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WO1986001298A1 - Procede de dosage de produits de degradation du fibrinogene - Google Patents

Procede de dosage de produits de degradation du fibrinogene Download PDF

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WO1986001298A1
WO1986001298A1 PCT/FR1985/000221 FR8500221W WO8601298A1 WO 1986001298 A1 WO1986001298 A1 WO 1986001298A1 FR 8500221 W FR8500221 W FR 8500221W WO 8601298 A1 WO8601298 A1 WO 8601298A1
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WO
WIPO (PCT)
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pdf
antibody
fibrinogen
monoclonal
monomeric
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/FR1985/000221
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English (en)
Inventor
Jean Amiral
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Diagnostica Stago SAS
Original Assignee
Diagnostica Stago SAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Diagnostica Stago SAS filed Critical Diagnostica Stago SAS
Publication of WO1986001298A1 publication Critical patent/WO1986001298A1/fr
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Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/56—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving blood clotting factors, e.g. involving thrombin, thromboplastin, fibrinogen
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/86—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood coagulating time or factors, or their receptors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/745—Assays involving non-enzymic blood coagulation factors
    • G01N2333/75—Fibrin; Fibrinogen

Definitions

  • the invention relates to a new method for assaying at least one degradation product of fibrinogen and fibrin (abbreviated: PDF) by means of a reaction mechanism of the antigen-antibody type using an anti- Monomeric PDF.
  • PDF fibrinogen and fibrin
  • fibrinolysis can have very serious consequences. Indeed, fibrinolyses, whether primary, extremely rare cases, or consecutive to disseminated intravascular coagulation, fairly frequent cases in surgery, obstetrics, resuscitation services, oncology or others, induce severe pathological disorders. It turns out that certain coagulation factors are either destroyed by proteolysis (fibrinogen, factors V, VIII etc.), or consumed (AT III, Protein C, Plasminogen, Factors V, VIII etc ). This results in a totally unbalanced coagulolytic picture, inducing bleeding disorders which can be very serious. PDFs from fibrinogen (abbreviated
  • PDFg or fibrin are markers of fibrinolytic status. They are produced by the action of plasmin formed on fibrinogen or fibrin.
  • the degradation of fibrinogen by plasmin gives the fragments X and Y called intermediate and the fragments D and E called terminal; under the action of thrombin fibrinogen transforms into spontaneously crosslinked fibrin; the degradation of the crosslinked fibrin gives fragments or polymer complexes (chains linked together by covalent bonds), in particular the fragment DD (or D dimer) and the complexes DDE and YDE; in terms of antigenic properties PDFg, such as fragment D (other nomenclatures: D monomer, PDF-D or PDFg-D), are different from PDFb, such as the DD fragment and the YDE complex, the differences in antigenic activities result from the presence of specific epitopes on the D fragment and explain in particular the possibilities of distinguish fragment D from fragment DD.
  • radioimmunoassays have been used in the past to determine PDF levels in serum.
  • radioimmunological equipment is not suited to the routine of hospitals and
  • a new technical solution for the dosing of PDF in the presence of fibrinogen which calls for the use of an anti-PDF monoclonal antibody produced from a monomeric PDF, in particular from fragment D fibrinogen.
  • the invention relates to a semi-quantitative dosing process for PDF in body fluids and more specifically plasma.
  • the invention relates to a quantitative dosing process for PDF of very high sensitivity in body fluids and more precisely plasma, the detection threshold according to said aspect of the invention being 0.5 ng / ml while it is of the order of 5 to 10 ng / ml according to the technique of EP-A-0 122 478.
  • the method for assaying at least one degradation product (PDF) of fibrinogen and fibrin according to the invention, by means of a reaction mechanism of the antigen-antibody type using an anti-PDF monoclonal antibody, is characterized in that a purified anti-PDF monoclonal antibody chosen from set including anti-PDF monoclonal antibodies which
  • (A) are made p "artir of at least one monomer PDF of fibrinogen, and (B) do not bind fibrinogen, with an aqueous liquid medium which may contain at least one PDF.
  • the complex product obtained by the reaction of the monomeric anti-PDF monoclonal antibody with the PDF or PDFs contained in the aqueous liquid medium to be tested constitutes a "signal" which is "amplified” according to a method known per se / _ ⁇ par example, EIA method (notably EIA-sandwich or EIA-co petition) according to which the complex is coupled with an appropriate enzyme conjugate, a radioimmunological method (RIA), an agglutination method or a luminescence method 7.
  • EIA method notably EIA-sandwich or EIA-co petition
  • the D neo and E neo fragments may be mentioned: the epitopes reacting with the corresponding anti-D neo (or anti-E neo) antibodies are hidden or masked inside the fibrinogen molecule intact (or native) but are exposed during the degradation of fibrinogen.
  • an anti-PDF-D monoclonal antibody is used to recognize the presence of a PDF-D, and can recognize PDF-DD if necessary. or PDF-DDE, and a monoclonal anti-PDF-E antibody recognizes the presence of a PDF-E.
  • the preparation of the anti-PDF monoclonal antibody which intervenes in the antigen-antibody mechanism according to the assay method of the invention comprises:
  • step 9) the purification of the antibodies is carried out by gel filtration according to a method known per se (gelfiltration). So 'advantageously this purification is followed by treatment with pepsin, to remove an element sensitive to the rheumatoid factors present in the plasma, prior to fixing on an inert support of the stadium 10 °).
  • the purified anti-PDF monoclonal antibody comprises a substantially Y-shaped element (see formula I) consisting of three fragments Fa, Fb and Fc.
  • the purpose of digestion with pepsin is to cleave said element in order to remove the Fc fragment which can react in an aspecific manner with Rheumatoid Factor and keep the element in the form of V (see formula II) comprising the fragments Fa and Fb and called ci -after F (ab ') 2.
  • Treatment with pepsin according to the mechanism:
  • the inert support which is involved in fixing the anti-PDF monoclonal antibody is chosen in particular from the group consisting of glass beads, latex particles (in particular polystyrene, polyacrylate, polymetacrylate latex, etc.), red blood cells, clays such as bentonite, carbon black and agarose.
  • any inert support other than those mentioned above can be used.
  • use will be made of an inert support constituted by particles of polystyrene latex having an average diameter less than or equal to 5 ⁇ m and preferably of the order of 0.1 to 1 ⁇ m, in particular 0.3 ⁇ m.
  • the binding of the anti-PDF monoclonal antibody to the inert support can be carried out by known means. Preferably, one of the following techniques will be used: - direct attachment to the inert support, in particular polystyrene beads,
  • a semi-quantitative assay method is recommended in which the monomeric anti-PDFg monoclonal antibody (preferably anti-E or better anti-D) purified, where appropriate.
  • an inert support consisting of particles of
  • the sensitivity threshold (expressed in fibrinogen equivalent) is here of the order of 1000 to 500 ng / ml. Given this threshold, it is not necessary to use, for example, a distinguishing monoclonal antibody
  • a method for the quantitative determination of PDF in a aqueous medium in particular a body fluid such as
  • This method comprises contacting the purified anti-PDFg monoclonal antibody, advantageously without Fc fragment, and attached to an inert support, with an aqueous sample to be tested, then reacting the resulting antigenic complex with an immunoconjugate chosen from c polyclonal anti-PDF antibodies, and revelation of the resulting complex according to a known method / _ ⁇ immunoenzymatique (EIA), radioimmun unanimous, lumi ⁇ nescence, agglutination_7-
  • EIA immunoenzymatique
  • the revelation will be carried out. here by enzyme-linked route, the polyclonal antibody 5 being labeled by an enzyme, peroxidase, and the determination of the PDFs in the test sample being carried out by competition or by the use of a sandwich.
  • the best mode for implementing the 0 quantitative dosing process includes, for PDF-D,
  • test sample containing .in particular PDF-D, PDF-DD and / or PDF-DDE
  • a neo D fragment leading to a monoclonal antibody can be chosen as the source of PDF-D anti D-neo which reacts selectively with PDF-D or with PDF-D and PDF-DD, but which does not react with fibrinogen
  • the PDF can be determined -D alone or the mixtures of PDF-D and PDF-DD, in combination, where appropriate with PDF-DDE.
  • the inert support for fixing monoclonal antibodies can be latex particles having the aforementioned granulo etry, or better can be constituted by tubes or wells to facilitate washing operations here.
  • the anti-D polyclonal immunoconjugate is prepared from a polyclonal antibody of the fragment D, in particular human.
  • the antibodies are then purified, either by chromatography ion exchange on a DEAE-Trisacryl, DEAE-Sephacel, DEAE-Sepharose exchanger (or any other exchanger type DEAE, QAE, CM or SP).
  • the thus obtained antibodies are then coupled to the -peroxydase selon- the periodate method of Nakane et al 1.
  • This i ⁇ i ⁇ unoconjugué - ' is then lyophilized in the presence of at least one stabilizing agent.
  • the sensitivity threshold (expressed in fibrinogen equivalent) is 0.5 ng / ml.
  • Such a low threshold is particularly interesting in subpathological cases where a low or moderate increase in the content of fragment D has an important diagnostic significance.
  • Such an assay is particularly important for detecting or detecting in particular: infarction and threat syndrome, various cancers, pulmonary embolism, deep venous thromboses; this list is only given for information only; indeed, any modification of the coagulolytic balance resulting in a pre-thrombotic state, will result in an increase in the rate of PDF-D anti-gene structures. It was therefore very important to be able to demonstrate, as is the case according to the invention, an abnormal rise very early, so as to be able to intervene preventively and thus avoid the thrombogenic ace.
  • the above-mentioned semi-quan ⁇ titative and quantitative assays can be implemented using an anti-PDF monoclonal antibody obtained from one of the easily isolatable PDFs, that is to say PDFg-D and PDFg-E and more precisely D neo and E neo, in particular of human origin.
  • sets or assay kits comprising the reagents / _ ⁇ , that is to say essentially an anti-PDF-D (or E) antibody adsorbed, are recommended. on an inert support, in particular a latex having particles with an average diameter of between 0.1 and
  • a prolonged degradation of human fibrinogen is carried out (1 g in 50 ml of citrate buffer 50 mg / ml, 0.15 M NaCl at pH 7.00) with human plasmin / _ ⁇ 50 CU (Casein Units) _7, for 24 hours at 37 ° C.
  • PDF-D and / or PDF-E are then purified by preparative electrophoresis on starch gel ("PEVIKON") according to MARDER et al. "The purification of fibrinogen degradation products by. Pevikon Block Electrophoresis". Thromb. Diath.Haemorrh. , 2, 234-239 (1969); or by ion exchange chromatography according to NILEHN, Thromb. Diath.Haemorrh. ,, 89-100 (1967).
  • PEVIKON starch gel
  • MARDER et al. The purification of fibrinogen degradation products by. Pevikon Block Electrophoresis. Thromb. Diath.Haemorrh. , 2, 234-239 (1969); or by ion exchange chromatography according to NILEHN, Thromb. Diath.Haemorrh. ,, 89-100 (1967).
  • the purified PDF-D and PDF-E are used for mouse immunizations (BALB-C) according to standard techniques, see for this purpose "Methods in Immunology”. A. Benjamin Inc. Publishers, 159-182, (1970).
  • mice After immunizations, the mice are sacrificed and the spleens are removed sterile (2 mice per fusion). The lymphocytes are extracted from the spleen and then the lymphocytes are fused with exponentially growing mouse myeloma cells at the rate of 10 lymphocytes per myeloma cell, in particular according to conventional hybridization protocols. lymphocitaire (see HURRELL JGR: “Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications". CRC Press Inc. Edit., 1981 ").
  • the ascites liquids are rich in monoclonal antibodies and are obtained by puncture. 5
  • the antibodies are then purified by precipitation with ammonium sulphate at 50% saturation, dialysis against the Tris buffer 0.025 iNaCl 0.035 M pH 8.80, then ion exchange chromatography on DEAE-Trisacryl gel balanced in the same buffer.
  • These purified Q antibodies are then used for fixing to latex particles or any other solid particle by simple adsorption or by covagent bond.
  • Fixation_par_liaison_covalente We take 5 ml of hydroxylated latex (having free OH functions) and active with metaperiodate 5 0.1 M at a rate of 5 ml. Incubate 30 minutes at room temperature (15-25 ° C) and then dialyse against 3 times 1000 volumes of 0.001 M acetate buffer at pH 4.20.
  • the dialysate is taken and 10 ml of 1 M ethylenediamine solution at pH 9.5 are added thereto. Incubate 10 'one hour at room temperature and dialysis against
  • the resulting dialysate is taken and 10 ml of 25% glutaraldehyde are added thereto and then incubated overnight at 5 at room temperature. Then dialyzed against
  • the dialysate thus obtained is taken and 12.5 mg of immunoglobulins are added thereto according to Example 1 (in 1 ml 2o of 0.05 M carbonate buffer, 0.25 M NaCl at pH 8.3).
  • the dialysate is taken and 10 ml of 25% glutaraldehyde are added thereto, then incubated overnight at laboratory temperature. Then dialyzed against 5 times 200 volumes of 0.05 M carbonate buffer containing 0.25 M NaCl at pH 8.3.
  • the procedure is as follows. 0 The blood is taken (9 volumes) and an anticoagulant (1 volume) is added thereto, the anticoagulant being an aqueous mixture of citrate (0.108 M) and excess aprotinin.
  • the plasma is collected by centrifugation and then the PDFs which it is likely to contain are assayed by bringing the plasma (1 drop) or its dilutions into contact with the reagent (1 drop) according to the invention.
  • the presence of macroscopic agglutination indicates that PDFs are present, the absence of PDF translating into the absence of agglutination.
  • Monoclonal anti-D neo antibodies are prepared from D neo fibrinogen according to Example 1 above.
  • the purified monoclonal antibodies are subjected to enzymatic digestion with pepsin to discard the Fc fragment.
  • the antibodies thus obtained are fixed ("coated") on an inert support (wells or tubes).
  • the aqueous sample to be tested is brought into contact with said fixed antibodies, the PDF-D to be assayed (or the PDF-D, PDF-DD and PDF-DDE mixture) are selected selectively compared to the other products contained in the In the sample, the other proteins, in excess, are removed by washing.
  • the antigenic complex thus formed is then revealed by a polyclonal rabbit antibody specific for fragment D and labeled with peroxidase.
  • the enzymatic activity is demonstrated by the oxidizing action on the orthophenylenediamine substrate (OPD) in the presence of hydrogen peroxide.
  • OPD orthophenylenediamine substrate
  • Coating buffer Carbonate 0.05 M pH 9.60
  • Dilution buffer Phosphate 0.05 M NaCl 0.15 M
  • Washing solution Phosphate 0.01 M NaCl 0.15 M Tween 20 0.1% pH 7.00
  • Ant ' i D-neo (monoclonal) coating antibodies according to the present example. used at 2 ug / ml in anti-PDF-D antibody conjugate (polyclonal) buffer conjugated to peroxidase. Use 1/8000 in dilution buffer.
  • the unconjugate is prepared as follows.
  • a rabbit is immunized with a purified PDF-D / _ ⁇ obtained by prolonged degradation of human fibrinogen with plasmin and then purification by electrophoresis according to MARDER et al.,
  • the resulting antiserum is made specific by exhaustion on a solid support.
  • the anti-D polyclonal antibodies are purified by ion exchange chromatography using a DEAE-Trisacryl exchanger, then coupled to peroxidase according to the aforementioned method of NAKANE et al.
  • the immunoconjugate is lyophilized in the presence of stabilizing agents and is diluted at the time of use.
  • the calibration is carried out using the DD fragment obtained from a solution with known concentration of fibrinogen, coagulated by thrombin in the presence of Ca, Factor XIII-A and plasmin. A clot forms and is then lysed. The preparation is stabilized with aprotinin. We have a fibrin lysate with known DD concentration. The DD is expressed in initial fibrinogenic equivalent, using concentrations ranging from 0 to 50 ng / ml as indicated above.
  • Plasma_to_test Normal levels: dilute 1/10 in dilution buffer
  • Pathological rates dilute 1/50 and 1/200 in dilution buffer. Protocol a) Coating:. Distribute 200 jul of coating solution
  • Antigen Distribute 200 ⁇ l of standard antigen or diluted plasma to be tested per cuvette. • Incubate for 1 hour at room temperature.
  • a product according to the invention was compared (product A »anti-D-neo monoclonal antibody without 5 Fc fragment) specific for the D and DD fragments and prepared according to Example 5, with an anti-PDF-DD monoclonal antibody 20
  • D and DD fragments specific for the D and DD fragments, namely a .. pro d uit (pro d uit CP-1, in accordance with the teaching of EP-A-0 122 478) obtained according to the present example 5 from a DD fragment cross-linked fibrin (instead of a D-neo fragment) and free of Fc,

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Abstract

Nouveau procédé de dosage de produits de dégradation (PDF) du fibrinogène et de la fibrine notamment sur le plasma. Ce procédé qui met en oeuvre un anticorps monoclonal anti-PDF dans une réaction du type antigène-anticorps est caractérisé en ce que l'on met en contact un anticorps monoclonal anti-PDF purifié choisi parmi l'ensemble comprenant les anticorps monoclonaux anti-PDF qui, (A) sont élaborés à partir d'au moins un PDF monomère du fibrinogène, et (B) ne fixent pas le fibrinogène, avec un milieu liquide aqueux susceptible de contenir au moins un PDF, le complexe formé par ledit anticorps monoclonal et ledit PDF dudit milieu aqueux constituant un signal que l'on amplifie de façon appropriée. Pour la mise en oeuvre de ce procédé, on préconise des ensembles ou kits de dosage prêts à l'emploi comprenant comme anticorps monoclonal anti-PDF monomère notamment un anticorps anti-D néo.

Description

Procédé de dosage de produits de dégradation du fibrinogène
L'invention concerne un nouveau procédé de dosage d'au moins un produit de dégradation du fibri¬ nogène et de la fibrine (en abrégé : PDF) au moyen d'un mécanisme réactionnel du type antigène-anticorps mettant en oeuvre un anticorps anti-PDF monomère.
On sait que les fibrinolyses peuvent avoir des conséquences très graves. En effet les fibrinolyses, qu'elles soient primaires, cas extrêmement rares, ou consécutives à une coagulation intra-vasculaire dissé¬ minée, cas assez fréquents en chirurgie, obstétrique, services de réanimation, cancérologie ou autres, induisent des troubles pathologiques sévères. Il se trouve que certains facteurs de la coagulation sont soit détruits par protéolyse (fibrinogène, facteurs V, VIII etc.), soit consommés (AT III, Protéine C, Plasminogène, Facteurs V, VIII etc...). Il en résulte un tableau coagulolytique totalement déséquilibré, induisant des troubles hémorragiques pouvant être très graves. Les PDF provenant du fibrinogène (en abrégé
PDFg) ou de la fibrine (en abrégé PDFb) sont des marqueurs de l'état fibrinolytique. Ils sont produits par l'action de la plasmine formée sur le fibrinogène ou la fibrine. A toutes fins utiles on rappelle que : dans l'organisme, la dégradation du fibrinogène par la plasmine donne les fragments X et Y dits intermédiaires et les fragments D et E dits terminaux ; sous l'action de la thrombine le fibrinogène se transforme en fibrine spontanément réticulée ; la dégradation de la fibrine réticulée donne des fragments ou complexes polymères (chaînes liées entre elles par des liaisons covalentes), notamment le fragment DD (ou D dimère) et les complexes DDE et YDE ; sur le plan des propriétés antigéniques les PDFg, tels que le fragment D (autres nomenclatures : D monomère, PDF-D ou PDFg-D), sont différents des PDFb, tels que le fragment DD et le complexe YDE, les différences d'acti¬ vités antigéniques résultent de la présence d'épitopes spécifiques sur le fragment D et expliquent notamment les possibilités de distinguer le fragment D du fragment DD. L'ensemble des informations sus-visées est extrait des publications suivantes : MARDER et al., "The Struc¬ ture of Fibrinogen Dégradation Products" publié dans "Progress in Hemostasis and Thrombosis", Vol II, pages 141-174, (1974) ; BUDZYNSKI et al., Biochim. Biophys. Acta, _147, pages 313-323, (1967) ; BUDZYNSKI et al., Blood 54. (N° 4), pages 794-804, (1979) - où il est indi¬ qué que le fragment DD (D dimère) provenant de la fibrine est beaucoup plus réactif en tant que marqueur que le fragment D (D monomère) provenant du fibrinogène - ; et PLO et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 70 (n° 4), pages 1169-1173, (1973) - où est décrite l'obtention d'antigènes néo présentant des épitopes jouant le rδle de déterminants antigéniques, cachés dans le fibrinogène et la fibrine et exposés lors de la- dégradation du fibrinogène ou de la fibrine, un épitope étant un chaînon peptidiqus de 4 à 6 aminoacides environ -.
Cliniquement il est important de pouvoir déterminer les taux de PDF dans les fluides corporels des patients, au moins de façon semi-quantitative.
On sait par ailleurs que pour doser les PDF on a utilisé dans le passé des méthodes de dosage sur le sérum, le sérum étant obtenu à partir du plasma par coagulation puis centrifugation pour recueillir le surnageant, le plasma étant lui obtenu par centrifuga¬ tion du sang et recueil du surnageant.
Parmi les techniques antérieures on connait celles qui font appel à l'agglutination de staphylocoques dorés inactivés, l'agglutination d'un support sensibilisé par des anticorps polyclonaux spécifiques ou encore la méthode de Merskey qui est un test d'inhibition. Ces techniques anciennes de dosage présentent un certain nombre d'inconvénients. En particulier elles ne permettent pas de distinguer le fibrinogène plasmatique des PDF et impliquent donc au préalable un traitement du plasma pour oter spécifiquement le fibrinogène natif ; cela peut s'effectuer par coagulation dans des conditions adéquates (en présence d'agents antifibrinolytiques). Les PDF sont ensuite recherchés sur le sérum obtenu. Ces opérations successives entraînent :
- un allongement de la durée du dosage,
- la coagulation de certains PDF précoces (notamment le fragment X également désigné PDF-X) , ce qui entraine l'élimination desdits PDF avec le caillot, - une proportion non négligeable des PDF formés est susceptible d'être adsorbée sur le. caillot de fibrine,
- le cas échéant, une mauvaise coagulation, laissant du fibrinogène résiduel, qui conduit à des erreurs de dosage.
On sait aussi que l'on a utilisé dans le passé des dosages radioimmunologiques pour déterminer les taux de PDF dans le sérum. Toutefois il convient de remarquer que l'utilisation du matériel radioimmunolo- gique n'est pas adapté à la routine des hôpitaux et des
» laboratoires d'analyses, eu égard aux éléments suivants :
- la grande sensibilité d'un dosage radio- immunologique est inutile pour ce genre de test,
- le matériel radioimmunologique est lourd et coûteux,
- la durée du dosage radioimmunologique est trop importante, quand un dosage semi-quantitatif suffit pour des recher¬ ches d'exploration. II est également connu qu'il a été recommandé récemment d'utiliser des anticorps monoclonaux anti-PDF pour l'étude de la structurée du fibrinogène, de la fibrine et de leurs produits de dégradation, d'une part, et des mécanismes pathogènes impliqués par la dégradation du fibrinogène et de la fibrine par la plasmine et la transformation du fibrinogène en fibrine par la thro bine, d'autre part. Ainsi, le résumé des Chemical Abstracts 100, 119083c (1984) signale l'obtention, à partir d'un antigène PDFb, d'un anticorps monoclonal spécifique d'un épitope particulier de la chaîne Bβ de la fibrine ; l'article de HUI et al., Science ^22, 1129-1131, (1983) décrit l'obtention d'anticorps monoclonaux, à partir d'un heptapeptide synthétique analogue à une portion de l'une des chaînes protéiniques de la fibrine, capables de se lier à la fibrine plasmatique en présence du fibrinogène. Une solution technique pour la détermina¬ tion et le dosage des PDF, qui met en oeuvre des anti¬ corps monoclonaux anti-PDFb-DD produits à partir du fragment D dimère de la fibrine réticulée, a été décrite dans les résumés des Chemical Abstracts ^9_, 136280t, (1983) et SJ9_, 209051f, (1983) ainsi que dans le document de brevet EP-A-0 122 478 (date de publication : 24 octobre 1984) .
Selon l'invention on préconise une nouvelle solution technique pour le dosage des PDF en présence de fibrinogène qui fait appel à l'utilisation d'un anticorps monoclonal anti-PDF produit à partir d'un PDF monomère, en particulier à partir du fragment D du fibrinogène.
Cette nouvelle technique, qui met en oeuvre des moyens différents de ceux préconisés dans CA 99,
136280t et 209051f (1983) et dans EP-A-0 122 478 précités, permet de réaliser des dosages sur le plasma humain de façon efficace. Les protocoles à suivre et le matériel à utiliser sont simples et non onéreux, notamment suivant les modalités opératoires données ci-après. De plus la nouvelle technique selon l'invention va à l'encontre de l'enseignement de BUDZYNSKI et al., Blood 54 (N°4), 794-804 (1979) précité en ce qui concerne la non-efficacité du fragment D en tant que source de marquage, notamment par rapport au fragment DD.
Selon l'un de ses aspects l'invention concerne un procédé de dosage semi-quantitatif de PDF dans les fluides corporels et plus précisément le plasma.
Selon un autre aspect l'invention a trait à un procédé de dosage quantitatif de PDF de très haute sensibilité dans les fluides corporels et plus précisé¬ ment le plasma, le seuil de détection selon ledit aspect de l'invention étant 0,5 ng/ml alors qu'il est de l'ordre de 5 à 10 ng/ml selon la technique de EP-A-0 122 478. Le procédé de dosage d'au moins un produit de dégradation (PDF) du fibrinogène et de la fibrine , selon l'invention, au moyen d'un mécanisme réactionnel du type antigène-anticorps mettant en oeuvre un anticorps monoclonal anti-PDF, est caractérisé en ce que l'on met en contact un anticorps monoclonal anti-PDF purifié choisi parmi l'ensemble comprenant les anticorps monoclonaux anti-PDF qui
(A) sont élaborés à p"artir d'au moins un PDF monomère du fibrinogène, et (B) ne fixent pas le fibrinogène, avec un milieu liquide aqueux susceptible de contenir au moins un PDF.
Le produit complexe obtenu par la réaction de l'anticorps monoclonal anti-PDF monomère avec le ou les PDF contenusdans le milieu liquide aqueux à tester constitue un "signal" que l'on "amplifie" selon une méthode connue en soi /_~par exemple, méthode EIA (notam¬ ment EIA-sandwich ou EIA-co pétition ) selon laquelle on couple le complexe avec un conjugué enzymatique approprié, une méthode radioimmunologique (RIA), une méthode d'agglutination ou une méthode de luminescence 7. On décèle ainsi la présence ou l'absence de PDF dans l'échantillon à tester, d'une part, on dose la quantité de PDF fixée à l'anticorps monoclonalanti-PDF'rnonomère,d'autre p Les antigènes PDF, qui interviennent dans la production d'anticorps monoclonaux, sont les produits de dégradation monomères du fibrinogène notamment d'origine humaine.
Il s'agit essentiellement-des fragments D et E (et à la rigueur Y) présentant des epitopes jouant le rôle de déterminants antigéniques, de façon que les anticorps anti-PDF corres- pondants fixent lesdits PDF sans fixer le fibrinogène.
Parmi les antigènes qui conviennent selon l'invention on peut citer les fragments D néoet E néo: les epitopes réagissant avec les anticorps anti-D néo (ou anti-E néo) correspondant sont cachés ou masqués à 1 'intérieur de la molécule de fibrinogène intact (ou natif) mais sont exposés lors de la dégradation du fibrinogène.
Comme les fragments de PDF comportent sen¬ siblement un certain nombre d'epitopes communs, un anti¬ corps monoclonal anti-PDF-D est utilisé pour reconnaître a présence d'un PDF-D, et peut reconnaître le cas échéant les PDF-DD ou PDF-DDE, et un anticorps monoclonal anti-PDF-E reconnaît la présence d'un PDF-E.
La préparation de l'anticorps monoclonal anti-PDF qui intervient dans le mécanisme antigène- anticorps selon le procédé de dosage de 1'invention comprend :
1°) la dégradation du fibrinogène par de la plasmine pendant 24 h à 37°C,
2°) la purification d'au moins un PDF ainsi obtenu,
3°) 1'innoculation dudit PDF à une souris, 4°) le prélèvement de la rate de l'animal immunisé,
5°) l'extraction des lymphocytes de la rate et la fusion des lymphocytes avec des cellules de myélome de souris en croissance exponentielle à raison de 5 à 20, de préférence 10 lymphocytes par cellule de myélome,
6°) la sélection des hybridomes sécréteurs ainsi obtenus en vue d'obtenir des clones produisant des anticorps monoclonaux réagissant sélectivement avec les PDF mais pas avec le fibrinogène.
7°) le développement de tumeurs ascitiques chez la souris avec les clones sélectionnés, 8°) a récupération des liquides d'ascite contenant les anticorps monoclonaux par ponction, 9°) la purification des anticorps, 10°) la fixation des anticorps monoclonaux purifiés sur un support inerte. Au stade 9°) la purification des anticorps est effectuée par filtration sur gel selon une méthode connue en soi (gelfiltration) . De façon'avantageuse cette purification est suivie d'un traitement à la pepsine, pour éliminer un élément sensible au Facteur Rhumatoide présent dans le plasma, avant la fixation sur support inerte du stade 10°).
De façon schématique l'anticorps monoclonal anti-PDF purifié comporte un élément sensiblement en forme de Y (voir formule I) constitué de trois fragments Fa, Fb et Fc. La digestion par la pepsine a pour objet de cliver ledit élément pour écarter le fragment Fc qui peut réagir de façon aspécifique avec le Facteur Rhumatoide et conserver l'élément en forme de V (voir formule II) comprenant les fragments Fa et Fb et dénommé ci-après F(ab')2. Le traitement avec la pepsine selon le mécanisme :
Figure imgf000009_0001
offre l'avantage d'éviter toute interférence avec ledit Facteur Rhumatoide et par suite tout résultat faussement positif lors du dosage des PDF.
Le support inerte qui intervient pour la fixation de l'anticorps monoclonal anti-PDF, est choisi notamment parmi l'ensemble constitué par les billes de verre, les particules de latex (notamment les latex de polystyrène, polyacrylate, polymétacrylate, etc.), les globules rouges, les argiles telles que la bentonite, le noir de carbone et l'agarose. Bien entendu on peut faire appel à un support inerte quelconque différent de ceux visés ci-dessus. De façon avantageuse on fera appel à un support inerte constitué par des particules de latex de polystyrène ayant un diamètre moyen inférieur ou égal à 5 μm et de préférence de l'ordre de 0,1 à 1 μm, notamment de 0,3 μm. La fixation de l'anticorps monoclonal anti-PDF sur le support inerte peut être réalisée par des moyens connus. De préférence l'on fera appel à l'une des techniques suivantes : - fixation directe sur le support inerte, notamment les billes de polystyrène,
- fixation par liaison covale te après activation chimique du support ou par activation de
1'anticorps, - fixation par l'intermédiaire d'un bras espaceur, lui-même activé, ou après activation de l'anti¬ corps,
- fixation sur couche intermédiaire (protéique, chimique ou autre...) enrobant la particule ou recouvrant le support, par simple adsorp ion, par activation chimique ou physique de la couche ou par activation de l'anticorps. Selon un premier aspect de l'invention, on préconise un procédé de dosage semi-quantitatif dans lequel l'anticorps monoclonal anti-PDFg monomère (de préférence anti-E ou mieux anti-D) purifié, le cas échéant
5 sans fragment Fc sensible au Facteur Rhumatoide, et fixé à un support inerte, est mis en contact avec un milieu aqueux (par exemple un liquide corporel tel que le plasma) à tester susceptible de contenir des PDF, la révélation (i.e. l'amplification du signal sus-visée)
10 étant réalisée par agglutination macroscopique : l'agglu¬ tination signalant la présence de PDF, et, l'absence d'agglutination l'absence de PDF.
Dans ce dosage on fera avantageusement appel à un support inerte constitué par des particules de
15 latex de polystyrène ayant la granulométrie sus-visée.
Le seuil de sensibilité (exprimé en équivalent fibrinogène) est ici de l'ordre de 1000 à 500 ng/ml. Compte-tenu de ce seuil, il n'est pas nécessaire de faire appel par exemple à un anticorps monoclonal distinguant
2o sélectivement le PDF-D dans un mélange pouvant renfermer le fibrinogène, les fragments D et DD et les autres PDF, il suffit d'utiliser un anticorps monoclonal anti-PDF-D selon l'invention (notamment un anti D-néo) reconnaissant les sites actifs déterminants antigéniques p c du fragment D qui sont présents sur ledit fragment D et le fragment DD.
Selon un second aspect de l'invention on pré¬ conise un procédé de dosage quantitatif des PDF dans un milieu aqueux, notamment un liquide corporel tel que
3 le plasma. Ce procédé comprend la mise en contact de l'anticorps monoclonal anti-PDFg purifié, avantageusement sans fragment Fc, et fixé à un support inerte, avec un échantillon aqueux à tester, puis, la réaction du complexe antigénique résultant avec un immunoconjugué choisi c parmi les anticorps polyclonaux anti-PDF, et la révélation du complexe résultant selon une méthode connue /_~immunoenzymatique (E.I.A.), radioimmunologique, lumi¬ nescence, agglutination_7-
De préférence la révélation sera effectuée . ici par voie i munoenzymatique, l'anticorps polyclonal 5 étant marqué par un enzyme, la peroxydase, et la détermination des PDF dans l'échantillon à tester étant réalisée par compétition ou par la mise en oeuvre d'un sandwich.
Le meilleur mode pour la mise en- oeuvre du 0 procédé de dosage quantitatif comprend, pour le PDF-D,
1° ) la dégradation du fibrinogène humain par de la plasmine pendant 24 h à 37°C,
2°) la purification d'au moins un PDF-D ainsi obtenu, -5 3°) 1'innoculation dudit PDF-D à une souris,
4°) le prélèvement de la rate de l'animal immunisé,
5°) l'extraction des lymphocytes de la rate et la fusion des lymphocytes avec des cellules de myélome 20 de souris en croissance exponentielle à raison de 5 à 20, de préférence 10 lymphocytes par cellule de myélome,
6°) la sélection des hybridomes sécréteurs ainsi obtenus en vue d'obtenir des clones produisant des anticorps monoclonaux réagissant sélectivement avec les 25 PDF mais pas avec le fibrinogène,
7°) le développement de tumeurs ascitiques chez la souris avec les clones sélectionnés,
8°) la récupération des liquides d'ascite contenant les anticorps monoclonaux par ponction, 3θ 9°) la purification des anticorps monoclonaux ainsi obtenus, puis, l'élimination du fragment Fc,
10°) la fixation des anticorps monoclonaux /_~F(abl)2_7 ainsi obtenus sur un support inerte,
11°) la mise en contact desdits anticorps 35 monoclonaux avec un échantillon à tester (contenant .notamment des PDF-D, PDF-DD et/ou PDF-DDE),
12°) la mise en contact du complexe antigénique résultant avec au moins un anticorps polyclonal anti-D marqué avec un enzyme (de préférence la peroxydase), et 13°) la mesure de l'activité enzymatique sur un substrat approprié /"de préférence un substrat orthophénylènediamine (OPD), en présence de H20 pour l'évaluation de l'activité de la peroxydase liée au complexe antigène-anticorps_7. Ici on peut choisir comme source de PDF-D un fragment D néo conduisant à un anticorps monoclonal anti D-néo qui réagit avec le PDF-D sélectivement ou avec les PDF-D et PDF-DD, mais qui ne réagit pas avec le fibrinogène. En fonction de la sélection des anticorps 5 monoclonaux anti-D néo on peut doser le PDF-D seul ou les mélanges de PDF-D et de PDF-DD, en association, le cas échéant avec PDF-DDE. Tout dépend dans cette sélec¬ tion du ou des epitopes (i) non communs entre les frag¬ ments D et DD, ou (ii) communs aux dits fragments. 0 Le support inerte de fixation des anticorps monoclonaux peut être des particules de latex ayant la granulo étrie sus-visée, ou mieux peut être constitué par des tubes ou cupules pour faciliter ici les opéra¬ tions de lavage. 5 L'immunoconjugué polyclonal anti-D est préparé à partir d'un anticorps polyclonal du fragment D notamment humain.
Pour cela un lapin esr ιrnrnun_.sώ avec au -fragment D hautement purifié /_~obtenu par dégradation prolongée de fibrinogène par la plasmine et purification par électro- phorèse préparative sur bloc de PEVIKON selon MARDER et al. "The purification of fibrinogen dégradation products by PEVIKON Block Electrophoresis", Thromb. Diath. Haemorrh. 2_2, 234-239, (1969)_7. L'antisérum ainsi obtenu est rendu spécifique par épuisement sur support solide. -. Les anticorps sont ensuite purifiés, soit par chromatograph d'échange d'ions sur un échangeur type DEAE-Trisacryl , DEAE-Séphacel, DEAE-Sépharose , (ou tout autre échangeur type DEAE, QAE, CM ou SP)-. Les anticorps ainsi obtenus sont ensuite couplés à la -peroxydase selon- la méthode au périodate1 de NAKANE et al . ,• - "Peroxydase labelled antibody : a new method of con jugation" , J. Hystochem.Cytochem.i 22, 1084-1091, (1974). Cet iπiπunoconjugué -' est ensuite lyophilisé en présence d'au moins un agent stabilisant. Selon ce meilleur mode de mise en oeuvre, le seuil de sensibilité (exprimé en équivalent fibrinogène) est de 0,5 ng/ml.
Un seuil aussi faible est particulièrement intéressant dans les cas subpathologiques où une élévation faible ou modérée de la teneur en fragment D a une signification de diagnostic importante. Un tel dosage est particulièrement important pour déceler ou détecter notamment : infarctus et syndrome de menace, cancers divers, embolie pulmonaire, thromboses veineuses pro¬ fondes ; cette liste n'étant donnée qu'à titre purement indicatif ; en effet, toute modification de l'équilibre coagulolytique entraînant un état préthrombotique, se traduira par une élévation du taux de structures anti¬ géniques PDF-D. Il était donc très important de pouvoir mettre en évidence, comme cela est le cas selon l'inven¬ tion, une élévation anormale de manière très précoce, de façon à pouvoir intervenir préventivement et éviter ainsi 1 ' ace ident thrombogène .
Ainsi selon l'invention les dosages semi-quan¬ titatif et quantitatif sus-visés peuvent être mis en oeuvre à partir d'un anticorps monoclonal anti-PDF obtenu à partir d'un des PDF facilement isolables, c'est-à-dire les PDFg-D et PDFg-E et plus précisément les D néo et E néo, notamment d'origine humaine.
Selon l'invention on préconise des ensembles ou kits de dosage comprenant les réactifs /_~c 'est-à-dire essentiellement un anticorps anti-PDF-D (ou E) adsorbé sur un support inerte, notamment un latex ayant des particules d'un diamètre moyen compris entre 0,1 et
1 μm ou encore des tubes ou cupules ; et des diluants_7.
D'autres avantages et caractéristiques de l'invention seront mieux compris à la lecture qui va suivre d'exemples de préparation nullement limitatifs mais donnés à titre d'illustration. EXEMPLE I
Préparâtion_des_réactifs A. PREPARATION DES PDF
On procède à une dégradation prolongée du fibrinogène humain (1 g dans 50 ml de tampon citrate 50 mg/ml, NaCl 0,15 M à pH 7,00) par de la plasmine humaine /_~50 CU (Unités Caséine)_7, pendant 24 heures à 37°C.
On procède ensuite à la purification des PDF-D et/ou PDF-E par électrophorèse préparative sur gel d'amidon ("PEVIKON") selon MARDER et al. "The purifica¬ tion of fibrinogen dégradation products by. Pevikon Block Electrophoresis". Thromb. Diath.Haemorrh. , 2, 234-239 (1969) ; ou par chromatographie d'échange d'ions selon NILEHN, Thromb. Diath.Haemorrh. , , 89-100 (1967). B. DEVELOPPEMENT DES ANTICORPS MONOCLONAUX
Les PDF-D et PDF-E purifiés sont utilisés pour des immunisations de souris (BALB-C) selon des technique usuelles, voir à cet effet "Methods in Immunology". A. Benjamin Inc. Publishers, 159-182, (1970).
Après immunisations on sacrifie les souris et on prélève stérilement les rates (2 souris par fusion). On extrait les lymphocytes de la rate puis on procède à la fusion des lymphocytes avec des cellules de myélome de souris en croissance exponentielle à raison de 10 lymphocytes par cellule de myélome, selon notamment des protocoles classiques d'hybridation lymphocitaire (voir HURRELL J.G.R. : "Monoclonal Hybridoma Antibodies : Techniques and Applications". CRC Press Inc. Edit., 1981").
On procède ensuite à la sélection des hybridomes sécréteurs et autres screening des clones produisant des anticorps monoclonaux réagissant avec les PDF (D ou E) mais pas avec le fibrinogène (par techniques immuno- enzymatiques) . C. PRODUCTION DES ANTICORPS MONOCLONAUX 0 Les clones sélectionnés sont mis en culture, puis utilisés pour développer des tumeurs ascitiques chez la souris BALB-C.
Les liquides d'ascite sont riches en anticorps monoclonaux et sont obtenus par ponction. 5 Les anticorps sont ensuite purifiés par préci¬ pitation au sulfate d'ammonium à 50 % de saturation, dialyse contre le tampon Tris 0,025 iNaCl 0,035 M pH 8,80, puis chromatographie d'échange d'ions sur gel de DEAE- Trisacryl équilibré dans le même tampon. Ces anticorps Q purifiés (immunoglobulines) sont ensuite utilisés pour fixation sur particules de latex ou toute autre parti¬ cule solide par simple adsorption ou par liaison cova- lente. EXEMPLE 2.
25 _-i_- _-_:20_S r_5ii_îPiÊ_ ËS2£PÏi2_-_-!_-_r__:-____:-.
On prend 5 ml de suspension de latex de poly¬ styrène de 0,3 μm de diamètre moyen et ajoute 12,5 mg d'immunoglobulines selon l'exemple 1 dans 1 ml de tampon glycine 0,1 M - NaCl 0,15 M à pH 8,35.
3Q On incube 4 heures à 37°C, puis une nuit à température ambiante (15-25°C). On centrifuge 1 h à 7000 tours/min. , puis reprend le culot obtenu par 50 ml de tampon glycocolle 0,1 M, NaCl 0,15 M, albumine bovine 5 mg/ml à pH 8,35. On remet en suspension et le réactif c est ainsi prêt à l'emploi. EXEMPLE 3
Fixâtion_par_liaison_covalente On prend 5 ml de latex hydroxylé (ayant des fonctions OH libres) et active par le métaperiodate 5 0,1 M à raison de 5 ml. On incube 30 minutes à tempé¬ rature ambiante (15-25°C) puis dialyse contre 3 fois 1000 volumes de tampon acétate 0,001 M à pH 4,20.
On prend le dialysat et y ajoute 10 ml de solution d'éthylènediamine 1 M à pH 9,5. On incube 10 'une heure à température ambiante et dialyse contre
4 fois 200 volumes de tampon phosphate 0,20 M contenant NaCl 0,15 M à pH 7,6.
On prend le dialysat résultant et y ajoute 10 ml de glutaraldéhyde à 25 % puis incube une nuit ^5 à température ambiante. On dialyse ensuite contre
5 fois 200 volumes de tampon carbonate 0,05 M contenant 0,25 M de NaCl à pH 8,3.
On prend le dialysat ainsi obtenu et y ajoute 12,5 mg d'immunoglobulines selon l'exemple 1 (dans 1 ml 2o de tampon carbonate 0,05 M, NaCl 0,25 M à pH 8,3).
On incube une nuit à température ambiante, puis centrifuge pendant 1 heure à 7000 tours/min. On reprend le culot dans 50 ml de tampon glycine 0,1 M, NaCl 0,15 M, albumine bovine à 5 mg/ml à pH 8,35. 25 EXEMPLE 4
Fix tion_par_liaison_covalente_ On prend 5 ml de latex (ayant des fonctions COOH libres) et y couple un bras d'éthylène-diamine à l'aide du carbodiimide soluble). Pour cela on ajoute 3Q 5 mg de EDAC /_~3-éthyl-(3-diméthylaminopropyl)-carbo- diimide_7. On incube une heure en maintenant le pH à 5,5 puis ajoute 5 ml d'éthylène-diamine 0,1 M à pH 5,5. On incube encore une heure à température ambiante, en maintenant le pH à 5,5 puis on laisse une nuit à tem- „ pérature ambiante. On dialyse contre 3 fois 500 volumes de tampon phosphate 0,20 M 'contenant. aCl 0,15 M à pH 7,6.
On prend le dialysat et y ajoute 10 ml de glutaraldéhyde à 25 % , puis incube une nuit à la tempé- rature du laboratoire. On dialyse ensuite contre 5 fois 200 volumes de tampon carbonate 0,05 M contenant 0,25 M de NaCl à pH 8,3.
On prend le dialysat et y ajoute 12,5 mg d'immu¬ noglobulines selon l'exemple 1 (dans 1 ml de tampon Q carbonate 0,05 M, contenant.0,25 M de;NaCl à pH 8,3).
On incube une nuit à température ambiante, puis centrifuge pendant une heure à 7000 tours/min. On reprend le culot dans 50 ml de tampon glycine 0,1 M, NaCl 0,15 M, albumine bovine à 5 mg/ml, pH 8,35. ,- Le réactif est prêt à l'emploi.
EXEMPLE 5
D2_!-lË_.-!Ê__iz3_.-H _._:_-__-__:_
Pour" réaliser le dosage selon le procédé de l'invention on procède comme suit. 0 On prélève le sang (9 volumes) et on y ajoute un anticoagulant (1 volume), l'anticoagulant étant un mélange aqueux de citrate (0,108 M) et d'aprotinine en excès.
On recueille le plasma par centrifugation puis 5 on dose les PDF qu'il est susceptible de contenir par mise en contact du plasma (1 goutte) ou de ses dilutions avec le réactif (l goutte) selon l'invention. La présence d'une agglutination macroscopique (visible à l'oeil nu) indique que des PDF sont présents, l'absence de PDF se traduisant par l'absence d'agglutination. EXEMPLE 6
_-2Ë!__-2 S-îfH fci_-___î__
On prépare des anticorps monoclonaux anti-D néo à partir de D néo de fibrinogène selon l'exemple 1 ci- dessus. Les anticorps monoclonaux purifiés sont soumis à une digestion enzymatique avec de la pepsine pour écarter le fragment Fc.
Les anticorps ainsi obtenus sont fixés ("coatés") sur un support inerte (cupules ou tubes). L'échantillon aqueux à tester est mis en contact avec lesdits anticorps fixés, les PDF-D à doser (ou le mélange PDF-D, PDF-DD et PDF-DDE) sont retenus de manière sélective par rapport aux autres produits contenus dans l'échantillon, les autres protéines, en excès, sont enlevées par lavage.
Le complexe antigénique ainsi formé est ensuite révélé par un anticorps de lapin polyclonal spécifique du fragment D et marqué à la peroxydase. L'activité enzymatique est mise en évidence par l'action oxydante sur le substrat orthophénylènediamine (OPD) en présence d'eau oxygénée.
Les modalités opératoires sont les suivantes. Réactifs
Tampon de coating : Carbonate 0,05 M pH 9,60 Tampon de dilution : Phosphate 0,05 M NaCl 0,15 M
Tween 20 0,1 % BSA 0,5 % ; pH 7,50
Solution de lavage : Phosphate 0,01 M NaCl 0,15 M Tween 20 0,1 % pH 7,00
Anticorps de coating Ant'i D-néo (monoclonal) selon le présent exemple . utilisé à 2 ug/ml en tampon de Immunoconjugué Anticorps (polyclonal ) anti PDF-D conjugué à la peroxydase . A uti¬ liser au 1/8000 en tampon de dilution .
Révélateur Orthophénylènediamine ( OPD ) à 0 , 4 mg/ml en tampon phosphate citrate à pH 5 , 00 et contenant 50 μl par 100 ml d ' eau oxygénée à 30 % . Solution d'arrêt H2„ S04„ 3M Plaques Immuno NUNC Type I avec certificat ou Dynatech M129B.
D-Dimère Etalon (Solution à 500 μg/ml) Apres décongélation, diluer au '
1/10 000 en tampon de dilution
(solution à 50 ng/ml) et réali¬ ser la gamme suivante en tampon de dilution : 50 ng/ml 25 ng/ml 10 ng/ml 5 ng/m
2,5rvg/ml 1 ng/ml 0,5 ng/ml 0 ng/m L'im unoconjugué est préparé comme suit . On immunise un lapin avec un PDF-D purifié /_~obtenu par dégradation prolongée du fibrinogène humain par la plasmine puis purification par électrophorèse selon MARDER et al.,
Thromb. Diath. Haemorrh. 2, 234-239 (1969) précité_7. L'antiserum résultant est rendu spécifique par épuisement sur un support solide. Les anticorps polyclonaux anti-D sont purifiés par chromatographie d'échange d'ions au moyens d'un échangeur DEAE-Trisacryl, puis couplés à la peroxydase selon la méthode précitée de NAKANE et al.. L'immunoconjugué est lyophilisé en présence d'agents stabilisants et est dilué au moment de l'emploi.
L'étalonnage est réalisé à l'aide du fragment DD obtenu à partir d'une solution à concentration connue de fibrinogène, coagulée par la thrombine en présence de Ca , de Facteur XIII-A et de plasmine. Un caillot se forme puis est lysé. La préparation est stabilisée par 1'aprotinine. On a un lysat de fibrine à concentra- tion connue en DD. Le DD est exprimé en équivalent fibri¬ nogène initial, à l'aide de concentrations allant de 0 à 50 ng/ml comme indiqué ci-dessus. Plasma_à_tester : Taux normaux : diluer au 1/10 en tampon de dilution Taux pathologiques : diluer au 1/50 et 1/200 en tampon de dilution. Protocole a) Coating : . Distribuer 200 jul de solution de coating
(anticorps de souris monoclonal anti D-néo à 2 ιg/ml préparé selon l'exemple 5) par 5 cuvette.
. Incuber 1 nuit à 37°C.
. laver 5 fois en solution de lavage. b) Antigène :. Distribuer 200 ul d'antigène étalon ou de plasma dilué à tester par cuvette. • Incuber 1 heure à température ambiante.
. Laver 5 fois en solution de lavage. c)Immuno Conjugué :
. Distribuer 200 ul d'immunoconjugué dilué (Immunoglobulines polyclonales de lapin, 5 spécifiques du PDF-D et couplées à la peroxydase) par cuvette. . Incuber 1 heure à température ambiante
(15-255C). . Laver 5 fois en solution de lavage. Ne pas 0 laisser la plaque sécher. d) Coloration
. Ajouter le substrat (OPD/H 0.) : 200 jul par cuvette. . Incuber 3 minutes (très exactement) à 5 température ambiante.
. Arrêter la réaction par 50 μl d'H S0.3M. e) Résultats :
. Après 10 minutes de stabilisation, lire la densité optique à 492 nm. O • Exprimer les résultats sur coordonnées bilo.garithmiques. ESSAIS COMPARATIFS
On a comparé un produit selon l'invention (produit A» anticorps monoclonal anti D-néo sans fragment 5 Fc) spécifique des fragments D et DD et préparé selon l'exemple 5, à un anticorps monoclonal anti-PDF-DD 20
spécifique des fragments D et DD, à savoir un .. produit (produit CP-1, conforme à l'enseignement de EP-A-0 122 478) obtenu selon le présent exemple 5 à partir d'un fragment DD de fibrine réticulée (au lieu d'un fragment D-néo) et exempt de Fc,
Les dosages ont été réalisés :
~ P2-J£_iË_δ£2-__-_:J-___' selo les modalités données à l'exemple 5 ci-dessus par réaction du complexe antigénique (anti D-néo - PDF à doser) avec un anticorps polyclonal anti-D marqué à la peroxydase pour la révélation (coloration obtenue en 3 minutes)
~ E2_--._i2_P£2--yi---_----Z1» selon les modalités données à l'exemple 5 ci-dessus par réaction du complexe (anti-DD - PDF à doser) avec un anticorps monoclonal anti-D marqué à la peroxydase pour la révélation (coloration obtenue en 30 minutes)
Les résultats obtenus sont consignés dans les tableaux I- .et II * où le signe + indique la détection de la substance à doser (fibrinogène ou FDP), le signe - l'absence de détection, et le signe-- un doute quant à la détection de ladite substance.
Ces résultats montrent que le produit A selon l'invention, qui permet de développer une coloration en
3 minutes au lieu de 30 minutes pour CP-1 ' a un seuil de sensibilité (0,5 ng/ml) inférieur à celui de CP-1 (5-10 ng/ml).
TABLEAU I Réactivité du produit A (selon l'exemple 5)
Figure imgf000023_0001
TABLEAU II Réactivité du produit CP-1
(selon l'enseignement de EP-A-0 122 478)
Figure imgf000023_0002

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de dosage d'au moins un produit de dégradation (PDF) du fibrinogène et de la fibrine au moyen d'un mécanisme réactionnel du type antigène- anticorps mettant en oeuvre un anticorps monoclonal anti-PDF, ledit procédé étant caractérisé en ce que l'on met en contact un anticorps monoclonal anti-PDF purifié choisi parmi l'ensemble comprenant les anticorps monoclo¬ naux anti-PDF qui
(A) sont élaborés à partir d'au moins un PDF monomère du fibrinogène, et
(B) ne fixent pas le fibrinogène, avec un milieu liquide aqueux susceptible"de contenir au moins un PDF. le complexe formé par ledit anticorps monoclonal et ledit PDF dudit milieu aqueux constituant un signal que l'on
:amplifie de façon appropriée.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le moyen anti-PDF monomère qui intervient dans le mécanisme réactionnel antigène-anticorps est préparé Par
1°) dégradation du fibrinogène par de la plasmine pendant 24 h à 37°C,
2°) purification d'au moins un PDF monomère ainsi obtenu,
3°) innoculation de souris,
4°) prélèvement de la rate de l'animal immunise,
5°) extraction des lymphocytes de la rate et fusion des lymphocytes avec des cellules de myélome de souris en croissance exponentielle à raison de 5 à 20, de préférence 10 lymphocytes par cellule de myélome,
6°) sélection des hybridomes sécréteurs ainsi obtenus en vue d'obtenir des clones produisant des anticorps monoclonaux réagissant sélectivement avec les PDF mais pas avec le fibrinogène,
7°) développement de tumeurs ascitiques chez la souris avec les clones sélectionnés,
8°) récupération des liquides d'ascite contenant les anticorps monoclonaux par ponction,
9°) purification des anticorps monoclonaux anti-PDF monomère,
10°) fixation des anticorps monoclonaux purifiés sur'un support inerte. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le support inerte intervenant pour la fixation de l'anticorps monoclonal anti-PDF monomère est choisi parmi l'ensemble constitué par les billes de verre, les particules de latex, les globules rouges, les argiles, le noir de carbone et l'agarose.
4. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le support inerte intervenant pour la fixation de l'anticorps monoclonal anti-PDF monomère est choisi parmi l'ensemble constitué par les tubes et cupules en verre et en matières plastiques.
5. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le support inerte est constitué par des parti¬ cules de latex ayant un diamètre moyen inférieur ou égal à 5 um, notamment des particules de latex de polystyrène ayant un diamètre moyen compris entre 0,1 et 1 um.
6. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le stade 9°) comprend la purification des an¬ ticorps monoclonaux anti-PDF monomère et l'élimination de leur fragment Fc sensible au Facteur Rhumatoide par digestion avec la pepsine.
7. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que (i) le moyen anti-PDF monomère qui intervient dans le mécanisme réactionnel antigène anti-corps est préparé par 1°) dégradation de fibrinogène par de la plasmine pendant 24 h à 37°C,
2°) purification d'au moins un PDF monomère ainsi obtenu,
3°) innoculation de souris,
4°) prélèvement de la rate de 1'animal immunise,
5° ) extraction des lymphocytes de la rate et fusion des lymphocytes avec des cellules de myléome
10 de souris en croissance exponentielle à raison de 5 à 20, de préférence 10 lymphocytes par cellule de myélome,
6°) sélection des hybridomes sécréteurs ainsi obtenus en vue d'obtenir des clones produisant des anticorps monoclonaux réagissant sélectivement avec les 15 PDF mais pas avec le fibrinogène,
7°) développement de tumeurs ascitiques chez la souris avec les clones sélectionnés,
8°) récupération des liquides d'ascite contenant les anticorps monoclonaux par ponction, 20 9°) purification des anticorps monoclonaux anti-PDF monomère, puis digestion avec la pepsine pour écarter le fragment Fc desdits anticorps,
10°) fixation des anticorps monoclonaux purifiés et sans fragment Fc ainsi obtenus, sur un 25 support inerte, et (ii) en ce que le mécanisme antigène-anticorps comprend les étapes suivantes :
11°) mise en contact desdits anticorps monoclonaux avec un échantillon à tester , „ 12° ) mise en contact du complexe antigénique résultant avec au moins un anticorps polyclonal anti-D marqué avec un enzyme,
13°) mesure de l'activité enzymatique sur un substrat approprié. ___. 8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que l'anticorps polyclonal anti-D est marqué par la peroxydase.
9. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que la mesure du stade 13°) de l'activité enzymati¬ que, lorsque l'anticorps polyclonal est marqué à la peroxydase, est réalisée selon une méthode immunoenzy- matique au moyen d'un substrat d'orthophénylènediamine en présence de HpO .
10. Procédé selon la revendication.1, caractérisé en ce que le milieu liquide aqueux à tester susceptible de contenir au moins un PDF est le plasma.
11. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'anticorps monoclonal anti-PDF monomère est choisi parmi les anticorps monoclonaux anti-D et anti-E, notamment anti-D néo et anti-E néo.
12. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'anticorps monoclonal anti-PDF monomère est un anti-D néo.
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