FR2645647A1 - Procede de dosage de complexes antithrombine-proteases - Google Patents
Procede de dosage de complexes antithrombine-proteases Download PDFInfo
- Publication number
- FR2645647A1 FR2645647A1 FR8904589A FR8904589A FR2645647A1 FR 2645647 A1 FR2645647 A1 FR 2645647A1 FR 8904589 A FR8904589 A FR 8904589A FR 8904589 A FR8904589 A FR 8904589A FR 2645647 A1 FR2645647 A1 FR 2645647A1
- Authority
- FR
- France
- Prior art keywords
- iii
- proteases
- antithrombin
- complexes
- protease
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 239000004365 Protease Substances 0.000 title claims abstract description 65
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 43
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 38
- 229960005348 antithrombin iii Drugs 0.000 claims abstract description 28
- 102000004411 Antithrombin III Human genes 0.000 claims abstract description 24
- 108090000935 Antithrombin III Proteins 0.000 claims abstract description 24
- 239000000463 material Substances 0.000 claims abstract description 21
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 20
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 claims abstract description 19
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 claims abstract description 17
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims abstract description 17
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 16
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 claims abstract description 14
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 claims abstract description 14
- 108010094028 Prothrombin Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 102100027378 Prothrombin Human genes 0.000 claims abstract description 11
- 229940039716 prothrombin Drugs 0.000 claims abstract description 11
- 108090000371 Esterases Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 8
- 108010072035 antithrombin III-protease complex Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 14
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 claims description 9
- 239000004019 antithrombin Substances 0.000 claims description 7
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 5
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000004816 latex Substances 0.000 claims description 5
- 229920000126 latex Polymers 0.000 claims description 5
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 5
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 claims description 4
- 238000002372 labelling Methods 0.000 claims description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims description 2
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 claims 1
- 210000003918 fraction a Anatomy 0.000 abstract description 2
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 17
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 14
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 12
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 12
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 11
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 11
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 11
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 11
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 11
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 11
- 230000023597 hemostasis Effects 0.000 description 10
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 9
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 8
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 8
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 7
- 239000013024 dilution buffer Substances 0.000 description 7
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 7
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 7
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 7
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 7
- 108020002447 serine esterase Proteins 0.000 description 7
- 102000005428 serine esterase Human genes 0.000 description 7
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 6
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 6
- 238000001994 activation Methods 0.000 description 6
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 6
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 5
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 5
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- 108010080805 Factor XIa Proteins 0.000 description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 4
- 229940096437 Protein S Drugs 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 4
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 4
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 4
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 4
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 4
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 4
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 4
- 108010048049 Factor IXa Proteins 0.000 description 3
- 108010014173 Factor X Proteins 0.000 description 3
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 3
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 3
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- 108010031318 Vitronectin Proteins 0.000 description 3
- 102100035140 Vitronectin Human genes 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- AGVAZMGAQJOSFJ-WZHZPDAFSA-M cobalt(2+);[(2r,3s,4r,5s)-5-(5,6-dimethylbenzimidazol-1-yl)-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] [(2r)-1-[3-[(1r,2r,3r,4z,7s,9z,12s,13s,14z,17s,18s,19r)-2,13,18-tris(2-amino-2-oxoethyl)-7,12,17-tris(3-amino-3-oxopropyl)-3,5,8,8,13,15,18,19-octamethyl-2 Chemical compound [Co+2].N#[C-].[N-]([C@@H]1[C@H](CC(N)=O)[C@@]2(C)CCC(=O)NC[C@@H](C)OP(O)(=O)O[C@H]3[C@H]([C@H](O[C@@H]3CO)N3C4=CC(C)=C(C)C=C4N=C3)O)\C2=C(C)/C([C@H](C\2(C)C)CCC(N)=O)=N/C/2=C\C([C@H]([C@@]/2(CC(N)=O)C)CCC(N)=O)=N\C\2=C(C)/C2=N[C@]1(C)[C@@](C)(CC(N)=O)[C@@H]2CCC(N)=O AGVAZMGAQJOSFJ-WZHZPDAFSA-M 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 3
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 102100022641 Coagulation factor IX Human genes 0.000 description 2
- 102100023804 Coagulation factor VII Human genes 0.000 description 2
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000005189 Embolism Diseases 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 108010076282 Factor IX Proteins 0.000 description 2
- 108010023321 Factor VII Proteins 0.000 description 2
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 2
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 2
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000007625 Hirudins Human genes 0.000 description 2
- 108010007267 Hirudins Proteins 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 108010066124 Protein S Proteins 0.000 description 2
- 102000029301 Protein S Human genes 0.000 description 2
- 108010079274 Thrombomodulin Proteins 0.000 description 2
- 102100026966 Thrombomodulin Human genes 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 210000000748 cardiovascular system Anatomy 0.000 description 2
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 2
- 230000006866 deterioration Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 229960004222 factor ix Drugs 0.000 description 2
- 229940012413 factor vii Drugs 0.000 description 2
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 2
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 2
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 2
- 229940006607 hirudin Drugs 0.000 description 2
- WQPDUTSPKFMPDP-OUMQNGNKSA-N hirudin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(OS(O)(=O)=O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@@H]2CSSC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N2)=O)CSSC1)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(C)C)[C@@H](C)O)CSSC1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 WQPDUTSPKFMPDP-OUMQNGNKSA-N 0.000 description 2
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- KWPACVJPAFGBEQ-IKGGRYGDSA-N (2s)-1-[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]-n-[(3s)-1-chloro-6-(diaminomethylideneamino)-2-oxohexan-3-yl]pyrrolidine-2-carboxamide Chemical compound C([C@@H](N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)CCl)C1=CC=CC=C1 KWPACVJPAFGBEQ-IKGGRYGDSA-N 0.000 description 1
- JWICNZAGYSIBAR-LEEGLKINSA-N (4s)-4-[[2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-aminopropanoyl]amino]-3-carboxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]acetyl]amino]-5-[[2-[[(2s)-3-carboxy-1-[[(2s)-1-[[1-[[(2s)-1-[[(2s)-4-carboxy-1-[[2-[[2-[[2-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-4-(diaminomethylideneamino Chemical compound NC(N)=NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)N)CC1=CC=CC=C1 JWICNZAGYSIBAR-LEEGLKINSA-N 0.000 description 1
- 206010004053 Bacterial toxaemia Diseases 0.000 description 1
- 101100491335 Caenorhabditis elegans mat-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 108010029144 Factor IIa Proteins 0.000 description 1
- 108010014172 Factor V Proteins 0.000 description 1
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 description 1
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 description 1
- 108010054265 Factor VIIa Proteins 0.000 description 1
- 108010074105 Factor Va Proteins 0.000 description 1
- 108010074864 Factor XI Proteins 0.000 description 1
- 108010080865 Factor XII Proteins 0.000 description 1
- 102000000429 Factor XII Human genes 0.000 description 1
- 108010071241 Factor XIIa Proteins 0.000 description 1
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 1
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 1
- 101800000974 Fibrinopeptide A Proteins 0.000 description 1
- 102400000525 Fibrinopeptide A Human genes 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N Hydroxylamine Chemical compound ON AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 108090000778 Platelet factor 4 Proteins 0.000 description 1
- 102000004211 Platelet factor 4 Human genes 0.000 description 1
- 101800004937 Protein C Proteins 0.000 description 1
- 102000017975 Protein C Human genes 0.000 description 1
- 101800001700 Saposin-D Proteins 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108010000499 Thromboplastin Proteins 0.000 description 1
- 102000002262 Thromboplastin Human genes 0.000 description 1
- 208000013222 Toxemia Diseases 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 239000012670 alkaline solution Substances 0.000 description 1
- 230000002785 anti-thrombosis Effects 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 1
- 238000012550 audit Methods 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- FNAQSUUGMSOBHW-UHFFFAOYSA-H calcium citrate Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O.[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O FNAQSUUGMSOBHW-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 239000001354 calcium citrate Substances 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000701 coagulant Substances 0.000 description 1
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 1
- 230000006957 competitive inhibition Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 230000006735 deficit Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 208000009190 disseminated intravascular coagulation Diseases 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- LWVRJZXYUQBNHW-UHFFFAOYSA-N disulfide(2-) Chemical compound [S-][S-] LWVRJZXYUQBNHW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000007824 enzymatic assay Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 description 1
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 1
- 239000000282 fibrinogen degradation product Substances 0.000 description 1
- 230000020764 fibrinolysis Effects 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 235000013882 gravy Nutrition 0.000 description 1
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 238000002796 luminescence method Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000006225 natural substrate Substances 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 230000000269 nucleophilic effect Effects 0.000 description 1
- QYSGYZVSCZSLHT-UHFFFAOYSA-N octafluoropropane Chemical compound FC(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)F QYSGYZVSCZSLHT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000000399 orthopedic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 1
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000007180 physiological regulation Effects 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 230000010118 platelet activation Effects 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000014773 positive regulation of hemostasis Effects 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 229960000856 protein c Drugs 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 229910021653 sulphate ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 239000012622 synthetic inhibitor Substances 0.000 description 1
- 235000013337 tricalcium citrate Nutrition 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 229940057466 vexa Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6854—Immunoglobulins
- G01N33/6857—Antibody fragments
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/86—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood coagulating time or factors, or their receptors
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/81—Protease inhibitors
- G01N2333/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
- G01N2333/811—Serine protease (E.C. 3.4.21) inhibitors
- G01N2333/8121—Serpins
- G01N2333/8128—Antithrombin III
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
- G01N2333/914—Hydrolases (3)
- G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- G01N2333/95—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99)
- G01N2333/964—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue
- G01N2333/96425—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals
- G01N2333/96427—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general
- G01N2333/9643—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general with EC number
- G01N2333/96433—Serine endopeptidases (3.4.21)
- G01N2333/96441—Serine endopeptidases (3.4.21) with definite EC number
- G01N2333/96444—Factor X (3.4.21.6)
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
- G01N2333/914—Hydrolases (3)
- G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- G01N2333/95—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99)
- G01N2333/964—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue
- G01N2333/96425—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals
- G01N2333/96427—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general
- G01N2333/9643—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general with EC number
- G01N2333/96433—Serine endopeptidases (3.4.21)
- G01N2333/96441—Serine endopeptidases (3.4.21) with definite EC number
- G01N2333/9645—Factor IX (3.4.21.22)
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
- G01N2333/914—Hydrolases (3)
- G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- G01N2333/974—Thrombin
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
La présente invention concerne un procédé de dosage de complexes AT III-protéases. Ce procédé, qui met en oeuvre l'utilisation d'un anticorps anti (Antithrombine III modifiée) [en abrégé : anti(ATM)] en tant que matériel immunologique, est caractérisé en ce que l'on met en contact un milieu liquide à analyser contenant au moins un complexe AT III-protéase avec un matériel immunologique choisi parmi l'ensemble constitué par i les anticorps monoclonaux anti(ATM) générés contre la fraction AT III d'au moins un complexe AT III-sérine estérase dans laquelle un peptide ayant un bas poids moléculaire de l'ordre de 5000 environ a été déplacé pour faire apparaître sur ladite fraction AT III une plage d'épitopes, et ii les fragments F(ab')2 et F(ab) desdits anticorps monoclonaux, lesdits anticorps et lesdits fragments F(ab')2 et F(ab) fixant spécifiquement les complexes AT III-protéases mais ne réagissant pas avec l'Antithrombine III, la Prothrombine, la Thrombine, les protéases IIa, IXa, XIa et XIIa, ladite mise en contact mettant en oeuvre la réaction : anti(ATM) + AT III-protéases --> anti(ATM)-(AT III-protéases). L'invention concerne également ledit matériel immunologique, en tant que produit industriel nouveau, ainsi que les trousses et nécessaires de dosage le renfermant.
Description
PROCGDE DE DOSAGE DE COMPLEXES ANTTHROMBINE-PROTEASES DOMAINe DE L'INVEXTIOS
La présente invention concerne un nouveau procédé de dosage de complexes Antithromoine-protéases mettant en oeuvre un matériau anticorps anti-Antithrombine (également dénommée Antithrombine III ou
AT III) généré à partir d'Antithrombine modifiée. Ce nouveau procédé de dosage est notamment utile dans le domaine du diagnostic pour apprécier de façon précoce, avant tout accident thromboembolique, l'existence d'activations anormales de la coagulation du sang ou de déficiences cliniques au niveau de l'hémostase.
La présente invention concerne un nouveau procédé de dosage de complexes Antithromoine-protéases mettant en oeuvre un matériau anticorps anti-Antithrombine (également dénommée Antithrombine III ou
AT III) généré à partir d'Antithrombine modifiée. Ce nouveau procédé de dosage est notamment utile dans le domaine du diagnostic pour apprécier de façon précoce, avant tout accident thromboembolique, l'existence d'activations anormales de la coagulation du sang ou de déficiences cliniques au niveau de l'hémostase.
L'invention concerne également une trousse, kit ou nécessaire de dosage comprenant les ingrédients essentiels, notamment les réactifs immunologiques et leurs diluants, qui sont requis pour la mise en oeuvre de ce nouveau procédé de dosage.
ARBIKRE-PLUN THNOLOGIQOE
L'organisme d'un animal à sang chaud, notamment celui d'un mammifère tel que l'homme, dispose de très importantes possibilités de régulation physiologique d'activation du sang, à savoir notamment des inhibiteurs (tels que lVAntithrotlibine III, le cofacteur II de l'héparine et les substances similaires), des régulateurs (tels que la Protéine C, la Protéine S, la Thrombomoduline et les substances similaires) et des moyens de fibrinolyse.
L'organisme d'un animal à sang chaud, notamment celui d'un mammifère tel que l'homme, dispose de très importantes possibilités de régulation physiologique d'activation du sang, à savoir notamment des inhibiteurs (tels que lVAntithrotlibine III, le cofacteur II de l'héparine et les substances similaires), des régulateurs (tels que la Protéine C, la Protéine S, la Thrombomoduline et les substances similaires) et des moyens de fibrinolyse.
Chez l'homne, l'altération progressive du système cardiovasculaire intervient chez tout individu et dépend de très nombreux facteurs liés au vieillissement, au mode de vie, aux caractères génétiques, aux épisodes pathologiques, à l'environnement psycho émotionnel, etc...
L'altération progressive du système cardio-vasculaire se traduit par une activation chronique du sang, qui reste très longtemps cliniquement silencieuse grâce à l'action de tous les facteurs antithrombotiques précités. Lorsque tous ces facteurs sont saturés, l'accident thromboembolique intervient avec toutes ses conséquences.
Toutefois, la phase cliniquement silencieuse peut être révélée par des moyens biochimiques intervenant en tant que "marqueurs" et résultant de l'activation du sang. Ces marqueurs peuvent notamment provenir de la génération de protéases et de leur action-sur leurs substrats naturels (notamment les FPA, PDF, D, DD et similaires), de l'activation plaquettaire (notamment les P Thromboglobuline, Facteur plaquettaire 4 et similaires) ou de l'intervention des inhibiteurs naturels empêchant l'extension de l'activation du sang (notamment ltAntithrombine III et similaires).
Ainsi, l'Antithrombine III joue un rôle majeur en neutralisant, c'est-à-dire en inhibant, les activités protéasiques générées comme le Facteur Xiia, le Facteur XIa, le Facteur Ixa et, surtout, le
Facteur Xa et le Facteur IIa (voir schéma de la figure 1 ci-après).
Facteur Xa et le Facteur IIa (voir schéma de la figure 1 ci-après).
I1 en résulte la formation de complexes Antithrombine-protéases; en particulier avec les protéases Xa, IIa, xIia, XIa et respectivement
IXa, il se forme des complexes AT iIi-Xa, AT III-IIa, AT III-XIIa, AT III-XIa et respectivement AT III-IXa.
IXa, il se forme des complexes AT iIi-Xa, AT III-IIa, AT III-XIIa, AT III-XIa et respectivement AT III-IXa.
ART ANTERIEUR
On sait que l'on a déjà décrit la formation de complexes
Thrombine-Antithrombine III (en abrégé : TAT), d'une part, et ltobtention d'anticorps monoclonaux et polyclonaux anti-TAT pouvant intervenir dans des méthodes radioimmunologiques (RIA) ou enzymoimmunologiques (EIA), d'autre part. Voir à cet effet l'article de P. BAUER et al., Thronibos. Res., 28, pages 595-606, (1982) qui signale la fixation spécifique de complexes TAT sur les hépatocytes pour distinguer lesdits complexes de la Thrombine et de l'Antithrombine III suivant des essais radioimmunologiques; et, l'article de K.A. BAUER, Ann. Biol.Clin., 43, pages 451-455 (1985) qui étudie la formation de complexes TAT suivant une méthode RIA.
On sait que l'on a déjà décrit la formation de complexes
Thrombine-Antithrombine III (en abrégé : TAT), d'une part, et ltobtention d'anticorps monoclonaux et polyclonaux anti-TAT pouvant intervenir dans des méthodes radioimmunologiques (RIA) ou enzymoimmunologiques (EIA), d'autre part. Voir à cet effet l'article de P. BAUER et al., Thronibos. Res., 28, pages 595-606, (1982) qui signale la fixation spécifique de complexes TAT sur les hépatocytes pour distinguer lesdits complexes de la Thrombine et de l'Antithrombine III suivant des essais radioimmunologiques; et, l'article de K.A. BAUER, Ann. Biol.Clin., 43, pages 451-455 (1985) qui étudie la formation de complexes TAT suivant une méthode RIA.
L'article de J. DAINES et al., Thrombos. Res., 36, pages 397409 (1984) décrit également l'obtention d'anticorps monoclonaux anti
TAT intervenant dans des essais RIA. L'article de J. JESTY et al.,
Analytical Biochenistry 128, pages 158-167 (1964) décrit ltobtention de complexes Antithrombine-Xa et leur détermination par des essais ETA.
TAT intervenant dans des essais RIA. L'article de J. JESTY et al.,
Analytical Biochenistry 128, pages 158-167 (1964) décrit ltobtention de complexes Antithrombine-Xa et leur détermination par des essais ETA.
L'art antérieur le plus proche est constitué par l'article de H. PELER et al., Thrombosis and Haemostasis, 59 (No. 1), pages 101-106 (1988) et la notice "ENZYGNOSTR-TAT" jointe à la trousse de dosage commercialisée par la société dite BEHRISSWERKE AG dans le domaine de détermination de complexes Thrombine-Antithrombine III.
Selon cet article et cette notice, l'on fait réagir le complexe TAT sur un anticorps polyclonal anti-Thrombine fixé sur un support (dans le cas d'espèce l'intérieur du godet ou de la microcuvette), le produit résultant anti (T)-TAT est mis à réagir avec un anticorps anti (AT III) conjugué à la peroxydase (POD) qui se lie au fragment
TAT audit produit résultant pour donner un composé
anti (T)-TAT-anti(AT III)/POD ce produit ainsi obtenu étant mis en contact avec le substrat POD contenant de l'eau oxygénée et on suit le clivage au moyen d'un spectrophotomètre.Les mécanismes réactionnels correspondants sont illustrés par les réactions suivantes 1) e anti(T) + TAT
anti(T)-TAT 2) F anti(T)-TAT + anti(AT III)/POD
ftanti(T)-TAT-anti(AT III)/POD 3) mesure de l'activité enzymatique après addition de POD en présence de H2O2 par formation de couleur
En bref, la technique du test "ENZYGNOSTR-TAT" met en oeuvre des anticorps polyclonaux anti-Thrombine, d'une part, et des anticorps polyclonaux anti-Antithrombine III, d'autre part, qui se fixent sur le complexe TAT.D'autres résultats de la technique selon le test "ENZYGNOSTR-TAT" ont fait l'objet de communications au cours du 11sème Congrès International sur l'Hémostase et la Thrombose tenu à
Bruxelles les 6-10 juillet 1987; voir à cet effet les résumés des communications publiées dans Thrombosis and Haemostasis, 58 (No. 1), page 237, (juillet 1987) : S. ASAKURA et al., résumé No. 874; H.
TAT audit produit résultant pour donner un composé
anti (T)-TAT-anti(AT III)/POD ce produit ainsi obtenu étant mis en contact avec le substrat POD contenant de l'eau oxygénée et on suit le clivage au moyen d'un spectrophotomètre.Les mécanismes réactionnels correspondants sont illustrés par les réactions suivantes 1) e anti(T) + TAT
anti(T)-TAT 2) F anti(T)-TAT + anti(AT III)/POD
ftanti(T)-TAT-anti(AT III)/POD 3) mesure de l'activité enzymatique après addition de POD en présence de H2O2 par formation de couleur
En bref, la technique du test "ENZYGNOSTR-TAT" met en oeuvre des anticorps polyclonaux anti-Thrombine, d'une part, et des anticorps polyclonaux anti-Antithrombine III, d'autre part, qui se fixent sur le complexe TAT.D'autres résultats de la technique selon le test "ENZYGNOSTR-TAT" ont fait l'objet de communications au cours du 11sème Congrès International sur l'Hémostase et la Thrombose tenu à
Bruxelles les 6-10 juillet 1987; voir à cet effet les résumés des communications publiées dans Thrombosis and Haemostasis, 58 (No. 1), page 237, (juillet 1987) : S. ASAKURA et al., résumé No. 874; H.
PELZER et al., résumé No. 875; et, J.A. HOEK et al., résumé No. - 876.
Le test "ENEZYGNOSTR-TAT" présente des inconvénients de trois natures différentes sur le plan de la technique, sur le plan biochimique et sur le plan biologique.
Du point de vue technique, il convient de remarquer que la
Thrombine est peu immunogène et présente des réactivités croisées (en anglais "cross-reactivities") avec la Prothrombine; dans ces circonstances il y a, soit perte de réactivité par inhibition compétitive de la fixation ("bindingn), ce qui réduit la sensibilité, soit la nécessité d'épuiser préalablement les anticorps communs à la Thrombine et à la Prothrombine, ce qui réduit également la réactivité et accroît le coût. C'est cette technique d'épuisement préalable qui intervient dans l'élaboration de la trousse de dosage ENZ YGNOSTR-TAT .
Thrombine est peu immunogène et présente des réactivités croisées (en anglais "cross-reactivities") avec la Prothrombine; dans ces circonstances il y a, soit perte de réactivité par inhibition compétitive de la fixation ("bindingn), ce qui réduit la sensibilité, soit la nécessité d'épuiser préalablement les anticorps communs à la Thrombine et à la Prothrombine, ce qui réduit également la réactivité et accroît le coût. C'est cette technique d'épuisement préalable qui intervient dans l'élaboration de la trousse de dosage ENZ YGNOSTR-TAT .
Du point de vue biochimique, il se trouve que la formation des complexes TAT, en l'absence d'héparine, passe par divers stades d'évolution relativement lents
- formation de complexes réversibles,
- formation d'un peptide de clivage de ltAT III,
- formation de complexes irréversibles,
- dégradation possible de ces derniers complexes en
produits inactifs.
- formation de complexes réversibles,
- formation d'un peptide de clivage de ltAT III,
- formation de complexes irréversibles,
- dégradation possible de ces derniers complexes en
produits inactifs.
A ces mécanismes il convient d'ajouter le fait que la cinétique de clearance des complexes est rapide : les complexes se fixent sur la
Vitronectine (S-protéine) plasmatique [Nota Bene : la S-protéine est différente de la Protéine S précitée] ce qui facilite et accélère la clearance, et les complexes TAT sont de plus éliminés par fixation sur la Thrombomoduline. Par suite l'on présume, de façon sérieuse, que le test "ENZYGNOSTR-TAT" ne dose qu'une faible partie des complexes Thrombine-Antithrombine III, à savoir les formes stables.
Vitronectine (S-protéine) plasmatique [Nota Bene : la S-protéine est différente de la Protéine S précitée] ce qui facilite et accélère la clearance, et les complexes TAT sont de plus éliminés par fixation sur la Thrombomoduline. Par suite l'on présume, de façon sérieuse, que le test "ENZYGNOSTR-TAT" ne dose qu'une faible partie des complexes Thrombine-Antithrombine III, à savoir les formes stables.
Du point de vue biologique, il convient de constater que la participation de llAntithrombine III dans la régulation de l'activation de 1 'hémostase est importante en amont de la thrombinoformation; il est plus que probable que, avant que 1'AT III ne soit mobilisée pour la neutralisation de la Thrombine, 1'AT III ait déjà été sollicitée pour réagir contre le Facteur Xa, le Facteur IXa et le
Facteur XIa; ainsi tout se passe comme si les complexes TAT stables peuvent ne représenter que "la partie émergée de l'iceberg" c'est-àdire qu'une partie des mécanismes de lthémostase illustrés par la figure 1 ci-après.
Facteur XIa; ainsi tout se passe comme si les complexes TAT stables peuvent ne représenter que "la partie émergée de l'iceberg" c'est-àdire qu'une partie des mécanismes de lthémostase illustrés par la figure 1 ci-après.
Les inconvénients biologiques précités sont notamment expliqués par les faibles taux de TAT mesurés selon le test "ENZYJOSTR-TAT", qui sont de l'ordre de 1 ng/ml et qui ne montent au maximum qu'au voisinage de 10 ng/ml dans les cas cliniques courants, voire 30 à 50 ng/ml dans les états tumoraux avoir en particulier les résultats donnés dans ladite notice précitée, l'article de E. PELZER et al., Thrombosis and Haemostasis 59, (No 1), pages 101-106, (1988) précité et les résumés 875 et 876 susvisés].
OBJET DE L'INVENTION
Selon l'invention on préconise une nouvelle solution technique pour apprécier de façon précoce les déficiences pathologiques au niveau de l'hémostase et plus particulièrement l'activation néfaste du sang.
Selon l'invention on préconise une nouvelle solution technique pour apprécier de façon précoce les déficiences pathologiques au niveau de l'hémostase et plus particulièrement l'activation néfaste du sang.
Cette nouvelle solution technique offre I avantage de pallier les inconvénients précités du test "ENZYGNOSTR-TA1"; elle repose sur l'utilisation d'un matériel iuunologique particulier choisi parmi l'ensemble constitué par (i) les anticorps monoclonaux anti (Antithrombine III modifiée) [en abrégé :: anti(ATM) 1 générés contre la fraction Antithrombine III de complexes AT III-sérine estérase, dans laquelle un peptide ayant un bas poids moléculaire de l'ordre de 5000 environ a été déplacé pour faire apparaitre sur ladite fraction Antithrombine III une plage d'épitopes, et (ii) les fragments F(ab')2 et F(ab) desdits anticorps monoclonaux, lesdits anticorps et lesdits fragments F(ab')2 et F(ab) fixant spécifiquement les complexes AT III-protéases, notamment les complexes AT III-IIa,
AT III-IXa, AT III-Xa, AT IIl-Xla et AT III-XIIa, mais ne réagissant pas avec la Prothrombine, la Thrombine ni 1 'Antithrombine III ni avec lesdites protéases IIa, vexa, Xa, XIa et Plia.
AT III-IXa, AT III-Xa, AT IIl-Xla et AT III-XIIa, mais ne réagissant pas avec la Prothrombine, la Thrombine ni 1 'Antithrombine III ni avec lesdites protéases IIa, vexa, Xa, XIa et Plia.
Selon cette nouvelle solution technique, l'anticorps anti (AT III modifiée) [désigné ci-après anticorps anti-ATM] ou ses fragments F(ab')2 ou F(ab) réagissent avec toutes les portions protéases IIa, IXa, Xa, XIa, XIIa des complexes Antithrombine IIIprotéases qui sont contenus dans le milieu liquide à analyser, notamment le plasma d'un patient, la présence d'au moins un desdits complexes étant révélée au moyen d'un anticorps anti-Antithrombine
III marqué.
III marqué.
La solution technique selon l'invention est sensible à la présence de tous les complexes réversibles ou irréversibles obtenus suivant les réactions
<tb> <SEP> + <SEP> IIa <SEP> = <SEP> AT <SEP> III-IIa
<tb> <SEP> + <SEP> lXa <SEP> f <SEP> AT <SEP> III-IXa
<tb> AT <SEP> III <SEP> + <SEP> Xa <SEP> ~ <SEP> ~ <SEP> AT <SEP> III-Xa
<tb> <SEP> + <SEP> XIa <SEP> - <SEP> AT <SEP> III-XIa
<tb> <SEP> + <SEP> XIIa <SEP> su~~ <SEP> AT <SEP> III-XIIa
<tb> alors que la technique du test "EN4ZYGNOSIR-TAT" est essentiellement sensible à la présence du complexe formé par la réaction
AT III + IIa
<tb> <SEP> + <SEP> lXa <SEP> f <SEP> AT <SEP> III-IXa
<tb> AT <SEP> III <SEP> + <SEP> Xa <SEP> ~ <SEP> ~ <SEP> AT <SEP> III-Xa
<tb> <SEP> + <SEP> XIa <SEP> - <SEP> AT <SEP> III-XIa
<tb> <SEP> + <SEP> XIIa <SEP> su~~ <SEP> AT <SEP> III-XIIa
<tb> alors que la technique du test "EN4ZYGNOSIR-TAT" est essentiellement sensible à la présence du complexe formé par la réaction
AT III + IIa
AT III-IIa
Le procédé de dosage de complexes AT III-protéases que l'on préconise suivant l'invention, qui met en oeuvre l'utilisation d'un anticorps anti (ATM) en tant que matériel immunologique, est caractérisé en ce que l'on met en contact un milieu liquide à analyser contenant au moins un complexe AT III-protéase avec un matériel imminologique, de préférence fixé sur un support inerte, choisi parmi 1 'ensemble constitué par (i) les anticorps monoclonaux anti (Antithrombine III modifiée) [en abrégé : anti (AIM)] générés contre la fraction Antithrombine III de complexes AT III-sérine estérase dans laquelle un peptide ayant un bas poids moléculaire de l'ordre de 5000 environ a été déplacé pour faire apparaître une plage d'épitoges sur ladite fraction Antithrombine III, et (il) les fragments F(ab')2 et F(ab) desdits anticorps monoclonaux, lesdits anticorps et lesdits fragments F(ab')2 et F(ab) fixant spécifiquement les complexes AT
III-protéases mais ne réagissant pas avec l'Antithrombine III, la
Prothrombine, la Thrombine, les protéases IIa, IXa, Xa, XIa et XIIa, ladite mise en contact mettant en oeuvre la réaction
anti(ATM) + AT III-protéases ) anti(ATM)-(AT III-protéases)
L'invention concerne également en tant que produit industriel nouveau le matériel inunologique anti (ATM) généré contre la fraction AT III desdits complexes AT III-sérine estérase.
Le procédé de dosage de complexes AT III-protéases que l'on préconise suivant l'invention, qui met en oeuvre l'utilisation d'un anticorps anti (ATM) en tant que matériel immunologique, est caractérisé en ce que l'on met en contact un milieu liquide à analyser contenant au moins un complexe AT III-protéase avec un matériel imminologique, de préférence fixé sur un support inerte, choisi parmi 1 'ensemble constitué par (i) les anticorps monoclonaux anti (Antithrombine III modifiée) [en abrégé : anti (AIM)] générés contre la fraction Antithrombine III de complexes AT III-sérine estérase dans laquelle un peptide ayant un bas poids moléculaire de l'ordre de 5000 environ a été déplacé pour faire apparaître une plage d'épitoges sur ladite fraction Antithrombine III, et (il) les fragments F(ab')2 et F(ab) desdits anticorps monoclonaux, lesdits anticorps et lesdits fragments F(ab')2 et F(ab) fixant spécifiquement les complexes AT
III-protéases mais ne réagissant pas avec l'Antithrombine III, la
Prothrombine, la Thrombine, les protéases IIa, IXa, Xa, XIa et XIIa, ladite mise en contact mettant en oeuvre la réaction
anti(ATM) + AT III-protéases ) anti(ATM)-(AT III-protéases)
L'invention concerne également en tant que produit industriel nouveau le matériel inunologique anti (ATM) généré contre la fraction AT III desdits complexes AT III-sérine estérase.
L'invention concerne également la trousse ou nécessaire de dosage comprenant ledit matériel imnunologique.
ATTT1ONS
Dans ce qui suit, par comnodité les abréviations suivantes ont été utilisées.
Dans ce qui suit, par comnodité les abréviations suivantes ont été utilisées.
anti-Z désigne un anticorps généré contre le moyen Z
[autre nomenclature : anti (Z)];
ATM désigne l'antithrodbine III modifiée; selon
l'invention, le terme ATM désigne plus précisément une
substance dans laquelle la portion de l'Antithrombine III
préalablement complexée par la sérine estérase a été clivée
de telle façon qu'un petit peptide de PM 5000 environ a été
déplacé pour dénuder et faire apparaître une plage
d'épitopes sur ladite portion d'AT III (le clivage peut être
partiel: ledit petit peptide restant fixé à ladite portion
d'AT III, ou total : ledit petit peptide n'étant plus lié à
ladite portion d'AT III);
AT désigne l'Antithrombine (également appelée Antithrombine
III ou AT III); désigne le coefficient de variation moyen;
D désigne le fragment D monomère des produits de
dégradation du fibrinogène; DD désigne le fragment D dimère des produits de
dégradation de la fibrine;
DIC désigne l'expression coagulation intravasculaire disséminée ;
DO désigne la densité optique (mesurée notamment à
une longueur d'onde de 492 nm); ElA désigne une technique enzymimm1nologique (en
anglais : "enzyme imuunoassay");
ELISA abréviation de l'expression anglaise "enzyme-
linked immunosorbent assay", désigne une technique EIA
particulière;
F(ab) désigne un premier fragment d'un anticorps obtenu -
par clivage dudit anticorps par la papaine;
F(ab')2 désigne un second fragment d'un anticorps obtenu
par clivage dudit anticorps par la pepsine;;
un anticorps (tel que IgG) présente d'une manière générale
une structure ayant schématiquement la forme d'un Y et
comprend deux chaines dites légères (a) reliées entre elles
au voisinage de leurs extrémités inférieures par un pont
disulfure (1) et deux channes dites lourdes (b) [de PM et de
longueur supérieurs à ceux des chaines (a)] reliées chacune
à la channe (a) opposée, d'une part, par deux ponts
disulfure (2) situés au-dessous du pont disulfure (1), et
d'autre part, par au moins un pont disulfure (3) situé dans
l'une des branches latérales de 1'Y; cette structure est
illustrée par le schéma suivant (dans lequel seuls les
ponts essentiels ont été représentés):
clivage par la papaine clivage parla pepsine la digestion (ou dégradation) par la papaine ou la pepsine va cliver la branche inférieure de 1 : le clivage par la papaine intervient entre le niveau du pont disulfure (1) et le niveau des deux ponts disulfure (2), et le clivage par la pepsine intervient en-dessous du niveau du pont disulfure (
le clivage par la papaine illustré par le mécanisme suivant
[autre nomenclature : anti (Z)];
ATM désigne l'antithrodbine III modifiée; selon
l'invention, le terme ATM désigne plus précisément une
substance dans laquelle la portion de l'Antithrombine III
préalablement complexée par la sérine estérase a été clivée
de telle façon qu'un petit peptide de PM 5000 environ a été
déplacé pour dénuder et faire apparaître une plage
d'épitopes sur ladite portion d'AT III (le clivage peut être
partiel: ledit petit peptide restant fixé à ladite portion
d'AT III, ou total : ledit petit peptide n'étant plus lié à
ladite portion d'AT III);
AT désigne l'Antithrombine (également appelée Antithrombine
III ou AT III); désigne le coefficient de variation moyen;
D désigne le fragment D monomère des produits de
dégradation du fibrinogène; DD désigne le fragment D dimère des produits de
dégradation de la fibrine;
DIC désigne l'expression coagulation intravasculaire disséminée ;
DO désigne la densité optique (mesurée notamment à
une longueur d'onde de 492 nm); ElA désigne une technique enzymimm1nologique (en
anglais : "enzyme imuunoassay");
ELISA abréviation de l'expression anglaise "enzyme-
linked immunosorbent assay", désigne une technique EIA
particulière;
F(ab) désigne un premier fragment d'un anticorps obtenu -
par clivage dudit anticorps par la papaine;
F(ab')2 désigne un second fragment d'un anticorps obtenu
par clivage dudit anticorps par la pepsine;;
un anticorps (tel que IgG) présente d'une manière générale
une structure ayant schématiquement la forme d'un Y et
comprend deux chaines dites légères (a) reliées entre elles
au voisinage de leurs extrémités inférieures par un pont
disulfure (1) et deux channes dites lourdes (b) [de PM et de
longueur supérieurs à ceux des chaines (a)] reliées chacune
à la channe (a) opposée, d'une part, par deux ponts
disulfure (2) situés au-dessous du pont disulfure (1), et
d'autre part, par au moins un pont disulfure (3) situé dans
l'une des branches latérales de 1'Y; cette structure est
illustrée par le schéma suivant (dans lequel seuls les
ponts essentiels ont été représentés):
clivage par la papaine clivage parla pepsine la digestion (ou dégradation) par la papaine ou la pepsine va cliver la branche inférieure de 1 : le clivage par la papaine intervient entre le niveau du pont disulfure (1) et le niveau des deux ponts disulfure (2), et le clivage par la pepsine intervient en-dessous du niveau du pont disulfure (
le clivage par la papaine illustré par le mécanisme suivant
<tb> PaS <SEP> X <SEP> I <SEP> H
<tb> <SEP> ;<SEP> | <SEP> 'ab) <SEP> c
<tb> <SEP> IgG
<tb> donne deux fragments F(ab) et un fragment Fc; le clivage par la pepsine illustré par le mécanisme suivant
<tb> <SEP> ;<SEP> | <SEP> 'ab) <SEP> c
<tb> <SEP> IgG
<tb> donne deux fragments F(ab) et un fragment Fc; le clivage par la pepsine illustré par le mécanisme suivant
<tb> <SEP> 'I
<tb> pepsne <SEP> +
<tb> <SEP> Pepsine <SEP> F <SEP> c
<tb> <SEP> IgS
<tb>
donne le fragment F(ab')2 et un fragment Fc (différent du fragment
Fc précédent);;
le clivage par la papaine ou la pepsine (ou tout autre moyen
réducteur approprié) a pour objet d'écarter la majeure partie du
fragment Fc qui peut réagir de façon aspécifique avec le Facteur
Rhumatoïde (FR), ce qui implique la perturbation possible des
dosages quand Fc est présent dans le matériel immunologique, d'une
part, et recueillir les fragments F(ab) et F(ab')2 qui sont
essentiellement insensibles audit Facteur Rhumatoide, d'autre
part.
<tb> pepsne <SEP> +
<tb> <SEP> Pepsine <SEP> F <SEP> c
<tb> <SEP> IgS
<tb>
donne le fragment F(ab')2 et un fragment Fc (différent du fragment
Fc précédent);;
le clivage par la papaine ou la pepsine (ou tout autre moyen
réducteur approprié) a pour objet d'écarter la majeure partie du
fragment Fc qui peut réagir de façon aspécifique avec le Facteur
Rhumatoïde (FR), ce qui implique la perturbation possible des
dosages quand Fc est présent dans le matériel immunologique, d'une
part, et recueillir les fragments F(ab) et F(ab')2 qui sont
essentiellement insensibles audit Facteur Rhumatoide, d'autre
part.
FPA désigne le fibrinopeptide A;
FT désigne le Facteur Tissulaire;
FR désigne le Facteur RhumatoIde;
PDF désigne les produits de dégradation du fibrinogè
ne comme indiqué dans la demande internationale PCI
WO-86-01298 (incorporée ici à titre de référence);
PLP désigne tout phospholipide
PM désigne le poids moléculaire; POD désigne la peroxydase;
OPD désigne ltortho-phénylènediamine;
R désigne un moyen de marquage;
RIA désigne une technique radioimmunologique;
SE désigne toute sérine estérase;
T désigne la Thrombine;
TAI désigne le complexe Thrombine-Antithrombine III
intervenant selon l'art antérieur précité; II désigne le Facteur Il (autre nomenclature Prothrombine);;
IIa désigne le Facteur II activé;
V désigne le Facteur V, il s'agit du cofacteur du
Facteur X; V* désigne le Facteur V activé;
VII désigne le Facteur VII;
VIIa désigne le Facteur VII activé; VIII * C désigne le Facteur VIII coagulant sous forme
activée, ladite forme activée est le cofacteur
de IXa;
IX désigne le Facteur IX;
IXa désigne le Facteur IX activé;
X désigne le Facteur X;
Xa désigne le Facteur X activé;
XI désigne le Facteur XI;
XIa désigne le Facteur XI activé;
XII désigne le Facteur XII;
XIIa désigne le Facteur XII activé;
XIII-A désigne le Facteur XIII-A de la coagualtion qui
stabilise sous sa forme active (XIIIA*);
la fibrine en introduisant des liaisons covalentes.
FT désigne le Facteur Tissulaire;
FR désigne le Facteur RhumatoIde;
PDF désigne les produits de dégradation du fibrinogè
ne comme indiqué dans la demande internationale PCI
WO-86-01298 (incorporée ici à titre de référence);
PLP désigne tout phospholipide
PM désigne le poids moléculaire; POD désigne la peroxydase;
OPD désigne ltortho-phénylènediamine;
R désigne un moyen de marquage;
RIA désigne une technique radioimmunologique;
SE désigne toute sérine estérase;
T désigne la Thrombine;
TAI désigne le complexe Thrombine-Antithrombine III
intervenant selon l'art antérieur précité; II désigne le Facteur Il (autre nomenclature Prothrombine);;
IIa désigne le Facteur II activé;
V désigne le Facteur V, il s'agit du cofacteur du
Facteur X; V* désigne le Facteur V activé;
VII désigne le Facteur VII;
VIIa désigne le Facteur VII activé; VIII * C désigne le Facteur VIII coagulant sous forme
activée, ladite forme activée est le cofacteur
de IXa;
IX désigne le Facteur IX;
IXa désigne le Facteur IX activé;
X désigne le Facteur X;
Xa désigne le Facteur X activé;
XI désigne le Facteur XI;
XIa désigne le Facteur XI activé;
XII désigne le Facteur XII;
XIIa désigne le Facteur XII activé;
XIII-A désigne le Facteur XIII-A de la coagualtion qui
stabilise sous sa forme active (XIIIA*);
la fibrine en introduisant des liaisons covalentes.
DESCRIPTION DlaSdJUUEZ DE L'INVENTION
Les mécanismes en cascade intervenant dans l'hémostase sont illustrés par la figure I ci-après. Ils montrent que l'AT III réagit en particulier sur les Facteurs activés IIa, IXa, et Xa (comme représenté) ainsi que sur les Facteurs activés XIa et XIIa pour donner des complexes AT III-IIa, AT Ili-Ixa et AT III-Xa (comme représenté) ainsi que des complexes AT III-XIa et AT III-XIIa.
Les mécanismes en cascade intervenant dans l'hémostase sont illustrés par la figure I ci-après. Ils montrent que l'AT III réagit en particulier sur les Facteurs activés IIa, IXa, et Xa (comme représenté) ainsi que sur les Facteurs activés XIa et XIIa pour donner des complexes AT III-IIa, AT Ili-Ixa et AT III-Xa (comme représenté) ainsi que des complexes AT III-XIa et AT III-XIIa.
En bref, suivant le schéma illustré sur la figure 1, 1'AT III agit
- lors de la mise en contact avec le sang, le sérum ou le plasma;
- sur le Facteur XIa (avec formation du complexe AT III-Xla, non représenté, en cas de difficulté ou déficience au niveau de l'hémostase); le Facteur IX est activé en IXa soit par le XIa soit par le complexe VII-FT [où le Facteur VII est sous forme activée VIIa (avec formation du complexe AT III-VIIa, non représenté, en cas de difficulté ou déficience au niveau de 1 'hémostase)]; le IXa forme un complexe enzymatique avec les phospholipides (PLP), le Ca2+ et son cofacteur VIII C, ce complexe active le Facteur X en Xa; le Xa ainsi obtenu forme un complexe avec les PLP, le Ca2+ et son cofacteur V (sous forme activée V*), ce dernier complexe active le Facteur II (Prothrombine) en IIa;
- sur le IXa pour donner, comne représenté, un complexe AT III
IXa,
- sur le Xa pour donner, comne représenté, un complexe AT III-Xa, et
- sur le IIa pour donner, comme représenté, un complexe AT III
IIa.
- lors de la mise en contact avec le sang, le sérum ou le plasma;
- sur le Facteur XIa (avec formation du complexe AT III-Xla, non représenté, en cas de difficulté ou déficience au niveau de l'hémostase); le Facteur IX est activé en IXa soit par le XIa soit par le complexe VII-FT [où le Facteur VII est sous forme activée VIIa (avec formation du complexe AT III-VIIa, non représenté, en cas de difficulté ou déficience au niveau de 1 'hémostase)]; le IXa forme un complexe enzymatique avec les phospholipides (PLP), le Ca2+ et son cofacteur VIII C, ce complexe active le Facteur X en Xa; le Xa ainsi obtenu forme un complexe avec les PLP, le Ca2+ et son cofacteur V (sous forme activée V*), ce dernier complexe active le Facteur II (Prothrombine) en IIa;
- sur le IXa pour donner, comne représenté, un complexe AT III
IXa,
- sur le Xa pour donner, comne représenté, un complexe AT III-Xa, et
- sur le IIa pour donner, comme représenté, un complexe AT III
IIa.
L'obtention du complexe AT III-sérine estérase qui permet de générer des anticorps monoclonaux spécifiques des complexes Antithrortibine III-protéases tels que AT III-IIa, AT III-IXa, AT III
Xa, AT III-XIa et AT III-XIIa est illustrée par la figure 2 ci-après.
Xa, AT III-XIa et AT III-XIIa est illustrée par la figure 2 ci-après.
En bref, lors de la mise en contact de 1'AT III (PM de l'ordre de 65000 environ) avec la sérine estérase, il se forme en premier lieu un complexe réversible (référencé 21) suivant la réaction d'équilibre
AT III + SE
AT III + SE
AT III-SE dans ce complexe réversible, la portion AT III comporte un petit peptide de PM 5000 environ (référencé 22). En second lieu, ce complexe réversible est transformé (selon la flèche 23) en complexe covalent irréversible (référencé 24) dans lequel (i) ledit peptide (22) a été déplacé suivant un clivage partiel faisant apparaltre une plage d'épitopes (référencée 25) sur la portion AT III dudit complexe covalent irréversible, et (ii) la liaison AT III/SE a été soumise à un réarrangement. En troisième lieu, ledit complexe covalent irréversible (25) est soumis à un clivage pour donner (suivant 26) une ATM comportant ladite plage d'épitopes (25) et ledit peptide (22) fixé à la portion AT III au voisinage de ladite plage, ou (suivant 27) une ATM comportant ladite - plage d'épitopes (25) mais dépourvue dudit peptide (22). En variante cette dernière ATM peut être obtenue (suivant 28) par traitement de 1 'ATM précédente comportant le peptide (22) par clivage total dudit peptide (22).
Suivant l'invention, le matériel immunologique, à savoir ltanticorps monoclonal anti (ATM), est généré contre une ATM choisie parmi (a) le complexe covalent irréversible, (b) la portion AT III modifiée séparée dudit complexe covalent irréversible et comportant ledit petit peptide de PM 5000 environ, et (c) la portion AT III modifiée séparée dudit complexe covalent irréversible et dépourvue dudit petit peptide, les moyens (a), (b) et (c) présentant bien entendu ladite plage d'épitopes précitée.
Si nécessaire, on recueille à partir desdits anticorps monoclonaux, les fragments F(ab')2 et F(ab) par digestion des anticorps monoclonaux par digestion avec la pepsine et respectivement la papaine, ou tout autre moyen équivalent.
Suivant l'invention, on préfère utiliser le moyen (b), à savoir la portion AT III modifiée séparée dudit complexe covalent irréversible et comportant ledit petit peptide de PM 5000 environ, pour la fabrication des anticorps monoclonaux anti (ATM) puis l'obtention, à partir desdits anticorps monoclonaux des fragments
F(ab')2 et F(ab) qui sont insensibles au Facteur Rhwmatoide.
F(ab')2 et F(ab) qui sont insensibles au Facteur Rhwmatoide.
Le meilleur mode de mise en oeuvre du procédé de dosage selon l'invention consiste à mettre en contact ledit matériel immunologique fixé sur un support inerte, notamment la paroi d'une microccvette, - par revêtement (en anglais : "coating"), selon la réaction F anti(AIM) + AT protéases
F anti(ATM)-(AT III-protéases) où P désigne la fixation sur ledit support, puis la révélation de ladite réaction selon une méthode connue en soi.
F anti(ATM)-(AT III-protéases) où P désigne la fixation sur ledit support, puis la révélation de ladite réaction selon une méthode connue en soi.
Cette réaction constitue "un signal" que l'on "amplifie" selon une méthode cornue en soi [par exemple, une méthode EIA (de préférence une méthode ElA sandwich) selon laquelle on couple le complexe anti (ATM)-(AT III-protéases) avec un conjugué enzymatique approprié, une méthode RIA, une méthode d'agglutination, une méthode de luminescence].Parmi les moyens utiles pour la révélation on peut notamment citer un anticorps monoclonal ou polyclonal anti (AT III) marqué, notamnent par la peroxydase, ou par un révélateur notamnent choisi parmi ltensemble comprenant les particules de latex coloré, d'agent fluorescent et d'or colloida1. D'une manière générale, l'amplification dudit signal peut être réalisée selon les techniques décrites dans EP-A-O 122 478 incorporé ici à titre de référence.
Le support F peut être notamment une membrane réactive M (telle que bandelette ou biosenseur). L'utilisation d'une telle wsbrane fait appel à une méthode différente de la méthode ELISA quand on utilise un complexe
M-anti (ATM)-(AT III-protéase) (où M représente une membrane remplaçant la microplaque ELISA), ce complexe peut être révélé par diverses méthodes, notamment (A) -par un anticorps anti (4T III) marqué, où le moyen de
marquage (R ) est un enzyme, un radioisotope, un substrat
chromogène, luminescent ou fluorescent, (B) par un anticorps anti (AT III) couplé au moyen de billes de
latex colorées ou fluorescentes (pour lecture directe), ou (C) par un anticorps anti (AT III) couplé à de l'or colloïdal
remplaçant les billes de latex précitées.
M-anti (ATM)-(AT III-protéase) (où M représente une membrane remplaçant la microplaque ELISA), ce complexe peut être révélé par diverses méthodes, notamment (A) -par un anticorps anti (4T III) marqué, où le moyen de
marquage (R ) est un enzyme, un radioisotope, un substrat
chromogène, luminescent ou fluorescent, (B) par un anticorps anti (AT III) couplé au moyen de billes de
latex colorées ou fluorescentes (pour lecture directe), ou (C) par un anticorps anti (AT III) couplé à de l'or colloïdal
remplaçant les billes de latex précitées.
L'amplification préférée suivant le meilleur mode de mise en oeuvre de l'invention consiste à faire réagir, selon une méthode EIA sandwich, le complexe anti (AT!)-(AT III-protéases) avec un anticorps anti-AT III marqué, suivant la réaction anti(ATM)-(AT III-protéases) + anti(AT III)
F anti(AIM)-(AT III-protéases)-anti(AT III)/R* où R désigne un élément de marquage, et le matériel immunologique anti (ATM) est avantageusement le fragment F(ab')2.
Le mode de marquage préféré consiste à utiliser un anticorps monoclonal ou polyclonal anti (AT III) marqué à la peroxydase. Dans ce cas, le substrat chromogène préféré est l'OPD, et le moyen développant la couleur est l'eau oxygénée.
En variante, l'amplification peut faire appel à des particules de latex colorées, ou à des particules d'or colloïdal où l'or est éventuellement associé à de l'argent, comme indiqué cidessus. Cette amplification peut également être utilisée selon les techniques photométriques, turbidimétriques ou néphélométriques; en particulier, on peut utiliser les particules de latex de dimensions submicroniques revêtues d'un réactif immunologique tel qu'un anticorps [dans le cas d'espèce le matériel immunologique anti (ATM) selon l'invention], telles que décrites dans la demande antérieure de brevet français nO 89 00 660 du 20 janvier 1989 de la Demanderesse, pour des dosages turbidimétriques ou néphélométriques.
D'autres avantages et caractéristiques de l'invention seront mieux compris à la lecture qui va suivre d ' exemples de mise en oeuvre nullement limitatifs mais donnés à titre d'illustration.
m5 1
Obtention du complexe AT III-sérine estérase
On procède selon le mécanisme opératoire illustré par la figure 2 en mettant en contact l'AT III avec une sérine estérase.
Obtention du complexe AT III-sérine estérase
On procède selon le mécanisme opératoire illustré par la figure 2 en mettant en contact l'AT III avec une sérine estérase.
A 1 mi d'une préparation aqueuse d'AT III humaine purifiée (ayant une concentration de 0,150 g/ml) on ajoute 2 ml de sérine estérase à 170-300 Ui/ml. On incube pendant 1 h à 370C puis arrête la réaction par addition d'un agent inhibiteur (1 ml) neutralisant l'excès de sérine estérase. On complète par 6 mi d'un tampon phosphate à pH 7,5 contenant 1 g/l d'albumine bovine ultra pure.
On obtient 10 ml d'une solution aqueuse d'ATM purifiée titrant 0,015 g/l d'ATM. Il s'agit du complexe covalent irréversible référencé (24) dans le schéma de la figure 2.
Ce complexe covalent irréversible peut être dissocié par des agents nucléophiles l'hydroxylamine ou des solutions alcalines [canine indiqué par C. BOYER-NEUMANN et al., Ann. Biol. Clin., 45, pages 175180, (1987), I. BJORK et al., FEBS Lett., 126, 257, (1981) ou G.
OSHIMA et al., Thrombosis Research, 46, pages 263-270, (1987)l pour donner une ATM comportant le peptide (22) ou une ATM dépourvue dudit peptide (22).
EXEMPLE 2
Obtention du complexe AT III-T
On procède comme indiqué ci-dessus avec une sérine-estérase particulière, la Thrombine.
Obtention du complexe AT III-T
On procède comme indiqué ci-dessus avec une sérine-estérase particulière, la Thrombine.
A 1 ml dune préparation aqueuse d'AT III humaine purifiée (ayant une concentration de 0,150 g/ml) on ajoute 2 ml de Thrombine à 200 NiH/ml. On incube pendant 1 h à 370C puis arrete la réaction par addition de 1 ml d'hirudine à 2000 ATU (afin d'inhiber l'excès de Throdbine). On complète par 6 mi d'un tampon aqueux à pH 7,5 [constitué de phosphate (0,05 M), glycine (0,1 M) et NaCl (0,15 M) et contenant 1 g/l d'albumine bovine ultra pure]. On obtient 10 ml d'une solution aqueuse d'ATM purifiée titrant 0,015 g/l d'ATM. I1 s'agit du complexe covalent irréversible référencé (24) dans le schéma de la figure 2. Le contrôle de cette ATM est effectuée par électrophorèse au moyen de SDS-PAGE (abréviation de "sodium Diodecylsulfate
Polyacrylamide gel Electrophoresis" à 7 X . La génération de complexes AIN-IIa est visualisée par l'apparition d'une bande de PM 96000 environ.
Polyacrylamide gel Electrophoresis" à 7 X . La génération de complexes AIN-IIa est visualisée par l'apparition d'une bande de PM 96000 environ.
Le complexe covalent irréversible AT III-T constituant cette
ATM peut être dissocié comme indiqué ci-dessus à l'exemple 1.
ATM peut être dissocié comme indiqué ci-dessus à l'exemple 1.
XtEMPLe 3
Obtention de I'anticorps anti (ATM)
A partir du complexe irréversible obtenu selon l'exemple 1 ou 2 on génère des anticorps monoclonaux contre la portion AT III dudit complexe AT III-sérine estérase.
Obtention de I'anticorps anti (ATM)
A partir du complexe irréversible obtenu selon l'exemple 1 ou 2 on génère des anticorps monoclonaux contre la portion AT III dudit complexe AT III-sérine estérase.
Le complexe AT III-protéases obtenu selon l'exemple.1 ou 2 est utilisé pour des immunisations de souris (BALB-C) selon des techniques usuelles d'immunisation, voir à cet effet "Methods in Immunology" W. A. BENJkMIN INC. Publishes, 159-182, (1970).
Après immunisation, on sacrifie les souris et on prélève stérilement les rates (2 souris par fusion). On extrait les lymphocytes de la rate puis on procède à la fusion des lymphocytes avec des cellules de myélome de souris en croissance exponentielle, selon notamment des protocoles classiques d'hybridation lymphocytaire [voir J.G.R. HURRELL, "Monoclonal Hybridoma Anti-bodies : Techniques and Applications", CRC PRESS INC., (198l)i.
On procède ensuite à la sélection des hybridomes sécréteurs par screening des clones produisant des anticorps monoclonaux réagissant avec les complexes AT III-protéases mais ne réagissant pas avec l'AT III native, la Prothrombine, la Thrombine et les autres protéases du sang telles que IIa, IXa, Xa, XIa et XIIa.
EXEMPLE 4
Obtention du fragment F(ab')2
On introduit 100 mg d'anticorps monoclonal- anti (ATM), obtenu selon l'exemple 3, dans un tampon acétate 0,07 M à pH 4,0 contenant 0,05 M de Nazi. A la composition aqueuse résultante on ajoute 3,2 mg de pepsine (par exemple la pepsine commercialisée par la société dite SIGMA CHEMICALS) et on incube 18 h à 370C. On concentre ensuite le mélange résultant jusqu'à un volume de 5 ml puis soumet le concentrat à une filtration sur gel (par exemple le gel commercialisé par la société dite PHARMACIA sous la nomenclature de
SEPHACRYLR S 200 HR), le gel garnissant une colonne de i m de hauteur et de 50 mm de diamètre extérieur.On recueille la fraction contenant le fragment F(ab')2 ainsi séparé du fragment Fc et de la pepsine. La fraction contenant le fragment F(ab')2 est dialysée contre un tampon glycine à 0,1 M contenant 0,15 M de NaCI et ayant un pH de 8,2. Le fragment F(ab')2 ainsi purifié est prêt à l'utilisation pour le revêtement ('.coating") d'un support approprié, notamment des microplaques.
Obtention du fragment F(ab')2
On introduit 100 mg d'anticorps monoclonal- anti (ATM), obtenu selon l'exemple 3, dans un tampon acétate 0,07 M à pH 4,0 contenant 0,05 M de Nazi. A la composition aqueuse résultante on ajoute 3,2 mg de pepsine (par exemple la pepsine commercialisée par la société dite SIGMA CHEMICALS) et on incube 18 h à 370C. On concentre ensuite le mélange résultant jusqu'à un volume de 5 ml puis soumet le concentrat à une filtration sur gel (par exemple le gel commercialisé par la société dite PHARMACIA sous la nomenclature de
SEPHACRYLR S 200 HR), le gel garnissant une colonne de i m de hauteur et de 50 mm de diamètre extérieur.On recueille la fraction contenant le fragment F(ab')2 ainsi séparé du fragment Fc et de la pepsine. La fraction contenant le fragment F(ab')2 est dialysée contre un tampon glycine à 0,1 M contenant 0,15 M de NaCI et ayant un pH de 8,2. Le fragment F(ab')2 ainsi purifié est prêt à l'utilisation pour le revêtement ('.coating") d'un support approprié, notamment des microplaques.
EXEMPLE 5
Réactivités
Le fragment F(ab')2 de l'anticorps monoclonal, tel qu'obtenu selon l'exemple 4, reconnaît les complexes AT III-protéases et en particulier les complexes AT III-IXa, AT III-Xa et AT III-IIa. I1 ne reconnaît pas 1'AT III native, les facteurs ISa, Xa et IIa, la Prothrombine et les autres protéases plasmatiques.
Réactivités
Le fragment F(ab')2 de l'anticorps monoclonal, tel qu'obtenu selon l'exemple 4, reconnaît les complexes AT III-protéases et en particulier les complexes AT III-IXa, AT III-Xa et AT III-IIa. I1 ne reconnaît pas 1'AT III native, les facteurs ISa, Xa et IIa, la Prothrombine et les autres protéases plasmatiques.
A titre d'exemple on a mis en contact ledit fragment avec un milieu contenant diverses quantités de complexes AT III-IXa, AT III
Xa et AT III-IIa en présence de diverses quantités d'AT III et de
Facteurs IXa, Xa et IIa. Les courbes de la figure 3 ci-après concernent les réactivités dudit fragment déterminées par dosage imsuno-enzymatique (technique ElA sandwich) et exprimées, après révélation de couleur au moyen du système POD/HD2O2, par la variation de la DO à 492 nm en fonction de la concentration donnée en ng/ml.
Xa et AT III-IIa en présence de diverses quantités d'AT III et de
Facteurs IXa, Xa et IIa. Les courbes de la figure 3 ci-après concernent les réactivités dudit fragment déterminées par dosage imsuno-enzymatique (technique ElA sandwich) et exprimées, après révélation de couleur au moyen du système POD/HD2O2, par la variation de la DO à 492 nm en fonction de la concentration donnée en ng/ml.
Les courbes de la figure 3 montre que, suivant ce dosage, les complexes AT III-IXa, AT III-Xa et AT III-IIa réagissent spécifiquement avec ledit fragment. La cross-réactivité de 1'AT III mesurée dans ledit dosage est inférieure à 1/30000.
EXEMPLE 6
Effet de l'addition de IIa, Xa, IXa à un plasma
Lorsqu'on ajoute les Facteurs IIa, Xa et IXa à un plasma contenant de 1'AT III, il se forme des complexes AT III-IIa, AT III
Xa et respectivement AT III-IXa. La formation de ces complexes est dite "dose-dépendante".
Effet de l'addition de IIa, Xa, IXa à un plasma
Lorsqu'on ajoute les Facteurs IIa, Xa et IXa à un plasma contenant de 1'AT III, il se forme des complexes AT III-IIa, AT III
Xa et respectivement AT III-IXa. La formation de ces complexes est dite "dose-dépendante".
On a ajouté à un plasma citraté et hépariné les produits suivants
- sérum physiologique (témoin),
- Facteurs IIa, IXa ou Xa suivant des concentrations finales allant de O à 5000 ng/ml.
- sérum physiologique (témoin),
- Facteurs IIa, IXa ou Xa suivant des concentrations finales allant de O à 5000 ng/ml.
Après incubation de 0,5 h à 370C et arrêt de toute réaction par l'hirudine et le PPACK (dichlorhydrate de D-phenylalanyl-Lprolyl-L-arginine-chlorométhyl-cétone, puissant inhibiteur synthétique de la Thrombine), on a dosé les quantités des complexes AT III IIa, AT III-IKa et AT III-Xa qui ont été formés, selon une technique
EIA sandwich en utilisant le fragment F(ab'32 pour fixer chacun desdits complexes puis en faisant réagir chaque produit résultant avec un anticorps (monoclonal ou polyclonal) anti (AT III) marqué à la peroxydase, la révélation étant effectuée au moyen du système OPD/H202. Les courbes de la figure 4 obtenues selon cette technique donnent la teneur en complexe AT III-protéase formée en fonction de la concentration (C) de chaque protéase IIa, IXa et Xa donnée en ng/ml. La teneur en AT III-protéase reste égale. à 0 pendant toute l'expérience pour les témoins.
EIA sandwich en utilisant le fragment F(ab'32 pour fixer chacun desdits complexes puis en faisant réagir chaque produit résultant avec un anticorps (monoclonal ou polyclonal) anti (AT III) marqué à la peroxydase, la révélation étant effectuée au moyen du système OPD/H202. Les courbes de la figure 4 obtenues selon cette technique donnent la teneur en complexe AT III-protéase formée en fonction de la concentration (C) de chaque protéase IIa, IXa et Xa donnée en ng/ml. La teneur en AT III-protéase reste égale. à 0 pendant toute l'expérience pour les témoins.
EXEMPLE 7 I;Imunoblotting
Les substances à analyser (à savoir : AT III, IIa, Xa, XIa,
AT III-IIa, AT III-Xa ou AT III-IXa) sont sabord séparées sur plaque de gel de polyacrylamide. Elles sont ensuite transférées sur une feuille de nitrocellulose puis incubées avec le fragment F(ab')2 obtenu selon l'exemple 2 ci-dessus. Les anticorps ayant réagi sont ensuite révelés par un second anticorps marqué (dans le cas d'espèce un anticorps monoclonal ou polyclonal anti-IgG de souris produit chez le lapin et marqué à la peroxydase). On constate que ledit fragment
F(ab')2 ne réagit qu'avec les complexes AT III-protéases et qu'il ne.
Les substances à analyser (à savoir : AT III, IIa, Xa, XIa,
AT III-IIa, AT III-Xa ou AT III-IXa) sont sabord séparées sur plaque de gel de polyacrylamide. Elles sont ensuite transférées sur une feuille de nitrocellulose puis incubées avec le fragment F(ab')2 obtenu selon l'exemple 2 ci-dessus. Les anticorps ayant réagi sont ensuite révelés par un second anticorps marqué (dans le cas d'espèce un anticorps monoclonal ou polyclonal anti-IgG de souris produit chez le lapin et marqué à la peroxydase). On constate que ledit fragment
F(ab')2 ne réagit qu'avec les complexes AT III-protéases et qu'il ne.
fixe pas 1'AT III ni les protéases IIa, Xa et XIa.
EXEMPLE 8
Trousse de dosage
La trousse de dosage comprend de façon avantageuse les ingrédients suivants
- plaque de 96 puits, en six barrettes sécables pré-revêtues au moyen du fragment F(ab')2 anti (ATM) obtenu selon l'exemple 2; cette plaque doit être conservée à + 40C;
- tampon de dilution (de préférence un flacon de 100 mi prêt à ltemploi);
- complexes AT III-protéases de référence (de préférence un flacon renfermant 1' ensemble des complexes AT III-protéases sous forme lyophilisée obtenus à partir d'AT III humaine, le contenu de ce flacon est à reprendre avec 5 ml de tampon de dilution afin d'obtenir une solution titrant 50 ng/ml, ce qui correspond à un plasma titrant 500 ng/ml dilué au 1/10);
- anticorps anti (AT III)/peroxydase (immunoglobulines de lapin spécifiques de lttT III et couplées à la peroxydase); sous forme lyophilisée (on dilue le contenu du flacon par 20 ml de tampon de dilution pour avoir la solution dlimmunoconjugé prête à ltem- ploi);
- solution de lavage (de préférence un flacon de 20 ml de solution de lavage à diluer au 1/20 afin d'obtenir la solution requise prête à l'emploi);
- substrat ortho-phénylènediamine (OPD); le substrat OPD est conservé lyophilisé avec son tampon d'utilisation; avant emploi on reconstitue la solution de substrat par addition de 20 mi d'eau distillée puis ajoute 10 microlitres d'eau oxygénée à 30 % (i.e. H202 à 110 volumes).
Trousse de dosage
La trousse de dosage comprend de façon avantageuse les ingrédients suivants
- plaque de 96 puits, en six barrettes sécables pré-revêtues au moyen du fragment F(ab')2 anti (ATM) obtenu selon l'exemple 2; cette plaque doit être conservée à + 40C;
- tampon de dilution (de préférence un flacon de 100 mi prêt à ltemploi);
- complexes AT III-protéases de référence (de préférence un flacon renfermant 1' ensemble des complexes AT III-protéases sous forme lyophilisée obtenus à partir d'AT III humaine, le contenu de ce flacon est à reprendre avec 5 ml de tampon de dilution afin d'obtenir une solution titrant 50 ng/ml, ce qui correspond à un plasma titrant 500 ng/ml dilué au 1/10);
- anticorps anti (AT III)/peroxydase (immunoglobulines de lapin spécifiques de lttT III et couplées à la peroxydase); sous forme lyophilisée (on dilue le contenu du flacon par 20 ml de tampon de dilution pour avoir la solution dlimmunoconjugé prête à ltem- ploi);
- solution de lavage (de préférence un flacon de 20 ml de solution de lavage à diluer au 1/20 afin d'obtenir la solution requise prête à l'emploi);
- substrat ortho-phénylènediamine (OPD); le substrat OPD est conservé lyophilisé avec son tampon d'utilisation; avant emploi on reconstitue la solution de substrat par addition de 20 mi d'eau distillée puis ajoute 10 microlitres d'eau oxygénée à 30 % (i.e. H202 à 110 volumes).
Les autres réactifs nécessaires non inclus dans la trousse de dosage comprennent : l'eau oxygénée et l'acide sulfurique 3 M. Le lecteur de plaque est réglé pour opérer à la longueur d'onde de 492 nm.
Le protocole opératoire est le suivant.
Recueil et traitement du plasma
On recueille le plasma au moyen de citrate de calcium 0,109
M à raison de 1 volume de citrate pour 9 volumes de sang en écartant le premier millilitre de sang. On centrifuge 10 minutes à environ 300 tours/minute. Le plasma ainsi obtenu peut être conservé 8 heures à la température ambiante (15-2O0C) ou un mois après congélation (si le plasma traité est utilisé après congélation il est recomnandé de le décongeler préalablement à 370C pendant au moins 15 minutes avant utilisation.
On recueille le plasma au moyen de citrate de calcium 0,109
M à raison de 1 volume de citrate pour 9 volumes de sang en écartant le premier millilitre de sang. On centrifuge 10 minutes à environ 300 tours/minute. Le plasma ainsi obtenu peut être conservé 8 heures à la température ambiante (15-2O0C) ou un mois après congélation (si le plasma traité est utilisé après congélation il est recomnandé de le décongeler préalablement à 370C pendant au moins 15 minutes avant utilisation.
Etalonnage
A partir du point titrant 50 ng/ml de AT III-protéases on réalise la gamme d'6talonnage suivante au moyen du tampon de dilu tion taux de AT III-protéases (ng/ml).. .50 20 10 5 2,5 0 tampon de dilution (ml) ............0 0,6 0,8 0,9 0,95 1 ml de AT III-protéases à ioo ng/ml 1 0,4 0,2 0,1 0,05 0
Plasma à tester
On dilue le plasma à tester au 1/10 au moyen de tampon de dilution; pour des concentrations plus élevées, il convient de diluer le plasma au 1/20 ou au 1/40.
A partir du point titrant 50 ng/ml de AT III-protéases on réalise la gamme d'6talonnage suivante au moyen du tampon de dilu tion taux de AT III-protéases (ng/ml).. .50 20 10 5 2,5 0 tampon de dilution (ml) ............0 0,6 0,8 0,9 0,95 1 ml de AT III-protéases à ioo ng/ml 1 0,4 0,2 0,1 0,05 0
Plasma à tester
On dilue le plasma à tester au 1/10 au moyen de tampon de dilution; pour des concentrations plus élevées, il convient de diluer le plasma au 1/20 ou au 1/40.
Dosage - Fixation de l'antigène
- On introduit par cupule 200 microlitres de dilution d'étalonnage ou de plasma à tester dilué au moyen du tampon de dilution.
- On introduit par cupule 200 microlitres de dilution d'étalonnage ou de plasma à tester dilué au moyen du tampon de dilution.
- On incube 2 heures à une température comprise entre 15 et 40 C (de préférence à 370C).
- On effectue ensuite 5 lavages successifs à l'aide de la solution de lavage.
- Addition du conjugué
- Dès que le dernier lavage a été effectué, on introduit aussitôt par cupule 200 microlitres d'immunoconjugué.
- Dès que le dernier lavage a été effectué, on introduit aussitôt par cupule 200 microlitres d'immunoconjugué.
- On incube 2 heures à une température comprise entre 15 et 4O0C (de préférence à 370C).
- On effectue ensuite 5 lavages successifs à l'aide de la solution de lavage.
- Développement de la coloration
- Dès que le dernier lavage a été effectué, on introduit aussitôt dans chaque cupule 20Q microlitres de substrat OPD/H202.
- Dès que le dernier lavage a été effectué, on introduit aussitôt dans chaque cupule 20Q microlitres de substrat OPD/H202.
- On incube très exactement pendant 6 minutes, puis arrête la réaction par addition de 50 microlitres d'acide sulfurique 3 M.
Lecture
- On laisse reposer la plaque pendant 10 minutes à la température ambiante.
- On laisse reposer la plaque pendant 10 minutes à la température ambiante.
- On mesure ensuite la DO à 492 nm.
Résultats
Sur du papier millimétré, on porte en abscisses la concentration d'AT III-protéases et en ordonnées la DO correspondante mesurée à 492 nm. Sur la courbe ainsi obtenue, on détermine le taux d'AT III-protéases du plasma à étudier, en multipliant la valeur obtenue par 10 (ou par le facteur d'ébullition si celui-ci est différent).
Sur du papier millimétré, on porte en abscisses la concentration d'AT III-protéases et en ordonnées la DO correspondante mesurée à 492 nm. Sur la courbe ainsi obtenue, on détermine le taux d'AT III-protéases du plasma à étudier, en multipliant la valeur obtenue par 10 (ou par le facteur d'ébullition si celui-ci est différent).
On constate que lorsque des complexes AT III-protases sont ajoutés à des plasmas normaux le taux de recouvrement desdits complexes se situe entre 90 à 110 X du taux attendu.
La plage de mesure, selon le présent procédé de dosage, des complexes AT III-protéases va de O à 50 ng/ml.
Les coefficients de variation moyens (CV) intra-essais et inter-essais sont inférieurs à 10 %
Le seuil de sensibilité du procédé de dosage selon l'invention est de l'ordre de 0,2 ng/mi.
Le seuil de sensibilité du procédé de dosage selon l'invention est de l'ordre de 0,2 ng/mi.
Des valeurs cliniques relatives à la teneur en complexes AT III-protéases qui ont obtenues sur des patients normaux, d'une part, et des patients ayant des déficiences au niveau de l'hémostase, d'autre patt, ont été consignées ci-après
- valeurs normales : < 20 ng/ml
sur 15 individus normaux on a obtenu
moyenne : 11,4 ng/ml
écart type : 2,7 ng/ml
extrêmes : 5 à 17 ng/ml
- valeurs pathologiques
- DIC : 26 à 160 ng/ml
- Chirurgie ortho
pédique sous pro
phyllaxie de Love
nox (24 h après
injection) : 20 à 250 ng/ml
- Toxémie gravi
dique : 50 à 1000 ngfml
On constate que lesdites valeurs cliniques chez les individus normaux et respectivement les cas pathologiques, sont nettement supérieures à celle rapportées ci-dessus et obtenues suivant le test de l'art antérieur mettant en oeuvre le complexe TAT.
- valeurs normales : < 20 ng/ml
sur 15 individus normaux on a obtenu
moyenne : 11,4 ng/ml
écart type : 2,7 ng/ml
extrêmes : 5 à 17 ng/ml
- valeurs pathologiques
- DIC : 26 à 160 ng/ml
- Chirurgie ortho
pédique sous pro
phyllaxie de Love
nox (24 h après
injection) : 20 à 250 ng/ml
- Toxémie gravi
dique : 50 à 1000 ngfml
On constate que lesdites valeurs cliniques chez les individus normaux et respectivement les cas pathologiques, sont nettement supérieures à celle rapportées ci-dessus et obtenues suivant le test de l'art antérieur mettant en oeuvre le complexe TAT.
Claims (10)
1. Procédé de dosage de complexes AT III-protéases que 1on préconise suivant l'invention, qui met en oeuvre l'utilisation d'un anticorps anti (AIM) en tant que matériel immunologique, est caractérisé en ce que l'on met en contact un milieu liquide à analyser contenant au moins un complexe AT III-protéase avec un matériel imnunologique choisi parmi 1'ensemble constitué par (i) les anticorps monoclonaux anti (Antithrombine III modifiée) générés contre la fraction Antithrombine III de complexes AT III-sérine estérase dans laquelle un peptide ayant un bas poids moléculaire de l'ordre de 5000 environ a été déplacé pour faire apparaître une plage d'épitopes sur ladite fraction Antithrombine III, et (ii) les fragments F(ab')2 et F(ab) desdits anticorps monoclonaux, lesdits anticorps et lesdits fragments F(ab')2 et F(ab) fixant spécifiquement les complexes AT III-protéases mais ne réagissant pas avec l'Antithronibine III, la Prothrombine, la Thrombine, les protéases
IIa, IXa, Xa, XIa et XIIa, ladite mise en contact mettant en oeuvre la réaction anti(ATM) + AT III-protéases
anti(AT!)-(AT III-protéases)
2. Procédé suivant la revendication 1, dans lequel le matériel irmrunologique est le fragment F(ab) de l'anticorps monoclonal anti (ATM).
3. Procédé suivant la revendication 1, dans lequel le matériel immunologique est le fragment F(ab')2 de l'anticorps monoclonal anti (ATM).
4. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que le matériel imuunologique est fixé sur un support inerte.
5. Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 et 4, caractérisé en ce qu'il comprend en outre la fixation d'un immunoconjugué.
6. Procédé suivant la revendication 5, caractérisé en ce que ledit immunoconjugud est un anticorps anti (AT III), qui est de préférence marqué à la peroxydase.
7. Procédé suivant la revendication 5, caractérisé en ce que ledit irrmunoconjugué est un anticorps anti (AT III) lié à un révélateur notamnent choisi parmi 1'ensemble comprenant les particules de latex coloré, d'agent fluorescent et d'or colloïdal.
8. Procédé suivant l'une quelconque des revendications précédentes 1 et 5, caractérisé en ce qu'il comprend les réactions 1 ) F anti(ATM) + AT III-protéases
F anti(ATM)-(AT III-protéases) 20) F anti(AIX)-(AT III-protéases) + anti(AT III)
F anti(ATM)-(AT III-protéases)-anti(AT III)/R* où R désigne un élément de marquage, et F désigne la fixation sur un support inerte.
9. Matériel Ùirminologique utile pour le dosage des complexes AT III-protéases, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi l'ensemble constitué par (i) les anticorps monoclonaux anti (Antithrombine III modifiée) générés contre la fraction Antithrombine III de complexes
AT III-sérine estérase dans laquelle un peptide ayant un bas poids moléculaire de l'ordre de 5000 environ a été déplacé pour faire apparaître une plage d'épitopes sur ladite fraction Antithrombine
III, et (ii) les fragments F(ab')2 et F(ab) desdits anticorps monoclonaux, lesdits anticorps et lesdits fragments F(ab')2 et F(ab) fixant spécifiquement les complexes AT III-protéases mais ne réagissant pas avec l'Antithrombine III, la Prothrombine, la Thrombine, les protéases IIa, IXa, Xa, XIa et XIIa.
10. Nécessaire de dosage caractérisé en ce qu'il renferme le matériel immunologique selon la revendication 8, et, le cas échéant, (a) un anticorps monoclonal ou polyclonal anti (AT III) éventuellement marqué, et éventuellement (b) un milieu de dilution, d'une part, et un milieu de rinçage, d'autre part.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR8904589A FR2645647B1 (fr) | 1989-04-07 | 1989-04-07 | Procede de dosage de complexes antithrombine-proteases |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR8904589A FR2645647B1 (fr) | 1989-04-07 | 1989-04-07 | Procede de dosage de complexes antithrombine-proteases |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FR2645647A1 true FR2645647A1 (fr) | 1990-10-12 |
| FR2645647B1 FR2645647B1 (fr) | 1991-07-05 |
Family
ID=9380485
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FR8904589A Expired - Fee Related FR2645647B1 (fr) | 1989-04-07 | 1989-04-07 | Procede de dosage de complexes antithrombine-proteases |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| FR (1) | FR2645647B1 (fr) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1995012817A1 (fr) * | 1992-06-08 | 1995-05-11 | Research Corporation Technologies, Inc. | Procede de mesure du taux d'heparine |
| FR2718849A1 (fr) * | 1994-04-14 | 1995-10-20 | Pasteur Sanofi Diagnostics | Procédé d'immunodosage de l'antithrombine III activée par un glycosaminoglycane, anticorps monoclonaux correspondants et leur procédé d'obtention. |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1986000910A1 (fr) * | 1984-07-30 | 1986-02-13 | Celltech Limited | Procede d'immunopurification |
-
1989
- 1989-04-07 FR FR8904589A patent/FR2645647B1/fr not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1986000910A1 (fr) * | 1984-07-30 | 1986-02-13 | Celltech Limited | Procede d'immunopurification |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| THE JOURNAL OF IMMUNOLOGY, vol. 127, no. 1, juillet 1981, pages 239-244, The Williams & Wilkins Co., US; F.C. McDUFFIE et al.: "Antigenic changes produced by complex formation between thrombin and anthithrombin-III" * |
| THROMBOSIS AND HAEMOSTASIS, vol. 59, no. 1, 1988, pages 101-106, F.K. Schattauer Verlagsgesellschaft mbH, Stuttgart, DE; H. PELZER et al.: "Determination of human thrombin-antithrombin III complex in plasma with an enzyme-linked immunosorbent assay" * |
| THROMBOSIS RESEARCH, vol. 36, 1984, pages 397-409, Pergamon Press, Ltd, US; J. DAWES et al.: "Monoclonal antibodies directed against human alpha-thrombin and the thrombin-antithrombin III complex" * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1995012817A1 (fr) * | 1992-06-08 | 1995-05-11 | Research Corporation Technologies, Inc. | Procede de mesure du taux d'heparine |
| FR2718849A1 (fr) * | 1994-04-14 | 1995-10-20 | Pasteur Sanofi Diagnostics | Procédé d'immunodosage de l'antithrombine III activée par un glycosaminoglycane, anticorps monoclonaux correspondants et leur procédé d'obtention. |
| WO1995028644A1 (fr) * | 1994-04-14 | 1995-10-26 | Pasteur Sanofi Diagnostics | Procede d'immunodosage de l'antithrombine iii activee par un glycosaminoglycane, anticorps monoclonaux correspondants et leur procede d'obtention |
| US5891647A (en) * | 1994-04-14 | 1999-04-06 | Pasteur Sanofi Diagnostics | Method for the immunoassay of antithrombin III activated by a glycosaminoglycan, corresponding monoclonal antibodies and method for obtaining them |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FR2645647B1 (fr) | 1991-07-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5523210A (en) | Bispecific antibody determinants | |
| WO1980002460A1 (fr) | Procede et dispositif pour le dosage des lipoproteines seriques | |
| EP0528525A1 (fr) | Procédé et compositions pour détecter des protéases sanguines, spécialement pour protéine C activée | |
| CA2071211C (fr) | Dosages immunologiques pour les peptides de l'activation de la prothrombine, anticorps monoclonaux diriges contre eux et leurs produits de degradation | |
| EP0008473A1 (fr) | Procédé pour la détection et/ou la détermination d'une immunoglobuline spécifique d'un antigène, réactifs immunologiques et trousse de réactifs à utiliser dans ce procédé de détermination | |
| NO166383B (no) | Fremgangsmaate ved fremstilling av bispesifikke antistoff-determinanter. | |
| JPS58129998A (ja) | 標識蛋白質性阻害剤を用いるプロテア−ゼの分析法 | |
| FR2645647A1 (fr) | Procede de dosage de complexes antithrombine-proteases | |
| FR2813395A1 (fr) | Methode de dosage in vitro de la fibrine soluble par generation de produits de degradation specifiques | |
| EP0755518B1 (fr) | Procede d'immunodosage de l'antithrombine iii activee par un glycosaminoglycane, anticorps monoclonaux correspondants et leur procede d'obtention | |
| EP0339302B1 (fr) | Système de réactif pour essai immunologique du complexe de l'inhibiteur d'activeur plasminogène humain et de l'activeur plasminogène humain de tissu et trousse à cet effet | |
| FR2561661A1 (fr) | Pellicule moleculaire supportee d'un reseau de fibrine permettant la retention selective, a sa surface, de l'activateur du plasminogene tissulaire et applications en decoulant | |
| FR2586813A1 (fr) | Supports proteiques modifies aptes a immobiliser de facon reversible des anticorps ou des substances immunologiquement actives, et leurs applications au dosage et a la purification d'antigenes ou similaires. | |
| WO1986001298A1 (fr) | Procede de dosage de produits de degradation du fibrinogene | |
| FR2542871A1 (fr) | Procede de dosage en phase heterogene de substances biologiques antigeniques, mettant en oeuvre des conjugues hybrides d'anticorps et reactifs pour sa mise en oeuvre | |
| JPH07117535B2 (ja) | ヒトプロテインｓに免疫学的測定方法、それに用いる測定試薬及びキット | |
| JPH0774805B2 (ja) | タンパク質分解性劣化に対するポリペプチドフラグメントの安定化 | |
| GUNDLACH | Conformational Changes in Chymotrypsin Detected with Antibodies, I. Antibody Response to Diisopropylphosphoryl-chymotrypsin | |
| JPH03200066A (ja) | 活性化ヒトプロテインｃの測定方法 | |
| JPH10185916A (ja) | 前駆型ペプチドの測定法 | |
| JPS6222064A (ja) | 第８因子凝固活性抗原の測定方法 | |
| FR2740223A1 (fr) | Procede de determination d'auto-anticorps revelateurs de complications pathologiques ; dans le serum sanguin, en particulier de diabetiques | |
| JPS63151856A (ja) | ヒトプロテインｓに対するモノクローナル抗体を用いた免疫学的測定試薬及びキット | |
| FR2769093A1 (fr) | Procede in vitro d'evaluation des risques thrombotiques par dosage du fibrinogene plasmatique | |
| FR2798469A1 (fr) | Procede de recherche in vitro d'une anomalie du fibrinogene |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| ST | Notification of lapse |