KR0177841B1

KR0177841B1 - 시티딘 디인산 콜린의 제조방법

Info

Publication number: KR0177841B1
Application number: KR1019930000998A
Authority: KR
Inventors: 아끼히꼬 마루야마; 다쯔로 후지오; 사다오 데시바
Original assignee: 나까무라 간노스께; 교오와학꼬고오교 가부시끼가이샤
Priority date: 1992-01-30
Filing date: 1993-01-27
Publication date: 1999-04-01
Anticipated expiration: 2013-01-27
Also published as: US20020151036A1; CN1060215C; KR930016543A; HK1000604A1; US6387667B1; ES2100376T3; US7226767B2; ATE150487T1; DE69308908D1; EP0553821A1; EP0553821B1; CN1074938A

Abstract

오로트산과 콜린 및/또는 포스포릴콜린으로 부터 CDP-콜린을 제조하는 방법을 제공한다.

콜린 포스페이트 시티딜 트랜스퍼라제 (CCT), 콜린 키나제 (CKI) 및 시티딘 -5'-트리인산리가제 (pyrG)의 효소활성을 갖는 미생물과, 오로트산으로 부터 우리딘 -5'-트리인산을 생성하는 활성을 갖는 미생물을 사용하고, 오로트산과 콜린 및/또는 포스포릴콜린을 기질로서 사용하여 시티딘 디인산 콜린을 제조한다.

Description

시티딘 디인산 콜린의 제조방법

제1도는 플라스미드 pCKG55의 조성 공정을 나타낸다.

제2도는 프라스미드 pCK1에 의해 코딩되는 CCT/CKI 융합 단백의 구조를 나타낸다.

제3도는 플라스미드 pCK1 및 pCK55상의 CCT/CKI 융합 단백을 코딩하는 유전자의 N말단 부분의 염기 배열을 나타낸다.

본 발명은 의약품으로서의 용도를 갖는 시티딘 디인산 콜린 (이하에서는 「CDP-콜린」이라고 약기한다)의 효소적 제조방법에 관한 것이다.

CDP-콜린은 인지질인 포스파티딜 콜린(레시틴)의 생합성 중간체이면, 두부외상, 뇌수술에 수반하는 의식장해, 파킨슨병, 뇌졸중 반신마비 등의 치료에 사용되고 있다.

CDP-콜린의 제조방법으로서는 화학적합성법(일본국 특공소 39-6541호 공보, 특공소 42-1384호 공보, 특공소 63-6558호 공보 등)과 효모 등의 미생물균체를 사용하는 효소법

(특공소 48-2358호 공보, 특공소 48-40757호 공보, 특공소 48-40758로 공보, 특개소 53-109996호 공보, 특개소 54-14593호 공보, 특개소 63-313594호 공보 등)의 2종의 알려져 있다.

이것들의 제조방법에서는 원료로서 시티딘 -5'-모노인산(이하에서는 「CMP」라고 약기한다), 시티딘 -5'- 디인산(이하에서는 「CDP」라 약기한다), 시티딘 -5'- 트리인산(이하에서는 「CTP」라 약기한다), 시토신 등의 시토신계 뉴클레오티드 및 그의 전구체가 사용되고 있는 것이 공통점이다.

이것들의 원료중, 기본적인 원료인 CMP는 주로 RNA (리보핵산) 분해법에 의해 제조되고 있으나, 이 방법에서는 4종의 뉴클레오티드가 동시에 얻어진다. 이 방법은 CMP만을 선택적으로 얻을 수가 없어 효율적인 방법은 아니다.

본 발명은 오로트산과 콜린 및/또는 포스포릴콜린으로부터 CDP콜린을 생성할 수 있는 효소활동을 갖는 미생물의 배양물 또는 배양물의 처리물을 효소원으로서 사용하고, 오로트산과 콜린 및/또는 포스포릴콜린을 기질로서 사용하여 효소적반응을 수행하여 CDP-콜린을 반응하여 축적시키고, 이 반응액으로부터 CDP-콜린을 채취하는 것을 특징으로 하는 CDP-콜린으 제조방법을 제공한다.

본 발명에 의하면 시토신계 뉴클레오티드 및 그의 전구체로 부터가 아니라 공업적으로 입수가 용이한 오로트산으로부터 1단계의 효소처리에 의해 CDP-콜린을 높은 효율로 제조하는 방법을 제공할 수가 있다.

오로트산은 피리미딘계 뉴클레오티드의 전구물질이며, 강간제(强肝濟)로서 사용되고 있다. 코리네박테륨속에 속하는 미생물을 사용한 발효법에 의한 공업적으로 적용가능한 오로트산의 생성방법의 알려져 있다(특개평1-104189로 공보). 본 발명자들은 오로트산을 원료로한 CDP-콜린 의 생산에 관하여 예의 연구를 한 결과, 콜린포스페이트 시티디릴트랜스퍼라제(이하에서는 「CCT」라고 약기한다), 콜린 키나제(이하에서는 「CKI」라고 약기한다), 및 CTP신세타제(이하에서는 「pyrG」라고 약기한다)를 코딩하는 유전자를 함유하는 DNA단편을 벡터 DNA에 삽입하여 조제한 제조합체 DNA를 보유하는 미생물과, 오로트산으로부터 우리딘-5'-트리포스페이트(이하에서는 「UPT」라 약기한다)를 생성하는 활성이 높은 미생물을 혼합하고, 이것들을 효소원으로서 사용하여, 오로트산과 콜린 및/또는 포스포릴콜린을 기질로서 반응시킴으로써, 높은 수율로 CDP-콜린을 생성할 수 있다는 것을 발견하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

본 발명에 따르면, 효소적 반응은 오로트산과 콜린 및/또는 포스포릴콜린으로부터 CDP-콜린을 생성할 수 있는 효소활성을 갖는 미생물의 배양액 또는 그의 처리물을 효소원으로서 사용하고 오로트산과 콜린 및/또는 포스포릴콜린을 기질로서 사용하여 수행되고, 이에 의해 반응액중에 CDP-콜린이 생성축적된다.

오로트산 및 포스포릴 콜린을 기질로한 CDP-콜린은 하기식으로 표시한 바와 같이 (1)내지 (6)의 6단계의 효소반응에 의해 생성된다. 또한, 오로트산 및 콜린을 기질로한 경우, 이것에 다시 (7)의 반응이 필요하게 된다.

그리고, 하기식에 있어서의 약호는 다음과 같다.

OMP:오로티딘-5'-모노인산

UMP:우리딘-5'-모노인산

UMP:우리딘-5'-디인산

UTP:우리딘-5'-트리인산

또한 (1)내지 (7)의 반응을 촉매하는 효소는 하기와 같다.

(1):오로테이트 포스포리보실트랜스퍼라제(EC 2.4.2.10)

(2):OMP 데카르복실라제(EC 4.1.1.23)

(3):뉴클레오시드모노포스페이트 키나제(EC 2.7.4.4)

(5):CTP 신세타제(EC 6.3.4.2)

(6):콜린포스페이트 시티디릴트랜스퍼라제(EC. 2.7.7.15)

(7):콜린 키나제(EC 2.7.1.32)

상기 단계(1)의 반응에 있어서, 포스포리보실 피로인산 (이하에서는「PRPP」라고 약기한다)이 소비되어 피로인산이 발생되며, 상기 단계(3), (4), (5) 및 (7)의 반응에서는 아데노신 -5'- 트리인산 (이하에서는 「ATP」라고 약기한다)이 소비되어 아데노신 -5'- 디인산 (이하에서는 「ADP」라고 한다)이 발생된다.

따라서, 본 발명에서 사용되는 미생물은 상기식에 있어서의 (1) 내지 (7)의 효소활성을 가지며, 또한 PRPP공급능력, ATP재생능력을 갖고 있는 것이 바람직하다. 이 조건을 만족시키는한, 사용되는 미생물의 수는 제한되지 않는다.

예를 들면, 이하에서 설명하는 바와 같이 이들 효소 활성을 2종의 미생물에게 분담시켜서, 이것을 혼합하여 사용하는 방법도 가능하다. 즉 (i)상기 식 (5), (6) 및 (7)의 효소활성을 갖는 미생물 (이하에서는 미생물 A1이라고 한다) 또는 상기식 (5)와 (6)의 효소활성을 갖는 미생물 (이하에서는 미생물 A2라고 한다) (미생물 A1과 A2는 이하에서 때때로 집합적으로 미생물 A라고 한다.); 과 (ii) 상기식의 (1) 내지 (4)의 활성이 충분히 있고, 오로트산으로부터 UTP를 축적하는 것이 가능하며, 바람직하게는 동시에 PRPP 공급능과, ATP 재생능이 강한 미생물 (이하에서는, 미생물 B 라고한다)의 혼합물을 사용할 수 있다.

미생물 A1 또는 미생물 A2로서 바람직한 균주는 유전자 재조합에 의해 이들의 효소활성을 발현강화한 에스케리키아속에 속하는 미생물이다. 더구체적으로는 사카로마이세스·세레비지아 (이하에서는 「효모」라고 약기한다) 유래의 CCT 및 CKI 유전자, 에스케리키아·콜리 (이하에서는 「대장균」이라고 약기한다) 유래의 pyrG 유전자를 함유하는 재조합체 DNA(pCKG 55)를 보유하는 대장균 MM 294주 (FERM BP-526, ATCC33625)를 들수 있다.

CCT 유전자는 효모염색체로부터, 효모 CCT 유전자 결손 변이의 상보를 지표로 클론화되고, 그의 전염기 배역이 결정되어 있다. [Eur. J. Biochem. 169 권, 477∼486 면, 1987년]. CCT 유전자의 급원으로서는 대장균 벡터 pUC 18[Gene, 33권, 103∼119면, 1985년]의 멀티클로닝 사이트의 SmaI 부위에 효모유래의 CCT 유전자를 함유하는 1296 베이스페어(이하에서는 「bp」라고 약기한다)의 DraI 단편이 삽입된 플라스미드 pCC41 [생화학, 60,701 (1988)]등을 들수 있다.

CKI 유전자도 마찬가지로 효모염색체로부터 클론화되고, 그의 전염기 배열이 결정되어 있다 [J. Bio1. Chem., 264권, 2053∼2059면, 1989년]. CKI 유전자의 급원으로서는 효모와 대장균의 셔틀 벡터 YEpM4 [Mo1. Cell. Biol., 7권 3629∼3636면, 1987년]에 효모 유래의 CKI 유전자를 함유하는 2692bp의 PstI-HindIII 단편이 삽입된 플라스미드 pCK1D 등을 들수 있다.

pyrG 유전자는 대장균 염색체로부터 클론화되고, 그의 전염기 배열이 결정되어 있다. [J. Bio1. Chem., 261권, 5568∼5574면, 1986년]. pyrG 유전자의 급원으로서는 대장균 벡터 pUC8[Gene, 19권, 259∼268면, 1982년]의 멀티클로닝 사이트의 SmaI-PstI 부위에 대장균 유래의 pyrG 유전자를 함유하는 2426 bp의 NruI-PstI 단편이 삽입된 플라스미드인 pMW6등을 들수 있다.

이들 플라스미드를 보유한 대장균으로부터의 플라스미드 DNA의 단리정제는 공지의 방법 [Nuc. Acids Res., 7권, 1513∼1523면, 1979년]으로 실시할 수가 있다. 또한, 플라스미드 DNA의 제한효소에 의한 절단, 절단한 DNA 단편의 단리정제, DNA 단면의 효소적 결합, 재조합체 DNA를 사용한 숙주 대장균의 형질전환등의 유전자 재조합에 관한 여러 가지의 조작은 공지의 방법 [예를 들면, T. Maniatis 등, Molecular Cloning, A Labolatory Manual, Cold Spring Harbor LAboratory, (1982)]에 따라 실시할 수가 있다.

벡터로서는 숙주 미생물내에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않으나, 대장균을 숙주로한 경우, pUC8, pBR 332 [Gene, 2권, 95∼113면, 1977년]등을 들수 있다.

숙주 미생물로서는, 재조합체 DNA가 발현할 수 있고 CDP-콜린의 생성 반응에 이용할 수 있는 것이면, 어떤 미생물도 사용할 수 있다. 구체적으로는 예를 들면, 상기 대장균 MM294 주 일 수 있다.

한편 미생물 B로서 바람직한 균주는 코리네박테륨 속에 속하는 미생물이다. 더욱 구체적으로는 코리네박테륨·암모니아 게네스(구명:브레비박테륨·암모니아게네스)ATCC 21170을 들 수 있다.

미생물 A1, 미생물 A2 및 미생물 B의 배양에 사용되는 배지는 탄소원, 질소원, 무기물, 아미노산, 비타민 등을 함유하고 사용되는 미생물에 의해 동화될 수 있는 배지라면, 천연배지, 합성배지의 어느것이라도 좋다. 미생물은 호기적 조건하에서 온도, pH등을 조절하면서, 통상의 방법으로 배양될 수 있다.

탄소원으로서는 글루코오스, 프럭토오스, 슈크로오스, 말토오스, 만니톨, 소르비톨 등의 탄소화물, 당알콜, 글리세롤, 전분가수분해물, 당밀 등, 더나아가서는 피루브산, 젖산, 시트르산 등의 각종 유기산, 글루탐산, 메티오닌, 리신등의 각종 아미노산이 사용될 수 있다. 또, 흰겨, 캇사바(cassava), 바가스(bagasse), 콘·스티프·리쿼(corn steep liguor)등의 천연 유기 영양원도 사용할 수가 있다.

질소원으로서는 암모니아 혹은 염화 암모늄, 황상 암모늄, 탄산 암모늄 아세트산 암모늄 등의 각종무기 및 유기 암모늄 염류, 글루탐산, 글루타민, 메티오닌 등의 아미노산, 혹은 펩톤, NZ 아민, 콘·스티프·리쿼, 고기추출물, 효모추출물, 카제인 가수분해물, 어분 혹은 그의 소화물, 번데기 가수분해물 등의 함질소 유기물 등, 여러가지의 것을 사용할 수 있다.

또한, 무기물로서는, 인산 일칼륨, 인산 이나트륨, 황산 마그네슘, 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산구리, 염화망간, 몰리브덴산 암몬, 황산 아연등을 필요에 따라 첨가한다. 비타민, 아미노산, 핵산 등의 기타의 것을 필요에 따라 첨가하지만, 상기한 바와 같은 다른 배지 성분에 수반하여 배지에 공급되면 특별히 첨가하지 않아도 좋다.

배양은 진탕배양 혹은 통기 교반 배양 등의 호기적 조건하에서 행한다. 배양온도는 15∼40。C가 좋고, 20∼35。C가 보다 바람직하다. 배양중의 배지의 pH는 중성부근으로 유지하는 것이 바람직하다. 배양시간은 통상 5∼72시간이다.

UTP와 콜린 및/또는 포스포릴콜린으로부터 CDP-콜린을 생성하는 능력을 갖는 미생물 A와 오르트산으로부터 UTP를 생성하는 능력을 갖는 미생물 B를 혼합할때에는 각각을 별개로 배양하고 종료후 혼합하여도 좋고, 하나의 배양기에 동시에 식균하여 혼합 배양하여도 좋다. 또한, 임의의 미생물의 배양중 또는 배양 종료시에 또한편의 미생물을 식균하여 배양을 실시하여도 좋다.

이렇게해서 얻어지는 미생물 A 및 미생물 B의 배양액은 그자체로 또는 여러가지의 처리를 한 후 CDP-콜린의 생성 반응을 실시한다. CDP-콜린의 생성 반응은 미생물 A 및 미생물 B의 배양액 또는 그 처리물의 혼합물에 오로트산과 콜린 및/또는 포스포릴콜린을 접촉시켜도 좋고 미생물 B의 배양액 또는 그 처리물에 오로트산을 접촉하고 UTP를 생성시킨 후, 미생물 A의 배양액 또는 그 처리물과 콜린 및/또는 포스포릴 콜린을 첨가하여도 좋다.

배양액의 처리물로서는 배양액의 농축물 또는 건조물, 배양액을 원심분리하여 얻어지는 균체, 균체의 건조물, 계면활성제 및/또는 유기 용제처리물, 용균효소처리물, 고정화균체 혹은 균체로부트의 추출효소 표품(標品)등을 들수가 있다.

CDP-콜린의 생성 반응은 상기 미생물과 반응기질의 혼합물에 다시 반응에 필요한 성분을 첨가하여, pH를 6∼10, 보다 바람직하게는 7∼8로 조절하면서, 20∼50。CDP서 2∼48시간 유지하면서 행한다. 반응에 필요한 성분으로서는 ATP재생에 필요한 에너지 공여체, 인산이온, 마그네슘이온, 암모늄이온, 더나아가서는 계면활성제 및/또는 유기용제 등을 들수 있다. 이들 성분은 상기 미생물의 배양액으로부터 필요량이 충당될 경우는 미리 첨가할 필요는 없다.

반응기질인 오로트산은 순수한 것을 사용하여도 좋고, 미생물의 오로트산 발효액이나 그의 조정제물 등의 오로트산을 함유하는 것으로 반응을 저해하지 않는 것이면 어느것이라도 좋다. 오로트산은 0.01∼1.0mol/L, 보다 바람직하게는 0.01∼0.3mol/L의 농도로 사용된다. 또한, 콜린 및/또는 포스포릴콜린은 순수한 것을 사용하여도 좋고, 콜린 및/또는 포스포린콜린을 함유하는 것으로 불순물이 반응을 저해하지 않는 것이면 사용할 수가 있다. 클린 및/또는 포스포릴콜린은 0.01∼0.3mol/L, 보다 바람직하게는 0.02∼1.0mol/L의 농도로 사용된다.

에너지 공여체로서는 글루코오스, 프럭토오스, 슈크로오스 등의 탄수화물, 당밀, 전분가수분해물등, 피루부산, 젖산, 아세트산, α-케토글루타르산 등의 유기산, 글리신, 알라닌, 아스파르트산, 클루타민산 등의 아미노산이 사용된다. 이것들은 0.02∼2.0mol/L의 농도로 사용된다.

인산이온으로서는 정인산, 피로인산, 트리폴리인산, 테트리폴리인산, 테트라폴리메타인산 등의 폴리인산, 폴리메타인산, 인산일칼륨, 인산이칼륨, 인산일나트륨, 인산이나트륨 등의 무기 인산염 등이 어느것이라도 사용된다. 이것들은 통상적으로 0.01∼0.5mol/L의 농도로 사용된다.

마그네슘 이온으로서는 황산 마그네슘, 질산 마그네슘, 염화 마그네슘 등의 무기 마그네슘염, 시트르산 마그네슘의 등의 유기 마그네슘염 등이 사용된다. 첨가량은 통상 0.005∼0/2mol/L이다.

암모늄 이온으로서는 암모니아수, 암모니아 가스, 각종 무기, 유기 암모늄염, 글루타민 또는 효모추출물, 카사미노산, 콘·스티프·리쿼 등의 글루타민 함유 천연물 등이 사용된다. 첨가량은 대개 0.01∼2.0mol/L이다.

계면 활성제로서는 디옥틸·술포·숙신산나트륨(예컨대 라피졸 B-80, 닛뽕유시사제), 라우로일·자루코시네이트 등의 음이온성 계면활성제, 폴리옥시에틸렌·세틸에테르(예를 들면 노니온 p-208, 닛뽕유시사제)등의 비이온성 계면활성제, 알킬 디메틸 아민 (예컨대 3급 아민 FB, 닛뽕유시사제)등의 3급 아민류 등, CDP-콜린의 생성을 촉진하는 것이라면 어느것이라도 사용할 수 있다. 이들은 통상 0.1∼50g/L, 바람직하기는 1∼20g/L의 농도로 사용된다.

유기 용제로서는 크실렌, 톨루엔, 지방족알콜, 아세톤, 아세트산에틸 등을 들수 있고, 이들은 통상 0.1∼50mL/L, 바람직하게는 1∼20mL/L의 농도로 사용된다.

반응액중에 생성된 CDP-콜린의 채취는 활성탄이나 이온 교환수지 등을 사용하는 통상의 방법에 의해서 수행할 수가 있다.

이하에 본 발명의 실시예를 기술한다.

[실시예1]

CCT, CKI, pyrg를 동시에 발현시키는 제조합체 플라스미드의 조성:

CCT, CKI, pyrg를 동시에 발현시키는 제조합체 플라스미드 pCKG55의 조성방법에 관하여 하기에 설명한다. 그리고 조성공정은 제1도에 종합하여 나타낸다.

[CCT/CKI 융합단백의 발현]

효모염색체 유래의 CCT유전자를 갖는 플라스미드 pCC41를 보유하고 있는 대장균 MM294/pCC41 주 (이하, 플라스미드 보유주는 「숙주주명/플라스미드명」의 형태로 표기한다)를 박토트리프톤 (티푸코사제) 10g/L, 효모 추출물 (디푸코사제) 5g/L, NaCI 5g/L을 함유하고, pH를 7.2로 조정한 L배지 400mL에 식균하고, 30。CDP서 18시간 배양한다. 얻어진 배양균체로부터 공지의 방법(사익)에 따라서 플라스미드 pCC41을 단리 정제한다. 효모염색체 유래의 CKI유전자를 갖는 플라스미드 pCK1D도, 동일한 방법으로 그의 보유주인 대장균 MM294/pCK1D주로 부터 단리 정제한다.

조제한 pCC41 플라스미드 DNA 5㎍을 10mM트리스-염산(pH7.5), 50mM NaCI, 7mM MgCI₂및 6mM 2-메르캅토 에탄올을 함유하는 완충액 (이하에서는 제한효소로 소화 반응을 실시하는 완충액을 함유하는 완충액은 NaCI의 농도의 값에 따라 「Y-50 완충액」이라고 하는 형태로 호칭한다) 50μL에 용해하고, 20단위의 HindIII(디까라 슈조사제, 이하, 제한 효소류는 모두 다까라 슈조사제를 사용한다)와 20단위의 HpaI를 가하고 37。CDP서 2시간 소화 반응을 시킨다. 이 소화물을 아가로오스겔로 전기영동을 실시한 후, 겔로부터 추출하여 큰쪽의 DNA단편 (3808bp)를 단리한다. 한편, pCKID플라스미드 DNA5μg도 동일하게 하여 HindIII와 Hpal로 소화 후, 2297bp의 DNA단편을 정제단리한다.

이와같이 해서 얻어진 약 0.2μg의 pCC41유래의 DNA단편과, 약 0.05μg의 pCK1D유래의 DNA단편을 20mM트리스-염산 (pH,7.6), 10mM MgC1₂, 10mM 디티오트레이톨 및 0.5mM ATP를 함유하는 완충액 (이하에서는 「T4 리가제 완충액」이라고 칭한다) 40μL중에서 2단위의 T4리가제 (다까라 슈조사제)를 가하여 4。CDP서 18시간 결합 반응시킨다. 이와같이해서 얻어진 재조합체 DNA를 사용하여 대장균 MM294주를 형질전환하여 암핌실린(50μg/mL)내성의 형질 전환주를 얻는다.

이 형질 전환주로부터 플라스미드 DNA를 단리 정제하고 그의 구조를 HindIII, HpaI, kpnI등의 제한효소로 소화시킴으로써 분석한다. 그 결과, 목적으로하는 구조를 갖는 6.1킬로베이스 (이하에서는「kb」라고 약기한다)의 플라스미드가 구축되어 있는 것을 확인한다. 이플라스미드를 pCKI이라고 명명한다(제1도참조).

pCK1에 의해서 코딩되는 CCT/CKI 융합 단백의 구조를 제2도에 나타낸다. pCC41은 대장균 백터 pUC18의 멀티 클로닝 사이트의 Smal부위에 효모염색체 유래의 1296 bp로 구성된 Dral 단편이 삽입된 구조를 갖고 있다. Dral 소화시에 본래의 CCT유전자의 N 말단 24개 아미노산이 제거되고 그대신에 벡터 1acZ 유전자 유래의 11개 아미노산이 접속된 형태로 되어 있다(제3도 참조). 또 Hpal에 의한 절단과 결합의 결과 CCT유전자의 C말단 14아미노산 및 CKI유전자의 N말단 31개 아미노산이 제거되어서 결합된 형대로 합계948개 아미노산으로 이루어지는 융합 단백으로 되어 있다.

MM294/pCK1주에 대하여, 후술하는 CCT활성 측정계로 반응시킨바, CTP와 포스포릴 콜린을 기질로 하여 CDP-콜린이 생성되고, 또한 동일한 계에 있어서 5mM 포스포릴 콜린을 5 mM 염화 콜린으로 치환하고, 5mM ATP를 첨가한 경우라도 동일하게 콜릴CDP-콜린이 생성된다. 즉, pCK1보유주는 CCT, CKI 양활성을 모두 갖고 있는 것으로 확인된다.

[CCT/CKI 융합 단백질의 N 말단 부분 결실체의 취득]

CCT/CKI 융합 단백의 발현량을 증대 시킬 목적으로 이하에서 설명하는 바와 같이 CCT/CKI 융합 단백의 N 말단 부분의 결실체의 취득을 수행한다.

pCK1 플라스미드 DNA 2μg을 Y-50완충액 30μL에 용해하여, 15단위의 kpnI를 가하고, 37。CDP서 2시간 소화반응을 시킨다. 이소화물에 5배 농도의 Bal31 완충액 [100mM트리스-염산 (pH8.0), 60mM MgC1₂, 60mM CaC1₂, 3M NaC1] 20μL, 중류수 46μL 및 0.1단위의 Ba131 뉴클레아제 (다까라 슈조 사제)를 가하고, 30。CDP서 3분간 소화반응 시킨다.

반응액에 100μL의 페놀:클로로포름(용량비1:1) 혼합액을 넣고 충분히 교반하여 반응을 정지시킨후 원심 분리하여 상층을 채취한다 (이하에서는 이 조작을 「페놀:클로로포름 추출」이라고 부른다). 채취한 수층에 대하여 2배의 용량의 빙냉 에탄올을 가하고 -80。CDP서 30분 정치한다. 이 에탄올 혼합물을 원심 분리후 상청을 버리고 침전을 감압하에서 건조 시킨다 (이하에서는 이 조작을 「에탄올 침전」이라고 부른다). 얻어진 침전에 T4리가제 완충액 50μL을 가하여 용해한 후, 1단위의 T4리가제를 가하여 4。CDP서 18시간 결합 반응을 시킨다.

얻어진 재조합체 DNA를 사용하여 대장균 MM294주를 형질 전환하고, 암피실린내성의 형질 전환주를 선택한다. 얻어진 암피실린 내성주를 배양하고 후술하는 CCT활성 측정계로 CCT활성을 측정하고 가장 활성이 높은 주를 선택한다. 이 주로 부터 플라스미드 DNA를 단리 정제하고, 이 DNA를 HindIII, Hpal, PvuII 등의 제한 효소로 절단함으로써 목적으로하는 구조를 갖는 것을 확인한다. 이 플라스미드를 pCK55라고 명명한다. (제1도 참조).

pCK55 상의 CCT/CKI 융합 단백질을 코딩하는 유전자의 N 말단 부분의 염기 배열을 F. Sanger 등의 다이데옥시법 [J. Mol. Biol., 143권, 161∼178면, 1980년]에 의해 결정한 결과, 제3도에 표시한 염기 배열을 갖고 있다. 즉, Bal31 뉴클레아제 소화에 의해 kpnI부위로부터 상류 하류 방향으로 합계 36bp가 상실되어 있고, 그 때문에 대장균 벡터 pUCI18 유래의 9개 아미노산과 CCT 유전자 유래의 3개 아미노산의 합계 12개 아미노산이 결실되어 결합한 936개 아미노산으로 이루어지는 융합 단백으로서 발현되고 있는 것을 발견한다.

[CCT, CKI, pyrG 동시 발현 플라스미드의 조성]

대장균 염색체 유래의 pyrG 유전자를 갖는 플라스미드 pMW6을 보유하고 있는 대장균 MM294/pMw6주로부터, 플라스미드 DNA를 단리 정제한다. 조제한 pMW6플라스미드 DNA 5μg을 Y-150완충액 50μL에 용해하여, 20단위의 M1μI를 가하고 37。CDP서 2시간 소화반응을 시킨다. 계속해서 페놀:클로로포름 추출과 에탄을 침전후, DNA단편을 전량 50μL의 DNA폴리머라제 완충액 [50mM트리스-염산(pH 8.8) 7mM MgC1₂, 6mM2-메르캅토에탄올, 7μM EDTA, 0.25 mM dATP, 0.25mM dCTP, 0.25mM dTTP]에 용해하고, 5단위의 T4 DNA 폴리머라제 (다까라 슈조사제)를 가하고, 37。CDP서 2시간 반응시켜서, M1uI소화에 의해서 생긴 5'-돌출말단을 평활말단으로 한단. 반응액을 페놀:클로로포름 추출, 에탄올 침전후, 얻어진 DNA단편을 Y-50완충액 50μL에 용해하고, 15단위의 HindIII을 가하고, 37。CDP서 2시간 소화 반응 시킨다. 이 소화물을 아가로오스겔로 전기영동을 한후, 큰쪽의 시간 소화 반응 시킨다. 이 소화물을 아가로오스겔로 전기영동을 한후, 큰쪽의 DNA 단면 (4652bp)을 겔로부터 추출하여 단리한다.

한편 동일하게하여 플라스미드 pCK55로 그의 보유주 (MM294/pCK55)로 부터 단리 정제한다. 조제한 pCK55플라스미드 DNA 5μg을 Y-50완충액 50μL에 용해하고, 20단위의 HindIII와 20단위의 PvuII를 가하고, 37。CDP서 2시간 소화반응 시킨다. 이 소화물을 아가로오스 겔 전기영동후, CCT/CKI유전자를 함유하는 큰쪽의 DNA단편 (3610bp)을 단리 정제한다. 이와같이 해서 얻어진 약 0.05μg의 pMW6유래의 DNA단편과 약 0.2μg의 pCK55 유래의 DNA단편을 50μg의 T4 리가제 완충액중에서 2단위의 T4 리가제에 의해 4。CDP서 18시간 결합반응을 시킨다. 얻어진 재조합체 DNA를 사용하여 대장균 MM294주를 형질전환하고 암피실린 내성의 형질 전환주를 얻는다.

이 형질 전환주로부터 플라스미드 DNA를 단리 정제하고, 이 DNA를 HindIII, Hpal, kpaI등의 제한효소로 소화함으로써 플라스미드이 구조해석을 한 결과, 목적으로하는 8.3kb의 플라스미드가 구축된 것이 확인된다. 이 플라스미드를 pCKG55라고 명명한다 (제1도 참조).

[재조합체 DNA를 보유하는 주의 CCT, pyrG 활성 ]

제조합체 DNA 를 보유하는 주의 CCT, pyrG활성의 측정은 하기에 기술하는 방법으로 수행한다. 활성측정 실험에 제공하는 대장균을 암피실린 50μg/mL을 함유하는 L배지 10mL가 들어있는 대형 시험관에 접종하고 25。CDP서 18시간 진탕 배양한다. 이러한 배양액 100μL을 암피실린 50μL/mL을 함유하는 배지 10mL가 들은 대형 시험관에 접종하고, 33。CDP서 10시간 진탕배양한다. 얻어진 배양액 500μL을 원심 분리후 상청을 버리고 균체를 20mM 인산 칼륨 완충액 (pH 7.0) 500μL에 현탁하고, 이것에 크실렌 5μL을 가하여 교반하고, 30。CDP서 10분간 처리한다. 이와같이해서 얻어진 크실렌 처리물을 조효소액으로서 사용하고, 이하에 기술하는 방법에 따라 효소 활성을 측정한다.

[CCT활성 측정법]

150mM 인산 칼륨 완충액 (pH 7.5), 25mM염화마그네슘, 5mM CTP, 5mM 포스포릴콜린 및 조효소액으로 이루어지는 500μL의 반응액을 30。CDP서 2시간 반응을 시킨다. 반응액을 경시적으로 50μL씩 채취하여, 0.2M 아세트산 50μL을 첨가후, 100。CDP서 2분간 열처리에 의해 반응을 멈추게한다. 이 처리물을 원심분리후, 상청을 적절하게 중류수로 희석하여 고속 액체 크로마토그래피에 의해 생성된 CDP-콜린을 정량한다. 매분 1μmol의 CDP-콜린을 생성하는 효소량을 1단위 (U)로 하여 효소활성을 산출한다.

[pyrG활성 측정법]

40mM 트리스-염산 (pH7.1), 10mM염화 마그네슘, 1mM ATP, 1mM UTP, 0.2mM GTP, 2mM글루타민, 8mM 포스포에놀피루브산 및 조효소액으로 이루어진 2mL의 반응액을 38。CDP서 60분간 반응시킨다. 반응액은 경시적으로 200μL씩 채취하고 3.5%과염소산 1.8mL와 혼합함으로써 반응을 정시시킨다.

이 산처리액을 원심분리한 후, 성청의 291nm의 흡광도를 비색계의 의해 측정한다. 3.5%과염소산중에서, 기질인 UTP에는 291nm로 흡수가 거의 없으나, 생성물인 CTP에는 흡수가 있다. 따라서 291nm에서의 흡수를 측정함으로써 CTP의 생성량을 알수가 있다. 매분 1μmol의 CTP를 생성하는 효소량을 1단위 (U)로하여 효소활성을 산출한다.

본 발명에서 조성한 플라스미드 보유주의 CCT 및 pyrG활성의 측정 결과를 표1에서 나타낸다. 활성의 값은 배양개 1mL당의 효소활성 (U)으로 나타낸다.

그리고 pCKG55를 보유하는 대장균 균주(Escherichia coli MM294/pCKG55)는 1992년 1월 27일자로 일본국 공업 기술원 미생물 공업 기술 연구소에서 부다페스트 조약의 조건으로 FERM BP-3717로서 기탁되어 있다.

[실시예2]

실시예1에서 얻은 대장균 MM294/pCKG55주를 암피실린 50μg/mL을 함유하는 L배지 10mL가 들은 대형 시험관에 접종하고, 25。CDP서 24시간 300rpm으로 진탕배양한다. 이 배양액 20mL을 암피실린 50μg/mL을 함유하는 배지 400mL가 들은 2L배플이 달린 3 각 플라스크에 접종하고 25。CDP서 16시간 190rpm로 회전 진탕 배양한다.

이 배양액 125mL을 글루코오스 5g/L(별도살균), 펩톤(꾜꾸또 세이야꾸 고오교사제) 5g/L, Na₂HPO₄6g/L KH₂PO₄3g/L, NaCI 5g/L, NH₄CI 1g/L, MgSO₄·7H₂O 250mg/L(별도살균) 및 비타민 B1 4mg/L (별도살균)의 조성으로 이루어지는 액체 배지 (pH 무조정) 2.5L이 들어있는 5L들이 배양조에 접종하고, 25。CDP서 11시간, 그후 32。CDP서 13시간동안, 교반 600rpm, 통기량 2.5L/분의 배양조건하에서 14%암모니아수로 pH7.0으로 조정하면서 배양을 수행한다. 배양중, 배양 11시간째부터 24시간째까지의 동안 글루코오스 167g/L의 조성으로 이루어진 공급액을 페리스터(Perista)펌프에 의해 30mL/시간의 속도로 흘려서 첨가한다.

한편, 코리네박테륨·암모니아게네스 ATCC 21170 주를 글루코오스 50g/L, 폴리펩톤 (다이고에이요가가꾸사제) 10g/L, 효모 추출물 (다이고에이요가가꾸사제) 10g/L, 요소, 5g/L, (NH₄)₂SO₄5g/L, KH₂PO₄1g/L K₂HPO₄3g/L, MgSO₄·7H₂O 1g/L, CaC1₂·2H₂O 0.1g/L, FeSO₄·7H₂O 10mg/L, ZnSO₄·7H₂O 10mg/L, MnSO₄·4∼6H₂O 20mg/L, L-시스테인 20mg/L, D-판토텐산칼슘 10mg/L 비타민 B1 5mg/L, 니코틴산 5mg/L 및 비오틴 30μg/L (가성소오다로 pH7.2로 조정)의 조성으로 이루어지는 액체 배지 10mL가 들은 대형 시험관에 접종하고, 28。CDP서 24시간 300rpm으로 왕복 진탕 배양한다.

이 배양액 20m/L을 상기와 동일 조성의 액체 배지 230mL가 들은 2L용적의 배플이 달린 3각 플라스크에 접종하고, 28。CDP서 24시간 190rpm으로 회전진탕 배양한다.

이 배양액 250mL을 글루코오스 100g/L, 고기 추출물 10g/L, 폴리펩톤 10g/L, KH₂PO₄1g/L, K₂HPO₄1g/L, MgSO₄·7H₂O 1g/L, CaC1₂·2H₂O 0.1g/1, FeSO₄·7H₂O 20 mg/L, ZnSO₄·7H₂O 10mg/L, MnSO₄·4∼6H₂O 20mg/L, β-알라닌 15mg/L, , L-시스테인 20mg/L, 비오틴 100μg/L, 요소 2g/L (별도살균) 및 비타민 B1 5mg/L (별도살균)(가성소오다로 pH7.2로 조정)의 조성으로 구성되는 액체 배지 2.5L가 들은 5L영적 배양조에 접종하고, 32。CDP서 교반 600rpm, 통기량 2.5L/분의 배양 조건하에서 진한 암모니아수로 pH를 6.8로 조정하면서 종배양을 한다.

상기 종 뱅야액의 상청중의 글루코오스가 소비된 시점에서 배양액을 350mL, 무균적으로 채취하고, 글루코오스 180g/L, KH₂PO₄10g/L, K₂HPO₄10g/L, MgSO₄·7H₂O 10g/L CaC1₂·2H₂O 0.1g/L, FeSO₄·7H₂O 20mg/L, ZnSO₄·7H₂O 10mg/L, MnSO₄·4∼6H₂O 20mg/L (별도살균), β-알라닌 15mg/L, L-시스텐인 20mg/L, 글루타민산 나트륨 1g/L, 비오틴 100μg/L, 요소 2g/L(별도살균) 및 비타민 B1 5mg/L (별도살균)(가성소오다로 pH7.2로 조정)의 조성으로 구성되는 액체 배지 2.5L가 들은 5L들이 배양조에 접종하고, 32。CDP서 교반 600rpm, 통기량 2.5L/분의 배양 조건하에서, 진한 암모니아수로 pH6.8로 조정하면서 본 배양을 한다. 배양액 상청중의 글루코오스가 소비된 시점에서 배양을 종료한다.

이와 같이 하여 얻어진 대장균 MM294/pCKG55주 배양액 360mL과 코리네박테륨·암모니아게네스 ATCC21170주 배양액 360mL을 2L용적 배양조에 넣고, 여기에 글루코오스 100g/L, 오로트산 10g/L (47mM), 염화콜린 8.4g/L (60mM), MgSO₄·7H₂O 5g/L, 크실렌 20mL/L을 첨가하고, 증류수를 가하여 전량을 800mL로 한다. 이 혼합액을 32。CDP서 교반 800rpm, 통기량 0.8L/분의 조건하에서, 10N수산화 나트륨으로 pH를 7.2로 조정하면서 반응을 시킨다. 반응중, 반응액 상청중의 인산 농도가 KH₂PO₄로 하여 1∼5g/L로 유지되도록 적절하게 도중에 첨가한다. 23시간 반응을 시킨 결과 CDP-콜린이 11.0g/L (21.5mM)생성된다. 그리고 대장균 MM294/pCKG55주 배양액을 첨가하지 않고, 대신에 증류수 360mL을 가하여 반응을 시킨 경우, CDP-콜린은 전혀 생성되지 않는다. 또한, 코리네박테륨·암모니아게네스 ATCC21170주 배양액 대신에 증류수 360mL을 가하여 반응을 시킨 경우, CDP-콜린의 생성량은 0.7g/L (1.4mM)이다.

[실시예3]

반응의 기질로서, 염화콜린대신에, 포스포릴콜린 16.5g/L (50mM)을 사용한 것 이외는 실시예2와 동일하게 반응을 시킨 결과, 반응 23시간에서 CDP-콜린 9.5g/L (18.6mM)이 생성된다.

[배열표]

배열번호:1

배열의 길이:54bp

배열의 형:핵산

스트랜드:이중

토플로지:직쇄상

분자형:게놈 DNA

프래그먼트형:N-말단 프래그먼트

기원

생물명:사카로마이스·세레비지아 (Saccharomyces cerevisiae)

주명:X2180-1

배열

ATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCAAAAAAAATAAAAATAAAAGA 54

배열번호:2

배열의 길이:18 bp

배열의 형:핵산

스트랜드:이중

토폴로지:직쇄상

분자형:게놈 DNA

프래그먼트형:N-말단 프래그먼트

기원

생물명:사카로마이세스·세레비지아 (Saccharomyces cerevisise)

주명:X2180-1

배열

ATGACCAAAAATAAAAGA 18

Claims

오로트산과 콜린 및/또는 포스포릴콜린으로부터 시티딘 디인산 콜린을 생성할 수 있는, 시티딘-5'-트리인산 신세타제(이하에서는 pyrG라고 한다), 콜린포스페이트 시티디릴 트랜스퍼라제 (이하에서는, CCT라고 한다) 및 콜린 키나제 (이하에서는 CKI라고 한다)의 효소활성을 갖는 미생물 (이하에서는 미생물 A1라고 한다) 또는 pyrG 및 CCT의 효소활성을 갖는 미생물(이하에서는 미생물 A2라고 한다)에서 선택한 1종의 미생물과 오로트산으로부터 우리딘-5'-트리인산을 생성하는 활성을 갖는 미생물(이하에서는 미생물 B라고 한다)의 배양액 또는 이의 배양액의 농축물 또는 건조물, 배양액을 원심분리하여 수득되는 균체, 균체의 건조물, 계면활성제 및/또는 유기 용제처리물, 용균효소처리물, 고정화균체 또는 균체로부터의 추출효소표퓸등으로 이루어진 군에서 선택한 1종이상의 처리물을 효소원으로서 사용하고, 오로트산과 콜린 및/또는 포스포릴콜린을 기질로서 사용하여 반응을 수행하고, 반응액중에 시티딘 디인산 콜린을 생성 축적시키고, 이 반응액으로부터 시티딘 디인산콜린을 채취하는 것을 특징으로 하는 시티딘 디인산 콜린의 제조방법.
제1항에 있어서, 미생물 A1이 pyrG, CCT 및 CKI를 코딩하는 유전자를 함유하는 DNA단편과 벡터와의 재조합체 DNA를 보유하는 것임을 특징으로하는 방법.
제1항에 있어서, 미생물 A2가 pyrG 및 CCT를 코딩하는 유전자를 함유하는 DNA단편과 벡터와의 재조합체 DNA를 보유하는 것임을 특징으로 하는 방법.
제2항 또는 제3항에 있어서, CCT 및 CKI를 코딩하는 유전자가 사카로마이세스·세레비지아 (Saccharomyces cerevisiae)유래이며, pyrG를 코딩하는 유전자가 에스케리키아·콜리 (Escherichia coli) 유래인 것임을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 미생물 A1 또는 미생물 A2가 에스케리키아속에 속하는 미생물이며, 미생물 B가 코리네박테륨(Coynebacterium)속에 속하는 미생물인 것을 특징으로하는 방법.
제5항에 있어서, 미생물 A1이 에스케리키아·콜리 MM294/pCKG 55 (FERM BP-3717) 인 것을 특징으로 하는 방법.
제5항에 있어서, 미생물 B가 코리네박테륨·암모니아게네스 ATCC21170 인 것을 특징으로하는 방법.