JP4059941B2 - Ｒｈｏ標的タンパク質ｐ１４０ｍＤｉａ - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の背景】
発明の分野
本発明は、Ｒｈｏタンパク質の標的タンパク質に関し、更に詳細には、アクチン細胞骨格の再構成に関与するタンパク質に関する。
【０００２】
背景技術
生体内には、サブユニット構造を有さない分子量２〜３万の一群の低分子量ＧＴＰ結合タンパク質（Ｇタンパク質）が存在している。現在、低分子量Ｇタンパク質のスーパーファミリーには酵母から哺乳動物に至るまですでに５０種類以上のメンバーが見出されている。低分子量Ｇタンパク質は、アミノ酸配列の類似性からＲａｓ、Ｒｈｏ、Ｒａｂ、その他の４つのファミリーに大別することができる。この低分子量Ｇタンパク質は種々の細胞機能を制御していることが明らかになってきており、例えば、Ｒａｓタンパク質は細胞の増殖や分化等を、Ｒｈｏタンパク質は細胞の形態変化や細胞接着、細胞運動等をそれぞれ制御していると考えられている。
【０００３】
このうちＲｈｏタンパク質は、ＧＤＰ／ＧＴＰ結合能および内在性ＧＴＰａｓｅ活性を示し、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）およびある種の成長因子等のような細胞外シグナルに対する細胞骨格応答に関係しているとされている。不活性型であるＧＤＰ結合Ｒｈｏタンパク質にある刺激が与えられると、Ｓｍｇ ＧＤＳ、ＤｂｌやＯｓｔのようなＧＤＰ／ＧＴＰ変換タンパク質の働きによって活性型であるＧＴＰ結合Ｒｈｏタンパク質（以下、「活性型Ｒｈｏタンパク質」という）に変換される。そして、この活性型Ｒｈｏタンパク質が標的タンパク質に作用することによってストレス繊維および接着斑が形成され、細胞接着および細胞運動等が誘導されると考えられている（実験医学 vol.12,No.8,97-102(1994) 、Takai, Y. et al. Trends Biochem. Sci., 20, 227-231 (1995) ）。一方、Ｒｈｏタンパク質内在性ＧＴＰａｓｅにより活性型Ｒｈｏタンパク質はＧＤＰ結合Ｒｈｏタンパク質に変換される。この内在性ＧＴＰａｓｅの活性を亢進するタンパク質はＧＴＰａｓｅ活性化タンパク質（ＧＡＰ）（Lamarche, N. & Hall,A. et al.,TIG, 10, 436-440 (1994) ）と呼ばれている。
【０００４】
ＲｈｏＡタンパク質、ＲｈｏＢタンパク質、ＲｈｏＣタンパク質、Ｒａｃ１タンパク質、Ｒａｃ２タンパク質、Ｃｄｃ４２タンパク質のようなＲｈｏファミリーのタンパク質のアミノ酸配列は、お互いに５０％以上の類似性がある。このＲｈｏファミリーのタンパク質は、リゾフォスファチジル酸（ＬＰＡ）や増殖因子のような細胞外シグナルに応答して、ストレス繊維（stress fiber）やフォーカルコンタクト（focal contact ）の形成を引き起こす反応に関与していると考えられている（A. J. Ridley & A. Hall、Cell,70,389-399 (1992) ,A. J. Ridley & A. Hall, EMBO J.,1353,2600-2610(1994)）。また、サブファミリーであるＲｈｏタンパク質は、細胞の形態変化（H.F.Parterson et al., J.Cell Biol.,111,1001-1007 (1990) ）、細胞接着（Morii,N. et al.,J. Biol.Chem. 267, 20921-20926 (1992) 、T. Tominaga et al.,J.Cell Biol., 120, 1529-1537(1993) 、Nusrat, A. et al.,Proc, Natl. Acad. Sci. USA, 92, 10629-10633 (1995)、Landanna, C. et al., Science 271, 981-983 (1996)）、細胞運動（K. Takaishi et al.,Oncogene,9,273-279 (1994)）、細胞質分裂（cytokinesis ）（K. Kishi et al.,J. Cell Biol.,120,1187-1195(1993) 、I. Mabuchi et al.,Zygote,1,325-331(1993)）のような細胞骨格の再編成をともなった生理機能にも関連があると考えられている。更に、Ｒｈｏタンパク質は、平滑筋収縮（K. Hirata et al.,J. Biol. Chem.,267,8719-8722(1992) 、M. Noda et al., FEBS Lett., 367, 246-250 (1995) 、M. Gong et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93,1340〜1345 (1996) ＊）、フォスファチジルイノシトール ３−キナーゼ（ＰＩ３−キナーゼ）（J. Zhang et al.,J. Biol. Chem.,268,22251-22254 (1993) ）、フォスファチジルイノシトール ４−リン酸 ５−キナーゼ（ＰＩ ４，５−キナーゼ）（L. D. Chong et al.,Cell,79,507-513(1994)）やｃ−ｆｏｓの発現（C. S. Hill et al.,Cell,81,1159-1170(1995) ）の制御にも関与していることが示唆されている。
【０００５】
また、最近では、アミノ酸配列を一部置換したＲｈｏタンパク質が細胞内に導入されるとＲａｓ依存的な腫瘍形成が抑制されること等が見出され、Ｒｈｏタンパク質がＲａｓによる細胞の形質転換、すなわち腫瘍形成、において重要な役割を果たしていることが明らかにされている（G.C.Prendergast et al.,Oncogene,10,2289-2296(1995)、Khosravi-Far,R.,et al.,Mol.Cell.Biol.,15,6443-6453(1995)、R.Qiu et al.、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,92,11781-11785(1995) 、およびLebowitz,P.et al.,Mol.Cell.Biol.,15,6613-6622(1995) ）。また、Ｒｈｏタンパク質のＧＤＰ／ＧＴＰ変換タンパク質が変異すると、細胞が形質転換することが明らかにされている（Collard,J.,Int.J.Oncol.,8,131 〜138(1996) ）、Hart,M. et al.,J.Biol Chem.,269,62-65 (1994)、Horii,Y. et al., EMBO J., 13,4776-4786 (1994) ）。更に、Ｒｈｏタンパク質はガン細胞の浸潤、すなわちガン転移に関与していることが明らかにされている（Yoshioka,K.et al.,FEBS Lett.,372,25 〜28 (1995) ）。ガン細胞の浸潤には、ガン細胞の細胞接着能の変化が密接に関連しているが、Ｒｈｏタンパク質は細胞接着に関与することが明らかにされている（前掲 Morii,N.et al.(1992)、Tominaga,T. et al.(1993)、Nusrat,A.et al.(1995) 、Landanna,C.et al.(1996) ）。
【０００６】
また、Ｒｈｏシグナル伝達におけるホスホイノシチドキナーゼの関与が報告されている。Ｒｈｏ（Chong, L.D. et al., Cell, 79, 507-513 (1994)）およびＲｈｏファミリー低分子量Ｇタンパク質の他のメンバーであるＲａｃ（Hartwig, J.H. et al., Cell, 82, 643-653 (1995)） は、異なる細胞系においてホスファチジルイノシトールビスホスフェート（ＰＩＰ２）の合成を刺激することが証明された。ＰＩＰ２の結合は多数のアクチン関連タンパク質の機能を調節すると考えられる（Janmey, P.A., Ann. Rev. Physiol., 56, 169-191 (1994)）ので、細胞内局在的なその生合成によってフォーカルアクチン再構成が促進されると考えられる。ＰＩＰ２により調節されるタンパク質の１つはプロフィリンであり、これはアクチンモノマーと複合体を作り、そしてＰＩＰ２との結合の際アクチンを解離する。プロフィリンは、また、チモシンβ４の存在下においてアクチンフィラメントの界合を促進する（Pantaloni, D., & Crlier, M-F, Cell, 75, 1007-1014 (1993)）。従って、プロフィリンの接着部位への蓄積がアクチン再構成において重要であると考えられる（Theriot, J. A. & Mitchison, T. J., Cell, 75, 835-838 (1993) ）。
【０００７】
ところで、アクチンの細胞骨格は、細胞の運動性、形態、食作用および細胞質分裂において重要な役割を果たす。それは空間的および動的に再構成され、大部分の真核細胞の形態変化および細胞表面運動のための力を提供する。アクチンの再構成（rearrangement ）は細胞外の刺激により急速に引き起こされ、一連のアクチン結合タンパク質はアクチンフィラメントの重合、架橋および固定に共調的に作用すると考えられる。低分子量Ｇタンパク質Ｒｈｏは多数のアクチン依存性細胞プロセス、例えば、血小板凝集（Morii, N. et al., J. Biol. Chem., 267, 20921-20926 (1992) ）、リンパ球接着（Tominaga, T. et al., J. Cell. Biol., 120, 1529-1537 (1993 ））、細胞運動性の亢進（Takaishi, K. et al., Oncogene, 11, 39-48 (1995) ）、および収縮環の形成および細胞質分裂（Kishi, K. et al., J. Cell Biol., 120, 1187-1195 (1993)、およびMabuchi, I. et al., Zygote, 1, 325-331 (1993) ）に必要とされることが示されている。培養した線維芽細胞において、Ｒｈｏタンパク質をマイクロインジェクションすると、アクチン・ストレスファイバーやフォーカル接着（focal adhesion）の形成を急速に誘導する。逆に、ボツリヌス菌（botulinum ）のＣ３菌体外酵素（ＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼ）によるＲｈｏの不活性化はこのプロセスを阻害する（Ridley, A. J. & Hall, A., Cell, 70, 389-399 (1992)）。Ｃ３菌体外酵素の処理は、また、フォーカル接着キナーゼ（focal adhesion kinase: ＦＡＫ）およびパキシリン（paxillin）のリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）−、エンドセリン−またはＧＴＰγＳ−誘導性チロシンリン酸化を阻害する（Kumagai, N. et al., J. Biol. Chem., 268, 24535-24538 (1993) 、Rankin, S. et al., FEBS Lett., 354, 315-319 (1994)、Ridley, A. J. & Hall, A., Cell, 70, 389-399 (1992)、およびSeckl, M. J. et al., J. Biol. Chem. 270, 6984-6990 (1995) ）。これらの結果より、Ｒｈｏタンパク質が細胞外刺激とアクチン細胞骨格の再構成とを連結するシグナル伝達経路を調節することが示されている。
【０００８】
Ｒｈｏタンパク質には多数の標的分子があり、上記の多数のシグナル伝達経路を調節していると考えられている。ごく最近、哺乳類において、いくつかの候補タンパク質が報告された。これらのタンパク質は、プロテインキナーゼＮ（ＰＫＮ）（Watanabe, G. et al., Science 271, 645-648 (1996); Amano, M. et al., Sceince 271, 648-650 (1996) ）、ローフィリン（Watanabe, G. et al., Science 271, 645-648 (1996)）、シトロン（Madaule, P. et al., FEBS Lett. 377, 243-248 (1995)）、ＲＯＫα（Leung, T. et al., J. Biol. Chem. 270, 29051-29054 (1995)）、Ｒｈｏ結合キナーゼ(Matsui,T.et al.,EMBO J.15,1885-1893(1996)）、ローテキン(Reid,T.et al.,J.Biol.Chem.,271,9816-9822(1996) ）、ミオシン軽鎖ホスファターゼ（Kimura, K. et al., Science, 273, 245-248(1996)）である。これらのタンパク質はいずれもＧＴＰ結合ＲｈｏＡタンパク質に結合する（ただし、シトロンだけはＧＴＰ結合Ｒａｃ１タンパク質にも結合する）。
【０００９】
しかしながら、Ｒｈｏタンパク質およびアクチン細胞骨格の再構成を調節するプロフィリンに結合するＲｈｏ標的タンパク質に関する報告は本発明者が知る限りなされていない。
【００１０】
【発明の概要】
本発明者は、今般、酵母ツー・ハイブリッド・システムを使用して、Ｒｈｏタンパク質の標的タンパク質（ｐ１４０ｍＤｉａ）を同定した。これは細胞質分裂に必要なショウジョウバエ（Drosophila）のディアファノス（diaphanous）の哺乳類ホモローグであり、繰り返し状ポリ−プロリンのストレッチおよびフォルミンホモロジー（ＦＨ２）ドメインを含有する。ｐ１４０ｍＤｉａはＧＴＰ結合型Ｒｈｏのそのアミノ末端領域を介して選択的に結合し、アクチン結合タンパク質であるプロフィリンに結合する。ｐ１４０ｍＤｉａ、プロフィリンおよびＲｈｏタンパク質は、広がった線維芽細胞の膜の波打ち構造（ruffle）、および分裂細胞の分裂溝（ｃleavage furrow）に局在化し、フィブロネクチンでコーティングされたラテックスビーズによりビーズ下の原形質膜にリクルート（recruit ）された。これらの結果から、Ｒｈｏタンパク質によるアクチン再構成の誘導のメカニズムの１つが、ｐ１４０ｍＤｉａを介した細胞の特異的部位におけるプロフィラクチン複合体のリクルートメント（recruitment ）であることが示唆された。本発明は、かかる知見に基づくものである。
【００１１】
従って、本発明は、活性型Ｒｈｏタンパク質結合能を有し、かつプロフィリンに結合するＲｈｏ標的タンパク質の提供をその目的とする。
【００１２】
また、本発明によれば、前記タンパク質をコードする塩基配列、前記塩基配列を含むベクター、前記ベクターによって形質転換された宿主細胞、前記タンパク質の製造法、前記タンパク質に対する抗体、および活性型Ｒｈｏタンパク質とその標的タンパク質との結合を阻害するスクリーニング法等の提供をその目的とする。
【００１３】
そして、本発明によるタンパク質は、活性型Ｒｈｏタンパク質結合能を有し、かつプロフィリン結合能を有するもの、である。
【００１４】
【発明の具体的説明】
定義
本発明において、「アミノ酸」とは、光学異性体、すなわちＬ体およびＤ体、のいずれをも含む意味で用いられるものとする。従って、本発明において「ペプチド」とは、Ｌ体のアミノ酸のみによって構成されているペプチドだけでなく、Ｄ体のアミノ酸を一部または全部含むペプチドをも意味するものとする。
【００１５】
また、本発明において、「アミノ酸」とは、天然のタンパク質を構成する２０種のα−アミノ酸のみならず、それら以外のα−アミノ酸、並びにβ−、γ−、δ−アミノ酸および非天然のアミノ酸等を含む意味で用いられるものとする。従って、下記のようにペプチドにおいて置換されるかまたはペプチド中に挿入されるアミノ酸としては、天然のタンパク質を構成する２０種のα−アミノ酸だけに限定されることはなく、それら以外のα−アミノ酸並びにβ−、γ−、δ−アミノ酸および非天然のアミノ酸等であってもよい。このようなβ−、γ−またはδ−アミノ酸としては、β−アラニン、γ−アミノ酪酸あるいはオルニチンが挙げられ、また天然タンパク質を構成するもの以外のアミノ酸あるいは非天然のアミノ酸としては、３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルグリシン、１，２，３，４−テトラハイドロイソキノリン−３−カルボン酸あるいは二ペコチン酸等が挙げられる。
【００１６】
また、本明細書において「本発明によるタンパク質」というときは、その誘導体を含む意味で用いられるものとする。
【００１７】
更にまた、本明細書において「塩基配列」とは、ＤＮＡ配列およびＲＮＡ配列のいずれをも意味するものとする。
【００１８】
タンパク質
本発明によるタンパク質は、活性型Ｒｈｏタンパク質結合能を有し、かつプロフィリン結合能を有するタンパク質またはその誘導体である。ここで、Ｒｈｏタンパク質としては、ＲｈｏＡタンパク質、ＲｈｏＢタンパク質、ＲｈｏＣタンパク質、またはＲｈｏＧタンパク質が挙げられる。
【００１９】
本発明において、「活性型Ｒｈｏタンパク質結合能を有するタンパク質」とは、当業者により活性型Ｒｈｏタンパク質との結合が認められたと評価されるタンパク質をいい、例えば、実施例１および５と同様の条件において実験した場合に活性型Ｒｈｏタンパク質との結合が認められたと評価されるタンパク質を意味するものとする。
【００２０】
本発明によるタンパク質は、Ｒｈｏタンパク質結合領域に加えて、ポリ−プロリン領域、およびＦＨ２領域を有する（実施例２）。また、本発明によるタンパク質はマウスの肺、睾丸、胸腺、肝臓、および胃において強く発現するという特徴を有する。
【００２１】
活性型Ｒｈｏ結合能を有し、かつプロフィリン結合能を有するタンパク質には、ｐ１４０ｍＤｉａのアイソフォームおよびホモローグも含まれる（実施例３参照）。
【００２２】
本発明において、「プロフィリン結合能を有するタンパク質」とは、当業者によりプロフィリンとの結合が認められたと評価されるタンパク質をいい、例えば、実施例６と同様の条件において実験した場合にプロフィリンとの結合が認められたと評価されるタンパク質を意味するものとする。
【００２３】
本明細書においてＲｈｏタンパク質は、Ｒｈｏタンパク質と本発明によるタンパク質との結合が実質的に損われないように改変されたＲｈｏタンパク質をも含むものとする。このような改変Ｒｈｏタンパク質としては、１４番目のアミノ酸をバリンで置換したＲｈｏＡ変異体（ＲｈｏＡVal14 ）が挙げられる。
【００２４】
本発明によるタンパク質の起源は特に限定されず、マウスを含むホ乳類由来のものであっても、それ以外を由来とするものであってもよい。
【００２５】
本発明によるタンパク質の分子量は、マウス由来である場合、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる測定で約１６０ｋＤである。
【００２６】
本発明によるタンパク質は、例えば、配列番号２のｃＤＮＡ配列を宿主において発現させることによって得ることができる（実施例４および９）。配列番号２の配列の取得および宿主における発現は、後述する。
【００２７】
本明細書において、「タンパク質の誘導体」とは、タンパク質のアミノ末端（Ｎ末端）のアミノ基または各アミノ酸の側鎖のアミノ基の一部もしくは全部、および／またはペプチドのカルボキシル末端（Ｃ末端）のカルボキシル基または各アミノ酸の側鎖のカルボキシル基の一部もしくは全部、および／または、ペプチドの各アミノ酸の側鎖のアミノ基およびカルボキシル基以外の官能基（例えば、水素基、チオール基、アミド基等）の一部もしくは全部が、適当な他の置換基によって修飾を受けたものをいう。適当な他の置換基による修飾は、例えば、ペプチド中に存在する官能基の保護、安全性ならびに組織移行性の向上、あるいは活性の増強等を目的として行われる。
【００２８】
タンパク質の誘導体としては、具体的には、
（１）タンパク質のアミノ末端（Ｎ末端）のアミノ基または各アミノ酸の側鎖のアミノ基の一部もしくは全部の水素原子が、置換または非置換のアルキル基（直鎖、分岐鎖または環状であってもよい）（例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、イソブチル基、ブチル基、ｔ−ブチル基、シクロプロピル基、シクロヘキシル基、ベンジル基）、置換または非置換のアシル基（例えば、ホルミル基、アセチル基、カプロイル基、シクロヘキシルカルボニル基、ベンゾイル基、フタロイル基、トシル基、ニコチノイル基、ピペリジンカルボニル基）、ウレタン型保護基（例えば、ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル基、ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル基、ｐ−ビフェニルイソプロピルオキシカルボニル基、ｔ−ブトキシカルボニル基）またはウレア型置換基（例えば、メチルアミノカルボニル基、フェニルカルボニル基、シクロヘキシルアミノカルボニル基）等によって置換されたもの、並びに
（２）タンパク質のカルボキシル末端（Ｃ末端）のカルボキシル基または各アミノ酸の側鎖のカルボキシル基の一部もしくは全部が、エステル型の修飾を受けているもの（例えば、その水素原子がメチル、エチル、イソプロピル、シクロヘキシル、フェニル、ベンジル、ｔ−ブチル、４−ピコリルにより置換されたもの）、アミド型の修飾を受けているもの（例えば、非置換アミド、Ｃ１−Ｃ６アルキルアミド（例えば、メチルアミド、エチルアミド、イソプロピルアミド）を形成しているもの、並びに
（３）タンパク質の各アミノ酸の側鎖のアミノ基およびカルボキシル基以外の官能基（例えば、水素基、チオール基、アミノ基等）の一部もしくは全部が、上述のアミノ基と同様の置換基あるいはトリチル基などで修飾されたもの等が挙げられる。
【００２９】
本発明によるタンパク質の例としては、配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質（本明細書において「ｐ１４０ｍＤｉａ」という）およびその誘導体が挙げられる。配列番号１のアミノ酸配列は、マウス脳および胚由来のｃＤＮＡライブラリーから得られたＤＮＡ配列（ｃＤＮＡ配列）から決定されたものである。このｃＤＮＡライブラリーは、市販のものまたは Kakizuka, A. et al. (1993), cDNA Libraty Construction (Stein, C. およびHolland, P. 編集） Essential Developmental Biology : A Practical Approach, pp223-232, IRL Press, Oxford に記載されたものを使用できる。また、ｃＤＮＡ配列は、図３の太い下線（クローン５０）に対応するオリゴヌクレオチドをプローブとして用いることによって得ることができる。
【００３０】
また、本発明によるタンパク質の例としては、配列番号１のアミノ酸配列からなり、前記配列番号１のアミノ酸配列に１以上のアミノ酸配列が付加および／または挿入され、および／または前記配列番号１のアミノ酸配列の１以上のアミノ酸が置換および／または欠失されたタンパク質であって、活性型Ｒｈｏタンパク質結合能を有し、かつプロフィリン結合能を有するものが挙げられる。すなわち、ここにいう付加(addition)、挿入(insertion) 、置換(substitution)、および欠失(deletion)とは、配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質の活性型Ｒｈｏタンパク質結合能およびプロフィリン結合能を損なわない（not damage）ようなものをいう。
【００３１】
本発明の別の面によれば、配列番号１の６３〜２６０番のアミノ酸配列（Ｒｈｏタンパク質結合領域）と５７１〜７３７番のアミノ酸配列（プロフィリン結合領域）とを有するタンパク質が提供される。
【００３２】
本発明によるタンパク質は、活性型Ｒｈｏタンパク質結合能とプロフィリン結合能とを有するものである。また、Ｒｈｏタンパク質は腫瘍の形成、転移をはじめとして細胞形態、細胞運動、細胞接着、細胞質分裂等の細胞の機能発現に密接にかかわっている（前掲Takai, Y., et al. 、G.C.Prendergast.et al.、Khosravi-Far, R., et al ．、R. Qiu et al. 、 Lebowitz 、P., et al., およびYoshioka,K.et al. ）。従って、本発明によるタンパク質は、腫瘍の形成および転移の機構解明に有用であると考えられる。
【００３３】
また、後記実施例によれば、本発明によるタンパク質は、細胞接着に関与することが示された。従って、本発明によるタンパク質は、ガンの細胞の浸潤および転移、白血球（Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、好中球、好酸球、好塩基球、マクロファージ等）の凝集および活性化、並びに血小板の凝集および活性化等の機能解明に有用である。
【００３４】
更に、後記実施例によれば、本発明によるタンパク質は、細胞分裂（特に、細胞の増殖）に関与することが示された。従って、本発明によるタンパク質は、ガンの増殖等の機能解明に有用である。
【００３５】
塩基配列
本発明によれば、本発明によるタンパク質をコードする塩基配列が提供される。この塩基配列の典型的配列は、配列番号２のＤＮＡ配列の一部または全部を有するものである。
【００３６】
配列番号２のＤＮＡ配列は、前記のように、マウス脳由来のｃＤＮＡライブラリーから得られたものである。配列番号２の９４〜３８６１番の配列が、ｐ１４０ｍＤｉａのオープンリーディングフレームに相当する。
【００３７】
本発明によるタンパク質のアミノ酸配列が与えられれば、それをコードする塩基配列は容易に定まり、配列番号１に記載されるアミノ酸配列をコードする種々の塩基配列を選択することができる。従って、本発明によるタンパク質をコードする塩基配列とは、配列番号２に記載のＤＮＡ配列の一部または全部に加え、同一のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列であって縮重関係にあるコドンをＤＮＡ配列として有する配列をも意味するものとし、更にこれらに対応するＲＮＡ配列も含まれる。
【００３８】
本発明による塩基配列は、天然由来のものであっても、全合成したものであってもよい。また、天然物由来のものの一部を利用して合成を行ったものであってもよい。塩基配列は、染色体ライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーから遺伝子工学の分野で慣用されている方法、例えば部分アミノ酸配列の情報を基にして作成した適当なＤＮＡプローブを用いてスクリーニングを行う方法、等によって得ることができる。本発明による塩基配列は、マウス由来のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって得ることができる。このｃＤＮＡライブラリーは、市販のものを使用できる。また、スクリーニングは、図３の太い下線（クローン５０）に対応するオリゴヌクレオチドをプローブとして用いることによって実施することができる。
【００３９】
塩基配列が天然由来のものである場合、その起源は特に限定されず、マウスを含むホ乳類由来のものであっても、それ以外を由来とするものであってもよい。
【００４０】
本発明によるタンパク質をコードする塩基配列の例は、配列番号２の塩基配列および配列番号２のＤＮＡ配列の一部（例えば、配列番号２の９４〜３８６１番（オープンリーディングフレームに相当）、２８０〜８７３番（Ｒｈｏタンパク質結合領域に相当）、および１８０４〜２３０４番（プロフィリン結合領域に相当）のＤＮＡ配列）である。
【００４１】
ベクターおよび宿主細胞
本発明によれば、前記の本発明による塩基配列を、宿主細胞内で複製可能でかつその塩基配列がコードするタンパク質を発現可能な状態で含んでなるベクターが提供される。更に、本発明によれば、このベクターによって形質転換された宿主細胞が提供される。この宿主−ベクター系は特に限定されず、また、他のタンパク質との融合タンパク質発現系などを用いることができる。融合タンパク質発現系としては、ＭＢＰ（マルトース結合タンパク質）、ＧＳＴ（グルタチオンＳトランスフェラーゼ）、ＨＡ（ヘマグルチニン）、ポリヒスチジン、ｍｙｃ、Ｆａｓ等を用いたものが挙げられる。
【００４２】
ベクターとしては、プラスミドベクター（例えば、原核細胞、酵母、昆虫細胞動物細胞等での発現ベクター）、ウイルスベクター（例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、センダイウイルスベクター、ＨＩＶベクター、バキュロウイルスベクター）、リポソームベクター（例えば、カチオニックリポソームベクター）等が挙げられる。
【００４３】
本発明によるベクターは、これを実際に宿主細胞に導入して所望のタンパク質を発現させるためには、前記の本発明による塩基配列の他に、その発現を制御する配列や宿主細胞を選択するための遺伝子マーカー等を含んでいてもよい。また、このベクターは、本発明による塩基配列を反復した形で（例えば、タンデムで）含んでいてもよい。これらは常法に従いベクターに存在させてよく、このベクターによる宿主細胞の形質転換の方法も、この分野で慣用されているものを用いることができる。
【００４４】
本発明によるベクター構築の手順および方法は、遺伝子工学の分野で慣用されているものを用いることができる。
【００４５】
また、宿主細胞としては、例えば、大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞（例えば、ＣＯＳ細胞、リンパ球、繊維芽細胞、ＣＨＯ細胞、血液系細胞、腫瘍細胞等）が挙げられる。
【００４６】
上記形質転換された宿主細胞を適当な培地で培養し、その培養物から上記した本発明によるタンパク質を得ることができる。従って、本発明の別の態様によれば、本発明によるタンパク質の製造法が提供される。形質転換された宿主細胞の培養およびその条件は、使用する細胞についてのそれと本質的に同様であってよい。また、培養液からの本発明によるタンパク質の回収、精製も常法に従って行うことができる。
【００４７】
スクリーニング法
本発明によれば、
（１）スクリーニングの対象となる物質を、活性型Ｒｈｏタンパク質と、本発明によるタンパク質とを含むスクリーニング系に存在させ、そして
（２）活性型Ｒｈｏタンパク質と、本発明によるタンパク質との結合の阻害の程度を測定すること
を含む、活性型Ｒｈｏタンパク質と、本発明によるタンパク質との結合を阻害する物質のスクリーニング法が提供される。
【００４８】
本発明によれば、また、
（１）スクリーニングの対象となる物質を、プロフィリンと、本発明によるタンパク質とを含むスクリーニング系に存在させ、そして
（２）プロフィリンと、本発明によるタンパク質との結合の阻害の程度を測定すること
を含む、プロフィリンと、本発明によるタンパク質との結合を阻害する物質のスクリーニング法が提供される。
【００４９】
ここで、「結合の阻害の程度を測定する」方法としては、本発明によるタンパク質に対する抗体によるイムノブロットを用いて測定する方法、ツー・ハイブリッド・システム（two hybrid system ）（M.Kawabata 実験医学13,2111-2120(1995)、 A.B.Vojetk et al.Cell 74,205-214(1993) ）による方法、オーバーレイ・アッセイを用いて測定する方法（Ishizaki, T. et al., EMBO J., 15, 1885-1893 (1996)）、インビトロ翻訳させたタンパク質を用いて測定する方法（Shibata, H. et al., FEBS Lett. 385, 221-224 (1996)）、Amano, M., et al., Science 271, 648-650 (1996)に記載された無細胞系での結合測定法等が挙げられ、例えば、実施例１、５、および６に記載される方法に準じて結合の阻害の程度を測定することができる。
【００５０】
本明細書において「結合の阻害の程度を測定する」とは結合の有無の測定を含む意味で用いられるものとする。また、「スクリーニング」とは、アッセイを含む意味で用いられる。
【００５１】
スクリーニング系は細胞系または無細胞系のいずれであってもよく、細胞系としては、例えば、酵母細胞、ＣＯＳ細胞、大腸菌、昆虫細胞、線虫細胞、リンパ細胞、繊維芽細胞、ＣＨＯ細胞、血液系細胞、および腫瘍細胞が挙げられる。
【００５２】
スクリーニングの対象となるものは、特に限定されないが、例えばペプチド、ペプチドのアナログ、微生物培養液、有機化合物等が挙げられる。
【００５３】
抗体
本発明による抗体は、当業界において通常用いられる方法によって製造することができる。例えば、図３の太線で示されるペプチドを、任意の担体（例えば、ウシ血清アルブミン）とともに動物体内（例えば、ウサギ、ヤギ、ラット、マウス、ヒツジ）に注射し、一定期間の後に、その動物の血清を精製することによって得ることができる。
【００５４】
図３の太線で示されるペプチドは、ｐ１４０ｍＤｉａの一部である。従って、このポリクローナル抗体の反応（すなわち、免疫反応）は、ｐ１４０ｍＤｉａの存在の１つの指標となる。従って、本発明のもう一つの面によれば、上記抗体によって認識されるタンパク質、および本発明によるタンパク質であって上記抗体によって認識されるものが提供される。
【００５５】
また、本発明の更にもう一つの面によれば、
（１）検出の対象となる物質を本発明による抗体を含む検出系に存在させ、そして
（２）検出の対象となる物質と本発明による抗体との反応の程度を測定することを含む、本発明による抗体によって認識される物質の検出法が提供される。
【００５６】
本発明による抗体との反応の程度を測定する方法としては、ＥＬＩＳＡ法、ラジオイムノアッセイ法、ウェスタンブロッティング法、免疫沈降法、および蛍光抗体法（例えば、単クローン抗体実験マニュアル、講談社、（１９８７年））等が挙げられ、例えば、実施例４〜６に記載される方法に準じて反応の程度を測定することができる。また、本発明において「反応の程度を測定する」とは、反応の有無を測定することをも含む。
【００５７】
本発明による検出法における検出系は、本発明によるポリクローナル抗体に加えて、例えば、ラテックス粒子等を含んでいてもよい。
更に、本発明によれば、本発明による抗体を含んでなる、前記抗体と特異的に反応する物質の検出キットが提供される。ここで「検出キット」には、本発明によるタンパク質が関与する疾患等の検出試薬並びに診断試薬や診断キットも含まれるものとする。
【００５８】
本発明による検出法の具体例としては、
（１）検出の対象となる物質を本発明による抗体を担持してなるラテックス粒子を含む検出系に存在させ、そして
（２）前記ラテックス粒子の凝集反応の程度を測定すること
を含む、前記抗体と特異的に反応する物質の検出法が挙げられる。
ラテックス粒子の凝集反応の程度は、例えば、比濁法、比ろう法のような光学的測定法によって測定することができる。
【００５９】
本発明による検出キットは、上記検出系と同様に、ラテックス粒子を含んでいてもよい。この場合、ラテックス粒子は抗体をその表面上に担持していてもよい。
また、更にラテックス粒子を含む本発明による検出キットは、前記した検出法の具体例に示されるような態様で用いることができる。
検出の対象となる物質としては、ヒトを含む動物由来の体液（例えば、血清、血液等）、尿、便、組織切片、細胞（例えば腫瘍細胞等）等が挙げられる。
【００６０】
本発明によるポリクローナル抗体と反応する物質としては、本発明によるタンパク質（配列番号１の配列）が挙げられる。
【００６１】
【実施例】
実施例１ 酵母ツー・ハイブリッド・システムを用いたＲｈｏＡ結合ペプチド断片のスクリーニング
ＬｅｘＡ ＤＮＡ結合タンパク質に融合したＮ１９−ＲｈｏＡ△Ｃ（Ｃ−末端のＡｌａ181 においてトランケートしたＲｈｏＡAsn19 ）をバイトとして使用して、酵母のツー・ハイブリッド・システムにより、新規なＲｈｏ結合タンパク質をスクリーニングした。酵母のツー・ハイブリッド・システムは、既に記載の方法（Vojtek, A. et al., Cell 74, 205-214 (1993); Modaule, P. et al., FEBS Lett., 377, 243-248 (1995); Watanabe, G. et al., Science 271, 645-648 (1996); Reid, T. et al., J. Biol. Chem., 271, 13556-13560 (1996)）に準じて実施した。
【００６２】
ツー・ハイブリッド・システムに使用したプラスミドｐＢＴＭ１１６およびｐＶＰ１６（Vojtek, A. et al., Cell 74, 205-214 (1993)）は、Stan Hollenberg 、Rolf Sternglanz 、Stan Fields およびPaul Bartel より入手した。ｐＢＴＭ−ＲｈｏＡ（ＲｈｏＡをコードするｃＤＮＡを含むｐＢＴＭ１１６）は、過去に記載された方法（Watanabe, G. et al., Science, 271, 645-648 (1996) ）に従って調製した。ＲｈｏＡ上にＶａｌ１４またはＡｓｎ１９変異を生じさせるために、ＲｈｏＡのＮ末端をコードするｐＧＥＸ−ＲｈｏＡのＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＶ断片をｐＢｌｕｅｓｃｉｐｔ（ストラタジーン社）中に挿入し、Kunkelの方法（Kunkel, T., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488-492 (1985)）に従って変異誘発させた。次いでｐＧＥＸ−ＲｈｏＡ（Morii, N. et al., J. Biol. Chem., 268, 27160-27163 (1993) ）の対応する野生型断片を各変異誘発断片と置換し、ｐＧＥＸ−Ｖ１４ＲｈｏＡおよびｐＧＥＸ−Ｎ１９ＲｈｏＡを作製した。
【００６３】
ｐＧＥＸ−Ｖ１４ＲｈｏＡおよびｐＧＥＸ−Ｎ１９ＲｈｏＡより変異体ＲｈｏＡの全長のコーディング領域をコードするＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ断片を切り出した後、ｐＢＴＭ１１６の中に挿入して、ｐＢＴＭ−Ｖ１４ＲｈｏＡおよびｐＢＴＭ−Ｎ１９ＲｈｏＡを得た。これらの変異体のＡｌａ１８１におけるＣ−末端の欠失変異体を挿入したｐＢＴＭ１１６（ｐＢＴＭ−Ｖ１４ＲｈｏＡ△ＣおよびｐＢＴＭ−Ｎ１９ＲｈｏＡ△Ｃ）は、過去に記載された方法（Reid, T. et al., J. Biol. Chem., (1996) ）に従って調製した。
【００６４】
ｐＢＴＭ−Ｎ１９ＲｈｏＡ△Ｃを有する酵母Ｌ４０株（MATa trp1 leu2 his3 LYS::lexA-HIS3 URA3::lexA-lacZ）（Vojtek, A. et al., Cell 74, 205-214 (1993)）を、マウス胚ｃＤＮＡライブラリー（Kakizuka, A. et al. (1993), cDNA Libraty Construction (Stein, C.およびHolland, P. 編集）Essential Developmental Biology : A Practical Approach, pp223-232, IRL Press, Oxford）と融合したｐＶＰ１６（Vojtek, A. et al., Cell 74, 205-214 (1993)）で形質転換した。初期の形質転換効率は２．２×１０7 であり、これはＨＩＳ（−）プレート上に播く前に６時間培養する間に７回分裂したことを意味する。１．５×１０8 の形質転換体の内、９７８クローンをＨｉｓ＋およびｌａｃＺ陽性として単離し、そして２２０クローンを分離してバイトプラスミドを排除した。種々の被験バイトを有する酵母株ＡＭＲ７０との交配により、他のタンパク質との相互作用を評価した。２２０クローンの中で、５５クローンはＮ１９−ＲｈｏＡ△Ｃで陽性のｌａｃＺ活性を示し、陰性の対照として使用したラミンでは陰性を示した。この手法により単離した５５クローンは、同一のサイズのｃＤＮＡインサートを有し、それらのいくつかを配列決定した結果、同一のヌクレオチド配列を有することが見出された。
【００６５】
これらのクローンを種々のＲｈｏＡ変異体に融合したＬｅｘＡを有するＡＭＲ７０に交配した。それらのすべてはＲｈｏＡVal14 と強く、ＲｈｏＡAsn19 と弱く、そして野生型ＲｈｏＡとはほとんど無視できるほどに弱く結合したが、それらはＮ１９−ＲｈｏＡ△Ｃまたは野生型ＲｈｏＡ△Ｃと強く結合した。同様の結果が、下記の実験によっても確認された。
【００６６】
ツー・ハイブリッド・システムにおける相互作用の特異性を試験するために、酵母のクローン５０から回収されたｐＶＰ１６プラスミド（ｐＶＰ−ｃｌ．５０）を種々のタンパク質のｃＤＮＡを有するｐＢＴＭ１１６プラスミドとともにＬ４０株の中に共形質転換し、相互作用をｌａｃＺアッセイにより試験した。実験に用いたｐＢＴＭ−ＲｈｏＡ△およびｐＢＴＭ−ラミン（Watanabe, G. et al., Science 271, 645-648 (1996)）、ｐＢＴＭ−ＲａｃおよびｐＢＴＭ−Ｃｄｃ４２Ｈ（Reid, T. et al., J. Biol. Chem., 271, 13556-13560 (1996)）の調製については、過去に記載されている。
【００６７】
その結果、結合の特異性は、代表的なクローン（クローン５０）から回収されたプラスミド、および種々のＬｅｘＡ−変異体ＲｈｏＡ融合構築物とでＬ４０株を共形質転換させることによって確認された（図１）。すなわち、クローン５０）から回収されたプラスミドとＬｅｘＡーＲａｃ融合構築物またはＬｅｘＡーＣｄｃ４２Ｈ融合構築物とでＬ４０株を共形質転換させたところ、このクローンによりコードされるペプチドはＲａｃおよびＣｄｃ４２Ｈいずれにも特異的に結合しないことがわかった。これらの結果は、このクローンによりコードされるペプチドがＲｈｏＡに特異的に結合することを示している。
【００６８】
実施例２ ｐ１４０ｍＤｉａの全長のｃＤＮＡのクローニング
全長のコーディング配列を得るために、本発明者はプローブとしてクローン５０より得られた０．６ＫｂｐのｃＤＮＡインサート（ｐＶＰ−ｃｌ．５０の32Ｐ標識化０．６ｋｂｐのｃＤＮＡインサート）を使用して、２つのマウス脳ライブラリー（λＺＡＰ ＩＩ中に作製した９３６３０９ライブラリー（ストラタジーン社）およびλｇｔ−１０中に作製したＭＬ３０００ａライブラリー（クロンテック社））をスクリーニングし、次いでこのスクリーニングから得られた２つのｃＤＮＡ断片をプローブとして使用してマウス胚ライブラリー（Kakizuka, A. et al. (1993), cDNA Libraty Construction (Stein, C.およびHolland, P. 編集）Essential Developmental Biology : A Practical Approach, pp223-232, IRL Press, Oxford）をスクリーニングした。
【００６９】
この手法により、６つのオーバーラップするクローンが単離された（図２）。１つの陽性のクローン（クローン５０２）、および２つの陽性のクローン（クローン５０３および５０４）が、それぞれ、前者および後者のライブラリーから得られた。５０４の５’部分および５０３の３’部分をプローブとして、クローンＥ５１、Ｅ５２、およびＥ７３がマウス胚ライブラリーから単離された。
【００７０】
これらのクローンのヌクレオチド配列をジデオキシ・チェーン・ターミネーション法により決定したところ、計算上１３９，３３６Ｄａの分子量をもつ１，２５５アミノ酸のタンパク質をコードする３，７６５ｂｐのオープンリーディングフレームを含むこれらのクローンから、完全なｃＤＮＡ配列が決定された（図３）。クローン５０から得られた初期のｃＤＮＡは、Ｎ末端部分のＲｈｏ結合ドメインを含む１９８アミノ酸配列（アミノ酸６３−２６０）をコードする。分子中央のアミノ酸５７１−７３７の間には、ＩＰＰＰＰＰＬＰＧ（Ｇ／Ｓ／Ａ／Ｖ）の１４回繰り返し構造、即ち相同配列により特徴づけられるプロリンに富んだ領域が存在する。推定アミノ酸配列とデータベース上の他の配列とを比較すると、いくつかの相同タンパク質が同定され、それらのすべてはプロリンに富んだ領域を共有する（図４）。これらのタンパク質は、２つの相同領域、すなわち、プロリンに富んだＦＨ−１領域およびＦＨ−２領域を有するフォルミン様分子のファミリーに属する。ＦＨ−２領域は、また、推定配列中のアミノ酸９４５−１０１０の間にも見出された。この配列に対して最も相同性が高いタンパク質はショウジョウバエ（Drosophila）のディアファノス（diaphanous: 細胞質分裂に必要とされることで特徴づけられたタンパク質）であり、これは同定されたタンパク質に対してＮ−末端のプロリンに富む領域において約３０％の同一性およびその領域のＣ−末端の領域において約３９％の同一性を示した。それは、また、それぞれの推定Ｒｈｏ結合ドメインおよびＦＨ−２領域において、同定されたタンパク質に対して約３２％および５７％のホモロジーを示した。これらの結果に基づいて、本発明者が同定したタンパク質はショウジョウバエのディアファノスタンパク質の哺乳類のホモローグであると結論し、このタンパク質をｐ１４０ｍＤｉａ（哺乳類のディアファノス（ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｄｉａｐｈａｎｏｕｓ））と命名した（以降「ｐ１４０ｍＤｉａ」と呼ぶ）。
【００７１】
ｐ１４０ｍＤｉａは、また、酵母（Saccharomyces cerevisiae）細胞の出芽に関与するＢｎｉ１ｐの全体領域に対して有意なホモロジーを示した。他方、ｐ１４０ｍＤｉａはフォルミンおよびショウジョウバエのカプシノ（ capuccino）に対してＣ末端側の半分の領域においてホモロジーを示した。ｐ１４０ｍＤｉａのＲｈｏ結合ドメインはＮ末端側の部分にマップされた（前述）が、Ｒｈｏ結合ドメインに類似する配列はフォルミンやカプシノには見い出されなかった。このことより、これらのタンパク質（Ｒｈｏ結合ドメインを含まないフォルミンおよびカプシノ）は細胞内で同定されたタンパク質と同様な機能を発揮するが、ｐ１４０ｍＤｉａ、ディアファノスおよびＢｎｉｌｐのみがＲｈｏ依存的な様式で機能を発揮することが示唆された。
【００７２】
実施例３ ｐ１４０ｍＤｉａを発現する組織の検索
ｐ１４０ｍＤｉａを発現する組織を検索するため、ノザンブロット解析を実施した。成熟マウスのいくつかの組織からオリゴ−ｄＴラテックスビーズ（ファルマシア・バイオテック社）を使用して標準的手法（Sambrook, J. et al. (1989) Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor）に従い、ポリ（Ａ）+ ＲＮＡを調製した。６μｇの各ポリ（Ａ）+ ＲＮＡを２．１％ホルムアルデヒドを含有する１．０％アガロースゲル上で分離し、そしてＢｉｏｄｙｎｅ Ａ フィルター（Pall BioSuport社）に移した。次いでフィルターを32Ｐ標識化ｃｌ．５０の０．６ＫｂｐのｃＤＮＡ断片とハイブリダイゼーションさせた。最後に、フィルターを０．４×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳで６５℃において洗浄し、オートラジオグラフィーにかけた。
【００７３】
その結果、主要な６．３ｋｂの転写物が、試験したすべての組織において普遍的に（ubiquitously）検出されたが、肺、睾丸、胸腺、肝臓および胃においては特に強い発現が検出された。また、睾丸および肺において、５ｋｂのもうひとつの別の転写物が見出された（図５）。
【００７４】
実施例４ 抗ｐ１４０Ｄｉａ抗体の調製
細胞におけるｐ１４０ｍＤｉａの局在化および他のタンパク質との結合を検討するために、クローン５０のｃＤＮＡによりコードされるペプチド（配列番号１の６３〜２６０番のアミノ酸配列を含む）をＨｉｓ標識化タンパク質として発現させ、このペプチドに対する抗体を調製することにより、ｐ１４０ｍＤｉａに対する特異的な抗体を得た。具体的には下記の方法に従って、実験を実施した。
【００７５】
ｐＶＰ−ｃｌ．５０のｃＤＮＡインサートに近接するＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ部位を使用して、ｃｌ．５０ｃＤＮＡをｐＱＥ１１（ＱＩＡＧＥＮ社）およびｐＧＥＸ−３Ｘ（ファルマシア社）ベクターの中に結合した。Ｈｉｓ６標識化ｃｌ．５０を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９株において発現させ、そしてこれをＮｉ−ＮＴＡ樹脂（ＱＩＡＧＥＮ社）で製造業者のプロトコールに従い精製した。精製されたタンパク質をフロインドアジュバントと混合し、ウサギに注射した。Reid, T. et al., J. Biol. Chem., 271, 13556-13560 (1992)に記載されている方法に従って、ニトロセルロース膜上に固定化されたＧＳＴ−ｃｌ．５０融合タンパク質を用いて抗体をアフィニティー精製した。具体的には、ＧＳＴ−ｃｌ．５０を含有する封入体（inclusion body）を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から単離し、レムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）バッファー中で可溶化し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ニトロセルロース膜に移した。ＧＳＴ−ｃｌ．５０のバンドをストリップとして切り出し、このストリップに吸収された抗体を４℃において１００ｍＭ グリシン−ＨＣｌバッファー（ｐＨ２．３）、１００ｍＭ モノエタノールアミンバッファー（ｐＨ１１．５）、および１０％の１，４−ジオキサンを含有する１００ｍＭ グリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．５）で連続的に溶出した。溶出液を直ちに０．２５倍容量の２５０ｍＭ リン酸ナトリウムバッファーで中和した（第１および第３の溶出液についてｐＨ８．８、そして第２溶出液についてｐＨ７．０）。これらの溶出液を一緒にし、アフィニティー精製した抗体ＡＰ５０として使用した。対照の免疫蛍光試験のために、ＡＰ５０のアリコートを連続的に５片のＧＳＴ−ｃｌ．５０ブロット膜とインキュベートすることによって、抗体を除去したＡＰ５０溶液を調製した。
【００７６】
得られたポリクローナル抗体ＡＰ５０の特異性は、期待される分子量である５０ｋＤａのタンパク質、およびＩＰＴＧ誘導後の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ライゼート中に見出されるその分解産物との反応性により確認された（図６、レーン１および２）。ＡＰ５０抗体はＳｗｉｓｓ ３Ｔ３細胞ライゼートにおいて約１６０ｋＤａの単一のタンパク質を検出し、このタンパク質は明らかに内在性のｐ１４０ｍＤｉａを示している（レーン３および４）。
【００７７】
実施例５ インビトロにおけるＲｈｏタンパク質とｐ１４０ｍＤｉａの結合の 検出
ＡＰ５０抗体を使用して、野生型Ｒｈｏファミリー低分子量Ｇタンパク質と天然ｐ１４０ｍＤｉａの結合についてin vitroにおいて検討した。具体的には下記に記載の方法に従って実験を実施した。
【００７８】
ＧＤＰまたはＧＴＰ結合型のＧＳＴ−低分子量Ｇタンパク質（ＧＳＴ−Ｒｈｏ、ＲａｃおよびＣｄｃ４２Ｈ）の調製は、過去に記載の方法（Reid, T. et al., J. Biol. Chem., 271, 13556-13560 (1992)）に従って実施した。ほぼ１×１０7 細胞のコンフルエントＳｗｉｓｓ ３Ｔ３細胞を集め、３．２ｍｌのバッファーＡ［１０ｍＭ Ｍｅｓ（ｐＨ６．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ2 、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ トリトンＸ−１００、５ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＰＭＳＦ、５μｇ／ｍｌ ロイペプチン］中で超音波処理（５秒、４回）することにより破壊した。超音波処理したホモジネートを１０，０００ｇにおいて２０分間遠心し、上清を取り置いた。過去に記載された方法（Ishizaki, T. et al., EMBO J., 15, 1885-1893 (1996)）に従って、１０μＭ ＧＳＴ−低分子量Ｇタンパク質を１ｍＭ ヌクレオチドとインキュベートすることによって、各ヌクレオチドのロードを実施した。次いで上清の１／１０量を４００ｐｍｏｌのＧＴＰγＳまたはＧＤＰをロードした各ＧＳＴ−低分子量Ｇタンパク質とインキュベートした。３０℃において３０分インキュベートした後、５μｌのグルタチオン−セファロースを溶液に添加し、この混合液を４℃において１時間インキュベートした。遠心により回収された免疫複合体を１ｍｌのバッファーＡで２回洗浄し、レムリ試料バッファー中で煮沸した。可溶化抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥに付し、分離されたタンパク質をＰＶＤＦ膜に移した。過去に記載された操作（Kumagai, N. et al., J. Biol. Chem., 268, 4535-24538 (1993)）に従い、抗ｃｌ．５０抗血清ＡＰ５０を使用してイムノブロッティングを実施した。
【００７９】
結果は、図７に示したとおりであった。ｐ１４０ｍＤｉａはＧＴＰγＳ結合型Ｒｈｏによってのみ沈降したが、そのＧＤＰ結合型Ｒｈｏ、またはＧＴＰγＳ結合型ＲａｃまたはＣｄｃ４２によっては沈降しなかった。これらの結果はツー・ハイブリッド・システムにおける結果を支持し、ｐ１４０ｍＤｉａが活性型Ｒｈｏと選択的に結合することを示している。
【００８０】
実施例６ インビトロにおけるプロフィリンとｐ１４０ｍＤｉａの結合の検出ｐ１４０ｍＤｉａはポリ−プロリンのストレッチの繰り返し構造を有し、かつプロフィリンはポリ−Ｌ−プロリン配列に結合することが示されている。そこで、本発明者はプロフィリンがｐ１４０ｍＤｉａに結合するかどうか、この結合がＲｈｏに依存するかどうかを検討した。具体的には下記に記載の方法に従って、実験を実施した。
【００８１】
まず、過去に記載された方法（Janmey, P.A., Ann. Rev. Physiol., 56, 169-191 (1994)）に従って、ヒト血小板プロフィリンをポリ−Ｌ−プロリンアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。具体的には、２５０ｍｇのポリ−Ｌ−プロリン（ＰＬＰ、分子量１２，０００、シグマ社）をＣＮＢｒ活性化セファローズ４Ｂ（ファルマシア社）に結合させた。過去に記載されている方法（Ishizaki, T. et al., EMBO J., 15, 1885-1893 (1996)）に従って、１００単位の血液のバッフィーコート画分から、洗浄したヒト血小板を調製した。血小板を２００ｍｌの抽出バッファー［２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ ＫＣｌ、０．２ｍＭ ＡＴＰ、１ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＰＭＳＦ］＋５０ｍＭ ベンズアミジンおよび１ｍｇ／ｍｌ アプロチニン中で超音波処理により破壊した。１００，００００×ｇで時間遠心した後、上清をＰＬＰ−セファロースカラムに適用した。これを４Ｍ尿素で洗浄後７Ｍ尿素で溶出することによりプロフィリンの均質調製物が得られた。次いで、０．９６ｍｇのプロフィリンを製造業者のプロトコールに従い１ｍｌのＮＨＳ活性化セファロース（ファルマシア社）と複合化させ、固定化プロフィリン・ビーズを得た。対照として、ウシ血清アルブミンを同様にＮＨＳ活性化セファロースに結合させた。
【００８２】
１２枚の６ｃｍの培養皿から得られたコンフルエントＳｗｉｓｓ ３Ｔ３細胞を２．４ｍｌのバッファーＣ中で可溶化し、ライゼートを１０，０００×ｇにおいて１０分間遠心し、上清を回収した。次いで、得られた上清の１／１０量のアリコートを、ＧＳＴ−低分子量Ｇタンパク質または遊離ＧＴＰγＳまたはＧＤＰの存在下または非存在下においてインキュベートした。また、２０μｌの固定化されたプロフィリンを添加した。混合液を２５℃において３０分間インキュベートした後、ビーズを１，０００×ｇで２分間遠心した。上清を取り置き、ビーズを１００ｍＭ ＮａＣｌの代わりに３００ｍＭ ＮａＣｌを含有するバッファーＣ（１００μｌ）で１回洗浄した。５０μｌのレムリ試料バッファーをビーズに添加し、上清の１／１０量をこれの１／５倍容量の５×レムリバッファーと混合した。試料を煮沸し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、ニトロセルロース膜に移した。イムノブロッティングを前述したように実施し、検出はＥＣＬシステム（アマシャム社）により実施した。
【００８３】
結果は図８に示したとおりであった。Ｓｗｉｓｓ ３Ｔ３細胞ライゼートにおけるｐ１４０ｍＤｉａはプロフィリン−アガロースの添加によりほとんど定量的に沈降したが、ＢＳＡ−アガロースでは沈降しなかった。一方、この結合は外からのＲｈｏＡの添加またはＧＴＰγＳの添加により影響を受けなかった。
【００８４】
実施例７ 広がって移動する細胞の膜の波打ち構造および分裂する細胞の分裂溝におけるＲｈｏＡ、ｐ１４０ｍＤｉａおよびプロフィリンの共局在化
ＨＴ１０８０培養ヒト線維芽肉腫細胞、Ｓｗｉｓｓ ３Ｔ３細胞、ｍｙｃ標識化ＲｈｏＡを安定的に発現するｓＭＤＣＫ２細胞（K. Takaishi, K. et al., Oncogene, 11, 39-48 (1995)）またはＨｅＬａ細胞において、ｐ１４０ｍＤｉａ、プロフィリンおよび内在性Ｒｈｏの分布およびそれらのインビボでの共局在化の可能性を、各タンパク質に対して特異的な抗体を使用した蛍光顕微鏡観察により検討した。
【００８５】
細胞を、１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）を補充したダルベッコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で増殖させた。ＨＴ１０８０細胞は５×１０4 細胞／３５ｍｍ皿の密度で播種し、一晩培養し、分析にかけた。ｓＭＤＣＫ２細胞の分析のために、カバーガラス上に１０％のＦＣＳを含有するＤＭＥＭ中の１×１０4 細胞／３５ｍｍ培養皿の密度で細胞を播種し、１６時間インキュベートした。次いで培地をＦＣＳを含まないＤＭＥＭに変え、２４時間インキュベートした。血清飢餓細胞を１×１０-7Ｍのホルボールエステル（phorbol myristate acetate : PMA ）の存在下または非存在下において１５分間３７℃において刺激し、固定した。
【００８６】
間接的免疫蛍光のために、３．７％ パラホルムアルデヒドを含有するリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で室温において２０分間細胞を固定し、次いで０．２％ トリトンＸ−１００を含むＰＢＳで１０分間で処理し透過性とした。ＰＢＳで数回洗浄した後、細胞を５％ ＢＳＡを含有するバッファーＢ［２０ｍＭＴｒｉｓ ｐＨ７．４、５０ｍＭ ＮａＣｌ］中で室温において３０分以上インキュベートした。ｐ１４０ｍＤｉａの染色のために、細胞をブロッキング溶液中のＡＰ５０の１：１０希釈物と室温において１時間インキュベートし、０．１％のトリトンＸ−１００を含有するバッファーＢで３回洗浄した。次いで細胞をＣｙ２標識化ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（Amersham Life Science 社）で染色した。アクチンの染色のために、ローダミンファロイジン（Molecular Probe 社）を第２抗体とともに１：２００希釈において添加した。Ｍｙｃ−エピトープの染色のために、９Ｅ１０モノクローナル抗Ｍｙｃ抗体を１０μｇ／ｍｌの濃度でＡＰ５０とともに１次インキュベーションのために添加した。次いでローダミン抗マウスＩｇＧ抗体を１：５０希釈で検出のために使用した。
【００８７】
結果は下記に記載したとおりであった。抗ｐ１４０ｍＤｉａ抗体により得られた蛍光の大部分は、ＨＴ１０８０細胞のより厚い部分、すなわち、核周辺の細胞質領域において局在化していた。しかしながら、顕著な蛍光は、また、高度に運動性であることが知られている周囲領域、例えば、広がって運動する細胞のリーディングラメラ（leading lamella ）および膜の波打ち構造（membrane ruffles）、においても観察された（図９Ａ）。核周囲の細胞質領域とリーディング・エッジ（leading edge）との間には、ｐ１４０ｍＤｉａの染色が顕著に欠如していた。ｐ１４０ｍＤｉａとフォーカル接着およびストレスファイバーとの結合は観察されなかった。上記と同様な分布のパターンは培養Ｓｗｉｓｓ ３Ｔ３細胞においても観察された（図９Ｅ）。
【００８８】
モノクローナル抗プロフィリン抗体（２Ｈ１１）を使用した二重免疫蛍光顕微鏡観察では、ＨＴ１０８０細胞の核周囲の細胞質領域および拡大しているラメラやベール（lamella an veils）におけるプロフィリンの蓄積が検出され、これはｐ１４０ｍＤｉａの分布と重複した（図９Ｂ）。このプロフィリンの分布はラット線維芽細胞において過去にされた結果（Buβ, F. et al., Cell Mot. Cytoskeleton, 22, 51-61 (1992) ）と一致した。興味あることには、プロフィリン抗体およびポリクローナル抗ＲｈｏＡ抗体を使用した二重免疫蛍光観察において、内在性ＲｈｏＡの一部分は、また、運動性細胞の膜ベールにおいてプロフィリンとともに蓄積することが明らかにされた（図９ＣおよびＤ）。このことから、ｐ１４０ｍＤｉａ、プロフィリンおよびＲｈｏＡが、細胞の高度な運動性構造に共局在化していることが示唆された。また、ｐ１４０ｍＤｉａの分布をＳｗｉｓｓ ３Ｔ３細胞で調べ、これをＦ−アクチンの分布と比較した。ｐ１４０ｍＤｉａはこの細胞でも、アクチン骨格（actin rib ）がよく発達した広がったラメラに局在していた（図９Ｅ、Ｆ）。
【００８９】
ｐ１４０ｍＤｉａ、プロフィリンおよびＲｈｏＡの共局在化は、また、ｍｙｃ標識化ＲｈｏＡを安定に発現し、ホルボールエステルに応答して膜を拡張するｓＭＤＣＫ細胞（Takaishi, K. et al., Oncogene, 11, 39-48 (1995) ）においても証明された。図１０に示すように、Ｍｙｃ−ＲｈｏＡおよびｐ１４０ｍＤｉａの双方は、休止細胞のより厚い部分における細胞質中にむしろ均質に存在した。ＰＭＡによる２分間の刺激の後、Ｍｙｃ−ＲｈｏＡの一部はｐ１４０ｍＤｉａが共局在化された膜の波打ち構造の周囲に移動した。プロフィリンの一部も膜の波打ち構造に移動し、ＲｈｏＡと共局在することが明らかになった。これらの細胞のホルボールエステルによる膜拡張の誘導はＲｈｏ依存的な様式で起こることが知られている（Takaishi, K. et al., Oncogene, 11, 39-48 (1995) ）ので、これらの結果はｐ１４０ｍＤｉａおよびプロフィリンのリクルートメント（recruitment ）もまた、Ｒｈｏ依存的であることを示唆している。
【００９０】
中間期（interphase）の細胞においては、ｐ１４０ｍＤｉａの大部分は細胞質中に存在し、あるものはスプレッディング・エッジの原形質膜へ移行している。他方、有糸分裂細胞においては、ｐ１４０ｍＤｉａの細胞内局在は、それらが細胞質分裂を行うまで、観察されなかった。この際、ｐ１４０ｍＤｉａの一部分は分裂溝部分の原形質膜に濃縮され、リング様構造物として見えた（図１１ＡおよびＣ）。この濃縮は細胞質分裂の終わりにおいて消失し、染色は原形質膜の取り囲む領域に移動した。娘細胞を接続している細胞間架橋部分には、染色は観察されなかった。プロフィリンはこれらのプロセスの間で、ｐ１４０ｍＤｉａとほとんど重複する染色パターンを示した（図１１Ｄ）。
【００９１】
実施例８ ＲｈｏＡおよびｐ１４０ｍＤｉａはフィブロネクチン（ＦＮ）コーティングされたビーズの周りにクラスター状に存在する
最近の研究において、Ｒｈｏ活性化および細胞外マトリックスタンパク質のインテグリンのライゲーション（ligation）の双方が細胞のスプレッディングおよび基質への接着のために必要であり（Hotchin, N.A. & Hall, A., J. Cell Biol., 131, 1857-1865 (1995)）、そしてフィブロネクチンまたは抗インテグリン抗体のいずれかでコーティングされたビーズによるインテグリンのライゲーションは、ビーズ直下の原形質膜にＲｈｏをリクルートすることが示されている（Burbelo, P. et al., J. Biol. Chem. 270, 30919-30926 (1995)）。そこで、ｐ１４０ｍＤｉａも、これらのビーズにより原形質膜にＲｈｏがリクルートされるかどうか、およびこのリクルートがＲｈｏ活性化に依存的かどうか、について検討した。
【００９２】
ポリスチレンラテックスのビーズ（１１．９μｍの平均直径、シグマ社）を５０μｇ／ｍｌ ヒトフィブロネクチン（Collabrative Research 社）または１００μｇ／ｍｌのポリ−Ｌ−リジン（シグマ社）に記載されているようにコーティングした（Grinnel & Geiger、Exp. Cell Res., 162, 449-461 (1986) ）。トリプシン処理したＳｗｉｓｓ ３Ｔ３細胞をポリ−リジンでコーティングしたガラススリップ上にプレートし、１０％のＦＣＳを含有するＤＭＥＭ中で３７℃で２時間かけてスリップに結合させた。次いで、各々異なる型のビーズを細胞上に置いた。３７℃において１５分間のインキュベーション後、細胞を固定した。ｐ１４０ｍＤｉａの染色は前述したように実施した。内在性ＲｈｏＡの免疫染色のために、ウサギ抗ＲｈｏＡ抗体（Santa Cruz社）を１：４０希釈において使用した。抗体を前述したようにＣｙ２標識化ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体を使用して可視化した。
【００９３】
結果は下記に記載したとおりであった。まず、内在性Ｒｈｏが、ポリ−リジンでコーティングされたビーズ直下ではなく（図１２ｄ）、フィブロネクチン（ＦＮ）でコーティングされたビーズ直下に蓄積されることを確認した（図１２ｂ）。この条件では、ｐ１４０ｍＤｉａもＦＮコーティングされたビーズ直下にリクルートされ、リング様の蓄積がビーズの周囲に観察された（図１２ａ）。上記結果（Ｒｈｏとｐ１４０ｍＤｉａ両方の蓄積）に加えて、細胞を予めＣ３菌体外酵素で処理した場合にはこれらの蓄積が阻害されたことから、これらのリクルートメントがＲｈｏ活性化依存的であることが判明した（データ省略）。
【００９４】
実施例９ ｐ１４０ｍＤｉａの過剰発現によるアクチン重合の誘導
ｐ１４０ｍＤｉａの機能を調べるため、過去に記載の方法（Ishizaki, T. et al., EMBO J., 15, 1885-1893 (1996)）に準じて、ｐ１４０ｍＤｉａのｃＤＮＡ（配列番号１の１〜１２５５番のアミノ酸配列）および／または他のタンパク質のｃＤＮＡをＣＯＳ７細胞で一過的に発現させた後、細胞を固定し、抗ｐ１４０ｍＤｉａ抗体で染色した。
【００９５】
トランスフェクト後４０時間目の細胞を抗ｐ１４０ｍＤｉａ抗体で染色したところ、よく染色され、ｐ１４０ｍＤｉａの発現が確認された。トランスフェクトしない細胞では核周辺に染色が観察された。これと比較すると、トランスフェクトした細胞では細胞の輪郭が明瞭にしかも均等に染色されたことから、ｐ１４０ｍＤｉａを過剰発現した場合にはこの分子が原形質膜全体に局在化することが示された（図１３Ａ）。ファロイジンで染色すると、ストレスファイバーが消失し、細胞の原形質膜に一致してアクチン染色が亢進されたことが観察された（図１３Ｂ）ことから、ｐ１４０ｍＤｉａは膜に移行し、そこでアクチンの重合を誘導することが示唆された。ｐ１４０ｍＤｉａをＣ３菌体外酵素とともに発現した場合にはより顕著な結果が得られた。即ち、Ｃ３菌体外酵素を単独でトランスフェクトすると、細胞からほとんど全てのアクチンファイバーが消失し細胞が球形化した（図１３Ｃ及びＤ）。ｐ１４０ｍＤｉａをＣ３菌体外酵素とともにトランスフェクトした時には、細胞は形態を維持し、ｐ１４０ｍＤｉａのみをトランスフェクトした細胞で観察されるのものと同様の繊維状アクチンの染色が観察された（データ省略）。
【００９６】
更に、ｐ１４０ｍＤｉａをＲｈｏVal14 又は野生型Ｒｈｏと共発現させた。ＲｈｏVal14 又は野生型Ｒｈｏを単独で発現させた場合には、ストレスファイバーや収縮の誘導が観察された。しかし、ｐ１４０ｍＤｉａをＲｈｏVal14 又は野生型Ｒｈｏと共発現させた場合には、上記に記載したｐ１４０ｍＤｉａ形質（ストレスファイバーの消失と細胞の原形質膜に一致したアクチン染色）がＲｈｏ単独によって誘導される形質（ストレスファイバーや収縮の誘導）よりも優勢に発現し、ストレスファイバーや収縮の誘導はほとんど観察されなかった（データ省略）。これらの結果から、ｐ１４０ｍＤｉａが過剰発現されると、原形質膜に自動的に移行する、すなわち、Ｒｈｏタンパク質によるアクチン重合とは独立して移行することを示唆している。
【００９７】
【配列表】
【００９８】
【図面の簡単な説明】
【図１】クローン５０とＲｈｏタンパク質とのツー・ハイブリッド・システムでの結合を示した写真である。Ｖａｌ、Ａｓｎ、ＷＴおよびＣｄｃ４２は、それぞれ、ＲｈｏＡVal14 、ＲｈｏＡAsn19 、野生型ＲｈｏＡおよびＣｄｃ４２Ｈｓを示している。ΔＡｓｎおよびΔＷＴは、Ａｌａ１８１でトランケートしたＲｈｏAsn19 および野生型ＲｈｏＡを示している。ラミン（Lamin ）および他のタンパク質と融合していないＬｅｘ結合ドメインを、ネガティブコントロールとして用いた。Ａｌａ１８１でトランケートしたＲｈｏＡVal14 は、他のタンパク質と融合していないＶＰ１６活性化ドメインとも結合して高ＬａｃＺ活性を示したので、この実験では使わなかった。
【図２】単離されたｐ１４０ｍＤｉａを模式的に示した図である。
ＯＲＦは点のボックスで示した。ヌクレオチド８７番目のＴからＣへの変換および２２２９番目のＣからＴへのヌクレオチドの変換が、それぞれ５０３およびＥ７３ｃＤＮＡ中に見出された。ライブラリーａ、ｂおよびＣは、それぞれマウス脳ライブラリー９３６３０９（ストラタジーン社）、ＭＬ３０００ａ（クロンテック社）およびマウス胚ライブラリーを示している。Ｅ７３ ｃＤＮＡには９アミノ酸の挿入が認められた。
【図３】ｐ１４０ｍＤｉａの推定アミノ酸配列を示した図である。ツー・ハイブリッド・システムで得られたクローンの配列は太い下線で、プロリンリッチ領域の繰り返し構造は点下線で、ＦＨ−２領域は細い下線で、それぞれ示した。矢じり印は９アミノ酸の挿入箇所を示している。
【図４】ｐ１４０ｍＤｉａおよびＦＨ領域を含む他の蛋白質との模式的な構造比較を示す。ｐ１４０ｍＤｉａの配列をDrosophilaの diaphanous 、S.cerevisiaeのＢｎｉ１ｐ、ラットｆｏｒｍｉｎ、およびDrosophilaのcappucino と比較した。比較は推定Ｒｈｏ結合領域（Ｒｈｏ-binding）、Ｎー末端からプロリンリッチ領域（poly-proline）、ＦＨ−２領域、プロリンリッチ領域からＣ末端領域で行った。アミノ酸の同一性は％で示した。フォルミンとカプチーノのＮー末端領域（＊で示した）はホモロジーが認められなかった。示した全ての配列は、中間部分にポリープロリンストレッチを持ち、Ｃ末端側の半分にホモロジーを持っている。
【図５】ノザンブロッティングによるマウスの種々の組織におけるｐ１４０ｍＤｉａの組織分布を示したＲＮＡブロット（電気泳動写真）である。
ｈｅａｒｔ：心臓、ｌｕｎｇ：肺、ｂｒａｉｎ：脳、ｋｉｄｎｅｙ：腎臓、ｔｅｓｔｉｓ：睾丸、ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ：骨格筋、ｔｈｙｍｕｓ：胸腺、ｓｐｌｅｅｎ：脾臓、ｌｉｖｅｒ：肝臓、ｓｔｏｍａｃｈ：胃、ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ：小腸、ｃｏｌｏｎ：結腸。
【図６】抗ｐ１４０ｍＤｉａ抗体の特異性を示した電気泳動写真である。
抗血清（ＡＰ５０）はツー・ハイブリッド・システムで得られたクローン５０がコードするペプチドに対するもので、その特異性を、ＩＰＴＧで誘導前（レーン１）および誘導後（レーン２）の組換えタンパク質を発現している大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の全ライゼート、あるいはＳｗｉｓｓ ３Ｔ３細胞（３Ｔ３ ｃｅｌｌｓ）の全ライゼート（レーン３）に対するウエスタンブロッティングにより検討した。レーン４は細胞の全ライゼートをＣＢＢ染色したものを示している。
【図７】ＧＴＰγＳ結合型Ｒｈｏタンパク質によるｐ１４０ｍＤｉａの沈降を示した電気泳動写真である。Ｓｗｉｓｓ ３Ｔ３細胞の全ライゼートを、ＧＴＰγＳ結合型あるいはＧＤＰ結合型のＧＳＴ−Ｒｈｏ、ＧＳＴ−Ｒａｃ、ＧＳＴ−Ｃｄｃ４２あるいはＧＳＴとともにインキュベートした。結合したタンパク質をグルタチオンアガロースビーズで沈降させ、抗ｐ１４０ｍＤｉａ抗体を用いたイムノブロッティングにより解析した。レーン９（cell lysates）では、細胞の全ライゼート中のｐ１４０ｍＤｉａを抗体で検出した。
【図８】ｐ１４０ｍＤｉａとプロフィリンのインビトロでの結合を示した電気泳動写真である。Ｓｗｉｓｓ ３Ｔ３細胞ライゼートを、ＧＴＰγＳ−またはＧＤＰ結合型のＧＳＴ−Ｒｈｏタンパク質の存在下または非存在下（none）で、プロフィリンあるいはＢＳＡをコンジュゲート（immobilized ）したアガロースビーズとインキュベートし、結合タンパク質を沈降させた。沈降物（Pellet）および上清（Supernatant ）は、抗ｐ１４０ｍＤｉａ抗体を用いてイムノブロッティングにより解析した。
【図９】広がった線維芽細胞の膜ラッフルでのＲｈｏＡとｐ１４０ｍＤｉａおよびプロフィリンの共局在を示した写真（生物の形態の写真）である。（Ａ−Ｄ）ＨＴ１０８０ヒト線維肉腫細胞。（ＥとＦ）Ｓｗｉｓｓ ３Ｔ３マウス線維芽細胞。細胞を培養し、固定し、抗ｐ１４０ｍＤｉａ抗体（ＡとＥ）、抗ＲｈｏＡポリクローナル抗体（Ｃ）あるいはマウス抗プロフィリンモノクローナル抗体（ＢとＤ）又はローダミン−ファロイジン（Ｆ）いずれかで同時に細胞を染色し、標準的な蛍光顕微鏡写真を撮影した。
【図１０】ＰＭＡで刺激した広がったｓＭＤＣＫ細胞の膜ラッフルにおけるｍｙｃ標識化ＲｈｏＡ、ｐ１４０ｍＤｉａおよびプロフィリンの共局在化を示した写真（生物の形態の写真）である。休止期（Resting ）（Ａ−Ｃ）またはphorbol myristate acetate （Ｄ−Ｈ）で刺激した（PMA stimulation ）ｓＭＤＣＫ細胞を固定し、抗ｐ１４０ｍＤｉａ抗体（Ｂ、ＥおよびＨ）またはモノクローナル抗ｍｙｃ抗体（Ｃ、Ｆ）で染色した。Ｈには、過剰量の組換えペプチドで予め吸収させた（preabsorbed ）抗ｐ１４０抗血清を用いた染色が示されている。Ａ、Ｄ、Ｇには、位相差顕微鏡（phase contrast）を用いてそれぞれの細胞を撮影した顕微鏡写真が示されている。写真上段左から、Ａ、Ｂ、Ｃであり、写真中段左からＤ、Ｅ、Ｆであり、写真下段左からＧ、Ｈである。
【図１１】分裂期細胞の分裂溝におけるｐ１４０ｍＤｉａの濃縮を示した写真（生物の形態の写真）である。ＡおよびＢ：Ｓｗｉｓｓ ３Ｔ３細胞、ＣおよびＤ：ＨｅＬａ細胞。抗ｐ１４０ｍＤｉａ抗体（anti-p140 ）で染色（staining）された対数増殖期の細胞（ＡおよびＣ）およびＤＡＰＩ（Ｂ）または２Ｈ１１モノクローナル抗プロフィリン抗体（Ｄ）（anti-profilin ）で同時に染色したものを標準的な蛍光顕微鏡で撮影した。
【図１２】フィブロネクチンでコートされたビーズの回りにＲｈｏ依存的な様式で出現したＲｈｏＡおよびｐ１４０ｍＤｉａのクラスターを示した写真である。４８時間培養したＳｗｉｓｓ ３Ｔ３細胞を用いた。細胞を播き、フィブロネクチン（ＦＮ−coated）（ａ、ｂ）またはポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ−coated）（ｃおよびｄ）でコートしたラテックス・ビーズとともに１５分間インキュベートした。細胞は固定後、抗ｐ１４０ｍＤｉａ抗体（anti-p140 ）（ａ、ｃ）または抗Ｒｈｏ抗体（anti-Rho）（ｂ、ｄ）で染色（staining）した。
【図１３】ＣＯＳ−７細胞におけるｐ１４０ｍＤｉａの一過性の発現を示した写真である。ＣＯＳ細胞はｐ１４０ｍＤｉａの発現ベクター単独（ＡおよびＢ）またはＣ３菌体外酵素の発現ベクター単独（ＣおよびＤ）でトランスフェクトした。Ｃ３菌体外酵素のトランスフェクションは、ＦＬＡＧエピトープを有したＣ３菌体外酵素発現様ベクターで実施した。細胞を固定し、抗ｐ１４０ｍＤｉａ抗体（anti-p140 ）単独（ＡおよびＣ）あるいは同時にアクチンをローダミン−ファロイジン（phalloidin）染色（staining）した（Ｂ、Ｄ）。
【発明の背景】
発明の分野
本発明は、Ｒｈｏタンパク質の標的タンパク質に関し、更に詳細には、アクチン細胞骨格の再構成に関与するタンパク質に関する。
【０００２】
背景技術
生体内には、サブユニット構造を有さない分子量２〜３万の一群の低分子量ＧＴＰ結合タンパク質（Ｇタンパク質）が存在している。現在、低分子量Ｇタンパク質のスーパーファミリーには酵母から哺乳動物に至るまですでに５０種類以上のメンバーが見出されている。低分子量Ｇタンパク質は、アミノ酸配列の類似性からＲａｓ、Ｒｈｏ、Ｒａｂ、その他の４つのファミリーに大別することができる。この低分子量Ｇタンパク質は種々の細胞機能を制御していることが明らかになってきており、例えば、Ｒａｓタンパク質は細胞の増殖や分化等を、Ｒｈｏタンパク質は細胞の形態変化や細胞接着、細胞運動等をそれぞれ制御していると考えられている。
【０００３】
このうちＲｈｏタンパク質は、ＧＤＰ／ＧＴＰ結合能および内在性ＧＴＰａｓｅ活性を示し、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）およびある種の成長因子等のような細胞外シグナルに対する細胞骨格応答に関係しているとされている。不活性型であるＧＤＰ結合Ｒｈｏタンパク質にある刺激が与えられると、Ｓｍｇ ＧＤＳ、ＤｂｌやＯｓｔのようなＧＤＰ／ＧＴＰ変換タンパク質の働きによって活性型であるＧＴＰ結合Ｒｈｏタンパク質（以下、「活性型Ｒｈｏタンパク質」という）に変換される。そして、この活性型Ｒｈｏタンパク質が標的タンパク質に作用することによってストレス繊維および接着斑が形成され、細胞接着および細胞運動等が誘導されると考えられている（実験医学 vol.12,No.8,97-102(1994) 、Takai, Y. et al. Trends Biochem. Sci., 20, 227-231 (1995) ）。一方、Ｒｈｏタンパク質内在性ＧＴＰａｓｅにより活性型Ｒｈｏタンパク質はＧＤＰ結合Ｒｈｏタンパク質に変換される。この内在性ＧＴＰａｓｅの活性を亢進するタンパク質はＧＴＰａｓｅ活性化タンパク質（ＧＡＰ）（Lamarche, N. & Hall,A. et al.,TIG, 10, 436-440 (1994) ）と呼ばれている。
【０００４】
ＲｈｏＡタンパク質、ＲｈｏＢタンパク質、ＲｈｏＣタンパク質、Ｒａｃ１タンパク質、Ｒａｃ２タンパク質、Ｃｄｃ４２タンパク質のようなＲｈｏファミリーのタンパク質のアミノ酸配列は、お互いに５０％以上の類似性がある。このＲｈｏファミリーのタンパク質は、リゾフォスファチジル酸（ＬＰＡ）や増殖因子のような細胞外シグナルに応答して、ストレス繊維（stress fiber）やフォーカルコンタクト（focal contact ）の形成を引き起こす反応に関与していると考えられている（A. J. Ridley & A. Hall、Cell,70,389-399 (1992) ,A. J. Ridley & A. Hall, EMBO J.,1353,2600-2610(1994)）。また、サブファミリーであるＲｈｏタンパク質は、細胞の形態変化（H.F.Parterson et al., J.Cell Biol.,111,1001-1007 (1990) ）、細胞接着（Morii,N. et al.,J. Biol.Chem. 267, 20921-20926 (1992) 、T. Tominaga et al.,J.Cell Biol., 120, 1529-1537(1993) 、Nusrat, A. et al.,Proc, Natl. Acad. Sci. USA, 92, 10629-10633 (1995)、Landanna, C. et al., Science 271, 981-983 (1996)）、細胞運動（K. Takaishi et al.,Oncogene,9,273-279 (1994)）、細胞質分裂（cytokinesis ）（K. Kishi et al.,J. Cell Biol.,120,1187-1195(1993) 、I. Mabuchi et al.,Zygote,1,325-331(1993)）のような細胞骨格の再編成をともなった生理機能にも関連があると考えられている。更に、Ｒｈｏタンパク質は、平滑筋収縮（K. Hirata et al.,J. Biol. Chem.,267,8719-8722(1992) 、M. Noda et al., FEBS Lett., 367, 246-250 (1995) 、M. Gong et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93,1340〜1345 (1996) ＊）、フォスファチジルイノシトール ３−キナーゼ（ＰＩ３−キナーゼ）（J. Zhang et al.,J. Biol. Chem.,268,22251-22254 (1993) ）、フォスファチジルイノシトール ４−リン酸 ５−キナーゼ（ＰＩ ４，５−キナーゼ）（L. D. Chong et al.,Cell,79,507-513(1994)）やｃ−ｆｏｓの発現（C. S. Hill et al.,Cell,81,1159-1170(1995) ）の制御にも関与していることが示唆されている。
【０００５】
また、最近では、アミノ酸配列を一部置換したＲｈｏタンパク質が細胞内に導入されるとＲａｓ依存的な腫瘍形成が抑制されること等が見出され、Ｒｈｏタンパク質がＲａｓによる細胞の形質転換、すなわち腫瘍形成、において重要な役割を果たしていることが明らかにされている（G.C.Prendergast et al.,Oncogene,10,2289-2296(1995)、Khosravi-Far,R.,et al.,Mol.Cell.Biol.,15,6443-6453(1995)、R.Qiu et al.、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,92,11781-11785(1995) 、およびLebowitz,P.et al.,Mol.Cell.Biol.,15,6613-6622(1995) ）。また、Ｒｈｏタンパク質のＧＤＰ／ＧＴＰ変換タンパク質が変異すると、細胞が形質転換することが明らかにされている（Collard,J.,Int.J.Oncol.,8,131 〜138(1996) ）、Hart,M. et al.,J.Biol Chem.,269,62-65 (1994)、Horii,Y. et al., EMBO J., 13,4776-4786 (1994) ）。更に、Ｒｈｏタンパク質はガン細胞の浸潤、すなわちガン転移に関与していることが明らかにされている（Yoshioka,K.et al.,FEBS Lett.,372,25 〜28 (1995) ）。ガン細胞の浸潤には、ガン細胞の細胞接着能の変化が密接に関連しているが、Ｒｈｏタンパク質は細胞接着に関与することが明らかにされている（前掲 Morii,N.et al.(1992)、Tominaga,T. et al.(1993)、Nusrat,A.et al.(1995) 、Landanna,C.et al.(1996) ）。
【０００６】
また、Ｒｈｏシグナル伝達におけるホスホイノシチドキナーゼの関与が報告されている。Ｒｈｏ（Chong, L.D. et al., Cell, 79, 507-513 (1994)）およびＲｈｏファミリー低分子量Ｇタンパク質の他のメンバーであるＲａｃ（Hartwig, J.H. et al., Cell, 82, 643-653 (1995)） は、異なる細胞系においてホスファチジルイノシトールビスホスフェート（ＰＩＰ２）の合成を刺激することが証明された。ＰＩＰ２の結合は多数のアクチン関連タンパク質の機能を調節すると考えられる（Janmey, P.A., Ann. Rev. Physiol., 56, 169-191 (1994)）ので、細胞内局在的なその生合成によってフォーカルアクチン再構成が促進されると考えられる。ＰＩＰ２により調節されるタンパク質の１つはプロフィリンであり、これはアクチンモノマーと複合体を作り、そしてＰＩＰ２との結合の際アクチンを解離する。プロフィリンは、また、チモシンβ４の存在下においてアクチンフィラメントの界合を促進する（Pantaloni, D., & Crlier, M-F, Cell, 75, 1007-1014 (1993)）。従って、プロフィリンの接着部位への蓄積がアクチン再構成において重要であると考えられる（Theriot, J. A. & Mitchison, T. J., Cell, 75, 835-838 (1993) ）。
【０００７】
ところで、アクチンの細胞骨格は、細胞の運動性、形態、食作用および細胞質分裂において重要な役割を果たす。それは空間的および動的に再構成され、大部分の真核細胞の形態変化および細胞表面運動のための力を提供する。アクチンの再構成（rearrangement ）は細胞外の刺激により急速に引き起こされ、一連のアクチン結合タンパク質はアクチンフィラメントの重合、架橋および固定に共調的に作用すると考えられる。低分子量Ｇタンパク質Ｒｈｏは多数のアクチン依存性細胞プロセス、例えば、血小板凝集（Morii, N. et al., J. Biol. Chem., 267, 20921-20926 (1992) ）、リンパ球接着（Tominaga, T. et al., J. Cell. Biol., 120, 1529-1537 (1993 ））、細胞運動性の亢進（Takaishi, K. et al., Oncogene, 11, 39-48 (1995) ）、および収縮環の形成および細胞質分裂（Kishi, K. et al., J. Cell Biol., 120, 1187-1195 (1993)、およびMabuchi, I. et al., Zygote, 1, 325-331 (1993) ）に必要とされることが示されている。培養した線維芽細胞において、Ｒｈｏタンパク質をマイクロインジェクションすると、アクチン・ストレスファイバーやフォーカル接着（focal adhesion）の形成を急速に誘導する。逆に、ボツリヌス菌（botulinum ）のＣ３菌体外酵素（ＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼ）によるＲｈｏの不活性化はこのプロセスを阻害する（Ridley, A. J. & Hall, A., Cell, 70, 389-399 (1992)）。Ｃ３菌体外酵素の処理は、また、フォーカル接着キナーゼ（focal adhesion kinase: ＦＡＫ）およびパキシリン（paxillin）のリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）−、エンドセリン−またはＧＴＰγＳ−誘導性チロシンリン酸化を阻害する（Kumagai, N. et al., J. Biol. Chem., 268, 24535-24538 (1993) 、Rankin, S. et al., FEBS Lett., 354, 315-319 (1994)、Ridley, A. J. & Hall, A., Cell, 70, 389-399 (1992)、およびSeckl, M. J. et al., J. Biol. Chem. 270, 6984-6990 (1995) ）。これらの結果より、Ｒｈｏタンパク質が細胞外刺激とアクチン細胞骨格の再構成とを連結するシグナル伝達経路を調節することが示されている。
【０００８】
Ｒｈｏタンパク質には多数の標的分子があり、上記の多数のシグナル伝達経路を調節していると考えられている。ごく最近、哺乳類において、いくつかの候補タンパク質が報告された。これらのタンパク質は、プロテインキナーゼＮ（ＰＫＮ）（Watanabe, G. et al., Science 271, 645-648 (1996); Amano, M. et al., Sceince 271, 648-650 (1996) ）、ローフィリン（Watanabe, G. et al., Science 271, 645-648 (1996)）、シトロン（Madaule, P. et al., FEBS Lett. 377, 243-248 (1995)）、ＲＯＫα（Leung, T. et al., J. Biol. Chem. 270, 29051-29054 (1995)）、Ｒｈｏ結合キナーゼ(Matsui,T.et al.,EMBO J.15,1885-1893(1996)）、ローテキン(Reid,T.et al.,J.Biol.Chem.,271,9816-9822(1996) ）、ミオシン軽鎖ホスファターゼ（Kimura, K. et al., Science, 273, 245-248(1996)）である。これらのタンパク質はいずれもＧＴＰ結合ＲｈｏＡタンパク質に結合する（ただし、シトロンだけはＧＴＰ結合Ｒａｃ１タンパク質にも結合する）。
【０００９】
しかしながら、Ｒｈｏタンパク質およびアクチン細胞骨格の再構成を調節するプロフィリンに結合するＲｈｏ標的タンパク質に関する報告は本発明者が知る限りなされていない。
【００１０】
【発明の概要】
本発明者は、今般、酵母ツー・ハイブリッド・システムを使用して、Ｒｈｏタンパク質の標的タンパク質（ｐ１４０ｍＤｉａ）を同定した。これは細胞質分裂に必要なショウジョウバエ（Drosophila）のディアファノス（diaphanous）の哺乳類ホモローグであり、繰り返し状ポリ−プロリンのストレッチおよびフォルミンホモロジー（ＦＨ２）ドメインを含有する。ｐ１４０ｍＤｉａはＧＴＰ結合型Ｒｈｏのそのアミノ末端領域を介して選択的に結合し、アクチン結合タンパク質であるプロフィリンに結合する。ｐ１４０ｍＤｉａ、プロフィリンおよびＲｈｏタンパク質は、広がった線維芽細胞の膜の波打ち構造（ruffle）、および分裂細胞の分裂溝（ｃleavage furrow）に局在化し、フィブロネクチンでコーティングされたラテックスビーズによりビーズ下の原形質膜にリクルート（recruit ）された。これらの結果から、Ｒｈｏタンパク質によるアクチン再構成の誘導のメカニズムの１つが、ｐ１４０ｍＤｉａを介した細胞の特異的部位におけるプロフィラクチン複合体のリクルートメント（recruitment ）であることが示唆された。本発明は、かかる知見に基づくものである。
【００１１】
従って、本発明は、活性型Ｒｈｏタンパク質結合能を有し、かつプロフィリンに結合するＲｈｏ標的タンパク質の提供をその目的とする。
【００１２】
また、本発明によれば、前記タンパク質をコードする塩基配列、前記塩基配列を含むベクター、前記ベクターによって形質転換された宿主細胞、前記タンパク質の製造法、前記タンパク質に対する抗体、および活性型Ｒｈｏタンパク質とその標的タンパク質との結合を阻害するスクリーニング法等の提供をその目的とする。
【００１３】
そして、本発明によるタンパク質は、活性型Ｒｈｏタンパク質結合能を有し、かつプロフィリン結合能を有するもの、である。
【００１４】
【発明の具体的説明】
定義
本発明において、「アミノ酸」とは、光学異性体、すなわちＬ体およびＤ体、のいずれをも含む意味で用いられるものとする。従って、本発明において「ペプチド」とは、Ｌ体のアミノ酸のみによって構成されているペプチドだけでなく、Ｄ体のアミノ酸を一部または全部含むペプチドをも意味するものとする。
【００１５】
また、本発明において、「アミノ酸」とは、天然のタンパク質を構成する２０種のα−アミノ酸のみならず、それら以外のα−アミノ酸、並びにβ−、γ−、δ−アミノ酸および非天然のアミノ酸等を含む意味で用いられるものとする。従って、下記のようにペプチドにおいて置換されるかまたはペプチド中に挿入されるアミノ酸としては、天然のタンパク質を構成する２０種のα−アミノ酸だけに限定されることはなく、それら以外のα−アミノ酸並びにβ−、γ−、δ−アミノ酸および非天然のアミノ酸等であってもよい。このようなβ−、γ−またはδ−アミノ酸としては、β−アラニン、γ−アミノ酪酸あるいはオルニチンが挙げられ、また天然タンパク質を構成するもの以外のアミノ酸あるいは非天然のアミノ酸としては、３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルグリシン、１，２，３，４−テトラハイドロイソキノリン−３−カルボン酸あるいは二ペコチン酸等が挙げられる。
【００１６】
また、本明細書において「本発明によるタンパク質」というときは、その誘導体を含む意味で用いられるものとする。
【００１７】
更にまた、本明細書において「塩基配列」とは、ＤＮＡ配列およびＲＮＡ配列のいずれをも意味するものとする。
【００１８】
タンパク質
本発明によるタンパク質は、活性型Ｒｈｏタンパク質結合能を有し、かつプロフィリン結合能を有するタンパク質またはその誘導体である。ここで、Ｒｈｏタンパク質としては、ＲｈｏＡタンパク質、ＲｈｏＢタンパク質、ＲｈｏＣタンパク質、またはＲｈｏＧタンパク質が挙げられる。
【００１９】
本発明において、「活性型Ｒｈｏタンパク質結合能を有するタンパク質」とは、当業者により活性型Ｒｈｏタンパク質との結合が認められたと評価されるタンパク質をいい、例えば、実施例１および５と同様の条件において実験した場合に活性型Ｒｈｏタンパク質との結合が認められたと評価されるタンパク質を意味するものとする。
【００２０】
本発明によるタンパク質は、Ｒｈｏタンパク質結合領域に加えて、ポリ−プロリン領域、およびＦＨ２領域を有する（実施例２）。また、本発明によるタンパク質はマウスの肺、睾丸、胸腺、肝臓、および胃において強く発現するという特徴を有する。
【００２１】
活性型Ｒｈｏ結合能を有し、かつプロフィリン結合能を有するタンパク質には、ｐ１４０ｍＤｉａのアイソフォームおよびホモローグも含まれる（実施例３参照）。
【００２２】
本発明において、「プロフィリン結合能を有するタンパク質」とは、当業者によりプロフィリンとの結合が認められたと評価されるタンパク質をいい、例えば、実施例６と同様の条件において実験した場合にプロフィリンとの結合が認められたと評価されるタンパク質を意味するものとする。
【００２３】
本明細書においてＲｈｏタンパク質は、Ｒｈｏタンパク質と本発明によるタンパク質との結合が実質的に損われないように改変されたＲｈｏタンパク質をも含むものとする。このような改変Ｒｈｏタンパク質としては、１４番目のアミノ酸をバリンで置換したＲｈｏＡ変異体（ＲｈｏＡVal14 ）が挙げられる。
【００２４】
本発明によるタンパク質の起源は特に限定されず、マウスを含むホ乳類由来のものであっても、それ以外を由来とするものであってもよい。
【００２５】
本発明によるタンパク質の分子量は、マウス由来である場合、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる測定で約１６０ｋＤである。
【００２６】
本発明によるタンパク質は、例えば、配列番号２のｃＤＮＡ配列を宿主において発現させることによって得ることができる（実施例４および９）。配列番号２の配列の取得および宿主における発現は、後述する。
【００２７】
本明細書において、「タンパク質の誘導体」とは、タンパク質のアミノ末端（Ｎ末端）のアミノ基または各アミノ酸の側鎖のアミノ基の一部もしくは全部、および／またはペプチドのカルボキシル末端（Ｃ末端）のカルボキシル基または各アミノ酸の側鎖のカルボキシル基の一部もしくは全部、および／または、ペプチドの各アミノ酸の側鎖のアミノ基およびカルボキシル基以外の官能基（例えば、水素基、チオール基、アミド基等）の一部もしくは全部が、適当な他の置換基によって修飾を受けたものをいう。適当な他の置換基による修飾は、例えば、ペプチド中に存在する官能基の保護、安全性ならびに組織移行性の向上、あるいは活性の増強等を目的として行われる。
【００２８】
タンパク質の誘導体としては、具体的には、
（１）タンパク質のアミノ末端（Ｎ末端）のアミノ基または各アミノ酸の側鎖のアミノ基の一部もしくは全部の水素原子が、置換または非置換のアルキル基（直鎖、分岐鎖または環状であってもよい）（例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、イソブチル基、ブチル基、ｔ−ブチル基、シクロプロピル基、シクロヘキシル基、ベンジル基）、置換または非置換のアシル基（例えば、ホルミル基、アセチル基、カプロイル基、シクロヘキシルカルボニル基、ベンゾイル基、フタロイル基、トシル基、ニコチノイル基、ピペリジンカルボニル基）、ウレタン型保護基（例えば、ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル基、ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル基、ｐ−ビフェニルイソプロピルオキシカルボニル基、ｔ−ブトキシカルボニル基）またはウレア型置換基（例えば、メチルアミノカルボニル基、フェニルカルボニル基、シクロヘキシルアミノカルボニル基）等によって置換されたもの、並びに
（２）タンパク質のカルボキシル末端（Ｃ末端）のカルボキシル基または各アミノ酸の側鎖のカルボキシル基の一部もしくは全部が、エステル型の修飾を受けているもの（例えば、その水素原子がメチル、エチル、イソプロピル、シクロヘキシル、フェニル、ベンジル、ｔ−ブチル、４−ピコリルにより置換されたもの）、アミド型の修飾を受けているもの（例えば、非置換アミド、Ｃ１−Ｃ６アルキルアミド（例えば、メチルアミド、エチルアミド、イソプロピルアミド）を形成しているもの、並びに
（３）タンパク質の各アミノ酸の側鎖のアミノ基およびカルボキシル基以外の官能基（例えば、水素基、チオール基、アミノ基等）の一部もしくは全部が、上述のアミノ基と同様の置換基あるいはトリチル基などで修飾されたもの等が挙げられる。
【００２９】
本発明によるタンパク質の例としては、配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質（本明細書において「ｐ１４０ｍＤｉａ」という）およびその誘導体が挙げられる。配列番号１のアミノ酸配列は、マウス脳および胚由来のｃＤＮＡライブラリーから得られたＤＮＡ配列（ｃＤＮＡ配列）から決定されたものである。このｃＤＮＡライブラリーは、市販のものまたは Kakizuka, A. et al. (1993), cDNA Libraty Construction (Stein, C. およびHolland, P. 編集） Essential Developmental Biology : A Practical Approach, pp223-232, IRL Press, Oxford に記載されたものを使用できる。また、ｃＤＮＡ配列は、図３の太い下線（クローン５０）に対応するオリゴヌクレオチドをプローブとして用いることによって得ることができる。
【００３０】
また、本発明によるタンパク質の例としては、配列番号１のアミノ酸配列からなり、前記配列番号１のアミノ酸配列に１以上のアミノ酸配列が付加および／または挿入され、および／または前記配列番号１のアミノ酸配列の１以上のアミノ酸が置換および／または欠失されたタンパク質であって、活性型Ｒｈｏタンパク質結合能を有し、かつプロフィリン結合能を有するものが挙げられる。すなわち、ここにいう付加(addition)、挿入(insertion) 、置換(substitution)、および欠失(deletion)とは、配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質の活性型Ｒｈｏタンパク質結合能およびプロフィリン結合能を損なわない（not damage）ようなものをいう。
【００３１】
本発明の別の面によれば、配列番号１の６３〜２６０番のアミノ酸配列（Ｒｈｏタンパク質結合領域）と５７１〜７３７番のアミノ酸配列（プロフィリン結合領域）とを有するタンパク質が提供される。
【００３２】
本発明によるタンパク質は、活性型Ｒｈｏタンパク質結合能とプロフィリン結合能とを有するものである。また、Ｒｈｏタンパク質は腫瘍の形成、転移をはじめとして細胞形態、細胞運動、細胞接着、細胞質分裂等の細胞の機能発現に密接にかかわっている（前掲Takai, Y., et al. 、G.C.Prendergast.et al.、Khosravi-Far, R., et al ．、R. Qiu et al. 、 Lebowitz 、P., et al., およびYoshioka,K.et al. ）。従って、本発明によるタンパク質は、腫瘍の形成および転移の機構解明に有用であると考えられる。
【００３３】
また、後記実施例によれば、本発明によるタンパク質は、細胞接着に関与することが示された。従って、本発明によるタンパク質は、ガンの細胞の浸潤および転移、白血球（Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、好中球、好酸球、好塩基球、マクロファージ等）の凝集および活性化、並びに血小板の凝集および活性化等の機能解明に有用である。
【００３４】
更に、後記実施例によれば、本発明によるタンパク質は、細胞分裂（特に、細胞の増殖）に関与することが示された。従って、本発明によるタンパク質は、ガンの増殖等の機能解明に有用である。
【００３５】
塩基配列
本発明によれば、本発明によるタンパク質をコードする塩基配列が提供される。この塩基配列の典型的配列は、配列番号２のＤＮＡ配列の一部または全部を有するものである。
【００３６】
配列番号２のＤＮＡ配列は、前記のように、マウス脳由来のｃＤＮＡライブラリーから得られたものである。配列番号２の９４〜３８６１番の配列が、ｐ１４０ｍＤｉａのオープンリーディングフレームに相当する。
【００３７】
本発明によるタンパク質のアミノ酸配列が与えられれば、それをコードする塩基配列は容易に定まり、配列番号１に記載されるアミノ酸配列をコードする種々の塩基配列を選択することができる。従って、本発明によるタンパク質をコードする塩基配列とは、配列番号２に記載のＤＮＡ配列の一部または全部に加え、同一のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列であって縮重関係にあるコドンをＤＮＡ配列として有する配列をも意味するものとし、更にこれらに対応するＲＮＡ配列も含まれる。
【００３８】
本発明による塩基配列は、天然由来のものであっても、全合成したものであってもよい。また、天然物由来のものの一部を利用して合成を行ったものであってもよい。塩基配列は、染色体ライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーから遺伝子工学の分野で慣用されている方法、例えば部分アミノ酸配列の情報を基にして作成した適当なＤＮＡプローブを用いてスクリーニングを行う方法、等によって得ることができる。本発明による塩基配列は、マウス由来のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって得ることができる。このｃＤＮＡライブラリーは、市販のものを使用できる。また、スクリーニングは、図３の太い下線（クローン５０）に対応するオリゴヌクレオチドをプローブとして用いることによって実施することができる。
【００３９】
塩基配列が天然由来のものである場合、その起源は特に限定されず、マウスを含むホ乳類由来のものであっても、それ以外を由来とするものであってもよい。
【００４０】
本発明によるタンパク質をコードする塩基配列の例は、配列番号２の塩基配列および配列番号２のＤＮＡ配列の一部（例えば、配列番号２の９４〜３８６１番（オープンリーディングフレームに相当）、２８０〜８７３番（Ｒｈｏタンパク質結合領域に相当）、および１８０４〜２３０４番（プロフィリン結合領域に相当）のＤＮＡ配列）である。
【００４１】
ベクターおよび宿主細胞
本発明によれば、前記の本発明による塩基配列を、宿主細胞内で複製可能でかつその塩基配列がコードするタンパク質を発現可能な状態で含んでなるベクターが提供される。更に、本発明によれば、このベクターによって形質転換された宿主細胞が提供される。この宿主−ベクター系は特に限定されず、また、他のタンパク質との融合タンパク質発現系などを用いることができる。融合タンパク質発現系としては、ＭＢＰ（マルトース結合タンパク質）、ＧＳＴ（グルタチオンＳトランスフェラーゼ）、ＨＡ（ヘマグルチニン）、ポリヒスチジン、ｍｙｃ、Ｆａｓ等を用いたものが挙げられる。
【００４２】
ベクターとしては、プラスミドベクター（例えば、原核細胞、酵母、昆虫細胞動物細胞等での発現ベクター）、ウイルスベクター（例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、センダイウイルスベクター、ＨＩＶベクター、バキュロウイルスベクター）、リポソームベクター（例えば、カチオニックリポソームベクター）等が挙げられる。
【００４３】
本発明によるベクターは、これを実際に宿主細胞に導入して所望のタンパク質を発現させるためには、前記の本発明による塩基配列の他に、その発現を制御する配列や宿主細胞を選択するための遺伝子マーカー等を含んでいてもよい。また、このベクターは、本発明による塩基配列を反復した形で（例えば、タンデムで）含んでいてもよい。これらは常法に従いベクターに存在させてよく、このベクターによる宿主細胞の形質転換の方法も、この分野で慣用されているものを用いることができる。
【００４４】
本発明によるベクター構築の手順および方法は、遺伝子工学の分野で慣用されているものを用いることができる。
【００４５】
また、宿主細胞としては、例えば、大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞（例えば、ＣＯＳ細胞、リンパ球、繊維芽細胞、ＣＨＯ細胞、血液系細胞、腫瘍細胞等）が挙げられる。
【００４６】
上記形質転換された宿主細胞を適当な培地で培養し、その培養物から上記した本発明によるタンパク質を得ることができる。従って、本発明の別の態様によれば、本発明によるタンパク質の製造法が提供される。形質転換された宿主細胞の培養およびその条件は、使用する細胞についてのそれと本質的に同様であってよい。また、培養液からの本発明によるタンパク質の回収、精製も常法に従って行うことができる。
【００４７】
スクリーニング法
本発明によれば、
（１）スクリーニングの対象となる物質を、活性型Ｒｈｏタンパク質と、本発明によるタンパク質とを含むスクリーニング系に存在させ、そして
（２）活性型Ｒｈｏタンパク質と、本発明によるタンパク質との結合の阻害の程度を測定すること
を含む、活性型Ｒｈｏタンパク質と、本発明によるタンパク質との結合を阻害する物質のスクリーニング法が提供される。
【００４８】
本発明によれば、また、
（１）スクリーニングの対象となる物質を、プロフィリンと、本発明によるタンパク質とを含むスクリーニング系に存在させ、そして
（２）プロフィリンと、本発明によるタンパク質との結合の阻害の程度を測定すること
を含む、プロフィリンと、本発明によるタンパク質との結合を阻害する物質のスクリーニング法が提供される。
【００４９】
ここで、「結合の阻害の程度を測定する」方法としては、本発明によるタンパク質に対する抗体によるイムノブロットを用いて測定する方法、ツー・ハイブリッド・システム（two hybrid system ）（M.Kawabata 実験医学13,2111-2120(1995)、 A.B.Vojetk et al.Cell 74,205-214(1993) ）による方法、オーバーレイ・アッセイを用いて測定する方法（Ishizaki, T. et al., EMBO J., 15, 1885-1893 (1996)）、インビトロ翻訳させたタンパク質を用いて測定する方法（Shibata, H. et al., FEBS Lett. 385, 221-224 (1996)）、Amano, M., et al., Science 271, 648-650 (1996)に記載された無細胞系での結合測定法等が挙げられ、例えば、実施例１、５、および６に記載される方法に準じて結合の阻害の程度を測定することができる。
【００５０】
本明細書において「結合の阻害の程度を測定する」とは結合の有無の測定を含む意味で用いられるものとする。また、「スクリーニング」とは、アッセイを含む意味で用いられる。
【００５１】
スクリーニング系は細胞系または無細胞系のいずれであってもよく、細胞系としては、例えば、酵母細胞、ＣＯＳ細胞、大腸菌、昆虫細胞、線虫細胞、リンパ細胞、繊維芽細胞、ＣＨＯ細胞、血液系細胞、および腫瘍細胞が挙げられる。
【００５２】
スクリーニングの対象となるものは、特に限定されないが、例えばペプチド、ペプチドのアナログ、微生物培養液、有機化合物等が挙げられる。
【００５３】
抗体
本発明による抗体は、当業界において通常用いられる方法によって製造することができる。例えば、図３の太線で示されるペプチドを、任意の担体（例えば、ウシ血清アルブミン）とともに動物体内（例えば、ウサギ、ヤギ、ラット、マウス、ヒツジ）に注射し、一定期間の後に、その動物の血清を精製することによって得ることができる。
【００５４】
図３の太線で示されるペプチドは、ｐ１４０ｍＤｉａの一部である。従って、このポリクローナル抗体の反応（すなわち、免疫反応）は、ｐ１４０ｍＤｉａの存在の１つの指標となる。従って、本発明のもう一つの面によれば、上記抗体によって認識されるタンパク質、および本発明によるタンパク質であって上記抗体によって認識されるものが提供される。
【００５５】
また、本発明の更にもう一つの面によれば、
（１）検出の対象となる物質を本発明による抗体を含む検出系に存在させ、そして
（２）検出の対象となる物質と本発明による抗体との反応の程度を測定することを含む、本発明による抗体によって認識される物質の検出法が提供される。
【００５６】
本発明による抗体との反応の程度を測定する方法としては、ＥＬＩＳＡ法、ラジオイムノアッセイ法、ウェスタンブロッティング法、免疫沈降法、および蛍光抗体法（例えば、単クローン抗体実験マニュアル、講談社、（１９８７年））等が挙げられ、例えば、実施例４〜６に記載される方法に準じて反応の程度を測定することができる。また、本発明において「反応の程度を測定する」とは、反応の有無を測定することをも含む。
【００５７】
本発明による検出法における検出系は、本発明によるポリクローナル抗体に加えて、例えば、ラテックス粒子等を含んでいてもよい。
更に、本発明によれば、本発明による抗体を含んでなる、前記抗体と特異的に反応する物質の検出キットが提供される。ここで「検出キット」には、本発明によるタンパク質が関与する疾患等の検出試薬並びに診断試薬や診断キットも含まれるものとする。
【００５８】
本発明による検出法の具体例としては、
（１）検出の対象となる物質を本発明による抗体を担持してなるラテックス粒子を含む検出系に存在させ、そして
（２）前記ラテックス粒子の凝集反応の程度を測定すること
を含む、前記抗体と特異的に反応する物質の検出法が挙げられる。
ラテックス粒子の凝集反応の程度は、例えば、比濁法、比ろう法のような光学的測定法によって測定することができる。
【００５９】
本発明による検出キットは、上記検出系と同様に、ラテックス粒子を含んでいてもよい。この場合、ラテックス粒子は抗体をその表面上に担持していてもよい。
また、更にラテックス粒子を含む本発明による検出キットは、前記した検出法の具体例に示されるような態様で用いることができる。
検出の対象となる物質としては、ヒトを含む動物由来の体液（例えば、血清、血液等）、尿、便、組織切片、細胞（例えば腫瘍細胞等）等が挙げられる。
【００６０】
本発明によるポリクローナル抗体と反応する物質としては、本発明によるタンパク質（配列番号１の配列）が挙げられる。
【００６１】
【実施例】
実施例１ 酵母ツー・ハイブリッド・システムを用いたＲｈｏＡ結合ペプチド断片のスクリーニング
ＬｅｘＡ ＤＮＡ結合タンパク質に融合したＮ１９−ＲｈｏＡ△Ｃ（Ｃ−末端のＡｌａ181 においてトランケートしたＲｈｏＡAsn19 ）をバイトとして使用して、酵母のツー・ハイブリッド・システムにより、新規なＲｈｏ結合タンパク質をスクリーニングした。酵母のツー・ハイブリッド・システムは、既に記載の方法（Vojtek, A. et al., Cell 74, 205-214 (1993); Modaule, P. et al., FEBS Lett., 377, 243-248 (1995); Watanabe, G. et al., Science 271, 645-648 (1996); Reid, T. et al., J. Biol. Chem., 271, 13556-13560 (1996)）に準じて実施した。
【００６２】
ツー・ハイブリッド・システムに使用したプラスミドｐＢＴＭ１１６およびｐＶＰ１６（Vojtek, A. et al., Cell 74, 205-214 (1993)）は、Stan Hollenberg 、Rolf Sternglanz 、Stan Fields およびPaul Bartel より入手した。ｐＢＴＭ−ＲｈｏＡ（ＲｈｏＡをコードするｃＤＮＡを含むｐＢＴＭ１１６）は、過去に記載された方法（Watanabe, G. et al., Science, 271, 645-648 (1996) ）に従って調製した。ＲｈｏＡ上にＶａｌ１４またはＡｓｎ１９変異を生じさせるために、ＲｈｏＡのＮ末端をコードするｐＧＥＸ−ＲｈｏＡのＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＶ断片をｐＢｌｕｅｓｃｉｐｔ（ストラタジーン社）中に挿入し、Kunkelの方法（Kunkel, T., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488-492 (1985)）に従って変異誘発させた。次いでｐＧＥＸ−ＲｈｏＡ（Morii, N. et al., J. Biol. Chem., 268, 27160-27163 (1993) ）の対応する野生型断片を各変異誘発断片と置換し、ｐＧＥＸ−Ｖ１４ＲｈｏＡおよびｐＧＥＸ−Ｎ１９ＲｈｏＡを作製した。
【００６３】
ｐＧＥＸ−Ｖ１４ＲｈｏＡおよびｐＧＥＸ−Ｎ１９ＲｈｏＡより変異体ＲｈｏＡの全長のコーディング領域をコードするＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ断片を切り出した後、ｐＢＴＭ１１６の中に挿入して、ｐＢＴＭ−Ｖ１４ＲｈｏＡおよびｐＢＴＭ−Ｎ１９ＲｈｏＡを得た。これらの変異体のＡｌａ１８１におけるＣ−末端の欠失変異体を挿入したｐＢＴＭ１１６（ｐＢＴＭ−Ｖ１４ＲｈｏＡ△ＣおよびｐＢＴＭ−Ｎ１９ＲｈｏＡ△Ｃ）は、過去に記載された方法（Reid, T. et al., J. Biol. Chem., (1996) ）に従って調製した。
【００６４】
ｐＢＴＭ−Ｎ１９ＲｈｏＡ△Ｃを有する酵母Ｌ４０株（MATa trp1 leu2 his3 LYS::lexA-HIS3 URA3::lexA-lacZ）（Vojtek, A. et al., Cell 74, 205-214 (1993)）を、マウス胚ｃＤＮＡライブラリー（Kakizuka, A. et al. (1993), cDNA Libraty Construction (Stein, C.およびHolland, P. 編集）Essential Developmental Biology : A Practical Approach, pp223-232, IRL Press, Oxford）と融合したｐＶＰ１６（Vojtek, A. et al., Cell 74, 205-214 (1993)）で形質転換した。初期の形質転換効率は２．２×１０7 であり、これはＨＩＳ（−）プレート上に播く前に６時間培養する間に７回分裂したことを意味する。１．５×１０8 の形質転換体の内、９７８クローンをＨｉｓ＋およびｌａｃＺ陽性として単離し、そして２２０クローンを分離してバイトプラスミドを排除した。種々の被験バイトを有する酵母株ＡＭＲ７０との交配により、他のタンパク質との相互作用を評価した。２２０クローンの中で、５５クローンはＮ１９−ＲｈｏＡ△Ｃで陽性のｌａｃＺ活性を示し、陰性の対照として使用したラミンでは陰性を示した。この手法により単離した５５クローンは、同一のサイズのｃＤＮＡインサートを有し、それらのいくつかを配列決定した結果、同一のヌクレオチド配列を有することが見出された。
【００６５】
これらのクローンを種々のＲｈｏＡ変異体に融合したＬｅｘＡを有するＡＭＲ７０に交配した。それらのすべてはＲｈｏＡVal14 と強く、ＲｈｏＡAsn19 と弱く、そして野生型ＲｈｏＡとはほとんど無視できるほどに弱く結合したが、それらはＮ１９−ＲｈｏＡ△Ｃまたは野生型ＲｈｏＡ△Ｃと強く結合した。同様の結果が、下記の実験によっても確認された。
【００６６】
ツー・ハイブリッド・システムにおける相互作用の特異性を試験するために、酵母のクローン５０から回収されたｐＶＰ１６プラスミド（ｐＶＰ−ｃｌ．５０）を種々のタンパク質のｃＤＮＡを有するｐＢＴＭ１１６プラスミドとともにＬ４０株の中に共形質転換し、相互作用をｌａｃＺアッセイにより試験した。実験に用いたｐＢＴＭ−ＲｈｏＡ△およびｐＢＴＭ−ラミン（Watanabe, G. et al., Science 271, 645-648 (1996)）、ｐＢＴＭ−ＲａｃおよびｐＢＴＭ−Ｃｄｃ４２Ｈ（Reid, T. et al., J. Biol. Chem., 271, 13556-13560 (1996)）の調製については、過去に記載されている。
【００６７】
その結果、結合の特異性は、代表的なクローン（クローン５０）から回収されたプラスミド、および種々のＬｅｘＡ−変異体ＲｈｏＡ融合構築物とでＬ４０株を共形質転換させることによって確認された（図１）。すなわち、クローン５０）から回収されたプラスミドとＬｅｘＡーＲａｃ融合構築物またはＬｅｘＡーＣｄｃ４２Ｈ融合構築物とでＬ４０株を共形質転換させたところ、このクローンによりコードされるペプチドはＲａｃおよびＣｄｃ４２Ｈいずれにも特異的に結合しないことがわかった。これらの結果は、このクローンによりコードされるペプチドがＲｈｏＡに特異的に結合することを示している。
【００６８】
実施例２ ｐ１４０ｍＤｉａの全長のｃＤＮＡのクローニング
全長のコーディング配列を得るために、本発明者はプローブとしてクローン５０より得られた０．６ＫｂｐのｃＤＮＡインサート（ｐＶＰ−ｃｌ．５０の32Ｐ標識化０．６ｋｂｐのｃＤＮＡインサート）を使用して、２つのマウス脳ライブラリー（λＺＡＰ ＩＩ中に作製した９３６３０９ライブラリー（ストラタジーン社）およびλｇｔ−１０中に作製したＭＬ３０００ａライブラリー（クロンテック社））をスクリーニングし、次いでこのスクリーニングから得られた２つのｃＤＮＡ断片をプローブとして使用してマウス胚ライブラリー（Kakizuka, A. et al. (1993), cDNA Libraty Construction (Stein, C.およびHolland, P. 編集）Essential Developmental Biology : A Practical Approach, pp223-232, IRL Press, Oxford）をスクリーニングした。
【００６９】
この手法により、６つのオーバーラップするクローンが単離された（図２）。１つの陽性のクローン（クローン５０２）、および２つの陽性のクローン（クローン５０３および５０４）が、それぞれ、前者および後者のライブラリーから得られた。５０４の５’部分および５０３の３’部分をプローブとして、クローンＥ５１、Ｅ５２、およびＥ７３がマウス胚ライブラリーから単離された。
【００７０】
これらのクローンのヌクレオチド配列をジデオキシ・チェーン・ターミネーション法により決定したところ、計算上１３９，３３６Ｄａの分子量をもつ１，２５５アミノ酸のタンパク質をコードする３，７６５ｂｐのオープンリーディングフレームを含むこれらのクローンから、完全なｃＤＮＡ配列が決定された（図３）。クローン５０から得られた初期のｃＤＮＡは、Ｎ末端部分のＲｈｏ結合ドメインを含む１９８アミノ酸配列（アミノ酸６３−２６０）をコードする。分子中央のアミノ酸５７１−７３７の間には、ＩＰＰＰＰＰＬＰＧ（Ｇ／Ｓ／Ａ／Ｖ）の１４回繰り返し構造、即ち相同配列により特徴づけられるプロリンに富んだ領域が存在する。推定アミノ酸配列とデータベース上の他の配列とを比較すると、いくつかの相同タンパク質が同定され、それらのすべてはプロリンに富んだ領域を共有する（図４）。これらのタンパク質は、２つの相同領域、すなわち、プロリンに富んだＦＨ−１領域およびＦＨ−２領域を有するフォルミン様分子のファミリーに属する。ＦＨ−２領域は、また、推定配列中のアミノ酸９４５−１０１０の間にも見出された。この配列に対して最も相同性が高いタンパク質はショウジョウバエ（Drosophila）のディアファノス（diaphanous: 細胞質分裂に必要とされることで特徴づけられたタンパク質）であり、これは同定されたタンパク質に対してＮ−末端のプロリンに富む領域において約３０％の同一性およびその領域のＣ−末端の領域において約３９％の同一性を示した。それは、また、それぞれの推定Ｒｈｏ結合ドメインおよびＦＨ−２領域において、同定されたタンパク質に対して約３２％および５７％のホモロジーを示した。これらの結果に基づいて、本発明者が同定したタンパク質はショウジョウバエのディアファノスタンパク質の哺乳類のホモローグであると結論し、このタンパク質をｐ１４０ｍＤｉａ（哺乳類のディアファノス（ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｄｉａｐｈａｎｏｕｓ））と命名した（以降「ｐ１４０ｍＤｉａ」と呼ぶ）。
【００７１】
ｐ１４０ｍＤｉａは、また、酵母（Saccharomyces cerevisiae）細胞の出芽に関与するＢｎｉ１ｐの全体領域に対して有意なホモロジーを示した。他方、ｐ１４０ｍＤｉａはフォルミンおよびショウジョウバエのカプシノ（ capuccino）に対してＣ末端側の半分の領域においてホモロジーを示した。ｐ１４０ｍＤｉａのＲｈｏ結合ドメインはＮ末端側の部分にマップされた（前述）が、Ｒｈｏ結合ドメインに類似する配列はフォルミンやカプシノには見い出されなかった。このことより、これらのタンパク質（Ｒｈｏ結合ドメインを含まないフォルミンおよびカプシノ）は細胞内で同定されたタンパク質と同様な機能を発揮するが、ｐ１４０ｍＤｉａ、ディアファノスおよびＢｎｉｌｐのみがＲｈｏ依存的な様式で機能を発揮することが示唆された。
【００７２】
実施例３ ｐ１４０ｍＤｉａを発現する組織の検索
ｐ１４０ｍＤｉａを発現する組織を検索するため、ノザンブロット解析を実施した。成熟マウスのいくつかの組織からオリゴ−ｄＴラテックスビーズ（ファルマシア・バイオテック社）を使用して標準的手法（Sambrook, J. et al. (1989) Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor）に従い、ポリ（Ａ）+ ＲＮＡを調製した。６μｇの各ポリ（Ａ）+ ＲＮＡを２．１％ホルムアルデヒドを含有する１．０％アガロースゲル上で分離し、そしてＢｉｏｄｙｎｅ Ａ フィルター（Pall BioSuport社）に移した。次いでフィルターを32Ｐ標識化ｃｌ．５０の０．６ＫｂｐのｃＤＮＡ断片とハイブリダイゼーションさせた。最後に、フィルターを０．４×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳで６５℃において洗浄し、オートラジオグラフィーにかけた。
【００７３】
その結果、主要な６．３ｋｂの転写物が、試験したすべての組織において普遍的に（ubiquitously）検出されたが、肺、睾丸、胸腺、肝臓および胃においては特に強い発現が検出された。また、睾丸および肺において、５ｋｂのもうひとつの別の転写物が見出された（図５）。
【００７４】
実施例４ 抗ｐ１４０Ｄｉａ抗体の調製
細胞におけるｐ１４０ｍＤｉａの局在化および他のタンパク質との結合を検討するために、クローン５０のｃＤＮＡによりコードされるペプチド（配列番号１の６３〜２６０番のアミノ酸配列を含む）をＨｉｓ標識化タンパク質として発現させ、このペプチドに対する抗体を調製することにより、ｐ１４０ｍＤｉａに対する特異的な抗体を得た。具体的には下記の方法に従って、実験を実施した。
【００７５】
ｐＶＰ−ｃｌ．５０のｃＤＮＡインサートに近接するＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ部位を使用して、ｃｌ．５０ｃＤＮＡをｐＱＥ１１（ＱＩＡＧＥＮ社）およびｐＧＥＸ−３Ｘ（ファルマシア社）ベクターの中に結合した。Ｈｉｓ６標識化ｃｌ．５０を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９株において発現させ、そしてこれをＮｉ−ＮＴＡ樹脂（ＱＩＡＧＥＮ社）で製造業者のプロトコールに従い精製した。精製されたタンパク質をフロインドアジュバントと混合し、ウサギに注射した。Reid, T. et al., J. Biol. Chem., 271, 13556-13560 (1992)に記載されている方法に従って、ニトロセルロース膜上に固定化されたＧＳＴ−ｃｌ．５０融合タンパク質を用いて抗体をアフィニティー精製した。具体的には、ＧＳＴ−ｃｌ．５０を含有する封入体（inclusion body）を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から単離し、レムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）バッファー中で可溶化し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ニトロセルロース膜に移した。ＧＳＴ−ｃｌ．５０のバンドをストリップとして切り出し、このストリップに吸収された抗体を４℃において１００ｍＭ グリシン−ＨＣｌバッファー（ｐＨ２．３）、１００ｍＭ モノエタノールアミンバッファー（ｐＨ１１．５）、および１０％の１，４−ジオキサンを含有する１００ｍＭ グリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．５）で連続的に溶出した。溶出液を直ちに０．２５倍容量の２５０ｍＭ リン酸ナトリウムバッファーで中和した（第１および第３の溶出液についてｐＨ８．８、そして第２溶出液についてｐＨ７．０）。これらの溶出液を一緒にし、アフィニティー精製した抗体ＡＰ５０として使用した。対照の免疫蛍光試験のために、ＡＰ５０のアリコートを連続的に５片のＧＳＴ−ｃｌ．５０ブロット膜とインキュベートすることによって、抗体を除去したＡＰ５０溶液を調製した。
【００７６】
得られたポリクローナル抗体ＡＰ５０の特異性は、期待される分子量である５０ｋＤａのタンパク質、およびＩＰＴＧ誘導後の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ライゼート中に見出されるその分解産物との反応性により確認された（図６、レーン１および２）。ＡＰ５０抗体はＳｗｉｓｓ ３Ｔ３細胞ライゼートにおいて約１６０ｋＤａの単一のタンパク質を検出し、このタンパク質は明らかに内在性のｐ１４０ｍＤｉａを示している（レーン３および４）。
【００７７】
実施例５ インビトロにおけるＲｈｏタンパク質とｐ１４０ｍＤｉａの結合の 検出
ＡＰ５０抗体を使用して、野生型Ｒｈｏファミリー低分子量Ｇタンパク質と天然ｐ１４０ｍＤｉａの結合についてin vitroにおいて検討した。具体的には下記に記載の方法に従って実験を実施した。
【００７８】
ＧＤＰまたはＧＴＰ結合型のＧＳＴ−低分子量Ｇタンパク質（ＧＳＴ−Ｒｈｏ、ＲａｃおよびＣｄｃ４２Ｈ）の調製は、過去に記載の方法（Reid, T. et al., J. Biol. Chem., 271, 13556-13560 (1992)）に従って実施した。ほぼ１×１０7 細胞のコンフルエントＳｗｉｓｓ ３Ｔ３細胞を集め、３．２ｍｌのバッファーＡ［１０ｍＭ Ｍｅｓ（ｐＨ６．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ2 、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ トリトンＸ−１００、５ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＰＭＳＦ、５μｇ／ｍｌ ロイペプチン］中で超音波処理（５秒、４回）することにより破壊した。超音波処理したホモジネートを１０，０００ｇにおいて２０分間遠心し、上清を取り置いた。過去に記載された方法（Ishizaki, T. et al., EMBO J., 15, 1885-1893 (1996)）に従って、１０μＭ ＧＳＴ−低分子量Ｇタンパク質を１ｍＭ ヌクレオチドとインキュベートすることによって、各ヌクレオチドのロードを実施した。次いで上清の１／１０量を４００ｐｍｏｌのＧＴＰγＳまたはＧＤＰをロードした各ＧＳＴ−低分子量Ｇタンパク質とインキュベートした。３０℃において３０分インキュベートした後、５μｌのグルタチオン−セファロースを溶液に添加し、この混合液を４℃において１時間インキュベートした。遠心により回収された免疫複合体を１ｍｌのバッファーＡで２回洗浄し、レムリ試料バッファー中で煮沸した。可溶化抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥに付し、分離されたタンパク質をＰＶＤＦ膜に移した。過去に記載された操作（Kumagai, N. et al., J. Biol. Chem., 268, 4535-24538 (1993)）に従い、抗ｃｌ．５０抗血清ＡＰ５０を使用してイムノブロッティングを実施した。
【００７９】
結果は、図７に示したとおりであった。ｐ１４０ｍＤｉａはＧＴＰγＳ結合型Ｒｈｏによってのみ沈降したが、そのＧＤＰ結合型Ｒｈｏ、またはＧＴＰγＳ結合型ＲａｃまたはＣｄｃ４２によっては沈降しなかった。これらの結果はツー・ハイブリッド・システムにおける結果を支持し、ｐ１４０ｍＤｉａが活性型Ｒｈｏと選択的に結合することを示している。
【００８０】
実施例６ インビトロにおけるプロフィリンとｐ１４０ｍＤｉａの結合の検出ｐ１４０ｍＤｉａはポリ−プロリンのストレッチの繰り返し構造を有し、かつプロフィリンはポリ−Ｌ−プロリン配列に結合することが示されている。そこで、本発明者はプロフィリンがｐ１４０ｍＤｉａに結合するかどうか、この結合がＲｈｏに依存するかどうかを検討した。具体的には下記に記載の方法に従って、実験を実施した。
【００８１】
まず、過去に記載された方法（Janmey, P.A., Ann. Rev. Physiol., 56, 169-191 (1994)）に従って、ヒト血小板プロフィリンをポリ−Ｌ−プロリンアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。具体的には、２５０ｍｇのポリ−Ｌ−プロリン（ＰＬＰ、分子量１２，０００、シグマ社）をＣＮＢｒ活性化セファローズ４Ｂ（ファルマシア社）に結合させた。過去に記載されている方法（Ishizaki, T. et al., EMBO J., 15, 1885-1893 (1996)）に従って、１００単位の血液のバッフィーコート画分から、洗浄したヒト血小板を調製した。血小板を２００ｍｌの抽出バッファー［２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ ＫＣｌ、０．２ｍＭ ＡＴＰ、１ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＰＭＳＦ］＋５０ｍＭ ベンズアミジンおよび１ｍｇ／ｍｌ アプロチニン中で超音波処理により破壊した。１００，００００×ｇで時間遠心した後、上清をＰＬＰ−セファロースカラムに適用した。これを４Ｍ尿素で洗浄後７Ｍ尿素で溶出することによりプロフィリンの均質調製物が得られた。次いで、０．９６ｍｇのプロフィリンを製造業者のプロトコールに従い１ｍｌのＮＨＳ活性化セファロース（ファルマシア社）と複合化させ、固定化プロフィリン・ビーズを得た。対照として、ウシ血清アルブミンを同様にＮＨＳ活性化セファロースに結合させた。
【００８２】
１２枚の６ｃｍの培養皿から得られたコンフルエントＳｗｉｓｓ ３Ｔ３細胞を２．４ｍｌのバッファーＣ中で可溶化し、ライゼートを１０，０００×ｇにおいて１０分間遠心し、上清を回収した。次いで、得られた上清の１／１０量のアリコートを、ＧＳＴ−低分子量Ｇタンパク質または遊離ＧＴＰγＳまたはＧＤＰの存在下または非存在下においてインキュベートした。また、２０μｌの固定化されたプロフィリンを添加した。混合液を２５℃において３０分間インキュベートした後、ビーズを１，０００×ｇで２分間遠心した。上清を取り置き、ビーズを１００ｍＭ ＮａＣｌの代わりに３００ｍＭ ＮａＣｌを含有するバッファーＣ（１００μｌ）で１回洗浄した。５０μｌのレムリ試料バッファーをビーズに添加し、上清の１／１０量をこれの１／５倍容量の５×レムリバッファーと混合した。試料を煮沸し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、ニトロセルロース膜に移した。イムノブロッティングを前述したように実施し、検出はＥＣＬシステム（アマシャム社）により実施した。
【００８３】
結果は図８に示したとおりであった。Ｓｗｉｓｓ ３Ｔ３細胞ライゼートにおけるｐ１４０ｍＤｉａはプロフィリン−アガロースの添加によりほとんど定量的に沈降したが、ＢＳＡ−アガロースでは沈降しなかった。一方、この結合は外からのＲｈｏＡの添加またはＧＴＰγＳの添加により影響を受けなかった。
【００８４】
実施例７ 広がって移動する細胞の膜の波打ち構造および分裂する細胞の分裂溝におけるＲｈｏＡ、ｐ１４０ｍＤｉａおよびプロフィリンの共局在化
ＨＴ１０８０培養ヒト線維芽肉腫細胞、Ｓｗｉｓｓ ３Ｔ３細胞、ｍｙｃ標識化ＲｈｏＡを安定的に発現するｓＭＤＣＫ２細胞（K. Takaishi, K. et al., Oncogene, 11, 39-48 (1995)）またはＨｅＬａ細胞において、ｐ１４０ｍＤｉａ、プロフィリンおよび内在性Ｒｈｏの分布およびそれらのインビボでの共局在化の可能性を、各タンパク質に対して特異的な抗体を使用した蛍光顕微鏡観察により検討した。
【００８５】
細胞を、１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）を補充したダルベッコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で増殖させた。ＨＴ１０８０細胞は５×１０4 細胞／３５ｍｍ皿の密度で播種し、一晩培養し、分析にかけた。ｓＭＤＣＫ２細胞の分析のために、カバーガラス上に１０％のＦＣＳを含有するＤＭＥＭ中の１×１０4 細胞／３５ｍｍ培養皿の密度で細胞を播種し、１６時間インキュベートした。次いで培地をＦＣＳを含まないＤＭＥＭに変え、２４時間インキュベートした。血清飢餓細胞を１×１０-7Ｍのホルボールエステル（phorbol myristate acetate : PMA ）の存在下または非存在下において１５分間３７℃において刺激し、固定した。
【００８６】
間接的免疫蛍光のために、３．７％ パラホルムアルデヒドを含有するリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で室温において２０分間細胞を固定し、次いで０．２％ トリトンＸ−１００を含むＰＢＳで１０分間で処理し透過性とした。ＰＢＳで数回洗浄した後、細胞を５％ ＢＳＡを含有するバッファーＢ［２０ｍＭＴｒｉｓ ｐＨ７．４、５０ｍＭ ＮａＣｌ］中で室温において３０分以上インキュベートした。ｐ１４０ｍＤｉａの染色のために、細胞をブロッキング溶液中のＡＰ５０の１：１０希釈物と室温において１時間インキュベートし、０．１％のトリトンＸ−１００を含有するバッファーＢで３回洗浄した。次いで細胞をＣｙ２標識化ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（Amersham Life Science 社）で染色した。アクチンの染色のために、ローダミンファロイジン（Molecular Probe 社）を第２抗体とともに１：２００希釈において添加した。Ｍｙｃ−エピトープの染色のために、９Ｅ１０モノクローナル抗Ｍｙｃ抗体を１０μｇ／ｍｌの濃度でＡＰ５０とともに１次インキュベーションのために添加した。次いでローダミン抗マウスＩｇＧ抗体を１：５０希釈で検出のために使用した。
【００８７】
結果は下記に記載したとおりであった。抗ｐ１４０ｍＤｉａ抗体により得られた蛍光の大部分は、ＨＴ１０８０細胞のより厚い部分、すなわち、核周辺の細胞質領域において局在化していた。しかしながら、顕著な蛍光は、また、高度に運動性であることが知られている周囲領域、例えば、広がって運動する細胞のリーディングラメラ（leading lamella ）および膜の波打ち構造（membrane ruffles）、においても観察された（図９Ａ）。核周囲の細胞質領域とリーディング・エッジ（leading edge）との間には、ｐ１４０ｍＤｉａの染色が顕著に欠如していた。ｐ１４０ｍＤｉａとフォーカル接着およびストレスファイバーとの結合は観察されなかった。上記と同様な分布のパターンは培養Ｓｗｉｓｓ ３Ｔ３細胞においても観察された（図９Ｅ）。
【００８８】
モノクローナル抗プロフィリン抗体（２Ｈ１１）を使用した二重免疫蛍光顕微鏡観察では、ＨＴ１０８０細胞の核周囲の細胞質領域および拡大しているラメラやベール（lamella an veils）におけるプロフィリンの蓄積が検出され、これはｐ１４０ｍＤｉａの分布と重複した（図９Ｂ）。このプロフィリンの分布はラット線維芽細胞において過去にされた結果（Buβ, F. et al., Cell Mot. Cytoskeleton, 22, 51-61 (1992) ）と一致した。興味あることには、プロフィリン抗体およびポリクローナル抗ＲｈｏＡ抗体を使用した二重免疫蛍光観察において、内在性ＲｈｏＡの一部分は、また、運動性細胞の膜ベールにおいてプロフィリンとともに蓄積することが明らかにされた（図９ＣおよびＤ）。このことから、ｐ１４０ｍＤｉａ、プロフィリンおよびＲｈｏＡが、細胞の高度な運動性構造に共局在化していることが示唆された。また、ｐ１４０ｍＤｉａの分布をＳｗｉｓｓ ３Ｔ３細胞で調べ、これをＦ−アクチンの分布と比較した。ｐ１４０ｍＤｉａはこの細胞でも、アクチン骨格（actin rib ）がよく発達した広がったラメラに局在していた（図９Ｅ、Ｆ）。
【００８９】
ｐ１４０ｍＤｉａ、プロフィリンおよびＲｈｏＡの共局在化は、また、ｍｙｃ標識化ＲｈｏＡを安定に発現し、ホルボールエステルに応答して膜を拡張するｓＭＤＣＫ細胞（Takaishi, K. et al., Oncogene, 11, 39-48 (1995) ）においても証明された。図１０に示すように、Ｍｙｃ−ＲｈｏＡおよびｐ１４０ｍＤｉａの双方は、休止細胞のより厚い部分における細胞質中にむしろ均質に存在した。ＰＭＡによる２分間の刺激の後、Ｍｙｃ−ＲｈｏＡの一部はｐ１４０ｍＤｉａが共局在化された膜の波打ち構造の周囲に移動した。プロフィリンの一部も膜の波打ち構造に移動し、ＲｈｏＡと共局在することが明らかになった。これらの細胞のホルボールエステルによる膜拡張の誘導はＲｈｏ依存的な様式で起こることが知られている（Takaishi, K. et al., Oncogene, 11, 39-48 (1995) ）ので、これらの結果はｐ１４０ｍＤｉａおよびプロフィリンのリクルートメント（recruitment ）もまた、Ｒｈｏ依存的であることを示唆している。
【００９０】
中間期（interphase）の細胞においては、ｐ１４０ｍＤｉａの大部分は細胞質中に存在し、あるものはスプレッディング・エッジの原形質膜へ移行している。他方、有糸分裂細胞においては、ｐ１４０ｍＤｉａの細胞内局在は、それらが細胞質分裂を行うまで、観察されなかった。この際、ｐ１４０ｍＤｉａの一部分は分裂溝部分の原形質膜に濃縮され、リング様構造物として見えた（図１１ＡおよびＣ）。この濃縮は細胞質分裂の終わりにおいて消失し、染色は原形質膜の取り囲む領域に移動した。娘細胞を接続している細胞間架橋部分には、染色は観察されなかった。プロフィリンはこれらのプロセスの間で、ｐ１４０ｍＤｉａとほとんど重複する染色パターンを示した（図１１Ｄ）。
【００９１】
実施例８ ＲｈｏＡおよびｐ１４０ｍＤｉａはフィブロネクチン（ＦＮ）コーティングされたビーズの周りにクラスター状に存在する
最近の研究において、Ｒｈｏ活性化および細胞外マトリックスタンパク質のインテグリンのライゲーション（ligation）の双方が細胞のスプレッディングおよび基質への接着のために必要であり（Hotchin, N.A. & Hall, A., J. Cell Biol., 131, 1857-1865 (1995)）、そしてフィブロネクチンまたは抗インテグリン抗体のいずれかでコーティングされたビーズによるインテグリンのライゲーションは、ビーズ直下の原形質膜にＲｈｏをリクルートすることが示されている（Burbelo, P. et al., J. Biol. Chem. 270, 30919-30926 (1995)）。そこで、ｐ１４０ｍＤｉａも、これらのビーズにより原形質膜にＲｈｏがリクルートされるかどうか、およびこのリクルートがＲｈｏ活性化に依存的かどうか、について検討した。
【００９２】
ポリスチレンラテックスのビーズ（１１．９μｍの平均直径、シグマ社）を５０μｇ／ｍｌ ヒトフィブロネクチン（Collabrative Research 社）または１００μｇ／ｍｌのポリ−Ｌ−リジン（シグマ社）に記載されているようにコーティングした（Grinnel & Geiger、Exp. Cell Res., 162, 449-461 (1986) ）。トリプシン処理したＳｗｉｓｓ ３Ｔ３細胞をポリ−リジンでコーティングしたガラススリップ上にプレートし、１０％のＦＣＳを含有するＤＭＥＭ中で３７℃で２時間かけてスリップに結合させた。次いで、各々異なる型のビーズを細胞上に置いた。３７℃において１５分間のインキュベーション後、細胞を固定した。ｐ１４０ｍＤｉａの染色は前述したように実施した。内在性ＲｈｏＡの免疫染色のために、ウサギ抗ＲｈｏＡ抗体（Santa Cruz社）を１：４０希釈において使用した。抗体を前述したようにＣｙ２標識化ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体を使用して可視化した。
【００９３】
結果は下記に記載したとおりであった。まず、内在性Ｒｈｏが、ポリ−リジンでコーティングされたビーズ直下ではなく（図１２ｄ）、フィブロネクチン（ＦＮ）でコーティングされたビーズ直下に蓄積されることを確認した（図１２ｂ）。この条件では、ｐ１４０ｍＤｉａもＦＮコーティングされたビーズ直下にリクルートされ、リング様の蓄積がビーズの周囲に観察された（図１２ａ）。上記結果（Ｒｈｏとｐ１４０ｍＤｉａ両方の蓄積）に加えて、細胞を予めＣ３菌体外酵素で処理した場合にはこれらの蓄積が阻害されたことから、これらのリクルートメントがＲｈｏ活性化依存的であることが判明した（データ省略）。
【００９４】
実施例９ ｐ１４０ｍＤｉａの過剰発現によるアクチン重合の誘導
ｐ１４０ｍＤｉａの機能を調べるため、過去に記載の方法（Ishizaki, T. et al., EMBO J., 15, 1885-1893 (1996)）に準じて、ｐ１４０ｍＤｉａのｃＤＮＡ（配列番号１の１〜１２５５番のアミノ酸配列）および／または他のタンパク質のｃＤＮＡをＣＯＳ７細胞で一過的に発現させた後、細胞を固定し、抗ｐ１４０ｍＤｉａ抗体で染色した。
【００９５】
トランスフェクト後４０時間目の細胞を抗ｐ１４０ｍＤｉａ抗体で染色したところ、よく染色され、ｐ１４０ｍＤｉａの発現が確認された。トランスフェクトしない細胞では核周辺に染色が観察された。これと比較すると、トランスフェクトした細胞では細胞の輪郭が明瞭にしかも均等に染色されたことから、ｐ１４０ｍＤｉａを過剰発現した場合にはこの分子が原形質膜全体に局在化することが示された（図１３Ａ）。ファロイジンで染色すると、ストレスファイバーが消失し、細胞の原形質膜に一致してアクチン染色が亢進されたことが観察された（図１３Ｂ）ことから、ｐ１４０ｍＤｉａは膜に移行し、そこでアクチンの重合を誘導することが示唆された。ｐ１４０ｍＤｉａをＣ３菌体外酵素とともに発現した場合にはより顕著な結果が得られた。即ち、Ｃ３菌体外酵素を単独でトランスフェクトすると、細胞からほとんど全てのアクチンファイバーが消失し細胞が球形化した（図１３Ｃ及びＤ）。ｐ１４０ｍＤｉａをＣ３菌体外酵素とともにトランスフェクトした時には、細胞は形態を維持し、ｐ１４０ｍＤｉａのみをトランスフェクトした細胞で観察されるのものと同様の繊維状アクチンの染色が観察された（データ省略）。
【００９６】
更に、ｐ１４０ｍＤｉａをＲｈｏVal14 又は野生型Ｒｈｏと共発現させた。ＲｈｏVal14 又は野生型Ｒｈｏを単独で発現させた場合には、ストレスファイバーや収縮の誘導が観察された。しかし、ｐ１４０ｍＤｉａをＲｈｏVal14 又は野生型Ｒｈｏと共発現させた場合には、上記に記載したｐ１４０ｍＤｉａ形質（ストレスファイバーの消失と細胞の原形質膜に一致したアクチン染色）がＲｈｏ単独によって誘導される形質（ストレスファイバーや収縮の誘導）よりも優勢に発現し、ストレスファイバーや収縮の誘導はほとんど観察されなかった（データ省略）。これらの結果から、ｐ１４０ｍＤｉａが過剰発現されると、原形質膜に自動的に移行する、すなわち、Ｒｈｏタンパク質によるアクチン重合とは独立して移行することを示唆している。
【００９７】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】クローン５０とＲｈｏタンパク質とのツー・ハイブリッド・システムでの結合を示した写真である。Ｖａｌ、Ａｓｎ、ＷＴおよびＣｄｃ４２は、それぞれ、ＲｈｏＡVal14 、ＲｈｏＡAsn19 、野生型ＲｈｏＡおよびＣｄｃ４２Ｈｓを示している。ΔＡｓｎおよびΔＷＴは、Ａｌａ１８１でトランケートしたＲｈｏAsn19 および野生型ＲｈｏＡを示している。ラミン（Lamin ）および他のタンパク質と融合していないＬｅｘ結合ドメインを、ネガティブコントロールとして用いた。Ａｌａ１８１でトランケートしたＲｈｏＡVal14 は、他のタンパク質と融合していないＶＰ１６活性化ドメインとも結合して高ＬａｃＺ活性を示したので、この実験では使わなかった。
【図２】単離されたｐ１４０ｍＤｉａを模式的に示した図である。
ＯＲＦは点のボックスで示した。ヌクレオチド８７番目のＴからＣへの変換および２２２９番目のＣからＴへのヌクレオチドの変換が、それぞれ５０３およびＥ７３ｃＤＮＡ中に見出された。ライブラリーａ、ｂおよびＣは、それぞれマウス脳ライブラリー９３６３０９（ストラタジーン社）、ＭＬ３０００ａ（クロンテック社）およびマウス胚ライブラリーを示している。Ｅ７３ ｃＤＮＡには９アミノ酸の挿入が認められた。
【図３】ｐ１４０ｍＤｉａの推定アミノ酸配列を示した図である。ツー・ハイブリッド・システムで得られたクローンの配列は太い下線で、プロリンリッチ領域の繰り返し構造は点下線で、ＦＨ−２領域は細い下線で、それぞれ示した。矢じり印は９アミノ酸の挿入箇所を示している。
【図４】ｐ１４０ｍＤｉａおよびＦＨ領域を含む他の蛋白質との模式的な構造比較を示す。ｐ１４０ｍＤｉａの配列をDrosophilaの diaphanous 、S.cerevisiaeのＢｎｉ１ｐ、ラットｆｏｒｍｉｎ、およびDrosophilaのcappucino と比較した。比較は推定Ｒｈｏ結合領域（Ｒｈｏ-binding）、Ｎー末端からプロリンリッチ領域（poly-proline）、ＦＨ−２領域、プロリンリッチ領域からＣ末端領域で行った。アミノ酸の同一性は％で示した。フォルミンとカプチーノのＮー末端領域（＊で示した）はホモロジーが認められなかった。示した全ての配列は、中間部分にポリープロリンストレッチを持ち、Ｃ末端側の半分にホモロジーを持っている。
【図５】ノザンブロッティングによるマウスの種々の組織におけるｐ１４０ｍＤｉａの組織分布を示したＲＮＡブロット（電気泳動写真）である。
ｈｅａｒｔ：心臓、ｌｕｎｇ：肺、ｂｒａｉｎ：脳、ｋｉｄｎｅｙ：腎臓、ｔｅｓｔｉｓ：睾丸、ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ：骨格筋、ｔｈｙｍｕｓ：胸腺、ｓｐｌｅｅｎ：脾臓、ｌｉｖｅｒ：肝臓、ｓｔｏｍａｃｈ：胃、ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ：小腸、ｃｏｌｏｎ：結腸。
【図６】抗ｐ１４０ｍＤｉａ抗体の特異性を示した電気泳動写真である。
抗血清（ＡＰ５０）はツー・ハイブリッド・システムで得られたクローン５０がコードするペプチドに対するもので、その特異性を、ＩＰＴＧで誘導前（レーン１）および誘導後（レーン２）の組換えタンパク質を発現している大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の全ライゼート、あるいはＳｗｉｓｓ ３Ｔ３細胞（３Ｔ３ ｃｅｌｌｓ）の全ライゼート（レーン３）に対するウエスタンブロッティングにより検討した。レーン４は細胞の全ライゼートをＣＢＢ染色したものを示している。
【図７】ＧＴＰγＳ結合型Ｒｈｏタンパク質によるｐ１４０ｍＤｉａの沈降を示した電気泳動写真である。Ｓｗｉｓｓ ３Ｔ３細胞の全ライゼートを、ＧＴＰγＳ結合型あるいはＧＤＰ結合型のＧＳＴ−Ｒｈｏ、ＧＳＴ−Ｒａｃ、ＧＳＴ−Ｃｄｃ４２あるいはＧＳＴとともにインキュベートした。結合したタンパク質をグルタチオンアガロースビーズで沈降させ、抗ｐ１４０ｍＤｉａ抗体を用いたイムノブロッティングにより解析した。レーン９（cell lysates）では、細胞の全ライゼート中のｐ１４０ｍＤｉａを抗体で検出した。
【図８】ｐ１４０ｍＤｉａとプロフィリンのインビトロでの結合を示した電気泳動写真である。Ｓｗｉｓｓ ３Ｔ３細胞ライゼートを、ＧＴＰγＳ−またはＧＤＰ結合型のＧＳＴ−Ｒｈｏタンパク質の存在下または非存在下（none）で、プロフィリンあるいはＢＳＡをコンジュゲート（immobilized ）したアガロースビーズとインキュベートし、結合タンパク質を沈降させた。沈降物（Pellet）および上清（Supernatant ）は、抗ｐ１４０ｍＤｉａ抗体を用いてイムノブロッティングにより解析した。
【図９】広がった線維芽細胞の膜ラッフルでのＲｈｏＡとｐ１４０ｍＤｉａおよびプロフィリンの共局在を示した写真（生物の形態の写真）である。（Ａ−Ｄ）ＨＴ１０８０ヒト線維肉腫細胞。（ＥとＦ）Ｓｗｉｓｓ ３Ｔ３マウス線維芽細胞。細胞を培養し、固定し、抗ｐ１４０ｍＤｉａ抗体（ＡとＥ）、抗ＲｈｏＡポリクローナル抗体（Ｃ）あるいはマウス抗プロフィリンモノクローナル抗体（ＢとＤ）又はローダミン−ファロイジン（Ｆ）いずれかで同時に細胞を染色し、標準的な蛍光顕微鏡写真を撮影した。
【図１０】ＰＭＡで刺激した広がったｓＭＤＣＫ細胞の膜ラッフルにおけるｍｙｃ標識化ＲｈｏＡ、ｐ１４０ｍＤｉａおよびプロフィリンの共局在化を示した写真（生物の形態の写真）である。休止期（Resting ）（Ａ−Ｃ）またはphorbol myristate acetate （Ｄ−Ｈ）で刺激した（PMA stimulation ）ｓＭＤＣＫ細胞を固定し、抗ｐ１４０ｍＤｉａ抗体（Ｂ、ＥおよびＨ）またはモノクローナル抗ｍｙｃ抗体（Ｃ、Ｆ）で染色した。Ｈには、過剰量の組換えペプチドで予め吸収させた（preabsorbed ）抗ｐ１４０抗血清を用いた染色が示されている。Ａ、Ｄ、Ｇには、位相差顕微鏡（phase contrast）を用いてそれぞれの細胞を撮影した顕微鏡写真が示されている。写真上段左から、Ａ、Ｂ、Ｃであり、写真中段左からＤ、Ｅ、Ｆであり、写真下段左からＧ、Ｈである。
【図１１】分裂期細胞の分裂溝におけるｐ１４０ｍＤｉａの濃縮を示した写真（生物の形態の写真）である。ＡおよびＢ：Ｓｗｉｓｓ ３Ｔ３細胞、ＣおよびＤ：ＨｅＬａ細胞。抗ｐ１４０ｍＤｉａ抗体（anti-p140 ）で染色（staining）された対数増殖期の細胞（ＡおよびＣ）およびＤＡＰＩ（Ｂ）または２Ｈ１１モノクローナル抗プロフィリン抗体（Ｄ）（anti-profilin ）で同時に染色したものを標準的な蛍光顕微鏡で撮影した。
【図１２】フィブロネクチンでコートされたビーズの回りにＲｈｏ依存的な様式で出現したＲｈｏＡおよびｐ１４０ｍＤｉａのクラスターを示した写真である。４８時間培養したＳｗｉｓｓ ３Ｔ３細胞を用いた。細胞を播き、フィブロネクチン（ＦＮ−coated）（ａ、ｂ）またはポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ−coated）（ｃおよびｄ）でコートしたラテックス・ビーズとともに１５分間インキュベートした。細胞は固定後、抗ｐ１４０ｍＤｉａ抗体（anti-p140 ）（ａ、ｃ）または抗Ｒｈｏ抗体（anti-Rho）（ｂ、ｄ）で染色（staining）した。
【図１３】ＣＯＳ−７細胞におけるｐ１４０ｍＤｉａの一過性の発現を示した写真である。ＣＯＳ細胞はｐ１４０ｍＤｉａの発現ベクター単独（ＡおよびＢ）またはＣ３菌体外酵素の発現ベクター単独（ＣおよびＤ）でトランスフェクトした。Ｃ３菌体外酵素のトランスフェクションは、ＦＬＡＧエピトープを有したＣ３菌体外酵素発現様ベクターで実施した。細胞を固定し、抗ｐ１４０ｍＤｉａ抗体（anti-p140 ）単独（ＡおよびＣ）あるいは同時にアクチンをローダミン−ファロイジン（phalloidin）染色（staining）した（Ｂ、Ｄ）。
Claims (17)
- 以下の（ａ）または（ｂ）であるタンパク質：
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質；または
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列に１若しくは数個のアミノ酸配列が付加および／または挿入され、および／または前記配列番号１のアミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸が置換および／または欠失されたアミノ酸配列からなり、かつ活性型Ｒｈｏタンパク質結合能およびプロフィリン結合能を有する、タンパク質。 - 配列番号１の６３〜２６０番のアミノ酸配列と配列番号１の５７１〜７３７番のアミノ酸配列とを有する、請求項１に記載のタンパク質。
- 請求項１または２に記載のタンパク質をコードする核酸分子。
- 配列番号２のＤＮＡ配列の一部または全部からなり、かつ活性型Ｒｈｏタンパク質結合能およびプロフィリン結合能を有するタンパク質をコードする、請求項３に記載の核酸分子。
- 塩基配列の一部が、配列番号２の９４〜３８６１番、２８０〜８７３番、１８０４〜２３０４番のＤＮＡ配列である、請求項４に記載の核酸分子。
- 請求項３〜５のいずれか一項に記載の核酸分子を含んでなる、ベクター。
- プラスミドベクター、ウイルスベクター、およびリポソームベクターからなる群から選択される、請求項６に記載のベクター。
- 請求項６または７に記載のベクターによって形質転換された、宿主細胞 （ただし、ヒト細胞にあってはヒトから単離された細胞に限る）。
- 大腸菌、酵母、昆虫細胞、ＣＯＳ細胞、リンパ細胞、繊維芽細胞、ＣＨＯ細胞、血液系細胞、および腫瘍細胞からなる群から選択されるものである、請求項８に記載の宿主細胞。
- 請求項８または９に記載の宿主細胞を培養し、そしてその培養物から請求項１または２に記載のタンパク質を単離することを含んでなる、請求項１または２に記載のタンパク質の製造法。
- （１）スクリーニングの対象となる物質を、活性型Ｒｈｏタンパク質と、請求項１または２に記載のタンパク質とを含むスクリーニング系に存在させ、そして
（２）活性型Ｒｈｏタンパク質と、請求項１または２に記載のタンパク質との結合の阻害の程度を測定すること
を含む、活性型Ｒｈｏタンパク質と、請求項１または２に記載のタンパク質との結合を阻害する物質のスクリーニング法。 - （１）スクリーニングの対象となる物質を、プロフィリンと、請求項１または２に記載のタンパク質とを含むスクリーニング系に存在させ、そして
（２）プロフィリンと、請求項１または２に記載のタンパク質との結合の阻害の程度を測定すること
を含む、プロフィリンと、請求項１または２に記載のタンパク質との結合を阻害する物質のスクリーニング法。 - スクリーニングの系が細胞系または無細胞系である、請求項１１または１２に記載のスクリーニング法。
- 配列番号１の６３〜２６０番のアミノ酸配列に対する、抗体。
- ポリクローナル抗体である、請求項１４に記載の抗体。
- （１）検出の対象となる物質を請求項１４または１５に記載の抗体を含む検出系に存在させ、そして
（２）検出の対象となる物質と請求項１４または１５に記載の抗体との反応の程度を測定すること
を含む、前記抗体と反応する物質の検出法。 - 請求項１４または１５に記載の抗体を含む、前記抗体によって認識される物質の検出キット。
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