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WO2023238843A1 - ３'－シアリルラクトースの生産性が向上した微生物および３'－シアリルラクトースの製造方法 - Google Patents

３'－シアリルラクトースの生産性が向上した微生物および３'－シアリルラクトースの製造方法 Download PDF

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WO2023238843A1
WO2023238843A1 PCT/JP2023/020924 JP2023020924W WO2023238843A1 WO 2023238843 A1 WO2023238843 A1 WO 2023238843A1 JP 2023020924 W JP2023020924 W JP 2023020924W WO 2023238843 A1 WO2023238843 A1 WO 2023238843A1
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WO
WIPO (PCT)
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seq
dna
gene
amino acid
activity
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/JP2023/020924
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English (en)
French (fr)
Inventor
大樹 直江
哲朗 氏原
▲祐▼梨子 青木
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kyowa Hakko Bio Co Ltd
Original Assignee
Kyowa Hakko Bio Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
Application filed by Kyowa Hakko Bio Co Ltd filed Critical Kyowa Hakko Bio Co Ltd
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Priority to US18/872,157 priority patent/US20250354186A1/en
Priority to JP2024526443A priority patent/JPWO2023238843A1/ja
Priority to EP23819823.8A priority patent/EP4538362A1/en
Priority to CN202380045187.4A priority patent/CN119301241A/zh
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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
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    • C12N9/1081—Glycosyltransferases (2.4) transferring other glycosyl groups (2.4.99)
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    • C12P19/02—Monosaccharides
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    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
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    • C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12Y204/99—Glycosyltransferases (2.4) transferring other glycosyl groups (2.4.99)
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    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/185—Escherichia
    • C12R2001/19—Escherichia coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/36—Neisseria

Definitions

  • the present invention relates to a microorganism with improved productivity of 3'-sialyllactose and a method for producing 3'-sialyllactose.
  • 3'-sialyllactose (hereinafter referred to as 3'SL) is an acidic oligosaccharide contained in human breast milk, and together with 6'-sialyllactose, it is a major acidic human milk oligosaccharide in breast milk (Non-patent Document 1). ). 3'SL is known to have important functions in the language development, cognitive functions, and various health of infants (Non-Patent Documents 2, 3, 4).
  • 3'SL is contained in human breast milk, but only a small amount is contained in the milk of other mammals such as cow's milk (Non-Patent Document 5).
  • Infant milk is mainly manufactured by adding necessary nutrients to raw materials such as cow's milk and processing it, so the content of human milk oligosaccharides, including 3'SL, is lower than that of breast milk.
  • it has been desired to add 3'SL to infant milk (Non-Patent Document 6).
  • Non-Patent Document 6 discloses various methods for obtaining human milk oligosaccharides, such as extraction methods, chemical synthesis methods, and fermentation methods using recombinant microorganisms.
  • the fermentation method using recombinant microorganisms is considered to be the most economically rational method among these methods.
  • the method for producing 3'SL using recombinant microorganisms involves producing cytidine-5'-monophosphate (hereinafter referred to as , also referred to as "CMP")-sialic acid, and transfer the sialic acid residue of CMP-sialic acid to externally added lactose using ⁇ 2,3-sialyltransferase to produce 3'SL.
  • CMP cytidine-5'-monophosphate
  • Non-Patent Documents 14 and 15 disclose a method for expressing a foreign sialyltransferase in E. coli by cleaving the N-terminus of the amino acid sequence. Although it is known that this method changes the expression and activity of sialyltransferase, it is not clear which region should be specifically cleaved to obtain useful activity.
  • the present invention aims to provide a microorganism in which the activity of a protein in which a specific amino acid residue has been deleted is enhanced, and the productivity of 3'SL is improved compared to the parent strain.
  • Another object of the present invention is to provide a method for producing 3'SL using the microorganism.
  • the present inventors found that a microorganism with enhanced activity of a protein consisting of an amino acid sequence in which the 20th to 37th amino acid residues on the N-terminal side of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 are deleted. discovered that the productivity of 3'SL was improved compared to the parent strain, and completed the present invention.
  • the present invention is as follows.
  • ⁇ 1> The activity of a protein consisting of an amino acid sequence in which the N-terminal 20 to 37 amino acid residues of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 are deleted is enhanced, and the 3'-sialyllactose Microorganisms with improved productivity.
  • a protein consisting of an amino acid sequence in which the 20 to 37 amino acid residues on the N-terminal side of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is deleted is the protein according to any one of the following [1] to [3].
  • [1] A protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, 6, 8 or 10.
  • [2] Consists of an amino acid sequence in which 1 to 20 amino acids are deleted, substituted, inserted, or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, 6, 8, or 10, and ⁇ 2,3-sialyltransferase activity
  • a mutant protein with [3] A homologous protein consisting of an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, 6, 8 or 10, and having ⁇ 2,3-sialyltransferase activity.
  • ⁇ 3> A method for producing 3'-sialyllactose, comprising preparing the microorganism according to ⁇ 1> or ⁇ 2> above, and producing 3'-sialyllactose in a culture using the microorganism. .
  • the microorganism according to one embodiment of the present invention can improve the productivity of 3'SL because the activity of a protein lacking a specific amino acid residue is enhanced.
  • 3'SL can be produced by using a culture obtained by culturing the microorganism.
  • FIG. 1 is a diagram showing an example of the 3'SL biosynthetic pathway.
  • microorganism with improved 3'SL productivity The microorganism of one embodiment of the present invention has enhanced activity of the protein described in [A] below, and has improved 3'SL productivity compared to the parent strain.
  • Examples include microorganisms that have [A] A protein consisting of an amino acid sequence in which the N-terminal 20 to 37 amino acid residues of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 are deleted.
  • productivity refers to the ability to accumulate target oligosaccharides produced by a microorganism in a culture of the microorganism. The productivity of oligosaccharides by a microorganism can be confirmed by detecting oligosaccharides in a culture of the microorganism using an analysis device or the like described below.
  • a protein consisting of an amino acid sequence in which the N-terminal 20 to 37 amino acid residues of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 are deleted has a higher ⁇ 2,3 - Preferably has sialyltransferase activity.
  • a protein consisting of an amino acid sequence in which the N-terminal 20 to 37 amino acid residues of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO. A protein consisting only of an amino acid sequence with a deleted group.
  • ⁇ 2,3-sialyltransferase activity refers to CMP-sialic acid and an acceptor carbohydrate as substrates, and transfers a sialic acid residue to galactose at the terminal of the carbohydrate through an ⁇ 2,3 linkage to obtain a sialic acid-containing carbohydrate. Refers to activity.
  • CMP-sialic acid examples include CMP-N-acetylneuraminic acid (hereinafter also referred to as "CMP-NeuAc").
  • CMP-NeuAc CMP-N-acetylneuraminic acid
  • the acceptor carbohydrate used as a substrate may be any one that serves as a substrate for sialyllactose, such as oligosaccharides, polysaccharides, and complex carbohydrates such as glycoproteins and glycolipids.
  • oligosaccharides or polysaccharides that serve as substrates for sialyllactose include those having galactose at the non-reducing end, or oligosaccharides having N-acetylneuraminic acid (hereinafter also referred to as "NeuAc") at the non-reducing end. or a polysaccharide, preferably a structure selected from the group consisting of lactose, globotriose, N-acetyllactosamine, lacto-N-tetraose, lacto-N-neotetraose, Lewis a, and Lewis X at the non-reducing end. or more preferably lactose.
  • complex carbohydrates include complex carbohydrates in which proteins, lipids, etc. are bound to the above-mentioned oligosaccharides and polysaccharides.
  • a NeuAc-containing carbohydrate is preferred.
  • Examples of NeuAc-containing carbohydrates include carbohydrates in which NeuAc is added to the above-mentioned receptor carbohydrates, preferably carbohydrates containing oligosaccharides having NeuAc ⁇ 2-3Gal ⁇ 1-4Glc at the non-reducing end, and more preferably It is 3'SL.
  • FIG. 1 An example of the 3'SL biosynthesis pathway is shown in Figure 1.
  • the enhanced ⁇ 2,3-sialyltransferase activity of microorganisms promotes ⁇ 2,3 bonding of NeuAc residues to galactose residues of lactose using CMP-NeuAc and lactose as substrates, leading to the production of 3'SL. It is assumed that the performance will improve.
  • a protein consisting of an amino acid sequence in which 20 to 37 amino acid residues on the N-terminal side of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 described in [A] above are deleted is one of the following [1] to [3]. It may be the protein described in . [1] A protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, 6, 8 or 10.
  • [2] Consists of an amino acid sequence in which 1 to 20 amino acids are deleted, substituted, inserted, or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, 6, 8, or 10, and ⁇ 2,3-sialyltransferase activity
  • a mutant protein with [3] A homologous protein consisting of an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, 6, 8 or 10, and having ⁇ 2,3-sialyltransferase activity.
  • a mutant protein refers to a protein obtained by artificially deleting or substituting amino acid residues in the original protein, or inserting or adding amino acid residues into the protein.
  • deletion, substitution, insertion, or addition of amino acids means that 1 to 20 amino acids are deleted, substituted, inserted, or added at any position in the same sequence. Good too.
  • the number of amino acids to be deleted, substituted, inserted or added is 1 to 20, preferably 1 to 10, more preferably 1 to 8, most preferably 1 to 5.
  • the amino acids to be deleted, substituted, inserted, or added may be natural or non-natural.
  • Natural amino acids include L-alanine, L-asparagine, L-aspartic acid, L-glutamine, L-glutamic acid, glycine, L-histidine, L-isoleucine, L-leucine, L-lysine, L-arginine, L- - Methionine, L-phenylalanine, L-proline, L-serine, L-threonine, L-tryptophan, L-tyrosine, L-valine, L-cysteine and the like.
  • Group A Leucine, isoleucine, norleucine, valine, norvaline, alanine, 2-aminobutanoic acid, methionine, O-methylserine, t-butylglycine, t-butylalanine, cyclohexylalanine
  • Group B aspartic acid, glutamic acid, isoaspartic acid, Isoglutamic acid, 2-aminoadipic acid, 2-aminosuberic acid
  • Group C asparagine, glutamine
  • D Lysine, arginine, ornithine, 2,4-diaminobutanoic acid, 2,3-diaminopropionic acid
  • Group E Proline, 3 -Hydroxyproline, 4-hydroxyproline
  • F group serine, threonine, homoserine
  • G group phenylalanine
  • a homologous protein is a protein whose structure and function are similar to that of the original protein, so that the gene encoding the protein is thought to have the same evolutionary origin as the gene encoding the original protein.
  • homologous proteins include, for example, amino acid sequences that preferably have 90% or more, particularly preferably 95% or more, identity with the amino acid sequence of the target protein.
  • parent strain refers to the original strain that is the target of genetic modification, transformation, and the like.
  • the original strain to be transformed by gene introduction is also called the host strain.
  • the parent strain is preferably a prokaryotic or yeast strain, more preferably Escherichia, Serratia, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Microbacterium, Pseudomonas, etc.
  • Prokaryotes belonging to the genus Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Kluyveromyces, Trichosporon, Siwaniomyces, Pichia, Candida, etc. are most preferably Escherichia coli BW25113 (National Genetics).
  • Prokaryotes such as D-0110, or Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Trichosporon pullulans, Yeast strains such as Schwanniomyces alluvius, Pichia pastoris, or Candida utilis can be mentioned.
  • the parent strain may be a wild strain, or if the wild strain does not have the ability to produce substrates for 3'SL production, such as CMP-NeuAc and/or lactose, artificially produce CMP-NeuAc and/or lactose. It may also be a breeding strain that has been given the ability to produce etc.
  • a microorganism is producing CMP-NeuAc and/or lactose can be determined by, for example, culturing the microorganism in a medium and measuring the CMP-NeuAc and/or lactose accumulated in the culture using a known method such as HPLC described below. This can be confirmed by detection.
  • Examples of methods for artificially imparting or enhancing the ability to produce CMP-NeuAc and/or lactose include the following known methods (a) to (d), and these methods may be used alone or in combination. Can be used.
  • (a) Method for enhancing the expression of at least one enzyme involved in the biosynthetic pathway that produces CMP-NeuAc and/or lactose (b) Enzyme gene involved in the biosynthetic pathway that produces CMP-NeuAc and/or lactose (c) A method of relaxing or releasing at least one of the mechanisms controlling the biosynthetic pathway that produces CMP-NeuAc and/or lactose.
  • (d) A method of increasing the copy number of at least one of CMP-NeuAc and/or lactose.
  • the parent strain has uridine diphosphate N-acetylglucosamine (hereinafter also referred to as "UDP-GlcNAc”) epimerase activity, NeuAc synthase activity, pyruvate carboxylase activity, L-glutamine-D-fructose 6-phosphate aminotransferase activity, and NanT. It is preferable to have at least one activity selected from CMP-NeuAc synthase activity, lactose permease activity, glucosamine acetyltransferase activity, and N-acetylmannosamine epimerase activity, and the activity is enhanced. is more preferable. Among these, it is preferable that the enzyme has the activity of CMP-NeuAc synthase, and it is more preferable that the activity is enhanced.
  • UDP-GlcNAc uridine diphosphate N-acetylglucosamine
  • UDP-GlcNAc epimerase is an enzyme responsible for the reaction of producing N-acetylmannosamine (hereinafter also referred to as "ManNAc") from UDP-GlcNAc, and is encoded by the neuC gene.
  • the neuC gene is preferably derived from Flavobacterium psychrophilum NBRC100250 strain.
  • NeuAc synthase is an enzyme responsible for the reaction of producing NeuAc using ManNAc and phosphoenolpyruvate (hereinafter also referred to as "PEP") as substrates.
  • the DNA encoding NeuAc synthase is preferably derived from prokaryotes such as bacteria or yeast, particularly preferably derived from prokaryotes, particularly preferably DNA encoding CjneuB derived from Campylobacter jejuni ATCC 43438 strain, or Examples include DNA encoding neuB derived from Rhodobacter capsulatus.
  • Pyruvate carboxylase is an enzyme responsible for the reaction of carboxylating pyruvate to produce oxaloacetate, and is encoded by the pyc gene. Pyc enhances the supply of PEP, as it is produced by decarboxylation of oxaloacetate.
  • the pyc gene is preferably derived from Sinorhizobium meliloti or Corynebacterium glutamicum.
  • L-glutamine-D-fructose 6-phosphate aminotransferase is an enzyme responsible for the reaction of producing glucosamine 6-phosphate from fructose 6-phosphate, and is encoded by the glmS gene.
  • the glmS gene is derived from E. coli. Since glucosamine hexaphosphate is an intermediate in the NeuAc synthesis pathway, Glms enhances the supply of NeuAc.
  • NanT is a NeuAc transporter that allows NeuAc to be reused by taking it into the bacterial body.
  • the nanT gene encoding the NeuAc transporter is derived from E. coli.
  • CMP-NeuAc synthase is an enzyme responsible for the reaction of producing CMP-NeuAc using cytidine-5'-triphosphate (hereinafter also referred to as "CTP") and NeuAc as substrates.
  • CTP cytidine-5'-triphosphate
  • the DNA encoding CMP-NeuAc synthase is preferably derived from prokaryotes such as bacteria or yeast, particularly preferably derived from prokaryotes, most preferably the neuA gene derived from Pasteurella multocida strain PM70.
  • Lactose permease is a membrane protein that takes lactose into cells, and is encoded by the lacY gene.
  • the lacY gene is derived from E. coli.
  • lactose permease promotes the uptake of lactose into the bacterial cells.
  • Glucosamine acetyltransferase is an enzyme responsible for the reaction of producing GlcNAc from glucosamine hexaphosphate.
  • Glucosamine acetyltransferase derived from Saccharomyces cerevisiae is encoded by the GNA1 gene.
  • N-acetylmannosamine epimerase is involved in epimerization from GlcNAc to ManNAc. Cyanobacterium Synechocystis sp. N-acetylmannosamine epimerase derived from PCC6803 is encoded by the slr1975 gene.
  • the neuC gene (SEQ ID NO: 19), the neuB gene (SEQ ID NO: 18 or ADE86687.1), the pyc gene (WP_010970538.1 or WP_208400776.1), the glmS gene (accession number BAE77559.1), nanT gene (SEQ ID NO: 15 or BAE77267.1), neuA gene (SEQ ID NO: 20), lacY gene (accession number BAE76125.1), GNA1 gene (NP_116637.1), slr1975 gene (BAK50383.1)
  • a genetically modified microorganism containing at least one base sequence selected from ) as a parent strain.
  • the genetically modified microorganism preferably has improved 3'SL productivity compared to a non-genetically modified parent strain.
  • UDP-GlcNAc epimerase activity NeuAc synthase activity, pyruvate carboxylase activity, L-glutamine-D-fructose 6-phosphate aminotransferase activity, NanT activity, CMP-NeuAc synthase activity, lactose permease activity, glucosamine acetyltransferase activity, N- Any known method may be used to produce E. coli that has at least one activity selected from acetylmannosamine epimerase activity or that has enhanced activity. Specific examples include methods using various genetic manipulations (Syst Microbiol Biomanufact, 2021, 1, 291).
  • the parent strain has N-acetylglucosamine (hereinafter also referred to as "GlcNAc”) transporter activity, N-acetylmannosamine kinase activity, N-acetylglucosamine-6-phosphate-2-epimerase activity, and RNase adapter protein.
  • GlcNAc N-acetylglucosamine
  • activity transcriptional regulator activity that negatively regulates the transcription of a gene group involved in NeuAc assimilation, NeuAc lyase activity, ⁇ -galactosidase activity, and galactoside acetyltransferase activity is reduced or deleted.
  • it is particularly preferable that the activities of ⁇ -galactosidase and NeuAc lyase are reduced or deleted.
  • the GlcNAc transporter is involved in the uptake and assimilation of GlcNAc into the bacterial body, and is encoded by the nagE and nagB genes.
  • a reduction or deletion of GlcNAc transporter activity can promote the production of GlcNAc, which is a substrate of ManNAc.
  • N-acetylmannosamine kinase is an enzyme responsible for the reaction of producing N-acetylmannosamine hexaphosphate (hereinafter also referred to as "ManNAc-6P") from ManNAc, and is encoded by the nanK gene. By suppressing the production of substances other than NeuAc from ManNAc, the supply of NeuAc can be promoted.
  • ManNAc-6P N-acetylmannosamine hexaphosphate
  • N-acetylglucosamine-6-phosphate-2-epimerase is an enzyme responsible for the reaction of converting ManNAc-6P to N-acetyl-D-glucosamine 6-phosphate (hereinafter also referred to as "GlcNAc-6P"). Yes, and encoded by the nanE gene.
  • RNase adapter protein is a transcription factor that negatively controls the activity of a gene encoding an enzyme involved in NeuAc biosynthesis, and is encoded by the yhbJ gene.
  • the yhbJ gene is also referred to as the rapZ gene.
  • YhbJ is a transcriptional regulator that negatively regulates the activity of the glmS gene encoding L-glutamine-D-fructose 6-phosphate aminotransferase involved in NeuAc biosynthesis.
  • a transcription control factor that negatively controls the transcription of a gene group involved in NeuAc assimilation is a transcription control factor involved in the synthesis and metabolism of sialic acid, and is encoded by the nanR gene.
  • NeuAc lyase is an enzyme that decomposes NeuAc into ManNAc and pyruvate, and is encoded by the nanA gene.
  • ⁇ -galactosidase is an enzyme that hydrolyzes lactose and is encoded by the lacZ gene.
  • Galactoside acetyltransferase is an enzyme that has the activity of acetylating lactose and its analogs, and is encoded by the lacA gene.
  • the present invention more preferably does not contain at least one base sequence selected from the nagE gene, nagB gene, nanK gene, nanE gene, yhbJ gene, nanR gene, nanA gene, lacZ gene, and lacA gene.
  • a genetically modified microorganism as the parent strain.
  • the genetically modified microorganism preferably has improved 3'SL productivity compared to a non-genetically modified parent strain.
  • Any known method may be used to produce E. coli in which at least one activity selected from transcriptional regulator activity, NeuAc lyase activity, ⁇ -galactosidase activity, and galactoside acetyltransferase activity is reduced or deleted. Specific examples include methods using various genetic manipulations (Metabolic Engineering, 2017, 41:23-38).
  • a parent strain microorganism with recombinant DNA containing DNA encoding the protein is used as a microorganism in which the activity of the protein according to any one of [A] and [1] to [3] is enhanced compared to the parent strain microorganism.
  • Examples include microorganisms in which the number of copies of the gene is increased compared to the parent strain, which is obtained by transforming the parent strain.
  • increasing the copy number of the gene may mean newly carrying the gene in a parent strain that does not carry the gene on the chromosome or plasmid, or increasing the copy number of the gene on the chromosome or plasmid.
  • the above-mentioned strain may additionally carry the gene.
  • a copy of the gene from the parent strain obtained by transforming a parent strain microorganism with a recombinant DNA containing a DNA encoding the protein according to any one of [A] and [1] to [3] above.
  • the microorganism whose number has increased can be obtained by transforming a parent strain of microorganism with a recombinant DNA containing DNA encoding the protein according to any one of [A] and [1] to [3] above.
  • Examples include microorganisms in which the number of copies of the gene has increased on its DNA, and microorganisms in which the gene is carried outside of chromosomal DNA as plasmid DNA.
  • the DNA encoding the protein according to any one of [A] and [1] to [3] above has the activity of the protein according to any one of [A] and [1] to [3] above.
  • Any DNA may be used as long as it encodes a protein having the following properties, but specific examples include DNA 1 selected from the group consisting of [4] to [7] below.
  • DNA encoding the protein according to any one of [A] and [1] to [3] above [5] DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 3, 5, 7 or 9
  • DNA to code [7] From a nucleotide sequence having 95% or more, preferably 97% or more, more preferably 98% or more, most preferably 99% or more identity with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3, 5, 7 or 9. and a DNA encoding a homologous protein having ⁇ 2,3-sialyltransferase activity
  • hybridize means that DNA hybridizes to DNA having a specific base sequence or a part of the DNA. Therefore, DNA having the specific base sequence or a portion thereof can be used as a probe for Northern or Southern blot analysis, and can also be used as an oligonucleotide primer for PCR analysis.
  • DNA used as a probe examples include DNA with at least 100 bases or more, preferably 200 bases or more, and more preferably 500 bases or more.
  • the DNA used as a primer can be at least 10 bases or more, preferably 15 bases or more.
  • DNA that hybridizes under stringent conditions can also be obtained by following the instructions attached to a commercially available hybridization kit.
  • commercially available hybridization kits include the Random Primed DNA Labeling Kit (manufactured by Roche Diagnostics), which prepares probes by the random prime method and performs hybridization under stringent conditions.
  • the above stringent conditions mean that the DNA-immobilized filter and the probe DNA are mixed in 50% formamide, 5x SSC (750 mmol/l sodium chloride, 75 mmol/l sodium citrate), and 50 mmol/l phosphoric acid. After overnight incubation at 42°C in a solution containing sodium (pH 7.6), 5x Denhardt's solution, 10% dextran sulfate, and 20 ⁇ g/l denatured salmon sperm DNA, e.g. Conditions for washing the filter in a 0.2 ⁇ SSC solution can be mentioned.
  • DNA that can hybridize under the above-mentioned stringent conditions includes, for example, the bases represented by SEQ ID NO: 3, 5, 7, or 9 when calculated based on the above-mentioned parameters using BLAST, FASTA, etc. DNA having at least 95% or more, preferably 97% or more, more preferably 98% or more, and most preferably 99% or more identity with the DNA sequence can be mentioned.
  • the DNA encoding the protein in [1] above and the DNA in [5] above can be produced using a microorganism, preferably a probe DNA that can be designed based on the base sequence represented by SEQ ID NO: 3, 5, 7 or 9. is carried out using the Southern hybridization method on a chromosomal DNA library of a microorganism belonging to the genus Escherichia, more preferably Escherichia coli strain BW25113, or using the chromosomal DNA of the above microorganism as a template using primer DNA that can be designed based on the base sequence. It can be obtained by PCR [PCR Protocols, Academic Press (1990)].
  • the DNA encoding the mutant protein of [2] above can be obtained, for example, by subjecting it to error-prone PCR or the like using DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 3, 5, 7, or 9 as a template.
  • PCR using a pair of PCR primers each having a nucleotide sequence at the 5' end designed to introduce the desired mutation (deletion, substitution, insertion, or addition) [Gene, 77, 51 (1989 )] can also obtain DNA encoding the mutant protein of [2] above.
  • the DNA can also be obtained by following the instructions attached to a commercially available partial-specific mutagenesis kit.
  • a commercially available part-specific mutagenesis kit for example, PrimeSTAR (registered trademark) Mutagenesis Basal Kit (manufactured by Takara Bio Inc.), which can introduce mutations (deletion, substitution, insertion, or addition) into the desired mutation position, is available. Can be mentioned.
  • a pair of mutation-introducing primers with 15 bases overlapping on the 5' side is designed. do. At this time, the overlapped portion contains the desired mutation.
  • PCR is performed using the mutation introduction primer and a plasmid having the nucleotide sequence into which the desired mutation is to be introduced as a template.
  • the DNA encoding the homologous protein in [3] above, and the DNA in [6] and [7] above are, for example, based on the base sequence represented by SEQ ID NO: 3, 5, 7, or 9 in various gene sequence databases. Search for a base sequence having an identity of 95% or more, preferably 97% or more, more preferably 98% or more, most preferably 99% or more with SEQ ID NO: 4 or 6 against various protein sequence databases. Search for an amino acid sequence having an identity of 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 97% or more, still more preferably 98% or more, and most preferably 99% or more with the amino acid sequence represented by , 8 or 10. However, it can be obtained by a method similar to the method for obtaining DNA described above using a probe DNA or primer DNA that can be designed based on the nucleotide sequence or amino acid sequence obtained by the search, and a microorganism that has the DNA.
  • the obtained DNA according to any one of [4] to [7] above is inserted into a vector by a conventional method, either as it is or after being cut with an appropriate restriction enzyme, and the obtained recombinant DNA is introduced into a host cell.
  • a commonly used base sequence analysis method such as the dideoxy method [Proc. Natl. Acad. Sci. , USA, 74, 5463 (1977)] or 3700 DNA Analyzer (manufactured by Applied Biosystems), the base sequence of the DNA can be determined.
  • any host cell may be used as long as the vector can be introduced and propagated, such as Escherichia coli DH5 ⁇ , Escherichia coli HST08 Premium, Escherichia coli HST02, Escherichia coli HST04 dam - /dcm - , Escherichia coli JM109, Escherichia coli HB101, Escherichia coliCJ236, Escherichia coli BMH71-18 mutS, Escherichia coli MV1184, Escherichia coli TH2 (all manufactured by Takara Bio), Escherichia coli XL1-Blue, Escherichia coli XL2-Blue (all manufactured by Agilent Technologies), Escherichia coli DH1, Escherichia coli MC1000, Escherichia coli W1485, Escherichia coli W3110, Escherichia
  • Examples of the above vectors include pBluescript II KS (+), pPCR-Script Amp SK (+) (all manufactured by Agilent Technologies), pT7Blue (manufactured by Merck Millipore), and pCRII (manufactured by Thermo Fisher Scientific). ), pCR-TRAP (manufactured by Gene Hunter), and pDIRECT (Nucleic Acids Res., 18, 6069, 1990).
  • Any method for introducing recombinant DNA into host cells can be used, such as a method using calcium ions [Proc. Natl. Acad. Sci. , USA, 69, 2110 (1972)], protoplast method (Japanese Unexamined Patent Publication No. 63-248394), electroporation method [Nucleic Acids Res. , 16, 6127 (1988)].
  • full-length DNA can be obtained by Southern hybridization of a chromosomal DNA library using the partial-length DNA as a probe.
  • the desired DNA can also be prepared by chemical synthesis based on the determined DNA base sequence using an NTS M series DNA synthesizer manufactured by Nippon Techno Service Co., Ltd., or the like.
  • a recombinant DNA containing a DNA encoding the protein according to any one of [A] and [1] to [3] above refers to a recombinant DNA that is capable of autonomous replication in the parent strain or that is not integrated into the chromosome. This refers to recombinant DNA that has been incorporated into an expression vector that contains a promoter at a location where the DNA can be transcribed.
  • the recombinant DNA is a recombinant DNA that can be integrated into the chromosome, it does not need to contain a promoter.
  • a copy of the gene from the parent strain obtained by transforming a parent strain microorganism with a recombinant DNA containing a DNA encoding the protein according to any one of [A] and [1] to [3] above.
  • Microorganisms whose number has increased can be obtained by the following method.
  • a suitable DNA containing a portion encoding the protein Based on the DNA encoding the protein according to any one of [A] and [1] to [3] obtained by the above method, if necessary, a suitable DNA containing a portion encoding the protein. Prepare a DNA fragment of appropriate length. Furthermore, by substituting bases in the base sequence of the protein-encoding portion so that the codon is optimal for expression in the host cell, a transformant with improved productivity can be obtained.
  • Recombinant DNA is produced by inserting the DNA fragment downstream of the promoter of an appropriate expression vector.
  • the recombinant DNA is composed of a promoter, a ribosome binding sequence, the DNA described in any one of [4] to [7] above, and a transcription termination sequence.
  • a promoter a ribosome binding sequence
  • the DNA described in any one of [4] to [7] above and a transcription termination sequence.
  • it is a recombinant DNA.
  • a gene that controls a promoter may be included.
  • a plasmid in which the distance between the Shine-Dalgarno sequence, which is a ribosome binding sequence, and the start codon is adjusted to an appropriate distance (for example, 6 to 18 bases).
  • an appropriate distance for example, 6 to 18 bases.
  • a transcription termination sequence is not necessarily required for expression of the DNA, it is preferable to place the transcription termination sequence immediately below the structural gene.
  • expression of a protein with ⁇ 2,3-sialyltransferase activity can be achieved by substituting bases in the base sequence of the part encoding the protein with ⁇ 2,3-sialyltransferase activity so that it becomes the optimal codon for expression in the host. quantity can be improved.
  • Examples of the protein having ⁇ 2,3-sialyltransferase activity include the proteins described in [A] and any one of [1] to [3] above. Information on codon usage in the parent strain used in the production method of the present invention is available through public databases.
  • the expression vector is not particularly limited as long as it is an appropriate nucleic acid molecule for introducing, propagating, and expressing the target DNA into a host, and includes not only plasmids but also artificial chromosomes, vectors using transposons, and cosmids. It's okay.
  • expression vectors such as pColdI, pSTV28, pSTV29, pUC118 (all manufactured by Takara Bio), pMW119 (manufactured by Nippon Gene), pET21a, pCOLADuet-1, pCDFDuet- 1, pCDF-1b, pRSF-1b (all manufactured by Merck Millipore), pMAL-c5x (all manufactured by New England Biolabs), pGEX-4T-1, pTrc99A (all manufactured by GE Healthcare Biosciences), pTrcHis , pSE280 (both manufactured by Thermo Fisher Scientific), pGEMEX-1 (manufactured by Promega), pQE-30, pQE80L (all manufactured by Qiagen), pET-3, pBluescriptII SK (+), pBluescriptII KS ( -)
  • any promoter may be used as long as it functions in the cells of microorganisms belonging to the genus Escherichia.
  • promoters of genes involved in amino acid biosynthesis such as trp promoter and ilv promoter Promoters derived from Escherichia coli, phages, etc., such as , uspA promoter, lac promoter, PL promoter, PR promoter, and PSE promoter, can be used.
  • examples include promoters that have been artificially designed and modified, such as a promoter in which two trp promoters are arranged in series, a tac promoter, a trc promoter, a lacT7 promoter, and a letI promoter.
  • expression vectors such as pCG1 (Japanese Unexamined Patent Publication No. 57-134500), pCG2 (Japanese Unexamined Patent Publication No. 58-35197), pCG4 (Japanese Unexamined Patent Publication No. 57-183799), pCG11 (Japanese Unexamined Patent Application No. 57-134500), pCG116, pCE54, pCB101 (all Japanese Unexamined Patent Application No. 58-105999), pCE51, pCE52 , pCE53 [both Molecular and General Genetics, 196, 175 (1984)], and the like.
  • any promoter may be used as long as it functions in the cells of a microorganism belonging to the genus Corynebacterium.
  • the P54-6 promoter [Appl. Microbiol. Biotechnol. , 53, 674-679 (2000)] can be used.
  • examples of expression vectors include YEp13 (ATCC37115), YEp24 (ATCC37051), YCp50 (ATCC37419), pHS19, pHS15, and the like.
  • any promoter may be used as long as it functions in the cells of the yeast strain, such as PHO5 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH promoter, gal1 promoter, gal10 promoter, heat promoter, etc.
  • promoters such as shock polypeptide promoter, MF ⁇ 1 promoter, and CUP1 promoter.
  • Recombinant DNA used in the production method of the present invention can be produced by inserting the DNA fragment described in any one of [4] to [7] above into the downstream of the promoter of an appropriate expression vector.
  • a method for introducing the recombinant DNA into the parent strain as a plasmid capable of autonomous replication for example, a method using calcium ions [Proc. Natl. Acad. Sci. , USA, 69, 2110 (1972)], the protoplast method (Japanese Unexamined Patent Publication No. 63-248394) and the electroporation method [Nucleic Acids Res. , 16, 6127 (1988)].
  • Examples of methods for integrating recombinant DNA into the chromosome of host cells include homologous recombination.
  • Examples of the homologous recombination method include a method using a plasmid for homologous recombination that can be prepared by ligating with plasmid DNA having a drug resistance gene that cannot autonomously replicate within the host cell into which the drug is to be introduced.
  • Examples of methods using homologous recombination frequently used in Escherichia coli include, for example, a method of introducing recombinant DNA using a lambda phage homologous recombination system [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 6640-6645 (2000)].
  • the recombinant DNA has been introduced into the parent strain as a plasmid capable of autonomous replication or has been integrated into the chromosome of the parent strain means that, for example, the microorganism amplifies the gene originally contained in the chromosomal DNA.
  • the gene introduced by transformation can be confirmed by a method such as confirming the amplification product by PCR using an amplifiable primer set.
  • an increase in the amount of transcription of the DNA or the amount of production of the protein encoded by the DNA can be determined by measuring the amount of transcription of the gene of the microorganism by Northern blotting or by Western blotting of the amount of production of the protein by the microorganism. This can be confirmed by comparing it with that of the parent strain.
  • microorganism created by the above method is a microorganism in which the activity of the protein according to any one of [A] and [1] to [3] above is enhanced than that of the parent strain means that after culturing the microorganism, This can be confirmed by appropriately diluting the solution, centrifuging it, analyzing the 3'SL contained in the supernatant using HPLC, etc., and comparing it with that of the parent strain.
  • the above-mentioned microorganism has an enhanced activity of the protein described in [A] and any one of [1] to [3] above compared to the parent strain, so that the activity of the protein described in any one of [A] and [1] to [3] is enhanced, so that the activity of the protein described in any one of [A] and [1] to [3] is enhanced.
  • Transfer of sialic acid residues to galactose is promoted by ⁇ 2,3 linkage, which can improve the productivity of 3'SL.
  • microorganisms examples include tNlsiaT ⁇ N20AA, tNlsiaT ⁇ N23AA, tNlsiaT ⁇ N27AA, and tNlsiaT ⁇ N37AA, which have enhanced expression of the ⁇ 2,3-sialyltransferase gene described later in the Examples.
  • a microorganism with enhanced ⁇ 2,3-sialyltransferase activity which is an example of such a microorganism, can improve 3'SL productivity due to the high ⁇ 2,3-sialyltransferase activity.
  • Method for manufacturing 3'SL examples include the following method. 1. A method for producing 3'SL, comprising: preparing a microorganism as described above; and producing 3'SL in a culture using the microorganism.
  • the method for culturing the microorganisms described above can be carried out according to the usual methods used for culturing microorganisms.
  • the medium for culturing the microorganism may be a natural medium, as long as it contains carbon sources, nitrogen sources, inorganic salts, etc. that the microorganism can assimilate, and can efficiently culture the transformant. Any synthetic medium may be used.
  • the carbon source may be anything that can be assimilated by the microorganisms, such as glucose, fructose, sucrose, molasses containing these, sugars such as starch or starch hydrolysates, organic acids such as acetic acid or propionic acid, Alternatively, alcohols such as glycerol, ethanol, and propanol can be mentioned.
  • nitrogen sources include ammonium salts of inorganic or organic acids such as ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate or ammonium phosphate, other nitrogen-containing compounds, as well as peptone, meat extract, yeast extract, corn steep liquor. , casein hydrolyzate, soybean meal, soybean meal hydrolyzate, various fermented microbial cells and digested products thereof, and the like.
  • inorganic salts include primary potassium phosphate, secondary potassium phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous sulfate, manganese sulfate, copper sulfate, calcium carbonate, and the like.
  • microorganism of the present invention used in the method for producing 3'SL, a microorganism having the ability to produce receptor carbohydrates such as glucose, lactose, or lactose monohydrate may be used.
  • glucose, liquid sugar, sucrose, lactose, NeuAc, etc. may be added to the medium during culturing.
  • a microorganism capable of producing lactose and NeuAc is simultaneously cultured with the microorganism of the present invention. Lactose, NeuAc, etc. may be supplied to the microorganism of one embodiment of the invention.
  • the medium contains GlcNAc transporter, N-acetylmannosamine kinase, N-acetylglucosamine-6-phosphate-2-epimerase, RNase adapter protein, and genes involved in NeuAc assimilation.
  • the transcriptional regulators, NeuAc lyase, ⁇ -galactosidase and galactoside acetyltransferase which negatively regulate transcription of the group, are not present.
  • Cultivation is usually preferably carried out under aerobic conditions using aerated agitation culture.
  • the culture temperature is usually 28 to 37°C, and the culture time is usually 36 hours to 4 days.
  • the pH of the culture solution during cultivation is usually maintained at 6.4 to 7.4.
  • the pH is adjusted using an inorganic or organic acid, alkaline solution, urea, calcium carbonate, ammonia, or the like.
  • 3'SL can be produced by producing and accumulating 3'SL in the culture by the above culture and collecting 3'SL from the culture.
  • 3'SL can be collected from the supernatant.
  • the 3'SL can be extracted from the supernatant obtained by disrupting the bacterial body by ultrasonic waves or the like, removing the bacterial body by centrifugation, etc. using an ion exchange resin method, etc. can be collected.
  • analysis and quantification of 3'SL were performed according to the procedure shown below.
  • the culture solution containing the cultured microorganisms was appropriately diluted, filter sterilized, and the supernatant was collected.
  • the 3'SL contained in the supernatant was analyzed using an analyzer SPD-20A (manufactured by Shimadzu Corporation).
  • Example 1 Creation of microorganisms used for production of 3'SL (1) Creation of host for 3'SL production ⁇ E. coli lacking yhbJ gene> A transcriptional control factor yhbJ gene (SEQ ID NO: 11) that negatively controls the activity of the glmS gene encoding L-glutamine-D-fructose 6-phosphate aminotransferase involved in N-acetylneuraminic acid (hereinafter referred to as NeuAc) biosynthesis. Escherichia coli that had been disrupted was prepared using the following procedure.
  • strain BW25113 (Keio collection (Systematic single-gene knock-out mutants of E. coli K-12)) as a host, Baba et al. By a method similar to T. et al. (2006) Mol systems Biol), A strain BW25113 ⁇ yhbJ in which the yhbJ gene was completely deleted was obtained.
  • PCR was performed using DNA consisting of the base sequence shown in "Primer Set” in Table 1 as a primer set and the DNA listed in "Template” in Table 1 as a template to obtain each amplified DNA fragment.
  • Genomic DNA of Bacillus subtilis strain 168 was prepared by a conventional method.
  • the amplified DNA fragment cat includes about 200 bp upstream to about 50 bp downstream of the cat gene (encoding chloramphenicol acetyl transferase) on pHSG396.
  • the amplified DNA fragment sacB includes about 300 bp upstream to about 100 bp downstream of the sacB gene (encoding levansucrase) on the genomic DNA of Bacillus subtilis strain 168.
  • PCR was performed using a mixture of the amplified DNA fragments cat and sacB in an equimolar ratio as a template and DNA consisting of the base sequences represented by SEQ ID NOs: 21 and 24 as a primer set.
  • a DNA fragment containing the sacB gene (hereinafter referred to as cat-sacB) was obtained.
  • PCR was performed using DNA consisting of the base sequence shown in "Primer set" in Table 2 as a primer set to obtain each amplified DNA fragment.
  • lacZ upstream 1 and lacZ upstream 2 include approximately 700 bp upstream from the start codon of the lacZ gene.
  • lacZ downstream 1 and lacZ downstream 2 include approximately 800 bp downstream from the stop codon of the lacZ gene.
  • lacZ::cat-sacB A DNA fragment (hereinafter referred to as lacZ::cat-sacB) consisting of a sequence in which a cat-sacB fragment was inserted into the sequence surrounding the lacZ gene was obtained.
  • PCR was performed using DNA consisting of the base sequences represented by SEQ ID NOs: 33 and 34 as a primer set, and lacZ without lacZ was detected.
  • a DNA fragment (hereinafter referred to as ⁇ lacZ) consisting of a sequence in which the upstream and downstream lacZ were directly linked was obtained.
  • lacZ::cat-sacB fragment was transferred to plasmid pKD46, which contains the gene encoding lambda recombinase [Datsenko, K. et al. A. , Warner, B. L. , Proc. Natl. Acad. Sci. , USA, Vol. 97, 6640-6645 (2000)] was introduced into the BW25113 ⁇ yhbJ strain by electroporation, and a transformant that showed chloramphenicol resistance and sucrose sensitivity (lacZ gene is lacZ::cat-sacB A transformant in which the substituents were substituted with
  • the ⁇ lacZ fragment was introduced into the transformant by electroporation to obtain a transformant that was sensitive to chloramphenicol and resistant to sucrose (a transformant in which lacZ::cat-sacB was replaced with ⁇ lacZ). .
  • the transformant was named strain BW25113 ⁇ yhbJ ⁇ lacZ.
  • nanR gene (SEQ ID NO: 13), which encodes a transcriptional control factor that negatively controls the transcription of a gene group involved in NeuAc assimilation
  • nanA gene (SEQ ID NO: 14), which encodes NeuAc lyase
  • NeuAc The nanT gene (SEQ ID NO: 15) encodes a transporter
  • the nanE gene (SEQ ID NO: 16) encodes N-acetylglucosamine-6-phosphate-2-epimerase
  • the nanK gene (SEQ ID NO: 16) encodes N-acetylmannosamine kinase.
  • E. coli in which SEQ ID NO: 17) was disrupted was produced using the following procedure.
  • nanR, nanA, nanT, nanE, and nanK form an operon on the E. coli genome.
  • PCR was performed using DNA consisting of the base sequence shown in "Primer set" in Table 3 as a primer set to obtain each amplified DNA fragment.
  • nanR upstream 1 and nanR upstream 2 include approximately 800 bp upstream from the start codon of the nanR gene.
  • nanK downstream 1 and nanK downstream 2 include approximately 850 bp downstream from the stop codon of the nanK gene.
  • nanRATEK A DNA fragment (hereinafter referred to as nanRATEK::cat-sacB) consisting of a sequence in which a cat-sacB fragment was inserted into the sequence surrounding the gene was obtained.
  • PCR was performed using DNA consisting of the base sequences represented by SEQ ID NOs: 43 and 44 as a primer set.
  • a DNA fragment (hereinafter referred to as ⁇ nanRATEK) consisting of a sequence in which the upstream and downstream of nanK were directly linked was obtained.
  • the nanRATEK::cat-sacB fragment was introduced into the BW25113 ⁇ yhbJ ⁇ lacZ strain carrying plasmid pKD46 containing the gene encoding ⁇ recombinase by electroporation method, and a transformant was obtained which showed chloramphenicol resistance and sucrose sensitivity. (A transformant in which the nanRATEK gene was replaced with nanRATEK::cat-sacB) was obtained.
  • the ⁇ nanRATEK fragment was introduced into the transformant by electroporation to obtain a transformant that was sensitive to chloramphenicol and resistant to sucrose (a transformant in which nanRATEK::cat-sacB was replaced with ⁇ nanRATEK).
  • the transformant was named BW25113 ⁇ yhbJ ⁇ lacZ ⁇ nanRATEK strain.
  • NeuAc production plasmid NeuAc synthase gene CjneuB (SEQ ID NO: 18) derived from Campylobacter jejuni ATCC43438 strain and UDP-G derived from Flavobacterium psychrophilum NBRC100250 strain
  • a plasmid expressing FpneuC (SEQ ID NO: 19) encoding lcNAc epimerase was , was created using the following procedure.
  • PCR was performed using DNA consisting of the base sequence shown in “Primer Set” in Table 4 as a primer set and the DNA listed in “Template” in Table 4 as a template to obtain an amplified DNA fragment.
  • start codon in the wild type sequence of FpneuC (SEQ ID NO: 19) is GTG
  • ATG is added in the primer sequence so that the start codon of the amplified DNA fragment FpneuC obtained by PCR is ATG. Added.
  • Genomic DNA of Campylobacter jejuni ATCC43438 strain and Flavobacterium psychrophilum NBRC100250 strain was prepared by a conventional method.
  • the base sequences represented by SEQ ID NOs: 46 and 47 include complementary sequences at their respective 5' ends.
  • PCR was performed using a mixture of the CjneuB fragment and FpneuC fragment obtained above in an equimolar ratio as a template and DNA consisting of the base sequences represented by SEQ ID NOs: 45 and 48 as a primer set.
  • a DNA fragment of about 2.2 kb (hereinafter referred to as CjneuB-FpneuC fragment) was obtained by ligating the fragments.
  • pBC expression plasmid pTrc99a-CjneuB-FpneuC
  • plasmid for 3'SL production The sialyltransferase gene NlsiaT (SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, or 9) derived from full-length or truncated Neisseria lactamica ATCC23970 strain and Pasteurella multocida subsp. multocida str.
  • a plasmid for expressing the CMP-NeuAc synthase gene PmneuA (SEQ ID NO: 20) derived from the Pm70 ATCC BAA-1909 strain was prepared by the following procedure.
  • PCR was performed using Neisseria lactamica chromosomal DNA prepared by a conventional method as a template and DNA consisting of the base sequence shown in "Primer set" in Table 5 as a primer set to obtain each amplified DNA fragment.
  • Pasteurella multocida subsp. prepared by a conventional method. multocida str. Using the chromosomal DNA of Pm70 ATCC BAA-11909 as a template and the DNA consisting of the base sequences represented by SEQ ID NOs: 55 and 56 as a primer set, PCR was performed to obtain a PmneuA fragment.
  • the base sequences represented by SEQ ID NOs: 50 and 55 include complementary sequences at their respective 5' ends.
  • a mixture of the NlsiaT fragment, tNlsiaT ⁇ N20AA fragment, tNlsiaT ⁇ N23AA fragment, tNlsiaT ⁇ N27AA fragment or tNlsiaT ⁇ N37AA fragment, and PmneuA fragment obtained above in an equimolar ratio was used as a template, and SEQ ID NO: 49, 51, 52, 53 or 54, and 56 PCR was performed using DNA consisting of the base sequence represented by as a primer set to obtain DNA fragments in which each NlsiaT fragment and PmneuA fragment were linked.
  • Expression was achieved by ligating the DNA fragment obtained above by ligating each NlsiaT fragment and PmneuA fragment and the expression vector pSTV29 (manufactured by Takara Bio) using In-Fusion HD Cloning Kit (manufactured by Takara Bio). Plasmids pSTV-NlsiaT, pSTV-tNlsiaT ⁇ N20AA, pSTV-tNlsiaT ⁇ N23AA, pSTV-tNlsiaT ⁇ N27AA and pSTV-tNlsiaT ⁇ N37AA were obtained.
  • E. coli having pBC was created by transforming the BW25113 ⁇ yhbJ ⁇ lacZ ⁇ nanRATEK strain created in (1) above using the plasmid pBC for NeuAc production obtained in (2) above.
  • the strain was named BW25113 ⁇ yhbJ ⁇ lacZ ⁇ nanRATEK/pBC strain.
  • Example 2 Production of 3'SL by fermentation method The productivity of 3'SL was evaluated for the NlsiaT strain, tNlsiaT ⁇ N20AA strain, tNlsiaT ⁇ N23AA strain, tNlsiaT ⁇ N27AA strain, and tNlsiaT ⁇ N37AA strain obtained in Example 1.
  • Each strain was cultured overnight at 30°C on LB plates containing 100 mg/L ampicillin and 25 mg/L chloramphenicol, and 5 ml of LB medium containing 100 mg/L ampicillin and 25 mg/L chloramphenicol. The cells were inoculated into large test tubes and cultured with shaking at 30°C for 16 hours.
  • the culture solution was transferred to a production medium containing 100 mg/L of ampicillin and 25 mg/L of chloramphenicol [30 g/L of glycerol, 10 g/L of lactose, 2.0 g/L of magnesium sulfate heptahydrate, and 2.0 g/L of dipotassium hydrogen phosphate.
  • IPTG isopropyl- ⁇ -thiogalactopyranoside
  • 3'SL can be efficiently produced.
  • SEQ ID NO: 1 Base sequence of sialyltransferase gene NlsiaT derived from Neisseria lactamica ATCC23970 strain
  • SEQ ID NO:2 Amino acid sequence of sialyltransferase gene NlsiaT derived from Neisseria lactamica ATCC23970 strain
  • SEQ ID NO:3 Base of tNlsiaT ⁇ N20AA
  • Sequence number 4 Amino acid sequence of tNlsiaT ⁇ N20AA
  • SEQ ID NO: 5 Base sequence of tNlsiaT ⁇ N23AA
  • SEQ ID NO: 6 Amino acid sequence of tNlsiaT ⁇ N23AA
  • SEQ ID NO: 7 Base sequence of tNlsiaT ⁇ N27AA
  • SEQ ID NO: 8 Amino acid sequence of tNlsiaT ⁇ N27AA
  • SEQ ID NO: 9 Base sequence of tNlsiaT ⁇ N

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Abstract

本発明は、配列番号２で表されるアミノ酸配列のＮ末端側２０～３７アミノ酸残基が欠失されたアミノ酸配列からなる蛋白質の活性が増強され、かつ、親株に比べて３'－シアリルラクトースの生産性が向上した微生物に関する。

Description

３’－シアリルラクトースの生産性が向上した微生物および３’－シアリルラクトースの製造方法
　本発明は、３’－シアリルラクトースの生産性が向上した微生物および３’－シアリルラクトースの製造方法に関する。
　３’－シアリルラクトース（以下、３’ＳＬという。）はヒト母乳中に含まれる酸性オリゴ糖であり、６’－シアリルラクトースと共に母乳中の主要な酸性ヒトミルクオリゴ糖である（非特許文献１）。３’ＳＬは幼児の言語の発達や認知機能、各種健康に重要な働きを持つことが知られている（非特許文献２，３，４）。
　３’ＳＬはヒトの母乳中には含まれるが、牛乳など他の哺乳類の乳汁中にはわずかしか含まれていない（非特許文献５）。乳児用ミルクは主に牛乳などの原料に必要な栄養素を加えて加工して製造しているため、３’ＳＬを含むヒトミルクオリゴ糖の含有量は母乳よりも低く、乳児用ミルクに母乳と同じような効果を与えるためには乳児用ミルクへの３’ＳＬの添加が望まれていた（非特許文献６）。
　非特許文献６には、抽出法、化学合成法、組換え微生物による発酵法といった、様々なヒトミルクオリゴ糖の取得方法が開示されている。組換え微生物による発酵法はこれらの中で最も経済合理性が高い方法と考えられる。
　３’ＳＬの組換え微生物による製造方法は、非特許文献７や特許文献１に開示されるように、細胞内にてグリセロールやグルコースなどの安価炭素源からシチジン－５’－一リン酸（以下、「ＣＭＰ」とも称する。）－シアル酸を合成させ、α２，３－シアリルトランスフェラーゼにより、外部から添加したラクトースにＣＭＰ－シアル酸のシアル酸残基を転移させ、３’ＳＬを製造する方法が一般的である。
国際公開第２０１５／０３７６９８号
Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ　Ｒｅｖｉｅｗｓ　７５　（２０１７）　９２０－９３３ Ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ　１１４　（２０２１）　５８８－５９７ Ｎｕｔｒｉｅｎｔｓ　１３　（２０２１）　４１９１ Ｎａｔｕｒｅ　Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ　２　（２０２０）　６７８－６８７ Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｄａｉｒｙ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　８６　（２００３）　５２－５９ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ　Ｒｅｖｉｅｗ　７４　（２０１６）　６３５－６４４ Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　１３４　（２００８）　２６１－２６５ Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２７１　（１９９６）　２８２７１－２８２７６ Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２７５　（２０００）　３８９６－３９０６ Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅ　５６　（２００９）　７７－８２ Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２８２　（２００７）　２９２７４－２９８０２ Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｓｏｃｉｅｔｙ　１２７　（２００５）　１７６１８－１７６１９ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　３９　（２００１）　３４１－３５０ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　３０　（２００８）　６７１－６７６ Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２８６　（２０１１）　３７２３７－３７２４８
　この組換え微生物による製法では、ラクトースにシアル酸残基を転移するα２，３－シアリルトランスフェラーゼの活性が３’ＳＬの生産性に重要であると考えられる。様々な種類のα２，３－シアリルトランスフェラーゼが既に微生物からクローニングされており、大腸菌等でα２，３－シアリルトランスフェラーゼを発現させることに成功している（非特許文献８，９，１０，１１，１２，１３）。そして、従来よりも３’ＳＬの生産性を向上させるために、高活性かつ効率的にラクトースへシアル酸残基を転移できる、α２，３－シアリルトランスフェラーゼが求められている。
　シアリルトランスフェラーゼは一般的に、アミノ酸配列のＮ末端に活性とは関連のない領域が存在していることが知られている。非特許文献１４及び１５には、外来のシアリルトランスフェラーゼを大腸菌で発現させる場合に、当該アミノ酸配列のＮ末端を切断し発現させる方法が開示されている。この方法により、シアリルトランスフェラーゼの発現や活性が変化することが知られているものの、具体的にどの領域を切断した場合に有用な活性が得られるかは明らかになっていない。
　したがって、本発明は、特定のアミノ酸残基が欠失された蛋白質の活性が増強され、かつ親株に比べて３’ＳＬの生産性が向上した微生物の提供を目的とする。また、該微生物を用いた３’ＳＬの製造方法の提供を目的とする。
　本発明者らは、鋭意検討を行った結果、配列番号２で表されるアミノ酸配列のＮ末端側２０～３７アミノ酸残基が欠失されたアミノ酸配列からなる蛋白質の活性が増強された微生物は、親株に比べて３’ＳＬの生産性が向上することを見出し、本発明を完成させた。
　すなわち、本発明は以下の通りである。
＜１＞　配列番号２で表されるアミノ酸配列のＮ末端側２０～３７アミノ酸残基が欠失されたアミノ酸配列からなる蛋白質の活性が増強され、かつ、親株に比べて３’－シアリルラクトースの生産性が向上した微生物。
＜２＞　前記配列番号２で表されるアミノ酸配列のＮ末端側２０～３７アミノ酸残基が欠失されたアミノ酸配列からなる蛋白質が、下記［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質である、上記＜１＞に記載の微生物。
［１］配列番号４、６、８又は１０で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質。
［２］配列番号４、６、８又は１０で表されるアミノ酸配列において、１～２０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつα２，３－シアリルトランスフェラーゼ活性を有する変異蛋白質。
［３］配列番号４、６、８又は１０で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつα２，３－シアリルトランスフェラーゼ活性を有する相同蛋白質。
＜３＞　上記＜１＞又は＜２＞に記載の微生物を調製すること、および当該微生物を用いて培養物中に３’－シアリルラクトースを生成することを含む、３’－シアリルラクトースの製造方法。
　本発明の一態様に係る微生物は、特定のアミノ酸残基を欠失した蛋白質の活性が増強されていることで、３’ＳＬの生産性を向上し得る。本発明の一態様の製造方法によれば、前記微生物を培養して得た培養物を用いることで、３’ＳＬを製造できる。
図１は、３’ＳＬ生合成経路の一例を示す図である。
１．３’ＳＬの生産性が向上した微生物
　本発明の一態様の微生物としては、下記［Ａ］に記載の蛋白質の活性が増強され、かつ、親株に比べて３’ＳＬの生産性が向上した微生物が挙げられる。
［Ａ］配列番号２で表されるアミノ酸配列のＮ末端側２０～３７アミノ酸残基が欠失されたアミノ酸配列からなる蛋白質。
　＜生産性＞
本明細書において、生産性とは、微生物が生産した対象物のオリゴ糖
を当該微生物の培養物中に蓄積させる能力のことをいう。微生物によるオリゴ糖の生産性は、後述の分析装置等を用いて当該微生物の培養物中のオリゴ糖を検出することにより確認できる。
　配列番号２で表されるアミノ酸配列のＮ末端側２０～３７アミノ酸残基が欠失されたアミノ酸配列からなる蛋白質は、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質よりも、高いα２，３－シアリルトランスフェラーゼ活性を有していることが好ましい。配列番号２で表されるアミノ酸配列のＮ末端側２０～３７アミノ酸残基が欠失されたアミノ酸配列からなる蛋白質とは、配列番号２で表されるアミノ酸配列のＮ末端側２０～３７アミノ酸残基が欠失されたアミノ酸配列のみからなる蛋白質を意味する。
　α２，３－シアリルトランスフェラーゼ活性とは、ＣＭＰ－シアル酸及び受容体糖質を基質として、該糖質末端のガラクトースにα２，３結合でシアル酸残基を転移させ、シアル酸含有糖質を得る活性をいう。
　ＣＭＰ－シアル酸としては、例えばＣＭＰ－Ｎ－アセチルノイラミン酸（以下、「ＣＭＰ－ＮｅｕＡｃ」とも称する。）が挙げられる。
　基質として用いられる受容体糖質としては、シアリルラクトースの基質になるものであれば、オリゴ糖、多糖、ならびに糖蛋白質および糖脂質等の複合糖質などいずれでもよい。
　シアリルラクトースの基質となるオリゴ糖または多糖としては、非還元末端にガラクトースを有するオリゴ糖または多糖、あるいは非還元末端にＮ－アセチルノイラミン酸（以下、「ＮｅｕＡｃ」とも称する。）を有するオリゴ糖または多糖をあげることができ、好ましくは非還元末端にラクトース、グロボトリオース、Ｎ－アセチルラクトサミン、ラクト‐Ｎ‐テトラオース、ラクト－Ｎ－ネオテトラオース、ルイスａおよびルイスＸからなる群より選ばれる構造を有するオリゴ糖、またはより好ましくはラクトースをあげることができる。
　複合糖質としては、上記したオリゴ糖及び多糖に蛋白質又は脂質等が結合した複合糖質をあげることができる。
　シアル酸含有糖質としては、ＮｅｕＡｃ含有糖質が好ましい。ＮｅｕＡｃ含有糖質としては、上記した受容体糖質にＮｅｕＡｃが付加した糖質、好ましくは、非還元末端にＮｅｕＡｃα２－３Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃを有するオリゴ糖を含む糖質をあげることができ、より好ましくは３’ＳＬである。
　３’ＳＬ生合成経路の一例を図１に示す。微生物のα２，３－シアリルトランスフェラーゼ活性が増強されていることにより、ＣＭＰ－ＮｅｕＡｃ及びラクトースを基質として、ラクトースのガラクトース残基へのＮｅｕＡｃ残基のα２，３結合が促進され、３’ＳＬの生産性が向上すると推測される。
　上記［Ａ］に記載の配列番号２で表されるアミノ酸配列のＮ末端側２０～３７アミノ酸残基が欠失されたアミノ酸配列からなる蛋白質は、下記［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質であってもよい。
［１］配列番号４、６、８又は１０で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質。
［２］配列番号４、６、８又は１０で表されるアミノ酸配列において、１～２０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつα２，３－シアリルトランスフェラーゼ活性を有する変異蛋白質。
［３］配列番号４、６、８又は１０で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつα２，３－シアリルトランスフェラーゼ活性を有する相同蛋白質。
　変異蛋白質とは、元となる蛋白質中のアミノ酸残基を人為的に欠失若しくは置換、または該蛋白質中にアミノ酸残基を挿入若しくは付加して得られる蛋白質をいう。
　上記［２］の変異蛋白質において、アミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたとは、同一配列中の任意の位置において、１～２０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されていてもよい。欠失、置換、挿入または付加されるアミノ酸の数は１～２０個、好ましくは１～１０個、さらに好ましくは１～８個、最も好ましくは１～５個である。
　欠失、置換、挿入または付加されるアミノ酸は天然型と非天然型とを問わない。天然型アミノ酸としては、Ｌ－アラニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－グルタミン、Ｌ－グルタミン酸、グリシン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－リジン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－プロリン、Ｌ－セリン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－チロシン、Ｌ－バリン、Ｌ－システインなどが挙げられる。
　以下に、相互に置換可能なアミノ酸の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸は相互に置換可能である。
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２－アミノブタン酸、メチオニン、Ｏ－メチルセリン、ｔ－ブチルグリシン、ｔ－ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２－アミノアジピン酸、２－アミノスベリン酸
Ｃ群：アスパラギン、グルタミン
Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、２，４－ジアミノブタン酸、２，３－ジアミノプロピオン酸
Ｅ群：プロリン、３－ヒドロキシプロリン、４－ヒドロキシプロリン
Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン
Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン
　本明細書において、相同蛋白質とは、元となる蛋白質と構造および機能が類似することにより、その蛋白質をコードする遺伝子が進化上の起源を元の蛋白質をコードする遺伝子と同一にすると考えられる蛋白質であって、自然界に存在する生物が有する蛋白質をいう。
　相同蛋白質としては、例えば、対象となる蛋白質が有するアミノ酸配列と好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列が挙げられる。
　アミノ酸配列および塩基配列の同一性は、Ｋａｒｌｉｎ　ａｎｄ　ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ［Ｐｒｏ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　９０，　５８７３（１９９３）］やＦＡＳＴＡ［Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．，　１８３，　６３　（１９９０）］を用いて決定できる。このアルゴリズムＢＬＡＳＴに基づいて、ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸとよばれるプログラムが開発されている［Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．，　２１５，　４０３（１９９０）］。ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＮによって塩基配列を解析する場合には、パラメータは例えばＳｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＸによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメータは例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ　ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である。
＜親株＞
　本明細書において、親株とは、遺伝子改変および形質転換等の対象となる元株のことをいう。遺伝子導入による形質転換の対象となる元株は宿主株ともいう。
　本明細書において、親株としては、好ましくは原核生物または酵母菌株を、より好ましくは、エシェリヒア属、セラチア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、若しくはシュードモナス属等に属する原核生物、またはサッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス属、クルイベロミセス属、トリコスポロン属、シワニオミセス属、ピチア属、若しくはキャンディダ属等に属する酵母菌株を、最も好ましくは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＢＷ２５１１３（国立遺伝学研究所より入手され得る）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＭＧ１６５５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＸＬ１－Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＸＬ２－Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＤＨ１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＭＣ１０００、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＫＹ３２７６、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｗ１４８５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｎｏ．４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｗ３１１０、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＮＹ４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＢＬ２１　ｃｏｄｏｎ　ｐｌｕｓ（ストラタジーン社製）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｗ３１１０Ｓ３ＧＫ（ＮＢＲＣ１１４６５７）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＡＴＣＣ９６３７、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｆｉｃａｒｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｆｏｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ　ＡＴＣＣ１４０６８、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ　ＡＴＣＣ１４０６６、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　ＡＴＣＣ１３０３２、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　ＡＴＣＣ１４０６７、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　ＡＴＣＣ１３８６９、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ　ＡＴＣＣ１３８７０、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ　ＡＴＣＣ１５３５４、若しくはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．　Ｄ－０１１０等の原核生物、またはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　ｌａｃｔｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ　ｐｕｌｌｕｌａｎｓ、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ　ａｌｌｕｖｉｕｓ、Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ、若しくはＣａｎｄｉｄａ　ｕｔｉｌｉｓ等の酵母菌株を挙げることができる。
　親株は、野生株であってもよいし、野生株が３’ＳＬ生産の基質、例えばＣＭＰ－ＮｅｕＡｃ及び／又はラクトースを生成する能力を有しない場合は、人工的にＣＭＰ－ＮｅｕＡｃ及び／又はラクトース等を生成する能力を付与した育種株であってもよい。
　微生物がＣＭＰ－ＮｅｕＡｃ及び／又はラクトースを生産していることは、例えば、微生物を培地に培養し、培養物中に蓄積したＣＭＰ－ＮｅｕＡｃ及び／又はラクトースを後述のＨＰＬＣなど公知の手法を用いて検出することにより確認できる。
　ＣＭＰ－ＮｅｕＡｃ及び／又はラクトースを生産する能力を人工的に付与又は強化する方法としては、例えば、下記（ａ）～（ｄ）などの公知の方法が挙げられ、これらの方法は単独または組み合わせて使用できる。
（ａ）ＣＭＰ－ＮｅｕＡｃ及び／又はラクトースを生成する生合成経路に関与する酵素の少なくとも１つの発現を強化する方法
（ｂ）ＣＭＰ－ＮｅｕＡｃ及び／又はラクトースを生成する生合成経路に関与する酵素遺伝子の少なくとも１つのコピー数を増加させる方法
（ｃ）ＣＭＰ－ＮｅｕＡｃ及び／又はラクトースを生成する生合成経路を制御する機構の少なくとも１つを緩和又は解除する方法
（ｄ）ＣＭＰ－ＮｅｕＡｃ及び／又はラクトースを生成する生合成経路から該目的物質以外の代謝産物へ分岐する代謝経路の少なくとも１つを弱化又は遮断する方法
＜＜親株において強化されていることが好ましい活性＞＞
　親株は、ウリジン二リン酸Ｎ－アセチルグルコサミン（以下、「ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ」とも称する。）エピメラーゼ活性、ＮｅｕＡｃシンターゼ活性、ピルビン酸カルボキシラーゼ活性、Ｌ－グルタミン－Ｄ－フルクトース６リン酸アミノトランスフェラーゼ活性、ＮａｎＴ活性、ＣＭＰ－ＮｅｕＡｃシンターゼ活性、ラクトースパーミアーゼ活性、グルコサミンアセチルトランスフェラーゼ活性、Ｎ－アセチルマンノサミンエピメラーゼ活性から選ばれる少なくとも１の活性を有していることが好ましく、その活性が強化されていることがより好ましい。このうち、ＣＭＰ－ＮｅｕＡｃシンターゼの活性を有していることが好ましく、その活性が強化されていることがさらに好ましい。
　ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃエピメラーゼは、ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃからＮ－アセチルマンノサミン（以下、「ＭａｎＮＡｃ」とも称する。）を生成する反応を担う酵素であり、ｎｅｕＣ遺伝子にコードされる。ｎｅｕＣ遺伝子は、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｕｍ　ＮＢＲＣ１００２５０株に由来することが好ましい。
　ＮｅｕＡｃシンターゼは、ＭａｎＮＡｃおよびホスホエノールピルビン酸（以下、「ＰＥＰ」とも称する。）を基質としてＮｅｕＡｃを生成する反応を担う酵素である。ＮｅｕＡｃシンターゼをコードするＤＮＡとしては、好ましくは細菌等の原核生物または酵母由来の、特に好ましくは原核生物由来の、特に好ましくは、カンピロバクター　ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｊｅｊｕｎｉ）ＡＴＣＣ　４３４３８株由来のＣｊｎｅｕＢをコードするＤＮＡまたはロドバクター・カプスラタス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ　ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）由来のｎｅｕＢをコードするＤＮＡが挙げられる。
　ピルビン酸カルボキシラーゼは、ピルビン酸をカルボキシル化してオキサロ酢酸を生成する反応を担う酵素であり、ｐｙｃ遺伝子にコードされる。ＰＥＰはオキサロ酢酸の脱炭酸によって生じるため、Ｐｙｃによって、ＰＥＰの供給が強化される。ｐｙｃ遺伝子は、Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｍｅｌｉｌｏｔｉ又はＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍに由来することが好ましい。
　Ｌ－グルタミン－Ｄ－フルクトース６リン酸アミノトランスフェラーゼは、フルクトース６リン酸からグルコサミン６リン酸を生成する反応を担う酵素であり、ｇｌｍＳ遺伝子にコードされる。ｇｌｍＳ遺伝子は、大腸菌に由来することが好ましい。グルコサミン６リン酸はＮｅｕＡｃ合成経路における中間体であるため、ＧｌｍｓによってＮｅｕＡｃの供給が強化される。
　ＮａｎＴはＮｅｕＡｃトランスポーターで、外に排出されたＮｅｕＡｃを菌体内へ取り込むことで、ＮｅｕＡｃの再利用を可能とする。ＮｅｕＡｃトランスポーターをコードするｎａｎＴ遺伝子は大腸菌に由来することが好ましい。
　ＣＭＰ－ＮｅｕＡｃシンターゼは、シチジン－５’－三リン酸（以下、「ＣＴＰ」とも称する。）及びＮｅｕＡｃを基質として、ＣＭＰ－ＮｅｕＡｃを生成する反応を担う酵素である。ＣＭＰ－ＮｅｕＡｃシンターゼをコードするＤＮＡは、好ましくは細菌等の原核生物または酵母由来の、特に好ましくは原核生物由来の、最も好ましくは、パスツレラ・マルトシダ　ＰＭ７０株由来のｎｅｕＡ遺伝子が挙げられる。
　ラクトースパーミアーゼは、ラクトースを細胞内に取り込む膜蛋白質であり、ｌａｃＹ遺伝子にコードされる。ｌａｃＹ遺伝子は、大腸菌に由来することが好ましい。ラクトースを外部から添加する場合、ラクトースパーミアーゼがラクトースの菌体内への取り込みを促進する。
　グルコサミンアセチルトランスフェラーゼは、グルコサミン６リン酸からＧｌｃＮＡｃを生成する反応を担う酵素である。出芽酵母由来のグルコサミンアセチルトランスフェラーゼはＧＮＡ１遺伝子にコードされる。
　Ｎ－アセチルマンノサミンエピメラーゼは、ＧｌｃＮＡｃからＭａｎＮＡｃへのエピメリ化に関与している。シアノバクテリアＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ　ｓｐ．ＰＣＣ６８０３由来のＮ－アセチルマンノサミンエピメラーゼは、ｓｌｒ１９７５遺伝子にコードされる。
　従って、本発明における１実施形態では、好ましくはｎｅｕＣ遺伝子（配列番号１９）、ｎｅｕＢ遺伝子（配列番号１８またはＡＤＥ８６６８７．１）、ｐｙｃ遺伝子（ＷＰ＿０１０９７０５３８．１またはＷＰ＿２０８４００７７６．１）、ｇｌｍＳ遺伝子（アクセッション番号ＢＡＥ７７５５９．１）、ｎａｎＴ遺伝子（配列番号１５またはＢＡＥ７７２６７．１）、ｎｅｕＡ遺伝子（配列番号２０）、ｌａｃＹ遺伝子（アクセッション番号ＢＡＥ７６１２５．１）、ＧＮＡ１遺伝子（ＮＰ＿１１６６３７．１）、ｓｌｒ１９７５遺伝子（ＢＡＫ５０３８３．１）から選ばれる少なくとも１の塩基配列を含む、遺伝的に改変された微生物を親株とすることが好ましい。本発明の１実施形態において、前記遺伝的に改変された微生物は、３’ＳＬの生産性が、遺伝的に改変されていない親株に比較して向上していることが好ましい。
　ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃエピメラーゼ活性、ＮｅｕＡｃシンターゼ活性、ピルビン酸カルボキシラーゼ活性、Ｌ－グルタミン－Ｄ－フルクトース６リン酸アミノトランスフェラーゼ活性、ＮａｎＴ活性、ＣＭＰ－ＮｅｕＡｃシンターゼ活性、ラクトースパーミアーゼ活性、グルコサミンアセチルトランスフェラーゼ活性、Ｎ－アセチルマンノサミンエピメラーゼ活性から選ばれる少なくとも１の活性を有している、またはその活性が強化されている大腸菌を製造する方法としては公知の方法を用いればよい。具体的には例えば、各種遺伝子操作による方法（Ｓｙｓｔ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　Ｂｉｏｍａｎｕｆａｃｔ，２０２１，１，２９１）等が挙げられる。
＜＜親株において低下又は欠失されていることが好ましい活性＞＞
　また、親株では、Ｎ－アセチルグルコサミン（以下、「ＧｌｃＮＡｃ」とも称する。）トランスポーター活性、Ｎ－アセチルマンノサミンキナーゼ活性、Ｎ－アセチルグルコサミン－６－リン酸－２－エピメラーゼ活性、ＲＮａｓｅ　ａｄａｐｔｅｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ活性、ＮｅｕＡｃの資化に関与する遺伝子群の転写を負に制御する転写制御因子活性、ＮｅｕＡｃリアーゼ活性、β－ガラクトシダーゼ活性およびガラクトシドアセチルトランスフェラーゼ活性から選ばれる少なくとも１の活性が低下又は欠失していることが好ましく、このうちβ－ガラクトシダーゼおよびＮｅｕＡｃリアーゼの活性が低下又は欠失していることが特に好ましい。
　ＧｌｃＮＡｃトランスポーターは、ＧｌｃＮＡｃの菌体内への取り込みや資化にかかわり、ｎａｇＥ遺伝子およびｎａｇＢ遺伝子にコードされている。ＧｌｃＮＡｃトランスポーター活性が低下又は欠失していることで、ＭａｎＮＡｃの基質であるＧｌｃＮＡｃの生成を促進できる。
　Ｎ－アセチルマンノサミンキナーゼは、ＭａｎＮＡｃからＮ‐アセチルマンノサミン６リン酸（以下、「ＭａｎＮＡｃ－６Ｐ」とも称する。）を生成する反応を担う酵素であり、ｎａｎＫ遺伝子にコードされる。ＭａｎＮＡｃからＮｅｕＡｃ以外の物質の生成の抑制により、ＮｅｕＡｃの供給を促進できる。
　Ｎ－アセチルグルコサミン－６－リン酸－２－エピメラーゼは、ＭａｎＮＡｃ－６ＰをＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン６－リン酸（以下、「ＧｌｃＮＡｃ－６Ｐ」とも称する。）に転換する反応を担う酵素であり、ｎａｎＥ遺伝子にコードされる。
　ＲＮａｓｅ　ａｄａｐｔｅｒ　ｐｒｏｔｅｉｎは、ＮｅｕＡｃ生合成に関わる酵素をコードする遺伝子の活性を負に制御する転写因子であり、ｙｈｂＪ遺伝子にコードされる。ｙｈｂＪ遺伝子は、ｒａｐＺ遺伝子ともいう。ＹｈｂＪは、ＮｅｕＡｃ生合成に関わるＬ－グルタミン－Ｄ－フルクトース６リン酸アミノトランスフェラーゼをコードするｇｌｍＳ遺伝子の活性を負に制御する転写制御因子である。
　ＮｅｕＡｃの資化に関与する遺伝子群の転写を負に制御する転写制御因子は、シアル酸の合成および代謝にかかわる転写制御因子であり、ｎａｎＲ遺伝子にコードされる。
　ＮｅｕＡｃリアーゼはＮｅｕＡｃをＭａｎＮＡｃとピルビン酸に分解する酵素であり、ｎａｎＡ遺伝子にコードされる。
　β－ガラクトシダーゼはラクトースを加水分解する酵素であり、ｌａｃＺ遺伝子にコードされる。
　ガラクトシドアセチルトランスフェラーゼはラクトースやそのアナログをアセチル化する活性を有する酵素であり、ｌａｃＡ遺伝子にコードされる。
　従って、本発明の１実施形態では、より好ましくはｎａｇＥ遺伝子、ｎａｇＢ遺伝子、ｎａｎＫ遺伝子、ｎａｎＥ遺伝子、ｙｈｂＪ遺伝子、ｎａｎＲ遺伝子、ｎａｎＡ遺伝子、ｌａｃＺ遺伝子およびｌａｃＡ遺伝子から選ばれる少なくとも１の塩基配列を含まない、遺伝的に改変された微生物を親株とすることが好ましい。本発明の１実施形態において、前記遺伝的に改変された微生物は、３’ＳＬの生産性が、遺伝的に改変されていない親株に比較して向上していることが好ましい。
　ＧｌｃＮＡｃトランスポーター活性、Ｎ－アセチルマンノサミンキナーゼ活性、Ｎ－アセチルグルコサミン－６－リン酸－２－エピメラーゼ活性、ＲＮａｓｅ　ａｄａｐｔｅｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ活性、ＮｅｕＡｃの資化に関与する遺伝子群の転写を負に制御する転写制御因子活性、ＮｅｕＡｃリアーゼ活性、β－ガラクトシダーゼ活性およびガラクトシドアセチルトランスフェラーゼ活性から選ばれる少なくとも１の活性が低下又は欠失した大腸菌を製造する方法としては公知の方法を用いればよい。具体的には例えば、各種遺伝子操作による方法（Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２０１７，４１：２３－３８）等が挙げられる。
＜特定の蛋白質の活性が増強した微生物の取得＞
　親株の微生物に比べ前記［Ａ］および［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質の活性が増強した微生物としては、該蛋白質をコードするＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡで親株の微生物を形質転換することにより得られる、親株よりも該遺伝子のコピー数が増大した微生物が挙げられる。本明細書において、該遺伝子のコピー数の増大とは、該遺伝子を染色体上またはプラスミド上に保有しない親株において新たに該遺伝子を保有させることであっても良いし、該遺伝子を染色体上またはプラスミド上に保有する株において追加的に該遺伝子を保有させることであっても良い。
　前記［Ａ］および［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質をコードするＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡで親株の微生物を形質転換することにより得られる、親株よりも該遺伝子のコピー数が増大した微生物としては、前記［Ａ］および［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質をコードするＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡで親株の微生物を形質転換することにより、染色体ＤＮＡ上において前記遺伝子のコピー数が増大した微生物、およびプラスミドＤＮＡとして染色体ＤＮＡ外に前記遺伝子を保有させた微生物を挙げることができる。
　前記［Ａ］および［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質をコードするＤＮＡとしては、前記［Ａ］および［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質の活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡであればいずれでもよいが、具体的には以下の［４］～［７］からなる群より選ばれる１のＤＮＡが挙げられる。
［４］前記［Ａ］および［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質をコードするＤＮＡ
［５］配列番号３、５、７または９で表される塩基配列からなるＤＮＡ
［６］配列番号３、５、７または９で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα２，３－シアリルトランスフェラーゼ活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡ
［７］配列番号３、５、７または９で表される塩基配列と９５％以上、好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、α２，３－シアリルトランスフェラーゼ活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡ
　上記［６］において「ハイブリダイズする」とは、特定の塩基配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡの一部にＤＮＡがハイブリダイズすることである。したがって、該特定の塩基配列を有するＤＮＡまたはその一部は、ノーザンまたはサザンブロット解析のプローブとして用いることができ、またＰＣＲ解析のオリゴヌクレオチドプライマーとして使用できるＤＮＡである。
　プローブとして用いられるＤＮＡとしては、少なくとも１００塩基以上、好ましくは２００塩基以上、より好ましくは５００塩基以上のＤＮＡを挙げることができる。プライマーとして用いられるＤＮＡとしては、少なくとも１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上のＤＮＡを上げることができる。
　ＤＮＡのハイブリダイゼーション実験の方法はよく知られており、例えば当業者であれば本明細書に従い、ハイブリダイゼーションの条件を決定できる。該ハイブリダイゼーションの条件は、モレキュラー・クローニング第４版（２０１２年）、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　Ｇｅｎｅｒａｌ　ａｎｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，　ＡＳＭ　Ｐｒｅｓｓ（１９９４）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ｍａｎｕａｌ，　Ａｃａｄｅｍｉｃ　ｐｒｅｓｓ（１９９６）に記載の他、多数の他の標準的な教科書に従って行うことができる。
　また、市販のハイブリダイゼーションキットに付属した説明書に従うことによっても、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを取得できる。市販のハイブリダイゼーションキットとしては、例えばランダムプライム法によりプローブを作製し、ストリンジェントな条件でハイブリダイゼーションを行うランダムプライムドＤＮＡラベリングキット（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）などを挙げることができる。
　上記のストリンジェントな条件とは、ＤＮＡを固定化したフィルターとプローブＤＮＡとを５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（７５０ｍｍｏｌ／ｌの塩化ナトリウム、７５ｍｍｏｌ／ｌのクエン酸ナトリウム）、５０ｍｍｏｌ／ｌのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％の硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｌの変性させたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で４２℃にて一晩、インキュベートした後、例えば約６５℃の０．２×ＳＳＣ溶液中で該フィルターを洗浄する条件を挙げることができる。
　上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、例えばＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡ等を用いて上記したパラメータ等に基づいて計算したときに、配列番号３、５、７または９で表される塩基配列からなるＤＮＡと少なくとも９５％以上、好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するＤＮＡを挙げることができる。
　上記［１］の蛋白質をコードするＤＮＡ、および上記［５］のＤＮＡは、例えば、配列番号３、５、７または９で表される塩基配列に基づき設計できるプローブＤＮＡを用いた、微生物、好ましくは、エシェリヒア属に属する微生物、より好ましくは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＢＷ２５１１３株の染色体ＤＮＡライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーション法、または該塩基配列に基づき設計できるプライマーＤＮＡを用いた、上記微生物の染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ［ＰＣＲ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　（１９９０）］により取得できる。
　上記［２］の変異蛋白質をコードするＤＮＡは、例えば、配列番号３、５、７または９で表される塩基配列からなるＤＮＡを鋳型としてエラープローンＰＣＲ等に供することにより取得できる。
　または、目的の変異（欠失、置換、挿入または付加）が導入されるように設計した塩基配列をそれぞれの５’端に持つ１組のＰＣＲプライマーを用いたＰＣＲ［Ｇｅｎｅ，　７７，　５１（１９８９）］によっても、上記［２］の変異蛋白質をコードするＤＮＡを取得できる。
　また、市販の部分特異的変異導入キットに付属した説明書に従うことによっても、該ＤＮＡを取得できる。市販の部分特異的変異導入キットとしては、例えば、目的の変異を導入したい位置に変異（欠失、置換、挿入又は付加）を導入できるＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｂａｓａｌ　Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）が挙げられる。
　すなわち、まず、目的の変異（欠失、置換、挿入又は付加）が導入されるように設計した塩基配列を有するプラスミドを鋳型に、５’側が１５塩基オーバーラップした一対の変異導入用プライマーを設計する。このとき、オーバーラップ部分には目的の変異を含む。次に、該変異導入用プライマーを用いて、目的の変異を導入したい塩基配列を有するプラスミドを鋳型にＰＣＲを行う。これにより得られた増幅断片を大腸菌に形質転換すると、目的の変異が導入された塩基配列を有するプラスミドが得られる。
　上記［３］の相同蛋白質をコードするＤＮＡ、並びに上記［６］および［７］のＤＮＡは、例えば、各種の遺伝子配列データベースに対して配列番号３、５、７または９で表される塩基配列と９５％以上、好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列を検索し、または、各種の蛋白質配列データベースに対して配列番号４、６、８又は１０で表されるアミノ酸配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を検索し、該検索によって得られた塩基配列またはアミノ酸配列に基づいて設計できるプローブＤＮＡまたはプライマーＤＮＡ、および当該ＤＮＡを有する微生物を用いて、上記のＤＮＡを取得する方法と同様の方法によって取得できる。
　取得した上記の［４］～［７］のいずれか１に記載のＤＮＡは、そのまま、または適当な制限酵素などで切断し、常法によりベクターに組み込み、得られた組換え体ＤＮＡを宿主細胞に導入した後、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばジデオキシ法［Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．，　ＵＳＡ，　７４，　５４６３　（１９７７）］または３７００　ＤＮＡアナライザー（アプライドバイオシステムズ社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、該ＤＮＡの塩基配列を決定できる。
　前記、ＤＮＡの塩基配列を決定する際に用いることができる宿主細胞としては、前記ベクターを導入し増殖可能なものであれば何でもよいが、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＤＨ５α、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＨＳＴ０８Ｐｒｅｍｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＨＳＴ０２、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＨＳＴ０４　ｄａｍ－／ｄｃｍ－、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉＣＪ２３６、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＢＭＨ７１－１８　ｍｕｔＳ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＭＶ１１８４、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＴＨ２（いずれもタカラバイオ社製）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＸＬ１－Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＸＬ２－Ｂｌｕｅ（いずれもアジレント・テクノロジー社製）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＤＨ１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＭＣ１０００、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｗ１４８５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｗ３１１０、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＭＰ３４７、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＮＭ５２２等が挙げられる。
　上記のベクターとしては、例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ　ＫＳ（＋）、ｐＰＣＲ－Ｓｃｒｉｐｔ　Ａｍｐ　ＳＫ（＋）（いずれもアジレント・テクノロジー社製）、ｐＴ７Ｂｌｕｅ（メルクミリポア社製）、ｐＣＲＩＩ（サーモフィッシャー・サイエンティフィック社製）、ｐＣＲ－ＴＲＡＰ（ジーンハンター社製）、及びｐＤＩＲＥＣＴ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，１８，６０６９，１９９０）等が挙げられる。
　組換え体ＤＮＡの導入方法としては、宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法［Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，　６９，　２１１０　（１９７２）］、プロトプラスト法（日本国特開昭６３－２４８３９４号公報）、エレクトロポレーション法［Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，　１６，　６１２７　（１９８８）］等が挙げられる。
　塩基配列を決定した結果、取得されたＤＮＡが部分長であった場合は、該部分長ＤＮＡをプローブに用いた、染色体ＤＮＡライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーション法等により、全長ＤＮＡを取得できる。
　更に、決定されたＤＮＡの塩基配列に基づいて、日本テクノサービス社製ＮＴＳ　ＭシリーズＤＮＡ合成装置等を用いて化学合成することにより目的とするＤＮＡを調製することもできる。
　前記［Ａ］および［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質をコードするＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡとは、該ＤＮＡが、親株において自律複製可能または染色体中への組込が可能で、該ＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有している発現ベクターに組み込まれている組換え体ＤＮＡをいう。
　組換え体ＤＮＡが、染色体への組込が可能な組換え体ＤＮＡである場合は、プロモーターを含有していなくてもよい。
　前記［Ａ］および［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質をコードするＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡで親株の微生物を形質転換することにより得られる、親株よりも該遺伝子のコピー数が増大した微生物は、以下の方法で取得できる。
　上記の方法で得られる前記［Ａ］および［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質をコードするＤＮＡをもとにして、必要に応じて、該蛋白質をコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製する。また、該蛋白質をコードする部分の塩基配列を、宿主細胞での発現に最適なコドンとなるように、塩基を置換することにより、生産性が向上した形質転換体を取得できる。
　前記ＤＮＡ断片を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換え体ＤＮＡを作製する。該組換え体ＤＮＡで親株を形質転換することにより、親株よりも該蛋白質をコードする遺伝子のコピー数が増大した微生物を取得できる。
　細菌等の原核生物を親株として用いる場合は、該組換え体ＤＮＡは、プロモーター、リボソーム結合配列、上記の［４］～［７］のいずれか１に記載のＤＮＡ、および転写終結配列により構成された組換え体ＤＮＡであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
　リボソーム結合配列であるシャイン－ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ－Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６～１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。該組換え体ＤＮＡにおいては、該ＤＮＡの発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
　また、α２，３－シアリルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードする部分の塩基配列を宿主の発現に最適なコドンとなるように塩基を置換することにより、α２，３－シアリルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質の発現量を向上させることができる。α２，３－シアリルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質としては、前記［Ａ］および［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質が挙げられる。本発明の製造法に用いられる親株におけるコドン使用頻度の情報は、公共のデータベースを通じて入手できる。
　発現ベクターとしては、目的ＤＮＡを宿主に導入し、増殖、発現させるための適当な核酸分子であれば特に限定されず、プラスミドのみならず、例えば、人工染色体、トランスポゾンを用いたベクター、コスミドを用いてもよい。
　親株にエシェリヒア属に属する微生物を用いる場合は、発現ベクターとしては、例えば、ｐＣｏｌｄＩ、ｐＳＴＶ２８、ｐＳＴＶ２９、ｐＵＣ１１８（いずれもタカラバイオ社製）、ｐＭＷ１１９（ニッポンジーン社製）、ｐＥＴ２１ａ、ｐＣＯＬＡＤｕｅｔ－１、ｐＣＤＦＤｕｅｔ－１、ｐＣＤＦ－１ｂ、ｐＲＳＦ－１ｂ（いずれもメルクミリポア社製）、ｐＭＡＬ－ｃ５ｘ（ニューイングランドバイオラブス社製）、ｐＧＥＸ－４Ｔ－１、ｐＴｒｃ９９Ａ（いずれもジーイーヘルスケアバイオサイエンス社製）、ｐＴｒｃＨｉｓ、ｐＳＥ２８０（いずれもサーモフィッシャー・サイエンティフィック社製）、ｐＧＥＭＥＸ－１（プロメガ社製）、ｐＱＥ－３０、ｐＱＥ８０Ｌ（いずれもキアゲン社製）、ｐＥＴ－３、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ　ＳＫ（＋）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ　ＫＳ（－）（いずれもアジレント・テクノロジー社製）、ｐＫＹＰ１０（日本国特開昭５８－１１０６００号公報）、ｐＫＹＰ２００［Ａｇｒｉｃ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　４８，　６６９（１９８４）］、ｐＬＳＡ１［Ａｇｒｉｃ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　５３，　２７７　（１９８９）］、ｐＧＥＬ１［Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．，　ＵＳＡ，　８２，　４３０６　（１９８５）］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ　ＳＫ（＋）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＫＳ（－）（ストラタジーン社製）、ｐＴｒＳ３０［Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭ　ＢＰ－５４０７）より調製］、ｐＴｒＳ３２［Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３２（ＦＥＲＭ　ＢＰ－５４０８）より調製］、ｐＴＫ３１［ＡＰＰＬＩＥＤ　ＡＮＤ　ＥＮＶＩＲＯＮＭＥＮＴＡＬ　ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ、　２００７、　Ｖｏｌ．　７３、Ｎｏ．　２０、ｐ．６３７８－６３８５］、ｐＰＡＣ３１（国際公開第１９９８／１２３４３号）、ｐＵＣ１９［Ｇｅｎｅ，　３３，　１０３　（１９８５）］、ｐＰＡ１（日本国特開昭６３－２３３７９８号公報））ｐＫＤ４６［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９７，６６４０－６６４５（２０００）］等を挙げることができる。
　上記発現ベクターを用いる場合のプロモーターとしては、エシェリヒア属に属する微生物の細胞中で機能するものであればいかなるものでもよいが、例えば、ｔｒｐプロモーターやｉｌｖプロモーター等のアミノ酸生合成に関与する遺伝子のプロモーター、ｕｓｐＡプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、ＰＳＥプロモーター等のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉやファージ等に由来するプロモーターを用いることができる。また、例えば、ｔｒｐプロモーターを２つ直列させたプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、ｌｅｔＩプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーターが挙げられる。
　親株にコリネバクテリウム属に属する微生物を用いる場合は、発現ベクターとしては、例えば、ｐＣＧ１（日本国特開昭５７－１３４５００号公報）、ｐＣＧ２（日本国特開昭５８－３５１９７号公報）、ｐＣＧ４（日本国特開昭５７－１８３７９９号公報）、ｐＣＧ１１（日本国特開昭５７－１３４５００号公報）、ｐＣＧ１１６、ｐＣＥ５４、ｐＣＢ１０１（いずれも日本国特開昭５８－１０５９９９号公報）、ｐＣＥ５１、ｐＣＥ５２、ｐＣＥ５３〔いずれもＭｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，　１９６，　１７５　（１９８４）〕等を挙げることができる。
　上記発現ベクターを用いる場合のプロモーターとしては、コリネバクテリウム属に属する微生物の細胞中で機能するものであればいかなるものでもよいが、例えば、Ｐ５４－６プロモーター［Ａｐｐｌ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，　５３，　６７４－６７９　（２０００）］を用いることができる。
　親株に酵母菌株を用いる場合には、発現ベクターとしては、例えば、ＹＥｐ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）、ＹＣｐ５０（ＡＴＣＣ３７４１９）、ｐＨＳ１９、ｐＨＳ１５等を挙げることができる。
　上記発現ベクターを用いる場合のプロモーターとしては、酵母菌株の細胞中で機能するものであればいかなるものでもよいが、例えば、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ｇａｌ１プロモーター、ｇａｌ１０プロモーター、ヒートショックポリペプチドプロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＣＵＰ１プロモーター等のプロモーターを挙げることができる。
　上記の［４］～［７］のいずれか１に記載のＤＮＡ断片を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、本発明の製造法に用いられる組換え体ＤＮＡを作製できる。
　組換え体ＤＮＡを親株において自律複製可能なプラスミドとして導入させる方法としては、例えば、カルシウムイオンを用いる方法［Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．，　ＵＳＡ，　６９，　２１１０　（１９７２）］、プロトプラスト法（日本国特開昭６３－２４８３９４号公報）およびエレクトロポレーション法［Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，　１６，　６１２７　（１９８８）］等の方法が挙げられる。
　組換え体ＤＮＡを宿主細胞の染色体中に組み込む方法としては、例えば、相同組換え法が挙げられる。相同組換え法としては、例えば、導入したい宿主細胞内では自律複製できない薬剤耐性遺伝子を有するプラスミドＤＮＡと連結して作製できる相同組換え用プラスミドを用いる方法が挙げられる。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉで頻用される相同組換えを利用した方法としては、例えば、ラムダファージの相同組換え系を利用して、組換え体ＤＮＡを導入する方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７，６６４０－６６４５（２０００）］が挙げられる。
　さらに、組換え体ＤＮＡと共に染色体上に組み込まれた枯草菌レバンシュークラーゼによって大腸菌がスクロース感受性となることを利用した選択法や、ストレプトマイシン耐性の変異ｒｐｓＬ遺伝子を有する大腸菌に野生型ｒｐｓＬ遺伝子を組み込むことによって大腸菌がストレプトマイシン感受性となることを利用した選択法［Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５５，１３７（２００５）、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，７１，２９０５（２００７）］等を用いて、宿主細胞の染色体ＤＮＡ上の目的の領域が組換え体ＤＮＡに置換された大腸菌を取得できる。
　該組換え体ＤＮＡが、親株において自律複製可能なプラスミドとして導入されたこと、または親株の染色体中に組み込まれたことは、例えば、微生物が元来、染色体ＤＮＡ上に有する該遺伝子を増幅することはできないが、形質転換により導入された該遺伝子は増幅可能なプライマーセットを用いてＰＣＲにより増幅産物を確認する方法等により確認できる。また、該ＤＮＡの転写量若しくは該ＤＮＡがコードする蛋白質の生産量が増大したことは、該微生物の該遺伝子の転写量をノーザン・ブロッティングにより、または該微生物の該蛋白質の生産量をウェスタン・ブロッティングにより、親株のそれと比較する方法等により確認できる。
　上記の方法で造成した微生物が、親株よりも上記［Ａ］および［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質の活性が増強した微生物であることは、該微生物の培養後、培養液を適宜希釈後に遠心分離し、上清に含まれる３’ＳＬをＨＰＬＣ等で分析することにより、親株のそれと比較することにより確認できる。
　上記した微生物は、親株よりも上記［Ａ］および［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質の活性が増強していることにより、ＣＭＰ－シアル酸から、受容体糖質末端のガラクトースにα２，３結合でシアル酸残基の転移が促進され、３’ＳＬの生産性を向上し得る。このような微生物の例としては、実施例において後述するα２，３－シアリルトランスフェラーゼ遺伝子の発現を強化した、ｔＮｌｓｉａＴΔＮ２０ＡＡ、ｔＮｌｓｉａＴΔＮ２３ＡＡ、ｔＮｌｓｉａＴΔＮ２７ＡＡ及びｔＮｌｓｉａＴΔＮ３７ＡＡが挙げられる。
　このような微生物の例である、α２，３－シアリルトランスフェラーゼの活性を増強した微生物では、α２，３－シアリルトランスフェラーゼの高い活性により、３’ＳＬ生産性を向上させることができる。
２．３’ＳＬの製造方法
　本発明の一態様の３’ＳＬの製造方法としては、以下の方法が挙げられる。
　１．で上記した微生物を調製すること、当該微生物を用いて培養物中に３’ＳＬを生成することを含む、３’ＳＬの製造方法。
　１．で上記した微生物を培養する方法は、微生物の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
　該微生物を培養する培地としては、該微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、該形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地と合成培地のいずれを用いてもよい。
　炭素源としては、該微生物が資化し得るものであればよく、例えば、グルコース、フルクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプン若しくはデンプン加水分解物等の糖、酢酸若しくはプロピオン酸等の有機酸、又は、グリセロール、エタノール若しくはプロパノール等のアルコール類等が挙げられる。
　窒素源としては、例えば、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム又はリン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕、大豆粕加水分解物、各種発酵菌体及びその消化物等が挙げられる。
　無機塩としては、例えば、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が挙げられる。
　３’ＳＬの製造方法に用いる本発明の微生物として、グルコース、ラクトース、またはラクトース一水和物等の受容体糖質を生成する能力を有する微生物を用いてもよい。
　３’ＳＬの製造方法において、培養中に、グルコース、液糖、スクロース、ラクトース、ＮｅｕＡｃ等を培地に添加してもよい。
　また、３’ＳＬの製造方法において、培養中に、ラクトース、ＮｅｕＡｃ等を培地に添加する代わりに、ラクトース、ＮｅｕＡｃを生成する能力を有する微生物を、本発明の微生物と同時に培養することにより、本発明の一態様の微生物にラクトース、ＮｅｕＡｃ等を供給してもよい。
　オリゴ糖の製造方法において、培地中には、ＧｌｃＮＡｃトランスポーター、Ｎ－アセチルマンノサミンキナーゼ、Ｎ－アセチルグルコサミン－６－リン酸－２－エピメラーゼ、ＲＮａｓｅ　ａｄａｐｔｅｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ、ＮｅｕＡｃの資化に関与する遺伝子群の転写を負に制御する転写制御因子、ＮｅｕＡｃリアーゼ、β－ガラクトシダーゼおよびガラクトシドアセチルトランスフェラーゼが存在しないことが好ましい。
　培養は、通常、通気撹拌培養による好気的条件下で行うことが好ましい。培養温度は、通常２８～３７℃であり、培養時間は、通常３６時間～４日間である。培養中の培養液ｐＨは、通常６．４～７．４に保持する。ｐＨの調整は、無機又は有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行う。
　上記の培養により、培養物中に３’ＳＬを生成、蓄積させ、該培養物中から３’ＳＬを採取することにより、３’ＳＬを製造できる。
　通常、該培養物の遠心分離後、上清より３’ＳＬを採取できる。なお、菌体内に３’ＳＬが蓄積する場合には、例えば菌体を超音波などにより破砕し、遠心分離によって菌体を除去して得られる上清からイオン交換樹脂法などによって、３’ＳＬを採取できる。
［分析例］
　実施例において、３’ＳＬの分析、定量は以下に示す手順で行った。培養後の微生物を含む培養液を適宜希釈後、フィルター滅菌し、上清を回収した。該上清に含まれる３’ＳＬを分析装置ＳＰＤ－２０Ａ（島津製作所社製）にて分析した。
［分析条件］
カラム：Ｓｈｏｄｅｘ　ＳＵＧＡＲ　ＳＨ１０１１
カラム温度：５０℃
溶離液組成：５ｍＭ硫酸水溶液
流速：０．６ｍｌ／ｍｉｎ
検出器：ＳＰＤ－２０Ａ
［実施例１］３’ＳＬの製造に用いる微生物の造成
（１）３’ＳＬ生産用宿主の造成
＜ｙｈｂＪ遺伝子を欠損した大腸菌＞
　Ｎ－アセチルノイラミン酸（以下、ＮｅｕＡｃという）生合成に関わるＬ－グルタミン－Ｄ－フルクトース６リン酸アミノトランスフェラーゼをコードするｇｌｍＳ遺伝子の活性を負に制御する転写制御因子ｙｈｂＪ遺伝子（配列番号１１）を破壊した大腸菌を、以下の手順で作製した。
　ＢＷ２５１１３株（Ｋｅｉｏ　ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　ｓｉｎｇｌｅ－ｇｅｎｅ　ｋｎｏｃｋ－ｏｕｔ　ｍｕｔａｎｔｓ　ｏｆ　Ｅ．　ｃｏｌｉ　Ｋ－１２）　）を宿主として用い、Ｂａｂａら（Ｂａｂａ　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．（２００６）　Ｍｏｌ　ｓｙｓｔｅｍｓ　Ｂｉｏｌ）と同様の方法により、ｙｈｂＪ遺伝子を完全に欠失させた株ＢＷ２５１１３ΔｙｈｂＪ株を得た。
＜遺伝子欠損の際にマーカーとして用いるＤＮＡ断片の取得＞
　表１の「プライマーセット」で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして、表１の「鋳型」に記載されたＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、各増幅ＤＮＡ断片を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ　１６８株のゲノムＤＮＡは常法により調製した。増幅ＤＮＡ断片のｃａｔは、ｐＨＳＧ３９６上のｃａｔ遺伝子（クロラムフェニコールアセチル転移酵素をコード）の上流約２００ｂｐから下流約５０ｂｐを含む。増幅ＤＮＡ断片のｓａｃＢは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ　１６８株のゲノムＤＮＡ上のｓａｃＢ遺伝子（レバンシュクラーゼをコード）の上流約３００ｂｐから下流約１００ｂｐを含む。
　次に、増幅ＤＮＡ断片のｃａｔ及びｓａｃＢを等モルの比率で混合したものを鋳型とし、配列番号２１及び２４で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして用いてＰＣＲを行い、ｃａｔ遺伝子及びｓａｃＢ遺伝子を含むＤＮＡ断片（以下、ｃａｔ－ｓａｃＢという。）を得た。
＜ｌａｃＺ遺伝子を欠損した大腸菌＞
　上記で造成したＢＷ２５１１３ΔｙｈｂＪ株を親株として、ラクトースの分解に関与するβ－ガラクトシダーゼをコードするｌａｃＺ遺伝子（配列番号１２）を破壊した大腸菌を、以下の手順で作製した。
　常法により調製したＢＷ２５１１３株の染色体ＤＮＡを鋳型として、表２の「プライマーセット」で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして用いてＰＣＲを行い、各増幅ＤＮＡ断片を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　ｌａｃＺ上流１及びｌａｃＺ上流２は、ｌａｃＺ遺伝子の開始コドンからその上流約７００ｂｐを含む。ｌａｃＺ下流１及びｌａｃＺ下流２は、ｌａｃＺ遺伝子の終止コドンからその下流約８００ｂｐを含む。
　ｌａｃＺ上流１、ｌａｃＺ下流１、及びｃａｔ－ｓａｃＢ断片を等モルの比率で混合したものを鋳型とし、配列番号３３及び３４で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いてＰＣＲを行い、ｌａｃＺ遺伝子周辺領域の配列にｃａｔ－ｓａｃＢ断片が挿入された配列からなるＤＮＡ断片（以下、ｌａｃＺ：：ｃａｔ－ｓａｃＢという。）を得た。
　ｌａｃＺ上流２及びｌａｃＺ下流２を等モルの比率で混合したものを鋳型とし、配列番号３３及び３４で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いてＰＣＲを行い、ｌａｃＺを含まず、ｌａｃＺ上流とｌａｃＺ下流が直接連結した配列からなるＤＮＡ断片（以下、ΔｌａｃＺという。）を得た。
　ｌａｃＺ：：ｃａｔ－ｓａｃＢ断片を、λリコンビナーゼをコードする遺伝子を含むプラスミドｐＫＤ４６［Ｄａｔｓｅｎｋｏ，Ｋ．Ａ．，Ｗａｒｎｅｒ，Ｂ．Ｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，Ｖｏｌ．９７，６６４０－６６４５（２０００）］を保持するＢＷ２５１１３ΔｙｈｂＪ株に、エレクトロポレーション法により導入し、クロラムフェニコール耐性、かつシュクロース感受性を示した形質転換体（ｌａｃＺ遺伝子がｌａｃＺ：：ｃａｔ－ｓａｃＢに置換した形質転換体）を得た。
　ΔｌａｃＺ断片を、当該形質転換体にエレクトロポレーション法により導入し、クロラムフェニコール感受性かつシュクロース耐性を示す形質転換体（ｌａｃＺ：：ｃａｔ－ｓａｃＢがΔｌａｃＺに置換した形質転換体）を得た。当該形質転換体をＢＷ２５１１３ΔｙｈｂＪΔｌａｃＺ株と命名した。
＜ｎａｎＲ、ｎａｎＡ、ｎａｎＴ、ｎａｎＥ及びｎａｎＫ遺伝子を欠損した大腸菌＞
　ＢＷ２５１１３ΔｙｈｂＪΔｌａｃＺ株を宿主として、ＮｅｕＡｃの資化に関与する遺伝子群の転写を負に制御する転写制御因子をコードするｎａｎＲ遺伝子（配列番号１３）、ＮｅｕＡｃリアーゼをコードするｎａｎＡ遺伝子（配列番号１４）、ＮｅｕＡｃトランスポーターをコードするｎａｎＴ遺伝子（配列番号１５）、Ｎ－アセチルグルコサミン－６－リン酸－２－エピメラーゼをコードするｎａｎＥ遺伝子（配列番号１６）及びＮ－アセチルマンノサミンキナーゼをコードするｎａｎＫ遺伝子（配列番号１７）を破壊した大腸菌を、以下の手順で作製した。なお、ｎａｎＲ、ｎａｎＡ、ｎａｎＴ、ｎａｎＥ及びｎａｎＫ（以下、ｎａｎＲＡＴＥＫという。）は大腸菌ゲノム上でオペロンを形成している。
　常法により調製したＢＷ２５１１３株の染色体ＤＮＡを鋳型として、表３の「プライマーセット」で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして用いてＰＣＲを行い、各増幅ＤＮＡ断片を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　ｎａｎＲ上流１及びｎａｎＲ上流２は、ｎａｎＲ遺伝子の開始コドンからその上流約８００ｂｐを含む。ｎａｎＫ下流１及びｎａｎＫ下流２は、ｎａｎＫ遺伝子の終止コドンからその下流約８５０ｂｐを含む。
　ｎａｎＲ上流１、ｎａｎＫ下流１及びｃａｔ－ｓａｃＢ断片を等モルの比率で混合したものを鋳型とし、配列番号４３及び４４で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いてＰＣＲを行い、ｎａｎＲＡＴＥＫ遺伝子周辺領域の配列にｃａｔ－ｓａｃＢ断片が挿入された配列からなるＤＮＡ断片（以下、ｎａｎＲＡＴＥＫ：：ｃａｔ－ｓａｃＢという。）を得た。
　ｎａｎＲ上流２及びｎａｎＫ下流２を等モルの比率で混合したものを鋳型とし、配列番号４３及び４４で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いてＰＣＲを行い、ｎａｎＲＡＴＥＫを含まず、ｎａｎＲ上流とｎａｎＫ下流が直接連結した配列からなるＤＮＡ断片（以下、ΔｎａｎＲＡＴＥＫという。）を得た。
　ｎａｎＲＡＴＥＫ：：ｃａｔ－ｓａｃＢ断片を、λリコンビナーゼをコードする遺伝子を含むプラスミドｐＫＤ４６を保持するＢＷ２５１１３ΔｙｈｂＪΔｌａｃＺ株に、エレクトロポレーション法により導入し、クロラムフェニコール耐性、かつシュクロース感受性を示した形質転換体（ｎａｎＲＡＴＥＫ遺伝子がｎａｎＲＡＴＥＫ：：ｃａｔ－ｓａｃＢに置換した形質転換体）を得た。
　ΔｎａｎＲＡＴＥＫ断片を、当該形質転換体にエレクトロポレーション法により導入し、クロラムフェニコール感受性かつシュクロース耐性を示す形質転換体（ｎａｎＲＡＴＥＫ：：ｃａｔ－ｓａｃＢがΔｎａｎＲＡＴＥＫに置換した形質転換体）を得た。当該形質転換体をＢＷ２５１１３ΔｙｈｂＪΔｌａｃＺΔｎａｎＲＡＴＥＫ株と命名した。
（２）ＮｅｕＡｃ生産用プラスミドの造成
　Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｊｅｊｕｎｉ　ＡＴＣＣ４３４３８株由来のＮｅｕＡｃ合成酵素遺伝子ＣｊｎｅｕＢ（配列番号１８）及びＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｕｍ　ＮＢＲＣ１００２５０株由来のＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃエピメラーゼをコードするＦｐｎｅｕＣ（配列番号１９）を発現させるプラスミドを、以下の手順で作製した。
　表４の「プライマーセット」で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして、表４の「鋳型」に記載されたＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、増幅ＤＮＡ断片を得た。
　なお、ＦｐｎｅｕＣ（配列番号１９）の野生型配列における開始コドンがＧＴＧであるため、大腸菌で発現させるために、ＰＣＲにより得られる増幅ＤＮＡ断片ＦｐｎｅｕＣの開始コドンがＡＴＧとなるよう、プライマー配列中にＡＴＧを付加した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｊｅｊｕｎｉ　ＡＴＣＣ４３４３８株及びＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｕｍ　ＮＢＲＣ１００２５０株のゲノムＤＮＡは常法により調製した。
　配列番号４６及び４７で表される塩基配列は、それぞれの５’末端に相補的な配列を含む。
　上記で得られたＣｊｎｅｕＢ断片及びＦｐｎｅｕＣ断片を等モルの比率で混合したものを鋳型とし、配列番号４５及び４８で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとしてＰＣＲを実施し、ＣｊｎｅｕＢ断片及びＦｐｎｅｕＣ断片を連結させた約２．２ｋｂのＤＮＡ断片（以下、ＣｊｎｅｕＢ－ＦｐｎｅｕＣ断片という。）を得た。
　ＣｊｎｅｕＢ－ＦｐｎｅｕＣ断片と発現ベクターｐＴｒｃ９９ａ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて連結することにより、発現プラスミドｐＴｒｃ９９ａ－ＣｊｎｅｕＢ－ＦｐｎｅｕＣ（以下、ｐＢＣという。）を得た。
（３）３’ＳＬ生産用プラスミドの造成
　全長型又は短縮型のＮｅｉｓｓｅｒｉａ　ｌａｃｔａｍｉｃａ　ＡＴＣＣ２３９７０株由来のシアル酸転移酵素遺伝子ＮｌｓｉａＴ（配列番号１、３、５、７又は９）及びＰａｓｔｅｕｒｅｌｌａ　ｍｕｌｔｏｃｉｄａ　ｓｕｂｓｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａ　ｓｔｒ．　Ｐｍ７０　ＡＴＣＣ　ＢＡＡ－１９０９株由来のＣＭＰ－ＮｅｕＡｃ合成酵素遺伝子ＰｍｎｅｕＡ（配列番号２０）を発現させるプラスミドを、以下の手順で作製した。
　常法により調製したＮｅｉｓｓｅｒｉａ　ｌａｃｔａｍｉｃａの染色体ＤＮＡを鋳型として、表５の「プライマーセット」で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして用いてＰＣＲを行い、各増幅ＤＮＡ断片を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　常法により調製したＰａｓｔｅｕｒｅｌｌａ　ｍｕｌｔｏｃｉｄａ　ｓｕｂｓｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａ　ｓｔｒ．　Ｐｍ７０　ＡＴＣＣ　ＢＡＡ－１１９０９の染色体ＤＮＡを鋳型として、配列番号５５及び５６で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いてＰＣＲを行い、ＰｍｎｅｕＡ断片を得た。
　配列番号５０及び５５で表される塩基配列は、それぞれの５’末端に相補的な配列を含む。
　上記で得られたＮｌｓｉａＴ断片、ｔＮｌｓｉａＴΔＮ２０ＡＡ断片、ｔＮｌｓｉａＴΔＮ２３ＡＡ断片、ｔＮｌｓｉａＴΔＮ２７ＡＡ断片又はｔＮｌｓｉａＴΔＮ３７ＡＡ断片、及びＰｍｎｅｕＡ断片を等モルの比率で混合したものを鋳型とし、配列番号４９、５１、５２、５３又は５４、及び５６で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとしてＰＣＲを実施し、各ＮｌｓｉａＴ断片及びＰｍｎｅｕＡ断片を連結させたＤＮＡ断片を得た。
　上記で得られた各ＮｌｓｉａＴ断片及びＰｍｎｅｕＡ断片を連結させたＤＮＡ断片及び発現ベクターｐＳＴＶ２９（タカラバイオ社製）を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて連結することにより、発現プラスミドｐＳＴＶ－ＮｌｓｉａＴ、ｐＳＴＶ－ｔＮｌｓｉａＴΔＮ２０ＡＡ、ｐＳＴＶ－ｔＮｌｓｉａＴΔＮ２３ＡＡ、ｐＳＴＶ－ｔＮｌｓｉａＴΔＮ２７ＡＡ及びｐＳＴＶ－ｔＮｌｓｉａＴΔＮ３７ＡＡを得た。
（４）ＮｅｕＡｃ生産用プラスミドを有する微生物の造成
　上記（２）で得られたＮｅｕＡｃ生産用プラスミドｐＢＣを用い、上記（１）で造成したＢＷ２５１１３ΔｙｈｂＪΔｌａｃＺΔｎａｎＲＡＴＥＫ株を形質転換することで、ｐＢＣを有する大腸菌を造成し、ＢＷ２５１１３ΔｙｈｂＪΔｌａｃＺΔｎａｎＲＡＴＥＫ／ｐＢＣ株と命名した。
（５）３’ＳＬ生産用プラスミドを有する微生物の造成
　上記（２）で得られた３’ＳＬ生産用プラスミド、ｐＳＴＶ－ＮｌｓｉａＴ、ｐＳＴＶ－ｔＮｌｓｉａＴΔＮ２０ＡＡ、ｐＳＴＶ－ｔＮｌｓｉａＴΔＮ２３ＡＡ、ｐＳＴＶ－ｔＮｌｓｉａＴΔＮ２７ＡＡ及びｐＳＴＶ－ｔＮｌｓｉａＴΔＮ３７ＡＡを用い、上記（４）で造成したＢＷ２５１１３ΔｙｈｂＪΔｌａｃＺΔｎａｎＲＡＴＥＫ／ｐＢＣ株を形質転換することで、各種プラスミドを有する大腸菌を造成し、それぞれＮｌｓｉａＴ株、ｔＮｌｓｉａＴΔＮ２０ＡＡ株、ｔＮｌｓｉａＴΔＮ２３ＡＡ株、ｔＮｌｓｉａＴΔＮ２７ＡＡ株及びｔＮｌｓｉａＴΔＮ３７ＡＡ株と命名した。
［実施例２］発酵法による３’ＳＬの製造
　実施例１で得られたＮｌｓｉａＴ株、ｔＮｌｓｉａＴΔＮ２０ＡＡ株、ｔＮｌｓｉａＴΔＮ２３ＡＡ株、ｔＮｌｓｉａＴΔＮ２７ＡＡ株及びｔＮｌｓｉａＴΔＮ３７ＡＡ株について、３’ＳＬの生産性を評価した。
　各菌株をそれぞれアンピシリン１００ｍｇ／Ｌ及びクロラムフェニコール２５ｍｇ／Ｌを含むＬＢプレート上で３０℃にて終夜培養し、アンピシリン１００ｍｇ／Ｌ及びクロラムフェニコール２５ｍｇ／Ｌを含むＬＢ培地５ｍｌが入った太型試験管に植菌して、３０℃で１６時間振盪培養した。
　その後、該培養液をアンピシリン１００ｍｇ／Ｌ及びクロラムフェニコール２５ｍｇ／Ｌを含む生産培地［グリセロール３０ｇ／Ｌ、ラクトース１０ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム７水和物２．０ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム１６ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム１４ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム２．０ｇ／Ｌ、クエン酸１水和物１．０ｇ／Ｌ、カザミノ酸（ディフコ社製）５．０ｇ／Ｌ、ビタミンＢ１　１０ｍｇ／Ｌ、硫酸鉄７水和物５０ｍｇ／Ｌ、硫酸マンガン７水和物１０ｍｇ／Ｌ、水酸化ナトリウム水溶液によりｐＨ７．２に調整した後オートクレーブした］［グリセロール、ラクトース及び硫酸マグネシウム７水和物水溶液は別途調整してオートクレーブし、冷却後に混合した］が３ｍｌ入った太型試験管に０．３ｍＬ植菌して、３０℃で２４時間振とう培養した。培養開始５時間後、終濃度が１ｍＭとなるようにイソプロピル－β－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加した。
　培養終了後、培養液を適宜希釈し、フィルター滅菌後のサンプルをＨＰＬＣ分析し、上清に含まれる３’ＳＬ濃度を定量した。結果を表６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　以上の結果より、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｌａｃｔａｍｉｃａ　ＡＴＣＣ２３９７０株由来のシアル酸転移酵素ＮｌｓｉａＴのＮ末端のアミノ酸を削除した短縮型のＮｌｓｉａＴを用いた場合に、全長型のＮｌｓｉａＴよりも高い３’ＳＬ生産性を示すことが明らかとなった。また、有効なＮ末端の削除の長さは２０アミノ酸残基、２３アミノ酸残基、２７アミノ酸残基、３７アミノ酸残基でほぼ同等であった。
　これら短縮型の糖転移酵素は、全長型の糖転移酵素に比べて３’ＳＬの効率的な生産に有用であることを示した。
　本発明を特定の態様を参照して詳細に説明したが、本発明の精神と範囲を離れることなく様々な変更および修正が可能であることは、当業者にとって明らかである。なお、本出願は、２０２２年６月６日付けで出願された日本特許出願（特願２０２２－０９１８０１）に基づくものであり、その全体が引用により援用される。また、ここに引用されるすべての参照は全体として取り込まれる。
　本発明により、３’ＳＬを効率的に生産することができる。
配列番号１：Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｌａｃｔａｍｉｃａ　ＡＴＣＣ２３９７０株由来のシアル酸転移酵素遺伝子ＮｌｓｉａＴの塩基配列
配列番号２：Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｌａｃｔａｍｉｃａ　ＡＴＣＣ２３９７０株由来のシアル酸転移酵素遺伝子ＮｌｓｉａＴのアミノ酸配列
配列番号３：ｔＮｌｓｉａＴΔＮ２０ＡＡの塩基配列
配列番号４：ｔＮｌｓｉａＴΔＮ２０ＡＡのアミノ酸配列
配列番号５：ｔＮｌｓｉａＴΔＮ２３ＡＡの塩基配列
配列番号６：ｔＮｌｓｉａＴΔＮ２３ＡＡのアミノ酸配列
配列番号７：ｔＮｌｓｉａＴΔＮ２７ＡＡの塩基配列
配列番号８：ｔＮｌｓｉａＴΔＮ２７ＡＡのアミノ酸配列
配列番号９：ｔＮｌｓｉａＴΔＮ３７ＡＡの塩基配列
配列番号１０：ｔＮｌｓｉａＴΔＮ３７ＡＡのアミノ酸配列
配列番号１１：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＢＷ２５１１３由来のｙｈｂＪ塩基配列
配列番号１２：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＢＷ２５１１３由来のｌａｃＺ塩基配列
配列番号１３：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＢＷ２５１１３由来のｎａｎＲ塩基配列
配列番号１４：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＢＷ２５１１３由来のｎａｎＡ塩基配列
配列番号１５：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＢＷ２５１１３由来のｎａｎＴ塩基配列
配列番号１６：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＢＷ２５１１３由来のｎａｎＥ塩基配列
配列番号１７：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＢＷ２５１１３由来のｎａｎＫ塩基配列
配列番号１８：Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｊｅｊｕｎｉ　ＡＴＣＣ４３４３８株由来のＮｅｕＡｃ合成酵素遺伝子ＣｊｎｅｕＢの塩基配列
配列番号１９：Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｕｍ　ＮＢＲＣ１００２５０株由来のＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃエピメラーゼをコードするＦｐｎｅｕＣの塩基配列
配列番号２０：Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ　ｍｕｌｔｏｃｉｄａ　ｓｕｂｓｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａ　ｓｔｒ．　Ｐｍ７０　ＡＴＣＣ　ＢＡＡ－１９０９株由来のＣＭＰ－ＮｅｕＡｃ合成酵素遺伝子ＰｍｎｅｕＡの塩基配列
配列番号２１：ｃａｔ断片増幅用プライマーＦｗの塩基配列
配列番号２２：ｃａｔ断片増幅用プライマーＲｖの塩基配列
配列番号２３：ｓａｃＢ断片増幅用プライマーＦｗの塩基配列
配列番号２４：ｓａｃＢ断片増幅用プライマーＲｖの塩基配列
配列番号２５：ｌａｃＺ上流１断片増幅用プライマーＦｗの塩基配列
配列番号２６：ｌａｃＺ上流１断片増幅用プライマーＲｖの塩基配列
配列番号２７：ｌａｃＺ下流１断片増幅用プライマーＦｗの塩基配列
配列番号２８：ｌａｃＺ下流１断片増幅用プライマーＲｖの塩基配列
配列番号２９：ｌａｃＺ上流２断片増幅用プライマーＦｗの塩基配列
配列番号３０：ｌａｃＺ上流２断片増幅用プライマーＲｖの塩基配列
配列番号３１：ｌａｃＺ下流２断片増幅用プライマーＦｗの塩基配列
配列番号３２：ｌａｃＺ下流２断片増幅用プライマーＲｖの塩基配列
配列番号３３：ｌａｃＺ破壊用断片作製用プライマーＦｗの塩基配列
配列番号３４：ｌａｃＺ破壊用断片作製用プライマーＲｖの塩基配列
配列番号３５：ｎａｎＲ上流１断片増幅用プライマーＦｗの塩基配列
配列番号３６：ｎａｎＲ上流１断片増幅用プライマーＲｖの塩基配列
配列番号３７：ｎａｎＫ下流１断片増幅用プライマーＦｗの塩基配列
配列番号３８：ｎａｎＫ下流１断片増幅用プライマーＲｖの塩基配列
配列番号３９：ｎａｎＲ上流２断片増幅用プライマーＦｗの塩基配列
配列番号４０：ｎａｎＲ上流２断片増幅用プライマーＲｖの塩基配列
配列番号４１：ｎａｎＫ下流２断片増幅用プライマーＦｗの塩基配列
配列番号４２：ｎａｎＫ下流２断片増幅用プライマーＲｖの塩基配列
配列番号４３：ｎａｎＲＡＴＥＫ破壊用断片作製用プライマーＦｗの塩基配列
配列番号４４：ｎａｎＲＡＴＥＫ破壊用断片作製用プライマーＲｖの塩基配列
配列番号４５：ＣｊｎｅｕＢ断片増幅用プライマーＦｗの塩基配列
配列番号４６：ＣｊｎｅｕＢ断片増幅用プライマーＲｖの塩基配列
配列番号４７：ＦｐｎｅｕＣ断片増幅用プライマーＦｗの塩基配列
配列番号４８：ＦｐｎｅｕＣ断片増幅用プライマーＲｖの塩基配列
配列番号４９：ＮｌｓｉａＴ増幅用プライマーＦｗの塩基配列
配列番号５０：ＮｌｓｉａＴ増幅用プライマーＲｖの塩基配列
配列番号５１：ｔＮｌｓｉａＴΔＮ２０ＡＡ増幅用プライマーＦｗの塩基配列
配列番号５２：ｔＮｌｓｉａＴΔＮ２３ＡＡ増幅用プライマーＦｗの塩基配列
配列番号５３：ｔＮｌｓｉａＴΔＮ２７ＡＡ増幅用プライマーＦｗの塩基配列
配列番号５４：ｔＮｌｓｉａＴΔＮ３７ＡＡ増幅用プライマーＦｗの塩基配列
配列番号５５：ＰｍｎｅｕＡ増幅用プライマーＦｗの塩基配列
配列番号５６：ＰｍｎｅｕＡ増幅用プライマーＲｖの塩基配列

Claims (3)

  1. 　配列番号２で表されるアミノ酸配列のＮ末端側２０～３７アミノ酸残基が欠失されたアミノ酸配列からなる蛋白質の活性が増強され、かつ、親株に比べて３’－シアリルラクトースの生産性が向上した微生物。
  2. 　前記配列番号２で表されるアミノ酸配列のＮ末端側２０～３７アミノ酸残基が欠失されたアミノ酸配列からなる蛋白質が、下記［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質である、請求項１に記載の微生物。
    ［１］配列番号４、６、８又は１０で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質。
    ［２］配列番号４、６、８又は１０で表されるアミノ酸配列において、１～２０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつα２，３－シアリルトランスフェラーゼ活性を有する変異蛋白質。
    ［３］配列番号４、６、８又は１０で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつα２，３－シアリルトランスフェラーゼ活性を有する相同蛋白質。
  3. 　請求項１又は２に記載の微生物を調製すること、および当該微生物を用いて培養物中に３’－シアリルラクトースを生成することを含む、３’－シアリルラクトースの製造方法。
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