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ES2657608T3 - Composiciones de arni de pcsk9 y métodos de uso de las mismas - Google Patents

Composiciones de arni de pcsk9 y métodos de uso de las mismas Download PDF

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ES2657608T3
ES2657608T3 ES13811327.9T ES13811327T ES2657608T3 ES 2657608 T3 ES2657608 T3 ES 2657608T3 ES 13811327 T ES13811327 T ES 13811327T ES 2657608 T3 ES2657608 T3 ES 2657608T3
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nucleotides
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nucleotide
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Anna Borodovsky
Rajeev G. KALLANTHOTTATHIL
Kevin Fitzgerald
Maria Frank-Kamenetsky
William Querbes
Martin Maier
Klaus CHARISSE
Satyanarayana Kuchimanchi
Muthiah Manoharan
Stuart Milstein
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Alnylam Pharmaceuticals Inc
Original Assignee
Alnylam Pharmaceuticals Inc
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Publication date
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Abstract

Un agente de iARN bicatenario que puede inhibir la expresión de proproteína convertasa subtilisina kexina 9 (PCSK9) en una célula, en el que dicho agente de iARN bicatenario comprende: (a) una hebra codificante complementaria a una hebra no codificante, en el que dicha hebra no codificante comprende una región complementaria a parte de un ARNm que codifica PCSK9, en el que cada hebra tiene aproximadamente 17 a 5 aproximadamente 30 nucleótidos de longitud, en el que dicha hebra no codificante comprende al menos 17 nucleótidos de la secuencia de nucleobases ACAAAAGCAAAACAGGUCUAG (SEC ID Nº 412) y el agente de iARN bicatenario se representa por la fórmula (III): sentido: 5' np -Na -(XXX)i-Nb -YYY -Nb -(ZZZ)j -Na - nq 3' antisentido: 3' np'-Na'-(X'X'X')k-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-(Z'Z'Z')l-Na'- nq' 5' (III) en la que: i, j, k y l son cada uno independientemente 0 ó 1; p, p', q y q'son cada uno independientemente 0-6; cada Na y Na' representa independientemente una secuencia de oligonucleótidos que comprende 0-25 nucleótidos que están tanto modificados como sin modificar o combinaciones de los mismos, comprendiendo cada secuencia al menos dos 15 nucleótidos modificados de forma diferente; cada Nb y Nb' representa independientemente una secuencia de oligonucleótidos que comprende 0-10 nucleótidos que están tanto modificados como sin modificar o combinaciones de los mismos; cada np, np', nq y nq', cada uno de los cuales puede o puede no estar presente, representa independientemente un nucleótido protuberante; XXX, YYY, ZZZ, X'X'X', Y'Y'Y' y Z'Z'Z' representan cada uno independientemente un motivo de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos; modificaciones en Nb se diferencian de la modificación enY y modificaciones en Nb' se diferencian de la modificación en Y'; en el que las modificaciones en los nucleótidos son modificaciones 2'-O-metilo o 2'-flúor; y en el que el ligando es uno o más derivados de GalNAc unidos mediante un conector ramificado bivalente o trivalente; o (b) una hebra no codificante que consiste en la secuencia de nucleótidos asCfsaAfAfAfgCfaAfaAfcAfgGfuCfuagsasa y una hebra codificante que consiste en la secuencia de nucleótidos csusagacCfuGfudTuugcuuuugu, en las que a, g, c y u son nucleótidos A, G, C y U modificados con 2'-O-metilo (2'-OMe), respectivamente; Af, Gf, Cf y Uf son nucleótidos A, G, C y U modificados con 2'-flúor, respectivamente; dT es un nucleótido desoxitimina y s es un enlace fosforotioato; y en el que la hebra codificante está conjugada con al menos un ligando.

Description

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DESCRIPCION
Composiciones de arni de pcsk9 y métodos de uso de las mismas
La proproteína convertasa subtilisina kexina 9 (PCSK9) es un miembro de la familia de subtilisina serina proteasa. Las otras ocho de proteasas subtilisina de mamífero, PCSK1-PCSK8 (también llamadas PC1/3, PC2, furina, PC4, PC5/6, PACE4, PC7 y S1P/SKI-1) son proproteína convertasas que procesan una amplia variedad de proteínas en la ruta secretora y desempeñan funciones en diversos procesos biológicos (Bergeron, F. (2000) J. Mol. Endocrinol. 24, 1-22, Gensberg, K., (1998) Semin. Cell Dev. Biol. 9, 11-17, Seidah, N. G. (1999) Brain Res. 848, 45-62, Taylor, N. A., (2003) FASEB J. 17, 1215-1227 y Zhou, A., (1999) J. Biol. Chem. 274, 20745-20748).
Se ha propuesto que la PCSK9 desempeña una función en el metabolismo del colesterol. La expresión de ARNm de PCSK9 se regula por disminución por la alimentación de colesterol dietético en ratones (Maxwell, K. N., (2003) J. Lipid Res. 44, 2109-2119), se regula por incremento por estatinas en células HepG2 (Dubuc, G., (2004) Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 24, 1454-1459) y se regula por incremento en la proteína de unión al elemento regulador del esterol (SREBP) de ratones transgénicos (Horton, J. D., (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 12027-12032), similar a las enzimas biosintéticas del colesterol y el receptor de la lipoproteína de baja densidad (LDLR). Además, se ha encontrado que las mutaciones de aminoácidos de PCSK9 se asocian a una forma de hipercolesterolemia dominante autosómica (Hchola3) (Abifadel, M., et al. (2003) Nat. Genet. 34, 154-156, Timms, K. M., (2004) Hum. Genet. 114, 349-353, Leren, T. P. (2004) Clin. Genet. 65, 419-422). La PCSK9 también pueden desempeñar una función en determinar los niveles de colesterol LDL en la población general, debido a que polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) se han asociado a niveles de colesterol en una población japonesa (Shioji, K., (2004) J. Hum. Genet. 49, 109-114).
Las hipercolesterolemias dominantes autosómicas (ADH) son enfermedades monogénicas en las que los pacientes presentan elevados niveles de colesterol total y LDL, xantomas del tendón y aterosclerosis prematura (Rader, D. J.,
(2003) J. Clin. Invest. 111, 1795-1803). La patogénesis de las ADH y una forma recesiva, la hipercolesterolemia recesiva autosómica (ARH) (Cohen, J. C., (2003) Curr. Opin. Lipidol. 14, 121-127), es debida a defectos en la captación de LDL por el hígado. La ADH puede producirse por mutaciones LDLR, que previenen la captación de LDL, o por mutaciones en la proteína sobre LDL, apolipoproteína B, que se une al LDLR. La ARH se produce por mutaciones en la proteína de ARH que son necesarias para la endocitosis del complejo LDLR-LDL mediante su interacción con clatrina. Por tanto, si las mutaciones de PCSK9 son causantes en familias de Hchola3, parece probable que PCSK9 desempeñe una función en la captación de LDL mediada por receptor.
Los estudios de expresión en exceso indican una función para PCSK9 en controlar los niveles de LDLR y, por tanto, la captación de LDL por el hígado (Maxwell, K. N. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101, 7100-7105, Benjannet, S., et al.
(2004) J. Biol. Chem. 279, 48865-48875, Park, S. W., (2004) J. Biol. Chem. 279, 50630-50638). La expresión en exceso mediada por adenovirus de PCSK9 de ratón o humana durante 3 ó 4 días en ratones produce elevados niveles de colesterol total y LDL; este efecto no se observa en animales inactivados en LDLR (Maxwell, K. N. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101, 7100-7105, Benjannet, S., et al. (2004) J. Biol. Chem. 279, 48865-48875, Park, S. W., (2004) J. Biol. Chem. 279, 50630-50638). Además, la expresión en exceso de PCSK9 produce una grave reducción en la proteína LDLR hepática, sin afectar los niveles de ARNm de LDLR, niveles de proteína SREBP, o proteína SREBP nuclear con respecto a la relación citoplásmica.
Aunque la propia hipercolesterolemia es asintomática, la elevación de larga duración del colesterol en suero puede conducir a aterosclerosis. Durante un periodo de décadas, el colesterol en suero crónicamente elevado contribuye a la formación de placas ateromatosas en las arterias que pueden conducir a estenosis progresiva o incluso oclusión completa de las arterias implicadas. Además, placas más pequeñas pueden romperse y hacer que se forme un coágulo y obstruir la circulación sanguínea produciendo, por ejemplo, infarto de miocardio y/o accidente cerebrovascular. Si la formación de la estenosis u oclusión es gradual, el riego sanguíneo a los tejidos y órganos disminuye lentamente hasta que se altera la función del órgano.
Por consiguiente, hay una necesidad en la materia de tratamientos eficaces para enfermedades asociadas a PCSK9, tales como una hiperlipidemia, por ejemplo, hipercolesterolemia.
Como se describe en más detalle más adelante, en el presente documento se desvelan composiciones que comprenden agentes de iARN, por ejemplo, agentes de ARNi bicatenario, dirigidos a PCSK9. También se desvelan métodos usando las composiciones de la invención para inhibir la expresión de PCSK9 y para tratar patologías relacionadas con la expresión de PCSK9, por ejemplo, hipercolesterolemia.
Por consiguiente, en un aspecto, la presente invención proporciona un agente de iARN bicatenario, que puede inhibir la expresión de la proproteína convertasa subtilisina kexina 9 (PCSK9) en una célula, en el que dicho agente de iARN bicatenario comprende:
(a) una hebra codificante complementaria a una hebra no codificante, en el que la hebra no codificante comprende una región complementaria a parte de un ARNm que codifica PCSK9, en el que cada hebra tiene aproximadamente 17 a aproximadamente 30 nucleótidos de longitud, en el que dicha hebra no codificante comprende al menos 17 nucleótidos de la secuencia de nucleobases ACAAAAGCAAAACAGGUCUAG (SEC ID N° 412) y el agente de iARN bicatenario se representa por la fórmula (III):
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sentido: 5' np -Na -(XXX)i-Nb -YYY-Nb -(ZZZ)j -Na - nq 3'
antisentido: 3' np'-Na'-(X'X'X')k-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-(Z'Z'Z')l-Na'- nq' 5' (III)
en la que:
i, j, k y l son cada uno independientemente 0 ó 1; p, p', q y q' son cada uno independientemente 0-6;
cada Na y Na' representa independientemente una secuencia de oligonucleótidos que comprende 0-25 nucleótidos que están tanto modificados como sin modificar o combinaciones de los mismos, comprendiendo cada secuencia al menos dos nucleótidos modificados de forma diferente;
cada Nb y Nb' representa independientemente una secuencia de oligonucleótidos que comprende 0-10 nucleótidos que están tanto modificados como sin modificar o combinaciones de los mismos;
cada np, np', nq y nq', cada uno de los cuales puede o puede no estar presente, representa independientemente un nucleótido protuberante;
XXX, YYY, ZZZ, X'X'X', Y'Y'Y' y Z'Z'Z' representan cada uno independientemente un motivo de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos;
modificaciones en Nb se diferencian de la modificación en Y y modificaciones en Nb' se diferencian de la modificación en
Y';
en el que las modificaciones en los nucleótidos son modificaciones 2'-O-metilo o 2'-flúor; y
en el que el ligando es uno o más derivados de GalNAc unidos mediante un conector ramificado bivalente o trivalente; o
(b) una hebra no codificante que consiste en la secuencia de nucleótidos asCfsaAfAfAfgCfaAfaAfcAfgGfuCfuagsasa y una hebra codificante que consiste en la secuencia de nucleótidos csusagacCfuGfudTuugcuuuugu,
en las que a, g, c y u son nucleótidos A, G, C y U modificados con 2'-O-metilo (2'-OMe), respectivamente; Af, Gf, Cf y Uf son nucleótidos A, G, C y U modificados con 2'-flúor, respectivamente; dT es un nucleótido desoxitimina y s es un enlace fosforotioato;
y en el que la hebra codificante está conjugada con al menos un ligando.
En una implementación, i es 0; j es 0; i es 1; j es 1; tanto i como j son 0; o tanto i como j son 1. En otra implementación, k es 0; l es 0; k es 1; l es 1; tanto k como l son 0; o tanto k como l son 1.
En una implementación, XXX es complementario a X'X'X', YYY es complementario a Y'Y'Y' y ZZZ es complementario a Z'Z'Z'.
En una implementación, el motivo YYY se produce en o cerca del sitio de escisión de la hebra codificante.
En una implementación, el motivo Y'Y'Y' se produce en las posiciones 11, 12 y 13 de la hebra no codificante desde el extremo 5'.
En una implementación, Y' es 2'-O-metilo.
En una implementación, la fórmula (III) se representa por la fórmula (Illa): sentido: 5' np -Na -YYY -Na - nq 3'
antisentido: 3' np-Na- Y'Y'Y'- Na- nq' 5' (IIIa).
En otra implementación, la fórmula (III) se representa por la fórmula (IIIb): sentido: 5' np -Na -YYY -Nb -ZZZ -Na - nq 3'
antisentido: 3' np-Na- Y'Y'Y'-Nb-Z'Z'Z'- Na- nq' 5' (IIIb)
en la que cada Nb y Nb' representa independientemente una secuencia de oligonucleótidos que comprende 1-5 nucleótidos modificados.
En otra implementación más, la fórmula (III) se representa por la fórmula (IIIc): sentido: 5' np -Na -XXX -Nb -YYY -Na - nq 3'
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antisentido: 3' np-Na- X'X'X'-Nb- Y'Y'Y'- Na- nq' 5' (IIIc)
en la que cada Nb y Nb' representa independientemente una secuencia de oligonucleótidos que comprende 1-5 nucleótidos modificados.
En una implementación, la fórmula (III) se representa por la fórmula (IIId):
sentido: 5' np -Na -XXX- Nb -YYY -Nb -ZZZ -Na - nq 3'
antisentido: 3' np-Na- X'X'X'- Nb-Y'Y'Y'-Nb-Z'Z'Z'- Na- nq' 5' (IIId)
en la que cada Nb y Nb' representa independientemente una secuencia de oligonucleótidos que comprende 1-5 nucleótidos modificados y cada Na y Na' representa independientemente una secuencia de oligonucleótidos que comprende 2-10 nucleótidos modificados.
En una implementación, la región bicatenaria tiene 15-30 pares de nucleótidos de longitud. En otra realización, la región bicatenaria tiene 17-23 pares de nucleótidos de longitud. En otra realización más, la región bicatenaria tiene 17-25 pares de nucleótidos de longitud. En una realización, la región bicatenaria tiene 23-27 pares de nucleótidos de longitud. En otra realización, la región bicatenaria tiene 19-21 pares de nucleótidos de longitud. En otra realización, la región bicatenaria tiene 21-23 pares de nucleótidos de longitud. En una implementación, cada hebra tiene 15-30 nucleótidos.
En una implementación, las modificaciones en los nucleótidos están seleccionadas del grupo que consiste en LNA, HNA, CeNA, 2'-metoxietilo, 2'-O-alquilo, 2'-O-alilo, 2'-C-alilo, 2'-flúor, 2'-desoxi, 2'-hidroxilo y combinaciones de los mismos. En otra realización, las modificaciones en los nucleótidos son modificaciones 2'-O-metilo o 2'-flúor.
En una realización, el ligando es uno o más derivados de GalNAc unidos mediante un conector ramificado bivalente o trivalente. En otra realización, el ligando es
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HO OH
0 ox
HO °-
AcHN
O
O
O
O
'N O H
En una realización, el ligando está unido al extremo 3' de la hebra codificante.
En una realización, el agente de iARN está conjugado con el ligando como se muestra en el siguiente esquema
3'
OH
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en el que X es O o S. En una implementación específica, X es O.
En una implementación, el agente comprende además al menos un enlace internucleotídico fosforotioato o
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metilfosfonato.
En una implementación, el enlace intemucleotídico fosforotioato o metilfosfonato está en el extremo 3' de una hebra. En una implementación, la hebra es la hebra no codificante. En otra implementación, la hebra es la hebra codificante.
En una implementación, el enlace internucleotídico fosforotioato o metilfosfonato está en el extremo 5' de una hebra. En una implementación, la hebra es la hebra no codificante. En otra realización, la hebra es la hebra codificante.
En una implementación, el enlace internucleotídico fosforotioato o metilfosfonato está en tanto el extremo 5' como el extremo 3' de una hebra. En una realización, la hebra es la hebra no codificante.
En una implementación, el par de bases en la posición 1 del extremo 5' de la hebra no codificante del dúplex es un par de bases AU.
En una implementación, los nucleótidos Y contienen una modificación de 2'-flúor.
En una implementación, los nucleótidos Y' contienen una modificación de 2'-O-metilo.
En una implementación, p'>0. En otra realización, p-2.
En una implementación, q'=0, p=0, q=0 y p' nucleótidos protuberantes son complementarios al ARNm diana. En otra implementación, q'=0, p=0, q=0 y p' nucleótidos protuberantes son no complementarios al ARNm diana.
En una implementación, la hebra codificante tiene un total de 21 nucleótidos y la hebra no codificante tiene un total de 23 nucleótidos.
En una implementación, al menos un np' está ligado a un nucleótido vecino mediante un enlace fosforotioato.
En una implementación, todos los np' están ligados a nucleótidos vecinos mediante enlaces fosforotioato.
En una implementación, el agente de iARN está seleccionado del grupo de agentes de iARN enumerados en la Tabla 1, Tabla 2, Tabla 9, Tabla 10, Tabla 12 y Figura 12.
En una implementación, el agente de iARN está seleccionado del grupo que consiste en AD-53815, AD-56663, AD- 56658, AD-56676, AD-56666, AD-57928 y AD-60212.
En otro aspecto, la presente divulgación proporciona agentes de iARN, por ejemplo, agentes de iARN bicatenario, que pueden inhibir la expresión de proproteína convertasa subtilisina kexina 9 (PCSK9) en una célula, en los que el agente de iARN bicatenario comprende una hebra codificante complementaria a una hebra no codificante, en los que la hebra no codificante comprende una región complementaria a parte de un ARNm que codifica PCSK9, en los que cada hebra tiene aproximadamente 14 a aproximadamente 30 nucleótidos de longitud, en los que el agente de iARN bicatenario se representa por la fórmula (III):
sentido: 5' np -Na -(XXX)i-Nb -YYY -Nb -(ZZZ)j -Na - nq 3'
antisentido: 3' np'-Na'-(X'X'X')k-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-(Z'Z'Z')rNa'- nq' 5' (III)
en la que:
i, j, k y l son cada uno independientemente 0 ó 1; p, p', q y q' son cada uno independientemente 0-6;
cada Na y Na' representa independientemente una secuencia de oligonucleótidos que comprende 0-25 nucleótidos que están tanto modificados como sin modificar o combinaciones de los mismos, comprendiendo cada secuencia al menos dos nucleótidos modificados de forma diferente;
cada Nb y Nb' representa independientemente una secuencia de oligonucleótidos que comprende 0-10 nucleótidos que están tanto modificados como sin modificar o combinaciones de los mismos;
cada np, np', nq y nq', cada uno de los cuales puede o puede no estar presente, representa independientemente un nucleótido protuberante;
XXX, YYY, ZZZ, X'X'X', Y'Y'Y' y Z'Z'Z' representan cada uno independientemente un motivo de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos, y en los que las modificaciones son modificaciones 2'-O-metilo o 2'-flúor;
modificaciones en Nb se diferencian de la modificación en Y y modificaciones en Nb' se diferencian de la modificación en Y'; y
en los que la hebra codificante está conjugada con al menos un ligando.
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En otro aspecto más, la presente divulgación proporciona agentes de iARN, por ejemplo, agentes de iARN bicatenario, que pueden inhibir la expresión de proproteína convertasa subtilisina kexina 9 (PCSK9) en una célula, en los que el agente de iARN bicatenario comprende una hebra codificante complementaria a una hebra no codificante, en los que la hebra no codificante comprende una región complementaria a parte de un ARNm que codifica PCSK9, en los que cada hebra tiene aproximadamente 14 a aproximadamente 30 nucleótidos de longitud, en los que el agente de iARN bicatenario se representa por la fórmula (III):
sentido: 5' np -Na -(XXX)i-Nb-YYY -Nb -(ZZZ)j -Na - nq 3'
antisentido: 3' np'-Na'-(X'X'X')k-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-(Z'Z'Z')rNa'- nq' 5' (III)
en la que:
i, j, k y l son cada uno independientemente 0 ó 1;
cada np, nq y nq', cada uno de los cuales puede o puede no estar presente, representa independientemente un nucleótido protuberante;
p, q y q' son cada uno independientemente 0-6;
np' >0 y al menos un np' está ligado a un nucleótido vecino mediante un enlace fosforotioato;
cada Na y Na' representa independientemente una secuencia de oligonucleótidos que comprende 0-25 nucleótidos que están tanto modificados como sin modificar o combinaciones de los mismos, comprendiendo cada secuencia al menos dos nucleótidos modificados de forma diferente;
cada Nb y Nb' representa independientemente una secuencia de oligonucleótidos que comprende 0-10 nucleótidos que están tanto modificados como sin modificar o combinaciones de los mismos;
XXX, YYY, ZZZ, X'X'X', Y'Y'Y' y Z'Z'Z' representan cada uno independientemente un motivo de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos, y en los que las modificaciones son modificaciones 2'-O-metilo o 2'-flúor;
modificaciones en Nb se diferencian de la modificación en Y y modificaciones en Nb' se diferencian de la modificación en Y'; y
en los que la hebra codificante está conjugada con al menos un ligando.
En otro aspecto, la presente divulgación proporciona agentes de iARN, por ejemplo, agentes de iARN bicatenario, que pueden inhibir la expresión de proproteína convertasa subtilisina kexina 9 (PCSK9) en una célula, en los que el agente de iARN bicatenario comprende una hebra codificante complementaria a una hebra no codificante, en los que la hebra no codificante comprende una región complementaria a parte de un ARNm que codifica PCSK9, en los que cada hebra tiene aproximadamente 14 a aproximadamente 30 nucleótidos de longitud, en los que el agente de iARN bicatenario se representa por la fórmula (III):
sentido: 5' np -Na -(XXX)i-Nb -YYY -Nb -(ZZZ)j -Na - nq 3'
antisentido: 3' np'-Na'-(X'X'X')k-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-(Z'Z'Z')rNa'- nq' 5' (III)
en la que:
i, j, k y l son cada uno independientemente 0 ó 1;
cada np, nq y nq', cada uno de los cuales puede o puede no estar presente, representa independientemente un nucleótido protuberante;
p, q y q' son cada uno independientemente 0-6;
np' >0 y al menos un np' está ligado a un nucleótido vecino mediante un enlace fosforotioato;
cada Na y Na' representa independientemente una secuencia de oligonucleótidos que comprende 0-25 nucleótidos que están tanto modificados como sin modificar o combinaciones de los mismos, comprendiendo cada secuencia al menos dos nucleótidos modificados de forma diferente;
cada Nb y Nb' representa independientemente una secuencia de oligonucleótidos que comprende 0-10 nucleótidos que están tanto modificados como sin modificar o combinaciones de los mismos;
XXX, YYY, ZZZ, X'X'X', Y'Y'Y' y Z'Z'Z' representan cada uno independientemente un motivo de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos, y en los que las modificaciones son modificaciones de 2'-O-metilo o 2'-flúor;
modificaciones en Nb se diferencian de la modificación en Y y modificaciones en Nb' se diferencian de la modificación en
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Y'; y
en los que la hebra codificante está conjugada con al menos un ligando, en la que el ligando es uno o más derivados de GalNAc unidos mediante un conector ramificado bivalente o trivalente.
En otro aspecto, la presente divulgación proporciona agentes de iARN, por ejemplo, agentes de iARN bicatenario que pueden inhibir la expresión de proproteína convertasa subtilisina kexina 9 (PCSK9) en una célula, en los que el agente de iARN bicatenario comprende una hebra codificante complementaria a una hebra no codificante, en los que la hebra no codificante comprende una región complementaria a parte de un ARNm que codifica PCSK9, en los que cada hebra tiene aproximadamente 14 a aproximadamente 30 nucleótidos de longitud, en los que el agente de iARN bicatenario se representa por la fórmula (III):
sentido: 5' np -Na -(XXX)i-Nb -YYY -Nb -(ZZZ)j -Na - nq 3'
antisentido: 3' np'-Na'-(X'X'X')k-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-(Z'Z'Z')l-Na'- nq' 5' (III)
en la que:
i, j, k y l son cada uno independientemente 0 ó 1;
cada np, nq y nq', cada uno de los cuales puede o puede no estar presente, representa independientemente un nucleótido protuberante;
p, q y q' son cada uno independientemente 0-6;
np' >0 y al menos un np' está ligado a un nucleótido vecino mediante un enlace fosforotioato;
cada Na y Na' representa independientemente una secuencia de oligonucleótidos que comprende 0-25 nucleótidos que están tanto modificados como sin modificar o combinaciones de los mismos, comprendiendo cada secuencia al menos dos nucleótidos modificados de forma diferente;
cada Nb y Nb' representa independientemente una secuencia de oligonucleótidos que comprende 0-10 nucleótidos que están tanto modificados como sin modificar o combinaciones de los mismos;
XXX, YYY, ZZZ, X'X'X', Y'Y'Y' y Z'Z'Z' representan cada uno independientemente un motivo de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos, y en los que las modificaciones son modificaciones de 2'-O-metilo o 2'-flúor;
modificaciones en Nb se diferencian de la modificación en Y y modificaciones en Nb' se diferencian de la modificación en
Y';
en los que la hebra codificante comprende al menos un enlace fosforotioato; y
en los que la hebra codificante está conjugada con al menos un ligando, en la que el ligando es uno o más derivados de GalNAc unidos mediante un conector ramificado bivalente o trivalente.
En otro aspecto más, la presente divulgación proporciona agentes de iARN, por ejemplo, agentes de iARN bicatenario, que pueden inhibir la expresión de proproteína convertasa subtilisina kexina 9 (PCSK9) en una célula, en los que el agente de iARN bicatenario comprende una hebra codificante complementaria a una hebra no codificante, en los que la hebra no codificante comprende una región complementaria a parte de un ARNm que codifica PCSK9, en los que cada hebra tiene aproximadamente 14 a aproximadamente 30 nucleótidos de longitud, en los que el agente de iARN bicatenario se representa por la fórmula (III):
sentido: 5' np -Na-YYY -Na - nq 3'
antisentido: 3' np'-Na'- Y'Y'Y'- Na'- nq' 5' (IIIa)
en la que:
cada np, nq y nq', cada uno de los cuales puede o puede no estar presente, representa independientemente un nucleótido protuberante;
p, q y q' son cada uno independientemente 0-6;
np' >0 y al menos un np' está ligado a un nucleótido vecino mediante un enlace fosforotioato;
cada Na y Na' representa independientemente una secuencia de oligonucleótidos que comprende 0-25 nucleótidos que están tanto modificados como sin modificar o combinaciones de los mismos, comprendiendo cada secuencia al menos dos nucleótidos modificados de forma diferente;
YYY e Y'Y'Y' representan cada uno independientemente un motivo de tres modificaciones idénticas en tres
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nucleótidos consecutivos, y en los que las modificaciones son modificaciones de 2'-O-metilo o 2'-flúor; en los que la hebra codificante comprende al menos un enlace fosforotioato; y
en los que la hebra codificante está conjugada con al menos un ligando, en la que el ligando es uno o más derivados de GalNAc unidos mediante un conector ramificado bivalente o trivalente.
La presente invención también proporciona células in vitro y composiciones farmacéuticas que comprenden los agentes de iARN bicatenario de la invención.
También se describe un agente de iARN seleccionado del grupo de agentes de iARN enumerados en la Tabla 1, Tabla 2, Tabla 9, Tabla 10, Tabla 12 y Figura 12.
En algunas implementaciones, el agente de iARN se administra usando una composición farmacéutica.
En implementaciones preferidas, el agente de iARN se administra en una disolución. En algunas de tales implementaciones, el ARNip se administra en una disolución no tamponada. En una implementación, el ARNip se administra en agua. En otras implementaciones, el ARNip se administra con una disolución de tampón, tal como un tampón acetato, un tampón citrato, un tampón prolamina, un tampón carbonato, o un tampón fosfato o cualquier combinación de los mismos. En algunas implementaciones, la disolución de tampón es solución salina tamponada con fosfato (PBS).
En una implementación, las composiciones farmacéuticas comprenden además una formulación de lípido. En una implementación, la formulación de lípido comprende un LNP, o XTC. En otra realización, la formulación de lípido comprende un MC3.
En un aspecto, la presente invención proporciona un método para inhibir la expresión de PCSK9 en una célula, incluyendo el método poner en contacto la célula con un agente de iARN, por ejemplo, un agente de iARN bicatenario de la invención; y mantener la célula producida en la etapa (a) durante un tiempo suficiente para obtener la degradación del transcrito de ARNm de un gen PCSK9, inhibiendo así la expresión del gen PCSK9 en la célula, en el que se excluyen los métodos para el tratamiento del cuerpo humano o animal mediante terapia.
En una implementación, la expresión de PCSK9 se inhibe al menos aproximadamente el 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o el 95 %.
En otro aspecto, la presente divulgación proporciona métodos para tratar un sujeto que tiene un trastorno mediado por la expresión de PCSK9. Los métodos incluyen administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente de iARN, por ejemplo, un agente de iARN bicatenario, o el vector de la invención, tratándose así el sujeto.
En una implementación, el sujeto es un ser humano.
En una implementación el ser humano tiene hipercolesterolemia.
En una implementación, el agente de iARN, por ejemplo, el agente de iARN bicatenario, se administra a una dosis de aproximadamente 0.01 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, aproximadamente 0.5 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 10 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg, aproximadamente 10 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg, aproximadamente 15 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg, aproximadamente 15 mg/kg a aproximadamente 25 mg/kg, aproximadamente 15 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg, o aproximadamente 20 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg.
En una implementación, el agente de iARN, por ejemplo, el agente de iARN bicatenario, se administra subcutáneamente o intravenosamente.
En una implementación, el agente de iARN se administra en una pauta de dosificación que incluye una fase de carga seguida de una fase de mantenimiento, en el que la fase de carga comprende administrar una dosis de 2 mg/kg, 1 mg/kg o 0.5 mg/kg cinco veces a la semana, y en el que la fase de mantenimiento comprende administrar una dosis de 2 mg/kg, 1 mg/kg o 0.5 mg/kg una vez, dos veces o tres veces a la semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas, una vez al mes, una vez cada dos meses, una vez cada tres meses, una vez cada cuatro meses, una vez cada cinco meses o una vez cada seis meses.
En una implementación, el agente de iARN se administra en dos o más dosis. En una realización específica, el agente de iARN se administra a intervalos seleccionados del grupo que consiste en una vez cada aproximadamente 12 horas, una vez cada aproximadamente 24 horas, una vez cada aproximadamente 48 horas, una vez cada aproximadamente 72 horas y una vez cada aproximadamente 96 horas.
En otro aspecto más, la presente divulgación proporciona métodos para tratar hipercolesterolemia en un sujeto. Los métodos incluyen administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente de iARN, por ejemplo, un agente de iARN bicatenario, o el vector de la invención, tratándose así el sujeto.
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En una implementación, el sujeto es un primate o roedor. En otra implementación, el sujeto es un ser humano.
En una implementación, el agente de iARN, por ejemplo, el agente de iARN bicatenario, se administra a una dosis de aproximadamente 0.01 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg o aproximadamente 0.5 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg. En otra realización, el agente de iARN bicatenario se administra a una dosis de aproximadamente 10 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg.
En una implementación, el agente de iARN, por ejemplo, el agente de iARN bicatenario, se administra subcutáneamente o intravenosamente.
En una implementación, el agente de iARN se administra en una pauta de dosificación que incluye una fase de carga seguida de una fase de mantenimiento, en el que la fase de carga comprende administrar una dosis de 2 mg/kg, 1 mg/kg o 0.5 mg/kg cinco veces a la semana, y en el que la fase de mantenimiento comprende administrar una dosis de 2 mg/kg, 1 mg/kg o 0.5 mg/kg una vez, dos veces o tres veces a la semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas, una vez al mes, una vez cada dos meses, una vez cada tres meses, una vez cada cuatro meses, una vez cada cinco meses o una vez cada seis meses.
En una implementación, el agente de iARN se administra en dos o más dosis. En una realización específica, el agente de iARN se administra a intervalos seleccionados del grupo que consiste en una vez cada aproximadamente 12 horas, una vez cada aproximadamente 24 horas, una vez cada aproximadamente 48 horas, una vez cada aproximadamente 72 horas y una vez cada aproximadamente 96 horas.
En una implementación, los métodos comprenden además determinar un genotipo o fenotipo de LDLR del sujeto.
En una implementación, la administración produce una disminución en el colesterol en suero en el sujeto.
En una implementación, los métodos comprenden además determinar el nivel de colesterol en suero en el sujeto.
La presente invención se ilustra adicionalmente por la siguiente descripción detallada y dibujos.
La Figura 1 es una gráfica que representa que hay un efecto de dosis-respuesta con AD-48400 conjugado con GalNAc en las tres dosificaciones probadas. AD-48399, conjugado con GalNAc, sirve de control.
Las Figuras 2A y 2B son gráficos que representa la eficacia in vivo y la duración de la respuesta para los ARNip indicados.
La Figura 3 es una tabla que muestra las secuencias de las hebras sentido (SEC ID N° 1633-1642, respectivamente, en orden de aparición) y antisentido (SEC ID N° 1643-1652, respectivamente, en orden de aparición) de los dúplex analizados para eficacia in vivo y optimización del candidato.
La Figura 4 es un gráfico que representa los resultados de los ensayos de eficacia in vivo para la optimización del candidato.
La Figura 5 es un gráfico que representa los resultados de los ensayos de dosis-respuesta in vivo realizados en ratones transgénicos PCSK9. Setenta y dos horas después de una dosis única de 10 mg/kg, 3 mg/kg, 1 mg/kg y 0.3 mg/kg de AD-57928, los niveles de proteína PCSK9 se determinaron por ELISA.
La Figura 6 es un gráfico que representa los niveles de proteína PCSK9 en suero de ratones transgénicos PCSK9 después de la administración de AD-57928 en dosis de 5x2 mg/kg durante la “fase de carga” y dosis de 1x2 mg/kg o 2x2 mg/kg durante la “fase de mantenimiento”.
La Figura 7 es un gráfico que representa los niveles de proteína PCSK9 en suero de ratones transgénicos PCSK9 después de la administración de AD-57928 en dosis de 5x1 mg/kg durante la “fase de carga” y dosis de 1x1 mg/kg o 2x1 mg/kg durante la “fase de mantenimiento”.
La Figura 8 es un gráfico que representa los niveles de proteína PCSK9 en suero de ratones transgénicos PCSK9 después de la administración de AD-57928 en dosis de 5x0.5 mg/kg durante la “fase de carga” y dosis de 1x0.5 mg/kg o 2x0.5 mg/kg durante la “fase de mantenimiento”.
La Figura 9 es un gráfico que representa los resultados de los ensayos de dosis-respuesta in vivo realizados en ratones transgénicos PCSK9. Setenta y dos horas después de una dosis única de 0.3 mg/kg de ARNip, los niveles de proteína de PCSK9 se determinaron por ELISA.
La Figura 10 es un gráfico que muestra la cantidad de AD-57928 y AD-58895 por nanogramo de hígado de ratones no mutantes C57B6 después de la administración de una dosis única de 1 mg/kg de AD-57928 o AD-58895.
La Figura 11 es un gráfico que muestra la cantidad de AD-57928 y AD-58895 expresada como % de la cantidad teórica en el hígado de ratones no mutantes C57B6 después de la administración de una dosis única de 1 mg/kg de AD-57928 o AD-58895.
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La Figura 12A es una tabla que representa los agentes de ARNi de la invención que contienen secuencias optimizadas en comparación con secuencias de AD-57928. La Figura 12A desvela las secuencias “sentido” como SEC ID N° 16531658, respectivamente, en orden de aparición, y las secuencias “antisentido” como SEC ID N° 1659-1664, respectivamente, en orden de aparición.
La Figura 12B es un gráfico que muestra los valores de CI50 de los agentes de ARNi indicados.
La Figura 13 es un gráfico que muestra el nivel de los agentes de ARNi indicados en el hígado de ratones no mutantes tras la administración de una única dosis de 1 mg/kg del agente de ARNi indicado.
La Figura 14A es un gráfico que muestra la cantidad de proteína PCSK9 en el suero de primates no humanos expresada como porcentaje de PCSK9 que queda con respecto a los niveles de PCSK9 antes del sangrado después de la administración de los agentes de ARNi indicados a qdx5 + qwx3.
La Figura 14B es un gráfico que muestra la cantidad absoluta de proteína PCSK9 en el suero de primates no humanos después de la administración de los agentes de ARNi indicados a qdx5 + qwx3.
La Figura 15 es un gráfico que muestra la cantidad de colesterol por lipoproteína de baja densidad (LDL o LDLc) en el suero de primates no humanos expresada como un porcentaje de lDl que queda con respecto a niveles antes del sangrado de LDL después de la administración de los agentes de ARNi indicados a qdx5 + qwx3.
La Figura 16A es un gráfico que muestra la cantidad de colesterol por lipoproteína de baja densidad (LDL o LDLc) en el suero de primates no humanos expresada como un porcentaje de la cantidad promedio de niveles antes del sangrado de LDL después de la administración de AD-57928 a 2 mg/kg, q1w y 1 mg/kg, 2xw.
La Figura 16B es un gráfico que muestra la cantidad de proteína PCSK9 con respecto a la cantidad antes del sangrado en el suero de primates no humanos después de la administración de AD-57928 a 2 mg/kg, q1w y 1 mg/kg, 2xw.
La Figura 17A es un gráfico que muestra la cantidad de colesterol por lipoproteína de baja densidad (LDL o LDLc) en el suero de primates no humanos expresada como un porcentaje de la cantidad promedio de niveles antes del sangrado de LDL después de la administración de AD-57928 a 2 mg/kg, 2xw y una dosis única de 25 mg/kg. La última dosis para 2 mg/kg, grupo 2xw, fue el día 36.
La Figura 17B es un gráfico que muestra la cantidad de proteína PCSK9 con respecto a la cantidad antes del sangrado en el suero de primates no humanos después de la administración de AD-57928 a 2 mg/kg, 2xw y una dosis única de 25 mg/kg.
La Figura 18 es un gráfico que muestra la cantidad de colesterol por lipoproteína de baja densidad (LDL o LDLc) en el suero de primates no humanos expresada como un porcentaje de lDl que queda con respecto a niveles antes del sangrado de LDL después de la administración de los agentes de ARNi indicados a qdx5 + qwx3.
La Figura 19 es un gráfico que muestra la cantidad de colesterol por lipoproteína de baja densidad (LDL o LDLc) en el suero de primates no humanos expresada como un porcentaje de lDl que queda con respecto a niveles antes del sangrado de LDL después de la administración de los agentes de ARNi indicados a qdx5 + qwx3.
La presente invención se define mediante las reivindicaciones. También se desvelan métodos usando las composiciones de la invención para inhibir la expresión de PCSK9 y para tratar patologías relacionadas con la expresión de PCSK9, por ejemplo, hipercolesterolemia.
I. Definiciones
Con el fin de que la presente invención pueda entenderse más fácilmente, ciertos términos se definen primero. Además, debe observarse que siempre que se cite un valor o intervalo de valores de un parámetro, se pretende que valores e intervalos intermedios a los valores citados también sean parte de la presente invención.
El artículos “un” y “una” se usan en el presente documento para referirse a uno o a más de uno (es decir, a al menos uno) del objeto gramatical del artículo. A modo de ejemplo, “un elemento” significa un elemento o más de un elemento, por ejemplo, una pluralidad de elementos.
El término “que incluye” se usa en el presente documento para significar, y se usa indistintamente con, la expresión “que incluye, pero no se limita a”.
El término “o” se usa en el presente para significar, y se usa indistintamente con, el término “y/o”, a menos que el contexto indique claramente de otro modo.
Como se usa en el presente documento, “PCSK9” se refiere al gen o proteína proproteína convertasa subtilisina kexina 9. PCSK9 también se conoce como FH3, HCHOLA3, NARC-1 o NARCl. El término PCSK9 incluye PCSK9 humana, cuya secuencia de aminoácidos y de nucleótidos puede encontrarse en, por ejemplo, n° de acceso de GenBank GI:299523249; PCSK9 de ratón, cuya secuencia de aminoácidos y de nucleótidos puede encontrarse en, por ejemplo,
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n° de acceso de GenBank GI:163644257; PCSK9 de rata, cuya secuencia de aminoácidos y de nucleótidos puede encontrarse en, por ejemplo, n° de acceso de GenBank GI:77020249. Ejemplos adicionales de secuencias de ARNm de PCSK9 están fácilmente disponibles usando, por ejemplo, GenBank.
Como se usa en el presente documento, “secuencia diana” se refiere a una porción contigua de la secuencia de nucleótidos de una molécula de ARNm formada durante la transcripción de un gen PCSK9, que incluye ARNm que es un producto del procesamiento de ARN de un producto de transcripción primario.
Como se usa en el presente documento, el término “hebra que comprende una secuencia” se refiere a un oligonucleótido que comprende una cadena de nucleótidos que se describe por la secuencia citada usando la nomenclatura de nucleótidos estándar.
“G”, “C”, “A” y “U” representan cada uno generalmente un nucleótido que contiene guanina, citosina, adenina y uracilo como base, respectivamente. “T” y “dT” se usan indistintamente en el presente documento y se refieren a un desoxirribonucleótido en el que la nucleobase es timina, por ejemplo, desoxirribotimina, 2'-desoxitimidina o timidina. Sin embargo, se entenderá que el término “ribonucleótido” o “nucleótido” o “desoxirribonucleótido” también pueden referirse a un nucleótido modificado, como se detalla adicionalmente más adelante, o un resto de sustitución sustituto. El experto sabe bien que la guanina, citosina, adenina y uracilo pueden sustituirse con otros restos sin alterar sustancialmente las propiedades de apareamiento de bases de un oligonucleótido que comprende un nucleótido que lleva tal resto de sustitución. Por ejemplo, sin limitación, un nucleótido que comprende inosina como su base puede emparejar bases con nucleótidos que contienen adenina, citosina o uracilo. Por tanto, los nucleótidos que contienen uracilo, guanina o adenina pueden sustituirse en las secuencias de nucleótidos de la invención con un nucleótido que contiene, por ejemplo, inosina. Secuencias que comprenden tales restos de sustitución son realizaciones de la invención.
Los términos “ARNi”, “agente de iARN”, “agente de ARNi”, “agente de interferencia de ARN”, como se usan indistintamente en el presente documento, se refieren a un agente que contiene ARN como tal término se define en el presente documento, y que media en la escisión dirigida de un transcrito de ARN mediante una ruta del complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC). El ARNi dirige la degradación específica de secuencia del ARNm mediante un proceso conocido como interferencia por ARN (iARN). El ARNi modula, por ejemplo, inhibe, la expresión de PCSK9 en una célula, por ejemplo, una célula dentro de un sujeto, tal como un sujeto mamífero.
En una implementación, un agente de iARN de la invención incluye un ARN monocatenario que interacciona con una secuencia de ARN diana, por ejemplo, una secuencia de ARNm diana de PCSK9, para dirigir la escisión del ARN diana. Sin desear ceñirse a teoría alguna, se cree que el ARN bicatenario largo introducido en células se rompe en ARNip por una endonucleasa de tipo III conocida como Dicer (Sharp et al. (2001) Genes Dev. 15:485). Dicer, una enzima similar a ribonucleasa-III, procesa el ARNbc en ARN interferentes pequeños de 19-23 pares de bases con nucleótidos protuberantes de 3' de dos bases característicos (Bernstein, et al., (2001) Nature 409:363). Entonces, los ARNip se incorporan en un complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC) en el que una o más helicasas desenrollan el dúplex de ARNip, permitiendo que la hebra no codificante complementaria guíe el reconocimiento de diana (Nykanen, et al., (2001) Cell 107:309). Tras la unión al ARNm diana apropiado, una o más endonucleasas dentro del RISC escinden la diana para inducir el silenciamiento (Elbashir, et al., (2001) Genes Dev. 15:188). Así, en un aspecto, la invención se refiere a un ARN monocatenario (ARNip) generado dentro de una célula y que promueve la formación de un complejo RISC para efectuar el silenciamiento del gen diana, es decir, un gen PCSK9. Por consiguiente, el término “ARNip” también se usa en el presente documento para referirse a una iARN como se ha descrito anteriormente.
En otra implementación, el agente de iARN puede ser un ARNip monocatenario que se introduce en una célula u organismo para inhibir un ARNm diana. Los agentes de iARN monocatenarios se unen a la endonucleasa del RISC Argonaute 2, que entonces escinde el ARNm diana. Los ARNip monocatenarios tienen generalmente 15-30 nucleótidos y están químicamente modificados. El diseño y prueba de ARNip monocatenarios se describen en la patente de EE.UU. n° 8,101,348 y en Lima et al., (2012) Cell 150: 883-894, cuyos contenidos enteros de cada uno se incorporan por este documento en el presente documento por referencia. Cualquiera de las secuencias de nucleótidos antisentido descritas en el presente documento puede usarse como ARNip monocatenario como se describe en el presente documento o como químicamente modificado por los métodos descritos en Lima et al., (2012) Cell 150;:883-894.
En otra implementación, un “ARNi” para su uso en las composiciones, usos y métodos de la invención es un ARN bicatenario y se denomina en el presente documento “el agente de iARN bicatenario”, “molécula de ARN bicatenario (ARNbc)”, “agente de ARNbc” o “ARNbc”. El término “ARNbc” se refiere a un complejo de moléculas de ácidos ribonucleicos, que tiene una estructura de dúplex que comprende dos hebras de ácidos nucleicos antiparalelas y sustancialmente complementarias, que se denomina que tienen orientaciones “sentido” y “antisentido” con respecto a un ARN diana, es decir, un gen PCSK9. En algunas realizaciones de la invención, un ARN bicatenario (ARNbc) desencadena la degradación de un ARN diana, por ejemplo, un ARNm, mediante un mecanismo de silenciamiento de genes postranscripcional denominado en el presente documento interferencia por ARN o iARN.
En general, la mayoría de los nucleótidos de cada hebra de una molécula de ARNbc son ribonucleótidos, pero como se describe en detalle en el presente documento, cada una o ambas de las hebras también puede incluir uno o más no ribonucleótidos, por ejemplo, un desoxirribonucleótido y/o un nucleótido modificado. Además, como se usa en esta memoria descriptiva, un “agente de iARN” puede incluir ribonucleótidos con modificaciones químicas; un agente de
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iARN puede incluir modificaciones sustanciales en múltiples nucleótidos. Tales modificaciones pueden incluir todos los tipos de modificaciones desveladas en el presente documento o conocidas en la técnica. Cualquiera de tales modificaciones, como se usa en una molécula tipo ARNip, está englobada por “agente de iARN” para los fines de esta memoria descriptiva y reivindicaciones.
Las dos hebras que forman la estructura de dúplex pueden ser porciones diferentes de una molécula de ARN mayor, o pueden ser moléculas de ARN separadas. Si las dos hebras son parte de una molécula mayor y, por tanto, están conectadas por una cadena de nucleótidos sin interrumpir entre el extremo 3' de una hebra y el extremo 5' de la otra hebra respectiva que forma la estructura de dúplex, la cadena de ARN de conexión se denomina un “bucle en horquilla”. Si las dos hebras están conectadas covalentemente por medios distintos de una cadena de nucleótidos sin interrumpir entre el extremo 3' de una hebra y el extremo 5' de la otra hebra respectiva que forma la estructura de dúplex, la estructura de conexión se denomina un “conector”. Las hebras de ARN pueden tener el mismo número o un número diferente de nucleótidos. El máximo número de pares de bases es el número de nucleótidos en la hebra más corta del ARNbc menos cualquier nucleótido protuberante que esté presente en el dúplex. Además de la estructura de dúplex, un agente de iARN puede comprender uno o más nucleótidos protuberantes.
En una implementación, un agente de iARN de la invención es un ARNbc de 24-30 nucleótidos que interacciona con una secuencia de ARN diana, por ejemplo, una secuencia de ARNm diana de PCSK9, para dirigir la escisión del ARN diana. Sin desear ceñirse a teoría alguna, el ARN bicatenario largo introducido en células se rompe en ARNip por una endonucleasa de tipo III conocida como Dicer (Sharp et al. (2001) Genes Dev. 15:485). Dicer, una enzima similar a ribonucleasa-III, procesa el ARNbc en ARN interferentes pequeños de 19-23 pares de bases con nucleótidos protuberantes en 3' de dos bases característicos (Bernstein, et al., (2001) Nature 409:363). Entonces, los ARNip se incorporan en un complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC) en el que una o más helicasas desenrollan el dúplex de ARNip, permitiendo que la hebra no codificante complementaria guíe el reconocimiento de diana (Nykanen, et al., (2001) Cell 107:309). Tras la unión al ARNm diana apropiado, una o más endonucleasas dentro del RISC escinden la diana para inducir el silenciamiento (Elbashir, et al., (2001) Genes Dev. 15:188).Como se usa en el presente documento, un “nucleótido protuberante” se refiere al nucleótido o nucleótidos sin aparear que sobresalen de la estructura de dúplex de un agente de iARN cuando un extremo 3' de una hebra del agente de iARN se extiende más allá del extremo 5' de la otra hebra, o viceversa. “Romo” o “extremo romo” significa que no hay nucleótidos no apareados en ese extremo del agente de iARN bicatenario, es decir, ningún nucleótido protuberante. Un agente de iARN “de extremos romos” es un ARNbc que es bicatenario en toda su longitud entera, es decir, ningún nucleótido protuberante en ningún extremo de la molécula. Los agentes de iARN de la invención incluyen agentes de iARN con nucleótidos protuberantes en un extremo (es decir, agentes con un nucleótido protuberante y un extremo romo) o con nucleótidos protuberantes en ambos extremos.
El término “hebra no codificante” se refiere a la hebra de un agente de iARN bicatenario que incluye una región que es sustancialmente complementaria a una secuencia diana (por ejemplo, un ARNm de PCSK9 humana). Como se usa en el presente documento, el término “región complementaria a parte de un ARNm que codifica transtiretina” se refiere a una región en la hebra no codificante que es sustancialmente complementaria a parte de una secuencia de ARNm de PCSK9. Si la región de complementariedad no es completamente complementaria a la secuencia diana, los desapareamiento son los más tolerados en las regiones terminales y, si están presentes, están generalmente en una región o regiones terminales, por ejemplo, dentro de 6, 5, 4, 3 ó 2 nucleótidos del extremo 5' y/o 3'.
El término “hebra codificante”, como se usa en el presente documento, se refiere a la hebra de un ARNbc que incluye una región que es sustancialmente complementaria a una región de la hebra no codificante.
Como se usa en el presente documento, el término “región de escisión” se refiere a una región que se localiza inmediatamente adyacente al sitio de escisión. El sitio de escisión es el sitio sobre la diana en el que se produce la escisión. En algunas implementaciones, la región de escisión comprende tres bases en cualquier extremo de, y inmediatamente adyacentes a, el sitio de escisión. En algunas implementaciones, la región de escisión comprende dos bases en cualquier extremo de, e inmediatamente adyacentes a, el sitio de escisión. En algunas implementaciones, el sitio de escisión se produce específicamente en el sitio unido por los nucleótidos 10 y 11 de la hebra no codificante, y la región de escisión comprende nucleótidos 11, 12 y 13.
Como se usa en el presente documento, y a menos que se indique lo contrario, el término “complementaria”, cuando se usa para describir una primera secuencia de nucleótidos en relación con una segunda secuencia de nucleótidos, se refiere a la capacidad de un oligonucleótido o polinucleótido que comprende la primera secuencia de nucleótidos para hibridarse y formar una estructura de dúplex bajo ciertas condiciones con un oligonucleótido o polinucleótido que comprende la segunda secuencia de nucleótidos, como entenderá el experto. Tales condiciones pueden ser, por ejemplo, condiciones rigurosas, pudiendo incluir las condiciones rigurosas: NaCl 400 mM, PIPES 40 mM pH 6.4, EDTA 1 mM, 50 °C o 70 °C durante 12-16 horas seguido de lavado. Pueden aplicarse otras condiciones, tales como condiciones fisiológicamente relevantes como pueden encontrarse dentro de un organismo. Por ejemplo, una secuencia complementaria es suficiente para permitir que avance la función relevante del ácido nucleico, por ejemplo, iARN. El experto podrá determinar el conjunto de condiciones más apropiadas para una prueba de complementariedad de dos secuencias según la aplicación definitiva de los nucleótidos hibridados.
Las secuencias pueden ser “completamente complementarias” entre sí cuando hay apareamiento de bases de los
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nucleótidos de la primera secuencia de nucleótidos con los nucleótidos de la segunda secuencia de nucleótidos a lo largo de la longitud entera de la primera y segunda secuencias de nucleótidos. Sin embargo, si una primera secuencia se denomina “sustancialmente complementaria” con respecto a una segunda secuencia en el presente documento, las dos secuencias pueden ser completamente complementarias, o pueden formar uno o más, pero generalmente no más de 4, 3 ó 2 pares de bases desapareados tras la hibridación, mientras que se retiene la capacidad para hibridarse en las condiciones más relevantes para su aplicación definitiva. Sin embargo, si se diseñan dos oligonucleótidos para formar, tras la hibridación, uno o más nucleótidos protuberantes monocatenarios, tales nucleótidos protuberantes no deben considerarse desapareamientos con respecto a la determinación de la complementariedad. Por ejemplo, un ARNbc que comprende un oligonucleótido de 21 nucleótidos de longitud y otro oligonucleótido de 23 nucleótidos de longitud, en el que el oligonucleótido más largo comprende una secuencia de 21 nucleótidos que es completamente complementaria al oligonucleótido más corto, todavía puede denominarse “completamente complementario” para los fines descritos en el presente documento.
También pueden incluir secuencias “complementarias”, como se usa en el presente documento, o formarse completamente a partir de, pares de bases no de Watson-Crick y/o pares de bases formados a partir de nucleótidos no naturales y modificados, en tanto que se cumplan todos los requisitos anteriores con respecto a su capacidad para hibridarse. Tales pares de bases no de Watson-Crick incluyen, pero no se limitan a, apareamiento de bases de Wobble o Hoogstein G:U.
Los términos “complementaria”, “completamente complementaria” y “sustancialmente complementaria” en el presente documento pueden usarse con respecto al apareamiento de bases entre la hebra codificante y la hebra no codificante de un ARNbc, o entre la hebra no codificante de un ARNbc y una secuencia diana, como se entenderá del contexto de su uso.
Como se usa en el presente documento, un polinucleótido que es “sustancialmente complementario a al menos parte de” un ARN mensajero (ARNm) se refiere a un polinucleótido que es sustancialmente complementario a una porción contigua del ARNm de interés (por ejemplo, un ARNm que codifica PCSK9) que incluye una 5' UTR, un marco de lectura abierto (ORF), o una 3' UTR. Por ejemplo, un polinucleótido es complementario a al menos una parte de un ARNm de PCSK9 si la secuencia es sustancialmente complementaria a una porción no interrumpida de un ARNm que codifica PCSK9.
El término “inhibir”, como se usa en el presente documento, se usa indistintamente con “reducir”, “silenciar”, “regular por disminución”, “suprimir” y otros términos similares, e incluye cualquier nivel de inhibición.
La expresión “inhibir la expresión de un PCSK9”, como se usa en el presente documento, incluye la inhibición de la expresión de cualquier gen PCSK9 (tal como, por ejemplo, un gen PCSK9 de ratón, un gen PCSK9 de rata, un gen PCSK9 de mono o un gen PCSK9 humano) además de variantes (por ejemplo, variantes que se producen naturalmente) o mutantes de un gen PCSK9. Así, el gen PCSK9 puede ser un gen PCSK9 no mutante, un gen PCSK9 mutante o un gen PCSK9 transgénico en el contexto de una célula genéticamente manipulada, grupo de células u organismo.
“Inhibir la expresión de un gen PCSK9” incluye cualquier nivel de inhibición de un gen PCSK9, por ejemplo, supresión al menos parcial de la expresión de un gen PCSK9, tal como una inhibición de al menos aproximadamente el 5 %, al menos aproximadamente el 10 %, al menos aproximadamente el 15 %, al menos aproximadamente el 20 %, al menos aproximadamente el 25 %, al menos aproximadamente el 30 %, al menos aproximadamente el 35 %, al menos
aproximadamente el 40 %, al menos aproximadamente el 45 %, al menos aproximadamente el 50 %, al menos
aproximadamente el 55 %, al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 65 %, al menos
aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos
aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 91 %, al menos
aproximadamente el 92 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos aproximadamente el 94 %, al menos
aproximadamente 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, o al menos aproximadamente el 99 %.
La expresión de un gen PCSK9 puede evaluarse basándose en el nivel de cualquier variable asociada a la expresión del gen PCSK9, por ejemplo, nivel de ARNm de PCSK9, nivel de proteína PCSK9 o niveles de lípidos en suero. La inhibición puede evaluarse por una disminución en un nivel absoluto o relativo de una o más de estas variables en comparación con un nivel de control. El nivel de control puede ser cualquier tipo de nivel de control que se utiliza en la materia, por ejemplo, un nivel inicial pre-dosis, o un nivel determinado a partir de un sujeto, célula o muestra similar que no está tratado o está tratado con un control (tal como, por ejemplo, control solo de tampón o control de agente inactivo).
La expresión “poner en contacto una célula con un agente de iARN bicatenario”, como se usa en el presente documento, incluye poner en contacto una célula por cualquier medio posible. Poner en contacto una célula con un agente de iARN bicatenario incluye poner en contacto una célula in vitro con el agente de iARN o poner en contacto una célula in vivo con el agente de íaRn. La puesta en contacto puede hacerse directamente o indirectamente. Así, por ejemplo, el agente de iARN puede ponerse en contacto físico con la célula por la realización individual del método, o alternativamente, el agente de iARN puede ponerse en una situación que permitirá o hará que posteriormente se ponga
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en contacto con la célula.
La puesta en contacto de una célula in vitro puede hacerse, por ejemplo, incubando la célula con el agente de iARN. La puesta en contacto de una célula in vivo puede hacerse, por ejemplo, inyectando el agente de iARN en o cerca del tejido en el que la célula se localiza, o inyectando el agente de íArN en otra área, la circulación sanguínea o el espacio subcutáneo, de forma que el agente llegará posteriormente al tejido en el que se localiza la célula que va a ponerse en contacto. Por ejemplo, el agente de iARN puede contener y/o acoplarse a un ligando, por ejemplo, un ligando de GalNAc3, que dirige el agente de iARN a un sitio de interés, por ejemplo, el hígado. También son posibles combinaciones de métodos in vitro e in vivo de poner en contacto. A propósito de los métodos de la invención, una célula también podría ponerse en contacto in vitro con un agente de iARN y posteriormente trasplantarse a un sujeto.
Un “paciente” o “sujeto”, como se usa en el presente documento, pretende incluir tanto un animal humano como no humano, preferentemente un mamífero, por ejemplo, un mono. Lo más preferentemente, el sujeto o paciente es un ser humano.
Una “enfermedad asociada a PCSK9”, como se usa en el presente documento, pretende incluir cualquier enfermedad asociada al gen o proteína PCSK9. Una enfermedad tal puede producirse, por ejemplo, por exceso de producción de la proteína PCSK9, por mutaciones del gen PCSK9, por escisión anormal de la proteína PCSK9, por interacciones anormales entre PCSK9 y otras proteínas u otras sustancias endógenas o exógenas. Enfermedades asociadas a PCSK9 a modo de ejemplo incluyen lipidemias, por ejemplo, hiperlipidemias, y otras formas de desequilibrio de lípidos tales como hipercolesterolemia, hipertrigliceridemia y las afecciones patológicas asociadas a estos trastornos tales como enfermedades cardíacas y circulatorias.
“Cantidad terapéuticamente eficaz”, como se usa en el presente documento, pretende incluir la cantidad de un agente de iARN que, cuando se administra a un paciente para tratar una enfermedad asociada a PCSK9, es suficiente para efectuar el tratamiento de la enfermedad (por ejemplo, disminuyendo, mejorando o manteniendo la enfermedad existente o uno o más síntomas de la enfermedad). La “cantidad terapéuticamente eficaz” puede variar dependiendo del agente de iARN, cómo el agente se administra, la enfermedad y su gravedad y la historia, edad, peso, historia familiar, constitución genética, fase de los procesos patológicos mediados por la expresión de PCSK9, los tipos de tratamientos precedentes o concomitantes, si los hay, y otras características individuales del paciente que va a tratarse.
“Cantidad profilácticamente eficaz”, como se usa en el presente documento, pretende incluir la cantidad de un agente de iARN que, cuando se administran a un sujeto que todavía no experimenta o muestra los síntomas de una enfermedad asociada a PCSK9, pero que puede tener predisposición a la enfermedad, es suficiente para prevenir o mejorar la enfermedad o uno o más síntomas de la enfermedad. Mejorar la enfermedad incluye ralentizar la evolución de la enfermedad o reducir la gravedad de la enfermedad que se desarrollará después. La “cantidad profilácticamente eficaz” puede variar dependiendo del agente de iARN, cómo el agente se administra, el grado de riesgo de la enfermedad y la historia, edad, peso, historia familiar, constitución genética, los tipos de tratamientos precedentes o concomitantes, si los hay, y otras características individuales del paciente que va a tratarse.
Una “cantidad terapéuticamente eficaz” o “cantidad profilácticamente eficaz” también incluye una cantidad de un agente de iARN que produce algún efecto local o sistémico deseado a una relación beneficio/riesgo razonable aplicable a cualquier tratamiento. Los agentes de iARN empleados en los métodos de la presente invención pueden administrarse en una cantidad suficiente para producir una relación de beneficio/riesgo razonable aplicable a tal tratamiento.
El término “muestra”, como se usa en el presente documento, incluye una colección de fluidos, células o tejidos similares aislados de un sujeto, además de fluidos, células o tejidos presentes dentro de un sujeto. Ejemplos de fluidos biológicos incluyen sangre, suero y fluidos serosos, plasma, líquido cefalorraquídeo, fluidos oculares, linfa, orina, saliva y similares. Las muestras de tejido pueden incluir muestras de tejidos, órganos o regiones localizadas. Por ejemplo, las muestras pueden derivarse de órganos, partes de órganos, o fluidos o células particulares dentro de aquellos órganos. En ciertas realizaciones, las muestras pueden derivarse del hígado (por ejemplo, hígado completo o ciertos segmentos del hígado o ciertos tipos de células en el hígado tales como, por ejemplo, hepatocitos). En realizaciones preferidas, una “muestra derivada de un sujeto” se refiere a sangre o plasma extraído del sujeto. En otras realizaciones, una “muestra derivada de un sujeto” se refiere a tejido de hígado (o subcomponentes del mismo) derivado del sujeto.
II. ARNi
En el presente documento se describen agentes de iARN bicatenario mejorados que inhiben la expresión de un gen PCSK9 en una célula, tal como una célula dentro de un sujeto, por ejemplo, un mamífero, tal como un ser humano que tiene un trastorno de lípidos, por ejemplo, hipercolesterolemia y usos de tales agentes de iARN bicatenario.
Los agentes de iARN bicatenario de la divulgación incluyen agentes con modificaciones químicas como se ha desvelado, por ejemplo, en la solicitud provisional de EE.UU. n° 61/561,710, presentada el 18 de noviembre de 2011, cuyo contenido entero se incorporan en el presente documento por referencia.
Como se muestra en el presente documento y en la solicitud provisional n° 61/561,710, puede obtenerse un resultado superior introduciendo uno o más motivos de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos en una hebra codificante y/o hebra no codificante de un agente de iARN, particularmente en o cerca del sitio de escisión. En
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algunas implementaciones, la hebra codificante y la hebra no codificante del agente de iARN pueden modificarse completamente de otro modo. La introducción de estos motivos interrumpe el patrón de modificación, si está presente, de la hebra codificante y/o no codificante. El agente de iARN puede estar opcionalmente conjugado con un ligando de derivado de GalNAc, por ejemplo, en la hebra codificante. Los agentes de iARN resultantes presentan actividad de silenciamiento génico superior.
Más específicamente, se ha descubierto sorprendentemente que cuando la hebra codificante y la hebra no codificante del agente de iARN bicatenario se modifican completamente para tener uno o más motivos de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos en o cerca del sitio de escisión de al menos una hebra de un agente de iARN, la actividad de silenciamiento génico del agente de iARN se potenció superiormente.
Por consiguiente, la divulgación proporciona agentes de iARN bicatenario que pueden inhibir la expresión de un gen diana (es decir, un gen proproteína convertasa subtilisina kexina 9 (PCSK9)) in vivo. El agente de iARN comprende una hebra codificante y una hebra no codificante. Cada hebra del agente de iARN puede oscilar de 12-30 nucleótidos de longitud. Por ejemplo, cada hebra puede tener entre 14-30 nucleótidos de longitud, 17-30 nucleótidos de longitud, 25-30 nucleótidos de longitud, 27-30 nucleótidos de longitud, 17-23 nucleótidos de longitud, 17-21 nucleótidos de longitud, 1719 nucleótidos de longitud, 19-25 nucleótidos de longitud, 19-23 nucleótidos de longitud, 19-21 nucleótidos de longitud, 21-25 nucleótidos de longitud, o 21-23 nucleótidos de longitud.
La hebra codificante y la hebra no codificante normalmente forman un ARN bicatenario dúplex (“ARNbc”), también denominado en el presente documento un “agente de iARN”. La región de dúplex de un agente de iARN puede tener 1230 pares de nucleótidos de longitud. Por ejemplo, la región de dúplex puede tener entre 14-30 pares de nucleótidos de longitud, 17-30 pares de nucleótidos de longitud, 27-30 pares de nucleótidos de longitud, 17-23 pares de nucleótidos de longitud, 17-21 pares de nucleótidos de longitud, 17-19 pares de nucleótidos de longitud, 19-25 pares de nucleótidos de longitud, 19-23 pares de nucleótidos de longitud, 19-21 pares de nucleótidos de longitud, 21-25 pares de nucleótidos de longitud, o 21-23 pares de nucleótidos de longitud. En otro ejemplo, la región de dúplex está seleccionada de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26 y 27 nucleótidos de longitud.
En una implementación, el agente de iARN puede contener una o más regiones de nucleótidos protuberantes y/o grupo de encapuchado en el extremo 3', extremo 5', o ambos extremos de una o ambas hebras. El nucleótido protuberante puede ter 1-6 nucleótidos de longitud, por ejemplo 2-6 nucleótidos de longitud, 1-5 nucleótidos de longitud, 2-5 nucleótidos de longitud, 1-4 nucleótidos de longitud, 2-4 nucleótidos de longitud, 1-3 nucleótidos de longitud, 2-3 nucleótidos de longitud, o 1-2 nucleótidos de longitud. Los nucleótidos protuberantes pueden ser el resultado de una hebra que es más larga que la otra, o el resultado de dos hebras de la misma longitud que están escalonadas. El nucleótido protuberante puede formar un desapareamiento con el ARNm diana o puede ser complementario a las secuencias de genes que son elegidas como diana o puede ser otra secuencia. La primera y segunda hebras también pueden unirse, por ejemplo, por bases adicionales para formar una horquilla, o por otros conectores no de base.
En una implementación, los nucleótidos en la región de nucleótidos protuberantes del agente de iARN pueden cada uno ser independientemente un nucleótido modificado o sin modificar que incluye, pero no se limita a, 2'-azúcar modificado, tal como, 2-F, 2'-O-metilo, timidina (T), 2'-O-metoxietil-5-metiluridina (Teo), 2'-O-metoxietiladenosina (Aeo), 2'-O- metoxietil-5-metilcitidina (m5Ceo), y cualquier combinación de los mismos. Por ejemplo, TT puede ser una secuencia de nucleótidos protuberantes para cualquier extremo en cualquier hebra. El nucleótido protuberante puede formar un desapareamiento con el ARNm diana o puede ser complementario a las secuencias de genes que son elegidas como diana o puede ser otra secuencia.
Los nucleótidos protuberantes en 5' o 3' en la hebra codificante, hebra no codificante o ambas hebras del agente de iARN, puede estar fosforilados. En algunas implementaciones, la(s) región (regiones) de nucleótidos protuberantes contiene(n) dos nucleótidos que tienen un fosforotioato entre los dos nucleótidos, en las que los dos nucleótidos pueden ser iguales o diferentes. En una implementación, el nucleótido protuberante está presente en el extremo 3' de la hebra codificante, hebra no codificante, o ambas hebras. En una implementación, este nucleótido protuberante de 3' está presente en la hebra no codificante. En una realización, este nucleótido protuberante de 3'está presente en la hebra codificante.
El agente de iARN puede contener solo un único nucleótido protuberante, que puede fortalecer la actividad de interferencia de la iARN, sin afectar su estabilidad global. Por ejemplo, el nucleótido protuberante monocatenario puede localizarse en el extremo 3' de la hebra codificante o, alternativamente, en el extremo 3' de la hebra no codificante. La iARN también puede tener un extremo romo, localizado en el extremo 5' de la hebra no codificante (o el extremo 3' de la hebra codificante) o viceversa. Generalmente, la hebra no codificante de la iARN tiene un nucleótido protuberante en el extremo 3', y el extremo 5' es romo. Aunque no se desea ceñirse a teoría alguna, el extremo romo asimétrico en el extremo 5' de la hebra no codificante y el nucleótido protuberante del extremo 3' de la hebra no codificante favorece la carga de hebra guía en el proceso de RISC.
En una implementación, el agente de iARN es un oligonucleótido de extremos romos dobles de 19 nucleótidos de longitud, en el que la hebra codificante contiene al menos un motivo de tres modificaciones de 2'-F en tres nucleótidos consecutivos en las posiciones 7, 8, 9 del extremo 5'. La hebra no codificante contiene al menos un motivo de tres modificaciones de 2'-O-metilo en tres nucleótidos consecutivos en las posiciones 11, 12, 13 del extremo 5'.
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En otra implementación, el agente de iARN es un oligonucleótido de extremos romos dobles de 20 nucleótidos de longitud, en el que la hebra codificante contiene al menos un motivo de tres modificaciones de 2'-F en tres nucleótidos consecutivos en las posiciones 8, 9, 10 del extremo 5'. La hebra no codificante contiene al menos un motivo de tres modificaciones de 2'-O-metilo en tres nucleótidos consecutivos en las posiciones 11, 12, 13 del extremo 5'.
En otra implementación más, el agente de iARN es un oligonucleótido de extremos romos dobles de 21 nucleótidos de longitud, en el que la hebra codificante contiene al menos un motivo de tres modificaciones de 2'-F en tres nucleótidos consecutivos en las posiciones 9, 10, 11 del extremo 5'. La hebra no codificante contiene al menos un motivo de tres modificaciones de 2'-O-metilo en tres nucleótidos consecutivos en las posiciones 11, 12, 13 del extremo 5'.
En una implementación, el agente de iARN comprende una hebra codificante de 21 nucleótidos y una hebra no codificante de 23 nucleótidos, en el que la hebra codificante contiene al menos un motivo de tres modificaciones de 2'-F en tres nucleótidos consecutivos en las posiciones 9, 10, 11 del extremo 5'; la hebra no codificante contiene al menos un motivo de tres modificaciones de 2'-O-metilo en tres nucleótidos consecutivos en las posiciones 11, 12, 13 del extremo 5', en el que un extremo del agente de iARN es romo, mientras que el otro comprende 2 nucleótidos protuberantes. Preferentemente, los 2 nucleótidos protuberantes están en el extremo 3' de la hebra no codificante. Si los 2 nucleótidos protuberantes están en el extremo 3' de la hebra no codificante, puede haber dos enlaces internucleotídicos fosforotioato entre los tres nucleótidos terminales, en los que dos de los tres nucleótidos son los nucleótidos protuberantes, y el tercer nucleótido es un nucleótido apareado próximo al nucleótido protuberante. En una implementación, el agente de iARN tiene adicionalmente dos enlaces internucleotídicos fosforotioato entre los tres nucleótidos terminales en tanto el extremo 5' de la hebra codificante como en el extremo 5' de la hebra no codificante. En una implementación, cada nucleótido en la hebra codificante y la hebra no codificante del agente de iARN, que incluye los nucleótidos que son parte de los motivos, son nucleótidos modificados. En una implementación, cada residuo está independientemente modificado con un 2'-O-metilo o 3'-flúor, por ejemplo, en un motivo alternante. Opcionalmente, el agente de iARN comprende además un ligando (preferentemente GalNAc3).
En una implementación, el agente de iARN comprende hebras codificantes y no codificantes, en el que el agente de iARN comprende una primera hebra que tiene una longitud que es al menos 25 y como máximo 29 nucleótidos y una segunda hebra que tiene una longitud que es como máximo 30 nucleótidos con al menos un motivo de tres modificaciones de 2'-O-metilo en tres nucleótidos consecutivos en la posición 11, 12, 13 del extremo 5'; en el que el extremo 3' de la primera hebra y el extremo 5' de la segunda hebra forman un extremo romo y la segunda hebra es 1-4 nucleótidos más larga en su extremo 3' que la primera hebra, en el que la región de dúplex que tiene al menos 25 nucleótidos de longitud, y la segunda hebra es suficientemente complementaria a un ARNm diana a lo largo de al menos 19 nucleótidos de la segunda longitud de hebra para reducir la expresión del gen diana cuando el agente de iARN se introduce en una célula de mamífero, y en el que la escisión con Dicer del agente de iARN produce preferencialmente un ARNip que comprende el extremo 3' de la segunda hebra, reduciéndose así la expresión del gen diana en el mamífero. Opcionalmente, el agente de iARN comprende además un ligando.
En una implementación, la hebra codificante del agente de iARN contiene al menos un motivo de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos, en la que uno de los motivos se produce en el sitio de escisión en la hebra codificante.
En una implementación, la hebra no codificante del agente de iARN también puede contener al menos un motivo de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos, en la que uno de los motivos se produce en o cerca del sitio de escisión en la hebra no codificante.
Para un agente de iARN que tiene una región de dúplex de 17-23 nucleótidos de longitud, el sitio de escisión de la hebra no codificante está normalmente alrededor de las posiciones 10, 11 y 12 desde el extremo 5'. Así, los motivos de tres modificaciones idénticas puede producirse en las posiciones 9, 10, 11; posiciones 10, 11, 12; posiciones 11, 12, 13; posiciones 12, 13, 14; o posiciones 13, 14, 15 de la hebra no codificante, empezando a contar desde el 1° nucleótido desde el extremo 5' de la hebra no codificante, o, empezando a contar desde el 1° nucleótido apareado dentro de la región de dúplex del extremo 5' de la hebra no codificante. El sitio de escisión en la hebra no codificante también puede cambiar según la longitud de la región de dúplex del iARN del extremo 5'.
La hebra codificante del agente de iARN puede contener al menos un motivo de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos en el sitio de escisión de la hebra; y la hebra no codificante puede tener al menos un motivo de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos en o cerca del sitio de escisión de la hebra. Cuando la hebra codificante y la hebra no codificante forman un dúplex de ARNbc, la hebra codificante y la hebra no codificante puede alinearse de forma que un motivo de los tres nucleótidos en la hebra codificante y un motivo de los tres nucleótidos en la hebra no codificante tengan al menos un solapamiento de nucleótidos, es decir, al menos uno de los tres nucleótidos del motivo en la hebra codificante forma un par de bases con al menos uno de los tres nucleótidos del motivo en la hebra no codificante. Alternativamente, al menos dos nucleótidos pueden solaparse, o los tres nucleótidos pueden solaparse.
En una implementación, la hebra codificante del agente de iARN puede contener más de un motivo de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos. El primer motivo puede producirse en o cerca del sitio de escisión de la hebra y los otros motivos pueden ser una modificación de ala. El término “modificación de ala” en el
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presente documento se refiere a un motivo que se produce en otra porción de la hebra que está separada del motivo en o cerca del sitio de escisión de la misma hebra. La modificación de ala está tanto adyacente al primer motivo como está separada por al menos uno o más nucleótidos. Cuando los motivos están inmediatamente adyacentes entre sí, entonces las químicas de los motivos son distintas entre sí y cuando los motivos están separados uno o más nucleótidos, entonces las químicas pueden ser iguales o diferentes. Pueden estar presentes dos o más modificaciones de ala. Por ejemplo, si están presentes dos modificaciones de ala, cada modificación de ala puede producirse en un extremo con respecto al primer motivo que está en o cerca del sitio de escisión o en cualquier lado del motivo principal.
Al igual que la hebra codificante, la hebra no codificante del agente de iARN puede contener más de un motivo de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos, produciéndose al menos uno de los motivos en o cerca del sitio de escisión de la hebra. Esta hebra no codificante también puede contener una o más modificaciones de ala en un alineamiento similar a las modificaciones de ala que pueden estar presentes en la hebra codificante.
En una implementación, la modificación de ala en la hebra codificante o hebra no codificante del agente de iARN normalmente no incluye el primer nucleótido terminal o dos nucleótidos terminales en el extremo 3', extremo 5', o ambos extremos de la hebra.
En otra implementación, la modificación de ala en la hebra codificante o hebra no codificante del agente de iARN normalmente no incluye el primer nucleótido apareado o dos nucleótidos apareados dentro de la región de dúplex en el extremo 3', extremo 5', o ambos extremos de la hebra.
Si la hebra codificante y la hebra no codificante del agente de iARN contienen cada una al menos una modificación de ala, las modificaciones de ala pueden encontrarse en el mismo extremo de la región de dúplex, y tener un solapamiento de uno, dos o tres nucleótidos.
Si la hebra codificante y la hebra no codificante del agente de iARN contienen cada una al menos dos modificaciones de ala, la hebra codificante y la hebra no codificante pueden alinearse de forma que dos modificaciones cada una de una hebra se encuentren en un extremo de la región de dúplex, que tiene un solapamiento de uno, dos o tres nucleótidos; dos modificaciones cada una de una hebra se encuentran en el otro extremo de la región de dúplex, que tiene un solapamiento de uno, dos o tres nucleótidos; dos modificaciones de una hebra se encuentren en cada lado del motivo principal, que tiene un solapamiento de uno, dos o tres nucleótidos en la región de dúplex.
En una implementación, cada nucleótido en la hebra codificante y la hebra no codificante del agente de iARN, que incluye los nucleótidos que son parte de los motivos, puede modificarse. Cada nucleótido puede modificarse con la misma modificación o modificación diferente que puede incluir una o más de alteración de uno o ambos de los oxígenos del fosfato no de enlace y/o de uno o más de los oxígenos del fosfato de enlace; alteración de un constituyente del azúcar de ribosa, por ejemplo, del 2'- hidroxilo en el azúcar de ribosa; sustitución completa del resto fosfato con conectores “defosfo”; modificación o sustitución de una base que se produce naturalmente; y sustitución o modificación del esqueleto de ribosa-fosfato.
Como los ácidos nucleicos son polímeros de subunidades, muchas de las modificaciones se producen en una posición que se repite dentro de un ácido nucleico, por ejemplo, una modificación de una base, o un resto fosfato, o un O no de enlace de un resto fosfato. En algunos casos, la modificación se producirá en todas las posiciones objeto en el ácido nucleico, pero en muchos casos no se producirá. A modo de ejemplo, una modificación solo puede producirse en una posición del extremo 3' o 5', solo puede producirse en una región terminal, por ejemplo, en una posición en un nucleótido terminal o en los 2, 3, 4, 5 ó 10 últimos nucleótidos de una hebra. Una modificación puede producirse en una región bicatenaria, una región monocatenaria, o en ambas. Una modificación solo puede producirse en la región bicatenaria de un ARN o solo puede producirse en una región monocatenaria de un ARN. Por ejemplo, una modificación de fosforotioato en una posición de O no de enlace solo puede producirse en uno o ambos extremos, solo puede producirse en una región terminal, por ejemplo, en una posición en un nucleótido terminal o en los 2, 3, 4, 5 ó 10 últimos nucleótidos de una hebra, o puede producirse en regiones bicatenarias y monocatenarias, particularmente en los extremos. El extremo o extremos 5' pueden estar fosforilados.
Puede ser posible, por ejemplo, potenciar la estabilidad, para incluir bases particulares en nucleótidos protuberantes, o para incluir nucleótidos modificados o sustitutos de nucleótidos, en nucleótidos protuberantes monocatenarios, por ejemplo, en un nucleótido protuberante de 5' o 3', o en ambos. Por ejemplo, puede desearse incluir nucleótidos de purina en nucleótidos protuberantes. En algunas implementaciones, todas o algunas de las bases en un nucleótido protuberante de 3' o 5' puede modificarse, por ejemplo, con una modificación descrita en el presente documento. Las modificaciones puede incluir, por ejemplo, el uso de modificaciones en la posición 2' del azúcar de ribosa con modificaciones que se conocen en la técnica, por ejemplo, el uso de desoxirribonucleótidos, 2'-desoxi-2'-fluoro (2'-F) o 2'-O-metilo modificados en lugar del riboazúcar de la nucleobase, y modificaciones en el grupo fosfato, por ejemplo, modificaciones de fosforotioato. Los nucleótidos protuberantes no necesitan ser homólogos a la secuencia diana.
En una implementación, cada residuo de la hebra codificante y hebra no codificante está independientemente modificado con LNA, HNA, CeNA, 2'-metoxietilo, 2'-O-metilo, 2'-O-alilo, 2'-C-alilo, 2'-desoxi, 2'-hidroxilo o 2'-flúor. Las hebras pueden contener más de una modificación. En una implementación, cada residuo de la hebra codificante y hebra no codificante está independientemente modificado con 2'- O-metilo o 2'-flúor.
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Normalmente están presentes al menos dos modificaciones diferentes en la hebra codificante y la hebra no codificante. Aquellas dos modificaciones pueden ser las modificaciones de 2'-O-metilo o 2'-flúor, u otras.
En una implementación, Na y/o Nb comprenden modificaciones de un patrón alternante. El término “motivo alternante”, como se usa en el presente documento, se refiere a un motivo que tiene una o más modificaciones, produciéndose cada modificación en nucleótidos alternantes de una hebra. El nucleótido alternante puede referirse a uno por cada dos nucleótidos o uno por cada tres nucleótidos, o un patrón similar. Por ejemplo, si A, B y C representan cada uno un tipo de modificación al nucleótido, el motivo alternante puede ser “AbABABAbAbAB...”, “AABBAABBAABB...”, “AABAABAABAAB...”, “AAABAAABAAAB...”, “AAABBBAAABBB...” o “ABCABCABCABC...”, etc.
El tipo de modificaciones contenidas en el motivo alternante pueden ser iguales o diferentes. Por ejemplo, si A, B, C, D representan cada uno un tipo de modificación en el nucleótido, el patrón alternante, es decir, las modificaciones en cada dos nucleótidos pueden ser las mismas, pero cada una de la hebra codificante o hebra no codificante puede seleccionarse de varias posibilidades de modificaciones dentro del motivo alternante tal como “ABABAB...”, “ACACAC...” “BDBDBD...” o “CDCDCD...”, etc.
En una implementación, el agente de iARN de la invención comprende el patrón de modificación para el motivo alternante en la hebra codificante con respecto al patrón de modificación para el motivo alternante en la hebra no codificante desplazado. El desplazamiento puede ser tal que el grupo modificado de nucleótidos de la hebra codificante se corresponda con un grupo modificado de otro modo de nucleótidos de la hebra no codificante y viceversa. Por ejemplo, cuando se aparea la hebra codificante con la hebra no codificante en el dúplex de ARNbc, el motivo alternante en la hebra codificante puede empezar con “ABABAB” de 5'-3' de la hebra y el motivo alternante en la hebra no codificante puede empezar con “BABABA” de 5'-3' de la hebra dentro de la región de dúplex. Como otro ejemplo, el motivo alternante en la hebra codificante puede empezar con “AABBAABB” de 5'-3' de la hebra y el motivo alternante en la hebra no codificante puede empezar con “BBAABBAA” de 5'-3' de la hebra dentro de la región de dúplex, de manera que haya un desplazamiento completo o parcial de los patrones de modificación entre la hebra codificante y la hebra no codificante.
En una implementación, el agente de iARN que comprende el patrón del motivo alternante de modificación de 2'-O- metilo y modificación de 2'-F en la hebra codificante tiene inicialmente un desplazamiento con respecto al patrón del motivo alternante de modificación de 2'-O-metilo y modificación de 2'-F en la hebra no codificante inicialmente, es decir, el nucleótido modificado con 2'-O-metilo en la hebra codificante aparea bases con un nucleótido modificado con 2'-F en la hebra no codificante y viceversa. La posición 1 de la hebra codificante puede empezar con la modificación de 2'-F y la posición 1 de la hebra no codificante puede empezar con la modificación 2'-O-metilo.
La introducción de uno o más motivos de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos a la hebra codificante y/o hebra no codificante interrumpe el patrón de modificación inicial presente en la hebra codificante y/o hebra no codificante. Esta interrupción del patrón de modificación de la hebra codificante y/o no codificante introduciendo uno o más motivos de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos a la hebra codificante y/o no codificante potencia sorprendentemente la actividad de silenciamiento génico para el gen diana.
En una implementación, si el motivo de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos se introduce a cualquiera de las hebras, la modificación del nucleótido siguiente al motivo es una modificación diferente a la modificación del motivo. Por ejemplo, la porción de la secuencia que contiene el motivo es “...NaYYYNb...”, en la que “Y” representa la modificación del motivo de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos, y “Na” y “Nb” representan una modificación al nucleótido siguiente al motivo “YYY” que es diferente de la modificación de Y, y en la que Na y Nb pueden ser modificaciones iguales o diferentes. Alternativamente, Na y/o Nb pueden estar presentes o ausentes cuando está presente una modificación de ala.
El agente de iARN puede comprender además al menos un enlace internucleotídico fosforotioato o metilfosfonato. La modificación del enlace internucleotídico fosforotioato o metilfosfonato puede producirse en cualquier nucleótido de la hebra codificante o hebra no codificante o ambas hebras en cualquier posición de la hebra. Por ejemplo, la modificación del enlace internucleotídico puede producirse en cada nucleótido en la hebra codificante y/o hebra no codificante; cada modificación del enlace internucleotídico puede producirse en un patrón alternante en la hebra codificante y/o hebra no codificante; o la hebra codificante o hebra no codificante puede contener ambas modificaciones del enlace internucleotídico en un patrón alternante. El patrón alternante de la modificación del enlace internucleotídico en la hebra codificante puede ser igual o diferente de aquel de la hebra no codificante, y el patrón alternante de la modificación del enlace internucleotídico en la hebra codificante puede tener un desplazamiento con respecto al patrón alternante de la modificación del enlace internucleotídico en la hebra no codificante.
En una implementación, la iARN comprende una modificación del enlace internucleotídico fosforotioato o metilfosfonato en la región de nucleótidos protuberantes. Por ejemplo, la región de nucleótidos protuberantes puede contener dos nucleótidos que tienen un enlace internucleotídico fosforotioato o metilfosfonato entre los dos nucleótidos. También pueden hacerse modificaciones del enlace internucleotídico para enlazar los nucleótidos protuberantes con los nucleótidos apareados terminales dentro de la región de dúplex. Por ejemplo, al menos 2, 3, 4, o todos los nucleótidos protuberantes, pueden estar enlazados mediante enlace internucleotídico fosforotioato o metilfosfonato, y opcionalmente, puede haber enlaces internucleotídicos fosforotioato o metilfosfonato adicionales que enlacen el
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nucleótido protuberante con un nucleótido apareado que está junto al nucleótido protuberante. Por ejemplo, puede haber al menos dos enlaces intemucleotídicos fosforotioato entre los tres nucleótidos terminales, en los que dos de los tres nucleótidos son nucleótidos protuberantes, y el tercero es un nucleótido apareado junto al nucleótido protuberante. Estos tres nucleótidos terminales pueden estar en el extremo 3' de la hebra no codificante, el extremo 3' de la hebra codificante, el extremo 5' de la hebra no codificante y/o el extremo 5' de la hebra no codificante.
En una implementación, los 2 nucleótidos protuberantes están en el extremo 3' de la hebra no codificante, y hay dos enlaces internucleotídicos fosforotioato entre los tres nucleótidos terminales, en la que dos de los tres nucleótidos son los nucleótidos protuberantes, y el tercer nucleótido es un nucleótido apareado junto al nucleótido protuberante. Opcionalmente, el agente de iARN puede tener adicionalmente os enlaces internucleotídicos fosforotioato entre los tres nucleótidos terminales en tanto el extremo 5' de la hebra codificante como en el extremo 5' de la hebra no codificante.
En una implementación, el agente de iARN comprende desapareamiento(s) con la diana, dentro del dúplex, o combinaciones de los mismos. El desapareamiento puede producirse en la región de nucleótidos protuberantes o la región de dúplex. El par de bases puede clasificarse basándose en su tendencia a promover la disociación o fusión (por ejemplo, en la energía de asociación libre o disociación de un apareamiento particular, el enfoque más simple es examinar los pares en un par de bases individual, aunque también pueden usarse el vecino siguiente o análisis similares). En términos de promover la disociación: se prefiere A:U a G:C; se prefiere G:U a G:C; y se prefiere I:C a G:C (I=inosina). Se prefieren los desapareamientos, por ejemplo, no canónicos o distintos de apareamientos canónicos (como se describe en cualquier parte en el presente documento) a los apareamientos canónicos (A:T, A:U, G:C); y se prefieren apareamientos que incluyen una base universal a los apareamientos canónicos.
En una implementación, el agente de iARN comprende al menos uno del primer 1, 2, 3, 4 ó 5 pares de bases dentro de las regiones de dúplex del extremo 5' de la hebra no codificante seleccionados independientemente del grupo de: A:U, G:U, I:C, y pares desapareados, por ejemplo, apareamientos no canónicos o distintos de canónicos o apareamientos que incluyen una base universal, para promover la disociación de la hebra no codificante en el extremo 5' del dúplex.
En una implementación, el nucleótido en la posición 1 dentro de la región de dúplex del extremo 5' en la hebra no codificante está seleccionado del grupo que consiste en A, dA, dU, U y dT. Alternativamente, al menos uno del primer 1, 2 ó 3 pares de bases dentro de la región de dúplex del extremo 5' de la hebra no codificante es un par de bases AU. Por ejemplo, el primer par de bases dentro de la región de dúplex del extremo 5' de la hebra no codificante es un par de bases AU.
En una implementación, la secuencia de la hebra codificante puede representarse por la fórmula (I):
5' np-Na-(XXX )i-Nb-YYY -Nb-(ZZZ )j-Na-nq 3' (I)
en la que:
i y j son cada uno independientemente 0 ó 1; p y q son cada uno independientemente 0-6;
cada Na representa independientemente una secuencia de oligonucleótidos que comprende 0-25 nucleótidos modificados, comprendiendo cada secuencia al menos dos nucleótidos modificados de forma diferente;
cada Nb representa independientemente una secuencia de oligonucleótidos que comprende 0-10 nucleótidos modificados;
cada np y nq representan independientemente un nucleótido protuberante; en la que Nb y Y no tienen la misma modificación; y
XXX, YYY y ZZZ representan cada uno independientemente un motivo de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos. Preferentemente, YYY es todos nucleótidos modificados con 2'-F.
En una implementación, Na y/o Nb comprenden modificaciones de patrón alternante.
En una implementación, el motivo YYY se produce en o cerca del sitio de escisión de la hebra codificante. Por ejemplo, si el agente de iARN tiene una región de dúplex de 17-23 nucleótidos de longitud, el motivo YYY puede producirse en o la vecindad del sitio de escisión (por ejemplo: puede producirse en las posiciones 6, 7, 8, 7, 8, 9, 8, 9, 10, 9, 10, 11, 10, 11, 12 u 11, 12, 13) de - la hebra codificante, empezando a contar desde el 1° nucleótido, desde el extremo 5'; u opcionalmente, empezando a contar en el 1° nucleótido apareado dentro de la región de dúplex, desde el extremo 5'.
En una implementación, i es 1 y j es 0, o i es 0 y j es 1, o tanto i como j son 1. La hebra codificante puede, por tanto, representarse por las siguientes fórmulas:
5' np-Na-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3' (Ib);
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5' np-Na-XXX-Nb-YYY-Na-nq 3' (Ic); o 5' np-Na-XXX-Nb-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3' (Id).
Si la hebra codificante se representa por la fórmula (Ib), Nb representa una secuencia de oligonucleótidos que comprende 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 ó 0 nucleótidos modificados. Cada Na puede representar independientemente una secuencia de oligonucleótidos que comprende 2-20, 2-15 ó 2-10 nucleótidos modificados
Si la hebra codificante se representa como la fórmula (Ic), Nb representa una secuencia de oligonucleótidos que comprende 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 ó 0 nucleótidos modificados. Cada Na puede representan independientemente una secuencia de oligonucleótidos que comprende 2-20, 2-15 ó 2-10 nucleótidos modificados.
Si la hebra codificante se representa como la fórmula (Id), cada Nb representa independientemente una secuencia de oligonucleótidos que comprende 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 ó 0 nucleótidos modificados. Preferentemente, Nb es 0, 1, 2, 3, 4, 5 ó 6, cada Na puede representar independientemente una secuencia de oligonucleótidos que comprende 2-20, 2-15 ó 2-10 nucleótidos modificados.
Cada uno de X, Y y Z puede ser igual o diferente entre sí.
En otras implementaciones, i es 0 y j es 0, y la hebra codificante puede representarse por la fórmula:
5' np-Na-YYY-Na-nq 3' (Ia).
Si la hebra codificante se representa por la fórmula (Ia), cada Na puede representar independientemente una secuencia de oligonucleótidos que comprende 2-20, 2-15 ó 2-10 nucleótidos modificados.
En una implementación, la secuencia de la hebra no codificante de la iARN puede representarse por la fórmula (II):
5' nq’-Na'-(Z’Z'Z')k-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-(X'X'X')l-N'a-np' 3' (II)
en la que:
k y l son cada uno independientemente 0 ó 1; p’ y q’ son cada uno independientemente 0-6;
cada Na' representa independientemente una secuencia de oligonucleótidos que comprende 0-25 nucleótidos modificados, comprendiendo cada secuencia al menos dos nucleótidos modificados de forma diferente;
cada Nb' representa independientemente una secuencia de oligonucleótidos que comprende 0-10 nucleótidos modificados;
cada np' y nq' representan independientemente un nucleótido protuberante; en la que Nb’ y Y’ no tienen la misma modificación; y
X'X'X', Y'Y'Y' y Z'Z'Z' representan cada uno independientemente un motivo de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos.
En una implementación, Na’ y/o Nb’ comprenden modificaciones de patrón alternante.
El motivo Y'Y'Y' se produce en o cerca del sitio de escisión de la hebra no codificante. Por ejemplo, si el agente de iARN tiene una región de dúplex de 17-23 nucleótidos de longitud, el motivo Y'Y'Y' puede producirse en las posiciones 9, 10, 11;10, 11, 12; 11, 12, 13; 12, 13, 14; o 13, 14, 15 de la hebra no codificante, empezando a contar desde el 1° nucleótido, desde el extremo 5’; u opcionalmente, empezando a contar en el 1° nucleótido apareado dentro de la región de dúplex, desde el extremo 5’. Preferentemente, el motivo Y'Y'Y' se produce en las posiciones 11, 12, 13.
En una implementación, el motivo Y'Y'Y' es todo nucleótidos modificados con 2’-OMe.
En una implementación, k es 1 y l es 0, o k es 0 y l es 1, o tanto k como l son 1.
La hebra no codificante puede, por tanto, representarse por las siguientes fórmulas:
5' nq-Na'-Z'Z'Z'-Nb'-Y'Y'Y'-Na'-np’ 3' (IIb);
5' nq-Na'-Y'Y'Y'-Nb'-X'X'X'-np’ 3' (IIc); o
5' nq’-Na'-Z'Z'Z'-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-X'X'X'-Na'-np’ 3' (IId).
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Si la hebra no codificante se representa por la fórmula (IIb), Nb representa una secuencia de oligonucleótidos que comprende 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 ó 0 nucleótidos modificados. Cada Na' representa independientemente una secuencia de oligonucleótidos que comprende 2-20, 2-15 ó 2-10 nucleótidos modificados.
Si la hebra no codificante se representa como la fórmula (IIc), Nb' representa una secuencia de oligonucleótidos que comprende 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 ó 0 nucleótidos modificados. Cada Na' representa independientemente una secuencia de oligonucleótidos que comprende 2-20, 2-15 ó 2-10 nucleótidos modificados.
Si la hebra no codificante se representa como la fórmula (IId), cada Nb' representa independientemente una secuencia de oligonucleótidos que comprende 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 ó 0 nucleótidos modificados. Cada Na' representa independientemente una secuencia de oligonucleótidos que comprende 2-20, 2-15 ó 2-10 nucleótidos modificados. Preferentemente, Nb es 0, 1,2, 3, 4, 5 ó 6.
En otras implementaciones, k es 0 y l es 0 y la hebra no codificante puede representarse por la fórmula:
5' np-Na-Y'Y'Y'-Na-nq' 3' (Ia).
Si la hebra no codificante se representa como la fórmula (IIa), cada Na' representa independientemente una secuencia de oligonucleótidos que comprende 2-20, 2-15 ó 2-10 nucleótidos modificados.
Cada uno de X', Y' y Z' puede ser igual o diferente entre sí.
Cada nucleótido de la hebra codificante y la hebra no codificante puede estar independientemente modificado con LNA, HNA, CeNA, 2'-metoxietilo, 2'-O-metilo, 2'-O-alilo, 2'-C-alilo, 2'-hidroxilo o 2'-flúor. Por ejemplo, cada nucleótido de la hebra codificante y la hebra no codificante está independientemente modificado con 2'-O-metilo o 2'-flúor. Cada X, Y, Z, X', Y' y Z', en particular, puede representar una modificación de 2'-O-metilo o una modificación de 2'-flúor.
En una implementación, la hebra codificante del agente de iARN puede contener el motivo YYY que se produce en las posiciones 9, 10 y 11 de la hebra cuando la región de dúplex tiene 21 nt, empezando a contar desde el 1° nucleótido desde el extremo 5', u opcionalmente, empezando a contar en el 1° nucleótido apareado dentro de la región de dúplex, desde el extremo 5'; y Y representa modificación de 2'-F. La hebra codificante puede contener adicionalmente un motivo XXX o motivos ZZZ como modificaciones de ala en el extremo opuesto de la región de dúplex; y XXX y ZZZ representan cada uno independientemente una modificación de 2'-OMe o modificación de 2'-F.
En una implementación la hebra no codificante puede contener el motivo Y'Y'Y' que se produce en las posiciones 11, 12, 13 de la hebra, empezando a contar desde el 1° nucleótido desde el extremo 5', u opcionalmente, empezando a contar en el 1° nucleótido apareado dentro de la región de dúplex, desde el extremo 5'; y Y' representa modificación de 2'-O-metilo. La hebra no codificante puede contener adicionalmente un motivo X'X'X' o motivos Z'Z'Z' como modificaciones de ala en el extremo opuesto de la región de dúplex; y X'X'X' y Z'Z'Z' representan cada uno independientemente una modificación de 2'-OMe o modificación de 2'-F.
La hebra codificante representada por una cualquiera de las fórmulas (la), (Ib), (Ic) y (Id) anteriores forma un dúplex con una hebra no codificante que se representa por una cualquiera de las fórmulas (IIa), (IIb), (IIc) y (IId), respectivamente.
Por consiguiente, los agentes de iARN para su uso en los métodos descritos pueden comprender una hebra codificante y una hebra no codificante, teniendo cada hebra 14 a 30 nucleótidos, el dúplex de iARN representado por la fórmula (III):
sentido: 5' np -Na-(XXX) -Nb-YYY-Nb -(ZZZ)rNa-nq 3'
antisentido: 3' np-Na-(X'X'X')k-Nb-Y'Y'Y'-Nb-(Z'Z'Z')l-Na-nq 5'
(III)
en la que:
i, j, k y l son cada uno independientemente 0 ó 1; p, p', q y q' son cada uno independientemente 0-6;
cada Na y Na representa independientemente una secuencia de oligonucleótidos que comprende 0-25 nucleótidos modificados, comprendiendo cada secuencia al menos dos nucleótidos modificados de forma diferente;
cada Nb y Nb representa independientemente una secuencia de oligonucleótidos que comprende 0-10 nucleótidos modificados;
en la que
cada np', np, nq' y nq, cada uno de los cuales puede o puede no estar presente, representa independientemente un nucleótido protuberante; y
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XXX, YYY, ZZZ, X'X'X', Y'Y'Y' y Z'Z'Z' representan cada uno independientemente un motivo de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos.
En una realización, i es 0 y j es 0; o i es 1 y j es 0; o i es 0 y j es 1; o tanto i como j son 0; o tanto i como j son 1. En otra realización, k es 0 y l es 0; o k es 1 y l es 0; k es 0 y l es 1; o tanto k como l son 0; o tanto k como l son 1.
Combinaciones a modo de ejemplo de la hebra codificante y la hebra no codificante que forman un dúplex de iARN incluyen las siguientes fórmulas:
5' np - Na -YYY -Na-nq 3' 3' np-Na-Y'Y'Y' -Na nq' 5'
(IIIa)
5' np -Na -YYY -Nb -ZZZ -Na-nq 3' 3' np-Na-Y'Y'Y'-Nb-Z'Z'Z'-Na'nq' 5'
(IIIb)
5' np-Na- XXX -Nb -YYY - Na-nq 3' 3' np-Na-X'X'X'-Nb-Y'Y'Y'-Na-nq' 5'
(IIIc)
5' np -Na -XXX -Nb-YYY -Nb- ZZZ -Na-nq 3'
3' np-Na-X'X'X'-Nb-Y'Y'Y'-Nb-Z'Z'Z'-Na-nq 5'
(IIId)
Si el agente de iARN se representa por la fórmula (Illa), cada Na representa independientemente una secuencia de oligonucleótidos que comprende 2-20, 2-15 ó 2-10 nucleótidos modificados.
Si el agente de iARN se representa por la fórmula (lllb), cada Nb representa independientemente una secuencia de oligonucleótidos que comprende 1-10, 1-7, 1-5 ó 1-4 nucleótidos modificados. Cada Na representa independientemente una secuencia de oligonucleótidos que comprende 2-20, 2-15 ó 2-10 nucleótidos modificados.
Si el agente de iARN se representa como la fórmula (IIIc), cada Nb, Nb' representa independientemente una secuencia de oligonucleótidos que comprende 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 ó 0 nucleótidos modificados. Cada Na representa independientemente una secuencia de oligonucleótidos que comprende 2-20, 2-15 ó 2-10 nucleótidos modificados.
Si el agente de iARN se representa como la fórmula (IIId), cada Nb, Nb' representa independientemente una secuencia de oligonucleótidos que comprende 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 ó 0 nucleótidos modificados. Cada Na, Na representa independientemente una secuencia de oligonucleótidos que comprende 2-20, 2-15 ó 2-10 nucleótidos modificados. Cada uno de Na, Na', Nb y Nb comprende independientemente modificaciones de patrón alternante.
Cada uno de X, Y y Z en las fórmulas (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc) y (IIId) puede ser igual o diferente entre sí.
Si el agente de iARN se representa por la fórmula (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc) y (IIId), al menos uno de los nucleótidos Y puede formar un par de bases con uno de los nucleótidos Y'. Alternativamente, al menos dos de los nucleótidos Y forman pares de bases con los nucleótidos Y' correspondientes; o los tres de los nucleótidos Y forman todos pares de bases con los nucleótidos Y' correspondientes.
Si el agente de iARN se representa por la fórmula (IIIb) o (IIId), al menos uno de los nucleótidos Z puede formar un par de bases con uno de los nucleótidos Z'. Alternativamente, al menos dos de los nucleótidos Z forman pares de bases con los nucleótidos Z' correspondientes; o los tres de los nucleótidos Z forman todos pares de bases con los nucleótidos Z' correspondientes.
Si el agente de iARN se representa como la fórmula (IIIc) o (IIId), al menos uno de los nucleótidos X puede formar un par de bases con uno de los nucleótidos X'. Alternativamente, al menos dos de los X nucleótidos forman pares de bases con los nucleótidos X' correspondientes; o los tres de los X nucleótidos forman todos pares de bases con los nucleótidos X' correspondientes.
En una implementación, la modificación en el nucleótido Y es diferente de la modificación en el nucleótido Y', la modificación en el nucleótido Z es diferente de la modificación en el nucleótido Z', y/o la modificación en el nucleótido X es diferente de la modificación en el nucleótido X'.
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En una implementación, si el agente de iARN se representa por la fórmula (IIId), las modificaciones en Na son modificaciones de 2'-O-metilo o 2'-flúor. En otra realización, si el agente de iARN se representa por la fórmula (IIId), las modificaciones en Na son modificaciones de 2'-O-metilo o 2'-flúor y np' >0 y al menos un np' está ligado a un nucleótido vecino mediante enlace fosforotioato. En otra realización más, si el agente de iARN se representa por la fórmula (IIId), las modificaciones en Na son modificaciones de 2'-O-metilo o 2'-flúor, np' >0 y al menos un np' está ligado a un nucleótido vecino mediante enlace fosforotioato, y la hebra codificante está conjugada con uno o más derivados de GalNAc unidos mediante un conector ramificado bivalente o trivalente. En otra realización, si el agente de iARN se representa por la fórmula (IIId), las modificaciones en Na son modificaciones de 2'-O-metilo o 2'-flúor, np' >0 y al menos un np' está ligado a un nucleótido vecino mediante enlace fosforotioato, la hebra codificante comprende al menos un enlace fosforotioato y la hebra codificante está conjugada con uno o más derivados de GalNAc unidos mediante un conector ramificado bivalente o trivalente.
En una implementación, si el agente de iARN se representa por la fórmula (IIIa), las modificaciones en Na son modificaciones de 2'-O-metilo o 2'-flúor, np' >0 y al menos un np' está ligado a un nucleótido vecino mediante enlace fosforotioato, la hebra codificante comprende al menos un enlace fosforotioato y la hebra codificante está conjugada con uno o más derivados de GalNAc unidos mediante un conector ramificado bivalente o trivalente.
En una implementación, el agente de iARN es un multímero que contiene al menos dos dúplex representados por la fórmula (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc) y (IIId), en el que los dúplex están conectados por un conector. El conector puede ser escindible o no escindible. Opcionalmente, el multímero comprende además un ligando. Cada uno de los dúplex puede dirigirse al mismo gen o a dos genes diferentes; o cada uno de los dúplex puede dirigirse al mismo gen en dos sitios diana diferentes.
En una implementación, el agente de iARN es un multímero que contiene tres, cuatro, cinco, seis o más dúplex representados por la fórmula (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc) y (IIId), en el que los dúplex están conectados por un conector. El conector puede ser escindible o no escindible. Opcionalmente, el multímero comprende además un ligando. Cada uno de los dúplex puede dirigirse al mismo gen o a dos genes diferentes; o cada uno de los dúplex puede dirigirse al mismo gen en dos sitios diana diferentes.
En una implementación, dos agentes de iARN representados por la fórmula (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc) y (IIId) están enlazados entre sí en el extremo 5', y uno o ambos de los extremos 3' y están opcionalmente conjugados con un ligando. Cada uno de los agentes puede dirigirse al mismo gen o a dos genes diferentes; o cada uno de los agentes puede dirigirse al mismo gen en dos sitios diana diferentes.
Diversas publicaciones describen agentes de iARN multiméricos que pueden usarse en los métodos de la invención. Tales publicaciones incluyen el documento WO2007/091269, patente de EE.UU. n° 7858769, documentos WO2010/141511, WO2007/117686, WO2009/014887 y WO2011/031520, cuyos contenidos enteros de cada uno se incorporan por este documento en el presente documento por referencia.
El agente de iARN que contiene conjugaciones de uno o más restos de hidrato de carbono con un agente de iARN puede optimizar una o más propiedades del agente de iARN. En muchos casos, el resto de hidrato de carbono se unirá a una subunidad modificada del agente de iARN. Por ejemplo, el azúcar de ribosa de una o más subunidades de ribonucleótido de un agente de ARNbc puede sustituirse con otro resto, por ejemplo, un vehículo no de hidrato de carbono (preferentemente cíclico) con el que está unido un ligando de hidrato de carbono. Una subunidad de ribonucleótido en la que el azúcar de ribosa de la subunidad se ha sustituido así se denomina en el presente documento una subunidad de modificación de sustitución de ribosa (RRMS). Un vehículo cíclico puede ser un sistema de anillos carbocíclicos, es decir, todos los átomos de anillo son átomos de carbono, o un sistema de anillos heterocíclicos, es decir, uno o más átomos del anillo pueden ser un heteroátomo, por ejemplo, nitrógeno, oxígeno, azufre. El vehículo cíclico puede ser un sistema de anillos monocíclicos, o puede contener dos o más anillos, por ejemplo, anillos condensados. El vehículo cíclico puede ser un sistema de anillos completamente saturados, o puede contener uno o más dobles enlaces.
El ligando puede unirse al polinucleótido mediante un vehículo. Los vehículos incluyen (i) al menos un “punto de unión al esqueleto”, preferentemente dos “puntos de unión al esqueleto” y (ii) al menos un “punto de unión al anclaje”. Un “punto de unión al esqueleto”, como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo funcional, por ejemplo, un grupo hidroxilo, o generalmente, un enlace disponible para, y que es adecuado para la incorporación del vehículo en el esqueleto, por ejemplo, el esqueleto de fosfato, o fosfato modificado, por ejemplo, que contiene azufre, de un ácido ribonucleico. Un “punto de unión al anclaje” (TAP) en algunas realizaciones se refiere a un átomo del anillo constituyente del vehículo cíclico, por ejemplo, un átomo de carbono o un heteroátomo (distinto de un átomo que proporciona un punto de unión al esqueleto), que conecta un resto seleccionado. El resto puede ser, por ejemplo, un hidrato de carbono, por ejemplo monosacárido, disacárido, trisacárido, tetrasacárido, oligosacárido y polisacárido. Opcionalmente, el resto seleccionado está conectado por un anclaje intermedio al vehículo cíclico. Así, el vehículo cíclico frecuentemente incluirá un grupo funcional, por ejemplo, un grupo amino, o generalmente, proporcionará un enlace, que es adecuado para la incorporación o anclaje de otra entidad química, por ejemplo, un ligando al anillo constituyente.
Los agentes de iARN pueden conjugarse con un ligando mediante un vehículo, en el que el vehículo puede ser grupo cíclico o grupo acíclico; preferentemente, el grupo cíclico está seleccionado de pirrolidinilo, pirazolinilo, pirazolidinilo,
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imidazolinilo, imidazolidinilo, piperidinilo, piperazinilo, [1,3]dioxolano, oxazolidinilo, isoxazolidinilo, morfolinilo, tiazolidinilo, isotiazolidinilo, quinoxalinilo, piridazinonilo, tetrahidrofurilo y decalina; preferentemente, el grupo acídico está seleccionado de esqueleto de serinol o esqueleto de dietanolamina.
En ciertas implementaciones específicas, el agente de iARN para su uso en los métodos de la invención es un agente seleccionado del grupo de agentes enumerados en la Tabla 1 y Tabla 2.
Estos agentes puede comprender además un ligando.
A. Ligandos
Los agentes de ARN bicatenario (ARNbc) pueden conjugarse opcionalmente con uno o más ligandos. El ligando puede unirse a la hebra codificante, hebra no codificante o ambas hebras, en el extremo 3', extremo 5' o ambos extremos. Por ejemplo, el ligando puede conjugarse con la hebra codificante. En realizaciones preferidas, el ligando se conjuga con el extremo 3' de la hebra codificante. En una realización preferida, el ligando es un ligando de GalNAc. En realizaciones particularmente preferidas, el ligando es GalNAc3:
imagen3
HO OH
0 ox
HO °-
AcHN
O
'N O H
En algunas realizaciones, el ligando, por ejemplo, ligando de GalNAc, está unido al extremo 3' del agente de iARN. En una realización, el agente de iARN está conjugado con el ligando, por ejemplo, ligando de GalNAc, como se muestra en el siguiente esquema
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en el que X es O o S. En una implementación, X es O.
Puede acoplarse una amplia variedad de entidades a los agentes de iARN de la presente invención. Restos preferidos son ligandos, que se acoplan, preferentemente covalentemente, tanto directa como indirectamente mediante un anclaje intermedio.
En implementaciones preferidas, un ligando altera la distribución, elección de diana o vida útil de la molécula en la que se incorpora. En implementaciones preferidas, un ligando proporciona una afinidad potenciada por una diana seleccionada, por ejemplo, molécula, célula o tipo de célula, compartimento, receptor, por ejemplo, un compartimento celular o de órgano, tejido, órgano o región del cuerpo, como, por ejemplo, en comparación con una especie tal como un ligando. Los ligandos que proporcionan afinidad potenciada por una diana seleccionada también se llaman ligandos que eligen diana.
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Algunos ligandos pueden tener propiedades endosomolíticas. Los ligandos endosomolíticos promueven la lisis del endosoma y/o transporte de la composición de la invención, o sus componentes, del endosoma al citoplasma de la célula. El ligando endosomolítico puede ser un péptido polianiónico o peptidomimético que muestra actividad de la membrana dependiente del pH y fusogenicidad. En una realización, el ligando endosomolítico asume su conformación activa a pH endosómico. La conformación “activa” es aquella conformación en la que el ligando endosomolítico promueve la lisis del endosoma y/o transporte de la composición de la invención, o sus componentes, del endosoma al citoplasma de la célula. Ligandos endosomolíticos a modo de ejemplo incluyen el péptido GALA (Subbarao et al., Biochemistry, 1987, 26: 2964-2972), el péptido EALA (Vogel et al., J. Am. Chem. Soc., 1996, 118: 1581-1586) y sus derivados (Turk et al., Biochem. Biophys. Acta, 2002, 1559: 56-68). En una realización, el componente endosomolítico puede contener un grupo químico (por ejemplo, un aminoácido) que experimentará un cambio en la carga o protonación en respuesta a un cambio en el pH. El componente endosomolítico puede ser lineal o ramificado.
Los ligandos pueden mejorar las propiedades de transporte, hibridación y especificidad y también pueden mejoran la resistencia a nucleasas del oligorribonucleótido natural o modificado resultante, o una molécula polimérica que comprenda cualquier combinación de monómeros descritos en el presente documento y/o ribonucleótidos naturales o modificados
Los ligandos pueden incluir en general modificadores terapéuticos, por ejemplo, para potenciar la captación; compuestos de diagnóstico o grupos indicadores, por ejemplo, para monitorizar la distribución; agentes de reticulación; y restos que confieren resistencia a nucleasas. Ejemplos generales incluyen lípidos, esteroides, vitaminas, azúcares, proteínas, péptidos, poliaminas y peptidomiméticos.
Los ligandos pueden incluir una sustancia que se produce naturalmente, tal como una proteína (por ejemplo, albúmina de suero humano (HSA), lipoproteína de baja densidad (LDL), lipoproteína de alta densidad (HDL) o globulina); un hidrato de carbono (por ejemplo, un dextrano, pululano, quitina, quitosano, inulina, ciclodextrina o ácido hialurónico); o un lípido. El ligando también puede ser una molécula recombinante o sintética, tal como un polímero sintético, por ejemplo, un poliaminoácido sintético, un oligonucleótido (por ejemplo, un aptámero). Ejemplos de poliaminoácidos incluyen poliaminoácido es una polilisina (PLL), ácido poli-L- aspártico, ácido poli-L-glutámico, copolímero de estireno- anhídrido de ácido maleico, copolímero de poli(L-lactida-co-glicolida), copolímero de éter divinílico-anhídrido maleico, copolímero de N-(2-hidroxipropil)metacrilamida (HMPA), polietilenglicol (PEG), poli(alcohol vinílico) (PVA), poliuretano, poli(ácido 2-etilacrílico), polímeros de N-isopropilacrilamida o polifosfazina. Ejemplos de poliaminas incluyen: polietilenimina, polilisina (PLL), espermina, espermidina, poliamina, pseudopéptido-poliamina, poliamina peptidomimética, poliamina dendrímera, arginina, amidina, protamina, lípido catiónico, porfirina catiónica, sal cuaternaria de una poliamina, o un péptido helicoidal alfa.
Los ligandos también pueden incluir grupos que eligen diana, por ejemplo, un agente que elige como diana célula o tejido, por ejemplo, una lectina, glucoproteína, lípido o proteína, por ejemplo, un anticuerpo, que se une a un tipo de célula especificada tal como una célula de riñón. Un grupo que elige diana puede ser una tirotropina, melanotropina, lectina, glucoproteína, proteína A tensioactiva, hidrato de carbono de mucina, lactosa multivalente, galactosa multivalente, N-acetil-galactosamina, N-acetil-glucosamina, manosa multivalente, fucosa multivalente, poliaminoácidos glucosilados, galactosa multivalente, transferrina, bisfosfonato, poliglutamato, poliaspartato, un lípido, colesterol, un esteroide, ácido biliar, folato, vitamina B12, biotina, un péptido RGD, un peptidomimético de RGD o un aptámero.
Otros ejemplos de ligandos incluyen colorantes, agentes intercalantes (por ejemplo, acridinas), reticulantes (por ejemplo, psoraleno, mitomicina C), porfirinas (TPPC4, texafirina, safirinas), hidrocarburos aromáticos policíclicos (por ejemplo, fenazina, dihidrofenazina), endonucleasas artificiales o un quelante (por ejemplo, EDTA), moléculas lipófilas, por ejemplo, colesterol, ácido cólico, ácido adamantanoacético, ácido 1-pirenobutírico, dihidrotestosterona, 1,3-bis- O(hexadecil)glicerol, grupo geraniloxihexilo, hexadecilglicerol, borneol, mentol, 1,3-propanodiol, grupo heptadecilo, ácido palmítico, ácido mirístico, ácido O3-(oleoil)litocólico, ácido O3-(oleoil)colénico, dimetoxitritilo o fenoxazina)y conjugados de péptidos (por ejemplo, péptido de Antennapedia, péptido Tat), agentes alquilantes, fosfato, amino, mercapto, PEG (por ejemplo, PEG-40K), MPEG, [MPEG]2, poliamino, alquilo, alquilo sustituido, marcadores radiomarcados, enzimas, haptenos (por ejemplo, biotina), facilitadores del transporte/absorción (por ejemplo, aspirina, vitamina E, ácido fólico), ribonucleasas sintéticas (por ejemplo, imidazol, bisimidazol, histamina, agrupaciones de imidazol, conjugados de acridina-imidazol, complejos de Eu3+ de tetraazamacrociclos), dinitrofenilo, HRP o AP.
Los ligandos pueden ser proteínas, por ejemplo, glucoproteínas, o péptidos, por ejemplo, moléculas que tienen una afinidad específica por un co-ligando, o anticuerpos, por ejemplo, un anticuerpo, que se une a un tipo de célula especificada tal como una célula cancerosa, célula endotelial o célula ósea. Los ligandos también pueden incluir hormonas y receptores de hormonas. También pueden incluir especies no peptídicas, tales como lípidos, lectinas, hidratos de carbono, vitaminas, cofactores, lactosa multivalente, galactosa multivalente, N-acetil-galactosamina, N- acetil-glucosamina, manosa multivalente, fucosa multivalente o aptámeros. El ligando puede ser, por ejemplo, un lipopolisacárido, un activador de MAP cinasa p38, o un activador de NF-kB.
El ligando puede ser una sustancia, por ejemplo, un fármaco, que puede aumentar la captación del agente de ARNi en la célula, por ejemplo, rompiendo el citoesqueleto de la célula, por ejemplo, rompiendo los microtúbulos, microfilamentos y/o filamentos intermedios de la célula. El fármaco puede ser, por ejemplo, taxon, vincristina, vinblastina, citocalasina, nocodazol, jasplaquinolida, latrunculina A, faloidina, swinholida A, indanocina o mioservina.
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El ligando puede aumentar la captación del oligonucleótido en la célula, por ejemplo, activando una respuesta inflamatoria. Ligandos a modo de ejemplo que tendrían un efecto tal incluyen factor de necrosis tumoral alfa (TNF-alfa), interleucina-1 beta o interferón gamma.
En un aspecto, el ligando es un lípido o molécula basada en lípido. Un lípido o molécula basada en lípido tal se une preferentemente a proteína del suero, por ejemplo, albúmina de suero humano (HSA). Un ligando que se une a HSA permite la distribución del conjugado a un tejido diana, por ejemplo, un tejido diana no de riñón del cuerpo. Por ejemplo, el tejido diana puede ser el hígado, que incluye células del parénquima del hígado. Otras moléculas que pueden unirse a HSA también pueden usarse como ligandos. Por ejemplo, pueden usarse naproxeno o aspirina. Un lípido o ligando basado en lípido puede (a) aumentar la resistencia a la degradación del conjugado, (b) aumentar la elección de diana o transporte en una célula diana o membrana celular, y/o (c) puede usarse para ajustar la unión a una proteína del suero, por ejemplo, HSA.
Un ligando basado en lípido puede usarse para modular, por ejemplo, controlar la unión del conjugado a un tejido diana. Por ejemplo, será menos probable que un lípido o ligando basado en lípido que se une a HSA más fuertemente se dirija al riñón y, por tanto, será menos probable que sea eliminado del cuerpo. Puede usarse un ligando de lípido o basado en lípido que se une a HSA menos fuertemente para dirigir el conjugado al riñón.
En una implementación preferida, el ligando basado en lípido se une a HSA. Preferentemente, se une a HSA con una afinidad suficiente de forma que el conjugado se distribuya preferentemente a un tejido no de riñón. Sin embargo, se prefiere que la afinidad no sea tan fuerte que la unión HSA-ligando no pueda invertirse.
En otra implementación preferida, el ligando basado en lípido se une a HSA débilmente o no se une en absoluto, de forma que el conjugado se distribuirá preferentemente en el riñón. También pueden usarse otros restos que se dirigen a las células del riñón en lugar de o además del ligando basado en lípido.
En otro aspecto, el ligando es un resto, por ejemplo, una vitamina, que es captada por una célula diana, por ejemplo, una célula proliferante. Éstas son particularmente útiles para tratar trastornos caracterizados por proliferación celular no deseada, por ejemplo, de tipo maligno o no maligno, por ejemplo, células cancerosas. Vitaminas a modo de ejemplo incluyen vitamina A, E y K. Otras vitaminas a modo de ejemplo incluyen vitaminas B, por ejemplo, ácido fólico, B12, riboflavina, biotina, piridoxal u otras vitaminas o nutrientes captados por células cancerosas. También se incluyen HAS, lipoproteína de baja densidad (LDL) y lipoproteína de alta densidad (HDL).
En otro aspecto, el ligando es un agente de permeación celular, preferentemente un agente de permeación celular helicoidal. Preferentemente, el agente es anfipático. Un agente a modo de ejemplo es un péptido tal como tat o Antennopedia. Si el agente es un péptido, puede modificarse, que incluye un peptidilmimético, invertómeros, enlaces no peptídicos o pseudo-peptídicos, y el uso de D-aminoácidos. El agente helicoidal es preferentemente un agente helicoidal alfa, que preferentemente tiene una fase lipófila y una lipófoba.
El ligando puede ser un péptido o peptidomimético. Un peptidomimético (también denominado en el presente documento un oligopeptidomimético) es una molécula capaz de plegarse en una estructura tridimensional definida similar a un péptido natural. El resto de péptido o peptidomimético puede tener aproximadamente 5-50 aminoácidos de longitud, por ejemplo, aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ó 50 aminoácidos de longitud. Un péptido o peptidomimético puede ser, por ejemplo, un péptido de permeación celular, péptido catiónico, péptido anfipático o péptido hidrófobo (por ejemplo, que consiste principalmente de Tyr, Trp o Phe). El resto de péptido puede ser un péptido dendrímero, péptido limitado o péptido reticulado. En otra alternativa, el resto de péptido puede incluir una secuencia de translocalización de la membrana hidrófoba (MTS). Un péptido que contiene MTS hidrófoba a modo de ejemplo es RFGF que tiene la secuencia de aminoácidos AAVALLPAVLLALLAP (SEC ID N°: 1). Un análogo de RFGF (por ejemplo, secuencia de aminoácidos AALLPVLLAAP (SEC ID N°: 2)) que contiene una MTS hidrófoba también puede ser un resto que elige diana. El resto de péptido puede ser un péptido de “administración”, que puede llevar grandes moléculas polares que incluyen péptidos, oligonucleótidos y proteína a través de las membranas celulares. Por ejemplo, se ha encontrado que las secuencias de la proteína Tat del VIH (GRKKRRQRRRPPQ (SEC ID N°: 3)) y la proteína Antennapedia de Drosophila (RQIKIWFQNRRMKWKK (SEC ID N°: 4)) pueden funcionar como péptidos de administración. Un péptido o peptidomimético puede codificarse por una secuencia de ADN aleatoria, tal como un péptido identificado de una biblioteca de expresión en fago, o biblioteca combinatoria de una perla-un compuesto (OBOC) (Lam et al., Nature, 354:82-84, 1991). Preferentemente, el péptido o peptidomimético anclado a un agente de ARNi mediante una unidad de monómero incorporada es un péptido que elige como diana una célula tal como un péptido arginina-glicina-ácido aspártico (RGD), o mimético RGD. Un resto de péptido puede oscilar en longitud de aproximadamente 5 aminoácidos a aproximadamente 40 aminoácidos. Los restos de péptido pueden tener una modificación estructural, tal como para aumentar la estabilidad o dirigir propiedades conformacionales. Puede utilizarse cualquiera de las modificaciones estructurales descritas más adelante. Puede usarse un resto de péptido RGD para elegir como diana una célula tumoral, tal como una célula tumoral endotelial o una célula tumoral de cáncer de mama (Zitzmann et al., Cáncer Res., 62:5139-43, 2002). Un péptido RGD puede facilitar dirigir un agente de ARNi a tumores de una variedad de otros tejidos, que incluyen el pulmón, riñón, bazo o hígado (Aoki et al., Cáncer Gene Therapy 8:783- 787, 2001). Preferentemente, el péptido RGD facilitará el dirigir un agente de ARNi al riñón. El péptido RGD puede ser linear o cíclico, y puede modificarse, por ejemplo, glucosilarse o metilarse para facilitar el ser dirigido a tejidos específicos. Por ejemplo, un péptido RGD glucosilado puede administrar un agente de ARNi a una célula tumoral que
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expresa avP3 (Haubner et al., Jour. Nucl. Med., 42:326-336, 2001). Pueden usarse péptidos que eligen como diana marcadores enriquecidos en células proliferantes. Por ejemplo, los péptidos y peptidomiméticos que contienen RGD pueden dirigirse a células cancerosas, en particular células que presentan una integrina. Así, podrían usarse péptidos RGD, péptidos cíclicos que contienen RGD, péptidos RGD que incluyen D-aminoácidos, además de miméticos de RGD sintéticos. Además de RGD, pueden usarse otros restos que eligen como diana el ligando de integrina. Generalmente, tales ligandos pueden usarse para controlar las células proliferantes y la angiogénesis. Conjugados preferidos de este tipo de ligando eligen como diana PECAM-1, VEGF, u otro gen de cáncer, por ejemplo, un gen de cáncer descrito en el presente documento.
Un “péptido de permeación celular” puede permear en una célula, por ejemplo, una célula microbiana, tal como una célula bacteriana o fúngica, o una célula de mamífero, tal como una célula humana. Un péptido de permeación en células microbianas puede ser, por ejemplo, un péptido lineal a-helicoidal (por ejemplo, LL-37 o Ceropin P1), un péptido que contiene enlace disulfuro (por ejemplo, a-defensina, p-defensina o bactenecina), o un péptido que contiene solo uno o dos aminoácidos dominantes (por ejemplo, PR-39 o indolicidina). Un péptido de permeación celular también puede incluir una señal de localización nuclear (NLS). Por ejemplo, un péptido de permeación celular puede ser un péptido anfipático bipartito, tal como MPG, que se deriva del dominio del péptido de fusión de gp41 del VIH-1 y NLS del antígeno T grande del SV40 (Simeoni et al., Nucl. Acids Res. 31:2717-2724, 2003).
En una implementación, un péptido que elige diana puede ser un péptido a-helicoidal anfipático. Péptidos a-helicoidales anfipáticos a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, cecropinas, licotoxinas, paradaxinas, buforina, CPF, péptido similar a bombinina (BLP), catelicidinas, ceratotoxinas, péptidos de S. clava, péptidos antimicrobianos intestinales de pez bruja (HFIAP), magaininas, brevininas-2, dermaseptinas, melitinas, pleurocidina, péptidos de H2A, péptidos de Xenopus, esculentinas-1 y caerinas. Se considerarán preferentemente varios factores para mantener la integridad de la estabilidad de la hélice. Por ejemplo, se utilizará un número máximo de residuos de estabilización de la hélice (por ejemplo, leu, ala o lys) y se utilizará un número mínimo de residuos de desestabilización de la hélice (por ejemplo, prolina, o unidades monoméricas cíclicas. Se considerará el residuo de encapuchado (por ejemplo, Gly es un residuo de encapuchado de N a modo de ejemplo y/o puede usarse amidación del extremo C para proporcionar un enlace de H adicional para estabilizar la hélice. La formación de puentes salinos entre residuos con cargas opuestas, separadas por i ± 3, o i ± 4 posiciones, puede proporcionar estabilidad. Por ejemplo, residuos catiónicos tales como lisina, arginina, homo-arginina, ornitina o histidina pueden formar puentes salinos con los residuos aniónicos glutamato o aspartato.
Ligandos de péptido y peptidomimético incluyen aquellos que tienen péptidos que se producen naturalmente o modificados, por ejemplo, péptidos D o L; péptidos a, p o y; N-metilpéptidos; azapéptidos; péptidos que tienen uno o más enlaces amida, es decir, peptídicos, sustituidos con uno o más enlaces urea, tiourea, carbamato o sulfonilurea; o péptidos cíclicos.
El ligando que elige diana puede ser cualquier ligando que pueda dirigirse a un receptor específico. Ejemplos son: folato, GalNAc, galactosa, manosa, manosa-6P, agrupaciones de azúcares tales como agrupación de GalNAc, agrupación de manosa, agrupación de galactosa o un aptámero. Una agrupación es una combinación de dos o más unidades de azúcar. Los ligandos que eligen diana también incluyen ligandos de receptor de integrina, ligandos de receptor de quimiocina, transferrina, biotina, ligandos de receptor de serotonina, PSMA, endotelina, GCPII, somatostatina, ligandos de LDL y HDL. Los ligandos también pueden basarse en ácido nucleico, por ejemplo, un aptámero. El aptámero puede estar sin modificar o tener cualquier combinación de modificaciones desveladas en el presente documento.
Los agentes de liberación endosómica incluyen imidazoles, poli u oligoimidazoles, PEI, péptidos, péptidos fusogénicos, policaboxilatos, policationes, oligo o policationes o aniones enmascarados, acetales, poliacetales, cetales/policetales, ortoésteres, polímeros con cargas catiónicas o aniónicas enmascaradas o desenmascaradas, dendrímeros con cargas catiónicas o aniónicas enmascaradas o desenmascaradas.
Modulador PC representa modulador farmacocinético. Moduladores PC incluyen lipófilos, ácidos biliares, esteroides, análogos de fosfolípidos, péptidos, agentes de unión a proteínas, PEG, vitaminas, etc. Moduladores PC a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, colesterol, ácidos grasos, ácido cólico, ácido litocólico, dialquilglicéridos, diacilglicérido, fosfolípidos, esfingolípidos, naproxeno, ibuprofeno, vitamina E, biotina, etc. Los oligonucleótidos que comprenden varios enlaces fosforotioato también son conocidos por unirse a proteína del suero, así, oligonucleótidos cortos, por ejemplo, oligonucleótidos de aproximadamente 5 bases, 10 bases, 15 bases o 20 bases, que comprenden múltiples enlaces fosforotioato en el esqueleto también son aceptados para la presente invención como ligandos (por ejemplo, como agentes de modulación PC).
Además, los aptámeros que se unen a componentes del suero (por ejemplo, proteínas del suero) también son aceptados para la presente invención como ligandos moduladores PC.
Otros conjugados de ligando aceptados por la invención se describen en las solicitudes de patente de EE.UU. USSN: 10/916,185, presentada el 10 de agosto de 2004; USSN: 10/946,873, presentada el 21 de septiembre de 2004; USSN: 10/833,934, presentada el 3 de agosto de 2007; USSN: 11/115,989 presentada el 27 de abril de 2005 y USSN: 11/944,227 presentada el 21 de noviembre de 2007.
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Si dos o más ligandos están presentes, los ligandos pueden todos tener las mismas propiedades, todos tener propiedades diferentes, o algunos ligandos tienen las mismas propiedades mientras que otros tienen propiedades diferentes. Por ejemplo, un ligando puede tener propiedades de elección de diana, tener actividad endosomolítica o tener propiedades de modulación PC. En una realización preferida, todos los ligandos tienen propiedades diferentes.
Los ligandos pueden acoplarse a los oligonucleótidos en diversos sitios, por ejemplo, extremo 3', extremo 5', y/o en una posición interna. En realizaciones preferidas, el ligando está unido a los oligonucleótidos mediante un anclaje intermedio, por ejemplo, un vehículo descrito en el presente documento. El ligando o ligando anclado puede estar presente en un monómero cuando el monómero se incorpora en la hebra en crecimiento. En algunas realizaciones, el ligando puede incorporarse mediante acoplamiento con un monómero “precursor” después de que el monómero “precursor” se haya incorporado en la hebra en crecimiento. Por ejemplo, un monómero que tiene, por ejemplo, un anclaje terminado en amino (es decir, que no tiene ligando asociado), por ejemplo, TAP-(CH2)nNH2 puede incorporarse en una hebra de oligonucleótido en crecimiento. En una operación posterior, es decir, después de la incorporación del monómero precursor en la hebra, un ligando que tiene un grupo electrófilo, por ejemplo, un grupo éster pentafluorofenílico o aldehído, puede unirse posteriormente al monómero precursor acoplando el grupo electrófilo del ligando al grupo nucleófilo terminal del anclaje del monómero precursor.
En otro ejemplo, puede incorporarse un monómero que tiene un grupo químico adecuado para tomar parte en la reacción de química de Click, por ejemplo, una anclaje/conector terminado en azida o alquino. En una operación posterior, es decir, después de la incorporación del monómero precursor en la hebra, un ligando que tiene grupo químico complementario, por ejemplo, un alquino o azida puede unirse al monómero precursor acoplando juntos el alquino y la azida.
Para oligonucleótidos bicatenarios, los ligandos pueden unirse a una o ambas hebras. En algunas realizaciones, un agente de ARNi bicatenario contiene un ligando conjugado con la hebra codificante. En otras realizaciones, un agente de ARNi bicatenario contiene un ligando conjugado con la hebra no codificante.
En algunas implementaciones, el ligando puede conjugarse con nucleobases, restos de azúcar o enlaces internucleosídicos de moléculas de ácidos nucleicos. La conjugación con nucleobases de purina o derivados de la misma puede producirse en cualquier posición que incluye, átomos endocíclicos y exocíclicos. En algunas realizaciones, las posiciones 2, 6, 7 u 8 de una nucleobase de purina están unidas a un resto de conjugado. La conjugación con nucleobases de pirimidina o derivados de la misma también puede producirse en cualquier posición. En algunas realizaciones, las posiciones 2, 5 y 6 de una nucleobase de pirimidina pueden estar sustituidas con un resto de conjugado. La conjugación con restos de azúcar de nucleósidos puede producirse en cualquier átomo de carbono. Átomos de carbono de ejemplo de un resto de azúcar que puede unirse a un resto de conjugado incluyen los átomos de carbono 2', 3' y 5'. La posición 1' también puede unirse a un resto de conjugado, tal como en un residuo abásico. Los enlaces internucleosídicos también pueden llevar restos de conjugado. Para enlaces que contienen fósforo (por ejemplo, fosfodiéster, fosforotioato, fosforoditioato, fosforoamidato y similares), el resto de conjugado puede unirse directamente al átomo de fósforo o a un átomo de O, No S unido al átomo de fósforo. Para enlaces internucleosídicos que contienen amina o amida (por ejemplo, PNA), el resto de conjugado puede unirse al átomo de nitrógeno de la amina o amida o a un átomo de carbono adyacente.
Puede usarse cualquier ligando adecuado en el campo de la interferencia por ARN, aunque el ligando normalmente es un hidrato de carbono, por ejemplo, monosacárido (tal como GalNAc), disacárido, trisacárido, tetrasacárido, polisacárido.
Conectores que conjugan el ligando con el ácido nucleico incluyen aquellos tratados anteriormente. Por ejemplo, el ligando puede ser uno o más derivados de GalNAc (W-acetilglucosamina) unidos mediante un conector ramificado bivalente o trivalente.
En una implementación, el ARNbc de la invención está conjugado con un conector ramificado bivalente y trivalente que incluye las estructuras mostradas en cualquiera de las fórmulas (IV) - (VII):
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q2A, q2B, q3A, q3B, q4A, q4B, q5A, q5B y q5C representan independientemente para cada aparición 0-20 y en los que la
unidad de repetición puede ser igual o diferente;
p2A p2B p3A p3B p4A p4B p5A p5B p5C -p2A ”|"
para cada aparición ausentes, son CO, nH, O, S, OC(O), NHC(O), CH2, CH2NH o CH2O;
P2A, P2B, P3A, P3B, P4A, P4B, P5A, P5B, P5C, T2A, T2B, T3A, T3B, T4A, T4B, T4A, T5B, T5C están cada uno independientemente
Q2A, Q2B, Q3A, Q3B, Q4A, Q4B, Q5A, Q5B, Q5C están independientemente para cada aparición ausentes, son alquileno, alquileno sustituido en los que uno o más metilenos pueden interrumpirse o terminarse con uno o más de O, S, S(O), SO2, N(Rn), C(R')=C(R''), CeC o C(O);
R2A, R2B, R3A, R3B, R4A, R4B, R5A, R5B, R5C están cada uno independientemente para cada aparición ausentes, son NH, O, S, CH2, C(O)O, C(O)NH, NHCH(Ra)C(O), -C(O)-CH(Ra)-NH-,
O
HO
CO,CH=N-O
s—S.
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O
=N
N
H ,
S—S.
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s—S.
\^o
heterociclilo;
L2A, L2B, L3A, L3B, L4A, L4B, L5A, L5B y L5C representan el ligando; es decir, cada uno independientemente para cada
aparición un monosacárido (tal como GalNAc), disacárido, trisacárido, tetrasacárido, oligosacárido o polisacárido; y
Ra es H o cadena lateral de aminoácido.
Los derivados de GalNAc de conjugación trivalentes son particularmente útiles para su uso con agentes de iARN para inhibir la expresión de un gen diana, tal como aquellos de fórmula (VII):
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Fórmula (VII),
en la que L5A, L5B y L5C representan un monosacárido, tal como GalNAc derivado.
Ejemplos de grupos conectores ramificados bivalentes y trivalentes adecuados que se conjugan con derivados de GalNAc incluyen, pero no se limitan a, los siguientes compuestos:
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HO
HO-
OH
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AcHN
N O H
O
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Oí
HO /°H
HO^V<
O
NHAc
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O
O
O
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O
NHAc
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o
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En otras implementaciones, el agente de iARN para su uso en los métodos de la invención es un agente seleccionado del grupo que consiste en AD-53815, AD-56663, AD-56658, AD-56676, AD-56666, AD-57928 y AD-60212.
III. Administración de un ARNi de la invención
La administración de un agente de ARNi de la invención a una célula, por ejemplo, una célula dentro de un sujeto, tal como un sujeto humano (por ejemplo, un sujeto en necesidad del mismo, tal como un sujeto que tiene un trastorno de lípidos, tal como a hiperlipidemia) puede lograrse de varias formas diferentes. Por ejemplo, la administración puede realizarse poniendo en contacto una célula con un ARNi de la invención tanto in vitro como in vivo. La administración in vivo también puede realizarse directamente administrando una composición que comprende un ARNi, por ejemplo, un ARNbc, a un sujeto. Alternativamente, la administración in vivo puede realizarse indirectamente administrando uno o más vectores que codifican y dirigen la expresión del ARNi. Estas alternativas se tratan adicionalmente más adelante.
En general, puede adaptarse cualquier método de administración de una molécula de ácido nucleico (in vitro o in vivo) para su uso con un ARNi de la invención (véase, por ejemplo, Akhtar S. y Julian RL. (1992) Trends Cell. Biol. 2(5):139- 144 y el documento WO94/02595, que se incorporan en el presente documento por referencia en sus totalidades). Para administración in vivo, factores a considerar con el fin de administrar una molécula de ARNi incluyen, por ejemplo, estabilidad biológica de la molécula administrada, prevención de efectos no específicos y acumulación de la molécula administrada en el tejido diana. Los efectos no específicos de un ARNi pueden minimizarse por administración local, por ejemplo, por inyección directa o implantación en un tejido o administrando tópicamente la preparación. La administración local a un sitio de tratamiento maximiza la concentración local del agente, limita la exposición del agente a tejidos sistémicos que pueden de otro modo ser dañados por el agente o que pueden degradar el agente, y permite administrar una menor dosis total de la molécula de ARNi. Varios estudios han mostrado la inactivación satisfactoria de productos génicos cuando se administra localmente un ARNi. Por ejemplo, se mostró que la administración intraocular de un ARNbc de VEGF por inyección intravítrea en monos cinomolgos (Tolentino, MJ., et al. (2004) Retina 24:132-138) e inyecciones subretinianas en ratones (Reich, SJ., et al. (2003) Mol. Vis. 9:210-216) previnieron ambas la neovascularización en un modelo experimental de degeneración macular senil. Además, la inyección intratumoral directa de un ARNbc en ratones reduce el volumen del tumor (Pille, J., et al. (2005) Mol. Ther.11:267-274) y puede prolongar la supervivencia de ratones portadores de tumor (Kim, WJ., et al. (2006) Mol. Ther. 14:343-350; Li, S., et al.
(2007) Mol. Ther. 15:515-523). La interferencia por ARN también ha mostrado éxito con la administración local al SNC por inyección directa (Dorn, G., et al. (2004) Nucleic Acids 32:e49; Tan, PH., et al. (2005) Gene Ther. 12:59-66; Makimura, H., et al. (2002) BMC Neurosci. 3:18; Shishkina, GT., et al. (2004) Neuroscience 129:521-528; Thakker, ER., et al. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101:17270-17275; Akaneya, Y., et al. (2005) J. Neurophysiol. 93:594-602) y a los pulmones por administración intranasal (Howard, KA., et al. (2006) Mol. Ther. 14:476-484; Zhang, X., et al. (2004) J. Biol. Chem. 279:10677-10684; Bitko, V., et al. (2005) Nat. Med. 11:50-55). Para administrar un ARNi sistémicamente para el tratamiento de una enfermedad, el ARN puede modificarse o alternativamente administrarse usando un sistema de administración de fármacos; ambos métodos actúan previniendo la rápida degradación del ARNbc por endo- y exo- nucleasas in vivo. La modificación del ARN o el vehículo farmacéutico también puede dirigir la composición de ARNi al tejido diana y evitar efectos inespecíficos no deseables. Las moléculas de ARNi pueden modificarse por conjugación química con grupos lipófilos tales como colesterol para potenciar la captación celular y prevenir la degradación. Por ejemplo, se inyectó un ARNi dirigido contra ApoB conjugado con un resto de colesterol lipófilo sistémicamente en ratones y produjo la inactivación del ARNm de apoB en tanto el hígado como el yeyuno (Soutschek, J., et al. (2004) Nature 432:173-178). Se ha mostrado que la conjugación de un ARNi con un aptámero inhibe el crecimiento tumoral y media en la regresión tumoral en un modelo de ratón de cáncer de próstata (McNamara, JO., et al. (2006) Nat. Biotechnol. 24:1005-1015). En una realización alternativa, el ARNi puede administrarse usando sistemas de administración de fármacos tales como una nanopartícula, un dendrímero, un polímero, liposomas o un sistema de administración catiónica. Los sistemas de administración catiónica positivamente cargados facilitan la unión de una molécula de ARNi (negativamente cargada) y también potencian interacciones en la membrana celular negativamente cargada para permitir la eficaz captación de un ARNi por la célula. Lípidos catiónicos, dendrímeros o polímeros pueden tanto unirse a un ARNi, como ser inducidos para formar una vesícula o micela (véase, por ejemplo, Kim SH., et al.
(2008) Journal of Controlled Release 129(2):107-116) que reviste un ARNi. La formación de vesículas o micelas previene adicionalmente la degradación del ARNi cuando se administra sistémicamente. Métodos de preparación y
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administración de complejos catiónicos de ARNi están perfectamente dentro de las capacidades de un experto en la materia (véanse, por ejemplo, Sorensen, DR., et al. (2003) J. Mol. Biol 327:761-766; Verma, UN., et al. (2003) Clin. Cáncer Res. 9:1291-1300; Arnold, AS et al. (2007) J. Hypertens. 25:197-205, que se incorporan en el presente documento por referencia en su totalidad). Algunos ejemplos no limitantes de sistemas de administración de fármacos útiles para la administración sistémico de ARNi incluyen DOTAP (Sorensen, DR., et al. (2003), arriba; Verma, UN., et al. (2003), arriba), Oligofectamine, “partículas lipídicas de ácidos nucleicos sólidos” (Zimmermann, TS., et al. (2006) Nature 441:111-114), cardiolipina (Chien, PY., et al. (2005) Cancer Gene Ther. 12:321-328; Pal, A., et al. (2005) Int J. Oncol. 26:1087-1091), polietilenimina (Bonnet ME., et al. (2008) Pharm. Res. Aug 16 Publicación electrónica antes de la impresión; Aigner, A. (2006) J. Biomed. Biotechnol. 71659), péptidos Arg-Gly-Asp (RGD) (Liu, S. (2006) Mol. Pharm. 3:472-487) y poliamidoaminas (Tomalia, DA., et al. (2007) Biochem. Soc. Trans. 35:61-67; Yoo, H., et al. (1999) Pharm. Res. 16:1799-1804). En algunas implementaciones, un ARNi forma un complejo con ciclodextrina para administración sistémica. Métodos para administración y composiciones farmacéuticas de ARNi y ciclodextrinas pueden encontrarse en la patente de EE.UU. n° 7,427,605.
A. ARNi codificados por vector de la invención
El ARNi dirigido al gen PCSK9 puede expresarse de unidades de transcripción insertadas en vectores de ADN o ARN (véanse, por ejemplo, Couture, A, et al., TIG. (1996), 12:5-10; Skillern, A., et al., publicación PCT internacional n° WO 00/22113, Conrad, publicación PCT internacional n° WO 00/22114, y Conrad, patente de EE.UU. n° 6,054,299). La expresión puede ser transitoria (en el orden de horas a semanas) o sostenida (semanas a meses o más), dependiendo de la construcción específica usada y el tejido diana o tipo de célula. Estos transgenes pueden introducirse como una construcción lineal, un plásmido circular o un vector viral, que puede ser un vector integrante o no integrante. El transgén también puede construirse para permitir que sea heredado como un plásmido extracromosómico (Gassmann, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92:1292).
La hebra o hebras individuales de un ARNi pueden transcribirse de un promotor en un vector de expresión. Si van a expresarse dos hebras separadas para generar, por ejemplo, un ARNbc, dos vectores de expresión separados pueden co-introducirse (por ejemplo, por transfección o infección) en una célula diana. Alternativamente, cada hebra individual de un ARNbc puede transcribirse por promotores ambos de los cuales están localizados sobre el mismo plásmido de expresión. En una realización, un ARNbc se expresa como polinucleótidos de repetición invertida unidos por una secuencia de polinucleótidos conectora de forma que el ARNbc tenga una estructura de tallo y bucle.
Los vectores de expresión de ARNi son generalmente plásmidos de ADN o vectores virales. Pueden usarse vectores de expresión compatibles con células eucariotas, preferentemente aquellos compatibles con células de vertebrado, para producir construcciones recombinantes para la expresión de un ARNi como se describe en el presente documento. Los vectores de expresión en células eucariotas son muy conocidos en la técnica y están disponibles de varias fuentes comerciales. Normalmente, se proporcionan vectores tales que contienen sitios de restricción convenientes para la inserción del segmento de ácido nucleico deseado. La administración de vectores que expresan ARNi puede ser sistémica, tal como por administración intravenosa o intramuscular, por administración a células diana explantadas del paciente, seguido de reintroducción en el paciente, o por cualquier otro medio que permita la introducción en una célula diana deseada.
Los plásmidos de expresión de ARNi pueden transfectarse en células diana como un complejo con vehículos de lípidos catiónicos (por ejemplo, Oligofectamine) o vehículos basados en lípidos no catiónicos (por ejemplo, Transit-TKO™). La invención también contempla múltiples transfecciones de lípidos para inactivaciones mediadas por ARNi dirigidas a diferentes regiones de un ARN diana durante un periodo de una semana o más. La satisfactoria introducción de vectores en células huésped puede monitorizarse usando diversos métodos conocidos. Por ejemplo, la transfección transitoria puede señalizarse con un indicador, tal como un marcador fluorescente, tal como proteína verde fluorescente (GFP). La transfección estable de células ex vivo puede garantizarse usando marcadores que proveen la célula transfectada de resistencia a factores medioambientales específicos (por ejemplo, antibióticos y fármacos), tales como resistencia a higromicina B.
Sistemas de vectores virales que pueden utilizarse con los métodos y composiciones descritos en el presente documento incluyen, pero no se limitan a, (a) vectores de adenovirus; (b) vectores de retrovirus, que incluyen, pero no se limitan a, vectores lentivirales, virus de la leucemia murina de Moloney, etc.; (c) vectores de virus adeno-asociados; (d) vectores del virus del herpes simple; (e) vectores del SV 40; (f) vectores del virus del polioma; (g) vectores del virus del papiloma; (h) vectores de picornavirus; (i) vectores del virus de la viruela tales como un ortopox, por ejemplo, vectores del virus de la variolovacuna o avipox, por ejemplo, viruela del canario o viruela aviar; y (j) un adenovirus dependiente de colaborador o de Gutless. También pueden ser ventajosos virus defectuosos en la replicación. Diferentes vectores se incorporarán o no se incorporarán en el genoma de las células. Las construcciones pueden incluir secuencias virales para la transfección, si se desea. Alternativamente, la construcción puede incorporarse en vectores capaces de replicación episómica, por ejemplo, vectores de EPV y EBV. Las construcciones para la expresión recombinante de un ARNi generalmente requerirán elementos reguladores, por ejemplo, promotores, potenciadores, etc., para garantizar la expresión del ARNi en células diana. Otros aspectos a considerar para los vectores y construcciones se describen adicionalmente más adelante.
Vectores útiles para la administración de un ARNi incluirán elementos reguladores (promotor, potenciador, etc.)
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suficientes para la expresión del ARNi en la célula o tejido diana deseado. Los elementos reguladores pueden elegirse para proporcionar tanto expresión constitutiva como regulada/inducible.
La expresión del ARNi puede regularse con precisión, por ejemplo, usando una secuencia reguladora inducible que es sensible aciertos reguladores fisiológicos, por ejemplo, niveles de glucosa circulante, u hormonas (Docherty et al., 1994, FASEB J. 8:20-24). Tales sistemas de expresión inducibles, adecuados para el control de la expresión de ARNbc en células o en mamíferos incluyen, por ejemplo, regulación por ecdisona, por estrógeno, progesterona, tetraciclina, inductores químicos de la dimerización e isopropil-beta-D1-tiogalactopiranósido (IPTG). Un experto en la materia sería capaz de elegir la secuencia reguladora/ promotora apropiada basándose en el uso previsto del transgén de ARNi.
Pueden usarse vectores virales que contienen secuencias de ácidos nucleicos que codifican un ARNi. Por ejemplo, puede usarse un vector retroviral (véase Miller et al., Meth. Enzymol. 217:581-599 (1993)). Estos vectores retrovirales contienen los componentes necesarios para la correcta encapsidación del genoma viral e integración en el ADN de la célula huésped. Las secuencias de ácidos nucleicos que codifican un ARNi se clonan en uno o más vectores, que facilitan la administración del ácido nucleico en un paciente. Más detalles sobre vectores retrovirales pueden encontrarse, por ejemplo, en Boesen et al., Biotherapy 6:291-302 (1994), que describe el uso de un vector retroviral para administrar el gen mdr1 a citoblastos hematopoyéticos con el fin de hacer los citoblastos más resistentes a la quimioterapia. Otras referencias que ilustran el uso de vectores retrovirales en terapia génica son: Clowes et al., J. Clin. Invest. 93:644-651 (1994); Kiem et al., Blood 83:1467-1473 (1994); Salmons y Gunzberg, Human Gene Therapy 4:129- 141 (1993); y Grossman y Wilson, Curr. Opin. in Genetics and Devel. 3:110-114 (1993). Vectores lentivirales contemplados para su uso incluyen, por ejemplo, los vectores basados en el VIH descritos en las patentes de EE.UU. n° 6,143,520; 5,665,557; y 5,981,276.
También se contemplan adenovirus para su uso en la administración de ARNi de la invención. Los adenovirus son vehículos especialmente atractivos, por ejemplo, para administrar genes a epitelios respiratorios. Los adenovirus infectan naturalmente epitelios respiratorios en los que producen una leve enfermedad. Otras dianas para los sistemas de administración basados en adenovirus son el hígado, el sistema nervioso central, células endoteliales y músculo. Los adenovirus tienen la ventaja de ser capaces de infectar células que no se dividen. Kozarsky y Wilson, Current Opinion in Genetics and Development 3:499-503 (1993) presentan una revisión de la terapia génica basada en adenovirus. Bout et al., Human Gene Therapy 5:3-10 (1994) demostraron el uso de vectores de adenovirus para transferir genes a los epitelios respiratorios en monos rhesus. Otros ejemplos del uso de adenovirus en terapia génica pueden encontrarse en Rosenfeld et al., Science 252:431-434 (1991); Rosenfeld et al., Cell 68:143-155 (1992); Mastrangeli et al., J. Clin. Invest. 91:225-234 (1993); publicación PCT WO94/12649; y Wang, et al., Gene Therapy 2:775-783 (1995). Un vector de AV adecuado para expresar un ARNi caracterizado en la invención, un método para construir el vector de AV recombinante y un método para administrar el vector en células diana se describen en Xia H et al. (2002), Nat. Biotech. 20: 1006-1010.
También pueden usarse vectores de virus adeno-asociados (AAV) para la administración de un ARNi de la invención (Walsh et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 204:289-300 (1993); patente de EE.UU. n° 5,436,146). En una realización, el ARNi puede expresarse como dos moléculas de ARN monocatenario complementarias separadas de un vector de AAV recombinante que tiene, por ejemplo, tanto los promotores del ARN U6 o H1 como el promotor del citomegalovirus (CMV). Vectores de AAV adecuados para expresar el ARNbc caracterizado en la invención, métodos para construir el vector de AV recombinante y métodos para administrar los vectores en células diana se describen en Samulski R et al. (1987), J. Virol. 61: 3096-3101; Fisher K J et al. (1996), J. Virol, 70: 520-532; Samulski R et al. (1989), J. Virol. 63: 38223826; patente de EE.UU. n° 5,252,479; patente de EE.UU. n° 5,139,941; solicitud de patente internacional n° WO 94/13788; y solicitud de patente internacional n° WO 93/24641, cuyas divulgaciones enteras se incorporan en el presente documento por referencia.
Otro vector viral adecuado para la administración de un ARNi de la invención es un virus de la viruela tal como un virus de la variolovacuna, por ejemplo, una variolovacuna atenuada tal como el virus de Ankara modificado (MVA) o NYVAC, un avipox tal como la viruela aviar o la viruela del canario.
El tropismo de vectores virales puede modificarse pseudotipando los vectores con proteínas de la envuelta u otros antígenos de superficie de otros virus, o sustituyendo diferentes proteínas de la cápside viral, según convenga. Por ejemplo, pueden pseudotiparse vectores lentivirales con proteínas de la superficie del virus de la estomatitis vesicular (VSV), rabia, Ébola, Mokola y similares. Los vectores de AAV pueden prepararse para dirigirse a diferentes células manipulando por ingeniería los vectores para expresar diferentes serotipos de proteínas de la cápside; véanse, por ejemplo, Rabinowitz J E et al. (2002), J Virol 76:791-801.
La preparación farmacéutica de un vector puede incluir el vector en un diluyente aceptable, o puede incluir una matriz de liberación lenta en la que está incorporada el vehículo de administración del gen. Alternativamente, si el vector de administración del gen completo puede producirse intacto de células recombinantes, por ejemplo, vectores retrovirales, la preparación farmacéutica puede incluir una o más células que producen el sistema de administración del gen.
V. Composiciones farmacéuticas de la invención
La presente invención también incluye composiciones farmacéuticas y formulaciones que incluyen los ARNi de la invención. En una implementación, en el presente documento se proporcionan composiciones farmacéuticas que
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contienen un ARNi, como se describe en el presente documento, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Las composiciones farmacéuticas que contienen el ARNi son útiles para tratar una enfermedad o trastorno asociado a la expresión o actividad de un gen PCSK9, por ejemplo, un trastorno de lípidos. Tales composiciones farmacéuticas se formulan basándose en el modo de administración. Un ejemplo es composiciones que se formulan para administración sistémica mediante administración parenteral, por ejemplo, por administración intravenosa (IV). Otro ejemplo es composiciones que se formulan para administración directa en el parénquima cerebral, por ejemplo, por infusión en el cerebro, tal como por infusión con bomba continua.
Las composiciones farmacéuticas que comprenden agentes de iARN de la invención pueden ser, por ejemplo, disoluciones con o sin un tampón, o composiciones que contienen vehículos farmacéuticamente aceptables. Tales composiciones incluyen, por ejemplo, composiciones acuosas o cristalinas, formulaciones liposómicas, formulaciones micelares, emulsiones y vectores de terapia génica.
En los métodos descritos, el agente de iARN puede administrarse en una disolución. Un agente de iARN libre puede administrarse en una disolución no tamponada, por ejemplo, en solución salina o en agua. Alternativamente, el ARNip libre también puede administrarse en una disolución de tampón adecuada. La disolución de tampón puede comprender acetato, citrato, prolamina, carbonato o fosfato, o cualquier combinación de los mismos. En una realización preferida, la disolución de tampón es solución salina tamponada con fosfato (PBS). El pH y osmolaridad de la disolución de tampón que contiene el agente de iARN puede ajustarse de forma que sea adecuada para administración a un sujeto.
En algunas implementaciones, la disolución de tampón comprende además un agente para controlar la osmolaridad de la disolución, de forma que la osmolaridad se mantenga en un valor deseado, por ejemplo, a los valores fisiológicos del plasma humano. Solutos que puede añadirse a la disolución de tampón para controlar la osmolaridad incluyen, pero no se limitan a, proteínas, péptidos, aminoácidos, polímeros no metabolizados, vitaminas, iones, azúcares, metabolitos, ácidos orgánicos, lípidos o sales. En algunas realizaciones, el agente para controlar la osmolaridad de la disolución es una sal. En ciertas implementaciones, el agente para controlar la osmolaridad de la disolución es cloruro sódico o cloruro de potasio.
Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden administrarse en dosificaciones suficientes para inhibir la expresión de un gen PCSK9. En general, una dosis adecuada de un ARNi de la invención estará en el intervalo de aproximadamente 0.001 a aproximadamente 200.0 miligramos por kilogramo de peso corporal del receptor por día, generalmente en el intervalo de aproximadamente 1 a 50 mg por kilogramo de peso corporal por día. Por ejemplo, el ARNbc puede administrarse a aproximadamente 0.01 mg/kg, aproximadamente 0.05 mg/kg, aproximadamente 0.5 mg/kg, aproximadamente 1 mg/kg, aproximadamente 1.5 mg/kg, aproximadamente 2 mg/kg, aproximadamente 3 mg/kg, aproximadamente 10 mg/kg, aproximadamente 20 mg/kg, aproximadamente 30 mg/kg, aproximadamente 40 mg/kg o aproximadamente 50 mg/kg por dosis única.
Por ejemplo, el agente de iARN, por ejemplo, ARNbc, puede administrarse a una dosis de aproximadamente 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9, 9.1, 9.2, 9.3, 9.4, 9.5, 9.6, 9.7, 9.8, 9.9, o aproximadamente 10 mg/kg. Valores e intervalos intermedios a los valores citados también pretenden ser parte de la presente invención.
En otra implementación, el agente de iARN, por ejemplo, ARNbc, se administra a una dosis de aproximadamente 0.1 a
aproximadamente
50 mg/kg, aproximadamente 0.25 a aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 0.5 a
aproximadamente
50 mg/kg, aproximadamente 0.75 a aproximadamente 50 mg/kg aproximadamente 1 a
aproximadamente
50 mg/mg, aproximadamente 1.5 a aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 2 a
aproximadamente
50 mg/kg, aproximadamente 2.5 a aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 3 a
aproximadamente
50 mg/kg, aproximadamente 3.5 a aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 4 a
aproximadamente
50 mg/kg, aproximadamente 4.5 a aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 5 a
aproximadamente
50 mg/kg, aproximadamente 7.5 a aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 10 a
aproximadamente
50 mg/kg, aproximadamente 15 a aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 20 a
aproximadamente
50 mg/kg, aproximadamente 20 a aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 25 a
aproximadamente
50 mg/kg, aproximadamente 25 a aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 30 a
aproximadamente
50 mg/kg, aproximadamente 35 a aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 40 a
aproximadamente
50 mg/kg, aproximadamente 45 a aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 0.1 a
aproximadamente
45 mg/kg, aproximadamente 0.25 a aproximadamente 45 mg/kg, aproximadamente 0.5 a
aproximadamente
45 mg/kg, aproximadamente 0.75 a aproximadamente 45 mg/kg, aproximadamente 1 a
aproximadamente
45 mg/mg, aproximadamente 1.5 a aproximadamente 45 mg/kg, aproximadamente 2 a
aproximadamente
45 mg/kg, aproximadamente 2.5 a aproximadamente 45 mg/kg, aproximadamente 3 a
aproximadamente
45 mg/kg, aproximadamente 3.5 a aproximadamente 45 mg/kg, aproximadamente 4 a
aproximadamente
45 mg/kg, aproximadamente 4.5 a aproximadamente 45 mg/kg, aproximadamente 5 a
aproximadamente
45 mg/kg, aproximadamente 7.5 a aproximadamente 45 mg/kg, aproximadamente 10 a
aproximadamente
45 mg/kg, aproximadamente 15 a aproximadamente 45 mg/kg, aproximadamente 20 a
aproximadamente
45 mg/kg, aproximadamente 20 a aproximadamente 45 mg/kg, aproximadamente 25 a
aproximadamente
45 mg/kg, aproximadamente 25 a aproximadamente 45 mg/kg, aproximadamente 30 a
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aproximadamente 45 mg/kg, aproximadamente 35 a aproximadamente 45 mg/kg, aproximadamente 40 a

aproximadamente 45 mg/kg, aproximadamente 0.1 a aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 0.25 a

aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 0.5 a aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 0.75 a

aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 1 a aproximadamente 40 mg/mg, aproximadamente 1.5 a

aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 2 a aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 2.5 a

aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 3 a aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 3.5 a

aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 4 a aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 4.5 a

aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 5 a aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 7.5 a

aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 10 a aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 15 a

aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 20 a aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 20 a

aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 25 a aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 25 a

aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 30 a aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 35 a

aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 0.1 a aproximadamente 30 mg/kg, aproximadamente 0.25 a

aproximadamente 30 mg/kg, aproximadamente 0.5 a aproximadamente 30 mg/kg, aproximadamente 0.75 a

aproximadamente 30 mg/kg, aproximadamente 1 a aproximadamente 30 mg/mg, aproximadamente 1.5 a

aproximadamente 30 mg/kg, aproximadamente 2 a aproximadamente 30 mg/kg, aproximadamente 2.5 a

aproximadamente 30 mg/kg, aproximadamente 3 a aproximadamente 30 mg/kg, aproximadamente 3.5 a

aproximadamente 30 mg/kg, aproximadamente 4 a aproximadamente 30 mg/kg, aproximadamente 4.5 a

aproximadamente 30 mg/kg, aproximadamente 5 a aproximadamente 30 mg/kg, aproximadamente 7.5 a

aproximadamente 30 mg/kg, aproximadamente 10 a aproximadamente 30 mg/kg, aproximadamente 15 a

aproximadamente 30 mg/kg, aproximadamente 20 a aproximadamente 30 mg/kg, aproximadamente 20 a

aproximadamente 30 mg/kg, aproximadamente 25 a aproximadamente 30 mg/kg, aproximadamente 0.1 a

aproximadamente 20 mg/kg, aproximadamente 0.25 a aproximadamente 20 mg/kg, aproximadamente 0.5 a aproximadamente 20 mg/kg, aproximadamente 0.75 a aproximadamente 20 mg/kg, aproximadamente 1 a

aproximadamente 20 mg/mg, aproximadamente 1.5 a aproximadamente 20 mg/kg, aproximadamente 2 a aproximadamente 20 mg/kg, aproximadamente 2.5 a aproximadamente 20 mg/kg, aproximadamente 3 a

aproximadamente 20 mg/kg, aproximadamente 3.5 a aproximadamente 20 mg/kg, aproximadamente 4 a

aproximadamente 20 mg/kg, aproximadamente 4.5 a aproximadamente 20 mg/kg, aproximadamente 5 a

aproximadamente 20 mg/kg, aproximadamente 7.5 a aproximadamente 20 mg/kg, aproximadamente 10 a
aproximadamente 20 mg/kg, o aproximadamente 15 a aproximadamente 20 mg/kg. Valores e intervalos intermedios a los valores citados también pretenden ser parte de la presente divulgación.
Por ejemplo, el agente de iARN, por ejemplo, ARNbc, puede administrarse a una dosis de aproximadamente 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9,
2, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7,
4.8, 4.9, 5, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5,
7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9, 9.1, 9.2, 9.3, 9.4, 9.5, 9.6, 9.7, 9.8, 9.9, o
aproximadamente 10 mg/kg. Valores e intervalos intermedios a los valores citados también pretenden ser parte de la presente divulgación.
En otra implementación, el agente de iARN, por ejemplo, ARNbc, se administra a una dosis de aproximadamente 0.5 a
aproximadamente
50 mg/kg, aproximadamente 0.75 a aproximadamente 50 mg/kg , aproximadamente 1 a
aproximadamente
50 mg/mg, aproximadamente 1.5 a aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 2 a
aproximadamente
50 mg/kg, aproximadamente 2.5 a aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 3 a
aproximadamente
50 mg/kg, aproximadamente 3.5 a aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 4 a
aproximadamente
50 mg/kg, aproximadamente 4.5 a aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 5 a
aproximadamente
50 mg/kg, aproximadamente 7.5 a aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 10 a
aproximadamente
50 mg/kg, aproximadamente 15 a aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 20 a
aproximadamente
50 mg/kg, aproximadamente 20 a aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 25 a
aproximadamente
50 mg/kg, aproximadamente 25 a aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 30 a
aproximadamente
50 mg/kg, aproximadamente 35 a aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 40 a
aproximadamente
50 mg/kg, aproximadamente 45 a aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 0.5 a
aproximadamente
45 mg/kg, aproximadamente 0.75 a aproximadamente 45 mg/kg , aproximadamente 1 a
aproximadamente
45 mg/mg, aproximadamente 1.5 a aproximadamente 45 mg/kg, aproximadamente 2 a
aproximadamente
45 mg/kg, aproximadamente 2.5 a aproximadamente 45 mg/kg, aproximadamente 3 a
aproximadamente
45 mg/kg, aproximadamente 3.5 a aproximadamente 45 mg/kg, aproximadamente 4 a
aproximadamente
45 mg/kg, aproximadamente 4.5 a aproximadamente 45 mg/kg, aproximadamente 5 a
aproximadamente
45 mg/kg, aproximadamente 7.5 a aproximadamente 45 mg/kg, aproximadamente 10 a
aproximadamente
45 mg/kg, aproximadamente 15 a aproximadamente 45 mg/kg, aproximadamente 20 a
aproximadamente
45 mg/kg, aproximadamente 20 a aproximadamente 45 mg/kg, aproximadamente 25 a
aproximadamente
45 mg/kg, aproximadamente 25 a aproximadamente 45 mg/kg, aproximadamente 30 a
aproximadamente
45 mg/kg, aproximadamente 35 a aproximadamente 45 mg/kg, aproximadamente 40 a
aproximadamente
45 mg/kg, aproximadamente 0.5 a aproximadamente 40 mg/kg, a proximadamente 0.75 a
aproximadamente
40 mg/kg, aproximadamente 1 a ! aproximadamente 40 mg/mg, aproximadamente 1.5 a
aproximadamente
40 mg/kg, aproximadamente 2 a aproximadamente 4 0 mg/kg, aproximadamente 2.5 a
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40 mg/kg, aproximadamente 3 a aproximadamente 4 0 mg/kg, aproximadamente 3.5 a
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40 mg/kg, aproximadamente 4 a aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 4.5 a
aproximadamente
40 mg/kg, aproximadamente 5 a aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 7.5 a
aproximadamente
40 mg/kg, aproximadamente 10 a aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 15 a
aproximadamente
40 mg/kg, aproximadamente 20 a aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 20 a
aproximadamente
40 mg/kg, aproximadamente 25 a aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 25 a
aproximadamente
40 mg/kg, aproximadamente 30 a aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 35 a
aproximadamente
40 mg/kg, aproximadamente 0.5 a aproximadamente 30 mg/kg, aproximadamente 0.75 a
aproximadamente
30 mg/kg, aproximadamente 1 a aproximadamente 30 mg/mg, aproximadamente 1.5 a
aproximadamente
30 mg/kg, aproximadamente 2 a aproximadamente 30 mg/kg, aproximadamente 2.5 a
aproximadamente
30 mg/kg, aproximadamente 3 a aproximadamente 30 mg/kg, aproximadamente 3.5 a
aproximadamente
30 mg/kg, aproximadamente 4 a aproximadamente 30 mg/kg, aproximadamente 4.5 a
aproximadamente
30 mg/kg, aproximadamente 5 a aproximadamente 30 mg/kg, aproximadamente 7.5 a
aproximadamente
30 mg/kg, aproximadamente 10 a aproximadamente 30 mg/kg, aproximadamente 15 a
aproximadamente
30 mg/kg, aproximadamente 20 a aproximadamente 30 mg/kg, aproximadamente 20 a
aproximadamente
30 mg/kg, aproximadamente 25 a aproximadamente 30 mg/kg, aproximadamente 0.5 a
aproximadamente
20 mg/kg, aproximadamente 0.75 a aproximadamente 20 mg/kg , aproximadamente 1 a
aproximadamente 20 mg/mg, aproximadamente 1.5 a aproximadamente 20 mg/kg, aproximadamente 2 a
aproximadamente 20 mg/kg, aproximadamente 2.5 a aproximadamente 20 mg/kg, aproximadamente 3 a
aproximadamente 20 mg/kg, aproximadamente 3.5 a aproximadamente 20 mg/kg, aproximadamente 4 a
aproximadamente 20 mg/kg, aproximadamente 4.5 a aproximadamente 20 mg/kg, aproximadamente 5 a
aproximadamente 20 mg/kg, aproximadamente 7.5 a aproximadamente 20 mg/kg, aproximadamente 10 a aproximadamente 20 mg/kg, o aproximadamente 15 a aproximadamente 20 mg/kg. En una realización, el ARNbc se administra a una dosis de aproximadamente 10 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg. Valores e intervalos intermedios a los valores citados también pretenden ser parte de la presente divulgación.
Por ejemplo, los sujetos pueden administrarse con una cantidad terapéutica de ARNi, tal como aproximadamente 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3, 3.1, 3.2, 3.3,
3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6, 6.1,
6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9, 9.1, 9.2, 9.3, 9.4, 9.5, 9.6, 9.7, 9.8, 9.9, 10, 10.5, 11, 11.5, 12, 12.5, 13, 13.5, 14, 14.5, 15, 15.5, 16, 16.5, 17, 17.5, 18, 18.5, 19, 19.5, 20, 20.5, 21, 21.5, 22, 22.5, 23, 23.5, 24, 24.5, 25, 25.5, 26, 26.5, 27, 27.5, 28, 28.5, 29, 29.5, 30, 31, 32, 33, 34, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, o aproximadamente 50 mg/kg. Valores e intervalos intermedios a los valores citados también pretenden ser parte de la presente divulgación.
La composición farmacéutica puede administrarse una vez al día, o el ARNi puede administrarse como dos, tres o más sub-dosis a intervalos apropiados a lo largo del día o incluso usando infusión continua o administración mediante una formulación de liberación controlada. En ese caso, el ARNi contenido en cada sub-dosis debe ser correspondientemente más pequeño con el fin de lograr la dosificación diaria total. La unidad de dosificación también puede calcularse para la administración durante varios días, por ejemplo, usando una formulación de liberación sostenida convencional que proporciona liberación sostenida del ARNi durante un periodo de varios días. Las formulaciones de liberación sostenida son muy conocidas en la técnica y son particularmente útiles para la administración de agentes en un sitio particular, tal como podría usarse con los agentes de la presente invención. En esta implementación, la unidad de dosificación contiene un múltiplo correspondiente de la dosis diaria.
En otras implementaciones, una dosis única de las composiciones farmacéuticas pueden ser de larga duración, tal que las dosis posteriores se administren en intervalos de no más de 3, 4 ó 5 días, o en intervalos de no más de 1, 2, 3 ó 4 semanas. En algunas implementaciones, una dosis única de las composiciones farmacéuticas de la invención se administra una vez por semana. En otras implementaciones, una dosis única de las composiciones farmacéuticas se administra cada dos meses.
El experto apreciará que ciertos factores pueden influir en la dosificación y momento adecuado requerido para tratar eficazmente un sujeto, que incluyen, pero no se limitan a, la gravedad de la enfermedad o trastorno, tratamientos previos, la salud general y/o edad del sujeto, y otras enfermedades presentes. Además, el tratamiento de un sujeto con una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición puede incluir un único tratamiento o una serie de tratamientos. Pueden hacerse cálculos estimados de dosificaciones eficaces y semividas in vivo para los ARNi individuales englobados por la invención usando metodologías convencionales o basándose en pruebas in vivo usando un modelo animal apropiado, como se describe en cualquier parte en el presente documento.
Los avances en la genética del ratón han generado varios modelos de ratón para el estudio de diversas enfermedades humanas, tales como un trastorno hemorrágico que se beneficiaría de la reducción en la expresión de PCSK9. Tales modelos pueden usarse para las pruebas in vivo del ARNi, además de para determinar una dosis terapéuticamente eficaz. Modelos de ratón adecuados se conocen en la técnica e incluyen, por ejemplo, un ratón que contiene un transgén que expresa PCSK9 humana.
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden administrarse de varias formas que dependen de si se desea tratamiento local o sistémico y del área que va a tratarse. La administración puede ser tópica (por ejemplo, por un parche transdérmico), pulmonar, por ejemplo, por inhalación o insuflación de polvos o aerosoles, que incluye por
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nebulizador; intratraqueal, intranasal, epidérmica y transdérmica, oral o parenteral. La administración parenteral incluye inyección o infusión intravenosa, intrarterial, subcutánea, intraperitoneal o intramuscular; subdérmica, por ejemplo, mediante un dispositivo implantado; o intracraneal, por ejemplo, por administración intraparenquimatosa, intratecal o intraventricular.
El ARNi puede administrarse de un modo para elegir como diana un tejido particular, tal como el hígado (por ejemplo, los hepatocitos del hígado).
Composiciones farmacéuticas y formulaciones para administración tópica pueden incluir parches transdérmicos, pomadas, lociones, cremas, geles, gotas, supositorios, esprays, líquidos y polvos. Pueden ser necesarios o deseables vehículos farmacéuticos convencionales, bases acuosas, en polvo o aceitosas, espesantes y similares. También pueden ser útiles preservativos recubiertos, guantes y similares. Formulaciones tópicas adecuadas incluyen aquellas en las que los ARNi caracterizados en la invención están en mezcla con un agente de administración tópica tal como lípidos, liposomas, ácidos grasos, ésteres de ácidos grasos, esteroides, agentes quelantes y tensioactivos. Lípidos y liposomas adecuados incluyen neutros (por ejemplo, dioleoilfosfatidiletanolamina DOPE, dimiristoilfosfatidilcolina DMPC, diestearoilfosfatidilcolina) negativos (por ejemplo, dimiristoilfosfatidilglicerol DMPG) y catiónicos (por ejemplo, dioleoiltetrametilaminopropilo DOTAP y dioleoilfosfatidiletanolamina DOTMA). Los ARNi caracterizados en la invención pueden estar encapsulados dentro de liposomas o pueden formar complejos con los mismos, en particular con liposomas catiónicos. Alternativamente, los ARNi pueden complejarse con lípidos, en particular con lípidos catiónicos. Ácidos grasos y ésteres adecuados incluyen, pero no se limitan a, ácido araquidónico, ácido oleico, ácido eicosanoico, ácido láurico, ácido caprílico, ácido cáprico, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido linoleico, ácido linolénico, dicaprato, tricaprato, monooleína, dilaurina, 1-monocaprato de glicerilo, 1-dodecilazacicloheptan-2-ona, una acilcarnitina, una acilcolina, o un éster de alquilo C1-20 (por ejemplo, miristato de isopropilo IPM), monoglicérido, diglicérido o sal farmacéuticamente aceptable de los mismos). Las formulaciones tópicas se describen en detalle en la patente de EE.UU. n° 6,747,014.
A. Formulaciones de ARNi que comprenden ensamblajes moleculares membranosos
Un ARNi para su uso en las composiciones y métodos de la invención puede formularse para la administración en un ensamblaje molecular membranoso, por ejemplo, un liposoma o una micela. Como se usa en el presente documento, el término “liposoma” se refiere a una vesícula compuesta de lípidos anfifílicos dispuestos en al menos una bicapa, por ejemplo, una bicapa o una pluralidad de bicapas. Los liposomas incluyen vesículas unilaminares y multilaminares que tienen una membrana formada de un material lipófilo y un interior acuoso. La porción acuosa contiene la composición de ARNi. El material lipófilo aísla el interior acuoso de un exterior acuoso, que normalmente no incluye la composición de ARNi, aunque puede en algunos ejemplos. Los liposomas son útiles para la transferencia y administración de principios activos al sitio de acción. Debido a que la membrana liposómica es estructuralmente similar a las membranas biológicas, cuando los liposomas se aplican a un tejido, la bicapa liposómica se fusiona con la bicapa de las membranas celulares. A medida que progresa la fusión del liposoma y la célula, el contenido acuoso interno que incluye el ARNi se administra a la célula en la que el ARNi puede unirse específicamente a un ARN diana y puede mediar en el iARN. En algunos casos, los liposomas también son específicamente elegidos como diana, por ejemplo, para dirigir el ARNi a tipos de células particulares.
Un liposoma que contiene un agente de iARN puede prepararse mediante una variedad de métodos. En un ejemplo, el componente de lípido de un liposoma se disuelve en un detergente de manera que se formen micelas con el componente de lípido. Por ejemplo, el componente de lípido puede ser un lípido catiónico anfipático o conjugado de lípido. El detergente puede tener una alta concentración micelar crítica y puede ser no iónico. Detergentes a modo de ejemplo incluyen colato, CHAPS, octilglucósido, desoxicolato y lauroilsarcosina. Entonces, la preparación de agente de iARN se añade a las micelas que incluyen el componente de lípido. Los grupos catiónicos en el lípido interaccionan con el agente de iARN y condensan alrededor del agente de iARN para formar un liposoma. Después de la condensación, el detergente se elimina, por ejemplo, por diálisis, dando una preparación liposómica de agente de iARN.
Si fuera necesario un compuesto de vehículo que ayudara en la condensación, puede añadirse durante la reacción de condensación, por ejemplo, por adición controlada. Por ejemplo, el compuesto de vehículo puede ser un polímero distinto de un ácido nucleico (por ejemplo, espermina o espermidina). El pH también puede ajustarse para favorecer la condensación.
Métodos para producir vehículos de administración de polinucleótidos estables, que incorporan un complejo de polinucleótido/lípido catiónico como componentes estructurales del vehículo de administración, se describen adicionalmente en, por ejemplo, el documento WO 96/37194. La formación de liposomas también puede incluir uno o más aspectos de métodos a modo de ejemplo descritos en Felgner, P. L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 8:7413- 7417, 1987; patente de EE.UU. n° 4,897,355; patente de EE.UU. n° 5,171,678; Bangham, et al. M. Mol. Biol. 23:238, 1965; Olson, et al. Biochim. Biophys. Acta 557:9, 1979; Szoka, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 75: 4194, 1978; Mayhew, et al. Biochim. Biophys. Acta 775:169, 1984; Kim, et al. Biochim. Biophys. Acta 728:339, 1983; y Fukunaga, et al. Endocrinol. 115:757, 1984. Las técnicas comúnmente usadas para preparar agregados de lípidos de tamaño apropiado para su uso como vehículos de administración incluyen sonicación y congelación-descongelación más extrusión (véase, por ejemplo, Mayer, et al. Biochim. Biophys. Acta 858:161, 1986). Puede usarse microfluidización cuando se deseen agregados coherentemente pequeños (5o a 200 nm) y relativamente uniformes (Mayhew, et al. Biochim. Biophys. Acta
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775:169, 1984). Estos métodos se adaptan fácilmente para envasar preparaciones de agente de iARN en liposomas.
Los liposomas se clasifican en dos amplias clases. Los liposomas catiónicos son liposomas positivamente cargados que interaccionan con las moléculas negativamente cargadas de ácidos nucleicos para formar un complejo estable. El complejo de ácido nucleico/liposoma positivamente cargado se une a la superficie celular negativamente cargada y se internaliza en un endosoma. Debido al pH ácido dentro del endosoma, los liposomas se rompen, liberando su contenido al citoplasma celular (Wang et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 1987, 147, 980-985).
Los liposomas que son sensibles al pH o están negativamente cargados atrapan ácidos nucleicos en vez de complejarse con ellos. Como tanto el ácido nucleico como el lípido están similarmente cargados, se produce repulsión en vez de formación de complejos. Sin embargo, algo del ácido nucleico queda atrapado dentro del interior acuoso de estos liposomas. Se han usado liposomas sensibles al pH para administrar ácidos nucleicos que codifican el gen timidina cinasa a monocapas de células en cultivo. La expresión del gen exógeno se detectó en las células diana (Zhou et al., Journal of Controlled Release, 1992, 19, 269-274).
Un tipo principal de composición liposómica incluye fosfolípidos distintos de fosfatidilcolina naturalmente derivada. Pueden formarse composiciones de liposomas neutras, por ejemplo, a partir de dimiristoilfosfatidilcolina (DMPC) o dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC). Generalmente se forman composiciones de liposomas aniónicos a partir de dimiristoilfosfatidilglicerol, mientras que los liposomas fusogénicos aniónicos se forman principalmente a partir de dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE). Otro tipo de composición liposómica se forma a partir de fosfatidilcolina (FC) tal como, por ejemplo, FC de soja y FC de huevo. Otro tipo se forma a partir de mezclas de fosfolípido y/o fosfatidilcolina y/o colesterol.
Ejemplos de otros métodos para introducir liposomas en células in vitro e in vivo incluyen la patente de EE.UU. n° 5,283,185; la patente de EE.UU. n° 5,171,678; documentos WO 94/00569; WO 93/24640; WO 91/16024; Felgner, J. Biol. Chem. 269:2550, 1994; Nabel, Proc. Natl. Acad. Sci. 90:11307, 1993; Nabel, Human Gene Ther. 3:649, 1992; Gershon, Biochem. 32:7143, 1993; y Strauss EMBO J. 11:417, 1992.
También se han examinado sistemas liposómicos no iónicos para determinar su utilidad en la administración de fármacos a la piel, en particular sistemas que comprenden tensioactivo no iónico y colesterol. Se usaron formulaciones liposómicas no iónicas que comprenden Novasome™ I (dilaurato de glicerilo/colesterol/polioxietilen-10-estearil éter) y Novasome™ II (diestearato de glicerilo/colesterol/polioxietilen-10-estearil éter) para administrar ciclosporina A en la dermis de piel de ratón. Los resultados indicaron que tales sistemas liposómicos no iónicos fueron eficaces en facilitar la deposición de ciclosporina A en diferentes capas de la piel (Hu et al. S.T.P. Pharma. Sci., 1994, 4(6) 466).
Los liposomas también incluyen liposomas “estéricamente estabilizados”, un término que, como se usa en el presente documento, se refiere a liposomas que comprenden uno o más lípidos especializados que, cuando se incorporan en liposomas, producen vidas útiles en circulación potenciadas con respecto a liposomas que carecen de tales lípidos especializados. Ejemplos de liposomas estéricamente estabilizados son aquellos en los que parte de la porción del lípido formador de vesícula del liposoma (A) comprende uno o más glicolípidos, tales como monosialogangliósido Gm-i, o (B) se derivatiza con uno o más polímeros hidrófilos, tales como un resto de polietilenglicol (PEG). Aunque no se desea ceñirse a teoría particular alguna, se cree en la materia que, al menos para los liposomas estéricamente estabilizados que contienen gangliósidos, esfingomielina, o lípidos derivatizados con PEG, la potenciada semivida en circulación de estos liposomas estéricamente estabilizados se deriva de una captación reducida en células del sistema reticuloendotelial (RES) (Allen et al., FEBS Letters, 1987, 223, 42; Wu et al., Cancer Research, 1993, 53, 3765).
Se conocen en la técnica diversos liposomas que comprenden uno o más glicolípidos. Papahadjopoulos et al. (Ann. N.Y. Acad. Sci., 1987, 507, 64) informaron de la capacidad del monosialogangliósido Gmi, sulfato de galactocerebrósido y fosfatidilinositol para mejorar las semividas en sangre de liposomas. Estos hallazgos se expusieron por Gabizon et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1988, 85, 6949). La patente de EE.UU. n° 4,837,028 y el documento WO 88/04924, ambos por Allen et al., desvelan liposomas que comprenden (1) esfingomielina y (2) el gangliósido Gmi o un éster de sulfato de galactocerebrósido. La patente de EE.UU. n° 5,543,152 (Webb et al.) desvela liposomas que comprenden esfingomielina. En el documento WO 97/13499 (Lim et al.) se desvelan liposomas que comprenden 1,2-sn- dimiristoilfosfatidilcolina.
En una implementación, se usan liposomas catiónicos. Los liposomas catiónicos poseen la ventaja de poder fusionarse con la membrana celular. Se recogen liposomas no catiónicos, aunque no pueden fusionarse tan eficazmente con la membrana plasmática, por macrófagos in vivo y pueden usarse para administrar agentes de iARN a macrófagos.
Ventajas adicionales de los liposomas incluyen: los liposomas obtenidos de fosfolípidos naturales son biocompatibles y biodegradables; los liposomas pueden incorporar un amplio intervalo de agua y fármacos solubles en lípidos; los liposomas pueden proteger agentes de iARN encapsulados en sus compartimentos internos del metabolismo y la degradación (Rosoff, en “Pharmaceutical Dosage Forms”, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, volumen 1, p. 245). Consideraciones importantes en la preparación de formulaciones de liposomas son la carga de la superficie del lípido, tamaño de las vesículas y el volumen acuoso de los liposomas.
Puede usarse un lípido catiónico sintético positivamente cargado, cloruro de N-[1-(2,3-dioleiloxi)propil]-N,N,N- trimetilamonio (DOTMA), para formar pequeños liposomas que interaccionan espontáneamente con ácido nucleico para
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formar complejos de lípido-ácido nucleico que pueden fusionarse con los lípidos negativamente cargados de las membranas celulares de células de cultivo de tejido, produciendo la administración de agente de iARN (véase, por ejemplo, Felgner, P. L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 8:7413-7417, 1987 y la patente de EE.UU. n° 4,897,355 para una descripción de DOTMA y su uso con ADN).
Puede usarse un análogo de DOTMA, 1,2-bis(oleoiloxi)-3-(trimetilamoniaco)propano (DOTAP), en combinación con un fosfolípido para formar vesículas de complejación con ADN. Lipofectin™ de Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, Md.) es un agente eficaz para la administración de ácidos nucleicos altamente aniónicos en células de cultivo de tejido vivas que comprenden liposomas de DOTMA positivamente cargados que interaccionan espontáneamente con polinucleótidos negativamente cargados para formar complejos. Si se usan suficientes liposomas positivamente cargados, la carga neta en los complejos resultantes también es positiva. Los complejos positivamente cargados preparados de esta forma se unen espontáneamente a superficies celulares negativamente cargadas, se fusionan con la membrana plasmática y liberan eficazmente ácidos nucleicos funcionales a, por ejemplo, células de cultivo de tejido. Otro lípido catiónico comercialmente disponible, 1,2-bis(oleoiloxi)-3,3-(trimetilamoniaco)propano (“DOTAP”) (Boehringer Mannheim, Indianápolis, Indiana), se diferencia de DOTMA en que los restos de oleoílo están enlazados por enlaces éster, en vez de éter.
Otros compuestos de lípidos catiónicos informados incluyen aquellos que se han conjugado con una variedad de restos que incluyen, por ejemplo, carboxiespermina que se ha conjugado con uno de los dos tipos de lípidos e incluye compuestos tales como dioctaoleoilamida de 5-carboxiespermilglicina (“DOGS”) (Transfectam™, Promega, Madison, Wisconsin) y 5-carboxiespermil-amida de dipalmitoilfosfatidiletanolamina (“DPPES”) (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. n° 5,171,678).
Otro conjugado de lípido catiónico incluye la derivatización del lípido con colesterol (“DC-Chol”) que se ha formulado en liposomas en combinación con DOPE (véase, Gao, X. y Huang, L., Biochim. Biophys. Res. Commun. 179:280, 1991). Se ha informado que la lipopolilisina, preparada conjugando polilisina con DOPE, es eficaz para la transfección en presencia de suero (Zhou, X. et al., Biochim. Biophys. Acta 1065:8, 1991). Para ciertas líneas celulares, se dice que estos liposomas que contienen lípidos catiónicos conjugados presentan menor toxicidad y proporcionan transfección más eficaz que las composiciones que contienen DOTMA. Otros productos de lípido catiónico comercialmente disponibles incluyen DMRIE y DMRIE-HP (Vical, La Jolla, California) y Lipofectamine (DOSPA) (Life Technology, Inc., Gaithersburg, Maryland). Otros lípidos catiónicos adecuados para la administración de oligonucleótidos se describen en los documentos WO 98/39359 y WO 96/37194.
Las formulaciones liposómicas son particularmente aptas para administración tópica, los liposomas presentan varias ventajas con respecto a otras formulaciones. Tales ventajas incluyen efectos secundarios reducidos relacionados con la alta absorción sistémica del fármaco administrado, elevada acumulación del fármaco administrado en la diana deseada y la capacidad de administrar agente de iARN en la piel. En algunas implementaciones, los liposomas se usan para administrar agente de iARN a células epidérmicas y también para potenciar la penetración de agente de iARN en tejidos dérmicos, por ejemplo, en piel. Por ejemplo, los liposomas pueden aplicarse apicalmente. Se ha documentado la administración tópica de fármacos formulados como liposomas a la piel (véase, por ejemplo, Weiner et al., Journal of Drug Targeting, 1992, vol. 2,405-410 y du Plessis et al., Antiviral Research, 18, 1992, 259-265; Mannino, R. J. y Fould- Fogerite, S., Biotechniques 6:682-690, 1988; Itani, T. et al. Gene 56:267-276. 1987; Nicolau, C. et al. Meth. Enz. 149:157-176, 1987; Straubinger, R. M. y Papahadjopoulos, D. Meth. Enz. 101:512-527, 1983; Wang, C. Y. y Huang, L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7851-7855, 1987).
También se han examinado sistemas liposómicos no iónicos para determinar su utilidad en la administración de fármacos a la piel, en particular sistemas que comprenden tensioactivo no iónico y colesterol. Se usaron formulaciones liposómicas no iónicas que comprenden Novasome I (dilaurato de glicerilo/colesterol/polioxietilen-10-estearil éter) y Novasome II (diestearato de glicerilo/ colesterol/polioxietilen-10-estearil éter) para administrar un fármaco a la dermis de piel de ratón. Tales formulaciones con agente de iARN son útiles para tratar un trastorno dermatológico.
Los liposomas que incluyen ARNi pueden hacerse altamente deformables. Tal deformabilidad puede permitir que los liposomas penetren a través de poros que son más pequeños que el radio promedio del liposoma. Por ejemplo, los transfersomas son un tipo de liposomas deformables. Los transferosomas pueden prepararse añadiendo activadores del borde superficial, normalmente tensioactivos, a una composición liposómica convencional. Los transfersomas que incluyen agente de iARN pueden administrarse, por ejemplo, subcutáneamente por infección con el fin de administrar agente de iARN a queratinocitos en la piel. Con el fin de cruzar intacta la piel de mamífero, las vesículas de lípidos deben pasar a través de una serie de poros finos, cada uno con un diámetro inferior a 50 nm, bajo la influencia de un gradiente transdérmico adecuado. Además, debido a las propiedades del lípido, estos transfersomas pueden ser auto- optimizantes (adaptables a la forma de los poros, por ejemplo, en la piel), auto-reparadores y frecuentemente pueden llegar a sus dianas sin fragmentarse, y frecuentemente se auto-cargan.
Otras formulaciones aceptadas para la presente invención se describen en las solicitudes provisionales de Estados Unidos n° de serie 61/018,616, presentada el 2 de enero de 2008; 61/018,611, presentada el 2 de enero de 2008; 61/039,748, presentada el 26 de marzo de 2008; 61/047,087, presentada el 22 de abril de 2008 y 61/051,528, presentada el 8 de mayo de 2008. La solicitud PCT n° PCT/US2007/080331, presentada el 3 de octubre de 2007, también describe formulaciones que son aceptadas para la presente invención.
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Los transfersomas son todavía otro tipo de liposomas, y son agregados de lípidos altamente deformares que son candidatos atractivos para vehículos de administración de fármaco. Los transfersomas pueden describirse como gotitas de lípido que son tan altamente deformables que son fácilmente capaces de penetrar a través de los poros que son más pequeños que la gotita. Los transfersomas son adaptables al entorno en el que se usan, por ejemplo, son auto- optimizantes (adaptables a la forma de los poros, por ejemplo, en la piel), auto-reparadores, frecuentemente pueden llegar a sus dianas sin fragmentarse, y frecuentemente se auto-cargan. Para preparar transfersomas es posible añadir activadores del borde superficial, normalmente tensioactivos, a una composición liposómica convencional. Se han usado transfersomas para administrar albúmina de suero a la piel. Se ha mostrado que la administración mediada por transfersomas de albúmina de suero es tan eficaz como la inyección subcutánea de una disolución que contiene albúmina de suero.
Los tensioactivos encuentran una amplia aplicación en formulaciones tales como emulsiones (incluyendo microemulsiones) y liposomas. La forma más común de clasificar y ordenar las propiedades de los muchos tipos diferentes de tensioactivos, tanto naturales como sintéticos, es por el uso del equilibrio hidrófilo/lipófilo (HLB). La naturaleza del grupo hidrófilo (también conocido como la “cabeza”) proporciona el medio más útil para clasificar los diferentes tensioactivos usados en formulaciones (Rieger, en Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, p. 285).
Si la molécula de tensioactivo no está ionizada, se clasifica como un tensioactivo no iónico. Los tensioactivos no iónicos encuentran una amplia aplicación en productos farmacéuticos y cosméticos y pueden usarse durante un amplio intervalo de valores de pH. En general, sus valores de HLB oscilan de 2 a aproximadamente 18 dependiendo de su estructura. Los tensioactivos no iónicos incluyen ésteres no iónicos tales como ésteres de etilenglicol, ésteres de propilenglicol, ésteres de glicerilo, ésteres de poliglicerilo, ésteres de sorbitano, ésteres de sacarosa y ésteres etoxilados. También están incluidas en esta clase alcanolamidas no iónicas y éteres tales como etoxilatos de alcoholes grasos, alcoholes propoxilados y polímeros de bloques etoxilados/propoxilados. Los tensioactivos de polioxietileno son los miembros más populares de la clase de tensioactivos no iónicos.
Si la molécula de tensioactivo lleva una carga negativa cuando se disuelve o dispersa en agua, el tensioactivo se clasifica como aniónico. Los tensioactivos aniónicos incluyen carboxilatos tales como jabones, lactilatos de acilo, acilamidas de aminoácidos, ésteres de ácido sulfúrico tales como sulfatos de alquilo y sulfatos de alquilo etoxilados, sulfonatos tales como alquilbencenosulfonatos, isetionatos de acilo, tauratos de acilo y sulfosuccinatos, y fosfatos. Los miembros más importantes de la clase de tensioactivos aniónicos son los sulfatos de alquilo y los jabones.
Si la molécula de tensioactivo lleva una carga positiva cuando se disuelve o dispersa en agua, el tensioactivo se clasifica como catiónico. Tensioactivos catiónicos incluyen sales de amonio cuaternario y aminas etoxiladas. Las sales de amonio cuaternario son los miembros más usados de esta clase.
Si la molécula de tensioactivo tiene la capacidad de llevar tanto una carga positiva como negativa, el tensioactivo se clasifica como anfótero. Los tensioactivos anfóteros incluyen derivados de ácido acrílico, alquilamidas sustituidas, N- alquilbetaínas y fosfatidas.
Se ha revisado el uso de tensioactivos en medicamentos, formulaciones y en emulsiones (Rieger, en Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, p. 285).
El ARNi para su uso en los métodos de la invención también puede proporcionarse como formulaciones micelares. Las “micelas” se definen en el presente documento como un tipo particular de ensamblaje molecular en el que moléculas anfipáticas están dispuestas en una estructura esférica tal que todas las porciones hidrófobas de las moléculas estén dirigidas hacia adentro, dejando las porciones hidrófilas en contacto con la fase acuosa circundante. Existe la disposición contraria si el entorno es hidrófobo.
Una formulación micelar mixta adecuada para la administración mediante membranas transdérmicas puede prepararse mezclando una disolución acuosa de la composición de ARNip, un sulfato de alquilo Ce a C22 de metal alcalino y un compuesto formador de micelas. Compuestos formadores de micelas a modo de ejemplo incluyen lecitina, ácido hialurónico, sales farmacéuticamente aceptables de ácido hialurónico, ácido glicólico, ácido láctico, extracto de camomila, extracto de pepino, ácido oleico, ácido linoleico, ácido linolénico, monooleína, monooleatos, monolauratos, aceite de borraja, aceite de onagra, mentol, trihidroxioxocolanilglicina y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, glicerina, poliglicerina, lisina, polilisina, trioleína, éteres de polioxietileno y análogos de los mismos, polidocanol alquil éteres y análogos de los mismos, quenodesoxicolato, desoxicolato, y mezclas de los mismos. Los compuestos formadores de micelas pueden añadirse al mismo tiempo o después de la adición del sulfato de alquilo de metal alcalino. Se formarán micelas mixtas con sustancialmente cualquier tipo de mezcla de los componentes, pero mezcla vigorosa, con el fin de proporcionar micelas de tamaño más pequeño.
En un método, se prepara una primera composición micelar que contiene la composición de ARNip y al menos el sulfato de alquilo de metal alcalino. A continuación, la primera composición micelar se mezcla con al menos tres compuestos formadores de micelas para formar una composición micelar mixta. En otro método, la composición micelar se prepara mezclando la composición de ARNip, el sulfato de alquilo de metal alcalino y al menos uno de los compuestos formadores de micelas, seguido de la adición de los restantes compuestos formadores de micelas, con mezcla vigorosa.
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Puede añadirse fenol y/o m-cresol a la composición micelar mixta para estabilizar la formulación y proteger contra el crecimiento bacteriano. Alternativamente, puede añadirse fenol y/o m-cresol con los componentes formadores de micelas. También puede añadirse un agente isotónico tal como glicerina después de la formación de la composición micelar mixta.
Para la administración de la formulación micelar como espray, la formulación puede ponerse en un dispensador de aerosol y el dispensador se carga con un propulsor. El propulsor, que está bajo presión, está en forma líquida en el dispensador. Las relaciones de los componentes se ajustan de manera que las fases acuosa y de propulsor sean una, es decir, hay una fase. Si hay dos fases, es necesario agitar el dispensador antes de dispensar una porción del contenido, por ejemplo, mediante una válvula de dos
ificación. La dosis dispensada de agente farmacéutico es expulsada de la válvula de dosificación en un fino espray.
Los propulsores pueden incluir clorofluorocarburos que contienen hidrógeno, fluorocarburos que contienen hidrógeno, éter dimetílico y éter dietílico. En ciertas realizaciones puede usarse HFA 134a (1,1,1,2-tetrafluoroetano).
Las concentraciones específicas de los componentes esenciales pueden determinarse por experimentación relativamente directa. Para absorción mediante las cavidades bucales, es frecuentemente deseable aumentar, por ejemplo, al menos el doble o triple, la dosificación para mediante inyección o administración mediante el tubo gastrointestinal.
B. Partículas de lípido
Los ARNi, por ejemplo, ARNbc de la invención pueden estar completamente encapsulados en una formulación de lípido, por ejemplo, una LNP, u otra partícula de ácido nucleico-lípido.
Como se usa en el presente documento, el término “LNP” se refiere a una partícula de ácido nucleico-lípido estable. Las LNP contienen un lípido catiónico, un lípido no catiónico y un lípido que previene la agregación de la partícula (por ejemplo, un conjugado de PEG-lípido). Las LNP son extremadamente útiles para aplicaciones sistémicas, ya que presentan vidas útiles en circulación prolongadas tras la inyección intravenosa (i.v.) y se acumulan en sitios distales (por ejemplo, sitios físicamente separados del sitio de administración). Las LNP incluyen “pSPLP”, que incluyen un complejo de agente de condensación-ácido nucleico encapsulado como se expone en la publicación pCt n° WO 00/03683. Las partículas de la presente invención normalmente tienen un diámetro medio de aproximadamente 50 nm a aproximadamente 150 nm, más normalmente aproximadamente 60 nm a aproximadamente 130 nm, más normalmente aproximadamente 70 nm a aproximadamente 110 nm, lo más normalmente aproximadamente 70 nm a aproximadamente 90 nm, y son sustancialmente no tóxicas. Además, los ácidos nucleicos, cuando están presentes en las partículas de ácido nucleico-lípido de la presente invención, son resistentes en disolución acuosa a la degradación con una nucleasa. Las partículas de ácido nucleico-lípido y su método de preparación se desvelan en, por ejemplo, las patentes de EE.UU. n° 5,976,567; 5,981,501; 6,534,484; 6,586,410; 6,815,432; publicación de EE.UU. n° 2010/0324120 y publicación PCT n° WO 96/40964.
En una implementación, la relación de lípido con respecto a fármaco (relación masa/masa) (por ejemplo, relación de lípido con respecto a ARNbc) estará en el intervalo de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 50:1, de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 25:1, de aproximadamente 3:1 a aproximadamente 15:1, de aproximadamente 4:1 a aproximadamente 10:1, de aproximadamente 5:1 a aproximadamente 9:1, o aproximadamente 6:1 a aproximadamente 9:1. También se contempla que intervalos intermedios a los intervalos anteriormente citados son parte de la invención.
El lípido catiónico puede ser, por ejemplo, cloruro de N,N-dioleil-N,N-dimetilamonio (DODAC), bromuro de N,N- diestearil-N,N-dimetilamonio (DDAB), cloruro de N-(1-(2,3- dioleoiloxi)propil)-N,N,N-trimetilamonio (DOTAP), cloruro de N-(1-(2,3-dioleiloxi)propil)-N,N,N-trimetilamonio (DoTmA), N,N-dimetil-2,3-dioleiloxi)propilamina (DoDmA), 1,2- dilinoleiloxi-N,N-dimetilaminopropano (DLinDMA), l,2-dilinoleniloxi-N,N-dimetilaminopropano (DLenDMA), 1,2- dilinoleilcarbamoiloxi-3-dimetilaminopropano (DLin-C-DAP), 1,2-dilinoleioxi-3-(dimetilamino)acetoxipropano (DLin-DAC),
1.2- dilinoleioxi-3-morfolinopropano (DLin-MA), 1,2-dilinoleoil-3-dimetilaminopropano (DLinDAP), 1,2-dilinoleiltio-3- dimetilaminopropano (DLin-S-DMA), 1-linoleoil-2-linoleiloxi-3-dimetilaminopropano (DLin-2-DMAP), sal de cloruro de 1,2- dilinoleiloxi-3-trimetilaminopropano (DLin-TMA.Cl), sal de cloruro de 1,2-dilinoleoil-3-trimetilaminopropano (DLin-TAP.Cl),
1.2- dilinoleiloxi-3-(N-metilpiperazino)propano (DLin-MPZ), o 3-(N,N-dilinoleilamino)-1,2-propanodiol (DLinAP), 3-(N,N- dioleilamino)-1,2-propanodio (DoAp), 1,2-dilinoleiloxo-3-(2-N,N-dimetilamino)etoxipropano (DLin-EG-DMA), l,2- dilinoleniloxi-N,N-dimetilaminopropano (DLinDMA), 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminometil-[1,3]-dioxolano (DLin-K-DMA) o análogos de los mismos, (3aR,5s,6aS)-N,N-dimetil-2,2-di((9Z,12Z)-octadeca-9,12-dienil)tetrahidro-3aH- ciclopenta[d][1,3]dioxol-5-amina (ALN100), 4-(dimetilamino)butanoato de (6Z,9Z,28Z,31Z)-heptatriaconta-6,9,28,31- tetraen-19-ilo (MC3), 1,1'-(2-(4-(2-((2-(bis(2-hidroxidodecil)amino)etil)(2-hidroxidodecil)amino)etil)piperazin-1- il)etilazanodiil)didodecan-2-ol (Tech G1), o una mezcla de los mismos. El lípido catiónico puede comprender de aproximadamente el 20 % en moles a aproximadamente el 50 % en moles o aproximadamente el 40 % en moles del lípido total presente en la partícula.
En otra implementación, el compuesto 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioxolano puede usarse para preparar nanopartículas de lípido-ARNip. La síntesis de 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioxolano se describe en la solicitud
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de patente provisional de Estados Unidos número 61/107,998 presentada el 23 de octubre de 2008, que se incorpora en el presente documento por referencia.
En una implementación, la partícula de lípido-ARNip incluye 40 % de 2,2-dilinoleM-4-dimetMaminoetil-[1,3]-dioxolano: 10 % de DSPC: 40 % de colesterol: 10 % de PEG-C-DOMG (porcentaje en moles) con un tamaño de partícula de 63.0 ± 20 nm y una de relación de ARNip/lípido de 0.027.
El lípido ionizable/no catiónico puede ser un lípido aniónico o un lípido neutro que incluye, pero no se limita a, diestearoilfosfatidilcolina (DSPC), dioleoilfosfatidilcolina (dOpC), dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), dioleoilfosfatidilglicerol (DOPG), dipalmitoilfosfatidilglicerol (DPPG), dioleoil-fosfatidiletanolamina (DOPE), palmitoiloleoilfosfatidilcolina (POPC), palmitoiloleoilfosfatidiletanolamina (POPE), 4-(N-maleimidometil)-ciclohexano-l- carboxilato de dioleoil-fosfatidiletanolamina (DOPE-mal), dipalmitoilfosfatidiletanolamina (DPPE), dimiristoilfosfoetanolamina (DMPE), diestearoil-fosfatidil-etanolamina (DSPE), 16-O-monometil-PE, 16-O-dimetil-PE, 18- 1-trans-PE, 1-estearoil-2-oleoil-fosfatidiletanolamina (SOPE), colesterol, o una mezcla de los mismos. El lípido no catiónico puede ser de aproximadamente el 5 % en moles a aproximadamente el 90 % en moles, aproximadamente 10 % en moles, o aproximadamente el 58 % en moles si se incluye colesterol, del contenido de lípido total en la partícula.
El lípido conjugado que inhibe la agregación de partículas puede ser, por ejemplo, un polietilenglicol (PEG)-lípido que incluye, sin limitación, un PEG-diacilglicerol (DAG), un PEG-dialquiloxipropilo (DAA), un PEG-fosfolípido, una PEG- ceramida (Cer), o una mezcla de los mismos. El conjugado PEG-DAA puede ser, por ejemplo, un PEG-dilauriloxipropilo (CÍ2), un PEG-dimiristiloxipropilo (C¡4), un PEG-dipalmitiloxipropilo (Cia) o un PEG- diesteariloxipropilo (C]s). El lípido conjugado que previene la agregación de partículas puede ser del 0 % en moles a aproximadamente el 20 % en moles o aproximadamente el 2 % en moles del lípido total presente en la partícula.
En algunas implementaciones, la partícula de ácido nucleico-lípido incluye colesterol a, por ejemplo, aproximadamente el 10 % en moles a aproximadamente el 60 % en moles o aproximadamente el 48 % en moles del lípido total presente en la partícula.
En una implementación, el lipidoide ND984HCl (MW 1487) (véase la solicitud de patente de EE.UU. n° 12/056,230, presentada el 26/03/2008, que se incorpora en el presente documento por referencia), colesterol (Sigma-Aldrich) y PEG- ceramida C16 (Avanti Polar Lipids) pueden usarse para preparar nanopartículas de lípido-ARNbc (es decir, partículas de LNP01). Pueden prepararse disoluciones madre de cada uno en etanol del siguiente modo: ND98, 133 mg/ml; colesterol, 25 mg/ml, PEG-ceramida C16, 100 mg/ml. Las disoluciones madre de ND98, colesterol y PEG-ceramida C16 pueden entonces combinarse en una relación molar, por ejemplo, 42:48:10. La disolución de lípido combinada puede mezclarse con ARNbc acuoso (por ejemplo, en acetato sódico a pH 5) de forma que la concentración de etanol final sea de aproximadamente el 35-45 % y la concentración de acetato sódico final sea aproximadamente 100-300 mM. Las nanopartículas de lípido-ARNbc normalmente se forman espontáneamente tras la mezcla. Dependiendo de la distribución deseada del tamaño de partícula, la mezcla de nanopartículas resultante puede extruirse a través de una membrana de policarbonato (por ejemplo, corte de 100 nm) usando, por ejemplo, una prensa extrusora de cilindro térmico, tal como la prensa extrusora Lipex (Northern Lipids, Inc). En algunos casos, puede omitirse la etapa de extrusión. La eliminación de etanol y el intercambio de tampón simultáneo pueden llevarse a cabo, por ejemplo, por diálisis o filtración de flujo tangencial. El tampón puede intercambiarse con, por ejemplo, solución salina tamponada con fosfato (PBS) a aproximadamente pH 7, por ejemplo, aproximadamente pH 6.9, aproximadamente pH 7.0, aproximadamente pH 7.1, aproximadamente pH 7.2, aproximadamente pH 7.3, o aproximadamente pH 7.4.
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Las formulaciones de LNP01 se describen, por ejemplo, en la publicación de solicitud internacional n° WO 2008/042973. Formulaciones de lípido-ARNbc a modo de ejemplo adicionales se describen en la Tabla A.
Tabla A.
Lípido ionizable/catiónico Conjugado de lípido catiónico/lípido no catiónico/colesterol/PEG-lípido Relación de lípido:ARNip
LNP-1
l,2-Dilinoleniloxi-N,N-dimetilaminopropano (DLinDMA) DLinDMA/DPPC/colesterol/PEG-cDMA (57.1/7.1/34.4/1.4) Lípido:ARNip ~ 7:1
2-XTC
2,2-Dilmoleil-4-diiTietilaiTiinoetil-[1,3]- dioxolano (XTC) XTC/DPPC/colesterol/PEG-cDMA 57.1/7.1/34.4/1.4 Lípido:ARNip ~ 7:1
LNP05
2,2-Dilmoleil-4-diiTietilaiTiinoetil-[1,3]- dioxolano (XTC) XTC/DSPC/colesterol/PEG-DMG 57.5/7.5/31.5/3.5 Lípido:ARNip ~ 6:1
LNP06
2,2-Dilmoleil-4-diiTietilaiTiinoetil-[1,3]- dioxolano (XTC) XTC/DSPC/colesterol/PEG-DMG 57.5/7.5/31.5/3.5 Lípido:ARNip ~ 11:1
LNP07
2,2-Dilmoleil-4-diiTietilaiTiinoetil-[1,3]- dioxolano (XTC) XTC/DSPC/colesterol/PEG-DMG 60/7.5/31/1.5, Lípido:ARNip ~ 6:1
LNP08
2,2-Dilmoleil-4-diiTietilaiTiinoetil-[1,3]- dioxolano (XTC) XTC/DSPC/colesterol/PEG-DMG 60/7.5/31/1.5, Lípido:ARNip ~ 11:1
LNP09
2,2-Dilmoleil-4-diiTietilaiTiinoetil-[1,3]- dioxolano (XTC) XTC/DSPC/colesterol/PEG-DMG 50/10/38.5/1.5 Lípido:ARNip 10:1
LNP10
(3aR,5s,6aS)-N,N-dimetil-2,2-di((9Z,12Z)- octadeca-9,12-dienil)tetrahidro-3aH- ciclopenta[d][1,3]dioxol-5-amina (ALN100) ALN100/DSPC/colesterol/PEG-DMG 50/10/38.5/1.5 Lípido:ARNip 10:1
LNP11
4-(Dimetilamino)butanoato de (6Z,9Z,28Z,31Z)-heptatriaconta-6,9,28,31- tetraen-19-ilo (MC3) MC-3/DSPC/colesterol/PEG-DMG 50/10/38.5/1.5 Lípido:ARNip 10:1
LNP12
1,1'-(2-(4-(2-((2-(bis(2- hidroxidodecil)amino)etil)(2- hidroxidodecil)airiino)etil)piperazin-1- il)etilazanodiil)didodecan-2-ol (Tech G1) Tech G1/DSPC/colesterol/PEG-DMG 50/10/38.5/1.5 Lípido:ARNip 10:1
Lípido ionizable/catiónico Conjugado de lípido catiónico/lípido no catiónico/colesterol/PEG-lípido Relación de lípido:ARNip
LNP13
XTC XTC/DSPC/Chol/PEG-DMG 50/10/38.5/1.5 Lípido:ARNip: 33:1
LNP14
MC3 MC3/DSPC/Chol/PEG-DMG 40/15/40/5 Lípido:ARNip: 11:1
LNP15
MC3 MC3/DSPC/Chol/PEG-DSG/GalNAc-PEG- DSG 50/10/35/4.5/0.5 Lípido:ARNip: 11:1
LNP16
MC3 MC3/DSPC/Chol/PEG-DMG 50/10/38.5/1.5 Lípido:ARNip: 7:1
LNP17
MC3 MC3/DSPC/Chol/PEG-DSG 50/10/38.5/1.5 Lípido:ARNip: 10:1
LNP18
MC3 MC3/DSPC/Chol/PEG-DMG 50/10/38.5/1.5 Lípido:ARNip: 12:1
LNP19
MC3 MC3/DSPC/Chol/PEG-DMG 50/10/35/5 Lípido:ARNip: 8:1
LNP20
MC3 MC3/DSPC/Chol/PEG-DPG 50/10/38.5/1.5 Lípido:ARNip: 10:1
LNP21
C12-200 C12-200/DSPC/Chol/PEG-DSG 50/10/38.5/1.5 Lípido:ARNip: 7:1
LNP22
XTC XTC/DSPC/Chol/PEG-DSG 50/10/38.5/1.5 Lípido:ARNip: 10:1
DSPC: diestearoilfosfatidilcolina DPPC: dipalmitoilfosfatidilcolina
PEG-DMG: PEG-didimiristoilglicerol (C14-PEG, o PEG-C14) (PEG con peso en moles promedio de 2000)
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PEG-DSG: PEG-diestirilglicerol (C18-PEG, o PEG-C18) (PEG con peso en moles promedio de 2000)
PEG-cDMA: PEG-carbamoil-1,2-dimiristiloxipropilamina (PEG con peso en moles promedio de 2000)
LNP (l,2-dilinoleniloxi-N,N-dimetilaminopropano (DLinDMA)) que comprende formulaciones descritas en la publicación internacional n° WO2009/127060, presentada el 15 de abril de 2009.
XTC que comprende formulaciones descritas, por ejemplo, en la solicitud provisional de EE.UU. n° de serie 61/148,366, presentada el 29 de enero de 2009; la solicitud provisional de EE.UU. n° de serie 61/156,851, presentada el 2 de marzo de 2009; la solicitud provisional de EE.UU. n° de serie presentada el 10 de junio 2009; la solicitud provisional de EE.UU. n° de serie 61/228,373, presentada el 24 de julio de 2009; la solicitud provisional de EE.UU. n° de serie 61/239,686, presentada el 3 de septiembre de 2009, y la solicitud internacional n° PCT/US2010/022614, presentada el 29 de enero 2010.
MC3 que comprende formulaciones descritas, por ejemplo, en la publicación de EE.UU. n° 2010/0324120, presentada el 10 de junio de 2010.
ALNY-100 que comprende formulaciones descritas, por ejemplo, en la solicitud de patente internacional número PCT/US09/63933, presentada el 10 de noviembre de 2009.
C12-200 que comprende formulaciones descritas en la solicitud provisional de EE.UU. n° de serie 61/175,770, presentada el 5 de mayo de 2009 y la solicitud internacional n° PCT/US10/33777, presentada el 5 de mayo de 2010.
Síntesis de lípidos ionizables/catiónicos
Cualquiera de los compuestos, por ejemplo, lípidos catiónicos y similares, usados en las partículas de ácido nucleico- lípido puede prepararse por técnicas de síntesis orgánica conocidas, que incluyen los métodos descritos en más detalle en los ejemplos. Todos los sustituyentes son como se definen más adelante, a menos que se indique lo contrario.
“Alquilo” significa un hidrocarburo alifático saturado de cadena lineal o ramificado, no cíclico o cíclico, que contiene de 1 a 24 átomos de carbono. Alquilos de cadena lineal saturados representativos incluyen metilo, etilo, n-propilo, n-butilo, n- pentilo, n-hexilo y similares; mientras que los alquilos ramificados saturados incluyen isopropilo, sec-butilo, isobutilo, terc-butilo, isopentilo y similares. Alquilos cíclicos saturados representativos incluyen ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo y similares; mientras que alquilos cíclicos insaturados incluyen ciclopentenilo y ciclohexenilo y similares.
“Alquenilo” significa un alquilo, como se ha definido anteriormente, que contiene al menos un doble enlace entre átomos de carbono adyacentes. Alquenilos incluyen tanto isómeros cis como trans. Alquenilos de cadena lineal y ramificados representativos incluyen etilenilo, propilenilo, 1 -butenilo, 2-butenilo, isobutilenilo, 1-pentenilo, 2-pentenilo, 3-metil-1- butenilo, 2-metil-2-butenilo, 2,3-dimetil-2-butenilo y similares.
“Alquinilo” significa cualquier alquilo o alquenilo, como se ha definido anteriormente, que contiene adicionalmente al menos un triple enlace entre carbonos adyacentes. Alquinilos de cadena lineal y ramificados representativos incluyen acetilenilo, propinilo, 1 -butinilo, 2-butinilo, 1 -pentinilo, 2-pentinilo, 3-metil-1 butinilo y similares.
“Acilo” significa cualquier alquilo, alquenilo o alquinilo en el que el carbono en el punto de unión está sustituido con un grupo oxo, como se define más adelante. Por ejemplo, -C(=O)alquilo, -C(=O)alquenilo y -C(=O)alquinilo son grupos acilo.
“Heterociclo” significa un anillo heterocíclico monocíclico de 5 a 7 miembros, o bicíclico de 7 a 10 miembros, que está tanto saturado, insaturado, como es aromático, y que contiene 1 ó 2 heteroátomos independientemente seleccionados de nitrógeno, oxígeno y azufre, y en el que los heteroátomos de nitrógeno y azufre pueden estar opcionalmente oxidados, y el heteroátomo de nitrógeno puede estar opcionalmente cuaternizado, que incluye anillos bicíclicos en los que cualquiera de los heterociclos anteriores están condensados con un anillo de benceno. El heterociclo puede unirse mediante cualquier heteroátomo o átomo de carbono. Los heterociclos incluyen heteroarilos como se definen más adelante. Los heterociclos incluyen morfolinilo, pirrolidinonilo, pirrolidinilo, piperidinilo, piperizinilo, hidantoinilo, valerolactamilo, oxiranilo, oxetanilo, tetrahidrofuranilo, tetrahidropiranilo, tetrahidropiridinilo, tetrahidroprimidinilo, tetrahidrotiofenilo, tetrahidrotiopiranilo, tetrahidropirimidinilo, tetrahidrotiofenilo, tetrahidrotiopiranilo y similares.
Los términos “alquilo opcionalmente sustituido”, “alquenilo opcionalmente sustituido”, “alquinilo opcionalmente sustituido”, “acilo opcionalmente sustituido” y “heterociclo opcionalmente sustituido” significan que, cuando están sustituidos, al menos un átomo de hidrógeno está sustituido con un sustituyente. En el caso de un sustituyente oxo (=O) se sustituyen dos átomos de hidrógeno. A este respecto, los sustituyentes incluyen oxo, halógeno, heterociclo, -CN, - ORx, -NRxRy, -NRxC(=O)Ry, -NRxSO2Ry, -C(=O)Rx, -C(=O)ORx, -C(=O)NRxRy, -SOnRx y -SOnNRxRy, en los que n es 0, 1 ó 2, Rx y Ry son iguales o diferentes e independientemente hidrógeno, alquilo o heterociclo, y cada uno de dichos sustituyentes alquilo y heterociclo puede estar adicionalmente sustituido con uno o más de oxo, halógeno, -OH, - CN, alquilo, -ORx, heterociclo, -NRxRy, -NRxC(=O)Ry, -NRxSO2Ry, -C(=O)Rx, -C(=O)ORx, -C(=O)NRxRy, -SOnRx y -SOnNRxRy.
“Halógeno” significa flúor, cloro, bromo y yodo.
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En algunas implementaciones, los métodos descritos pueden requerir el uso de grupos protectores. La metodología de grupos protectores es muy conocida para aquellos expertos en la materia (véase, por ejemplo, Protective Groups in Organic Synthesis, Green, T.W. et al., Wiley-Interscience, New York City, 1999). Brevemente, grupos protectores dentro del contexto de la presente invención son cualquier grupo que reduzca o elimine la reactividad no deseada de un grupo funcional. Un grupo protector puede añadirse a un grupo funcional para enmascarar su reactividad durante ciertas reacciones y luego se elimina para revelar el grupo funcional original. En algunas realizaciones se usa un “grupo protector de alcohol”. Un “grupo protector de alcohol” es cualquier grupo que disminuya o elimine la reactividad no deseada de un grupo funcional de alcohol. Los grupos protectores pueden añadirse y eliminarse usando técnicas muy conocidas en la técnica.
Síntesis de la fórmula A
En algunas implementaciones, las partículas de ácido nucleico-lípido de la invención se formulan usando un lípido catiónico de fórmula A:
r3
\
N
imagen21
R4
en la que R1 y R2 son independientemente alquilo, alquenilo o alquinilo, cada uno puede estar opcionalmente sustituido, y R3 y R4 son independientemente alquilo inferior o R3 y R4 pueden tomarse conjuntamente para formar un anillo heterocíclico opcionalmente sustituido. En algunas implementaciones, el lípido catiónico es XTC (2,2-dilinoleil-4- dimetilaminoetil-[1,3]-dioxolano). En general, el lípido de fórmula A anterior puede prepararse por los siguientes Esquemas de reacción 1 ó 2, en los que todos los sustituyentes son como se han definido anteriormente, a menos que se indique lo contrario.
Esquema 1
imagen22
El lípido A, en el que R1 y R2 son independientemente alquilo, alquenilo o alquinilo, cada uno puede estar opcionalmente sustituido, y r3 y R4 son independientemente alquilo inferior o R3 y R4 pueden tomarse conjuntamente para formar un anillo heterocíclico opcionalmente sustituido, puede prepararse según el Esquema 1. La cetona 1 y el bromuro 2 pueden comprarse o prepararse según métodos conocidos para aquellos expertos habituales en la materia. La reacción de 1 y 2 da el cetal 3. El tratamiento del cetal 3 con la amina 4 da los lípidos de fórmula A. Los lípidos de fórmula A pueden convertirse en la sal de amonio correspondiente con una sal orgánica de fórmula 5, en la que X es el contraión aniónico seleccionado de halógeno, hidróxido, fosfato, sulfato o similares.
Esquema 2
BrMg—R-, + R2-CN
H+
imagen23
R2
Ri
Ra
N—R4
imagen24
Alternativamente, el material de partida de cetona 1 puede prepararse según el Esquema 2. El reactivo de Grignard 6 y el cianuro 7 pueden comprarse o prepararse según métodos conocidos para aquellos expertos habituales en la materia. La reacción de 6 y 7 da la cetona 1. La conversión de la cetona 1 en los lípidos correspondientes de fórmula A es como 5 se ha descrito en el Esquema 1.
Síntesis de MC3
La preparación de DLin-M-C3-DMA (es decir, 4-(dimetilamino)butanoato de (6Z,9Z,28Z,31Z)-heptatriaconta-6,9,28,31- tetraen-19-ilo) fue del siguiente modo. Se agitó una disolución de (6Z,9Z,28Z,31Z)-heptatriaconta-6,9,28,31-tetraen-19- ol (0.53 g), clorhidrato del ácido 4-N,N-dimetilaminobutírico (0.51 g), 4-N,N-dimetilaminopiridina (0.61 g) y clorhidrato de 10 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (0.53 g) en diclorometano (5 ml) a temperatura ambiente durante la noche. La disolución se lavó con ácido clorhídrico diluido, seguido de bicarbonato sódico acuoso diluido. Las fracciones orgánicas se secaron sobre sulfato de magnesio anhidro, se filtraron y el disolvente se eliminó en un rotavapor. El residuo se pasó a través de una columna de gel de sílice (20 g) usando un gradiente de elución del 1-5 % de metanol/diclorometano. Se combinaron las fracciones que contenían el producto purificado y el disolvente se eliminó, dando un aceite incoloro (0.54 15 g).
Síntesis de ALNY-100
La síntesis del cetal 519 [ALNY-100] se realizó usando el siguiente Esquema 3:
NHBoc NHMi
6 —ó
Cbz-OSu, NEt3
NCbz
ó
imagen25
o
imagen26
PTSA
Me2N""
imagen27
imagen28
519
518
Síntesis de 515
20 A una suspensión con agitación de LiAlH4 (3.74 g, 0.09852 moles) en 200 ml de THF anhidro en un RBF de dos bocas (1 l) se añadió una disolución de 514 (10 g, 0.04926 moles) en 70 ml de THF lentamente a 0 °C bajo atmósfera de nitrógeno. Después de completarse la adición, la mezcla de reacción se calentó a temperatura ambiente y a continuación se calentó a reflujo durante 4 h. El progreso de la reacción se monitorizó por CCF. Después de completarse la de reacción (por CCF), la mezcla se enfrió a 0 °C y se extinguió con la adición cuidadosa de disolución
25 saturada de Na2SO4. La mezcla de reacción se agitó durante 4 h a temperatura ambiente y se separó por filtración. El residuo se lavó bien con THF. El filtrado y los lavados se mezclaron y se diluyeron con 400 ml de dioxano y 26 ml de HCl conc. y se agitaron durante 20 minutos a temperatura ambiente. Los volátiles se separaron por arrastre a vacío dando la sal de clorhidrato de 515 como un sólido blanco. Rendimiento: 7.12 g RMN 1H (DMSO, 400 MHz): 8= 9.34 (ancho, 2H), 5.68 (s, 2H), 3.74 (m, 1H), 2.66-2.60 (m, 2H), 2.50-2.45 (m, 5H).
30 Síntesis de 516
A una disolución con agitación del compuesto 515 en 100 ml de DCM seco en un RBF de dos bocas de 250 ml se añadió NEt3 (37.2 ml, 0.2669 moles) y se enfrió a 0 °C bajo atmósfera de nitrógeno. Después de una lenta adición de N- (benciloxi-carboniloxi)-succinimida (20 g, 0.08007 moles) en 50 ml de DCM seco, la mezcla de reacción se dejó calentar a temperatura ambiente. Después de completarse la reacción (2-3 h por CCF), la mezcla se lavó sucesivamente con
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disolución 1 N de HCl (1 x 100 ml) y disolución saturada de NaHCO3 (1 x 50 ml). A continuación, la fase orgánica se secó sobre Na2SO4 anhidro y el disolvente se evaporó dando el material en bruto que se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice para conseguir 516 como una masa pegajosa. Rendimiento: 11 g (89 %). RMN 1H (CDCl3, 400 MHz): 8 = 7.36-7.27 (m, 5H), 5.69 (s, 2H), 5.12 (s, 2H), 4.96 (a., 1H) 2.74 (s, 3H), 2.60 (m, 2H), 2.30-2.25 (m, 2H). LC- MS [M+H] -232.3 (96.94 %).
Síntesis de 517A y 517B
El ciclopenteno 516 (5 g, 0.02164 moles) se disolvió en una disolución de 220 ml de acetona y agua (10:1) en un RBF de una sola boca de 500 ml y a él se añadió N-óxido de N-metilmorfolina (7.6 g, 0.06492 moles), seguido de 4.2 ml de disolución al 7.6 % de OsO4 (0.275 g, 0.00108 moles) en terc-butanol a temperatura ambiente. Después de completarse la reacción (~ 3 h), la mezcla se inactivó con la adición de Na2SO3 sólido y la mezcla resultante se agitó durante 1.5 h a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se diluyó con DCM (300 ml) y se lavó con agua (2 x 100 ml), seguido de disolución saturada de NaHCO3 (1 x 50 ml), agua (1 x 30 ml) y finalmente con salmuera (1 x 50 ml). La fase orgánica se secó sobre Na2SO4 anhidro y el disolvente se eliminó a vacío. La purificación cromatográfica en columna de gel de sílice del material en bruto dio una mezcla de diaestereómeros, que se separaron por HPLC prep. Rendimiento: - 6 g brutos
517A - Pico-1 (sólido blanco), 5.13 g (96 %). RMN 1H (DMSO, 400 MHz): 8= 7.39-7.31 (m, 5H), 5.04(s, 2H), 4.78-4.73 (m, 1H), 4.48-4.47 (d, 2H), 3.94-3.93 (m, 2H), 2.71 (s, 3H), 1.72- 1.67 (m, 4H). LC-MS - [M+H]-266.3, [M+NH4+] -283.5 presente, HPLC-97.86 %. Estereoquímica confirmada por rayos X.
Síntesis de 518
Usando un procedimiento análogo al descrito para la síntesis del compuesto 505, el compuesto 518 (1.2 g, 41 %) se obtuvo como un aceite incoloro. RMN 1H (CDCl3, 400 MHz): 8= 7.35-7.33 (m, 4H), 7.30-7.27 (m, 1H), 5.37-5.27 (m, 8H), 5.12 (s, 2H), 4.75 (m,1H), 4.58-4.57 (m,2H), 2.78-2.74 (m,7H), 2.06-2.00 (m,8H), 1.96-1.91 (m, 2H), 1.62 (m, 4H), 1.48 (m, 2H), 1.37-1.25 (a m, 36H), 0.87 (m, 6H). HPLC-98.65 %.
Procedimiento general para la síntesis del compuesto 519
Se añadió una disolución del compuesto 518 (1 eq) en hexano (15 ml) en un modo gota a gota a una disolución fría en hielo de LAH en THF (1 M, 2 eq). Después de completarse adición, la mezcla se calentó a 40 °C durante 0.5 h, a continuación se enfrió de nuevo en un baño de hielo. La mezcla se hidrolizó ARNicuidadosamente con Na2SO4 acuoso saturado, luego se filtró a través de Celite y se redujo a un aceite. La cromatografía en columna proporcionó 519 puro (1.3 g, 68 %), que se obtuvo como un aceite incoloro. RMN 13C 8 = 130.2, 130.1 (x2), 127.9 (x3), 112.3, 79.3, 64.4, 44.7, 38.3, 35.4, 31.5, 29.9 (x2), 29.7, 29.6 (x2), 29.5 (x3), 29.3 (x2), 27.2 (x3), 25.6, 24.5, 23.3, 226, 14.1; EM por electropulverización (+va): Peso molecular para C44H80NO2 (M + H)+ Calc. 654.6, Hallado 654.6.
Las formulaciones preparadas por tanto el método convencional como libre de extrusión pueden caracterizarse de maneras similares. Por ejemplo, las formulaciones normalmente se caracterizan por inspección visual. Deben ser disoluciones translúcidas blanquecinas libres de agregados o sedimento. El tamaño de partícula y la distribución del tamaño de partícula de las nanopartículas de lípido pueden medirse por dispersión de la luz usando, por ejemplo, un Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvern, EE.UU.). Las partículas deben tener aproximadamente 20-300 nm, tal como 40100 nm de tamaño. La distribución del tamaño de partícula debe ser unimodal. La concentración de ARNbc total en la formulación, además de la fracción atrapada, se estima usando un ensayo de exclusión de colorante. Una muestra de ARNbc formulado puede incubarse con un colorante de unión a ARN, tal como Ribogreen (Molecular Probes) en presencia o ausencia de un tensioactivo de rotura de la formulación, por ejemplo, 0.5 % de Triton-X100. El ARNbc total en la formulación puede determinarse por la señal de la muestra que contiene el tensioactivo, con respecto a una curva patrón. La fracción atrapada se determina restando el contenido de ARNbc “libre” (como se mide por la señal en ausencia de tensioactivo) del contenido de ARNbc total. El porcentaje de ARNbc atrapado es normalmente >85 %. Para la formulación de LNP, el tamaño de partícula es al menos 30 nm, al menos 40 nm, al menos 50 nm, al menos 60 nm, al menos 70 nm, al menos 80 nm, al menos 90 nm, al menos 100 nm, al menos 110 nm y al menos 120 nm. El intervalo adecuado normalmente es aproximadamente al menos 50 nm a aproximadamente al menos 110 nm, aproximadamente al menos 60 nm a aproximadamente al menos 100 nm, o aproximadamente al menos 80 nm a aproximadamente al menos 90 nm.
Las composiciones y formulaciones para administración por vía oral incluyen polvos o gránulos, micropartículas, nanopartículas, suspensiones o disoluciones en agua o medios no acuosos, cápsulas, cápsulas de gel, sobres, comprimidos o minicomprimidos. Pueden ser deseables espesantes, aromatizantes, diluyentes, emulsionantes, adyuvantes de dispersión o aglutinantes. En algunas realizaciones, las formulaciones orales son aquellas en las que los ARNbc caracterizados en la invención se administran conjuntamente con uno o más tensioactivos potenciadores de la penetración y quelantes. Tensioactivos adecuados incluyen ácidos grasos y/o ésteres o sales de los mismos, ácidos biliares y/o sales de los mismos. Ácidos biliares/sales adecuados incluyen ácido quenodesoxicólico (CDCA) y ácido ursodesoxiquenodesoxicólico (UDCA), ácido cólico, ácido dehidrocólico, ácido desoxicólico, ácido glucólico, ácido glicólico, ácido glicodesoxicólico, ácido taurocólico, ácido taurodesoxicólico, tauro-24,25-dihidro-fusidato de sodio y glicodihidrofusidato de sodio. Ácidos grasos adecuados incluyen ácido araquidónico, ácido undecanoico, ácido oleico, ácido láurico, ácido caprílico, ácido cáprico, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido linoleico, ácido
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linolénico, dicaprato, tricaprato, monooleína, dilaurina, 1-monocaprato de glicerilo, 1-dodecilazacicloheptan-2-ona, una acilcarnitina, una acilcolina, o un monoglicérido, un diglicérido o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos (por ejemplo, sodio). En algunas realizaciones, se usan combinaciones de potenciadores de la penetración, por ejemplo, ácidos grasos/sales en combinación con ácidos biliares/sales. Una combinación a modo de ejemplo es la sal de sodio del ácido láurico, ácido cáprico y UDCA. Potenciadores de la penetración adicionales incluyen polioxietilen-9-lauril éter, polioxietilen-20-cetil éter. Los ARNbc caracterizados en la invención pueden administrarse por vía oral, en forma granulada que incluye partículas secadas por pulverización, o complejados para formar micro o nanopartículas. Los agentes de complejación de ARNbc incluyen poli-aminoácidos; poliiminas; poliacrilatos; polialquilacrilatos, polioxetanos, polialquilcianoacrilatos; gelatinas cationizadas, albúminas, almidones, acrilatos, polietilenglicoles (PEG) y almidones; polialquilcianoacrilatos; poliiminas derivatizadas con DEAE, polulanos, celulosas y almidones. Agentes complejantes adecuados incluyen quitosano, N-trimetilquitosano, poli-L-lisina, polihistidina, poliornitina, poliesperminas, protamina, polivinilpiridina, politiodietilaminometiletileno P(TDAE), poliaminoestireno (por ejemplo, p-amino), poli(metilcianoacrilato), poli(etilcianoacrilato), poli(butilcianoacrilato), poli(isobutilcianoacrilato), poli(isohexilcianoacrilato), DEAE-metacrilato, DEAE-hexilacrilato, DEAE-acrilamida, DEAE-albúmina y DEAE-dextrano, polimetilacrilato, polihexilacrilato, poli(ácido D,L-láctico), poli(ácido DL-láctico-co-glicólico (PLGA), alginato, y polietilenglicol (PEG). Formulaciones orales para ARNbc y su preparación se describen en detalle en la patente de EE.UU. 6,887,906, la publicación de EE.UU. n° 20030027780 y la patente de EE.UU. n° 6,747,014, cada una de las cuales se incorpora en el presente documento por referencia.
Composiciones y formulaciones para administración parenteral, intraparenquimatosa (en el cerebro), intratecal, intraventricular o intrahepática pueden incluir disoluciones acuosas estériles que también pueden contener tampones, diluyentes y otros aditivos adecuados tales como, pero no se limitan a, potenciadores de la penetración, compuestos de vehículo y otros vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables.
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, disoluciones, emulsiones y formulaciones que contienen liposomas. Estas composiciones pueden generarse a partir de una variedad de componentes que incluyen, pero no se limitan a, líquidos previamente formados, sólidos auto-emulsionantes y semisólidos auto-emulsionantes. Particularmente se prefieren formulaciones que se dirigen al hígado cuando se tratan trastornos hepáticos tales como carcinoma hepático.
Las formulaciones farmacéuticas de la presente invención, que pueden presentarse convenientemente en forma de dosificación unitaria, pueden prepararse según técnicas convencionales muy conocidas en la industria farmacéutica. Tales técnicas incluyen la etapa de poner en asociación los principios activos con el (los) vehículo(s) farmacéutico(s) o excipiente(s). En general, las formulaciones se preparan poniendo uniforme e íntimamente en asociación los principios activos con vehículos líquidos o vehículos sólidos finamente divididos, o ambos, y entonces, si fuera necesario, moldeando el producto.
Las composiciones de la presente invención pueden formularse en cualquiera de las muchas posibles formas de dosificación tales como, pero no se limitan a, comprimidos, cápsulas, cápsulas de gel, jarabes líquidos, geles blandos, supositorios y enemas. Las composiciones de la presente invención también pueden formularse como suspensiones en medios acuosos, no acuosos o mixtos. Las suspensiones acuosas pueden contener adicionalmente sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión que incluyen, por ejemplo, carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol y/o dextrano. La suspensión también puede contener estabilizadores.
C. Formulaciones adicionales
i. Emulsiones
Las composiciones de la presente invención pueden prepararse y formularse como emulsiones. Las emulsiones normalmente son sistemas heterogéneos de un líquido dispersado en otro en forma de gotitas que normalmente superan 0.1 |im de diámetro (véase, por ejemplo, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms Delivery Systems, Allen, LV., Popovich nG., y Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Idson, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volumen 1, p. 199; Rosoff, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Volumen 1, p. 245; Block en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volumen 2, p. 335; Higuchi et al., en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, p. 301). Las emulsiones son frecuentemente sistemas bifásicos que comprenden dos fases líquidas inmiscibles íntimamente mezcladas y dispersadas entre sí. En general, las emulsiones pueden ser de tanto la variedad de agua en aceite (w/o) como de aceite en agua (o/w). Cuando una fase acuosa se divide finamente en y se dispersa como gotitas ínfimas en una fase aceitosa a granel, la composición resultante se llama una emulsión de agua en aceite (w/o). Alternativamente, cuando una fase aceitosa está finamente dividida en y dispersada como gotitas ínfimas en una fase acuosa a granel, la composición resultante se llama una emulsión de aceite en agua (o/w). Las emulsiones pueden contener componentes adicionales, además de las fases dispersadas, y el fármaco activo que puede estar presente como una disolución en tanto la fase acuosa, fase aceitosa como en sí misma como una fase separada. Excipientes farmacéuticos tales como emulsionantes, estabilizadores, colorantes y antioxidantes también pueden estar presentes en emulsiones según se necesite. Las emulsiones farmacéuticas también pueden ser emulsiones múltiples que comprenden más de dos fases tales como, por ejemplo, en el caso de emulsiones de aceite
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en agua en aceite (o/w/o) y agua en aceite en agua (w/o/w). Tales formulaciones complejas frecuentemente proporcionan ciertas ventajas que no tienen las emulsiones binarias simples. Múltiples emulsiones en las que gotitas de aceite individuales de una emulsión o/w encierran pequeñas gotitas de agua constituyen una emulsión w/o/w. Asimismo, un sistema de gotitas de aceite encerradas en glóbulos de agua estabilizados en una fase continua aceitosa proporciona una emulsión o/w/o.
Las emulsiones se caracterizan por poca o ninguna estabilidad termodinámica. Frecuentemente, la fase dispersada o discontinua de la emulsión está bien dispersada en la fase externa o continua y se mantiene en esta forma mediante emulsionantes o la viscosidad de la formulación. Cualquiera de las fases de la emulsión puede ser un semisólido o un sólido, como es el caso de bases de pomada y cremas del estilo emulsión. Otros medios de estabilizar emulsiones conllevan el uso de emulsionantes que pueden incorporarse en cualquier fase de la emulsión. Los emulsionantes pueden clasificarse ampliamente en cuatro categorías: tensioactivos sintéticos, emulsionantes que se producen naturalmente, bases de absorción y sólidos finamente dispersados (véase, por ejemplo, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich Ng., y Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Idson, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volumen 1, p. 199).
Los tensioactivos sintéticos, también conocidos como agentes tensioactivos, han encontrado una amplia aplicabilidad en la formulación de emulsiones y se han revisado en la bibliografía (véase, por ejemplo, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., y Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Rieger, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volumen 1, p. 285; Idson, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, volumen 1, p. 199). Los tensioactivos normalmente son anfifílicos y comprenden una porción hidrófila y una hidrófoba. La relación de la naturaleza hidrófila con respecto a la hidrófoba del tensioactivo se ha llamado el equilibrio hidrófilo/lipófilo (HLB) y es una valiosa herramienta en clasificar y seleccionar tensioactivos en la preparación de formulaciones. Los tensioactivos pueden clasificarse en diferentes clases basándose en la naturaleza del grupo hidrófilo: no iónico, aniónico, catiónico y anfótero (véase, por ejemplo, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., y Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY Rieger, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volumen 1, p. 285).
Los emulsionantes que se producen naturalmente usados en las formulaciones en emulsión incluyen lanolina, cera de abeja, fosfatidas, lecitina y goma arábiga. Las bases de absorción poseen propiedades hidrófilas de forma que puedan absorber agua para formar emulsiones w/o que todavía retienen sus consistencias semisólidos, tales como lanolina anhidra y vaselina hidrófila. También se han usado sólidos finamente divididos como buenos emulsionantes, especialmente en combinación con tensioactivos y en preparaciones viscosas. Éstos incluyen sólidos inorgánicos polares, tales como hidróxidos de metales pesados, arcillas no hinchables tales como bentonita, atapulgita, hectorita, caolín, montmorillonita, silicato de aluminio coloidal y silicato de magnesio y aluminio coloidal, pigmentos y sólidos no polares tales como carbono o triestearato de glicerilo.
También están incluidos en las formulaciones en emulsión una gran variedad de materiales no emulsionantes y contribuyen a las propiedades de las emulsiones. Éstos incluyen grasas, aceites, ceras, ácidos grasos, alcoholes grasos, ésteres grasos, humectantes, coloides hidrófilos, conservantes y antioxidantes (Block, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volumen 1, p. 335; Idson, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volumen 1, p. 199).
Los coloides hidrófilos o hidrocoloides incluyen gomas que se producen naturalmente y polímeros sintéticos tales como polisacáridos (por ejemplo, goma arábiga, agar, ácido algínico, carragenina, goma guar, goma karaya y tragacanto), derivados de celulosa (por ejemplo, carboximetilcelulosa y carboxipropilcelulosa) y polímeros sintéticos (por ejemplo, carbómeros, éteres de celulosa y polímeros de carboxivinilo). Éstos se dispersan o hinchan en agua para formar disoluciones coloidales que estabilizan las emulsiones formando fuertes películas interfaciales alrededor de las gotitas de fase dispersada y aumentando la viscosidad de la fase externa.
Como las emulsiones contienen frecuentemente varios componentes tales como hidratos de carbono, proteínas, esteroles y fosfatidas que pueden soportar fácilmente el crecimiento de microbios, estas formulaciones frecuentemente incorporan conservantes. Conservantes comúnmente usados incluidos en las formulaciones en emulsión incluyen metilparabeno, propilparabeno, sales de amonio cuaternario, cloruro de benzalconio, ésteres de ácido p-hidroxibenzoico y ácido bórico. También se añaden comúnmente antioxidantes a las formulaciones en emulsión para prevenir el deterioro de la formulación. Los antioxidantes usados pueden ser secuestrantes de radicales libres tales como tocoferoles, galatos de alquilo, hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado o agentes reductores tales como ácido ascórbico y metabisulfito de sodio, y sinergistas de antioxidantes tales como ácido cítrico, ácido tartárico y lecitina.
Se ha revisado la aplicación de formulaciones en emulsión mediante las vías dermatológica, oral y parenteral y los métodos para su fabricación en la bibliografía (véanse, por ejemplo, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., y Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Idson, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York,
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N.Y., volumen 1, p. 199). Las formulaciones en emulsión para administración oral se han usado muy ampliamente debido a la facilidad de formulación, además de la eficacia desde un punto de vista de la absorción y biodisponibilidad (véanse, por ejemplo, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., y Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Rosoff, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volumen 1, p. 245; Idson, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volumen 1, p. 199). Los laxantes de base de aceite mineral, vitaminas liposolubles y preparaciones nutritivas ricas en grasas están entre los materiales que se han administrado comúnmente por vía oral como emulsiones o/w.
ii. Microemulsiones
En una implementación, las composiciones de los ARNi y ácidos nucleicos se formulan como microemulsiones. Una microemulsión puede definirse como un sistema de agua, aceite y anfífilo que es una disolución líquida ópticamente isotrópica y termodinámicamente estable única (véase, por ejemplo, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., y Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Rosoff, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volumen 1, p. 245). Normalmente, las microemulsiones son sistemas que se preparan dispersando primero un aceite en una disolución de tensioactivo acuoso y a continuación añadiendo una cantidad suficiente de un cuarto componente, generalmente un alcohol de longitud de cadena intermedia para formar un sistema transparente. Por tanto, también se han descrito microemulsiones como dispersiones isotrópicamente claras termodinámicamente estables, de dos líquidos inmiscibles que se estabilizan por películas interfaciales de moléculas tensioactivas (Leung y Shah, en: Controlled Release of Drugs: Polymers and Aggregate Systems, Rosoff, M., Ed., 1989, VCH Publishers, New York, páginas 185-215). Las microemulsiones se preparan comúnmente mediante una combinación de tres a cinco componentes que incluyen aceite, agua, tensioactivo, co-tensioactivo y electrolito. Si la microemulsión es del tipo agua en aceite (w/o) o aceite en agua (o/w) depende de las propiedades del aceite y tensioactivo usados y de la estructura y el empaquetamiento geométrico de las cabezas polares y colas de hidrocarburo de las moléculas de tensioactivo (Schott, en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, p. 271).
El enfoque fenomenológico que utiliza diagramas de fases se ha estudiado ampliamente y ha dado un amplio conocimiento, para un experto en la materia, de cómo formular microemulsiones (véase, por ejemplo, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., y Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Rosoff, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volumen 1, p. 245; Block, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volumen 1, p. 335). En comparación con emulsiones convencionales, las microemulsiones ofrecen la ventaja de solubilizar fármacos insolubles en agua en una formulación de gotitas termodinámicamente estables que se forman espontáneamente.
Los tensioactivos usados en la preparación de microemulsiones incluyen, pero no se limitan a, tensioactivos iónicos, tensioactivos no iónicos, Brij 96, polioxietilen oleil éteres, ésteres de ácidos grasos de poliglicerol, monolaurato de tetraglicerol (ML310), monooleato de tetraglicerol (MO310), monooleato de hexaglicerol (PO310), pentaoleato de hexaglicerol (PO500), monocaprato de decaglicerol (MCA750), monooleato de decaglicerol (MO750), sesquioleato de decaglicerol (SO750), decaoleato de decaglicerol (DAO750), solos o en combinación con co-tensioactivos. El co- tensioactivo, normalmente un alcohol de cadena corta, tal como etanol, 1-propanol y 1-butanol, sirve para aumentar la fluidez interfacial penetrando en la película del tensioactivo y, por consiguiente, creando una película desordenada debido al espacio vacío generado entre moléculas de tensioactivo. Sin embargo, las microemulsiones pueden prepararse sin el uso de co-tensioactivos y se conocen en la técnica sistemas de microemulsiones auto-emulsionantes libres de alcohol. La fase acuosa puede normalmente ser, pero no se limita a, agua, una disolución acuosa del fármaco, glicerol, PEG300, PEG400, poligliceroles, propilenglicoles y derivados de etilenglicol. La fase aceitosa puede incluir, pero no se limita a, materiales tales como Captex 300, Captex 355, Capmul MCM, ésteres de ácidos grasos, mono, di, y tri-glicéridos de cadena media (C8-C12), ésteres de ácidos grasos de glicerilo polioxietilados, alcoholes grasos, glicéridos poliglicolizados, glicéridos C8-C10 poliglicolizados saturados, aceites vegetales y aceite de silicona.
Las microemulsiones son particularmente de interés desde el punto de vista de la solubilización del fármaco y la potenciada absorción de fármacos. Se han propuesto microemulsiones basadas en lípidos (tanto o/w como w/o) para potenciar la biodisponibilidad oral de fármacos, que incluyen péptidos (véanse, por ejemplo, las patentes de EE.uU. n° 6,191,105; 7,063,860; 7,070,802; 7,157,099; Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385-1390; Ritschel, Meth. Find. Exp. Clin. Pharmacol., 1993, 13, 205). Las microemulsiones proporcionan ventajas de solubilización del fármaco mejorada, protección del fármaco de la hidrólisis enzimática, posible potenciamiento de la absorción del fármaco debido a alteraciones inducidas por el tensioactivo en la fluidez y permeabilidad de la membrana, facilidad de preparación, facilidad de administración por vía oral con respecto a formas de dosificación sólidas, potencia clínica mejorada y toxicidad reducida (véanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. n° 6,191,105; 7,063,860; 7,070,802; 7,157,099; Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385; Ho et al., J. Pharm. Sci., 1996, 85, 138143). Frecuentemente, las microemulsiones pueden formarse espontáneamente cuando sus componentes se ponen juntos a temperatura ambiente. Esto puede ser particularmente ventajoso cuando se formulan fármacos termolábiles, péptidos o ARNi. Las microemulsiones también han sido eficaces en la administración transdérmica de componentes activos en tanto aplicaciones cosméticas como farmacéuticas. Se espera que las composiciones en microemulsión y las formulaciones de la presente invención faciliten la elevada absorción sistémica de los ARNi y ácidos nucleicos del tubo
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gastrointestinal, además de mejorar la captación celular local de los ARNi y ácidos nucleicos.
Las microemulsiones también pueden contener componentes y aditivos adicionales tales como monoestearato de sorbitano (Grill 3), Labrasol y potenciadores de la penetración para mejorar las propiedades de la formulación y para potenciar la absorción de los ARNi y ácidos nucleicos de la presente invención. Los potenciadores de la penetración usados en las microemulsiones de la presente invención pueden clasificarse como que pertenecen a una de las cinco amplias categorías--tensioactivos, ácidos grasos, sales biliares, agentes quelantes y no tensioactivos no quelantes (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p. 92). Cada uno de estas clases se ha tratado anteriormente.
iii. Micropartículas
Un agente de iARN de la invención puede incorporarse en una partícula, por ejemplo, una micropartícula. Las micropartículas pueden producirse por secado por pulverización, pero también pueden producirse por otros métodos que incluyen liofilización, evaporación, secado en lecho fluidizado, secado a vacío, o una combinación de estas técnicas.
iv. Potenciadores de la penetración
En una implementación, la presente invención emplea diversos potenciadores de la penetración para efectuar la eficaz administración de ácidos nucleicos, particularmente ARNi, a la piel de animales. La mayoría de los fármacos están presentes en disolución en tanto formas ionizadas como no ionizadas. Sin embargo, normalmente solo los fármacos liposolubles o lipófilos cruzan fácilmente las membranas celulares. Se ha descubierto que incluso los fármacos no lipófilos pueden cruzar membranas celulares si la membrana que va a cruzarse se trata con un potenciador de la penetración. Además de ayudar en la difusión de fármacos no lipófilos a través de las membranas celulares, los potenciadores de la penetración también potencian la permeabilidad de fármacos lipófilos.
Los potenciadores de la penetración pueden clasificarse como pertenecientes a una de las cinco amplias categorías, es decir, tensioactivos, ácidos grasos, sales biliares, agentes quelantes y no tensioactivos no quelantes (véase, por ejemplo, Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92). Cada uno de las clases anteriormente mencionadas de potenciadores de la penetración se describe a continuación en mayor detalle.
Los tensioactivos (o “agentes tensioactivos”) son entidades químicas que, cuando se disuelven en una disolución acuosa, reducen la tensión superficial de la disolución o la tensión interfacial entre la disolución acuosa y otro líquido, con el resultado de que se potencia la absorción de los ARNi mediante la mucosa. Además de sales biliares y ácidos grasos, estos potenciadores de la penetración incluyen, por ejemplo, laurilsulfato de sodio, polioxietilen-9-lauril éter y polioxietilen-20-cetil éter) (véase, por ejemplo, Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92); y emulsiones perfluoroquímicas, tales como FC-43. Takahashi et al., J. Pharm. Pharmacol., 1988, 40, 252).
Diversos ácidos grasos y sus derivados que actúan de potenciadores de la penetración incluyen, por ejemplo, ácido oleico, ácido láurico, ácido cáprico (ácido n-decanoico), ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido linoleico, ácido linolénico, dicaprato, tricaprato, monooleína (1-monooleoil-rac-glicerol), dilaurina, ácido caprílico, ácido araquidónico, 1-monocaprato de glicerol, 1-dodecilazacicloheptan-2-ona, acilcarnitinas, acilcolinas, ésteres de alquilo C1- 20 de los mismos (por ejemplo, metilo, isopropilo y t-butilo) y mono- y di-glicéridos de los mismos (es decir, oleato, laurato, caprato, miristato, palmitato, estearato, linoleato, etc.) (véase, por ejemplo, Touitou, E., et al. Enhancement in Drug Delivery, CRC Press, Danvers, MA, 2006; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; El Hariri et al., J. Pharm. Pharmacol., 1992, 44, 651-654).
La función fisiológica de la bilis incluye facilitar la dispersión y absorción de lípidos y vitaminas liposolubles (véase, por ejemplo, Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Brunton, Capítulo 38 en: Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9th Ed., Hardman et al. Eds., McGraw-Hill, New York, 1996, pp. 934-935). Diversas sales biliares naturales, y sus derivados sintéticos, actúan de potenciadores de la penetración. Así el término “sales biliares” incluye cualquiera de los componentes que se producen naturalmente de la bilis, además de cualquiera de sus derivados sintéticos. Sales biliares adecuadas incluyen, por ejemplo, ácido cólico (o su sal farmacéuticamente aceptable de sodio, colato de sodio), ácido dehidrocólico (dehidrocolato de sodio), ácido desoxicólico (desoxicolato de sodio), ácido glucólico (glucolato de sodio), ácido glicólico (glicocolato de sodio), ácido glicodesoxicólico (glicodesoxicolato de sodio), ácido taurocólico (taurocolato de sodio), ácido taurodesoxicólico (taurodesoxicolato de sodio), ácido quenodesoxicólico (quenodesoxicolato de sodio), ácido ursodesoxicólico (UDCA), tauro-24,25-dihidro-fusidato de sodio (STDHF), glicodihidrofusidato de sodio y polioxietilen-9- lauril éter (POE) (véanse, por ejemplo, Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92; Swinyard, Capítulo 39 en: Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990, páginas 782-783; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; Yamamoto et al., J. Pharm. Exp. Ther., 1992, 263, 25; Yamashita et al., J. Pharm. Sci., 1990, 79, 579-583).
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Los agentes quelantes, como se usa a propósito de la presente invención, pueden definirse como compuestos que eliminan iones metálicos de la disolución formando complejos con los mismos, con el resultado de que se potencia la absorción de los ARNi a través de la mucosa. Con respecto a su uso como potenciadores de la penetración en la presente invención, los agentes quelantes tienen la ventaja añadida de que también sirven de inhibidores de DNasa, ya que las ADN nucleasas más caracterizadas requieren un ión metálico divalente para la catálisis y así son inhibidos por agentes quelantes (Jarrett, J. Chromatogr., 1993, 618, 315-339). Agentes quelantes adecuados incluyen, pero no se limitan a, etilendiaminatetraacetato de disodio (EDTA), ácido cítrico, salicilatos (por ejemplo, salicilato de sodio, 5- metoxisalicilato y homovanilato), derivados de N-acilo de colágeno, lauril éter-9 y derivados de N-aminoacilo de beta- dicetonas (enaminas)(véanse, por ejemplo, Katdare, A. et al., Excipient development for pharmaceutical, biotechnology, and drug delivery, CRC Press, Danvers, MA, 2006; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; Buur et al., J. Control Rel., 1990, 14, 43-51).
Como se usa en el presente documento, los compuestos potenciadores de la penetración no tensioactivos no quelantes pueden definirse como compuestos que demuestran actividad insignificativa como agentes quelantes o como tensioactivos, pero que sin embargo potencian la absorción de los ARNi a través de la mucosa alimentaria (véase, por ejemplo, Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33). Esta clase de potenciadores de la penetración incluye, por ejemplo, ureas cíclicas insaturadas, derivados de 1 -alquil- y 1-alquenilazaciclo-alcanonas (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, página 92); y agentes antiinflamatorios no esteroideos tales como diclofenaco sódico, indometacina y fenilbutazona (Yamashita et al., J. Pharm. Pharmacol., 1987, 39, 621-626).
También pueden añadirse agentes que potencian la captación de los ARNi al nivel celular a las composiciones farmacéuticas y otras composiciones de la presente invención. Por ejemplo, también se conocen lípidos catiónicos, tales como lipofectina (Junichi et al., patente de EE.UU. n° 5,705,188), derivados de glicerol catiónicos y moléculas policatiónicas, tales como polilisina (Lollo et al., solicitud PCT WO 97/30731), para potenciar la captación celular de ARNbc. Ejemplos de reactivos de transfección comercialmente disponibles incluyen, por ejemplo, Lipofectamine™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), Lipofectamine 2000™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), 293fectin™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), Cellfectin™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), DMRIE-C™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), FreeStyle™ MAX (Invitrogen; Carlsbad, CA), Lipofectamine™ 2000 CD (Invitrogen; Carlsbad, CA), Lipofectamine™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), RNAiMAX (Invitrogen; Carlsbad, CA), Oligofectamine™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), Optifect™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), reactivo de transfección X-tremeGENE Q2 (Roche; Grenzacherstrasse, Suiza), reactivo de transfección liposómica DOTAP (Grenzacherstrasse, Suiza), reactivo de transfección liposómica DOSPER (Grenzacherstrasse, Suiza) o Fugene (Grenzacherstrasse, Suiza), reactivo Transfectam® (Promega; Madison, WI), reactivo de transfección TransFast™ (Promega; Madison, WI), reactivo Tfx™-20 (Promega; Madison, WI), reactivo Tfx™-50 (Promega; Madison, WI), DreamFect™ (OZ Biosciences; Marsella, Francia), EcoTransfect (OZ Biosciences; Marsella, Francia), reactivo de transfección TransPass3 D1 (New England Biolabs; Ipswich, MA, EE.UU.), LyoVec™/LipoGen™ (Invitrogen; San Diego, CA, USA), reactivo de transfección PerFectin (Genlantis; San Diego, CA, EE.UU.), reactivo de transfección NeuroPORTER (Genlantis; San Diego, CA, EE.UU.), reactivo de transfección GenePORTER (Genlantis; San Diego, CA, EE.UU.), reactivo de transfección GenePORTER 2 (Genlantis; San Diego, CA, USA), reactivo de transfección Cytofectin (Genlantis; San Diego, CA, EE.UU.), reactivo de transfección BaculoPORTER (Genlantis; San Diego, CA, EE.UU.), reactivo de transfección TroganPORTER™ (Genlantis; San Diego, CA, EE.UU.), RiboFect (Bioline; Taunton, MA, EE.UU.), PlasFect (Bioline; Taunton, MA, EE.UU.), UniFECTOR (B-Bridge International; Mountain View, CA, EE.UU.), SureFECTOR (B-Bridge International; Mountain View, CA, EE.UU.) o HiFect™ (B-Bridge International, Mountain View, CA, EE.UU.), entre otros.
Pueden utilizarse otros agentes para potenciar la penetración de los ácidos nucleicos administrados, que incluyen glicoles tales como etilenglicol y propilenglicol, pirroles tales como 2-pirrol, azonas y terpenos tales como limoneno y mentona.
v. Vehículos
Ciertas composiciones de la presente invención también incorporan compuestos de vehículo en la formulación. Como se usa en el presente documento, “compuesto de vehículo” o “vehículo” puede referirse a un ácido nucleico, o análogo del mismo, que es inerte (es decir, no posee actividad biológica por sí mismo), pero es reconocido como un ácido nucleico por procesos in vivo que reducen la biodisponibilidad de un ácido nucleico que tiene actividad biológica, por ejemplo, degradando el ácido nucleico biológicamente activo o promoviendo su eliminación de la circulación. La coadministración de un ácido nucleico y un compuesto de vehículo, normalmente con un exceso de la última sustancia, puede producir una reducción sustancial de la cantidad de ácido nucleico recuperada en el hígado, riñón u otros depósitos extracirculatorios, supuestamente debido a la competición entre el compuesto de vehículo y el ácido nucleico para un receptor común. Por ejemplo, la recuperación de un ARNbc parcialmente de fosforotioato en tejido hepático puede reducirse cuando se co-administra con ácido poliinosínico, sulfato de dextrano, ácido policitídico o diácido 4-acetamido- 4'isotiociano-estilbeno-2,2'-sulfónico (Miyao et al., DsRNA Res. Dev., 1995, 5, 115-121; Takakura et al., DsRNA & Nucl. Acid Drug Dev., 1996, 6, 177-183.
vi. Excipientes
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A diferencia de un compuesto de vehículo, un “vehículo farmacéutico” o “excipiente” es un disolvente farmacéuticamente aceptable, agente de suspensión o cualquier otro vehículo farmacológicamente inerte para administrar uno o más ácidos nucleicos a un animal. El excipiente puede ser líquido o sólido y se selecciona, teniendo en cuenta el modo planeado de administración, de manera que se proporcione el volumen deseado, consistencia, etc., cuando se combine con un ácido nucleico y los otros componentes de una composición farmacéutica dada. Vehículos farmacéuticos típicos incluyen, pero no se limitan a, agentes de unión (por ejemplo, almidón de maíz pregelatinizado, polivinilpirrolidona o hidroxipropilmetilcelulosa, etc.); cargas (por ejemplo, lactosa y otros azúcares, celulosa microcristalina, pectina, gelatina, sulfato de calcio, etilcelulosa, poliacrilatos o hidrogenofosfato de calcio, etc.); lubricantes (por ejemplo, estearato de magnesio, talco, sílice, dióxido de silicio coloidal, ácido esteárico, estearatos metálicos, aceites vegetales hidrogenados, almidón de maíz, polietilenglicoles, benzoato de sodio, acetato sódico, etc.); disgregantes (por ejemplo, almidón, glicolato sódico de almidón, etc.); y agentes humectantes (por ejemplo, laurilsulfato de sodio, etc.).
También pueden usarse excipientes orgánicos o inorgánicos farmacéuticamente aceptables adecuados para administración no parenteral que no reaccionan perjudicialmente con los ácidos nucleicos para formular las composiciones de la presente invención. Vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen, pero no se limitan a, agua, disoluciones salinas, alcoholes, polietilenglicoles, gelatina, lactosa, amilosa, estearato de magnesio, talco, ácido silícico, parafina viscosa, hidroximetilcelulosa, polivinilpirrolidona y similares.
Las formulaciones para administración tópica de ácidos nucleicos pueden incluir disoluciones acuosas estériles y no estériles, disoluciones no acuosas en disolventes comunes tales como alcoholes, o disoluciones de los ácidos nucleicos en bases de aceite líquidas o sólidas. Las disoluciones también pueden contener tampones, diluyentes y otros aditivos adecuados. Pueden usarse excipientes orgánicos o inorgánicos farmacéuticamente aceptables adecuados para administración no parenteral que no reaccionan perjudicialmente con ácidos nucleicos.
Excipientes farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen, pero no se limitan a, agua, disoluciones salinas, alcohol, polietilenglicoles, gelatina, lactosa, amilosa, estearato de magnesio, talco, ácido silícico, parafina viscosa, hidroximetilcelulosa, polivinilpirrolidona y similares.
vii. Otros componentes
Las composiciones de la presente invención pueden contener adicionalmente otros componentes auxiliares convencionalmente encontrados en composiciones farmacéuticas, a sus niveles de uso establecidos en la materia. Así, por ejemplo, las composiciones pueden contener materiales farmacéuticamente activos compatibles adicionales tales como, por ejemplo, antipruríticos, astringentes, anestésicos locales o agentes antiinflamatorios, o pueden contener materiales adicionales útiles en la formulación física de diversas formas de dosificación de las composiciones de la presente invención, tales como colorantes, aromatizantes, conservantes, antioxidantes, opacificantes, espesantes y estabilizadores. Sin embargo, tales materiales, cuando se añaden, no deben interferir excesivamente con las actividades biológicas de los componentes de las composiciones de la presente invención. Las formulaciones pueden esterilizarse y, si se desea, mezclarse con agentes auxiliares, por ejemplo, lubricantes, conservantes, estabilizadores, agentes humectantes, emulsionantes, sales para influir en la presión osmótica, tampones, colorantes, aromatizantes y/o sustancias aromáticas y similares que no interaccionan perjudicialmente con el (los) ácido(s) nucleico(s) de la formulación.
Las suspensiones acuosas pueden contener sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión que incluyen, por ejemplo, carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol y/o dextrano. La suspensión también puede contener estabilizadores.
En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas caracterizadas en la invención incluyen (a) uno o más compuestos de ARNi y (b) uno o más agentes que funcionan por un mecanismo no de iARN y que son útiles en el tratamiento de un trastorno hemorrágico. Ejemplos de tales agentes incluyen, pero no se limitan a, un agente antiinflamatorio, agente antiesteatosis, agente antiviral y/o antifibrosis. Además, también pueden usarse otras sustancias comúnmente usadas para proteger el hígado, tales como silimarina, conjuntamente con los ARNi descritos en el presente documento. Otros agentes útiles para tratar enfermedades del hígado incluyen telbivudina, entecavir e inhibidores de la proteasa tales como telaprevir y otros desvelados, por ejemplo, en Tung et al., publicaciones de solicitud de EE.UU. n° 2005/0148548, 2004/0167116 y 2003/0144217; y en Hale et al., publicación de solicitud de EE.UU. n° 2004/0127488.
La toxicidad y eficacia terapéutica de tales compuestos pueden determinarse mediante procedimientos farmacéuticos convencionales en cultivos celulares o animales experimentales, por ejemplo, para determinar la DL50 (la dosis letal para el 50 % de la población) y la DE50 (la dosis terapéuticamente eficaz en el 50 % de la población). La relación de dosis entre efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico y puede expresarse como la relación DL50/DE50. Se prefieren compuestos que presentan altos índices terapéuticos.
Los datos obtenidos de ensayos de cultivo celular y estudios en animales pueden usarse en la formulación de un intervalo de dosificación para su uso en seres humanos. La dosificación de composiciones caracterizadas en el presente documento en la invención se encuentra generalmente dentro de un intervalo de concentraciones circulantes que incluyen la DE50 con poca o ninguna toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosificación empleada y la vía de administración utilizada. Para cualquier compuesto usado en los métodos
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caracterizados en la invención, la dosis terapéuticamente eficaz puede estimarse inicialmente a partir de ensayos de cultivo celular. Una dosis puede formularse en modelos animales para lograr un intervalo de concentración plasmática circulante del compuesto o, cuando convenga, del producto de polipéptido de una secuencia diana (por ejemplo, logrando una concentración disminuida del polipéptido) que incluye la CI50 (es decir, la concentración del compuesto de prueba que logra una inhibición al 50 % de los síntomas) como se ha determinado en cultivo celular. Tal información puede usarse para determinar con más exactitud dosis útiles en seres humanos. Los niveles en plasma pueden medirse, por ejemplo, por cromatografía líquida de alta resolución.
Además de su administración, como se trata anteriormente, los ARNi caracterizados en la invención pueden administrarse en combinación con otros agentes conocidos eficaces en el tratamiento de procesos patológicos mediados por la expresión de PCSK9. En cualquier caso, el médico que administra puede ajustar la cantidad y el momento exacto de la administración de ARNi basándose en resultados observados usando medidas estándar de eficacia conocidas en la técnica o descritas en el presente documento.
IV. Métodos para inhibir la expresión PCSK9
La presente divulgación proporciona métodos para inhibir la expresión de una proproteína convertasa subtilisina kexina 9 (PCSK9) en una célula. Los métodos incluyen poner en contacto una célula con un agente de iARN, por ejemplo, un agente de iARN bicatenario, en una cantidad eficaz para inhibir la expresión de la PCSK9 en la célula, inhibiendo así la expresión de la PCSK9 en la célula.
La puesta en contacto de una célula con un agente de iARN bicatenario puede hacerse in vitro o in vivo. La puesta en contacto de una célula in vivo con el agente de iARN incluye poner en contacto una célula o grupo de células dentro de un sujeto, por ejemplo, un sujeto humano, con el agente de iARN. También son posibles combinaciones de métodos in vitro e in vivo de poner en contacto. La puesta en contacto puede ser directa o indirecta, como se trata anteriormente. Además, la puesta en contacto de una célula puede llevarse a cabo mediante un ligando que elige diana, que incluye cualquier ligando descrito en el presente documento o conocido en la técnica. En implementaciones preferidas, el ligando que elige diana es un resto de hidrato de carbono, por ejemplo, un ligando de GalNAc3, o cualquier otro ligando que dirige el agente de iARN a un sitio de interés, por ejemplo, el hígado de un sujeto.
El término “inhibir”, como se usa en el presente documento, se usa indistintamente con “reducir”, “silenciar”, “regular por disminución” y otros términos similares, e incluye cualquier nivel de inhibición.
La expresión “inhibir la expresión de un PCSK9”, pretende referirse a la inhibición de la expresión de cualquier gen PCSK9 (tal como, por ejemplo, un gen PCSK9 de ratón, un gen PCSK9 de rata, un gen PCSK9 de mono o un gen PCSK9 humano) además de variantes o mutantes de un gen PCSK9. Así, el gen PCSK9 puede ser un gen PCSK9 no mutante, un gen PCSK9 mutante o un gen PCSK9 transgénico en el contexto de una célula genéticamente manipulada, grupo de células u organismo.
“Inhibir la expresión de un gen PCSK9” incluye cualquier nivel de inhibición de un gen PCSK9, por ejemplo, supresión al menos parcial de la expresión de un gen PCSK9. La expresión del gen PCSK9 puede evaluarse basándose en el nivel, o el cambio en el nivel, de cualquier variable asociada a la expresión del gen PCSK9, por ejemplo, nivel de ARNm de PCSK9, nivel de proteína PCSK9, o niveles de lípidos. Este nivel puede evaluarse en una célula individual o en un grupo de células, que incluyen, por ejemplo, una muestra derivada de un sujeto.
La inhibición puede evaluarse por una disminución en un nivel absoluto o relativo de una o más de estas variables que están asociadas a la expresión de PCSK9 en comparación con un nivel de control. El nivel de control puede ser cualquier tipo de nivel de control que se utiliza en la materia, por ejemplo, un nivel inicial pre-dosis, o un nivel determinado a partir de un sujeto, célula o muestra similar que no está tratado o está tratado con un control (tal como, por ejemplo, control solo de tampón o control de agente inactivo).
En algunas implementaciones de los métodos de la invención, la expresión de un gen PCSK9 se inhibe al menos
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el 5 %, al menos aproximadamente el 10 %, al menos aproximadamente el 15 %, al menos
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aproximadamente
el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos
aproximadamente
el 91 %, al menos aproximadamente el 92 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos
aproximadamente
el 94 % , al menos aproximadamente 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos
aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, o al menos aproximadamente el 99 %.
La inhibición de la expresión de un gen PCSK9 puede manifestarse por una reducción de la cantidad de ARNm expresado por una primera célula o grupo de células (tales células pueden estar presentes, por ejemplo, en una muestra derivada de un sujeto) en las que un gen PCSK9 se transcribe y que ha sido tratada o han sido tratadas (por ejemplo, poniendo en contacto la célula o células con un agente de iARN de la invención, o administrando un agente de iARN de la invención a un sujeto en el que las células están o estaban presentes) de forma que se inhiba la expresión de un gen PCSK9, en comparación con una segunda célula o grupo de células sustancialmente idéntica a la primera célula o
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grupo de células, pero que no se ha tratado o no se han tratado así (célula(s) de control). En realizaciones preferidas, la inhibición se evalúa expresando el nivel de ARNm en células tratadas como un porcentaje del nivel de ARNm en células de control, usando la siguiente fórmula:
ím en céluLas de control) —
Jm en células
ím en células de control)
100 %
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Alternativamente, la inhibición de la expresión de un gen PCSK9 puede evaluarse en términos de una reducción de un parámetro que está funcionalmente ligado a la expresión del gen PCSK9, por ejemplo, la expresión de proteínas PCSK9, tales como niveles de lípidos, niveles de colesterol, por ejemplo, niveles de LDLc. El silenciamiento del gen PCSK9 puede determinarse en cualquier célula que exprese PCSK9, tanto constitutivamente como por ingeniería genómica, y por cualquier ensayo conocidos en la técnica. El hígado es el principal sitio de expresión de PCSK9. Otros sitios de expresión significativos incluyen el páncreas, el riñón y los intestinos.
La inhibición de la expresión de una proteína PCSK9 puede manifestarse por una reducción en el nivel de la proteína PCSK9 que se expresa por una célula o grupo de células (por ejemplo, el nivel de proteína expresada en una muestra derivada de un sujeto). Como se ha explicado anteriormente para la evaluación de la supresión de ARNm, la inhibición de los niveles de expresión de proteína en una célula tratada o grupo de células puede expresarse similarmente como un porcentaje del nivel de proteína en una célula de control o grupo de células.
Una célula de control o grupo de células que puede usarse para evaluar la inhibición de la expresión de un gen PCSK9 incluye una célula o grupo de células que todavía no se ha puesto en contacto con un agente de iARN de la invención. Por ejemplo, la célula de control o grupo de células puede derivarse de un sujeto individual (por ejemplo, un sujeto humano o animal) antes del tratamiento del sujeto con un agente de iARN.
El nivel de ARNm de PCSK9 que se expresa por una célula o grupo de células puede determinarse usando cualquier método conocido en la técnica para evaluar la expresión de ARNm. En una realización, el nivel de expresión de PCSK9 en una muestra se determina detectando un polinucleótido transcrito, o porción del mismo, por ejemplo, ARNm del gen PCSK9. El ARN puede extraerse de células usando técnicas de extracción de ARN que incluyen, por ejemplo, usando extracción con fenol ácido/isotiocianato de guanidina (RNAzol B; Biogenesis), kits de preparación de aRn RNeasy (Qiagen) o PAXgene (PreAnalytix, Suiza). Formatos de ensayo típicos que utilizan hibridación de ácidos ribonucleicos incluyen ensayos de transcripción nuclear, RT-PCR, ensayos de protección con RNasa (Melton et al., Nuc. Acids Res. 12:7035), transferencia Northern, hibridación in situ y análisis de micromatrices.
En una implementación, el nivel de expresión de PCSK9 se determina usando una sonda de ácido nucleico. El término “sonda”, como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier molécula que puede unirse selectivamente a un PCSK9 específico. Las sondas pueden sintetizarse por un experto en la materia, o derivarse de preparaciones biológicas apropiadas. Las sondas pueden diseñarse específicamente para ser marcadas. Ejemplos de moléculas que pueden utilizarse como sondas incluyen, pero no se limitan a, ARN, ADN, proteínas, anticuerpos y moléculas orgánicas.
Puede usarse ARNm aislado en ensayos de hibridación o amplificación que incluyen, pero no se limitan a, análisis Southern o Northern, análisis de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y matrices de sondas. Un método para la determinación de niveles de ARNm implica poner en contacto el ARNm aislado con una molécula de ácido nucleico (sonda) que puede hibridarse con ARNm de PCSK9. En una realización, el ARNm se inmoviliza sobre una superficie sólida y se pone en contacto con una sonda, por ejemplo, migrando el ARNm aislado sobre un gel de agarosa y transfiriendo el ARNm del gel a una membrana, tal como nitrocelulosa. En una implementación alternativa, la(s) sonda(s) se inmoviliza(n) sobre una superficie sólida y el ARNm se pone en contacto con la(s) sonda(s), por ejemplo, en un matriz de chip génico Affymetrix. Un experto puede adaptar fácilmente métodos de detección de ARNm conocidos para su uso en determinar el nivel de ARNm de PCSK9.
Un método alternativo para determinar el nivel de expresión de PCSK9 en una muestra implica el proceso de amplificación de ácido nucleico y/o transcriptasa inversa (para preparar ADNc) de, por ejemplo, ARNm en la muestra, por ejemplo, por RT-PCR (la realización experimental expuesta en Mullis, 1987, patente de EE.UU. n° 4,683,202), reacción en cadena de la ligasa (Barany (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:189-193), replicación auto-sostenida de secuencias (Guatelli et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878), sistema de amplificación transcripcional (Kwoh et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177), Q-beta replicasa (Lizardi et al. (1988) Bio/Technology 6:1197), replicación por círculo rodante (Lizardi et al., patente de EE.UU. n° 5,854,033) o cualquier otro método de amplificación de ácidos nucleicos, seguido de la detección de las moléculas amplificadas usando técnicas muy conocidas para aquellos expertos en la materia. Estos esquemas de detección son especialmente útiles para la detección de moléculas de ácidos nucleicos si tales moléculas están presentes en números muy bajos. En aspectos particulares de la invención, el nivel de expresión de PCSK9 se determina por RT-PCR fluorogénica cuantitativa (es decir, el sistema TaqMan™).
Los niveles de expresión de ARNm de PCSK9 pueden monitorizarse usando una transferencia en membrana (tal como se usa en análisis de hibridación tales como Northern, Southern, puntual y similares), o micropocillos, tubos de muestra, geles, perlas o fibras (o cualquier soporte sólido que comprenda ácidos nucleicos unidos). Véanse las patentes de EE.UU. n° 5,770,722, 5,874,219, 5,744,305, 5,677,195 y 5,445,934, que se incorporan en el presente documento por
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referencia. La determinación del nivel de expresión de PCSK9 también puede comprender usar sondas de ácido nucleico en disolución.
En implementaciones preferidas, el nivel de expresión de ARNm se evalúa usando ensayos de ADN ramificado (ADNr) o PCR en tiempo real (qPCR). El uso de estos métodos se describe y ejemplifica en los ejemplos presentados en el presente documento.
El nivel de la expresión de proteínas PCSK9 puede determinarse usando cualquier método conocido en la técnica para la medición de niveles de proteína. Tales métodos incluyen, por ejemplo, electroforesis, electroforesis capilar, cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), cromatografía en capa fina (CCF), cromatografía de hiperdifusión, reacciones con precipitina fluida o en gel, espectroscopía de absorción, ensayos colorimétricos, ensayos espectrofotométricos, citometría de flujo, inmunodifusión (individual o doble), inmunoelectroforesis, transferencia Western, radioinmunoensayo (RIA), enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA), ensayos inmunofluorescentes, ensayos de electroquimioluminiscencia y similares.
El término “muestra”, como se usa en el presente documento, se refiere a una colección de fluidos, células o tejidos similares aislados de un sujeto, además de fluidos, células o tejidos presentes dentro de un sujeto. Ejemplos de fluidos biológicos incluyen sangre, suero y fluidos serosos, plasma, linfa, orina, líquido cefalorraquídeo, saliva, fluidos oculares y similares. Las muestras de tejido pueden incluir muestras de tejidos, órganos o regiones localizadas. Por ejemplo, las muestras pueden derivarse de órganos, partes de órganos, o fluidos o células particulares dentro de aquellos órganos. En ciertas implementaciones, las muestras pueden derivarse del hígado (por ejemplo, hígado completo o ciertos segmentos del hígado o ciertos tipos de células en el hígado tales como, por ejemplo, hepatocitos). En realizaciones preferidas, una “muestra derivada de un sujeto” se refiere a sangre o plasma extraído del sujeto. En otras implementaciones, una “muestra derivada de un sujeto” se refiere a tejido de hígado derivado del sujeto.
En algunas implementaciones de los métodos de la invención, el agente de iARN se administra a un sujeto tal que el agente de iARN se administre a un sitio específico dentro del sujeto. La inhibición de la expresión de PCSK9 puede evaluarse usando mediciones del nivel o cambio en el nivel de ARNm de PCSK9 o proteína PCSK9 en una muestra derivada de fluido o tejido del sitio específico dentro del sujeto. En implementaciones preferidas, el sitio es el hígado. El sitio también puede ser una subsección o subgrupo de células de uno cualquiera de los sitios anteriormente mencionados. El sitio también puede incluir células que expresan un tipo particular de receptor.
V. Métodos para tratar o prevenir una enfermedad asociada a PCSK9
La presente divulgación también proporciona métodos para tratar o prevenir enfermedades y afecciones que pueden modularse regulando por disminución la expresión del gen PCSK9. Por ejemplo, las composiciones descritas en el presente documento pueden usarse para tratar lipidemia, por ejemplo, una hiperlipidemia y otras formas de desequilibrio de lípidos tales como hipercolesterolemia, hipertrigliceridemia y las afecciones patológicas asociadas a estos trastornos tales como enfermedades cardíacas y circulatorias. Otras enfermedades y afecciones que pueden modularse regulando por disminución la expresión del gen PCSK9 incluyen enfermedades de almacenamiento lisosómico que incluyen, pero no se limitan a, enfermedad de Niemann-Pick, enfermedad de Tay-Sachs, deficiencia de lipasa ácida lisosómica y enfermedad de Gaucher. Los métodos incluyen administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz o cantidad profilácticamente eficaz de un agente de iARN de la invención. En algunas implementaciones, el método incluye administrar una cantidad eficaz de un ARNip de PCSK9 a un paciente que tiene un genotipo de LDLR heterocigótico.
El efecto de la disminución del gen PCSK9 produce preferentemente una disminución en los niveles de LDLc (colesterol por lipoproteína de baja densidad) en la sangre, y más particularmente en el suero, del mamífero. En algunas implementaciones, los niveles de LDLc disminuyen al menos el 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o más, en comparación con los niveles de pretratamiento.
Como se usa en el presente documento, un “sujeto” incluye un animal humano o no humano, preferentemente un vertebrado, y más preferentemente un mamífero. Un sujeto puede incluir un organismo transgénico. Lo más preferentemente, el sujeto es un ser humano, tal como un ser humano que padece o predispuesto a desarrollar una enfermedad asociada a PCSK9.
En algunas implementaciones de los métodos de la invención, la expresión de PCSK9 disminuye durante una duración prolongada, por ejemplo, al menos una semana, dos semanas, tres semanas o cuatro semanas o más. Por ejemplo, en ciertos casos, la expresión del gen PCSK9 se suprime al menos aproximadamente el 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 % o el 50 % por administración de un agente de ARNi descrito en el presente documento. En algunas implementaciones, el gen PCSK9 se suprime al menos aproximadamente el 60 %, 70 % o el 80 % por administración del agente de ARNi. En algunas realizaciones, el gen PCSK9 se suprime al menos aproximadamente el 85 %, 90 % o el 95 % por administración del oligonucleótido bicatenario.
Los agentes de iARN de la invención pueden administrarse a un sujeto usando cualquier modo de administración conocido en la técnica, que incluye, pero no se limita a subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraocular, intrabronquial, intrapleural, intraperitoneal, intrarterial, linfática, cerebroespinal, y cualquier combinación de los mismos. En realizaciones preferidas, los agentes se administran subcutáneamente.
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En algunas implementaciones, la administración es mediante una inyección de liberación prolongada. Una inyección de liberación prolongada puede liberar el agente de iARN de una forma coherente durante un periodo de tiempo prolongado. Así, una inyección de liberación prolongada puede reducir la frecuencia de dosificación necesaria para obtener un efecto deseado, por ejemplo, una inhibición deseada de PCSK9, o un efecto terapéutico o profiláctico. Una inyección de liberación prolongada puede también proporcionar concentraciones más coherentes en suero. Las inyecciones de liberación prolongada pueden incluir inyecciones subcutáneas o inyecciones intramusculares. En implementaciones preferidas, la inyección de liberación prolongada es una inyección subcutánea.
En algunas implementaciones, la administración es mediante una bomba. La bomba puede ser una bomba externa o una bomba quirúrgicamente implantada. En ciertas implementaciones, la bomba es una bomba osmótica subcutáneamente implantada. En otras implementaciones, la bomba es una bomba de infusión. Una bomba de infusión puede usarse para infusiones intravenosas, subcutáneas, arteriales o epidurales. En implementaciones preferidas, la bomba de infusión es una bomba de infusión subcutánea. En otras implementaciones, la bomba es una bomba quirúrgicamente implantada que administra el agente de iARN al hígado.
Otros modos de administración incluyen administración epidural, intracerebral, intracerebroventricular, nasal, intraarterial, intracardíaca, infusión intraósea, intratecal e intravítrea, y pulmonar. El modo de administración puede elegirse basándose en si se desea tratamiento local o sistémico y basándose en el área que va a tratarse. La vía y sitio de administración puede elegirse para potenciar el direccionamiento.
El método incluye administrar un agente de ARNi, por ejemplo, a dosis suficientes para disminuir los niveles de ARNm de PCSK9 durante al menos 5, más preferentemente 7, 10, 14, 21, 25, 30 ó 40 días; y opcionalmente, administrar una segunda dosis única de ARNbc, en el que la segunda dosis única se administra al menos 5, más preferentemente 7, 10, 14, 21,25, 30 ó 40 días después de administrar la primera dosis única, inhibiendo así la expresión del gen PCSK9 en un sujeto.
En una implementación, la dosis del agente de ARNi de la invención se administra no más de una vez cada cuatro semanas, no más de una vez cada tres semanas, no más de una vez cada dos semanas, o no más de una vez cada semana. En otra implementación, las administraciones pueden mantenerse durante uno, dos, tres o seis meses, o un año o más.
En otra implementación, la administración puede proporcionarse cuando se alcanzan niveles de colesterol por lipoproteína de baja densidad (LDLc) o se sobrepasa un nivel mínimo predeterminado, tal como superior a 70 mg/dl, 130 mg/dl, 150 mg/dl, 200 mg/dl, 300 mg/dl o 400 mg/dl.
En general, el agente de ARNi no activa el sistema inmunitario, por ejemplo, no aumenta los niveles de citocinas, tales como niveles de TNF-alfa o IFN-alfa. Por ejemplo, cuando se mide por un ensayo, tal como un ensayo de PBMC in vitro, tal como se describe en el presente documento, el aumento en los niveles de TNF-alfa o IFN-alfa es inferior al 30 %, 20 % o el 10 % de las células de control tratadas con un ARNbc de control, tal como un ARNbc que no se dirige a PCSK9.
Por ejemplo, un sujeto puede administrarse con una cantidad terapéutica de un agente de ARNi, tal como 0.5 mg/kg, 1.0 mg/kg, 1.5 mg/kg, 2.0 mg/kg o 2.5 mg/kg de ARNbc. El agente de ARNi puede administrarse por infusión intravenosa durante un periodo de tiempo, tal como durante un periodo de 5 minutos, 10 minutos, 15 minutos, 20 minutos o 25 minutos. La administración se repite, por ejemplo, regularmente, tal como cada dos semanas (es decir, cada dos semanas) durante un mes, dos meses, tres meses, cuatro meses o más. Después de una pauta de tratamiento inicial, los tratamientos pueden administrarse menos frecuentemente. Por ejemplo, después de la administración cada dos semanas durante tres meses, la administración puede repetirse una vez al mes, durante seis meses o un año o más. La administración del agente de ARNi puede reducir los niveles de PCSK9, por ejemplo, en una célula, tejido, sangre, orina u otro compartimento del paciente al menos el 10 %, al menos el 15 %, al menos el 20 %, al menos el 25 %, al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 % o al menos el 90 % o más.
Antes de la administración de una dosis completa del agente de ARNi, los pacientes pueden administrarse con una dosis más pequeña, tal como una reacción de infusión > 5 %, y monitorizarse para efectos adversos, tales como una reacción alérgica, o para niveles de lípidos o tensión arterial elevados. En otro ejemplo, el paciente puede monitorizarse para efectos inmunoestimulantes no deseados, tales como elevados niveles de citocinas (por ejemplo, TNF-alfa o INF- alfa).
Es evidente un efecto del tratamiento o preventivo cuando hay una mejora estadísticamente significativa en uno o más parámetros del estado de enfermedad, o por una imposibilidad para empeorar o desarrollar síntomas que de otro modo se anticiparían. Como un ejemplo, un cambio favorable de al menos el 10 % en un parámetro medible de enfermedad, y preferentemente al menos el 20 %, 30 %, 40 %, 50 % o más, puede ser indicativo de tratamiento eficaz. La eficacia para un agente de ARNi dado de la invención o formulación de ese agente de ARNi también puede determinarse usando un modelo animal experimental para la enfermedad dada como se conoce en la técnica. Si se usa un modelo animal experimental, la eficacia del tratamiento se prueba cuando se observa una reducción estadísticamente significativa en un marcador o síntoma.
En una implementación, el agente de iARN se administra a una dosis de entre aproximadamente 0.25 mg/kg y
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aproximadamente 50 mg/kg, por ejemplo, entre aproximadamente 0.25 mg/kg y aproximadamente 0.5 mg/kg, entre aproximadamente 0.25 mg/kg y aproximadamente 1 mg/kg, entre aproximadamente 0.25 mg/kg y aproximadamente 5 mg/kg, entre aproximadamente 0.25 mg/kg y aproximadamente 10 mg/kg, entre aproximadamente 1 mg/kg y aproximadamente 10 mg/kg, entre aproximadamente 5 mg/kg y aproximadamente 15 mg/kg, entre aproximadamente 10 mg/kg y aproximadamente 20 mg/kg, entre aproximadamente 15 mg/kg y aproximadamente 25 mg/kg, entre aproximadamente 20 mg/kg y aproximadamente 30 mg/kg, entre aproximadamente 25 mg/kg y aproximadamente 35 mg/kg, o entre aproximadamente 40 mg/kg y aproximadamente 50 mg/kg.
En algunas implementaciones, el agente de iARN se administra a una dosis de aproximadamente 0.25 mg/kg, aproximadamente 0.5 mg/kg, aproximadamente 1 mg/kg, aproximadamente 2 mg/kg, aproximadamente 3 mg/kg, aproximadamente 4 mg/kg, aproximadamente 5 mg/kg, aproximadamente 6 mg/kg, aproximadamente 7 mg/kg, aproximadamente 8 mg/kg, aproximadamente 9 mg/kg, aproximadamente 10 mg/kg, aproximadamente 11 mg/kg, aproximadamente 12 mg/kg, aproximadamente 13 mg/kg, aproximadamente 14 mg/kg, aproximadamente 15 mg/kg,
aproximadamente 16 mg/kg, aproximadamente 17 mg/kg, aproximadamente 18 mg/kg, aproximadamente 19 mg/kg,
aproximadamente 20 mg/kg, aproximadamente 21 mg/kg, aproximadamente 22 mg/kg, aproximadamente 23 mg/kg,
aproximadamente 24 mg/kg, aproximadamente 25 mg/kg, aproximadamente 26 mg/kg, aproximadamente 27 mg/kg,
aproximadamente 28 mg/kg, aproximadamente 29 mg/kg, 30 mg/kg, aproximadamente 31 mg/kg, aproximadamente 32 mg/kg, aproximadamente 33 mg/kg, aproximadamente 34 mg/kg, aproximadamente 35 mg/kg, aproximadamente 36

mg/kg, aproximadamente 37 mg/kg, aproximadamente 38 mg/kg, aproximadamente 39 mg/kg, aproximadamente 40

mg/kg, aproximadamente 41 mg/kg, aproximadamente 42 mg/kg, aproximadamente 43 mg/kg, aproximadamente 44

mg/kg, aproximadamente 45 mg/kg, aproximadamente 46 mg/kg, aproximadamente 47 mg/kg, aproximadamente 48
mg/kg, aproximadamente 49 mg/kg o aproximadamente 50 mg/kg. En una implementación, el agente de ARNi se administra a una dosis de aproximadamente 25 mg/kg.
La dosis de un agente de iARN que se administra a un sujeto puede adaptarse para equilibrar los riesgos y beneficios de una dosis particular, por ejemplo, para lograr un nivel deseado de supresión del gen PCSK9 (como se evalúa, por ejemplo, basándose en la supresión de ARNm de PCSK9, la expresión de proteínas PCSK9, o una reducción en los niveles de lípidos) o un efecto terapéutico o profiláctico deseado, mientras que al mismo tiempo se evitan efectos secundarios no deseables.
En algunas implementaciones, el agente de iARN se administra en dos o más dosis. Si se desea facilitar infusiones repetidas o frecuentes, puede ser recomendable la implantación de un dispositivo de administración, por ejemplo, una bomba, prótesis endovascular semi-permanente (por ejemplo, intravenosa, intraperitoneal, intracisternal o intracapsular), o depósito. En algunas implementaciones, el número o cantidad de dosis posteriores depende del logro de un efecto deseado, por ejemplo, la supresión de un gen PCSK9, o el logro de un efecto terapéutico o profiláctico, por ejemplo, reducir un síntoma de hipercolesterolemia. En algunas implementaciones, el agente de iARN se administra según un programa. Por ejemplo, el agente de iARN puede administrarse una vez por semana, dos veces por semana, tres veces por semana, cuatro veces por semana o cinco veces por semana. En algunas implementaciones, el programa implica administraciones regularmente separadas, por ejemplo, cada hora, cada cuatro horas, cada seis horas, cada ocho horas, cada doce horas, diariamente, cada 2 días, cada 3 días, cada 4 días, cada 5 días, semanalmente, cada dos semanas o mensualmente. En otras realizaciones, el programa implica administraciones estrechamente separadas, seguido de un periodo de tiempo más largo durante el cual el agente no se administra. Por ejemplo, el programa puede implicar un conjunto inicial de dosis que se administran en un periodo de tiempo relativamente corto (por ejemplo, aproximadamente cada 6 horas, aproximadamente cada 12 horas, aproximadamente cada 24 horas, aproximadamente cada 48 horas o aproximadamente cada 72 horas), seguido de un periodo de tiempo más largo (por ejemplo, aproximadamente 1 semana, aproximadamente 2 semanas, aproximadamente 3 semanas, aproximadamente 4 semanas, aproximadamente 5 semanas, aproximadamente 6 semanas, aproximadamente 7 semanas o aproximadamente 8 semanas) durante el cual el agente de iARN no se administra. En una implementación, el agente de iARN se administra inicialmente cada hora y después se administra a un mayor intervalo (por ejemplo, diariamente, semanalmente, cada dos semanas o mensualmente). En otra implementación, el agente de iARN se administra inicialmente diariamente y después se administra a un intervalo más grande (por ejemplo, semanalmente, bisemanalmente o mensualmente). En ciertas implementaciones, el intervalo más largo aumenta con el tiempo o se determina basándose en el logro de un efecto deseado. En una implementación específica, el agente de iARN se administra una vez al día durante una primera semana, seguido de dosificación semanal empezando en el octavo día de la administración. En otra implementación específica, el agente de iARN se administra cada dos días durante una primera semana, seguido de dosificación semanal empezando en el octavo día de administración.
En una implementación, el agente de ARNi se administra dos veces por semana. En una implementación, el agente de ARNi se administra dos veces por semana a una dosis de 1 mg/kg. En otra implementación, el agente de ARNi se administra dos veces por semana a una dosis de 2 mg/kg.
En una implementación, el agente de ARNi se administra una vez cada dos semanas. En una implementación, el agente de ARNi se administra una vez cada dos semanas a una dosis de 1 mg/kg. En otra implementación, el agente de ARNi se administra una vez cada dos semanas a una dosis de 2 mg/kg.
En una implementación, el agente de ARNi se administra una vez a la semana. En una implementación, el agente de ARNi se administra una vez a la semana a una dosis de 0.5 mg/kg. En una implementación, el agente de ARNi se
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administra una vez a la semana a una dosis de 1 mg/kg. En otra implementación, el agente de ARNi se administra una vez a la semana a una dosis de 2 mg/kg.
En algunas implementaciones, el agente de iARN se administra en una pauta de dosificación que incluye una “fase de carga” de administraciones estrechamente separadas que puede ir seguida de una “fase de mantenimiento”, en la que el agente de iARN se administra a intervalos más separados. En una implementación, la fase de carga comprende cinco administraciones diarias del agente de iARN durante la primera semana. En otra implementación, la fase de mantenimiento comprende una o dos administraciones semanales del agente de iARN. En otra implementación, la fase de mantenimiento dura durante 5 semanas. En una implementación, la fase de carga comprende la administración de una dosis de 2 mg/kg, 1 mg/kg o 0.5 mg/kg cinco veces a la semana. En otra implementación, la fase de mantenimiento comprende la administración de una dosis de 2 mg/kg, 1 mg/kg o 0.5 mg/kg una vez, dos veces o tres veces a la semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas, una vez al mes, una vez cada dos meses, una vez cada tres meses, una vez cada cuatro meses, una vez cada cinco meses o una vez cada seis meses.
Cualquiera de estos programas puede repetirse opcionalmente una o más iteraciones. El número de iteraciones puede depender del logro de un efecto deseado, por ejemplo, la supresión de un gen PCSK9, y/o el logro de un efecto terapéutico o profiláctico, por ejemplo, reducir los niveles de colesterol en suero o reducir un síntoma de hipercolesterolemia.
En otras implementaciones, la administración de un ARNip se administra en combinación con un agente terapéutico adicional. El ARNip y un agente terapéutico adicional pueden administrarse en combinación en la misma composición, por ejemplo, parenteralmente, o el agente terapéutico adicional puede administrarse como parte de una composición separada o por otro método descrito en el presente documento.
Ejemplos de agentes terapéuticos adicionales incluyen aquellos conocidos para tratar un agente conocido para tratar trastornos de lípidos, tales como hipercolesterolemia, aterosclerosis o dislipidemia. Por ejemplo, un ARNip caracterizado en la invención puede administrarse con, por ejemplo, un inhibidor de la HMG-CoA reductasa (por ejemplo, una estatina), un fibrato, un secuestrante de ácidos biliares, niacina, un agente antiplaquetario, un inhibidor de la enzima conversora de angiotensina, un antagonista del receptor de angiotensina II (por ejemplo, losartán potásico, tal como Cozaar® de Merck & Co.), un inhibidor de la acilCoA colesterol acetiltransferasa (ACAT), un inhibidor de la absorción del colesterol, un inhibidor de la proteína de transferencia de ésteres de colesterol (CETP), un inhibidor de la proteína de transferencia de triglicéridos microsómicos (MTTP), un modulador del colesterol, un modulador de ácidos biliares, un agonista de receptores activados por la proliferación del peroxisoma (PPAR), una terapia basada en genes, un protector vascular compuesto (por ejemplo, AGI-1067, de Atherogenics), un inhibidor de la glucoproteína IIb/IIIa, aspirina o un compuesto similar a aspirina, un inhibidor de IBAT (por ejemplo, S-8921, de Shionogi), un inhibidor de la escualeno sintasa, o un inhibidor de la proteína quimioatrayente de monocitos (MCP)-I. Inhibidores de la HMG-CoA reductasa a modo de ejemplo incluyen atorvastatina (Lipitor®/Tahor/Sortis/Torvast/Cardyl de Pfizer), pravastatina (Pravachol de Bristol-Myers Squibb, Mevalotin/Sanaprav de Sankyo), simvastatina (Zocor®/Sinvacor de Merck, Denan de Boehringer Ingelheim, Lipovas de Banyu), lovastatina (Mevacor/Mevinacor de Merck, lovastatina de Bexal, Cepa; Liposcler de Schwarz Pharma), fluvastatina (Lescol®/Locol/Lochol de Novartis, Cranoc de Fujisawa, Digaril de Solvay), cerivastatina (Lipobay de Bayer/Baycol de GlaxoSmithKline), rosuvastatina (Crestor® de AstraZeneca) y pitivastatina (itavastatina/risivastatina) (Nissan Chemical, Kowa Kogyo, Sankyo y Novartis). Fibratos a modo de ejemplo incluyen, por ejemplo, bezafibrato (por ejemplo, Befizal®/Cedur®/Bezalip® de Roche, Bezatol de Kissei), clofibrato (por ejemplo, Atromid-S® de Wyeth), fenofibrato (por ejemplo, Lipidil/Lipantil de Fournier, Tricor® de Abbott, Lipantil de Takeda, genéricos), gemfibrozilo (por ejemplo, Lopid/Lipur de Pfizer) y ciprofibrato (Modalim® de Sanofi-Synthelabo). Secuestrantes de ácidos biliares a modo de ejemplo incluyen, por ejemplo, colestiramina (Questran® de Bristol-Myers Squibb y Light™ de Questran), colestipol (por ejemplo, Colestid de Pharmacia) y colesevelam (WelChol™ de Genzyme/Sankyo). Terapias de niacina a modo de ejemplo incluyen, por ejemplo, formulaciones de liberación inmediata, tales como Nicobid de Aventis, Niacor de Upsher-Smith, Nicolar de Aventis y Perycit de Sanwakagaku. Formulaciones de liberación prolongada de niacina incluyen, por ejemplo, Niaspan de Kos Pharmaceuticals y SIo-Niacin de Upsher-Smith. Agentes antiplaquetarios a modo de ejemplo incluyen, por ejemplo, aspirina (por ejemplo, aspirina de Bayer), clopidogrel (Plavix de Sanofi-Synthelabo/Bristol-Myers Squibb) y ticlopidina (por ejemplo, Ticlid de Sanofi- Synthelabo y Panaldine de Daiichi). Otros compuestos similares a la aspirina útiles en combinación con un ARNbc que se dirige a PCSK9 incluyen, por ejemplo, Asacard (aspirina de liberación lenta, por Pharmacia) y Pamicogrel (Kanebo/Angelini Ricerche/CEPA). Inhibidores de la enzima conversora de angiotensina a modo de ejemplo incluyen, por ejemplo, ramiprilo (por ejemplo, Altace de Aventis) y enalaprilo (por ejemplo, Vasotec de Merck & Co.). Inhibidores de la acil CoA colesterol acetiltransferasa (AC AT) a modo de ejemplo incluyen, por ejemplo, avasimibe (Pfizer), eflucimibe (BioMerieux Pierre Fabre/Eli Lilly), CS-505 (Sankyo y Kyoto) y SMP-797 (Sumito). Inhibidores de la absorción del colesterol a modo de ejemplo incluyen, por ejemplo, ezetimiba (Zetia® de Merck/Schering-Plough Pharmaceutical) y Pamaqueside (Pfizer). Inhibidores de CETP a modo de ejemplo incluyen, por ejemplo, Torcetrapib (también llamado CP- 529414, Pfizer), JTT-705 (Japan Tobacco) y CETi-I (Avant Immunotherapeutics). Inhibidores de la proteína de transferencia de triglicéridos microsómicos (MTTP) a modo de ejemplo incluyen, por ejemplo, implitapida (Bayer), R- 103757 (Janssen) y CP-346086 (Pfizer). Otros moduladores del colesterol a modo de ejemplo incluyen, por ejemplo, NO-1886 (Otsuka/TAP Pharmaceutical), CI-1027 (Pfizer) y WAY-135433 (Wyeth-Ayerst).
Moduladores de los ácidos biliares a modo de ejemplo incluyen, por ejemplo, HBS-107 (Hisamitsu/Banyu), Btg-511 (British Technology Group), BARI-1453 (Aventis), S-8921 (Shionogi), Sd-5613 (Pfizer) y AZD-7806 (AstraZeneca).
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Agonistas de receptores activados por la proliferación del peroxisoma (PPAR) a modo de ejemplo incluyen, por ejemplo, tesaglitazar (AZ-242) (AstraZeneca), Netoglitazone (MCC-555) (Mitsubishi/ Johnson & Johnson), GW-409544 (Ligand Pharmaceuticals/GlaxoSmithKline), GW-501516 (Ligand Pharmaceuticals/GlaxoSmithKline), LY-929 (Ligand Pharmaceuticals y Eli Lilly), LY-465608 (Ligand Pharmaceuticals y Eli Lilly), LY-518674 (Ligand Pharmaceuticals y Eli Lilly) y MK-767 (Merck y Kyorin). Terapias basadas en genes a modo de ejemplo incluyen, por ejemplo, AdGWEGF 121.10 (GenVec), ApoAl (UCB Pharma/Groupe Fournier), EG-004 (Trinam) (Ark Therapeutics) y transportador del casete de unión al ATP Al (ABCA1) (CV Therapeutics/Incyte, Aventis, Xenon). Inhibidores de la glucoproteína IIb/IIIa a modo de ejemplo incluyen, por ejemplo, roxifiban (también llamado DMP754, Bristol-Myers Squibb), Gantofiban (Merck KGaA/Yamanouchi) y Cromafiban (Millennium Pharmaceuticals). Inhibidores de la escualeno sintasa a modo de ejemplo incluyen, por ejemplo, BMS- 1884941 (Bristol-Myers Squibb), CP-210172 (Pfizer), CP-295697 (Pfizer), CP-294838 (Pfizer) y TAK-475 (Takeda). Un inhibidor de MCP-I a modo de ejemplo es, por ejemplo, RS-504393 (Roche Bioscience). El agente antiaterosclerótico BO-653 (Chugai Pharmaceuticals) y el derivado de ácido nicotínico Nyclin (Yamanouchi Pharmaceuticals) también son apropiados para ser administrados en combinación con un ARNbc caracterizado en la invención. Terapias de combinación a modo de ejemplo adecuadas para administración con un ARNbc que se dirige a PCSK9 incluyen, por ejemplo, advicor (niacina/lovastatina de Kos Pharmaceuticals), amlodipino/atorvastatina (Pfizer) y ezetimiba/simvastatina (por ejemplo, comprimidos Vytorin® 10/10, 10/20, 10/40 y 10/80 por Merck/Schering-Plough Pharmaceuticals). Agentes para tratar hipercolesterolemia, y adecuados para administración en combinación con un ARNbc que se dirige a PCSK9, incluyen, por ejemplo, lovastatina, comprimidos de liberación prolongada Altoprev® de niacina (Andrx Labs), comprimidos Caduet® de lovastatina (Pfizer), besilato de amlodipino, comprimidos Crestor® de atorvastatina cálcica (AstraZeneca), cápsulas Lescol® de rosuvastatina cálcica (Novartis), Lescol® de fluvastatina sódica (Reliant, Novartis), comprimidos Lipitor® de fluvastatina sódica (Parke-Davis), cápsulas Lofibra® de atorvastatina cálcica (Gate), comprimidos de liberación prolongada Niaspan (Kos), comprimidos Pravachol de niacina (Bristol-Myers Squibb), comprimidos TriCor® de pravastatina sódica (Abbott), comprimidos Vytorin® 10/10 de fenofibrato (Merck/Schering-Plough Pharmaceuticals), ezetimiba, comprimidos WelChol™ de simvastatina (Sankyo), comprimidos Zetia® de clorhidrato de colesevelam (Schering), comprimidos Zetia® de ezetimiba (Merck/Schering-Plough Pharmaceuticals) y comprimidos Zocor® de ezetimiba (Merck).
En una implementación, un agente de ARNi se administra en combinación con una combinación de ezetimiba/simvastatina (por ejemplo, Vytorin® (Merck/Schering-Plough Pharmaceuticals)). En una implementación, el agente de ARNi se administra al paciente, y entonces el agente terapéutico adicional se administra al paciente (o viceversa). En otra implementación, el agente de ARNi y el agente terapéutico adicional se administran al mismo tiempo.
En otro aspecto, la divulgación caracteriza un método de enseñar al usuario final, por ejemplo, un cuidador o un sujeto, cómo administrar un agente de ARNi descrito en el presente documento. El método incluye, opcionalmente, proporcionar al usuario final una o más dosis del agente de ARNi, e instruir al usuario final a administrar el agente de ARNi en una pauta descrita en el presente documento, enseñando así al usuario final.
En un aspecto, la divulgación proporciona un método para tratar un paciente seleccionando un paciente basándose en que el paciente está en necesidad de reducir LDL, reducir LDL sin reducir HDL, reducir ApoB, o reducir el colesterol total. El método incluye administrar al paciente un ARNip en una cantidad suficiente para reducir los niveles de LDL del paciente o niveles de ApoB, por ejemplo, sin reducir sustancialmente los niveles de HDL.
La predisposición genética desempeña una función en el desarrollo de enfermedades asociadas a genes diana, por ejemplo, hiperlipidemia. Por tanto, un paciente en necesidad de un ARNip puede identificarse tomando una historia familiar, o, por ejemplo, cribando uno o más marcadores genéticos o variantes. Ejemplos de genes que participan en la hiperlipidemia incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, receptor de LDL (LDLR), las apoliproteínas (ApoAl, ApoB, ApoE y similares), proteína de transferencia de ésteres de colesterilo (CETP), lipoproteína lipasa (LPL), lipasa hepática (LIPC), lipasa endotelial (EL), lecitin colesteril aciltransferasa (LCAT).
Un profesional sanitario, tal como un médico, enfermera o miembro de la familia, puede tomar una historia familiar antes de recetar o administrar un agente de ARNi de la invención. Además, puede realizarse una prueba para determinar un genotipo o fenotipo. Por ejemplo, puede realizarse una prueba de ADN en una muestra del paciente, por ejemplo, una muestra de sangre, para identificar el genotipo y/o fenotipo de PCSK9 antes de administrar un ARNbc de PCSK9 al paciente. En otra realización, se realiza una prueba para identificar un genotipo y/o fenotipo relacionado, por ejemplo, un genotipo de LDLR. Ejemplos de variantes genéticas con el gen LDLR pueden encontrarse en la materia, por ejemplo, en las siguientes publicaciones que se incorporan por referencia: Costanza et al. (2005) Am J Epidemiol. 15;161(8):714-24; Yamada et al. (2008) J Med Genet. Jan;45(l):22-8, Epub 2007 Aug 31; y Boes et al. (2009) Exp. Gerontol 44: 136-160, Epub 2008 Nov 17.
VI. Kits
La presente divulgación también proporciona kits para usar cualquiera de los agentes de ARNi y/o realizar cualquiera de los métodos descritos. Tales kits incluyen uno o más agentes de iARN e instrucciones para su uso, por ejemplo, instrucciones para inhibir la expresión de un PCSK9 en una célula poniendo en contacto la célula con el (los) agente(s) de iARN en una cantidad eficaz para inhibir la expresión del PCSK9. Los kits pueden comprender opcionalmente además medios para poner en contacto la célula con el agente de iARN (por ejemplo, un dispositivo de inyección), o medios para medir la inhibición de PCSK9 (por ejemplo, medios para medir la inhibición de ARNm de PCSK9 o proteína
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TTR). Tales medios para medir la inhibición de PCSK9 pueden comprender un medio para obtener una muestra de un sujeto, tal como, por ejemplo, una muestra de plasma. Los kits de la invención pueden comprender opcionalmente además medios para administrar el (los) agente(s) de iARN a un sujeto o medios para determinar la cantidad terapéuticamente eficaz o profilácticamente eficaz.
A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que comúnmente es entendido por un experto habitual en la materia a la que pertenece la presente invención. Aunque pueden usarse métodos y materiales similares o equivalentes a aquellos descritos en el presente documento en la práctica o prueba de los ARNi y métodos, métodos adecuados y materiales se describen a continuación. En caso de conflicto, controlará la presente memoria descriptiva, que incluye definiciones. Además, los materiales, métodos y ejemplos son ilustrativos solo y no pretenden ser limitantes.
EJEMPLOS
Materiales y métodos
Se usaron los siguientes materiales y métodos en los ejemplos.
Síntesis de ADNc usando el kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad de ABI (Applied Biosystems, Foster City, CA, Cat n° 4368813)
Se añadió una mezcla maestra de 2 |il de 10X tampón, 0.8 |il de 25X dNTP, 2 |il de cebadores aleatorios, 1 |il de transcriptasa inversa, 1 |il de inhibidor de RNasa y 3.2 |il de H2O por reacción en 10 |il de ARN total. Se generó ADNc usando un ciclador térmico Bio-Rad C-1000 o S-1000 (Hercules, CA) mediante las siguientes etapas: 25 °C 10 min, 37 °C 120 min, 85 °C 5 s, 4 °C mantenimiento.
Cultivo celular y transfecciones
Se cultivaron células Hep3B, HepG2 o HeLa (ATCC, Manassas, VA) a casi confluencia a 37 °C en una atmósfera de 5 % de CO2 en medio recomendado (ATCC) complementado con 10 % de FBS y glutamina (ATCC) antes de desprenderse de la placa portripsinización. Para los dúplex cribados en formato de 96 pocillos, la transfección se llevó a cabo añadiendo 44.75 |il de Opti-MEM más 0.25 |il de Lipofectamine RNAiMax por pocillo (Invitrogen, Carlsbad CA. Cat n° 13778-150) a 5 |il de cada dúplex de ARNip a un pocillo individual en una placa de 96 pocillos. A continuación, la mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 15 minutos. A continuación se añadieron cincuenta |il de medio de crecimiento completo sin antibiótico que contenía ~2 x 104 células a la mezcla de ARNip. Para los dúplex cribados en formato de 384 pocillos, se mezclaron 5 |il de Opti-MEM más 0.1 |il de Lipofectamine RNAiMax (Invitrogen, Carlsbad CA. Cat n° 13778-150) con 5 |il de cada dúplex de ARNip por pocillo individual. A continuación, la mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 15 minutos, seguido de la adición de 40 |il de medio de crecimiento completo sin antibiótico que contenía ~8 x 103 células. Las células se incubaron durante 24 horas antes de la purificación del ARN. Se realizaron experimentos de dosis única a concentración del dúplex final de 10 nM y 0.1 nM y se hicieron experimentos de dosis-respuesta usando 8 x diluciones sucesivas de 5 veces a partir de 2 nM.
Transfección de captación libre
Se combinaron cinco |il de cada ARNip conjugado con GalNac en PBS con 3 x 104 hepatocitos de mono cinomolgo criopreservados recientemente descongelados (In Vitro Technologies-Celsis, Baltimore, MD; lote n° JQD) resuspendidos en 95 |il de medio In Vitro Gro CP (In Vitro Technologies-Celsis, Baltimore, MD) en cada pocillo de una placa de 96 pocillos o 5 |il de ARNip y 45 |il de medio que contenía 1.2 x 103 células para el formato de placa de 384 pocillos. La mezcla se incubó durante aproximadamente 24 horas a 37 °C en una atmósfera de 5 % de CO2. Los ARNip se probaron a múltiples concentraciones entre 500 y 0.1 nM para experimentos de dosis única y usando 8 x diluciones sucesivas de 5 veces a partir de 500 nM para los experimentos de dosis-respuesta.
Aislamiento de ARN total usando el kit de aislamiento de ARNm DYNABEADS (Invitrogen, pieza n°: 610-12)
Se recogieron células y se lisaron en 150 |il de tampón de lisis/unión, a continuación se mezclaron durante 5 minutos a 850 rpm usando una mezcladora térmica de Eppendorf (la velocidad de mezcla fue la misma durante todo el proceso). Se añadieron diez microlitros de perlas magnéticas y 80 |il de mezcla de tampón de lisis/unión a una placa de fondo redondo y se mezclaron durante 1 minuto. Las perlas magnéticas se capturaron usando un mecano magnético y el sobrenadante se extrajo sin alterar las perlas. Después de extraer el sobrenadante, las células lisadas se añadieron a las perlas restantes y se mezclaron durante 5 minutos. Después de extraer el sobrenadante, las perlas magnéticas se lavaron 2 veces con 150 |il de tampón de lavado A y se mezclaron durante 1 minuto. Las perlas se capturaron de nuevo y se extrajo el sobrenadante. A continuación, las perlas se lavaron con 150 |il de tampón de lavado B, se capturaron y se extrajo el sobrenadante. A continuación, las perlas se lavaron con 150 |il de tampón de elución, se capturaron y se extrajo el sobrenadante. Las perlas se dejaron secar durante 2 minutos. Después de secar, se añadieron 50 |il de tampón de elución y se mezclaron durante 5 minutos a 70 °C. Las perlas se capturaron con un imán durante 5 minutos. Se extrajeron cincuenta |il de sobrenadante y se añadieron a otra placa de 96 pocillos.
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Para el formato de 384 pocilios, las células se lisaron durante un minuto mediante la adición de 50 pl de tampón de lisis/unión. Se usaron dos pl de perlas magnéticas por pocillo. Se tomó en alícuotas el volumen requerido de perlas, se capturó sobre un mecano magnético y se extrajo la disolución de almacenamiento de perlas. A continuación, las perlas se resuspendieron en el volumen requerido de tampón de lisis/unión (25 pl por pocillo) y se añadieron 25 pl de suspensión de perlas a las células lisadas. La mezcla de lisado-perla se incubó durante 10 minutos en VibraTranslator al parámetro n° 7 (Union Scientific Corp., Randallstown, MD). Posteriormente, las perlas se capturaron usando un mecano magnético, se extrajo el sobrenadante y las perlas se lavaron una vez con 90 pl de tampón A, seguido de etapas de lavado individuales con 90 pl de tampón B y 100 pl de tampón de elución. Las perlas se pusieron en remojo en cada tampón de lavado durante ~1 minuto (no implicó mezcla). Después de la etapa de lavado final, las perlas se resuspendieron en 15 pl de tampón de elución durante 5 minutos a 70 °C, seguido de la captura de perlas y la extracción del sobrenadante (hasta 8 pl) para la síntesis de ADNc y/o almacenamiento de ARN purificado (-20 °C).
PCR en tiempo real
Se añadieron dos pl de ADNc a una mezcla maestra que contenía 0.5 pl de sonda TaqMan de GAPDH humana (catálogo de Applied Biosystems n° 4326317E), 0.5 pl de sonda TaqMan de PCSK9 humana (catálogo de Applied Biosystems n° Hs03037355_m1) para células humanas o 0.5 pl de ensayo TaqMan personalizado de GAPDH de cinomolgo (GAP F de cino 150 nM cebador-5'GCATCCTGGGCTACACTGA (SEC ID N°: 5); GAP R de cino 150 nM cebador-5'-TGGGTGTCGCTGTTGAAGTC (SEC ID N°: 6) GAP de cino 250 nM sonda-5'-5HEX-
CCAGGTGGTCTCCTCC-BHQ1-Q-3' (SEC ID N°: 7)), 0.5 pl de ensayo TaqMan personalizado de PCSK9 de cinomolgo (PCSK9 F de cino 900 nM cebador 5'-ACGTGGCTGGCATTGCA (SEC ID N°: 8); PCSK9 R de cino 900 nM cabador 5'- AAGTGGATCAGTCTCTGCCTCAA (SEC ID N°: 9); PCSK9 de cino 250 nM sonda 5'-6FAM-
CATGATGCTGTCTGCCGAGCCG-BHQ1-Q-3' (SEC ID N°: 10)) para células de cinomolgo y 5 pl de mezcla maestra de la sonda Lightcycler 480 (catálogo de Roche n° 04887301001) por pocillo en una placa de 384 pocillos (catálogo de Roche n° 04887301001). Se realizó PCR en tiempo real en un sistema de PCR en tiempo real LC480 de Roche (Roche) usando el ensayo AACt(RQ). Cada dúplex se probó en dos transfecciones independientes y cada transfección se ensayó por duplicado, a menos que se indique lo contrario.
Para calcular el cambio de veces relativo, se analizaron datos en tiempo real usando el método AACt y se normalizaron a los ensayos realizados con células transfectadas con AD-19 5510 nM, o células transfectadas con vector vacío. Para los ensayos de captación libre, los datos se normalizaron a células tratadas con PBS o GalNAc-1955 (mayor concentración usada para compuestos experimentales). Se calcularon CI50 usando un modelo de ajuste de 4 parámetros usando XLFit y se normalizaron a células transfectadas con AD-1955 durante el mismo intervalo de dosis, o a su propia dosis más baja.
Las secuencias sentido y antisentido de AD-1955 son: SENTIDO: 5'-cuuAcGcuGAGuAcuucGAdTsdT-3' (SEC ID N°: 11); y ANTISENTIDO: 5'-UCGAAGuACUcAGCGuAAGdTsdT-3' (SEC ID N°: 12).
Tabla B: Abreviaturas de monómeros de nucleótido usados en la representación de secuencias de ácidos nucleicos.
Abreviatura
Nucleótido(s)
A
Adenosina-3'-fosfato
Ab
beta-L-adenosina-3'-fosfato
Af
2'-fluoroadenosina-3'-fosfato
Afs
2'-fluoroadenosina-3'-fosforotioato
As
adenosina-3'-fosforotioato
C
citidina-3'-fosfato
Cb
beta-L-citidina-3'-fosfato
Cf
2'-fluorocitidina-3'-fosfato
Cfs
2'-fluorocitidina-3'-fosforotioato
Cs
citidina-3'-fosforotioato
G
guanosina-3'-fosfato
Gb
beta-L-guanosina-3'-fosfato
Gbs
beta-L-guanosina-3'-fosforotioato
Abreviatura
Nucleótido(s)
Gf
2'-fluoroguanosina-3'-fosfato
Gfs
2'-fluoroguanosina-3'-fosforotioato
Gs
guanosina-3'-fosforotioato
T
5'-metiluridina-3'-fosfato
Tf
2'-fluoro-5-metiluridina-3'-fosfato
Tfs
2'-fluoro-5-metiluridina-3'-fosforotioato
Ts
5-metiluridina-3'-fosforotioato
U
uridina-3'-fosfato
Uf
2'-fluorouridina-3'-fosfato
Ufs
2'-fluorouridina-3'-fosforotioato
Us
uridina-3'-fosforotioato
N
cualquier nucleótido (G, A, C, T o U)
a
2'-O-metiladenosina-3'-fosfato
as
2'-O-metiladenosina-3'-fosforotioato
c
2'-O-metilcitidina-3'-fosfato
cs
2'-O-metilcitidina-3'-fosforotioato
g
2'-O-metilguanosina-3'-fosfato
gs
2'-O-metilguanosina-3'-fosforotioato
t
2'-O-metil-5-metiluridina-3'-fosfato
ts
2'-O-metil-5-metiluridina-3'-fosforotioato
u
2'-O-metiluridina-3'-fosfato
us
2'-O-metiluridina-3'-fosforotioato
dT
2'-desoxitimidina
dTs
2'-desoxitimidina-3'-fosforotioato
dU
2'-desoxiuridina
s
enlace fosforotioato
L96
N-[tris(GalNAc-alquil)-amidodecanoil)]-4-hidroxiprolinol Hyp-(GalNAc-alquilo)3
(Aeo)
2'-O-metoxietiladenosina-3'-fosfato
(Aeos)
2'-O-metoxietiladenosina-3'-fosforotioato
(Geo)
2'-O-metoxietilguanosina-3'-fosfato
(Geos)
2'-O-metoxietilguanosina-3'-fosforotioato
(Teo)
2'-O-metoxietil-5-metiluridina-3'-fosfato
(Teos)
2'-O-metoxietil-5-metiluridina-3'-fosforotioato
(m5Ceo)
2'-O-metoxietil-5-metilcitidina-3'-fosfato
Abreviatura
Nucleótido(s)
(m5Ceos)
2'-O-metoxietil-5-metilcitidina-3'-fosforotioato
(A3m)
3'-O-metiladenosina-2'-fosfato
(A3mx)
3'-O-metil-xilofuranosiladenosina-2'-fosfato
(G3m)
3'-O-metilguanosina-2'-fosfato
(G3mx)
3'-O-metil-xilofuranosilguanosina-2'-fosfato
(C3m)
3'-O-metilcitidina-2'-fosfato
(C3mx)
3'-O-metil-xilofuranosilcitidina-2'-fosfato
(U3m)
3'-O-metiluridina-2'-fosfato
(U3mx)
3'-O-metilxilouridina-2'-fosfato
(Chd)
2'-O-hexadecil-citidina-3'-fosfato
(pshe)
Hidroxietilfosforotioato
(Uhd)
2'-O-hexadecil-uridina-3'-fosfato
(Tgn)
S-Isómero de ácido nucleico de timidina-glicol (GNA)
(Cgn)
Ácido nucleico de citidina-glicol (GNA)
(Chd)
2'-O-hexadecil-citidina-3'-fosfato
(Ggn)
2'-O-hexadecil-citidina-3'-fosfato
(Agn)
Ácido nucleico de adenosina-glicol (GNA)
P
5'-fosfato
(m5Cam)
2'-O-(N-metilacetamida)-5-metilcitidina-3'-fosfato
(m5Cams)
2'-O-(N-metilacetamida)-5-metilcitidina-3'-fosforotioato
(Tam)
2'-O-(N-metilacetamida)timidina-3'-fosfato
(Tams)
2'-O-(N-metilacetamida)timidina-3'-fosforotioato
(Aam)
2'-O-(N-metilacetamida)adenosina-3'-fosfato
(Aams)
2'-O-(N-metilacetamida)adenosina-3'-fosforotioato
(Gam)
2'-O-(N-metilacetamida)guanosina-3'-fosfato
(Gams)
2'-O-(N-metilacetamida)guanosina-3'-fosforotioato
(Uyh)
2'-O-(1-hexil-4-metilen-1,2,3-triazolil)-uridina-3'-fosfato
(Ayh)
2'-O-(1-hexil-4-metilen-1,2,3-triazolil)-adenosina-3'-fosfato
(Gyh)
2'-O-(1-hexil-4-metilen-1,2,3-triazolil)-guanosina-3'-fosfato
(Cyh)
2'-O-(1-hexil-4-metilen-1,2,3-triazolil)-citidina-3'-fosfato
Ejemplo 1. Síntesis de oligonucleótidos conjugados con GalNAc
Se diseñaron una serie de dúplex de ARNip que abarcan la secuencia de ARNm de PCSK9, se sintetizaron y conjugaron un GalNAc trivalente en el extremo 3 de la hebra codificante usando las técnicas descritas anteriormente. Las secuencias de estos dúplex se muestran en la Tabla 1. Estas mismas secuencias también se sintetizaron con 5 diversas modificaciones de nucleótidos y se conjugaron con un GalNAc trivalente. Las secuencias de los dúplex modificados se muestran en la Tabla 2.
Nombre del dúplex
Nombre del oligo sentido Sec trans sentido SEC ID N°: Nombre del oligo antisentido Sec trans antisentido SEC ID N°: Empieza en NM 17493 6.3 Termina en NM 17493 6.3
AD-53649.1
A-110542.1 CGAGGACGGCGAC 13 A-109239.2 UCCUCGUAGUCGCCG 234 459 481
UACGAGGA UCCUCGUC
AD-53661.1
A-110544.1 ACCGCUGCGCCAA 14 A-109243.2 ACGGAUCCUUGGCGC 235 554 576
GGAUCCGU AGCGGUGG
AD-53667.1
A-110545.1 GCUGCGCCAAGGA 15 A-109245.2 UCCACGGAUCCUUGG 236 557 579
UCCGUGGA CGCAGCGG
AD-53679.1
A-110547.1 CUACGUGGUGGUG 16 A-109249.2 UCCUUCAGCACCACCA 237 591 613
CUGAAGGA CGUAGGU
AD-53685.1
A-110548.1 CCCGCCGGGGAUA 17 A-109251.2 UGGUGAGGUAUCCCC 238 668 690
CCUCACCA GGCGGGCA
AD-53691.1
A-110549.1 CCGCCGGGGAUAC 18 A-109253.2 UUGGUGAGGUAUCCC 239 669 691
CUCACCAA CGGCGGGC
AD-53650.1
A-110550.1 GCCGGGGAUACCU 19 A-109255.2 UCUUGGUGAGGUAUC 240 671 693
CACCAAGA CCCGGCGG
AD-53656.1
A-110551.1 CCGGGGAUACCUC 20 A-109257.2 AUCUUGGUGAGGUAU 241 672 694
ACCAAGAU CCCCGGCG
AD-53668.1
A-110553.1 AUACCUCACCAAG 21 A-109261.2 UGCAGGAUCUUGGUG 242 678 700
AUCCUGCA AGGUAUCC
AD-53674.1
A-110554.1 CACCAAGAUCCUG 22 A-109263.2 AAGACAUGCAGGAUC 243 684 706
CAUGUCUU UUGGUGAG
AD-53680.1
A-110555.1 CAAGAUCCUGCAU 23 A-109265.2 U GGAAGACAU GCAGG 244 687 709
GUCUUCCA AUCUUGGU
AD-53692.1
A-110557.1 GUUGCCCCAUGUC 24 A-109269.2 AUGUAGUCGACAUGG 245 768 790
GACUACAU GGCAACUU
AD-53651.1
A-110558.1 GCCCCAUGUCGAC 25 A-109271.2 UCGAUGUAGUCGACA 246 771 793
UACAUCGA UGGGGCAA
AD-53657.1
A-110559.1 CCAUGUCGACUAC 26 A-109273.2 UCCUCGAUGUAGUCG 247 774 796
AUCGAGGA ACAUGGGG
AD-53663.1
A-110560.1 UCGACUACAUCGA 27 A-109275.2 AGUCCUCCUCGAUGU 248 779 801
GGAGGACU AGUCGACA
AD-53669.1
A-110561.1 ACUACAUCGAGGA 28 A-109277.2 AGGAGUCCUCCUCGA 249 782 804
GGACUCCU UGUAGUCG
AD-53675.1
A-110562.1 UACAUCGAGGAGG 29 A-109279.2 AGAGGAGUCCUCCUC 250 784 806
ACUCCUCU GAUGUAGU
AD-53681.1
A-110563.1 UCGAGGAGGACUC 30 A-109281.2 AGACAGAGGAGUCCU 251 788 810
CUCUGUCU CCUCGAUG
AD-53687.1
A-110564.1 CGAGGAGGACUCC 31 A-109283.2 AAGACAGAGGAGUCC 252 789 811
UCUGUCUU UCCUCGAU
AD-53693.1
A-110565.1 GUACCGGGCGGAU 32 A-109285.2 UGGUAUUCAUCCGCC 253 855 877
GAAUACCA CGGUACCG
Nombre del dúplex
Nombre del oligo sentido Sec trans sentido SEC ID N°: Nombre del oligo antisentido Sec trans antisentido SEC ID N°: Empieza en NM 17493 6.3 Termina en NM 17493 6.3
AD-53652.1
A-110566.1 CCUGGUGGAGGUG 33 A-109287.2 AGGAGAUACACCUCCA 254 894 916
UAUCUCCU CCAGGCU
AD-53658.1
A-110567.1 CUGGUGGAGGUGU 34 A-109289.2 UAGGAGAUACACCUC 255 895 917
AUCUCCUA CACCAGGC
AD-53664.1
A-110568.1 GGUGGAGGUGUAU 35 A-109291.2 UCUAGGAGAUACACC 256 897 919
CUCCUAGA UCCACCAG
AD-53670.1
A-110569.1 UGGAGGUGUAUCU 36 A-109293.2 UGUCUAGGAGAUACA 257 899 921
CCUAGACA CCUCCACC
AD-53676.1
A-110570.1 AGGUGUAUCUCCU 37 A-109295.2 UGGUGUCUAGGAGAU 258 902 924
AGACACCA ACACCUCC
AD-53682.1
A-110571.1 GUAUCUCCUAGAC 38 A-109297.2 AUGCUGGUGUCUAGG 259 906 928
ACCAGCAU AGAUACAC
AD-53688.1
A-110572.1 UAUCUCCUAGACA 39 A-109299.2 UAUGCUGGUGUCUAG 260 907 929
CCAGCAUA GAGAUACA
AD-53694.1
A-110573.1 UCUCCUAGACACC 40 A-109301.2 UGUAUGCUGGUGUCU 261 909 931
AGCAUACA AGGAGAUA
AD-53653.1
A-110574.1 UCCUAGACACCAG 41 A-109303.2 UCUGUAUGCUGGUGU 262 911 933
CAUACAGA CUAGGAGA
AD-53659.1
A-110575.1 AGACACCAGCAUA 42 A-109305.2 UCACUCUGUAUGCUG 263 915 937
CAGAGUGA GUGUCUAG
AD-53665.1
A-110576.1 CACCAGCAUACAG 43 A-109307.2 UGGUCACUCUGUAUG 264 918 940
AGUGACCA CUGGUGUC
AD-53671.1
A-110577.1 UACAGAGUGACCA 44 A-109309.2 UUUCCCGGUGGUCAC 265 926 948
CCGGGAAA UCUGUAUG
AD-53677.1
A-110578.1 ACAGAGUGACCAC 45 A-109311.2 AUUUCCCGGUGGUCA 266 927 949
CGGGAAAU CUCUGUAU
AD-53683.1
A-110579.1 GAGUGACCACCGG 46 A-109313.2 UCGAUUUCCCGGUGG 267 930 952
GAAAUCGA UCACUCUG
AD-53689.1
A-110580.1 GGAAAUCGAGGGC 47 A-109315.2 AUGACCCUGCCCUCG 268 942 964
AGGGUCAU AUUUCCCG
AD-53695.1
A-110581.1 AAUCGAGGGCAGG 48 A-109317.2 ACCAUGACCCUGCCC 269 945 967
GUCAUGGU UCGAUUUC
AD-53654.1
A-110582.1 GCAGGGUCAUGGU 49 A-109319.2 AGUCGGUGACCAUGA 270 953 975
CACCGACU CCCUGCCC
AD-53660.1
A-110583.1 CAGGGUCAUGGUC 50 A-109321.2 AAGUCGGUGACCAUG 271 954 976
ACCGACUU ACCCUGCC
AD-53666.1
A-110584.1 GGUCAUGGUCACC 51 A-109323.2 UCGAAGUCGGUGACC 272 957 979
GACUUCGA AUGACCCU
AD-53672.1
A-110585.1 UCAUGGUCACCGA 52 A-109325.2 UCUCGAAGUCGGUGA 273 959 981
CUUCGAGA CCAUGACC
AD-53678.1
A-110586.1 AGGACGGGACCCG 53 A-109327.2 UGUGGAAGCGGGUCC 274 992 1014
CUUCCACA CGUCCUCC
Nombre del dúplex
Nombre del oligo sentido Sec trans sentido SEC ID N°: Nombre del oligo antisentido Sec trans antisentido SEC ID N°: Empieza en NM 17493 6.3 Termina en NM 17493 6.3
AD-53684.1
A-110587.1 CGGGACCCGCUUC 54 A-109329.2 UGUCUGUGGAAGCGG 275 996 1018
CACAGACA GUCCCGUC
AD-53690.1
A-110588.1 UCCACAGACAGGC 55 A-109331.2 ACUUGCUGGCCUGUC 276 1007 1029
CAGCAAGU UGUGGAAG
AD-53696.1
A-110589.1 CCUGCGCGUGCUC 56 A-109333.2 UGGCAGUUGAGCACG 277 1107 1129
AACUGCCA CGCAGGCU
AD-53702.1
A-110590.1 CUGCGCGUGCUCA 57 A-109335.2 UUGGCAGUUGAGCAC 278 1108 1130
ACUGCCAA GCGCAGGC
AD-53708.1
A-110591.1 CGUGCUCAACUGC 58 A-109337.2 UUCCCUUGGCAGUUG 279 1113 1135
CAAGGGAA AGCACGCG
AD-53714.1
A-110592.1 CACCCUCAUAGGC 59 A-109339.2 AACUCCAGGCCUAUG 280 1149 1171
CUGGAGUU AGGGUGCC
AD-53720.1
A-110593.1 ACCCUCAUAGGCC 60 A-109341.2 AAACUCCAGGCCUAU 281 1150 1172
UGGAGUUU GAGGGUGC
AD-53726.1
A-110594.1 CCCUCAUAGGCCU 61 A-109343.2 UAAACUCCAGGCCUAU 282 1151 1173
GGAGUUUA GAGGGUG
AD-53732.1
A-110595.1 CCUCAUAGGCCUG 62 A-109345.2 AUAAACUCCAGGCCUA 283 1152 1174
GAGUUUAU UGAGGGU
AD-53738.1
A-110596.1 CUCAUAGGCCUGG 63 A-109347.2 AAUAAACUCCAGGCCU 284 1153 1175
AGUUUAUU AUGAGGG
AD-53697.1
A-110597.1 UAGGCCUGGAGUU 64 A-109349.2 UCCGAAUAAACUCCAG 285 1157 1179
UAUUCGGA GCCUAUG
AD-53703.1
A-110598.1 AGGCCUGGAGUUU 65 A-109351.2 UUCCGAAUAAACUCCA 286 1158 1180
AUUCGGAA GGCCUAU
AD-53709.1
A-110599.1 GGCCUGGAGUUUA 66 A-109353.2 UUUCCGAAUAAACUCC 287 1159 1181
UUCGGAAA AGGCCUA
AD-53715.1
A-110600.1 GCCUGGAGUUUAU 67 A-109355.2 UUUUCCGAAUAAACUC 288 1160 1182
UCGGAAAA CAGGCCU
AD-53721.1
A-110601.1 GGAGUUUAUUCGG 68 A-109357.2 UGGCUUUUCCGAAUA 289 1164 1186
AAAAGCCA AACUCCAG
AD-53727.1
A-110602.1 GUUUAUUCGGAAA 69 A-109359.2 AGCUGGCUUUUCCGA 290 1167 1189
AGCCAGCU AUAAACUC
AD-53733.1
A-110603.1 GGGCUGGGGUCG 70 A-109361.2 UGACCAGCACGACCC 291 1277 1299
UGCUGGUCA CAGCCCUC
AD-53739.1
A-110604.1 GGUCACCGCUGCC 71 A-109363.2 AAGU UGCCGGCAGCG 292 1293 1315
GGCAACUU GUGACCAG
AD-53698.1
A-110605.1 GGGACGAUGCCUG 72 A-109365.2 AGUAGAGGCAGGCAU 293 1316 1338
CCUCUACU CGUCCCGG
AD-53704.1
A-110606.1 CAACUUUGGCCGC 73 A-109367.2 UCCACACAGCGGCCA 294 1419 1441
UGUGUGGA AAGUUGGU
AD-53710.1
A-110607.1 UUGGCCGCUGUGU 74 A-109369.2 AGAGGUCCACACAGC 295 1424 1446
GGACCUCU GGCCAAAG
Nombre del dúplex
Nombre del oligo sentido Sec trans sentido SEC ID N°: Nombre del oligo antisentido Sec trans antisentido SEC ID N°: Empieza en NM 17493 6.3 Termina en NM 17493 6.3
AD-53716.1
A-110608.1 UGGCCGCUGUGUG 75 A-109371.2 AAGAGGUCCACACAG 296 1425 1447
GACCUCUU CGGCCAAA
AD-53722.1
A-110609.1 GGCCGCUGUGUGG 76 A-109373.2 AAAGAGGUCCACACAG 297 1426 1448
ACCUCUUU CGGCCAA
AD-53728.1
A-110610.1 UGUGUGGACCUCU 77 A-109375.2 UGGGGCAAAGAGGUC 298 1432 1454
UUGCCCCA CACACAGC
AD-53734.1
A-110611.1 GGGAGGACAUCAU 78 A-109377.2 AGGCACCAAUGAUGU 299 1454 1476
UGGUGCCU CCUCCCCU
AD-53740.1
A-110612.1 ACUGCAGCACCUG 79 A-109379.2 ACACAAAGCAGGUGC 300 1481 1503
CUUUGUGU UGCAGUCG
AD-53699.1
A-110613.1 GCAUUGCAGCCAU 80 A-109381.2 ACAGCAUCAUGGCUG 301 1541 1563
GAUGCUGU CAAUGCCA
AD-53705.1
A-110614.1 GUUGAGGCAGAGA 81 A-109383.2 UGGAUCAGUCUCUGC 302 1590 1612
CUGAUCCA CUCAACUC
AD-53711.1
A-110615.1 UGAGGCAGAGACU 82 A-109385.2 AGUGGAUCAGUCUCU 303 1592 1614
GAUCCACU GCCUCAAC
AD-53717.1
A-110616.1 GAGGCAGAGACUG 83 A-109387.2 AAGUGGAUCAGUCUC 304 1593 1615
AUCCACUU UGCCUCAA
AD-53723.1
A-110617.1 GGCAGAGACUGAU 84 A-109389.2 AGAAGUGGAUCAGUC 305 1595 1617
CCACUUCU UCUGCCUC
AD-53729.1
A-110618.1 CAGAGACUGAUCC 85 A-109391.2 AGAGAAGUGGAUCAG 306 1597 1619
ACUUCUCU UCUCUGCC
AD-53735.1
A-110619.1 ACUGAUCCACUUC 86 A-109393.2 UUGGCAGAGAAGUGG 307 1602 1624
UCUGCCAA AUCAGUCU
AD-53741.1
A-110620.1 AUCCACUUCUCUG 87 A-109395.2 AUCUUUGGCAGAGAA 308 1606 1628
CCAAAGAU GUGGAUCA
AD-53700.1
A-110621.1 GGCCUGGUUCCCU 88 A-109397.2 UGGUCCUCAGGGAAC 309 1638 1660
GAGGACCA CAGGCCUC
AD-53706.1
A-110622.1 GGUACUGACCCCC 89 A-109399.2 ACCAGGUUGGGGGUC 310 1662 1684
AACCUGGU AGUACCCG
AD-53712.1
A-110623.1 GUUGGCAGCUGUU 90 A-109401.2 UCCUGCAAAACAGCU 311 1715 1737
UUGCAGGA GCCAACCU
AD-53718.1
A-110624.1 UGGCAGCUGUUUU 91 A-109403.2 AGUCCUGCAAAACAGC 312 1717 1739
GCAGGACU UGCCAAC
AD-53724.1
A-110625.1 GCAGCUGUUUUGC 92 A-109405.2 ACAGUCCUGCAAAACA 313 1719 1741
AGGACUGU GCUGCCA
AD-53730.1
A-110626.1 UCUGCCGGGCCCA 93 A-109407.2 AAGCGUUGUGGGCCC 314 1883 1905
CAACGCUU GGCAGACC
AD-53736.1
A-110627.1 CUGCCGGGCCCAC 94 A-109409.2 AAAGCGUUGUGGGCC 315 1884 1906
AACGCUUU CGGCAGAC
AD-53742.1
A-110628.1 GCCCACAACGCUU 95 A-109411.2 ACCCCCAAAAGCGUU 316 1891 1913
UUGGGGGU GUGGGCCC
Nombre del dúplex
Nombre del oligo sentido Sec trans sentido SEC ID N°: Nombre del oligo antisentido Sec trans antisentido SEC ID N°: Empieza en NM 17493 6.3 Termina en NM 17493 6.3
AD-53701.1
A-110629.1 CGCUUUUGGGGGU 96 A-109413.2 ACACCCUCACCCCCAA 317 1899 1921
GAGGGUGU AAGCGUU
AD-53707.1
A-110630.1 CUUUUGGGGGUGA 97 A-109415.2 AGACACCCUCACCCCC 318 1901 1923
GGGUGUCU AAAAGCG
AD-53713.1
A-110631.1 UUUUGGGGGUGAG 98 A-109417.2 UAGACACCCUCACCCC 319 1902 1924
GGUGUCUA CAAAAGC
AD-53719.1
A-110632.1 GGGGUGAGGGUG 99 A-109419.2 UGGCGUAGACACCCU 320 1907 1929
UCUACGCCA CACCCCCA
AD-53725.1
A-110633.1 GGGUGAGGGUGUC 100 A-109421.2 AUGGCGUAGACACCC 321 1908 1930
UACGCCAU UCACCCCC
AD-53731.1
A-110634.1 GGUGAGGGUGUCU 101 A-109423.2 AAUGGCGUAGACACC 322 1909 1931
ACGCCAUU CUCACCCC
AD-53737.1
A-110635.1 AGGGUGUCUACGC 102 A-109425.2 UGGCAAUGGCGUAGA 323 1913 1935
CAUUGCCA CACCCUCA
AD-53743.1
A-110636.1 GUGUCUACGCCAU 103 A-109427.2 ACCUGGCAAUGGCGU 324 1916 1938
UGCCAGGU AGACACCC
AD-53749.1
A-110637.1 UGCAGCGUCCACA 104 A-109429.2 UGGAGCUGUGUGGAC 325 1960 1982
CAGCUCCA GCUGCAGU
AD-53755.1
A-110638.1 GCAUGGGGACCCG 105 A-109431.2 AGUGGACACGGGUCC 326 1994 2016
UGUCCACU CCAUGCUG
AD-53761.1
A-110639.1 CCCACAAGCCGCC 106 A-109433.2 UCAGCACAGGCGGCU 327 2078 2100
UGUGCUGA UGUGGGUG
AD-53767.1
A-110640.1 GAGGCCACGAGGU 107 A-109435.2 UUGGGCUGACCUCGU 328 2097 2119
CAGCCCAA GGCCUCAG
AD-53773.1
A-110641.1 CACGAGGUCAGCC 108 A-109437.2 ACUGGUUGGGCUGAC 329 2102 2124
CAACCAGU CUCGUGGC
AD-53779.1
A-110642.1 GGGAGGCCAGCAU 109 A-109439.2 AAGCGUGGAUGCUGG 330 2135 2157
CCACGCUU CCUCCCUG
AD-53785.1
A-110643.1 AUCCACGCUUCCU 110 A-109441.2 AUGGCAGCAGGAAGC 331 2146 2168
GCUGCCAU GUGGAUGC
AD-53744.1
A-110644.1 GGAAUGCAAAGUC 111 A-109443.2 UGCUCCUUGACUUUG 332 2178 2200
AAGGAGCA CAUUCCAG
AD-53750.1
A-110645.1 AAUCCCGGCCCCU 112 A-109445.2 UGCUCCUGAGGGGCC 333 2202 2224
CAGGAGCA GGGAUUCC
AD-53762.1
A-110647.1 GCUGGGGCUGAGC 113 A-109449.2 AUUUUAAAGCUCAGCC 334 2479 2501
UUUAAAAU CCAGCCC
AD-53768.1
A-110648.1 GGAGGUGCCAGGA 114 A-109451.2 AGGGAGCUUCCUGGC 335 2648 2670
AGCUCCCU ACCUCCAC
AD-53774.1
A-110649.1 ACUGUGGGGCAUU 115 A-109453.2 AAUGGUGAAAUGCCC 336 2674 2696
UCACCAUU CACAGUGA
AD-53780.1
A-110650.1 CCACCAAGGAGGC 116 A-109455.2 AGAAUCCUGCCUCCU 337 2811 2833
AGGAUUCU UGGUGGAG
Nombre del dúplex
Nombre del oligo sentido Sec trans sentido SEC ID N°: Nombre del oligo antisentido Sec trans antisentido SEC ID N°: Empieza en NM 17493 6.3 Termina en NM 17493 6.3
AD-53786.1
A-110651.1 CACCAAGGAGGCA 117 A-109457.2 AAGAAUCCUGCCUCC 338 2812 2834
GGAUUCUU UUGGUGGA
AD-53804.1
A-110701.1 ACCAAGGAGGCAG 118 A-109557.2 AAAGAAUCCUGCCUCC 339 2813 2835
GAUUCUUU UUGGUGG
AD-53810.1
A-110702.1 GGAGGCAGGAUUC 119 A-109559.2 AAUGGGAAGAAUCCU 340 2818 2840
UUCCCAUU GCCUCCUU
AD-53816.1
A-110703.1 GAGGCAGGAUUCU 120 A-109561.2 UCAUGGGAAGAAUCC 341 2819 2841
UCCCAUGA UGCCUCCU
AD-53745.1
A-110652.1 UGAUGGCCCUCAU 121 A-109459.2 AGCUGGAGAUGAGGG 342 2904 2926
CUCCAGCU CCAUCAGC
AD-53822.1
A-110704.1 CUUUCUGGAUGGC 122 A-109563.2 UGCUAGAUGCCAUCC 343 2971 2993
AUCUAGCA AGAAAGCU
AD-53751.1
A-110653.1 UUUCUGGAUGGCA 123 A-109461.2 UGGCUAGAUGCCAUC 344 2972 2994
UCUAGCCA CAGAAAGC
AD-53827.1
A-110705.1 UUCUGGAUGGCAU 124 A-109565.2 UUGGCUAGAUGCCAU 345 2973 2995
CUAGCCAA CCAGAAAG
AD-53757.1
A-110654.1 UCUGGAUGGCAUC 125 A-109463.2 UCUGGCUAGAUGCCA 346 2974 2996
UAGCCAGA UCCAGAAA
AD-53833.1
A-110706.1 CUGGAUGGCAUCU 126 A-109567.2 UUCUGGCUAGAUGCC 347 2975 2997
AGCCAGAA AUCCAGAA
AD-53793.1
A-110707.1 CUUUACUCUGCUC 127 A-109569.2 UUGGCAUAGAGCAGA 348 3053 3075
UAUGCCAA GUAAAGGU
AD-53799.1
A-110708.1 UUUACUCUGCUCU 128 A-109571.2 UCUGGCAUAGAGCAG 349 3054 3076
AUGCCAGA AGUAAAGG
AD-53763.1
A-110655.1 GCUCUAUGCCAGG 129 A-109465.2 UAGCACAGCCUGGCA 350 3062 3084
CUGUGCUA UAGAGCAG
AD-53769.1
A-110656.1 CUCAGCCAACCCG 130 A-109467.2 UAGUGGAGCGGGUUG 351 3158 3180
CUCCACUA GCUGAGAC
AD-53805.1
A-110709.1 UCAGCCAACCCGC 131 A-109573.2 UUAGUGGAGCGGGUU 352 3159 3181
UCCACUAA GGCUGAGA
AD-53811.1
A-110710.1 CCUGCCAAGCUCA 132 A-109575.2 UUGCUGUGUGAGCUU 353 3245 3267
CACAGCAA GGCAGGCA
AD-53781.1
A-110658.1 GCCAAGCUCACAC 133 A-109471.2 UUCCUGCUGUGUGAG 354 3248 3270
AGCAGGAA CUUGGCAG
AD-53817.1
A-110711.1 CCAAGCUCACACA 134 A-109577.2 UUUCCUGCUGUGUGA 355 3249 3271
GCAGGAAA GCUUGGCA
AD-53787.1
A-110659.1 CAAGCUCACACAG 135 A-109473.2 AGUUCCUGCUGUGUG 356 3250 3272
CAGGAACU AGCUUGGC
AD-53823.1
A-110712.1 AAGCUCACACAGC 136 A-109579.2 AAGUUCCUGCUGUGU 357 3251 3273
AGGAACUU GAGCUUGG
AD-53746.1
A-110660.1 CUGAAGCCAAGCC 137 A-109475.2 UAAGAAGAGGCUUGG 358 3298 3320
UCUUCUUA CUUCAGAG
Nombre del dúplex
Nombre del oligo sentido Sec trans sentido SEC ID N°: Nombre del oligo antisentido Sec trans antisentido SEC ID N°: Empieza en NM 17493 6.3 Termina en NM 17493 6.3
AD-53828.1
A-110713.1 UGAAGCCAAGCCU 138 A-109581.2 UUAAGAAGAGGCUUG 359 3299 3321
CUUCUUAA GCUUCAGA
AD-53752.1
A-110661.1 GAAGCCAAGCCUC 139 A-109477.2 AGUAAGAAGAGGCUU 360 3300 3322
UUCUUACU GGCUUCAG
AD-53758.1
A-110662.1 AAGCCAAGCCUCU 140 A-109479.2 AAGUAAGAAGAGGCU 361 3301 3323
UCUUACUU UGGCUUCA
AD-53834.1
A-110714.1 AGUGAGGCUGGGA 141 A-109583.2 UUUCCCCUUCCCAGC 362 3355 3377
AGGGGAAA CUCACUGU
AD-53764.1
A-110663.1 GUGAGGCUGGGAA 142 A-109481.2 UGUUCCCCUUCCCAG 363 3356 3378
GGGGAACA CCUCACUG
AD-53770.1
A-110664.1 GGCUGGGAAGGGG 143 A-109483.2 UCUGUGUUCCCCUUC 364 3360 3382
AACACAGA CCAGCCUC
AD-53776.1
A-110665.1 GAAGGGGAACACA 144 A-109485.2 UCCUGGUCUGUGUUC 365 3366 3388
GACCAGGA CCCUUCCC
AD-53782.1
A-110666.1 AAGGGGAACACAG 145 A-109487.2 UUCCUGGUCUGUGUU 366 3367 3389
ACCAGGAA CCCCUUCC
AD-53794.1
A-110715.1 AGGGGAACACAGA 146 A-109585.2 UUUCCUGGUCUGUGU 367 3368 3390
CCAGGAAA UCCCCUUC
AD-53788.1
A-110667.1 GGGAACACAGACC 147 A-109489.2 AGCUUCCUGGUCUGU 368 3370 3392
AGGAAGCU GUUCCCCU
AD-53747.1
A-110668.1 ACUGUCCCUCCUU 148 A-109491.2 UGGUGCUCAAGGAGG 369 3509 3531
GAGCACCA GACAGUUG
AD-53753.1
A-110669.1 CCAGCCCCACCCA 149 A-109493.2 UGCUUGCUUGGGUGG 370 3527 3549
AGCAAGCA GGCUGGUG
AD-53759.1
A-110670.1 CCCCACCCAAGCA 150 A-109495.2 UGUCUGCUUGCUUGG 371 3531 3553
AGCAGACA GUGGGGCU
AD-53765.1
A-110671.1 CCCACCCAAGCAA 151 A-109497.2 AUGUCUGCUUGCUUG 372 3532 3554
GCAGACAU GGUGGGGC
AD-53771.1
A-110672.1 CCACCCAAGCAAG 152 A-109499.2 AAUGUCUGCUUGCUU 373 3533 3555
CAGACAUU GGGUGGGG
AD-53777.1
A-110673.1 CACCCAAGCAAGC 153 A-109501.2 AAAUGUCUGCUUGCU 374 3534 3556
AGACAUUU UGGGUGGG
AD-53783.1
A-110674.1 ACCCAAGCAAGCA 154 A-109503.2 UAAAUGUCUGCUUGC 375 3535 3557
GACAUUUA UUGGGUGG
AD-53789.1
A-110675.1 CCCAAGCAAGCAG 155 A-109505.2 AUAAAUGUCUGCUUG 376 3536 3558
ACAUUUAU CUUGGGUG
AD-53800.1
A-110716.1 CCAAGCAAGCAGA 156 A-109587.2 AAUAAAUGUCUGCUU 377 3537 3559
CAUUUAUU GCUUGGGU
AD-53748.1
A-110676.1 CAAGCAAGCAGAC 157 A-109507.2 AGAUAAAUGUCUGCU 378 3538 3560
AUUUAUCU UGCUUGGG
AD-53754.1
A-110677.1 AAGCAAGCAGACA 158 A-109509.2 AAGAUAAAUGUCUGCU 379 3539 3561
UUUAUCUU UGCUUGG
Nombre del dúplex
Nombre del oligo sentido Sec trans sentido SEC ID N°: Nombre del oligo antisentido Sec trans antisentido SEC ID N°: Empieza en NM 17493 6.3 Termina en NM 17493 6.3
AD-53760.1
A-110678.1 AGCAAGCAGACAU UUAUCUUU 159 A-109511.2 AAAGAUAAAUGUCUGC UUGCUUG 380 3540 3562
AD-53806.1
A-110717.1 CAAGCAGACAUUU AUCUUUUU 160 A-109589.2 AAAAAGAUAAAUGUCU GCUUGCU 381 3542 3564
AD-56975.1
A-116394.4 160 A-109589.5 381
AD-56976.1
A-116407.1 160 A-109589.11 381
AD-56977.1
A-116406.2 160 A-109589.11 381
AD-56978.1
A-116418.1 160 A-109589.18 381
AD-56979.1
A-116393.1 160 A-109589.6 381
AD-56980.1
A-116408.1 160 A-109589.12 381
AD-56981.1
A-116419.1 160 A-109589.19 381
AD-56982.1
A-116426.1 Misma 160 A-109589.19 Misma 381 Misma Misma
AD-56983.1
A-116400.1 160 A-109589.7 381
AD-56984.1
A-116409.1 160 A-109589.13 381
AD-56985.1
A-116420.1 160 A-109589.20 381
AD-56986.1
A-116428.1 160 A-109589.20 381
AD-56986.2
A-116428.2 160 A-109589.17 381
AD-56987.1
A-116410.1 160 A-109589.14 381
AD-56988.1
A-116421.1 160 A-109589.21 381
AD-56989.1
A-116430.1 160 A-109589.21 381
AD-56990.1
A-116432.1 Misma 160 A-109589.9 Misma 381 Misma Misma
AD-56991.1
A-116415.1 160 A-109589.15 381
AD-56992.1
A-116434.1 160 A-109589.15 381
AD-56993.1
A-116416.1 160 A-109589.16 381
AD-56994.1
A-116436.1 160 A-109589.22 381
AD-56995.1
A-116417.1 160 A-109589.17 381
AD-56996.1
A-116438.1 160 A-109589.17 381
AD-56997.1
A-116450.1 160 A-109589.17 381
AD-56998.1
A-116471.1 160 A-109589.17 381
AD-56999.1
A-116479.2 160 A-109589.17 381
AD-57000.1
A-116492.3 160 A-109589.17 381
Nombre del dúplex
Nombre del oligo sentido Sec trans sentido SEC ID N°: Nombre del oligo antisentido Sec trans antisentido SEC ID N°: Empieza en NM 17493 6.3 Termina en NM 17493 6.3
AD-57001.1
A-116440.1 160 A-109589.17 381
AD-57002.1
A-116452.1 160 A-109589.17 381
AD-57003.1
A-116460.1 160 A-109589.17 381
AD-57004.1
A-116473.1 160 A-109589.17 381
AD-57005.1
A-116486.1 160 A-109589.17 381
AD-57006.1
A-116494.3 160 A-109589.17 381
AD-57007.1
A-116442.1 160 A-109589.17 381
AD-57008.1
A-116453.1 160 A-109589.17 381
AD-57009.1
A-116462.1 160 A-109589.17 381
AD-57010.1
A-116475.1 160 A-109589.17 381
AD-57011.1
A-116488.1 160 A-109589.17 381
AD-57012.1
A-116498.1 160 A-109589.17 381
AD-57013.1
A-116444.1 160 A-109589.17 381
AD-57014.1
A-116454.1 160 A-109589.17 381
AD-57015.1
A-116464.1 160 A-109589.17 381
AD-57016.1
A-116477.1 160 A-109589.17 381
AD-57017.1
A-116490.1 160 A-109589.17 381
AD-57018.1
A-116500.1 160 A-109589.17 381
AD-57019.1
A-116446.1 160 A-109589.17 381
AD-57020.1
A-116455.1 160 A-109589.23 381
AD-57021.1
A-116481.1 160 A-109589.23 381
AD-57022.1
A-116448.1 160 A-109589.23 381
AD-57023.1
A-116467.1 160 A-109589.23 381
AD-57024.1
A-116483.1 160 A-109589.23 381
AD-57025.1
A-116449.1 160 A-109589.23 381
AD-57026.1
A-116457.1 160 A-109589.23 381
AD-57027.1
A-116469.1 160 A-109589.23 381
AD-53812.1
A-110718.1 AAGCAGACAUUUA UCUUUUGA 161 A-109591.2 UCAAAAGAUAAAUGUC UGCUUGC 382 3543 3565
Nombre del dúplex
Nombre del oligo sentido Sec trans sentido SEC ID N°: Nombre del oligo antisentido Sec trans antisentido SEC ID N°: Empieza en NM 17493 6.3 Termina en NM 17493 6.3
AD-53818.1
A-110719.1 AGCAGACAU U UAU 162 A-109593.2 UCCAAAAGAUAAAUGU 383 3544 3566
CUUUUGGA CUGCUUG
AD-53766.1
A-110679.1 GCAGACAUUUAUC 163 A-109513.2 ACCCAAAAGAUAAAUG 384 3545 3567
UUUUGGGU UCUGCUU
AD-53772.1
A-110680.1 AGACAUUUAUCUU 164 A-109515.2 AGACCCAAAAGAUAAA 385 3547 3569
UUGGGUCU UGUCUGC
AD-53824.1
A-110720.1 GACAUUUAUCUUU 165 A-109595.2 AAGACCCAAAAGAUAA 386 3548 3570
UGGGUCUU AUGUCUG
AD-53778.1
A-110681.1 ACAUUUAUCUUUU 166 A-109517.2 ACAGACCCAAAAGAUA 387 3549 3571
GGGUCUGU AAUGUCU
AD-53784.1
A-110682.1 UUUAUCUUUUGGG 167 A-109519.2 AGGACAGACCCAAAAG 388 3552 3574
UCUGUCCU AUAAAUG
AD-53829.1
A-110721.1 UUAUCUUUUGGGU 168 A-109597.2 AAGGACAGACCCAAAA 389 3553 3575
CUGUCCUU GAUAAAU
AD-53790.1
A-110683.1 UAUCUUUUGGGUC 169 A-109521.2 AGAGGACAGACCCAAA 390 3554 3576
UGUCCUCU AGAUAAA
AD-53835.1
A-110722.1 AUCUUUUGGGUCU 170 A-109599.2 AAGAGGACAGACCCAA 391 3555 3577
GUCCUCUU AAGAUAA
AD-53796.1
A-110684.1 UCUUUUGGGUCUG 171 A-109523.2 AGAGAGGACAGACCC 392 3556 3578
UCCUCUCU AAAAGAUA
AD-53802.1
A-110685.1 UUUUGGGUCUGUC 172 A-109525.2 ACAGAGAGGACAGAC 393 3558 3580
CUCUCUGU CCAAAAGA
AD-53808.1
A-110686.1 UUUGGGUCUGUCC 173 A-109527.2 AACAGAGAGGACAGAC 394 3559 3581
UCUCUGUU CCAAAAG
AD-53795.1
A-110723.1 UUGGGUCUGUCCU 174 A-109601.2 AAACAGAGAG GACAGA 395 3560 3582
CUCUGUUU CCCAAAA
AD-53801.1
A-110724.1 UGGGUCUGUCCUC 175 A-109603.2 U CAACAGAGAGGACA 396 3561 3583
UCUGUUGA GACCCAAA
AD-53807.1
A-110725.1 GGGUCUGUCCUCU 176 A-109605.2 UGCAACAGAGAGGAC 397 3562 3584
CUGUUGCA AGACCCAA
AD-53814.1
A-110687.1 GGUCUGUCCUCUC 177 A-109529.2 AGGCAACAGAGAGGA 398 3563 3585
UGUUGCCU CAGACCCA
AD-53820.1
A-110688.1 GUCUGUCCUCUCU 178 A-109531.2 AAGGCAACAGAGAGG 399 3564 3586
GUUGCCUU ACAGACCC
AD-53825.1
A-110689.1 UCUGUCCUCUCUG 179 A-109533.2 AAAGGCAACAGAGAG 400 3565 3587
UUGCCUUU GACAGACC
AD-53831.1
A-110690.1 CUGUCCUCUCUGU 180 A-109535.2 AAAAGGCAACAGAGAG 401 3566 3588
UGCCUUUU GACAGAC
AD-53791.1
A-110691.1 UGUCCUCUCUGUU 181 A-109537.2 AAAAAGGCAACAGAGA 402 3567 3589
GCCUUUUU GGACAGA
AD-53797.1
A-110692.1 GUCCUCUCUGUUG 182 A-109539.2 UAAAAAGGCAACAGAG 403 3568 3590
CCUUUUUA AGGACAG
Nombre del dúplex
Nombre del oligo sentido Sec trans sentido SEC ID N°: Nombre del oligo antisentido Sec trans antisentido SEC ID N°: Empieza en NM 17493 6.3 Termina en NM 17493 6.3
AD-48400.1
A-98247.2 UUUUCUAGACCUG UUUUGCUU 183 A-93455.4 AAGCAAAACAGGUCUA GAAAAGU 404 3597 3619
AD-53830.1
A-110872.1 A-110873.1
AD-53803.1
A-110693.1 UUUCUAGACCUGU UUUGCUUU 184 A-109541.2 AAAGCAAAACAGGUCU AGAAAAG 405 3598 3620
AD-53809.1
A-110694.1 UUCUAGACCUGUU UUGCUUUU 185 A-109543.2 AAAAGCAAAACAGGUC UAGAAAA 406 3599 3621
AD-53813.1
A-110726.1 UCUAGACCUGUUU UGCUUUUU 186 A-109607.2 AAAAAG CAAAACAG G U CUAGAAA 407 3600 3622
AD-53815.1
A-110695.1 CUAGACCUGUUUU GCUUUUGU 187 A-109545.2 ACAAAAGCAAAACAGG UCUAGAA 408 3601 3623
AD-56610.1
A-115523.2 187 A-115525.1 408
AD-56611.1
A-115533.2 187 A-115534.1 408
AD-56612.1
A-115536.2 Misma 187 A-115540.3 Misma 408 Misma Misma
AD-56613.1
A-115538.3 187 A-115541.5 408
AD-56614.1
A-110695.9 187 A-115548.1 408
AD-56615.1
A-110695.5 187 A-115519.1 408
AD-56616.1
A-115523.3 187 A-115526.1 408
AD-56617.1
A-115535.1 187 A-109545.7 408
AD-56618.1
A-115537.2 187 A-115540.4 408
AD-56619.1
A-115539.3 187 A-115541.6 408
AD-56620.1
A-115542.2 187 A-115548.2 408
AD-56621.1
A-115520.1 Misma 187 A-115519.2 Misma 408 Misma Misma
AD-56622.1
A-115527.1 187 A-115526.2 408
AD-56623.1
A-115536.1 187 A-109545.8 408
AD-56624.1
A-115538.2 187 A-115540.5 408
AD-56625.1
A-115542.1 187 A-109545.12 408
AD-56626.1
A-115543.2 187 A-115548.3 408
AD-56627.1
A-115521.1 187 A-115519.3 408
AD-56628.1
A-115527.2 187 A-115528.1 408
AD-56629.1
A-115537.1 187 A-109545.9 408
AD-56630.1
A-115539.2 187 A-115540.6 408
AD-56631.1
A-115543.1 Misma 187 A-109545.13 Misma 408 Misma Misma
Nombre del dúplex
Nombre del oligo sentido Sec trans sentido SEC ID N°: Nombre del oligo antisentido
AD-56632.1
A-115544.2 Misma Misma 187 A-115548.4
AD-56633.1
A-115520.2 187 A-109545.6
AD-56634.1
A-115529.1 187 A-115530.1
AD-56635.1
A-115538.1 187 A-109545.10
AD-56636.1
A-110695.8 187 A-115541.1
AD-56637.1
A-115544.1 187 A-109545.14
AD-56638.1
A-115545.2 187 A-115548.5
AD-56639.1
A-115520.3 187 A-115522.1
AD-56640.1
A-115529.2 187 A-115531.1
AD-56641.1
A-115539.1 187 A-109545.11
AD-56642.1
A-115535.3 187 A-115541.2
AD-56643.1
A-115545.1 187 A-109545.15
AD-56644.1
A-115546.2 187 A-115548.6
AD-56645.1
A-110695.6 187 A-115522.2
AD-56646.1
A-115529.3 187 A-115532.1
AD-56647.1
A-110695.7 187 A-115540.1
AD-56648.1
A-115536.3 187 A-115541.3
AD-56649.1
A-115546.1 187 A-109545.16
AD-56650.1
A-115547.2 187 A-115548.7
AD-56651.1
A-115523.1 187 A-115524.1
AD-56652.1
A-115533.1 187 A-115532.2
AD-56653.1
A-115535.2 187 A-115540.2
AD-56654.1
A-115537.3 187 A-115541.4
AD-56655.1
A-115547.1 187 A-109545.17
AD-56656.1
A-110695.10 187 A-115549.1
AD-56657.1
A-115550.1 187 A-115551.1
AD-56658.1
A-115564.1 187 A-115565.1
AD-56659.1
A-110695.12 187 A-115579.1
AD-56662.1
A-115542.3 187 A-115549.2
Sec trans antisentido
SEC Empieza
ID N°: en
Termina
en
Misma
Misma
408
408
408
408
408
408
408
408
408
408
408
408
408
408
408
408
408
408
408
408
408
408
408
408
408
408
408
408
408
NM_17493
6.3
Misma
Misma
NM_17493
6.3
Misma
Misma
Nombre del dúplex
Nombre del oligo sentido Sec trans sentido SEC ID N°: Nombre del oligo antisentido Sec trans antisentido SEC ID N°: Empieza en NM 17493 6.3 Termina en NM 17493 6.3
AD-56663.1
A-115552.1 187 A-115553.1 408
AD-56664.1
A-115566.1 187 A-115567.1 408
AD-56668.1
A-115543.3 187 A-115549.3 408
AD-56669.1
A-115554.1 187 A-115555.1 408
AD-56670.1
A-115568.1 187 A-115569.1 408
AD-56673.1
A-115544.3 187 A-115549.4 408
AD-56674.1
A-115556.1 187 A-115557.1 408
AD-56678.1
A-115545.3 187 A-115549.5 408
AD-56679.1
A-115558.1 187 A-115559.1 408
AD-56680.1
A-115572.1 187 A-115573.1 408
AD-56683.1
A-115546.3 187 A-115549.6 408
AD-56684.1
A-115560.1 187 A-115561.1 408
AD-56685.1
A-115574.1 187 A-115575.1 408
AD-56688.1
A-115547.3 187 A-115549.7 408
AD-56689.1
A-115535.4 187 A-115562.1 408
AD-56690.1
A-115542.4 187 A-115576.1 408
AD-56693.1
A-115520.4 187 A-115563.1 408
AD-56694.1
A-115577.1 187 A-115578.1 408
AD-53821.1
A-110696.1 UAGACCUGUUUUG CUUUUGUA 188 A-109547.2 UACAAAAGCAAAACAG GUCUAGA 409 3602 3624
AD-56660.1
A-115594.1 AGACCUGUUUUGC UUUUGU 189 A-115595.1 ACAAAAGCAAAACAGG UCUAG 410 3603 3623
AD-56661.1
A-115580.2 189 A-115610.1 410
AD-56665.1
A-115580.1 189 A-115581.1 410
AD-56666.1
A-115596.1 189 A-115597.1 410
AD-56667.1
A-115611.1 GACCUGUUUUGCU UUUGU 190 A-115612.1 ACAAAAGCAAAACAGG UCAUA 411 3603 3623
AD-56671.1
A-115582.1 AGACCUGUUUUGC UUUUGU 191 A-115583.1 ACAAAAGCAAAACAGG UCUAG 412 3603 3623
AD-56672.1
A-115598.1 191 A-115599.1 412
AD-56676.1
A-115584.1 191 A-115585.1 412
AD-56677.1
A-115600.1 191 A-115601.1 412
Nombre del dúplex
Nombre del oligo sentido Sec trans sentido SEC ID N°: Nombre del oligo antisentido Sec trans antisentido SEC ID N°: Empieza en NM 17493 6.3 Termina en NM 17493 6.3
AD-56681.1
A-115586.1 191 A-115587.1 412
AD-56682.1
A-115602.1 191 A-115603.1 412
AD-56686.1
A-115588.1 Misma 191 A-115589.1 Misma 412 Misma Misma
AD-56687.1
A-115604.1 191 A-115605.1 412
AD-56691.1
A-115590.1 191 A-115591.1 412
AD-56692.1
A-115606.1 191 A-115607.1 412
AD-56695.1
A-115592.1 191 A-115593.1 412
AD-56696.1
A-115608.1 191 A-115609.1 412
AD-53826.1
A-110697.1 UUUUGUAACUUGA AGAUAUUU 192 A-109549.2 AAAUAUCUUCAAGUUA CAAAAGC 413 3616 3638
AD-53832.1
A-110698.1 UUUGUAACUUGAA GAUAUUUA 193 A-109551.2 UAAAUAUCUUCAAGUU ACAAAAG 414 3617 3639
AD-53792.1
A-110699.1 UUGUAACUUGAAG AUAUUUAU 194 A-109553.2 AUAAAUAUCUUCAAGU UACAAAA 415 3618 3640
AD-53798.1
A-110700.1 UGUAACUUGAAGA UAUUUAUU 195 A-109555.2 AAUAAAUAUCUUCAAG UUACAAA 416 3619 3641
AD-53819.1
A-110727.1 GUAACUUGAAGAU AUUUAUUU 196 A-109609.2 AAAUAAAUAUCUUCAA GUUACAA 417 3620 3642
AD-53815.1
CUAGACCUGUUUU GCUUUUGU 197 ACAAAAGCAAAACAGG UCUAGAA 418 3601
AD-57928.40
Misma 197 Misma 418 Misma
AD-59182.5
197 418
AD-59184.3
197 418
AD-59186.3
197 418
AD-59171.13
197 418
AD-59176.7
197 418
AD-59170.7
Misma 197 Misma 418 Misma
AD-59175.7
197 418
AD-59179.7
197 418
AD-59218.1
197 418
AD-59222.1
197 418
AD-59226.1
197 418
AD-59230.1
197 418
Nombre del dúplex
Nombre del oligo sentido Sec trans sentido SEC ID N°: Nombre del oligo antisentido Sec trans antisentido SEC ID N°: Empieza en NM 17493 6.3 Termina en NM 17493 6.3
AD-59235.1
197 418
AD-59207.1
197 418
AD-59211.1
197 418
AD-59215.1
197 418
AD-59219.1
197 418
AD-59223.1
197 418
AD-59181.5
Misma 197 Misma 418 Misma
AD-59172.5
197 418
AD-59177.5
197 418
AD-59180.5
197 418
AD-59183.5
197 418
AD-59185.5
197 418
AD-59173.5
197 418
AD-59232.1
CUAGACCUGUUUU GCUUUUGU 198 ACAAAAGCAAAACAGG UCUAGAA 419 3600
AD-59236.1
Misma 198 Misma 419 Misma
AD-59216.1
198 419
AD-59220.1
198 419
AD-59224.1
198 419
AD-59228.1
198 419
AD-59233.1
198 419
AD-59237.1
198 419
AD-59209.1
198 419
AD-59208.1
198 419
AD-59212.1
CUAGACCUGUUUU GCUUUUGU 199 ACAAAAGCAAAACAGG UCUAGAA 420 3600
AD-59210.1
CUAGACCUGUUUU GCUUUUGU 200 ACAAAAGCAAAACAGG UCUAGAA 421 3601
AD-59214.1
AGACCUGUUUUGC UUUUGU 201 ACAAAAGCAAAACAGG UCUAG 422 3603
AD-59227.1
201 422
Nombre del dúplex
Nombre del oligo sentido Sec trans sentido SEC ID N°: Nombre del oligo antisentido Sec trans antisentido SEC ID N°: Empieza en NM 17493 6.3 Termina en NM 17493 6.3
AD-59231.1
Misma 201 Misma 422
AD-59198.3
201 422
AD-59200.3
201 422
AD-59203.3
201 422
AD-59204.3
Misma 201 Misma 422
AD-59188.3
201 422
AD-59191.3
201 422
AD-59213.1
201 422
AD-59217.1
201 422
AD-59221.1
201 422
AD-59225.1
201 422
AD-59229.1
201 422
AD-59234.1
201 422
AD-59238.1
201 422
AD-59241.1
201 422
AD-59245.1
201 422
AD-59250.1
201 422
AD-59246.1
CUAGACCUGUUUU GCUUUUGU 202 ACAAAAGCAAAACAGG UCUAGA 423 3602
AD-59253.2
UAGACCUGUUUUG CUUUUGU 203 ACAAAAGCAAAACAGG UCUAGA 424 3602
AD-59242.1
AGACCUGUUUUGC UUUUGU 204 ACAAAAGCAAAACAGG UCUAGA 425 3602
AD-59253.1
UAGACCUGUUUUG CUUUUGU 205 ACAAAAGCAAAACAGG UCUAGA 426 3602
AD-59258.1
UAGACCUGUUUUG CUUUUGU 206 ACAAAAGCAAAACAGG UCUAGA 427 3602
AD-59251.1
CUAGACCUGUUUU GCUUUUGU 207 ACAAAAGCAAAACAGG UCUAG 428 3603
AD-59256.1
UAGACCUGUUUUG CUUUUGU 208 ACAAAAGCAAAACAGG UCUA 429 3604
AD-59260.1
AGACCUGUUUUGC UUUUGU 209 ACAAAAGCAAAACAGG UCU 430 3605
AD-59248.1
GACCUGUUUUGCU UUUGU 210 ACAAAAGCAAAACAGG UCU 431 3605
Nombre del dúplex
Nombre del oligo sentido Sec trans sentido SEC ID N°: Nombre del oligo antisentido Sec trans antisentido SEC ID N°: Empieza en NM 17493 6.3 Termina en NM 17493 6.3
AD-59247.1
GACCUGUUUUGCU UUUGU 211 ACAAAAGCAAAACAGG UCUA 432 3604
AD-59252.1
AGACCUGUUUUGC UUUUGU 212 ACAAAAGCAAAACAGG UCUA 433 3604
AD-59257.1
UAGACCUGUUUUG CUUUUGU 213 ACAAAAGCAAAACAGG UCUA 434 3604
AD-59261.1
AGACCUGUUUUGC UUUUGU 214 ACAAAAGCAAAACAGG UCUAG 435 3603
AD-59262.1
UAGACCUGUUUUG CUUUUGU 215 ACAAAAGCAAAACAGG UCUAG 436 3603
AD-59265.1
CUAGACCUGUUUU GCUUUUGU 216 ACAAAAGCAAAACAGG UCUAG 437 3603
AD-59196.13
UAGACCUGUUUUG CUUUUGU 217 ACAAAAGCAAAACAGG UCUAGAA 438 3601
AD-59189.11
AGACCUGUUUUGC UUUUGU 218 ACAAAAGCAAAACAGG UCUAGAA 439 3601
AD-59190.3
UCUAGACCUGUUU UGCUUUUGU 219 ACAAAAGCAAAACAGG UCUAGAA 440 3601
AD-59192.3
UUCUAGACCUGUU UUGCUUUUGU 220 ACAAAAGCAAAACAGG UCUAGAA 441 3601
AD-59240.1
220 441
AD-59244.1
Misma 220 Misma 441 Misma
AD-59202.7
220 441
AD-59195.5
220 441
AD-59249.1
220 441
AD-59254.1
220 441
AD-59259.1
Misma 220 Misma 441 Misma
AD-59264.1
220 441
AD-59264.2
220 441
AD-59255.1
220 441
AD-57928.1
220 441
AD-58893.1
220 441
AD-58894.1
220 441
AD-58895.1
220 441
AD-58896.1
220 441
Nombre del dúplex
Nombre del oligo sentido Sec trans sentido SEC ID N°: Nombre del oligo antisentido Sec trans antisentido SEC ID N°: Empieza en NM 17493 6.3 Termina en NM 17493 6.3
AD-58897.1
220 441
AD-58898.1
220 441
AD-58899.1
220 441
AD-58900.1
CAAGCAGACAUUU AUCUUUUU 221 AAAAAGAUAAAUGUCU GCUUGCU 442 N/A
AD-58902.1
UUUUCUAGACCUG UUUUGCUU 222 AAGCAAAACAGGUCUA GAAAAGU 443 3597
AGACCUGUUUUGC UUUUGU 223 ACAAAAGCAAAACAGG UCUAG 444
AGACCUGUUUUGC UUUUGU 224 ACAAAAGCAAAACAGG UCUAG 445
AGACCUGUUUUGC UUUUGU 225 ACAAAAGCAAAACAGG UCUAG 446
AGACCUGUUUUGC UUUUGU 226 ACAAAAGCAAAACAGG UCUAG 447
AGACCUGUUUUGC UUUUGU 227 ACAAAAGCAAAACAGG UCUAG 448
AGACCUGUUUUGC UUUUGU 228 ACAAAAGCAAAACAGG UCUAG 449
CUAGACCUGUUUU GCUUUUGU Misma 229 ACAAAAGCAAAACAGG UCUAGAA Misma 450
229 450
229 450
229 450
229 450
229 450
229 450
229 450
229 450
229 450
229 450
229 450
AGACCUGUUUUGC UUUUGU 230 ACAAAAGCAAAACAGG UCUAG 451
AGACCUGUUUUGC UUUUGU 231 ACAAAAGCAAAACAGG UCUAG 452
Nombre del dúplex
Nombre del oligo sentido Sec trans sentido SEC ID N°: Nombre del oligo antisentido Sec trans antisentido SEC ID N°: Empieza en NM 17493 6.3 Termina en NM 17493 6.3
CUAGACCUGUUUU GCUUUUGU Misma 232 ACAAAAGCAAAACAGG UCUAGAA Misma 453
232 453
232 453
232 453
232 453
232 453
CUAGACCUGUUUU GCUUUUGU Misma Misma 233 ACAAAAGCAAAACAGG UCUAGAA Misma Misma 454
233 454
233 454
233 454
233 454
233 454
233 454
233 454
233 454
233 454
233 454
233 454
233 454
233 454
233 454
233 454
233 454
233 454
233 454
233 454
233 454
233 454
233 454
Nombre del dúplex
Nombre del oligo sentido Sec trans sentido SEC ID N°: Nombre del oligo antisentido Sec trans antisentido SEC ID N°: Empieza en NM 17493 6.3 Termina en NM 17493 6.3
233 454
233 454
233 454
233 454
Misma 233 Misma 454
233 454
233 454
233 454
233 454
233 454
233 454
233 454
233 454
233 454
233 454
233 454
233 454
233 454
233 454
233 454
233 454
233 454
233 454
233 454
233 454
233 454
233 454
233 454
233 454
Nombre del dúplex
Nombre del oligo sentido Sec trans sentido SEC ID N°: Nombre del oligo antisentido Sec trans antisentido SEC ID N°: Empieza en NM 17493 6.3 Termina en NM 17493 6.3
233 454
233 454
Misma 233 Misma 454
233 454
233 454
233 454
233 454
233 454
233 454
233 454
233 454
233 454
233 454
233 454
00
“vj
Nombre del dúplex
Nombre del oligo sentido Secuencia del oligo sentido SEC ID N°: Posición con respecto a NM_174936.3 Nombre del oligo antisentido Secuencia del oligo antisentido SEC ID N°:
AD-53649.1
A-110542.1 CfgAfgGfaCfgGfCfGfaCfuAf 455 461 A-109239.2 uCfcUfcGfuAfgUfcgcCfgUfc 1006
cGfaGfgAfL96 CfuCfgsUfsc
AD-53650.1
A-110550.1 Gf cCf g Gf g Gf a UfAf Cf cU fe Af 456 673 A-109255.2 u Cf u Uf g Gf u Gf a Gf g u a Uf cCfc 1007
cCfaAfgAfL96 CfgGfcsGfsg
AD-53651.1
A-110558.1 GfcCfcCfaUfgUfCfGfaCfuAf 457 773 A-109271.2 u Cf g Afu Gf u Af g Uf cga Cf a Ufg 1008
cAfuCfgAfL96 GfgGfcsAfsa
AD-53652.1
A-110566.1 CfcUfgGfuGfgAfGfGfuGfuAf 458 896 A-109287.2 a Gf gAf gAf uAfc Afee u CfcAf cC 1009
uCfuCfcUfL96 faGfgsCfsu
AD-53653.1
A-110574.1 UfcCfuAfgAfcAfCfCfaGfcAf 459 913 A-109303.2 uCfuGfuAfuGfcUfgguGfuCfu 1010
uAfcAfgAfL96 AfgGfasGfsa
AD-53654.1
A-110582.1 GfcAfgGfgUfcAfUfGfgUfcAf 460 955 A-109319.2 a Gf u Cf g Gf u Gf aCf ca u Gf a Cfc 1011
cCfgAfcUfL96 CfuGfcsCfsc
AD-53696.1
A-110589.1 CfcUfgCfgCfgUfGfCfuCfaAf 461 1109 A-109333.2 u Gfg Cf a Gf u Uf g Af gca Cf g Cfg 1012
cUfgCfcAfL96 CfaGfgsCfsu
AD-53697.1
A-110597.1 UfaGfgCfcUfgGfAfGfu Ufu Af 462 1159 A-109349.2 uCfcGfaAfuAfaAfcucCfaGfg 1013
uUfcGfgAfL96 CfcUfasUfsg
AD-53698.1
A-110605.1 GfgGfaCfgAfuGfCfCfuGfcCf 463 1318 A-109365.2 aGfuAfgAfgGfcAfggcAfuCfg 1014
uCfuAfcUfL96 UfcCfcsGfsg
AD-53699.1
A-110613.1 Gf cAf u Uf gCf a Gf Cf Cf a Uf g Af 464 1543 A-109381.2 aCfaGfcAfuCfaUfggcUfgCfa 1015
uGfcUfgUfL96 AfuGfcsCfsa
AD-53700.1
A-110621.1 GfgCfcUfgGf u Uf CfCfcUf gAf 465 1640 A-109397.2 u Gfg Uf cCf u Cf aGf gg a Af cCf a 1016
gGfaCfcAfL96 GfgCfcsUfsc
AD-53701.1
A-110629.1 CfgCfu Ufu UfgGfGfGfg UfgAf 466 1901 A-109413.2 aCfaCfcCfuCfaCfcccCfaAfaA 1017
gGfgUfgUfL96 fgCfgsUfsu
AD-48400.1
A-98247.2 U fu Ufu Cf u Af g Af cCf u Gf u Uf u 467 A-93455.4 a Af g Cf a Af a Afc Af g Gf u Cf u Afg 1018
UfgCfuUfL96 AfaAfasGfsu
AD-53656.1
A-110551.1 CfcGfgGfgAfuAfCfCfuCfaCf 468 674 A-109257.2 a UfcUfu Gfg Ufg Afggu Af u Cfc 1019
cAfaGfaUfL96 CfcGfgsCfsg
Nombre del dúplex
Nombre del oligo sentido Secuencia del oligo sentido SEC ID N°: Posición con respecto a NM_174936.3 Nombre del oligo antisentido Secuencia del oligo antisentido SEC ID N°:
AD-53657.1
A-110559.1 CfcAfuGfuCfgAfCfUfaCfaUf 469 776 A-109273.2 uCfcUfcGfaUfgUfaguCfgAfc 1020
cGfaGfgAfL96 AfuGfgsGfsg
AD-53658.1
A-110567.1 CfuGfgUfgGfaGfGfUfgUfaU 470 897 A-109289.2 uAfgGfaGfaUfaCfaccUfcCfa 1021
fcUfcCfuAfL96 CfcAfgsGfsc
AD-53659.1
A-110575.1 AfgAfcAfcCfaGfCfAfuAfcAfg 471 917 A-109305.2 uCfaCfuCfuGfuAfugcUfgGfu 1022
AfgUfgAfL96 GfuCfusAfsg
AD-53660.1
A-110583.1 CfaGfgGfuCfaUfGfGfuCfaC 472 956 A-109321.2 a Afg UfcGfg Ufg Af ccaUfg Af cC 1023
fcGfaCfuUfL96 fcUfgsCfsc
AD-53702.1
A-110590.1 Cfu GfcGfcGfuGfCfUfcAfaCf 473 1110 A-109335.2 u UfgGfcAfg Ufu Gf agcAfcGfc 1024
uGfcCfaAfL96 GfcAfgsGfsc
AD-53703.1
A-110598.1 Afg Gf cCf u Gf g Af Gf Uf u Uf a Uf 474 1160 A-109351.2 u Uf cCf g Af a Uf a Af a cu Cf cAf g 1025
uCfgGfaAfL96 GfcCfusAfsu
AD-53704.1
A-110606.1 Cfa AfcUfu UfgGfCfCfgCf u Gf 475 1421 A-109367.2 uCfcAfcAfcAfgCfggcCfaAfaG 1026
uGfuGfgAfL96 fuUfgsGfsu
AD-53705.1
A-110614.1 Gf u UfgAfgGfcAfGfAfgAf cUf 476 1592 A-109383.2 uGfgAfuCfaGfuCfucuGfcCfu 1027
gAfuCfcAfL96 CfaAfcsUfsc
AD-53706.1
A-110622.1 GfgUfaCfuGfaCfCfCfcCfaAf 477 1664 A-109399.2 aCfcAfgGfuUfgGfgggUfcAfg 1028
cCfuGfgUfL96 UfaCfcsCfsg
AD-53707.1
A-110630.1 Cfu Ufu UfgGfgGfGf UfgAfgGf 478 1903 A-109415.2 aGfaCfaCfcCfuCfaccCfcCfa 1029
gUfgUfcUfL96 AfaAfgsCfsg
AD-53661.1
A-110544.1 AfcCfgCfuGfcGfCfCfaAfgGf 479 556 A-109243.2 aCfgGfaUfcCfu UfggcGfcAfg 1030
aUfcCfgUfL96 CfgGfusGfsg
AD-53663.1
A-110560.1 UfcGfaCfuAfcAfUfCfgAfgGf 480 781 A-109275.2 a Gf u Cf c Uf cCf u Cf g a u Gf u Afg 1031
aGfgAfcUfL96 UfcGfasCfsa
AD-53664.1
A-110568.1 GfgUfgGfaGfgUfGfUfaUfcUf 481 899 A-109291.2 u Cfu Afg Gf aGf a Uf a caCf c Ufe 1032
cCfuAfgAfL96 CfaCfcsAfsg
AD-53665.1
A-110576.1 C fa Cf cAfg CfaUfAfCfaGfaGf 482 920 A-109307.2 uGfgUfcAfcUfcUfguaUfgCfu 1033
uGfaCfcAfL96 GfgUfgsUfsc
AD-53666.1
A-110584.1 Gf g Uf cAf u Gf g Uf Cf Af cCf g Af 483 959 A-109323.2 uCfgAfaGfuCfgGfugaCfcAfu 1034
cUfuCfgAfL96 GfaCfcsCfsu
Nombre del dúplex
Nombre del oligo sentido Secuencia del oligo sentido SEC ID N°: Posición con respecto a NM_174936.3 Nombre del oligo antisentido Secuencia del oligo antisentido SEC ID N°:
AD-53708.1
A-110591.1 CfgUfgCfuCfaAfCfUfgCfcAf 484 1115 A-109337.2 u UfcCfcUfuGfgCfagu UfgAfg 1035
aGfgGfaAfL96 CfaCfgsCfsg
AD-53709.1
A-110599.1 GfgCfcUfgGfaGf Uf Uf u Afu Uf 485 1161 A-109353.2 u UfuCfcGfaAfuAfaacUfcCfa 1036
cGfgAfaAfL96 GfgCfcsUfsa
AD-53710.1
A-110607.1 Ufu GfgCfcGfcUfGfUfgUfgGf 486 1426 A-109369.2 aGfaGfgUfcCfaCfacaGfcGfg 1037
aCfcUfcUfL96 CfcAfasAfsg
AD-53711.1
A-110615.1 UfgAfgGfcAfgAfGfAfcUfgAf 487 1594 A-109385.2 a Gf u Gfg Afu Cf a Gf u cu Cf u Gfc 1038
uCfcAfcUfL96 CfuCfasAfsc
AD-53712.1
A-110623.1 Gf u UfgGfcAfgCf Uf Gf u Ufu Uf 488 1717 A-109401.2 uCfcUfgCfaAfaAfcagCfuGfc 1039
gCfaGfgAfL96 CfaAfcsCfsu
AD-53713.1
A-110631.1 UfuUfuGfgGfgGfUfGfaGfgG 489 1904 A-109417.2 uAfgAfcAfcCfcUfcacCfcCfcAf 1040
fuGfuCfuAfL96 aAfasGfsc
AD-53667.1
A-110545.1 GfcUfgCfgCfcAfAfGfgAfuCf 490 559 A-109245.2 u Cf cAfcGf g Afu Cf c u u Gf g Cf g 1041
cGfuGfgAfL96 CfaGfcsGfsg
AD-53668.1
A-110553.1 Afu Af cCfu Cf a Cf CfAf a Gf a Uf 491 680 A-109261.2 uGfcAfgGfaUfcUfuggUfgAfg 1042
cCfuGfcAfL96 GfuAfusCfsc
AD-53669.1
A-110561.1 AfcUfaCfaUfcGfAfGfgAfgGf 492 784 A-109277.2 aGfgAfgUfcCfuCfcucGfaUfg 1043
aCfuCfcUfL96 UfaGfusCfsg
AD-53670.1
A-110569.1 UfgGfaGfgUfgUfAfUfcUfcCf 493 901 A-109293.2 u Gf u Cf u Af g Gf a Gf a u a Cf a Cfc 1044
uAfgAfcAfL96 UfcCfasCfsc
AD-53671.1
A-110577.1 UfaCfaGfaGfuGfAfCfcAfcCf 494 928 A-109309.2 u Uf u Cf cCf g Gf u Gf g u c Af c Ufe 1045
gGfgAfaAfL96 UfgUfasUfsg
AD-53672.1
A-110585.1 UfcAfuGfgUfcAfCfCfgAfcUf 495 961 A-109325.2 u Cf u Cf g Af a Gf u Cf g g u Gf a Cfc 1046
uCfgAfgAfL96 AfuGfasCfsc
AD-53714.1
A-110592.1 CfaCfcCfuCfaUfAfGfgCfcUf 496 1151 A-109339.2 aAfcUfcCfaGfgCfcu aUfgAfg 1047
gGfaGfuUfL96 GfgUfgsCfsc
AD-53715.1
A-110600.1 Gf cCf u Gf g Af g UfUfUfaUfuCf 497 1162 A-109355.2 u Uf u Uf cCf g Af a Uf a aa Cf u Cfc 1048
gGfaAfaAfL96 AfgGfcsCfsu
AD-53716.1
A-110608.1 U fg GfcCf gCf u Gf Uf Gf u Gfg Af 498 1427 A-109371.2 aAfgAfgGfuCfcAfcacAfgCfg 1049
cCfuCfuUfL96 GfcCfasAfsa
Nombre del dúplex
Nombre del oligo sentido Secuencia del oligo sentido SEC ID N°: Posición con respecto a NM_174936.3 Nombre del oligo antisentido Secuencia del oligo antisentido SEC ID N°:
AD-53717.1
A-110616.1 GfaGfgCfaGfaGfAfCfuGfaU 499 1595 A-109387.2 aAfgUfgGfaUfcAfgucUfcUfg 1050
fcCfaCfuUfL96 CfcUfcsAfsa
AD-53718.1
A-110624.1 U fg GfcAf gCf u GfUfUfuUfgCf 500 1719 A-109403.2 aGfuCfcUfgCfaAfaacAfgCfu 1051
aGfgAfcUfL96 GfcCfasAfsc
AD-53719.1
A-110632.1 Gfg Gfg UfgAfgGfGf Ufg UfcUf 501 1909 A-109419.2 uGfgCfgUfaGfaCfaccCfuCfa 1052
aCfgCfcAfL96 CfcCfcsCfsa
AD-53674.1
A-110554.1 CfaCfcAfaGfaUfCfCfuGfcAf 502 686 A-109263.2 a Af g AfcAf u Gf cAf gg a Uf c Uf u 1053
uGfuCfuUfL96 GfgUfgsAfsg
AD-53675.1
A-110562.1 UfaCfaUfcGfaGfGfAfgGfaCf 503 786 A-109279.2 aGfaGfgAfgUfcCfuccUfcGfa 1054
uCfcUfcUfL96 UfgUfasGfsu
AD-53676.1
A-110570.1 Afg Gf u Gf u Af u Cf Uf Cf c Ufa Gf 504 904 A-109295.2 u Gfg Ufg UfcUfaGf gag Af u Afc 1055
aCfaCfcAfL96 AfcCfusCfsc
AD-53677.1
A-110578.1 AfcAfg Afg UfgAf CfCfaCfcGf 505 929 A-109311.2 a Uf u Ufe CfcGf g Uf g g u Cf a Cfu 1056
gGfaAfaUfL96 CfuGfusAfsu
AD-53678.1
A-110586.1 Afg Gf a Cf g Gf g Af Cf Cf cGf c Uf 506 994 A-109327.2 u Gf u Gf g Af a Gf cGf gg u Cf cCfg 1057
uCfcAfcAfL96 UfcCfusCfsc
AD-53720.1
A-110593.1 AfcCfcUfcAf u AfGfGf cCf u Gf 507 1152 A-109341.2 a Af aCfu CfcAfgGfccu Af u Gfa 1058
gAfgUfuUfL96 GfgGfusGfsc
AD-53721.1
A-110601.1 GfgAfgUfuUfaUfUfCfgGfaAf 508 1166 A-109357.2 uGfgCf u Uf u UfcCfgaa Ufa Afa 1059
aAfgCfcAfL96 CfuCfcsAfsg
AD-53722.1
A-110609.1 GfgCfcGfcUfgUfGfUfgGfaCf 509 1428 A-109373.2 a Afa Gfa Gfg Uf cCf aca Cf a Gfc 1060
cUfcUfuUfL96 GfgCfcsAfsa
AD-53723.1
A-110617.1 GfgCfaGfaGfaCfUfGfaUfcCf 510 1597 A-109389.2 a Gfa Afg Uf g Gf a Uf cag Uf c Ufe 1061
aCfu UfcUf L96 UfgCfcsUfsc
AD-53724.1
A-110625.1 GfcAfgCfuGfuUfUfUfgCfaGf 511 1721 A-109405.2 aCfaGfuCfcUfgCfaaaAfcAfg 1062
gAfcUfgUfL96 CfuGfcsCfsa
AD-53725.1
A-110633.1 GfgGfuGfaGfgGfUfGfuCfuA 512 1910 A-109421.2 a Ufg GfcGfu Afg Afea cCfc Uf cA 1063
fcGfcCfaUfL96 fcCfcsCfsc
AD-53679.1
A-110547.1 Cfu AfcGfu Gfg Uf GfGf u GfcUf 513 593 A-109249.2 uCfcUfuCfaGfcAfccaCfcAfcG 1064
gAfaGfgAfL96 fuAfgsGfsu
Nombre del dúplex
Nombre del oligo sentido Secuencia del oligo sentido SEC ID N°: Posición con respecto a NM_174936.3 Nombre del oligo antisentido Secuencia del oligo antisentido SEC ID N°:
AD-53680.1
A-110555.1 CfaAfgAfuCfcUfGfCfaUfgUf 514 689 A-109265.2 u Gf g Af a Gf a Cf a Uf gca Gf g Afu 1065
cUfuCfcAfL96 CfuUfgsGfsu
AD-53681.1
A-110563.1 U fcGf a Gf g Af g GfAf Cf u Cf cUf 515 790 A-109281.2 a Gf a Cf a Gf a Gf g Af g u cCf u Cfc 1066
cUfgUfcUfL96 UfcGfasUfsg
AD-53682.1
A-110571.1 GfuAfuCfu Cf cUf Af Gf aCf a Cf 516 908 A-109297.2 a Uf g Cf u Gf g Uf g Uf cu a Gf g Afg 1067
cAfgCfaUfL96 AfuAfcsAfsc
AD-53683.1
A-110579.1 GfaGfuGfaCfcAfCfCfgGfgAf 517 932 A-109313.2 uCfgAfu UfuCfcCfgguGfgUfc 1068
aAfuCfgAfL96 AfcUfcsUfsg
AD-53684.1
A-110587.1 CfgGfgAfcCfcGfCf Uf u CfcAf 518 998 A-109329.2 uGfuCfuGfu Gf g Af ag cGf g Gfu 1069
cAfgAfcAfL96 CfcCfgsUfsc
AD-53726.1
A-110594.1 CfcCfuCfaUfaGfGfCfcUfgGf 519 1153 A-109343.2 u AfaAfcUfcCfaGfgccUfa UfgA 1070
aGfuUfuAfL96 fgGfgsUfsg
AD-53727.1
A-110602.1 GfuUfuAfuUfcGfGfAfaAfaGf 520 1169 A-109359.2 aGfcUfgGfcUfuUfuccGfaAfu 1071
cCfaGfcUfL96 AfaAfcsUfsc
AD-53728.1
A-110610.1 U fg Uf g Uf g Gf a Cf Cf Uf c Uf u Uf 521 1434 A-109375.2 uGfgGfgCfaAfaGfaggUfcCfa 1072
gCfcCfcAfL96 CfaCfasGfsc
AD-53729.1
A-110618.1 CfaGfaGfaCfuGfAfUfcCfaCf 522 1599 A-109391.2 a Gf a Gf a Af g Uf g Gf a u c Af g Ufe 1073
uUfcUfcUfL96 UfcUfgsCfsc
AD-53730.1
A-110626.1 UfcUfgCfcGfgGfCfCfcAfcAf 523 1885 A-109407.2 a Af gCfg Ufu Gfu GfggcCfcGfg 1074
aCfgCfuUfL96 CfaGfasCfsc
AD-53731.1
A-110634.1 Gf g Uf g Af g Gf g Uf Gf Uf c Uf aCf 524 1911 A-109423.2 a Afu Gf g Cfg Uf a Gf aca Cf cCfu 1075
gCfcAfuUfL96 CfaCfcsCfsc
AD-53685.1
A-110548.1 CfcCfgCfcGfgGfGfAfuAfcCf 525 670 A-109251.2 u Gfg UfgAfgGf u Af uccCfcGfg 1076
uCfaCfcAfL96 CfgGfgsCfsa
AD-53687.1
A-110564.1 Cfg Af g Gf a Gf g Af Cf Uf cCf u Cf 526 791 A-109283.2 aAfgAfcAfgAfgGfaguCfcUfcC 1077
uGfuCfuUfL96 fuCfgsAfsu
AD-53688.1
A-110572.1 UfaUfcUfcCfuAfGfAfcAfcCf 527 909 A-109299.2 uAfuGfcUfgGfuGfucuAfgGfa 1078
aGfcAfuAfL96 GfaUfasCfsa
AD-53689.1
A-110580.1 GfgAfaAfuCfgAfGfGfgCfaGf 528 944 A-109315.2 a UfgAfcCfcUfgCfccu Cfg Afu U 1079
gGfuCfaUfL96 fuCfcsCfsg
Nombre del dúplex
Nombre del oligo sentido Secuencia del oligo sentido SEC ID N°: Posición con respecto a NM_174936.3 Nombre del oligo antisentido Secuencia del oligo antisentido SEC ID N°:
AD-53690.1
A-110588.1 UfcCfaCfaGfaCfAfGfgCfcAf 529 1009 A-109331.2 a Cfu Ufg Cfu GfgCf cu g Ufe Ufg 1080
gCfaAfgUfL96 UfgGfasAfsg
AD-53732.1
A-110595.1 CfcUfcAfuAfgGfCfCfuGfgAf 530 1154 A-109345.2 aUfaAfaCfuCfcAfggcCfuAfu 1081
gUfuUfaUfL96 GfaGfgsGfsu
AD-53733.1
A-110603.1 GfgGfcUfgGfgGfUfCfgUfgCf 531 1279 A-109361.2 uGfaCfcAfgCfaCfgacCfcCfa 1082
uGfgUfcAfl_96 GfcCfcsUfsc
AD-53734.1
A-110611.1 GfgGfaGfgAfcAfUfCfaUfuGf 532 1456 A-109377.2 a Gfg Cf a Cf c Af a Uf g a u Gf u Cfc 1083
gUfgCfcUfL96 UfcCfcsCfsu
AD-53735.1
A-110619.1 AfcUfgAfuCfcAfCfUfuCfuCf 533 1604 A-109393.2 u UfgGfcAfgAfgAfagu Gfg Af u 1084
uGfcCfaAfL96 CfaGfusCfsu
AD-53736.1
A-110627.1 Cfu GfcCfgGfgCfCfCfaCfaAf 534 1886 A-109409.2 aAfaGfcGfuUfgUfgggCfcCfg 1085
cGfcUfuUfL96 GfcAfgsAfsc
AD-53737.1
A-110635.1 AfgGfgUfgUfcUfAfCfgCfcAf 535 1915 A-109425.2 u GfgCf a Afu Gf gCf g u a Gf a Cf a 1086
uUfgCfcAfL96 CfcCfusCfsa
AD-53691.1
A-110549.1 CfcGf cCf gGf g GfAfUfa Cf c Uf 536 671 A-109253.2 uUfgGfuGfaGfgUfaucCfcCfg 1087
cAfcCfaAfL96 GfcGfgsGfsc
AD-53692.1
A-110557.1 Gf u UfgCfcCfcAf UfGf u Cfg Af 537 770 A-109269.2 a Uf g Uf a Gf u Cfg Afea u Gfg Gfg 1088
cUfaCfaUfL96 CfaAfcsUfsu
AD-53693.1
A-110565.1 Gf u AfcCfgGfgCfGfGfa Ufg Af 538 857 A-109285.2 uGfgUfaUfuCfaUfccgCfcCfg 1089
aUfaCfcAfL96 GfuAfcsCfsg
AD-53694.1
A-110573.1 UfcUfcCfuAfgAfCfAfcCfaGf 539 911 A-109301.2 uGfuAfuGfcUfgGfuguCfuAfg 1090
cAfuAfcAfL96 GfaGfasUfsa
AD-53695.1
A-110581.1 Afa Uf cGf aGf g Gf Cf Af g Gfg Uf 540 947 A-109317.2 aCfcAfu Gf aCfcCf u gcCfcUfc 1091
cAfuGfgUfL96 GfaUfusUfsc
AD-53738.1
A-110596.1 CfuCfaUfaGfgCfCfUfgGfaGf 541 1155 A-109347.2 aAfuAfaAfcUfcCfaggCfcUfaU 1092
uUfuAfuUfL96 fgAfgsGfsg
AD-53739.1
A-110604.1 Gf g Uf cAf cCf g Cf Uf Gf cCf g Gf 542 1295 A-109363.2 aAfgUfu GfcCfgGfcagCfgGfu 1093
cAfaCfuUfL96 GfaCfcsAfsg
AD-53740.1
A-110612.1 AfcUfgCfaGfcAfCfCfuGfcUf 543 1483 A-109379.2 aCfaCfaAfaGfcAfgguGfcUfg 1094
uUfgUfgUfL96 CfaGfusCfsg
Nombre del dúplex
Nombre del oligo sentido Secuencia del oligo sentido SEC ID N°: Posición con respecto a NM_174936.3 Nombre del oligo antisentido Secuencia del oligo antisentido SEC ID N°:
AD-53741.1
A-110620.1 AfuCfcAfcUfuCfUfCfuGfcCf 544 1608 A-109395.2 aUfcUfu UfgGfcAfgagAfaGfu 1095
aAfaGfaUfL96 GfgAfusCfsa
AD-53742.1
A-110628.1 GfcCfcAfcAfaCfGfCfuUfuUf 545 1893 A-109411.2 a Cf cCfcCf a Af a Af g cg Uf u Gf u 1096
gGfgGfgUfL96 GfgGfcsCfsc
AD-53743.1
A-110636.1 GfuGfuCfuAfcGfCfCfaUfuGf 546 1918 A-109427.2 aCfcUfgGfcAfaUfggcGfuAfg 1097
cCfaGfgUfL96 AfcAfcsCfsc
AD-53744.1
A-110644.1 GfgAfaUfgCfaAfAfGfuCfaAf 547 2180 A-109443.2 uGfcUfcCfuUfgAfcuuUfgCfa 1098
gGfaGfcAfL96 UfuCfcsAfsg
AD-53745.1
A-110652.1 UfgAfuGfgCfcCfUfCfaUfcUf 548 2906 A-109459.2 a Gf c Uf g Gf a Gf a Uf gag Gf g Cfc 1099
cCfaGfcUfL96 AfuCfasGfsc
AD-53746.1
A-110660.1 CfuGfaAfgCfcAfAfGfcCfuCf 549 3300 A-109475.2 uAfaGfaAfgAfgGfcuuGfgCfu 1100
uUfcUfuAfL96 UfcAfgsAfsg
AD-53747.1
A-110668.1 AfcUfgUfcCfcUfCfCfuUfgAf 550 3511 A-109491.2 uGfgUfgCfuCfaAfggaGfgGfa 1101
gCfaCfcAfL96 CfaGfusUfeg
AD-53748.1
A-110676.1 CfaAfgCfaAfgCfAfGfaCfaUf 551 3540 A-109507.2 a Gf a Uf a Af a Uf g Uf cu g Cf u Ufg 1102
uUfaUfcUfL96 CfuUfgsGfsg
AD-53790.1
A-110683.1 Ufa UfcUfu Uf u Gf GfGf u Cfu Gf 552 3556 A-109521.2 aGfaGfgAfcAfgAfcccAfaAfaG 1103
uCfcUfcUfL96 faUfasAfsa
AD-53791.1
A-110691.1 UfgUfcCfuCfuCfUfGfuUfgCf 553 3569 A-109537.2 aAfaAfaGfgCfaAfcagAfgAfg 1104
cUfuUfuUfL96 GfaCfasGfsa
AD-53792.1
A-110699.1 UfuGfuAfaCfuUfGfAfaGfaUf 554 3620 A-109553.2 aUfaAfaUfaUfcUfucaAfgUfu 1105
aUfuUfaUfL96 AfcAfasAfsa
AD-53793.1
A-110707.1 CfuUfuAfcUfcUfGfCfuCfuAf 555 3055 A-109569.2 u UfgGfcAfu AfgAfgcaGfaGfu 1106
uGfcCfaAfL96 AfaAfgsGfsu
AD-53794.1
A-110715.1 AfgGfgGfaAfcAfCfAfgAfcCf 556 3370 A-109585.2 u Uf u Cfc Ufg Gf u Cf u g u Gf u Ufe 1107
aGfgAfaAfL96 CfcCfusUfsc
AD-53795.1
A-110723.1 UfuGfgGfuCfuGfUfCfcUfcUf 557 3562 A-109601.2 aAfaCfaGfaGfaGfgacAfgAfc 1108
cUfgUfuUfL96 CfcAfasAfsa
AD-53749.1
A-110637.1 UfgCfaGfcGfu CfCfAfcAfcAf 558 1962 A-109429.2 u Gfg AfgCf u Gf u Gf ugg AfcGfc 1109
gCfuCfcAfL96 UfgCfasGfsu
Nombre del dúplex
Nombre del oligo sentido Secuencia del oligo sentido SEC ID N°: Posición con respecto a NM_174936.3 Nombre del oligo antisentido Secuencia del oligo antisentido SEC ID N°:
AD-53750.1
A-110645.1 AfaUfcCfcGfgCfCfCfcUfcAf 559 2204 A-109445.2 u GfcUfcCf u Gf aGfgggCfcGfg 1110
gGfaGfcAfL96 GfaUfusCfsc
AD-53751.1
A-110653.1 Ufu UfcUfgGfa UfGfGf cAf u Cf 560 2974 A-109461.2 u Gf g Cf u Af g Af u Gf cea Uf cCf a 1111
uAfgCfcAfL96 GfaAfasGfsc
AD-53752.1
A-110661.1 GfaAfgCfcAfaGfCfCf uCfu Uf 561 3302 A-109477.2 aGfuAfaGfaAfgAfggcUfuGfg 1112
cUfuAfcUfL96 CfuUfcsAfsg
AD-53753.1
A-110669.1 CfcAfgCfcCfcAfCfCfcAfaGfc 562 3529 A-109493.2 u Gf c Ufu Gf c Ufu Gf gg u Gf g Gfg 1113
AfaGfcAfL96 CfuGfgsUfsg
AD-53754.1
A-110677.1 AfaGfcAfaGfcAfGfAfcAfuUf 563 3541 A-109509.2 a Af g Afu Af a Afu GfucuGfcUfu 1114
uAfuCfuUfL96 GfcUfusGfsg
AD-53796.1
A-110684.1 UfcUfuUfuGfgGfUfCfuGfuCf 564 3558 A-109523.2 a Gf a Gf a Gf g Af cAf ga cCf cAf a 1115
cUfcUfcUfL96 AfaGfasUfsa
AD-53797.1
A-110692.1 GfuCfcUfcUfcUfGfUfuGfcCf 565 3570 A-109539.2 uAfaAfaAfgGfcAfacaGfaGfa 1116
uUfuUfuAfL96 GfgAfcsAfsg
AD-53798.1
A-110700.1 UfgUfaAfcUfuGfAfAfgAfuAf 566 3621 A-109555.2 a Af u AfaAf u Afu Cf u ucAfaGf u 1117
uUfuAfuUfL96 UfaCfasAfsa
AD-53799.1
A-110708.1 U fu Uf a Cf u Cf u Gf Cf Uf c Uf a Uf 567 3056 A-109571.2 u Cf u GfgCfa Uf aGfagcAfg Afg 1118
gCfcAfgAfL96 UfaAfasGfsg
AD-53800.1
A-110716.1 CfcAfaGfcAfaGfCfAfgAfcAf 568 3539 A-109587.2 a Afu AfaAf u Gf u Cf u gcUf u Gfc 1119
uUfuAfuUfL96 UfuGfgsGfsu
AD-53801.1
A-110724.1 UfgGfgUfcUfgUfCfCfuCfuCf 569 3563 A-109603.2 uCfaAfcAfgAfgAfggaCfaGfa 1120
uGfuUfgAfL96 CfcCfasAfsa
AD-53755.1
A-110638.1 GfcAfuGfgGfgAfCfCfcGfuGf 570 1996 A-109431.2 aGfuGfgAfcAfcGfgguCfcCfc 1121
uCfcAfcUfL96 AfuGfcsUfsg
AD-53757.1
A-110654.1 UfcUfgGfa UfgGfCfAfuCfuAf 571 2976 A-109463.2 u Cf u GfgCf u Afg Af ugcCfa Ufe 1122
gCfcAfgAfL96 CfaGfasAfsa
AD-53758.1
A-110662.1 AfaGfcCfaAfgCfCf UfcUf u Cf 572 3303 A-109479.2 aAfgUfaAfgAfaGfaggCfu Ufg 1123
uUfaCfuUfL96 GfcUfusCfsa
AD-53759.1
A-110670.1 CfcCfcAfcCfcAfAfGfcAfaGfc 573 3533 A-109495.2 uGfuCfuGfcUfuGfcuuGfgGfu 1124
AfgAfcAfL96 GfgGfgsCfsu
Nombre del dúplex
Nombre del oligo sentido Secuencia del oligo sentido SEC ID N°: Posición con respecto a NM_174936.3 Nombre del oligo antisentido Secuencia del oligo antisentido SEC ID N°:
AD-53760.1
A-110678.1 AfgCfa AfgCfaGfAfCfa Uf u Uf 574 3542 A-109511.2 aAfaGfaUfaAfaUfgucUfgCfu 1125
aUfcUfuUfL96 UfgCfusUfsg
AD-53802.1
A-110685.1 UfuUfuGfgGfuCfUfGfuCfcUf 575 3560 A-109525.2 aCfaGfaGfaGfgAfcagAfcCfc 1126
cUfcUfgUfL96 AfaAfasGfsa
AD-53803.1
A-110693.1 Ufu UfcUfaGfaCfCfUfgUfu Uf 576 3600 A-109541.2 aAfaGfcAfaAfaCfaggUfcUfa 1127
uGfcUfuUfL96 GfaAfasAfsg
AD-53804.1
A-110701.1 AfcCfaAfgGfaGfGfCfaGfgAf 577 2815 A-109557.2 aAfaGfaAfuCfcUfgccUfcCfu 1128
uUfcUfuUfL96 UfgGfusGfsg
AD-53805.1
A-110709.1 UfcAfgCfcAfaCfCfCfgCfuCf 578 3161 A-109573.2 u Uf a Gf u Gf g Af g Cf g gg Ufu Gfg 1129
cAfcUfaAfL96 CfuGfasGfsa
AD-53806.1
A-110717.1 CfaAfgCfaGfaCf Af Uf u Ufa Uf 579 3544 A-109589.2 a Af a Af aGf a Uf a Af a u g Uf c Uf g 1130
cUfuUfuUfL96 CfuUfgsCfsu
AD-53807.1
A-110725.1 GfgGfuCfuGfuCfCfUfcUfcUf 580 3564 A-109605.2 uGfcAfaCfaGfaGfaggAfcAfg 1131
gUfuGfcAfL96 AfcCfcsAfsa
AD-53761.1
A-110639.1 CfcCfaCfaAfgCfCfGfcCf u Gf 581 2080 A-109433.2 u Cf aGfcAfcAfgGfcggCf u Ufg 1132
uGfcUfgAfL96 UfgGfgsUfsg
AD-53762.1
A-110647.1 GfcUfgGfgGfcUfGfAfgCfu Uf 582 2481 A-109449.2 aUfuUfuAfaAfgCfucaGfcCfc 1133
uAfaAfaUfL96 CfaGfcsCfsc
AD-53763.1
A-110655.1 GfcUfcUfaUfgCfCfAfgGfcUf 583 3064 A-109465.2 uAfgCfaCfaGfcCfuggCfaUfa 1134
gUfgCfuAfL96 GfaGfcsAfsg
AD-53764.1
A-110663.1 GfuGfaGfgCfuGfGfGfaAfgG 584 3358 A-109481.2 u Gf u UfcCfcCfu UfcccAfgCfcU 1135
fgGfaAfcAfL96 fcAfcsUfsg
AD-53765.1
A-110671.1 CfcCfaCfcCfaAfGfCfaAfgCf 585 3534 A-109497.2 a Uf gUfc UfgCf u Ufgcu Uf gGfg 1136
aGfaCfaUfL96 UfgGfgsGfsc
AD-53766.1
A-110679.1 GfcAfgAfcAfu UfUfAf uCfu Uf 586 3547 A-109513.2 a Cf cCf a Af a Afg Af u a a Af u Gf u 1137
uUfgGfgUfL96 CfuGfcsUfsu
AD-53808.1
A-110686.1 U fu Uf g Gf g Uf c Uf Gf Uf cCf u Cf 587 3561 A-109527.2 aAfcAfgAfgAfgGfacaGfaCfc 1138
uCfuGfuUfL96 CfaAfasAfsg
AD-53809.1
A-110694.1 UfuCfuAfgAfcCfUfGfuUfuUf 588 3601 A-109543.2 aAfaAfgCfaAfaAfcagGfuCfu 1139
gCfuUfuUfL96 AfgAfasAfsa
Nombre del dúplex
Nombre del oligo sentido Secuencia del oligo sentido SEC ID N°: Posición con respecto a NM_174936.3 Nombre del oligo antisentido Secuencia del oligo antisentido SEC ID N°:
AD-53810.1
A-110702.1 GfgAfgGfcAfgGfAfUf uCfu Uf 589 2820 A-109559.2 a Afu Gf g Gf a Af g Af a u cCf u Gfc 1140
cCfcAfuUfL96 CfuCfcsUfsu
AD-53811.1
A-110710.1 CfcUfgCfcAfaGfCfUfcAfcAfc 590 3247 A-109575.2 uUfgCfuGfuGfuGfagcUfuGfg 1141
AfgCfaAfL96 CfaGfgsCfsa
AD-53812.1
A-110718.1 AfaGfcAfgAfcAfUfUfuAfuCf 591 3545 A-109591.2 u Cf a Af a Af g Afu Af a a u Gf u Cf u 1142
uUfuUfgAfL96 GfcUfusGfsc
AD-53813.1
A-110726.1 UfcUfaGfaCfcUfGfUfuUfuGf 592 3602 A-109607.2 aAfaAfaGfcAfa AfacaGfg Ufe 1143
cUfuUfuUfL96 UfaGfasAfsa
AD-53767.1
A-110640.1 GfaGfgCfcAfcGfAfGfg UfcAf 593 2099 A-109435.2 u Uf g Gf g Cf u Gf a Cf cu cGf u Gfg 1144
gCfcCfaAfL96 CfcUfcsAfsg
AD-53768.1
A-110648.1 Gf g Af g Gf u Gf cCfAf Gf g Af a Gf 594 2650 A-109451.2 aGfgGfaGfcUfuCfcugGfcAfc 1145
cUfcCfcUfL96 CfuCfcsAfsc
AD-53769.1
A-110656.1 CfuCfaGfcCfaAfCfCfcGfcUf 595 3160 A-109467.2 uAfgUfgGfaGfcGfgguUfgGfc 1146
cCfaCfuAfL96 UfgAfgsAfsc
AD-53770.1
A-110664.1 GfgCfuGfgGfaAfGfGfgGfaA 596 3362 A-109483.2 u Cf u Gf u Gf u Uf cCfccu UfcCfc 1147
fcAfcAfgAfL96 AfgCfcsUfsc
AD-53771.1
A-110672.1 CfcAfcCfcAfaGfCfAfaGfcAf 597 3535 A-109499.2 a Afu Gf u Cf u Gf cUf ugcUf u Gfg 1148
gAfcAfuUfL96 GfuGfgsGfsg
AD-53772.1
A-110680.1 AfgAfcAfu Uf u Af UfCf u Uf u Uf 598 3549 A-109515.2 a Gf a Cf cCf a Af a Af ga u Af a Af u 1149
gGfgUfcUfL96 GfuCfusGfsc
AD-53814.1
A-110687.1 GfgUfcUfgUfcCfUfCfuCfuGf 599 3565 A-109529.2 aGfgCfaAfcAfgAfgagGfaCfa 1150
uUfgCfcUfL96 GfaCfcsCfsa
AD-53815.1
A-110695.1 Cf u AfgAf cCf u Gf Uf Uf u UfgCf 600 3603 A-109545.2 aCfaAfaAfgCfaAfaacAfgGfu 1151
uUfuUfgUfL96 CfuAfgsAfsa
AD-53816.1
A-110703.1 GfaGfgCfaGfgAfUfUfcUfuCf 601 2821 A-109561.2 u Cf a Uf g Gf g Af a Gf aa u Cf c Ufg 1152
cCfaUfgAfL96 CfcUfcsCfsu
AD-53817.1
A-110711.1 CfcAfaGfcUfcAfCfAfcAfgCfa 602 3251 A-109577.2 uUfuCfcUfgCfuGfuguGfaGfc 1153
GfgAfaAfL96 UfuGfgsCfsa
AD-53818.1
A-110719.1 Afg Cf a Gf a Cf a UfUfUfaUfcUf 603 3546 A-109593.2 u Cf c Af a Af a Gf a Uf a aa Uf g Ufe 1154
uUfuGfgAfL96 UfgCfusUfsg
Nombre del dúplex
Nombre del oligo sentido Secuencia del oligo sentido SEC ID N°: Posición con respecto a NM_174936.3 Nombre del oligo antisentido Secuencia del oligo antisentido SEC ID N°:
AD-53819.1
A-110727.1 Gf u Af aCf u Uf g AfAf Gf a Uf a Uf 604 3622 A-109609.2 aAfaUfaAfaUfaUfcuuCfaAfg 1155
uUfaUfuUfL96 UfuAfcsAfsa
AD-53773.1
A-110641.1 CfaCfgAfgGfuCfAfGfcCfcAf 605 2104 A-109437.2 aCf u Gfg Ufu Gf gGfcug AfcCfu 1156
aCfcAfgUfL96 CfgUfgsGfsc
AD-53774.1
A-110649.1 Afc Uf g Ufg Gf g Gf CfAf u Uf u Cf 606 2676 A-109453.2 a Afu Gf g Uf g Af a Af u g cCf cCf a 1157
aCfcAfuUfL96 CfaGfusGfsa
AD-53776.1
A-110665.1 GfaAfgGfgGfaAfCfAfcAfgAf 607 3368 A-109485.2 u CfcUfg Gfu Cfu Gf u gu UfcCfc 1158
cCfaGfgAfL96 CfuUfcsCfsc
AD-53777.1
A-110673.1 Cf aCf cCf a Af g Cf Af Af g Cf a Gf 608 3536 A-109501.2 aAfaUfgUfcUfgCfuugCfuUfg 1159
aCfaUfuUfL96 GfgUfgsGfsg
AD-53778.1
A-110681.1 AfcAfu Ufu AfuCfUfUfu UfgGf 609 3551 A-109517.2 aCfaGfaCfcCfaAfaagAfuAfa 1160
gUfcUfgUfL96 AfuGfusCfsu
AD-53820.1
A-110688.1 GfuCfuGfuCfcUfCfUfcUfgUf 610 3566 A-109531.2 aAfgGfcAfaCfaGfagaGfgAfc 1161
uGfcCfuUfL96 AfgAfcsCfsc
AD-53821.1
A-110696.1 UfaGfaCfcUfgUfUfUfuGfcUf 611 3604 A-109547.2 uAfcAfaAfaGfcAfaaaCfaGfg 1162
uUfuGfuAfL96 UfcUfasGfsa
AD-53822.1
A-110704.1 Cfu Uf u Cf u Gf g Af Uf Gf g Cf a Uf 612 2973 A-109563.2 uGfcUfaGfaUfgCfcauCfcAfg 1163
cUfaGfcAfL96 AfaAfgsCfsu
AD-53823.1
A-110712.1 AfaGfcUfcAfcAfCfAfgCfaGf 613 3253 A-109579.2 a Af g Ufu Cfc Ufg Cf u g u Gf u Gf a 1164
gAfaCfuUfL96 GfcUfusGfsg
AD-53824.1
A-110720.1 GfaCfaUf u UfaUf Cf Uf u Ufu Gf 614 3550 A-109595.2 aAfgAfcCfcAfaAfagaUfaAfaU 1165
gGfuCfuUfL96 fgUfcsUfsg
AD-48400.4
A-98247.3 U fu Ufu Cf u Af g Af cCf u Gf u Uf u 615 A-93455.5 a Af g Cf a Af a Afc Af g Gfu Cf u Afg 1166
UfgCfuUfL96 AfaAfasGfsu
AD-53779.1
A-110642.1 GfgGfaGfgCfcAfGfCfa UfcCf 616 2137 A-109439.2 aAfgCfgUfgGfaUfgcuGfgCfc 1167
aCfgCfuUfL96 UfcCfcsUfsg
AD-53780.1
A-110650.1 Cf cAf cCf a Af g Gf Af Gf gCf a Gf 617 2813 A-109455.2 aGfaAfuCfcUfgCfcucCfuUfg 1168
gAfuUfcUfL96 GfuGfgsAfsg
AD-53781.1
A-110658.1 Gf cCf a Af gCf u Cf Af Cf a Cf a Gf 618 3250 A-109471.2 u UfcCfu GfcUfgUfgugAfgCfu 1169
cAfgGfaAfL96 UfgGfcsAfsg
Nombre del dúplex
Nombre del oligo sentido Secuencia del oligo sentido SEC ID N°: Posición con respecto a NM_174936.3 Nombre del oligo antisentido Secuencia del oligo antisentido SEC ID N°:
AD-53782.1
A-110666.1 AfaGfgGfgAfaCfAfCfaGfaCf 619 3369 A-109487.2 uUfcCfuGfgUfcUfgugUfuCfc 1170
cAfgGfaAfL96 CfcUfusCfsc
AD-53783.1
A-110674.1 AfcCfcAfaGfcAfAfGfcAfgAfc 620 3537 A-109503.2 u Af a Afu Gf u Cf u Gfc u u Gfc Ufu 1171
AfuUfuAfL96 GfgGfusGfsg
AD-53784.1
A-110682.1 UfuUfaUfcUfuUfUfGfgGfuCf 621 3554 A-109519.2 aGfgAfcAfgAfcCfcaaAfaGfa 1172
uGfuCfcUfL96 UfaAfasUfsg
AD-53825.1
A-110689.1 UfcUfgUfcCfuCfUfCfuGfuUf 622 3567 A-109533.2 aAfaGfgCfaAfcAfgagAfgGfa 1173
gCfcUfuUfL96 CfaGfasCfsc
AD-53826.1
A-110697.1 UfuUfuGfuAfaCfUfUfgAfaGf 623 3618 A-109549.2 aAfaUfaUfcUfuCfaagUfuAfc 1174
aUfaUfuUfL96 AfaAfasGfsc
AD-53827.1
A-110705.1 U fu Cf u Gf g Af u Gf Gf Cf a Ufe Uf 624 2975 A-109565.2 u Uf g Gfc Ufa Gf a Uf gee Af u Cfc 1175
aGfcCfaAfL96 AfgAfasAfsg
AD-53828.1
A-110713.1 UfgAfaGfcCfaAfGfCfcUfcUf 625 3301 A-109581.2 uUfaAfgAfaGfaGfgcuUfgGfc 1176
uCfuUfaAfL96 UfuCfasGfsa
AD-53829.1
A-110721.1 UfuAfuCfuUfuUfGfGfgUfcUf 626 3555 A-109597.2 aAfgGfaCfaGfaCfccaAfaAfg 1177
gUfcCfuUfL96 AfuAfasAfsu
AD-53830.1
A-110872.1 Ufu Uf u Cf u AfgAfCfCf u Gf u Uf 627 A-110873.1 aAfgCfaAfaAfcAfgguCfuAfgA 1178
uUfgCfuUfL96 faAfasGfsu
AD-53785.1
A-110643.1 Afu CfcAfcGfcUf UfCfcUf gCf 628 2148 A-109441.2 aUfgGfcAfgCfaGfgaaGfcGfu 1179
uGfcCfaUfL96 GfgAfusGfsc
AD-53786.1
A-110651.1 CfaCfcAfaGfgAfGfGfcAfgGf 629 2814 A-109457.2 a Af g Af a Uf cCf u Gf ccu Cfc Ufu 1180
aUfuCfuUfL96 GfgUfgsGfsa
AD-53787.1
A-110659.1 Cf a Af gCf u Cf a Cf Af Cf a Gfc Af 630 3252 A-109473.2 a Gf u Uf cCf u Gf cUf g u g Uf g Afg 1181
gGfaAfcUfL96 CfuUfgsGfsc
AD-53788.1
A-110667.1 GfgGfaAfcAfcAfGfAfcCfaGf 631 3372 A-109489.2 aGfcUfuCfcUfgGfucuGfuGfu 1182
gAfaGfcUfL96 UfcCfcsCfsu
AD-53789.1
A-110675.1 CfcCf a Afg Cf a Af Gf Cf a Gf a Cf 632 3538 A-109505.2 aUfaAfaUfgUfcUfgcuUfgCfu 1183
aUfuUfaUfL96 UfgGfgsUfsg
AD-53831.1
A-110690.1 CfuGfuCfcUfcUfCfUfgUfuGf 633 3568 A-109535.2 a Af a Afg GfcAf a Cf a gaGf a Gfg 1184
cCfuUfuUfL96 AfcAfgsAfsc
100
Nombre del dúplex
Nombre del oligo sentido Secuencia del oligo sentido SEC ID N°: Posición con respecto a NM_174936.3 Nombre del oligo antisentido Secuencia del oligo antisentido SEC ID N°:
AD-53832.1
A-110698.1 UfuUfgUfaAfcUfUfGfaAfgAf 634 3619 A-109551.2 u Af aAfu Af u Cfu UfcaaGf u Ufa 1185
uAfuUfuAfL96 CfaAfasAfsg
AD-53833.1
A-110706.1 Cfu GfgAfuGfgCfAfUfcUfaGf 635 2977 A-109567.2 uUfcUfgGfcUfaGfaugCfcAfu 1186
cCfaGfaAfL96 CfcAfgsAfsa
AD-53834.1
A-110714.1 AfgUfgAfgGfcUfGfGfgAfaGf 636 3357 A-109583.2 u UfuCfcCfcUfuCfccaGfcCfu 1187
gGfgAfaAfL96 CfaCfusGfsu
AD-53835.1
A-110722.1 AfuCfuUfuUfgGfGfUfcUfgUf 637 3557 A-109599.2 aAfgAfgGfaCfaGfaccCfaAfa 1188
cCfuCfuUfL96 AfgAfusAfsa
AD-48399.1
A-100981.1 Cfa Cf u Uf a Cf g Cfu Gf a Gf u Afc 638 A-100982.1 uCfgAfaGfuAfcUfcAfgCfgUfa 1189
UfuCfgAfL96 AfgUfgsAfsu
AD-53815.5
A-110695.11 Cf u AfgAf cCf u Gf Uf Uf u UfgCf 639 3603 A-109545.18 aCfaAfaAfgCfaAfaacAfgGfu 1190
uUfuUfgUfL96 CfuAfgsAfsa
AD-53815.4
A-110695.4 Cf u AfgAf cCfu Gf Uf Uf u UfgCf 640 3603 A-109545.5 aCfaAfaAfgCfaAfaacAfgGfu 1191
uUfuUfgUfL96 CfuAfgsAfsa
AD-56633.1
A-115520.2 cu AfgAfcCfu GfUfUfu UfgCfu 641 3603 A-109545.6 aCfaAfaAfgCfaAfaacAfgGfu 1192
UfuUfgUfL96 CfuAfgsAfsa
AD-56617.1
A-115535.1 CfuagAfcCfuGfUfUfuUfgCfu 642 3603 A-109545.7 aCfaAfaAfgCfaAfaacAfgGfu 1193
UfuUfgUfL96 CfuAfgsAfsa
AD-56623.1
A-115536.1 CfuagAfcCfuGfUfUfuUfgcu 643 3603 A-109545.8 aCfaAfaAfgCfaAfaacAfgGfu 1194
UfuUfguL96 CfuAfgsAfsa
AD-56629.1
A-115537.1 Cfu agAfccuGfUfUfu Ufgcu Uf 644 3603 A-109545.9 aCfaAfaAfgCfaAfaacAfgGfu 1195
uUfguL96 CfuAfgsAfsa
AD-56635.1
A-115538.1 Cfu agAfccuGfUfUfu ugcu Uf 645 3603 A-109545.10 aCfaAfaAfgCfaAfaacAfgGfu 1196
uuguL96 CfuAfgsAfsa
AD-56641.1
A-115539.1 CfuagaccuGfUfUfuugcuuuu 646 3603 A-109545.11 aCfaAfaAfgCfaAfaacAfgGfu 1197
guL96 CfuAfgsAfsa
AD-56625.1
A-115542.1 Cfu Af GfAfcCfu GfUfUfu UfgC 647 3603 A-109545.12 aCfaAfaAfgCfaAfaacAfgGfu 1198
fuUfuUfgUfL96 CfuAfgsAfsa
AD-56631.1
A-115543.1 CfuAfGfAfcCfuGfUfUfuUfGf 648 3603 A-109545.13 aCfaAfaAfgCfaAfaacAfgGfu 1199
CfuUfuUfgUfL96 CfuAfgsAfsa
Nombre del dúplex
Nombre del oligo sentido Secuencia del oligo sentido SEC ID N°: Posición con respecto a NM_174936.3 Nombre del oligo antisentido Secuencia del oligo antisentido SEC ID N°:
AD-56637.1
A-115544.1 CfuAfGfAfcCfuGfUfUfuUfGf 649 3603 A-109545.14 aCfaAfaAfgCfaAfaacAfgGfu 1200
CfuUfUfUfgUfL96 CfuAfgsAfsa
AD-56643.1
A-115545.1 Cfu AfGfAfCfCfuGfUfUfu UfG 650 3603 A-109545.15 aCfaAfaAfgCfaAfaacAfgGfu 1201
fCf u Uf Uf UfGf Uf L96 CfuAfgsAfsa
AD-56649.1
A-115546.1 Cf UfAfGfAfCfCf u Gf Uf Uf u Uf 651 3603 A-109545.16 aCfaAfaAfgCfaAfaacAfgGfu 1202
GfCfUfUfUfUfGfUfL96 CfuAfgsAfsa
AD-56655.1
A-115547.1 CfUfAfGfAfCfCfUfGfUfUfUf 652 3603 A-109545.17 aCfaAfaAfgCfaAfaacAfgGfu 1203
UfGfCfUfUfUfUfGfUfL96 CfuAfgsAfsa
AD-56615.1
A-110695.5 Cf u AfgAf cCf u Gf Uf Uf u UfgCf 653 3603 A-115519.1 acaAfaAfgcaAfaacAfgGfuCfu 1204
uUfuUfgUfL96 AfgsAfsa
AD-56621.1
A-115520.1 cu AfgAfcCfu GfUfUfu UfgCfu 654 3603 A-115519.2 acaAfaAfgcaAfaacAfgGfuCfu 1205
UfuUfgUfL96 AfgsAfsa
AD-56627.1
A-115521.1 c u AfgAf cCfu GfU f U fu u gCf u 655 3603 A-115519.3 a caAf a Af g ca Af a ac Afg Gf u Cf u 1206
UfuugUfL96 AfgsAfsa
AD-56639.1
A-115520.3 cu AfgAfcCfu GfUfUfu UfgCfu 656 3603 A-115522.1 ACfaAfaAfgCfaAfaacAfgGfu 1207
UfuUfgUfL96 CfuAfgsAfsa
AD-56645.1
A-110695.6 Cf u AfgAf cCfu GfUfUfu UfgCf 657 3603 A-115522.2 ACfaAfaAfgCfaAfaacAfgGfu 1208
uUfuUfgUfL96 CfuAfgsAfsa
AD-56651.1
A-115523.1 (¡C)uAfgAfcCfuGfUfUfu Ufg 658 3603 A-115524.1 (i A) Cf a Af a Af gCf a Af aa cAfg Gf 1209
CfuUfuUfgUfL96 uCfuAfgsAfs(iA)
AD-56610.1
A-115523.2 (¡C)uAfgAfcCfuGfUfUfu Ufg 659 3603 A-115525.1 aCfaAfaAfgCfaAfaacAfgGfu 1210
CfuUfuUfgUfL96 CfuAfgsAfs(iA)
AD-56616.1
A-115523.3 (¡C)uAfgAfcCfuGfUfUfu Ufg 660 3603 A-115526.1 acaAfaAfgcaAfaacAfgGfuCfu 1211
CfuUfuUfgUfL96 AfgsAfs(iA)
AD-56622.1
A-115527.1 (¡C)uAfgAfcCfuGfUfUfu Ufg 661 3603 A-115526.2 acaAfaAfgcaAfaacAfgGfuCfu 1212
CfuUfuugUfL96 AfgsAfs(iA)
AD-56628.1
A-115527.2 (¡C)uAfgAfcCfuGfUfUfu Ufg 662 3603 A-115528.1 (iA)caAfaAfgcaAfaacAfgGfu 1213
CfuUfuugUfL96 CfuAfgsAfs(iA)
AD-56634.1
A-115529.1 CbuAfgAfcCfuGfUfUfu UfgCf 663 3603 A-115530.1 AbCf a Af a Af g Cf a Af aa cAf g Gf 1214
uUfuUfgUfL96 uCfuAfgsAfsAb
102
Nombre del dúplex
Nombre del oligo sentido Secuencia del oligo sentido SEC ID N°: Posición con respecto a NM_174936.3 Nombre del oligo antisentido Secuencia del oligo antisentido SEC ID N°:
AD-56640.1
A-115529.2 CbuAfgAfcCfuGfUfUfuUfgCf uUfuUfgUfL96 664 3603 A-115531.1 aCfaAfaAfgCfaAfaacAfgGfu CfuAfgsAfsAb 1215
AD-56646.1
A-115529.3 CbuAfgAfcCfuGfUfUfuUfgCf uUfuUfgUfL96 665 3603 A-115532.1 acaAfaAfgcaAfaacAfgGfuCfu AfgsAfsAb 1216
AD-56652.1
A-115533.1 CbuAfgAfcCfuGfUfUfuUfgCf uUfuugUfL96 666 3603 A-115532.2 acaAfaAfgcaAfaacAfgGfuCfu AfgsAfsAb 1217
AD-56611.1
A-115533.2 CbuAfgAfcCfuGfUfUfuUfgCf uUfuugUfL96 667 3603 A-115534.1 (iA)caAfaAfgcaAfaacAfgGfu CfuAfgsAfsAb 1218
AD-56647.1
A-110695.7 Cfu AfgAfcCfuGfUfUfu UfgCf uUfuUfgUfL96 668 3603 A-115540.1 a Cf a aa Afg Cf a Af aa cAf g Gfu Cf uAfgsasa 1219
AD-56653.1
A-115535.2 CfuagAfcCfuGfUfUfuUfgCfu UfuUfgUfL96 669 3603 A-115540.2 a Cf a aa Afg Cf a Af aa cAf g Gfu Cf uAfgsasa 1220
AD-56612.1
A-115536.2 CfuagAfcCfuGfUfUfuUfgcu UfuUfguL96 670 3603 A-115540.3 a Cf a aa Afg Cf a Af aa cAf g Gfu Cf uAfgsasa 1221
AD-56618.1
A-115537.2 Cfu agAfccuGfUfUfu Ufgcu Uf uUfguL96 671 3603 A-115540.4 a Cf a aa Afg Cf a Af aa cAf g Gfu Cf uAfgsasa 1222
AD-56624.1
A-115538.2 CfuagAfccuGfUfUfuugcuUf uuguL96 672 3603 A-115540.5 a Cf a aa Afg Cf a Af aa cAf g Gfu Cf uAfgsasa 1223
AD-56630.1
A-115539.2 CfuagaccuGfUfUfuugcuuuu guL96 673 3603 A-115540.6 a Cf a aa Afg Cf a Af aa cAf g Gfu Cf uAfgsasa 1224
AD-56636.1
A-110695.8 Cf u AfgAf cCf u Gf Uf Uf u UfgCf uUfuUfgUfL96 674 3603 A-115541.1 aCfaaaAfgCfaAfaacAfgguCf uAfgsasa 1225
AD-56642.1
A-115535.3 CfuagAfcCfuGfUfUfuUfgCfu UfuUfgUfL96 675 3603 A-115541.2 aCfaaaAfgCfaAfaacAfgguCf uAfgsasa 1226
AD-56648.1
A-115536.3 CfuagAfcCfuGfUfUfuUfgcu UfuUfguL96 676 3603 A-115541.3 aCfaaaAfgCfaAfaacAfgguCf uAfgsasa 1227
AD-56654.1
A-115537.3 Cfu agAfccuGfUfUfu Ufgcu Uf uUfguL96 677 3603 A-115541.4 aCfaaaAfgCfaAfaacAfgguCf uAfgsasa 1228
AD-56613.1
A-115538.3 CfuagAfccuGfUfUfuugcuUf uuguL96 678 3603 A-115541.5 aCfaaaAfgCfaAfaacAfgguCf uAfgsasa 1229
103
Nombre del dúplex
Nombre del oligo sentido Secuencia del oligo sentido SEC ID N°: Posición con respecto a NM_174936.3 Nombre del oligo antisentido Secuencia del oligo antisentido SEC ID N°:
AD-56619.1
A-115539.3 CfuagaccuGfUfUfuugcuuuu 679 3603 A-115541.6 aCfaaaAfgCfaAfaacAfgguCf 1230
guL96 uAfgsasa
AD-56614.1
A-110695.9 Cf u AfgAf cCf u Gf Uf Uf u UfgCf 680 3603 A-115548.1 a Cf a Af Af Af g Cf a Af a a cAf g GfU 1231
uUfuUfgUfL96 fCfuAfgsAfsa
AD-56620.1
A-115542.2 Cfu Af GfAfcCfu Gf Uf Uf u UfgC 681 3603 A-115548.2 a Cf a Af Af Af g Cf a Af a a cAf g GfU 1232
fuUfuUfgUfL96 fCfuAfgsAfsa
AD-56626.1
A-115543.2 CfuAfGfAfcCfuGfUfUfuUfGf 682 3603 A-115548.3 a Cf a Af Af Af g Cf a Af a a cAf g GfU 1233
CfuUfuUfgUfL96 fCfuAfgsAfsa
AD-56632.1
A-115544.2 CfuAfGfAfcCfuGfUfUfuUfGf 683 3603 A-115548.4 a Cf a Af Af Af g Cf a Af a a cAf g GfU 1234
CfuUfUfUfgUfL96 fCfuAfgsAfsa
AD-56638.1
A-115545.2 Cfu AfGfAfCfCfuGfUfUfu UfG 684 3603 A-115548.5 a Cf a Af Af Af g Cf a Af a a cAf g GfU 1235
fCf u Uf Uf UfGf Uf L96 fCfuAfgsAfsa
AD-56644.1
A-115546.2 Cf UfAfGfAfCfCf u Gf Uf Uf u Uf 685 3603 A-115548.6 a Cf a Af Af Af g Cf a Af a a cAf g GfU 1236
GfCfUfUfUfUfGfUfL96 fCfuAfgsAfsa
AD-56650.1
A-115547.2 CfUfAfGfAfCfCfUfGfUfUfUf 686 3603 A-115548.7 a Cf a Af Af Af g Cf a Af a a cAf g GfU 1237
UfGfCfUfUfUfUfGfUfL96 fCfuAfgsAfsa
AD-56656.1
A-110695.10 Cf u AfgAf cCfu Gf Uf Uf u UfgCf 687 3603 A-115549.1 a Cf a AfAfAf GfCfa Af a acAf g Gf 1238
uUfuUfgUfL96 UfCfuAfgsAfsa
AD-56662.1
A-115542.3 Cfu AfGf AfcCfu Gf Uf Uf u UfgC 688 3603 A-115549.2 a Cf a Af AfAf GfCfa Af a acAf g Gf 1239
fuUfuUfgUfL96 UfCfuAfgsAfsa
AD-56668.1
A-115543.3 CfuAfGfAfcCfuGfUfUfuUfGf 689 3603 A-115549.3 a Cf a Af AfAf GfCfa Af a acAf g Gf 1240
CfuUfuUfgUfL96 UfCfuAfgsAfsa
AD-56673.1
A-115544.3 CfuAfGfAfcCfuGfUfUfuUfGf 690 3603 A-115549.4 a Cf a Af AfAf GfCfa Af a acAf g Gf 1241
CfuUfUfUfgUfL96 UfCfuAfgsAfsa
AD-56678.1
A-115545.3 Cfu AfGfAfCfCfuGfUfUfu UfG 691 3603 A-115549.5 a Cf a Af AfAf GfCfa Af a acAf g Gf 1242
fCf u Uf Uf UfGf Uf L96 UfCfuAfgsAfsa
AD-56683.1
A-115546.3 Cf Uf AfGf AfCfCf u Gf Uf Uf u Uf 692 3603 A-115549.6 a Cf a Af AfAf GfCfa Af a acAf g Gf 1243
GfCfUfUfUfUfGfUfL96 UfCfuAfgsAfsa
AD-56688.1
A-115547.3 CfUfAfGfAfCfCfUfGfUfUfUf 693 3603 A-115549.7 a Cf a Af AfAf GfCfa Af a acAf g Gf 1244
UfGfCfUfUfUfUfGfUfL96 UfCfuAfgsAfsa
104
Nombre del dúplex
Nombre del oligo sentido Secuencia del oligo sentido SEC ID N°: Posición con respecto a NM_174936.3 Nombre del oligo antisentido Secuencia del oligo antisentido SEC ID N°:
AD-56657.1
A-115550.1 Cf u AfgAf cCf u Gf Uf Uf u UfgCf uUfuugUfL96 694 3603 A-115551.1 a Cf Af Af a Af g Cf a Af a a cAf g Gfu CfuAfgsAfsa 1245
AD-56663.1
A-115552.1 Cf u AfgAf cCfu Gf Uf Uf u UfgCf uuuUfgUfL96 695 3603 A-115553.1 a Cf a Af Af Af g Cf a Af a a cAf g Gfu CfuAfgsAfsa 1246
AD-56669.1
A-115554.1 Cfu AfgAfcCfuGfUfUfu Ufgcu UfuUfgUfL96 696 3603 A-115555.1 aCfaAfaAfGfCfaAfaacAfgGfu CfuAfgsAfsa 1247
AD-56674.1
A-115556.1 CfuAfgAfcCfuGfUfUfuugCfu UfuUfgUfL96 697 3603 A-115557.1 a Cf a Af a Af g Cf Af Af a a cAf g Gfu CfuAfgsAfsa 1248
AD-56679.1
A-115558.1 Cfu AfgAfccuGfUf Ufu UfgCfu UfuUfgUfL96 698 3603 A-115559.1 aCfaAfaAfgCfaAfaacAfGfGfu CfuAfgsAfsa 1249
AD-56684.1
A-115560.1 CfuAfgacCfuGfUfUfuUfgCfu UfuUfgUfL96 699 3603 A-115561.1 aCfaAfaAfgCfaAfaacAfgGfUf CfuAfgsAfsa 1250
AD-56689.1
A-115535.4 CfuagAfcCfuGfUfUfuUfgCfu UfuUfgUfL96 700 3603 A-115562.1 aCfaAfaAfgCfaAfaacAfgGfu CfUfAfgsAfsa 1251
AD-56693.1
A-115520.4 cu AfgAfcCfu GfUfUfu UfgCfu UfuUfgUfL96 701 3603 A-115563.1 aCfaAfaAfgCfaAfaacAfgGfu CfuAfGfsAfsa 1252
AD-56658.1
A-115564.1 Cf u AfgAf cCfu GfUfUfu UfgCf uUfUfUfgUfL96 702 3603 A-115565.1 a Cf a aa Afg Cf a Af aa cAf g Gfu Cf uAfgsAfsa 1253
AD-56664.1
A-115566.1 Cf u AfgAf cCfu GfUfUfu UfgCf UfUfuUfgUfL96 703 3603 A-115567.1 aCfaAfaagCfaAfaacAfgGfuCf uAfgsAfsa 1254
AD-56670.1
A-115568.1 Cfu AfgAfcCfu Gf Uf Uf u Uf GfC fuUfuUfgUfL96 704 3603 A-115569.1 aCfaAfaAfgcaAfaacAfgGfuCf uAfgsAfsa 1255
AD-56680.1
A-115572.1 CfuAfgAfcCfUfGfUfUfuUfgC fuUfuUfgUfL96 705 3603 A-115573.1 aCfaAfaAfgCfaAfaacagGfuCf uAfgsAfsa 1256
AD-56685.1
A-115574.1 CfuAfgAfCfCfuGfUfUfuUfgC fuUfuUfgUfL96 706 3603 A-115575.1 aCfaAfaAfgCfaAfaacAfgguCf uAfgsAfsa 1257
AD-56690.1
A-115542.4 Cfu Af GfAfcCfu GfUfUfu UfgC fuUfuUfgUfL96 707 3603 A-115576.1 aCfaAfaAfgCfaAfaacAfgGfuc uAfgsAfsa 1258
AD-56694.1
A-115577.1 CfUfAfgAfcCfuGfUfUfuUfgC fuUfuUfgUfL96 708 3603 A-115578.1 aCfaAfaAfgCfaAfaacAfgGfu CfuagsAfsa 1259
105
Nombre del dúplex
Nombre del oligo sentido Secuencia del oligo sentido SEC ID N°: Posición con respecto a NM_174936.3 Nombre del oligo antisentido Secuencia del oligo antisentido SEC ID N°:
AD-56659.1
A-110695.12 Cf u AfgAf cCf u Gf Uf Uf u UfgCf uUfuUfgUfL96 709 3603 A-115579.1 aCfaAfaAfgCfaAfaacAfgGfu CfuAfgsasa 1260
AD-56665.1
A-115580.1 Afg AfcCfu Gf Uf Uf u UfgCf u Uf uUfgUfL96 710 3605 A-115581.1 aCfaAfaAfgCfaAfaacAfgGfu CfusAfsg 1261
AD-56671.1
A-115582.1 Afg AfcCfu Gf Uf Uf u UfgCf u Uf uugUfL96 711 3605 A-115583.1 a Cf Af Af a Af g Cf a Af a a cAf g Gfu CfusAfsg 1262
AD-56676.1
A-115584.1 Afg AfcCfuGf Uf Uf u UfgCf u u u UfgUfL96 712 3605 A-115585.1 a Cf a Af Af Af g Cf a Af a a cAf g Gfu CfusAfsg 1263
AD-56681.1
A-115586.1 Afg AfcCfu Gf Uf Uf u Uf gcu Uf u UfgUfL96 713 3605 A-115587.1 aCfaAfaAfGfCfaAfaacAfgGfu CfusAfsg 1264
AD-56686.1
A-115588.1 Afg AfcCfuGf UfUfu u gCf u Uf u UfgUfL96 714 3605 A-115589.1 aCfaAfaAfgCfAfAfaacAfgGfu CfusAfsg 1265
AD-56691.1
A-115590.1 AfgAfccuGfUf Ufu UfgCfu Ufu UfgUfL96 715 3605 A-115591.1 aCfaAfaAfgCfaAfaacAfGfGfu CfusAfsg 1266
AD-56695.1
A-115592.1 Afg acCfuGf UfUfu UfgCfu Ufu UfgUfL96 716 3605 A-115593.1 aCfaAfaAfgCfaAfaacAfgGfUf CfusAfsg 1267
AD-56660.1
A-115594.1 ag AfcCfuGf UfUfu UfgCfu Ufu UfgUfL96 717 3605 A-115595.1 aCfaAfaAfgCfaAfaacAfgGfu CfUfsAfsg 1268
AD-56666.1
A-115596.1 Afg AfcCfu Gf UfUfu UfgCfu Uf UfUfgUfL96 718 3605 A-115597.1 a Cf a aa Afg Cf a Af aa cAf g Gfu Cf usAfsg 1269
AD-56672.1
A-115598.1 Afg AfcCfu Gf UfUfu UfgCf UfU fuUfgUfL96 719 3605 A-115599.1 aCfaAfaagCfaAfaacAfgGfuCf usAfsg 1270
AD-56677.1
A-115600.1 Afg AfcCfu Gf UfUfu UfGfCfu U fuUfgUfL96 720 3605 A-115601.1 aCfaAfaAfgcaAfaacAfgGfuCf usAfsg 1271
AD-56682.1
A-115602.1 Afg AfcCfu Gf UfUfUf UfgCf u U fuUfgUfL96 721 3605 A-115603.1 aCfaAfaAfgCfaaaacAfgGfuCf usAfsg 1272
AD-56687.1
A-115604.1 AfgAfcCfUfGfUfUfuUfgCfuU fuUfgUfL96 722 3605 A-115605.1 aCfaAfaAfgCfaAfaacagGfuCf usAfsg 1273
AD-56692.1
A-115606.1 Afg Af Cf Cf u GfU f U fu Uf g Cf u U fuUfgUfL96 723 3605 A-115607.1 aCfaAfaAfgCfaAfaacAfgguCf usAfsg 1274
106
Nombre del dúplex
Nombre del oligo sentido Secuencia del oligo sentido SEC ID N°: Posición con respecto a NM_174936.3 Nombre del oligo antisentido Secuencia del oligo antisentido SEC ID N°:
AD-56696.1
A-115608.1 AfGfAfcCfuGfUfUfuUfgCfuU 724 3605 A-115609.1 aCfaAfaAfgCfaAfaacAfgGfuc 1275
fuUfgUfL96 usAfsg
AD-56661.1
A-115580.2 Afg AfcCfu Gf Uf Uf u UfgCf u Uf 725 3605 A-115610.1 aCfaAfaAfgCfaAfaacAfgGfu 1276
uUfgUfL96 Cfusasg
AD-56667.1
A-115611.1 gAfcCfuGfUfUfu UfgCfu Ufu 726 3605 A-115612.1 aCfaAfaAfgCfaAfaacAfgGfu 1277
UfgUfL96 Cfausa
AD-53806.11
A-110717.10 CfaAfgCfaGfaCf Af Uf u Ufa Uf 727 3544 A-109589.15 a Af a Af aGf a Uf a Af a u g Uf c Uf g 1278
cUfuUfuUfL96 CfuUfgsCfsu
AD-53806.13
A-110717.11 CfaAfgCfaGfaCf Af Ufu Ufa Uf 728 3544 A-109589.10 a Af a Af aGf a Uf a Af a u g Uf c Uf g 1279
cUfuUfuUfL96 CfuUfgsCfsu
AD-53806.12
A-110717.12 CfaAfgCfaGfaCf Af Ufu Ufa Uf 729 3544 A-109589.22 a Af a Af aGf a Uf a Af a u g Uf c Uf g 1280
cUfuUfuUfL96 CfuUfgsCfsu
AD-53806.5
A-110717.4 Cfa AfgCfaGfaCfAf Uf u Ufa Uf 730 3544 A-109589.5 a Af a Af aGf a Uf a Af a u g Uf c Uf g 1281
cUfuUfuUfL96 CfuUfgsCfsu
AD-53806.6
A-110717.5 CfaAfgCfaGfaCf Af Ufu Ufa Uf 731 3544 A-109589.7 a Af a Af aGf a Uf a Af a u g Uf c Uf g 1282
cUfuUfuUfL96 CfuUfgsCfsu
AD-53806.7
A-110717.6 CfaAfgCfaGfaCfAfUfuUfaUf 732 3544 A-109589.8 a Af a Af aGf a Uf a Af a u g Uf c Uf g 1283
cUfuUfuUfL96 CfuUfgsCfsu
AD-53806.8
A-110717.7 CfaAfgCfaGfaCfAfUfuUfaUf 733 3544 A-109589.9 a Af a Af aGf a Uf a Af a u g Uf c Uf g 1284
cUfuUfuUfL96 CfuUfgsCfsu
AD-53806.9
A-110717.8 CfaAfgCfaGfaCfAfUfuUfaUf 734 3544 A-109589.9 a Af a Af aGf a Uf a Af a u g Uf c Uf g 1285
cUfuUfuUfL96 CfuUfgsCfsu
AD-53806.10
A-110717.9 CfaAfgCfaGfaCfAfUfuUfaUf 735 3544 A-109589.9 a Af a Af aGf a Uf a Af a u g Uf c Uf g 1286
cUfuUfuUfL96 CfuUfgsCfsu
AD-56979.1
A-116393.1 caAfgCfaGfaCfAf Uf u Ufa Ufe 736 3544 A-109589.6 a Af a Af aGf a Uf a Af a u g Uf c Uf g 1287
UfuUfuUfL96 CfuUfgsCfsu
AD-56979.2
A-116393.2 caAfgCfaGfaCf Af Ufu Ufa Ufe 737 3544 A-109589.17 a Af a Af aGf a Uf a Af a u g Uf c Uf g 1288
UfuUfuUfL96 CfuUfgsCfsu
AD-56975.3
A-116394.1 (i C) a Afg Cfa Gf aCfAfU fu Ufa 738 3544 A-109589.9 aAfaAfaGfaUfaAfaugUfcUfg 1289
UfcUfuUfuUfL96 CfuUfgsCfsu
107
Nombre del dúplex
Nombre del oligo sentido Secuencia del oligo sentido SEC ID N°: Posición con respecto a NM_174936.3 Nombre del oligo antisentido Secuencia del oligo antisentido SEC ID N°:
AD-56975.4
A-116394.2 (i C)a AfgCfaGf aCf AfUfu Ufa 739 3544 A-109589.15 a Af a Af aGf a Uf a Af a u g Uf c Uf g 1290
UfcUfuUfuUfL96 CfuUfgsCfsu
AD-56975.5
A-116394.3 (i C) a Af g Cf a Gf aCf AfU fu Ufa 740 3544 A-109589.22 a Af a Af aGf a Uf a Af a u g Uf c Uf g 1291
UfcUfuUfuUfL96 CfuUfgsCfsu
AD-56975.1
A-116394.4 (i C) a Af g Cf a Gf aCf AfU fu Ufa 741 3544 A-109589.5 a Af a Af aGf a Uf a Af a u g Uf c Uf g 1292
UfcUfuUfuUfL96 CfuUfgsCfsu
AD-56975.2
A-116394.5 (i C) a Af g Cf a Gf aCf AfU fu Ufa 742 3544 A-109589.6 aAfaAfaGfaUfaAfaugUfcUfg 1293
UfcUfuUfuUfL96 CfuUfgsCfsu
AD-56983.1
A-116400.1 C baAfgCfaGfaCfAf Uf u UfaU 743 3544 A-109589.7 a Af a Af aGf a Uf a Af a u g Uf c Uf g 1294
fcUfuUfuUfL96 CfuUfgsCfsu
AD-56983.2
A-116400.2 C baAfgCfaGfaCfAfUfu UfaU 744 3544 A-109589.8 a Af a Af aGf a Uf a Af a u g Uf c Uf g 1295
fcUfuUfuUfL96 CfuUfgsCfsu
AD-56983.3
A-116400.3 C baAfgCfaGfaCf AfUfu UfaU 745 3544 A-109589.9 a Af a Af aGf a Uf a Af a u g Uf c Uf g 1296
fcUfuUfuUfL96 CfuUfgsCfsu
AD-56983.4
A-116400.4 C baAfgCfaGfaCf AfUfu UfaU 746 3544 A-109589.9 a Af a Af aGf a Uf a Af a u g Uf c Uf g 1297
fcUfuUfuUfL96 CfuUfgsCfsu
AD-56983.5
A-116400.5 C baAfgCfaGfaCf AfUfu UfaU 747 3544 A-109589.15 a Af a Af aGf a Uf a Af a u g Uf c Uf g 1298
fcUfuUfuUfL96 CfuUfgsCfsu
AD-56977.3
A-116406.1 CfaagCfaGfaCfAfUfuUfaUfc 748 3544 A-109589.10 a Af a Af aGf a Uf a Af a u g Uf c Uf g 1299
UfuUfuUfL96 CfuUfgsCfsu
AD-56977.1
A-116406.2 CfaagCfaGfaCfAfUfuUfaUfc 749 3544 A-109589.11 a Af a Af aGf a Uf a Af a u g Uf c Uf g 1300
UfuUfuUfL96 CfuUfgsCfsu
AD-56977.2
A-116406.3 CfaagCfaGfaCfAfUfuUfaUfc 750 3544 A-109589.18 a Af a Af aGf a Uf a Af a u g Uf c Uf g 1301
UfuUfuUfL96 CfuUfgsCfsu
AD-56976.1
A-116407.1 CfaagCfaGfaCfAfUfuUfauc 751 3544 A-109589.11 a Af a Af aGf a Uf a Af a u g Uf c Uf g 1302
UfuUfuUfL96 CfuUfgsCfsu
AD-56976.2
A-116407.2 CfaagCfaGfaCfAfUfuUfauc 752 3544 A-109589.12 a Af a Af aGf a Uf a Af a u g Uf c Uf g 1303
UfuUfuUfL96 CfuUfgsCfsu
AD-56980.1
A-116408.1 CfaagCfagaCfAfUfuUfaucUf 753 3544 A-109589.12 a Af a Af aGf a Uf a Af a u g Uf c Uf g 1304
uUfuUfL96 CfuUfgsCfsu
108
Nombre del dúplex
Nombre del oligo sentido Secuencia del oligo sentido SEC ID N°: Posición con respecto a NM_174936.3 Nombre del oligo antisentido Secuencia del oligo antisentido SEC ID N°:
AD-56980.2
A-116408.2 CfaagCfagaCfAfUfuUfaucUf 754 3544 A-109589.13 a Af a Af aGf a Uf a Af a u g Uf c Uf g 1305
uUfuUfL96 CfuUfgsCfsu
AD-56984.1
A-116409.1 CfaagCfagaCfAfUfuUfaucUf 755 3544 A-109589.13 a Af a Af aGf a Uf a Af a u g Uf c Uf g 1306
uuuUfL96 CfuUfgsCfsu
AD-56984.2
A-116409.2 CfaagCfagaCfAfUfuUfaucUf 756 3544 A-109589.14 a Af a Af aGf a Uf a Af a u g Uf c Uf g 1307
uuuUfL96 CfuUfgsCfsu
AD-56987.1
A-116410.1 CfaagCfagaCfAfUfuUfaucUf 757 3544 A-109589.14 a Af a Af a Gf a Uf a Af a u g Uf c Uf g 1308
uuuuL96 CfuUfgsCfsu
AD-56987.2
A-116410.2 CfaagCfagaCfAfUfuUfaucUf 758 3544 A-109589.9 a Af a Af aGf a Uf a Af a u g Uf c Uf g 1309
uuuuL96 CfuUfgsCfsu
AD-56991.1
A-116415.1 CfaagCfagaCfAfUfuUfaucu 759 3544 A-109589.15 a Af a Af aGf a Uf a Af a u g Uf c Uf g 1310
uuuuL96 CfuUfgsCfsu
AD-56993.1
A-116416.1 CfaagcagaCfAfUfuUfaucuu 760 3544 A-109589.16 a Af a Af aGf a Uf a Af a u g Uf c Uf g 1311
uuuL96 CfuUfgsCfsu
AD-56995.1
A-116417.1 CfaagcagaCfAfUfuuaucuuu 761 3544 A-109589.17 a Af a Af aGf a Uf a Af a u g Uf c Uf g 1312
uuL96 CfuUfgsCfsu
AD-56978.1
A-116418.1 CfaAfGfCfaGfaCfAfUfuUfaU 762 3544 A-109589.18 a Af a Af aGf a Uf a Af a u g Uf c Uf g 1313
fcUfuUfuUfL96 CfuUfgsCfsu
AD-56978.2
A-116418.2 CfaAfGfCfaGfaCfAfUfuUfaU 763 3544 A-109589.17 a Af a Af aGf a Uf a Af a u g Uf c Uf g 1314
fcUfuUfuUfL96 CfuUfgsCfsu
AD-56981.1
A-116419.1 CfaAfGf CfaGfaCfAf Uf u UfAf 764 3544 A-109589.19 a Af a Af aGf a Uf a Af a u g Uf c Uf g 1315
UfcUfuUfuUfL96 CfuUfgsCfsu
AD-56985.1
A-116420.1 CfaAfGfCfaGfaCfAf Uf u Uf Af 765 3544 A-109589.20 a Af a Af aGf a Uf a Af a u g Uf c Uf g 1316
UfCfUfuUfuUfL96 CfuUfgsCfsu
AD-56988.1
A-116421.1 CfaAfGfCfAfGfaCfAf Uf u Uf A 766 3544 A-109589.21 a Af a Af aGf a Uf a Af a u g Uf c Uf g 1317
f UfCf Uf u Ufu Uf L96 CfuUfgsCfsu
AD-56988.2
A-116421.2 CfaAfGfCf AfGfaCfAfUfu Uf A 767 3544 A-109589.9 a Af a Af aGf a Uf a Af a u g Uf c Uf g 1318
f UfCf Uf u Ufu Uf L96 CfuUfgsCfsu
AD-56988.3
A-116421.3 CfaAfGf CfAfGfaCf AfUfu UfA 768 3544 A-109589.15 a Af a Af aGf a Uf a Af a u g Uf c Uf g 1319
f UfCf Ufu Ufu UfL96 CfuUfgsCfsu
109
Nombre del dúplex
Nombre del oligo sentido Secuencia del oligo sentido SEC ID N°: Posición con respecto a NM_174936.3 Nombre del oligo antisentido Secuencia del oligo antisentido SEC ID N°:
AD-56982.1
A-116426.1 CfaAfgcaGfaCfAfUfuUfaUfc 769 3544 A-109589.19 a Af a Af aGf a Uf a Af a u g Uf c Uf g 1320
UfuUfuUfL96 CfuUfgsCfsu
AD-56982.2
A-116426.2 CfaAfgcaGfaCfAfUfuUfaUfc 770 3544 A-109589.23 a Af a Af aGf a Uf a Af a u g Uf c Uf g 1321
UfuUfuUfL96 CfuUfgsCfsu
AD-56986.1
A-116428.1 CfaAfgCfagaCfAfUfuUfaUfc 771 3544 A-109589.20 a Af a Af aGf a Uf a Af a u g Uf c Uf g 1322
UfuUfuUfL96 CfuUfgsCfsu
AD-56986.2
A-116428.2 CfaAfgCfagaCfAfUfuUfaUfc 772 3544 A-109589.17 a Af a Af aGf a Uf a Af a u g Uf c Uf g 1323
UfuUfuUfL96 CfuUfgsCfsu
AD-56989.1
A-116430.1 CfaAfgCfaGfacAfUfuUfaUfc 773 3544 A-109589.21 a Af a Af aGf a Uf a Af a u g Uf c Uf g 1324
UfuUfuUfL96 CfuUfgsCfsu
AD-56990.1
A-116432.1 CfaAfgCfaGfaCfAfuuUfaUfc 774 3544 A-109589.9 aAfaAfaGfaUfaAfaugUfcUfg 1325
UfuUfuUfL96 CfuUfgsCfsu
AD-56992.1
A-116434.1 CfaAfgCfaGfaCfAfUfuUfauc 775 3544 A-109589.15 a Af a Af aGf a Uf a Af a u g Uf c Uf g 1326
UfuUfuUfL96 CfuUfgsCfsu
AD-56992.2
A-116434.2 CfaAfgCfaGfaCfAfUfuUfauc 776 3544 A-109589.17 a Af a Af aGf a Uf a Af a u g Uf c Uf g 1327
UfuUfuUfL96 CfuUfgsCfsu
AD-56994.1
A-116436.1 CfaAfgCfaGfaCfAf Uf u Ufa Uf 777 3544 A-109589.22 a Af a Af aGf a Uf a Af a u g Uf c Uf g 1328
cUfuuuUfL96 CfuUfgsCfsu
AD-56994.2
A-116436.2 CfaAfgCfaGfaCf AfUfu Ufa Uf 778 3544 A-109589.23 a Af a Af aGf a Uf a Af a u g Uf c Uf g 1329
cUfuuuUfL96 CfuUfgsCfsu
AD-56996.1
A-116438.1 caagCfaGfaCfAfUfuUfaUfc 779 3544 A-109589.17 a Af a Af aGf a Uf a Af a u g Uf c Uf g 1330
UfuUfuUfL96 CfuUfgsCfsu
AD-57001.1
A-116440.1 CfaAfgcagaCfAfUfu UfaUfcU 780 3544 A-109589.17 a Af a Af aGf a Uf a Af a u g Uf c Uf g 1331
fuUfuUfL96 CfuUfgsCfsu
AD-57007.1
A-116442.1 Cf a Af g Cf a Gf a CfAf u u u a Uf c 781 3544 A-109589.17 a Af a Af aGf a Uf a Af a u g Uf c Uf g 1332
UfuUfuUfL96 CfuUfgsCfsu
AD-57013.1
A-116444.1 CfaAfgCfaGfaCfAfUfuUfauc 782 3544 A-109589.17 a Af a Af aGf a Uf a Af a u g Uf c Uf g 1333
uuUfuUfL96 CfuUfgsCfsu
AD-57019.1
A-116446.1 CfaAfgCfaGfaCf AfUfu Ufa Uf 783 3544 A-109589.17 a Af a Af aGf a Uf a Af a u g Uf c Uf g 1334
cUfuuuuL96 CfuUfgsCfsu
110
Nombre del dúplex
Nombre del oligo sentido Secuencia del oligo sentido SEC ID N°: Posición con respecto a NM_174936.3 Nombre del oligo antisentido Secuencia del oligo antisentido SEC ID N°:
AD-57022.1
A-116448.1 CfaAfgCfaGfaCfAf Uf u Ufa Uf 784 3544 A-109589.23 a Af a Af aGf a Uf a Af a u g Uf c Uf g 1335
cUfUfUfuUfL96 CfuUfgsCfsu
AD-57025.1
A-116449.1 CfaAfgCfaGfaCfAfUfuUfaUf 785 3544 A-109589.23 a Af a Af aGf a Uf a Af a u g Uf c Uf g 1336
CfUfuUfuUfL96 CfuUfgsCfsu
AD-56997.1
A-116450.1 CfaAfgCfaGfaCfAfUfu Uf Af U 786 3544 A-109589.17 a Af a Af aGf a Uf a Af a u g Uf c Uf g 1337
fcUfuUfuUfL96 CfuUfgsCfsu
AD-57002.1
A-116452.1 CfaAfgCfaGfaCfAfUfUf Ufa U 787 3544 A-109589.17 a Af a Af aGf a Uf a Af a u g Uf c Uf g 1338
fcUfuUfuUfL96 CfuUfgsCfsu
AD-57008.1
A-116453.1 CfaAfgCfaGfAfCfAfUfuUfaU 788 3544 A-109589.17 a Af a Af aGf a Uf a Af a u g Uf c Uf g 1339
fcUfuUfuUfL96 CfuUfgsCfsu
AD-57014.1
A-116454.1 CfaAfgCfAfGfAfCfAfUfu Ufa 789 3544 A-109589.17 a Af a Af aGf a Uf a Af a u g Uf c Uf g 1340
UfcUfuUfuUfL96 CfuUfgsCfsu
AD-57020.1
A-116455.1 CfAfAfgCfaGfaCfAfUfuUfaU 790 3544 A-109589.23 a Af a Af aGf a Uf a Af a u g Uf c Uf g 1341
fcUfuUfuUfL96 CfuUfgsCfsu
AD-57020.2
A-116455.2 CfAfAfgCfaGfaCfAfUfuUfaU 791 3544 A-109589.23 a Af a Af aGf a Uf a Af a u g Uf c Uf g 1342
fcUfuUfuUfL96 CfuUfgsCfsu
AD-57026.1
A-116457.1 CfaAfgCfaGfaCfAfUfuUfaUf 792 3544 A-109589.23 a Af a Af aGf a Uf a Af a u g Uf c Uf g 1343
cuuUfuUfL96 CfuUfgsCfsu
AD-57003.1
A-116460.1 CfaAfgCfaGfaCfAfUfuuaUfc 793 3544 A-109589.17 a Af a Af aGf a Uf a Af a u g Uf c Uf g 1344
UfuUfuUfL96 CfuUfgsCfsu
AD-57009.1
A-116462.1 Cf a Af g Cf a Gf aCf a u u Ufa Ufe 794 3544 A-109589.17 a Af a Af aGf a Uf a Af a u g Uf c Uf g 1345
UfuUfuUfL96 CfuUfgsCfsu
AD-57015.1
A-116464.1 Cf a Af g Cf a Gf a caUfuUfaUfc 795 3544 A-109589.17 a Af a Af a Gf a Uf a Af a u g Uf c Uf g 1346
UfuUfuUfL96 CfuUfgsCfsu
AD-57023.1
A-116467.1 CfaAfgCfaGfaCfAfUfuUfauc 796 3544 A-109589.23 a Af a Af aGf a Uf a Af a u g Uf c Uf g 1347
UfUfUfuUfL96 CfuUfgsCfsu
AD-57027.1
A-116469.1 CfaAfgCfaGfaCfAfUfuuaUfc 797 3544 A-109589.23 a Af a Af aGf a Uf a Af a u g Uf c Uf g 1348
UfUfUfuUfL96 CfuUfgsCfsu
AD-56998.1
A-116471.1 CfaAfgCfagaCfAfUfuUfaUfc 798 3544 A-109589.17 a Af a Af aGf a Uf a Af a u g Uf c Uf g 1349
UfUfUfuUfL96 CfuUfgsCfsu
Nombre del dúplex
Nombre del oligo sentido Secuencia del oligo sentido SEC ID N°: Posición con respecto a NM_174936.3 Nombre del oligo antisentido Secuencia del oligo antisentido SEC ID N°:
AD-57004.1
A-116473.1 CfaAfgcaGfaCfAfUfuUfaUfc 799 3544 A-109589.17 a Af a Af aGf a Uf a Af a u g Uf c Uf g 1350
UfUfUfuUfL96 CfuUfgsCfsu
AD-57010.1
A-116475.1 CfaagCfaGfaCfAfUfuUfaUfc 800 3544 A-109589.17 a Af a Af aGf a Uf a Af a u g Uf c Uf g 1351
UfUfUfuUfL96 CfuUfgsCfsu
AD-57016.1
A-116477.1 caAfgCfaGfaCf Af Uf u Ufa Ufe 801 3544 A-109589.17 a Af a Af aGf a Uf a Af a u g Uf c Uf g 1352
UfUfUfuUfL96 CfuUfgsCfsu
AD-56999.2
A-116479.1 CfaAfgCfaGfaCfAf Uf u Uf Af U 802 3544 A-109589.17 a Af a Af aGf a Uf a Af a u g Uf c Uf g 1353
fcUfUfUfuUfL96 CfuUfgsCfsu
AD-56999.1
A-116479.2 CfaAfgCfaGfaCfAfUfu Uf Af U 803 3544 A-109589.17 a Af a Af aGf a Uf a Af a u g Uf c Uf g 1354
fcUfUfUfuUfL96 CfuUfgsCfsu
AD-57021.1
A-116481.1 CfaAfgCfAfGfaCfAfUfuUfaU 804 3544 A-109589.23 a Af a Af aGf a Uf a Af a u g Uf c Uf g 1355
fcUfUfUfuUfL96 CfuUfgsCfsu
AD-57024.1
A-116483.1 CfaAfGfCfaGfaCfAfUfuUfaU 805 3544 A-109589.23 a Af a Af aGf a Uf a Af a u g Uf c Uf g 1356
fcUfUfUfuUfL96 CfuUfgsCfsu
AD-57005.1
A-116486.1 CfaAfgCfaGfaCf AfUfu Ufa Uf 806 3544 A-109589.17 a Af a Af aGf a Uf a Af a u g Uf c Uf g 1357
CfUfuuuUfL96 CfuUfgsCfsu
AD-57011.1
A-116488.1 Cf a Af g Cf a GfaCfAfUfu u a Uf 807 3544 A-109589.17 a Af a Af aGf a Uf a Af a u g Uf c Uf g 1358
CfUfuUfuUfL96 CfuUfgsCfsu
AD-57017.1
A-116490.1 CfaAfGfCfagaCfAfUfu Ufa Uf 808 3544 A-109589.17 a Af a Af aGf a Uf a Af a u g Uf c Uf g 1359
cUfuUfuUfL96 CfuUfgsCfsu
AD-57000.2
A-116492.1 Cf(Aeo)Af(Geo)CfaGfaCfAf 809 3544 A-109589.17 a Af a Af aGf a Uf a Af a u g Uf c Uf g 1360
UfuUfaUfcUf(Teo)Uf(Teo)Uf CfuUfgsCfsu
L96
AD-57000.3
A-116492.2 Cf(Aeo)Af(Geo)CfaGfaCfAf 810 3544 A-109589.23 a Af a Af aGf a Uf a Af a u g Uf c Uf g 1361
UfuUfaUfcUf(Teo)Uf(Teo)Uf CfuUfgsCfsu
L96
AD-57000.1
A-116492.3 Cf(Aeo)Af(Geo)CfaGfaCfAf 811 3544 A-109589.17 a Af a Af aGf a Uf a Af a u g Uf c Uf g 1362
UfuUfaUfcUf(Teo)Uf(Teo)Uf CfuUfgsCfsu
L96
AD-57006.2
A-116494.1 Cf(Aeo)Af(Geo)CfaGfaCfAf 812 3544 A-109589.23 a Af a Af aGf a Uf a Af a u g Uf c Uf g 1363
UfuUf(Aeo)Uf(m5Ceo)Uf(Te CfuUfgsCfsu
o)Uf(Teo)UfL96
112
Nombre del dúplex
Nombre del oligo sentido Secuencia del oligo sentido SEC ID N°: Posición con respecto a NM_174936.3 Nombre del oligo antisentido Secuencia del oligo antisentido SEC ID N°:
AD-57006.3
A-116494.2 Cf(Aeo)Af(Geo)CfaGfaCfAf UfuUf(Aeo)Uf(m5Ceo)Uf(Te o)Uf(Teo)UfL96 813 3544 A-109589.23 a Af a Af a Gf a Uf a Af a u g Uf c Uf g CfuUfgsCfsu 1364
AD-57006.1
A-116494.3 Cf(Aeo)Af(Geo)CfaGfaCfAf Ufullf(Aeo)Uf(m5Ceo)Uf(Te o)Uf(Teo)UfL96 814 3544 A-109589.17 a Af a Af aGf a Uf a Af a u g Uf c Uf g CfuUfgsCfsu 1365
AD-57012.1
A-116498.1 Cf(Aeo)Af(Geo)CfaGfaCfAf UfuUfaUfcUf(T eo)Uf(T eo)U bL96 815 3544 A-109589.17 a Af a Af aGf a Uf a Af a u g Uf c Uf g CfuUfgsCfsu 1366
AD-57018.1
A-116500.1 Cf(Aeo)Af(Geo)CfaGfaCfAf UfuUf(Aeo)Uf(m5Ceo)Uf(Te o)Uf(Teo)UbL96 816 3544 A-109589.17 a Af a Af aGf a Uf a Af a u g Uf c Uf g CfuUfgsCfsu 1367
AD-53815.1
CfuAfgAfcCfuGfUfUfuUfgC fuUfuUfgUfL96 817 3601 aCfaAfaAfgCfaAfaacAfgGfu CfuAfgsAfsa 1368
AD-57928.40
Cfsus Afg AfcCf u Gf Uf Uf u Uf gCfuUfuUfgUfL96 818 3601 asCfsaAfaAfgCfaAfaacAfgG fuCfuAfgsasa 1369
AD-59182.5
Cfs us Afg AfcCf u GfUfUfuug CfuuuuguL96 819 3601 asCfsaAfaAfgCfaAfaacAfgG fuCfuAfgsasa 1370
AD-59184.3
Cfs usAfg AfcCf uGfu Uf u u gC fuuuuguL96 820 3601 asCfsaAfaAfgCfaAfaacAfgG fuCfuAfgsasa 1371
AD-59186.3
Cfs usAfg AfcCf u GfUfu u u gC fuuuuguL96 821 3601 asCfsaAfaAfgCfaAfaacAfgG fuCfuAfgsasa 1372
AD-59171.13
Cfs usAfg AfcCf u Gfu u u ugCf uuuuguL96 822 3601 asCfsaAfaAfgCfaAfaacAfgG fuCfuAfgsasa 1373
AD-59176.7
Cfs usAfg AfcCf u Gfu u u ugcu uuuguL96 823 3601 asCfsaAfaAfgCfaAfaacAfgG fuCfuAfgsasa 1374
AD-59170.7
CfsusagacCfuGfuuuugCfu uuuguL96 824 3601 asCfsaAfaAfgCfaAfaacAfgG fuCfuAfgsasa 1375
AD-59175.7
CfsusagacCfuGfuuuugcuu uuguL96 825 3601 asCfsaAfaAfgCfaAfaacAfgG fuCfuAfgsasa 1376
AD-59179.7
csusagacCfuGfuuuugcuuu uguL96 826 3601 asCfsaAfaAfgCfaAfaacAfgG fuCfuAfgsasa 1377
113
Nombre del dúplex
Nombre del oligo sentido Secuencia del oligo sentido SEC ID N°: Posición con respecto a NM_174936.3 Nombre del oligo antisentido Secuencia del oligo antisentido SEC ID N°:
AD-59218.1
Cfs usAfg AfcCf u Gf u u u ugCf 827 3601 asCfsaAfaAfgCfaAfAfAfcAfg 1378
uuuuguL96 GfuCfuAfgsasa
AD-59222.1
Cfs usAfg AfcCf u Gfu u u ugcu 828 3601 asCfsaAfaAfgCfaAfAfAfcAfgG 1379
uuuguL96 uCfuAfgsasa
AD-59226.1
CfsusagacCfuGfuuuugCfu 829 3601 asCfsaAfaAfgCfaAfAfAfcAfg 1380
uuuguL96 GfuCfuAfgsasa
AD-59230.1
CfsusagacCfuGfuuuugcuu 830 3601 asCfsaAfaAfgCfaAfAfAfcAfg 1381
uuguL96 GfuCfuAfgsasa
AD-59235.1
csusagacCfuGfuuuugcuuu 831 3601 asCfsaAfaAfgCfaAfAfAfcAfg 1382
uguL96 GfuCfuAfgsasa
AD-59207.1
Cfs usAfg AfcCf u Gfu u u ugCf 832 3601 as Cfsa AfAfAf g Cf a Af a Af cAf g 1383
uuuuguL96 GfuCfuagsasa
AD-59211.1
Cfs usAfg AfcCf u Gfu u u ugcu 833 3601 as Cfsa Af AfAfg Cf a Af a Af cAf g 1384
uuuguL96 GfuCfuagsasa
AD-59215.1
CfsusagacCfuGfuuuugCfu 834 3601 as Cfsa Af AfAfg Cf a Af a Af cAf g 1385
uuuguL96 GfuCfuagsasa
AD-59219.1
CfsusagacCfuGfuuuugcuu 835 3601 as Cfs a Af Af Af gCf a Af aAf cAf g 1386
uuguL96 GfuCfuagsasa
AD-59223.1
csusagacCfuGfuuuugcuuu 836 3601 as Cfsa Af AfAfg Cf a Af a Af cAf g 1387
uguL96 GfuCfuagsasa
AD-59181.5
CfsusAfg AfcCf u Gf Uf Uf u Uf 837 3601 asCfsaAfaAfgCfaAfaacAfgG 1388
gCfu Ufu UfgsUfL96 fuCfuAfgsasa
AD-59172.5
Cfs us Afg AfcCf u GfUfUfuUf 838 3601 asCfsaAfaAfgCfaAfaacAfgG 1389
gCfuUfuUfsgsUfL96 fuCfuAfgsasa
AD-59177.5
CfsusAfg AfcCf u Gf Uf Uf u Uf 839 3601 asCfsaAfaAfgCfaAfaacAfgG 1390
gCfsuUfsuUfsgsUfL96 fuCfuAfgsasa
AD-59180.5
CfsusAfg AfcCf u Gf Uf Uf u Uf 840 3601 asCfsaAfaAfgCfaAfaacAfgG 1391
gCfsu Ufsu UfsgsUfsL96 fuCfuAfgsasa
AD-59183.5
CfsusAfg AfcCf u Gf Uf Uf u Uf 841 3601 asCfsaAfaAfgCfaAfaacAfgG 1392
gCfuUfuUfsgsUfsL96 fuCfuAfgsasa
114
Nombre del dúplex
Nombre del oligo sentido Secuencia del oligo sentido SEC ID N°: Posición con respecto a NM_174936.3 Nombre del oligo antisentido Secuencia del oligo antisentido SEC ID N°:
AD-59185.5
Cfsus Afg AfcCf u Gf Uf Uf u Uf 842 3601 asCfsaAfaAfgCfaAfaacAfgG 1393
gCfuUfuUfgUfsL96 fuCfuAfgsasa
AD-59173.5
Cfs us Afg AfcCf u GfUfUfuug 843 3601 asCfsaAfaAfgCfaAfaacAfgG 1394
CfuuuugsuL96 fuCfuAfgsasa
AD-59232.1
Cfsus Afg AfcCf u Gf Uf Uf u Uf 844 3600 PasCfsaAfaAfgCfaAfaacAfg 1395
gCfuUfuUfgUfL96 GfuCfuAfgsasa
AD-59236.1
Cfsus Afg AfcCf u Gf Uf Uf u Uf 845 3601 asCfsaAfaAfsgCfaAfaacAfg 1396
gCfuUfuUfgUfL96 GfuCfsuAfgsasa
AD-59216.1
Cfsus Afg AfcCf u Gf Uf Uf u Uf 846 3601 asCfsaAfaAfsgCfaAfaacAfg 1397
gCfu Ufu UfgsUfL96 GfuCfsuAfgsasa
AD-59220.1
Cfsus Afg AfcCf u Gf Uf Uf u Uf 847 3601 asCfsaAfaAfsgCfaAfaacAfg 1398
gCfuUfuUfsgsUfL96 GfuCfsuAfgsasa
AD-59224.1
Cfsus Afg AfcCf u Gf Uf Uf u Uf 848 3601 asCfsaAfaAfsgCfaAfaacAfg 1399
gCfsuUfsuUfsgsUfL96 GfuCfsuAfgsasa
AD-59228.1
Cfsus Afg AfcCf u Gf Uf Uf u Uf 849 3601 asCfsaAfaAfsgCfaAfaacAfg 1400
gCfsu Ufsu UfsgsUfsL96 GfuCfsuAfgsasa
AD-59233.1
Cfsus Afg AfcCf u GfUf Uf u Uf 850 3601 asCfsaAfaAfsgCfaAfaacAfg 1401
gCfuUfuUfsgsUfsL96 GfuCfsuAfgsasa
AD-59237.1
Cfsus Afg AfcCf u Gf Uf Uf u Uf 851 3601 asCfsaAfaAfsgCfaAfaacAfg 1402
gCfuUfuUfgUfsL96 GfuCfsuAfgsasa
AD-59209.1
Cfs us Afg AfcCf u GfUfUfuug 852 3601 asCfsaAfaAfsgCfaAfaacAfg 1403
CfuuuugsuL96 GfuCfsuAfgsasa
AD-59208.1
Cfsus Afg AfcCf u Gf Uf Uf u Uf 853 3601 asCfsaAfaAfsgCfaAfaacAfg 1404
gCfuUfuUfgUfL96 GfuCfsusAfgsasa
AD-59212.1
Cfsus Afg AfcCf u Gf Uf Uf u Uf 854 3600 PasCfsaAfaAfsgCfaAfaacAf 1405
gCfuUfuUfgUfL96 gGfuCfsuAfgsasa
AD-59210.1
csusAGAccuGuuuuGcuuu 855 3601 As c sAAAAG cAAAAc AG G u c 1406
uGuL96 uAGsasa
AD-59214.1
AsGsAccuGuuuuGcuuuuG 856 3603 As c sAAAAG cAAAAc AG G u c 1407
uL96 usAsG
115
Nombre del
Nombre del
Secuencia del oligo SEC Posición con Nombre del Secuencia del oligo SEC ID
dúplex
oligo sentido sentido ID N°: respecto a oligo antisentido N°:
NM_174936.3 antisentido
AD-59227.1
CfsusAfGfAfccuGfuuuuGfc 857 3601 asCfsAfAfAfAfGfcAfAfAfAfc 1408
uuuuGfuL96 AfGfGfucuAfGfsasa
AD-59231.1
CfsusAfGfAfccuGfuuuuGfc 858 3601 asCfsAfAfAfAfGfcAfAfaacAf 1409
uuuuGfuL96 GfGfucuAfGfsasa
AD-59198.3
(C 3 m) us Af g Af cCf u Gf Uf Uf u 859 3601 asCfsaAfaAfgCfaAfaacAfgG 1410
UfgCf u Uf u UfgUf L96 fuCfuAfgsasa
AD-59200.3
(C3m)(U3m)AfgAfcCfuGfUf 860 3601 asCfsaAfaAfgCfaAfaacAfgG 1411
Uf u UfgCfu Uf u Ufg Uf L96 fuCfuAfgsasa
AD-59203.3
(m5Cam)usAfgAfcCfuGfUf 861 3601 asCfsaAfaAfgCfaAfaacAfgG 1412
Uf u UfgCfu Uf u Ufg Uf L96 fuCfuAfgsasa
AD-59204.3
(m5Cam)(Tam)AfgAfcCfuG 862 3601 as Cfs a Af a Af g Cfa Af aa cAfg G 1413
f Uf Uf u UfgCfu Uf u UfgUf L96 fuCfuAfgsasa
AD-59188.3
(m5Cams)(T ams)AfgAfcCf 863 3601 asCfsaAfaAfgCfaAfaacAfgG 1414
uGf Uf Uf u UfgCfu Uf u Ufg Uf L 96 fuCfuAfgsasa
AD-59191.3
(m5Cams)usAfgAfcCfuGfU 864 3601 asCfsaAfaAfgCfaAfaacAfgG 1415
fUfu UfgCfu UfuUfgUfL96 fuCfuAfgsasa
AD-59213.1
Cfsus Afg AfcCf u Gf Uf Uf u Uf 865 3601 asCfsaAfaAfgCfaAfaacAfgG 1416
gCfuUfuUfgUfL96 fuCfuAfgs(A3m)a
AD-59217.1
Cfsus Afg AfcCf u Gf Uf Uf u Uf 866 3601 asCfsaAfaAfgCfaAfaacAfgG 1417
gCfuUfuUfgUfL96 fuCfuAf(G3m)(A3m)a
AD-59221.1
Cfsus Afg AfcCf u Gf Uf Uf u Uf 867 3601 asCfsaAfaAfgCfaAfaacAfgG 1418
gCfuUfuUfgUfL96 fuCfuAfgs(Aam)a
AD-59225.1
Cfsus Afg AfcCf u Gf Uf Uf u Uf 868 3601 asCfsaAfaAfgCfaAfaacAfgG 1419
gCfuUfuUfgUfL96 fuCfuAf(Gam)(Aam)a
AD-59229.1
Cfsus Afg AfcCf u Gf Uf Uf u Uf 869 3601 asCfsaAfaAfgCfaAfaacAfgG 1420
gCfuUfuUfgUfL96 fuCfuAfgs(Aams)a
AD-59234.1
Cfsus Afg AfcCf u Gf Uf Uf u Uf 870 3601 asCfsaAfaAfgCfaAfaacAfgG 1421
gCfuUfuUfgUfL96 fuCfuAf(Gams)(Aams)a
AD-59238.1
Cfsus Afg AfcCf u Gf Uf Uf u Uf 871 3601 (A3m)CfsaAfaAfgCfaAfaacA 1422
gCfuUfuUfgUfL96 fgGfuCfuAfgsasa
116
Nombre del dúplex
Nombre del oligo sentido Secuencia del oligo sentido SEC ID N°: Posición con respecto a NM_174936.3 Nombre del oligo antisentido Secuencia del oligo antisentido SEC ID N°:
AD-59241.1
Cfsus Afg AfcCf u Gf Uf Uf u Uf 872 3601 as(C3m)aAfaAfgCfaAfaacAf 1423
gCfuUfuUfgUfL96 gGfuCfuAfgsasa
AD-59245.1
Cfsus Afg AfcCf u Gf Uf Uf u Uf 873 3601 (Aam)CfsaAfaAfgCfaAfaacA 1424
gCfuUfuUfgUfL96 fgGfuCfuAfgsasa
AD-59250.1
Cfsus Afg AfcCf u Gf Uf Uf u Uf 874 3601 as(m5Cam)aAfaAfgCfaAfaa 1425
gCfuUfuUfgUfL96 cAfgGfuCfuAfgsasa
AD-59246.1
Cfsus Afg AfcCf u Gf Uf Uf u Uf 875 3602 asCfsaAfaAfgCfaAfaacAfgG 1426
gCfuUfuUfgUfL96 fuCfuAfsgsa
AD-59253.2
usAfsgAfcCfuGfUfUfuUfgC 876 3602 asCfsaAfaAfgCfaAfaacAfgG 1427
fuUfuUfgUfL96 fuCfuAfsgsa
AD-59242.1
Afsgs AfcCf u Gf Uf Uf u UfgCf 877 3602 asCfsaAfaAfgCfaAfaacAfgG 1428
uUfuUfgUfL96 fuCfuAfsgsa
AD-59253.1
usAfsgAfcCfuGfUfUfuUfgC 878 3602 asCfsaAfaAfgCfaAfaacAfgG 1429
fuUfuUfgUfL96 fuCfuAfsgsa
AD-59258.1
usasgAfcCfuGfUfUfu UfgCf 879 3602 asCfsaAfaAfgCfaAfaacAfgG 1430
uUfuUfgUfL96 fuCfuAfsgsa
AD-59251.1
Cfsus Afg AfcCf u Gf Uf Uf u Uf 880 3603 asCfsaAfaAfgCfaAfaacAfgG 1431
gCfuUfuUfgUfL96 fuCfusAfsg
AD-59256.1
usAfsgAfcCfuGfUfUfuUfgC 881 3604 asCfsaAfaAfgCfaAfaacAfgG 1432
fuUfuUfgUfL96 fuCfsusAf
AD-59260.1
Afsgs AfcCf u Gf Uf Uf u UfgCf 882 3605 asCfsaAfaAfgCfaAfaacAfgG 1433
uUfuUfgUfL96 fusCfsu
AD-59248.1
gsAfscCfuGfUfUfuUfgCfuU 883 3605 asCfsaAfaAfgCfaAfaacAfgG 1434
fuUfgUfL96 fusCfsu
AD-59247.1
gsAfscCfuGfUfUfuUfgCfuU 884 3604 asCfsaAfaAfgCfaAfaa c Afg G 1435
fuUfgUfL96 fuCfsusa
AD-59252.1
Afsgs AfcCf u Gf Uf Uf u UfgCf 885 3604 asCfsaAfaAfgCfaAfaacAfgG 1436
uUfuUfgUfL96 fuCfsusa
AD-59257.1
usAfsgAfcCfuGfUfUfuUfgC 886 3604 asCfsaAfaAfgCfaAfaacAfgG 1437
fuUfuUfgUfL96 fuCfsusa
117
Nombre del dúplex
Nombre del oligo sentido Secuencia del oligo sentido SEC ID N°: Posición con respecto a NM_174936.3 Nombre del oligo antisentido Secuencia del oligo antisentido SEC ID N°:
AD-59261.1
Afsgs AfcCf u Gf Uf Uf u UfgCf 887 3603 asCfsaAfaAfgCfaAfaacAfgG 1438
uUfuUfgUfL96 fuCfusasg
AD-59262.1
usAfsgAfcCfuGfUfUfuUfgC 888 3603 asCfsaAfaAfgCfaAfaacAfgG 1439
fuUfuUfgUfL96 fuCfusasg
AD-59265.1
csu sAfgAf cCf u Gf Uf Uf u Ufg 889 3603 asCfsaAfaAfgCfaAfaacAfgG 1440
CfuUfuUfgUfL96 fuCfusasg
AD-59196.13
usAfsgAfcCfuGfUfUfuUfgC 890 3601 asCfsaAfaAfgCfaAfaacAfgG 1441
fuUfuUfgUfL96 fuCfuAfgsasa
AD-59189.11
Afsgs AfcCf u Gf Uf Uf u UfgCf 891 3601 asCfsaAfaAfgCfaAfaacAfgG 1442
uUfuUfgUfL96 fuCfuAfgsasa
AD-59190.3
u sCfs u Afg AfcCf u GfUfUfuU 892 3601 asCfsaAfaAfgCfaAfaacAfgG 1443
fgCfuUfuUfgUfL96 fuCfuAfgsasa
AD-59192.3
UfsusCfuAfgAfcCfuGfUfUf 893 3601 asCfsaAfaAfgCfaAfaacAfgG 1444
u UfgCf u Ufu Ufg Uf L96 fuCfuAfgsasa
AD-59240.1
Cfs usAfg AfcCf u Gfu u u ugCf 894 3601 asCfsaAfaAfsgCfaAfaacAfg 1445
uuuuguL96 Gfu Cf u Afg s( A3 m) a
AD-59244.1
Cfs usAfg AfcCf u Gfu u u ugCf 895 3601 asCfsaAfaAfsgCfaAfaacAfg 1446
uuuuguL96 GfuCfuAfgsasa
AD-59202.7
(C3m)usagaccuguuuugcuu 896 3601 asCfsaAfaAfgCfaAfaacAfgG 1447
uuguL96 fuCfuAfgsasa
AD-59195.5
(C3 m )u sAfg AfcCf uGfu u u u 897 3601 asCfsaAfaAfgCfaAfaacAfgG 1448
gCfuuuuguL96 fuCfuAfgsasa
AD-59249.1
Cfs us Afg AfcCf u GfUfUfuug 898 3601 asCfsaAfaAfgCfaAfaacAfgG 1449
CfuuuuguL96 fuCfuAfgs(A3m)a
AD-59254.1
Cfs usAfg AfcCf u Gfu u u ugCf 899 3601 asCfsaAfaAfgCfaAfaacAfgG 1450
uuuuguL96 fuCfuAfgs(A3m)a
AD-59259.1
(C3 m )u sAfg AfcCf uGfu u u u 900 3601 asCfsaAfaAfgCfaAfaacAfgG 1451
gCfuuuuguL96 fuCfuAfgs(A3m)a
AD-59264.1
(C3m)usagaccuguuuugcuu 901 3601 asCfsaAfaAfgCfaAfaacAfgG 1452
uuguL96 fuCfuAfgs(A3m)a
118
Nombre del dúplex
Nombre del oligo sentido Secuencia del oligo sentido SEC ID N°: Posición con respecto a NM_174936.3 Nombre del oligo antisentido Secuencia del oligo antisentido SEC ID N°:
AD-59264.2
(C3m)usagaccuguuuugcuu 902 3601 asCfsaAfaAfgCfaAfaacAfgG 1453
uuguL96 fuCfuAfgs(A3m)a
AD-59255.1
CsusagaccuGfUfUfuugcuu 903 3601 asCfsaAfaAfgCfaAfaacAfgG 1454
uuguL96 fuCfuAfgs(A3m)a
AD-57928.1
Cfsus Afg AfcCf u Gf Uf Uf u Uf 904 3601 asCfsaAfaAfgCfaAfaacAfgG 1455
gCfuUfuUfgUfL96 fuCfuAfgsasa
AD-58893.1
Cfsu AfgAfcCfuGfUfUfu Ufg 905 3601 as Cf a Af a Af gCf a Af aa cAf g Gf 1456
CfuUfuUfgUfL96 uCfuAfgasa
AD-58894.1
Cf usAfgAfcCf u Gf Uf Uf u Ufg 906 3601 aCfsaAfaAfgCfaAfaacAfgGf 1457
CfuUfuUfgUfL96 uCfuAfgsaa
AD-58895.1
CfuAfgAfcCfuGfUfUfuUfgC 907 3601 asCfsaAfaAfgCfaAfaacAfgG 1458
fuUfuUfgUfL96 fuCfuAfgsasa
AD-58896.1
Cfsus Afg AfcCf u Gf Uf Uf u Uf 908 3601 aCfaAfaAfgCfaAfaacAfgGfu 1459
gCfuUfuUfgUfL96 CfuAfgaa
AD-58897.1
CfsusAfsgAfcCfuGfUfUfuU 909 3601 asCfsasAfaAfgCfaAfaacAfg 1460
fgCfuUfuUfgUfL96 GfuCfuAfsgsasa
AD-58898.1
CfsusAfsgAfcCfuGfUfUfuU 910 3601 asCfsaAfaAfgCfsaAfaacAfs 1461
fgCfuUfuUfgUfL96 gGfuCfuAfsgsasa
AD-58899.1
CfsusAfsgAfcCfuGfUfUfuU 911 3601 asCfsaAfaAfgCfsaAfaacAfs 1462
fgCf u Ufu Ufsg Uf L96 gGfuCfuAfsgsasa
AD-58900.1
Cfsas Af g Cf a Gf a CfAf Uf u Uf 912 NA asAfsaAfaGfaUfaAfaugUfcU 1463
aUfcUfuUfuUfL96 fgCfuUfgscsu
AD-58902.1
Ufsus Ufu Cf u Afg AfCfCf u Gf 913 3597 asAfs gCf a Af a Afc Af g g u Cfu A 1464
uUfuUfgCfuUfL96 fgAfaAfasgsu
(A3 mx) (G3 mx) Af cCfu Gf Uf U 914 asCfsaAfaAfgCfaAfaacAfgGf 1465
fu UfgCf u Ufu UfgUf L96 uCfusasg
(A3 mx) (G3 mx) AfcCfu Gf Uf U 915 (A3mx)CfaAfaAfgCfaAfaacAf 1466
fu UfgCf u Ufu UfgUf L96 gGfuCfusasg
(A3 mx) (G3 mx) AfcCfu Gf Uf U 916 (A3mx)CfaAfaAfgCfaAfaacAf 1467
fu UfgCf u Ufu UfgUf L96 gGfuCfu(A3mx)g
119
Nombre del dúplex
Nombre del oligo sentido Secuencia del oligo sentido SEC ID N°: Posición con respecto a NM_174936.3 Nombre del oligo antisentido Secuencia del oligo antisentido SEC ID N°:
(A3mx)gAfcCfuGfUfUfullfg 917 asCfsaAfaAfgCfaAfaacAfgGf 1468
CfuUfuUfgUfL96 uCfusasg
(A3mx)gAfcCfuGfUfUfullfg 918 (A3mx)CfaAfaAfgCfaAfaacAf 1469
CfuUfuUfgUfL96 gGfuCfusasg
(A3mx)gAfcCfuGfUfUfullfg 919 (A3mx)CfaAfaAfgCfaAfaacAf 1470
CfuUfuUfgUfL96 gGfuCfu(A3mx)g
(C3 mx)( U 3mx) Afg AfcCf u Gf 920 asCfsa Af a Af g Cf a Af a ac Afg Gf 1471
Uf Uf u UfgCfu Uf u Ufg Uf L96 uCfuAfgsasa
(C3 mx)( U 3mx) Afg AfcCf u Gf 921 (A3mx)CfaAfaAfgCfaAfaacAf 1472
Uf Uf u UfgCfu Uf u Ufg Uf L96 gGfuCfuAf(G3mx)(A3mx)a
(C3 mx) u Afg AfcCf uGfUfUfu 922 asCfsaAfaAfgCfaAfaacAfgGf 1473
UfgCfu Ufu Ufg Uf L96 uCfuAfgsasa
(C3 mx) u Afg AfcCf uGfUfUfu 923 (A3mx)CfaAfaAfgCfaAfaacAf 1474
UfgCfu Ufu Ufg Uf L96 gGfuCfuAfgsasa
(C3 mx) u Afg AfcCf uGfUfUfu 924 (A3mx)CfaAfaAfgCfaAfaacAf 1475
UfgCfu Ufu Ufg Uf L96 gGfuCfuAfg(A3mx)a
(C3 mx) u Afg AfcCf uGfUfUfu 925 (A3mx)CfaAfaAfgCfaAfaacAf 1476
UfgCfu Ufu Ufg Uf L96 gGfuCfuAf(G3mx)(A3mx)a
(C3 mx) usAfgAfcCf u Gf UfUfu 926 asCfsaAfaAfgCfaAfaacAfgGf 1477
UfgCfu Ufu Ufg Uf L96 uCfuAfgsasa
(C hd)s usAfgAfcCf u Gf UfUfu 927 asCfsaAfaAfgCfaAfaacAfgGf 1478
UfgCfu Ufu Ufg Uf L96 uCfuAfgsasa
(p h e) Cf s u Afg AfcCf u GfU f U fu 928 asCfsaAfaAfgCfaAfaacAfgGf 1479
UfgCfu Ufu Ufg Uf L96 uCfuAfgsasa
(p h e) Cfu Afg AfcCf u Gf UfUfu 929 asCfsaAfaAfgCfaAfaacAfgGf 1480
UfgCfu Ufu Ufg Uf L96 uCfuAfgsasa
(ps h e) Cfs u Afg AfcCf u Gf Uf Uf 930 asCfsaAfaAfgCfaAfaacAfgGf 1481
u UfgCfu Ufu Ufg Uf L96 uCfuAfgsasa
(ps h e) Cfu Afg AfcCf u GfU f U fu 931 asCfsaAfaAfgCfaAfaacAfgGf 1482
UfgCfuUfuUfgUfL96 uCfuAfgsasa
120
Nombre del dúplex
Nombre del oligo sentido Secuencia del oligo sentido SEC ID N°: Posición con respecto a NM_174936.3 Nombre del oligo antisentido Secuencia del oligo antisentido SEC ID N°:
AfsgsAfcCfuGfUfUfuUfgCfu 932 (A3mx)CfaAfaAfgCfaAfaacAf 1483
UfuUfgUfL96 gGfuCfusasg
AfsgsAfcCfuGfUfUfuUfgCfu 933 (A3mx)CfaAfaAfgCfaAfaacAf 1484
UfuUfgUfL96 gGfuCfu(A3mx)g
Cfs(Uhd)sAfgAfcCfuGfUfUf 934 asCfsaAfaAfgCfaAfaacAfgGf 1485
u UfgCf u Uf u Ufg Uf L96 uCfuAfgsasa
CfsusAfgAf(Chd)CfuGfUfUf 935 asCfsaAfaAfgCfaAfaacAfgGf 1486
u UfgCf u Uf u Ufg Uf L96 uCfuAfgsasa
CfsusAfgAfc(Chd)uGfUfUfu 936 asCfsaAfaAfgCfaAfaacAfgGf 1487
UfgCf u Ufu Ufg Uf L96 uCfuAfgsasa
CfsusAfgAfcCf(Uhd)GfUfUf 937 asCfsaAfaAfgCfaAfaacAfgGf 1488
u UfgCf u Ufu Ufg Uf L96 uCfuAfgsasa
CfsusAfgAfcCfuGfUfUf(Uhd 938 asCfsaAfaAfgCfaAfaacAfgGf 1489
)UfgCfuUfuUfgUfL96 uCfuAfgsasa
CfsusAfgAfcCfuGfUfUfuUf( 939 asCfsa Af a Afg Cf a Af a ac Afg Gf 1490
Ggn)CfuUfuUfgUfL96 uCfuAfgsasa
CfsusAfgAfcCfuGfUfUfuUfg 940 asCfsaAfaAfgCfaAfaacAfgGf 1491
(Cgn)uUfuUfgUfL96 uCfuAfgsasa
CfsusAfgAfcCfuGfUfUfuUfg 941 asCfsaAfaAfgCfaAfaacAfgGf 1492
(Chd)uUfuUfgUfL96 uCfuAfgsasa
CfsusAfgAfcCfuGfUfUfuUfg 942 asCfsaAfaAfgCfaAfaacAfgGf 1493
Cf(Tgn)UfuUfgUfL96 uCfuAfgsasa
CfsusAfgAfcCfuGfUfUfuUfg 943 asCfsaAfaAfgCfaAfaacAfgGf 1494
Cf(Uhd)UfuUfgUfL96 uCfuAfgsasa
CfsusAfgAfcCfuGfUfUfuUfg 944 asCfsaAfaAfgCfaAfaacAfgGf 1495
Cfu(Tgn)uUfgUfL96 uCfuAfgsasa
CfsusAfgAfcCfuGfUfUfu Ufg 945 asCfsaAfaAfgCfaAfaacAfgGf 1496
CfuUf(Tgn)UfgUfL96 uCfuAfgsasa
CfsusAfgAfcCfuGfUfUfuUfg 946 asCfsaAfaAfgCfaAfaacAfgGf 1497
CfuUf(Uhd)UfgUfL96 uCfuAfgsasa
Nombre del dúplex
Nombre del oligo sentido Secuencia del oligo sentido SEC ID N°: Posición con respecto a NM_174936.3 Nombre del oligo antisentido Secuencia del oligo antisentido SEC ID N°:
CfsusAfgAfcCfuGfUfUfuUfg 947 asCfsaAfaAfgCfaAfaacAfgGf 1498
CfuUfu(Tgn)gUfL96 uCfuAfgsasa
CfsusAfgAfcCfuGfUfUfuUfg 948 asCfsaAfaAfgCfaAfaacAfgGf 1499
CfuUfu(Uhd)gUfL96 uCfuAfgsasa
CfsusAfgAfcCfuGfUfUfuUfg 949 asCfsaAfaAfgCfaAfaacAfgGf 1500
CfuUfuUf(Ggn)UfL96 uCfuAfgsasa
CfsusAfgAfcCfuGfUfUfuUfg 950 asCfsaAfaAfgCfaAfaacAfgGf 1501
CfuUfuUfg(Tgn)L96 uCfuAfgsasa
CfsusAfgAfcCfuGfUfUfuUfg 951 asCfsaAfaAfgCfaAfaacAfgGf 1502
CfuUfuUfg(Uhd)L96 uCfuAfgsasa
CfsusAfgAfcCfuGfUfUfuUfg 952 asCfsaAfaAfgCfaAfaacAfgGf 1503
CfuUfuUfgUfL96 uCfuAfgsasa
CfsusAfgAfcCfuGfUfUfuUfg 953 (Agn)CfsaAfaAfgCfaAfaacAf 1504
CfuUfuUfgUfL96 gGfuCfuAfgsasa
CfsusAfgAfcCfuGfUfUfuUfg 954 (Agn)CfaAfaAfgCfaAfaacAfg 1505
CfuUfuUfgUfL96 GfuCfuAfgsasa
CfsusAfgAfcCfuGfUfUfuUfg 955 P(Agn)CfaAfaAfgCfaAfaacAf 1506
CfuUfuUfgUfL96 gGfuCfuAfgsasa
CfsusAfgAfcCfuGfUfUfuUfg 956 as(Cgn)aAfaAfgCfaAfaacAfg 1507
CfuUfuUfgUfL96 GfuCfuAfgsasa
CfsusAfgAfcCfuGfUfUfuUfg 957 asCfs(Agn)AfaAfgCfaAfaacA 1508
CfuUfuUfgUfL96 fgGfuCfuAfgsasa
CfsusAfgAfcCfuGfUfUfuUfg 958 asCfsa(Agn)aAfgCfaAfaacAf 1509
CfuUfuUfgUfL96 gGfuCfuAfgsasa
CfsusAfgAfcCfuGfUfUfuUfg 959 asCfsaAf(Agn)AfgCfaAfaacA 1510
CfuUfuUfgUfL96 fgGfuCfuAfgsasa
CfsusAfgAfcCfuGfUfUfuUfg 960 asCfsaAfa(Agn)gCfaAfaacAf 1511
CfuUfuUfgUfL96 gGfuCfuAfgsasa
CfsusAfgAfcCfuGfUfUfuUfg 961 asCfsaAfaAf(Ggn )CfaAfaacA 1512
CfuUfuUfgUfL96 fgGfuCfuAfgsasa
122
Nombre del dúplex
Nombre del oligo sentido Secuencia del oligo sentido SEC ID N°: Posición con respecto a NM_174936.3 Nombre del oligo antisentido Secuencia del oligo antisentido SEC ID N°:
CfsusAfgAfcCfuGfUfUfuUfg 962 asCfsaAfaAfg(Cgn)aAfaacAf 1513
CfuUfuUfgUfL96 gGfuCfuAfgsasa
CfsusAfgAfcCfuGfUfUfuUfg 963 asCfsaAfaAfgCf(Agn)AfaacA 1514
CfuUfuUfgUfL96 fgGfuCfuAfgsasa
CfsusAfgAfcCfuGfUfUfuUfg 964 asCfsaAfaAfgCfa(Agn)aacAf 1515
CfuUfuUfgUfL96 gGfuCfuAfgsasa
CfsusAfgAfcCfuGfUfUfuUfg 965 asCfsaAfaAfgCfaAf(Agn)acA 1516
CfuUfuUfgUfL96 fgGfuCfuAfgsasa
CfsusAfgAfcCfuGfUfUfuUfg 966 asCfsaAfaAfgCfaAfa(Agn)cA 1517
CfuUfuUfgUfL96 fgGfuCfuAfgsasa
CfsusAfgAfcCfuGfUfUfuUfg 967 asCfsaAfaAfgCfaAfaa(Cgn)A 1518
CfuUfuUfgUfL96 fgGfuCfuAfgsasa
CfsusAfgAfcCfuGfUfUfuUfg 968 asCfsaAfaAfi Cf aAf aacAfiGfu 1519
CfuUfuUfgUfL96 CfuAfisasa
CfsusAfgAfcCfuGfUfUfuUfg 969 asCfsaAfaAfgCfaAfaacAfgGf 1520
CfuUfuUfgUfL96 uCfuAfg(A3mx)a
CfsusAfgAfcCfuGfUfUfuUfg 970 asCfsaAfaAfgCfaAfaacAfgGf 1521
CfuUfuUfgUfL96 uCfuAfgs(A3mx)a
CfsusAfgAfcCfuGfUfUfuUfg 971 asCfsaAfaAfgCfaAfaacAfgGf 1522
CfuUfuUfgUfL96 uCfuAf(G3mx)(A3mx)a
CfsusAfgAfcCfuGfUfUfuUfg 972 (A3mx)CfaAfaAfgCfaAfaacAf 1523
CfuUfuUfgUfL96 gGfuCfuAfgsasa
CfsusAfgAfcCfuGfUfUfuUfg 973 (A3mx)CfsaAfaAfgCfaAfaac 1524
CfuUfuUfgUfL96 AfgGfuCfuAfgsasa
CfsusAfgAfcCfuGfUfUfuUfg 974 P(A3mx)CfaAfaAfgCfaAfaac 1525
CfuUfuUfgUfL96 AfgGfuCfuAfgsasa
CfsusAfgAfcCfuGfUfUfuUfg 975 a(C3mx)aAfaAfgCfaAfaacAf 1526
CfuUfuUfgUfL96 gGfuCfuAfgsasa
CfsusAfgAfcCfuGfUfUfuUfg 976 as(C3mx)aAfaAfgCfaAfaacAf 1527
CfuUfuUfgUfL96 gGfuCfuAfgsasa
123
Nombre del dúplex
Nombre del oligo sentido Secuencia del oligo sentido SEC ID N°: Posición con respecto a NM_174936.3 Nombre del oligo antisentido Secuencia del oligo antisentido SEC ID N°:
CfsusAfgAfcCfuGfUfUfuUfg 977 (A3mx)(C3mx)aAfaAfgCfaAf 1528
CfuUfuUfgUfL96 aacAfgGfuCfuAfgsasa
CfsusAfgAfcCfuGfUfUfuUfg 978 (A3mx)CfaAfaAfgCfaAfaacAf 1529
CfuUfuUfgUfL96 gGfuCfuAfg(A3mx)a
CfsusAfgAfcCfuGfUfUfuUfg 979 (A3mx)CfsaAfaAfgCfaAfaac 1530
CfuUfuUfgUfL96 AfgGfuCfuAfgs(A3mx)a
CfsusAfgAfcCfuGfUfUfuUfg 980 (A3mx)CfaAfaAfgCfaAfaacAf 1531
CfuUfuUfgUfL96 gGfuCfuAf(G3mx)(A3mx)a
CfsusAfgAfcCfuGfUfUfuUfg 981 asCfsaAfaAfgCfaAfaacAfgGf 1532
CfuUfuUfgUfL96 uCfuAfgasas(phe)
CfsusAfgAfcCfuGfUfUfuUfg 982 asCfsaAfaAfgCfaAfaacAfgGf 1533
CfuUfuUfgUfL96 uCfuAfgaas(phe)
CfsusAfgAfcCfuGfUfUfuUfg 983 asCfsaAfaAfgCfaAfaacAfgGf 1534
CfuUfuUfgUfL96 uCfuAfgaa(phe)
CfsusAfgAfcCfuGfUfUfuUfg 984 asCfsaAfaAfgCfaAfaacAfgGf 1535
CfuUfuUfgUfL96 uCfuAfgsas(phe)
CfsusAfgAfcCfuGfUfUfuUfg 985 asCfsaAfaAfgCfaAfaacAfgGf 1536
CfuUfuUfgUfL96 uCfuAfgas(phe)
CfsusAfgAfcCfuGfUfUfuUfg 986 asCfsaAfaAfgCfaAfaacAfgGf 1537
CfuUfuUfgUfL96 uCfuAfga(phe)
CfsusAfgAfcCfuGfUfUfuUfg 987 asCfsaAfaAfgCfaAfaacAfgGf 1538
CfuUfuUfgUfL96 (Uhd)CfuAfgsasa
CfsusAfgAfcCfuGfUfUfuUfg 988 asCfsaAfaAfgCfaAfaacAfgGf 1539
CfuUfuUfgUfL96 uCf(Uhd)Afgsasa
CfsusAfgAfcCfuGfUfUfuUfg 989 asCfsaAfaAfg(Chd)aAfaacAf 1540
CfuUfuUfgUfL96 gGfuCfuAfgsasa
CfsusAfgAfcCfuGfUfUfuUfg 990 asCfsaAfaagCfaAfaacAfgGfu 1541
CfuUfuUfgUfL96 cuAfgsasa
CfsusAfgAfcCfuGfUfUfuUfg 991 asCfsaAfaAfgCfaAfaacAfgGf 1542
CfuUfuUfguL96 uCfuAfgsasa
124
Nombre del dúplex
Nombre del oligo sentido Secuencia del oligo sentido SEC ID N°: Posición con respecto a NM_174936.3 Nombre del oligo antisentido Secuencia del oligo antisentido SEC ID N°:
CfsusAfgAfcCfuGfUfUfuUfg CfuUfuUfguL96 992 asCfsaAfaagCfaAfaacAfgGfu cuAfgsasa 1543
CfsusAfgAfcCfuGfUfUfuUfg CfuUfuugUfL96 993 asCfsaAfaAfgCfaAfaacAfgGf uCfuAfgsasa 1544
CfsusAfgAfcCfuGfUfUfuUfg CfuUfuugUfL96 994 asCfsaAfaagCfaAfaacAfgGfu cuAfgsasa 1545
CfsusAfgAfcCfuGfUfUfuUfg CfuUfuuguL96 995 asCfsaAfaAfgCfaAfaacAfgGf uCfuAfgsasa 1546
CfsusAfgAfcCfuGfUfUfuUfg CfuUfuuguL96 996 asCfsaAfaagCfaAfaacAfgGfu cuAfgsasa 1547
CfsusAfgAfcCfuGfUfUfuUfg cuuuugUfL96 997 asCfsaAfaAfgCfaAfaacAfgGf uCfuAfgsasa 1548
CfsusAfgAfcCfuGfUfUfuUfg cuuuugUfL96 998 asCfsaAfaagCfaAfaacAfgGfu cuAfgsasa 1549
CfsusAfgAfcCfuGfUfUfuUfg cuuuuguL96 999 asCfsaAfaAfgCfaAfaacAfgGf uCfuAfgsasa 1550
CfsusAfgAfcCfuGfUfUfuUfg cuuuuguL96 1000 asCfsaAfaagCfaAfaacAfgGfu cuAfgsasa 1551
CfsusAfgAfcCfuGfUfUfuUfg UfuUfuUfgUfL96 1001 asCfsaAfaAfgCfaAfaacAfgGf uCfuAfgsasa 1552
CfsusAfgAfcCfuGfUfUfuUfi CfuUfuUf¡UfL96 1002 asCfsaAfaAfgCfaAfaacAfgGf uCfuAfgsasa 1553
CfsusAfgAfcCfuGfUfUfuUfi CfuUfuUfiUfL96 1003 as Cfs a Af a Af i Cf a Af aa cAf g Gf uCfuAfgsasa 1554
CfsusAfgAfcCfuGfUfUfuUfi CfuUfuUfiUfL96 1004 asCfsaAfaAfi Cf aAf aacAfiGfu CfuAfisasa 1555
CfsusAfiAfcCfuGfUfUfuUfiC fuUfuUfiUfL96 1005 asCfsaAfaAfi Cf aAf aacAfiGfu CfuAfisasa 1556
Se evaluó un subconjunto de estos dúplex para la eficacia en ensayos de captación libre de dosis única en hepatocitos de mono cinomolgo. Brevemente, se trataron hepatocitos de mono cinomolgo primarios (PCH) con los dúplex de ARNip modificados conjugados a tres concentraciones, 500 nM, 100 nM y 10 nM. Los ensayos de captación libre de 100 nM y 10 5 nM se realizaron dos veces y los datos se representan como mensajero promedio que queda con respecto al control +/- la desviación estándar (DE). El cribado a 500 nM se realizó una única vez. La Tabla 3 muestra los resultados de estos ensayos.
Tabla 3. Cribado de eficacia de PCSK9 por captación libre en hepatocitos de mono cinomolgo primarios.
ID del DÜPLEX
PCH 500 nM PCH 100nM Promedio PCH 10nM Promedio PCH 100 nM DE PCH10 nM DE
AD-48399
1.08 1.03 0.98 0.09 0.02
AD-48399
0.97 0.95 1.10 0.03 0.09
AD-48399
0.89 0.98 1.02 0.06 0.06
AD-48399
1.04 1.00 1.01 0.02 0.08
AD-48399
0.92 1.03 0.96 0.02 0.09
AD-48399
1.13 1.03 0.96 0.05 0.01
AD-48400
0.48 0.63 0.90 0.04 0.00
AD-48400.4
0.65 0.78 0.89 0.14 0.13
AD-53649.1
0.96 0.96 1.14 0.02 0.07
AD-53650.1
0.97 0.92 1.15 0.01 0.06
AD-53651.1
1.02 0.98 1.15 0.13 0.10
AD-53652.1
0.83 0.89 1.14 0.20 0.05
AD-53653.1
0.85 0.95 1.26 0.04 0.07
AD-53654.1
0.84 0.93 1.19 0.02 0.13
AD-53656.1
0.92 0.92 1.07 0.05 0.03
AD-53657.1
0.92 0.89 1.02 0.05 0.03
AD-53658.1
0.89 0.83 0.97 0.04 0.14
AD-53659.1
0.79 0.82 1.05 0.06 0.13
AD-53660.1
0.89 0.86 0.98 0.07 0.07
AD-53661.1
0.92 1.03 1.07 0.02 0.04
AD-53663.1
0.88 0.90 1.08 0.03 0.02
AD-53664.1
0.95 0.86 1.00 0.09 0.13
AD-53665.1
0.92 0.91 1.05 0.01 0.13
AD-53666.1
0.73 0.80 0.95 0.08 0.02
AD-53667.1
0.95 0.96 1.12 0.06 0.03
AD-53668.1
1.03 0.89 1.17 0.03 0.12
ID del DÜPLEX
PCH 500 nM PCH 100nM Promedio PCH 10nM Promedio PCH 100 nM DE PCH10 nM DE
AD-53669.1
1.12 0.90 1.05 0.01 0.15
AD-53670.1
0.85 0.88 1.00 0.06 0.06
AD-53671.1
0.87 0.90 0.93 0.02 0.04
AD-53672.1
0.87 0.86 0.95 0.04 0.16
AD-53674.1
0.69 0.75 0.92 0.08 0.02
AD-53675.1
0.99 0.92 1.17 0.11 0.06
AD-53676.1
0.90 0.87 1.10 0.03 0.08
AD-53677.1
1.22 0.86 1.12 0.10 0.04
AD-53678.1
1.01 0.98 1.03 0.03 0.12
AD-53679.1
0.96 0.85 1.02 0.04 0.11
AD-53680.1
1.21 0.94 0.99 0.03 0.01
AD-53681.1
1.02 0.94 1.01 0.01 0.11
AD-53682.1
0.98 0.90 1.01 0.06 0.11
AD-53683.1
0.95 0.90 1.01 0.02 0.08
AD-53684.1
1.14 1.01 1.01 0.09 0.07
AD-53685.1
0.96 0.92 1.03 0.00 0.07
AD-53687.1
1.31 0.91 1.02 0.02 0.11
AD-53688.1
0.90 0.95 0.96 0.03 0.03
AD-53689.1
0.97 0.95 1.05 0.04 0.07
AD-53690.1
0.82 0.97 0.99 0.13 0.08
AD-53691.1
0.99 1.01 0.97 0.01 0.12
AD-53692.1
1.11 0.91 1.00 0.04 0.03
AD-53693.1
1.02 0.96 1.02 0.04 0.10
AD-53694.1
1.12 0.98 0.97 0.07 0.06
AD-53695.1
0.97 1.04 0.94 0.11 0.08
AD-53696.1
0.85 0.91 1.23 0.10 0.01
AD-53697.1
0.89 0.91 1.06 0.03 0.00
AD-53698.1
0.90 0.86 1.15 0.06 0.01
AD-53699.1
0.84 0.85 1.07 0.00 0.03
AD-53700.1
0.93 1.02 1.21 0.02 0.15
AD-53701.1
1.01 0.96 1.12 0.00 0.17
AD-53702.1
0.95 0.94 1.06 0.05 0.15
ID del DÜPLEX
PCH 500 nM PCH 100nM Promedio PCH 10nM Promedio PCH 100 nM DE PCH10 nM DE
AD-53703.1
0.82 0.85 1.04 0.07 0.13
AD-53704.1
0.92 0.97 0.94 0.04 0.02
AD-53705.1
0.96 0.98 1.00 0.11 0.15
AD-53706.1
0.90 0.97 1.03 0.01 0.20
AD-53707.1
0.86 0.98 1.11 0.14 0.24
AD-53708.1
1.10 0.94 1.05 0.02 0.15
AD-53709.1
0.79 0.84 1.08 0.01 0.18
AD-53710.1
1.03 0.91 1.06 0.01 0.09
AD-53711.1
0.90 0.90 0.99 0.00 0.28
AD-53712.1
0.97 0.92 0.97 0.00 0.12
AD-53713.1
0.98 0.93 1.07 0.01 0.16
AD-53714.1
1.09 0.86 0.99 0.03 0.09
AD-53715.1
1.04 0.83 0.94 0.06 0.06
AD-53716.1
0.82 0.85 1.02 0.05 0.14
AD-53717.1
0.98 0.94 0.98 0.11 0.12
AD-53718.1
0.89 1.04 1.01 0.18 0.01
AD-53719.1
0.98 1.05 1.05 0.06 0.17
AD-53720.1
1.02 0.88 1.08 0.01 0.15
AD-53721.1
0.88 0.95 1.03 0.07 0.11
AD-53722.1
0.98 0.95 1.01 0.06 0.12
AD-53723.1
0.89 0.89 1.02 0.10 0.06
AD-53724.1
0.98 0.93 1.00 0.13 0.01
AD-53725.1
1.04 1.05 1.09 0.19 0.11
AD-53726.1
0.87 0.88 0.88 0.00 0.02
AD-53727.1
0.82 0.92 1.02 0.05 0.13
AD-53728.1
0.86 0.93 1.06 0.03 0.08
AD-53729.1
0.86 0.81 1.02 0.12 0.03
AD-53730.1
1.01 0.95 1.02 0.07 0.01
AD-53731.1
0.99 0.98 1.00 0.08 0.07
AD-53732.1
0.93 0.86 1.01 0.12 0.11
AD-53733.1
1.06 1.02 1.08 0.05 0.06
AD-53734.1
0.95 0.93 1.04 0.12 0.05
ID del DÜPLEX
PCH 500 nM PCH 100nM Promedio PCH 10nM Promedio PCH 100 nM DE PCH10 nM DE
AD-53735.1
1.00 0.93 1.01 0.02 0.06
AD-53736.1
0.90 1.09 1.16 0.05 0.01
AD-53737.1
0.94 0.93 1.00 0.02 0.09
AD-53738.1
0.93 0.79 0.93 0.03 0.01
AD-53739.1
1.11 0.90 0.90 0.05 0.00
AD-53740.1
0.86 0.92 0.97 0.08 0.01
AD-53741.1
0.96 0.84 0.92 0.00 0.07
AD-53742.1
1.03 0.93 1.03 0.04 0.06
AD-53743.1
0.92 0.98 1.05 0.08 0.14
AD-53744.1
0.95 1.02 1.03 0.08 0.12
AD-53745.1
0.81 0.99 1.11 0.10 0.18
AD-53746.1
0.65 0.83 1.04 0.07 0.16
AD-53747.1
0.82 0.88 1.02 0.05 0.13
AD-53748.1
0.46 0.59 0.72 0.06 0.07
AD-53749.1
0.93 0.90 1.04 0.12 0.16
AD-53750.1
0.90 1.02 0.97 0.02 0.10
AD-53751.1
0.92 0.87 1.02 0.19 0.16
AD-53752.1
0.73 0.88 0.99 0.06 0.18
AD-53753.1
0.87 0.97 1.06 0.07 0.19
AD-53754.1
0.43 0.58 0.72 0.10 0.05
AD-53755.1
1.01 0.99 1.03 0.03 0.02
AD-53757.1
0.98 0.91 1.07 0.05 0.13
AD-53758.1
0.63 0.73 0.92 0.05 0.00
AD-53759.1
0.91 0.92 0.99 0.02 0.08
AD-53760.1
0.51 0.67 0.80 0.03 0.12
AD-53761.1
0.89 1.07 1.10 0.11 0.18
AD-53762.1
1.06 1.00 0.96 0.12 0.10
AD-53763.1
0.95 1.10 1.00 0.07 0.09
AD-53764.1
0.99 0.94 0.99 0.05 0.16
AD-53765.1
0.92 0.87 0.86 0.09 0.11
AD-53766.1
0.75 0.78 0.86 0.09 0.14
AD-53767.1
1.01 1.02 0.97 0.05 0.18
ID del DÜPLEX
PCH 500 nM PCH 100nM Promedio PCH 10nM Promedio PCH 100 nM DE PCH10 nM DE
AD-53768.1
0.89 1.07 0.97 0.09 0.15
AD-53769.1
0.89 1.11 0.95 0.05 0.11
AD-53770.1
0.76 1.01 0.98 0.01 0.12
AD-53771.1
0.70 0.74 0.84 0.06 0.12
AD-53772.1
0.72 0.83 0.85 0.04 0.11
AD-53773.1
0.96 1.00 0.98 0.05 0.07
AD-53774.1
0.75 0.92 1.01 0.06 0.14
AD-53776.1
0.78 0.94 0.97 0.11 0.08
AD-53777.1
0.67 0.68 0.74 0.11 0.01
AD-53778.1
0.74 0.73 0.92 0.13 0.14
AD-53779.1
1.00 0.98 0.95 0.14 0.04
AD-53780.1
0.90 0.92 0.98 0.12 0.05
AD-53781.1
0.84 0.95 1.00 0.17 0.06
AD-53782.1
0.87 0.92 0.90 0.11 0.02
AD-53783.1
0.71 0.79 0.78 0.14 0.03
AD-53784.1
0.68 0.82 0.86 0.10 0.10
AD-53785.1
1.10 0.96 0.96 0.09 0.07
AD-53786.1
0.98 0.89 0.95 0.20 0.14
AD-53787.1
1.23 0.93 1.00 0.11 0.21
AD-53788.1
0.95 0.90 0.94 0.17 0.08
AD-53789.1
0.55 0.60 0.78 0.09 0.08
AD-53790.1
0.70 0.91 1.04 0.08 0.16
AD-53791.1
0.47 0.67 0.92 0.12 0.09
AD-53792.1
0.52 0.75 0.89 0.06 0.04
AD-53793.1
0.88 1.03 1.07 0.20 0.09
AD-53794.1
0.85 1.00 1.09 0.17 0.22
AD-53795.1
0.58 0.71 1.00 0.10 0.12
AD-53796.1
0.62 0.78 0.96 0.07 0.12
AD-53797.1
0.72 0.78 0.93 0.12 0.10
AD-53798.1
0.50 0.55 0.76 0.08 0.03
AD-53799.1
0.98 0.92 1.10 0.11 0.21
AD-53800.1
0.59 0.65 0.87 0.15 0.14
ID del DÜPLEX
PCH 500 nM PCH 100nM Promedio PCH 10nM Promedio PCH 100 nM DE PCH10 nM DE
AD-53801.1
0.81 0.84 1.05 0.14 0.18
AD-53802.1
0.68 0.79 1.03 0.13 0.13
AD-53803.1
0.51 0.53 0.77 0.09 0.05
AD-53804.1
0.94 0.86 1.05 0.15 0.15
AD-53805.1
0.95 0.93 1.03 0.12 0.19
AD-53806.1
0.38 0.45 0.78 0.05 0.12
AD-53807.1
0.85 0.95 1.15 0.09 0.24
AD-53808.1
0.81 0.85 0.93 0.08 0.11
AD-53809.1
0.50 0.62 0.77 0.00 0.12
AD-53810.1
0.84 0.82 0.98 0.16 0.22
AD-53811.1
0.94 0.95 1.00 0.10 0.11
AD-53812.1
0.61 0.76 0.97 0.14 0.22
AD-53813.1
0.67 0.76 0.94 0.01 0.15
AD-53814.1
0.58 0.67 0.84 0.11 0.19
AD-53815.1
0.49 0.50 0.72 0.09 0.17
AD-53816.1
0.82 0.91 0.93 0.08 0.10
AD-53817.1
0.92 0.94 1.07 0.13 0.36
AD-53818.1
0.83 0.99 0.99 0.07 0.41
AD-53819.1
0.61 0.75 0.88 0.24 0.16
AD-53820.1
0.71 0.81 0.92 0.17 0.04
AD-53821.1
0.56 0.54 0.68 0.13 0.05
AD-53822.1
1.24 0.88 1.05 0.12 0.17
AD-53823.1
1.03 0.86 0.99 0.11 0.18
AD-53824.1
0.76 0.73 0.93 0.16 0.11
AD-53825.1
0.57 0.63 0.82 0.18 0.04
AD-53826.1
0.54 0.51 0.78 0.08 0.07
AD-53827.1
0.99 0.91 1.05 0.12 0.08
AD-53828.1
0.69 0.77 0.87 0.09 0.16
AD-53829.1
0.72 0.91 0.95 0.11 0.16
AD-53830.1
0.48 0.73 0.76 0.11 0.01
AD-53831.1
0.97 0.92 1.00 0.22 0.25
AD-53832.1
0.68 0.63 0.81 0.15 0.02
ID del DÜPLEX
PCH 500 nM PCH 100nM Promedio PCH 10nM Promedio PCH 100 nM DE PCH10 nM DE
AD-53833.1
0.92 0.90 0.84 0.20 0.03
AD-53834.1
1.15 0.93 0.86 0.16 0.02
AD-53835.1
0.88 0.79 0.81 0.18 0.03
PBS
0.90 1.02 0.99 0.04 0.15
Los dúplex de ARNip de PCSK9 modificados y conjugados también se evaluaron para la eficacia por ensayos de transfección en tres líneas celulares humanas. Se transfectaron ARNip de PCSK9 en tres líneas celulares diferentes, HeLa, Hep3B y HepG2 a dos dosis, 10 nM y 0.1 nM. Los resultados de estos ensayos se muestran en la Tabla 4 y los datos se expresan como una fracción del mensajero que queda con respecto al control.
5 La Figura 1 muestra que hay una reproducibilidad general en la actividad de silenciamiento de los dúplex de PCSK9 entre los ensayos de captación libre y los ensayos de transfección.
Los valores de CI50 para los dúplex seleccionados por captación libre en células de cinomolgo y por transfección en células Hep3B se muestran en la Tabla 5.
Tabla 4. Cribado de la eficacia de PCSK9 por transfección en líneas celulares humanas.
ID del DÜPLEX
Hela, 10 nM Hela, 0.1 nM Hep3b, 10 nM Hep3b, 0.1 nM HepG2, 10 nM HepG2, 0.1 nM
AD-48399
0.94 0.90 1.18 1.03 1.34 1.05
AD-48399
0.90 1.03 0.87 0.88 0.84 0.91
AD-48399
0.88 1.14 0.90 0.99 0.92 1.04
AD-48399
1.22 0.97 0.95 0.98 0.81 0.92
AD-48399
1.04 0.81 1.01 1.10 1.03 1.09
AD-48399
1.06 1.20 1.14 1.04 1.16 1.01
AD-48400
0.05 0.63 0.10 0.51 0.17 0.69
AD-48400.4
0.06 0.28 0.14 0.31 0.13 0.32
AD-53649.1
0.84 1.05 1.07 0.94 0.97 1.11
AD-53650.1
0.16 0.87 0.41 0.87 0.52 1.12
AD-53651.1
0.47 0.86 0.49 0.92 0.71 1.08
AD-53652.1
0.34 0.93 0.50 0.96 0.40 1.21
AD-53653.1
0.36 0.99 0.43 1.01 0.52 1.13
AD-53654.1
0.85 1.06 0.99 0.92 0.95 1.06
AD-53656.1
0.46 0.92 0.78 0.98 0.80 0.74
AD-53657.1
0.71 0.97 0.75 1.01 0.81 0.94
AD-53658.1
0.32 0.97 0.50 0.91 0.58 1.05
AD-53659.1
0.11 0.86 0.24 0.93 0.22 0.94
AD-53660.1
0.35 1.12 0.43 0.99 0.44 1.31
ID del DÚPLEX
Hela, 10 nM Hela, 0.1 nM Hep3b, 10 nM Hep3b, 0.1 nM HepG2, 10 nM HepG2, 0.1 nM
AD-53661.1
0.94 1.07 0.85 0.95 0.88 0.92
AD-53663.1
0.82 1.03 0.74 1.06 1.04 1.04
AD-53664.1
0.60 0.94 0.61 1.06 0.85 1.28
AD-53665.1
0.33 1.00 0.55 1.01 0.45 1.12
AD-53666.1
0.09 0.98 0.22 0.97 0.21 1.08
AD-53667.1
0.94 1.07 0.95 0.96 0.95 1.02
AD-53668.1
0.27 0.88 0.36 1.07 0.35 1.13
AD-53669.1
0.81 1.02 0.93 1.08 1.35 1.24
AD-53670.1
0.55 0.94 0.52 0.48 0.45 1.13
AD-53671.1
0.68 1.07 0.78 1.02 0.82 1.27
AD-53672.1
0.22 1.04 0.38 1.06 0.34 1.15
AD-53674.1
0.08 0.67 0.15 0.85 0.15 0.80
AD-53675.1
0.25 1.04 0.43 0.95 0.38 1.04
AD-53676.1
0.81 0.94 0.90 1.14 0.98 1.06
AD-53677.1
0.45 0.90 0.70 0.98 0.70 1.14
AD-53678.1
0.41 1.02 0.72 1.04 0.70 1.15
AD-53679.1
0.44 0.93 0.58 0.88 0.50 0.95
AD-53680.1
0.36 0.99 0.55 0.98 0.52 0.96
AD-53681.1
0.33 0.93 0.57 1.12 0.54 1.11
AD-53682.1
0.84 0.94 0.85 1.06 0.93 1.13
AD-53683.1
0.65 0.78 0.95 1.05 0.73 1.06
AD-53684.1
0.57 0.98 0.79 0.92 0.62 1.08
AD-53685.1
0.85 0.90 0.94 0.95 0.69 0.98
AD-53687.1
0.15 0.83 0.39 1.09 0.34 1.23
AD-53688.1
0.45 0.89 0.72 1.01 0.57 1.19
AD-53689.1
0.56 0.93 1.04 1.14 0.59 1.24
AD-53690.1
0.45 0.79 0.53 1.26 0.41 1.22
AD-53691.1
0.82 1.03 0.91 1.22 0.57 1.05
AD-53692.1
0.68 0.81 0.81 0.89 0.82 1.05
AD-53693.1
0.61 0.92 0.85 0.81 0.53 1.03
AD-53694.1
0.59 0.87 0.58 1.01 0.53 0.82
ID del DÚPLEX
Hela, 10 nM Hela, 0.1 nM Hep3b, 10 nM Hep3b, 0.1 nM HepG2, 10 nM HepG2, 0.1 nM
AD-53695.1
0.91 0.78 1.02 1.23 1.14 1.11
AD-53696.1
0.57 0.98 0.82 1.01 0.68 1.05
AD-53697.1
0.31 1.04 0.40 0.95 0.24 0.90
AD-53698.1
0.17 0.97 0.31 0.92 0.32 0.84
AD-53699.1
0.29 1.00 0.47 0.90 0.47 1.23
AD-53700.1
0.81 1.07 0.94 0.99 0.97 1.08
AD-53701.1
0.89 1.07 0.96 0.84 0.65 0.93
AD-53702.1
0.45 1.03 0.84 1.08 0.72 0.99
AD-53703.1
0.18 0.79 0.28 0.97 0.29 0.90
AD-53704.1
0.77 0.80 0.88 1.06 0.91 0.95
AD-53705.1
0.63 0.89 0.81 1.06 0.76 0.97
AD-53706.1
0.39 0.82 0.41 1.00 0.48 0.88
AD-53707.1
0.42 0.97 0.60 0.83 0.54 0.80
AD-53708.1
0.49 0.95 0.82 0.96 1.07 1.09
AD-53709.1
0.19 0.90 0.43 0.85 0.38 1.05
AD-53710.1
0.66 1.00 0.82 0.85 0.69 1.08
AD-53711.1
0.40 0.90 0.45 0.95 0.23 1.03
AD-53712.1
0.47 0.99 0.51 0.94 0.62 0.97
AD-53713.1
0.52 1.05 0.69 0.83 0.79 0.94
AD-53714.1
0.43 1.01 0.71 1.11 0.75 1.12
AD-53715.1
0.23 0.99 0.58 1.24 0.58 1.09
AD-53716.1
0.39 1.00 0.52 0.98 0.51 0.80
AD-53717.1
0.20 0.84 0.33 1.02 0.41 1.09
AD-53718.1
0.35 1.08 0.33 1.02 0.45 0.97
AD-53719.1
0.58 0.96 0.74 0.84 0.79 1.01
AD-53720.1
0.31 1.00 0.55 1.09 0.48 1.24
AD-53721.1
0.26 1.02 0.62 0.92 0.49 0.94
AD-53722.1
0.50 0.99 0.86 0.99 0.87 1.26
AD-53723.1
0.28 0.86 0.37 0.92 0.54 1.11
AD-53724.1
0.18 1.11 0.20 0.98 0.36 1.05
AD-53725.1
0.47 1.00 0.63 0.95 0.60 1.04
ID del DÚPLEX
Hela, 10 nM Hela, 0.1 nM Hep3b, 10 nM Hep3b, 0.1 nM HepG2, 10 nM HepG2, 0.1 nM
AD-53726.1
0.19 1.01 0.42 0.96 0.41 1.21
AD-53727.1
0.55 0.82 0.77 1.08 0.68 1.35
AD-53728.1
0.44 0.92 0.65 1.11 0.68 1.44
AD-53729.1
0.11 0.92 0.25 0.94 0.11 1.01
AD-53730.1
0.31 0.91 0.51 1.05 0.59 1.34
AD-53731.1
0.26 0.63 0.42 0.95 0.44 1.07
AD-53732.1
0.17 0.87 0.29 0.99 0.36 0.98
AD-53733.1
1.06 0.72 1.21 1.14 1.07 1.28
AD-53734.1
0.79 0.92 0.93 0.98 0.90 1.33
AD-53735.1
0.54 0.87 0.83 1.12 0.66 1.24
AD-53736.1
0.40 0.69 0.76 1.09 0.76 1.11
AD-53737.1
0.29 0.82 0.41 1.04 0.39 0.96
AD-53738.1
0.19 0.70 0.24 1.09 0.28 1.10
AD-53739.1
0.91 0.94 0.72 1.07 0.78 1.09
AD-53740.1
0.17 1.06 0.42 1.07 0.32 1.05
AD-53741.1
0.17 0.91 0.32 0.99 0.41 1.05
AD-53742.1
0.55 1.07 0.69 0.97 0.72 1.08
AD-53743.1
0.71 0.99 0.75 0.76 0.58 1.08
AD-53744.1
0.13 0.86 0.50 0.69 0.36 0.87
AD-53745.1
0.46 0.91 0.78 0.72 0.87 0.94
AD-53746.1
0.13 0.82 0.23 0.50 0.28 0.90
AD-53747.1
0.29 1.08 0.54 0.77 0.50 1.07
AD-53748.1
0.04 0.22 0.12 0.21 0.20 0.32
AD-53749.1
0.56 0.76 0.48 0.81 0.53 0.85
AD-53750.1
0.61 0.75 0.69 0.81 0.81 1.07
AD-53751.1
0.25 0.69 0.37 0.72 0.26 0.77
AD-53752.1
0.11 0.43 0.13 0.40 0.16 0.61
AD-53753.1
0.70 0.76 0.75 0.92 0.63 1.09
AD-53754.1
0.06 0.31 0.10 0.34 0.12 0.40
AD-53755.1
0.46 0.91 0.66 0.84 0.56 0.79
AD-53757.1
0.61 0.90 0.50 0.89 0.44 0.91
ID del DÚPLEX
Hela, 10 nM Hela, 0.1 nM Hep3b, 10 nM Hep3b, 0.1 nM HepG2, 10 nM HepG2, 0.1 nM
AD-53758.1
0.11 0.31 0.11 0.29 0.11 0.60
AD-53759.1
0.61 0.87 0.57 0.84 0.56 0.98
AD-53760.1
0.05 0.36 0.14 0.42 0.12 0.53
AD-53761.1
0.95 0.99 0.76 0.72 0.55 0.61
AD-53762.1
0.58 1.18 0.74 0.88 0.69 0.88
AD-53763.1
0.16 0.86 0.19 0.64 0.21 0.75
AD-53764.1
0.70 0.91 0.54 0.85 0.59 0.94
AD-53765.1
0.16 0.63 0.38 0.64 0.30 0.87
AD-53766.1
0.09 0.72 0.16 0.67 0.18 0.63
AD-53767.1
0.30 1.14 0.69 0.83 0.71 0.83
AD-53768.1
0.50 0.98 0.75 0.98 0.52 1.06
AD-53769.1
0.36 1.07 0.26 0.62 0.39 0.83
AD-53770.1
0.27 1.08 0.45 1.00 0.44 1.25
AD-53771.1
0.18 0.62 0.19 0.44 0.21 0.65
AD-53772.1
0.12 0.75 0.30 0.66 0.18 0.85
AD-53773.1
0.39 0.98 0.60 0.84 0.19 1.00
AD-53774.1
0.07 0.54 0.25 0.40 0.20 0.71
AD-53776.1
0.33 0.97 0.45 0.94 0.34 0.95
AD-53777.1
0.06 0.39 0.18 0.30 0.11 0.41
AD-53778.1
0.09 0.72 0.24 0.69 0.23 0.78
AD-53779.1
0.47 0.66 0.68 0.67 0.57 0.81
AD-53780.1
0.29 0.93 0.61 0.71 0.42 0.92
AD-53781.1
0.41 0.99 0.38 0.87 0.28 1.09
AD-53782.1
0.56 0.47 0.56 0.89 0.41 1.16
AD-53783.1
0.16 0.68 0.32 0.46 0.34 0.61
AD-53784.1
0.15 0.71 0.27 0.72 0.25 0.80
AD-53785.1
0.17 0.90 0.57 0.71 0.29 0.64
AD-53786.1
0.11 0.78 0.28 0.48 0.24 0.74
AD-53787.1
0.34 0.72 0.56 1.04 0.46 0.81
AD-53788.1
0.36 0.83 0.46 0.95 0.32 0.65
AD-53789.1
0.09 0.43 0.18 0.42 0.12 0.47
ID del DÚPLEX
Hela, 10 nM Hela, 0.1 nM Hep3b, 10 nM Hep3b, 0.1 nM HepG2, 10 nM HepG2, 0.1 nM
AD-53790.1
0.10 0.74 0.30 0.65 0.31 0.81
AD-53791.1
0.07 0.51 0.20 0.30 0.16 0.58
AD-53792.1
0.05 0.40 0.11 0.30 0.17 0.64
AD-53793.1
0.23 1.19 0.42 0.84 0.45 1.12
AD-53794.1
0.43 1.15 0.65 0.67 0.42 0.95
AD-53795.1
0.08 0.37 0.15 0.34 0.12 0.48
AD-53796.1
0.07 0.33 0.19 0.49 0.15 0.58
AD-53797.1
0.10 0.43 0.16 0.39 0.20 0.62
AD-53798.1
0.04 0.31 0.09 0.29 0.16 0.60
AD-53799.1
0.22 0.71 0.30 0.85 0.27 0.85
AD-53800.1
0.09 0.34 0.16 0.35 0.14 0.51
AD-53801.1
0.09 0.28 0.25 0.55 0.20 0.54
AD-53802.1
0.10 0.31 0.20 0.40 0.15 0.72
AD-53803.1
0.07 0.27 0.08 0.21 0.14 0.29
AD-53804.1
0.18 0.57 0.29 0.47 0.27 0.79
AD-53805.1
0.69 0.85 0.68 0.85 0.48 1.01
AD-53806.1
0.07 0.38 0.18 0.43 0.13 0.50
AD-53807.1
0.29 0.61 0.26 0.71 0.28 0.68
AD-53808.1
0.15 0.68 0.26 0.50 0.28 0.72
AD-53809.1
0.04 0.23 0.17 0.22 0.12 0.31
AD-53810.1
0.31 0.88 0.30 0.55 0.36 0.85
AD-53811.1
0.28 0.77 0.33 0.57 0.39 0.87
AD-53812.1
0.12 0.69 0.16 0.62 0.22 0.79
AD-53813.1
0.11 0.33 0.18 0.26 0.17 0.40
AD-53814.1
0.12 0.59 0.57 0.60 0.29 0.57
AD-53815.1
0.03 0.27 0.11 0.18 0.18 0.33
AD-53816.1
0.16 0.89 0.24 0.62 0.32 0.75
AD-53817.1
0.26 0.98 0.44 0.69 0.44 1.18
AD-53818.1
0.12 0.71 0.21 0.55 0.21 0.70
AD-53819.1
0.09 0.52 0.12 0.45 0.12 0.46
AD-53820.1
0.20 0.96 0.27 0.67 0.34 0.74
ID del DÚPLEX
Hela, 10 nM Hela, 0.1 nM Hep3b, 10 nM Hep3b, 0.1 nM HepG2, 10 nM HepG2, 0.1 nM
AD-53821.1
0.04 0.29 0.10 0.23 0.13 0.29
AD-53822.1
0.54 1.05 0.60 0.91 0.48 0.96
AD-53823.1
0.21 0.76 0.41 0.59 0.33 0.85
AD-53824.1
0.16 0.78 0.40 0.51 0.36 0.70
AD-53825.1
0.05 0.40 0.12 0.31 0.24 0.73
AD-53826.1
0.04 0.34 0.10 0.21 0.20 0.34
AD-53827.1
0.40 1.11 0.40 0.84 0.31 1.15
AD-53828.1
0.17 0.51 0.23 0.55 0.17 1.14
AD-53829.1
0.06 0.71 0.21 0.58 0.24 1.21
AD-53830.1
0.07 0.27 0.06 0.30 0.15 0.43
AD-53831.1
0.09 0.56 0.21 0.39 0.16 0.95
AD-53832.1
0.08 0.52 0.26 0.31 0.11 0.76
AD-53833.1
1.04 1.05 0.74 1.24 0.60 1.58
AD-53834.1
0.70 1.14 0.71 0.85 0.38 1.47
AD-53835.1
0.11 0.43 0.33 0.35 0.09 0.53
PBS
0.67 1.13 0.90 0.90 0.99 0.99
Tabla 5. Valores de CI50 de PCSK9 para dúplex seleccionados por captación libre en células de mono cinomolgo y por transfección en la línea celular humana Hep3B.
Transfección Captación libre
Dúplex
CI50, nM CI50, nM
AD-53806.1
0.07 18.00
AD-53748.1
0.06 16.88
AD-53815.1
0.05 39.21
AD-53809.1
0.05 571.00
AD-53821.1
0.05 55.41
AD-53830.1
0.08 ND
AD-53754.1
0.25 67.42
AD-53800.1
0.30 ND
AD-53798.1
0.04 ND
AD-53789.1
0.37 ND
AD-48400.4
0.23 ND
También se ensayó AD-48400 para la eficacia in vivo en ratones hembra que llevan un transgén de PCSK9 humano aleatoriamente insertado en el genoma sin rotura del gen PCSK9 endógeno. Brevemente, se inyectaron subcutáneamente ratones con una dosis única de 20 mg/kg en el día 0, una dosis única de 100 mg/kg en el día 0 y cinco dosis de 20 mg/kg en los días 0, 1, 2, 3, 4 y 5. Se recogió suero en los días -6, -3, 0, 1, 2, 3, 4 y 7 y la cantidad de proteína PCSK9 se determinó 5 por ensayo de ELISA. Los resultados de estos análisis se representan en la Figura 2 y muestran que hay un efecto de dosis- respuesta con AD-48400 conjugado con GalNAc en las tres dosificaciones probadas.
Los seis dúplex más eficaces identificados por los cribados in vitro descritos anteriormente se evaluaron para eficacia in vivo y duración de la respuesta. Se inyectaron ratones PCSK9 transgénicos en los días 0, 1, 2, 3 y 4 con tanto 5 mg/kg como 25 mg/kg de AD-48400, AD-53830, AD-53806, AD-53815, AD-53748 o AD-53798. Se determinaron los niveles de proteína 10 PCSK9 en suero por ELISA en los días -3, 0, 1, 2, 3, 4, 8, 11, 15, 18, 22, 26, 31 y 36. Los resultados se representan en las Figuras 3A y 3B.
Ejemplo 3. Optimización del candidato.
Basándose en los ensayos de eficacia descritos en el Ejemplo 2 anterior, se evaluaron ARNip de PCSK9 basados en las secuencias parentales de AD-53815 y AD-53806 con una variedad de modificaciones químicas para eficacia en ensayos de 15 captación libre en hepatocitos de mono cinomolgo primarios (PCH) a 200 nM, 20 nM, 2 nM y 0.2 nM. Para todas las dosis distintas de la dosis de 0.2 nM, se realizaron ensayos dos veces y los datos se expresan como fracción promedio de mensajero que queda con respecto al control. La dosis de 0.2 nM se ensayó una única vez. Los resultados de estos ensayos se muestran en la Tabla 6.
Tabla 6. Cribados de eficacia para la optimización del candidato de AD-53815 y AD-53806 por captación libre en hepatocitos 20 de mono cinomolgo.
Dúplex parental
ID del dúplex 200 nM Promedio 20 nM Promedio 2 nM Promedio 0.2 nM- 384 200 nM DE 20 nM DE 2 nM DE
AD-53815
AD-53815.5 0.45 0.48 0.74 0.95 0.05 0.00 0.05
AD-53815
AD-53815.4 0.43 0.54 0.84 0.83 0.00 0.04 0.10
AD-53815
AD-56633.1 0.33 0.52 0.82 0.88 0.04 0.01 0.10
AD-53815
AD-56617.1 0.40 0.65 0.91 1.06 0.03 0.02 0.03
AD-53815
AD-56623.1 0.52 0.61 0.87 1.05 0.03 0.04 0.21
AD-53815
AD-56629.1 0.50 0.62 0.87 1.05 0.04 0.13 0.17
AD-53815
AD-56635.1 0.45 0.71 0.92 1.03 0.03 0.02 0.03
AD-53815
AD-56641.1 0.47 0.73 0.84 1.04 0.04 0.00 0.17
AD-53815
AD-56625.1 0.49 0.55 0.82 1.12 0.01 0.16 0.16
AD-53815
AD-56631.1 0.48 0.57 0.82 1.05 0.04 0.11 0.06
AD-53815
AD-56637.1 0.48 0.58 0.76 1.01 0.01 0.14 0.13
AD-53815
AD-56643.1 0.59 0.77 0.93 1.04 0.05 0.01 0.04
AD-53815
AD-56649.1 0.76 0.87 0.95 1.06 0.02 0.07 0.14
AD-53815
AD-56655.1 0.73 0.86 0.85 0.96 0.01 0.04 0.11
AD-53815
AD-56615.1 0.58 0.70 0.92 0.98 0.00 0.02 0.03
AD-53815
AD-56621.1 0.71 0.76 0.93 0.95 0.18 0.07 0.07
AD-53815
AD-56627.1 0.58 0.72 0.93 0.94 0.01 0.08 0.02
AD-53815
AD-56639.1 0.52 0.57 0.72 0.94 0.16 0.00 0.04
Dúplex parental
ID del dúplex 200 nM Promedio 20 nM Promedio 2 nM Promedio 0.2 nM- 384 200 nM DE 20 nM DE 2 nM DE
AD-53815
AD-56645.1 0.32 0.49 0.74 0.88 0.03 0.03 0.14
AD-53815
AD-56651.1 0.71 0.94 0.88 0.88 0.08 0.29 0.12
AD-53815
AD-56610.1 0.31 0.57 0.82 0.93 0.02 0.01 0.04
AD-53815
AD-56616.1 0.47 0.68 0.70 1.01 0.06 0.08 0.34
AD-53815
AD-56622.1 0.47 0.66 0.88 0.95 0.06 0.10 0.10
AD-53815
AD-56628.1 1.02 1.15 1.04 0.99 0.00 0.12 0.02
AD-53815
AD-56634.1 0.75 0.90 0.97 1.03 0.11 0.04 0.07
AD-53815
AD-56640.1 0.58 0.76 0.81 1.01 0.10 0.05 0.12
AD-53815
AD-56646.1 0.77 0.94 0.82 0.99 0.09 0.12 0.14
AD-53815
AD-56652.1 0.61 0.74 0.78 0.89 0.00 0.00 0.03
AD-53815
AD-56611.1 0.93 1.02 1.16 0.89 0.05 0.15 0.05
AD-53815
AD-56647.1 0.38 0.58 0.79 0.94 0.05 0.08 0.00
AD-53815
AD-56653.1 0.47 0.46 0.63 0.84 0.12 0.04 0.04
AD-53815
AD-56612.1 0.41 0.61 0.88 0.85 0.03 0.09 0.09
AD-53815
AD-56618.1 0.64 0.60 1.03 1.08 0.21 0.09 0.01
AD-53815
AD-56624.1 0.46 0.61 0.85 1.05 0.04 0.17 0.15
AD-53815
AD-56630.1 0.49 0.69 0.87 1.01 0.01 0.00 0.15
AD-53815
AD-56636.1 0.49 0.57 0.82 1.13 0.01 0.05 0.03
AD-53815
AD-56642.1 0.43 0.55 0.82 1.09 0.00 0.08 0.03
AD-53815
AD-56648.1 0.48 0.66 0.80 0.96 0.00 0.04 0.08
AD-53815
AD-56654.1 0.43 0.53 0.72 0.84 0.01 0.00 0.07
AD-53815
AD-56613.1 0.54 0.61 0.81 0.91 0.16 0.08 0.19
AD-53815
AD-56619.1 0.55 0.67 1.02 1.06 0.04 0.07 0.07
AD-53815
AD-56614.1 0.42 0.56 0.86 0.90 0.05 0.04 0.10
AD-53815
AD-56620.1 0.41 0.52 0.85 0.84 0.01 0.12 0.08
AD-53815
AD-56626.1 0.59 0.68 0.90 1.12 0.01 0.03 0.10
AD-53815
AD-56632.1 0.60 0.73 0.91 1.05 0.04 0.09 0.10
AD-53815
AD-56638.1 0.68 0.89 0.94 1.19 0.03 0.03 0.18
AD-53815
AD-56644.1 0.84 0.89 1.09 1.09 0.08 0.08 0.06
AD-53815
AD-56650.1 0.86 0.95 1.05 1.05 0.10 0.01 0.10
AD-53815
AD-56656.1 0.53 0.64 0.92 0.88 0.09 0.04 0.14
Dúplex parental
ID del dúplex 200 nM Promedio 20 nM Promedio 2 nM Promedio 0.2 nM- 384 200 nM DE 20 nM DE 2 nM DE
AD-53815
AD-56662.1 0.55 0.61 0.96 1.03 0.02 0.09 0.01
AD-53815
AD-56668.1 0.76 0.79 0.99 1.10 0.07 0.11 0.06
AD-53815
AD-56673.1 0.81 0.87 1.12 1.09 0.01 0.15 0.13
AD-53815
AD-56678.1 0.84 0.76 1.12 1.05 0.04 0.24 0.05
AD-53815
AD-56683.1 0.88 0.93 1.08 1.06 0.05 0.10 0.06
AD-53815
AD-56688.1 0.80 0.86 0.93 0.99 0.10 0.11 0.19
AD-53815
AD-56657.1 0.45 0.63 0.84 0.88 0.20 0.04 0.09
AD-53815
AD-56663.1 0.35 0.49 0.77 1.03 0.00 0.07 0.04
AD-53815
AD-56669.1 0.53 0.68 0.99 1.11 0.00 0.18 0.03
AD-53815
AD-56674.1 0.44 0.64 0.84 1.03 0.06 0.01 0.17
AD-53815
AD-56679.1 0.52 0.67 0.77 1.01 0.01 0.06 0.14
AD-53815
AD-56684.1 0.43 0.59 0.84 1.08 0.01 0.03 0.04
AD-53815
AD-56689.1 0.55 0.57 0.73 0.95 0.09 0.01 0.11
AD-53815
AD-56693.1 0.45 0.48 0.65 0.84 0.04 0.02 0.11
AD-53815
AD-56658.1 0.46 0.55 0.85 0.84 0.21 0.09 0.07
AD-53815
AD-56664.1 0.35 0.60 0.80 0.91 0.13 0.03 0.14
AD-53815
AD-56670.1 0.62 0.61 0.90 1.11 0.17 0.06 0.00
AD-53815
AD-56680.1 0.74 0.90 1.00 0.91 0.05 0.01 0.05
AD-53815
AD-56685.1 0.64 0.64 0.77 1.07 0.15 0.01 0.15
AD-53815
AD-56690.1 0.39 0.61 0.75 0.97 0.13 0.03 0.08
AD-53815
AD-56694.1 0.41 0.53 0.67 0.94 0.01 0.00 0.04
AD-53815
AD-56659.1 0.57 0.58 0.84 0.95 0.25 0.09 0.05
AD-53815
AD-56665.1 0.38 0.51 0.78 1.01 0.05 0.07 0.17
AD-53815
AD-56671.1 0.32 0.45 0.78 0.94 0.03 0.05 0.01
AD-53815
AD-56676.1 0.31 0.55 0.81 1.02 0.03 0.13 0.02
AD-53815
AD-56681.1 0.54 0.75 0.88 1.02 0.02 0.07 0.11
AD-53815
AD-56686.1 0.50 0.74 0.86 1.03 0.01 0.10 0.10
AD-53815
AD-56691.1 0.44 0.56 0.79 1.03 0.01 0.00 0.05
AD-53815
AD-56695.1 0.37 0.70 0.67 0.89 0.01 0.29 0.11
AD-53815
AD-56660.1 0.36 0.73 0.83 0.93 0.02 0.22 0.10
AD-53815
AD-56666.1 0.39 0.47 0.74 0.94 0.02 0.05 0.13
Dúplex parental
ID del dúplex 200 nM Promedio 20 nM Promedio 2 nM Promedio 0.2 nM- 384 200 nM DE 20 nM DE 2 nM DE
AD-53815
AD-56672.1 0.63 0.55 0.87 1.03 0.25 0.10 0.04
AD-53815
AD-56677.1 0.54 0.70 0.85 0.99 0.24 0.11 0.00
AD-53815
AD-56682.1 0.48 0.57 0.90 0.96 0.11 0.09 0.05
AD-53815
AD-56687.1 0.81 0.94 1.06 1.08 0.07 0.02 0.05
AD-53815
AD-56692.1 0.45 0.64 0.73 0.95 0.03 0.13 0.05
AD-53815
AD-56696.1 0.40 0.48 0.66 0.95 0.01 0.04 0.06
AD-53815
AD-56661.1 0.52 0.54 0.75 0.98 0.22 0.06 0.04
AD-53815
AD-56667.1 0.40 0.68 0.87 1.03 0.03 0.03 0.11
AD-53806
AD-53806.11 0.28 0.44 0.74 0.98 0.05 0.01 0.13
AD-53806
AD-53806.13 0.31 0.36 0.65 0.92 0.01 0.08 0.06
AD-53806
AD-53806.12 0.53 0.56 0.70 1.04 0.00 0.01 0.15
AD-53806
AD-53806.5 0.34 0.54 0.85 0.87 0.01 0.00 0.10
AD-53806
AD-53806.6 0.41 0.51 0.77 0.91 0.05 0.04 0.08
AD-53806
AD-53806.7 0.39 0.58 0.75 0.97 0.02 0.16 0.14
AD-53806
AD-53806.8 0.35 0.49 0.69 0.91 0.06 0.03 0.09
AD-53806
AD-53806.9 0.36 0.55 0.77 1.01 0.04 0.07 0.13
AD-53806
AD-53806.10 0.29 0.44 0.73 0.93 0.04 0.10 0.14
AD-53806
AD-56979.1 0.43 0.50 0.78 0.96 0.01 0.03 0.11
AD-53806
AD-56979.2 0.32 0.47 0.65 1.02 0.02 0.11 0.05
AD-53806
AD-56975.3 0.27 0.57 0.72 0.83 0.01 0.16 0.08
AD-53806
AD-56975.4 0.55 0.67 0.81 0.92 0.11 0.10 0.04
AD-53806
AD-56975.5 0.34 0.54 0.71 0.94 0.04 0.22 0.10
AD-53806
AD-56975.1 0.38 0.53 0.74 0.93 0.13 0.14 0.02
AD-53806
AD-56975.2 0.50 0.62 0.82 0.98 0.09 0.16 0.11
AD-53806
AD-56983.1 0.49 0.72 0.89 1.11 0.10 0.09 0.21
AD-53806
AD-56983.2 0.74 0.89 1.14 1.16 0.10 0.06 0.02
AD-53806
AD-56983.3 0.91 1.05 1.02 1.04 0.09 0.10 0.08
AD-53806
AD-56983.4 0.40 0.57 0.83 1.05 0.03 0.02 0.08
AD-53806
AD-56983.5 0.33 0.51 0.83 0.90 0.03 0.04 0.03
AD-53806
AD-56977.3 0.44 0.49 0.62 0.95 0.17 0.16 0.06
AD-53806
AD-56977.1 0.27 0.58 0.81 0.88 0.06 0.07 0.08
Dúplex parental
ID del dúplex 200 nM Promedio 20 nM Promedio 2 nM Promedio 0.2 nM- 384 200 nM DE 20 nM DE 2 nM DE
AD-53806
AD-56977.2 0.41 0.60 0.81 0.90 0.01 0.07 0.12
AD-53806
AD-56976.1 0.40 0.64 0.85 0.90 0.14 0.21 0.01
AD-53806
AD-56976.2 0.37 0.47 0.70 1.01 0.09 0.10 0.13
AD-53806
AD-56980.1 0.47 0.54 0.83 0.97 0.12 0.02 0.14
AD-53806
AD-56980.2 0.44 0.55 0.81 1.08 0.15 0.11 0.08
AD-53806
AD-56984.1 0.41 0.63 0.81 1.08 0.04 0.07 0.14
AD-53806
AD-56984.2 0.32 0.58 0.86 1.04 0.02 0.17 0.07
AD-53806
AD-56987.1 0.37 0.63 0.82 1.11 0.08 0.08 0.05
AD-53806
AD-56987.2 0.33 0.59 0.79 1.02 0.05 0.05 0.13
AD-53806
AD-56991.1 0.36 0.57 0.73 1.08 0.01 0.07 0.18
AD-53806
AD-56993.1 0.41 0.54 0.75 0.99 0.12 0.09 0.06
AD-53806
AD-56995.1 0.35 0.45 0.67 1.00 0.07 0.02 0.12
AD-53806
AD-56978.1 0.35 0.67 0.88 0.91 0.04 0.22 0.05
AD-53806
AD-56978.2 0.47 0.55 0.78 1.12 0.03 0.01 0.07
AD-53806
AD-56981.1 0.45 0.65 0.86 1.08 0.01 0.16 0.15
AD-53806
AD-56985.1 0.53 0.61 1.08 1.14 0.02 0.09 0.07
AD-53806
AD-56988.1 0.62 0.81 0.91 1.13 0.01 0.05 0.20
AD-53806
AD-56988.2 0.76 0.94 0.85 1.14 0.17 0.10 0.11
AD-53806
AD-56988.3 0.55 0.79 0.86 1.19 0.04 0.05 0.16
AD-53806
AD-56982.1 0.40 0.65 0.84 1.07 0.04 0.10 0.09
AD-53806
AD-56982.2 0.38 0.50 0.70 1.01 0.03 0.03 0.08
AD-53806
AD-56986.1 0.45 0.57 0.80 1.12 0.02 0.11 0.15
AD-53806
AD-56986.2 0.49 0.59 0.79 1.04 0.01 0.05 0.17
AD-53806
AD-56989.1 0.69 0.84 0.95 1.12 0.08 0.06 0.12
AD-53806
AD-56990.1 0.49 0.56 0.79 1.08 0.03 0.02 0.13
AD-53806
AD-56992.1 0.61 0.70 0.90 1.14 0.01 0.04 0.14
AD-53806
AD-56992.2 0.48 0.63 0.87 0.99 0.05 0.10 0.07
AD-53806
AD-56994.1 0.88 0.89 0.97 1.11 0.02 0.06 0.13
AD-53806
AD-56994.2 0.34 0.42 0.73 0.98 0.01 0.05 0.05
AD-53806
AD-56996.1 0.50 0.59 0.77 0.95 0.07 0.12 0.10
AD-53806
AD-57001.1 0.44 0.54 0.77 1.08 0.01 0.05 0.12
Dúplex parental
ID del dúplex 200 nM Promedio 20 nM Promedio 2 nM Promedio 0.2 nM- 384 200 nM DE 20 nM DE 2 nM DE
AD-53806
AD-57007.1 0.62 0.68 0.91 1.11 0.04 0.02 0.19
AD-53806
AD-57013.1 0.65 0.78 0.94 1.17 0.05 0.04 0.22
AD-53806
AD-57019.1 0.57 0.74 0.87 1.14 0.01 0.09 0.13
AD-53806
AD-57022.1 0.46 0.48 0.72 0.98 0.14 0.01 0.17
AD-53806
AD-57025.1 0.37 0.47 0.68 0.92 0.04 0.11 0.06
AD-53806
AD-56997.1 0.41 0.56 0.77 0.88 0.00 0.10 0.09
AD-53806
AD-57002.1 0.46 0.58 0.81 1.04 0.03 0.03 0.08
AD-53806
AD-57008.1 0.68 0.75 0.91 1.13 0.02 0.03 0.15
AD-53806
AD-57014.1 0.80 0.82 0.99 1.17 0.02 0.01 0.12
AD-53806
AD-57020.1 0.51 0.53 0.81 1.07 0.17 0.03 0.07
AD-53806
AD-57020.2 0.37 0.46 0.68 1.02 0.04 0.07 0.13
AD-53806
AD-57026.1 0.34 0.51 0.68 0.97 0.01 0.08 0.06
AD-53806
AD-57003.1 0.76 0.90 0.94 1.11 0.02 0.16 0.11
AD-53806
AD-57009.1 0.81 0.88 0.93 0.98 0.01 0.03 0.10
AD-53806
AD-57015.1 0.72 0.92 0.90 1.04 0.01 0.05 0.15
AD-53806
AD-57023.1 0.41 0.50 0.75 1.00 0.08 0.07 0.06
AD-53806
AD-57027.1 0.38 0.46 0.68 0.93 0.11 0.00 0.07
AD-53806
AD-56998.1 0.45 0.57 0.94 0.98 0.01 0.06 0.11
AD-53806
AD-57004.1 0.39 0.61 0.80 1.13 0.03 0.04 0.13
AD-53806
AD-57010.1 0.43 0.64 0.81 1.00 0.01 0.07 0.15
AD-53806
AD-57016.1 0.44 0.71 0.80 0.97 0.01 0.25 0.05
AD-53806
AD-56999.2 0.49 0.60 0.69 1.04 0.04 0.02 0.16
AD-53806
AD-56999.1 0.39 0.55 0.68 0.96 0.01 0.09 0.10
AD-53806
AD-57021.1 0.40 0.58 0.71 1.02 0.03 0.03 0.11
AD-53806
AD-57024.1 0.41 0.49 0.68 1.02 0.14 0.00 0.10
AD-53806
AD-57005.1 0.45 0.56 0.87 1.06 0.03 0.03 0.20
AD-53806
AD-57011.1 0.53 0.63 0.92 1.02 0.02 0.07 0.10
AD-53806
AD-57017.1 0.48 0.60 0.81 1.07 0.00 0.01 0.12
AD-53806
AD-57000.2 0.50 0.60 0.74 0.93 0.04 0.01 0.02
AD-53806
AD-57000.3 0.54 0.49 0.72 0.97 0.22 0.08 0.00
AD-53806
AD-57000.1 0.70 0.76 0.80 0.95 0.02 0.05 0.04
Dúplex parental
ID del dúplex 200 nM Promedio 20 nM Promedio 2 nM Promedio 0.2 nM- 384 200 nM DE 20 nM DE 2 nM DE
AD-53806
AD-57006.2 0.48 0.75 0.76 0.94 0.00 0.31 0.12
AD-53806
AD-57006.3 0.45 0.57 0.71 0.98 0.08 0.09 0.12
AD-53806
AD-57006.1 0.64 0.76 0.84 0.97 0.00 0.11 0.10
AD-53806
AD-57012.1 0.53 0.83 0.79 0.93 0.04 0.42 0.02
AD-53806
AD-57018.1 0.67 0.73 0.72 0.93 0.07 0.04 0.03
También se cribaron ARNip con una variedad de modificaciones químicas basadas en las secuencias parentales de AD- 53815 y AD-53806 para la eficacia in vitro por transfección en células Hep3B a 10 nM y 0.1 nM. Los resultados de este cribado de la relación estructura-actividad se muestran en la Tabla 7, y se expresan como la fracción promedio de mensajero que queda con respecto al control +/- DE.
5 Tabla 7. Cribados de eficacia para la optimización del candidato de AD-53815 y AD-53806 por transfección en células humanas.
Dúplex parental
ID del dúplex Trans 10 nM Promedio Trans 10 nM DE Trans 0.1 nM Promedio Trans 0.1 nM DE
AD-53815
AD-53815.5 0.14 0.05 0.24 ND
AD-53815
AD-53815.4 0.18 0.07 0.38 ND
AD-53815
AD-56633.1 0.18 0.10 0.24 ND
AD-53815
AD-56617.1 0.13 0.06 0.25 ND
AD-53815
AD-56623.1 0.14 0.05 0.24 ND
AD-53815
AD-56629.1 0.14 0.02 0.17 ND
AD-53815
AD-56635.1 0.12 0.02 0.22 ND
AD-53815
AD-56641.1 0.15 0.01 0.16 ND
AD-53815
AD-56625.1 0.12 0.03 0.29 ND
AD-53815
AD-56631.1 0.13 0.01 0.20 ND
AD-53815
AD-56637.1 0.22 0.14 0.16 ND
AD-53815
AD-56643.1 0.18 0.08 0.16 ND
AD-53815
AD-56649.1 0.16 0.00 0.19 ND
AD-53815
AD-56655.1 0.24 0.11 0.24 ND
AD-53815
AD-56615.1 0.15 0.00 0.32 ND
AD-53815
AD-56621.1 0.20 0.07 0.41 ND
AD-53815
AD-56627.1 0.17 0.04 0.31 ND
AD-53815
AD-56639.1 0.19 0.08 0.24 ND
AD-53815
AD-56645.1 0.19 0.09 0.27 ND
Dúplex parental
ID del dúplex Trans 10 nM Promedio Trans 10 nM DE Trans 0.1 nM Promedio Trans 0.1 nM DE
AD-53815
AD-56651.1 0.29 0.09 0.68 ND
AD-53815
AD-56610.1 0.21 0.11 0.23 ND
AD-53815
AD-56616.1 0.16 0.04 0.29 ND
AD-53815
AD-56622.1 0.18 0.07 0.36 ND
AD-53815
AD-56628.1 0.28 0.07 0.60 ND
AD-53815
AD-56634.1 0.16 0.04 0.29 ND
AD-53815
AD-56640.1 0.21 0.09 0.26 ND
AD-53815
AD-56646.1 0.27 0.21 0.37 ND
AD-53815
AD-56652.1 0.26 0.08 0.29 ND
AD-53815
AD-56611.1 0.35 0.11 0.96 ND
AD-53815
AD-56647.1 0.17 0.09 0.13 ND
AD-53815
AD-56653.1 0.17 0.09 0.28 ND
AD-53815
AD-56612.1 0.17 0.07 0.24 ND
AD-53815
AD-56618.1 0.14 0.00 0.26 ND
AD-53815
AD-56624.1 0.15 0.02 0.27 ND
AD-53815
AD-56630.1 0.13 0.01 0.24 ND
AD-53815
AD-56636.1 0.17 0.08 0.22 ND
AD-53815
AD-56642.1 0.12 0.03 0.13 ND
AD-53815
AD-56648.1 0.15 0.05 0.21 ND
AD-53815
AD-56654.1 0.22 0.10 0.24 ND
AD-53815
AD-56613.1 0.17 0.07 0.40 ND
AD-53815
AD-56619.1 0.21 0.12 0.30 ND
AD-53815
AD-56614.1 0.12 0.01 0.23 ND
AD-53815
AD-56620.1 0.12 0.02 0.15 ND
AD-53815
AD-56626.1 0.14 0.03 0.20 ND
AD-53815
AD-56632.1 0.12 0.02 0.21 ND
AD-53815
AD-56638.1 0.15 0.10 0.23 ND
AD-53815
AD-56644.1 0.23 0.11 0.17 ND
AD-53815
AD-56650.1 0.13 0.03 0.20 ND
AD-53815
AD-56656.1 0.26 0.03 0.27 ND
Dúplex parental
ID del dúplex Trans 10 nM Promedio Trans 10 nM DE Trans 0.1 nM Promedio Trans 0.1 nM DE
AD-53815
AD-56662.1 0.13 0.06 0.18 ND
AD-53815
AD-56668.1 0.19 0.05 0.20 ND
AD-53815
AD-56673.1 0.18 0.05 0.21 ND
AD-53815
AD-56678.1 0.17 0.00 0.20 ND
AD-53815
AD-56683.1 0.29 0.22 0.27 ND
AD-53815
AD-56688.1 0.19 0.02 0.18 ND
AD-53815
AD-56657.1 0.18 0.14 0.34 ND
AD-53815
AD-56663.1 0.11 0.04 0.18 ND
AD-53815
AD-56669.1 0.11 0.02 0.31 ND
AD-53815
AD-56674.1 0.14 0.00 0.21 ND
AD-53815
AD-56679.1 0.14 0.05 0.19 ND
AD-53815
AD-56684.1 0.14 0.03 0.19 ND
AD-53815
AD-56689.1 0.18 0.09 0.18 ND
AD-53815
AD-56693.1 0.19 0.11 0.21 ND
AD-53815
AD-56658.1 0.19 0.13 0.30 ND
AD-53815
AD-56664.1 0.15 0.07 0.20 ND
AD-53815
AD-56670.1 0.18 0.10 0.26 ND
AD-53815
AD-56680.1 0.27 0.05 0.31 ND
AD-53815
AD-56685.1 0.14 0.02 0.28 ND
AD-53815
AD-56690.1 0.10 0.03 0.18 ND
AD-53815
AD-56694.1 0.15 0.06 0.17 ND
AD-53815
AD-56659.1 0.16 0.04 0.27 ND
AD-53815
AD-56665.1 0.14 0.06 0.26 ND
AD-53815
AD-56671.1 0.11 0.01 0.29 ND
AD-53815
AD-56676.1 0.14 0.06 0.20 ND
AD-53815
AD-56681.1 0.15 0.03 0.30 ND
AD-53815
AD-56686.1 0.15 0.03 0.26 ND
AD-53815
AD-56691.1 0.11 0.02 0.16 ND
AD-53815
AD-56695.1 0.14 0.06 0.24 ND
AD-53815
AD-56660.1 0.10 0.03 0.37 ND
Dúplex parental
ID del dúplex Trans 10 nM Promedio Trans 10 nM DE Trans 0.1 nM Promedio Trans 0.1 nM DE
AD-53815
AD-56666.1 0.18 0.13 0.22 ND
AD-53815
AD-56672.1 0.14 0.02 0.35 ND
AD-53815
AD-56677.1 0.15 0.04 0.23 ND
AD-53815
AD-56682.1 0.14 0.06 0.28 ND
AD-53815
AD-56687.1 0.24 0.01 0.53 ND
AD-53815
AD-56692.1 0.09 0.01 0.36 ND
AD-53815
AD-56696.1 0.16 0.09 0.26 ND
AD-53815
AD-56661.1 0.21 0.15 0.48 ND
AD-53815
AD-56667.1 0.22 0.16 0.26 ND
AD-53806
AD-53806.11 0.19 0.05 0.25 0.06
AD-53806
AD-53806.13 0.21 0.07 0.21 0.16
AD-53806
AD-53806.12 0.21 0.08 0.21 0.02
AD-53806
AD-53806.5 0.22 0.01 0.29 0.06
AD-53806
AD-53806.6 0.24 0.07 0.33 0.12
AD-53806
AD-53806.7 0.19 0.02 0.24 0.11
AD-53806
AD-53806.8 0.20 0.01 0.23 0.05
AD-53806
AD-53806.9 0.22 0.01 0.19 0.06
AD-53806
AD-53806.10 0.17 0.01 0.21 0.07
AD-53806
AD-56979.1 0.18 0.00 0.29 0.14
AD-53806
AD-56979.2 0.24 0.11 0.24 0.12
AD-53806
AD-56975.3 0.26 0.09 0.28 0.18
AD-53806
AD-56975.4 0.35 0.02 0.50 0.23
AD-53806
AD-56975.5 0.17 0.01 0.21 0.18
AD-53806
AD-56975.1 0.24 0.09 0.32 0.12
AD-53806
AD-56975.2 0.19 0.04 0.16 0.02
AD-53806
AD-56983.1 0.17 0.01 0.32 0.18
AD-53806
AD-56983.2 0.28 0.07 0.63 0.15
AD-53806
AD-56983.3 1.22 0.61 0.83 0.02
AD-53806
AD-56983.4 0.25 0.10 0.24 0.10
AD-53806
AD-56983.5 0.17 0.01 0.26 0.15
Dúplex parental
ID del dúplex Trans 10 nM Promedio Trans 10 nM DE Trans 0.1 nM Promedio Trans 0.1 nM DE
AD-53806
AD-56977.3 0.31 0.11 0.28 0.23
AD-53806
AD-56977.1 0.22 0.04 0.34 0.12
AD-53806
AD-56977.2 0.22 0.05 0.29 0.16
AD-53806
AD-56976.1 0.21 0.09 0.34 0.20
AD-53806
AD-56976.2 0.17 0.03 0.25 0.04
AD-53806
AD-56980.1 0.22 0.04 0.20 0.02
AD-53806
AD-56980.2 0.19 0.01 0.20 0.06
AD-53806
AD-56984.1 0.24 0.11 0.22 0.10
AD-53806
AD-56984.2 0.19 0.01 0.21 0.10
AD-53806
AD-56987.1 0.19 0.05 0.29 0.19
AD-53806
AD-56987.2 0.24 0.03 0.24 0.09
AD-53806
AD-56991.1 0.17 0.01 0.17 0.08
AD-53806
AD-56993.1 0.14 0.09 0.22 0.06
AD-53806
AD-56995.1 0.19 0.07 0.27 0.13
AD-53806
AD-56978.1 0.27 0.12 0.36 0.12
AD-53806
AD-56978.2 0.24 0.03 0.20 0.01
AD-53806
AD-56981.1 0.22 0.03 0.28 0.17
AD-53806
AD-56985.1 0.21 0.00 0.28 0.04
AD-53806
AD-56988.1 0.20 0.02 0.24 0.02
AD-53806
AD-56988.2 0.20 0.03 0.27 0.13
AD-53806
AD-56988.3 0.23 0.03 0.27 0.01
AD-53806
AD-56982.1 0.23 0.06 0.24 0.00
AD-53806
AD-56982.2 0.21 0.06 0.18 0.07
AD-53806
AD-56986.1 0.23 0.05 0.20 0.06
AD-53806
AD-56986.2 0.24 0.04 0.25 0.13
AD-53806
AD-56989.1 0.31 0.02 0.43 0.00
AD-53806
AD-56990.1 0.27 0.00 0.28 0.10
AD-53806
AD-56992.1 0.27 0.06 0.31 0.01
AD-53806
AD-56992.2 0.22 0.10 0.30 0.14
AD-53806
AD-56994.1 0.97 0.05 0.85 0.09
Dúplex parental
ID del dúplex Trans 10 nM Promedio Trans 10 nM DE Trans 0.1 nM Promedio Trans 0.1 nM DE
AD-53806
AD-56994.2 0.22 0.09 0.26 0.01
AD-53806
AD-56996.1 0.18 0.04 0.31 0.08
AD-53806
AD-57001.1 0.24 0.09 0.23 0.08
AD-53806
AD-57007.1 0.25 0.01 0.27 0.03
AD-53806
AD-57013.1 0.30 0.08 0.33 0.02
AD-53806
AD-57019.1 0.29 0.03 0.28 0.02
AD-53806
AD-57022.1 0.20 0.06 0.21 0.05
AD-53806
AD-57025.1 0.23 0.12 0.25 0.15
AD-53806
AD-56997.1 0.20 0.05 0.25 0.11
AD-53806
AD-57002.1 0.21 0.07 0.28 0.01
AD-53806
AD-57008.1 0.26 0.01 0.31 0.01
AD-53806
AD-57014.1 0.32 0.03 0.43 0.05
AD-53806
AD-57020.1 0.19 0.00 0.23 0.01
AD-53806
AD-57020.2 0.20 0.08 0.28 0.22
AD-53806
AD-57026.1 0.34 0.24 0.37 0.24
AD-53806
AD-57003.1 0.34 0.04 0.45 0.15
AD-53806
AD-57009.1 0.30 0.07 0.40 0.02
AD-53806
AD-57015.1 0.32 0.01 0.47 0.04
AD-53806
AD-57023.1 0.17 0.06 0.27 0.13
AD-53806
AD-57027.1 0.20 0.03 0.19 0.11
AD-53806
AD-56998.1 0.23 0.09 0.29 0.24
AD-53806
AD-57004.1 0.24 0.13 0.30 0.12
AD-53806
AD-57010.1 0.23 0.09 0.23 0.11
AD-53806
AD-57016.1 0.21 0.03 0.23 0.06
AD-53806
AD-56999.2 0.25 0.10 0.35 0.05
AD-53806
AD-56999.1 0.24 0.08 0.28 0.21
AD-53806
AD-57021.1 0.18 0.04 0.29 0.17
AD-53806
AD-57024.1 0.20 0.09 0.28 0.11
AD-53806
AD-57005.1 0.18 0.10 0.29 0.17
AD-53806
AD-57011.1 0.21 0.07 0.26 0.12
Dúplex parental
ID del dúplex Trans 10 nM Promedio Trans 10 nM DE Trans 0.1 nM Promedio Trans 0.1 nM DE
AD-53806
AD-57017.1 0.20 0.07 0.29 0.21
AD-53806
AD-57000.2 0.20 0.04 0.29 0.21
AD-53806
AD-57000.3 0.22 0.11 0.30 0.16
AD-53806
AD-57000.1 0.25 0.14 0.38 0.33
AD-53806
AD-57006.2 0.22 0.14 0.31 0.18
AD-53806
AD-57006.3 0.19 0.09 0.31 0.25
AD-53806
AD-57006.1 0.20 0.12 0.41 0.29
AD-53806
AD-57012.1 0.16 0.05 0.36 0.17
AD-53806
AD-57018.1 0.20 0.37 0.10 0.14
Para determinar si cualquiera de los ARNip del cribado de SAR in vitro son más eficaces en silenciar PCSK9 que el ARNip parental (AD-53815), ratones transgénicos PCSK9 se administraron con una dosis única de 3 mg/kg del ARNip mostrado en la Figura 4, y 72 horas después de la dosificación, se determinaron los niveles de proteína PCSK9 por ensayo de ELISA. Los resultados, mostrados en la Figura 5, demuestran que AD-57928 es sorprendentemente eficaz en silenciar PCSK9. La 5 Figura 6 muestra que, no solo una dosis única de AD-57928 inactivó eficazmente la proteína PCSK9, sino que también hay una respuesta a la dosis usando AD-57928.
Ejemplo 4. Estudio de dosificación fraccionada usando AD-57928
Se evaluó la capacidad de AD-57928 para suprimir la expresión de la proteína PCSK9 midiendo los niveles de la proteína PCSK9 humana (PCSK9h) en suero de ratones transgénicos PCSK9h tras la administración de AD-57928. Se administró 10 AD-57928 subcutáneamente usando seis programas de dosificación diferentes que incluyeron una “fase de carga” durante
la primera semana (una dosis de 0.5 mg/kg, 1 mg/kg o 2 mg/kg diariamente durante 5 días posteriores), seguido de una “fase de mantenimiento” (dosificación de una vez o dos veces a la semana de tanto 0.5 mg/kg, 1 mg/kg como 2 mg/kg durante 5 semanas), como se describe en la Tabla 8 a continuación. La última dosis se administró en el día 38. Cada programa de dosificación se probó usando un grupo de 3 ratones que incluyó dos machos y una hembra. Un grupo de 15 control recibió inyecciones con PBS.
Tabla 8. Programas de dosificación para la administración de AD-57928
Artículo de prueba
Semana 1 Semanas 2-6
Dosis de carga (mg/kg) Dosis total (mg/kg) Dosis de mantenimiento (mg/kg) Dosis semanal total (mg/kg)
PBS
5x 0 2x 0
AD-57928
5x2 10 2x2 4
AD-57928
5x2 10 1x2 2
AD-57928
5x1 5 2x1 2
AD-57928
5x1 5 1x1 1
AD-57928
5x0.5 2.5 2x0.5 1
AD-57928
5x0.5 2.5 1x0.5 0.5
Se recogió suero 3 días antes de la administración de la primera dosis y en los días 1, 4, 7, 10, 14, 17, 21, 24, 28, 31, 35, 38, 42, 45, 52, 59 y 65 después de la primera dosis. Se evaluaron los niveles de proteína PCSK9 en suero por ensayo de ELISA. Los resultados se muestran en las Figuras 6, 7 y 8.
Se observaron niveles de proteína PCSK9h en suero reducidos 72 horas tras la primera dosis, y se mantuvieron hasta el día 5 38. La administración de AD-57928 a las dosis de carga de 5x2 mg/kg, 5x1 mg/kg y 5x0.5 mg/kg produjo ~90 %, ~70 % y
~60 % de reducción de los niveles de proteína PCSK9h en suero, respectivamente (véanse las Figuras 6-8). En el grupo dosificado usando 2x programa de dosificación de mantenimiento, los niveles de PCSK9h reducidos se mantuvieron durante 1 semana más que en el grupo dosificado usando 1x programa de dosificación de mantenimiento, y volvió al nivel inicial 4 semanas después de la última dosis (véanse las Figuras 6-8).
10 Ejemplo 5. Valoración de fosforotioato
Con el fin de determinar el efecto del número y posición de las modificaciones de fosforotioato sobre la capacidad del ARNbc para inhibir la expresión de PCSK9, se prepararon varios ARNip basados en las secuencias parentales de AD- 57928, AD-53806 y AD-53830 como se muestra en la Tabla 9 y se probaron. Para determinar si cualquiera de los ARNip es más eficaz en el silenciamiento de PCSK9 que AD-57928, ratones transgénicos PCSK9 se administraron con una dosis 15 única de 0.3 mg/kg del ARNip en la Tabla 9, y 72 horas después de la dosificación, se determinaron los niveles de proteína PCSK9 por ensayo de ELISA. Los resultados, mostrados en la Figura 9, demuestran que AD-57928 es sorprendentemente eficaz en silenciar PCSK9. AD-58893, AD-58894, AD-58896, AD-58897, AD-58898 y AD-58899 también fueron capaces de silenciar PCSK9 en comparación con el control.
Tabla 9. ARNip usados en el experimento de valoración de fosforotioato
ID del
Secuencia sentido SEC ID N°: Secuencia antisentido SEC ID Química
dúplex
N°:
AD-57928
CfsusAfgAfcCfuGfUfUfuUfg 1557 asCfsaAfaAfgCfaAfaacAfgG 156 7 TOFFEE con 6 PS, y 3OMe en el extremo 3' de AS
CfuUfuUfgUfL96
fuCfuAfgsasa
CfsuAfgAfcCfuGfUfUfuUfgC 1558 156
AD-58893
fuUfuUfgUfL asCfaAfaAfgCfaAfaacAfgGf 8 TOFFEE con 3
96
uCfuAfgasa PS externas
CfusAfgAfcCfuGfUfUfuUfgC 1559 156
AD-58894
fuUfuUfgUfL aCfsaAfaAfgCfaAfaacAfgGf 9 TOFFEE con 3
96
uCfuAfgsaa PS internas
AD-58895
CfuAfgAfcCfuGfUfUfuUfgCf 1560 asCfsaAfaAfgCfaAfaacAfgG 157 TOFFEE con solo
uUfuUfgUfL96
fuCfuAfgsasa 0 4 PS antisentido
AD-58896
CfsusAfgAfcCfuGfUfUfuUfg 1561 aCfaAfaAfgCfaAfaacAfgGfu 157 TOFFEE con solo
CfuUfuUfgUfL96
CfuAfgaa 1 2 PS sentido
AD-58897
CfsusAfsgAfcCfuGfUfUfuUf 1562 asCfsasAfaAfgCfaAfaacAfg 157 TOFFEE con 9
gCfuUfuUfgUfL96
GfuCfuAfsgsasa 2 PS
AD-58898
CfsusAfsgAfcCfuGfUfUfuUf 1563 asCfsaAfaAfgCfsaAfaacAfs 157 TOFFEE con 10
gCfuUfuUfgUfL96
gGfuCfuAfsgsasa 3 PS
AD-58899
CfsusAfsgAfcCfuGfUfUfuUf 1564 asCfsaAfaAfgCfsaAfaacAfs 157 TOFFEE con 11
gCfuUfuUfsgUfL96
gGfuCfuAfsgsasa 4 PS
AD-58900
CfsasAfgCfaGfaCfAfUfuUfa 1565 asAfsaAfaGfaUfaAfaugUfcU 157 Versión de 6 PS
UfcUfuUfuUfL96
fgCfuUfgscsu 5 de AD-53806
AD-58902
UfsusUfuCfuAfgAfCfCfuGfu 1566 asAfsgCfaAfaAfcAfgguCfuA 157 Versión de 6 PS
UfuUfgCfuUfL96
fgAfaAfasgsu 6 de AD-53830
5
10
15
20
25
30
35
40
Ejemplo 6. Niveles de fármaco en el hígado de AD-57928 y AD-58895
El objetivo de este estudio era cuantificar los niveles de ARNip en el hígado de ratones no mutantes con el fin de definir condiciones apropiadas para el cribado del nivel de fármaco. Los ARNip usados en el experimento fueron AD-57928 y AD- 58895 (que no produjeron disminución en el nivel de proteína PCSK9 en el Ejemplo 5). Se usó AD-58895 como comparador para definir momentos de tiempo en los que es observable una diferencia en el nivel de fármaco que refleje eficacia.
Se usaron un total de 33 ratones hembra C57B6 en el experimento (3 ratones por grupo). Estos ratones se administraron con una única dosis subcutánea de tanto AD-57928, AD-58895 como PBS como control. Se recogieron hígados 4, 24, 48, 72, 96 y 168 horas después de la dosis. Se recogieron alícuotas de tejido duplicadas por muestra, y la concentración de ARNip en el hígado se midió usando un ensayo de qRT-PCR específico de secuencias antisentido recientemente diseñadas. La cantidad medida de AD-57928 y AD-58895 por gramo de hígado con el tiempo se muestra en la Figura 10, y la cantidad de AD-57928 y AD-58895 expresada como un porcentaje de dosis teórica total se muestra en la Figura 11. El límite de detección (LOD) del ensayo de qRT-PCR fue ~1 ng/g de hígado, y el ensayo mostró buen rendimiento y reproducibilidad de duplicados precisa. Los resultados indican que AD-57928 es más estable en el hígado y AD-58895 es menos estable, y ambos pueden detectarse a través de todos los momentos de tiempo. 7 días después de la dosis, el nivel de AD-57928 es >100 veces por encima del LOD del ensayo de qRT-PCR, y el nivel de AD-58895 es >10 veces por encima del LOD. Las concentraciones de AD-57928 y AD-58895 se diferencian en promedio >10 veces según su estabilidad predicha y la eficacia observada. El momento de tiempo entre 72 y 120 horas después de la dosis puede ser apropiado para los cribados basados en la concentración de ARNip.
Ejemplo 7. Optimización de AD-57928
Con el fin de potenciar la actividad in vivo y la estabilidad de AD-57928, se prepararon agentes de ARNi adicionales basándose en las secuencias parentales de AD-57928 y se probaron (Tabla 10; las secuencias “sentido” en la Tabla 10 se desvelan como SEC ID N°: 1653-1658, respectivamente, en orden de aparición, y las secuencias “antisentido” se desvelan como SEC ID N°: 1659-1664, respectivamente, en orden de aparición; las mismas secuencias sentido y antisentido desveladas en la Tabla 10 también se desvelan en la Figura 12A).
Las secuencias sentido y antisentido sin modificar para AD-60212 son:
Sentido - 5'- CUAGACCUGUTUUGCUUUUGU - 3' (A-122088.3; SEC ID N°:1665); y
Antisentido - 5'-ACAAAAGCAAAACAGGUCUAGAA -3' (A-120190.19; SEC ID N°:1666).
En general, estos compuestos contuvieron menos modificaciones de 2'-flúor y se eliminaron las uridinas modificadas con flúor. La potencia in vitro de estos dúplex se probó por transfección de células HeLa y Hep3b. Como se muestra en la Figura 12B, AD-59849, AD-59228 y AD-60212 tienen valores de CI50 comparables al parental (AD-57928).
La capacidad de estos dúplex para persistir in vivo en el hígado también se determinó administrando 1 mg/kg de cada dúplex a ratones no mutantes y determinando el nivel de ARNip por PCR cuantitativa. Como se representa en la Figura 13, todos los dúplex muestran mayor persistencia en el hígado que el dúplex parental a partir del momento de tiempo de 120 horas después de la administración.
La capacidad de estos dúplex para suprimir la expresión de proteína PCSK9 también se evaluó in vivo midiendo niveles de proteína PCSK9, LDL, HDL, colesterol total (Ct), triglicéridos (Tg), alanina transaminasa (ALT), aspartato aminotransferasa (AST) y fosfatasa alcalina (ALP) en el suero de primates no humanos (NHP). También se monitorizó la presencia de reacción en el sitio de inyección. Los dúplex se administraron usando un programa de dosificación que incluyó una “fase de carga” durante la primera semana (una dosis de 2 mg/kg diariamente durante 5 días posteriores, qdx5), seguido de una “fase de mantenimiento” (tres dosis a la semana de 2 mg/kg durante 3 semanas, qwx3), como se describe en la Tabla 11 a continuación.
Dúplex
ID sentido Sentido ID antisentido Antisentido
AD-57928 (parental)
A-117428 Cfs us AfgAfcCf uGf Uf Uf u UfgCf u Uf u UfgUf L96 A-117429 as Cfs a Af a Af g Cf a Af a acAf gGf u Cf u Afg sasa
AD-59849
A-121244 Cfs us AfgAfcCf u Gf Uf Uf u Ufgcu u u ug u L96 A-121239 asCfsaAfaagCfaAfaacAfgGfucuAfgsasa
AD-60688
A-120188 csusagacCfuGfuuuugcuuuuguL96 A-121239 asCfsaAfaagCfaAfaacAfgGfucuAfgsasa
AD-59223
A-120188 csusagacCfuGfuuuugcuuuuguL96 A-120190 asCfsaAfAfAfgCfaAfaAfcAfgGfuCfuagsasa
AD-60212
A-122088 csusagacCfuGfudTuugcuuuuguL96 A-120190 asCfsaAfAfAfgCfaAfaAfcAfgGfuCfuagsasa
AD-59228
A-120197 CfsusAfgAfcCfuGfUfUfuUfgCfsuUfsuUfsgsUfsL96 A-120202 asCfsaAfaAfsgCfaAfaacAfgGfuCfsuAfgsasa
Artículo de prueba
Número de grupo N Nivel de dosis (mg/kg) Frecuencia de dosis Dosis acumulada (mg/kg)
AD-57928
1 2 qdx5+qwx3, 8 dosis 16
AD-59849
2 2 qdx5+qwx3, 8 dosis 16
AD-60688
3 3 hembras 2 qdx5+qwx3, 8 dosis 16
AD-59223
4 2 qdx5+qwx3, 8 dosis 16
AD-60212
5 2 qdx5+qwx3, 8 dosis 16
AD-59228
6 2 qdx5+qwx3, 8 dosis 16
Sangre: Días -9, -6, -3, 4, 7, 10, 14, 17, 21,24, 28, 31, 35, 42, 49, 56, 63 (primera dosis, día 1) Observación del sitio de inyección: Sí
Lecturas: proteína PCSK9, LDL, HDL, Ct, Trig, ALT, AST, ALP
Como se muestra en las Figuras 14A y 14B, todos los compuestos, excepto AD-60688, logran más del 80 % de silenciamiento de PCSK9 y animales individuales en el grupo de AD-60212 logran más del 90 % de silenciamiento de PCSK9. La Figura 15 demuestra que, en ausencia de estatinas, todos los compuestos, excepto AD-60688, logran el 60 % 5 de reducción del colesterol LDL y animales individuales en el grupo de AD-59223 logran hasta el 77 % de reducción del colesterol LDL. Sorprendentemente, y como se representa en la Figura 18, los agentes indicados mantuvieron la reducción del colesterol 46 días tras la última dosis de los agentes indicados. Incluso más sorprendentemente, y como se representa en la Figura 19, AD-60212 y AD-59849 mantienen hasta el 60 % de reducción del colesterol LDL hasta al menos el día 120 (93 días después de la dosis final), más que cualquier efecto observado para un agente de iARN in vivo, que indica que, tras 10 una fase de carga, estos compuestos pueden administrarse a una frecuencia de una vez al mes, una vez cada dos meses, una vez cada tres meses, una vez cada cuatro meses, una vez cada cinco meses o una vez cada seis meses durante la fase de mantenimiento.
Ejemplo 8. Preparación de secuencias de PCSK9 basadas en AD-57928 adicionales
Se prepararon agentes de ARNi adicionales basándose en las secuencias parentales de AD-57928 (véase la Tabla 12, más 15 adelante) y se probaron in vitro para la potencia transfectando células HeLa y Hep3B con estos agentes. Los valores de CI50 para estos agentes se muestran en la Tabla 13.
155
ID del dúplex
Hebra codificante Sentido (5' a 3')
AD-57928.45
A-117428.1 CfsusAfgAfcCfuGfUfUfuUfgCfuUf uUfgUfL96
AD-60928.1
A-122701.2 CfsusAfgAfcCfuGfUfUfu UfgCfu Uf uUfgAfL96
AD-60929.1
A-122703.2 GfsusAfgAfcCf uGfUf Ufu UfgCfu Uf uUfgUfL96
AD-60930.1
A-122705.2 Gfsas Afg AfcCf u Gf Uf Uf u Ufg Cfu Uf uUfgUfL96
AD-60931.1
A-122707.3 GfsasUfgAfcCfuGfUfUfu UfgCfu Uf uUfgUfL96
AD-60932.1
A-122707.4 GfsasUfgAfcCfuGfUfUfu UfgCfu Uf uUfgUfL96
AD-60933.1
A-122710.2 Cfsas UfcAfcCf uGfUf Ufu UfgCfu Uf uUfgUfL96
AD-60934.1
A-122712.2 Cfs us UfcUfcCf u Gf Uf Uf u Ufg Cfu Uf uUfgUfL96
AD-60927.1
A-122714.2 Cfs us Afc Uf g Cf u Gf Uf Uf u Ufg Cf u Uf uUfgUfL96
AD-57928.45
A-117428.1 CfsusAfgAfcCfuGfUfUfu UfgCfu Uf uUfgUfL96
AD-60906.1
A-117428.1 CfsusAfgAfcCfuGfUfUfu UfgCfu Uf uUfgUfL96
AD-60907.1
A-117428.1 CfsusAfgAfcCfuGfUfUfu UfgCfu Uf uUfgUfL96
AD-60908.1
A-117428.1 CfsusAfgAfcCfuGfUfUfu UfgCfu Uf uUfgUfL96
AD-60909.1
A-117428.1 CfsusAfgAfcCfuGfUfUfu UfgCfu Uf uUfgUfL96
AD-60910.1
A-117428.1 CfsusAfgAfcCfuGfUfUfu UfgCfu Uf uUfgUfL96
SEC ID
N°:
1577
1578
1579
1580
1581
1582
1583
1584
1585
1586
1587
1588
1589
1590
1591
Antisentido
Antisentido (5' a 3') SEC ID N°:
A-117429.1
asCfsaAfaAfgCfaAfaacAfgGfuCfuAfgs asa 1605
A-122702.2
usCfsaAfaAfgCfaAfaacAfgGfuCfuAfgs asa 1606
A-122704.2
asCfsaAfaAfgCfaAfaacAfgGfuCfuAfcs usu 1607
A-122706.2
asCfsaAfaAfgCfaAfaacAfgGfuCfuUfcs usu 1608
A-122708.2
asCfsaAfaAfgCfaAfaacAfgGfuCfaUfcs usu 1609
A-122709.2
asCfsaAfaAfgCfaAfaacAfgGfuCfaUfcs asa 1610
A-122711.2
asCfsaAfaAfgCfaAfaacAfgGfuGfaUfg sasa 1611
A-122713.2
asCfsaAfaAfgCfaAfaacAfgGfaGfaAfg sasa 1612
A-122715.2
as Cfsa Af a Af gCf a Af aa cAf g Cf a Gf u Af gs asa 1613
A-117429.1
asCfsaAfaAfgCfaAfaacAfgGfuCfuAfgs asa 1614
A-122309.1
asCfsaAfaAfgCf(Ayh)AfaacAfgGfuCfu Afgsasa 1615
A-122310.1
asCfsaAfaAfgCfa(Ayh)aacAfgGfuCfu Afgsasa 1616
A-122311.1
asCfsaAfaAfgCfaAf( Ayh) acAfgGf u Cfu Afgsasa 1617
A-122312.1
as Cfs a Af a Af g Cf a Af a( Ay h) cAf gGf u Cfu Afgsasa 1618
A-122313.1
asCfsa Af a Af gCf (Ay h) Af a acAf (Gy h) Gf uCf(Uyh)Afgsasa 1619
156
ID del dúplex
Hebra codificante Sentido (5' a 3')
AD-60911.1
A-122307.1 Cfsus(Ayh)(Gyh)(Ayh)(Cyh)CfuGf UfUfuUf(Gyh)Cf(Uyh)Uf(Uyh)Uf( Gyh)UfL96
AD-60912.1
A-122308.1 (Cyh)u(Ayh)(Gyh)(Ayh)(Cyh)Cfu GfUfUfuUf(Gyh)Cf(Uyh)Uf(Uyh)U f(Gyh)UfL96
AD-60913.1
A-122307.1 Cfsus(Ayh)(Gyh)(Ayh)(Cyh)CfuGf UfUfuUf(Gyh)Cf(Uyh)Uf(Uyh)Uf( Gyh)UfL96
AD-60914.1
A-122307.1 Cfsus(Ayh)(Gyh)(Ayh)(Cyh)CfuGf UfUfuUf(Gyh)Cf(Uyh)Uf(Uyh)Uf( Gyh)UfL96
AD-60915.1
A-122307.1 Cfsus(Ayh)(Gyh)(Ayh)(Cyh)CfuGf UfUfuUf(Gyh)Cf(Uyh)Uf(Uyh)Uf( Gyh)UfL96
AD-57928.45
A-117428.1 CfsusAfgAfcCfuGfUfUfu UfgCfu Uf uUfgUfL96
AD-60916.1
A-122307.1 Cfsus(Ayh)(Gyh)(Ayh)(Cyh)CfuGf UfUfuUf(Gyh)Cf(Uyh)Uf(Uyh)Uf( Gyh)UfL96
AD-60917.1
A-122307.1 Cfsus(Ayh)(Gyh)(Ayh)(Cyh)CfuGf UfUfuUf(Gyh)Cf(Uyh)Uf(Uyh)Uf( Gyh)UfL96
AD-60918.1
A-122308.1 (Cyh)u(Ayh)(Gyh)(Ayh)(Cyh)Cfu GfUfUfuUf(Gyh)Cf(Uyh)Uf(Uyh)U f(Gyh)UfL96
AD-60919.1
A-122308.1 (Cyh)u(Ayh)(Gyh)(Ayh)(Cyh)Cfu GfUfUfuUf(Gyh)Cf(Uyh)Uf(Uyh)U f(Gyh)UfL96
SEC ID
N°:
1592
1593
1594
1595
1596
1597
1598
1599
1600
1601
Antisentido
A-117429.1
A-117429.1 A-122309.1
asCfsaAfaAfgCfaAfaacAfgGfuCfuAfgs 1620 asa
asCfsaAfaAfgCfaAfaacAfgGfuCfuAfgs 1621
asa
asCfsaAfaAfgCf(Ayh)AfaacAfgGfuCfu 1622 Afgsasa
A-122310.1
A-122311.1
A-117429.1 A-122312.1
A-122313.1
A-122309.1
A-122310.1
asCfsaAfaAfgCfa(Ayh)aacAfgGfuCfu 1623 Afgsasa
asCfsaAfaAfgCfaAf(Ayh)acAfgGfuCfu 1624 Afgsasa

asCfsaAfaAfgCfaAfaacAfgGfuCfuAfgs 1625
asa

asCfsaAfaAfgCfaAfa(Ayh)cAfgGfuCfu 1626
Afgsasa

asCfsa Af a Af gCf (Ay h) Af a acAf (Gy h) Gf 1627
uCf(Uyh)Afgsasa
asCfsaAfaAfgCf(Ayh)AfaacAfgGfuCfu 1628 Afgsasa
asCfsaAfaAfgCfa(Ayh)aacAfgGfuCfu 1629 Afgsasa
ID del dúplex
Hebra codificante Sentido (5' a 3')
AD-60920.1
A-122308.1 (Cyh)u(Ayh)(Gyh)(Ayh)(Cyh)Cfu GfUfUfuUf(Gyh)Cf(Uyh)Uf(Uyh)U f(Gyh)UfL96
AD-60921.1
A-122308.1 (Cyh)u(Ayh)(Gyh)(Ayh)(Cyh)Cfu GfUfUfuUf(Gyh)Cf(Uyh)Uf(Uyh)U f(Gyh)UfL96
AD-60922.1
A-122308.1 (Cyh)u(Ayh)(Gyh)(Ayh)(Cyh)Cfu GfUfUfuUf(Gyh)Cf(Uyh)Uf(Uyh)U f(Gyh)UfL96

1602 A-122311.1 asCfsaAfaAfgCfaAf( Ayh) acAfgGf u Cfu 1630
Afgsasa

1603 A-122312.1 asCfsaAfaAfgCfaAfa(Ayh)cAfgGfuCfu 1631
Afgsasa

1604 A-122313.1 asCfsaAfaAfgCf(Ayh)AfaacAf(Gyh)Gf 1632
uCf(Uyh)Afgsasa
Tabla 13. Valores de CI50 para los agentes de ARNi identificados en la Tabla 12.
ID del dúplex
HeLa CI5ü(nM) Hep3b Cbo(nM)
AD-57928.47
0.0026 0.0005
AD-60928.1
0.0000 0.0009
AD-60929.1
0.0010 0.0027
AD-60930.1
0.0055 0.0019
AD-60931.1
0.0028 0.0019
AD-60932.1
0.0039 0.0036
AD-60933.1
0.0349 0.1518
AD-60934.1
0.2115 0.5420
AD-60927.1
>10 -
AD-57928.45
<3.57225e-005 0.0007
AD-60906.1
0.0048 0.0007
AD-60907.1
0.0001 <3.57225e-005
AD-60908.1
0.0003 0.0072
AD-60909.1
- 0.0142
AD-60910.1
0.0001 0.0030
AD-60911.1
0.0955 0.1935
AD-60912.1
0.1834 0.4106
AD-60913.1
0.2693 0.5715
AD-60914.1
0.2292 0.4319
AD-60915.1
0.2069 0.3185
AD-57928.45
0.0057 0.0027
AD-60916.1
0.0802 0.2040
AD-60917.1
0.1420 0.0976
AD-60918.1
0.4101 0.3268
AD-60919.1
0.3202 0.5143
AD-60920.1
0.5199 0.5978
AD-60921.1
0.7969 2.0875
AD-60922.1
1.1078 1.0307
Ejemplo 9. Eficacia de dosis repetidas de AD-57928
Se evaluó la eficacia de dosis repetidas de AD-57928 en suprimir la expresión de la proteína PCSK9 in vivo midiendo los
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niveles de proteína PCSK9, LDL, HDL, colesterol total (Ct), triglicéridos (Tg), alanina transaminasa (ALT), aspartato aminotransferasa (AST) y fosfatasa alcalina (ALP) en el suero de primates no humanos (NHP). También se monitorizó la presencia de reacción en el sitio de inyección. Se administraron subcutáneamente dúplex de AD-57928 usando los programas de dosificación descritos en la Tabla 14 a continuación. Los animales del grupo 5 se volvieron a dosificar con una única dosis de 25 mg/kg en el día 92. Un grupo de animales adicional se administró con una dosis única de 25 mg/kg. “2xw” es dos veces a la semana; “q2w” es una vez cada dos semanas; y “q1w” es una vez a la semana.
Tabla 14. Programas de dosificación
Artículo de prueba
Número del grupo N Nivel de dosis (mg/kg) Frecuencia de dosis Dosis acumulada (mg)
AD-57928
1 3 hembras 1 2xw, 12 dosis 12
2
2
2xw, 12 dosis 24
3
1 q2w, 6 dosis 6
4
2 q2w, 6 dosis 12
5
0,5 q1w, 6 dosis 3
6
1 q1w, 10 dosis 10
7
2 q1w, 10 dosis 20
Sangre: Días -9, -6, -3, 1 (sangrados previos) 3-129 (sangrados de eficacia) Observación del sitio de inyección: Sí Lecturas: proteína PCSK9, LDL, HDL, Ct, Trigs, ALT, AST, ALP
Como se representa en la Figura 16A, la pauta más eficaz para reducir LDL era una pauta de dos veces a la semana (2xw) que logró aproximadamente una reducción del 60 % en los niveles de LDL. La misma dosis acumulada administrada menos frecuentemente fue menos eficaz que la pauta de dos veces a la semana. La Figura 16B demuestra que la pauta de 2xw logró más del 80 % de silenciamiento de PCSK9.
Las Figuras 17A y 17B demuestran que una única dosis de 25 mg/kg de AD-57928 tiene la misma aparición de reducción de LDL y PCSK9, el mismo punto más bajo de reducción de PCSK9 y LDL y tasa equivalente de reducción de LDL que una dosis múltiple menor de 2 mg/kg de AD-57928 administrada dos veces por semana (2xw). Estos gráficos también demuestran que hay una tendencia hacia una reducción de PCSK9 más rápida con la dosis única de 25 mg/kg y que la recuperación de tanto los niveles de PCSK9 como los niveles de LDL empieza aproximadamente 20 días después de alcanzarse el punto más bajo (día 7) para la dosis única de 25 mg/kg. El punto más bajo para la dosis única de 25 mg/kg es en el día 7.
Ejemplo 10. Tolerabilidad de agentes de ARNi de AD-57928 optimizados
Se evaluaron los agentes de ARNi adicionales preparados basándose en las secuencias parentales de AD-57928 descritas en la Figura 12A (y Tabla 10) para la tolerabilidad en ratas. Se administraron subcutáneamente ratas macho con 225 mg/kg de los agentes de ARNi indicados en los días 1, 8 y 15, y se sacrificaron y se les hizo la autopsia en el día 16 (véase la Tabla 15). Los animales se observaron para cualquier síntoma clínico diariamente y los pesos corporales de los animales se determinaron antes del estudio y semanalmente durante el estudio. En el día 16, se evaluó la sangre de los animales hematológicamente, para coagulación y para química del suero; el metabolismo del fármaco y la farmacocinética de los agentes se determinaron usando muestras de hígado de los animales; y se analizaron el corazón, pulmones (hinchados), riñones, hígado, bazo, testículos, y el primer y último sitios de inyección para cualquier cambio. No hubo cambios en signos clínicos, observaciones visuales del sitio de inyección, química del suero, coagulación o patología microscópica del hígado, bazo, pulmón, corazón o testículos. La Tabla 16 proporciona un resumen de los pesos del hígado, los pesos corporales finales, los resultados de los análisis hematológicos y las puntuaciones de gravedad de la patología para los sitios de inyección finales y los riñones para cada agente probado.
Grupo de dosis
TA Dosis (mg/kg) Vol. de dosis (ml/kg) N° de machos Programa dosificación de Nx Día
1
PBS 0 3
2
AD-57928 (parental) 225 3
3
AD-59849 225 3
4
AD-59223 225 5 3 SC en los días 1, 15 8 y Día 16
5
AD-59228 225 3
6
AD-60688 225 3
7
AD-60212 225 3
Tabla 16. Resumen de tolerabilidad
AD-57928 AD-59849 AD-59223 AD-59228 AD-60688 AD-60212
(parental)
N° PS
6 6 6 13 6 6
N° 2'F
21 15 12 21 9 12
N° dT
0 0 0 0 0 1
[Hígadol (ug/g)
907±62 1139±160 1277±231 1999±424 1624±147 1258±286
AD-57928 (parental) AD-59849 AD-59223 AD-59228 AD-60688 AD-60212
BW final (% del control)
-2.1 % -4.6 % -2.1 % -6.8 % -0.5% -2.9 %
Día 16 Hematología
Sin cambio Sin cambio tWBC, tLYM, hemólisis Sin cambio Sin cambio Sin cambio
Día 16 Inflamación del sitio de inv. final
3/3 (1.7) 3/3 (1.3) 2/3 (1.5) 3/3 (2.3) 2/3 (1.0) 3/3 (1.3)
Día 16 Gránulos basófilos, riñón
3/3 (2.0) 3/3 (2.3) 3/3 (1.0) 3/3 (2.0) 3/3 (1.3) 3/3 (1.3)
Puntuaciones de gravedad de la patología: 1 = mínima; 2 = ligera; 3 = moderada BW = Peso corporal WBC = Glóbulos blancos LYM = Linfocitos

Claims (14)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    1. Un agente de iARN bicatenario que puede inhibir la expresión de proproteína convertasa subtilisina kexina 9 (PCSK9) en una célula, en el que dicho agente de iARN bicatenario comprende:
    (a) una hebra codificante complementaria a una hebra no codificante, en el que dicha hebra no codificante comprende una región complementaria a parte de un ARNm que codifica PCSK9, en el que cada hebra tiene aproximadamente 17 a aproximadamente 30 nucleótidos de longitud, en el que dicha hebra no codificante comprende al menos 17 nucleótidos de la secuencia de nucleobases ACAAAAGCAAAACAGGUCUAG (SEC ID N° 412) y el agente de iARN bicatenario se representa por la fórmula (III):
    sentido: 5' np -Na -(XXX)i-Nb-YYY -Nb-(ZZZ)j-Na - nq 3'
    antisentido: 3' np,-Na,-(X,X,X,)k-Nb,-Y,Y,Y,-Nb,-(Z,Z,Z,)l-Na'- nq' 5' (III)
    en la que:
    1, j, k y l son cada uno independientemente 0 ó 1; p, p', q y q, son cada uno independientemente 0-6;
    cada Na y Na, representa independientemente una secuencia de oligonucleótidos que comprende 0-25 nucleótidos que están tanto modificados como sin modificar o combinaciones de los mismos, comprendiendo cada secuencia al menos dos nucleótidos modificados de forma diferente;
    cada Nby Nb, representa independientemente una secuencia de oligonucleótidos que comprende 0-10 nucleótidos que están tanto modificados como sin modificar o combinaciones de los mismos;
    cada np, np,, nq y nq,, cada uno de los cuales puede o puede no estar presente, representa independientemente un nucleótido protuberante;
    XXX, YYY, ZZZ, YXX, YYY y ZZZ representan cada uno independientemente un motivo de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos;
    modificaciones en Nb se diferencian de la modificación en Y y modificaciones en Nb, se diferencian de la modificación en Y,; en el que las modificaciones en los nucleótidos son modificaciones 2'-O-metilo o 2'-flúor; y
    en el que el ligando es uno o más derivados de GalNAc unidos mediante un conector ramificado bivalente o trivalente; o
    (b) una hebra no codificante que consiste en la secuencia de nucleótidos asCfsaAfAfAfgCfaAfaAfcAfgGfuCfuagsasa y una hebra codificante que consiste en la secuencia de nucleótidos csusagacCfuGfudTuugcuuuugu,
    en las que a, g, c y u son nucleótidos A, G, C y U modificados con 2'-O-metilo (2'-OMe), respectivamente; Af, Gf, Cf y Uf son nucleótidos A, G, C y U modificados con 2'-flúor, respectivamente; dT es un nucleótido desoxitimina y s es un enlace fosforotioato;
    y en el que la hebra codificante está conjugada con al menos un ligando.
  2. 2. El agente de iARN bicatenario de la reivindicación 1, en el que
    (a) la hebra no codificante comprende la secuencia de nucleobases ACAAAAGCAAAACAGGUCUAGAA (SEC ID N° 418);
    (b) la hebra codificante comprende la secuencia de nucleobases de AGACCUGUUUUGCUUUUGU (SEC ID N° 191);
    (c) la hebra codificante comprende la secuencia de nucleobases de CUAGACCUGUUUUGCUUUUGU (SEC ID N° 197);
    (d) la hebra no codificante comprende la secuencia de nucleobases ACAAAAGCAAAACAGGUCUAGAA (SEC ID N° 418) y la hebra codificante comprende la secuencia de nucleobases CUAGACCUGUUUUGCUUUUGU (SEC ID N° 197);
    (e) la hebra no codificante comprende la secuencia de nucleobases ACAAAAGCAAAACAGGUCUAG (SEC ID N° 412) y la hebra codificante comprende la secuencia de nucleobases AGACCUGUUUUGCUUUUGU (SEC ID N° 191); o
    (f) la hebra no codificante comprende la secuencia de nucleobases ACAAAAGCAAAACAGGUCUAGAA (SEC ID N° 418) y la hebra codificante comprende la secuencia de nucleobases CUAGACCUGUTUUGCUUUUGU (SEC ID N° 1665).
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    10
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    30
  3. 3. El agente de iARN bicatenario de la reivindicación 1, en el que la región bicatenaria tiene 17-23 pares de nucleótidos de longitud, 17-25 pares de nucleótidos de longitud, 23-27 pares de nucleótidos de longitud, 19-21 pares de nucleótidos de longitud o 21-23 pares de nucleótidos de longitud.
  4. 4. El agente de iARN bicatenario de la reivindicación 1, en el que el ARNbc comprende:
    (a) una hebra no codificante que consiste en la secuencia de nucleótidos aCfaAfaAfgCfaAfaacAfgGfuCfuAfgsAfsa (SEC ID N° 1151) y una hebra codificante que consiste en la secuencia de nucleótidos CfuAfgAfcCfuGfUfUfuUfgCfuUfuUfgUf (SEC ID N° 600);
    (b) una hebra no codificante que consiste en la secuencia de nucleótidos aCfaAfAfAfgCfaAfaacAfgGfuCfuAfgsAfsa (SEC ID N° 1246) y una hebra codificante que consiste en la secuencia de nucleótidos CfuAfgAfcCfuGfUfUfuUfgCfuuuUfgUf (SEC ID N° 695);
    (c) una hebra no codificante que consiste en la secuencia de nucleótidos aCfaaaAfgCfaAfaacAfgGfuCfuAfgsAfsa (SEC ID N° 1253) y una hebra codificante que consiste en la secuencia de nucleótidos CfuAfgAfcCfuGfUfUfuUfgCfuUfUfUfgUf (SEC ID N° 702);
    (d) una hebra no codificante que consiste en la secuencia de nucleótidos aCfaAfAfAfgCfaAfaacAfgGfuCfusAfsg (SEC ID N° 1263) y una hebra codificante que consiste en la secuencia de nucleótidos AfgAfcCfuGfUfUfuUfgCfuuuUfgUf (SEC ID N° 712);
    (e) una hebra no codificante que consiste en la secuencia de nucleótidos aCfaaaAfgCfaAfaacAfgGfuCfusAfsg (SEC ID N° 1269) y una hebra codificante que consiste en la secuencia de nucleótidos AfgAfcCfuGfUfUfuUfgCfuUfUfUfgUf (SEC ID N° 718);
    (f) una hebra no codificante que consiste en la secuencia de nucleótidos asCfsaAfaAfgCfaAfaacAfgGfuCfuAfgsasa (SEC ID N° 1369) y una hebra codificante que consiste en la secuencia de nucleótidos CfsusAfgAfcCfuGfUfUfuUfgCfuUfuUfgUf (SEC ID N° 818);
    (g) una hebra no codificante que consiste en la secuencia de nucleótidos asCfsaAfaagCfaAfaacAfgGfucuAfgsasa y una hebra codificante que consiste en la secuencia de nucleótidos CfsusAfgAfcCfuGfUfUfuUfgcuuuugu; o
    (h) una hebra no codificante que consiste en la secuencia de nucleótidos
    asCfsaAfaAfsgCfaAfaacAfgGfuCfsuAfgsasa (SEC ID N° 1400) y una hebra codificante que consiste en la secuencia de nucleótidos CfsusAfgAfcCfuGfUfUfuUfgCfsuUfsuUfsgsUfs (SEC ID N° 849);
    en las que a, g, c y u son nucleótidos A, G, C y U modificados con 2'-O-metilo (2'-OMe), respectivamente; Af, Gf, Cf y Uf son nucleótidos A, G, C y U modificados con 2'-flúor, respectivamente; dT es un nucleótido desoxitimina y s es un enlace fosforotioato.
  5. 5. El agente de iARN bicatenario de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el ligando es
    imagen1
    HO
    OH
    AcHN
    O
  6. 6. El agente de iARN bicatenario de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el ligando está unido al extremo 3' de la hebra codificante.
    5
    10
    15
    20
    25
    30
    imagen2
    en el que X es O o S.
  7. 8. El agente de iARN bicatenario de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la hebra codificante tiene un total de 21 nucleótidos y la hebra no codificante tiene un total de 23 nucleótidos.
  8. 9. Una célula in vitro que contiene el agente de iARN bicatenario de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
  9. 10. Una composición farmacéutica que comprende el agente de iARN bicatenario de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
  10. 11. La composición farmacéutica de la reivindicación 10, en la que
    (a) dicho agente de iARN se debe administrar en una disolución no tamponada,
    en la que preferentemente dicha disolución no tamponada es solución salina o agua; o
    (b) dicho agente de iARN se debe administrar con una disolución de tampón,
    en la que preferentemente dicha disolución de tampón comprende acetato, citrato, prolamina, carbonato, o fosfato o cualquier combinación de los mismos, y en la que más preferentemente dicha disolución de tampón es solución salina tamponada con fosfato (PBS).
  11. 12. Un método para inhibir la expresión de PCSK9 en una célula, comprendiendo el método:
    (a) poner en contacto la célula con el agente de iARN bicatenario de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o una composición farmacéutica de la reivindicación 10 u 11; y
    (b) mantener la célula producida en la etapa (a) durante un tiempo suficiente para obtener la degradación del transcrito de ARNm de un gen PCSK9, inhibiéndose así la expresión del gen PCSK9 en la célula,
    en el que se excluyen los métodos para el tratamiento del cuerpo humano o animal mediante terapia.
  12. 13. Un ARNbc de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o la composición farmacéutica de la reivindicación 10 u 11 para uso en un método para tratar un sujeto que tiene un trastorno mediado por la expresión de PCSK9.
  13. 14. El ARNbc o la composición farmacéutica para uso de la reivindicación 13, en el que
    (a) el sujeto es un ser humano;
    (b) el trastorno es hipercolesterolemia;
    (c) el agente de iARN bicatenario se debe administrar a una dosis de aproximadamente 0.01 mg/kg a aproximadamente 10mg/kg, aproximadamente 0.5 mg/kg, y/o a aproximadamente 50 mg/k y/o aproximadamente 10 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg;
  14. 15. El ARNbc o la composición farmacéutica para uso de la reivindicación 13 o 14, en el que dicho agente de iARN se debe administrar en una pauta de dosificación que incluye una fase de carga seguida de una fase de mantenimiento,
    en el que la fase de carga comprende administrar una dosis de 2 mg/kg, 1 mg/kg o 0.5 mg/kg cinco veces a la semana, y
    5 en el que la fase de mantenimiento comprende administrar una dosis de 2 mg/kg, 1 mg/kg o 0.5 mg/kg una vez a la semana, dos veces a la semana, tres veces a la semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas, una vez al mes, una vez cada dos meses, una vez cada tres meses, una vez cada cuatro meses, una vez cada cinco meses o una vez cada seis meses.
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