TARIFNAME FAKTÖR IX POLIPEPTIT MUTANTI, BUNUN KULLANIMLARI VE BUNU ÜRETMEYE YÖNELIK BIR YÖNTEM Bulusun Sahasi Mevcut bulus, modifiyeli bir FIX (faktör IX) polipeptidinin kullanimlari ile ilgilidir. Ayrica burada, bir nükleotid dizisi, söz konusu nükleotid dizisini içeren bir vektör ve mofidiyeli FIX polipeptidini üretmeye yönelik bir yöntem açiklanir. Ayrica, modifiyeli faktör FIX'in ve nükleotid dizisinin farmasötik preparatlari ve kullanimlari açiklanir. Önceki teknik FIX, serin-proteaz ailesine ait bir K vitaminine bagli glikoproteindir ve koagülasyon kaskadinin içsel ve dissal yollarinda önemli bir rol oynayarak, memeliler dahil olmak üzere insan ve diger hayvanlarin karacigerinde sentezlenir. Insan FIX, 415 amino asitten olusan tek Zincirli bir proenzim olarak plazma içinde sirküle eder. Insan FIX, 56 kD,lik bir moleküler agirliga ve yaklasik 5 ug/mVlik bir plazma konsantrasyonuna sahiptir. Proenzim, aktive faktör XI (FXla) ve doku faktör kompleksi (TF) (aktive faktör VII (FVIIa)) tarafindan aktive edilir. Yapisal FIX organizasyonu, faktör Vll (FVII), faktör X (FX) ve C proteini (PC) gibi diger K vitaminine bagli koagülasyon proteinlerinin organizasyonuna benzerdir. Molekülün amino-terminal kismi, karboksilasyonunun, K vitamininin varligina bagli oldugu gamma-karboksi-glutamik kalintilar bakimindan zengin bir bölge olan "Gla" alanini içerir. FlX"in ana fizyolojik islevi aktive edildiginde, bir fosfolipit yüzeyi, kalsiyum iyonlari ve kofaktör etkisi, diger bir deyisle aktive faktör VIII (FVIIla) ile bir proteinin varligini gerektiren bir proseste faktör X3in (FX) aktive faktör X,e (FXa) dönüstürmektir. FXa°nin kendisi, polimerizasyon üzerine pihti olusturan çözünebilir fibrine fibrinojeni degistiren trombine 02084-P-0001 profrombini dönüstürebilir. FXa eylemi, aktive faktör V,nin (FVa) varligi ile Insan FIX geni, pozisyon Xq27. 1 "de kromozom X üzerinde konumlandirilir ve 25 baz çifti (bp) ila 2000 bp arasinda degisen uzunluklara sahip 8 eksonu içerir. Insan FIX mRNA"si, uzunluk bakimindan yaklasik 3 kb1dir ve 5' UTR bölgesini olusturan 205 bazi, FIX polipeptidini kodlayan 1386 bazi ve 3' UTR bölgesinin 1392 bazini içerir. Bu mRNA, insan FIX öncülünü olusturan 461 amino asidin sentezini kodlar. Bu öncül (SEQ ID NO: 1), takip eden segmentleri ve alanlari içerir: bir hidrofobik sinyal peptidi (amino asitler 1-28), bir propeptit (amino asitler 29-46), bir Gla-alani (amino asitler 47 ila 92), bir EGF benzeri 1 alani (amino asitler 93 ila , bir aktivasyon peptidi (amino asitler 192 ila 226) ve bir serin-proteaz alani (amino asitler , hidrofobik sinyal peptidi ve propeptidi kaybeder. Akabinde önceden bahsedilen alanlarin karsilik gelen amino asit pozisyonlari, takip edenler haline gelir: bir Gla alani (amino asitler 1 ila 46), bir EGF benzeri 1 alani (amino asitler 47 ila 83), bir EGF benzeri 2 alani (amino asitler 84 ila 125), bir aktivasyon peptidi (amino asitler 146 ila SEQ ID NO: 2 türetilir), erisim nuinarasi AAB59620"a girilerek bulunan PubMed ("Protein" kategorisi) üzerindeki diziye karsilik gelir; bu amino asit dizisi, sinyal peptidini (46 AA) akabinde matür proteinin amino asit dizisini içerir. FIX içinde genetik bir yetersizlik, birçok koagülasyon hastaligina (koagülopatiler) örnegin etkilenen erkeklerde (cinsiyete bagli genetik hastalik) hemot'il B olarak bilinen hemorajik hastaliga neden olabilir. Hemofîl B, her birinin, FlX,in farkli plazma konsantrasyonlarinin varligi ile karakterize edildigi üç sinifa siniflandirilabilir. Agir hemofil B"de FIX aktivitesinin plazma düzeyleri, normal düzeyin %lsi altindadir; orta formda düzeyler, %1 ile %5 arasinda; hafif formda normal düzeyin %5 ile %25*i arasindadir. Ayrica, normal düzeyin %251 ile 02084-P-0001 ancak birçok tasiyici, %50iyi asan düzeylere dahi sahip olabilir. Agir hemofil Biden etkilenen hastalar, tek bir ticari formülasyonda mevcut durumda elde edilebilir olan özütlenebilir (insan plazmasindan) olan veya rekombinant kökenin F IX konsantrelerin uygulanmasi yoluyla kontrol edilebilen veya önlenebilen ciddi Gen terapisi araciligiyla genetik kusurlari düzeltmek üzere girisimler simdiye kadar, çesitli sorunlardan dolayi sonuçsuz olmustur. Bunlar ilk olarak, plazma içinde FIX düzeylerinin insanda ifadesinin düsük diger bir deyisle %1, dolayisiyla hastaligi düzeltmek üzere yeterli olmayan verimliligine bagli sorunlari; viral vektörler ile tedavinin immünojenesitene bagli sorunlar; son olarak hepatit, iniyozit ve digerlerini içeren gen terapisinin kendisinin yan etkilerine bagli sorunlari içerir. Normal düzeylerden daha yüksege (plazma içinden FIX'in normal araligi, %70- 12, diger bir deyisle 70-120 U/dl`dir, burada bir birim, yaklasik 5 ilgiye esit normal plazmanin l mililitresinde bulunan FIX miktaridir) plazma FIX'teki bir artis, venöz sistemde gelisen trombotik belirtilerin insanlarda artan bir riski ile iliskilendirilmistir. Özellikle 150 U/dl üzerindeki degerlere yönelik trombotik Bunun ile birlikte bu bireylerin plazmasinda artan FIX düzeylerine yönelik genetik temel tanimlanmistir. Mutasyona ugramis rekombinant FIX ifadesinin in vitro mutagenez çalismalari, hemofil B,li hastalarda z'n vivo karsilasilan FIX sentezi ve aktivitesindeki alterasyonlarin yeniden üretilme olasiligini göstermistir. Tam tersi bir durum olarak, F IX molekülü üzerinde belirli pozisyonlarda yere spesifik mutagenez ile FIX mutantlari, fizyolojik alt tabakalara yönelik özgünlükleri degistirilerek ve/veya diger islevleri modifiye edilerek "islev kazanci" (normal moleküle göre artan aktivite) ile üretilmistir. WO 99/03496,da, aktivite düzeylerinin, dogal tip FIX içinde bulunandan 2-3 kat daha yüksek oldugu bir islev kazanci ile 02084-P-0001 sonuçlanan rekombinant FlX arginin 338 alanin mutanti açiklanir. Bu islev kazanimli mutantlarin (özellikle fizyolojik alt tabakaya, diger bir deyisle FX,e dogru artan proteaz aktivitesi ile veya FIXasnin bir kofaktörü olan FVIlIa ile etkilesime yönelik artan bir kapasite ile), dogada mevcut olduklari buluninamistir veya bunlar insanda test edilmemistir. Daha açik sekilde takip edenlerin hiçbir kaniti yoktur: 1) islevsel aktivitede herhangi bir islev kazanci ile normal FIX,e (WT) kiyasla artan islevsel aktivite ile karakterize edilen islev kazanci ile mutasyona ugramis FIX°in (dogal FIX mutanti) bir insan tasiyicisinin mevcudiyeti; 2) modifiyeli rekombinant FIXîn uygulamalari ile insanda in vi'vo yürütülen testler; 3) hemofilden (genetik veya edinilmis) veya diger koagülopatilerden etkilenen hastalarin profilaksisi ve tedavisine yönelik islev kazanci ile modifiyeli rekombinant FIXlin uygulamalari ile insanda in vivo yürütülen testler; 4) yan etkilerin yoklugunu gösteren modifiyeli rekombinant FIX7in uygulamalari ile insanda in vi'vo yürütülen testler. Bulusun Kisa Açiklamasi Burada, bir modifiyeli FIX polipeptidi, bir nükleotid dizisi, söz konusu nükleotid dizisini içeren bir vektör ve modifiyeli FIX polipeptidini üretmeye yönelik bir yöntem açiklanir. Ayrica, modifiyeli faktör FIX ve nükleotid dizisine yönelik farmasötik preparatlar ve kullanimlar açiklanir. Bulusun Detayli Açiklamasi Burada açiklanan modifiyeli F 1)( polipeptitler, dogal sus F 1)( inolekülününkinden en az 5 kat aha yüksek olan bir islev kazanci gösterir. Aktivite düzeyindeki bu artis, bilinen rekombinant F IX arginin 338 alanin inutandina yönelik açiklanandan dahi beklenmedik sekilde daha yüksektir. Buna uygun olarak mevcut bulus, 0.1 ug/kg ile 400 tig/kg vücut agirligi arasindaki günlük bir dozajda tibbi bir tedavide kullanima yönelik modifiyeli bir 02084-P-0001 F IX (faktör IX) polipeptidini saglar, söz konusu modifiyeli FIX polipeptidi, SEQ lD NO: 1 veya SEQ ID NO: 2 ile en az %70°lik özdeslige sahiptir; burada lösin, SEQ ID NO: 2 ile tanimlandigi üzere modifiyesiz matür FIX polipeptidinin pozisyon 338,ine karsilik gelen bir pozisyonda mevcuttur. Aksi açik sekilde belirtilmedikçe asagidaki terimler, asagida gösterilen anlamlara sahiptir. Mevcut metinde, iki amino asit (peptit) veya nükleik asit (nükleotid) dizileri arasindaki "yüzde özdeslik" ve "% özdeslik" terimi, iki optimal olarak hizalanan dizide karsilik gelen pozisyonlarda özdes amino asit veya nükleotid kalintilarin yüzdeligini ifade eder. Iki amino asit veya nükleik asit dizisinin "yüzde özdesligini" belirlemek üzere diziler birlikte hizalanir. Optimal bir eslesme saglamak üzere bosluklar, dizi içine dahil edilebilir (diger bir deyisle ayrica dizi uçlarinda yerlestirilebilen delesyonlar veya insersiyonlar). Karsilik gelen pozisyonlarda amino asit ve nükleotid kalintilari akabinde karsilastirilir. Birinci dizideki bir pozisyon, ikinci dizide karsilik gelen pozisyonu isgal eden ayni amino asit veya nükleotid kalintisi ile isgal edildiginde moleküller, bu pozisyonda özdestir. Iki dizi arasindaki yüzde Özdesligi, diziler tarafindan paylasilan özdes pozisyonlarin sayisinin bir islevidir Avantajli bir düzenlemeye göre diziler, ayni uzunluga sahiptir. Avantajli olarak karsilastirilan diziler, bosluklara (veya insersiyonlar) sahip degildir. Yüzde özdeslik, matematiksel algoritmalar kullanilarak elde edilebilir. Iki diziyi karsilastirmaya yönelik olarak kullanilan bir algoritinanin sinirlayici olmayan bir tarafindan modifiye edilen Karlin ve Altschul algoritmasidir [Proc. Natl. Acad. 02084-P-0001 Bir veya daha fazla boslugun (veya insersiyonlar) varliginda dahi hizalari saglama amaci ile, her bir bosluga (veya insersiyon) yönelik oldukça yüksek bir kayip ve bosluk içinde her bir ilave amino asit veya nükleotid kalintisina (bu ilave amino asit veya nükleotid kalintisi, bosluk uzantisi olarak tanimlanir) yönelik daha düsük bir kayip tahsis eden yöntemler kullanilabilir. Yüksek kayiplar belirgin sekilde, en az sayida bosluk ile optimize edilen hizalara yol açacaktir. Bu türden hizayi saglayabilen bir programin bir örnegi, Altschul vd., Nucleic amaca yönelik olarak BLASTn ve BLASTp programlari, varsayilan parametreler ile kullanilabilir. BLAST programi kullanilirken BLOSUM62 matriksi tipik olarak kullanilir. Optimal bir hizayi saglamaya yönelik bir programin avantajli ve sinirlayici olmayan bir örnegi, GCG Wisconsin Bestfit paketidir (University of Wisconsin, parametreler tekrar kullanilir, diger bir deyisle bir amino asit dizisine yönelik bunlar, bir bosluk için -12 olan bir kayba ve her bir uzanti için -4 olan bir kayba olanak saglar. Mevcut metinde, iki amino asit ile nükleotid dizisi arasindaki "yüzde homoloji" ve "% homoloji" terimi, iki optimal olarak hizalanan dizide karsilik gelen pozisyonlarda homolog ainino asit veya nükleotid kalintilarin yüzdeligini ifade Iki dizi arasindaki yüzde homoloji, hoinolog pozisyonlarin ve sadece özdes olmayan pozisyonlarin hesaplamada göz önünde tutuldugu disinda yüzde 02084-P-0001 özdesligi belirlemeye yönelik yukarida açiklanana önemli ölçüde özdes bir sekilde belirlenir. Bir nükleotid dizisi bakiinindan iki homolog pozisyon, farkli ancak kodonlari içinde ayni amino asidi kodlayan iki nükleotidi sunar. Bir amino asit dizisi bakimindan iki homolog pozisyon, iki homolog amino asidi sunar, diger bir deyisle ainino asitler, benzer fizikokimyasal Özelliklere sahiptir, örnegin amino asitler: aromatik (Phe, Trp, Tyr), asitler (Glu, Asp), polar (Gin, Asn), bazik (Lys, Arg, His), alifatik (Ala, Leu, Ile, Val), bir hidroksil grubu ile (Ser, Thr), bir kisa yan Zincirli (Gly, Ala, Ser, Thr, Met) gibi ayni gruplara aittir. Bu homolog amino asitler arasindaki sübstitüsyonlarin, proteinlerin fenotipini degistirmemesi beklenir (konservatif amino asit sübstitüsyonlari). Konservatif sübstitüsyonlarin spesifik örnekleri, bu teknik sahada bilinir ve çesitli literatürde Hizalarin ve yüzde homolojilerin ve/veya özdesliklerin belirlenmesi ile ilgili programlar ve/Veya makalelerin diger örnekleri örnegin Mevcut metinde "karsilik gelen pozisyon" terimi, bir hizayi takip ederek bir referans dizide kesin bir pozisyona karsilik gelen (veya bakan) bir polipeptit veya nükleik asit dizisindeki bir pozisyonu ifade eder. Örnegin SEQ lD NO: 2,yi gösteren FIX polipeptidi üzerinde kesin bir pozisyona karsilik gelen bir pozisyon, ilgili bir polipeptit ile SEQ lD NO: 2"nin hizalanmasi yoluyla belirlenebilir; hizalama, manüel olarak veya yüzde özdeslik belirlemesi ile ilgili olarak yukarida açiklandigi üzere gerçeklestirilebilir. Mevcut metinde "yalin zincir" terimi, kimyasal olarak modifiye edilmemis ancak sadece esdegerli olarak bagli amino asitleri içeren bir polipeptidi ifade eder. 02084-P-0001 Mevcut terimde "promotör" terimi, bunun operatif olarak baglandigi (ancak zorunlu olarak bunun yaninda degildir) bir nükleotid dizisinin transkripsiyonunu kontrol eden (aktive eden) bir genin bir DNA kismini ifade eder. Promotör, RNA polimerazi tarafindan fark edilen ve RNA polimerazinin kendisinin transkripsiyonu baslatacagi sekilde RNA polimerazini baglayan bir veya daha fazla DNA dizisini içerir. Mevcut inetinde bir patolojiyi "tedavi etmek" veya bunun "tedavisi" terimi, bu patolojinin profilaksisi ve/veya terapisi ve/veya kürünü ifade eder. Profilaksi terimi avantajli olarak, olasi bir hastaligin gelisimini en azindan kismen durdurmayi ve/veya semptomlarinin daha kötüye gitmesini veya bir hastaligin ilerlemesini önlemeyi ifade eder. Avantajli olarak terapi terimi, hastalik semptomlarinin kismen veya tamamen azaltilmasini ifade eder. Mevcut terimde "vektör" terimi, söz konusu nükleik asidin ifadesine veya replikasyonuna yönelik bir hücre içine bir nükleik asidi uygulamak üzere kullanilan bir elemani ifade eder. Vektörlerin bir örnegi, ekstra-kromozomal replikasyonu yapabilen epizomlardir. Vektörler ayrica, konakçi kromozomlar içine entegre edilebilir. Vektörler siklikla, genel olarak çift-sarmal DNA olan plazmitlerin formundadir. Mevcut metinde "bir nükleik asidi sunan araç" terimi: nükleik asidi içeren bir vektör; nükleik asidi içeren bir hücre; veya karistirilarak nükleik asit ile kombine edilen farmasötik olarak kabul edilebilir bir eksipiyani ifade eder. Avantajli olarak araç, bir vektör veya bir hücreden seçilir. Mevcut bulusa göre bir modifiyeli FIX polipeptidi, pozisyon 338"e karsilik gelen bir pozisyonda lösini içerecek sekilde saglanir. 02084-P-0001 Modifiyeli FlX polipeptidinin, koagülasyon kaskadi içinde islevini gerçeklestirebilmesi gerekir ve sentetik veya dogal kökenli, örnegin insan veya hayvan kökenli olabilir. FIX polipeptitlerinin örnekleri (bunlar ile sinirli olmaksizin) modifiyesiz dogal sus FIX (SEQ ID NO: 2'nin polipeptidi gibi), söz konusu dogal sus FIX,in öncülü (SEQ ID NO: 1"in polipeptidi gibi), dogal polimorfik degiskenleri (pozisyon T148,e veya bunun bir öncül polipeptidine karsilik gelen bir pozisyonda bir alanini sunan bir polipeptit gibi) içerir. Mevcut metinde modifiyeli veya modifiyesiz amino asit dizilerinin konumlari (pozisyonlar), SEQ 1 D NO: 2 tarafindan tanimlandigi üzere modifiyesiz matür bir FIX polipeptidinin karsilik gelen pozisyonlarinda amino asit numaralandirmasina referans yoluyla tanimlanir. Karsilik gelen pozisyonlar, modifiyesiz kalintilarin hizalanmasi yoluyla belirlenebilir (yukari bakiniz). Örnek yoluyla bundan sonra matür FIX polipeptidinin (SEQ ID NO: 2) ve FIX polipeptit öncülünün (SEQ ID NO: 1) dizileri ve nispi numaralandinnalari rapor edilir. Kalin alti çizili Arg 384steki SEQ ID NO: 1 F IliîIl-l.? .' ..'I' . 7.5.1' T" Tlflî7.I`.iÇZ'.' TIFF??? .'Il` ` T`..F.TTÇ'_.i`llI TFF '-.III-.Ü ,. ?ETI-..7 T'Ü-'TIT TFF*`.".FGI`II._ ."" -I . 7-› Ç - 1:. I 1 1 H. i .... i 1 .al i i SEQ ID NO: 2°deki Arg 338°e karsilik gelir. Kalin alti çizili Arg 3387de SEQ ID NO: 2 asagidakidir. 02084-P-0001 YNSGKLCEFV OGVLCRCCME EKCSFCEARE VFCNvîFl'TE FWKOYVSGDO CES\PCLNÜG SCKDJINSYE CWCPFCFE-IJK VCELDVTCNl K\L3qCE|ÇJFCK NSADNKVVCS CTEGVRLAEN C-KSCEPAVPF DCGQVSVSDT SKLTRAETV: PDVDYVNS'C AZTILDNI'Ü STÜSFRDFT? VVGGEDAKPG OFPWOVVLNG KVDAFUGGSI VNEKWIV'AA HîJVETGVKIT ``i'VAGEHNIEE TEHTEÇ KFGSS VSGW GRVFHKGPSA LVLCIYLRVî'.. VDPATCLBB' KFTlYNNMFC AGFHEGGPCS CG'GDSGGFHV TEVEGTSFLT GIISWGEECA MKGKVGIVTK VSRYVNW KE KTKLT Benzer sekilde modifiyeli veya modifiyesiz nükleotid dizilerinin pozisyonlari, erisim numarasi K ile tanimlanan nükleotid dizisinin karsilik gelen pozisyonlarinda nükleotid numaralandirinaya referans yoluyla aksi gösterilmedikçe tanimlanir. Nükleotid dizisi K02402, FIX polipeptit öncülünü (SEQ ID NO: 1) kodlar ve bazi intron bölgeleri içerir (bu bakimdan bakiniz Anson DS, Choo KH, Rees DJ, Giannelli F, Gould K, Huddleston JA, Brownlee GG. The gene structure of human anti-haemophilic factor IX. The EMBO Journal Bir modifiyeli FIX polipeptidinin tanimi içine, FIX"in amino asitlerinin veya tüm alanlarinin, koagülasyon faktör ailesine ait diger faktörlerin (örnegin faktör VII veya faktör X) amino asitleri veya dizileri ile degistirilerek üretilebilen kimerik degiskenler dahil edilir. Diger düzenlemelere göre burada sunulan modifiyeli FIX polipeptidi, yalin bir zincirdir veya transkripsiyon sonrasi modifikasyonlar sergiler. Modifikasyonlarin örnekleri, (bunlar ile sinirli olmaksizin) glikosilasyon, asilasyon, metilasyon, fosforilasyon, sülfatlasma, karboksilasyon, tuzlasma, prolin, aspartik asit, lizinin hidrolizi veya karboksi-termal amidasyonu gibi C vitaminine bagli modifikasyonlar; glutamik asit kalintilarinin karboksilasyonu gibi K Vitaminine bagli modifikasyon; bir veya daha fazla selenosisteini (selenosisteinler) 02084-P-0001 olusturmak üzere selenyuinun dahil edilmesi; bir PEG kisminin (polietilen glikol) dahil edilmesini içeren bir veya daha fazla kimyasal modifikasyonu içerir. Burada açiklanan olasi modifikasyonlara ek olarak modifiyeli FIX polipeptidi, hiperglikosilasyon, deimmünizasyon ve digerleri gibi teknigin durumunda bilinen bir veya daha fazla degiskeni içerebilir (bakiniz örnegin: Modifiyeli FIX polipeptit degiskenlerinin sinirlayici olmayan örnekleri, takip eden referanslardan biri veya daha fazlasindan Modifiyeli FIX polipeptidi, SEQ ID NO: 1 ve SEQ ID NO: 2Sden olusan gruptan homolojiye (veya avantajli olarak özdeslik) sahiptir. Avantajli olarak modifiyeli FIX polipeptidi, SEQ ID NO: 1 ve SEQ ID NO: 2an olusan gruptan seçilen bir peptit dizi ile en az %80 homolojiye (veya avantajli olarak Özdeslik) sahiptir. Avantajli olarak modifiyeli FIX polipeptidi, SEQ ID NO: 1 ve SEQ ID NO: 2lden olusan gruptan seçilen bir peptit dizi ile en az %90 homolojiye (veya avantajli olarak özdeslik) sahiptir. Avantajli olarak peptit dizisi, SEQ 1D NO: 2"dir. 02084-P-0001 Ayrica burada, mevcut bulusun FIX polipeptidini kodlayan bir nükleotid dizisi açiklanir. Bazi alternatiflere göre nükleotid dizisi, erisim numarasi K02402"ye (GenBank) homolojiye (veya avantajli olarak özdeslik) sahiptir. Avantajli olarak nükleotid dizisi, erisim numarasi K02402"ye (GenBank) sahip dizi ile en az %70 homolojiye (veya avantajli olarak özdeslik) sahiptir. Avantajli olarak nükleotid dizisi, erisim numarasi K02402°ye (GenBank) sahip dizi ile en az nükleotid dizisi, erisim numarasi K02402'ye (GenBank) sahip dizi ile en az %100 homolojiye (veya avantajli olarak özdeslik) sahiptir. Bazi altematitlere göre nükleotid dizisi, bir RNA dizisidir ve Anson OS, Chao KH, Rees OJ, Giannelli F, Gould K, Huddleston JA and Brownlee GG. The gene structure of human anti-hemophilic factor IX. The EMBO Journal 1984; 3: 1053- 1060 tarafindan makalede sekil 2"nin polinükleotidinin pozisyon 31 ila pozisyon (avantajli olarak pozisyon 169 ila pozisyon 1411 Bu durumda diger bir deyisle SEQ ID NO: 3 ve SEQ ID NO: 43e referans ile) pozisyon numaralari, önceden bahsedilen sekil 2"de rapor edilen numaralandirmaya refere eder. Avantajli olarak RNA dizisi, dizi SEQ ID NO: 3 (avantajli olarak, SEQ ID NO: 4) ile en az %80 hoinolojiye (veya avantajli olarak özdeslik) sahiptir. Avantajli olarak RNA dizisi, dizi SEQ ID NO: 3 (avantajli olarak, SEQ lD NO: 4) ile en az dizisi, dizi SEQ lD NO: 3 (avantajli olarak, SEQ ID NO: 4) ile en az %95 homolojiye (veya avantajli olarak özdeslik) sahiptir. 02084-P-0001 RNA dizisi, çevrilmeyen veya ayri olarak çevrilen ilave nükleotid zincirlerine bastan ve/veya kuyruktan baglanabilir. Bazi alternatiflere göre nükleotid dizisi, bir DNA dizisidir ve Anson DS, Chao KH, Rees OJ, Giannelli F, Gould K, Huddleston JA and Brownlee GG. The gene structure of human anti-hemophilic factor IX. The EMBO Journall984; 3:] 053- (diger bir deyisle bosluklara sahip olmayan ve sirayla birbirine bagli ekson kisimlari) sunan intron ve ekson kisimlarini içerir (özellikle bunlardan olusur). Avantajli olarak ekson kisimlari, birbirinden ayridir ve dizi SEQ lD NO: S"te ilgili ekson bölgeleri gibi sirayla yerlestirilir (birbirine göre düzenlenir). Avantajli olarak ekson kisimlarinin tüm dizisi, ekson bölgelerinin tüm kismi ile en az %80 homolojiye (veya avantajli olarak özdeslik) sahiptir. Avantajli olarak ekson kisimlarinin tüm dizisi, ekson bölgelerinin tüm kismi ile en az %90 homolojiye (veya avantajli olarak özdeslik) sahiptir. Avantajli olarak ekson kisimlarinin tüm dizisi, ekson bölgelerinin tüm kismi ile en az %95 homolojiye (veya avantajli olarak özdeslik) sahiptir. Bazi düzenlemelere göre nükleotid dizisi, SEQ ID NO: 5'te verilen numaralandirmaya göre pozisyon 34099,a karsilik gelen bir pozisyonda (veya karsilik gelen pozisyon 32318,de; veya Hemofi] B,nin mutasyon Veri Tabaninda (Giannelli et al., Hemophilia B: Database of point mutations and short additions numaralandirinaya göre karsilik gelen pozisyon 31134"te) bir timini; veya SEQ lD NO: 3 veya SEQ lD NO: 4,ün karsilik gelen pozisyon l 1 180ide bir urasili içerir. Diger bir deyisle önceden bahsedilen nükleotid dizisi, pozisyon 34099,da (G34099T) veya karsilik gelen bir pozisyonda guanin ila timin arasinda (örnegin 02084-P-0001 SEQ ID NO: 5,in numaralandirmasina göre pozisyon 32318; veya SEQ ID NO: 3 veya SEQ lD NO: 4,ün karsilik gelen pozisyon 11180,inde guanin ila urasil arasinda) bir mutasyonun en azindan tasinmasi yoluyla erisim numarasi K02402°ye (GenBank) sahip olan diziden farklilik gösterir. Bu durumda nükleotid dizisi, pozisyon 3387e karsilik gelen bir pozisyonda bir lösini kodlar. UUA, TTG, UUG, CTT, CUU, CTC, CUC, CTA, CUA, CTG, CUG,den olusan gruptan seçilen bir tripleti sunabilir. Özellikle nükleotid dizisi bir DNA dizisi oldugunda triplet, TTA, TTG, CTT, CTC, CTA, CTG"den olusan gruptan seçilir. Avantajli olarak triplet, CTA7d1r. Bu durumda dizi, pozisyon 338"e karsilik gelen bir pozisyonda bir lösini kodlar. Yukarida bahsedilen homoloji (veya özdeslik) yüzdelikleri, gösterilen spesifik mutasyona ugramis pozisyonlar göz önünde tutulmaksizin hesaplanir. Diger bir deyisle ömegin, pozisyon 338°de bir lösin ile modifiye edilen dizi SEQ ID NO: 2, modifiyesiz dizi SEQ ID NO: 2 ile %100 homolojiye (ve özdeslik) sahip oldugu düsünülür. Ayrica burada, yukarida açiklandigi üzere bir nükleotid dizisini içeren bir nükleik asit açiklanir. Nükleik asit, nükleotid dizisi ile islemsel baglanti halinde bir promotörü içerebilir. Ayrica burada, yukarida tanimlandigi üzere bir nükleik asidi içeren bir vektör açiklanir. Özellikle vektör, yukarida açiklandigi üzere bir nükleotid dizisini içerir. Vektör: bir prokaryot vektörü, bir ökaryot vektörü veya bir viral vektörden seçilebilir. Avantajli olarak vektör, bir viral vektördür. Özellikle vektör: bir 02084-P-0001 adenovirüs, bir retrovirüs, bir herpesvirüs, bir lentivirüs, bir poksvirüs, bir sitomagelovirüsten seçilir. Bir modifiyeli F 1)( polipeptidin üretimine yönelik bir yöntem ayrica açiklanir, bu sekilde modifiyeli FIX polipeptidi, yukarida açiklandigi üzere bir nükleik asit araciligiyla ifade edilir. Yöntem, bir hücre içine yukarida açiklandigi üzere bir vektörün dahil edilmesi; ve FIX polipeptidinin ifade edilecegi sekilde hücrenin kültürlenmesi adimlarini içerebilir. Alternatif olarak modifiyeli FIX polipeptidi, önceden bahsedilen nükleotid dizisinden bir konakçi hayvan tarafindan veya in vitro üretilebilir. Belirli bir yöntem, hücresiz bir sistem içine yukarida açiklandigi üzere nükleotid dizisinin dahil edilmesi; hücresiz sistem içinde modifiyeli polipeptidin ifade edilmesi adimlarini içerir. Yöntem, modifiyeli FIX polipeptidinin, yukarida açiklandigi üzere bir nükleik asidi (özellikle yukarida açiklandigi üzere nükleotid dizisi) içeren bir transgenik hayvanda ifade edilmesine olanak saglayabilir. Modifiyeli FIX polipeptidinin ifadesine yönelik kullanisli konakçilar: E. coli, maya, bitkiler, böcek hücreleri, memeli hücreleri (Pham et al. (2003) hayvanlari içerir. Konakçilar, protein üretim düzeyleri ve ayrica transkripsiyondan sonra modifiyeli F IX polipeptidi içinde indüklü modifikasyonlarin türüne iliskin olarak degisebilir. Ökaryotik konakçilar, Saccharomyces cerevisiae ve Pichia pastoris (Skoko et al. 02084-P-0001 pirinç, alg gibi bitkilerden hücreler (Mayfield et al. (, vb.,ni içerebilir. Bitkiler tipik olarak, DNAlnin dogrudan transferi ve agrobakteri aracili dönüsümler yoluyla modifiye edilir. Avantajli olarak kullanilabilir vektörler, promotör dizileri ve transkripsiyon sonu ve kontrol elemanlarini içerir. Mayalar genel olarak, epizomal vektörlerin çogaltilmasi yoluyla veya homolog rekombinasyon ile stabil bir kromozomal entegrasyon yoluyla modifiye edilir. Avantajli olarak promotörler, gen ifadesini düzenlemek üzere kullanilir. Promotörlerin örnekleri, GAL 1, GAL7, GALS, CUPl'i içerir. Mayalardan üretilen proteinler genel olarak çözünebilirdir; alternatif olarak mayalar içinde ifade edilen proteinler salgilanabilir. Ökaryotik konakçilar içinde ifade ayrica, hayvanlarda örnegin serum, süt ve yumurtalar içinde üretimi içerir. FIX polipeptitlerinin üretimine yönelik Önceden tanimlandigi üzere modifiyeli FIX polipeptidini üretmeye yönelik olarak adapte edilebilir. Prokaryot hücreler özellikle E. Coli,, önceden tanimlandigi üzere büyük miktarlarda modifiyeli FIX polipeptidi üretmek üzere avantajli olarak E. coli' ile kullanilan vektörler avantajli olarak, yüksek düzeylerde protein ifadesini indükleyebilen ve konakçi hücrelere dogru bir miktar toksisiteyi gösteren proteinleri ifade edebilen promotörleri içerir. Promotörlerin örnekleri, T7 ve SP6 RNAldir. 02084-P-0001 l3-rnerkap0etanol gibi ajanlari azaltma, E. colfnin sitoplazmik çevresinde çökelebilen polipeptitleri çözmek üzere kullanilabilir. Mevcut bulusa göre yukarida açiklandigi üzere bir modifiyeli F IX polipeptidi, bir ilaç olarak kullanima yönelik saglanir. Modifiyeli FIX polipeptidi, tek basina veya diger aktif bilesikler ile kombinasyon halinde hastalik tedavilerine yönelik olarak kullanilabilir. Modifiyeli FIX polipeptidi, koagülopatiler (dogustan veya edinilmis), hematolojik hastaliklar (dogustan veya edinilmis), hemorajik bozukluklar (hemorajik gastrit ve/veya rahim kanamasi gibi), diger kardiyovasküler hastaliklari tedavi etmeye yönelik olarak kullanislidir. Bazi düzenlemelere göre modifiyeli FIX polipeptidi, en az bir koagülopatinin tedavisine yönelik olarak saglanir. Bazi düzenlemelere göre modifiyeli FIX polipeptidi, hematolojik hastaliklarin tedavisine yönelik olarak saglanir. Bazi düzenlemelere göre modifiyeli FIX polipeptidi, hemorajik bozukluklarin tedavisine yönelik olarak saglanir. Bazi düzenlemelere göre modifiyeli FIX polipeptidi, hemorajileri azaltmak ve/veya Önlemek üzere oldukça uzun bir süre veya cerrahi prosedürlerden önce, bunlar sirasinda ve/veya bunlardan sonra periyodik olarak hastalara uygulanir. Koagülopatilerin tedavisine yönelik modifiyeli FlX polipeptidinin kullanimi özellikle etkilidir. 02084-P-0001 Avantajli olarak modifiyeli FIX polipeptidi, hemofil ve özellikle hemofil A ve hemofil Binin tedavisine yönelik olarak kullanilir. Avantajli düzenlemelere göre inodifiyeli FIX polipeptidi, hemofil B ve avantajli olarak agir ve/veya orta hemofil B"yi tedavi etmeye yönelik olarak saglanir. Avantajli olarak modifiyeli F IX polipeptidi, memelilerin özellikle insan hastalarin tedavisine yönelik olarak kullanilir. Yukarida açiklandigi üzere modifiyeli FIX polipeptidinin kullanimi, avantajli olarak bir koagülopatiyi tedavi etmek için bir ilaci (farmasötik preparat); ve modifiyeli FIX polipeptidi ve avantajli olarak en az bir farmasötik olarak kabul edilebilir eksipiyani içeren farmasötik bir preparati hazirlamaya yönelik olarak saglanir. Bazi düzenlemelere göre farmasötik preparat, koagülopatiler (dogustan veya edinilmis), hematolojik hastaliklar (dogustan veya edinilmis), hemorajik bozukluklar (hemorajik gastrit ve/veya rahim kanamasi), hemofilden (hemofil A veya hemofil B) olusan gruptan seçilen bir patolojinin tedavisine yöneliktir. Spesifik düzenlemelere göre farmasötik preparat, bir koagülopatiyi tedavi etmeye yöneliktir. Spesifik düzenlemelere göre farmasötik preparat, hemofili tedavi etmeye yöneliktir. Mevcut bulus ayrica, en az bir koagülopatiyi tedavi etmeye yönelik bir yöntem ile ilgilidir, bu yöntem, önceden tanimlandigi üzere bir modifiyeli FIX polipeptidinin etkili bir mikatrinin uygulanmasina olanak saglar. Modifiyeli FIX polipeptidi, saf bir bilesik olarak uygulanabilir ancak avantajli olarak bir farmasötik preparatin formunda sunulur. Bu amaca yönelik gerekmesi halinde farmasötik preparatlarin sinirlayici olmayan örnekleri asagida açiklanir. 02084-P-0001 Modifiyeli F IX polipeptidi, oral, parenteral veya rektal uygulamaya yönelik veya inhalasyon veya insuflasyon (agiz veya burun vasitasiyla) yoluyla uygulamalara uygun formlarda formüle edilebilir. Oral veya parenteral uygulamaya yönelik formülasyonlar avantajlidir. Oral uygulamalara yönelik farmasötik preparatlar, baglayicilar (örnegin prejelatinize misir nisastasi, polivinilpirolidon veya metil selüloz); dolgular (örnegin laktoz, mikrokristalin selüloz veya kalsiyum hidrojen fosfat); katki maddeleri (örnegin magnezyum stearat, talki, silika); dagitieilar (örnegin patates nisastasi); veya/ve yaglayicilar (örnegin sodyum loril sülfat) gibi farmasötik olarak kabul edilebilir eksipiyanlar ila bilinen yöntemler yoluyla hazirlanmis örnegin tabletler veya kapsüllerin forrnundadir. Tabletler, bilinen yöntemler kullanilarak kaplanabilir. Oral uygulamalara yönelik likit preparatlar, örnegin solüsyonlar, suruplar veya süspansiyonlarin formuna sahiptir veya kullanimdan önce su veya bir diger likit içinde çözünebilen kuru bir ürünün formunda olabilir. Söz konusu preparatlar, süspanse edici ajanlar (örnegin sorbitol, selüloz türevleri, yenilebilir hidrojenlenmis yaglar); emülsiyonlastirma ajanlari (örnegin lesitin veya akasya); aköz olmayan likitler (örnegin badem yagi, yagli esterler, etil alkol veya parçalarina ayrilmis bitkisel yaglar); ve/veya koruyucular (örnegin metil veya propilhidroksibenzoatlar, sorbik asit veya askorbik asit) gibi farmasötik olarak kabul edilebilir katki maddeleri ile bilindik yöntemler yoluyla hazirlanir. Preparatlar ayrica, uygun durumlarda tamponlama tuzlari, renklendirici ajanlar, tat verici ajanlar ve/veya tatlandiricilari içerebilir. Oral uygulamaya yönelik preparatlar, aktif bilesigin kontrollü bir salinimini saglamak amaciyla bilindik bir sekilde formüle edilir. Modifiyeli F IX polipeptidi, enjeksiyon veya sürekli uygulama yoluyla parenteral uygulamaya yönelik bilindik bir sekilde formüle edilir. Enjeksiyona yönelik formülasyonlar avantajli olarak, dozaj birimlerinin formunda, örnegin koruyuculari içeren ampüller veya çok dozlu konteynerler içindedir. Bilesim, aköz 02084-P-0001 veya yagli likitler içinde bir süspansiyon formunda olabilir ve dagitici ve stabilize edici ajanlar olarak forinülasyonun elemanlarini içerebilir. Alternatif olarak aktif bilesik, steril su gibi gerektikçe bir likit içinde kullanimdan hemen önce çözünecek sekilde toz formda olabilir. Modifiyeli F IX polipeptidi, supozituvarlar veya kakao yagi veya diger gliseritler gibi bilindik türden supozituvar eksipiyanlari örnegin içeren lavmanlar olarak rektal uygulamaya yönelik olarak formüle edilebilir. Modifiyeli FIX polipeptidi ayrica, uzatilmis saliniinli bilesimler içinde bilindik bir sekilde formüle edilir. Bu uzatilmis salinimli bilesimler örnegin, bir implant (örnegin subkütanöz veya intramüsküler) veya bir intramüsküler enjeksiyon araciligiyla uygulanir. Bu nedenle örnegin modifiyeli FIX polipeptidi, uygun polimer veya hidrofobik materyaller (bir emülsiyon veya bir yag gibi) veya iyon degisimli reçineler veya oldukça az çözünebilir tuzlar gibi oldukça az çözünebilir türevler ile formüle edilir. Intranazal uygulamaya yönelik modifiyeli FIX polipeptidi, uygun bir araç ile bir toz içinde oldugu gibi bir (bilindik) cihaz vasitasiyla uygulamalar yoluyla formüle Modifiyeli FIX polipeptidin dozajlari, hasta yasi ve durumuna bagli olacaktir ve bu sekilde kesin dozajin, doktor tarafinda her seferinde belirlenmesi gerekecektir. Dozaj ayrica, uygulama modu ve seçilen belirli bilesige bagli olacaktir. Kullanilabilir dozlar örnegin, günlük 0,] tig/kg ile 400 ug/kg Vücut agirligi arasinda olabilir. Yukarida açiklanan nükleotid dizisi, bir ilaç olarak kullanima yönelik (avantajli olarak bir koagülopatiyi tedavi etmeye yönelik) olabilir. 02084-P-0001 Nükleotid dizisi, tek basina veya diger aktif bilesikler ile kombinasyon halinde bir patolojiyi tedavi etmeye yönelik kullanilabilir. Nükleotid dizisi, modifiyeli FlX polipeptidine iliskin olarak yukarida açiklanan patolojileri tedavi etmeye yönelik kullanislidir. Önceden bahsedilen nükleotid dizisi, avantajli olarak bir koagülopatiyi tedavi etmeye yönelik bir ilaci hazirlamaya yönelik olarak kullanilabilir; ve bir farmasötik preparat, nükleotid dizisini içerebilir. Modifiyeli FIX polipeptidinin uygulanmasi yerine bunu kodlayan nükleotid dizisinin uygulanmasi olasidir. Nükleotid dizisi, bilindik herhangi bir yöntem araciligiyla hücreler veya dokular içine yerlestirilebilir. Nükleotid dizisi, sonraki manipülasyonlara yönelik bir vektör içine dahil edilebilir. Örnegin belirli hücreler, promotör diziler ile operatif olarak baglanan bir genomik konum içine önceden bahsedilen nükleotid dizisinin entegre edilmesi yoluyla modifiyeli FIX polipeptidi ifade etmek amaciyla düzenlenebilir. Söz konusu hücreler, lokal olarak veya sistemik olarak bir hastaya uygulanabilir. Kullanilabilir viral vektörler, poksvirüs, herpesvirüs, retrovirüs, adenovirüs, adenoya bagli virüs ve gen terapisine uygun diger virüsleri içerir. Vektörler epizomal olarak kalabilir veya tedavi edilen bireyin kromozomlari içine entegre edilebilir. Adenovirüs serotipler ticari olarak, Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonundan (ATCC, Rockville) elde edilebilirdir. 02084-P-0001 Viral vektörler özellikle adenovirüs. ex vi'vo kullanilir; örnegin hücreler, bir hastadan izole edilir ve modifiyeli FlX polipeptidi ifade eden bir adenovirüs ile transdüse edilir. Uygun bir süre kültürlemeden sonra transdüse hücreler, lokal olarak veya sisteinik olarak hastaya uygulanir. Alternatif olarak, modifiyeli FlX polipeptidi ifade eden virüsler özellikle adenovirüsler izole edilir ve farrnasötik olarak kabul edilebilir bir eksipiyan ile formüle edilir ve hastaya uygulanir. Tipik olarak adenovirüsler, hasta agirliginin kilogrami basina 1 ila 1014 partikül, genel olarak hasta agirliginin kilogrami basina 106 ila `1012 partikül arasindaki dozlarda uygulanir. Modifiyeli F IX polipeptidinin ifadesi ve salinimina yönelik hücre türlerinin ilave örnekleri, fibroblastlar ve endotelyal hücrelerdir (Palmer et al. (1989) Blood Önceden bahsedilen nükleotid dizisini sunan bir araç, modifiyeli FIX polipeptidine yönelik yukarida açiklanana benzer bir sekilde formüle edilebilir. Nükleotid dizisi ve/veya ilaçlar ve/veya söz konusu nükleotid dizisini sunan araçlar, modifiye FIX peptidi ile iliskili olarak yukariya refere eden patolojileri tedavi etmeye yönelik olarak kullanilabilir. Avantajli olarak önceden bahsedilen nükleotid dizisi, memelileri özellikle insan hastalari tedavi etmeye yönelik olarak kullanilir. Bir yöntem, yukarida açiklandigi üzere mevcut bulusun proteinini ve/veya nükleotid dizisini saptamaya yönelik olarak kullanilabilir. Kullanilabilir yöntemler, teknigin durumunda bilinen yöntemlerdir ve örnegin immünoenzimatik analizleri, koagülasyon protein aktivite testleri (FIX aktivitesi 02084-P-0001 dahil olmak üzere), koagülometrik ve kromojenik testleri içerecek sekilde çalisma altinda bu poliforfizme adapte edilebilir. Yöntem, bir nükleik asit molekülünün PCR parçasi yoluyla kuvvetlendirme adimini içerebilir (burada, yukarida açiklandigi üzere nükleotid dizisinin varliginin dogrulanmasi gerekir). Avantajli olarak kuvvetlendirme adimi, nükleik asit iriolekülünün saflastirilmasi ve özellikle izole edilmesi adimindan önce gelir. Avantajli olarak kuvvetlendirme adimi, bir dizilime adimi tarafindan takip edilir. Örnek yoluyla örnekler 2 ve 37ün yöntemleri, yukarida bahsedilen nükleotid dizisini saptama üzere takip edilebilir. Protein ve/veya nükleotid dizisini saptamaya yönelik yöntem, tromboz gibi kan hastaliklarini gelistirmek üzere yüksek bir egilim sergileyen bu bireylerin tanimlanmasina yardimci olmak üzere kullanilabilir. Mevcut bulusun diger özellikleri, sadece tanimlayici olan ve sinirlayici olmayan bazi örneklerin asagidaki açiklamasindan meydana gelecektir. Örnek 1 - Proband üzerinde gerçeklestirilen rutin laboratuvar testleri Rutin laboratuvar koagülasyon testleri, derin ven trombozunun evrelerini gösteren ancak diger saglik sorunlarina sahip olmayan bir birey (Proband olarak tanimlanmistir) izlenerek trombofili bakimindan gerçeklestirilmistir. Özellikle takip edenler gerçeklestirilmistir: protrombin süresi, kismen tromboplastin süresi, faktör IX düzeyleri, faktör VIII ve XI düzeyleri, antitrombin düzeyleri (aktivite ve antijen), C proteini düzeyleri (koagülometrik ve kromojenik 02084-P-0001 aktivite, antijen), S proteini düzeyleri (toplam antijen, antijensiz ve aktivite), aktivite C proteini direnci, faktör V Leiden için DNA analizi, protrombin degiskeni G20210A için DNA analizi, antifosfolipigt antikorlari, plasminojen, fibrinoliz testleri. Proband üzerinde gerçeklestirilen koagülasyon testlerinin tamaminin, FIX aktivitesi disinda normal sinirlar dahilinde oldugu bulunmustur (bakiniz asagidaki örnek 4). Örnek 2 - Plazmadan ve hücre kültür ortamindan mutant FIX,in izolasyonu. Plazmadan veya kültür ortamindan FIXain izolasyonu, anti-FIX monoklonal antikor AHIX-5041"in [Haematologic Technologies, Inc. (Essex Junction, VT, USA)], esdegerli olarak baglandigi (her 3 ml sefaroz reçinesi için 3.5 mg monoklonal antikor) bir reçine (sefaroz 4B) kullanilarak immünoafinite kolon teknigi araciligiyla saglanmistir. Kisaca kolon, 20 mM Tris, 150 mM NaCl, l mM benzamidi (mM = milimolar) içeren tampon ile ekilibre edilmistir. Plazmadan baslanarak K vitaminine bagli faktörler, baryum klorit eklenerek çökeltilmistir. Santrifüjleineden sonra tortu, 0.2 M EDTA,yi içeren bir solüsyon içinde tekrar süspanse edilmistir. Bu sekilde elde edilen preparat, 20 mM Tris, 150 mM NaCl içeren bir solüsyon içinde kapsamli olarak diyaliz edilmistir (2 kez, en az 2 saat). Diyalizden sonra preparatin, 0,5 nil/dakikalik bir hizda kolon içinden geçmesine olanak verilmistir. Tris/NaCl tamponu ile kapsamli kolon (10 kolon hacmi) yikamasindan sonra elüzyon, bir asidik glisin (pH 2.45) kullanilarak gerçeklestirilmistir. Eluat pH degeri, pH 7.5"te 2 M Tris eklenerek hemen nötralize edilmistir. Proteini içeren eluat parçalari (Bradford protein analizi yoluyla test edilmistir) hazirlaninistir ve bir Tris-NaCl solüsyonuna karsi diyalize edilmistir, FIX akabinde, 200 ul mikrokolonluk hizli akisli bir sefaroz Q (iyon degisimli) araciligiyla konsantre edilmistir. Preparatin safligi, SDS-PAGE jeli üzerinde gümüs boyama teknigi uygulanarak degerlendirilmistir. Örnek 3 - Genetik FIX çalismasi 02084-P-0001 PCR kuvvetlendirme ve eksonlarin ve Proband FIX geninin birlesme yerlerinin dogrudan dizilenmesi, literatürde rapor edildigi üzere standardize teknikler ve primerler kullanilarak gerçeklestirilmistir (Methods in Molecular Medicine, Vol 31: Hemostasis and Throinbosis Protocols. Edited by DJ. Perry and KJ. Pasi. Humana Press Inc. Totowa, NJ. Chapter 16: Hemophilia B mutational analysis. By Peter Green). Kisaca kuvvetlendirme, FIX geninin sekiz eksonunun her biri yaninda olan intron primer çiftleri kullanilarak gerçeklestirilmistir. Dizileme, döngü dizileme reaksiyonlarina yönelik ABI PRISM BigDye Terminator kiti kullanilarak ABI PRISM 310 dizileyici (Perkin Elmer, Foster City, CA) ile gerçeklestirilmistir. Dizi verileri, Dizileme Analizi 3.0 programi (Perkin Elmer, CA) kullanilarak analiz edilmistir. Elde edilen dizi, GenBank veri tabaninda (erisim numarasi: K02402) rapor edilen FIX dizisi ile kiyaslanmistir. Proband FIX geninin nükleotid dizisinin analizi, normal diziye kiyaslanan FIX geninin ekson VIIIii içinde tek bir mutasyonu belgelemistir. Hastanin, Arginin ila Lösin arasinda kodon 3387i degistirebilen FIX geninin pozisyon 34099,unda (FIX geninin normal dizisi, Gen bankasi erisim numarasi: K02402) (veya Hemofil B7nin mutasyonlarinin Veri tabaninda verilen numaralandirmaya göre karsilik gelen pozisyon 31134'te (Giannelli et al., Hemophilia B: Database of point mutations and short additions and deletions. Nucleic Acids Research bulunmustur. Bu nedenle, Proband plazmasinda mevcut FIX molekülü (mutasyona ugramis FIX), Arginin yerine bir Lösinin oldugu pozisyon 338"de sadece amino asit sübstitüsyonunun varligi ile normal FIX molekülünden farklilik gösterir. Örnek 4 - Leu 338 mutasyonunu içeren rekombinant FIX9in in vitro mutagenezi, ifadesi ve saflastirilmasi Yere spesifik mutagenez, Kunkel tarafindan açiklanan standart tekniklere göre gerçeklestirilmistir (Kunkel TA. Rapid and efficient site-specific mutagenesis 02084-P-0001 cDNA"nin dizilenmesi, mutasyonun dogru oldugu ve herhangi bir yeni mutasyonun uygulanmadigina dair teminata yönelik gerçeklestirilmistir. Rekombinant FlX"in ifadesi, literatürde halihazirda rapor edilen "insan embriyonik böbrek hücre hatti 293" ve yöntemler kullanilarak elde edilmistir (Chang JL, Jin JP, Lollar P, et al. Changing residue 338 in human factor IX from arginine to alanine causes an increase in catalytic activity. J. Biol. Chem. immünoafinite kolonu araciligiyla üst fazdan (kültür ortami) izole edilmistir. Kisaca hücre kültürünün üst fazi, 10 gün her 24 saat toplanmistir ve -20°C*de korunmustur. SaIlastirmaya yönelik olarak üst faz çözülmüstür ve benzamid ve EDTA, sirasiyla 5 miliMol ve 4 miliMol olan nihai bir konsantrasyona eklenmistir. Bir Millipore filtre içinden filtrelemeden sonra üst faz, 4°C"de 12 saat hizli akisli Sefaroz Q ile inkübe edilmistir. Reçine akabinde, Tris, NaCl ve benzamid tamponu içinde tekrar ekilibre edilmistir ve kolon üzerine yüklenmistir. Elüzyon, 0-60 nM°lik bir kalsiyum gradyani ile gerçeklestirilmistir. Eluat akabinde bir Tris-NaCI tamponu içinde diyalize edilmistir. Preparat akabinde, örnek 2'de açiklanan yöntem takip edilecek immünoafinite kolonuna uygulanmistir (rekombinant proteinin "in vitro" ifadesinde). Kültür ortamindan baslayarak prosedür, BaCI kullanan çökeltme prosedürü disinda plazmaya yönelik ile ayni olmustur. Kültür ortami, 20 dakika 4000g"de santrifüjlenmistir, akabinde Tris-NaCI içinde diyalize maruz birakilmistir ve 0,5 ml/dakikalik bir hizda immünoafinite kolonu üzerine yüklenmistir. Geriye kalan adimlar, plazmaya yönelik alinanlar ile ayni olinustur. 338Leu amino asit sübstitüsyonu ile sonuçlanan G34099T gen mutasyonu ile FIX, in vitro mutagenez ve ifade teknikleri yoluyla elde edilmistir. Hücre kültürü içinde ifade düzeyinin, mutasyona ugramamis rekombinant FIX (normal molekül) ile elde edilebilir düzeye benzer oldugu bulunmustur. Spesifik olarak mutasyona ugramamis rekombinant FIX"in ifade düzeyi, 750 ile 880 ng/ml arasinda olurken 02084-P-0001 338Leu amino asit ile sonuçlanan gen mutasyonu G34099T ile rekombinant faktörü IX için düzey 590 ila 629 ng/ml arasinda olmustur. islevsel FIX analizi, Aktin (Dade Behring, Marburg, Almanya) ve FlX bakimindan yetersiz plazma (Dade Behring, Marburg, Almanya) kullanilarak bir koagülometrik test ile Proband plazma üzerinde gerçeklestirilmistir. Kisaca koagülometrik teste yönelik kismen tromboplastin süresinin (PTT) bir degiskeni, FIX bakimindan yetersiz plazmayi içeren bir sistemde kullanilmistir. Kalsiyum kloritin eklenmesinden sonra pihtilasma süresi saniyeler içinde ölçülmüstür. Bu pihtilasma süresi, 5 tig/ml"lik (diger bir deyisle %100) bir miktarda FIX içeren referans olarak normal plazmanin bir havuzunun seri seyrelmeleri ile elde edilen bir kalibrasyon egrisinin süreleri ile karsilastirilmistir ve numune içinde mevcut FIX yüzdeligi, normal plazma havuzunun %100°ü üzerinden hesaplanir (yaygin standardize yöntemlere göre). Teste yönelik normal aralik, 20 ile 70 arasindaki yaslarda, iki cinsiyetten 100 saglikli bireyin ayni yöntemler kullanilarak analiz edilmesi yoluyla önceden elde edilmistir. Proband içinde FIX"in aktivite düzeylerinin, %7765ya esit oldugu bulunmustur (100 saglikli bireyde normal aralik, %80-120). Örnek 6 - FIX antijen analizi F IX antijeni, yakalamaya yönelik plaka üzerine kaplanan (bagli) bir birinci anti- FIX inonoklonal antikor (Affinity Biologicals, Ontario, Kanada) ve FlXain saptanmasina yönelik Yabanturpu peroksidazi (HRP) (Affinity Biologicals, Kanada) ile etiketli bir ikinci monoklonal antikor kullanilarak ELISA testi ile belirlenmistir. Referans egri, standardize prosedürlere göre numunelere yönelik 02084-P-0001 seyreltilmesi yoluyla yapilmistir. Kisaca birinci antikor, 4 ug/mlilik nihai bir konsantrasyonda bazik lede (pH : 9.0) sodyum bikarbonat tampon içinde seyrelmeden sonra plakaya baglanmistir. Tris-NaCI-TweenZO tamponu ile plkanin kapsamli yikanmasindan sonra, ayni tampon içinde 12100 ve 1:200 oraninda seyreltilmis numuneler, gözler için yüklenmistir ve 2 saat ambiyant sicakliginda inkübe edilmistir. Gözlerden numunelerin çikarilmasindan ve tampon ile kapsamli yikamadan sonra, HRP ile konjüge edilen ikinci antikoiu içeren 100 u171ik bir solüsyon, gözlerin her birine eklenmistir ve iki saat ambiyant sicakliginda inkübe edilmistir. Diger yikamalardan sonra, tetrametilbenzidini (TMB) içeren 100 ulslik bir solüsyon eklenmistir ve gelisen renk, 450 nanometrelik bir filtre ile spektroforometre yoluyla ölçülmüstür. FIX antijen düzeyi, referans egri kullanilarak hesaplanmistir ve normal plazmanin bir havuz yüzdeligi olarak ifade edilmistir. Normal test araligi, 20 ile 70 arasindaki yaslarda, iki cinsiyetten 100 saglikli bireyin analiz edilmesi yoluyla ayni yöntem kullanilarak önceden elde edilmistir. FIX antijen düzeylerinin, %927ye esit oldugu bulunmustur (normal aralik %80- 120). Bu sonuç (örnek 5"te elde edilen ile kombine edilmistir), normal miktarlarda sentezlenen sirküle eden bir FIX"in varligi ile uyumlu olmustur ancak prokoagülant islevi, normal FlX molekülünden yaklasik 8-9 kez daha büyük olmustur. Örnek 7 - Proband plazmadan özütlenen bir FIX ile ve rekombinant FIX ile FIX bakimindan yetersiz bir plazmanin yapilmasindan sonra FIX aktivitesi ve antijen düzeyleri Proband plazinasindan FlX"in izole edilinesinden sonra bu FIX, 5 ug/inlilik (normalin %100"üne esittir) nihai bir FIX konsantrasyonu ile FIX bakimindan yetersiz bir plazmayi (Dade-Behring, Milan, Italya) yeniden yapmaya yönelik olarak kullanilmistir. Bu sekilde yeniden yapilan plazma içinden F IX aktivitesi ve 02084-P-0001 antij eninin ölçümleri sirasiyla %740 ve %95 olmustur, bunlar dolayisiyla Proband plazmasinin ölçümleri ile uyumludur. Örnek 4 ile uygun olarak elde edilen rekombinant FlXin aktivitesini degerlendirmeye yönelik olarak ayni sistem, örnegin normal insan plazmasi içinde, (diger bir deyisle 5 tig/ml) (normalin %100"üne karsilik gelir) (tig = mikrogram) normal FIX konsantrasyonunu yenilemek üzere mutasyona ugramis rekombinant FIX"in (rF IX 338Leu) yeninden yapilmasindan sonra kullanilmistir. Rekombinant faktör IX aktivitesinin ve antijenlerinin ölçümleri, sirasiyla %780 ve Bu durum, Probandhn faktör IX9i içinde ayrica mevcut amino asit sübstitüsyonunu içeren, bu sekilde elde edilen rekombinant proteinin, normal faktör IXiten en az 8-9 kez daha büyük olan biyolojik bir aktiviteye sahip oldugunu gösterir. Örnek 8 - FIX3in SDS-PAGE ve Immünoblotlanmasi FIX7in SDS-PAGE ve immünoblotlanmasi (Western blot), Standart prosedürlere göre %5-15,lik lineer bir gradyan jeli üzerinde gerçeklestirilmistir. Kisaca normal FIX veya rekombinant FIX içeren numuneler, poliakrilamid jel gözleri içine yüklenmistir ve elektroforeze tabi tutulmustur. FIX akabinde, yari kuru bir aparat (Novablot, GE-Healtheare, Milan, Italya) kullanilarak bir poliviniliden florit (PVDF) üzerinde transblotlamaya tabi tutulmustur. FIX, HRPiye konjüge edilen bir anti-FIX monoklonal antikoru (Affinity Biologicals, Ontario, Kanada) kullanilarak transblotlamadan sonra PVDF membrani üzerinde saptanmistir. 02084-P-0001 Sekil 1, Probandidan izole edilen FlX, 338Leu rekombinant FIX ve normal FlXiin, ayni elektroforetik mobiliteyi ve ayni agirlik markörlerini sergiledigini gösterir (Sekil lide l, moleküler agirlik markörlerini gösterir, 2, nonnal FIX"i gösterir, 3, dogal modifiyeli FIXii gösterir, 4, modifiyeli rekombinant FlX*i gösterir). Bu nedenle, normal insan FIXii, 338 Leu dogal mutant insan FIX`i ve 338Leu rekombinant FIX,i arasinda önemli hiçbir fark (niceliksel veya niteliksel), bu teknik kullanilarak bulunmamistir. Önceden açiklanandan, pozisyon 338°e karsilik gelen bir pozisyonda bir lösinin varliginin sasirtici sekilde, neredeyse sekiz kat FIX polipeptidinin aktivitesini arttirdi gi anlasilirdir. Mevcut bulus, in vi'vo insanda artan bir koagülasyon aktivitesi disinda herhangi bir yan etkiye neden olmayan bir moditiyeli FIX polipeptidi saglamasi nedeniyle teknigin durumu üzerinde belirli bir gelisme oldugunu kanitlar. rekombinant FIX"in in vitro mutagenezi, ifadesi ve saflastirilmasi (Referans Yere spesifik mutagenez, pozisyon 34098'de sitosin yerine bir guanin ve pozisyon yerlestirilmesi yoluyla Kunkel (Kunkel T A. Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection; Proc Natl Acad Sci USA 1985, 82: 488-492) tarafindan açiklanan standart tekniklere göre gerçeklestirilinistir (mutagenez ayrica, pozisyon 34098'de sitosinin yerine bir guanin, pozisyon guaninin yerlestirilmesi yoluyla tekrar edilmistir). 02084-P-0001 cDNA'nin dizilenmesi, mutasyonun dogru oldugu ve herhangi bir yeni mutasyonun uygulanmadigina dair teminata yönelik gerçeklestirilmistir. Rekombinant FIXSIn ifadesi, literatürde halihazirda rapor edilen "insan embriyonik böbrek hücre hatti 293" ve yöntemler kullanilarak elde edilmistir (Chang JL, Jin JP, Lollar P, et al. Changing residue 338 in human factor IX from arginine to alanine causes an increase in catalytic activity. J. Biol. Chem. immünoafinite kolonu araciligiyla üst fazdan (kültür ortami) izole edilmistir. Kisaca hücre kültürünün üst fazi, 10 gün her 24 saat toplanmistir ve -20°C`de korunmustur. Saflastirmaya yönelik olarak üst faz çözülmüstür ve benzamid ve EDTA, sirasiyla 5 miliMol ve 4 miliMol olan nihai bir konsantrasyona eklenmistir. Bir Millipore filtre içinden filtrelemeden sonra üst faz, 4°C'de 12 saat hizli akisli Sefaroz Q ile inkübe edilmistir. Reçine akabinde, Tris, NaCl ve benzamid tamponu içinde tekrar ekilibre edilmistir ve kolon üzerine yüklenmistir. Elüzyon, 0-60 nMilik bir kalsiyum gradyani ile gerçeklestirilmistir. Eluat akabinde bir Tris-NaCI tamponu içinde diyalize edilmistir. Preparat, örnek 2"de açiklanan yöntem takip edilecek immünoafinite kolonuna uygulanmistir (rekombinant proteinin "in vitro " ifadesinde). Kültür ortamindan baslayarak prosedür, BaCl kullanan çökeltme prosedürü disinda plazmaya yönelik ile ayni olmustur. Kültür ortami, 20 dakika 4000g'de santriûijlenmistir, akabinde Tris- NaCl içinde diyalize maruz birakilmistir ve 0,5 ml/dakikalik bir hizda immünoafinite kolonu üzerine yüklenmistir. Geriye kalan adimlar, plazmaya yönelik alinanlar ile ayni olmustur. Amino asit sübstitüsyonu 338Asp ile F IX, in vitro mutagenez ve ifade teknikleri yoluyla elde edilmistir. Hücre kültürü içinde ifade düzeyinin, mutasyona ugramamis rekombinant FIX (normal molekül) ile elde edilebilir düzeye benzer oldugu bulunmustur. Spesifik olarak mutasyona ugramamis rekombinant FlX°in ifade düzeyi, 750 ile 880 ng/ml arasinda olurken 338Asp amino asit sübstitüsyonu ile rekombinant faktörü IX için düzey 650 ila 740 ng/ml arasinda olmustur. 02084-P-0001 Örnek 10 - 338Asp mutasyonu ile rekombinant FIX°in FIX bakimindan yetersiz bir plazmanin yeninden yapilmasindan sonra FIX aktivitesi ve antijen düzeyleri (Referans Örnek) Örnek 9 ile uygun olarak elde edilen rekombinant FIX aktivitesinin analizine yönelik olarak ayni sistem, örnegin normal insan plazmasi içinde, (diger bir deyisle 5 lig/ml) (normalin %lOO°üne karsilik gelir) (tig = mikrogram) normal FIX konsantrasyonunu yenilemek üzere bir miktar mutasyona ugramis rekombinant FIX (rFIX 338Asp) ile FIX bakimindan yetersiz bir plazmasinin yeniden olusturulmasindan sonra kullanilmistir. Rekombinant faktör IX aktivitesinin ve antijenlerinin ölçümleri sirasiyla %460 ve %98 olmustur. Bu durum, bu sekilde elde edilen rekombinant proteinin (FIX 338 Asp), normal faktör IX"ten en az 5 kez daha büyük bir biyolojik aktiviteye sahip oldugunu gösterir. Örnek 11 - FIX"in SDS-PAGE ve Immünoblotlanmasi (Referans Örnek) FIX"in SDS-PAGE ve immünoblotlanmasi (Western blot), standart prosedürlere göre %5-15"lik lineer bir gradyan jeli üzerinde gerçeklestirilmistir. Kisaca normal FIX veya rekombinant FIX içeren numuneler, poliakrilamid jel gözleri içine yüklenmistir ve elektroforeze tabi tutulmustur. FIX akabinde, yari kuru bir aparat (Novablot, GE-Healthcare, Milan, Italya) kullanilarak bir poliviniliden florit (PVDF) üzerinde transblotlamaya tabi tutulmustur. FIX, HRP,ye konjüge edilen bir anti-FlX monoklonal antikoru (Affinity Biologicals, Ontario, Kanada) kullanilarak transblotlamadan sonra PVDF membrani üzerinde saptanmistir. 02084-P-0001 338Asp rekombinant F IX ve normal F IX, ayni elektroforetik inobiliteyi ve ayni immünoblot modelini sergiler. Bu nedenle, normal insan FlX`i ile 338Asp rekombinant FIX'i arasinda önemli hiçbir fark (niceliksel veya niteliksel), bu teknik kullanilarak bulunmamistir. Önceden açiklanandan, pozisyon 338,e karsilik gelen bir pozisyonda bir Aspartik asidin varliginin sasirtici sekilde, neredeyse sekiz kat FIX polipeptidinin aktivitesini arttirdigi anlasilirdir. Mevcut örnek, in vivo insanda artan bir koagülasyon aktivitesi disinda herhangi bir yan etkiye neden olmayan bir modifiyeli FIX polipeptidi saglamasi nedeniyle teknigin durumu üzerinde belirli bir gelisme oldugunu kanitlar. FIX,in in vitro mutagenezi, ifadesi ve satlastirilmasi (Referans Örnek) Yere spesifik mutagenez, pozisyon 34099"da guanin yerine bir adeninin yerlestirilmesi yoluyla Kunkel (Kunkel T A. Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection; Proc Natl Acad Sci USA 1985, 82: 488-492) tarafindan açiklanan standart tekniklere göre gerçeklestirilmistir (mutagenez ayrica, pozisyon 34099,da guanin yerine bir adenin ve pozisyon 34100'de adenin yerine bir guaninin yerlestirilmesi yoluyla tekrar edilmistir). cDNA"nin dizilenmesi, mutasyonun dogru oldugu ve herhangi bir yeni mutasyonun uygulanmadigina dair teminata yönelik gerçeklestirilmistir. Rekombinant FlXsin ifadesi, literatürde halihazirda rapor edilen "insan embriyonik böbrek hücre hatti 293" ve yöntemler kullanilarak elde edilmistir (Chang JL, Jin JP, Lollar P, et al. Changing residue 338 in human factor IX from arginine to alanine causes an increase in catalytic activity. J. Biol. Chem. immünoafinite kolonu araciligiyla üst fazdan (kültür ortami) izole edilmistir. Kisaca hücre kültürünün üst fazi, l 0 gün her 24 saat toplanmistir ve -20°C"de 02084-P-0001 korunmustur. Saflastirmaya yönelik olarak üst faz çözülmüstür ve benzainid ve EDTA, sirasiyla 5 miliMol ve 4 miliMol olan nihai bir konsantrasyona eklenmistir. Bir Millipore filtre içinden filtrelemeden sonra üst faz, 4°C9de 12 saat hizli akisli Sefaroz Q ile inkübe edilmistir. Reçine akabinde. Tris, NaCl ve benzamid tamponu içinde tekrar ekilibre edilmistir ve kolon üzerine yüklenmistir. Elüzyon, 0-60 nM,lik bir kalsiyum gradyani ile gerçeklestirilmistir. Eluat akabinde bir Tris-NaCI tamponu içinde diyalize edilmistir. Preparat akabinde, örnek 2,de açiklanan yöntem takip edilecek immünoafinite kolonuna uygulanmistir (rekombinant proteinin "in vitro" ifadesinde). Kültür ortamindan baslayarak prosedür, BaCI kullanan çökeltme prosedürü disinda plazmaya yönelik ile ayni olmustur. Kültür ortami, 20 dakika 4000g°de santrifüjlenmistir, akabinde Tris-NaCI içinde diyalize maruz birakilmistir ve 0,5 ml/dakikalik bir hizda immünoafinite kolonu üzerine yüklenmistir. Geriye kalan adimlar, plazmaya yönelik alinanlar ile ayni olmustur. Amino asit sübstitüsyonu 33 8Gln ile F IX, in vitro mutagenez ve ifade teknikleri yoluyla elde edilmistir. Hücre kültürü içinde ifade düzeyinin, mutasyona ugramamis rekombinant FIX (normal molekül) ile elde edilebilir düzeye benzer oldugu bulunmustur. Spesifik olarak mutasyona ugrainamis rekombinant FlX"in ifade düzeyi, 750 ile 880 ng/ml arasinda olurken 338Gln amino asit sübstitüsyonu ile rekoinbinant faktörü IX için düzey 600 ila 720 ng/ml arasinda olmustur. Örnek 13 - 338Gln mutasyonu ile rekombinant FIX ile FIX bakimindan yetersiz bir plazmanin yeninden yapilmasindan s0nra FIX aktivite ve antijen düzeyleri (Referans Örnek) Örnek 12 ile uygun olarak elde edilen rekombinant FIX aktivitesinin analizine yönelik olarak ayni sistem, örnegin normal insan plazmasi içinde, (diger bir deyisle 5 tig/ml) (normalin %100"üne karsilik gelir) (ug = mikrogram) normal FIX konsantrasyonunu yenilemek üzere bir miktar mutasyona ugramis rekombinant FIX (rFIX 338Gln) ile FIX bakimindan yetersiz bir plazmasinin 02084-P-0001 yeniden olusturulmasindan sonra kullanilmistir. Rekombinant faktör lX aktivitesinin ve antijenlerinin ölçümleri sirasiyla %1360 ve %99 olmustur. Bu durum, bu sekilde elde edilen rekombinant proteinin (FIX 338 Gln) normal faktör lX"ten en az 13 kez daha büyük bir biyolojik aktiviteye sahip oldugunu gösterir. Örnek 14 - FIX,in SDS-PAGE ve Immünoblotlanmasi (Referans Örnek) FIXiin SDS-PAGE ve immünoblotlanmasi (Western blot), standart prosedürlere göre %5-15,lik lineer bir gradyan jeli üzerinde gerçeklestirilmistir. Kisaca normal FIX veya rekombinant FIX içeren numuneler, poliakrilamid jel gözleri içine yüklenmistir ve elektroforeze tabi tutulmustur. FIX akabinde, yari kuru bir aparat (Novablot, GE-Healthcare, Milan, Italya) kullanilarak bir poliviniliden florit (PVDF) üzerinde transblotlamaya tabi tutulmustur. FIX, HRPsye konjüge edilen bir anti-FIX monoklonal antikoru (Affinity Biologicals, Ontario, Kanada) kullanilarak transblotlamadan sonra PVDF membrani üzerinde saptanmistir. 338G1n rekombinant FIX ve normal FIX, ayni elektroforetik mobiliteyi ve ayni immünoblot modelini sergilemistir. Bu nedenle, normal insan FIX,i ile 338Gln rekombinant FIX,i arasinda önemli hiçbir fark (niceliksel veya niteliksel), bu teknik kullanilarak bulunmamistir. Önceden açiklanandan, pozisyon 338,6 karsilik gelen bir pozisyonda bir glutaminin varliginin sasirtici sekilde, neredeyse sekiz kat FlX polipeptidinin aktivitesini arttirdigi anlasilirdir. Mevcut örnek, i'n vi'vo insanlarda artan bir koagülasyon aktivitesi disinda herhangi bir yan etkiye neden olmayan bir modifiyeli F IX polipeptidi saglamasi nedeniyle teknigin durumu üzerinde belirli bir gelisme oldugunu kanitlar. Bu nedenle asagidakilere dair kanit saglanir: 1) FIX dogal susuna kiyasla 8-9 kat artan bir islevsel aktivite ile dogal olarak meydana gelen F IX mutanti (arginin 338 lösin) kesfedilmistir; 2) FIX dogal susuna kiyasla sirasiyla 5 kat (FIX arginin 338 aspartik asit), 8 islevsel (prokoagülant) aktivite ile rekombinant modifiyeli FIX polipeptidi (önceden bilindik degildir) olusturulabilir. FIX dogal susu ile kiyasla 5 kat veya üzeri ve özellikler 8 ila 9 kat olan bu tür spesifik bir islevsel aktiviteyi gösteren bulusun mutantlarinin kullanimi, tibbi kullanima yönelik ve özellikle Hemofil B hastalarinin profilaksisi ve tedavisine yöneliktir; bulusun mutantlarinin söz konusu kullanimi, önceden hiç göz önünde bulundurulmamistir ve mevcut bulusun parçasidir. Hemofil B hastalarinin gen terapisine yönelik FIX dogal susu ile kiyasla 5 kat veya üzeri ve özellikler 8 ila 9 kat olan bu tür spesifik bir islevsel aktiviteyi gösteren bulusun mutantlarinin kullanimi, önceden hiç göz önünde bulundurulmamistir ve mevcut bulusun parçasidir. Hemofil B disinda hemorajik koagülopatilerin profilaksisi ve tedavisine yönelik veya bu tür hastaliklarin gen terapisine yönelik FIX dogal susu ile kiyasla 5 kat veya üzeri ve özellikler 8 ila 9 kat olan bu tür spesifik bir islevsel aktiviteyi gösteren bulusun mutantlarinin kullanimi, önceden hiç göz önünde bulundurulmamistir ve mevcut bulusun parçasidir. FIX dogal susuna kiyasla 5 kat veya üzeri olan spesifik islevsel bir aktivite gösteren bulusun ve özellikle 8 ila 9 kat artan islevsel aktivite gösteren FlX arginin 338 lösinin mutantlarinin kullaniminin, nötralize edici antikorlari olusturmayan insanlardaki (önceden hiç açiklanmamistir) Özdes dogal olarak meydana gelen bir mutantin varligindan dolayi hemofil B7li hastalarin tedavisine yönelik optimal olarak düsünüldügü belirtilmelidir. Ek olarak, FIX arginin 338 lösin tarafindan ifade edilen FIX islevsel aktivite düzeyleri inuhtemelen, FlX arginin 338 alaninin düzeyinden (önceden bilinmistir ve aktivitede bakimindan F IX dogal susunkinden 2 ila 3 katlik az miktardaki bir artis ile açiklanmistir) daha yüksek olan ve hemofil B hastalarinda ve diger hemorajik koagülopatilere sahip hastalarda trombotik komplikasyonlara neden olmak üzere oldukça yüksek olmayan en iyi opsiyondur. FIX arginin 338 lösin ayrica, Hemofil B7nin tedavisine (kismen düzeltme) yönelik yöntemin fiili etkililigi ve verimi göz önünde bulunduruldugunda viral vektörler kullanilarak gen terapisinde FIX mutantlarinin kullanimina yönelik en iyi seçimdir. TR TR TR TR TR TR TR TR TR