KR20120060209A - 변형된 인자 ｉｘ 폴리펩티드 및 그의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 변형된 인자 IX 폴리펩티드, 예컨대 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 인자 IX 폴리펩티드에 관한 것이다. 또한 본 발명은 변형된 인자 IX 폴리펩티드의 제조 방법, 및 변형된 인자 IX 폴리펩티드의 사용 방법, 예를 들어 B형 혈우병에 걸린 환자를 치료하기 위해 사용하는 방법에 관한 것이다.
Description
[관련 출원에 대한 참조]
본원은 2009년 7월 31일에 출원된 미국 가출원 번호 61/230,551을 우선권 주장하며, 이는 모든 목적을 위해 본원에 참고로 포함된다.
[분야]
본원은 변형된 인자 IX 폴리펩티드, 예를 들어 증가된 비활성을 나타내는 인자 IX 폴리펩티드, 및 중합체 접합된 인자 IX 폴리펩티드에 관한 것이다. 또한, 본원은 변형된 인자 IX 폴리펩티드 및 그의 접합체의 제조 방법, 및 변형된 인자 IX 폴리펩티드의 사용 방법, 예를 들어 B형 혈우병에 걸린 환자를 치료하기 위한 방법에 관한 것이다.
B형 혈우병은 34,500명의 남성 중 1명에서 초래되고, 혈액 내의 낮은 또는 검출불가능한 응고 인자 IX (FIX) 단백질을 초래하는 FIX를 코딩하는 유전자에서의 다양한 유전적 결함에 의해 초래된다 (문헌 [Kurachi, et al., Hematol. Oncol. Clin. North Am. 6:991-997, 1992]; [Lillicrap, Haemophilia 4:350-357, 1998]). 불충분한 수준의 FIX는 결함이 있는 응고, 제어되지 않은 출혈로부터 초래되는 증상에 이른다. B형 혈우병은 이미 시작된 출혈을 정지시키거나 출혈이 발생하는 것을 방지 (예방)하기 위한 혈장-유래 또는 재조합 FIX 단백질의 정맥내 주입에 의해 효과적으로 치료된다 (문헌 [Dargaud, et al., Expert Opin. Biol. Ther. 7:651-663]; [Giangrande, Expert Opin. Pharmacother. 6:1517-1524, 2005]). 효과적인 예방은 정상 수준의 약 1％인 최소 저점 수준의 FIX를 유지하는 것을 필요로 한다 (문헌 [Giangrande, Expert Opin. Pharmacother. 6:1517-1524, 2005]). 천연 FIX (혈장-유래 또는 재조합)의 대략 18시간 내지 24시간의 반감기로 인해, FIX 수준이 볼루스(bolus) 주사 후 3일 내지 4일 이내에 정상 수준의 1％ 미만으로 떨어지고, 이는 효과적인 예방을 달성하기 위해 평균적으로 3일마다 주사를 반복하는 것을 필요로 한다 (문헌 [Giangrande, Expert Opin. Pharmacother. 6:1517-1524, 2005]). 이같은 빈번한 정맥내 주사는 환자에게 문제가 되고, 효과적인 예방 달성에 대한 장애물이며 (문헌 [Petrini, Haemophilia 13 Suppl 2:16-22, 2007]), 특히 어린이에서 그러하다. 증가된 비활성을 갖는 FIX 단백질은 보호의 지속시간을 증가시키고, 이에 따라 유의한 의학적 혜택을 받을 잠재력을 갖는다.
[개요]
본원은 FIX의 비활성이 개선되도록 변형된 아미노산 서열을 포함하는 FIX 폴리펩티드 (또한, 변형된 FIX 폴리펩티드, FIX 뮤테인 또는 FIX 변이체로 지칭됨)를 제공한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 아미노산 치환이 도입된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 응고 활성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 변형된 FIX 폴리펩티드는 아미노산 잔기 85, 86, 87, 338 및 410에 하나 이상의 치환을 포함할 수 있다.
변형된 FIX 폴리펩티드는 하나 이상의 아미노산 치환의 도입, 예를 들어 임의의 아미노산으로의 치환에 의해 생성될 수 있다. 예시적 실시양태는 하기와 같은 (이에 제한되지는 않음) 하나 이상의 치환을 포함하는 FIX 폴리펩티드를 포함한다:
(a) D85F; D85G; D85H; D85I; D85M; D85N; D85R; D85S; D85W; D85Y; V86A; V86D; V86E; V86G; V86H; V86I; V86L; V86M; V86N; V86P; V86Q; V86R; V86S; V86T; T87F; T87I; T87K; T87M; T87R; T87V; T87W; R338A; R338F; R338I; R338L; R338M; R338S; R338T; R338V; R338W; E410N; E410Q;
(b) D85W 및 T87R; D85F 및 T87I; D85W 및 T87W; D85R 및 T85R; D85I 및 T87R; D85Y 및 T87F; D85I 및 T87M; D85F 및 T87R; D85F 및 T87V; D85R 및 T87K; D85H 및 T87I; D85I 및 T87I; D85Y 및 T87K; D85S 및 T87R; D85Y 및 T87R; D85G 및 T87K; D85H 및 T87W; D85H 및 T87K; D85F 및 T87K; D85H 및 T87V; D85M 및 T87I; D85H 및 T87M; R338A 및 E410N; R338A 및 E410Q;
(c) D85W, V86A, 및 T87R; D85F, V86A, 및 T87I; D85W, V86A, 및 T87W; D85R, V86A, 및 T85R; D85I, V86A, 및 T87R; D85Y, V86A, 및 T87F; D85I, V86A, 및 T87M; D85F, V86A, 및 T87R; D85F, V86A, 및 T87V; D85R, V86A, 및 T87K; D85H, V86A, 및 T87I; D85I, V86A, 및 T87I; D85Y, V86A, 및 T87K; D85S, V86A, 및 T87R; D85Y, V86A, 및 T87R; D85G, V86A, 및 T87K; D85H, V86A, 및 T87W; D85H, V86A, 및 T87K; D85F, V86A, 및 T87K; D85H, V86A, 및 T87V; D85M, V86A, 및 T87I; D85H, V86A, 및 T87M;
(d) D85W, V86A, T87R, 및 R338A; D85F, V86A, T87I, 및 R338A; D85W, V86A, T87W, 및 R338A; D85R, V86A, T85R, 및 R338A; D85I, V86A, T87R, 및 R338A; D85Y, V86A, T87F, 및 R338A; D85I, V86A, T87M, 및 R338A; D85F, V86A, T87R, 및 R338A; D85F, V86A, T87V, 및 R338A; D85R, V86A, T87K, 및 R338A; D85H, V86A, T87I, 및 R338A; D85I, V86A, T87I, 및 R338A; D85Y, V86A, T87K, 및 R338A; D85S, V86A, T87R, 및 R338A; D85Y, V86A, T87R, 및 R338A; D85G, V86A, T87K, 및 R338A; D85H, V86A, T87W, 및 R338A; D85H, V86A, T87K, 및 R338A; D85F, V86A, T87K, 및 R338A; D85H, V86A, T87V, 및 R338A; D85M, V86A, T87I, 및 R338A; D85H, V86A, T87M, 및 R338A;
(e) D85W, V86A, T87R, R338A, 및 E410N; D85F, V86A, T87I, R338A, 및 E410N; D85W, V86A, T87W, R338A, 및 E410N; D85R, V86A, T85R, R338A, 및 E410N; D85I, V86A, T87R, R338A, 및 E410N; D85Y, V86A, T87F, R338A, 및 E410N; D85I, V86A, T87M, R338A, 및 E410N; D85F, V86A, T87R, R338A, 및 E410N; D85F, V86A, T87V, R338A, 및 E410N; D85R, V86A, T87K, R338A, 및 E410N; D85H, V86A, T87I, R338A, 및 E410N; D85I, V86A, T87I, R338A, 및 E410N; D85Y, V86A, T87K, R338A, 및 E410N; D85S, V86A, T87R, R338A, 및 E410N; D85Y, V86A, T87R, R338A, 및 E410N; D85G, V86A, T87K, R338A, 및 E410N; D85H, V86A, T87W, R338A, 및 E410N; D85H, V86A, T87K, R338A, 및 E410N; D85F, V86A, T87K, R338A, 및 E410N; D85H, V86A, T87V, R338A, 및 E410N; D85M, V86A, T87I, R338A, 및 E410N; D85H, V86A, T87M, R338A, 및 E410N; D85W, V86A, T87R, R338A, 및 E410Q; D85F, V86A, T87I, R338A, 및 E410Q; D85W, V86A, T87W, R338A, 및 E410Q; D85R, V86A, T85R, R338A, 및 E410Q; D85I, V86A, T87R, R338A, 및 E410Q; D85Y, V86A, T87F, R338A, 및 E410Q; D85I, V86A, T87M, R338A, 및 E410Q; D85F, V86A, T87R, R338A, 및 E410Q; D85F, V86A, T87V, R338A, 및 E410Q; D85R, V86A, T87K, R338A, 및 E410Q; D85H, V86A, T87I, R338A, 및 E410Q; D85I, V86A, T87I, R338A, 및 E410Q; D85Y, V86A, T87K, R338A, 및 E410Q; D85S, V86A, T87R, R338A, 및 E410Q; D85Y, V86A, T87R, R338A, 및 E410Q; D85G, V86A, T87K, R338A, 및 E410Q; D85H, V86A, T87W, R338A, 및 E410Q; D85H, V86A, T87K, R338A, 및 E410Q; D85F, V86A, T87K, R338A, 및 E410Q; D85H, V86A, T87V, R338A, 및 E410Q; D85M, V86A, T87I, R338A, 및 E410Q; D85H, V86A, T87M, R338A, 및 E410Q; 및 이들의 임의의 조합.
본원은 또한 FIX의 비활성이 개선되도록 변형된 아미노산 서열을 포함하는 FIX 폴리펩티드 접합체, 및 FIX 폴리펩티드에 공유 결합에 의해 부착된 하나 이상의 중합체 잔기를 제공한다. 일부 실시양태에서, 중합체 잔기는 FIX 폴리펩티드 상의 당 잔기에 공유 결합에 의해 부착되고, 여기서 당 잔기는 포유동물 세포에서의 발현 동안 펩티드에 자연적으로 부착된다.
본원은 변형된 FIX 폴리펩티드 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 제제를 또한 제공한다.
본원은 B형 혈우병의 치료를 필요로 하는 대상에게 치료 유효량의 본원에 기재된 제약 제제를 투여하는 것을 포함하는, B형 혈우병을 치료하는 방법을 또한 제공한다.
본원은 변형된 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열, 뿐만 아니라 이러한 DNA 서열로 형질감염된 진핵 숙주 세포를 또한 제공한다.
본원은 또한 (i) 하나 이상의 아미노산 치환의 도입에 의해 폴리펩티드의 아미노산 서열을 변형시키는 것; (ii) 예를 들어 포유동물 세포주에서 폴리펩티드를 발현시키는 것; 및 (iii) 폴리펩티드를 정제하는 것을 포함하는, 변형된 FIX 폴리펩티드의 생성 방법을 제공한다.
본원은 또한 a) 하나 이상의 아미노산 치환의 도입에 의해 변형된 아미노산 서열을 포함하는 인자 IX 폴리펩티드 (여기서, 하나 이상의 아미노산 치환은 잔기 338에 있음); b) 상기 하나 이상의 글리코실화 부위에 부착된 하나 이상의 당 잔기; 및 c) 하나 이상의 당 잔기에 공유 결합에 의해 부착된 하나 이상의 중합체 잔기를 포함하는 접합체를 제공한다.
본원은 또한 a) 하나 이상의 글리코실화 부위를 갖는 폴리펩티드를 제공하는 것 (여기서, 글리코실화 부위는 하나 이상의 시알산을 포함함); b) 상기 폴리펩티드의 상기 시알산을 산화시키는 것; c) 촉매를 제공하는 것; 및 d) 아미노-옥시 관능기를 포함하는 중합체 잔기를 상기 산화된 시알산에 공유 결합에 의해 부착시키는 것을 포함하는, 폴리펩티드에 대한 중합체 잔기의 접합을 개선시키는 방법을 제공한다.
도 1은 정상 래트에서 글리코PEG화 FIX-R338A, FIX-R338A 및 재조합 야생형 FIX의 용량 정상화 약동학적 프로파일을 보여주는 그래프를 도시한다.
도 2는 B형 혈우병 마우스에서 글리코PEG화 FIX-R338A, FIX-R338A 및 rFIX의 약동학적 프로파일을 보여주는 그래프를 도시한다.
도 3은 rFIX, FIX-R338A 또는 글리코PEG화 FIX-R338A의 정맥내 주사 후의 B형 혈우병 마우스의 혈장에서의 FIX 활성을 보여주는 그래프를 도시한다.
도 4는 촉매의 존재 또는 부재하에 PEG화 반응의 SDS-PAGE에 의한 경시적 분석을 보여준다.
도 2는 B형 혈우병 마우스에서 글리코PEG화 FIX-R338A, FIX-R338A 및 rFIX의 약동학적 프로파일을 보여주는 그래프를 도시한다.
도 3은 rFIX, FIX-R338A 또는 글리코PEG화 FIX-R338A의 정맥내 주사 후의 B형 혈우병 마우스의 혈장에서의 FIX 활성을 보여주는 그래프를 도시한다.
도 4는 촉매의 존재 또는 부재하에 PEG화 반응의 SDS-PAGE에 의한 경시적 분석을 보여준다.
[본 발명의 상세한 설명]
본원은 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 FIX 폴리펩티드를 제공한다. 예를 들어, 변형된 FIX 폴리펩티드는 아미노산 잔기 85, 86, 87, 338 및 410에 하나 이상의 치환을 포함할 수 있다. 변형된 FIX 폴리펩티드는 예를 들어 B형 혈우병 환자에서의 출혈에 대한 보호 기간 연장을 제공할 증가된 비활성을 가질 수 있다. 변형된 FIX 폴리펩티드는 야생형 FIX 단백질의 현재 이용가능한 치료법으로 가능한 것보다 더 적은 FIX 주사로 B형 혈우병 환자가 출혈에 대한 보호를 달성할 수 있게 할 것이다.
활성화된 인자 VII (FVII)는 혈관벽에 대한 손상의 결과로서 노출된 조직 인자 (TF)와 복합체를 형성함으로써 정상적인 지혈 과정을 개시시킨다. 이어서 복합체가 FIX를 활성화시키고; 활성 형태는 FIXa로 지칭된다. FIX의 활성화 펩티드가 인자 XIa (FXIa) 또는 조직 인자 (TF)/인자 VIIa 복합체에 의해 2개의 부위에서 단백질분해성 절단에 의해 제거되어, 촉매적으로 활성인 분자인 인자 IXa (FIXa)가 생성된다. FIXa 및 인자 VIIIa (FVIIIa)가 FX를 인자 Xa (FXa)로 변환시키고, 차례로 이는 프로트롬빈을 트롬빈으로 변환시킨다. 이어서, 트롬빈이 피브리노겐을 피브린으로 변환시켜, 피브린 응괴의 형성이 초래된다.
야생형 FIX는 그의 일부가 생체내 약동학적 프로파일에서 소정의 역할을 수행하는 것으로 제안된 다수의 번역후 변형을 갖는다. 생성되면, FIX는 B형 혈우병을 위한 유효한 치료가 되기 위해 효소 활성을 유지하고 FVIII, FXI 및 FX와 상호작용하여야 한다. 치환된 아미노산의 도입은 이러한 상호작용 및 기능을 방해해서는 안 된다. 본원은 부분적으로 기능의 혼란을 최소화하면서 증가된 비활성을 나타낼 가능성이 있는 FIX의 변형을 제공한다. FIX의 비활성을 향상시키는 변경은 응고 활성의 잠재적 손실을 보충하고, 또한 단백질의 보다 낮은 수준에서 효능을 부여함으로써 변형된 분자의 효능을 잠재적으로 연장할 수 있다.
변형된 FIX 폴리펩티드
본원은 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 FIX 폴리펩티드, 즉 변형된 FIX 폴리펩티드를 제공한다. 본원에 사용된 "인자 IX"는 내인성 응고 경로의 구성원이고 혈액 응고에 필수적인 FIX 단백질을 나타낸다. 본 정의는 천연 형태의 FIX 단백질 뿐만 아니라 재조합 형태의 FIX 단백질도 포함한다는 것을 이해하여야 한다. 달리 상술되거나 지시되지 않는 한, 본원에 사용된 FIX는 응고에서 자신의 정상적인 역할을 하는 임의의 기능성 인간 FIX 단백질 분자를 의미하고, 그의 임의의 단편, 유사체, 변이체 및 유도체를 포함한다. 용어 "단편", "유도체", "유사체", "뮤테인", 및 "변이체"는, 본원의 폴리펩티드를 지칭하는 경우에, 실질적으로 동일한 생물학적 기능 또는 활성을 유지하는 폴리펩티드의 단편, 유도체, 유사체, 뮤테인 및 변이체를 의미한다.
FIX 폴리펩티드의 비제한적인 예로는 FIX, FIXa, 및 FIX 활성이 있는 FIX의 말단절단(truncated) 버전이 포함된다. 어느 정도 이상의 FIX 활성을 유지하는 상기 물질들 중 임의의 것의 생물학적으로 활성인 단편, 결실 변이체, 치환 변이체, 또는 부가 변이체가 또한 FIX 폴리펩티드의 역할을 할 수 있다. 일부 실시양태에서, FIX 폴리펩티드는 서열 1에 대해 약 70, 80, 90 또는 95％ 이상 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 변형된 FIX 폴리펩티드는 생물학적으로 활성이다. 생물학적 활성은, 예를 들어 본원에 기재된 응고 검정에 의해 결정될 수 있다.
변형된 FIX 폴리펩티드는 아미노산의 보존적 치환을 함유할 수 있다. 보존적 치환은 하나의 아미노산이 특성이 유사한 또 다른 아미노산을 치환하는 것으로 당업계에서 인지되고, 예를 들어 알라닌 → 세린; 아르기닌 → 리신; 아스파라긴 → 글루타민 또는 히스티딘; 아스파르테이트 → 글루타메이트; 시스테인 → 세린; 글루타민 → 아스파라긴; 글루타메이트 → 아스파르테이트; 글리신 → 프롤린; 히스티딘 → 아스파라긴 또는 글루타민; 이소류신 → 류신 또는 발린; 류신 → 발린 또는 이소류신; 리신 → 아르기닌; 메티오닌 → 류신 또는 이소류신; 페닐알라닌 → 티로신, 류신 또는 메티오닌; 세린 → 트레오닌; 트레오닌 → 세린; 트립토판 → 티로신; 티로신 → 트립토판 또는 페닐알라닌; 및 발린 → 이소류신 또는 류신의 변화를 포함한다. 일부 실시양태에서, 서열 1의 FIX 폴리펩티드는 1-30, 1-20, 또는 1-10개의 보존적 아미노산 치환을 포함한다.
특정한 아미노산, 그의 상응하는 아미노산에 대한 단일 글자 약어 및 3문자 약어는 다음과 같다: A, 알라닌 (Ala); C, 시스테인 (Cys); D, 아스파르트산 (Asp); E, 글루탐산 (Glu); F, 페닐알라닌 (Phe); G, 글리신 (Gly); H, 히스티딘 (His); I, 이소류신 (Ile); K, 리신 (Lys); L, 류신 (Leu); M, 메티오닌 (Met); N, 아스파라긴 (Asn); P, 프롤린 (Pro); Q, 글루타민 (Gln); R, 아르기닌 (Arg); S, 세린 (Ser); T, 트레오닌 (Thr); V, 발린 (Val); W, 트립토판 (Trp); Y, 티로신 (Tyr); 노르류신 (Nle).
변형된 FIX 폴리펩티드는 또한 글리코실화될 수 있다. 폴리펩티드의 글리코실화는 전형적으로 N-연결되거나 O-연결된다. N-연결은 아스파라긴 잔기의 측쇄에 대한 탄수화물 잔기의 부착을 나타낸다. 트리펩티드 서열 Asn-X-Ser 및 Asn-X-Thr (식 중 X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산임)이 Asn 측쇄에 탄수화물 잔기가 효소에 의해 부착되는 것에 대한 인식 서열이다. 따라서, 폴리펩티드 내에 이러한 트리펩티드 서열들 중 어느 하나가 존재하는 것은 잠재적인 N-연결 글리코실화 부위를 생성시킨다. 예시적인 N-연결 글리코실화 부위는 하기와 같이 표시될 수 있다: X1-Asn-X2-X3-X4 (여기서, X1은 임의로 Asp, Val, Glu, Gly, 또는 Ile이고; X2는 Pro를 제외한 임의의 아미노산이고; X3은 Ser 또는 Thr이고; X4는 임의로 Val, Glu, Gly, Gln, 또는 Ile임). N-연결 글리코실화 부위를 FIX 폴리펩티드에 부가하는 것은 하나 이상의 상기 기재된 트리펩티드 서열이 도입되도록 아미노산 서열을 변경시킴으로써 달성될 수 있다.
O-연결 글리코실화는 당 N-아세틸갈락토사민, 갈락토스 또는 크실로스 중 하나가 히드록시아미노산, 가장 통상적으로는 세린 또는 트레오닌에 부착되는 것을 지칭하지만, 5-히드록시프롤린 또는 5-히드록시리신에 부착되는 것 또한 가능하다. O-연결 글리코실화 부위를 FIX 폴리펩티드에 부가하는 것은 하나 이상의 Ser 또는 Thr 잔기가 도입되도록 아미노산 서열을 변경시킴으로써 달성될 수 있다.
예를 들어, 하나 이상의 아미노산 잔기를 결실시킴으로써, 하나 이상의 내인성 FIX 아미노산 잔기를 또 다른 아미노산(들)로 치환함으로써, 또는 하나 이상의 아미노산 잔기를 부가함으로써, 글리코실화 부위가 도입될 수 있다. 아미노산 잔기는 2개의 기존 아미노산 잔기 사이에서 또는 천연 FIX 분자의 N- 또는 C-말단 끝부분에서 부가될 수 있다.
사용된 아미노산 치환에 대한 명명법은 하기와 같다. 첫번째 문자는 인간 FIX의 소정의 위치에 본래 존재하는 아미노산 잔기를 나타낸다. 이어지는 숫자는 성숙한 인간 FIX 아미노산 서열 (서열 1)에서의 위치를 나타낸다. 두번째 문자는 천연 아미노산을 치환 (교체/치환)하는 상이한 아미노산을 나타낸다. 예를 들어, V86A는 서열 1의 위치 86의 Val 잔기가 Ala 잔기로 교체되었음을 표시한다.
본원에 사용된 FIX 잔기 번호 시스템은 성숙한 인간 FIX 단백질의 시스템을 나타내고, 이때 잔기 1은 신호 서열 및 프로펩티드 둘 모두의 제거 후의 성숙한 FIX 폴리펩티드의 첫번째 아미노산을 나타낸다. 천연 또는 야생형 FIX는 서열 1에 나타낸 바와 같은 전장 성숙한 인간 FIX 분자이다.
하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 변형된 FIX 폴리펩티드의 특성을 대조군 폴리펩티드와 비교하는 것이 바람직할 수 있다. 비교용 특성에는, 예를 들어 용해도, 활성, 혈장 반감기 및 결합 특성이 포함된다. 비교를 위한 가장 적합한 대조군 폴리펩티드를 선택하는 것은 당업자의 영역 내에 속한다. 일부 실시양태에서, 대조군 폴리펩티드는 하나 이상의 아미노산 치환을 제외하고는 변형된 폴리펩티드와 동일할 수 있다. 예시적인 폴리펩티드에는 야생형 FIX 폴리펩티드 및 하나 이상의 활성화 치환, 예컨대 R338A 및/또는 V86A를 포함하는 FIX 폴리펩티드가 포함된다.
본원의 한 측면은 대조군 폴리펩티드와 비교하여 증가된 비활성을 갖는 변형된 FIX 폴리펩티드를 제공한다. 향상된 비활성은 치료 효과를 달성하는데 필요한 투약 빈도를 감소시키는데 바람직할 수 있다. 따라서, 특정 실시양태에서, FIX 폴리펩티드의 비활성은 대조군 단백질에 비해 약 20, 30, 40, 60, 80, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 또는 1000％ 증가한다.
폴리펩티드 약물을 환자에게 투여하는 정황에서 본원에 사용된 용어 "반감기"는 환자 내의 약물의 혈장 농도가 1/2로 감소되는데 필요한 시간으로 정의된다. 약동학적 분석 및 반감기 및 생체내 안정성 결정을 위한 방법이 당업자에게 익숙할 것이다. 문헌 [Kenneth, et al., Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists] 및 [Peters, et al., Pharmacokinetc analysis: A Practical Approach (1996)]에서 상세사항을 찾아볼 수 있다. t-알파 및 t-베타 반감기 및 곡선 아래 면적 (AUC)과 같은 약동학적 파라미터가 기재되어 있는 문헌 ["Pharmacokinetics," M Gibaldi & D Perron, published by Marcel Dekker, 2nd Rev. edition (1982)]를 또한 참조한다.
변형된 FIX 폴리펩티드의 활성은 절대값으로, 예컨대 유닛으로, 또는 대조군 폴리펩티드의 활성의 백분율로서 기술될 수 있다. FIX 비활성은 응고 케스케이드에서 기능하거나, 활성화된 혈소판 상에서 FVIIIa와의 상호작용을 통해 FXa의 형성을 유도하거나, 또는 혈병의 형성을 지지하는 능력으로 정의될 수 있다. 문헌 [McCarthy, et al., (Thromb. Haemost. 87:824-830, 2002)]에 예를 들어 기재된 바와 같은 혈병 분석과 같은 기술, 및 당업자에게 공지된 다른 기술에 의해 시험관 내에서 활성을 평가할 수 있다. 계통으로부터 생성된 동물이 FIX에 대해 결핍성이도록 B형 혈우병에 대한 유전 돌연변이가 있는 의도적으로 사육된 여러 동물 계통들 중 하나를 사용하여 생체 내에서 활성을 또한 평가할 수 있다. 이같은 계통들은 <Division of Laboratories and Research, New York Department of Public Health, Albany, N.Y.> 및 <Department of Pathology, University of North Carolina, Chapel Hill, N.C.>와 같은 비제한적인 다양한 공급원으로부터 입수가능하다. 이들 공급원은 둘 모두 예를 들어 개과동물 B형 혈우병을 앓고 있는 개과동물을 제공한다. 대안적으로, FIX가 결핍성인 마우스가 또한 입수가능하다 (문헌 [Sabatino, et al., Blood 104:2767-2774, 2005]). FIX 활성에 대해 시험하기 위해, 시험 폴리펩티드를 병에 걸린 동물에게 주사하고, 작게 절개하고, 출혈 시간을 건강한 대조군과 비교한다.
인간 야생형 FIX는 비활성이 약 200 유닛/㎎이다. FIX 1 유닛은 1 ㎖의 정상 (모은(pooled)) 인간 혈장 내에 존재하는 FIX의 양으로 정의되었다 (100％의 FIX 수준에 상응함). 일부 실시양태에서, 변형된 FIX 폴리펩티드는 비활성이 FIX 폴리펩티드 ㎎ 당 약 200 유닛, 300 유닛, 400 유닛, 500 유닛 이상이거나, 또는 이를 초과할 수 있다. 일부 실시양태에서, 변형된 FIX 폴리펩티드는 비활성이 FIX 폴리펩티드 ㎎ 당 약 500 유닛, 600 유닛, 700 유닛, 750 유닛 이상이거나, 또는 이를 초과할 수 있다. 일부 실시양태에서, FIX의 비활성을 APTT 또는 활성화된 부분적 트롬보플라스틴 시간 검정 (예를 들어, 문헌 [Proctor, et al., Am. J. Clin. Pathol. 36:212, 1961]에 기재됨)을 사용하여 측정할 수 있다.
세포, 예컨대 간 또는 신장 세포에서 발현될 때, FIX 폴리펩티드는 세포 기계에 의해 합성될 수 있고, 번역후 변형을 겪은 후, 세포에 의해 세포외 환경 내로 분비된다. 따라서, 세포로부터 분비되는 FIX 폴리펩티드의 양은 단백질 번역 프로세스 및 세포외 분비 프로세스 둘 모두에 좌우된다. 일부 실시양태에서, 변형된 FIX 폴리펩티드는 대조군 단백질의 분비량에 비해 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 또는 80％를 초과하여 감소되지 않은 양으로 분비될 수 있다. 예를 들어, 변형된 폴리펩티드가 대조군과 비교하여 약 20％ 이상의 양으로 분비된다면, 변형된 FIX 폴리펩티드는 대조군 FIX 폴리펩티드에 비해 약 80％를 초과하여 감소되지 않은 양으로 분비될 수 있다. 예를 들어, 임의의 당업계에 공지된 방법을 사용하여 세포외 배지 내의 단백질 수준을 결정함으로써, FIX 폴리펩티드의 분비량을 측정할 수 있다. 전통적인 단백질 정량 방법에는 2-D 겔 전기영동, 질량 분광법, 및 항체 결합이 포함된다. 생물학적 샘플 내의 단백질 수준을 분석하기 위한 예시적인 방법에는 항체-기반 기술, 예컨대 면역블롯팅 (웨스턴 블롯팅), 면역조직화학적 검정, 효소 결합 면역흡착 검정 (ELISA), 또는 방사성면역검정 (RIA)이 포함된다.
일부 실시양태에서, 변형된 FIX 폴리펩티드는 FVIII, FXI, 또는 FX 중 하나 이상과 대조군 단백질의 상호작용에 비해 약 40, 50, 60, 70, 또는 80％를 초과하여 감소되지 않은 수준으로 FVIII, FXI, 또는 FX 중 하나 이상과 상호작용한다. 예를 들어, 변형된 폴리펩티드가 대조군과 비교하여 약 20％ 이상의 수준으로 FVIII, FXI, 또는 FX 중 하나 이상과 상호작용한다면, 변형된 FIX 폴리펩티드는 대조군 FIX 폴리펩티드에 비해 약 80％를 초과하여 감소되지 않은 수준으로 FVIII, FXI, 또는 FX 중 하나 이상과 상호작용할 수 있다. 문헌 [Chang, et al., (J. Biol. Chem. 273:12089-12094, 1998)]에 기재된 방법이 예를 들어 포함되는 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해 응고 케스케이드의 다른 구성원에 대한 FIX의 결합을 결정할 수 있다.
본원은 부분적으로 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 FIX 폴리펩티드를 제공한다. 일부 실시양태에서, D85F; D85G; D85H; D85I; D85M; D85N; D85R; D85S; D85W; D85Y; V86A; V86D; V86E; V86G; V86H; V86I; V86L; V86M; V86N; V86P; V86Q; V86R; V86S; V86T; T87F; T87I; T87K; T87M; T87R; T87V; T87W; R338A; R338F; R338I; R338L; R338M; R338S; R338T; R338V; R338W; E410N; E410Q; 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 치환을 포함하는 FIX 폴리펩티드가 제공된다.
일부 실시양태에서, D85W 및 T87R; D85F 및 T87I; D85W 및 T87W; D85R 및 T85R; D85I 및 T87R; D85Y 및 T87F; D85I 및 T87M; D85F 및 T87R; D85F 및 T87V; D85R 및 T87K; D85H 및 T87I; D85I 및 T87I; D85Y 및 T87K; D85S 및 T87R; D85Y 및 T87R; D85G 및 T87K; D85H 및 T87W; D85H 및 T87K; D85F 및 T87K; D85H 및 T87V; D85M 및 T87I; D85H 및 T87M; R338A 및 E410N; R338A 및 E410Q; 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 치환을 포함하는 FIX 폴리펩티드가 제공된다.
일부 실시양태에서, D85W, V86A, 및 T87R; D85F, V86A, 및 T87I; D85W, V86A, 및 T87W; D85R, V86A, 및 T85R; D85I, V86A, 및 T87R; D85Y, V86A, 및 T87F; D85I, V86A, 및 T87M; D85F, V86A, 및 T87R; D85F, V86A, 및 T87V; D85R, V86A, 및 T87K; D85H, V86A, 및 T87I; D85I, V86A, 및 T87I; D85Y, V86A, 및 T87K; D85S, V86A, 및 T87R; D85Y, V86A, 및 T87R; D85G, V86A, 및 T87K; D85H, V86A, 및 T87W; D85H, V86A, 및 T87K; D85F, V86A, 및 T87K; D85H, V86A, 및 T87V; D85M, V86A, 및 T87I; D85H, V86A, 및 T87M; 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 치환을 포함하는 FIX 폴리펩티드가 제공된다.
일부 실시양태에서, D85W, V86A, T87R, 및 R338A; D85F, V86A, T87I, 및 R338A; D85W, V86A, T87W, 및 R338A; D85R, V86A, T85R, 및 R338A; D85I, V86A, T87R, 및 R338A; D85Y, V86A, T87F, 및 R338A; D85I, V86A, T87M, 및 R338A; D85F, V86A, T87R, 및 R338A; D85F, V86A, T87V, 및 R338A; D85R, V86A, T87K, 및 R338A; D85H, V86A, T87I, 및 R338A; D85I, V86A, T87I, 및 R338A; D85Y, V86A, T87K, 및 R338A; D85S, V86A, T87R, 및 R338A; D85Y, V86A, T87R, 및 R338A; D85G, V86A, T87K, 및 R338A; D85H, V86A, T87W, 및 R338A; D85H, V86A, T87K, 및 R338A; D85F, V86A, T87K, 및 R338A; D85H, V86A, T87V, 및 R338A; D85M, V86A, T87I, 및 R338A; D85H, V86A, T87M, 및 R338A; 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 치환을 포함하는 FIX 폴리펩티드가 제공된다.
일부 실시양태에서, D85W, V86A, T87R, R338A, 및 E410N; D85F, V86A, T87I, R338A, 및 E410N; D85W, V86A, T87W, R338A, 및 E410N; D85R, V86A, T85R, R338A, 및 E410N; D85I, V86A, T87R, R338A, 및 E410N; D85Y, V86A, T87F, R338A, 및 E410N; D85I, V86A, T87M, R338A, 및 E410N; D85F, V86A, T87R, R338A, 및 E410N; D85F, V86A, T87V, R338A, 및 E410N; D85R, V86A, T87K, R338A, 및 E410N; D85H, V86A, T87I, R338A, 및 E410N; D85I, V86A, T87I, R338A, 및 E410N; D85Y, V86A, T87K, R338A, 및 E410N; D85S, V86A, T87R, R338A, 및 E410N; D85Y, V86A, T87R, R338A, 및 E410N; D85G, V86A, T87K, R338A, 및 E410N; D85H, V86A, T87W, R338A, 및 E410N; D85H, V86A, T87K, R338A, 및 E410N; D85F, V86A, T87K, R338A, 및 E410N; D85H, V86A, T87V, R338A, 및 E410N; D85M, V86A, T87I, R338A, 및 E410N; D85H, V86A, T87M, R338A, 및 E410N; D85W, V86A, T87R, R338A, 및 E410Q; D85F, V86A, T87I, R338A, 및 E410Q; D85W, V86A, T87W, R338A, 및 E410Q; D85R, V86A, T85R, R338A, 및 E410Q; D85I, V86A, T87R, R338A, 및 E410Q; D85Y, V86A, T87F, R338A, 및 E410Q; D85I, V86A, T87M, R338A, 및 E410Q; D85F, V86A, T87R, R338A, 및 E410Q; D85F, V86A, T87V, R338A, 및 E410Q; D85R, V86A, T87K, R338A, 및 E410Q; D85H, V86A, T87I, R338A, 및 E410Q; D85I, V86A, T87I, R338A, 및 E410Q; D85Y, V86A, T87K, R338A, 및 E410Q; D85S, V86A, T87R, R338A, 및 E410Q; D85Y, V86A, T87R, R338A, 및 E410Q; D85G, V86A, T87K, R338A, 및 E410Q; D85H, V86A, T87W, R338A, 및 E410Q; D85H, V86A, T87K, R338A, 및 E410Q; D85F, V86A, T87K, R338A, 및 E410Q; D85H, V86A, T87V, R338A, 및 E410Q; D85M, V86A, T87I, R338A, 및 E410Q; D85H, V86A, T87M, R338A, 및 E410Q; 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 치환을 포함하는 FIX 폴리펩티드가 제공된다.
일부 실시양태에서,
(a) D85F; D85G; D85H; D85I; D85M; D85N; D85R; D85S; D85W; D85Y; V86A; V86D; V86E; V86G; V86H; V86I; V86L; V86M; V86N; V86P; V86Q; V86R; V86S; V86T; T87F; T87I; T87K; T87M; T87R; T87V; T87W; R338A; R338F; R338I; R338L; R338M; R338S; R338T; R338V; R338W; E410N; E410Q;
(b) D85W 및 T87R; D85F 및 T87I; D85W 및 T87W; D85R 및 T85R; D85I 및 T87R; D85Y 및 T87F; D85I 및 T87M; D85F 및 T87R; D85F 및 T87V; D85R 및 T87K; D85H 및 T87I; D85I 및 T87I; D85Y 및 T87K; D85S 및 T87R; D85Y 및 T87R; D85G 및 T87K; D85H 및 T87W; D85H 및 T87K; D85F 및 T87K; D85H 및 T87V; D85M 및 T87I; D85H 및 T87M;
(c) D85W, V86A, 및 T87R; D85F, V86A, 및 T87I; D85W, V86A, 및 T87W; D85R, V86A, 및 T85R; D85I, V86A, 및 T87R; D85Y, V86A, 및 T87F; D85I, V86A, 및 T87M; D85F, V86A, 및 T87R; D85F, V86A, 및 T87V; D85R, V86A, 및 T87K; D85H, V86A, 및 T87I; D85I, V86A, 및 T87I; D85Y, V86A, 및 T87K; D85S, V86A, 및 T87R; D85Y, V86A, 및 T87R; D85G, V86A, 및 T87K; D85H, V86A, 및 T87W; D85H, V86A, 및 T87K; D85F, V86A, 및 T87K; D85H, V86A, 및 T87V; D85M, V86A, 및 T87I; D85H, V86A, 및 T87M; R338A 및 E410N; R338A 및 E410Q;
(d) D85W, V86A, T87R, 및 R338A; D85F, V86A, T87I, 및 R338A; D85W, V86A, T87W, 및 R338A; D85R, V86A, T85R, 및 R338A; D85I, V86A, T87R, 및 R338A; D85Y, V86A, T87F, 및 R338A; D85I, V86A, T87M, 및 R338A; D85F, V86A, T87R, 및 R338A; D85F, V86A, T87V, 및 R338A; D85R, V86A, T87K, 및 R338A; D85H, V86A, T87I, 및 R338A; D85I, V86A, T87I, 및 R338A; D85Y, V86A, T87K, 및 R338A; D85S, V86A, T87R, 및 R338A; D85Y, V86A, T87R, 및 R338A; D85G, V86A, T87K, 및 R338A; D85H, V86A, T87W, 및 R338A; D85H, V86A, T87K, 및 R338A; D85F, V86A, T87K, 및 R338A; D85H, V86A, T87V, 및 R338A; D85M, V86A, T87I, 및 R338A; D85H, V86A, T87M, 및 R338A;
(e) D85W, V86A, T87R, R338A, 및 E410N; D85F, V86A, T87I, R338A, 및 E410N; D85W, V86A, T87W, R338A, 및 E410N; D85R, V86A, T85R, R338A, 및 E410N; D85I, V86A, T87R, R338A, 및 E410N; D85Y, V86A, T87F, R338A, 및 E410N; D85I, V86A, T87M, R338A, 및 E410N; D85F, V86A, T87R, R338A, 및 E410N; D85F, V86A, T87V, R338A, 및 E410N; D85R, V86A, T87K, R338A, 및 E410N; D85H, V86A, T87I, R338A, 및 E410N; D85I, V86A, T87I, R338A, 및 E410N; D85Y, V86A, T87K, R338A, 및 E410N; D85S, V86A, T87R, R338A, 및 E410N; D85Y, V86A, T87R, R338A, 및 E410N; D85G, V86A, T87K, R338A, 및 E410N; D85H, V86A, T87W, R338A, 및 E410N; D85H, V86A, T87K, R338A, 및 E410N; D85F, V86A, T87K, R338A, 및 E410N; D85H, V86A, T87V, R338A, 및 E410N; D85M, V86A, T87I, R338A, 및 E410N; D85H, V86A, T87M, R338A, 및 E410N; D85W, V86A, T87R, R338A, 및 E410Q; D85F, V86A, T87I, R338A, 및 E410Q; D85W, V86A, T87W, R338A, 및 E410Q; D85R, V86A, T85R, R338A, 및 E410Q; D85I, V86A, T87R, R338A, 및 E410Q; D85Y, V86A, T87F, R338A, 및 E410Q; D85I, V86A, T87M, R338A, 및 E410Q; D85F, V86A, T87R, R338A, 및 E410Q; D85F, V86A, T87V, R338A, 및 E410Q; D85R, V86A, T87K, R338A, 및 E410Q; D85H, V86A, T87I, R338A, 및 E410Q; D85I, V86A, T87I, R338A, 및 E410Q; D85Y, V86A, T87K, R338A, 및 E410Q; D85S, V86A, T87R, R338A, 및 E410Q; D85Y, V86A, T87R, R338A, 및 E410Q; D85G, V86A, T87K, R338A, 및 E410Q; D85H, V86A, T87W, R338A, 및 E410Q; D85H, V86A, T87K, R338A, 및 E410Q; D85F, V86A, T87K, R338A, 및 E410Q; D85H, V86A, T87V, R338A, 및 E410Q; D85M, V86A, T87I, R338A, 및 E410Q; D85H, V86A, T87M, R338A, 및 E410Q; 및 이들의 임의의 조합
으로부터 선택된 하나 이상의 치환을 포함하는 FIX 폴리펩티드가 제공된다.
본원의 추가의 측면은 비활성이 증가된 FIX 폴리펩티드를 제공한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 비활성이 폴리펩티드 ㎎ 당 약 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1400, 1600, 1800, 2000, 4000, 6000, 8000 이상 또는 이를 초과하는 유닛일 수 있다. 기존에 기재된 바와 같이, 예를 들어 APTT 검정을 사용하여, 비활성을 결정할 수 있다. 이러한 폴리펩티드들은, 특히 B형 혈우병에 걸린 환자에서, 치료제로서 유용하다. 이러한 폴리펩티드들은 추가의 치환 또는 변형, 예컨대 본원에 기재된 글리코실화 부위를 포함할 수 있다.
본원의 한 측면은 하기의 아미노산 서열을 포함하고, 변형된 인자 IX 폴리펩티드를 제공한다:
여기서
X85는 D, F, G, H, I, M, N, R, S, W 및 Y로부터 선택되고;
X86은 A, D, E, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T 및 V로부터 선택되고;
X87은 F, I, K, M, R, T, V 및 W로부터 선택되고;
X338은 A, F, I, L, M, R, S, T, V 및 W로부터 선택되고;
X410은 E, N 및 Q로부터 선택된다.
하나 이상의 아미노산 치환의 도입은 X 위치 중 하나 이상에서의 치환의 결과이다. 일부 실시양태에서, 변형된 폴리펩티드는 약 1-30, 1-20, 또는 1-10개의 보존적 아미노산 변화를 추가적으로 포함하고, FIX 활성을 유지한다. 일부 실시양태에서, 변형된 폴리펩티드는 서열 1과 약 80, 85, 90, 95, 또는 99％ 이상 동일하고, FIX 활성을 유지한다.
변형된 FIX 폴리펩티드의 생성
아미노산 서열 변경은 다양한 기술에 의해, 예를 들어 상응하는 핵산 서열을 부위-특이적 돌연변이유발에 의해 변형시킴으로써 달성될 수 있다. 부위-특이적 돌연변이유발에 관한 기술은 당업계에 잘 알려져 있고, 예를 들어 문헌 [Zoller, et al., (DNA 3:479-488, 1984)] 또는 [Horton, et al., (Gene 77:61-68, 1989, pp. 61-68)]에 기재되어 있다. 따라서, FIX의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 사용하여, 선택한 변경(들)을 도입할 수 있다. 마찬가지로, 특이적 프라이머를 이용한 중합효소 연쇄 반응을 사용하여 DNA 구축물을 제조하는 절차가 당업자에게 잘 알려져 있다 (예를 들어, 문헌 [PCR Protocols, 1990, Academic Press, San Diego, California, USA] 참조).
FIX 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 구축물을 확립된 표준 방법, 예를 들어 문헌 [Beaucage, et al., (Gene Amplif. Anal. 3:1-26, 1983)]에 기재된 포스포르아미다이트 방법에 의해 합성적으로 또한 제조할 수 있다. 포스포르아미다이트 방법에 따라, 예를 들어 적절한 벡터로 정제하고, 어닐링하고, 라이게이션하고, 클로닝하여 자동 DNA 합성기에서 올리고뉴클레오티드를 합성한다. FIX 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열을, 예를 들어 미국 특허 번호 4,683,202; 또는 문헌 [Saiki, et al., (Science 239:487-491, 1988)]에 기재된 바와 같이, 특이적 프라이머를 사용하는 중합효소 연쇄 반응에 의해 또한 제조할 수 있다. 또한, 핵산 구축물은 표준 기술에 따라, 전체 핵산 구축물의 다양한 부분에 상응하는, (적절하게는) 합성물질, 유전체 또는 cDNA 기원의 단편을 라이게이션시켜 제조된 혼합된 합성물질 및 유전체, 혼합된 합성물질 및 cDNA, 또는 혼합된 유전체 및 cDNA 기원일 수 있다.
FIX 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열을 재조합 DNA 절차를 사용하여 재조합 벡터 내로 삽입할 수 있다. 벡터의 선택은 종종 숙주 세포에 따라 달려있고, 벡터는 도입될 것이다. 벡터는 자율적으로 복제하는 벡터이거나 또는 통합하는 벡터일 수 있다. 자율적으로 복제하는 벡터는 염색체외 독립체로서 존재하고, 그의 복제는 염색체의 복제, 예를 들어 플라스미드에 대해 독립적이다. 통합하는 벡터는 숙주 세포 게놈으로 통합되고, 염색체(들)과 함께 복제되어 통합되는 벡터이다.
벡터는 변형된 FIX를 코딩하는 DNA 서열이 DNA의 전사, 번역 또는 프로세싱에 필요한 추가의 절편들, 예컨대 프로모터, 종결인자 및 폴리아데닐화 부위에 작동가능하게 연결된 발현 벡터일 수 있다. 일반적으로, 발현 벡터는 플라스미드 또는 바이러스 DNA로부터 유래될 수 있거나 또는 두 가지 요소를 함유할 수 있다. 용어 "작동가능하게 연결된"은 절편이 그의 의도한 목적을 콘서트 (concert) 중 기능하기 위해 배열되는 것을 나타내고, 예를 들어 전사는 프로모터에서 개시되고, 폴리펩티드에 대해 DNA 서열 코딩을 통해 진행된다.
FIX 폴리펩티드를 발현시키기 위해 사용하기 위한 발현 벡터는 클로닝된 유전자 또는 cDNA의 전사를 지시할 수 있는 프로모터를 포함할 수 있다. 프로모터는 숙주 세포의 선택에서 전사적 활성을 나타내는 임의의 DNA 서열일 수 있고, 숙주 세포에 대해 동종 또는 이종의 단백질을 코딩하는 유전자로부터 유래될 수 있다.
포유동물 세포에서 FIX 폴리펩티드를 코딩하는 DNA의 전사를 지시하기 위한 적합한 프로모터의 예는, 예를 들어 SV40 프로모터 (문헌 [Subramani, et al., Mol. Cell Biol. 1:854-864, 1981]), MT-I (메탈로티오네인 유전자) 프로모터 (문헌 [Palmiter, et al., Science 222:809-814, 1983]), CMV 프로모터 (문헌 [Boshart, et al., Cell 41:521-530, 1985]) 또는 아데노바이러스 2 주요 후기 프로모터 (문헌 [Kaufman et al., Mol. Cell Biol, 2:1304-1319, 1982])이다.
또한 FIX 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열은, 필요하다면, 적합한 종결인자, 예컨대 인간 성장 호르몬 종결인자 (문헌 [Palmiter, et al., Science 222:809-814, 1983]) 또는 TPIl (문헌 [Alber et al., J. MoI. Appl. Gen. 1:419-434, 1982]) 또는 ADH3 (문헌 [McKnight, et al., EMBO J. 4:2093-2099, 1985]) 종결인자에 작동가능하게 연결될 수 있다. 발현 벡터는 또한 삽입 부위의 하류에 위치하는 폴리아데닐화 신호를 함유할 수 있다. 폴리아데닐화 신호에는 SV40으로부터의 초기 또는 후기 폴리아데닐화 신호, 아데노바이러스 5 EIb 영역으로부터의 폴리아데닐화 신호, 인간 성장 호르몬 유전자 종결인자 (문헌 [DeNoto, et al., Nucl. Acids Res. 9:3719-3730, 1981]), 또는 인간 FIX 유전자로부터의 폴리아데닐화 신호가 포함된다. 발현 벡터는 또한 인핸서 서열, 예컨대 SV40 인핸서를 포함할 수 있다.
본 발명의 FIX 폴리펩티드를 숙주 세포의 분비 경로 내로 지시하기 위해, 천연 FIX 분비 신호 서열을 사용할 수 있다. 대안적으로, 분비 신호 서열 (리더(leader) 서열, 프리프로(prepro) 서열 또는 프리(pre) 서열로 또한 알려짐)이 재조합 벡터 내에 제공될 수 있다. 정확한 리딩 프레임 내의 FIX 유사체를 코딩하는 DNA 서열에 분비 신호 서열이 연결될 수 있다. 통상적으로 분비 신호 서열은 펩티드를 코딩하는 DNA 서열에 대해 5'에 위치한다. 예시적인 신호 서열에는, 예를 들어 MPIF-1 신호 서열 및 스타니오칼신 신호 서열이 포함된다.
FIX 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열, 프로모터, 및 임의로 종결인자 및/또는 분비 신호 서열을 라이게이션시키고, 이들을 복제에 필요한 정보를 함유하는 적절한 벡터 내로 삽입하기 위해 사용되는 절차는 당업자에게 주지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, 1989] 참조).
포유동물 세포를 형질 감염시키고, 세포로 도입되는 DNA 서열을 발현시키는 방법은, 예를 들어 문헌 [Kaufman, et al., (J. Mol. Biol. 159:601-621, 1982)]; [Southern, et al., (J. Mol. Appl. Genet. 1:327-341, 1982)]; [Loyter, et al., (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:422-426, 1982)]; [Wigler, et al., (Cell 14:725-731, 1978)]; [Corsaro, et al., (Somatic Cell Genetics 7:603-616, 1981)]; [Graham, et al., (Virology 52:456-467, 1973)]; 및 [Neumann, et al., (EMBO J. 1:841-845, 1982)]에 기재되어 있다. 클로닝된 DNA 서열은, 예를 들어 리포펙션 (lipofection), DEAE-덱스트란-매개 형질감염, 마이크로주사, 원형질체 융합, 인산 칼슘 침전, 레트로바이러스 전달, 전기천공, 소노포레이션 (sonoporation), 레이저 조사, 마그네토펙션 (magnetofection), 자연적 형질전환, 및 유전자총 (biolistic) 형질전환 (예를 들어, 문헌 [Mehier-Humbert, et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 57:733-753, 2005] 참조)에 의해 배양된 포유동물 세포에 도입될 수 있다. 외인성 DNA를 발현시키는 세포를 확인하고 선택하기 위해, 선택가능한 표현형 (선택가능한 마커)을 부여하는 유전자는 일반적으로 관심 cDNA 또는 유전자에 따라 세포로 도입한다. 선택가능한 마커는 약물, 예를 들어 네오마이신, 퓨로마이신, 히그로마이신, 및 메토트렉세이트에 대해 저항을 부여하는 유전자를 포함한다. 선택가능한 마커는 확대할 수 있는 선택가능한 마커일 수 있고, 서열이 연결되어 있을 경우 마커 및 외인성 DNA의 확대를 허용한다. 예시적으로 확대할 수 있는, 선택가능한 마커는 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR) 및 아데노신 디아미나제를 포함한다. 당업자의 범위 내에서 적합한 선택가능한 마커를 선택한다 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,238,820 참조).
세포를 DNA로 형질감염한 후, 이들을 적절한 성장 배지에서 성장시켜 관심 유전자를 발현하였다. 본원에 사용된 용어 "적절한 성장 배지"는 세포의 성장 및 활성 FIX 폴리펩티드의 발현에 요구되는 영양소 및 다른 성분을 함유하는 배지를 의미한다.
일반적으로 배지는, 예를 들어 탄소원, 질소원, 필수 아미노산, 필수 당, 비타민, 염, 인지질, 단백질 및 성장 인자를 포함하고, FIX와 같은 비타민 K 의존적 단백질의 경우에는, 비타민 K가 또한 제공될 수 있다. 이어서, 안정한 방식으로 선별가능한 마커를 발현하는 세포의 성장을 선별하기 위해 약물 선별을 적용한다. 증폭될 수 있는 선별가능한 마커로 형질감염된 세포에 있어서, 약물 농도는 클로닝된 서열의 증가된 카피 수에 대하여 선별되도록 증가시킬 수 있고, 이로써, 발현 수준을 증가시킬 수 있다. 이어서, 안정적으로 형질감염된 세포의 클론을 FIX 폴리펩티드의 발현에 대해 스크리닝한다.
본 발명에 사용하기 위한 포유동물 세포주의 예는 COS-1 (ATCC CRL 1650), 베이비 햄스터 신장 (BHK), HKB11 세포 (문헌 [Cho, et al., J. Biomed. Sci, 9:631-638, 2002]), 및 HEK-293 (ATCC CRL 1573; 문헌 [Graham, et al., J. Gen. Virol. 36:59-72, 1977]) 세포주이다. 또한, 래트 Hep I (래트 간암; ATCC CRL 1600), 래트 Hep II (래트 간암; ATCC CRL 1548), TCMK-1 (ATCC CCL 139), Hep-G2 (ATCC HB 8065), NCTC 1469 (ATCC CCL 9.1), CHO-K1 (ATCC CCL 61), 및 CHO-DUKX 세포 (문헌 [Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, 1980])를 비롯한, 다수의 다른 세포주가 본 발명에서 사용될 수 있다.
FIX 폴리펩티드를 세포 배양 배지로부터 회수할 수 있고, 그후 크로마토그래피 (예를 들어, 이온 교환, 친화성, 소수성, 크로마토포커싱 및 크기 배제), 전기영동 절차 (예를 들어, 분취용 등전 포커싱 (IEF), 차등 용해도 (예를 들어, 황산암모늄 침전)), 추출 (예를 들어, 문헌 [Protein Purification, Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989] 참조), 또는 이들의 다양한 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는 당업계에 공지된 다양한 절차에 의해 이를 정제할 수 있다. 예시적인 실시양태에서, 폴리펩티드를 항-FIX 항체 칼럼 상에서의 친화성 크로마토그래피에 의해 정제할 수 있다. 추가 정제는 통상적인 화학적 정제 방법, 예컨대 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 달성될 수 있다. 또 다른 정제 방법들이 당업계에 공지되어 있고, 변형된 FIX 폴리펩티드의 정제에 적용될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Scopes, R., Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y., 1982] 참조).
일반적으로, "정제된"이라는 것은 분획화를 통해 각종의 기타 다른 성분들은 제거하고, 실질적으로 그의 발현된 생물학적 활성은 유지하고 있는 것인 단백질 또는 펩티드 조성물을 지칭하여야 한다. "실질적으로 정제된"이라는 용어가 사용되는 경우, 이러한 표현은 단백질 또는 펩티드가 조성물의 주성분을 형성하는 것인, 예를 들어 조성물 중 약 50％, 약 60％, 약 70％, 약 80％, 약 90％, 약 95％, 약 99％ 이상의 단백질이 구성 요소가 되는 것인 조성물을 나타내어야 한다.
폴리펩티드의 정제 정도를 정량하는 각종 방법이 당업자에게 공지되어 있다. 이들은 예를 들어, 활성 분획의 비활성을 결정하거나 또는, SDS/PAGE 분석에 의해 분획 내의 폴리펩티드의 양을 평가하는 것을 포함한다. 분획의 순도를 평가하는 예시적인 방법은 분획의 비활성, 초기 추출물의 활성과 비활성을 비교하여 계산하는 것이고, 따라서 "-배 정제 수"에 의해 본원에 평가되는 순도를 계산한다. 활성의 양을 나타내기 위해 사용되는 실제 유닛은, 당연히 특정한 검정 테크닉에 달려있을 것이다.
일부 실시양태에서, FIX 폴리펩티드는 조직 배양 세포에서 재조합적으로 발현되고, 글리코실화는 숙주 세포, 예컨대 포유동물 세포의 정상적인 번역후 세포 기능의 결과이다. 다른 경우에, 발현된 폴리펩티드에 원하는 당 잔기를 부가하는 것이 세포 내에서 발생하도록 효소들 및 원하는 폴리펩티드들의 조합을 발현하도록 세포가 유전자 조작되었다. 대안적으로, 글리코실화는 화학적 또는 효소적 변형을 통해 달성될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Lee, et al., J. Biol. Chem. 264:13848-13855, 1989] 참조). 폴리펩티드의 글리코실화 패턴을 주문제작하기 위해 다양한 방법이 당업계에서 제안되었다 (예를 들어, WO 99/22764; WO 98/58964; WO 99/54342; 미국 공개 번호 2008/0050772; 및 미국 특허 번호 5,047,335 참조).
중합체 접합
변형된 FIX 폴리펩티드는 추가로 중합체 잔기를 부착시키는데 사용될 수 있는 하나 이상의 중합체 접합 부위를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, FIX 폴리펩티드가 생체적합성 중합체에 접합될 수 있다. 생체적합성 중합체는 약동학에서의 원하는 개선을 제공하도록 선택될 수 있다. 예를 들어, FIX 활성이 있는 폴리펩티드의 순환 반감기를 개선하도록 또는 활성에서의 허용되지 않는 감소 없이 폴리펩티드의 항원성을 감소시키도록 중합체의 신원, 크기 및 구조를 선택할 수 있다.
변형된 FIX 폴리펩티드는 포유동물 세포에서 발현 동안 자연적으로 펩티드에 부착되는 하나 이상의 당 잔기를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이들 당 잔기를 중합체 잔기를 부착시키기 위한 접합 부위로 제공할 수 있다. 일부 실시양태에서, 중합체 잔기는 다양한 링커 또는 연결 화학을 사용하여 당 잔기에 부착될 수 있다. 예를 들어, 중합체 잔기는 히드라존 연결 또는 아미노-옥시 연결에 의해 당 잔기에 접합될 수 있다.
본 발명에서 유용한 중합체의 예로는 폴리(알킬렌 글리콜), 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 폴리(프로필렌 글리콜) ("PPG"), 에틸렌 글리콜 및 프로필렌 글리콜 등의 공중합체, 폴리(옥시에틸화 폴리올), 폴리(올레핀산 알콜), 폴리(비닐피롤리돈), 폴리(히드록시알킬메타크릴아미드), 폴리(히드록시알킬메타크릴레이트), 폴리(사카라이드), 폴리(알파-히드록시산), 폴리(비닐 알콜), 폴리포스파젠, 폴리옥사졸린, 폴리(N-아크릴로모르폴린), 폴리시알산, 히드록시에틸 전분 (HES), 폴리에틸렌 옥시드, 알킬-폴리에틸렌 옥시드, 비스폴리에틸렌 옥시드, 폴리알킬렌 옥시드의 공중합체 또는 블록 공중합체, 폴리(에틸렌 글리콜-코-프로필렌 글리콜), 폴리(N-2-(히드록시프로필)메타크릴아미드), 및 덱스트란이 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다.
중합체는 특정 구조에 한정되지 않고, 선형 (예를 들어, 알콕시 PEG 또는 2관능성 PEG), 또는 비-선형 예컨대 분지형, 포크형, 다지형 (예를 들어, 폴리올 코어(core)에 부착된 PEG), 및 수지모양일 수 있다. 또한, 중합체의 내부 구조는 임의의 가짓수의 상이한 패턴으로 구성될 수 있고, 단독중합체, 교대 공중합체, 무작위 공중합체, 블록 공중합체, 교대 3원중합체, 무작위 3원중합체, 및 블록 3원중합체로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
FIX 폴리펩티드 상의 원하는 부위에 대한 커플링에 적합한 적절한 활성화 기로 PEG 및 다른 수용성 중합체 (즉, 중합체성 시약)가 활성화될 수 있다. 따라서, 중합체성 시약은 FIX 폴리펩티드와의 반응을 위한 반응성 기를 지닐 것이다. 대표적인 중합체성 시약 및 이러한 중합체를 활성 잔기에 접합시키는 방법이 당업계에 공지되어 있고, 문헌 [Zalipsky, et al., ("Use of Functionalized Poly(Ethylene Glycols) for Modification of Polypeptides" in Polyethylene Glycol Chemistry: Biotechnical and Biomedical Applications, J. M. Harris, Plenus Press, New York (1992))], 및 [Zalipsky (Adv. Drug Rev. 16:157-182, 1995)]에 추가로 기재되어 있다.
중합체의 중량 평균 분자량은 약 100 달톤 내지 약 150,000 달톤일 수 있다. 그러나, 예시적인 범위에는 약 5,000 달톤 초과 내지 약 100,000 달톤 범위, 약 6,000 달톤 내지 약 90,000 달톤 범위, 약 10,000 달톤 내지 약 85,000 달톤 범위, 약 10,000 달톤 초과 내지 약 85,000 달톤 범위, 약 20,000 달톤 내지 약 85,000 달톤 범위, 약 53,000 달톤 내지 약 85,000 달톤 범위, 약 25,000 달톤 내지 약 120,000 달톤 범위, 약 29,000 달톤 내지 약 120,000 달톤 범위, 약 35,000 달톤 내지 약 120,000 달톤 범위, 및 약 40,000 달톤 내지 약 120,000 달톤 범위의 중량 평균 분자량이 포함된다.
생체적합성 중합체에 대한 예시적인 중량 평균 분자량에는 약 100 달톤, 약 200 달톤, 약 300 달톤, 약 400 달톤, 약 500 달톤, 약 600 달톤, 약 700 달톤, 약 750 달톤, 약 800 달톤, 약 900 달톤, 약 1,000 달톤, 약 1,500 달톤, 약 2,000 달톤, 약 2,200 달톤, 약 2,500 달톤, 약 3,000 달톤, 약 4,000 달톤, 약 4,400 달톤, 약 4,500 달톤, 약 5,000 달톤, 약 5,500 달톤, 약 6,000 달톤, 약 7,000 달톤, 약 7,500 달톤, 약 8,000 달톤, 약 9,000 달톤, 약 10,000 달톤, 약 11,000 달톤, 약 12,000 달톤, 약 13,000 달톤, 약 14,000 달톤, 약 15,000 달톤, 약 20,000 달톤, 약 22,500 달톤, 약 25,000 달톤, 약 30,000 달톤, 약 35,000 달톤, 약 40,000 달톤, 약 45,000 달톤, 약 50,000 달톤, 약 55,000 달톤, 약 60,000 달톤, 약 65,000 달톤, 약 70,000 달톤, 및 약 75,000 달톤이 포함된다. 전체 분자량이 상기의 것들 중 임의의 것인 분지형 버전의 생체적합성 중합체 (예를 들어, 2개의 20,000 달톤 중합체로 구성된 분지형 40,000 달톤 중합체)가 또한 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 중합체는 PEG이다. PEG는 시판되고 있거나 또는 당해 분야에 주지된 방법에 따라서 에틸렌 글리콜을 개환 중합 반응시킴으로써 제조될 수 있는 주지된 수용성 중합체이다 (문헌 [Sandler and Karo, Polymer Synthesis, Academic Press, New York, Vol. 3, pages 138-161] 참조). 용어 "PEG"는 크기 또는 PEG의 끝부분에서의 변형과 관계없이 임의의 폴리에틸렌 글리콜 분자를 포함하도록 광범위하게 사용되고, 화학식 X-O(CH2CH2O)n-1CH2CH2OH [식 중 n은 20 내지 2300이고, X는 H 또는 말단 변형, 예를 들어 C1-4 알킬임]로 표시될 수 있다. PEG는 결합 반응에 필요하거나, 분자의 화학적 합성으로부터 초래되거나, 또는 분자의 일부분들의 최적의 거리를 위한 스페이서로서 작용하는 추가의 화학기를 함유할 수 있다. 또한, 이같은 PEG는 서로 연결된 하나 이상의 PEG 측쇄로 구성될 수 있다. 1개 초과의 PEG 쇄를 갖는 PEG는 다지형 또는 분지형 PEG로 지칭된다. 예를 들어, 폴리에틸렌 옥시드를 글리세롤, 펜타에리트리올 및 소르비톨이 포함되는 다양한 폴리올에 부가함으로써 분지형 PEG가 제조될 수 있다. 예를 들어, 팔이 4개인 분지형 PEG가 펜타에리트리올 및 에틸렌 옥시드로부터 제조될 수 있다. 분지형 PEG의 예가, 예를 들어 유럽 출원 공개 번호 473084A 및 미국 특허 번호 5,932,462에 기재되어 있다. PEG의 한 형태는 리신의 1차 아미노 기를 통해 연결된 2개의 PEG 측쇄 (PEG2)를 포함한다 (문헌 [Monfardini, et al., Bioconjugate Chem. 6:62-69, 1995]).
한 실시양태에서, 중합체는 끝부분이 캡핑된(capped) 중합체, 즉 1개 이상의 말단이 비교적 불활성인 기, 예컨대 저급 C1-6 알콕시 기 (그러나 히드록실 기도 또한 사용될 수 있음)로 캡핑된 중합체일 수 있다. 중합체가 PEG인 경우, 예를 들어 중합체의 1개의 말단은 메톡시 (-OCH3) 기인 한편 다른쪽 말단은 히드록실 또는 또 다른 관능기 (임의로 화학적으로 변형될 수 있음)인 선형 형태의 PEG인 메톡시-PEG (일반적으로 mPEG로 지칭됨)가 사용될 수 있다.
다지형 또는 분지형 PEG 분자, 예컨대 미국 특허 번호 5,932,462에 기재된 것들이 또한 PEG 중합체로 사용될 수 있다. 또한, PEG는 포크형 PEG를 포함할 수 있다 (예를 들어, 본 발명의 하나 이상의 실시양태에서 사용할 수 있는 다양한 포크형 PEG 구조가 개시되어 있는 PCT 공개 번호 WO 1999/45964 참조). Z 관능기를 분지화 탄소 원자에 연결하는 원자들의 쇄가 속박기(tethering group) 역할을 하고, 여기에는, 예를 들어 알킬 쇄, 에테르 쇄, 에스테르 쇄, 아미드 쇄 및 이들의 조합이 포함된다.
PEG 중합체는 PEG 쇄의 끝부분보다는 PEG의 길이를 따라 반응성 기, 예컨대 카르복실이 공유 결합에 의해 부착되어 있는 펜던트(pendant) PEG 분자를 또한 포함할 수 있다. 펜던트 반응성 기는 PEG에 직접적으로 또는 스페이서 잔기, 예컨대 알킬렌 기를 통해 부착될 수 있다.
폴리펩티드에 대한 중합체 분자(들)의 공유 결합 부착을 달성하기 위해, 중합체 분자의 히드록실 말단기가 활성화된 형태로 즉, 반응성 관능기 (이의 예로는 1차 아미노 기, 히드라지드 (HZ), 티올, 숙시네이트 (SUC), 숙신이미딜 숙시네이트 (SS), 숙신이미딜 숙신아미드 (SSA), 숙신이미딜 프로피오네이트 (SPA), 숙신이미딜 부타노에이트 (SBA), 숙신이미딜 카르복시메틸레이트 (SCM), 벤조트리아졸 카르보네이트 (BTC), N-히드록시숙신이미드 (NHS), 알데히드, 니트로페닐카르보네이트 (NPC), 및 트레실레이트 (TRES)가 포함됨)와 함께 제공되어야 한다. 적절하게 활성화된 중합체 분자가, 예를 들어 NOF (일본); 넥타 테라퓨틱스 인크.(Nektar Therapeutics, Inc., 미국 알라바마주 헌츠빌); 폴리엠에이에스씨 파마슈티컬스 피엘씨(PolyMASC Pharmaceuticals plc, 영국); 또는 선바이오 코포레이션(SunBio Corporation, 대한민국 안양시)로부터 시판된다. 대안적으로, 당업계에 공지된 통상적인 방법에 의해 중합체 분자가 활성화될 수 있다 (예를 들어, WO 90/13540 참조). 본 발명에서 사용하기에 적합한 활성화된 선형 또는 분지형 중합체 분자의 구체적인 예가, 예를 들어 NOF (일본); 넥타 테라퓨틱스 인크. (미국 알라바마주 헌츠빌)로부터 시판된다. 활성화된 PEG 중합체의 구체적인 예로는 하기의 선형 PEG들이 포함된다: NHS-PEG, SPA-PEG, SSPA-PEG, SBA-PEG, SS-PEG, SSA-PEG, SC-PEG, SG-PEG, SCM-PEG, NOR-PEG, BTC-PEG, EPOX-PEG, NCO-PEG, NPC-PEG, CDI-PEG, ALD-PEG, TRES-PEG, VS-PEG, OPSS-PEG, IODO-PEG, 및 MAL-PEG, 및 분지형 PEG, 예컨대 PEG2-NHS, PEG2-MAL, 및 미국 특허 번호 5,932,462 및 미국 특허 번호 5,643,575 (둘 모두 본원에 참고로 포함됨)에 예를 들어 개시된 것들.
한 실시양태에서, 중합체는 FIX 폴리펩티드 상의 유리 시스테인과 반응하여 공유 결합 연결을 형성할 수 있는 반응성 술프히드릴 잔기를 지닌다. 이같은 술프히드릴 반응성 잔기에는 티올, 트리플레이트, 트레실레이트, 아지리딘, 옥시란, S-피리딜, 또는 말레이미드 잔기가 포함된다. 추가로, 본원에 참고로 포함된 하기의 간행물에 유용한 중합체 분자 및/또는 PEG화 화학이 개시되어 있다: 미국 특허 번호 6,113,906; 7,199,223; 5,824,778; 5,476,653; 4,902,502; 5,281,698; 5,122,614; 5,219,564; 5,736,625; 5,473,034; 5,516,673; 5,629,384; 5,382,657; WO 97/32607; WO 92/16555; WO 94/04193; WO 94/14758; WO 94/17039; WO 94/18247; WO 94/28024; WO 95/00162; WO 95/11924; WO95/13090; WO 95/33490; WO 96/00080; WO 97/18832; WO 98/41562; WO 98/48837; WO 99/32134; WO 99/32139; WO 99/32140; WO 96/40791; WO 98/32466; WO 95/06058; WO 97/03106; WO 96/21469; WO 95/13312; WO 98/05363; WO 96/41813; WO 96/07670; EP809996; EP921131; EP605963; EP510356; EP400472; EP183503; EP154316; EP229108; EP402378; 및 EP439508.
시스테인 잔기의 PEG화를 위해, PEG화 전에 환원제, 예컨대 디티오트레이톨 (DDT)로 폴리펩티드를 처리할 수 있다. 이어서 임의의 통상적인 방법에 의해, 예컨대 탈염에 의해 환원제를 제거할 수 있다. 시스테인 잔기에 대한 PEG의 접합은 약 16시간까지의 기간 동안 4℃ 내지 25℃의 온도에서 pH 6-9의 적절한 완충제에서 전형적으로 일어난다. 시스테인 잔기에 커플링시키기 위한 활성화된 PEG 중합체의 예로는, 예를 들어 하기의 선형 및 분지형 PEG가 포함된다: 비닐술폰-PEG (PEG-VS), 예컨대 비닐술폰-mPEG (mPEG-VS); 오르토피리딜-디술피드-PEG (PEG-OPSS), 예컨대 오르토피리딜-디술피드-mPEG (MPEG-OPSS); 및 말레이미드-PEG (PEG-MAL), 예컨대 말레이미드-mPEG (mPEG-MAL) 및 분지형 말레이미드-mPEG2 (mPEG2-MAL).
한 실시양태에서, 하나 이상의 중합체 접합 부위가 도입된 FIX 폴리펩티드가 디술피드 결합을 형성함으로써 폴리펩티드의 시스테인 잔기를 "캡핑"하는 시스테인을 함유하는 세포 배양 배지에서 성장된 세포에서 발현될 수 있다. 중합체 접합체를 FIX 폴리펩티드에 부가하기 위해, 캡을 방출시키는 가벼운 반응에 의해 시스테인 캡이 제거될 수 있고, 그후 시스테인-특이적 중합체 시약이 부가된다.
본원은 중합체 접합 부위, 즉 시스테인 잔기를 FIX 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 내로 도입하는 것; 돌연변이된 뉴클레오티드 서열을 발현시켜 도입된 중합체 접합 부위를 포함하는 폴리펩티드를 생성하는 것; 폴리펩티드를 정제하는 것; 폴리펩티드를 환원된 시스테인 잔기에서 폴리펩티드와 반응하도록 활성화된 생체적합성 중합체와 반응시켜, 접합체가 형성되는 것; 및 접합체를 정제하는 것을 포함하는, 중합체가 접합된 FIX 폴리펩티드의 제조 방법을 또한 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 본원은 (a) 도입된 중합체 접합 부위, 즉, FIX 폴리펩티드의 노출된 표면 상에 도입된 시스테인 잔기를 포함하는 FIX 폴리펩티드를 발현시키는 것 (여기서, 시스테인은 캡핑됨); (b) 도입된 시스테인을 가볍게 환원시키고 캡을 방출시키는 조건하에 FIX 폴리펩티드를 환원제와 접촉시키는 것; (c) 캡 및 환원제를 FIX 폴리펩티드에서 제거하는 것; 및 (d) 환원제를 제거하고 나서 약 5분, 15분, 또는 30분 이상 후에, FIX 폴리펩티드를 PEG화 FIX 폴리펩티드가 생성되도록 하는 조건하에 술프히드릴 커플링 잔기를 포함하는 PEG로 처리하는 것을 포함하는, FIX 폴리펩티드 뮤테인의 부위-지정 PEG화 방법을 제공한다. PEG의 술프히드릴 커플링 잔기는 티올, 트리플레이트, 트레실레이트, 아지리딘, 옥시란, S-피리딜 및 말레이미드 잔기로 이루어진 군으로부터 선택된다.
PEG화 FIX 폴리펩티드의 예시적인 제조 방법이 하기에 기재된다. 약 1 μM의 도입된 비-천연 시스테인 잔기를 포함하는 정제된 FIX 폴리펩티드를 환원제, 예컨대 0.7mM 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 (TCEP) 또는 0.07mM 디티오트레이톨 (DTT)로 30분 동안 4℃에서 가볍게 환원시켜, "캡"을 방출시킨다. 도입된 시스테인은 환원된 유리 상태이게 하는 한편 디술피드가 재형성되도록 샘플을 스핀 칼럼에 러닝(running)시키는 것과 같은 크기-배제 크로마토그래피 (SEC) 방법에 의해 환원제를 "캡"과 함께 제거하였다. 환원제를 제거하고 나서 30분 이상 후에, FIX 폴리펩티드를 4℃에서 1시간 이상 동안 10배 이상의 몰 과량의 크기가 5 내지 85 kD 범위인 PEG-말레이미드로 처리한다.
FIX의 중합체 접합을 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해 평가할 수 있다. 예를 들어, 중합체가 접합된 FIX를 6％ 트리스-글리신 SDS 폴리아크릴아미드 환원 겔 상에서의 전기영동에 의해 분석할 수 있다. 전기영동 후, 접합되지 않은 FIX 폴리펩티드와 비교하여 밴드 분자량에서의 이동을 확인하기 위해, 겔을 쿠마시 블루로 염색하여 모든 단백질을 확인할 수 있거나, 또는 표준 웨스턴 블롯 프로토콜에 적용할 수 있다. PEG에 대해 특이적인 바륨-아이오딘 염색을 사용하여 분자량 이동이 있는 밴드가 PEG화 단백질을 포함한다는 것을 확증할 수 있다. 중합체 접합의 정도 및 효율을 결정하기 위해, 중합체 접합 전 및 접합 후에, FIX 폴리펩티드를 매트릭스-보조 레이저 탈착/이온화 (MALDI) 질량 분광법에 의해 또한 분석할 수 있다.
일부 실시양태에서, 중합체 접합은 글리코실화에 의해 부착된 당 잔기 중 하나 이상에서 일어날 수 있다. 이러한 중합체 접합의 방법은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 WO94/05332, US2009/0081188 및 미국 특허 번호 5,621,039 (이 중 둘 모두는 참고로 포함됨)에 기재되어 있다. 중합체가 PEG인 경우, 이는 또한 통상적으로 글리코PEG화로 지칭된다.
일부 실시양태에서, 미국 특허 번호 5,621,039에서 제공된 바와 같은 화학적 부착에 의한 중합체 접합은 촉매의 첨가에 의해 개선될 수 있다. 일부 실시양태에서, 촉매는 화학적 촉매이다. 예를 들어, 화학적 촉매는 당 상의 유리 알데히드와 아미노 기 사이의 반응의 효율을 증가시키는데 사용될 수 있는 아닐린일 수 있다. 다른 실시양태에서, 다른 적합한 화학적 촉매는 아닐린 유도체, 예컨대 o-Cl-, p-Cl-, o-CH3O-, p-CH3O-, 및 p-CH3-아닐린일 수 있다.
일부 실시양태에서, 중합체 접합은 FIX에서 자연적으로 발생하는 글리코실화 부위에서 일어날 수 있다. 야생형 인자 IX는 인자 IX의 전체 시알산 함량 중 약 80％를 함유하는 2개의 N-연결 글리코실화 부위를 갖는다. 이들 2개의 N-연결 부위 (N157 및 N167)는 둘 모두 2개의 부위 (R145-Ala146) 및 (R180-V181)에서 절단되어 응고 캐스캐이드의 전파 동안 촉매 활성 FIXa 분자를 생성하는 활성화 펩티드 내에 위치한다.
FIX에서 자연적으로 발생하는 글리코실화 부위에서의 중합체 접합 뿐만 아니라, 중합체를 FIX 단백질의 상이한 도메인에 위치하는 대안적 부위에서 접합시키는 것이 바람직할 수 있다. 이는 우선 예를 들어 N157의 A157로의 변화 및 N167의 A167로의 변화에 의해 위치 N157 및 N167에서 자연적으로 발생하는 N-연결 글리코실화 부위를 제거하고, 다음으로 분자의 다른 곳에, 예를 들어 촉매 도메인 또는 2개의 EGF 도메인 중 하나에 신규 및 기능성 N-연결 글리코실화 부위를 도입하여 달성될 수 있다. 이러한 신규 및 기능성 N-연결 글리코실화 부위는 이전에 PCT US2009/040813에 개시되어 있다.
제약 조성물
포유동물에서 상기 확인된 용태들의 치료에 대한 효능을 결정하는데 사용되는 주지된 검정을 기초로, 및 이러한 결과들을 이러한 용태들을 치료하는데 사용되는 공지된 의약의 결과와 비교함으로써, 각각의 원하는 적응증의 치료에 대해 본 발명의 폴리펩티드의 유효 투여량을 쉽게 결정할 수 있다. 이들 병태들 중 하나의 치료에서 투여되는 활성 성분의 양은 사용되는 특정 폴리펩티드 및 투여 유닛, 투여 방식, 치료 기간, 및 치료받는 환자의 연령 및 성별, 및 치료되는 병태의 특성 및 정도와 같은 고려 사항에 따라 광범위하게 달라질 수 있다.
본원은 부분적으로 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 FIX 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 제공한다. 조성물은 생체내 투여에 적절할 수 있고, 발열원이 없다. 조성물은 제약상 허용되는 담체를 또한 포함할 수 있다. "제약상 또는 약물학상 허용가능한"이라는 어구는, 동물 또는 인간에게 투여되었을 때, 부작용, 알레르기, 또는 다른 다른 원치않는 반응을 일으키지 않는 분자 엔티티 및 조성물을 나타낸다. 본원에 사용된 "제약상 허용되는 담체"로는 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항균제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 제약 활성 물질에 대한 이러한 매질 및 작용제의 사용은 당업계에 주지되어 있다. 보충적인 활성 성분 또한 조성물에 혼입될 수 있다.
본 발명의 조성물은 고전적인 제약 제제를 포함한다. 본 발명에 따른 이와 같은 조성물의 투여는 임의의 보편적인 경로를 통해 이루어질 수 있다. 제약 조성물은 예를 들어, 정맥내, 진피내, 근육내, 피하, 또는 경피 전달에 의한 것과 같은 임의의 종래 방법에 의해 대상체 내로 도입될 수 있다. 치료는 단일 투약, 또는 일정 기간 동안에 걸쳐 다회 투약하는 것으로 구성될 수 있다.
활성 화합물은 물 중 유리 염기 또는 약리학상 허용되는 염의 용액으로 투여하기 위해 제조될 수 있다. 분산액이 또한 액체 폴리에틸렌 글리콜에서 제조될 수 있다. 보관 및 사용의 통상적인 조건하에, 이들 제제는 미생물의 성장을 방지하는 보존제를 함유한다.
주사용으로 사용하기에 적합한 제약 제형으로는 멸균 수성 액제 또는 분산제, 및 멸균 주사용 액제 또는 분산제의 즉석 제조를 위한 멸균 분제를 포함한다. 제형은 멸균성을 띠어야 하고, 쉽게 주사할 수 있을 정도로 유체성을 띠어야 한다. 제조 및 보관 조건하에서는 안정적이어야 하며, 미생물, 예를 들어 세균 및 진균의 오염 작용에 대해서도 보존되어야 한다. 담체는 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 수크로스, L-히스티딘, 폴리소르베이트 80, 또는 그의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 미생물의 작용은 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로산 등과 같은 각종의 항균제 및 항진균제에 의해 막을 수 있다. 주사용 조성물은 예를 들어, 당 또는 염화나트륨과 같은 등장화제를 포함할 수 있다. 주사가능한 조성물의 흡착 지연은 조성물 중에 흡착 지연제를 사용하여 일으킬 수 있다.
필요한 대로 상기 열거된 다양한 다른 성분과 함께 적합한 용매 내에 필요한 양의 활성 화합물 (예를 들어, FIX 폴리펩티드)을 혼입시킨 후, 멸균 여과함으로써 무균성 주사용 용액이 제조될 수 있다.
일반적으로, 분산제는 기본 분산 매질과 상기 열거된 것으로부터 필요시되는 다른 다른 성분들을 포함하는 멸균 비히클 내로 각종의 멸균처리된 활성 성분을 혼입시킴으로써 제조할 수 있다. 멸균 주사용 액제의 제조를 위한 멸균 분제의 경우, 그의 제조 방법으로는 예를 들어, 활성 성분과, 그의 상기 멸균 여과처리된 액제로부터 임의의 추가의 원하는 성분으로 이루어진 분제를 생성하는 진공-건조법 및 냉동-건조법을 포함한다.
조성물은 미생물 성장을 방지 또는 방해하기 위한 항균제를 또한 포함할 수 있다. 본 발명에 적절한 항균제의 비제한적인 예로는 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드, 벤질 알콜, 세틸피리디늄 클로라이드, 클로로부탄올, 페놀, 페닐에틸 알콜, 질산페닐수은, 티메르솔, 및 이들의 조합물이 포함된다.
항산화제가 또한 조성물 내에 존재할 수 있다. 산화를 방지함으로써 제제의 열화를 방지하기 위해 항산화제가 사용될 수 있다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 항산화제에는 예를 들어, 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화 히드록시아니솔, 부틸화 히드록시톨루엔, 하이포인산, 모노티오글리세롤, 프로필 갈레이트, 나트륨 비술파이트, 나트륨 포름알데히드 술폭실레이트, 나트륨 메타비술파이트, 및 이들의 조합물이 포함된다.
계면활성제가 부형제로서 존재할 수 있다. 예시적인 계면활성제에는 폴리소르베이트, 예컨대 트윈(Tween)®-20 (폴리옥시에틸렌소르비탄 모노라우레이트) 및 트윈®-80 (폴리옥시에틸렌소르비탄 모노올레에이트) 및 플루로닉, 예컨대 F68 및 F88 (둘 모두 BASF (미국 뉴저지주 마운트 올리브)에서 입수가능); 소르비탄 에스테르; 지질, 예컨대 인지질, 예컨대 레시틴 및 다른 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 지방산 및 지방 에스테르; 스테로이드, 예컨대 콜레스테롤; 및 킬레이팅제, 예컨대 EDTA, 아연 및 다른 적합한 양이온이 포함된다.
산 또는 염기가 조성물 내에 부형제로서 존재할 수 있다. 사용될 수 있는 산의 비-제한적인 예로는 염산, 아세트산, 인산, 시트르산, 말산, 락트산, 포름산, 트리클로로아세트산, 질산, 과염소산, 인산, 황산, 푸마르산 및 이들의 조합물이 포함된다. 적합한 염기의 예로는 수산화나트륨, 아세트산나트륨, 수산화암모늄, 수산화칼륨, 아세트산암모늄, 아세트산칼륨, 인산나트륨, 인산칼륨, 시트르산나트륨, 포름산나트륨, 황산나트륨, 황산칼륨, 푸메르산칼륨 및 이들의 조합물이 포함된다.
조성물 내의 임의의 개별적인 부형제의 양은 부형제의 활성 및 조성물의 특정 요구사항에 따라 변할 수 있다. 전형적으로, 일상적인 실험을 통해, 즉 다양한 양의 부형제 (낮은 양 내지 높은 양 범위)를 함유하는 조성물을 제조하고, 안정성 및 다른 파라미터를 시험한 후, 유의한 유해 효과 없이 최적의 성능이 달성되는 범위를 결정함으로써 임의의 개별적인 부형제의 최적량을 결정할 수 있다. 일반적으로, 부형제는 부형제의 약 1 내지 약 99 중량％, 약 5 내지 약 98 중량％, 약 15 내지 약 95 중량％의 양으로, 30 중량％ 미만의 농도에서 조성물 내에 존재할 수 있다. 이러한 상기 제약 부형제들이 다른 부형제들과 함께 문헌 ["Remington: The Science & Practice of Pharmacy," 19 ed., Williams & Williams, (1995)]; ["Physician's Desk Reference," 52 ed., Medical Economics, Montvale, N.J. (1998)]; 및 [Kibbe, A. H., Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3 Edition, American Pharmaceutical Association, Washington, D.C., 2000]에 기재되어 있다.
제조시, 액제는 투약 제형과 화합성인 방식으로, 치료 유효량인 양으로 투여될 수 있다. 본원에 사용된 "치료 유효량"은 혈류 중 또는 표적 조직 중에 폴리펩티드를 원하는 수준으로 제공하는 데 필요한 폴리펩티드의 양을 나타낸다. 정확한 양은 다수의 요인, 예를 들어 특정 FIX 폴리펩티드, 치료 조성물의 성분 및 물리적 특성, 의도되는 환자 집단, 전달 방식, 개별적인 환자 고려사항 등에 좌우될 것이고, 본원에서 제공된 정보를 기초로 당업자가 쉽게 결정할 수 있다.
제제는 예를 들어, 주사용 액제 등과 같이 다양한 투여 형태로 쉽게 투여될 수 있다. 수성 액제로 비경구적으로 투여하기 위해서는 예를 들어, 액제는 필요한 경우에는 적합하게 완충처리되어야 하며, 액상의 희석제는 먼저 충분한 염수 또는 글루코스로 등장성을 띠어야 한다. 이들 특정 수용액은 정맥내, 근육내, 피하 및 복강내 투여에 특히 적합하다.
FIX의 투여량은 일반적으로 유닛으로 표현된다. 체중 ㎏ 당 1 유닛의 FIX는 혈장 수준을 0.01 U/㎖, 즉 1％ 상승시킬 수 있다. 다르게는, 건강한 환자에는 혈장 ㎖ 당 1 유닛의 FIX, 즉 100％가 있다. B형 혈우병의 경도 사례는 6-60％의 FIX 혈장 농도로 정의되고, 중도 사례는 1-5％로 정의되며, B형 혈우병 사례의 약 절반을 차지하는 고도 사례는 FIX가 1％ 미만이다. 예방 치료 또는 경증 출혈의 치료는 일반적으로 FIX 수준을 15-30％로 상승시키는 것을 필요로 한다. 중등도 출혈의 치료는 일반적으로 수준을 30-50％로 상승시키는 것을 필요로 하는 한편, 중증 외상의 치료는 수준을 50 내지 100％로 상승시키는 것을 요구할 수 있다. 환자의 혈액 수준을 상승시키는데 필요한 유닛의 총수를 하기와 같이 결정할 수 있다: 1.0 유닛/㎏ x 체중 (㎏) x 원하는 백분율 증가 (정상의 ％). 최초의 볼루스에 이어지는 약물 제품의 치료적 순환 수준을 유지하기 위한 연속 주입으로 비경구 투여가 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 15 내지 150 유닛/㎏의 FIX 폴리펩티드가 투여될 수 있다. 당업자는 우수한 진료(good medical practice) 및 개별적인 환자의 임상 상태에 의해 결정되는 바와 같이 효과적인 투여량 및 투여 계획을 쉽게 최적화할 것이다.
투약 빈도는 작용제의 약동학적 파라미터 및 투여 경로에 좌우될 것이다. 투여 경로 및 원하는 투여량에 따라 당업자는 최적의 제약 제형을 결정할 수 있다 (예를 들어, 본원에 참고로 포함된 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 20th edition, 2000] 참조). 이같은 제형은 투여된 작용제의 물리적 상태, 안정성, 생체내 방출 속도 및 생체내 소거 속도에 영향을 미칠 수 있다. 투여 경로에 따라, 적절한 용량을 체중, 체표면적 또는 기관 크기에 따라 계산할 수 있다. 특히 본원에 개시된 투여량 정보 및 검정, 뿐만 아니라 동물 또는 인간 임상 시험에서 관찰되는 약동학적 데이터의 견지에서, 적합한 치료 용량을 결정하기 위해 필요한 계산의 추가의 개량이 과도한 실험 없이 당업자에 의해 일상적으로 이루어진다. 예시적인 투약 스케줄에는 1일 5회, 1일 4회, 1일 3회, 1일 2회, 1일 1회, 매주 3회, 매주 2회, 매주 1회, 매월 2회, 매월 1회, 및 이들의 임의의 조합으로 투여하는 것이 비제한적으로 포함된다.
관련된 투여량 반응 데이터와 함께 혈액 응고 수준을 특정하는 확립된 검정의 사용을 통해 적절한 투여량을 확정할 수 있다. 약물의 작용을 변형시킬 수 있는 인자, 예를 들어 약물의 특이 활성, 손상의 중증도, 및 환자의 반응성, 환자의 연령, 상태, 체중, 성별 및 섭식, 임의의 감염의 중증도, 투여 시간, 및 다른 다른 임상적 요인을 고려하면서, 주치의에 의해 최종 투여 요법이 결정될 수 있다.
예시적 용도
본원에 기재된 조성물은 FIX의 기능 결함 또는 FIX의 결핍, 예컨대 FIX의 짧아진 생체내 반감기, FIX의 변경된 결합 특성, FIX의 유전적 결함, 및 FIX의 감소된 혈장 농도와 관련된 임의의 출혈 장애를 치료하는데 사용될 수 있다. FIX의 유전적 결함은, 예를 들어 FIX를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 내의 염기의 결실, 부가 및/또는 치환을 포함한다. 한 실시양태에서, 출혈 장애는 B형 혈우병일 수 있다. 상기 출혈성 질병의 증상으로는 예를 들어, 중증 코피, 구강 점막 출혈, 혈관절증, 혈종, 지속성 혈뇨, 위장관 출혈, 복막뒤 출혈, 혀/인두뒤 출혈, 두개내 출혈, 및 외상-관련 출혈을 포함한다.
본 발명의 조성물은 예방적 적용을 위해 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 변형된 FIX 폴리펩티드는 대상체 자신의 응고 능력을 강화하기 위해 질환 상태 또는 손상의 여지가 있거나 다른 방식으로 질환 상태 또는 손상의 위험에 있는 대상체에게 투여될 수 있다. 상기와 같은 양은 "예방 유효량"으로 정의될 수 있다. 예방을 위한 변형된 FIX 폴리펩티드의 투여는 B형 혈우병을 앓고 있는 환자가 수술을 받을 예정이고 폴리펩티드가 수술 1시간 내지 4시간 전에 투여되는 상황을 포함한다. 추가로, 폴리펩티드는 임의로 혈우병을 앓지 않는 환자에서 비조절성 출혈에 대한 예방제로서 사용하기에 적합하다. 따라서, 예를 들어 폴리펩티드는 수술하기 이전에 비조절성 출혈의 위험이 있는 환자에게 투여될 수 있다.
본원에 기재된 폴리펩티드, 물질, 조성물, 및 방법은 본 발명의 대표적인 실시예를 의미하고, 본 발명의 범위가 실시예의 범위에 의해 제한되지는 않는다고 이해될 것이다. 본 발명은 개시된 폴리펩티드, 물질, 조성물 및 방법 상에서 변화가 수행될 수 있고, 이러한 변화가 본 발명의 영역 내에서 관련되어 있다는 것을 당업자는 인지할 것이다.
하기 실시예는 본원에 기재된 본 발명을 예시하기 위해 제시되지만 임의의 방식으로 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예
본 발명을 더 잘 이해하기 위해, 다음의 실시예를 기재하였다. 이들 실시예는 예시의 목적으로만 존재하고, 임의의 방식으로 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본원에 인용되는 모든 간행물은 그 전체 내용이 본원에 참고로 포함된다.
실시예 1: 인간 인자 IX cDNA의 클로닝
인간 FIX cDNA의 코딩 영역의 5' 및 3' 말단의 서열에 상보적인 한 쌍의 PCR 프라이머를 공개된 cDNA 서열 (NM_000133)로부터 설계하였다. 5' 프라이머 (FIXF1; ATCATAAGCTTGCCACC ATGCAGCGCGTGAACATG (서열 3), FIX의 개시 코돈은 굵은 글꼴임)는 컨센서스 코작(Kozak) 서열 (밑줄) 및 HindIII 제한 부위 앞에 ATG 개시 코돈을 포함하는 FIX 코딩 영역의 처음 18개 뉴클레오티드를 함유하였다. 3' 프라이머 (FIXR3, ATCATAAGCTTGATTAGTTAGTGAGAGGCCCTG) (서열 4)는 HindIII 부위 앞에 FIX 코딩 영역의 말단의 45개 뉴클레오티드 3'이 놓여 있는 FIX 서열의 22개 뉴클레오티드를 함유하였다. 이들 프라이머 및 고충실도 프루프리딩 중합효소 (인비트로젠(Invitrogen), 미국 캘리포니아주 칼스배드)를 사용한 정상 인간 간으로부터의 제1 가닥 cDNA (스트라타진(Stratagene), 미국 캘리포니아주 샌 디에고)의 증폭으로 인간 FIX cDNA에 대해 예상된 크기 (1464 bp)의 단일 밴드가 생성되었다. HindIII로의 분해 후, PCR 생성물을 겔 정제한 후에, 플라스미드 pEAKflcmv의 HindIII 부위 내로 클로닝하였다. 벡터 내의 CMV 프로모터에 대해 정방향 배향으로 FIX cDNA가 삽입된 클론이 제한 분해에 의해 확인되었다. 여러 클론의 삽입물에 대해 이중 가닥 DNA 서열분석을 수행하였고, FIX 서열에 대한 유래된 서열의 정렬은 cDNA가 성숙한 단백질의 아미노산 148에 트레오닌이 있는 인간 FIX를 코딩한다는 것을 입증하였다. 이러한 플라스미드를 pEAKflcmv-FIX로 지정하였다.
실시예 2: 변형된 인자 IX 폴리펩티드의 생성
인간 FIX 서열 내의 다양한 아미노산을 변화시키기 위해, 한 쌍의 프라이머를 퀵체인지(Quickchange)TM 프라이머 설계 프로그램 (스트라타진, 미국 캘리포니아주 샌 디에고)을 사용하여 설계하였다. 이러한 프라이머들을 사용하여, 퀵체인지TM II XL 부위 지정 돌연변이유발 키트 (스트라타진, 미국 캘리포니아주 샌 디에고)를 제조사의 설명서에 따라 사용하여 pEAKflcmv-FIX 플라스미드 내에 돌연변이를 생성시켰다. 원하는 돌연변이를 함유하는 클론이 전체 FIX 코딩 영역의 DNA 서열분석에 의해 확인되었다. 돌연변이를 생성시키는데 사용된 센스 가닥 올리고뉴클레오티드의 서열을 표 1에 나타내었다.
실시예 3: HKB11 세포에서의 인자 IX 폴리펩티드의 발현
단백질 서열이 변경된 FIX 유전자가 포유동물 세포로부터 발현되어 분비될 수 있는지를 결정하고, FIX 응고 활성에 대한 이러한 치환의 효과를 결정하기 위해, 이러한 FIX 변이체들을 코딩하는 발현 플라스미드를 HKB11 세포 내로 형질감염시켰다. HKB11은 HEK293 세포와 B 세포 림프종의 융합에 의해 생성된 인간 세포주이다.
HKB11 세포를 10 ng/㎖ 가용성 비타민 K3 (시그마-알드리치(Sigma-Aldrich), 미국 미주리주 세인트 루이스)이 보충된 혈청-비함유 배지 중에서 37℃의 CO2 (5％) 인큐베이터 내의 궤도형 진탕기 (100-125 rpm) 상에서 현탁 배양으로 성장시키고, 0.25 내지 1.5 x 106개 세포/㎖의 밀도로 유지시켰다.
형질감염용 세포를 1000 rpm에서 5분 동안의 원심분리에 의해 수집한 후, 프리스타일(FreeStyle)TM 293 발현 배지 (인비트로젠 (미국 캘리포니아주 칼스배드)) 내에 1.1 x 106개의 세포/㎖로 재현탁시켰다. 세포를 6웰 플레이트에 시딩하고 (4.6 ㎖/웰), 37℃ CO2 인큐베이터 내의 궤도형 회전기 (125 rpm) 상에서 인큐베이션하였다. 각각의 웰에 대해, 5 ㎍ 플라스미드 DNA를 0.2 ㎖ Opti-MEM® I 배지 (인비트로젠)와 혼합하였다. 각각의 웰에 대해, 7 ㎕ 293펙틴(fectin)TM 시약 (인비트로젠)을 0.2 ㎖ Opti-MEM® I 배지와 부드럽게 혼합하고, 실온에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 희석된 293펙틴TM을 희석된 DNA 용액에 첨가하고, 부드럽게 혼합하고, 실온에서 20-30분 동안 인큐베이션한 후, 5 x 106개 (4.6 ㎖)의 HKB11 세포가 시딩되어 있는 각각의 웰에 첨가하였다. 이어서, 세포를 37℃의 CO2 인큐베이터 내의 궤도형 회전기 (125 rpm) 상에서 3일 동안 인큐베이션한 후에, 1000 rpm에서 5분 동안의 원심분리에 의해 세포를 펠릿화하고, 상청액을 수집하고, 4℃에서 보관하였다.
실시예 4: BHK21 세포에서의 인자 IX 폴리펩티드의 발현
단백질 서열이 변경된 FIX 유전자가 포유동물 세포로부터 발현되어 분비될 수 있는지를 결정하고, FIX 응고 활성에 대한 이러한 치환의 효과를 결정하기 위해, 이러한 FIX 변이체들을 코딩하는 발현 플라스미드를 BHK21 세포 내로 형질감염시켰다.
BHK21 세포를 10 ng/㎖ 가용성 비타민 K3 (메나디온(Menadione), 시그마)이 보충된 독점 혈청-비함유 배지 중에서 37℃의 CO2 (5％) 인큐베이터 내의 궤도형 진탕기 (100-125 rpm) 상에서 현탁 배양으로 성장시키고, 0.25 내지 1.5 x 106개 세포/㎖의 밀도로 유지시켰다.
형질감염용 세포를 1000 rpm에서 5분 동안 원심분리에 의해 수집한 후에, 1 x 106개 세포/㎖로 재현탁시켰다.
세포를 6웰 플레이트에 시딩하고 (4.6 ㎖/웰), 37℃ CO2 인큐베이터 내의 궤도형 회전기 (125 rpm) 상에서 인큐베이션하였다. 각각의 웰에 대해, 5 ㎍ 플라스미드 DNA를 0.2 ㎖ Opti-MEM I 배지 (인비트로젠)와 혼합하였다. 각각의 웰에 대해, 7 ㎕ 293펙틴 시약 (인비트로젠)을 0.2 ㎖ Opti-MEM I 배지와 부드럽게 혼합하고, 실온에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 희석된 293펙틴을 희석된 DNA 용액에 첨가하고, 부드럽게 혼합하고, 실온에서 20-30분 동안 인큐베이션한 후, 5 x 106개 (4.6 ㎖) BHK21 세포가 시딩되어 있는 각각의 웰에 첨가하였다. 이어서, 세포를 37℃의 CO2 인큐베이터 내의 궤도형 회전기 (125 rpm) 상에서 3일 동안 인큐베이션한 후에, 1000 rpm에서 5분 동안의 원심분리에 의해 세포를 펠릿화하고, 상청액을 수집하고, 4℃에서 보관하였다.
실시예 5: 인자 IX에 대한 웨스턴 블롯.
세포 배양물 상청액 (50 ㎕)을 20 ㎕ 4x SDS-PAGE 로딩 염료와 혼합하고, 95℃에서 5분 동안 가열하고, NuPAGE® 4-12％ SDS PAGE 겔 상에 로딩한 후에 니트로셀룰로스 막으로 옮겼다. 5％ 밀크 파우더로 30분 동안 차단시킨 후에, 막을 인간 FIX에 대한 HRP-표지된 염소 폴리클로날 항체 (US 바이올로지칼 (US Biological), 미국 매사추세츠주 스왐프스콧, 카탈로그 번호 F0017-07B)와 실온에서 60분 동안 인큐베이션하였다. 0.1％ 트윈®-20 완충제를 포함한 포스페이트-완충 염수로 세척한 후에, HRP로부터의 신호를 수퍼시그날(SuperSignal)® 피코(Pico) (피어스(Pierce), 미국 일리노이주 락포드) 및 x-선 필름에 대한 노출을 사용하여 검출하였다.
실시예 6: 인자 IX ELISA
세포 배양물 상청액 내의 FIX 항원 수준을 FIX ELISA 키트 (하이펜 바이오메드(Hyphen Biomed)/아니아라(Aniara), 미국 오하이오주 매슨)를 사용하여 결정하였다. 표준 곡선의 범위 내의 신호를 달성하도록 세포 배양물 상청액을 샘플 희석 완충제 (키트에서 공급됨)에서 희석하였다. 샘플 희석제 내에 희석된 인간 혈장으로부터 정제된 FIX 단백질 (하이펜 바이오메드/아니아라, 카탈로그 번호 RK032A, 비활성 196 U/㎎)을 사용하여 100 ng/㎖ 내지 0.2 ng/㎖의 표준 곡선이 생성되었다. 희석된 샘플 및 표준물을 폴리클로날 항-FIX 포획 항체로 미리 코팅된 ELISA 플레이트에 첨가하였다. 폴리클로날 검출 항체를 첨가한 후, 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하고, 광범위하게 세척한 후에, 키트 제조사가 기재한 바와 같이 TMB 기질 (3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘)을 사용하여 발색시키고, 신호를 450 nM에서 스펙트라맥스(SpectraMax)® 플레이트 판독기 (몰레큘라 디바이시즈(Molecular Devices), 미국 캘리포니아주 서니베일)를 사용하여 측정하였다. 표준 곡선을 2-성분 플롯에 핏팅하고, 미지의 값은 곡선으로부터 추정하였다.
시판되는 FIX ELISA 시약 (해모크롬 디아그노스티카 게엠베하(Haemochrom Diagnostica GmbH), 독일 에센)을 사용하여 제조사의 설명서에 따라 FIX 발현 수준을 또한 정량하였다. 밀 배아 응집소 (시그마-알드리치 (미국 미주리주 세인트 루이스))를 384웰 맥시소프(MaxiSorp)TM 플레이트 (넌크(Nunc)TM, 미국 뉴욕주 로체스터) 상에 코팅하였다. 웰을 차단하고, 세척한 후, 상청액을 첨가하였다. 추가의 세척 후, HRP가 커플링된 폴리클로날 항-FIX 항체 (해모크롬 디아그노스티카 게엠베하, 독일 에센)를 사용하여 검출하였다.
실시예 7: 인자 IX 응고 검정
일렉트라(Electra)TM 1800C 자동 응고 분석기 (베크만 코울터(Beckman Coulter), 미국 캘리포니아주 풀러톤) 상에서 실행된 FIX 결핍 인간 혈장에서의 aPTT 검정을 사용하여 FIX 응고 활성을 결정하였다. 간략하게, 응고 희석제 내의 상청액 샘플의 3가지 희석물을 장치에 의해 생성시킨 후, 100 ㎕를 100 ㎕ FIX 결핍 혈장 (아니아라, 미국 오하이오주 매슨) 및 100 ㎕ 자동화 aPTT 시약 (토끼 뇌 인지질 및 미분화 실리카 (바이오메리욱스, 인크.(bioMerieux, Inc.), 미국 노쓰 캐롤라이나주 더햄)과 혼합하였다. 100 ㎕의 25mM CaCl2 용액을 첨가한 후, 응괴 형성 시간을 기록하였다. ELISA 검정에서 표준물로 사용된 동일한 정제된 인간 FIX (하이펜 바이오메드/아니아라)의 일련의 희석물을 사용하여 각각의 실행에 대해 표준 곡선이 생성되었다. 표준 곡선은 일상적으로 상관 계수가 0.95 이상인 직선이었고, 이를 사용하여 미지 샘플의 FIX 활성을 결정하였다. 위치 86에 아미노산 치환을 포함하는 FIX 폴리펩티드에 대한 활성을 표 2에 나타내었다. 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 FIX 폴리펩티드에 대한 활성을 표 3 및 4에 나타내었다.
실시예 8: 순환 FIX의 측정
FIX 폴리펩티드의 순환 반감기를 시험관내 검정을 사용하여 측정하였다. 이러한 검정은 간세포 내의 아데노바이러스 (Ad) 축적을 매개하는 FIX의 생체내 및 시험관내 능력을 기초로 한다. 간략하게, FIX가 Ad 피버 놉(fiber knob) 도메인에 결합할 수 있고 세포 표면 헤파린 술페이트 프로테오글리칸 (HSPG)을 통한 바이러스 흡수에 대한 다리를 제공할 수 있는 것으로 나타났다 (문헌 [Shayakhmetov, et al., J. Virol 79:7478-7491, 2005]). 피버 놉 도메인에 돌연변이를 함유하는 아데노바이러스 벡터 돌연변이체 Ad5mut는 FIX에 결합하지 않는다. Ad5mut는 상당히 감소된 간 세포 감염 능력 및 생체내 간 독성을 지니는데, 이는 FIX가 Ad 벡터를 간 세포로 표적화하는 것에서 주요 역할을 한다는 것을 입증한다 (문헌 [Shayakhmetov, et al., 2005]). Ad 벡터를 간 세포로 표적화하는 FIX의 능력을 단백질-HSPG 상호작용의 억제제에 의해 차단할 수 있다 (문헌 [Shayakhmetov, et al., 2005]).
또한, FIX의 HSPG-매개 흡수는 FIX 소거에 상당히 기여하고, 결과적으로, HSPG 상호작용을 방해하는 것은 FIX의 반감기를 증가시킬 것으로 예상된다. 따라서, 간세포에서의 FIX 및/또는 FIX 변이체의 시험관내 흡수를 측정하였고, 흡수가 감소된 변이체는 생체내 반감기가 증가된 것으로 예상되었다.
시험관 내에서 FIX 반감기를 측정하기 위해, 포유동물 세포를 FIX 또는 FIX 변이체의 존재 또는 부재하에 아데노바이러스와 함께 인큐베이션하였다. 바이러스 흡수가 야생형 FIX에 의해 매개되었고, 바이러스 게놈 내에 코딩된 리포터 유전자, 예를 들어 녹색 형광 단백질 (GFP)의 발현 또는 루시퍼라제 발현에 의해 측정되었다. FIX 변이체의 존재하에서의 아데노바이러스 흡수 감소가 야생형 FIX에 비교하여 감소된 리포터 유전자 발현, 예를 들어 감소된 GFP 형광 또는 감소된 루시퍼라제 효소 활성으로서 측정되었다.
당업자에게 주지된 표준 기술을 사용하여 생체 내에서 FIX 순환 반감기를 측정하였다. 간략하게, 각각의 용량의 FIX 또는 FIX 변이체를 정맥내 주사에 의해 대상체에게 투여하였다. 주사 후 다수의 시점에 혈액 샘플을 취하고, FIX 농도를 적절한 검정 (예를 들어, ELISA)에 의해 결정하였다. 반감기, 즉 FIX의 농도가 투약 직후의 FIX 농도의 절반인 시간을 결정하기 위해, 다양한 시점의 FIX 농도를 FIX 용량의 투여 직후 예상되거나 측정된 FIX 농도와 비교하였다. 시험관내 검정에서의 감소된 세포 흡수와 생체내 검정에서의 증가된 반감기 간의 상관관계가 예상된다.
실시예 9: 변형된 FIX의 글리코PEG화
대략 5 ㎎의 변형된 FIX 단백질을 반응 완충제 (25mM HEPES, pH 7.7, 50mM NaCl, 10mM CaCl2, 0.01％ 트윈-80)로 완충제-교환하여 접합 반응을 방해하는 수크로스 및 아미노산을 제거한 후에, 1-㎖ 샘플 루프 (이동상으로서의 반응 완충제)를 사용하여 1 ㎖/분의 유속으로 AKTA-FPLC 크로마토그래피 시스템 (GE)을 사용하는 하이트랩(HiTrap) 탈염 5 ㎖ 칼럼 (세파덱스(Sephadex) G25) 상에 로딩하였다. 단백질 분획을 수집하고, 스크류-캡 튜브에 모았다 (약 2 ㎖). 이 FIX 용액 (약 2.1 ㎎/㎖)에, 나트륨 메타-퍼아이오데이트 (시그마 #311448, Mw213.89, NaIO4) 원액 (400mM 수용액, 새로 제조)을 첨가하여 온화한 산화를 위한 2mM의 최종 [NaIO4]에 도달하고, 이로써 FIX의 탄수화물 잔기 상에 반응성 알데히드를 생성하였다. 혼합물을 회전기 상에서 어두운 상태로 60분 동안 4℃에서 인큐베이션하였다. 0.5mM 만큼 낮은 나트륨 메타-퍼아이오데이트 농도가 또한 효과적이었다.
이어서, 2M 글리세롤 수성 원액 (20mM 글리세롤의 최종 농도까지)으로 잔류 NaIO4를 켄칭하고 4℃에서 15분 동안 추가로 인큐베이션하여 산화 단계를 종결시켰다. 산화 반응 혼합물 (약 2 ㎖)을 상기 기재된 바와 같이 G25 칼럼 상에 다시 직접 로딩하여, 분리하지 않으면 이후의 PEG화 반응을 방해할 잉여량의 NaIO4, 글리세롤 및 글리세르알데히드로부터 산화된 재조합 FIX를 분리하였다.
반응 완충제 중 생성된 산화 FIX 용액 (약 0.95 ㎎/㎖, 4.5 ㎖ 중 4.3 ㎎)에, 80 ㎎ 히드라진-PEG30 (40x 몰 과량, NOF 카달로그# SUNBRIGHT ME-300HZ) 및 10mM 아닐린 (100％ EtOH 중 1M 원액)을 첨가하고, PEG화 반응을 4℃에서 회전 플랫폼 상에서 밤새 수행하였다. PEG화 반응을 위한 최적의 조건은 [FIX]에 대해 5 내지 40배 몰 과량으로 히드라진-PEG30이 첨가된 0.3 내지 0.9 ㎎/㎖ [FIX]인 것으로 나타났다. PEG화 시간은 디-PEG화 FIX에 대한 모노-PEG화 FIX의 비가 변경되도록 추가로 최적화될 수 있다.
SDS-PAGE, 쿠마시 블루, 아이오딘 염색, 웨스턴 블롯 분석 및 크기-배제 크로마토그래피에 의한 글리코PEG FIX의 광범위한 특성화는 글리코PEG화 FIX가 대략 70％ 모노-PEG화 FIX 및 30％ 디-PEG화 FIX를 함유한다는 것을 입증하였다. FIX에 대한 글리코PEG화 방법의 추가의 최적화는 0.6 ㎎/㎖의 인자 IX 농도에서 5배 몰 과량의 아미노옥시-PEG를 사용하여 나트륨 메타-퍼아이오데이트 농도를 0.5mM으로 감소시키고, PEG화 반응의 시간을 최적화시키고, 헤파린 칼럼에 이어 크기 배제 칼럼 상에서 정제하여 달성하였다. 최적화된 조건을 이용하여 98.7％ 균질한 PEG화 종을 달성할 수 있었다. 퍼아이오데이트에 의한 탄수화물 산화의 속도 및 정도는, 예를 들어 울프(Wolfe) 및 헤이지(Hage) (1995) [18]에 의해 항체에 대해 기재된 바와 같이, 퍼아이오데이트의 반응 시간, pH, 온도 및 농도에 의해 제어될 수 있다. 당단백질 상의 시알산 잔기는 1mM 퍼아이오데이트 및 0℃의 온도를 사용하여 나트륨 퍼아이오데이트 (NaIO4)로 특이적으로 산화될 수 있다고 보고되었다. FIX 글리코PEG화의 부위 특이성은 1mM 퍼아이오데이트 또는 훨씬 더 낮은 농도를 사용하여 최적화될 수 있다. 켄칭 단계의 최적화가 또한 달성될 수 있다. 마지막으로, PEG화 단계는 예를 들어 상이한 분자량, 예를 들어 5K, 10K, 15K, 20K, 30K, 40K, 60K 또는 150K 이하를 갖는 PEG를 사용하여 최적화될 수 있다. 대안적 중합체를 또한 도입부에서 상기 기재된 바와 같이 사용할 수 있다. 예를 들어 아미노옥시 PGE 또는 히드록시-PEG-아민을 포함하는 PEG 잔기 또는 다른 중합체에 부착된 대안적 반응성 기를 사용하는 대안적 링커 화학이 또한 도입부에서 상기 기재된 바와 같이 사용될 수 있다.
실시예 10: PEG-히드라지드를 사용한 FIX-R338A의 글리코PEG화
돌연변이 R338A (FIX-R338A)를 함유하는 인간 인자 IX를 발현하는 BHK21 세포주를 표준 방법을 사용하여 생성하고, 15L 스케일 관류 반응기에서 발효를 위해 스케일링하였다. 배지에 존재하는 분비된 FIX-R338A 단백질을 이온 교환 크로마토그래피에 의해 98％ 순도로 정제하였다. 생성된 단백질을 "방법" 부분에서 상기 기재된 바와 같이 40Kda PEG-히드라진을 사용하여 글리코PEG화시켰다. PEG화 FIX-R338A의 수율은 PEG화 반응 동안 촉매로서 아닐린을 함유시켜 약 10％ 내지 약 50％ 증가시킬 수 있다. 5 ㎎의 FIX-R338A에 대해 큰 스케일의 PEG화를 수행하고, 생성된 단백질을 aPTT 검정 (활성화제로 엘라직산 사용)에 의해 또는 시판되는 크로마제닉 검정 키트에서 응고 활성에 대해 시험관내 검정하였다. 두 검정은 상업적으로 생성된 재조합 야생형 FIX (rFIX)를 사용하여 표준 곡선을 생성하였다. 각각의 검정에서 출발 물질 (FIX-R338A) 및 rFIX의 대조군을 실행하였다. 표 5에 나타낸 데이터는 글리코PEG화 FIX-R338A가 출발 물질의 활성의 47％ 내지 60％를 갖지만 rFIX의 활성의 184％ 내지 189％를 갖는다는 것을 나타낸다.
활성화 펩티드에서 당 상의 PEG화를 FIX의 보다 높은 활성 변이체와 조합하여 재조합 야생형 FIX 단백질의 비활성보다 약 2배 더 높은 비활성을 갖는 PEG화 FIX를 생성할 수 있었다. rFIX에 대해 동일한 글리코PEG화 절차 및 정제를 수행하였을 때 생성된 글리코PEG화 rFIX는 크로마제닉 검정에 의해 122 IU/㎎의 비활성 (변형되지 않은 rFIX의 비활성의 59％)을 가졌다. 따라서, 글리코PEG화 재조합 야생형 FIX와 비교하여, 글리코PEG화 R338A는 3배 더 높은 비활성 (3배 더 적은 단백질로 동일한 치료 이익을 달성할 수 있음)을 가졌다.
글리코PEG화 FIX-R338A의 겔 분석은 단백질이 오직 하나의 부위 (모노-PEG화) 또는 2개의 부위 (디-PEG화)에 FIX-R338A PEG화의 혼합물을 함유한다는 것을 나타내었다. 단백질을 염색하는 쿠마시 염색된 겔은 2개의 주요 PEG화 밴드의 존재가 모노-PEG화 및 디-PEG화 FIX-R338A의 지표라는 것을 나타내었다. 모노-PEG화 형태가 우세한 형태인 것으로 나타났다.
실시예 11: 아미노-옥시-PEG를 사용하는 변형된 FIX의 글리코PEG화
정제된 인자 IX (FIX)를 우선 하이트랩 탈염 5 ㎖ 칼럼 (GE 헬쓰케어 (GE Healthcare))을 사용하여 AKTA-FPLC 크로마토그래피 시스템 (GE 헬쓰케어) 상에서 1 ㎖/분의 유속으로 반응 완충제 (25mM HEPES, pH 7.7, 50mM NaCl, 10mM CaCl2, 0.01％ w/v 트윈-80)로 완충제-교환하였다. 단백질 분획을 수집하고, 모았다. FIX를 400mM 수성 원액으로부터 새로 제조된 나트륨 메타-퍼아이오데이트 (NaIO4) (시그마)를 2mM의 최종 농도로 첨가하여 산화시켰다. FIX의 산화는 아미노-옥시-PEG 또는 히드라진-PEG에 의해 변형될 수 있는 FIX의 탄수화물 잔기 상의 반응성 알데히드를 생성하였다. 혼합물을 회전기 상에서 어두운 상태로 60분 동안 4℃에서 인큐베이션하였다. NaIO4를 2M 글리세롤을 20mM 글리세롤의 최종 농도로 첨가하여 켄칭하고, 15분 동안 4℃에서 추가로 인큐베이션하였다. 산화 반응 혼합물을 상기 기재된 바와 같이 다시 탈염 칼럼에 직접 로딩하여, 이후의 PEG화를 방해할 잉여량의 NaIO4, 글리세롤 및 글리세르알데히드로부터 산화된 FIX를 분리하였다. 생성된 산화된 FIX 용액 (FIX 농도 약 0.5 ㎎/㎖)에, 40배 몰 과량의 고체 메톡시-PEG-30-옥시아민 (NOF cat# SUNBRIGHT ME-300CA) 및 10mM 아닐린 (100％ EtOH 중 1M 원액)을 첨가하였다. PEG화 반응을 4℃에서 회전 플랫폼 상에서 밤새 수행하였다. PEG화 반응의 최적 조건은 PEG의 20 내지 40배 몰 과량을 갖는 0.3-0.9 ㎎/㎖ FIX인 것으로 나타났다. PEG화 시간은 디-PEG화 FIX에 대한 생성된 모노-PEG화 FIX의 비율이 변경되도록 추가로 최적화될 수 있다.
PEG화 반응 혼합물을 반응 완충제로 1:1 희석하고, AKTA 크로마토그래피 시스템을 사용하여 0.5 ㎖/분 유속으로 하이트랩TM 헤파린 HP 1-㎖ 칼럼 (GE)에 로딩하여 PEG화 FIX를 정제하였다. 유리 PEG는 헤파린 칼럼에 결합하지 않았다. PEG화 FIX를 비-PEG화 FIX로부터 구배 용리 (20분에 걸쳐 0-100％ 완충제 B)에 의해 분리하였다. 완충제 A는 반응 완충제이고, 완충제 B는 25mM HEPES, pH 7.7, 500mM NaCl, 20mM CaCl2, 0.01％ w/v 트윈-80이었다. PEG화 FIX를 우선 용리한 후에, 비-PEG화 FIX를 용리하였다. PEG화 FIX를 함유하는 분획을 모으고, 내독소를 제거하였다. 가능한 내독소를 1-㎖ 엔도트랩(Endotrap) 칼럼을 사용하여 제거하고, 발열원-비함유 H2O를 사용하여 프로포스(Profos)® AG 엔도트랩 HD 비드로 패킹하였다. 칼럼을 정제된 튜빙을 사용하여 AKTA 시스템에 부착시켰다. AKTA 기기, 모든 라인, 및 칼럼을 20％ 에탄올 중 1N NaOH로 1시간 동안 정제한 후에 0.1N 아세트산, 20％ 에탄올로 2시간 동안 정제하였다. 이어서, 칼럼을 Milli-Q 물로 광범위하게 세척하였다. 재생 완충제 (20mM Tris-HCl pH 7.5, 1M NaCl, 2mM EDTA)를 우선 칼럼에 적용한 후에, 칼럼을 50％ 완충제 B (25mM HEPES, pH 7.7, 500mM NaCl, 20mM CaCl2, 0.01％ 트윈-80)로 1 ㎖/분에서 평형화시켰다. 헤파린 칼럼으로부터 PEG화 FIX를 엔도트랩 칼럼에 0.5 ㎖/분으로 로딩하고, FIX를 함유하는 분획을 통한 흐름을 멸균, 발열원-비함유 용기에 수집하였다.
정제된 및 내독소-비함유 PEG화 FIX를 농축시키고, 한외여과 (10K MW 컷오프)에 의해 제제화 완충제 (0.234％ NaCl, 8mM 히스티딘, 0.8％ 수크로스, 208mM 글리신, 0.004％ 트윈-80)로 6배 완충제-교환시키고, 분취시키고, 급속 냉동 후에 -80℃에 보관하였다. 글리코PEG FIX의 단백질 농도를 A280 (13.3 (㎎/㎖)-1cm-1의 흡광 계수)을 측정하여 결정하였다. 비활성을 단백질 농도 및 FIX 발색 및 aPTT 검정 (엘라직산 활성화제)으로부터 계산하였다. FIXa 및 내독소로의 가능한 오염을 또한 FIXa 발색 및 내독소 검출 검정에 의해 평가하였다. 글리코PEG FIX의 추가의 생화학적 특성화를 또한 수행하였다 (쿠마시 블루 및 아이오딘 염색을 사용한 SDS-PAGE, 웨스턴 블롯 분석, 크기-배제 크로마토그래피). 이로부터 글리코PEG화 FIX (피크 1)가 60％ 모노PEG화 FIX 및 40％ 디PEG화 FIX를 함유한다는 것이 입증되었다. PEG화 효율은 50％에서, 전체 회수는 30％에서 추정되었다.
실시예 12: PEG-아미노-옥시를 사용하는 FIX-R338A의 글리코PEG화
돌연변이 R338A를 함유하는 인간 인자 IX (FIX-R338A)를 발현하는 BHK21 세포주를 표준 방법을 사용하여 생성하고, 15L 스케일 관류 반응기에서 발효를 위해 스케일링하였다. 배지에 존재하는 분비된 FIX-R338A 단백질을 이온 교환 크로마토그래피에 의해 98％ 순도로 정제하였다. 생성된 FIX-R338A 단백질을 상기 기재된 바와 같이 아미노 옥시-30Kda PEG를 사용하여 글리코PEG화시켰다. 5 ㎎의 FIX-R338A의 PEG화를 수행하고, 생성된 단백질을 aPTT 검정 (활성화제로 엘라직산 사용)에 의해 또는 시판되는 크로마제닉 검정 키트에서 응고 활성에 대해 시험관내 검정하였다. 두 검정은 상업적으로 생성된 재조합 야생형 FIX를 사용하여 표준 곡선을 생성하였다. 각각의 검정에서 출발 물질 (FIX-R338A) 및 rFIX의 대조군을 실행하였다. 표 6에 나타낸 데이터는 글리코PEG화 FIX-R338A가 출발 물질의 활성의 ％ 내지 ％를 갖지만, rFIX의 활성의 ％ 내지 ％를 갖는다는 것을 나타내었다.
실시예 13: 균질한 모노PEG화 FIX-R338A를 생성하도록 최적화된 조건하에 PEG-아미노-옥시를 사용하는 FIX-R338A의 글리코PEG화
돌연변이 R338A를 함유하는 인간 인자 IX (FIX-R338A)를 발현하는 BHK21 세포주를 표준 방법을 사용하여 생성하고, 15L 스케일 관류 반응기에서 발효를 위해 스케일링하였다. 배지에 존재하는 분비된 FIX-R338A 단백질을 이온 교환 크로마토그래피에 의해 98％ 순도로 정제하였다. 10 ㎎의 FIX-R338A 단백질을 우선 1 ㎖/분의 유속으로 AKTA-FPLC 크로마토그래피 시스템 (GE 헬쓰케어) 상에서 하이트랩 탈염 5 ㎖ 칼럼 (GE 헬쓰케어)을 사용하여 반응 완충제 (25mM HEPES, pH 7.7, 50mM NaCl, 10mM CaCl2, 0.01％ w/v 트윈-80)로 완충제-교환시켰다. 단백질 분획을 수집하고, 모았다. FIX를 400mM 수성 원액으로부터 새로 제조된 나트륨 메타-퍼아이오데이트 (NaIO4) (시그마)를 0.5mM의 최종 농도로 첨가하여 산화시켰다. FIX의 산화는 아미노-옥시-PEG에 의해 변형될 수 있는 FIX의 탄수화물 잔기 상에 반응성 알데히드를 생성한다. 혼합물을 회전기 상에서 어두운 상태로 60분 동안 4℃에서 인큐베이션하였다. NaIO4를 2M 글리세롤을 20mM 글리세롤의 최종 농도로 첨가하여 켄칭하고, 15분 동안 4℃에서 추가로 인큐베이션하였다. 산화 반응 혼합물을 상기 기재된 바와 같이 탈염 칼럼 상에 다시 직접 로딩하여, 이후의 PEG화를 방해할 잉여량의 NaIO4, 글리세롤 및 글리세르알데히드로부터 산화된 FIX를 분리하였다. 생성된 산화된 FIX 용액 (FIX 농도 약 0.6 ㎎/㎖)에, FIX 단백질에 대해 5배 몰 과량의 고체 메톡시-PEG-30-옥시아민 (NOF cat# SUNBRIGHT ME-300CA) 및 10mM 아닐린 (100％ EtOH 중 1M 원액)을 첨가하였다. PEG화 반응을 4℃에서 2시간 동안 회전 플랫폼 상에서 수행하였다. PEG화 반응 혼합물을 반응 완충제로 1:1 희석하고, 0.5 ㎖/분 유속으로 AKTA 크로마토그래피 시스템을 사용하여 하이트랩TM 헤파린 HP 1-㎖ 칼럼 (GE) 상에 로딩하여 PEG화 FIX를 정제하였다. 유리 PEG는 헤파린 칼럼에 결합하지 않았다. PEG화 FIX를 구배 용리 (20분에 걸쳐 0-100％ 완충제 B)에 의해 비-PEG화 FIX로부터 분리하였다. 완충제 A는 반응 완충제이고, 완충제 B는 25mM HEPES, pH 7.7, 500mM NaCl, 20mM CaCl2, 0.01％ w/v 트윈-80이었다. PEG화 FIX를 우선 용리한 후에 비-PEG화 FIX를 용리하였다. 대부분 모노-PEG화 FIX를 함유하는 분획을 모으고, 크기 배제 크로마토그래피 (SD200)를 수행하여 모노PEG화 FIX-R338A, 디PEG화 FIX-R338A 및 유리 FIX-R338A를 추가로 분리하였다. 95％ 균질한 모노PEG화 FIX를 함유하는 분획을 수집하고, 농축시키고, 제제화 완충제 (0.234％ NaCl, 8mM 히스티딘, 0.8％ 수크로스, 208mM 글리신, 0.004％ 트윈-80)로 다시 투석하고, 분취하고, 급속 냉동 후에 -80℃에 보관하였다. 글리코PEG FIX-R338A의 단백질 농도를 A280 (13.3 (㎎/㎖)-1cm-1의 흡광 계수)을 측정하여 결정하였다. 비활성을 단백질 농도 및 FIX 발색 및 aPTT 검정 (엘라직산 활성화제)으로부터 계산하였다. 두 검정은 상업적으로 생성된 재조합 야생형 FIX를 사용하여 표준 곡선을 생성하였다. 출발 물질 (FIX-R338A)의 대조군. 표 7에 나타낸 데이터는 글리코PEG화 FIX-R338A가 검정에 따라 출발 물질의 활성의 34％ 내지 80％를 갖는다는 것을 나타내었다.
실시예 14: 글리코PEG화 FIX-R338A의 약동학적 프로파일
글리코PEG화 FIX-R338A, FIX-R338A 또는 재조합 야생형 FIX (rFIX)를 정상 래트 또는 B형 혈우병 마우스에게 정맥내 주사에 의해 투여하였다. FIX 단백질의 순환 수준을 ELISA 기반 검정을 사용하여 시간이 경과함에 따라 측정하였다. 정상 래트에서, 글리코PEG화 FIX-R338A의 약동학적 프로파일이 FIX-R338A 및 rFIX 둘 모두와 비교하여 유의하게 개선되었다 (도 1).
B형 혈우병 마우스에서, 글리코PEG화 FIX-R338A의 약동학적 프로파일이 또한 FIX-R338A 및 rFIX 둘 모두와 비교하여 유의하게 개선되었다 (도 2).
이들 연구로부터 계산된 약동학적 파라미터 (표 8 및 9)는 글리코PEG화 FIX-R338A의 최종 반감기 (T1/2)가 래트에서 약 1.4배 및 마우스에서 1.5배 개선되었다는 것을 나타내었다. 전체 소거는 래트에서 3 내지 4배 및 마우스에서 6 내지 8배 감소하였다. 용량 정상화된 곡선 아래 면적 (AUCnorm) 및 평균 체류 시간 (MRT) 둘 모두가 또한 두 종에서 모두 증가하였다.
FIX 활성을 또한 도 3에 나타낸 바와 같이 rFIX, FIX-R338A 또는 글리코PEG화 FIX-R338A의 정맥내 주사 후에 상이한 시점에서 B형 혈우병 마우스로부터 혈장 샘플에서 결정하였다. 이들 데이터는 PEG화 FIX-R338A 분자에 대한 활성에 의해 유의하게 개선된 PK 프로파일을 입증하였다.
실시예 15: 인자 IX의 PEG화를 위한 촉매로서의 아닐린
FIX를 포함하는 단백질 상의 당에 대한 중합체 잔기, 예컨대 PEG의 접합을 위한 촉매로서의 아닐린을 평가하기 위해, 재조합 WT-FIX 단백질을 하나의 반응이 10mM 아닐린을 함유하는 한편 두번째 동일한 반응은 아닐린을 첨가하지 않고 수행한다는 것을 제외하고 실시예 11에 기재된 바와 같이 PEG화시켰다. PEG화 반응의 시간 진행을 SDS-PAGE 상에서의 분석에 의해 모니터링하였다 (도 4). 아닐린의 존재하에 PEG화의 효율은, 55Kda 유리 FIX 단백질의 보다 높은 분자량 형태로의 전환에 의해 증명된 바와 같이, 증가하였다. 겔의 정량화는 18시간 반응 후에 유리 FIX의 오직 18％만이 아닐린의 부재하에 PEG화된 한편 유리 FIX의 73％가 아닐린의 존재하에 PEG화되었다는 것을 나타내었으며, 이는 아닐린이 PEG 접합의 속도를 개선시켰다는 것을 입증하였다.
실시예 16: N157 또는 N167에서의 돌연변이에 의한 인자 IX의 당 상에서의 부위 특이적 중합체 접합
인자 IX는 N157 및 N167에 위치한 2개의 N-연결 글리코실화 부위를 함유하고, 포유동물 세포에서 단백질 발현 동안 이들 부위에 첨가되는 글리칸은 인자 IX의 전체 글리칸 상에 존재하는 대부분의 시알산 잔기를 함유한다. 실시예 9 내지 15에 기재된 바와 같은 중합체, 예컨대 PEG의 인자 IX의 시알산으로의 접합은 N157 및 N167에 부착된 글리칸 중 어느 하나 또는 둘 모두에서 일어날 수 있다. 제약적 견해에서 중합체가 2개의 N-연결 글리코실화 부위 중 어느 하나에만 부착된 중합체 접합된 인자 IX를 생성하는 것이 이러한 생성물이 보다 균질할 것이기 때문에 바람직할 것이다. R338A 돌연변이를 함유하는 인자 IX를 N157이 A157로 또는 N167이 A167로 변화되도록 돌연변이시켜, 각각의 N-연결 글리코실화 부위를 제거하였다. N157Q 및 N167Q는 아스파라긴 (N)과 글루타민 (Q) 잔기 사이의 구조적 유사성으로 인해 각각의 N-연결 글리코실화 부위를 제거하기 위한 대안적 돌연변이일 것으로 예상된다. BHK21 세포에서 R338A-N157A 및 R338A-N167A의 발현 및 ELISA에 의한 항원 수준 측정 및 세포 배양물 상청액에서의 aPTT 검정에 의한 활성 측정은 N167A 뮤테인이 모 FIX-R338A 단백질의 비활성과 유사한 비활성 (FIX 단백질 ㎎ 당 IU로 표현)을 갖는다는 것을 나타내었다 (표 10). 반면, N157A 뮤테인은 모 FIX-R338A 단백질보다 1.7배 더 높은 비활성을 나타내었다 (표 10). FIX-R338A 단백질과 비교하여 유사한 1.7배 더 높은 비활성이 정제된 FIX-R338A-N157A 단백질에서 측정되었다 (표 10). 따라서, N157에서 N-연결 글리코실화 부위를 제거하고 이에 따라 N167에서 우선적으로 중합체 접합을 가능하게 하기 위한 N157의 돌연변이, 예컨대 N157A 또는 N157Q가 균질한 중합체 접합된 인자 IX 단백질을 생성하는 목적을 위해 N167에서의 돌연변이 중에서 바람직하다.
상기 명세서에 언급된 모든 공개물 및 특허는 본원에 참고로 포함된다. 본 발명의 범주 및 취지를 벗어나지 않으면서 기재된 본 발명의 방법에 대한 다양한 변경 및 변화는 당업자에 자명할 것이다.
본 발명이 구체적 실시양태와 관련하여 기재되어 있더라도, 청구되는 본 발명이 이러한 구체적 실시양태로 과도하게 제한되지 않는 것으로 이해되어야 한다. 실제로, 생화학 분야 또는 관련 분야의 당업자에게는 명백한 것으로서, 본 발명을 수행하기 위해 실시되는 상기 기재된 방식에 관한 다양한 변형은 하기 특허청구범위의 범주 내에 포함되는 것으로 한다. 당업자는 단지 일상적인 실험을 이용하여, 본원에 기재된 본 발명의 구체적인 실시양태와의 많은 등가물을 인식하거나 확인할 수 있게 될 것이다. 이러한 등가물은 하기 청구범위에 포함되도록 의도된다.
SEQUENCE LISTING
<110> Bayer HealthCare LLC
Brooks, Alan
Patel, Chandra
Jiang, Xiaoqiao
Gritzan, Uwe
Apeler, Heiner
Wang, Jun
<120> MODIFIED FACTOR IX POLYPEPTIDES AND USES THEREOF
<130> BHC 10 5 004
<150> US 61/230,551
<151> 2009-07-31
<160> 57
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 415
<212> PRT
<213> Homo sapiens
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
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130 135 140
Arg Ala Glu Thr Val Phe Pro Asp Val Asp Tyr Val Asn Ser Thr Glu
145 150 155 160
Ala Glu Thr Ile Leu Asp Asn Ile Thr Gln Ser Thr Gln Ser Phe Asn
165 170 175
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210 215 220
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245 250 255
His Asn Tyr Asn Ala Ala Ile Asn Lys Tyr Asn His Asp Ile Ala Leu
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275 280 285
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Gly Tyr Val Ser Gly Trp Gly Arg Val Phe His Lys Gly Arg Ser Ala
305 310 315 320
Leu Val Leu Gln Tyr Leu Arg Val Pro Leu Val Asp Arg Ala Thr Cys
325 330 335
Leu Arg Ser Thr Lys Phe Thr Ile Tyr Asn Asn Met Phe Cys Ala Gly
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Phe His Glu Gly Gly Arg Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro
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His Val Thr Glu Val Glu Gly Thr Ser Phe Leu Thr Gly Ile Ile Ser
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<211> 415
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (85)..(85)
<223> X is selected from D, F, G, H, I, M, N, R, S, W, and Y
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (86)..(86)
<223> X is selected from A, D, E, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, and
V
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<221> MISC_FEATURE
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<223> X A, F, I, L, M, R, S, T, V, and W
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<223> X is selected from E, N, and Q
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245 250 255
His Asn Tyr Asn Ala Ala Ile Asn Lys Tyr Asn His Asp Ile Ala Leu
260 265 270
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275 280 285
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355 360 365
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ggaaagaact gtgaattaga tatgacctgt aacattaaga atggcag 47
<210> 30
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> V86M primer
<400> 30
ctgccattct taatgttaca ggtcatatct aattcacagt tctttcc 47
<210> 31
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> V86Y primer
<400> 31
ggaaagaact gtgaattaga ttacacctgt aacattaaga atggcag 47
<210> 32
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> V86Y primer
<400> 32
ctgccattct taatgttaca ggtgtaatct aattcacagt tctttcc 47
<210> 33
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> V86K primer
<400> 33
ggaaagaact gtgaattaga taagacatgt aacattaaga atggcag 47
<210> 34
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> V86K primer
<400> 34
ctgccattct taatgttaca tgtcttatct aattcacagt tctttcc 47
<210> 35
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> V86F primer
<400> 35
ggaaagaact gtgaattaga tttcacctgt aacattaaga atggcag 47
<210> 36
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> V86F primer
<400> 36
ctgccattct taatgttaca ggtgaaatct aattcacagt tctttcc 47
<210> 37
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> V86C primer
<400> 37
ggaaagaact gtgaattaga ttgcacctgt aacattaaga atggcag 47
<210> 38
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> V86C primer
<400> 38
ctgccattct taatgttaca ggtgcaatct aattcacagt tctttc 46
<210> 39
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> V86W primer
<400> 39
ggaaagaact gtgaattaga ttggacctgt aacattaaga atggcag 47
<210> 40
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> V86W primer
<400> 40
ctgccattct taatgttaca ggtccaatct aattcacagt tctttcc 47
<210> 41
<211> 55
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> V86G primer
<400> 41
gaaggaaaga actgtgaatt agatggcacc tgtaacatta agaatggcag atgcg 55
<210> 42
<211> 55
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> V86G primer
<400> 42
cgcatctgcc attcttaatg ttacaggtgc catctaattc acagttcttt ccttc 55
<210> 43
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> E410N primer
<400> 43
tcccggtatg tcaactggat taagaacaaa acaaagctca cttaatgaaa g 51
<210> 44
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> E410N primer
<400> 44
ctttcattaa gtgagctttg ttttgttctt aatccagttg acataccggg a 51
<210> 45
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> E410Q primer
<400> 45
tcccggtatg tcaactggat taagcagaaa acaaagctca cttaatgaaa g 51
<210> 46
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> E410Q primer
<400> 46
ctttcattaa gtgagctttg ttttctgctt aatccagttg acataccggg a 51
<210> 47
<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Primer
<400> 47
ctgtttttcc tgatgtggac tacgtagcct ctactgaagc tgaaaccatt ct 52
<210> 48
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Primer
<400> 48
gaagctgaaa ccattctaga tgccatcact caaagcaccc aatc 44
<210> 49
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Primer
<400> 49
cttgttgacc gagccacatg ccttgcatct acaaagttca ccatc 45
<210> 50
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Primer
<400> 50
cttgttgacc gagccacatg ccttctgtct acaaagttca ccatc 45
<210> 51
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Primer
<400> 51
gaccgagcca catgccttgt gtctacaaag ttcaccatc 39
<210> 52
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Primer
<400> 52
gttgaccgag ccacatgcct tatctctaca aagttcacca tctataac 48
<210> 53
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Primer
<400> 53
gttgaccgag ccacatgcct tttctctaca aagttcacca tctataac 48
<210> 54
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Primer
<400> 54
cttgttgacc gagccacatg cctttggtct acaaagttca ccatc 45
<210> 55
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Primer
<400> 55
cacttgttga ccgagccaca tgccttatgt ctacaaagtt caccatc 47
<210> 56
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Primer
<400> 56
cttgttgacc gagccacatg ccttagctct acaaagttca ccatc 45
<210> 57
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Primer
<400> 57
gttgaccgag ccacatgcct tacctctaca aagttcacca tc 42
Claims (26)
- 하나 이상의 아미노산 치환의 도입에 의해 변형된 아미노산 서열을 포함하는 인자 IX 폴리펩티드.
- 제1항에 있어서, 잔기 86에 아미노산 치환을 포함하는 폴리펩티드.
- 제1항에 있어서, 아미노산 잔기 85, 86 및 87로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 폴리펩티드.
- 제1항에 있어서, 아미노산 잔기 85, 86, 87, 338 및 410으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 폴리펩티드.
- 제4항에 있어서, 하나 이상의 아미노산 치환이 D85F; D85G; D85H; D85I; D85M; D85N; D85R; D85S; D85W; D85Y; V86A; V86D; V86E; V86G; V86H; V86I; V86L; V86M; V86N; V86P; V86Q; V86R; V86S; V86T; T87F; T87I; T87K; T87M; T87R; T87V; T87W; R338A; R338F; R338I; R338L; R338M; R338S; R338T; R338V; R338W; E410N; E410Q; D85W 및 T87R; D85F 및 T87I; D85W 및 T87W; D85R 및 T85R; D85I 및 T87R; D85Y 및 T87F; D85I 및 T87M; D85F 및 T87R; D85F 및 T87V; D85R 및 T87K; D85H 및 T87I; D85I 및 T87I; D85Y 및 T87K; D85S 및 T87R; D85Y 및 T87R; D85G 및 T87K; D85H 및 T87W; D85H 및 T87K; D85F 및 T87K; D85H 및 T87V; D85M 및 T87I; D85H 및 T87M; R338A 및 E410N; R338A 및 E410Q; D85W, V86A, 및 T87R; D85F, V86A, 및 T87I; D85W, V86A, 및 T87W; D85R, V86A, 및 T85R; D85I, V86A, 및 T87R; D85Y, V86A, 및 T87F; D85I, V86A, 및 T87M; D85F, V86A, 및 T87R; D85F, V86A, 및 T87V; D85R, V86A, 및 T87K; D85H, V86A, 및 T87I; D85I, V86A, 및 T87I; D85Y, V86A, 및 T87K; D85S, V86A, 및 T87R; D85Y, V86A, 및 T87R; D85G, V86A, 및 T87K; D85H, V86A, 및 T87W; D85H, V86A, 및 T87K; D85F, V86A, 및 T87K; D85H, V86A, 및 T87V; D85M, V86A, 및 T87I; D85H, V86A, 및 T87M; D85W, V86A, T87R, 및 R338A; D85F, V86A, T87I, 및 R338A; D85W, V86A, T87W, 및 R338A; D85R, V86A, T85R, 및 R338A; D85I, V86A, T87R, 및 R338A; D85Y, V86A, T87F, 및 R338A; D85I, V86A, T87M, 및 R338A; D85F, V86A, T87R, 및 R338A; D85F, V86A, T87V, 및 R338A; D85R, V86A, T87K, 및 R338A; D85H, V86A, T87I, 및 R338A; D85I, V86A, T87I, 및 R338A; D85Y, V86A, T87K, 및 R338A; D85S, V86A, T87R, 및 R338A; D85Y, V86A, T87R, 및 R338A; D85G, V86A, T87K, 및 R338A; D85H, V86A, T87W, 및 R338A; D85H, V86A, T87K, 및 R338A; D85F, V86A, T87K, 및 R338A; D85H, V86A, T87V, 및 R338A; D85M, V86A, T87I, 및 R338A; D85H, V86A, T87M, 및 R338A; D85W, V86A, T87R, R338A, 및 E410N; D85F, V86A, T87I, R338A, 및 E410N; D85W, V86A, T87W, R338A, 및 E410N; D85R, V86A, T85R, R338A, 및 E410N; D85I, V86A, T87R, R338A, 및 E410N; D85Y, V86A, T87F, R338A, 및 E410N; D85I, V86A, T87M, R338A, 및 E410N; D85F, V86A, T87R, R338A, 및 E410N; D85F, V86A, T87V, R338A, 및 E410N; D85R, V86A, T87K, R338A, 및 E410N; D85H, V86A, T87I, R338A, 및 E410N; D85I, V86A, T87I, R338A, 및 E410N; D85Y, V86A, T87K, R338A, 및 E410N; D85S, V86A, T87R, R338A, 및 E410N; D85Y, V86A, T87R, R338A, 및 E410N; D85G, V86A, T87K, R338A, 및 E410N; D85H, V86A, T87W, R338A, 및 E410N; D85H, V86A, T87K, R338A, 및 E410N; D85F, V86A, T87K, R338A, 및 E410N; D85H, V86A, T87V, R338A, 및 E410N; D85M, V86A, T87I, R338A, 및 E410N; D85H, V86A, T87M, R338A, 및 E410N; D85W, V86A, T87R, R338A, 및 E410Q; D85F, V86A, T87I, R338A, 및 E410Q; D85W, V86A, T87W, R338A, 및 E410Q; D85R, V86A, T85R, R338A, 및 E410Q; D85I, V86A, T87R, R338A, 및 E410Q; D85Y, V86A, T87F, R338A, 및 E410Q; D85I, V86A, T87M, R338A, 및 E410Q; D85F, V86A, T87R, R338A, 및 E410Q; D85F, V86A, T87V, R338A, 및 E410Q; D85R, V86A, T87K, R338A, 및 E410Q; D85H, V86A, T87I, R338A, 및 E410Q; D85I, V86A, T87I, R338A, 및 E410Q; D85Y, V86A, T87K, R338A, 및 E410Q; D85S, V86A, T87R, R338A, 및 E410Q; D85Y, V86A, T87R, R338A, 및 E410Q; D85G, V86A, T87K, R338A, 및 E410Q; D85H, V86A, T87W, R338A, 및 E410Q; D85H, V86A, T87K, R338A, 및 E410Q; D85F, V86A, T87K, R338A, 및 E410Q; D85H, V86A, T87V, R338A, 및 E410Q; D85M, V86A, T87I, R338A, 및 E410Q; D85H, V86A, T87M, R338A, 및 E410Q; 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택되는 것인 폴리펩티드.
- 아미노산 서열
을 포함하고, 여기서
X85는 D, F, G, H, I, M, N, R, S, W 및 Y로부터 선택되고;
X86은 A, D, E, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T 및 V로부터 선택되고;
X87은 F, I, K, M, R, T, V 및 W로부터 선택되고;
X338은 A, F, I, L, M, R, S, T, V 및 W로부터 선택되고;
X410은 E, N 및 Q로부터 선택되는 것인, 인자 IX 폴리펩티드. - 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 글리코실화 부위를 더 포함하는 폴리펩티드.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 인자 IX 폴리펩티드 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 제제.
- B형 혈우병의 치료를 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의 제8항의 제약 제제를 투여하는 것을 포함하는 B형 혈우병의 치료 방법.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열.
- 숙주 세포가 인자 IX 폴리펩티드를 발현하도록 하는 방식으로 제10항에 따른 DNA 서열로 형질감염된 진핵 숙주 세포.
- (i) 하나 이상의 아미노산 치환의 도입에 의해 폴리펩티드의 아미노산 서열을 변형시키는 것; (ii) 세포주에서 폴리펩티드를 발현시키는 것; 및 (iii) 폴리펩티드를 정제하는 것을 포함하는 인자 IX 폴리펩티드의 생성 방법.
- 제7항에 있어서, 상기 하나 이상의 글리코실화 부위에 부착된 하나 이상의 당 잔기를 더 포함하는 폴리펩티드.
- 제13항에 있어서, 하나 이상의 당 잔기가 시알산인 폴리펩티드.
[청구항 14]
a) 제13항 또는 제14항의 폴리펩티드, 및 b) 이에 공유 결합에 의해 부착된 하나 이상의 중합체 잔기를 포함하는 접합체. - 제14항에 있어서, 하나 이상의 중합체 잔기가 하나 이상의 당 잔기에 공유 결합에 의해 부착된 접합체.
- 제15항에 있어서, 하나 이상의 중합체 잔기가 폴리(알킬렌 글리콜), 폴리(프로필렌 글리콜) ("PPG"), 에틸렌 글리콜 및 프로필렌 글리콜 등의 공중합체, 폴리(옥시에틸화 폴리올), 폴리(올레핀계 알콜), 폴리(비닐피롤리돈), 폴리(히드록시알킬메타크릴아미드), 폴리(히드록시알킬메타크릴레이트), 폴리(사카라이드), 폴리(알파-히드록시산), 폴리(비닐 알콜), 폴리포스파젠, 폴리옥사졸린, 폴리(N-아크릴로일모르폴린), 폴리시알산, 히드록시에틸 전분 (HES), 폴리에틸렌 옥시드, 알킬-폴리에틸렌 옥시드, 비스폴리에틸렌 옥시드, 폴리알킬렌 옥시드의 공중합체 또는 블록 공중합체, 폴리(에틸렌 글리콜-코-프로필렌 글리콜), 폴리(N-2-(히드록시프로필)메타크릴아미드) 및 덱스트란으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 접합체.
- 제16항에 있어서, 하나 이상의 중합체 잔기가 폴리(알킬렌 글리콜)인 접합체.
- 제17항에 있어서, 폴리(알킬렌 글리콜)이 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)인 접합체.
- a) 하나 이상의 아미노산 치환의 도입에 의해 변형된 아미노산 서열을 포함하는 인자 IX 폴리펩티드 (여기서, 하나 이상의 아미노산 치환은 잔기 338에 있음);
b) 상기 하나 이상의 글리코실화 부위에 부착된 하나 이상의 당 잔기; 및
c) 하나 이상의 당 잔기에 공유 결합에 의해 부착된 하나 이상의 중합체 잔기
를 포함하는 접합체. - 제19항에 있어서, 잔기 338에서의 상기 치환이 R338A, R338F, R338I, R338L, R338M, R338S, R338T, R338V 및 R338W로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 접합체.
- 제19항 또는 제20항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 아미노산 잔기 157 및 167로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 치환을 더 포함하는 접합체.
- 제21항에 있어서, 잔기 157에서의 상기 치환이 N157A 및 N157Q로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 접합체.
- 제21항에 있어서, 잔기 167에서의 상기 치환이 N167A 및 N167Q로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 접합체.
- a) 하나 이상의 글리코실화 부위를 갖는 폴리펩티드를 제공하는 것 (여기서, 글리코실화 부위는 하나 이상의 시알산을 포함함); b) 상기 폴리펩티드의 상기 시알산을 산화시키는 것; c) 촉매를 제공하는 것; 및 d) 아미노-옥시 관능기를 포함하는 중합체 잔기를 상기 산화된 시알산에 공유 결합에 의해 부착시키는 것을 포함하며; 이에 의해 접합 속도가 증가되는 것인, 폴리펩티드에 대한 중합체 잔기의 접합을 개선시키는 방법.
- 제24항에 있어서, 상기 촉매가 아닐린 및 아닐린 유도체, 예컨대 o-Cl-, p-Cl-, o-CH3O-, p-CH3O- 및 p-CH3-아닐린으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
- 제24항에 있어서, 상기 접합 속도가 촉매 없이 비례하여 증가되는 것인 방법.
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