UA73940C2 - Спосіб одержання біологічно активної молекули - Google Patents
Спосіб одержання біологічно активної молекули Download PDFInfo
- Publication number
- UA73940C2 UA73940C2 UA2001117751A UA2001117751A UA73940C2 UA 73940 C2 UA73940 C2 UA 73940C2 UA 2001117751 A UA2001117751 A UA 2001117751A UA 2001117751 A UA2001117751 A UA 2001117751A UA 73940 C2 UA73940 C2 UA 73940C2
- Authority
- UA
- Ukraine
- Prior art keywords
- cleavage
- caspase
- biologically active
- site
- protease
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 24
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims abstract description 74
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims abstract description 73
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims abstract description 35
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims abstract description 34
- 108090000426 Caspase-1 Proteins 0.000 claims abstract description 22
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims abstract description 19
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims abstract description 19
- 102100035904 Caspase-1 Human genes 0.000 claims abstract description 18
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims abstract description 16
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 7
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims abstract 7
- 102000011727 Caspases Human genes 0.000 claims description 36
- 108010076667 Caspases Proteins 0.000 claims description 36
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 claims description 27
- 102000004091 Caspase-8 Human genes 0.000 claims description 23
- 108090000538 Caspase-8 Proteins 0.000 claims description 23
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 21
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 claims description 20
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims description 15
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 11
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 10
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims description 9
- 108010013369 Enteropeptidase Proteins 0.000 claims description 6
- 102100029727 Enteropeptidase Human genes 0.000 claims description 6
- 108090000787 Subtilisin Proteins 0.000 claims description 5
- 241000430519 Human rhinovirus sp. Species 0.000 claims description 4
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 claims description 3
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 claims description 3
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 claims description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 claims description 2
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 claims 2
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 claims 1
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 claims 1
- 102000003810 Interleukin-18 Human genes 0.000 abstract description 15
- 108090000171 Interleukin-18 Proteins 0.000 abstract description 15
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 66
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 33
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 32
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 28
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 27
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 26
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 23
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 20
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 20
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 18
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 17
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 17
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 17
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 17
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 17
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 13
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 12
- 239000000047 product Substances 0.000 description 12
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 10
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 10
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 9
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 9
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 9
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 9
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 8
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 8
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 7
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 7
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 7
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 7
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 6
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 6
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 6
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 6
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 6
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 5
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 5
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 5
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 5
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 244000019459 Cynara cardunculus Species 0.000 description 4
- 235000019106 Cynara scolymus Nutrition 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 235000016520 artichoke thistle Nutrition 0.000 description 4
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 4
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 4
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 4
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 4
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 4
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 3
- 238000011537 Coomassie blue staining Methods 0.000 description 3
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 3
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 3
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 3
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 3
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 3
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 3
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 3
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 3
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 3
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 description 3
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 description 2
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 108010062466 Enzyme Precursors Proteins 0.000 description 2
- 102000010911 Enzyme Precursors Human genes 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 125000000570 L-alpha-aspartyl group Chemical group [H]OC(=O)C([H])([H])[C@]([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 2
- GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N Leupeptin Natural products CC(C)CC(NC(C)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- 241000183024 Populus tremula Species 0.000 description 2
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 2
- 229960004405 aprotinin Drugs 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N aspartic acid group Chemical group N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 108091092328 cellular RNA Proteins 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 2
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N leupeptin Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(C)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 2
- 108010052968 leupeptin Proteins 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 2
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- 108010091212 pepstatin Proteins 0.000 description 2
- FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N pepstatin A Chemical compound OC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CC(C)C FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N 0.000 description 2
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 108010051152 Carboxylesterase Proteins 0.000 description 1
- 102000013392 Carboxylesterase Human genes 0.000 description 1
- 108010062580 Concanavalin A Proteins 0.000 description 1
- 235000019750 Crude protein Nutrition 0.000 description 1
- 102000005927 Cysteine Proteases Human genes 0.000 description 1
- 108010005843 Cysteine Proteases Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 108010063907 Glutathione Reductase Proteins 0.000 description 1
- 102100036442 Glutathione reductase, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 102000004457 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241001562081 Ikeda Species 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108010093965 Polymyxin B Proteins 0.000 description 1
- 108010040201 Polymyxins Proteins 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000003782 apoptosis assay Methods 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000005889 cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 230000004940 costimulation Effects 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- -1 for example Proteins 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000014828 interferon-gamma production Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000001865 kupffer cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000005497 microtitration Methods 0.000 description 1
- 230000001617 migratory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- UPSFMJHZUCSEHU-JYGUBCOQSA-N n-[(2s,3r,4r,5s,6r)-2-[(2r,3s,4r,5r,6s)-5-acetamido-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)-6-(4-methyl-2-oxochromen-7-yl)oxyoxan-3-yl]oxy-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-3-yl]acetamide Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](NC(C)=O)[C@H](OC=2C=C3OC(=O)C=C(C)C3=CC=2)O[C@@H]1CO UPSFMJHZUCSEHU-JYGUBCOQSA-N 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000002957 persistent organic pollutant Substances 0.000 description 1
- 229920000024 polymyxin B Polymers 0.000 description 1
- 229960005266 polymyxin b Drugs 0.000 description 1
- 230000000861 pro-apoptotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005522 programmed cell death Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 229960000856 protein c Drugs 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000012134 supernatant fraction Substances 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6472—Cysteine endopeptidases (3.4.22)
- C12N9/6475—Interleukin 1-beta convertase-like enzymes (3.4.22.10; 3.4.22.36; 3.4.22.63)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
- C07K14/545—IL-1
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Steroid Compounds (AREA)
Abstract
Згідно зі способом одержують біологічно активну молекулу з її біологічно неактивного попередника мутацією його нативної ділянки розщеплення каспазою-1 з утворенням ділянки, що розщеплюється протеазою, і розщепленням мутованої молекули з одержанням біологічно активної молекули, причому біологічно активна молекула являє собою цитокін, зокрема IL-1β та IL-18.
Description
Опис винаходу
Даний винахід головним чином відноситься до одержання біологічно активних молекул, які існують у вигляді 2 неактивних попередників і іп мімо розщеплюються протеазами з одержанням зрілих біологічно активних молекул.
Конкретніше, винахід відноситься до одержання каспаз і цитокінів, які продукуються іп мімо з відповідних попередників саморозщепленням, розщепленням іншими каспазами або розщепленням, наприклад, протеазою каспазою-1, також відомою як інтерлейкін-1-перетворюючий фермент (ІСЕ). Прикладами цитокінів, які продукуються подібним чином, служать інтерлейкін-1р і інтерлейкін-18.
Каспази являють собою сімейство цистеїнових протеаз, які розщеплюють свої білок-мішені за залишком Азр.
З одинадцяти описаних каспаз каспаза-1ї і, можливо, каспази -4, -5 і -11, як передбачається, насамперед залучені до процесінгу протизапальних цитокінів, тоді як інші відіграють вирішальну роль в ініціації і виконанні апоптозу, або запрограмованій клітинній загибелі. Каспази мають декілька спільних рис, в тому числі, те, що вони синтезуються у вигляді каталітично неактивних зимогенів, що активуються головним чином розщепленням після специфічних внутрішніх залишків Агр, присутніх у міждоменних лінкерах, а також, здатність розщеплювати свої субстрати після залишків Авр. У результаті, деякі зрілі активні каспази, особливо, отримані з каспаз з довгим продоменом, можуть процесувати і активувати самих себе і інші неактивні зимогени каспаз.
Засновуючись на первинній структурі, проапоптотичні каспази можна розділити на два класи: клас І, що включає каспази -2, -8, -9 ії -10, які містять довгий М-кінцевий продомен, і клас ІІ, що включає каспази -3, -6 і -7 з коротким або відсутнім продоменом. Експерименти по розщепленню іп міго кажуть про те, що каспази ІЇ класу вимагають для свого протеолітичного процесінгу наявності активованих каспаз | класу (12).
Інша класифікація каспаз розділяє їх за специфічністю ділянки розщеплення |13)|. Тут каспази | групи містять консенсусну ділянку УУЕНО (каспази -1, -4 і -5), каспази ІІ групи - консенсусну ділянку ЮОехО (каспази -2, -3 і -7), а каспази І групи - консенсусну ділянку ((М)ЗЕХО (каспази -6, -8 і -93. Оптимальною ділянкою с 29 для каспази-В є ЕТО 1141. Ге)
Інтерлейкін-18 (ІІ--18), спочатку описаний як інтерферон-у (ІЕМ-у)-індукуючий чинник, являє собою нещодавно охарактеризований цитокін, що має спільні структурні риси з сімейством білків 1-1 (1-4). І/-18 спочатку був виділений і згодом клонований з печінки мишей, що отримували оброблені теплом Ргоріопорасіегішт аспез (Р.аспез), з подальшим введенням ліпополісахариду (ГР) |2, 5)Ї. Також нещодавно описане клонування о 3о людського ІІ -18 ЗІ. Й
Як і 11-12, 1-18 продукується активованими макрофагами, такими як купферовські клітини печінки та інші немігруючі макрофаги ІЗ). 1-18 є раннім індуктором відповіді Тй1, костимулює продукцію ІРМ-у, ТМЕ-у, Ф гранулоцитарно-макрофагального колонієстимулюючого фактора і 1/-2 |6) У доповнення, він посилює (зе) з проліферацію Т-клітин, викликану антитілами проти СОЗ, і підвищує клітинну цитотоксичіність, зумовлену М природними кіллерами, шляхом збільшення експресії Раз-ліганду |б, 71.
На відміну від більшості інших цитокінів, що демонструють структуру, згорнену в чотири спіралі, 1-18 і 1 -1рД мають р-складчасту листову структуру І7). Подібно 1-1р, 1-18 синтезується у вигляді біологічно неактивного попередника (ргоіЇ-18), позбавленого сигнального пептиду |З). Попередники І1-1р їі 1-18 розщеплюються « каспазою 1 (І.-1р-перетворюючий фермент, або ІСЕ), який розщеплює після залишку аспарагінової кислоти в шщ с позиції Р1. Утворені зрілі цитокіни легко вивільняються з клітини |8, 9). Дослідження на мишах, дефіцитних у ц відношенні каспази-ї, продемонстрували важливу роль зрілого І/-18 як індуктора ІЕМ- у і відповідей. ТН1. ,» Ін'єкція таким мишам Р.аспев і ГР5 приводила до низьких рівнів циркулюючого ІРМ-у у порівнянні з мишами дикого типу |8, 9). Ін'єкція ІІ-18 відновлювала І Рз-індукований рівень ІЕМ-у у мишей, дефіцитних за каспазою-1 |9), що служить подальшим підтвердженням уявлення про те, що каспаза-1 залучена до продукції активного - І/-18. Інші каспази, особливо ті, що розщеплюють внутрішньоклітинні білки, асоційовані з апоптозом, були с принаймні у 100 разів менш активні, ніж каспаза-1 (9). Подібні дослідження з ІІ - АЗ-дефіцитними мишами виявили його роль у активності МК-клітин і індукції цитокінів (101. се) Рекомбінантний 1-1р і мишачий 1-18, експресований у БЕ.соїї, можуть бути піддані рефолдінгу з їх 50 одержанням повністю активних цитокінів. Спроби експресувати зрілу форму людського ІІ -18 у Е.соїї або в інших живителях не призвели до одержання повністю активного цитокіну. Внаслідок його потенційного терапевтичного «2 використання, наприклад, при злоякісних новоутвореннях або у будь-яких умовах, коли бажана індукція продукції інтерферону-у, виникає потреба у створенні ефективної системи експресії для продукції зрілого, біологічно активного людського І/-18. 59 Даний винахід дозволяє отримувати молекули, які в процесі їх формування у природі продукуються у формі
ГФ) біологічно неактивного попередника і стають активними після розщеплення їх попередника. Останнє не може бути легко здійснене іп міго. о Даний винахід, таким чином, відноситься до способу продукції біологічно активної молекули з її біологічно неактивного попередника мутацією її нативної ділянки розщеплення з одержанням ділянки, чутливої до 60 розщеплення звичайною протеазою, і розщепленням мутантної молекули з одержанням біологічно активної молекули.
У переважному випадку, біологічно активна молекула представляє каспазу або цитокін, більш переважно вибраний з ІІ-1р і 1-18.
У даних цитокінах переважною нативною ділянкою розщеплення є ділянка розщеплення каспази-1. бо Звичайна протеаза, залучена для розщеплення, може бути вибрана з тромбіну, ентерокінази, субтилізину,
гененази (депепазетм; Мем Епдіапа Віоіїарз, Вемепу МА, ОБА), протеази людського ріновірусу ЗС і протеази фактора Ха. Коли для розщеплення залучається каспаза, переважною є каспаза-8.
Спосіб, що застосовується у переважному здійсненні даного винаходу, включає трансфекцію клітин вектором, що містить ДНК, яка кодує попередник біологічно активної молекули, мутований у його ділянці розщеплення, культивування трансфікованих клітин і виділення біологічно активної молекули після обробки протеазою.
Необов'язково спосіб може бути вдосконалений тим, що здійснюють злиття кКДНК в рамку зчитування після послідовності, що кодує глутатіон-З-трансферазу (551), і експресовані молекули злиття перед обробкою 7/0 протеазою затримують на гранулах глутатіон-агарози.
Даний винахід також описує КДНК, що кодує мутантний попередник біологічно активної молекули, яку при бажанні піддають злиттю з послідовністю, що кодує 51.
У одному здійсненні даний винахід відноситься до способу одержання і/або очищення рекомбінантного гібридного поліпептиду, або білка злиття. Точніше, фрагмент ДНК, що кодує молекулу білка, підлягає злиттю з 75 фрагментом ДНК, що кодує зв'язуючий білок з використанням як лінкерної послідовності ДНК, що кодує пептидну послідовність, яка розпізнається і розрізається каспазою. ДНК злиття включають до складу вектора клонування, який використовується для трансформації відповідних клітин. Після експресії гібридний поліпептид очищують за допомогою контакту з лігандом або субстратом, до якого володіє специфічною афінністю зв'язуючий білок, наприклад, афінною хроматографією.
У переважному здійсненні даного винаходу зв'язуючим білком служить О5Т, а ділянка розщеплення являє собою ділянку розщеплення каспази-8.
Винахід також відноситься до біологічно активних молекул, отриманих вищеописаним способом.
Експресія зрілого ІЇ/-18 у Е.соїї веде до виникнення білка, позбавленого біологічнії активності. Подальші спроби провести правильний рефолдінг поліпептидного кістяка 1/-18, експресованого у Е.соїії, були с безуспішними. Людський 1-18 і людський 1І.-1р експресуються іп мімо як їх попередники ргоїІ-18 і ргоїІ-1 Д, які розщеплюються каспазою-1 з одержанням біологічно активних зрілих 1І--18 і 1-1 р, відповідно. Однак, каспаза-1 о комерційно не доступна. Даний винахід відноситься до простого способу одержання біологічно активних молекул у Е.соїї, зокрема, цитокіну і, більш конкретно, людського ІЇ/-18. З цією метою конструювали кДНК, що кодує людський ргоіІЇ-18, в якому ділянка розщеплення каспазою-ї мутована з утворенням ділянки розщеплення (ав) комерційно доступним білком, наприклад, фактором Ха. Для спрощення маніпуляцій мутантну кДНК рго!І-18 піддавали злиттю з послідовністю, що кодує глутатіон-З-трансферазу (551). Отриманий білок злиття З о5Т-ргоІЇ-18, що містить ділянку розщеплення фактором Ха, експресували у Е.соїї і зв'язували на гранулах (Ге) глутатіон-агарози. Зрілий людський І/-18, що виявляє високу біологічну активність, вивільняли з гранул обробкою фактором Ха. о
Схожим чином в послідовності ДНК, що кодує людський ІІ-1р, ділянку розщеплення каспазою-1 мутували з ч- утворенням ділянки розщеплення фактором Ха. Для спрощення маніпуляцій мутантну кКДНК ргоїЇ-1 Д піддавали злиттю в рамку зчитування з послідовністю, що кодує глутатіон-5-трансферазу (5Тт). Отриманий білок злиття оеТ-ргоїЇ-1р, що містить ділянку розщеплення фактором Ха, експресували у Е.соїї і зв'язували на гранулах « глутатіон-агарози. Зрілий людський 1ІІ-1Д вивільняли з гранул обробкою фактором Ха.
Коли для розщеплення застосовували каспазу-8, виконували схожу процедуру, з тією різницею, що ділянку в с розщеплення каспазою-1 людського 1-18 або людський ІЇ/-1 ДЗ мутували з утворенням ділянки розщеплення
Із» каспазою-8. Згодом, злиття з послідовністю, що кодує О51, і подальші стадії процедури проводили, як описано вище.
На Фігурі 1 проілюстроване клонування кДНК, що кодує мутантний людський ргої!-18 (ргоіЇ-181єсв). Цю кКДНК клонували у три стадії РОК з використанням методу праймерів, що перекриваються. Доріжки являють собою: М, і маркери розмірів ДНК, відмічені з лівого боку; 1, ДНК довжиною у 498нп, отримана у першій РСК; 2, ДНК оз довжиною у 551нп, отримана у другій РСК; 3, ДНК довжиною у бООнп, отримана у третій РОК і кодуюча людський ро! -18 єсв. о На Фігурі 2 показана структура експресуючої плазміди роОЕХ-рго-ІЇ-18ієсєвк. (а) Фланкуючі нуклеотидні «їз» 20 послідовності Ватні/ЕсовВ. | фрагменту кКДНК довжиною у бООнп, що кодує людський ргоїЇ-18|рєсв. Сайти рестрикції Ватн І і Єсок І, а також ділянка скріплення фактора Ха показані дужками. Незафарбованою стрілкою с відмічена ділянка розщеплення фактором Ха. (Б) Схематичне представлення рОоЕХ-2ТК. Також показані сайти рестрикції. Зафарбованою стрілкою позначена ділянка лігування ВатнН І/ЕЄсок І у вставці.
На Фігурі З показаний 505-РАСЕ грубих білкових екстрактів Е.соїї, що експресує білок злиття 29 е5Т-РргоЇЇ-18|єсв. Доріжки являють собою: 1. Клітини, трансформовані початковою плазмідою рОЕХ-2ТК без
ГФ) індукції. 2. Клітини, трансформовані початковою плазмідою рОЕХ-2ТК і індуковані 01мММ ізопропіл-тіогалактозиду (ІРТО). Очікувана смуга (2бкДа) глутатіонтіоредуктази (551) позначена стрілкою о зліва. Доріжкам 3-7 відповідають клітини, трансформовані плазмідою роОЕХ-ргої!-181єсв і неіндуковані (доріжка 3) або індуковані ІРТО протягом позначеного часу. Смуга (43кДа), помічена стрілкою праворуч, 60 відповідає розміру білка злиття (з5Т-ргої! -18/єсв.
На Фігурі 4 показаний 5О5-РАСЕ (1095 акриламід) білка злиття З5Т-ргоІЇ/-18 рок після очищення на глутатіон-агарозі. Супернатант оброблених ультразвуком бактерій (див. Фігуру 3, доріжку 7) піддавали афінному очищенню на глутатіон-агарозі. Доріжки являють собою: 1. маркери молекулярної маси (відмічені в кДа з лівого боку); 2. Афінно очищений О5Т-ргоїЇ -18 | єсв. Гель забарвлювали кумасі блакитним. бо На фігурі 4 показаний 5О5-РАСЕ (12965 акриламід) очищеного людського ІІ-18. Білок злиття З5Т-ргої! -181єсв затримували на гранулах глутатіон-агарози і інкубували з фактором Ха як протеазу у співвідношенні з субстратом 1/50 (мас/мас); супернатант аналізували через бгод. Доріжка 1, маркери молекулярної маси, поміченої в кДа з лівого боку; доріжка 2.
Людський ІІ -18 у супернатанті від гранул глутатіон-агарози. Гель забарвлювали кумасі блакитним.
На Фігурі 6 показане дослідження біологічної активності людського ІЇ/-18. Людський ІЇ/-18 в позначених дозах додавали до культур, що не прилипають до пластику мишачих спленоцитів (5х10Уклітин/ямка), У присутності конканаваліну А (0,125мкг/мл) і поліміксину В (мкг/мл). Супернатант досліджували на предмет наявності інтерферону-гамма за допомогою ЕГІ5А. Рівень інтерферону-гамма, індукований 1-18 (1О0Онг/мл) у 70 Відсутності Соп А, становив 1бОпг/мл.
На Фігурі 7 показана у схематичній формі процедура очищення ПІ -18 з використанням каспази 8.
На Фігурі 8 показана послідовність З5Т-рго-ПІЇ-18, сто. Рамкою відмічена ділянка розщеплення каспазою-8.
Підкреслена послідовність представляє зрілий ПІЇ-18.
На фігурі 9 показаний забарвлений кумасі блакитним ЗО5-РАСЕ (1095 акриламідний гель), що відображає 75 очищення білка злиття 51-рго-пІЇ-18 |рєтр она глутатіон-агарозї. Супернатант зруйнованих клітин рекомбинантної Е.соїї ОМ109, що експресує О5Т-рго-ПІЇ-18)єтро афінно очищали на глутатіон-агарозі і обробляли каспазою-8 на твердій фазі. Супернатант, отриманий після обробки, концентрували і розділяли за розмірами молекул на Зирегаех-75. Доріжки являють собою: 1. Маркери молекулярної маси (позначена в кДа з лівого боку); 2. Супернатант зруйнованих клітин; 3. Афінно очищений О5Т-рго-ПІЇ-18і тр; 4. Глутатіон-агарозна смола після твердофазної обробки каспазою-8 протягом 4год.; 5. Концентрований результат обробки каспазою-8 протягом 4год.; 6. Фракція чистого ПІІ -18 з З ирегдех-75.
Згідно з даним винаходом, отримана кДНК, що кодує людський ргоіІЇ/-18, в якому ділянка розщеплення каспазою-1 мутована з утворенням ділянки фактора Ха. Можна використати інші мутації з утворенням ділянок, відповідних для інших протеаз. Га
Приклади можливих.ділянок розщеплення і відповідних протеаз включають:
Геи-МаІ-Рго-Ага-Сіу-Зег (ЗЕБО ІО МО:1), послідовність, що розщеплюється між амінокислотами Аг і Су і9) протеазою тромбіном.
Пе-Сін-Сту-Аго- (ЗЕО ІЮ МО:2), послідовність, що розщеплюється після залишку Агу протеазою фактором Ха.
Авр-Азр-Авзр-Іуз- (5БО ІО МО:3), послідовність, що розщеплюється після залишку Гуз протеазою ав! ентерокіназою.
Нів-Туг- (ЗЕО ІЮ МО:4), послідовність, що розщеплюється після залишку Туг протеазою субтилізином у його М варіанті Сепепазетм (Мем Епдіапа Віоіарвз). Ге»!
Туг-Нів- (5БЕО ІЮ МО:5), послідовність, що розщеплюється після залишку Туг протеазою субтилізином у його варіанті Сепепазетм (Мем Епдіапа Віоіарвз). о
Геи-СіІи-МаІ--еи-Рпе-СіІп-сСІу-Рго (ЗЕ ІО МО:б), послідовність, що розщеплюється після залишку біп - протеазою людського ріновірусу ЗО.
Подібним чином, отримана кКДНК, що кодує людський ргоіЇ-1р, в якому ділянка розщеплення каспазою-1 мутована з утворенням ділянки фактора Ха. Можна використати інші мутації з утворенням ділянок, відповідних « для інших протеаз.
Приклади можливих ділянок розщеплення і відповідних протеаз включають: - с Пе-Сін-Сту-Аго- (ЗЕО ІЮ МО:2), послідовність, що розщеплюється після залишку Агу протеазою фактором Ха. м Авр-Азр-Авзр-Іуз- (5БО ІО МО:3), послідовність, що розщеплюється після залишку Гуз протеазою я ентерокіназою.
Геи-СіІи-МаІ--еи-Рпе-СіІп-сСІу-Рго (ЗЕ ІО МО:б), послідовність, що розщеплюється після залишку біп протеазою людського ріновірусу ЗС. - Вибір мутації залежить від наступних параметрів: ділянка розщеплення, утворена мутацією, повинна бути с дуже специфічною, щоб уникнути небажаного розщеплення в інших ділянках поліпептидного кістяка ргої!-18 або ргої/-1р; протеаза повинна виявляти високий рівень специфічності відносно сконструйованої ділянки се) розщеплення; протеаза повинна бути легко доступна, наприклад, з комерційних джерел; і мутація не повинна їх 20 викликати великі зміни у вторинній або третинній структурі ргоіЇ-18 або ргоіЇ/-1р. Використання фактора Ха, ентерокінази або субтилізину є переважним перед іншими протеазами, оскільки отримані в результаті ІІ -18 або ме, І/-1д не мають мутованих амінокислот. Використання фактора Ха найбільш переважно, оскільки воно вимагає найбільш консервативних мутацій, таким чином знижуючи ризик зміни вторинної або третинної структури рго!І/-18 або ргоіЇ/-1р і ризик того, що розщеплення не буде мати місце. Використання фактора Ха або ентерокінази є 25 переважним перед іншими протеазами, оскільки отримані в результаті І/-18 або І/-13 не мають мутованих
ГФ) амінокислот. 7 Для того, щоб сконструювати кКДНК, що кодує людський мутантний ргої!-18 (ргоіЇ-18/єсв), В якому ділянка розщеплення каспазою-1 мутована з утворенням ділянки розщеплення фактором Ха, в кКДНК людського ргої!-18 вводили наступні мутації: І 33І; 53505 і ЮЗ6К. Ці мутації склали послідовність І(ЕСК, що розпізнається фактором бо Ха.
Вектор, що експресує людський ргоіЇ!-181єсв, конструювали таким чином. Мононуклеарні клітини периферичної крові (РВМО) здорового донора стимулювали бактерійним ліпополісахаридом (ІРБ5). З клітин виділяли загальну РНК. РНК піддавали оберненій транскрипції, і отриману ДНК використовували як шаблон у полімеразній ланцюговій реакції (РСК). Мутацію вводили у послідовність з використанням праймерів, що бо перекриваються в три стадії РОК (Фіг.1). Отриманий продукт РСК довжиною у бООнп, що кодує мутантний людський ргоіЇ/-18, клонували у клонуючий вектор ТА (рОЕМ-Т еазу, Рготеда), і послідовність його ДНК підтверджували ДНК-секвенуванням. Отриману плазміду РОЕМ-Т-ргоіІЇ-18 (єсв розщеплювали Есок | і Ватн і, ї фрагмент довжиною бООнп, що кодує людський ргоїіЇ-18(1єсв, субклонували у прокаріотичному експресуючому векторі РОЕХ-2ТК, що містить послідовність гена 51 (Рпатасіа). Отриманий експресуючий вектор, що містить послідовність гена людського ргої!-18/єсв, піддавали злиттю в рамку зчитування до 3'-кінця гена 51 (Фіг.2).
Потім проводили експресію і очищення с5Т-ргоІЇ/-18 ієсвк. Свіжу одиничну колонію Е.соїї УМ109, трансформовану плазмідою роєМ-Т-ргоІЇ-181єсєю6, вирощували при струшуванні при 372С до досягнення оптичної щільності 0,6 при бООнм. Потім експресію білка індукували.ізопропілтіогалактозидом (ІРТО) і 70 Культивували далі при 372С протягом Згод. За допомогою 50О5-РАСЕ загального бактеріального білка була виявлена індукція білка масою 4ЗкДа, за розмірами відповідного З5Т-ргої! -18 (єсов (Фіг.3). Усі подальші стадії виділення 5Т-ргоІЇ-18 ск проводили при 42С. Бактерії збирали центрифугуванням, ресуспендували. у фосфатно-сольовому буфері (РВ5З), що містить інгібітори протеаз. Бактерії лізували обробкою ультразвуком, додавали Ттіоп Х-100 до кінцевої концентрації 195, і змішували очищений лізат з гранулами глутатіон-агарози 75 (РНпапгтасіа). Гранули відмивали, і аналізували їх аліквоту за допомогою 5О5-РАСЕ. При цьому була виявлена єдина смуга на 4ЗкДа, відповідна білку злиття З5Т-ргоїІ-18/єсв (Фіг.4). Гранули потім обробляли фактором Ха і збирали супернатант. ЗО5-РАСЕ супернатанту характеризувався великою смугою приблизно на 18кДа, що узгоджувалося з очікуваною масою зрілого людського ІІ -18. Крім того, спостерігалася додаткова, більш слабка смуга на 19,5кДа (Фіг.5)3. Аналіз білкової послідовності смуг на 18 і 19,5кДа в обох випадках показав наявність очікуваної М-кінцевої послідовності зрілого людського І/-18. Смуга на 4ЗкДа, відповідна білку злиття О5Т-ргоіЇ/-18 їєсв, ще була присутньою на 5ЮО5-РАСЕ гранул глутатіон-агарози після їх обробки протеазою, що відображало неповне розщеплення (не показане).
Рекомбінантний людський 1І/-18 тестували у відношенні біологічної активності на мишачих спленоцитах на основі їх здатності індукувати експресію інтерферону-гамма. Інкубація не пов'язаних з поверхнею мишачих Ге спленоцитів тільки з людським 1-18 виявила малу продукцію ІРМ-гамма, що наводило на думку про необхідність (5) костимулятору. Тільки Соп А при 0,125мкг/мл не викликав індукції ІРМ-у на значущому рівні. Коли не пов'язані з поверхнею спленоцити інкубували з Соп А і 1-18, отриманим згідно з даним винаходом, досягали індукції ІЕМ-у, залежної від дози (Фіг.б).
Для того, щоб сконструювати кКДНК, що кодує людський мутантний ргої!--1 дД (ргоїС-1рієсв), В якому ділянка о розщеплення каспазою-1 мутована з утворенням ділянки розщеплення фактором Ха, у кДНК людського ргої! -1 В «ЖЕ вводять наступні мутації: М1131, М11465, НІї15К і 0116МКк. Ці мутації складають послідовність І(ЕСК, що розпізнається фактором Ха. о
Щоб сконструювати вектор, експресуючий людський ргоіЇ-1руєсв, здійснюють наступні стадії. с
Мононуклеарні клітини периферичної крові (РВМС) здорового донора стимулюють бактерійним
Зо ліпополісахаридом (І Р). З клітин виділяють загальну РНК. РНК піддають оберненій транскрипції, і отриману т
ДНК використовують як шаблон у полімеразній ланцюговій реакції (РСК) з праймерами, відповідними кодуючій послідовності людського ІЇ-1р. Отриманий продукт РОК клонують у клонуючий вектор ТА, наприклад, "РОЕМ-Т еазу' від Рготеда, і потім піддають сайт-специфічному мутагенезу відповідними олігонуклеотидами. « дю Послідовність отриманого вектора підтверджують ДНК-секвенуванням. Отриману плазміду рОєМ-Т-ргоїІ--1 Д/єсв з розщеплюють належними ферментами рестрикції, і фрагмент довжиною приблизно 82О0нп, що кодує людський с ргої-1Дуєсв; субклонують у прокаріотичному експресуючому векторі рОЕХ-2ТК, що містить послідовність гена :з» ОТ (РІаптасіа) Отриманий експресуючий вектор містить послідовність гена людського ргоїІ-1Дєсвр; підданого злиттю в рамку зчитування з 3-кінцем гена 51.
Експресію і очищення З5Т-ргоїіЇ-1 Дієсєю проводять схожим чином. Свіжу одиничну колонію Е.соїї УМ109, -І трансформовану плазмідою реєМ-Т-ргої1-1р єв вирощують при струшуванні при 372С до досягнення оптичної щільності 0,6 при бООнм. Потім експресію білка індукують ізопропілтіогалактозидом (ІРТО) і культивують далі о при 372 протягом Згод. За допомогою 5ЗО5-РАСЕ загального бактеріального білка виявляють індукцію білка (се) масою -52кДа, за розмірами відповідного 5Т-ргоіЇ-1рієсв. Усі подальші стадії виділення. 5Т-ргоїіІ-1 Дуєсв їх 50 проводять при 42С. Бактерії збирають центрифугуванням, ресуспендують у фосфатно-сольовому буфері (РВ5Б), що містить інгібітори протеаз. Бактерії лізують обробкою ультразвуком, додають Тпйоп Х-100 до кінцевої (зе) концентрації 195, і змішують очищений лізат з гранулами глутатіон-агарози (Рпаптасіа). Гранули відмивають, і аналізують їх аліквоту за допомогою 5ОЗ-РАСЕ на присутність білка злиття 5Т-ргоіЇ-1 Дуєсв масою -52кДа.
Потім гранули обробляють фактором Ха і збирають супернатант, що містить зрілий людський 1І--1рД. 59 У іншому здійсненні даного винаходу експресію і очищення поліпептиду проводять за допомогою продукції
ГФ) білка злиття, що містить ділянку розщеплення каспазою. Плазміду, що експресує зв'язуючий пептид у злитті з білком, який цікавить, можна мутувати так, що ділянка розщеплення каспазою буде введена у позиції, зручній о для очищення активного поліпептиду.
Ділянки розпізнавання каспази становлять 4 амінокислоти, останньою з яких є аспарагінова кислота. У 60 цілому каспази виявляють більш високу і відмінну від протеаз, що звичайно використовуються, специфічність ділянок розщеплення і мають значні переваги перед раніше описаними протеазами, будучи зручними для розщеплення пептидів злиття. Приклад процедури очищення наведений на Фіг.7.
Переважні ділянки розщеплення для кожної каспази описані в літературі (Апп. Кеу. Віосп. 1999). Усі вони звичайно містять залишок Агр в позиції РІ. бо Описану вище плазміду рРОЕМ-Т-ргоІЇ-184уєсєк модифікували з одержанням іншого мутантного людського рго!Ї-18 (ргоїІ-18,; сто Див. Фігуру 8), в якому ділянку розщеплення фактором Ха мутують з утворенням ділянки розщеплення каспазою-8. Це дозволяє використати для розщеплення каспазу-8.
Іншою перевагою використання каспази є її висока ефективність відносно виходу і часі розщеплення. Було
Виявлено, що при порівнянні кількості білка І/-18, отриманої від рРОЕМ-Т-ргоїіЇ -18 (єсв ії рРОЕМ-Т-ргої! -18, стр, кількість ферменту і час, необхідні для одержання 1мг ПІІ-18, зменшуються. Процедура приводить до продукції білка з очікуваним розміром (Фіг.9) і біологічною активністю.
Каспаза-8 не є єдиною застосовною каспазою, і, в залежності від наявності або відсутності ділянки розщеплення специфічною каспазою у білці, що цікавить в плані очищення, або від будь-яких інших критеріїв, 7/0 Можна використати мутації, відповідні ділянкам розщеплення будь-якою іншою каспазою.
Каспазу можна відділити від білка, що цікавить, з використанням стандартних способів очищення, таких як, наприклад, гель-фільтрація або іонообмінна хроматографія.
На закінчення, описаний тут спосіб дозволяє отримувати з Е.соїї очищені, біологічно активні людські білки, такі як І/-18 і /-дД. Виявляється, що для правильного фолдінгу цих цитокінів потрібна їх експресія 75 спочатку у формі попередників, і потім - розщеплення до їх зрілої форми.
Людський 1І/-18 у цьому відношенні відрізняється від мишачого ІЇ/-18, який може експресуватися у бактеріальних клітинах у вигляді зрілого, біологічно активного цитокіну.
Тепер винахід буде проілюстрований наступними прикладами, що не обмежують його.
Приклад 1: Конструювання плазміди, що кодує людський ргої!-18 з ділянкою Фактора Ха
РМВС отримували з периферичної крові здорового добровольця розділенням на градієнті щільності
Еісо!-Радцне РІ ОБ (РНагтасіа). Потім РМВС двічі відмивали крижаним РВ5, що містить 290 ЕВз і ресуспендували до 2,Бх10бклітин/мл у середовищі КЕРМІ-1640, доповненому фетальною бичачою сироваткою (ЕВ5), 2мММ
Ї-глутаміну, 100Од/мл пеніциліну їі 100Од/мл стрептоміцину (КРМІ-10). Культуру стимулювали ГРЗ (мкг/мл,
Згод., 3720). Загальну РНК екстрагували з клітин за допомогою ТгіРигетм |зоЇайоп Кеадепі (Воейгіпдегї с
Мапппеїт) згідно з інструкцією виробника. (5)
КДНК ргоїЇ/-181єсв конструювали шляхом тристадійної РСК з використанням методу праймерів, що перекриваються. Різні праймери створювали на основі КДНК людського ргої!-18 (Сеп-ВапкК ассезвіоп по. 049950, (39).
Для першої РСК прямим праймером був наступний: (ав) 5-ААСАТСОААООТСОТТАСТТТООСААОССТТОААТО-У (5БО ІЮО МО: 7) а оберненим праймером був « 5-СОСОААТТССТАСТСТТСОТТТТОААСАСТ-3 (ЗЕБО І МО:8). Сайт Есо КІ входив до складу оберненого праймера. Шаблоном служила піддана оберненій транскрипції загальна клітинна РНК, виділена з РВМС, (Ф) стимульованих І Р5. Умови термоциклу були наступними: 10 циклів (9422, ЗОс; 559С, ЗОс і 682С, 2хв.), після с чого слідували 25 циклів (942, ЗОс.; 5592, ЗОс. і 682, 125с./цикл). Отриманий продукт РСК довжиною 498нп ампліфікували на наступній стадії РСК, використовуючи прямий праймер, що перекривається: в. 5-ААТОАААТТТАТТОАСААТАСОСТТТАСТТТАТАССТОААСАТОАТОААААСАТСОААДОСТСОТТАСТТТО-3! (ЗЕО ІЮО МО: 9) і той же, що на попередній стадії, обернений праймер. Умови термоциклу були наступними: 30 циклів (942С, ЗОс.; 562, ЗОс. і 722С, 1хв.). Отриманий продукт довжиною 551нп ампліфікували на третій стадії «
РСК, використовуючи прямий праймер, що перекривається: 5-ССТОбАТССАТООСТСТОАДАССАСТАСІДАСАСААТТОСАТСААСТТТОТООССААТОАААТТТАТТОАС-3! З с (ЗЕО ІО МО: 10) і той же, що на попередній стадії, обернений праймер. До складу прямого праймера входив сайт "» Ватн І. Умови термоциклу були тими ж, що і на попередній стадії. Отриманий продукт РСК довжиною 0, бтис.нп " (Фіг.1) очищували за допомогою набору Нідпй Ригетм для очищення продуктів РОК (Воепйгіпдег МаппНеїт) і лігували до складу вектора РОЕМ-Т Еазу з одержанням плазміди рОєЕМ-ргоїіЇ-18 |єсвк. Продуктами лігування трансформували компетентні клітини /М109 (Рготеда Согрогайоп). Протягом усієї роботи використовували
Ше стандартні протоколи клонування |111.
Ге) Плазміду рОєМ-ргоїЇ-181єсвк перевіряли на наявність правильної вставки шляхом обробки ферментами рестрикції і ДНК-секвенування. Плазміду обробляли Ватн І і Есок І. Отриману Ватн І/Есок І ДНК, ту, що кодує ее, людський ргоїЇ-18)єсвк, піддавали електрофорезу у 1,095 агарозі, і виділяли з гелю смугу, відповідну ї» 20 Обтиснп, за допомогою ОІАдніск Се! Ехігасіоп КИ (ОІАСЕМ, Сегптапу) Цю ДНК лігували до складу експресуючого вектора рОЕХ-2ТК (РНагтасіа), який був лінеазований за допомогою Ваптн І і Есок І. Отриманою с рекомбінантною плазмідою роєЕХ-ргоїІ-181єсв (Фіг.2) трансформували штам Е.соїї )УМ109, і підтверджували послідовність отриманого вектора обробкою ферментами рестрикції і ДНК-секвенуванням.
Приклад 2: Експресія і очищення білка злиття З5Т-ргоїІ -18|1єсв 29 БОмл культури, що інкубувалась протягом ночі, з свіжої одиничної колонії Е.соїї "М109, трансформованої (ФІ плазмідою роЕХх-ргоіЇ-181єсв, розчиняли у 45О0мл середовища /В, що містить 100Од/мл ампіциліну, і вирощували при струшуванні при 3723 до досягнення оптичної щільності при бОбОнм, що дорівнює 0,6. Потім по експресію білка індукували додаванням ІРТО до кінцевої концентрації О01ММ і подальшим культивуванням протягом Згод. при 37 С. Бактерії осаджували шляхом центрифугування (5000х9, бхв., 4 22) і швидко бо ресуспендували у 1:100 від первинного об'єму крижаного фосфатно-сольового буфера (РВ5; 150мМ Масі, 1бмМ
Ма2НРО,, 4мММ МаньоРО,, рН 7,3), що містить інгібітори протеаз (лейпептин мкг/мл, пепстатин А мкг/мл, апротинін 2мкг/мл, РМ5Е 0,2мММ і ЕОТА 5мМ). Клітини лізували на льоді м'якою обробкою ультразвуком (4 імпульсами по 15с). Додавали Топ Х-100 до кінцевої концентрації 1905, і суміш тримали на льоді протягом 5хв.
Очищений від осаду лізат (14000хо, 15хв., 422) змішували з 5095 суспензією гранул глутатіон-агарози (2мл, 65 РІПаптасіа), і інкубували суміш при м'якому струшуванні при 4 9С протягом Згод. Гранули осаджували центрифугуванням (500хо, 5хв.), двічі відмивали 10 об'ємами буфера для лізису (195 Тгйоп Х-100 в РВ5), двічі - 10 об'ємами 20мМ трис-НСЇІ, рН 8,0, 150мММ Меасі і двічі - 10 об'ємами 20мММ трис-НСІ, рН 8,0, 150мМ масі, 2,0ММ Сасі» (буфер розщеплення). Усі стадії виконували при 490.
Приклад 3: Розщеплення білка злиття і очищення зрілого людського ІІ -18
Гранули глутатіон-агарози з пов'язаним білком злиття 5Т-ргоїІ-18 (єсв інкубували (бгод., 2322) з фактором
Ха (Мем Епдіапа Віоїарв) в тїмл буфера розщеплення, використовуючи протеазу у співвідношенні до субстрату 1:50 (мас./мас.), при постійному перемішуванні на ротаторі. На цій стадії звільняється зрілий людський ІІ -18.
Гранули осаджували центрифугуванням при 500хд протягом 5хв. при 4 С і відмивали 5 разів 2мл крижаного 70 РВ5. Супернатант і усі об'єми відмивання об'єднували, очищали від осаду центрифугуванням (14000ха, 15хв., 420) і концентрували шляхом ультрафільтрації (Сепігісоп-10, Атісоп). Аліквоти білка, також як і гранули до і після обробки, піддавали електрофорезу у 0,195 5005-1296 поліакриламідному гелі з подальшим забарвленням кумасі блакитним. При електрофорезі супернатанту отримали велику смугу приблизно на 18кДа, що узгоджувалося з очікуваною масою зрілого людського ІІ-18. Крім того, спостерігалася мала смуга на 19,5кДа (Фіг.5)3. При аналізі М-кінцевої послідовності білка з двох смуг отримали послідовність МЕОК....., що узгоджувалося з такою зрілого людського ІЇ-18. Очищений білок стерилізували, пропускаючи через фільтр 0,2мкм і зберігали при -7026.
Приклад 4: Дослідження біологічної активності людського ІІ -18
Активність людського ІІ-18 виявляли, як описано у |2). У короткому викладі, селезінки нормальних мишей лінії СЗН/Неу виділяли, подрібнювали і вміщували у буфер Джея (Сеу Бийег; 0,144М МН СІ у 0,017М трис-НСЇ, рН 7,2) для руйнування еритроцитів. Лейкоцити двічі відмивали КРМІ-5 і потім ресуспендували у КРМІ-10. Для одержання не прилипаючих до пластика клітин клітинні суспензії інкубували (бОхв., 3722) у 100мм пластиковьїх чашках (Весіоп ОісКіпгоп (Я. ОК). Клітини, що не собрбувались, акуратно відбирали, центрифугували і ресуспендували у КРМІ-10. Життєздатні клітини підраховували за допомогою виключаючого мертві клітини тесту с 29 . забарвлення трипановим синім, і концентрацію клітин доводили до 5Х10 ЄСклітин/мл. За допомогою цієї Ге) процедури позбувалися більшої частини неспецифічних естераза-позитивних клітин. Суспензію не прилипаючих до пластика клітин (0,15мл) вміщували у 96-ямковий плоскодонний культуральний планшет для мікротитрування (МОМСГ ОМ тм, Данія). І/-18 у різних концентраціях, поліміксин (Імкг/мл) і Соп А (0,125мкг/мл) додавали у ямки у 5Омкл КРМІ-10. Планшети інкубували протягом 24 або 48год. при 37 «С в 595 СО». Після інкубації о супернатанти збирали, і визначали титри мишачого ІЕМ-у за допомогою ЕГІЗ2А. При інкубації неприлипаючихдо Ж пластика мишачих клітин селезінки тільки з людським І/-18 виявляли малу продукцію ІЄМ- у, що вказувало на Фо необхідність костимуляції. Додавання одного Соп А у концентрації 0,125мкг/мл не індукувало значного рівня
ІЕМ-у. Коли спленоцити, що не прилипають, інкубували з Соп А і людським ІЇ-18, отриманим в даному винаході, о
Зз5 отримували залежну від дози індукцію ІРМ-у (Фіг.б). ч-
Приклад 5: Конструювання плазміди, що кодує людський ргоїІ-1р з ділянкою фактора Ха
РМВС отримували з периферичної крові здорового добровольця розділенням на градієнті щільності
Еісо!-Радцне РІ ОБ (РНагтасіа). Потім РМВС двічі відмивали крижаним РВ5, що містить 290 ЕВз і ресуспендували « до 2,5х1О0бклітин/мл у середовищі ЕРМІ-1640, доповненому фетальною бичачою сироваткою (ЕВ5), 2мММ
І-глутаміну, 100Од/мл пеніциліну і 100Од/мл стрептоміцину (КРМІ-10). Культуру стимулювали ГРБ5 (мкг/мл, - с Згод., 3722). Загальну РНК екстрагували з клітин за допомогою ТгіРигетм |зоЇайоп Кеадепі (Военгіпдег хз» Маппвеїт). Один мг загальної РНК використовували для КТ-РСК за допомогою однопробіркового тесту Тіап для КТ-РСК (Воепгіпдег Мапппеїт) згідно з інструкцією виробника.
КДНК ргоїЇ-1д клонували шляхом РОК зі смисловим і оберненим праймерами, створеними на основі кКДНК людського ргоїЇ-1р (СепВапк ассеззіоп по. М15330). Смисловий праймер відповідав нуклеотидам 87-107 - послідовності М15330, попередній ділянці розщеплення ВатнН І. Обернений праймер відповідав нуклеотидам
Га 896-876 послідовності М15330, попередній ділянці Есо КІ. Шаблоном служила піддана оберненій транскрипції загальна клітинна РНК, виділена з РВМС, стимульованих І Р5. Умови термоциклу були наступними: 10 циклів ісе) (9420, ЗОс.; 5590, ЗОс. і 682С, 2хв.), після чого слідували 25 циклів (942С, ЗОс.; 5520, ЗОс. і 6820, 125с./цикл). «їз» 20 Отриманий продукт РСК довжиною 83Онп очищували за допомогою набору НідпРигетм для очищення продуктів РСК (Воепйгіпдег Мапппеїт) і лігували до складу вектора рОЕМ-Т Еазу з одержанням плазміди с рОЕМ-ргої.-1р. Плазміду піддавали сайт-специфічному мутагенезу із застосуванням олігонуклеотиду
АСАТООСАТААСОАСОСТАТТОААСОССОООСАССТОТАСОА (5БО ІО МО: 11), відповідного нуклеотидам 405-452мМРНК людського ІІ -1р і який несе мутації 1131, М114Е,НІ1155 і 0116К.
Отриману плазміду рОєМ-ргоїЇ.-1Дуєср З одиничної колонії перевіряли на наявність правильної вставки (Ф) шляхом обробки ферментами рестрикції і ДНК-секвенування. Плазміду обробляли Ватн І і Есок І. Отриману
Ге Ватн /Єсок І ДНК, ту, що кодує людський ргоїІ-1р/єсв піддавали електрофорезу у 1,095 агаррзі, і виділяли з гелю смугу, відповідну 0,82тис.нп, за допомогою ОіІАдціскК Се! Ехігасіоп КИ (ОІАСЕМ, Септапу). Цю ДНК во лігували до складу експресуючого вектора рОЕХ-2ТК (РНагтасіа), який був лінеазований за допомогою Ватні і
ЕсокК І. Отриманою рекомбінантною плазмідою реЕХх-ргоіЇ-1ф,єсв трансформували штам Е.соїї 9ОМ109, і підтверджували послідовність отриманого вектора обробкою ферментами рестрикції і ДНК-секвенуванням.
Приклад 6: Експресія і очищення білка злиття З5Т-ргоїЇ -1Дєсе
БОмл культури, що інкубувалася протягом ночі, зі свіжої одиничної колонії Е.соїї "М109, трансформованої 65 плазмідою рОєЕХ-ргої-1р |єсв розчиняли у 450мл середовища І.В, що містить 100Од/мл ампіциліну, і вирощували при струшуванні при 372С до досягнення оптичної щільності при бООнм, яка дорівнює 0,6. Потім експресію білка індукували додаванням ІРТО до кінцевої концентрації 0,1мМ і подальшим культивуванням протягом Згод. при 3720. Бактерії осаджували шляхом центрифугування (5000х4д, 5хв., 4 С) і швидко ресуспендували у 1;100 від первинного об'єму крижаного фосфатно-сольового буфера (РВ5; 150мМ масі, 16мМ Ма»НРО,, 4мММ МанН»оРо,,
ВН 7,3), що містить інгібітори протеаз (лейпептин 1мкг/мл, пепстатин А мкг/мл, апротинін 2мкг/мл, РМБЕ 0,2ММ ії ЕОТА 5мМ). Клітини лізували на льоді м'якою обробкою ультразвуком (4 імпульсами по 15с.). Додавали Тіп
Х-100 до кінцевої концентрації 1905, і суміш тримали на льоді протягом 5хв. Очищений від осаду лізат (14000ха9, 15хв., 422) змішували з 5095 суспензією гранул глутатіон-агарози (2мл, РНпаптасіа), і інкубували суміш при м'якому струшуванні при 492С протягом Згод. Гранули осаджували центрифугуванням (500ха, 5хв.), двічі 70 відмивали 10 об'ємами буфера для лізису (195 Топ Х-100 в РВ5), двічі - 10 об'ємами 20мММ трис-НСІ, рН 8,0, 150мММ Масі і двічі - 10 об'ємами 20мМ трис-НСІ, рН 8,0, 150мМ Масі, 2,0мМ Сасі» (буфер'розщеплення). Усі стадії виконували при 4296.
Приклад 7: Розщеплення білка злиття і очищення зрілого людського 1І--1 Д
Гранули глутатіон-агарози з пов'язаним білком злиття З5Т-ргоїІ--1 р/єск інкубували (бгод., 2322) з фактором 75 Ха (Мем Епдіапа Віоіарв) у їмл буфера розщеплення, використовуючи протеазу у співвідношенні до субстрату 1:50 (мас./мас.), при постійному перемішуванні на ротаторі. На цій стадії звільняється зрілий людський 1-1 р.
Гранули осаджували центрифугуванням при 500хд протягом 5хв. при 4 С і відмивали 5 разів 2мл крижаного
РВ5. Супернатант і усі об'єми відмивання об'єднували, очищали від осаду центрифугуванням (14000ха, 15хв., 420) і концентрували шляхом ультрафільтрації (Сепігісоп-10, Атісоп). Аліквоти білка, також як і гранули до і після обробки, піддавали електрофорезу у 0,195 5005-1296 поліакриламідному гелі з подальшим забарвленням кумасі блакитним. При електрофорезі супернатанту отримували велику смугу приблизно на 17кДа, що узгоджувалося з очікуваною масою зрілого людського 1-1 Д. Очищений білок стерилізували, пропускаючи через фільтр 0,2мкм і зберігали при -7026. сч
Приклад 8: Конструювання плазміди кодуючої людський ргоіІ-18 з ділянкою розщеплення каспазою-8
Рекомбінантну плазміду рОоЕХ-рго-ІЇ-181єсв з прикладу 1 модифікували вставкою ампліфікованого шляхом (о)
РСК фрагменту ДНК з ділянкою розщеплення каспазою-8 (ЕТО). У короткому викладі, роєХ-рго-1ІЇ-18 |єсв обробляли ферментами рестрикції ВАМ НІ у позиції 951 і Ніпа І у позиції 1074, відрізаючи порцію ДНК, що містить Рго-домен, ділянку розщеплення фактором Ха (ІЕС) і три амінокислоти від М-кінця ПІЇ -18. о зо Ту ж плазміду використовували як шаблон для ампліфікації у РСК шляхом введення мутованої ділянки ГЕТО у склад розташованого нижче праймера: аїдсаАаС СТТ ОСС ААА СТА СТО ОСТ ТТ САС СТІ ТТСАТСАТС СЯ
ТТС АОС ТАТ АА (ЗЕБЕО ІЮО МО:12). Фрагмент РОК очищували з використанням набору для "одержання о високоочищеного продукту" ("Підп риге ргодисі ригіїісайоп"; Воепгіпдег Мапппеїт), після чого схожим чином нарізали за допомогою ВАМ НІ ії Ніпа ІП з одержанням вставки довжиною 12Знп. Відкритий вектор і вставку со розділяли на агарозному гелі і екстрагували з використанням комерційного набору "Уеї Зогр" (Сепотед). чн
Лігування проводили протягом ночі, використовуючи лігазу Т4 (Мем Епдіапа Віоіїарз5, Вемепу МА, СШУА), і трансформували продуктами лігування компетентні клітини Е.соїї ОНба. Виділяли і субкультивували декілька колоній і отримували препарати Міпіргер за допомогою набору "Оіадеп". Щоб секвенувати істотну частину рекомбінантної плазміди, усі препарати Міпіргер піддавали ампліфікації шляхом РСК (Регкіп ЕІтег Сепе Атр- « 20 АтріТтад ОМА роїутегаге). Остаточну трансформацію проводили на компетентних бактеріях Е.соїї УМ109, з с слідуючи способу Т55 (Спипа, СТ. еї аї. (1989) Ргос. Маї). Асад. Зсі. ОБА 86, 2172-2175).
Приклад 9: Експресія і очищення білка злиття З5Т-ргоїІ-18) єто :з» Використовуючи плазміду, сконструйовану згідно з наведеним, вище прикладом 8, експресію білка еБТ-Рго-і єто-ПІ/-18 проводили у флаконах при струшуванні і 5-літрових ферментерах по суті так само, як описано вище у прикладі 2. -І Приклад 10: Розщеплення білка злиття з використанням каспази-8 і очищення зрілого людського ІІ -18
Гранули глутатіон-агарози з пов'язаним білком злиття (5Т-рго-І.-18 |рєто інкубували (бгод. 2390) з і каспазою-8 (саІріо-спет) в їмл буфера розщеплення (описаному у прикладі 6), використовуючи співвідношення со протеаза: субстрат 1:1200 (мас./мас.), при постійному перемішуванні на ротаторі або роллері. Гранули осаджували центрифугуванням при 500хд протягом бхв. при 4 «С і відмивали 5 разів 2мл крижаного РВ5. т- Супернатант і усі об'єми відмивання об'єднували, очищували від осаду центрифугуванням (14000ха, 15хв., 420) о і концентрували шляхом ультрафільтрації (Сепігісоп-10, Атісоп). Концентровану після обробки суміш розділяли за розмірами молекул на Зирегдех-75 (Рпагтасіа), щоб відділити ПІ/-18 (18кДа) від високомолекулярних продуктів розщеплення і протеолітичного ферменту, що залишився (гетеродимер каспази-8, 29кКДа, і
Ггетеротетрамери, 58кДа).
У різних фракціях Зирегдех-75 аналізували ферментну активність каспази-8 з використанням набору для
Ф, аналізу каспази-8 і флуорогенного субстрату Ас-ІЕТО-АМС (ВІОМОЇ), і ця активність спостерігалася у фракціях, ко відповідних молекулярній масі 55кДа (відповідних гетеротетрамеру каспази-8); так було показано, що каспаза-8 дуже добре відділилася від фракцій, що містять ПІІ -18 (17кДа). во Фракції після гель-фільтрації, що містять високоочищений ПІІ -18 масою 18кДа, об'єднували, концентрували на Сепігісоп-10 (Атісоп), в кінці стерилізували, пропускаючи через 0,22мкм фільтр, і зберігали при -8096.
Аліквоти білка, також як і гранули до і після обробки, піддавали електрофорезу у 0,196 5005-1290 поліакриламідному гелі з подальшим забарвленням кумасі блакитним (Фіг.9). При електрофорезі фракції супернатанту спостерігали смугу на 18кДа, що узгоджувалося з очікуваною масою зрілого людського ІІ -18. 65 Аналіз фракції гранул показав, що не відбувається повного розщеплення, оскільки на гранулах залишився пов'язаний білок-попередник. Більш того у фракції гранул залишилася деяка кількість розщепленого ІІ -18.
Приклад 11: Дослідження біологічної активності людського І/-18, отриманого шляхом розщеплення каспазою-8
Активність людського 1-18 оцінювали, як описано |10). У короткому викладі, клітини КО-1 культивували у
ОМЕМ, що містить 20956 ЕВ5. Для аналізу 1-18 клітини КО-1 ресуспендували у концентрації 1,2 х105бклітин/мл (25О0мкл/ямка, 48-ямковий планшет) і стимулювали ттТМЕ ос (Іпподепеййсв) разом з ПІІ-18 у різних концентраціях (декілька розведень, починаючи з 8Онг/мл). Планшет інкубували протягом 24год. при 37 2С у 595
СО». Після інкубації супернатанти збирали, і визначали вміст мишачого ІЕМ-у за допомогою ЕГІЗА (гес. ПІЕМ-у і анти-пІЕМ-у від К 5. О Зувіетзв).
Людський 1-18 індукував залежну від дози продукцію ІБМ-у з активністю, ідентичною такій у ПНІЇ-18, отриманого шляхом конструювання ділянки розщеплення фактором Ха.
Посилання 1. Макатига, К., Окатига, Н., Мадаїйа, К., Котаїйви, Т., апа Татига, Т. (1993) Іптесі. Іттип. 61, 64-70. 2. ОКатига, Н., Твцівиії, Н., Котаїви, Т., Мицївидо, М, На-Кига, А., Тапітоїо, Т., Тогідое, К., ОКига, Т., 72 Микада, М., Найцогі, К., Акйа, К., Матра, М, Тапаре, Е., Копізпі, К., Бикида, 5., апа Кигітоїю, М. (1995)
Майшге 378, 88-91. 3. Ов8піо, 5., Матбра, М., ОКига, Т., Найогі, К., МиКада, М., АКіїа, К., Тапаре, Р., Копігйпі, К,.,
МісайПеї, М., Еційї, М., Тогідое, К., Тапітоїо, Т., Рикида, 5., ІКкеда, М, ОКатига, Н., апа Кигітоїо, М. (1996) 9. Іттипої. 156, 4274-4279. 4. Вагап. у. Р., Тітапв, 9.С, апа Казеїеїп, К.А. (1996) Майте 379, 591. 5. ОКатига, Н., Мадаїа, К., Котаїви, Т., Тапітоїо, Т., Ми-каїа, МУ., Тапаре, Р., АКйа, К., Тогідое, К.,
Окига, Т., Рикида, 5., апа Кигітоїо, М. (1995) Іптесі. Іттип. 63, 3966-3972. б. Місаїеї М. 9., Опівикі, Т., Коппо, К., Тапаре, Г., Ов5піо, 5., Матбра, М., Тапітоїю, Т., Тогідое, К,.,
Еції, М., Ікеда, М., Рикиаа, 5., апа Кигітою, М. (1996).Еиг. 9. Іттипої. 26, 1647-1651. с 7. Твшцівиі, Н., МаКапівпі, К., Маївиї, К., Нідазпіпо, К., ОКатига, Н., Міуагажа, М., апа Капеада, К. Го) (1996) 9. Іттипої. 157, 3967-3973. 8. ОСПауциг, Т., Вапегієе, 5., Нидипіп, М., ВиШег, О., Нег2од, Ї., Сапег, А., ОціпіаіІ, Ї., зекиї, Г.,
ТаїІапіап, К., РавкКіпа, М., УУопоа, МУ., Катеп, К., Тгасеу, О., апа Аїеп, Н. (1997) Майиге 386, 619-623. 9. би, У., Киїда, К., Твцівиі, Н., Ки, б., Нвіао, К., Ріетіпо, М.А., Науавзпі, М., Нідазпіпо, К., ОКатига, о
Н., МакКкапівйі, К., Кигітоїо, М., Тапітоїо, Т., Ріамеїї, К. А., зай, М., Нагаїпо, М.МУ., Ііміповіоп, 0.9., апа «І
Би, М.5. (1997) Зсіепсе 275, 206-209. 10. ТаКкеда, К., Тецівиі, Н., МозПпітоїо, Т., Адаспі, О., МозПпіда, М., Ківпітої, Т., ОКатига, Н,, б»
МакКапівпії, К., апа Акіга, 5. (1998) Іттипіу 8, 383-390. со 11. БатргоокК, .., Егйвесп, Е.Р., апа Мапіайів, Т. (1989) Моіесшаг Сіопіпд: А І арогаїогу Мапиаї, 2па еадп.
Еа., Соїа Зргіпд Нагбог І арогайгіез, Соїд 5ргіпд Нагброг, МУ. - 12. Міна, Р., Кашїтапп, 5. Н., апа Еагозпам, М.С. (1997) Сазразез апа сазразе іппіріоге Тгепаз Віоспет. сі. 22 388-393. 13. Міспоїзоп, О.МУ., Тпогпреггу, М.А., (1997) Сазразезв: КіПег ргоїеазев. Тгтепаз Віоспет. сі. 22 299-306. « 14. Сагсіа-Саімо, М., Реїегзоп, Е.Р., Казрег, О.М., Маї-Іапсоцшгі, 9У.Р., 7атропі, К., Міспоївоп, О.МУ.,
Трогпреггу, М.А., (1999) Ригійсайоп апа сайамуііс ргорепіез ої питап сазразе Татійу тетрбегв. СеїЇ ЮОеай не) с Оійег. 6; (4) 362-369. Коп-івпі, К., Тапаре, Р. Тапідиспі, М., Матаисні, Н., Тапітоїо, Т., ІКеда, М., "» Огіа, К., Кигітоїю, М. (1997) А вітріе апа взепзійме ріоаззау ог (пе де(есіоп ої питап іпіепешикКіп-18/іпіепегоп-у " іпдисіпд Тасіог изіпд питап туеіотопосуїіс КО-1 сеїІв, 9. Іттипої. Меїйодз 209 187-191. -і
Claims (5)
1. Спосіб одержання біологічно активної молекули з її біологічно неактивного попередника, що включає о забезпечення мутування його нативної ділянки розщеплення каспазою-1ї з утворенням ділянки, що ї» 20 розщеплюється протеазою, і розщеплення мутованої молекули з одержанням біологічно активної молекули, причому вказана біологічно активна молекула являє собою цитокін. ме, 2.
Спосіб за п.1, де цитокін вибраний з ІІ -18 і ІІ -18.
З.
Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, де протеаза вибрана з тромбіну, ентерокінази, субтилізину, гененази, протеази людського риновірусу ЗС, протеази фактора Ха і каспази, переважно каспази-8. 52 4. кКДНК, що кодує попередник біологічно активної молекули, мутований в нативній ділянці його розщеплення ГФ) каспазою-ї з утворенням ділянки, що розщеплюється протеазою, необов'язково підданий злиттю з послідовністю, що кодує глутатіон-З-трансферазу (95), причому вказана біологічно активна молекула являє о собою цитокін, вибраний з ІІ -18 і 1-18.
5. Спосіб одержання біологічно активної молекули, що включає трансфекцію клітин-хазяїнів вектором, що 60 містить КДНК, що кодує неактивний попередник біологічно активної молекули, мутований в нативній ділянці його розщеплення каспазою-1 з утворенням ділянки, що розщеплюється протеазою, культивування трансфікованих клітин-хазяїнів і виділення біологічно активної молекули після обробки протеазою, причому вказана біологічно активна молекула являє собою цитокін.
б. Спосіб за п.5, де кДНК піддають злиттю ов рамці зчитування з послідовністю, що кодує бо глутатіон-З-трансферазу (351), і експресовану молекулу злиття затримують на гранулах глутатіон-агарози
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IL12942799A IL129427A0 (en) | 1999-04-13 | 1999-04-13 | Preparation of biologically active molecules |
| PCT/IL2000/000220 WO2000061768A2 (en) | 1999-04-13 | 2000-04-13 | Preparation of biologically active molecules |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| UA73940C2 true UA73940C2 (uk) | 2005-10-17 |
Family
ID=11072700
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| UA2001117751A UA73940C2 (uk) | 1999-04-13 | 2000-04-13 | Спосіб одержання біологічно активної молекули |
Country Status (23)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7098002B1 (uk) |
| EP (1) | EP1169460B1 (uk) |
| JP (1) | JP4822587B2 (uk) |
| KR (1) | KR100682185B1 (uk) |
| CN (1) | CN1324140C (uk) |
| AR (1) | AR023468A1 (uk) |
| AT (1) | ATE326536T1 (uk) |
| AU (1) | AU781342B2 (uk) |
| BR (1) | BR0009782A (uk) |
| CA (1) | CA2368994C (uk) |
| DE (1) | DE60028022T2 (uk) |
| DK (1) | DK1169460T3 (uk) |
| EA (1) | EA006825B1 (uk) |
| EE (1) | EE05591B1 (uk) |
| ES (1) | ES2259287T3 (uk) |
| IL (3) | IL129427A0 (uk) |
| MX (1) | MXPA01010487A (uk) |
| NO (1) | NO329525B1 (uk) |
| PT (1) | PT1169460E (uk) |
| SI (1) | SI1169460T1 (uk) |
| UA (1) | UA73940C2 (uk) |
| WO (1) | WO2000061768A2 (uk) |
| ZA (1) | ZA200108364B (uk) |
Families Citing this family (28)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001029232A2 (en) * | 1999-10-20 | 2001-04-26 | Scios Inc. | Functional cloning of genes encoding proteins/enzymes involved in proteolytic cleavage |
| US7273722B2 (en) | 2000-11-29 | 2007-09-25 | Allergan, Inc. | Neurotoxins with enhanced target specificity |
| BRPI0207933B8 (pt) | 2001-03-08 | 2021-05-25 | Ares Trading Sa | polipeptídeo mutante de interleucina-18 e composição farmacêutica |
| IL142246A0 (en) * | 2001-03-26 | 2002-03-10 | Applied Research Systems | Method and kit for quantitation of polypeptides |
| JP2005523001A (ja) | 2002-02-11 | 2005-08-04 | ザイモジェネティクス，インコーポレイティド | 二量体増殖因子を調製するための材料と方法 |
| JP2006518207A (ja) * | 2003-02-21 | 2006-08-10 | ビーオテクノル エス．アー． | 構築された組み換えポリペプチド融合物の成熟化のためのカスパーゼ酵素の使用 |
| CA2534629C (en) * | 2003-08-06 | 2016-01-19 | University Of Maryland Biotechnology Institute | Engineered proteases for affinity purification and processing of fusion proteins |
| EP1689877A1 (en) * | 2003-11-24 | 2006-08-16 | Novo Nordisk A/S | Fusion proteins and methods of cleavage of such proteins |
| ATE517914T1 (de) | 2004-03-08 | 2011-08-15 | Zymogenetics Inc | Dimere fusionsproteine und materialien und verfahren zu deren herstellung |
| JP5134540B2 (ja) * | 2005-09-19 | 2013-01-30 | アラーガン、インコーポレイテッド | クロストリジウム毒素活性化クロストリジウム毒素 |
| JP5093783B2 (ja) | 2006-04-20 | 2012-12-12 | クリングルファーマ株式会社 | Ｈｇｆ前駆体蛋白質改変体及びその活性型蛋白質 |
| DE102007008596B4 (de) * | 2007-02-15 | 2010-09-02 | Friedrich-Schiller-Universität Jena | Biologisch wirksame Moleküle auf Grundlage von PNA und siRNA, Verfahren zu deren zellspezifischen Aktivierung sowie Applikationskit zur Verabreichung |
| EP2190861A4 (en) | 2007-08-22 | 2011-03-30 | Univ California | ACTIVE BINDING POLYPEPTIDES AND METHOD FOR THEIR IDENTIFICATION AND USE |
| WO2009044988A1 (en) * | 2007-10-01 | 2009-04-09 | Korea Research Institute Of Bioscience And Biotechnology | Method for large scale preparation of procaspases, which can be artificially activated, in e. coli expression system and their activation |
| DE102009043743B4 (de) | 2009-03-13 | 2016-10-13 | Friedrich-Schiller-Universität Jena | Zellspezifisch wirksame Moleküle auf Grundlage von siRNA sowie Applikationskits zu deren Herstellung und Verwendung |
| BRPI1006141B8 (pt) | 2009-01-12 | 2021-05-25 | Cytomx Therapeutics Llc | composições de anticorpo modificado, métodos para preparar e usar as mesmas |
| CN102481341B (zh) | 2009-02-23 | 2017-05-17 | 希托马克斯医疗有限公司 | 蛋白原及其使用方法 |
| CN103923897B (zh) * | 2013-01-11 | 2016-06-01 | 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 | caspase重组酶原及其编码基因与应用 |
| CN103388001B (zh) * | 2013-07-16 | 2016-01-20 | 中国人民解放军第四军医大学 | 一种含凝血酶切割位点gst膜型表达载体及转染阳性细胞的方法 |
| RU2019134445A (ru) * | 2013-12-20 | 2019-12-20 | Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг | Улучшенные способы получения рекомбинантного полипептида |
| AU2016243623B2 (en) | 2015-03-30 | 2022-04-14 | Greenlight Biosciences, Inc. | Cell-free production of ribonucleic acid |
| MY193078A (en) | 2015-06-24 | 2022-09-26 | Hoffmann La Roche | Anti-transferrin receptor antibodies with tailored affinity |
| AR106189A1 (es) | 2015-10-02 | 2017-12-20 | Hoffmann La Roche | ANTICUERPOS BIESPECÍFICOS CONTRA EL A-b HUMANO Y EL RECEPTOR DE TRANSFERRINA HUMANO Y MÉTODOS DE USO |
| CN108137697A (zh) | 2015-10-02 | 2018-06-08 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 双特异性抗人cd20/人转铁蛋白受体抗体及使用方法 |
| EP3440215A1 (en) | 2016-04-06 | 2019-02-13 | Greenlight Biosciences, Inc. | Cell-free production of ribonucleic acid |
| AR113764A1 (es) | 2017-10-11 | 2020-06-10 | Greenlight Biosciences Inc | Métodos y composiciones para la producción de nucleósido trifosfato y ácido ribonucleico |
| KR20200080749A (ko) * | 2018-12-27 | 2020-07-07 | 주식회사 폴루스 | N-말단의 메티오닌이 절단된 목적 단백질 발현용 유전자 발현 카세트 및 이를 이용하여 n-말단의 메티오닌이 절단된 목적 단백질을 생산하는 방법 |
| AU2020327671A1 (en) * | 2019-08-13 | 2022-03-03 | King's College London | Immunoresponsive cells armoured with spatiotemporally restricted activity of cytokines of the IL-1 superfamily |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5824297A (en) * | 1990-06-25 | 1998-10-20 | Oncogene Science, Inc. | Tissue-derived tumor growth inhibitors, methods of preparation and uses thereof |
| EP0538398A4 (en) * | 1990-06-25 | 1993-12-29 | Oncogene Science, Inc. | Tissue-derived tumor growth inhibitors, methods for preparation and uses thereof |
| DE69229252T2 (de) * | 1991-08-16 | 1999-12-16 | Merck & Co., Inc. | DNS, welche das Interleukin-1B-Vorläufer-Converting-Enzym kodiert |
| US5476777A (en) | 1991-12-31 | 1995-12-19 | Zymogenetics, Inc. | Methods for producing thrombin |
| JPH06125784A (ja) * | 1992-01-17 | 1994-05-10 | Takeda Chem Ind Ltd | モノクローナル抗体，ハイブリドーマ，その製造法および用途 |
| US6303369B1 (en) * | 1993-09-30 | 2001-10-16 | Carl Spana | Protein expression system |
| JP2000502903A (ja) | 1995-12-29 | 2000-03-14 | インサイト・ファーマスーティカルズ・インコーポレイテッド | インターフェロンγ誘導因子―２をコードする核酸 |
| JP4059941B2 (ja) * | 1996-08-26 | 2008-03-12 | 社団法人芝蘭会 | Ｒｈｏ標的タンパク質ｐ１４０ｍＤｉａ |
| AT405516B (de) * | 1997-02-27 | 1999-09-27 | Immuno Ag | Faktor x-analoge mit modifizierter proteasespaltstelle |
| JPH10327872A (ja) * | 1997-05-30 | 1998-12-15 | Otsuka Pharmaceut Co Ltd | Ｂｃｌ−２相互作用蛋白遺伝子ｂｉｓ |
| WO1999007851A1 (fr) | 1997-08-07 | 1999-02-18 | Toray Industries, Inc. | INTERLEUKINE 18 CANINE, INTERLEUKINE-1 β-CONVERTASE CANINE, SEQUENCES D'ADN CODANT CETTE ENZYME, PROCEDE DE PRODUCTION DE L'INTERLEUKINE 18, ET REMEDES CONTRE LES MALADIES IMMUNOLOGIQUES CHEZ LE CHIEN |
-
1999
- 1999-04-13 IL IL12942799A patent/IL129427A0/xx unknown
-
2000
- 2000-04-12 AR ARP000101692A patent/AR023468A1/es not_active Application Discontinuation
- 2000-04-13 EE EEP200100530A patent/EE05591B1/xx not_active IP Right Cessation
- 2000-04-13 SI SI200030860T patent/SI1169460T1/sl unknown
- 2000-04-13 EA EA200101078A patent/EA006825B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2000-04-13 CN CNB008080577A patent/CN1324140C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2000-04-13 BR BR0009782-9A patent/BR0009782A/pt active Search and Examination
- 2000-04-13 MX MXPA01010487A patent/MXPA01010487A/es active IP Right Grant
- 2000-04-13 UA UA2001117751A patent/UA73940C2/uk unknown
- 2000-04-13 JP JP2000611691A patent/JP4822587B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2000-04-13 ES ES00919108T patent/ES2259287T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-04-13 EP EP00919108A patent/EP1169460B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-04-13 IL IL14584200A patent/IL145842A0/xx active IP Right Grant
- 2000-04-13 PT PT00919108T patent/PT1169460E/pt unknown
- 2000-04-13 AT AT00919108T patent/ATE326536T1/de active
- 2000-04-13 CA CA002368994A patent/CA2368994C/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-04-13 US US09/958,914 patent/US7098002B1/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-04-13 KR KR1020017012973A patent/KR100682185B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 2000-04-13 DE DE60028022T patent/DE60028022T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-04-13 AU AU39851/00A patent/AU781342B2/en not_active Ceased
- 2000-04-13 DK DK00919108T patent/DK1169460T3/da active
- 2000-04-13 WO PCT/IL2000/000220 patent/WO2000061768A2/en not_active Ceased
-
2001
- 2001-10-10 IL IL145842A patent/IL145842A/en not_active IP Right Cessation
- 2001-10-11 ZA ZA200108364A patent/ZA200108364B/en unknown
- 2001-10-12 NO NO20014966A patent/NO329525B1/no not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| UA73940C2 (uk) | Спосіб одержання біологічно активної молекули | |
| AU2019204675B2 (en) | Using rna-guided foki nucleases (rfns) to increase specificity for rna-guided genome editing | |
| AU2017207284B2 (en) | Chimeric proteins and methods of regulating gene expression | |
| O'Farrell et al. | Structure and processing of yeast precursor tRNAs containing intervening sequences | |
| McBlane et al. | Cleavage at a V (D) J recombination signal requires only RAG1 and RAG2 proteins and occurs in two steps | |
| AU2006272634B2 (en) | Targeted integration and expression of exogenous nucleic acid sequences | |
| EP0620854B1 (en) | Expression and purification of recombinant soluble tissue factor | |
| US20160153003A1 (en) | Using RNA-guided FokI Nucleases (RFNs) to Increase Specificity for RNA-Guided Genome Editing | |
| EP3612630B1 (en) | Site-specific dna modification using a donor dna repair template having tandem repeat sequences | |
| US20220025422A1 (en) | Improved Filamentous Fungal Host Cells | |
| US11447780B2 (en) | Preparation of wheat cysteine protease triticain-alpha produced in soluble form and method of producing same | |
| CN115427560A (zh) | 使用无催化活性rna指导的内切核酸酶的crispr-aid | |
| CN120731271A (zh) | 多拷贝宿主细胞的生成 | |
| US20040043455A1 (en) | Methods for producing mammalian trypsins | |
| WO2004027072A2 (en) | Method for making recombinant proteins | |
| US20250297237A1 (en) | Engineering of CAS9 Variants That Possess Targeted Nuclease Activity When Paired with Short SGRNAS | |
| RU2337965C2 (ru) | Рекомбинантная плазмидная днк, кодирующая последовательность белка фактора vii человека, линия клеток внк/f7, трансформированная плазмидной днк | |
| JPH04507347A (ja) | 活性化プロテインｃを生成するための細胞培養法 | |
| EP3866860B1 (en) | Complement component 1s (c1s) deficient cells for production of vaccines and biopharmaceutical proteins | |
| CN100392079C (zh) | 蛋白c或活化的蛋白c-样分子 | |
| JPH02500947A (ja) | 動物細胞内でのメッセンジャーｒｎａの安定化 | |
| US20160138047A1 (en) | Improved polynucleotide sequences encoding tale repeats | |
| KR20240055677A (ko) | Cas 단백질 및 박테리아 톡신을 포함하는 융합 단백질 및 이의 용도 | |
| EP4630563A1 (en) | Modified rna polymerase activities | |
| EP1888744A2 (en) | A process comprising codon optimization for the production of recombinant activated human protein c for the treatment of sepsis |