含む DNA断片とベクタ —との組換え体 DN Aを保有する 1種類以上の微生物から構成されることを特徴 とする、 請求項 3 7記載の製造法。
39. g l mUをコ一ドする遺伝子がェシヱリ ヒア · コリ由来の遺伝子で あることを特徴とする、 請求項 38記載の製造法。
4 0. 糖と NTPから糖ヌクレオチドを生産する能力を有する微生物が、 ホスホグルコムタ一ゼ （以下 p gmと略す） およびホスホフルク トキナ一ゼ （以 下、 p f k Bと略す） 活性の強い微生物であることを特徴とする、 請求頃 1また は 2記載の製造法。
4 1. 微生物が、 p gmをコードする遺伝子、 p f k Bをコードする遺伝 子から選ばれる 1種類以上の遺伝子を含む DN A断片とベクタ一との組換え体 D N Aを保有する 1種類以上の微生物から構成されることを特徴とする、 請求項 4 0記載の製造法。
42. p gmをコードする遺伝子、 p f k Bをコードする遺伝子がェシヱ リヒア ' コリ由来の遺伝子であることを特徴とする、 請求項 4 1記載の製造法。
43. 請求項 4 0記載の p gmおよび p f k B活性の強い微生物により、 グルコース一 6—リ ン酸およびフルク トース一 6—リ ン酸を基質にして、 グルコ —ス _ 1， 6—二リン酸が供給されることを特徴とする、 請求項 4 0記載の製造 法。
44. 請求項 4 3記載の方法によ り供給されたグルコース一 1， 6—二リ ン酸によ り、 ホスホグルコサミ ンムタ一ゼまたはホスホマンノムタ一ゼ活性が増 強されることを特徴とする、 請求項 4 3記載の製造法。
45. 糖と NT Pから糖ヌクレオチドを生産する能力を有する微生物が、 グルコサミ ン _ 1ーリ ン酸ァセチルトランスフェラ一ゼ、 N—ァセチルグルコサ ミ ンー 1一リ ン酸ゥリジルトランスフェラ一ゼ （以下、 g 1 m Uと略す） 、 ピ口 フォスファタ一ゼ （以下、 p p aと略す） 、 ホスホダルコサミ ンムタ一ゼ （以下、 g 1 mMと略す） 、 グルコキナーゼ （以下、 g 1 kと略す） から選ばれる 1っ以 上の酵素の活性の強い微生物であることを特徴とする、 請求項 4 0記載の製造法。
46. 微生物が、 g l mUをコー ドする遺伝子、 p p aをコードする遺伝 子、 g 1 mMをコ一ドする遺伝子および g 1 kをコードする遺伝子から選ばれる 1種類以上の遺伝子を含む D N A断片とベクターとの組換え体 DNAを保有する 1種類以上の微生物から構成されることを特徴とする、 請求 ¾4 5記載の製造法。
4 7. g 1 mUをコー ドする遺伝子、 p p aをコー ドする遗伝子、 g l m Mをコー ドする遺伝子および g 1 kをコードする遺伝子がェシヱリヒア · コリ由 来の遺伝子であることを特徴とする、 請求項 4 6記載の製造法。
4 8. 糖ヌクレオチドがゥリジン二リ ン酸 _ N—ァセチルグルコサミ ンで ある、 請求項 2 6、 3 7、 4 0または 4 5記載の製造法。
4 9. 微生物が U D P— G 1 C NA C 4 —ェピメラーゼ活性の強い微生物 であり、 糖ヌクレオチドがゥリジンニリン酸一 N—ァセチルガラク トサミ ンであ る、 請求項 2 6、 3 7、 4 0または 4 5記載の製造法。
5 0. 糖と NT Pから糖ヌクレオチドを生産する能力を有する微生物が、 ホスホマンノムターゼ （以下、 m a n Bと略す） 、 マンノース一 1ーリン酸グァ ニルト ランスフェラ一ゼ （以下、 m a n Cと略す） 、 グルコキナーゼ （以下、 g
1 kと略す） から選ばれる 1つ以上の酵素の活性の強い微生物であることを特徴 とする、 請求項 4 0記載の製造法。
5 1. 微生物が、 m a n Bをコードする遺伝子、 m a n Cをコードする遣 伝子、 g 1 kをコ一ドする遺伝子から選ばれる 1種類以上の遺伝子を含む DN A 断片とベクタ一との組換え体 DN Aを保有する 1種類以上の微生物から構成され ることを特徴とする、 請求項 50記載の製造法。
5 2. m a n Bをコードする遺伝子、 m a n Cをコードする逍伝子、 g 1 kをコ一ドする遺伝子がェシヱリヒア . コリ由来の遺伝子であることを特徴とす る、 請求項 5 1記載の製造法。
5 3. 糖ヌクレオチドがグアノシン二リン酸マンノ一スである、 請求項 4 0または 5 0記載の製造法。
54. 糖と NT Pから糖ヌクレオチドを生産する能力を有する微生物が、 ホスホマンノムタ一ゼ （以下、 m a n Bと略す） 、 マンノース一 1一リ ン酸グァ ニルトランスフェラ一ゼ （以下、 m a n Cと略す） 、 グルコキナーゼ （以下、 g 1 kと略す） 、 G DP- 4 , 6-マンノースデヒ ドラタ―ゼ （以下、 gm dと略 す） および G D P— 4—ケト _ 6—デォキシマンノース ェピメラーゼ /レダク 夕一ゼ （以下、 w c a Gと略す） から選ばれる 1つ以上の酵素の活性の強い微生 物であることを特徴とする、 請求項 40記載の製造法。
55. 微生物が、 m a n Bをコードする遺伝子、 m a n Cをコードする遺 伝子、 g 1 kをコードする遺伝子、 gmdをコードする遺伝子および wc a Gを コ一ドする遣伝子から選ばれる 1種類以上の遺伝子を含む DN A断片とベクター との組換え体 DN Aを保有する 1種類以上の微生物から構成されることを特徴と する、 請求項 54記載の製造法。
56. ma n Bをコードする遺伝子、 ma n Cをコ一ドする遺伝子、 g 1 kをコ一ドする遺伝子、 gmdをコードする遺伝子および w c a Gをコードする 遺伝子がエシ リヒア · コリ由来の遺伝子であることを特徴とする、 請求項 55 記載の製造法。
57. 糖ヌクレオチドがグアノシンニリン酸フコースである、 請求項 4 0 または 54記載の製造法。
58. 糖と NT Pから糖ヌクレオチドを生産する能力を有する微生物が、 G l c NA c 2—ェピメラ一ゼ、 CMP_N e u A cシンセ夕一ゼ （以下、 n e u Aと略す） 、 N e u A cアルドラーゼ （以下、 n a n Aと略す） 、 N e u A cシンセタ一ゼ （以下、 n e u Bと略す） および C T Pシンセターゼ （以下、 p y r Gと略す） から選ばれる 1つ以上の酵素の活性の強い微生物であることを特 徴とする、 請求項 1または 2記載の製造法。
59. 微生物力、 G l c NA c 2—ェピメラ一ゼをコードする遺伝子、 n e uAをコー ドする遺伝子、 n a nAをコードする遺伝子、 n e u Bをコード する遺伝子および p y r Gをコードする遺伝子から選ばれる 1種類以上の遺伝子 を含む DNA断片とベクターとの組換え体 DNAを保有する 1種類以上の微生物 から構成されることを特徴とする、 請求項 58記載の製造法。
60. n e u Aをコードする遺伝子、 n a n Aをコードする遺伝子、 n e u Bをコードする遺伝子および p y r Gをコードする遺伝子がェシエリヒア - コ リ由来の遺伝子であることを特徴とする、 請求項 59記載の製造法。
6 1. 糖ヌク レオチ ドがシチジン一リ ン酸一 N—ァセチルノイラミ ン酸で ある、 請求項 5 8記載の製造法。
6 2 . 糖ヌクレオチドと複合糖皙前駆物質から複合糖質を生産する能力を 有する微生物が、 ェシエリヒア · コリまたはサッカロマイセス · セレピシェまた はコリネバクテリゥム · アンモニアゲネスであることを特徴とする請求項 2また は 3記載の製造法。
6 3 . 微生物が、 グルコシルトランスフェラ一ゼ、 ガラク トシルトランス フェラーゼ、 N—ァセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、 N—ァセチルガ ラク トサミニルトランスフェラ一ゼ、 グルクロノシルトランスフェラ一ゼ、 マン ノシルトランスフェラ一ゼ、 シァリルトランスフェラ一ゼおよびフコシルトラン スフエラ一ゼから選ばれる トランスフェラーゼをコ一ドする遺伝子を含む D N A 断片とベクターとの組換え体 D N Aを保有する微生物であることを特徴とする、 請求項 6 2記載の製造法。
6 4 . グルコシル トランスフェラーゼ、 ガラク トシルトランスフヱラ一ゼ、 N—ァセチルグルコサミニルトランスフェラ一ゼ、 N—ァセチルガラク トサミニ ルトランスフェラ一ゼ、 グルクロノシルトランスフェラ一ゼ、 マンノシルトラン スフエラーゼ、 シァリルトランスフェラ一ゼおよびフコシルトランスフェラーゼ から選ばれる トランスフヱラーゼをコ一ドする遣伝了-が微生物由来であることを 特徴とする、 請求項 6 3記載の製造法。
6 5 . 動物細胞が、 C O S— 7細胞またはナマルバ K J M— 1細胞であり， 昆虫細胞が S f 9細胞であることを特徴とする、 請求項 2または 3記載の製造法 c
6 6 . 動物細胞あるいは昆虫細胞が、 グルコシル トランスフェラーゼ、 ガ ラク トシルトランスフェラーゼ、 N—ァセチルグルコサミニルトランスフェラ— ゼ、 N—ァセチルガラク トサミニルトランスフェラ—ゼ、 グルクロノシルトラン スフエラ一ゼ、 マンノシルトランスフェラーゼ、 シァリル トランスフェラ一ゼぉ よびフコシルトランスフェラーゼから選ばれる トランスフェラ一ゼをコ一ドする 遺伝子を含む D N A断片とベクタ一との組換え体 D N Aを保有する動物細胞ある いは昆虫細胞であることを特徴とする、 請求 ¾ 2または 3記載の製造法。
6 7 . ダルコシルトランスフェラ一ゼ、 ガラク トシルトランスフェラ一ゼ N—ァセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、 N—ァセチルガラク トサミニ ルトランスフェラ一ゼ、 グルクロノシルトランスフェラ一ゼ、 マンノシルトラン スフエラ一ゼ、 シァリルトランスフェラ一ゼおよびフコシルトランスフェラーゼ から選ばれる トランスフヱラーゼをコードする遺伝子が動物細胞由来であること を特徴とする、 請求項 6 6記載の製造法。
6 8 . 請求項 2 6記載の g a 1 K活性の強い微生物の培養液または該培養 液の処理物を酵素源として用い、 該酵素源および Ν—ァセチルグルコサミンを水 性媒体中に存在せしめ、 該水性媒体中に Ν—ァセチルグルコサミ ンー 1 一リン酸 を生成蓄積させ、 該水性媒体中から Ν—ァセチルグルコサミン— 1 ーリン酸を採 取することを特徴とする Ν—ァセチルグルコサミン一 1—リン酸の製造法。
6 9 . 微生物が、 g a 1 Κをコードする遣伝子を含む D N Α断片とベクタ 一との組換え体 D N Aを保有する微生物である、 請求項 6 8記載の製造法。
7 0 . g a l Kをコ一ドする遺伝子が、 ェシエリヒア · コリ由来のガラク トキナーゼをコ一ドする遺伝子である、 請求項 6 9記載の製造法。
7 1 . 培養液の処理物が、 培養液の濃縮物、 培養液の乾燥物、 培養液を 遠心分離して得られる培養上清、 該培養上清の濃縮物、 培養上清から得られる酵 素標品、 培養液を遠心分離して得られる細胞、 該細胞の乾燥物、 該細胞の凍結乾 燥物、 該細胞の界面活性剤処理物、 該細胞の超音波処理物、 該細胞の機械的摩砕 処理物、 該細胞の溶媒処理物、 該細胞の酵素処理物、 該細胞の蛋白質分画物、 該 細胞の固定化物あるいは該細胞よ り抽出して得られる酵素標品であることを特徴 とする、 請求項 6 8記載の製造法。
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