CN106053861A - 一种卵泡刺激素生物活性强度检测方法 - Google Patents
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Abstract
一种卵泡刺激素生物活性强度检测方法，包括以下步骤：（1）无卵泡刺激素血清的制备：（2）支持细胞的准备，（3）受检者血清样品中卵泡刺激素生物活性强度的分析：将雌二醇的检测结果在卵泡刺激素标准曲线上反算，查出待测样本中卵泡刺激素生物活性强度。本发明的方法（即睾丸细胞法）可以检出待测样本中卵泡刺激素生物活性强度，灵敏度高。
Description
技术领域
本发明涉及一种卵泡刺激素生物活性强度检测方法。
背景技术
卵泡刺激素（FSH）是垂体前叶细胞分泌的一种蛋白质激素。在男性，作用于睾丸曲细精管，可促进精子形成；作用于支持（Sertoli）细胞分泌雌二醇。在女性，促进卵泡颗粒层细胞增生分化，促进卵巢长大。目前卵泡刺激素的检测主要是通过酶联免疫法和化学发光法。这些方法都是直接或间接的检测卵泡刺激素本身，没有检测其生物活性。而唯有生物活性与临床症状体征相关。同时，由于酶联免疫法和化学发光法都是通过免疫反应原理进行检测，其检测的敏感性受到极大限制。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，克服现有技术的不足，提供一种卵泡刺激素生物活性强度检测方法。
本发明解决其技术问题采用的技术方案是，一种卵泡刺激素生物活性强度检测方法，通过受检者血清样品中的卵泡刺激素（FSH）刺激动物支持（Sertoli）细胞产生雌二醇：通过测定雌二醇的浓度反算出卵泡刺激素（FSH）的生物活性强度。
本发明具体包括以下步骤：
（一）无卵泡刺激素血清的制备：
将硅橡胶管塞满雌二醇结晶，皮下植入动物背部4-6周用以抑制动物卵泡刺激素的分泌；收集40-60毫升动物血清，加入10-20mg的活性炭，在室温下吸附12小时以上，用滤纸过滤除去甾体激素，滤液存于-40～-80℃冰箱中保存；
（二）支持细胞（Sertoli细胞）的准备：
取动物睾丸2个，去包膜，按4～6.5ml 199培养液/2个睾丸的用量，将睾丸放于199培养液中，再加入胶原酶III和分离酶II，使培养液中胶原酶III的最终浓度为0.25－0.29mg/ml，分离酶II的最终浓度为0.11－0.15μg/ml；在34～37℃孵育15～20分钟，所得悬浮液用等量199培养液稀释，过滤后往滤液中加入聚蔗糖，使聚蔗糖终浓度为11～14g/100mL，将其在1000～1500g下离心3～20分钟；将离心所得含支持（Sertoli）细胞的沉淀用4～8mL 199培养液重悬；然后，加入3-异丁甲基黄嘌呤、牛血清蛋白和胎牛血清，其终浓度分别是：3-异丁甲基黄嘌呤为0.125－0.150mmol/L；牛血清蛋白为0.5－0.6g/100mL；胎牛血清为总体积的0.5－2%；用台盼蓝排除法做活细胞计算，得支持（Sertoli）细胞悬液；
（三）受检者血清样品中卵泡刺激素生物活性强度分析：
（A）血清样品中的卵泡刺激素刺激支持（Sertoli）细胞产生雌二醇：
取70-100μl步骤（二）所得支持细胞悬液，加受检者血清30-50μl；同时取70-100μl步骤（二）所得支持（Sertoli）细胞悬液，加30-50μl磷酸盐缓冲液稀释过的各浓度的卵泡刺激素标准品（其中含有与受检者标本等量但无卵泡刺激素的血清）；将配置好的试剂在37℃，用5% CO2 和95%O2孵育4－6小时后，加入1.5－1.6ml含0.01－0.012g/100mL硫柳汞明胶的磷酸盐缓冲液以终止反应；
（B）雌二醇的检测：将经过步骤（Ａ）处理的受检者血清样品及标准品按照现有雌二醇检测试剂盒或其它方法进行雌二醇浓度的检测，绘制卵泡刺激素生物活性强度－雌二醇浓度标准曲线；
步骤（Ａ）中配置的各浓度的卵泡刺激素标准品，其浓度与卵泡刺激素生物活性强度呈正线性比例关系，即卵泡刺激素标准品浓度越高，卵泡刺激素生物活性强度越高。但研究发现，受检者血清中，卵泡刺激素浓度与活性强度却不是呈线性比例关系，因此，我们利用此原理来进行活性强度的检测。
（c）卵泡刺激素（FSH）浓度的推算：
将受检者血清样品中雌二醇的检测结果在卵泡刺激素生物活性强度－雌二醇浓度标准曲线上反算，查出待测样本中卵泡刺激素生物活性强度。
本发明（即睾丸细胞法）的优点：通过采用受检者血清刺激动物的支持细胞产生雌二醇，通过测定雌二醇的浓度反算出卵泡刺激素（FSH）的生物活性水平。检测的是卵泡刺激素的生物活性，而不是卵泡刺激素本身的含量。检测结果与临床症状体征紧密相关。而且灵敏度高。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例：本实验以豚鼠支持细胞检测人FSH为例：
（一）无卵泡刺激素血清的制备：
将0.25cm长（内径0.062英寸，外径0.095英寸）的硅橡胶管塞满雌二醇结晶（雌二醇结晶，购自西格玛公司，圣路易斯，密苏里州，美国），皮下植入豚鼠背部6周用以抑制豚鼠卵泡刺激素的分泌；收集50毫升豚鼠血清，加入10mg的活性炭，在室温下吸附12小时，用滤纸过滤，除去甾体激素（即雌二醇等），滤液存于-80℃冰箱中保存；
（二）豚鼠支持细胞的准备：
取体重为550-700g的豚鼠的睾丸2个，去包膜；按6.2ml 199培养液/2个睾丸的用量，将睾丸放于199培养液（购自西格玛公司，圣路易斯，密苏里州，美国）中，再加入胶原酶III和分离酶II，使培养液中胶原酶III的最终浓度为0.28mg/ml；分离酶II的最终浓度为0.14μg/ml；在37℃孵育20分钟，所得悬浮液用等量199培养液稀释，过滤后往滤液中加入聚蔗糖，使聚蔗糖终浓度为13g/100mL，将其在1500g下离心10分钟；将离心所得含支持细胞的沉淀用8mL 199培养液重悬；然后，加入3-异丁甲基黄嘌呤、牛血清蛋白和胎牛血清。其终浓度分别是：3-异丁甲基黄嘌呤为0.125 mmol/L；牛血清蛋白为0.5g/100mL；胎牛血清为总体积的2%；用台盼蓝排除法做活细胞计算，得支持（Sertoli）细胞悬液；
（三）受检者血清样品中卵泡刺激素生物活性强度分析
（A）血清样品中的卵泡刺激素刺激Sertoli细胞产生雌二醇：
取100μl步骤（二）所得支持（Sertoli）细胞悬液，加受检者血清50μl；同时取100μl步骤（二）所得支持（Sertoli）细胞悬液，加50μl磷酸盐缓冲液稀释过的各浓度的卵泡刺激素标准品（其中含有与受检者标本等量但无卵泡刺激素的血清）；将配置好的试剂在37℃，用5%CO2 和95%O2孵育4小时后，加入1.5ml含0.01g/100mL硫柳汞明胶的磷酸盐缓冲液以终止反应；
（B）雌二醇的检测：
将经过步骤（Ａ）处理的受检者血清样品及标准品按照现有雌二醇检测试剂盒方法进行雌二醇浓度的检测，绘制卵泡刺激素生物活性强度－雌二醇浓度标准曲线；
本实施例是以上海酶联生物科技有限公司雌二醇检测试剂盒进行检测。以下为按说明书操作的方法：
1.实验前所有的试剂、样本和微孔板条达到室温（18～25℃）；
2.双蒸水1:40稀释浓缩的洗液(稀释的洗液储存在2～8℃可保存2周)；
3.每孔加25μl标准品、质控品、样品（96孔板要求在3分钟内加样完毕）。
4.每孔加200μl的酶结合物，充分混合10秒钟，室温孵育120分钟。
5.洗板：弃去孵育混合物，在吸水纸上拍干。每孔加洗液400μL，洗板之间浸泡时间为10秒或振荡5秒，弃去，重复上述操作3次。洗完后在吸水纸上拍干直至没有潮气。
6.每孔添加100μl的底物溶液，混匀，室温孵育15分钟。
7.每孔加入50μl的终止液，混匀，终止反应。
8.在10分钟内读取OD值，酶标仪的波长（OD值）使用450±10nm。
9.结果计算： ①计算标准、质控品和样本的平均OD值。所有的OD值均减去“0”标准品的平均OD值；②建立标准曲线，使用每一个标准品的OD值与其相对应的浓度值描点作图。OD值为纵轴（Y轴），浓度为横轴（X轴）。③样品的雌二醇浓度，首先在Y轴上查找OD值，横向延伸至标准曲线，以标准曲线上的点拉垂直线与X轴相交，得出雌二醇的浓度值。
(C) 卵泡刺激素（FSH）浓度的推算：
将受检者血清样品中雌二醇的检测结果在卵泡刺激素生物活性强度－雌二醇浓度标准曲线上反算，查出待测样本中卵泡刺激素生物活性强度。
结果评价：
将FSH标准品（法玛西亚普强公司，美国）从1.00 mIU/ml进行系列稀释为：1.00 mIU/ml、0.100 mIU/ml、0.010 mIU/ml、0.001 mIU/ml、0.0001 mIU/ml,然后分别用放免法、化学发光法以及本发明的睾丸细胞法进行检测。每一稀释浓度进行三次检测。实验重复5次。结果列于表1：
从结果可见，睾丸细胞法检测人FSH比放免法和化学发光法敏感100倍。
Claims (3)
1.一种卵泡刺激素生物活性强度检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
（一）无卵泡刺激素血清的制备：
将硅橡胶管塞满雌二醇结晶，皮下植入动物背部4-6周用以抑制动物卵泡刺激素的分泌；收集40-60毫升动物血清，加入10-20mg的活性炭，在室温下吸附12小时以上，用滤纸过滤除去甾体激素，滤液存于-40～-80℃冰箱中保存；
（二）支持细胞的准备：
取动物睾丸2个，去包膜，按4～6.5ml 199培养液/2个睾丸的用量，将睾丸放于199培养液中，再加入胶原酶III和分离酶II，使培养液中胶原酶III的最终浓度为0.25－0.29mg/ml，分离酶II的最终浓度为0.11－0.15μg/ml；在34～37℃孵育15～20分钟，所得悬浮液用等量199培养液稀释，过滤后往滤液中加入聚蔗糖，使聚蔗糖终浓度为11～14g/100mL，将其在1000～1500g下离心3～20分钟；将离心所得含支持细胞的沉淀用4～8mL 199培养液重悬；然后，加入3-异丁甲基黄嘌呤、牛血清蛋白和胎牛血清；用台盼蓝排除法做活细胞计算，得支持细胞悬液；
（三）受检者血清样品中卵泡刺激素生物活性强度分析：
（A）血清样品中的卵泡刺激素刺激支持细胞产生雌二醇：
取70-100μl步骤（二）所得支持细胞悬液，加受检者血清30-50μl；同时取70-100μl步骤（二）所得支持细胞悬液，加30-50μl磷酸盐缓冲液稀释过的各浓度的卵泡刺激素标准品；将配置好的试剂在37℃，用5% CO2 和95%O2孵育4－6小时后，加入1.5－1.6ml含0.01－0.012g/100mL硫柳汞明胶的磷酸盐缓冲液以终止反应；
（B）雌二醇的检测：将经过步骤（Ａ）处理的受检者血清样品及标准品按照现有雌二醇检测试剂盒或其它方法进行雌二醇浓度的检测，绘制卵泡刺激素生物活性强度－雌二醇浓度标准曲线；
（c）卵泡刺激素浓度的推算：
将受检者血清样品中雌二醇的检测结果在卵泡刺激素生物活性强度－雌二醇浓度标准曲线上反算，查出待测样本中卵泡刺激素生物活性强度。
2.根据权利要求1所述的卵泡刺激素生物活性强度检测方法，其特征在于，步骤（二）中，检测用的是动物的睾丸支持细胞。
3.根据权利要求1所述的卵泡刺激素生物活性强度检测方法，其特征在于，步骤（二）中，3-异丁甲基黄嘌呤、牛血清蛋白和胎牛血清终浓度分别是：3-异丁甲基黄嘌呤为0.125－0.150mmol/L；牛血清蛋白为0.5－0.6g/100mL；胎牛血清为总体积的0.5-2%。
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| CN116286647A (zh) * | 2022-11-29 | 2023-06-23 | 兰州荣晔生物科技有限责任公司 | 一种去激素胎牛血清和新生牛血清的制备工艺 |
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