[go: up one dir, main page]

RS56783B1 - Sastavi pcsk9 irnk i postupci njihovih primena - Google Patents

Sastavi pcsk9 irnk i postupci njihovih primena

Info

Publication number
RS56783B1
RS56783B1 RS20180075A RSP20180075A RS56783B1 RS 56783 B1 RS56783 B1 RS 56783B1 RS 20180075 A RS20180075 A RS 20180075A RS P20180075 A RSP20180075 A RS P20180075A RS 56783 B1 RS56783 B1 RS 56783B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
rnai agent
nucleotides
nucleotide
seq
antisense strand
Prior art date
Application number
RS20180075A
Other languages
English (en)
Inventor
Anna Borodovsky
Rajeev G Kallanthottathil
Kevin Fitzgerald
Maria Frank-Kamenetsky
William Querbes
Martin Maier
Klaus Charisse
Satyanarayana Kuchimanchi
Muthiah Manoharan
Stuart Milstein
Original Assignee
Alnylam Pharmaceuticals Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=49841845&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS56783(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Alnylam Pharmaceuticals Inc filed Critical Alnylam Pharmaceuticals Inc
Publication of RS56783B1 publication Critical patent/RS56783B1/sr
Publication of RS56783B9 publication Critical patent/RS56783B9/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/549—Sugars, nucleosides, nucleotides or nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering nucleic acids [NA]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/312—Phosphonates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/321—2'-O-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/322—2'-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/343—Spatial arrangement of the modifications having patterns, e.g. ==--==--==--
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C12N2310/3515—Lipophilic moiety, e.g. cholesterol
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/353—Nature of the modification linked to the nucleic acid via an atom other than carbon
    • C12N2310/3533—Halogen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/35—Special therapeutic applications based on a specific dosage / administration regimen

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Description

[0001] Opis
[0002] Proprotein konvertaza subtilizin keksin 9 (PCSK9) je član porodice subtilizin serinske proteaze. Ostalih osam sisarskih subtilizinskih proteaza, PCSK1-PCSK8 (takođe nazvane PC1/3, PC2, furin, PC4, PC5/6, PACE4, PC7 i S1P/SKI-1) su proproteinske konvertaze koje obrađuju širok spektar proteina u sekretornom putu i uloge u različitim biološkim procesima (Bergeron, F. (2000) J. Mol. Endocrinol.24, 1-22, Gensberg, K., (1998) Semin. Cell Dev. Biol. 9, 11-17, Seidah, N. G. (1999) Brain Res.848, 45-62, Taylor, N. A., (2003) FASEB J.
[0003] 17, 1215-1227, and Zhou, A., (1999) J. Biol. Chem.274, 20745-20748).
[0005] PCSK9 je predložen da igra ulogu u metabolizmu holesterola. PCSK9 mRNK eksprimiranje je regulisano hranljivim holesterolom kod miševa (Maxwell, K. N., (2003) J. Lipid Res.44, 2109-2119), regulisana na gore statinima u HepG2 ćelijama (Dubuc, G., (2004) Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol.24, 1454-1459), i regulisana na gore u vezujućem proteinu sterolskog regulatornog elementa (SREBP) transgenih miševa (Horton, J. D., (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 12027-12032), slično biosintetičkim enzimima holesterola i lipoproteinskom receptoru male gustine (LDLR). Pored toga, pronađeno je da su PCSK9 misenzne mutacije povezane sa obliku autosomalne dominantne hiperholesterolemije (Hchola3) (Abifadel, M., i dr. (2003) Nat. Genet.34,154-156, Timms, K. M., (2004) Hum. Genet. 114, 349-353, Leren, T. P. (2004) Clin. Genet.65, 419-422). PCSK9 takođe može igrati ulogu u određivanju nivoa LDL holesterola u opštoj populaciji, jer su jedno-nukleotidni polimorfizmi (SNP) povezani sa nivoima holesterola kod japanske populacije (Shioji, K., (2004) J. Hum. Genet.49, 109-114).
[0007] [0003] Autosomalne dominantne hiperholesterolemije (ADH) su monogene bolesti kod kojih pacijenti pokazuju povišene ukupne nivoe LDL holesterola, ksandome tetiva i preuranjenu aterosklerozu (Rader, D. J., (2003) J. Clin. Invest.111, 1795-1803). Patogeneza ADH-a i recesivi oblik, autosomalna recesivna hiperholesterolemija (ARH) (Cohen, J. C., (2003) Curr. Opin. Lipidol.14, 121-127), usled nedostataka u uzimanju LDL-a od strane jetre. ADH mogu biti uzrokovane LDLR mutacijama, koje sprečavaju uzimanje LDL-a ili mutacije u proteinu na LDL, apolipoprotein B, koji se vezuje za LDLR. ARH su uzrokovane mutacijama u ARH proteinu koji je neophodan za endocitozu LDLR-LDL kompleksa zahvaljujući interakciji sa klatrinom. Prema tome, ako su mutacije PCSK9 uzročne u Hchola3 porodicama, čini se verovatno da PCSK9 igra ulogu u uzimanju LDL-a posredovanim receptorom.
[0009] Studije prekomernog eksprimiranja ukazuju na ulogu PCSK9 u kontrolisanju nivoa LDLR-a i, s toga, uzimanju LDL-a od strane jetre (Maxwell, K. N. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101, 7100-7105, Benjannet, S., i dr. (2004) J. Biol. Chem.279, 48865-48875, Park, S. W., (2004) J. Biol. Chem.279, 50630-50638). Adenovirusno posredovano prekomerno eksprimiranje mišjeg ili ljudskog PCSK9 tokom 3 ili 4 dana kod miševa dovodi do povećanja ukupnog nivoa LDL holesterola; ovaj efekat se ne vidi kod LDLR nokaut životinja (Maxwell, K. N. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101, 7100-7105, Benjannet, S., i dr. (2004) J. Biol. Chem. 279, 48865-48875, Park, S. W., (2004) J. Biol. Chem.279, 50630-50638). Pored toga, prekomerno eksprimiranje PCSK9 rezultira u značajnom smanjenju proteina LDLR hepatitisa, bez uticaja na nivoe LDLR mRNK, nivoe proteina SREBP ili odnosu nuklearnog proteina SREBP i citoplazme.
[0011] Iako je hiperholesterolemija asimptomatična, dugotrajna elevacija serumskog holesterola može dovesti do ateroskleroze. Tokom decenija, hronično povišeni serumski holesterol doprinosi stvaranju aterotermnih plaka u arterijama koje mogu dovesti do progresivne stenoze ili čak potpune okluzije uključenih arterija. Pored toga, manje ploče mogu puknuti i uzrokovati nastanak krvnih sudova i ometati protok krvi koji rezultira, na primer, infarktom miokarda i/ili moždanim udarom. Ako je formiranje stenoze ili okluzije postepeno, snabdevanje krvlju tkiva i organa polako se smanjuje sve dok se ne smanji funkcija organa.
[0013] Prema tome, u struci postoji potreba za efikasnim tretmanima za PCSK9-povezane bolesti, kao što je hiperlipidemija, npr., hiperholesterolemija.
[0015] Kao što je detaljnije opisano u daljem tekstu, ovde su obelodanjeni sastavi koji sadrže RNKi agense, npr., dvolančane iRNK agense, usmeravajući PCSK9. Takođe su opisani postupci koji koriste sastavi pronalaska za inhibiranje eksprimiranja PCSK9 i za lečenje patologija vezanih sa eksprimiranjem PCSK9, na primer, hiperholesterolemija.
[0016] Prema tome, u jednom aspektu, predmetni pronalazak pruža dvolančani RNKi agens sposoban da inhibira eksprimiranje Proprotein konvertaza subtilizin keksina 9 (PCSK9) u ćeliji, gde navedeni dvolančana RNKi agens obuhvata:
[0017] (a) sens lanac komplementaran antisens lancu, gde navedeni antisens lanac obuhvata regiju komplementarnu delu mRNK koji kodira PCSK9, gde je svaki lanac oko 17 do oko 30 nukleotida dugačak, gde navedeni antisens lanac obuhvata barem 17 nukleotida iz nukleobazne sekvence ACAAAAGCAAAACAGGUCUAG (SEQ ID NO: 412) i dvolančani RNKi agens je predstavljena formulom (III):
[0018] sens: 5' n<p>-N<a>-(XXX)<i>-N<b>-YYY-N<b>-(ZZZ)<i>-N<a>-n<q>3'
[0019] antisens: 3' n<p>'-N<a>'-(X'X'X')<k>-N<b>'-Y'Y'Y'-N<b>'-(Z'Z'Z')<i>-N<a>'-n<q>'5' (III) gde:
[0020] i, j, k, i l su svaki nezavisno 0 ili 1;
[0021] p, p', q, i q' su svaki nezavisno 0-6;
[0022] svaki N<a>i N<a>' nezavisno predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja sadrži 0-25 nukleotida koji su ili modifikovani ili nemodifikovani ili kombinacije toga, gde svaka sekvenca sadrži barem dva različito modifikovana nukleotida; svaki N<b>i N<b>' nezavisno predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja sadrži 0-10 nukleotida koji su ili modifikovani ili nemodifikovani ili kombinacije toga; svaki n<p>, n<p>', n<q>, i n<q>', gde svaki može ali ne mora biti prisutan, nezavisno predstavlja višak nukleotid; '
[0023] XXX, YYY, ZZZ, X'X'X', Y'Y'Y', i Z'Z'Z' svaki nezavisno predstavlja jedan motiv tri identične modifikacije na tri nukleotida za redom; modifikacije na N<b>razlikuju se od modifikacije na Y i modifikacije na N<b>' razlikuju se od modifikacije na Y';
[0024] gde su modifikacije na nukleotidima 2'-O-metil ili 2'-fluoro modifikacije; i gde je ligand jedan ili više GalNAc derivat vezan bivalentnim ili trovalentnim razgranatim veznikom; ili
[0025] (b) antisens lanac koji se sastoji od nukleotidne sekvence asCfsaAfAfAfgCfaAfaAfcAfgGfuCfuagsasa i sens lanac koji se sastoji od nukleotidne sekvence csusagacCfuGfudTuugcuuuugu,
[0026] gde a, g, c, i u su 2'-O-metil (2'-OMe) modifikovani A, G, C, i U nukleotidi, respektivno: Af, Gf, Cf i Uf su 2'fluoro A, G, C i U modified nukleotidi, respektivno; dT je dezoksi-timin nukleotid i s je fosforotioat veza;
[0027] i gde je sens lanac konjugovan za barem jedan ligand.
[0028] U jednoj implementaciji, i je 0; j je 0; i je 1; j je 1; oba od i i j su 0; ili oba od i i j su 1. U drugoj implementaciji, k je 0; 1 je 0; k je 1; l je 1; oba od k i 1 su 0; ili oba od k i l su 1.
[0030] U jednoj implementaciji, XXX je komplementaran X'X'X', YYY je komplementaran Y'Y'Y', i ZZZ je komplementaran Z'Z'Z'.
[0032] U jednoj implementaciji, YYY motiv se dešava na ili blizu mesta cepanja sens lanca.
[0034] U jednoj implementaciji, Y'Y'Y' motiv se dešava na 11, 12 i 13 položajima antisens lanca od 5'-kraja.
[0036] U jednoj implementaciji, Y' je 2'-O-metil.
[0038] U jednoj implementaciji, formula (III) je predstavljena formulom (IIIa):
[0039] sens: 5' n<p>-N<a>-YYY-N<a>-n<q>3'
[0040] antisens: 3' n<p'>-N<a'>-Y'Y'Y'-N<a'>n<q'>5' (IIIa)
[0042] U drugoj implementaciji, formula (III) je predstavljena formulom (IIIb):
[0043] sens: 5' n<p>-N<a>-YYY-N<b>-ZZZ-N<a>-n<q>3'
[0044] antisens: 3' n<p'>-N<a'>-Y'Y'Y'-N<b'>-Z'Z'Z'-N<a'>-n<q'>5' (IIIb)
[0045] gde svaki N<b>i N<b>' nezavisno predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja sadrži 1-5 modifikovanih nukleotida.
[0047] U još jednoj implementaciji, formula (III) je predstavljena formulom (IIIc): sens: 5' n<p>-N<a>-XXX-N<b>-YYY-N<a>-n<q>3'
[0048] antisens: 3' n<p'>-N<a'>-X'X'X'-N<b'>-Y'Y'Y'-N<a'>-n<q'>5' (IIIc)
[0049] gde svaki N<b>i N<b>' nezavisno predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja sadrži 1-5 modifikovanih nukleotida.
[0051] U jednoj implementaciji, formula (III) je predstavljena formulom (IIId):
[0052] sens: 5' n<p>-N<a>-XXX-N<b>-YYY-N<b>-ZZZ-N<a>-n<q>3'
[0053] antisens: 3' n<p'>-N<a'>-X'X'X'-N<b'>-Y'Y'Y'-N<b'>-Z'Z'Z'-N<a'>-n<q'>5'
[0054] (IIId)
[0055] gde svaki N<b>i N<b>' nezavisno predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja sadrži 1-5 modifikovanih nukleotida i svaki N<a>i N<a>' nezavisno predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja sadrži 2-10 modifikovanih nukleotida.
[0057] U jednoj implementaciji, dvolančana regija je 15-30 nukleotidnih parova dugačka. U drugom otelotvorenju, dvolančana regija je 17-23 nukleotidnih parova dugačka. U još jednom otelotvorenju, dvolančana regija je 17-25 nukleotidnih parova dugačka. U jednom otelotvorenju, dvolančana regija je 23-27 nukleotidnih parova dugačka. U drugom otelotvorenju, dvolančana regija je 19-21 nukleotidnih parova dugačka. U drugom otelotvorenju, dvolančana regija je 21-23 nukleotidnih parova dugačka. U jednoj implementaciji, svaki lanac ima 15-30 nukleotida.
[0059] U jednoj implementaciji, modifikacije na nukleotidima izabrane su iz grupe koju čine LNA, HNA, CeNA, 2'-metoksietil, 2'-O-alkil, 2'-O-allil, 2'-C-allil, 2'-fluoro, 2'-dezoksi, 2'-hidroksil, i njihove kombinacije. U drugom otelotvorenju, modifikacije na nukleotidima su 2'-O-metil ili 2'-fluoro modifikacije.
[0061] U jednom otelotvorenju, ligand je jedan ili više GalNAc derivat vezan bivalentnim ili trovalentnim razgranatim veznikom. U drugom otelotvorenju, ligand je
[0063]
[0066] U jednom otelotvorenju, ligand je vezan za 3' kraj sens lanca.
[0068] U jednom otelotvorenju, RNKi agens je konjugovan za ligand kako je prikazano u narednoj šemi
[0069]
[0071] gde X je O ili S. U specifičnoj implementaciji, X je O.
[0073] U jednoj implementaciji, agens dalje obuhvata barem jednu fosforotioat ili metilfosfonat internukleotidnu vezu.
[0075] U jednoj implementaciji, fosforotioat ili metilfosfonat internukleotidna veza je na 3'-terminusu jednog lanca. U jednoj implementaciji, lanac je antisens lanac. U drugoj implementaciji, lanac je sens lanac.
[0077] U jednoj implementaciji, fosforotioat ili metilfosfonat internukleotidna veza je na 5'-terminusu jednog lanca. U jednoj implementaciji, lanac je antisens lanac. U drugom otelotvorenju, lanac je sens lanac.
[0079] U jednoj implementaciji, fosforotioat ili metilfosfonat internukleotidna veza je na oba 5'- i 3'-terminusa jednog lanca. U jednom otelotvorenju, lanac je antisens lanac.
[0081] U jednoj implementaciji, bazni par na 1 položaju 5'-kraja antisens lanca dupleksa je AU bazni par.
[0083] U jednoj implementaciji, Y nukleotidi sadrže 2'-fluoro modifikaciju.
[0085] U jednoj implementaciji, Y' nukleotidi sadrže 2'-O-metil modifikaciju.
[0087] U jednoj implementaciji, p'>0. U drugom otelotvorenju, p'=2.
[0088] U jednoj implementaciji, q'=0, p=0, q=0, i p' nukleotid koji vise su komplementarni ciljanoj mRNK. U drugoj implementaciji, q'=0, p=0, q=0, i p' višak nukleotid su nekomplementarni target mRNK.
[0090] U jednoj implementaciji, sens lanac ima ukupno 21 nukleotida i antisens lanac ima ukupno 23 nukleotida.
[0092] U jednoj implementaciji, barem jedan n<p>' je vezan za susedni nukleotid putem fosforotioatne veze.
[0094] U jednoj implementaciji, svi n<p>' su vezani za susedne nukleotide putem fosforotioatnih veza.
[0096] U jednoj implementaciji, RNKi agens je izabran iz grupe koju čine RNKi agensi navedeni u Tabeli 1, Tabeli 2, Tabeli 9, Tabeli 10, Tabeli 12, i Slici 12.
[0098] U jednoj implementaciji, RNKi agens je izabran iz grupe koju čine AD-53815, AD-56663, AD-56658, AD-56676, AD-56666, AD-57928, i AD-60212.
[0100] U drugom aspektu, predmetna objava pruža RNKi agense, npr., dvolančane RNKi agense, sposobne da inhibiraju eksprimiranje Proprotein konvertaza subtilizin keksina 9 (PCSK9) u ćeliji, gde dvolančani RNKi agens obuhvata sens lanac komplementaran antisens lancu, gde antisens lanac obuhvata regiju komplementarnu delu mRNK koji kodira PCSK9, gde je svaki lanac oko 14 do oko 30 nukleotida dugačak, gde je dvolančani RNKi agens predstavljena formulom (III):
[0101] sens: 5' n<p>-N<a>-(XXX)<i>-N<b>-YYY-N<b>-(ZZZ)<i>-N<a>-n<q>3'
[0102] antisens: 3' n<p>'-N<a>'-(X'X'X')<k>-N<b>'-Y'Y'Y'-N<b>'-(Z'Z'Z')<i>-N<a>'-n<q>'5' (III)
[0103] gde:
[0104] i, j, k, i l su svaki nezavisno 0 ili 1;
[0105] p, p', q, i q' su svaki nezavisno 0-6;
[0106] svaki N<a>i N<a>' nezavisno predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja sadrži 0-25 nukleotida koji su ili modifikovani ili nemodifikovani ili kombinacije toga, gde svaka sekvenca sadrži barem dva različito modifikovana nukleotida;
[0107] svaki N<b>i N<b>' nezavisno predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja sadrži 0-10 nukleotida koji su ili modifikovani ili nemodifikovani ili kombinacije toga; svaki np, n<p>', n<q>, i n<q>', gde svaki može ali ne mora biti prisutan nezavisno predstavlja višak nukleotid;
[0108] XXX, YYY, ZZZ, X'X'X', Y'Y'Y', i Z'Z'Z' svaki nezavisno predstavlja jedan motiv tri identične modifikacije na tri nukleotida za redom, i gde modifikacije su 2'-O-metil ili 2'-fluoro modifikacije;
[0109] modifikacije na N<b>razlikuju se od modifikacije na Y i modifikacije na N<b>' razlikuju se od modifikacije na Y'; i
[0110] gde je sens lanac konjugovan za barem jedan ligand.
[0112] U još jednom aspektu, predmetna objava pruža RNKi agense, npr., dvolančane RNKi agense, sposobne da inhibiraju eksprimiranje Proprotein konvertaza subtilizin keksina 9 (PCSK9) u ćeliji, gde dvolančani RNKi agens obuhvata sens lanac komplementaran antisens lancu, gde antisens lanac obuhvata regiju komplementarnu delu mRNK koji kodira PCSK9, gde je svaki lanac oko 14 do oko 30 nukleotida dugačak, gde dvolančani RNKi agens je predstavljena formulom (III):
[0113] sens: 5' n<p>-N<a>-(XXX)<i>-N<b>-YYY-N<b>-(ZZZ)<i>-N<a>-n<q>3'
[0114] antisens: 3' n<p>'-N<a>'-(X'X'X')<k>-N<b>'-Y'Y'Y'-N<b>'-(Z'Z'Z')<i>-N<a>'-n<q>'5' (III)
[0115] gde:
[0116] i, j, k, i l su svaki nezavisno 0 ili 1;
[0117] svaki n<p>, n<q>, i n<q>', gde svaki može ali ne mora biti prisutan, nezavisno predstavlja višak nukleotid;
[0118] p, q, i q' su svaki nezavisno 0-6;
[0119] n<p>' >0 i barem jedan n<p>' je vezan za susedni nukleotid putem fosforotioat veza; svaki N<a>i N<a>' nezavisno predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja sadrži 0-25 nukleotida koji su ili modifikovani ili nemodifikovani ili kombinacije toga, gde svaka sekvenca sadrži barem dva različito modifikovana nukleotida;
[0120] svaki N<b>i N<b>' nezavisno predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja sadrži 0-10 nukleotida koji su ili modifikovani ili nemodifikovani ili kombinacije toga;
[0121] XXX, YYY, ZZZ, X'X'X', Y'Y'Y', i Z'Z'Z' svaki nezavisno predstavlja jedan motiv tri identične modifikacije na tri nukleotida za redom, i gde modifikacije su 2'-O-metil ili 2'-fluoro modifikacije;
[0122] modifikacije na N<b>razlikuju se od modifikacije na Y i modifikacije na N<b>' razlikuju se od modifikacije na Y'; i
[0123] gde je sens lanac konjugovan za barem jedan ligand.
[0125] U daljem aspektu, predmetna objava pruža RNKi agense, npr., dvolančane RNKi agense, sposobne da inhibiraju eksprimiranje Proprotein konvertaza subtilizin keksina 9 (PCSK9) u ćeliji, gde dvolančani RNKi agens obuhvata sens lanac komplementaran antisens lancu, gde antisens lanac obuhvata regiju komplementarnu delu mRNK koji kodira PCSK9, gde je svaki lanac oko 14 do oko 30 nukleotida dugačak, gde dvolančani RNKi agens je predstavljena formulom (III):
[0126] sens: 5' n<p>-N<a>-(XXX)<i>-N<b>-YYY-N<b>-(ZZZ)<i>-N<a>-n<q>3'
[0127] antisens: 3' n<p>'-N<a>'-(X'X'X')<k>-N<b>'-Y'Y'Y'-N<b>'-(Z'Z'Z')<i>-N<a>'-n<q>'5' (III)
[0128] gde:
[0129] i, j, k, i l su svaki nezavisno 0 ili 1;
[0130] svaki n<p>, n<q>, i n<q>', gde svaki može ali ne mora biti prisutan, nezavisno predstavlja višak nukleotid;
[0131] p, q, i q' su svaki nezavisno 0-6;
[0132] n<p>' >0 i barem jedan n<p>' je vezan za susedni nukleotid putem fosforotioat veza; svaki N<a>i N<a>' nezavisno predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja sadrži 0-25 nukleotida koji su ili modifikovani ili nemodifikovani ili kombinacije toga, gde svaka sekvenca sadrži barem dva različito modifikovana nukleotida;
[0133] svaki N<b>i N<b>' nezavisno predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja sadrži 0-10 nukleotida koji su ili modifikovani ili nemodifikovani ili kombinacije toga;
[0134] XXX, YYY, ZZZ, X'X'X', Y'Y'Y', i Z'Z'Z' svaki nezavisno predstavlja jedan motiv tri identične modifikacije na tri nukleotida za redom, i gde modifikacije su 2'-O-metil ili 2'-fluoro modifikacije;
[0135] modifikacije na N<b>razlikuju se od modifikacije na Y i modifikacije na N<b>' razlikuju se od modifikacije na Y'; i
[0136] gde je sens lanac konjugovan za barem jedan ligand, gde ligand je jedan ili više GalNAc derivat vezan bivalentnim ili trovalentnim razgranatim veznikom.
[0138] [0040] U drugom aspektu, predmetna objava pruža RNKi agense, npr., dvolančane RNKi agense, sposobne da inhibiraju eksprimiranje Proprotein konvertaza subtilizin keksina 9 (PCSK9) u ćeliji, gde dvolančani RNKi agens obuhvata sens lanac komplementaran antisens lancu, gde antisens lanac obuhvata regiju komplementarnu delu mRNK koji kodira PCSK9, gde je svaki lanac oko 14 do oko 30 nukleotida dugačak, gde dvolančani RNKi agens je predstavljena formulom (III):
[0139] sens: 5' n<p>-N<a>-(XXX)<i>-N<b>-YYY-N<b>-(ZZZ)<i>-N<a>-n<q>3'
[0140] antisens: 3' n<p>'-N<a>'-(X'X'X')<k>-N<b>'-Y'Y'Y'-N<b>'-(Z'Z'Z')<i>-N<a>'-n<q>'5' (III)
[0141] gde:
[0142] i, j, k, i l su svaki nezavisno 0 ili 1;
[0143] svaki n<p>, n<q>, i n<q>', gde svaki može ali ne mora biti prisutan, nezavisno predstavlja višak nukleotid;
[0144] p, q, i q' su svaki nezavisno 0-6;
[0145] n<p>' >0 i barem jedan n<p>' je vezan za susedni nukleotid putem fosforotioat veza; svaki N<a>i N<a>' nezavisno predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja sadrži 0-25 nukleotida koji su ili modifikovani ili nemodifikovani ili kombinacije toga, gde svaka sekvenca sadrži barem dva različito modifikovana nukleotida;
[0146] svaki N<b>i N<b>' nezavisno predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja sadrži 0-10 nukleotida koji su ili modifikovani ili nemodifikovani ili kombinacije toga;
[0147] XXX, YYY, ZZZ, X'X'X', Y'Y'Y', i Z'Z'Z' svaki nezavisno predstavlja jedan motiv tri identične modifikacije na tri nukleotida za redom, i gde modifikacije su 2'-O-metil ili 2'-fluoro modifikacije;
[0148] modifikacije na N<b>razlikuju se od modifikacije na Y i modifikacije na N<b>' razlikuju se od modifikacije na Y';
[0149] gde sens lanac obuhvata barem jednu fosforotioat vezu; i
[0150] gde je sens lanac konjugovan za barem jedan ligand, gde ligand je jedan ili više GalNAc derivat vezan bivalentnim ili trovalentnim razgranatim veznikom.
[0151] U još jednom aspektu, predmetna objava pruža RNKi agense, npr., dvolančane RNKi agense, sposobne da inhibiraju eksprimiranje Proprotein konvertaza subtilizin keksina 9 (PCSK9) u ćeliji, gde dvolančani RNKi agens obuhvata sens lanac komplementaran antisens lancu, gde antisens lanac obuhvata regiju komplementarnu delu mRNK koji kodira PCSK9, gde je svaki lanac oko 14 do oko 30 nukleotida dugačak, gde dvolančani RNKi agens je predstavljena formulom (III):
[0152] sens: 5' n<p>-N<a>-YYY-N<a>-n<q>3'
[0153] antisens: 3' n<p'>-N<a'>-Y'Y'Y'-N<a'>n<q'>5' (IIIa)
[0154] gde:
[0155] svaki n<p>, n<q>, i n<q>', svaki svaki od kojih može ali ne mora biti prisutan, nezavisno predstavlja višak nukleotid;
[0156] p, q, i q' su svaki nezavisno 0-6;
[0157] n<p>' >0 i barem jedan n<p>' je vezan za susedni nukleotid putem fosforotioat veza; svaki N<a>i N<a>' nezavisno predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja sadrži 0-25 nukleotida koji su ili modifikovani ili nemodifikovani ili kombinacije toga, gde svaka sekvenca sadrži barem dva različito modifikovana nukleotida;
[0158] YYY i Y'Y'Y' svaki nezavisno predstavlja jedan motiv tri identične modifikacije na tri nukleotida za redom, i gde modifikacije su 2'-O-metil ili 2'-fluoro modifikacije; gde sens lanac obuhvata barem jednu fosforotioat vezu; i
[0159] gde je sens lanac konjugovan za barem jedan ligand, gde ligand je jedan ili više GalNAc derivat vezan bivalentnim ili trovalentnim razgranatim veznikom.
[0161] Predmetni pronalazak takođe pruža in vitro ćelije i farmaceutske sastave koji sadrže dvolančane RNKi agense pronalaska.
[0163] Takođe je opisan RNKi agens izabran iz grupe koju čine RNKi agensi navedeni u Tabeli 1, Tabeli 2, Tabeli 9, Tabeli 10, Tabeli 12, i Slici 12..
[0165] U nekim implementacijama, RNKi agens se primenjuje koristeći farmaceutski sastav.
[0167] U poželjnim implementacijama, RNKi agens se primenjuje u rastvoru. U nekim takvim implementacijama, siRNK se primenjuje u nepuferisanom rastvoru. U jednoj implementaciji, siRNK se primenjuje u vodi. U drugim implementacijama, siRNK se primenjuje sa puferisanim rastvorom, kao što su acetatni pufer, citratni pufer, prolaminski pufer, karbonatni pufer, ili fosfatni pufer ili bilo koje njihove kombinacije. U nekim implementacijama, puferisani rastvor je fosfatni puferisan fiziološki rastvor (PBS).
[0169] U jednoj implementaciji, farmaceutski sastavi dalje obuhvataju lipidnu formulaciju. U jednoj implementaciji, lipidna formulacija obuhvata LNP, ili XTC. U drugom otelotvorenju, lipidna formulacija obuhvata MC3.
[0171] [0047] U jednom aspektu, predmetni pronalazak pruža postupak inhibicije PCSK9 eksprimiranja u ćeliji, postupak uključuje dovođenje u dodir ćelije sa RNKi agensom, npr., dvolančanim RNKi agensom pronalaska; i održavanje ćelije proizvedene u koraku (a) tokom vremena dovoljnog da se dobije degradacija mRNK transkripta PCSK9 gena, što inhibira eksprimiranje PCSK9 gena u ćeliji, gde su postupci za tretman ljudskog ili životinjskog tela terapijom isključeni.
[0173] U jednoj implementaciji, PCSK9 eksprimiranje je inhibirano za barem oko 30% 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ili 95%.
[0175] U drugom aspektu, predmetna objava pruža postupke tretmana pacijenta koji ima poremećaj posredovan PCSK9 eksprimiranjem. Postupci uključuju primenu kod pacijenta terapeutski efektivne količine RNKi agensa, npr., dvolančanog RNKi agensa, ili vektora pronalaska, time tretirajući pacijenta.
[0177] U jednoj implementaciji, pacijent je čovek.
[0179] U jednoj implementaciji, čovek ima hiperholesterolemiju.
[0181] U jednoj implementaciji, RNKi agens, npr., dvolančani RNKi agens, se primenjuje pri dozi od oko 0,01 mg/kg do oko 10 mg/kg, oko 0,5 mg/kg do oko 50 mg/kg, oko 10 mg/kg do oko 30 mg/kg, oko 10 mg/kg do oko 20 mg/kg, oko 15 mg/kg do oko 20 mg/kg, oko 15 mg/kg do oko 25 mg/kg, oko 15 mg/kg do oko 30 mg/kg, ili oko 20 mg/kg do oko 30 mg/kg.
[0183] U jednoj implementaciji, RNKi agens, npr., dvolančani RNKi agens, se primenjuje potkožno ili intravenozno.
[0185] U jednoj implementaciji, RNKi agens se primenjuje u režimu doziranja koji uključuje fazu stavljanja praćenu fazom održavanja, gde faza stavljanja obuhvata primenu doze od 2 mg/kg, 1 mg/kg ili 0,5 mg/kg pet puta nedeljno, i gde faza održavanja obuhvata primenu doze od 2 mg/kg, 1 mg/kg ili 0,5 mg/kg jednom, dvaput, ili tri puta nedeljno, jednom svake dve nedelje, jednom svake tri nedelje, jednom mesečno, jednom svakih dva meseca, jednom svakih tri meseca, jednom svakih četiri meseca, jednom svakih pet meseci, ili jednom svakih šest meseci.
[0186] U jednoj implementaciji, RNKi agens se primenjuje u dve ili više doze. U specifičnom otelotvorenju, RNKi agens se primenjuje na intervalima izabranim su iz grupe koju čine jednom svakih oko 12 sati, jednom svakih oko 24 sata, jednom svakih oko 48 sati, jednom svakih oko 72 sati, i jednom svakih oko 96 sati.
[0188] U još jednom aspektu, predmetna objava pruža postupke tretmana hiperholesterolemija kod pacijenta. Postupci uključuju primenu kod pacijenta terapeutski efektivne količine RNKi agensa, npr., dvolančanog RNKi agensa, ili vektora pronalaska, time tretirajući pacijenta.
[0190] U jednoj implementaciji, pacijent je primat ili glodar. U drugoj implementaciji, pacijent je čovek.
[0192] U jednoj implementaciji, RNKi agens, npr., dvolančani RNKi agens, se primenjuje pri dozi od oko 0,01 mg/kg do oko 10 mg/kg ili oko 0,5 mg/kg do oko 50 mg/kg. U drugom otelotvorenju, dvolančani RNKi agens se primenjuje pri dozi od oko 10 mg/kg do oko 30 mg/kg.
[0194] U jednoj implementaciji, RNKi agens, npr., dvolančani RNKi agens, se primenjuje potkožno ili intravenozno.
[0196] U jednoj implementaciji, RNKi agens se primenjuje u režimu doziranja koji uključuje fazu stavljanja praćenu fazom održavanja, gde faza stavljanja obuhvata primenu doze od 2 mg/kg, 1 mg/kg ili 0,5 mg/kg pet puta nedeljno, i gde faza održavanja obuhvata primenu doze od 2 mg/kg, 1 mg/kg ili 0,5 mg/kg jednom, dvaput, ili tri puta nedeljno, jednom svake dve nedelje, jednom svake tri nedelje, jednom mesečno, jednom svakih dva meseca, jednom svakih tri meseca, jednom svakih četiri meseca, jednom svakih pet meseci, ili jednom svakih šest meseci.
[0198] U jednoj implementaciji, RNKi agens se primenjuje u dve ili više doze. U specifičnom otelotvorenju, RNKi agens se primenjuje na intervalima izabranim iz grupe koju čine jednom svakih oko 12 sati, jednom svakih oko 24 sata, jednom svakih oko 48 sati, jednom svakih oko 72 sati, i jednom svakih oko 96 sati.
[0199] U jednoj implementaciji, postupak dalje obuhvata određivanje LDLR genotipa ili fenotipa pacijenta.
[0201] U jednoj implementaciji, primena rezultuje u smanjenju holesterola u serumu kod pacijenta.
[0203] U jednoj implementaciji, postupak dalje obuhvata određivanje nivoa holesterola u serumu kod pacijenta.
[0205] Ovaj pronalazak se dalje ilustruje sledećim detaljnim opisom i crtežima.
[0206] Slika 1 je grafikon koji pokazuje da postoji efekat odgovora na dozu sa AD-48400 konjugovanom na GalNAc pri sve tri testirane doze. AD-48399, konjugovan na GalNAc, služi kao kontrola.
[0207] Slike 2A i 2B su grafikoni koji pokazuju efikasnost in vivo i trajanje odgovora za naznačene siRNK.
[0208] Slika 3 je tabela koja pokazuje sekvence sens (SEQ ID NOS 1633-1642, respektivno po redosledu pojavljivanja) i antisens (SEQ ID NOS 1643-1652, respektivno po redosledu pojavljivanja) lanaca dupleksa analiziranih za in vivo efikasnost i optimizaciju.
[0209] Slika 4 je grafikon koji pokazuje rezultate testova efikasnosti in vivo za optimizaciju. Slika 5 je grafikon koji pokazuje rezultate in vivo testova odgovora na dozu izvedenih na PCSK9 transgenim miševima. Sedamdeset dva sata nakon jedne doze od 10 mg/kg, 3 mg/kg, 1 mg/kg i 0,3 mg/kg AD-57928, nivoi proteina PCSK9 su određeni pomoću ELISA.
[0210] Slika 6 je grafikon koji pokazuje nivoe PCSK9 proteina u serumu PCSK9 transgenih miševa nakon primene AD-57928 u dozama od 5x2 mg/kg tokom „faze stavljanja“ i 1x2 mg/kg ili 2x2 mg/kg doze tokom „faze održavanja“.
[0211] Slika 7 je grafikon koji pokazuje nivoe PCSK9 proteina u serumu PCSK9 transgenih miševa nakon primene AD-57928 u dozama od 5x1 mg/kg tokom „faze stavljanja“ i 1xmg/kg ili doze 2x1 mg/kg tokom „faze održavanja“.
[0212] Slika 8 je grafikon koji pokazuje nivoe PCSK9 proteina u serumu PCSK9 transgenih miševa nakon primene AD-57928 u dozama od 5x0,5 mg/kg tokom „faze stavljanja“ i 1x0,5 mg/kg ili 2x0,5 mg/kg doze tokom „faze održavanja“.
[0213] Slika 9 je grafikon koji pokazuje rezultate in vivo doza ispitivanja doze izvedenih na PCSK9 transgenim miševima. Sedamdeset dva sata nakon jedne doze od 0,3 mg/kg siRNK, nivoi proteina PCSK9 su određeni pomoću ELISA.
[0214] Slika 10 je grafikon koji pokazuje količinu AD-57928 i AD-58895 po nanogramu jetre C57B6 divljih tipova nakon primene pojedinačne doze od 1 mg/kg AD-57928 ili AD-58895.
[0215] Slika 11 je grafikon koji pokazuje količinu AD-57928 i AD-58895 eksprimiranu kao % teoretske količine u jetri miševa divljeg tipa C57B6 nakon primene jedne doze od 1 mg/kg AD-57928 ili AD- 58895.
[0216] Slika 12A je tabela koja pokazuje iRNK agense prema pronalasku koji sadrže optimizovane sekvence u odnosu na AD-57928 sekvence. Slika 12A opisuje sekvence „sens“ kao SEQ ID NOS 1653-1658, po redosledu pojavljivanja, i sekvence „antisens“ kao SEQ ID NOS 1659-1664, respektivno, po redosledu pojavljivanja. Slika 12B je grafikon koji pokazuje IC<50>vrednosti navedenih iRNK agenata.
[0217] Slika 13 je grafikon koji pokazuje nivo indiciranih iRNK agenasa u jetri miševa divljeg tipa nakon primene pojedinačne doze od 1 mg/kg naznačenog iRNK agensa. Slika 14A je grafikon koji pokazuje količinu PCSK9 proteina u serumu primata koji nisu čovek eksprimiranu kao procenat PCSK9 koji ostaju u odnosu na nivoe PCSK9 pre krvarenja nakon primene naznačenih iRNK agensa kod qdx5 qwx3.
[0218] Slika 14B je grafikon koji pokazuje apsolutnu količinu PCSK9 proteina u serumu primata koji nisu čovek nakon primene naznačenih iRNK agensa kod qdx5 qwx3. Slika 15 je grafikon koji pokazuje količinu holesterola lipoproteina niske gustine (LDL ili LDLc) u serumu primata koji nisu čovek eksprimiranih kao procenat LDL koji ostaju u odnosu na nivoe LDL pre izlučivanja posle primene navedenih iRNK agensa kod qdx5 qwx3.
[0219] Slika 16A je grafikon koji pokazuje količinu holesterola lipoproteina niske gustine (LDL ili LDLc) u serumu primata koji nisu čovek eksprimiranih kao procenat prosečne količine nivoa LDL pre krvarenja posle primene AD-57928 na 2 mg/kg, q1w i 1 mg/kg, 2xw. ,
[0220] Slika 16B je grafikon koji pokazuje količinu PCSK9 proteina u odnosu na prethodno izlučenu količinu u serumu primata koji nisu čovek nakon primene AD-57928 na 2 mg/kg, q1w i 1 mg/kg, 2xw.
[0221] Slika 17A je grafikon koji pokazuje količinu holesterola lipoproteina niske gustine (LDL ili LDLc) u serumu primata koji nisu čovek, eksprimiranu kao procenat prosečne količine nivoa LDL pre krvarenja posle primene AD-57928 na 2 mg/kg, 2xw i pojedinačno doziranje od 25 mg/kg. Poslednja doza za grupu od 2 mg/kg, 2xw bila je 36. dana.
[0222] Slika 17B je grafikon koji pokazuje količinu PCSK9 proteina u odnosu na prethodno izlučenu količinu u serumu primata koji nisu čovek nakon primene AD-57928 na 2 mg/kg, 2xw i pojedinačne doze 25 mg/kg.
[0223] Slika 18 je grafikon koji pokazuje količinu holesterola lipoproteina niske gustine (LDL ili LDLc) u serumu primata koji nisu čovek eksprimiranu kao procenat LDL koji ostaju u odnosu na nivoe LDL pre izlučivanja nakon primene navedenih iRNK agensa kod qdx5 qwx3.
[0224] Slika 19 je grafikon koji pokazuje količinu holesterola lipoproteina niske gustine (LDL ili LDLc) u serumu primata koji nisu čovek eksprimiran kao procenat LDL koji ostaju u odnosu na nivoe LDL pre izlučivanja posle primene navedenih iRNK agensa kod qdx5 qwx3.
[0226] Predmetni pronalazak je definisan patentnim zahtevima. Takođe su opisani postupci koji koriste sastavi pronalaska za inhibiranje eksprimiranja PCSK9 i za lečenje patologija vezanih za eksprimiranje PCSK9, na primer, hiperholesterolemiju.
[0228] I. Definicije
[0229] Kako bi se ovaj pronalazak mogao lakše razumeti, određeni pojmovi su najpre definisani. Pored toga, treba napomenuti da, kad god se navode vrednost ili opseg vrednosti parametra, namera je da vrednosti i opsezi u intervalu sa navedenim vrednostima takođe budu deo ovog pronalaska.
[0231] Oblici jednine koji se koriste ovde odnose se na jedan ili na više od jednog (tj. na najmanje jedan) gramatičkog oblika. Kao primer, „element“ označava jedan element ili više od jednog elementa, npr. mnoštvo elemenata.
[0233] Izraz „uključivanje“ se ovde koristi da označava i koristi se zamenljivo sa frazom „uključujući ali ne ograničavajući se na“.
[0235] Izraz „ili“ se ovde koristi da označava i koristi se zamenljivo sa izrazom „i/ili“, osim ako kontekst jasno ne ukazuje na drugačije.
[0236] Kad se ovde koristi, „PCSK9“ se odnosi na Proprotein konvertaza subtilizin keksin 9 gen ili proteina. PCSK9 je takođe poznat kao FH3, HCHOLA3, NARC-1 ili NARC1. Izraz PCSK9 obuhvata ljudski PCSK9, čije aminokiselinska i nukleotidna sekvence se mogu naći u, na primer, GenBank Accession No. GI:299523249; mišji PCSK9, čije aminokiselinska i nukleotidna sekvence se mogu naći u, na primer, GenBank Accession No. GI:163644257; pacovski PCSK9, čije aminokiselinska i nukleotidna sekvence se mogu naći u, na primer, u GenBank Accession No. GI:77020249. Dodatni primeri PCSK9 mRNK sekvenci su lako dostupni koristeći, na primer, GenBank.
[0238] Kad se ovde koristi, „ciljna sekvenca“ odnosi se na susedni deo nukleotidne sekvence mRNK molekula formiran tokom transkripcije PCSK9 gena, uključujući mRNK koja je proizvod obrade RNK primarnog proizvoda transkripcije.
[0240] Kad se ovde koristi, izraz „lanac koji sadrži sekvencu“ odnosi se na oligonukleotid koji sadrži lanac nukleotida koji je opisan u sekvenci koja se pominje korišćenjem standardne nukleotidne nomenklature.
[0242] „G“, „C“, „A“ i „U“ obično predstavljaju nukleotid koji sadrži gvanin, citozin, adenin i uracil kao bazu, respektivno. „T“ i „dT“ se ovde koriste zamenljivo i odnose se na dezoksiribonukleotid u kome je nukleobaza timin, npr. dezoksiribotiamin, 2'-dezoksietimidin ili timidin. Međutim, razumeće se da izraz „ribonukleotid“ ili „nukleotid“ ili „dezoksiribonukleotid“ takođe može da se odnosi na modifikovani nukleotid, kako je dalje detaljno navedeno u nastavku, ili surogatni zamenski deo. Obučena osoba je sasvim svesna da gvanin, citozin, adenin i uracil mogu biti zamenjeni drugim delovima bez značajnog promena osobina baznog para oligonukleotida koji sadrži nukleotid koji nosi takav zamenski deo. Na primer, bez ograničenja, nukleotid koji sadrži inozin kao njegovu bazu može se bazno upariti sa nukleotidima koji sadrže adenin, citozin ili uracil. Prema tome, nukleotidi koji sadrže uracil, gvanin ili adenin mogu se zameniti u nukleotidnim sekvencama pronalaska pomoću nukleotida koji sadrži, na primer, inozin. Sekvence koje sadrže takve zamenljive grupe su otelotvorenja pronalaska.
[0244] [0075] Izrazi „iRNK“, „RNKi agens“, „iRNK agens“, „agens interferencije RNK“, kad se ovde koriste zamenljivo, odnose se na agens koji sadrži RNK kako je taj izraz definisan ovde, i koji posreduje ciljanom cepanju transkripta RNK putem RNK-indukovanog kompleksa za utišavanje (RISC). iRNK usmerava specifičnu degradaciju mRNK sekvenci kroz proces poznat kao RNK interferencija (RNKi). Modulati iRNK, npr., inhibiraju eksprimiranje PCSK9 u ćeliji, npr. ćeliji unutar pacijenta, kao što je pacijent sisar.
[0246] U jednoj implementaciji, RNKi agens prema pronalasku uključuje jednolančanu RNK koja interaguje sa ciljanom RNK sekvencom, npr. PCSK9 ciljanom mRNK sekvencom, kako bi se usmerilo cepanje ciljane RNK. Bez želje da se veže teorijom, veruje se da je duga dvolančana RNK uvedena u ćelije podeljena na siRNK pomoću endonukleaze tipa III poznate kao Dicer (Sharp i dr. (2001) Genes Dev.15:485). Dicer, enzim poput ribonukleaze-III, obrađuje dsRNK u 19-23 bazni paru kratke interferišuće RNK sa karakterističnim dvobaznim, 3' viškovima (Bernstein, i dr., (2001) Nature 409:363). SiRNK se onda inkorporiraju u RNK-indukovani kompleks za utišavanje (RISC), gde jedna ili više helikaza odvijaju siRNK dupleks, što omogućava komplementarnu antisens mrežu za vođenje prepoznavanja cilja (Nykanen, i dr., (2001) Cell 107:309). Nakon vezivanja za odgovarajuću ciljanu mRNK, jedna ili više endonukleaza unutar RISC cepaju cilj da indukuju utišavanje (Elbashir, i dr., (2001) Genes Dev.15:188). Prema tome, u jednom aspektu pronalazak se odnosi na jednolančanu RNK (siRNK) generisanu unutar ćelije koja promoviše formiranje kompleksa RISC za efektivno utišavanje ciljanog gena, tj. PCSK9 gena. Shodno tome, izraz „siRNK“ se takođe ovde koristi da se odnosi na RNKi kao što je gore opisano.
[0248] U drugoj implementaciji, RNKi agens može biti jednolančana siRNK koja se unosi u ćeliju ili organizam da inhibira ciljanu mRNK. Jednolančani RNKi agensi se vezuju za RISC endonukleazu Argonaut 2, koja zatim cepa ciljanu mRNK. Jednolančane siRNK su generalno 15-30 nukleotida i hemijski modifikovane. Dizajn i testiranje jednolančanih siRNK su opisani u U.S. Patent No.8,101,348 i u Lima i dr., (2012) Cell 150: 883-894, čiji celokupni sadržaj je ovde uključen ovde referencom. Bilo koja antisens nukleotidna sekvenca opisana ovde može se koristiti kao jednolančana siRNK kao što je ovde opisano ili kao hemijski modifikovana postupcima opisanim u Lima i dr., (2012) Cell 150:883-894.
[0250] [0078] U drugoj implementaciji, „iRNK“ za upotrebu u sastavima, upotrebama i postupcima iz pronalaska je dvolančana RNK i ovde se ovde naziva kao „dvolančani RNKi agens“, „dvolančani RNK ( dsRNK) molekul, „dsRNK agensa“ ili „dsRNK“. izraz „dsRNK“ odnosi se na kompleks molekula ribonukleinske kiseline, koji ima dupleks strukturu koja sadrži dve anti-paralelne i značajno komplementarne ćelije nukleinskih kiselina, koje se nazivaju „sens“ i „antisens“ orijentacijama u odnosu na ciljanu RNK, tj. PCSK9 gena. U nekim aspektima pronalaska, dvolančana RNK (dsRNK) pokreće degradaciju ciljne RNK, na primer, mRNK, putem post-transkripcijskog mehanizma za zatezanje gena koji se ovde pominje kao interferencija RNK ili RNKi.
[0252] Uopšteno govoreći, većina nukleotida svake ćelije dsRNK molekula su ribonukleotidi, ali kao što je detaljno opisano ovde, svaki ili oba lanca mogu takođe da uključe jedan ili više ne-ribonukleotida, npr. dezoksiribonukleotid i/ili modifikovan nukleotid. Pored toga, kako se koristi u ovoj specifikaciji, „RNKi agens“ može uključivati ribonukleotide sa hemijskim modifikacijama; RNKi agens može sadržati značajne modifikacije kod više nukleotida. Takve modifikacije mogu obuhvatiti sve vrste modifikacija opisanih ovde ili poznato u struci. Sve takve modifikacije, kako se koriste u molekulu tipa siRNK, obuhvaćene su „RNKi agensom“ u svrhu ove specifikacije i zahteva.
[0254] Dva lanca koje oblikuju dupleks strukturu mogu biti različiti delovi jednog većeg molekula RNK ili mogu biti odvojeni RNK molekuli. Gde su dve ćelije deo jednog većeg molekula i stoga su povezane neprekidnim lancem nukleotida između 3'-kraja jednog lanca i 5'-kraja odgovarajućeg drugog lanca koje formiraju dupleks strukturu, povezujući RNK lanac se naziva „ukosnica petlja“. Tamo gde su dva lanca povezana kovalentno pomoću sredstava koja nisu neprekidni lanac nukleotida između 3'-kraja jednog lanca i 5'-kraja odgovarajućeg drugog lanca koji oblikuje dupleks strukturu, povezujuća struktura se naziva „veznik“. RNK ćelije mogu imati isti ili različiti broj nukleotida. Maksimalan broj baznih parova je broj nukleotida u najkraćem nizu dsRNK minus bilo koji višak prisutan u dupleksu. Pored strukture dupleksa, RNKi agens može sadržati jedan ili više nukleotidni višak.
[0256] [0081] U jednoj implementaciji, RNKi agens prema pronalasku je dsRNK od 24-30 nukleotida koji interaguje sa ciljanom RNK sekvencom, npr. PCSK9 ciljanom mRNK sekvencom, kako bi se usmerio cepanje ciljane RNK. Bez želje da se veže teorijom, duga dvolančana RNK koja se unosi u ćelije razdvaja se u siRNK pomoću endonukleaze tipa III poznate kao Dicer (Sharp i dr. (2001) Genes Dev.15:485). Dicer, enzim poput ribonukleaze-III, obrađuje dsRNK u 19-23 bazni paru kratke interferišuće RNK sa karakterističnim dvobaznim, 3' viškovima (Bernstein, i dr., (2001) Nature 409:363). SiRNK se onda inkorporiraju u RNK-indukovani kompleks za utišavanje (RISC), gde jedna ili više helikaza odvijaju siRNK dupleks, što omogućava komplementarnu antisens mrežu za vođenje prepoznavanja cilja (Nykanen, i dr., (2001) Cell 107:309). Nakon vezivanja za odgovarajuću ciljanu mRNK, jedna ili više endonukleaza unutar RISC cepaju cilj da indukuju utišavanje (Elbashir, i dr., (2001) Genes Dev.15:188). Kao što je ovde korišćeno, „nukleotidni višak“ se odnosi na neuparene nukleotide ili nukleotide koji izdužuju iz dupleks strukture RNKi agenata kada se 3'-kraj jednog lanca iz RNKi agensa proteže preko 5'-kraja drugog lanca , ili obrnuto. „Tupi“ ili „tupi kraj“ znači da nema neuparenih nukleotida na tom kraju dvolančanog RNKi agensa, tj., nema viška nukleotida. RNKi agensi sa „tupim krajem“ su dsRNK koja je dvolančano ujednačena u celoj dužini, tj. nema nukleotidnog viška na bilo kom kraju molekula. RNKi agensi iz ovog pronalaska uključuju agense RNKi sa nukleotidnim nadvišenjima na jednom kraju (to jest, agensi sa jednim viškom i jednim tupim krajem) ili sa nukleotidnim viškovima na oba kraja.
[0258] Izraz „antisens lanac“ odnosi se na vezu dvolančanog RNKi agensa koji uključuje regiju koja je u suštini komplementarna sa ciljanom sekvencom (npr., ljudski PCSK9 mRNK). Kad se ovde koristi, izraz „regija komplementarna delu mRNK koja kodira transtiretin“ odnosi se na regiju antisens lanca koja je u suštini komplementarna sa delom PCSK9 mRNK sekvence. Kada regija komplementarnosti nije u potpunosti komplementarna ciljanoj sekvenci, neusaglašenosti se najviše tolerišu u terminalnim regijama i, ukoliko su prisutne, uglavnom su u terminalnoj regiji ili regijama, npr. unutar 6, 5, 4, 3 ili 2 nukleotida 5' i/ili 3' terminusa.
[0260] izraz „sens“, kad se ovde koristi, odnosi se na vezu dsRNK koja uključuje regiju koji je u suštini komplementarna sa regijom antisens lanca.
[0262] Kad se ovde koristi, izraz „regija cepanja“ odnosi se na regiju koji se nalazi odmah pored mesta cepanja. Mesto cepanja je mesto na meti na kom se dešava cepanje. U nekim implementacijama, područje cepanja obuhvata tri baze na svakom kraju i neposredno uz lokaciju cepanja. U nekim implementacijama regija razdvajanja se sastoji od dve baze na svakom kraju i odmah pored mesta cepanja. U nekim implementacijama, mesto cepanja se specifično javlja na mestu vezanom nukleotidima 10 i 11 antisens lanca, a regija cepanja sadrži nukleotide 11, 12 i 13.
[0263] Kad se ovde koristi, i ako nije drugačije naznačeno, izraz „komplementarni“ kada se koristi za opisivanje prve nukleotidne sekvence u odnosu na drugu nukleotidnu sekvencu, odnosi se na sposobnost oligonukleotida ili polinukleotida koji sadrži prvu nukleotidnu sekvencu da hibridizuju i formiraju dupleks strukturu pod određenim uslovima sa oligonukleotidom ili polinukleotidom koji sadrži drugu nukleotidnu sekvencu, što će se razumeti od strane kvalifikovane osobe. Takvi uslovi mogu, na primer, biti strogi uslovi, gde strogi uslovi mogu uključivati: 400 mM NaCI, 40 mM PIPE pH 6,4, 1 mM EDTA, 50oC ili 70oC tokom 12-16 sati, praćeno pranjem. Drugi uslovi, kao što su fiziološki relevantni uslovi koji se mogu naći u organizmu, mogu se primeniti. Na primer, komplementarna sekvenca je dovoljna da omogući odgovarajuću funkciju nukleinske kiseline da se nastavi, npr., RNKi. Vešta osoba će moći da odredi skup uslova koji su najpogodniji za ispitivanje komplementarnosti dve sekvence u skladu sa konačnom primenom hibridizovanih nukleotida.
[0265] Sekvence mogu biti „potpuno komplementarne“ u odnosu na svaku kada postoji bazno uparivanje nukleotida prve nukleotidne sekvence sa nukleotidima druge nukleotidne sekvence preko cele dužine prve i druge nukleotidne sekvence. Međutim, kada je prva sekvenca označena kao „suštinski komplementarna“ u odnosu na drugu sekvencu ovde, dve sekvence mogu biti potpuno komplementarne, ili mogu formirati jedan ili više, ali uglavnom ne više od 4, 3 ili 2 neusaglašena bazna para pri hibridizaciji, dok zadržavaju sposobnost hibridizacije u uslovima koji su najvažniji za njihovu krajnju primenu. Međutim, kada su dva oligonukleotida dizajnirana da, nakon hibridizacije, formiraju jedan ili više jednolančani višak, takvi viškovi se ne smatraju neusaglašenostima u odnosu na određivanje komplementarnosti. Na primer, dsRNK sadrži dužinu jednog oligonukleotida 21 nukleotida dugačkog i drugog oligonukleotida 23 nukleotida dugačkog, pri čemu duži oligonukleotid sadrži sekvencu od 21 nukleotida koja je u potpunosti komplementarna kraćem oligonukleotidu, ipak može biti označena kao „potpuno komplementarna“ za ciljeve opisane ovde.
[0267] „Komplementarne“ sekvence, kad se ovde koriste, takođe mogu uključiti ili biti u potpunosti formirane od ne-Votson-Krik baznih parova i/ili baznih parova formiranih od neprirodnih i modifikovanih nukleotida, sve dok gore navedeni zahtevi u pogledu njihove sposobnosti hibridizacije su ispunjeni. Takvi bazni parovi koji nisu Votson- Krik uključuju, ali bez ograničavanja na, G:U Wobble ili Hoogstein bazne parove.
[0268] Izrazi „komplementarni“, „potpuno komplementarni“ i „suštinski komplementarni“ ovde mogu biti korišćeni u odnosu na bazno usklađivanje između sens i antisens lanac dsRNK, ili između antisens lanca dsRNK i ciljane sekvence, što će se razumeti iz konteksta njihove upotrebe.
[0270] Kad se ovde koristi, polinukleotid koji je „u suštini komplementaran bar jednom delu“, mesindžer RNK (mRNK) odnosi se na polinukleotid koji je u suštini komplementarni sa susednim delom mRNK interesa (npr. mRNK kodiranje PCSK9) uključujući 5' UTR, otvoreni okvir za čitanje (ORF) ili 3' UTR. Na primer, polinukleotid komplementaran je sa najmanje jednim PCSK9 mRNK ako je sekvenca u suštini komplementarna neprekidnom delu mRNK kodirajući PCSK9.
[0272] Izraz „inhibiranje“, kad se ovde koristi, se koristi zamenljivo sa „redukcijom“, „utišavanjem“, „regulacijom“, „potiskivanjem“ i drugim sličnim Izrazima i uključuje bilo koji nivo inhibicije.
[0274] Fraza „inhibiranje eksprimiranja PCSK9“, kad se ovde koristi, podrazumeva inhibiciju eksprimiranja bilo kog PCSK9 gena (kao što je, na primer, PCSK9 gen miša, PCSK9 gen pacova, PCSK9 gena majmuna ili PCSK9 gen čoveka) kao i varijante (npr. varijante koje se javljaju u prirodi), ili mutanti PCSK9 gena. Prema tome, PCSK9 gen može biti gen PCSK9 divljeg tipa, mutant PCSK9 gena ili transgeni PCSK9 gen u kontekstu genetički manipulisane ćelije, grupe ćelija ili organizma.
[0276] „Inhibicija eksprimiranja PCSK9 gena“ uključuje bilo koji nivo inhibicije PCSK9 gena, na primer, najmanje delimičnu supresiju eksprimiranja PCSK9 gena, kao što je inhibicija barem 5%, barem oko 10 barem oko 15%, barem oko 20%, barem oko 25%, barem oko 30%, barem oko 35%, barem oko 40%, barem oko 45%, barem oko 50% barem oko 55%, barem oko 60%, barem oko 65%, barem oko 70%, barem oko 75%, barem oko 80%, barem oko 85%, barem oko 90%, barem oko 91%, bar oko 92%, barem oko 93%, barem oko 94%. barem oko 95%, barem oko 96%, barem oko 97%, barem oko 98%, ili barem oko 99%.
[0278] [0093] Eksprimiranje PCSK9 gena može se proceniti na osnovu nivoa bilo koje promenljive koja je povezana sa eksprimiranjem PCSK9 gena, npr. nivo PCSK9 mRNK, nivo PCSK9 proteina ili nivo lipida u serumu. Inhibicija se može proceniti smanjenjem apsolutnog ili relativnog nivoa jedne ili više ovih promenljivih u poređenju sa kontrolnim nivoom. Nivo kontrole može biti bilo koji tip nivoa kontrole koji se koristi u struci, npr. početni nivo preddoze ili nivo određen od sličnog pacijenta, ćelije ili uzorka koji se ne tretira ili ne tretira sa kontrolom (kao što je , npr. samo kontrola pufera ili kontrola neaktivnog agensa).
[0280] Fraza „dovođenje u dodir ćelije sa dvolančanim RNKi agensom“, kad se ovde koristi, uključuje dovođenje u dodir ćelije bilo kojim mogućim sredstvom. dovođenje u dodir ćelije sa dvolančanim RNKi agensom uključuje dovođenje u dodir ćelije in vitro sa agensom RNKi ili dovođenje u dodir ćelije in vivo sa agensom RNKi. Dovođenje u dodir može biti direktno ili indirektno. Tako, na primer, RNKi agens može biti stavljen u fizički dodir sa ćelijom od strane pojedinca koji izvodi postupak ili, alternativno, RNKi agens može biti stavljen u situaciju koja će dozvoliti ili dovesti do toga da kasnije dođe u dodir sa ćelijom.
[0282] Dovođenje u dodir ćelije in vitro može se izvršiti, na primer, inkubiranjem ćelije sa RNKi agensom. Dovođenje u dodir ćelije in vivo može se izvršiti, na primer, ubrizgavanjem RNKi agensa u tkivo ili u blizini tkiva u kom se nalazi ćelija, ili injektiranjem RNKi agensa u drugu oblast, krvotok ili potkožni prostor, tako da agens kasnije dođe do tkiva u kom se nalazi ćelija koja će biti dovedena u dodir. Na primer, RNKi agens može sadržati i/ili biti spojen sa ligandom, na primer, GalNAc3 ligandom, koji usmerava RNKi agens na mesto od interesa, na primer, jetre. Moguće su kombinacije in vitro i in vivo postupaka dovođenja u dodir. U vezi sa postupcima pronalaska, ćelija se takođe može dovodi u dodir in vitro sa agensom RNKi i zatim transplantirati u pacijenta.
[0284] „Pacijent“, kad se ovde koristi, ima za cilj da uključi ili ljudsku ili ne-ljudsku životinju, poželjno sisara, npr. majmuna. Najpoželjnije, pacijent je čovek.
[0286] „PCSK9-povezana bolest“, kad se ovde koristi, ima za cilj da uključi bilo koja bolest povezana sa PCSK9 genom ili proteinom. Takva bolest može biti uzrokovana, na primer, preko viška proizvodnje PCSK9 proteina, mutacijom PCSK9 gena, abnormalnim cepanjem proteina PCSK9, abnormalnim interakcijama između PCSK9 i drugih proteina ili drugih endogenih ili egzogenih supstanci. Primeri PCSK9-pridruženih bolesti uključuju lipidemije, na primer, hiperlipidemije i druge oblike lipidne disbalanse kao što su hiperholesterolemija, hipertrigliceridemija i patološki uslovi koji su povezani sa ovim poremećajima kao što su bolesti srca i cirkulacije.
[0287] „Terapeutski efikasna količina“, kao što je ovde korišćena, ima za cilj da uključi količinu RNKi agensa koja je, kada se daje pacijentu za lečenje bolesti povezane sa PCSK9, dovoljna da utiče na lečenje bolesti (npr. smanjenjem, poboljšanjem ili održavanjem postojeće bolesti ili jednog ili više simptoma bolesti). „Terapeutski efikasna količina“ može se razlikovati u zavisnosti od RNKi agensa, kako se sredstvo primenjuje, bolesti i njene težine i istorije, starosti, telesne težine, porodične istorije, genetske slike, stadijuma patoloških procesa posredovanih eksprimiranjem PCSK9, vrste prethodnih ili istovremenih tretmana, ako ih ima, i drugih individualnih karakteristika pacijenta koji se leči.
[0289] „Profilaktički efikasna količina“, kad se ovde koristi, ima za cilj da uključi količinu RNKi agensa koja, kada se daju pacijentu koji još ne proživljava ili pokazuje simptome bolesti povezane sa PCSK9, ali koji može biti predisponiran na bolest, dovoljna da spreči ili poboljša bolest ili jedan ili više simptoma bolesti. Poboljšanje bolesti uključuje usporavanje toka bolesti ili smanjenje težine kasnijeg razvoja bolesti. „Profilaktički efikasna količina“ može se razlikovati u zavisnosti od RNKi agensa, kako se primenjuje sredstvo, stepen rizika od bolesti i istorija, starost, težina, porodična istorija, genetski sastav, vrste prethodnih ili istovremenih tretmana, ako bilo koje, i druge individualne karakteristike pacijenta koji se leči.
[0291] „Terapeutski efikasna količina“ ili „profilaktička efektivna količina“ takođe uključuje količinu RNKi agensa koja daje neki poželjan lokalni ili sistemski efekat uz razumni odnos odnosa koristi/rizika koji se primenjuje za bilo koji tretman. RNKi geni koji se koriste u postupcima iz ovog pronalaska mogu se davati u dovoljnoj količini kako bi se postigao razumni odnos koristi/rizik koji se primenjuje na takav tretman.
[0293] [0101] Izraz „uzorak“, kad se ovde koristi, uključuje zbir sličnih tečnosti, ćelija ili tkiva izolovanih od pacijenta, kao i tečnosti, ćelija ili tkiva prisutnih u pacijentu. Primeri bioloških tečnosti uključuju krv, serum i serozalne tečnosti, plazmu, cerebrospinalnu tečnost, očne tečnosti, limfu, urin, pljuvačku i slično. Uzorci tkiva mogu obuhvatiti uzorke iz tkiva, organa ili lokalizovanih regija. Na primer, uzorci mogu biti izvedeni iz određenih organa, delova organa ili fluida ili ćelija unutar tih organa. U određenim rešenjima, uzorci mogu biti izvedeni iz jetre (npr. cele jetre ili određenih segmenata jetre ili određenih tipova ćelija u jetri, kao što su, na primer, hepatociti). U poželjnim otelotvorenjima, „uzorak izveden iz pacijenta“ odnosi se na krv ili plazmu izvedenu od pacijenta. U daljem otelotvorenju, „uzorak izveden iz pacijenta“ odnosi se na tkivo jetre (ili njegove podkomponente) izvedene iz pacijenta.
[0295] II. iRNK
[0296] Ovde opisani su poboljšani dvolančani RNKi agensi koji inhibiraju eksprimiranje PCSK9 gena u ćeliji, kao što je ćelija pacijenta, npr. sisara, kao što je čovek koji ima poremećaj lipida, na primer, hiperholesterolemiju i upotreba takvih dvolančanih RNKi agensa.
[0298] dvolančani RNKi agensi otkrivanja uključuju agense sa hemijskim modifikacijama, kao što su objavljeni, na primer, u U.S. privremena prijava br.61/561,710,, podneseno 18. novembra 2011. godine, čiji celokupni sadržaj je ovde uključen referencom.
[0300] Kao što je prikazano ovde i u privremenoj prijavi br.61/561,710, superioran rezultat se može dobiti uvođenjem jednog ili više motiva od tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida u sens i/ili antisens vezu RNKi agensa, posebno na ili blizu mesta cepanja. U nekim implementacijama, sens i antisens lanac RNKi agensa mogu inače biti potpuno izmenjeni. Uvođenje ovih motiva prekida modifikacioni obrazac, ako je prisutan, od sens i/ ili antisens lanca. RNKi agens može biti opciono konjugovan sa derivatom liganda GalNAc, na primer, na sens lancu. Dobijeni agensi RNKi predstavljaju superiornu aktivnost utišavanja gena.
[0302] Preciznije, bilo je iznenađujuće otkriveno da kada su sens lanac i antisens lanac dvolančanog RNKi agensa potpuno modifikovani, da imaju jedan ili više motiv od tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida na ili u blizini mesta cepanja barem jednog lanca RNKi agensa, aktivnost za utišavanje gena RNKi agensa je superiorno poboljšana.
[0304] [0106] Shodno tome, objava pruža dvolančane RNKi agense sposobne da inhibiraju eksprimiranje ciljanog gena (tj., gena za Proprotein konvertaza subtilizin keksin 9 (PCSK9)) in vivo. RNKi agens ima sens i antisens lanac. Svaka ćelija RNKi agensa može biti u rasponu od 12-30 nukleotida dugačak. Na primer, svaki lanac može biti između 14-30 nukleotida dugačak, 17-30 nukleotida dugačak, 25-30 nukleotida dugačak, 27-30 nukleotida dugačak, 17-23 nukleotida dugačak, 17-21 nukleotida dugačak, 17-19 nukleotida dugačak, 19-25 nukleotida dugačak, 19-23 nukleotida dugačak, 19-21 nukleotida dugačak, 21-25 nukleotida dugačak, ili 21-23 nukleotida dugačak.
[0306] Sens i antisens lanac obično formiraju dupleks sa dvolančanim RNK („dsRNK“), takođe ovde označen kao „RNKi agens“. Dupleks regija RNKi agensa može biti 12-30 nukleotidnih parova dugačka. Na primer, dupleks regija može biti između 14-30 nukleotidnih parova dugačka, 17-30 nukleotidnih parova dugačka, 27-30 nukleotidnih parova dugačka, 17-23 nukleotidnih parova dugačka, 17-21 nukleotidnih parova dugačka, 17 -19 nukleotidnih parova dugačka, 19-25 nukleotidnih parova dugačka, 19-23 nukleotidnih parova dugačka, 19-21 nukleotidnih parova dugačka, 21-25 nukleotidnih parova dugačka ili 21-23 nukleotidnih parova dugačka. U drugom primeru, regija dupleksa je izabrana od dužine od 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 i 27 nukleotida.
[0308] U jednoj implementaciji, RNKi agens može sadržati jednu ili više višak regiju i/ili grupu za ograničavanje na 3'-kraju, 5'-kraju ili na oba kraja jednog ili oba lanca. Više može biti dužine 1-6 nukleotida, na primer 2-6 nukleotida dugačak, 1-5 nukleotida dugačak, 2-5 nukleotida dugačak, 1-4 nukleotida dugačak, 2-4 nukleotida dugačak, 1- 3 nukleotida dugačak, 2-3 nukleotida dugačak, ili 1-2 nukleotida dugačak. Viškovi mogu biti rezultat jednog lanca koji je duži od drugog, ili rezultat dva lanca jednake dužine koji su razdvojeni. Višak može da stvori neusaglašenost sa ciljanom mRNK ili može biti komplementaran sekvenci gena koji su ciljani ili može biti druga sekvenca. Prvi i drugi lanca mogu se takođe spojiti, npr., pomoću dodatnih osnova kako bi se formirale ukosnice ili drugi ne-bazni veznici.
[0310] U jednoj implementaciji, nukleotidi u višak regiji RNKi agensa mogu svaki nezavisno biti modifikovani ili nemodifikovani nukleotid uključujući, ali bez ograničavanja na 2'-šećer modifikovan, kao što su 2-F, 2'-Ometil, 2-O-metoksietil-5-metilcitidin (m5Ceo), i bilo koje njihove kombinacije. Na primer, TT može biti višak niz za bilo koji kraj na bilo kojoj vrsti. Nagib može da stvori neusaglašenost sa ciljanom mRNK ili može biti komplementarna sekvenci gena koji su ciljani ili mogu biti drugi redosled.
[0312] [0110] 5'- ili 3'- viškovi na sens lancu, antisens lancu ili oba lanca RNKi agensa mogu biti fosforilisani. U nekim primenama, višak regije sadrže dva nukleotida koji imaju fosforotioat između dva nukleotida, gde dva nukleotida mogu biti ista ili različita. U jednoj implementaciji, višak je prisutan na 3'-kraju sens lanca, antisens lanca ili oba lanca. U jednom aspektu, ovaj 3'- višak je prisutan u antisens lancu. U jednoj implementaciji, ovaj 3'- višak je prisutan u sens lancu.
[0314] RNKi agens može sadržati samo jedan višak, što može ojačati interferencijalnu aktivnost RNKi, bez uticaja na njegovu ukupnu stabilnost. Na primer, jednolančani višak može se nalaziti na 3'-terminalnom kraju sens lanca ili, alternativno, na 3'-terminalnom kraju antisens lanca. RNKi takođe može imati tupi kraj, koji se nalazi na 5'-kraju antisens lanca (ili na kraju 3'-kraja sens lanca) ili obrnuto. Uopšteno govoreći, antisens lanac RNKi ima nukleotidni višak na 3'-kraju, i 5'-kraj je tup. Bez želje da se veže teorijom, asimetrični tupi kraj na 5'-kraju antisens lanca i 3'-kraju viška antisens lanca favorizuje stavljanje lanca vodiča u RISC procesu.
[0316] U jednoj implementaciji, RNKi agens je dvolančani završni blok 19 nukleotida dugačak, pri čemu sens lanac sadrži najmanje jedan motiv od tri 2'-F modifikacije na tri uzastopna nukleotida na položajima 7, 8, 9 od 5'kraja. Antisens lanac sadrži najmanje jedan motiv od tri 2'-O-metil modifikacije na tri uzastopna nukleotida na položajima 11,12,13 od 5'kraja.
[0318] U drugoj implementaciji, RNKi agens je dvolančani završni blok 20 nukleotida dugačak, pri čemu sens lanac sadrži najmanje jedan motiv od tri 2'-F modifikacije na tri uzastopna nukleotida na položajima 8, 9, 10 od 5'kraja. Antisens lanac sadrži najmanje jedan motiv od tri 2'-O-metil modifikacije na tri uzastopna nukleotida na položajima 11,12,13 od 5'kraja.
[0320] U još jednoj implementaciji, RNKi agens je dvolančani završni blok od 21 nukleotida dugačak, pri čemu sens lanac sadrži najmanje jedan motiv od tri 2'-F modifikacije na tri uzastopna nukleotida na položajima 9, 10, 11 od 5'kraja antisens lanac sadrži najmanje jedan motiv od tri 2'-O-metil modifikacije na tri uzastopna nukleotida na položajima 11,12,13 od 5'kraja.
[0322] [0115] U jednoj implementaciji, RNKi agens obuhvata 21 nukleotidni sens lanac i 23 nukleotidni antisens lanac, pri čemu sens lanac sadrži najmanje jedan motiv od tri 2'-F modifikacije na tri uzastopna nukleotida na položajima 9, 10, 11 od 5'kraja; antisens lanac sadrži najmanje jedan motiv od tri 2'-O-metil modifikacije na tri uzastopna nukleotida na položajima 11,12,13 od 5'kraja, pri čemu je jedan kraj RNKi agensa tup, dok drugi kraj sadrži 2 nukleotidni viška. Poželjno je da se 2 nukleotidni višak nalazi na 3'-kraju antisens lanca. Kada je 2 nukleotidni višak na 3'-kraju antisens lanca, mogu biti dve fosforotioatne internukleotidne veze između terminala tri nukleotida, pri čemu su dva od tri nukleotida iznad nukleotida, a treći nukleotid je uparen nukleotid pored višak nukleotida. U jednoj implementaciji, RNKi agens dodatno ima dve fosforotioatne internukleotidne veze između terminala tri nukleotida na oba od 5'-kraja sens lanca i 5'-kraja antisens lanca. U jednoj implementaciji, svaki nukleotid u sens lancu i antisens lancu RNKi agensa, uključujući i nukleotide koji su deo motiva, su modifikovani nukleotidi. U jednoj implementaciji svaki ostatak je nezavisno modifikovan sa 2'-O-metilom ili 3'-fluorom, npr., u alternativnom motivu. Opciono, RNKi agens dalje sadrži ligand (poželjno GalNAc<3>).
[0324] U jednoj implementaciji, RNKi agens sadrži sens lanac i antisens lanac, pri čemu RNKi agens sadrži prvi lanac koji ima dužinu koja je najmanje 25, a najviše 29 nukleotida i drugi lanac koja ima dužinu koja je najviše 30 nukleotida sa najmanje jednim motivom tri 2'-O-metil modifikacija na tri uzastopna nukleotida na položaju 11, 12, 13 od 5' kraja; pri čemu 3' kraj prvog lanca i 5' kraj drugog lanca čine tupi kraj, a drugi lanac je 1-4 nukleotida duži na svom 3' kraju od prvog lanca, pri čemu dupleks regija koja je najmanje 25 nukleotida dugačka, i druga lanac je dovoljno komplementaran ciljanoj mRNK uz najmanje 19 nukleotida dužine drugog lanca da smanji eksprimiranje ciljanog gena kada je RNKi agens uveden u ćeliju sisara, pri čemu dicer cepanje RNKi agensa preferencijalno rezultira u siRNK koja sadrži 3' kraj drugog lanca, čime se smanjuje eksprimiranje ciljanog gena kod sisara. Opciono, RNKi agens dalje sadrži ligand.
[0326] U jednoj implementaciji, sens lanac RNKi agensa sadrži najmanje jedan motiv od tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida, gde se jedan od motiva pojavljuje na mestu cepanja u sens lancu.
[0328] U jednoj implementaciji, antisens lanac RNKi agensa može takođe sadržati najmanje jedan motiv od tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida, pri čemu se jedan od motiva javlja na ili u blizini mesta cepanja u antisens lancu.
[0329] Za RNKi agens koji ima dupleks regiju od 17 do 23 nukleotida dužine, mesto cepanja antisens lanca je tipično oko položaja 10, 11 i 12 od 5-kraja. Tako se mogu pojaviti motivi od tri identične modifikacije na položajima 9, 10, 11; položajima 10, 11, 12; položajima 11, 12, 13; položajima 12, 13, 14; ili položajima 13, 14, 15 antisens lanca, brojanje počinje od prvog nukleotida od 5'-kraja antisens lanca, ili brojanje počinje od prvog uparenog nukleotida u dupleks regiji od 5'- kraj antisens lanca. Mesto cepanja u antisens lancu se takođe može promeniti prema dužini dupleks regije RNKi od 5'-kraja.
[0331] Sens lanac RNKi agensa može sadržati najmanje jedan motiv od tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida na mestu cepanja lanca; a antisens lanac može imati najmanje jedan motiv od tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida na ili blizu mesta cepanja lanca. Kada sens lanac i antisens lanac formiraju dsRNK dupleks, sens lanac i antisens lanac mogu biti tako usklađeni da jedan motiv tri nukleotida na sens lancu i jedan motiv tri nukleotida na antisens lancu ima najmanje jedno nukleotidno preklapanje, tj., bar jedan od motiva tri nukleotida u sens lancu stvara bazni par sa najmanje jednim od motiva tri nukleotida u antisens lancu. Alternativno, najmanje dva nukleotida se mogu preklapati, ili se sva tri nukleotida mogu preklapati.
[0333] U jednoj implementaciji, sens lanac RNKi agensa može sadržati više od jednog motiva od tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida. Prvi motiv može da se pojavi na ili blizu mesta cepanja lanca, a drugi motivi mogu biti modifikacija krila. Izraz „modifikacija krila“ ovde se odnosi na motiv koji se javlja na drugom delu lanca koji je odvojen od motiva na ili u blizini mesta cepanja istog lanca. Modifikacija krila je ili prikladna za prvi motiv ili je odvojena najmanje jednim ili više nukleotida. Kada su motivi direktno susedni jedan drugom, onda se hemija motiva razlikuje jedna od druge i kada su motivi odvojeni jednim ili više nukleotida kada hemija može biti ista ili različita. Dve ili više modifikacija krila mogu biti prisutne. Na primer, kada su prisutne dve modifikacije krila, svaka modifikacija krila može se pojaviti na jednom kraju u odnosu na prvi motiv koji je na ili u blizini mesta cepanja ili na obe strane glavnog motiva.
[0335] [0122] Kao i sens lanac, antisens lanac RNKi agensa može sadržati više od jednog motiva od tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida, sa najmanje jednim od motiva koji se javljaju na ili u blizini mesta cepanja lanca. Ovaj antisens lanac može takođe sadržati jednu ili više modifikacija krila u poravnanju slične modifikacijama krila koje mogu biti prisutne na sens lancu.
[0337] U jednoj implementaciji, modifikacija krila na sens lancu ili antisens lancu RNKi agensa obično ne uključuje prva dva terminalna nukleotida na 3'-kraju, 5'-kraju ili oba kraja lanca.
[0339] U drugoj implementaciji, modifikacija krila na sens lancu ili antisens lancu RNKi agensa obično ne uključuje prva dva uparena nukleotida u dupleks regiji na 3'-kraju, 5'-kraju ili oba kraja lanca.
[0341] Kada sens lanac i antisens lanac RNKi agensa sadrže najmanje jednu modifikaciju krila, modifikacije krila mogu biti na istom kraju dupleks regije i imaju preklapanje jednog, dva ili tri nukleotida.
[0343] Kada čitav niz i antisens lanca RNKi agensa sadrži najmanje dve modifikacije krila, sens lanac i antisens lanac mogu biti tako usklađeni da dve modifikacije svakog od lanac bude na jednom kraju dupleks regije, sa preklapanjem od jednog, dva ili tri nukleotida; dve modifikacije svakog od lanaca su na drugom kraju dupleks regije, sa preklapanjem jednog, dva ili tri nukleotida; dve modifikacije svakog od lanaca su na svakoj strani vodećeg motiva, koji ima preklapanje jednog, dva ili tri nukleotida u dupleks regiji.
[0345] U jednoj implementaciji, svaki nukleotid u sens lancua i antisens lancu RNKi agensa, uključujući i nukleotide koji su deo motiva, mogu se modifikovati. Svaki nukleotid može biti modifikovan sa istom ili različitom modifikacijom koja može uključivati jednu ili više izmena jednog ili oba nevezujuća fosfatna kiseonika i/ili jednog ili više vezujućih fosfatnih kiseonika; izmena sastojka riboznog šećera, npr., 2' hidroksila na riboznom šećeru; sveobuhvatna zamene fosfatnog ostatka sa „defosfo“ veznicima; modifikacija ili zamena prirodne baze; i zamena ili modifikacija riboza-fosfatne kičme.
[0347] [0128] Kako su nukleinske kiseline polimeri podjedinica, mnoge od modifikacija se javljaju na položaju koji se ponavlja unutar nukleinske kiseline, npr. modifikacija baze ili fosfatnog ostatka, ili ne vezujući O fosfatnog ostatka. U nekim slučajevima modifikacija će se pojaviti na svim predmetnim položajima u nukleinskoj kiselini, ali u mnogim slučajevima neće. Kao primer, modifikacija može da se desi samo u položaju 3' ili 5', može se pojaviti samo u terminalnoj regiji, npr. u položaju na terminalnom nukleotidu ili u poslednja 2, 3, 4, 5 ili 10 nukleotida lanca. Modifikacija može da se desi u regiji sa dvolančanoj regiji, jednolančanoj regiji, ili u obe. Modifikacija se može pojaviti samo u dvolančanoj regiji RNK ili se može pojaviti samo u jednolančanoj regiji RNK. Na primer, modifikovanje fosforotiata kod nevezujućeg O položaja može se pojaviti samo na jednom ili oba terminala, može se pojaviti samo u terminalnoj regiji, npr. na položaju na terminalu nukleotida ili u poslednja 2, 3, 4, 5 , ili 10 nukleotida lanca, ili se može pojaviti u dvolančanoj regiji i jednolančanoj regiji, naročito na terminalima. 5' kraj ili krajevi mogu biti fosforilisani.
[0349] Moguće je, na primer, povećati stabilnost, uključiti određene baze u viškove, ili uključiti modifikovane nukleotide ili nukleotidne surogate, u jednolančane viškove, npr., u 5' ili 3' višak ili u oba. Na primer, može biti poželjno uključiti purinske nukleotide u viškove. U nekim implementacijama sve ili neke od baza u 3' ili 5' viškovima mogu biti modifikovani, npr. sa modifikacijom koja je ovde opisana. Modifikacije mogu uključivati npr. upotrebu modifikacija na poziciji 2 ' riboznog šećera sa modifikacijama koje su poznate u struci, npr. upotreba dezoksiribonukleotida, , 2'-dezoksi-2'-fluoro (2'-F) ili 2'-O-metil modifikovan umesto ribošećera nukleobaze, i modifikacije u fosfatnoj grupi, npr. modifikacije fosforotiata. Viškovi ne moraju biti homologni sa ciljanom sekvencom.
[0351] U jednoj implementaciji, svaki ostatak sens lanca i antisens lanca je nezavisno modifikovan sa LNA, HNA, CeNA, 2'-metoksietil, 2'-O-metil, 2'-O-alil, 2'-C- alil, 2'-dezoksi, 2'-hidroksil ili 2'-fluoro. Lanci mogu sadržati više od jedne modifikacije. U jednoj implementaciji, svaki ostatak sens lanca i antisens lanca je nezavisno modifikovan sa 2'-O-metilom ili 2'-fluorom.
[0353] Najmanje dve različite modifikacije su tipično prisutne na sens lancu i antisens lancu. Ove dve modifikacije mogu biti 2'-O-metil ili 2'-fluoro modifikacije, ili druge.
[0355] U jednoj implementaciji, N<a>i/ili N<b>sadrže modifikacije alternativnog obrasca. Izraz „alternativni motiv“ koji se ovde koristi odnosi se na motiv koji ima jednu ili više modifikacija, gde se svaka modifikacija na naizmeničnim nukleotidima jednog lanca.
[0356] Naizmenični nukleotid može se odnositi na jedan od svakog drugog nukleotid ili jedan na svakog trećeg nukleotida ili slično. Na primer, ako A, B i C predstavljaju jednu vrstu modifikacije nukleotida, alternativni motivi mogu biti „ABABABABABAB ...", „AABBAABBAABB ...,“ „AABAABAABAAB ...,“ „AAABAAABAAAB..., „AAABBBAAABBB ...,“ ili „ ABCABCABCABC ...,“ itd.
[0358] Tip modifikacija sadržan u alternativnom motivu može biti isti ili različit. Na primer, ako A, B, C, D svaki predstavlja jednu vrstu modifikacije na nukleotidu, naizmenični obrazac, tj. modifikacije na svakom drugom nukleotidu, može biti isti, ali svaki od sens lanca ili antisens lanca može biti izabran od nekoliko mogućnosti modifikacija unutar naizmeničnog motiva kao što su „ABABAB ...", „ACACAC ...“ „BDBDBD ...“ ili „CDCDCD ...,“ itd.
[0360] U jednoj implementaciji, RNKi agens prema pronalasku obuhvata modifikacioni obrazac za pomeranje motiva na sens lancu je pomeren u odnosu na modifikacijski obrazac za pomeranje motiva na antisens lancu. Pomeranje može biti takvo da modifikovana grupa nukleotida sens lanca odgovara drugačijoj modifikovanoj grupi nukleotida antisens lanca i obrnuto. Na primer, sens lanac kada su upari sa antisens lancem u dsRNK dupleksu, naizmenični motiv u sens lancu može početi sa „ABABAB“ od 5'-3' od lanca i alternativni motivi u antisens lancu mogu početi sa „BABABA“ od 5'-3' od trake unutar dupleks regije. Kao još jedan primer, naizmenični motiv u sens lancu može početi sa „AABBAABB“ od 5'-3' od lanca i alternativni motiv u antisens lancu može početi sa „BBAABBAA“ od 5'-3' od lanca unutar dupleks regije, tako da postoji potpuna ili parcijalna promena modifikacionih obrazaca između sens lanca i antisens lanca.
[0362] U jednoj implementaciji, RNKi agens obuhvata obrazac naizmeničnog motiva 2'-O-metil modifikacije i 2'-F modifikacije na sens lancu na inicijalno ima pomeranje u odnosu na uzorak naizmeničnog motiva od 2'-O-metil modifikacija i 2'-F modifikacija na antisens lancu inicijalno, tj.2'-O-metil modifikovan nukleotid na baznim parovima sens lanca sa 2'-F modifikovanim nukleotidom na antisens lancu i obrnuto. Prvi položaj sens lanca može početi sa 2'-F modifikacijom, i prvi položaj antisens lanca može početi sa 2'-O-metil modifikacijom.
[0364] [0136] Uvođenje jednog ili više motiva od tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida na sens lanac i/ili antisens lanac prekida inicijalnu modifikaciju koja je prisutna u sens lancu i/ili antisens lancu. Ovaj prekid modifikacionog obrasca sens lanca i/ ili antisens lanca uvođenjem jednog ili više motiva od tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida sens lanca i/ ili antisens lanca iznenađujuće povećava aktivnost gena za ciljanje na ciljni gen.
[0366] U jednoj implementaciji, kada je motiv jedne od tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida uveden u bilo koji od lanaca, modifikacija nukleotida pored motiva je različita modifikacija od modifikacije motiva. Na primer, deo sekvence koja sadrži motiv je „...N<a>YYYN<b>...,“ gde „Y“ predstavlja modifikaciju motiva tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida, a „N<a>“ i „N<b>“ predstavljaju modifikaciju nukleotida pored motiva „YYY“ koja se razlikuje od modifikacije Y, i gde N<a>i N<b>mogu biti iste ili različite modifikacije. Alternativno, N<a>i/ili N<b>mogu biti prisutni ili odsutni kada postoji prisutna modifikacija krila.
[0368] RNKi agens može dodatno da sadrži najmanje jednu fosforotioatnu ili metilfosfonatnu internukleotidnu vezu. Modifikacija fosforotioatne ili metilfosfonate međukleotidne veze može se pojaviti na bilo kom nukleotidu sens lanca ili antisens lanca ili oba lanca u bilo kojoj poziciji lanca. Na primer, modifikacija međukleotidne veze može se pojaviti na svakom nukleotidu na sens lancu i/ili antisens lancu; svaka internukleotidna vezna modifikacija se može pojaviti u naizmeničnom obrascu na sens lancu i/ili antisens lancu; ili sens lanac ili antisens lanac mogu sadržati obe modifikacije interkutkotidne veze u naizmeničnom obrazacu. Naizmenični obrazac modifikacije interkutkotidne veze na sens lancu može biti isti ili različit od antisens lanca, i naizmenični obrazac modifikacije interkutkotidne veze na sens lancu može imati promenu u odnosu na naizmenični obrazac modifikacije interkutkotidne veze na antisens lancu.
[0370] [0139] U jednoj implementaciji, RNKi sadrži modifikaciju vezivanja internukleotida fosforotioata ili metilfosfonata u višak regiji. Na primer, višak regija može sadržati dva nukleotida koji imaju fosforotioatnu ili metilfosfonatnu internukleotidnu vezu između dva nukleotida. Moguće je izvršiti i modifikacije interklukleotidnih veza kako bi se vezali višak nukleotidi sa terminalnim nukleotidima u okviru dupleks regije. Na primer, najmanje 2,3,4 ili svi višak nukleotidi mogu biti povezani putem interklukleotidne veze fosforotioata ili metilfosfonata, i opciono, mogu postojati dodatne fosforotioatne ili metilfosfonatne internukleotidne veze koji povezuju višak nukleotid sa uparenim nukleotidom koji je pored višak nukleotida. Na primer, mogu postojati najmanje dve fosforotioatne internukleotidne veze između terminala tri nukleotida, u kojima su dva od tri nukleotida višak nukleotidi, a treći je uparen nukleotid pored višak nukleotida. Ovi terminali tri nukleotida mogu biti na 3'-kraju antisens lanca, 3'-kraju sens lanca, 5'-kraju antisens lanca i/ili 5'-kraju antisens lanca.
[0372] U jednoj implementaciji, drugi višak nukleotid je na 3'-kraju antisens lanca, i postoje dve fosforotioatne internukleotidne veze između terminala tri nukleotida, pri čemu su dva od tri nukleotida višak nukleotidi, a treći nukleotid je upareni nukleotid pored višak nukleotida. Opciono, RNKi agens može dodatno imati dve fosforotioatne internukleotidne veze između terminala tri nukleotida i na 5'-kraju sens lanca i na 5'-kraju antisens lanca.
[0374] U jednoj implementaciji, RNKi agens sadrži neusklađenosti sa ciljem, unutar dupleksa ili njihovih kombinacija. Neusklađenosti mogu doći u višak regiji ili dupleks regiji. Bazni par se može rangirati na osnovu svoje sklonosti da promoviše disocijaciju ili topljenje (npr. na slobodnoj energiji udruživanja ili disocijacije određenog uparivanja, najjednostavniji pristup je ispitati parove na nivou pojedinačnih parova, iako sledeći sused ili slična analiza takođe mogu biti korišćeni). U smislu promovisanja disocijacije: A:U je poželjniji od G:C; G:U je poželjniji od G:C; i I:C je poželjniji od G:C (I =inozin). Neusklađenosti, npr., ne-kanonska ili osim kanonskih uparivanja (kao što je opisano na drugom mestu ovde), poželjnija su od kanonskih (A: T, A: U, G: C) uparivanja; i uparivanja koja uključuju univerzalnu bazu su poželjnija od kanonskih uparivanja.
[0376] U jednoj implementaciji, RNKi agens sadrži najmanje jedan od prvih 1, 2, 3, 4 ili 5 baznih parova u dupleks regijama od 5'-kraja antisens lanca koje se nezavisno biraju iz grupe koju čine: A:U, G:U, I:C i neusklađeni parovi, npr. ne-kaononska ili druga osim kanonskih uparivanja ili uparivanja koja uključuju univerzalnu bazu, kako bi se promovisala disocijacija antisens lanca na 5'-kraju dupleksa.
[0378] U jednoj implementaciji, nukleotid na poziciji 1 u dupleks regiji od 5'-kraja u antisens lancu je izabran iz grupe koju čine A, dA, dU, U i dT. Alternativno, bar jedan od prvih 1, 2 ili 3 baznih parova unutar dupleks regije od 5'-kraja antisens lanca je AU bazni par. Na primer, prvi bazni par unutar dupleks regije od 5'-kraja antisens lanca je AU bazni par.
[0380] U jednom otelotvorenju, sekvenca sens lanca može biti predstavljena formulom (I):
[0382] 5' n<p>-N<a>-(X X X)<i>-N<b>-Y Y Y-N<b>-(Z Z Z)<j>-N<a>-n<q>3' (I) gde:
[0383] i i j su svaki nezavisno 0 ili 1;
[0384] p i q su svaki nezavisno 0-6;
[0385] svaki N<a>nezavisno predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja sadrži 0-25 modifikovanih nukleotida, svaka sekvenca koja sadrži barem dva različito modifikovana nukleotida;
[0386] svaki N<b>nezavisno predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja sadrži 0-10 modifikovanih nukleotida;
[0387] svaki np i n<q>nezavisno predstavlja višak nukleotid;
[0388] gde Nb i Y nemaju istu modifikaciju; i
[0389] XXX, YYY i ZZZ svaki nezavisno predstavlja jedan motiv tri identične modifikacije na tri nukleotida za redom. Poželjno YYY su svi 2'-F modifikovani nukleotidi.
[0391] U jednoj implementaciji, N<a>i/ili N<b>sadrže modifikacije naizmeničnog obrasca.
[0393] U jednoj implementaciji, YYY motiv se dešava na ili blizu mesta cepanja sens lanca. Na primer, kada RNKi agens ima dupleks regiju dugačku 17-23 nukleotida, YYY motiv može da se nađe na ili u blizini mesta cepanja (npr.: može da se nađe na položajima 6, 7, 8, 7, 8, 9, 8, 9, 10, 9, 10, 11, 10, 11,12 ili 11, 12, 13) - sens lanca, brojanje počinje od prvog nukleotida, od 5'-kraja; ili opciono, brojanje počinje od prvog uparenog nukleotida unutar dupleks regije, od 5'- kraja.
[0395] U jednoj implementaciji, i je 1 i j je 0, ili i je 0 i j je 1, ili oba od i i j su 1. Sens lanac stoga može biti predstavljen narednim formulama:
[0397] 5' n<p>-N<a>-YYY-N<b>-ZZZ-N<a>-n<q>3' (Ib);
[0399] 5' n<p>-N<a>-XXX-N<b>-YYY-N<a>-n<q>3' (Ic);
[0401] ili
[0403] 5' n<p>-N<a>-XXX-N<b>-YYY-N<b>-ZZZ-N<a>-n<q>3' (Id).
[0404] Kada je sens lanac predstavljen formulom (Ib), N<b>predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja sadrži 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 ili 0 modifikovanih nukleotida. Svaki N<a>nezavisno može da predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja sadrži 2-20, 2-15, ili 2-10 modifikovanih nukleotida.
[0406] Kada je sens lanac predstavljen kao formula (Ic), N<b>predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja sadrži 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 ili O modifikovani nukleotidi. Svaki N<a>može nezavisno da predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja sadrži 2-20, 2-15, ili 2-10 modifikovanih nukleotida.
[0408] Kada je sens lanac predstavljen kao formula (Id), svaki N<b>nezavisno predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja sadrži 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 ili 0 modifikovanih nukleotida. Poželjno, N<b>je 0, 1, 2, 3, 4, 5 ili 6 svaki N<a>može nezavisno da predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja sadrži 2-20, 2-15, ili 2-10 modifikovanih nukleotida.
[0410] Svaki od X, Y i Z može biti isti ili drugačiji kao svi ostali.
[0412] U drugim implementacijama, i je 0 i j je 0, i sens lanac može biti predstavljen formulom:
[0414] 5' n<p>-N<a>-YYY-N<a>-n<q>3' (Ia).
[0415] Kada je sens lanac predstavljen formulom (Ia), svaki N<a>nezavisno može da predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja sadrži 2-20, 2-15, ili 2-10 modifikovanih nukleotida.
[0417] U jednoj implementaciji, sekvenca antisens lanca od RNKi može biti predstavljena formulom (II):
[0419] 5' n<q'>-N<a>'-(Z'Z'Z')<k>-N<b>'-Y'Y'Y'-N<b>'-(X'X'X')<l>-N'<a>-n<p>' 3' (II)
[0421] gde:
[0422] k i l su svaki nezavisno 0 ili 1;
[0423] p' i q' su svaki nezavisno 0-6;
[0424] svaki N<a>' nezavisno predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja sadrži 0-25 modifikovanih nukleotida, svaka sekvenca koja sadrži barem dva različito modifikovana nukleotida;
[0425] svaki N<b>' nezavisno predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja sadrži 0-10 modifikovanih nukleotida;
[0426] svaki n<p>' i n<q>' nezavisno predstavlja višak nukleotid;
[0427] gde N<b>' i Y' nemaju istu modifikaciju;
[0428] i
[0429] X'X'X', Y'Y'Y' i Z'Z'Z' svaki nezavisno predstavlja jedan motiv tri identične modifikacije na tri nukleotida za redom.
[0431] U jednoj implementaciji, N<a>' i/ili N<b>' sadrže modifikacije naizmeničnog obrasca.
[0433] Y'Y'Y' motiv se dešava na ili blizu mesta cepanja antisens lanca. Na primer, kada RNKi agens ima dupleks regiju dugačku 17-23 nukleotida, Y'Y'Y' motiv može da se nađe na položajima 9, 10, 11;10, 11, 12; 11, 12, 13; 12, 13, 14 ; ili 13, 14, 15 antisens lanca, uz do da brojanje počinje od prvog nukleotida, od 5'-kraja; ili opciono, brojanje počinje od prvog uparenog nukleotida unutar dupleks regije, od 5'- kraj. Poželjno, Y'Y'Y' motiv se dešava na položajima 11, 12, 13.
[0435] U jednoj implementaciji, Y'Y'Y' motiv su svi 2'-OMe modifikovani nukleotidi.
[0437] U jednoj implementaciji, k je 1 i l je 0, ili k je 0 i l je 1, ili oba od k i l su 1.
[0439] Antisens lanac stoga može biti predstavljen narednim formulama:
[0441] 5' n<q'>-N<a>'-Z'Z'Z'-N<b>'-Y'Y'Y'-N<a>'-n<p'>3' (IIb);
[0443] 5' n<q'>-N<a>'-Y'Y'Y'-N<b>'-X'X'X'-n<p'>3' (IIc);
[0445] ili
[0447] 5' n<q'>-N<a>'-Z'Z'Z'-N<b>'-Y'Y'Y'-N<b>'-X'X'X'-N<a>'-n<p'>3' (IId).
[0448] Kada je antisens lanac predstavljen formulom (IIb), N<b>'
predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja sadrži 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 ili 0 modifikovanih nukleotida. Svaki N<a>' nezavisno predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja sadrži 2-20, 2-15, ili 2-10 modifikovanih nukleotida.
[0450] Kada antisens lanac predstavljen kao formula (IIc), N<b>' predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja sadrži 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 ili 0 modifikovanih nukleotida. Svaki N<a>' nezavisno predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja sadrži 2-20, 2-15, ili 2-10 modifikovanih nukleotida.
[0452] Kada antisens lanac predstavljen kao formula (IId), svaki N<b>' nezavisno predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja sadrži 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 ili 0 modifikovanih nukleotida. Svaki N<a>' nezavisno predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja sadrži 2-20, 2-15, ili 2-10 modifikovanih nukleotida. Poželjno, N<b>je 0, 1, 2, 3, 4, 5 ili 6.
[0454] U drugim implementacijama, k je 0 i 1 je 0 i antisens lanac može biti predstavljen formulom:
[0456] 5' n<p'>-N<a'>-Y'Y'Y'-N<a'>-n<q'>3' (Ia).
[0457] Kada antisens lanac predstavljen kao formula (IIa), svaki N<a>' nezavisno predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja sadrži 2-20, 2-15, ili 2-10 modifikovanih nukleotida.
[0459] svaki od X', Y' i Z' može biti isti ili drugačiji kao svi ostali.
[0461] Svaki nukleotid sens lanca i antisens lanca može biti nezavisno modifikovan sa LNA, HNA, CeNA, 2'-metoksietil, 2'-O-metil, 2'-O-allil, 2'-C-allil, 2'-hidroksil, ili 2'-fluoro. Na primer, svaki nukleotid sens lanca i antisens lanca je nezavisno modifikovan sa 2'-O-metil ili 2'-fluoro. Svaki X, Y, Z, X', Y' i Z', naročito, može da predstavlja 2'-O-metil modifikaciju ili 2'-fluoro modifikaciju.
[0463] [0167] U jednoj implementaciji, sens lanac RNKi agensa može da sadrži YYY motiv koji se javlja na 9, 10 i 11 položajima lanca kada je dupleks regija dugačka 21 nt, brojanje počinje od prvog nukleotida od 5'-kraja, ili opciono, brojanje počinje od prvog uparenog nukleotida unutar dupleks regije, od 5'- kraj; i Y predstavlja 2'-F modifikaciju. Sens lanac može dodatno da sadrži XXX motiv ili ZZZ motiv kao modifikacije krila na suprotnom kraju dupleks regije; i XXX i ZZZ svaki nezavisno predstavlja 2'-OMe modifikaciju ili 2'-F modifikaciju.
[0465] U jednoj implementaciji antisens lanac može da sadrži Y'Y'Y' motiv koji se javlja na na položajima 11, 12, 13 lanca, brojanje počinje od prvog nukleotida od 5'-kraja, ili opciono, brojanje počinje od prvog uparenog nukleotida unutar dupleks regija, od 5'- kraj; i Y' predstavlja 2'-O-metil modifikacija. Antisens lanac može dodatno da sadrži X'X'X' motiv ili Z'Z'Z' motiv kao modifikacije krila na suprotnom kraju dupleksa regija; i X'X'X' i Z'Z'Z' svaki nezavisno predstavlja 2'-OMe modifikaciju ili 2'-F modifikaciju.
[0467] Sens lanac predstavljen bilo kojom od gore navedenih formula (Ia), (Ib), (Ic), i (Id) formira dupleks sa antisens lancem koji je predstavljen bilo kojom od gore navedenih formula (IIa), (IIb), (IIc), i (IId), respektivno.
[0469] Prema tome, RNKi agensi za primenu u opisanim postupcima mogu da sadrže sens lanac i antisens lanac, gde svaki lanac ima 14 do 30 nukleotida, RNKi dupleks predstavljen formulom (III):
[0470] sens: 5' n<p>-N<a>-(XXX)<i>-N<b>-YYY-N<b>-(ZZZ)<i>-N<a>-n<q>3'
[0471] antisens: 3' n<p>'-N<a>'-(X'X'X')<k>-N<b>'-Y'Y'Y'-N<b>'-(Z'Z'Z')<i>-N<a>'-n<q>'5'
[0473] (III)
[0474] gde:
[0475] i, j, k, i l su svaki nezavisno 0 ili 1;
[0476] p, p', q, i q' su svaki nezavisno 0-6;
[0477] svaki N<a>i N<a>' nezavisno predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja sadrži 0-25 modifikovanih nukleotida, svaka sekvenca koja sadrži barem dva različito modifikovana nukleotida;
[0478] svaki N<b>i N<b>' nezavisno predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja sadrži 0-10 modifikovanih nukleotida;
[0479] gde
[0480] svaki n<p>', n<p>, n<q>', i n<q>, gde svaki može ali ne mora biti prisutan, nezavisno predstavlja višak nukleotid; i
[0481] XXX, YYY, ZZZ, X'X'X', Y'Y'Y', i Z'Z'Z' svaki nezavisno predstavlja jedan motiv tri identične modifikacije na tri nukleotida za redom.
[0482] U jednom otelotvorenju, i je 0 i j je 0; ili i je 1 i j je 0; ili i je 0 i j je 1; ili oba od i i j su 0; ili oba od i i j su 1. U drugom otelotvorenju, k je 0 i l je 0; ili k je 1 i l je 0; k je 0 i l je 1; ili oba od k i l su 0; ili oba od k i 1 su 1.
[0484] Primerne kombinacije sens lanca i antisens lanca koji formiraju RNKi dupleks uključuju formule u nastavku:
[0485] 5' n<p>-N<a>-YYY-N<a>-n<q>3'
[0486] 3' n<p>'-N<a>'-Y'Y'Y'-N<a>'n<q>'5'
[0487] (IIIa)
[0489] 5' n<p>-N<a>-YYY-N<b>-ZZZ-N<a>-n<q>3'
[0490] 3' n<p>'-N<a>'-Y'Y'Y'-N<b>'-Z'Z'Z'-N<a>'-n<q>'5'
[0491] (IIIb)
[0493] 5' n<p>-N<a>-XXX-N<b>-YYY-N<a>-n<q>3'
[0494] 3' n<p>'-N<a>'-X'X'X'-N<b>'-Y'Y'Y'-N<a>'-n<q>'5'
[0495] (IIIc)
[0497] 5' n<p>-N<a>-XXX-N<b>-YYY-N<b>-ZZZ-N<a>-n<q>3'
[0498] 3' n<p>'-N<a>'-X'X'X'-N<b>'-Y'Y'Y'-N<b>'-Z'Z'Z'-N<a>'-n<q>'5'
[0499] (IIId)
[0501] Kada je RNKi agens predstavljen formulom (IIIa), svaki N<a>nezavisno predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja sadrži 2-20, 2-15, ili 2-10 modifikovanih nukleotida.
[0503] Kada je RNKi agens predstavljen formulom (IIIb), svaki N<b>nezavisno predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja sadrži 1-10, 1-7, 1-5 ili 1-4 modifikovanih nukleotida. Svaki N<a>nezavisno predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja sadrži 2-20, 2-15, ili 2-10 modifikovanih nukleotida.
[0505] Kada je RNKi agens predstavljen kao formula (IIIc), svaki N<b>, N<b>' nezavisno predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja sadrži 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 ili 0 modifikovanih nukleotida. Svaki N<a>nezavisno predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja sadrži 2-20, 2-15, ili 2-10 modifikovanih nukleotida.
[0506] Kada je RNKi agens predstavljen kao formula (IIId), svaki N<b>, N<b>' nezavisno predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja sadrži 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 ili 0 modifikovanih nukleotida. Svaki N<a>, N<a>' nezavisno predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja sadrži 2-20, 2-15, ili 2-10 modifikovanih nukleotida. Svaki od N<a>, N<a>', N<b>i N<b>' nezavisno obuhvata modifikacije naizmeničnog obrasca.
[0508] Svaki od X, Y i Z u formulama (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc), i (IIId) može biti isti ili drugačiji kao svi ostali.
[0510] Kada je RNKi agens predstavljen formulom (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc), i (IIId), barem jedan od Y nukleotida može formirati bazni par sa jednim od Y' nukleotida. Alternativno, barem dva od Y nukleotida formiraju bazne parove sa odgovarajućim Y' nukleotidima; ili svi tri od Y nukleotida svi formiraju bazne parove sa odgovarajućim Y' nukleotidima.
[0512] Kada je RNKi agens predstavljen formulom (IIIb) ili (IIId), barem jedan od Z nukleotida može formirati bazni par sa jednim od Z' nukleotidi. Alternativno, barem dva od Z nukleotida formiraju bazne parove sa odgovarajućim Z' nukleotidima; ili svi tri od Z nukleotida svi formiraju bazne parove sa odgovarajućim Z' nukleotidima.
[0514] Kada je RNKi agens predstavljen kao formula (IIIc) ili (IIId), barem jedan od X nukleotida može formirati bazni par sa jednim od X' nukleotida. Alternativno, barem dva od X nukleotida formiraju bazne parove sa odgovarajućim X' nukleotidima; ili svi tri od X nukleotida svi formiraju bazne parove sa odgovarajućim X' nukleotidima.
[0516] U jednoj implementaciji, modifikacija na Y nukleotidu je drugačija od modifikacije na Y' nukleotidu, modifikacija na Z nukleotidu je drugačija od modifikacije na Z' nukleotidu, i/ili modifikacija na X nukleotidu je drugačija od modifikacije na X' nukleotidu.
[0518] [0182] U jednoj implementaciji, kada je RNKi agens predstavljen formulom (IIId), N<a>modifikacije su 2'-O-metil ili 2'-fluoro modifikacije. U drugom otelotvorenju, kada je RNKi agens predstavljen formulom (IIId), N<a>modifikacije su 2'-O-metil ili 2'-fluoro modifikacije i n<p>' >0 i barem jedan n<p>' je vezan za susedni nukleotid putem fosforotioatne veze. U još jednom otelotvorenju, kada je RNKi agens predstavljen formulom (IIId), N<a>modifikacije su 2'-O-metil ili 2'-fluoro modifikacije, n<p>' >0 i barem jedan n<p>' je vezan za susedni nukleotid putem fosforotioatne veze, i sens lanac je konjugovan za jedan ili više GalNAc derivat vezan bivalentnim ili trovalentnim razgranatim veznikom. U drugom otelotvorenju, kada je RNKi agens predstavljen formulom (IIId), N<a>modifikacije su 2'-O-metil ili 2'-fluoro modifikacije , n<p>' >0 i barem jedan n<p>' je vezan za susedni nukleotid putem fosforotioatne veze, sens lanac obuhvata barem jednu fosforotioat vezu, i sens lanac je konjugovan za jedan ili više GalNAc derivat vezan bivalentnim ili trovalentnim razgranatim veznikom.
[0520] U jednoj implementaciji, kada je RNKi agens predstavljen formulom (IIIa), N<a>modifikacije su 2'-O-metil ili 2'-fluoro modifikacije , n<p>' >0 i barem jedan n<p>' je vezan za susedni nukleotid putem fosforotioatne veze, sens lanac obuhvata barem jednu fosforotioat vezu, i sens lanac je konjugovan za jedan ili više GalNAc derivat vezan bivalentnim ili trovalentnim razgranatim veznikom.
[0522] U jednoj implementaciji, RNKi agens je multimer koji sadrži barem dva dupleksa predstavljen formulama (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc), i (IIId), gde su dupleksi spojeni veznikom. Veznik može da bude takav da može da se cepa ili da ne može da se cepa. Opciono, multimer dalje obuhvata ligand. Svaki dupleks može da cilja isti gen ili dva različita gena; ili svaki dupleks može da cilja isti gen na dva različita ciljana mesta.
[0524] U jednoj implementaciji, RNKi agens je multimer koji sadrži tri, četiri, pet, šest ili više dupleksa predstavljen formulama (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc), i (IIId), gde su dupleksi spojeni veznikom. Veznik može da bude takav da može da se cepa ili da ne može da se cepa. Opciono, multimer dalje obuhvata ligand. Svaki dupleks može da cilja isti gen ili dva različita gena; ili svaki dupleks može da cilja isti gen na dva različita ciljana mesta.
[0526] U jednoj implementaciji, dva RNKi agensi predstavljeni formulom (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc), i (IIId) su vezani za svaki drugi na 5' kraju, i jedan ili oba od 3' kraja i su opciono konjugovani za ligand. Svaki od agenasa može da cilja isti gen ili dva različita gena; ili svaki od agenasa može da cilja isti gen na dva različita ciljana mesta.
[0528] Različite publikacije opisuju multimerne RNKi agense koji se mogu koristiti u postupcima pronalaska. Takve publikacije obuhvataju VO2007/091269, US Patent br.
[0529] 7858769, VO2010/141511, VO2007/117686, VO2009/014887 i VO2011/031520, celokupan sadržaj od kojih je svaki ovde uključen ovde referencom.
[0531] RNKi agens koji sadrži konjugacije jedne ili više ugljenih hidrata u RNKi agensu može optimizovati jedno ili više svojstava RNKi agensa. U mnogim slučajevima, ugljeni hidratni deo će biti vezan za modifikovanu podjedinicu agenasa RNKi. Na primer, ribozni šećer jedne ili više ribonukleotidnih podjedinica dsRNK agensa može biti zamenjen drugim delom, npr. ne-ugljenim-hidratom (poželjno cikličkom) nosaču na koji je vezan ugljeni hidratni ligand. Ribonukleotidna podjedinica u kojoj je ribozni šećer podjedinice tako zamenjen ovde se ovde pominje kao podjedinica za modifikaciju zamene riboza (RRMS). Ciklični nosač može biti karbociklični prstenasti sistem, tj. svi atomi prstena su atomi ugljenika ili heterociklični prstenasti sistem, tj. jedan ili više atoma prstena mogu biti heteroatom, npr. azot, kiseonik, sumpor. Ciklični nosač može biti monociklični prstenasti sistem ili može sadržati dva ili više prstenova, npr. spojeni prstenovi. Ciklični nosač može biti potpuno zasićeni prstenasti sistem ili može sadržati jednu ili više dvostrukih veza.
[0533] Ligand može biti vezan za polinukleotid preko nosača. Nosioci uključuju (i) najmanje jednu „tačku pričvršćivanja", poželjno dve „tačke za pričvršćivanje“ i (ii) najmanje jednu „vezivnu tačku pričvršćivanja.“ „Tačka pričvršćivanja“ kad se ovde koristi odnosi se na funkcionalnu grupu, npr. hidroksil grupa ili generalno dostupna veza i koja je pogodna za inkorporiranje nosača u kičmu, na primer, fosfat ili modifikovani fosfat, npr. sumpor koji sadrži, kičmu, ribonukleinske kiseline. „Priključna tačka za vezivanje“ (TAP) u nekim otelotvorenjima se odnosi na sastavni atom prstena cikličkog nosača, npr. atoma ugljenika ili heteroatoma (koji se razlikuje od atoma koji pruža tačku pričvršćivanja), koji povezuje izabranu grupu. Ostatak može biti, na primer, ugljeni hidrat, npr. monosaharid, disaharid, trisaharid, tetrasaharid, oligosaharid i polisaharid. Opciono, izabrani deo je preko interferišućeg veznika povezan sa cikličnim nosačem. Prema tome, ciklični nosač će često uključivati funkcionalnu grupu, npr., amino grupu ili generalno pružiti vezu koja je pogodna za inkorporaciju ili vezivanje drugog hemijskog entiteta, npr., liganda za sastavni prsten.
[0535] [0190] RNKi agensi mogu biti konjugovani u ligand preko nosača, pri čemu nosač može biti ciklična grupa ili aciklična grupa; Poželjno, ciklična grupa je odabrana od pirolidinila, pirazolinila, pirazolidinila, imidazolinila, imidazolidinila, piperidinila, piperazinila, [1,3] dioksolana, oksazolidinila, izoksazolidinila, morfolinila, tiazolidinila, izotiazolidinila, hinoksalinila, piridazinonila, tetrahidrofurila i dekana; poželjno, aciklična grupa je izabrana od serinoloske kičme ili dijetanolaminske kičme.
[0537] U određenim specifičnim implementacijama, RNKi agens za upotrebu u postupcima prema pronalasku je sredstvo izabrano iz grupe agensa navedenih u tabeli 1 i tabelu 2.
[0539] Ovi agensi mogu dalje sadržati ligand.
[0541] A. Ligandi
[0542] Dvostruki RNK (dsRNK) agensi mogu opciono biti konjugovani sa jednim ili više liganda. Ligand se može pričvrstiti na sens lanac, antisens lanac ili oba, na 3'-kraj, 5'-kraj ili oba kraja. Na primer, ligand može biti konjugovan na sens. U poželjnim otelotvorenjima, ligand je konjugovan na 3'-kraj sens lanca. U jednom poželjnom otelotvorenju, ligand je GalNAc ligand. U posebno poželjnim otelotvorenjima, ligand je GalNAc3:
[0545]
[0548] U nekim otelotvorenjima, ligand, npr., GalNAc ligand, je povezan sa 3' krajem RNKi agensa. U jednom otelotvorenju, RNKi agens je konjugovan sa ligandom, npr. GalNAc ligandom, kao što je prikazano u sledećoj šemi
[0551]
[0553] gde je Ks O ili S. U jednoj implementaciji, Ks je O.
[0554] Širok spektar entiteta može biti spojen sa RNKi agensima ovog pronalaska.
[0555] Preferirani delovi su ligandi, koji su spojeni, poželjno kovalentno, bilo direktno ili indirektno putem interferirajućeg lanca.
[0557] U poželjnim implementacijama, ligand menja distribuciju, ciljanje ili vek trajanja molekula u koji je ugrađen. U poželjnim implementacijama ligand pruža poboljšani afinitet za odabran cilj, npr. molekul, ćeliju ili ćelijsku vrstu, odeljak, receptor npr. ćelijski ili organski odeljak, tkivo, organ ili regiju tela, kao što je npr. u poređenju sa vrstom koja nema takav ligand. Ligandi koji pružaju poboljšani afinitet za izabran cilj takođe se nazivaju ciljajućim ligandima.
[0559] Neki ligandi mogu imati endozomolitička svojstva. Endozomolitički ligandi promovišu lizu endozoma i/ili transport sastavi pronalaska, ili njegovih komponenti, od endozoma do citoplazme ćelije. Endozomolitički ligand može biti polianjonski peptid ili peptidomimetik koji pokazuje pH-zavisnu aktivnost membrane i fuzogenost. U jednom aspektu, endozomolitički ligand pretpostavlja svoju aktivnu konformaciju kod endozomalnog pH. „Aktivna“ konformacija je ona konformacija u kojoj endozomolitički ligand promoviše lizu endozoma i/ili transporta sastavi pronalaska, ili njegovih komponenti, od endozoma do citoplazme ćelije. Primerni endozomolitički ligandi uključuju GALA peptid (Subbarao i dr., Biochemistry, 1987, 26: 2964-2972), EALA peptid (Vogel i dr., J. Am. Chem. Soc., 1996, 118: 1581-1586), i njihove derivate (Turk i dr., Biochem. Biophys. Acta, 2002, 1559: 56-68). U jednom aspektu, endozomolitička komponenta može sadržati hemijsku grupu (npr., aminokiselinu) koja će se podvrgnuti promeni u naelektrisanju ili protoniranju u odgovoru na promenu pH. Endozomolitička komponenta može biti linearna ili razgranata.
[0561] Ligandi mogu poboljšati svojstva transporta, hibridizacije i specifičnosti, a takođe mogu poboljšati rezistenciju nukleaze nastalog prirodnog ili modifikovanog oligoribonukleotida ili polimernog molekula koji sadrži bilo koju kombinaciju monomera opisanih ovde i/ili prirodnih ili modifikovanih ribonukleotida.
[0563] [0199] Ligandi uopšteno mogu da sadrže terapeutske modifikatore, npr., za poboljšanje uzimanja; dijagnostička jedinjenja ili grupe reportera, npr., za praćenje distribucije; agensi za unakrsno povezivanje; i rezistenciju na nukleaze. Opšti primeri uključuju lipide, steroide, vitamine, šećere, proteine, peptide, poliamine i peptidne mimike.
[0565] Ligandi mogu uključivati supstancu koja se prirodno pojavljuje, kao što je protein (npr. ljudski serumski albumin (HSA), lipoprotein niske gustine (LDL), lipoprotein visoke gustine (HDL) ili globulin); ugljeni hidrat (npr., dekstran, pululan, citin, hitosan, inulin, ciklodekstrin ili hijaluronska kiselina); ili lipid. Ligand takođe može biti rekombinantni ili sintetički molekul, kao što je sintetski polimer, npr., sintetička poliaminska kiselina, oligonukleotid (npr., aptamer). Primeri poliaminokiselina koji uključuju poliaminokiselinu su poli-lizin (PLL), poli-L-asparatna kiselina, poli-L-glutaminska kiselina, kopolimer anhidrida stirol-maleinske kiseline, poli (L-laktid-ko-glikolirani) kopolimer, divinil eter-malein anhidrid kopolimer, N-(2-hidroksipropil) metakrilamid kopolimer (HMPA), polietilenglikol (PEG), polivinil alkohol (PVA), poliuretan, poli(2-etilakrilna kiselina), N-izopropilakrilamid polimeri ili polifosfazin. Primer poliamina obuhvata: polietilenin, polilizin (PLL), spermin, spermidin, poliamin, pseudopeptid-poliamin, peptidomimetski poliamin, dendrimer poliamin, arginin, amidin, protamin, katjonski lipid, katjonski porfirin, kvaternarnu so poliamina ili alfa spirusno peptid.
[0567] Ligandi takođe mogu da obuhvate grupe za ciljanje, npr., agens za ciljanje ćelija ili tkiva, na primer, lektin, glikoprotein, lipid ili protein, na primer, antitelo koje se vezuje za određeni tip ćelije kao što je ćelija bubrega. Ciljna grupa može biti tirotropin, melanotropin, lektin, glikoprotein, površinski aktivni protein A, Mucin ugljeni hidrat, multivalentna laktoza, multivalentna galaktoza, N-acetil-galaktozamin, multivalentna manoza N-acetilgulukosamina, multivalentna fukoza, glikozilovane poliaminoacide, multivalentna galaktoza, transferin, bisfosfonat, poliglutamat, poliaspartat, lipid, holesterol, steroid, žučna kiselina, folat, vitamin B12, biotin, RGD peptid, membetik RGD peptida ili aptamer.
[0569] [0202] Drugi primeri liganda uključuju boje, interkalirajuće agense (npr. akridine), unakrsne veze (npr. Psoralen, mitomicin C), porfirine (TPPC4, tekaphirin, Sapphirin), policiklične aromatične ugljovodonike (npr. fenazin, dihidrofenazin), veštačke endonukleaze ili helator (npr. EDTA), lipofilne molekule, npr. holesterol, holinska kiselina, adamantan sirćetna kiselina, 1-piren maslena kiselina, dihidrotestosteron, 1,3-Bis-O(heksadecil)glicerol, geraniloksiheksil grupa, heksadecilglicerol, mentol, 1,3-propandiol, heptadecil grupa, palmitinska kiselina, miristinska kiselina, O3-(oleoil)litoholna kiselina, O3-(oleoil)holenska kiselina, dimetoksitritel ili fenoksazin) i peptidni konjugati (npr. antenapedia peptid, Tat peptid), alkilirajuće agense, fosfat, amino, merkapto, PEG (npr., PEG-40K), MPEG, [MPEG]<2>, poliamino, alkil, supstituisani alkil, radioobeleženi markeri, enzimi, hapteni (npr. biotin), transportatori/apsorpcioni facilitatori (npr., aspirin, vitamin E, folna kiselina), sintetička ribonukleaza (npr., imidazol, bisimidazol, histamin, imidazol klasteri, akridinimidazol konjugati, Eu3+ kompleksi tetraazamakrocikla), dinitrofenil, HRP ili AP.
[0571] Ligandi mogu biti proteini, npr. glikoproteini ili peptidi, npr. molekuli koji imaju specifičan afinitet za ko-ligand ili antitela npr. antitelo koje se vezuje za određeni tip ćelije kao što je ćelija raka, endotelna ćelija, ili koštana ćelije. Ligandi mogu takođe uključivati hormone i receptore hormona. Mogu se takođe uključiti i ne-peptidne vrste, kao što su lipidi, lektini, ugljeni hidrati, vitamini, kofaktori, multivalentna laktoza, multivalentna galaktoza, N-acetilgalaktozamin, multivalentna manoza N-acetil-gulukosamina, multivalentna fukoza ili aptameri. Ligand može biti, na primer, lipopolisaharid, aktivator p38 MAP kinaze ili aktivator NF-kB.
[0573] Ligand može biti supstanca, npr. lek, koji može povećati uzimanje iRNK agensa u ćeliju, na primer, poremećavajući citoskelet ćelije, npr. prekidanjem mikrotubula ćelije, mikrofilamenata i/ili intermedijarnih filamenata. Lek može biti, na primer, takson, vinkristin, vinblastin, citohalazin, nokodazol, japlakinolid, latrunculin A, faloidin, svinholid A, indanocin ili mioservin.
[0575] Ligand može povećati unošenje oligonukleotida u ćeliju pomoću, na primer, aktiviranja upalnog odgovora. Primeri liganda koji bi imali takav efekat uključuju faktor tumorske nekroze alfa (TNFalpha), interleukin-1 beta ili gama interferon.
[0577] [0206] U jednom aspektu, ligand je molekul na bazi lipida ili lipida. Takav molekul na bazi lipida ili lipida poželjno se vezuje serumskim proteinom, npr. ljudskim serumskim albuminom (HSA). HSA vezujući ligand dozvoljava distribuciju konjugata u ciljano tkivo, npr. ciljano ne-bubrežno tkivo tela. Na primer, ciljano tkivo može biti jetra, uključujući parenhimske ćelije jetre. Ostali molekuli koji mogu vezati HSA mogu se takođe koristiti kao ligandi. Na primer, naproksen ili aspirin se mogu koristiti. Lipid ili ligand zasnovan na lipidu može (a) povećati otpornost na degradaciju konjugata, (b) povećati ciljanje ili transport u ciljnu ćeliju ili ćelijsku membranu, i/ili (c) se može koristiti za prilagođavanje vezivanja za serumski protein, npr. HSA.
[0579] Ligand bazirani ligand se može koristiti za modulaciju, na primer, kontrolu vezivanja konjugata na ciljano tkivo. Na primer, lipid ili ligand zasnovan lipidu koji se veće vezuje za HSA će manje verovatno biti ciljani na bubreg i stoga je manji rizik da će biti očišćen iz tela. Lipid ili ligand zasnovan lipidu koji se manje vezuje za HSA može se koristiti za ciljanje konjugata na bubreg.
[0581] U poželjnoj implementaciji, ligand zasnovan lipidu vezuje HSA. Poželjno, vezuje HSA sa dovoljnim afinitetom tako da je konjugat poželjno raspoređen u tkivo bez bubrega. Međutim, poželjno je da afinitet nije toliko jak da vezivanje HSA-liganda ne može biti obrnuto.
[0583] U još jednoj poželjnoj implementaciji, lipidni ligand vezuje HSA slabo ili uopšte ne, tako da je konjugat poželjno distribuiran do bubrega. Druge grupe koje se bave bubrežnim ćelijama mogu se takođe koristiti umesto ili pored lipidnog liganda.
[0585] U drugom aspektu, ligand je deo, na primer, vitamina, koji uzima ciljana ćelija, npr., proliferirajuća ćelija. Ovo su posebno korisno za lečenje poremećaja koje karakteriše neželjena proliferacija ćelija, npr. malignog ili nemalignog tipa, npr. ćelija raka. Primeri vitamina uključuju vitamin A, E i K. Ostali primeri vitamina uključuju vitamine B, npr. folnu kiselinu, B12, riboflavin, biotin, piridoksal ili druge vitamine ili hranljive materije koje uzimaju ćelije raka. Uključeni su i HAS, lipoprotein male gustine (LDL) i lipoprotein visoke gustine (HDL).
[0587] U drugom aspektu, ligand je agens za propuštanje ćelija, poželjno spiralni agens za propuštanje ćelija. Poželjno, agens je amfipatičan. Primerni agens je peptid kao što je tat ili antenopedija. Ako je agens peptid, može se modifikovati, uključujući peptidilmimetičku, invertormu, nepeptidnu ili pseudopeptidnu vezu i upotrebu D-aminokiselina. Spiralni agens je poželjno alfa-spiralni agens, koje poželjno ima lipofilnu i lipofobnu fazu.
[0589] [0212] Ligand može biti peptid ili peptidomimetik. Peptidomimetik (takođe ovde označen kao oligopeptidomimetik) je molekul sposoban za preklapanje u definisanu trodimenzionalnu strukturu sličnu prirodnom peptidu. Peptidni ili peptidomimetički deo može biti dug oko 5-50 aminokiselina, npr. oko 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ili 50 aminokiselina. Peptid ili peptidomimetik mogu biti, na primer, peptid permeacije ćelija, katjonski peptid, amfipatski peptid ili hidrofobni peptid (npr., sastoji se prvenstveno od Tyr, Trp ili Phe). Peptidni deo može biti dendrimer peptid, ograničeni peptid ili ukršteni peptid. U drugoj alternativi, peptidni deo može obuhvatiti translacijsku sekvencu hidrofobne membrane (MTS). Primerni hidrofobni peptid koji sadrži MTS je RFGF koji ima sekvencu aminokiselina AAVALLPAVLLALLAP (SEQ ID NO: 1). Analogni RFGF (npr., sekvenca aminokiselina AALLPVLLAAP (SEQ ID NO: 2)) koja sadrži hidrofobni MTS takođe može biti ciljni deo. Peptidni deo može biti peptid „isporuke“ koji može nositi velike polarne molekule uključujući peptide, oligonukleotide i proteine preko ćelijskih membrana. Na primer, utvrđeno je da su sekvence iz proteina HIV Tat (GRKKRRQRRRPPQ (SEQ ID NO: 3)) i Drosophila Antennapedia proteina (RQIKIWFQNRRMKWKK (SEQ ID NO: 4)) sposobne da funkcionišu kao peptidi isporuke. Peptid ili peptidomimetik mogu biti kodirani nasumičnom sekvencom DNK, kao što je peptid identifikovan iz biblioteke faga-displeja ili jedan-zrno-jedan-jedinjenje (OBOC) kombinatorijalne biblioteke (Lam i dr., Nature, 354:82-84, 1991). Poželjno, peptid ili peptidomimetik vezan za iRNK agens preko inkorporirane monomerne jedinice je peptid koji cilja na ćelije kao što je arginin-glicin-asparaginska kiselina (RGD)-peptid ili RGD mimik. Peptidni deo može biti dužine od oko 5 aminokiselina do oko 40 aminokiselina. Peptidne grupe mogu imati strukturne modifikacije, kao što su povećanje stabilnosti ili direktnih konformacijskih osobina. Bilo koja od strukturnih modifikacija opisanih dole može biti korišćena. RGD peptidni deo može se koristiti za ciljanje tumorske ćelije, kao što je endotelna tumorska ćelija ili tumorska ćelija raka dojke (Zitzmann i dr., Cancer Res., 62:5139-43, 2002). RGD peptid može olakšati ciljanje iRNK agensa na tumore različitih drugih tkiva, uključujući pluća, bubrege, slezinu ili jetru (Aoki i dr., Cancer Gene Therapy 8:783-787, 2001). Poželjno, RGD peptid će olakšati ciljanje iRNK agensa na bubreg. RGD peptid može biti linearan ili cikličan i može se modifikovati, npr., glikozilovati ili metilirati kako bi se olakšalo ciljanje na specifična tkiva. Na primer, glikozilovani RGD peptid može isporučiti iRNK agens u tumorsku ćeliju koja eksprimira α<V>ß<3>(Haubner i dr., Jour. Nucl. Med., 42:326-336, 2001). Peptidi koji ciljaju markere obogaćene proliferirajućim ćelijama mogu se koristiti. Na primer, RGD koji sadrži peptide i peptidomimetike može ciljati ćelije raka, posebno ćelije koje imaju integrin. Tako se mogu koristiti RGD peptidi, ciklični peptidi koji sadrže RGD, RGD peptide koji uključuju D-aminokiseline, kao i sintetičke RGD mimike. Pored RGD-a, mogu se koristiti i druge grupe koje ciljaju integrin ligand. Generalno, takvi ligandi mogu se koristiti za kontrolu ćelija proliferacije i angiogeneze. Poželjni konjugati ove vrste ligand mete PECAM-1, VEGF ili drugi geni kancera, npr. gen tumora opisan ovde.
[0591] „Peptid koji prolazi kroz ćeliju“ je sposoban da prođe kroz ćeliju, na pr., mikrobiološku ćeliju, kao što je bakterijska ili gljivična ćelija, ili ćeliju sisara, kao što je ćelija čoveka. Mikrobni peptid koji prolazi kroz ćelije može biti, na primer, α-spiralni linearni peptid (npr. LL-37 ili Ceropin P1), peptid koji sadrži disulfidnu vezu (npr. α-defensin, βdefensin ili bakterenin) ili peptid koji sadrži samo jednu ili dve dominantne aminokiseline (npr. PR-39 ili indolistidin). Peptid koji prolazi kroz ćeliju može takođe uključiti signal nuklearne lokalizacije (NLS). Na primer, peptid koji prolazi kroz ćeliju može biti bipartitni amfipatski peptid, kao što je MPG, koji je izveden iz domena fuzionog peptida HIV-1 gp41 i NLS velikog T antigena SV40 (Simeoni i dr., Nucl. Acids Res.31:2717-2724, 2003).
[0593] U jednoj implementaciji, ciljni peptid može biti amfipatski α-spiralni peptid. Primeri amfipatskih α- spiralnih peptida uključuju, ali se ne ograničavaju na, cekropine, likotoksine, paradaksine, buforin, CPF, bombininu sličan peptid (BLP), katetilidine, ceratotoksine, S. clava peptide, intestinalne antimikrobne peptide (HFIAPs) slepulja, magainine, brevinine-2, dermaseptine, melitine, pleurocidine, H<2>A peptide, Ksenopus peptide, eskulentinis-1 i caerine. Poželjno je uzeti u obzir niz faktora kako bi se održao integritet stabilnosti spirale. Na primer, biće iskorišćen maksimalan broj ostataka stabilizacije spirale (npr. leu, ala ili lis), a ostaci destabilizacije spektra minimalnog broja će se koristiti (npr. prolin ili ciklične monomerne jedinice. Ograničavanje ostatka će se razmotriti (na primer, Gli je primerni N-ograničavajući ostatak i/ili C-terminalna amidacija mogu se koristiti za pružanje dodatne H-veze za stabilizaciju spirale. Formiranje solnih mostova između ostataka suprotnih apona, odvojenih sa ± 3 ili ± 4 položaja može dati stabilnost. Na primer, katjonski ostaci kao što su lizin, arginin, homo-arginin, ornitin ili histidin mogu da formiraju solne mostove pomoću anjonskih ostataka glutamata ili aspartata.
[0595] Peptidni i peptidomimetički ligandi uključuju one koji imaju prirodne ili modifikovane peptide, npr., D ili L peptide; α, β, ili γ peptide; N-metil peptide; azapeptide; peptide koji imaju jedan ili više amida, t.j., peptide, veze zamenjene jednim ili više vezom uree, tiouree, karbamate ili sulfonil uree; ili ciklične peptide.
[0596] Ciljani ligand može biti bilo koji ligand koji je sposoban da cilja određeni receptor. Primeri su: folat, GalNAc, galaktoza, manoza, manoza-6P, klasteri šećera kao što su GalNAc klaster, manozni klaster, galaktozni klaster ili apatamer. Klaster je kombinacija dve ili više jedinice šećera. Ciljni ligandi takođe uključuju ligande receptora integrina, ligande receptore hemokina, transferin, biotin, serotonin receptorske ligande, PSMA, endotelin, GCPII, somatostatin, LDL i HDL ligande. Ligandi takođe mogu biti bazirani na nukleinskoj kiselini, npr. aptameru. Aptamer može biti nemodifikovan ili imati bilo koju kombinaciju modifikacija obelodanjenih ovde.
[0598] Agensi za oslobađanje endozoma uključuju imidazole, poli ili oligoimidazole, PEI, peptide, fuzogene peptide, polikaboksilate, poliakacije, maskirani oligo ili polikatacije ili anjone, acetale, poliacetale, ketale/poliketale, ortoestre, polimere sa maskiranim ili nemaskiranim katjonskim ili anjonskim naelektrisanjima, dendrimere sa maskiranim ili nemaskiranim katjonskim ili anjonskim naelektrisanjima.
[0600] PK modulator označava farmakokinetički modulator. Modulatori PK uključuju lipofile, žučne kiseline, steroide, analoge fosfolipida, peptide, agense za vezivanje proteina, PEG, vitamine i sl. Primerni PK modulatori uključuju, ali bez ograničavanja na, holesterol, masne kiseline, fosfolipide, sfingolipide, naproksen, ibuprofen, vitamin E, biotin itd. Takođe poznato je da se oligonukleotidi koji sadrže niz veza fosforotioata vezuju za serumski protein, a time i kratke oligonukleotide, npr. oligonukleotide od oko 5 baza, 10 baza, 15 baza ili 20 baza, koje sadrže višestruke fosforotioatne veze u kičmi, takođe su obuhvaćeni ovim pronalaskom kao ligandi (npr. kao PK modulišući ligandi).
[0602] Pored toga, aptameri koji vezuju serumske komponente (npr., serumske proteine) takođe su obuhvaćeni ovim pronalaskom kao PK modulišući ligandi.
[0604] Drugi konjugati liganda koji obuhvaćeni ovim pronalaskom opisani su u U.S. prijave patenata USSN: 10/916,185 , podnesena 10. avgusta 2004.; USSN: 10/946,873, podnesena 21. septembra 2004; USSN: 10/833,934, podnesena 3. avgusta 2007; USSN: 11/115,989 podnesena 27. aprila 2005 i USSN: 11/944.227 podnesena 21. novembra 2007.
[0606] [0221] Kada su prisutni dva ili više liganda, ligandi mogu svi imati ista svojstva, mogu svi imati različita svojstva ili neki ligandi mogu imati ista svojstva, dok drugi imaju različita svojstva. Na primer, ligand može imati svojstva ciljanja, imati endozomolitičku aktivnost ili imati PK modulirajuća svojstva. U poželjnom otelotvorenju, svi ligandi imaju različita svojstva.
[0608] Ligande se mogu povezati sa oligonukleotidima na različitim mestima, na primer, 3'-kraj, 5'-kraj i/ili na unutrašnjoj poziciji. U poželjnim otelotvorenjima, ligand je pričvršćen za oligonukleotide preko interferirajućeg tetera, npr. nosača opisanog ovde. Ligand ili teterisani ligand može biti prisutan na monomeru kada je monomer ugrađen u rastući lanac. U nekim otelotvorenjima, ligand se može inkorporirati pomoću spajanja na „prekursorski“ monomer nakon što je monomer „prekursora“ ugrađen u rastući lanac. Na primer, monomer koji ima, na primer, amino-prekinut teter (tj., nema povezanog liganda), npr., TAP-(CH<2>)<n>NH<2>možda je inkorporiran u rastuću liniju oligonukelotida. U sledećoj operaciji, tj. nakon inkorporacije prekursor monomera u vezu, ligand koji ima elektrofilnu grupu, npr. pentafluorofenil estar ili aldehidnu grupu, može se naknadno priključiti na prekursorski monomer spajanjem elektrofilne grupe liganda sa terminalnom nukleofilnom grupa prekursora monomerovog tetra.
[0610] U drugom primeru, monomer koji ima hemijsku grupu pogodnu za učestvovanje u reakciji hemijske reakcije, može biti inkorporiran, npr., azid ili alkin-vezan teter/veznik. U sledećoj operaciji, tj. nakon inkorporacije monomera prekursora u lanac, ligand koji ima komplementarnu hemijsku grupu, npr. alkin ili azid može biti vezan za prekursor monomer spajanjem alkina i azida zajedno.
[0612] Za dvostruke oligonukleotide, ligand može biti pričvršćen za jednu ili oba lanca. U nekim otelotvorenjima, dvolančani iRNK agens sadrži ligand konjugovan u sens lancu. U drugim otelotvorenjima, dvolančani iRNK agens sadrži ligand konjugovan u antisens lancu.
[0614] [0225] U nekim implementacijama, ligand može biti konjugovan na nukleobaze, šećerne delove ili internukleozidne veze molekula nukleinske kiseline. Konjugacija za purinske nukleobaze ili njihove derivate može se pojaviti na bilo kojoj poziciji uključujući, endociklične i egociklične atome. U nekim otelotvorenjima položaji 2-, 6-, 7- ili 8-položaja purinske nukleobaze su pričvršćeni za konjugatni deo. Konjugovanje na pirimidinske nukleobaze ili njihovi derivati takođe se mogu pojaviti na bilo kojoj poziciji. U nekim otelotvorenjima, položaji 2-, 5- i 6 pirimidinske nukleobaze mogu biti supstituisani sa konjugatnim delom. Konjugovanje sa šećernim ostacima nukleozida može se pojaviti na bilo kom ugljeničnom atomu. Primeri ugljenikovih atoma sa šećernim ostacima koji se mogu vezati za konjugatni deo uključuju 2 ', 3' i 5' atoma ugljenika. Položaj 1' se takođe može spojiti sa konjugovanim delom, kao što je u abasičkom ostatku. Internukleozidne veze takođe mogu nositi konjugatne delove. Za veze koje sadrže fosfor (npr., fosfodiester, fosforotioat, fosforoditioat, fosforomidat i slično), konjugatni deo može biti vezan direktno na atom fosfora ili na atom O, N ili S vezan za atom fosfora. Za internukleozidne veze koje sadrže amin ili amid (npr., PNA), konjugatski deo može biti vezan za atom azota amina ili amida ili susednog ugljenikovog atoma.
[0616] Može se koristiti bilo koji pogodan ligand u polju interferencije RNK, iako je ligand uglavnom ugljeni hidrat, npr. monosaharid (kao što je GalNAc), disaharid, trisaharid, tetrasaharid, polisaharid.
[0618] Veznici koji konjuguju ligand u nukleinsku kiselinu uključuju one koje su gore razmatrani. Na primer, ligand može biti jedan ili više derivata GalNAc (N-acetilglukozamin) vezanih preko bivalentnog ili trivalentnog razgranatog veznika.
[0620] U jednoj implementaciji, dsRNK pronalaska je konjugovana na bivalentne i trivalentne razgranate veznike koji uključuju strukture prikazane u bilo kojoj od formula (IV) – (VII):
[0623]
[0626] gde:
[0627] q<2A>, q<2B>, q<3A>, q<3B>, q4<A>q<4B>, q<5A>, q<5B>i q<5C>predstavljaju nezavisno za svaku pojavu 0-20 i gde ponavljajuća jedinica može biti ista ili različita; P<2A>, P<2B>, P<3A>, P<3B>, P<4A>, P<4B>, P<5A>, P<5B>, P<5C>, T<2A>, T<2B>, T<3A>, T<3B>, T<4A>, T<4B>, T<4A>, T<5B>, T<5C>su svi nezavisno za svaku pojavu odsutni, CO, NH, O, S, OC(O), NHC(O), CH<2>, CH<2>NH ili CH<2>O;
[0628] Q<2A>, Q<2B>, Q<3A>, Q<3B>, Q<4A>, Q<4B>, Q<5A>, Q<5B>, Q<5C>su nezavisno za svaku pojavu odsutni, alkilen, supstituisan alkilen gde jedan ili više metilene može biti ometen ili prekinut jednim ili više od O, S, S(O), SO<2>, N(R<N>), C(R')=C(R"), C=C ili C(O);
[0629] R<2A>, R<2B>, R<3A>, R<3B>, R<4A>, R<4B>, R<5A>, R<5B>, R<5C>su svi nezavisno za svaku pojavu odsutni,
[0632]
[0634] ili heterociklil;
[0635] L<2A>, L<2B>, L<3A>, L<3B>, L<4A>, L<4B>, L<5A>, L<5B>i L<5C>predstavljaju ligand; i.e. svaki nezavisno za svaku pojavu monosaharid (kao što je GalNAc), disaharid, trisaharid, tetrasaharid, oligosaharid, ili polisaharid; i
[0636] R<a>je H ili bočni lanac aminokiseline.
[0638] Trivalentni konjugujući GalNAc derivat su naročito korisni za primenu sa RNKi agensima za inhibiranje eksprimiranja ciljanog gena, kao što su oni formule (VII):
[0641]
[0643] gde L<5A>, L<5B>i L<5C>predstavljaju monosaharid, kao što je GalNAc derivat. Primeri odgovarajućih bivalentih i trivalentnih razgranatih grupa veznika konjugujućeg GalNAc derivata uključuju, ali bez ograničavanja na, naredna jedinjenja:
[0644]
[0645]
[0647] U drugim implementacijama, RNKi agens za primenu u postupku pronalaska je agens izabran iz grupe koju čine AD-53815, AD-56663, AD-56658, AD-56676, AD-56666, AD-57928, i AD-60212.
[0648] III. Isporuka iRNK pronalaska
[0649] Isporuka iRNK agensa pronalaska u ćeliju npr. ćelija unutar pacijenta, kao što je ljudski pacijent (npr. pacijent kom je to potrebno, kao što je osoba koja ima lipidni poremećaj, kao što je hiperlipidemija ) može se postići na više različitih načina. Na primer, isporuka može biti izvedena dovođenjem u dodir ćelije sa iRNK pronalaska bilo in vitro ili in vivo. Isporuka in vivo može takođe biti izvedena direktno davanjem sastavi koja sadrži iRNK, npr., dsRNK, pacijentu. Alternativno, isporuka in vivo može se vršiti indirektno davanjem jednog ili više vektora koji kodiraju i usmeravaju eksprimiranje iRNK. Ove alternative su diskutovane dalje u nastavku.
[0651] Generalno, svaki način isporuke molekula nukleinske kiseline (in vitro ili in vivo) može se prilagoditi za upotrebu sa iRNK pronalaska (pogledati npr. akhtar S. and Julian RL. (1992) Trends Cell. Biol.2(5):139-144 i WO94/02595, koji su ovde u potpunosti obuhvaćeni referencom). Za isporuku in vivo faktori koji treba razmotriti kako bi se isporučio iRNK molekul uključuju, na primer, biološku stabilnost isporučenog molekula, sprečavanje nespecifičnih efekata i akumulaciju isporučenog molekula u ciljanom tkivu. Nespecifični efekti iRNE mogu se minimizirati lokalnom primenom, na primer, direktnim ubrizgavanjem ili implantacijom u tkivo ili lokalnom primenom preparata. Lokalna primena na mesto terapije maksimizuje lokalnu koncentraciju agensa, ograničava izlaganje agensa na sistemska tkiva koja inače mogu biti oštećena od strane agensa ili mogu da degradiraju agens i dozvoljava manju ukupnu dozu molekula iRNK koja se primenjuje. Nekoliko studija pokazalo je uspešno obaranje genskih proizvoda kada se iRNK primenjuje lokalno. Na primer, intraokularna isporuka VEGF dsRNK intravitrealnim injekcijama kod cinomolgus majmuna (Tolentino, m., et al (2004) Retina 24:132-138) i subretinalne injekcije kod miševa Reich, SJ., et al (2003) Mol. Vis.9:210-216) pokazale su da sprečavaju neovaskularizaciju u eksperimentalnom modelu starosne degeneracije makule. Pored toga, direktna intratumoralna injekcija dsRNK kod miševa smanjuje zapreminu tumora (Pille, J., et al (2005) Mol.
[0652] Ther.11:267-274) i može produžiti preživljavanje miševa koji nose tumor (Kim, WJ., et al (2006) Mol. Ther.14:343-350; Li, S., et al (2007) Mol. Ther.15:515-523). RNK interferencija je takođe pokazala uspeh u lokalnoj isporuci u CNS sa direktnim injekcijama (Dorn, G., i dr. (2004) Nucleic Acids 32:e49; Tan, PH., et al (2005) Gene Ther.12:59-66; Makimura, H., et al (2002) BMC Neurosci. 3:18; Shishkina, GT., et al (2004) Neuroscience 129:521-528; Thakker, ER., et al (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.101:17270-17275; Akaneya, Y., et al (2005) J. Neurophysiol.93:594-602) i pluća intranazalnom primenom(Howard, KA., et al (2006) Mol. Ther.14:476-484; Zhang, X., et al (2004) J. Biol.
[0653] Chem. 279:10677-10684; Bitko, V., et al (2005) Nat. Med.11:50-55). Za primenu iRNK sistemske terapije za lečenje bolesti, RNK se može modifikovati ili alternativno isporučiti pomoću sistema za davanje leka; oba postupka deluju da spreče brzu degradaciju dsRNK endo- i ekso-nukleazama in vivo. Modifikacija RNK ili farmaceutskog nosača takođe može dozvoliti ciljanje sastava iRNK u ciljano tkivo i izbegavati neželjene efekte van cilja. iRNK molekuli se mogu modifikovati hemijskom konjugacijom na lipofilne grupe, kao što je holesterol, radi poboljšanja mobilnog uzimanja i sprečavanja degradacije. Na primer, iRNK usmerena protiv ApoB konjugovanog sa lipofilnom holesterolom, sistemski je injektirana miševima i dovela je do udvostručavanja apoB mRNK u jetri i jejunumu (Soutschek, J., et al (2004) Nature 432:173-178). Pokazalo se da konjugacija iRNE aptamera inhibira rast tumora i posreduje tumorsku regresiju u mišem modelu karcinoma prostate (McNamara, JO., et al (2006) Nat. Biotechnol.24:1005-1015). U alternativnom otelotvorenju, iRNK se može isporučiti pomoću sistema za isporuku lekova, kao što su nanočestice, dendrimer, polimer, lipozom ili katjonski sistem dovođenja. Pozitivno naelektrisani sistemi katjonske isporuke olakšavaju vezivanje iRNK molekula (negativno naelektrisani), i takođe povećavaju interakcije na negativno naelektrisanu ćelijsku membranu kako bi se omogućila efikasna primena iRNE od strane ćelije. Katjonski lipidi, dendrimi ili polimeri mogu biti vezani za iRNK ili izazvati formiranje vezikula ili micela (pogledati npr. Kim SH., et al (2008) Journal of Controlled Release 129(2):107-116) koje okružuju iRNK. Formiranje vezikula ili micela dodatno sprečava degradaciju iRNK kada se sistemski primenjuje. Postupci za izradu i primenu kompleksa katjonskih iRNK su u okviru sposobnosti stručnjaka u oblasti (pogledati npr.Sorensen, DR., et al (2003) J. Mol. Biol 327:761-766; Verma, UN., et al (2003) Clin. Cancer Res. 9:1291-1300; Arnold, AS et al (2007) J. Hypertens. 25:197-205, koji je ovde u potpunosti obuhvaćen referencom). Neki neograničavajući primeri sistema za isporuku lekova koji su korisni za sistemsku isporuku iRNK-a uključuju DOTAP (Sorensen, DR., et al (2003), supra; Verma, UN., et al (2003), supra), Oligofectamine, „lipidne čestice čvrste nukleinske kiseline“ (Zimmermann, TS., et al (2006) Nature 441:111-114), kardiolipin (Chien, PY., et al (2005) Cancer Gene Ther.12:321-328; Pal, A., et al (2005) Int J. Oncol. 26:1087-1091), polietilenimin (Bonnet ME., et al (2008) Pharm. Res. Aug 16 Epub pre štampe; Aigner, A. (2006) J. Biomed. Biotechnol. 71659), Arg-Gly-Asp (RGD) peptidi (Liu, S. (2006) Mol. Pharm.3:472-487), i poliamidoamini (Tomalia, DA., et al (2007) Biochem. Soc. Trans.35:61-67; Yoo, H., et al (1999) Pharm. Res.16:1799-1804). U nekim implementacijama, iRNK formira kompleks sa ciklodekstrinom za sistemsku primenu.
[0654] Postupci za primenu i farmaceutski sastavi iRNK i ciklodekstrina mogu se naći u U.S. Patent No. 7,427,605.
[0656] A. Vektor kodiranih iRNK iz pronalaska
[0657] iRNK koja cilja PCSK9 gen može se izraziti iz transkripcionih jedinica ubačenih u vektore DNK ili RNK (pogledati npr. Couture, A, i dr., TIG. (1996), 12:5-10; Skillern, A., i dr., International PCT Publication No. WO 00/22113, Conrad, International PCT Publication No. WO 00/22114, and Conrad, U.S. Pat. No.6,054,299). Eksprimiranje može biti prolazano (red veličina od nekoliko sati do sedmica) ili održano (sedmice do meseci ili duže), u zavisnosti od specifičnog korištenog konstrukta i ciljanog tkiva ili tipa ćelije. Ovi transgeni mogu se uvesti kao linearni konstrukt, kružni plazmid ili virusni vektor, koji može biti integrisan ili neintegrisan vektor. Transgen takođe može biti konstruisan tako da se dozvoli da se nasledi kao ekstrahromosomni plazmid (Gassmann, i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92:1292).
[0659] Pojedinačni lanac ili lanci iRNK mogu se transkribovati iz promotera na vektoru eksprimiranja. Kada se dve odvojene linije eksprimiraju da generišu, na primer, dsRNK, dva odvojena vektora eksprimiranja mogu biti zajednički uvedena (npr., transfekcijom ili infekcijom) u ciljnu ćeliju. Alternativno, svaka pojedinačna mreža dsRNK može se transkribovati od strane promotera koji su smešteni na istom plazmidu eksprimiranja. U jednom otelotvorenju, dsRNK se eksprimira kao obrnuti ponovljeni polinukleotidi spojeni sa veznik polinukleotidnom sekvencom, tako da dsRNK ima strukturu stabla i petlje.
[0661] Vektori eksprimiranja iRNK su uglavnom DNK plazmidi ili virusni vektori. Vektori eksprimiranja koji su kompatibilni sa eukariotskim ćelijama, poželjno oni koji su kompatibilni sa ćelijama kičmenjaka, mogu se koristiti za proizvodnju rekombinantnih konstrukta za eksprimiranje iRNK, kao što je ovde opisano. Vektori eksprimiranja eukariotskih ćelija su dobro poznati u struci i dostupni su iz više komercijalnih izvora.
[0662] Tipično su takvi vektori pruženi da sadrže pogodna restrikciona mesta za unošenje željenog segmenta nukleinske kiseline. Isporuka vektora eksprimiranja iRNK može biti sistemska, na primer intravenskim ili intramuskularnim primenama, primenom na ciljne ćelije dobijene od pacijenta, praćeno ponovnim uvođenjem u pacijenta ili bilo kojim drugim sredstvom koje omogućava unošenje u željenu ciljnu ćeliju.
[0663] Plazmidi eksprimiranja iRNK mogu biti transfektovani u ciljne ćelije kao kompleks sa katjonskim lipidnim nosačima (npr., Oligofektamin) ili ne-katjonskim nosačima na bazi lipida (npr., Transit-TKO™). Višestruke transfekcijama lipida za iRNK knockdown koji cilja različite regije ciljne RNK tokom perioda od jedne sedmice ili više su takođe razmotrene pronalaskom. Uspešno uvođenje vektora u ćelije domaćina može se pratiti korišćenjem različitih poznatih postupaka. Na primer, transientna transfekcija može biti signalizirana reporterom, kao što je fluorescentni marker, kao što je zeleni fluorescentni protein (GFP). Stabilna transfekcija ćelija ex vivo može se osigurati korišćenjem markera koji pružaju transfektovanu ćeliju sa otpornošću na specifične faktore zaštite životne sredine (npr. antibiotike i lekove), kao što je otpornost na higromicin B.
[0665] Virusni vektorski sistemi koji se mogu koristiti sa postupcima i sastavima opisanim ovde uključuju, ali bez ograničavanja na, (a) vektore adenovirusa; (b) vektore retrovirusa, uključujući, ali bez ograničavanja na, lentivirusne vektore, virus molekularnog mišića leukemije itd .; (c) adeno-povezani virusni vektori; (d) vektori virusnog herpes simpleksa; (e) SV 40 vektora; (f) vektori virusa polioma; (g) vektori virusa papilome; (h) vikori picornavirusa; (i) vektori pok virusa, kao što je ortopoks, npr. vektori virusa vakcinije ili avipoks, npr. kanarinacki pukotina ili ptica; i (j) adenovirus koji zavisi od helpera ili estomačni adenovirus. Virusi sa neispravnim replikacijama takođe mogu biti povoljni. Razni vektori će se ili neće uklopiti u genom ćelija. Konstrukcije mogu uključivati virusne sekvence za transfekciju, po želji. Alternativno, konstrukt se može inkorporirati u vektore sposobne za epizomijalnu replikaciju, npr. EPV i EBV vektori. Konstrukti za rekombinantno eksprimiranje iRNK-a će uglavnom zahtevati regulatorne elemente, npr. promotere, poboljšivače itd., kako bi se osiguralo eksprimiranje iRNK u ciljnim ćelijama. Drugi aspekti koje treba uzeti u obzir za vektore i konstrukte su dalje opisani u nastavku.
[0667] Vektori korisni za isporuku iRNE-a uključuju regulatorne elemente (promoter, poboljšivač itd.) koji su dovoljni za eksprimiranje iRNK u željenoj ciljanoj ćeliji ili tkivu. Regulatorni elementi mogu biti izabrani tako da pružaju konstitutivni ili regulisani/inducibilni izraz.
[0669] [0239] Eksprimiranje iRNE može se precizno regulisati, na primer, koristeći inducibilnu regulatornu sekvencu koja je osetljiva na određene fiziološke regulatore, npr. nivoe glukoze u krvotoku ili hormone (Docherty i dr., 1994, FASEB J.8:20-24). Takvi inducibilni sistemi eksprimiranja, pogodni za kontrolu eksprimiranja dsRNK u ćelijama ili kod sisara, uključuju, na primer, regulaciju ecdisonom, estrogenom, progesteronom, tetraciklinom, hemijske induktore dimerizacije i izopropil-beta-D1-tiogalaktopiranozid (IPTG). Stručnjak u oblasti bi bio sposoban da izabere odgovarajuću regulatornu/promotersku sekvencu zasnovanu na predvidjenoj upotrebi iRNK transgena.
[0671] Mogu se koristiti virusni vektori koji sadrže sekvence nukleinske kiseline koji kodiraju iRNK. Na primer, može se koristiti retrovirusni vektor (pogledati Miller i dr., Meth. Enzymol. 217:581-599 (1993)). Ovi retrovirusni vektori sadrže komponente neophodne za ispravno pakovanje virusnog gena i integraciju u DNK ćelije domaćina. Nukleinske kiseline koje kodiraju iRNK kloniraju se u jedan ili više vektora, što olakšava isporuku nukleinske kiseline pacijentu. Više detalja o retrovirusnim vektorima može se naći na primer u Boesen i dr., Biotherapy 6:291-302 (1994), koji opisuje upotrebu retrovirusnog vektora za isporuku gena mdr1 hematopoetskih matičnih ćelija kako bi se matične ćelije učinile otpornije na hemoterapiju. Druge reference koje ilustruju upotrebu retrovirusnih vektora u genskoj terapiji su: Clowes i dr., J. Clin. Invest.93:644-651 (1994); Kiem i dr., Blood 83:1467-1473 (1994); Salmons and Gunzberg, ljudsk Gene Therapy 4:129-141 (1993); i Grossman and Wilson, Curr. Opin. in Genetics and Devel.3:110-114 (1993) Lentivirusni vektori koji su razmatrani za upotrebu uključuju, na primer, vektore na bazi HIV-a opisane u U.S. Patent No.6,143,520; 5,665,557; i 5,981,276.
[0673] Adenovirusi su takođe razmatrani za upotrebu u isporuci iRNK pronalaska.
[0674] Adenovirusi su posebno atraktivni nosači, npr. za isporuku gena respiratornoj epiteliji.
[0675] Adenovirusi prirodno zaraze respiratornu epiteliju u kojoj uzrokuju blagu bolest. Druge mete za sisteme isporučivanja adenovirusa su jetra, centralni nervni sistem, endotelne ćelije i mišići. Adenovirusi imaju prednost da budu sposobni da zaraze ćelije koje se ne dele.
[0676] Kozarsky and Wilson, Current Opinion in Genetics and Development 3:499-503 (1993) predstavljaju pregled genske terapije zasnovane na adenovirusu. Bout i dr., ljudsk Gene Therapy 5:3-10 (1994) demostrirali su upotrebu vektora adenovirusa za prenos gena na respiratornu epiteliju rezus majmuna. Drugi primeri upotrebe adenovirusa u genskoj terapiji mogu se naći uRosenfeld i dr., Science 252:431-434 (1991); Rosenfeld i dr., Cell 68:143-155 (1992); Mastrangeli i dr., J. Clin. Invest.91:225-234 (1993); PCT Publication WO94/12649; and Wang, i dr., Gene Therapy 2:775-783 (1995). Pogodan AV vektor za eksprimiranje iRNK koja se nalazi u pronalasku, postupak za konstrukciju rekombinantnog AV vektora i postupak za davanje vektora u ciljne ćelije opisani su u Xia H i dr. (2002), Nat. Biotech.20: 1006-1010.
[0678] Vektori adeno-pridruženog virusa (AAV) takođe mogu biti korišćeni za isporuku iRNE pronalaska (Walsh i dr., Proc. Soc. Exp. Biol. Med.204:289-300 (1993); U.S. Pat. No.
[0679] 5,436,146). U jednom aspektu, iRNK se može eksprimirati kao dva odvojena, komplementarna jednolančana RNK molekula iz rekombinantnog AAV vektora koji ima, na primer, ili promotere U6 ili H1 RNK ili promotor citomegalovirusa (CMV). Pogodni AAV-vektori za eksprimiranje dsRNK izloženih u pronalasku, postupci za konstrukciju rekombinantnog AV vektora i postupci za davanje vektora u ciljne ćelije su opisani u Samulski R i dr. (1987), J. Virol.61: 3096-3101; Fisher K J i dr. (1996), J. Virol, 70: 520-532; Samulski R i dr. (1989), J. Virol.63: 3822-3826; U.S. Pat. No.5,252,479; U.S. Pat. No.
[0680] 5,139,941; International Patent Application No. WO 94/13788; and International Patent Application No. WO 93/24641, čije celokupne objave su ovde uključene referencom.
[0682] Drugi virusni vektor pogodan za isporuku iRNK pronalaska je virus boginja kao što je virus vakcinije, na primer osušena vakcinija kao što su Modifikovani Ankara virus (MVA) ili NIVAC, ptičije boginje, kao što su boginje živine ili kanarinaca.
[0684] Tropizam virusnih vektora može se modifikovati pseudotipizacijom vektora sa proteinima koverte ili drugim površinskim antigenom iz drugih virusa ili zamenom različitih virusnih kapsidnih proteina, prema potrebi. Na primer, lentivirusni vektori mogu biti pseudotipirani sa površinskim proteinama iz virusa vezikularnog stomatitisa (VSV), besnila, Ebole, Mokole i slično. AAV vektori se mogu napraviti kako bi se ciljale različite ćelije inžinjeringom vektora eksprimiranja različitih serotipova proteina kapsida; pogledati, npr., Rabinowitz J E i dr. (2002), J Virol 76:791-801.
[0686] Farmaceutski preparat vektora može uključiti vektor u prihvatljivom razblaživaču ili može uključiti matricu sa sporim oslobađanjem u kojoj je ugrađen nosač za isporuku gena. Alternativno, gde kompletan vektor vraćanja gena može biti proizveden netaknut od rekombinantnih ćelija, npr. retrovirusnih vektora, farmaceutski preparat može uključivati jednu ili više ćelija koje proizvode sistem za gene.
[0688] V. Farmaceutski sastavi pronalaska
[0689] Ovaj pronalazak takođe uključuje farmaceutski sastavi i formulacije koje uključuju iRNK pronalaska. U jednoj implementaciji, ovde navedeni su farmaceutski sastavi koji sadrže iRNK, kako je ovde opisano, i farmaceutski prihvatljiv nosač. Farmaceutski sastavi koji sadrže iRNK su korisni za lečenje bolesti ili poremećaja povezanih sa eksprimiranjem ili aktivnošću PCSK9 gena, npr. lipidnog poremećaja. Takvi farmaceutski sastavi su formulisani na osnovu načina isporuke. Jedan primer su sastavi koji su formulisani za sistemsku primenu putem parenteralne isporuke, npr. Intravenskom (IV) isporukom. Drugi primer su sastavi koji su formulisane za direktnu isporuku u moždanoj parenhimi, npr. infuzijom u mozak, kao što je kontinuirana pumpna infuzija.
[0691] Farmaceutski sastavi koji sadrže RNKi agense prema pronalasku mogu biti, na primer, rastvori sa ili bez pufera, ili sastavi koji sadrže farmaceutski prihvatljive nosače. Takvi preparati uključuju, na primer, vodene ili kristalne sastavi, lipozomske formulacije, micelarne formulacije, emulzije i vektore genske terapije.
[0693] U opisanim postupcima, RNKi agens se može davati u rastvoru. Slobodan RNKi agens se može davati u neupotrebljenom rastvoru, npr. u fiziološkom ili u vodi. Alternativno, slobodna siRNK se takođe može primenjivati u odgovarajućem pufernom rastvoru. Puferski rastvor može sadržati acetat, citrat, prolamin, karbonat ili fosfat, ili bilo koja njihova kombinacija. U poželjnom otelotvorenju, puferni rastvor je fiziološki pufer sa fosfatnim puferom (PBS). pH i osmolarnost pufernog rastvora koji sadrži RNKi agens mogu se podesiti tako da su pogodni za davanje pacijentu.
[0695] U nekim implementacijama, puferni rastvor dalje sadrži agens za kontrolu osmolarnosti rastvora, tako da se osmolarnost čuva na željenoj vrednosti, na primer, na fiziološkim vrednostima ljudske plazme. Rastvori koji se mogu dodati u puferni rastvor za kontrolu osmolarnosti obuhvataju, ali nisu ograničeni na, proteine, peptide, aminokiseline, ne-metabolizovane polimere, vitamine, jone, šećere, metabolite, organske kiseline, lipide ili sole. U nekim otelotvorenjima, agens za kontrolisanje osmolarnosti rastvora je so. U određenim implementacijama, agens za kontrolisanje osmolarnosti rastvora je natrijum hlorid ili kalijum hlorid.
[0697] [0250] Farmaceutski sastavi pronalaska mogu se primenjivati u dozama dovoljnim da inhibiraju eksprimiranje PCSK9 gena. Uopšteno, odgovarajuća doza iRNK pronalaska biće u opsegu od oko 0,001 do oko 200,0 miligrama po kilogramu telesne težine primaoca dnevno, uglavnom u opsegu od oko 1 do 50 mg po kilogramu telesne težine dnevno. Na primer, dsRNK može da se primenjuje na oko 0,01 mg/kg, oko 0,05 mg/kg, oko 0,5 mg/kg, oko 1 mg/kg, oko 1,5 mg/kg, oko 2 mg/kg, oko 3 mg/kg, oko 10 mg/kg, oko 20 mg/kg, oko 30 mg/kg, oko 40 mg/kg, ili oko 50 mg/kg po pojedinačnoj dozi.
[0699] Na primer, RNKi agens, npr., dsRNK, mogu se primenjivati pri dozi od oko 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9, ili oko 10 mg/kg. Vrednosti i opsezi između navedenih vrednosti takođe su namenjeni da budu deo predmetnog pronalaska.
[0701] [0252] U drugoj implementaciji, RNKi agens, npr., dsRNK, se primenjuje pri dozi od oko 0,1 do oko 50 mg/kg, oko 0,25 do oko 50 mg/kg, oko 0,5 do oko 50 mg/kg, oko 0,75 do oko 50 mg/kg, oko 1 do oko 50 mg/mg, oko 1,5 do oko 50 mg/kb, oko 2 do oko 50 mg/kg, oko 2,5 do oko 50 mg/kg, oko 3 do oko 50 mg/kg, oko 3,5 do oko 50 mg/kg, oko 4 do oko 50 mg/kg, oko 4,5 do oko 50 mg/kg, oko 5 do oko 50 mg/kg, oko 7,5 do oko 50 mg/kg, oko 10 do oko 50 mg/kg, oko 15 do oko 50 mg/kg, oko 20 do oko 50 mg/kg, oko 20 do oko 50 mg/kg, oko 25 do oko 50 mg/kg, oko 25 do oko 50 mg/kg, oko 30 do oko 50 mg/kg, oko 35 do oko 50 mg/kg, oko 40 do oko 50 mg/kg, oko 45 do oko 50 mg/kg, oko 0,1 do oko 45 mg/kg, oko 0,25 do oko 45 mg/kg, oko 0,5 do oko 45 mg/kg, oko 0,75 do oko 45 mg/kg, oko 1 do oko 45 mg/mg, oko 1,5 do oko 45 mg/kb, oko 2 do oko 45 mg/kg, oko 2,5 do oko 45 mg/kg, oko 3 do oko 45 mg/kg, oko 3,5 do oko 45 mg/kg, oko 4 do oko 45 mg/kg, oko 4,5 do oko 45 mg/kg, oko 5 do oko 45 mg/kg, oko 7,5 do oko 45 mg/kg, oko 10 do oko 45 mg/kg, oko 15 do oko 45 mg/kg, oko 20 do oko 45 mg/kg, oko 20 do oko 45 mg/kg, oko 25 do oko 45 mg/kg, oko 25 do oko 45 mg/kg, oko 30 do oko 45 mg/kg, oko 35 do oko 45 mg/kg, oko 40 do oko 45 mg/kg, oko 0,1 do oko 40 mg/kg, oko 0,25 do oko 40 mg/kg, oko 0,5 do oko 40 mg/kg, oko 0,75 do oko 40 mg/kg, oko 1 do oko 40 mg/mg, oko 1,5 do oko 40 mg/kb, oko 2 do oko 40 mg/kg, oko 2,5 do oko 40 mg/kg, oko 3 do oko 40 mg/kg, oko 3,5 do oko 40 mg/kg, oko 4 do oko 40 mg/kg, oko 4,5 do oko 40 mg/kg, oko 5 do oko 40 mg/kg, oko 7,5 do oko 40 mg/kg, oko 10 do oko 40 mg/kg, oko 15 do oko 40 mg/kg, oko 20 do oko 40 mg/kg, oko 20 do oko 40 mg/kg, oko 25 do oko 40 mg/kg, oko 25 do oko 40 mg/kg, oko 30 do oko 40 mg/kg, oko 35 do oko 40 mg/kg, oko 0,1 do oko 30 mg/kg, oko 0,25 do oko 30 mg/kg, oko 0,5 do oko 30 mg/kg, oko 0,75 do oko 30 mg/kg, oko 1 do oko 30 mg/mg, oko 1,5 do oko 30 mg/kb, oko 2 do oko 30 mg/kg, oko 2,5 do oko 30 mg/kg, oko 3 do oko 30 mg/kg, oko 3,5 do oko 30 mg/kg, oko 4 do oko 30 mg/kg, oko 4,5 do oko 30 mg/kg, oko 5 do oko 30 mg/kg, oko 7,5 do oko 30 mg/kg, oko 10 do oko 30 mg/kg, oko 15 do oko 30 mg/kg, oko 20 do oko 30 mg/kg, oko 20 do oko 30 mg/kg, oko 25 do oko 30 mg/kg, oko 0,1 do oko 20 mg/kg, oko 0,25 do oko 20 mg/kg, oko 0,5 do oko 20 mg/kg, oko 0,75 do oko 20 mg/kg, oko 1 do oko 20 mg/mg, oko 1,5 do oko 20 mg/kb, oko 2 do oko 20 mg/kg, oko 2,5 do oko 20 mg/kg, oko 3 do oko 20 mg/kg, oko 3,5 do oko 20 mg/kg, oko 4 do oko 20 mg/kg, oko 4,5 do oko 20 mg/kg, oko 5 do oko 20 mg/kg, oko 7,5 do oko 20 mg/kg, oko 10 do oko 20 mg/kg, ili oko 15 do oko 20 mg/kg. Vrednosti i opsezi između navedenih vrednosti takođe su namenjeni da budu deo predmetnog pronalaska.
[0703] Na primer, RNKi agens, npr., dsRNK, mogu se primenjivati pri dozi od oko 0.,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9, ili oko 10 mg/kg. Vrednosti i opsezi između navedenih vrednosti takođe su namenjeni da budu deo predmetne objave.
[0705] [0254] U drugoj implementaciji, RNKi agens, npr., dsRNK, se primenjuje pri dozi od oko 0,5 do oko 50 mg/kg, oko 0,75 do oko 50 mg/kg, oko 1 do oko 50 mg/mg, oko 1,5 do oko 50 mg/kg, oko 2 do oko 50 mg/kg, oko 2,5 do oko 50 mg/kg, oko 3 do oko 50 mg/kg, oko 3,5 do oko 50 mg/kg, oko 4 do oko 50 mg/kg, oko 4,5 do oko 50 mg/kg, oko 5 do oko 50 mg/kg, oko 7,5 do oko 50 mg/kg, oko 10 do oko 50 mg/kg, oko 15 do oko 50 mg/kg, oko 20 do oko 50 mg/kg, oko 20 do oko 50 mg/kg, oko 25 do oko 50 mg/kg, oko 25 do oko 50 mg/kg, oko 30 do oko 50 mg/kg, oko 35 do oko 50 mg/kg, oko 40 do oko 50 mg/kg, oko 45 do oko 50 mg/kg, oko 0,5 do oko 45 mg/kg, oko 0,75 do oko 45 mg/kg, oko 1 do oko 45 mg/mg, oko 1,5 do oko 45 mg/kb, oko 2 do oko 45 mg/kg, oko 2,5 do oko 45 mg/kg, oko 3 do oko 45 mg/kg, oko 3,5 do oko 45 mg/kg, oko 4 do oko 45 mg/kg, oko 4,5 do oko 45 mg/kg, oko 5 do oko 45 mg/kg, oko 7,5 do oko 45 mg/kg, oko 10 do oko 45 mg/kg, oko 15 do oko 45 mg/kg, oko 20 do oko 45 mg/kg, oko 20 do oko 45 mg/kg, oko 25 do oko 45 mg/kg, oko 25 do oko 45 mg/kg, oko 30 do oko 45 mg/kg, oko 35 do oko 45 mg/kg, oko 40 do oko 45 mg/kg, oko 0,5 do oko 40 mg/kg, oko 0,75 do oko 40 mg/kg, oko 1 do oko 40 mg/mg, oko 1,5 do oko 40 mg/kb, oko 2 do oko 40 mg/kg, oko 2,5 do oko 40 mg/kg, oko 3 do oko 40 mg/kg, oko 3,5 do oko 40 mg/kg, oko 4 do oko 40 mg/kg, oko 4,5 do oko 40 mg/kg, oko 5 do oko 40 mg/kg, oko 7,5 do oko 40 mg/kg, oko 10 do oko 40 mg/kg, oko 15 do oko 40 mg/kg, oko 20 do oko 40 mg/kg, oko 20 do oko 40 mg/kg, oko 25 do oko 40 mg/kg, oko 25 do oko 40 mg/kg, oko 30 do oko 40 mg/kg, oko 35 do oko 40 mg/kg, oko 0,5 do oko 30 mg/kg, oko 0,75 do oko 30 mg/kg, oko 1 do oko 30 mg/mg, oko 1,5 do oko 30 mg/kb, oko 2 do oko 30 mg/kg, oko 2,5 do oko 30 mg/kg, oko 3 do oko 30 mg/kg, oko 3,5 do oko 30 mg/kg, oko 4 do oko 30 mg/kg, oko 4,5 do oko 30 mg/kg, oko 5 do oko 30 mg/kg, oko 7,5 do oko 30 mg/kg, oko 10 do oko 30 mg/kg, oko 15 do oko 30 mg/kg, oko 20 do oko 30 mg/kg, oko 20 do oko 30 mg/kg, oko 25 do oko 30 mg/kg, oko 0,5 do oko 20 mg/kg, oko 0,75 do oko 20 mg/kg, oko 1 do oko 20 mg/mg, oko 1,5 do oko 20 mg/kb, oko 2 do oko 20 mg/kg, oko 2,5 do oko 20 mg/kg, oko 3 do oko 20 mg/kg, oko 3,5 do oko 20 mg/kg, oko 4 do oko 20 mg/kg, oko 4,5 do oko 20 mg/kg, oko 5 do oko 20 mg/kg, oko 7,5 do oko 20 mg/kg, oko 10 do oko 20 mg/kg, ili oko 15 do oko 20 mg/kg. U jednom otelotvorenju, dsRNK se primenjuje pri dozi od oko 10mg/kg do oko 30 mg/kg. Vrednosti i opsezi između navedenih vrednosti takođe su namenjeni da budu deo predmetne objave.
[0707] Na primer, pacijentima može da se daje terapeutska količina iRNK, kao što je oko 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9, 10, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5, 13, 13,5, 14, 14,5, 15, 15,5, 16, 16,5, 17, 17,5, 18, 18,5, 19, 19,5, 20, 20,5, 21, 21,5, 22, 22,5, 23, 23,5, 24, 24,5, 25, 25,5, 26, 26,5, 27, 27,5, 28, 28,5, 29, 29,5, 30, 31, 32, 33, 34, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, ili oko 50 mg/kg. Vrednosti i opsezi između navedenih vrednosti takođe su namenjeni da budu deo predmetne objave.
[0709] [0256] Farmaceutski sastav se može davati jednom dnevno, ili se iRNK može primenjivati kao dve, tri ili više pod-doza u odgovarajućim intervalima tokom celog dana ili čak uz kontinuiranu infuziju ili isporuku putem formulacije sa kontrolisanim oslobađanjem. U tom slučaju, iRNK sadržana u svakoj pod-dozi mora biti odgovarajuće manja kako bi se postigla ukupna dnevna doza. Jedinica za doziranje se takođe može sastaviti za isporuku tokom nekoliko dana, npr., koristeći konvencionalnu formulaciju sa produženim oslobađanjem koja pruža kontinuirano oslobađanje iRNK tokom nekoliko dana. Formulacije sa zadržanim oslobađanjem su dobro poznate u struci i naročito su korisne za isporuku agensa na određenom mestu, kao što se može koristiti sa agensima iz ovog pronalaska. U ovoj primeni, jedinica za doziranje sadrži odgovarajuće višestruke dnevne doze.
[0711] U drugim implementacijama, pojedinačna doza farmaceutskih sastav može biti dugotrajna, tako da se naredne doze primenjuju u intervalima od ne više od 3, 4 ili 5 dana, ili ne više od 1,2,3 ili 4 nedelje. U nekim primenama pojedinačna doza farmaceutskih sastav prema pronalasku se daje jednom nedeljno. U drugim primenama, pojedinačna doza farmaceutskih sastav pronalaska se daje dvomesečno.
[0713] Obučeni veštaci će ceniti da određeni faktori mogu uticati na doziranje i vreme potrebno za efikasno lečenje pacijenta, uključujući, ali ne ograničavajući se na težinu bolesti ili poremećaja, prethodne tretmane, opšte zdravlje i/ili starost pacijenta, i druge prisutne bolesti. Štaviše, lečenje pacijenta sa terapeutski efektivnom količinom preparata može uključiti pojedinačni tretman ili niz tretmana. Procene efektivnih doza i poluživota in vivo za pojedinačne iRNK koje su obuhvaćene pronalaskom mogu se napraviti koristeći konvencionalne metodologije ili na osnovu in vivo testiranja koristeći odgovarajući model životinja, kako je ovde opisano na drugim mestima.
[0715] Napredak u genetici miševa generisao je niz modela miševa za proučavanje različitih ljudskih bolesti, kao što je poremećaj krvarenja koji bi imao koristi od smanjenja eksprimiranja PCSK9. Takvi modeli mogu se koristiti za in vivo ispitivanje iRNK, kao i za određivanje terapeutski efikasne doze. Pogodni modeli miševa su poznati u struci i uključuju, na primer, miša koji sadrži transgen koji eksprimira ljudski PCSK9.
[0717] [0260] Farmaceutski sastavi predmetnog pronalaska mogu se davati na više načina u zavisnosti od toga da li je poželjno lokalno ili sistemsko lečenje i površine koja se tretira. Upotreba može biti aktuelna (npr. transdermalni flasteri), plućna, npr. udisanje ili insuflacija praškova ili aerosola, uključujući nebulizatorom; intratrahealna, intranazalna, epidermalna i transdermalna, oralna ili parenteralna. Parenteralna primena obuhvata intravenoznu, intraarterijalnu, potkožnu, intraperitonealnu ili intramuskularnu injekciju ili infuziju; subdermalno, npr. preko implantiranog uređaja; ili intrakranijalnog, npr., intraparenhimalnom, intratekalnom ili intraventrikularnom primenom.
[0719] iRNK se može isporučiti na način da cilja određeno tkivo, kao što je jetra (npr., hepatocite jetre).
[0721] Farmaceutski sastavi i formulacije za lokalnu primenu mogu uključivati transdermalne zakrpe, masti, losione, kreme, gelove, kapi, supozitorijume, sprejeve, tečnosti i prahove. Konvencionalni farmaceutski nosači, vodeni, u prahu ili uljane baze, agensi za zgrušnjavanje i slično mogu biti neophodni ili poželjni. Obloženi kondomi, rukavice i slično takođe mogu biti korisni. Pogodne topikalne formulacije obuhvataju one u kojima su iRNK pronalaska u dodatku sa lokalnim sredstvom za isporuku kao što su lipidi, lipozomi, masne kiseline, estri masnih kiselina, steroidi, helatirajući agensi i surfaktanti. Pogodni lipidi i lipozomi uključuju neutralne (npr., dioleoilfosfatidil DOPE etanolamin, dimriristoilfosfatidilholin DMPC, distearolifosfatidil holin) negativne (npr., dimriristoilfosfatidil glicerol DMPG) i katjonske (npr., dioleoiltetrametilaminopropil DOTAP i diozoilfosfatidil etanolamin DOTMA). iRNK pronalaska mogu biti inkapsulirani unutar lipozoma ili mogu formirati komplekse za to, naročito za katjonske lipozome. Alternativno, iRNK se mogu složiti sa lipidima, posebno sa katjonskim lipidima. Pogodne masne kiseline i esteri uključuju ali nisu ograničeni na arahidonsku kiselinu, oleinsku kiselinu, eikozanojsku kiselinu, laurinu kiselinu, kaprilnu kiselinu, kaprinsku kiselinu, miristinsku kiselinu, palmitinsku kiselinu, stearnu kiselinu, linolnu kiselinu, linolensku kiselinu, dikaprat, tricaprat, monoolein, dilaurin, gliceril 1-monokaprat, 1-dodecilazacikloheptan-2-on, acilkarnitin, acilholin ili C<1-20>alkil estar (npr., izopropilmirritat IPM), monoglicerid, diglicerid ili njegova farmaceutski prihvatljiva so). Topične formulacije su detaljno opisane u U.S. Patent No.6,747,014.
[0723] A. Formulacije iRNK koje sadrže membranske molekularne sklopove
[0724] [0263] iRNK za upotrebu u sastavima i postupcima prema pronalasku može se formulisati za isporuku u membranskom molekulskom sklopu, na primer, lipozomu ili micelu. Kad se ovde koristi, izraz „lipozom“ odnosi se na vezikulu sastavljenu od amfifilnih lipida raspoređenih u najmanje jednom bisloju, na primer, jednom bisloju ili mnoštvu bisloja. lipozomi uključuju unilamelarne i multilamelarne vezikule koje imaju membranu formiranu od lipofilnog materijala i vodene unutrašnjosti. Vodeni deo sadrži sastav iRNK. Lipofilni materijal izoluje vodeni enterijer od vodenog eksterijera, koji obično ne uključuje sastav iRNK, iako u nekim primerima to može biti slučaj. Lipozomi su korisni za prenos i isporuku aktivnih sastojaka na mesto delovanja. Zbog toga što je lipozomska membrana strukturno slična biološkim membranama, kada se lipozomi primenjuju na tkivo, lipozomski bisloju se spaja sa bislojem ćelijskih membrana. Kako napreduje spajanje lipozoma i ćelije, unutrašnji vodeni sadržaj koji uključuje iRNK se dostavlja u ćeliju gde se iRNK može specifično vezati za ciljnu RNK i može posredovati RNKi. U nekim slučajevima lipozomi su takođe posebno ciljani, npr., da usmeravaju iRNK na određene ćelijske tipove.
[0726] lipozom koji sadrži RNKi agens može se dobiti različitim postupcima. U jednom primeru, lipidna komponenta lipozoma se rastvara u deterdžentu, tako da se micele formiraju sa lipidnom komponentom. Na primer, lipidna komponenta može biti amfipatski katjonski lipid ili lipidni konjugat. Deterdžent može imati visoko kritičnu koncentraciju micela i može biti nejon. Primeri deterdženta uključuju holat, CHAPS, octilglucoside, dezoksiholat i lauroil sarkosin. Priprema RNKi agensa se zatim dodaje na micele koji uključuju lipidnu komponentu. katjonske grupe na lipidu komuniciraju sa RNKi agensom i kondenzuju oko RNKi agensa kako bi se formiralo lipozom. Posle kondenzacije, deterdžent se uklanja, na primer, putem dijalize, kako bi se dobio lipozomski preparat RNKi agensa.
[0728] Ako je neophodno, tokom reakcije kondenzacije može se dodati jedinjenje nosač koje pomaže u kondenzaciji, npr. kontrolisanim dodavanjem. Na primer, jedinjenje nosač može biti polimer koji nije nukleinska kiselina (npr. spermin ili spermidin). pH se takođe može prilagoditi kako bi se favorizovala kondenzacija.
[0730] [0266] Postupci za proizvodnju stabilnih nosača za isporuku polinukleotida, koje uključuju polinukleotidni/katjonski lipidni kompleks kao strukturne komponente nosača za isporuku, dalje su opisani u, npr., WO 96/37194. Formacija lipozoma može takođe uključiti jedan ili više aspekata primernih postupaka opisanih u Felgner, P. L. i dr., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 8:7413-7417, 1987; U.S. Pat. No.4,897,355; U.S. Pat. No.5,171,678; Bangham, i dr. M. Mol. Biol.23:238, 1965; Olson, i dr. Biochim. Biophys. Acta 557:9, 1979; Szoka, i dr. Proc. Natl. Acad. Sci.75: 4194, 1978; Mayhew, i dr. Biochim. Biophys. Acta 775:169, 1984; Kim, i dr. Biochim. Biophys. Acta 728:339, 1983; i Fukunaga, i dr. Endocrinol.115:757, Najčešće korišćene tehnike za pripremu lipidnih agregata odgovarajuće veličine za upotrebu kao isporučujuća sredstva uključuju sonikaciju i zamrzavanje-odleđivanje i ekstruziju (pogledati, npr., Mayer, i dr. Biochim. Biophys. Acta 858:161, 1986). Mikrofluidizacija se može koristiti kada je konzistentno mala (50 do 200 nm) i relativno ravnomerni agregati su poželjni (Mayhew, i dr. Biochim. Biophys. Acta 775:169, 1984) Ovi postupci se lako prilagođavaju pakovanju RNKi priprema u lipozome.
[0732] Lipozomi padaju u dve široke klase. Katjonski lipozomi su pozitivno naelektrisani lipozomi koji komuniciraju sa negativno naelektrisanim molekulima nukleinske kiseline kako bi se formirao stabilan kompleks. Kompleks nukleinske kiseline/lipozoma sa pozitivnim naelektrisanjem se vezuje za negativno naelektrisanu ćelijsku površinu i internalizuje se u endozomu. Zbog kiselog pH u endozomu, lipozomi su pukli, i njihov sadržaj se ulazi u ćelijsku citoplazmu (Wang i dr., Biochem. Biophys. Res. Commun., 1987, 147, 980-985).
[0734] Lipozomi koji su pH-osetljivi ili negativno-naelektrisani, zarobjavaju nukleinske kiseline pre nego što se kompleksiraju sa njima. Pošto su i nukleinska kiselina i lipid slično naelektrisani, javlja se odbojnost umesto formacije kompleksa. Ipak, neka nukleinska kiselina je zarobljena u vodenom enterijeru ovih lipozoma. pH osetljivi lipozomi su korišćeni da daju nukleinske kiseline koje kodiraju gen timidin kinaze za ćelijske monoslojeve u kulturi.
[0735] Izražavanje egzogenog gena je otkriveno u ciljnim ćelijama (Zhou i dr., Journal of Controlled Release, 1992, 19, 269-274).
[0737] Jedan od glavnih tipova lipozomskih preparata uključuje fosfolipide, osim fosfatidilholina iz prirodnih izvora. Neutralnei lipozomski sastavi, na primer, mogu se formirati od dimriristoil fosfatidilholina (DMPC) ili dipalmitoil fosfatidilholina (DPPC). Anjonske lipozomske sastavi se generalno formiraju iz dimiristoil fosfatidilglicerola, dok se anjonski fuzogenični lipozomi formiraju prvenstveno od dioleoil fosfatidiletanolamina (DOPE). Druga vrsta lipozomskog sastavi formira se od fosfatidilholina (PC), kao što je, na primer, sojin PC i jajni PC. Drugi tip se formira iz smeše fosfolipida i/ili fosfatidilholina i/ili holesterola.
[0739] Primeri drugih postupaka uvođenja lipozoma u ćelije in vitro i in vivo uključuju U.S. Pat. No.5,283,185; U.S. Pat. No.5,171,678; WO 94/00569; WO 93/24640; WO 91/16024; Felgner, J. Biol. Chem.269:2550, 1994; Nabel, Proc. Natl. Acad. Sci.90:11307, 1993; Nabel, ljudsk Gene Ther.3:649, 1992; Gershon, Biochem.32:7143, 1993; i Strauss EMBO J.
[0740] 11:417, 1992.
[0741] Nejonski lipozomalni sistemi su takođe ispitivani kako bi se utvrdila njihova upotreba u isporuci lekova na kožu, posebno sistemima koji sadrže ne-jonske surfaktante i holesterol. Nejonske lipozomske formulacije koje sadrže Novasome™ I (gliceril dilaurat/holesterol/polioksietilen-10-stearil eter) i Novasome™ II (gliceril distearat/holesterol/polioksietilen-10-stearil etar) su korišćeni da isporuče ciklosporin-A u dermis kože miša. Rezultati pokazuju da su takvi nejonski lipozomalni sistemi bili efikasni u olakšavanju depozicije ciklosporina A u različite slojeve kože (Hu i dr. S.T.P.Pharma. Sci., 1994, 4(6) 466).
[0743] Lipozomi takođe sadrže „sterički stabilizovane“ lipozome, izraz koji se, kad se ovde koristi, odnosi na lipozome koji sadrže jedan ili više specijalnih lipida koji, kada su inkorporirani u lipozome, rezultiraju poboljšanim životnim vekom cirkulacije u odnosu na lipozome koji nemaju takve specijalizovane lipide. Primeri sterikalno stabilizovanih lipozoma su oni u kojima deo lipidnog dela lipozoma koji formira vezikulu (A) sadrži jedan ili više glikolipida, kao što je monosialogangliosid GM1, ili (B) je derivatizovan sa jednim ili više hidrofilnih polimera, kao što je polietilenglikol (PEG) ostatak. Bez namere da se veže bilo kojom specifičnom teorijom, u struci je zastupljeno mišljenjea da, bar za sterički stabilizovane lipozome koji sadrže ganglioside, sfingomijelin ili lipidne derivate PEG, poboljšani poluživot cirkulacije ovih sterički stabilizovanih lipozoma potiče od smanjenog uzimanja retikuloendotelijalnog sistema u ćelije (RES) (Allen i dr., FEBS Letters, 1987, 223, 42; Wu i dr., Cancer Research, 1993, 53, 3765).
[0745] Različiti lipozomi koji sadrže jedan ili više glikolipid su poznati u struci.
[0746] Papahadjopoulos i dr. (Ann. N.Y. Acad. Sci., 1987, 507, 64) su izvestili o sposobnosti monosialogangliosid GM1, galaktokeribrozid sulfata i fosfatidilinositola za poboljšanje poluživota krvi lipozoma. Ovi nalazi su tmačeni od strane Gabizon i dr. (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1988, 85, 6949). U.S. Pat. No.4,837,028 i WO 88/04924, oba za Allen i dr., objavljuju lipozome koji sadrže (1) sfingomijelin i (2) gangliozid GM1 ili estar gelakocerebrozid sulfata. U.S. Pat.5,543,152 (Webb i dr.) objavljuje lipozome koji sadrže sfingomielin. lipozomi koji sadrže 1,2-sn-dimiristoilfosfatidilholin su opisani u WO 97/13499 (Lim et al).
[0748] [0274] U jednoj implementaciji se koriste katjonski lipozomi. katjonski lipozomi poseduju prednost u tome da se mogu spajati u ćelijsku membranu. Nestacionarni lipozomi, iako nisu u mogućnosti da se efikasno osiguraju sa plazemskom membranom, uzimaju makrofag in vivo i mogu se koristiti za isporuku RNKi agensa na makrofage.
[0750] Daljnje prednosti lipozoma uključuju: lipozomi dobijeni od prirodnih fosfolipida su biokompatibilni i biorazgradivi; lipozomi mogu uključiti širok raspon lekova koji rastvaraju vodu i lipide; lipozomi mogu zaštititi inkapsulirane RNKi agense u njihovim unutrašnjim odeljcima od metabolizma i degradacije (Rosoff, in „Pharmaceutical Dosage Forms,“ Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, volume 1, p.245). Važna razmatranja u pripremi lipozomskih formulacija su površinsko naelektrisanje lipida, veličina vezikula i vodena zapremina lipozoma.
[0752] Pozitivno naelektrisani sintetski katjonski lipid, N-[1-(2,3-dioliloksi)propil]-N,N,N-trimetilamonijum hlorid (DOTMA) se može koristiti za formiranje malih lipozoma koji spontano interaguju sa nukleinskom kiselinom da formiraju komplekse lipidnih nukleinskih kiselina koji su sposobni da se spajaju sa negativno naelektrisanim lipidima ćelijskih membrana ćelija ćelija tkiva, što dovodi do isporuke RNKi agensa (pogledati, npr., Felgner, P. L. i dr., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 8:7413-7417, 1987 and U.S. Pat. No.4,897,355 za opis DOTME i njegove upotrebu sa DNK).
[0754] DOTMA analog, 1,2-bis (oleoiloksi)-3-(trimetilamonijum)propan (DOTAP) može se koristiti u kombinaciji sa fosfolipidom u cilju formiranja veznika koji kompleksiraju DNK. Lipofectin™ Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, Md.) je efikasan agens za isporuku visoko anjonskih nukleinskih kiselina u ćelije ćelijske kulture živog tkiva koje sadrže pozitivno naelektrisane DOTMA lipozome koji spontano interaguju sa negativno naelektrisanim polinukleotidima da formiraju komplekse. Kada se koriste dovoljno pozitivno naelektrisani lipozomi, neto naelektrisanje na rezultirajućim kompleksima je takođe pozitivno. Pozitivno naelektrisani kompleksi pripremljeni na ovaj način spontano se spajaju sa negativno naelektrisanim ćelijskim površinama, fuzionišu se sa plazemskom membranom i efikasno isporučuju funkcionalne nukleinske kiseline u, na primer, ćelije kulture tkiva. Još jedan komercijalno dostupan katjonski lipid, 1,2-bis(oleoiloksi)-3,3-(trimetilamonijum) propan („DOTAP“) (Boehringer Mannheim, Indianapolis, Indiana) razlikuje se od DOTME po tome što su oleoil grupe povezane estrskim umesto etarskim vezama.
[0755] Druga prijavljena katjonska lipidna jedinjenja uključuju ona koja su konjugovana različitim delovima, uključujući, na primer, karboksispermin koji je konjugovan sa jednim od dva tipa lipida i uključuje jedinjenja kao što je 5-karboksispermilglicin dioctaoleojlamid („DOGS“) (Transfectam™, Promega, Madison, Wisconsin) i dipalmitoilfosfatidiletanolamin 5-karboksispermil-amid („DPPES“) (pogledati npr. U.S. Pat. No.5,171,678).
[0757] Još jedan katjonski lipidni konjugat obuhvata derivatizaciju lipida sa holesterolom („DC-Chol“) koji je formulisan u lipozome u kombinaciji sa DOPE (pogledati, Gao, X. and Huang, L., Biochim. Biophys. Res. Commun. 179:280, 1991). Pokazalo se da je lipopolilizin koji je dobijen konjugovanjem polilzina do DOPE efikasan za transfekciju u prisustvu seruma (Zhou, X. i dr., Biochim. Biophys. Acta 1065:8, 1991). Za određene ćelijske linije, za ove lipozome koji sadrže konjugovane katjonske lipide navodi se da imaju manju toksičnost i pružaju efikasniju transfekciju nego sastavi koje sadrže DOTMA. Ostali komercijalno dostupni katjonski lipidni proizvodi uključuju DMRIE i DMRIE-HP (Vical, La Jolla, California) i Lipofectamin (DOSPA) (Life Technology, Inc., Gaithersburg, Maryland). Ostali katjonski lipidi pogodni za isporuku oligonukleotida opisani su u WO 98/39359 i WO 96/37194.
[0759] Lipozomske formulacije su posebno pogodne za lokalnu primenu, lipozomi daju nekoliko prednosti u odnosu na druge formulacije. Takve prednosti uključuju smanjene neželjene efekte vezane za visoku sistemsku apsorpciju primenjenog leka, povećanu akumulaciju primenjenog leka na željenoj meti i mogućnost davanja RNKi agensa u kožu. U nekim primenama, lipozomi se koriste za isporuku RNKi agensa u epidermalne ćelije, a takođe i za povećanje penetracije agensa RNKi u kožna tkiva, na primer, u kožu. Na primer, lipozomi se mogu primeniti lokalno. Lokalna isporuka lekova formulisanih kao lipozomi na kožu je dokumentovana (pogledati npr. Weiner i dr., Journal of Drug Targeting, 1992, vol. 2,405-410 and du Plessis i dr., Antiviral Research, 18, 1992, 259-265; Mannino, R. J. and Fould-Fogerite, S., Biotechniques 6:682-690, 1988; Itani, T. i dr. Gene 56:267-276.1987; Nicolau, C. i dr. Meth. Enz.149:157-176, 1987; Straubinger, R. M. and Papahadjopoulos, D. Meth. Enz.101:512-527, 1983; Wang, C. Y. and Huang, L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7851-7855, 1987).
[0761] Nejonski lipozomalni sistemi takođe su ispitivani kako bi se utvrdili njihova korisnost u isporuci lekova na kožu, posebno sistemi koji sadrže nejonske surfaktante i holesterol.
[0762] Nejonske lipozomske formulacije koje sadrže Novasome I (gliceril dilaurat/holesterol/polioksietilen-10-stearil eter) i Novasome II (gliceril distearat/holesterol/polioksietilen-10-stearil eter) su korišćene kako bi se isporučio lek u dermis kože miša. Takve formulacije sa RNKi agensom su korisne za lečenje dermatološkog poremećaja.
[0764] Lipozomi koji uključuju iRNK mogu biti visoko deformabilni. Takva deformabilnost može omogućiti da se lipozomi prodru kroz pore koji su manji od prosečnog radijusa lipozoma. Na primer, transferomi su tip deformabilnih lipozoma. Transferozomi mogu biti napravljeni dodavanjem aktivatora površinskih ivica, obično surfakanata, u standardni lipozomski sastav. Transferi koji uključuju RNKi agens mogu se dostaviti, na primer, potkožno infekcijom, kako bi se RNKi agens isporučili keratinocitima u koži. kako bi se prešla netaknuta koža sisara, lipidne vezikule moraju proći kroz seriju finih pora, svaka sa prečnikom manjim od 50 nm, pod uticajem pogodnog transdermalnog gradijenta. Pored toga, zbog osobina lipida, ovi transferosomi mogu biti samooptimizujući (prilagođavaju se obliku pora, na primer, u koži), samopopopravljajući i često mogu postići svoje ciljeve bez fragmentacije, i često se samopostavljaju.
[0766] Druge formulacije koje su podložne ovom pronalasku opisane su u United States privremene prijave br.61/018,616, podneta 2. januara 2008; 61/018,611, podneta 2. januara 2008; 61/039,748, podneta 26. marta 2008; 61/047,087, podneta 22. aprila 2008 i 61/051,528, podneto 8. maja 2008. PCT prijava br. PCT/US2007/080331, podneto 3. oktobra 2007 takođe opisuje formulacije koje se primenjuju na ovaj pronalazak.
[0768] Transferzomi su još jedan tip lipozoma i visoko deformabilni lipidni agregati koji su atraktivni kandidati za nosača za isporuku lekova. Transferzomi mogu biti opisani kao lipidne kapljice koje su tako visoko deformabilne tako da lako mogu prodreti kroz pore koje su manje od kapljice. Transferzomi se mogu prilagoditi okruženju u kome se koriste, npr., oni su sami samo-optimizujući ( prilagođavaju se obliku pora u koži), samo-popravljajući i često mogu postići svoje ciljeve bez fragmentacije, i često se samo-postavljaju. kako bi se napravili transferzomi, moguće je dodati površinski aktivator, obično površinski aktivne materije, u standardni lipozomski sastav. Transferzomi su korišćeni za isporuku serumskih albumina na kožu. Pokazano je da transferzomno posredovan serumski albumin deluje jednako efikasno kao i potkožna injekcija rastvora koji sadrži serumski albumin.
[0769] Surfaktanti pronalaze široku primenu u formulacijama kao što su emulzije (uključujući mikroemulzije) i lipozomi. Najčešći način klasifikacije i rangiranja svojstava mnogih različitih tipova surfakanata, prirodnih i sintetičkih, je korišćenje hidrofilnog/lipofilnog bilansa (HLB). Priroda hidrofilne grupe (poznata i kao „glava“) daje najkorisniji način za kategorizaciju različitih surfaktanata koji se koriste u formulacijama (Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, p. 285).
[0771] Ako molekul surfaktanta nije jonizovan, klasifikovan je kao nejonski surfaktant. Nejonski surfaktanti pronalaze široku primenu u farmaceutskim i kozmetičkim proizvodima i mogu se koristiti u širokom spektru pH vrednosti. Generalno, njihove vrednosti HLB se kreću od 2 do oko 18 u zavisnosti od njihove strukture. Nejonski surfaktanti uključuju nejonske estre kao što su etilen glikol estri, estri propilen glikola, gliceril estri, poligliceril estri, sorbitan estri, estri saharoze i etoksilovani esteri. U ovu klasu su takođe uključeni nejonski alkanolamidi i etri kao što su etoksilati masnih alkohola, propoksilovani alkoholi i etoksilovani/propoksilovani blokovi polimera. Polioksietilen surfaktanti su najpopularniji članovi klase nejonskih surfakanata.
[0773] Ako molekul surfaktanta nosi negativno naelektrisanje kada je rastvoren ili raspršen u vodi, surfaktant je klasifikovan kao anjonski. Anjonski surfaktanti uključuju karboksilate kao što su sapuni, acil laktilati, acil amidi aminokiselina, estri sumporne kiseline kao što su alkil sulfati i etoksilovani alkil sulfati, sulfonati kao što su alkil benzen sulfonati, acil izetionati, acil taurati i sulfosukcinati i fosfati. Najvažniji članovi klase anjonskih surfakanata su alkil sulfati i sapuni.
[0775] Ako molekul surfaktanta nosi pozitivno naelektrisanje kada se rastvara ili dispergira u vodi, surfaktant je klasifikovan kao katjonski. Katjonski surfaktanti uključuju kvaternarne amonijum soli i etoksilovane amine. Kvaternarne soli amonijaka su najkorisniji članovi ove klase.
[0777] Ako molekul surfaktanta ima sposobnost da nosi ili pozitivno ili negativno naelektrisanje, surfaktant je klasifikovan kao amfoteričan. Amfoterni surfaktanti uključuju derivate akrilne kiseline, supstituisane alkilamide, N-alkilbetene i fosfatide.
[0778] Pregledana je upotreba surfakanata u proizvodima lekova, formulacijama i emulzijama (Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, p.285).
[0780] iRNK za upotrebu u postupcima prema pronalasku može se takođe dati kao micelarne formulacije. „Micele“ su ovde definisane kao posebna vrsta molekularnih sklopova u kojima su amfipatski molekuli raspoređeni u sferičnoj strukturi tako da su svi hidrofobni delovi molekula usmereni unutra, ostavljajući hidrofilne delove u dodiru sa okolnom vodenom fazom. Konverzioni aranžman postoji ako je životna sredina hidrofobna.
[0782] Mešovita micelarna formulacija pogodna za isporuku preko transdermalnih membrana može se dobiti mešanjem vodenog rastvora siRNK sastavi, alkalnog metala C<8>do C<22>alkil sulfata i jedinjenja koja formiraju micelu. Jedinjenja koja formiraju micelu uključuju lecitin, hijaluronsku kiselinu, farmaceutski prihvatljive soli hijaluronske kiseline, glikolnu kiselinu, mlečnu kiselinu, ekstrakt kamilice, ekstrakt krastavaca, oleinsku kiselinu, linolnu kiselinu, linolensku kiselinu, monoolein, monooleate, monolaurate, ulje borača, ulje jagorčevine, mentol, trihidroksi okso holanil glicin i njihove farmaceutski prihvatljive soli, glicerin, poliglicerin, lizin, polilizin, triolein, polioksietilen etere i njihove analoge, poliokanol alkil etere i njihove analoge, njihodezoksolat, dezoksiholat i njihove smeše. Jedinjenja koja formiraju micelu mogu se dodati istovremeno ili posle dodavanja alkalnog metil alkil sulfata. Mešane micele će se formirati sa suštinski bilo kakvim mešanjem sastojaka, ali snažno mešanje je potrebno kako bi se pružile manje micele.
[0784] U jednom postupku se priprema prvi micelarni sastav koji sadrži siRNK sastav i najmanje alkil-metil-alkil sulfat. Prvi micelarni sastav se zatim meša sa najmanje tri micelarno formirajuća jedinjenja kako bi se formirao mešani micelarni sastav. U drugom postupku, micelarni sastav se priprema mešanjem siRNK sastava, alkalnog alkil sulfata i najmanje jednog od micelarnh formirajućih jedinjenja, nakon čega sledi dodavanje preostalih micelarnih formirajućih jedinjenja, uz snažno mešanje.
[0786] [0294] Fenol i/ili m-krezol mogu biti dodati u mešani micelarni sastav kako bi se stabilizovala formulacija i zaštitila od bakterijskog rasta. Alternativno, fenol i/ili m-krezol se mogu dodati sa sastojcima koji stvaraju micelu. Izotonični agens, kao što je glicerin, takođe se može dodati nakon formiranja mešovitog micelarnog sastava.
[0788] Za isporuku micelarne formulacije kao spreja, formulacija se može staviti u aerosolni dozator, a dozator je napunjen sa propelantom. Propelant, koje je pod pritiskom, je u tečnom obliku u dozatoru. Koeficijenti sastojaka su prilagođeni tako da vodene i propelantne faze postanu jedna, tj. postoji jedna faza. Ako postoje dve faze, neophodno je protresati dispenzer pre izdavanja dela sadržaja, npr. preko mernog ventila. Dozirana doza farmaceutskog sredstva se kreće iz merenog ventila u finom spreju.
[0790] Propelanti mogu uključivati hlorofluorougljenike koji sadrže vodonik, fluorokorbone koji sadrže vodonik, dimetil etar i dietil etar. U određenim otelotvorenjima može se koristiti HFA 134a (1,1,1,2-tetrafluoroetan).
[0792] Specifične koncentracije osnovnih sastojaka mogu se odrediti relativno jednostavnom eksperimentisanjem. Za apsorpciju kroz oralne šupljine, često je poželjno povećati, na primer, najmanje dvostruku ili trostruku dozu za injektiranje ili primenu kroz gastrointestinalni trakt.
[0794] B. Lipidne čestice
[0795] iRNK, npr., dsRNK pronalaska mogu biti potpuno inkapsulirani u lipidnoj formulaciji, npr. LNP ili drugoj čestici nukleinske kiseline-lipida.
[0797] [0299] Kad se ovde koristi, izraz „LNP“ se odnosi na stabilnu česticu nukleinske kiselinelipid. LNP sadrže katjonski lipid, nekatjonski lipid i lipid koji sprečava agregaciju čestice (npr., konjugat PEG lipida). LNP su izuzetno korisni za sistemske primene, jer oni pokazuju vek trajanja prolongirane cirkulacije nakon intravenske (i.v.) injekcije i akumuliraju se na distalnim mestima (npr., lokacije fizički odvojene od mesta primene). LNP uključuju „pSPLP“, koji uključuju inkapsulirani kompleks kondenzacionog agensa-nukleinske kiseline, kao što je navedeno u PCT Publication No. WO 00/03683. Čestice prema predmetnom pronalasku tipično imaju srednji prečnik od oko 50 nm do oko 150 nm, tipičnije oko 60 nm do oko 130 nm, tipičnije oko 70 nm do oko 110 nm, najtipičnije oko 70 nm do oko 90 nm, i suštinski su netoksični. Pored toga, nukleinske kiseline kada su prisutne u nukleinska kiselina-lipid česticama iz predmentog pronalaska su otporne u vodenom rastvoru do degradacije sa nukleazom. Nukleinska kiselina-lipid čestice i njihovi postupci pripreme su objavljeni u, na primer, u U.S. Patent Nos.5,976,567; 5,981,501; 6,534,484; 6,586,410;
[0798] 6,815,432; U.S. Publication No.2010/0324120 and PCT Publication No. WO 96/40964.
[0800] U jednoj implementaciji, odnos lipida prema leku (odnos masa/masa) (npr. odnos lipida i dsRNK) biće u opsegu od oko 1:1 do oko 50: 1, od oko 1:1 do oko 25:1, od oko 3:1 do oko 15:1, od oko 4:1 do oko 10:1, od oko 5:1 do oko 9:1 ili oko 6:1 do oko 9:1. Opsezi koji su između gore navedenih opsega se takođe smatraju delom pronalaska.
[0802] Katjonski lipid može biti, na primer, N,N-dioleil-N,N-dimetilamonijum hlorid (DODAC), N,N-distearil-N,N-dimetilamonijum bromid (DDAB), N-(I-(2,3-dioleoiloksi)propil)-N,N,N-trimetilamonijum hlorid (DOTAP), N-(I-(2,3-dioleiloksi)propil)-N,N,N-trimetilamonijum hlorid (DOTMA), N,N-dimetil-2,3-dioleiloksi)propilamin (DODMA), 1,2-DiLinoleiloksi-N,N-dimetilaminopropan (DLinDMA), 1,2-Dilinoleniloksi-N,N-dimetilaminopropan (DLenDMA), 1,2-Dilinoleilkarbamoiloksi-3-dimetilaminopropan (DLin-C-DAP), 1,2-Dilinolejoksi-3-(dimetilamino)acetoksipropan (DLin-DAC), 1,2-Dilinolejoksi-3-morfolinopropan (DLin-MA), 1,2-Dilinoleoil-3-dimetilaminopropan (DLinDAP), 1,2-Dilinoleilthio-3-dimetilaminopropan (DLin-S-DMA), 1-Linoleoil-2-linoleiloksi-3-dimetilaminopropan (DLin-2-DMAP), 1,2-Dilinoleiloksi-3-trimetilaminopropan hlorid so (DLin-TMA.Cl), 1,2-Dilinoleoil-3-trimetilaminopropan hlorid so (DLin-TAP.Cl), 1,2-Dilinoleiloksi-3-(N-metilpiperazino)propan (DLin-MPZ), ili 3-(N,N-Dilinoleilamino)-1,2-propanediol (DLinAP), 3-(N,N-Dioleilamino)-1,2-propanedio (DOAP), 1,2-Dilinoleilokso-3-(2-N,N-dimetilamino)etoksipropan (DLin-EG-DMA), 1,2-Dilinoleniloksi-N,N-dimetilaminopropan (DLinDMA), 2,2-Dilinoleil-4-dimetilaminometil-[1,3]-dioksolan (DLin-K-DMA) ili njihovi analozi, (3aR,5s,6aS)-N,N-dimetil-2,2-di((9Z,12Z)-oktadeka-9,12-dienil)tetrahidro-3aH-ciklopenta[d][1,3]dioksol-5-amin (ALN100), (6Z,9Z,28Z,31Z)-heptatriakonta-6,9,28,31-tetraen-19-il 4-(dimetilamino)butanoat (MC3), 1,1'-(2-(4-(2-((2-(bis(2-hidroksidodecil)amino)etil)(2-hidroksidodecil)amino)etil)piperazin-1-il)etilazanediil)didodekan-2-ol (Tech G1), ili njihova smeša. Katjonski lipid može da sadrži od oko 20 mol % do oko 50 mol % ili oko 40 mol % ukupnog lipida prisutnog u čestici.
[0804] U drugoj implementaciji, jedinjenje 2,2-Dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioksolan može se koristiti za pripremu lipid-siRNK nanočestica. Sinteza 2,2-Dilinoleil-4dimetilaminoetil-[1,3]-dioksolana je opisana u United States provisional patent application number 61/107,998 podneto 23. oktobra 2008, koji je ovde uključen referencom.
[0805] U jednoj implementaciji, lipid-siRNK čestica uključuje 40% 2, 2-Dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioksolan: 10% DSPC: 40% holesterol: 10% PEG-C-DOMG (procenat mola) veličinom čestica od 63,0 ± 20 nm i 0,027 siRNK/Lipid odnos.
[0807] Jonizirajući/nekatjonski lipid može biti anjonski lipid ili neutralni lipid uključujući, ali ne ograničavajući se na, distearoilfosfatidilholin (DSPC), dioleoilfosfatidilholin (DOPC), dipalmitoilfosfatidilholin (DPPC), dioleoilfosfatidilglicerol (DOPG), dipalmitoilfosfatidilglicerol (DPPG), dioleoil-fosfatidiletanolamin (DOPE), palmitoiloleoilfosfatidilholin (POPC), palmitoiloleoilfosfatidiletanolamin (POPE), dioleoilfosfatidiletanolamin 4-(N-maleimidometil)-cikloheksan-1-karboksilat (DOPE-mal), dipalmitoil fosfatidil etanolamin (DPPE), dimiristoilfosfoetanolamin (DMPE), distearoilfosfatidil-etanolamin (DSPE), 16-O-monometil PE, 16-O-dimetil PE, 18-1 -trans PE, 1 -stearoil-2-oleoil-fosfatidietanolamin (SOPE), holesterol, ili njihova smeša. Nekatjonski lipid može biti od oko 5 mol % do oko 90 mol %, oko 10 mol %, ili oko 58 mol % ako je holesterol uključen, ukupnog lipida prisutnog u čestici.
[0809] Konjugovani lipid koji inhibira agregaciju čestica može biti, na primer, polietileneglikol (PEG)-lipid uključuje, ne ograničavajući se na PEG-diacilglicerol (DAG), PEG-dialkiloksipropil (DAA), PEG-fosfolipid, PEG-ceramid (Cer), ili njihova smeša. PEG-DAA konjugat može biti, na primer, PEG-dilauriloksipropil (Ci<2>), PEG-dimiristiloksipropil (Ci<4>), PEG-dipalmitiloksipropil (Ci<6>), ili PEG-disteariloksipropil (C]<8>). Konjugovani lipid koji sprečava agregaciju čestica može biti od 0 mol % do oko 20 mol % ili oko 2 mol % ukupnog lipida prisutnog u čestici.
[0811] U nekim implementacijama, nukleinska kiselina-lipid čestica dalje uključuje holesterol pri, npr., oko 10 mol % do oko 60 mol % ili oko 48 mol % ukupnog lipida prisutnog u čestici.
[0813] [0306] U jednoj implementaciji, lipidoid ND98·4HCl (MV 1487) (pogledati U.S. Patent Application No.12/056,230, podnetu 3/26/2008, koja je ovde uključena referencom), holesterol (Sigma-Aldrich) i PEG-ceramide C16 (Avanti Polar Lipids) se mogu koristiti za pripremu naničestica lipid-dsRNK (npr., čestice LNP01). Osnovni rastvori svakog u etanolu mogu se pripremiti na sledeći način: ND98, 133 mg/ml; holesterol, 25 mg/ml, PEG-Ceramide C16, 100 mg/ml. ND98, holesterol i PEG-Ceramide C16 osnovni rastvori se zatim mogu kombinovati u, na primer, molarnom odnosu 42:48:10. Kombinovani lipidni rastvor se može mešati sa vodenom dsRNK (npr., u natrijum acetatu pH 5) tako da je konačna koncentracija etanola oko 35-45%, a konačna koncentracija natrijum acetata oko 100-300 mM. Nanočestice lipid-dsRNK obično se spontano formiraju prilikom mešanja. U zavisnosti od željene raspodele veličine čestica, dobijena smeša nanočestica može se ekstrudirati kroz polikarbonatnu membranu (npr., odrezak od 100 nm) pomoću, na primer, termobaričnog ekstrudera, kao što je Lipex Extruder (Northern Lipids, Inc). U nekim slučajevima, korak ekstruzije se može izostaviti. Odstranjivanje etanola i istovremena zamena pufera mogu se postići, na primer, na dijalizi ili filtraciji tangencijalnog protoka. Pufer se može zameniti, na primer, sa fiziološkim puferom (PBS) sa fosfatnim puferom, na oko pH 7,9, pH oko 6,9, pH 7,0, oko pH 7,1, oko pH 7,2, oko pH 7,3 ili oko pH 7,4.
[0816]
[0818] LNP01 formulacije su opisane, npr., u International Application Publication No. WO 2008/042973.
[0820] Dodatne primerne lipid-dsRNK formulacije su opisane u Tabeli A.
[0822] Tabela A.
[0824]
[0825]
[0826]
[0827]
[0830] Sinteza jonizujućih/katjonskih lipida
[0831] Bilo koje od jedinjenja, npr. katjonskih lipida i slično, koji se koriste u česticama nukleinske kiseline-lipida mogu se pripremiti poznatim tehnikama organske sinteze, uključujući postupke koji su detaljnije opisani u Primerima. Svi supstituenti su kako su definisani u nastavku, osim ako nije drugačije naznačeno.
[0833] „Alkil“ označava ravnog ili razgranatog, ne-cikličnog ili cikličnog, zasićenog alifatičnog ugljovodonika koji sadrži od 1 do 24 atoma ugljenika. Reprezentativni zasićeni alkilni ravni lanac uključuje metil, etil, n-propil, n-butil, n-pentil, n-heksil i slično; dok zasićeni razgranati alkili uključuju izopropil, sek-butil, izobutil, terc-butil, izopentil i slično. Reprezentativni zasićeni ciklični alkili uključuju ciklopropil, ciklobutil, ciklopentil, cikloheksil i slično; dok nezasićeni ciklični alkili uključuju ciklopentenil i cikloheksenil i slično.
[0835] „Alkenil“ označava alkil, kao što je prethodno definisano, sadrži najmanje jednu dvostruku vezu između susednih atoma ugljenika. Alkenili uključuju i cis i trans izomere.
[0836] Reprezentativni alkenili ravnog lanca i razgranati alkenili uključuju etilenil, propilenil, 1-butenil, 2-butenil, izobutilenil, 1-pentenil, 2-pentenil, 3-metil-1-butenil, 2-metil-2-butenil, 2,3-dimetil -2-butenil i slično.
[0838] „Alkinil“ označava bilo koji alkil ili alkenil, kao što je prethodno definisano, što dodatno sadrži najmanje jednu trostruku vezu između susednih ugljenika. Reprezentativni alkenili ravnog lanca i razgranati alkenili uključuju acetilenil, propinil, 1-butinil, 2-butinil, 1-pentinil, 2-pentilil, 3-metil-1-butinil i slično.
[0840] „Acil“ označava bilo koji alkil, alkenil ili alkinil gde je ugljenik na tački vezivanja supstituisan sa okso grupom, kako je definisano u nastavku. Na primer, -C (=O) alkil, -C (=O) alkenil i -C (=O) alkinil su acil grupe.
[0842] „Heterocikl“ označava 5- do 7-člani monociklični ili 7- do 10-člani biciklični, heterociklični prsten koji je ili zasićen, nezasićen ili aromatičan i koji sadrži od 1 ili 2 heteroatoma nezavisno odabrana od azota, kiseonika i sumpora, i gde heteroatomi azota i sumpora mogu biti opciono oksidovani, a heteroatom azota može biti opciono kvaternizovan, uključujući biciklične prstenove u kojima je bilo koji od gore navedenih heterocikla spojen sa benzenskim prstenom. Heterocikl može biti vezan preko bilo kog heteroatoma ili ugljenikovog atoma. Heterocikli uključuju heteroarile kao što je definisano u nastavku.
[0843] Heterocikli uključuju morfolinil, pirolidinonil, pirolidinil, piperidinil, piperizinil, hidantoinil, valerolaktamil, oksiranil, oksetanil, tetrahidrofuranil, tetrahidropiranil, tetrahidropiridinil, tetrahidroprimidinil, tetrahidrotiofenil, tetrahidrotiopiranil, tetrahidropirimidinil, tetrahidrotiofenil, tetrahidrotiopiranil, i slično.
[0845] [0315] Izrazi „opciono supstituisani alkil", „opciono supstituisani alkenil", „opciono supstituisani alkinil", „opciono supstituisani acil“ i „opciono supstituisani heterociklus“ podrazumevaju da, kada se supstituiše, najmanje jedan atom vodonika zamenjuje supstituent. U slučaju okso supstituenta (=O) dva atoma vodonika se zamenjuju. U tom pogledu supstituenti uključuju okso, halogen, heterocikl, -CN, -ORx, -NRxRy, -NRxC(=O)Ry, -NRxSO2Ry, -C(=O)Rx, -C(=O)ORx, -C(=O)NRxRy, -SOnRx i -SOnNRxRy, pri čemu je n 0, 1 ili 2, Rx i Ry su isti ili različiti i nezavisno su vodonik, alkil ili heterocikl, i svaki od pomenutih alkil i heterocikličnih supstituenata može dalje biti supstituisan sa jednim ili više od okso, halogena, -OH, -CN, alkila, -ORk, heterocikla, -NRkRi, -NRkC (=O) Ri, -NRkS02Ri, -C (=O) Rk, -C (=O) ORk , -C (=O) NRkRi, -SOnRk i -SnNRkRi.
[0847] „Halogen“ označava fluoro, hloro, bromo i jodo.
[0849] U nekim implementacijama, opisani postupci mogu zahtevati upotrebu zaštitnih grupa. metodologije zaštitne grupe je dobro poznata stručnjacima (pogledati, na primer, Protective Groups in Organic Synthesis, Green, T.W. i dr., Wiley-Interscience, New York City, 1999). Ukratko, zaštitna grupa u kontekstu ovog pronalaska je svaka grupa koja smanjuje ili eliminiše neželjenu reaktivnost funkcionalne grupe. Zaštitna grupa može biti dodata u funkcionalnu grupu da maskira svoju reaktivnost tokom određenih reakcija, a zatim ukloni da otkrije prvobitnu funkcionalnu grupu. U nekim otelotvorenjima se koristi „alkoholna zaštitna grupa“. „Alkoholna zaštitna grupa“ je svaka grupa koja smanjuje ili eliminiše neželjenu reaktivnost funkcionalne grupe alkohola. Zaštitne grupe se mogu dodati i ukloniti korišćenjem tehnika koje su dobro poznate u struci.
[0851] Sinteza Formule A
[0852] U nekim implementacijama, nukleinska kiselina-lipid čestice pronalaska su formulisane koristeći katjonski lipid Formule A:
[0855]
[0857] gde su R1 i R2 nezavisno alkil, alkenil ili alkinil, svaki može biti opciono supstituisan, i R3 i R4 su nezavisno niži alkil ili R3 i R4 mogu biti uzeti zajedno da formiraju opciono supstituisan heterociklični prsten. U nekim implementacijama, katjonski lipid je XTC (2,2-Dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioksolan). Uopšteno, lipid Formule A iznad može se napraviti prateći Reakcione Šeme 1 ili 2, gde su svi supstituenti kako je definisano iznad osim ako nije naznačeno drugačije.
[0858]
[0860] Lipid A, gde su R1 i R2 nezavisno alkil, alkenil ili alkinil, svaki može biti opciono supstituisan, i R3 i R4 su nezavisno niži alkil ili R3 i R4 mogu biti uzeti zajedno da formiraju opciono supstituisan heterociklični prsten, može biti pripremljen prema Šemi 1. Keton 1 i bromid 2 mogu biti kupljeni ili pripremljeni prema postupcima poznatim prosečnom stručnjaku u oblasti. Reakcija 1 i 2 prinosi ketal 3. Tretman ketala 3 sa aminom 4 prinosi lipide Formule A. Lipidi Formule A mogu biti konvertovani do odgovarajuće amonijum soli sa organskom soli Formule 5, gde je X anjon kontra jon izabran od halogena, hidroksida, fosfata, sulfata, ili slično.
[0863]
[0866] Alternativno, keton 1 početni materijal može biti pripremljen prema Šemi 2. Grignard reagens 6 i cijanid 7 mogu biti kupljeni ili pripremljeni prema postupcima poznatim prosečnom stručnjaku u oblasti. Reakcija 6 i 7 prinosi keton 1. konverzija ketona 1 do odgovarajućih lipida Formule A je kako je opisano u Šemi 1.
[0868] Sinteza MC3
[0869] Priprema DLin-M-C3-DMA (tj., (6Z,9Z,28Z,31Z)-heptatriakonta-6,9,28,31-tetraen-19-il 4-(dimetilamino)butanoat) bila je kako sledi. Rastvor (6Z,9Z,28Z,31Z)-heptatriakonta-6,9,28,31-tetraen-19-ol (0,53 g), 4-N,N-dimetilaminobuterna kiselina hidrohloride (0,51 g), 4-N,N-dimetilaminopiridina (0,61g) i 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)karbodiimid hidrohlorida (0,53 g) u dihlorometanu (5 mL) je mešan na sobnoj temperaturi preko noći. Rastvor je opran sa razblaženom hlorovodoničnom kiselinom praćeno razblaženim vodenim natrijum bikarbonatom. Organski fragmenti su osušeni preko nevodenog magnezijum sulfata, filtrirani i rastvarač je uklonjen na rotovapu. Ostatak je pušten niz silika gel kolonu (20 g) koristeći 1-5% metanol/dihlorometan gradijent elucije. Fragmenti koji sadrže pročišćen proizvod su kombinovani i rastvarač je uklonjen, prinoseći bezbojno ulje (0,54 g).
[0870] Sinteza ALNY-100
[0872] Sinteza ketala 519 [ALNY-100] je obavljena koristeći narednu Šemu 3:
[0875]
[0878] Sinteza 515
[0879] Mešanoj suspenziji LiAlH4 (3,74 g, 0,09852 mol) u 200 ml nevodenog THF u RBF sa dva grla (1L), dodat je rastvor 514 (10g, 0,04926mol) u 70 mL THF polako na 00C pod atmosferom azota. Nakon što je dodavanje završeno, reakciona smeša je zagrejana do sobne temperature i zatim zagrejana do refluksa tokom 4 sata. Napredak reakcije je praćen sa TLC. Nakon završetka reakcije (sa TLC) smeša je ohlađena do 00C i ugašena pažljivim dodavanjem saturisanog Na2SO4 rastvora. Reakciona smeša je mešana tokom 4 sata na sobnoj temperaturi i filtrirana. Ostatak je dobro opran sa THF. Filtrat i oprana smeša su pomešani i razblaženi sa 400 mL dioksana i 26 mL koncentrisanog HCl i mešani tokom 20 minuta na sobnoj temperaturi. Isparljive materije su uklonjene pod vakuumom kako bi se dobila hidrohlorid so 515 kao bela čvrsta materija. Prinos: 7,12 g 1H-NMR (DMSO, 400MHz): δ= 9,34 (široko, 2H), 5,68 (s, 2H), 3,74 (m, 1H), 2,66-2,60 (m, 2H), 2,50-2,45 (m, 5H).
[0880] Sinteza 516
[0881] Mešanom rastvoru jedinjenja 515 u 100 mL suvom DCM u 250 mL RBF sa dva grla, dodat je NEt3 (37,2 mL, 0,2669 mol) i ohlađen do 00C pod atmosferom azota. Nakon sporog dodavanja N-(benziloksi-karboniloksi)-sukcinimida (20 g, 0,08007 mol) u 50 mL suvog DCM, reakcionoj smeši je dopušteno da se zagreje do sobne temperature. Nakon završetka reakcije (2-3 sata sa TLC) smeša je oprana redom sa 1N HCl rastvorom (1 x 100 mL) i zasićenim NaHCO3 rastvorom (1 x 50 mL). Organski sloj je zatim osušen preko anhida. Na2SO4 i rastvarač su ispareni kako bi se dobio sirov materijal koji je pročišćen sa silika gel kolonskom hromatografijom kako bi se dobio 516 kao lepljiva masa. Prinos: 11g (89%).1H-NMR (CDCl3, 400MHz): δ = 7,36-7,27(m, 5H), 5,69 (s, 2H), 5,12 (s, 2H), 4,96 (br., 1H) 2,74 (s, 3H), 2,60(m, 2H), 2,30-2,25(m, 2H). LC-MS [M+H] -232,3 (96,94%).
[0883] Sinteza 517A i 517B
[0884] Ciklopenten 516 (5 g, 0,02164 mol) je rastvoren u rastvoru 220 mL acetona i vode (10:1) u 500 mL RBF sa jednim grlom i tome je dodat N-metil morfolin-N-oksid (7,6 g, 0,06492 mol) praćen sa 4,2 mL 7,6% rastvora OsO4 (0,275 g, 0,00108 mol) u tert-butanol na sobnoj temperaturi. Nakon završetka reakcije (∼ 3 h), smeša je ugašena sa dodavanjem čvrstog Na2SO3 i rezultujuća smeša je mešana tokom 1,5 sata na sobnoj temperaturi.
[0885] Reakciona smeša je razblažena sa DCM (300 mL) i oprana sa vodom (2 x 100 mL) praćeno sa zasićenim NaHCO3 (1 x 50 mL) rastvorom, vodom (1 x 30 mL) i konačno sa fiziološkim rastvorom (1x 50 mL). Organska faza je osušena preko nevodenog Na2SO4 i rastvarač je uklonjen u vakuumu. Pročišćavanje sirovog materijala silika gel kolonskom hromatografijom je dalo smešu diastereomera, koji su razdvojeni sa pripremnim HPLC.
[0886] Prinos: - 6 g sirove materije
[0887] 517A - Vrh-1 (bela čvrsta materija), 5,13 g (96%).1H-NMR (DMSO, 400MHz): δ= 7,39-7,31(m, 5H), 5,04(s, 2H), 4,78-4,73 (m, 1H), 4,48-4,47(d, 2H), 3,94-3,93(m, 2H), 2,71(s, 3H), 1,72-1,67(m, 4H). LC-MS - [M+H]-266,3, [M+NH4 ]-283,5 prisutno, HPLC-97,86%. Stereohemija potvrđena sa rendgenskim zracima.
[0889] Sinteza 518
[0890] [0326] Koristeći procedure analogne onim opisanim tokom sinteze jedinjenja 505, jedinjenje 518 (1,2 g, 41%) je dobijeno kao bezbojno ulje.1H-NMR (CDC13, 400MHz): δ= 7,35-7,33(m, 4H), 7,30-7,27(m, 1H), 5,37-5,27(m, 8H), 5,12(s, 2H), 4,75(m,1H), 4,58-4,57(m,2H), 2,78-2,74(m,7H), 2,06-2,00(m,8H), 1,96-1,91(m, 2H), 1,62(m, 4H), 1,48(m, 2H), 1,37-1,25(br m, 36H), 0,87(m, 6H). HPLC-98,65%.
[0892] Opšti postupak tokom sinteze jedinjenja 519
[0893] Rastvor jedinjenje 518 (1 eq) u heksanu (15 mL) dodat je kapanjem ledeno hladnom rastvoru LAH u THF (1 M, 2 eq). Nakon što je dodavanje završeno, smeša je zagrejana na 40oC tokom 0,5 sata i zatim ohlađena ponovo u ledenoj kupki. Smeša je pažljivo hidrolizovana sa zasićenim vodenim Na2SO4 zatim filtrirana kroz celit i svedena na ulje. Kolonska hromatografija dala je čist 519 (1,3 g, 68%) koji je dobijen kao bezbojno ulje. 13C NMR δ = 130,2, 130,1 (x2), 127,9 (x3), 112,3, 79,3, 64,4, 44,7, 38,3, 35,4, 31,5, 29,9 (x2), 29,7, 29,6 (x2), 29,5 (x3), 29,3 (x2), 27,2 (x3), 25,6, 24,5, 23,3, 226, 14,1; Elektrosprej MS (+ve): Molekularna težina tokom C44H80NO2 (M H)+ Izračunato 654,6, Pronađeno 654,6.
[0895] Formulacije pripremljene ili standardnim ili postupkom bez ekstruzije mogu se karakterisati na slične načine. Na primer, formulacije obično karakteriše vizuelni pregled. One bi trebalo da budu beličasti prozirni rastvori bez agregata ili sedimenta. Veličina čestica i raspodela veličine lipidnih nanočestica se može meriti rasipanjem svetlosti koristeći, na primer, Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvern, SAD). Čestice treba da budu veličine oko 20-300 nm, kao što je 40-100 nm. Distribucija veličine čestica treba da bude unimodalna.
[0896] Ukupna koncentracija dsRNK u formulaciji, kao i uhvaćen fragment, procenjuju se pomoću testa za isključivanje boje. Uzorak formulisane dsRNK može se inkubirati sa RNK vezujućom bojom, kao što je Ribogreen (Molecular Probes) u prisustvu ili odsustvu formulacije koja prekida surfaktant, na primer, 0,5% Triton-X100. Ukupna dsRNK u formulaciji može se odrediti signalom iz uzorka koji sadrži surfaktant, u odnosu na standardnu krivu. Uključen fragment se određuje oduzimanjem „slobodnog“ dsRNK sadržaja (kao što je mereno signalom u odsustvu surfaktanta) iz ukupnog sadržaja dsRNK. Procenat uhvaćenog dsRNK je tipično> 85%. Za LNP formulaciju, veličina čestica je najmanje 30 nm, najmanje 40 nm, najmanje 50 nm, najmanje 60 nm, najmanje 70 nm, najmanje 80 nm, najmanje 90 nm, najmanje 100 nm, najmanje 110 nm i najmanje 120 nm. Odgovarajući opseg je tipično oko 50 nm do oko 110 nm, oko 60 nm do oko 100 nm ili oko 80 nm do oko 90 nm.
[0898] [0329] Sastavi i formulacije za oralnu primenu uključuju prahove ili granule, mikropartikulate, nanopartikulate, suspenzije ili rastvore u vodi ili ne-vodenim medijima, kapsulama, želatinastim kapsulama, vrećicama, tabletama ili minitabletima. Zamućivači, agensi za ukus, razređivači, emulgatori, agensi za disperziju ili veznika mogu biti poželjni. U nekim otelotvorenjima, oralne formulacije su one u kojima se dsRNK koji se nalaze u pronalasku daju u kombinaciji sa jednim ili više surfakanata za poboljšanje penetracije i helatatora. Odgovarajući surfakanti uključuju masne kiseline i/ili njihove estere ili soli, žučne kiseline i/ili njihove soli. Odgovarajuće žučne kiseline/soli mogu biti henodezoksiholna kiselina (CDCA) i ursodezoksihenodezoksiholna kiselina (UDCA), holna kiselina, dehidroholna kiselina, dezoksiholna kiselina, gluholna kiselina, gliholna kiselina, glikodezoksiholna kiselina, tauroholna kiselina, taurodezoksiholna kiselina, natrijum tauro-24,25-dihidro-fusidat i natrijum glikodihidrofusidat. Odgovarajuće masne kiseline mogub biti arahidonska kiselina, undekanska kiselina, oleinska kiselina, laurinska kiselina, kaprilna kiselina, dekanska kiselina, miristinska kiselina, palmitinska kiselina, sterinska kiselina, linoleinska kiselina, linoleinska kiselina, dikaprat, trikaprat, monoolein, dilaurin, gliceril 1-monokaprat, 1-dodecilazacikloheptan-2-one, acilkarnitin, acilholin, ili monoglicerid, diglicerid ili njihoca farmaceutski prihvatljiva so (npr., natrijum). U nekim otelotvorenjima, kombinacije korišćene su kombinacije pobošljivača penetracije, na primer, masne kiseline/soli u kombinaciji sa žučnim kiselinama/solima. Jedna primerna kombinacija je natrijum so laurinske kiseline, dekanske kiseline i UDCA. Dalji poboljšivači penetracije uključuju polioksietilen-9-lauril eter, polioksietilen-20-cetil eter. dsRNK pronalaska mogu se isporučiti oralno, u granularnom obliku koji uključuje prskane suve čestice, ili kompleksovani da formiraju mikro ili nanočestice. dsRNK komplekirajući agensi mogu biti poli-aminokiseline; poliimini poliacrilati; polialkilacrilati, polioksetani, polialkilcijanoacrilati; katjonizovani želatinu, albumini, skrobovi, acrilati, polietilenglikoli (PEG) i skrobovi; polialkilcijanoacrilati; DEAE-derivatizovani poliimini, pululani, celuloze i skrobovi. Odgovarajući komplekirajući agensi mogu biti hitozan, N-trimetilhitozan, poli-L-lizin, polihistidin, poliornithin, polispermini, protamin, polivinilpiridin, polithiodietilaminometiletilen P(TDAE), poliaminostiren (npr., p-amino), poli(metilcijanoacrilat), poli(etilcijanoacrilat), poli(butilcijanoacrilat), poli(izobutilcijanoacrilat), poli(izoheksilcinaoakrilat), DEAE-metakrilat, DEAE-heksilakrilat, DEAE-acrilamid, DEAE-albumin i DEAE-deXtran, polimetilakrilat, poliheksilakrilat, poli(D,L-mlečna kiselina), poli(DL-mlečna-co-glikolna kiselina (PLGA), alginat, i polietilenglikol (PEG). Oralne formulacije za dsRNK i njihova priprema su opisani detaljno u U.S. Patent 6,887,906, US objava No. 20030027780, i U.S. Patent No.6,747,014, koji su svi ovde uključeni referencom.
[0899] Sastavi i formulacije za parenteralno, intraparenhimalno (u mozak), intratekalno, intraventrikularno ili intrahepatično primenjivanje mogu uključivati sterilne vodene rastvore koji takođe mogu sadržati pufere, razblaživače i druge pogodne aditive kao što su, ali nisu ograničene na, poboljšivači penetracije, nosač jedinjenja i drugi farmaceutski prihvatljive nosači ili ekscipijenti.
[0901] Farmaceutski sastavi prema predmetnom pronalasku uključuju, ali nisu ograničene na, rastvore, emulzije i formulacije koje sadrže lipozome. Ove sastavi mogu se generisati od različitih komponenti koje uključuju, ali se ne ograničavaju na, prethodno formirane tečnosti, samo-emulgirajuće čvrste materije i samo-emulgirajuće polučvrste materije. Posebno su poželjne formulacije koje ciljaju jetru pri lečenju jetre kao što je karcinom jetre.
[0903] Farmaceutske formulacije prema predmetnom pronalasku, koje se pogodno mogu predstaviti u jediničnoj doznoj formi, mogu se pripremiti u skladu sa konvencionalnim tehnikama koje su dobro poznate u farmaceutskoj industriji. Takve tehnike uključuju korak uključivanja aktivnih sastojaka sa farmaceutskim nosačem ili ekscipijentima. Generalno, formulacije se pripremaju ravnomerno i blisko dovodeći u vezu aktivne sastojke sa tečnim nosačima ili fino podeljenim čvrstim nosačima ili oba, a zatim, ako je potrebno, oblikujući proizvod.
[0905] Sastavi ovog pronalaska mogu se formulisati u bilo kom od mnogih mogućih oblika doziranja kao što su, ali bez ograničavanja na, tablete, kapsule, želatinaste kapsule, tečne sirupe, meke gelove, supozitorijume i klistire. Sastavi ovog pronalaska se takođe mogu formulisati kao suspenzije u vodenom, ne-vodenom ili mešovitom medijumu. Vodene suspenzije mogu dalje sadržati supstance koje povećavaju viskozitet suspenzije uključujući, na primer, natrijum karboksimetilcelulozu, sorbitol i/ili dekstran. Suspenzija takođe može sadržati stabilizatore.
[0907] C. Dodatne formulacije
[0908] Emulzije
[0909] [0334] Sastavi ovog pronalaska mogu se pripremati i formulisati kao emulzije. Emulzije su tipično heterogeni sistemi jedne tečnosti raspršene u drugoj u obliku kapljica koja obično prelazi 0, 1µm u prečniku (pogledati npr. Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p.199; Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Volume 1, p.245; Block in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 2, p.335; Higuchi i dr., u Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, p.301). Emulzije su često dvofazni sistemi koji sadrže dve faze nepomešanih tečnosti koje se intenzivno mešaju i raspršuju jedna u drugu. Uopšteno govoreći, emulzije mogu biti u voda-u-ulju (w/o) ili ulje u vodi (o/w). Kada se vodena faza fino podeli i rasprši kao kapljice u uljanoj fazi, dobijeni sastav se naziva emulziji voda u ulju (w/o). Alternativno, kada je uljana faza fino podeljena i raspršena kao kapljice u vodenoj fazi, dobijeni sastav se naziva emulzija ulje-u-vodi (o/w). Emulzije mogu da sadrže dodatne komponente pored raspršenih faza i aktivni lek koji može biti prisutan kao rastvor ili u vodenoj fazi, uljanoj fazi ili sam po sebi kao zasebna fazi. Farmaceutski ekscipijenti kao što su emulgatori, stabilizatori, boje i antioksidanti mogu takođe biti prisutni u emulzijama po potrebi. Farmaceutske emulzije takođe mogu biti višestruke emulzije koje se sastoje od više od dve faze, kao što su, na primer, ulje-u-vodi-u-ulju (o/w/o) i voda-u-ulju-u-vodi (w/o/w) emulzije. Takve kompleksne formulacije često pružaju određene prednosti koje jednostavne binarne emulzije nemaju. Višestruke emulzije u kojima pojedinačne uljne kapljice emulzije o/w sadrže male kapljice vode predstavljaju emulziju w/o/w. Takođe, sistem kapljica ulja zatvoren u kapljice vode stabilizovan u uljanoj kontinuiranoj fazi pruža emulziju o/w/o.
[0911] Emulzije karakteriše malo ili nimalo termodinamičke stabilnosti. Često, raspršena ili diskontinuirana faza emulzije dobro je raspršena u spoljnu ili kontinuiranu fazu i održava se u ovom obliku pomoću emulgatora ili viskoznosti formulacije. Jedna od faza emulzije može biti poluprovodna ili čvrsta, kao što je slučaj sa bazama masti i kremama u obliku emulzije. Ostala sredstva za stabilizaciju emulzija podrazumevaju upotrebu emulgatora koji mogu biti inkorporirani u bilo koju fazu emulzije. Emulgatori se uopšte mogu klasifikovati u četiri kategorije: sintetički surfakanti, prirodni emulgatori, apsorbacione baze i fino raspršene čvrste materije (pogledati npr. Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p.199).
[0912] Sintetički surfaktanti, takođe poznati kao površinski aktivni agensi, pronašli su široku primenljivost u formulaciji emulzija i pregledani su u literaturi (pogledati npr. Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p.285; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, volume 1, p.199). Surfaktanti su tipično amfifilni i sadrže hidrofilni i hidrofobni deo. Odnos hidrofilne i hidrofobne prirode surfaktanta nazvan je hidrofilno/lipofilni balans (HLB) i predstavlja važan alat u kategorizaciji i selekciji surfakanata u pripremi formulacija. Surfaktanti se mogu klasifikovati u različite klase, zasnovane na prirodi hidrofilne grupe: nejonska, anjonska, katjonska i amfoterična (pogledati npr. Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p.285).
[0914] Emulgatori koji se prirodno pojavljuju u formulacijama emulzije uključuju lanolin, pčelinji vosak, fosfatid, lecitin i akaciju. Apsorpcione baze poseduju hidrofilna svojstva tako da mogu da upiju vodu kako bi se formirale w/o emulzije uz zadržavanje svog polučvrstog sastava, kao što su anhidrirani lanolin i hidrofilni petrolatum. Fino podeljene čvrste supstance su takođe korišćene kao dobri emulgatori posebno u kombinaciji sa surfaktantima i u viskoznim preparatima. Ovo uključuje polarne neorganske čvrste materije, kao što su hidroksidi teških metala, gline koje ne sadrže bentonit, atapulgit, hektorit, kaolin, montmorilonit, koloidni aluminijum silikat i koloidni magnezijum aluminijum silikat, pigmenti i nepolarne čvrste supstance kao što su ugljenik ili gliceril tristearat.
[0916] Veliki broj ne-emulgujućih materijala takođe je uključen u formulacije emulzije i doprinosi svojstvima emulzija. Među njima su masti, ulja, voskovi, masne kiseline, masni alkoholi, masni estri, humektanti, hidrofilni koloidi, konzervansi i antioksidanti (Block, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p.335; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p.199).
[0917] Hidrofilni koloidi ili hidrokoloidi uključuju prirodne gume i sintetičke polimere kao što su polisaharidi (na primer akacija, agar, alginska kiselina, karagenan, guar guma, karaja guma i tragakant), derivati celuloze (na primer, karboksimetilceluloza i karboksimetilceluloza) i sintetički polimeri (na primer, karboneri, etil celuloza i karboksivinil polimeri). Oni se raspršuju ili nadimaju u vodi kako bi se formirali koloidni rastvori koji stabilizuju emulzije stvaranjem jakih međufaznih filmova oko kapljica raspršene faze i povećanjem viskoznosti spoljne faze.
[0919] Pošto emulzije često sadrže niz sastojaka kao što su ugljeni hidrati, proteini, steroli i fosfatidi koji mogu lako podržati rast mikroba, ove formulacije često sadrže konzervanse. Najčešće korišćeni konzervansi uključeni u formulacije emulzije uključuju metil paraben, propil paraben, kvaternarne amonijum soli, benzalkonijum hlorid, estre p-hidroksibenzojeve kiseline i bornu kiselinu. Antioksidanti se takođe često dodaju u formulacije emulzije kako bi se sprečilo pogoršanje formulacije. Korišćeni antioksidanti mogu biti slobodni radikali, kao što su tokoferoli, alkil galati, butilovani hidroksianizol, butilovani hidroksitoluen ili redukcioni agensi kao što su askorbinska kiselina i natrijum metabisulfit i antioksidativni sinergisti kao što su limunska kiselina, vinska kiselina i lecitin.
[0921] Primena formulacija emulzije putem dermatoloških, oralnih i parenteralnih puteva i postupci za njihovu proizvodnju pregledana je u literaturi (pogledati npr. Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p.199). Formulacije emulzije za oralnu isporuku su se široko koristile zbog lakoće formulacije, kao i efikasnosti sa stanovišta apsorpcije i biološke dostupnosti (pogledati npr. Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p.245; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p.199). Laksativi na bazi mineralnih ulja, vitamini rastvorljivi u uljima i prehrambeni preparati sa visokim sadržajem masnih kiselina su među materijalima koji se obično primenjuju kao oralne emulzije.
[0922] ii. Mikroemulzije
[0923] U jednoj implementaciji, sastavi iRNK i nukleinskih kiselina formulisani su kao mikroemulzije. Mikroemulzija se može definisati kao sistem vode, ulja i amfifila koji predstavlja jedinstveni optički izotropni i termodinamički stabilan tečni rastvor (pogledati npr. Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p.245). Tipično, mikroemulzije su sistemi koji se pripremaju prvim dispergiranjem ulja u vodenom rastvoru površinskog sredstva i zatim dodavanjem dovoljne količine četvrte komponente, uglavnom alkohola srednje dužine lanca, kako bi se formirao transparentan sistem. Stoga, mikroemulzije su takođe opisane kao termodinamički stabilne, izotropski jasne disperzije dve tečnosti koje se ne mogu mešati koje su stabilizovane pomoću interfacijalnih filmova površinski aktivnih molekula (Leung and Shah, in: Controlled Release of Drugs: Polymers and Aggregate Systems, Rosoff, M., Ed., 1989, VCH Publishers, New York, pages 185-215). Mikroemulzije se obično pripremaju kombinacijom od tri do pet komponenti koje uključuju ulje, vodu, surfaktant, kosurfaktant i elektrolit. Da li je mikroemulzija u voda-u-ulju (w/o) ili ulje-u-vodi (o/w) zavisi od karakteristika korišćenog ulja i surfakanta, kao i strukture i geometrijske ambalaže polarne glave i ugljovodoničnih repova molekula surfaktanta (Schott, in Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, p.271).
[0925] Fenomenološki pristup korišćenjem faznih dijagrama je u velikoj meri proučavan i dao jesveobuhvatno znanje stručnjaku o tome kako formulisati mikroemulzije (pogledati npr. Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p.245; Block, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 335). U poređenju sa konvencionalnim emulzijama, mikroemulzije nude, prednost solubiliziranja lekova nerastvorljivih u vodi u formulaciji termodinamički stabilnih kapljica koji se formiraju spontano.
[0927] [0344] Surfaktanti koji se koriste pri izradi mikroemulzija uključuju, ali se ne ograničavaju na, jonske surfaktante, nejonske surfaktante, Brij 96, polioksietilen oleil etre, poliglicerol estre masnih kiselina, tetraglicerol monolaurat (ML310), tetraglicerol monooleat (MO310) heksaglicerol monooleat (PO310), heksaglicerol pentaoleat (PO500), dekaglicerol monokaprat (MCA750), dekaglicerol monooleat (MO750), dekaglicerol sekiooleat (SO750), dekaglicerol decaoleat (DAO750), same ili u kombinaciji sa kosurfaktanima. Kosurfaktant, obično alkohol kratkog lanca, kao što su etanol, 1-propanol i 1-butanol, služi za povećanje interfacijalne fluidnosti penetrirajući u površinski aktivni film i stoga stvarajući neuređeni film zbog praznog prostora koji se stvara između molekula surfaktanta. Mikroemulzije, međutim, mogu biti pripremljene bez upotrebe kosurfaktanata i samo-emulgujujući mikroemulzioni sistemi bez alkohola su poznati u struci. Vodena faza može biti, ali nije ograničena na, vodu, vodeni rastvor leka, glicerol, PEG300, PEG400, poliglicerol, propilen glikol i derivate etilen glikola. Uljana faza može uključivati, ali nije ograničena na, materijale kao što su Captex 300, Captex 355, Capmul MCM, estre masnih kiselina, mono, di i trigliceride srednjeg lanca (C8-C12), polioksietilovane gliveril estre masnih kiselina, masne alkohole, poliglikolizovane gliceride, zasićene poliglikolizovane C8-C10 gliceride, biljna ulja i silikonska ulja.
[0929] Mikroemulzije su posebno interesantne sa stanovišta solubilizacije leka i povećane apsorpcije lekova. Mikroemulzije na lipidima (i o/w i w/o) su predložene kako bi se poboljšala oralna biodostupnost lekova, uključujući peptide (pogledati npr. U.S. Patent Nos.
[0930] 6,191,105; 7,063,860; 7,070,802; 7,157,099; Constantinides i dr., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385-1390; Ritschel, Meth. Find. Exp. Clin. Pharmacol., 1993, 13, 205).
[0931] Mikroemulzije pružaju prednosti poboljšane solubilizacije leka, zaštite leka od enzimske hidrolize, moguće poboljšanja apsorpcije lekova usled promena u tečnosti membrane i propustljivosti membrane, lakoće pripreme, lakoće oralne primene putem čvrstih doznih oblika, poboljšanje kliničke potencije i smanjene toksičnosti (pogledati npr. U.S. Patent Nos.
[0932] 6,191,105; 7,063,860; 7,070,802; 7,157,099; Constantinides i dr., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385; Ho i dr., J. Pharm. Sci., 1996, 85, 138-143). Često se mikroemulzije formiraju spontano kada se njihove komponente sjedinjuju na temperaturi okoline. Ovo može biti posebno pogodno kada se formulišu termolabilni lekovi, peptidi ili iRNK. Mikroemulzije su takođe bile efikasne u transdermalnoj isporuci aktivnih komponenata i u kozmetičkim i farmaceutskim primenama. Očekuje se da će mikroemulzioni preparati i formulacije predmetnog pronalaska olakšati povećanu sistemsku apsorpciju iRNK i nukleinskih kiselina iz gastrointestinalnog trakta, kao i poboljšati lokalnu mobilnu primenu iRNK i nukleinskih kiselina.
[0933] Mikroemulzije mogu takođe da sadrže dodatne komponente i aditive kao što su sorbitan monostearat (Grill 3), Labrasol i poboljšivače penetracije radi poboljšanja svojstava formulacije i povećanja apsorpcije iRNK i nukleinskih kiselina iz ovog pronalaska.
[0934] Poboljšivači penetracije koji se koriste u mikroemulzijama predmetnog pronalaska mogu se klasifikovati kao pripadajući jednoj od pet širokih kategorija - površinski aktivni sastojci, masne kiseline, soli žuči, agensi za heliranje i ne- helirajući ne-surfaktanti (Lee i dr., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92). Svaka od ovih klasa je gore opisana.
[0936] iii. Mikročestice
[0937] RNKi agens prema pronalasku može biti inkorporiran u česticu, npr., mikročesticu. Mikročestice se mogu proizvoditi sušenjem prskanjem, ali se takođe mogu proizvoditi drugim postupcima, uključujući liofilizaciju, isparavanje, sušenje u fluidnom sloju, vakuumsko sušenje ili kombinaciju ovih tehnika.
[0939] iv. Poboljšivači penetracije
[0940] U jednoj implementaciji, ovaj pronalazak koristi različite poboljšivače penetracije kako bi efikasno isporučivao nukleinske kiseline, posebno iRNK, na kožu životinja. Većina lekova je prisutna u rastvoru u jonizovanim i nejonizovanim oblicima. Međutim, obično samo lipidni ili lipofilni lekovi lako prelaze ćelijske membrane. Otkriveno je da čak i ne-lipofilni lekovi mogu da pređu ćelijske membrane ukoliko se membrana koja se pređe tretira sa poboljšivačem penetracije. Osim što pomaže u difuziji ne-lipofilnih lekova preko ćelijskih membrana, poboljšavanje penetracije povećava i propusnost lipofilnih lekova.
[0942] Poboljšivači penetracije mogu se klasifikovati kao pripadajući jednoj od pet širokih kategorija, tj. surfakanti, masne kiseline, žučne soli, agensi za heliranje i ne-helirajući nesurfakanati (pogledati npr. Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Lee i dr., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92). Svaka od gore pomenutih klasa poboljšanja penetracije opisana je dole detaljnije.
[0944] [0350] Surfaktanti (ili „površinski aktivni agensi“) su hemijska jedinjenja koja, kada se rastvore u vodenom rastvoru, smanjuju površinsko naelektrisanje rastvora ili međusobne napetosti između vodenog rastvora i druge tečnosti, tako da se poboljšava apsorpcija iRNK preko sluznice. Pored žučnih soli i masnih kiselina, ovi poboljšivači penetracije uključuju, na primer, natrijum lauril sulfat, polioksietilen-9-lauril eter i polioksietilen-20-cetil eter) (pogledati npr. Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Lee i dr., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92); i perfluorohemijske emulzije, kao što je FC-43. Takahashi i dr., J. Pharm.
[0945] Pharmacol., 1988, 40, 252).
[0947] Različite masne kiseline i njihovi derivati koji deluju kao poboljšivači penetracije uključuju, na primer, oleinsku kiselinu, laurinsku kiselinu, kapričnu kiselinu (n-dekansku kiselinu), miristinsku kiselinu, palmitinsku kiselinu, stearinsku kiselinu, linolensku kiselinu, linolensku kiselinu, dikaprat , trikaprat, monoolein (1-monooloil-rac-glicerol), dilaurin, kaprilnu kiselinu, arahidonsku kiselina, glicerol 1-monokaprat, 1-dodecilazacikloheptan-2-on, acilkarnitine, acilholine, njihove C<1-20>alkil estere (npr., metil, izopropil i t-butil) i njihove mono- i di-gliceride (tj. oleat, laurat, kaprat, miristat, palmitat, stearat, linoleat itd.) (pogledati npr. Touitou, E., i dr. Enhancement in Drug Delivery, CRC Press, Danvers, MA, 2006; Lee i dr., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; El Hariri i dr., J. Pharm.
[0948] Pharmacol., 1992, 44, 651-654).
[0950] Fiziološka uloga žuči uključuje olakšavanje disperzije i apsorpcije lipida i masti rastvorljivih vitamina (pogledati npr. Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Brunton, Chapter 38 in: Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9th Ed., Hardman i dr. Eds., McGraw-Hill, New York, 1996, pp.934-935). Različite prirodne žučne soli i njihovi sintetički derivati deluju kao poboljšivači penetracije. Tako izraz „žučne soli“ uključuje bilo koju od prirodno prisutnih komponenti žuči, kao i bilo koji od njihovih sintetičkih derivata. Pogodne žučne soli uključuju, na primer, holinu kiselinu (ili njenu farmaceutski prihvatljivu natrijumovu so, natrijum holat), dehidroholnu kiselinu (natrijum dehidroholat), dezoksiholnu kiselinu (natrijum dezoksiholat), gluholnu kiselinu (natrijum gluholat), glikolnu kiselinu (natrijum glikololat), glikodezoksiholnu kiselinu (natrijum glikodezoksiholat), tauroholnu kiselinu (natrijum tauroholat), taurodezoksiholnu kiselinu (natrijum taurodezoksiholat), henodezoksiholnu kiselina (natrijum henodezoksiholat), ursodezoksiholnu kiselinu (UDCA), natrijum tauro-24,25-dihidro-fusidat (STDHF), natrijum glikodihidrofusidat i polioksietilen9-lauril eter (POE) (pogledati npr. Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Lee i dr., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92; Swinyard, Chapter 39 In: Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990, pages 782-783; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; Yamamoto i dr., J. Pharm. Exp. Ther., 1992, 263, 25; Yamashita i dr., J. Pharm. Sci., 1990, 79, 579-583).
[0952] Agensi za keliranje, kako se koriste u vezi sa ovim pronalaskom, mogu se definisati kao jedinjenja koja uklanjaju metalne jone iz rastvora formiranjem kompleksa sa njima, tako da je povećana apsorpcija iRNK preko sluznice. Što se tiče njihove upotrebe kao poboljšivača penetracije u ovom pronalasku, agensi za heliranje imaju dodatnu prednost da služe i kao inhibitori DNaze, jer najslabije karakterisane DNK nukleaze zahtevaju divalentni metal jon za katalizu i na taj način su inhibirani od strane helirajućih agenasa (Jarrett, J. Chromatogr., 1993, 618, 315-339). Pogodni helatanti uključuju, ali se ne ograničavaju na, dinatrijum etilenediamintetraacetat (EDTA), limunsku kiselinu, salicilate (npr. natrijum salicilat, 5-metoksisalicilat i homovanilat), N-acil derivate kolagena, lauret-9 i N-amino-acil derivate beta-diketona (enamini) (pogledati npr. Katdare, A. i dr., Excipient development for pharmaceutical, biotechnology, and drug delivery, CRC Press, Danvers, MA, 2006; Lee i dr., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; Buur i dr., J. Control Rel., 1990, 14, 43-51).
[0954] Kao što je ovde korišćeno, jedinjenja koja povećavaju penetraciju koja nisu surfakanti mogu se definisati kao jedinjenja koja pokazuju beznačajnu aktivnost kao agensi za keliranje ili kao surfaktanti, ali ipak povećavaju apsorpciju iRNK kroz alimentarnu sluznicu (pogledati npr. Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33). Ova klasa poboljšivača penetracije uključuje, na primer, nezasićene ciklične kiseline, derivate 1-alkil- i 1-alkenilazaciklo-alkanona (Lee i dr., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92); i nesteroidne anti upalne agense kao što su diklofenak natrijum, indometacin i fenilbutazon (Yamashita i dr., J. Pharm. Pharmacol., 1987, 39, 621-626).
[0956] [0355] Agensi koji poboljšavaju uzimanje iRNK na nivou ćelije mogu se takođe dodati farmaceutskim i drugim sastavima ovog pronalaska. Na primer, katjonski lipidi, kao što su lipofektin (Junichi et al, U.S. Pat. No.5,705,188), katjonski derivati glicerola i polikatjonski molekuli, kao što je polilizin ((Lollo i dr., PCT Application WO 97/30731) takođe su poznati da pobošavaju ćelijsko uzimanje dsRNK. Primeri komercijalno dostupnih transfekcionih reagensa uključuju, na primer Lipofectamine™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), Lipofectamine 2000™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), 293fectin™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), Cellfectin™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), DMRIE-C™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), FreeStyle™ MAX (Invitrogen; Carlsbad, CA), Lipofectamine™ 2000 CD (Invitrogen; Carlsbad, CA), Lipofectamine™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), RNKiMAX (Invitrogen; Carlsbad, CA), Oligofectamine™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), Optifect™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), X-tremeGENE Q2 Transfection Reagens (Roche; Grenzacherstrasse, Switzerland), DOTAP lipozomal Transfection Reagens (Grenzacherstrasse, Switzerland), DOSPER lipozomal Transfection Reagens (Grenzacherstrasse, Switzerland), ili Fugene (Grenzacherstrasse, Switzerland), Transfectam® Reagens (Promega; Madison, WI), TransFast™ Transfection Reagens (Promega; Madison, WI), Tfx™-20 Reagens (Promega; Madison, WI), Tfx™-50 Reagens (Promega; Madison, WI), DreamFect™ (OZ Biosciences; Marseille, France), EcoTransfect (OZ Biosciences; Marseille, France), TransPass<a>D1 Transfection Reagens (New England Biolabs; Ipswich, MA, USA), LyoVec™/LipoGen™ (Invitrogen; San Diego, CA, USA), PerFectin Transfection Reagens (Genlantis; San Diego, CA, USA), NeuroPORTER Transfection Reagens (Genlantis; San Diego, CA, USA), GenePORTER Transfection reagens (Genlantis; San Diego, CA, USA), GenePORTER 2 Transfection reagens (Genlantis; San Diego, CA, USA), Cytofectin Transfection Reagens (Genlantis; San Diego, CA, USA), BaculoPORTER Transfection Reagens (Genlantis; San Diego, CA, USA), TroganPORTER™ transfection Reagens (Genlantis; San Diego, CA, USA ), RiboFect (Bioline; Taunton, MA, USA), PlasFect (Bioline; Taunton, MA, USA), UniFECTOR (B-Bridge International; Mountain View, CA, USA), SureFECTOR (B-Bridge International; Mountain View, CA, USA), ili HiFect™ (B-Bridge International, Mountain View, CA, USA), između ostalih
[0958] Ostali agensi mogu se koristiti za poboljšanje penetracije primenjenih nukleinskih kiselina, uključujući glikole kao što su etilen glikol i propilen glikol, pirolide kao što su 2-pirol, azoni i terpene kao što su limonen i menton.
[0960] v. Nosači
[0961] [0357] Određeni sastavi predmetnog pronalaska takođe u formulaciji sadrže jedinjenja nosače. Kad se ovde koristi, „jedinjenje nosač“ ili „nosač“ može se odnositi na nukleinsku kiselinu ili njen analog, koji je inertan (tj. ne poseduje biološku aktivnost per se), ali je prepoznat kao nukleinska kiselina od strane in vivo procesa koji smanjuju bioraspoloživost nukleinske kiseline koja ima biološku aktivnost, na primer, degradirajući biološki aktivnu nukleinsku kiselinu ili promovisanje njenog uklanjanja iz cirkulacije. Istovremena primena nukleinske kiseline i nosača jedinjenja, obično sa viškom druge supstance, može dovesti do značajnog smanjenja količine nukleinske kiseline koja se oporavlja u jetri, bubrezima ili drugim ekstrakcirkulatornim rezervoarima, verovatno zbog konkurencije između nosača jedinjenja i nukleinske kiseline za zajednički receptor. Na primer, oporavak delimično fosforotioatne dsRNK u hepatičnom tkivu može se smanjiti kada se daje zajedno sa poliinosinskom kiselinom, dekstran sulfatom, policitidnom kiselinom ili 4-acetamido-4'-izotiocijano-stilben-2,2'-disulfonskom kiselinom (Miyao i dr., DsRNK Res. Dev., 1995, 5, 115-121; Takakura i dr., DsRNK & Nucl. Acid Drug Dev., 1996, 6, 177-183.
[0963] vi. Ekscipijenti
[0964] Za razliku od jedinjenja nosača, „farmaceutski nosač“ ili „ekscipijent“ je farmaceutski prihvatljiv rastvarač, suspendujući agens ili bilo koje drugi farmakološki inertan agens za isporuku jedne ili više nukleinske kiseline životinjama. Ekscipijent može biti tečan ili čvrst i odabran je, sa planiranim načinom primene u vidu, kako bi se pružio željeni sadržaj, konzistencija itd., kada se kombinuje sa nukleinskom kiselinom i ostalim komponentama datog farmaceutskog sastava. Tipični farmaceutski nosači uključuju, ali nisu ograničeni na, agense za vezivanje (npr., preželatinizovani skrob kukuruza, polivinilpirolidon ili hidroksipropil metilceluloza itd.); punila (npr. laktoza i drugi šećeri, mikrokristalna celuloza, pektin, želatin, kalcijum sulfat, etil celuloza, poliakrilati ili kalcijum hidrogenfosfat itd.); lubrikante (npr. magnezijum stearat, talk, silicijum dioksid, koloidni silicijum dioksid, stearinska kiselina, metalni stearati, hidrogenizovana biljna ulja, kukuruzni skrob, polietilen glikoli, natrijum benzoat, natrijum acetat itd.); dezintegrante (npr., skrob, natrijum skrob glikolat, itd.); i agense za vlaženje (npr. natrijum lauril sulfat itd.).
[0966] Farmaceutski prihvatljivi organski ili neorganski ekscipijenti pogodni za neparenteralno primenjivanje koje ne reaguju štetno sa nukleinskim kiselinama takođe se mogu koristiti za formulaciju sastav prema ovom pronalasku. Pogodni farmaceutski prihvatljivi nosači uključuju, ali se ne ograničavaju na, vodu, rastvore soli, alkohole, polietilen glikole, želatin, laktozu, amilozu, magnezijum stearat, talk, silikatnu kiselinu, viskozni parafin, hidroksimetilcelulozu, polivinilpirolidon i slično.
[0967] Formulacije za lokalnu primenu nukleinskih kiselina mogu uključivati sterilne i nesterilne vodene rastvore, ne-vodene rastvore u zajedničkim rastvaračima kao što su alkoholi ili rastvori nukleinskih kiselina u bazama tečnosti ili čvrstog ulja. Rastvori mogu takođe sadržati pufere, razblaživače i druge pogodne aditive. Mogu se koristiti farmaceutski prihvatljivi organski ili neorganski eksipijenti pogodni za ne-parenteralnu primenu, koji ne reaguju štetno sa nukleinskim kiselinama.
[0969] Pogodni farmaceutski prihvatljivi ekscipijenti uključuju, ali nisu ograničeni na, vodu, rastvore soli, alkohol, polietilen glikole, želatin, laktozu, amilozu, magnezijum stearat, talk, silicijumsku kiselinu, viskozni parafin, hidroksimetilcelulozu, polivinilpirolidon i slično.
[0971] vii. Ostale komponente
[0972] Sastavi predmetnog pronalaska mogu dodatno da sadrže druge dodatne komponente koje se konvencionalno nalaze u farmaceutskim sastavima, na njihovim standardnim nivoima upotrebe u struci. Tako, na primer, sastavi mogu da sadrže dodatne, kompatibilne, farmaceutski aktivne materijale kao što su, na primer, antipruriti, astringenti, lokalni anestetici ili antiupalni agensi ili mogu sadržati dodatne materijale koji su korisni u fizičkom formulisanju različitih doznih oblika sastav prema predmetnom pronalasku, kao što su boje, agensi za ukus, konzervansi, antioksidanti, agensi za raspršivanje, agensi za zgušnjavanje i stabilizatori. Međutim, takvi materijali, kada se dodaju, ne bi trebalo da se preterano mešaju u biološke aktivnosti komponenti sastav predmetnog pronalaska. Formulacije se mogu sterilisati i, ako je poželjno, pomešati sa pomoćnim agensima, npr. lubirkantima, konzervansima, stabilizatorima, agensima za vlaženje, emulgatorima, solima za uticaj na osmotski pritisak, puferima, bojama, aromama i/ili aromatičim supstancama i slično koji ne interaguju štetno sa nukleinskom kiselinom formulacije.
[0974] Vodene suspenzije mogu sadržati supstance koje povećavaju viskozitet suspenzije uključujući, na primer, natrijum karboksimetilcelulozu, sorbitol i/ili dekstran. Suspenzija takođe može sadržati stabilizatore.
[0976] [0364] U nekim otelotvorenjima farmaceutski sastavi pronalaska uključuju (a) jedno ili više iRNK jedinjenje i (b) jedan ili više agens koji funkcioniše pomoću mehanizma koji nije RNKi i koji su korisni u lečenju poremećaja krvarenja. Primeri takvih agensa uključuju, ali nisu ograničeni na, protivupalni agens, agens protiv steatoze, anti-virusni i/ili anti-fibrozni agens. Pored toga, druge supstance koje se obično koriste za zaštitu jetre, kao što je silimarin, mogu se takođe koristiti zajedno sa iRNK opisanim ovde. Ostali agensi koji su korisni za lečenje oboljenja jetre uključuju telbivudin, entekavir i inhibitore proteaze kao što su telaprevir i drugi koji su objavljeni, na primer, u Tung i dr., U.S. objava prijave br.
[0977] 2005/0148548, 2004/0167116, i 2003/0144217; i u Hale i dr., U.S. objava prijave br.
[0978] 2004/0127488.
[0980] Toksičnost i terapeutska efikasnost takvih jedinjenja mogu se odrediti standardnim farmaceutskim procedurama u ćelijskim kulturama ili eksperimentalnim životinjama, npr. Za određivanje LD50 (doza smrtonosna za 50% populacije) i ED50 (doza koja je terapeutski efikasna za 50% populacije). Odnos doza između toksičnih i terapijskih efekata je terapeutski indeks i može se izraziti kao odnos LD50/ED50. Poželjne su jedinjenja koja pokazuju visoke terapeutske indekse.
[0982] Podaci dobijeni iz analiza ćelijske kulture i ispitivanja na životinjama mogu se koristiti u formulisanju raspona doziranja za upotrebu kod ljudi. Doziranje sastava pronalaska leži u opsegu koncentracija cirkulacije koje uključuju ED50 sa malo ili bez toksičnosti.
[0983] Doziranje može varirati u ovom opsegu u zavisnosti od upotrebljenog doznog oblika i korišćenog načina primene. Za bilo koje jedinjenje koje se koristi u postupcima opisanim u pronalasku, terapeutski efektivna doza se na početku može proceniti na osnovu analize ćelijske kulture. Doza se može formulisati u životinjskim modelima kako bi se postigao opseg koncentracije cirkulacione plazme u sastavu ili, kada je potrebno, polipeptidnog proizvoda ciljne sekvence (npr. postizanje smanjene koncentracije polipeptida) koji uključuje IC<50>(tj. koncentracija test jedinjenja koja postiže polu-maksimalnu inhibiciju simptoma) utvrđene u ćelijskoj kulturi. Takve informacije mogu se koristiti za preciznije određivanje korisnih doza kod ljudi. Nivoi u plazmi se mogu meriti, na primer, tečnom hromatografijom visoke performanse.
[0985] Pored njihove primene, kao što je prethodno razmatrano, iRNK pronalaska mogu se primeniti u kombinaciji sa drugim poznatim agensima koji su efikasni u tretmanu patoloških procesa posredovanih eksprimiranjem PCSK9. U svakom slučaju, lekar koji primenjuje dozu može prilagoditi količinu i vreme primene iRNK na osnovu rezultata posmatranih korišćenjem standardnih mera efikasnosti poznatih u ovoj oblasti ili opisanih ovde.
[0986] IV. Postupci za inhibiranje eksprimiranja PCSK9
[0987] Predmetna objava pruža postupke inhibiranja eksprimiranja Proprotein konvertaza subtilizin keksina 9 (PCSK9) u ćeliji. Postupci uključuju dovođenje u dodir ćelije sa RNKi agensom, npr., dvolančanim RNKi agensom, u količini koja je efikasna da inhibira eksprimiranje PCSK9 u ćeliji, čime se inhibira eksprimiranje PCSK9 u ćeliji.
[0989] dovođenje u dodir ćelije sa dvolančanim RNKi agensom može se obaviti in vitro ili in vivo. dovođenje u dodir ćelije in vivo sa agensom RNKi uključuje dovođenje u dodir ćelije ili grupe ćelija u pacijentu, na primer, ljudskom pacijentu, sa agensom RNKi. Moguće su kombinacije in vitro i in vivo postupka dovođenja u dodir. dovođenje u dodir može biti direktno ili indirektno, kao što je gore navedeno. Osim toga, dovođenje u dodir ćelije može biti ostvareno preko ciljanog liganda, uključujući bilo koji ligand koji je ovde opisan ili je poznat u stanju tehnike. U poželjnim implementacijama ciljani ligand je ugljenohidratni deo, na primer, GalNAc<3>ligand ili bilo koji drugi ligand koji usmerava RNKi agens na mesto od interesa, na primer, jetra pacijenta.
[0991] Izraz „inhibira“, kad se ovde koristi, koristi se naizmenično sa „redukuje“, „utišava“, „reguliše na dole“ i drugim sličnim uslovima, i uključuje bilo koji nivo inhibicije.
[0993] Fraza „inhibira eksprimiranje PCSK9“ ima za cilj da se odnosi na inhibiciju eksprimiranja bilo kog PCSK9 gena (kao što je npr. PCSK9 gen miša, PCSK9 gen pacova, PCSK9 gena majmuna ili PCSK9 gen čoveka), kao i varijante ili mutante PCSK9 gena. Prema tome, PCSK9 gen može biti PCSK9 gen divljeg tipa, mutant PCSK9 gena ili transgeni PCSK9 gen u kontekstu genetički manipulisane ćelije, grupe ćelija ili organizma.
[0995] „Inhibicija eksprimiranja PCSK9 gena“ uključuje bilo koji nivo inhibicije PCSK9 gena, npr., barem delimičnu supresiju eksprimiranja PCSK9 gena. Eksprimiranje PCSK9 gena može se proceniti na osnovu nivoa ili promene nivoa bilo koje promenljive koja je povezana sa eksprimiranjem PCSK9 gena, npr. nivo PCSK9 mRNK, nivo PCSK9 proteina ili nivo lipida. Ovaj nivo se može proceniti u pojedinačnoj ćeliji ili u grupi ćelija, uključujući, na primer, uzorak koji se dobija od pacijenta.
[0996] Inhibicija se može proceniti smanjenjem apsolutnog ili relativnog nivoa jedne ili više promenljivih koje su povezane sa eksprimiranjem PCSK9 u poređenju sa kontrolnim nivoom. Nivo kontrole može biti bilo koji tip nivoa kontrole koji se koristi u struci, npr. početni nivo pre doze ili nivo određen lod sličnog pacijenta, ćelije ili uzorka koji se ne tretira ili se tretira sa kontrolom (kao što je , npr. samo kontrola pufera ili kontrola neaktivnog agensa).
[0998] U nekim implementacijama postupaka pronalaska, eksprimiranje PCSK9 gena je inhibirano za barem oko 5%, barem oko 10%, barem oko 15%, barem oko 20%, barem oko 25%, barem oko 30%, barem oko 35%, barem oko 40%, barem oko 45%, barem oko 50%, barem oko 55%, barem oko 60%, barem oko 65%, barem oko 70%, barem oko 75%, barem oko 80%, barem oko 85%, barem oko 90%, barem oko 91%, barem oko 92%, barem oko 93%, barem oko 94%. barem oko 95%, barem oko 96%, barem oko 97%, barem oko 98%, ili barem oko 99%.
[1000] Inhibicija eksprimiranja PCSK9 gena može se manifestovati redukcijom količine mRNK eksprimirane prvom ćelijom ili grupom ćelija (takve ćelije mogu biti prisutne, na primer, u uzorku izvedenom od pacijenta) u koji je transkribovan PCSK9 gen i koji je transkribovan ili je bio tretiran (npr. dovođenjem u dodir ćelije ili ćelija sa RNKi agensom pronalaska, ili davanjem RNKi agensa pronalaska pacijentu u kom su ćelije ili su prisutne) tako da je eksprimiranje PCSK9 gena inhibirana, u poređenju sa drugom ćelijom ili grupom ćelija u suštini identičnom sa prvom ćelijom ili grupom ćelija, ali koja nije ili nije bila tako tretirana (kontrolna ćelija). U poželjnim aspektima, inhibicija se procenjuje izražavanjem nivoa mRNK u tretiranim ćelijama kao procenat nivoa mRNK u kontrolnim ćelijama, koristeći sledeću formulu:
[1003]
[1005] Alternativno, inhibicija eksprimiranja PCSK9 gena može biti procenjena u smislu redukcije parametra koji je funkcionalno povezan sa eksprimiranjem PCSK9 gena, npr. eksprimiranje proteina PCSK9, kao što su nivoi lipida, nivoi holesterola, npr. LDLc nivoi. Utišavanje PCSK9 gena može se odrediti u bilo kojoj ćeliji koja eksprimira PCSK9, bilo konstitutivno ili genomskim inženjeringom, i bilo kojim postupkom koji je poznat u struci. Jetra je glavno mesto eksprimiranja PCSK9. Ostala značajna mesta eksprimiranja uključuju pankreas, bubrege i creva.
[1006] Inhibicija eksprimiranja PCSK9 proteina se može manifestovati smanjenjem nivoa PCSK9 proteina koji je eksprimiran od strane ćelije ili grupe ćelija (npr. nivo proteina eksprimiran u uzorku koji je izveden iz pacijenta). Kao što je gore objašnjeno za procenu supresije mRNK, inhibitor nivoa eksprimiranja proteina u tretiranoj ćeliji ili grupi ćelija može se slično eksprimirati kao procenat nivoa proteina u kontrolnoj ćeliji ili grupi ćelija.
[1008] Kontrolna ćelija ili grupa ćelija koje se mogu koristiti za procenu inhibicije eksprimiranja PCSK9 gena uključuje ćeliju ili grupu ćelija koje još nisu dovedene u dodir sa RNKi agensom pronalaska. Na primer, kontrolna ćelija ili grupa ćelija mogu biti izvedene od pojedinačnog pacijenta (npr. pacijenta čoveka ili životinja) pre tretmana pacijenta sa RNKi agensom.
[1010] Nivo PCSK9 mRNK koji je eksprimiran od strane ćelije ili grupe ćelija može se odrediti pomoću bilo kog postupka poznatog u struci za procenu eksprimiranja mRNK. U jednom otelotvorenju, nivo eksprimiranja PCSK9 u uzorku se određuje detektovanjem transkribovanog polinukleotida ili njegovog dela, npr. mRNK PCSK9 gena. RNK se može ekstrahovati iz ćelija korišćenjem tehnike ekstrakcije RNK, uključujući, na primer, korišćenje ekstrakcije kiseline fenol/gvanidin izotiocianat (RNKzol B, biogeneza), RNeasy RNK komplet za pripremu (Qiagen) ili PAXgene (PreAnalytix, Switzerland). Tipični oblici analize koji koriste hibridizaciju ribonukleinske kiseline uključuju testove probe nukleusa, RT-PCR, testove za zaštitu RNaz (Melton i dr., Nuc. Acids Res.12:7035), Northern blotting, in situ hibridizaciju i mikro-analizu.
[1012] U jednoj implementaciji, nivo eksprimiranja PCSK9 se određuje pomoću sonde nukleinske kiseline. izraz „sonda“, kad se ovde koristi, odnosi se na bilo koji molekul koji je sposoban za selektivno vezivanje za određenog PCSK9. Sonde mogu biti sintetizovane od strane stručnjaka ili izvedene iz odgovarajućih bioloških preparata. Sonde mogu biti posebno dizajnirane da budu obeležene. Primeri molekula koji se mogu koristiti kao sonde uključuju, ali nisu ograničeni na, RNK, DNK, proteine, antitela i organske molekule.
[1014] [0381] Izolovana mRNK se može koristiti u hibridizacijskim ili amplifikacionim analizama koje uključuju, ali nisu ograničene na, Southern ili Northern analize, lančane reakcije polimeraze (PCR) i nizove sondi. Jedan postupak za određivanje nivoa mRNK podrazumeva dovođenje u dodir izolovane mRNK sa molekulom nukleinske kiseline (sonda) koji može da hibridizuje do PCSK9 mRNK. U jednom aspektu mRNK se imobilizuje na čvrstu površinu i dovodi u dodir sondom, na primer pokretanjem izolovane mRNK na agaroza gelu i prenošenjem mRNK iz gela u membranu, kao što je nitroceluloza. U alternativnoj implementaciji, sonda se imobilizuje na čvrstu površinu i mRNK se dovodi u dodir sa sondom, na primer, u nizu čip gena Affymetrix. Stručnjak u oblasti može lako prilagoditi poznate postupke mRNK detekcije za određivanje nivoa PCSK9 mRNK.
[1016] Alternativni postupak za određivanje nivoa eksprimiranja PCSK9 u uzorku uključuje proces amplifikacije nukleinske kiseline i/ili reverzne transkriptaze (za pripremu cDNK), na primer mRNK u uzorku, npr. RT-PCR (eksperimentalno otelotvorenje prikazano u Mullis, 1987, U.S. Pat. No.4,683,202), lančana reakcija ligaze (Barany (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:189-193), samoodrživa replikacija sekvence (Guatelli i dr. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878), transkripcijski sistem amplifikacije (Kwoh i dr. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177), Q-Beta Replikaza (Lizardi i dr. (1988) Bio/Technology 6:1197), replikacija kotrljajućih krugova (Lizardi i dr., U.S. Pat. No.5,854,033) ili bilo koji drugi postupak amplifikacije nukleinskih kiselina, nakon čega sledi detekcija pojačanih molekula korišćenjem tehnika dobro poznati stručnjacima. Ove šeme detekcije su naročito korisne za detekciju molekula nukleinske kiseline ako su takvi molekuli prisutni u vrlo niskim brojevima. U određenim aspektima pronalaska, nivo eksprimiranja PCSK9 je određen kvantitativnim fluorogenim RT-PCR (tj., TaqMan™ System).
[1018] Nivoi eksprimiranja PCSK9 mRNK mogu se pratiti korišćenjem membranskog blota (kao što se koristi u analizi hibridizacije kao što su Northern, Southern, tačka i slično) ili mikrokomorica, cevi sa uzorcima, želatina, perlica ili vlakana (ili bilo koje druge čvrste podloge koja sadrži vezane nukleinske kiseline). Pogledati U.S. Pat. Nos.5,770,722, 5,874,219, 5,744,305, 5,677,195 i 5,445,934, koji su ovde obuhvaćeni referencom.
[1019] Određivanje nivoa eksprimiranja PCSK9 može takođe obuhvatiti upotrebu sondi nukleinske kiseline u rastvoru.
[1021] U poželjnim implementacijama, nivo eksprimiranja mRNK se procenjuje korišćenjem razgranatih DNK (bDNK) ili PCR (kPCR) u realnom vremenu. Korišćenje ovih postupka je opisano i prikazano u Primerima koji su ovde predstavljeni.
[1022] Nivo eksprimiranja proteina PCSK9 može se odrediti pomoću bilo kog postupka poznatog u struci za merenje nivoa proteina. Takvi postupci uključuju, na primer, elektroforezu, kapilarnu elektroforezu, tečnu hromatografiju visokih performansi (HPLC), tankoslojnu hromatografiju (TLC), hiperdifuznu hromatografiju, fluide ili želatinaste reackije precipitina, apsorpcionu spektroskopiju, kolorimetrijske testove, spektrofotometrijske testove, protočnu citometriju, imunodifuziju (jednokratna ili dvostruka), imunoelektroforezu, Western blotting, radioimunoanaliza (RIA), enzimski-povezane imunosorbentne analize (ELISA), imunofluorescentne analize, elektrohemiluminiscentne analize i slično.
[1024] izraz „uzorak“ kad se ovde koristi odnosi se na zbirku sličnih tečnosti, ćelija ili tkiva izolovanih od pacijenta, kao i fluida, ćelija ili tkiva prisutnih u pacijentu. Primeri bioloških tečnosti uključuju krv, serum i serozalne tečnosti, plazmu, limfu, urin, cerebrospinalnu tečnost, pljuvačku, očne tečnosti i slično. Uzorci tkiva mogu obuhvatiti uzorke iz tkiva, organa ili lokalizovanih regija. Na primer, uzorci mogu biti izvedeni iz određenih organa, delova organa ili fluida ili ćelija unutar tih organa. U određenim primenama, uzorci mogu biti izvedeni iz jetre (npr. cele jetre ili određenih segmenata jetre ili određenih tipova ćelija u jetri, kao što su, na primer, hepatociti). U poželjnim varijantama, „uzorak izveden iz pacijenta“ odnosi se na krv ili plazmu dobijenu od pacijenta. U daljim primenama, „uzorak izveden iz pacijenta“ odnosi se na jetreno tkivo izvedeno od pacijenta.
[1026] U nekim implementacijama postupaka pronalaska, RNKi agens se daje pacijentu tako da je RNKi agens isporučen na određeno mesto unutar pacijenta. Inhibicija eksprimiranja PCSK9 može se proceniti pomoću merenja nivoa ili promene nivoa PCSK9 mRNK ili PCSK9 proteina u uzorku izvedenom iz tečnosti ili tkiva sa specifičnog mesta unutar pacijenta. U poželjnim implementacijama, mesto je jetra. Mesto takođe može biti podsekcija ili podgrupa ćelija sa bilo koje od prethodno navedenih lokacija. Mesto može uključivati i ćelije koje izražavaju određeni tip receptora.
[1028] V. Postupci za lečenje ili prevenciju bolesti povezanih sa PCSK9
[1029] [0388] Predmetna objava takođe nudi postupke za lečenje ili prevenciju bolesti i stanja koje se mogu modulisati regulisanjem na dole eksprimiranja PCSK9 gena. Na primer, ovde opisani sastavi se mogu koristiti za lečenje lipidemije, npr., hiperlipidemije i drugih oblika lipidnih disbalansa kao što su hiperholesterolemija, hipertrigliceridemija i patološka stanja koja su povezana sa ovim poremećajima kao što su bolesti srca i cirkulacije. Ostale bolesti i stanja koji se mogu modulisati regulisanjem eksprimiranja PCSK9 gena obuhvataju bolesti lizozomskog skladištenja, uključujući, ali ne ograničavajući se na, Neiman-Pikovu bolest, Taj-Saksovu bolest, nedostatak lizozomske kisele lipaze i Gaušerovu bolest. Postupci uključuju davanje pacijentu terapeutski efikasne količine ili profilaktički efikasne količine RNKi agensa prema pronalasku. U nekim primenama, postupak obuhvata davanje efikasne količine PCSK9 siRNK pacijentu koji ima heterozigotni LDLR genotip.
[1031] Efekat smanjenog gena PCSK9 poželjno dovodi do smanjenja nivoa LDLc (nizak nivo gastrointestinalnog holesterola) u krvi, a naročito u serumu sisara. U nekim implementacijama nivoi LDLc su smanjeni za najmanje 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ili više, u poređenju sa nivoom pre tretmana.
[1033] Kao što je ovde korišćeno, „pacijent“ uključuje ljudsku ili ne-ljudsku životinju, poželjno kičmenjaka, i poželjnije sisara. Pacijent može uključiti transgeni organizam.
[1034] Najpoželjnije, pacijent je čovek, poput čoveka koji pati od ili je predisponiran za razvoj bolesti povezanih sa PCSK9.
[1036] U nekim implementacijama postupaka pronalaska, eksprimiranje PCSK9 se smanjuje u produženom trajanju, npr., najmanje jednu nedelju, dve nedelje, tri nedelje ili četiri nedelje ili duže. Na primer, u određenim slučajevima, eksprimiranje PCSK9 gena je potisnuta za najmanje oko 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% ili 50% ovde opisanog iRNK agensa. U nekim implementacijama, PCSK9 genom je potisnut za najmanje oko 60%, 70% ili 80% primenom iRNK agensa. U nekim otelotvorenjima, PCSK9 gen je potisnut za najmanje oko 85%, 90% ili 95% primenom dvolančanog oligonukleotida.
[1038] RNKi agensi iz ovog pronalaska mogu se davati pacijentu koristeći bilo koji način primene koji je poznat u struci, uključujući, ali ne ograničavajući se na potkožnu, intravenoznu, intramuskularnu, intraokularnu, intrabronhijalnu, intrapleuralnu, intraperitonealno, intraarterijalnu, limfnu, cerebrospinalnu primenu, i sve njihove kombinacije. U poželjnim otelotvorenjima, agensi se daju potkožno.
[1040] [0393] U nekim primenama, primena je preko injektiranja depoa. Injekcija depoa može osloboditi RNKi agens na konzistentan način tokom dužeg vremenskog perioda. Prema tome, ubrizgavanje depoa može smanjiti frekvenciju doziranja koja je potrebna da se dobije željeni efekat, npr. željena inhibicija PCSK9, ili terapeutski ili profilaktički efekat. Injekcija depoa može takođe pružiti konzistentnije koncentracije seruma. Injekcije depoa mogu uključivati potkožne injekcije ili intramuskularne injekcije. U poželjnim implementacijama, injekcija depoa je potkožna injekcija.
[1042] U nekim primenama, primena se vrši preko pumpe. Pumpa može biti spoljna pumpa ili hirurški implantirana pumpa. U određenim implementacijama, pumpa je potkožno implantirana osmotska pumpa. U drugim primenama, pumpa je pumpa za infuziju. Pumpa za infuziju se može koristiti za intravenozne, potkožne, arterijske ili epiduralne infuzije. U poželjnim izvedbama, infuziona pumpa je potkožna pumpa za infuziju. U drugim primenama, pumpa je hirurški implantirana pumpa koja isporučuje RNKi agens za jetru.
[1044] Ostali načini primene su epiduralna, intracerebralna, intracerebroventrikularna, nazalna primena, intraarterijalna, intrakadijska, intraozna infuzija, intratekalna i intravitrealna i plućna. Način primene može se odabrati na osnovu toga da li je poželjno lokalno ili sistemsko lečenje i na osnovu područja za lečenje. Put i mesto primene mogu biti izabrani da bi poboljšali ciljanje.
[1046] Postupak uključuje primenu iRNK agensa, na primer, doze koja je dovoljna da smanji nivo PCSK9 mRNK za najmanje 5, poželjnije 7, 10, 14, 21, 25, 30 ili 40 dana; i opciono, primenu druge pojedinačne doze dsRNK, pri čemu se druga pojedinačna doza primenjuje najmanje 5, poželjnije 7, 10, 14, 21, 25, 30 ili 40 dana nakon primene prve pojedinačne doze, čime se inhibira eksprimiranje PCSK9 gena kod pacijenta.
[1048] U jednoj implementaciji, doze iRNK agensa pronalaska se daju ne više od jednom na svake četiri nedelje, ne više od jednom na svake nedelje, ne više od jednom na svake dve nedelje, ili ne više od jednom nedeljno. U drugoj implementaciji, primenete se mogu održavati jedan, dva, tri ili šest meseci, ili godinu dana ili duže.
[1050] U drugoj implementaciji, primena se može pružiti kada nivoi holesterola male gustine lipoproteina (LDLc) dostignu ili prevazilaze unapred određeni minimalni nivo, kao što je više od 70 mg/dL, 130 mg/dL, 150 mg/dL, 200 mg/dL , 300 mg/dL ili 400 mg/dL.
[1051] Generalno, iRNK agens ne aktivira imuni sistem, npr.,nNe povećava nivoe citokina, kao što su TNF-alfa ili IFN-alfa nivoi. Na primer, kada se meri pomoću analize, kao što je in vitro PBMC test, kao što je ovde opisano, povećanje TNF-alfa ili IFN-alfa nivoa je manje od 30%, 20% ili 10% kontrolnih ćelija tretiranih sa kontrolnom dsRNK, kao što je dsRNK koja ne cilja na PCSK9.
[1053] Na primer, pacijentu se može davati terapeutska količina iRNK agensa, kao što je 0,5 mg/kg, 1,0 mg/kg, 1,5 mg/kg, 2,0 mg/kg ili 2,5 mg/kg dsRNK. iRNK agens se može davati intravenskom infuzijom tokom vremenskog perioda, kao što je tokom 5 minuta, 10 minuta, 15 minuta, 20 minuta ili 25 minuta. Primena se ponavlja, na primer, na redovnoj osnovi, kao što je dvonedeljno (tj. svake dve nedelje) tokom jednog meseca, dva meseca, tri meseca, četiri meseca ili duže. Nakon početnog režima lečenja, lečenje se može primenjivati na manje učestaloj osnovi. Na primer, nakon primene dvonedeljno tokom tri meseca, primena se može ponoviti jednom mesečno, na šest meseci ili godinu dana ili duže. Primena iRNK agensa može smanjiti nivoe PCSK9, npr. u ćeliji, tkivu, krvi, urinu ili drugom odeljku pacijenta za najmanje 10%, najmanje 15%, najmanje 20%, najmanje 25%, najmanje 30%, najmanje 40%, najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80% ili najmanje 90% ili više.
[1055] Pre davanja pune doze iRNK agensa, pacijentima se može davati manja doza, kao što je reakciona infuzija od 5%, i nadgleda se za neželjene efekte, kao što je alergijska reakcija ili za povećane nivoe lipida ili krvni pritisak. U drugom primeru, pacijent može biti nadgledan za neželjene imunostimulatorne efekte, kao što su povećani nivoi citokina (npr., TNF-alfa ili INF-alfa).
[1057] Tretman ili preventivni efekat je očigledan kada postoji statistički značajno poboljšanje u jednom ili više parametara statusa bolesti, ili zbog neuspeha ili razvoja simptoma tamo gde bi inače bilo predviđeno. Kao primer, povoljna promena od najmanje 10% u merljivom parametru bolesti, a poželjno najmanje 20%, 30%, 40%, 50% ili više, može biti indikativna za efikasno lečenje. Efikasnost za dati iRNK agens iz pronalaska ili formulaciju tog iRNK agensa takođe se može proceniti korišćenjem eksperimentalnog modela životinja za datu bolest, kako je poznato u struci. Kada se koristi eksperimentalni model životinja, efikasnost lečenja se dokazuje kada se primećuje statistički značajno smanjenje markera ili simptoma.
[1058] U jednoj implementaciji, RNKi agens se primenjuje pri dozi od između oko 0,25 mg/kg do oko 50 mg/kg, npr., između oko 0,25 mg/kg do oko 0,5 mg/kg, između oko 0,25 mg/kg do oko 1 mg/kg, između oko 0,25 mg/kg do oko 5 mg/kg, između oko 0,25 mg/kg do oko 10 mg/kg, između oko 1 mg/kg do oko 10 mg/kg, između oko 5 mg/kg do oko 15 mg/kg, između oko 10 mg/kg do oko 20 mg/kg, između oko 15 mg/kg do oko 25 mg/kg, između oko 20 mg/kg do oko 30 mg/kg, između oko 25 mg/kg do oko 35 mg/kg, ili između oko 40 mg/kg do oko 50 mg/kg.
[1060] U nekim implementacijama, RNKi agens se primenjuje pri dozi od oko 0,25 mg/kg, oko 0,5 mg/kg, oko 1 mg/kg, oko 2 mg/kg, oko 3 mg/kg, oko 4 mg/kg, oko 5 mg/kg, oko 6 mg/kg, oko 7 mg/kg, oko 8 mg/kg, oko 9 mg/kg, oko 10 mg/kg, oko 11 mg/kg, oko 12 mg/kg, oko 13 mg/kg, oko 14 mg/kg, oko 15 mg/kg, oko 16 mg/kg, oko 17 mg/kg, oko 18 mg/kg, oko 19 mg/kg, oko 20 mg/kg, oko 21 mg/kg, oko 22 mg/kg, oko 23 mg/kg, oko 24 mg/kg, oko 25 mg/kg, oko 26 mg/kg, oko 27 mg/kg, oko 28 mg/kg, oko 29 mg/kg, 30 mg/kg, oko 31 mg/kg, oko 32 mg/kg, oko 33 mg/kg, oko 34 mg/kg, oko 35 mg/kg, oko 36 mg/kg, oko 37 mg/kg, oko 38 mg/kg, oko 39 mg/kg, oko 40 mg/kg, oko 41 mg/kg, oko 42 mg/kg, oko 43 mg/kg, oko 44 mg/kg, oko 45 mg/kg, oko 46 mg/kg, oko 47 mg/kg, oko 48 mg/kg, oko 49 mg/kg ili oko 50 mg/kg. U jednoj implementaciji, iRNK agens se primenjuje pri dozi od oko 25 mg/kg.
[1062] Doza RNKi agensa koja se daje pacijentu može biti prilagođena kako bi se uravnotežili rizici i koristi određene doze, na primer, kako bi se postigao željeni nivo supresije gena PCSK9 (kao što je procenjeno, npr., na osnovu PCSK9 supresija mRNK, eksprimiranja PCSK9 proteina ili smanjenja nivoa lipida) ili željenog terapijskog ili profilaktičkog efekta, istovremeno izbegavajući neželjene efekte.
[1064] [0406] U nekim implementacijama, RNKi agens se primenjuje u dve ili više doza. Ako je poželjno da se olakšaju ponovljene ili česte infuzije, može se preporučiti implantacija uređaja za isporuku, npr. pumpa, polu-trajni stent (npr. intravenozni, intraperitonealni, intracisternalni ili intrakapsularni) ili rezervoar. U nekim implementacijama, broj ili količina naknadnih doza zavisi od postizanja željenog efekta, npr. potiskivanja PCSK9 gena, ili postizanja terapeutskog ili profilaktičkog efekta, npr. smanjenja simptoma hiperholesterolemije. U nekim implementacijama, RNKi agens se primenjuje prema rasporedu. Na primer, RNKi agens se može davati jednom nedeljno, dvaput nedeljno, tri puta nedeljno, četiri puta nedeljno ili pet puta nedeljno. U nekim implementacijama, raspored uključuje redovno raspoređene primene, npr. svakog sata, svaka četiri sata, svakih šest sati, svakih osam sati, svakih dvanaest sati, jednom dnevno, svaka 2 dana, svaka 3 dana, svaka 4 dana, svakih 5 dana, jednom nedeljno, na dve nedelje, ili mesečno. U drugim otelotvorenjima, raspored uključuje tačno raspoređene primene praćene dužim vremenskim periodom tokom kog se agens ne primenjuje. Na primer, raspored može uključivati početni set doza koje se primenjuju u relativno kratkom vremenskom periodu (npr. oko 6 sati, oko 12 sati, oko svaka 24 sata, oko 48 sati, ili oko 72 sata ), nakon čega sledi duži vremenski period (npr. oko 1 nedelje, oko 2 nedelje, oko 3 nedelje, oko 4 nedelje, oko 5 nedelja, oko 6 nedelja, oko 7 nedelja ili oko 8 nedelja) tokom kog RNKi agens ne primenjuje. U jednoj implementaciji, RNKi agens se inicijalno primenjuje na sat i kasnije se primenjuje u dužem intervalu (npr. dnevno, nedeljno, na dve nedelje, ili mesečno). U drugoj primeni, RNKi agens se prvobitno daje dnevno i kasnije se primenjuje u dužem intervalu (npr. nedeljno, na dve nedelje ili mesečno). U određenim implementacijama, duži interval se vremenom povećava ili se određuje na osnovu postizanja željenog efekta. U specifičnoj primeni, RNKi agens se primenjuje jednom dnevno tokom prve sedmice, nakon čega sledi nedeljno doziranje počevši od osmog dana primene. U drugoj specifičnoj primeni, RNKi agens se primenjuje svakog drugog dana tokom prve sedmice, nakon čega sledi nedeljno doziranje počevši od osmog dana primene.
[1066] U jednoj implementaciji, iRNK agens se primenjuje dva puta nedeljno. U jednoj implementaciji, iRNK agens se primenjuje dva puta nedeljno pri dozi od 1 mg/kg. U drugoj primeni, iRNK agens se primenjuje dva puta nedeljno pri dozi od 2 mg/kg.
[1068] U jednom primeni, iRNK agens se daje jednom na svake dve nedelje. U jednoj implementaciji, iRNK agens se daje jednom na svake dve nedelje pri dozi od 1 mg/kg. U drugoj primeni, iRNK agens se daje jednom na svake dve nedelje pri dozi od 2 mg/kg.
[1070] U jednom primeni, iRNK agens se daje jednom nedeljno. U jednom primeni, iRNK agens se daje jednom nedeljno pri dozi od 0,5 mg/kg. U jednom primeni, iRNK agens se daje jednom nedeljno pri dozi od 1 mg/kg. U drugoj primeni, iRNK agens se daje jednom nedeljno pri dozi od 2 mg/kg.
[1072] [0410] U nekim primenama, RNKi agens se primenjuje u režimu doziranja koji uključuje „fazu postavljanja“ blisko raspoređenih primena koje mogu biti praćene „fazom održavanja“, u kojoj se RNKi agens primenjuje u dužim razmacima. U jednoj implementaciji, faza postavljanja sadrži pet dnevnih primena RNKi agensa tokom prve sedmice. U drugoj implementaciji, faza održavanja sadrži jednu ili dve nedeljne primene RNKi agensa. U daljem sprovođenju, faza održavanja traje 5 nedelja. U jednoj implementaciji, faza učitavanja sadrži primenu doze od 2 mg/kg, 1 mg/kg ili 0,5 mg/kg pet puta nedeljno. U drugoj primeni, faza održavanja obuhvata primenu doze od 2 mg/kg, 1 mg/kg ili 0,5 mg/kg jednom, dvaput ili tri puta nedeljno, jednom svake dve nedelje, jednom svake tri nedelje, jednom mesečno, jednom na svaka dva meseca, jednom na svaka tri meseca, jednom na svaka četiri meseca, jednom na svakih pet meseci, ili jednom na svakih šest meseci.
[1074] Svaki od ovih rasporeda može opciono ponoviti za jednu ili više iteracija. Broj iteracija može zavisiti od postizanja željenog efekta, npr. potiskivanja PCSK9 gena i/ili postizanja terapeutskog ili profilaktičkog efekta, npr. smanjenje nivoa holesterola u serumu ili smanjenje simptoma hiperholesterolemije.
[1076] U daljem sprovođenju, primena siRNK se daje u kombinaciji sa dodatnim terapeutskim agensom. siRNK i dodatni terapeutski agens mogu se davati u kombinaciji u istom sastavu, npr. parenteralno, ili se dodatni terapeutski agens može davati kao deo odvojenog sastava ili drugim postupkom koji je ovde opisan.
[1078] [0413] Primeri dodatnih terapeutskih agenasa obuhvataju one za koje je poznato da tretiraju agens poznao za lečenje poremećaja lipida, kao što su hiperholesterolemija, ateroskleroza ili dislipidemija. Na primer, siRNK pronalaska može da se primenjuje suz, npr., HMG-CoA reduktaza inhibitor (npr., statin), fibrat, sekvestant žučne kiseline, niacin, antiplatelet agens, inhibitor enzima koji konvertuje angiotensin, angiotensin II receptor antagonist (npr., losartan kalijum, kao što je Merck & Co. 's Cozaar®), inhibitor acilCoA holesterol acetiltransferaze (ACAT), inhibitor apsorpcije holesterola, inhibitor holesterol ester transfernog proteina (CETP), inhibitor mikrosomalnog triglicerid transfernog proteina (MTTP), modulator holesterola, modulator žučne kiseline, agonist receptora aktiviranog proliferacijom peroksizoma (PPAR), terapija genima, kompozitni vaskularni protektant (npr., AGI-1067, od Atherogenics), inhibitor glikoproteina Ilb/IIIa, aspirin ili aspirin-slično jedinjenje, IBAT inhibitor (npr., S-8921, od Shionogi), inhibitor skvalen sintaza, ili inhibitor monocitnog hemoatraktant proteina (MCP)-I. Primerni inhibitori HMG-CoA reduktaze uključuju atorvastatin (Pfizer's Lipitor®/Tahor/Sortis/Torvast/Cardil), pravastatin (Bristol-Myers Squibb's Pravachol, Sankyo's Mevalotin/Sanaprav), simvastatin (Merck's Zocor®/Sinvacor, Boehprstener Ingelheim's Denan, Banyu's Lipovas), lovastatin (Merck's Mevacor/Mevinacor, Bexal's Lovastatina, Cepa; Schwarz Pharma's Liposcler), fluvastatin (Novartis' Lescol®/Locol/Lochol, Fujisawa's Cranoc, Solvay's Digaril), cerivastatin (Bayer's Lipobay/GlaxoSmithKline's Baycol), rosuvastatin (AstraZeneca' s Crestor®), i pitivastatin (itavastatin/risivastatin) (Nissan Chemical, kowa Kogyo, Sankyo, i Novartis). Primerni fibrati uključuju, npr., bezafibrat (npr., Roche's Befizal®/Cedur®/Bezalip®, Kissei's Bezatol), clofibrat (npr., Wyet's Atromid-S®), fenofibrat (npr., četirinier's Lipidil/Lipantil, Abbott's Tricor®, Takeda's Lipantil, generics), gemfibrozil (npr., Pfizer' s Lopid/Lipur) i ciprofibrat (Sanofi-Synthelabo's Modalim®). Primerni sekvestanti žučne kiseline uključuju, npr., holestiramin (Bristol-Myers Squibb's Questran® i Questran Light™), colestipol (npr., Pharmacia's Colestid), i kolosevelam (Genzyme/Sankyo's WelChol™). Primerni terapije niacinom uključuju, npr., formulacije sa trenutnim oslobađanjem, kao što su Aventis' Nicobid, Upsher-Smith's Niacor, Aventis' Nicolar, i Sanwakagaku's Perycit. Niacin formulacije sa produženim oslobađanjem uključuju, npr., Kos Pharmaceuticals' Niaspan i Upsher-Smith's SIo- Niacin. Primerni antiplatelet agensi uključuju, npr., aspirin (npr., Bayer's aspirin), clopidogrel (Sanofi-Synthelabo/Bristol-Myers Squibb's Plavix), i ticlopidin (npr., Sanofi-Synthelabo's Ticlid i Daiichi's Panaldin). Druga jedinjenja slična aspirinu korisna u kombinaciji sa dsRNK koji cilja PCSK9 uključuju, npr., Asacard (aspirin sa sporim oslobađanjem, od Pharmacia) i Pamicogrel (Kanebo/Angelini Ricerche/CEPA). Primerni inhibitori enzima koji konvertuje angiotensin uključuju, npr., ramipril (npr., Aventis' Altace) i enalapril (npr., Merck & Co.'s Vasotec). Primerni inhibitori acil CoA holesterol acetilttransferaze (AC AT) uključuju, npr., avasimib (Pfizer), eflucimib (BioMsrieux Pierre Fabre/Eli Lilly), CS-505 (Sankyo i Kyoto), i SMP-797 (Sumito). Primerni inhibitori apsorpcije holesterola uključuju, npr., ezetimib (Merck/Scheprsten-Plough Pharmaceuticals Zetia®) i Pamaqueside (Pfizer). Primerni CETP inhibitori uključuju, npr., Torcetrapib (takođe nazvan CP-529414, Pfizer), JTT-705 (Japan Tobacco), i CETi-1 (Avant Immunotherapeutics). Primerni inhibitori mikrosomalnog triglicerid transfernog proteina (MTTP) uključuju, npr., implitapie (Bayer), R-103757 (Janssen), i CP-346086 (Pfizer). Drugi primerni modulatori holesterola, npr., NO- 1886 (Otsuka/TAP Pharmaceutical), CI-1027 (Pfizer), i WAY- 135433 (Wyet-Ayerst).
[1080] [0414] Primerni modulatori žučne kiseline uključuju, npr., HBS-107 (Hisamitsu/Banyu), Btg-511 (British Technology Group), BARI-1453 (Aventis), S-8921 (Shionogi), SD-5613 (Pfizer), i AZD- 7806 (AstraZeneca). Primerni agonisti receptora aktiviranog proliferacijom peroksizoma (PPAR) uključuju, npr., tesaglitazar (AZ-242) (AstraZeneca), Netoglitazon (MCC-555) (Mitsubishi/ Johnson & Johnson), GW-409544 (Ligand Pharniaceuticals/GlaxoSmithKline), GW-501516 (Ligand Pharmaceuticals/GlaxoSmithKline), LY-929 (Ligand Pharmaceuticals i Eli Lilly), LY-465608 (Ligand Pharmaceuticals i Eli Lilly), LY-518674 (Ligand Pharmaceuticals i Eli Lilly), i MK-767 (Merck i Kyorin). Primerne genske terapije uključuju, npr., AdGWEGF 121,10 (GenVec), ApoAl (UCB Pharma/Groupe četirinier), EG-004 (Trinam) (Ark Therapeutics), i ATP -binding cassette transporter- A1 (ABCA1) (CV Therapeutics/Incyte, Aventis, Xenon). Primerni inhibitori glikoproteina Ilb/IIIa uključuju, npr., roksifiban (takođe called DMP754, Bristol-Myers Squibb), Gantofiban (Merck KGaA/Yamanouchi), i Cromafiban (Millennium Pharmaceuticals). Primerni inhibitori skvalene sintaze uključuju, npr., BMS- 1884941 (Bristol-Myers Squibb), CP-210172 (Pfizer), CP-295697 (Pfizer), CP-294838 (Pfizer), i TAK-475 (Takeda). Primerni MCP-I inhibitor je, npr., RS-504393 (Roche Bioscience). Antiaterosklerotski agens BO- 653 (Chugai Pharmaceuticals), i derivat nikotinske kiseline Nyclin (Yamanouchi Pharmacuticals) su takođe odgovarajući tokom primene u kombinaciji sa dsRNK pronalaska. Primerne kombinacione terapije odgovarajuće tokom primene sa dsRNK koja cilja PCSK9 uključuju, npr., advicor (Niacin/lovastatin od Kos Pharmaceuticals), amlodipin/atorvastatin (Pfizer), i ezetimib/simvastatin (npr., Vytorin® 10/10, 10/20, 10/40, i 10/80 tablete od Merck/Scheprsten-Plough Pharmaceuticals). Agensi za tretiranje hiperholesterolemije, i odgovarajući za primenu u kombinaciji sa dsRNK koja cilja PCSK9 uključuju, npr., lovastatin, niacin Altoprev® Extended-Release Tabelats (Andrx Labs), lovastatin Caduet® Tabelats (Pfizer), amlodipin besilat, atorvastatin calcium Crestor® tablete (AstraZeneca), rosuvastatin kalcijum Lescol® kapsule (Novartis), fluvastatin natrijum Lescol® (Reliant, Novartis), fluvastatin natrijum Lipitor® tablete (Parke-Davis), atorvastatin calcium Lofibra® kapsule (Gate), Niaspan Extended-Release tablete (Kos), niacin Pravachol tablete (Bristol-Myers Squibb), pravastatin natrijum TriCor® tablete (Abbott), fenofibrat Vytorin® 10/10 tablete (Merck/Scheprsten-Plough Pharmaceuticals), ezetimibe, simvastatin WelChol™ tablete (Sankyo), kolosevelam hidrohlorid Zetia® tablete (Scheprsten), ezetimib Zetia® tablete (Merck/Scheprsten-Plough Pharmaceuticals), i ezetimib Zocor® tablete (Merck).
[1082] [0415] U jednoj implementaciji, iRNK agens se daje u kombinaciji sa kombinacijom ezetimiba/simvastatina (npr., Vytorin® (Merck/Schering-Plough Pharmaceuticals)). U jednoj implementaciji, iRNK agens se daje pacijentu, a zatim se dodatni terapeutski agens daje pacijentu (ili obrnuto). U drugoj implementaciji, iRNK agens i dodatni terapeutski agens se primenjujeju istovremeno.
[1084] U sledećem aspektu, objava daje postupak instrukcija za krajnjeg korisnika, na primer, negovatelja ili pacijenta, kako primenjivati iRNK agens koji je ovde opisan. Ovaj postupak uključuje, opciono, omogućavanje krajnjem korisniku jednu ili više doza iRNK agensa i instrukciju krajnjeg korisnika da primenjuje iRNK agens pri režimu koji je ovde opisan, čime se daju instrukcije krajnjem korisniku.
[1086] U jednom aspektu, objava daje postupak za lečenje pacijenta odabirom pacijenta na osnovu toga što pacijentu treba snižavanje LDL, snižavanje LDL bez snižavanja HDL, snižavanje ApoB ili snižavanje ukupnog holesterola. Ovaj postupak obuhvata davanje pacijentu siRNK u količini koja je dovoljna za snižavanje pacijentovog nivoa LDL ili nivoa ApoB, npr., bez značajnog smanjenja nivoa HDL.
[1088] Genetska predispozicija igra ulogu u razvoju bolesti povezanih sa ciljnim genom, na primer, hiperlipidemijom. Stoga, pacijent kom je potrebna siRNK može se identifikovati uzimanjem porodične istorije ili, na primer, skrininga za jedan ili više genetskih markera ili varijanti. Primeri gena koji su uključeni u hiperlipidemiju uključuju, ali nisu ograničeni na, npr. LDL receptor (LDLR), apoliprotein (ApoAl, ApoB, ApoE i slično), holesterol ester transferni protein (CETP), lipoprotein lipazu (LPL) hepatičku lipazu (LIPC), endotelnu lipazu (EL), lecitinhholesteril aciltransferazu (LCAT).
[1090] Pružalac zdravstvene zaštite, kao što je lekar, medicinska sestra ili član porodice, može da preuzme porodičnu istoriju pre nego što propiše ili primeni iRNK agens prema pronalasku. Osim toga, može se izvršiti test da se odredi genotip ili fenotip. Na primer, DNK test se može izvesti na uzorku pacijenta, na primer, uzorku krvi, kako bi se identifikovao PCSK9 genotip i/ili fenotip pre nego što se pacijentu primeni PCSK9 dsRNK. U još jednom otelotvorenju, izvršen je test kako bi se identifikovao povezan genotip i/ili fenotip, npr., LDLR genotip. Primer genetskih varijanti sa LDLR genom mogu se naći u struci, npr., u sedećim publikacijama koje su obuhvaćene referencom: Costanza et al (2005) Am J Epidemiol. 15;161(8):714-24; Yamada i dr. (2008) J Med Genet. Jan;45(1):22-8, Epub 2007 Aug 31; and Boes et al (2009) Exp. Gerontol 44: 136-160, Epub 2008 Nov 17.
[1091] VI. Kompleti
[1092] Ova objava takođe nudi komplete za korišćenje bilo kog od iRNK agenasa i/ili obavljanje bilo koje od opisanih postupaka. Takvi kompleti uključuju jedan ili više RNKi agens i uputstva za upotrebu, na primer, uputstva za inhibiciju eksprimiranja PCSK9 u ćeliji dovođenjem u dodir ćelije sa RNKi agensom u količini koja je efikasna da inhibira eksprimiranje PCSK9. Kompleti mogu dodatno uključivati sredstvo za dovođenje u dodir ćelije sa RNKi agensom (npr. uređaj za injektiranje) ili sredstvo za merenje inhibicije PCSK9 (npr. sredstvo za merenje inhibicije PCSK9 mRNK ili TTR proteina). Takva sredstva za merenje inhibicije PCSK9 mogu sadržati sredstvo za dobijanje uzorka od pacijenta, kao što je, na primer, uzorak plazme. Kompleti iz ovog pronalaska mogu opciono dodatno da sadrže sredstva za davanje RNKi agensa pacijentu ili sredstvo za određivanje terapeutski efikasne ili profilaktički efikasne količine.
[1094] Sve dok se ne definiše drukčije, svi tehnički i naučni izrazi koji se ovde koriste imaju isto značenje kao što je obično poznato od strane stručnjaka u oblasti kojoj pripada ovaj pronalazak. Iako postupci i materijali koji su slični ili ekvivalentni onima opisanim ovde mogu biti korišćeni u praksi ili testiranju iRNK i postupaka, opisani su u daljem tekstu su odgovarajući postupci i materijali. U slučaju sukoba, ova specifikacija, uključujući definicije, će kontrolisati. Pored toga, materijali, postupci i primeri su samo ilustrativni i nisu namenjeni da budu ograničavajući.
[1096] PRIMERI
[1097] Materijali i postupci
[1098] Naredni materijali i postupci su korišćeni u Primerima.
[1100] cDNK sinteza koristeći ABI cDNK reverzno transkripcioni komplet visokog kapaciteta (Applied Biosystems, Foster City, CA, Cat #4368813)
[1101] Mater smeša 2µl 10X pufera, 0,8µl 25X dNTP, 2µl nasumičnih prajmera, 1µl revezne transcriptaza, 1µl inhibitora RNaze i 3,2µl H<2>O po reakciju dodato je u 10µl ukupne RNK. cDNK je generisana koristeći Bio-Rad C-1000 ili S-1000 termalni cikler (Hercules, CA) kroz naredne korake: 25°C 10 minuta, 37°C 120 minuta, 85°C 5 sekundi, 4°C držanje.
[1103] Ćelijska kultira i transfekcije
[1104] Hep3B, HepG2 ili HeLa ćelije (ATCC, Manassas, VA) su uzgajane skoro do konfulencije na 37°C u atmosferi 5% CO<2>u preporučenom medijumu (ATCC) obogaćenom sa 10% FBS i glutaminom (ATCC) pre oslobađanja sa ploča sa tripsinizacijom. Za duplekse ispitane u 96-komoričnom formatu, transfekcija je sprovedena sa dodavanjem 44,75µl Opti-MEM plus 0,25µl Lipofectamina RNKiMax po komorici (Invitrogen, Carlsbad CA. cat # 13778-150) do 5µl svakog siRNK dupleksa pojedinačnoj komorici u 96-komoričnoj ploči. Smeša je zatim inkubirana na sobnoj temperaturi tokom 15 minuta. Pedeset µl kompletnog medijuma rasta bez antibiotika koji sadrži ∼2 x10<4>ćelija je zatim dodat siRNK smeši. Tokom ispitivanja dupleksa u 384-komoričnom formatu, 5µl od Opti-MEM plus 0,1µl Lipofectamina RNKiMax (Invitrogen, Carlsbad CA. cat # 13778-150) je pomešano sa 5µl svakog siRNK dupleksa pojedinačnoj komorici. Smeša je zatim inkubirana na sobnoj temperaturi tokom 15 minuta što je praćeno sa dodavanjem od 40µl kompletnog medijuma rasta bez antibiotika koji sadrži ∼8 x10<3>ćelija. Ćelije su inkubirane tokom 24 sata pre RNK pročišćavanja.
[1105] Eksperimenti sa jednom dozom su obavljeni na 10nM i 0,1nM konačnoj koncentraciji dupleksa i eksperimenti odgovora doze su obavljeni koristeći 8 X 5-struko serijsko rastvaranje počevši od 2nM.
[1107] Transfekcija slobodnog uzimanja
[1108] Pet µl od svake GalNac konjugovane siRNK u PBS je kombinovano sa 3X10<4>sveže otopljenim krio-očuvanim hepatocitima cinomolgus majmuna(In Vitro Technologies- Celsis, Baltimore, MD; lot#JQD) resuspendovano u 95µl od In Vitro Gro CP medijumu (In Vitro Technologies- Celsis, Baltimore, MD) u svakoj komorici 96-komorične ploče ili 5ul siRNK i 45 µl medijuma koji sadrži 1,2x10<3>ćelija za format 384-komorične ploče. Smeša je inkubirana tokom oko 24 sata na 37°C u atmosferi od 5% CO<2>. SiRNK su testirani na više koncentracija između 500 i 0,1nM tokom Eksperimenata sa jednom dozom i koristeći 8 X 5-struko serijsko rastvaranje počevši od 500nM tokom eksperimenata odgovora na dozu.
[1110] Ukupna RNK izolacija koristeći DYNABEADS mRNK Isolation Kit (Invitrogen, part #: 610-12)
[1111] [0426] Ćelije su prikupljene i lizirane u 150µl liza/vezujućem puferu zatim pomešane tokom 5 minuta na 850rpm koristeći Eppendorf Thermomixer (brzina mešanja je ista kroz ceo proces). Deset mikrolitara magnetnih kuglica i 80µl liza/vezujući pufer smeše su dodati ploči sa okruglim dnom i pomešani tokom 1 minuta. Magnetne kuglice su uhvaćene koristeći magnetni štand i supernatant je je uklonjen bez uznemiravanja kuglica. Nakon uklanjanja supernatanta, lizirane ćelije su dodate preostalim kuglicama i pomešane tokom 5 minuta. Nakon uklanjanja supernatanta, magnetne kuglice su oprane 2 puta sa 150µl puferom za pranje A i pomešae tokom 1 minuta. Kuglice su uhvaćene ponovo i supernatant je uklonjen. Kuglice su zatim oprane sa 150µl puferom za pranje B, uhvaćene i supernatant je je uklonjen. Kuglice su zatim oprane sa 150µl elucionim puferom, uhvaćene i supernatant je uklonjen. Kuglicama je dopušteno da se osuše tokom 2 minuta. Nakon sušenja, 50µl elucionog pufera je dodat i pomešano tokom 5 minuta na 70°C. Kuglice su uhvaćene na magnetu tokom 5 minuta. Pedeset µl supernatanta je je uklonjen i dodato drugoj 96-komoričnoj ploči.
[1113] Za 384-komorični format, ćelije su lizirane tokom jednog minuta sa dodavanjem 50µl lize/vezujućeg pufera. Dva µl magnetnih kuglica po komorici je korišćeno. Potrebna zapremina kuglica je alikvotovana, uhvaćene su na magnetnom štandu, i rastvor čuvanja kuglica je uklonjen. Kuglice su zatim resuspendovane u potrebnoj zapremini liza/vezujućeg pufera (25µl po komorici) i 25µl suspenzije kuglica dodato je do liziranim ćelijama. Lizatkuglica smeša je inkubirana tokom 10 minuta na VibraTransoor na podešavanju #7 (UnionScientific Corp., Randallstown, MD). Potom su kuglice uhvaćene koristeći magnetni štand, supernatant je uklonjen i kuglice su oprane jednom sa 90µl pufera A, praćeno sa pojedinačnim koracima pranja sa 90µl pufera B i 100µl elucionog pufera. Kuglice su natopljene u svakom puferu za pranje tokom ∼1 minuta (bez mešanja). Nakon konačnog koraka pranja, kuglice su resuspendovane u 15µl elucionog pufera tokom 5 minuta na 70°C, praćeno sa hvatanjem kuglica i uklanjanjem supernatanta (do 8µl) tokom cDNK sinteze i/ili čuvanja pročišćenog RNK (-20°C).
[1115] Real time PCR
[1116] [0428] Dva µl cDNK dodato je do master smeši koja sadrži 0,5µl ljudske GAPDH TaqMan sonde (Applied Biosystems Cat #4326317E), 0,5µl ljudske PCSK9 TaqMan sonde (Applied Biosystems cat # Hs03037355_m1) za ljudske ćelije ili 0,5µl cinomolgus GAPDH custom TaqMan Assay (150nM cino GAP F prajmer-5'GCATCCTGGGCTACACTGA (SEQ ID NO: 5); 150nM cino GAP R prajmer-5'-TGGGTGTCGCTGTTGAAGTC (SEQ ID NO: 6) 250nM cino GAP sonda- 5'-5heks-CCAGGTGGTCTCCTCC-BHQ1-Q-3' (SEQ ID NO: 7)), 0,5µl cinomolgus PCSK9 custom TaqMan Assay (900nM cino PCSK9 F prajmer 5'-ACGTGGCTGGCATTGCA (SEQ ID NO: 8); 900nM cino PCSK9 R prajmer 5'-AAGTGGATCAGTCTCTGCCTCAA (SEQ ID NO: 9); 250nM cino PCSK9 sonda 5'-6FAM-CATGATGCTGTCTGCCGAGCCG-BHQ1-Q-3' (SEQ ID NO: 10)) za cinomolgus ćelije i 5µl Lightcikler 480 sonda master smeše (Roche Cat #04887301001) po komorici u 384-komoričnoj ploči (Roche cat # 04887301001). PCR u realnom vremenu je obavljena u Roche LC480 Real Time PCR sistemu (Roche) koristeći ΔΔCt(RQ) test. Svaki dupleks je testiran u dve nezavisne transfekcije i svaka transfekcija je testirana u duplikatu, ako nije drugačije navedeno.
[1118] Kako bi se izračunao relativni red veličine promene, podaci su u realnom vremenu analizirani koristeći ΔΔCt postupak i normalizovani za testove obavljene sa ćelijama transfekovanim sa 10nM AD-1955, ili lažno transfekovanim ćelijama. Tokom testova slobodnog uzimanja podaci su normalizovani za PBS ili GalNAc-1955 (najviša koncentracija korišćena za eksperimentalna jedinjenja) tretirane ćelije. IC<50>s su izračunati koristeći 4 parameter fit model koristeći XLFit i normalizovani za ćelije transfekovane sa AD-1955 preko istog raspona doza, ili za svoju najnižu dozu.
[1120] Sens i antisens sekvence od AD-1955 su: sens: 5'-cuuAcGcuGAGuAcuucGAdTsdT-3' (SEQ ID NO: 11); i ANTIsens: 5'-UCGAAGuACUcAGCGuAAGdTsdT-3' (SEQ ID NO: 12).
[1122] Tabela B: Skraćenice nukleotidnih monomera korišćene u predstavljanje sekvence nukleinske kiseline
[1124]
[1125]
[1126]
[1127]
[1130] Primer 1. Sinteza GalNAc-konjugovanih oligonukleotidia
[1131] Serija siRNK dupleksa u rasponu sekvence PCSK9 mRNK dizajnirana je, sintetizovana i konjugovana sa trovalentnim GalNAc na 3-kraju sens lanca koristeći tehnike opisane iznad. Sekvence tih dupleksa su prikazane u Tabeli 1. Ove iste sekvence su takođe sintezovane sa različitim nukleotidnim modifikacijama i konjugovane sa trovalentnim GalNAc. Sekvence modifikovanih dupleksa su prikazane u Tabeli 2.
[1132] Tabela 1. PCSK9 nemodifikovane sekvence
[1133]
[1134]
[1135]
[1136]
[1137]
[1138]
[1139]
[1140]
[1141]
[1142]
[1143]
[1144]
[1145]
[1146]
[1147]
[1148]
[1149]
[1150]
[1151]
[1152]
[1153]
[1154]
[1155]
[1156]
[1157]
[1158]
[1159]
[1160]
[1161]
[1162]
[1163]
[1164]
[1165]
[1166]
[1167]
[1168]
[1169]
[1170]
[1171]
[1172] Tabela 2. PCSK9- modifikovaei sekvence
[1173]
[1174]
[1175]
[1176]
[1177]
[1178]
[1179]
[1180]
[1181]
[1182]
[1183]
[1184]
[1185]
[1186]
[1187]
[1188]
[1189]
[1190]
[1191]
[1192]
[1193]
[1194]
[1195]
[1196]
[1197]
[1198]
[1199]
[1200]
[1201]
[1202]
[1203]
[1204]
[1205]
[1206]
[1207]
[1208]
[1209]
[1210]
[1211]
[1212]
[1213]
[1214]
[1215]
[1216]
[1217] Primer 2. in vitro i in vivo ispitivanje.
[1218] Podskup tih dupleksa je procenjen za efikasnost u testovima slobodnog uzimanja pojedinačne doze u hepatocitima cinomolgus majmuna. Ukratko, primarni hepatociti cinomolgus majmuna (PCH) su tretirani sa konjugovanim modifikovanim siRNK dupleksima pri tri koncentracije, 500nM, 100nM i 10nM.100nM i 10nM testovi slobodnog uzimanja su obavljeni dvaput i podaci su predstavljeni kao prosečna poruka preostala u odnosu na kontrolu /- standardna devijacija (SD).500nM ispitivanje je obavljeno jedanput. Tabela 3 pokazuje rezultate tih testova.
[1220] Tabela 3. PCSK9 efikasnost ispitivanja sa slobodnim uzimanjem kod primarnih hepatocita cinomolgous majmuna.
[1222]
[1223]
[1224]
[1225]
[1226]
[1227]
[1230] Modifikovani i konjugovani PCSK9 siRNK dupleksi su takođe procenjeni za efikasnost sa testovima transfekcije u tri ljudske ćelijske linije. PCSK9 siRNK su transfekovani u tri različite ćelijske linije, HeLa, Hep3B i HepG2 pri dve doze, 10nM i 0,1nM. Rezultati tih testova su prikazani u Tabeli 4 i podaci su izraženi kao fragment preostale poruke u odnosu na kontrolu.
[1231] Slika 1 pokazuje da postoji opšta reproduktivnost kod aktivnosti utišavanja PCSK9 dupleksa između testova slobodnog uzimanja i testova transfekcije.
[1232] IC<50>vrednosti za izabrane duplekse sa slobodnim uzimanjem u cinomologous ćelijama i sa transfekcijom u Hep3B ćelijama su prikazane u Tabeli 5.
[1233] Tabela 4. PCSK9 efikasnost ispitivanja sa transfekcijama u ljudske ćelijske linije.
[1234]
[1235]
[1236]
[1237]
[1238]
[1239]
[1241] Tabela 5. PCSK9 IC<50>vrednosti za izabrane duplekse sa slobodnim uzimanjem u ćelijama cinomologous majmuna i sa transfekcijom u Hep3B ljudskoj ćelijskoj liniji.
[1242]
[1243]
[1246] AD-48400 je takođe testiran za in vivo efikasnost kod ženskih miševa koji nose ljudski PCSK9 transgen nasumično umetnut u genom bez ometanja endogenog PCSK9 gena.
[1247] Ukratko, miševi su potkožno injektirani sa jednom 20 mg/kg dozom na Dan 0, jednom 100 mg/kg dozom na Dan 0, i pet 20 mg/kg doza na Dane 0, 1, 2, 3, 4, i 5. Serum je prikupljen na Dane -6, -3, 0, 1, 2, 3, 4, i 7 i količina PCSK9 proteina je određena sa ELISA testom.
[1248] Rezultati tih analiza su prikazani na Slici 2 i pokazuj da postoji efekat odgovora na dozu sa AD-48400 konjugovanim za GalNAc na sve tri testirane doze.
[1250] Šest najefikasnijih dupleksa identifikovanih in vitro ispitivanjima opisanim iznad, procenjen su za in vivo efikasnost i dužinu odgovora. Transgeni PCSK9 miševi su injektirani na Dane 0, 1, 2, 3, i 4 sa ili 5 mg/kg ili 25 mg/kg AD-48400, AD-53830, AD-53806, AD-53815, AD-53748, ili AD-53798. Serum PCSK9 protein i serumu su određeni sa ELISA na Dane -3, 0, 1, 2, 3, 4, 8, 11.15. 18, 22, 26, 31, i 36. Rezultati su prikazani na Slikama 3A i 3B.
[1252] Primer 3. Vodeća optimizacija.
[1253] Na osnovu testova efikasnosti opisanih u Primeru 2 iznad, PCSK9 siRNK na osnovu matične sekvence AD-53815 i AD-53806 sa mnoštvom hemijskih modifikacija su procenjeni za efikasnost u testovima slobodnog uzimanja kod primarnih hepatocita cinomolgous majmuna (PCH) na 200nM, 20nM, 2nM, i 0,2nM. Za sve doze osim 0,2nM doze, testovi su obavljeni dvaput i podaci su izraženi kao prosečni fragment preostale poruke u odnosu na kontrolu. 0,2nM doza je testirana jedanput. Rezultati tih testovi su prikazani u Tabeli 6.
[1255] Tabela 6. Efikasnost ispitivanja tokom vodeće optimizacije AD-53815 i AD-53806 sa slobodnim uzimanjem kod hepatocita cinomolgous majmuna.
[1256]
[1257]
[1258]
[1259]
[1260]
[1261]
[1262]
[1263]
[1264]
[1265]
[1266] siRNK sa mnoštvom hemijskih modifikacija na osnovu matične sekvence AD-53815 i AD-53806 su takođe ispitani za in vitro efikasnost sa transfekcijom u Hep3B ćelijama na 10nM i 0,1nM. Rezultati ovog ispitivanja odnosa strukture i aktivnosti su prikazani u Tabeli 7, i izraženi su kao prosečni fragment preostale poruke u odnosu na kontrolu /- SD.
[1268] Tabela 7. Efikasnost ispitivanja za vodeću optimizaciju AD-53815 i AD-53806 sa transfekcijom u ljudske ćelije.
[1270]
[1271]
[1272]
[1273]
[1274]
[1275]
[1278] Kako bi se odredilo da li je bilo koji od siRNK iz in vitro SAR ispitivanja efektivniji za utišavanje PCSK9 nego matični siRNK (AD-53815) PCSK9 transgenim miševima je primenjena jedna 3 mg/kg doza siRNK prikazana na Slici 4, i 72 sati nakon doziranja, nivoi PCSK9 proteina su određeni sa ELISA testom. Rezultati, prikazani na Slici 5, pokazuju da je AD-57928 iznenađujuće efektivan na utišavanje PCSK9. Slika 6 pokazuje da, ne samo da pojedinačna doza AD-57928 efektivno obara PCSK9 protein, nego takođe postoji i odgovor na dozu kad se koristi AD-57928.
[1280] Primer 4. Ispitivanje deljenja doza koristeći AD-57928
[1281] Sposobnost AD-57928 da potiskuje eksprimiranje PCSK9 proteina je procenjena merenjem nivoa ljudskog PCSK9 (hPCSK9) proteina u serumu hPCSK9 transgenih miševa nakon primene AD-57928. AD-57928 je primenjen potkožno koristeći šest različitih rasporeda doziranja koji su uključivali „fazu stavljanja“ tokom prve nedelje (jedna doza od 0,5 mg/kg, 1 mg/kg ili 2 mg/kg dnevno tokom 5 narednih dana), praćeno sa "faza održavanja" (jednom ili dvaput nedeljno doziranje ili 0,5 mg/kg, 1 mg/kg ili 2 mg/kg tokom 5 nedelja), kako je opisano u Tabeli 8 ispod. Poslednja doza je primenjena na dan 38. Svaki raspored doziranja je testiran koristeći grupu od 3 miša koji su uključivali dva mužjaka i jednu ženku. Kontrolna grupa je primila injekcije sa PBS.
[1283] Tabela 8. Raspored doziranja tokom primene AD-57928
[1284]
[1287] Serum je prikupljen 3 dana pre primene prve doze i na Dane 1, 4, 7, 10, 14, 17, 21, 24, 28, 31, 35, 38, 42, 45, 52, 59 i 65 nakon prve doze. PCSK9 protein nivoi u serumu su procenjeni sa ELISA testom. Rezultati su prikazani na Slikama 6, 7 i 8.
[1289] Redukcija nivoa hPCSK9 proteina u serumu je primećena 72 sata nakon prve doze, i održana je do dana 38. Primene AD-57928 pri dozama stavljanja od 5x2 mg/kg, 5x1 mg/kg i 5x0,5 mg/kg rezultovalo je u ∼90%, ∼70% i ∼60% redukciji nivoa hPCSK9 proteina u serumu, respektivno (pogledati Slike 6-8). Kod grupe dozirane koristeći 2x raspored doziranja održavanja, redukcija nivoa hPCSK9 održana je tokom 1 nedelje duže nego kod grupe dozirane koristeći 1x raspored doziranja održavanja, i vratila se do osnovice 4 nedelje nakon poslednje doze (pogledati Slike 6-8).
[1291] Primer 5. Titracija fosforotioata
[1292] Kako bi se odredio efekat broja i položaja modifikacija fosforotioata na sposobnost dsRNK da inhibira eksprimiranje PCSK9, više siRNK na osnovu matične sekvence AD-57928, AD-53806 i AD-53830 kako je prikazano u Tabeli 9 su pripremljene i testirane. Kako bi se odredilo da li je bilo koja od siRNK efektivnija na utišavanje PCSK9 nego AD-57928, PCSK9 transgenim miševima su primenjene pojedinačne 0,3 mg/kg doza siRNK u Tabeli 9, i 72 sata nakon doziranja, nivoi PCSK9 proteina su određena sa ELISA testom. Rezultati, prikazani na Slici 9, pokazuju da AD-57928 je iznenađujuće efektivan od utišavanja PCSK9.
[1293] AD-58893, AD-58894, AD-58896, AD-58897, AD-58898 i AD-58899 su takođe sposobni da utišaju PCSK9 u poređenju sa kontrolom.
[1294] Tabela 9. siRNK korišćene u eksperimentu titracije fosforotioata
[1295]
[1296] Primer 6. AD-57928 i AD-58895 nivoi leka u jetri
[1297] Cilj ovog ispitivanja je kvantifikovanje siRNK nivoa u jetri divljeg tipa miševa kako bi se definisali odgovarajući uslovi tokom ispitivanja nivoa leka. siRNK korišćene u eksperimentu su AD-57928 i AD-58895 (koji nije proizveo smanjenje nivoa PCSK9 proteina u Primer 5). AD-58895 je korišćen za poređenje kako bi se definisale vremenske tačke u kojima je razlika u nivou leka primetna na efikasnost.
[1299] Ukupno 33 C57B6 ženki miševa su korišćene u eksperimentu (3 miša po grupi). Ovim miševima su primenjene pojedinačne potkožne doze ili AD-57928, AD-58895 ili PBS kao kontrola. Jetre su prikupljene na 4, 24, 48, 72, 96 i 168 sati posle doze. Prikupljeni su duplikati alikvota tkiva po uzorku, i koncentracija siRNK u jetri je merena koristeći novo dizajniran antisens sekvenca specifični qRT-PCR test. Merena količina AD-57928 i AD-58895 po gramu jetre tokom vremena je prikazana na Slici 10, i količina AD-57928 i AD-58895 izraženih kao procenat ukupne teoretske doze je prikazana na Slici 11. Ograničenje detektovanja (LOD) qRT-PCR testa je ∼1 ng/ g jetre, i test je pokazao dobre performanse i precizno reprodukovanje duplikata. Rezultati ukazuju da je AD-57928 stabilniji u jetri i AD-58895 je manje stabilan, a oba se mogu detektovati u svim vremenskim tačkama. Na 7 dana posle doze, nivo AD-57928 je >100 puta iznad LOD qRT-PCR testa, i nivo AD-58895 je >10 puta iznad LOD. Koncentracije AD-57928 i AD-58895 razlikuju se u proseku >10 puta prema njihovoj predviđenoj sposobnosti i primećenoj efikasnosti. Vremenska tačka između 72 i 120 sati posle doze može biti odgovarajuća za ispitivanja na osnovu siRNK koncentracija.
[1301] Primer 7. Optimizacija AD-57928
[1302] Kako bi se poboljšala in vivo aktivnost i stabilnost AD-57928, dodatni iRNK agensi na osnovu matične sekvence AD-57928 su pripremljeni i testirani (Tabela 10; „Sens“ sekvence u Tabeli 10 su objavljene kao SEQ ID NOS: 1653-1658, respektivno, po redosledu pojavljivanja, i „Antisens“ sekvence su objavljene kao SEQ ID NOS: 1659-1664, respektivno, po redosledu pojavljivanja; iste sens i antisens sekvence objavljene u Tabeli 10 su takođe objavljene na Slici 12A).
[1304] Nemodifikovane sens i antisens sekvence za AD-60212 su:
[1305] Sens - 5'- CUAGACCUGUTUUGCUUUUGU - 3' (A-122088,3; SEQ ID NO:1665); i Antisens - 5'- ACAAAAGCAAAACAGGUCUAGAA - 3'(A-120190,19; SEQ ID NO:1666).
[1307] Uopšteno, ova jedinjenja su sadržala manje 2'-fluro modifikacija i fluoromodifikovani uridini su uklonjeni. In vitro potencija tih dupleksa je testirana sa transfekcijom HeLa i Hep3b ćelija. Kako je prikazano na Slici 12B, AD-59849, AD-59228, i AD-60212 imaju IC<50>vrednosti uporedive sa matičnim (AD-57928).
[1309] Sposobnost tih dupleksa da se sadržavaju in vivo u jetri je takođe određena primenom 1 mg/kg svakog dupleksa divljim miševima i određivanjem siRNK nivoa sa kvantitativnim PCR. Kako je prikazano na Slici 13, svi dupleksi pokazuju veće zadržavanje u jetri nego matični dupleks počevši od vremenske tačke 120 sati posle primene.
[1311] Sposobnost tih dupleksa da potiskuju eksprimiranje PCSK9 proteina je takođe procenjena in vivo merenjem nivoa PCSK9 proteina, LDL, HDL, ukupnog holesterola (Tc), triglicerida (Tgs), alanin transaminaze (ALT), aspartat aminottransferaza (AST), i alkalin fosfataze (ALP) u serumu od ne-ljudskih primata (NHP). Prisustvo reakcije na mestu injektiranja je takođe posmatrano. Dupleksi su primenjeni koristeći rasporede doziranja koji su uključivali „fazu stavljanja“ tokom prve nedelje (jedna doza od 2 mg/kg dnevno tokom 5 narednih dana, qdx5), praćeno sa „fazom održavanja“ (tri nedeljne doze od 2 mg/kg tokom 3 nedelje, qwx3), kao je opisano u Tabeli 11 ispod.
[1312] Tabela 10. Dodatni iRNK agensi.
[1313]
[1314] Tabela 11. rasporeda doziranja
[1316]
[1319] Kako je prikazano na Slikama 14A i 14B, sva jedinjenja osim AD-60688 postigla su više od 80% PCSK9 utišavanja i pojedinačne životinje u AD-60212 grupi postigle su više od 90% PCSK9 utišavanja. Slika 15 pokazuje da, u odsustvu statina, sva jedinjenja osim AD-60688 postižu 60% snižavanja LDL holesterola i pojedinačne životinje u AD-59223 grupi postižu do 77% snižavanja LDL holesterola. Iznenađujuće, i kako je prikazano na Slici 18, naznačeni agensi održali su snižavanje holesterola 46 dana nakon poslednje doze naznačenih agenasa. Još više iznenađujuće, i kako je prikazano na Slici 19, AD-60212 i AD-59849 održavali su do 60% snižavanja LDL holesterola do barem dana 120 (93 dana nakon poslednje doze), duže nego bilo koji efekat primećen za RNKi agens in vivo, ukazujući da, nakon faze stavljanja, ova jedinjenja se mogu primenjivati pri učestalosti od jednom mesečno, jednom svaka dva meseca, jednom svaka tri meseca, jednom svaka četiri meseca, jednom svakih pet meseci, ili jednom svakih šest meseci tokom faza održavanja.
[1321] Primer 8. Priprema od dodatnih PCSK9 zasnovanih na AD-57928
[1322] Dodatni iRNK agensi na osnovu matične sekvence AD-57928 su pripremljeni (pogledati Tabelu 12, ispod) i testirani in vitro za potencija sa transfektovanjem HeLa i Hep3B ćelije sa ovim agensima. IC<50>vrednosti za ove agense su prikazane u Tabeli 13.
[1323] Tabela 12. PCSK9 sekvence
[1324]
[1325]
[1326]
[1327] Tabela 13. IC<50>vrednosti za iRNK agense identifikovane u Tabeli 12.
[1329]
[1331] Primer 9. Efikasnost ponovljene doze AD-57928
[1332] Efikasnost ponovljene doze AD-57928 u suzbijanju eksprimiranja PCSK9 proteina je procenjena in vivo merenjem nivoa PCSK9 proteina, LDL, HDL, ukupnog holesterola (Tc), triglicerida (Tgs), alanin transaminaze (ALT), aspartat aminottransferaza (AST), i alkalin fosfataze (ALP) u serumu od ne-ljudskih primata (NHP). Prisustvo reakcije na mestu injektiranja je takođe posmatrano. AD-57928 dupleksi su potkožno primenjeni koristeći rasporeda doziranja opisan u Tabeli 14 ispod. Životinje grupe 5 su ponovo dozirane sa pojedinačnom 25 mg/kg dozom na dan 92. Jedna dodatna grupa životinja je primila pojedinačnu dozu od 25 mg/kg. „2xw“ je dva puta nedeljno; „q2w“ je jednom svake dve nedelje; i „q1w“ je jednom nedeljno.
[1335]
[1338] Kako je prikazano na Slici 16A, najefektivniji režim za snižavanje LDL je režim dvaput nedeljno (2xw) koji postiže oko 60% redukcije LDL nivoa. Ista kumulativna doza primenjena manje učestalo je manje efikasna nego režim dvaput nedeljno. Slika 16B pokazuje da 2xw režim postiže više od 80% PCSK9 utišavanja.
[1340] [0456] Slike 17A i 17B pokazuju da pojedinačne 25 mg/kg doze AD-57928 imaju isti početak kao LDL i snižavanje PCSK9, istog nadira kao PCSK9 i snižavanje LDL, i ekvivalentnu stopu snižavanja LDL kao niža višestruka doza od 2 mg/kg AD-57928 primenjena dva puta nedeljno (2xw). Ovi grafici takođe pokazuju da postoji trend ka bržem snižavanju PCSK9 sa pojedinačnom 25 mg/kg dozom i da oporavak i PCSK9 nivoa i LDL nivoa počinje oko 20 dana nakon što je nadir dostignut (dan 7) za 25 mg/kg pojedinačne doze. Nadir za 25 mg/kg pojedinačne doze je na Dan 7.
[1342] Primer 10. Tolerantnost optimizovanih AD-57928 iRNK agenasa
[1343] Dodatni iRNK agensi pripremljeni na osnovu matične sekvence AD-57928 opisane na Slici 12A (i Tabela 10) su procenjeni za toleranciju kod pacova. Mužjacima pacova je potkožno primenjeno 225 mg/kg naznačenih iRNK agenasa na Dane 1, 8, i 15, i žrtvovani su i obavljena im je nekropsija na dan 16 (pogledati Tabela 15). Životinje su posmatrane za bilo koje kliničke simptome na dnevnoj bazi i telesne težine životinja su određene pre ispitivanja i nedeljno tokom ispitivanja. Na dan 16, krv životinja je procenjena hematološki, za zgrušavanje i za hemiju seruma; metaboliam leka i farmakokinetika agenasa je određena koristeći uzorke jetre od životinja, i srce, pluća (naduvana), bubrezi, jetra, slezina, testisi, i prvo i poslednje mesto injektiranja su analizirani za bilo kakve promene. Nije bilo promena u kliničkim znacima, vizuelnoj proveri mesta injektiranja, hemiji seruma, zgrušavanju ili mikroskopskoj patologiji jetre, slezine, pluća, srca ili testisa. Tabela 16 daje zaključak težina jetre, konačnih telesnih težina, rezultate hematoloških analiza i rezultate ozbiljnosti patologija za konačna mesta injektiranja i bubrege za sve testirane agense.
[1345] Tabela 15. Raspored doziranja
[1347]
[1350] Tabela 16. Zaključak tolerancije
[1351]
[1352] POPIS SEKVENCI
[1353]
[1354]
[1355]
[1356]
[1357]
[1358]
[1359]
[1360]
[1361]
[1362]
[1363]
[1364]
[1365]
[1366]
[1367]
[1368]
[1369]
[1370]
[1371]
[1372]
[1373]
[1374]
[1375]
[1376]
[1377]
[1378]
[1379]
[1380]
[1381]
[1382]
[1383]
[1384]
[1385]
[1386]
[1387]
[1388]
[1389]
[1390]
[1391]
[1392]
[1393]
[1394]
[1395]
[1396]
[1397]
[1398]
[1399]
[1400]
[1401]
[1402]
[1403]
[1404]
[1405]
[1406]
[1407]
[1408]
[1409]
[1410]
[1411]
[1412]
[1413]
[1414]
[1415]
[1416]
[1417]
[1418]
[1419]
[1420]
[1421]
[1422]
[1423]
[1424]
[1425]
[1426]
[1427]
[1428]
[1429]
[1430]
[1431]
[1432]
[1433]
[1434]
[1435]
[1436]
[1437]
[1438]
[1439]
[1440]
[1441]
[1442]
[1443]
[1444]
[1445]
[1446]
[1447]
[1448]
[1449]
[1450]
[1451]
[1452]
[1453]
[1454]
[1455]
[1456]
[1457]
[1458]
[1459]
[1460]
[1461]
[1462]
[1463]
[1464]
[1465]
[1466]
[1467]
[1468]
[1469]
[1470]
[1471]
[1472]
[1473]
[1474]
[1475]
[1476]
[1477]
[1478]
[1479]
[1480]
[1481]
[1482]
[1483]
[1484]
[1485]
[1486]
[1487]
[1488]
[1489]
[1490]
[1491]
[1492]
[1493]
[1494]
[1495]
[1496]
[1497]
[1498]
[1499]
[1500]
[1501]
[1502]
[1503]
[1504]
[1505]
[1506]
[1507]
[1508]
[1509]
[1510]
[1511]
[1512]
[1513]
[1514]
[1515]
[1516]
[1517]
[1518]
[1519]
[1520]
[1521]
[1522]
[1523]
[1524]
[1525]
[1526]
[1527]
[1528]
[1529]
[1530]
[1531]
[1532]
[1533]
[1534]
[1535]
[1536]
[1537]
[1538]
[1539]
[1540]
[1541]
[1542]
[1543]
[1544]
[1545]
[1546]
[1547]
[1548]
[1549]
[1550]
[1551]
[1552]
[1553]
[1554]
[1555]
[1556]
[1557]
[1558]
[1559]
[1560]
[1561]
[1562]
[1563]
[1564]
[1565]
[1566]
[1567]
[1568]
[1569]
[1570]
[1571]
[1572]
[1573]
[1574]
[1575]
[1576]
[1577]
[1578]
[1579]
[1580]
[1581]
[1582]
[1583]
[1584]
[1585]
[1586]
[1587]
[1588]
[1589]
[1590]
[1591]
[1592]
[1593]
[1594]
[1595]
[1596]
[1597]
[1598]
[1599]
[1600]
[1601]
[1602]
[1603]
[1604]
[1605]
[1606]
[1607]
[1608]
[1609]
[1610]
[1611]
[1612]
[1613]
[1614]
[1615]
[1616]
[1617]
[1618]
[1619]
[1620]
[1621]
[1622]
[1623]
[1624]
[1625]
[1626]
[1627]
[1628]
[1629]
[1630]
[1631]
[1632]
[1633]
[1634]
[1635]
[1636]
[1637]
[1638]
[1639]
[1640]
[1641]
[1642]
[1643]
[1644]
[1645]
[1646]
[1647]
[1648]
[1649]
[1650]
[1651]
[1652]
[1653]
[1654]
[1655]
[1656]
[1657]
[1658]
[1659]
[1660]
[1661]
[1662]
[1663]
[1664]
[1665]
[1666]
[1667]
[1668]
[1669]
[1670]
[1671]
[1672]
[1673]
[1674]
[1675]
[1676]
[1677]
[1678]
[1679]
[1680]
[1681]
[1682]
[1683]
[1684]
[1685]
[1686]
[1687]
[1688]
[1689]
[1690]
[1691]
[1692]
[1693]
[1694]
[1695]
[1696]
[1697]
[1698]
[1699]
[1700]
[1701]
[1702]
[1703]
[1704]
[1705]
[1706]
[1707]
[1708]
[1709]
[1710]
[1711]
[1712]
[1713]
[1714]
[1715]
[1716]
[1717]
[1718]
[1719]
[1720]

Claims (15)

1. Patentni zahtevi
1. Dvolančani RNKi agens sposoban da inhibira eksprimiranje Proprotein konvertaza subtilizin keksina 9 (PCSK9) u ćeliji, gde navedeni dvolančani RNKi agens obuhvata:
(a) sens lanac komplementaran antisens lancu, gde navedeni antisens lanac obuhvata regiju komplementarnu delu mRNK koji kodira PCSK9, gde je svaki lanac oko 17 do oko 30 nukleotida dugačak, gde navedeni antisens lanac obuhvata barem 17 nukleotida iz nukleobazne sekvence ACAAAAGCAAAACAGGUCUAG (SEQ ID NO: 412) i dvolančani RNKi agens je predstavljena formulom (III):
sens: 5' n<p>-N<a>-(XXX)<i>-N<b>-YYY-N<b>-(ZZZ)<i>-N<a>-n<q>3'
antisens: 3' n<p>'-N<a>'-(X'X'X')<k>-N<b>'-Y'Y'Y'-N<b>'-(Z'Z'Z')<i>-N<a>'-n<q>'5' (III) gde:
i, j, k, i I su svaki nezavisno 0 ili 1; p, p', q, i q' su svaki nezavisno 0-6;
svaki N<a>i N<a>' nezavisno predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja sadrži 0-25 nukleotida koji su ili modifikovani ili nemodifikovani ili kombinacije toga, gde svaka sekvenca sadrži barem dva različito modifikovana nukleotida;
svaki N<b>i N<b>' nezavisno predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja sadrži 0-10 nukleotida koji su ili modifikovani ili nemodifikovani ili kombinacije toga; svaki n<p>, n<p>', n<q>, i n<q>', gde svaki može ali ne mora biti prisutan, nezavisno predstavlja višak nukleotid;
XXX, YYY, ZZZ, X'X'X', Y'Y'Y', i Z'Z'Z' svaki nezavisno predstavlja jedan motiv tri identične modifikacije na tri nukleotida za redom;
modifikacije na N<b>razlikuju se od modifikacije na Y i modifikacije na N<b>' razlikuju se od modifikacije na Y;
gde su modifikacije na nukleotidima 2'-O-metil ili 2'-fluoro modifikacije; i gde ligand je jedan ili više GalNAc derivat vezan bivalentnim ili trovalentnim razgranatim veznikom; ili
(b) antisens lanac koji se sastoji od nukleotidne sekvence asCfsaAfAfAfgCfaAfaAfcAfgGfuCfuagsasa i sens lanac koji se sastoji od nukleotidne sekvence csusagacCfuGfudTuugcuuuugu,
gde a, g, c, i u su 2'-O-metil (2'-OMe) modifikovani A, G, C, i U nukleotidi, respektivno; Af, Gf, Cf i Uf su 2'-fluoro A, G, C i U modifikovani nukleotidi, respektivno; dT je dezoksi-timin
nukleotid i s je fosforotioat veza;
i gde sens lanac je konjugovan za barem jedan ligand.
2. Dvolančani RNKi agens patentnog zahteva 1, gde
(a) antisens lanac obuhvata nukleobaznu sekvencu ACAAAAGCAAAACAGGUCUAGAA (SEQ ID NO: 418);
(b) sens lanac obuhvata nukleobaznu sekvencu od AGACCUGUUUUGCUUUUGU (SEQ ID NO: 191);
(c) sens lanac obuhvata nukleobaznu sekvencu CUAGACCUGUUUUGCUUUUGU (SEQ ID NO: 197);
(d) antisens lanac obuhvata nukleobaznu sekvencu ACAAAAGCAAAACAGGUCUAGAA (SEQ ID NO: 418) i sens lanac obuhvata nukleobaznu sekvencu CUAGACCUGUUUUGCUUUUGU (SEQ ID NO: 197); (e) antisens lanac obuhvata nukleobaznu sekvencu ACAAAAGCAAAACAGGUCUAG (SEQ ID NO: 412) i sens lanac obuhvata nukleobaznu sekvencu AGACCUGUUUUGCUUUUGU (SEQ ID NO: 191); ili (f) antisens lanac obuhvata nukleobaznu sekvencu ACAAAAGCAAAACAGGUCUAGAA (SEQ ID NO: 418) i sens lanac obuhvata nukleobaznu sekvencu CUAGACCUGUTUUGCUUUUGU (SEQ ID NO: 1665).
3. Dvolančani RNKi agens patentnog zahteva 1, gde je dvolančana regija dugačka 17-23 nukleotidnih parova, dugačka 17-25 nukleotidnih parova, dugačka 23-27 nukleotidnih parova, dugačka 19-21 nukleotidnih parova, ili dugačka 21-23 nukleotidnih parova.
4. Dvolančani RNKi agens patentnog zahteva 1, gde dsRNK obuhvata:
(a) antisens lanac koji se sastoji od nukleotidne sekvence aCfaAfaAfgCfaAfaacAfgGfuCfuAfgsAfsa (SEQ ID NO: 1151) i sens lanac koji se sastoji od nukleotidne sekvence CfuAfgAfcCfuGfUfUfuUfgCfuUfuUfgUf (SEQ ID NO: 600);
(b) antisens lanac koji se sastoji od nukleotidne sekvence aCfaAfAfAfgCfaAfaacAfgGfuCfuAfgsAfsa (SEQ ID NO: 1246) i sens lanac koji se sastoji od nukleotidne sekvence CfuAfgAfcCfuGfUfUfuUfgCfuuuUfgUf (SEQ ID NO: 695);
(c) antisens lanac koji se sastoji od nukleotidne sekvence aCfaaaAfgCfaAfaacAfgGfuCfuAfgsAfsa (SEQ ID NO: 1253) i sens lanac koji se
sastoji od nukleotidne sekvence CfuAfgAfcCfuGfUfUfuUfgCfuUfUfUfgUf (SEQ ID NO: 702);
(d) antisens lanac koji se sastoji od nukleotidne sekvence aCfaAfAfAfgCfaAfaacAfgGfuCfusAfsg (SEQ ID NO: 1263) i sens lanac koji se sastoji od nukleotidne sekvence AfgAfcCfuGfUfUfuUfgCfuuuUfgUf (SEQ ID NO: 712);
(e) antisens lanac koji se sastoji od nukleotidne sekvence aCfaaaAfgCfaAfaacAfgGfuCfusAfsg (SEQ ID NO: 1269) i sens lanac koji se sastoji od nukleotidne sekvence AfgAfcCfuGfUfUfuUfgCfuUfUfUfgUf (SEQ ID NO: 718); (f) antisens lanac koji se sastoji od nukleotidne sekvence asCfsaAfaAfgCfaAfaacAfgGfuCfuAfgsasa (SEQ ID NO: 1369) i sens lanac koji se sastoji od nukleotidne sekvence CfsusAfgAfcCfuGfUfUfuUfgCfuUfuUfgUf (SEQ ID NO: 818);
(g) antisens lanac koji se sastoji od nukleotidne sekvence asCfsaAfaagCfaAfaacAfgGfucuAfgsasa, i sens lanac koji se sastoji od nukleotidne sekvence CfsusAfgAfcCfuGfUfUfuUfgcuuuugu; ili
(h) antisens lanac koji se sastoji od nukleotidne sekvence asCfsaAfaAfsgCfaAfaacAfgGfuCfsuAfgsasa (SEQ ID NO: 1400) i sens lanac koji se sastoji od nukleotidne sekvence CfsusAfgAfcCfuGfUfUfuUfgCfsuUfsuUfsgsUfs (SEQ ID NO: 849);
gde a, g, c, i u su 2'-O-metil (2'-OMe) modifikovani A, G, C, i U nukleotidi, respektivno; Af, Gf, Cf i Uf su 2'-fluoro A, G, C i U modifikovani nukleotidi, respektivno; dT je dezoksi-timin nukleotid i s je fosforotioat veza.
5. Dvolančani RNKi agens bilo kog patentnog zahteva od 1 do 4, gde je ligand
6. Dvolančani RNKi agens bilo kog patentnog zahteva od 1 do 5, gde ligand je vezan za 3' kraj sens lanca.
7. Dvolančani RNKi agens patentnog zahteva 6, gde RNKi agens je konjugovan za ligand kako je prikazano u narednoj šemi
gde X je O ili S.
8. Dvolančani RNKi agens bilo kog patentnog zahteva od 1 do 7, gde sens lanac ima ukupno 21 nukleotid i antisens lanac ima ukupno 23 nukleotida.
9. In vitro ćelija koji sadrži dvolančani RNKi agens bilo kog patentnog zahteva od 1 do 8.
10. A farmaceutski sastav koja sadrži dvolančani RNKi agens bilo kog patentnog zahteva od 1 do 8.
11. Farmaceutski sastav patentnog zahteva 10, gde
(a) navedeni RNKi agens se primenjuje u nepuferisanom rastvoru, gde je poželjno navedeni nepuferisani rastvor fiziološki rastvor ili voda; ili
(b) navedeni RNKi agens se primenjuje sa puferisanim rastvorom, gde poželjno navedeni puferisani rastvor obuhvata acetat, citrat, prolamin, karbonat, ili fosfat ili bilo koje njihove kombinacije, i gde je najpoželjnije navedeni puferisani rastvor fosfatni puferisan fiziološki rastvor (PBS).
12. Postupak inhibicije eksprimiranja PCSK9 u ćeliji, gde postupak sadrži:
(a) dovođenje u dodir ćelije sa dvolančanim RNKi agensom bilo kog patentnog zahteva od 1 do 8 ili farmaceutskim sastavom patentnog zahteva 10 ili 11; i
(b) održavanje ćelije proizvedene u koraku (a) tokom vremena dovoljnog da se dobije degradacija mRNK transkripta PCSK9 gena, što inhibira eksprimiranje PCSK9 gena u ćeliji,
gde su postupci za tretman ljudskog ili životinjskog tela terapijom isključeni.
13. dsRNK bilo kog patentnog zahteva od 1 do 8 ili farmaceutski sastav patentnog zahteva 10 ili 11 za primenu u postupku tretmana pacijenta koji ima poremećaj posredovan eksprimiranjem PCSK9.
14. dsRNK ili farmaceutski sastav za primenu patentnog zahteva 13, gde
(a) pacijent je čovek;
(b) poremećaj je hiperholesterolemija;
(c) dvolančani RNKi agens se primenjuje pri dozi od oko 0,01 mg/kg do oko 10 mg/kg, oko 0,5 mg/kg do oko 50 mg/kg, ili oko 10 mg/kg do oko 30 mg/kg; i/ili (d) dvolančani RNKi agens se primenjuje potkožno ili intravenozno.
15. dsRNK ili farmaceutski sastav za primenu patentnog zahteva 13 ili 14,
gde se navedeni RNKi agens primenjuje u režimu doziranja koji uključuje fazu stavljanja praćenu fazom održavanja,
gde faza stavljanja obuhvata primenu doze od 2 mg/kg, 1 mg/kg ili 0,5 mg/kg pet puta nedeljno, i
gde faza održavanja obuhvata primenu doze od 2 mg/kg, 1 mg/kg ili 0,5 mg/kg jednom nedeljno, dvaput nedeljno, tri puta nedeljno, jednom svake dve nedelje, jednom svake tri nedelje, jednom mesečno, jednom svakih dva meseca, jednom svakih tri meseca, jednom svakih četiri meseca, jednom svakih pet meseci, ili jednom svakih šest meseci.
RS20180075A 2012-12-05 2013-12-05 Sastavi pcsk9 irnk i postupci njihovih primena RS56783B9 (sr)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261733518P 2012-12-05 2012-12-05
US201361793530P 2013-03-15 2013-03-15
US201361886916P 2013-10-04 2013-10-04
US201361892188P 2013-10-17 2013-10-17
PCT/US2013/073349 WO2014089313A1 (en) 2012-12-05 2013-12-05 PCSK9 iRNA COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF
EP13811327.9A EP2929031B9 (en) 2012-12-05 2013-12-05 Pcsk9 irna compositions and methods of use thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RS56783B1 true RS56783B1 (sr) 2018-04-30
RS56783B9 RS56783B9 (sr) 2021-12-31

Family

ID=49841845

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20180075A RS56783B9 (sr) 2012-12-05 2013-12-05 Sastavi pcsk9 irnk i postupci njihovih primena

Country Status (30)

Country Link
US (2) US10125369B2 (sr)
EP (3) EP3336187A1 (sr)
JP (5) JP6574383B2 (sr)
KR (2) KR20200035490A (sr)
CN (2) CN108220295B (sr)
AR (1) AR093835A1 (sr)
AU (4) AU2013355237C1 (sr)
BR (1) BR112015013105B1 (sr)
CA (1) CA2892160C (sr)
CY (2) CY1120195T1 (sr)
DK (1) DK2929031T5 (sr)
ES (1) ES2657608T3 (sr)
FR (1) FR21C1021I2 (sr)
HK (1) HK1256621A1 (sr)
HR (1) HRP20180126T2 (sr)
HU (2) HUE035887T2 (sr)
IL (2) IL238917B (sr)
LT (2) LT2929031T (sr)
LU (1) LUC00209I2 (sr)
MX (2) MX367076B (sr)
NL (1) NL301107I2 (sr)
NO (1) NO2021024I1 (sr)
NZ (1) NZ709013A (sr)
PL (1) PL2929031T4 (sr)
PT (1) PT2929031T (sr)
RS (1) RS56783B9 (sr)
SI (1) SI2929031T1 (sr)
SM (1) SMT201800039T1 (sr)
WO (1) WO2014089313A1 (sr)
ZA (1) ZA201503829B (sr)

Families Citing this family (68)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FI3366775T4 (fi) * 2011-11-18 2025-11-14 Alnylam Pharmaceuticals Inc Modifioituja rnai-agensseja
EP3336187A1 (en) * 2012-12-05 2018-06-20 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Pcsk9 irna compositions and methods of use thereof
EP4039278A1 (en) * 2013-07-11 2022-08-10 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide-ligand conjugates and process for their preparation
IL316808A (en) 2014-08-20 2025-01-01 Alnylam Pharmaceuticals Inc Modified double-stranded RNA materials and their uses
JOP20200115A1 (ar) * 2014-10-10 2017-06-16 Alnylam Pharmaceuticals Inc تركيبات وطرق لتثبيط التعبير الجيني عن hao1 (حمض أوكسيداز هيدروكسيلي 1 (أوكسيداز جليكولات))
WO2016057693A1 (en) * 2014-10-10 2016-04-14 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for inhalation delivery of conjugated oligonucleotide
JP6892433B2 (ja) * 2015-04-03 2021-06-23 ユニバーシティ・オブ・マサチューセッツＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｏｆ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ 十分に安定化された非対称ｓｉｒｎａ
WO2017030973A1 (en) 2015-08-14 2017-02-23 University Of Massachusetts Bioactive conjugates for oligonucleotide delivery
KR102793532B1 (ko) * 2015-08-25 2025-04-14 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 전구단백질 컨버타제 서브틸리신 켁신 (pcsk9) 유전자-관련 장애를 치료하기 위한 방법 및 조성물
WO2017132669A1 (en) 2016-01-31 2017-08-03 University Of Massachusetts Branched oligonucleotides
US12285464B2 (en) 2016-04-18 2025-04-29 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Therapeutic targets involved in the progression of nonalcoholic steatohepatitis (NASH)
US11753638B2 (en) 2016-08-12 2023-09-12 University Of Massachusetts Conjugated oligonucleotides
CA3042423A1 (en) * 2016-10-18 2018-04-26 The Medicines Company Methods for preventing cardiovascular events through proprotein convertase subtilisin kexin 9 (pcsk9) protein reduction
FR3058061A1 (fr) * 2016-10-27 2018-05-04 Selexel Nouvelle utilisation d'oligonucleotides double brin
CN108265052B (zh) * 2016-12-30 2021-05-28 苏州瑞博生物技术股份有限公司 一种小干扰核酸和药物组合物及其用途
RU2019126483A (ru) 2017-01-23 2021-02-24 Ридженерон Фармасьютикалз, Инк. Варианты 17-бета-гидроксистероиддегидрогеназы 13 (hsd17b13) и их применение
JOP20190215A1 (ar) 2017-03-24 2019-09-19 Ionis Pharmaceuticals Inc مُعدّلات التعبير الوراثي عن pcsk9
IL321221A (en) 2017-04-05 2025-07-01 Silence Therapeutics Gmbh Products and compositions
CA3059348A1 (en) 2017-04-11 2018-10-18 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Assays for screening activity of modulators of members of the hydroxysteroid (17-beta) dehydrogenase (hsd17b) family
CA3058567A1 (en) 2017-04-13 2018-10-18 Cadila Healthcare Limited Novel peptide based pcsk9 vaccine
JP7406793B2 (ja) 2017-06-23 2023-12-28 ユニバーシティー オブ マサチューセッツ ２テイル自己デリバリー型ｓｉＲＮＡおよび関連方法
WO2019006455A1 (en) 2017-06-30 2019-01-03 Solstice Biologics, Ltd. AUXILIARIES OF CHIRAL PHOSPHORAMIDITIS AND METHODS OF USE THEREOF
KR102694809B1 (ko) 2017-10-11 2024-08-16 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 Pnpla3 i148m 변이를 발현하는 환자의 간 질환의 치료에서의 hsd17b13의 저해
EP3719128B1 (en) 2017-12-01 2025-01-15 Suzhou Ribo Life Science Co., Ltd. Double-stranded oligonucleotide, composition and conjugate comprising double-stranded oligonucleotide, preparation method therefor and use thereof
EP3718572B1 (en) 2017-12-01 2024-07-31 Suzhou Ribo Life Science Co., Ltd. Nucleic acid, composition and conjugate containing nucleic acid, preparation method and use
JP7360716B2 (ja) 2017-12-01 2023-10-13 スーチョウ リボ ライフ サイエンス カンパニー、リミテッド 核酸、当該核酸を含む組成物および複合体ならびに調製方法と使用
JP7261494B2 (ja) 2017-12-01 2023-04-20 スーチョウ リボ ライフ サイエンス カンパニー、リミテッド 核酸、当該核酸を含む組成物及び複合体ならびに調製方法と使用
CN118291456A (zh) 2017-12-01 2024-07-05 苏州瑞博生物技术股份有限公司 一种核酸、含有该核酸的组合物与缀合物及制备方法和用途
CN109957565B (zh) * 2017-12-26 2023-04-07 广州市锐博生物科技有限公司 一种修饰的siRNA分子及其应用
US20230139322A1 (en) * 2017-12-26 2023-05-04 Guangzhou Ribobio Co., Ltd. SiRNA molecule inhibiting the expression of the PCSK9 gene and use thereof
JP7436030B2 (ja) 2017-12-29 2024-02-21 スーチョウ リボ ライフ サイエンス カンパニー、リミテッド 複合体及びその調製方法と使用
MX2020009812A (es) 2018-03-21 2021-01-08 Regeneron Pharma COMPOSICIONES DE ARNI DE 17ß-HIDROXIESTEROIDE DESHIDROGENASA TIPO 13 (HSD17B13) Y MÉTODOS DE USO DE LAS MISMAS.
AU2019266207B2 (en) 2018-05-07 2025-04-24 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Extrahepatic delivery
WO2020038377A1 (zh) 2018-08-21 2020-02-27 苏州瑞博生物技术有限公司 一种核酸、含有该核酸的药物组合物和缀合物及其用途
US11279930B2 (en) 2018-08-23 2022-03-22 University Of Massachusetts O-methyl rich fully stabilized oligonucleotides
US11896674B2 (en) 2018-09-30 2024-02-13 Suzhou Ribo Life Science Co., Ltd. SiRNA conjugate, preparation method therefor and use thereof
MX2021007570A (es) 2018-12-19 2021-08-24 Alnylam Pharmaceuticals Inc Composiciones de agente de arni de la proteina precursora del amiloide (app) y metodos de uso de las mismas.
JP7507495B2 (ja) 2018-12-28 2024-06-28 スーチョウ リボ ライフ サイエンス カンパニー、リミテッド 核酸、当該核酸を含む組成物及び複合体ならびに調製方法と使用
CA3125441A1 (en) 2019-01-18 2020-07-23 University Of Massachusetts Dynamic pharmacokinetic-modifying anchors
CN118256498A (zh) 2019-05-22 2024-06-28 苏州瑞博生物技术股份有限公司 核酸、药物组合物与缀合物及制备方法和用途
CN117701564A (zh) * 2019-05-22 2024-03-15 苏州瑞博生物技术股份有限公司 核酸、药物组合物与缀合物及制备方法和用途
CA3149835A1 (en) 2019-08-09 2021-02-18 University Of Massachusetts Chemically modified oligonucleotides targeting snps
CN110540992B (zh) * 2019-08-21 2021-02-09 武汉泽智生物医药有限公司 增强靶基因沉默效率的siRNA分子及其应用
US20210115442A1 (en) * 2019-08-23 2021-04-22 University Of Massachusetts O-methyl rich fully stabilized oligonucleotides
US20220290156A1 (en) * 2019-08-27 2022-09-15 Sanofi Compositions and methods for inhibiting pcsk9
US12365894B2 (en) 2019-09-16 2025-07-22 University Of Massachusetts Branched lipid conjugates of siRNA for specific tissue delivery
CN110638788A (zh) * 2019-10-25 2020-01-03 广州医科大学 一种能够沉默Pcsk9蛋白的siRNA、其纳米递送系统及应用
WO2022089486A1 (zh) * 2020-10-28 2022-05-05 江苏柯菲平医药股份有限公司 抑制PCSK9基因表达的siRNA及其修饰物与应用
AU2022242899A1 (en) * 2021-03-24 2023-11-09 Atalanta Therapeutics, Inc. Double-stranded sirna having patterned chemical modifications
CN113234725B (zh) * 2021-05-28 2022-02-18 厦门甘宝利生物医药有限公司 一种抑制pcsk9基因表达的rna抑制剂及其应用
WO2022266486A2 (en) * 2021-06-17 2022-12-22 Sirnaomics, Inc. Products and compositions
CN115572241B (zh) * 2021-06-21 2024-08-30 润佳（苏州）医药科技有限公司 双价化合物、偶联物及其用途
CA3174095A1 (en) 2021-06-23 2022-12-29 Vignesh Narayan HARIHARAN Optimized anti-flt1 oligonucleotide compounds for treatment of preeclampsia and other angiogenic disorders
WO2023016999A2 (en) 2021-08-09 2023-02-16 Cargene Therapeutics Pte. Ltd. Compounds
WO2023017004A1 (en) 2021-08-09 2023-02-16 Cargene Therapeutics Pte. Ltd. Inhibitory nucleic acids for pcsk9
EP4402263A2 (en) * 2021-09-14 2024-07-24 Argonaute Rna Limited Treatment of cardiovascular disease
WO2023109945A1 (zh) * 2021-12-16 2023-06-22 上海拓界生物医药科技有限公司 一种dsRNA、其制备方法及应用
EP4464781A1 (en) * 2022-01-13 2024-11-20 CSPC Zhongqi Pharmaceutical Technology (Shijiazhuang) Co., Ltd. Rnai agent inhibiting pcsk9 gene expression and application thereof
AU2023295621A1 (en) * 2022-06-14 2025-01-09 Rona Bioscience, Limited Sirna molecule for regulating pcsk9 gene activity
CN120202010A (zh) * 2022-10-21 2025-06-24 上海京新生物医药有限公司 配体-寡核苷酸共轭物及用于该共轭物的接头
CN118086311B (zh) * 2023-05-25 2024-08-09 苏州时安生物技术有限公司 抑制PCSK9基因表达的siRNA、其缀合物和药物组合物及用途
US20250027089A1 (en) * 2023-06-21 2025-01-23 Sanegene Bio Usa Inc. Double stranded rna targeting proprotein convertase subtilisin kexin 9 (pcsk9) and methods of use thereof
CN117563009B (zh) * 2023-09-01 2025-07-01 杭州天龙药业有限公司 一种含有核糖环或其衍生结构的GalNAc化合物及其寡核苷酸缀合物
WO2025082057A1 (zh) * 2023-10-16 2025-04-24 润佳(上海)医药技术有限公司 抑制抑制素Beta E基因表达的抑制剂及其用途
WO2025096355A1 (en) * 2023-10-29 2025-05-08 Corsera Llc Improved sirna for silencing expression of pcsk9 and uses thereof
CN118147134B (zh) * 2023-11-06 2025-02-25 北京悦康科创医药科技股份有限公司 靶向调控PCSK9基因表达的siRNA及其应用
CN117384907B (zh) * 2023-12-11 2024-03-29 上海鼎新基因科技有限公司 抑制PCSK9表达的siRNA分子及其应用
WO2025171650A1 (zh) * 2024-02-18 2025-08-21 中山大学孙逸仙纪念医院 一种环状多倍串联的PCSK9 siRNA

Family Cites Families (339)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US1861608A (en) 1929-12-21 1932-06-07 Emerson Electric Mfg Co Fan and means for directing the air current therethrough
US1861108A (en) 1930-01-24 1932-05-31 Eugene O Brace Integral clutch and transmission control
US3974808A (en) 1975-07-02 1976-08-17 Ford Motor Company Air intake duct assembly
US4708708A (en) 1982-12-06 1987-11-24 International Paper Company Method and apparatus for skiving and hemming
US4897355A (en) 1985-01-07 1990-01-30 Syntex (U.S.A.) Inc. N[ω,(ω-1)-dialkyloxy]- and N-[ω,(ω-1)-dialkenyloxy]-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US5139941A (en) 1985-10-31 1992-08-18 University Of Florida Research Foundation, Inc. AAV transduction vectors
US4837028A (en) 1986-12-24 1989-06-06 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US4920016A (en) 1986-12-24 1990-04-24 Linear Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
FR2645866B1 (fr) 1989-04-17 1991-07-05 Centre Nat Rech Scient Nouvelles lipopolyamines, leur preparation et leur emploi
US5143854A (en) 1989-06-07 1992-09-01 Affymax Technologies N.V. Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof
US5744101A (en) 1989-06-07 1998-04-28 Affymax Technologies N.V. Photolabile nucleoside protecting groups
NL8901881A (nl) 1989-07-20 1991-02-18 Rockwool Grodan Bv Drainagekoppelelement.
US5436146A (en) 1989-09-07 1995-07-25 The Trustees Of Princeton University Helper-free stocks of recombinant adeno-associated virus vectors
US5264618A (en) 1990-04-19 1993-11-23 Vical, Inc. Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules
US5981276A (en) 1990-06-20 1999-11-09 Dana-Farber Cancer Institute Vectors containing HIV packaging sequences, packaging defective HIV vectors, and uses thereof
US5283185A (en) 1991-08-28 1994-02-01 University Of Tennessee Research Corporation Method for delivering nucleic acids into cells
US5252479A (en) 1991-11-08 1993-10-12 Research Corporation Technologies, Inc. Safe vector for gene therapy
WO1993009668A1 (en) 1991-11-22 1993-05-27 Affymax Technology N.V. Combinatorial strategies for polymer synthesis
US5587308A (en) 1992-06-02 1996-12-24 The United States Of America As Represented By The Department Of Health & Human Services Modified adeno-associated virus vector capable of expression from a novel promoter
EP0646178A1 (en) 1992-06-04 1995-04-05 The Regents Of The University Of California expression cassette with regularoty regions functional in the mammmlian host
WO1994000569A1 (en) 1992-06-18 1994-01-06 Genpharm International, Inc. Methods for producing transgenic non-human animals harboring a yeast artificial chromosome
JPH07509133A (ja) 1992-07-17 1995-10-12 リボザイム・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 動物疾患の処置のための方法および剤
US5783701A (en) 1992-09-08 1998-07-21 Vertex Pharmaceuticals, Incorporated Sulfonamide inhibitors of aspartyl protease
EP1024198A3 (en) 1992-12-03 2002-05-29 Genzyme Corporation Pseudo-adenoviral vectors for the gene therapy of haemophiliae
US5478745A (en) 1992-12-04 1995-12-26 University Of Pittsburgh Recombinant viral vector system
CA2156288C (en) 1993-02-19 2005-10-18 Junichi Yano Glycerol derivative, device and pharmaceutical composition
US6191105B1 (en) 1993-05-10 2001-02-20 Protein Delivery, Inc. Hydrophilic and lipophilic balanced microemulsion formulations of free-form and/or conjugation-stabilized therapeutic agents such as insulin
US6054299A (en) 1994-04-29 2000-04-25 Conrad; Charles A. Stem-loop cloning vector and method
US5543152A (en) 1994-06-20 1996-08-06 Inex Pharmaceuticals Corporation Sphingosomes for enhanced drug delivery
US5556752A (en) 1994-10-24 1996-09-17 Affymetrix, Inc. Surface-bound, unimolecular, double-stranded DNA
US5665557A (en) 1994-11-14 1997-09-09 Systemix, Inc. Method of purifying a population of cells enriched for hematopoietic stem cells populations of cells obtained thereby and methods of use thereof
JP3269301B2 (ja) 1994-12-28 2002-03-25 豊田合成株式会社 ガラスラン用ゴム配合物
JPH11508231A (ja) 1995-05-26 1999-07-21 ソマティックス セラピー コーポレイション 安定な脂質／核酸複合体を含む送達ビヒクル
US5545531A (en) 1995-06-07 1996-08-13 Affymax Technologies N.V. Methods for making a device for concurrently processing multiple biological chip assays
US5981501A (en) 1995-06-07 1999-11-09 Inex Pharmaceuticals Corp. Methods for encapsulating plasmids in lipid bilayers
US7422902B1 (en) 1995-06-07 2008-09-09 The University Of British Columbia Lipid-nucleic acid particles prepared via a hydrophobic lipid-nucleic acid complex intermediate and use for gene transfer
CA2222328C (en) 1995-06-07 2012-01-10 Inex Pharmaceuticals Corporation Lipid-nucleic acid particles prepared via a hydrophobic lipid-nucleic acid complex intermediate and use for gene transfer
US5858397A (en) 1995-10-11 1999-01-12 University Of British Columbia Liposomal formulations of mitoxantrone
WO1997014809A2 (en) 1995-10-16 1997-04-24 Dana-Farber Cancer Institute Novel expression vectors and methods of use
US5854033A (en) 1995-11-21 1998-12-29 Yale University Rolling circle replication reporter systems
US5858401A (en) 1996-01-22 1999-01-12 Sidmak Laboratories, Inc. Pharmaceutical composition for cyclosporines
US5994316A (en) 1996-02-21 1999-11-30 The Immune Response Corporation Method of preparing polynucleotide-carrier complexes for delivery to cells
US6034135A (en) 1997-03-06 2000-03-07 Promega Biosciences, Inc. Dimeric cationic lipids
JP2002510319A (ja) 1997-07-01 2002-04-02 アイシス・ファーマシューティカルス・インコーポレーテッド オリゴヌクレオチドの消化管を介したデリバリーのための組成物及び方法
US6506559B1 (en) 1997-12-23 2003-01-14 Carnegie Institute Of Washington Genetic inhibition by double-stranded RNA
PL341762A1 (en) 1997-12-24 2001-05-07 Vertex Pharma Precursors of aspartil protease inhibitors
US6436989B1 (en) 1997-12-24 2002-08-20 Vertex Pharmaceuticals, Incorporated Prodrugs of aspartyl protease inhibitors
EP2267139B1 (en) 1998-04-08 2017-03-22 Commonwealth Scientific and Industrial Research Organisation Methods and means for obtaining modified phenotypes
AR020078A1 (es) 1998-05-26 2002-04-10 Syngenta Participations Ag Metodo para alterar la expresion de un gen objetivo en una celula de planta
WO2000003683A2 (en) 1998-07-20 2000-01-27 Inex Pharmaceuticals Corporation Liposomal encapsulated nucleic acid-complexes
US6379957B1 (en) 1998-09-21 2002-04-30 Leslie A. Johnston-Dow Methods for HIV sequencing and genotyping
BR9914772A (pt) 1998-10-09 2001-12-11 Ingene Inc Conjunto de elementos genéticos, vetor, célulahospedeira, conjunto para a produção de umasequência de ácido nucléico, método para aprodução in vivo ou in vitro de uma sequência deácido nucléico, transcrição de cdna, molécula deácido nucléico inibidor, transcrição de mrna,molécula heteroduplex e composiçãofarmacêutica
CA2345936A1 (en) 1998-10-09 2000-04-20 Ingene, Inc. Production of ssdna in a cell
DE19956568A1 (de) 1999-01-30 2000-08-17 Roland Kreutzer Verfahren und Medikament zur Hemmung der Expression eines vorgegebenen Gens
TNSN00027A1 (fr) 1999-02-12 2005-11-10 Vertex Pharma Inhibiteurs de l'aspartyle protease
JP2002537343A (ja) 1999-02-23 2002-11-05 アイシス・ファーマシューティカルス・インコーポレーテッド 多重粒子製剤
US6271359B1 (en) 1999-04-14 2001-08-07 Musc Foundation For Research Development Tissue-specific and pathogen-specific toxic agents and ribozymes
DE10100586C1 (de) 2001-01-09 2002-04-11 Ribopharma Ag Verfahren zur Hemmung der Expression eines Ziegens
EP1261620A2 (en) 2000-02-07 2002-12-04 Roche Diagnostics Corporation Cationic amphiphiles for use in nucleic acid transfection
US20050032733A1 (en) 2001-05-18 2005-02-10 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (SiNA)
US8273866B2 (en) 2002-02-20 2012-09-25 Merck Sharp & Dohme Corp. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (SINA)
US7491805B2 (en) 2001-05-18 2009-02-17 Sirna Therapeutics, Inc. Conjugates and compositions for cellular delivery
US8202979B2 (en) 2002-02-20 2012-06-19 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid
WO2002081628A2 (en) 2001-04-05 2002-10-17 Ribozyme Pharmaceuticals, Incorporated Modulation of gene expression associated with inflammation proliferation and neurite outgrowth, using nucleic acid based technologies
US7833992B2 (en) 2001-05-18 2010-11-16 Merck Sharpe & Dohme Conjugates and compositions for cellular delivery
US20050182008A1 (en) 2000-02-11 2005-08-18 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of NOGO and NOGO receptor gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
WO2003070918A2 (en) 2002-02-20 2003-08-28 Ribozyme Pharmaceuticals, Incorporated Rna interference by modified short interfering nucleic acid
IT1318539B1 (it) 2000-05-26 2003-08-27 Italfarmaco Spa Composizioni farmaceutiche a rilascio prolungato per lasomministrazione parenterale di sostanze idrofile biologicamente
WO2005003350A2 (en) 2003-06-27 2005-01-13 Sirna Therapeutics, Inc. RNA INTERFERENCE MEDIATED TREATMENT OF ALZHEIMER’S DISEASE USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
US20060247194A1 (en) 2000-08-30 2006-11-02 Sirna Therapeutics , Inc. Rna interference mediated treatment of alzheimer's disease using short interfering nucleic acid (sina)
US20050209179A1 (en) 2000-08-30 2005-09-22 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated treatment of Alzheimer's disease using short interfering nucleic acid (siNA)
KR100909681B1 (ko) 2000-12-01 2009-07-29 막스-플랑크-게젤샤프트 츄어 푀르더룽 데어 비쎈샤프텐 에.파우. Ｒｎａ 간섭을 매개하는 작은 ｒｎａ 분자
GB2375646A (en) 2001-05-16 2002-11-20 Monox Ltd Safety module for fuel-burning appliance, and appliance using such a safety module
US20050136436A1 (en) 2001-05-18 2005-06-23 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of G72 and D-amino acid oxidase (DAAO) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20070042983A1 (en) 2001-05-18 2007-02-22 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
EP1627061B1 (en) 2001-05-18 2009-08-12 Sirna Therapeutics, Inc. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF GENE EXPRESSION USING CHEMICALLY MODIFIED SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
US20070173473A1 (en) 2001-05-18 2007-07-26 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of proprotein convertase subtilisin Kexin 9 (PCSK9) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20050227935A1 (en) 2001-05-18 2005-10-13 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of TNF and TNF receptor gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20050182009A1 (en) 2001-05-18 2005-08-18 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of NF-Kappa B / REL-A gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20050164224A1 (en) 2001-05-18 2005-07-28 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of cyclin D1 gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20050159378A1 (en) 2001-05-18 2005-07-21 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of Myc and/or Myb gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20050176664A1 (en) 2001-05-18 2005-08-11 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of cholinergic muscarinic receptor (CHRM3) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20050070497A1 (en) 2001-05-18 2005-03-31 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibtion of tyrosine phosphatase-1B (PTP-1B) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20050137155A1 (en) 2001-05-18 2005-06-23 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated treatment of Parkinson disease using short interfering nucleic acid (siNA)
US20050153916A1 (en) 2001-05-18 2005-07-14 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of telomerase gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20050119211A1 (en) 2001-05-18 2005-06-02 Sirna Therapeutics, Inc. RNA mediated inhibition connexin gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20060142226A1 (en) 2001-05-18 2006-06-29 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of cholesteryl ester transfer protein (CETP) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20070270579A1 (en) 2001-05-18 2007-11-22 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20050159376A1 (en) 2002-02-20 2005-07-21 Slrna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition 5-alpha reductase and androgen receptor gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20050222066A1 (en) 2001-05-18 2005-10-06 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of vascular endothelial growth factor and vascular endothelial growth factor receptor gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20050176025A1 (en) 2001-05-18 2005-08-11 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of B-cell CLL/Lymphoma-2 (BCL-2) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20060019917A1 (en) 2001-05-18 2006-01-26 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of stromal cell-derived factor-1 (SDF-1) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20050209180A1 (en) 2001-05-18 2005-09-22 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of hepatitis C virus (HCV) expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20050124567A1 (en) 2001-05-18 2005-06-09 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of TRPM7 gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20050176666A1 (en) 2001-05-18 2005-08-11 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of GPRA and AAA1 gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20080249040A1 (en) 2001-05-18 2008-10-09 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of sterol regulatory element binding protein 1 (SREBP1) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20050260620A1 (en) 2001-05-18 2005-11-24 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of retinolblastoma (RBI) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20050267058A1 (en) 2001-05-18 2005-12-01 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of placental growth factor gene expression using short interfering nucleic acid (sINA)
US20050153914A1 (en) 2001-05-18 2005-07-14 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of MDR P-glycoprotein gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20050187174A1 (en) 2001-05-18 2005-08-25 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of intercellular adhesion molecule (ICAM) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20050124566A1 (en) 2001-05-18 2005-06-09 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of myostatin gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20060276422A1 (en) 2001-05-18 2006-12-07 Nassim Usman RNA interference mediated inhibition of B7-H1 gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20050171040A1 (en) 2001-05-18 2005-08-04 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of cholesteryl ester transfer protein (CEPT) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20050239731A1 (en) 2001-05-18 2005-10-27 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of MAP kinase gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20080188430A1 (en) 2001-05-18 2008-08-07 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of hypoxia inducible factor 1 (HIF1) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20050119212A1 (en) 2001-05-18 2005-06-02 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of FAS and FASL gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20060019913A1 (en) 2001-05-18 2006-01-26 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibtion of protein tyrosine phosphatase-1B (PTP-1B) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20050282188A1 (en) 2001-05-18 2005-12-22 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20060142225A1 (en) 2001-05-18 2006-06-29 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of cyclin dependent kinase-2 (CDK2) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20050164967A1 (en) 2001-05-18 2005-07-28 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of platelet-derived endothelial cell growth factor (ECGF1) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20050227936A1 (en) 2001-05-18 2005-10-13 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of TGF-beta and TGF-beta receptor gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US9994853B2 (en) 2001-05-18 2018-06-12 Sirna Therapeutics, Inc. Chemically modified multifunctional short interfering nucleic acid molecules that mediate RNA interference
WO2005014811A2 (en) 2003-08-08 2005-02-17 Sirna Therapeutics, Inc. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF XIAP GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
US20070049543A1 (en) 2001-05-18 2007-03-01 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of 11 beta-hydroxysteroid dehydrogenase-1 (11 beta-HSD-1) gene expression using short interfering nucleic acid siNA
US20050148530A1 (en) 2002-02-20 2005-07-07 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of vascular endothelial growth factor and vascular endothelial growth factor receptor gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20050287128A1 (en) 2001-05-18 2005-12-29 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of TGF-beta and TGF-beta receptor gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20050159380A1 (en) 2001-05-18 2005-07-21 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of angiopoietin gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20050203040A1 (en) 2001-05-18 2005-09-15 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of vascular cell adhesion molecule (VCAM) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20050124569A1 (en) 2001-05-18 2005-06-09 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of CXCR4 gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20050176665A1 (en) 2001-05-18 2005-08-11 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of hairless (HR) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20050182007A1 (en) 2001-05-18 2005-08-18 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of interleukin and interleukin receptor gene expression using short interfering nucleic acid (SINA)
US20050191618A1 (en) 2001-05-18 2005-09-01 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of human immunodeficiency virus (HIV) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20050079610A1 (en) 2001-05-18 2005-04-14 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of Fos gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20050164966A1 (en) 2001-05-18 2005-07-28 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of type 1 insulin-like growth factor receptor gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20070093437A1 (en) 2001-05-18 2007-04-26 Sirna Therapeutics, Inc. Rna interference mediated inhibition of xiap gene expression using short interfering nucleic acid (sina)
US20060287267A1 (en) 2001-05-18 2006-12-21 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of respiratory syncytial virus (RSV) expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20050130181A1 (en) 2001-05-18 2005-06-16 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of wingless gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20050159382A1 (en) 2001-05-18 2005-07-21 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of polycomb group protein EZH2 gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20050256068A1 (en) 2001-05-18 2005-11-17 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of stearoyl-CoA desaturase (SCD) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20050233997A1 (en) 2001-05-18 2005-10-20 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of matrix metalloproteinase 13 (MMP13) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20060241075A1 (en) 2001-05-18 2006-10-26 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of desmoglein gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20070179104A1 (en) 2001-05-18 2007-08-02 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of winged helix nude (WHN) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20050159381A1 (en) 2001-05-18 2005-07-21 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of chromosome translocation gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20050196781A1 (en) 2001-05-18 2005-09-08 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of STAT3 gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20050261219A1 (en) 2001-05-18 2005-11-24 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of interleukin and interleukin receptor gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20070032441A1 (en) 2001-05-18 2007-02-08 Sirna Therapeutics, Inc. Rna interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (sina)
US20050233344A1 (en) 2001-05-18 2005-10-20 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of platelet derived growth factor (PDGF) and platelet derived growth factor receptor (PDGFR) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20050196765A1 (en) 2001-05-18 2005-09-08 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of checkpoint Kinase-1 (CHK-1) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20050277133A1 (en) 2001-05-18 2005-12-15 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated treatment of polyglutamine (polyQ) repeat expansion diseases using short interfering nucleic acid (siNA)
US20030170891A1 (en) 2001-06-06 2003-09-11 Mcswiggen James A. RNA interference mediated inhibition of epidermal growth factor receptor gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20090299045A1 (en) 2001-05-18 2009-12-03 Sirna Therapeutics, Inc. RNA Interference Mediated Inhibition Of Interleukin and Interleukin Gene Expression Using Short Interfering Nucleic Acid (siNA)
US20080161256A1 (en) 2001-05-18 2008-07-03 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20050233996A1 (en) 2002-02-20 2005-10-20 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of hairless (HR) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20050124568A1 (en) 2001-05-18 2005-06-09 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of acetyl-CoA-carboxylase gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20050164968A1 (en) 2001-05-18 2005-07-28 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of ADAM33 gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20050158735A1 (en) 2001-05-18 2005-07-21 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of proliferating cell nuclear antigen (PCNA) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20060148743A1 (en) 2001-05-18 2006-07-06 Vasant Jadhav RNA interference mediated inhibition of histone deacetylase (HDAC) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20050182006A1 (en) 2001-05-18 2005-08-18 Sirna Therapeutics, Inc RNA interference mediated inhibition of protein kinase C alpha (PKC-alpha) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20050176024A1 (en) 2001-05-18 2005-08-11 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of epidermal growth factor receptor (EGFR) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20050196767A1 (en) 2001-05-18 2005-09-08 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of GRB2 associated binding protein (GAB2) gene expression using short interfering nucleic acis (siNA)
US20050143333A1 (en) 2001-05-18 2005-06-30 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of interleukin and interleukin receptor gene expression using short interfering nucleic acid (SINA)
US20050159379A1 (en) 2001-05-18 2005-07-21 Sirna Therapeutics, Inc RNA interference mediated inhibition of gastric inhibitory polypeptide (GIP) and gastric inhibitory polypeptide receptor (GIPR) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20050176663A1 (en) 2001-05-18 2005-08-11 Sima Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of protein tyrosine phosphatase type IVA (PRL3) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20050288242A1 (en) 2001-05-18 2005-12-29 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of RAS gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20060211642A1 (en) 2001-05-18 2006-09-21 Sirna Therapeutics, Inc. RNA inteference mediated inhibition of hepatitis C virus (HVC) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US7517864B2 (en) 2001-05-18 2009-04-14 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of vascular endothelial growth factor and vascular endothelial growth factor receptor gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20060217331A1 (en) 2001-05-18 2006-09-28 Sirna Therapeutics, Inc. Chemically modified double stranded nucleic acid molecules that mediate RNA interference
US20050170371A1 (en) 2001-05-18 2005-08-04 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of 5-alpha reductase and androgen receptor gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
WO2005007855A2 (en) 2003-07-14 2005-01-27 Sirna Therapeutics, Inc. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF B7-H1 GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
US20050277608A1 (en) 2001-05-18 2005-12-15 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibtion of vitamin D receptor gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US8008472B2 (en) 2001-05-29 2011-08-30 Merck Sharp & Dohme Corp. RNA interference mediated inhibition of human immunodeficiency virus (HIV) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US7063860B2 (en) 2001-08-13 2006-06-20 University Of Pittsburgh Application of lipid vehicles and use for drug delivery
EP1298125A1 (en) 2001-09-26 2003-04-02 Aventis Pharma S.A. Substituted benzimidazole compounds and their use for the treatment of cancer
US7667029B2 (en) 2002-02-20 2010-02-23 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of checkpoint kinase-1 (CHK-1) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US7893248B2 (en) 2002-02-20 2011-02-22 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of Myc and/or Myb gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US7700760B2 (en) 2002-02-20 2010-04-20 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of vascular cell adhesion molecule (VCAM) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US7667030B2 (en) 2002-02-20 2010-02-23 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of matrix metalloproteinase 13 (MMP13) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20090099117A1 (en) 2002-02-20 2009-04-16 Sirna Therapeutics, Inc. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF MYOSTATIN GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
US20090137507A1 (en) 2002-02-20 2009-05-28 Sirna Therapeutics, Inc. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF ANGIOPOIETIN GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
US8258288B2 (en) 2002-02-20 2012-09-04 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of respiratory syncytial virus (RSV) expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20050137153A1 (en) 2002-02-20 2005-06-23 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of alpha-1 antitrypsin (AAT) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US7691999B2 (en) 2002-02-20 2010-04-06 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of NOGO and NOGO receptor gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US8067575B2 (en) 2002-02-20 2011-11-29 Merck, Sharp & Dohme Corp. RNA interference mediated inhibition of cyclin D1 gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20090192105A1 (en) 2002-02-20 2009-07-30 Sirna Therapeutics, Inc. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF INTERCELLULAR ADHESION MOLECULE (ICAM) GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCELIC ACID (siNA)
US8013143B2 (en) 2002-02-20 2011-09-06 Merck Sharp & Dohme Corp. RNA interference mediated inhibition of CXCR4 gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US7928220B2 (en) 2002-02-20 2011-04-19 Merck Sharp & Dohme Corp. RNA interference mediated inhibition of stromal cell-derived factor-1 (SDF-1) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US7897753B2 (en) 2002-02-20 2011-03-01 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of XIAP gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20090093439A1 (en) 2002-02-20 2009-04-09 Sirna Therapeutics, Inc. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF CHROMOSOME TRANSLOCATION GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
US7897757B2 (en) 2002-02-20 2011-03-01 Merck Sharp & Dohme Corp. RNA interference mediated inhibition of protein tyrosine phosphatase-1B (PTP-1B) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20090137513A1 (en) 2002-02-20 2009-05-28 Sirna Therapeutics, Inc. RNA Interference Mediated Inhibition of Acetyl-CoA-Carboxylase Gene Expression Using Short Interfering Nucleic Acid (siNA)
US20100240730A1 (en) 2002-02-20 2010-09-23 Merck Sharp And Dohme Corp. RNA Interference Mediated Inhibition of Gene Expression Using Chemically Modified Short Interfering Nucleic Acid (siNA)
US7928218B2 (en) 2002-02-20 2011-04-19 Merck Sharp & Dohme Corp. RNA interference mediated inhibition of polycomb group protein EZH2 gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20090253773A1 (en) 2002-02-20 2009-10-08 Sirna Therapeutics, Inc. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF TNF AND TNF RECEPTOR GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
US7662952B2 (en) 2002-02-20 2010-02-16 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of GRB2 associated binding protein (GAB2) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20090137510A1 (en) 2002-02-20 2009-05-28 Sirna Therapeutics, Inc. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF NF-KAPPA B/ REL-A GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
US7683165B2 (en) 2002-02-20 2010-03-23 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of interleukin and interleukin receptor gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US7683166B2 (en) 2002-02-20 2010-03-23 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of interleukin and interleukin receptor gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20090253774A1 (en) 2002-02-20 2009-10-08 Sirna Therapeutics, Inc. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF PLATELET DERIVED GROWTH FACTOR (PDGF) AND PLATELET DERIVED GROWTH FACTOR RECEPTOR (PDGFR) GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
US7935812B2 (en) 2002-02-20 2011-05-03 Merck Sharp & Dohme Corp. RNA interference mediated inhibition of hepatitis C virus (HCV) expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20090306182A1 (en) 2002-02-20 2009-12-10 Sirna Therapeutics, Inc. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF MAP KINASE GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
US20090137509A1 (en) 2002-02-20 2009-05-28 Sirna Therapeutics, Inc. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF PROLIFERATION CELL NUCLEAR ANTIGEN (PCNA) GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
US7928219B2 (en) 2002-02-20 2011-04-19 Merck Sharp & Dohme Corp. RNA interference mediated inhibition of placental growth factor gene expression using short interfering nucleic acid (SINA)
US20050222064A1 (en) 2002-02-20 2005-10-06 Sirna Therapeutics, Inc. Polycationic compositions for cellular delivery of polynucleotides
US7910724B2 (en) 2002-02-20 2011-03-22 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of Fos gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US7678897B2 (en) 2002-02-20 2010-03-16 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of platelet-derived endothelial cell growth factor (ECGF1) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US7897752B2 (en) 2002-02-20 2011-03-01 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of telomerase gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20040009216A1 (en) 2002-04-05 2004-01-15 Rodrigueza Wendi V. Compositions and methods for dosing liposomes of certain sizes to treat or prevent disease
ES2550609T3 (es) 2002-07-10 2015-11-11 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Interferencia de ARN mediante de moléculas de ARN de cadena sencilla
US6649638B1 (en) 2002-08-14 2003-11-18 Ppd Discovery, Inc. Prenylation inhibitors and methods of their synthesis and use
US7923547B2 (en) 2002-09-05 2011-04-12 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (siNA)
FR2844591B1 (fr) 2002-09-13 2005-04-15 Arvinmeritor Light Vehicle Sys Dispositif de determination du deplacement d'un arbre
US9771586B2 (en) 2002-11-14 2017-09-26 Thermo Fisher Scientific Inc. RNAi targeting ZNF205
US10011836B2 (en) 2002-11-14 2018-07-03 Thermo Fisher Scientific Inc. Methods and compositions for selecting siRNA of improved functionality
US7977471B2 (en) 2002-11-14 2011-07-12 Dharmacon, Inc. siRNA targeting TNFα
US20090023908A1 (en) 2002-11-14 2009-01-22 Dharmacon, Inc. siRNA targeting ribosomal protein S2 (RPS2)
US8937172B2 (en) 2002-11-14 2015-01-20 Thermo Fisher Scientific Inc. siRNA targeting catenin, beta-1 (CTNNB1)
US20090043084A1 (en) 2002-11-14 2009-02-12 Dharmacon, Inc. siRNA targeting minichromosome maintenance deficient 3 (MCM3)
US7635770B2 (en) 2002-11-14 2009-12-22 Dharmacon, Inc. siRNA targeting protein kinase N-3 (PKN-3)
US9839649B2 (en) 2002-11-14 2017-12-12 Thermo Fisher Scientific Inc. Methods and compositions for selecting siRNA of improved functionality
US7619081B2 (en) 2002-11-14 2009-11-17 Dharmacon, Inc. siRNA targeting coatomer protein complex, subunit beta 2 (COPB2)
WO2006006948A2 (en) 2002-11-14 2006-01-19 Dharmacon, Inc. METHODS AND COMPOSITIONS FOR SELECTING siRNA OF IMPROVED FUNCTIONALITY
US20080221316A1 (en) 2002-11-14 2008-09-11 Dharmacon, Inc. siRNA targeting ethanolamine Kinase I1 (EKI1)
US7951935B2 (en) 2002-11-14 2011-05-31 Dharmacon, Inc. siRNA targeting v-myc myelocytomatosis viral oncogene homolog (MYC)
US7781575B2 (en) 2002-11-14 2010-08-24 Dharmacon, Inc. siRNA targeting tumor protein 53 (p53)
US9879266B2 (en) 2002-11-14 2018-01-30 Thermo Fisher Scientific Inc. Methods and compositions for selecting siRNA of improved functionality
US20080207884A1 (en) 2002-11-14 2008-08-28 Dharmacon, Inc. siRNA targeting 5-aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleotide formyltransferase/IMP cyclohydrolase (ATIC)
US20090005547A1 (en) 2002-11-14 2009-01-01 Dharmacon, Inc. siRNa targeting neuropilin 1 (NRP1)
US20080161547A1 (en) 2002-11-14 2008-07-03 Dharmacon, Inc. siRNA targeting serine/threonine protein kinase AKT
US9228186B2 (en) 2002-11-14 2016-01-05 Thermo Fisher Scientific Inc. Methods and compositions for selecting siRNA of improved functionality
US8198427B1 (en) 2002-11-14 2012-06-12 Dharmacon, Inc. SiRNA targeting catenin, beta-1 (CTNNB1)
US20100113307A1 (en) 2002-11-14 2010-05-06 Dharmacon, Inc. siRNA targeting vascular endothelial growth factor (VEGF)
US20090023907A1 (en) 2002-11-14 2009-01-22 Dharmacon, Inc. siRNA targeting kinesin spindle protein (KSP)
US7582747B2 (en) 2002-11-14 2009-09-01 Dharmacon, Inc. siRNA targeting inner centromere protein antigens (INCENP)
US9719094B2 (en) 2002-11-14 2017-08-01 Thermo Fisher Scientific Inc. RNAi targeting SEC61G
US20090227780A1 (en) 2002-11-14 2009-09-10 Dharmacon, Inc. siRNA targeting connexin 43
US7691998B2 (en) 2002-11-14 2010-04-06 Dharmacon, Inc. siRNA targeting nucleoporin 62kDa (Nup62)
US20090182134A1 (en) 2002-11-14 2009-07-16 Dharmacon, Inc. siRNA targeting phosphatases
US20080268457A1 (en) 2002-11-14 2008-10-30 Dharmacon, Inc. siRNA targeting forkhead box P3 (FOXP3)
US9719092B2 (en) 2002-11-14 2017-08-01 Thermo Fisher Scientific Inc. RNAi targeting CNTD2
US7612196B2 (en) 2002-11-14 2009-11-03 Dharmacon, Inc. siRNA targeting cyclin-dependent kinase inhibitor 1B (p27, Kip1) (CDKN1B)
US20090005548A1 (en) 2002-11-14 2009-01-01 Dharmacon, Inc. siRNA targeting nuclear receptor interacting protein 1 (NRIP1)
EP2213738B1 (en) 2002-11-14 2012-10-10 Dharmacon, Inc. siRNA molecules targeting Bcl-2
US7592442B2 (en) 2002-11-14 2009-09-22 Dharmacon, Inc. siRNA targeting ribonucleotide reductase M2 polypeptide (RRM2 or RNR-R2)
US20090030190A1 (en) 2002-11-14 2009-01-29 Dharmacon, Inc. siRNA targeting 1-acylglycerol-3-phosphate O-acyltransferase 2 (AGPAT2)
DE10302421A1 (de) 2003-01-21 2004-07-29 Ribopharma Ag Doppelsträngige Ribonukleinsäure mit verbesserter Wirksamkeit
EP2239329A1 (en) 2003-03-07 2010-10-13 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Therapeutic compositions
AU2004227414A1 (en) 2003-04-03 2004-10-21 Alnylam Pharmaceuticals iRNA conjugates
EP1471152A1 (en) 2003-04-25 2004-10-27 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Mutations in the human PCSK9 gene associated to hypercholesterolemia
WO2004110167A2 (en) 2003-06-09 2004-12-23 Magiccom, Inc. Edible novelty products
US7786290B2 (en) 2003-06-13 2010-08-31 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Double-stranded ribonucleic acid with increased effectiveness in an organism
KR100500579B1 (ko) 2003-06-28 2005-07-12 한국과학기술원 씨모스 게이트 산화물 안티퓨즈를 이용한 3-트랜지스터한번 프로그램 가능한 롬
ITRM20030329A1 (it) 2003-07-07 2005-01-08 Micron Technology Inc Cella "famos" senza precarica e circuito latch in un
WO2005007854A2 (en) 2003-07-09 2005-01-27 Sirna Therapeutics, Inc. Polycationic compositions for cellular delivery of polynucleotides
WO2005007859A2 (en) 2003-07-11 2005-01-27 Sirna Therapeutics, Inc. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF ACETYL-COA CARBOXYLASE GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
KR100546342B1 (ko) 2003-07-12 2006-01-26 삼성전자주식회사 반복적으로 배치되는 프리-디코딩된 신호선들의레이아웃을 개선시키는 로우 디코더 구조, 이를 구비한반도체 메모리 장치, 및 그 방법
US20050064595A1 (en) 2003-07-16 2005-03-24 Protiva Biotherapeutics, Inc. Lipid encapsulated interfering RNA
US6919690B2 (en) 2003-07-22 2005-07-19 Veeco Instruments, Inc. Modular uniform gas distribution system in an ion source
US6854364B1 (en) 2003-08-04 2005-02-15 James Tassano Screw hook socket
US20050028649A1 (en) 2003-08-06 2005-02-10 Dan Settanni Box wrench with hinged socket
CA2437525C (en) 2003-08-15 2007-01-09 Mvp (H.K.) Industries Limited Jacks having a detachable rear-end handle
WO2005035759A2 (en) 2003-08-20 2005-04-21 Sirna Therapeutics, Inc. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF HYPOXIA INDUCIBLE FACTOR 1 (HIF1) GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
US6989051B2 (en) 2003-08-25 2006-01-24 Delphi Technologies, Inc. Portable air filtration system
US7008469B2 (en) 2003-08-25 2006-03-07 Delphi Technologies, Inc. Portable air filtration system utilizing a conductive coating and a filter for use therein
US6890372B2 (en) 2003-08-27 2005-05-10 Dionex Corporation Denuder assembly for collection and removal of soluble atmospheric gases
US20050045041A1 (en) 2003-08-29 2005-03-03 Hechinger Glenn R. Removable cartridge for swing-type adsorption system
US20050044981A1 (en) 2003-08-29 2005-03-03 Yuan-Hsin Huang Clipping cover for the assembling of a bicycle handle accessories
US7022165B2 (en) 2003-08-29 2006-04-04 The Regents Of The University Of California Tubular hydrogen permeable metal foil membrane and method of fabrication
US7132011B2 (en) 2003-09-02 2006-11-07 Entegris, Inc. Reactive gas filter
ATE517673T1 (de) 2003-09-02 2011-08-15 Airsep Corp Schallgehäuse für tragbare sauerstoffkonzentratoren
US20050045038A1 (en) 2003-09-03 2005-03-03 Ping Huang Frame structure of an electrostatic precipitator
US8079374B2 (en) 2003-09-15 2011-12-20 Ranir, Llc Dental flosser with bendable head
JP2007505606A (ja) 2003-09-16 2007-03-15 サーナ・セラピューティクス・インコーポレイテッド 低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）を使用したＣ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）発現のＲＮＡ干渉媒介性抑制
WO2005045032A2 (en) 2003-10-20 2005-05-19 Sima Therapeutics, Inc. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF EARLY GROWTH RESPONSE GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
WO2005045038A2 (en) 2003-10-23 2005-05-19 Sirna Therapeutics, Inc. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF GPRA AND AAA1 GENE EXPRESSION USING SHORT NUCLEIC ACID (siNA)
WO2005045039A2 (en) 2003-10-23 2005-05-19 Sirna Therapeutics, Inc. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF INTERCELLULAR ADHESION MOLECULE (ICAM) GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
US20070185043A1 (en) 2003-10-23 2007-08-09 Sima Therapeutics, Inc. Rna interference mediated inhibition of nogo and nogo receptor gene expression using short interfering nucleic acid (sina)
WO2005045035A2 (en) 2003-10-23 2005-05-19 Sirna Therapeutics, Inc. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF NOGO AND NOGO RECEPTOR GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
WO2005045037A2 (en) 2003-10-23 2005-05-19 Sirna Therapeutics, Inc. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF 5-ALPHA REDUCTASE AND ANDROGEN RECEPTOR GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
WO2005045034A2 (en) 2003-10-23 2005-05-19 Sirna Therapeutics, Inc. RNA INTERFERENCE MEDIATED TREATMENT OF PARKINSON DISEASE USING SHORT INTERERING NUCLEIC ACID (siNA)
US20050105995A1 (en) 2003-11-13 2005-05-19 Vantage Mobility International, Llc Internal lift for light duty motor vehicle
US20100145038A1 (en) 2003-11-24 2010-06-10 Merck & Co., Inc. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
ATE452188T1 (de) 2004-02-10 2010-01-15 Sirna Therapeutics Inc Rna-interferenz-vermittelte hemmung der genexpression unter verwendung multifunktioneller sina (short interfering nucleic acid)
EP1778298A4 (en) 2004-04-01 2010-03-31 Univ Pennsylvania LIPOPROTEIN-NANO PLATFORMS
WO2005105995A2 (en) 2004-04-14 2005-11-10 Sirna Therapeutics, Inc. RNA INTERFERENCE MEDIATED TREATMENT OF POLYGLUTAMINE (POLYQ) REPEAT EXPANSION DISEASES USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
JP4796062B2 (ja) 2004-06-07 2011-10-19 プロチバ バイオセラピューティクス インコーポレイティッド 脂質封入干渉ｒｎａ
CA2569645C (en) 2004-06-07 2014-10-28 Protiva Biotherapeutics, Inc. Cationic lipids and methods of use
WO2006017447A1 (en) 2004-08-02 2006-02-16 University Of Iowa Research Foundation Methods of inhibiting vegf-c
US20110313024A1 (en) 2004-08-20 2011-12-22 Leonid Beigelman RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF PROPROTEIN CONVERTASE SUBTILISIN KEXIN 9 (PCSK9) GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
CA2597724A1 (en) 2005-02-14 2007-08-02 Sirna Therapeutics, Inc. Cationic lipids and formulated molecular compositions containing them
CA2603730A1 (en) 2005-03-31 2006-10-05 Calando Pharmaceuticals, Inc. Inhibitors of ribonucleotide reductase subunit 2 and uses thereof
US7915230B2 (en) 2005-05-17 2011-03-29 Molecular Transfer, Inc. Reagents for transfection of eukaryotic cells
WO2007012191A1 (en) 2005-07-27 2007-02-01 Protiva Biotherapeutics, Inc. Systems and methods for manufacturing liposomes
KR20080048505A (ko) 2005-08-31 2008-06-02 센토코 인코포레이티드 증진된 작용자 기능을 지닌 항체 불변 영역을 생산하기위한 숙주 세포주
US8101741B2 (en) 2005-11-02 2012-01-24 Protiva Biotherapeutics, Inc. Modified siRNA molecules and uses thereof
US20070218122A1 (en) 2005-11-18 2007-09-20 Protiva Biotherapeutics, Inc. siRNA silencing of influenza virus gene expression
BRPI0620641A2 (pt) 2005-12-22 2011-11-16 Schering Corp usos de compostos antagonistas de receptor de trombina na profilaxia de complicações de cirurgia cardiopulmonar
US20100148013A1 (en) 2005-12-23 2010-06-17 General Electric Company System and method for optical locomotive decoupling detection
WO2007091269A2 (en) 2006-02-08 2007-08-16 Quark Pharmaceuticals, Inc. NOVEL TANDEM siRNAS
KR101362681B1 (ko) 2006-03-31 2014-02-13 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 Ｅｇ5 유전자의 발현을 억제하는 조성물 및 억제 방법
EP2021008B1 (en) 2006-04-07 2015-12-02 Idera Pharmaceuticals, Inc. Stabilized immune modulatory rna (simra) compounds for tlr7 and tlr8
CN103614375A (zh) * 2006-05-11 2014-03-05 阿尔尼拉姆医药品有限公司 抑制pcsk9基因表达的组合物和方法
US8598333B2 (en) 2006-05-26 2013-12-03 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. SiRNA silencing of genes expressed in cancer
WO2008011431A2 (en) 2006-07-17 2008-01-24 Sirna Therapeutics Inc. Rna interference mediated inhibition of proprotein convertase subtilisin kexin 9 (pcsk9) gene expression using short interfering nucleic acid (sina)
WO2008042973A2 (en) 2006-10-03 2008-04-10 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Lipid containing formulations
EP2410053B2 (en) * 2006-10-18 2020-07-15 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Antisense compounds
DK2094086T3 (da) 2006-11-08 2013-11-25 Veritas Bio LLC Indgivelse in vivo af dobbeltstrenget rna til en målcelle
US8093222B2 (en) 2006-11-27 2012-01-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating hypercholesterolemia
KR20090103894A (ko) 2006-11-27 2009-10-01 아이시스 파마수티컬즈 인코포레이티드 고콜레스테롤혈증을 치료하는 방법
WO2008109369A2 (en) 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting tnf gene expression and uses thereof
CN101795715A (zh) 2007-07-09 2010-08-04 艾德拉药物股份有限公司 稳定化免疫调控性rna(simra)化合物
ES2339201B1 (es) 2007-07-27 2011-03-14 Airbus España, S.L. Componentes estructurales de material compuesto con añadido superficial metalico para aumentar su conductividad electrica.
JOP20080381B1 (ar) 2007-08-23 2023-03-28 Amgen Inc بروتينات مرتبطة بمولدات مضادات تتفاعل مع بروبروتين كونفيرتاز سيتيليزين ككسين من النوع 9 (pcsk9)
WO2009082607A2 (en) 2007-12-04 2009-07-02 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Targeting lipids
US9006191B2 (en) 2007-12-27 2015-04-14 Protiva Biotherapeutics, Inc. Silencing of polo-like kinase expression using interfering RNA
CA2709875C (en) 2008-01-02 2019-07-16 Tekmira Pharmaceuticals Corporation Improved compositions and methods for the delivery of nucleic acids
CN101493631B (zh) 2008-01-24 2012-01-25 鸿富锦精密工业（深圳）有限公司 机械快门及使用该机械快门的相机模组
EP2245039A4 (en) 2008-01-31 2012-06-06 Alnylam Pharmaceuticals Inc OPTIMIZED METHODS FOR EXPORING DSRNA TO TARGET THE PCSK9 GEN
JP2011518117A (ja) 2008-03-05 2011-06-23 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド Ｅｇ５およびＶＥＧＦ遺伝子の発現を阻害するための組成物および方法
WO2009114475A2 (en) 2008-03-09 2009-09-17 Intradigm Corporation Compositions comprising human pcsk9 and apolipoprotein b sirna and methods of use
CA2721333C (en) 2008-04-15 2020-12-01 Protiva Biotherapeutics, Inc. Novel lipid formulations for nucleic acid delivery
WO2010048228A2 (en) 2008-10-20 2010-04-29 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of transthyretin
WO2010054406A1 (en) 2008-11-10 2010-05-14 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Novel lipids and compositions for the delivery of therapeutics
NZ593618A (en) 2008-12-10 2013-02-22 Alnylam Pharmaceuticals Inc Gnaq targeted dsrna compositions and methods for inhibiting expression
WO2010088537A2 (en) 2009-01-29 2010-08-05 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Improved lipid formulation
NZ711583A (en) 2009-05-05 2017-03-31 Arbutus Biopharma Corp Lipid compositions
CA2764158A1 (en) 2009-06-01 2010-12-09 Halo-Bio Rnai Therapeutics, Inc. Polynucleotides for multivalent rna interference, compositions and methods of use thereof
KR102066189B1 (ko) 2009-06-10 2020-01-14 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 향상된 지질 조성물
WO2010147992A1 (en) 2009-06-15 2010-12-23 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Methods for increasing efficacy of lipid formulated sirna
EA201270019A1 (ru) 2009-06-15 2012-06-29 Элнилэм Фармасьютикалз, Инк. Двуцепочечная рнк, включенная в липидный состав и мишенью которой является ген pcsk9
EP2456870A1 (en) 2009-07-21 2012-05-30 Santaris Pharma A/S Antisense oligomers targeting pcsk9
EP2470656B1 (en) 2009-08-27 2015-05-06 Idera Pharmaceuticals, Inc. Composition for inhibiting gene expression and uses thereof
US8721620B2 (en) 2009-12-24 2014-05-13 Rani Therapeutics, Llc Swallowable drug delivery device and methods of drug delivery
US8529306B2 (en) 2010-09-07 2013-09-10 Aaron Leland Baldwin Device for pedal powering a watercraft
US20130289094A1 (en) 2010-10-29 2013-10-31 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and Methods for Inhibition of PCSK9 Genes
US20130074974A1 (en) 2011-09-26 2013-03-28 Phillip W. Murchie Ductwork stiffener
FI3366775T4 (fi) 2011-11-18 2025-11-14 Alnylam Pharmaceuticals Inc Modifioituja rnai-agensseja
AU2012340159B2 (en) 2011-11-18 2017-09-07 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. RNAi agents, compositions and methods of use thereof for treating transthyretin (TTR) associated diseases
EP3336187A1 (en) * 2012-12-05 2018-06-20 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Pcsk9 irna compositions and methods of use thereof
US9513606B1 (en) 2013-04-05 2016-12-06 The Boeing Company Safety systems and methods for production environments
EP3071198A1 (en) 2013-11-20 2016-09-28 Cymabay Therapeutics, Inc. Treatment of homozygous familial hypercholesterolemia
EP3318015B1 (en) 2015-06-30 2019-10-30 British Telecommunications public limited company Energy management in a network
KR102403371B1 (ko) 2015-08-03 2022-05-30 삼성전자주식회사 생체 상태를 판단하는 방법 및 장치
KR102793532B1 (ko) 2015-08-25 2025-04-14 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 전구단백질 컨버타제 서브틸리신 켁신 (pcsk9) 유전자-관련 장애를 치료하기 위한 방법 및 조성물
CA3042423A1 (en) 2016-10-18 2018-04-26 The Medicines Company Methods for preventing cardiovascular events through proprotein convertase subtilisin kexin 9 (pcsk9) protein reduction
US10799808B2 (en) 2018-09-13 2020-10-13 Nina Davis Interactive storytelling kit
CN111845757A (zh) 2019-04-30 2020-10-30 通用汽车环球科技运作有限责任公司 分心驾驶消除系统
CN110649043B (zh) 2019-09-30 2021-11-19 厦门天马微电子有限公司 阵列基板、显示面板、显示装置及阵列基板的制备方法
KR102318555B1 (ko) 2020-03-19 2021-10-29 한국과학기술연구원 광소자용 역나노콘과 그 제조방법

Also Published As

Publication number Publication date
IL238917B (en) 2022-05-01
BR112015013105B1 (pt) 2022-02-08
NZ709013A (en) 2020-01-31
AU2013355237A1 (en) 2015-07-02
EP3336187A1 (en) 2018-06-20
NZ749002A (en) 2020-10-30
JP2021097680A (ja) 2021-07-01
KR20150091097A (ko) 2015-08-07
PT2929031T (pt) 2018-01-19
JP2016506240A (ja) 2016-03-03
JP2025128073A (ja) 2025-09-02
CY2021017I2 (el) 2021-10-15
EP4083209A1 (en) 2022-11-02
WO2014089313A1 (en) 2014-06-12
HRP20180126T2 (hr) 2021-08-20
LTC2929031I2 (sr) 2022-10-10
CN104854242B (zh) 2018-03-16
JP2023103244A (ja) 2023-07-26
US10125369B2 (en) 2018-11-13
AU2013355237B2 (en) 2019-11-28
ES2657608T3 (es) 2018-03-06
KR102096014B9 (ko) 2020-04-03
KR20200035490A (ko) 2020-04-03
HUS2100021I1 (hu) 2021-06-28
AR093835A1 (es) 2015-06-24
IL292159A (en) 2022-06-01
HRP20180126T1 (hr) 2018-02-23
US12460206B2 (en) 2025-11-04
LTPA2021510I1 (sr) 2021-06-25
MX2015007035A (es) 2015-09-25
ZA201503829B (en) 2020-05-27
PL2929031T4 (pl) 2022-06-27
PL2929031T3 (pl) 2018-04-30
KR102096014B1 (ko) 2020-04-03
CN108220295B (zh) 2022-09-02
JP7670747B2 (ja) 2025-04-30
AU2020201441A1 (en) 2020-03-19
CY1120195T1 (el) 2018-12-12
FR21C1021I1 (sr) 2021-07-16
NL301107I2 (nl) 2021-06-24
RS56783B9 (sr) 2021-12-31
DK2929031T3 (da) 2018-01-29
SMT201800039T1 (it) 2018-03-08
JP7239335B2 (ja) 2023-03-14
MX2019009283A (es) 2019-12-11
MX367076B (es) 2019-08-05
AU2025202694A1 (en) 2025-05-08
CN108220295A (zh) 2018-06-29
HUE035887T2 (en) 2018-05-28
HK1256621A1 (en) 2019-09-27
US20160017335A1 (en) 2016-01-21
NL301107I1 (nl) 2021-06-09
US20230002772A1 (en) 2023-01-05
LT2929031T (lt) 2018-02-12
FR21C1021I2 (fr) 2022-04-22
JP2019103501A (ja) 2019-06-27
AU2022224712A1 (en) 2022-11-10
NO2021024I1 (no) 2021-06-04
CA2892160C (en) 2021-03-23
EP2929031A1 (en) 2015-10-14
BR112015013105A2 (pt) 2017-09-12
EP2929031B9 (en) 2020-08-12
DK2929031T5 (da) 2021-08-23
LUC00209I2 (sr) 2022-10-07
SI2929031T1 (en) 2018-02-28
CY2021017I1 (el) 2021-10-15
IL238917A0 (en) 2015-07-30
CA2892160A1 (en) 2014-06-12
AU2013355237C1 (en) 2022-09-22
HK1213598A1 (en) 2016-07-08
EP2929031B1 (en) 2017-10-25
CN104854242A (zh) 2015-08-19
JP6574383B2 (ja) 2019-09-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US12460206B2 (en) PCSK9 iRNA compositions and methods of use thereof
JP7641997B2 (ja) アンジオポエチン様３（ＡＮＧＰＴＬ３）ｉＲＮＡ組成物及びその使用方法
US11408001B1 (en) Apolipoprotein C3 (APOC3) iRNA compositions and methods of use thereof
JP2024105396A (ja) １７β－水酸化ステロイド脱水素酵素１３型（ＨＳＤ１７Ｂ１３）ｉＲＮＡ組成物およびその使用方法
US20160354404A1 (en) Compositions and Methods for Inhibition of PCSK9 Genes
RS57418B1 (sr) Serpina1 irnk sastavi i postupci njihove primene
RS62854B1 (sr) Kompozicije i postupci za inhibiciju ekspresije gena hao1 (oksidaza 1 hidroksilne kiseline (glikolat oksidaza))
WO2011038031A1 (en) Dual targeting sirna agents
HK40082689A (en) Pcsk9 irna compositions and methods of use thereof
HK1213598B (en) Pcsk9 irna compositions and methods of use thereof
EA037110B1 (ru) КОМПОЗИЦИИ С иРНК К PCSK9 И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
EA046901B1 (ru) КОМПОЗИЦИИ С иРНК К PCSK9 И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ