ES2259287T3 - Preparacion de moleculas biologicamente activas. - Google Patents
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Abstract
Un método para producir una citoquina biológicamente activa a partir de su precursor biológicamente inactivo, que comprende mutar el sitio de escisión natural de la citoquina a un sitio que es capaz de ser escindido por una proteasa, y escindir el precursor inactivo mutado para producir una citoquina biológicamente activa, en el que la citoquina se selecciona entre IL-1â e IL-18 y en el que el sitio de escisión natural es un sitio de escisión de la caspasa-1.
Description
Preparación de moléculas biológicamente
activas.
La presente invención se refiere en general a la
producción de citoquinas biológicamente activas, seleccionadas
entre IL-1\beta e IL-18, que se
presentan en forma de precursores inactivos y que son escindidas
in vivo por proteasas dando lugar a moléculas maduras y
biológicamente activas.
De manera más específica, la invención se
refiere a la producción de citoquinas, que se producen in
vivo a partir de sus correspondientes precursores mediante
autoescisión, escisión por otras caspasas o mediante escisión, p.
ej., con la proteasa caspasa-1, también conocida
como enzima convertidora de interleuquina-1 (ICE).
Las citoquinas producidas de esta manera son la
interleuquina-1\beta y la
interleuquina-18.
Las caspasas son una familia de
cisteína-proteasas que escinden sus proteínas diana
detrás de un residuo de Asp. De las once caspasas publicadas
conocidas, la caspasa-1 y probablemente las caspasas
-4, -5 y -11 parecen estar sobre todo implicadas en el
procesamiento de citoquinas proinflamatorias, mientras que otras
caspasas desempeñan papeles cruciales en la iniciación y ejecución
de la apoptosis o muerte celular programada. Las caspasas comparten
varias características comunes, entre ellas que son sintetizadas en
forma de zimógenos catalíticamente inactivos que generalmente son
activados mediante escisión detrás de residuos específicos e
internos de Asp presentes en fragmentos enlazadores interdominios, y
que presentan la capacidad de escindir sus sustratos detrás de
residuos de Asp. Como resultado, algunas caspasas maduras activas,
en particular las que derivan de las caspasas con prodominio largo,
son capaces de procesar y activar sus propios zimógenos y otros
zimógenos inactivos de caspasas. En relación con la estructura
primaria, las caspasas proapoptósicas se pueden dividir en dos
clases, una clase I que incluye las caspasas -2, -8, -9 y -10 que
contienen un prodominio largo amino-terminal, y una
clase II que incluye por ejemplo las caspasas -3, -6 y -7 que
contienen un prodominio corto o ausente. Experimentos de escisión
in vitro sugieren que las caspasas de clase II requieren
caspasas de clase I activadas para su procesamiento proteolítico
(12).
Otra clasificación de caspasas es la que se hace
por la especificidad del sitio de escisión (13). En esta
clasificación las caspasas del Grupo I contienen la secuencia
consenso WEHD (caspasas -1, -4 y -5), las caspasas del Grupo II
contienen la secuencia consenso DExD (caspasas -2, -3 y -7) y las
caspasas del Grupo III contienen la secuencia consenso
(IVL)ExD (caspasas -6, -8 y -9). El sitio de escisión óptimo
de la caspasa-8 es LETD (14).
La interleuquina-18
(IL-18), inicialmente descrita como un factor
inductor de interferón-\gamma
(IFN-\gamma), es una citoquina recientemente
caracterizada que comparte características estructurales con la
familia de proteínas IL-1 (1-4). La
IL-18, inicialmente se purificó, y posteriormente se
clonó, en el hígado de ratones tratados con Propionbacterium
acnes (P. acnes) inactivado con calor, y tratados después
con lipopolisacárido (LPS) (2, 5). La clonación de la
IL-18 humana se ha descrito recientemente (3).
Al igual que la IL-12,
IL-18 es producida por macrófagos activados tales
como las células hepáticas de Kupffer y otros macrófagos residentes
(3). La IL-18 es un inductor temprano de la
respuesta Th1, y coestimula la producción de
IFN-\gamma, así como la de
TNF-\gamma, del factor estimulador de colonias de
granulocitos-macrófagos y de IL-2
(6). Además, potencia la proliferación de células T inducida por
anticuerpos anti-CD3 e incrementa la citotoxicidad
de las células citotóxicas naturales aumentando la expresión del
Ligando de Fas (6, 7).
A diferencia de la mayoría de las otras
citoquinas, que exhiben una estructura en haz de cuatro hélices,
IL-18 e IL-1\beta presentan una
estructura total en lámina \beta plegada (7). De manera similar a
IL-1\beta, IL-18 se sintetiza en
forma de un precursor biológicamente inactivo
(proIL-18), que carece de péptido señal (3). Los
precursores de IL-1\beta e IL-18
son escindidos por la caspasa-1 (enzima convertidora
de IL-1\beta, o ICE), que escinde detrás de un
residuo de ácido aspártico en la posición P1. Las citoquinas maduras
resultantes son fácilmente liberadas por la célula (8, 9). Estudios
realizados con ratones deficientes en caspasa-1
demostraron el importante papel de la IL-18 madura
como inductor de IFN-\gamma y de respuestas Th1.
La inyección a esos ratones de P. acnes y LPS produjo
niveles bajos de IFN-\gamma circulante comparados
con los de ratones de tipo salvaje (8, 9). La inyección de
IL-18 restableció el nivel de
IFN-\gamma inducido por LPS en los ratones
deficientes en caspasa-1 (9), respaldando más el
concepto de que la caspasa-1 está implicada en la
producción de IL-18 activa. Otras caspasas y en
particular las que escinden proteínas intracelulares asociadas con
apoptosis, fueron al menos 100 veces menos activas que la
caspasa-1 (9). Estudios similares realizados con
ratones deficientes en IL-18 revelaron su papel en
la actividad de células NK y en la inducción de citoquinas (10).
La IL-1\beta y la
IL-18 de ratón recombinantes, expresadas en E.
coli, pueden ser replegadas para producir una citoquina
totalmente activa. Intentos realizados para expresar la forma madura
de la IL-18 humana en E. coli o en otros
hospedadores no proporcionaron una citoquina totalmente activa.
Debido a sus usos terapéuticos potenciales, p. ej., en enfermedades
malignas, o en una enfermedad en la que se requiere la inducción de
la producción de interferón-\gamma, es
conveniente establecer un sistema de expresión eficiente para la
producción de IL-18 humana madura y biológicamente
activa.
La presente invención permite la producción de
moléculas que, en su proceso de formación natural, se producen en
forma de precursores biológicamente inactivos, y se vuelven activas
después de la escisión de sus precursores. Esto no se puede llevar
a cabo con facilidad in vitro.
La presente invención proporciona por lo tanto
un método para la producción de una citoquina biológicamente
activa, seleccionada entre IL-1\beta e
IL-18, a partir de su precursor biológicamente
inactivo, mediante mutación de su sitio de escisión natural en un
sitio susceptible a la escisión por acción de una proteasa común, y
mediante escisión de la molécula mutada para producir una molécula
biológicamente activa.
En esas citoquinas el sitio de escisión natural
es un sitio de escisión de la caspasa-1.
La proteasa común empleada en la escisión se
puede seleccionar entre trombina, enteroquinasa, subtilisina,
genena-
sa^{TM} (New England Biolabs, Beverly MA, USA), la proteasa 3C de rinovirus humanos y la proteasa Factor Xa. Cuando se utiliza una caspasa para la escisión, la caspasa-8 es la preferida.
sa^{TM} (New England Biolabs, Beverly MA, USA), la proteasa 3C de rinovirus humanos y la proteasa Factor Xa. Cuando se utiliza una caspasa para la escisión, la caspasa-8 es la preferida.
En una realización preferida de la presente
invención, el método comprende transfectar un hospedador con un
vector que comprende un cDNA que codifica un precursor de una
citoquina biológicamente activa, seleccionada entre
IL-1\beta e IL-18 mutadas en su
sitio de escisión, en el que el sitio de escisión natural del
precursor biológicamente inactivo es un sitio de escisión por
caspasa-1, cultivar el hospedador transfectado,
expresar el precursor y aislar la citoquina biológicamente activa
después de un tratamiento con una proteasa.
Opcionalmente esto se puede realizar porque el
cDNA está fusionado en el marco de lectura al lado de una secuencia
codificadora de
glutation-S-transferasa (GST) y la
molécula de fusión expresada se captura sobre bolitas de
agarosa-glutation antes del tratamiento con la
proteasa.
La presente invención también proporciona un
cDNA que codifica un precursor mutado de una citoquina
biológicamente activa, seleccionada entre
IL-1\beta e IL-18, opcionalmente
fusionado con una secuencia codificadora de GST, en el que el sitio
de escisión natural por caspasa-1 del precursor
biológicamente inactivo, ha sido mutado a un sitio de escisión por
una proteasa.
En una de las realizaciones de la presente
invención se proporciona un procedimiento para producir y/o
purificar un polipéptido híbrido recombinante o una proteína de
fusión recombinante. De manera más específica, un fragmento de DNA
que codifica una molécula de proteína, se fusiona con un fragmento
de DNA que codifica una proteína de unión usando, como secuencia
enlazadora, el DNA que codifica una secuencia peptídica que es
reconocida y cortada por una caspasa. EL DNA fusionado se inserta
en un vector de clonación que se usa para transformar un hospedador
apropiado. Después de la expresión, el polipéptido híbrido se
purifica poniéndolo en contacto con un ligando o con un sustrato
frente al que la proteína de unión presenta una afinidad específica,
p. ej., mediante cromatografía de afinidad.
En una realización preferida de la presente
invención, la proteína de unión es GST y el sitio de escisión es el
sitio de escisión de la caspasa-8.
La invención también se refiere a una citoquina
biológicamente activa, seleccionada entre
IL-1\beta e IL-18, preparada con
el método anterior.
La expresión de la IL-18 madura
en E. coli produce una proteína que carece de actividad
biológica. Los intentos realizados para replegar correctamente la
cadena principal polipeptídica de IL-18 expresada en
E. coli han fracasado hasta el momento. La
IL-18 humana y la IL-1\beta humana
se expresan in vivo en forma de precursores
proIL-18 y proIL-1\beta, que son
escindidos por caspasa-1 para producir
respectivamente IL-18 e IL-1\beta
maduras y biológicamente activas. Sin embargo, la
caspasa-1 no se encuentra comercialmente disponible.
La presente invención proporciona un procedimiento sencillo para la
producción en E. coli de una molécula biológicamente activa,
en particular de una citoquina, y más en particular de la
IL-18 humana. Con este fin, se construyó un cDNA
que codifica una proIL-18 humana en la que el sitio
de escisión de la caspasa-1 se había mutado a un
sitio de escisión de una proteasa comercialmente disponible., p.
ej., el factor Xa. Por facilidad en la manipulación, el cDNA mutado
de proIL-18 se fusionó con una secuencia que
codifica glutation-S-transferasa
(GST). La proteína de fusión resultante
GST-proIL-18, que contiene un sitio
de escisión del factor Xa, se expresó en E. coli y se
capturó sobre bolitas de agarosa-glutation. La
IL-18 humana madura, que exhibe una actividad
biológica alta, se liberó de las bolitas mediante escisión con
Factor Xa.
De manera similar, la secuencia de DNA que
codifica el sitio de escisión por caspasa-1 de la
IL-1\beta humana, se muta a un sitio de escisión
por factor Xa. Por facilidad en la manipulación, el cDNA mutado de
proIL-1\beta se fusiona en el marco de lectura
con una secuencia que codifica
glutation-S-transferasa (GST). La
proteína de fusión resultante
GST-proIL-1\beta, que contiene un
sitio de escisión por factor Xa, se expresa en E. coli y se
captura sobre bolitas de agarosa-glutation. La
IL-1\beta humana madura se libera de las bolitas
mediante escisión con Factor Xa.
Cuando la caspasa-8 se utiliza
para la escisión, se lleva a cabo un procedimiento similar, siendo
la diferencia que el sitio de escisión por
caspasa-1 de la IL-18 o de la
IL-1\beta se encuentra mutado a un sitio de
escisión por caspasa-8. Después de eso la fusión
con una secuencia codificadora de GST y las etapas posteriores del
método se llevan a cabo de la manera anteriormente descrita.
La Figura 1 describe la clonación del cDNA que
codifica un mutante de la proIL-18 humana
(proIL-18_{IEGR}). Este cDNA se clonó en tres
etapas de PCR usando un método con cebadores solapantes. Las pistas
son: M, marcadores de tamaño molecular de DNA, indicados en el lado
izquierdo; 1, un DNA de 498 pb producido en la primera PCR; 2, un
DNA de 551 pb producido en la segunda PCR; 3, un DNA de 600 pb
producido en la tercera PCR, que codifica la
proIL-18_{IEGR}.
La Figura 2 muestra la estructura del plásmido
de expresión pGEX-proIL-18_{IEGR}.
(a) Secuencias de ácido nucleico flanqueantes del cDNA
BamHI/EcoRI, 600 pb, que codifica
pro-IL-18_{IEGR}. Los sitios de
restricción de BamHI y EcoRI y el sitio diana para el
Factor Xa se indican mediante corchetes. Una flecha blanca indica
el sitio de escisión del Factor Xa. (b) Representación esquemática
de pGEX-2TK. También se muestran los sitios de
restricción. La flecha negra indica el sitio
BamHI/EcoI de ligación del inserto.
La Figura 3 muestra una SDS-PAGE
de extractos de proteína en crudo de una E. coli que expresa
la proteína de fusión
GST-proIL-18_{IEGR}. Las pistas
son: 1. Células transformadas con el plásmido parental
pGEX-2TK sin inducción. 2. Células transformadas
con el plásmido parental pGEX-2TK e inducidas con
isopropiltiogalactósido (IPTG) 0,1 mM. La banda de 26 kDa esperada
de glutation-tioreductasa (GST) está indicada con
una flecha en el lado izquierdo. Las pistas 3-7
muestran células transformadas con el plásmido
pGEX-proIL-18_{IEGR} y que o no
han sido inducidas (pista 3) o han sido inducidas con IPTG durante
los tiempos indicados. La banda de 43 kDa indicada con una flecha
en el lado derecho, corresponde en tamaño a la proteína de fusión
GST-proIL-18_{IEGR}.
La Figura 4 muestra una SDS-PAGE
(acrilamida al 10%) de la proteína de fusión
GST-proIL-18_{IEGR} después de la
purificación en agarosa-glutation. El sobrenadante
del extracto bacteriano sonicado (véase Fig. 3, pista 7) se
purificó por afinidad en agarosa-glutation. Las
pistas son: 1. Marcadores de masa molecular (indicados en kDa en el
lado izquierdo) 2.
GST-proIL-18_{IEGR} purificada por
afinidad. El gel se tiñó con azul de Coomassie.
La Figura 5 muestra una SDS-PAGE
(acrilamida al 12%) de la IL-18 humana purificada.
La proteína de fusión
GST-proIL-18_{IEGR} se capturó
sobre bolitas de agarosa-glutation y se incubó con
Factor Xa en una proporción 1:50 (p/p) de proteasa con respecto a
sustrato, y el sobrenadante se analizó después de 6 h. Pista 1,
marcadores de peso molecular, indicados en kDa en el lado
izquierdo; Pista 2. IL-18 humana presente en el
sobrenadante de las bolitas de agarosa-glutation.
El gel se tiñó con azul de Coomassie.
La Figura 6 muestra un bioensayo de
IL-18 humana. La IL-18 humana en las
dosis indicadas, se añadió a los cultivos de esplenocitos murinos
no adherentes a plástico (5 x 10^{6} células/pocillo) en presencia
de Concanavalina A (0,125 \mug/ml) y de polimixina B (1
\mug/ml). El sobrenadante se sometió a un ensayo de determinación
de interferón-gamma murino mediante ELISA. El nivel
de interferón-gamma inducido por
IL-18 (100 ng/ml) en ausencia de Con A fue 160
pg/ml.
La Figura 7 muestra en forma esquemática el
procedimiento básico para la purificación de hIL-18
usando Caspasa-8.
La Figura 8 muestra la secuencia de la
GST-proIL-18_{LETD}. La caja
indica el sitio de escisión de la Caspasa-8. La
secuencia subrayada es la hIL-18 madura.
La Figura 9 muestra una SDS-PAGE
(gel de acrilamida al 10%) teñida con azul de Coomassie de la
purificación de la proteína de fusión
GST-proIL-18_{LETD} sobre
agarosa-glutation. El sobrenadante resultante de la
rotura celular de E. coli JM109 recombinante que expresa
GST-proIL-18_{LETD} se purificó
por afinidad sobre glutation-agarosa y se digirió
con Caspasa-8 en fase sólida. El sobrenadante
obtenido postdigestión se concentró y se aplicó a una separación
por tamaño molecular sobre Superdex-75. Las pistas
son: 1. Marcadores de masa molecular (indicados en kDa en el lado
izquierdo); 2. Sobrenadante resultante de la rotura celular; 3.
GST-proIL-18_{LETD} purificada por
afinidad; 4. Material digerido 4 h con Caspasa-8 en
fase sólida y después purificado en resina de
agarosa-glutation; 5. Material digerido 4 h con
Caspasa-8 y concentrado; 6. Material reunido de
hIL-18 pura resultante de la separación en
Superdex-75.
Conforme a la presente invención, se preparó un
cDNA que codifica una proIL-18 humana en la que el
sitio de escisión de la Caspasa-1 se había mutado a
un sitio de Factor Xa. Se pueden usar otras mutaciones, que generan
sitios de escisión adecuados para otras proteasas.
Ejemplos de sitios de escisión posibles y de
proteasas adecuadas incluyen:
Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser
(SEQ ID NO: 1), secuencia escindida entre los aminoácidos Arg y Gly
por la proteasa Trombina.
Ile-Glu-Gly-Arg-
(SEQ ID NO: 2), secuencia escindida detrás del residuo de Arg por la
proteasa Factor Xa.
Asp-Asp-Asp-Lys-
(SEQ ID NO: 3), secuencia escindida detrás del residuo de Lys por la
proteasa Enteroquinasa.
His-Tyr- (SEQ ID NO: 4),
secuencia escindida detrás del residuo de Tyr por la proteasa
subtilisina o por su variante Genenase^{TM} (New England
Biolabs).
Tyr-His (SEQ ID NO: 5),
secuencia escindida detrás del residuo de Tyr por la proteasa
subtilisina o por su variante Genenase^{TM} (New England
Biolabs).
Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro
(SEQ ID NO: 6), secuencia escindida detrás del residuo de Gln por la
proteasa 3C de rinovirus humanos.
De manera similar, se prepara un cDNA que
codifica una proIL-1\beta humana en la que el
sitio de escisión de la Caspasa-1 está mutado a un
sitio de Factor Xa. Se pueden usar otras mutaciones, que generan
sitios de escisión adecuados para otras proteasas.
Ejemplos de sitios de escisión posibles y de
proteasas adecuadas incluyen:
Ile-Glu-Gly-Arg-
(SEQ ID NO: 2), secuencia escindida detrás del residuo de Arg por la
proteasa Factor Xa.
Asp-Asp-Asp-Lys-
(SEQ ID NO: 3), secuencia escindida detrás del residuo de Lys por la
proteasa Enteroquinasa.
Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro
(SEQ ID NO: 6), secuencia escindida detrás del residuo de Gln por la
proteasa 3C de rinovirus humanos.
La elección de la mutación depende de los
siguientes parámetros: el sitio de escisión generado por la mutación
debe ser muy específico para evitar escisiones no deseadas en otros
sitios del interior de la cadena principal polipeptídica de la
proIL-18 o de la
pro-IL-1\beta; la proteasa debe
exhibir un alto nivel de especificidad con respecto al sitio de
escisión creado por ingeniería genética; la proteasa debe de
encontrarse convenientemente disponible, p. ej., procedente de
fuentes comerciales; y la mutación preferiblemente no debe
introducir alteraciones importantes en la estructura secundaria o
terciaria de la proIL-18 o de la
proIL-1\beta. El uso de Factor Xa, o de
Enteroquinasa o de subtilisina es preferible al de otras proteasas
porque la IL-18 o la IL-1\beta
resultante no contiene aminoácidos mutados. El uso de Factor Xa es
el más favorable porque requiere las mutaciones más conservadoras,
reduciendo así el riesgo de una estructura secundaria o terciaria
alterada de proIL-18 o de
proIL-1\beta y el riesgo de que la escisión no
tenga lugar. El uso de Factor Xa o de Enteroquinasa es preferible
al de otras proteasas porque la IL-18 o la
IL-1\beta resultante no contiene aminoácidos
mutados.
Con el fin de construir un cDNA que codifica un
mutante de la proIL-18 humana
(proIL-18_{IEGR}) en el que el sitio de escisión
por Caspasa-1 está mutado a un sitio de escisión por
Factor Xa, se introdujeron las siguientes mutaciones en el cDNA de
la proIL-18 humana: L33I; S35G y D36R. Estas
mutaciones dieron lugar a la secuencia IEGR de reconocimiento por
el Factor Xa.
Un vector que expresa la
proIL-18_{IEGR} humana se construyó de la
siguiente manera. Células mononucleares de sangre periférica (PBMC)
(del inglés, " Peripheral Blood Mononuclear
Cells") de un individuo donante sano, se estimularon
con lipopolisacárido (LPS) bacteriano. El RNA total se extrajo de
las células. El RNA se sometió a transcripción inversa y el cDNA
resultante sirvió como molde para la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR). La mutación en la secuencia se introdujo usando
cebadores solapantes en tres etapas de PCR (Fig. 1). El producto
resultante de la PCR, de 600 pb, que codifica la
proIL-18 humana mutada, se clonó en un vector de
clonación TA (pGEM-T easy, Promega) y la secuencia
de su DNA se verificó mediante análisis de secuencia de DNA. El
plásmido
pGEM-T-proIL-18_{IEGR}
resultante se cortó con EcoRI y BamHI y el fragmento
de 600 pb que codifica proIL-18_{IEGR} se subclonó
en el vector pGEX-2TK de expresión en procariotas,
que contiene la secuencia del gen de GST (Pharmacia). El
vector de expresión resultante contenía la secuencia del gen de la
proIL-18_{IEGR} humana, fusionado en el marco de
lectura con el extremo 3' del gen de GST (Fig. 2).
La expresión y purificación de
GST-proIL-18_{IEGR} se llevó a
cabo a continuación. Una colonia individual y recién obtenida de
E. coli JM 109, transformada con el plásmido
pGEX-proIL-18_{IEGR}, se hizo
crecer con agitación a 37ºC, hasta alcanzar una densidad de 0,6 a
OD_{600}. A continuación se indujo la expresión de proteínas con
isopropiltiogalactósido (IPTG) y cultivando de nuevo a 37ºC durante
3 h. Una SDS-PAGE de las proteínas bacterianas
totales reveló la inducción de una proteína de 43 kDa, que
corresponde en tamaño a la
GST-proIL-18_{IEGR} (Fig. 3).
Todas las etapas aguas abajo para el aislamiento de la
GST-proIL-18_{IEGR} se llevaron a
cabo a 4ºC. Las bacterias se recogieron mediante centrifugación, se
resuspendieron en disolución salina tamponada con fosfato (PBS)
(del inglés, " Phosphate Buffered
Saline"), que contenía inhibidores de proteasas. Las
bacterias se lisaron mediante sonicación, se añadió Tritón
X-100 hasta alcanzar una concentración final del 1%
y el lisado clarificado se mezcló con bolitas de
agarosa-glutation (Pharmacia). Las bolitas
se lavaron y una parte alícuota de las bolitas se analizó mediante
SDS-PAGE. Se encontró una banda simple de 43 kDa,
que corresponde a la proteína de fusión
GST-proIL-18_{IEGR} (Fig. 4).
Las bolitas se digirieron entonces con Factor Xa, y se recogió el
sobrenadante. La SDS-PAGE del sobrenadante
proporcionó una banda principal de aproximadamente 18 kDa, en
concordancia con la masa de la IL-18 humana madura
esperada. También se observó una banda adicional más débil, de 19,5
kDa (Fig. 5). El análisis de la secuencia de proteína de las bandas
de 18 kDa y de 19,5 kDa proporcionó en ambos casos la secuencia
N-terminal esperada de la IL-18
humana madura. Una banda de 43 kDa, que corresponde a la proteína
de fusión GST-proIL-18_{IEGR}, se
encontraba aún presente en las bolitas de
agarosa-glutation después de la digestión, lo que
indica una escisión incompleta (datos no mostrados).
Se realizó un ensayo de la actividad biológica
de la IL-18 humana recombinante en esplenocitos
murinos, basado en la capacidad de la IL-18 para
inducir la expresión de interferón-gamma. La
incubación de esplenocitos no adherentes de ratón con
IL-18 humana solo, mostró una escasa producción de
IFN-gamma, lo que sugiere el requerimiento de un
coestimulante. La Con A sola, a una concentración de 0,125
\mug/ml, no fue capaz de inducir niveles significativos de
IFN-\gamma. Cuando los esplenocitos no adherentes
se incubaron con Con A y la IL-18 de la presente
invención, se obtuvo una inducción de IFN-\gamma
dosis-dependiente (Fig. 6).
Con el fin de construir un cDNA que codifica un
mutante de la proIL-1\beta humana
(proIL-1\beta_{IEGR}) en el que el sitio de
escisión por Caspasa-1 está mutado a un sitio de
escisión por Factor Xa, se introducen las siguientes mutaciones en
el cDNA de la proIL-1\beta humana: Y113I, V114E,
H115G y D116R. Estas mutaciones dan lugar a la secuencia IEGR de
reconocimiento por el Factor Xa.
Se llevan a cabo las siguientes etapas con el
fin de construir un vector que expresa la
proIL-1\beta_{IEGR} humana. Células
mononucleares de sangre periférica (PBMC) de un individuo donante
sano, se estimulan con lipopolisacárido (LPS) bacteriano. El RNA
total se extrae de las células. El RNA se somete a transcripción
inversa y el cDNA resultante sirve como molde para la reacción en
cadena de la polimerasa (PCR) con cebadores que corresponden a la
secuencia codificadora de la proIL-1\beta humana.
El producto resultante de la PCR se clona en un vector de clonación
TA, p. ej., pGEM-T easy procedente de Promega, y a
continuación se somete a una mutagénesis dirigida de sitio
específico con un oligonucleótido adecuado. La secuencia del vector
resultante, que codifica una proIL-1\beta humana
mutada, se verifica mediante análisis de la secuencia. El plásmido
pGEM-T-proIL-1\beta_{IEGR}
resultante se corta con enzimas de restricción apropiadas y el
fragmento de \sim820 pb que codifica la
proIL-1\beta_{IEGR} humana se subclona en el
vector pGEX-2TK (Pharmacia) de expresión en
procariotas. El vector de expresión resultante contiene la
secuencia del gen de la proIL-1\beta_{IEGR}
humana fusionado en el marco de lectura con el extremo 3' del gen
de GST.
La expresión y purificación de
GST-proIL-1\beta_{IEGR} se
realiza de manera similar. Una colonia individual y recién obtenida
de E. coli JM 109, transformada con el plásmido
pGEX-proIL-1\beta_{IEGR}, se
hace crecer con agitación a 37ºC, hasta alcanzar una densidad de
0,6 a OD_{600}. A continuación se induce la expresión de
proteínas con isopropiltiogalactósido (IPTG) y cultivando de nuevo a
37ºC durante 3 h. Una SDS-PAGE de las proteínas
bacterianas totales revela la inducción de una proteína de \sim52
kDa que corresponde en tamaño a la
GST-proIL-1\beta_{IEGR}. Todas
las etapas aguas abajo para el aislamiento de la
GST-proIL-1\beta_{IEGR} se
llevan a cabo a 4ºC. Las bacterias se recogen mediante
centrifugación y se resuspenden en disolución salina tamponada con
fosfato (PBS) que contiene inhibidores de proteasas. Las bacterias
se lisan mediante sonicación, se añade Tritón X-100
hasta alcanzar una concentración final del 1% y el lisado
clarificado se mezcla con bolitas de
agarosa-glutation (Pharmacia). Las bolitas se
lavan y una parte alícuota de las bolitas se analiza mediante
SDS-PAGE con respecto a la presencia de la proteína
de fusión GST-IL-1\beta de
\sim52 kDa. Las bolitas se digieren luego con Factor Xa y se
recoge el sobrenadante que contiene la IL-1\beta
humana
madura.
madura.
En otra realización de la presente invención, la
expresión y purificación de un polipéptido se obtiene produciendo
una proteína de fusión que contiene el sitio de escisión de una
caspasa. Un plásmido que expresa un péptido de unión fusionado a
una proteína de interés se puede mutar de manera que un sitio de
escisión de una caspasa se introduce en una posición conveniente
para la purificación de un polipéptido activo.
Los sitios de reconocimiento por caspasas se
componen de 4 aminoácidos, siendo el último un ácido aspártico.
Generalmente, las caspasas muestran una especificidad diferente y
más alta con respecto a los sitios de escisión que las proteasas
comúnmente utilizadas, ofreciendo ventajas importantes frente a
proteasas previamente descritas como útiles para cortar péptidos de
fusión. El procedimiento de purificación se ilustra en la fig.
7.
Los sitios de escisión preferidos de cada
caspasa se encuentran descritos en la literatura (Ann. Rev.
Biochem., 1999, 68:383-424). Todos ellos
contienen en común el residuo de Asp en la posición P1.
El plásmido anteriormente descrito,
pGEX-proIL-18_{IEGR}, se modificó
para obtener un mutante diferente de la proIL-18
humana (proIL-18_{LETD}, véase la figura 8), en el
que el sitio de escisión por Factor Xa está mutado a un sitio de
escisión por caspasa-8. Esto permite el uso de la
caspasa-8 en la escisión.
Otra ventaja del uso de una caspasa es su
elevada eficiencia, en lo que se refiere al rendimiento de la
digestión y al tiempo de digestión. Se encontró que cuando se
compara la proteína IL-18 obtenida a partir de
pGEX-proIL-18_{IEGR} y de
pGEX-proIL-18_{LETD}, la cantidad
de enzima y el tiempo necesario para obtener 1 mg de
hIL-18 se reducen. El procedimiento conduce a la
producción de una proteína del tamaño (Fig. 9) y de la bioactividad
esperados.
La caspasa-8 no es la única
caspasa adecuada y, según la presencia o ausencia de un sitio
específico de escisión por caspasa en una proteína de interés para
purificar, o algún otro criterio, se pueden usar las mutaciones
correspondientes al sitio de escisión de cualquier otra caspasa.
La caspasa se puede separar de la proteína de
interés usando métodos de purificación estándar, tales como p. ej.
la filtración en gel o la cromatografía de intercambio iónico.
En conclusión, el método aquí descrito
proporciona proteínas humanas purificadas y biológicamente activas
IL-18 e IL-1 \beta procedentes de
E. coli. Parece ser que el plegado correcto de estas
citoquinas requiere primero su expresión en forma de un precursor y
después la escisión para constituir su forma madura.
La IL-18 humana difiere a este
respecto de la IL-18 murina, la cual puede ser
expresada en células hospedadoras en forma de una citoquina madura
y biológicamente activa.
La invención se ilustra a continuación por medio
de los siguientes ejemplos no limitativos:
Se obtuvieron PBMC procedentes de sangre
periférica de un voluntario sano, mediante separación en gradiente
de densidad con Ficoll-Paque PLUS
(Pharmacia). Las PBMC se lavaron dos veces con PBS enfriado
en hielo que contenía FBS al 2% y se resuspendieron a una densidad
de 2,5 x 10^{6} células/ml en medio RPMI-1640,
suplementado con suero bovino fetal (FBS),
L-glutamina 2 mM, penicilina 100 U/ml y
estreptomicina 100 U/ml (RPMI-10). El cultivo se
estimuló con LPS (1 \mug/ml, 3 h, 37ºC). El RNA total se extrajo
de las células con el reactivo TriPure^{TM} Isolation
Reagent (Boehringher Mannheim). Un microgramo de RNA
total se usó para una RT-PCR con el kit
Titan para RT-PCR en un único tubo (Boehringher
Mannheim) conforme a las instrucciones del
fabricante.
fabricante.
El cDNA de proIL-18_{IEGR} se
construyó mediante una PCR de tres etapas, usando el método de los
cebadores solapantes. Los diferentes cebadores se diseñaron basados
en el cDNA de la proIL-18 humana (GenBank, número
de registro D49950, (3)).
En la primera PCR, el cebador directo fue:
| 5'-AACATCGAAGGTCGTTACTTTGGCAAGCTTGAATC-3' | (SEQ ID NO:7) |
y el cebador inverso fue:
| 5'-CGCGAATTCCTAGTCTTCGTTTTGAACAGT-3' | (SEQ ID NO:8) |
Un sitio EcoRI se incluyó en el cebador inverso.
El molde fue un RNA celular total sometido a transcripción inversa,
aislado a partir de las PBMC estimuladas con LPS. Las condiciones de
la termociclación fueron: 10 ciclos de 94ºC, 30 s; 55ºC, 30 s y
68ºC, 2 min, seguidos de 25 ciclos de 94ºC, 30 s; 55ºC, 30 s y 68ºC,
125 s/ciclo. El producto resultante de la PCR, de 498 pb, se
amplificó en la segunda etapa de PCR usando el cebador
solapante
directo:
directo:
y el cebador inverso de la etapa
anterior. Las condiciones de la termociclación fueron: 30 ciclos de
94ºC, 30 s; 56ºC, 30 s y 72ºC, 1 min. El producto resultante, de
551 pb, se amplificó en la tercera etapa usando el cebador
solapante
directo:
y el cebador inverso de las etapas
anteriores. Se incluyó un sitio BamHI en el cebador directo.
Las condiciones de la termociclación fueron las mismas de la etapa
anterior. El producto resultante de la PCR de 0,6 kb (Fig. 1) se
purificó con un kit High Pure^{TM} de purificación de
productos de PCR (Boehringer Mannheim) y se ligó en el
vector pGEM-T-Easy para dar el
plásmido pGEM-proIL-18_{IEGR}. Los
productos resultantes de la ligación se utilizaron para transformar
células JM109 competentes (Promega Corporation). A lo largo
de todo el procedimiento se utilizaron protocolos de clonación
estándar
(11).
El plásmido
pGEM-proIL-18_{IEGR} procedente de
una colonia individual se verificó con respecto a la presencia de
un inserto correcto mediante digestión con enzimas de restricción y
secuenciación de DNA. El plásmido se digirió con BamHI y
EcoRI. El DNA BamHI/EcoRI resultante, que
codifica la proIL-18_{IEGR} humana, se resolvió
mediante electroforesis en agarosa al 1,0% y la banda de 0,6 kb se
aisló del gel mediante un QIAquick Gel Extraction Kit
(DIAGEN, Alemania). Este DNA se ligó en el vector de expresión
pGEX-2TK (Pharmacia) que se había
linearizado con BamHI y EcoRI. El plásmido
recombinante resultante
pGEM-proIL-18_{IEGR} (Fig. 2) se
utilizó para transformar la cepa JM109 de E. coli y el vector
resultante se confirmó mediante digestión con enzimas de
restricción y secuenciación de ácidos nucleicos.
Un volumen de 50 ml de un cultivo de toda la
noche, procedente de una colonia individual y recién obtenida de
E. coli JM 109 transformada con el plásmido
pGEX-proIL-18_{IEGR}, se diluyó en
450 ml de medio LB que contenía ampicilina 100 U/ml y se hizo
crecer con agitación a 37ºC, hasta alcanzar una densidad de 0,6 a
OD_{600}. A continuación se indujo la expresión de proteínas
añadiendo IPTG hasta una concentración final 0,1 mM y cultivando de
nuevo a 37ºC durante 3 h. Las bacterias se recogieron mediante
centrifugación (5.000 x g, 5 min, 4ºC) y se resuspendieron
rápidamente en proporción 1:100 en un volumen de partida de
disolución salina tamponada con fosfato y enfriada en hielo (PBS;
NaCl 150 mM, Na_{2}HPO_{4} 16 mM, NaH_{2}PO_{4} 4 mM, pH
7,3), que contenía los inhibidores de proteasas (leupeptina 1
\mug/ml, pepstatina A 1 \mug/ml, aprotinina 2 \mug/ml, PMSF
0,2 mM y EDTA 5 mM). Las células se lisaron en hielo mediante
sonicación suave (4X pulsos de 15 s). Se añadió Tritón
X-100 hasta alcanzar una concentración final del 1%
y la mezcla se mantuvo en hielo durante 5 min. El lisado
clarificado (14.000 x g, 15 min, 4ºC) se mezcló con una suspensión
al 50% de bolitas de agarosa-glutation (2 ml,
Pharmacia) y la mezcla se incubó con agitación suave a 4ºC
durante 3 h. Las bolitas se sedimentaron mediante centrifugación
(500 x g, 5 min), se lavaron dos veces con 10 volúmenes de tampón
de lisis (Tritón X-100 al 1% en PBS), dos veces con
10 volúmenes de Tris-HCl 20 mM, pH 8,0, dos veces
con 10 volúmenes de Tris-HCl 20 mM, pH 8,0, NaCl 150
mM, y dos veces con 10 volúmenes de Tris-HCl 20 mM,
pH 8,0, NaCl 150 mM, CaCl_{2} 2,0 mM (Tampón de Escisión). Todas
las etapas se llevaron a cabo
a 4ºC.
a 4ºC.
Las bolitas de agarosa-glutation
que llevan unida la proteína de fusión
GST-proIL-18_{IEGR} se incubaron
(6 h, 23ºC) con Factor Xa (New England Biolabs) en 1 ml de
Tampón de Escisión, usando una proporción 1:50 (p/p) de proteasa
con respecto a sustrato, con mezclado constante en una rueda
giratoria. Esta etapa libera la IL-18 humana
madura. Las bolitas se sedimentaron mediante centrifugación a 500 x
g durante 5 minutos a 4ºC y se lavaron 5 veces con 2 ml de PBS
enfriado en hielo. El sobrenadante y todos los volúmenes de los
lavados, se mezclaron, se clarificaron mediante centrifugación
(14.000 x g, 15 min, 4ºC y se concentraron mediante ultrafiltración
(Centricon-10, Amicon). Partes alícuotas de la
proteína, así como de las bolitas antes y después de la digestión
se resolvieron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida al
12% con SDS al 0,1%, seguido de tinción con azul de Coomassie. Una
banda principal de aproximadamente 18 kDa, que coincide con la masa
esperada de la IL-18 humana madura, se obtuvo en el
sobrenadante. También se observó una banda menor de 19,5 kDa (Fig.
5). El análisis de la secuencia de proteínas
N-terminal de las dos bandas proporcionó la
secuencia YFGK..., que coincide con la secuencia de la
IL-18 humana madura. La proteína purificada se
esterilizó a través de un filtro de 0,2 \mum y se almacenó a
-70ºC.
La actividad de la IL-18 humana
se determinó según se encuentra descrito (2). Brevemente expuesto,
bazos de ratones CH3/HeJ normales se extirparon, se trocearon y se
expusieron a tampón de Gey (NH_{4}Cl 0,144 M en
Tris-HCl 0,017 M, pH 7,2) para romper los
eritrocitos. Los glóbulos blancos se lavaron dos veces con
RPMI-5 y luego se resuspendieron en
RPMI-10. Para la preparación de las células no
adherentes a plástico, las suspensiones celulares se incubaron (60
min, 37ºC) en placas de plástico de 100 mm (Becton Dickinson
Ltd., U.K.). Las células no adherentes se reunieron con
cuidado, se centrifugaron y se resuspendieron en
RPMI-10. Las células viables se contaron mediante
el ensayo de exclusión con colorante azul tripán y la concentración
celular se ajustó a 5 x 10^{6} células/ml. La mayor parte de las
células inespecíficas esterasa-positivas se
retiraron mediante estos procedimientos. Las suspensiones de las
células no adherentes a plástico (0,15 ml) se dispusieron en una
placa de cultivo de microtitulación, de 96 pocillos y de fondo plano
(NUNCLON^{TM}, Dinamarca). Diferentes concentraciones de
IL-18, polimixina (1 \mug/ml) y Con A (0,125
\mug/ml) se añadieron a los pocillos en 50 \mul de
RPMI-10. Las placas se incubaron 24 h o 48 h a 37ºC
en CO_{2} al 5%. Después de la incubación los sobrenadantes se
recogieron y se determinaron los títulos del
IFN-\gamma murino mediante ELISA. La incubación
de esplenocitos de ratón no adherentes con IL-18
humana sola, mostró una producción escasa de
IFN-\gamma, lo que sugiere el requerimiento de un
coestimulante. La Con A sola a una concentración de 0,125 \mug/ml,
no fue capaz de inducir niveles significativos de
IFN-\gamma. Cuando los esplenocitos no adherentes
se incubaron con Con A y con la IL-18 humana de la
presente invención, se obtuvo una inducción de
IFN-\gamma dosis-dependiente
(Fig. 6).
Se obtienen PBMC procedentes de sangre
periférica de un voluntario sano, mediante separación en gradiente
de densidad con Ficoll-Paque PLUS
(Pharmacia). Las PBMC se lavan dos veces con PBS enfriado en
hielo que contiene FBS al 2% y se resuspenden a una densidad de 2,5
x 10^{6} células/ml en medio RPMI-1640,
suplementado con suero bovino fetal (FBS),
L-glutamina 2 mM, penicilina 100 U/ml y
estreptomicina 100 U/ml (RPMI-10). El cultivo se
estimula con LPS (1 \mug/ml, 3 h, 37ºC). El RNA total se extrae de
las células con el reactivo TriPure^{TM} Isolation Reagent
(Boehringher Mannheim). Un microgramo de RNA total se usa
para una RT-PCR con el kit Titan de
RT-PCR en un único tubo (Boehringher
Mannheim) conforme al procedimiento del fabricante.
El cDNA de proIL-1\beta se
clona mediante PCR utilizando un cebador con sentido y un cebador
inverso diseñados tomando como referencia el cDNA de la
proIL-1\beta humana (GenBank, número de registro
M15330). El cebador con sentido corresponde a los nucleótidos
87-107 de la secuencia M15330, precedidos por un
sitio de escisión de BamHI. El cebador inverso corresponde a
los nucleótidos 896-876 de la secuencia M15330,
precedidos por un sitio EcoRI. El molde es un RNA celular
total sometido a transcripción inversa, aislado a partir de las
PBMC estimuladas con LPS. Las condiciones de la termociclación son:
10 ciclos de 94ºC, 30 s; 55ºC, 30 s y 68ºC, 2 min, seguidos de 25
ciclos de 94ºC, 30 s; 55ºC, 30 s y 68ºC, 125 s/ciclo. El producto
resultante de la PCR, de 830 pb, se purifica con un kit High
Pure^{TM} de purificación de productos de PCR (Boehringer
Mannheim) y se liga en el vector pGEM-T Easy
para dar el plásmido
pGEM-proIL-1\beta. El plásmido se
somete a una mutagénesis dirigida de sitio específico con el
oligonucleótido
| ACATGGGATAACGAGGCTATTGAAGGCCGGGCACCTGTACGA | (SEQ ID NO:11), |
que corresponde a los nucleótidos
405-452 del mRNA de la IL-1\beta
humana y que contiene las mutaciones Y131I, V114E, H115G y
D116R.
El plásmido resultante
pGEM-proIL-1\beta_{IEGR}
procedente de una colonia individual se verifica con respecto a la
presencia de un inserto correcto mediante digestión con enzimas de
restricción y secuenciación de DNA. El plásmido se digiere con
BamHI y EcoRI. El DNA BamHI/EcoRI
resultante, que codifica la proIL-1\beta_{IEGR}
humana, se resuelve mediante electroforesis en agarosa al 1,0% y la
banda de 0,82 kb se aisla del gel mediante un QIAquick Gel
Extraction Kit (DIAGEN, Alemania). Este DNA se liga en el vector
de expresión pGEX-2TK (Pharmacia) que se ha
linearizado con BamHI y EcoRI. El plásmido
recombinante resultante
pGEX-proIL-1\beta_{IEGR} (Fig.
2) se utiliza para transformar la cepa JM109 de E. coli y el
vector resultante se confirma mediante digestión con enzimas de
restricción y secuenciación de ácidos nucleicos.
Un volumen de 50 ml de un cultivo de toda la
noche, procedente de una colonia individual y recién obtenida de
E. coli JM 109 transformada con el plásmido
pGEX-proIL-1\beta_{IEGR}, se
diluye en 450 ml de medio LB que contiene ampicilina 100 U/ml y se
hace crecer con agitación a 37ºC, hasta alcanzar una densidad de
0,6 a OD_{600}. A continuación se induce la expresión de proteínas
añadiendo IPTG hasta una concentración final 0,1 mM y cultivando de
nuevo a 37ºC durante 3 h. Las bacterias se recogen mediante
centrifugación (5.000 x g, 5 min, 4ºC) y se resuspenden rápidamente
en proporción 1:100 en un volumen de partida de disolución salina
tamponada con fosfato y enfriada en hielo (PBS; NaCl 150 mM,
Na_{2}HPO_{4} 16 mM, NaH_{2}PO_{4} 4 mM, pH 7,3), que
contiene los inhibidores de proteasas (leupeptina 1 \mug/ml,
pepstatina A 1 \mug/ml, aprotinina 2 \mug/ml, PMSF 0,2 mM y
EDTA 5 mM). Las células se lisan en hielo mediante sonicación suave
(4X pulsos de 15 s). Se añade Tritón X-100 hasta
alcanzar una concentración final del 1% y la mezcla se mantiene en
hielo durante 5 min. El lisado clarificado (14.000 x g, 15 min, 4ºC)
se mezcla con una suspensión al 50% de bolitas de
agarosa-glutation (2 ml, Pharmacia) y la
mezcla se incuba con agitación suave a 4ºC durante 3 h. Las bolitas
se sedimentan mediante centrifugación (500 x g, 5 min), se lavan dos
veces con 10 volúmenes de tampón de lisis (Tritón
X-100 al 1% en PBS), dos veces con 10 volúmenes de
Tris-HCl 20 mM, pH 8,0, dos veces con 10 volúmenes
de Tris-HCl 20 mM, pH 8,0, NaCl 150 mM, y dos veces
con 10 volúmenes de Tris-HCl 20 mM, pH 8,0, NaCl
150 mM, CaCl_{2} 2,0 mM (Tampón de escisión). Todas las etapas se
llevan a cabo a 4ºC.
Las bolitas de agarosa-glutation
que llevan unida la proteína de fusión
GST-proIL-1\beta_{IEGR} se
incuban (6 h, 23ºC) con Factor Xa (New England Biolabs) en 1
ml de Tampón de Escisión, usando una proporción 1:50 (p/p) de
proteasa con respecto a sustrato, con mezclado constante en una
rueda giratoria. Esta etapa libera la IL-1\beta
humana madura. Las bolitas se sedimentan mediante centrifugación a
500 x g durante 5 minutos a 4ºC y se lavan 5 veces con 2 ml de PBS
enfriado en hielo. El sobrenadante y todos los volúmenes de los
lavados, se mezclan, se clarifican mediante centrifugación (14.000
x g, 15 min, 4ºC) y se concentran mediante ultrafiltración
(Centricon-10, Amicon). Partes alícuotas de la
proteína, así como de las bolitas antes y después de la digestión
se resuelven mediante electroforesis en gel de poliacrilamida al 12%
con SDS al 0,1%, seguido de tinción con azul de Coomassie. Una
banda principal de aproximadamente 17 kDa, que coincide con la masa
esperada de la IL-1\beta humana madura, se
obtiene en el sobrenadante. La proteína purificada se esteriliza a
través de un filtro de 0,2 \mum y se almacena a -70ºC.
El plásmido recombinante
pGEX-proIL-18_{IEGR} del ejemplo 1
se modificó insertando un fragmento de DNA amplificado por PCR que
contenía el sitio de escisión de la caspasa-8
(LETD). De manera breve,
pGEX-proIL-18_{IEGR} se digirió
con las enzimas de restricción BamHI en la posición 951 y
HindIII en la posición 1.074 cortando la porción de DNA que
contiene el Pro-dominio, el sitio de escisión del
factor Xa (IEGR) y tres aminoácidos del extremo
N-terminal de la hIL-18.
El mismo plásmido se usó como molde para la
amplificación por PCR, introduciendo el sitio LETD mutado en el
cebador aguas arriba: atgcAAG CTT GCC AAA GTA GTC GGT TTC CAG GTT
TTC ATC ATC TTC AGC TAT AA (SEQ ID NO: 12). El fragmento resultante
de la PCR se purificó usando el kit "high pure product
purification" (Boehringer Mannheim) y luego se cortó
de manera similar con BamHI y HindIII generando un
inserto de 123 pb. El vector abierto y el inserto se separaron
sobre gel de agarosa y se extrajeron usando el kit comercial
"Jet Sorb" (Genomed). La ligación se realizó durante la
noche usando una Ligasa de T4 (New England BioLabs, Beverly
MA, USA) y los productos resultantes de la ligación se utilizaron
para transformar células competentes de E. coli DH5\alpha.
Se aislaron varias colonias, se subcultivaron y se prepararon
minipreps con el kit "Quiagen". Se realizó una
amplificación por PCR (Perkin Elmer Gene
Amp-AmpliTag DNA polymerase) de todas las
minipreps con el fin de secuenciar la parte esencial del
plásmido recombinante. La transformación final se realizó en
bacterias competentes de E. coli JM109 seguido del Método TSS
(Chung, C.T. y col. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86,
2172-2175).
Usando el plásmido construido según el anterior
ejemplo 8, se obtuvo la proteína de expresión
GST-proIL-18_{LETD} en matraces
de agitación y fermentadores de 5 litros, esencialmente según se
describe en el anterior ejemplo 2.
Las bolitas de agarosa-glutation
que llevan unida la proteína de fusión
GST-proIL-18_{LETD} se incubaron
(4 h, 23ºC) con caspasa-8 (Calbiochem) en Tampón de
Escisión (definido en el ejemplo 6), usando una proporción 1:1.200
(p/p) de proteasa:sustrato, con mezclado constante en una rueda
giratoria o en un rodillo giratorio. Las bolitas se sedimentaron
mediante centrifugación a 500 x g durante 5 minutos a 4ºC y se
lavaron 5 veces con 2 ml de PBS enfriado en hielo. El sobrenadante
y todos los volúmenes de los lavados, se mezclaron, se clarificaron
mediante centrifugación (14.000 x g, 15 min, 4ºC) y se concentraron
mediante centrifugación (Centricon-10, Amicon). El
material digerido concentrado se sometió luego a una separación por
tamaño molecular sobre Superdex-75
(Pharmacia) con el fin de separar la hIL-18
(18 kDa) de los productos de mayor peso molecular resultantes de la
escisión y de la enzima proteolítica residual
(Caspasa-8 heterodimérica, 29 kDa, y
Caspasa-8 heterotetramérica, 58kDa).
La actividad enzimática
Caspasa-8 se determinó en las diferentes fracciones
obtenidas de Superdex-75, usando el kit de
ensayo de Caspasa-8 y el sustrato fluorogénico
Ac-IETD-AMC (BIOMOL) y se observó
que estaba presente en las fracciones correspondientes a una masa
molecular de 55kDa (que corresponden a la caspasa-8
heterotetramérica), demostrando por lo tanto que se encontraba
perfectamente separada de las fracciones que contenían
hIL-18 (17 kDa).
Las fracciones resultantes de la filtración en
gel de la hIL-18 muy pura, de 18 kDa, se reunieron,
se concentraron en Centricon-10, Amicon y por
último se esterilizaron a través de un filtro de 0,22 \mum y se
almacenaron a -80ºC.
Partes alícuotas de la proteína, así como de las
bolitas antes y después de la digestión, se resolvieron mediante
electroforesis en gel de poliacrilamida al 12% con SDS al 0,1%,
seguido de tinción con azul de Coomassie (Fig. 9). Una banda de 18
kDa, que coincide con la masa esperada de la IL-18
humana madura, se observó en la fracción del sobrenadante. El
análisis de la fracción correspondiente a las bolitas mostró que la
escisión no es completa, ya que proteína precursora permanece unida
a las bolitas. Además, parte de la proteína IL-18
escindida queda unida en la fracción de las bolitas.
La actividad de la IL-18 humana
se determinó según se encuentra descrito (10). Brevemente expuesto,
células KG-1 se mantuvieron en DMEM que contenía
FBS al 20%. Para el ensayo de la IL-18, las células
KG-1 se suspendieron a una densidad de 1,2 x
10^{6} células/ml (250 \mul/pocillo, placa de 48 pocillos) y se
estimularon con mTNF\alpha (Innogenetics) junto con
diferentes concentraciones de hIL-18 (diluciones
seriadas, comenzando desde 80 ng/ml). La placa se incubó 24 h a
37ºC en CO_{2} al 5%. Después de la incubación, los sobrenadantes
se recogieron y el contenido en IFN-\gamma se
determinó mediante ELISA (hIFN-\gamma rec. y
anti-hIFN-\gamma procedentes de
R&D Systems).
La IL-18 humana indujo una
producción de IFN-\gamma
dosis-dependiente, con una actividad idéntica a la
de la hIL-18 obtenida a partir de la construcción
que contenía el sitio de escisión del Factor Xa.
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Preparación de moléculas
biológicamente activas
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> Producción de
IL-18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 129427
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
13-04-1.999
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de una secuencia
artificial: traducida a partir de un oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Leu Val Pro Arg Gly Ser}
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<210> 2
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<211> 4
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de una secuencia
artificial: traducida a partir de un oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ile Gln Gly Arg}
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<210> 3
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<211> 4
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de una secuencia
artificial: traducida a partir de un oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
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\sa{Asp Asp Asp Lys}
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<211> 2
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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artificial: traducida a partir de un oligonucleótido sintético
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\sa{His Tyr}
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<211> 2
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de una secuencia
artificial: traducida a partir de un oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 5
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\sa{Tyr His}
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artificial: traducida a partir de un oligonucleótido sintético
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\vskip0.400000\baselineskip
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Claims (5)
1. Un método para producir una citoquina
biológicamente activa a partir de su precursor biológicamente
inactivo, que comprende mutar el sitio de escisión natural de la
citoquina a un sitio que es capaz de ser escindido por una
proteasa, y escindir el precursor inactivo mutado para producir una
citoquina biológicamente activa, en el que la citoquina se
selecciona entre IL-1\beta e IL-18
y en el que el sitio de escisión natural es un sitio de escisión de
la cas-
pasa-1.
pasa-1.
2. Un método según la reivindicación 1, en el
que la proteasa se selecciona entre trombina, enteroquinasa,
subtilisina, la proteasa 3C de rinovirus humanos, la proteasa Factor
Xa y una caspasa, preferiblemente la caspasa-8.
3. Un método según la reivindicación 1 ó 2, que
comprende transfectar un hospedador con un vector que comprende un
cDNA que codifica el precursor de la citoquina biológicamente
activa, mutado en el sitio de escisión de la citoquina, cultivar el
hospedador transfectado y aislar la citoquina biológicamente activa
después de tratamiento con una proteasa.
4. Un método según la reivindicación 3, en el
que el cDNA está fusionado en el marco de lectura con una secuencia
que codifica GST y la molécula de fusión expresada se captura sobre
bolitas de agarosa-glutation antes del tratamiento
con la proteasa.
5. Un cDNA que codifica un precursor mutado de
una citoquina biológicamente activa, opcionalmente fusionado con
una secuencia que codifica GST, en el que la citoquina se selecciona
entre IL-1\beta e IL-18 y en el
que el sitio natural de escisión por caspasa-1 del
precursor biológicamente inactivo ha sido mutado a un sitio de
escisión por una proteasa.
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