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TW202126284A - 慢病毒載體配製物 - Google Patents

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TW202126284A
TW202126284A TW109134248A TW109134248A TW202126284A TW 202126284 A TW202126284 A TW 202126284A TW 109134248 A TW109134248 A TW 109134248A TW 109134248 A TW109134248 A TW 109134248A TW 202126284 A TW202126284 A TW 202126284A
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TW
Taiwan
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poloxamer
lentiviral vector
formulation
certain embodiments
seq
Prior art date
Application number
TW109134248A
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English (en)
Inventor
安德魯 克羅奇
伊西卓 札拉加
Original Assignee
美商百歐維拉提夫治療公司
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Publication date
Application filed by 美商百歐維拉提夫治療公司 filed Critical 美商百歐維拉提夫治療公司
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Abstract

本文提供了慢病毒載體（LV）配製物和包含此類LV配製物的醫藥組合物，其具有改善的穩定性並且適於全身性投予。本文還提供了使用LV配製物的全身性投予來治療障礙，尤其是血液障礙的方法。

Description

慢病毒載體配製物
本公開文本涉及用於治療疾病的重組慢病毒載體（LV）的配製物和相關藥物產品。具體地，本發明涉及改善LV穩定性和品質，同時還適用於全身性和其他類型投予至受試者以治療疾病（包括出血障礙，如A型血友病和B型血友病）的配製物。
慢病毒載體（LV）和其他病毒載體是用於基因療法的有吸引力的工具（Thomas等人, 2003）。LV可以轉導眾多種組織，包括非分裂細胞，如肝細胞、神經元和造血幹細胞。此外，LV可以整合到靶細胞基因組中並提供長期的基因轉殖表現。
基因療法和疫苗開發領域中的一項持續挑戰是產生無毒的液體配製物，所述液體配製物能夠使LV在更長的時間段內保持結構穩定和生物學活性，並且能承受如攪拌、冷凍/解凍和在一定溫度範圍下儲存的條件。已經觀察到隨著冷凍/解凍循環增加和在較高溫度下的儲存，LV滴度以雙相方式降低（Kigashikawa和Chang 2001, Virology 280, 124-131）。為了使基因療法最有效，希望使慢病毒載體維持其生物學活性或效力。
LV的生物學活性取決於至少由以下組成的封閉結構的構造完整性：(a) 核心多核苷酸，(b) 圍繞核心多核苷酸的互連衣殼蛋白的外殼，和 (c) 圍繞互連衣殼蛋白的外殼的嵌入糖蛋白的脂質膜。與有機和無機藥物不同，LV是高度複雜的生物結構，並且較小的化學或物理應力源可導致封閉結構的結構完整性劣化。此類應力源包括容積滲透壓莫耳濃度、緩衝液、pH、粘度、電解質、攪拌和溫度波動。LV的結構或構造完整性與其生物學活性或效力直接相關。因此，LV可能由於物理不穩定性（包括變性、可溶性和不溶性聚集、沈澱和吸附）以及化學不穩定性（包括水解、脫醯胺和氧化）而失去效力。這些劣化類型中的任一種都可能導致生物學活性降低，並且還可能潛在地導致形成具有增加的毒性和/或改變的免疫原性的副產物或衍生物。因此，良好的LV配製物不僅對於確保合理的貯存期限至關重要，而且對於確保在投予至受試者（如經由全身性投予）後的降低的毒性也是至關重要的。尋找穩定化LV以產生穩健的配製物（其中LV在寬範圍的條件下均是穩定的）需要對緩衝液類型、pH和賦形劑進行精確優化。對於測試的每組條件，需要經由不同的實驗方法測量LV的穩定性。因此，鑒於所有可能變化的因素，尋找用於配製LV的最佳條件是具有挑戰性的，並且良好配製物的組成是先驗不可預測的。
因此，業內需要製備適於投予至受試者並且通過在一定條件範圍下保持LV的數量、結構完整性和效力來改善LV穩定性的配製物。在本文中，我們公開了在各種條件下展示出改善的LV穩定性並且適於全身性投予至受試者的配製物。
本公開文本是基於意料不到的發現，即當將LV懸浮在媒劑中時，可以實現具有改善的穩定性的慢病毒載體（LV）配製物，所述媒劑包含無TRIS緩衝系統（例如磷酸鹽或組胺酸緩衝液）與碳水化合物（例如蔗糖）、表面活性劑（例如泊洛沙姆或聚山梨醇酯）和鹽（例如NaCl或其他氯化物鹽）的組合。表面活性劑（例如泊洛沙姆）對LV穩定性的貢獻是令人驚訝的，因為在業內已知表面活性劑會使脂質膜結合的顆粒不穩定。以下觀察結果也令人驚訝：在約6.0至約7.5的pH範圍內（例如6.5的pH）的LV配製物改善了LV穩定性，而不是使LV表面蛋白（例如衣殼蛋白和VSV-G蛋白）不穩定和促進LV解體或分解。此外，本公開文本證明，本公開文本的LV配製物特別適於全身性投予（例如靜脈內投予）至受試者。
在一方面，本公開文本提供了重組慢病毒載體製劑，所述重組慢病毒載體製劑包含： (a) 治療有效劑量的重組慢病毒載體；(b) 無TRIS緩衝系統；(c) 鹽；(d) 表面活性劑；和 (e) 碳水化合物，其中所述醫藥組合物適於全身性投予至人類患者。
在某些實施例中，所述慢病毒載體包含編碼VSV-G或其片段的核苷酸序列。
在某些實施例中，所述緩衝系統包括磷酸鹽緩衝液。
在某些實施例中，所述磷酸鹽緩衝液的濃度在5 mM與30 mM之間。
在某些實施例中，所述磷酸鹽緩衝液的濃度為約10至約20 mM、約10至約15 mM、約20至約30 mM、約20至約25 mM或約15至約20 mM。
在某些實施例中，所述鹽的濃度在80 mM與150 mM之間。
在某些實施例中，所述鹽的濃度為約100 mM、約110 mM、約130 mM或約150 mM。
在某些實施例中，所述鹽是氯化物鹽。
在某些實施例中，所述氯化物鹽是NaCl。
在某些實施例中，所述表面活性劑是泊洛沙姆。
在某些實施例中，所述泊洛沙姆選自泊洛沙姆101（P101）、泊洛沙姆105（P105）、泊洛沙姆108（P108）、泊洛沙姆122（P122）、泊洛沙姆123（P123）、泊洛沙姆124（P124）、泊洛沙姆181（P181）、泊洛沙姆182（P182）、泊洛沙姆183（P183）、泊洛沙姆184（P184）、泊洛沙姆185（P185）、泊洛沙姆188（P188）、泊洛沙姆212（P212）、泊洛沙姆215（P215）、泊洛沙姆217（P217）、泊洛沙姆231（P231）、泊洛沙姆234（P234）、泊洛沙姆235（P235）、泊洛沙姆237（P237）、泊洛沙姆238（P238）、泊洛沙姆282（P282）、泊洛沙姆284（P284）、泊洛沙姆288（P288）、泊洛沙姆331（P331）、泊洛沙姆333（P333）、泊洛沙姆334（P334）、泊洛沙姆335（P335）、泊洛沙姆338（P338）、泊洛沙姆401（P401）、泊洛沙姆402（P402）、泊洛沙姆403（P403）、泊洛沙姆407（P407）及其組合。
在某些實施例中，所述泊洛沙姆是泊洛沙姆188（P188）。
在某些實施例中，所述泊洛沙姆是泊洛沙姆407（P407）。
在某些實施例中，表面活性劑是聚山梨醇酯。
在某些實施例中，所述聚山梨醇酯選自聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯80及其組合。
在某些實施例中，所述表面活性劑的濃度在0.01%（w/v）與0.1%（w/v）之間。
在某些實施例中，所述表面活性劑的濃度為約0.03%（w/v）、約0.05%（w/v）、約0.07%（w/v）或約0.09%（w/v）。
在某些實施例中，所述碳水化合物的濃度在0.5%（w/v）與5%（w/v）之間。
在某些實施例中，所述碳水化合物的濃度為約1%（w/v）、約2%（w/v）、約3%（w/v）或約4%（w/v）。
在某些實施例中，所述碳水化合物是蔗糖。
在某些實施例中，所述緩衝系統或所述製劑的pH在6.0與8.0之間。
在某些實施例中，所述pH在6.0與7.0之間。
在某些實施例中，所述pH為約6.5。
在某些實施例中，所述pH為約7.0至約8.0。
在某些實施例中，所述pH為約7.3。
在一方面，本發明涉及重組慢病毒載體製劑，所述重組慢病毒載體製劑包含： (a) 治療有效劑量的重組慢病毒載體；(b) 組胺酸緩衝系統；(c) 鹽；(d) 表面活性劑；和 (e) 碳水化合物，其中所述醫藥組合物適於全身性投予至人類患者。
在某些實施例中，所述慢病毒載體包含編碼VSV-G或其片段的核苷酸序列。
在某些實施例中，所述組胺酸緩衝液的濃度在5 mM與30 mM之間。
在某些實施例中，所述組胺酸緩衝液的濃度為約10至約20 mM、約10至約15 mM、約20至約30 mM、約20至約25 mM或約15至約20 mM。
在某些實施例中，鹽的濃度在80 mM與150 mM之間。
在某些實施例中，所述鹽的濃度為約100 mM、約110 mM、約130 mM或約150 mM。
在某些實施例中，所述鹽是氯化物鹽。
在某些實施例中，所述氯化物鹽是NaCl。
在某些實施例中，所述表面活性劑是泊洛沙姆。
在某些實施例中，所述泊洛沙姆選自泊洛沙姆101（P101）、泊洛沙姆105（P105）、泊洛沙姆108（P108）、泊洛沙姆122（P122）、泊洛沙姆123（P123）、泊洛沙姆124（P124）、泊洛沙姆181（P181）、泊洛沙姆182（P182）、泊洛沙姆183（P183）、泊洛沙姆184（P184）、泊洛沙姆185（P185）、泊洛沙姆188（P188）、泊洛沙姆212（P212）、泊洛沙姆215（P215）、泊洛沙姆217（P217）、泊洛沙姆231（P231）、泊洛沙姆234（P234）、泊洛沙姆235（P235）、泊洛沙姆237（P237）、泊洛沙姆238（P238）、泊洛沙姆282（P282）、泊洛沙姆284（P284）、泊洛沙姆288（P288）、泊洛沙姆331（P331）、泊洛沙姆333（P333）、泊洛沙姆334（P334）、泊洛沙姆335（P335）、泊洛沙姆338（P338）、泊洛沙姆401（P401）、泊洛沙姆402（P402）、泊洛沙姆403（P403）、泊洛沙姆407（P407）及其組合。
在某些實施例中，所述泊洛沙姆是泊洛沙姆188（P188）。
在某些實施例中，所述泊洛沙姆是泊洛沙姆407（P407）。
在某些實施例中，表面活性劑是聚山梨醇酯。
在某些實施例中，所述聚山梨醇酯選自聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯80及其組合。
在某些實施例中，所述表面活性劑的濃度在0.01%（w/v）與0.1%（w/v）之間。
在某些實施例中，所述表面活性劑的濃度為約0.03%（w/v）、約0.05%（w/v）、約0.07%（w/v）或約0.09%（w/v）。
在某些實施例中，所述碳水化合物的濃度在0.5%（w/v）與5%（w/v）之間。
在某些實施例中，所述碳水化合物的濃度為約1%（w/v）、約2%（w/v）、約3%（w/v）或約4%（w/v）。
在某些實施例中，所述碳水化合物是蔗糖。
在某些實施例中，所述緩衝系統或所述製劑的pH在6.0與8.0之間。
在某些實施例中，所述pH在6.0與7.0之間。
在某些實施例中，所述pH為約6.5。
在某些實施例中，所述pH為約7.0至約8.0。
在某些實施例中，所述pH為約7.3。
在一方面，本發明涉及重組慢病毒載體製劑，所述重組慢病毒載體製劑包含：(a) 治療有效劑量的重組慢病毒載體；(b) 磷酸鹽緩衝系統；(c) 鹽；(d) 表面活性劑；和 (e) 碳水化合物，其中所述醫藥組合物適於全身性投予至人類患者。
在某些實施例中，所述慢病毒載體包含編碼VSV-G或其片段的核苷酸序列。
在某些實施例中，所述磷酸鹽緩衝液的濃度在5 mM與30 mM之間。
在某些實施例中，所述磷酸鹽緩衝液的濃度為約10至約20 mM、約10至約15 mM、約20至約30 mM、約20至約25 mM或約15至約20 mM。
在某些實施例中，所述鹽的濃度在80 mM與150 mM之間。
在某些實施例中，所述鹽的濃度為約100 mM、約110 mM、約130 mM或約150 mM。
在某些實施例中，所述鹽是氯化物鹽。
在某些實施例中，所述氯化物鹽是NaCl。
在某些實施例中，所述表面活性劑是泊洛沙姆。
在某些實施例中，所述泊洛沙姆選自泊洛沙姆101（P101）、泊洛沙姆105（P105）、泊洛沙姆108（P108）、泊洛沙姆122（P122）、泊洛沙姆123（P123）、泊洛沙姆124（P124）、泊洛沙姆181（P181）、泊洛沙姆182（P182）、泊洛沙姆183（P183）、泊洛沙姆184（P184）、泊洛沙姆185（P185）、泊洛沙姆188（P188）、泊洛沙姆212（P212）、泊洛沙姆215（P215）、泊洛沙姆217（P217）、泊洛沙姆231（P231）、泊洛沙姆234（P234）、泊洛沙姆235（P235）、泊洛沙姆237（P237）、泊洛沙姆238（P238）、泊洛沙姆282（P282）、泊洛沙姆284（P284）、泊洛沙姆288（P288）、泊洛沙姆331（P331）、泊洛沙姆333（P333）、泊洛沙姆334（P334）、泊洛沙姆335（P335）、泊洛沙姆338（P338）、泊洛沙姆401（P401）、泊洛沙姆402（P402）、泊洛沙姆403（P403）、泊洛沙姆407（P407）及其組合。
在某些實施例中，所述泊洛沙姆是泊洛沙姆188（P188）。
在某些實施例中，所述泊洛沙姆是泊洛沙姆407（P407）。
在某些實施例中，表面活性劑是聚山梨醇酯。
在某些實施例中，所述聚山梨醇酯選自聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯80及其組合。
在某些實施例中，所述表面活性劑的濃度在0.01%（w/v）與0.1%（w/v）之間。
在某些實施例中，所述表面活性劑的濃度為約0.03%（w/v）、約0.05%（w/v）、約0.07%（w/v）或約0.09%（w/v）。
在某些實施例中，所述碳水化合物的濃度在0.5%（w/v）與5%（w/v）之間。
在某些實施例中，所述碳水化合物的濃度為約1%（w/v）、約2%（w/v）、約3%（w/v）或約4%（w/v）。
在某些實施例中，所述碳水化合物是蔗糖。
在某些實施例中，所述緩衝系統或所述製劑的pH在6.0與8.0之間。
在某些實施例中，所述pH在6.0與7.0之間。
在某些實施例中，所述pH為約6.5。
在某些實施例中，所述pH為約7.0至約8.0。
在某些實施例中，所述pH為約7.3。
在某些實施例中，所述重組慢病毒載體進一步包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2所示的因子VIII（FVIII）編碼序列至少80%相同的核苷酸序列。
在某些實施例中，所述重組慢病毒載體進一步包含SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2所示的因子VIII（FVIII）編碼序列。
在某些實施例中，所述重組慢病毒載體進一步包含與SEQ ID NO: 3所示的因子IX（FIX）編碼序列至少80%相同的核苷酸序列。
在某些實施例中，所述重組慢病毒載體進一步包含SEQ ID NO: 3所示的因子IX（FIX）編碼序列。
在某些實施例中，所述重組慢病毒載體進一步包含增強型運甲狀腺素蛋白（ET）啟動子。
在某些實施例中，所述重組慢病毒載體進一步包含與SEQ ID NO: 7所示的miR-142的靶序列至少90%相同的核苷酸序列。
在某些實施例中，所述重組慢病毒載體從選自以下的轉染宿主細胞中分離：CHO細胞、HEK293細胞、BHK21細胞、PER.C6細胞、NSO細胞和CAP細胞。
在某些實施例中，所述宿主細胞是CD47陽性宿主細胞。
在一方面，本發明涉及治療患有障礙的人類患者的方法，其中向所述人類患者投予重組慢病毒載體製劑，所述重組慢病毒載體製劑包含：(a) 治療有效劑量的重組慢病毒載體；(b) 無TRIS緩衝系統；(c) 鹽；(d) 表面活性劑；和 (e) 碳水化合物，其中所述醫藥組合物適於全身性投予至人類患者。
在某些實施例中，所述製劑全身性投予至所述人類患者。
在某些實施例中，所述製劑是靜脈內投予的。
在某些實施例中，所述障礙是出血障礙。
在某些實施例中，所述出血障礙是A型血友病或B型血友病。
在另一方面，提供了重組慢病毒載體製劑，所述重組慢病毒載體製劑包含：(a) 治療有效劑量的重組慢病毒載體；(b) 無TRIS緩衝系統；(c) 鹽；(d) 表面活性劑；和 (e) 碳水化合物，其中所述緩衝系統或所述製劑的pH為約6.0至約7.5，並且其中所述醫藥組合物適於全身性投予至人類患者。
在某些示例性實施例中，所述慢病毒載體包含編碼VSV-G或其片段的核苷酸序列。
在某些示例性實施例中，所述緩衝系統包括磷酸鹽緩衝液或組胺酸緩衝液。在某些示例性實施例中，所述磷酸鹽緩衝液的濃度為約5 mM至約30 mM。在某些示例性實施例中，所述磷酸鹽緩衝液的濃度為約10 mM至約20 mM、約10 mM至約15 mM、約20 mM至約30 mM、約20 mM至約25 mM、或約15 mM至約20 mM。在某些示例性實施例中，所述組胺酸緩衝液的濃度為約5 mM至約30 mM。在某些示例性實施例中，所述組胺酸緩衝液的濃度為約10 mM至約20 mM、約10 mM至約15 mM、約20 mM至約30 mM、約20 mM至約25 mM、或約15 mM至約20 mM。
在某些示例性實施例中，所述鹽的濃度為約80 mM至約150 mM。在某些示例性實施例中，所述鹽的濃度為約100 mM、約110 mM、約130 mM或約150 mM。在某些示例性實施例中，所述鹽是氯化物鹽。在某些示例性實施例中，所述氯化物鹽是NaCl。
在某些示例性實施例中，所述表面活性劑是泊洛沙姆。在某些示例性實施例中，所述泊洛沙姆選自泊洛沙姆101（P101）、泊洛沙姆105（P105）、泊洛沙姆108（P108）、泊洛沙姆122（P122）、泊洛沙姆123（P123）、泊洛沙姆124（P124）、泊洛沙姆181（P181）、泊洛沙姆182（P182）、泊洛沙姆183（P183）、泊洛沙姆184（P184）、泊洛沙姆185（P185）、泊洛沙姆188（P188）、泊洛沙姆212（P212）、泊洛沙姆215（P215）、泊洛沙姆217（P217）、泊洛沙姆231（P231）、泊洛沙姆234（P234）、泊洛沙姆235（P235）、泊洛沙姆237（P237）、泊洛沙姆238（P238）、泊洛沙姆282（P282）、泊洛沙姆284（P284）、泊洛沙姆288（P288）、泊洛沙姆331（P331）、泊洛沙姆333（P333）、泊洛沙姆334（P334）、泊洛沙姆335（P335）、泊洛沙姆338（P338）、泊洛沙姆401（P401）、泊洛沙姆402（P402）、泊洛沙姆403（P403）、泊洛沙姆407（P407）及其組合。在某些示例性實施例中，所述泊洛沙姆是泊洛沙姆188（P188）。在某些示例性實施例中，所述泊洛沙姆是泊洛沙姆407（P407）。
在某些示例性實施例中，所述表面活性劑是聚山梨醇酯。在某些示例性實施例中，所述聚山梨醇酯選自聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯80及其組合。在某些示例性實施例中，所述表面活性劑的濃度為約0.01%（w/v）至約0.1%（w/v）。在某些示例性實施例中，所述表面活性劑的濃度為約0.03%（w/v）、約0.05%（w/v）、約0.07%（w/v）或約0.09%（w/v）。
在某些示例性實施例中，所述碳水化合物的濃度為約0.5%（w/v）至約5%（w/v）。在某些示例性實施例中，所述碳水化合物的濃度為約1%（w/v）、約2%（w/v）、約3%（w/v）或約4%（w/v）。在某些示例性實施例中，所述碳水化合物是蔗糖。
在某些示例性實施例中，所述製劑包含：(a) 治療有效劑量的重組慢病毒載體；(b) 約10 mM磷酸鹽；(c) 約100 mM氯化鈉；(d) 約0.05%（w/v）泊洛沙姆188；和 (e) 約3%（w/v）蔗糖，其中所述製劑的pH為約7.3，並且其中所述醫藥組合物適於全身性投予至人類患者。
在某些示例性實施例中，所述製劑包含：(a) 治療有效劑量的重組慢病毒載體；(b) 約10 mM磷酸鹽；(c) 約130 mM氯化鈉；(d) 約0.05%（w/v）泊洛沙姆188；和 (e) 約1%（w/v）蔗糖，其中所述製劑的pH為約7.3，並且其中所述醫藥組合物適於全身性投予至人類患者。
在某些示例性實施例中，所述製劑包含：(a) 治療有效劑量的重組慢病毒載體；(b) 約20 mM組胺酸；(c) 約100 mM氯化鈉；(d) 約0.05%（w/v）泊洛沙姆188；和 (e) 約3%（w/v）蔗糖，其中所述製劑的pH為約6.5，並且其中所述醫藥組合物適於全身性投予至人類患者。
在某些示例性實施例中，所述製劑包含：(a) 治療有效劑量的重組慢病毒載體；(b) 約10 mM磷酸鹽；(c) 約100 mM氯化鈉；(d) 約0.05%（w/v）泊洛沙姆188；和 (e) 約3%（w/v）蔗糖，其中所述製劑的pH為約7.0，並且其中所述醫藥組合物適於全身性投予至人類患者。
在某些示例性實施例中，所述製劑包含：(a) 治療有效劑量的重組慢病毒載體；(b) 約20 mM組胺酸；(c) 約100 mM氯化鈉；(d) 約0.05%（w/v）泊洛沙姆188；和 (e) 約3%（w/v）蔗糖，其中所述製劑的pH為約7.0，並且其中所述醫藥組合物適於全身性投予至人類患者。
在某些示例性實施例中，所述重組慢病毒載體包含核酸，所述核酸包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2所示的因子VIII（FVIII）編碼序列至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%相同的核苷酸序列。在某些示例性實施例中，所述重組慢病毒載體包含核酸，所述核酸包含SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2所示的因子VIII（FVIII）編碼序列。在某些示例性實施例中，所述重組慢病毒載體包含核酸，所述核酸由SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2所示的因子VIII（FVIII）編碼序列組成。
在某些示例性實施例中，所述重組慢病毒載體包含核酸，所述核酸包含與SEQ ID NO: 3所示的因子IX（FIX）編碼序列至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%相同的核苷酸序列。在某些示例性實施例中，所述重組慢病毒載體包含核酸，所述核酸包含SEQ ID NO: 3所示的因子IX（FIX）編碼序列。在某些示例性實施例中，所述重組慢病毒載體包含核酸，所述核酸由SEQ ID NO: 3所示的因子IX（FIX）編碼序列組成。
在某些示例性實施例中，所述重組慢病毒載體包含增強型運甲狀腺素蛋白（ET）啟動子。
在某些示例性實施例中，所述重組慢病毒載體進一步包含與SEQ ID NO: 7所示的miR-142的靶序列至少90%相同的核苷酸序列。
在某些示例性實施例中，所述重組慢病毒載體從選自以下的轉染宿主細胞中分離：CHO細胞、HEK293細胞、BHK21細胞、PER.C6細胞、NSO細胞和CAP細胞。在某些示例性實施例中，所述宿主細胞是CD47陽性宿主細胞。
在另一方面，提供了治療患有障礙的人類患者的方法，所述方法包括向所述人類患者投予本文所述的重組慢病毒載體製劑。
在某些示例性實施例中，所述製劑全身性投予至所述人類患者。在某些示例性實施例中，所述製劑是靜脈內投予的。
在某些示例性實施例中，所述障礙是出血障礙。在某些示例性實施例中，所述出血障礙是A型血友病或B型血友病。
相關申請的交叉引用
本申請要求於2019年9月30日提交的美國臨時專利申請序號62/908,390的優先權，將其公開內容通過引用以其整體特此併入。 序列表
本申請含有已經以ASCII格式電子提交並且通過引用以其整體特此併入的序列表。在2020年9月28日創建的所述ASCII副本命名為“709718_SA9-472PC_SeqList_ST25.txt”並且大小為104,426位元組。
本公開文本尤其提供了慢病毒載體（LV）（包括重組LV）的製劑（配製物）和醫藥組合物。本公開文本還提供了使用LV製劑治療患有障礙（包括出血障礙如A型血友病或B型血友病）的受試者的方法。本公開文本進一步提供了用於生產LV製劑的方法。
通常，關於本文所述的細胞和組織培養、分子生物學、生物物理學、免疫學、微生物學、遺傳學以及蛋白質和核酸化學所使用的術語是業內熟知且常用的。除非另有指示，否則本文提供的方法和技術通常是根據業內熟知並且如本說明書通篇引用和討論的各個通用和更具體參考文獻中所述的常規方法來進行。酶反應和純化方法是根據製造商說明書來進行，如業內通常所完成的或如本文所述。關於本文所述的分析化學、合成有機化學以及醫藥和藥物化學的術語以及實驗室程式和技術是業內熟知且常用的。使用標準技術進行化學合成、化學分析、藥物製備、配製和遞送，以及患者的治療。
除非本文中另有定義，否則本文中所用的科學和技術術語具有業內一般技術者一般理解的含義。如果存在任何可能的歧義，本文提供的定義優先於任何字典或外部定義。除非上下文另有要求，否則單數術語應包括複數，並且複數術語應包括單數。除非另外陳述，否則「或」的使用意指「和/或」。術語「包括（including）」以及其他形式如「包括（includes）」和「包括（included）」的使用是非限制性的。
為了可以更容易理解本發明，首先定義某些術語。
如本文所用，術語「載體」是指用於將核酸克隆和/或轉移到宿主細胞中的任何媒劑。載體可以是複製子，另一核酸區段可以與其連接以實現所連接區段的複製。「複製子」是指在體內作為自主複製單元（即能夠在其自身控制下複製）起作用的任何遺傳元件（例如質體、噬菌體、粘粒、染色體、病毒）。術語「載體」包括用於體外、離體或體內將核酸引入細胞的病毒載體和非病毒媒劑。很多載體是業內已知且使用的，包括例如質體、修飾的真核病毒或修飾的細菌病毒。通過將適當的多核苷酸片段連接到具有互補粘性末端的選擇載體中，可以完成將多核苷酸插入合適的載體中。
如本文所用，短語「重組慢病毒載體」是指如下載體：其具有足夠慢病毒遺傳信息，以允許在包裝組分分的存在下將RNA基因組包裝到能夠感染靶細胞的病毒顆粒中。靶細胞的感染可包括逆轉錄和整合到靶細胞基因組中。重組慢病毒載體攜帶將由載體遞送至靶細胞中的非病毒編碼序列。重組慢病毒載體在最終靶細胞內無法獨立複製以產生感染性慢病毒顆粒。通常，重組慢病毒載體缺少功能性gag-pol和/或env基因和/或複製所必需的其他基因。本發明的載體可以被構造為分裂-內含子載體。
如本文所用，術語「治療」是指改善或減輕障礙的一種或多種症狀。治療不一定是治癒。
如本文所用，術語「人類患者」是指患有疾病或障礙並且需要針對該疾病或障礙的治療的人類。
如本文所用，短語「全身性投予」是指向受試者開具或投予包含LV的醫藥組合物，使得將LV直接引入到受試者的血流中。全身性投予途徑的例子包括但不限於靜脈內，例如靜脈內注射和靜脈內輸注，例如經由中心靜脈通路。
如本文所用，術語「約」，當關於具體列舉的數值使用時，意指所述值可以與所列舉值相差不超過10%。例如，如本文所用，表述「約100」包括90和100以及它們之間的所有值（例如，90、91、92、93、94、95等）。
A.包含無TRIS緩衝系統的慢病毒載體（LV）的配製物
在一方面，本發明涉及重組慢病毒載體製劑，所述重組慢病毒載體製劑包含：(a) 有效劑量的重組慢病毒載體；(b) 無TRIS緩衝系統；(c) 鹽；(d) 表面活性劑；和 (e) 碳水化合物，其中所述醫藥組合物適於全身性投予至人類患者。在某些實施例中，所述載體包含編碼VSV-G或其片段的核苷酸序列。在某些實施例中，所述緩衝系統的pH為約6.0至約8.0。在某些實施例中，所述緩衝系統的pH為約6.0至約7.5。在某些實施例中，所述緩衝系統的pH為約6.0至約7.0。在某些實施例中，所述緩衝系統的pH為約6.0至約8.0。在某些實施例中，所述緩衝系統的pH為約6.5。在某些實施例中，所述緩衝系統的pH為約7.3。在某些實施例中，所述緩衝系統是磷酸鹽緩衝液或組胺酸緩衝液。在某些實施例中，所述磷酸鹽或組胺酸緩衝液的濃度為約5 mM至約30 mM。在某些實施例中，所述磷酸鹽緩衝液的濃度為約10 mM至約20 mM、約10 mM至約15 mM、約20 mM至約30 mM、約20 mM至約25 mM、或約15 mM至約20 mM。在某些實施例中，所述鹽是氯化物鹽。在某些實施例中，所述氯化物鹽的濃度為約80 mM至約150 mM。在某些實施例中，所述鹽的濃度為約100 mM、約110 mM、約130 mM或約150 mM。在某些實施例中，所述表面活性劑是泊洛沙姆或聚山梨醇酯。在某些實施例中，所述泊洛沙姆或聚山梨醇酯的濃度為約0.01%（w/v）至約0.1%（w/v）。在某些實施例中，所述碳水化合物是蔗糖。在某些實施例中，所述碳水化合物的濃度為約0.5%（w/v）至約5%（w/v）。在某些實施例中，所述氯化物鹽是氯化鈉（NaCl）。在某些實施例中，所述泊洛沙姆選自泊洛沙姆101（P101）、泊洛沙姆105（P105）、泊洛沙姆108（P108）、泊洛沙姆122（P122）、泊洛沙姆123（P123）、泊洛沙姆124（P124）、泊洛沙姆181（P181）、泊洛沙姆182（P182）、泊洛沙姆183（P183）、泊洛沙姆184（P184）、泊洛沙姆185（P185）、泊洛沙姆188（P188）、泊洛沙姆212（P212）、泊洛沙姆215（P215）、泊洛沙姆217（P217）、泊洛沙姆231（P231）、泊洛沙姆234（P234）、泊洛沙姆235（P235）、泊洛沙姆237（P237）、泊洛沙姆238（P238）、泊洛沙姆282（P282）、泊洛沙姆284（P284）、泊洛沙姆288（P288）、泊洛沙姆331（P331）、泊洛沙姆333（P333）、泊洛沙姆334（P334）、泊洛沙姆335（P335）、泊洛沙姆338（P338）、泊洛沙姆401（P401）、泊洛沙姆402（P402）、泊洛沙姆403（P403）、泊洛沙姆407（P407）及其組合。在某些實施例中，所述聚山梨醇酯選自聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯80及其組合。在某些實施例中，所述磷酸鹽或組胺酸緩衝液的pH為約6.1、約6.3、約6.5、約6.7、約6.9、約7.1、約7.3、約7.5、約7.7或約7.9。在某些實施例中，所述磷酸鹽或組胺酸緩衝液的濃度為約10 mM、約15 mM、約20 mM或約25 mM。在某些實施例中，所述氯化物鹽為約100 mM、約110 mM、約130 mM或約150 mM。在某些實施例中，所述泊洛沙姆或聚山梨醇酯的濃度為約0.03%（w/v）、約0.05%（w/v）、約0.07%（w/v）或約0.09%（w/v）。在某些實施例中，所述碳水化合物的濃度為約1%（w/v）、約2%（w/v）、約3%（w/v）或約4%（w/v）。在某些實施例中，所述泊洛沙姆是泊洛沙姆188（P188）。在某些實施例中，所述泊洛沙姆是泊洛沙姆407（P407）。
在某些實施例中，本公開文本提供了重組慢病毒載體製劑，所述重組慢病毒載體製劑包含：(a) 治療有效劑量的重組慢病毒載體；(b) 約10 mM磷酸鹽；(c) 約100 mM氯化鈉；(d) 約0.05%（w/v）泊洛沙姆188；和 (e) 約3%（w/v）蔗糖，其中所述製劑的pH為約7.3，並且其中所述醫藥組合物適於全身性投予至人類患者。
在某些實施例中，本公開文本提供了重組慢病毒載體製劑，所述重組慢病毒載體製劑包含：(a) 治療有效劑量的重組慢病毒載體；(b) 約10 mM磷酸鹽；(c) 約130 mM氯化鈉；(d) 約0.05%（w/v）泊洛沙姆188；和 (e) 約1%（w/v）蔗糖，其中所述製劑的pH為約7.3，並且其中所述醫藥組合物適於全身性投予至人類患者。
在某些實施例中，本公開文本提供了重組慢病毒載體製劑，所述重組慢病毒載體製劑包含：(a) 治療有效劑量的重組慢病毒載體；(b) 約20 mM組胺酸；(c) 約100 mM氯化鈉；(d) 約0.05%（w/v）泊洛沙姆188；和 (e) 約3%（w/v）蔗糖，其中所述製劑的pH為約6.5，並且其中所述醫藥組合物適於全身性投予至人類患者。
在某些實施例中，本公開文本提供了重組慢病毒載體製劑，所述重組慢病毒載體製劑包含：(a) 治療有效劑量的重組慢病毒載體；(b) 約10 mM磷酸鹽；(c) 約100 mM氯化鈉；(d) 約0.05%（w/v）泊洛沙姆188；和 (e) 約3%（w/v）蔗糖，其中所述製劑的pH為約7.0，並且其中所述醫藥組合物適於全身性投予至人類患者。
在某些實施例中，本公開文本提供了重組慢病毒載體製劑，所述重組慢病毒載體製劑包含：(a) 治療有效劑量的重組慢病毒載體；(b) 約20 mM組胺酸；(c) 約100 mM氯化鈉；(d) 約0.05%（w/v）泊洛沙姆188；和 (e) 約3%（w/v）蔗糖，其中所述製劑的pH為約7.0，並且其中所述醫藥組合物適於全身性投予至人類患者。
A.1.慢病毒載體
慢病毒載體是更大逆轉錄病毒載體組的一部分（Coffin等人(1997) 「Retroviruses」Cold Spring Harbor Laboratory Press 編輯：J M Coffin, S M Hughes, H E Varmus 第758-763頁）。靈長類慢病毒的例子包括：人免疫缺陷病毒（HIV）和猿猴免疫缺陷病毒（SIV）。慢病毒家族與逆轉錄病毒的不同之處在於，慢病毒具有感染分裂細胞和非分裂細胞二者的能力（Lewis等人(1992)；Lewis和Emerman (1994)）。
如本文所用，慢病毒載體是包含至少一個可衍生自慢病毒的組成部分的載體。較佳地，該組成部分參與載體感染細胞、表現基因或複製的生物學機制。在重組慢病毒載體中，可以從病毒中除去複製所必需的一個或多個蛋白質編碼區的至少一部分。這使得病毒載體具有複製缺陷。病毒基因組的部分也可以被基因轉殖代替，從而使載體能夠轉導靶非分裂宿主細胞和/或將其基因組整合到宿主基因組中。
重組慢病毒通常是假型化的。假型化可以賦予一個或多個優點。例如，基於HIV的載體的env基因產物將這些載體限制為僅感染表現稱為CD4的蛋白的細胞。但是，如果這些載體中的env基因已被來自其他RNA病毒的env序列取代，則它們可以具有更寬的感染譜（Verma和Somia (1997)）。水皰性口炎病毒（VSV，一種彈狀病毒）的包膜糖蛋白（G）是已顯示能夠對某些逆轉錄病毒進行假型化的包膜蛋白。假型化VSV-G載體可用於轉導寬範圍的哺乳動物細胞。併入非慢病毒假型化包膜（如VSV-G蛋白）得到這樣的優點：載體顆粒可以被濃縮至高滴度而不損失感染性（Akkina等人(1996) J. Virol.70:2581-5）。慢病毒和逆轉錄病毒包膜蛋白顯然無法承受超速離心過程中的剪切力，這可能是因為它們由兩個非共價連接的亞基組成。亞基之間的相互作用可能被離心破壞。相比之下，VSV糖蛋白由單一單元構成。因此，VSV-G蛋白假型化可以提供潛在的優點。
慢病毒包括牛慢病毒組、馬慢病毒組、貓慢病毒組、綿羊山羊慢病毒組和靈長類慢病毒組的成員。用於基因療法的慢病毒載體的開發已經綜述於Klimatcheva等人(1999) Frontiers in Bioscience 4:481-496中。適於基因療法的慢病毒載體的設計和使用描述例如於美國專利號6,207,455和6,615,782中。慢病毒的例子包括但不限於HIV-1、HIV-2、HIV-1/HIV-2假型、HIV-1/SIV、FIV、山羊關節炎腦炎病毒（CAEV）、馬感染性貧血病毒和牛免疫缺陷病毒。
在一些實施例中，本公開文本的慢病毒載體是「第三代」慢病毒載體。如本文所用，術語「第三代」慢病毒載體是指具有第二代載體系統的特徵，並且進一步缺少功能性tat基因的慢病毒包裝系統，如其中tat基因已經缺失或失活的慢病毒包裝系統。通常，將編碼rev的基因提供於單獨表現構建體上。參見例如，Dull等人(1998) J. Virol.72: 8463-8471。如本文所用，「第二代」慢病毒載體系統是指缺少功能性輔助基因的慢病毒包裝系統，如其中輔助基因vif、vpr、vpu和nef已缺失或失活的慢病毒包裝系統。參見例如，Zufferey等人(1997) Nat. Biotechnol.15:871-875。如本文所用，「包裝系統」是指一系列病毒構建體，其包含編碼參與包裝重組病毒的病毒蛋白的基因。通常，包裝系統的構建體最後將被併入到包裝細胞中。
在一些實施例中，本公開文本的第三代慢病毒載體是自滅活的慢病毒載體。在一些實施例中，慢病毒載體是VSV.G假型慢病毒載體。在一些實施例中，慢病毒載體包含用於基因轉殖表現的肝細胞特異性啟動子。在一些實施例中，肝細胞特異性啟動子是增強型運甲狀腺素蛋白啟動子。在一些實施例中，慢病毒載體包含miR-142的一個或多個靶序列，以減少對基因轉殖產物的免疫反應。在一些實施例中，將miR-142的一個或多個靶序列併入到本公開文本的慢病毒載體中允許期望的基因轉殖表現譜。例如，併入miR-142的一個或多個靶序列可以抑制血管內和血管外造血譜系中的基因轉殖表現，而在非造血細胞中維持基因轉殖表現。在用本公開文本的慢病毒載體系統治療的腫瘤易發小鼠中未檢測到腫瘤發生。參見Brown等人(2007) Blood 110:4144-52；Brown等人(2006) Nat. Ned.12:585-91；和Cantore等人(2015) Sci.Transl.Med.7(277):277ra28。
本公開文本的慢病毒載體包括編碼特定蛋白（如本文所述的FVIII或FIX蛋白）的基因轉殖的密碼子優化多核苷酸。在一個實施例中，FVIII或FIX蛋白的優化編碼序列與表現控制序列可操作地連接。如本文所用，當將兩個核酸序列以允許每個組分核酸序列保留其功能性的方式共價連接時，所述兩個核酸序列是可操作地連接的。當將編碼序列和基因表現控制序列以使編碼序列的表現或轉錄和/或翻譯置於基因表現控制序列的影響或控制下的方式共價連接時，稱所述編碼序列和基因表現控制序列是可操作連接的。如果在5'基因表現序列中啟動子的誘導導致編碼序列的轉錄，並且如果兩個DNA序列之間的連線性質沒有 (1) 導致引入移碼突變，(2) 干擾啟動子區引導編碼序列轉錄的能力，或 (3) 干擾相應的RNA轉錄物翻譯成蛋白質的能力，則稱所述兩個DNA序列是可操作連接的。因此，如果基因表現序列能夠實現編碼核酸序列的轉錄，由此使得所得的轉錄物被翻譯成所需的蛋白質或多肽，則所述基因表現序列將是與該編碼核酸序列可操作地連接的。
在某些實施例中，慢病毒載體是能夠感染非分裂細胞的重組慢病毒的載體。在某些實施例中，慢病毒載體是能夠感染肝臟細胞（例如，肝細胞）的重組慢病毒的載體。慢病毒基因組和原病毒DNA通常具有在逆轉錄病毒中發現的三個基因：gag，pol和env，其側接有兩個長末端重複（LTR）序列。gag基因編碼內部結構（基質、衣殼和核衣殼）蛋白；pol基因編碼RNA引導的DNA聚合酶（逆轉錄酶）、蛋白酶和整合酶；並且env基因編碼病毒包膜糖蛋白。5'和3' LTR用於促進病毒體RNA的轉錄和聚腺苷酸化。LTR含有病毒複製所必需的所有其他順式作用序列。慢病毒具有另外的基因，包括vif、vpr、tat、rev、vpu、nef和vpx（在HIV-1、HIV-2和/或SIV中）。
與5'LTR相鄰的是基因組逆轉錄（tRNA引子結合位點）和將病毒RNA有效衣殼化為顆粒（Psi位點）所必需的序列。如果衣殼化（或將逆轉錄病毒RNA包裝成感染性病毒體）所必需的序列從病毒基因組中缺失，則順式缺陷會阻止基因組RNA的衣殼化。
然而，所得的突變體仍然能夠引導所有病毒體蛋白的合成。本公開文本提供了產生能夠感染非分裂細胞的重組慢病毒的方法，所述方法包括用兩種或更多種攜帶包裝功能（即gag、pol和env以及rev和tat）的載體轉染合適的宿主細胞。如下文將公開的，缺少功能性tat基因的載體對於某些應用是期望的。因此，例如，第一載體可提供編碼病毒gag和病毒pol的核酸，並且另一載體可提供編碼病毒env的核酸以產生包裝細胞。將提供異源基因的載體（在本文中被鑒定為轉移載體）引入到該包裝細胞中產生生產細胞，其釋放攜帶目的外源基因的感染性病毒顆粒。
根據載體和外源基因的上述構型，第二載體可提供編碼病毒包膜（env）基因的核酸。env基因可源自幾乎任何合適的病毒，包括逆轉錄病毒。在一些實施例中，env蛋白是雙嗜性包膜蛋白，其允許轉導人和其他物種的細胞。
逆轉錄病毒來源的env基因的例子包括但不限於：莫洛尼鼠白血病病毒（MoMuLV或MMLV）、哈威鼠肉瘤病毒（HaMuSV或HSV）、鼠乳腺腫瘤病毒（MuMTV或MMTV）、長臂猿白血病病毒（GaLV或GALV）、人免疫缺陷病毒（HIV）和勞斯肉瘤病毒（RSV）。也可以使用其他env基因，如水泡性口炎病毒（VSV）蛋白G（VSV-G）、肝炎病毒的env基因和流感病毒的env基因。在一些實施例中，病毒env核酸序列與本文其他地方所述的調節序列可操作地締合。在某些實施例中，本公開文本的配製緩衝液賦予慢病毒穩定性並提供長期冷凍儲存，特別是對於包含VSV-G的慢病毒。本發明的配製緩衝液在冷凍和解凍以及暴露於升高的溫度時提供增強的慢病毒穩定性，特別是對於包含VSV-G的慢病毒。
在某些實施例中，慢病毒載體缺失HIV毒力基因env、vif、vpr、vpu和nef，而不損害載體轉導非分裂細胞的能力。在一些實施例中，慢病毒載體包含3'LTR的U3區的缺失。U3區的缺失可以是完全缺失或部分缺失。
在一些實施例中，包含本文所述的FVIII核苷酸序列的本公開文本的慢病毒載體可以在細胞中用以下來轉染：(a) 包括gag、pol或gag和pol基因的第一核苷酸序列和 (b) 包括異源env基因的第二核苷酸序列；其中慢病毒載體缺少功能性tat基因。在其他實施例中，將細胞進一步用包括rev基因的第四核苷酸序列轉染。在某些實施例中，慢病毒載體缺少選自vif、vpr、vpu、vpx和nef或其組合的功能性基因。
在某些實施例中，本公開文本的慢病毒載體包含一個或多個編碼gag蛋白、Rev響應元件、中央聚嘌呤區（cPPT）或其任何組合的核苷酸序列。
在一些實施例中，慢病毒載體在其表面上表現一種或多種改善慢病毒載體或編碼的FVIII多肽的靶向和/或活性的多肽。一種或多種多肽可以由慢病毒載體編碼，或者可以在慢病毒載體從宿主細胞中出芽的過程中被併入。在慢病毒產生期間，病毒顆粒從生產宿主細胞中出芽。在出芽過程中，病毒顆粒帶有脂質包衣，所述脂質包衣源自宿主細胞的脂質包衣。因此，病毒顆粒的脂質包衣可包括先前存在於宿主細胞表面上的膜結合多肽。
在一些實施例中，慢病毒載體在其表面上表現一種或多種多肽，所述一種或多種多肽在投予至人受試者後抑制對慢病毒載體的免疫反應。在一些實施例中，慢病毒載體的表面包含一個或多個CD47分子。CD47是一種「自身標記」蛋白，其在人細胞上遍在表現。CD47的表面表現通過CD47與巨噬細胞表現的SIRPα的相互作用抑制巨噬細胞誘導的對內源性細胞的吞噬作用。表現高水準CD47的細胞在體內不太可能被人巨噬細胞靶向和破壞。
在一些實施例中，慢病毒載體在其表面上包含高濃度的CD47多肽分子。在一些實施例中，慢病毒載體在具有高表現水準的CD47的細胞系中產生。在某些實施例中，慢病毒載體在CD47高 細胞中產生，其中所述細胞在細胞膜上具有高的CD47表現。在特定的實施例中，慢病毒載體在CD47高 HEK 293T細胞中產生，其中HEK 293T在細胞膜上具有高的CD47表現。在一些實施例中，將HEK 293T細胞修飾為相對於未修飾的HEK 293T細胞具有增加的CD47表現。在某些實施例中，CD47是人CD47。
在一些實施例中，慢病毒載體幾乎沒有或沒有主要組織相容性複合物I類（MHC-I）的表面表現。表面表現的MHC-I展示來自細胞內的「非自身」蛋白的肽片段，如指示感染的蛋白片段，從而促進了針對細胞的免疫反應。在一些實施例中，慢病毒載體在MHC-I低 細胞中產生，其中所述細胞在細胞膜上具有降低的MHC-I表現。在一些實施例中，慢病毒載體在MHC-I- （或「MHC-I無 」、「MHC-1陰性 」或「MHC-陰性」）細胞中產生，其中所述細胞缺少MHC-I的表現。
在特定的實施例中，慢病毒載體包含脂質包衣，所述脂質包衣包含高濃度的CD47多肽並且缺少MHC-I多肽。在某些實施例中，慢病毒載體在CD47高 /MHC-I低 細胞系，例如CD47高 /MHC-I低 HEK 293T細胞系中產生。在一些實施例中，慢病毒載體在CD47高 /MHC-I無 細胞系，例如CD47高 /MHC-I無 HEK 293T細胞系中產生。
慢病毒載體的例子披露於美國專利號9,050,269和國際公開號WO9931251、WO9712622、WO9817815、WO9817816和WO9818934中，將所述專利通過引用以其整體併入本文。
在一些實施例中，本公開文本提供了包含分離的核酸分子的慢病毒載體，所述分離的核酸分子包含包括表1中所示的核苷酸序列的核苷酸序列。
表1：序列
SEQ ID NO 描述 序列
1 FVIII編碼序列 ATGCAGATTGAGCTGTCCACTTGTTTCTTCCTGTGCCTCCTGCGCTTCTGTTTCTCCGCCACTCGCCGGTACTACCTTGGAGCCGTGGAGCTTTCATGGGACTACATGCAGAGCGACCTGGGCGAACTCCCCGTGGATGCCAGATTCCCCCCCCGCGTGCCAAAGTCCTTCCCCTTTAACACCTCCGTGGTGTACAAGAAAACCCTCTTTGTCGAGTTCACTGACCACCTGTTCAACATCGCCAAGCCGCGCCCACCTTGGATGGGCCTCCTGGGACCGACCATTCAAGCTGAAGTGTACGACACCGTGGTGATCACCCTGAAGAACATGGCGTCCCACCCCGTGTCCCTGCATGCGGTCGGAGTGTCCTACTGGAAGGCCTCCGAAGGAGCTGAGTACGACGACCAGACTAGCCAGCGGGAAAAGGAGGACGATAAAGTGTTCCCGGGCGGCTCGCATACTTACGTGTGGCAAGTCCTGAAGGAAAACGGACCTATGGCATCCGATCCTCTGTGCCTGACTTACTCCTACCTTTCCCATGTGGACCTCGTGAAGGACCTGAACAGCGGGCTGATTGGTGCACTTCTCGTGTGCCGCGAAGGTTCGCTCGCTAAGGAAAAGACCCAGACCCTCCATAAGTTCATCCTTTTGTTCGCTGTGTTCGATGAAGGAAAGTCATGGCATTCCGAAACTAAGAACTCGCTGATGCAGGACCGGGATGCCGCCTCAGCCCGCGCCTGGCCTAAAATGCATACAGTCAACGGATACGTGAATCGGTCACTGCCCGGGCTCATCGGTTGTCACAGAAAGTCCGTGTACTGGCACGTCATCGGCATGGGCACTACGCCTGAAGTGCACTCCATCTTCCTGGAAGGGCACACCTTCCTCGTGCGCAACCACCGCCAGGCCTCTCTGGAAATCTCCCCGATTACCTTTCTGACCGCCCAGACTCTGCTCATGGACCTGGGGCAGTTCCTTCTCTTCTGCCACATCTCCAGCCATCAGCACGACGGAATGGAGGCCTACGTGAAGGTGGACTCATGCCCGGAAGAACCTCAGTTGCGGATGAAGAACAACGAGGAGGCCGAGGACTATGACGACGATTTGACTGACTCCGAGATGGACGTCGTGCGGTTCGATGACGACAACAGCCCCAGCTTCATCCAGATTCGCAGCGTGGCCAAGAAGCACCCCAAAACCTGGGTGCACTACATCGCGGCCGAGGAAGAAGATTGGGACTACGCCCCGTTGGTGCTGGCACCCGATGACCGGTCGTACAAGTCCCAGTATCTGAACAATGGTCCGCAGCGGATTGGCAGAAAGTACAAGAAAGTGCGGTTCATGGCGTACACTGACGAAACGTTTAAGACCCGGGAGGCCATTCAACATGAGAGCGGCATTCTGGGACCACTGCTGTACGGAGAGGTCGGCGATACCCTGCTCATCATCTTCAAAAACCAGGCCTCCCGGCCTTACAACATCTACCCTCACGGAATCACCGACGTGCGGCCACTCTACTCGCGGCGCCTGCCGAAGGGCGTCAAGCACCTGAAAGACTTCCCTATCCTGCCGGGCGAAATCTTCAAGTATAAGTGGACCGTCACCGTGGAGGACGGGCCCACCAAGAGCGATCCTAGGTGTCTGACTCGGTACTACTCCAGCTTCGTGAACATGGAACGGGACCTGGCATCGGGACTCATTGGACCGCTGCTGATCTGCTACAAAGAGTCGGTGGATCAACGCGGCAACCAGATCATGTCCGACAAGCGCAACGTGATCCTGTTCTCCGTGTTTGATGAAAACAGATCCTGGTACCTCACTGAAAACATCCAGAGGTTCCTCCCAAACCCCGCAGGAGTGCAACTGGAGGACCCTGAGTTTCAGGCCTCGAATATCATGCACTCGATTAACGGTTACGTGTTCGACTCGCTGCAGCTGAGCGTGTGCCTCCATGAAGTCGCTTACTGGTACATTCTGTCCATCGGCGCCCAGACTGACTTCCTGAGCGTGTTCTTTTCCGGTTACACCTTTAAGCACAAGATGGTGTACGAAGATACCCTGACCCTGTTCCCTTTCTCCGGCGAAACGGTGTTCATGTCGATGGAGAACCCGGGTCTGTGGATTCTGGGATGCCACAACAGCGACTTTCGGAACCGCGGAATGACTGCCCTGCTGAAGGTGTCCTCATGCGACAAGAACACCGGAGACTACTACGAGGACTCCTACGAGGATATCTCAGCCTACCTCCTGTCCAAGAACAACGCGATCGAGCCGCGCAGCTTCAGCCAGAACCCGCCTGTGCTGAAGAGGCACCAGCGAGAAATTACCCGGACCACCCTCCAATCGGATCAGGAGGAAATCGACTACGACGACACCATCTCGGTGGAAATGAAGAAGGAAGATTTCGATATCTACGACGAGGACGAAAATCAGTCCCCTCGCTCATTCCAAAAGAAAACTAGACACTACTTTATCGCCGCGGTGGAAAGACTGTGGGACTATGGAATGTCATCCAGCCCTCACGTCCTTCGGAACCGGGCCCAGAGCGGATCGGTGCCTCAGTTCAAGAAAGTGGTGTTCCAGGAGTTCACCGACGGCAGCTTCACCCAGCCGCTGTACCGGGGAGAACTGAACGAACACCTGGGCCTGCTCGGTCCCTACATCCGCGCGGAAGTGGAGGATAACATCATGGTGACCTTCCGTAACCAAGCATCCAGACCTTACTCCTTCTATTCCTCCCTGATCTCATACGAGGAGGACCAGCGCCAAGGCGCCGAGCCCCGCAAGAACTTCGTCAAGCCCAACGAGACTAAGACCTACTTCTGGAAGGTCCAACACCATATGGCCCCGACCAAGGATGAGTTTGACTGCAAGGCCTGGGCCTACTTCTCCGACGTGGACCTTGAGAAGGATGTCCATTCCGGCCTGATCGGGCCGCTGCTCGTGTGTCACACCAACACCCTGAACCCAGCGCATGGACGCCAGGTCACCGTCCAGGAGTTTGCTCTGTTCTTCACCATTTTTGACGAAACTAAGTCCTGGTACTTCACCGAGAATATGGAGCGAAACTGTAGAGCGCCCTGCAATATCCAGATGGAAGATCCGACTTTCAAGGAGAACTATAGATTCCACGCCATCAACGGGTACATCATGGATACTCTGCCGGGGCTGGTCATGGCCCAGGATCAGAGGATTCGGTGGTACTTGCTGTCAATGGGATCGAACGAAAACATTCACTCCATTCACTTCTCCGGTCACGTGTTCACTGTGCGCAAGAAGGAGGAGTACAAGATGGCGCTGTACAATCTGTACCCCGGGGTGTTCGAAACTGTGGAGATGCTGCCGTCCAAGGCCGGCATCTGGAGAGTGGAGTGCCTGATCGGAGAGCACCTCCACGCGGGGATGTCCACCCTCTTCCTGGTGTACTCGAATAAGTGCCAGACCCCGCTGGGCATGGCCTCGGGCCACATCAGAGACTTCCAGATCACAGCAAGCGGACAATACGGCCAATGGGCGCCGAAGCTGGCCCGCTTGCACTACTCCGGATCGATCAACGCATGGTCCACCAAGGAACCGTTCTCGTGGATTAAGGTGGACCTCCTGGCCCCTATGATTATCCACGGAATTAAGACCCAGGGCGCCAGGCAGAAGTTCTCCTCCCTGTACATCTCGCAATTCATCATCATGTACAGCCTGGACGGGAAGAAGTGGCAGACTTACAGGGGAAACTCCACCGGCACCCTGATGGTCTTTTTCGGCAACGTGGATTCCTCCGGCATTAAGCACAACATCTTCAACCCACCGATCATAGCCAGATATATTAGGCTCCACCCCACTCACTACTCAATCCGCTCAACTCTTCGGATGGAACTCATGGGGTGCGACCTGAACTCCTGCTCCATGCCGTTGGGGATGGAATCAAAGGCTATTAGCGACGCCCAGATCACCGCGAGCTCCTACTTCACTAACATGTTCGCCACCTGGAGCCCCTCCAAGGCCAGGCTGCACTTGCAGGGACGGTCAAATGCCTGGCGGCCGCAAGTGAACAATCCGAAGGAATGGCTTCAAGTGGATTTCCAAAAGACCATGAAAGTGACCGGAGTCACCACCCAGGGAGTGAAGTCCCTTCTGACCTCGATGTATGTGAAGGAGTTCCTGATTAGCAGCAGCCAGGACGGGCACCAGTGGACCCTGTTCTTCCAAAACGGAAAGGTCAAGGTGTTCCAGGGGAACCAGGACTCGTTCACACCCGTGGTGAACTCCCTGGACCCCCCACTGCTGACGCGGTACTTGAGGATTCATCCTCAGTCCTGGGTCCATCAGATTGCATTGCGAATGGAAGTCCTGGGCTGCGAGGCCCAGGACCTGTAC
2 包含 XTEN 的FVIII編碼序列(XTEN以粗體和底線表示) ATGCAGATTGAGCTGTCCACTTGTTTCTTCCTGTGCCTCCTGCGCTTCTGTTTCTCCGCCACTCGCCGGTACTACCTTGGAGCCGTGGAGCTTTCATGGGACTACATGCAGAGCGACCTGGGCGAACTCCCCGTGGATGCCAGATTCCCCCCCCGCGTGCCAAAGTCCTTCCCCTTTAACACCTCCGTGGTGTACAAGAAAACCCTCTTTGTCGAGTTCACTGACCACCTGTTCAACATCGCCAAGCCGCGCCCACCTTGGATGGGCCTCCTGGGACCGACCATTCAAGCTGAAGTGTACGACACCGTGGTGATCACCCTGAAGAACATGGCGTCCCACCCCGTGTCCCTGCATGCGGTCGGAGTGTCCTACTGGAAGGCCTCCGAAGGAGCTGAGTACGACGACCAGACTAGCCAGCGGGAAAAGGAGGACGATAAAGTGTTCCCGGGCGGCTCGCATACTTACGTGTGGCAAGTCCTGAAGGAAAACGGACCTATGGCATCCGATCCTCTGTGCCTGACTTACTCCTACCTTTCCCATGTGGACCTCGTGAAGGACCTGAACAGCGGGCTGATTGGTGCACTTCTCGTGTGCCGCGAAGGTTCGCTCGCTAAGGAAAAGACCCAGACCCTCCATAAGTTCATCCTTTTGTTCGCTGTGTTCGATGAAGGAAAGTCATGGCATTCCGAAACTAAGAACTCGCTGATGCAGGACCGGGATGCCGCCTCAGCCCGCGCCTGGCCTAAAATGCATACAGTCAACGGATACGTGAATCGGTCACTGCCCGGGCTCATCGGTTGTCACAGAAAGTCCGTGTACTGGCACGTCATCGGCATGGGCACTACGCCTGAAGTGCACTCCATCTTCCTGGAAGGGCACACCTTCCTCGTGCGCAACCACCGCCAGGCCTCTCTGGAAATCTCCCCGATTACCTTTCTGACCGCCCAGACTCTGCTCATGGACCTGGGGCAGTTCCTTCTCTTCTGCCACATCTCCAGCCATCAGCACGACGGAATGGAGGCCTACGTGAAGGTGGACTCATGCCCGGAAGAACCTCAGTTGCGGATGAAGAACAACGAGGAGGCCGAGGACTATGACGACGATTTGACTGACTCCGAGATGGACGTCGTGCGGTTCGATGACGACAACAGCCCCAGCTTCATCCAGATTCGCAGCGTGGCCAAGAAGCACCCCAAAACCTGGGTGCACTACATCGCGGCCGAGGAAGAAGATTGGGACTACGCCCCGTTGGTGCTGGCACCCGATGACCGGTCGTACAAGTCCCAGTATCTGAACAATGGTCCGCAGCGGATTGGCAGAAAGTACAAGAAAGTGCGGTTCATGGCGTACACTGACGAAACGTTTAAGACCCGGGAGGCCATTCAACATGAGAGCGGCATTCTGGGACCACTGCTGTACGGAGAGGTCGGCGATACCCTGCTCATCATCTTCAAAAACCAGGCCTCCCGGCCTTACAACATCTACCCTCACGGAATCACCGACGTGCGGCCACTCTACTCGCGGCGCCTGCCGAAGGGCGTCAAGCACCTGAAAGACTTCCCTATCCTGCCGGGCGAAATCTTCAAGTATAAGTGGACCGTCACCGTGGAGGACGGGCCCACCAAGAGCGATCCTAGGTGTCTGACTCGGTACTACTCCAGCTTCGTGAACATGGAACGGGACCTGGCATCGGGACTCATTGGACCGCTGCTGATCTGCTACAAAGAGTCGGTGGATCAACGCGGCAACCAGATCATGTCCGACAAGCGCAACGTGATCCTGTTCTCCGTGTTTGATGAAAACAGATCCTGGTACCTCACTGAAAACATCCAGAGGTTCCTCCCAAACCCCGCAGGAGTGCAACTGGAGGACCCTGAGTTTCAGGCCTCGAATATCATGCACTCGATTAACGGTTACGTGTTCGACTCGCTGCAGCTGAGCGTGTGCCTCCATGAAGTCGCTTACTGGTACATTCTGTCCATCGGCGCCCAGACTGACTTCCTGAGCGTGTTCTTTTCCGGTTACACCTTTAAGCACAAGATGGTGTACGAAGATACCCTGACCCTGTTCCCTTTCTCCGGCGAAACGGTGTTCATGTCGATGGAGAACCCGGGTCTGTGGATTCTGGGATGCCACAACAGCGACTTTCGGAACCGCGGAATGACTGCCCTGCTGAAGGTGTCCTCATGCGACAAGAACACCGGAGACTACTACGAGGACTCCTACGAGGATATCTCAGCCTACCTCCTGTCCAAGAACAACGCGATCGAGCCGCGCAGCTTCAGCCAGAAC ACATCAGAGAGCGCCACCCCTGAAAGTGGTCCCGGGAGCGAGCCAGCCACATCTGGGTCGGAAACGCCAGGCACAAGTGAGTCTGCAACTCCCGAGTCCGGACCTGGCTCCGAGCCTGCCACTAGCGGCTCCGAGACTCCGGGAACTTCCGAGAGCGCTACACCAGAAAGCGGACCCGGAACCAGTACCGAACCTAGCGAGGGCTCTGCTCCGGGCAGCCCAGCCGGCTCTCCTACATCCACGGAGGAGGGCACTTCCGAATCCGCCACCCCGGAGTCAGGGCCAGGATCTGAACCCGCTACCTCAGGCAGTGAGACGCCAGGAACGAGCGAGTCCGCTACACCGGAGAGTGGGCCAGGGAGCCCTGCTGGATCTCCTACGTCCACTGAGGAAGGGTCACCAGCGGGCTCGCCCACCAGCACTGAAGAAGGTGCCTCGAGC CCGCCTGTGCTGAAGAGGCACCAGCGAGAAATTACCCGGACCACCCTCCAATCGGATCAGGAGGAAATCGACTACGACGACACCATCTCGGTGGAAATGAAGAAGGAAGATTTCGATATCTACGACGAGGACGAAAATCAGTCCCCTCGCTCATTCCAAAAGAAAACTAGACACTACTTTATCGCCGCGGTGGAAAGACTGTGGGACTATGGAATGTCATCCAGCCCTCACGTCCTTCGGAACCGGGCCCAGAGCGGATCGGTGCCTCAGTTCAAGAAAGTGGTGTTCCAGGAGTTCACCGACGGCAGCTTCACCCAGCCGCTGTACCGGGGAGAACTGAACGAACACCTGGGCCTGCTCGGTCCCTACATCCGCGCGGAAGTGGAGGATAACATCATGGTGACCTTCCGTAACCAAGCATCCAGACCTTACTCCTTCTATTCCTCCCTGATCTCATACGAGGAGGACCAGCGCCAAGGCGCCGAGCCCCGCAAGAACTTCGTCAAGCCCAACGAGACTAAGACCTACTTCTGGAAGGTCCAACACCATATGGCCCCGACCAAGGATGAGTTTGACTGCAAGGCCTGGGCCTACTTCTCCGACGTGGACCTTGAGAAGGATGTCCATTCCGGCCTGATCGGGCCGCTGCTCGTGTGTCACACCAACACCCTGAACCCAGCGCATGGACGCCAGGTCACCGTCCAGGAGTTTGCTCTGTTCTTCACCATTTTTGACGAAACTAAGTCCTGGTACTTCACCGAGAATATGGAGCGAAACTGTAGAGCGCCCTGCAATATCCAGATGGAAGATCCGACTTTCAAGGAGAACTATAGATTCCACGCCATCAACGGGTACATCATGGATACTCTGCCGGGGCTGGTCATGGCCCAGGATCAGAGGATTCGGTGGTACTTGCTGTCAATGGGATCGAACGAAAACATTCACTCCATTCACTTCTCCGGTCACGTGTTCACTGTGCGCAAGAAGGAGGAGTACAAGATGGCGCTGTACAATCTGTACCCCGGGGTGTTCGAAACTGTGGAGATGCTGCCGTCCAAGGCCGGCATCTGGAGAGTGGAGTGCCTGATCGGAGAGCACCTCCACGCGGGGATGTCCACCCTCTTCCTGGTGTACTCGAATAAGTGCCAGACCCCGCTGGGCATGGCCTCGGGCCACATCAGAGACTTCCAGATCACAGCAAGCGGACAATACGGCCAATGGGCGCCGAAGCTGGCCCGCTTGCACTACTCCGGATCGATCAACGCATGGTCCACCAAGGAACCGTTCTCGTGGATTAAGGTGGACCTCCTGGCCCCTATGATTATCCACGGAATTAAGACCCAGGGCGCCAGGCAGAAGTTCTCCTCCCTGTACATCTCGCAATTCATCATCATGTACAGCCTGGACGGGAAGAAGTGGCAGACTTACAGGGGAAACTCCACCGGCACCCTGATGGTCTTTTTCGGCAACGTGGATTCCTCCGGCATTAAGCACAACATCTTCAACCCACCGATCATAGCCAGATATATTAGGCTCCACCCCACTCACTACTCAATCCGCTCAACTCTTCGGATGGAACTCATGGGGTGCGACCTGAACTCCTGCTCCATGCCGTTGGGGATGGAATCAAAGGCTATTAGCGACGCCCAGATCACCGCGAGCTCCTACTTCACTAACATGTTCGCCACCTGGAGCCCCTCCAAGGCCAGGCTGCACTTGCAGGGACGGTCAAATGCCTGGCGGCCGCAAGTGAACAATCCGAAGGAATGGCTTCAAGTGGATTTCCAAAAGACCATGAAAGTGACCGGAGTCACCACCCAGGGAGTGAAGTCCCTTCTGACCTCGATGTATGTGAAGGAGTTCCTGATTAGCAGCAGCCAGGACGGGCACCAGTGGACCCTGTTCTTCCAAAACGGAAAGGTCAAGGTGTTCCAGGGGAACCAGGACTCGTTCACACCCGTGGTGAACTCCCTGGACCCCCCACTGCTGACGCGGTACTTGAGGATTCATCCTCAGTCCTGGGTCCATCAGATTGCATTGCGAATGGAAGTCCTGGGCTGCGAGGCCCAGGACCTGTAC
3 FIX-R338L編碼序列( 信號肽 以粗體和底線表示) ATGCAGAGAGTCAACATGATTATGGCTGAGTCACCTGGGCTGATTACTATTTGCCTGCTGGGCTACCTGCTGTCCGCCGAGTGTACCGTGTTCCTGGACCATGAGAACGCAAATAAGATCCTGAACAGGCCCAAAAGA TACAATAGTGGGAAGCTGGAGGAATTTGTGCAGGGCAACCTGGAGAGAGAATGCATGGAGGAAAAGTGTAGCTTCGAGGAAGCCCGCGAGGTGTTTGAAAATACAGAGCGAACCACAGAGTTCTGGAAGCAGTATGTGGACGGCGATCAGTGCGAGAGCAACCCCTGTCTGAATGGCGGAAGTTGCAAAGACGATATCAACTCATACGAATGCTGGTGTCCTTTCGGGTTTGAAGGCAAAAATTGCGAGCTGGACGTGACATGTAACATTAAGAATGGACGGTGCGAGCAGTTTTGTAAAAACTCTGCCGATAATAAGGTGGTGTGCAGCTGTACTGAAGGATATCGCCTGGCTGAGAACCAGAAGTCCTGCGAACCAGCAGTGCCCTTCCCTTGTGGGAGGGTGAGCGTCTCCCAGACTTCAAAACTGACCAGAGCAGAGACAGTGTTTCCCGACGTGGATTACGTCAACAGCACTGAGGCCGAAACCATCCTGGACAACATTACTCAGTCTACCCAGAGTTTCAATGACTTTACTCGGGTGGTCGGGGGCGAGGATGCTAAACCAGGCCAGTTCCCCTGGCAGGTGGTCCTGAACGGAAAGGTGGATGCATTTTGCGGAGGGTCTATCGTGAATGAGAAATGGATTGTCACCGCCGCTCACTGCGTGGAAACCGGAGTCAAGATCACAGTGGTCGCTGGGGAGCACAACATTGAGGAAACAGAACATACTGAGCAGAAGCGGAATGTGATCCGCATCATTCCTCACCATAACTACAATGCAGCCATCAACAAATACAATCATGACATTGCCCTGCTGGAACTGGATGAGCCTCTGGTGCTGAACAGCTACGTCACTCCAATCTGCATTGCTGACAAAGAGTATACCAATATCTTCCTGAAGTTTGGATCAGGGTACGTGAGCGGCTGGGGAAGAGTCTTCCACAAGGGCAGGAGCGCCCTGGTGCTCCAGTATCTGCGAGTGCCTCTGGTCGATCGAGCTACCTGTCTGCTCTCTACCAAGTTTACAATCTACAACAACATGTTCTGCGCTGGGTTTCACGAGGGAGGACGAGACTCCTGTCAGGGCGATTCTGGGGGCCCACATGTGACAGAGGTCGAAGGCACCAGCTTCCTGACTGGCATCATTTCCTGGGGAGAGGAATGTGCAATGAAGGGAAAATACGGGATCTACACCAAAGTGAGCCGCTATGTGAACTGGATCAAGGAAAAAACCAAACTGACC
4 成熟的FVIII多肽 ATRRYYLGAVELSWDYMQSDLGELPVDARFPPRVPKSFPFNTSVVYKKTLFVEFTDHLFNIAKPRPPWMGLLGPTIQAEVYDTVVITLKNMASHPVSLHAVGVSYWKASEGAEYDDQTSQREKEDDKVFPGGSHTYVWQVLKENGPMASDPLCLTYSYLSHVDLVKDLNSGLIGALLVCREGSLAKEKTQTLHKFILLFAVFDEGKSWHSETKNSLMQDRDAASARAWPKMHTVNGYVNRSLPGLIGCHRKSVYWHVIGMGTTPEVHSIFLEGHTFLVRNHRQASLEISPITFLTAQTLLMDLGQFLLFCHISSHQHDGMEAYVKVDSCPEEPQLRMKNNEEAEDYDDDLTDSEMDVVRFDDDNSPSFIQIRSVAKKHPKTWVHYIAAEEEDWDYAPLVLAPDDRSYKSQYLNNGPQRIGRKYKKVRFMAYTDETFKTREAIQHESGILGPLLYGEVGDTLLIIFKNQASRPYNIYPHGITDVRPLYSRRLPKGVKHLKDFPILPGEIFKYKWTVTVEDGPTKSDPRCLTRYYSSFVNMERDLASGLIGPLLICYKESVDQRGNQIMSDKRNVILFSVFDENRSWYLTENIQRFLPNPAGVQLEDPEFQASNIMHSINGYVFDSLQLSVCLHEVAYWYILSIGAQTDFLSVFFSGYTFKHKMVYEDTLTLFPFSGETVFMSMENPGLWILGCHNSDFRNRGMTALLKVSSCDKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFSQNSRHPSTRQKQFNATTIPENDIEKTDPWFAHRTPMPKIQNVSSSDLLMLLRQSPTPHGLSLSDLQEAKYETFSDDPSPGAIDSNNSLSEMTHFRPQLHHSGDMVFTPESGLQLRLNEKLGTTAATELKKLDFKVSSTSNNLISTIPSDNLAAGTDNTSSLGPPSMPVHYDSQLDTTLFGKKSSPLTESGGPLSLSEENNDSKLLESGLMNSQESSWGKNVSSTESGRLFKGKRAHGPALLTKDNALFKVSISLLKTNKTSNNSATNRKTHIDGPSLLIENSPSVWQNILESDTEFKKVTPLIHDRMLMDKNATALRLNHMSNKTTSSKNMEMVQQKKEGPIPPDAQNPDMSFFKMLFLPESARWIQRTHGKNSLNSGQGPSPKQLVSLGPEKSVEGQNFLSEKNKVVVGKGEFTKDVGLKEMVFPSSRNLFLTNLDNLHENNTHNQEKKIQEEIEKKETLIQENVVLPQIHTVTGTKNFMKNLFLLSTRQNVEGSYDGAYAPVLQDFRSLNDSTNRTKKHTAHFSKKGEEENLEGLGNQTKQIVEKYACTTRISPNTSQQNFVTQRSKRALKQFRLPLEETELEKRIIVDDTSTQWSKNMKHLTPSTLTQIDYNEKEKGAITQSPLSDCLTRSHSIPQANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLTRVLFQDNSSHLPAASYRKKDSGVQESSHFLQGAKKNNLSLAILTLEMTGDQREVGSLGTSATNSVTYKKVENTVLPKPDLPKTSGKVELLPKVHIYQKDLFPTETSNGSPGHLDLVEGSLLQGTEGAIKWNEANRPGKVPFLRVATESSAKTPSKLLDPLAWDNHYGTQIPKEEWKSQEKSPEKTAFKKKDTILSLNACESNHAIAAINEGQNKPEIEVTWAKQGRTERLCSQNPPVLKRHQREITRTTLQSDQEEIDYDDTISVEMKKEDFDIYDEDENQSPRSFQKKTRHYFIAAVERLWDYGMSSSPHVLRNRAQSGSVPQFKKVVFQEFTDGSFTQPLYRGELNEHLGLLGPYIRAEVEDNIMVTFRNQASRPYSFYSSLISYEEDQRQGAEPRKNFVKPNETKTYFWKVQHHMAPTKDEFDCKAWAYFSDVDLEKDVHSGLIGPLLVCHTNTLNPAHGRQVTVQEFALFFTIFDETKSWYFTENMERNCRAPCNIQMEDPTFKENYRFHAINGYIMDTLPGLVMAQDQRIRWYLLSMGSNENIHSIHFSGHVFTVRKKEEYKMALYNLYPGVFETVEMLPSKAGIWRVECLIGEHLHAGMSTLFLVYSNKCQTPLGMASGHIRDFQITASGQYGQWAPKLARLHYSGSINAWSTKEPFSWIKVDLLAPMIIHGIKTQGARQKFSSLYISQFIIMYSLDGKKWQTYRGNSTGTLMVFFGNVDSSGIKHNIFNPPIIARYIRLHPTHYSIRSTLRMELMGCDLNSCSMPLGMESKAISDAQITASSYFTNMFATWSPSKARLHLQGRSNAWRPQVNNPKEWLQVDFQKTMKVTGVTTQGVKSLLTSMYVKEFLISSSQDGHQWTLFFQNGKVKVFQGNQDSFTPVVNSLDPPLLTRYLRIHPQSWVHQIALRMEVLGCEAQDLY
5 包含 XTEN 的FVIII胺基酸序列(XTEN以粗體和底線表示) MQIELSTCFFLCLLRFCFSATRRYYLGAVELSWDYMQSDLGELPVDARFPPRVPKSFPFNTSVVYKKTLFVEFTDHLFNIAKPRPPWMGLLGPTIQAEVYDTVVITLKNMASHPVSLHAVGVSYWKASEGAEYDDQTSQREKEDDKVFPGGSHTYVWQVLKENGPMASDPLCLTYSYLSHVDLVKDLNSGLIGALLVCREGSLAKEKTQTLHKFILLFAVFDEGKSWHSETKNSLMQDRDAASARAWPKMHTVNGYVNRSLPGLIGCHRKSVYWHVIGMGTTPEVHSIFLEGHTFLVRNHRQASLEISPITFLTAQTLLMDLGQFLLFCHISSHQHDGMEAYVKVDSCPEEPQLRMKNNEEAEDYDDDLTDSEMDVVRFDDDNSPSFIQIRSVAKKHPKTWVHYIAAEEEDWDYAPLVLAPDDRSYKSQYLNNGPQRIGRKYKKVRFMAYTDETFKTREAIQHESGILGPLLYGEVGDTLLIIFKNQASRPYNIYPHGITDVRPLYSRRLPKGVKHLKDFPILPGEIFKYKWTVTVEDGPTKSDPRCLTRYYSSFVNMERDLASGLIGPLLICYKESVDQRGNQIMSDKRNVILFSVFDENRSWYLTENIQRFLPNPAGVQLEDPEFQASNIMHSINGYVFDSLQLSVCLHEVAYWYILSIGAQTDFLSVFFSGYTFKHKMVYEDTLTLFPFSGETVFMSMENPGLWILGCHNSDFRNRGMTALLKVSSCDKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFSQN TSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGASS PPVLKRHQREITRTTLQSDQEEIDYDDTISVEMKKEDFDIYDEDENQSPRSFQKKTRHYFIAAVERLWDYGMSSSPHVLRNRAQSGSVPQFKKVVFQEFTDGSFTQPLYRGELNEHLGLLGPYIRAEVEDNIMVTFRNQASRPYSFYSSLISYEEDQRQGAEPRKNFVKPNETKTYFWKVQHHMAPTKDEFDCKAWAYFSDVDLEKDVHSGLIGPLLVCHTNTLNPAHGRQVTVQEFALFFTIFDETKSWYFTENMERNCRAPCNIQMEDPTFKENYRFHAINGYIMDTLPGLVMAQDQRIRWYLLSMGSNENIHSIHFSGHVFTVRKKEEYKMALYNLYPGVFETVEMLPSKAGIWRVECLIGEHLHAGMSTLFLVYSNKCQTPLGMASGHIRDFQITASGQYGQWAPKLARLHYSGSINAWSTKEPFSWIKVDLLAPMIIHGIKTQGARQKFSSLYISQFIIMYSLDGKKWQTYRGNSTGTLMVFFGNVDSSGIKHNIFNPPIIARYIRLHPTHYSIRSTLRMELMGCDLNSCSMPLGMESKAISDAQITASSYFTNMFATWSPSKARLHLQGRSNAWRPQVNNPKEWLQVDFQKTMKVTGVTTQGVKSLLTSMYVKEFLISSSQDGHQWTLFFQNGKVKVFQGNQDSFTPVVNSLDPPLLTRYLRIHPQSWVHQIALRMEVLGCEAQDLY
6 FIX-R338L胺基酸序列( 信號肽 以粗體和底線表示) MQRVNMIMAESPGLITICLLGYLLSAECTVFLDHENANKILNRPKR YNSGKLEEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQYVDGDQCESNPCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELDVTCNIKNGRCEQFCKNSADNKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQTSKLTRAETVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAKPGQFPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITVVAGEHNIEETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYVTPICIADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDRATCLLSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFLTGIISWGEECAMKGKYGIYTKVSRYVNWIKEKTKLT
7 miR-142的靶序列 tccataaagtaggaaacactaca
當以5x1010 TU/kg或更低、109 TU/kg或更低、或108 TU/kg或更低的劑量投予時，本公開文本的慢病毒載體是治療有效的。在此類劑量下，關於受試者中的基礎水準、相對於投予了對照慢病毒載體的受試者中的水準、相對於投予了對照核酸分子的受試者中的水準、或相對於投予了由對照核酸分子編碼的多肽後的受試者中的水準，本公開文本的慢病毒載體的投予可以導致有需要的受試者中血漿FVIII活性增加至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約11倍、至少約12倍、至少約13倍、至少約14倍、至少約15倍、至少約20倍、至少約25倍、至少約30倍、至少約35倍、至少約40倍、至少約45倍、至少約50倍、至少約55倍、至少約60倍、至少約65倍、至少約70倍、至少約75倍、至少約80倍、至少約85倍、至少約90倍、至少約95倍、至少約100倍、至少約110、至少約120倍、至少約130倍、至少約140倍、至少約150倍、至少約160倍、至少約170倍、至少約180倍、至少約190倍或至少約200倍。
在某些實施例中，有用的是在慢病毒載體內包括一個或多個miRNA靶序列，所述miRNA靶序列例如與基因轉殖，如優化FVIII基因轉殖可操作地連接。因此，本公開文本還提供了至少一個與優化FVIII或優化FIX核苷酸序列可操作地連接或以其他方式插入慢病毒載體內的miRNA序列靶標。慢病毒載體中包括的多於一個拷貝的miRNA靶序列可以增加系統的有效性。
還包括不同miRNA靶序列。例如，表現多於一種基因轉殖的慢病毒載體可以具有在多於一個可以相同或不同的miRNA靶序列控制下的基因轉殖。miRNA靶序列可以是串聯的，但是也包括其他排列。含有miRNA靶序列的基因轉殖表現盒也能以反義定向插入慢病毒載體內。反義定向可用於產生病毒顆粒，以避免原本可能對生產細胞有毒的基因產物的表現。
在其他實施例中，慢病毒載體包含1、2、3、4、5、6、7或8個拷貝的相同或不同的miRNA靶序列。在某些實施例中，慢病毒載體不包括任何miRNA靶序列。是否要包括miRNA靶序列（以及數量）的選擇將依據已知參數如計畫的組織靶標、所需的表現水準等來指導。
在一個實施例中，靶序列是miR-223靶標，已經報導其可在骨髓定向祖細胞中最有效地阻斷表現，以及在更原始的HSPC中至少部分阻斷表現。miR-223靶標可以在分化的髓樣細胞（包括粒細胞、單核細胞、巨噬細胞、髓樣樹突細胞）中阻斷表現。miR-223靶標還可以適於依賴於淋巴或紅細胞譜系中的穩健基因轉殖表現的基因療法應用。miR-223靶標還可以在人HSC中非常有效地阻斷表現。
在另一個實施例中，靶序列是miR142靶標（tccataaagtaggaaacactaca（SEQ ID NO: 7））。在一個實施例中，慢病毒載體包含4個拷貝的miR-142靶序列。在某些實施例中，將造血特異性微小RNA（如miR-142（142T））的互補序列併入慢病毒載體的3'非翻譯區中，使得編碼基因轉殖的轉錄物易發生miRNA介導的下調。通過這種方法，可以在造血譜系抗原呈遞細胞（APC）中防止基因轉殖表現，同時在非造血細胞中維持所述基因轉殖表現（Brown等人, Nat Med 2006）。這種策略可以對基因轉殖表現施加嚴格的轉錄後控制，並且由此使得能夠穩定遞送和長期表現基因轉殖。在一些實施例中，miR-142調節防止經轉導細胞的免疫介導的清除和/或誘導抗原特異性調節T細胞（T reg），並且介導對基因轉殖編碼抗原的穩健的免疫耐受。
在一些實施例中，靶序列是miR181靶標。Chen C-Z和Lodish H, Seminars in Immunology (2005) 17(2):155-165披露了miR-181，它是在小鼠骨髓內的B細胞中特異性表現的miRNA（Chen和Lodish, 2005）。所述文獻還披露，一些人miRNA與白血病相關。
靶序列可以與miRNA完全或部分互補。術語「完全互補」意指，靶序列的核酸序列與識別所述靶序列的miRNA的序列100%互補。術語「部分互補」意指，靶序列與識別所述靶序列的miRNA的序列僅部分互補，借此部分互補的序列仍然被miRNA識別。換句話說，在本公開文本的上下文中，部分互補的靶序列有效識別相應miRNA，並且實現在表現該miRNA的細胞中防止或減少基因轉殖表現。miRNA靶序列的例子描述於以下文獻中：WO 2007/000668、WO 2004/094642、WO 2010/055413或WO 2010/125471，將上述文獻通過引用以其整體併入本文。
A.2.配製物的賦形劑、載劑和其他成分
出於基因療法的目的，慢病毒載體（LV）通常被全身性地投予，即直接進入患者的血流中。因此，產生無毒但仍保持LV的穩定性和效力的LV配製物具有廣泛的意義。在測試媒劑以產生適於全身性投予的LV配製物時，必須牢記某些核心原則。為了確保對投予配製物的受試者的衝擊最小，必須優化pH、離子濃度和容積滲透壓莫耳濃度以匹配生理條件。緩衝液、鹽和碳水化合物的組合（分別用於調節pH、離子濃度和容積滲透壓莫耳濃度）不是可先驗確定的，並且必須通過實驗進行測試。
例如，US20170073702A1披露TSSM媒劑（20 mM TRIS，100 mM NaCl，1%（w/v）蔗糖，1%（w/v）甘露醇，pH 7.3），其可能已經被預測為在對哺乳動物的全身性投予中是無毒的。然而，發現（參見實例2）使用單獨的或與LV組合的TSSM的配製物對小鼠有毒。然而，令人驚訝的是，當使用磷酸鹽媒劑（10 mM磷酸鹽，100 mM NaCl，3%（w/v）蔗糖，0.05%（w/v）P188，pH 7.3）或組胺酸媒劑（20 mM組胺酸，100 mM NaCl，使用3%（w/v）的蔗糖，0.05%（w/v）P188，pH 6.5）時，配製物對小鼠無毒。
因為先驗無法預測，與TSSM配製物相比，具有磷酸鹽媒劑的配製物導致LV的更高穩定性和完整性（實例3和實例4）。意料不到的是，組胺酸媒劑比磷酸鹽媒劑賦予LV更大的穩定性（實例4）。組胺酸配製物的這一關鍵特徵，即與磷酸鹽或TRIS緩衝液的中性pH（pH 7.3）相比，慢病毒載體與媒劑的較低pH（pH 6.5）的相容性至少出於以下原因而令人驚訝。VSV-G包膜蛋白是慢病毒載體的重要組分，其有利於慢病毒載體對細胞的感染性。VSV-G的pI（等電點）為大約5，其意味著隨著溶液的pH接近pI，蛋白質上的電荷變得更中性。隨著蛋白質的電荷變得更中性，它們相互吸引的能力更強，並且這可能導致聚集（劣化機制），從而喪失感染能力。
同樣令人驚訝的是，與TSSM配製物相比，在磷酸鹽和組胺酸配製物中包含表面活性劑泊洛沙姆188（P188）賦予了增加的LV穩定性和完整性。這是意料不到的，因為據預測表面活性劑會使LV的外脂質膜包膜不穩定，從而降低LV的穩定性和完整性。類似地，將甘露醇從配製物中去除將不是先驗明顯的，以產生具有更高LV穩定性和完整性的配製物（實例3和實例4）。
這樣，基於本文所述的發現，發現包含無TRIS緩衝系統的慢病毒載體製劑提供增加的慢病毒載體穩定性和完整性。熟習此項技術者將理解，無TRIS緩衝系統是指不包含TRIS（也稱為三(羥甲基)胺基甲烷、三甲胺或THAM）的任何緩衝系統。在某些實施例中，無TRIS緩衝系統包含磷酸鹽。在某些實施例中，無TRIS緩衝系統包含組胺酸。
在某些實施例中，無TRIS緩衝系統或製劑的pH為約6.0至約8.0。在某些實施例中，無TRIS緩衝系統或製劑的pH為約6.0至約7.5。在某些實施例中，無TRIS緩衝系統或製劑的pH為約6.0至約7.0。在某些實施例中，無TRIS緩衝系統或製劑的pH為約7.0至約8.0。在某些實施例中，無TRIS緩衝系統或製劑的pH為約6.5。在某些實施例中，無TRIS緩衝系統或製劑的pH為約7.3。
熟習此項技術者將能夠確定在本文公開的製劑的無TRIS緩衝系統中使用的合適的緩衝組分，以維持目標pH或目標pH範圍。在某些實施例中，無TRIS緩衝系統包含有效pH緩衝範圍為約6.0至約8.0的緩衝組分。在某些實施例中，無TRIS緩衝系統包含有效pH緩衝範圍為約6.0至約7.5的緩衝組分。在某些實施例中，無TRIS緩衝系統包含有效pH緩衝範圍為約6.0至約7.0的緩衝組分。在某些實施例中，無TRIS緩衝系統包含有效pH緩衝範圍為約7.0至約8.0的緩衝組分。在某些實施例中，無TRIS緩衝系統包含有效pH緩衝範圍可維持6.5的pH的緩衝組分。在某些實施例中，無TRIS緩衝系統包含有效pH緩衝範圍可維持為7.3的pH的緩衝組分。
包含本文公開的慢病毒基因療法載體或本公開文本的宿主細胞（例如，用本文公開的慢病毒基因療法載體靶向的肝細胞）的組合物可以含有合適的醫藥上可接受的載劑。例如，所述組合物可以含有有助於將活性化合物加工成設計用於遞送至作用位點的製劑的賦形劑和/或助劑。
醫藥組合物可以經配製用於通過推注注射進行腸胃外投予（即靜脈內、皮下或肌內）。注射用配製物可以以單位劑型存在，例如在添加有防腐劑的安瓿中或多劑量容器中。組合物可以採取諸如以下等形式：於油性或水性媒劑中的懸浮液、溶液或乳液，並且含有配製劑如懸浮劑、穩定劑和/或分散劑。可替代地，活性成分可以呈粉末形式，用於用合適媒劑（例如，無熱原水）來構造。
適於腸胃外投予的配製物還包括呈水溶性形式（例如，水溶性鹽）的活性化合物的水溶液。另外，可以投予作為適當油性注射懸浮液的活性化合物的懸浮液。適宜親脂溶劑或媒劑包括脂肪油（例如，芝麻油）或合成脂肪酸酯（例如，油酸乙酯或甘油三酯）。水性注射懸浮液可以含有增加懸浮液粘度的物質，包括例如羧甲基纖維素鈉、山梨醇和葡聚糖。任選地，懸浮液還可以含有穩定劑。脂質體還可以用於包封本公開文本的分子，用於遞送至細胞或間質空間中。示例性醫藥上可接受的載劑是生理上相容的溶劑、分散介質、包衣、抗細菌和抗真菌劑、等滲和吸收延遲劑、水、鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水、右旋糖、甘油、乙醇等。在一些實施例中，組合物包含等滲劑，例如糖、多元醇（如甘露醇、山梨醇）或氯化鈉。在其他實施例中，組合物包含增強活性成分的貯存期限或有效性的醫藥上可接受的物質（如潤濕劑）或少量輔助物質（如潤濕或乳化劑、防腐劑或緩衝劑）。
本公開文本的組合物可以呈多種形式，包括例如液體（例如，可注射和可輸注的溶液）、分散體、懸浮液、半固體和固體劑型。較佳形式取決於投予模式和治療應用。
組合物可以配製為溶液、微乳液、分散體、脂質體或其他適於高藥物濃度的有序結構。無菌可注射溶液可以通過以下方式製備：將活性成分以所需量併入視需要具有上文所列舉成分中的一種或組合的適當溶劑中，之後過濾滅菌。通常，分散體是通過以下方式來製備：將活性成分併入無菌媒劑中，所述媒劑含有基礎分散介質和來自上文所列舉的那些成分的所需其他成分。在用於製備無菌可注射溶液的無菌粉末的情況下，較佳製備方法為真空乾燥和冷凍乾燥，所述真空乾燥和冷凍乾燥由先前無菌過濾的溶液產生活性成分和任何另外所需成分的粉末。可以例如通過以下方式維持溶液的適當流動性：通過使用包衣如卵磷脂，在分散體情況下通過維持所需粒徑，以及通過使用表面活性劑。可注射組合物的延長吸收可通過在組合物中包含延遲吸收的藥劑來實現，所述藥劑例如單硬脂酸鹽和明膠。
活性成分可以用受控釋放配製物或裝置來配製。此類配製物和裝置的例子包括植入物、經皮貼劑和微包封遞送系統。可以使用生物可降解的生物相容性聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯和聚乳酸。製備此類配製物和裝置的方法是業內已知的。參見例如，Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson編輯, Marcel Dekker, Inc., 紐約, 1978。
可注射長效配製物可以通過以下方式來製備：形成藥物於生物可降解聚合物（如聚丙交酯-聚乙交酯）中的微包封基質。根據藥物與聚合物的比率以及所採用聚合物的性質，可以控制藥物釋放速率。其他示例性生物可降解聚合物是聚原酸酯和聚酐。可注射長效配製物還可以通過將藥物捕集於脂質體或微乳液中來製備。
可以將補充性活性化合物併入組合物中。在一個實施例中，用另一凝血因子或其變異體、片段、類似物或衍生物配製本公開文本的嵌合蛋白。例如，凝血因子包括但不限於因子V、因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子XI、因子XII、因子XIII、凝血酶原、纖維蛋白原、血管性血友病因子或重組可溶性組織因子（rsTF）或前述任一種的啟動形式。凝血因子或止血劑還可以包括抗纖維蛋白溶藥，例如ε-胺基己酸、胺甲環酸。
可以調節劑量方案以提供最佳所需反應。例如，可以投予單次推注，可以隨時間投予若干次分開劑量，或者可以如治療情況的緊迫性所示成比例地減少或增加劑量。有利的是以劑量單位形式配製腸胃外組合物，以便於劑量的投予和統一。參見例如，Remington's Pharmaceutical Sciences（Mack Pub.Co., 賓夕法尼亞州伊斯頓1980）。
除了活性化合物以外，液體劑型還可以含有惰性成分，如水、乙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲醯胺、油、甘油、四氫糠醇、聚乙二醇和脫水山梨糖醇的脂肪酸酯。
適宜醫藥載劑的非限制性例子也描述於E. W. Martin的Remington's Pharmaceutical Sciences中。賦形劑的一些例子包括澱粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、水稻、麵粉、白堊、矽膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石、氯化鈉、脫脂乳粉、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇等。組合物還可以含有pH緩衝試劑以及潤濕或乳化劑。
對於口服投予，醫藥組合物可以採取通過常規手段製備的片劑或膠囊的形式。還可以將組合物製備為液體，例如糖漿或懸浮液。液體可以包括懸浮劑（例如，山梨醇糖漿、纖維素衍生物或氫化食用脂肪）、乳化劑（卵磷脂或阿拉伯膠）、非水性媒劑（例如，扁桃仁油、油性酯、乙醇或分餾植物油）和防腐劑（例如，對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯或山梨酸）。製劑還可以包括矯味劑、著色劑和甜味劑。可替代地，組合物可以作為幹產物存在，用於用水或另一種適宜媒劑來構造。
對於經頰投予，組合物可以採取根據常規方案的片劑或錠劑的形式。
對於通過吸入投予，根據本公開文本使用的化合物便捷地以含有或不含賦形劑的霧化氣溶膠的形式或以氣溶膠噴霧劑的形式從任選地具有推進劑的加壓包或霧化器遞送，所述推進劑是例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟甲烷、二氧化碳或其他適宜氣體。在加壓氣溶膠的情況下，劑量單位可以通過提供閥以遞送計量量來確定。例如用於吸入器或吹入器中的明膠的膠囊和藥筒可以配製為含有化合物與合適粉末基質（如乳糖或澱粉）的粉末混合物。
醫藥組合物還可以經配製用於作為例如含有常規栓劑基質（如可可脂或其他甘油酯）的栓劑或保留灌腸劑經直腸投予。
在一個實施例中，醫藥組合物包含慢病毒載體和醫藥上可接受的載劑，所述慢病毒載體包含編碼具有因子VIII或因子IX活性的多肽的優化的核酸分子。在另一個實施例中，醫藥組合物包含宿主細胞（例如，肝細胞）和醫藥上可接受的載劑，所述宿主細胞包含慢病毒載體，所述慢病毒載體包含編碼具有因子VIII或因子IX活性的多肽的優化的核酸分子。
在一些實施例中，組合物是通過選自以下的途徑來投予：局部投予、眼內投予、腸胃外投予、鞘內投予、硬膜下投予和口服投予。腸胃外投予可以是靜脈內或皮下投予。
確保治療性配製物從實驗室轉變為具有高且一致品質的可製造且可銷售產品的基本方面是它們在劑型中的穩定性。由於其複雜的化學和結構，蛋白質（如病毒的表面蛋白和衣殼蛋白）易發生各種形式的物理和化學劣化，從而可能損害最終藥物產品的生物學功效和安全性。例如，蛋白質聚集是關鍵的品質屬性，所述品質屬性對於基於蛋白質的產品要定期監測並且對於確定產品貯存期限是關鍵的。從根本上講，蛋白質聚集與蛋白質天然形式的穩定性相關聯，其在非天然細胞（例如非天然哺乳動物細胞）中的生長通常與增加的聚集速率和程度相關聯。因此，毫不奇怪的是，通常通過使用旨在增加蛋白質構象穩定性的賦形劑或配製條件來介導在產品貯存期限期間控制和最小化聚集（動力學穩定性）的嘗試。本質上，目的是使蛋白質穩定處於其天然構象，以使有聚集能力的「非天然」種類的群體最小化。通常使用糖和多元醇（如蔗糖、海藻糖、甘露醇、山梨糖醇等）使蛋白質穩定處於其天然狀態並降低聚集速率。然而，使用這些穩定劑的不希望效應是溶液粘度的濃度依賴性增加。
溶液粘度是蛋白質產品（尤其是在高蛋白質濃度下配製的那些）的關鍵屬性，並且它可能顯著影響產品的效用和成功。產品的可製造性和患者或保健從業者的最終使用與溶液無縫流動的能力緊密相關。例如，高粘度可能需要使用專用投予裝置或方案，所述裝置或方案可能並不總是適合於所需群體，從而限制了產品的使用。在其他情況下，高溶液粘度可能需要應用可能對蛋白質的穩定性產生負面影響的製造技術（例如高溫處理）。因此，通常在高蛋白質濃度的溶液中採用降粘賦形劑（如鹽和胺基酸）。然而，這些賦形劑可能對蛋白質的穩定性產生負面影響，從而導致與缺少降粘劑的高粘度對照溶液相比，溶液的聚集速率有所增加。本質上，常用的穩定劑和降粘賦形劑可能對產品性能產生相反的作用，從而使產品開發複雜化。
可注射產品（大多數基於蛋白質的產品）需要考慮的另一個關鍵屬性是其重量滲透壓莫耳濃度。雖然靜脈內溶液通常需要等滲，但皮下溶液通常是高滲的。實際上，文獻中有證據表明，在皮下投予後，高滲配製物產生增強的蛋白質生物利用度（Fathallah, A.M.等人, Biopharm Drug Dispos.2015年3月; 36(2):115-25）。因此，在臨床開發階段期間，需要仔細監測和表徵在患者群體中溶液重量滲透壓莫耳濃度（以及因此張度）對注射位點不適和/或反應以及生物利用度的影響。
配製物有時可以含有可能賦予某些益處的表面活性劑（如泊洛沙姆和聚山梨醇酯）。泊洛沙姆是非離子聚(環氧乙烷)（PEO）-聚(環氧丙烷)（PPO）共聚物。它們在醫藥配製物中用作表面活性劑、乳化劑、增溶劑、分散劑和體內吸收增強劑。泊洛沙姆是具有以下核心式的合成三嵌段共聚物：(PEO)a-(PPO)b-(PEO)a。所有泊洛沙姆均具有相似的化學結構，但其分子量以及親水性PEO嵌段和疏水性PPO嵌段的組成不同。兩種最常用的泊洛沙姆是分子量範圍為7680至9510 Da的泊洛沙姆188（a = 80，b = 27）和分子量範圍為9840至14600 Da的泊洛沙姆407（a = 101，b = 56）。其他泊洛沙姆包括：泊洛沙姆101（P101）、泊洛沙姆105（P105）、泊洛沙姆108（P108）、泊洛沙姆122（P122）、泊洛沙姆123（P123）、泊洛沙姆124（P124）、泊洛沙姆181（P181）、泊洛沙姆182（P182）、泊洛沙姆183（P183）、泊洛沙姆184（P184）、泊洛沙姆185（P185）、泊洛沙姆212（P212）、泊洛沙姆215（P215）、泊洛沙姆217（P217）、泊洛沙姆231（P231）、泊洛沙姆234（P234）、泊洛沙姆235（P235）、泊洛沙姆237（P237）、泊洛沙姆238（P238）、泊洛沙姆282（P282）、泊洛沙姆284（P284）、泊洛沙姆288（P288）、泊洛沙姆331（P331）、泊洛沙姆333（P333）、泊洛沙姆334（P334）、泊洛沙姆335（P335）、泊洛沙姆338（P338）、泊洛沙姆401（P401）、泊洛沙姆402（P402）和泊洛沙姆403（P403）。
聚山梨醇酯是在一些藥物和食物製備配製物中使用的一類乳化劑。聚山梨醇酯是源自被脂肪酸酯化的乙氧基化脫水山梨糖醇（山梨糖醇的衍生物）的油狀液體。聚山梨醇酯的常見品牌名稱包括Scattics、Alkest、Canarcel和Tween。聚山梨醇酯的命名約定通常如下：聚山梨醇酯x（聚氧乙烯（y）脫水山梨糖醇單'z'），其中x與聚氧乙烯脫水山梨糖醇所締合的脂肪酸（z）的類型有關，並且y是指在聚山梨醇酯分子中發現的氧乙烯-(CH2 CH2 O)-基團的總數。聚山梨醇酯的例子包括：(a) 聚山梨醇酯20（聚氧乙烯（20）脫水山梨糖醇單月桂酸酯）、(b) 聚山梨醇酯40（聚氧乙烯（20）脫水山梨醇單棕櫚酸酯）、(c) 聚山梨醇酯60（聚氧乙烯（20）脫水山梨醇單硬脂酸酯）、和 (d) 聚山梨醇酯80（聚氧乙烯（20）脫水山梨糖醇單油酸酯）。
B.用於治療血液障礙的慢病毒載體（LV）配製物
在一方面，本發明涉及重組慢病毒載體製劑，所述重組慢病毒載體製劑包含：(a) 有效劑量的重組慢病毒載體；(b) 無TRIS緩衝系統；(c) 鹽；(d) 表面活性劑；(e) 碳水化合物，和 (f) 與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2所示的因子VIII（FVIII）編碼序列或SEQ ID NO: 3所示的因子IX（FIX）編碼序列至少80%相同的核苷酸序列，其中所述醫藥組合物適於全身性投予至人類患者。在某些實施例中，所述載體包含SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2所示的因子VIII（FVIII）編碼序列。在某些實施例中，所述載體包含SEQ ID NO: 3所示的因子IX（FIX）編碼序列。
在另一方面，本發明提供了重組慢病毒載體製劑，所述重組慢病毒載體製劑包含：(a) 治療有效劑量的重組慢病毒載體；(b) 無TRIS緩衝系統；(c) 鹽；(d) 表面活性劑；和 (e) 碳水化合物，其中所述重組慢病毒載體包含核酸，所述核酸包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2所示的因子VIII（FVIII）編碼序列至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%相同的核苷酸序列或與SEQ ID NO: 3所示的因子IX（FIX）編碼序列至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%相同的核苷酸序列，並且其中所述醫藥組合物適於全身性投予至人類患者。在某些實施例中，所述重組慢病毒載體包含核酸，所述核酸包含SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2所示的因子VIII（FVIII）編碼序列。在某些實施例中，所述重組慢病毒載體包含核酸，所述核酸包含SEQ ID NO: 3所示的因子IX（FIX）編碼序列。在某些實施例中，所述重組慢病毒載體包含核酸，所述核酸由SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2所示的因子VIII（FVIII）編碼序列組成。在某些實施例中，所述重組慢病毒載體包含核酸，所述核酸由SEQ ID NO: 3所示的因子IX（FIX）編碼序列組成。
在某些實施例中，所述緩衝系統的pH為約6.0至約8.0。在某些實施例中，所述緩衝系統的pH為約6.0至約7.5。在某些實施例中，所述緩衝系統的pH為約6.0至約7.0。在某些實施例中，所述緩衝系統的pH為約6.0至約8.0。在某些實施例中，所述緩衝系統的pH為約6.5。在某些實施例中，所述緩衝系統的pH為約7.3。在某些實施例中，所述緩衝系統是磷酸鹽緩衝液或組胺酸緩衝液。在某些實施例中，所述磷酸鹽或組胺酸緩衝液的濃度為約5 mM至約30 mM。在某些實施例中，所述磷酸鹽緩衝液的濃度為約10 mM至約20 mM、約10 mM至約15 mM、約20 mM至約30 mM、約20 mM至約25 mM、或約15 mM至約20 mM。在某些實施例中，所述鹽是氯化物鹽。在某些實施例中，所述氯化物鹽的濃度為約80 mM至約150 mM。在某些實施例中，所述鹽的濃度為約100 mM、約110 mM、約130 mM或約150 mM。在某些實施例中，所述表面活性劑是泊洛沙姆或聚山梨醇酯。在某些實施例中，所述泊洛沙姆或聚山梨醇酯的濃度為約0.01%（w/v）至約0.1%（w/v）。在某些實施例中，所述碳水化合物是蔗糖。在某些實施例中，所述碳水化合物的濃度為約0.5%（w/v）至約5%（w/v）。在某些實施例中，所述氯化物鹽是氯化鈉（NaCl）。在某些實施例中，所述泊洛沙姆選自泊洛沙姆101（P101）、泊洛沙姆105（P105）、泊洛沙姆108（P108）、泊洛沙姆122（P122）、泊洛沙姆123（P123）、泊洛沙姆124（P124）、泊洛沙姆181（P181）、泊洛沙姆182（P182）、泊洛沙姆183（P183）、泊洛沙姆184（P184）、泊洛沙姆185（P185）、泊洛沙姆188（P188）、泊洛沙姆212（P212）、泊洛沙姆215（P215）、泊洛沙姆217（P217）、泊洛沙姆231（P231）、泊洛沙姆234（P234）、泊洛沙姆235（P235）、泊洛沙姆237（P237）、泊洛沙姆238（P238）、泊洛沙姆282（P282）、泊洛沙姆284（P284）、泊洛沙姆288（P288）、泊洛沙姆331（P331）、泊洛沙姆333（P333）、泊洛沙姆334（P334）、泊洛沙姆335（P335）、泊洛沙姆338（P338）、泊洛沙姆401（P401）、泊洛沙姆402（P402）、泊洛沙姆403（P403）、泊洛沙姆407（P407）及其組合。在某些實施例中，所述聚山梨醇酯選自聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯80及其組合。在某些實施例中，所述磷酸鹽或組胺酸緩衝液的pH為約6.1、約6.3、約6.5、約6.7、約6.9、約7.1、約7.3、約7.5、約7.7或約7.9。在某些實施例中，所述磷酸鹽或組胺酸緩衝液的濃度為約10 mM、約15 mM、約20 mM或約25 mM。在某些實施例中，所述氯化物鹽為約100 mM、約110 mM、約130 mM或約150 mM。在某些實施例中，所述泊洛沙姆或聚山梨醇酯的濃度為約0.03%（w/v）、約0.05%（w/v）、約0.07%（w/v）或約0.09%（w/v）。在某些實施例中，所述碳水化合物的濃度為約1%（w/v）、約2%（w/v）、約3%（w/v）或約4%（w/v）。在某些實施例中，所述泊洛沙姆是泊洛沙姆188（P188）。在某些實施例中，所述泊洛沙姆是泊洛沙姆407（P407）。
在某些實施例中，本公開文本提供了重組慢病毒載體製劑，所述重組慢病毒載體製劑包含：(a) 治療有效劑量的重組慢病毒載體；(b) 約10 mM磷酸鹽；(c) 約100 mM氯化鈉；(d) 約0.05%（w/v）泊洛沙姆188和 (e) 約3%（w/v）蔗糖，其中所述製劑的pH值為約7.3，其中所述醫藥組合物適於全身性投予至人類患者，並且其中所述重組慢病毒載體包含核酸，所述核酸包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2所示的因子VIII（FVIII）編碼序列至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%相同的核苷酸序列，或與SEQ ID NO: 3所示的IX因子（FIX）編碼序列至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%相同的核苷酸序列，並且其中所述醫藥組合物適於全身性投予至人類患者。在某些實施例中，所述重組慢病毒載體包含核酸，所述核酸包含SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2所示的因子VIII（FVIII）編碼序列。在某些實施例中，所述重組慢病毒載體包含核酸，所述核酸包含SEQ ID NO: 3所示的因子IX（FIX）編碼序列。在某些實施例中，所述重組慢病毒載體包含核酸，所述核酸由SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2所示的因子VIII（FVIII）編碼序列組成。在某些實施例中，所述重組慢病毒載體包含核酸，所述核酸由SEQ ID NO: 3所示的因子IX（FIX）編碼序列組成。
在某些實施例中，本公開文本提供了重組慢病毒載體製劑，所述重組慢病毒載體製劑包含：(a) 治療有效劑量的重組慢病毒載體；(b) 約10 mM磷酸鹽；(c) 約130 mM氯化鈉；(d) 約0.05%（w/v）泊洛沙姆188和 (e) 約1%（w/v）蔗糖，其中所述製劑的pH值為約7.3，其中所述醫藥組合物適於全身性投予至人類患者，並且其中所述重組慢病毒載體包含核酸，所述核酸包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2所示的因子VIII（FVIII）編碼序列至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%相同的核苷酸序列，或與SEQ ID NO: 3所示的IX因子（FIX）編碼序列至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%相同的核苷酸序列，並且其中所述醫藥組合物適於全身性投予至人類患者。在某些實施例中，所述重組慢病毒載體包含核酸，所述核酸包含SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2所示的因子VIII（FVIII）編碼序列。在某些實施例中，所述重組慢病毒載體包含核酸，所述核酸包含SEQ ID NO: 3所示的因子IX（FIX）編碼序列。在某些實施例中，所述重組慢病毒載體包含核酸，所述核酸由SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2所示的因子VIII（FVIII）編碼序列組成。在某些實施例中，所述重組慢病毒載體包含核酸，所述核酸由SEQ ID NO: 3所示的因子IX（FIX）編碼序列組成。
在某些實施例中，本公開文本提供了重組慢病毒載體製劑，所述重組慢病毒載體製劑包含：(a) 治療有效劑量的重組慢病毒載體；(b) 約20 mM組胺酸；(c) 約100 mM氯化鈉；(d) 約0.05%（w/v）泊洛沙姆188和 (e) 約3%（w/v）蔗糖，其中所述製劑的pH值為約6.5，其中所述醫藥組合物適於全身性投予至人類患者，並且其中所述重組慢病毒載體包含核酸，所述核酸包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2所示的因子VIII（FVIII）編碼序列至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%相同的核苷酸序列，或與SEQ ID NO: 3所示的IX因子（FIX）編碼序列至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%相同的核苷酸序列，並且其中所述醫藥組合物適於全身性投予至人類患者。在某些實施例中，所述重組慢病毒載體包含核酸，所述核酸包含SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2所示的因子VIII（FVIII）編碼序列。在某些實施例中，所述重組慢病毒載體包含核酸，所述核酸包含SEQ ID NO: 3所示的因子IX（FIX）編碼序列。在某些實施例中，所述重組慢病毒載體包含核酸，所述核酸由SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2所示的因子VIII（FVIII）編碼序列組成。在某些實施例中，所述重組慢病毒載體包含核酸，所述核酸由SEQ ID NO: 3所示的因子IX（FIX）編碼序列組成。
在某些實施例中，本公開文本提供了重組慢病毒載體製劑，所述重組慢病毒載體製劑包含：(a) 治療有效劑量的重組慢病毒載體；(b) 約10 mM磷酸鹽；(c) 約100 mM氯化鈉；(d) 約0.05%（w/v）泊洛沙姆188和 (e) 約3%（w/v）蔗糖，其中所述製劑的pH值為約7.0，其中所述醫藥組合物適於全身性投予至人類患者，並且其中所述重組慢病毒載體包含核酸，所述核酸包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2所示的因子VIII（FVIII）編碼序列至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%相同的核苷酸序列，或與SEQ ID NO: 3所示的IX因子（FIX）編碼序列至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%相同的核苷酸序列，並且其中所述醫藥組合物適於全身性投予至人類患者。在某些實施例中，所述重組慢病毒載體包含核酸，所述核酸包含SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2所示的因子VIII（FVIII）編碼序列。在某些實施例中，所述重組慢病毒載體包含核酸，所述核酸包含SEQ ID NO: 3所示的因子IX（FIX）編碼序列。在某些實施例中，所述重組慢病毒載體包含核酸，所述核酸由SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2所示的因子VIII（FVIII）編碼序列組成。在某些實施例中，所述重組慢病毒載體包含核酸，所述核酸由SEQ ID NO: 3所示的因子IX（FIX）編碼序列組成。
在某些實施例中，本公開文本提供了重組慢病毒載體製劑，所述重組慢病毒載體製劑包含：(a) 治療有效劑量的重組慢病毒載體；(b) 約20 mM組胺酸；(c) 約100 mM氯化鈉；(d) 約0.05%（w/v）泊洛沙姆188和 (e) 約3%（w/v）蔗糖，其中所述製劑的pH值為約7.0，其中所述醫藥組合物適於全身性投予至人類患者，並且其中所述重組慢病毒載體包含核酸，所述核酸包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2所示的因子VIII（FVIII）編碼序列至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%相同的核苷酸序列，或與SEQ ID NO: 3所示的IX因子（FIX）編碼序列至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%相同的核苷酸序列，並且其中所述醫藥組合物適於全身性投予至人類患者。在某些實施例中，所述重組慢病毒載體包含核酸，所述核酸包含SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2所示的因子VIII（FVIII）編碼序列。在某些實施例中，所述重組慢病毒載體包含核酸，所述核酸包含SEQ ID NO: 3所示的因子IX（FIX）編碼序列。在某些實施例中，所述重組慢病毒載體包含核酸，所述核酸由SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2所示的因子VIII（FVIII）編碼序列組成。在某些實施例中，所述重組慢病毒載體包含核酸，所述核酸由SEQ ID NO: 3所示的因子IX（FIX）編碼序列組成。
在某些實施例中，所述重組慢病毒載體包含編碼VSV-G或其片段的核苷酸序列。在某些實施例中，所述重組慢病毒載體包含增強型運甲狀腺素蛋白（ET）啟動子。在某些實施例中，所述重組慢病毒載體包含與SEQ ID NO: 7所示的miR-142的靶序列至少90%相同的核苷酸序列。
在某些實施例中，所述重組慢病毒載體從包括以下的轉染宿主細胞中分離：CHO細胞、HEK293細胞、BHK21細胞、PER.C6細胞、NSO細胞和CAP細胞。在某些實施例中，所述宿主細胞是CD47陽性宿主細胞。
在某些實施例中，所述製劑全身性投予至所述人類患者。在某些實施例中，所述製劑是靜脈內投予的。
在某些實施例中，所述緩衝系統的pH在6.0與8.0之間。在某些實施例中，所述緩衝系統是磷酸鹽緩衝液或組胺酸緩衝液。在某些實施例中，所述磷酸鹽或組胺酸緩衝液的濃度在5 mM與30 mM之間。在某些實施例中，所述磷酸鹽緩衝液的濃度為約10至約20 mM、約10至約15 mM、約20至約30 mM、約20至約25 mM或約15至約20 mM。在某些實施例中，所述鹽是氯化物鹽。在某些實施例中，所述氯化物鹽的濃度在80 mM與150 mM之間。在某些實施例中，所述鹽的濃度為約100 mM、約110 mM、約130 mM或約150 mM。在某些實施例中，所述表面活性劑是泊洛沙姆或聚山梨醇酯。在某些實施例中，所述泊洛沙姆或聚山梨醇酯的濃度在0.01%（w/v）與0.1%（w/v）之間。在某些實施例中，所述碳水化合物是蔗糖。在某些實施例中，所述碳水化合物的濃度在0.5%（w/v）與5%（w/v）之間。在某些實施例中，所述氯化物鹽是NaCl。在某些實施例中，所述泊洛沙姆選自泊洛沙姆101（P101）、泊洛沙姆105（P105）、泊洛沙姆108（P108）、泊洛沙姆122（P122）、泊洛沙姆123（P123）、泊洛沙姆124（P124）、泊洛沙姆181（P181）、泊洛沙姆182（P182）、泊洛沙姆183（P183）、泊洛沙姆184（P184）、泊洛沙姆185（P185）、泊洛沙姆188（P188）、泊洛沙姆212（P212）、泊洛沙姆215（P215）、泊洛沙姆217（P217）、泊洛沙姆231（P231）、泊洛沙姆234（P234）、泊洛沙姆235（P235）、泊洛沙姆237（P237）、泊洛沙姆238（P238）、泊洛沙姆282（P282）、泊洛沙姆284（P284）、泊洛沙姆288（P288）、泊洛沙姆331（P331）、泊洛沙姆333（P333）、泊洛沙姆334（P334）、泊洛沙姆335（P335）、泊洛沙姆338（P338）、泊洛沙姆401（P401）、泊洛沙姆402（P402）、泊洛沙姆403（P403）、泊洛沙姆407（P407）及其組合。在某些實施例中，所述聚山梨醇酯選自聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯80及其組合。在某些實施例中，所述磷酸鹽或組胺酸緩衝液的pH為6.1、6.3、6.5、6.7、6.9、7.1、7.3、7.5、7.7或7.9。在某些實施例中，所述磷酸鹽或組胺酸緩衝液的濃度為10 mM、15 mM、20 mM或25 mM。在某些實施例中，所述氯化物鹽為100 mM、110 mM、130 mM或150 mM。在某些實施例中，所述泊洛沙姆或聚山梨醇酯的濃度為0.03%（w/v）、0.05%（w/v）、0.07%（w/v）或0.09%（w/v）。在某些實施例中，所述碳水化合物的濃度為1%（w/v）、2%（w/v）、3%（w/v）或4%（w/v）。在某些實施例中，所述泊洛沙姆是泊洛沙姆188（P188）。在某些實施例中，所述泊洛沙姆是泊洛沙姆407（P407）。
在一方面，本發明涉及重組慢病毒載體製劑，所述重組慢病毒載體製劑包含：(a) 有效劑量的重組慢病毒載體；(b) 無TRIS緩衝系統；(c) 鹽；(d) 表面活性劑；(e) 碳水化合物，和 (f) 增強型運甲狀腺素蛋白（ET）啟動子，其中所述醫藥組合物適於全身性投予至人類患者。在某些實施例中，所述載體進一步包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2所示的因子VIII（FVIII）編碼序列或SEQ ID NO: 3所示的因子IX（FIX）編碼序列至少80%相同的核苷酸序列，其中所述醫藥組合物適於全身性投予至人類患者。在某些實施例中，所述載體包含SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2所示的因子VIII（FVIII）編碼序列。在某些實施例中，所述載體包含SEQ ID NO: 3所示的因子IX（FIX）編碼序列。
在某些實施例中，所述載體進一步包含編碼VSV-G或其片段的核苷酸序列。在某些實施例中，所述緩衝系統的pH在6.0與8.0之間。在某些實施例中，所述緩衝系統是磷酸鹽緩衝液或組胺酸緩衝液。在某些實施例中，所述磷酸鹽或組胺酸緩衝液的濃度在5 mM與30 mM之間。在某些實施例中，所述磷酸鹽緩衝液的濃度為約10至約20 mM、約10至約15 mM、約20至約30 mM、約20至約25 mM或約15至約20 mM。在某些實施例中，所述鹽是氯化物鹽。在某些實施例中，所述氯化物鹽的濃度在80 mM與150 mM之間。在某些實施例中，所述鹽的濃度為約100 mM、約110 mM、約130 mM或約150 mM。在某些實施例中，所述表面活性劑是泊洛沙姆或聚山梨醇酯。在某些實施例中，所述泊洛沙姆或聚山梨醇酯的濃度在0.01%（w/v）與0.1%（w/v）之間。在某些實施例中，所述碳水化合物是蔗糖。在某些實施例中，所述碳水化合物的濃度在0.5%（w/v）與5%（w/v）之間。在某些實施例中，所述氯化物鹽是NaCl。在某些實施例中，所述泊洛沙姆選自泊洛沙姆101（P101）、泊洛沙姆105（P105）、泊洛沙姆108（P108）、泊洛沙姆122（P122）、泊洛沙姆123（P123）、泊洛沙姆124（P124）、泊洛沙姆181（P181）、泊洛沙姆182（P182）、泊洛沙姆183（P183）、泊洛沙姆184（P184）、泊洛沙姆185（P185）、泊洛沙姆188（P188）、泊洛沙姆212（P212）、泊洛沙姆215（P215）、泊洛沙姆217（P217）、泊洛沙姆231（P231）、泊洛沙姆234（P234）、泊洛沙姆235（P235）、泊洛沙姆237（P237）、泊洛沙姆238（P238）、泊洛沙姆282（P282）、泊洛沙姆284（P284）、泊洛沙姆288（P288）、泊洛沙姆331（P331）、泊洛沙姆333（P333）、泊洛沙姆334（P334）、泊洛沙姆335（P335）、泊洛沙姆338（P338）、泊洛沙姆401（P401）、泊洛沙姆402（P402）、泊洛沙姆403（P403）、泊洛沙姆407（P407）及其組合。在某些實施例中，所述聚山梨醇酯選自聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯80及其組合。在某些實施例中，所述磷酸鹽或組胺酸緩衝液的pH為6.1、6.3、6.5、6.7、6.9、7.1、7.3、7.5、7.7或7.9。在某些實施例中，所述磷酸鹽或組胺酸緩衝液的濃度為10 mM、15 mM、20 mM或25 mM。在某些實施例中，所述氯化物鹽為100 mM、110 mM、130 mM或150 mM。在某些實施例中，所述泊洛沙姆或聚山梨醇酯的濃度為0.03%（w/v）、0.05%（w/v）、0.07%（w/v）或0.09%（w/v）。在某些實施例中，所述碳水化合物的濃度為1%（w/v）、2%（w/v）、3%（w/v）或4%（w/v）。在某些實施例中，所述泊洛沙姆是泊洛沙姆188（P188）。在某些實施例中，所述泊洛沙姆是泊洛沙姆407（P407）。在一方面，本發明涉及重組慢病毒載體製劑，所述重組慢病毒載體製劑包含：(a) 有效劑量的重組慢病毒載體；(b) 無TRIS緩衝系統；(c) 鹽；(d) 表面活性劑；(e) 碳水化合物；和 (f) 與SEQ ID NO: 7所示的miR-142的靶序列至少90%相同的核苷酸序列，其中所述醫藥組合物適於全身性投予至人類患者。在某些實施例中，所述載體進一步包含增強型運甲狀腺素蛋白（ET）啟動子。在某些實施例中，所述載體進一步包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2所示的因子VIII（FVIII）編碼序列或SEQ ID NO: 3所示的因子IX（FIX）編碼序列至少80%相同的核苷酸序列。在某些實施例中，所述載體包含SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2所示的因子VIII（FVIII）編碼序列。在某些實施例中，所述載體包含SEQ ID NO: 3所示的因子IX（FIX）編碼序列。
在某些實施例中，所述載體進一步包含編碼VSV-G或其片段的核苷酸序列。在某些實施例中，所述緩衝系統的pH在6.0與8.0之間。在某些實施例中，所述緩衝系統是磷酸鹽緩衝液或組胺酸緩衝液。在某些實施例中，所述磷酸鹽或組胺酸緩衝液的濃度在5 mM與30 mM之間。在某些實施例中，所述磷酸鹽緩衝液的濃度為約10至約20 mM、約10至約15 mM、約20至約30 mM、約20至約25 mM或約15至約20 mM。在某些實施例中，所述鹽是氯化物鹽。在某些實施例中，所述氯化物鹽的濃度在80 mM與150 mM之間。在某些實施例中，所述鹽的濃度為約100 mM、約110 mM、約130 mM或約150 mM。在某些實施例中，所述表面活性劑是泊洛沙姆或聚山梨醇酯。在某些實施例中，所述泊洛沙姆或聚山梨醇酯的濃度在0.01%（w/v）與0.1%（w/v）之間。在某些實施例中，所述碳水化合物是蔗糖。在某些實施例中，所述碳水化合物的濃度在0.5%（w/v）與5%（w/v）之間。在某些實施例中，所述氯化物鹽是NaCl。在某些實施例中，所述泊洛沙姆選自泊洛沙姆101（P101）、泊洛沙姆105（P105）、泊洛沙姆108（P108）、泊洛沙姆122（P122）、泊洛沙姆123（P123）、泊洛沙姆124（P124）、泊洛沙姆181（P181）、泊洛沙姆182（P182）、泊洛沙姆183（P183）、泊洛沙姆184（P184）、泊洛沙姆185（P185）、泊洛沙姆188（P188）、泊洛沙姆212（P212）、泊洛沙姆215（P215）、泊洛沙姆217（P217）、泊洛沙姆231（P231）、泊洛沙姆234（P234）、泊洛沙姆235（P235）、泊洛沙姆237（P237）、泊洛沙姆238（P238）、泊洛沙姆282（P282）、泊洛沙姆284（P284）、泊洛沙姆288（P288）、泊洛沙姆331（P331）、泊洛沙姆333（P333）、泊洛沙姆334（P334）、泊洛沙姆335（P335）、泊洛沙姆338（P338）、泊洛沙姆401（P401）、泊洛沙姆402（P402）、泊洛沙姆403（P403）、泊洛沙姆407（P407）及其組合。在某些實施例中，所述聚山梨醇酯選自聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯80及其組合。在某些實施例中，所述磷酸鹽或組胺酸緩衝液的pH為6.1、6.3、6.5、6.7、6.9、7.1、7.3、7.5、7.7或7.9。在某些實施例中，所述磷酸鹽或組胺酸緩衝液的濃度為10 mM、15 mM、20 mM或25 mM。在某些實施例中，所述氯化物鹽為100 mM、110 mM、130 mM或150 mM。在某些實施例中，所述泊洛沙姆或聚山梨醇酯的濃度為0.03%（w/v）、0.05%（w/v）、0.07%（w/v）或0.09%（w/v）。在某些實施例中，所述碳水化合物的濃度為1%（w/v）、2%（w/v）、3%（w/v）或4%（w/v）。在某些實施例中，所述泊洛沙姆是泊洛沙姆188（P188）。在某些實施例中，所述泊洛沙姆是泊洛沙姆407（P407）。
在一方面，本發明涉及重組慢病毒載體製劑，其中所述重組慢病毒載體從包括以下的轉染宿主細胞中分離：CHO細胞、HEK293細胞、BHK21細胞、PER.C6細胞、NSO細胞和CAP細胞，其中所述重組慢病毒載體製劑包括：(a) 有效劑量的重組慢病毒載體；(b) 無TRIS緩衝系統；(c) 鹽；(d) 表面活性劑；和 (e) 碳水化合物，其中所述醫藥組合物適於全身性投予至人類患者。在某些實施例中，所述宿主細胞是CD47陽性宿主細胞。在某些實施例中，所述載體進一步包含增強型運甲狀腺素蛋白（ET）啟動子。在某些實施例中，所述載體進一步包含與SEQ ID NO: 7所示的miR-142的靶序列至少90%相同的核苷酸序列。在某些實施例中，所述載體進一步包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2所示的因子VIII（FVIII）編碼序列或SEQ ID NO: 3所示的因子IX（FIX）編碼序列至少80%相同的核苷酸序列。在某些實施例中，所述載體包含SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2所示的因子VIII（FVIII）編碼序列。在某些實施例中，所述載體包含SEQ ID NO: 3所示的因子IX（FIX）編碼序列。
在某些實施例中，所述載體進一步包含編碼VSV-G或其片段的核苷酸序列。在某些實施例中，所述緩衝系統的pH在6.0與8.0之間。在某些實施例中，所述緩衝系統是磷酸鹽緩衝液或組胺酸緩衝液。在某些實施例中，所述磷酸鹽或組胺酸緩衝液的濃度在5 mM與30 mM之間。在某些實施例中，所述磷酸鹽緩衝液的濃度為約10至約20 mM、約10至約15 mM、約20至約30 mM、約20至約25 mM或約15至約20 mM。在某些實施例中，所述鹽是氯化物鹽。在某些實施例中，所述氯化物鹽的濃度在80 mM與150 mM之間。在某些實施例中，所述鹽的濃度為約100 mM、約110 mM、約130 mM或約150 mM。在某些實施例中，所述表面活性劑是泊洛沙姆或聚山梨醇酯。在某些實施例中，所述泊洛沙姆或聚山梨醇酯的濃度在0.01%（w/v）與0.1%（w/v）之間。在某些實施例中，所述碳水化合物是蔗糖。在某些實施例中，所述碳水化合物的濃度在0.5%（w/v）與5%（w/v）之間。在某些實施例中，所述氯化物鹽是NaCl。在某些實施例中，所述泊洛沙姆選自泊洛沙姆101（P101）、泊洛沙姆105（P105）、泊洛沙姆108（P108）、泊洛沙姆122（P122）、泊洛沙姆123（P123）、泊洛沙姆124（P124）、泊洛沙姆181（P181）、泊洛沙姆182（P182）、泊洛沙姆183（P183）、泊洛沙姆184（P184）、泊洛沙姆185（P185）、泊洛沙姆188（P188）、泊洛沙姆212（P212）、泊洛沙姆215（P215）、泊洛沙姆217（P217）、泊洛沙姆231（P231）、泊洛沙姆234（P234）、泊洛沙姆235（P235）、泊洛沙姆237（P237）、泊洛沙姆238（P238）、泊洛沙姆282（P282）、泊洛沙姆284（P284）、泊洛沙姆288（P288）、泊洛沙姆331（P331）、泊洛沙姆333（P333）、泊洛沙姆334（P334）、泊洛沙姆335（P335）、泊洛沙姆338（P338）、泊洛沙姆401（P401）、泊洛沙姆402（P402）、泊洛沙姆403（P403）、泊洛沙姆407（P407）及其組合。在某些實施例中，所述聚山梨醇酯選自聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯80及其組合。在某些實施例中，所述磷酸鹽或組胺酸緩衝液的pH為6.1、6.3、6.5、6.7、6.9、7.1、7.3、7.5、7.7或7.9。在某些實施例中，所述磷酸鹽或組胺酸緩衝液的濃度為10 mM、15 mM、20 mM或25 mM。在某些實施例中，所述氯化物鹽為100 mM、110 mM、130 mM或150 mM。在某些實施例中，所述泊洛沙姆或聚山梨醇酯的濃度為0.03%（w/v）、0.05%（w/v）、0.07%（w/v）或0.09%（w/v）。在某些實施例中，所述碳水化合物的濃度為1%（w/v）、2%（w/v）、3%（w/v）或4%（w/v）。在某些實施例中，所述泊洛沙姆是泊洛沙姆188（P188）。在某些實施例中，所述泊洛沙姆是泊洛沙姆407（P407）。
在一方面，本發明涉及治療患有障礙的人類患者的方法，其中向所述人類患者全身性地投予重組慢病毒載體製劑，所述重組慢病毒載體製劑包含：(a) (a) 有效劑量的重組慢病毒載體；(b) 無TRIS緩衝系統；(c) 鹽；(d) 表面活性劑；和 (e) 碳水化合物，其中所述醫藥組合物適於全身性投予至人類患者。在某些實施例中，所述製劑全身性投予至所述人類患者。在某些實施例中，所述製劑是靜脈內投予的。
在某些實施例中，所述障礙是出血障礙。在某些實施例中，所述出血障礙是A型血友病或B型血友病。
在某些實施例中，所述載體進一步包含增強型運甲狀腺素蛋白（ET）啟動子。在某些實施例中，所述載體進一步包含與SEQ ID NO: 7所示的miR-142的靶序列至少90%相同的核苷酸序列。在某些實施例中，所述載體進一步包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2所示的因子VIII（FVIII）編碼序列或SEQ ID NO: 3所示的因子IX（FIX）編碼序列至少80%相同的核苷酸序列。在某些實施例中，所述載體包含SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2所示的因子VIII（FVIII）編碼序列。在某些實施例中，所述載體包含SEQ ID NO: 3所示的因子IX（FIX）編碼序列。
在某些實施例中，所述載體進一步包含編碼VSV-G或其片段的核苷酸序列。在某些實施例中，所述緩衝系統的pH在6.0與8.0之間。在某些實施例中，所述緩衝系統是磷酸鹽緩衝液或組胺酸緩衝液。在某些實施例中，所述磷酸鹽或組胺酸緩衝液的濃度在5 mM與30 mM之間。在某些實施例中，所述磷酸鹽緩衝液的濃度為約10至約20 mM、約10至約15 mM、約20至約30 mM、約20至約25 mM或約15至約20 mM。在某些實施例中，所述鹽是氯化物鹽。在某些實施例中，所述氯化物鹽的濃度在80 mM與150 mM之間。在某些實施例中，所述鹽的濃度為約100 mM、約110 mM、約130 mM或約150 mM。在某些實施例中，所述表面活性劑是泊洛沙姆或聚山梨醇酯。在某些實施例中，所述泊洛沙姆或聚山梨醇酯的濃度在0.01%（w/v）與0.1%（w/v）之間。在某些實施例中，所述碳水化合物是蔗糖。在某些實施例中，所述碳水化合物的濃度在0.5%（w/v）與5%（w/v）之間。在某些實施例中，所述氯化物鹽是NaCl。在某些實施例中，所述泊洛沙姆選自泊洛沙姆101（P101）、泊洛沙姆105（P105）、泊洛沙姆108（P108）、泊洛沙姆122（P122）、泊洛沙姆123（P123）、泊洛沙姆124（P124）、泊洛沙姆181（P181）、泊洛沙姆182（P182）、泊洛沙姆183（P183）、泊洛沙姆184（P184）、泊洛沙姆185（P185）、泊洛沙姆188（P188）、泊洛沙姆212（P212）、泊洛沙姆215（P215）、泊洛沙姆217（P217）、泊洛沙姆231（P231）、泊洛沙姆234（P234）、泊洛沙姆235（P235）、泊洛沙姆237（P237）、泊洛沙姆238（P238）、泊洛沙姆282（P282）、泊洛沙姆284（P284）、泊洛沙姆288（P288）、泊洛沙姆331（P331）、泊洛沙姆333（P333）、泊洛沙姆334（P334）、泊洛沙姆335（P335）、泊洛沙姆338（P338）、泊洛沙姆401（P401）、泊洛沙姆402（P402）、泊洛沙姆403（P403）、泊洛沙姆407（P407）及其組合。在某些實施例中，所述聚山梨醇酯選自聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯80及其組合。在某些實施例中，所述磷酸鹽或組胺酸緩衝液的pH為6.1、6.3、6.5、6.7、6.9、7.1、7.3、7.5、7.7或7.9。在某些實施例中，所述磷酸鹽或組胺酸緩衝液的濃度為10 mM、15 mM、20 mM或25 mM。在某些實施例中，所述氯化物鹽為100 mM、110 mM、130 mM或150 mM。在某些實施例中，所述泊洛沙姆或聚山梨醇酯的濃度為0.03%（w/v）、0.05%（w/v）、0.07%（w/v）或0.09%（w/v）。在某些實施例中，所述碳水化合物的濃度為1%（w/v）、2%（w/v）、3%（w/v）或4%（w/v）。在某些實施例中，所述泊洛沙姆是泊洛沙姆188（P188）。在某些實施例中，所述泊洛沙姆是泊洛沙姆407（P407）。
B.1.出血障礙
出血障礙是由於血液在血管損傷位點形成凝塊的能力受損所致。有若干種類型的出血障礙，包括A型血友病、B型血友病、血管性血友病和罕見因子缺乏症。A型血友病起因於因子VIII的基因突變或表現不足引起的因子VIII（FVIII）的缺乏，而B型血友病起因於因子IX的基因突變或表現不足引起的因子IX（FIX）的缺乏。
根據美國疾病控制和預防中心，大約每5,000例活產就有1例患血友病。在美國，有約20,000人患有血友病。所有人種和種族都受到影響。A型血友病比B型血友病多四倍，同時超過一半的A型血友病患者患有嚴重形式的血友病。罹患血友病的人終其一生都需要廣泛的醫學監測。在沒有干預的情況下，患病個體遭受關節內的自發性出血，這產生嚴重的疼痛和令人虛弱的行動受限。出血至肌肉中導致血液在這些組織中積累，而咽喉和頸部中的自發性出血，如果未及時治療，可引起窒息。腎出血和術後、小的意外傷害或拔牙後的重度出血也是普遍的。
本文公開了用於在有需要的受試者中治療出血疾病或病症的配製物。出血疾病或病症選自出血凝血障礙、關節積血、肌肉出血、口腔出血、出血症、出血至肌肉中、口腔出血症、創傷、頭部創傷（trauma capitis）、胃腸出血、顱內出血、腹內出血、胸腔內出血、骨折、中樞神經系統出血、咽後間隙出血、腹膜後間隙出血、髂腰肌鞘出血及其任何組合。在仍其他實施例中，安排受試者進行手術。在又其他實施例中，治療是預防性的或按需的。
使用穩定且有效的慢病毒載體（LV）配製物的基因療法顯示通過將因子VIII或因子IX基因穩定整合到細胞中從而導致表現足夠水準的功能性因子VIII或因子IX來治療罹患A型血友病或B的個體的巨大前景。
已經探索了體細胞基因療法作為出血障礙的可能治療方法。基因療法由於其通過在單次投予編碼相應凝血因子的載體後持續內源性產生FVIII或FIX來治癒疾病的潛力而成為特別有吸引力的血友病治療方法。A型血友病（缺乏FVIII）和B型血友病（缺乏FIX）非常適合於基因替代方法，因為其臨床表現可完全歸因於缺少以微小量（200 ng/ml）在血漿中循環的單一基因產物（FVIII或FIX）。
慢病毒由於其大容量和經由整合持續表現基因轉殖的能力而作為基因遞送媒劑逐漸引人注目。已經在眾多離體細胞療法臨床計畫中評估慢病毒，其具有有希望的功效和安全性概況，在過去十年中獲得了廣泛的經驗。隨著慢病毒在體內基因療法中的使用日益普及，業內需要提供增強慢病毒的穩定性以便長期儲存的改善的配製物。
本公開文本通過提供賦予慢病毒穩定性（從而提供長期冷凍儲存）的配製緩衝液或媒劑滿足了業內的重要需求。在某些示例性實施例中，在投予途徑是全身投予的情況下，配製緩衝液賦予慢病毒穩定性並提供長期冷凍儲存。在一些實施例中，將慢病毒在純化後處理到本公開文本的配製緩衝液或媒劑中。配製後，將慢病毒冷凍儲存。本發明的配製緩衝液或媒劑提供增強的在冷凍和解凍時以及暴露於升高的溫度時的穩定性。
本文提供了慢病毒載體，所述慢病毒載體包含密碼子優化FVIII序列或密碼子優化FIX序列，當在基因療法中使用時，所述序列在受試者中展示出增加的表現並且潛在地產生更大的治療功效。本公開文本的實施例涉及如本文所述的包含編碼具有FVIII活性的多肽的一種或多種密碼子優化核酸分子的慢病毒載體、或包含編碼具有FIX活性的多肽的一種或多種密碼子優化核酸分子的慢病毒載體、包含所述慢病毒載體的宿主細胞（例如，肝細胞）、以及所公開的慢病毒載體的使用方法（例如，使用本文公開的慢病毒載體對出血障礙的治療）。在某些實施例中，在按比例放大處理過程中，將慢病毒載體包裝到慢病毒中，將所述慢病毒處理到本公開文本的配製緩衝液或媒劑中。
通常，本文公開的治療方法涉及投予包含含有編碼FVIII凝血因子的至少一種密碼子優化核酸序列的核酸分子的慢病毒載體或包含含有編碼FIX凝血因子的至少一種密碼子優化核酸序列的核酸分子的慢病毒載體。在一些實施例中，將編碼FVIII凝血因子的核酸序列與合適的表現控制序列可操作地連接，在一些實施例中將所述表現控制序列併入慢病毒載體（例如複製缺陷型慢病毒病毒載體）中。在一些實施例中，將編碼FIX凝血因子的核酸序列與合適的表現控制序列可操作地連接，在一些實施例中將所述表現控制序列併入慢病毒載體（例如複製缺陷型慢病毒病毒載體）中。
本公開文本提供了在有需要的受試者中治療出血障礙（例如，A型血友病或B型血友病）的方法，所述方法包括向受試者投予至少一個劑量的慢病毒載體，所述慢病毒載體包含含有編碼具有FVIII或FIX活性的多肽的核苷酸序列的核酸分子。在某些實施例中，將慢病毒載體包裝到慢病毒中，所述慢病毒被處理到本發明的配製緩衝液中。在某些實施例中，編碼具有FVIII活性的多肽的核苷酸序列包括具有與SEQ ID NO: 1所示的核酸序列（如表1所示）具有至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%或至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%，至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或至少100%序列同一性的核苷酸序列。在某些實施例中，編碼具有FVIII活性的多肽的核苷酸序列由SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列（如表1所示）組成。在某些實施例中，編碼具有FVIII活性的多肽的核苷酸序列包括具有與SEQ ID NO: 2所示的核酸序列（如表1所示）至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%或至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%，至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或至少100%序列同一性的核苷酸序列。在某些實施例中，編碼具有FVIII活性的多肽的核苷酸序列由SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列（如表1所示）組成。在某些實施例中，編碼具有FIX活性的多肽的核苷酸序列包括具有與SEQ ID NO: 3所示的核酸序列（如表1所示）至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%或至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%，至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或至少100%序列同一性的核苷酸序列。在某些實施例中，編碼具有FIX活性的多肽的核苷酸序列由SEQ ID NO: 3所示的核苷酸序列（如表1所示）組成。
本公開文本提供了在有需要的受試者中治療出血障礙（例如，A型血友病或B型血友病）的方法，所述方法包括向受試者投予至少一個劑量的慢病毒載體，所述慢病毒載體包含含有編碼具有FVIII或FIX活性的多肽的核苷酸序列的核酸分子。在某些實施例中，將慢病毒載體包裝到慢病毒中，所述慢病毒被處理到本發明的配製緩衝液或媒劑中。在某些實施例中，向受試者投予5x1010 或更少轉導單位/kg（TU/kg）（或109 TU/kg或更少、或108 TU/kg或更少）的至少一個劑量的如本文所述的慢病毒載體，所述慢病毒載體包含含有編碼具有FVIII或FIX活性的多肽的核苷酸序列的核酸分子。
在一些實施例中，劑量為約5.0x1010 TU/kg、約4.9x1010 TU/kg、約4.8x1010 TU/kg、約4.7x1010 TU/kg、約4.6x1010 TU/kg、約4.5x1010 TU/kg、約4.4x1010 TU/kg、約4.3x1010 TU/kg、約4.2x1010 TU/kg、約4.1x1010 TU/kg、約4.0x1010 TU/kg、約3.9x1010 TU/kg、約3.8x1010 TU/kg、約3.7x1010 TU/kg、約3.6x1010 TU/kg、約3.5x1010 TU/kg、約3.4x1010 TU/kg、約3.3x1010 TU/kg、約3.2x1010 TU/kg、約3.1x1010 TU/kg、約3.0x1010 TU/kg、約2.9x1010 TU/kg、約2.8x1010 TU/kg、約2.7x1010 TU/kg、約2.6x1010 TU/kg、約2.5x1010 TU/kg、約2.4x1010 TU/kg、約2.3x1010 TU/kg、約2.2x1010 TU/kg、約2.1x1010 TU/kg、約2.0x1010 TU/kg、約1.9x1010 TU/kg、約1.8x1010 TU/kg、約1.7x1010 TU/kg、約1.6x1010 TU/kg、約1.5x1010 TU/kg、約1.4x1010 TU/kg、約1.3x1010 TU/kg、約1.2x1010 TU/kg、約1.1x1010 TU/kg、或約1.0x1010 TU/kg。
在一些實施例中，劑量為約9.9x109 TU/kg、約9.8x109 TU/kg、約9.7x109 TU/kg、約9.6x109 TU/kg、約9.5x109 TU/kg、約9.4x109 TU/kg、約9.3x109 TU/kg、約9.2x109 TU/kg、約9.1x109 TU/kg、約9.0x109 TU/kg、約8.9x109 TU/kg、約8.8x109 TU/kg、約8.7x109 TU/kg、約8.6x109 TU/kg、約8.5x109 TU/kg、約8.4x109 TU/kg、約8.3x109 TU/kg、約8.2x109 TU/kg、約8.1x109 TU/kg、約8.0x109 TU/kg、約7.9x109 TU/kg、約7.8x109 TU/kg、約7.7x109 TU/kg、約7.6x109 TU/kg、約7.5x109 TU/kg、約7.4x109 TU/kg、約7.3x109 TU/kg、約7.2x109 TU/kg、約7.1x109 TU/kg、約7.0x109 TU/kg、約6.9x109 TU/kg、約6.8x109 TU/kg、約6.7x109 TU/kg、約6.6x109 TU/kg、約6.5x109 TU/kg、約6.4x109 TU/kg、約6.3x109 TU/kg、約6.2x109 TU/kg、約6.1x109 TU/kg、約6.0x109 TU/kg、約5.9x109 TU/kg、約5.8x109 TU/kg、約5.7x109 TU/kg、約5.6x109 TU/kg、約5.5x109 TU/kg、約5.4x109 TU/kg、約5.3x109 TU/kg、約5.2x109 TU/kg、約5.1x109 TU/kg、約5.0x109 TU/kg、約4.9x109 TU/kg、約4.8x109 TU/kg、約4.7x109 TU/kg、約4.6x109 TU/kg、約4.5x109 TU/kg、約4.4x109 TU/kg、約4.3x109 TU/kg、約4.2x109 TU/kg、約4.1x109 TU/kg、約4.0x109 TU/kg、約3.9x109 TU/kg、約3.8x109 TU/kg、約3.7x109 TU/kg、約3.6x109 TU/kg、約3.5x109 TU/kg、約3.4x109 TU/kg、約3.3x109 TU/kg、約3.2x109 TU/kg、約3.1x109 TU/kg、約3.0x109 TU/kg、約2.9x109 TU/kg、約2.8x109 TU/kg、約2.7x109 TU/kg、約2.6x109 TU/kg、約2.5x109 TU/kg、約2.4x109 TU/kg、約2.3x109 TU/kg、約2.2x109 TU/kg、約2.1x109 TU/kg、約2.0x109 TU/kg、約1.9x109 TU/kg、約1.8x109 TU/kg、約1.7x109 TU/kg、約1.6x109 TU/kg、約1.5x109 TU/kg、約1.4x109 TU/kg、約1.3x109 TU/kg、約1.2x109 TU/kg、約1.1x109 TU/kg、或約1.0x109 TU/kg。
在一些實施例中，劑量為約9.9x108 TU/kg、約9.8x108 TU/kg、約9.7x108 TU/kg、約9.6x108 TU/kg、約9.5x108 TU/kg、約9.4x108 TU/kg、約9.3x108 TU/kg、約9.2x108 TU/kg、約9.1x108 TU/kg、約9.0x108 TU/kg、約8.9x108 TU/kg、約8.8x108 TU/kg、約8.7x108 TU/kg、約8.6x108 TU/kg、約8.5x108 TU/kg、約8.4x108 TU/kg、約8.3x108 TU/kg、約8.2x108 TU/kg、約8.1x108 TU/kg、約8.0x108 TU/kg、約7.9x108 TU/kg、約7.8x108 TU/kg、約7.7x108 TU/kg、約7.6x108 TU/kg、約7.5x108 TU/kg、約7.4x108 TU/kg、約7.3x108 TU/kg、約7.2x108 TU/kg、約7.1x108 TU/kg、約7.0x108 TU/kg、約6.9x108 TU/kg、約6.8x108 TU/kg、約6.7x108 TU/kg、約6.6x108 TU/kg、約6.5x108 TU/kg、約6.4x108 TU/kg、約6.3x108 TU/kg、約6.2x108 TU/kg、約6.1x108 TU/kg、約6.0x108 TU/kg、約5.9x108 TU/kg、約5.8x108 TU/kg、約5.7x108 TU/kg、約5.6x108 TU/kg、約5.5x108 TU/kg、約5.4x108 TU/kg、約5.3x108 TU/kg、約5.2x108 TU/kg、約5.1x108 TU/kg、約5.0x108 TU/kg、約4.9x108 TU/kg、約4.8x108 TU/kg、約4.7x108 TU/kg、約4.6x108 TU/kg、約4.5x108 TU/kg、約4.4x108 TU/kg、約4.3x108 TU/kg、約4.2x108 TU/kg、約4.1x108 TU/kg、約4.0x108 TU/kg、約3.9x108 TU/kg、約3.8x108 TU/kg、約3.7x108 TU/kg、約3.6x108 TU/kg、約3.5x108 TU/kg、約3.4x108 TU/kg、約3.3x108 TU/kg、約3.2x108 TU/kg、約3.1x108 TU/kg、約3.0x108 TU/kg、約2.9x108 TU/kg、約2.8x108 TU/kg、約2.7x108 TU/kg、約2.6x108 TU/kg、約2.5x108 TU/kg、約2.4x108 TU/kg、約2.3x108 TU/kg、約2.2x108 TU/kg、約2.1x108 TU/kg、約2.0x108 TU/kg、約1.9x108 TU/kg、約1.8x108 TU/kg、約1.7x108 TU/kg、約1.6x108 TU/kg、約1.5x108 TU/kg、約1.4x108 TU/kg、約1.3x108 TU/kg、約1.2x108 TU/kg、約1.1x108 TU/kg、或約1.0x108 TU/kg。
在一些實施例中，劑量小於5.0x1010 TU/kg、小於4.9x1010 TU/kg、小於4.8x1010 TU/kg、小於4.7x1010 TU/kg、小於4.6x1010 TU/kg、小於4.5x1010 TU/kg、小於4.4x1010 TU/kg、小於4.3x1010 TU/kg、小於4.2x1010 TU/kg、小於4.1x1010 TU/kg、小於4.0x1010 TU/kg、小於3.9x1010 TU/kg、小於3.8x1010 TU/kg、小於3.7x1010 TU/kg、小於3.6x1010 TU/kg、小於3.5x1010 TU/kg、小於3.4x1010 TU/kg、小於3.3x1010 TU/kg、小於3.2x1010 TU/kg、小於3.1x1010 TU/kg、小於3.0x1010 TU/kg、小於2.9x1010 TU/kg、小於2.8x1010 TU/kg、小於2.7x1010 TU/kg、小於2.6x1010 TU/kg、小於2.5x1010 TU/kg、小於2.4x1010 TU/kg、小於2.3x1010 TU/kg、小於2.2x1010 TU/kg、小於2.1x1010 TU/kg、小於2.0x1010 TU/kg、小於1.9x1010 TU/kg、小於1.8x1010 TU/kg、小於1.7x1010 TU/kg、小於1.6x1010 TU/kg、小於1.5x1010 TU/kg、小於1.4x1010 TU/kg、小於1.3x1010 TU/kg、小於1.2x1010 TU/kg、小於1.1x1010 TU/kg、或小於1.0x1010 TU/kg。
在一些實施例中，劑量小於9.9x109 TU/kg、小於9.8x109 TU/kg、小於9.7x109 TU/kg、小於9.6x109 TU/kg、小於9.5x109 TU/kg、小於9.4x109 TU/kg、小於9.3x109 TU/kg、小於9.2x109 TU/kg、小於9.1x109 TU/kg、小於9.0x109 TU/kg、小於8.9x109 TU/kg、小於8.8x109 TU/kg、小於8.7x109 TU/kg、小於8.6x109 TU/kg、小於8.5x109 TU/kg、小於8.4x109 TU/kg、小於8.3x109 TU/kg、小於8.2x109 TU/kg、小於8.1x109 TU/kg、小於8.0x109 TU/kg、小於7.9x109 TU/kg、小於7.8x109 TU/kg、小於7.7x109 TU/kg、小於7.6x109 TU/kg、小於7.5x109 TU/kg、小於7.4x109 TU/kg、小於7.3x109 TU/kg、小於7.2x109 TU/kg、小於7.1x109 TU/kg、小於7.0x109 TU/kg、小於6.9x109 TU/kg、小於6.8x109 TU/kg、小於6.7x109 TU/kg、小於6.6x109 TU/kg、小於6.5x109 TU/kg、小於6.4x109 TU/kg、小於6.3x109 TU/kg、小於6.2x109 TU/kg、小於6.1x109 TU/kg、小於6.0x109 TU/kg、小於5.9x109 TU/kg、小於5.8x109 TU/kg、小於5.7x109 TU/kg、小於5.6x109 TU/kg、小於5.5x109 TU/kg、小於5.4x109 TU/kg、小於5.3x109 TU/kg、小於5.2x109 TU/kg、小於5.1x109 TU/kg、小於5.0x109 TU/kg、小於4.9x109 TU/kg、小於4.8x109 TU/kg、小於4.7x109 TU/kg、小於4.6x109 TU/kg、小於4.5x109 TU/kg、小於4.4x109 TU/kg、小於4.3x109 TU/kg、小於4.2x109 TU/kg、小於4.1x109 TU/kg、小於4.0x109 TU/kg、小於3.9x109 TU/kg、小於3.8x109 TU/kg、小於3.7x109 TU/kg、小於3.6x109 TU/kg、小於3.5x109 TU/kg、小於3.4x109 TU/kg、小於3.3x109 TU/kg、小於3.2x109 TU/kg、小於3.1x109 TU/kg、小於3.0x109 TU/kg、小於2.9x109 TU/kg、小於2.8x109 TU/kg、小於2.7x109 TU/kg、小於2.6x109 TU/kg、小於2.5x109 TU/kg、小於2.4x109 TU/kg、小於2.3x109 TU/kg、小於2.2x109 TU/kg、小於2.1x109 TU/kg、小於2.0x109 TU/kg、小於1.9x109 TU/kg、小於1.8x109 TU/kg、小於1.7x109 TU/kg、小於1.6x109 TU/kg、小於1.5x109 TU/kg、小於1.4x109 TU/kg、小於1.3x109 TU/kg、小於1.2x109 TU/kg、小於1.1x109 TU/kg、或小於1.0x109 TU/kg。
在一些實施例中，劑量小於9.9x108 TU/kg、小於9.8x108 TU/kg、小於9.7x108 TU/kg、小於9.6x108 TU/kg、小於9.5x108 TU/kg、小於9.4x108 TU/kg、小於9.3x108 TU/kg、小於9.2x108 TU/kg、小於9.1x108 TU/kg、小於9.0x108 TU/kg、小於8.9x108 TU/kg、小於8.8x108 TU/kg、小於8.7x108 TU/kg、小於8.6x108 TU/kg、小於8.5x108 TU/kg、小於8.4x108 TU/kg、小於8.3x108 TU/kg、小於8.2x108 TU/kg、小於8.1x108 TU/kg、小於8.0x108 TU/kg、小於7.9x108 TU/kg、小於7.8x108 TU/kg、小於7.7x108 TU/kg、小於7.6x108 TU/kg、小於7.5x108 TU/kg、小於7.4x108 TU/kg、小於7.3x108 TU/kg、小於7.2x108 TU/kg、小於7.1x108 TU/kg、小於7.0x108 TU/kg、小於6.9x108 TU/kg、小於6.8x108 TU/kg、小於6.7x108 TU/kg、小於6.6x108 TU/kg、小於6.5x108 TU/kg、小於6.4x108 TU/kg、小於6.3x108 TU/kg、小於6.2x108 TU/kg、小於6.1x108 TU/kg、小於6.0x108 TU/kg、小於5.9x108 TU/kg、小於5.8x108 TU/kg、小於5.7x108 TU/kg、小於5.6x108 TU/kg、小於5.5x108 TU/kg、小於5.4x108 TU/kg、小於5.3x108 TU/kg、小於5.2x108 TU/kg、小於5.1x108 TU/kg、小於5.0x108 TU/kg、小於4.9x108 TU/kg、小於4.8x108 TU/kg、小於4.7x108 TU/kg、小於4.6x108 TU/kg、小於4.5x108 TU/kg、小於4.4x108 TU/kg、小於4.3x108 TU/kg、小於4.2x108 TU/kg、小於4.1x108 TU/kg、小於4.0x108 TU/kg、小於3.9x108 TU/kg、小於3.8x108 TU/kg、小於3.7x108 TU/kg、小於3.6x108 TU/kg、小於3.5x108 TU/kg、小於3.4x108 TU/kg、小於3.3x108 TU/kg、小於3.2x108 TU/kg、小於3.1x108 TU/kg、小於3.0x108 TU/kg、小於2.9x108 TU/kg、小於2.8x108 TU/kg、小於2.7x108 TU/kg、小於2.6x108 TU/kg、小於2.5x108 TU/kg、小於2.4x108 TU/kg、小於2.3x108 TU/kg、小於2.2x108 TU/kg、小於2.1x108 TU/kg、小於2.0x108 TU/kg、小於1.9x108 TU/kg、小於1.8x108 TU/kg、小於1.7x108 TU/kg、小於1.6x108 TU/kg、小於1.5x108 TU/kg、小於1.4x108 TU/kg、小於1.3x108 TU/kg、小於1.2x108 TU/kg、小於1.1x108 TU/kg、或小於1.0x108 TU/kg。
在一些實施例中，劑量在1x108 TU/kg與5x1010 TU/kg之間、在1.5x108 TU/kg與5x1010 TU/kg之間、在2x108 TU/kg與5x1010 TU/kg之間、在2.5x108 TU/kg與5x1010 TU/kg之間、在3x108 TU/kg與5x1010 TU/kg之間、在3.5x108 TU/kg與5x1010 TU/kg之間、在4x108 TU/kg與5x1010 TU/kg之間、在4.5x108 TU/kg與5x1010 TU/kg之間、在5x108 TU/kg與5x1010 TU/kg之間、在5.5x108 TU/kg與5x1010 TU/kg之間、在6x108 TU/kg與5x1010 TU/kg之間、在6.5x108 TU/kg與5x1010 TU/kg之間、在7x108 TU/kg與5x1010 TU/kg之間、在7.5x108 TU/kg與5x1010 TU/kg之間、在8x108 TU/kg與5x1010 TU/kg之間、在8.5x108 TU/kg與5x1010 TU/kg之間、在9x108 TU/kg與5x1010 TU/kg之間、在9.5x108 TU/kg與5x1010 TU/kg之間、在1x109 TU/kg與5x1010 TU/kg之間、在1.5x109 TU/kg與5x1010 TU/kg之間、在2x109 TU/kg與5x1010 TU/kg之間、在2.5x109 TU/kg與5x1010 TU/kg之間、在3x109 TU/kg與5x1010 TU/kg之間、在3.5x109 TU/kg與5x1010 TU/kg之間、在4x109 TU/kg與5x1010 TU/kg之間、在4.5x109 TU/kg與5x1010 TU/kg之間、在5x109 TU/kg與5x1010 TU/kg之間、在5.5x109 TU/kg與5x1010 TU/kg之間、在6x109 TU/kg與5x1010 TU/kg之間、在6.5x109 TU/kg與5x1010 TU/kg之間、在7x109 TU/kg與5x1010 TU/kg之間、在7.5x109 TU/kg與5x1010 TU/kg之間、在8x109 TU/kg與5x1010 TU/kg之間、在8.5x109 TU/kg與5x1010 TU/kg之間、在9x109 TU/kg與5x1010 TU/kg之間、在9.5x109 TU/kg與5x1010 TU/kg之間、在1010 TU/kg與5x1010 TU/kg之間、在1.5x1010 TU/kg與5x1010 TU/kg之間、在2x1010 TU/kg與5x1010 TU/kg之間、在2.5x1010 TU/kg與5x1010 TU/kg之間、在3x1010 TU/kg與5x1010 TU/kg之間、在3.5x1010 TU/kg與5x1010 TU/kg之間、在4x1010 TU/kg與5x1010 TU/kg之間、或在4.5x1010 TU/kg與5x1010 TU/kg之間。
在一些實施例中，劑量在1x108 TU/kg與5x1010 TU/kg之間、在1x108 TU/kg與4.5x1010 TU/kg之間、在1x108 TU/kg與4x1010 TU/kg之間、在1x108 TU/kg與3.5x1010 TU/kg之間、在1x108 TU/kg與3x1010 TU/kg之間、在1x108 TU/kg與2.5x1010 TU/kg之間、在1x108 TU/kg與2x1010 TU/kg之間、在1x108 TU/kg與1.5x1010 TU/kg之間、在1x108 TU/kg與1010 TU/kg之間、在1x108 TU/kg與9x109 TU/kg之間、在1x108 TU/kg與8.5x109 TU/kg之間、在1x108 TU/kg與8x109 TU/kg之間、在1x108 TU/kg與7.5x109 TU/kg之間、在1x108 TU/kg與7x109 TU/kg之間、在1x108 TU/kg與6.5x109 TU/kg之間、在1x108 TU/kg與6x109 TU/kg之間、在1x108 TU/kg與5.5x109 TU/kg之間、在1x108 TU/kg與5x109 TU/kg之間、在1x108 TU/kg與4.5x109 TU/kg之間、在1x108 TU/kg與4x109 TU/kg之間、在1x108 TU/kg與3.5x109 TU/kg之間、在1x108 TU/kg與3x109 TU/kg之間、在1x108 TU/kg與2.5x109 TU/kg之間、在1x108 TU/kg與2x109 之間、在1x108 TU/kg與1.5x109 TU/kg之間、在1x108 TU/kg與1x109 TU/kg之間、在1x108 TU/kg與9.5x108 TU/kg之間、在1x108 TU/kg與9x108 TU/kg之間、在1x108 TU/kg與8.5x108 TU/kg之間、在1x108 TU/kg與8x108 TU/kg之間、在1x108 TU/kg與7.5x108 TU/kg之間、在1x108 TU/kg與7x108 TU/kg之間、在1x108 TU/kg與6.5x108 TU/kg之間、在1x108 TU/kg與6x108 TU/kg之間、在1x108 TU/kg與5.5x108 TU/kg之間、在1x108 TU/kg與5x108 TU/kg之間、在1x108 TU/kg與4.5x108 TU/kg之間、在1x108 TU/kg與4x108 TU/kg之間、在1x108 TU/kg與3.5x108 TU/kg之間、在1x108 TU/kg與3x108 TU/kg之間、在1x108 TU/kg與2.5x108 TU/kg之間、在1x108 TU/kg與2x108 之間、或在1x108 TU/kg與1.5x108 TU/kg之間。
在一些實施例中，劑量在1x1010 TU/kg與2x1010 TU/kg之間、在1.1x1010 TU/kg與1.9x1010 TU/kg之間、在1.2x1010 TU/kg與1.8x1010 TU/kg之間、在1.3x1010 TU/kg與1.7x1010 TU/kg之間、或在1.4x1010 TU/kg與1.6x1010 TU/kg之間。在一些實施例中，劑量為約1.5x1010 TU/kg。在一些實施例中，劑量為1.5x1010 TU/kg。
在一些實施例中，劑量在1x109 TU/kg與2x109 TU/kg之間、在1.1x109 TU/kg與1.9x109 TU/kg之間、在1.2x109 TU/kg與1.8x109 TU/kg之間、在1.3x109 TU/kg與1.7x109 TU/kg之間、或在1.4x109 TU/kg與1.6x109 TU/kg之間。在一些實施例中，劑量為1.5x109 TU/kg。在某些實施例中，劑量為約3.0 x 109 TU/kg。
在一些實施例中，相對於投予了對照慢病毒載體的受試者中的血漿FVIII活性，在投予本公開文本的慢病毒載體後24小時、36小時或48小時的血漿FVIII活性增加。在一些實施例中，相對於投予了對照核酸分子的受試者中的血漿FVIII活性，在投予本公開文本的慢病毒載體後24小時、36小時或48小時的血漿FVIII活性增加。
在一些實施例中，相對於投予了對照慢病毒載體的受試者中的血漿FIX活性，在投予本公開文本的慢病毒載體後24小時、36小時或48小時的血漿FIX活性增加。在一些實施例中，相對於投予了對照核酸分子的受試者中的血漿FIX活性，在投予本公開文本的慢病毒載體後24小時、36小時或48小時的血漿FIX活性增加。
在一些實施例中，相對於投予了對照慢病毒載體或對照核酸分子的受試者，在投予本公開文本的慢病毒載體後約6小時、約12小時、約18小時、約24小時、約36小時、約48小時、約3天、約4天、約5天、約6天、約7天、約8天、約9天、約10天、約11天、約12天、約13天、約14天天、約15天、約16天、約17天、約18天、約19天、約20天、約21天、約22天、約23天、約24天、約25天、約26天、約27天或約28天，血漿FVIII或血漿FIX活性增加。
在一些實施例中，關於受試者中的基礎水準，相對於投予了對照慢病毒載體或對照核酸分子的受試者中的水準，受試者中的血漿FVIII或血漿FIX活性增加了至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約11倍、至少約12倍、至少約13倍、至少約14倍、至少約15倍、至少約20倍、至少約25倍、至少約30倍、至少約35倍、至少約40倍、至少約45倍、至少約50倍、至少約55倍、至少約60倍、至少約65倍、至少約70倍、至少約75倍、至少約80倍、至少約85倍、至少約90倍、至少約95倍、至少約100倍、至少約110倍、至少約120倍、至少約130倍、至少約140倍、至少約150倍、至少約160倍、至少約170倍、至少約180倍、至少約190倍、或至少約200倍。
在一些實施例中，慢病毒載體以單劑量或多劑量投予。在一些實施例中，慢病毒載體劑量被一次投予或分成多個亞劑量，例如兩個亞劑量、三個亞劑量、四個亞劑量、五個亞劑量、六個亞劑量或多於六個亞劑量。在一些實施例中，投予多於一種慢病毒載體。
在一些實施例中，將慢病毒載體的劑量重複投予至少兩次、至少三次、至少四次、至少五次、至少六次、至少七次、至少八次、至少九次、或至少十次。在一些實施例中，慢病毒載體經由靜脈內注射投予。
在一些實施例中，受試者是小兒科受試者。在一些實施例中，受試者是成人受試者。
在一些實施例中，慢病毒載體包含至少一種組織特異性啟動子，即將調節具有FVIII活性的多肽或具有FIX活性的多肽在特定組織或細胞類型中的表現的啟動子。在一些實施例中，慢病毒載體中的組織特異性啟動子選擇性增強具有FVIII活性的多肽在靶肝細胞中的表現。在一些實施例中，選擇性增強具有FVIII活性的多肽在靶肝細胞中的表現的組織特異性啟動子包括mTTR啟動子。在一些實施例中，選擇性增強具有FIX活性的多肽在靶肝細胞中的表現的組織特異性啟動子包括APOA2啟動子、SERPINA1（hAAT）啟動子、mTTR啟動子、MIR122啟動子、ET啟動子（GenBank號AY661265；還參見Vigna等人,Molecular Therapy 11(5) :763 (2005)）或其任何組合。在一些實施例中，靶肝細胞是肝細胞。
由於慢病毒載體可以轉導所有肝細胞類型，因此可以通過在慢病毒載體中使用不同的啟動子來控制基因轉殖（例如，FVIII或FIX）在不同細胞類型中的表現。因此，慢病毒載體可包含將控制FVIII基因轉殖或FIX基因轉殖在不同組織或細胞類型（如不同肝組織或細胞類型）中的表現的特異性啟動子。因此，在一些實施例中，慢病毒載體可包含將控制FVIII基因轉殖或FIX基因轉殖在肝內皮組織中的表現的內皮特異性啟動子、或將控制FVIII基因轉殖或FIX基因轉殖在肝細胞中的表現的肝細胞特異性啟動子、或二者。
在一些實施例中，慢病毒載體包含控制FVIII基因轉殖或FIX基因轉殖在除肝臟以外的組織中的表現的一種或多種組織特異性啟動子。在一些實施例中，將分離的核酸分子穩定地整合到靶細胞或靶組織的基因組中，例如，在肝細胞的基因組中或在肝內皮細胞的基因組中。
在一些實施例中，本公開文本的慢病毒載體中的分離的核酸分子進一步包含編碼異源胺基酸序列（例如，半衰期延長劑）的異源核苷酸序列。在一些實施例中，異源胺基酸序列是免疫球蛋白恒定區或其部分、XTEN、轉鐵蛋白、白蛋白或PAS序列。在一些實施例中，異源胺基酸序列與由核苷酸序列編碼的胺基酸序列的N末端或C末端連接，或者在選自表2的一個或多個插入位點插入由核苷酸序列編碼的胺基酸序列中的兩個胺基酸之間。異源核苷酸序列在本文中進一步進行描述。
在一些實施例中，具有FVIII活性的多肽是人FVIII。在一些實施例中，具有FVIII活性的多肽是全長FVIII。在一些實施例中，具有FVIII活性的多肽是B結構域缺失的FVIII。
在一些實施例中，具有FIX活性的多肽是人FIX。在一些實施例中，具有FIX活性的多肽是全長FIX。在一些實施例中，具有FIX活性的多肽是人FIX的變異體。在某些實施例中，具有FIX活性的多肽是人FIX的R338L變異體。在某些實施例中，具有FIX活性的多肽是帕多瓦（Padua）變異體。
本文公開的慢病毒載體可以在哺乳動物（例如人類患者中）體內使用，使用基因治療方法治療選自以下的出血疾病或障礙將是治療上有益的：出血凝血障礙、關節積血、肌肉出血、口腔出血、出血症、出血至肌肉中、口腔出血症、創傷、頭部創傷、胃腸出血、顱內出血、腹內出血、胸腔內出血、骨折、中樞神經系統出血、咽後間隙出血、腹膜後間隙出血和髂腰肌鞘出血。在一個實施例中，出血疾病或障礙是血友病。在另一個實施例中，出血疾病或障礙是A型血友病。在另一個實施例中，出血疾病或障礙是B型血友病。
在一些實施例中，在投予至患者之前，將靶細胞（例如肝細胞）用本文公開的慢病毒載體進行體外處理。在某些實施例中，在投予至患者之前，將靶細胞（例如肝細胞）用本文公開的慢病毒載體進行體外處理。在又另一個實施例中，在投予至患者之前，將來自患者的細胞（例如肝細胞）用本文公開的慢病毒載體進行離體處理。
在一些實施例中，相對於生理上正常的循環FVIII水準，在投予本文公開的慢病毒載體（例如以1010 TU/kg或更低、109 TU/kg或更低、或108 TU/kg或更低投予）後，血漿FVIII活性增加了至少約100%、至少約110%、至少約120%、至少約130%、至少約140%、至少約150%、至少約160%、至少約170%、至少約180%、至少約190%、至少約200%、至少約210%、至少約220%、至少約230%、至少約240%、至少約250%、至少約260%、至少約270%、至少約280%、至少約290%、或至少約300%。
在一些實施例中，相對於生理上正常的循環FIX水準，在投予本文公開的慢病毒載體（例如以1010 TU/kg或更低、109 TU/kg或更低、或108 TU/kg或更低投予）後，血漿FIX活性增加了至少約100%、至少約110%、至少約120%、至少約130%、至少約140%、至少約150%、至少約160%、至少約170%、至少約180%、至少約190%、至少約200%、至少約210%、至少約220%、至少約230%、至少約240%、至少約250%、至少約260%、至少約270%、至少約280%、至少約290%、或至少約300%。
在一個實施例中，相對於生理上正常的循環FVIII水準，在投予本公開文本的慢病毒載體後，血漿FVIII活性增加了至少約3,000%至約5,000%。在一些實施例中，相對於投予了對照慢病毒載體或對照核酸分子的受試者，在投予本文所述的包含編碼具有因子VIII（FVIII）活性的多肽的密碼子優化基因的慢病毒載體後，血漿FVIII活性增加了至少約10倍、至少約20倍、至少約30倍、至少約40倍、至少約50倍、至少約60倍、至少約70倍、至少約80倍、至少約90倍、至少約100倍、至少約110倍、至少約120倍、至少約130倍、至少約140倍、至少約150倍、至少約160倍、至少約170倍、至少約180倍、至少約190倍、或至少約200倍。
在一個實施例中，相對於生理上正常的循環FIX水準，在投予本公開文本的慢病毒載體後，血漿FIX活性增加了至少約3,000%至約5,000%。在一些實施例中，相對於投予了對照慢病毒載體或對照核酸分子的受試者，在投予本文所述的包含編碼具有因子IX（FIX）活性的多肽的密碼子優化基因的慢病毒載體後，血漿FIX活性增加了至少約10倍、至少約20倍、至少約30倍、至少約40倍、至少約50倍、至少約60倍、至少約70倍、至少約80倍、至少約90倍、至少約100倍、至少約110倍、至少約120倍、至少約130倍、至少約140倍、至少約150倍、至少約160倍、至少約170倍、至少約180倍、至少約190倍、或至少約200倍。
本公開文本還提供了在有需要的受試者中治療、預防或改善止血障礙（例如，出血障礙如A型血友病或B型血友病）的方法，所述方法包括向所述受試者投予治療有效量的慢病毒載體，所述慢病毒載體包含含有編碼具有FVIII活性的多肽或具有FIX活性的多肽的核苷酸序列的分離的核酸分子。
通過本公開文本的慢病毒載體進行的治療、改善和預防可以是旁路療法。接受旁路療法的受試者可能已經產生針對凝血因子（例如，FVIII或FIX）的抑制劑，或者正在產生凝血因子抑制劑。
本公開文本的慢病毒載體通過促進纖維蛋白凝塊的形成治療或預防止血障礙。由本公開文本的核酸分子編碼的具有FVIII或FIX活性的多肽可以啟動凝血級聯的成員。凝血因子可以是外在途徑、內在途徑或二者的參與者。
本公開文本的慢病毒載體可以用於治療已知可用FVIII或FIX治療的止血障礙。可以使用本公開文本的方法治療的止血障礙包括但不限於A型血友病、B型血友病、血管性血友病、因子XI缺乏（PTA缺乏）、因子XII缺乏、以及纖維蛋白原、凝血酶原、因子V、因子VII、因子X或因子XIII的缺乏或結構異常、關節積血、肌肉出血、口腔出血、出血症、出血至肌肉中、口腔出血症、創傷、頭部創傷、胃腸出血、顱內出血、腹內出血、胸腔內出血、骨折、中樞神經系統出血、咽後間隙出血、腹膜後間隙出血和髂腰肌鞘出血。
用於投予至受試者的組合物包括慢病毒載體，所述慢病毒載體包含含有本公開文本的優化核苷酸序列的核酸分子，所述優化核苷酸序列編碼FVIII凝血因子或FIX凝血因子（用於基因療法應用）以及FVIII或FIX多肽分子。在一些實施例中，用於投予的組合物是在體內、體外或離體與本公開文本的慢病毒載體接觸的細胞。
在一些實施例中，止血障礙是遺傳性障礙。在一個實施例中，受試者患有A型血友病。在其他實施例中，止血障礙是缺乏FVIII的結果。在其他實施例中，止血障礙可能是缺陷性FVIII凝血因子的結果。在一個實施例中，受試者患有B型血友病。在其他實施例中，止血障礙是缺乏FIX的結果。在其他實施例中，止血障礙可能是缺陷性FIX凝血因子的結果。
在另一個實施例中，止血障礙可以是獲得性障礙。獲得性障礙可能源自潛在的繼發性疾病或病症。無關病症可以是（作為例子但不限制）癌症、自身免疫疾病或妊娠。獲得性障礙可能起因於衰老或起因於治療潛在繼發性障礙的藥物療法（例如，癌症化學療法）。
本公開文本還涉及治療未患止血障礙或導致獲得止血障礙的繼發性疾病或病症的受試者的方法。本公開文本因此涉及治療需要通用止血劑的受試者的方法，所述方法包括投予治療有效量的本公開文本的慢病毒載體。例如，在一個實施例中，需要通用止血劑的受試者正在進行或即將進行手術。本公開文本的慢病毒載體可以在手術之前或之後作為預防劑投予。
本公開文本的慢病毒載體可以在手術期間或之後投予以控制急性出血發作。手術可以包括但不限於肝移植、肝切除或幹細胞移植。
在另一個實施例中，本公開文本的慢病毒載體可以用於治療未患止血障礙的患有急性出血發作的受試者。急性出血發作可能起因於嚴重創傷（例如，手術）、車禍、傷口、槍擊撕裂（laceration gun shot）或導致不受控制的出血的任何其他創傷性事件。
慢病毒載體可以用於預防性治療患有止血障礙的受試者。慢病毒載體還可以用於治療患有止血障礙的受試者的急性出血發作。
在另一個實施例中，本文公開的慢病毒載體的投予和/或FVIII蛋白或FIX蛋白的後續表現在受試者中不誘導免疫反應。在一些實施例中，免疫反應包含產生針對FVIII或FIX的抗體。在一些實施例中，免疫反應包含細胞因子分泌。在一些實施例中，免疫反應包含啟動B細胞、T細胞或B細胞和T細胞二者。在一些實施例中，免疫反應是抑制性免疫反應，其中相對於未產生免疫反應的受試者中FVIII的活性，受試者的免疫反應降低FVIII蛋白的活性。在某些實施例中，通過投予本公開文本的慢病毒載體表現FVIII蛋白預防針對FVIII蛋白或從分離的核酸分子或慢病毒載體表現的FVIII蛋白的抑制性免疫反應。在一些實施例中，免疫反應是抑制性免疫反應，其中相對於未產生免疫反應的受試者中FIX的活性，受試者的免疫反應降低FIX蛋白的活性。在某些實施例中，通過投予本公開文本的慢病毒載體表現FIX蛋白預防針對FIX蛋白或從分離的核酸分子或慢病毒載體表現的FIX蛋白的抑制性免疫反應。
在一些實施例中，本公開文本的慢病毒載體與至少一種促進止血的其他藥劑組合投予。促進止血的所述其他藥劑是具有已證實的凝血活性的治療劑。作為例子但不限制，止血劑可以包括因子V、因子VII、因子IX、因子X、因子XI、因子XII、因子XIII、凝血酶原或纖維蛋白原或前述任一種的啟動形式。凝血因子或止血劑還可以包括抗纖維蛋白溶藥，例如ε-胺基己酸、胺甲環酸。
在本公開文本的一個實施例中，組合物（例如，慢病毒載體）是FVIII以可在投予至受試者時啟動的形式存在的組合物。在本公開文本的一個實施例中，組合物（例如，慢病毒載體）是FIX以可在投予至受試者時啟動的形式存在的組合物。這種可啟動的分子可以在投予至受試者後在體內於凝血位點被啟動。
本公開文本的慢病毒載體可以靜脈內、皮下、肌內投予，或經由任何粘膜表面投予，例如口服、 舌下、經頰、舌下、經鼻、經直腸、經陰道或經肺途徑投予。可以將慢病毒載體植入生物聚合物固相支援體內或與所述固相支援體連接，從而允許將載體緩慢釋放至所需位點。
在一個實施例中，慢病毒載體的投予途徑是腸胃外的。如本文所用的術語腸胃外包括靜脈內、動脈內、腹膜內、肌內、皮下、直腸或陰道投予。腸胃外投予的靜脈內形式是較佳的。雖然所有這些投予形式都明確地考慮在本公開文本的範圍內，但是投予形式可以是用於注射，特別是用於靜脈內或動脈內注射或滴注的溶液。通常，適於注射的醫藥組合物可以包含緩衝液（例如乙酸鹽、磷酸鹽或檸檬酸鹽緩衝液）、表面活性劑（例如聚山梨醇酯）、任選地穩定劑（例如人白蛋白）等。然而，在與本文的傳授內容相容的其他方法中，可以將慢病毒載體直接遞送至不良細胞群的位點，由此增加患病組織對治療劑的暴露。
用於腸胃外投予的製劑包括無菌的水性或非水性溶液、懸浮液和乳液。非水性溶劑的例子是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄欖油、以及可注射的有機酯如油酸乙酯。水性載劑包括水、醇性/水性溶液、乳液或懸浮液，包括鹽水和緩衝介質。在本公開文本中，醫藥上可接受的載劑包括但不限於0.01-0.1 M且較佳地0.05 M磷酸鹽緩衝液或0.8%鹽水。其他常見的腸胃外媒劑包括磷酸鈉溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化鈉、乳酸林格氏液或不揮發油。靜脈內媒劑包括流體和營養補充劑、電解質補充劑（如基於林格氏右旋糖的那些）等。也可以存在防腐劑和其他添加劑，如例如抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑和惰性氣體等。
更具體地，適用於注射使用的醫藥組合物包括無菌的水性溶液（在水溶性的情況下）或分散體、以及用於臨時製備無菌可注射溶液或分散體的無菌粉末。在此類情況下，組合物必須是無菌的並且應當是易於注射的程度的流體。其應在製造和儲存條件下穩定，並且將較佳地抵抗微生物（如細菌和真菌）的污染作用而保存。載劑可以是溶劑或分散介質，所述溶劑或分散介質含有例如水、乙醇、多元醇（例如，甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等）及其合適的混合物。可以例如通過以下方式維持適當流動性：通過使用包衣如卵磷脂，在分散體情況下通過維持所需粒徑，以及通過使用表面活性劑。
防止微生物的作用可以通過各種抗細菌以及抗真菌劑，例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗壞血酸、硫柳汞等來實現。在許多情況下，較佳在組合物中包含等滲劑，例如糖、多元醇（如甘露糖醇、山梨糖醇）或氯化鈉。可注射組合物的延長吸收可以通過在所述組合物中包含延遲吸收的藥劑（例如單硬脂酸鋁和明膠）來實現。
在任何情況下，無菌可注射溶液可以通過以下方式製備：將活性化合物（例如，多肽自身或與其他活性劑組合）以所需量併入視需要具有上文所列舉成分中的一種或組合的適當溶劑中，之後過濾滅菌。通常，分散體是通過以下方式來製備：將活性化合物併入無菌媒劑中，所述媒劑含有基礎分散介質和來自上文所列舉的那些成分的所需其他成分。在用於製備無菌可注射溶液的無菌粉末的情況下，較佳製備方法為真空乾燥和冷凍乾燥，所述真空乾燥和冷凍乾燥由先前無菌過濾的溶液產生活性成分和任何另外所需成分的粉末。將用於注射的製劑處理，填充至容器如安瓿、袋子、瓶子、注射器或小瓶中，並根據業內已知的方法在無菌條件下密封。此外，製劑可以以套組的形式包裝和出售。此類製品較佳具有標籤或包裝說明書，其指示相關組合物可用於治療罹患或易患凝血障礙的受試者。
醫藥組合物還可以經配製用於作為例如含有常規栓劑基質（如可可脂或其他甘油酯）的栓劑或保留灌腸劑經直腸投予。
用於治療病症的本公開文本的組合物的有效劑量根據許多不同因素而變化，所述因素包括投予方式、靶位點、患者的生理狀態、患者是人還是動物、所投予的其他藥物以及治療是預防性的還是治療性的。通常，患者是人，但也可以治療非人哺乳動物，包括基因轉殖哺乳動物。治療劑量可以使用熟習此項技術者已知的常規方法逐步增加，以優化安全性和功效。
慢病毒載體可以以單劑量或多劑量投予，其中多劑量可以連續或以特定的時間間隔投予。可以採用體外測定來確定用於投予的最佳劑量範圍和/或時間計畫。測量凝血因子活性的體外測定是業內已知的。另外，可以從獲自動物模型（例如血友病犬）的劑量-反應曲線外推有效劑量（Mount等人2002, Blood 99 (8): 2670）。
在上述範圍內的中間劑量也旨在處於本公開文本的範圍內。可以每日、隔日、每週或按根據經驗分析確定的任何其他時間計畫向受試者投予此類劑量。示例性治療使得需要在例如至少六個月的延長時段內以多劑量投予。
可以在多個時機投予本公開文本的慢病毒載體。單個劑量之間的間隔可以是每日、每週、每月或每年。如通過測量患者中經修飾的多肽或抗原的血液水準所指示，間隔也可以是不規律的。本公開文本的慢病毒載體的劑量和頻率根據由基因轉殖編碼的FVIII多肽或FIX多肽在患者體內的半衰期而變化。
本公開文本的慢病毒載體的投予的劑量和頻率可以根據治療是預防性的還是治療性的而變化。在預防性應用中，將含有本公開文本的慢病毒載體的組合物投予至尚未處於疾病狀態的患者，以增強患者的抵抗力或使疾病的影響最小化。將這種量定義為「預防有效劑量」。以相對不頻繁的間隔在長時間段內投予相對低的劑量。一些患者在餘生持續接受治療。
本公開文本的慢病毒載體可以任選地與在需要治療（例如，預防性或治療性）的障礙或病症的治療中有效的其他藥劑組合投予。
如本文所用，與輔助療法結合或組合的本公開文本的慢病毒載體的投予意指依序、同時、同延、並行、伴隨或同期投予或施用所述療法和所公開多肽。熟習此項技術者應瞭解，組合治療方案中各種組分的投予或施用可以定時以增強治療的整體有效性。基於所選輔助療法和本說明書的傳授內容，熟習此項技術者（例如，醫師）在不進行過度實驗的情況下便能夠容易地辨別有效的組合治療方案。
應進一步瞭解，本公開文本的慢病毒載體可以與一種或多種藥劑結合或組合使用（例如，以提供組合治療方案）。可以與本公開文本的慢病毒載體組合的示例性藥劑包括代表用於所治療的特定障礙的當前護理標準的藥劑。此類藥劑在本質上可以是化學的或生物的。術語「生物劑（biologic）」或「生物劑（biologic agent）」是指預期用作治療劑的從活的生物體和/或其產物製備的任何醫藥活性劑。
要與本公開文本的慢病毒載體組合使用的藥劑的量可以隨受試者變化，或者可以根據業內的知識來投予。參見例如，Bruce A Chabner等人,Antineoplastic Agents, 於Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics 1233-1287（Joel G. Hardman等人編輯, 第9版 1996）。在另一個實施例中，投予符合護理標準的量的這種藥劑。
在某些實施例中，本公開文本的慢病毒載體與免疫抑制劑、抗過敏劑或抗炎劑結合投予。這些藥劑通常是指起到抑制或掩蔽本文所治療的受試者的免疫系統的作用的物質。這些藥劑包括抑制細胞因子產生、下調或抑制自身抗原表現或掩蔽MHC抗原的物質。此類藥劑的例子包括2-胺基-6-芳基-5-取代的嘧啶；硫唑嘌呤；環磷醯胺；溴麥角環肽；達那唑；胺苯碸；戊二醛；MHC抗原和MHC片段的抗獨特型抗體；環孢菌素A；類固醇如糖皮質激素，例如潑尼松、甲潑尼龍和地塞米松；細胞因子或細胞因子受體拮抗劑，包括抗干擾素-γ、-β或-α抗體、抗腫瘤壞死因子-α抗體、抗腫瘤壞死因子-β抗體、抗介白素-2抗體和抗IL-2受體抗體；抗LFA-1抗體，包括抗CD11a和抗CD18抗體；抗L3T4抗體；異源抗淋巴細胞球蛋白；全T抗體；含有LFA-3結合結構域的可溶性肽；鏈激酶；TGF-β；鏈道酶；FK506；RS-61443；去氧精胍菌素和雷帕黴素。在某些實施例中，藥劑是抗組胺劑。如本文所用，「抗組胺劑」是拮抗組胺的生理作用的藥劑。抗組胺劑的例子是氯苯那敏、苯海拉明、異丙嗪、色甘酸鈉、阿司咪唑（astemizole）、馬來酸阿紮他定（azatadine）、馬來酸溴苯那敏（bropheniramine）、馬來酸卡比沙明（carbinoxamine）、鹽酸西替利嗪（cetirizine）、富馬酸氯馬斯汀（clemastine）、鹽酸塞庚啶（cyproheptadine）、馬來酸右溴苯那敏、馬來酸右氯苯那敏、茶苯海明（dimenhydrinate）、鹽酸苯海拉明（diphenhydramine）、琥珀酸多西拉敏（doxylamine）、鹽酸非索非那定（fexofendadine）、鹽酸特非那定（terphenadine）、鹽酸羥嗪、氯雷他定（loratidine）、鹽酸美克洛嗪（meclizine）、檸檬酸曲吡那敏（tripelannamine）、鹽酸曲吡那敏（tripelennamine）和鹽酸曲普利啶（triprolidine）。
可以將免疫抑制劑、抗過敏劑或抗炎劑併入慢病毒載體投予方案中。例如，免疫抑制劑或抗炎劑的投予可以在所公開的慢病毒載體的投予之前開始，並且此後可以繼續投予一個或多個劑量。在某些實施例中，將免疫抑制劑或抗炎劑作為慢病毒載體的前驅藥物進行投予。
如先前所討論，本公開文本的慢病毒載體可以以醫藥有效量投予，以用於凝血障礙的體內治療。在這一方面，應當理解，本公開文本的慢病毒載體可以被配製成有利於投予且促進活性劑的穩定性。較佳地，根據本公開文本的醫藥組合物包含醫藥上可接受的、無毒的、無菌載劑，如生理鹽水、無毒緩衝液、防腐劑等。當然，本公開文本的醫藥組合物可以以單劑量或多劑量投予，以提供醫藥有效量的多肽。
多種測試可用於評估凝血系統的功能：啟動部分促凝血酶原激酶時間（aPTT）測試、生色測定、ROTEM® 測定、凝血酶原時間（PT）測試（也用於確定INR）、纖維蛋白原測試（通常通過克勞斯法（Clauss method）進行）、血小板計數、血小板功能測試（通常通過PFA-100進行）、TCT、出血時間、混合測試（如果將患者的血漿與正常血漿混合，是否矯正異常）、凝血因子測定、抗磷脂抗體、D-二聚體、遺傳測試（例如，因子V Leiden、凝血酶原突變G20210A）、稀釋魯塞爾蝰蛇毒時間（dRVVT）、雜項血小板功能測試、凝血彈性描記法（TEG或Sonoclot）、凝血彈性測定法（TEM® ，例如ROTEM® ）或優球蛋白溶解時間（ELT）。
aPTT測試是測量「內在」（也稱為接觸啟動途徑）和常見凝血途徑二者的功效的表現指標。這個測試一般用於測量市售重組凝血因子（例如，FVIII或FIX）的凝血活性。其與測量外在途徑的凝血酶原時間（PT）結合使用。
ROTEM® 分析提供關於止血的整體動力學的資訊：凝血時間、凝塊形成、凝塊穩定性和溶解。凝血彈性測定法中的不同參數依賴於血漿凝血系統的活性、血小板功能、纖維蛋白溶解或影響這些相互作用的許多因素。這個測定可以提供次級止血的全面見解。
B.2.組織特異性表現
在某些實施例中，有用的是在慢病毒載體內包括一個或多個miRNA靶序列，所述miRNA靶序列例如與優化FVIII基因轉殖可操作地連接。因此，本公開文本還提供了至少一個與優化FVIII或優化FIX核苷酸序列可操作地連接或以其他方式插入慢病毒載體內的miRNA序列靶標。慢病毒載體中包括的多於一個拷貝的miRNA靶序列可以增加系統的有效性。
還包括不同miRNA靶序列。例如，表現多於一種基因轉殖的慢病毒載體可以具有在多於一個可以相同或不同的miRNA靶序列控制下的基因轉殖。miRNA靶序列可以是串聯的，但是也包括其他排列。含有miRNA靶序列的基因轉殖表現盒也能以反義定向插入慢病毒載體內。反義定向可用於產生病毒顆粒，以避免原本可能對生產細胞有毒的基因產物的表現。
在其他實施例中，慢病毒載體包含1、2、3、4、5、6、7或8個拷貝的相同或不同的miRNA靶序列。在某些實施例中，慢病毒載體不包括任何miRNA靶序列。是否要包括miRNA靶序列（以及數量）的選擇將依據已知參數如計畫的組織靶標、所需的表現水準等來指導。
在一個實施例中，靶序列是miR-223靶標，已經報導其可在骨髓定向祖細胞中最有效地阻斷表現，以及在更原始的HSPC中至少部分阻斷表現。miR-223靶標可以在分化的髓樣細胞（包括粒細胞、單核細胞、巨噬細胞、髓樣樹突細胞）中阻斷表現。miR-223靶標還可以適於依賴於淋巴或紅細胞譜系中的穩健基因轉殖表現的基因療法應用。miR-223靶標還可以在人HSC中非常有效地阻斷表現。
在另一個實施例中，靶序列是miR142靶標（tccataaagtaggaaacactaca（SEQ ID NO: 7））。在一個實施例中，慢病毒載體包含4個拷貝的miR-142靶序列。在某些實施例中，將造血特異性微小RNA（如miR-142（142T））的互補序列併入慢病毒載體的3'非翻譯區中，使得編碼基因轉殖的轉錄物易發生miRNA介導的下調。通過這種方法，可以在造血譜系抗原呈遞細胞（APC）中防止基因轉殖表現，同時在非造血細胞中維持所述基因轉殖表現（Brown等人, Nat Med 2006）。這種策略可以對基因轉殖表現施加嚴格的轉錄後控制，並且由此使得能夠穩定遞送和長期表現基因轉殖。在一些實施例中，miR-142調節防止經轉導細胞的免疫介導的清除和/或誘導抗原特異性調節T細胞（T reg），並且介導對基因轉殖編碼抗原的穩健的免疫耐受。
在一些實施例中，靶序列是miR181靶標。Chen C-Z和Lodish H, Seminars in Immunology (2005) 17(2):155-165披露了miR-181，它是在小鼠骨髓內的B細胞中特異性表現的miRNA（Chen和Lodish, 2005）。所述文獻還披露，一些人miRNA與白血病相關。
靶序列可以與miRNA完全或部分互補。術語「完全互補」意指，靶序列的核酸序列與識別所述靶序列的miRNA的序列100%互補。術語「部分互補」意指，靶序列與識別所述靶序列的miRNA的序列僅部分互補，借此部分互補的序列仍然被miRNA識別。換句話說，在本公開文本的上下文中，部分互補的靶序列有效識別相應miRNA，並且實現在表現該miRNA的細胞中防止或減少基因轉殖表現。miRNA靶序列的例子描述於以下文獻中：WO 2007/000668、WO 2004/094642、WO 2010/055413或WO 2010/125471，將上述文獻通過引用以其整體併入本文。
B.3.異源核苷酸序列
在一些實施例中，分離的核酸分子進一步包含異源核苷酸序列。在一些實施例中，分離的核酸分子進一步包含至少一個異源核苷酸序列。異源核苷酸序列可以在5'端、3'端與本公開文本的FVIII或FIX編碼序列連接，或者插入中間中。因此，在一些實施例中，由異源核苷酸序列編碼的異源胺基酸序列與由核苷酸序列編碼的FVIII胺基酸序列或FIX胺基酸序列的N末端或C末端連接，或者插入所述FVIII胺基酸序列或所述FIX胺基酸序列中的兩個胺基酸之間。在一些實施例中，異源胺基酸序列可以在選自表2的一個或多個插入位點插入FVIII多肽的兩個胺基酸之間。在一些實施例中，異源胺基酸序列可以在以下文獻中披露的任何位點處插入由本公開文本的核酸分子編碼的FVIII多肽內：國際公開號WO 2013/123457 A1和WO 2015/106052 A1或美國公開號2015/0158929 A1，將上述文獻通過引用以其整體併入本文。
在一些實施例中，由異源核苷酸序列編碼的異源胺基酸序列插入B結構域或其片段內。在一些實施例中，異源胺基酸序列緊鄰對應於成熟人FVIII（SEQ ID NO: 4）的胺基酸745的胺基酸的下游插入FVIII內。在一個特定實施例中，FVIII包含對應於成熟人FVIII（SEQ ID NO: 4）的胺基酸746-1646的缺失，並且由異源核苷酸序列編碼的異源胺基酸序列緊鄰對應於成熟人FVIII（SEQ ID NO: 4）的胺基酸745的下游插入。
表 2 ： 異源部分插入位點
插入 位點 結構域   插入位點 結構域   插入 位點 結構域
3 A1   375 A2   1749 A3
18 A1   378 A2   1796 A3
22 A1   399 A2   1802 A3
26 A1   403 A2   1827 A3
40 A1   409 A2   1861 A3
60 A1   416 A2   1896 A3
65 A1   442 A2   1900 A3
81 A1   487 A2   1904 A3
116 A1   490 A2   1905 A3
119 A1   494 A2   1910 A3
130 A1   500 A2   1937 A3
188 A1   518 A2   2019 A3
211 A1   599 A2   2068 C1
216 A1   603 A2   2111 C1
220 A1   713 A2   2120 C1
224 A1   745 B   2171 C2
230 A1   1656 a3區域   2188 C2
333 A1   1711 A3   2227 C2
336 A1   1720 A3   2332 CT
339 A1   1725 A3      
注意： 插入位點指示對應於成熟人FVIII（SEQ ID NO: 4）的胺基酸位置的胺基酸位置。
在其他實施例中，分離的核酸分子進一步包含2個、3個、4個、5個、6個、7個或8個異源核苷酸序列。在一些實施例中，所有異源核苷酸序列是相同的。在一些實施例中，至少一個異源核苷酸序列與其他異源核苷酸序列不同。在一些實施例中，本公開文本可以包含2個、3個、4個、5個、6個或多於7個串聯的異源核苷酸序列。
在一些實施例中，異源核苷酸序列編碼胺基酸序列。在一些實施例中，由異源核苷酸序列編碼的胺基酸序列是可以增加FVIII分子的半衰期的異源部分（「半衰期延長劑」）。
在一些實施例中，異源部分是具有非結構化或結構化特徵的肽或多肽，所述特徵在併入本公開文本的蛋白質中時與體內半衰期的延長相關。非限制性例子包括白蛋白、白蛋白片段、免疫球蛋白的Fc片段、人絨毛膜促性腺激素的β亞基的C末端肽（CTP）、HAP序列、XTEN序列、轉鐵蛋白或其片段、PAS多肽、聚甘胺酸連接子、聚絲胺酸連接子、白蛋白結合部分或者這些多肽的任何片段、衍生物、變異體或組合。在一個特定實施例中，異源胺基酸序列是免疫球蛋白恒定區或其部分、轉鐵蛋白、白蛋白或PAS序列。
在一些方面中，異源部分包括血管性血友病因子或其片段。在其他相關方面中，異源部分可以包括非多肽部分的附著位點（例如，半胱胺酸胺基酸），所述非多肽部分是如聚乙二醇（PEG）、羥乙基澱粉（HES）、聚唾液酸或者這些元件的任何衍生物、變異體或組合。在一些方面中，異源部分包含用作非多肽部分的附著位點的半胱胺酸胺基酸，所述非多肽部分是例如聚乙二醇（PEG）、羥乙基澱粉（HES）、聚唾液酸或者這些元件的任何衍生物、變異體或組合。
在一個具體實施例中，第一異源核苷酸序列編碼為業內已知的半衰期延長分子的第一異源部分，並且第二異源核苷酸序列編碼也可以為業內已知的半衰期延長分子的第二異源部分。在某些實施例中，第一異源部分（例如，第一Fc部分）和第二異源部分（例如，第二Fc部分）彼此締合形成二聚體。在一個實施例中，第二異源部分是第二Fc部分，其中第二Fc部分與第一異源部分（例如，第一Fc部分）連接或締合。例如，第二異源部分（例如，第二Fc部分）可以通過連接子連接至第一異源部分（例如，第一Fc部分），或者通過共價或非共價鍵與第一異源部分締合。
在一些實施例中，異源部分是如下多肽，其包含至少約10個、至少約100個、至少約200個、至少約300個、至少約400個、至少約500個、至少約600個、至少約700個、至少約800個、至少約900個、至少約1000個、至少約1100個、至少約1200個、至少約1300個、至少約1400個、至少約1500個、至少約1600個、至少約1700個、至少約1800個、至少約1900個、至少約2000個、至少約2500個、至少約3000個或至少約4000個胺基酸，基本上由所述胺基酸組成，或由所述胺基酸組成。
在其他實施例中，異源部分是如下多肽，其包含約100個至約200個胺基酸、約200個至約300個胺基酸、約300個至約400個胺基酸、約400個至約500個胺基酸、約500個至約600個胺基酸、約600個至約700個胺基酸、約700個至約800個胺基酸、約800個至約900個胺基酸或約900個至約1000個胺基酸，基本上由所述胺基酸組成，或由所述胺基酸組成。
在某些實施例中，異源部分改善FVIII或FIX蛋白的一種或多種藥物代謝動力學特性，但不顯著影響其生物學活性或功能。
在某些實施例中，異源部分增加本公開文本的FVIII或FIX蛋白的體內和/或體外半衰期。在其他實施例中，異源部分有助於本公開文本的FVIII或FIX蛋白或其片段（例如，在FVIII或FIX蛋白的蛋白質水解切割後包含異源部分的片段）的視覺化或定位。本公開文本的FVIII或FIX蛋白或其片段的視覺化和/或定位可以是體內的、體外的、離體的或其組合。
在其他實施例中，異源部分增加本公開文本的FVIII或FIX蛋白或其片段（例如，在FVIII或FIX蛋白的蛋白質水解切割後包含異源部分的片段）的穩定性。如本文所用，術語「穩定性」是指業內公認的回應環境條件（例如升高或降低的溫度）維持FVIII或FIX蛋白的一種或多種物理特性的量度。在某些方面中，物理特性可以是維持FVIII或FIX蛋白的共價結構（例如，不存在蛋白質水解切割、不期望的氧化或脫醯胺作用）。在其他方面，物理特性也可以是處於正確折疊狀態的FVIII或FIX蛋白的存在（例如，不存在可溶性或不溶性聚集體或沈澱物）。
在一方面，FVIII或FIX蛋白的穩定性是通過測定FVIII或FIX蛋白的生物物理特性來測量，所述生物物理特性例如熱穩定性、pH解折疊譜、糖基化的穩定去除、溶解度、生化功能（例如，結合至蛋白質、受體或配體的能力）等和/或其組合。在另一方面，通過相互作用的結合親和力證明生化功能。在一方面，蛋白質穩定性的量度是熱穩定性，即對熱激發的抗性。穩定性可以使用業內已知的方法來測量，如HPLC（高效液相層析）、SEC（尺寸排阻層析）、DLS（動態光散射）等。測量熱穩定性的方法包括但不限於差式掃描量熱法（DSC）、差式掃描螢光測定法（DSF）、圓二色性（CD）和熱激發測定。
在某些方面中，由本公開文本的核酸分子編碼的FVIII或FIX蛋白包含至少一種半衰期延長劑，即關於缺少這種異源部分的相應FVIII或FIX蛋白的體內半衰期增加FVIII或FIX蛋白的體內半衰期的異源部分。FVIII或FIX蛋白的體內半衰期可以通過熟習此項技術者已知的任何方法來確定，例如活性測定（生色測定或一步式凝血aPTT測定）、ELISA、ROTEMTM 等。
在一些實施例中，一種或多種半衰期延長劑的存在導致FVIII或FIX蛋白的半衰期與缺少這一種或多種半衰期延長劑的相應蛋白質的半衰期相比有所增加。包含半衰期延長劑的FVIII或FIX蛋白的半衰期比缺少這種半衰期延長劑的相應FVIII或FIX蛋白的體內半衰期長至少約1.5倍、至少約2倍、至少約2.5倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約11倍或至少約12倍。
在一個實施例中，包含半衰期延長劑的FVIII或FIX蛋白的半衰期比缺少這種半衰期延長劑的相應蛋白質的體內半衰期長約1.5倍至約20倍、約1.5倍至約15倍或約1.5倍至約10倍。在另一個實施例中，與缺少這種半衰期延長劑的相應蛋白質的體內半衰期相比，包含半衰期延長劑的FVIII或FIX蛋白的半衰期延長約2倍至約10倍、約2倍至約9倍、約2倍至約8倍、約2倍至約7倍、約2倍至約6倍、約2倍至約5倍、約2倍至約4倍、約2倍至約3倍、約2.5倍至約10倍、約2.5倍至約9倍、約2.5倍至約8倍、約2.5倍至約7倍、約2.5倍至約6倍、約2.5倍至約5倍、約2.5倍至約4倍、約2.5倍至約3倍、約3倍至約10倍、約3倍至約9倍、約3倍至約8倍、約3倍至約7倍、約3倍至約6倍、約3倍至約5倍、約3倍至約4倍、約4倍至約6倍、約5倍至約7倍、或約6倍至約8倍。
在其他實施例中，包含半衰期延長劑的FVIII或FIX蛋白的半衰期為至少約17小時、至少約18小時、至少約19小時、至少約20小時、至少約21小時、至少約22小時、至少約23小時、至少約24小時、至少約25小時、至少約26小時、至少約27小時、至少約28小時、至少約29小時、至少約30小時、至少約31小時、至少約32小時、至少約33小時、至少約34小時、至少約35小時、至少約36小時、至少約48小時、至少約60小時、至少約72小時、至少約84小時、至少約96小時或至少約108小時。
在仍其他實施例中，包含半衰期延長劑的FVIII或FIX蛋白的半衰期為約15小時至約2周、約16小時至約1周、約17小時至約1周、約18小時至約1周、約19小時至約1周、約20小時至約1周、約21小時至約1周、約22小時至約1周、約23小時至約1周、約24小時至約1周、約36小時至約1周、約48小時至約1周、約60小時至約1周、約24小時至約6天、約24小時至約5天、約24小時至約4天、約24小時至約3天、或約24小時至約2天。
在一些實施例中，包含半衰期延長劑的FVIII或FIX蛋白的每名受試者的平均半衰期為約15小時、約16小時、約17小時、約18小時、約19小時、約20小時、約21小時、約22小時、約23小時、約24小時（1天）、約25小時、約26小時、約27小時、約28小時、約29小時、約30小時、約31小時、約32小時、約33小時、約34小時、約35小時、約36小時、約40小時、約44小時、約48小時（2天）、約54小時、約60小時、約72小時（3天）、約84小時、約96小時（4天）、約108小時、約120小時（5天）、約6天、約7天（1周）、約8天、約9天、約10天、約11天、約12天、約13天或約14天。
一種或多種半衰期延長劑可以融合至FVIII或FIX的C末端或N末端或者插入FVIII或FIX內。
B.3.a.免疫球蛋白恒定區或其部分
在另一方面，異源部分包含一個或多個免疫球蛋白恒定區或其部分（例如，Fc區）。在一個實施例中，本公開文本的分離的核酸分子還包含編碼免疫球蛋白恒定區或其部分的異源核酸序列。在一些實施例中，免疫球蛋白恒定區或其部分是Fc區。
免疫球蛋白恒定區由表示為CH（恒定重）結構域（CH1、CH2等）的結構域構成。根據同種型（即IgG、IgM、IgA、IgD或IgE），恒定區可以由3個或4個CH結構域構成。一些同種型（例如IgG）恒定區還含有鉸鏈區。參見Janeway等人2001,Immunobiology , Garland Publishing, 紐約州紐約。
用於產生本公開文本的FVIII蛋白的免疫球蛋白恒定區或其部分可以從多種不同來源獲得。在一個實施例中，免疫球蛋白恒定區或其部分源自人免疫球蛋白。然而，應理解，免疫球蛋白恒定區或其部分可以源自另一哺乳動物物種的免疫球蛋白，所述另一哺乳動物物種包括例如齧齒類動物（例如，小鼠、大鼠、兔、豚鼠）或非人靈長類動物（例如，黑猩猩、獼猴）物種。此外，免疫球蛋白恒定區或其部分可以源自任何免疫球蛋白類別（包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE）以及任何免疫球蛋白同種型（包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4）。在一個實施例中，使用人同種型IgG1。
多個免疫球蛋白恒定區基因序列（例如，人恒定區基因序列）能以可公開獲得的存放物的形式獲得。可以選擇具有特定效應子功能（或缺少特定效應子功能）或具有特定修飾以降低免疫原性的恒定區結構域序列。已經公開了許多抗體和抗體編碼基因的序列並且合適的Ig恒定區序列（例如，鉸鏈、CH2和/或CH3序列或其部分）可以使用業內公認的技術源自這些序列。然後可以改變或合成使用任何前述方法獲得的遺傳物質以獲得本公開文本的多肽。應進一步瞭解，本公開文本的範圍涵蓋恒定區DNA序列的等位基因、變異體和突變。
免疫球蛋白恒定區或其部分的序列可以例如使用聚合酶鏈式反應和所選用於擴增目的結構域的引子來克隆。為了從抗體克隆免疫球蛋白恒定區或其部分的序列，可以從雜交瘤、脾臟或淋巴細胞分離mRNA，逆轉錄成DNA，並通過PCR擴增抗體基因。PCR擴增方法詳細描述於以下文獻中：美國專利號4,683,195；4,683,202；4,800,159；4,965,188；和例如「PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications」 Innis等人編輯, Academic Press, 加利福尼亞州聖地牙哥 (1990)；Ho等人1989.Gene 77:51；Horton等人1993.Methods Enzymol. 217:270）。PCR可以基於所公開的重鏈和輕鏈DNA和胺基酸序列由共有恒定區引子或由更具特異性的引子來起始。PCR還可以用於分離編碼抗體輕鏈和重鏈的DNA克隆。在這種情況下，可以通過共有引子或較大同源探針（如小鼠恒定區探針）篩選文庫。許多適於擴增抗體基因的引子組是業內已知的（例如，基於純化抗體的N末端序列的5'引子（Benhar和Pastan.1994.Protein Engineering 7:1509）；cDNA末端的快速擴增（Ruberti, F.等人1994.J. Immunol.Methods 173:33）；抗體前導序列（Larrick等人1989Biochem.Biophys.Res.Commun .160:1250）。抗體序列的克隆進一步描述Newman等人於1995年1月25日提交的美國專利號5,658,570中，將所述專利通過引用併入本文。
本文所用的免疫球蛋白恒定區可以包括所有結構域和鉸鏈區或其部分。在一個實施例中，免疫球蛋白恒定區或其部分包含CH2結構域、CH3結構域和鉸鏈區，即Fc區或FcRn結合配偶體。
如本文所用，術語「Fc區」定義為多肽中對應於天然Ig的Fc區的部分，即如通過其兩條重鏈的相應Fc結構域的二聚締合所形成。天然Fc區與另一Fc區形成同二聚體。相比之下，如本文所用的術語「基因融合的Fc區」或「單鏈Fc區」（scFc區）是指合成二聚Fc區，其由基因連接於單條多肽鏈內（即，編碼於單一連續基因序列中）的Fc結構域構成。參見國際公開號WO 2012/006635，將其通過引用以其整體併入本文。
在一個實施例中，「Fc區」是指單條Ig重鏈的如下部分，其始於鉸鏈區中緊鄰木瓜蛋白酶切割位點（即IgG中的殘基216，以重鏈恒定區的第一個殘基為114）上游，並終於抗體的C末端。因此，完整Fc區至少包含鉸鏈結構域、CH2結構域和CH3結構域。
免疫球蛋白恒定區或其部分可以是FcRn結合配偶體。FcRn在成人上皮組織中有活性並在腸腔、肺氣道、鼻表面、陰道表面、結腸和直腸表面中表現（美國專利號號6,485,726）。FcRn結合配偶體是免疫球蛋白中結合至FcRn的部分。
已經從包括人在內的若干哺乳動物物種分離出FcRn受體。人FcRn、猴FcRn、大鼠FcRn和小鼠FcRn的序列是已知的（Story等人1994, J. Exp.Med.180:2377）。FcRn受體在相對低pH下結合IgG（但不結合其他免疫球蛋白類別，如IgA、IgM、IgD和IgE），以內腔至漿膜方向跨細胞主動轉運IgG，然後在間質液中發現的相對高pH下釋放IgG。它在成人上皮組織中表現（美國專利.號6,485,726、6,030,613、6,086,875；WO 03/077834；US 2003-0235536A1），所述上皮組織包括肺和腸上皮（Israel等人1997,Immunology 92:69）、腎臟近端的管狀上皮（Kobayashi等人2002,Am. J. Physiol.Renal Physiol .282:F358）以及鼻上皮、陰道表面和膽管樹表面。
可用於本公開文本中的FcRn結合配偶體涵蓋可由FcRn受體特異性結合的分子，包括完整IgG、IgG的Fc片段和包括FcRn受體的完整結合區的其他片段。已經基於X射線晶體學描述了IgG的Fc部分中結合至FcRn受體的區域（Burmeister等人1994,Nature 372:379）。Fc與FcRn的主要接觸區域接近CH2和CH3結構域的連接處。Fc-FcRn接觸全部位於單條Ig重鏈內。FcRn結合配偶體包括完整IgG、IgG的Fc片段和IgG的包括FcRn的完整結合區的其他IgG片段。主要接觸位點包括CH2結構域的胺基酸殘基248、250-257、272、285、288、290-291、308-311和314以及CH3結構域的胺基酸殘基385-387、428和433-436。對免疫球蛋白或免疫球蛋白片段或區域的胺基酸編號的參考均基於Kabat等人1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Public Health, 馬里蘭州貝塞斯達。
FcRn可以跨越上皮障壁有效穿梭結合至FcRn的Fc區或FcRn結合配偶體，由此提供全身投予所需治療分子的非侵入性手段。另外，包含Fc區或FcRn結合配偶體的融合蛋白被表現FcRn的細胞內吞。但是這些融合蛋白未被標記以供降解，而是被再次回收至循環中，由此增加這些蛋白質的體內半衰期。在某些實施例中，免疫球蛋白恒定區的部分是Fc區或FcRn結合配偶體，其通常通過二硫鍵和其他非特異性相互作用與另一Fc區或另一FcRn結合配偶體締合，以形成二聚體和更高階多聚體。
兩個FcRn受體可以結合單個Fc分子。晶體學資料表明，每個FcRn分子結合Fc同二聚體的單一多肽。在一個實施例中，將FcRn結合配偶體（例如，IgG的Fc片段）與生物活性分子連接提供口服、經頰、舌下、經直腸、經陰道、作為經鼻或經由肺途徑投予的氣溶膠、或經由眼部途徑遞送生物活性分子的手段。在另一個實施例中，FVIII蛋白可以侵入性地投予，例如皮下、 靜脈內投予。
FcRn結合配偶體區域是可由FcRn受體特異性結合，隨後通過Fc區的FcRn受體主動轉運的分子或其部分。特異性結合是指兩個分子形成在生理條件下相對穩定的複合物。特異性結合的特徵在於高親和力和低至中的容量，與之相區分，非特異性結合通常具有低親和力和中至高的容量。通常，在親和常數KA高於106 M-1 或高於108 M-1 時，將結合視為特異性的。如有必要，可以通過改變結合條件來減少非特異性結合而基本上不影響特異性結合。熟習此項技術者可以使用常規技術優化適當的結合條件，如分子濃度、溶液的離子強度、溫度、允許結合的時間、阻斷劑（例如，血清白蛋白、乳酪蛋白）濃度等。
在某些實施例中，由本公開文本的核酸分子編碼的FVIII蛋白包含一個或多個截短Fc區，但是其足以將Fc受體（FcR）結合特性賦予Fc區。例如，Fc區中結合至FcRn的部分（即，FcRn結合部分）包含IgG1的約胺基酸282-438，EU編號（主要接觸位點是CH2結構域的胺基酸248、250-257、272、285、288、290-291、308-311和314以及CH3結構域的胺基酸殘基385-387、428和433-436）。因此，本公開文本的Fc區可以包含FcRn結合部分或由所述FcRn結合部分組成。FcRn結合部分可以源自任何同種型（包括IgGl、IgG2、IgG3和IgG4）的重鏈。在一個實施例中，使用來自人同種型IgG1的抗體的FcRn結合部分。在另一個實施例中，使用來自人同種型IgG4的抗體的FcRn結合部分。
Fc區可以從多種不同來源獲得。在一個實施例中，多肽的Fc區源自人免疫球蛋白。然而，應理解，Fc部分可以源自另一哺乳動物物種的免疫球蛋白，所述另一哺乳動物物種包括例如齧齒類動物（例如，小鼠、大鼠、兔、豚鼠）或非人靈長類動物（例如，黑猩猩、獼猴）物種。此外，Fc結構域或其部分的多肽可以源自任何免疫球蛋白類別（包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE）以及任何免疫球蛋白同種型（包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4）。在另一個實施例中，使用人同種型IgG1。
在某些實施例中，Fc變異體賦予至少一種由包含所述野生型Fc結構域的Fc部分賦予的效應子功能的變化（例如，Fc區結合至Fc受體（例如FcγRI、FcγRII或FcγRIII）或補體蛋白（例如，C1q）或觸發抗體依賴性細胞毒性（ADCC）、吞噬作用或補體依賴性細胞毒性（CDCC）的能力的改善或降低）。在其他實施例中，Fc變異體提供工程化半胱胺酸殘基。
本公開文本的Fc區可以利用業內公認的Fc變異體，已知所述Fc變異體可賦予效應子功能和/或FcR或FcRn結合的變化（例如，增強或降低）。具體來說，本公開文本的Fc區可以包括例如在以下文獻中披露的一個或多個胺基酸位置處的變化（例如，取代）：國際PCT公開案WO 88/07089A1、WO 96/14339A1、WO 98/05787A1、WO 98/23289A1、WO 99/51642A1、WO 99/58572A1、WO 00/09560A2、WO 00/32767A1、WO 00/42072A2、WO 02/44215A2、WO 02/060919A2、WO 03/074569A2、WO 04/016750A2、WO 04/029207A2、WO 04/035752A2、WO 04/063351A2、WO 04/074455A2、WO 04/099249A2、WO 05/040217A2、WO 04/044859、WO 05/070963A1、WO 05/077981A2、WO 05/092925A2、WO 05/123780A2、WO 06/019447A1、WO 06/047350A2和WO 06/085967A2；美國專利公開號US 2007/0231329、US 2007/0231329、US 2007/0237765、US 2007/0237766、US 2007/0237767、US 2007/0243188、US 2007/0248603、US 2007/0286859、US 2008/0057056；或美國專利5,648,260；5,739,277；5,834,250；5,869,046；6,096,871；6,121,022；6,194,551；6,242,195；6,277,375；6,528,624；6,538,124；6,737,056；6,821,505；6,998,253；7,083,784；7,404,956和7,317,091，將每篇文獻通過引用併入本文。在一個實施例中，可以在一個或多個所公開的胺基酸位置進行特定變化（例如，業內披露的一個或多個胺基酸的特定取代）。在另一個實施例中，可以在一個或多個所公開胺基酸位置進行不同變化（例如，業內披露的一個或多個胺基酸位置的不同取代）。
IgG的Fc區或FcRn結合配偶體可以根據公認程式（如定點誘變等）來修飾，以產生將由FcRn結合的經修飾IgG或其Fc片段或部分。此類修飾包括遠離FcRn接觸位點的修飾以及在接觸位點內的修飾，所述修飾保留或甚至增強與FcRn的結合。例如，可以在不顯著損失Fc對FcRn的結合親和力的情況下取代人IgG1 Fc（Fcγ1）中的以下單個胺基酸殘基：P238A、S239A、K246A、K248A、D249A、M252A、T256A、E258A、T260A、D265A、S267A、H268A、E269A、D270A、E272A、L274A、N276A、Y278A、D280A、V282A、E283A、H285A、N286A、T289A、K290A、R292A、E293A、E294A、Q295A、Y296F、N297A、S298A、Y300F、R301A、V303A、V305A、T307A、L309A、Q311A、D312A、N315A、K317A、E318A、K320A、K322A、S324A、K326A、A327Q、P329A、A330Q、P331A、E333A、K334A、T335A、S337A、K338A、K340A、Q342A、R344A、E345A、Q347A、R355A、E356A、M358A、T359A、K360A、N361A、Q362A、Y373A、S375A、D376A、A378Q、E380A、E382A、S383A、N384A、Q386A、E388A、N389A、N390A、Y391F、K392A、L398A、S400A、D401A、D413A、K414A、R416A、Q418A、Q419A、N421A、V422A、S424A、E430A、N434A、T437A、Q438A、K439A、S440A、S444A和K447A，其中例如P238A表示在位置編號238處由丙胺酸取代的野生型脯胺酸。作為例子，一個具體實施例併入N297A突變，從而去除高度保守的N糖基化位點。除了丙胺酸以外，可以在上文指定的位置用其他胺基酸取代野生型胺基酸。可以將突變單獨引入Fc中，從而產生多於一百個與天然Fc不同的Fc區。另外，這些單獨突變中的2個、3個或更多個的組合可以一起引入，從而產生另外數百個Fc區。
某些上述突變可以對Fc區或FcRn結合配偶體賦予新功能。例如，一個實施例併入N297A，從而去除高度保守的N糖基化位點。這個突變的作用是降低免疫原性，由此增強Fc區的循環半衰期，並使Fc區不能結合至FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB和FcγRIIIA，並且不損害對FcRn的親和力（Routledge等人1995,Transplantation 60:847；Friend等人1999,Transplantation 68:1632；Shields等人1995,J. Biol.Chem .276:6591）。作為從上述突變產生的新功能的另一例子，對FcRn的親和力可以增加，在一些情況下超過野生型的所述親和力。這種增加的親和力可以反映增加的「締合」率、降低的「解離」率或增加的「締合」率與降低的「解離」率二者。相信可賦予增加的對FcRn的親和力的突變的例子包括但不限於T256A、T307A、E380A和N434A（Shields等人2001,J. Biol.Chem .276:6591）。
另外，至少三種人Fcγ受體似乎識別IgG上於下鉸鏈區內的結合位點，通常是胺基酸234-237。因此，如例如通過將人IgG1的胺基酸233-236「ELLG」（SEQ ID NO: 8）替代為來自IgG2的相應序列「PVA」（一個胺基酸缺失），可以從這個區域的突變產生新功能的另一例子和可能降低的免疫原性。已經顯示，在已經引入此類突變時，介導多種效應子功能的FcγRI、FcγRII和FcγRIII不會結合至IgG1。Ward和Ghetie 1995,Therapeutic Immunology 2:77和Armour等人1999,Eur.J. Immunol .29:2613。
在另一個實施例中，免疫球蛋白恒定區或其部分包含鉸鏈區或其部分中的與第二免疫球蛋白恒定區或其部分形成一個或多個二硫鍵的胺基酸序列。第二免疫球蛋白恒定區或其部分可以連接至第二多肽，使FVIII蛋白與第二多肽結合在一起。在一些實施例中，第二多肽是增強子部分。如本文所用，術語「增強子部分」是指能夠增強FVIII的促凝血活性的分子、其片段或多肽組分。增強子部分可以是輔因子，如可溶性組織因子（sTF）或促凝血肽。因此，在啟動FVIII後，增強子部分可用於增強FVIII活性。
在某些實施例中，由本公開文本的核酸分子編碼的FVIII蛋白包含對免疫球蛋白恒定區或其部分的胺基酸取代（例如，Fc變異體），所述胺基酸取代改變Ig恒定區的抗原非依賴性效應子功能，特別是蛋白質的循環半衰期。
B.3.b. scFc區
在另一方面，異源部分包含scFc（單鏈Fc）區。在一個實施例中，本公開文本的分離的核酸分子進一步包含編碼scFc區的異源核酸序列。scFc區在同一線性多肽鏈內包含至少兩個免疫球蛋白恒定區或其部分（例如，Fc部分或結構域（例如，2、3、4、5、6個或更多個Fc部分或結構域）），所述恒定區或部分能夠折疊（例如，分子內或分子間折疊）以形成一個由Fc肽連接子連接的功能性scFc區。例如，在一個實施例中，本公開文本的多肽能夠經由其scFc區結合至至少一種Fc受體（例如，FcRn、FcγR受體（例如，FcγRIII）或補體蛋白（例如，C1q）），以改善半衰期或觸發免疫效應子功能（例如，抗體依賴性細胞毒性（ADCC）、吞噬作用或補體依賴性細胞毒性（CDCC）和/或改善可製造性）。
B.3.c.CTP
在另一方面，異源部分包含人絨毛膜促性腺激素的β亞基的一種C末端肽（CTP）或其片段、變異體或衍生物。已知插入重組蛋白中的一種或多種CTP肽增加該蛋白質的體內半衰期。參見例如，美國專利號5,712,122，將其通過引用以其整體併入本文。
示例性CTP肽包括DPRFQDSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPIL（SEQ ID NO: 9）或SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ（SEQ ID NO: 10）。參見例如，美國專利申請公開號US 2009/0087411 A1，將其通過引用併入。
B.3.d.XTEN序列
在一些實施例中，異源部分包含一個或多個XTEN序列、其片段、變異體或衍生物。如本文所用，「XTEN序列」是指具有非天然存在的基本上不重複的序列的延伸長度的多肽，其主要由小親水性胺基酸構成，並且所述序列在生理條件下具有較低程度的或不具有二級或三級結構。作為異源部分，XTEN可以用作半衰期延長部分。另外，XTEN可以提供所需特性，包括但不限於增強的藥物代謝動力學參數和溶解度特徵。
將包含XTEN序列的異源部分併入本公開文本的蛋白質中可以賦予蛋白質以下有利特性中的一種或多種：構象柔性、增強的水溶解度、高蛋白酶抗性程度、低免疫原性、與哺乳動物受體的低結合或增加的流體力學（或斯托克斯（Stokes））半徑。
在某些方面，XTEN序列可以增加藥物代謝動力學特性，如較長體內半衰期或增加的曲線下面積（AUC），使得與相同的但不具有XTEN異源部分的蛋白質相比，本公開文本的蛋白質在增加的時間段中停留在體內並且具有促凝血活性。
在一些實施例中，可用於本公開文本的XTEN序列是具有大於約20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1200、1400、1600、1800或2000個胺基酸殘基的肽或多肽。在某些實施例中，XTEN是具有大於約20至約3000個胺基酸殘基、大於30至約2500個殘基、大於40至約2000個殘基、大於50至約1500個殘基、大於60至約1000個殘基、大於70至約900個殘基、大於80至約800個殘基、大於90至約700個殘基、大於100至約600個殘基、大於110至約500個殘基、或大於120個至大約400個殘基的肽或多肽。在一個特定實施例中，XTEN包含長度長於42個胺基酸且短於144個胺基酸的胺基酸序列。
本公開文本的XTEN序列可以包含一個或多個5至14（例如，9至14）個胺基酸殘基的序列基序或與所述序列基序至少80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列，其中所述基序包含4至6種類型的選自甘胺酸（G）、丙胺酸（A）、絲胺酸（S）、蘇胺酸（T）、麩胺酸（E）和脯胺酸（P）的胺基酸（例如，5種胺基酸），基本上由所述胺基酸組成或由所述胺基酸組成。參見US 2010-0239554 A1。
在一些實施例中，XTEN包含非重疊序列基序，其中約80%、或至少約85%、或至少約90%、或約91%、或約92%、或約93%、或約94%、或約95%、或約96%、或約97%、或約98%、或約99%或約100%的序列由選自從表3選擇的單一基序家族的非重疊序列的多個單元組成，從而得到家族序列。
如本文所用，「家族」意指，XTEN具有僅選自表3的單一基序類別的基序；即，AD、AE、AF、AG、AM、AQ、BC或BD XTEN，並且選擇XTEN中並非來自家族基序的任何其他胺基酸以實現所需特性，如允許通過編碼核苷酸併入限制位點、併入切割序列，或實現與FVIII的更佳連接。在XTEN家族的一些實施例中，XTEN序列包含AD基序家族、或AE基序家族、或AF基序家族、或AG基序家族、或AM基序家族、或AQ基序家族、或BC家族或BD家族的非重疊序列基序的多個單元，所得XTEN展現出上述同源性範圍。在其他實施例中，XTEN包含來自表3的兩個或更多個基序家族的基序序列的多個單元。
可以選擇這些序列以實現所需的物理/化學特徵，包括如淨電荷、親水性、二級結構缺少或重複性缺少等特性，這些特性由基序的胺基酸組成賦予，下面將更全面地描述。在本段中的上述實施例中，可以使用本文所述的方法選擇和組裝併入XTEN中的基序，以實現具有約36至約3000個胺基酸殘基的XTEN。
表3. 12個胺基酸的XTEN序列基序和基序家族
基序家族 * 基序序列 SEQ ID NO:
AD GESPGGSSGSES 11
AD GSEGSSGPGESS 12
AD GSSESGSSEGGP 13
AD GSGGEPSESGSS 14
AE, AM GSPAGSPTSTEE 15
AE, AM, AQ GSEPATSGSETP 16
AE, AM, AQ GTSESATPESGP 17
AE, AM, AQ GTSTEPSEGSAP 18
AF, AM GSTSESPSGTAP 19
AF, AM GTSTPESGSASP 20
AF, AM GTSPSGESSTAP 21
AF, AM GSTSSTAESPGP 22
AG, AM GTPGSGTASSSP 23
AG, AM GSSTPSGATGSP 24
AG, AM GSSPSASTGTGP 25
AG, AM GASPGTSSTGSP 26
AQ GEPAGSPTSTSE 27
AQ GTGEPSSTPASE 28
AQ GSGPSTESAPTE 29
AQ GSETPSGPSETA 30
AQ GPSETSTSEPGA 31
AQ GSPSEPTEGTSA 32
BC GSGASEPTSTEP 33
BC GSEPATSGTEPS 34
BC GTSEPSTSEPGA 35
BC GTSTEPSEPGSA 36
BD GSTAGSETSTEA 37
BD GSETATSGSETA 38
BD GTSESATSESGA 39
BD GTSTEASEGSAS 40
* 表示單獨基序序列，其在以各種排列一起使用時得到「家族序列」
可以用作本公開文本的嵌合蛋白中的異源部分的XTEN序列的例子披露於例如以下文獻中：美國專利公開號2010/0239554 A1、2010/0323956 A1、2011/0046060 A1、2011/0046061 A1、2011/0077199 A1或2011/0172146 A1，或者國際專利公開號WO 2010/091122 A1、WO 2010/144502 A2、WO 2010/144508 A1、WO 2011/028228 A1、WO 2011/028229 A1或WO 2011/028344 A2，將每篇文獻通過引用以其整體併入本文。
XTEN可以具有不同的長度用於插入FVIII中或連接至FVIII。在一個實施例中，基於融合蛋白中要實現的特性或功能來選擇一個或多個XTEN序列的長度。根據預期的特性或功能，XTEN可以是可以充當載劑的短序列或中等長度序列或更長的序列。在某些實施例中，XTEN包括約6至約99個胺基酸殘基的短區段、約100至約399個胺基酸殘基的中等長度和約400至約1000以及多達約3000個胺基酸殘基的較長長度。因此，插入FVIII中或連接至FVIII的XTEN可以具有約6、約12、約36、約40、約42、約72、約96、約144、約288、約400、約500、約576、約600、約700、約800、約864、約900、約1000、約1500、約2000、約2500或多達約3000個胺基酸殘基的長度。在其他實施例中，XTEN序列的長度為約6至約50、約50至約100、約100至150、約150至250、約250至400、約400至約500、約500至約900、約900至1500、約1500至2000或約2000至約3000個胺基酸殘基。
插入FVIII中或連接至FVIII的XTEN的精確長度可以在不對FVIII的活性造成不利影響的情況下變化。在一個實施例中，本文使用的一個或多個XTEN的長度為42個胺基酸、72個胺基酸、144個胺基酸、288個胺基酸、576個胺基酸或864個胺基酸，並且可以選自一個或多個XTEN家族序列；所述家族即AD、AE、AF、AG、AM、AQ、BC或BD。
在一些實施例中，用於本公開文本中的XTEN序列與選自以下的序列至少60%、70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同：AE42、AG42、AE48、AM48、AE72、AG72、AE108、AG108、AE144、AF144、AG144、AE180、AG180、AE216、AG216、AE252、AG252、AE288、AG288、AE324、AG324、AE360、AG360、AE396、AG396、AE432、AG432、AE468、AG468、AE504、AG504、AF504、AE540、AG540、AF540、AD576、AE576、AF576、AG576、AE612、AG612、AE624、AE648、AG648、AG684、AE720、AG720、AE756、AG756、AE792、AG792、AE828、AG828、AD836、AE864、AF864、AG864、AM875、AE912、AM923、AM1318、BC864、BD864、AE948、AE1044、AE1140、AE1236、AE1332、AE1428、AE1524、AE1620、AE1716、AE1812、AE1908、AE2004A、AG948、AG1044、AG1140、AG1236、AG1332、AG1428、AG1524、AG1620、AG1716、AG1812、AG1908、AG2004及其任何組合。參見US 2010-0239554 A1。在一個特定實施例中，XTEN包含AE42、AE72、AE144、AE288、AE576、AE864、AG 42、AG72、AG144、AG288、AG576、AG864或其任何組合。
可以用作本公開文本的嵌合蛋白中的異源部分的示例性XTEN序列包括XTEN AE42-4（SEQ ID NO: 41）、XTEN 144-2A（SEQ ID NO: 42）、XTEN A144-3B（SEQ ID NO: 43）、XTEN AE144-4A（SEQ ID NO: 44）、XTEN AE144-5A（SEQ ID NO: 45）、XTEN AE144-6B（SEQ ID NO: 46）、XTEN AG144-1（SEQ ID NO: 47）、XTEN AG144-A（SEQ ID NO: 48）、XTEN AG144-B（SEQ ID NO: 49）、XTEN AG144-C（SEQ ID NO: 50）和XTEN AG144-F（SEQ ID NO: 51）。在一個特定實施例中，XTEN由SEQ ID NO: 52編碼。
在一些實施例中，XTEN的小於100%的胺基酸選自甘胺酸（G）、丙胺酸（A）、絲胺酸（S）、蘇胺酸（T）、麩胺酸（E）和脯胺酸（P），或者小於100%的序列由來自表3的序列基序或本文所提供的XTEN序列組成。在此類實施例中，XTEN的其餘胺基酸殘基選自其他14種天然L-胺基酸中的任一種，但是可以優先地選自親水胺基酸，使得XTEN序列含有至少約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少約99%的親水胺基酸。
綴合構建體中所利用的XTEN中疏水胺基酸的含量可以為小於5%、或小於2%、或小於1%疏水胺基酸含量。在XTEN構建中不太有利的疏水殘基包括色胺酸、苯丙胺酸、酪胺酸、白胺酸、異白胺酸、擷胺酸和甲硫胺酸。另外，XTEN序列可以含有小於5%或小於4%或小於3%或小於2%或小於1%或無以下胺基酸：甲硫胺酸（例如，以避免氧化）、或天門冬醯胺酸和麩醯胺酸（以避免脫醯胺）。
所述一個或多個XTEN序列可以插入由核苷酸序列編碼的胺基酸序列的C末端或N末端處，或者插入由核苷酸序列編碼的胺基酸序列中的兩個胺基酸之間。例如，XTEN可以在選自表2的一個或多個插入位點插入兩個胺基酸之間。FVIII內可允許XTEN插入的位點的例子可在例如國際公開號WO 2013/123457 A1或美國公開號2015/0158929 A1中找到，將所述文獻通過引用以其整體併入本文。
B.3.e.白蛋白或其片段、衍生物或變異體
在一些實施例中，異源部分包含白蛋白或其功能片段。人血清白蛋白（HSA，或HA）是全長形式有609個胺基酸的蛋白質，負責大部分血清滲透壓，並且還起到內源和外源配體的載劑的作用。如本文所用的術語「白蛋白」包括全長白蛋白或其功能性片段、變異體、衍生物或類似物。白蛋白或其片段或變異體的例子披露於以下文獻中：美國專利公開號2008/0194481A1、2008/0004206 A1、2008/0161243 A1、2008/0261877 A1或2008/0153751 A1或PCT申請公開號WO 2008/033413 A2、WO 2009/058322 A1或WO 2007/021494 A2，將所述文獻通過引用以其整體併入本文。
在一個實施例中，由本公開文本的核苷酸分子編碼的FVIII蛋白包含進一步連接至第二異源部分的白蛋白、其片段或變異體，所述第二異源部分選自免疫球蛋白恒定區或其部分（例如，Fc區）、PAS序列、HES和PEG。
B.3.f.白蛋白結合部分
在某些實施例中，異源部分是白蛋白結合部分，其包含白蛋白結合肽、細菌白蛋白結合結構域、白蛋白結合抗體片段或其任何組合。
例如，白蛋白結合蛋白可以是細菌白蛋白結合蛋白、抗體或抗體片段，包括結構域抗體（參見美國專利號6,696,245）。例如，白蛋白結合蛋白可以是細菌白蛋白結合結構域，如一種鏈球菌蛋白G（Konig, T.和Skerra, A. (1998)J. Immunol.Methods 218, 73-83）。可以用作綴合配偶體的白蛋白結合肽的其他例子是例如具有Cys-Xaa1 -Xaa2 -Xaa3 -Xaa4 -Cys（SEQ ID NO:52）共有序列的那些白蛋白結合肽，其中Xaa1 是Asp、Asn、Ser、Thr、或Trp；Xaa2 是Asn、Gln、His、Ile、Leu、或Lys；Xaa3 是Ala、Asp、Phe、Trp、或Tyr；並且Xaa4 是Asp、Gly、Leu、Phe、Ser、或Thr，如美國專利申請公開號2003/0069395或Dennis等人（Dennis等人(2002)J. Biol.Chem. 277, 35035-35043）中所述。
來自鏈球菌蛋白G的結構域3（如由Kraulis等人,FEBS Lett .378:190-194 (1996)和Linhult等人,Protein Sci. 11:206-213 (2002)所披露）是細菌白蛋白結合結構域的例子。白蛋白結合肽的例子包括具有核心序列DICLPRWGCLW（SEQ ID NO: 54）的一系列肽。參見例如，Dennis等人,J. Biol.Chem .2002, 277: 35035-35043 (2002)。白蛋白結合抗體片段的例子披露於以下文獻中：Muller和Kontermann,Curr.Opin.Mol.Ther .9:319-326 (2007)；Roovers等人,Cancer Immunol.Immunother .56:303-317 (2007)；和Holt等人,Prot.Eng. Design Sci ., 21:283-288 (2008)，將所述文獻通過引用以其整體併入本文。這種白蛋白結合部分的例子是2-(3-馬來醯亞胺基丙醯胺基)-6-(4-(4-碘苯基)丁醯胺基)己酸酯（「Albu」標籤），如Trussel等人,Bioconjugate Chem .20:2286-2292 (2009)所披露的。
脂肪酸、特別是長鏈脂肪酸（LCFA）和長鏈脂肪酸樣白蛋白結合化合物可以用於延長本公開文本的FVIII蛋白的體內半衰期。LCFA樣白蛋白結合化合物的例子是16-(1-(3-(9-(((2,5-二氧代吡咯烷-1-基氧基)羰氧基)-甲基)-7-磺基-9H-芴-2-基胺基)-3-氧代丙基)-2,5-二氧代吡咯烷-3-基硫基)十六烷酸（參見例如，WO 2010/140148）。
B.3.g.PAS序列
在其他實施例中，異源部分是PAS序列。如本文所用的PAS序列意指主要包含丙胺酸和絲胺酸殘基或主要包含丙胺酸、絲胺酸和脯胺酸殘基的胺基酸序列，所述胺基酸序列在生理條件下形成隨機螺旋構象。因此，PAS序列是包含丙胺酸、絲胺酸和脯胺酸、基本上由所述胺基酸組成或由所述胺基酸組成的構造塊、胺基酸聚合物或序列盒，其可以用作嵌合蛋白中異源部分的一部分。然而，熟習此項技術者知道，在添加除了丙胺酸、絲胺酸和脯胺酸以外的殘基作為PAS序列中的次要成分時，胺基酸聚合物也可以形成隨機螺旋構象。
如本文所用的術語「次要成分」意指，可以在PAS序列中添加除了丙胺酸、絲胺酸和脯胺酸以外的胺基酸至某種程度，例如，高達約12%，即PAS序列的100個胺基酸中的約12個；高達約10%，即PAS序列的100個胺基酸中的約10個；高達約9%，即100個胺基酸中的約9個；高達約8%，即100個胺基酸中的約8個；約6%，即100個胺基酸中的約6個；約5%，即100個胺基酸中的約5個；約4%，即100個胺基酸中的約4個；約3%，即100個胺基酸中的約3個；約2%，即100個胺基酸中的約2個；約1%，即100個胺基酸中的約1個。不同於丙胺酸、絲胺酸和脯胺酸的胺基酸可選自Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Thr、Trp、Tyr、和Val。
在生理條件下，PAS序列延伸段形成隨機螺旋構象，由此可以介導增加的FVIII蛋白的體內和/或體外穩定性。由於隨機螺旋結構域自身不具有穩定結構或功能，基本上保留了由FVIII蛋白介導的生物學活性。在其他實施例中，形成隨機螺旋結構域的PAS序列具有生物惰性，尤其關於血漿中的蛋白質水解、免疫原性、等電點/靜電行為、與細胞表面受體的結合或內化，但仍然是生物可降解的，這提供了優於合成聚合物如PEG的明顯優勢。
形成隨機螺旋構象的PAS序列的非限制性例子包括選自以下的胺基酸序列：ASPAAPAPASPAAPAPSAPA（SEQ ID NO: 55）、AAPASPAPAAPSAPAPAAPS（SEQ ID NO: 56）、APSSPSPSAPSSPSPASPSS（SEQ ID NO: 57）、APSSPSPSAPSSPSPASPS（SEQ ID NO: 58）、SSPSAPSPSSPASPSPSSPA（SEQ ID NO: 59）、AASPAAPSAPPAAASPAAPSAPPA（SEQ ID NO: 60）和ASAAAPAAASAAASAPSAAA（SEQ ID NO: 61）或其任何組合。PAS序列的另外例子可從以下文獻中得知：例如美國專利公開號2010/0292130 A1和PCT申請公開號WO 2008/155134 A1。
B.3.h.HAP序列
在某些實施例中，異源部分是富含甘胺酸的同胺基酸聚合物（HAP）。HAP序列可以包含甘胺酸的重複序列，所述重複序列的長度為至少50個胺基酸、至少100個胺基酸、120個胺基酸、140個胺基酸、160個胺基酸、180個胺基酸、200個胺基酸、250個胺基酸、300個胺基酸、350個胺基酸、400個胺基酸、450個胺基酸或500個胺基酸。在一個實施例中，HAP序列能夠延長融合至或連接至HAP序列的部分的半衰期。HAP序列的非限制性例子包括但不限於(Gly)n 、(Gly4 Ser)n 或S(Gly4 Ser)n ，其中n為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。在一個實施例中，n為20、21、22、23、24、25、26、26、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40。在另一個實施例中，n為50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200。
B.3.i.轉鐵蛋白或其片段
在某些實施例中，異源部分是轉鐵蛋白或其片段。任何轉鐵蛋白都可以用於製備本公開文本的FVIII蛋白。作為例子，野生型人TF（TF）是679個胺基酸的蛋白質，大約75 KDa（不計糖基化），具有似乎源自基因重複的兩個主要結構域N（約330個胺基酸）和C（約340個胺基酸）。參見GenBank登錄號NM001063、XM002793、M12530、XM039845、XM 039847和S95936（www.ncbi.nlm.nih.gov/），它們都是通過引用以其整體併入本文。轉鐵蛋白包含兩個結構域N結構域和C結構域。N結構域包含兩個子結構域，即N1結構域和N2結構域，並且C結構域包含兩個子結構域，即C1結構域和C2結構域。
在一個實施例中，轉鐵蛋白異源部分包括轉鐵蛋白剪接變異體。在一個例子中，轉鐵蛋白剪接變異體可以是人轉鐵蛋白的剪接變異體，例如Genbank登錄號AAA61140。在另一個實施例中，嵌合蛋白的轉鐵蛋白部分包括轉鐵蛋白序列的一個或多個結構域，例如N結構域、C結構域、N1結構域、N2結構域、C1結構域、C2結構域或其任何組合。
B.3.j.清除受體
在某些實施例中，異源部分是清除受體、其片段、變異體或衍生物。LRP1是600 kDa膜內在蛋白，其參與受體介導的多種蛋白質（如因子X）的清除。參見例如，Narita等人,Blood 91:555-560 (1998)。
B.3.k. 血管性血友病因子或其片段
在某些實施例中，異源部分是血管性血友病因子（VWF）或其一個或多個片段。
VWF（也稱為F8VWF）是存在於血漿中的大多聚糖蛋白，並且在內皮（在懷布林-帕拉德體（Weibel-Palade body）中）、巨核細胞（血小板的α顆粒）和內皮下結締組織中組成性地產生。基本VWF單體是2813個胺基酸的蛋白質。每個單體含有多個具有特定功能的特定結構域，即D'和D3結構域（其一起結合至因子VIII）、A1結構域（其結合至血小板GPIb-受體、肝素和/或可能地膠原）、A3結構域（其結合至膠原）、C1結構域（其中RGD結構域在被啟動時結合至血小板整聯蛋白αIIbβ3）以及在蛋白質C末端的「半胱胺酸結」結構域（其為VWF與源自血小板的生長因子（PDGF）、轉化生長因子-β（TGFβ）和β-人絨毛膜促性腺激素（βHCG）所共有）。
人VWF的2813單體胺基酸序列是作為Genbank中的登錄號NP000543.2來報導。編碼人VWF的核苷酸序列是作為Genbank中的登錄號NM000552.3來報導。SEQ ID NO:62是以Genbank登錄號NM000552.3報導的胺基酸序列。D'結構域包括SEQ ID NO: 62的胺基酸764至866。D3結構域包括SEQ ID NO: 62的胺基酸867至1240。
在血漿中，95%-98%的FVIII以與全長VWF的緊密非共價複合物來循環。這種複合物的形成對於在體內維持適當的FVIIII血漿水準是重要的。Lenting等人,Blood. 92(11): 3983-96 (1998)；Lenting等人,J. Thromb.Haemost .5(7): 1353-60 (2007)。在FVIII由於重鏈中的位置372和740以及輕鏈中的位置1689的蛋白質水解而被啟動時，從啟動的FVIII去除結合至FVIII的VWF。
在某些實施例中，異源部分是全長血管性血友病因子。在其他實施例中，異源部分是血管性血友病因子片段。如本文所用，本文所用的術語「VWF片段（VWF fragment）」或「VWF片段（VWF fragments）」意指任何VWF片段，其與FVIII相互作用並保留至少一種或多種通常由全長VWF提供給FVIII的特性，所述特性是例如防止過早啟動為FVIIIa、防止過早蛋白質水解、防止與磷脂質膜的締合（可導致過早清除）、防止與可以結合裸FVIII而不是VWF結合FVIII的FVIII清除受體結合和/或穩定FVIII重鏈和輕鏈相互作用。在具體實施例中，異源部分是包含VWF的D'結構域和D3結構域的（VWF）片段。包含D'結構域和D3結構域的VWF片段還可以包含選自以下的VWF結構域：A1結構域、A2結構域、A3結構域、D1結構域、D2結構域、D4結構域、B1結構域、B2結構域、B3結構域、C1結構域、C2結構域、CK結構域、其一個或多個片段及其任何組合。融合至VWF片段的具有FVIII活性的多肽的其他例子披露於以下文獻中：2012年7月3日提交的美國臨時專利申請號61/667,901和美國公開號2015/0023959 A1，將這兩篇文獻都通過引用以其整體併入本文。
B.3.l.連接子部分
在某些實施例中，異源部分是肽連接子。
如本文所用，術語「肽連接子」或「連接子部分」是指連接多肽鏈的線性胺基酸序列中的兩個結構域的肽或多肽序列（例如，合成肽或多肽序列）。
在一些實施例中，可以將編碼肽連接子的異源核苷酸序列插入本公開文本的優化FVIII多核苷酸序列與編碼例如上述異源部分之一（如白蛋白）的異源核苷酸序列之間。肽連接子可以向嵌合多肽分子提供柔性。連接子通常不被切割，但是可能需要這種切割。在一個實施例中，在加工期間不去除這些連接子。
可以存在於本公開文本的嵌合蛋白中的連接子類型是蛋白酶可切割的連接子，其包含切割位點（即，蛋白酶切割位點底物，例如因子XIa、Xa或凝血酶切割位點）並且其可以在切割位點的N末端或C末端或兩側上包括另外的連接子。這些可切割連接子在併入本公開文本的構建體中時產生具有異源切割位點的嵌合分子。
在一個實施例中，由本公開文本的核酸分子編碼的FVIII多肽包含兩個或更多個Fc結構域或部分，所述Fc結構域或部分於單條多肽鏈中經由cscFc連接子連接以形成Fc區。cscFc連接子側接有至少一個細胞內加工位點，即由細胞內酶切割的位點。多肽在所述至少一個細胞內加工位點的切割產生包含至少兩條多肽鏈的多肽。
其他肽連接子可以任選地用於本公開文本的構建體中，例如以將FVIII蛋白連接至Fc區。可以結合本公開文本使用的一些示例性連接子包括例如更詳細地描述於下文中的包含GlySer胺基酸的多肽。
在一個實施例中，肽連接子是合成的，即非天然存在的。在一個實施例中，肽連接子包括包含如下胺基酸序列的肽（或多肽）（其可以是或可以不是天然存在的），所述胺基酸序列將在自然界中並非與其天然地連接或遺傳融合的第一線性胺基酸序列與第二線性胺基酸序列連接或遺傳融合。例如，在一個實施例中，肽連接子可以包含非天然存在的多肽，其是天然存在的多肽的修飾形式（例如，包含突變，如添加、取代或缺失）。在另一個實施例中，肽連接子可以包含非天然存在的胺基酸。在另一個實施例中，肽連接子可以包含存在於在自然界中不存在的線性序列中的天然存在的胺基酸。在仍另一個實施例中，肽連接子可以包含天然存在的多肽序列。
例如，在某些實施例中，肽連接子可以用於融合相同的Fc部分，由此形成同二聚scFc區。在其他實施例中，肽連接子可以用於融合不同的Fc部分（例如野生型Fc部分和Fc部分變異體），由此形成異二聚scFc區。
在另一個實施例中，肽連接子包含gly-ser連接子或由所述gly-ser連接子組成。在一個實施例中，scFc或cscFc連接子包含免疫球蛋白鉸鏈的至少一部分和gly-ser連接子。如本文所用，術語「gly-ser連接子」是指由甘胺酸和絲胺酸殘基組成的肽。在某些實施例中，所述gly-ser連接子可以插入肽連接子的兩個其他序列之間。在其他實施例中，gly-ser連接子連接於肽連接子的另一序列的一個或兩個末端。在又其他實施例中，兩個或更多個gly-ser連接子串聯併入肽連接子中。在一個實施例中，本公開文本的肽連接子包含上鉸鏈區的至少一部分（例如，源自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4分子）、中鉸鏈區的至少一部分（例如，源自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4分子）和一系列gly/ser胺基酸殘基。
本公開文本的肽連接子的長度為至少一個胺基酸並且可以具有變化的長度。在一個實施例中，本公開文本的肽連接子的長度為約1至約50個胺基酸。如在此上下文中所用，術語「約」指示+/-兩個胺基酸殘基。由於連接子長度必須是正整數，長度為約1至約50個胺基酸的長度意指長度為1-3至48-52個胺基酸的長度。在另一個實施例中，本公開文本的肽連接子的長度為約10至約20個胺基酸。在另一個實施例中，本公開文本的肽連接子的長度為約15至約50個胺基酸。在另一個實施例中，本公開文本的肽連接子的長度為約20至約45個胺基酸。在另一個實施例中，本公開文本的肽連接子的長度為約15至約35或約20至約30個胺基酸。在另一個實施例中，本公開文本的肽連接子的長度為約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90、100、500、1000或2000個胺基酸。在一個實施例中，本公開文本的肽連接子的長度為20或30個胺基酸。
在一些實施例中，肽連接子可以包含至少2、至少3、至少4、至少5、至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90或至少100個胺基酸。在其他實施例中，肽連接子可以包含至少200、至少300、至少400、至少500、至少600、至少700、至少800、至少900或至少1,000個胺基酸。在一些實施例中，肽連接子可以包含至少約10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900或2000個胺基酸。肽連接子可以包含1-5個胺基酸、1-10個胺基酸、1-20個胺基酸、10-50個胺基酸、50-100個胺基酸、100-200個胺基酸、200-300個胺基酸、300-400個胺基酸、400-500個胺基酸、500-600個胺基酸、600-700個胺基酸、700-800個胺基酸、800-900個胺基酸或900-1000個胺基酸。
可以使用業內已知的技術將肽連接子引入多肽序列中。可以通過DNA序列分析來確認修飾。可以使用質體DNA轉化宿主細胞用於穩定產生所產生的多肽。
B.3.m.單體-二聚體雜合物
在一些實施例中，本公開文本的進一步包含異源核苷酸序列的分離的核酸分子編碼包含FVIII的單體-二聚體雜合分子。
本文所用的術語「單體-二聚體雜合物」是指包含通過二硫鍵相互締合的第一多肽鏈和第二多肽鏈的嵌合蛋白，其中，例如，第一鏈包含因子VIII和第一Fc區，並且第二鏈包含無FVIII的第二Fc區、基本上由所述第二Fc區組成或由所述第二Fc區組成。因此，單體-二聚體雜合構建體是包含僅具有一種凝血因子的單體方面和具有兩個Fc區的二聚體方面的雜合物。
B.3.n.表現控制元件
在一些實施例中，本公開文本的核酸分子或載體進一步包含至少一個表現控制序列。如本文所用的表現控制序列是任何調節性核苷酸序列，如啟動子序列或啟動子-增強子組合，其有利於與其可操作地連接的編碼核酸的有效轉錄和翻譯。例如，本公開文本的分離核酸分子可以與至少一個轉錄控制序列可操作地連接。
基因表現控制序列可以是例如哺乳動物或病毒啟動子，如組成型或誘導型啟動子。組成型哺乳動物啟動子包括但不限於以下基因的啟動子：次黃嘌呤磷酸核糖轉移酶（HPRT）、腺苷脫胺酶、丙酮酸激酶、β-肌動蛋白啟動子和其他組成型啟動子。在真核細胞中組成型起作用的示例性病毒啟動子包括例如來自巨細胞病毒（CMV）、猿猴病毒（例如SV40）、乳頭瘤病毒、腺病毒、人免疫缺陷病毒（HIV）、勞斯氏肉瘤病毒、巨細胞病毒、莫洛尼氏白血病毒的長末端重複序列（LTR）和其他逆轉錄病毒的啟動子，以及單純皰疹病毒的胸苷激酶啟動子。
其他組成型啟動子是業內一般技術者已知的。可用作本公開文本的基因表現序列的啟動子還包括誘導型啟動子。誘導型啟動子是在誘導劑存在下表現。例如，在某些金屬離子存在下誘導金屬硫蛋白啟動子以促進轉錄和翻譯。其他誘導型啟動子是業內一般技術者已知的。
在一個實施例中，本公開文本包括基因轉殖在組織特異性啟動子和/或增強子控制下的表現。在另一個實施例中，啟動子或其他表現控制序列選擇性地增強基因轉殖在肝細胞中的表現。肝臟特異性啟動子的例子包括但不限於小鼠運甲狀腺素蛋白啟動子（mTTR）、內源人因子VIII（F8）啟動子、內源人因子IX（F9）啟動子、人α-1-抗胰蛋白酶啟動子（hAAT）、人白蛋白最小啟動子和小鼠白蛋白啟動子。在一個特定實施例中，啟動子包括mTTR啟動子。mTTR啟動子描述於R. H. Costa等人, 1986,Mol.Cell.Biol .6:4697中。F8啟動子描述於Figueiredo和Brownlee, 1995,J. Biol.Chem .270:11828-11838中。在某些實施例中，啟動子包括mTTR啟動子（例如，mTTR202啟動子、mTTR202opt啟動子、mTTR482啟動子）中的任一種，如美國專利公開號US2019/0048362中所披露，將所述文獻通過引用以其整體併入本文。
可以使用一種或多種增強子進一步增強表現水準以實現治療功效。一種或多種增強子可以單獨提供，或與一種或多種啟動子元件一起提供。通常，表現控制序列包含多個增強子元件和組織特異性啟動子。在一個實施例中，增強子包括一個或多個拷貝的α-1-微球蛋白/比庫寧蛋白（bikunin）增強子（Rouet等人, 1992,J. Biol.Chem .267:20765-20773；Rouet等人, 1995,Nucleic Acids Res .23:395-404；Rouet等人, 1998,Biochem.J . 334:577-584；Ill等人, 1997,Blood Coagulation Fibrinolysis 8:S23-S30）。在另一個實施例中，增強子源自肝臟特異性轉錄因子結合位點，如EBP、DBP、HNF1、HNF3、HNF4、HNF6和Enh1，包含HNF1、（有義）-HNF3、（有義）-HNF4、（反義）-HNF1、（反義）-HNF6、（有義）-EBP、（反義）-HNF4（反義）。
在特定例子中，可用於本公開文本的啟動子包含SEQ ID NO: 63（即，ET啟動子），其還作為GenBank號AY661265而已知。還參見Vigna等人,Molecular Therapy 11(5) :763 (2005)。其他合適載體和基因調節元件的例子描述於以下文獻中：WO 02/092134、EP1395293或美國專利號6,808,905、7,745,179或7,179,903，將所述文獻通過引用以其整體併入本文。
通常，表現控制序列應視需要包括分別涉及轉錄和翻譯的起始的5'非轉錄序列和5'非翻譯序列，如TATA盒、加帽序列、CAAT序列等。特別地，此類5'非轉錄序列將包括啟動子區，所述啟動子區包括用於可操作地連接的編碼核酸的轉錄控制的啟動子序列。基因表現序列任選地根據需要包括增強子序列或上游啟動子序列。實例
實例1 – 重組慢病毒載體（LV）製劑
慢病毒載體藥物產品穩定性是通過將載體暴露於各種應力條件（例如冷凍和解凍（F/T）、升高的溫度（37ºC）、攪拌）並監測隨時間的變化來評估的。確定穩定性的方法包括：用於功能滴度的ddPCR、用於p24濃度的p24 ELISA、以及用於粒徑分佈和顆粒濃度的NanoSight。功能滴度是一種基於細胞的測定（HEK293），其中將LV與細胞一起培養，使其整合到細胞基因組中，進行提取，並通過ddPCR測量DNA。基於ELISA的p24方法是基於套組的方法（Invitrogen），其中測量病毒衣殼蛋白p24並且其與總顆粒濃度相關。NanoSight是一種利用顆粒的布朗運動來評價溶液中LV顆粒的大小和濃度的方法。
功能滴度是劑量定義參數並且是關鍵度量。它提供了關於LV是否穩定以及因此可以將其有效載荷整合到細胞中的資訊（與藥物的功效和作用機制相關）。功能滴度是劑量定義標準。
載體產生和測量
如OXB專利（US 9,169,491 B2）中所述，通過將四種質體暫態共轉染到HEK293T細胞中來產生VSV假型化的第三代慢病毒載體（LV），並通過陰離子交換進行純化。最初通過功能滴度和HIV-I gag p24抗原免疫捕獲（NEN Life Science Products）分析載體顆粒，以確保適當的轉染、產生和純化產量。對於所有載體，濃縮的載體表現滴度或功能滴度的範圍為1-10E8 TU/mL轉導單位293T （TU）/ml。
細胞培養
通過用慢病毒載體轉導貼壁HEK293T細胞來測量功能滴度。將細胞分割三次，然後收穫用於基因組DNA分離。使用慢病毒載體特異性引子和探針通過液滴數位PCR（ddPCR）在基因組DNA中測量LV整合。將HEK293T貼壁細胞維持在Iscove氏改良的Dulbecco氏培養基（IMDM；Gibco）中，所述培養基補充有10%胎牛血清（FBS；Gibco）和青黴素-鏈黴素和麩醯胺酸的組合。
將LV處理到媒劑中（配製）
純化後，將LV材料（原料藥-DS）合併，並且使用中空纖維膜將其緩衝液交換到相應配製緩衝液中。首先將DS濃縮大約10倍，然後用六倍於濃縮DS的體積的相應配製緩衝液交換（例如， 每1 mL濃縮DS，用6 mL緩衝液）。最終配製的LV被認為是藥物產品（DP），並測試其穩定性。圖 7A 至圖 7B 和圖 8A 至圖 8B 示出了在從媒劑TSSM（20 mM Tris，100 mM NaCl，1%（w/v）蔗糖，1%（w/v）甘露醇，pH 7.3）再處理到媒劑磷酸鹽（配製物 1 ）（10 mM磷酸鹽，100 mM NaCl，3%（w/v）蔗糖，0.05%（w/v）P188，pH 7.3）中之後，對配製物的表徵。除TSSM之外，本文還測試了四種替代性配製物：配製物 2 （磷酸鹽更高鹽）.10 mM磷酸鹽，130 mM NaCl，1%（w/v）蔗糖，0.05%（w/v）P188，pH 7.3；配製物 3 （組胺酸）. 20 mM組胺酸，100 mM NaCl，3%（w/v）蔗糖，0.05%（w/v）P188，pH 6.5；配製物 4 （磷酸鹽pH 7.0）.10 mM磷酸鹽，100 mM NaCl，3%（w/v）蔗糖，0.05%（w/v）P188，pH 7.0；配製物 5 （組胺酸pH 7.0）. 20 mM組胺酸，100 mM NaCl，3%（w/v）蔗糖，0.05%（w/v）P188，pH 7.0。
實例2 – 慢病毒載體（LV）製劑的體內投予
從Charles Rivers Laboratories購買了5周齡CD-1和C57BL6小鼠，並將其維持在無特定病原體的條件下。從我們在Charles River飼養的集落獲得6只HemA雄性小鼠。在小鼠中通過尾靜脈注射或顳靜脈注射進行載體加媒劑或單獨媒劑的投予。根據由Bioverativ/Sanofi IACUC批准的方案（動物方案547）進行所有動物程式。測試了三種不同的配製物：(1) 20 mM Tris，100 mM NaCl，1%（w/v）蔗糖，1%（w/v）甘露醇，pH 7.3（TSSM）；(2) 10 mM磷酸鹽，100 mM NaCl，3%（w/v）蔗糖，0.05%（w/v）P188，pH 7.3（磷酸鹽）；和 (3) 20 mM組胺酸，100 mM NaCl，3%（w/v）蔗糖，0.05%（w/v）P188，pH 6.5（組胺酸）（表4）。
表4：LV製劑的體內投予
配製物 處理 死亡率 觀察結果 無反應
TSSM 載體 + 媒劑 x（n=1） x [皮毛粗糙、過度理毛、弓背姿勢]（n=5）
TSSM 單獨媒劑 x [皮毛粗糙、過度理毛、弓背姿勢]（n=4）
磷酸鹽 載體 + 媒劑 x（n = 3）
磷酸鹽 單獨媒劑 x（n = 3）
組胺酸 載體 + 媒劑 x（n = 3）
組胺酸 單獨媒劑 x（n = 3）
配製物：單獨媒劑（TSSM）以及媒劑（TSSM）和LV
在單次靜脈內投予後，使用LV-coFIX在C57BL6和CD-1成年小鼠中進行劑量反應研究。使用11只雄性C57BL6小鼠（5周齡）和11只雄性CD-1小鼠（5周齡）。所投予的劑量如下：6E10（n = 3）、2E10（n = 4）和7.5E9（n = 4）TU/kg。配製媒劑是TSSM緩衝液。
用配製於TSSM緩衝液中的LV-FIX載體對C57BL6和CD-1小鼠進行給藥。6E10 TU/kg劑量是在不稀釋的情況下以13.3-15 ml/kg直接投予。在投予前，將其他兩個較低劑量在PBS中稀釋。向每個品系的三隻小鼠投予高劑量。注射6E10 TU/kg劑量後，立即有一隻C57BL6小鼠發生心臟驟停並且死亡。大約半小時後，組中的其他小鼠展現出不良影響。我們觀察到過度理毛，然後觀察到皮毛粗糙、精神萎靡和不活躍。這些小鼠似乎在注射後一小時後恢復。只有高劑量（6E10 TU/kg）組中的小鼠顯示出不良影響。接受稀釋劑量的小鼠完全沒有顯示出不良影響。後來，以10-15 ml/kg向2只CD-1小鼠和2只C57BL6小鼠投予僅單獨的TSSM媒劑配製緩衝液。這些小鼠在注射後也展現出不良影響（過度理毛，然後皮毛粗糙、精神萎靡和不活躍），所述不良影響在約一小時後正常化。結果匯總於表4中。
配製物：單獨的媒劑（磷酸鹽）
使用HemA小鼠進行劑量反應研究。使用了3只雄性HemA小鼠（9周齡）。所投予的劑量為15 ml/kg。配製媒劑是磷酸鹽緩衝液。
用15 ml/kg磷酸鹽配製緩衝液對三隻HemA小鼠進行給藥，以測試任何不良的體內影響。在接下來的2天內密切觀察小鼠。沒有注意到任何不良影響，包括使用TSSM配製緩衝液時見到的過度理毛、皮毛粗糙、精神萎靡和不活躍。
配製物：媒劑（磷酸鹽）和LV
通過顳靜脈注射在HemA小鼠幼崽中使用LV-coFVIII-6XTEN進行劑量反應研究。使用了22只雄性和雌性HemA幼崽（2日齡）。所投予的劑量如下：3E9和1.5E9 TU/kg。配製媒劑是磷酸鹽緩衝液。
通過顳靜脈注射以3E9或1.5E9 TU/kg向兩日齡小鼠投予配製於磷酸鹽緩衝液中的LV-FVIIIXTEN。在不稀釋的情況下投予高劑量（3E9）。注射後，在這些小鼠中未見到不良影響。
配製物：單獨的媒劑（組胺酸）
使用HemA小鼠進行劑量反應研究。使用了3只雄性HemA小鼠（19周齡）。所投予的劑量為15 ml/kg。配製媒劑是組胺酸緩衝液。
用15 ml/kg組胺酸配製緩衝液對三隻HemA小鼠進行給藥，以測試任何不良的體內影響。在接下來的2天內密切觀察小鼠。沒有注意到任何不良影響，包括使用TSSM配製緩衝液時見到的過度理毛、皮毛粗糙、精神萎靡和不活躍。
配製物：媒劑（組胺酸）和LV
通過尾靜脈注射在耐受的成年HemA小鼠中使用LV-coFVIII-6XTEN進行劑量反應研究。使用了4只雄性HF8小鼠（12周齡）。所投予的劑量為15 ml/kg。配製媒劑是組胺酸緩衝液。
用配製於組胺酸配製緩衝液中的15 ml/kg LV-FVIIIXTEN載體對四隻耐受的HemA小鼠（HF8）進行給藥。沒有注意到任何不良影響，包括使用TSSM配製物時見到的過度理毛、皮毛粗糙、精神萎靡和不活躍。
概括地說，對於每種配製物，向小鼠注射載體加媒劑或單獨的媒劑。表 4 顯示，TSSM注射（載體加媒劑和單獨的媒劑二者）對小鼠具有不良毒性影響，包括一隻死亡。相反地，磷酸鹽和組胺酸配製物（載體加媒劑或單獨的媒劑）在小鼠中沒有產生反應（沒有毒性影響）。
實例3 – 對使用媒劑TSSM的配製物的測試
攪拌、冷凍-解凍和溫度條件
通過使配製物經受攪拌、冷凍-解凍（F/T）循環（5個和10個）以及6小時室溫培養來測試添加或不添加1%（w/v）P188（最終濃度為1%（w/v）P188）的TSSM配製物（載體加媒劑）的穩定性（圖 3A 至圖 3B 、圖 4 、圖 5A 至圖 5B 、表 5 ）。通過測定功能滴度、p24濃度以及粒徑和分佈（NanoSight）來測量載體的穩定性。如圖 3A 至圖 3B 、圖 4 、圖 5A 至圖 5B 和表 5 所示，對於具有或沒有P188的配製物，在不同條件下，載體穩定性沒有顯著變化。使用NanoSight通過粒徑測量來確定載體完整性。
表5：對使用媒劑TSSM的配製物的測試
    ddPCR NanoSight p24 NanoSight/ddPCR p24/ddPCR
配製物 應力 TU/mL 顆粒 /mL 顆粒 /mL 感染比 感染比
TSSM To 1.33E+08 6.08E+11 9.46E+11 4571 7109
TSSM + P188 To 1.27E+08 6.74E+11 1.00E+12 5292 7876
TSSM 攪拌 1.45E+08 6.50E+11 1.03E+12 4471 7101
TSSM + P188 攪拌 1.45E+08 6.46E+11 1.21E+12 4443 8339
TSSM RT- 6h 1.29E+08 NT 1.04E+12 NT 8047
TSSM + P188 RT- 6h 1.34E+08 NT 1.13E+12 NT 8461
TSSM F/T 1.49E+08 6.18E+11 8.81E+11 4153 5919
TSSM + P188 F/T 1.72E+08 6.78E+11 9.66E+11 3945 5620
*假設1 ng/mL p24 = 1.25E7個顆粒/mL（NT = 未測試）
稀釋條件
將TSSM配製物（載體加媒劑）稀釋1倍、20倍和100倍，在37ºC下培養，並在第0、3、7和14天通過經由ddPCR測量功能滴度來確定穩定性。圖 6A 和圖 6B 顯示，在升高的溫度下兩周內，稀釋對穩定性沒有影響。
持續不同時間段的培養
將TSSM配製物（載體加媒劑）在37ºC下培養0、3、7或14天。通過經由ddPCR確定功能滴度來測量穩定性，同時使用Nanosight或p24 ELISA測量顆粒完整性（顆粒濃度）。確定了隨培養時間變化的穩定性和載體完整性（顆粒濃度），如圖 7A 至圖 7B 和圖 8A 至圖 8B 所示。隨著培養時間增加，載體穩定性降低，而顆粒濃度增加。
在37ºC下的延長培養
將TSSM配製物（載體加媒劑）在37ºC下培養0天、3天、1周或2周。使用Nanosight測量粒徑分佈。如圖 7A 至圖 7B 和圖 8A 至圖 8B 所示，對於延長的培養時間，粒徑分佈變寬，同時顆粒濃度增加。結果可以解釋如下。總顆粒濃度在增加，而感染性在降低，這是因為長期暴露於37ºC溫度會使衣殼破裂，從而導致ELISA中測量的p24更加明顯。此外，病毒破裂導致較小尺寸的物質增加。
實例4 –測試使用媒劑磷酸鹽和組胺酸的配製物
磷酸鹽配製物
在處理到媒劑磷酸鹽（10 mM磷酸鹽，100 mM NaCl，3%（w/v）蔗糖，0.05%（w/v）P188，pH 7.3）中之後，對慢病毒載體（LV）配製物進行表徵。使用Nanosight測量粒徑和分佈（圖 1 ）。圖 1 是示出了Nanosight的結果的曲線圖，其顯示出原料藥（DS）池的乾淨單體峰，在超濾/滲濾到最終的媒劑緩衝液中之後（切向流過濾-TFF後），所述峰略微漂移至較大的粒徑，且顯現出一些較大顆粒的存在。不受理論的束縛，這可能是由於在處理材料的應力期間顆粒的物理劣化所致。當通過0.22 µm大小的濾膜過濾時，最終藥物產品（DP）產生恢復為與開始處理時的DS池重合的粒徑和分佈曲線。TFF應力在圖 2A 至圖 2B 的照片中可視地示出。
在不同條件下測試了磷酸鹽配製物（載體加媒劑）的載體穩定性，所述不同條件包括攪拌、在37ºC下培養、持續時間和稀釋度（圖 9 和圖 10A 至圖 10B ）。
圖 10A 至圖 10B 示出了在37ºC下一周內磷酸鹽緩衝液的NanoSight大小資料。在培養時間內，較高分子量物質略有增加，並且總顆粒整體減少。資料表明，在RT或37ºC下的穩定性過程中，圖 9 所示的功能滴度的損失可能對應於圖 10A 至圖 10B 中觀察到的顆粒的物理損失。
為了評估磷酸鹽配製物在臨床投予期間的典型輸注場景過程中的穩定性，進行了模擬使用中研究。將LVV材料用磷酸鹽媒劑稀釋並注射到空的IV袋中。在室溫下在6小時內收集資料（圖 13 ）。穩定性研究依據功能滴度或p24顯示沒有損失的跡象，這表明載體在研究的持續時間內是穩定的。
為了測試與前瞻性容器封閉系統的相容性，進行研究以檢查載體和磷酸鹽媒劑在Schott 1型玻璃小瓶以及West CZ COP小瓶中的穩定性（圖 14 、圖 15 和圖 16A 至圖 16C ）。資料表明，當在1型或CZ小瓶中僅用媒劑處理時，沒有產生明顯的顆粒（圖 14 ）。為了評估在冷凍和解凍過程中小瓶上的應變，將應變儀膠粘到玻璃小瓶並且置於-80ºC冷凍器中2小時的時段，之後在37ºC水浴中快速加溫（圖 15 ）。研究表明，在小瓶上沒有可感知的正應變，這將表明在該相對較高的5 mL填充體積下，磷酸鹽配製物不會對容器施加高應力，文獻中已經顯示高應力會損壞某些小瓶。還測試了LVV材料與各個容器的相容性，顯示於圖 16A 至圖 16C 中。通過每個測試，即轉導滴度（圖 16A ）、p24（圖 16B ）和顆粒濃度（圖 16C ），載體具有可比性穩定性和完整性，從而表明與兩種容器封閉形式（即玻璃小瓶和塑膠小瓶）的相容性。
磷酸鹽和組胺酸配製物比較
在不同的應力條件下測試了磷酸鹽（配製物 1 和配製物 2 ）和組胺酸（配製物 3 ）配製物（載體加媒劑）的載體穩定性（圖 11A 至圖 11B 、圖 12A 至圖 12B ）。在冷凍-解凍循環研究中，觀察到兩種磷酸鹽配製物的功能滴度均隨循環進行而降低。相比之下，組胺酸配製物沒有顯示出功能損失並且保持穩定。在保持室溫以及攪拌應力條件過程中，磷酸鹽配製物顯示出高水準的功能損失（降至定量極限）。令人驚訝的是，組胺酸配製物仍不受在室溫下培養3天或攪拌3天的影響。另外，對於磷酸鹽配製物（比較配製物 1 和配製物 2 ），添加更多氯化鈉和減少蔗糖不影響載體穩定性。
在材料的單獨製劑中，重複圖 11A 至圖 11B 中展示的穩定性研究的重新測試並報告在圖 17 中。功能滴度的損失不像磷酸鹽配製物那麼劇烈，但是組胺酸配製物與磷酸鹽配製物之間的趨勢是一致的。
在9個月的冷凍（-80ºC）穩定性研究過程中，磷酸鹽配製物 1 和組胺酸配製物 3 緩衝液似乎都使得能實現穩定的LVV DP（圖 18 ）。基於功能滴度，資料表明，在-80ºC下儲存期間沒有任何材料損失（在測定變異性內）。
最後，為了評價僅緩衝液（磷酸鹽和組胺酸）的影響，以相同方式製備在相同pH 7.0下的兩種配製物。也就是說，配製物 4 與配製物 5 之間的唯一區別是緩衝組分（磷酸鹽或組胺酸）。在製造過程的情境下，兩種配製物在超濾和滲濾（TFF）以及最終無菌過濾中表現相似（表 6 ）。
表 6 ：使 用切向流過濾製備配製物 4 （磷酸鹽）和配製物 5 （組胺酸）。將樣品針對六倍體積的相應配製物滲濾，然後超濾（濃縮）若干倍體積。
配製物 過程步驟 體積(mL) NanoSight (顆粒/mL) 總顆粒
磷酸鹽 TFF前 165.2 1.28E+11 2.11E+13
磷酸鹽 0.2 um過濾後 88.5 2.11E+11 1.87E+13
組胺酸 TFF前 155.8 9.64E+10 1.50E+13
組胺酸 0.2 um過濾後 65.2 2.54E+11 1.66E+13
在製備相應的配製物後，進行穩定性研究以比較緩衝組分。圖 19A 至圖 19D 總結了在功能滴度和歸一化功能滴度、p24和顆粒濃度上隨穩定性條件變化示出的發現：任一種配製物的LVV穩定性之間僅存在微小差異。這似乎表明，圖 11A 至圖 11B 、圖 12A 至圖 12B 和圖 13 中呈現的結果似乎反映了由於pH（7.3和6.5）而不是緩衝液組成（磷酸鹽或組胺酸）的差異導致的變化的穩定性水準。
無
從以下說明性實施例的詳細描述結合附圖將更充分地理解本發明的前述和其他特徵和優點。所述專利或申請檔包含至少一幅彩色附圖。在請求並支付必要的費用後，官方將會提供帶有一幅或多幅彩色附圖的本專利或專利申請公開案的副本。
圖 1 描繪了對處理到媒劑磷酸鹽（10 mM磷酸鹽，100 mM NaCl，3%（w/v）蔗糖，0.05%（w/v）P188，pH 7.3）中後的慢病毒載體（LV）配製物的表徵。原料藥（DS）池顯示出乾淨的單體峰，在超濾/滲濾到最終的媒劑緩衝液中之後（切向流過濾-TFF後），所述峰略微漂移至較大的大小，並且存在一些較大的顆粒。不受理論的束縛，這可能是由於在處理材料的應力期間顆粒的物理劣化所致。最終DP已通過0.22 µm大小的過濾膜進行過濾，並且分佈曲線恢復為與開始處理時的DS池重合。TFF應力的影響可以在圖 2A 至圖 2B 所示的圖片中可視地看到。
圖 2A 至圖 2B 描繪了無菌過濾對在切向流過濾（TFF）後在媒劑磷酸鹽（10 mM磷酸鹽，100 mM NaCl，3%（w/v）蔗糖，0.05%（w/v）P188，pH 7.3）中（圖 2A ）和在最終原料藥（DS）池中（圖 2B ）的慢病毒載體（LV）的影響。
圖 3A 至圖 3B 描繪了在不添加1%（w/v）P188的情況下（圖 3A ）和在添加1%（w/v）P188的情況下（圖 3B ），慢病毒載體（LV）在媒劑TSSM（20 mM TRIS，100 mM NaCl，1%（w/v）蔗糖，1%（w/v）甘露醇，pH 7.3）中的穩定性，如使用p24 ELISA通過p24濃度測量的。
圖 4 描繪了在攪拌時，慢病毒載體（LV）在媒劑TSSM（20 mM TRIS，100 mM NaCl，1%（w/v）蔗糖，1%（w/v）甘露醇，pH 7.3）中的穩定性，如使用NanoSight通過顆粒濃度和粒徑測量的。使用TSSM配製物的穩定性研究：20 mM Tris，100 mM NaCl，1%（w/v）蔗糖，1%（w/v）甘露醇，pH 7.3，如在具有和沒有Poloxomer 188（P188）的情況下所指示的。使用NanoSight進行測量。
圖 5A 至圖 5B 描繪了在攪拌時，慢病毒載體（LV）在媒劑TSSM（20 mM TRIS，100 mM NaCl，1%（w/v）蔗糖，1%（w/v）甘露醇，pH 7.3）中的穩定性，如使用NanoSight通過顆粒濃度和粒徑測量的。圖 5A 顯示，在攪拌應力下，慢病毒顆粒的大小似乎僅略微增長。假定主峰是單體慢病毒載體（約130 nm），並且較小的較大峰可能是單體顆粒的劣化。圖 5B 顯示，添加1%（w/v）泊洛沙姆188（P188）不干擾慢病毒顆粒。
圖 6A 至圖 6B 描繪了在37ºC下在0、3、7和14天內慢病毒載體（LV）在媒劑TSSM（20 mM TRIS，100 mM NaCl，1%（w/v）蔗糖，1%（w/v）甘露醇，pH 7.3）中的穩定性，如使用ddPCR通過以TU/ml計（圖 6A ）和以T0%計（圖 6B ）的功能滴度測量的。將圖 6B 針對時間0進行歸一化。每個條形組表示以下稀釋系列：未稀釋（無稀釋）、20倍稀釋（20x）、100倍稀釋（100x）。
圖 7A 至圖 7B 描繪了在37ºC下在0、3、7和14天內慢病毒載體（LV）在媒劑TSSM（20 mM TRIS，100 mM NaCl，1%（w/v）蔗糖，1%（w/v）甘露醇，pH 7.3）中的穩定性，如使用ddPCR通過功能滴度（以TU/ml計）和使用NanoSight通過顆粒濃度（圖 7A ）或通過與p24資料疊加的功能滴度（圖 7B ）測量的。
圖 8A 至圖 8B .圖 8A 描繪了在37ºC下慢病毒載體（LV）在媒劑TSSM（20 mM TRIS，100 mM NaCl，1%（w/v）蔗糖，1%（w/v）甘露醇，pH 7.3）中隨培養時間（以天和周計）而變化的的穩定性，如使用Nanosight通過顆粒濃度和大小測量的。圖 8B 以對數標度報告37ºC穩定性實驗的結果，以更清楚地看到粒徑隨時間的差異。
圖 9 描繪了慢病毒載體（LV）在媒劑磷酸鹽配製物（10 mM磷酸鹽，100 mM NaCl，3%（w/v）蔗糖，0.05%（w/v）P188，pH 7.3）中隨培養時間、培養溫度、攪拌和冷凍/解凍（F/T）循環（以天計）而變化的穩定性，如使用ddPCR通過功能滴度（以T0%計）和使用p24 ELISA通過p24濃度測量的。
圖 10A 至圖 10B 描繪了使用磷酸鹽配製物（10 mM磷酸鹽，100 mM NaCl，3%（w/v）蔗糖，0.05%（w/v）P188，pH 7.3）的慢病毒載體（LV）在37ºC下隨時間（以天計）而變化的穩定性，如使用NanoSight通過顆粒濃度和粒徑分佈測量的。圖 10A 報告了針對1進行歸一化以使劣化峰的差異更明顯的NanoSight資料。圖 10B 呈現了原始資料，其顯示出在37ºC培養下單體峰隨時間的減小。
圖 11A 至圖 11B 描繪了慢病毒載體（LV）的穩定性，其比較了三種配製物：配製物 1 .磷酸鹽配製物：10 mM磷酸鹽，100 mM NaCl，3%（w/v）蔗糖，0.05%（w/v）P188，pH 7.3；配製物 2 .10 mM磷酸鹽，130 mM NaCl，1%（w/v）蔗糖，0.05%（w/v）P188，pH 7.3；配製物 3. 20 mM組胺酸，100 mM NaCl，3%（w/v）蔗糖，0.05%（w/v）P188，pH 6.5；在5個和10個冷凍和解凍（F/T）循環期間（圖 11A ），並且在室溫（RT）下以及在室溫和攪拌（軌道式震盪器，350 rpm）下比較3天（圖 11B ），如使用ddPCR通過功能滴度測量的。
圖 12A 至圖 12B 描繪了慢病毒載體（LV）的穩定性，其比較了三種配製物：配製物 1 （Phos）.磷酸鹽配製物：10 mM磷酸鹽，100 mM NaCl，3%（w/v）蔗糖，0.05%（w/v）P188，pH 7.3；配製物 2 （Phos.更高鹽）.10 mM磷酸鹽，130 mM NaCl，1%（w/v）蔗糖，0.05%（w/v）P188，pH 7.3；配製物 3 （Hist）. 20 mM組胺酸，100 mM NaCl，3%（w/v）蔗糖，0.05%（w/v）P188，pH 6.5，如使用NanoSight通過顆粒數量測量的。圖 12A 示出了在室溫（RT）下和在室溫和攪拌（軌道式震盪器，350 rpm）下3天的資料，而圖 12B 示出了對於5個和10個冷凍和解凍（F/T）循環的資料。
圖 13 描繪了使用以下一種配製物在室溫下暴露於IV袋6小時期間的模擬使用中穩定性研究：配製物 1 （磷酸鹽緩衝液）：10 mM磷酸鹽，100 mM NaCl，3%（w/v）蔗糖，0.05% （w/v）P188，pH 7.3。
圖 14 描繪了配製緩衝液穩定性研究，其比較了在一個冷凍和解凍循環（-80ºC過夜，在37ºC水浴中解凍）內的容器封閉（Schott 1型玻璃小瓶和West CZ COP小瓶）性能：配製物 1 （磷酸鹽緩衝液）：10 mM磷酸鹽，100 mM NaCl，3%（w/v）蔗糖，0.05%（w/v）P188，pH 7.3。使用微流成像（MFI）獲得顆粒濃度。
圖 15 描繪了使用Schott 1型玻璃小瓶經過一個冷凍和解凍循環（-80C，在37ºC水浴中解凍）的小瓶應變研究：配製物 1 （僅磷酸鹽緩衝液）：10 mM磷酸鹽，100 mM NaCl，3%（w/v）蔗糖，0.05%（w/v）P188，pH 7.3。使用應變儀和熱電偶收集資料。
圖 16A 至圖 16C 描繪了LVV材料相容性，其比較了經過各種穩定性條件的容器封閉（Schott 1型玻璃小瓶和West CZ小瓶）性能，1FT = 1個冷凍和解凍循環，2 hr = 暴露於室溫2 hr；3x泡沫是從吸液管快速（aggressive）抽吸和分配，從而在容器中產生可見的泡沫；10x是10倍稀釋度下的相同穩定性參數。LVV是在配製物 1 （磷酸鹽緩衝液）中：10 mM磷酸鹽，100 mM NaCl，3%（w/v）蔗糖，0.05%（w/v）P188，pH 7.3；如通過功能滴度（圖 16A ）、p24濃度（圖 16B ） 和顆粒濃度（圖 16C ）測量的。使用應變儀和熱電偶收集資料。使用NanoSight獲得顆粒濃度。
圖 17 描繪了穩定性研究，其比較了經過10個冷凍和解凍（F/T）循環的兩種配製物並且比較了在室溫下（RT）下1天和3天：配製物 1 （ 磷酸鹽緩衝液）：10 mM磷酸鹽，100 mM NaCl，3%（w/v）蔗糖，0.05%（w/v）P188，pH 7.3；配製物 3 （組胺酸緩衝液）. 20 mM組胺酸，100 mM NaCl，3%（w/v）蔗糖，0.05%（w/v）P188，pH 6.5。
圖 18 描繪了磷酸鹽和組胺酸配製物的長期穩定性（在-80ºC冷凍儲存的9個月時間點（9 mo.））數據：配製物 1 （磷酸鹽）：10 mM磷酸鹽，100 mM NaCl，3%（w/v）蔗糖，0.05%（w/v）P188，pH 7.3；配製物 3 （組胺酸）. 20 mM組胺酸，100 mM NaCl，3%（w/v）蔗糖，0.05%（w/v）P188，pH 6.5。
圖 19A 至圖 19D 描繪了在相同pH 7.0下比較磷酸鹽緩衝液與組胺酸緩衝液的穩定性研究：配製物 4 （磷酸鹽）：10 mM磷酸鹽，100 mM NaCl，3%（w/v）蔗糖，0.05%（w/v）P188，pH 7.0；配製物 5 （組胺酸）. 20 mM組胺酸，100 mM NaCl，3%（w/v）蔗糖，0.05%（w/v）P188，pH 7.0；如通過功能滴度（圖 19A ）、歸一化的功能滴度（圖 19B ）、p24濃度（圖 19C ）和顆粒濃度（圖 19D ）測量的。將結果以功能滴度的單位示出並歸一化為起始材料（T0）的百分比。使用NanoSight獲得顆粒濃度。
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Claims (48)

  1. 一種重組慢病毒載體製劑，其包含： (a) 治療有效劑量的重組慢病毒載體； (b) 無TRIS緩衝系統； (c) 鹽； (d) 表面活性劑；以及 (e) 碳水化合物， 其中所述醫藥組合物適於全身性投予至人類患者。
  2. 如請求項1所述的製劑，其中所述緩衝系統或所述製劑的pH為約6.0至約8.0。
  3. 如請求項1或2所述的製劑，其中所述緩衝系統或所述製劑的pH為約6.0至約7.5。
  4. 如前述請求項中任一項所述的製劑，其中所述緩衝系統或所述製劑的pH為約6.0至約7.0。
  5. 如前述請求項中任一項所述的製劑，其中所述緩衝系統或所述製劑的pH為約6.5。
  6. 如前述請求項中任一項所述的製劑，其中所述緩衝系統或所述製劑的pH為約7.0至約8.0。
  7. 如前述請求項中任一項所述的製劑，其中所述緩衝系統或所述製劑的pH為約7.3。
  8. 如前述請求項中任一項所述的製劑，其中所述慢病毒載體包含編碼VSV-G或其片段的核苷酸序列。
  9. 如前述請求項中任一項所述的製劑，其中所述緩衝系統包括磷酸鹽緩衝液或組胺酸緩衝液。
  10. 如請求項9所述的製劑，其中所述磷酸鹽緩衝液的濃度為約5 mM至約30 mM。
  11. 如請求項10所述的製劑，其中所述磷酸鹽緩衝液的濃度為約10 mM至約20 mM、約10 mM至約15 mM、約20 mM至約30 mM、約20 mM至約25 mM、或約15 mM至約20 mM。
  12. 如請求項9所述的製劑，其中所述組胺酸緩衝液的濃度為約5 mM至約30 mM。
  13. 如請求項12所述的製劑，其中所述組胺酸緩衝液的濃度為約10 mM至約20 mM、約10 mM至約15 mM、約20 mM至約30 mM、約20 mM至約25 mM、或約15 mM至約20 mM。
  14. 如前述請求項中任一項所述的製劑，其中所述鹽的濃度為約80 mM至約150 mM。
  15. 如前述請求項中任一項所述的製劑，其中所述鹽的濃度為約100 mM、約110 mM、約130 mM或約150 mM。
  16. 如前述請求項中任一項所述的製劑，其中所述鹽是氯化物鹽。
  17. 如請求項16所述的製劑，其中所述氯化物鹽是NaCl。
  18. 如前述請求項中任一項所述的製劑，其中所述表面活性劑是泊洛沙姆(poloxamer)。
  19. 如請求項18所述的製劑，其中所述泊洛沙姆選自以下所組成之群組：泊洛沙姆101（P101）、泊洛沙姆105（P105）、泊洛沙姆108（P108）、泊洛沙姆122（P122）、泊洛沙姆123（P123）、泊洛沙姆124（P124）、泊洛沙姆181（P181）、泊洛沙姆182（P182）、泊洛沙姆183（P183）、泊洛沙姆184（P184）、泊洛沙姆185（P185）、泊洛沙姆188（P188）、泊洛沙姆212（P212）、泊洛沙姆215（P215）、泊洛沙姆217（P217）、泊洛沙姆231（P231）、泊洛沙姆234（P234）、泊洛沙姆235（P235）、泊洛沙姆237（P237）、泊洛沙姆238（P238）、泊洛沙姆282（P282）、泊洛沙姆284（P284）、泊洛沙姆288（P288）、泊洛沙姆331（P331）、泊洛沙姆333（P333）、泊洛沙姆334（P334）、泊洛沙姆335（P335）、泊洛沙姆338（P338）、泊洛沙姆401（P401）、泊洛沙姆402（P402）、泊洛沙姆403（P403）、泊洛沙姆407（P407）及其組合。
  20. 如請求項18或19所述的製劑，其中所述泊洛沙姆是泊洛沙姆188（P188）。
  21. 如請求項18或19所述的製劑，其中所述泊洛沙姆是泊洛沙姆407（P407）。
  22. 如請求項1-17中任一項所述的製劑，其中所述表面活性劑是聚山梨醇酯。
  23. 如請求項22所述的製劑，其中所述聚山梨醇酯選自以下組成之群組：聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯80及其組合。
  24. 如前述請求項中任一項所述的製劑，其中所述表面活性劑的濃度為約0.01%（w/v）至約0.1%（w/v）。
  25. 如前述請求項中任一項所述的製劑，其中表面活性劑的濃度為約0.03%（w/v）、約0.05%（w/v）、約0.07%（w/v）或約0.09%（w/v）。
  26. 如前述請求項中任一項所述的製劑，其中所述碳水化合物的濃度為約0.5%（w/v）至約5%（w/v）。
  27. 如前述請求項中任一項所述的製劑，其中所述碳水化合物的濃度為約1%（w/v）、約2%（w/v）、約3%（w/v）或約4%（w/v）。
  28. 如前述請求項中任一項所述的製劑，其中所述碳水化合物是蔗糖。
  29. 如請求項1-28中任一項所述的製劑，其包含： (a) 治療有效劑量的重組慢病毒載體； (b) 約10 mM磷酸鹽； (c) 約100 mM氯化鈉； (d) 約0.05%（w/v）泊洛沙姆188；以及 (e) 約3%（w/v）蔗糖， 其中所述製劑的pH為約7.3，且其中所述醫藥組合物適於全身性投予至人類患者。
  30. 如請求項1-28中任一項所述的製劑，其包含： (a) 治療有效劑量的重組慢病毒載體； (b) 約10 mM磷酸鹽； (c) 約130 mM氯化鈉； (d) 約0.05%（w/v）泊洛沙姆188；以及 (e) 約1%（w/v）蔗糖， 其中所述製劑的pH為約7.3，且其中所述醫藥組合物適於全身性投予至人類患者。
  31. 如請求項1-28中任一項所述的製劑，其包含： (a) 治療有效劑量的重組慢病毒載體； (b) 約20 mM組胺酸； (c) 約100 mM氯化鈉； (d) 約0.05%（w/v）泊洛沙姆188；以及 (e) 約3%（w/v）蔗糖， 其中所述製劑的pH為約6.5，且其中所述醫藥組合物適於全身性投予至人類患者。
  32. 如請求項1-28中任一項所述的製劑，其包含： (a) 治療有效劑量的重組慢病毒載體； (b) 約10 mM磷酸鹽； (c) 約100 mM氯化鈉； (d) 約0.05%（w/v）泊洛沙姆188；以及 (e) 約3%（w/v）蔗糖， 其中所述製劑的pH為約7.0，且其中所述醫藥組合物適於全身性投予至人類患者。
  33. 如請求項1-28中任一項所述的製劑，其包含： (a) 治療有效劑量的重組慢病毒載體； (b) 約20 mM組胺酸； (c) 約100 mM氯化鈉； (d) 約0.05%（w/v）泊洛沙姆188；以及 (e) 約3%（w/v）蔗糖， 其中所述製劑的pH為約7.0，且其中所述醫藥組合物適於全身性投予至人類患者。
  34. 如前述請求項中任一項所述的製劑，其中所述重組慢病毒載體包含核酸，所述核酸包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2所示的因子VIII（FVIII）編碼序列至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%相同的核苷酸序列。
  35. 如請求項34所述的製劑，其中所述重組慢病毒載體包含核酸，所述核酸包含SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2所示的因子VIII（FVIII）編碼序列。
  36. 如請求項34或35所述的製劑，其中所述重組慢病毒載體包含核酸，所述核酸由SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2所示的因子VIII（FVIII）編碼序列組成。
  37. 如請求項1-36中任一項所述的製劑，其中所述重組慢病毒載體包含核酸，所述核酸包含與SEQ ID NO: 3所示的因子IX（FIX）編碼序列至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%相同的核苷酸序列。
  38. 如請求項37所述的製劑，其中所述重組慢病毒載體包含核酸，所述核酸包含SEQ ID NO: 3所示的因子IX（FIX）編碼序列。
  39. 如請求項37或38所述的製劑，其中所述重組慢病毒載體包含核酸，所述核酸由SEQ ID NO: 3所示的因子IX（FIX）編碼序列組成。
  40. 如前述請求項中任一項所述的製劑，其中所述重組慢病毒載體包含增強型運甲狀腺素蛋白（enhanced transthyretin, ET）啟動子。
  41. 如前述請求項中任一項所述的製劑，其中所述重組慢病毒載體進一步包含與SEQ ID NO: 7所示的miR-142的靶序列至少90%相同的核苷酸序列。
  42. 如前述請求項中任一項所述的製劑，其中所述重組慢病毒載體從選自以下的轉染宿主細胞中分離：CHO細胞、HEK293細胞、BHK21細胞、PER.C6細胞、NSO細胞和CAP細胞。
  43. 如請求項42所述的製劑，其中所述宿主細胞是CD47陽性宿主細胞。
  44. 一種治療患有障礙的人類患者的方法，其包括向所述人類患者投予如前述請求項中任一項所述的重組慢病毒載體製劑。
  45. 如請求項44所述的方法，其中所述製劑全身性投予至所述人類患者。
  46. 如請求項44或45所述的方法，其中所述製劑是靜脈內投予。
  47. 如請求項44-46中任一項所述的方法，其中所述障礙是出血障礙。
  48. 如請求項47所述的方法，其中所述出血障礙是A型血友病或B型血友病。
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