RS54905B1

RS54905B1 - Poboljšani rekombinantni humani folikulo-stimulišući hormon

Info

Publication number: RS54905B1
Application number: RS20160459A
Authority: RS
Inventors: Steffen Goletz; Lars Stöckl
Original assignee: Glycotope Gmbh
Priority date: 2010-08-04
Filing date: 2011-08-04
Publication date: 2016-10-31
Also published as: EA201390194A1; US9527899B2; ES2576868T3; SG186755A1; US20130137636A1; BR112013004051A2; CN103068839A; EP3075744B1; HUE028357T2; SMT201600219B; IL223867B; CY1117778T1; HRP20160671T1; EA029955B1; CN103068839B; SI2601210T1; EP3075744A1; WO2012017058A1; WO2012017058A8; CN106146646A

Abstract

Rekombinantni FSH preparat. pri čemu rekombinantni FSH u preparatu ima šemu glikoziiacije koja ima sledeće karakteristike:(i) relativnu količinu glikana koji nose bisektirajući N-acetilglukozamin (bisGlcNAc) od najmanje 20 % od ukupne količine glikana vezanih za FSH u preparatu; i(ii) relativnu količinu 2,6-kuplovane sijalinske kiseline od najmanje 40% od ukupne količine sijalinskih kiselina.Prijava sadrži još 14 patentnih zahteva.

Description

OBLAST TEHNIKE

[0001]Predmetni pronalazak se odnosi na oblast gonadotropma Naročito je realizovan poboljšani rekombinantni humani f ol i k u lo-stim u I i raj uć i hormon (rhFSH). Ovaj poboljšani rhFSH je koristan u lečenju neplodnosti, a naročito kod ljudskih pacijenata.

STANJE TEHNIKE

[0002]Gonadotropini su grupa proteinskih hormona koji regulišu gonadnu, odn polnu funkciju kod muškaraca i žena i zato igraju značajnu ulogu u ljudskoj plodnosti. Njih izlučuju gonadotropne ćelije hipofize kićmenjaka posle stimulacije sa hormonom koji oslobađa gonadotropin (engl. gonadotropin-releasing hormone, skr. GnRH). Gonadotropini su heterodimerni glikoproteini koji obuhvataju folikulo-stimulirajući hormon (FSH). luteinizirajući hormon (LH) i horionski gonadotropin (CG). Gonadotropini dele identične alfa-podjedinice, ali sadrže različite beta-podjedinice koje obezbeđuju specifičnost vezivanja receptora.

[0003]FSH sadrži 92 aminokiselinske alfa-podjedinice i 111 aminokiselinskih beta-podjedinica koje dodeljuju specifično vezivanje za FSH receptor. Obe podjedinice prirodnog proteina su modifikovane glikozilacijom. Alfa-podjedinica je prirodno glikozilovana na Asn52 i Asn78, a beta-podjedinica na Asn7 i Asn24. Obe podjedinice se proizvode u ćelijama kao prekursorski proteini, a onda se prerađuju i izlučuju. FSH reguliše razvoj, rast, pubertetsko sazrevanje, i reproduktivne procese tela. On naročito stimuliše sazrevanje germinativnih ćelija i zato je uključen u spermatogenezu i folikulogenezu

[0004]Folikulogenezu indukuje FSH, na primer, vezivanjem FSH za FSH receptore na površini granuloznih ćelija. FSH receptori su receptori kuplovani sa G proteinom koji aktiviraju kuplovani G protein posle vezivanja FSH. G protein dalje aktivira adenilil ciklazu, što rezultuje proizvodnjom cAMP, drugog mesendžerskog molekula. Povećanje cAMP koncentracije u ćeliji aktivira nekoliko nizvodnih ciljeva, a naročito protein kinaze zavisne od cAMP. što onda dovodi do sinteze progesterona i estradiola. Progesteron i estradiol izlučuju granulozne ćelije, indukujući folikulogenezu. Posle stimulacije granuloznih ćelija sa FSH, one takođe oslobađaju inhibin-B, koji formira kolo sa negativnom povratnom spregom, inhibirajući proizvodnju i izlučivanje FSH u hipofizi. Pokazano je da je inhibin-B dobar surogat marker za stimulaciju jajnika sa FSH

[0005]FSH se široko koristi u lečenju neplodnosti, bilo sam. ili u kombinaciji sa drugim agensima, a naročito LH U odgovarajućoj oblasti se za lečenje ljudi generalno koristi FSH prečišćen iz post-menopauzalnog humanog urina (urinarni FSH) ili FSH rekombinantno proizveden u ovarijalnim ćelijama kineskog hrčka (engl. Chinese hamster ovarv, skr. CHO). Međutim, postoji značajna heterogenost povezana sa FSH preparatima zbog prisustva različitih izoformi Pojedinačne FSH izoforme imaju identične aminokiselinske sekvence, ali se razlikuju po obimu i prirodi svoje glikozilacije Posebne izoforme su karakterisane heterogenošću struktura ugljenohidratnih grana i inkorporiranjem različitih količina sijalinske kiseline (negativno naelektrisana terminalna monosaharidna jedinica), pri čemu oba utiču na specifičnu bioaktivnost izoforme. Shodno tome. šema glikozilacije FSH ima značajan uticaj na njegovu biološku aktivnost

[0006]Međutim, urinarni FSH od različitih donora i iz različitih preparata može značajno varirati u pogledu svojih ugljeničnohidratnih struktura, što rezultuje sa velikim varijacijama od šarže do šarže Takođe postoje bezbednosni razlozi za zabrinutost usled prisustva virusa u urinarnim proizvodima. Pored toga. FSH dobijen iz CHO ćelija ispoljava šemu glikozilacije koja je specifična za ove ćelije hrčaka koje nisu identične humanim šemama glikozilacije. Ove razlike rezultuju različitim biološkim aktivnostima i neželjenim dejstvima dobijenog FSH i. shodno tome, farmaceutskih preparata koji treba da se daju pacijentu.

[0007]Imajući ovo u vidu, jedan cilj predmetnog pronalaska je realizacija poboljšanih FSH preparata

[0008]Pored toga, cilj predmetnog pronalaska je da se realizuju FSH preparati sa novim terapeutskim ili farmakološkim karakteristikama.

[0009]Pored toga, cilj predmetnog pronalaska je da se realizuju FSH preparati koji imaju poboljšanu šemu glikozilacije.

SUŠTINA PRONALASKA

[0010]Aktuelni pronalazači su otkrili da poboljšani FSH preparati dobijem iz humanih ćelija koje su prvenstveno izabrane na osnovu optimizirane glikozilacije mogu da indukuju izlučivanje seksualnih steroida kao što su estradiol i progesteron pri nižim koncentracijama od odgovarajućih FSH preparata dobijenih od ljudskog urina ili CHO ćelija Zbog toga. FSH preparati prema predmetnom pronalasku imaju iznenađujuće karakteristike koje su korisne u terapiji.

[0011]Predmetnim pronalaskom je realizovan, prema prvom aspektu, rekombinantni FSH preparat, pri čemu rekombinantni FSH u preparatu ima šemu glikozilacije koja ima sledeće karakteristike: (i) relativnu količinu glikana koji nose bisektirajući N-acetilglukozamin (bisGIcNAc) od najmanje 20% ukupne količine glikana vezanih za FSH u preparatu; i (ii) relativnu količinu 2,6-kuplovane sijalinske kiseline od najmanje 40% ukupne količine sijalinskih kiselina.

[0012]Rekombinantni FSH preparat se može dobiti proizvodnjom u humanim ćelijama ili humanoj ćelijskoj liniji, a prvenstveno u ćelijskoj liniji GT-5s (DSM ACC3078, deponovana 28 jula 2010 ) Utvrđeno je da FSH proizveden u odgovarajućoj ćelijskoj liniji rezultuje poboljšanim profilom glikozilacije, kao što je opisano gore i u nastavku.

[0013]Takođe je realizovana i farmaceutska kompozicija koja sadrži rekombinantni FSH prema predmetnom pronalasku

[0014]Pored toga, predmetni pronalazak se odnosi na rekombinantni FSH preparat ili farmaceutsku kompoziciju prema predmetnom pronalasku za primenu u lečenju neplodnosti.

[0015]Pored toga. predmetni pronalazak se odnosi na rekombinantni FSH preparat ili farmaceutsku kompoziciju prema predmetnom pronalasku za indukciju i/ili stimulaciju izlučivanja seksualnih steroida takođe nezavisno od cAMP

[0016]Neki eksperimenti su pokazali da niska koncentracija FSH prema pronalasku u izvesnim okolnostima utiče nezavisno od cAMP signalizacije u ciljnim ćelijama. Shodno tome, eksperimenti sugerišu da poboljšani FSH preparati prema predmetnom pronalasku mogu mdukovati izlučivanje seksualnih steroida kao što je progesteron u koncentracijama koje ne povećavaju izlučivanje cAMP. Zbog toga se smatra da izvesni primeri izvođenja poboljšanih FSH preparata prema predmetnom pronalasku mogu da indukuju putanju prenosa signala koja dovodi do izlučivanja seksualnih steroida koja je drugačija od poznate putanje prenosa signala korišćenjem cAMP kao drugog mesendžera koja je opisana za uobičajeno korišćene FSH preparate

[0017]Pored toga, predmetni pronalazak se odnosi na rekombinantni FSH preparat ili farmaceutsku kompoziciju prema predmetnom pronalasku za stimulaciju ili ko-stimulaciju sazrevanja germinativnih ćelija biološkim procesom koji je nezavisan od cAMP signalizacije

[0018]Pored toga, predmetni pronalazak se odnosi na rekombinantni FSH preparat ili farmaceutsku kompoziciju prema predmetnom pronalasku za indukciju i/ili stimulaciju izlučivanja seksualnih steroida pri FSH koncentracijama pri kojima se ne indukuje detektabilno oslobađanje cAMP koje je veće od oslobađanja cAMP u odsustvu FSH

[0019]Drugi ciljevi, karakteristike, prednosti i aspekti predmetnog pronalaska će postati jasni stručnjacima iz odgovarajuće oblasti na osnovu sledećeg opisa i priloženih patentnih zahteva Međutim, podrazumeva se da su sledeći opis. priloženi patentni zahtevi i specifični primeri, koji ukazuju na poželjne primere izvođenja prijave, dati samo kao ilustracija. Različite promene i modifikacije u okviru duha i obima otkrivenog pronalaska će lako postati očigledne stručnjacima iz odgovarajuće oblasti posle čitanja sledećeg.

DETALJNI OPIS PRONALASKA

Definicije:

[0020]Kada se ovde koriste, sledeći izrazi generalno treba da prvenstveno imaju značenja koja su navedena u nastavku, osim u meri u kojoj kontekst ukazuje drugačije

[0021]Kada se ovde koristi, izraz "sadrži", pored svog regularnog značenja takođe obuhvata i specifično se odnosi na izraze "u suštini se sastoji od" i "sastoji se od" Shodno tome, izraz "sadrži" se odnosi na primere izvođenja gde predmet koji "sadrži" specifično navedene elemente ne sadrži druge elemente, kao i primere izvođenja gde predmet koji "sadrži" specifično navedene elemente može i/ili zaista obuhvata i druge elemente.

[0022]Izraz "FSH" se odnosi na folikulo-stimulišući hormon, gonadotropin. FSH je glikoprotein koji sadrži dve podjedinice. označene kao alfa i beta podjedinice Prvenstveno, FSH je humani FSH, a naročito humani FSH koji sadrži alfa podjedinicu koja ima aminokiselinsku sekvencu sa SEQIDNO 1 i beta podjedinicu koja ima aminokiselinsku sekvencu sa SEQ ID NO: 2. Međutim, jedna ili više, kao što su 1, 1 ili 2, do 3, do 5, do 10 ili do 20, aminokiselinske supstitucije, adicije i/ili delecije mogu biti prisutne u jednoj ili obe podjedinice. Prvenstveno, aminokiselinska sekvenca sa alfa podjedinicom deli globalnu homologiju ili identičnost od najmanje 80%. još poželjnije najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 98% sa aminokiselinskom sekvencom prema SEQ ID NO 1 Pored toga, aminokiselinska sekvenca sa beta podjedinicom prvenstveno deli globalnu homologiju ili identičnost od najmanje 80%, još poželjnije najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 98% sa aminokiselinskom sekvencom prema SEQ ID NO: 2. Podjedinice FSH su prvenstveno dva posebna polipeptidna lanca, međutim, kada se ovde koristi, onda izraz "FSH" takođe obuhvata primere izvođenja gde su đve podjedinice međusobno kovalento vezane, npr. pomoću agenasa za umrežavanje ili veznog polipeptidnog lanca, i primere izvođenja, gde su jedna ili obe podjedinice dalje podeljene na nekoliko polipeptidnih lanaca. Prvenstveno FSH prema pronalasku može da se vezuje i/ili da aktivira FSH receptor, a prvenstveno humani FSH receptor Izraz "FSH" kada se ovde koristi se naročito odnosi na sve FSH proteine u preparatu Shodno tome, izraz "FSH" se naročito odnosi na celinu svih FSH proteina u FSH preparatu ili kompoziciji

[0023]Prvenstveno obe podjedinice FSH proteina sadrže jednu ili više ugljenohidratnih struktura vezanih za polipeptidni lanac. Još poželjnije, ugljenohidratne strukture su vezane za asparaginske ostatke podjedinica. U posebno poželjnim primenma izvođenja, alfa podjedinica sadrži dve ugljenohidratne strukture koje su vezane za Asn52 i Asn78 i/ili beta-podjedinica sadrži dve ugljenohidratne strukture koje su vezane za Asn7 i Asn24. Aminokiselinski ostaci koji nose ugljenohidratne strukture su označeni u odnosu na humane aminokiselinske sekvence alfa i beta podjedinica sa SEQ ID NO: 1 i 2, respektivno Šećerni deo humanog FSH je prvenstveno sačinjen od fukoze, galaktoze, manoze. galaktozamina, glukozamina, i/ili sijalinske kiseline

[0024]FSH koji se upotrebljava prema predmetnom pronalasku je prvenstveno rekombinantni FSH, još poželjnije rekombinantni humani FSH Izraz "rekombinantni FSH" se odnosi na FSH koji prirodno ne proizvodi ljudsko ili životinjsko telo i koji se onda dobija od uzorka dobijenog iz njega, kao što je urin, krv ili neka druga telesna tečnost, feces ili tkivo iz ljudskog ili životinjskog teia Prvenstveno se rekombinantni FSH dobija iz ćelija koje su tretirane biotehnološkim inženjeringom, a naročito ćelija koje su bile transformisane ili transfektovane sa nukleinskom kiselinom koja kodira FSH ili alfa ili beta podjedinice FSH. Prema poželjnim primerima izvođenja, rekombinantni FSH se dobija iz humanih ćelija koje sadrže egzogenu nuklemsku kiselinu koja kodira FSH. Odgovarajuće egzogene nukleinske kiseline se mogu uvesti npr korišćenjem jednog ili više vektora ekspresije, koji se mogu uvesti u ćeliju domaćina npr. putem transfekcije. Odgovarajuće metode za rekombmantnu proizvodnju proteina i FSH su dobro poznate iz stanja tehnike i shodno tome, nije potrebno dalje opisivanje.

[0025]FSH prema pronalasku prvenstveno je FSH, još poželjnije humani FSH, koji se može dobiti proizvodnjom u humanoj ćeliji, a prvenstveno humanoj ćelijskoj liniji Humana ćelijska linija se prvenstveno dobija od humanih krvnih ćelija, a naročito je to mijeloidna ćelijska linija a prvenstveno mijeloidna leukemična ćelijska linija. Ćelijska linija je prvenstveno imortalizovana. U poželjnom primeru izvođenja, ćelijska linija za proizvodnju FSH prema pronalasku je ćelijska linija GT-5s, deponovana 28. jula 2010. pod pristupnim brojem DSM ACC3078 u skladu sa zahtevima iz Budimpeštanskog sporazuma kod Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ). lnhoffenstra[3e 7B, 38124 Braunschweig (DE) od strane Givcotope GmbH. Robert-Rossle-Str. 10, 13125 Berlin (DE), ili ćelijska linija dobijena od nje, ili homologna ćelijska linija GT-5s je imortalizovana humana mijeloidna leukemična ćelijska linija koja može da obezbedi specifičnu šemu glikozilacije kao što je ovde opisano Prema predmetnom pronalasku, izrazi "GT-5s" i "GT-5s ćelijska linija" takođe obuhvataju ćelije ili ćelijske linije dobijene od GT-5s Ćelijska linija koja je dobijena od GT-5s, može biti, na pnmer, dobijena slučajnom ili specifičnom selekcijom pojedinačnog klona ili grupe ćelija iz GT-5s kulture, opciono posle tretiranja GT-5s ćelija sa ciljem da se poveća njihova stopa mutacije, ili genetskom izmenom GT-5s ćelijske linije. Izabrani klon ili grupa ćelija mogu dalje biti tretirani kao što je gore opisano i/ili se mogu izvršiti sledeći krugovi selekcije. Ćelijska linija koja je homologna sa GT-5s je naročito imortalizovana humana mijeloidna ćelijska linija. Prvenstveno ćelijska linija dobijena od GT-5s ili homologna sa njom može da proizvodi FSH koji ima šemu glikozilacije koja je slična onoj koja je dobijena od GT-5s Prvenstveno, FSH koji proizvodi ćelijska linija dobijena od GT-5s ili homologna sa njom ima jednu ili više glikozilacionih karakteristika koje su ovde opisane, a naročito relativnu količinu glikana koji nose bisektirajući N-acetilglukozamin (bisGIcNAc) od najmanje 20 %; i/ili relativnu količinu glikana koji nose fukozu od najmanje 30%; i/ili relativnu količinu 2,6-kuplovane sijalmske kiseline od najmanje 30%; i/ili drugačiju šemu glikozilacije Prema jednom primeru izvođenja, ćelijska linija dobijena od GT-5s ili homologna sa njom može da izražava FSH koji ima šemu glikozilacije koja je ovde opisana kao poželjna, a naročito šemu glikozilacije izabranu iz Tabele 1. Slična šema glikozilacije FSH koji proizvodi ćelijska linija dobijena od GT-5s ili homologna sa njom se prvenstveno razlikuje od šeme glikozilacije FSH dobijenog od GT-5s za 20% ili manje, još poželjnije za 15% ili manje, za 10% ili manje il za 5% ili manje, a naročito po jednom ili više, a prvenstveno po svim svojstvima glikozilacije izabranih iz grupe koja se sastoji od relativne količine bisGIcNAc, relativne količine sijalizovanih glikana, relativne količine sulfonovanih glikana, relativne količine 2.6-kuplovanih sijalinskih kiselina, relativne količine fukoze, relativne količine tetraantenarnih glikana, relativne količine glikanskih grana koje nose galaktozu, i Z broja. Pored toga, FSH prema pronalasku je prvenstveno FSH, još poželjnije humani FSH, koji ima jednu ili više specifičnih ovde opisanih karakteristika glikozilacije, a prvenstveno šemu glikozilacije izabranu iz Tabele 1. Ćelijska linija GT-5s, kao i ćelijske linije dobijene od nje i ćelijske linije homologne sa njom su naročito poželjne, pošto one obezbeđuju veoma stabilnu i homogenu proizvodnju proteina, a naročito u pogledu FSH proteina. One imaju veoma dobru konzistenciju od šarže do šarže, tj. proizvedeni proteini i njihova šema glikozilacije su slični kada se dobijaju iz različitih proizvodnih serija ili kada se proizvode u različitim razmerama i/ili sa različitim procedurama kultivacije Naročito je različita šema glikozilacije koja je ovde opisana veoma reproduktibilna u različitim proizvodnim serijama u kojima se koriste ove ćelijske linije za izražavanje FSH.

[0026] FSH prema predmetnom pronalasku je glikozilovan, tj on je modifikovan sa jednim ili više, a prvenstveno četiri oligosahanda vezanih za polipeptidne lance. Ovi oligosaharidi, koji se takođe nazivaju glikani ili ugljeni hidrati, mogu biti linearni ili razgranati saharidni lanci, a prvenstveno su N-vezani oligosaharidni lanci kompleksnog-tipa U zavisnosti od broja grana oligosaharid se naziva mono-, bi-, tri- ili tetraantenarnim (ili čak pentaantenarnim) Monoantenarni oligosaharid je linearan, dok bi-, tri-ili tetraantenarni oligosaharid ima jednu, dve ili tri grane, respektivno Glikoprotein sa većom antenarnosti shodno tome ima više oligosaharidnih krajnjih tačaka i može nositi više funkcionalnih terminalnih saharidnih jedinica, kao što su, na primer, sijalinske kiseline "Bar triantenarni" kada se ovde koristi se odnosi na oligosaharide koji imaju antenarnost bar od 3. uključujući triantenarne, tetraantenarne i pentaantenarne oligosaharide. "Bar tetraantenarni" kada se ovde koristi se odnosi na oligosaharide koji imaju antenarnost bar od 4, uključujući tetraantenarne i pentaantenarne oligosaharide. Što se tiče N-glikana kompleksnog tipa, bisektirajući GIcNAc ostatak se prvenstveno ne smatra granom ili antenom i shodno tome, ne dodaje antenarnost FSH

[0027] Šema glikozilacije FSH, kada se ovde navodi, se naročito odnosi na celokupnu šemu glikozilacije svih FSH proteina u FSH preparat prema predmetnom pronalasku. Naročito su razmotrene bilo koje glikanske strukture koje su sadržane u FSH proteinu i shodno tome, vezane za FSH polipeptidne lance u FSH preparatu i odražavaju se na šemu glikozilacije

[0028]Izraz "sijalinska kiselina" se naročito odnosi na bilo koji IM- ili O-supstituisani derivat neuraminske kiseline. On se može odnositi i na 5-N-acetilneuraminsku kiselinu, i na 5-N-glikolilneuraminsku kiselinu, ali se prvenstveno odnosi samo na 5-N-acetilneuraminsku kiselinu. Sijalinska kiselina, a naročito 5-N-acetilneuramska kiselina je prvenstveno vezana za ugljenohidratni lanac preko 2,3- ili 2,6-veze. Prvenstveno su u ovde opisanim FSH preparatima prisutne i 2,3-, kao i 2 6-kuplovane sijalinske kiseline.

[0029]Stepen sijalizacije FSH se normalno izražava kao Z-broj. Z-broj ukazuje na relativno negativno naelektrisanje glikanske strukture glikoproteina Z-broj se izračunava po formuli:

pri čemu je A1% procenat glikana sa naelektrisanjem od -1, A2% je procenat glikana sa naelektrisanjem od -2, A3% je procenat glikana sa naelektrisanjem od -3. i A4% je procenat glikana sa naelektrisanjem od -4 Ovi procenti se izračunavaju u odnosu na sve glikane vezane za FSH, uključujući naelektrisane, kao i nenaelektrisane glikane Naelektrisanje glikana se može obezbediti sa bilo kojom od naeiektrisanih monosaharidnih jedinica ili supstituenata sadržanih u glikanu, a naročito sa ostacima sijalinske kiseline i/ili sulfatnim grupama i/ili fosfatnim grupama. Pošto je naelektrisanje glikana FSH generalno određeno samo njihovim ostacima sijalinske kiseline i FSH generalno ima četiri glikanske strukture, Z-broj je indikacija količine sijalmskih kiselina na FSH ili kiselosti FSH. Međutim, kada FSH takođe sadrži značajnu količinu sulfnovanih glikana, onda je Z-broj indikacija kombinovanih količina sijalinskih kiselina i sulfatnih grupa.

[0030]"Relativna količina glikana" prema pronalasku se odnosi na specifični procenat ili opseg procenata glikana vezanih za FSH glikoproteine FSH preparata ili u kompoziciji koja sadrži FSH, respektivno. Naročito se relativna količina glikana odnosi na specifični procenat ili opseg procenata svih glikana sadržanih u FSH proteinima i shodno tome. vezanih za FSH polipeptidne lance u FSH preparatu ili u kompoziciji koja sadrži FSH 100 % glikana se odnosi na sve glikane vezane za FSH glikoproteine FSH preparata ili u kompoziciji koja sadrži FSH, respektivno Na pnmer, relativna količina glikana koji nose bisektirajući GlcNAc od 60% se odnosi na FSH preparat u kome 60% svih glikana sadržanih u FSH proteinima i shodno tome, vezanih za FSH polipeptidne lance u pomenutom FSH preparatu sadrži bisektirajući GlcNAc ostatak, dok 40% svih glikana sadržanih u FSH proteinima i shodno tome, vezanih za FSH polipeptidne lance u pomenutom FSH preparatu ne sadrži bisektirajući GlcNAc ostatak.

[0031]Ovde dati brojevi, a naročito relativne količine specifičnog svojstva glikozilacije, se prvestveno smatraju približnim brojevima. Naročito brojevi prvenstveno mogu biti do 10% veći i/ili manji, a naročito do 9%, 8%, 7%, 6%. 5%. 4%. 3%, 2% ili 1% veći i/ili manji

[0032]"FSH preparat" može biti bilo koja kompozicija ili supstanca koja sadrži ili se sastoji od FSH On može biti u čvrstom ili tečnom obliku i može sadržati druge sastojke pored FSH Naročito FSH preparat može biti rastvor koji sadrži FSH i podesni rastvarač, kao što je voda i/ili alkohol, ili prašak dobijen, na primer, posle liofilizacije rastvora koji sadrži FSH Podesni primeri FSH preparata su kompozicija dobijena posle ekspresije FSH u ćelijama, a naročito posle prečišćavanja FSH. ili farmaceutske kompozicije koje sadrže FSH. FSH preparat može sadržati, na primer. pored FSH, rastvarače, razređivače, ekscipijense, stabilizatore, konzervanse. soli, adjuvanse i/ili surfaktante Izraz "FSH preparat" kada se ovde koristi, naročito ima značenje "kompozicija koja sadrži FSH" Ovi izrazi se prvenstveno koriste kao sinonimi.

[0033]"Relativna količina 2,6-kuplovane sijalinske kiseline" se odnosi na specifični procenat ili opseg procenata ukupne količine sijalinskih kiselina koje su 2,6-kuplovane sijalinske kiseline Relativna količina 2,6-kuplovane sijalinske kiseline od 100% shodno tome označava da su sve sijalinske kiseline 2,6-kuplovane sijalinske kiseline. Na primer, relativna količina 2.6-kuplovanih sijalinskih kiselina od 60% se odnosi na FSH preparat u kome je 60% svih sijalinskih kiselina sadržanih u FSH proteinima i shodno tome, vezanih za oligosaharidne lance FSH proteina u pomenutom FSH preparatu vezano preko 2,6-veze, dok 40% svih sijalinskih kiselina sadržanih u FSH proteinima i shodno tome, vezanih za oligosaharidne lance FSH proteina u pomenutom FSH preparatu nije vezano preko 2,6-veze, već, na primer, preko 2,3-veze ili 2,8-veze.

[0034]Izraz "različita šema glikozilacije" se naročito odnosi na šemu glikozilacije FSH proteina u preparatu ili kompoziciji koja šema glikozilacije sadrži više različitih glikanskih struktura. Različite glikanske strukture su oligosaharidne strukture koje se razlikuju po prisustvu/odsustvu, količini i/ili poziciji najmanje jedne monosaharidne jedinice i/ili najmanje jedne hemijske modifikacije, kao što su npr. sulfatni ostaci, acetil ostaci ili slično Specifična "različita glikanska struktura" se prvenstveno razmatra samo ako je njena relativna količina najmanje 0.02 % još poželjnije najmanje 0 03 %, najmanje 0.05 %, najmanje 0.07 %, najmanje 0,1 %. najmanje 0.15 %, najmanje 0.2 %, najmanje 0.25 %, najmanje 0.3 % ili najmanje 0.5 % od ukupne količine glikanskih struktura u šemi glikozilacije. Različita šema glikozilacije je naročito šema glikozilacije koja sadrži najmanje 5 različitih glikanskih struktura. Prvenstveno, različita šema glikozilacije sadrži najmanje 7. još poželjnije najmanje 10, najmanje 15, najmanje 20, najmanje 25, najmanje 30, najmanje 35. najmanje 40, najmanje 45, najmanje 50, najmanje 55 i najpoželjnije najmanje 60 različitih glikanskih struktura Različita šema glikozilacije se takođe naročito odnosi na šemu glikozilacije FSH u preparatu ili kompoziciji koja šema glikozilacije sadrži više različitih glikanskih struktura od FSH dobijenog iz CHO ćelija u odgovarajućem preparatu ili kompoziciji Naročito, šema glikozilacije sadrži najmanje 10 %, a prvenstveno najmanje 20 %, najmanje 30 %, najmanje 40 %, najmanje 50 %, najmanje 60 %. najmanje 70 %, najmanje 80%, najmanje 90 %, i najpoželjnije najmanje 100 % više različitih glikanskih struktura od FSH dobijenog iz CHO ćelija

[0035]Izraz "nukleinska kiselina" obuhvata jednolančane i dvolančane nukelinske kiseline i ribonukleinske kiseline, kao i dezoksiribonukleinske kiseline. Ona može sadržati prirodne, kao i sintetičke nukleotide, a može biti prirodna ili sintetički modrfikovana, na primer, metilacijom, 5'- i/ili 3'-kapiranjem

[0036]Izraz "vektor" se ovde koristi u svom najopštijem značenju i obuhvata bilo koji intermedijerni nosač za nukleinsku kiselinu koji omogućava da se pomenuta nukleinska kiselina, na primer, uvede u prokariotske i/ili eukariotske ćelije domaćine i. ako je podesno, bude integrisana u genom ćelije domaćina. Vektori ove vrste se prvenstveno replikuju i/ili izražavaju u ćelijama domaćinima. Vektor prvenstveno sadrži jedan ili više selekcionih markera za selekciju ćelija domaćina koje sadrže vektor. Podesni selekcioni markeri su geni rezistencije koji obezbeđuju rezistenciju ćelije domaćina npr. protiv specifičnog antibiotika. Sledeći podesni selekcioni markeri su, na primer, geni za enzime, kao što su DHFR ili GS Vektori koji omogućavaju izražavanje rekombinantnih proteina koji obuhvataju FSH, kao i podesne ekspresione kasete i ekspresione elemente koji omogućavaju izražavanje rekombinantnog proteina sa visokim prinosom u ćeliji domaćinu su dobro poznati iz stanja tehnike i takođe se mogu komercijalno nabaviti, i shodno tome, ovde ih nije potrebno detaljno opisivati.

[0037]Izrazi "ćelija" i "ćelije" i "ćelijska linija" se koriste jedan umesto drugog, a prvenstveno se odnose na jednu ili više sisarskih ćelija, a naročito humanih ćelija. Izraz obuhvata i potomstvo ćelije ili ćelijsku populaciju Stručnjacima iz odgovarajuće oblasti će biti jasno da "ćelije" obuhvataju potomstvo pojedinačne ćelije, i to potomstvo ne mora nužno biti potpuno identično (po morfologiji ili celokupnom DNK komplementu) sa originalnom roditeljskom ćelijom zbog prirodne, slučajne, ili namerne mutacije i/iii promene "Ćelija" se prvenstveno odnosi na izolovane ćelije i/ili kultivisane ćelije koje nisu inkorporirane u živo ljudsko ili životinjsko telo.

[0038]Izraz "pacijent" označava prema pronalasku ljudsko biće. nehumanog primata ili drugu životinju, a naročito sisara, kao što je krava, konj, svinja, ovca. koza, pas, mačka ili glodar. kao što su miš i pacov. U posebno poželjnom primeru izvođenja, pacijent je ljudsko biće U slučaju humanog pacijenta, FSH je prvenstveno humani FSH. Pacijent može biti muškarac ili žena, a prvenstveno je žena

[0039]Izraz "farmaceutska kompozicija" se naročito odnosi na kompoziciju koja je podesna za administraciju čoveku ili životinji, tj. na kompoziciju koja sadrži komponente koje su farmaceutski prihvatljive. Prvenstveno, farmaceutska kompozicija sadrži aktivno jedinjenje ili njegovu so ili prolek zajedno sa nosačem, razređivačem ili farmaceutskim ekscipijensom, kao što je pufer, konzervans i modifikator toničnosti.

[0040]Međunarodne jedinice (IU) za FSH se odnose na četvrti Međunarodni standard za humani urinarni FSH i LH (Storring, P.L & Games Das. R.E. (2001) Journal of Endocrinologv 171. 119-129) i određuju se prema metodu inkrementalnog prirasta težine jajnika (Steelman, Si. & Pohlev, F.M (1953) Endocrinologv 53, 604-616)

[0041]Izraz "lečenje neplodnosti" prema pronalasku označava lečenje disfunkcije ili bolesti u vezi sa reprodukcijom Ili plodnošću humanog ili životinjskog subjekta Lečenje neplodnosti naročito obuhvata tehnologije asistirane reprodukcije, indukcije ovulacije, in-vitro fertilizaciju, intrautennu inseminaciju, kao i omogućavanje ili poboljšanje sazrevanja germinativnih ćelija, kao što su folikulogeneza i spermatogeneza.

[0042]Prema pronalasku, izraz "pri čemu se ne oslobađaju značajne količine cAMP" ili slični izrazi, respektivno, se naročito odnosi na oslobađanje cAMP u ćelijama ili tkivima u količini koja je manja od 25%, prvenstveno manja od 20%, još poželjnije manja od 15%. manja od 10%, manja od 7.5%, manja od 5% ili manja od 2.5% od količine oslobođenog cAMP dobijene iz ćelija ili tkiva posle stimulacije sa FSH u koncentraciji koja rezultuje maksimalnim oslobađanjem cAMP. Ove ćelije ili tkiva su osetljive ili reaguju na stimulaciju sa FSH, kao što su granulozne ćelije ili Sertolijeve ćelije Oslobađanje cAMP koje je nezavisno od FSH, tj. oslobađanje cAMP koje se takođe dešava u odsustvu FSH, ne bi trebalo razmatrati u ovom pogledu Prvenstveno je "oslobađanje značajne količine cAMP" ili "značajno oslobađanje cAMP" bilo kakvo oslobađanje cAMP iznad oslobađanja cAMP u odsustvu FSH, a naročito bilo koje detektabilno oslobađanje cAMP iznad nepreciznosti merenja. Standardna procedura za merenje oslobađanja cAMP je opisana u primerima i može se koristiti za određivanje značajnog ili beznačajnog oslobađanja cAMP. "Oslobađanje cAMP" se odnosi intracelularno oslobađanje cAMP i/ili na ekstracelularno oslobađanje ili izlučivanje cAMP, a prvenstveno samo na izlučivanje cAMP cAMP se odnosi na ciklični adenozin monofosfat koji deluje kao drugi molekul mesendžer u ćelijskom prenosu signala. cAMP se sintetiše u ćelijama od ATP pomoću adenilil ciklaze Biološki proces ili putanja prenosa signala koji su "nezavisni od cAMP signalizacije" prvenstveno ne uključuju aktivaciju adenilil ciklaze.

[0043]"Seksualni steroidi" su takođe poznati kao gonadni steroidi ili seksualni hormoni, a naročito se odnose na steroidne hormone koji sadejstvuju sa androgenskim ili estrogenskim receptorima kod kičmenjaka. Izraz "seksualni steroid" obuhvata androgene kao što su anabolički steroidi, androstenedion, dehidroepiandrosteron, dihidrotestosteron i testosteron;estrogene kao što su estradiol, estriol i estron: i progesteron. Prvenstveno se seksualni steroidi odnose na prirodne seksualne steroide, još poželjnije na prirodne humane seksualne steroide. Poželjni seksualni steroidi prema pronalasku su estradiol i progesteron, a naročito progesteron.

[0044]Predmetni pronalazak je prema jednom aspektu baziran na otkriću da poboljšani rekombinantni FSH preparat koji ima optimalnu šemu glikozilacije može da indukuje izlučivanje seksualnih steroida. kao što je progesteron, sa niskim FSH koncentracijama za koje se ne indukuje značajno oslobađanje cAMP. Naročito, prema ovom izvesnom aspektu poboljšani FSH prema predmetnom pronalasku indukuje izlučivanje seksualnih steroida sa mnogo nižim koncentracijama nego obično primenjivani urinarni FSH ili rekombinantni FSH dobijen iz CHO ćelija. Zahvaljujući tome se poboljšani FSH može davati u mnogo nižim dozama, čime se smanjuje rizik od neželjenih dejstava, a pored toga se smanjuju troškovi proizvodnje. Pored toga, kada se daje u uporedivim dozama, u ovom pnmeru izvođenja poboljšani FSH obezbeđuje dužu aktivnost u telu pacijenta u poređenju sa uobičajeno korišćenim FSH, pošto posle duže administracije u cirkulaciji ostaje samo veoma niska koncentracija FSH, FSH prema ovom primeru izvođenja predmetnog pronalaska još uvek ispoljava svoju biološku aktivnost, a prvenstveno stimuliše ili ko-stimuliše sazrevanje germinativnih ćelija i/ili oslobađanje seksualnih steroida. Pored toga, u visokim koncentracijama, poboljšani FSH prema predmetnom pronalasku i uobičajeno korišćeni urinarni ili od CHO-dobijeni FSH ispoljavaju uporedive efekte. Zbog toga nema dodatnog rizika od prekomernog doziranja u poređenju sa uobičajeno korišćenim FSH

[0045]Pored toga, aktuelni pronalazači su pokazali da je kod simijanih majmuna poboljšani FSH prema predmetnom pronalasku imao sličan ili čak veći farmakološki efekat u poređenju sa uobičajeno korišćenim urinarnim ili od CHO-dobijenim FSH. Ovo je naročito iznenađujuće, pošto FSH prema predmetnom pronalasku kod pacova i majmuna ispoljava nižu maksimalnu serumsku koncentraciju (Cmax) i poluživot u cirkulaciji od uobičajenih FSH preparata dobijenih iz urina ili CHO ćelija. Pošto uprkos nižoj bioraspoloživosti poboljšani FSH ima sličan ili veći farmakološki efekat, može se zaključiti da poboljšani FSH prema predmetnom pronalasku ima veću specifičnu terapeutsku aktivnost od urinarnog ili od CHO-dobijenog FSH Prema dobijenim kliničkim podacima, kod ljudi poboljšani FSH prema predmetnom pronalasku ima značajno većiC„, 3Xod uobičajenih FSH preparata; međutim, za poboljšani FSH poluživot u cirkulaciji je neznatno niži. ali je uporediv. Najviše iznenađujuće je to da su poboljšani FSH preparati prema predmetnom pronalasku ispoljili terapeutske efekte kod ljudi, a naročito na rast folikula, čak i posle administracije samo jedne doze Nasuprot tome. nisu uočeni nikakvi efekti posle administracije samo jedne doze uobičajeno korišćenih FSH preparata Zbog toga se očekuje da je sa poboljšanim FSH moguće mnogo preciznije lečenje pacijenata Naročiti je moguće da se upotrebe precizno vremenski i količinski određene doze za lečenje, a specijalno za poboljšanje plodnosti pacijenta i nije neophodno potencijalno dugotrajno kontinualno lečenje. Time se smanjuje rizik od višestrukih trudnoća.

[0046] Da rezimiramo, poboljšani FSH preparati prema predmetnom pronalasku su efektivniji Zbog toga se pacijentu mogu davati manje doze, koje izazivaju manje neželjenih efekata, podesnije su za pacijenta i manje koštaju Pored toga, moguć je specifičniji i detaljniji režim doziranja sa poboljšanim FSH. Pored toga, kraći poluživot smanjuje nepoželjna neželjena dejstva, a pored toga obezbeđuje brže odstranjivanje FSH iz ljudskog tela posle završetka terapije.

[0047] Bez vezivanja za ovu teoriju, aktuelni pronalazači pretpostavljaju da je veća specifična terapeutska aktivnost FSH preparata prema predmetnom pronalasku bazirana na poboljšanoj šemi glikozilacije. Naročito veća količina bisektirajućih GlcNAc ostataka i/ili veća količina 2,6-kuplovanih sijalinskih kiselina, kao i veća količina sulfonovanih glikana mogu biti odgovorne za veću aktivnost. Pored toga, FSH preparati prema predmetnom pronalasku takođe ispolavaju mnogo raznovrsniju i kompleksniju šemu glikozilacije. što znači da je više različitih glikanskih struktura prisutno u preparatu u poređenju sa uobičajenim FSH preparatima dobijenim. npr od CHO ćelija Smatra se da je od CHO-dobijeni FSH sposoban da aktivira samo jednu putanju u ciljnim ćelijama, dok poboljšani FSH prema predmetnom pronalasku, zbog svoje jedinstvene šeme glikozilacije, očigledno ispoljava svoju biološku aktivnost preko više različitih putanja, što rezultuje povećanom biološkom reakcijom Kao što je ovde pokazano sa eksperimentalnim podacima, neke od ovih putanja uključuju cAMP signalizaciju, dok su druge, nove putanje nezavisne od cAMP

[0048] U svetlosti ovih otkrića, predmetnim pronalaskom je prema prvom aspektu realizovan FSH preparat, pri čemu FSH u preparatu ima šemu glikozilacije koja ima sledeće karakteristike: (i) relativnu količinu glikana koji nose bisektirajući N-acetilglukozamin (bisGIcNAc) od najmanje 20% od ukupne količine glikana vezanih za FSH u preparatu; i (ii) relativnu količinu 2,6-kuplovane sijalinske kiseline od najmanje 40% od ukupne količine sijalinskih kiselina

[0049] Šema glikozilacije može dalje:

(iii) sadržati relativnu količinu glikana koji nose fukozu od najmanje 30%; i/ili

(iv) biti drugačija šema glikozilacije.

[0050] U izvesnim primenma izvođenja, predmetnim pronalaskom je realizovan FSH preparat, pri čemu FSH u preparatu ima šemu glikozilacije koja ima jednu ili više od sledečih karakteristika (i) relativnu količinu glikana koji nose bisektirajući N-acetilglukozamin (bisGIcNAc) od najmanje 35<%>;

(ii) relativnu količinu glikana koji nose fukozu od najmanje 60%; i

(iii) relativnu količinu 2,6-kuplovane sijalinske kiseline od najmanje 40%

[0051]Prvenstveno, pomenuti FSH je rekombinantni FSH i shodno tome, se dobija rekombinantnom proizvodnjom u ćeliji domaćinu, koja je prvenstveno humana ćelija domaćin Podesne humane ćelije domaćini koje obezbeđuju odgovarajuću šemu glikozilacije su opisane u nastavku.

[0052]Pored toga, šema glikozilacije može dalje sadržati relativnu količinu bar tetraantenarnih glikana od najmanje 15%, i/ili relativnu količinu glikana koji nose jedan ili više ostataka sijalinske kiseline od najmanje 80%, i/ili relativnu količinu glikana koji nose galaktozu od najmanje 95%, i/ili relativnu količinu glikanskih grana koje nose terminalnu galaktoznu jedinicu od najmanje 60%, i/ili relativnu količinu glikana koji nose sulfatnu grupu od najmanje 1%, a prvenstveno od najmanje 2.5%. Terminalna galaktozna jedinica može opciono dalje nositi ostatak sijalinske kiseline Rekombinantni FSH u kompoziciji prvenstveno ima Z-broj od najmanje 200,

[0053]Relativna količina glikana koji nose bisGIcNAc je prvenstveno najmanje 25%. najmanje 27%, najmanje 30%, najmanje 35%, najmanje 38% ili najmanje 40% Još poželjnije, ona je u opsegu od oko 25% do oko 60%, a naročito u opsegu od oko 35% do oko 60% ili u opsegu od oko 38% do oko 50% ili u opsegu od oko 40% do oko 45%. Prema jednom pnmeru izvođenja, ona je oko 42% Relativna količina glikana koji nose jedan ili više ostataka sijalinske kiseline je prvenstveno najmanje 83%, najmanje 85% ili najmanje 88%, i još poželjnije u opsegu od oko 85% do oko 98% ili u opsegu od oko 88% do oko 95%, najpoželjnije oko 90% Z broj je prvenstveno najmanje 210, još poželjnije najmanje 215, najmanje 220, najmanje 230 ili najmanje 240 Veći Z broj se, na primer, može dobiti obogaćivanjem FSH preparata sa kiselim i/ili negativno naelektrisanim FSH proteinima. Prvenstveno je relativna količina bar tetraantenarnih glikana najmanje 16% najmanje 17%. najmanje 18% iii najmanje 19%, još poželjnije najmanje 20% ili najmanje 21%. Relativna količina bar tnantenarnih glikana, a naročito tri- i tetraantenarnih glikana je prvenstveno najmanje 25%. najmanje 30%, najmanje 35% ili najmanje 40%, još poželjnije najmanje 45%, najmanje 50% ih najmanje 55% Prvenstveno je relativna količina glikana koji nose fukozu najmanje 35%, najmanje 40%, najmanje 50%, najmanje 60% ili najmanje 70%, još poželjnije najmanje 75% ili najmanje 78%. Ona može biti u opsegu od oko 70% do oko 90%, a naročito u opsegu od oko 75% do oko 85%. Prvenstveno je relativna količina 2,6-kuplovane sijalinske kiseline najmanje 45%, najmanje 50%, najmanje 53%, najmanje 55%, najmanje 60% ili najmanje 65%, a naročito u opsegu od oko 40 % do oko 99%. a prvenstveno od oko 40% do oko 80%, oko 50% do oko 60% ili oko 53 % do oko 70 % Prvenstveno je odnos 2,3-kuplovane sijalinske kiseline prema 2,6-kuplovanoj sijalinskoj kiselini u opsegu od oko 1:10 do oko 7.3, još poželjnije od oko 1:5 do oko 3:2 ili od oko 1:2 do oko 1:1, najpoželjnije od oko 2:3 do oko 1:1. U poželjnim primerima izvođenja, relativna količina 2,6-kuplovanih sijalinskih kiselina je veća od količine 2,3-kuplovanih sijalinskih kiselina. Relativna količina glikana koji nose galaktozu je prvenstveno najmanje 97%, a najpoželjnije je oko 98%. Prvenstveno je relativna količina glikanskih grana koje nose galaktoznu jedinicu opciono modifikovanu sa ostatkom sijalinske kiseline najmanje 65%, još poželjnije najmanje 70% ili najmanje 73%. Ona je prvenstveno u opsegu od oko 60% do oko 95%, i još poželjnije u opsegu od oko 70% do oko 80% Prvenstveno je relativna količina glikana koji nose sulfatnu grupu (sulfonovanih glikana) najmanje 1%, najmanje 15%, najmanje 2%, najmanje 2 5%, najmanje 3% ili najmanje 5%, još poželjnije najmanje 7%, najmanje 10% ili najmanje 12%. Prema jednom primeru izvođenja, relativna količina glikana koji nose sulfatnu grupu ne prelazi 50%, a prvenstveno 40%, 35%, 30%, 25% ili 20%.

[0054]U poželjnim primerima izvođenja, FSH u preparatu ima drugačiju šemu glikozilacije, pri čemu FSH u preparatu sadrži najmanje 45 ili prvenstveno najmanje 50 različitih glikanskih struktura, pri čemu svaka od različitih glikanskih struktura ima relativnu količinu od najmanje 0.05 % od ukupne količine glikanskih struktura FSH u preparatu Prema jednom primeru izvođenja, FSH u preparatu sadrži najmanje 35 ili prvenstveno najmanje 40 različitih glikanskih struktura, pri čemu svaka od različitih glikanskih strukture ima relativnu količinu od najmanje 0 1 % od ukupne količine glikanskih struktura FSH u preparatu; i/ili FSH u preparatu sadrži najmanje 20 ili prvenstveno najmanje 25 različitih glikanskih struktura, pri čemu svaka od različitih glikanskih struktura ima relativnu količinu od najmanje 0.5 % od ukupne količine glikanskih struktura FSH u preparatu U sledećem primeru izvođenja, FSH u preparatu sadrži najmanje 40 %, a prvenstveno najmanje 50 % više različitih glikanskih struktura od FSH dobijenih iz CHO ćelija u odgovarajućem preparatu, pri čemu svaka od različitih glikanskih struktura ima relativnu količinu od najmanje 0 05 %, 0.1 % ili 0 5% od ukupne količine glikanskih struktura FSH u odgovarajućem preparatu.

[0055]U poželjnim primerima izvođenja, rekombinantni FSH preparat prema pronalasku ne sadrži N-glikolil neurammske kiseline (NeuGc) ili detektabilne količine of NeuGc Pored toga, rekombinantni FSH preparat prema pronalasku takođe prvenstveno ne sadrži Galili epitope (Gala1,3-Gal strukture) ili detektabilne količine Galili epitopa

[0056] Predmetnim pronalaskom je naročito realizovan FSH sa humanom šemom glikozilacije. Zbog ovih svojstava glikozilacije, strane imunogene nehumane strukture koje mdukuju neželjene efekte su odsutne, što znači da su izbegnuta nepoželjna neželjena dejstva ili nedostaci za koje je poznato da ih izazivaju izvesne strane šećerne strukture, kao što su imunogene nehumane sijalinske kiseline (NeuGc) ili Galili epitop (Gal-Gal strukture), pri čemu su obe poznate za giodarske proizvodne sisteme, ili druge strukture kao što je imunogena visoko-manozna struktura, koja je poznata npr iz sistema sa kvascima

[0057]U Izvesnim primerima izvođenja šema glikozilacije rekombinantnog FSH u preparatu prema predmetnom pronalasku ima jednu ili više, a prvenstveno sve od sledećih karakteristika: (i) relativnu količinu glikana koji nose bisektirajući N-acetilglukozamin (bisGIcNAc) u opsegu od oko 25% do oko 50%; (ii) relativnu količinu glikana koji nose fukozu od najmanje 35%; (iii) relativnu količinu 2,64xuplovane sijalinske kiseline od najmanje 53%; (iv) relativnu količinu glikana koji nose jedan ili više ostataka sijalinskih kiselina od najmanje 88%; i

(v) relativnu količinu bar tetraantenarnih glikana od najmanje 16%

[0058]U izvesnim poželjnim primerima izvođenja, rekombinantni FSH preparat prema pronalasku ima jednu od šema glikozilacije navedenih u sledećoj Tabeli 1

[0059]U primerima izvođenja od 1 do 12 navedenim u Tabeli 1. prvenstveno je relativna količina bisektirajućeg GlcNAc najmanje 25% umesto najmanje 20%: i/ili je relativna količina 2.6-kuplovanih sijalinskih kiselina prvenstveno najmanje 55% još poželjnije najmanje 60%. umesto najmanje 53%, i/ili je relativna količina sulfonovanih glikana prvenstveno najmanje 3%. još poželjnije najmanje 10%, umesto najmanje 2.5%. Šeme glikozilacija navedene u Tabeli 1 su prvenstveno humane šeme glikozilacija i/ili ne sadrže NeuGc i Galili epitop

[0060]Pored toga, rekombinantni FSH preparat se može dobiti proizvodnjom u humanoj ćeliji domaćinu ili humanoj ćelijskoj liniji. Prvenstveno se rekombinantni FSH može dobiti iz humane mijeloidne ćelijske linije, a prvenstveno imortalizovane humane mijeloidne leukemične ćelijske linije, a naročito ćelijska linija GT-5s ili ćelijska linija koja je dobijena od nje ili ćelijska linija homologa sa GT-5s Utvrđeno je da FSH koji je proizveden u pomenutoj ćelijskoj liniji ispoljava šemu glikozilacije kao što je gore opisano, a naročito ispoljava poželjne terapeutske i farmakološke efekte koji su ovde opisani Shodno tome, predmetnim pronalaskom je takođe realizovan postupak za proizvodnju rekombinantng FSH preparata rekombinantnom ekspresijom FSH u podesnoj ćelijskoj liniji, a naročito ćelijskoj liniji koja je gore opisana, a prvenstveno ćelijskoj liniji GT-5s, ćelijskoj liniji dobijenoj od GT-5s ili ćelijskoj liniji homolognoj sa GT-5s, Rekombinantni FSH respektivno proizveden može biti izolovan i opciono prečišćen.

[0061]Shodno tome, rekombinantni FSH preparat se prvenstveno može dobiti procesom koji sadrži korake: (i) kultivaciju humane ćelije domaćina, a prvenstveno dobijene od ćelijske linije GT-5s ili homologne ćelijske linije, koja sadrži nukleinske kiseline koje kodiraju FSH alfa i beta podjedinice pod uslovima podesnim za ekspresiju FSH; i

(ii) izolaciju FSH

[0062]Humane ćelije domaćini koje se upotrebljavaju za ekspresiju su prvenstveno mijeloidne ćelije, a naročito imortalizovane mijeloidne leukemične ćelije, i prvenstveno su ćelijska linija GT-5s ili su dobijene od nje ili ćelijska linija koja je homologna sa njom. Humane ćelije domaćini se kultivušu tako da izražavaju FSH Podesni uslovi za kultivaciju su poznati stručnjaku iz odgovarajuće oblasti.

[0063]Izolacija FSH prvenstveno obuhvata sledeće korake: (a) dobijanje supernatanta kulture gde je FSH izlučen od strane humanih ćelija, ili liziranje humanih ćelija gde FSH nije izlučen, (b) izolaciju FSH iz supernatanta kulture ili ćelijskog lizata korišćenjem hromatografskih koraka, kao što su reverzno-fazna hromatografija, hromatografija na molekulskim sitima i/ili hidrofobna interaktivna hromatografija; i (c) opciono dobijanje kisele frakcije FSH zahvaljujući odstranjivanju alkalnih, odn. baznih FSH izoformi, a prvenstveno korišćenjem anjonsko izmenjivačke hromatografije koja sadrži korak ispiranja kojim se odstranjuju bazne FSH izoforme, kao što je korak ispiranja sa pH oko 5.0 ili pH oko 4.5 ili pH oko 4.0

[0064]Prvenstveno, kodiranje nukleinske kiseline za FSH alfa podjedinicu i kodiranje nukleinske kiseline za FSH beta podjedinicu su sadržani u ekspresionim kasetama koje su sadržane u podesnom ekspresionom vektoru koji omogućava izražavanje u humanoj ćeliji domaćinu. Kodiranje nukleinske kiseline za FSH alfa podjedinicu i kodiranje nukleinske kiseline za FSH beta podjedinicu mogu biti sadržani u istom vektoru, ali su prvenstveno sadržani u odvojenim vektorima Pored toga. oni takođe mogu biti izraženi u jednoj ekspresionoj kaseti uz korišćenje odgovarajućih elemenata, kao što je IRES element. Prvenstveno FSH izlučuju humane ćelije U poželjnim primerima izvođenja, kultivacija humanih ćelija se vrši u fermentoru i/ili pod uslovima bez seruma

[0065]Podesni proces prečišćavanja za rekombinantni FSH je opisan, na primer, u US prijavi patenta br. US 61/263,931, evropskoj prijavi patenta br. EP 09 014 585 5 i PCT prijavi patenta br. WO 2011/063943.

[0066]Rekombinantni FSH preparat koji se može dobiti proizvodnjom u humanim ćelijama domaćinima ili humanoj ćelijskoj liniji ispoljava karakteristike koje su ovde opisane u vezi rekombmantnog FSH preparata prema predmetnom pronalasku Naročito njegova šema glikozilacije ima jednu ili više gore opisanih karakteristika, a prvenstveno najmanje jednu šemu glikozilacije, kao što je opisano u Tabeli 1 i/ili u zahtevima od 1 do 7.

[0067]U poželjnim primerima izvođenja aspekata predmetnog pronalaska, rekombinantni FSH prema predmetnom pronalasku je rekombinantni humani FSH (rhFSH), koji se prvenstveno može dobiti proizvodnjom u humanoj ćelijskoj liniji, kao što je ćelijska linija GT-5s, koja sadrži jednu ili više nukleinskih kiselina koje kodiraju humane FSH podjedinice i elemente za izražavanje pomenute jedne ili više nukleinskih kiselina u ćeliji domaćinu Prvenstveno, alfa podjedinica rhFSH ima aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 1 ili aminokiselinsku sekvencu koja ima homolognost ili je prvenstveno identična sa SEQ ID NO 1 po njenoj celoj dužini najmanje 80 %, a prvenstveno najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 987o U poželjnim primerima izvođenja, alfa podjedinica rhFSH sadrži asparaginske ostatke na pozicijama 52 i 78 i glikozilovana je na aminokiselinama Asn52 i Asn78. Beta podjedinica rhFSH prvenstveno ima aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 2 ili aminokiselinsku sekvencu koja ima homolognost ili je prvenstveno identična sa SEG ID NO: 2 po njenoj celoj dužini najmanje 80 %, a prvenstveno najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 98% U poželjnim primerima izvođenja, beta podjedinica rhFSH sadrži asparaginske ostatke na pozicijama 7 i 24 i glikozilovana je na aminokiselinama Asn7 i Asn24.

[0068]Prema jednom primeru izvođenja, rekombinantni FSH preparat prema predmetnom pronalasku može da stimuliše oslobađanje progesterona u granuloznim ćelijama

(a) u koncentracijama za koje se ne oslobađaju značajne količine cAMP: i/ili (b) indukcijom putanje transdukcije signala koja je nezavisna od cAMP signalizacije

[0069]Prema jednom primeru izvođenja, rekombinantni FSH preparat prema predmetnom pronalasku može da stimuliše ili ko-stimuliše sazrevanje germinativnih ćelija biološkim procesom koji je nezavisan od cAMP signalizacije Kao iznenađujuće u eksperimentima je otkriveno da gore opisana šema glikozilacije rezultuje odgovarajućim novim farmakološkim profilom rekombinantnog FSH, koji ispoljava ovde opisane farmakološke i terapeutske prednosti

[0070]Rekombinantni FSH preparat prema predmetnom pronalasku može imati jednu ili više u nastavku opisanih karakteristika, što se može odrediti testiranjem na granuloznim ćelijama (kao što je npr opisano u primeru 2). Kao što je pokazano u primerima, rekombinantni FSH koji ima gore opisanu šemu glikozilacije i naročito rekombinantni FSH koji se može dobiti proizvodnjom u ćelijskoj liniji GT-5s ispoljava u nastavku opisane karakteristike koje rezultuju ovde opisanim farmakološkim i terapeutskim prednostima.

[0071]Rekombinantni FSH preparat prema jednom primeru izvođenja može da stimuliše oslobađanje progesterona u granuloznim ćelijama u koncentracijama koje su manje od minimalne koncentracije koja je potrebna za indukciju oslobađanja cAMP u granuloznim ćelijama Dole navedeno oslobađanje progesterona, estradiola i/ili cAMP se odnosi nain vitrooslobađanje u oko 1<*>10<J>do oko 1<*>10<S>granuloznih ćelija/ml, a prvenstveno u oko 5<*>10<4>do oko 1<*>10<5>granuloznih ćelija/ml, a naročito pod uslovima koji su opisani dole u primeru 2.

[0072]Prvenstveno, rekombinantni FSH preparat prema predmetnom pronalasku može da oslobodi najmanje 100ng/ml, najmanje 150 ng/ml, najmanje 200ng/ml, a prvenstveno najmanje 250ng/ml, najmanje 300 ng/ml ili najmanje 400 ng/ml progesterona sa koncentracijom koja ne indukuje oslobađanje cAMP ili koja indukuje oslobađanje cAMP manje od 20 pmol/ml. manje od 15 pmol/ml, manje od 10 pmol/ml, manje od 5 pmol/ml.

[0073]Pored toga, rekombinantni FSH preparat prema predmetnom pronalasku prvenstveno može da oslobodi najmanje 100ng/ml, najmanje 200ng/ml, a prvenstveno najmanje 300ng/ml li najmanje 400ng/ml progesterona sa FSH koncentracijom koja je niža od koncentracije koja je neophodna za humani urinarni FSH ili rekombinantni FSH proizveden u CHO ćelijama (Gonal F) Shodno tome, on prvenstveno može da oslobodi najmanje 100ng/ml, najmanje 200ng/ml, a prvenstveno najmanje 300ng/m! li najmanje 400ng/ml progesterona sa koncentracijom za koju humani urinarni FSH Ni rekombinantni FSH proizveden u CHO ćelijama (Gonal F) ne rezultuju odgovarajućim, odnosno podjednako visokim oslobađanjem progesterona. Kao što je pokazano u primerima, rekombinantni FSH prema predmetnom pronalasku indukuje. odnosno stimuliše proizvodnju progesterona jače od humanog urinarnog FSH ili rekombinantnog FSH proizvedenog u CHO ćelijama (Gonal F)

[0074]Pored toga, rekombinantni FSH preparat prema predmetnom pronalasku prvenstveno može da oslobodi najmanje 50 nmol/l, najmanje 75 nmol/l, najmanje 100 nmol/l, najmanje 125 nmol/l ili najmanje najmanje 150 nmol/l estradiola sa FSH koncentracijom koja ne indukuje oslobađanje cAMP ili koja indukuje oslobađanje cAMP manje od 20 pmol/ml, manje od 15 pmol/ml. manje od 10 pmol/ml, manje od 5 pmol/ml.

[0075]Pored toga, rekombinantni FSH preparat prema predmetnom pronalasku prvenstveno može da oslobodi najmanje 50 nmol/l, najmanje 75 nmol/l, najmanje 100 nmol/l, najmanje 125 nmol/l, najmanje 150 nmol/l, najmanje 200 nmol/l, najmanje 250 nmol/l, najmanje 300 nmol/l ili najmanje 350 nmol/l estradiola sa FSH koncentracijom koja je niža od koncentracije koja je neophodna za humani urinarni FSH ili rekombinantni FSH proizveden u CHO ćelijama (Gonal F) Shodno tome, on prvenstveno može da oslobodi najmanje 50 nmol/l, najmanje 75 nmol/l, najmanje 100 nmol/l, najmanje 125 nmol/l, najmanje najmanje 150 nmol/l najmanje 200 nmol/l, najmanje 250 nmol/l. 300 nmol/l ili najmanje 350 nmol/l estradiola sa koncentracijom za koju humani urinarni FSH ili rekombinantni FSH proizveden u CHO ćelijama (Gonal F) ne rezultuju odgovarajućim, odnosno jednako visokim oslobađanjem estradiola. Kao što je pokazano u primerima, rekombinantni FSH preparati prema predmetnom pronalasku mdukuju, odnosno stimulišu proizvodnju estradiola jače od humanog urinarnog FSH ili rekombinantnog FSH proizvedenog u CHO ćelijama (Gonal F)

[0076]Ovde opisane odgovarajuće karakteristike u vezi oslobađanja cAMP i izražavanja seksualnih steroida se mogu analizirati i odrediti korišćenjem testiranja na granuloznim ćelijama, kao što je npr. opisano u primeru 2.

[0077]Rekombinantni FSH preparat prema predmetnom pronalasku prvenstveno je prisutan u farmaceutskoj kompoziciji Shodno tome, sledeći aspekt predmetnog pronalaska je farmaceutska kompozicija koja sadrži rekombinantni FSH preparat prema predmetnom pronalasku za primenu u lečenju neplodnosti kao što je ovde opisano. Farmaceutska kompozicija može sadržati druge farmaceutski aktivne agense, a naročito druge agense koji su korisni u lečenju neplodnosti, kao što su drugi gonadotropini, a naročito LH i/ili CG, a prvenstveno rekombinantni i/ili human LH ili CG. Alternativno tome, farmaceutska kompozicija koja sadrži rekombinantni FSH može biti prilagođena za primenu u kombinaciji sa drugim takvim farmaceutski aktivnim agensima

[0078]Pored toga. predmetnim pronalaskom je realizovan rekombinantni FSH preparat prema predmetnom pronalasku ili farmaceutska kompozicija prema predmetnom pronalasku za primenu u lečenju neplodnosti, kao i metod lečenja neplodnosti koji sadrži administraciju rekombinantnog FSH preparata prema predmetnom pronalasku ili farmaceutsku kompoziciju prema predmetnom pronalasku pacijentu.

[0079]Kao što je gore razmotreno, u izvesnim primerima izvođenja rekombinantni FSH preparat prema predmetnom pronalasku može da stimuliše ili ko-stimuliše oslobađanje seksualnih steroida kao što je progesteron, a naročito oslobađanje progesterona u granuloznim ćelijama, već u koncentracijama za koje se ne oslobađa značajna količina cAMP Naročito rekombinantni FSH prema predmetnom pronalasku može stimulisati oslobađanje seksualnih steroida, kao što je progesteron, u granuloznim ćelijama u koncentracijama koje su manje od minimalne koncentracije koja je potrebna za indukciju oslobađanja cAMP sa granuloznim ćelijama.

[0080]Pored toga, u izvesnim primerima izvođenja rekombinantni FSH preparat prema predmetnom pronalasku može da stimuliše oslobađanje progesterona, a naročito oslobađanje progesterona u granuloznim ćelijama, indukovanjem putanje prenosa signala koja je nezavisna od cAMP signalizacije. Prvenstveno, lečenje neplodnosti obuhvata indukciju putanje prenosa signala koja je nezavisna od cAMP signalizacije sa rekombinantnim FSH prema predmetnom pronalasku, što rezultuje stimulacijom oslobađanja progesterona Međutim, druge putanje prenosa signala koje uključuju cAMP signalizaciju mogu biti dodatno aktivirane sa rekombinantnim FSH. U drugim primerima izvođenja, lečenje neplodnosti ne obuhvata indukciju značajnog oslobađanja cAMP sa rekombinantnim FSH prema predmetnom pronalasku.

[0081]U sledećim primerima izvođenja, kao što je gore opisano, rekombinantni FSH preparat prema predmetnom pronalasku može da stimuliše ili ko-stimuliše sazrevanje germinativnih ćelija biološkim procesom koji je nezavisan od cAMP signalizacije.

[0082]Shodno tome, predmetni pronalazak se takođe odnosi na gore opisani rekombinantni FSH preparat ili farmaceutsku kompoziciju za indukciju i/ili stimulaciju izlučivanja seksualnih steroida koja je takođe nezavisna od cAMP. Pored toga, predmetni pronalazak se takođe odnosi na gore opisani rekombinantni FSH preparat ili farmaceutsku kompoziciju za stimulaciju ili ko-stimulaciju sazrevanja germinativnih ćelija biološkim procesom koji je nezavisan od cAMP signalizacije Pored toga, predmetni pronalazak se takođe odnosi na gore opisani rekombinantni FSH preparat iii farmaceutsku kompoziciju za indukciju i/ili stimulaciju izlučivanja seksualnih steroida u FSH koncentracijama za koje se ne indukuje značajno oslobađanje cAMP Pored toga, predmetni pronalazak se takođe odnosi na gore opisani rekombinantni FSH preparat ili farmaceutsku kompoziciju za indukciju izlučivanja seksualnog steroida sa mnogo nižim koncentracijama od uobičajeno konšćenog urinarnog FSH ili rekombinantnog FSH dobijenog iz CHO ćelija. Farmakološke i terapeutske prednosti odgovarajućih primena, a naročito za lečenje neplodnosti su bile detaljno razmotrene gore

[0083]Naročito lečenje neplodnosti može obuhvatati stimulaciju ili ko-stimulaciju sazrevanja germinativnih ćelija biološkim procesom koji je nezavisan od cAMP signalizacije. Međutim, lečenje neplodnosti može pored toga sadržati stimulaciju sazrevanja germinativnih ćelija sa jednim Ili više drugih bioloških procesa koji uključuju cAMP signalizaciju. U drugim primerima izvođenja, lečenje neplodnosti ne uključuje stimulaciju sazrevanja germinativnih ćelija drugim takvim biološkim procesima

[0084]Sazrevanje germinativnih ćelija prvenstveno obuhvata rast folikula i/ili spermatogenezu. Poreci toga. biološki proces kojim FSH stimuliše sazrevanje germinativnih ćelija može obuhvatati izlučivanje seksualnih steroida. a naročito progesterona. a prvenstveno u granuloznim ćelijama Prvenstveno se biološki proces koji je nezavisan od cAMP signalizacije odnosi na izlučivanje seksualnih steroida. a naročito progesterona, a prvenstveno u granuloznim ćelijama, indukovano putanjom prenosa signala koja ne uključuje cAMP kao molekul mesendžer.

[0085]U poželjnim primerima izvođenja, rekombinantni FSH preparat prema pronalasku može da pobudi biološki efekat čak i posle administracije samo jedne doze Naročito FSH preparat prema pronalasku ili farmaceutska kompozicija prema pronalasku mogu da mdukuju rast folikula i/ili sazrevanje jajne ćelije kod pacijenta, a naročito humanog pacijenta, posle administracije samo jedne doze FSH preparata ili farmaceutske kompozicije Prvenstveno je biološki efekat koji se ostvaruje posle administracije samo jedne doze veći. a naročito rast folikula i/ili sazrevanje jajne ćelije, je izraženiji i/ili se ostvaruje kod većeg udela tretiranih pacijenata u poređenju sa FSH preparatima dobijenim od ljudskog urina i/ili izraženim u CHO ćelijama. Pomenuta samo jedna doza naročito sadrži najmanje 10 IU FSH, a prvenstveno najmanje 15 IU FSH, najmanje 20 ILI FSH ili najmanje 25 IU FSH, i/ili 1000 IU FSH ili manje, a prvenstveno 750 IU FSH ili manje 500 IU FSH ili manje. 300 IU FSH ili manje, 200 IU FSH ili manje, 150 IU FSH ili manje, 100 IU FSH ili manje ili 50 IU FSH ili manje. Prvenstveno, pomenuta samo jedna doza sadrži oko 10 IU do oko 500 IU FSH. još poželjnije oko 20 IU do oko 300 IU FSH, na primer, oko 25 IU FSH, oko 75 IU FSH ili oko 100 IU FSH.

[0086]U sledećim primerima izvođenja, rekombinantni FSH preparat prema pronalasku ima manji poluživot u cirkulaciji od FSH preparata dobijenih od ljudskog urina i/ili izraženih u CHO ćelijama. Naročito, on ima manji poluživot u cirkulaciji kod jednog ili više od ljudi, simijanih majmuna, pacova i/ili miševa Prvenstveno, poluživot u cirkulaciji je najmanje 5% kraći, još poželjnije najmanje 10%, najmanje 15% ili najmanje 20% kraći od onog za FSH preparate dobijene od ljudskog urina i/ili izražene u CHO ćelijama. U izvesnim primerima izvođenja, rekombinantni FSH preparat prema pronalasku ima manju bioraspoloživost od FSH preparata dobijenih od ljudskog urina i/ili izraženih u CHO ćelijama, a naročito, kod jednog ili više od ljudi, simijanih majmuna, pacova i/ili miševa. Prvenstveno je bioraspoloživost najmanje 5% manja, još poželjnije najmanje 10%. najmanje 15% ili najmanje 20% manja od one za FSH preparate dobijene od ljudskog urina i/ili izražene u CHO ćelijama. Bioraspoloživost u ovom pogledu se prvenstveno odnosi na vrednost površine ispod krive (AUC) dobijenu u farmakokinetičkim studijama u kojima se određuje serumska FSH koncentracija u različitim vremenskim trenucima posle administracije definisane količine FSH. Poluživot u cirkulaciji i bioraspoloživost se prvenstveno određuju posle administracije FSH subkutanom injekcijom, a naročito posle administracije samo jedne doze koja prvenstveno sadrži od oko 10 do oko 1000 IU FSH, još poželjnije od oko 25 IU do oko 500 IU FSH ili od oko 50 IU do oko 300 IU FSH. a naročito oko 100 IU FSH Naročito se poluživot u cirkulaciji i bioraspoloživost određuju kao što je opisano dole u primeru 6.

[0087]U poželjnim primerima izvođenja, rekombinantni FSH preparat prema pronalasku ima terapeutsku efikasnost koja je slična ili je čak veća od one koju imaju FSH preparati dobijem od ljudskog urina i/ili izraženi u CHO ćelijama, a naročito kod jednog ili više ljudi, simijanih majmuna, pacova i/ili miševa. Izraz "terapeutska efikasnost" se prvenstveno odnosi na sposobnost da stimulišu oslobađanje estradiola i/ili inhibina-B kada se daju pacijentu Terapeutska efikasnost se prvenstveno određuje merenjem koncentracije estradiola i/ili inhibina-B u krvi ili serumu jednog ili više subjekata posle administracije FSH subkutanom injekcijom, a naročito posle administracije samo jedne doze, pri čemu samo jedna doza prvenstveno sadrži od oko 10 do oko 1000 IU FSH, a prvenstveno od oko 25 IU do oko 500 IU FSH ili od oko 50 IU do oko 300 IU FSH, a naročito oko 100 IU FSH. Naročito se terapeutska efikasnost određuje kao što je opisano dole u primeru 5 Slične terapeutske efikasnosti se naročito odnose na stimulacije oslobađanja estradiola i/ili inhibina-B sa odgovarajućim FSH preparatima koje rezultuju serumskim koncentracijama estradiola i/ili inhibina-B koje se međusobno ne razlikuju za više od 25%, a prvenstveno ne više od 20%, ne više od 15% ili ne više od 10%

[0088]FSH preparat se dobija od ljudskog urina, a naročito se dobija od urina žena posle menopauze. FSH preparat izražen u CHO ćelijama je, na primer, izražen u CHO ćelijskoj liniji CHOdhfr- [ATCC No. CRL-9096]. FSH preparat dobijen od ljudskog urina i FSH preparat izražen u CHO ćelijama prvenstveno se mogu komercijalno nabaviti i predstavljaju odobrene farmaceutske preparate, a naročito Bravelle i Gonal-f. respektivno. Kada se upoređuju efekti različitih FSH preparata, a naročito njihov poluživot u cirkulaciji, bioraspoloživost i terapeutska efikasnost, onda se FSH preparati analiziraju putem njihove administracije grupama sličnih subjekata sa istim režimom doziranja uz korišćenje istog načina administracije i korišćenje sličnih ili istih drugih uslova.

[0089]U izvesnim primerima izvođenja, rekombinantni FSH preparat prema predmetnom pronalasku se daje pacijentu u dozi koja rezultuje FSH koncentracijom u cirkulaciji pacijenta manjom od 5 IU/L U izvesnim primerima izvođenja, doza koja treba da se da pacijentu rezultuje FSH koncentracijom u cirkulaciji pacijenta manjom od oko 4 I U/L, a naročito manjom od oko 3 I U/L, manjom od oko 2 I U/L, manjom od oko 1 IU/L ili manjom od oko 0 5 IU/L Koncentracija FSH u cirkulaciji pacijenta je, na primer, u opsegu od oko 0.01 do oko 5 IU/L. a naročito od oko 0 05 do oko 2 IU/L od oko 0.1 do oko 1.5 IU/L ili od oko 0 2 do oko 1 IU/L. Naročito se FSH daje pacijentu u dozi koja ne indukuje značajno oslobađanje cAMP. Kao što je pokazano u primerima. rekombinantni FSH preparati prema pronalasku u izvesnim primerima izvođenja pobuđuju terapeutski efekat sa ovim koncentracijama Međutim, rekombinantni FSH preparati prema pronalasku se takođe mogu davati u dozi koja rezultuje većim FSH koncentracijama u cirkulaciji pacijenta

[0090]U poželjnim primerima izvođenja, lečenje neplodnosti obuhvata tehnologije asistirane reprodukcije, indukciju ovulacije, in-vitro fertilizaciju. na primer, in-vitro fertilizaciju sa intracitoplazmičkim ubrizgavanjem sperme, intrafalopijalni transfer gameta. mtrautermu inseminaciju, lečenje anovulatornog poremećaja kod žena. lečenje poremećaja ozbiljne hormonske deficijencije radi sazrevanja jajne ćelije kod žena, lečenje đeficijencija produkcije sperme kod muškaraca, i/ili omogućavanje ili poboljšanje sazrevanja germinativnih ćelija, kao što su folikulogeneza i spermatogeneza. a naročito sazrevanje folikula kod žena, na primer, tokom protokola in vitro stimulacije fertilizacije i/ili radi lećenja anovulatornog poremećaja

[0091]Prvenstveno je rekombinantni FSH preparat prema predmetnom pronalasku namenjen za parenteralnu administraciju pacijentu Naročito rekombinantni FSH treba da se daje injekcijom ili infuzijom, na primer, intravenski, intramuskularno ili subkutano U izvesnim primerima izvođenja predmetnog pronalaska, rekombinantni FSH je prisutan u farmaceutskoj kompoziciji. Podesne režime doziranja može odrediti stručnjak iz odgovarajuće oblasti i oni se mogu odrediti na osnovu opšteg znanja iz odgovarajuće oblasti.

[0092]Farmaceutska kompozicija prema pronalasku može biti u obliku jedne jedinične doze ili višestruke jedinične doze Prvenstveno je farmaceutska kompozicija sterilni rastvor koji sadrži rekombinantni FSH prema predmetnom pronalasku, a dalje sadrži jedan ili više sastojaka izabranih iz grupe koja se sastoji od rastvarača kao što je voda, puferske supstance, stabilizatori, konzervansi, ekscipijensi, surfaktanti i soli. Jedna jedinična doza prvenstveno sadrži od oko 10 IU do oko 750 IU FSH, još poželjnije od oko 25 IU do oko 500 IU FSH. od oko 50 IU do oko 400 IU FSH. ili od oko 100 IU do oko 300 IU FSH. Višestruka jedinična doza sadrži dovoljno FSH da bi se obezbedilo više pojedinačnih doza, a naročito najmanje 5, najmanje 10. najmanje 20 ili najmanje 50 pojedinačnih doza Farmaceutska kompozicija može biti, na primer, u obliku pera za injekciju

SLIKE NACRTA

[0093]

Fig. 1prikazuje oslobađanje cAMP iz izolovanih granuloznih ćelija stimulisanih sa različitim koncentracijama poboljšanog rekombinantnog humanog FSH (FSH (pronalazak); preparat 1:

otvoreni kvadrati, preparat 2 zatvoreni trouglovi) ili FSH dobijen iz CHO ćelija (Gonal F; zatvoreni rombovi).Fig.2 prikazuje sintezu estradiola u izolovanim granuloznim ćelijama stimulisanim sa različitim koncentracijama poboljšanog rekombinantnog humanog FSH (FSH (pronalazak); preparat 1: otvoreni kvadrati, preparat 2: zatvoreni trouglovi) ili FSH dobijen iz CHO ćelija (Gonal F; zatvoreni rombovi)Fig.3 prikazuje sintezu progesterona u izolovanim granuloznim ćelijama stimulisanim sa različitim koncentracijama poboljšanog rekombinantnog humanog FSH (FSH (pronalazak); preparat 1: otvoreni kvadrati, preparat 2: zatvoreni trouglovi) ili FSH dobijen iz CHO ćelija (Gonal F; zatvoreni rombovi).Fig.4 prikazuje oslobađanje cAMP iz izolovanih granuloznih ćelija stimulisanih sa različitim koncentracijama poboljšanog rekombinantnog humanog FSH (FSH (pronalazak), otvoreni kvadrati) ili urinarnog FSH (Fostimon, zatvoreni rombovi).Fig.5 prikazuje sintezu estradiola u izolovanim granuloznim ćelijama stimulisanim sa različitim koncentracijama poboljšanog rekombinantnog humanog FSH (FSH (pronalazak); otvoreni kvadrati) ili urinarnog FSH (Fostimon; zatvoreni rombovi)Fig.6 prikazuje sintezu progesterona u izolovanim granuloznim ćelijama stimulisanim sa različitim koncentracijama poboljšanog rekombinantnog humanog FSH (FSH (pronalazak); otvoreni kvadrati) ili urinarnog FSH (Fostimon; zatvoreni rombovi).Fig.7 prikazuje rezultate Stilman-Polijevog testa sa korišćenjem poboljšanog rekombinantnog humanog FSH u poređenju sa standardnim urinarnim FSH i standardnim rekombinantnim FSH dobijenim iz CHO ćelija Porast težine jajnika kod nezrelih ženki pacova posle dnevne administracije tokom tri dana je grafički prikazan prema upotrebljenoj FSH koncentraciji,Fig.8 prikazuje serumske koncentracije estradiola (E2) i inhibina-B uočene kod simijanih majmuna posle samo jedne (A) i ponovljene (B) s.c injekcije FSH (pronalazak), urinarnog FSH Bravelle ili rekombinantnog FSH Gonal-f izraženog u CHO ćelijama. Svaka vertikalna crta predstavlja srednje i standardno odstupanje za 4 životinjeFig.9 prikazuje serumske koncentracije FSH kod ženki simijanih majmuna posle samo jedne i.v. ili s.c. injekcije. Svaki simbol predstavlja prosečnu vrednost za grupu od 4 životinjeFig.10 prikazuje šematski prikaz kompleksnog tipa glikanskih struktura koje mogu biti vezane za FSH mesta glikozilacije Prikazane su (a) biantename. (b) triantenarne i (c) tetraantenarne strukture Jedan ili više ostataka sijalinske kiseline i galaktoze takođe ne moraju biti prisutni u ovim strukturama, a strukture mogu dalje sadržati, na primer, bisektirajući GlcNAc ostatak, fukozni ostatak i/ili sulfatne grupe. Sia: sijalinska kiselina; Gal: galaktoza, ovde se takođe naziva terminalnom galaktozom; GlcNAc: N-acetilglukozamin; Man: manoza.

PRIMERI

Primer 1.Preparat FSH ( pronalazak)

[0094]FSH je proizveden kultivacijom GT-5s ćelija stabilno transfektovanih sa dva ekspresiona kontrukta u kojima su bili smešteni alfa i beta lanac humanog FSH (alfa lanac pristupni broj NT_007299.13; beta lanac pristupni broj NTJ309237.18). Plazmid za izražavanje FSH alfa lanca je nosio gen mutirane verzije misije dihidrofolat reduktaze[ dhfr)sa većom rezistencijom na inhibitor enzima metotreksat od prirodnog oblika, a drugi plazmid za izražavanje FSH alfa lanca je nosio gen rezistencije na puromicin.

[0095]Transfekcija ćelijske linije za FSH (pronalazak) ekspresiju je bila izvedena nukleofekcijom uz korišćenje dva gore opisana ekspresiona plazmida Za selekciju i amplifikaciju čelijskih klonova koji stabilno proizvode antitela su bili dodati puromicin i metotreksat u rastućim koncentracijama Pulovi amplifikovanih ćelija su bili zasejani u polučvrstu matricu za kloniranje pojedinačnih ćelija prema Clone PixFL tehnologiji ili su pojedinačne ćelije kolonirane ograničenim razređivanjem. Klonovi su bili provereni u pogledu visokog izlučivanja intaktnih FSH molekula

[0096]FSH je proizveden fermentacijom finalnog GT-5s klona koji proizvodi FSH u šaržnom. protočno-šaržnom ili perfuzionom procesu pod uslovima bez seruma. Fermentacija je obično vršena tokom 2-3 nedelje.

[0097]Posle fermentacije supernatant je bio isfiltriran kroz fiitere od 2um da bi se eliminisale ćelije i ostaci ćelija pre sterilisanja filtriranjem korišćenjem filtera od 0 2um U procesu prečišćavanja je upotrebljena reverzno-fazna hromatografija (RPC) kao korak hvatanja, koji je bio praćen korakom koncentracije i sledstvenom hromatografijom na molekulskim sitima (SEC) Onda je opciono primenjena anjonsko izmenjivačka hromatografija (AEC) da bi se elimmisao manje kiseli FSH sadržaji Ovo je izvedeno ispiranjem vezanog FSH sa puferom za ispiranje na pH 5.0 ("obogaćivanje na pH 5.0") ili pH 4.5 ("obogaćivanje na pH 4.5") da bi se eluirale manje kisele FSH izoforme pre eluiranja željene FSH frakcije. Kao završni korak je upotrebljena hidrofobna interaktivna hromatografija (HIC) da bi se dobio FSH sa visokom čistoćom

Primer 2:Testiranje na granuloznim ćelijama

[0098]Da bi se izvršio test na granuloznim ćelijama, primarne ćelije su bile izolovane iz folikularnog fluida IVF pacijenata tokom sakupljanja oocita. Posle Ficoll građijentnog centnfugiranja, kojim su eliminisani drugi tipovi ćelija npr. crvena krvna zrnca, granulozne ćelije su bile zasejane u 24 do 96 bunarčića formata ploče tokom 5-7 dana u međijumu za kultivaciju koji je sadržao androstendion ili testosteron. Posle tog perioda, ćelije (2 do 4<*>10<4>ćelija po bunarčiću) su bile stimulisane sa FSH u opsegu od 1 pg/ml do 2 mg/ml u koracima koji su prikazani na dijagramu (400 ul medijuma po bunarčiću). Posle tri do četiri sata inkubacije sakupljena je polovina supernatanta radi izvođenja cAMP testa Sledećih 24 h kasnije ćelije su bile lizirane prvo zamrzavanjem, pa topljenjem u preostalom supernatantu Lizat je bio upotrebljen u progesteronskim i estradiolskim testovima.

Poređenje FSH ( pronalazak) i Gonala F

[0099]U prvom skupu eksperimenata je FSH (pronalazak) upoređen sa Gonalom F (Merck Serono SA). Gonal F je FSH rekombinantno proizveden u CHO ćelijama Rezultati su prikazani na Fig. 1 do 3. Dok je drugi mesendžerski cAMP proizveden sa uporedivim FSH koncentracijama Gonal F i FSH (pronalazak) proizvoda u uporedivim količinama, steroidi progesteron i estradiol su oslobođeni pri mnogo nižim FSH koncentracijama u slučaju FSH (pronalazak) proizvoda u poređenju sa FSH rekombinantno proizvedenim u CHO ćelijama (Gonal F)

Poređenje FSH ( pronalazak) i Fostimona

[0100]U sledećoj grupi eksperimenata FSH (pronalazak) je bio upoređen sa Fostimonom (IBSA Institut Biochimipue SA), FSH proizvodom izolovanim iz ljudskog urina. Rezultati su prikazani na Fig 4 do 6 Dok su se cAMP nivoi slično podizali pri uporedivim opsezima doza FSH za oba proizvoda, seksualni steroidi su bili proizvedeni pri znatno nižoj koncentraciji FSH (pronalazak) u poređenju sa Fostimonom

[0101]Napomena: Pošto su testovi bili izvedeni uz korišćenje različitih donora, razlike u profilu stimulacije se mogu pripisati donorima koji su korišćeni u svakom testu

Primer3:Stilman- Polijev ( Steelman- Pohley) test

[0102]Aktivnost FSH je takođe bila određena sa Stilman-Polijevim testom. Test je bio izveden prema farmakopeji. Naročito je bio meren prirast težine jajnika kod nezrelih ženki pacova posle administracije tri različite FSH koncentracije koje su davane svakodnevno tri dana Potencija je bila izračinata korišćenjem paralelne linijske evaluacije Rezultati su prikazani na Fig. 7

[0103]Kao što je pokazao Stilman-Polijev test.in vivoaktivnosti FSH (pronalazak) i urinarnog i rekombinantnog standarda FSH kod pacova su slične.

Primer 4:Glikoprofilisanje

[0104]Glikoprofili različitih FSH preparata su bili određeni strukturnom analizom glikozilacije Glikoprofilisanje generiše informaciju na kompleksnoj glikanskoj strukturi na mestima glikozilacije Radi glikoprofilisanja intaktni N glikani su oslobođeni iz proteinskog jezgra koje koristi PNGase F. Digestija je izvedena u gelu ili bloku gela radi nesumnjive prerade Slobodni N-glikani su obeleženi sa fluorescentnim markerom 2-aminobenzamidom Prečišćeni uzorak N-glikana je izdvojen hidrofilnom interaktivnom hromatografijom (HILIC) sa fluorometrijskom detekcijom Analizom su dobijem sledeći rezultati:

[0105]Prikazane su relativne količine N-glikana na FSH koji nose naznačene jedinice. Puregon je sledeći rekombinantni humani FSH koji je proizveden u CHO ćelijama.

[0106]Pored toga, odnos 2,3-kuplovanih i 2,6-kuplovanih sijalinskih kiselina u glikanima FSH je bio analiziran upoređivanjem količine sijalinske kiseline oslobođene sa sijalidazom A (koja iseca 2,3- i 2,6-kuplovane sijalinske kiseline) i sijalidazom S (koja iseca samo 2.3-kuplovane sijalinske kiseline)

[0107]U FSH (pronalazak) su ostaci sijalinske kiseline kuplovani sa glikanima pomoću 2,3- kao i 2,6-veza u odnosu od oko 1.1, koji su sadržali još više 2,6-kuplovanih sijalinskih kiselina od 2,3-kuplovanih sijalinskih kiselina, dok je u urinarnorn FSH Bravelle (Ferring Pharmaceuticals Inc.) odnos oko 3 ; 1 u korist 2,3-vezane sijalinske kiseline Zbog njihove rekombinantne proizvodnje u CHO ćelijama, Puregon (Organon / EssexPharma) i Gonal F (Merck Serono) nemaju bisektirajuće N-acetilgalaktozamine i sadrže samo 2.3-kuplovane sijalinske kiseline

[0108]Antenarnost, terminalne jedinice galaktoze i Z-broj su bili izračunati na osnovu gore navedenih merenja i određivanjem raspodele naelektrisanja glikana posle oslobađanja od FSH.

[0110]Prikazane su relativne količine N-glikanskih grana na FSH koje imaju jedinicu galaktoze na svom kraiu.

[0111]Prikazan je Z-broj, tj. relativna kiselost FSH preparata. Veći Z-broj ukazuje na kiseliji FSH preparat.

[0112]Kao zaključak, FSH prema predmetnom pronalasku (FSH (pronalazak)) ima veći stepen bisektirajućeg N-acetilglukozamina, veću antenarnost i veći stepen sijalinacije, a naročito posle obogaćivanja kiselim izoformama, i visoki stepen sulfonovanja Pretpostavlja se da zbog jednog ili više od ova tri parametra glikozilacije, FSH (pronalazak) ima superiornu aktivnost u poređenju sa uobičajenim rekombinantnim ili urinarnim FSH preparatima.

[0113]Pored toga, FSH (pronalazak) je takođe visoko fukozilovan i ima odnos 2,3- prema 2,6-sijalinaciji od oko 1:1 ili čak veću količinu 2,6-sijalinacije

[0114]Pored toga, glikanske strukture FSH preparata su takođe bile analizirane sa masenom spektroskopijom oslobođenih glikana. Bili su dobijeni sledeći rezultati:

[0115]Prikazane su relativne količine N-glikana na FSH koje nose sulfatnu grupu.

Primer 5:Farmakološki efekti

[0116]Farmakološki profil FSH (pronalazak) je bio ispitivan u različitim in vivo farmakološkim i toksikološkim studijama kod ženki pacova i majmuna i in vivo biotestovima. Kao molekulski markeri su bili upotrebljem estradiol i inhibin-B Ovi markeri su bili oslobođeni iz jajnika posle stimulacije sa FSH. Estradiol je odgovoran za rast i sazrevanje folikula, dok je inhibin-B deo mehanizma prirodne negativne povratne sprege. Pored toga, prethodno je bilo pokazano da je inhibin-B dobar surogat marker za stimulaciju jajnika sa FSH.

5. 1 FSH lečenje kod zrelih pacova

[0117]Posle tretiranja zrelih ženki pacova sa samo jednom s.c dozom od 100 IU FSH (pronalazak)/kg b.w., serumski nivoi inhibina-B su se povećali 2-3 dana posle administracije i onda su se smanjili ponovo na osnovne nivoe Ponovljeno doziranje pacovima u skladu sa njihovim ciklusom estrusa sa 100 IU FSH (pronalazak) rezultovalo je sa značajnim povećanjem serumskog progesterona i inhibina-B koji su odražavali višestruke ovulacije praćene sa proizvodnjom hormona u lutealnim ćelijama. Slični nalazi su bili uočeni u studiji za određivanje opsega doza gde su bile davane 7-d ponovljene doze od 1200 IU FSH (pronalazak)/kg. Nisu mogle biti uočene razlike između farmakodinamičke aktivnosti FSH (pronalazak) u poređenju sa referentnim proizvodima koji su sadržali FSH (Gonal-f. Bravelle) koji su ispitivani u istim studijama.

[0118]U studijama toksičnosti sa 28-dnevnim ponovljenim dozama izvedenim na ženkama pacova su bili uočeni povećanje jajnika povezano sa dozom i povećanje broja Grafovih folikula kod svih doziranih grupa (30, 100, 300 lU/kg b.w.). U korelaciji sa ovim nalazima su bili uočeni povećani nivoi inhibina-B u poređenju sa kontrolom tokom perioda tretiranja Nivoi inhibina-B kod tretiranih životinja su bili povećani u zavisnosti od doze polazeći od niskog nivoa doze od 30 IU FSH (pronalazak)/kg bw./dnevno. Svi nalazi su bili u potpunosti reverzibilni.

5. 2 FSH lečenje kod zrelih majmuna

[0119]Farmakološki profil posle samo jedne i ponovljenih doza FSH (pronalazak) je bio određen na simijanim majmunima Simijani majmun se smatra najrelevantnihim životinjskim modelom baziranim na velikim sličnostima sa humanim. Studija se sastojala od administracije samo jedne doze FSH seksualno zrelim ženkama kod kojih se ispoljavao regularni menstrualni ciklus. Životinje su bile podeljena na slučajan način u grupe za testiranje na bazi faze njihovog ciklusa estrusa Administracija predmeta testiranja životinjama je započela 1 do 3 dana posle početka menstruacije Studija je obuhvatala 4 grupe, od kojih su svaku sačinjavale 4 životinje koje su bile tretirane sa samo jednom s c. bolus injekcijom od 100 lU/kg b.w. FSH (pronalazak), urinarnog FSH Bravelle ili rekombinantnog FSH Gonala-f izraženog u CHO ćelijama. Bilo je izvršeno uzimanje uzoraka krvi od svih životinja radi analize nivoa estradiola i inhibina-B pre doze, i u navedenim vremenskim trenucima posle administracije. Vremenski trenuci posle administracije su bili izabrani tako da odražavaju različite faze ciklusa estrusa. Rezultati su prikazani na Fig. 8A.

[0120]2a sve testirane FSH supstance, nivoi estradiola i inhibina-B kod tretiranih životinja su se povećali 5 dana posle samo jedne administracije testiranih supstanci, pa su se ponovo smanjili do osnovnih nivoa Normalna oscilacija estradiola na sredini ciklusa je bila uočena kod skoro svih životinja u danima testiranja od 14 do 22. FSH (pronalazak) je ispoljio najveće povećanje nivoa estradiola. Ovaj eksperiment je pokazao najmanju komparativnu farmakološku efikasnost za FSH (pronalazak) pri manjim AUC nivoima (vidi Primer 6), što ukazuje na veću aktivnost u stimulaciji receptora

[0121]Pored toga je bila izvedena slična studija gde su majmuni primili ponovljene doze FSH Studija sa ponovljenim dozama je obuhvatila 3 grupe, od kojih je svaka sadržala 4 životinje koje su bile ponovljeno dnevno tretirane sa s.c bolus injekcijama od 100 lU/kg b.w. FSH (pronalazak), Bravelle ili Gonala-f tokom 7 uzastopnih dana. Uzimanje uzoraka krvi je bilo kao što je opisano za studiju sa samo jednom dozom Nivoi estradiola i inhibina-B kod životinja koje su tretirane ponovljeno s.c sa 100 IU FSH (pronalazak)/kg b.w , 100 IU Bravelte/kg b w ili 100 IU Gonala-f/kg b.w. su se povećali tokom celog perioda tretiranja od 7 dana (vidi Fig. 8B). Posle kraja tretmana, nivoi hormona su se polako smanjili i dostigli su normalne nivoe posle 5-7 dana. Maksimalne koncentracije estradiola i inhibina-B uočene posle ponovljene administracije FSH (pronalazak) su bile mnogo više u poređenju sa koncentracijama uočenim posle samo jednog doziranja, a takođe u poređenju sa nivoima tokom normalnog ciklusa estrusa Farmakodinamički efekti uočeni posle ponovljene s c administracije FSH (pronalazak) su bili kao što se očekivalo za ovu klasu proizvoda i bili su uporedivi sa efektima uočenim za referentne proizvode u istoj studiji

Indukcija rasta folikula

[0122]4-nedeljna subhronična studija toksičnosti sa uključenom analizom farmakodinamičkih parametara je bila izvedena na simijanim majmunima 4 grupe, od kojih su svaku činile 4 ženke seksualno zrelih simijanih majmuna koje su bile tretirane sa FSH (pronalazak) ponovljenim subkutanim injekcijama jednom dnevno tokom 28 dana Nivoi doza su bili 30, 100, i 300 lU/kg b.w/dnevno za grupe sa niskim, srednjim i visokim dozama, respektivno. Pored ove glavne studije, 2 ženske životinje po grupi su bile određene za 6-nedeljni period oporavka u kontrolnoj grupi i grupi sa visokom dozom. Uzorci krvi za analize estradiola i inhibina-B su bili uzeti pre i na kraju perioda tretiranja (pre doze, dani 1 i 28), 6 sati p.a. na dan 17 i na kraju perioda oporavka (dan 70)

[0123]Ponovljeno lečenje sa 30, 100 ili 300 IU FSH (pronalazak)/kg b w./dnevno tokom 4 nedelje je rezultovalo povećanjem apsolutnih i relativnih težina jajnika i povećanjem broja Grafovih folikula posle finalnog usmrćivanja. Pored toga, kod nekoliko životinja iz svih grupa za doziranje je bilo otkriveno blago smanjenje broja corpora lutea, U korelaciji sa ovim nalazom, bili su uočeni povećani serumski nivoi estradiola i inhtbina-B u svim grupama za doziranje.

5.3 Analiza neželjenih dejstava

[0124]Da bi se analizirao rizik od bilo kakvih neočekivanih neželjenih efekata FSH (pronalazak), glavni bezbednosni farmakološki parametri su bili uključeni u 4-voro nedeljne stožerne studije toksičnosti na pacovima i simijanim majmunima (ECG, frekvencija rada srca, krvni pritisak, frekvencija disanja). Ove studije nisu dale nikakav dokaz generalnog dejstva FSH (pronalazak) na glavne sisteme, i shodno tome, FSH (pronalazak) se može smatrati bezbednim i ne ispoljava neželjene efekte

Primer 6:Farmakokinetika

[0125]Cilj studije je bio da se ispita bioraspoloživost i farmakologija FSH (pronalazak) u poređenju sa Bravelle i Gonalom-f subkutanom ili intravenskom administracijom simijanim majmunima. Studija je bila izvedena sa seksualno zrelim, ženskim životinjama koje su imale regularni menstrualni ciklus Životinje su bile dodeljene grupama za testiranje na slučajan način bazirano na fazi njihovog ciklusa estrusa. Administracija predmeta testiranja životinjama je započela od 1 do 3 dana posle početka menstruacije Studija je obuhvatila 4 grupe, od kojih je svaka sadržala 4 životinje koje su bile tretirane sa samo jednom i.v. bolus injekcijom sa 100 lU/kg b w. FSH (pronalazak) ili samo jednom s.c bolus injekcijom sa 100 lU/kg b.w. FSH (pronalazak), Bravelle® ili Gonala-f ®. Uzimanje uzoraka krvi za analizu FSH nivoa je bilo izvršeno za sve životinje u različitim vremenskim trenucima posle administracije koji su odražavali različite faze ciklusa estrusa,

[0126]Nijedna od životinja nije prevremeno uginula tokom studije, niti je pokazala kliničke znake sistemske toksičnosti. Nije bio uočen nikakav uticaj u vezi predmeta testiranja ili referentnog predmeta, niti lokalna netolerancija

[0127]Cma)(-nivo od 186.13 mlU FSH/mLje bio uočen 8 sati p a posle samo jednog s.c lečenja sa 100 IU FSH (pronalazak)/kg b.w Izračunati prosečni poluživot eliminacije serumskog FSH (pronalazak) je bio 16.85 sati Serumski nivoi su prikazani na Fig. 9. Srednje vrednosti toksičkokinetičkih parametara u serumu majmuna posle samo jednog izlaganja su date u Tabeli 11

[0128]Relativna bioraspoloživost (F) od 72.77% je bila izračunata za FSH (pronalazak) posle subkutane administracije poređenjem sa FSH (pronalazak) datim intravenski. Bili su uočeni sledeći odnosi posle izlaganja FSH, i to posle samo jednog izlaganja: FSH (pronalazak) (s.c.) < FSH (pronalazak) (i.v.) < Bravelle < Gonal-f

[0129]Slični podaci su takođe dobijeni iz studija za više doza na simijanim majmunima i iz studija na pacovima i golim miševima: Studija sa ponovljenim dozama na simijanim majmunima je bila izvedena slično studiji sa samo jednom dozom. Studija je uključivala 3 grupe, od kojih se svaka sastojala od 4 životinje, koje su bile tretirane dnevno ponavljanim s.c. bolus injekcijama sa 100 lU/kg b w. FSH (pronalazak), Bravelle ili Gonala-f tokom 7 uzastopnih dana. Doza je bila izabrana imajući u vidu farmakokinetičke i toksikološke studije na majmunima kada su konšćene doze od 10 - 1000 lU/kg b.w Gonala-f Nijedna od životinja nije prerano uginula tokom studije, niti je ispoljila kliničke znake sistemske toksičnosti. Nije bio uočen uticaj ili lokalna netolerancija za predmet testiranja ili reference Rezultati su pokazali da su Cma„- i ALJC-vrednosti FSH (pronalazak) kod majmuna u poređenju sa FSH koji su sadržali referentni proizvodi (Gonal-f, Bravelle) bili smanjeni, što je rezultovalo manjem izlaganju leku kod životinja tretiranih sa FSH (pronalazak) Ipak, farmakološki podaci dobijeni u istim studijama su pokazali da nije bilo razlike između FSH proizvoda u pogledu njihove sposobosti da stimultšu proizvodnju estradiola i inhibina-B kao efektora FSH receptora (vidi Primer 5)

[0130]Ženkama golih miševa je bilo davano 5 iig FSH sa s.c. injekcijom i onda je praćena FSH koncentracija u krvi. Farmakokinetički profili FSH (pronalazak), kao i Gonala-f i Bravelle su bili najvećim delom uporedivi u pogledu Cmaxi AUC0.t |35,-vrednosti Cmax nivoi od 5.1 ± 1 9 %ID, 6.7 ± 0.4 %ID i 5.5 ± 0.4 %ID su bili uočeni posle samo jedne subkutane injekcije FSH (pronalazak). Bravelle i Gonala-f, respektivno. AUC0.. ,ast-vrednosti od 71.6 + 25 4 %ID. 99 1 ± 12.9 %ID i 79 7 ± 9.7 %ID su bile uočene za FSH (pronalazak), Bravelle i Gonal-f, respektivno Generano su klirens iz krvi i relativno izlaganje leku bili uporedivi za sve ispitivane supstance; nisu izmerene statistički relevantne razlike. Posle ispitivanja biodistnbucije davanog FSH, bila je uočena akumulacija FSH u jajnicima i materici (pored visoke akumulacije u bubrezima zbog njihove uloge u eliminaciji FSH iz tela)

[0131]Zrele ženke pacova su dobile samo jednu ili više doza 100 lU/kg b.w. FSH (pronalazak), Bravelle ili Gonala-f sa s.c. injekcijom, pa je praćena serumska koncentracija FSH. Rezultati su pokazali da su serumski poluživot i AUC vrednosti FSH (pronalazak) kod pacova u poređenju sa FSH koji su sadržali referentni proizvodi (Gonal-f, Bravelle) bih smanjeni, što je rezultovalo manjem izlaganju leku kod životinja tretiranih sa FSH (pronalazak). Ipak, farmakološki podaci dobijeni u istim studijama su pokazali da nije bilo razlike između FSH proizvoda u pogledu njihove sposobosti da stimulišu proizvodnju estradiola i inhibina-B kao efekton FSH receptora (vidi Primer 5).

Primer7:Farmakokinetika i farmakodinamika kod ljudi

[0132]U kliničkoj studiji, FSH (pronalazak) je bio davan dobrovoljcima, pa su onda bili određeni farmakokinetički i farmakodinamički parametri. Zdravi ženski dobrovoljci su primili 25 IU, 75 IU ili 150 IU FSH (pronalazak) u samo jednoj s.c dozi, pa je zatim bila praćena FSH koncentracija u cirkulaciji. Pored toga, takođe su bili analizirani broj i veličina folikula pre i posle medikacije.

[0133]Kao preliminarni rezultat, bilo je uočeno skoro udvostručavanje maksimalne serumske koncentracije FSH (pronalazak) (Cmai) u poređenju sa objavljenim podacima za urinarni i rekombinantni FSH koje su izmerile različite laboratorije Poluživot u cirkulaciji (t1/2) posle subkutane administracije je bio uporediv za FSH (pronalazak) (33 h ± 3 h), FSH dobijen u rekombinantnim CHO-ćelijama (Gonal-f: 37 h ± 28 h (le Cotonnec et al. (1994) Fertilitv i Sterilitv 61, 679-686) i urinarni FSH (MetrodinHP: 45 h ± 21 h (le Cotonnec et al (1993) Human Reproduction 8. 1604-1611). Farmakodinamički podaci su pokazali da se kod nekih pacijenata može videti rast folikula već posle samo jedne doze od 25 IU FSH (pronalazak). Ovo se nije moglo uočiti u slučaju referenci Bravelle i Gonal-f. U slučaju 75 i 150 IU FSH (pronalazak) kod svih subjekata su se pojavili uvećani folikuli, pri čemu je jedna pacijentkinja imala jedan dvostruko veći folikul

LISTA SEKVENCI

[0134]

Claims

1. Rekombinantni FSH preparat, pri čemu rekombinantni FSH u preparatu ima šemu glikozilacije koja ima sledeće karakteristike: (i) relativnu količinu glikana koji nose bisektirajući N-acetilglukozamin (bisGIcNAc) od najmanje 20 % od ukupne količine glikana vezanih za FSH u preparatu; i (ii) relativnu količinu 2,6-kuplovane sijalinske kiseline od najmanje 40% od ukupne količine sijalinskih kiselina.

2. Rekombinantni FSH preparat prema zahtevu 1, pri čemu šema glikozilacije dalje (iii) sadrži relativnu količinu glikana koji nose fukozu od najmanje 30% od ukupne količine glikana vezanih za FSH u preparatu; i/ili (iv) je drugačija šema glikozilacije, pri čemu FSH u preparatu sadrži najmanje 35 različitih glikanskih struktura, pri čemu svaka od ovih različitih glikanskih struktura ima relativnu količinu od najmanje 0 1% od ukupne količine glikanskih struktura FSH u preparatu.

3. Rekombinantni FSH preparat prema zahtevu 1 ili 2, koji se može dobiti proizvodnjom u humanoj ćelijskoj liniji GT-5s ili ćelijskoj liniji dobijenoj od nje ili ćelijskoj liniji koja je homologna sa njom.

4.Rekombinantni FSH preparat prema bilo kom od zahteva 1 do 3, pri čemu rekombinantni FSH u preparatu ima šemu glikozilacije koji ima sledeće karakteristike: (i) relativnu količinu glikana koji nose bisektirajući N-acetilglukozamin (bisGIcNAc) od najmanje 25 %, a prvenstveno od najmanje 30 % od ukupne količine glikana vezanih za FSH u preparatu; i (ii) relativnu količinu 2,6-kuplovane sijalinske kiseline od najmanje 50%, a prvenstveno najmanje 53% od ukupne količine sijalinskih kiselina.

5. Rekombinantni FSH preparat prema bilo kom od zahteva 1 do 4, koji ima jednu ili više sledećih karakteristika: (a) šema glikozilacije sadrži relativnu količinu glikana koji nose jedan ili više ostataka sijalinske kiseline od najmanje 85%; (b) šema glikozilacije sadrži relativnu količinu bar tetraantenarnih glikana od najmanje 18%; (c) Z-broj od najmanje 200; (d) on je humani rekombinantni FSH; (e) on se proizvodi sa humanom ćelijskom linijom ili humanim ćelijama; i/ili (f) FSH u preparatu sadrži alfa podjedinicu koja ima aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 1 i beta podjedinicu koja ima aminokiselinsku sekvencu prema SEG ID NO: 2.

6. Rekombinantni FSH preparat prema bilo kom od zahteva 1 do 5, pri čemu šema glikozilacije ima jednu ili više od sledećih karakteristika: (i) relativna količina glikana koji nose bisektirajući N-acetilglukozamin (bisGIcNAc) u opsegu od oko 25% do oko 50%; (ii) relativnu količinu bar tetraantenarnih glikana od najmanje 16%, (iii) relativnu količinu glikana koji nose fukozu od najmanje 35%, (iv) relativnu količinu 2,6-kuplovane sijalinske kiseline od najmanje 53%; (v) relativnu količinu glikana koji nose jedan ili više ostataka sijalinske kiseline od najmanje 88%; (vi) Z-broj od najmanje 220; (vii) relativnu količinu glikana koji nose galaktozu od najmanje 95%, (viii) relativnu količinu glikanskih grana koje nose terminalnu galaktoznu jedinicu opciono modifikovanu sa ostatkom sijalinske kiseline od najmanje 60%; (ix) relativnu količinu glikana koji nose sulfatnu grupu od najmanje 3%, (x) on sadrži najmanje 45 različitih glikanskih struktura, pri čemu svaka od različitih glikanskih struktura ima relativnu količinu od najmanje 0 05 % od ukupne količine glikanskih struktura FSH u preparatu; (xi) on sadrži najmanje 35 različitih glikanskih struktura, pri čemu svaka od različitih glikanskih struktura ima relativnu količinu od najmanje 0.1 % od ukupne količine glikanskih struktura FSH u preparatu; (xiii) sadrži najmanje 20 različitih glikanskih struktura, pri čemu svaka od različitih glikanskih struktura ima relativnu količinu od najmanje 0.5 % od ukupne količine glikanskih struktura FSH u preparatu; i/ili (xiv) on sadrži najmanje 40 % još razlićitijih glikanskih struktura od FSH dobijenog iz CHO ćelija u odgovarajućem preparatu, pri čemu svaka od različitih glikanskih struktura ima relativnu količinu od najmanje 0,05 % od ukupne količine glikanskih struktura FSH u odgovarajućem preparatu,

7. Rekombinantni FSH preparat prema bilo kom od zahteva 1 do 6, pri čemu šema glikozilacije ima sledeće karakteristike: (i) relativnu količinu glikana koji nose bisektirajući N-acetilglukozamin (bisGIcNAc) u opsegu od oko 25% do oko 50%: (ii) relativnu količinu bar tetraantenarnih glikana od najmanje 16%; (iii) relativnu količinu glikana koji nose fukozu od najmanje 35%; (iv) relativnu količinu 2.6-kuplovane sijalinske kiseline u opsegu od oko 53% do oko 99%; i (v) relativnu količinu glikana koji nose jedan ili više ostataka sijalinske kiseline od najmanje 88%.

8. Rekombinantni FSH preparat prema bilo kom od zahteva 1 do 7, pri čemu pomenuti FSH (i) može da stimuliše oslobađanje progesterona u granuloznim ćelijama (a) u koncentracijama pri kojima se ne može detektovati veće oslobađanje cAMP od oslobađanja cAMP u odsustvu FSH; i/ili (b) indukcijom putanje transdukcije signala koja je nezavisna od cAMP signalizacije; i/ili (ii) može da stimuliše ili ko-stimuliše sazrevanje germinativnih ćelija biološkim procesom koji je nezavisan od cAMP signalizacije; i/ili (iii) ima jednu ili više od sledećih karakteristika, što se može odrediti testiranjem granuloznih ćelija (a) može da stimuliše oslobađanje progesterona u granuloznim ćelijama u koncentracijama koje su manje od minimalne koncentracije potrebne za indukciju oslobađanja cAMP u granuloznim ćelijama; (b) može da stimuliše oslobađanje od najmanje 200ng/ml progesterona u oko 5<*>10<4>do oko 1<*>10<5>granuloznih ćelija/ml sa FSH koncentracijama koje ne indukuju oslobađanje cAMP ili koje indukuju oslobađanje cAMP manje od 10 pmol/ml; (c) može da stimuliše oslobađanje najmanje 100ng/ml progesterona u oko 5<*>10<4>do oko 1<*>10<5>granuloznih ćelija/ml u koncentracijama koje su manje od koncentracije potrebne za humani urinarni FSH ili rekombinantni FSH proizveden u CHO ćelijama (Gonal F): i/ili (d) može da stimuliše oslobađanje od najmanje 100ng/ml progesterona u oko 5<*>10<4>do oko 1<*>10<5>granuloznih ćelija/ml sa koncentracijom za koju humani urinarni FSH ili rekombinantni FSH proizveden u CHO ćelijama (Gonal F) ne rezultuju odgovarajućim oslobađanjem progesterona; i/ili (iv) može da indukuje rast folikula kod ženske osobe posle administracije samo jedne doze, pri čemu samo jedna doza prvenstveno sadrži od 25 do 500 IU FSH, a prvenstveno je podesna za parenteralnu administraciju, a naročito subkutanom injekcijom.

9. Farmaceutska kompozicija koja sadrži rekombinantni FSH preparat prema bilo kom od zahteva 1 do 8.

10.Farmaceutska kompozicija prema zahtevu 9 koja je u obliku pojedinačne jedinične doze koja sadrži od oko 50 IU do oko 400 IU FSH, a naročito od oko 100 IU do oko 300 IU FSH.

11.Rekombinantni FSH preparat prema bilo kom od zahteva 1 do 8 ili farmaceutska kompozicija prema zahtevu 9 ili 10 za primenu u lečenju neplodnosti.

12.Rekombinantni FSH preparat ili farmaceutska kompozicija za primenu prema zahtevu 11, pri čemu doza koja treba da se da pacijentu rezultuje FSH koncentracijom u cirkulaciji pacijenta u opsegu od oko 0.05 do oko 2 IU/L, a prvenstveno od oko 0 1 do oko 1 IU/L

13.Rekombinantni FSH preparat prema bilo kom od zahteva 1 do 8 ili farmaceutska kompozicija prema zahtevu 9 ili 10 za primenu u medicini, pri čemu medicinska primena obuhvata (i) indukciju i/ili stimulaciju izlučivanja seksualnih steroida takođe nezavisnu od cAMP; ili (ii) stimulaciju ili ko-stimulaciju sazrevanja germinativnih ćelija biološkim procesom koji je nezavisan od cAMP signalizacije; ili (iii) indukciju i/ili stimulaciju izlučivanja seksualnih steroida sa FSH koncentracijama pri kojima se ne indukuje veće detektabilno oslobađanje cAMP u odnosu na oslobađanje cAMP u odsustvu FSH.

14. Rekombinantni FSH preparat ili farmaceutska kompozicija prema bilo kom od zahteva 11 do 13 za primenu u lečenju neplodnosti, pri čemu lečenje neplodnosti obuhvata tehnologije asistirane reprodukcije, indukciju ovulacije, in-vitro fertilizaciju. na primer, in-vitro fertilizaciju sa intracitoplazmičkim ubrizgavanjem sperme, intrafalopijalni transfer gameta, intrauterinu inseminaciju, lečenje anovulatornog poremećaja kod žena, lečenje poremećaja ozbiljne hormonske deficijencije radi sazrevanja jajne ćelije kod žena, lečenje deficijencija produkcije sperme kod muškaraca, i/ili omogućavanje ili poboljšanje sazrevanja germinativnih ćelija, kao što su folikulogeneza i spermatogeneza, a naročito sazrevanje folikula kod žena. na primer, tokom protokola in vitro stimulacije fertilizacije i/ili radi lečenja anovulatornog poremećaja,

15. Rekombinantni FSH preparat ili farmaceutska kompozicija za primenu prema bilo kom od zahteva 11 do 14, pri čemu rekombinantni FSH preparat ili farmaceutska kompozicija ima jednu ili više od sledećih karakteristika; (i) on može da indukuje rast folikula i/ili sazrevanje jajne ćelije posle administracije samo jedne jedine doze, i/ili (ii) on ima kraće vreme poluživota kod jednog ili više ljudi, simijanih majmuna, pacova i/ili miševa od FSH preparata dobijenih od ljudskog urina i/ili izraženih u CHO ćelijama; i/ili (iii) on ima manju bioraspoloživost kod jednog ili više ljudi, simijanih majmuna, pacova i/ili miševa od FSH preparata dobijenih od ljudskog urina i/ili izraženih u CHO ćelijama; i/ili (iv) on ima terapeutsku efikasnost kod jednog ili više ljudi, simijanih majmuna, pacova i/ili miševa koja je slična ili veća od FSH preparata dobijenih od ljudskog urina i/ili izraženih u CHO ćelijama.