KR100555161B1 - 당뉴클레오티드류및복합당질의제조법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 (a) 뉴클레오티드의 전구 물질로부터 NTP를 생산하는 능력을 갖는 미생물의 배양액 또는 당해 배양액의 처리물 및 (b) 당과 NTP로부터 당 뉴클레오티드를 생산하는 능력을 갖는 미생물의 배양액 또는 당해 배양액의 처리물을 효소원으로서 사용하는 당 뉴클레오티드의 제조법, 상기한 (a), (b), 및 (c) 당 뉴클레오티드와 복합 당질 전구 물질로부터 복합 당질을 생산하는 능력을 갖는 미생물, 동물 세포나 곤충 세포의 배양액 또는 당해 배양액의 처리물을 효소원으로서 사용하는 복합 당질의 제조법, 당 뉴클레오티드와 복합 당질 전구 물질로부터 복합 당질을 생산하는 능력을 갖는 미생물, 동물 세포나 곤충 세포의 배양액 또는 당해 배양액의 처리물을 효소원으로서 사용하는 복합 당질의 제조법, 및 갈락토키나제 활성이 강한 미생물의 배양액 또는 당해 배양액의 처리물을 효소원으로서 사용하는 N-아세틸글루코사민-1-인산의 제조법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 세균, 바이러스 등의 감염 방어, 심장 혈관 장애에 대한 적응과 면역 치료 등에 유용한 복합 당질의 제조방법 및 당해 복합 당질의 합성 기질로서 중요한 당 뉴클레오티드의 제조방법에 관한 것이다.
당 뉴클레오티드의 제조방법으로서 (1) 화학 합성법[참조: Adv. Carbohydr. Chem. Biochem., 28, 307 (1973), Bull. Chem. Soc. Japan, 46, 3275 (1973), J. Org. Chem., 57, 146 (1992), Carbohydr. Res., 242, 69 (1993)], (2) 효소를 사용하는 제조방법[참조: J. Org. Chem., 55, 1834 (1990), J. Org. Chem., 57, 152 (1992), J. Am. Chem. Soc., 110, 7159 (1988), 국제공개특허공보 제(평)7-508413호, 제(평)7-500248호, WO96/27670], (3) 효모 등의 미생물 균체를 사용하는 방법[참조: 일본국 특허공보 제(소)45-2073호, 제(소)46-40756호, 제(소)47-1837호, 제(소)47-26703호, 제(소)49-8278호, 공개특허공보 제(평)2-268692호], (4) 내염성 효모의 미생물 균체에서의 추출법[참조: 일본국 공개특허공보 제(평)8-23993호] 등이 공지되어 있다.
(1)의 방법에서는 가격이 비싼 뉴클레오사이드-5'-일인산(이하, NMP라고 약칭한다)의 모르폴리데이트 유도체나 당 인산 등이 필요하며, (2)의 방법에서는 뉴클레오사이드-5'-이인산(이하, NDP라고 약칭한다), 뉴클레오사이드-5'-삼인산(이하, NTP라고 약칭한다), 포스포에놀피루브산, 당 인산 등의 가격이 비싼 원료나 피루브산 키나제 등의 다수의 효소가 필요하며, (3)의 방법에서는 균체의 건조 처리 등이 필요하다. (4)의 방법을 포함하여 상기한 어느 방법에서도 원료로서 가격이 비싼 뉴클레오티드나 당 인산 등이 사용되고 있거나, 조작적으로 대량 생산이 곤란하므로, 지금에 이르기까지 당 뉴클레오티드의 공업적 규모에서의 제조법은 확립되어 있지 않다.
복합 당질의 제조법으로서 (1) 화학 합성법[참조: Methods in Ehzymol., 247, 193 (1994), Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 21, 155 (1982), Carbohydr. Res., 211, cl (1991)], (2) 가수분해 효소[참조: Anal. biochem., 202, 215 (1992), Trends Biotechnol., 6, 256 (1988)]를 사용하는 방법 및 (3) 당전이 효소[참조: 일본국 공개특허공보 제(평)7-79792호, 국제공개특허공보 제(평)7-500248호, 특허공보 제(평)5-82200호, WO94/25614, 제(평)9-503905호, USP 5,583,042]를 이용하는 방법이 공지되어 있다.
(1)의 방법에서는 입체선택적 합성을 위해 보호기의 도입이 필수적이며, (2)의 방법에서는 수율 및 선택성이 충분하지 않으며, (3)의 방법에서는 NDP, NTP, 포스포에놀피루브산, 당 인산 또는 당 뉴클레오티드 등의 가격이 비싼 원료나 피루브산 키나제 등의 다수의 효소가 필요하며, 어느 방법에서도 복합 당질의 저렴한 공업적 제조방법은 확립되어 있지 않다. 또한 저렴한 뉴클레오티드의 전구 물질 및 당과 복합 당질 전구 물질만을 원료로 하여 직접 복합 당질을 공업적으로 제조하는 방법은 공지되어 있지 않다.
코리네박테리움 속에 속하는 미생물에서 오르토산을 첨가함으로써 UMP가 생산된다는 보고가 있다[참조: Amino Acid Nucleic Acid, 23, 107 (1971)]. 또한, 오르토산을 원료로 하여 시티딘 이인산 콜린을 생성하는 방법이 공지되어 있다[참조: 일본국 공개특허공보 제(평)5-276974].
도 1은 발현 플라스미드 pPA 31 및 pPAC 31의 조성 공정을 도시한 것이다.
도 2는 galU, ppa 유전자 발현 플라스미드 pNT 12 및 pNT 32의 조성 공정을 도시한 것이다.
도 3은 galT, galK 유전자 발현 플라스미드 pNT 25의 조성 공정을 도시한 것이다.
도 4는 galT, galK 유전자를 코리네박테리움·암모니아게네스로 발현하는 플라스미드 pTK 7의 조성 공정을 도시한 것이다.
도 5는 glmU, ppa 유전자 발현 플라스미드 pNT 14의 조성 공정을 도시한 것이다.
도 6은 pgm 유전자 발현 플라스미드 pNT 24의 조성 공정을 도시한 것이다.
도 7은 glmM 유전자 발현 플라스미드 pNT 44의 조성 공정을 도시한 것이다.
도 8은 glk 유전자 발현 플라스미드 pNT 46의 조성 공정을 도시한 것이다.
도 9는 pfkB 유전자 발현 플라스미드 pNT 47의 조성 공정을 도시한 것이다.
도 10은 galK 유전자 발현 플라스미드 pNT 54의 조성 공정을 도시한 것이다.
도 11은 manB, manC 유전자 발현 플라스미드 pNK 7의 조성 공정을 도시한 것이다.
도 12는 pgm, pfkB 유전자 발현 플라스미드 pNT 55의 조성 공정을 도시한 것이다.
도 13는 gmd, wcaG 유전자 발현 플라스미드 pNK 8의 조성 공정을 도시한 것이다.
도 14는 neuA 유전자 발현 플라스미드 pTA 14의 조성 공정을 도시한 것이다.
도 15는 lgtC 유전자 발현 플라스미드 pGT 3의 조성 공정을 도시한 것이다.
도 16는 lgtB 유전자 발현 플라스미드 pNT 60의 조성 공정을 도시한 것이다.
표 1a 및 표 1b에 본 발명에서 사용하는 약어와 당해 약어의 설명을 기재한다.
[표 1a]
[표 1b]
본 발명에 따르면 (1) NTP나 당 인산 등의 가격이 비싼 원료를 필요로 하지 않으며, 오르토산 등의 가격이 저렴한 뉴클레오티드의 전구 물질 및 당만을 원료로 한다. (2) NMP 또는 NDP로부터 NTP로 전환함에 있어서 비싼 포스포에놀피루브산과 피루브산 키나제의 첨가가 필요하지 않다. 또한, (3) 효소의 단리 조작이 필요하지 않은 등의 특징이 있는 당 뉴클레오티드의 신규한 제조법 및 이러한 당 뉴클레오티드 제조법을 이용하는 신규한 복합 당질의 제조법을 제공할 수 있다.
본 발명의 제조법으로 제조하는 당 뉴클레오티드로서는 뉴클레오사이드-5'-이인산 잔기의 말단 인산기와 당 잔기의 환원기가 에스테르 결합을 하는 일반 구조를 갖는 화합물을 들 수 있으며, 또한 뉴클레오티드 잔기가 시티딘-5'-인산이며, 당 잔기가 폴리올인 것도 본 발명에 따라 제조되는 당 뉴클레오티드에 포함된다.
본 발명의 제조법으로 제조하는 복합 당질로서는 단당, 올리고사카라이드, 담체 등에 결합되는 단당 또는 올리고사카라이드, 단백질, 펩타이드, 지질, 당 단백질, 당 지질, 올리고펩타이드 또는 스테로이드 화합물 등에 당질이 결합되는 화합물을 들 수 있다.
하기에 본 발명을 상세하게 설명한다.
1) 본 발명에서 사용되는 뉴클레오티드의 전구 물질로부터 NTP를 생산하는 능력을 갖는 미생물로서는 뉴클레오티드의 전구 물질로부터 NTP를 생산하는 능력을 갖는 미생물이면 모두 사용할 수 있으며, 예를 들면, 에스케리키아 속 또는 코리네박테리움 속에 속하는 미생물 등을 들 수 있다.
에스케리키아 속에 속하는 미생물로서 에스케리키아·콜라이 등을 들 수 있다.
코리네박테리움 속에 속하는 미생물로서는 코리네박테리움·암노니아게네스 등을 들 수 있다.
2) 본 발명에서 사용하는 당과 NTP로부터 당 뉴클레오티드를 생성하는 능력을 갖는 미생물로서는 목적하는 당 뉴클레오티드를 생성하는 활성이 있는 생물이면 모두 사용할 수 있으며, 예를 들면, 2)-① UDP-Glc의 생산에 관해서 하기의 식 1의 (1) 내지 (4)의 효소 활성이 강한 미생물을 사용하는 것이 바람직하다.
구체적으로는, 에스케리키아 속에 속하는 미생물 및 코리네박테리움 속에 속하는 미생물을 들 수 있으며, 바람직한 구체적인 예로서 에스케리키아·콜라이 또는 코리네박테리움·암모니아게네스를 들 수 있다.
또한, (1), (2), (3) 및 (4)에서 선택되는 하나 이상의 효소의 활성을 유전자 재조합 기술로 증강되는 형질전환주를 사용할 수 있다. 이러한 형질전환체의 구체적인 예로서 에스케리키아·콜라이 유래의 galU 및 ppa 유전자를 함유하는 재조합체 DNA(pNT 12)를 보유하는 에스케리키아·콜라이 KY 8415(FERM BP-408)주 등을 들 수 있다.
[식 1]
(1) 헥소키나제(EC 2.7.1.1) 또는 글루코키나제(EC 2.7.1.2)
(2) 포스포글루코뮤타제(EC 2.7.5.1)
(3) 글로코즈-1-인산우리딜트랜스페라제(EC 2.7.7.9)
(4) (무기) 피로포스파타제(EC 3.6.1.1)
2)-② UDP-Gal의 생산에 관해서는 하기의 식 2의 (5) 및 (6)의 효소 활성이 강한 미생물, 또한 바람직하게는 식 1의 (1) 내지 (4)의 효소 활성이 강한 성질을 아울러 갖는 미생물을 사용하는 것이 바람직하다.
구체적으로는, 에스케리키아 속에 속하는 미생물 및 코리네박테리움 속에 속하는 미생물을 들 수 있으며, 바람직한 구체적인 예로서는 에스케리키아·콜라이 및 코리네박테리움·암모니아게네스를 들 수 있다.
또한, (5) 및 (6)에서 선택되는 하나 이상의 효소 활성 또는 (5) 및 (6)에서 선택되는 하나 이상의 효소와 (1) 내지 (4)에서 선택되는 하나 이상의 효소 활성을 유전자 재조합 기술로 증강되는 형질전환주를 사용할 수 있다. 이러한 형질전환체의 구체적인 예로서 에스케리키아·콜라이 유래의 galT 및 galK 유전자를 함유하는 재조합체 DNA(pNT 25)를 보유하는 에스케리키아·콜라이 NM522주 및 에스케리키아·콜라이 유래의 galT 및 galK 유전자를 함유하는 재조합체 DNA(pTK 7)를 보유하는 코리네박테리움·암모니아게네스 ATCC 21170을 들 수 있다.
[식 2]
(5) : 갈락토키나제(EC 2.7.1.6)
(6) : 갈락토즈-1-인산우리딜트랜스페라제(EC 2.7.7.12)
2)-③ UDP-GlcNAc의 생산에 관해서는 하기의 식 3의 (7) 내지 (12) 및 식 1의 (4)의 효소 활성이 강한 미생물 또는 식 3의 (13) 및 (10)의 효소 활성이 강한 미생물을 사용하는 것이 바람직하다.
구체적으로는, 에스케리키아 속 및 코리네박테리움 속에 속하는 미생물을 들 수 있으며, 바람직한 구체적인 예로서는 에스케리키아·콜라이 및 코리네박테리움·암모니아게네스를 들 수 있다.
또한, (4), (7), (8), (9), (10) 및 (13)에서 선택되는 하나 이상의 효소 활성을 유전자 재조합 기술로 증강되는 형질전환주를 사용할 수 있다. 이러한 형질전환체의 구체적인 예로서는 에스케리키아·콜라이 유래의 glmM 유전자를 함유하는 재조합체 DNA(pNT 44)를 보유하는 에스케리키아·콜라이 NM 522주, 에스케리키아·콜라이 유래의 glmU 및 PPa 유전자를 함유하는 재조합체 DNA(pNT 14)를 보유하는 에스케리키아·콜라이 KY 8415주, 에스케리키아·콜라이 유래의 glk 유전자를 함유하는 재조합체 DNA(pNT 46)를 보유하는 에스케리키아·콜라이 NM 522주, 에스케리키아·콜라이 유래의 galK 유전자를 함유하는 재조합체 DNA(pNT 54)를 보유하는 에스케리키아·콜라이 NM 522주 등을 들 수 있다.
유전자 재조합에 따른 (8)의 포스포글루코사민뮤타제 활성의 발현 및 증강에는 Glc-1,6-P2를 첨가하는 것이 필요하며[참조: J. Biol. Chem., 271, 32(1996)], (11) 및 (12)의 효소 활성을 유전자 재조합 기술로 증강시킨 형질전환주를 사용함으로써, Glc-1,6-P2를 첨가하지 않고 G-6-P 및 F-6-P로부터 Glc-1,6-P2를 공급할 수 있다.
이러한 형질전환체의 구체적인 예로서, 에스케리키아·콜라이 유래의 pgm 유전자를 함유하는 재조합체 DNA(pNT 24)를 보유하는 에스케리키아·콜라이 NM 522주, 에스케리키아·콜라이 유래의 pfkB 유전자를 함유하는 재조합체 DNA(pNT 47)를 보유하는 에스케리키아·콜라이 NM 522주, 에스케리키아·콜라이 유래의 pgm 및 pfkB 유전자를 함유하는 재조합체 DNA(pNT 55)를 보유하는 에스케리키아·콜라이 NM 522주 등을 들 수 있다.
(11) 및 (12)의 효소 활성을 이용하여 G-6-P 및 F-6-P로부터 Glc-1,6-P2를 공급함으로써, (8)의 포스포글루코사민뮤타제 활성의 발현을 증강하는 방법은 본 발명에서 처음으로 개시하는 방법이다.
(13)의 갈락토키나제(EC 2.7.1.6)를 사용하여 GlcNAc로부터 GlcNAc-1-P를 제조하는 방법은 본 발명에서 처음으로 개시하는 제조법이다. 당해 제조법을 사용하여 GlcNAc-1-P를 제조할 수 있다. 즉, 갈락토키나제 활성이 강한 미생물, 예를 들면, galK를 암호화하는 유전자를 함유하는 DNA 단편과 벡터의 재조합체 DNA를 보유하는 미생물의 배양액 또는 당해 배양액의 처리물을 효소원으로서 사용하고, 이러한 효소원 및 GlcNAc를 수성 매체 속에 존재시키고, 당해 수성 매체 속에 GlcNAc-1-P를 생성 축적시키고, 수성 매체 속으로부터 GlcNAc-1-P를 채취함으로써 GlcNAc-1-P를 제조할 수 있다.
수성 매체로부터 GLcNAc-1-P를 채취하는 것은 활성탄이나 이온 교환 수지 등을 사용하는 통상적인 방법으로 실시할 수 있다.
[식 3]
(7) 헥소키나제(EC 2.7.1.1) 또는 글루코키나제(EC 2.7.1.2)
(8) 포스포글루코사민뮤타제
(9) 글루코사민-1-인산아세틸트랜스페라제
(10) N-아세틸글루코사민-1-인산우리딜트랜스페라제(EC 2.7.7.23)
(11) 포스포프룩토키나제(EC 2.7.1.11)
(12) 포스포글루코뮤타제(EC 2.7.5.1)
(13) 갈락토키나제(EC 2.7.1.6)
2)-④ UDP-GalNAc의 생산에 관해서는 식 3의 (7) 내지 (12), 식 4의 (14) 및 식 1의 (4)의 효소 활성이 강한 미생물 또는 식 3의 (10), (13) 및 식 4의 (14)의 효소 활성이 강한 미생물을 사용하는 것이 바람직하다.
구체적으로는, 에스케리키아 속 및 코리네박테리움 속에 속하는 미생물을 들 수 있으며, 바람직한 구체적인 예로서 에스케리키아·콜라이 및 코리네박테리움·암모니아게네스를 들 수 있다.
또한, (7) 내지 (14) 및 (4)에서 선택되는 하나 이상의 효소 활성을 유전자 재조합 기술로 증강시킨 형질전환주를 사용할 수 있다.
[식 4]
(14) UDP-GlcNAc 4-에피메라제(EC 5.1.3.7)
2)-⑤ UDP-GlcUA의 생산에 관해서는 식 1의 (1) 내지 (4) 및 식 5의 (15)의 효소 활성이 강한 미생물을 사용하는 것이 바람직하다.
구체적으로는, 에스케리키아 속 및 코리네박테리움 속에 속하는 미생물을 들 수 있으며, 바람직한 구체적인 예로서는 에스케리키아·콜라이 및 코리네박테리움·암모니아게네스를 들 수 있다.
또한, (1), (2), (3), (4) 및 (15)에서 선택되는 하나 이상의 효소 활성을 유전자 재조합 기술로 증강시킨 형질전환주를 사용할 수 있다.
[식 5]
(15) : UDP-GLc데하이드로게나제(EC 1.1.1.22)
2)-⑥ GDP-Man의 생산에 관해서는 하기의 식 6의 (16) 내지 (18) 및 식 3의 (11) 및 (12)의 효소 활성이 강한 미생물을 사용하는 것이 바람직하다.
구체적으로는, 에스케리키아 속 또는 코리네박테리움 속에 속하는 미생물을 들 수 있으며, 바람직한 구체적인 예로서 에스케리키아·콜라이 또는 코리네박테리움·암모니아게네스를 들 수 있다.
또한, (16), (17) 및 (18)에서 선택되는 하나 이상의 효소의 활성을 유전자 재조합 기술로 증강시킨 형질전환주를 사용할 수 있다. 이러한 형질전환체의 구체적인 예로서 에스케리키아·콜라이 유래의 manB 및 manC 유전자를 함유하는 재조합체 DNA(pNK 7)를 보유하는 에스케리키아·콜라이 NM522주, 에스케리키아·콜라이 유래의 glk 유전자를 함유하는 재조합체 DNA(pNT 46)를 보유하는 에스케리키아·콜라이 NM 522주 등을 들 수 있다.
유전자-재조합 기술에 따른 (17)의 포스포만노뮤타제 활성의 발현 및 증강에는 Glc-1,6-P2의 첨가가 필요하며, (11) 및 (12)의 효소 활성을 유전자-재조합 기술로 증강시킨 형질전환주를 사용함으로써, Glc-1,6-P2를 첨가하지 않고 G-6-P 및 F-6-P로부터 Glc-1,6-P2를 공급할 수 있다. 이러한 형질전환체의 구체적인 예로서는 에스케리키아·콜라이 유래의 pgm 유전자를 함유하는 재조합체 DNA(pNT 24)를 보유하는 에스케리키아·콜라이 NM 522주, 에스케리키아·콜라이 유래의 pfkB 유전자를 함유하는 재조합체 DNA(pNT 47)를 보유하는 에스케리키아·콜라이 NM 522주, 에스케리키아·콜라이 유래의 pgm 및 pfkB 유전자를 함유하는 재조합체 DNA(pNT55)를 보유하는 에스케리키아·콜라이 NM 552주 등을 들 수 있다.
(11) 및 (12)의 효소 활성을 이용하여 G-6-P 및 F-6-P로부터 Glc-1,6-P2를 공급함으로써, (17)의 포스포만노뮤타제 활성의 발현을 증강하는 방법은 본 발명에서 처음으로 개시하는 방법이다.
[식 6]
(16) : 헥소키나제(EC 2.7.1.1) 또는 글루코키나제(EC 2.7.1.2)
(17) : 포스포만노뮤타제(EC 2.7.5.7)
(18) : 만노즈-1-인산구아닐트랜스페라제(EC 2.7.7.13)
2)-⑦ GDP-Fuc의 생산에 관해서는 하기의 식 7의 (19)와 (20) 및 식 6의 (16) 내지 (18) 및 식 3의 (11)과 (12)의 효소 활성이 강한 미생물을 사용하는 것이 바람직하다.
구체적으로는, 에스케리키아 속 또는 코리네박테리움 속에 속하는 미생물을 들 수 있으며, 바람직한 구체적인 예로서는 에스케리키아·콜라이 또는 코리네박테리움·암모니아게네스를 들 수 있다.
또한, (16), (17), (18), (19) 및 (20)에서 선택되는 하나 이상의 효소 활성을 유전자 재조합 기술로 증강시킨 형질전환주를 사용할 수 있다. 이러한 형질전환체의 구체적인 예로서는 에스케리키아·콜라이 유래의 manB 및 manC 유전자를 함유하는 재조합체 DNA(pNK 7)를 보유하는 에스케리키아·콜라이 NM 522주, 에스케리키아·콜라이 유래의 gmd 및 wcaG 유전자를 함유하는 재조합체 DNA(pNK 8)를 보유하는 에스케리키아·콜라이 NM 522주, 에스케리키아·콜라이 유래의 glk 유전자를 함유하는 재조합체 DNA(pNT 46)를 보유하는 에스케리키아·콜라이 NM 522주 등을 들 수 있다.
유전자 재조합 기술에 따른 (17)의 포스포만노뮤타제 활성의 발현 및 증강에는 Glc-1, 6-P2의 첨가가 필요하며, (11) 및 (12)의 효소 활성을 유전자 재조합 기술로 증강시킨 형질전환주를 사용함으로써, Glc-1,6-P2를 첨가하지 않고 G-6-P 및 F-6-P로부터 Glc-1,6-P2를 공급할 수 있다.
이러한 형질전환체의 구체적인 예로서 에스케리키아·콜라이 유래의 pgm 유전자를 함유하는 재조합체 DNA(pNT 24)를 보유하는 에스케리키아·콜라이 NM 522주, 에스케리키아·콜라이 유래의 pfkB 유전자를 함유하는 재조합체 DNA(pNT 47)를 보유하는 에스케리키아·콜라이 NM 522주, 에스케리키아·콜라이 유래의 pgm 및 pfkB 유전자를 함유하는 재조합체 DNA(pNT 55)를 보유하는 에스케리키아·콜라이 NM 552주 등을 들 수 있다.
[식 7]
(19) : GDP-Man-4,6-데하이드라타제(EC 4.2.1.47)
(20) : GDP-4-케토-6-데옥시만노즈 에피메라제/리덕타제
2)-⑧ CMP-NeuAc의 생산에 관해서는 하기의 식 8의 (21), (22) 또는 (23), (24) 및 (25)의 효소 활성이 강한 미생물을 사용하는 것이 바람직하다.
구체적으로는, 에스케리키아 속 또는 코리네박테리움 속에 속하는 미생물을 들 수 있으며, 바람직한 구체적인 예로서는 에스케리키아·콜라이 또는 코리네박테리움·암모니아게네스를 들 수 있다.
또한, (21), (22), (23), (24) 및 (25)에서 선택되는 하나 이상의 효소 활성을 유전자 재조합 기술로 증강시킨 형질전환주를 사용할 수 있다. 이러한 형질전환체의 구체적인 예로서 에스케리키아·콜라이 유래의 manA 유전자를 함유하는 재조합체 DNA(pNAL 1)를 보유하는 에스케리키아·콜라이 C600주[참조: Appl. Environ. Microbiol., 51, 562 (1986)], 에스케리키아·콜라이 유래의 neuA 유전자를 함유하는 재조합체 DNA(pTA 14)를 보유하는 에스케리키아·콜라이 NM 552주 등을 들 수 있다.
[식 8]
(21) : GlcNAc 2-에피메라제(EC 5.1.3.8)
(22) : NeuAc 알도라제(EC 4.1.3.3)
(23) : NeuAc 신세타제(EC 4.1.3.19)
(24) : CMP-NeuAc 신세타제(EC 2.7.7.43)
(25) : CTP 신세타제(EC 6.3.4.2)
미생물이 1)에 기재된 미생물의 성질 및 2)에 기재된 미생물의 성질을 동시에 갖는 경우에는, 당해 미생물을 이용하여, 뉴클레오티드의 전구 물질과 당으로부터 당 뉴클레오티드를 생산할 수 있다.
미생물이 1)에 기재된 미생물의 성질 및 2)-①에 기재된 성질을 동시에 갖는 경우에는, 당해 미생물을 이용하여, 오르토산 등의 UTP 전구 물질과 글루코즈로부터 UDP-Glc를, 1)에 기재된 미생물의 성질 및 2)-②에 기재된 미생물의 성질을 동시에 갖는 경우에는, 당해 미생물을 이용하여, 오르토산 등의 UTP 전구 물질과 갈락토즈로부터 UDP-Gal를, 1)에 기재된 미생물의 성질 및 2)-③에 기재된 성질을 동시에 갖는 경우에는, 당해 미생물을 이용하여, 오르토산 등의 UTP 전구 물질과 글루코사민 또는 N-아세틸글루코사민으로부터 UDP-GlcNAc를, 1)에 기재된 미생물의 성질 및 2)-④에 기재된 성질을 동시에 갖는 경우에는, 당해 미생물을 이용하여, 오르토산 등의 UTP 전구 물질과 글루코사민 또는 N-아세틸글루코사민으로부터 UDP-GalNAc를, 1)에 기재된 미생물의 성질 및 2)-⑤에 기재된 성질을 동시에 갖는 경우에는, 당해 미생물을 이용하여, 오르토산 등의 UTP 전구 물질과 글루코즈로부터 UDP-GlcUA를, 1)에 기재된 미생물의 성질 및 2)-⑥에 기재된 성질을 동시에 갖는 경우에는, 당해 미생물을 이용하여, GMP 등의 GTP 전구 물질과 만노즈로부터 GDP-Man을, 1)에 기재된 미생물의 성질 및 2)-⑦에 기재된 성질을 동시에 갖는 경우에는, 당해 미생물을 이용하여, GMP 등의 GTP 전구 물질과 만노즈로부터 GDP-Fuc를, 1)에 기재된 미생물의 성질 및 2)-⑧에 기재된 성질을 동시에 갖는 경우에는, 당해 미생물을 이용하여, 오르토산 등의 CTP 전구 물질과 N-아세틸글루코사민 또는 N-아세틸만노사민으로부터 CMP-NeuAc를 생산할 수 있다.
이러한 미생물의 구체적인 예로서는, 에스케리키아·콜라이 유래의 galT 및 galK 유전자를 발현하는 코리네박테리움·암모니아게네스를 들 수 있다.
또한, 상기한 균주와 상이하며, 1균주 중에 당 뉴클레오티드의 제조에 필요한 활성의 일부밖에 갖지 않는 미생물의 경우, 각각의 활성이 있는 미생물을 적절하게 조합하여, 당 뉴클레오티드의 제조를 실시할 수 있다.
1)에 기재된 성질을 갖는 미생물은 1종류일 필요는 없으며, 2종류 이상으로 1)에 기재된 성질을 구성하는 경우에도 1)에 기재된 성질을 갖는 미생물로서 이용할 수 있다. 구체적으로, 에스케리키아·콜라이 유래의 pyrG 유전자를 발현하는 에스케리키아·콜라이와 코리네박테리움·암모니아게네스의 조합을 예시할 수 있다[참조: 일본국 공개특허공보 제(평)5-276974호].
동일하게 2)에 기재된 성질을 갖는 미생물도 1종류일 필요는 없으며, 2종류 이상으로 구성할 수 있다. 당해 미생물 그룹을 적절하게 조합함으로써, 목적하는 당 뉴클레오티드를 생산할 수 있다.
예를 들면, 1)에 기재된 성질을 갖는 미생물 및 2)-①에 기재된 성질을 갖는 1종류 이상의 미생물을 사용하여 오르토산 등의 UTP 전구 물질과 글루코즈로부터 UDP-Glc를, 1)에 기재된 성질을 갖는 미생물 및 2)-②에 기재된 성질을 갖는 1종류 이상의 미생물을 사용하여 오르토산 등의 UTP 전구 물질과 갈락토즈로부터 UDP-Gal을, 1)에 기재된 성질을 갖는 미생물 및 2)-③에 기재된 성질을 갖는 1종류 이상의 미생물을 사용하여 오르토산 등의 UTP 전구 물질과 글루코사민 또는 N-아세틸글루코사민으로부터 UDP-GlcNac를, 1)에 기재된 성질을 갖는 미생물 및 2)-④에 기재된 성질을 갖는 1종류 이상의 미생물을 사용하여 오르토산 등의 UTP 전구 물질과 글루코사민 또는 N-아세틸글루코사민으로부터 UDP-GalNAc를, 1)에 기재된 성질을 갖는 미생물 및 2)-⑤에 기재된 성질을 갖는 1종류 이상의 미생물을 사용하여 오르토산 등의 UTP 전구 물질과 글루코즈로부터 UDP-GlcUA를. 1)에 기재된 성질을 갖는 미생물 및 2)-⑥에 기재된 성질을 갖는 1종류 이상의 미생물을 사용하여 GMP 등의 GTP 전구 물질과 만노즈로부터 GDP-Man을, 1)에 기재된 성질을 갖는 미생물 및 2)-⑦에 기재된 성질을 갖는 1종류 이상의 미생물을 사용하여 GMP 등의 GTP 전구 물질과 만노즈로부터 GDP-Fuc를, 1)에 기재된 성질을 갖는 미생물 및 2)-⑧에 기재된 성질을 갖는 1종류 이상의 미생물을 사용하여 오르토산 등의 CTP 전구 물질과 N-아세틸글루코사민 또는 N-아세틸만노사민으로부터 CMP-NeuAc를 생산할 수 있다.
상기와 같이, 당 뉴클레오티드의 제조에서, 유전자 재조합 미생물을 이용할 수 있으며, 당해 제조에 관여하는 표 2에 기재된 유전자는 에스케리키아·콜라이의 염색체로부터 클론화되고, 이의 전체 염기 서열이 결정된다.
[표 2]
이러한 유전자를 함유하는 플라스미드를 보유하는 에스케리키아·콜라이로부터의 플라스미드 DNA의 단리 정제, 플라스미드 DNA의 제한 효소에 의한 절단, 절단된 DNA 단편의 단리 정제, DNA 단편의 효소적 결합, 재조합체 DNA를 사용하는 에스케리키아·콜라이의 형질전환 등의 유전자 재조합에 관한 각종 조작은 공지된 방법[예: J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual Second edition Cold Spring Harbor Laboratory (1989)]에 준해 실시할 수 있다. 또한, 폴리머라제·연쇄 반응(이하, PCR라고 약칭한다)은 퍼킨·엘머·시타즈사제의 써멀·사이클러 등을 사용하여 실시할 수 있다.
당 뉴클레오티드의 제조에 관여하는 유전자를 숙주 중에서 발현시키기 위해, 당해 유전자를 함유하는 DNA 단편을, 제한 효소류 또는 PCR로, 당해 유전자를 함유하는 적당한 길이의 DNA 단편으로 한 후, 발현 벡터 내의 프로모터의 하류에 삽입한 다음, 상기한 DNA를 삽입한 발현 벡터를, 발현 벡터에 적합한 숙주 내에 도입함으로써 달성할 수 있다.
숙주로서는, 목적하는 유전자를 발현할 수 있는 것은 모두 사용할 수 있다. 예를 들면, 에스케리키아 속, 세라티아 속, 코리네박테리움 속, 브레비박테리움 속, 슈도모나스 속, 바실러스 속 등에 속하는 미생물 이외에, 사카로마이세스 속, 캔디다 속 등에 속하는 효모 등을 들 수 있다.
발현 벡터로서는, 상기한 숙주에서 자립 복제가능하거나 염색체 내로 편입 가능하고, 당 뉴클레오티드의 제조에 관여하는 유전자를 전사할 수 있는 위치에 프로모터를 함유하는 것이 사용된다.
상기한 미생물을 숙주로서 사용하는 경우에, 당 뉴클레오티드의 제조에 관여하는 유전자의 발현 벡터는 미생물 내에서 자립 복제할 수 있는 동시에, 프로모터, 리보솜 결합 서열, 당 뉴클레오티드의 제조에 관여하는 유전자 및 전사 종결 서열로 구성하는 것이 바람직하다. 프로모터를 제어하는 유전자를 함유할 수 있다.
발현 벡터로서는, 예를 들면, pBTrp2, pBTacl, pBTac2(모두 베링거 만하임사제), pKYP10(참조: 일본국 공개특허공보 제(소)58-110600호), pKYP200[참조: Agric. Biol. Chem. 48, 669 (1984)], pLSA1[참조: Agric. Biol. Chem., 53, 277 (1989)], pGEL1[참조: Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 82, 4306 (1985)], pBluescript II SK+(STRATAGENE사제), pTrS30[에스케리키아 콜라이 JM109/pTrS30(FERM BP-5407)으로부터 조제], pTrS32[에스케리키아 콜라이 JM109/pTrS32(FERM BP-5408)으로부터 조제], pUC19[Gene, 33, 103 (1985)], pSTV28(다카라슈조사제), pPA1(참조: 일본국 공개특허공보 제(소)63-233798호), pCG11(참조: 일본 특허공보 제(평)6-91827호) 등을 예시할 수 있다.
프로모터로서는, 상기한 숙주 내에서 발현할 수 있는 것이면 어떠한 것도 사용할 수 있다. 예를 들면, trp 프로모터, lac 프로모터, PL 프로모터, PR 프로모터 등의, 에스케리키아·콜라이나 파지 등에 유래하는 프로모터를 들 수 있다. 또한, trp 프로모터를 2개씩 직렬시킨 프로모터, tac 프로모터와 같이 인위적으로 설계 개변한 프로모터 등도 사용할 수 있다.
리보솜 결합 서열로서는, 상기한 숙주 내에서 발현할 수 있는 것이면 어떠한 것도 사용할 수 있으며, 리보솜 결합 서열과 개시 코돈 사이를 적당한 거리(예: 6 내지 18개 염기)로 조절한 플라스미드를 사용하는 것이 바람직하다.
당 뉴클레오티드의 제조에 관여하는 유전자의 발현에 전사 종결 서열은 반드시 필요하지 않으며, 적절하게는 구조 유전자의 하류에 전사 종결 서열을 배치하는 것이 바람직하다.
숙주로서는, 재조합체 DNA를 발현할 수 있고, 당 뉴클레오티드의 생성 반응에 이용할 수 있는 것이면 어떤 미생물도 사용할 수 있으며, 구체적으로, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) XL1-Blue, 에스케리키아 콜라이 XL2-Blue, 에스케리키아 콜라이 DH1, 에스케리키아 콜라이 MC1000, 에스케리키아 콜라이 KY3276, 에스케리키아 콜라이 W1485, 에스케리키아 콜라이 JM109, 에스케리키아 콜라이 HB101, 에스케리키아 콜라이 No.49, 에스케리키아 콜라이 W3110, 에스케리키아 콜라이 NY49, 에스케리키아 콜라이 KY8415, 에스케리키아 콜라이 NM522, 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실루스 브레비스(Bacillus brevis), 바실루스 아밀로리크파시네스(Bacillus amyloliquefacines), 브레비박테리움 임마리오필룸(Brevibacterium immariophilum) ATCC14068, 브레비박테리움 사카롤리티쿰(Brevibacterium saccharolyticum) ATCC14066, 브레비박테리움 플라붐(Brevibacterium flavum) ATCC14067, 브레비박테리움 락토퍼멘툼(Brevibacterium lactofermentum) ATCC13869, 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) ATCC21170, 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) ATCC13032, 코리네박테리움 아세토아시도필룸(Corynebacterium acetoacidophilum) ATCC13870, 마이크로박테리움 암모니아필룸(Microbacterium ammoniaphilum) ATCC15354, 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida), 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens) 등을 들 수 있다.
효모 균주를 숙주로서 사용하는 경우에는, 발현 벡터로서, 예를 들면, YEp13(ATCC37115), YEp24(ATCC37051), YCp50(ATCC37419) 등을 예시할 수 있다.
프로모터로서는 효모 균주의 숙주 내에서 발현할 수 있는 것이면 어떠한 것도 사용할 수 있다. 예를 들면, 헥소키나제 등의 해당계의 유전자 프로모터, gal1 프로모터, gal10 프로모터, 사람 충격 단백질 프로모터, MFα1 프로모터, CUP1 프로모터 등의 프로모터를 들 수 있다.
숙주로서는 재조합체 DNA를 발현시킬 수 있고, 당 뉴클레오티드의 생성 반응에 이용할 수 있는 것이면 어떤 효모도 사용할 수 있으며, 구체적으로, 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 캔디다 유틸리스(Candida utilis), 캔디다 파랍실로시스(Candida parapsilosis), 캔디다 크루세이(Candida krusei), 캔디다 베르사틸리스(Candida versatilis), 캔디다 리포리티카(Candida lipolytica), 캔디다 제일라노이데스(Candida zeylanoides), 캔디다 구일리에르몬디이(Candida guilliermondii), 캔디다 알비칸스(Candida albicans), 캔디다 휴미콜라(Candida humicola), 피키아 파리노사(Pichia farinosa), 피키아 오메리(Pichia ohmeri), 토룰롭시스 캔디다(Torulopsis candida), 토룰롭시스 스파에리카(Torulopsis spaerica), 토룰롭시스 실리누스(Torulopsis xylinus), 토룰롭시스 파마타(Torulopsis famata), 토룰롭시스 베르사틸리스(Torulopsis versatilis), 데바리오마이세스 서브글로보수스(Debaryomyces subglobosus), 데바리오마이세스 칸타렐리이(Debaryomyces cantarellii), 데바리오마이세스 글로보수스(Debaryomyces globosus), 데바리오마이세스 한세니이(Debaryomyces hansenii), 데바리오마이세스 자포니쿠스(Debaryomyces japonicus), 지고사카로마이세스 로욱시이(Zygosaccharomyces rouxii), 지고사카로마이세스 바일리이(Zygosaccharomyces bailii), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 글루이베로마이세스 마르시아누스(Kluyveromyces marxianus), 한세눌라 아노말라(Hansenula anomala), 한세눌라 자디니이(Hansenula jadinii), 브레타노마이세스 람비쿠스(Brettanomyces lambicus), 브레타노마이세스 아노말루스(Brettanomyces anomalus), 쉬조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 트리코스포론 풀루란스(Trichosporon pullulans), 쉬완니오마이세스 알루비우스(Schwanniomyces alluvius) 등을 들 수 있다.
본 발명에서 사용하는 미생물의 배양은 통상적인 배양 방법에 따라 실시할 수 있다. 당해 미생물을 배양하는 배지는 당해 미생물이 자화할 수 있는 탄소원, 질소원, 무기염류 등을 함유하고, 당해 미생물의 배양을 효율적으로 실시할 수 있는 배지이면 천연 배지, 합성 배지의 어느 것도 바람직하다.
탄소원으로서는, 각각의 미생물이 자화할 수 있는 것이면 사용할 수 있으며, 글루코즈, 프룩토즈, 슈크로즈, 락토즈, 말토즈, 만니톨, 소르비톨, 당밀, 전분 또는 전분 가수분해물 등의 탄수화물, 피루브산, 락트산, 시트르산, 푸마르산 등의 각종 유기산, 글루탐산, 메티오닌, 라이신 등의 각종 아미노산, 메탄올, 프로판올, 글리세롤 등의 알콜류가 사용된다. 또한, 쌀겨, 캐사바, 바가스, 옥수수 침지액 등의 천연 유기 영양원을 사용할 수 있다.
질소원으로서는, 암모니아, 염화암모늄, 황산암모늄, 탄산암모늄, 아세트산암모늄, 인산암모늄 등의 각종 무기 및 유기 암모늄염류, 글루탐산, 글루타민, 메티오닌 등의 아미노산, 펩톤, NZ 아민, 옥수수 침지액, 육즙, 효모 추출물, 맥아 추출물, 카제인 가수분해물, 대두박, 대두박 가수분해물, 어분 또는 이의 분해물 등을 사용할 수 있다.
무기물로서는, 인산일칼륨, 인산이칼륨, 인산일나트륨, 인산이나트륨, 인산마그네슘, 황산마그네슘, 염화마그네슘, 염화나트륨, 염화칼슘, 황산제일철, 황산망간, 황산구리, 황산아연, 탄산칼슘 등이 사용된다. 비타민, 아미노산, 핵산 등을 필요에 따라 첨가할 수 있다.
배양은, 진탕 배양 또는 통기 교반 배양 등의 호기적 조건하에서 실시한다. 배양 온도는 15 내지 45℃가 바람직하며, 배양 시간은 통상적으로 5 내지 96시간이다. 배양 중의 pH는 3.0 내지 9.0으로 유지한다. pH의 조정은, 무기 또는 유기산, 알칼리 용액, 요소, 탄산칼슘, 암모니아 등을 사용하여 실시한다. 또한, 배양중에 필요에 따라 암피실린, 가나마이신 또는 클로람페니콜 등의 항생 물질을 배지에 첨가할 수 있다.
프로모터로서 유도성의 프로모터를 사용하는 발현 벡터로 형질전환된 미생물을 배양할 때에, 필요에 따라 유도인자를 배지에 첨가할 수 있다. 예를 들면, lac 프로모터를 사용하는 발현 벡터로 형질전환된 미생물을 배양할 때에는 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노사이드(IPTG) 등을, trp 프로모터를 사용하는 발현 벡터로 형질전환된 미생물을 배양할 때에는 인돌 아크릴산(IAA) 등을 배지에 첨가할 수 있다.
본 발명의 당 뉴클레오티드의 제조에서, 2종류 이상의 미생물을 사용하는 경우, 당해 미생물 각각을 개별적으로 배양하고, 당해 배양액을 이용하여 당 뉴클레오티드의 제조에 사용할 수 있으며, 하나의 배양기에 동시에 접종하고, 혼합 배양한 다음, 당해 배양액을 이용하여 당 뉴클레오티드의 제조에 사용할 수 있다. 또한, 어느 하나의 미생물의 배양중 또는 배양 종료 후에 나머지 미생물을 접종하고, 배양한 후 당해 배양액을 이용하여 당 뉴클레오티드의 제조에 사용할 수 있다. 또한, 상기한 1)에 기재된 성질을 갖는 미생물과 2)에 기재된 성질을 갖는 미생물을 각각 배양하고, 각각의 배양액을 이용하여 당 뉴클레오티드의 제조에 사용할 수 있다.
이러한 배양에 따라 수득되는 미생물의 배양액 및 당해 배양액을 여러가지로 처리한 배양액의 처리물을 효소원으로서 사용하고, 수성 매체 내에서 당 뉴클레오티드의 생성에 사용할 수 있다.
배양액의 처리물로서는, 배양액의 농축물, 배양액의 건조물, 배양액을 원심분리하여 수득된 배양 상등액, 배양 상등액의 농축물, 배양 상등액으로부터 수득된 효소 표준품, 배양액을 원심분리하여 수득된 세포(균체를 함유함), 당해 세포의 건조물, 당해 세포의 동결 건조물, 당해 세포의 계면활성제 처리물, 당해 세포의 초음파 처리물, 당해 세포의 기계적 마쇄 처리물, 당해 세포의 용매 처리물, 당해 세포의 효소 처리물, 당해 세포의 단밸질 분획물, 당해 세포의 고정화물 또는 당해 세포로부터 추출하여 수득된 효소 표준품 등을 들 수 있다.
당 뉴클레오티드의 생성에서 사용되는 효소원의 양은, 습윤 균체로서, 1 내지 500g/ℓ이며, 바람직하게는 5 내지 300g/ℓ이다. 또한, 동시에 2종류 이상의 미생물을 사용하여, 수성 매체 내에서 반응을 실시하는 경우에, 수성 매체 내의 당해 미생물의 전체 습윤 균체량은 2 내지 500g/ℓ이며, 바람직하게는 5 내지 400g/ℓ이다.
당 뉴클레오티드의 생성에 사용되는 수성 매체로서는, 물, 인산염, 탄산염, 아세트산염, 붕산염, 시트르산염, 트리스 등의 완충액, 메탄올, 에탄올 등의 알콜류, 아세트산에틸 등의 에스테르류, 아세톤 등의 케톤류, 아세트아미드 등의 아미드류 등을 수 있다. 또한, 효소원으로서 사용하는 미생물의 배양액을 수성 매체로서 사용할 수 있다.
당 뉴클레오티드의 생성에 사용되는 뉴클레오티드의 전구 물질로서는, 오르토산, 우라실, 오로티딘, 우리딘, 시토신, 시티딘, 아데닌, 아데노신, 구아닌, 구아노신, 히포크산틴, 이노신, 크산틴, 크산토신, 이노신-5'-일인산, 크산토신-5'-일인산, 구아노신-5'-일인산, 우리딘-5'-일인산 및 시티딘-5'-일인산 등을 들 수 있으며, 바람직하게는 오르토산 및 구아노신-5'-일인산을 들 수 있다. 이러한 뉴클레오티드의 전구 물질은, 순품과 당해 전구 물질의 염 및 협잡물이 반응을 억제하지 않는 한, 미생물에 의해 발효 생성된 당해 전구 물질 함유 배양액 및 당해 배양액의 전구 물질 조 정제물을 사용할 수 있다. 뉴클레오티드의 전구 물질은 0.1mM 내지 1.0M, 바람직하게는 0.01 내지 0.3M의 농도에서 사용한다.
당 뉴클레오티드의 생성에 사용되는 당으로서는, 글루코즈, 프룩토즈, 갈락토즈, 글루코사민, N-아세틸글루코사민, N-아세틸갈락토사민, 만노즈, 푸코즈, N-아세틸만노사민, 아세틸노이라민산 및 이들의 유도체 등을 들 수 있다. 이러한 당은 순품을 사용할 수 있으며, 이들을 함유하는 것으로, 협잡물이 반응을 억제하지 않는 것이면 모두 사용할 수 있다. 당은 반응을 개시할 때에 일괄적으로 첨가하거나 반응 중에 분할 또는 연속적으로 첨가할 수 있으며, 0.1mM 내지 2.0M의 농도로 사용한다.
당 뉴클로에티드의 생성에서, 필요에 따라, ATP 재생에 필요한 에너지 공여체, 보조효소, 인산 이온, 마그네슘 이온, 피틴산 등의 킬레이트제, 계면활성제 및 유기 용제를 첨가할 수 있다.
에너지 공여체로서는, 글루코즈, 프룩토즈, 슈크로즈, 락토즈, 말토즈, 만니톨, 소르비톨 등의 탄수화물, 피루브산, 락트산, 아세트산 등의 유기산, 글리신, 알라닌, 아스파라긴산, 글루탐산 등의 아미노산, 당밀, 전분 가수분해물 등을 들 수 있으며, 1.0mM 내지 2.0M의 농도로 사용한다.
인산 이온으로서는, 정인산, 피로인산, 트리폴리인산, 테트라폴리인산, 폴리인산, 메타인산, 트리메타인산, 인산일칼륨, 인산이칼륨, 인산일나트륨, 인산이나트륨 등의 무기 인산염 등을 들 수 있으며, 1.0mM 내지 1.0M의 농도로 사용할 수 있다.
마그네슘 이온으로서는, 황산마그네슘, 질산마그네슘, 염화마그네슘 등의 무기 마그네슘염, 시트르산마그네슘 등의 유기 마그네슘염 등을 들 수 있으며, 통상적으로 1 내지 100mM의 농도로 사용한다.
계면활성제로서는, 폴리옥시에틸렌·옥타데실아민 등의 비이온계 계면활성제(예: 나이민 S-215, 니혼유시사제), 세틸트리메틸암모늄· 브로마이드나 알킬디메틸·벤질암모늄클로라이드 등의 양이온계 계면활성제(예: 캣이온 F2-40E, 니혼유시사제), 라우로일· 사르코시네이트 등의 음이온계 계면활성제, 알킬디메틸아민 등의 3급 아민류(예: 3급 아민 FB, 니혼유시사제) 등, 각종 당 뉴클레오티드의 생성을 촉진하는 것이면 모두 바람직하며, 하나 또는 몇종류를 혼합하여 사용할 수 있다. 계면활성제는 통상적으로 0.1 내지 50g/ℓ의 농도로 사용한다.
유기 용제로서는, 크실렌, 톨루엔, 지방족 알콜, 아세톤, 아세트산에틸 등을 들 수 있으며, 통상적으로 0.1 내지 50ml/ℓ의 농도로 사용한다.
당 뉴클레오티드의 생성 반응은 수성 매체 내에서, pH 5 내지 10, 바람직하게는 pH 6 내지 9, 20 내지 50℃의 조건에서 2 내지 96시간 동안 실시한다.
당해 방법에 따라 당 뉴클레오티드를 생성할 수 있으며, 예를 들면, 우리딘이인산 화합물, 구아노신이인산 화합물 및 시티딘일인산 화합물 등을 들 수 있다. 구체적으로, UDP-Glc, UDP-Gal, UDP-GlcNAc, UDP-GalNAc, UDP-GlcUA, GDP-Man, GDP-Fuc, CMP-NeuAc 및 이들의 유도체 중에서 선택되는 당 뉴클레오티드 등을 들 수 있다.
수성 매체 내에 생성되는 당 뉴클레오티드의 정량은 공지된 방법에 준해 실시할 수 있으며, 예를 들면, UDP-Glc과 UDP-Gal의 분리 정량은 문헌[참조: Anal. Biochem., 216, 188 (1994)]에 기재된 고속 액체 크로마토그래피(이하, HPLC라고 약칭한다)에 따른 방법으로 실시할 수 있다. 또한, UDP-GLcNac, GDP-Man, GDP-Fuc, CMP-NeuAc의 분리 정량은 하기 조건의 HPLC를 사용하여 실시할 수 있다.
용출액 : 0.1M KH2PO4(H3PO4를 사용하여 pH3.2로 조정)
유 속 : 1ml/분
칼 럼 : Partisil-10 SAX(왓트만사제)
검 출 : UV 262nm
정 량 : 표준물의 흡광도 값과 비교함으로써 산출
반응액 내에 생성되는 당 뉴클레오티드의 채취는 활성탄이나 이온 교환 수지 등을 사용하는 통상적인 방법으로 실시할 수 있으며, 예를 들면, UDP-Gal 및 UDP-Glc에서는 문헌[참조: Org. Chem., 57, 152 (1992)] 및 UDP-GlcNAc에서는 문헌[참조: Org. Chem., 57, 146 (1992)]에 기재된 방법에 준해 실시할 수 있다.
본 발명의 복합 당질의 제조에 사용할 수 있는 미생물 또는 동물 세포와 곤충 세포로서는, 당 뉴클레오티드와 복합 당질 전구 물질로부터 복합 당질을 생산하는 능력을 갖는 미생물 또는 동물 세포나 곤충 세포이면 모두 사용할 수 있다. 예를 들면, 글루코실트랜스페라제, 갈락토실트랜스페라제, N-아세틸글루코사미닐트랜스페라제, N-아세틸갈락토사미닐트랜스페라제, 글루클로노실트랜스페라제, 만노실트랜스페라제, 시알릴트랜스페라제 및 푸코실트랜스페라제 등의 활성을 갖는 미생물 또는 동물 세포나 곤충 세포를 들 수 있다.
또한, 상기한 당 뉴클레오티드의 제조의 경우와 동일하게 유전자 재조합 기술로 조성된 미생물 또는 동물 세포나 곤충 세포를 이용할 수 있다. 예를 들면, 사람·흑색종 세포 SK-Mel-28 세포 유래의 세라미드글루코실트랜스페라제 유전자를 발현하는 에스케리키아·콜라이[참조: Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 93, 4638 (1996)], β1,3-갈락토실트랜스페라제를 생산하는 사람· 흑색종 세포 WM266-4주(ATCC CRL1676) 및 사람· 흑색종 세포 WM266-4 유래의 β1,3-갈락토실트랜스페라제 유전자를 함유하는 나말바 세포 KJM-1주 등의 재조합주(참조: 일본국 공개특허공보 제(평)6-181759호), 사람 Hela 세포 유래의 1,4-갈락토실트랜스페라제 유전자를 발현하는 에스케리키아·콜라이[참조: EMBO J., 9, 3171 (1990)] 또는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)[Biochem. Biophys. Res. Commun., 201, 160 (1994)], 래트 유래의 β1,6-N-아세틸글루코사미닐트랜스페라제 유전자를 발현하는 COS-7 세포(ATCC CRL1651)[참조: J. Biol. Chem., 268. 15381 (1993)], 사람 유래의 N-아세틸갈락토사미닐트랜스페라제 유전자를 발현하는 Sf9 세포[참조: J. Biochem., 118, 568 (1995)], 사람 유래의 글루크로노실트랜스페라제를 발현하는 에스케리키아·콜라이[참조: Biochem. Biophys. Res. Commun., 196, 473 (1993)], 사람 유래의 α1,3-푸코실트랜스페라제를 발현하는 나말바 세포[참조: J. Biol. Chem., 269. 14730 (1994)], 사람 유래의 α1,3/1,4-푸코실트랜스페라제를 발현하는 COS-1 세포[참조: Genes Dev., 4, 1288 (1990)], 사람 유래의 α1,2-푸코실트랜스페라제를 발현하는 COS-1 세포[참조: Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 87, 6674 (1990)], 닭 유래의 α2,6-시알릴트랜스페라제를 발현하는 COS-7 세포[참조: Eur. J. Biochem., 219, 375 (1994)], 사람 유래의 α2,8-시알릴트랜스페라제를 발현하는 CHO 세포[참조: Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 91, 7952 (1994)], 나이세리아 유래의 β1,3-아세틸글루코사미닐트랜스페라제 또는 β1,4-칼락토실트랜스페라제 또는 β1,3-N-아세틸갈락토사미닐트랜스페라제 또는 α1,4-갈락토실트랜스페라제를 발현하는 에스케리키아·콜라이(WO96/10086), 나이세리아 유래의 α2,3-시알릴트랜스페라제를 발현하는 에스케리키아·콜라이[참조: J. Biol. Chem., 271. 28271 (1996)], 헬리코박터·피롤리 유래의 α1,3-푸코실트랜스페라제를 발현하는 에스케리키아·콜라이[참조: J. Biol. Chem., 272. 21349 및 21357 (1997)], 효모 유래의 α1,2-만노실트랜스페라제를 발현하는 에스케리키아·콜라이[참조: J. Org. Chem., 58, 3985 (1993)] 등의 미생물 또는 동물 세포나 곤충 세포를 들 수 있다.
본 발명의 복합 당질의 제조에 미생물을 사용하는 경우에는 당해 미생물을 상기한 뉴클레오티드의 전구 물질과 당으로부터 당 뉴클레오티드를 생산하는 능력을 갖는 미생물의 배양과 동일한 배지 및 배양 조건으로 배양할 수 있다.
본 발명의 복합 당질의 제조에 동물 세포를 사용하는 경우에는 동물 세포를 배양하는 배지로서 일반적으로 사용되는 RPMI 1640 배지 Eagle의 MEM 배지 또는 이들 배지에 소 태아 혈청 등을 첨가한 배지 등이 사용된다. 배양은 5% CO2 존재하 등의 조건하에서 실시한다. 배양 온도는 20 내지 40℃가 바람직하며, 배양 시간은 통상적으로 3 내지 14일 동안이다. 또한, 필요에 따라 항생 물질을 배지에 첨가할 수 있다.
본 발명의 복합 당질의 제조에 곤충 세포를 사용하는 경우에는 곤충 세포의 배양을 공지된 방법[참조: J. Biol. Chem., 268, 12609 (1993)]에 준해 실시할 수 있다.
이러한 배양에 의해 수득되는 미생물 또는 동물 세포나 곤충 세포의 배양액 및 당해 배양액을 여러가지로 처리한 배양액의 처리물을 효소원으로서 사용하여 수성매체 내에서 복합 당질의 생성에 사용할 수 있다. 배양액의 처리물로서는 배양액의 농축물, 배양액의 건조물, 배양액을 원심분리하여 수득된 배양 상등액, 배양 상등액의 농축물, 배양 상등액으로부터 수득된 효소 표준품, 배양액을 원심분리하여 수득된 세포(균체를 함유함), 당해 세포의 건조물, 당해 세포의 동결 건조물, 당해 세포의 계면활성제 처리물, 당해 세포의 초음파 처리물, 당해 세포의 기계적 마쇄 처리물, 당해 세포의 용매 처리물, 당해 세포의 효소 처리물, 당해 세포의 단백질 분획물, 당해 세포의 고정화물 또는 당해 세포로부터 추출하여 수득된 효소 표준품 등을 들 수 있다.
복합 당질의 생성에 사용되는 효소원의 양은 효소의 활성을 37℃에서 1분 동안에 1μ mol의 복합 당질을 생성할 수 있는 활성을 1 단위(U)로 하여 0.1mU/ℓ 내지 10000U/ℓ이며, 바람직하게는 1mU/ℓ 내지 1000U/ℓ의 농도로 사용할 수 있다.
복합 당질의 생성에 사용되는 수성 매체로서는, 물, 인산염, 탄산염, 아세트산염, 붕산염, 시트르산염, 트리스 등의 완충액, 메탄올, 에탄올 등의 알콜류, 아세트산에틸 등의 에스테르류, 아세톤 등의 케톤류, 아세트아미드 등의 아미드류 등을 들 수 있다. 또한, 효소원으로서 사용하는 미생물, 동물 세포 또는 곤충 세포의 배양액을 수성 매체로서 사용할 수 있다.
복합 당질의 생성에서 필요에 따라 피틴산 등의 킬레이트제, MnCl2 등의 무기염, β-머캅토에탄올 등을 첨가할 수 있다.
복합 당질의 생성에 사용되는 당 뉴클레오티드로서는 상기한 당 뉴클레오티드의 생성으로 수득되는 반응액 또는 당해 반응액으로부터 정제된 당 뉴클레오티드를 사용할 수 있으며, 0.01mM 내지 2.0M의 농도로 사용할 수 있다.
또한, 복합 당질의 생성 반응액 내에서 상기한 방법을 사용하여 당 뉴클레오티드를 생성시킴으로써, 당 뉴클레오티드를 공급할 수 있다.
복합 당질의 생성에 사용되는 복합 당질 전구 물질로서는, 단당, 올리고사카라이드, 담체 등에 결합되는 단당 및 올리고사카라이드, 단백질, 펩타이드, 지질, 당단백질, 당지질, 글리코펩타이드 또는 스테로이드 화합물 등, 당 전이 효소의 기질로 되는 것이면 어느 것도 사용할 수 있다.
구체적으로는 글루코즈, 갈락토즈, 만노즈, 시알산, N-아세틸글루코사민, N-아세틸갈락토사민, 락토즈, N-아세틸락토사민, 락토-N-비오즈, GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc, GlcNAcβ1-4Galβ1-4Glc, 글로보트리오즈, Galα1-4Galβ1-4GlcNAc, 2'-푸코실락토즈, 3-푸코실락토즈, 3'-시알릴락토즈, 6'-시알릴락토즈, 3'-시알릴-N-아세틸락토사민, 6'-시알릴-N-아세틸락토사민, 시알릴락토-N-비오즈, 루이스 X, 루이스 a, 락토-N-테트라오즈, 락토-N-네오테트라오즈, 락토디푸코테트라오즈, 3'-시알릴-3-푸코실락토즈, 시알릴루이스 X, 시알릴루이스 a, 락토-N-푸코펜타오즈 I, 락토-N-푸코펜타오즈 II, 락토-N-푸코펜타오즈 III, 락토-N-푸코펜타오즈 V, LS-테트라사카라이드 a, LS-테트라사카라이드 b, LS-테트라사카라이드 c, (α2, 3) 시알릴락토-N-네오테트라오즈 및 이들의 유도체, 세린, 트레오닌, 아스파라긴 및 당해 아미노산을 함유하는 펩타이드 및 이의 유도체, 세라미드 및 이의 유도체 등을 예시할 수 있다. 당해 복합 당질 전구 물질은 0.01mM 내지 2.0M의 농도로 사용할 수 있다.
본 발명의 복합 당질로서는, 글루코즈, 갈락토즈, N-아세틸글루코사민, N-아세틸갈락토사민, 글루크론산, 만노즈, N-아세틸만노사민, 푸코즈, 시알산, 락토즈, N-아세틸락토사민, 락토-N-비오즈, GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc, GlcNAcβ1-4Galβ1-4Glc, 글로보트리오즈, Galα1-4Galβ1-4GlcNAc, 2'-푸코실프룩토즈, 3-푸코실락토즈, 3'-시알릴갈락토즈, 6'-시알릴락토즈, 3'-시알릴-N-아세틸락토사민, 6'-시알릴-N-아세틸락토사민, 시알릴락토-N-비토즈, 루이스 X, 루이스 a, 락트-N-테트라오즈, 락토-N-네오테트라오즈, 락토디푸코테트라오즈, 3'-시알릴-3-푸코실락토즈, 시알릴루이스 X, 시알릴루이스 a, 락토-N-푸코펜타오즈 I, 락토-N-푸코펜타오즈 II, 락토-N-푸코펜타오즈 III, 락토-N-푸코펜타오즈 V, LS-테드라사카라이드 a, LS-테트라사카라이드 b, LS-테트라사카라이드 c, (α2,3) 시알릴락토-N-네오테르라오즈, 락토-N-디푸코헥사오즈 I, 락토-N-디푸코헥사오즈 II, 락토-N-헥사오즈, 락토-N-네오헥사오즈, 디시알릴락토-N-테트라오즈 및 이들의 유도체에서 선택되는 당을 하나 이상 함유하는 복합 당질 또는 당해 복합 당질을 함유하는 복합 당질을 들 수 있으며, 예를 들면, Galβ1-3Glc, Galβ1-4Glc, Galβ1-3GlcNAc, Galβ1-4GlcNAc, Galβ1-3Gal, Galβ1-4Gal, Galβ1-3GalNAc, Galβ1-4GalNAc, Galα1-3Glc, Galα1-4Glc, Galα1-3GlcNAc, Galα1-4GlcNAc, Galα1-3Gal, Galα1-4Gal, Galα1-3GalNAc, Galα1-4GalNAc, GlcNAcβ1-3Gal, GlcNAcβ1-4Gal, GlcNAcβ1-6Gal, GlcNAcβ1-3Glc, GlcNAcβ1-4Glc, GlcNAcβ1-3GlcNAc, GlcNAcβ1-4GlcNAc, GlcNAcβ1-6GalNAc, GlcNAcβ1-2Man, GlcNAcβ1-4Man, GlcNAcβ1-6Man, GalNAcβ1-3Gal, GalNAcβ1-4Gal, GalNAcβ1-4GlcNAc, GalNAcα1-3GalNAc, Manβ1-4GlcNAc, Manα1-6Man, Manα1-3Man, Manα1-2Man, GlcUAβ1-4GlcN, GlcUAβ1-3Gal, GlcUAβ1-3GlcNAc, GlcUAβ1-3GalNAc, NeuAcα2-3Gal, NeuAcα2-6Gal, NeuAcα2-3GlcNAc, NeuAcα2-6GlcNAc, NeuAcα2-3GalNAc, NeuAcα2-6GalNAc, NeuAcα2-8NeuAc, Fucα1-3Glc, Fucα1-4Glc, Fucα1-3GlcNAc, Fucα1-4GlcNac, Fucα1-2Gal 및 Fucα1-6GlcNAc에서 선택되는 결합을 갖는 당을 함유하는 복합 당질 또는 당해 복합 당질을 함유하는 복합 당질을 들 수 있다. 또한, 이러한 당을 갖는 복합 당질에 함유되는 당의 수로서는 10개 이하 또는 6개 이하를 들 수 있다.
구체적인 복합 당질 제조법으로 다음 방법 등을 예로 들 수 있다:
(1)나이세리아 유래의 β1,4-갈락토실트랜스페라제(WO96/10086)을 발현하는 미생물, UTP의 전구 물질로부터 UTP를 생산하는 능력을 갖는 미생물, 당과 UTP로부터 UDP-Gal을 생산하는 능력을 갖는 미생물의 배양액 또는 당해 배양액의 처리물을 효소원으로 하는 효소 반응을 실시함으로써, 오르토산과 갈락토즈와 글루코즈로부터 락토즈를 생성시킬 수 있다.
(2) 나이세리아 유래의 β1,4-갈락토실트랜스페라제(WO96/10086)를 발현하는 미생물, UTP의 전구 물질로부터 UTP를 생산하는 능력을 갖는 미생물, 당과 UTP로부터 UDP-Gal을 생산하는 능력을 갖는 미생물의 배양액 또는 당해 배양액의 처리물을 효소원으로 하는 효소 반응을 실시함으로써, 오르토산, 갈락토즈와 N-아세틸글루코사민으로부터 N-아세틸락토사민을 생성시킬 수 있다.
(3) 나이세리아 유래의 α2,3-시알릴트랜스페라제[참조: J. Biol. Chem., 271, 28271 (1996)]을 발현하는 미생물, CTP의 전구 물질로부터 CTP를 생산하는 능력을 갖는 미생물, 당과 CTP로부터 CMP-NeuAc를 생산하는 능력을 갖는 미생물의 배양액 또는 당해 배양액의 처리물을 효소원으로 하는 효소 반응을 실시함으로써, 오르토산과 N-아세틸만노사민, 피루브산과 락토즈로부터 3'-시알릴락토즈를 생성시킬수 있다.
(4) 나이세리아 유래의 α2,3-시알릴트랜스페라제[참조: J. Biol. Chem., 271, 28271 (1996)]을 발현하는 미생물, CTP의 전구 물질로부터 CTP를 생산하는 능력을 갖는 미생물, 당과 CTP로부터 CMP-NeuAc를 생산하는 능력을 갖는 미생물의 배양액 또는 당해 배양액의 처리물을 효소원으로 하는 효소 반응을 실시함으로써, 오르토산과 N-아세틸만노사민, 피루브산과 N-아세틸락토사민으로부터 3'-시알릴-N-아세틸락토사민을 생성시킬 수 있다.
(5) 닭 유래의 α2,6-시알릴트랜스페라제를 발현하는 COS-7 세포[참조: Eur. J. Biochem., 219, 375 (1994)], CTP의 전구 물질로부터 CTP를 생산하는 능력을 갖는 미생물, 당과 CTP로부터 CMP-NeuAc를 생산하는 능력을 갖는 미생물의 배양액 또는 당해 배양액의 처리물을 효소원으로 하는 효소 반응을 실시함으로써, 오르토산과 N-아세틸만노사민, 피루브산과 N-아세틸락토사민으로부터 6'-시알릴-N-아세틸락토사민을 생성시킬 수 있다.
(6) 나이세리아 유래의 β1,3-N-아세틸글루코사미닐트랜스페라제(참조: WO96/10086)을 발현하는 미생물, UTP의 전구 물질로부터 UTP를 생산하는 능력을 갖는 미생물, 당과 UTP로부터 UDP-GlcNAc를 생산하는 능력을 갖는 미생물의 배양액 또는 당해 배양액의 처리물을 효소원으로 하는 효소 반응을 실시함으로써, 오르토산, N-아세틸글루코사민과 락토즈로부터 GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc를 생성시킬수 있다.
(7) β1,3-갈락토실트랜스페라제를 생산하는 사람·흑색종 세포 WM266-4주(ATCC CRL1676), 또는 사람·흑색종 세포 WM266-4 유래 β1,3-갈락토실트랜스페라제 유전자를 발현하는 나말바 세포 KJM-1주 등의 재조합체주(참조: 일본국공개특허공보 제(평)6-181759호), UTP의 전구 물질로부터 UTP를 생산하는 능력을 갖는 미생물, 당과 UTP로부터 UDP-Gal을 생산하는 능력을 갖는 미생물의 배양액 또는 당해 배양액의 처리물을 효소원으로 하는 효소 반응을 실시함으로써, 오르토산, 갈락토즈와 GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc로부터 락토-N-테트라오즈를 생성시킬 수 있다.
(8) 사람 Hela 세포 유래의 β1,4-갈락토실트랜스페라제 유전자를 발현하는 에스케리키아·콜라이[참조: EMBO J., 9, 3171 (1990)] 또는 사카로마이세스 세레비지애[참조: Biochem. Biophys. Res. Commun., 201, 160 (1994)], UTP의 전구 물질로부터 UTP를 생산하는 능력을 갖는 미생물, 당과 UTP로부터 UDP-Gal을 생산하는 능력을 갖는 미생물 배양액 또는 당해 배양액의 처리물을 효소원으로 하는 효소 반응을 실시함으로써, 오르토산, 갈락토즈와 GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc로부터 락토-N-네오테트라오즈를 생성시킬 수 있다.
(9) 나이세리아 유래의 β1,4-갈락토즈트랜스페라제(참조: WO96/10086)을 발현하는 미생물, UTP의 전구 물질로부터 UTP를 생산하는 능력을 갖는 미생물, 당과 UTP로부터 UDP-Gal를 생산하는 능력을 갖는 미생물의 배양액 또는 당해 배양액의 처리물을 효소원으로 하는 효소 반응을 실시함으로써, 오르토산, 갈락토즈와 GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc로부터 락토-N-네오테트라오즈를 생성시킬 수 있다.
(10) 나이세리아 유래의 β1,3-N-아세틸글루코사미닐트랜스페라제(참조: WO96/10086)을 발현하는 미생물, 나이세리아 유래의 β1,4-N-갈락토실트랜스페라제(참조: WO96/10086)을 발현하는 미생물, UTP의 전구 물질로부터 UTP를 생산하는 능력을 갖는 미생물, 당과 UTP로부터 UDP-GlcNAc를 생산하는 능력을 갖는 미생물, 당과 UTP로부터 UDP-Gal을 생산하는 능력을 갖는 미생물의 배양액 또는 당해 배양액의 처리물을 효소원으로 하는 효소 반응을 실시함으로써, 오르토산, N-아세틸글루코사민, 갈락토즈와 락토즈로부터 락토-N-네오테르라오즈를 생성시킬 수 있다.
(11) 나이세리아 유래의 α2,3-시알릴트랜스페라제[참조: J. Biol. Chem., 271, 28271 (1996)]을 발현하는 미생물, CTP의 전구 물질로부터 CTP를 생산하는 능력을 갖는 미생물, 당과 CTP로부터 CMP-NeuAc를 생산하는 능력을 갖는 미생물의 배양액 또는 당해 배양액의 처리물을 효소원으로 하는 효소 반응을 실시함으로써, 오르토산과 N-아세틸만노사민, 피루브산과 락토-N-네오테트라오즈로부터 (α2,3) 시알릴락토-N-네오테트라오즈를 생성시킬 수 있다.
(12) 사람 유래의 α1,3-푸코실트랜스페라제를 발현하는 나말바 세포[참조: J. Biol. Chem., 269, 14730 (1994)], GTP의 전구 물질로부터 GTP를 생산하는 능력을 갖는 미생물, 당과 GTP로부터 GDP-Fuc를 생산하는 능력을 갖는 미생물의 배양액 또는 당해 배양액의 처리물을 효소원으로 하는 효소 반응을 실시함으로써, GMP, 만노즈와 락토-N-네오테트라오즈로부터 락토-N-푸코펜타오즈 III를 생성시킬 수 있다.
(13) 헬리코박터·피롤리 유래의 α1,3-푸코실트랜스페라제[참조: J. Biol. Chem., 272, 21349 및 21357 (1997)]를 발현하는 미생물, GTP의 전구 물질로부터 GTP를 생산하는 능력을 갖는 미생물, 당과 GTP로부터 GDP-Fuc를 생산하는 능력을 갖는 미생물의 배양액 또는 당해 배양액의 처리물을 효소원으로 하는 효소 반응을 실시함으로써, GMP, 만노즈와 락토-N-네오테트라오즈로부터 락토-N-푸코펜타오즈 III를 생성시킬 수 있다.
(14) 나이세리아 유래의 α1,4-갈락토실트랜스페라제(참조: WO96/10086)를 발현하는 미생물, UTP의 전구 물질로부터 UTP를 생성하는 능력을 갖는 미생물, 당과 UTP로부터 UDP-Gal을 생산하는 능력을 갖는 미생물의 배양액 또는 당해 배양액의 처리물을 효소원으로 하는 효소 반응을 실시함으로써, 오르토산, 갈락토즈와 락토즈로부터 글로보트리오즈를 생성시킬 수 있다.
(15) 나이세리아 유래의 β1,4-갈락토실트랜스페라제(참조: WO96/10086)를 발현하는 미생물, 나이세리아 유래의 α1,4-갈락토실트랜스페라제(참조: WO96/10086)를 발현하는 미생물, UTP의 전구 물질로부터 UTP를 생성하는 능력을 갖는 미생물, 당과 UTP로부터 UDP-Gal을 생산하는 능력을 갖는 미생물의 배양액 또는 당해 배양액의 처리물을 효소원으로 하는 효소 반응을 실시함으로써, 오르토산, 갈락토즈와 락토즈로부터 글루코즈를 생성시킬 수 있다.
(16) 나이세리아 유래의 α1,4-갈락토실트랜스페라제(참조: WO96/10086)를 발현하는 미생물, UTP의 전구 물질로부터 UTP를 생산하는 능력을 갖는 미생물, 당과 UTP로부터 UDP-Gal을 생산하는 능력을 갖는 미생물의 배양액 또는 당해 배양액의 처리물을 효소원으로 하는 효소 반응을 실시함으로써, 오르토산, 갈락토즈와 N-아세틸락토사민으로부터 Galα1-4Galβ1-4GlcNAc를 생성시킬 수 있다.
(17) 사람 유래의 β1,3-갈락토실트랜스페라제(참조: 일본국공개특허공보 제(평)6-181759호)를 발현하는 동물 세포, UTP의 전구 물질로부터 UTP를 생산하는 능력을 갖는 미생물, 당과 UTP로부터 UDP-Gal을 생산하는 능력을 갖는 미생물의 배양액 또는 당해 배양액의 처리물을 효소원으로 하는 효소 반응을 실시함으로써, 오르토산, 갈락토즈와 N-아세틸글루코사민으로부터 락토-N-비오즈를 생성시킬 수 있다.
(18) 나이세리아 유래의 α2,3-시알릴트랜스페라제[참조: J. Biol. Chem., 271, 28271 (1996)]을 발현하는 미생물, CTP의 전구 물질로부터 CTP를 생성하는 능력을 갖는 미생물, 당과 CTP로부터 CMP-NeuAc를 생산하는 능력을 갖는 미생물의 배양액 또는 당해 배양액의 처리물을 효소원으로 하는 효소 반응을 실시함으로써, 오르토산과 N-아세틸만노사민, 피루브산과 락토-N-비오즈로부터 시알릴락토-N-비오즈를 생성시킬 수 있다.
(19) 사람 유래의 α1,3-푸코실트랜스페라제[참조: J. Biol. Chem., 269, 14730 (1994)]을 발현하는 동물 세포, GTP의 전구 물질로부터 GTP를 생산하는 능력을 갖는 미생물, 당과 GTP로부터 GDP-Fuc를 생산하는 능력을 갖는 미생물의 배양액 또는 당해 배양액의 처리물을 효소원으로 하는 효소 반응을 실시함으로써, GMP, 만노즈와 3'-시알릴 N-아세틸락토사민으로부터 시알릴루이스 X를 생성시킬 수 있다.
(20) 사람 유래의 α1,3/1,4-푸코실트랜스페라제[참조: Carbohydrate Research, 190, 1 (1989)], GTP의 전구 물질로부터 GTP를 생산하는 능력을 갖는 미생물, 당과 GTP로부터 GDP-Fuc를 생산하는 능력을 갖는 미생물의 배양액 또는 당해 배양액의 처리물을 효소원으로 하는 효소 반응을 실시함으로써, GMP, 만노즈와 시알릴 락토-N-비오즈로부터 시알릴루이스 a를 생성시킬 수 있다.
(21) 효모 유래의 α1,2-만노실트랜스페라제를 발현하는 에스케리키아·콜라이[참조: J. Org. Chem., 58, 3985 (1993)], GTP의 전구 물질로부터 GTP를 생산하는 능력을 갖는 미생물, 당과 GTP로부터 GDP-Man을 생산하는 능력을 갖는 미생물의 배양액 또는 당해 배양액의 처리물을 효소원으로 하는 효소 반응을 실시함으로써, GMP와 만노즈로부터 Manα1-2Man을 생성시킬 수 있다.
복합 당질의 제조법은 상기에 기재된 예로 한정되지는 않으며, 본 특허에 기재된 당 뉴클레오티드 제조법과 조합할 수 있는 당 전이 효소, 및 당해 효소가 허용되는 기질 특이성의 범위에서 어떠한 당쇄라도 뉴클레오티드의 전구 물질, 당, 복합 당질 전구 물질만을 원료로 하여 공업적으로 제조할 수 있다.
본 발명의 제조방법에 따라 제조하는 복합 당질로서, 예를 들면,
(1) 병원성 미생물이나 바이러스의 감염에 관여하는 복합 당질류, 예를 들면, 병원성 미생물이나 바이러스의 수용체로서 인식되는 복합 당질류,
(2) 병원성 미생물이나 바이러스가 생성하는 독소의 수용체로서 인식되는 복합 당질류,
(3) 생체내에서 세포 접착, 이물질의 인식, 각종 림포카인의 결합 등에 관여하는 복합 당질류 등의 글루코즈, 갈락토즈, N-아세틸글루코사민, N-아세틸갈락토사민, 글루클론산, 만노즈, N-아세틸만노사민, 푸코즈, 시알산 등의 당을 단독 또는 복수, 화학적으로 허용되는 결합 형식으로 함유하는 복합 당질을 들 수 있으며, 보다 구체적으로는,
(1) 사람이나 동물의 젖속에 함유되는 유아의 미생물 감염 방어에 관여하는 복합 당질류, 예를 들면, 락토-N-테트라오즈, 락토-N-네오테트라오즈 등의 복합당질,
(2) 에스케리키아 콜라이, 프로피오니박테리움 그라눌로시움(Propionibacterium granulosium), 마이코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis), 모락셀라 카타랄리스(Moraxella cataraxella), 캔디다 알비칸스(Candida albicans), 스타필로코쿠스 사프로피티쿠스(Staphylococcus saprophytcus), 스트렙토코쿠스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae), 스트렙토코쿠스 아갈락티아에(Streptococcus agalactiae), 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 액티노마이세스 나에스룬디이(Actinomyces naeslundii), 나이세리아 고노르호에아에(Neisseria gonorrhoeae), 헬리코박터 피롤리(Helicobacter pylori), 헤모필루스 인플루엔자에(Haemophilus influenzae) 등의 미생물을 인식하는 수용체 복합 당질,
(3) 인플루엔자 바이러스, 코로나 바이러스, 센다이 바이러스, 뉴캐슬병 바이러스, 레오 바이러스, 로타 바이러스, 에이즈 바이러스 등의 바이러스 수용체 복합 당질,
(4) 크립토스포리듐, 트리파노조마 등의 원충의 수용체 복합 당질,
(5) 콜레라 독소, 대장균 이열성 독소, 보툴리누스 독소, 클로스트리듐δ독소, 클로스트리듐 A 독소, 시가 독소, 벨로 독소, 시가 독소양 독소, 장염 비브리오 내열성 독소, 파상풍 독소 등의 독소가 결합하는 수용체 복합 당질,
(6) GD 3, GM 3 등의 강글리오사이드나 글로보계 당지질 등의 암 관련 복합 당질,
(7) 시알릴루이스 X 당쇄 등의, 백혈구의 염증 부위에 대한 접착이나 기능 변이에 관여하는 복합 당질류,
(8) 만성 관절 류마티스나 IgA 신장염 등의 자기 면역 질환에 관여하는 복합 당질류,
(9) 이물질 인식이나 암 세포의 인식에 관여하는 각종 렉틴 유사 물질이 인식하는 복합 당질류 등을 들 수 있다.
수성 매체내에 생성되는 복합 당질의 정량은 공지된 방법에 준해 실시할 수 있다.[참조: Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 85, 3289 (1988), Anal. Biochem., 174, 459 (1988)].
반응액 내에 생성되는 복합 당질의 채취는 활성탄이나 이온 교환 수지 등을 사용하는 통상적인 방법에 따라 실시할 수 있으며, 예를 들면, N-아세틸락토사민에 대해서는 문헌[참조: J. Org. Chem., 47, 5416 (1982)]에 기재된 방법에 준해 실시할 수 있다.
하기에 본 발명의 실시예를 기재하며, 본 발명은 이들 실시예로 한정되지 않는다.
하기에 본 발명의 실시예를 기재한다.
본 발명의 목적은 세균, 바이러스 등의 감염 방어, 심장 혈관 장애에 대한 적응과 면역 치료 등에 유용한 복합 당질의 제조방법 및 당해 복합 당질의 합성 기질로서 중요한 당 뉴클레오티드의 저렴하면서 효율적인 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 미생물을 이용하여, 뉴클레오티드의 전구 물질을 원료로 하는 복합 당질과 당 뉴클레오티드의 생산에 관해 예의 검토를 한 결과, 뉴클레오티드의 전구 물질과 당만을 원료로 하여 당 뉴클레오티드를 효율적으로 생산할 수 있으며, 당 뉴클레오티드의 생산에 관여하는 유전자의 발현을 강화함으로써, 이의 생산성이 향상되는 것을 밝혀내고, 또한 이러한 당 뉴클레오티드를 생산할 수 있는 미생물 및 당 뉴클레오티드와 복합 당질 전구 물질로부터 복합 당질을 생산하는 능력을 갖는 미생물 또는 동물 세포나 곤충 세포를 이용하고, 뉴클레오티드의 전구 물질 및 당과 복합 당질 전구 물질만을 원료로 하여 효율적인 복합 당질을 생산할 수 있는 것을 밝혀내어 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명은 (a) 뉴클레오티드의 전구 물질로부터 NTP를 생산하는 능력을 갖는 미생물의 배양액 또는 당해 배양액의 처리물, (b) 당과 NTP로부터 당 뉴클레오티드를 생산하는 능력을 갖는 미생물의 배양액 또는 당해 배양액의 처리물 및 (c) 당 뉴클레오티드와 복합 당질 전구 물질로부터 복합 당질을 생산하는 능력을 갖는 미생물, 동물 세포 또는 곤충 세포의 배양액이나 당해 배양액의 처리물을 효소원으로서 사용하여, 이들 효소원, 뉴클레오티드의 전구 물질, 당 및 복합 당질 전구 물질을 수성 매체 속에 존재시키고, 이러한 수성 매체 속에 복합 당질을 생성 축적시켜 수성 매체 속에서 복합 당질을 채취함을 특징으로 하는 복합 당질의 제조법; (a) 뉴클레오티드의 전구 물질로부터 NTP를 생산하는 능력을 갖는 미생물의 배양액 또는 당해 배양액의 처리물 및 (b) 당과 NTP로부터 당 뉴클레오티드를 생산하는 능력을 갖는 미생물의 배양액 또는 당해 배양액의 처리물을 효소원으로서 사용하여, 이들 효소원, 뉴클레오티드의 전구 물질 및 당을 수성 매체 속에 존재시키고, 이러한 수성 매체 속에 당 뉴클레오티드를 생성 축적시켜 수성 매체 속으로부터 당 뉴클레오티드를 채취함을 특징으로 하는 당 뉴클레오티드의 제조법; 및 당 뉴클레오티드와 복합 당질 전구 물질로부터 복합 당질을 생산하는 능력을 갖는 미생물, 동물 세포 또는 곤충 세포의 배양액 또는 당해 배양액의 처리물을 효소원으로서 사용하여, 당해 효소원, 복합 당질 전구 물질 및 상기에 기재된 당 뉴클레오티드의 제조법에 따라 수득되는 당 뉴클레오티드를 수성 매체 속에 존재시키고, 이러한 수성 매체속에 복합 당질을 생성 축적시켜 수성 매체 속으로부터 복합 당질을 채취함을 특징으로 하는 복합 당질의 제조법을 제공한다. 또한, 갈락토키나제 활성이 강한 미생물의 배양액 또는 당해 배양액의 처리물을 효소원으로서 사용하고 당해 효소원 및 N-아세틸글루코사민을 수성 매체 속에 존재시키고, 이러한 수성 매체속에 N-아세틸글루코사민-1-인산을 생성 축적시키며, 이러한 수성 매체 속으로부터 N-아세틸글루코사민-1-인산을 채취함을 특징으로 하는 N-아세틸글루코사민-1-인산의 제조법을 제공한다.
실시예 1. galU, ppa를 발현하는 재조합체 플라스미드의 조성
galU, ppa를 발현하는 재조합체 플라스미드 pNT12의 조성 방법에 대해 하기에 기재한다(도 1 및 도 2).
1) PL 프로모터를 함유하는 발현 벡터의 조성
PL 프로모터를 함유하는 발현 벡터인 pPA31 및 pPAC31은 하기에 기재된 방법으로 조성한다(도 1).
트립토판 프로모터를 함유하는 플라스미드 pTrS30을 보유하는 에스케리키아·콜라이 JM109/pTrS30(FERM BP-5407) 및 PL 프로모터를 함유하는 플라미드 pPA1(참조: 일본 공개특허공보제(소)63-233798호), PL 프로모터 및 cI857 리프레서를 함유하는 플라스미드 pPACl(FERM BP-6054)을 보유하는 에스케리키아·콜라이를 각각 LB 배지[박토트립톤(디프코사제) 10g/ℓ, 효모 추출물(디프코사제) 5g/ℓ, NaCl 5g/ℓ, pH 7.2]에 접종하고, 30℃에서 18시간 동안 배양한다.
이러한 배양에 의해 수득되는 균체로부터 상기의 공지된 방법에 따라, pTrS30, pPAl 및 pPACl 플라스미드 DNA를 단리 정제한다.
정제된 pTrS30 DNA 0.2㎍을 제한 효소 PstI 및 ClaI으로 절단한 다음, 아가로즈 겔 전기영동으로 DNA 단편을 분리하고, 진클린 Ⅱ 키트(Bio101사제)을 사용하여 3.4kb의 단편을 회수한다. 정제된 pPAl DNA 0.5㎍을 제한 효소 PstI 및 ClaI로 절단한 다음, 아가로즈 겔 전기영동으로 DNA 단편을 분리하고, 동일하게 1.0kb의 단편을 회수한다.
이러한 3.4kb의 단편 및 1.0kb의 단편을 연결 키트(TAKARA ligation Kit, 다카라슈조사제)를 사용하여 16℃에서 16시간 동안 연결 반응을 실시한다.
이러한 연결 반응액을 사용하여 에스케리키아·콜라이 NM522주를 상기의 공지된 방법에 따라 형질전환하고, 당해 형질전환체를 암피실린 50㎍/ml를 함유하는 한천 배지에 도말한 다음, 37℃에서 하룻밤 배양한다.
생육시킨 형질전환체의 콜로니로 상기의 공지된 방법에 따라 플라스미드를 추출하고, 프로모터에 의해 발현 벡터인 pPA31을 수득한다. 이러한 플라스미드의 구조를 제한 효소 분해로 확인한다(참조: 도 1).
정제한 pPA31 DNA 0.2㎍을 제한 효소 PstI 및 ClaI로 절단한 다음, 아가로즈겔 전기영동으로 DNA 단편을 분리하고, 진클린 Ⅱ 키트를 사용하여 3.4kb의 단편을 회수한다. 정제한 pPACl DNA 0.5㎍을 제한 효소 PstI 및 ClaI로 절단한 다음, 아가로즈 겔 전기영동으로 DNA 단편을 분리하고, 동일하게 2.3kb의 단편을 회수한다.
당해 3.4kb의 단편 및 2.3kb의 단편을 연결 키트를 사용하여 16℃에서 16시간 동안 연결 반응을 실시한다.
이러한 연결 반응액을 사용하여 에스케리키아·콜라이 NM522주를 상기의 공지된 방법에 따라 형질전환하고, 당해 형질전환체를 암피실린 50㎍/ml를 함유하는 한천 배지에 도말한 다음, 37℃에서 하룻밤 배양한다.
생육시킨 형질전환체의 콜로니로 상기의 공지된 방법에 따라 플라스미드를 추출하고, cI857 리프레서를 함유하는 PL 프로모터에 의해 발현 벡터인 pPAC31을 취득한다. 이러한 플라스미드의 구조를 제한 효소 분해로 확인한다(참조: 도 1).
2) galU 발현 플라스미드의 조성
에스케리키아·콜라이 W3110주의 염색체 DNA를 공지된 방법[참조: Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons Inc. (1994)]으로 단리 정제한다.
서열번호 1에 기재된 센스 쇄 DNA 프라이머 및, 서열번호 2에 기재된 안티센스 쇄 DNA 프라이머를 어플라이드· 바이오시스템즈(Applied Biosystems)사제 380A· DNA 합성기를 사용하여 합성한다.
이러한 합성 DNA를 프라이머로서, W3110주의 염색체 DNA를 주형으로 하여 PCR을 실시한다. PCR은 W3110 염색체 DNA 0.04㎍, 프라이머 각 0.5μM, TAKARA Ex Taq(다카라슈조사제) 1.0단위, 10×Ex Taq 완충액(다카라슈조사제) 4㎕, 데옥시 NTP 각 200μM을 함유하는 반응액 40㎕를 사용하여, 94℃-1분, 42℃-2분, 72℃-3분의 공정을 30회 반복함으로써 실시한다.
이러한 반응액 1/10 양을 아가로즈겔 전기영동에 걸어, 목적하는 단편이 증폭되는 것을 확인한 다음, 나머지 반응액과 등량의 TE[10mM 트리스 염산 완층액(pH 8.0), 1mM EDTA] 포화 페놀/클로로포름(1용적/1용적)을 첨가하여 혼합한다. 당해 혼합액을 원심분리한 다음, 수득된 상층에 2배 용량의 냉 에탄올을 가하여 혼합하고, -80℃에서 30분 동안 방치한다. 이러한 방치액을 원심분리하여 DNA의 침전을 수득한다. 당해 침전을 70% 냉 에탄올로 세정하고, 진공 건조하여 침전을 수득한다. 이후에 TE 포화 페놀/클로로포름을 첨가하고, 에탄올로 세정한 DNA의 침전을 수득할 때까지의 조작을 에탄올 침전법이라고 호칭한다.
당해 DNA의 침전을 20㎕의 TE에 용해시킨다. 이러한 용해액 5㎕를 사용하고, DNA를 제한 효소 HindⅢ 및 BamHI로 절단하여 아가로즈겔 전기영동으로 DNA 단편을 분리한 다음, 진클린 키트 II를 사용하여 0.9kb의 단편을 회수한다. 실시예 1-1)에서 취득한 pPA31 DNA 0.2㎍을 제한 효소 HindⅢ 및 BamHI로 절단한 다음, 아가로즈겔 전기영동으로 DNA 단편을 분리하고, 동일하게 4.2kb의 단편을 회수한다.
이러한 0.9kb의 단편 및 4.2kb의 단편을 연결 키트를 사용하여 16℃에서 16시간 동안 연결 반응을 실시한다.
이러한 연결 반응액을 사용하여 에스케리키아·콜라이 KY8415주를 상기의 공지된 방법에 따라 형질전환하고, 당해 형질전환체를 암피실린 50㎍/ml를 함유하는 LB 한천 배지에 도말한 다음, 30℃에서 하룻밤 배양한다.
생육시킨 형질전환체의 콜로니로부터 상기의 공지된 방법에 따라 플라스미드를 추출하고, galU 발현 플라스미드인 pNT9를 수득한다. 당해 플라스미드의 구조를 제한 효소 분해로 확인한다(참조: 도 2).
3) galU, ppa 동시 발현 플라스미드의 조성
서열번호 3에 기재된 센스 쇄 DNA 프라이머 및, 서열번호 4에 기재된 안티센스 쇄 DNA 프라이머를 합성하고, 당해 합성 DNA를 프라이머로 하여 W3110주의 염색체 DNA를 주형으로서 상기와 동일한 조건으로 PCR을 실시한다.
PCR 종료 후에 에탄올 침전법으로 DNA의 침전을 취득한다. 이러한 침전을 20㎕의 TE에 용해시킨다. 당해 용해액 5㎕를 사용하고, DNA를 제한 효소 BamHI 및 SalI로 절단하여 아가로즈겔 전기영동으로 DNA 단편을 분리한 다음, 진클린 키트를 사용하여 1.0kb의 단편을 회수한다. 실시예 1-2)에서 취득한 pNT9 DNA 0.2㎍을 제한 효소 BamHI 및 SalI로 절단한 다음, 아가로즈겔 전기영동으로 DNA 단편을 분리하고, 동일하게 4.9kb의 단편을 회수한다.
이러한 1.0kb의 단편 및 4.9kb의 단편을 연결 키트를 사용하여 16℃에서 16시간 동안 연결 반응을 실시한다.
이러한 연결 반응액을 사용하여 에스케리키아·콜라이 KY 8415주를 공지된 방법에 따라 형질전환하고, 당해 형질전환체를 암피실린 50㎍/ml를 함유하는 한천 배지에 도말한 다음, 30℃에서 하룻밤 배양한다.
생육시킨 형질전환체의 콜로니로 상기의 공지된 방법에 따라 플라스미드를 추출하고, galU, ppa 동시 발현 플라스미드인 pNT12를 수득한다. 당해 플라스미드의 구조를 제한 효소 분해로 확인한다(참조: 도 2).
이러한 pNT12 DNA 0.5㎍을 제한 효소 EcoRI 및 SalI로 절단한 다음, 아가로즈겔 전기영동으로 DNA 단편을 분리하고, 진클린 II 키트로 2.2kb의 단편을 회수한다. 한편, pSTV28 DNA(다카라슈조사제) 0.2㎍을 제한 효소 EcoRI 및 SalI로 절단한 다음, 아가로즈겔 전기영동으로 DNA 단편을 분리하고, 동일하게 3.0kb의 단편을 회수한다.
이러한 2.2kb의 단편 및 3.0kb의 단편을 연결 키트를 사용하여 16℃에서 16시간 동안 연결 반응을 실시한다. 당해 연결 반응액을 사용하여 에스케리키아·콜라이 NM522주를 통상적인 방법에 따라 형질전환하고, 당해 형질전환체를 클로람페니콜 10㎍/ml를 함유하는 LB 한천 배지에 도말한 다음, 30℃에서 하룻밤 배양한다.
생육시킨 형질전환체의 콜로니로부터 통상적인 방법에 따라 플라스미드를 추출하고 galU, ppa 유전자 발현 플라스미드인 pNT32를 수득한다. 당해 플라스미드의 구조를 제한 효소 분해로 확인한다(참조: 도 2).
실시예 2 : UDP-Glc의 생산
실시예 1에서 수득한 에스케리키아·콜라이 KY8415/pNT12주를, 암피실린 50㎍/ml를 함유하는 LB 배지 125ml가 투입된 1L 용적 배플 부착 삼각 플라스크에 접종하고, 30℃에서 220rpm의 조건으로 17시간 동안 배양한다. 당해 배양액 125ml를 글루코즈 10g/ℓ, 박토트립톤(디프코사제) 12g/ℓ, 효모 추출물(디프코사제) 24g/ℓ, KH2PO4 2.3g/ℓ(별도 살균), K2HPO4 12.5g/ℓ(별도 살균), 암피실린 50㎍/ml의 조성으로 이루어진 액체 배지(pH 조정하지 않음) 2.5L가 투입된 5L 용적 배양조에 접종하고, 30℃에서 4시간 동안, 다시, 40℃에서 3시간 동안, 600rpm, 통기량 2.5L/분의 조건으로 배양을 실시한다.
당해 배양중에 28% 암모니아수를 사용하여, 배양액의 pH를 7.0으로 유지시킨다. 또한 배양 도중에 필요에 따라 글루코즈를 첨가한다. 이러한 배양액을 원심분리하여 습윤 균체를 취득한다. 당해 습윤 균체는 필요에 따라 -20℃로 보존할 수 있으며, 사용 전에 해동시켜 사용할 수 있다.
코리네박테리움·암모니아게네스 ATCC21170주를, 글루코즈 50g/ℓ, 폴리펩톤(닛폰세이야쿠사제) 10g/ℓ, 효모 추출물(오리엔탈고보사제) 10g/ℓ, 요소 5g/ℓ, (NH4)2SO4 5g/ℓ, KH2PO4 1g/ℓ, K2HPO4 3g/ℓ, MgSO4·7H2O 1g/ℓ, CaCl2·2H2O 0.1g/ℓ, FeSO4·7H2O 10mg/ℓ, ZnSO4·7H2O 10mg/ℓ, MnSO4·4 ~ 6H2O 20mg/ℓ, L-시스테인 20mg/ℓ, D-판토텐산칼슘 10mg/ℓ, 비타민 B1 5mg/ℓ, 니코틴산 5mg/ℓ, 및 비오틴 30㎍/ℓ(10N NaOH로 pH 7. 2로 조정)의 조성으로 이루어진 액체 배지 20ml가 투입된 300ml 용적 배플 부착 삼각 플라스크에 접종하고, 28℃에서 220rpm의 조건으로 24시간 동안 배양한다.
당해 배양액 20ml를 상기와 동일한 조성의 액체 배지 250ml가 투입된 2L 용적 배플 부착 삼각 플라스크에 접종하고, 28℃에서 220rpm의 조건으로 24시간 동안 배양한다. 수득된 배양액을 종배양액으로서 사용한다.
종배양액 250ml를, 글루코즈 150g/ℓ, 육즙(교쿠토세이야쿠사제) 5g/ℓ, KH2PO4 10g/ℓ, K2HPO4 10g/ℓ, MgSO4·7H2O 10g/ℓ, CaCl2·2H2O 0.1g/ℓ, FeSO4·7H2O 20mg/ℓ, ZnSO4·7H2O 10mg/ℓ, MnSO4·4 ~ 6H2O 20mg/ℓ(별도 살균), β-알라닌 15mg/ℓ(별도 살균), L-시스테인 20mg/ℓ, 비오틴 100㎍/ℓ, 요소 2g/ℓ, 및 비타민 Bl 5mg/ℓ(별도 살균)(10N NaOH로 pH 7.2로 조정)의 조성으로 이루어진 액체 배지 2.25L가 투입된 5L 용적 배양조에 접종하고, 32℃에서 600rpm, 통기량 2.5L/분의 조건으로 24시간 동안 배양을 실시한다. 배양중에 28% 암모니아수를 사용하여 배양액의 pH를 6.8로 유지시킨다.
당해 배양액을 원심분리하여 습윤 균체를 취득한다. 이러한 습윤 균체는 필요에 따라 -20℃로 보존할 수 있으며, 사용 전에 해동시켜 사용할 수 있다.
에스케리키아·콜라이 KY8415/pNT12주 습윤 균체 40g/ℓ, 코리네박테리움·암모니아게네스 ATCC21170주 습윤 균체 150g/ℓ, 글루코즈 100g/ℓ, KH2PO4 20g/ℓ, MgSO4·7H2O 5g/ℓ, 피틴산 5g/ℓ, 오르토산(칼륨염) 21.2g/ℓ, 나이민 S-215 4g/ℓ, 크실렌 10ml/ℓ의 조성으로 이루어진 반응액 30ml를 200ml 용적 비이커에 투입하고, 당해 반응액을 자기 교반기로 교반하고(900rpm), 32℃에서 21시간 동안 반응을 실시한다.
반응 중에, 4N NaOH를 사용하여 당해 반응액의 pH를 7.2로 유지시키고, 필요에 따라 글루코즈, KH2PO4를 첨가한다.
당해 반응에 따라, 반응액 중에 43.9g/ℓ의 UDP-Glc(2Na 염)이 생성된다.
실시예 3: galT, galK를 발현하는 재조합체 플라스미드의 조성
galT, galK을 발현하는 재조합체 플라스미드 pNT25의 조성 방법에 대해 하기에 기재한다(도 3).
서열번호 5에 기재된 센스 쇄 DNA 프라이머 및 서열번호 6에 기재된 안티센스 쇄 DNA 프라이머를 합성하고, 이러한 합성 DNA를 프라이머로서, W3110주의 염색체 DNA를 주형으로 하여 상기와 동일한 조건으로 PCR을 실시한다.
PCR 종료 후에 에탄올 침전법으로 DNA의 침전을 취득한다. 이러한 DNA 침전을 20㎕의 TE에 용해한다. 당해 용해액 5㎕를 사용하고, DNA를 제한 효소 HindⅢ 및 HincⅡ로 절단한 다음, 아가로즈겔 전기영동으로 DNA 단편을 분리한 다음, 진클린 Ⅱ 키트를 사용하여 2.3kb의 단편을 회수한다. pBluescript Ⅱ SK+ DNA 0.2㎍을 제한 효소 HindⅢ 및 EcoRV로 절단하고, 아가로즈겔 전기영동으로 DNA 단편을 분리하여 동일하게 3.0kb의 단편을 회수한다.
이러한 2.3kb의 단편 및 3.0kb의 단편을 연결 키트를 사용하여 16℃에서 16시간 동안 연결 반응을 실시한다.
이러한 연결 반응액을 사용하여 에스케리키아·콜라이 NM522주를 상기의 공지된 방법에 따라 형질전환하고, 당해 형질전환체를 암피실린 50㎍/ml를 함유하는 LB 한천 배지에 도말한 다음, 30℃에서 하룻밤 배양한다.
생육시킨 형질전환체의 콜로니로부터 상기의 공지된 방법에 따라 플라스미드를 추출하고, galT, galK 유전자를 함유하는 플라스미드인 pNT19를 수득한다. 당해 플라스미드의 구조를 제한 효소 분해로 확인한다(참조: 도 3).
이러한 pNT19 DNA 0.5㎍을 제한 효소 ClaI 및 BamHI로 절단한 다음, 아가로즈겔 전기영동으로 DNA 단편을 분리하고, 동일하게 2.3kb의 단편을 회수한다. 실시예 1-1)에서 취득한 pPAC31 DNA 0.2㎍을 제한 효소 ClaI 및 BamHI로 절단한 다음, 아가로즈겔 전기영동으로 DNA 단편을 분리하고, 동일하게 5.5kb의 단편을 회수한다.
이러한 2.3kb의 단편 및 5.5kb의 단편을 연결 키트를 사용하여 16℃에서 16시간 동안 연결 반응을 실시한다.
이러한 연결 반응액을 사용하여 에스케리키아·콜라이 NM52주를 상기의 공지된 방법에 따라 형질전환하고, 당해 형질전환체를 암피실린 50㎍/ml를 함유하는 LB 한천 배지에 도말한 다음, 30℃에서 하룻밤 배양한다.
생육시킨 형질전환체의 콜로니로부터 상기의 공지된 방법에 따라 플라스미드를 추출하고, galT, galK 동시 발현 플라스미드인 pNT25를 수득한다. 당해 플라스미드의 구조를 제한 효소 분해로 확인한다(참조: 도 3).
실시예 4 : UDP-Gal의 생산
1) galT, glaK, galU, ppa 발현주의 조성
실시예 1-3)에서 수득한 pNT32 DNA를 사용하여 에스케리키아·콜라이 NM522/pNT25주를 통상적인 방법에 따라 형질전환하고, 당해 형질전환체를 암피실린 50㎍/ml 및 클로람페니콜 10㎍/ml를 함유하는 한천 배지에 도말한 다음, 30℃에서 하룻밤 배양한다. 생육시킨 형질전환체를 선택함으로써, galT, galK, galU, ppa 발현주인 에스케리키아·콜라이 NM522/pNT25/pNT32주를 수득한다.
2) UDP-Gal의 생산
실시예 4-1)에서 수득한 에스케리키아·콜라이 NM522/pNT25/pNT32주를 실시예 2와 동일한 방법으로 배양하고, 수득된 각각의 배양물을 원심분리하여 습윤 균체를 취득한다. 또한, 코리네박테리움·암모니아게네스 ATCC21170 주를 실시예 2와 동일한 방법으로 배양하고, 수득된 배양물을 원심분리하여 습윤 균체를 취득한다. 습윤 균체는 필요에 따라 -20℃에서 보존할 수 있으며, 사용 전에 해동시켜 사용할 수 있다.
에스케리키아·콜라이 NM522/pNT25/pNT32주 습윤 균체 50g/ℓ, 코리네박테리움·암모니아게네스 ATCC21170주 습윤 균체 150g/ℓ, 글루코즈 80g/ℓ, 갈락토즈 20g/ℓ, KH2PO4 15g/ℓ, MgSO4·7H2O 5g/ℓ, 피틴산 5g/ℓ, 오르토산(칼륨염) 21.2g/ℓ, 나이민 S-215 4g/ℓ, 크실렌 10ml/ℓ의 조성으로 이루어진 반응액 2L를 5L 용적 배양조에 투입하고, 당해 반응액을 600rpm으로 교반하고, 1L/분으로 통기하며, 32℃에서 26시간 동안 반응을 실시한다.
반응 중에 4N NaOH를 사용하여, 당해 반응액을 pH 7.2로 유지시키고, 필요에 따라, 글루코즈, 갈락토즈, KH2PO4를 첨가한다.
당해 반응에 따라, 반응액 중에 47.4g/ℓ의 UDP-Gal(2Na염)이 생성된다.
실시예 5: galT, galK를 코리네박테리움·암모니아게네스에서 발현하는 재조합체 플라스미드의 조성
에스케리키아·콜라이 유래의 galT, galK를 코리네박테리움·암모니아게네스에서 발현하는 재조합체 플라스미드 pTK7의 조성 방법에 대해 하기에 기재한다(참조: 도 4).
1) pCG116의 조성
코리네박테리움·암모니아게네스에서 복제할 수 있는 플라스미드 pCG116의 조성을 하기와 같이 실시한다.
플라스미드 pCG11(참조: 일본 특허공보 제(평)6-91827호) DNA 0.5㎍을 제한 효소 PstI 및 StuI으로 절단한 다음, 아가로즈겔 전기영동으로 DNA 단편을 분리하고, 진클린 II 키트를 사용하여 6.5kb의 단편을 회수한다.
한편, 플라스미드 pUC19 DNA 1.0㎍을 제한 효소 EcoRI로 절단한 다음, DNA 평활 말단화 키트(다카라슈조사제)를 사용하여 평활 말단화한다. 평활 말단화된 DNA를 PstI로 절단한 다음, 아가로즈겔 전기영동으로 DNA 단편을 분리하고, MERmaid 키트(Bio101사제)를 사용하여 43bp의 단편을 회수한다.
이러한 6.5kb의 단편 및 43bp의 단편을 연결 키트를 사용하여, 16℃에서 16시간 동안 연결 반응을 실시한다.
이러한 연결 반응액을 사용하여 코리네박테리움·암모니아게네스 ATCC21170주를 전기 천공법[FERM Microbiol. Lett., 65, 299 (1989)]으로 형질전환하고, 당해 형질전환체를 스펙티노마이신 100㎍/ml를 함유하는 LB 한천 배지에 도말한 다음, 30℃에서 2일 동안 배양한다.
생육시킨 형질전환체의 콜로니로부터 공지된 방법[참조: J. Bacteriol., 159 306 (1984)]에 따라 플라스미드를 추출하고, 플라스미드 pCG116을 수득한다. 당해 플라스미드의 구조를 제한 효소 분해로 확인한다(참조: 도 4).
2) galT, galK를 발현하는 플라스미드 pTK7의 조성
실시예 3에서 조성된 galT, galK를 발현하는 플라스미드 pNT25 DNA 1.0㎍을 제한 효소 XhoI 및 BamHI로 절단한 다음, 아가로즈겔 전기 영동으로 DNA 단편을 분리하고, 진클린 키트를 사용하여 3.5kb의 단편을 회수한다.
한편, 실시예 5-1)에서 조성된 플라스미드 pCG116 DNA 0.5㎍을 제한 효소 SalI 및 BamHI로 절단한 다음, 아가로즈겔 전기 영동으로 DNA 단편을 분리하고, 동일하게 6.5kb의 단편을 회수한다.
이러한 3.5kb의 단편 및 6.5kb의 단편을 연결 키트를 사용하여 16℃에서 16시간 동안 연결 반응을 실시한다.
이러한 연결 반응액을 사용하여 코리네박테리움·암모니아게네스 ATCC21170주를 전기 천공법으로 형질전환하고, 당해 형질전환체를 스펙티노마이신 100㎍/ml를 함유하는 LB 한천 배지에 도말한 다음, 30℃에서 2일 동안 배양한다.
생육시킨 형질전환체의 콜로니로부터 공지된 방법에 따라 플라스미드를 추출하고, galT, galK 동시 발현 플라스미드인 pTK7를 수득한다. 당해 플라스미드의 구조를 제한 효소 분해로 확인한다(참조: 4 도).
실시예 6 : UDP-Gal의 생성
실시예 5에서 수득한 코리네박테리움·암모니아게네스 ATCC21170/pTK7주를 실시예 2와 동일한 방법으로 32℃에서 20시간 동안 배양한 다음, 40℃에서 4시간 동안 배양하고, 수득된 배양물을 원심분리하여 습윤 균체를 취득한다. 습윤 균체는 필요에 따라 -20℃로 보존할 수 있으며, 사용 전에 해동시켜 사용할 수 있다.
코리네박테리움·암모니아게네스 ATCC21170/pTK7주 습윤 균체 150g/ℓ, 프룩토즈 40g/ℓ, 갈락토즈 20g/ℓ, KH2PO4 15g/ℓ, MgSO4·7H2O 5g/ℓ, 피틴산 5g/ℓ, 오르토산(칼륨염) 10.6g/ℓ, 나이민 S-215 4g/ℓ, 크실렌 10ml/ℓ의 조성으로 이루어진 반응액 30ml를 200ml 용적 비이커에 투입하고, 당해 반응액을 자기 교반기로 교반하고(900rpm), 32℃에서 22시간 동안 반응을 실시한다.
반응 중에 4N NaOH를 이용하여 당해 반응액을 pH 7.2로 유지하고, 필요에 따라 프룩토즈, 갈락토즈, KH2PO4를 첨가한다.
당해 반응에 따라, 반응액 중에 7.2g/ℓ의 UDP-Gal(2Na 염)이 생성된다.
실시예 7 : glmU, ppa, pgm, glmM, glk, pfkB 발현 플라스미드의 조성
1) glmU, ppa 발현 플라스미드의 조성
서열번호 7에 기재된 센스 쇄 DNA 프라이머 및 서열번호 8에 기재된 안티센스 쇄 DNA 프라이머를 합성한다. 이러한 합성 DNA를 프라이머로서 W3110주의 염색체 DNA를 주형으로 하여 상기와 동일한 조건에서 PCR을 실시한다.
PCR 종료 후에 에탄올 침전법으로 DNA의 침전을 취득한다. 당해 DNA 침전을 20㎕의 TE에 용해시킨다. 당해 용해액 5㎕를 사용하고, DNA를 제한 효소 HindIII 및 BamHI로 절단한 다음, 아가로즈겔 전기영동으로 DNA 단편을 분리하고, 진클린 II 키트를 사용하여 1.4kb의 단편을 회수한다. 실시에 1-1)에서 취득한 pPA31 DNA 0.5㎍을 제한 효소 HindIII 및 BamHI로 절단한 다음, 아가로즈겔 전기영동으로 DNA 단편을 분리하고, 동일하게 4.2kb의 단편을 회수한다.
이러한 1.4kb의 단편 및 4.2kb의 단편을 연결 키트를 사용하여 16℃에서 16시간 동안 연결 반응을 실시한다.
이러한 연결 반응액을 사용하여 에스케리키아·콜라이 KY8415주를 상기의 공지된 방법에 따라 형질전환하고, 당해 형질전환체를 암피실린 50㎍/ml를 함유하는 LB 한천 배지에 도말한 다음, 30℃에서 하룻밤 배양한다.
생육시킨 형질전환체의 콜로니로부터 상기의 공지된 방법에 따라 플라스미드를 추출하고, glmU 발현 플라스미드인 pNT10을 수득한다. 당해 플라스미드의 구조를 제한 효소 분해로 확인한다(참조: 도 5).
실시예 1-3)에서 취득한 pNT12 DNA 0.5㎍을 제한 효소 BamHI 및 SalI로 절단한 다음, 아가로즈겔 전기영동으로 DNA 단편을 분리하고, 동일하게 1.0kb의 단편을 회수한다. 상기한 pNT10 DNA 0.2㎍을 제한 효소 BamHI 및 SalI로 절단한 다음, 아기로즈겔 전기영동으로 DNA 단편을 분리하고, 동일하게 5.3kb의 단편을 회수한다.
이러한 1.0kb의 단편 및 5.3kb의 단편을 연결 키트를 사용하여 16℃에서 16시간 동안 연결 반응을 실시한다.
이러한 연결 반응액을 사용하여 에스케리키아·콜라이 KY8415주를 상기의 공지된 방법에 따라 형질전환하고, 당해 형질전환체를 암피실린 50㎍/ml을 함유하는 LB 한천 배지에 도말한 다음, 30℃에서 하룻밤 배양한다.
생육시킨 형질전환체의 콜로니로부터 공지된 방법에 따라 플라스미드를 추출하고, glmU, ppa 동시 발현 플라스미드인 pNT14를 수득한다. 당해 플라스미드의 구조를 제한 효소 분해로 확인한다(참조: 도 5).
2) pgm 발현 플라스미드의 조성
서열번호 9에 기재된 센스 쇄 DNA 프라이머 및 서열번호 10에 기재된 안티센스 쇄 DNA 프라이머를 합성한다. 당해 합성 DNA를 프라이머로서, W3110주의 염색체 DNA를 주형으로 하여 상기와 동일한 조건으로 PCR을 실시한다.
PCR 종료 후에 에탄올 침전법으로 DNA의 침전을 취득한다. 이러한 침전을 20㎕의 TE에 용해시킨다. 당해 용해액 5㎕를 사용하고, DNA를 제한 효소 ClaI 및 BamHI로 절단한 다음 아가로즈겔 전기영동으로 DNA 단편을 분리하고, 진클린 II 키트를 사용하여 1.8kb의 단편을 회수한다. 실시예 1-1)에서 취득한 pPAC31 DNA 0.2㎍을 제한 효소 ClaI 및 BamHI로 절단한 다음, 아가로즈겔 전기영동으로 DNA 단편을 분리하고, 동일하게 5.5kb의 단편을 회수한다.
이러한 1.8kb의 단편 및 5.5kb의 단편을 연결 키트를 사용하여 16℃에서 16시간 동안 연결 반응을 실시한다.
이러한 연결 반응액을 사용하여 에스케리키아·콜라이 NM522주를 상기의 공지된 방법에 따라 형질전환하고, 당해 형질전환체를 암피실린 50㎍/ml을 함유하는 LB 한천 배지에 도말한 다음 30℃에서 하룻밤 배양한다.
생육시킨 형질전환체의 콜로니로부터 상기의 공지된 방법에 따라 플라스미드를 추출하고, pgm 발현 플라스미드인 pNT24를 수득한다. 당해 플라스미드의 구조를 제한 효소 분해로 확인한다(참조: 도 6).
3) glmM 발현 플라스미드의 조성
서열번호 11에 기재된 센스 쇄 DNA 프라이머 및 서열번호 12에 기재된 안티센스 쇄 DNA 프라이머를 합성한다. 이러한 합성 DNA를 프라이머로 하고, 에스케리키아·콜라이 W3110주의 염색체 DNA를 주형으로 하여 상기와 동일한 조건으로 PCR을 실시한다.
PCR 종료 후에 에탄올 침전법으로 DNA의 침전을 취득한다. 이러한 침전을 20㎕의 TE에 용해한다. 당해 용해액 5㎕를 사용하고, DNA를 제한 효소 ClaI 및 BamHI로 절단한 다음, 아가로즈겔 전기영동으로 DNA 단편을 분리하고, 진클린 II 키트를 사용하여 1.6kb의 단편을 회수한다. 실시예 1-1)에서 취득한 pPAC31 DNA 0.2㎍을 제한 효소 ClaI 및 BamHI로 절단한 다음, 아가로즈겔 전기영동으로 DNA 단편을 분리하고, 동일하게 5.5kb의 단편을 회수한다.
이러한 1.6kb의 단편 및 5.5kb의 단편을 연결 키트를 사용하여 16℃에서 16시간 동안 연결 반응을 실시한다.
이러한 연결 반응액을 사용하여 에스케리키아·콜라이 NM522주를 상기의 공지된 방법에 따라 형질전환하고, 당해 형질전환체를 암피실린 50㎍/ml을 함유하는 LB 한천 배지에 도말한 다음, 30℃에서 하룻밤 배양한다.
생육시킨 형질전환체의 콜로니로부터 상기의 공지된 방법에 따라 플라스미드를 추출하고, glmU 발현 플라스미드인 pNT44를 수득한다. 당해 플라스미드의 구조를 제한 효소 분해로 확인한다(참조: 도 7).
4) glk 발현 플라스미드의 조성
서열번호 13에 기재된 센스 쇄 DNA 프라이머 및 서열번호 14에 기재된 안티센스 쇄 DNA 프라이머를 합성한다. 이러한 합성 DNA를 프라이머로 하고 에스케리키아·콜라이 W3110주의 염색체 DNA를 주형으로 하여 상기와 동일한 조건으로 PCR을 실시한다.
PCR 종료 후에 에탄올 침전법으로 DNA의 침전을 취득하고, 이러한 침전을 20㎕의 TE에 용해시킨다. 당해 용해액 5㎕를 사용하고, DNA를 제한 효소 HindIII 및 BamHI로 절단한 다음, 아가로즈겔 전기영동으로 DNA 단편을 분리하고, 진클린 II 키트를 사용하여 0.5kb의 단편을 회수한다.
실시예 1-1)에서 취득한 pPA31 DNA 0.2㎍을 제한 효소 HindIII 및 BamHI로 절단한 다음, 아가로즈겔 전기영동으로 DNA 단편을 분리하고, 동일하게 4.2kb의 단편을 회수한다.
이러한 0.5kb의 단편 및 4.2kb의 단편을 연결 키트를 사용하여 16℃에서 16시간 동안 연결 반응을 실시한다. 이러한 연결 반응액을 사용하여 에스케리키아·콜라이 NM522주를 통상적인 방법에 따라 형질전환하고, 당해 형질전환체를 암피실린 50㎍/ℓ를 함유하는 LB 한천 배지에 도말한 다음, 30℃에서 하룻밤 배양한다.
생육시킨 형질전환체의 콜로니로부터 통상적인 방법에 따라 플라스미드를 추출하고, 1k의 일부를 갖는 플라스미드인 pNT45를 수득한다. 당해 플라스미드의 구조를 제한 효소 분해로 확인한다(참조: 도 8).
상기와 동일한 조건으로 PCR을 실시하고, 수득된 DNA 용해액 5㎕를 사용하고, DNA를 제한 효소 HindIII로 절단한 다음, 아가로즈겔 전기영동으로 DNA 단편을 분리하고, 동일하게 0.5kb의 단편을 회수한다. 위에 기재한 방법으로 취득한 pNT45 DNA 0.2㎍을 제한 효소 HindIII로 절단한 다음, 알칼리 포스파타제로 탈인산화 처리를 실시하고, 아가로즈겔 전기영동으로 DNA 단편을 분리하고, 동일하게 4.7kb의 단편을 회수한다.
이러한 0.5kb의 단편 및 4.7kb의 단편을 연결 키트를 사용하여 16℃에서 16시간 동안 연결 반응을 실시한다.
이러한 연결 반응액을 사용하여 에스케리키아·콜라이 NM522주를 통상적인 방법에 따라 형질전환하고, 당해 형질전환체를 암피실린 50㎍/ml을 함유하는 LB 한천 배지에 도말한 다음, 30℃에서 하룻밤 배양한다.
생육시킨 형질전환체의 콜로니로부터 통상적인 방법에 따라 플라스미드를 추출하고, glk 발현 플라스미드인 pNT46을 수득한다. 당해 플라스미드의 구조를 제한 효소 분해로 확인한다(참조: 도 8).
5) pfkB 발현 플라스미드의 조성
서열번호 15에 기재된 센스 쇄 DNA 프라이머 및 서열번호 16에 기재된 안티센스 쇄 DNA 프라이머를 합성한다. 이러한 합성 DNA를 프라이머로 하고, W3110주의 염색체 DNA를 주형으로 하여 상기와 동일한 조건으로 PCR을 실시한다.
PCR 종료 후에 에탄올 침전법으로 DNA의 침전을 취득한다. 이러한 침전을 20㎕의 TE에 용해시킨다. 당해 용해액 5㎕를 사용하고, DNA를 제한 효소 HindIII 및 EcoRV로 절단한 다음, 아가로즈겔 전기영동으로 DNA 단편을 분리하고, 진클린 II 키트를 사용하여 1.3kb의 단편을 회수한다. pBluescript II SK+ DNA 0.2㎍을 제한 효소 HindIII 및 EcoRV로 절단한 다음, 아가로즈겔 전기영동으로 DNA 단편을 분리하고, 동일하게 3.0kb의 단편을 회수한다.
이러한 1.3kb의 단편 및 3.0kb의 단편을 연결 키트를 사용하여 16℃에서 16시간 동안 연결 반응을 실시한다.
이러한 연결 반응액을 사용하여 에스케리키아·콜라이 NM522주를 상기의 공지된 방법에 따라 형질전환하고, 당해 형질전환체를 암피실린 50㎍/ml을 함유하는 LB 한천 배지에 도말한 다음, 30℃에서 하룻밤 배양한다.
생육시킨 형질전환체의 콜로니로부터 통상적인 방법에 따라 플라스미드를 추출하고, pfkB 유전자를 보유하는 플라스미드인 pNT43을 수득한다. 당해 플라스미드의 구조를 제한 효소 분해로 확인한다(참조: 도 9).
pNT43 DNA 0.5㎍을 사용하고, DNA를 제한 효소 ClaI 및 SacI로 절단한 다음, 아가로즈겔 전기영동으로 DNA 단편을 분리하고, 동일하게 1.3kb의 단편을 회수한다.
실시예 1-1)에서 취득한 pPAC31 DNA 0.2㎍을 제한 효소 ClaI 및 SacI로 절단한 다음, 아가로즈겔 전기영동으로 DNA 단편을 분리하고, 동일하게 5.7kb의 단편을 회수한다.
이러한 1.3kb의 단편 및 5.7kb의 단편을 연결 키트를 사용하여 16℃에서 16시간 동안 연결 반응을 실시한다.
이러한 연결 반응액을 사용하여 에스케리키아·콜라이 NM522주를 통상적인 방법에 따라 형질전환하고, 당해 형질전환체를 암피실린 50㎍/ml을 함유하는 LB 한천 배지에 도말한 다음, 30℃에서 하룻밤 배양한다.
생육시킨 형질전환체의 콜로니로부터 통상적인 방법에 따라 플라스미드를 추출하고, pfkB 발현 플라스미드인 pNT47를 수득한다. 당해 플라스미드의 구조를 제한 효소 분해로 확인한다(참조: 도 9).
실시예 8 : UDP-GlcNAc의 생산
실시예 7에서 수득된 에스케리키아·콜라이 KY8415/pNT14주, NM522/pNT24주, NM522/pNT44주, NM522/pNT47주를 실시예 2와 동일한 방법으로 배양하고, 수득된 각각의 배양물을 원심분리하여 습윤 균체를 취득한다. 당해 습윤 균체는 필요에 따라 -20℃에서 보존할 수 있으며, 사용 전에 해동시켜 사용할 수 있다.
에스케리키아·콜라이 NM522/pNT24주 습윤 균체 6g/ℓ, NM522/pNT47주 습윤 균체 6g/ℓ, 100mM 트리스 염산 완충액(pH 8.0), 6mM MgCl2·6H2O 10mM 글루코즈-6-인산, 2.5mM 프룩토즈 6-인산, 2.5mM ATP, 나이민 S-215 4g/ℓ의 조성으로 이루어진 반응액 0.1ml를 1.5ml 용적 튜브에 투입하고, 37℃에서 1시간 동안 반응을 실시한다. 반응액을 65℃에서 5분 동안 처리한 다음, 에스케리키아·콜라이 KY8415/pNT14주 습윤 균체 0.3g/ℓ, NM522/pNT44주 습윤 균체 6g/ℓ, 5mM 글루코사민-6-인산, 5mM 아세틸 CoA, 5mM UTP로 되도록 균체 및 기질을 첨가한 다음, 37℃에서 30분 동안 반응시킨 바, 반응액 중에 2.5mM(1.6g/ℓ)의 UDP-GlcNAc (2Na 염)이 생성된다. 이때에, 에스케리키아·콜라이 NM522/pNT24주 습윤 균체 또는 NM522/pNT47주 습윤 균체를 첨가하지 않은 경우에 UDP-GlcNAc 생성량은 각각 0.08mM, 0.16mM이다.
이러한 점은, pgm 발현주와 pfkB 발현주를 조합함으로써, glmM의 활성 발현에 필요한 Glc-1, 6-P2가 공급될 수 있음을 나타낸다.
실시예 9 : UDP-GlcNAc의 생산
실시예 7에서 수득한 에스케리키아·콜라이 KY8415/pNT14주, NM522/pNT24주, NM522/pNT44주, NM522/pNT46주, NM522/pNT47주를 실시예 2와 동일한 방법으로 배양하고, 수득되는 각각의 배양물을 원심분리하여 습윤 균체를 취득한다. 또한, 코리네박테리움·암모니아게네스 ATCC21170주를 실시예 2와 동일한 방법으로 배양하고, 수득된 배양물을 원심분리하여 습윤 균체를 취득한다. 습윤 균체는 필요에 따라 -20℃에서 보존할 수 있으며, 사용 전에 해동시켜 사용할 수 있다.
에스케리키아·콜라이 KY8415/pNT14주, NM522/pNT24주, NM522/pNT44주, NM522/pNT47주, NM522/pNT46주 습윤 균체를 각 10g/ℓ, 코리네박테리움·암모니아게네스 ATCC21170주 습윤 균체 150g/ℓ, 프룩토즈 50g/ℓ, 글루코사민 염산염 80g/ℓ, KH2PO4 15g/ℓ, MgSO4, 7H2O 5g/ℓ, 피틴산 5g/ℓ, 오르토산(칼륨염) 10g/ℓ, 나이민 S-215 4g/ℓ, 크실렌 10ml/ℓ의 조성으로 이루어진 반응액 30ml를 200ml 용적 비이커에 투입하고, 이러한 반응액을 자기 교반기로 교반하고(900rpm), 32℃에서 10시간 동안 반응을 실시한다.
반응 중에 4N NaOH를 사용하여, 당해 반응액의 pH를 7.2로 유지하고, 필요에 따라 프룩토즈 및 KH2PO4를 첨가한다.
당해 반응에 따라, 반응액 중에 6.2g/ℓ의 UDP-GlcNAc (2Na 염)이 생성된다.
실시예 10: galK 발현 플라스미드의 조성
실시예 3-1)에서 취득한 pNT25 DNA 0.5㎍을 제한 효소 ClaI 및 EcoRV로 절단한 다음, 아가로즈겔 전기영동으로 DNA 단편을 분리하고, 진클린 II 키트를 사용하여 6.7kb의 단편을 회수한다. 회수된 DNA를 DNA 평활 말단화 키트로 평활 말단화한 다음, 연결 키트를 사용하여 16℃에서 16시간 동안 연결 반응을 실시한다.
이러한 연결 반응액을 사용하여 에스케리키아·콜라이 NM522주를 통상적인 방법에 따라 형질전환하고, 당해 형질전환체를 암피실린 50㎍/ml를 함유하는 LB 한천 배지에 도말한 다음, 30℃에서 하룻밤 배양한다.
생육시킨 형질전환체의 콜로니로부터 통상적인 방법에 따라 플라스미드를 추출하고, galK 발현 플라스미드인 pNT54를 수득한다. 당해 플라스미드의 구조를 제한 효소 분해로 확인한다(참조: 도 10).
실시예 11: UDP-GlcNAc의 생산
실시예 10에서 수득한 에스케리키아·콜라이 NM522/pNT54주를 실시예 2와 동일한 방법으로 배양하고, 수득된 배양물을 원심분리하여 습윤 균체를 취득한다. 또한, 코리네박테리움·암모니아게네스 ATCC21170주를 실시예 2와 동일한 방법으로 배양하고, 수득되는 배양물을 원심분리하여 습윤 균체를 취득한다. 습윤 균체는 필요에 따라 -20℃에서 보존할 수 있으며, 사용 전에 해동시켜 사용할 수 있다.
에스케리키아·콜라이 NM522/pNT54주 습윤 균체 50g/ℓ, 코리네박테리움·암모니아게네스 ATCC21170주 습윤 균체 150g/ℓ, 프룩토즈 40g/ℓ, N-아세틸글루코사민 67g/ℓ, KH2PO4 15g/ℓ, MgSO4·7H2O 5g/ℓ, 피틴산 5g/ℓ, 오르토산 (칼륨염) 10g/ℓ, 나이민 S-215 4g/ℓ, 크실렌 10ml/ℓ의 조성으로 이루어진 반응액 30ml를 200ml 용적 비이커에 투입하고, 이러한 반응액을 자기 교반기로 교반하고(900rpm), 32℃에서 27시간 동안 반응을 실시한다.
반응 중에 4N NaOH를 사용하여, 당해 반응액의 pH를 7.2로 유지하고, 필요에 따라 프룩토즈 및 KH2PO4를 첨가한다.
당해 반응에 따라, 반응액 중에 17.1g/ℓ의 UDP-GlcNAc(2Na 염)이 생성된다.
실시예 12: UDP-GlcNAc와 UDP-Gal의 동시 생산
실시예 3에서 수득한 NM522/pNT25주를 실시예 2와 동일한 방법으로 배양하고, 수득되는 배양물을 원심분리하여 습윤 균체를 취득한다. 또한, 코리네박테리움·암모니아게네스 ATCC21170주를 실시예 2와 동일한 방법으로 배양하고, 수득되는 배양물을 원심분리하여 습윤 균체를 취득한다. 습윤 균체는 필요에 따라 -20℃에서 보존할 수 있으며, 사용 전에 해동시켜 사용할 수 있다.
에스케리키아·콜라이 NM522/pNT25주 습윤 균체 25g/ℓ, 코리네박테리움·암모니아게네스 ATCC21170주 습윤 균체 150g/ℓ, 프룩토즈 60g/ℓ, N-아세틸글루코사민 50g/ℓ, 갈락토즈 40g/ℓ, KH2PO4 15g/ℓ, MgSO4·7H2O 5g/ℓ, 피틴산 5g/ℓ, 오르토산(칼륨염) 10g/ℓ, 나이민 S-215 4g/ℓ, 크실렌 10ml/ℓ의 조성으로 이루어진 반응액 30ml를 200ml 용적 비이커에 투입하고, 이러한 반응액을 자기 교반기로 교반하고 (900rpm), 32℃에서 24시간 동안 반응을 실시한다.
반응 중에 4N NaOH를 사용하여 당해 반응액의 pH를 7.2로 유지하고, 필요에 따라 KH2PO4를 첨가한다.
당해 반응에 따라, 반응액 속에 11.4g/ℓ의 UDP-GlcNAc(2Na 염) 및 18g/ℓ의 UDP-Gal(2Na 염)이 생성된다.
실시예 13 : manB, manC, pgm, pfkB 발현 플라스미드의 조성
1) manB, manC 발현 플라스미드의 조성
서열번호 17에 기재된 센스 쇄 DNA 프라이머 및 서열번호 18에 기재된 안티센스 쇄 DNA 프라이머를 합성한다. 이러한 합성 DNA를 프라이머로 하고, 에스케리키아·콜라이 W3110주 염색체 DNA를 주형으로 하여 상기와 동일한 조건으로 PCR을 실시한다.
PCR 종료 후에 에탄올 침전법으로 DNA의 침전을 취득한다. 당해 침전을 20㎕의 TE에 용해시킨다. 당해 용해액 5㎕를 사용하고, DNA를 제한 효소 HindIII 및 BamHI로 절단한 다음, 아가로즈겔 전기영동으로 DNA 단편을 분리하고, 진클린 II 키트를 사용하여 3.0kb의 단편을 회수한다. pBluescript II SK+ DNA 0.2㎍을 제한 효소 HindIII 및 BamHI로 절단한 다음, 아가로즈겔 전기영동으로 DNA 단편을 분리하고, 동일하게 3.0kb의 단편을 회수한다.
이러한 3.0kb의 양쪽 단편을 연결 키트를 사용하여 16℃에서 16시간 동안 연결 반응을 실시한다. 이러한 연결 반응액을 사용하여 에스케리키아·콜라이 NM522주를 통상적인 방법에 따라 형질전환하고, 당해 형질전환체를 암피실린 50㎍/ml를 함유하는 LB 한천 배지에 도말한 다음, 30℃에서 하룻밤 배양한다.
생육시킨 형질전환체의 콜로니로부터 통상적인 방법에 따라 플라스미드를 추출하고, manC 및 manB를 함유하는 플라스미드인 pNK6를 수득한다. 당해 플라스미드의 구조를 제한 효소 분해로 확인한다(도 11).
이러한 pNK6 DNA 0.5㎍을 제한 효소 ClaI 및 BamHI로 절단한 다음, 아가로즈겔 전기영동으로 DNA 단편을 분리하고, 3.0kb의 단편을 회수한다. 실시예 1-1)에서 취득한 pPAC31 DNA 0.2㎍을 제한 효소 ClaI 및 BamHI로 절단한 다음, 아가로즈겔 전기영동으로 DNA 단편을 분리하고, 동일하게 5.5kb의 단편을 회수한다.
이러한 3.0kb의 단편 및 5.5kb의 단편을 연결 키트를 사용하여 16℃에서 16시간 동안 연결 반응을 실시한다. 이러한 연결 반응액을 사용하여 에스케리키아·콜라이 NM522주를 통상적인 방법에 따라 형질전환하고, 당해 형질전환체를 암피실린 50㎍/ml를 함유하는 LB 한천 배지에 도말한 다음, 30℃에서 하룻밤 배양한다.
생육시킨 형질전환체의 콜로니로부터 통상적인 방법에 따라 플라스미드를 추출하고, manC 및 manB 발현 플라스미드인 pNK7를 수득한다. 당해 플라스미드의 구조를 제한 효소 분해로 확인한다(참조: 도 11).
2) pgm, pfkB 동시 발현 플라스미드의 조성
실시예 7에서 취득한 pNT24 DNA 0.5㎍을 제한 효소 XhoI 및 BamHI로 절단한 다음, 아가로즈겔 전기영동으로 DNA 단편을 분리하고, 진클린 II 키트를 사용하여 3.0kb의 단편을 회수한다. 한편, pSTV28 DNA(다카라슈조사제) 0.2㎍을 제한 효소 SalI 및 BamHI로 절단한 다음, 아가로즈겔 전기영동으로 DNA 단편을 분리하고, 동일하게 3.0kb의 단편을 회수한다.
이러한 3.0kb의 양쪽 단편을 연결 키트를 사용하여 16℃에서 16시간 동안 연결 반응을 실시한다. 이러한 연결 반응액을 사용하여 에스케리키아·콜라이 NM522주를 통상적인 방법에 따라 형질전환하고, 당해 형질전환체를 클로람페니콜 10㎍/ml를 함유하는 LB 한천 배지에 도말한 다음, 30℃에서 하룻밤 배양한다.
생육시킨 형질전환체의 콜로니로부터 통상적인 방법에 따라 플라스미드를 추출하고, pgm 유전자를 갖는 플라스미드인 pNT53을 수득한다. 당해 플라스미드의 구조를 제한 효소 소화로 확인한다(참조: 도 12).
서열번호 19에 기재된 센스 쇄 DNA 프라이머를 합성하고, 당해 센스 쇄 DNA 프라이머 및 서열번호 16에 기재된 안티센스 쇄 DNA 프라이머를 사용하고, 실시예 7에서 취득한 플라스미드 pNT47 DNA를 주형으로 하여 상기와 동일한 조건으로 PCR을 실시한다.
PCR 종료 후에, 에탄올 침전법으로 DNA의 침전을 취득한다. 이러한 침전을 20㎕의 TE에 용해시킨다. 당해 용해액 5㎕를 사용하여, DNA를 제한 효소 EcoRV 및 BglII로 절단한 다음, 아가로즈겔 전기영동으로 DNA 단편을 분리하고, 동일하게 1.3kb의 단편을 회수한다. pNT53 DNA 0.2㎍을 제한 효소 SmaI 및 BamHI로 절단한 다음, 아가로즈겔 전기영동으로 DNA 단편을 분리하고, 동일하게 6.0kb의 단편을 회수한다.
이러한 1.3kb의 단편 및 6.0kb의 단편을 연결 키트를 사용하여 16℃에서 16시간 동안 연결 반응을 실시한다.
이러한 연결 반응액을 사용하여 에스케리키아·콜라이 NM522주를 통상적인 방법에 따라 형질전환하고, 당해 형질전환체를 클로람페니콜 10㎍/ml를 함유하는 LB 한천 배지에 도말한 다음, 30℃에서 하룻밤 배양한다.
생육시킨 형질전환체의 콜로니로부터 통상적인 방법에 따라 플라스미드를 추출하고, pgm 및 pfkB 발현 플라스미드인 pNT55를 수득한다. 당해 플라스미드의 구조를 제한 효소 분해로 확인한다(참조: 도 12).
실시예 14 : GDP-Man의 생산
1) manB, manC, pgm, pfkB 발현주의 조성
실시예 13-2)에서 수득한 pNT55 DNA를 사용하여 에스케리키아·콜라이 NM522/pNK7주를 통상적인 방법에 따라 형질전환하고, 당해 형질전환체를 암피실린 50㎍/ml 및 클로람페니콜 10㎍/ml를 함유하는 LB 한천 배지에 도말한 다음, 30℃에서 하룻밤 배양한다. 생육시킨 형질전환체를 선택함으로써, manB, manC, pgm, pfkB 발현주인 에스케리키아·콜라이 NM522/pNK7/pNT55주를 수득한다.
2) GDP-Man의 생산
상기의 1)에서 수득한 에스케리키아·콜라이 NM522/pNK7/pNT55주 및 실시예 7에서 수득한 에스케리키아·콜라이 NM522/pNT46주를 실시예 2와 동일한 방법으로 배양하고, 수득되는 각각의 배양물을 원심분리하여 습윤 균체를 취득한다. 또한, 코리네박테리움·암모니아게네스 ATCC21170주를 실시예 2와 동일한 방법으로 배양하고, 수득되는 배양물을 원심분리하여 습윤 균체를 취득한다. 습윤 균체는 필요에 따라 -20℃에서 보존할 수 있으며, 사용 전에 해동시켜 사용할 수 있다.
에스케리키아·콜라이 NM522/pNK7/pNT55주 습윤 균체 25g/ℓ, NM522/pNT46주 습윤 균체 25g/ℓ, 코리네박테리움·암모니아게네스 ATCC21170주 습윤 균체 150g/ℓ, 프룩토즈 60g/ℓ, 만노즈 50g/ℓ, KH2PO4 15g/ℓ, MgSO4·7H2O 5g/ℓ, 피틴산 5g/ℓ, GMP(2Na, 7H2O 염) 60g/ℓ, 나이민 S-215 4g/ℓ, 크실렌 10ml/ℓ의 조성으로 이루어진 반응액 30ml를 200ml 용적 비이커에 투입하고, 이러한 반응액을 자기 교반기로 교반하여(900rpm), 24시간 동안 반응을 실시한다.
반응 중에 4N NaOH를 사용하여 당해 반응액의 pH를 7.2로 유지하고, 필요에 따라 KH2PO4을 첨가한다.
당해 반응에 따라, 반응액 중에 14.6g/ℓ의 GDP-Man(2Na, 1H2O 염)이 생성된다.
실시예 15: gmd, wcaG 발현 플라스미드의 조성
서열번호 20에 기재된 센스 쇄 DNA 프라이머 및 서열번호 21에 기재된 안티센스 쇄 DNA 프라이머를 합성한다. 이러한 합성 DNA를 프라이머로 하고, 에스케리키아·콜라이 W3110주 염색체 DNA를 주형으로 하여 상기와 동일한 조건으로 PCR을 실시한다.
PCR 종료 후에, 에탄올 침전법으로 DNA의 침전을 취득한다. 이러한 침전을 20㎕의 TE에 용해시킨다. 당해 용해액 5㎕를 사용하고, DNA를 제한 효소 HindIII 및 XhoI로 절단한 다음, 아가로즈겔 전기영동으로 DNA 단편을 분리하고, 진클린 II 키트를 사용하여 2.3kb의 단편을 회수한다.
실시예 1-1)에서 취득한 pPA31 DNA 0.2㎍을 제한 효소 HindIII 및 SalI로 절단한 다음, 아가로즈겔 전기영동으로 DNA 단편을 분리하고, 동일하게 3.9kb의 단편을 회수한다.
이러한 2.3kb 및 3.9kb의 단편을 연결 키트를 사용하여, 16℃에서 16시간 동안 연결 반응을 실시한다.
이러한 연결 반응액을 사용하여 에스케리키아·콜라이 NM522주를 통상적인 방법에 따라 형질전환하고, 당해 형질전환체를 암피실린 50㎍/ml를 함유하는 LB 한천 배지에 도말한 다음, 30℃에서 하룻밤 배양한다.
생육시킨 형질전환체의 콜로니로부터 통상적인 방법에 따라 플라스미드를 추출하고, gmd 및 wcaG를 함유하는 플라스미드인 pNK8을 수득한다. 당해 플라스미드의 구조를 제한 효소 분해로 확인한다(참조: 도 13).
실시예 16 : GDP-Fuc의 생산
실시예 14에서 수득한 에스케리키아·콜라이 NM522/pNK7/pNT55주, 실시예 15에서 수득한 NM522/pNK8주 및 실시예 7에서 수득한 NM522/pNT46을 실시예 2와 동일한 방법으로 배양하여 수득되고, 각각의 배양물을 원심분리하여 습윤 균체를 취득한다. 또한, 코리네박테리움·암모니아게네스 ATCC21170주를 실시예 2와 동일한 방법으로 배양하고, 수득되는 배양물을 원심분리하여 습윤 균체를 취득한다. 습윤 균체는 필요에 따라 -20℃로 보존할 수 있으며, 사용 전에 해동시켜 사용할 수 있다.
에스케리키아·콜라이 NM522/pNK7/pNT55주 습윤 균체 25g/ℓ, 에스케리키아·콜라이 NM522/pNK8주 습윤 균체 25g/ℓ, 에스케리키아·콜라이 NM522/pNT46주 습윤 균체 25g/ℓ, 코리네박테리움·암모니아게네스 ATCC21170주 습윤 균체 150g/ℓ, 프룩토즈 40g/ℓ, 만노즈 60g/ℓ, KH2PO4 15g/ℓ, MgSO4·7H2O 5g/ℓ, 피틴산 5g/ℓ, GMP(2Na/7H2O염) 60g/ℓ, 나이민 S-215 4g/ℓ, 크실렌 10ml/ℓ의 조성으로 이루어진 반응액 30ml를 200ml 용적 비이커에 투입하고, 이러한 반응액을 자기 교반기로 교반하고(900rpm), 32℃에서 24시간 동안 반응을 실시한다.
반응 중에 4N NaOH를 사용하여 당해 반응액의 pH를 7.2로 유지하고, 필요에 따라 KH2PO4를 첨가한다.
당해 반응에 따라, 반응액 중에 1.0g/ℓ의 GDP-Fuc(2.5Na, 1H2O 염)이 생성된다.
실시예 17 : neuA 발현 플라스미드의 조성
에스케리키아·콜라이 K235주(ATCC13027) 염색체 DNA를 실시예 1과 동일한 방법으로 조제한다.
서열번호 22에 기재된 센스 쇄 DNA 프라이머 및 서열번호 23에 기재된 안티센스 쇄 DNA 프라이머를 합성한다. 이러한 합성 DNA를 프라이머로 하고 에스케리키아·콜라이 K235주(ATCC13027) 염색체 DNA를 주형으로 하여 상기와 동일한 조건으로 PCR을 실시한다.
PCR 종료 후에, 에탄올 침전법으로 DNA의 침전을 취득한다. 이러한 침전을 20㎕의 TE에 용해시킨다. 당해 용해액 5㎕를 사용하고, DNA를 제한 효소 EcoRI 및 BamHI로 절단한 다음, 아가로즈겔 전기영동으로 DNA 단편을 분리하고, 진클린 II 키트를 사용하여 1.3kb의 단편을 회수한다. pBluescript II SK+ DNA 0.2㎍을 제한 효소 EcoRI 및 BamHI로 절단한 다음, 아가로즈겔 전기영동으로 DNA 단편을 분리하고, 동일하게 3.0kb의 단편을 회수한다.
이러한 1.3kb 및 3.0kb의 단편을 연결 키트를 사용하여 16℃에서 16시간 동안 연결 반응을 실시한다. 이러한 연결 반응액을 사용하여 에스케리키아·콜라이 NM522주를 통상적인 방법에 따라 형질전환하고, 당해 형질전환체를 암피실린 50㎍/ml를 함유하는 LB 한천 배지에 도말한 다음, 30℃에서 하룻밤 배양한다.
생육시킨 형질전환체의 콜로니로부터 통상적인 방법에 따라 플라스미드를 추출하고, neuA 유전자를 함유하는 플라스미드인 pTA12를 수득한다. 당해 플라스미드의 구조를 제한 효소 분해로 확인한다(참조: 도 14).
이러한 pTA12 DNA 0.5㎍을 제한 효소 ClaI 및 BamHI로 절단한 다음, 아가로즈겔 전기영동으로 DNA 단편을 분리하고, 동일하게 1.3kb의 단편을 회수한다. 실시예 1-1)에서 취득한 pPAC31 DNA 0.2㎍을 제한 효소 ClaI 및 BamHI로 절단한 다음, 아가로즈겔 전기영동으로 DNA 단편을 분리하고, 동일하게 5.5kb의 단편을 회수한다.
당해 1.3kb의 단편 및 5.5kb의 단편을 연결 키트를 사용하여 16℃에서 16시간 동안 연결 반응을 실시한다.
이러한 연결 반응액을 사용하여 에스케리키아·콜라이 NM522주를 통상적인 방법에 따라 형질전환하고, 당해 형질전환체를 암피실린 50㎍/ml를 함유하는 LB 한천 배지에 도말한 다음, 30℃에서 하룻밤 배양한다.
생육시킨 형질전환체의 콜로니로부터 통상적인 방법에 따라 플라스미드를 추출하고, neuA 발현 플라스미드인 pTA14를 수득한다. 당해 플라스미드의 구조를 제한 효소 분해로 확인한다(참조: 도 14).
실시예 18 : CMP-NeuAc의 생산
실시예 17에서 수득한 에스케리키아·콜라이 NM522/pTA14주, C600/pNAL1주 [참조: Appl. Environ. Micribiol., 51 562 (1986)] 및 JF646/pMW5주[참조: J. Biol. Chem., 261, 5568 (1986)]를 실시예 2와 동일한 방법으로 배양하고, 수득된 각각의 배양물을 원심분리하여 습윤 균체를 취득한다. 또한, 코리네박테리움·암모니아게네스 ATCC21170주를 실시예 2와 동일한 방법으로 배양하고, 수득되는 배양물을 원심분리하여 습윤 균체를 취득한다. 습윤 균체는 필요에 따라 -20℃로 보존할 수 있으며, 사용 전에 해동시켜 사용할 수 있다.
에스케리키아·콜라이 NM522/pTA14주 습윤 균체 50g/ℓ, 에스케리키아·콜라이 C600/pNAL1주 습윤 균체 15g/ℓ, 에스케리키아·콜라이 JF646/pMW5주 습윤 균체 25g/ℓ, 코리네박테리움·암모니아게네스 ATCC21170주 습윤 균체 150g/ℓ, 오르토산(칼륨염) 10g/ℓ, 피루브산(Na 염) 20g/ℓ, 프룩토즈 40g/ℓ, N-아세틸만노사민 10g/ℓ, KH2PO4 15g/ℓ, MgSO4·7H2O 5g/ℓ, 피틴산 5g/ℓ, 나이민 S-215 4g/ℓ, 크실렌 10ml/ℓ의 조성으로 이루어진 반응액 30ml를 200ml 용적 비이커에 투입하고, 이러한 반응액을 자기 교반기로 교반하고(900rpm), 32℃에서 24시간 동안 반응을 실시한다.
반응 중에 4N NaOH를 사용하여, 당해 반응액의 pH를 7.2로 유지하고, 필요에 따라 KH2PO4를 첨가한다.
당해 반응에 따라, 반응액 중에 2.7g/ℓ의 CMP-NeuAc(Na 염)이 생성된다.
실시예 19 : 락토-N-테트라오즈의 생산
1) β 1,3-갈락토실트랜스페라제의 조제
단백질 A의 IgG 결합 영역과 β 1,3-갈락토실트랜스페라제의 융합 단백질을 암호화하는 유전자를 함유하는 플라스미드 pAMoERSAW1(참조: 일본 공개특허공보 제(평)6-181759호)로 형질전환시킨 나말바 KJM-1주를 G-418(지브코사제)를 0.5mg/ml 함유하는 RPMI640·ITPSGF 배지 30ml에 5 x 104개 세포/ml로 되도록 현탁하고, CO2 배양기 속에서 37℃로 8일 동안 배양한다.
이러한 배양액으로부터 원심분리에 의해 세포를 제거하고, 상등액을 회수한다. 당해 상등액은 필요에 따라 -80℃에서 보존할 수 있으며, 사용 전에 해동시켜 사용할 수 있다.
당해 단백질 A의 IgG 결합 영역과 β 1,3-갈락토실트랜스페라제의 융합 단백질이 생성되는 배양 상등액에 아지드화나트륨을 최종 농도 0.1%로 되도록 첨가한 다음, 제품 설명서에 따라 전처리한 IgG 세팔로즈(파마시아사제)를 50㎕ 첨가하고, 4℃에서 하룻밤 완만하게 교반한다.
교반후에 원심분리함으로써 β1,3-갈록토실트랜스퍼라제가 결합된 IgG 세파로즈를 회수하고, RPMI640·ITPSGF 배지 1ml로 3회 세정한 다음, 이러한 IgG 세파로즈를 β1,3-갈락토실트랜스퍼라제의 효소원으로서 사용한다.
2) 락토-N-테트라오즈의 생산
락토-N-네오테트라오즈(옥스포드·글리코시스템즈사제)를 공지된 방법[참조: Agric. Biol. Chem. 54, 2169(1990)]에 따라 2-아미노피리딘을 사용하여 형광 표지한 다음, 0.1U의 β-갈락토시다제(세이가가쿠고교사제)를 가하여 37℃에서 16시간 동안 반응시키고, 비환원 말단의 갈락토즈를 제거한다.
이러한 반응액을 5분 동안 100℃로 가열하고, β-갈락토시다제를 실활시킨다.
당해 반응에 따라 수득되는 GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc를 복합 당질 전구체로서 사용한다.
이러한 복합 당질 전구 물질 0.5mM, 상기의 1)에서 취득한 IgG 세파로즈 결합 β1,3-갈락토실트랜스퍼라제 0.5U, 실시예 4에서 취득한 UDP-Gal를 함유하는 반응액 6㎕(5mM), 100mM 트리스 염산 완충액(pH 7.9) 10mM MnCl2, 2mM β-머캅토에탄올의 조성으로 이루어진 반응액 36㎕를 32℃에서 65시간 동안 방치하고, 반응을 실시한다.
반응 종료 후에, 당해 반응액에 축적되는 생성물을 하기 조건으로 HPLC를 사용하여 정량한다.
칼럼 : TSK 겔 ODS-80TM 칼럼(4.6mm x 30cm, TOSOH사제)
액상 : 0.02M 아세트산암모늄 완충액(pH 4.0)
온도 : 50℃
유속 : 1ml/분
검출 : 형광 검출기(여기 파장 320nm, 방사 파장 400nm)
생성물의 동정은 아미노피리딘으로 표지한 락토-N-테트라오즈와 표지된 생성물의 용출 시간을 비교함으로써 실시한다.
당해 반응에 따라 0.17mM(0.12g/ℓ)의 락토-N-테트라오즈가 생성된다.
실시예 20 : 락토-N-네오테트라오즈의 생산
실시예 19와 동일한 방법으로, 락토-N-네오테트라오즈로부터 GlcNAc β1-3Galβ1-4Glc를 조제하고, 복합 당질 전구체로서 사용한다.
이러한 복합 당질 전구체 0.5mM, β1,4-갈락토실트랜스페라제(시그마사제) 0.5U, 실시예 4에서 취득한 UDP-Gal을 함유하는 반응액 6㎕(5mM), 100mM 트리스 염산 완충액(pH 7.9), 10mM MnCl2, 2mM β-머캅토에탄올의 조성으로 이루어진 반응액 36㎕를 32℃에서 65시간 동안 방치하여 반응을 실시한다.
반응 종료 후에, 당해 반응액에 축적되는 생성물을 실시예 19-2)와 동일한 조건으로, HPLC를 사용하여 정량한다. 또한, 생성물의 동정은 아미노피리딘으로 표지한 락토-N-네오테트라오즈와 생성물의 용출 시간을 비교함으로써 실시한다.
당해 반응에 따라, 0.15mM(0.11g/ℓ)의 락토-N-네오테트라오즈가 생성된다.
실시예 21: 락토-N-푸코펜타오즈 III의 생산
α1,3-푸코실트랜스페라제가 결합된 IgG 세파로즈는 단백질 A의 IgG 결합 영역과 α1,3-푸코실트랜스페라제의 융합 단백질을 암호화하는 유전자를 함유하는 플라스미드 pAMoA-FT6[참조: J. Biol. Chem., 269, 14730 (1994)]으로 형질전환시킨 나말바 KJM-1주로부터 실시예 19-1)와 동일한 방법으로 조제하고, α1,3-푸코실트랜스페라제의 효소원으로서 사용한다.
락토-N-네오테트라오즈(옥스포드·글리코시스템즈사제) 0.25mM, IgG 세파로즈 결합 α1,3-푸코실트랜스페라제 1.0U, 실시예 16에서 취득한 GDP-Fuc를 함유하는 반응액 6㎕(0.25mM), 100mM 트리스 염산 완충액(pH 7.9), 10mM MnCl2의 조성으로 이루어진 반응액 50㎕를 37℃에서 24시간 동안 방치하여 반응을 실시한다.
반응 종료 후에, 당해 반응액에 축적되는 생성물을 다이오넥스사제의 당 분석 장치(DX-500)로 정량한다. 또한, 생성물의 동정은 락토-N-푸코펜타오즈 III (옥스포드·글리코시스템사제)과 생성물의 용출 시간을 비교함으로써 실시한다.
당해 반응에 따라, 0.21mM(0.18g/ℓ)의 락토-N-푸코펜타오즈 III가 생성된다.
실시예 22: α1,4-갈락토실트랜스페라제(IgtC) 발현 플라스미드의 조성
나이세리아 고노르호에아에(ATCC33084주) 염색체 DNA를 실시예 1과 동일한 방법으로 조제한다.
서열번호 24에 기재된 센스 쇄 DNA 프라이머 및 서열번호 25에 기재된 안티센스 쇄 DNA 프라이머를 합성한다. 이러한 합성 DNA를 프라이머로 하고, 나이세리아 고노르호에아에(ATCC33084주) 염색체 DNA를 주형으로 하여 상기와 동일한 조건으로 PCR을 실시한다.
PCR 종료 후에, 에탄올 침전법으로 DNA의 침전을 취득한다. 이러한 침전을 20㎕의 TE에 용해시킨다. 당해 용해액 5㎕를 사용하고, DNA를 제한 효소 HindIII 및 BamHI로 절단한 다음, 아가로즈겔 전기영동으로 DNA 단편을 분리하고, 진클린 II 키트를 사용하여 1.0kb의 단편을 회수한다. 실시예 1-1)에서 취득한 pPA31 DNA 0.2㎍을 제한 효소 HindIII 및 BamHI로 절단한 다음, 아가로즈겔 전기영동으로 DNA 단편을 분리하고, 동일하게 4.2kb의 단편을 회수한다.
이러한 1.0kb의 단편 및 4.2kb의 단편을 연결 키트를 사용하여 16℃에서 16시간 동안 연결 반응을 실시한다. 이러한 연결 반응액을 사용하여 에스케리키아·콜라이 NM522주를 통상적인 방법에 따라 형질전환하고, 당해 형질전환체를 암피실린 50㎍/ml를 함유하는 LB 한천 배지에 도말한 다음, 30℃에서 하룻밤 배양한다.
생육시킨 형질전환체의 콜로니로부터 통상적인 방법에 따라 플라스미드를 추출하고, IgtC 발현 플라스미드인 pGT3을 수득한다. 당해 플라스미드의 구조를 제한 효소 분해로 확인한다(참조: 도 15).
실시예 23: 글로보트리오즈의 생산
실시예 4에서 수득한 에스케리키아·콜라이 NM522/pNT25/pNT32주, 실시예 22에서 수득한 에스케리키아·콜라이 NM522/pGT3주를 실시예 2와 동일한 방법으로 배양하고, 수득된 각각의 배양물을 원심분리하여 습윤 균체를 취득한다. 또한, 코리네박테리움·암모니아게네스 ATCC21170주를 실시예 2와 동일한 방법으로 배양하고, 수득되는 배양물을 원심분리하여 습윤 균체를 취득한다. 습윤 균체는 필요에 따라 -20℃로 보존할 수 있으며, 사용 전에 해동시켜 사용할 수 있다.
에스케리키아·콜라이 NM522/pNT25/pNT32주 습윤 균체 50g/ℓ, 에스케리키아·콜라이 NM522/pGT3주 습윤 균체 50g/ℓ, 코리네박테리움·암모니아게네스 ATCC21170주 습윤 균체 150g/ℓ, 프룩토즈 100g/ℓ, 갈락토즈 100g/ℓ, 락토즈 100g/ℓ, KH2PO4 15g/ℓ, MgSO4·7H2O 5g/ℓ, 피틴산 5g/ℓ, 오르토산(칼륨염) 10g/ℓ, 나이민 S-215 4g/ℓ, 크실렌 10ml/ℓ의 조성으로 이루어진 반응액 30ml를 200ml 용적 비이커에 투입하고, 이러한 반응액을 자기 교반기로 교반하고(900rpm), 32℃에서 36시간 동안 반응을 실시한다.
반응 중에 4N NaOH를 사용하여 당해 반응액의 pH를 7.2로 유지하고, 필요에 따라 갈락토즈, 락토즈, 프룩토즈, KH2PO4를 첨가한다.
당해 반응에 따라, 반응액 중에 188g/ℓ의 글로보트리오즈가 생성된다.
당해 반응액으로부터 원심분리로 균체를 제거하고, 수득된 상등액 10ml로부터 활성탄을 사용하는 방법에 의해 정제를 실시하고, 글로보트리오즈의 백색 분말 1.5g을 수득한다.
실시예 24:Galα1-4Galβ1-4GlcNAc의 생산
실시예 4에서 수득한 에스케리키아·콜라이 NM522/pNT25/pNT32주, 실시예 22에서 수득한 에스케리키아·콜라이 NM522/pGT3주를 실시예 2와 동일한 방법으로 배양하고, 수득된 각각의 배양물을 원심분리하여 습윤 균체를 취득한다. 또한, 코리네박테리움·암모니아게네스 ATCC21170주를 실시예 2와 동일한 방법으로 배양하고, 수득되는 배양물을 원심분리하여 습윤 균체를 취득한다. 습윤 균체는 필요에 따라 -20℃로 보존할 수 있으며, 사용 전에 해동시켜 사용할 수 있다.
에스케리키아·콜라이 NM522/pNT25/pNT32주 습윤 균체 50g/ℓ, 에스케리키아·콜라이 NM522/pGT3주 습윤 균체 50g/ℓ, 코리네박테리움·암모니아게네스 ATCC21170주 습윤 균체 150g/ℓ, 프룩토즈 50g/ℓ, 갈락토즈 50g/ℓ, N-아세틸락토사민 96g/ℓ, KH2PO4 15g/ℓ, MgSO4·7H2O 5g/ℓ, 피틴산 5g/ℓ, 오르토산(칼륨염) 10g/ℓ, 나이민 S-215 4g/ℓ, 크실렌 10ml/ℓ의 조성으로 이루어진 반응액 30ml를 200ml 용적 비이커에 투입하고, 이러한 반응액을 자기 교반기로 교반하고(900rpm), 32℃에서 23시간 동안 반응을 실시한다.
반응 중에 4N NaOH를 사용하여 당해 반응액의 pH를 7.2로 유지하고, 필요에 따라 갈락토즈, 프룩토즈, KH2PO4를 첨가한다.
당해 반응에 따라, 반응액 속에 10g/ℓ의 Galα1-4Galβ1-4GlcNAc가 생성된다.
당해 반응액으로부터 원심분리로 균체를 제거하고, 수득된 상등액 30ml로부터 활성탄을 사용하는 방법에 의해 생성물을 정제하고, Galα1-4Galβ1-4GlcNAc의 백색 분말 0.2g을 수득한다.
실시예 25: β1,4-갈락토실트랜스페라제(1gtB) 발현 플라스미드의 조성
서열번호 26에 기재된 센스 쇄 DNA 프라이머 및 서열번호 27에 기재된 안티센스 쇄 DNA 프라이머를 합성한다. 이러한 합성 DNA를 프라이머로 하고, 나이세리아 고노르호에아에(ATCC33084주) 염색체 DNA를 주형으로 하여 상기와 동일한 조건으로 PCR을 실시한다.
PCR 종료 후에, 에탄올 침전법으로 DNA의 침전을 취득한다. 당해 침전을 20㎕의 TE에 용해시킨다. 당해 용해액 5㎕를 사용하고, DNA를 제한 효소 HindIII 및 BamHI로 절단한 다음, 아가로즈겔 전기영동으로 DNA 단편을 분리하고, 진클린 II 키트를 사용하여 0.8kb의 단편을 회수한다. pBluescript II SK+ DNA 0.2㎍을 제한 효소 HindIII 및 BamHI로 절단한 다음, 아가로즈겔 전기영동으로 DNA 단편을 분리하고, 동일하게 3.0kb의 단편을 회수한다.
이러한 0.8kb 및 3.0kb의 단편을 연결 키트를 사용하여 16℃에서 16시간 동안 연결 반응을 실시한다. 이러한 연결 반응액을 사용하여 에스케리키아·콜라이 NM522주를 통상적인 방법에 따라 형질전환하고, 당해 형질전환체를 암피실린 50㎍/ml를 함유하는 LB 한천 배지에 도말한 다음, 30℃에서 하룻밤 배양한다.
생육시킨 형질전환체의 콜로니로부터 통상적인 방법에 따라 플라스미드를 추출하고, IgtB 유전자를 함유하는 플라스미드인 pNT60P를 수득한다. 당해 플라스미드의 구조를 제한 효소 소화로 확인한다(참조: 도 16).
이러한 pNT60P DNA 0.5㎍을 제한 효소 ClaI 및 BamHI로 절단한 다음, 아가로즈겔 전기영동으로 DNA 단편을 분리하여 0.8kb의 단편을 회수한다. 실시예 1-1)에서 취득한 pPAC31 DNA 0.2㎍을 제한 효소 ClaI 및 BamHI로 절단한 다음, 아가로즈겔 전기영동으로 DNA 단편을 분리하고, 동일하게 5.5kb의 단편을 회수한다.
이러한 0.8kb의 단편 및 5.5kb의 단편을 연결 키트를 사용하여 16℃에서 16시간 동안 연결 반응을 실시한다. 이러한 연결 반응액을 사용하여 에스케리키아·콜라이 NM522주를 통상적인 방법에 따라 형질전환하고, 당해 형질전환체를 암피실린 50㎍/ml를 함유하는 LB 한천 배지에 도말한 다음, 30℃에서 하룻밤 배양한다.
생육시킨 형질전환체의 콜로니로부터 통상적인 방법에 따라 플라스미드를 추출하고, lgtB 발현 플라스미드인 pNT60을 수득한다. 당해 플라스미드의 구조를 제한 효소 분해로 확인한다(참조: 도 16).
실시예 26: N-아세틸락토사민의 생산
실시예 25에서 수득한 에스케리키아·콜라이 NM522/pNT60주, 실시예 3에서 수득한 에스케리키아·콜라이 NM522/pNT25주를 실시예 2와 동일한 방법으로 배양하고, 수득되는 각각의 배양물을 원심분리하여 습윤 균체를 취득한다. 또한, 코리네박테리움·암모니아게네스 ATCC21170주를 실시예 2와 동일한 방법으로 배양하고, 수득되는 배양물을 원심분리하여 습윤 균체를 취득한다. 당해 습윤 균체는 필요에 따라 -20℃에서 보존할 수 있으며, 사용 전에 해동시켜 사용할 수 있다.
에스케리키아·콜라이 NM522/pNT25주 습윤 균체 50g/ℓ, 에스케리키아·콜라이 NM522/pNT60주 습윤 균체 50g/ℓ, 코리네박테리움·암모니아게네스 ATCC21170주 습윤 균체 150g/ℓ, 오르토산(칼륨염) 10g/ℓ, 프룩토즈 100g/ℓ, N-아세틸글루코사민 100g/ℓ, 갈락토즈 100g/ℓ, KH2PO4 15g/ℓ, MgSO4 7H2O 5g/ℓ, 피틴산 5g/ℓ, 나이민 S-215 4g/ℓ, 크실렌 10ml/ℓ의 조성으로 이루어진 반응액 30ml를 200ml 용적 비이커에 투입하고, 이러한 반응액을 자기 교반기로 교반하고(900rpm), 32℃에서 34시간 동안 반응을 실시한다.
반응 중에 4N NaOH를 사용하여 당해 반응액의 pH를 7.2로 유지하고, 필요에 따라 갈락토즈, 프룩토즈, KH2PO4를 첨가한다.
당해 반응에 따라, 반응액 중에 114g/ℓ의 N-아세틸락토사민이 생성된다.
실시예 27: 락토즈의 생산
실시예 25에서 수득한 에스케리키아·콜라이 NM522/pNT60주, 실시예 3에서 수득한 에스케리키아·콜라이 NM522/pNT25주를 실시예 2와 동일한 방법으로 배양하고, 수득되는 각각의 배양물을 원심분리하여 습윤 균체를 취득한다. 또한, 코리네박테리움·암모니아게네스 ATCC21170주를 실시예 2와 동일한 방법으로 배양하고, 수득되는 배양물을 원심분리하여 습윤 균체를 취득한다. 당해 습윤 균체는 필요에 따라 -20℃에서 보존할 수 있으며, 사용 전에 해동시켜 사용할 수 있다.
에스케리키아·콜라이 NM522/pNT25주 습윤 균체 50g/ℓ, 에스케리키아·콜라이 NM522/pNT60주 습윤 균체 50g/ℓ, 코리네박테리움·암모니아게네스 ATCC21170주 습윤 균체 150g/ℓ, 오르토산(칼륨염) 10g/ℓ, 글루코즈 115g/ℓ, 갈락토즈 115g/ℓ, KH2PO4 15g/ℓ, MgSO4 7H2O 5g/ℓ, 피틴산 5g/ℓ, 나이민 S-215 4g/ℓ, 크실렌 10ml/ℓ의 조성으로 이루어진 반응액 30ml를 200ml 용적 비이커에 투입하고, 이러한 반응액을 자기 교반기로 교반하고(900rpm), 32℃에서 15시간 동안 반응을 실시한다.
반응 중에 4N NaOH를 사용하여 당해 반응액의 pH를 7.2로 유지하고, 필요에 따라 KH2PO4를 첨가한다.
당해 반응에 따라, 반응액 중에 49g/ℓ의 락토즈가 생성된다.
실시예 28: 글로보트리오즈의 생산
실시예 25에서 수득한 에스케리키아·콜라이 NM522/pNT25주, 실시예 3에서 수득한 에스케리키아·콜라이 NM522/pNT25주 및 실시예 22에서 수득한 에스케리키아·콜라이 NM522/pGT3을 실시예 2와 동일한 방법으로 배양하고, 수득되는 각각의 배양물을 원심분리하여 습윤 균체를 취득한다. 또한, 코리네박테리움·암모니아게네스 ATCC21170주를 실시예 2와 동일한 방법으로 배양하고, 수득되는 배양물을 원심분리하여 습윤 균체를 취득한다. 당해 습윤 균체는 필요에 따라 -20℃에서 보존할 수 있으며, 사용 전에 해동시켜 사용할 수 있다.
에스케리키아·콜라이 NM522/pNT25주 습윤 균체 50g/ℓ, 에스케리키아·콜라이 NM522/pNT60주 습윤 균체 50g/ℓ, 에스케리키아·콜라이 NM522/pGT3주 습윤 균체 50g/ℓ, 코리네박테리움·암모니아게네스 ATCC21170주 습윤 균체 150g/ℓ, 오르토산(칼륨염) 10g/ℓ, 글루코즈 115g/ℓ, 갈락토즈 115g/ℓ, KH2PO4 15g/ℓ, MgSO4 7H2O 5g/ℓ, 피틴산 5g/ℓ, 나이민 S-215 4g/ℓ, 크실렌 10ml/ℓ의 조성으로 이루어진 반응액 30ml를 200ml 용적 비이커에 투입하고, 이러한 반응액을 자기 교반기로 교반하고(900rpm), 32℃에서 13시간 동안 반응을 실시한다.
반응 중에 4N NaOH를 사용하여 당해 반응액의 pH를 7.2로 유지하고, 필요에 따라 KH2PO4를 첨가한다.
당해 반응에 따라, 반응액 중에 5g/ℓ의 글로보트리오즈가 생성된다.
본 발명에 따라, 뉴클레오티드의 전구 물질 및 당만을 원료로 하여 당 뉴클레오티드를 당해 뉴클레오티드와 복합 당질 전구 물질로부터 복합 당질을 공업적으로 우수한 효율로 제조할 수 있다.
[서열표]
서열번호 : 1
서열의 길이 : 31
서열형 : 핵산
토폴로지 : 일본쇄
서열의 종류 : 기타 핵산, 합성 DNA
[서열 1]
서열번호 : 2
서열의 길이 : 30
서열형 : 핵산
토폴로지 : 일본쇄
서열의 종류 : 기타 핵산, 합성 DNA
[서열 2]
서열번호 : 3
서열의 길이 : 28
서열형 : 핵산
토폴로지 : 일본쇄
서열의 종류 : 기타 핵산, 합성 DNA
[서열 3]
서열번호 : 4
서열의 길이 : 20
서열형 : 핵산
토폴로지 : 일본쇄
서열의 종류 : 기타 핵산, 합성 DNA
[서열 4]
서열번호 : 5
서열의 길이 : 31
서열형 : 핵산
토폴로지 : 일본쇄
서열의 종류 : 기타 핵산, 합성 DNA
[서열 5]
서열번호 : 6
서열의 길이 : 20
서열형 : 핵산
토폴로지 : 일본쇄
서열의 종류 : 기타 핵산, 합성 DNA
[서열 6]
서열번호 : 7
서열의 길이 : 31
서열형 : 핵산
토폴로지 : 일본쇄
서열의 종류 : 기타 핵산, 합성 DNA
[서열 7]
서열번호 : 8
서열의 길이 : 27
서열형 : 핵산
토폴로지 : 일본쇄
서열의 종류 : 기타 핵산, 합성 DNA
[서열 8]
서열번호 : 9
서열의 길이 : 28
서열형 : 핵산
토폴로지 : 일본쇄
서열의 종류 : 기타 핵산, 합성 DNA
[서열 9]
서열번호 : 10
서열의 길이 : 27
서열형 : 핵산
토폴로지 : 일본쇄
서열의 종류 : 기타 핵산, 합성 DNA
[서열 10]
서열번호 : 11
서열의 길이 : 20
서열형 : 핵산
토폴로지 : 일본쇄
서열의 종류 : 기타 핵산, 합성 DNA
[서열 11]
서열번호 : 12
서열의 길이 : 26
서열형 : 핵산
토폴로지 : 일본쇄
서열의 종류 : 기타 핵산, 합성 DNA
[서열 12]
서열번호 : 13
서열의 길이 : 29
서열형 : 핵산
토폴로지 : 일본쇄
서열의 종류 : 기타 핵산, 합성 DNA
[서열 13]
서열번호 : 14
서열의 길이 : 29
서열형 : 핵산
토폴로지 : 일본쇄
서열의 종류 : 기타 핵산, 합성 DNA
[서열 14]
서열번호 : 15
서열의 길이 : 25
서열형 : 핵산
토폴로지 : 일본쇄
서열의 종류 : 기타 핵산, 합성 DNA
[서열 15]
서열번호 : 16
서열의 길이 : 31
서열형 : 핵산
토폴로지 : 일본쇄
서열의 종류 : 기타 핵산, 합성 DNA
[서열 16]
서열번호 : 17
서열의 길이 : 31
서열형 : 핵산
토폴로지 : 일본쇄
서열의 종류 : 기타 핵산, 합성 DNA
[서열 17]
서열번호 : 18
서열의 길이 : 25
서열형 : 핵산
토폴로지 : 일본쇄
서열의 종류 : 기타 핵산, 합성 DNA
[서열 18]
서열번호 : 19
서열의 길이 : 33
서열형 : 핵산
토폴로지 : 일본쇄
서열의 종류 : 기타 핵산, 합성 DNA
[서열 19]
서열번호 : 20
서열의 길이 : 27
서열형 : 핵산
토폴로지 : 일본쇄
서열의 종류 : 기타 핵산, 합성 DNA
[서열 20]
서열번호 : 21
서열의 길이 : 25
서열형 : 핵산
토폴로지 : 일본쇄
서열의 종류 : 기타 핵산, 합성 DNA
[서열 21]
서열번호 : 22
서열의 길이 : 27
서열형 : 핵산
토폴로지 : 일본쇄
서열의 종류 : 기타 핵산, 합성 DNA
[서열 22]
서열번호 : 23
서열의 길이 : 25
서열형 : 핵산
토폴로지 : 일본쇄
서열의 종류 : 기타 핵산, 합성 DNA
[서열 23]
서열번호 : 24
서열의 길이 : 30
서열형 : 핵산
토폴로지 : 일본쇄
서열의 종류 : 기타 핵산, 합성 DNA
[서열 24]
서열번호 : 25
서열의 길이 : 28
서열형 : 핵산
토폴로지 : 일본쇄
서열의 종류 : 기타 핵산, 합성 DNA
[서열 25]
서열번호 : 26
서열의 길이 : 30
서열형 : 핵산
토폴로지 : 일본쇄
서열의 종류 : 기타 핵산, 합성 DNA
[서열 26]
서열번호 : 27
서열의 길이 : 29
서열형 : 핵산
토폴로지 : 일본쇄
서열의 종류 : 기타 핵산, 합성 DNA
[서열 27]
Claims (74)
- (a) 코리네박테리움 속 또는 에스케리키아 속에 속하며 또한 뉴클레오티드의 전구 물질로부터 뉴클레오사이드-5'-삼인산(이하, NTP라고 약칭한다)을 생산하는 능력을 갖는 미생물을 포함한 배양액 또는 당해 배양액의 농축물, 배양액의 건조물, 배양액을 원심분리하여 수득된 배양 상등액, 배양 상등액의 농축물, 배양 상등액으로부터 수득된 효소 표준품, 배양액을 원심분리하여 수득된 세포, 당해 세포의 건조물, 당해 세포의 동결 건조물, 당해 세포의 계면활성제 처리물, 당해 세포의 초음파 처리물, 당해 세포의 기계적 마쇄 처리물, 당해 세포의 용매 처리물, 당해 세포의 효소 처리물, 당해 세포의 단백질 분획물, 당해 세포의 고정화물 또는 당해 세포로부터 추출하여 수득된 효소 표준품, 및 (b) 코리네박테리움 속 또는 에스케리키아 속에 속하며 또한 당과 NTP로부터 당 뉴클레오티드를 생산하는 능력을 갖는 미생물을 포함한 배양액 또는 당해 배양액의 건조물, 당해 배양액을 원심분리하여 수득되는 배양 상등액, 당해 배양 상등액의 농축물, 당해 배양액을 원심분리하여 수득되는 세포, 당해 세포의 건조물, 당해 세포의 동결 건조물, 당해 세포의 계면활성제 처리물, 당해 세포의 용매 처리물, 당해 세포의 효소 처리물 또는 당해 세포의 고정화물을 효소원으로서 사용하여 이들 효소원, 뉴클레오티드의 전구 물질 및 당을 수성 매체 속에 존재시키고, 이러한 수성 매체 속에 당 뉴클레오티드를 생성 축적시켜 수성 매체 속에서 당 뉴클레오티드를 채취함을 특징으로 하는 당 뉴클레오티드의 제조법.
- (a) 코리네박테리움 속 또는 에스케리키아 속에 속하며 또한 뉴클레오티드의 전구 물질로부터 뉴클레오사이드-5'-삼인산(이하, NTP라고 약칭한다)을 생산하는 능력을 갖는 미생물을 포함한 배양액 또는 당해 배양액의 농축물, 배양액의 건조물, 배양액을 원심분리하여 수득된 배양 상등액, 배양 상등액의 농축물, 배양 상등액으로부터 수득된 효소 표준품, 배양액을 원심분리하여 수득된 세포, 당해 세포의 건조물, 당해 세포의 동결 건조물, 당해 세포의 계면활성제 처리물, 당해 세포의 초음파 처리물, 당해 세포의 기계적 마쇄 처리물, 당해 세포의 용매 처리물, 당해 세포의 효소 처리물, 당해 세포의 단백질 분획물, 당해 세포의 고정화물 또는 당해 세포로부터 추출하여 수득된 효소 표준품, (b) 코리네박테리움 속 또는 에스케리키아 속에 속하며 또한 당과 NTP로부터 당 뉴클레오티드를 생산하는 능력을 갖는 미생물을 포함한 배양액 또는 당해 배양액의 건조물, 당해 배양액을 원심분리하여 수득되는 배양 상등액, 당해 배양 상등액의 농축물, 당해 배양액을 원심분리하여 수득되는 세포, 당해 세포의 건조물, 당해 세포의 동결 건조물, 당해 세포의 계면활성제 처리물, 당해 세포의 용매 처리물, 당해 세포의 효소 처리물 또는 당해 세포의 고정화물 및 (c) 당 뉴클레오티드와 복합 당질 전구 물질로부터 복합 당질을 생산하는 능력을 갖는 미생물, 동물 세포 또는 곤충 세포의 배양액이나 당해 배양액의 처리물을 효소원으로서 사용하여 이들 효소원, 뉴클레오티드의 전구 물질, 당 및 복합 당질 전구 물질을 수성 매체 속에 존재시키고, 이러한 수성 매체 속에 복합 당질을 생성 축적시켜 수성 매체 속에서 복합 당질을 채취함을 특징으로 하는 복합 당질의 제조법.
- 당 뉴클레오티드와 복합 당질 전구 물질로부터 복합 당질을 생산하는 능력을 갖는 미생물, 동물 세포나 곤층 세포의 배양액 또는 당해 배양액의 처리물을 효소원으로서 사용하여 당해 효소원, 복합 당질 전구 물질 및 제1항에 따른 제조법으로 수득되는 당 뉴클레오티드를 수성 매체 속에 존재시키고, 당해 수성 매체 속에 복합 당질을 생성 축적시켜 수성 매체 속에서 복합 당질을 채취함을 특징으로 하는 복합 당질의 제조법.
- 제2항 또는 제3항에 있어서, 배양액의 처리물이 배양액의 농축물, 배양액의 건조물, 배양액을 원심분리하여 수득된 배양 상등액, 배양 상등액의 농축물, 배양 상등액으로부터 수득된 효소 표준품, 배양액을 원심분리하여 수득된 세포, 당해 세포의 건조물, 당해 세포의 동결 건조물, 당해 세포의 계면활성제 처리물, 당해 세포의 초음파 처리물, 당해 세포의 기계적 마쇄 처리물, 당해 세포의 용매 처리물, 당해 세포의 효소 처리물, 당해 세포의 단백질 분획물, 당해 세포의 고정화물 또는 당해 세포로부터 추출하여 수득된 효소 표준품임을 특징으로 하는 제조법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 뉴클레오티드의 전구 물질이 오르토산, 우라실, 오로티딘, 우리딘, 시토신, 시티딘, 아데닌, 아데노신, 구아닌, 구아노신, 히포크산틴, 이노신, 크산틴, 크산토신, 이노신-5'-일인산, 크산토신-5'-일인산, 구아노신-5'-일인산, 우리딘-5'-일인산 또는 시티딘-5'-일인산인 제조법.
- 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 당 뉴클레오티드가 우리딘이인산 화합물, 구아노신이인산 화합물 또는 시티딘일인산 화합물인 제조법.
- 제6항에 있어서, 우리딘이인산 화합물, 구아노신이인산 화합물 및 시티딘일인산 화합물이 우리딘이인산글루코즈, 우리딘이인산갈락토즈, 우리딘이인산-N-아세틸글루코사민, 우리딘이인산-N-아세틸갈락토사민, 우리딘이인산글루클론산, 구아노신이인산만노즈, 구아노신이인산푸코즈, 시티딘일인산-N-아세틸노이라민산 및 이들의 유도체 중에서 선택되는 화합물인 제조법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 당이 글루코즈, 프룩토즈, 갈락토즈, 글루코사민, N-아세틸글루코사민, N-아세틸갈락토사민, 만노즈, 푸코즈, N-아세틸만노사민, 아세틸노이라민산 및 이들의 유도체 중에서 선택되는 당인 제조법.
- 제2항 또는 제3항에 있어서, 복합 당질이 글루코즈, 갈락토즈, N-아세틸글루코사민, N-아세틸갈락토사민, 글루크론산, 만노즈, N-아세틸만노사민, 푸코즈, 시알산, 락토즈, N-아세틸락토사민, 락토-N-비오즈, GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc, GlcNacβ1-4Galβ1-4Glc, 글로보트리오즈, Galα1-4Galβ1-4GlcNAc, 2'-푸코실프룩토즈, 3-푸코실락토즈, 3'-시알릴락토즈, 6'-시알릴락토즈, 3'-시알릴-N-아세틸락토사민, 6'-시알릴-N-아세틸락토사민, 시알릴락토-N-비오즈, 루이스 X, 루이스 a, 락토-N-테트라오즈, 락토-N-네오테트라오즈, 락토디푸코테트라오즈, 3'-시알릴-3-푸코실락토즈, 시알릴루이스 X, 시알릴루이스 a, 락토-N-푸코펜타오즈 I, 락토-N-푸코펜타오즈 II, 락토-N-푸코펜타오즈 III, 락토-N-푸코펜타오즈 V, LS-테트라사카라이드 a, LS-테트라사카라이드 b, LS-테트라사카라이드 c, (α2,3) 시알릴락토-N-네오테트라오즈, 락토-N-디푸코헥사오즈 I, 락토-N-디푸코헥사오즈 II, 락토-N-헥사오즈, 락토-N-네오헥사오즈, 디시알릴락토-N-테트라오즈 및 이들의 유도체 중에서 선택되는 당을 하나 이상 함유하는 복합 당질 또는 당해 복합 당질을 함유하는 복합 당질인 제조법.
- 제2항 또는 제3항에 있어서, 복합 당질이 Galβ1-3Glc, Galβ1-4Glc, Galβ1-3GlcNAc, Galβ1-4GlcNAc, Galβ1-3Gal, Galβ1-4Gal, Galβ1-3GalNAc, Galβ1-4GalNAc, Galα1-3Glc, Galα1-4Glc, Galα1-3GlcNAc, Galα1-4GlcNAc, Galα1-3Gal, Galα1-4Gal, Galα1-3GalNAc, Galα1-4GalNAc, GlcNAcβ1-3Gal, GlcNAcβ1-4Gal, GlcNAcβ1-6Gal, GlcNAcβ1-3Glc, GlcNAcβ1-4Glc, GlcNAcβ1-3GlcNAc, GlcNAcβ1-4GlcNAc, GlcNAcβ1-6GalNAc, GlcNAcβ1-2Man, GlcNAcβ1-4Man, GlcNAcβ1-6Man, GalNAcβ1-3Gal, GalNAcβ1-4Gal, GalNAcβ1-4GlcNAc, GalNAcα1-3GalNAc, Manβ1-4GlcNAc, Manα1-6Man, Manα1-3Man, Manα1-2Man, GlcUAβ1-4GlcN, GlcUAβ1-3Gal, GlcUAβ1-3GlcNAc, GlcUAβ1-3GalNAc, NeuAcα2-3Gal, NeuAcα2-6Gal, NeuAcα2-3GlcNAc, NeuAcα2-6GlcNAc, NeuAcα2-3GalNAc, NeuAcα2-6GalNAc, NeuAcα2-8NeuAc, Fucα1-3Glc, Fucα1-4Glc, Fucα1-3GlcNAc, Fucα1-4GlcNAc, Fucα1-2Gal 및 Fucα1-6GlcNAc 중에서 선택되는 결합을 갖는 당을 함유하는 복합 당질 또는 당해 복합 당질을 함유하는 복합 당질인 제조법.
- 제9항에 있어서, 복합 당질에 함유되는 당이 10개 이하인 방법.
- 제9항에 있어서, 복합 당질에 함유되는 당이 6개 이하인 방법.
- 제2항 또는 제3항에 있어서, 복합 당질 전구 물질이 단당, 올리고사카라이드, 단백질, 펩타이드, 지질, 당단백질, 당지질, 글리코펩타이드 및 스테로이드 화합물 중에서 선택되는 복합 당질 전구 물질인 제조법.
- 제13항에 있어서, 복합 당질 전구 물질이 글루코즈, 갈락토즈, 만노즈, 시알산, N-아세틸글루코사민, N-아세틸갈락토사민, 락토즈, N-아세틸락토사민, 락토-N-비오즈, GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc, GlcNAcβ1-4Galβ1-4Glc, 글로보트리오즈, Galα1-4Galβ1-4GlcNAc, 2'-푸코실프룩토즈, 3-푸코실락토즈, 3'-시알릴락토즈, 6'-시알릴락토즈, 3'-시알릴-N-아세틸락토사민, 6'-시알릴-N-아세틸락토사민, 시알릴락토-N-비오즈, 루이스 X, 루이스 a, 락토-N-테트라오즈, 락토-N-네오테트라오즈, 락토디푸코테트라오즈, 3'-시알릴-3-푸코실락토즈, 시알릴루이스 X, 시알릴루이스 a, 락토-N-푸코펜타오즈 I, 락토-N-푸코펜타오즈 II, 락토-N-푸코펜타오즈 III, 락토-N-푸코펜타오즈 V, LS-테트라사카라이드 a, LS-테트라사카라이드 b, LS-테트라사카라이드 c, (α2,3) 시알릴락토-N-네오테트라오즈 및 이들의 유도체, 세린, 트레오닌, 아스파라긴 및 당해 아미노산을 함유하는 펩타이드 및 이의 유도체, 세라미드 및 이의 유도체 중에서 선택되는 복합 당질 전구 물질 또는 당해 복합 당질 전구 물질을 함유하는 복합 당질 전구 물질인 제조법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 뉴클레오티드의 전구 물질로부터 NTP를 생산하는 능력을 갖는 미생물이 코리네박테리움 속에 속하는 미생물 중에서 선택되는 미생물임을 특징으로 하는 제조법.
- 제15항에 있어서, 코리네박테리움 속에 속하는 미생물이 코리네박테리움·암모니아게네스임을 특징으로 하는 제조법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 코리네박테리움 속 또는 에스케리키아 속에 속하며 또한 당과 NTP로부터 당 뉴클레오티드를 생산하는 능력을 갖는 미생물이 코리네박테리움 속 또는 에스케리키아 속에 속하는 미생물로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상의 미생물로 구성됨을 특징으로 하는 제조법.
- 제17항에 있어서, 에스케리키아 속에 속하는 미생물이 에스케리키아·콜라이인 제조법.
- 제17항에 있어서, 코리네박테리움 속에 속하는 미생물이 코리네박테리움·암모니아게네스인 제조법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 당과 NTP로부터 당 뉴클레오티드를 생산하는 능력을 갖는 미생물이 글루코키나제(이하, glk라고 약칭한다), 포스포글루코뮤타제(이하, pgm이라고 약칭한다), 글루코즈-1-인산우리딜트랜스페라제(이하, galU라고 약칭한다) 및 피로포스파타제(이하, ppa라고 약칭한다) 중에서 선택되는 하나 이상의 효소 활성이 강한 미생물임을 특징으로 하는 제조법.
- 제20항에 있어서, 미생물이 glk를 암호화하는 유전자, pgm을 암호화하는 유전자, galU를 암호화하는 유전자 및 ppa를 암호화하는 유전자 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자를 함유하는 DNA 단편과 벡터의 재조합체 DNA를 보유하는 하나 이상의 미생물로 구성됨을 특징으로 하는 제조법.
- 제21항에 있어서, glk를 암호화하는 유전자, pgm을 암호화하는 유전자, galU를 암호화하는 유전자 및 ppa를 암호화하는 유전자가 에스케리키아·콜라이 유래의 유전자임을 특징으로 하는 제조법.
- 제20항에 있어서, 당 뉴클레오티드가 우리딘이인산글루코즈인 제조법.
- 제20항에 있어서, 미생물이 우리딘이인산글루코즈 데하이드로게나제 활성이 강한 미생물이고, 당 뉴클레오티드가 우리딘이인산글루클론산인 제조법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 당과 NTP로부터 당 뉴클레오티드를 생산하는 능력을 갖는 미생물이 갈락토키나제(이하, galK라고 약칭한다) 활성이 강한 미생물임을 특징으로 하는 제조법.
- 제25항에 있어서, galK 활성이 강한 미생물에 의해 N-아세틸글루코사민을 기질로 하여 N-아세틸글루코사민-1-인산이 공급됨을 특징으로 하는 제조법.
- 제25항에 있어서, 미생물이 galK를 암호화하는 유전자를 함유하는 DNA 단편과 벡터의 재조합체 DNA를 보유하는 하나 이상의 미생물로 구성됨을 특징으로 하는 제조법.
- 제27항에 있어서, galK를 암호화하는 유전자가 에스케리키아·콜라이 유래의 유전자임을 특징으로 하는 제조법.
- 제25항에 있어서, 당과 NTP로부터 당 뉴클레오티드를 생산하는 능력을 갖는 미생물이 갈락토즈-1-인산우리딜트랜스페라제(이하, galT라고 약칭한다) 활성이 강한 미생물임을 특징으로 하는 제조법.
- 제29항에 있어서, 미생물이 galT를 암호화하는 유전자를 함유하는 DNA 단편과 벡터의 재조합체 DNA를 보유하는 하나 이상의 미생물로 구성됨을 특징으로 하는 제조법.
- 제30항에 있어서, galT를 암호화하는 유전자가 에스케리키아·콜라이 유래의 유전자임을 특징으로 하는 제조법.
- 제29항에 있어서, 당과 NTP로부터 뉴클레오티드를 생산하는 능력을 갖는 미생물이 글루코키나제(이하, glk라고 약칭한다), 포스포글루코뮤타제(이하, pgm이라고 약칭한다), 글루코즈-1-인산우리딜트랜스페라제(이하, galU라고 약칭한다) 및 피로포스파타제(이하, ppa라고 약칭한다) 중에서 선택되는 하나 이상의 효소 활성이 강한 미생물임을 특징으로 하는 제조법.
- 제32항에 있어서, 미생물이 glk를 암호화하는 유전자, pgm을 암호화하는 유전자, galU를 암호화하는 유전자 및 ppa를 암호화하는 유전자 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자를 함유하는 DNA 단편과 벡터의 재조합체 DNA를 보유하는 하나 이상의 미생물로 구성됨을 특징으로 하는 제조법.
- 제33항에 있어서, glk를 암호화하는 유전자, pgm을 암호화하는 유전자, galU를 암호화하는 유전자 및 ppa를 암호화하는 유전자가 에스케리키아·콜라이 유래의 유전자임을 특징으로 하는 제조법.
- 제29항에 있어서, 당 뉴클레오티드가 우리딘이인산갈락토즈인 제조법.
- 제25항에 있어서, 당과 NTP로부터 당 뉴클레오티드를 생산하는 능력을 갖는 미생물이 N-아세틸글루코사민-1-인산우리딜트랜스페라제(이하, glmU라고 약칭한다) 활성이 강한 미생물임을 특징으로 하는 제조법.
- 제36항에 있어서, 미생물이 glmU를 암호화하는 유전자를 함유하는 DNA 단편과 벡터의 재조합체 DNA를 보유하는 하나 이상의 미생물로 구성됨을 특징으로 하는 제조법.
- 제37항에 있어서, glmU를 암호화하는 유전자가 에스케리키아·콜라이 유래의 유전자임을 특징으로 하는 제조법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 당과 NTP로부터 당 뉴클레오티드를 생산하는 능력을 갖는 미생물이 포스포글루코뮤타제(이하, pgm이라고 약칭한다) 및 포스포프룩토키나제(이하, pfkB라고 약칭한다) 활성이 강한 미생물임을 특징으로 하는 제조법.
- 제39항에 있어서, 미생물이 pgm을 암호화하는 유전자, pfkB를 암호화하는 유전자 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자를 함유하는 DNA 단편과 벡터의 제조합체 DNA를 보유하는 하나 이상의 미생물로 구성됨을 특징으로 하는 제조법.
- 제40항에 있어서, pgm을 암호화하는 유전자, pfkB를 암호화하는 유전자가 에스케리키아·콜라이 유래의 유전자임을 특징으로 하는 제조법.
- 제39항에 있어서, pgm 및 pfkB 활성이 강한 미생물에 의해 글루코즈-6-인산 및 프룩토즈-6-인산을 기질로 하여, 글루코즈-1,6-이인산이 공급됨을 특징으로 하는 제조법.
- 제42항에 있어서, 공급되는 글루코즈-1,6-이인산에 의해 포스포글루코사민뮤타제 또는 포스포만노뮤타제 활성이 증강됨을 특징으로 하는 제조법.
- 제39항에 있어서, 당과 NTP로부터 당 뉴클레오티드를 생산하는 능력을 갖는 미생물이 글루코사민-1-인산아세틸트랜스페라제, N-아세틸글루코사민-1-인산우리딜트랜스페라제(이하, glmU라고 약칭한다), 피로포스파타제(이하, ppa라고 약칭한다), 포스포글루코사민뮤타제(이하, glmM라고 약칭한다), 글루코키나제(이하, glk라고 약칭한다) 중에서 선택되는 하나 이상의 효소 활성이 강한 미생물임을 특징으로 하는 제조법.
- 제44항에 있어서, 미생물이 glmU를 암호화하는 유전자, ppa를 암호화하는 유전자, glmM을 암호화하는 유전자 및 glk를 암호화하는 유전자 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자를 함유하는 DNA 단편과 벡터의 재조합체 DNA를 보유하는 하나 이상의 미생물로 구성됨을 특징으로 하는 제조법.
- 제45항에 있어서, glmU를 암호화하는 유전자, ppa를 암호화하는 유전자, glmM을 암호화하는 유전자 및 glk를 암호화하는 유전자가 에스케리키아·콜라이 유래의 유전자임을 특징으로 하는 제조법.
- 제25항에 있어서, 당 뉴클레오티드가 우리딘이인산-N-아세틸글루코사민인 제조법.
- 제25항에 있어서, 미생물이 UDP-GlcNAc4-에피메라제 활성이 강한 미생물이고, 당 뉴클레오티드가 우리딘이인산-N-아세틸갈락토사민인 제조법.
- 제39항에 있어서, 당과 NTP로부터 당 뉴클레오티드를 생산하는 능력을 갖는 미생물이 포스포만노뮤타제(이하, manB라고 약칭한다), 만노즈-1-인산구아닐트랜스페라제(이하, manC라고 약칭한다), 글루코키나제(이하, glk라고 약칭한다) 중에서 선택되는 하나 이상의 효소 활성이 강한 미생물임을 특징으로 하는 제조법.
- 제49항에 있어서, 미생물이 manB를 암호화하는 유전자, manC를 암호화하는 유전자, glk를 암호화하는 유전자 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자를 함유하는 DNA 단편과 벡터의 재조합체 DNA를 보유하는 하나 이상의 미생물로 구성됨을 특징으로 하는 제조법.
- 제50항에 있어서, manB를 암호화하는 유전자, manC를 암호화하는 유전자, glk를 암호화하는 유전자가 에스케리키아·콜라이 유래의 유전자임을 특징으로 하는 제조법.
- 제39항에 있어서, 당 뉴클레오티드가 구아노신이인산만노즈인 제조법.
- 제39항에 있어서, 당과 NTP로부터 당 뉴클레오티드를 생산하는 능력을 갖는 미생물이 포스포만노뮤타제(이하, manB라고 약칭한다), 만노즈-1-인산구아닐트랜스페라제(이하, manC라고 약칭한다), 글루코키나제(이하, glk라고 약칭한다), GDP-4,6-만노즈 데하이드라타제(이하, gmd라고 약칭한다) 및 GDP-4-케토-6-데옥시만노즈 에피메라제/리덕타제(이하, wcaG라고 약칭한다) 중에서 선택되는 하나 이상의 효소 활성이 강한 미생물임을 특징으로 하는 제조법.
- 제53항에 있어서, 미생물이 manB를 암호화하는 유전자, manC를 암호화하는 유전자, glk를 암호화하는 유전자, gmd를 암호화하는 유전자 및 wcaG를 암호화하는 유전자 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자를 함유하는 DNA 단편과 벡터의 재조합체 DNA를 보유하는 하나 이상의 미생물로 구성됨을 특징으로 하는 제조법.
- 제54항에 있어서, manB를 암호화하는 유전자, manC를 암호화하는 유전자, glk를 암호화하는 유전자, gmd를 암호화하는 유전자 및 wcaG를 암호화하는 유전자가 에스케리키아·콜라이 유래의 유전자임을 특징으로 하는 제조법.
- 제39항에 있어서, 당 뉴클레오티드가 구아노신이인산푸코즈인 제조법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 당과 NTP로부터 당 뉴클레오티드를 생산하는 능력을 갖는 미생물이 GlcNAc 2-에피메라제, CMP-NeuAc 신세타제(이하, neuA라고 약칭한다), NeuAc 알도라제(이하, nanA라고 약칭한다), NeuAc 신세타제(이하, neuB라고 약칭한다) 및 CTP 신세타제(이하, pyrG라고 약칭한다) 중에서 선택되는 하나 이상의 효소 활성이 강한 미생물임을 특징으로 하는 제조법.
- 제57항에 있어서, 미생물이 GlcNAc 2-에피메라제를 암호화하는 유전자, neuA를 암호화하는 유전자, nanA를 암호화하는 유전자, neuB를 암호화하는 유전자 및 pyrG를 암호화하는 유전자 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자를 함유하는 DNA 단편과 벡터의 재조합체 DNA를 보유하는 하나 이상의 미생물로 구성됨을 특징으로 하는 제조법.
- 제58항에 있어서, neuA를 암호화하는 유전자, nanA를 암호화하는 유전자, neuB를 암호화하는 유전자 및 pyrG를 암호화하는 유전자가 에스케리키아·콜라이 유래의 유전자임을 특징으로 하는 제조법.
- 제57항에 있어서, 당 뉴클레오티드가 시티딘일인산-N-아세틸노이라민산인 제조법.
- 제2항 또는 제3항에 있어서, 당 뉴클레오티드와 복합 당질 전구 물질로부터 복합 당질을 생산하는 능력을 갖는 미생물이 에스케리키아·콜라이 또는 사카로마이세스·세레비지애 또는 코리네박테리움·암모니아게네스임을 특징으로 하는 제조법.
- 제61항에 있어서, 미생물이 글루코실트랜스페라제, 갈락토실트랜스페라제, N-아세틸글루코사미닐트랜스페라제, N-아세틸갈락토사미닐트랜스페라제, 글루크로노실트랜스페라제, 만노실트랜스페라제, 시알릴트랜스페라제 및 푸코실트랜스페라제 중에서 선택되는 트랜스페라제를 암호화하는 유전자를 함유하는 DNA 단편과 벡터의 재조합체 DNA를 보유하는 미생물임을 특징으로 하는 제조법.
- 제62항에 있어서, 글루코실트랜스페라제, 갈락토실트랜스페라제, N-아세틸글루코사미닐트랜스페라제, N-아세틸갈락토사미닐트랜스페라제, 글루크로노실트랜스페라제, 만노실트랜스페라제, 시알릴트랜스페라제 및 푸코실트랜스페라제 중에서 선택되는 트랜스페라제를 암호화하는 유전자가 미생물 유래임을 특징으로 하는 제조법.
- 제2항 또는 제3항에 있어서, 동물 세포가 COS-7 세포 또는 나말바 KJM-1 세포이고 곤충 세포가 Sf9 세포임을 특징으로 하는 제조법.
- 제2항 또는 제3항에 있어서, 동물 세포 또는 곤충 세포가 글루코실트랜스페라제, 갈락토실트랜스페라제, N-아세틸글루코사미닐트랜스페라제, N-아세틸갈락토사미닐트랜스페라제, 글루크로노실트랜스페라제, 만노실트랜스페라제, 시알릴트랜스페라제 및 푸코실트랜스페라제 중에서 선택되는 트랜스페라제를 암호화하는 유전자를 함유하는 DNA 단편과 벡터의 재조합체 DNA를 보유하는 동물 세포 또는 곤충 세포임을 특징으로 하는 제조법.
- 제65항에 있어서, 글루코실트랜스페라제, 갈락토실트랜스페라제, N-아세틸글루코사미닐트랜스페라제, N-아세틸갈락토사미닐트랜스페라제, 글루크로노실트랜스페라제, 만노실트랜스페라제, 시알릴트랜스페라제 및 푸코실트랜스페라제 중에서 선택되는 트랜스페라제를 암호화하는 유전자가 동물 세포 유래임을 특징으로 하는 제조법.
- 제25항에 따른 galK 활성이 강한 미생물의 배양액 또는 당해 배양액의 처리물을 효소원으로 사용하여 효소원 및 N-아세틸글루코사민을 수성 매체 속에 존재시키고, 당해 수성 매체 속에 N-아세틸글루코사민-1-인산을 생성 축적시켜 이러한 수성 매체 속에서 N-아세틸글루코사민-1-인산을 채취함을 특징으로 하는 N-아세틸글루코사민-1-인산의 제조법.
- 제67항에 있어서, 미생물이 galk를 암호화하는 유전자를 함유하는 DNA 단편과 벡터의 재조합체 DNA를 보유하는 미생물인 제조법.
- 제68항에 있어서, galk를 암호화하는 유전자가 에스케리키아·콜라이 유래의 갈락토키나제를 암호화하는 유전자인 제조법.
- 제67항에 있어서, 배양액의 처리물이 배양액의 농축물, 배양액의 건조물, 배양액을 원심분리하여 수득된 배양 상등액, 배양 상등액의 농축물, 배양 상등액으로부터 수득된 효소 표준품, 배양액을 원심분리하여 수득된 세포, 당해 세포의 건조물, 당해 세포의 동결 건조물, 당해 세포의 계면활성제 처리물, 당해 세포의 초음파 처리물, 당해 세포의 기계적 마쇄 처리물, 당해 세포의 용매 처리물, 당해 세포의 효소 처리물, 당해 세포의 단백질 분획물, 당해 세포의 고정화물 또는 당해 세포로부터 추출하여 수득된 효소 표준품임을 특징으로 하는 제조법.
- 제10항에 있어서, 복합 당질에 함유되는 당이 10개 이하인 방법.
- 제10항에 있어서, 복합 당질에 함유되는 당이 6개 이하인 방법.
- 제39항에 있어서, 당 뉴클레오티드가 우리딘이인산-N-아세틸글루코사민인 제조법.
- 제39항에 있어서 , 미생물이 UDP-GlcNAc4-에피메라제 활성이 강한 미생물이고, 당 뉴클레오티드가 우리딘이인산-N-아세틸갈락토사민인 제조법.
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