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WO2025047865A1 - 遺伝子改変微生物、及びオリゴ糖の製造方法 - Google Patents

遺伝子改変微生物、及びオリゴ糖の製造方法 Download PDF

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WO2025047865A1
WO2025047865A1 PCT/JP2024/030935 JP2024030935W WO2025047865A1 WO 2025047865 A1 WO2025047865 A1 WO 2025047865A1 JP 2024030935 W JP2024030935 W JP 2024030935W WO 2025047865 A1 WO2025047865 A1 WO 2025047865A1
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WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
seq
blon
lnt
amino acid
activity
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
PCT/JP2024/030935
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
杉本 茉未 須貝
智惇 杉田
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kirin Holdings Co Ltd
Original Assignee
Kirin Holdings Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kirin Holdings Co Ltd filed Critical Kirin Holdings Co Ltd
Publication of WO2025047865A1 publication Critical patent/WO2025047865A1/ja
Pending legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides

Definitions

  • the present invention relates to genetically modified microorganisms and a method for producing oligosaccharides.
  • HMOs Human Milk Oligosaccharides
  • the present invention therefore aims to provide a microorganism with excellent LNT productivity and a method for producing oligosaccharides using the microorganism.
  • MFS Facilitator Superfamily
  • Blon_2344 Blon_2343, Blon_2342, Blon_2347, Blon_2346, Blon_2345, Blon_2361, Blon_2362, Blon_2363, Blon_2364, Blon_2365, Blon_2366, Blon_2367, Blon_2368, Blon_2369, Blon_2370, Blon_2371, Blon_2372, Blon_2373, Blon_2374, Blon_2375, Blon_2376, Blon_2377, Blon_2378, Blon_2379, Blon_2380, Blon_2381, Blon_2382, Blon_2383, Blon_2384, Blon_2385,
  • the present invention is as follows.
  • ⁇ 2> The genetically modified microorganism according to ⁇ 1> above, wherein the GlcNAc permease is NagP derived from a bacterium belonging to the genus Shewanella, and the GalNAc permease is AgaP derived from a bacterium belonging to the genus Shewanella.
  • ⁇ 3> A genetically modified microorganism according to ⁇ 1> or ⁇ 2> above, in which the activity of the protein according to [1] below is enhanced.
  • a protein consisting of at least one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 89, 106, 108, 110, and 112.
  • ⁇ 4> A genetically modified microorganism described in ⁇ 1> or ⁇ 2> above, in which the activity of the protein described in [2] or [3] below is enhanced and the productivity of lacto-N-tetraose (LNT) is improved compared to that of a parent strain.
  • a mutant protein consisting of an amino acid sequence represented by at least one selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 89, 106, 108, 110, and 112, in which 1 to 20 amino acids have been deleted, substituted, inserted or added.
  • a homologous protein having an amino acid sequence having 60% or more identity to at least one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 89, 106, 108, 110, and 112.
  • ⁇ 5> A genetically modified microorganism according to ⁇ 1> or ⁇ 2> above, which has been modified in any one of the following items [4] to [7]: [4] A modification that enhances the activity of each of the proteins consisting of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 64, 65, and 66. [5] A modification that enhances the activity of each of the proteins consisting of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 67, 68, and 69. [6] A modification that enhances the activity of each of the proteins consisting of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 70, 71, and 72.
  • [7] A modification that enhances the activity of each of the proteins consisting of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 106, 108, and 110.
  • ⁇ 6> A genetically modified microorganism described in ⁇ 1> or ⁇ 2> above, which produces oligosaccharides having an LNT backbone.
  • LNFPI lacto-N-fucopentaose I
  • LST-a sialyllacto-N-tetraose a
  • ⁇ 8> The genetically modified microorganism described in ⁇ 1> or ⁇ 2> above, wherein the genetically modified microorganism is Escherichia coli.
  • ⁇ 9> A method for producing oligosaccharides, comprising preparing a genetically modified microorganism described in ⁇ 1> or ⁇ 2> above, and producing oligosaccharides in at least one of a culture supernatant and intracellular space using the genetically modified microorganism.
  • oligosaccharide is at least one selected from the group consisting of lacto-N-tetraose (LNT), lacto-N-fucopentaose I (LNFPI) and sialyllacto-N-tetraose a (LST-a).
  • LNT lacto-N-tetraose
  • LNFPI lacto-N-fucopentaose I
  • LST-a sialyllacto-N-tetraose a
  • the microorganism according to this embodiment can improve LNT productivity by enhancing the activity of a specific protein. Therefore, by using the microorganism according to this embodiment, LNT can be produced efficiently.
  • FIG. 1 shows a schematic diagram of the biosynthetic pathway of LNT in a microorganism according to one embodiment of the present invention.
  • the microorganisms of this embodiment are those that are genetically modified to produce LNT, such as MhpT, YfcJ, EmrD, YdeE, GlcNAc permease, GalNAc permease, Shewanella-derived sugar MFS transporter, Blon_2344, Blon_2343, Blon_2342, Blon_2347, Blon_2346, Blon_2345, Blon_2361, Blon_2360, Blon_2359, Bifidobacterium breve-derived ABC transporter, and Bifidobacterium breve-derived ABC transporter.
  • the present invention relates to a genetically modified microorganism that produces LNT, and in which the activity of at least one protein selected from the group consisting of L. breve-derived galactoside symporters is enhanced.
  • producing LNT means producing LNT in the culture of the genetically modified microorganism, i.e., in the culture supernatant (also referred to as extracellular) and/or intracellular.
  • the amount of LNT produced can be confirmed by detecting LNT in the culture of the genetically modified microorganism using an analytical device or the like described below.
  • the “total LNT production amount” is the sum of the quantified amount of extracellular LNT and the amount of intracellular LNT.
  • the “extracellular ratio” is the ratio of the amount of extracellular LNT to the total amount of LNT produced (extracellular LNT amount/total LNT production amount).
  • the microorganism of this embodiment may be a genetically modified microorganism that produces LNT in which the activity of at least one of the proteins membrane-bound lytic murein transglycosylase MltF and sodium:proton antigen is enhanced.
  • the genetically modified microorganism is preferably a microorganism that produces LNT and has improved LNT productivity compared to the parent strain.
  • the produced LNT may be a final product or an intermediate product.
  • LNT can also be a precursor of other oligosaccharides
  • the genetically modified microorganism that produces LNT can produce oligosaccharides such as oligosaccharides having an LNT backbone.
  • the genetically modified microorganism may further produce oligosaccharides having an LNT backbone, which is the final product, using the LNT produced in the bacterial cell as an intermediate.
  • oligosaccharide refers to a sugar polymer composed of at least three moieties, i.e., including trisaccharides, tetrasaccharides, pentasaccharides, etc., and preferably includes LNT and oligosaccharides having an LNT backbone.
  • an oligosaccharide having an LNT backbone is preferably a human milk oligosaccharide containing LNT as the core tetrasaccharide.
  • a human milk oligosaccharide containing LNT as the "core tetrasaccharide” means that it contains LNT as the tetrasaccharide corresponding to the reducing end of the desired oligosaccharide, and in some cases, it also contains another sugar portion in addition to the specific tetrasaccharide corresponding to the main portion.
  • examples of oligosaccharides having an LNT backbone include lacto-N-fucopentaose I (hereinafter also referred to as "LNFPI”), lacto-N-fucopentaose II (hereinafter also referred to as “LNFPII”), lacto-N-fucopentaose V (hereinafter also referred to as "LNFPV”), sialyllacto-N-tetraose-a (hereinafter also referred to as "LST-a”), sialyllacto-N-tetraose-b (hereinafter also referred to as "LST-b”), disialyllacto-N-tetraose (hereinafter also referred to as "DSLNT”), lacto-N-hexaose (hereinafter also referred to as "LNH”), lacto-N-difucosylhexaose I (hereinafter also referred to as "
  • the oligosaccharide having the LNT backbone is preferably at least one of LNFPI and LST-a, and the precursor of LNFPI and LST-a is more preferably LNT.
  • FucT ⁇ 1,2-fucosyltransferase
  • Examples of FucT include FucT derived from Neisseriaceae bacterium DSM 100970, FucT derived from Yersinia sp., and FucT derived from Gramella forsetii (International Publication No. 2019/008133).
  • the activity of at least one of proteins involved in the biosynthetic pathway of GDP-fucose such as phosphomannomutase (hereinafter referred to as ManB), mannose-1-phosphate guanylyltransferase (hereinafter referred to as ManC), GDP-mannose 4,6 dehydratase (hereinafter referred to as Gmd), and GDP-L-fucose synthetase (hereinafter referred to as Fcl)
  • ManB phosphomannomutase
  • ManC mannose-1-phosphate guanylyltransferase
  • Gmd GDP-mannose 4,6 dehydratase
  • Fcl GDP-L-fucose synthetase
  • siaT ⁇ -2,3-sialyltransferase
  • a protein required for the biosynthesis of sialic acid also referred to as N-acetylneuraminic acid
  • Examples of siaT include Pasteurella multocida PM70-derived siaT (JP Patent No. 4275529) and Photobacterium genus-derived siaT (JP Patent Publication No. 2020-528280).
  • the protein necessary for the biosynthesis of sialic acid for example, at least one activity such as UDP-N-acetylglucosamine-2-epimerase (hereinafter referred to as NeuC), N-acetylneuraminic acid synthase (hereinafter referred to as NeuB), and acylneuraminic acid cytidylyltransferase (hereinafter referred to as NeuA), may be further enhanced.
  • NeuC UDP-N-acetylglucosamine-2-epimerase
  • NeuB N-acetylneuraminic acid synthase
  • NeuA acylneuraminic acid cytidylyltransferase
  • Methods for preparing genetically modified microorganisms in which the activities of proteins necessary for the biosynthesis of sialic acid and sialylated oligosaccharides are enhanced include, for example, the methods described in Japanese Patent Nos. 4275529, 6441806,
  • An example of the amino acid sequence of MhpT is the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • An example of the base sequence of DNA encoding MhpT is the base sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • An example of the amino acid sequence of YfcJ is the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4.
  • An example of the base sequence of DNA encoding YfcJ is the base sequence shown in SEQ ID NO: 3.
  • An example of the amino acid sequence of EmrD is the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6.
  • An example of the base sequence of DNA encoding EmrD is the base sequence shown in SEQ ID NO: 5.
  • An example of the amino acid sequence of YdeE is the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8.
  • An example of the base sequence of DNA encoding YdeE is the base sequence shown in SEQ ID NO: 7.
  • GlcNAc permease An example of GlcNAc permease is NagP.
  • NagP NagP derived from a bacterium belonging to the genus Shewanella is preferred.
  • Specific examples of NagP derived from a bacterium belonging to the genus Shewanella include NagP derived from Shewanella sp. ANA3 (hereinafter also referred to as "NagP(ANA3)"), NagP derived from Shewanella amazonensis SB2B (hereinafter also referred to as "NagP(Sama)”), and NagP derived from Shewanella sp. MR4 (hereinafter also referred to as "NagP(MR4)").
  • the GlcNAc permease in this embodiment may have a function as membrane-bound lytic murein transglycosylase MltF or a sodium:proton antigen.
  • An example of the amino acid sequence of NagP derived from Shewanella sp. ANA3 is the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10.
  • An example of the base sequence of DNA encoding NagP derived from Shewanella sp. ANA3 is the base sequence shown in SEQ ID NO: 9.
  • An example of the base sequence of codon-optimized NagP (ANA3) in which bases have been substituted to provide optimal codons for expression in Escherichia coli is the base sequence shown in SEQ ID NO: 73.
  • NagP derived from Shewanella sp. ANA3 is also known as membrane-bound lytic murein transglycosylase MltF.
  • Shewanella amazonensis SB2B-derived NagP is the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12.
  • An example of the base sequence of DNA encoding Shewanella amazonensis SB2B-derived NagP is the base sequence shown in SEQ ID NO: 11.
  • An example of the base sequence of codon-optimized NagP (Sama), in which bases have been substituted to provide optimal codons for expression in Escherichia coli, is the base sequence shown in SEQ ID NO: 74.
  • Shewanella amazonensis SB2B-derived NagP is also known as sodium:proton antiporter.
  • An example of the amino acid sequence of NagP derived from Shewanella sp. MR4 is the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 89.
  • An example of the base sequence of DNA encoding NagP derived from Shewanella sp. MR4 is the base sequence represented by SEQ ID NO: 88.
  • An example of the base sequence of codon-optimized NagP (MR4) in which bases have been substituted to provide optimal codons for expression in Escherichia coli is the base sequence represented by SEQ ID NO: 126.
  • NagP derived from Shewanella sp. MR4 is also known as sugar MFS transporter.
  • GalNAc permease An example of GalNAc permease is AgaP.
  • AgaP AgaP derived from bacteria of the genus Shewanella is preferable.
  • Specific examples of AgaP derived from bacteria of the genus Shewanella include AgaP derived from Shewanella sp. ANA3 (hereinafter also referred to as "AgaP(ANA3)") and AgaP derived from Shewanella sp. MR-4 (hereinafter also referred to as "AgaP(MR4)").
  • An example of the amino acid sequence of AgaP derived from Shewanella sp. ANA3 is the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14.
  • An example of the base sequence of DNA encoding AgaP derived from Shewanella sp. ANA3 is the base sequence shown in SEQ ID NO: 13.
  • An example of the base sequence of codon-optimized AgaP (ANA3), in which bases have been replaced to provide optimal codons for expression in E. coli, is the base sequence shown in SEQ ID NO: 75.
  • MR-4-derived AgaP is the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 16.
  • An example of the base sequence of DNA encoding Shewanella sp. MR-4-derived AgaP is the base sequence shown in SEQ ID NO: 15.
  • An example of the base sequence of codon-optimized AgaP (MR4), in which bases have been replaced to provide optimal codons for expression in E. coli, is the base sequence shown in SEQ ID NO: 76.
  • Shewanella-derived sugar MFS transporter Specific examples of sugar MFS transporters derived from bacteria of the genus Shewanella include NagP (MR4), AgaP (ANA3), and AgaP (MR4).
  • Blon_2344, Blon_2343, Blon_2342, Blon_2347, Blon_2346, Blon_2345, Blon_2361, Blon_2360, Blon_2359) Blon_2344, Blon_2343, Blon_2342, Blon_2347, Blon_2346, Blon_2345, Blon_2361, Blon_2360, and Blon_2359 are ABC transporters derived from Bifidobacterium longum subsp. Infantis.
  • An example of the amino acid sequence of Blon_2344 is the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 64.
  • An example of the base sequence of DNA encoding Blon_2344 is the base sequence shown in SEQ ID NO: 77.
  • An example of the amino acid sequence of Blon_2343 is the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 65.
  • An example of the base sequence of DNA encoding Blon_2343 is the base sequence shown in SEQ ID NO: 78.
  • An example of the amino acid sequence of Blon_2342 is the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 66.
  • An example of the base sequence of DNA encoding Blon_2342 is the base sequence shown in SEQ ID NO: 79.
  • An example of a base sequence containing the DNA encoding Blon_2344, the DNA encoding Blon_2343, and the DNA encoding Blon_2342 is the base sequence shown in SEQ ID NO:17.
  • An example of the amino acid sequence of Blon_2347 is the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 67.
  • An example of the base sequence of DNA encoding Blon_2347 is the base sequence shown in SEQ ID NO: 80.
  • An example of the amino acid sequence of Blon_2346 is the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 68.
  • An example of the base sequence of DNA encoding Blon_2346 is the base sequence shown in SEQ ID NO: 81.
  • An example of the amino acid sequence of Blon_2345 is the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 69.
  • An example of the base sequence of DNA encoding Blon_2345 is the base sequence shown in SEQ ID NO: 82.
  • An example of a base sequence containing the DNA encoding Blon_2347, the DNA encoding Blon_2346, and the DNA encoding Blon_2345 is the base sequence shown in SEQ ID NO:18.
  • An example of the amino acid sequence of Blon_2361 is the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 70.
  • An example of the base sequence of DNA encoding Blon_2361 is the base sequence shown in SEQ ID NO: 83.
  • An example of the amino acid sequence of Blon_2360 is the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 71.
  • An example of the base sequence of DNA encoding Blon_2360 is the base sequence shown in SEQ ID NO: 84.
  • An example of the amino acid sequence of Blon_2359 is the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 72.
  • An example of the base sequence of DNA encoding Blon_2359 is the base sequence shown in SEQ ID NO: 85.
  • An example of a base sequence containing the DNA encoding Blon_2361, the DNA encoding Blon_2360, and the DNA encoding Blon_2359 is the base sequence shown in SEQ ID NO:19.
  • a genetically modified microorganism in which the activity of at least one protein selected from the group consisting of Blon_2344, Blon_2343, Blon_2342, Blon_2347, Blon_2346, Blon_2345, Blon_2361, Blon_2360, and Blon_2359 is enhanced may not have improved productivity of lacto-N-neotetraose (LNnT) compared to the parent strain.
  • LNnT lacto-N-neotetraose
  • ABC transporter derived from Bifidobacterium breve examples include Bbr_1590, Bbr_1589, and Bbr_1588.
  • An example of the amino acid sequence of Bbr_1590 is the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 106.
  • An example of the base sequence of DNA encoding Bbr_1590 is the base sequence shown in SEQ ID NO: 122.
  • An example of the base sequence of codon-optimized Bbr_1590, in which bases have been replaced to provide optimal codons for expression in E. coli, is the base sequence shown in SEQ ID NO: 107.
  • An example of the amino acid sequence of Bbr_1589 is the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 108.
  • An example of the base sequence of DNA encoding Bbr_1589 is the base sequence shown in SEQ ID NO: 123.
  • An example of the base sequence of codon-optimized Bbr_1589, in which bases have been replaced to provide optimal codons for expression in E. coli, is the base sequence shown in SEQ ID NO: 109.
  • An example of the amino acid sequence of Bbr_1588 is the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 110.
  • An example of the base sequence of DNA encoding Bbr_1588 is the base sequence shown in SEQ ID NO: 124.
  • An example of the base sequence of codon-optimized Bbr_1588, in which bases have been replaced to provide optimal codons for expression in E. coli, is the base sequence shown in SEQ ID NO: 111.
  • Examples of the galactoside symporter derived from Bifidobacterium breve include Bbr_1551.
  • Examples of the amino acid sequence of Bbr_1551 include the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 112.
  • Examples of the base sequence of DNA encoding Bbr_1551 include the base sequence represented by SEQ ID NO: 125.
  • Examples of the base sequence of codon-optimized Bbr_1551 in which bases have been substituted to provide optimal codons for expression in Escherichia coli include the base sequence represented by SEQ ID NO: 113.
  • a genetically modified microorganism having enhanced activity of the protein described in the following [1] is preferred.
  • Such a genetically modified microorganism has improved LNT productivity compared to the parent strain.
  • a protein consisting of amino acid sequences represented by SEQ ID NO:X, Y and Z may mean “one protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:X, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:Y and the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:Z” or "a combination of a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:X, a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:Y and a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:Z.”
  • X, Y and Z are any integers.
  • the protein described in [1] above is more preferably a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:8, a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:10, a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:12, a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:16, a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:64 to 66, a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:67 to 69, or a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:70 to 72.
  • a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:8 a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:10, a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:12, or a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:70 to 72 is most preferred.
  • the protein described in [1] above is more preferably a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6, a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8, a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10, a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12, a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16, a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 64 to 66, a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 67 to 69, or a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 70 to 72.
  • a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:8 a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:16, a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:64 to 66, a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:67 to 69, and a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:70 to 72 are most preferred.
  • the genetically modified microorganism of this embodiment is also preferably a genetically modified microorganism in which the activity of a protein described in [2] or [3] below is enhanced and the productivity of LNT is improved compared to that of a parent strain.
  • a mutant protein consisting of an amino acid sequence represented by at least one selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 89, 106, 108, 110, and 112, in which 1 to 20 amino acids have been deleted, substituted, inserted or added.
  • a homologous protein having an amino acid sequence having 60% or more identity to at least one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 89, 106, 108, 110, and 112.
  • the genetically modified microorganism of this embodiment also includes a genetically modified microorganism having any one of the modifications described in [4] to [7] below.
  • [4] A modification that enhances the activity of each of the proteins consisting of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 64, 65, and 66.
  • [5] A modification that enhances the activity of each of the proteins consisting of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 67, 68, and 69.
  • [6] A modification that enhances the activity of each of the proteins consisting of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 70, 71, and 72.
  • [7] A modification that enhances the activity of each of the proteins consisting of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 106, 108, and 110.
  • the genetically modified microorganism of this embodiment also includes a genetically modified microorganism in which the activity of a protein consisting of at least one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 2, 4, 6, and 8, and the activity of a protein consisting of at least one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 10, 12, 14, 16, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 89, 106, 108, 110, and 112 are both enhanced.
  • productivity refers to the ability of a microorganism to accumulate the target oligosaccharide produced by the microorganism in the culture of the microorganism, i.e., in the culture supernatant (also referred to as outside the cells) and/or inside the cells.
  • the productivity of oligosaccharides by a microorganism can be confirmed by detecting at least one of the oligosaccharides in the culture supernatant and/or inside the cells of the microorganism using an analytical device or the like described below.
  • Productivity is also referred to as production amount.
  • the genetically modified microorganism of this embodiment preferably has improved LNT productivity compared to the parent strain, and more preferably has an improved extracellular ratio of the produced LNT.
  • a microorganism in which the activity of the protein described in any one of [1] to [7] above is enhanced can be, for example, a microorganism in which the copy number of the gene is increased compared to that of the parent strain, obtained by transforming a parent strain of a microorganism with a recombinant DNA containing a DNA encoding the protein described in any one of [1] to [7] above.
  • increasing the copy number of the gene can mean that a parent strain that does not have the gene on a chromosome or a plasmid newly has the gene, or that a strain that has the gene on a chromosome or a plasmid additionally has the gene.
  • a mutant protein refers to a protein obtained by artificially deleting or substituting amino acid residues in a base protein, or by inserting or adding amino acid residues into the base protein.
  • the deletion, substitution, insertion or addition of amino acids may mean the deletion, substitution, insertion or addition of 1 to 20 amino acids at any position in the same sequence.
  • the number of amino acids deleted, substituted, inserted or added is preferably 1 to 10, more preferably 1 to 8, and most preferably 1 to 5.
  • the amino acids deleted, substituted, inserted or added may be either natural or non-natural.
  • Natural amino acids include L-alanine, L-asparagine, L-aspartic acid, L-glutamine, L-glutamic acid, glycine, L-histidine, L-isoleucine, L-leucine, L-lysine, L-arginine, L-methionine, L-phenylalanine, L-proline, L-serine, L-threonine, L-tryptophan, L-tyrosine, L-valine, L-cysteine, etc.
  • amino acids in the same group can be substituted for each other.
  • Group A leucine, isoleucine, norleucine, valine, norvaline, alanine, 2-aminobutanoic acid, methionine, O-methylserine, t-butylglycine, t-butylalanine, cyclohexylalanine
  • Group B aspartic acid, glutamic acid, isoaspartic acid, isoglutamic acid, 2-aminoadipic acid, 2-aminosuberic acid
  • Group C asparagine, glutamine
  • D lysine, arginine, ornithine, 2,4-diaminobutanoic acid, 2,3-diaminopropionic acid
  • Group E proline, 3-hydroxyproline, 4-hydroxyproline
  • Group F serine, threonine, homoserine
  • Group G phenylalanine, tyros
  • a homologous protein refers to a protein that is found in organisms that exist in nature and is similar in structure and function to the original protein, such that the gene that codes for that protein is considered to have the same evolutionary origin as the gene that codes for the original protein.
  • homologous proteins include amino acid sequences that have an identity of 60% or more, preferably 65% or more, 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more, more preferably 90% or more, and particularly preferably 95% or more, to the amino acid sequence of the target protein.
  • the method for confirming the identity of amino acid sequences is as described below.
  • the above-mentioned homologous protein preferably has oligosaccharide transport activity.
  • Parent strain refers to an original strain that is the subject of genetic modification, transformation, etc.
  • An original strain that is the subject of transformation by gene introduction is also called a host strain.
  • the parent strain is preferably a prokaryote or a yeast strain, more preferably a prokaryote belonging to the genus Escherichia, such as Escherichia coli, Serratia, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Microbacterium, or Pseudomonas, or a yeast strain belonging to the genus Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Kluyveromyces, Trichosporon, Siwaniomyces, Pichia, or Candida, and most preferably Escherichia coli MG1655, Escherichia coli i XL1-Blue, Escherichia coli XL2-Blue, Escherichia coli DH1, Esch erichia coli MC1000, Escherichia coli KY3276, Escherichia coli W1 485, Escherichia coli JM109, Escherichia coli HB101,
  • prokaryotes examples include Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Trichosporon pullulans, Schwanniomyces alluvius, Pichia pastoris, and Candida utilis.
  • the parent strain may be a wild-type strain if it is a microorganism that produces LNT, or if the wild-type strain does not have the ability to produce LNT, it may be a bred strain that has been artificially given the ability to produce LNT.
  • Methods for artificially imparting the ability to produce LNT to a microorganism include, for example, the following methods (1a) to (1e), and these methods can be used alone or in combination.
  • (1c) A method for increasing the copy number of at least one of the enzyme genes involved in the biosynthetic pathway for producing LNT;
  • (1d) A method for weakening or blocking at least one of the metabolic pathways branching off from the biosynthetic pathway for producing LNT to a metabolic product other than the target substance;
  • the parent strain may be a wild-type strain as long as it is a microorganism that produces oligosaccharides and LNT having an LNT skeleton, or, if the wild-type strain does not have the ability to produce oligosaccharides and LNT having an LNT skeleton, the parent strain may be a bred strain that has been artificially imparted with the ability to produce oligosaccharides and LNT having an LNT skeleton.
  • Methods for artificially imparting the ability to produce oligosaccharides having an LNT backbone and LNT to a microorganism include the methods described below in (2a) to (2e), and these methods can be used alone or in combination.
  • Whether a microorganism is capable of producing LNT can be confirmed by transforming the microorganism with a recombinant DNA having a DNA encoding a protein consisting of at least one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 89, 106, 108, 110, and 112, culturing the transformed microorganism in a medium, and detecting LNT accumulated in at least one of the culture supernatant and the bacterial cells using a sugar analyzer or the like described below.
  • a microorganism is capable of producing oligosaccharides having an LNT backbone and LNT can be confirmed by transforming the microorganism with a recombinant DNA having a DNA encoding a protein consisting of at least one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 89, 106, 108, 110, and 112, culturing the transformed microorganism in a medium, and detecting the oligosaccharides having an LNT backbone and LNT accumulated in at least one of the culture supernatant and the bacterial cells using a sugar analyzer described later or the like.
  • the parent strain has at least one activity selected from the group consisting of lactose permease (hereinafter referred to as LacY) activity, ⁇ 1,3-N-acetylglucosamine transferase (hereinafter referred to as LgtA) activity, GlmS activity, GlmM activity, GlmU activity, ⁇ 1,3-galactosyltransferase (hereinafter referred to as GalT) activity, phosphoglucomutase (hereinafter referred to as Pgm) activity, UTP glucose-1-phosphate uridylyltransferase (hereinafter referred to as GalU) activity, UDP glucose-4-epimerase (hereinafter referred to as GalE) activity, UTP glucose-1-phosphate uridylyltransferase (hereinafter referred to as GalF) activity, and glucose-6-phosphate isomerase (hereinafter referred to as Pgi) activity, and it is more prefer to as LacY
  • the parent strain has the above LacY activity, the above LgtA activity, the above GlmS activity, the above GlmM activity, the above GlmU activity, the above GalT activity, the above Pgm activity, the above GalU activity, the above GalE activity, the above GalF activity, the above Pgi activity, mannose-6-phosphate isomerase (hereinafter referred to as ManA) activity, phosphomannomutase (hereinafter referred to as ManB) activity, mannose-1-phosphate guanylyltransferase (hereinafter referred to as ManC) activity, GDP-mannose 4,6 dehydratase activity, and the above ATPase activity.
  • ManA mannose-6-phosphate isomerase
  • ManB phosphomannomutase
  • ManC mannose-1-phosphate guanylyltransferase
  • GDP-mannose 4,6 dehydratase activity and the above ATPase activity.
  • the enzyme has at least one activity selected from the group consisting of ⁇ -1,2-fucosyltransferase (hereinafter referred to as Gmd), GDP-L-fucose synthetase (hereinafter referred to as Fcl), UDP-N-acetylglucosamine-2-epimerase (hereinafter referred to as NeuC), N-acetylneuraminic acid synthase (hereinafter referred to as NeuB), acylneuraminic acid cytidylyltransferase (hereinafter referred to as NeuA), ⁇ 1,2-fucosyltransferase activity, and ⁇ -2,3-sialyltransferase activity, and it is more preferable that the activity is enhanced.
  • Gmd ⁇ -1,2-fucosyltransferase
  • Fcl GDP-L-fucose synthetase
  • NeuC UDP-N-acetyl
  • the genetically modified microorganism of this embodiment produces oligosaccharides having an LNT backbone, preferably at least one of LNFPI and LST-a, it is preferable that the parent strain has at least one of FucT activity and SiaT activity, and it is even more preferable that the activity is enhanced.
  • LacY is a membrane protein that takes up lactose, which is a substrate for LNT, into cells.
  • LgtA is an enzyme involved in the production of LNTII from lactose and uridine diphosphate-N-acetylglucosamine (hereinafter referred to as UDP-GlcNAc).
  • GlmS, GlmM and GlmU are enzymes involved in the biosynthetic pathway producing UDP-GlcNAc, which is involved in the production of LNTII from lactose.
  • GalT is an enzyme involved in the production of LNT from LNTII, as shown in FIG.
  • Pgm, GalU, GalE, and GalF are enzymes involved in the pathway producing uridine diphosphate galactose (hereinafter referred to as UDP-Gal), which is involved in the production of LNT from LNTII.
  • Pgi is an enzyme involved in the pathway that produces LNTII.
  • ManA, ManB, ManC, Gmd, and Fcl are enzymes involved in the supply of GDP-fucose necessary for the production of LNFPI.
  • NeuC, NeuB, and NeuA are enzymes involved in the supply of CMP-sialic acid necessary for the production of LST-a or LST-b.
  • FucT is an enzyme involved in the pathway that produces LNFPI from LNT and fucose.
  • SiaT is an enzyme involved in the pathway that produces LST-a or LST-b from LNT.
  • a nucleotide sequence encoding LacY (e.g., accession number BAE76125), a nucleotide sequence encoding LgtA (e.g., SEQ ID NO: 22), a nucleotide sequence encoding GlmS (e.g., accession number BAE77559), a nucleotide sequence encoding GlmM (e.g., accession number BAE77220), a nucleotide sequence encoding GlmU (e.g., accession number BAE77558), a nucleotide sequence encoding GalT (e.g., SEQ ID NO: 20), a nucleotide sequence encoding Pgm (e.g., SEQ ID NO: 21), a nucleotide sequence encoding GlmS (e.g., accession number BAE77559), a nucleotide sequence encoding GlmM (e.g.,
  • a genetically modified microorganism as a parent strain, which contains at least one base sequence selected from the base sequence encoding GalU (e.g., accession number BAA35337.1), the base sequence encoding GalU (e.g., accession number BAA36104.1), the base sequence encoding GalE (e.g., accession number BAA35421.1), the base sequence encoding GalF (e.g., accession number BAA15896.1), and the base sequence encoding Pgi (e.g., accession number BAE78027.1).
  • a genetically modified microorganism as a parent strain, which contains a base sequence encoding LacY, a base sequence encoding LgtA, and a base sequence encoding GalT.
  • the genetically modified microorganism has an increased LNT productivity compared to a parent strain that has not been genetically modified.
  • a base sequence encoding LacY (e.g., accession number BAE76125), a base sequence encoding LgtA (e.g., SEQ ID NO: 22), a base sequence encoding GlmS (e.g., accession number BAE77559), a base sequence encoding GlmM (e.g., accession number BAE77220), a base sequence encoding GlmU (e.g., accession number BAE77223), a base sequence encoding GlmU (e.g., accession number BAE77224), a base sequence encoding GlmS (e.g., accession number BAE77225), a base sequence encoding GlmU (e.g., accession number BAE77226), a base sequence encoding GlmU (e.g., accession number BAE77226), a base sequence encoding GlmU (e.g., accession number BAE77226),
  • BAA35337.1 a nucleotide sequence encoding GalU (e.g., Accession No. BAA36104.1); a nucleotide sequence encoding GalE (e.g., Accession No. BAA35421.1); a nucleotide sequence encoding GalF (e.g., Accession No. BAA15896.1); a nucleotide sequence encoding Pgi (e.g., Accession No.
  • a nucleotide sequence encoding ManA (e.g., accession number BAA15361), a nucleotide sequence encoding ManB (e.g., accession number BAA15901.1), a nucleotide sequence encoding ManC (e.g., accession number BAA15905), a nucleotide sequence encoding Gmd (e.g., accession number BAA15909), a nucleotide sequence encoding Fcl (e.g., accession number BAA15908), a nucleotide sequence encoding NeuC (e.g., accession number BAA15909 ...
  • a genetically modified microorganism as the parent strain, which contains at least one base sequence selected from the base sequence encoding NeuB (e.g., accession number CAL43338), the base sequence encoding NeuB (e.g., accession number YP_002344534), the base sequence encoding NeuA (e.g., accession number AAK02271), the base sequence encoding FucT (e.g., accession number BBB25221), and the base sequence encoding SiaT (e.g., accession number BAA25316).
  • the base sequence encoding NeuB e.g., accession number CAL43338
  • the base sequence encoding NeuB e.g., accession number YP_002344534
  • the base sequence encoding NeuA e.g., accession number AAK02271
  • FucT e.g., accession number BBB25221
  • SiaT e.g., accession number B
  • the parent strain has reduced or absent ⁇ -galactosidase (hereinafter referred to as LacZ) activity.
  • the genetically modified microorganism of this embodiment produces oligosaccharides having an LNT backbone and LNT, it is preferable that the parent strain has reduced or absent WcaJ activity and WcaJM activity in addition to the above-mentioned LacZ activity.
  • LacZ is an enzyme that hydrolyzes lactose, which is a substrate for LNT, and therefore, the decrease in lactose supply can be suppressed by eliminating LacZ activity.
  • WcaJ and WcaJM are enzymes involved in the metabolism of GDP-fucose to colanic acid, and blocking them can increase the supply of GDP-fucose.
  • a genetically modified microorganism as the parent strain, which preferably has reduced or absent LacZ activity, and more preferably does not contain a base sequence encoding LacZ.
  • the genetically modified microorganism has increased LNT productivity compared to a non-genetically modified parent strain.
  • a genetically modified microorganism that produces oligosaccharides having an LNT backbone and LNT
  • a method for producing E. coli in which at least one activity selected from the group consisting of LacZ activity, WcaJ activity, and WcaJM activity has been reduced or lost may be a known method. Specific examples include methods using various genetic manipulations (Metabolic Engineering, 2017, 41:23-38), etc.
  • An example of a genetically modified microorganism in which the activity of a protein according to any one of [1] to [3] above is enhanced compared to a parent strain microorganism is a microorganism in which the copy number of the gene is increased compared to the parent strain, the microorganism being obtained by transforming a parent strain microorganism with a recombinant DNA containing a DNA encoding the protein.
  • Microorganisms that have an increased copy number of a gene compared to the parent strain, obtained by transforming a parent strain microorganism with recombinant DNA containing DNA encoding a protein described in any one of [1] to [3] above include microorganisms in which the copy number of the gene on the chromosomal DNA has been increased by transforming a parent strain microorganism with recombinant DNA containing DNA encoding a protein described in any one of [1] to [3] above, and microorganisms that have the gene outside the chromosomal DNA as plasmid DNA.
  • the DNA encoding the protein according to any one of [1] to [3] above may be any DNA encoding a protein having the activity of the protein according to any one of [1] to [3] above, and specifically includes a DNA selected from the group consisting of the following [8] to [11]: [8] A DNA encoding the protein according to any one of [1] to [3] above.
  • a DNA consisting of at least one of the base sequences selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 18, 19, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 88, 107, 109, 111, 113, 122, 123, 124, 125, and 126.
  • the recombinant DNA containing the DNA encoding the protein described in any one of [1] to [3] above includes the recombinant DNA containing the DNA described in any one of [8] to [11] above.
  • the recombinant DNA containing the DNA described in any one of [8] to [11] above refers to a recombinant DNA that is incorporated into an expression vector that is capable of autonomous replication in a parent strain or of being integrated into a chromosome and that contains a promoter at a position where the DNA can be transcribed.
  • hybridize means that DNA hybridizes to DNA having a specific base sequence or a part of the DNA. Therefore, the DNA having the specific base sequence or a part of the DNA can be used as a probe for Northern or Southern blot analysis, and can also be used as an oligonucleotide primer for PCR analysis.
  • DNA used as a probe can be at least 100 bases long, preferably at least 200 bases long, and more preferably at least 500 bases long.
  • DNA used as a primer can be at least 10 bases long, and preferably at least 15 bases long.
  • hybridization conditions can be set according to those described in Molecular Cloning, 4th Edition (2012), Methods for General and Molecular Bacteriology, ASM Press (1994), Immunology methods manual, Academic Press (1996), and many other standard textbooks.
  • DNA that hybridizes under stringent conditions can be obtained by following the instructions that come with a commercially available hybridization kit.
  • An example of a commercially available hybridization kit is the Random Primed DNA Labeling Kit (manufactured by Roche Diagnostics), which prepares a probe by the random prime method and performs hybridization under stringent conditions.
  • the above-mentioned stringent conditions include incubating the DNA-immobilized filter and the probe DNA overnight at 42°C in a solution containing 50% formamide, 5xSSC (750 mmol/l sodium chloride, 75 mmol/l sodium citrate), 50 mmol/l sodium phosphate (pH 7.6), 5xDenhardt's solution, 10% dextran sulfate, and 20 ⁇ g/l denatured salmon sperm DNA, and then washing the filter in a 0.2xSSC solution at about 65°C, for example.
  • 5xSSC 750 mmol/l sodium chloride, 75 mmol/l sodium citrate
  • 50 mmol/l sodium phosphate pH 7.6
  • 5xDenhardt's solution 10% dextran sulfate
  • 20 ⁇ g/l denatured salmon sperm DNA 20 ⁇ g/l denatured salmon sperm DNA
  • DNA that can hybridize under the above-mentioned stringent conditions include DNA that has an identity of at least 95%, preferably 97%, more preferably 98%, and most preferably 99% to DNA consisting of at least one of the base sequences selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 18, 19, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 88, 107, 109, 111, 113, 122, 123, 124, 125, and 126, when calculated based on the above-mentioned parameters using, for example, BLAST or FASTA.
  • a microorganism having an increased copy number of the gene compared to the parent strain, obtained by transforming a parent strain microorganism with a recombinant DNA containing DNA encoding a protein described in any one of [1] to [3] above, can be obtained by the following method.
  • the DNA encoding the protein of [1] described in [8] above and the DNA of [9] above can be designed based on at least one of the base sequences selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 18, 19, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 88, 107, 109, 111, 113, 122, 123, 124, 125, and 126.
  • the DNA can be obtained by Southern hybridization to a chromosomal DNA library of a microorganism, preferably a microorganism belonging to the genus Escherichia coli, more preferably the Escherichia coli W3110S strain, using a probe DNA corresponding to the base sequence, or by PCR [PCR Protocols, Academic Press (1990)] using primer DNA that can be designed based on the base sequence and the chromosomal DNA of the above microorganism as a template.
  • a chromosomal DNA library of a microorganism preferably a microorganism belonging to the genus Escherichia coli, more preferably the Escherichia coli W3110S strain
  • primer DNA that can be designed based on the base sequence and the chromosomal DNA of the above microorganism as a template.
  • the Escherichia coli W3110S strain is available from the National Institute of Technology and Evaluation (NITE) Biological Resource Center.
  • the DNA encoding the mutant protein of [2] above can be obtained by subjecting a DNA consisting of at least one of the base sequences selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 18, 19, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 88, 107, 109, 111, 113, 122, 123, 124, 125, and 126, as a template to error-prone PCR or the like.
  • DNA encoding the mutant protein described above in [2] can be obtained by PCR [Gene, 77, 51 (1989)] using a pair of PCR primers each having a base sequence at the 5' end designed to introduce the desired mutation (deletion, substitution, insertion or addition).
  • the DNA can also be obtained by following the instructions that come with a commercially available site-specific mutagenesis kit.
  • a commercially available site-specific mutagenesis kit is the PrimeSTAR (registered trademark) Mutagenesis Basal Kit (manufactured by Takara Bio Inc.), which can introduce a mutation (deletion, substitution, insertion, or addition) at the desired position.
  • a pair of primers for introducing mutations is designed using a plasmid as a template having a base sequence designed to introduce the desired mutation (deletion, substitution, insertion or addition).
  • the overlapping portion contains the desired mutation.
  • PCR is performed using the primers for introducing mutations and a plasmid as a template having the base sequence into which the desired mutation is to be introduced.
  • the amplified fragment obtained in this way is transformed into E. coli, resulting in a plasmid having a base sequence into which the desired mutation has been introduced.
  • the DNA encoding the homologous protein of [3] above, and the DNA of [10] and [11] above, for example, can be detected by searching various gene sequence databases for base sequences having an identity of 60% or more, preferably 65% or more, 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more, preferably 97% or more, more preferably 98% or more, and most preferably 99% or more, to at least any one of the base sequences selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 18, 19, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 88, 107, 109, 111, 113, 122, 123, 124, 125, and 126, in the following order, or by searching various protein sequences.
  • the sequence database is searched for amino acid sequences that have an identity of 60% or more, preferably 65% or more, 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more, preferably 97% or more, more preferably 98% or more, and most preferably 99% or more, to at least one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 89, 106, 108, 110, and 112, in the following order, and the DNA or primer DNA that can be designed based on the base sequence or amino acid sequence obtained by the search, and a microorganism having the DNA, can be obtained by a method similar to the method for obtaining the DNA described above.
  • a DNA fragment of an appropriate length containing a portion that encodes the protein is prepared as necessary.
  • bases in the base sequence of the portion that encodes the protein so that it has optimal codons for expression in a host cell, a transformant with improved productivity can be obtained.
  • Information on the frequency of codon usage in the parent strain used in the production method of this embodiment can be obtained through public databases.
  • the DNA fragment is inserted downstream of the promoter of an appropriate expression vector to produce recombinant DNA.
  • a microorganism By transforming a parent strain with the recombinant DNA, a microorganism can be obtained in which the copy number of the gene encoding the protein is increased compared to the parent strain.
  • the recombinant DNA is preferably a recombinant DNA composed of a promoter, a ribosome binding sequence, the DNA described in any one of [8] to [11] above, and a transcription termination sequence.
  • a gene that controls the promoter may also be included. It is preferable to use a plasmid in which the distance between the Shine-Dalgarno sequence, which is a ribosome binding sequence, and the initiation codon is adjusted to an appropriate distance (for example, 6 to 18 bases).
  • a transcription termination sequence is not necessarily required for expression of the DNA, but it is preferable to place a transcription termination sequence immediately downstream of the structural gene.
  • examples of the expression vector include pColdI, pSTV28, pSTV29, pUC118 (all manufactured by Takara Bio Inc.), pMW118, pMW119 (all manufactured by Nippon Gene Co., Ltd.), pET21a, pCOLADuet-1, pCDFDuet-1, pUAKQE31 (Appl. Environ. Microbiol.
  • the promoter may be any promoter that functions in the cells of a microorganism belonging to the genus Escherichia, and examples of such promoters include promoters derived from Escherichia coli or phages, such as the trp promoter (P trp ), lac promoter (P lac ), P L promoter, P R promoter, and P SE promoter.
  • examples of such promoters include artificially designed and modified promoters, such as a promoter in which two P trp promoters are connected in series, a tac promoter, a lacT7 promoter, and a letI promoter.
  • examples of the expression vector include pCG1 (JP Patent Publication No. 57-134500), pCG2 (JP Patent Publication No. 58-35197), pCG4 (JP Patent Publication No. 57-183799), pCG11 (JP Patent Publication No. 57-134500), pCG116, pCE54, pCB101 (all JP Patent Publication No. 58-105999), pCE51, pCE52, and pCE53 (all Molecular and General Genetics, 196, 175 (1984)).
  • any promoter that functions in the cells of a microorganism belonging to the genus Corynebacterium may be used, but for example, the P54-6 promoter [Appl. Microbiol. Biotechnol., 53, 674-679 (2000)] can be used.
  • examples of the expression vector include YEp13 (ATCC37115), YEp24 (ATCC37051), YCp50 (ATCC37419), pHS19, pHS15, etc.
  • any promoter that functions in the cells of a yeast strain may be used, and examples of such promoters include the PHO5 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH promoter, gal1 promoter, gal10 promoter, heat shock polypeptide promoter, MF ⁇ 1 promoter, and CUP1 promoter.
  • the recombinant DNA used in the manufacturing method of this embodiment can be prepared by inserting any one of the DNA fragments described in [8] to [11] above downstream of the promoter of an appropriate expression vector.
  • the method of integrating recombinant DNA into the chromosome of a host cell includes, for example, the homologous recombination method.
  • the homologous recombination method uses a plasmid for homologous recombination that can be prepared by linking with a plasmid DNA having a drug resistance gene that cannot autonomously replicate in the host cell to be introduced.
  • a method using homologous recombination that is frequently used in Escherichia coli includes a method of introducing recombinant DNA using the homologous recombination system of lambda phage [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 6640-6645 (2000)].
  • That the recombinant DNA has been introduced into the parent strain as an autonomously replicable plasmid or incorporated into the chromosome of the parent strain can be confirmed, for example, by a method in which a gene that is originally present on the chromosomal DNA of a microorganism cannot be amplified, but an amplified product is confirmed by PCR using a primer set that can amplify the gene introduced by transformation.
  • an increase in the amount of transcription of the DNA or the amount of production of the protein encoded by the DNA can be confirmed by a method in which the amount of transcription of the gene in the microorganism is compared with that of the parent strain by Northern blotting, or the amount of production of the protein in the microorganism is compared with that of the parent strain by Western blotting.
  • the microorganism constructed by the above method is a microorganism in which the activity of the protein described in any one of the above [1] to [3] is enhanced compared to the parent strain can be confirmed by culturing the microorganism, appropriately diluting the culture solution, centrifuging it, and analyzing the LNT contained in at least one of the supernatant and the bacterial cells using a sugar analyzer or the like, and comparing it with that of the parent strain.
  • microorganism constructed by the above method is a microorganism in which the activity of the protein according to any one of [1] to [3] above is enhanced compared to the parent strain can also be confirmed by, for example, measuring the amount of the protein produced by the microorganism and the amount of the protein produced by the parent strain of the microorganism by Western blotting and comparing them.
  • microorganisms can improve LNT productivity by enhancing the activity of the protein described in any one of [1] to [3] above compared to the parent strain.
  • An example of such a microorganism is the CGLY/pSTV29-MhpT strain, which enhances the expression of the MhpT gene, as described later in the Examples.
  • Methods for producing oligosaccharides include the following methods. 1. A method for producing oligosaccharides, comprising preparing the genetically modified microorganism described above in 1. and producing oligosaccharides in at least one of a culture supernatant and intracellular space using the genetically modified microorganism.
  • the oligosaccharide produced is preferably at least one of an oligosaccharide having an LNT backbone and LNT, and more preferably at least one of LNT, LNFPI and LST-a.
  • the method for culturing the microorganisms mentioned above in 1. can be carried out according to the usual method used for culturing microorganisms.
  • the medium for culturing the microorganism may be either a natural medium or a synthetic medium, so long as it contains a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, etc. that the microorganism can assimilate, and allows the transformant to be cultured efficiently.
  • the carbon source may be anything that the microorganism can assimilate, such as glucose, fructose, sucrose, sugars containing these, such as molasses, starch, or starch hydrolysates, organic acids such as acetic acid or propionic acid, or alcohols such as glycerol, ethanol, or propanol.
  • Nitrogen sources include, for example, ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate, ammonium phosphate, and other ammonium salts of inorganic or organic acids, as well as other nitrogen-containing compounds, as well as peptone, meat extract, yeast extract, corn steep liquor, casein hydrolysate, soybean meal, soybean meal hydrolysate, various fermentation bacteria and their digested products, etc.
  • inorganic salts include potassium dibasic phosphate, potassium dibasic phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous sulfate, manganese sulfate, copper sulfate, calcium carbonate, etc.
  • a microorganism having the ability to produce a carbohydrate that can be a substrate for oligosaccharides, such as glucose, lactose, or lactose monohydrate may be used.
  • a microorganism having the ability to produce glucose and galactosyltransferase may be used.
  • a microorganism having the ability to produce glucose and having ⁇ 1,4-galactosyltransferase introduced therein may be used.
  • glucose, lactose, lactose monohydrate, or the like may be added to the medium during the culture.
  • glucose may be added to the medium during the culture.
  • ⁇ 1,4-galactosyltransferase is introduced into the microorganism, glucose may be added to the medium during the culture.
  • a microorganism capable of producing glucose, lactose, lactose monohydrate, or the like from sugar may be simultaneously cultured with the microorganism of this embodiment, thereby supplying glucose, lactose, lactose monohydrate, or the like to the microorganism of this embodiment.
  • Cultivation is preferably carried out under aerobic conditions, such as shaking culture or deep aeration stirring culture.
  • the culture temperature is usually 30 to 37°C, and the culture time is usually 24 hours to 3 days.
  • the pH of the culture solution during cultivation is usually maintained at 6.0 to 9.0.
  • the pH is adjusted using inorganic or organic acids, alkaline solutions, urea, calcium carbonate, ammonia, etc.
  • oligosaccharides are produced and accumulated in at least one of the culture supernatant and the bacterial cells, and oligosaccharides can be produced by collecting them from at least one of the culture supernatant and the bacterial cells.
  • oligosaccharides can be collected from the supernatant. If oligosaccharides accumulate within the cells, the cells can be disrupted, centrifuged to remove the cells, and the resulting supernatant can be used to collect oligosaccharides by ion exchange resin methods.
  • the gist of the present invention is as follows. ⁇ 1>> A genetically modified microorganism in which the activity of at least one protein selected from the group consisting of MhpT, YfcJ, EmrD, YdeE, GlcNAc permease, GalNAc permease, Shewanella genus sugar MFS transporter, Blon_2344, Blon_2343, Blon_2342, Blon_2347, Blon_2346, Blon_2345, Blon_2361, Blon_2360, Blon_2359, Bifidobacterium breve-derived ABC transporter, and Bifidobacterium breve-derived galactoside symporter is enhanced and produces LNT.
  • ⁇ 2>> The genetically modified microorganism according to ⁇ 1>> above, wherein the GlcNAc permease is NagP derived from a bacterium belonging to the genus Shewanella, and the GalNAc permease is AgaP derived from a bacterium belonging to the genus Shewanella.
  • ⁇ 3>> A genetically modified microorganism described in ⁇ 1>> or ⁇ 2>> above, in which the activity of the protein described in [1] below is enhanced.
  • a protein consisting of at least one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 89, 106, 108, 110, and 112.
  • ⁇ 4>> A genetically modified microorganism described in any one of ⁇ 1>> to ⁇ 3>> above, in which the activity of the protein described in [2] or [3] below is enhanced and LNT productivity is improved compared to that of a parent strain.
  • a mutant protein consisting of an amino acid sequence represented by at least one selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 89, 106, 108, 110, and 112, in which 1 to 20 amino acids have been deleted, substituted, inserted or added.
  • a homologous protein having an amino acid sequence having 60% or more identity to at least one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 89, 106, 108, 110, and 112.
  • ⁇ 5>> A genetically modified microorganism described in any one of ⁇ 1>> to ⁇ 3>> above, which has been modified as described in any one of [4] to [7] below.
  • [4] A modification that enhances the activity of each of the proteins consisting of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 64, 65, and 66.
  • [5] A modification that enhances the activity of each of the proteins consisting of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 67, 68, and 69.
  • [6] A modification that enhances the activity of each of the proteins consisting of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 70, 71, and 72.
  • [7] A modification that enhances the activity of each of the proteins consisting of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 106, 108, and 110.
  • ⁇ 6>> A genetically modified microorganism according to any one of ⁇ 1>> to ⁇ 5>> above, which produces oligosaccharides having an LNT backbone.
  • ⁇ 7>> The genetically modified microorganism described in ⁇ 6>> above, wherein the oligosaccharide having an LNT backbone is at least one of lacto-N-fucopentaose I (LNFPI) and sialyllacto-N-tetraose a (LST-a).
  • LNFPI lacto-N-fucopentaose I
  • LST-a sialyllacto-N-tetraose a
  • ⁇ 8>> The genetically modified microorganism described in any one of ⁇ 1>> to ⁇ 7>> above, wherein the genetically modified microorganism is Escherichia coli.
  • ⁇ 9>> A method for producing oligosaccharides, comprising preparing a genetically modified microorganism described in any one of ⁇ 1>> to ⁇ 8>> above, and using the genetically modified microorganism to produce oligosaccharides in at least one of a culture supernatant and intracellular space.
  • ⁇ 10>> The method for producing an oligosaccharide described in ⁇ 9>> above, wherein the oligosaccharide is at least one selected from the group consisting of LNT, LNFPI and LST-a.
  • Example 1 Creation of a microorganism for use in the production of lacto-N-tetraose (LNT) (1) Acquisition of a DNA fragment used as a marker for gene deletion PCR was performed using DNA consisting of the base sequences represented by SEQ ID NOs: 24 and 25 as a primer set and pCatSac (Appl Environ Microbiol (2013) 79, 3033-3039) as a template to obtain a cat-sacB fragment containing a chloramphenicol-resistant cat gene and a sucrose-sensitive sacB gene.
  • LNT lacto-N-tetraose
  • LacZ gene DNA encoding ⁇ -galactosidase
  • LacY gene DNA encoding lactose permease
  • PCR was performed using DNA consisting of the base sequence shown in "Primer set" in Table 2 as a primer set to amplify each DNA fragment.
  • LacZ upstream 1 and LacZ upstream 2 include the region from the start codon of the LacZ gene to approximately 1000 bp upstream of the start codon.
  • LacY downstream 1 and LacY downstream 2 include the region from approximately 50 bp downstream of the stop codon of the LacY gene to approximately 1000 bp downstream.
  • LacZY::cat-sacB DNA fragment consisting of a sequence in which the cat-sacB fragment was inserted into the sequence of the region surrounding the LacZ and LacY genes.
  • PCR was performed using DNA consisting of the base sequences represented by SEQ ID NOs: 58 and 61 as a primer set to obtain a DNA fragment (hereinafter referred to as ⁇ LacZY) that does not contain LacZY and consists of a sequence in which the upstream of LacZ and the downstream of LacY are directly linked.
  • the LacZY::cat-sacB fragment was introduced by electroporation into the W3110S strain carrying the plasmid pKD46 [Datsenko, K. A., Warner, B. L., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, Vol. 97, 6640-6645 (2000)], which contains a gene encoding ⁇ recombinase, to obtain a transformant that exhibited chloramphenicol resistance and sucrose sensitivity (a transformant in which the LacZY gene had been replaced with LacZY::cat-sacB).
  • the ⁇ LacZY fragment was introduced into the transformant by electroporation to obtain a transformant that was sensitive to chloramphenicol and resistant to sucrose (a transformant in which LacZY::cat-sacB was replaced by ⁇ LacZY). From these, a transformant that was sensitive to ampicillin (a transformant in which pKD46 had been lost) was further obtained.
  • the transformant was named W3110S ⁇ LacZY.
  • a PCR was performed using an equimolar mixture of the cv ⁇ 3GalT fragment, the NpLgtA fragment, and the LacY fragment as a template and DNA consisting of the base sequences represented by SEQ ID NOs: 26 and 31 as a primer set to obtain a DNA fragment in which the three fragments were linked (hereinafter referred to as cv ⁇ 3GalT-NpLgtA-LacY).
  • a PCR was performed using a primer set consisting of DNA with the base sequences represented by SEQ ID NOs: 32 and 33 and the plasmid pUAKQE31 (Appl. Environ. Microbiol. 2007, 73: 6378-6385) as a template to obtain a vector fragment of approximately 4.7 kb.
  • the DNA represented by SEQ ID NO:20 is a DNA encoding ⁇ 1,3-Gal transferase derived from Chromobacterium violaceum
  • the DNA represented by SEQ ID NO:22 is a DNA encoding ⁇ 1,3-GlcNAc transferase derived from Neisseria polysaccharea ATCC43768 strain.
  • the base sequences of the genes encoding these enzymes have been codon-optimized for expression in Escherichia coli, and were prepared by artificial synthesis.
  • SEQ ID NO:26 has a sequence complementary to the 3' end of the pUAKQE fragment added to the 5' region
  • SEQ ID NO:31 has a sequence complementary to the 5' end of the pUAKQE fragment added to the 3' region.
  • the expression vector pUAKQE-cv ⁇ 3GalT-NpLgtA-LacY was obtained by ligating the cv ⁇ 3GalT-NpLgtA-LacY fragment and the vector fragment obtained above using In-Fusion HD Cloning Kit (Takara Bio).
  • the above expression plasmid pUAKQE-cv ⁇ 3GalT-NpLgtA-LacY was used to transform the W3110S ⁇ LacZY strain constructed above to create an E. coli strain carrying pUAKQE-cv ⁇ 3GalT-NpLgtA-LacY, which was named CGLY strain.
  • HpGalT-NpLgtA-LacY The HpGalT fragment, NpLgtA fragment and LacY fragment were mixed in an equimolar ratio as a template, and PCR was performed using DNA consisting of the base sequences represented by SEQ ID NOs: 129 and 134 as a primer set to obtain a DNA fragment in which the three fragments were linked (hereinafter referred to as HpGalT-NpLgtA-LacY).
  • DNA consisting of the base sequences represented by SEQ ID NOs: 135 and 136 as a primer set was performed using plasmid pTK31 (Appl Environ Microbiol. 2007 Oct; 73(20):6378-85.) as a template to obtain a vector fragment of approximately 3.8 kb.
  • the DNA represented by SEQ ID NO:127 is a DNA encoding ⁇ 1,4-Gal transferase derived from Helicobacter pylori strain
  • the DNA represented by SEQ ID NO:22 is a DNA encoding ⁇ 1,3-GlcNAc transferase derived from Neisseria polysaccharea ATCC43768 strain.
  • the DNAs are codon-optimized DNAs for expression in Escherichia coli, and were prepared by artificial synthesis.
  • SEQ ID NO:129 has a sequence complementary to the 3' end of the pTK31 fragment added to its 5' region
  • SEQ ID NO:134 has a sequence complementary to the 5' end of the pTK31 fragment added to its 3' region.
  • HGLY strain The above expression plasmid pTK31-HpGalT-NpLgtA-LacY was used to transform the W3110S ⁇ LacZY strain constructed above to construct an E. coli strain carrying pTK31-HpGalT-NpLgtA-LacY, which was named HGLY strain.
  • PCR was performed using DNA consisting of the base sequences shown in “Primer Set” in Tables 5 and 6 as a primer set and DNA shown in “Template” in Tables 5 and 6 as a template to obtain each amplified DNA fragment.
  • the DNAs represented by SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 86, 90, 92, and 94 were amplified by PCR using the genomic DNA of the Escherichia coli W3110S strain prepared by a conventional method as a template and DNA consisting of the base sequences represented by the "primer set" in Table 5 as a primer set.
  • the DNA represented by SEQ ID NO: 73 is a DNA in which the base sequence of the gene encoding GlcNAc permease derived from Shewanella sp. ANA3 strain has been codon-optimized for expression in Escherichia coli, and was prepared by artificial synthesis.
  • the DNA represented by SEQ ID NO: 74 is a DNA in which the base sequence of the gene encoding GlcNAc permease derived from Shewanella amazonensis SB2B strain has been codon-optimized for expression in Escherichia coli, and was prepared by artificial synthesis.
  • the DNA shown by SEQ ID NO:126 is a codon-optimized DNA for expressing the base sequence of the gene encoding GlcNAc permease derived from Shewanella sp. MR4 strain in Escherichia coli, and was prepared by artificial synthesis. For these DNAs, PCR was carried out using DNAs consisting of the base sequences shown in "Primer Set" in Table 5 as a primer set to amplify each DNA fragment.
  • the DNA shown in SEQ ID NO:75 is a DNA in which the base sequence of the gene encoding GalNAc permease derived from Shewanella sp. ANA3 strain has been codon-optimized to express it in E. coli, and was prepared by artificial synthesis.
  • the DNA shown in SEQ ID NO:76 is a DNA in which the base sequence of the gene encoding GalNAc permease derived from Shewanella sp. MR4 strain has been codon-optimized to express it in E. coli, and was prepared by artificial synthesis. PCR was performed on these DNAs using DNA consisting of the base sequences shown in "Primer Set" in Table 5 as a primer set, and each DNA fragment was amplified.
  • the DNA represented by SEQ ID NO:17 was prepared by performing PCR using the genomic DNA of a Bifidobacterium longum subsp. Infantis strain prepared by a conventional method, which was used as a template to generate the base sequences of the genes encoding the ABC transporters Blon_2344, Blon_2343, and Blon_2342, as well as the DNA sequences shown in "Primer Set” in Table 6 as a primer set, to amplify the DNA fragment with the three genes linked together, thereby obtaining the Blon_2344-2342 fragment.
  • the DNA represented by SEQ ID NO:18 was prepared by performing PCR using the genomic DNA of a Bifidobacterium longum subsp. Infantis strain prepared by a conventional method, which was used as a template to generate the base sequences of the genes encoding the ABC transporters Blon_2347, Blon_2346, and Blon_2345 derived from Bifidobacterium longum subsp. Infantis, and the DNA fragment consisting of the base sequences shown in "Primer Set" in Table 6 was used as a primer set to amplify the DNA fragment with the three genes linked together, thereby obtaining the Blon_2347-2345 fragment.
  • the DNA represented by SEQ ID NO:19 was prepared by performing PCR using the genomic DNA of a Bifidobacterium longum subsp. Infantis strain prepared by a conventional method as a template and DNA consisting of the base sequence represented by the "primer set” in Table 6 as a primer set to amplify the DNA fragment with the three genes linked together, thereby obtaining the Blon_2361-2359 fragment.
  • the DNAs represented by SEQ ID NOs: 107, 109, and 111 are DNAs in which the base sequence of the gene encoding the ABC transporter derived from Bifidobacterium breve has been codon-optimized for expression in Escherichia coli, and were prepared by artificial synthesis.
  • PCR was performed on these DNAs using DNAs consisting of the base sequences shown in "Primer Set” in Table 6 as a primer set to amplify each DNA fragment, and then PCR was performed using a mixture of the Bbr_1590 fragment, the Bbr_1589 fragment, and the Bbr_1588 fragment in an equimolar ratio as a template, and DNAs consisting of the base sequences shown by SEQ ID NOs: 114 and 119 as a primer set to obtain the Bbr_1590-1588 fragment in which the three fragments are linked.
  • the DNA represented by SEQ ID NO:113 is a DNA in which the base sequence of the gene encoding the galactoside symporter derived from Bifidobacterium breve has been codon-optimized for expression in Escherichia coli, and was prepared by artificial synthesis. PCR was performed on this DNA using DNA consisting of the base sequence represented by "Primer set" in Table 6 as a primer set, and each DNA fragment was amplified.
  • a PCR was performed using the DNA consisting of the base sequences represented by SEQ ID NOs: 34 and 35 as a primer set and the plasmid pSTV29 (Takara Bio) as a template to obtain a vector fragment of approximately 3.0 kb.
  • sequences complementary to the 3' end of the pSTV29 fragment are added to the 5' region of sequences in sequence numbers 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 96, 98, 100, 102, 104, 114, and 120, and sequences complementary to the 5' end of the pSTV29 fragment are added to the 3' region of sequences in sequence numbers 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 97, 99, 101, 103, 105, 119, and 121.
  • coli strains having various plasmids namely, CGLY/pSTV29-MhpT strain, CGLY/pSTV29-YfcJ strain, CGLY/pSTV29-EmrD strain, CGLY/pSTV29-YdeE strain, CGLY/pSTV29-SetB strain, CGLY/pSTV29-SetC strain, CGLY/pSTV29-YnfM strain, CGLY/pSTV29-MdtD strain, CGLY/pST V29-NagP (ANA3) strain, CGLY/pSTV29-NagP (Sama) strain, CGLY/pSTV29-NagP (MR4), CGLY/pST V29-AgaP (ANA3) strain, CGLY/pSTV29-AgaP (MR4) strain, CGLY/pSTV29-(Blon_2344-2342) strain, CG CGLY/pSTV29-(
  • Example 2 Production of lacto-N-tetraose (LNT) and lacto-N-neotetraose (LNnT)
  • CGLY/pSTV29-NagP (Sama) strain, CGLY/pSTV29-NagP (MR4), CGLY/pSTV29-AgaP (ANA3) strain, CGLY/pSTV29-AgaP (MR4) strain, CGLY/pSTV29- (Blon_2344-2342) strain, CGLY/pSTV29- (Blon_2347-2345) strain, CGLY/pSTV29- (Blon_2361-2359) strain, CGLY/pSTV29- LNT productivity of strains HGLY/pSTV29-(Bbr_1590-1588), CGLY/pSTV29-(Bbr_1551), and CGLY/Ctrl, and strains HGLY/pSTV29-MhpT, HGLY/pSTV29-YfcJ, HGLY/pSTV29-EmrD, HGLY/pSTV29-Y
  • Each strain was cultured for 16 hours at 30°C on an LB plate containing 100 mg/L kanamycin and 25 mg/L chloramphenicol, and then inoculated into a test tube containing 2 mL of LB medium containing 100 mg/L kanamycin (and 25 mg/L chloramphenicol for the CGLY strain-derived producer), and cultured with shaking at 30°C for 16 hours.
  • the resulting culture solution was then transferred to a production medium containing 100 mg/L kanamycin and 25 mg/L chloramphenicol [glucose 30 g/L, lactose monohydrate or magnesium sulfate heptahydrate 2 g/L, dipotassium hydrogen phosphate 16 g/L, potassium dihydrogen phosphate 14 g/L, ammonium sulfate 2 g/L, citric acid 1 g/L, casamino acids 5 g/L, thiamine hydrochloride 10 mg/L, ferrous sulfate heptahydrate 50 mg/L, manganese sulfate pentahydrate 10 mg/L (Except for glucose, lactose monohydrate, and magnesium sulfate heptahydrate, the pH was adjusted to 7.2 with aqueous sodium hydroxide solution before autoclaving) (Aqueous solutions containing glucose, lactose monohydrate, and magnesium sulfate heptahydrate were prepared separately, auto
  • the culture solution was centrifuged, appropriately diluted, and the cells were disrupted, and the LNT and LNnT contained in the supernatant and the cells were analyzed using a sugar analyzer ICS-6000.
  • the results are shown in Tables 7 to 10.
  • the total LNT amount is the sum of the amount of LNT outside the cells (supernatant) and the amount of LNT inside the cells.
  • the LNT contained in the supernatant and cells was analyzed simultaneously for the four strains listed in Table 7, and the LNT contained in the supernatant for the six strains listed in Table 9.
  • the LNnT contained in the supernatant for the four strains listed in Table 8 and the six strains listed in Table 10 were analyzed simultaneously.
  • Tables 7 and 9 show that the production of extracellular and total LNT is improved in the CGLY/pSTV29-MhpT, CGLY/pSTV29-YfcJ, CGLY/pSTV29-EmrD, and CGLY/pSTV29-YdeE strains compared to the control strain CGLY/Ctrl.
  • the CGLY/pSTV29-EmrD and CGLY/pSTV29-YdeE strains showed that the production of total LNT was improved by 1.7 times or more compared to the control strain CGLY/Ctrl.
  • the LNT contained in the supernatant and intracellular tissue was analyzed simultaneously for the six strains listed in Table 11.
  • Table 11 The results shown in Table 11 indicate that the CGLY/pSTV29-NagP(ANA3), CGLY/pSTV29-NagP(Sama), CGLY/pSTV29-NagP(MR4), CGLY/pSTV29-AgaP(ANA3), and CGLY/pSTV29-AgaP(MR4) strains exhibit improved extracellular and total LNT production compared to the control strain, CGLY/Ctrl.
  • CGLY/pSTV29-NagP ANA3
  • CGLY/pSTV29-NagP Sama
  • CGLY/pSTV29-AgaP MR4 strains were shown to have a total LNT production rate of 1.5 times or more compared to the control strain CGLY/Ctrl.
  • Table 11 in terms of total LNT production rate, particularly good results were shown when CGLY/pSTV29-NagP (ANA3), CGLY/pSTV29-NagP (Sama), and CGLY/pSTV29-AgaP (MR4) strains were used.
  • CGLY/pSTV29-NagP ANA3
  • CGLY/pSTV29-NagP Sama
  • CGLY/pSTV29-AgaP ANA3
  • CGLY/pSTV29-AgaP MR4 strains were shown to improve extracellular and total LNT production as well as the extracellular ratio of LNT compared to the control strain CGLY/Ctrl.
  • the LNT contained in the supernatant and intracellular space of the four strains listed in Table 12 was analyzed simultaneously.
  • the results shown in Table 12 indicate that the production of extracellular and total LNT is improved in the CGLY/pSTV29-(Blon_2344-2342), CGLY/pSTV29-(Blon_2347-2345), and CGLY/pSTV29-(Blon_2361-2359) strains compared to the control strain, CGLY/Ctrl.
  • the CGLY/pSTV29-(Blon_2347-2345) strain showed the highest improvement in total LNT production, at 1.95 times that of the control strain CGLY/Ctrl.
  • the CGLY/pSTV29-(Blon_2347-2345) strain showed particularly good results in terms of total LNT production.
  • the CGLY/pSTV29-(Blon_2361-2359) strain was shown to have the greatest improvement in extracellular LNT production, at 2.44 times that of the control strain CGLY/Ctrl.
  • the CGLY/pSTV29-(Blon_2361-2359) strain showed particularly good results in terms of extracellular LNT production.
  • the CGLY/pSTV29-(Blon_2344-2342), CGLY/pSTV29-(Blon_2347-2345) and CGLY/pSTV29-(Blon_2361-2359) strains were shown to have improved extracellular and total LNT production as well as an improved extracellular ratio of LNT compared to the control strain CGLY/Ctrl.
  • the CGLY/pSTV29-(Blon_2361-2359) strain was shown to have the greatest improvement in the extracellular ratio of LNT, at 1.3 times, compared to the control strain CGLY/Ctrl.
  • Table 12 in terms of improving the extracellular ratio, particularly good results were observed when using the CGLY/pSTV29-(Blon_2361-2359) strain.
  • the LNT contained in the supernatant and intracellular space was analyzed simultaneously.
  • the LNnT contained in the supernatant and intracellular space was analyzed simultaneously.
  • SEQ ID NO: 1 Base sequence of MhpT
  • SEQ ID NO: 2 Amino acid sequence of MhpT (Accession No.: WP_000107627.1)
  • SEQ ID NO: 3 Base sequence of YfcJ
  • SEQ ID NO: 4 Amino acid sequence of YfcJ (Accession No.: WP_000127781.1)
  • SEQ ID NO: 5 Base sequence of EmrD
  • SEQ ID NO: 6 Amino acid sequence of EmrD (Accession No.: WP_000828746.1)
  • SEQ ID NO: 7 Base sequence of YdeE
  • SEQ ID NO: 8 Amino acid sequence of YdeE (Accession No.: WP_001054204.1)
  • SEQ ID NO: 10 Amino acid sequence of NagP (ANA3) (Accession No.: WP_011716320.1)
  • SEQ ID NO: 11

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Abstract

本発明は、ＭｈｐＴ、ＹｆｃＪ、ＥｍｒＤ、ＹｄｅＥ、ＧｌｃＮＡｃ　ｐｅｒｍｅａｓｅ、ＧａｌＮＡｃ　ｐｅｒｍｅａｓｅ、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ属細菌由来ｓｕｇａｒ　ＭＦＳ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ、Ｂｌｏｎ＿２３４４、Ｂｌｏｎ＿２３４３、Ｂｌｏｎ＿２３４２、Ｂｌｏｎ＿２３４７、Ｂｌｏｎ＿２３４６、Ｂｌｏｎ＿２３４５、Ｂｌｏｎ＿２３６１、Ｂｌｏｎ＿２３６０、Ｂｌｏｎ＿２３５９、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｂｒｅｖｅ由来ＡＢＣトランスポーター、及びＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｂｒｅｖｅ由来ガラクトシドシンポーターからなる群より選択される少なくともいずれか１つの蛋白質の活性が増強され、かつ、ＬＮＴを生産する、遺伝子改変微生物に関する。

Description

遺伝子改変微生物、及びオリゴ糖の製造方法
　本発明は、遺伝子改変微生物、及びオリゴ糖の製造方法に関する。
　ヒトの母乳中に含まれるオリゴ糖（Ｈｕｍａｎ　Ｍｉｌｋ　Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ、以下ＨＭＯ）はプレバイオティクス素材として注目されており、乳幼児の認知機能発達や感染防御、腸内環境の改善などに有効であることが示されている（非特許文献１）。
　ＨＭＯ中の主要なオリゴ糖の１つはＬａｃｔｏ－Ｎ－ｔｅｔｒａｏｓｅ（ラクト－Ｎ－テトラオース、以下「ＬＮＴ」とも称する。）とそのフコシル化またはシアリル化誘導体であり、ＬＮＴは母乳中に比較的多く含まれているため、母乳に近い粉ミルクを製造するために、ＬＮＴの効率的な合成プロセス開発が求められている。ＬＮＴの製造法としては、ラクトースを添加基質としてβ－１、３－ＧｌｃＮＡｃ　ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅやβ１－３－Ｇａｌａｃｔｏｓｙｌ　ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅなどの糖転移酵素を導入した微生物発酵法が知られている。また、ＬＮＴの化学的・酵素的な合成法も公知であるが、プロセスの複雑さなどの課題がある（非特許文献２）。
　先行技術においては、Ｅ．ｃｏｌｉ由来ＭｄｆＡがＬＮＴ生産大腸菌内部から菌体外へのＬＮＴ輸送に関与し、当該蛋白質をコードする遺伝子を過剰発現させることでＬＮＴの生産量が向上することが報告されている（特許文献１）。
　ＬＮＴ以外のＨＭＯの輸送体としては、２－フコシルラクトースおよび３－フコシルラクトースの排出に関わる大腸菌由来ＳｅｔＡ蛋白質、ＭｄｆＡ蛋白質、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ　ｃｒａｓｓａ由来ＣＤＴ－２蛋白質などが報告されている（特許文献２及び３、並びに非特許文献３）。
国際公開第２０１７／０４２３８２号 日本国特許第５５８０４０８号明細書 国際公開第２０２１／０１３７０８号
Ｉｎｔ　Ｊ　Ｐｅｄｉａｔｒ．　２０１９　Ａｕｇ　４；２０１９：２３９０２４０． Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ　Ｒｅｓ．　２０１９　Ｄｅｃ　１；４８６：１０７８２４． Ｍｅｔａｂ　Ｅｎｇ．　２０１９　Ｍａｒ；５２：２３２－２４２．
　上述したように、ＬＮＴを含むＨＭＯは近年その機能性が注目されており、効率的なＬＮＴの生産を実現する手段として、ＬＮＴの生産性向上に寄与する蛋白質の更なる探索が求められている。
　したがって、本発明は、ＬＮＴの生産性に優れる微生物の提供及び該微生物を用いるオリゴ糖の製造方法の提供を目的とする。
　本発明者らは、ＭｈｐＴ、ＹｆｃＪ、ＥｍｒＤ、ＹｄｅＥ、ＧｌｃＮＡｃ　ｐｅｒｍｅａｓｅ、ＧａｌＮＡｃ　ｐｅｒｍｅａｓｅ、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ属細菌由来ｓｕｇａｒ　Ｍａｊｏｒ　Ｆａｃｉｌｉｔａｔｏｒ　Ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ（以下、「ＭＦＳ」とも称する。）　ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ、Ｂｌｏｎ＿２３４４　、Ｂｌｏｎ＿２３４３、Ｂｌｏｎ＿２３４２、Ｂｌｏｎ＿２３４７、Ｂｌｏｎ＿２３４６、Ｂｌｏｎ＿２３４５、Ｂｌｏｎ＿２３６１、Ｂｌｏｎ＿２３６０、Ｂｌｏｎ＿２３５９、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｂｒｅｖｅ由来ＡＴＰ－ｂｉｎｄｉｎｇ　ｃａｓｓｅｔｔｅトランスポーター（以下、「ＡＢＣトランスポーター」とも称する）、及びＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｂｒｅｖｅ由来トランスポーター（Ｂｂｒ＿１５５１）よりなる群より選択される少なくともいずれか１つの蛋白質の活性が増強された遺伝子改変微生物は、親株に比べてＬＮＴの生産性が向上することを見出し、本発明を完成させた。
　すなわち、本発明は以下の通りである。
＜１＞ＭｈｐＴ、ＹｆｃＪ、ＥｍｒＤ、ＹｄｅＥ、ＧｌｃＮＡｃ　ｐｅｒｍｅａｓｅ、ＧａｌＮＡｃ　ｐｅｒｍｅａｓｅ、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ属細菌由来ｓｕｇａｒ　ＭＦＳ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ、Ｂｌｏｎ＿２３４４、Ｂｌｏｎ＿２３４３、Ｂｌｏｎ＿２３４２、Ｂｌｏｎ＿２３４７、Ｂｌｏｎ＿２３４６、Ｂｌｏｎ＿２３４５、Ｂｌｏｎ＿２３６１、Ｂｌｏｎ＿２３６０、Ｂｌｏｎ＿２３５９、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｂｒｅｖｅ由来ＡＢＣトランスポーター、及びＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｂｒｅｖｅ由来ガラクトシドシンポーターからなる群より選択される少なくともいずれか１つの蛋白質の活性が増強され、かつ、ＬＮＴを生産する、遺伝子改変微生物。
＜２＞前記ＧｌｃＮＡｃ　ｐｅｒｍｅａｓｅがＳｈｅｗａｎｅｌｌａ属細菌由来ＮａｇＰであり、前記ＧａｌＮＡｃ　ｐｅｒｍｅａｓｅがＳｈｅｗａｎｅｌｌａ属細菌由来ＡｇａＰである、上記＜１＞に記載の遺伝子改変微生物。
＜３＞下記［１］に記載の蛋白質の活性が増強された、上記＜１＞又は＜２＞に記載の遺伝子改変微生物。
［１］配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、８９、１０６、１０８、１１０、及び１１２からなる群より選択される少なくともいずれか１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質。
＜４＞下記［２］又は［３］に記載の蛋白質の活性が増強され、かつ、親株に比べてラクト－Ｎ－テトラオース（ＬＮＴ）の生産性が向上した、上記＜１＞又は＜２＞に記載の遺伝子改変微生物。
［２］配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、８９、１０６、１０８、１１０、及び１１２からなる群より選択される少なくともいずれか１で表されるアミノ酸配列において、１～２０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなる変異蛋白質。
［３］配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、８９、１０６、１０８、１１０、及び１１２からなる群より選択される少なくともいずれか１で表されるアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる相同蛋白質。
＜５＞下記［４］～［７］のいずれか１に記載の改変が加えられた上記＜１＞又は＜２＞に記載の遺伝子改変微生物。
［４］　配列番号６４、６５及び６６で表されるアミノ酸配列からなるそれぞれの蛋白質の活性を増強する改変。
［５］　配列番号６７、６８及び６９で表されるアミノ酸配列からなるそれぞれの蛋白質の活性を増強する改変。
［６］　配列番号７０、７１及び７２で表されるアミノ酸配列からなるそれぞれの蛋白質の活性を増強する改変。
［７］　配列番号１０６、１０８及び１１０で表されるアミノ酸配列からなるそれぞれの蛋白質の活性を増強する改変。
＜６＞ＬＮＴ骨格を有するオリゴ糖を生産する、上記＜１＞又は＜２＞に記載の遺伝子改変微生物。
＜７＞前記ＬＮＴ骨格を有するオリゴ糖が、ラクト－Ｎ－フコペンタオ－スＩ（ＬＮＦＰＩ）及びシアリルラクト－Ｎ－テトラオースａ（ＬＳＴ－ａ）のうち少なくとも１つである、上記＜６＞に記載の遺伝子改変微生物。
＜８＞前記遺伝子改変微生物が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）である、上記＜１＞又は＜２＞に記載の遺伝子改変微生物。
＜９＞上記＜１＞又は＜２＞に記載の遺伝子改変微生物を調製すること、及び当該遺伝子改変微生物を用いて培養上清中及び菌体内の少なくとも一方にオリゴ糖を生産することを含む、オリゴ糖の製造方法。
＜１０＞前記オリゴ糖が、ラクト－Ｎ－テトラオース（ＬＮＴ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオ－スＩ（ＬＮＦＰＩ）及びシアリルラクト－Ｎ－テトラオースａ（ＬＳＴ－ａ）からなる群より選択される少なくとも１つである、上記＜９＞に記載のオリゴ糖の製造方法。
　本実施態様に係る微生物は、特定の蛋白質の活性が増強されていることでＬＮＴの生産性を向上し得る。したがって、本実施態様に係る微生物を用いることで、効率的に、ＬＮＴを生産できる。
図１は、本発明の一実施態様に係る微生物における、ＬＮＴの生合成経路の模式図を示す。
１．ＬＮＴを生産する遺伝子改変微生物
　本実施態様の微生物は、ＭｈｐＴ、ＹｆｃＪ、ＥｍｒＤ、ＹｄｅＥ、ＧｌｃＮＡｃ　ｐｅｒｍｅａｓｅ、ＧａｌＮＡｃ　ｐｅｒｍｅａｓｅ、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ属細菌由来ｓｕｇａｒ　ＭＦＳ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ、Ｂｌｏｎ＿２３４４、Ｂｌｏｎ＿２３４３、Ｂｌｏｎ＿２３４２、Ｂｌｏｎ＿２３４７、Ｂｌｏｎ＿２３４６、Ｂｌｏｎ＿２３４５、Ｂｌｏｎ＿２３６１、Ｂｌｏｎ＿２３６０、Ｂｌｏｎ＿２３５９、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｂｒｅｖｅ由来ＡＢＣトランスポーター、及びＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｂｒｅｖｅ由来ガラクトシドシンポーターよりなる群より選択される少なくともいずれか１つの蛋白質の活性が増強された、ＬＮＴを生産する遺伝子改変微生物である。
　ここで、「ＬＮＴを生産する」とは、前記遺伝子改変微生物の培養物中、すなわち培養上清中（菌体外、ともいう）及び菌体内の少なくとも一方にＬＮＴを生産することを意味する。ＬＮＴの生産量は、後述の分析装置等を用いて、前記遺伝子改変微生物の培養物中のＬＮＴを検出することにより確認できる。また、「ＴｏｔａｌのＬＮＴ生産量」とは、定量した菌体外のＬＮＴ量と菌体内のＬＮＴ量を合算したものである。なお、「菌体外比率」とは、生産したＴｏｔａｌのＬＮＴ生産量に対する菌体外のＬＮＴ量の割合（菌体外のＬＮＴ量／ＴｏｔａｌのＬＮＴ生産量）のことである。
　また、本実施態様の微生物は、ｍｅｍｂｒａｎｅ－ｂｏｕｎｄ　ｌｙｔｉｃ　ｍｕｒｅｉｎ　ｔｒａｎｓｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ　ＭｌｔＦ及びｓｏｄｉｕｍ：ｐｒｏｔｏｎ　ａｎｔｉｐｏｒｔｅｒの少なくともいずれか一方の蛋白質の活性が増強されたＬＮＴを生産する遺伝子改変微生物であってもよい。
　前記遺伝子改変微生物は、ＬＮＴを生産する微生物であり、親株に比べてＬＮＴの生産性が向上している微生物であることが好ましい。ここで、生産されたＬＮＴは、最終生産物でもよく、中間生産物であってもよい。ＬＮＴは他のオリゴ糖の前駆体にもなりえるため、前記のＬＮＴを生産する遺伝子改変微生物は、ＬＮＴ骨格を有するオリゴ糖等のオリゴ糖を生産しうる。例えば、前記遺伝子改変微生物は、菌体内で生産したＬＮＴを中間体として、最終生成物であるＬＮＴ骨格を有するオリゴ糖を更に生産してもよい。
＜オリゴ糖＞
　本明細書において、オリゴ糖としては、少なくとも３つの部分から構成される糖ポリマーを意味し、即ち、三糖類、四糖類、五糖類等を含み、好ましくはＬＮＴや、ＬＮＴ骨格を有するオリゴ糖が挙げられる。
　本明細書において、ＬＮＴ骨格を有するオリゴ糖とは、ＬＮＴをコア４糖として含むヒトミルクオリゴ糖であることが好ましい。なお、本明細書において、ＬＮＴを「コア４糖」として含むヒトミルクオリゴ糖とは、所望のオリゴ糖の還元末端に相当する４糖としてＬＮＴを含むことを意味し、場合により、主要部分に相当する前記特定の４糖と共に別の糖部分も含む。
　本明細書において、ＬＮＴ骨格を有するオリゴ糖としては、例えば、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩ（以下、「ＬＮＦＰＩ」とも称する。）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩＩ（以下、「ＬＮＦＰＩＩ」とも称する。）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＶ（以下、「ＬＮＦＰＶ」とも称する。）、シアリルラクト－Ｎ－テトラオース－ａ（以下、「ＬＳＴ－ａ」とも称する。）、シアリルラクト－Ｎ－テトラオース－ｂ（以下、「ＬＳＴ－ｂ」とも称する。）、ジシアリルラクト－Ｎ－テトラオース（以下、「ＤＳＬＮＴ」とも称する。）、ラクト－Ｎ－ヘキサオース（以下、「ＬＮＨ」とも称する。）、ラクト－Ｎ－ジフコシルヘキサオースＩ（以下、「ＬＮＤＦＨＩ」とも称する。）、ラクト－Ｎ－ジフコシルヘキサオースＩＩ（以下、「ＬＮＤＦＨＩＩ」とも称する。）等が挙げられる。なお、ＬＮＴ骨格を有するオリゴ糖にはＬＮＴは含まれない。
　本実施態様において、前記ＬＮＴ骨格を有するオリゴ糖はＬＮＦＰＩおよびＬＳＴ－ａの少なくとも一方であることが好ましく、ＬＮＦＰＩおよびＬＳＴ－ａの前駆体はＬＮＴであることがより好ましい。
　前記ＬＮＴを生産する遺伝子改変微生物がＬＮＦＰＩを生産するためには、更にα１、２－フコシルトランスフェラーゼ（以下、ＦｕｃＴという）の活性が増強されていることが好ましい。ＦｕｃＴとしては、例えば、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｃｅａｅ　ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ＤＳＭ　１００９７０由来ＦｕｃＴ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ　ｓｐ．由来ＦｕｃＴ、Ｇｒａｍｅｌｌａ　ｆｏｒｓｅｔｉｉ由来ＦｕｃＴ（国際公開第２０１９／００８１３３号）等が挙げられる。また、ＧＤＰ－フコースの生合成経路に関する蛋白質として、例えばホスホマンノムターゼ（以下、ＭａｎＢという）、マンノース―１―リン酸グアニリルトランスフェラーゼ（以下、ＭａｎＣという）、ＧＤＰ－マンノース４，６デヒドラターゼ（以下、Ｇｍｄという）、ＧＤＰ－Ｌ－フコースシンテターゼ（以下、Ｆｃｌという）等の少なくとも一つの活性を更に増強しても良い。フコシル化オリゴ糖の生合成に必要な蛋白質の活性が強化された遺伝子改変微生物の調整方法としては、例えば日本国特表２０１５－５２９４５３、国際公開第２０１９／００８１３３号などに記載の方法が挙げられる。
　前記ＬＮＴを生産する遺伝子改変微生物がＬＳＴ－ａを生産するためには、更にα－２、３－シアリルトランスフェラーゼ（以下、ｓｉａＴという）、及びシアル酸（Ｎ－アセチルノイラミン酸、ともいう）の生合成に必要な蛋白質の活性が増強されていることが好ましい。ｓｉａＴとしては、例えば、パスツレラ・マルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｍｕｌｔｏｃｉｄａ）　ＰＭ７０由来ｓｉａＴ（日本国特許第４２７５５２９号明細書）、Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属由来ｓｉａＴ（日本国特表２０２０－５２８２８０号公報）などが挙げられる。シアル酸の生合成に必要な蛋白質としては、例えば、ＵＤＰ－Ｎ－アセチルグルコサミン―２－エピメラーゼ（以下、ＮｅｕＣという）活性、Ｎ－アセチルノイラミン酸シンターゼ（以下、ＮｅｕＢという）活性、アシルノイラミン酸シチジルトランスフェラーゼ（以下、ＮｅｕＡという）活性等の少なくとも一つの活性を更に増強しても良い。シアル酸及びシアリル化オリゴ糖の生合成に必要な蛋白質の活性が強化された遺伝子改変微生物の調整方法としては、例えば、日本国特許第４２７５５２９号明細書、日本国特許第６４４１８０６号明細書、日本国特許第３９４６４２３号明細書に記載の方法が挙げられる。
　各種オリゴ糖を表１にも示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
＜活性が増強された蛋白質＞
（大腸菌内在性トランスポーター：ＭｈｐＴ、ＹｆｃＪ、ＥｍｒＤ、ＹｄｅＥ）
　ＭｈｐＴ（３－ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌｐｒｏｐｉｏｎｉｃ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）、ＹｆｃＪ、ＥｍｒＤ（Ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｄ）、ＹｄｅＥは、大腸菌内在性トランスポーターである。
　ＭｈｐＴのアミノ酸配列としては、例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列が挙げられる。ＭｈｐＴをコードするＤＮＡの塩基配列としては、例えば配列番号１で表される塩基配列が挙げられる。
　ＹｆｃＪのアミノ酸配列としては、例えば、配列番号４で表されるアミノ酸配列が挙げられる。ＹｆｃＪをコードするＤＮＡの塩基配列としては、例えば配列番号３で表される塩基配列が挙げられる。
　ＥｍｒＤのアミノ酸配列としては、例えば、配列番号６で表されるアミノ酸配列が挙げられる。ＥｍｒＤをコードするＤＮＡの塩基配列としては、例えば配列番号５で表される塩基配列が挙げられる。
　ＹｄｅＥのアミノ酸配列としては、例えば、配列番号８で表されるアミノ酸配列が挙げられる。ＹｄｅＥをコードするＤＮＡの塩基配列としては、例えば配列番号７で表される塩基配列が挙げられる。
（ＧｌｃＮＡｃ　ｐｅｒｍｅａｓｅ）
　ＧｌｃＮＡｃ　ｐｅｒｍｅａｓｅとしては、ＮａｇＰ等が挙げられる。
　ＮａｇＰとしては、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ属細菌由来ＮａｇＰが好ましい。Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ属細菌由来ＮａｇＰとして、具体的には、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ　ｓｐ．　ＡＮＡ３由来ＮａｇＰ（以下、「ＮａｇＰ（ＡＮＡ３）」とも称する。）、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ　ａｍａｚｏｎｅｎｓｉｓ　ＳＢ２Ｂ由来ＮａｇＰ（以下、「ＮａｇＰ（Ｓａｍａ）」とも称する。）、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ　ｓｐ．　ＭＲ４由来ＮａｇＰ（以下、「ＮａｇＰ（ＭＲ４）」とも称する。）等が挙げられる。
　また、本実施態様におけるＧｌｃＮＡｃ　ｐｅｒｍｅａｓｅは、ｍｅｍｂｒａｎｅ－ｂｏｕｎｄ　ｌｙｔｉｃ　ｍｕｒｅｉｎ　ｔｒａｎｓｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ　ＭｌｔＦ又はｓｏｄｉｕｍ：ｐｒｏｔｏｎ　ａｎｔｉｐｏｒｔｅｒとしての機能を有するものであってもよい。
　Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ　ｓｐ．　ＡＮＡ３由来ＮａｇＰのアミノ酸配列としては、例えば、配列番号１０で表されるアミノ酸配列が挙げられる。Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ　ｓｐ．　ＡＮＡ３由来ＮａｇＰをコードするＤＮＡの塩基配列としては、例えば配列番号９で表される塩基配列が挙げられる。大腸菌の発現に最適なコドンとなるように塩基を置換した、コドン最適化型ＮａｇＰ（ＡＮＡ３）の塩基配列としては、例えば配列番号７３で表される塩基配列が挙げられる。
　なお、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ　ｓｐ．　ＡＮＡ３由来ＮａｇＰはｍｅｍｂｒａｎｅ－ｂｏｕｎｄ　ｌｙｔｉｃ　ｍｕｒｅｉｎ　ｔｒａｎｓｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ　ＭｌｔＦとしても知られている。
　Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ　ａｍａｚｏｎｅｎｓｉｓ　ＳＢ２Ｂ由来ＮａｇＰのアミノ酸配列としては、例えば、配列番号１２で表されるアミノ酸配列が挙げられる。Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ　ａｍａｚｏｎｅｎｓｉｓ　ＳＢ２Ｂ由来ＮａｇＰをコードするＤＮＡの塩基配列としては、例えば配列番号１１で表される塩基配列が挙げられる。大腸菌の発現に最適なコドンとなるように塩基を置換した、コドン最適化型ＮａｇＰ（Ｓａｍａ）の塩基配列としては、例えば配列番号７４で表される塩基配列が挙げられる。
　なお、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ　ａｍａｚｏｎｅｎｓｉｓ　ＳＢ２Ｂ由来ＮａｇＰはｓｏｄｉｕｍ：ｐｒｏｔｏｎ　ａｎｔｉｐｏｒｔｅｒとしても知られている。
　Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ　ｓｐ．　ＭＲ４由来ＮａｇＰのアミノ酸配列としては、例えば、配列番号８９で表されるアミノ酸配列が挙げられる。Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ　ｓｐ．　ＭＲ４由来ＮａｇＰをコードするＤＮＡの塩基配列としては、例えば配列番号８８で表される塩基配列が挙げられる。大腸菌の発現に最適なコドンとなるように塩基を置換した、コドン最適化型ＮａｇＰ（ＭＲ４）の塩基配列としては、例えば配列番号１２６で表される塩基配列が挙げられる。
　なお、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ　ｓｐ．　ＭＲ４由来ＮａｇＰはｓｕｇａｒ　ＭＦＳ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒとしても知られている。
（ＧａｌＮＡｃ　ｐｅｒｍｅａｓｅ）
　ＧａｌＮＡｃ　ｐｅｒｍｅａｓｅとしては、ＡｇａＰ等が挙げられる。
　ＡｇａＰとしては、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ属細菌由来ＡｇａＰが好ましい。Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ属細菌由来ＡｇａＰとして、具体的には、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ　ｓｐ．　ＡＮＡ３由来ＡｇａＰ（以下、「ＡｇａＰ（ＡＮＡ３）」とも称する。）、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ　ｓｐ．　ＭＲ－４由来ＡｇａＰ（以下、「ＡｇａＰ（ＭＲ４）」とも称する。）等が挙げられる。
　Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ　ｓｐ．　ＡＮＡ３由来ＡｇａＰのアミノ酸配列としては、例えば、配列番号１４で表されるアミノ酸配列が挙げられる。Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ　ｓｐ．　ＡＮＡ３由来ＡｇａＰをコードするＤＮＡの塩基配列としては、例えば配列番号１３で表される塩基配列が挙げられる。大腸菌の発現に最適なコドンとなるように塩基を置換した、コドン最適化型ＡｇａＰ（ＡＮＡ３）の塩基配列としては、例えば配列番号７５で表される塩基配列が挙げられる。
　Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ　ｓｐ．　ＭＲ－４由来ＡｇａＰのアミノ酸配列としては、例えば、配列番号１６で表されるアミノ酸配列が挙げられる。Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ　ｓｐ．　ＭＲ－４由来ＡｇａＰをコードするＤＮＡの塩基配列としては、例えば配列番号１５で表される塩基配列が挙げられる。大腸菌の発現に最適なコドンとなるように塩基を置換した、コドン最適化型ＡｇａＰ（ＭＲ４）の塩基配列としては、例えば配列番号７６で表される塩基配列が挙げられる。
（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ属細菌由来ｓｕｇａｒ　ＭＦＳ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）
　Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ属細菌由来ｓｕｇａｒ　ＭＦＳ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒとして、具体的には、ＮａｇＰ（ＭＲ４）、ＡｇａＰ（ＡＮＡ３）、ＡｇａＰ（ＭＲ４）等が挙げられる。
（Ｂｌｏｎ＿２３４４、Ｂｌｏｎ＿２３４３、Ｂｌｏｎ＿２３４２、Ｂｌｏｎ＿２３４７、Ｂｌｏｎ＿２３４６、Ｂｌｏｎ＿２３４５、Ｂｌｏｎ＿２３６１、Ｂｌｏｎ＿２３６０、Ｂｌｏｎ＿２３５９）
　Ｂｌｏｎ＿２３４４、Ｂｌｏｎ＿２３４３、Ｂｌｏｎ＿２３４２、Ｂｌｏｎ＿２３４７、Ｂｌｏｎ＿２３４６、Ｂｌｏｎ＿２３４５、Ｂｌｏｎ＿２３６１、Ｂｌｏｎ＿２３６０、Ｂｌｏｎ＿２３５９は、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｌｏｎｇｕｍ　ｓｕｂｓｐ．　Ｉｎｆａｎｔｉｓ由来ＡＢＣトランスポーターである。
　Ｂｌｏｎ＿２３４４のアミノ酸配列としては、例えば、配列番号６４で表されるアミノ酸配列が挙げられる。Ｂｌｏｎ＿２３４４をコードするＤＮＡの塩基配列としては、例えば配列番号７７で表される塩基配列が挙げられる。
　Ｂｌｏｎ＿２３４３のアミノ酸配列としては、例えば、配列番号６５で表されるアミノ酸配列が挙げられる。Ｂｌｏｎ＿２３４３をコードするＤＮＡの塩基配列としては、例えば配列番号７８で表される塩基配列が挙げられる。
　Ｂｌｏｎ＿２３４２のアミノ酸配列としては、例えば、配列番号６６で表されるアミノ酸配列が挙げられる。Ｂｌｏｎ＿２３４２をコードするＤＮＡの塩基配列としては、例えば配列番号７９で表される塩基配列が挙げられる。
　Ｂｌｏｎ＿２３４４をコードするＤＮＡ、Ｂｌｏｎ＿２３４３をコードするＤＮＡ及びＢｌｏｎ＿２３４２をコードするＤＮＡを含む塩基配列としては、例えば配列番号１７で表される塩基配列が挙げられる。
　Ｂｌｏｎ＿２３４７のアミノ酸配列としては、例えば、配列番号６７で表されるアミノ酸配列が挙げられる。Ｂｌｏｎ＿２３４７をコードするＤＮＡの塩基配列としては、例えば配列番号８０で表される塩基配列が挙げられる。
　Ｂｌｏｎ＿２３４６のアミノ酸としては、例えば、配列番号６８で表されるアミノ酸配列が挙げられる。Ｂｌｏｎ＿２３４６をコードするＤＮＡの塩基配列としては、例えば配列番号８１で表される塩基配列が挙げられる。
　Ｂｌｏｎ＿２３４５のアミノ酸としては、例えば、配列番号６９で表されるアミノ酸配列が挙げられる。Ｂｌｏｎ＿２３４５をコードするＤＮＡの塩基配列としては、例えば配列番号８２で表される塩基配列が挙げられる。
　Ｂｌｏｎ＿２３４７をコードするＤＮＡ、Ｂｌｏｎ＿２３４６をコードするＤＮＡ及びＢｌｏｎ＿２３４５をコードするＤＮＡを含む塩基配列としては、例えば配列番号１８で表される塩基配列が挙げられる。
　Ｂｌｏｎ＿２３６１のアミノ酸配列としては、例えば、配列番号７０で表されるアミノ酸配列が挙げられる。Ｂｌｏｎ＿２３６１をコードするＤＮＡの塩基配列としては、例えば配列番号８３で表される塩基配列が挙げられる。
　Ｂｌｏｎ＿２３６０のアミノ酸としては、例えば、配列番号７１で表されるアミノ酸配列が挙げられる。Ｂｌｏｎ＿２３６０をコードするＤＮＡの塩基配列としては、例えば配列番号８４で表される塩基配列が挙げられる。
　Ｂｌｏｎ＿２３５９のアミノ酸としては、例えば、配列番号７２で表されるアミノ酸配列が挙げられる。Ｂｌｏｎ＿２３５９をコードするＤＮＡの塩基配列としては、例えば配列番号８５で表される塩基配列が挙げられる。
　Ｂｌｏｎ＿２３６１をコードするＤＮＡ、Ｂｌｏｎ＿２３６０をコードするＤＮＡ及びＢｌｏｎ＿２３５９をコードするＤＮＡを含む塩基配列としては、例えば配列番号１９で表される塩基配列が挙げられる。
　Ｂｌｏｎ＿２３４４、Ｂｌｏｎ＿２３４３、Ｂｌｏｎ＿２３４２、Ｂｌｏｎ＿２３４７、Ｂｌｏｎ＿２３４６、Ｂｌｏｎ＿２３４５、Ｂｌｏｎ＿２３６１、Ｂｌｏｎ＿２３６０及びＢｌｏｎ＿２３５９からなる群より選択される少なくともいずれか１つの蛋白質の活性が増強された遺伝子改変微生物は、親株に比べてラクト－Ｎ－ネオテトラオース（ＬＮｎＴ）の生産性が向上していなくてもよい。
（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｂｒｅｖｅ由来ＡＢＣトランスポーター）
　Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｂｒｅｖｅ由来ＡＢＣトランスポーターとしては、Ｂｂｒ＿１５９０、Ｂｂｒ＿１５８９、Ｂｂｒ＿１５８８等が挙げられる。
　Ｂｂｒ＿１５９０のアミノ酸配列としては、例えば、配列番号１０６で表されるアミノ酸配列が挙げられる。Ｂｂｒ＿１５９０をコードするＤＮＡの塩基配列としては、例えば配列番号１２２で表される塩基配列が挙げられる。大腸菌の発現に最適なコドンとなるように塩基を置換した、コドン最適化型Ｂｂｒ＿１５９０の塩基配列としては、例えば配列番号１０７で表される塩基配列が挙げられる。
　Ｂｂｒ＿１５８９のアミノ酸配列としては、例えば、配列番号１０８で表されるアミノ酸配列が挙げられる。Ｂｂｒ＿１５８９をコードするＤＮＡの塩基配列としては、例えば配列番号１２３で表される塩基配列が挙げられる。大腸菌の発現に最適なコドンとなるように塩基を置換した、コドン最適化型Ｂｂｒ＿１５８９の塩基配列としては、例えば配列番号１０９で表される塩基配列が挙げられる。
　Ｂｂｒ＿１５８８のアミノ酸配列としては、例えば、配列番号１１０で表されるアミノ酸配列が挙げられる。Ｂｂｒ＿１５８８をコードするＤＮＡの塩基配列としては、例えば配列番号１２４で表される塩基配列が挙げられる。大腸菌の発現に最適なコドンとなるように塩基を置換した、コドン最適化型Ｂｂｒ＿１５８８の塩基配列としては、例えば配列番号１１１で表される塩基配列が挙げられる。
（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｂｒｅｖｅ由来ガラクトシドシンポーター）
　Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｂｒｅｖｅ由来ガラクトシドシンポーターとしては、Ｂｂｒ＿１５５１等が挙げられる。Ｂｂｒ＿１５５１のアミノ酸配列としては、例えば、配列番号１１２で表されるアミノ酸配列が挙げられる。Ｂｂｒ＿１５５１をコードするＤＮＡの塩基配列としては、例えば配列番号１２５で表される塩基配列が挙げられる。大腸菌の発現に最適なコドンとなるように塩基を置換した、コドン最適化型Ｂｂｒ＿１５５１の塩基配列としては、例えば配列番号１１３で表される塩基配列が挙げられる。
＜遺伝子改変微生物＞
　本実施態様の遺伝子改変微生物としては、下記［１］に記載の蛋白質の活性が増強された、遺伝子改変微生物が好ましい。このような遺伝子改変微生物は、親株に比べてＬＮＴの生産性が向上している。
［１］配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、８９、１０６、１０８、１１０、及び１１２からなる群より選択される少なくともいずれか１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質。
　本明細書において、「配列番号Ｘ、Ｙ及びＺで表されるアミノ酸配列からなる蛋白質」とは、「配列番号Ｘで表されるアミノ酸配列、配列番号Ｙで表されるアミノ酸配列及び配列番号Ｚで表されるアミノ酸配列からなるひとつの蛋白質」であってもよいし、「配列番号Ｘで表されるアミノ酸配列からなる蛋白質、配列番号Ｙで表されるアミノ酸配列からなる蛋白質及び配列番号Ｚで表されるアミノ酸配列からなる蛋白質の組み合わせ」であってもよい。ここで、Ｘ、Ｙ、Ｚは任意の整数である。
　菌体外のＬＮＴの生産量の観点で、上記［１］に記載の蛋白質としては、配列番号８で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質、配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質、配列番号１２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質、配列番号１６で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質、配列番号６４ないし６６で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質、配列番号６７ないし６９で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質、又は配列番号７０ないし７２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質がより好ましい。
　更には、配列番号８で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質、配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質、配列番号１２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質、又は配列番号７０ないし７２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質が最も好ましい。
　ＴｏｔａｌのＬＮＴの生産量の観点で、上記［１］に記載の蛋白質としては、配列番号４で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質、配列番号６で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質、配列番号８で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質、配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質、配列番号１２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質、配列番号１６で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質、配列番号６４ないし６６で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質、配列番号６７ないし６９で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質、又は配列番号７０ないし７２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質がより好ましい。
　更には、配列番号８で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質、配列番号１６で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質、配列番号６４ないし６６で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質、配列番号６７ないし６９で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質、及び配列番号７０ないし７２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質が最も好ましい。
　また、本実施態様の遺伝子改変微生物としては、下記［２］又は［３］に記載の蛋白質の活性が増強され、かつ、親株に比べてＬＮＴの生産性が向上した、遺伝子改変微生物も好ましい。
［２］配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、８９、１０６、１０８、１１０、及び１１２からなる群より選択される少なくともいずれか１で表されるアミノ酸配列において、１～２０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなる変異蛋白質。
［３］配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、８９、１０６、１０８、１１０、及び１１２からなる群より選択される少なくともいずれか１で表されるアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる相同蛋白質。
　本実施態様の遺伝子改変微生物としては、下記［４］～［７］のいずれか１に記載の改変が加えられた遺伝子改変微生物も挙げられる。
［４］　配列番号６４、６５及び６６で表されるアミノ酸配列からなるそれぞれの蛋白質の活性を増強する改変。
［５］　配列番号６７、６８及び６９で表されるアミノ酸配列からなるそれぞれの蛋白質の活性を増強する改変。
［６］　配列番号７０、７１及び７２で表されるアミノ酸配列からなるそれぞれの蛋白質の活性を増強する改変。
［７］　配列番号１０６、１０８及び１１０で表されるアミノ酸配列からなるそれぞれの蛋白質の活性を増強する改変。
　本実施態様の遺伝子改変微生物としては、配列番号２，４，６及び８からなる群より選択される少なくともいずれか１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質の活性と、配列番号から１０、１２、１４、１６、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、８９、１０６、１０８、１１０及び１１２からなる群より選択される少なくともいずれか１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質の活性がいずれも増強された、遺伝子改変微生物も挙げられる。
（生産性）
　本明細書において、生産性とは、微生物が生産した対象物のオリゴ糖を当該微生物の培養物中、すなわち培養上清中（菌体外、ともいう）及び菌体内の少なくとも一方に蓄積させる能力のことをいう。微生物によるオリゴ糖の生産性は、後述の分析装置等を用いて当該微生物の培養上清中及び菌体内の少なくとも一方のオリゴ糖を検出することにより確認できる。なお、生産性は生産量ともいう。
　本実施態様の遺伝子改変微生物は、親株に比べて、ＬＮＴの生産性が向上することが好ましく、生産したＬＮＴの菌体外比率が向上することが更に好ましい。
　なお、Ｅ．ｃｏｌｉ内在性のトランスポーターであるＥｍｒＤ、ＹｄｅＥ、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ　ｓｐ．　ＡＮＡ３由来ＮａｇＰ、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ　ａｍａｚｏｎｅｎｓｉｓ　ＳＢ２Ｂ由来ＮａｇＰ、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ　ｓｐ．　ＡＮＡ３由来ＡｇａＰ、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ　ｓｐ．　ＭＲ４由来ＡｇａＰ、Ｂｌｏｎ＿２３４４－２３４２、Ｂｌｏｎ＿２３４７－２３４５、及びＢｌｏｎ＿２３６１－２３５９遺伝子から成る群から選択される少なくとも１つの遺伝子をコードする蛋白質の活性を増強した微生物は、親株に比べて、菌体外及びＴｏｔａｌのＬＮＴの生産性が向上すると共に、ＬＮＴの菌体外比率が特に向上する。
　前記［１］～［７］のいずれか１に記載の蛋白質の活性が増強された微生物は、例えば、前記［１］～［７］のいずれか１に記載の蛋白質をコードするＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡで親株の微生物を形質転換することにより得られる、親株よりも該遺伝子のコピー数が増大した微生物が挙げられる。本明細書において、該遺伝子のコピー数の増大とは、該遺伝子を染色体上またはプラスミド上に保有しない親株において新たに該遺伝子を保有させることであってもよいし、該遺伝子を染色体上またはプラスミド上に保有する株において追加的に該遺伝子を保有させることであってもよい。
　本明細書において、変異蛋白質とは、元となる蛋白質中のアミノ酸残基を人為的に欠失若しくは置換、または該蛋白質中にアミノ酸残基を挿入若しくは付加して得られる蛋白質をいう。
　上記［２］の変異蛋白質において、アミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたとは、同一配列中の任意の位置において、１～２０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されていてもよい。欠失、置換、挿入または付加されるアミノ酸の数は好ましくは１～１０個、より好ましくは１～８個、最も好ましくは１～５個である。
　欠失、置換、挿入または付加されるアミノ酸は天然型と非天然型とを問わない。天然型アミノ酸としては、Ｌ－アラニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－グルタミン、Ｌ－グルタミン酸、グリシン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－リジン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－プロリン、Ｌ－セリン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－チロシン、Ｌ－バリン、Ｌ－システインなどが挙げられる。
　以下に、相互に置換可能なアミノ酸の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸は相互に置換可能である。
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２－アミノブタン酸、メチオニン、Ｏ－メチルセリン、ｔ－ブチルグリシン、ｔ－ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２－アミノアジピン酸、２－アミノスベリン酸
Ｃ群：アスパラギン、グルタミン
Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、２、４－ジアミノブタン酸、２、３－ジアミノプロピオン酸
Ｅ群：プロリン、３－ヒドロキシプロリン、４－ヒドロキシプロリン
Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン
Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン
　上記変異蛋白質は、オリゴ糖の輸送活性を有することが好ましい。
　本明細書において、相同蛋白質とは、元となる蛋白質と構造および機能が類似することにより、その蛋白質をコードする遺伝子が進化上の起源を元の蛋白質をコードする遺伝子と同一にすると考えられる蛋白質であって、自然界に存在する生物が有する蛋白質をいう。
　相同蛋白質としては、例えば、対象となる蛋白質が有するアミノ酸配列と６０％以上、好ましくは以下順に６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列が挙げられる。
　アミノ酸配列の同一性の確認方法は、後述の通りである。
　上記相同蛋白質は、オリゴ糖の輸送活性を有することが好ましい。
（親株）
　本明細書において、親株とは、遺伝子改変および形質転換等の対象となる元株のことをいう。遺伝子導入による形質転換の対象となる元株は宿主株ともいう。
　本明細書において、親株としては、好ましくは原核生物または酵母菌株を、より好ましくは、大腸菌等のエシェリヒア属、セラチア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、若しくはシュードモナス属等に属する原核生物、またはサッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス属、クルイベロミセス属、トリコスポロン属、シワニオミセス属、ピキア属、若しくはキャンディダ属等に属する酵母菌株を、最も好ましくは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＭＧ１６５５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＸＬ１－Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＸＬ２－Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＤＨ１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＭＣ１０００、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＫＹ３２７６、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｗ１４８５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｗ３１１０、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｗ３１１０Ｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＮＹ４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＢＬ２１　ｃｏｄｏｎ　ｐｌｕｓ（ストラタジーン社製）、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｆｉｃａｒｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｆｏｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ　ＡＴＣＣ１４０６８、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ　ＡＴＣＣ１４０６６、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　ＡＴＣＣ１３０３２、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　ＡＴＣＣ１４０６７、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　ＡＴＣＣ１３８６９、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ　ＡＴＣＣ１３８７０、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ　ＡＴＣＣ１５３５４、若しくはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．　Ｄ－０１１０等の原核生物、またはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　ｌａｃｔｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ　ｐｕｌｌｕｌａｎｓ、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ　ａｌｌｕｖｉｕｓ、Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ、若しくはＣａｎｄｉｄａ　ｕｔｉｌｉｓ等の酵母菌株を挙げることができる。
　親株は、ＬＮＴを生産する微生物であれば、野生株であってもよいし、野生株がＬＮＴを生産する能力を有しない場合は、人工的にＬＮＴを生産する能力を付与した育種株であってもよい。
　微生物に、ＬＮＴを生産する能力を人工的に付与する方法としては、例えば、下記（１ａ）～（１ｅ）などの方法を挙げることができ、これらの方法は単独又は組み合わせて用いることができる。
（１ａ）ＬＮＴを生産する生合成経路を制御する機構の少なくとも１つを緩和又は解除する方法
（１ｂ）ＬＮＴを生産する生合成経路に関与する酵素の少なくとも１つを発現強化する方法
（１ｃ）ＬＮＴを生産する生合成経路に関与する酵素遺伝子の少なくとも１つのコピー数を増加させる方法
（１ｄ）ＬＮＴを生産する生合成経路から該目的物質以外の代謝産物へ分岐する代謝経路の少なくとも１つを弱化又は遮断する方法
（１ｅ）野生株に比べ、ＬＮＴのアナログに対する耐性度が高い細胞株を選択する方法
　本実施態様の遺伝子改変微生物がＬＮＴ骨格を有するオリゴ糖及びＬＮＴを生産する場合、親株は、ＬＮＴ骨格を有するオリゴ糖及びＬＮＴを生産する微生物であれば、野生株であってもよいし、野生株がＬＮＴ骨格を有するオリゴ糖及びＬＮＴを生産する能力を有しない場合は、人工的にＬＮＴ骨格を有するオリゴ糖及びＬＮＴを生産する能力を付与した育種株であってもよい。
　微生物に、ＬＮＴ骨格を有するオリゴ糖及びＬＮＴを生産する能力を人工的に付与する方法としては、下記（２ａ）～（２ｅ）などに記載の方法を挙げることができ、これらの方法は単独又は組み合わせて用いることができる。
（２ａ）ＬＮＴ骨格を有するオリゴ糖及びＬＮＴを生産する生合成経路を制御する機構の少なくとも１つを緩和又は解除する方法
（２ｂ）ＬＮＴ骨格を有するオリゴ糖及びＬＮＴを生産する生合成経路に関与する酵素の少なくとも１つを発現強化する方法
（２ｃ）ＬＮＴ骨格を有するオリゴ糖及びＬＮＴを生産する生合成経路に関与する酵素遺伝子の少なくとも１つのコピー数を増加させる方法
（２ｄ）ＬＮＴ骨格を有するオリゴ糖及びＬＮＴを生産する生合成経路から該目的物質以外の代謝産物へ分岐する代謝経路の少なくとも１つを弱化又は遮断する方法
（２ｅ）野生株に比べ、ＬＮＴ骨格を有するオリゴ糖及びＬＮＴのアナログに対する耐性度が高い細胞株を選択する方法
　微生物がＬＮＴを生産することのできる微生物であることは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、８９、１０６、１０８、１１０、及び１１２からなる群より選択される少なくともいずれか１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡで該微生物を形質転換し、形質転換した該微生物を培地に培養し、培養上清中及び菌体内の少なくとも一方に蓄積したＬＮＴを後述の糖分析装置等を用いて検出することにより確認できる。
　微生物がＬＮＴ骨格を有するオリゴ糖及びＬＮＴを生産することのできる微生物であることは、それぞれ、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、８９、１０６、１０８、１１０、及び１１２からなる群より選択される少なくともいずれか１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡで該微生物を形質転換し、形質転換した該微生物を培地に培養し、培養上清中及び菌体内の少なくとも一方に蓄積したＬＮＴ骨格を有するオリゴ糖及びＬＮＴを後述の糖分析装置等を用いて検出することにより確認できる。
　親株は、ラクトースパーミアーゼ（以下、ＬａｃＹという）活性、β１、３－Ｎ－アセチルグルコサミントランスフェラーゼ（以下、ＬｇｔＡという）活性、ＧｌｍＳ活性、ＧｌｍＭ活性、ＧｌｍＵ活性、β１、３―ガラクトース転移酵素（以下、ＧａｌＴという）活性、ホスホグルコムターゼ（以下、Ｐｇｍという）活性、ＵＴＰグルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（以下、ＧａｌＵという）活性、ＵＤＰグルコース－４－エピメラーゼ（以下、ＧａｌＥという）活性、ＵＴＰグルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（以下、ＧａｌＦという）活性、グルコース－６－リン酸イソメラーゼ（以下、Ｐｇｉという）活性からなる群より選択される少なくとも１の活性を有していることが好ましく、その活性が強化されていることがより好ましい。このうち、ＬａｃＹ、ＬｇｔＡ及びＧａｌＴのからなる群より選択される少なくとも１つの活性を有していることがより好ましく、その活性が強化されていることがさらに好ましい。
　本実施態様の遺伝子改変微生物がＬＮＴ骨格を有するオリゴ糖及びＬＮＴを生産する場合、親株は、上記ＬａｃＹ活性、上記ＬｇｔＡ活性、上記ＧｌｍＳ活性、上記ＧｌｍＭ活性、上記ＧｌｍＵ活性、上記ＧａｌＴ活性、上記Ｐｇｍ活性、上記ＧａｌＵ活性、上記ＧａｌＥ活性、上記ＧａｌＦ活性、上記Ｐｇｉ活性、マンノース―６―リン酸イソメラーゼ（以下、ＭａｎＡという）活性、ホスホマンノムターゼ（以下、ＭａｎＢという）活性、マンノース―１―リン酸グアニリルトランスフェラーゼ（以下、ＭａｎＣという）活性、ＧＤＰ－マンノース４，６デヒドラターゼ（以下、Ｇｍｄという）活性、ＧＤＰ－Ｌ－フコースシンテターゼ（以下、Ｆｃｌという）活性、ＵＤＰ－Ｎ－アセチルグルコサミン―２－エピメラーゼ（以下、ＮｅｕＣという）活性、Ｎ－アセチルノイラミン酸シンターゼ（以下、ＮｅｕＢという）活性、アシルノイラミン酸シチジルトランスフェラーゼ（以下、ＮｅｕＡという）活性、α１、２－フコシルトランスフェラーゼ活性及びα－２、３－シアリルトランスフェラーゼ活性からなる群より選択される少なくとも１の活性を有していることが好ましく、その活性が強化されていることがより好ましい。このうち、ＬａｃＹ、ＬｇｔＡ、ＧａｌＴ、ＦｕｃＴ、ＳｉａＴからなる群より選択される少なくとも１つの活性を有していることがより好ましく、その活性が強化されていることがさらに好ましい。
　本実施態様の遺伝子改変微生物がＬＮＴ骨格を有しているオリゴ糖、好ましくはＬＮＦＰＩ及びＬＳＴ－ａのうち少なくとも一方を生産する場合、親株はＦｕｃＴ活性及びＳｉａＴ活性の少なくとも一方を有していることが好ましく、その活性が強化されていることがさらに好ましい。
　ＬａｃＹは、図１に示すように、ＬＮＴの基質であるラクトースを細胞内に取り込む膜タンパク質である。
　ＬｇｔＡは、図１に示すように、ラクトースおよびウリジン二リン酸－Ｎ－アセチルグルコサミン（以下、ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃという）からのＬＮＴＩＩの生産に関与する酵素である。
　ＧｌｍＳ、ＧｌｍＭおよびＧｌｍＵは、ラクトースからＬＮＴＩＩの生産に関与する、ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃを生産する生合成経路に関与する酵素である。
　ＧａｌＴは、図１に示すように、ＬＮＴＩＩからのＬＮＴの生産に関与する酵素である。
　Ｐｇｍ、ＧａｌＵ、ＧａｌＥ、ＧａｌＦは、ＬＮＴＩＩからＬＮＴの生産に関与する、ウリジン二リン酸ガラクトース（以下、ＵＤＰ－Ｇａｌという）を生産する経路に関与する酵素である。
　Ｐｇｉは、ＬＮＴＩＩを生産する経路に関与する酵素である。
　ＭａｎＡ、ＭａｎＢ、ＭａｎＣ、Ｇｍｄ、Ｆｃｌは、ＬＮＦＰＩの生産に必要なＧＤＰ－フコースの供給に関与する酵素である。
　ＮｅｕＣ、ＮｅｕＢ、ＮｅｕＡは、ＬＳＴ－ａまたはＬＳＴ－ｂの生産に必要なＣＭＰ－シアル酸の供給に関与する酵素である。
　ＦｕｃＴは、ＬＮＴとフコースからＬＮＦＰＩを生産する経路に関与する酵素である。
　ＳｉａＴは、ＬＮＴからＬＳＴ－ａまたはＬＳＴ－ｂを生産する経路に関与する酵素である。
　従って、本実施態様では、好ましくはＬａｃＹをコードする塩基配列（例えば、アクセッション番号　ＢＡＥ７６１２５）、ＬｇｔＡをコードする塩基配列（例えば、配列番号２２）、ＧｌｍＳをコードする塩基配列（例えば、アクセッション番号ＢＡＥ７７５５９）、ＧｌｍＭをコードする塩基配列（例えば、アクセッション番号ＢＡＥ７７２２０）、ＧｌｍＵをコードする塩基配列（例えば、アクセッション番号ＢＡＥ７７５５８）、ＧａｌＴをコードする塩基配列（例えば、配列番号２０）、Ｐｇｍをコードする塩基配列（例えば、アクセッション番号ＢＡＡ３５３３７．１）、ＧａｌＵをコードする塩基配列（例えば、アクセッション番号ＢＡＡ３６１０４．１）、ＧａｌＥをコードする塩基配列（例えば、アクセッション番号ＢＡＡ３５４２１．１）、ＧａｌＦをコードする塩基配列（例えば、アクセッション番号ＢＡＡ１５８９６．１）、Ｐｇｉをコードする塩基配列（例えば、アクセッション番号ＢＡＥ７８０２７．１）から選ばれる少なくとも１の塩基配列を含む、遺伝的に改変された微生物を親株とすることが好ましい。特に、好ましくはＬａｃＹをコードする塩基配列、ＬｇｔＡをコードする塩基配列、及びＧａｌＴをコードする塩基配列を含む、遺伝的に改変された微生物を親株とすることがより好ましい。本実施態様において、上記遺伝子改変微生物は、ＬＮＴの生産性が、遺伝的に改変されていない親株に比較して上昇していることが好ましい。
　また、本実施態様の一例である、ＬＮＴ骨格を有するオリゴ糖及びＬＮＴを生産する遺伝子改変微生物においては、好ましくはＬａｃＹをコードする塩基配列（例えば、アクセッション番号　ＢＡＥ７６１２５）、ＬｇｔＡをコードする塩基配列（例えば、配列番号２２）、ＧｌｍＳをコードする塩基配列（例えば、アクセッション番号ＢＡＥ７７５５９）、ＧｌｍＭをコードする塩基配列（例えば、アクセッション番号ＢＡＥ７７２２０）、ＧｌｍＵをコードする塩基配列（例えば、アクセッション番号ＢＡＥ７７５５８）、ＧａｌＴをコードする塩基配列（例えば、配列番号２０）、Ｐｇｍをコードする塩基配列（例えば、アクセッション番号ＢＡＡ３５３３７．１）、ＧａｌＵをコードする塩基配列（例えば、アクセッション番号ＢＡＡ３６１０４．１）、ＧａｌＥをコードする塩基配列（例えば、アクセッション番号ＢＡＡ３５４２１．１）、ＧａｌＦをコードする塩基配列（例えば、アクセッション番号ＢＡＡ１５８９６．１）、Ｐｇｉをコードする塩基配列（例えば、アクセッション番号ＢＡＥ７８０２７．１）、ＭａｎＡをコードする塩基配列（例えば、アクセッション番号ＢＡＡ１５３６１）、ＭａｎＢをコードする塩基配列（例えば、アクセッション番号ＢＡＡ１５９０１．１）、ＭａｎＣをコードする塩基配列（例えば、アクセッション番号ＢＡＡ１５９０５）、Ｇｍｄをコードする塩基配列（例えば、アクセッション番号ＢＡＡ１５９０９）、Ｆｃｌをコードする塩基配列（例えば、アクセッション番号ＢＡＡ１５９０８）、ＮｅｕＣをコードする塩基配列（例えば、アクセッション番号ＣＡＬ４３３３８）、ＮｅｕＢをコードする塩基配列（例えば、アクセッション番号ＹＰ＿００２３４４５３４）、ＮｅｕＡをコードする塩基配列（例えば、アクセッション番号ＡＡＫ０２２７１）、ＦｕｃＴをコードする塩基配列（例えば、アクセッション番号ＢＢＢ２５２２１）及びＳｉａＴをコードする塩基配列（例えば、アクセッション番号ＢＡＡ２５３１６）から選ばれる少なくとも１の塩基配列を含む、遺伝的に改変された微生物を親株とすることが好ましい。
　ＬａｃＹ活性、ＬｇｔＡ活性、ＧｌｍＳ活性、ＧｌｍＭ活性、ＧｌｍＵ活性、ＧａｌＴ活性、Ｐｇｍ活性、ＧａｌＵ活性、ＧａｌＥ活性、ＧａｌＦ活性、Ｐｇｉ活性から選ばれる少なくとも１の活性を有している、またはその活性が強化されている大腸菌を製造する方法、及びＬａｃＹ活性、ＬｇｔＡ活性、ＧｌｍＳ活性、ＧｌｍＭ活性、ＧｌｍＵ活性、ＧａｌＴ活性、Ｐｇｍ活性、ＧａｌＵ活性、ＧａｌＥ活性、ＧａｌＦ活性、Ｐｇｉ活性、ＭａｎＡ活性、ＭａｎＢ活性、ＭａｎＣ活性、Ｇｍｄ活性、Ｆｃｌ活性、ＮｅｕＣ活性、ＮｅｕＢ活性、ＮｅｕＡ活性、ＦｕｃＴ活性及びＳｉａＴ活性からなる群より選択される少なくとも１の活性から選ばれる少なくとも１の活性を有している、またはその活性が強化されている大腸菌を製造する方法としては公知の方法を用いればよい。具体的には例えば、各種遺伝子操作による方法（Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、２０１７、４１：２３－３８）等が挙げられる。
　親株では、β－ガラクトシダーゼ（以下、ＬａｃＺという）活性が低下又は欠失していることが好ましい。
　本実施態様の遺伝子改変微生物がＬＮＴ骨格を有するオリゴ糖及びＬＮＴを生産する場合、親株では、上述のＬａｃＺ活性に加えて、ＷｃａＪ活性及びＷｃａＪＭ活性が低下又は欠失していることが好ましい。
　ＬａｃＺはＬＮＴの基質であるラクトースを加水分解する酵素である。そのため、ＬａｃＺの活性を喪失させることで、ラクトース供給の低下を抑制できる。
　ＷｃａＪ及びＷｃａＪＭは、ＧＤＰ－フコースからコラン酸への代謝に関与する酵素であり、遮断することで、ＧＤＰ－フコースの供給を高めることができる。
　従って、本実施態様では、好ましくはＬａｃＺの活性が低下または欠失しており、より好ましくはＬａｃＺをコードする塩基配列を含まない、遺伝的に改変された微生物を親株とすることが好ましい。本実施態様において、上記遺伝子改変微生物は、ＬＮＴの生産性が、遺伝的に改変されていない親株に比較して上昇していることが好ましい。
　本実施態様である、ＬＮＴ骨格を有するオリゴ糖及びＬＮＴを生産する遺伝子改変微生物においては、ＬａｃＺ、ＷｃａＪ及びＷｃａＪＭからなる群から選択される少なくとも１つの活性が低下または欠失しており、より好ましくはＬａｃＺをコードする塩基配列、ＷｃａＪをコードする塩基配列及びＷｃａＪＭをコードする塩基配列からなる群より選択される少なくとも１つの塩基配列を含まない、遺伝的に改変された微生物を親株とすることが好ましい。
　ＬａｃＺ活性、ＷｃａＪ活性及びＷｃａＪＭ活性からなる群より少なくとも１つの活性が低下または喪失した大腸菌を製造する方法としては公知の方法を用いればよい。具体的には例えば、各種遺伝子操作による方法（Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、２０１７、４１：２３－３８）等が挙げられる。
＜遺伝子改変微生物の製造＞
　親株の微生物に比べ前記［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質の活性が増強した遺伝子改変微生物としては、該蛋白質をコードするＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡで親株の微生物を形質転換することにより得られる、親株よりも該遺伝子のコピー数が増大した微生物が挙げられる。　
　前記［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質をコードするＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡで親株の微生物を形質転換することにより得られる、親株よりも該遺伝子のコピー数が増大した微生物としては、前記［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質をコードするＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡで親株の微生物を形質転換することにより、染色体ＤＮＡ上において前記遺伝子のコピー数が増大した微生物、およびプラスミドＤＮＡとして染色体ＤＮＡ外に前記遺伝子を保有させた微生物を挙げることができる。
　前記［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質をコードするＤＮＡとしては、前記［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質の活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡであればいずれでもよいが、具体的には以下の［８］～［１１］からなる群より選ばれる１のＤＮＡが挙げられる。
［８］前記［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質をコードするＤＮＡ
［９］配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１８、１９、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８８、１０７、１０９、１１１、１１３、１２２、１２３、１２４、１２５及び１２６からなる群より選択される少なくともいずれか１で表される塩基配列からなるＤＮＡ
［１０］配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１８、１９、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８８、１０７、１０９、１１１、１１３、１２２、１２３、１２４、１２５及び１２６からなる群より選択される少なくともいずれか１で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、［３］に記載の相同蛋白質をコードするＤＮＡ
［１１］配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１８、１９、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８８、１０７、１０９、１１１、１１３、１２２、１２３、１２４、１２５及び１２６からなる群より選択される少なくともいずれか１で表される塩基配列と９５％以上、好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列からなり、［３］に記載の相同蛋白質をコードするＤＮＡ
　前記［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質をコードするＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡとしては、前記［８］～［１１］のいずれか１に記載のＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡが挙げられる。前記［８］～［１１］のいずれか１に記載のＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡとは、該ＤＮＡが、親株において自律複製可能または染色体中への組込が可能で、該ＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有している発現ベクターに組み込まれている組換え体ＤＮＡをいう。
　上記［１０］において「ハイブリダイズする」とは、特定の塩基配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡの一部にＤＮＡがハイブリダイズすることである。したがって、該特定の塩基配列を有するＤＮＡまたはその一部は、ノーザンまたはサザンブロット解析のプローブとして用いることができ、またＰＣＲ解析のオリゴヌクレオチドプライマーとして使用できるＤＮＡである。
　プローブとして用いられるＤＮＡとしては、少なくとも１００塩基以上、好ましくは２００塩基以上、より好ましくは５００塩基以上のＤＮＡを挙げることができる。プライマーとして用いられるＤＮＡとしては、少なくとも１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上のＤＮＡを上げることができる。
　ＤＮＡのハイブリダイゼーション実験の方法はよく知られており、例えば当業者であれば本明細書に従い、ハイブリダイゼーションの条件を決定できる。該ハイブリダイゼーションの条件は、モレキュラー・クローニング第４版（２０１２年）、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　Ｇｅｎｅｒａｌ　ａｎｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、　ＡＳＭ　Ｐｒｅｓｓ（１９９４）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ｍａｎｕａｌ、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　ｐｒｅｓｓ（１９９６）に記載の他、多数の他の標準的な教科書に従って行うことができる。
　また、市販のハイブリダイゼーションキットに付属した説明書に従うことによっても、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを取得できる。市販のハイブリダイゼーションキットとしては、例えばランダムプライム法によりプローブを作製し、ストリンジェントな条件でハイブリダイゼーションを行うランダムプライムドＤＮＡラベリングキット（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）などを挙げることができる。
　上記のストリンジェントな条件とは、ＤＮＡを固定化したフィルターとプローブＤＮＡとを５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（７５０ｍｍｏｌ／ｌの塩化ナトリウム、７５ｍｍｏｌ／ｌのクエン酸ナトリウム）、５０ｍｍｏｌ／ｌのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％の硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｌの変性させたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で４２℃にて一晩、インキュベートした後、例えば約６５℃の０．２×ＳＳＣ溶液中で該フィルターを洗浄する条件を挙げることができる。
　上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、例えばＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡ等を用いて上記したパラメータ等に基づいて計算したときに、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１８、１９、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８８、１０７、１０９、１１１、１１３、１２２、１２３、１２４、１２５及び１２６からなる群より選択される少なくともいずれか１で表される塩基配列からなるＤＮＡと少なくとも９５％以上、好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するＤＮＡを挙げることができる。
　アミノ酸配列および塩基配列の同一性は、Ｋａｒｌｉｎ　ａｎｄ　ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ［Ｐｒｏ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ、　９０、　５８７３（１９９３）］やＦＡＳＴＡ［Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．、　１８３、　６３　（１９９０）］を用いて決定できる。このアルゴリズムＢＬＡＳＴに基づいて、ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸとよばれるプログラムが開発されている［Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．、　２１５、　４０３（１９９０）］。ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＮによって塩基配列を解析する場合には、パラメータは例えばＳｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＸによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメータは例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ　ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である。
　前記［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質をコードするＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡで親株の微生物を形質転換することにより得られる、親株よりも該遺伝子のコピー数が増大した微生物は、以下の方法で取得できる。
　上記［８］に記載の上記［１］の蛋白質をコードするＤＮＡ、および上記［９］のＤＮＡは、例えば、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１８、１９、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８８、１０７、１０９、１１１、１１３、１２２、１２３、１２４、１２５及び１２６からなる群より選択される少なくともいずれか１で表される塩基配列に基づき設計できるプローブＤＮＡを用いた、微生物、好ましくは、エシェリヒア・コリ属に属する微生物、より好ましくは、エシェリヒア・コリＷ３１１０Ｓ株の染色体ＤＮＡライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーション法、または該塩基配列に基づき設計できるプライマーＤＮＡを用いた、上記微生物の染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ［ＰＣＲ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　（１９９０）］により取得できる。
　エシェリヒア・コリＷ３１１０Ｓ株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジーセンター（ＮＩＴＥ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｒｅｓｏｕｒｃｅ　Ｃｅｎｔｅｒ）から入手できる。
　上記［２］の変異蛋白質をコードするＤＮＡは、例えば、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１８、１９、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８８、１０７、１０９、１１１、１１３、１２２、１２３、１２４、１２５及び１２６からなる群より選択される少なくともいずれか１で表される塩基配列からなるＤＮＡを鋳型としてエラープローンＰＣＲ等に供することにより取得できる。
　または、目的の変異（欠失、置換、挿入または付加）が導入されるように設計した塩基配列をそれぞれの５’端に持つ１組のＰＣＲプライマーを用いたＰＣＲ［Ｇｅｎｅ、　７７、　５１（１９８９）］によっても、上記［２］の変異蛋白質をコードするＤＮＡを取得できる。
　また、市販の部分特異的変異導入キットに付属した説明書に従うことによっても、該ＤＮＡを取得できる。市販の部分特異的変異導入キットとしては、例えば、目的の変異を導入したい位置に変異（欠失、置換、挿入又は付加）を導入できるＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｂａｓａｌ　Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）が挙げられる。
　すなわち、まず、目的の変異（欠失、置換、挿入又は付加）が導入されるように設計した塩基配列を有するプラスミドを鋳型に、５’側が１５塩基オーバーラップした一対の変異導入用プライマーを設計する。このとき、オーバーラップ部分には目的の変異を含む。次に、該変異導入用プライマーを用いて、目的の変異を導入したい塩基配列を有するプラスミドを鋳型にＰＣＲを行う。これにより得られた増幅断片を大腸菌に形質転換すると、目的の変異が導入された塩基配列を有するプラスミドが得られる。
　上記［３］の相同蛋白質をコードするＤＮＡ、並びに上記［１０］および［１１］のＤＮＡは、例えば、各種の遺伝子配列データベースに対して配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１８、１９、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８８、１０７、１０９、１１１、１１３、１２２、１２３、１２４、１２５及び１２６からなる群より選択される少なくともいずれか１で表される塩基配列と６０％以上、好ましくは以下順に６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列を検索し、または、各種の蛋白質配列データベースに対して配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、８９、１０６、１０８、１１０、及び１１２からなる群より選択される少なくともいずれか１で表されるアミノ酸配列と６０％以上、好ましくは以下順に６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を検索し、該検索によって得られた塩基配列またはアミノ酸配列に基づいて設計できるプローブＤＮＡまたはプライマーＤＮＡ、および当該ＤＮＡを有する微生物を用いて、上記のＤＮＡを取得する方法と同様の方法によって取得できる。
　上記の方法で得られる前記［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質をコードするＤＮＡ、好ましくは前記［８］～［１１］からなる群より選ばれる１のＤＮＡをもとにして、必要に応じて、該蛋白質をコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製する。また、該蛋白質をコードする部分の塩基配列を、宿主細胞での発現に最適なコドンとなるように、塩基を置換することにより、生産率が向上した形質転換体を取得できる。本実施態様の製造法に用いられる親株におけるコドン使用頻度の情報は、公共のデータベースを通じて入手できる。
　前記ＤＮＡ断片を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換え体ＤＮＡを作製する。該組換え体ＤＮＡで親株を形質転換することにより、親株よりも該蛋白質をコードする遺伝子のコピー数が増大した微生物を取得できる。
　細菌等の原核生物を親株として用いる場合は、該組換え体ＤＮＡは、プロモーター、リボソーム結合配列、上記の［８］～［１１］のいずれか１に記載のＤＮＡ、および転写終結配列により構成された組換え体ＤＮＡであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
　リボソーム結合配列であるシャイン－ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ－Ｄａｌｇａｒ）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６～１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。該組換え体ＤＮＡにおいては、該ＤＮＡの発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
　親株にエシェリヒア属に属する微生物を用いる場合は、発現ベクターとしては、例えば、ｐＣｏｌｄＩ、ｐＳＴＶ２８、ｐＳＴＶ２９、ｐＵＣ１１８（いずれもタカラバイオ社製）、ｐＭＷ１１８、ｐＭＷ１１９（いずれもニッポンジーン社製）、ｐＥＴ２１ａ、ｐＣＯＬＡＤｕｅｔ－１、ｐＣＤＦＤｕｅｔ－１、ｐＵＡＫＱＥ３１（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００７、７３：６３７８－６３８５）、ｐＣＤＦ－１ｂ、ｐＲＳＦ－１ｂ（いずれもノバジェン社製）、ｐＭＡＬ－ｃ２ｘ、ｐＭＡＬ－ｃ５ｘ（いずれもニューイングランドバイオラブス社製）、ｐＧＥＸ－４Ｔ－１（ジーイーヘルスケアバイオサイエンス社製）、ｐＴｒｃＨｉｓ（インビトロジェン社製）、ｐＳＥ２８０（インビトロジェン社製）、ｐＧＥＭＥＸ－１（プロメガ社製）、ｐＱＥ－３０、ｐＱＥ８０Ｌ（いずれもキアゲン社製）、ｐＥＴ－３、ｐＴｒｃ９９Ａ（ジーイーヘルスケアバイオサイエンス社製）、ｐＥＴ－３（ノバジェン社製）、ｐＫＹＰ１０（日本国特開昭５８－１１０６００号公報）、ｐＫＹＰ２００［Ａｇｒｉｃ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．、　４８、　６６９（１９８４）］、ｐＬＳＡ１［Ａｇｒｉｃ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．、　５３、　２７７　（１９８９）］、ｐＧＥＬ１［Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．、　ＵＳＡ、　８２、　４３０６　（１９８５）］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ　ＳＫ（＋）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＫＳ（－）（ストラタジーン社製）、ｐＴｒＳ３０［エシェリヒア・コリ　ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭ　ＢＰ－５４０７）より調製］、ｐＴｒＳ３２［エシェリヒア・コリＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３２（ＦＥＲＭ　ＢＰ－５４０８）より調製］、ｐＴＫ３１［ＡＰＰＬＩＥＤ　ＡＮＤ　ＥＮＶＩＲＯＮＭＥＮＴＡＬ　ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ、　２００７、　Ｖｏｌ．　７３、．　２０、ｐ．６３７８－６３８５］ｐＰＡＣ３１（国際公開第１９９８／１２３４３号）、ｐＵＣ１９［Ｇｅｎｅ、　３３、　１０３　（１９８５）］、ｐＳＴＶ２８（タカラバイオ社製）、ｐＵＣ１１８（タカラバイオ社製）、ｐＰＡ１（日本国特開昭６３－２３３７９８号公報）、ｐＫＤ４６［Ｄａｔｓｅｎｋｏ、Ｋ．Ａ．、Ｗａｒｎｅｒ、Ｂ．Ｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、Ｖｏｌ．９７、６６４０－６６４５（２０００）］等を挙げることができる。
　上記発現ベクターを用いる場合のプロモーターとしては、エシェリヒア属に属する微生物の細胞中で機能するものであればいかなるものでもよいが、例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター（Ｐｌａｃ）、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、ＰＳＥプロモーター等の、エシェリヒア・コリやファージ等に由来するプロモーターが挙げられる。また、例えば、Ｐｔｒｐを２つ直列させたプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、ｌｅｔＩプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーターが挙げられる。
　親株にコリネバクテリウム属に属する微生物を用いる場合は、発現ベクターとしては、例えば、ｐＣＧ１（日本国特開昭５７－１３４５００号公報）、ｐＣＧ２（日本国特開昭５８－３５１９７号公報）、ｐＣＧ４（日本国特開昭５７－１８３７９９号公報）、ｐＣＧ１１（日本国特開昭５７－１３４５００号公報）、ｐＣＧ１１６、ｐＣＥ５４、ｐＣＢ１０１（いずれも日本国特開昭５８－１０５９９９号公報）、ｐＣＥ５１、ｐＣＥ５２、ｐＣＥ５３〔いずれもＭｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、　１９６、　１７５　（１９８４）〕等を挙げることができる。
　上記発現ベクターを用いる場合のプロモーターとしては、コリネバクテリウム属に属する微生物の細胞中で機能するものであればいかなるものでもよいが、例えば、Ｐ５４－６プロモーター［Ａｐｐｌ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、　５３、　６７４－６７９　（２０００）］を用いることができる。
　親株に酵母菌株を用いる場合には、発現ベクターとしては、例えば、ＹＥｐ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）、ＹＣｐ５０（ＡＴＣＣ３７４１９）、ｐＨＳ１９、ｐＨＳ１５等を挙げることができる。
　上記発現ベクターを用いる場合のプロモーターとしては、酵母菌株の細胞中で機能するものであればいかなるものでもよいが、例えば、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ｇａｌ１プロモーター、ｇａｌ１０プロモーター、ヒートショックポリペプチドプロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＣＵＰ１プロモーター等のプロモーターを挙げることができる。
　上記の［８］～［１１］のいずれか１に記載のＤＮＡ断片を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、本実施態様の製造法に用いられる組換え体ＤＮＡを作製できる。
　組換え体ＤＮＡを宿主細胞の染色体中に組み込む方法としては、例えば、相同組換え法が挙げられる。相同組換え法としては、例えば、導入したい宿主細胞内では自律複製できない薬剤耐性遺伝子を有するプラスミドＤＮＡと連結して作製できる相同組換え用プラスミドを用いる方法が挙げられる。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉで頻用される相同組換えを利用した方法としては、例えば、ラムダファージの相同組換え系を利用して、組換え体ＤＮＡを導入する方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９７、６６４０－６６４５（２０００）］が挙げられる。さらに、組換え体ＤＮＡと共に染色体上に組み込まれた枯草菌レバンシュークラーゼによって大腸菌がスクロース感受性となることを利用した選択法や、ストレプトマイシン耐性の変異ｒｐｓＬ遺伝子を有する大腸菌に野生型ｒｐｓＬ遺伝子を組み込むことによって大腸菌がストレプトマイシン感受性となることを利用した選択法［Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、５５、１３７（２００５）、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、７１、２９０５（２００７）］等を用いて、宿主細胞の染色体ＤＮＡ上の目的の領域が組換え体ＤＮＡに置換された大腸菌を取得できる。
　該組換え体ＤＮＡが、親株において自律複製可能なプラスミドとして導入されたこと、または親株の染色体中に組み込まれたことは、例えば、微生物が元来、染色体ＤＮＡ上に有する該遺伝子を増幅することはできないが、形質転換により導入された該遺伝子は増幅可能なプライマーセットを用いてＰＣＲにより増幅産物を確認する方法等により確認できる。また、該ＤＮＡの転写量若しくは該ＤＮＡがコードする蛋白質の生産量が増大したことは、該微生物の該遺伝子の転写量をノーザン・ブロッティングにより、または該微生物の該蛋白質の生産量をウェスタン・ブロッティングにより、親株のそれと比較する方法等により確認できる。
　上記の方法で造成した微生物が、親株よりも上記［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質の活性が増強した微生物であることは、該微生物の培養後、培養液を適宜希釈後に遠心分離し、上清中及び菌体内の少なくとも一方に含まれるＬＮＴを糖分析装置等にて分析することにより、親株のそれと比較することにより確認できる。
　また、上記の方法で造成した微生物が、親株よりも上記［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質の活性が増強した微生物であることは、該微生物の該蛋白質の生産量及び該微生物の親株の該蛋白質の生産量をそれぞれウェスタン・ブロッティングで測定し、比較する方法等によっても、確認できる。
　上記した微生物は、親株よりも上記［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質の活性が増強していることにより、ＬＮＴの生産性を向上し得る。このような微生物の例としては、実施例において後述するＭｈｐＴ遺伝子の発現を強化したＣＧＬＹ／ｐＳＴＶ２９－ＭｈｐＴ株などが挙げられる。
２．オリゴ糖の製造方法
　本実施態様のオリゴ糖の製造方法としては、以下の方法が挙げられる。
　１．で上記した遺伝子改変微生物を調製すること、及び当該遺伝子改変微生物を用いて培養上清中及び菌体内の少なくとも一方にオリゴ糖を生産することを含む、オリゴ糖の製造方法。
＜オリゴ糖＞
　本実施態様の方法において、製造されるオリゴ糖は、ＬＮＴ骨格を有するオリゴ糖及びＬＮＴの少なくとも一方であることが好ましく、ＬＮＴ、ＬＮＦＰＩおよびＬＳＴ－ａの少なくとも一つであることがより好ましい。
　１．で上記した微生物を培養する方法は、微生物の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
　該微生物を培養する培地としては、該微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、該形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地と合成培地のいずれを用いてもよい。
　炭素源としては、該微生物が資化し得るものであればよく、例えば、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプン若しくはデンプン加水分解物等の糖、酢酸若しくはプロピオン酸等の有機酸、又は、グリセロール、エタノール若しくはプロパノール等のアルコール類等が挙げられる。
　窒素源としては、例えば、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム又はリン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕、大豆粕加水分解物、各種発酵菌体及びその消化物等が挙げられる。
　無機塩としては、例えば、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が挙げられる。
　オリゴ糖の製造方法に用いる本実施態様の微生物として、グルコース、ラクトース、またはラクトース一水和物等のオリゴ糖の基質となり得る糖質を生産する能力を有する微生物を用いてもよい。そのような微生物として、グルコースを生産する能力及びガラクトース転移酵素を有する微生物を用いてもよい。又は、そのような微生物として、グルコースを生産する能力を有する微生物に、β１、４―ガラクトース転移酵素を導入した微生物を、用いてもよい。
　オリゴ糖の製造方法において、培養中に、グルコース、ラクトース、またはラクトース一水和物等を培地に添加してもよい。β１、４―ガラクトース転移酵素を有する微生物を用いる場合に、培養中に、グルコースを培地に添加してもよい。又は、微生物にβ１、４―ガラクトース転移酵素を導入する場合には、培養中に、グルコースを培地に添加してもよい。
　また、オリゴ糖の製造方法において、培養中に、グルコース、ラクトース、またはラクトース一水和物等を培地に添加する代わりに、糖からグルコース、ラクトース、またはラクトース一水和物等を生産する能力を有する微生物を、本実施態様の微生物と同時に培養することにより、本実施態様の微生物にグルコース、ラクトース、またはラクトース一水和物等を供給してもよい。
　培養は、通常、振盪培養又は深部通気撹拌培養等の好気的条件下で行うことが好ましい。培養温度は、通常３０～３７℃であり、培養時間は、通常２４時間～３日間である。培養中の培養液ｐＨは、通常６．０～９．０に保持する。ｐＨの調整は、無機又は有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行う。
　上記の培養により、培養上清中及び菌体内の少なくとも一方にオリゴ糖を生産、蓄積させ、該培養上清中及び菌体内の少なくとも一方からオリゴ糖を採取することにより、オリゴ糖を製造できる。
　通常、該培養物の遠心分離後、上清よりオリゴ糖を採取できる。なお、菌体内にオリゴ糖が蓄積する場合には、例えば菌体を破砕し、遠心分離によって菌体を除去して得られる上清からイオン交換樹脂法などによって、オリゴ糖を採取できる。
　即ち、本発明の要旨は、次のとおりである。
＜＜１＞＞ＭｈｐＴ、ＹｆｃＪ、ＥｍｒＤ、ＹｄｅＥ、ＧｌｃＮＡｃ　ｐｅｒｍｅａｓｅ、ＧａｌＮＡｃ　ｐｅｒｍｅａｓｅ、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ属細菌由来ｓｕｇａｒ　ＭＦＳ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ、Ｂｌｏｎ＿２３４４、Ｂｌｏｎ＿２３４３、Ｂｌｏｎ＿２３４２、Ｂｌｏｎ＿２３４７、Ｂｌｏｎ＿２３４６、Ｂｌｏｎ＿２３４５、Ｂｌｏｎ＿２３６１、Ｂｌｏｎ＿２３６０、Ｂｌｏｎ＿２３５９、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｂｒｅｖｅ由来ＡＢＣトランスポーター、及びＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｂｒｅｖｅ由来ガラクトシドシンポーターからなる群より選択される少なくともいずれか１つの蛋白質の活性が増強され、かつ、ＬＮＴを生産する、遺伝子改変微生物。
＜＜２＞＞前記ＧｌｃＮＡｃ　ｐｅｒｍｅａｓｅがＳｈｅｗａｎｅｌｌａ属細菌由来ＮａｇＰであり、前記ＧａｌＮＡｃ　ｐｅｒｍｅａｓｅがＳｈｅｗａｎｅｌｌａ属細菌由来ＡｇａＰである、上記＜＜１＞＞に記載の遺伝子改変微生物。
＜＜３＞＞下記［１］に記載の蛋白質の活性が増強された、上記＜＜１＞＞又は＜＜２＞＞に記載の遺伝子改変微生物。
［１］配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、８９、１０６、１０８、１１０、及び１１２からなる群より選択される少なくともいずれか１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質。
＜＜４＞＞下記［２］又は［３］に記載の蛋白質の活性が増強され、かつ、親株に比べてＬＮＴの生産性が向上した、上記＜＜１＞＞～＜＜３＞＞のいずれか１つに記載の遺伝子改変微生物。
［２］配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、８９、１０６、１０８、１１０、及び１１２からなる群より選択される少なくともいずれか１で表されるアミノ酸配列において、１～２０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなる変異蛋白質。
［３］配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、８９、１０６、１０８、１１０、及び１１２からなる群より選択される少なくともいずれか１で表されるアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる相同蛋白質。
＜＜５＞＞下記［４］～［７］のいずれか１に記載の改変が加えられた上記＜＜１＞＞～＜＜３＞＞のいずれか１つに記載の遺伝子改変微生物。
［４］　配列番号６４、６５及び６６で表されるアミノ酸配列からなるそれぞれの蛋白質の活性を増強する改変。
［５］　配列番号６７、６８及び６９で表されるアミノ酸配列からなるそれぞれの蛋白質の活性を増強する改変。
［６］　配列番号７０、７１及び７２で表されるアミノ酸配列からなるそれぞれの蛋白質の活性を増強する改変。
［７］　配列番号１０６、１０８及び１１０で表されるアミノ酸配列からなるそれぞれの蛋白質の活性を増強する改変。
＜＜６＞＞ＬＮＴ骨格を有するオリゴ糖を生産する、上記＜＜１＞＞～＜＜５＞＞のいずれか１つに記載の遺伝子改変微生物。
＜＜７＞＞前記ＬＮＴ骨格を有するオリゴ糖が、ラクト－Ｎ－フコペンタオ－スＩ（ＬＮＦＰＩ）及びシアリルラクト－Ｎ－テトラオースａ（ＬＳＴ－ａ）のうち少なくとも１つである、上記＜＜６＞＞に記載の遺伝子改変微生物。
＜＜８＞＞前記遺伝子改変微生物が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）である、上記＜＜１＞＞～＜＜７＞＞のいずれか１つに記載の遺伝子改変微生物。
＜＜９＞＞上記＜＜１＞＞～＜＜８＞＞のいずれか１に記載の遺伝子改変微生物を調製すること、及び当該遺伝子改変微生物を用いて培養上清中及び菌体内の少なくとも一方にオリゴ糖を生産することを含む、オリゴ糖の製造方法。
＜＜１０＞＞前記オリゴ糖が、ＬＮＴ、ＬＮＦＰＩ及びＬＳＴ－ａからなる群より選択される少なくとも１つである、上記＜＜９＞＞に記載のオリゴ糖の製造方法。
［分析例］
　実施例において、ＬＮＴの分析、定量は以下に示す手順で行った。
　培養後の微生物を含む培養液を遠心分離し、菌体外ＬＮＴの定量のために上清を回収した。また、沈殿菌体を元培養液と同量の水で懸濁し、さらに等量のクロロホルムを加えて菌体破砕した後に遠心分離し、上清水相を菌体内画分として回収した。該上清及び／又は菌体内に含まれるＬＮＴは糖分析装置ＩＣＳ－６０００（サーモフィッシャー・サイエンティフィック社製）にて分析し、標準試料で作成した検量線から、生産量を算出した。標準試料となるＬＮＴは、例えばｍｅｄｃｈｅｍｅｘｐｒｅｓｓ（製品番号：ＨＹ－Ｎ９４４８）等で手に入れることができる。
［分析条件］
カラム：ＣａｒｂｏＰＡＣ　ＰＡ１０
カラム温度：２５℃
移動相：
　　（移動相Ａ）水
　　（移動相Ｂ）５００ｍｍｏｌ／Ｌ　水酸化ナトリウム
　　（移動相Ｃ）３００ｍｍｏｌ／Ｌ　酢酸ナトリウム
移動相Ａ、移動相Ｂ及び移動相Ｃ混合比：
　　（０～１８分）８０：２０：０から７０：２０：１０の勾配
　　（１８～２０分）７０：２０：１０
　　（２０～２５分）８０：２０：０
流速：０．８ｍＬ／ｍｉｎ
検出器：パルスドアンペロメトリー検出器
　以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
［実施例１］ラクト－Ｎ－テトラオース（ＬＮＴ）の製造に用いる微生物の造成
（１）遺伝子欠損の際にマーカーとして用いるＤＮＡ断片の取得
　配列番号２４及び２５で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして、ｐＣａｔＳａｃ（Ａｐｐｌ　Ｅｎｖｉｒｏｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ（２０１３）７９、３０３３－３０３９）を鋳型としてＰＣＲを行い、クロラムフェニコール耐性ｃａｔ遺伝子およびスクロース感受性ｓａｃＢ遺伝子を含む、ｃａｔ－ｓａｃＢ断片を得た。
（２）β－ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）活性及びラクトースパーミアーゼ（ＬａｃＹ）活性が喪失した大腸菌の造成
　β－ガラクトシダーゼをコードするＤＮＡ（以下、ＬａｃＺ遺伝子という。）、ラクトースパーミアーゼをコードするＤＮＡ（以下、ＬａｃＹ遺伝子という。）、を欠損した大腸菌を、以下の方法で造成した。なお、ＬａｃＺ及びＬａｃＹは大腸菌ゲノム上でオペロンを形成している。
　常法により調製したエシェリヒア・コリ　Ｗ３１１０Ｓ株のゲノムＤＮＡを鋳型として、表２の「プライマーセット」で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとしてＰＣＲを行い、各ＤＮＡ断片を増幅した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　ＬａｃＺ上流１およびＬａｃＺ上流２は、ＬａｃＺ遺伝子の開始コドンから開始コドンの上流約１０００ｂｐまでの領域を含む。ＬａｃＹ下流１およびＬａｃＹ下流２は、ＬａｃＹ遺伝子の終止コドン下流約５０ｂｐから約１０００ｂｐまでの領域を含む。
　ＬａｃＺ上流１、ＬａｃＹ下流１、およびｃａｔ－ｓａｃＢ断片を等モルの比率で混合したものを鋳型とし、配列番号５８及び６１で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いてＰＣＲを行い、ＬａｃＺ及びＬａｃＹ遺伝子周辺領域の配列にｃａｔ－ｓａｃＢ断片が挿入された配列からなるＤＮＡ（以下、ＬａｃＺＹ：：ｃａｔ－ｓａｃＢという。）断片を得た。
　ＬａｃＺ上流２およびＬａｃＹ下流２を等モルの比率で混合したものを鋳型とし、配列番号５８及び６１で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いてＰＣＲを行い、ＬａｃＺＹを含まず、ＬａｃＺ上流とＬａｃＹ下流が直接連結した配列からなるＤＮＡ（以下、ΔＬａｃＺＹという。）断片を得た。
　ＬａｃＺＹ：：ｃａｔ－ｓａｃＢ断片を、λリコンビナーゼをコードする遺伝子を含むプラスミドｐＫＤ４６［Ｄａｔｓｅｎｋｏ、Ｋ．Ａ．、Ｗａｒｎｅｒ、Ｂ．Ｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、Ｖｏｌ．９７、６６４０－６６４５（２０００）］を保持するＷ３１１０Ｓ株に、エレクトロポレーション法により導入し、クロラムフェニコール耐性かつシュクロース感受性を示した形質転換体（ＬａｃＺＹ遺伝子がＬａｃＺＹ：：ｃａｔ－ｓａｃＢに置換した形質転換体）を得た。
　ΔＬａｃＺＹ断片を、当該形質転換体にエレクトロポレーション法により導入し、クロラムフェニコール感受性かつシュクロース耐性を示す形質転換体（ＬａｃＺＹ：：ｃａｔ－ｓａｃＢがΔＬａｃＺＹに置換した形質転換体）を得た。それらのうちからさらに、アンピシリン感受性を示す形質転換体（ｐＫＤ４６が脱落した形質転換体）を得た。当該形質転換体をＷ３１１０ＳΔＬａｃＺＹと命名した。
（３）ＬＮＴ生産のための発現ベクターの造成
　表３の「プライマーセット」で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして、表３の「鋳型」に記載されたＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、各増幅ＤＮＡ断片を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　ｃｖβ３ＧａｌＴ断片、ＮｐＬｇｔＡ断片及びＬａｃＹ断片を等モルの比率で混合したものを鋳型とし、配列番号２６及び３１で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いてＰＣＲを行い、３断片を連結したＤＮＡ（以下、ｃｖβ３ＧａｌＴ－ＮｐＬｇｔＡ－ＬａｃＹという。）断片を得た。
　配列番号３２及び３３で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして、プラスミドｐＵＡＫＱＥ３１（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００７、７３：６３７８－６３８５）を鋳型にＰＣＲを行い、約４．７ｋｂのベクター断片を得た。
　配列番号２０で表されるＤＮＡは、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｖｉｏｌａｃｅｕｍ由来β１、３－Ｇａｌ転移酵素、配列番号２２で表されるＤＮＡは、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｅａ　ＡＴＣＣ４３７６８株由来β１、３－ＧｌｃＮＡｃ転移酵素、それぞれをコードする遺伝子の塩基配列を、大腸菌で発現させるためにコドン最適化したＤＮＡであり、人工合成により調製した。
　このとき、配列番号２６は５’領域にｐＵＡＫＱＥ断片の３’末端と相補的な配列を付加し、配列番号３１には３’領域にｐＵＡＫＱＥ断片の５’末端と相補的な配列を付加している。
　上記で得られたｃｖβ３ＧａｌＴ－ＮｐＬｇｔＡ－ＬａｃＹ断片とベクター断片を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて連結することにより、発現ベクターｐＵＡＫＱＥ－ｃｖβ３ＧａｌＴ－ＮｐＬｇｔＡ－ＬａｃＹを得た。
　上記、発現プラスミドｐＵＡＫＱＥ－ｃｖβ３ＧａｌＴ－ＮｐＬｇｔＡ－ＬａｃＹを用いて上記で造成したＷ３１１０ＳΔＬａｃＺＹ株を形質転換することで、ｐＵＡＫＱＥ－ｃｖβ３ＧａｌＴ－ＮｐＬｇｔＡ－ＬａｃＹを有する大腸菌を造成し、ＣＧＬＹ株と命名した。
（４）ＬＮｎＴ生産のための発現ベクターの造成
　表４の「プライマーセット」で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして、表４の「鋳型」に記載されたＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、各増幅ＤＮＡ断片を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　ＨｐＧａｌＴ断片、ＮｐＬｇｔＡ断片及びＬａｃＹ断片を等モルの比率で混合したものを鋳型とし、配列番号１２９及び１３４で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いてＰＣＲを行い、３断片を連結したＤＮＡ（以下、ＨｐＧａｌＴ－ＮｐＬｇｔＡ－ＬａｃＹという。）断片を得た。
　配列番号１３５及び１３６で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして、プラスミドｐＴＫ３１（Ａｐｐｌ　Ｅｎｖｉｒｏｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　２００７　Ｏｃｔ；７３（２０）：６３７８－８５．）を鋳型にＰＣＲを行い、約３．８ｋｂのベクター断片を得た。
　配列番号１２７で表されるＤＮＡは、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ　ｐｙｌｏｒｉ株由来β１，４－Ｇａｌ転移酵素、配列番号２２で表されるＤＮＡは、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｅａ　ＡＴＣＣ４３７６８株由来β１，３－ＧｌｃＮＡｃ転移酵素、のそれぞれをコードする遺伝子の塩基配列を大腸菌で発現させるためにコドン最適化したＤＮＡであり、人工合成により調製した。
　このとき、配列番号１２９は５’領域にｐＴＫ３１断片の３’末端と相補的な配列を付加し、配列番号１３４には３’領域にｐＴＫ３１断片の５’末端と相補的な配列を付加している。
　上記で得られたＨｐＧａｌＴ－ＮｐＬｇｔＡ－ＬａｃＹ断片とベクター断片を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて連結することにより、発現ベクターｐＴＫ３１－ＨｐＧａｌＴ－ＮｐＬｇｔＡ－ＬａｃＹを得た。
　上記、発現プラスミドｐＴＫ３１－ＨｐＧａｌＴ－ＮｐＬｇｔＡ－ＬａｃＹを用いて上記で造成したＷ３１１０ＳΔＬａｃＺＹ株を形質転換することで、ｐＴＫ３１－ＨｐＧａｌＴ－ＮｐＬｇｔＡ－ＬａｃＹを有する大腸菌を造成し、ＨＧＬＹ株と命名した。
（５）各種トランスポーター活性を有する微生物の造成
　ｌａｃプロモーター下に各種トランスポーターをコードする遺伝子を配置した、該遺伝子発現用プラスミドを有する大腸菌を、以下の方法で造成した。
　表５及び６の「プライマーセット」で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして、表５及び６の「鋳型」に記載されたＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、各増幅ＤＮＡ断片を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　配列番号１、３、５、７、８６、９０、９２、９４で表されるＤＮＡは、常法により調製したエシェリヒア・コリ　Ｗ３１１０Ｓ株のゲノムＤＮＡを鋳型として、表５の「プライマーセット」で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとしてＰＣＲを行い、各ＤＮＡ断片を増幅した。
　配列番号７３で表されるＤＮＡは、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ　ｓｐ．　ＡＮＡ３株由来ＧｌｃＮＡｃ　ｐｅｒｍｅａｓｅをコードする遺伝子の塩基配列を大腸菌で発現させるためにコドン最適化したＤＮＡであり、人工合成により調製した。配列番号７４で表されるＤＮＡは、表されるＳｈｅｗａｎｅｌｌａ　ａｍａｚｏｎｅｎｓｉｓ　ＳＢ２Ｂ株由来ＧｌｃＮＡｃ　ｐｅｒｍｅａｓｅをコードする遺伝子の塩基配列を大腸菌で発現させるためにコドン最適化したＤＮＡであり、人工合成により調製した。
　配列番号１２６で表されるＤＮＡは、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ　ｓｐ．　ＭＲ４株由来ＧｌｃＮＡｃ　ｐｅｒｍｅａｓｅをコードする遺伝子の塩基配列を大腸菌で発現させるためにコドン最適化したＤＮＡであり、人工合成により調製した。
　これらＤＮＡについて、表５の「プライマーセット」で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとしてＰＣＲを行い、各ＤＮＡ断片を増幅した。
　配列番号７５で表されるＤＮＡは、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ　ｓｐ．　ＡＮＡ３株由来ＧａｌＮＡｃ　ｐｅｒｍｅａｓｅをコードする遺伝子の塩基配列を大腸菌で発現させるためにコドン最適化したＤＮＡであり、人工合成により調製した。配列番号７６で表されるＤＮＡは、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ　ｓｐ．　ＭＲ４株由来ＧａｌＮＡｃ　ｐｅｒｍｅａｓｅをコードする遺伝子の塩基配列を大腸菌で発現させるためにコドン最適化したＤＮＡであり、人工合成により調製した。これらＤＮＡについて、表５の「プライマーセット」で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとしてＰＣＲを行い、各ＤＮＡ断片を増幅した。
　配列番号１７で表されるＤＮＡは、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｌｏｎｇｕｍ　ｓｕｂｓｐ．　Ｉｎｆａｎｔｉｓ由来ＡＢＣトランスポーターＢｌｏｎ＿２３４４、Ｂｌｏｎ＿２３４３、Ｂｌｏｎ＿２３４２をコードする遺伝子の塩基配列を、常法により調製したＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｌｏｎｇｕｍ　ｓｕｂｓｐ．　Ｉｎｆａｎｔｉｓ株のゲノムＤＮＡを鋳型として表６の「プライマーセット」で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとしてＰＣＲを行い、３遺伝子が連結した状態でＤＮＡ断片を増幅し、Ｂｌｏｎ＿２３４４－２３４２断片を得た。
　配列番号１８で表されるＤＮＡは、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｌｏｎｇｕｍ　ｓｕｂｓｐ．　Ｉｎｆａｎｔｉｓ由来ＡＢＣトランスポーターＢｌｏｎ＿２３４７、Ｂｌｏｎ＿２３４６、Ｂｌｏｎ＿２３４５をコードする遺伝子の塩基配列を、常法により調製したＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｌｏｎｇｕｍ　ｓｕｂｓｐ．　Ｉｎｆａｎｔｉｓ株のゲノムＤＮＡを鋳型として表６の「プライマーセット」で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとしてＰＣＲを行い、３遺伝子が連結した状態でＤＮＡ断片を増幅し、Ｂｌｏｎ＿２３４７－２３４５断片を得た。
　配列番号１９で表されるＤＮＡは、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｌｏｎｇｕｍ　ｓｕｂｓｐ．　Ｉｎｆａｎｔｉｓ由来ＡＢＣトランスポーターＢｌｏｎ＿２３６１、Ｂｌｏｎ＿２３６０、Ｂｌｏｎ＿２３５９をコードする遺伝子の塩基配列を、常法により調製したＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｌｏｎｇｕｍ　ｓｕｂｓｐ．　Ｉｎｆａｎｔｉｓ株のゲノムＤＮＡを鋳型として表６の「プライマーセット」で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとしてＰＣＲを行い、３遺伝子が連結した状態でＤＮＡ断片を増幅し、Ｂｌｏｎ＿２３６１－２３５９断片を得た。
　配列番号１０７、１０９、１１１で表されるＤＮＡは、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｂｒｅｖｅ由来ＡＢＣトランスポーターをコードする遺伝子の塩基配列を、大腸菌で発現させるためにコドン最適化したＤＮＡであり、人工合成により調製した。これらＤＮＡについて、表６の「プライマーセット」で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとしてＰＣＲを行い、各ＤＮＡ断片を増幅したのち、Ｂｂｒ＿１５９０断片、Ｂｂｒ＿１５８９断片及びＢｂｒ＿１５８８断片を等モルの比率で混合したものを鋳型とし、配列番号１１４及び１１９で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いてＰＣＲを行い、３断片を連結したＢｂｒ＿１５９０－１５８８断片を得た。
　配列番号１１３で表されるＤＮＡは、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｂｒｅｖｅ由来ガラクトシドシンポーターをコードする遺伝子の塩基配列を、大腸菌で発現させるためにコドン最適化したＤＮＡであり、人工合成により調製した。このＤＮＡについて、表６の「プライマーセット」で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとしてＰＣＲを行い、各ＤＮＡ断片を増幅した。
　配列番号３４及び３５で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして、プラスミドｐＳＴＶ２９（タカラバイオ社）を鋳型にＰＣＲを行い、約３．０ｋｂのベクター断片を得た。上記で得られた各種増幅ＤＮＡ断片とベクター断片をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて連結することにより、各種トランスポーターを発現するプラスミド、ｐＳＴＶ２９－ＭｈｐＴ、ｐＳＴＶ２９－ＹｆｃＪ、ｐＳＴＶ２９－ＥｍｒＤ、ｐＳＴＶ２９－ＹｄｅＥ、ｐＳＴＶ２９－ＳｅｔＢ、ｐＳＴＶ２９－ＳｅｔＣ、ｐＳＴＶ２９－ＹｎｆＭ、ｐＳＴＶ２９－ＭｄｔＤ、ｐＳＴＶ２９－ＮａｇＰ（ＡＮＡ３）、ｐＳＴＶ２９－ＮａｇＰ（Ｓａｍａ）、ｐＳＴＶ２９－ＮａｇＰ（ＭＲ４）、ｐＳＴＶ２９－ＡｇａＰ（ＡＮＡ３）、ｐＳＴＶ２９－ＡｇａＰ（ＭＲ４）、ｐＳＴＶ２９－（Ｂｌｏｎ＿２３４４－２３４２）、ｐＳＴＶ２９－（Ｂｌｏｎ＿２３４７－２３４５）、ｐＳＴＶ２９－（Ｂｌｏｎ＿２３６１－２３５９）、ｐＳＴＶ２９－（Ｂｂｒ＿１５９０－１５８８）、ｐＳＴＶ２９－（Ｂｂｒ＿１５５１）を造成した。
　このとき、配列番号３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、９６、９８、１００、１０２、１０４、１１４、１２０は配列の５’領域にｐＳＴＶ２９断片の３’末端と相補的な配列を付加し、配列番号３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１１９、１２１には３’領域にｐＳＴＶ２９断片の５’末端と相補的な配列を付加している。
（６）トランスポーター発現用プラスミドを有する大腸菌の造成
　上記で得られたトランスポーター発現用プラスミド、ｐＳＴＶ２９－ＭｈｐＴ、ｐＳＴＶ２９－ＹｆｃＪ、ｐＳＴＶ２９－ＥｍｒＤ、ｐＳＴＶ２９－ＹｄｅＥ、ｐＳＴＶ２９－ＳｅｔＢ、ｐＳＴＶ２９－ＳｅｔＣ、ｐＳＴＶ２９－ＹｎｆＭ、ｐＳＴＶ２９－ＭｄｔＤ、ｐＳＴＶ２９－ＮａｇＰ（ＡＮＡ３）、ｐＳＴＶ２９－ＮａｇＰ（Ｓａｍａ）、ｐＳＴＶ２９－ＮａｇＰ（ＭＲ４）、ｐＳＴＶ２９－ＡｇａＰ（ＡＮＡ３）、ｐＳＴＶ２９－ＡｇａＰ（ＭＲ４）、ｐＳＴＶ２９－（Ｂｌｏｎ＿２３４４－２３４２）、ｐＳＴＶ２９－（Ｂｌｏｎ＿２３４７－２３４５）、ｐＳＴＶ２９－（Ｂｌｏｎ＿２３６１－２３５９）、ｐＳＴＶ２９－（Ｂｂｒ＿１５９０－１５８８）、ｐＳＴＶ２９－（Ｂｂｒ＿１５５１）並びに、ベクターコントロールとしてｐＳＴＶ２９を用い、実施例１（３）及び（４）でそれぞれ造成したＣＧＬＹ株及びＨＧＬＹ株を形質転換することで、各種プラスミドを有する大腸菌を造成し、それぞれＣＧＬＹ／ｐＳＴＶ２９－ＭｈｐＴ株、ＣＧＬＹ／ｐＳＴＶ２９－ＹｆｃＪ株、ＣＧＬＹ／ｐＳＴＶ２９－ＥｍｒＤ株、ＣＧＬＹ／ｐＳＴＶ２９－ＹｄｅＥ株、ＣＧＬＹ／ｐＳＴＶ２９－ＳｅｔＢ株、ＣＧＬＹ／ｐＳＴＶ２９－ＳｅｔＣ株、ＣＧＬＹ／ｐＳＴＶ２９－ＹｎｆＭ株、ＣＧＬＹ／ｐＳＴＶ２９－ＭｄｔＤ株、ＣＧＬＹ／ｐＳＴＶ２９－ＮａｇＰ（ＡＮＡ３）株、ＣＧＬＹ／ｐＳＴＶ２９－ＮａｇＰ（Ｓａｍａ）株、ＣＧＬＹ／ｐＳＴＶ２９－ＮａｇＰ（ＭＲ４）、ＣＧＬＹ／ｐＳＴＶ２９－ＡｇａＰ（ＡＮＡ３）株、ＣＧＬＹ／ｐＳＴＶ２９－ＡｇａＰ（ＭＲ４）株、ＣＧＬＹ／ｐＳＴＶ２９－（Ｂｌｏｎ＿２３４４－２３４２）株、ＣＧＬＹ／ｐＳＴＶ２９－（Ｂｌｏｎ＿２３４７－２３４５）株、ＣＧＬＹ／ｐＳＴＶ２９－（Ｂｌｏｎ＿２３６１－２３５９）株、ＣＧＬＹ／ｐＳＴＶ２９－（Ｂｂｒ＿１５９０－１５８８）株、ＣＧＬＹ／ｐＳＴＶ２９－（Ｂｂｒ＿１５５１）株、ＣＧＬＹ／Ｃｔｒｌ株、ＨＧＬＹ／ｐＳＴＶ２９－ＭｈｐＴ株、ＨＧＬＹ／ｐＳＴＶ２９－ＹｆｃＪ株、ＨＧＬＹ／ｐＳＴＶ２９－ＥｍｒＤ株、ＨＧＬＹ／ｐＳＴＶ２９－ＹｄｅＥ株、ＨＧＬＹ／ｐＳＴＶ２９－ＳｅｔＢ株、ＨＧＬＹ／ｐＳＴＶ２９－ＳｅｔＣ株、ＨＧＬＹ／ｐＳＴＶ２９－ＹｎｆＭ株、ＨＧＬＹ／ｐＳＴＶ２９－ＭｄｔＤ株、ＨＧＬＹ／ｐＳＴＶ２９－（Ｂｌｏｎ＿２３４４－２３４２）株、ＨＧＬＹ／ｐＳＴＶ２９－（Ｂｌｏｎ＿２３４７－２３４５）株、ＨＧＬＹ／ｐＳＴＶ２９－（Ｂｌｏｎ＿２３６１－２３５９）株、ＨＧＬＹ／ｐＳＴＶ２９－（Ｂｂｒ＿１５９０－１５８８）株、ＨＧＬＹ／ｐＳＴＶ２９－（Ｂｂｒ＿１５５１）株、ＨＧＬＹ／Ｃｔｒｌ株と命名した。
［実施例２］ラクト－Ｎ－テトラオース（ＬＮＴ）、ラクト－Ｎ－ネオテトラオース（ＬＮｎＴ）の製造
　実施例１で得られたＣＧＬＹ／ｐＳＴＶ２９－ＭｈｐＴ株、ＣＧＬＹ／ｐＳＴＶ２９－ＹｆｃＪ株、ＣＧＬＹ／ｐＳＴＶ２９－ＥｍｒＤ株、ＣＧＬＹ／ｐＳＴＶ２９－ＹｄｅＥ株、ＣＧＬＹ／ｐＳＴＶ２９－ＳｅｔＢ株、ＣＧＬＹ／ｐＳＴＶ２９－ＳｅｔＣ株、ＣＧＬＹ／ｐＳＴＶ２９－ＹｎｆＭ株、ＣＧＬＹ／ｐＳＴＶ２９－ｍｄｔＤ株、ＣＧＬＹ／ｐＳＴＶ２９－ＮａｇＰ（ＡＮＡ３）株、ＣＧＬＹ／ｐＳＴＶ２９－ＮａｇＰ（Ｓａｍａ）株、ＣＧＬＹ／ｐＳＴＶ２９－ＮａｇＰ（ＭＲ４）、ＣＧＬＹ／ｐＳＴＶ２９－ＡｇａＰ（ＡＮＡ３）株、ＣＧＬＹ／ｐＳＴＶ２９－ＡｇａＰ（ＭＲ４）株、ＣＧＬＹ／ｐＳＴＶ２９－（Ｂｌｏｎ＿２３４４－２３４２）株、ＣＧＬＹ／ｐＳＴＶ２９－（Ｂｌｏｎ＿２３４７－２３４５）株、ＣＧＬＹ／ｐＳＴＶ２９－（Ｂｌｏｎ＿２３６１－２３５９）株、ＣＧＬＹ／ｐＳＴＶ２９－（Ｂｂｒ＿１５９０－１５８８）株、ＣＧＬＹ／ｐＳＴＶ２９－（Ｂｂｒ＿１５５１）、及びＣＧＬＹ／Ｃｔｒｌ株のＬＮＴ生産性及び、ＨＧＬＹ／ｐＳＴＶ２９－ＭｈｐＴ株、ＨＧＬＹ／ｐＳＴＶ２９－ＹｆｃＪ株、ＨＧＬＹ／ｐＳＴＶ２９－ＥｍｒＤ株、ＨＧＬＹ／ｐＳＴＶ２９－ＹｄｅＥ株、ＨＧＬＹ／ｐＳＴＶ２９－ＳｅｔＢ株、ＨＧＬＹ／ｐＳＴＶ２９－ＳｅｔＣ株、ＨＧＬＹ／ｐＳＴＶ２９－ＹｎｆＭ株、ＨＧＬＹ／ｐＳＴＶ２９－ＭｄｔＤ株、ＨＧＬＹ／ｐＳＴＶ２９－（Ｂｌｏｎ＿２３４４－２３４２）株、ＨＧＬＹ／ｐＳＴＶ２９－（Ｂｌｏｎ＿２３４７－２３４５）株、ＨＧＬＹ／ｐＳＴＶ２９－（Ｂｌｏｎ＿２３６１－２３５９）株、ＨＧＬＹ／ｐＳＴＶ２９－（Ｂｂｒ＿１５９０－１５８８）株、ＨＧＬＹ／ｐＳＴＶ２９－（Ｂｂｒ＿１５５１）株、ＨＧＬＹ／Ｃｔｒｌ株のＬＮｎＴ生産性を評価した。
　各菌株をそれぞれ１００ｍｇ／Ｌのカナマイシン及び２５ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコールを含むＬＢプレート上で３０℃にて１６時間培養し、１００ｍｇ／Ｌのカナマイシン（さらにＣＧＬＹ株由来生産菌には２５ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコール）を含むＬＢ培地２ｍＬが入った試験管に植菌して３０℃で１６時間、振盪培養した。その後、得られた培養液を１００ｍｇ／Ｌのカナマイシン及び２５ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコールを含む生産培地［グルコース３０ｇ／Ｌ、ラクトース一水和物又は、硫酸マグネシウム七水和物２ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム１６ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム１４ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム２ｇ／Ｌ、クエン酸１ｇ／Ｌ、カザミノ酸５ｇ／Ｌ、チアミン塩酸塩１０ｍｇ／Ｌ、硫酸第一鉄七水和物５０ｍｇ／Ｌ、硫酸マンガン五水和物１０ｍｇ／Ｌ（グルコース、ラクトース一水和物、硫酸マグネシウム七水和物以外については、水酸化ナトリウム水溶液によりｐＨ７．２に調整した後オートクレーブした）（グルコース、ラクトース一水和物、硫酸マグネシウム七水和物含有水溶液は別途調製した後オートクレーブし、それぞれ冷却後、混合した）］が４ｍＬ入った大型試験管に０．２ｍＬ植菌し、３０℃で２９時間振盪培養し、培養開始６時間後にＩＰＴＧを終濃度１ｍＭとなるよう添加した。
　培養終了後、培養液を遠心分離後に適宜希釈・菌体破砕し、上清及び菌体内に含まれるＬＮＴ及びＬＮｎＴを糖分析装置ＩＣＳ－６０００にて分析した。結果を表７～１０に示す。なお、ＴｏｔａｌのＬＮＴ量は、菌体外（上清）ＬＮＴ量と菌体内ＬＮＴ量を合算したものである。
　表７に記載の菌株４種類に関しては、上清及び菌体内に含まれるＬＮＴを、表９に記載の菌株６種類に関しては上清に含まれるＬＮＴを、それぞれ同時に分析した。また、表８に記載の菌株４種類及び表１０に記載の菌株６種類に関して、上清に含まれるＬＮｎＴをそれぞれ同時に分析した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　表７及び９に示された結果により、ＣＧＬＹ／ｐＳＴＶ２９－ＭｈｐＴ、ＣＧＬＹ／ｐＳＴＶ２９－ＹｆｃＪ、ＣＧＬＹ／ｐＳＴＶ２９－ＥｍｒＤ、ＣＧＬＹ／ｐＳＴＶ２９－ＹｄｅＥ株において、コントロール株であるＣＧＬＹ／Ｃｔｒｌ株と比較して、菌体外及びＴｏｔａｌのＬＮＴの生産量が向上することが示された。中でも、ＣＧＬＹ／ｐＳＴＶ２９－ＥｍｒＤ、ＣＧＬＹ／ｐＳＴＶ２９－ＹｄｅＥ株は、コントロール株であるＣＧＬＹ／Ｃｔｒｌ株と比較してＴｏｔａｌのＬＮＴの生産量が１．７倍以上に向上していることが示された。表７に記載した株の中では、菌体外及びＴｏｔａｌのＬＮＴの生産量の観点では、ＣＣＧＬＹ／ｐＳＴＶ２９－ＥｍｒＤ、ＣＧＬＹ／ｐＳＴＶ２９－ＹｄｅＥ株を用いたときに特に良好な結果が示された。
　なお、ＣＧＬＹ／ｐＳＴＶ２９－ＥｍｒＤ、ＣＧＬＹ／ｐＳＴＶ２９－ＹｄｅＥ株は、コントロール株であるＣＧＬＹ／Ｃｔｒｌ株と比較して、菌体外及びＴｏｔａｌのＬＮＴの生産量が向上すると共に、ＬＮＴの菌体外比率が向上することが示された。
　表１１に記載の菌株６種類に関して、上清及び菌体内に含まれるＬＮＴを同時に分析した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　表１１に示された結果から、ＣＧＬＹ／ｐＳＴＶ２９－ＮａｇＰ（ＡＮＡ３）、ＣＧＬＹ／ｐＳＴＶ２９－ＮａｇＰ（Ｓａｍａ）、ＣＧＬＹ／ｐＳＴＶ２９－ＮａｇＰ（ＭＲ４）、ＣＧＬＹ／ｐＳＴＶ２９－ＡｇａＰ（ＡＮＡ３）、ＣＧＬＹ／ｐＳＴＶ２９－ＡｇａＰ（ＭＲ４）株において、コントロール株であるＣＧＬＹ／Ｃｔｒｌ株と比較して、菌体外及びＴｏｔａｌのＬＮＴの生産量が向上することが示された。
　中でも、ＣＧＬＹ／ｐＳＴＶ２９－ＮａｇＰ（ＡＮＡ３）、ＣＧＬＹ／ｐＳＴＶ２９－ＮａｇＰ（Ｓａｍａ）、ＣＧＬＹ／ｐＳＴＶ２９－ＡｇａＰ（ＭＲ４）株は、コントロール株であるＣＧＬＹ／Ｃｔｒｌ株と比較してＴｏｔａｌのＬＮＴの生産量が１．５倍以上に向上していることが示された。表１１に記載した株の中では、ＴｏｔａｌのＬＮＴの生産量の観点では、ＣＧＬＹ／ｐＳＴＶ２９－ＮａｇＰ（ＡＮＡ３）、ＣＧＬＹ／ｐＳＴＶ２９－ＮａｇＰ（Ｓａｍａ）、ＣＧＬＹ／ｐＳＴＶ２９－ＡｇａＰ（ＭＲ４）株を用いたときに特に良好な結果が示された。
　また、ＣＧＬＹ／ｐＳＴＶ２９－ＮａｇＰ（ＡＮＡ３）、ＣＧＬＹ／ｐＳＴＶ２９－ＮａｇＰ（Ｓａｍａ）、ＣＧＬＹ／ｐＳＴＶ２９－ＡｇａＰ（ＭＲ４）株は、コントロール株であるＣＧＬＹ／Ｃｔｒｌ株と比較して菌体外のＬＮＴの生産量が１．８倍以上に向上していることが示された。表１１に記載した株の中では、菌体外のＬＮＴの生産量の観点では、ＣＧＬＹ／ｐＳＴＶ２９－ＮａｇＰ（ＡＮＡ３）、ＣＧＬＹ／ｐＳＴＶ２９－ＮａｇＰ（Ｓａｍａ）、ＣＧＬＹ／ｐＳＴＶ２９－ＡｇａＰ（ＭＲ４）株を用いたときに特に良好な結果が示された。
　なお、ＣＧＬＹ／ｐＳＴＶ２９－ＮａｇＰ（ＡＮＡ３）、ＣＧＬＹ／ｐＳＴＶ２９－ＮａｇＰ（Ｓａｍａ）、ＣＧＬＹ／ｐＳＴＶ２９－ＡｇａＰ（ＡＮＡ３）、ＣＧＬＹ／ｐＳＴＶ２９－ＡｇａＰ（ＭＲ４）株は、コントロール株であるＣＧＬＹ／Ｃｔｒｌ株と比較して、菌体外及びＴｏｔａｌのＬＮＴの生産量が向上すると共に、ＬＮＴの菌体外比率が向上することが示された。表１１に記載した株の中では、菌体外比率を向上させる観点では、ＣＧＬＹ／ｐＳＴＶ２９－ＮａｇＰ（ＡＮＡ３）、ＣＧＬＹ／ｐＳＴＶ２９－ＮａｇＰ（Ｓａｍａ）、ＣＧＬＹ／ｐＳＴＶ２９－ＡｇａＰ（ＡＮＡ３）、ＣＧＬＹ／ｐＳＴＶ２９－ＡｇａＰ（ＭＲ４）株を用いたときに特に良好な結果が示された。
　表１２に記載の菌株４種類に関して、上清及び菌体内に含まれるＬＮＴを同時に分析した。また、表１３に記載の菌株４種類に関して、上清に含まれるＬＮｎＴを同時に分析した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
　表１２に示された結果から、ＣＧＬＹ／ｐＳＴＶ２９－（Ｂｌｏｎ＿２３４４－２３４２）、ＣＧＬＹ／ｐＳＴＶ２９－（Ｂｌｏｎ＿２３４７－２３４５）、ＣＧＬＹ／ｐＳＴＶ２９－（Ｂｌｏｎ＿２３６１－２３５９）株において、コントロール株であるＣＧＬＹ／Ｃｔｒｌ株と比較して、菌体外及びＴｏｔａｌのＬＮＴの生産量が向上することが示された。
　また、ＣＧＬＹ／ｐＳＴＶ２９－（Ｂｌｏｎ＿２３４７－２３４５）株は、コントロール株であるＣＧＬＹ／Ｃｔｒｌ株と比較してＴｏｔａｌのＬＮＴの生産量が１．９５倍と、最も向上していることが示された。表１２に記載した株の中では、ＴｏｔａｌのＬＮＴの生産量の観点では、ＣＧＬＹ／ｐＳＴＶ２９－（Ｂｌｏｎ＿２３４７－２３４５）株を用いたときに特に良好な結果が示された。
　また、ＣＧＬＹ／ｐＳＴＶ２９－（Ｂｌｏｎ＿２３６１－２３５９）株は、コントロール株であるＣＧＬＹ／Ｃｔｒｌ株と比較して、菌体外のＬＮＴの生産量が２．４４倍と、最も向上することが示された。表１２に記載した株の中で、菌体外のＬＮＴの生産量の観点では、ＣＧＬＹ／ｐＳＴＶ２９－（Ｂｌｏｎ＿２３６１－２３５９）株を用いたときに特に良好な結果が示された。
　なお、ＣＧＬＹ／ｐＳＴＶ２９－（Ｂｌｏｎ＿２３４４－２３４２）、ＣＧＬＹ／ｐＳＴＶ２９－（Ｂｌｏｎ＿２３４７－２３４５）及びＣＧＬＹ／ｐＳＴＶ２９－（Ｂｌｏｎ＿２３６１－２３５９）株は、コントロール株であるＣＧＬＹ／Ｃｔｒｌ株と比較して、菌体外及びＴｏｔａｌのＬＮＴの生産量が向上すると共に、ＬＮＴの菌体外比率が向上することが示された。特に、ＣＧＬＹ／ｐＳＴＶ２９－（Ｂｌｏｎ＿２３６１－２３５９）株において、コントロール株であるＣＧＬＹ／Ｃｔｒｌ株と比較して、ＬＮＴの菌体外比率が１．３倍と、最も向上することが示された。表１２に記載した株の中で、菌体外比率を向上させる観点では、ＣＧＬＹ／ｐＳＴＶ２９－（Ｂｌｏｎ＿２３６１－２３５９）株を用いたときに特に良好な結果が示された。
　表１４に記載の菌株３種類に関して、上清及び菌体内に含まれるＬＮＴを同時に分析した。表１５に記載の菌株３種類に関して、上清及び菌体内に含まれるＬＮｎＴを同時に分析した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
　表１４に示された結果から、ＣＧＬＹ／ｐＳＴＶ２９－（Ｂｂｒ＿１５９０－１５８８）、ＣＧＬＹ／ｐＳＴＶ２９－（Ｂｂｒ＿１５５１）株において、コントロール株であるＣＧＬＹ株と比較して、ＴｏｔａｌのＬＮＴの生産量が向上することが示された。
　特に、ＣＧＬＹ／ｐＳＴＶ２９－（Ｂｂｒ＿１５５１）株において、コントロール株であるＣＧＬＹ株と比較して、ＴｏｔａｌのＬＮＴの生産量が１．４倍以上に向上することが示された。
　当業者であれば、特許請求の範囲に記載された範疇内において、各種の変更例又は修正例に想到し得ることは明らかであり、それらについても当然に本発明の技術的範囲に属するものと了解される。また、発明の趣旨を逸脱しない範囲において、上記実施の形態における各構成要素を任意に組み合わせてもよい。
　なお、本出願は、２０２３年８月３０日出願の日本特許出願（特願２０２３－１４０４３９）に基づくものであり、その内容は本出願の中に参照として援用される。
配列番号１：ＭｈｐＴの塩基配列
配列番号２：ＭｈｐＴのアミノ酸配列（アクセッション番号：ＷＰ＿０００１０７６２７．１）
配列番号３：ＹｆｃＪの塩基配列
配列番号４：ＹｆｃＪのアミノ酸配列（アクセッション番号：ＷＰ＿０００１２７７８１．１）
配列番号５：ＥｍｒＤの塩基配列
配列番号６：ＥｍｒＤのアミノ酸配列（アクセッション番号：ＷＰ＿０００８２８７４６．１）
配列番号７：ＹｄｅＥの塩基配列
配列番号８：ＹｄｅＥのアミノ酸配列（アクセッション番号：ＷＰ＿００１０５４２０４．１）
配列番号９：ＮａｇＰ（ＡＮＡ３）の塩基配列
配列番号１０：ＮａｇＰ（ＡＮＡ３）のアミノ酸配列（アクセッション番号：ＷＰ＿０１１７１６３２０．１）
配列番号１１：ＮａｇＰ（Ｓａｍａ）の塩基配列
配列番号１２：ＮａｇＰ（Ｓａｍａ）のアミノ酸配列（アクセッション番号：ＷＰ＿０１１７５９９８４．１）
配列番号１３：ＡｇａＰ（ＡＮＡ３）の塩基配列
配列番号１４：ＡｇａＰ（ＡＮＡ３）のアミノ酸配列（アクセッション番号：ＷＰ＿０１１７１７５８０．１）
配列番号１５：ＡｇａＰ（ＭＲ４）の塩基配列
配列番号１６：ＡｇａＰ（ＭＲ４）のアミノ酸配列（アクセッション番号：ＷＰ＿０１１６２３２８２．１）
配列番号１７：Ｂｌｏｎ２３４４、Ｂｌｏｎ２３４３及びＢｌｏｎ２３４２の塩基配列
配列番号１８：Ｂｌｏｎ２３４７、Ｂｌｏｎ２３４６及びＢｌｏｎ２３４５の塩基配列
配列番号１９：Ｂｌｏｎ２３６１、Ｂｌｏｎ２３６０及び２３５９の塩基配列
配列番号２０：コドン最適化型ｃｖβ３ＧａｌＴの塩基配列
配列番号２１：コドン最適化型ｃｖβ３ＧａｌＴのアミノ酸配列
配列番号２２：コドン最適化型ＮｐＬｇｔＡの塩基配列
配列番号２３：ＡＴＣＣ４３７６８株由来ＮｐＬｇｔＡのアミノ酸配列
配列番号２４：ｃａｔｓａｃＢ断片増幅用プライマーＦの塩基配列
配列番号２５：ｃａｔｓａｃＢ断片増幅用プライマーＲの塩基配列
配列番号２６：ｃｖβ３ＧａｌＴ断片増幅用プライマーＦの塩基配列
配列番号２７：ｃｖβ３ＧａｌＴ断片増幅用プライマーＲの塩基配列
配列番号２８：ＮｐＬｇｔＡ断片増幅用プライマーＦの塩基配列
配列番号２９：ＮｐＬｇｔＡ断片増幅用プライマーＲの塩基配列
配列番号３０：ＬａｃＹ断片増幅用プライマーＦの塩基配列
配列番号３１：ＬａｃＹ断片増幅用プライマーＲの塩基配列
配列番号３２：ｐＵＡＫＱＥ３１断片増幅用プライマーＦの塩基配列
配列番号３３：ｐＵＡＫＱＥ３１断片増幅用プライマーＲの塩基配列
配列番号３４：ｐＳＴＶ２９断片増幅用プライマーＦの塩基配列
配列番号３５：ｐＳＴＶ２９断片増幅用プライマーＲの塩基配列
配列番号３６：ＭｈｐＴ断片増幅用プライマーＦの塩基配列
配列番号３７：ＭｈｐＴ断片増幅用プライマーＲの塩基配列
配列番号３８：ＹｆｃＪ断片増幅用プライマーＦの塩基配列
配列番号３９：ＹｆｃＪ断片増幅用プライマーＲの塩基配列
配列番号４０：ＥｍｒＤ断片増幅用プライマーＦの塩基配列
配列番号４１：ＥｍｒＤ断片増幅用プライマーＲの塩基配列
配列番号４２：ＹｄｅＥ断片増幅用プライマーＦの塩基配列
配列番号４３：ＹｄｅＥ断片増幅用プライマーＲの塩基配列
配列番号４４：ＮａｇＰ（ＡＮＡ３）断片増幅用プライマーＦの塩基配列
配列番号４５：ＮａｇＰ（ＡＮＡ３）断片増幅用プライマーＲの塩基配列
配列番号４６：ＮａｇＰ（Ｓａｍａ）断片増幅用プライマーＦの塩基配列
配列番号４７：ＮａｇＰ（Ｓａｍａ）断片増幅用プライマーＲの塩基配列
配列番号４８：ＡｇａＰ（ＡＮＡ３）断片増幅用プライマーＦの塩基配列
配列番号４９：ＡｇａＰ（ＡＮＡ３）断片増幅用プライマーＲの塩基配列
配列番号５０：ＡｇａＰ（ＭＲ４）断片増幅用プライマーＦの塩基配列
配列番号５１：ＡｇａＰ（ＭＲ４）断片増幅用プライマーＲの塩基配列
配列番号５２：Ｂｌｏｎ＿２３４４―２３４２断片増幅用プライマーＦの塩基配列
配列番号５３：Ｂｌｏｎ＿２３４４―２３４２断片増幅用プライマーＲの塩基配列
配列番号５４：Ｂｌｏｎ＿２３４７－２３４５断片増幅用プライマーＦの塩基配列
配列番号５５：Ｂｌｏｎ＿２３４７－２３４５断片増幅用プライマーＲの塩基配列
配列番号５６：Ｂｌｏｎ＿２３６１－２３５９断片増幅用プライマーＦの塩基配列
配列番号５７：Ｂｌｏｎ＿２３６１－２３５９断片増幅用プライマーＲの塩基配列
配列番号５８：ＬａｃＺＹ上流１断片増幅用プライマーＦの塩基配列
配列番号５９：ＬａｃＺＹ上流１断片増幅用プライマーＲの塩基配列
配列番号６０：ＬａｃＺＹ下流１断片増幅用プライマーＦの塩基配列
配列番号６１：ＬａｃＺＹ下流１断片増幅用プライマーＲの塩基配列
配列番号６２：ＬａｃＺＹ上流２断片増幅用プライマーＲの塩基配列
配列番号６３：ＬａｃＺＹ下流２断片増幅用プライマーＦの塩基配列
配列番号６４：Ｂｌｏｎ２３４４のアミノ酸配列（アクセッション番号：ＡＣＪ５３４０２．１）
配列番号６５：Ｂｌｏｎ２３４３のアミノ酸配列（アクセッション番号：ＷＰ＿０１２５７８５７０．１）
配列番号６６：Ｂｌｏｎ２３４２のアミノ酸配列（アクセッション番号：ＷＰ＿０１２５７８５６９．１）
配列番号６７：Ｂｌｏｎ２３４７のアミノ酸配列（アクセッション番号：ＷＰ＿０１２５７８５７２．１）
配列番号６８：Ｂｌｏｎ２３４６のアミノ酸配列（アクセッション番号：ＷＰ＿０１２５７８５７０．１）
配列番号６９：Ｂｌｏｎ２３４５のアミノ酸配列（アクセッション番号：ＷＰ＿０１２５７８５６９．１）
配列番号７０：Ｂｌｏｎ２３６１のアミノ酸配列（アクセッション番号：ＷＰ＿０１２５７８５８６．１）
配列番号７１：Ｂｌｏｎ２３６０のアミノ酸配列（アクセッション番号：ＷＰ＿０１２５７８５８５．１）
配列番号７２：Ｂｌｏｎ２３５９のアミノ酸配列（アクセッション番号：ＷＰ＿０１２５７８５８４．１）
配列番号７３：コドン最適化型ＮａｇＰ（ＡＮＡ３）の塩基配列
配列番号７４：コドン最適化型ＮａｇＰ（Ｓａｍａ）の塩基配列
配列番号７５：コドン最適化型ＡｇａＰ（ＡＮＡ３）の塩基配列
配列番号７６：コドン最適化型ＡｇａＰ（ＭＲ４）の塩基配列
配列番号７７：Ｂｌｏｎ２３４４の塩基配列
配列番号７８：Ｂｌｏｎ２３４３の塩基配列
配列番号７９：Ｂｌｏｎ２３４２の塩基配列
配列番号８０：Ｂｌｏｎ２３４７の塩基配列
配列番号８１：Ｂｌｏｎ２３４６の塩基配列
配列番号８２：Ｂｌｏｎ２３４５の塩基配列
配列番号８３：Ｂｌｏｎ２３６１の塩基配列
配列番号８４：Ｂｌｏｎ２３６０の塩基配列
配列番号８５：Ｂｌｏｎ２３５９の塩基配列
配列番号８６：ＳｅｔＢの塩基配列
配列番号８７：ＳｅｔＢのアミノ酸配列
配列番号８８：ＮａｇＰ（ＭＲ４）の塩基配列
配列番号８９：ＮａｇＰ（ＭＲ４）のアミノ酸配列（アクセッション番号：ＷＰ＿０１１６２３６８０．１）
配列番号９０：ＳｅｔＣの塩基配列
配列番号９１：ＳｅｔＣのアミノ酸配列
配列番号９２：ＹｎｆＭの塩基配列
配列番号９３：ＹｎｆＭのアミノ酸配列
配列番号９４：ＭｄｔＤの塩基配列
配列番号９５：ＭｄｔＤのアミノ酸配列
配列番号９６：ＳｅｔＢ断片増幅用プライマーＦの塩基配列
配列番号９７：ＳｅｔＢ断片増幅用プライマーＲの塩基配列
配列番号９８：ＮａｇＰ（ＭＲ４）断片増幅用プライマーＦの塩基配列
配列番号９９：ＮａｇＰ（ＭＲ４）断片増幅用プライマーＲの塩基配列
配列番号１００：ＳｅｔＣ断片増幅用プライマーＦの塩基配列
配列番号１０１：ＳｅｔＣ断片増幅用プライマーＲの塩基配列
配列番号１０２：ＹｎｆＭ断片増幅用プライマーＦの塩基配列
配列番号１０３：ＹｎｆＭ断片増幅用プライマーＲの塩基配列
配列番号１０４：ＭｄｔＤ断片増幅用プライマーＦの塩基配列
配列番号１０５：ＭｄｔＤ断片増幅用プライマーＲの塩基配列
配列番号１０６：Ｂｂｒ＿１５９０のアミノ酸配列（アクセッション番号：ＷＰ＿０１５４３９１８７．１）
配列番号１０７：Ｂｂｒ＿１５９０の塩基配列
配列番号１０８：Ｂｂｒ＿１５８９のアミノ酸配列（アクセッション番号：ＷＰ＿００３８２９９４７．１）
配列番号１０９：Ｂｂｒ＿１５８９の塩基配列
配列番号１１０：Ｂｂｒ＿１５８８のアミノ酸配列（アクセッション番号：ＷＰ＿００３８２９９４９．１）
配列番号１１１：Ｂｂｒ＿１５８８の塩基配列
配列番号１１２：Ｂｂｒ＿１５５１のアミノ酸配列（アクセッション番号：ＷＰ＿０１５４３９１６４．１）
配列番号１１３：Ｂｂｒ＿１５５１の塩基配列
配列番号１１４：Ｂｂｒ＿１５９０断片増幅用プライマーＦの塩基配列
配列番号１１５：Ｂｂｒ＿１５９０断片増幅用プライマーＲの塩基配列
配列番号１１６：Ｂｂｒ＿１５８９断片増幅用プライマーＦの塩基配列
配列番号１１７：Ｂｂｒ＿１５８９断片増幅用プライマーＲの塩基配列
配列番号１１８：Ｂｂｒ＿１５８８断片増幅用プライマーＦの塩基配列
配列番号１１９：Ｂｂｒ＿１５８８断片増幅用プライマーＲの塩基配列
配列番号１２０：Ｂｂｒ＿１５５１断片増幅用プライマーＦの塩基配列
配列番号１２１：Ｂｂｒ＿１５５１断片増幅用プライマーＲの塩基配列
配列番号１２２：Ｂｂｒ＿１５９０の塩基配列
配列番号１２３：Ｂｂｒ＿１５８９の塩基配列
配列番号１２４：Ｂｂｒ＿１５８８の塩基配列
配列番号１２５：Ｂｂｒ＿１５５１の塩基配列
配列番号１２６：コドン最適化型ＮａｇＰ（ＭＲ４）の塩基配列
配列番号１２７：ＨｐＧａｌＴの塩基配列
配列番号１２８：ＨｐＧａｌＴのアミノ酸配列
配列番号１２９：ＨｐＧａｌＴ断片増幅用プライマーＦの塩基配列
配列番号１３０：ＨｐＧａｌＴ断片増幅用プライマーＲの塩基配列
配列番号１３１：ＮｐＬｇｔＡ２断片増幅用プライマーＦの塩基配列
配列番号１３２：ＮｐＬｇｔＡ２断片増幅用プライマーＲの塩基配列
配列番号１３３：ＬａｃＹ２断片増幅用プライマーＦの塩基配列
配列番号１３４：ＬａｃＹ２断片増幅用プライマーＲの塩基配列
配列番号１３５：ｐＴＫ３１断片増幅用プライマーＦの塩基配列　　
配列番号１３６：ｐＴＫ３１断片増幅用プライマーＲの塩基配列

Claims (10)

  1. 　ＭｈｐＴ、ＹｆｃＪ、ＥｍｒＤ、ＹｄｅＥ、Ｎ－アセチルグルコサミン（以下、「ＧｌｃＮＡｃ」とも称する。）　ｐｅｒｍｅａｓｅ、Ｎ－アセチルガラクトサミン（以下、「ＧａｌＮＡｃ」とも称する。）　ｐｅｒｍｅａｓｅ、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ属細菌由来ｓｕｇａｒ　Ｍａｊｏｒ　Ｆａｃｉｌｉｔａｔｏｒ　Ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ、Ｂｌｏｎ＿２３４４、Ｂｌｏｎ＿２３４３、Ｂｌｏｎ＿２３４２、Ｂｌｏｎ＿２３４７、Ｂｌｏｎ＿２３４６、Ｂｌｏｎ＿２３４５、Ｂｌｏｎ＿２３６１、Ｂｌｏｎ＿２３６０、Ｂｌｏｎ＿２３５９、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｂｒｅｖｅ由来ＡＴＰ－ｂｉｎｄｉｎｇ　ｃａｓｓｅｔｔｅトランスポーター（以下、「ＡＢＣトランスポーター」とも称する）、及びＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｂｒｅｖｅ由来ガラクトシドシンポーターからなる群より選択される少なくともいずれか１つの蛋白質の活性が増強され、かつ、ラクト－Ｎ－テトラオース（ＬＮＴ）を生産する、遺伝子改変微生物。
  2. 　前記ＧｌｃＮＡｃ　ｐｅｒｍｅａｓｅがＳｈｅｗａｎｅｌｌａ属細菌由来ＮａｇＰであり、前記ＧａｌＮＡｃ　ｐｅｒｍｅａｓｅがＳｈｅｗａｎｅｌｌａ属細菌由来ＡｇａＰである、請求項１に記載の遺伝子改変微生物。
  3. 　下記［１］に記載の蛋白質の活性が増強された、請求項１又は２に記載の遺伝子改変微生物。
    ［１］配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、８９、１０６、１０８、１１０、及び１１２からなる群より選択される少なくともいずれか１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質。
  4. 　下記［２］又は［３］に記載の蛋白質の活性が増強され、かつ、親株に比べてラクト－Ｎ－テトラオース（ＬＮＴ）の生産性が向上した、請求項１又は２に記載の遺伝子改変微生物。
    ［２］配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、８９、１０６、１０８、１１０、及び１１２からなる群より選択される少なくともいずれか１で表されるアミノ酸配列において、１～２０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなる変異蛋白質。
    ［３］配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、８９、１０６、１０８、１１０、及び１１２からなる群より選択される少なくともいずれか１で表されるアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる相同蛋白質。
  5. 　下記［４］～［７］のいずれか１に記載の改変が加えられた請求項１又は２に記載の遺伝子改変微生物。
    ［４］　配列番号６４、６５及び６６で表されるアミノ酸配列からなるそれぞれの蛋白質の活性を増強する改変。
    ［５］　配列番号６７、６８及び６９で表されるアミノ酸配列からなるそれぞれの蛋白質の活性を増強する改変。
    ［６］　配列番号７０、７１及び７２で表されるアミノ酸配列からなるそれぞれの蛋白質の活性を増強する改変。
    ［７］　配列番号１０６、１０８及び１１０で表されるアミノ酸配列からなるそれぞれの蛋白質の活性を増強する改変。
  6. 　ＬＮＴ骨格を有するオリゴ糖を生産する、請求項１又は２に記載の遺伝子改変微生物。
  7. 　前記ＬＮＴ骨格を有するオリゴ糖が、ラクト－Ｎ－フコペンタオ－スＩ（ＬＮＦＰＩ）及びシアリルラクト－Ｎ－テトラオースａ（ＬＳＴ－ａ）のうち少なくとも１つである、請求項６に記載の遺伝子改変微生物。
  8. 　前記遺伝子改変微生物が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）である、請求項１又は２に記載の遺伝子改変微生物。
  9. 　請求項１又は２に記載の遺伝子改変微生物を調製すること、及び当該遺伝子改変微生物を用いて培養上清中及び菌体内の少なくとも一方にオリゴ糖を生産することを含む、オリゴ糖の製造方法。
  10. 　前記オリゴ糖が、ラクト－Ｎ－テトラオース（ＬＮＴ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオ－スＩ（ＬＮＦＰＩ）及びシアリルラクト－Ｎ－テトラオースａ（ＬＳＴ－ａ）からなる群より選択される少なくとも１つである、請求項９に記載のオリゴ糖の製造方法。
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