FR2508486A1 - Methode de dosage immuno-enzymatique et trousse pour sa mise en oeuvre - Google Patents

Abstract

METHODE DE DOSAGE IMMUNO-ENZYMATIQUE ET TROUSSE POUR SA MISE EN OEUVRE. METHODE DE DOSAGE IMMUNO-ENZYMATIQUE POUR DETERMINER LA PRESENCE OU LA QUANTITE D'UNE SUBSTANCE DANS UN MILIEU POUVANT LA RENFERMER. CETTE METHODE COMPORTE LES ETAPES SUIVANTES: A.MELANGER LE MILIEU AVEC UN CONJUGUE CONSISTANT EN LADITE SUBSTANCE LIEE A UN ANTICORPS SUSCEPTIBLE D'ACTIVER UNE ENZYME SENSIBLEMENT INACTIVE, AVEC UN ANTICORPS OU UNE PROTEINE LIANTE SPECIFIQUE POUR LADITE SUBSTANCE ET AVEC UN EXCES DE LADITE ENZYME SENSIBLEMENT INACTIVE, LESDITS COMPOSES ETANT AJOUTES DANS UN ORDRE TEL QUE LADITE ENZYME N'EST PAS MELANGEE AVEC LE CONJUGUE TANT QUE LADITE SUBSTANCE N'A PAS ENCORE EU L'OPPORTUNITE DE REAGIR AVEC L'ANTICORPS OU LA PROTEINE LIANTE SPECIFIQUE POUR LADITE SUBSTANCE, ET B.AJOUTER UN SUBSTRAT POUR LADITE ENZYME ET DETERMINER L'ACTIVITE DE LADITE ENZYME. APPLICATION AU DOSAGE D'HORMONES, DE PROTEINES, DE VITAMINES, DE POISONS, DE DROGUES OU DE METABOLITES DE CELLES-CI CONTENUS DANS DES LIQUIDES BIOLOGIQUES.

Description

La présente invention est relative à une

méthode de dosage immuno-enzymatique pour déterminer la pré-

sence ou la quantité d'une substance dans un milieu pouvant

la renfermer, ainsi qu'à une trousse pour sa mise en oeuvre.

Diverses techniques de dosage immuno- enzymatique sont connues et comprennent des méthodes selon lesquelles une enzyme est liée à un anticorps ou un antigène, dont la présence doit être mise en évidence Les méthodes de dosage immuno-enzymatique, et notamment les méthodes de dosage

immuno-enzymatique homogène,sont passées en revue dans la de-

mande de brevet GB-A N O 2 043 245 Cette demande concerne un dosage immuno-enzymatique homogène dans lequel une enzyme et un inhibiteur irréversible pour cette enzyme sont présents, cet inhibiteur irréversible étant conjugué à un analogue d'un

coordinat pour être mis en évidence et le conjugué étant capa-

ble de réagir avec l'enzyme pour former des liaisons covalentes qui modifient la structure de l'enzyme inhibant ainsi de façon irréversible l'activité de cette enzyme Une protéine liante pouvant être liée à un coordinat pour être mise en évidence et le coordinat conjugué sont aussi présents,le conjugué étant inactif qoeardil est IE à a protéine liante La quantité de oeordinat àmette en évid ence a une influence sur la liaison entre le conjugué et la protéine liante, agissant par conséquent sur l'action que le conjugué a sur l'activité de l'enzyme L'activité de l'enzyme est alors mesurée et, comparée avec l'activité quand aucun coordinat

n'est présent et la quantité de coordinat présente déterminée.

Les lettres FEBS volume 16, juillet 1980, pages 285-288 décrivent également un tel système mais en plus suggèrent plusieurs autres systèmes immuno-enzymatiques homogènes basés sur des principes semblables Cependant ils ne font l'objet d'aucun exemple Il est suggéré qu'un tel système peut impliquer l'utilisation d'un activateur d'enzyme, tel qu'un anticorps

pour la P-galactosidase d'E coli sauvage.

La présente invention est relative à une nouvelle technique immunoenzymatique homogène pour déterminer la quantité de substance supposée être présente, qui est basée sur l'activation d'une enzyme inactive, le degré d'activation

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de l'enzyme étant dépendant de la quantité de substance présente.

En conséquence,la présente invention fournit une mé-

thode pour déterminer la présence ou la quantité de substance dans un milieu soupçonné en contenir qui comprend les étapes suivantes: a) mélanger le milieu avec un conjugué consistant en la subs- tance liée à un anticorps susceptible d'activerune enzyme sensiblement inactive, avec un anticorps ou protéine liante spécifique pour cette substance et avec un excès d'enzyme sensiblement inactive, ces composants étant ajoutés dans un ordre tel que l'enzyme n'est pas mélangée avec le conjugué tant qu'aucune substance dans le milieu n'a eu la possibilité de réagir avec l'anticorps ou la protéine liante spécifique pour cette substance; b) ajouter un substrat de l'enzyme et déterminer l'activité de

l'enzyme.

Selon un mode préféré de réalisation, la pré-

sente invention fournit une méthode pour déterminer la présence ou la quantité d'une substance dans un milieu soupçonné en contenir,qui comprend les étapes suivantes

a) ajouter le milieu à un mélange d'un anticorps ou d'une pro-

téine liante spécifique pour la substance et d'un excès d'une enzyme sensiblement inactive; b) ajouter un conjugué consistant en cette substance liée à un

anticorps susceptible d'activer l'enzyme sensiblement inacti-

ve,

c) ajouter un substrat pour cette enzyme et déterminer l'activi-

té de celle-ci.

Selon un autre mode de réalisation préféré, la présente invention fournit une méthode pour déterminer la

présence ou la quantité d'une substance dans un milieu soupçon-

né en contenir qui comprend les étapes suivantes: a) mélanger ensemble le milieu avec un conjugué consistant en cette substance liée à un anticorps susceptible d'activer une enzyme sensiblement inactive; b) ajouter un anticorps ou une protéine liante spécifique pour cette substance; c) ajouter un excès d'enzyme sensiblement inactive, et

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d) ajouter un substrat pour l'enzyme et déterminer l'activité

de celle-ci.

De préférence, l'anticorps susceptible d'ac-

tiver l'enzyme sensiblement inactive est un anticorps monocloral.

L,:anticorps ou la protéine liante spécifique pour la substance est susceptible de se Lier à la substance

quand celle-ci n'est pas conjuguée ou est conjuguée à l'anti-

corps activant Quand l'anticorps ou la protéine liante spéci-

fique pour la substance est liée au conjugué, alors celui-ci entraîne une diminution de l'activité de l'enzyme ce qui est observé Avantageusement, l'anticorps a été purifié selon les

techniques habituelles, par exemple par fractionnement-impli-

quant la précipitation par le sulfate d'ammonium et une chroma-

tographie en colonne sur une cellulose échanguse d'io" Avantageu-

sement, l'anticorps purifié ne contient sensiblement aucune autre

protéine, c'est-à-dire contient moins de 10 %n d'autres protéines.

De préférence, un autre anticorps susceptible

d'activer l'enzyme sensiblement i nactive est mélangé avec l'en-

zyme avant d'ajouter ce dernier à tout autre ingrédient.

Par enzyme sensiblement inactive il faut en-

tendre une enzyme telle qu'un mutant inactif de 3-galuctosidase

qui a moins de 10 %h, de préférence moins de 5 % et avantageuse-

ment moins de 1 % d'activité que la même enzyme activée Avan-

tageusement une telle forme mutant de P-galactosidase est pré-

parée en cultivant une souche mutante de E Coli.

Il a été trouvé qu'un nombre de types de -

galactosidase sensiblement inactive produite en cultivant des souches mutantes de E Coli ne sont pas stables Il a également été trouvé qu'un nombre de types de P-galactosidase sensiblement

inactive produisent un bruit de fond important, c'est-à-dire pro-

duisent une réaction de couleur, quand elles sont mélangées

avec une substance hors de la présence d'un anticorps activant.

En conséquence les galactosidases sensiblement inactives conve-

nant pour la méthode selon la présente invention sont celles qui sont stables (c'est-à-dire qui conservent leur aptitude

a être activées pendant plusieurs mois et catalysent une réac-

tion qui est linéaire pendant beaucoup de minutes) et ne pro-

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duisent pas un bruit de fond significatif Un type particulié-

rement approprié de 3-galactosidase est celle produite par la souche d'E Coli (WM 298), Allele; lac oba 627 obtenue par le Docteur W Messer, Institut Max Planck, Ihnerstrasse 63-73 1-Berlin 33 (DAHLEM). L'anticorps monoclonal activant utilisé dans la technique est avantageusement une immunoglobuline entière bien que des fragments d'immunoglobulinepuissent être également utilisés L'anticorps ou la protéine liante spécifique pour la substance à doser est de préférence un anticorps polyclonal à haut titre ou un anticorps monoclonal spécifique pour cette substance.

La présente invention est relative à des mé-

thodes convenant particulièrement pour déterminer des substances dans des liquides biologiques tels que du sérum, du plasma, du liquide rachidien et de l'urine Les substances pouvant être déterminées et dosées par la méthode selon la présente invention comprennent les hormones, les protéines, les vitamines, les

poisons, les drogues ou les métabolites de celles-ci Les métho-

des selon la présente invention sont particulièrement appropriées pour détecter des substances ayant une importance médicale De telles substances comprennent les stéroïdes, les vitamines, les protéines et les fragments de protéines, l'acide folique,la sérotonine, les prostaglandines, l'adrénaline, la noradrénaline, les opiates, la théophylline, la dilantine, les barbituriques, les antibiotiques aminoglucosides, l'acyclovir et les agents

antiviraux De préférence la substance est une drogue anti-épi-

leptique, un antibiotique, un agent anti-viral, une hormone

ou une protéine Il a été trouvé que cette méthode convient par-

ticulièrement pour doser l'hydantofne diphényle, la cortisone, l'acyclovir, le fibrinogène et le produit D de dégradation

du fibrinogène Il est considéré comme particulièrement sur-

prenant et avantageux que les méthodes selon la présente invention

conviennent pour détecter des substances de haut poids molàcu-

laire, c'est-à-dire entre 10 000 et 1 000 000 telles que des

protéines ou des fragments de protéines.

La substance à doser doit normalement être

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présente à une concentration à 1 nanomolaire, avantageusement à une concentration supérieure à 40 nanomolaire dans le cas de la cortisone, à une concentration supérieure à 250 nanomolaires dans le cas d'acyclovir,à une concentration supérieure à 10 micromolaires dans le cas de la diphényl-hydantoine et à une

concentration supérieure à 60 nanomolaires dans le cas du fi-

brimogène et du produit D de dégradation du fibrinogène.

Le conjugué consistant en la substance et l'anticorps susceptible d'activer l'enzyme sensiblement inactive

doit être préparé selon des méthodes conventionnelles bien con-

nues de l'homme de l'art La substance doit être liée à un anti-

corps par des groupes conventionnels de liaison Pour le corti-

sol, l'acyclovir et la diphényl-hydantoîne, une méthode convenant particulièrement est d'introduire une fonction acide carboxylique dans ces coordonats suiviepar une conversion en

l'ester de N-hydroxy succinimide qui lie facilement les fonc-

tions appropriées des anticorps monoclonaux; pour le produit D

de la dégradation du fibrinogène une méthode convenant particu-

lièrement est d'introduire des groupes thiols dans le fragment D et des résidus maléimide dans l'anticorps monoclonal puis de retirer le groupe protecteur des restes thiol et de mélanger

les deux protéines pour faciliter le couplage D'autres métho-

des de conjugaison acceptables sont recensées par Kabakoff dans Enzyme Immunoassay C R C Press, Editeur E T Maggio, 1980

71-104.

Le dosage selon la présente invention doit être normalement réalisé en milieu liquide aqueux, à un p H compris entre 5 et 10 et de préférence à un p H de 7,4 environ Le dosage est commodément arrêté en faisant monter le p H à environ 10 et en ajoutant un agent séquestrant pour le magnésium, tel que

l'E D T A, et un agent lipidique solubilisant, tel que le cho-

late de sodium ou le disoxycholate de sodium De préférence

un alcanol ou un polyol est présent dans le mélange liquide aqueux.

Le méthanol, l'éthane-diol, le propane 1,2 -diol, le mannitol, le sorbitol et le D-arabitol conviennent particulièrement pour être ajoutésau milieu liquide aqueux De façon surprenante il a été trouvé que le D-arabitol à la fois augmente la sensibilité

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du dosage et diminue la durée nécessaire pour réaliser ce dosage, selon un mécanisme distinct et complémentaire de celui selon lequel le méthanol agit La température du milieu liquide durant la mise en oeuvre de la méthode selon la présente invention doit être normalement comprise entre 10 et 450 C et doit de pré- férence être de 370 C. Il doit être évident pour l'homme de l'art que la durée (période d'incubation) doit être suffisante pour

permettre aux réactions immunologiques appropriées de se pro-

duire, c'est-à-dire la réaction de l'anticorps ou de la protéine liante spécifique pour la substance avec le conjugué et avec la

substance dans le milieu, si elle est présente, et aussi de per-

mettre à l'enzyme d'atteindre son niveau d'activité normale.

Les moments précis auxquels il est nécessaire de réaliser des incubations, sont fonction des circonstantes particulières du

dosage, par exemple l'ordre d'addition des réactifs, mais l'in-

cubation doit toujours avoir lieu avant l'addition du substrat.

L'homme de l'art doit être apte à juger si une étape particuliè-

re d'incubation convient.

La substance, le conjugué, l'enzyme et les anticorps sont normalement solubles dans le milieu dans lequel la méthode est réalisée Le substrat peut être ou ne pas être soluble dans le milieu mais de préférence il est soluble dans le milieu Dans certains cas il peut être souhaitable de fournir un substrat synthétique qui n'est pas soluble ou d'utiliser un

substrat naturel insoluble.

De préférence, un excès d' immunoglobuline nor-

male, par exemple de l'immunoglobuline normale de mouton est

ajoutée lors du dosage selon la présente invention pour neutra-

liser l'effet d'anticorps accidentellement présents dans le mi-

lieu qui pourraient réagir avec les anticorps susceptibles d'ac-

tiver l'enzyme sensiblement inactive.

Des formes mutantes de 5-galactosidase sont

connues pour contenir un groupe thiol essentiel à leur activité.

Quand de telles enzymes sont utilisées dans les dosages selon

la présente invention, le dithiolthreitol ou un réactif simi-

laire doit être normalement ajouté afin de prévenir l'oxy-

dation du groupe thiol Des agents préservateurs appropriés,tels

quel'azothydrure de sodium, peuvent être facilement et avanta-

geusement ajoutés lors du dosage selon la présente invention.

Dans la méthode selon la présente invention

il y a compétition entre la substance à doser, si elle est pré-

sente, et le conjugué consistant en la substance et un anticorps susceptible d'activer l'enzyme sensiblement inactive pour

lier ce conjugué à l'anticorps spécifique ou à la protéine li-

ante Comme le niveau d'activation de l'enzyme dépend du degré exact de liaison entre le conjugué et l'anticorps spécifique ou la protéine liante, de ce fait l'activité de l'enzyme de

l'échantillon dépend de la quantité de substance dans l'échan-

tillon. La manière de doser l'activité de l'enzyme peut être modifiée en fonction des nécessités Avantageusement les mesures spectrophotométriques ou fluométriques peuvent être

faites pour déterminer le niveau d'activité de l'enzyme.

Les conjugués consistant en la substance à

déterminer liée à l'anticorps susceptible d'activer l'enzyme sen-

siblement inactive sont nouveaux et constituent un autre aspect

important de la présente invention.

La présente invention concerne également une trousse comprenant: Réactif 1: anticorps spécifique pour la substance à analyser mélangé à une enzyme sensiblement inactive Réactif 2: conjugué Réactif 3: substrat de l'enzyme

Réactif 4: réactif d'arrêt.

Le réactif 1 comprend un anticorps susceptible d'activer l'enzyme sensiblement inactive L'enzyme sensiblement inactive est une forme mutante de 3-galactosidase dans lequel

cas le réactif 1 comprend du dithiothreitol ou un réactif simi-

laire pour empêcher l'oxydation du groupe thiol contenu dans la Pgalactosidase De préférence le réactif 1 comprend aussi

une immunoglobuline normale et avantageusement une immunoglo-

buline normale de mouton Les réactifs 1 et 2 contiennent un

polyol et de préférence le D-arabitol.

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Le réactif 2 renferme une immunoglobuline

normale et de préférence une immunoglobuline normale de mouton.

De préférence le réactif 3 contient un alca-

nol tel que le méthanol L'agent d'arrêt est un mélange de-p H tampon élevé, d'un agent séquestrant pour le magnésium et d'un agent lipidique solubilisant Le p H tampon comprend un hydroxyde de sodium dans du glycocolle, l'agent séquestrant est de l'EDTA et l'agent lipidique solubilisant est le cholate de

sodium La préparation des compositions de la présente in-

vention et l'opération de dosage sont décrits ci-dessous.

Purification de l'enzyme.

Des souches d'E Coli qui ont produit un mutant de 3-galactosidase activable comme décrit par Melchers et Messer(Enr J Biochm 17 ( 1970), 267)se sont développées sur un milieu de sels minéraux supplémenté par du succinate de sodium et de la thiamine (Fowler, J Bactérial 112 ( 1972), 856) Une autre souche A 324-5 décrite par Fowler

(ci-dessus) a été cultivée pour produire un type sauvage des f-

galactosidase enzymatiquement active.

Les bactéries ont été récoltées par centrifuga-

tion et conservées au froid Après décongélation et traitement

aux ultra-sons, la P-galactosidase et ses diverses formes mu-

tantes activables ont été purifiées par les techniques classiques

de chromatographie tellesque décrites par Craven et al (J Biol.

chem 240 ( 1965), 2468) et par Tenu et al (Eur J Biochem 20 ( 1981) 363) La chromatographie par affinité pourrait être aussi utilisée mais présente les désavantages de milieux de colonnes

de synthèse chers et de faibles capacités Dans une purifica-

tion typique, 30 litres de milieu de croissance bactérien ont été récoltés, les bactéries ont été alors traitées aux ultra-scnset

la suspension centrifugée On a obtenu environ l litre de sur-

nageant contenant toute la protéine de P-galactosidase des

bactéries et l'enzyme a été partiellement purifiée et concen-

trée en recueillant ce qui précipite entre 15 % et 45 % de

saturation avec du sulfate d'ammonium Après dialyse ou fil-

tration sur gel, l'enzyme a été envoyée dans une colonne de

DEAE-cellulose et élevée avec un gradient Des fractions prove-

nant de la colonne DEAE combinant l'enzyme ont été recueillies

et envoyées directement dans une colonne de DEAE-Sepharose CLUB.

L'élution avec un gradient a produit de 500 à 1000 mg de 5-

galactosidase homogène La colonne d'hydroxylapatite pourrait être remplacée sans perte d'efficience par une colonne de

Sephacryl S 300.

Les enzymes purifiées ont été conservées pendant plusieurs mois sans perte d'activité enzymatique réelle ou potentielle ou les mettant en suspension dans une solution

tampon de sulfate d'ammonium saturé à 5 O contenant du mercapto-

éthanol ou tout autre agent protecteur sulfhydryle.

Production de l'anticorpso

Des souris ont été immunisée avec une -

gal ctosidase purifiée de type sauvage, et les méthodes sui-

vantes ont été mises au point par Kolher et Milshein (Eur J. Immunol, 6, ( 1975) 511) Leurs rates ont été amalgamées avec une lignée cellulaire de myélome Les cellules amalgamées ont été cultivées in vitro dans des plateaux multi-places et les solutions surnageantes ont été examinées pour des anti-corps

anti-3-galactosidase qui ont activés les enzymes mutantes inac-

tives autrement Les cellules issues des places qui produisent les anticorps désirés, ont été clrées répétitivement par la

méthode de dilution limitante Les cellules d'anticorps mono-

clonaux ont ainsi été établies et cultivées comme requis soit in vitro en utilisant la culture de tissu soit in vivo dans

les cavités péritonéales de souris pour donner un liquide asci-

tique Les anticorps ont été purifiés à partir des milieux de culture ou du liquide ascitique par chromatographie sur une

cellulose échangeuse d'ions.

Quatre lignées de cellules produisant des an-

ticorps ont été établies et numérotées BG-18,BG-19,BG-79 et BG-

81; l'imm oglobuline produite par ces lignées quand elle est mélangée avec une enzyme mutante purifiée et inactive, procure une activité pgalactosidase L'anticorps de la lignée BG-79 a montré une propriété spéciale; quand il est mélangé avec un anticorps provenant d'une autre des trois cellules et ajouté à une enzyme mutante inactive, il a été trouvé que l'activité de l'enzyme était augmentée de façon synergique procurant une activité plus grande que celle attendue en faisant la somme de celle de chacun des anticorps utilisés séparément L'activité peut être augmenté par utilisation du méthanol, de l'éthane-diol, du propane-l,2 diol ou d'autres produits renfermant la fonction hydroxyle; et en outre par un mécanisme différent, des alcools de sucre, en particulier le sorbitol et le mannitol et plus

particulièrement par le D-arabitol.

La synergie observée et l'effet du méthanol ajouté est montré au tableau I.

T A B L E A U

I Activation de l'enzyme type-295 Anticorps par BG-79 BG-81 BG-18 BG-19 Sans méthanol 7,6 +

0,86 +

12,5 +

1,0 + 0,16 0,04 0,03 0,01 Avec 10 % de méthanol 4,6 + 0,2 + 32 +

0,88 +

0,4 0,004 0,25 0,003

BG-79 + BG-81

BG-79 + BG-19

BG-79 + BG-18

BG-18 + BG-19

d'anticorps est d'enzyme/minute P-D-galactoside L'activité de l'enzyme en présence d'un excès exprimée en moles de o-nitrophénol/n mole

et est déterminéeen utilisant le o-nitrophénol-

comme substrat.

On peut se procurer les anticorps monochlonaux BG-18, BG-19, BG-79 et BG81 auprès de Wellcome Diagnostics,

Dartford, Angleterre.

Préparation de l'anticorps, L'anticorps monoclonal, conservé sous la

forme d'une poudre lyophylisée, a été rehydratée, puis frac-

28 + ,9 +

42,5 +

1,2 0,2 0,5 46 +

16,9 +

93,5 +

1,8 0,1 3,5 u.il 2508486 tionnée par précipitation avec du sulfate d'ammonium saturé

à 50 % Après mise en suspention et filtration sur gel du pré-

cipité recueilli, l'anticorps monoclonal est mis dans une colonne de DE AE-cellulose ou Procion-3 B substituée Bio-Gel DE à p H 7,0 dans 10 m M d'un tampon phosphaté L'anticorps élevé est de faire homogène et est obtenu avec un rendement de 45 mg

d'anticorps pour 10 ml de poudre lyophylisée mise en suspension.

L'anticorps monochlonal purifié a été substi-

tué par traitement avec un ester de N-hydroxysuccinimide ou tout autre dérivé actif du coordinat en question Pour le cortisol

une concentration optimale de 10 molécules de N-Lortisol-21-

hémisuccinyl)-succinimide est nécessaire pour réagir avec chaque molécule d'anticorps purifié pendant 16 à 20 heures dans un tampon contenant 10 % de diméthylformamide, du phosphate et un sel à p H 7,4 L'anticorps substitué est précipité par un sulfate d'ammonium saturé à 70 % et, après lavage et mise en

suspension dans du sulfate d'ammonium saturé à 70 %, et centri-

fugation au moins deux fois, toute trace de cortisol-21-hémi-

succinate autre que celui lié à la protéine est enlevée par filtration sur gel Le produit est dilué de façon appropriée

et conservé gelé, bien que la lyophylisation puisse être uti-

lisée à la place.

Pour la diphényl-hydantoine, on fait réagir

molécules de l'ester du N-hydroxysuccinimide dela 3-(N-carboxy-

méthyl)-diphényl-hydantoine avec chaque molécule d'anticorps purifié pendant 16 heures à la température ambiante ( 20 C) dans

un tampon de p H 7,4 contenant O,01 M de phosphate et un sel.

L'anticorps substitué est séparé de la 3-(N-carboxyméthyl)-

diphényl-hydantoine par filtration sur gel en utilisant une colonne de Biogel P 10, de 200 à 400 mesh utilisant 6 ml de volume de lit avec 1 ml d'échantillon et avec la colonne

équilibrée avec 0,15 M de Saline Pour le fibrinogène et le pro-

duit D de dégradation du fibrinogène, on fait réagir la protéine purifiée ou le fragment D avec l'anhydride S-acétyl mercapto

succinique de façon à y inclure les groupes protégés thiol.

On fait réagir l'anticorps monoclonal avec le 4-(N-maléimido-

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méthyle)cyclohexane-l-carboxylate de succinimidyle pour y in-

tr Qduire des radicaux maléimides.

Pour le couplage les groupes protégés thiol dans le fibrinogène ou le fragment D ont été soumis au traitement par 25 m M de l'hydroxylamine à p H 7 pendant 1 heure à la tempé- rature ambiante, la protéine thiol ou le fragment D ont été alors mélangés avec l'anticorps monochlonal-maléimide Après

* couplage pendant une nuit, le conjugué est traité par du mer-

captoéthanol pour bloquer les restes maléimides en excès puis par du Néthyl maléimide pour bloquer les groupes thiol en excès; le conjugué est alors purifié par chromatographie sur Sepharose Cl-4 B pour l'anticorps du fibrinogène ou Sephacryl S-300 pour l'anticorps du fragment D, les premières protéines éluées étant

seules utiles.

Pour l'acyclovir agent antiviral, de nom chi-

mique 9-( 2-hydroxy-éthoxyméthyl)guanine, on fait réagir 10 molécules d'ester de N-hydroxysuccinimide de succinyl acyclovir avec chaque molécule d'anticorps purifié pendant 16 heures à la température ambiante ( 20 C) dans un tampon de p H 7,4 contenant 0,01 M de phosphate et un sel L'anticorps substitué est séparé despetites molécules libres par filtration sur gel en utilisant une colonne de Biogel P-10, de 200 à 400 mesh utilisant 6 ml de volume de lit avec 1 ml d'échantillon et avec la colonne

équilibrée par 0,15 M de sel.

Protocole d'un dosaqe type-immuno-enzymatique.

EXEMPLE 1: Dosage du cortisol.

On mélange 50 (-m d'un échantillon d'urine ou de sérum supposé contenir de O à 1000 piccmoles de cortisdl avec 1 picomole d'un anticorps conjugué monochlonal-cortisol BG-79, avec 60 picomoles de Ig G purifiée d'un antisérum agissant contre

le cortisol dans 20 p et 50 p de 2 m M de 8 anilino-l-naphty-

lène-sulfonate de sodium (p H 7,6) Après incubation pendant minutes à 37 C, on ajoute environ 1 picomole de l'enzyme P-galactosidase activable déjà mélangée avec 130 nanomoles de dithiothréitol et avec 20 picomoles d'un second anticorps activant non substitué BG-81, avec 200 e d'un substrat à 7 m M

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de o-nitrophényl-g-D-galactoside dans un tampon phosphate à

m M, p H 7,4 contenant 10 o/ de méthanol On continue l'incuba-

tion pendant 30 minutes supplémentaires puis on lit et relève la densité à 420 nm, la réaction étant arrêtée avec 1 ml de 0,4 M de carbonate de sodium contenant 10 % de sulfoxyde de sodium ou d'un autre solvant organique ou de 1 % de désoxycholate de sodium Des témoins ont été préparés sur une gamme appropriée,

et aussi des blancs (sans anticorps anti-cortisol et sans anti-

corps substitué) pour chaque échantillon.

Les résultats ont été regroupés dans le ta-

bleau II ci-après.

T A B L E A U II

Courbe d'étalonnage du cortisol Cortisol présent D O 420 (pmoles)

0 0,68

0,95

1,07

1,12

40 1,18

1,21

1,25

1000 1,36

EXEMPLE 2:

Dosage de la diphénylhydantoine.

On mélange 25 M 1 d'un échantillon de sérum supposé contenir de 0,5 à 2,5 nmoles de diphénylhydantoine avec 4 picomoles d'un anticorps monochonal de diphénylhydantoine BG-79 conjugué dans 25 1 et 900 picomoles d'Ig G purifiée dans

25 c d'un antisérum agissant contre la diphénylhydantoine.

Les tubes ont été soumis à une incubation à 37 C et on a ajouté 6 picomoles de l'enzyme 3-galactosidase activable déjà mélangé avec 500 nanomoles de dithiothréitol et 20 picomoles d'un second

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anticorps non substitué activant B 6-81 Puis on a ajouté 200 r 1 d'unsubstrat d'o-nitrophényl-3-D-galactoside 7 m M dans l O Om M d'un tampon phosphaté (p H 7,4) pour obtenir un volume total d'incubation de 325 1 l L'incubation a été poursuivie à 37 C pendant 15 minutes, puis la réaction a été stoppée avec 1 ml de 0,2 M de carbonate de sodium contenant 1 % de dioxycholate de sodium et la densité optique a été lue à 420 nm Des témoins de diphénylhydantoine ont été préparés sur la gamme appropriée de 5 à 20 g/ml de sérum, ainsi que des blancs (sans anticorps anti-phénytoine et sans anticorps conjugué hydantoine diphényle) pour chaque échantillon On a regroupé les résultats dans le tableau Ilci-après

T A B L E A U III

Courbe d'étalonnage de la diphénylhydantoine Diphénylhydantoîne DO 420 n DO 420 nm (pg/ml)

O 0,175

0,225

0,241

20 0,247

témoin:sans anticorps 0,328 témoin:sans conjugué 0,074

EXEMPLE 3

Dosage du produit D de dégradation du fibrino-

gène.

On a mélangé à la température ambiante 10 el d'un échantillon de sérum supposé contenir de 0,6 à 24 picomoles du fragment D avec 20 el du réactif 1 et on a laissé réagir pendant 5 minutes Puis on a ajouté 20 u 1 du réactif 2 et on a commencé l'incubation à 37 C pendant 10 minutes Puis ona ajouté 500 Il de substrat et l'incubation à 37 C poursuivie pendant minutes; la réaction a alors été arrêtée par addition de 100 f 1 d'un réactif d'arrêt et la densité optique de la solution lue à 420 nm Des témoins du fragment D ont été préparés sur la gamme appropriée de 5 à 200 ag/ml de sérum Les réactifs utilisés et

2508486

les résultats obtenus sont regroupés respectivement dans les

tableaux I Vet V ci-après.

T A B L E A U IV

Réactif pour le dosage du produit D de dégra-

dation du fibrinogène.

Réactif 1: 15 mg/ml d'anti-fragment D du mouton (immunoglobuli-

ne purifiée) 520 el 250 m M de dithiothréitol dans 1 ' eau 400 1

1,9 mg/ml Monoclonal 81 (immu-

noglobuline purifiée) 400 1 D(+) arabitol 300 mg/ml, 1 mg/ ml d'immunoglobuline de mouton normale dans un tampon 2680 e 1

Enzyme 12 e 1 de 20 mg de sus-

pension dans le sulfate d'am-

monium dans 12 m M de dithio-

thréitol, 1 mg/ml d'immunoglo-

buline de mouton normale dans un tampon 4000 e 1 Réactif 2: (Conjugué du fragment D-Ig G monoclonal: 800 Pl

300 mg/ml d'arabitol, 1 mg/ml d'immuno-

globuline de mouton normale dans un tampon 7,200 1 l

Tampon utilisé pour Réactif 1 et 2 et substrat.

m M Très m M de chlorure de sodium m M de chlorure de magnésium 1 m M EDTA p H 7,5 Substrat 2,5 mg/ml d'O-nitrophényl -P-galactoside dans un tampon contenant 2,5 moles de méthanol Agent d'arrêt: 2 M de glycocolle Réactif: 200 m M EDTA 0,2 % de cholate de sodium

p H ajusté à 10,1 avec de la soude.

T A B L E A U V

Courbe d'étalonnage du produit D de dégradation du fibrinogène Fragment D D 420 nm D.O 42 Onm Pg/kl

O 0,404

0,409

0,412

0,426

65 0,464

0,548

0,566

EXEMPLE 4:

Dosage du fibrinogène.

On a mélange 20 el d'un échantillon de sérum supposé contenir de O à 3 mg/ml du fibrinogène avec 20 1, 260 ug/ml de Ig G purifiéeà partir d'un antisérum agissant contre le fibrinogène 20 el du conjugué Ig G fibrinogène ( 79), D 0280 nm + 0,22 ont été ajoutés, puis 20 pl d'un mélange d'enzyme, ( 6 e 1 d'une suspension d'enzyme dans le sulfate d'ammonium, 100 el de 10 mg/ml de dithiothréitol, 1 ml de 250 m M d'un tampon tris avec 1 ml d'anticorps monoclonal B 6-81 élevé en flacon) Les solutions mélangées ont été soumises à une incubation à 37 C

pendant 5 minutes, puis on a ajouté 200 el de O-nitrophényl-3-

galactoside 7 m M dans du tampon trié à 10 % de méthanol L'in-

cubation à 37 e C a été poursuivie pendant 20 minutes, puis la

réaction a été arrêtée avec 500 ml de 0,4 m M de carbonate de so-

dium contenant 1 % de disoxycholate de sodium Des témoins ont été préparés pour la gamme appropriée ainsi que des blancs sans anticorps monoclonal substitué pour chaque témoin Les résultats

ont été regroupés dans le tableau VI ci-après.

U 1

17 2508486

T A B L E A U VI

Courbe d'étalonnage du fibrinogène Fibrinogène DD 420 nm 420 nm (mg/ml)

0 0,518

0,031 0,626

0,063 0,667

0,125 0,769

0,25 0,892

0,50 0,953

1,0 1,102

EXEMPLE 5.

Dosage d'acyclovir.

Des sérums supposés contenir de 10 à 100 picomoles d'acyclovir ont été dilués quatre fois avec un tampon, puis un échantillon de 10 e 1 a été mélangé à la température ambiante avec 20 Pl d'un Réactif A, la réaction a duré 5 minutes Puis on a ajouté 20 V 1 d'un Réactif B, l'incubation à la température ambiante continuant pendant 10 minutes On a ajouté 500 el de

substrat préchauffé à 37 C et l'incubation a eu lieu au bain-

marie à 37 C pendant 5 minutes; la réaction a alors été stoppée par addition de 100 el d'un agent d'arrêt et la densité optique lue à 420 nm Des témoins d'acyclovir ont été préparés pour la

gamme appropriée de 1 à 10 e M dans le sérum Les réactifs uti-

lisés et les résultats obtenus sont groupés respectivement dans

les tableaux VII et VIII ci-après.

T A B L E A U VII

Réactifspour le dosage d'acyclovir Réactif A. Liquide ascitique contenant des anticorps AC/AI No 2, anti-acyclovir monoclonal 250 m M dithiothréitol dans 800 1 l d'eau 200 1,9 mg/ml de monoclonal 81 (immunoglobuline) purifiée) 200 I D(+) Arabitol 1,2 g

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Enzyme, 10 mg/ml en suspension dans le sulfate d'ammonium dans 12 m M de dithiothréitol 12 el Tampon 3000 Réactif B. Conjugué d'acyclovir-Ig G monoclonal à 20 ug/ml dans un tampon avec 0,1 mg/ml d'immunoglobuline de mouton normal

Tampon utilisé pour les réactifs A et B et le substrat.

m M Tris 25 m M de chlorure de sodium m M de chlorure de magnésium 1 m M EDTA

p H ajusté à 7,5 par de l'acide chlorhydrique.

Substrat. 2 mg/ml de 0-nitrophényl-3-D-galactoside dans un tampon

contenant 2,5 moles de méthanol.

Agent d'arrêt.

2 M Glycocolle m M d'EDTA 0,2 % de cholate de sodium p H ajusté à 10,1 par de la soude

T A B L E A U VIII

Courbe d'étalonnage d'acyclovir Acyclovir DO 420 éM (double dosage)

0 0,329

0,345

2,5 0,391

0,395

0,569

0,575

7,5 0,645

0,629

0,675

0,665

Claims (14)

REVENDICATIONS

1. Méthode pour déterminer la présence ou la quan-

tité d'une substance dans un milieu susceptible d'en contenir, caractérisée par le fait qu'elle comprend les étapes suivantes: a) mélanger le milieu avec un conjugué consistant en ladite

substance liée à un anticorps susceptible d'activer une en-

zyme sensiblement inactive, avec un anticorps ou une protéine liante spécifique pour ladite substance et avec un excès de ladite enzyme sensiblement inactive, lesdits composés étant

ajoutés dans un ordre tel que ladite enzyme n'est pas mélan-

gée avec le conjugué tant que ladite substance n'a pas en-

core eu l'opportunité de réagir avec l'anticorps ou la protéine liante spécifique pour ladite substance, et

b) ajouter un substrat pour ladite enzyme et déterminer l'acti-

vité de ladite enzyme.

2. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes, a) ajouter ledit

milieu à un mélange d'un anticorps ou d'une protéine liante spé-

cifique pour ladite substance et de ladite enzyme sensiblement inactive; b) ajouter un conjugué de ladite substance liée à un anticorps capable d'activer ladite enzyme sensiblement inactive, et

c) ajouter un substrat pour ladite enzyme et déterminer l'acti-

vité de ladite enzyme.

3 Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes: a) mélanger ledit milieu avec un conjugué consistant en ladite substance liée à un anticorps capable d'activer ladite enzyme sensiblement inactive, et avec un anticorps ou une protéine liante spécifique pour ladite substance; b) ajouter un excès de ladite enzyme sensiblement inactive, et

c) ajouter un substrat pour ladite enzyme et déterminer l'acti-

viter de ladite enzyme.

4. Méthode selon l'une quelconque des revendica-

tions 1 à 3, caractérisée en ce que ledit anticorps capable d'ac-

tiver ladite enzyme sensiblement inactive est un anticorps monoclonal 1

5. Méthode selon l'une quelconque des revendica-

tions 1 à 4, caractérisée en ce qu'un autre anticorps capable d'activer ladite enzyme sensiblement inactive est mélangé avec ladite enzyme avant qu'elle soit ajoutée à un des autres composés.

6. Méthode selon l'une quelconque des revendica-

tions 1 à 5, caractérisée en ce que ladite enzyme sensiblement inactive est une forme mutante de P-galactosidase qui a moins

de 1 % d'activité 3-galactosidase quand elle est activée.

7 Méthode selon la revendication 6, caractéri-

sée en ce que ladite forme mutante de 3-galactosidase est

préparée par culture d'une souche mutante d'E Coli.

8. Méthode selon l'une quelconque des revendica-

tions 1 à 7, caractérisée en ce que ladite substance à doser est une drogue anti-épileptique, un antibiotique, un agent

antiviral, une hormone ou une protéine.

9. Méthode selon l'une quelconque des revendica-

tions 1 à 8, caractérisée en ce que ledit dosage est réalisé à un p H de 7,4 environ en présence d'un alcanol ou d'un polyol à une température comprise entre 10 et 450 C.

10. Méthode selon l'une quelconque des revendica-

tions 1 à 9, caractérisée en ce qu'elle est réalisée en présence

de D-arabitol.

11. Méthode selon l'une quelconque des revendica-

tions 1 à 10, caractérisée en ce qu'elle est réalisée en pré-

sence de méthanol.

12. Méthode seion l'une quelconque des revendica-

tions 1 à 11, caractérisée en ce que ledit dosage est arrêté par variation du p H jusqu'à obtenir un p H de l'ordre de 10 et par addition d'un agent séquestrant pour le magnésium et un

agent lipidique solubilisant.

13. Conjugué consistant à la substance à déter-

miner, telle que définie dans une quelconque des revendications

précédentes, liée à un anticorps susceptible d'activer une

enzyme sensiblement inactive.

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14. Trousse pour la mise en oeuvre de la méthode

selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisée

en ce qu'elle comprend: un réactif 1: anticorps spécifique pour la substance à analyser mélangé avec ladite enzyme sensiblement inactive. un réactif 2: conjugué consistant en ladite substance liée à un anticorps capable d'activer ladite enzyme sensiblement inactive; un réactif 3: substrat pour ladite enzyme sensiblement inactive;

un réactif 4: agent d'arrêt.