RS20181002A1 - Tretman sa anti-vegf antitelima - Google Patents

Description

TRETMAN SA ANTI-VEGF ANTITELIMA

Ova prijava štiti prioritet United States Provisional Application Serial No.

60/474,480, podnete 30. maja 2003., čiji je opis ovde priključen kroz citat.

Uopšteno, ovaj pronalazak se odnosi na tretman humanih bolesti i patoloških stanja. Određenije, ovaj pronalazak se odnosi na terapiju anti-angiogeneze kancera, bilo samu ili u kombinaciji sa drugim terapijama protiv kancera.

Kancer predstavlja jednu od najsmrtonosnijih pretnji Ijudskom zdravlju. U SAD, svake godine kancer napada približno 1,3 miliona novih pacijenata i predstavlja drugi vodeći uzrok smrti, posle srčanih bolesti, sa približno jednom od četri smrti. Predviđa se takođe, da tokom narednih 5 godina kancer, kao uzročnik smrti, može da prevaziđe kardiovaskularne bolesti. Čvrsti tumori su odgovorni za većinu ovih smrti. Mada je postignut značajan napredak u medicinskom tretmanu nekih kancera, ukupni broj preživljavanja u periodu od 5 godina za sve kancere, povećan je samo za oko 10% u toku poslednjih 20 godina. Kanceri, ili maligni tumori, metastaziraju i brzo rastu na nekontrolisan način, čineći blagovremeno otkrivanje i tretman izuzetno otežanim. Pored toga, kanceri mogu da rastu u bilo kom tkivu u telu, kroz malignu transformaciju jedne ili više normalnih ćelija unutar

tog tkiva, a poreklo svake vrste kancera u posmatranom tkivu razlikuje se od drugih.

Današnji postupci tretmana kancera relativno su neselektivni. Hirurgijom se uklanja obolelo tkivo; radioaterapija smanjuje čvrste tumore, a hemoterapija ubija ćelije koje se brzo dele. Naročito hemoterapija dovodi do brojnih sporednih efekata, u nekim slučajevima toliko jakih da ograničavaju doziranje koje bi se moglo primeniti, pa na taj način sprečavaju upotrebu potencijalno efikasnih lekova. Pored toga, kanceri često uspostavljaju rezistentnost prema hemoterapeutskim lekovima.

Dakle, postoji hitna potreba za specifičnim i efikasnijim terapijama kancera.

Angiogeneza je značajno ćelijsko događanje u kome dolazi do proliferacije, izmene i reorganizacije ćelija vaskularnog endotelijuma, tako da se formiraju novi krvni sudovi iz postojeće mrže krvnih sudova. Postoje ubedljivi dokazi da je razvoj snabdevanja vaskularnog sistema bitan za normalne i patološke proliferativne procese (Folkman i Klasbrun, Science, 1987, 235, 442-447). Snabdevanje kiseonikom i hranljivim sastojcima, kao i uklanjanje kataboličkih proizvoda, predstavljaju stupnjeve koji određuju brzinu većine procesa rasta, koji se dešavaju u višećelijskim organizmima. Dakle, obično se predpostavlja da je ovaj vaskularni segment neophodan, ne samo za razvoj i deiferencijaciju organa tokom embriogeneze, već takođe za zarastanje rana i reproduktivne funkcije odraslih.

Angiogeneza je takođe implicirana u patogenezi raznih poremećaja, uključujući, ali bez ograničavanja, tumore, proliferaivne retinopatije, staračku makularnu degeneraciju, reumatoidni artritis (AR) i psorijazu. Angiogeneza je bitna za rast većine primarnih tumora i metastaze koje slede. Tumori mogu da absorbuju dovoljno hranljivih sastojaka i kiseonika, jednostavno difundovanjem do veličine od 1-2 mm, kada njihov dalji rast zahteva vaskularnu podršku. Smatra se da ovaj proces obuhvata regrutovanje okolne zrele vaskulature domaćina, da bi počelo širenje i rast novih kapilara krvnih sudova, i nakon toga infiltriranje, u masu tumora. Pored toga, angiogeneza tumora obuhvata regrutovanje prekursorskih ćelija endotelijuma krvotoka iz koštane srži, da promoviše neovaskularizaciju, Kerbel, Carcinogenesis, 2000, 21, 505-515; Lynden et al., Nat. Med., 2001, 7, 1194-1201.

Mada se smatra da je indukcija novih krvnih sudova dominantan način angiogeneze tumora, skorašnji podaci ukazuju da neki tumori mogu da rastu prisvajanjem već postojećih krvnih sudova domaćina. Ova prisvojena vaskulatura zatim se povlači, što dovodi do regresije tumora, koja konačno menja smer preko angiogeneze izazvane hipoksijom na ivicama tumora. Holash et al., Science, 1999, 284, 1994-1998.

U pogledu izuzetnog fiziološkog i patološkog značaja angiogeneze, mnogo truda je posvećeno razjašnjavanju faktora koji su u stanju da regulišu taj proces. Predloženo je da proces angiogeneze reguliše ravnoteža između pro- i antiangiogenih molekula, koja je poremećena kod raznih bolesti, a naročito kancera. Carmeliet and Jain, Nature, 2000, 407, 249-257.

Faktor rasta ćelija vaskularnog endotelijuma (VEGF, od engl. vascular endothelial cell growth factor), koji se naziva takođe VEGF-A ili faktor vaskularne permeabilnosti (VPF, od engl. vascular permeability factor), označen je glavnim regulatorom i normalne i abnormalne angiogeneze. Ferrara i Davis-Smyth, Endocrine Rev.1997, 18, 4-25; Ferrara, J. Mol. Med.1999, 77, 527-543. U poređenju sa drigim faktorima rasta, koji doprinose procedu vaskularnog formiranja, VEGF je jedinstven po njegovoj specifičnosti prema ćelijama endotelijuma, unutar vaskularnog sistema. VEGF je bitan za embrionalnu vaskulogenezu i angiogenezu. Carmeliet et al., Nature, 1996, 380, 435-439; Ferrara et al., Nature, 1996, 380, 439-442. Pored toga, VEGF je neophodan za cikličnu proliferaciju krvnih sudova u reproduktivnom traktu žena i za rast kostiju i

formiranje hrskavice. Ferrara et al., Nature Med., 1998, 4, 336-340; Gerber et al., Nature Med.1999, 5, 623-628.

Pored toga što predstavlja angiogeni faktor u angiogenezi i vaskulogenezi, VEGF kao pleiotropni faktor rasta, ispoljava višestruke biološke efekte u drugim fiziološkim procesima, kao što je preživljavanje ćelija endotelijuma, permeabilnost i vazodilatacija krvnih sudova, hemotaksija monocita i priliv kalcijuma. Ferrara i Davis-Smyth (1997), videti gore. Pored toga, objavljena su nedavna ispitivanja mitogenih efekata VEGF na nekoliko vrsta ne- endotelijumskih ćelija, kao što su ćelije epitelijuma pigmenta mrežnjače, ćelije kanala pankreasa. Guerrin et al., J. Cell Physiol. 1995, 164.385-394; Oberg- VVelsh et al., Mol. Cell. Endocrinol.1997, 126, 125-132; Sondell et al., J. Neurosci., 1999, 19, 5731-5740.

Takođe, bitan dokaz je dodeljivanje VEGF-u ključne uloge u razvoju stanja ili bolesti koje obuhvataju patološku angiogenezu. Kod većine ispitanih humanih tumora preterano se izlučuje VEGF mRNK (Berkman et al., J. Clin. Invest.1993, 91, 153-159; Brovvn et al., Human Pathol., 1995, 26, 86-91; Brown et al., Cancer Res., 1993, 53, 4727-2735; Mattern et al„ Brit. J. Cancer, 1996, 73, 931-934; i Dvorak et al„ Am. J. Pathol. 1995, 146, 1029-1039). Takođe, koncentracija VEGF u fluidima oka je usko povezana sa prisustvom proliferacije u krvnim sudovima pacijenta sa dijabetskom retinopatijom i drugim retinopatijama povezanim sa ishemijom (Aiello et al„ N. Engl. J. Med., 1994, 331.1480-1487). Pored toga, nedavna ispitivanja su pokazala da postoji lokalizacija VEGF u horoidalnim neovaskularnim membranama kod pacijenata sa AMD (Lopez et al„ Invest. Ophtalmo. Vis. Sci., 1996, 37, 855-868).

Zahvaljujući njegovoj centralnoj ulozi u promovisanju rasta tumora, VEGF predstavlja privlačnu metu za terapeutsko intervenisanje. Zaista, danas su razvijene razne terapeutske strategije, usmerene na blokiranje VEGF ili sistema za signalizaciju njegovih receptora, prilikom tretmana bolesti neoplazama.

Rosen, Oncologist, 2000, 5, 20-27; Ellis et al., Oncologist, 2000, 5, 11-15; Kerbel, J. Clin. Oncol. 2001, 19, 45S-51S. Do sada, najbolje proučeni pristupi su blokada VEGF/VEGF receptora pomoću monoklonalnih antitela i inhibicija receptora koji signaliziraju inhibitori tirozin kinaze. Ispitivani su takođe ribozomi VEGFR-1, konjugati VEGF toksina i rastvorni receptori VEGF.

U skladu sa radom Presta et al., Cancer Res.1997, 57, 4593-4599, generisano je anti-VEGF antitelo "Bevacizumab (BV)”, poznato takođe i kao "rhuMAb VEGF” ili "Avastin ™”, a to je rekombinantno humanizovano anti-VEGF monoklonalno antitelo. Ono sadrži regione mutiranog humanog skeleta lgG1 i regione koji određuju komplementarnost vezivanja antigena, iz mišjeg anti-hVEGF monoklonalnog antitela A4.6.1, koje blokira vezivanje huumanog VEGF za receptore. Približno 93% sekvencije aminokiselina Bevacizumaba, uključujući većinu regiona skeleta, se izvodi iz humanog lgG1, a oko 7% sekvencije se izvodi iz mišjeg antitela A4.6.1. Bevacizumab ima molekulsku težinu od oko 149.000 daltona i glikolzilovan je. Bevacizumab je ispitan klinički za tretiranje raznih kancera, a neki pokušaju u početnoj fazi su pokazali rezultate koji obećavaju. Kerbel, J. Clin. Oncoi, 2001, 19, 45S-51S; De Vore et al., Proc. Am. Soc. Clin. Oncol., 2000, 19, 485a; Johnson et al., Proc. Am. Soc. Clin. Oncol., 2001, 20, 315a; Kabbinavar et al., J. Clin. Oncoi, 2003, 21, 60-65.

Ovaj pronalazak se odnosi na postupke za upotrebu anti-VEGF antitela za tretiranje bolesti i patoloških stanja. Naročito, ovaj pronalazak daje efikasan pristup tretiranju kancera, delimično zasnovan na rezultatima koji su proistekli iz dodavanja anti-VEGF antitela standardnoj hemoterapiji, koji su statistički signifikantni i koji su pokazali klinički značajna poboljšanja kod pacijenata sa kancerom.

Prema tome, ovaj pronalazak u jednom aspektu daje postupak za tretman kancera kod humanog pacijenta, koji se sastoji od ordiniranja tom pacijentu

efikasnih količina anti-VEGF antitela i preparata protiv neoplazma, gde ovaj preparat proitiv neoplazma sadrži najmanje jedan hemoterapeutski agens.

Kancer podložan tretmanu sa ovim pronalaskom obuhvata, ali bez ograničavanja, karcinom, limfom, blastom, sarkom i leukemiju ili limfoidne malignitete. Određenije, primeri tih kancera su kancer skvamoznih ćelija, kancer pluća (uključujući kancer malih ćelija pluća, kancer ne-malih ćelija pluća, adenokarcinom pluća i skvamozni karcinom pluća), kancer peritoneuma, hepatocelularni kancer, gastrični ili stomačni kancer (uključujući gastrointestinalni kancer), kancer pankreasa, glioblastom, cervikalni kancer, kancer jajnika, kancer jetre, kancer bešike, hepatom, kancer dojke, kancer debelog creva, kolorektalni kancer, karcinom endometrijuma ili materice, karcinom pljuvačnih žlezda, bubrežni ili renalni kancer, kancer jetre, kancer prostate, kancer vulve, kancer tiroide, hepatički karcinom i razne vrste kancera glave i vrata, kao i limfom B- ćelija (uključujući folikularni ne-Hodgkin-ov limfom (NHL) niskog intenziteta; mali limfocitni (SL) NHL; folikularni NHL srednjeg intenziteta; difuzni NHL srednjeg intenziteta; imunoblastni NHL visokog intenziteta; limfoblastni NHL visokog intenziteta; NHL visokog intenziteta bez otcepljivanja malih ćelija; opšta bolest NHL; limfom obloge ćelije; limfomi povezani sa AIDS-om i Waldenstrom-ova makroglobulinemija); hronična limfocitna leukemija (CLL); akutna limfoblastna leukemija (ALL); leukemija kosmatih ćelia; hronična mijeloblastna leukemija; i hipoproliferativni poremećaj posle transplantacije (PTDL), kao i abnormalna ćelijska proliferacija povezana sa fakomatozama, edem (kao što su oni povezani sa tumorima mozga) i Meigs-ov sindrom. Poželjno je da se kancer bira iz grupe koju čine kancer dojke, kolorektalni kancer, rektalni kancer, kancer ne-malih ćelija pluća, ne-Hodgkin-ov limfom (NHL), kancer renalnih ćelija, kancer prostate, kancer jetre, kancer pankreasa, sarkom mekog tkiva, Kaposi-ev sarkom, karcinoidni sarkom, kancer glave i vrata, melanom, kancer jajnika, mezoteliom i višestruki mijelom. Poželjnije je da kancer predstavlja kolorektalni kancer. Kancerozna stanja, podložna tretmanu iz ovog pronalaska, obuhvataju metastazirane kancere. Postupak iz ovog pronalaska je naročito pogodan za tretman vaskularizovanih tumora.

Bilo koji hemoterapeutski agens koji pokazuje aktivnost protiv kancera može se koristiti u skladu sa ovim pronalaskom. Poželjno je da se hemoterapeutski agens bira iz grupe koju čine agensi za alkilovanje, antimetabolici, analozi folne kiseline, analozi pirimidina, analozi purina i srodni inhibitori, vinca alkaloidi, epipodopiilotoksini, antibiotici, L-asparaginaza, inhibitor topoizomeraze, interferoni, koordinacioni kompleksi platine, urea supstituisana antracendionom, derivati metilhidrazina, adrenokortiko supresant, adrenokortikosteroidi, progestini, estrogeni, antiestrogen, androgeni, antiandrogen i analog hormona koji oslobađa gonadotropin. Poželjnije je da se hemoterapeutski agens bira iz grupe koju čine 5-fluorouracil (5-FU), leucovorin (LV), irinotecan, oxaliplatin, capecitabin, paclitaxel i doxetaxel. U koktelu koji se ordinira sa anti-VEGF antitelom mogu se koristiti dva ili više hemoterapeutskih agenasa. Jedna poželjna kombinacija hemoterapije je na bazi fluorouracila, koja se sastoji od 5-FU i jednog ili više drugih hemoterapeutskih agenasa. Pogodni režimi doziranja kombinovane hemoterapije su poznati u stanju tehnike, a opisali su ih na primer, Saltz et al., Proc. ASCO, 1999, 18, 233a i Douillard et al., Lancet, 2000, 355, 1041-7.

U jednom aspektu ovaj pronalazak daje postupak za produženje trajanja preživljavanja humanog pacijenta koji ima kancer, a koji se sastoji u ordiniranju tom pacijentu efikasne količine preparata anti-VEGF antitela i preparata protiv neoplazma, gde pomenuti preparat protiv neoplazma sadrži najmanje jedan hemoterapeutski agens, pri čemu istovremeno ordiniranje anti-VEGF antitela i preparata protiv neoplazma efikasno produžava trajanje preživljavanja.

U sledećem aspektu, ovaj pronalazak daje postupak za produženje trajanja preživljavanja humanog pacijenta sa kancerom bez napredovanja, a koji se sastoji u ordiniranju tom pacijentu efikasne količine preparata anti-VEGF antitela i preparata protiv neoplazma, gde pomenuti preparat protiv neoplazma sadrži

najmanje jedan hemoterapeutski agens, pri čemu istovremeno ordiniranje anti-VEGF antitela i preparata protiv neoplazma efikasno produžava trajanje preživljavanja bez napredovanja kancera.

Pored toga, ovaj pronalazak daje postupak za tretiranje grupe humanih pacijenata koji imaju kancer, koji se sastoji od ordiniranja tom pacijentu efikasne količine preparata anti-VEGF antitela i preparata protiv neoplazma, gde pomenuti preparat protiv neoplazma sadrži najmanje jedan hemoterapeutski agens, pri čemu istovremeno ordiniranje anti-VEGF antitela i preparata protiv neoplazma efikasno produžava visinu odgovora kod takve grupe pacijenata.

U još jednom aspektu, ovaj pronalazak daje postupak za produžavanje trajanja odgovora kod humanog pacijenta koji ima kancer, koji se sastoji od ordiniranja tom pacijentu efikasne količine preparata anti-VEGF antitela i preparata protiv neoplazma, gde pomenuti preparat protiv neoplazma sadrži najmanje jedan hemoterapeutski agens, pri čemu istovremeno ordiniranje anti-VEGF antitela i preparata protiv neoplazma efikasno produžava trajanje odgovora.

Ovaj pronalazak daje takođe postupak za tretiranje humanog pacijenta podložnog ili sa dijagnozom kolorektalnog kancera, koji se sastoji od ordiniranja tom pacijentu efikasne količine anti-VEGF antitela. Kolorektalni kancer može biti sa metastazama. Tratman sa anti-VEGF antitelom može biti još i kombinovan sa standardnom hemoterapijom kolorektalnog kancera, kao što je Saltz-ov režim (5-FU/LV/irinotecan), koji su opisali Saltz et al. (1999).

U jednoj poželjnoj realizaciji, ovaj pronalazak daje postupak za tretiranje humanog pacijenta ili grupe humanih pacijenata, koji imaju kolorektalni kancer sa metastazama, a koji se sastoji od ordiniranja tom pacijentu efikasne količine preparata anti-VEGF antitela i preparata protiv neoplazma, gde pomenuti preparat protiv neoplazma sadrži najmanje jedan hemoterapeutski agens, pri čemu istovremeno ordiniranje anti-VEGF antitela i preparata protiv neoplazma dovodi do statistički signifikantnog i klinički značajnog poboljšanja kod tretiranog pacijenta, mereno trajanjem preživljavanja, preživljavanjem bez napredovanja kancera, jačinom odgovora i trajanjem odgovora. Poželjno je da preparat protiv neoplazma predstavlja kombinovani režim na bazi fluorouracila. Poželjnije je da se kombinovani režim sastoji od 5-FU+leucovorin, 5-FU+leucovorin+irinotecan (IFL) ili 5-FU+leucovorin+oxaliplatin (FOLFOX).

Ovaj pronalazak daje proizvodni artikl koji se sastoji od kontejnera, preparata unutar kontejnera, koji sadrži anti-VEGF antitelo, i dodatka sa uputstvom korisniku tog preparata za ordiniranje pacijentu sa kancerom preparata anti- VEGF antitela i preparata protiv neoplazma, koji sadrži najmanje jedan hemoterapeutski agens.

Ovaj pronalazak daje i komplet za tretiranje kancera u pacijentu, koji se sastoji od pakovanja koje sadrži preparat anti-VEGF antitela i uputstvo za upotrebu preparata anti-VEGF antitela i preparata protiv neoplazma, koji sadrži najmanje jedan hemoterapeutski agens, za tretiranje kancera u pacijentu.

Kratak opis slika

Slika 1 predstavlja Kaplan-Meier-ove procene preživljavanja. Medijana trajanja preživljavanja (naznačena isprekidanom linijom) bila je 20,3 meseca, za grupu kojoj je davan irinotecan, fluorouracil i leucovorin (IFL), plus bevacizumab, u poređenju sa 15,6 meseci grupe kojoj je davan IFL plus placebo, što odgovara pokazatelju opasnosti od smrti od 0,66 (P<0,001).

Slika 2 predstavlja Kaplan-Meier-ove procene preživljavanja bez napredovanja bolesti. Medijana trajanja preživljavanja bez napredovanja bolesti (naznačena isprekidanom linijom) bila je 10,6 meseci, za grupu kojoj je davan irinotecan, fluorouracil i leucovorin (IFL), plus bevacizumab, u poređenju sa 6,2 meseca grupe kojoj je davan IFL plus placebo, što odgovara pokazatelju opasnosti od napredovanja od 0,54 (P<0,001).

Slike 3A-3C daju analizu trajanja preživljavanja raznih podgrupa pacijenata, podeljenih prema polaznim karakteristikama.

Slika 4 predstavlja Kaplan-Meier-ove procene preživljavanja pri poređenju grupe kojoj je davan 5-FU/LV plus placebo, u odnosu na grupu kojoj je davan 5-FU/LV plus bevacizumab (BV).

Slika 5 predstavlja Kaplan-Meier-ove procene preživljavanja bez napredovanja bolesti pri poređenju grupe kojoj je davan 5-FU/LV plus placebo, u odnosu na grupu kojoj je davan 5-FU/LV plus bevacizumab (BV).

Detalian opis poželjnih realizacija

1, Definicije

Nazivi ”VEGF” i ”VEGF-A” koriste se naizmenično da označe faktor rasta ćelija vaskularnog endotelijuma od 165 aminokiselina i njemu srodne faktore rasta ćelija vaskularnog endotelijuma sa 121, 189 i 206 aminokiselina, kao što su opisali Leung et al., u Science, 1989, 246, 1306; i Houck et al., u Mol. Endocrin. 1991, 5, 1806, zajedno sa njihovim alelomorfnim i obrađenim oblicima. Naziv VEGF” koristi se takođe da označi skraćene oblike polipeptida koji sadrže aminokiseline od 8 do 109 ili od 1 do 109, humanog faktora rasta ćelija vaskularnog endotelijuma od 165 aminokiselina. Pozivanje na bilo koji od tih oblika VEGF može se identifikovati u ovoj prijavi, npr. kao ”VEGF (8-109)", VEGF (1-109” ili kao VEGF165”. Položaji aminokiselina za "skraćeni” nativni VEGF numerisani su kao što je pokazano u nativnoj sekvenciji VEGF. Na primer, položaj 17. amino kiseline (metionin) u skraćenom nativnom VEGF takođe je položaj 17 (metionin) i u nativnom VEGF.

Skraćeni nativni VEGF ima afinitet vezivanja za receptore KDR i Flt-1, koji je uporediv sa nativnim VEGF.

”Anti-VEGF antitelo” je antitelo koje se vezuje za VEGF sa dovoljnim afinitetom i specifičnošću. Poželjno je da se anti-VEGF antitelo iz ovog pronalaska može koristiti kao terapeuski agens za usmeravanje na i interferiranje sa bolestima ili stanjima kod kojih je prisutna aktivnost VEGF. Anti-VEGF antitelo obično se neće vezivati za druge homologe VEGF, kao što su VEGF-B ili VEGF-C, niti za druge faktore rasta, kao što su PIGF, PDGF ili bFGF. Poželjno anti-VEGF antitelo je monoklonalno antitelo koje se vezuje za isti epitop kao i monoklonalno anti- VEGF antitelo A4.6.1, koje proizvodi hibridom ATCC FIB 10709. Poželjnije je da je anti-VEGF antitelo rekombinantno humanizovano anti-VEGF monoklonalno antitelo, koje se generiše kao što su opisali Presta et al., Cancer Res.1997, 57, 4593-4599, uključujući, ali bez ograničavanja i antitelo, poznato kao bevacizumab (BV, Avastin<™).>

"Antagonist VEGF” se odnosi na molekul koji je u stanju da neutrališe, blokira, inhibira, poništi, umanji ili interferira sa aktivnostima VEGF, uključujući njegovo vezivanje za jedan ili više receptora VEGF. Antagonisti VEGF su anti-VEGF antitela i njhihovi fragmenti koji vezuju antigen, molekuli i derivati receptora koji specifično vezuju VEGF, čime sprečavaju njegovo vezivanje za jedan ili više receptora, receptor anti-VEGF anatitela i receptor antagonista VEGF, kao što su mali molekuli, inhibitori tirozin kinaza VEGFR.

Kroz ovu prijavu i petentne zahteve, numeracija ostataka u teškom lancu imunoglobulina je ona iz indeksa EU, kao što je dato u knjizi Kabat et al., ”Sequences of Proteins of Immunological Interest”, 5th Ed., Public Health Service, National Institues of Health, Bethesda, MD (1991), koja je izričito ovde priključena kroz citat. "Indeks EU, kao kod Kabat-a” se odnosi na numeraciju ostataka humanog lgG1 EU antitela.

”Nativna sekvencija” polipeptida obuhvata polipeptid koji ima istu sekvenciju aminokiselina kao i polipeptid dobijen u prirodi. Dakle, nativna sekvencija polipeptida može imati sekvenciju aminokiselina polipeptida koji se nalazi u prirodi, u bilo kom sisaru. Ovakva nativna sekvencija polipeptida se može izolovati iz prirode, ili se može stvoriti rekombinantnim ili sintetskim načinima. Naziv "nativna sekvencija” polipetida specifično obuhvata skraćene ili izlučene

oblike polipeptida koji se nalaze u prirodi (npr. sekvencija vanćelijskog domena), varijantne oblike onih koji se nalaze u prirodi (npr. oblici koji su alternaitvno spajani) i aleloformne varijante polipeptida koji se nalaze u prirodi.

"Varijanta” polipeptida označava biološki aktivni polipeptid koji ima najmanje oko 80% sekvencije aminokiselina identičan sa sekvencijom nativnog polipeptida. Ovakve varijante su, na primer, polipeptidi kojima je dodat ili izbačen jedan ili više ostataka aminokiselina na N- ili C-kraju polipetida. Obično varijanta ima najmanje oko 80% sekvencije aminokiselina identično, poželjnije oko 90% sekvencije aminokiselina identično, ili još poželjnije najmaje oko 95% sekvencije aminokiselina identično sa nativnom sekvencijom polipeptida.

Naziv "antitelo” koristi se u najširem smislu i obuhvata monoklonalna antitela (uključujući monoklonalna antitela čitave dužine ili nedirnuta), poliklonalna antitela, polivalentna antitela, polispecifična antitela (npr. bispecifična antitela) i fragmente antitela (videti niže) sve dok isti pokazuju željenu biološku aktivnost.

Ukoliko se drugačije ne naznači, izraz "polivalentno antitelo” se koristi u ovoj prijavi da označi antitelo koje sadrži tri ili više mesta za vezivanje antigena. Poželjno je da je polivalentno telo skrojeno tako da ima tri ili više mesta za vezivanje antigena, i obično to nije nativna sekvencija antitela IgM ili IgA.

"Fragmenti antitela” sadrže samo jedan deo nedirnutog antitela, koji obično obuhvata mesto za vezivanje antigena iz nedirnutog antitela, pa tako zadržava sposobnost za vezivanje antigena. Primeri fragmenata antitela obuhvaćenih ovim pronalaskom su: (i) fragment Fab, koji ima VL, CL, VH i CHI domene; (ii) fragment Fab’, koji je fragment Fab koji ima jedan ili više cisteinskih ostataka sa C-kraja domena CH1; (iii) fragment Fd, koji ima VH i CH1 domene; (iv) fragment Fd’, koji ima VH i CH1 domene i jedan ili više cisteinskih ostataka sa C-kraja domena CH1; (v) fragment Fv, koji ima VL i VH domene samo jednog kraka antitela; (vi) fragment dAb (Ward et al., Nature, 1989, 341, 544-546) koji se

sastoji od VH domena; (vii) izolovani CDR regioni; (viii) fragmenti F(ab’)2, dvovalentni fragment koji obuhvata dva Feb’ fragmenta, povezana disulfidnom vezom u savitljivom regionu; (ix) molekuli antitela samo jednog lanca (npr. jedan lanac Fv; scFv) (Bird et al., Science, 1988, 242, 423-426) i Huston et al., PNAS (USA), 1988, 85, 5879-5883); (x) "diatela”, sa dva mesta za vezivanje antitela, koja se sastoje od teškog lanca varijabilnog domena (VH), povezanog sa lakim lancem varijabilnog domena (VL) u istom lancu polipeptida (videti, npr. EP 404,097; WO 93/11161; i Hollinger et al„ Poc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90, 6444.6448); (xi) ’linearna antitela” koja se sastoje od para tandemskih segmenata Fd (VH-CH1-VH-CH1), koji, zajedno sa komplementarnim lakim lancem polipeptida, formiraju par regiona za vezivanje antigena (Zapata et al„ Protein Eng., 1995, 8(10), 1057-1062; i U. S. Patent No.5,641,870).

Naziv "monoklonalno antitelo” ovde se koristi da označi antitelo dobijeno iz populacije suštinski homogenih antitela, tj. individualna antitela koja čine populaciju, su identična, izuzev što su moguće mutacije koje se prirodno dešavaju, a koje mogu biti prisutne u malim količinama. Monoklonalna antitela su veoma specifična, jer su usmerena protiv samo jednog antigena. Pored toga, nasuprot preparatima poliklonalnih antitela, koji tipično sadrže različita antitela, usmerena protiv različitih determinanti (epitopa), svako monoklonalno antitelo je usmereno protiv samo jedne determinante antigena. Modifikator "monoklonalno” ne treba shvatiti kao zahtev za stvaranje antitela nekom posebnom metodom. Na primer, monoklonalna antitela koja se koriste u skladu sa ovim pronalaskom, mogu se napraviti po metodi hibridoma, koju su prvi opisali Kohler et al„ Nature, 1975, 256, 495, ili se mogu napraviti meodama rekombinantne DNK (videti npr„ U.S. Patent No.

4,186,567). "Monoklonalna antitela” se mogu takođe izolovati iz biblioteke antitela fage, koristeći tehnike koje su opisal, na primer: Clackson et al„ Nature, 1991, 352, 624-628, ili Marks et al„ J. Mol. Biol, 1991,222, 581-597.

Ovde monoklonalna antitela specifično obuhvataju "himerna” antitela u kojima je deo teškog i/ili lakog lanca identičan sa ili homologan sa odgovarajućim sekvencijama u antitelima izvedenim iz određenih vrsta, ili koji pripadaju određenoj klasi ili pod-klasi antitela, dok je ostatak lanca ili lanaca identičan ili homologan sa odgovarajućim sekvencijama u antitelima izvedenim iz drugih vrsta, ili koji pripadaju drugoj klasi ili pod-klasi antitela, kao i fragmentima takvih antitela, sve dok ispoljavaju željenu biološku aktivnost (U.S. Patent No.4,816,567; i Morrison et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1984, 81, 6851-6855).

"Humanizovani" oblici ne-humanih (npr. mišjih) antitela su himerna antitela koja sadrže minimalnu sekvenciju koja se izvodi iz ne-humanog imunoglobulina. U najvećem delu, humanizovana antitela su humani imunoglobulini (antitela primaoca) u kojima su ostaci iz hipervarijabilnog regiona primaoca zamenjeni ostacima iz hipervarijabilnog dela ne-humane vrste (antitelo donora), kao što je miš, pacov, zec ili ne-humani primat, koji ima željenu specifičnost, afinitet i kapacitet. U nekim primerima, ostaci iz regiona skeleta (FR, od engl. framework region) humanog imunoglobulina su zamenjeni odgovarajućim ne-humanim ostacima. Pored toga, humanizovana antitela mogu da sadrže ostatke koji se ne nalaze u antitelu primaoca ili u antitelu donora. Ove modifikacije se prave da se dodatno poboljšaju performanse antitela. Obično, humanizovano antitelo će se sastojati suštinski od najmanje jednog, a tipično dva, varijabilna domena, u kome sve ili suštinski sve hipervarijabilne petlje odgovaraju onima iz ne-humanog imunoglobulina, a svi ili suštinski svi FR su oni iz sekvencije humanog imunoglobulina. Opciono, humanizovano antitelo će sadržati takođe i najmanje jedan deo konstantnog regiona imunoglobulina (Fc), tipično onaj iz humanog imunoglobulina. Za detalje, videti Jones et al., Nature, 1986, 321, 522-525; Riechmann et al., Nature, 1988, 332, 323-329; i Presta, Curr. Op. Struct. Biol.1992, 2, 593-596.

"Humano antitelo” je ono koje poseduje sekvenciju aminokiselina koja odgovara sekvenciji antitela proizvedenog humanim i/ili načinjenim korišćenjem bilo koje od tehnika za pravljenje humanih antitela, kao što su ovde opisane. Ova definicija humanih antitela specifično isključuje humanizovana antitela koja sadrže nehumane ostatke za vezivanje antigena. Humana antitela se mogu proizvesti korišćenjem raznih tehnika, poznatih u struci. U jednoj realizaciji, humano antitelo se odbire iz biblioteke faga, pri čemu ta biblioteka faga izlučuje humana antitela (Vaughan et al., Nature Biotechnology, 1996, 14, 309-314; Sheets et al., PNAS (USA), 1998, 95, 6157-6162; Hoogenboom i VVinter, J. Med. Biol.1991, 227, 381; Marks et al., J. Mol. Biol., 1991, 222, 581). Humana antitela se mogu napraviti takođe uvođenjem lokacija humanog imunoglobulina u transgene životinje, npr. miševe, u kojima su geni endogenog imunoglobulina delimično ili potpuno inaktivirani. Posle izlaganja, opaža se proizvodnja humanog antitela, koja, u svakom pogledu veoma potsećaju na ona koja su viđena u humanim bićima, uključujući preuređenje, skup i repertoar antitela gena. Ovaj pristup je opisan, na primer u U.S. Patent-ima No.

5,545,807, 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425, 5,661,016, i u sledećim naučnim publikacijama: Marks et al., Bio/Technology, 1992, 10, 779-783; Lonberg et al., Nature, 1994, 368, 856- 859; Morrison, Nature, 1994, 368, 812-13; Fishvvild et al., Nature Biotechnology, 1996, 14. 845-51; Neuberger, Nature Biotechnology, 1996, 14. 826; Lonberg i Huszar, Intern. Rev. Immunol., 1995, 13, 65-93. Alternativno, humanizovano antitelo se može dobiti čineći besmrtnim humane B limfocite, koji proizvode antitelo usmereno protin ciljanog antigena (B limfociti mogu da se regenerišu iz pojedinca, ili se mogu imunizovati in vitro). Videti, npr. Cole et al., "Monoclonal Antiboddies and Cancer Therapy”, Alan R. Liss, str.7 (1985); Boerner et al., J. Immunol.1991, 147(1), 86-95; i U.S. Patent No.5,750,373.

Naziv telo ”zrelog afiniteta” je ono sa jednom ili više izmena u jednom ili više njegovih CDR, koje vode poboljšanju afiniteta antitela prema antigenu, u poređenju sa roditeljskim antigenom, koji ne poseduje te izmene. Poželjna antitela zrelog afiniteta imaju nanomolarni, ili čak pikomolarni afinitet prema ciljanom antigenu. Antitela zrelog afiniteta se proizvode procedurama koje su poznate u stanju tehnike. Marks et al., Bio/Technol., 1992, 10, 779-783 opisuju zrenje afiniteta mešanjem VH i VL domena. Nasumičnu mutagenezu CDR i/ili ostataka skeleta opisali su: Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, 91,

3809-3813; Schier et al., Gene, 1995, 169, 147-155; Yelton et al., J. Immunol., 1995, 155, 1994-2004; Jackson et al., J. Immunol., 1995, 154(7), 3310-9; i Havvkins et al„ J. Mol. Biol., 1992, 226, 889-896.

"Izolovani” polipeptid je onaj koji je identifikovan i odvojen i/ili izolovan iz komponente njegovog prirodnog okruženja. Zagađujuće komponente iz njegovog prirodnog okruženja su materijali koji bi interferirali sa dijagnostičkim ili terapeutskim upotrebama tog polipeptida, a to mogu da budu enzimi, hormoni i druge proteinske ili ne-proteinske rastvorene supstance. U poželjnim realizacijama ovaj polipeptid je prečišćen: (1) do više od 95 mas% polipeptida, određeno Lowry-evom metodom, a najpoželjnije više od 99 mas%, (2) do stepena koji je dovoljan da se dobije najmanje 15 ostataka sa N-kraja, ili interna sekvencija aminokiselina, korišćenjem sekvencionatora sa rotirajućom korpom, ili (3) do homogenosti pomoću SDS-PAGE pod redukcionim ili ne-redukcionim uslovima, koristeći Coomassie-ovo plavo, ili poželjno, srebrnu boju. Izolovani polipetid je polipetid in situ unutar rekombinantne ćelije, zato što neće biti prisutna najmanje jedna komponenta prirodnog okruženja polipeptida. Međutim, obično se izolovani polipeptid dobija pomoću njamanje jednog koraka prečišćavanja.

"Fukcionalno mesto vezivanja antigena” antitela je ono koje je u stanju da se veže za ciljani antigen. Afinitet mesta za vezivanje antigena za vezivanje antigena nije potrebno da bude toliko jak kao u roditeljskom antitelu, iz koga je izvedeno mesto vezivanja antigena, već ovo svojstvo da se veže antigen mora biti merljivo, na bazi korišćenja jedne od brojnih metoda poznatih za ocenjivanje vezivanja antitela za antigen. Pored toga, afinitet vezivanja za antigen svakog od mesta za vezivanje antigena polivalentnog antitela ne treba da je isti u kvantitativnom pogledu. Za multimerna antitela ovde, broj funkcionalnih mesta za vezivanje antigena se može oceniti upotrebom analize ultracentrifugiranja, kao što je opisano u Primeru 2, niže. U skladu sa ovom metodom analize, kombinuju se razni odnosi ciljanog antigena i multimernog antitela, a prosečna molekulska

težina kompleksa se izračunava predspostavljajući različite brojeve funkcionalnih mesta za vezivanje. Ove teorijske vrednosti se porede sa stvarnim, eksperimentalnim vrednostima, dobijenim u cilju ocenjivanja broja funkcionalnih mesta za vezivanje.

Antitelo koje ima "biološke karakteristike” naznačenog antitela je ono koje poseduje jednu ili više bioloških karakteristika tog antitela, koje ga razlikuju od drugih antitela koja se vezuju za isti antigen.

Da bi se testirala antitela koja se vezuju za epitop antgena, vezanog preko posmatranog antitela, može se obaviti rutinski test unakrsnog blokiranja, kao što je onaj koje je opisan u "Antibodies. A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlovv i David Lane (1988).

"Antitelo agonist” je antitelo koje se vezuje da aktivira neki receptor. Obično, sposobnost aktiviranja receptora antitela agonista je bar kvalitativno slična (a može biti u suštini i kvantitativno slična) nativnom ligandu agonista tog receptora. Primer antitela agonista je ono koje se vezuje za receptor u superfamiliji TNF receptora i izaziva apoptozu ćelija koje izlučuju receptor TNF. Testovi za određivanje izazivanja apoptoze su opisani u VV098/51793 i VV099/37684, oba ovde izričito priključena kroz citat.

"Poremećaj” je bilo koje stanje koje može da se popravi tretmanom sa antitelom. To obuhvata hronične i akutne poremećaje ili bolesti, uključujući ona patološka stanja koja predstavljaju predispoziciju kod sisara za posmatrani poremećaj. Primeri, ali bez ograničavanja, poremećaja koji se ovde mogu tretirati su benigni i maligni tumori; leukemije i limfoidni maligniteti; neuronski, glijalni, astrocitalni, hipotalamusni i poremećaji drugih žlezda, i poremećaji makrofaga, epitela, strome i blastocela; i inflamatorni, angiogeni i imunološki poremećaji.

Naziv "terapeutski efikasna količina” odnosi se na količinu leka koja je efikasna za tretiranje bolesti ili premećaja kod sisara. U slučaju kancera, terapeutski efikasna količina leka može da smanji broj ćelija kancera; smanji veličinu tumora; inhibira (tj. u izvesnoj meri uspori, a poželjno zaustavi) infiltraciju ćelija kancera u periferne organe; inhibira (tj. u izvesnoj meri uspori, a poželjno zaustavi) metastaze tumora; u izvesnoj meri inhibira rast tumora; i/ili u izvesnoj meri ublaži jedan ili više simptoma povezanih sa tim poremećajem. Donekle, ovaj lek može da spreči rast i/ili ubije postojeće ćelije kancera, on može biti citostatičan i/ili citotoksičan. Za terapiju kancera, efikasnost in vivo može biti, na primer, merena ocenom trajanja preživljavanja, vremenom naperdovanja bolesti (TTP, od engl. time to desease progression), brzinom odgovora (RR, od engl. response rate), trajanjem odgovora i/ili kvalitetom života.

’Tretman” se odnosi i na terapeutski tretman i na profilaktičke ili preventivne mere. Oni kojima je potreban tretman su oni koji već imaju poremećaj, kao i oni kod kojih se taj poremećaj može sprečiti.

Nazivi ”kancer” i "kancerozan” se odnose na, ili opisuju fiziološko stanje sisara koje tipično karakteriše neregularan rast ćelija. Primeri kancera su, ali bez ograničavanja, karcinom, limfom, blastom, sarkom i leukemija. Konkretniji primeri ovih kancera su kancer skvamoznih ćelija (uključujući kancer malih ćelija pluća, kancer ne-malih ćelija pluća, adenokarcinom pluća i skvamozni karcinom pluća), kancer peritoneuma, hepatocelularni kancer, gastrični ili stomačni kancer (uključujući gastrointestinalni kancer), kancer pankreasa, glioblastom, cervikalni kancer, kancer jajnika, kancer jetre, kancer bešike, hepatom, kancer dojke, kancer debelog creva, kolorektalni kancer, karcinom endometrijuma ili materice, karcinom pljuvačnih žlezda, renalni ili kancer bubrega, kancer jetre, kancer prostate, kancer vulve, kancer tiroide, hepatički karcinom i razne vrste kancera glave i vrata, kao i limfom B-ćelija (uključujući folikularni ne-Hodgkin-ov limfom (NHL) niskog intenziteta; mali limfocitični (SL) NHL; folikularni NHL srednjeg intenziteta; difuzni NHL srednjeg intenziteta; imunoblastni NHL srednjeg

intenziteta; limfoblastni NH visokog intenziteta; NHL malih neodvojenih ćelija visokog intenziteta; masivno obollenje NHL; limfom obloge ćelije; limfom povezan sa AIDS-om; i Waldenstrom-ova makroglobulinemija); hronična limfocitna leukemija (CLL); akutna limfoblastna leukemija (ALL); leukemija kosmatih ćelija; hronična mijeloblastna leukemija; i limfoproliferativni poremećaj posle transplantacije (PTLD), kao i abnormalna vaskularna proliferacija, povezana sa fakomatozom, edem (kao što je onaj povezan sa tumorima mozga) i Meigs-ov sindrom.

Naziv ”sisar-domaćin”, kako se ovde koristi, odnosi se na kompatibilnog primaoca transplantacije. Pod ”kompatibilni" podrazumeva se sisar-domaćin koji će prihvatiti dobijeni graft. Poželjno je da domaćina predstavlja humano biće. Ukoliko su donor grafta i domaćin humana bića, poželjno je da se slažu u pogledu antgiena HLA, klasa II, da bi se poboljšala histokompatibilnost.

Naziv "citotoksični agens”, kako se ovde koristi, odnosi se na supstancu koja inhibira ili sprečava funkciju ćelije i/ili izaziva destrukciju ćelije. Namera je da su nazivom obuhvaćeni radioizotopi (npr.<211>At,<131>l,<125>l,<90>Ym<186>Re,<188>Re,<153>Sm,<212>Bi,

<32>P i radioaktivni izotopi Lu), hemoterapeutski agensi i toksini, kao što su toksini malih molekula ili enzimatski aktivni toksini bakterijskog, gljivičnog, biljnog ili animalnog porekla, uključujući njihove fagmente i/ili varijante.

Naziv "preparat protiv neoplazma” odnosi se na preparat koji je koristan pri tretmanu kancera, a koji sadrži najmanje jedan terapeutski aktivni agens koji je u stanju da inhibira ili speči rast ili funkciju tumora, i/ili izazove destrukciju ćelija tumora. Terapeutski agensi pogodni kao preparati protiv neoplazma za tretiranje kancera su, ali bez ograničavanja, hemoterapeutski agensi, radioaktivni izotopi, toksini, citokini, kao što je interferon, i antagonistički agensi koji ciljaju citokine, receptori citokina ili antigeni povezani sa ćelijama tumora. Na primer, terapeutski agensi korisni u ovom pronalasku mogu biti antitela, kao što je antitelo anti-HER2 i antitelo anti-CD20, ili mali molekuli, inhibitori tirozin kinaze, kao što su inhibitori receptora VEGF i inhibitori receptora EGF. Poželjno je da je terapeutski agens hemoterapeutski agens.

"Hemoterapeutski agens” je hemijsko jedinjenje koje je korisno za tretman kancera. Primeri hemoterapeutskih agenasa su agensi za alkilovanje, kao što su thiotepa i CYTOXAN<™>ciklofosfamid; alkilsulfonati, kao što je bisulfan, improsulfan i piposulfan; aziridini, kao što je benzodopa, carboquone, meturedopa i uredopa; etilenimini i metilamelamini, uključujući altretamin, trietilenmelanin, trietilenfosforamid, trietilentiofosforamid i trimetillolomelamin; acetogenini (naročito bullatacin i bullatacinone); kamptotecin (uključujući sintetske analoge topotecan-a); bryostatin; callystatin; CC-1065 (uključujući njegove sintetske analoge adozelesin, carzelesin i bizelesin); cryptophycins (naročito cryptophycin 1 i cryptophycin 8); dolastatin; duocarmycin (uključujući sintetske analoge, KVV-2189 i CB1-TM1); eleutherobin; pancratistatin; sarcodictyin;

spongistatin; azotne slačice, kao što su chlorambucil, chlornaphazine, cholophosphamide, estramustine, ifosfamide, mechlorethamine, mechlorethamine oksid hidrohlorid, melphalan, novembichin, phenesterine, prednimustine, trofosfamide, uracilna slačica; nitrozouree, kao što su carmustine, chlorozotocin, fotemustine, lomustine, nimustine i ranimnustine; antibiotici kao što su enediyne antibiotici (npr., calicheamicin, naročito calicheamicin gammall i calicheamicin omega l1 (videti npr., Agnew. Chem. Intl. Ed. Engl, 1994, 33,.

183-186); dynemicin, uključujući dynemicin A; bisfosfonati, kao što je clodronate; esperamicin; kao i neocarzinostatin hromofor i srodni hromoprotein enediyne antiobiotički hromofori), aclacinorrrysin-i, actinomycin, authramycin, azaserine, bleomycins, cactinomycin, carabicin, carminomycin, carzinophilin, chromomycinis, dactinomycin, daunorubicin, detorubicin, 6-diazo-5-okso-L-norleucin, ADRIAMYCIN® doxorubicin (uključujući morfolino-doxorubicin, cijanomorfolino- doxorubicin, 2-pirolino-doxorubicin i deoksidoxorubicin), epirubicin, esorubicin, idarubicin, marcellomycin, mitomycin-i kao što su mitorrrycin C, mikofenolna kiselina, nogalamycin, olivomycin-i, peplomycin, potfiromycin, puromycin, quelamycin, rodorubicin, streptonigrin, streptozocin, tubercidin, ubenimex,

zinostatin, zorubicin; anti-metaboliti kao što su methotrexate i 5-fluorouracil (5-FU); analozi folne kiseline, kao što su denopterin, methotrexate, pteropterin, trimetrexate; analozi purina, kao što su fludarabine, 6-merkaptopurin, thiamiprine, thioguanine; analozi pirimidina, kao što su ancitabine, azacitidine, 6- azauridine, carmofur, cytarabine, dideoxyuridine, doxifluridine, enocitabine, floxuridine; androgeni, kao što su calusterone, dromostanolone propionat, epitiostanol, mepitiostane, testolactone; anti-adrenali, kao što je aminoglutethimide, mitotane, trilostane; dopuna folne kiseline, kao što je frolinska kiselina; aceglatone; aldophosphamide glikozid; aminolevulinska kiselina; eniluracil; amsacrine; bestrabucil; bisantrene; edatraxate; defofamine; demecolcine; diaziquone; elfornithine; elliptinium acetat; epothilone; etoglucid; galijum nitrat; hidroksiurea; lentinan; lonidainine; maytansinoid-i kao što su maytansine i ansamitocin-i; mitoguazone; mitoxantrone; mopidanmol; nitraerine; pentostatin; phenamet; pirarubicin; losoxantrone; podofilinska kiselina; 2- etilhidrazid; procarbazine; PSK® polisaharidni kompleks (JHS Natural Products, Eugene, OR); razoxane; rhizoxin; sizofiran; spirogermanium; tenuazonska kiselina; triaziquone; 2,2',2"-trihlorotrietilamin; trichothecenes (naročito T-2 toksin, verracurin A, roridin A i anguidine); uretan; vindesine; dacarbazine; mannomustine; mitobronitol; mitolactol; pipobroman; gacytosine; arabinoside ("Ara-C"); cyclophosphamide; thiotepa; taxoid-i, npr., TAXOL® paclitaxel (Bristol- Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), ABRAXANE™ formulacija nanočestica paclitaxel-a bez Cremophor-a, albumin-engineered (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, lllinois), i TAXOTERE® doxetaxel (Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France); chloranbucil; GEMZAR® gemcitabine; 6-tiogvanin; merkaptopurin; methotrexate; koordinacioni kompleksi platine, kao što su cisplatin, oxaliplatin i carboplatin; vinblastine; platina; etoposide (VP-16); ifosfamide; mitoxantrone; vincristine; NAVELBINE® vinorelbine; novantrone; teniposide; edatrexate; daunomycin; aminopterin; xeloda; ibandronate; irinotecan (npr., CPT-11); inhibitor topoizomeraze RFS 2000; difluorometilornitin (DMFO); retinoidi, kao što je retinoinska kiselina; capecitabine; i farmaceutski prihvatljive soli kiselina ili derivata bilo kog od gore pomenutih.

U ovu definiciju su takođe uključeni antihormonski agensi, koji deluju tako što regulišu ili inhibiraju delovanje hormona na tumore, kao što su anti-estrogeni i selektivni modulatori receptora estrogena (SERM), uključujući na primer, tamoxifen (uključujući NOLVADEX® tamoxifen), raloxifene, droloxifene, 4-hydroxytamoxifen, trioxifene, keoxifene, LY117018, onapristone i FARESTON-toremifene; inhibitori aromataze koji inhibiraju enzim aromatazu, koji reguliše stvaranje estrogena u nadbubrežnim žlezdama, kao što su na primer, 4(5)-imidazoli, aminoglutetimid, MEGASE® megestrol acetat, AROMASIN® exemestane, formestanie, fadrozole, RIVISOR® vorozole, FEMARA® letrozole, i ARIMIDEX® anastrozole; i anti-androgeni, kao što su flutamide, nilutamide, bicalutamide, leuprolide, i goserelin; kao i troxacitabine (analog 1,3-dioksolan nucleozid citozina); antisensni oligonukleotidi, naročito oni koji inhibiraju izlučivanje gena na putu signalizacije učesnika u nenormalnoj proliferaciji ćelija, kao što su na primer, PKC-alfa, Ralf i H-Ras; ribozym-i, kao što je inhibitor izlučivanja VEGF (npr., ANGIOZYME® ribozyme) i inhibitor izlučivanja HER2; vakcine, kao što su vakcine za gensku terapiju, na primer, vakcina ALLOVECTIN®, vakcina LEUVECTIN<®>i vakcina VAXID<®>; PROLEUKIN® rlL-2; LURTOTECAN<®>inhibitor topoizomeraze 1; ABARELIX<®>rmRH; i farmaceutski prihvatjive soli i derivati bilo kog od gore pomenutih.

"Inhibitorni agens rasta", kada se ovde koristi, odnosi se na jedinjenje ili preparat koji inhibira rast ćelije in vitro i/ili in vivo. Dakle, inhibitorni agens rasta može biti onaj koji signifikantno snižava procent ćelija u S fazi. Primeri inhibitornih agenasa rasta su agensi koji blokiraju napredovanje ćelijskog ciklusa (na mestu koje se razlikuje od S faze), kao što su agensi koji indukuju zaustavljanje G1 i zaustavljanje M-faze. Klasični blokatori M-faze su vinca-e (vincristine i vinblastine), TAXOL<®>i topo II inhibitori, kao što su doxorubicin, epirubicin, daunorubicin, etoposide i bleomycin. Oni agensi koji zaustavljaju G1, takođe će se proširiti na zaustavljanje S-faze, na primer, agensi za alkilovanje DNK, kao što su tamoxifen, prednisone, dacarbazine, meclorethamine, cisplatin, methotrexate, 5-fluorouracil i ara-C. Dodatne informacije se mogu naći u ”The

Molecular Basis of Cancer”, urednici Mendelson i Israel, glava 1. pod naslovom: ”Cel cycle regulation, oncogenesis and antineoplastic drugs”, Murakami et al. (WB Saunders, Philadelphia, 1995), a naročito str.13.

Naziv ”citokin” je generičko ime za proteine koje oslobađa jedna populacija ćelija, a koji deluju na druge ćelije kao interćelijski medijatori. Primeri ovakvih citokina su limfokini, monokini i tradicionalni polipeptidni hormoni. Među citokine se ubrajaju hormoni rasta, kao što je humani hormon rasta, N-metionil humani hormon rasta i goveđi hormon rasta; paratiroidni hormon; thyroxine; insulin; proinsulin; relaxin; prorelaxin; glikoproteinski hormoni, kao hormon za stimulaciju folikula (FSH), hormon za stimulaciju tiroide (TSH) i hormon za luteinizaciju (LH); faktor rasta epiderma; jetreni faktor rasta, faktor rasta fibroplasta; prolaktin; laktogen placente; faktor-alfa i -beta nekroze tumora; koji inhibira Miler-ovu supstancu; mišji peptid povezan sa gonadotropinom; inhibin; aktivin; faktor rasta vaskularnog endotelijuma; integrin; trombopoietin (TPO); faktori rasta nerava, kao što je NGF-alfa; faktor rasta trombocita; faktori rasta transformacije (TGF), kao što su TGF-alfa i TGF-beta; faktor rasta-l i -II, nalik insulinu; eritropoietin (EPO); osteoinduktivni faktori; interferoni, kao što su interferon-alfa, -beta i - gama, faktori stimulisanja kolonija (CSF), kao što su CSF makrofaga (M-CSF), CSF-granulocita-makrofaga (GM-CSF) i CSF-granulocita (G-CSF); interleukini (IL), kao što su IL-1, IL-1-alfa, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12; faktori nekroze tumora, kao što su TNF-alfa ili TNF-beta; i drugi polipeptidni faktori, uključujući LIF i kit ligande (KL). Kako se ovde koristi, naziv citokin obuhvata proteine iz prirodnih izvora ili iz rekombinantne kulture ćelija, i biološki aktivne ekvivalente citokina sa nativnom sekvencijom.

Naziv ”prolek”, kako se koristi, odnosi se na prekursor ili derivatni oblik farmaceutski aktivne supstance, koji je manje toksičan za ćelije tumora, u poređenju sa roditeljskim lekom, a u stanju je da se enzimatski aktivira ili konvertuje u aktivniji roditeljski oblik. Videti npr., Wilman, "Prodrugs in Cancer Chemotherapy”, u ”Biochemical Society Transactions", 14, str. 375-382, 615th Meeting Belfast (1986) i u Stella et al., "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery”, u "Directed Drug Delivery”, uredn. Borchardt et al., str.

247-267, Humana Press (1985). Prolekovi iz ovog pronalaska su, ali bez ograničavanja, prolekovi koji sadrže fosfat, prolekovi koji sadrže tiofosfat, prolekovi koji sadrže sulfat, prolekovi koji sadrže peptid, prolekovi sa modifikovanom D-aminokiselinom; glikozilovani prolekovi, prolekovi koji sadrže beta-laktam, prolekovi koji sadrže opciono supstituisani fenoksiacetamid, ili prolekovi koji sadrže opciono supstituisani fenilacetamid, 5-fluorocitozin i drugi prolekovi 5-fluorouridina, koji se mogu konvertovati u aktivnije lekove bez citotoksičnosti. Primeri citotoksičnih lekova, koji se mogu derivatizovati u oblik proleka, za upotrebu u ovom pronalasku, su ali bez ograničavanja, hemoterapeutski agensi koji su opisani gore.

Naziv "intravenozna infuzija” odnosi se na unošenje leka u venu animalnog ili humanog pacijenta, tokom perioda vremena dužeg od približno 5 minuta, poželjno između približno 30 i 90 min, mada, u skladu sa ovim pronalaskom, intravenozna infuzija se alternativno ordinira tokom 10 sati, ili manje.

Naziv "intravenozni bolus” ili “intravenozna injekcija” odnosi se na ordiniranje u venu animalnog ili humanog pacijenta, ali tako da telo primi lek za približno 15 min, ili manje, poželjno 5 min ili manje.

Naziv "subkutano ordiniranje” odnosi se na unošenje leka kroz kožu animalnog ili humanog pacijenta, poželjno u džep između kože i potkožnog tkiva, relativno laganim, uzdržanim oslobađanjem iz posude sa lekom. Ovaj džep se može kreirati stiskanjem ili povlačenjem kože nagore ili od potkožnog tkiva.

Naziv "potkožna infuzija” se odnosi na unošenje leka pod kožu animalnog ili humanog pacijenta, poželjno u džep između kože i potkožnog tkiva, relativno laganim, uzdržanim oslobađanjem iz posude sa lekom, tokom perioda od, ali bez ograničavanja, 30 min ili manje, ili 90 min ili manje. Opciono, infuzija se može davati potkožnom implantacijom, ili iz pumpe za oslobađanje leka, implantirane pod kožu animalnog ili humanog pacijenta, pri čemu ta pumpa

oslobađa unapred određenu količinu leka u unapred određenom periodu vremena, kao što je 30 min, 90 min, ili unutar perioda vremena koji pokriva režim tretmana.

Naziv "subkutani bolus” odnosi se na ordiniranje ispod kože animalnog ili humanog pacijenta, pri čemu je poželjno da oslobađanje leka bolusom traje manje od približno 15 min, poželjnije manje od 5 min, a najpoželjnije, manje od 60 s. Poželjno je da se ordiniranje obavlja u džep između kože i potkožnog tkiva, gde se stvara džep, na primer stiskanjem ili povlačenjem kože nagore ili od potkožnog tkiva.

"Angiogeni faktor” je faktor rasta koji stimuliše razvoj krvnih sudova. Poželjan angiogeni faktor ovde je faktor vaskularnog rasta endotelijuma (VEGF).

Reč ”oznaka”, kada se ovde koristi, odnosi se na jedinjenje ili preparat koji se može detektovati, a direktno ili indirektno je konjugovano sa polipeptidom. Oznaka i sama po sebi može da se detektuje (npr. oznake od radioaktivnih izotopa, ili fluorescentne oznake), ili kao u slučaju enzimatiskih oznaka, mogu da katalizuju hemijske izmene jedinjenja ili preparata kao substrata, koje se mogu detektovati.

"Izolovani” molekul nukleinske kiseline je molekul nukleinske kiseline koji je idntifikovan i odvojen od najmanje jednog molekula zagađivača nukleinske kiseline, sa kojim je inače povezan u prirodnom izvoru polipeptidne nukleinske kiseline. Izolovani molekul nukleinske kiseline se razlikuje po obliku i smeštaju od onog koji se nalazi u prirodi. Prema tome, izolovani molekuli nukleinske kiseline se razlikuju od molekula nukleinske kiseline kako se oni nalaze u prirodi. Međutim, izolovani molekul nukleinske kiselineu ključuje i molekul nukleinske kiseline koji se sadrži u ćelijama koje obično izlučuju polipeptid, gde se, na primer, molekul nukleinske kiseline razlikuje po lokaciji od istog u prirodnim ćelijama.

Izraz "kontrolne sekvencije”, odnosi se na sekvencije DNK neophodne za izlučivanje operativno povezane sekvencije za kodiranje u posmatranom organizmu domaćina. Na primer, kontrolne sekvencije koje su pogodne za prokariote, obuhvataju promoter, opciono operatorsku sekvenciju i mesto za vezivanje ribozoma. Za eukariotske ćelije je poznato da koriste promotere, signale za poliadenilovanje i pojačavače.

Nukleinska kiselina je "operabilno povezana” kada je stavljena u funkcionalnu vezu sa drugom sekvencijom nukleinske kiseline. Na primer, DNK za pre- sekvencijalno ili sekretorno vođstvo, operabilno je povezana sa DNK za polipeptid, ako se isti izlučuje kao pre-protein, koji učestvuje u izlučivanju polipetida; promoter ili pojačavač je operabilno povezan sa sekvencijom za kodiranje, ukoliko ona utiče na transkripciju sekvencije; ili, mesto za vezivanje ribozoma je operabilno povezano sa sekvencijom za kodiranje, ako je postavljeno tako da olakšava translaciju. Obično, "operabilno povezan” znači da su povezane sekvencije DNK susedne, a u slučaju sekretornog vođstva, susedne i u fazi očitavanja. Međutim, pojačavači ne moraju biti u susedstvu. Povezivanje se ostvaruje vezivanjem na pogodna mesta restrikcije. Ukoliko takva mesta ne postoje, koriste se sintetski oligonukleotidi kao adapteri ili linkeri, u skladu sa konvencionalnom praksom.

Kako se ovde koriste, nazivi "ćelija”, ”soj ćelija” i "kultura ćelija”, koriste se naizmenično, a sva ta imena obuhvataju i potomstvo. Dakle, reči "transformanti” i "transformisane ćelije" obuhvataju primarnu predmetnu ćeliju i kulture izvedene iz nje, bez obzira na broj transfera. Podrazumeva se takođe, da svi potomci ne moraju imati precizno identičan sadržaj DNK, zahvaljućuji namernim ili slučajnim mutacijama. Obuhvaćeni su i potomci mutanti, koji imaju istu funkciju ili biološku aktivnost, koja je ispitana za originalno transformisane ćelije. Tamo gde se daju različita imena, to će biti jasno iz konteksta.

II. Stvaranje anti-VEGF antitela

A. Dobijanie antitela

(i) Antiaen VEGF

U stanju tehnike dobro su poznata sredstva za dobijanje i karakterizaciju antitela. Opis koji sledi predstavlja egzemplarne tehnike da dobijanje anti-VEGF antitela, koja se koriste u skladu sa ovim pronalaskom. Antigen VEGF, koji treba da se koristi za dobijanje antitela, može biti npr. molekul VEGF165, kao i drugi izoformi VEGF ili njihovi fragmenti, koji sadrže željeni epitop. Drugi oblici VEGF, koji su korisni za generisanje anti-VEGF antitela iz ovog pronalaska, jasni su onima koji su verzirani u stanje tehnike.

Humani VEGF se dobija prvo ispitivanjem biblioteke cDNK, dobijene iz humanih ćelija, koristeći goveđu VEGF cDNK, kao probu za hibridizaciju. Leung et al., Science, 1989, 246, 1306. Tako, jedna iddentifikovana cDNK kodira protein od 165 aminokiselina, koji ima više od 95% homologije sa goveđim VEGF; ovaj protein sa 165 aminokiselina tipično se označava kao humani VEGF (hVEGF) ili VEGF165. Mitogena aktivnost humanog VEGF potvrđena je izlučivanjem humane VEGF cDNK u ćelijama sisara kao domaćina. Medijumi sa ćelijama transficiranim sa humanim VEGF cDNK pomovišu proliferaciju ćelija kapilarnog endotelijuma, dok kontrolnih ćelija ne. Leung et al., Science, 1989, videti gore.

Mada se faktor rasta ćelija vaskularnog endotelijuma, za naknadnu terapeutsku upotrebu može izolovati i prečistiti iz prirodnih izvora, relativno niske koncentracije ovog proteina u folikularnim ćelijama i visoka cena, dakle i u pogledu truda i troškova, ovakvo izolovanje VEGF se pokazalo komercijalno nekorisno. Stoga, preduzimaju se dalji napori za kloniranje i izlučivanje VEGF tehnikama rekombinantne DNK (videti, npr. Ferrara, Laboratory Investigation, 1995, 72, 615-618 i literatura koja se tu citira).

VEGF se izlučuje u raznim tkivima u višestruko homodimernim oblicima (121, 145, 165, 189 i 206 aminokiselina po monomeru), što je posledica alternativnog spajanja RNK. VEGF121 je rastvorni mitogen, koji ne vezuje heparin; duži oblici VEGF vezuju heparin, progresivno, sa sve većim afinitetom. Oblici VEGF koji

vezuju heparin mogu se otcepiti pomoću plazmina sa karboksi-kraja, oslobađajući oblik(e) VEGF koji mogu da difunduju. Sekvencioniranje aminokiselina peptida sa karboksi kraja, identifikovano posle otcepljivanja plazmina, je Arg110-Ala111. Protein ”jezgra” sa amino kraja, VEGF (1-110), izolovan kao homodimer, vezuje neutrališuća monoklonalna antitela (kao što je antitelo koje se navodi kao 4.6.1 i 3.2E3.1.1) i rastvorne oblike receptroa VEGF, sa sličnim afinitetom u poređenju sa nedirnutim homodimerom VEGF165.

Nedavno je identifikovano nekoliko molekula, strukturno srodnih sa VEGF, uključujući faktor rasta placente (PIGF), VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D i VEGF-E. Ferrara i Davis-Smyth, Endocrin. Erv., 1987, videti gore; Ogavva et al., J. Biological Chem,, 1998, 273, 31273-31281; Meyer et al„ EMBO J., 1999, 18, 363-374. Identifikovan je receptor tirozin kinaze Flt-4 (VEGFR-3) kao receptor za VEGF-C i VEGF-D. Joukov et al„ EMBO J„ 1996, 15, 1751; Lee et al„ Proc. Natl. Acd. Sci. USA, 1996, 93, 1988-1992; Achen et al„ proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, 95, 548-533. Nedavno je pokazano da je VEGF-C uključen u regulisanje limfatičke angiogeneze. Jeltsch et al„ Science, 1997, 276, 1423- 1425.

Identifikovana su dva receptora, Flt-1 (nazvan takođe VEGFR-1) i KDR (nazvan takođe VEGFR-2). Shibuya et al„ Oncogene, 1992, 8, 519-527; de Vries et al„ Science, 1992, 255, 989-991; Terman et al„ Biochem. Biophys. Res. Commun., 1992, 187, 1579-1586.

Pokazano je da je neuropilin-1-selektivni receptor VEGF i da je u stanju da vezuje izoforme VEGF koji vezuju heparin (Soker et al„ Cell, 1998, 92, 735-45). I Flt-I i KDR pripadaju familiji receptora tirozin kinaze (RTK). Ovi RTK čine veliku familiju transmembranskih receptora sa raznovrsnim biološkim aktivnostima. Do sada, identifikovano je najmanje devetnaest (19) različitih sub-familija RTK. Familija receptora tirozin kinaze (RTK) obuhvata receptore koji su presudni za rast i diferencijaciju raznih vrsta ćelija (Yarden i Ullrich, Ann. Rev. Biochem., 1988, 57, 433-438; Ullrich i Schlessinger, Cell, 1990, 61, 243-254). Svojstvena

funkcija RTK se aktivira nakon vezivanja liganda, što dovodi do fosforilovanja receptora i mnogih ćelijskih supstrata, pa zatim do raznovrsnih ćelijskih odgovora (Ulrich i Sxhlessinger, Cell, 1990, 61, 203-212). Dakle, signal transdukcije posredovan receptorom tirozin kinaze se inicira vanćelijskom interakcijom sa specifičnim faktorom rasta (ligandom), pa tipično sledi dimerizacija receptora, stimulacija svojstvene aktivnosti proteina tirozin kinaze i trans-fosforilovanje receptora. Time se stvaraju mesta za vezivanje za molekule unutarćelijske transdukcije signala, koje vodi stvaranju kompleksa sa spektrom molekula za citoplazmičku signalizaciju, što olakšava odgovarajući ćelijski odgovor (npr. deljenje ćelije, diferencijacija, metabolički efekti, promene u vanćelijskom mikro-okruženju) videti, Schlessinger i llrich, Neuron, 1992, 9, 1- 20. Strukturno, i Flt-1 i KDR imaju sedam domena nalik imunoglobulinu u vanćelijskom domenu, jedan transmembranski region i konsenzusnu sekvenciju tirozin kinaze, prekinutu sa domenom ubačene kinaze. Matthevvs et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 1991, 88, 9026-9030; Terman et al., Oncogene, 1991, 6, 1677-1683.

(ii) Poliklonalna anitela

Poželjno je da se poliklonalna antitela uspostavljaju u animalnim bićima multiplim subkutanim (Sc) ili intraperitonealnim (ip) injekcijama relevantnog antigena i nekog adjuvanta. Može biti od koristi da se konjuguje relevantni anigen sa proteinom koji je imunogen u vrsti koja se imunizuje, npr. ključni limpet hemocijanin, serum albumina, goveđi tiroglobulin ili inhibitor sojinog tripsina, korišćenjem bifukcionalnog agensa za derivatizaciju, na primer maleimidobenzoil-suflosukcinimidnog estra (konjugovanog sa cisteinskim ostacima), N-hidroksisukcinimida (preko lizinskih ostataka), glutaraldehida, anhidrida ćilibarne kiseline, SOCI2, ili R<1>N=C=NR, gde su R i R<1>različite alkil grupe.

Životinje se imunizuju protiv antigena, imunogenih konjugata ili derivata, kombinovanjem npr.100 pg ili 5 pg proteina ili konjugata (za zečeve i miševe, respektivno) u 3 zapemine Freund-ovog komletnog adjuvanta, pa injektovanjem ovog rastvora intradermalno na više mesta. Mesec dana kasnije životinje se injektiraju sa 1/5 do 1/10 prvobitne količine peptida ili konjugata u Freund-ovom kompletnom adjuvantu, subkutanom injekcijom na više mesta. Sedam do 14 dana kasnije uzme se krv životinjama, a serum se testira na titar antitela. Životinje se ovao injektiraju do platoa titra. Poželjno je da se životinja injektira sa konjugatom istog antigena, ali konjugovanog na različiti protein i/ili preko različitog reagensa za ukršteno vezivanje. Konjugati se mogu takođe napraviti u rekombinantnoj kulturi ćelija, kao fuzije proteina. Takođe, pogodno je da sekoristi agregatiranje agenasa, kao što je stipsa, da se pojača imuni odgovor.

(iii) Monoklonalna antiela

Monoklonalna antiela se mogu napraviti korišćenjem metode hibridoma, koju su prvi opisali Kohler et al,, u Nature, 1975, 256, 495, ili se mogu napraviti metodama rekombinantne DNK (U. S. Patent No.4,816,567).

U metodi hibridoma, miš ili druga odgovarajuća životinja domaćin, kao što je zamorac ili majmun makaku, imunizuje se kao što je opisano gore, da daje limfocite koji proizvode, ili su u stanju da proizvode, antitela koja će se specifično vezati za protein koji je korišćen za imunizaciju. Alternativno, limfociti se mogu imunizovati in vitro. Limfociti se zatim fuzionišu sa ćelijama mijeloma, koristeći pogodan agens za fuzionisanje, kao što je polietilenglikol, formirajući ćeliju hibridome (Goding, "Monoclonal Antibodies: Principles and Practice”, str. 59-103 (Academic Press, 1986)).

Ovako dobijene ćelije hibridoma se zaseju i gaje u pogodnom medijumu kulture, za koji je poželjno da sadrži jednu ili više supstanci koje inhibiraju rast ili preživljavanje nefuzionisanih, roditeljskih ćelija mijeloma. Na primer, ako roditeljskim ćelijama mijeloma nedostaje enzim hipoksantin-gvanin-fosforibozil transferaza (HGPRT ili HPRT), medijum kulture za hibridome će tipično sadržati hipoksantin, aminopterin i timidin (medijum HAT), supstance koje sprečavaju rast ćelija kojima nedostaje HGPRT.

Poželjne ćelije mijeloma su one koje se efikasno fuzionišu, podržavaju stabilan visok nivo proizvodnje antitela u odabranim ćelijama koje proizvode antitelo, a osetljive su na medijum, kao što je medijum HAT. Među ovima, poželjni sojevi ćelija mijeloma su mišji sojevi mijeloma, kao što su oni koji se izvode iz mišjih tumora MOPC-21 i MPC-11, koji su dostupni iz ustanove Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California, USA, i ćelije SP-2 ili X63-Ag8-653, dostupne iz ustanove American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA. Sojevi ćelija humanog mijeloma i mišjeg-humanog mijeloma opisani su takođe u proizvodnji humanih monoklonalnih antitela (Kozbor, J. Immunol, 1984, 133, 3001; Brodeur et al., "Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications", str. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1897).

Medijum kulture u kojoj rastu ćelije hibridome, testira se na proizvodnju monoklonalnih antitela usmerenih protiv antigena. Poželjno je da se odredi specifičnost vezivanja proizvedenih monoklonalnih antitela u ćelijama hibridome imunoprecipitacijom, ili pomoću testa vezivanja in vivo, kao što je radio-imuno test (RIA) ili test imunoabsorbenta povezan sa enzimom (ELISA).

Posle idenitifikacije ćelija hibridome, koje proizvode antitela željene specifičnosti, afiniteta i/ili aktivnosti, kloni se mogu sub-klonirati procedurama ograničenog razblaživanja, pa gajiti standardnim metodama (Goding, "Monoclonal Antibodies: Principles and Practice”, str. 59-103 (Academic Press, 1986). Pogodni medijumi kulture za ovu svrhu su, na primer, D-MEM ili RPMI-1640 medijum. Pored toga, ćelije hibridome mogu da se gaje in vivo, kao ascitni tumori u animalnom biću.

Monoklonalna antitela koja izlučuju sub-kloni, pogodno je da se izdvoje iz medijuma kulture, ascitnog fluida, ili seruma, konvencionalnim procedurama prečišćavanja imunoglobulina, kao što su na primer, protien A-sefaroza, hromatografija na hidroksiapatitu, gel elektroforeza, dijaliza ili afinitetna hromatografija.

DNK koja kolonira monoklonalna antitela lako se izoluje i sekvencionira korišćenjem konvencionalnih procedura (npr. korišćenjem oligonukleotidnih proba, koja su u stanju da se specifično vežu na gene koji kodiraju teške i lake lance monoklonalnih antitela). Ćelije hibridome služe kao poželjan izvor takve DNK. Kada se jednom izoluje, DNK se može smestiti u vektore za izlučivanje, koji se zatim transficiraju u ćelije domaćina, kao što su ćelije E. coli, COS ćelije majmuna, ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO), ili ćelije mijeloma, koje inače ne proizvode imunoglobulinski protein, tako da se dobije sinteza monoklonalnih antitela u rekombinantnim ćelijama domaćina. Rekombinantna proizvodnja antitela će biti detaljnije opisana niže.

U sledećoj realizaciji, antitela, ili fagmenti antitela, se mogu izolovati iz biblioteka antitela fage generisanih korišćenjem tehnika koje su opisali McCafferty et al., Nature, 1990, 348, 552-554. Clackson et al., Nature, 1991, 352, 624-628 i Marks et al., J. Mol. Biol., 1991, 222, 581-589 opisuju izolovanje mišjih i humanih antitela, respektivno, korišćenjem biblioteka fage. Kasnije publikacije opisuju proizvodnju humanih antitela visokg afiniteta (nM opseg) pomoću mešanja lanaca (Marks et al., Bio/Technology, 1992, 10, 779-783, kao i kombinatornu infekciju i rekombinaciju in vivo, kao strategiju za konstrukciju vrlo velikih biblioteka fage (Waterhouse et al., Nucl. Acids Res., 1993, 21, 2265- 2266). Dakle ove tehnike su raspoložive alternative tradicionalnih hibridoma monoklonalnih antitela za izolovanje monoklonalnih antitela.

DNK se takođe može modifikovati, na primer, zamenom sekvencije kodiranja sa humanim konstantnim domenima teškog i lakog lanca, umesto homolognih mišjih sekvencija (U. S. Patent No.4,816,567; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1984, 81, 6851), ili kovalentnim pripajanjem na sekvenciju koja kodira imunoglobulin, čitavu ili deo sekvencije za kodiranje ne-imunogenog polipeptida.

Tipično, ti ne-imunoglobulinski polipeptidi se zamenjuju sa konstantnim domenima antitela, ili se supstituišu varijabilnim domenima jednog mesta za kombinaciju antigena iz antitela, tako da nastane himerno dvovalentno antitelo,

koje sadrži mesto za kombinovanje antigena koje je visoko specifično za antigen, i drugo mesto za kombinovanje antigena koje je specifično za različit antigen.

(iv) Humanizovana i humana antitela

Humanizovano antitelo ima jedan ili više ostataka aminokiselina uvedenih u njega iz izvora koji je ne-humani. Ovi ne-humani ostaci aminokiselina se često navode kao ”importovani" ostaci, koji se tipično uzimaju iz ”importovanih” varijabilnih domena. Suštinski, humanizacija se može obaviti kada se sledi metoda Winter-a i saradnika (Jones et al., Nature, 1986, 321, 522-525; Riechmann et al., Nature, 1988, 332, 323-327; Verhoeyen et al., Sc/ence, 1988, 239, 1534-1536), zamenom sekvencija CDRs ili CDR glodara sa odgovarajućim sekvencijama humanog antitela. Prema tome, ovako ”humanizovana” antitela su himerna antitela (U. S. Patent No.

4,816,567), u kojima je u suštini manje od nedirnutoig humanog varijabilnog domena zamenjeno sa odgovarajućom sekvencijom iz ne-humane vrste. U praksi, humanizovana antitela su tipično humana antitela u kojima su neki CDR ostaci, a moguće i neki FR ostaci, zamenjeni sa ostacima sa analognih mesta u antitelima glodara.

Izbor humanih varijabilnih domena, i lakih i teških, koji treba da se koriste u pravljenju humanizovanih antitela, vrlo je važan za smanjivanje antigeniciteta. U skladu sa tako-zvanom metodom ”najboljeg fitovanja”, sekvencija varijabilnog domena antitela glodara se ispituje na čitavu biblioteku poznatih humanih sekvencija varijabilnog domena. Humana sekvencija, koja je najbliža glodarskoj, prihvata se zatim kao humani skelet (FR) za humanizovano antitelo (Sims et al., J. Immunol., 1993, 151<,>2296: Chothia et al., J. Mol. Biol., 1987, 196, 901). Sledeća metoda koristi poseban skelet, izveden iz konsenzusne sekvencije svih humanih antitela određene podgrupe lakih ili teških lanaca. Isti skelet se može koristiti za nekoliko različitih humanih antitela (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 1992, 89, 4285; Presta et al„ J. Immunol., 1993,151, 2623).

Dalje, značajno je da se antitela humanizuju uz zadržavanje visokog afiniteta prema antigenu i ostalih poželjnih bioloških svojstava. Da bi se postigao ovaj cilj, u skladu sa poželjnom metodom, dobijaju se humanizovana antitela procesom analize roditeljskih sekvencija i raznih konceptualnih humanizovanih proizvoda, korišćenjem trodimenzionalnog modela roditeljskih i humanizovanih sekvencija. Modeli trodimenzionalnog imunoglobulina su uobičajeno dostupni i poznati su verziranima u stanje tehnike. Dostupni su kompjuterski programi koji ilustruju i prikazuju verovatne trodimenzionalne konformacione strukture odabranih sekvencija kandidata imunoglobulina. Ispitivanje ovih prikaza dozvoljava da se analizira verovatna uloga ovih ostataka u funkcionisanju sekvencje kandidata imunoglobulina, tj. analiza ostataka koji utiču na sposobnost kandidata imunoglobulina da se veže za njegov antigen. Na taj način mogu se odabrati FR ostaci, kombinovati iz primaoca i importovati sekvencije tako da se ostvare željene karakteristike antitela, kao što je povećan afinitet prema ciljanom antigenu ili antigenima. Obično, CDR ostaci direktno i najsuštinskije učestvuju u uticaju na vezivanje antigena.

Alternativno, sada je moguće dobiti transgenske životinje (npr. miševe) koji su u stanju, nakon imunizacije, da proizvode čitav repertoar humanih antitela, u odsustvu endogenog stvaranja imunoglobulina. Na primer, opisano je da homozigotno izbacivanje regiona za spajanje teškog lanca antitela (J<H>) gena, kod himernih ili sa gljivičnim sojem mutanata miševa, dovodi do kompletne inhibicije endogenog stvaranja antitela. Transfer skupa gena gljivičnog soja humanog imunoglobulina u ovakve miševe mutante gljivičnog soja, dovodi do stvaranja humanih antitela, nakon izlaganja antigenu. Videti, npr. Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 1993, U90U, 2551; Jakobovits et al., Nature, 1993, 362, 255-258; Bruggermann et al., Year in Immuno., 1993, 7, 33; i Duchosal et al., Nature, 1992, 355, 258. Humana antitela se mogu takođe izvesti iz prikaza biblioteka fage (Hoogenboom et al., J. Mol. Biol., 1991, 227, 381; Marks et al., J. Mol. Bioi, 1991, 222, 581-597; Vaughan et al., Nature Biotech., 1996, 14, 309).

(v) Fraamenti antitela

Razvijene su razne tehnike za proizvodnju fragmenata antitela. Tradicionalno, ovi fragmenti se izvode proteolitičkom digestijom nedirnutih antitela (videti npr. , Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 1992, 24, 107-117 i Brennan et al., Science, 1985, 229, 81). Međutim, ovi fagmenti se danas mogu proizvesti direktno u rekombinantnim ćelijama domaćina. Na primer, fragmenti antitela se mogu izolovati iz biblioteka fage, diskutovanih gore. Alternativno, fragmenti Fab’-SH se mogu direktno izolovati iz E. coli, pa hemijski kuplovati da se formiraju fragmenti F(ab’)2(Carter et al., Bio/Technology, 1992, 10, 163-167). U skladu sa drugim pristupom, fragmenti F(ab’)2se mogu direktno izolovati iz kulture rekombinantnih ćelija domaćina. Verziranom stručnjaku biće jasne druge tehnike za proizvodnju fragmenata antitela. U drugim realizacijama, odabrano antitelo je fragment Fv sa jednim lancem (scFv). Videti WO 93/16185.

(vi) Multispecifična antitela

Multispecifična antitela imaju specifičnosti vezivanja za najmanje dva različita antigena. Dok takvi molekuli normalno vezuju samo dva antigena (tj. bispecifična antitela, BsAbs), antitela sa dodatnim specifičnostima, kao što su trispecifična antitela, obuhvaćena su ovim izrazom, kada se ovde koristi. Primeri BsAbs su oni koji su jednim krakom usmereni protiv antigena ćelije tumora, a drugim krakom su usmereni protiv molekula za citotoksično startovanje, kao što su anti-FCyRI/anti-CD15, anti-p185<HER2>/FcyRIII (CD16), anti-CD3(anti-maligna B-ćelija (1D10), anti-CD3/antip185<HER2>, anti-CD3/anti-p97, anti-CD3/anti-renalna ćelija karcinoma, anti-CD3/anti-OVCAR-3, anti-CD3/L-D1 (anti- kancer debelog creva), anti-CD3/anti-melanocitni analog za stimulaciju hormona, anti-EGF receptor/anti-CD3, anti-CD3/anti-CAMA1, anti-CD3/anti-CD19, anti-CD3/MoV18, adhezioni molekul anti-neuronske ćelije (NCAM)/anti-CD3, anti-folni vezujući protein (FBP)/anti-CD3, antigen povezan sa anti-pan karcinomom (AMOC-31)/anti-CD3; BsAbs, sa jednim krakom koji se specifično vezuje za antiegn tumora, i jednim krakom se vezuje za toksin, kao što je anti-saporin/ani-ld-1, anti-CD22/antisaporin, anti-CD7/anti-saporin, anti-CD38/anti-saporin, anti-CEA/anti-ricin A lanac, anti-interferon-a(IFN-a)/anti-idiotip hibridome, anti-CEA/anti-vinca alkaloid; BsAbs za konvertovanje enzimatski aktiviranih prolekova, kao što je anti-CD30-anti-alkalna fosfataza (koja katalizuje konverziju proleka mitomicin fosfata, u mitomicin alkohol); BsAbs koji se može koristiti kao fibrinolitički agens, kao što su anti-fibrin/aktivator plazminogena anti-tkiva (tPA), anti-fibrin/aktivator plazminogena tipa anti-urokinaze (uPA); BsAbs za ciljanje imunokompleksa na receptore na površini ćelije, kao što je anti-lipoprotein niske gustine (LDL)/anti-Fc receptor (npr. FcyRI, FcyRII, FcyRIII); BsAbs za upotrebu u terapiji infektivnih bolesti, kao što su anti-CD3/anti-herpes simpleks virus (HSV), receptor anti-T-ćelije: CD3 kompleks/anti-grip, anti-FcyR/anti-HIV; BaAbs za detekciju tumora in vitro ili in vivo, kao što su anti-CEA/anti-EOTUBE, anti-CEA/anti-DPTA, antip185<HER2>/anti-hapten; BsAbs kao adjuvanti vakcine; i BaAbs kao dijagnostičko oruđe, kao što je anti-zečji IgG/anti-feritin, anti-konjska peroksidaza rena (HRP)/anti-hormon, anti-somatostatin/anti-supstanca P, anti-HRP/anti-FITC, anti-CEA/anti-p-galaktozidaza. Primeri trispecifičnih antitela su anti-CD3/anti-CD4/anti-CD37, anti-CD3/anti-CD5/anti-CD37 i anti-CD3/anti-CD8/anti-CD37. Bispecifična antitela se mogu dobiti kao antitela čitave dužine, ili kao fragmenti antitela (npr. F(ab’)2 bispecifična antitela).

U stanju tehnike su poznate metode za pravljene bispecifičnih antitela. Tradicionalna proizvoda bispecifičnih antitela čitave dužine zasnovana je na istovremenom izlučivanju dva imunoglobulina sa parom teškog lanca i lakog lanca, gde ova dva lanca imaju različite specifičnosti (Millstein et al, Nature, 1983, 305, 537-539). Zbog nasumičnog svrstavanja teškog i lakog lanca imunoglobulina, ove hibridome (kvadrome) proizvode potencijalnu smešu 10 različitih molekula antitela, od kojih samo jedna ima ispravnu bispecifičnu strukturu. Prečišćavanje ovog ispravnog molekula, koje se obično obavlja koracima afinitetne hromatografije, je teško, a prinosi proizvoda vrlo niski. Slične procedure su opisane u WO 93/08829 i u Traunecker et al., EMBO J., 1991, 10, 3655-3659.

U skladu sa različitim pristupom, varijabilni domeni antitela, sa željenim specifičnostima vezivanja (kombinovana mesta antitelo-antigen), se fuzionišu sa sekvencijama konstantnog domena imunoglobulina. Poželjno je da ova fuzija sa teškim lancem konstantnog domena imunoglobulina, sadrži bar deo savitljivih, CH2 i CH3 regiona. Poželjno je da se ima prvi teški lanac konstantnog domena (CH1), koji sadrži mesto neophodno za vezivanje lakog lanca, prisutnog u bar jednoj od ovih fuzija. DNK koje kodiraju fuziju teškog lanca imunoglobulina i, ako se želi, lakog lanca imunoglobulina, umeću se u odvojene vektore izlučivanja, pa se istovremeo trasficiraju u pogodni organizam domaćina. Ovo pruža veliku fleksibilnost u podešavanju međusobnih proporcija tri fragmenta polipetida u realizacijama kada se koriste nejednaki odnosi ova tri polipeptidna lanca u konstrukciji, obezbeđujući optimalan prinos. Međutim, moguće je da se umetnu sekvencije za kodiranje dva ili sva tri polipeptidna lanca u jedan vektor za izlučvanje, kada dolazi do izlučivanja bar dva polipetidna lanca u jednakom odnosu i visokim prinosima, ili kada ovi odnosi nisu od posebnog značaja.

U poželjnoj realizaciji ovog pristupa, bispecifična antitela se sastavljaju od teškog lanca hibridnog imunoglobulina, sa prvom specifičnošću vezivanja u jednom kraku, a u drugom kraku od para teški lanac laki lanac hibridnog imunoglobulina (što obezbeđuje drugu specifičnost vezivanja). Nađeno je da ova asimetrična struktura olakšava razdvajanje željenog bispecifičnog jedinjenja od neželjenih kombinacija lanca imunoglobulina, zato što prisustvo lakog lanca imunoglobulina u samo jednoj polovini bispecifičnog molekula obezbeđuje lak put razdvajanja. Ovaj pristup je opisan u WO 94/04690. Za detalje oko generisanja bispecifičnih antitela, videti na primer, Suresh et al., Methods in Enzymology, 1986, 121.210.

U skladu sa sledećim pristupom, opisanim u WO 96/27011, interfejs između para molekula antitela se može hemijskim inžinjeringom skrojiti tako da procent heterodimera bude maksimalan, kada se izoluje iz kulture rekombinantnih ćelija. Poželjan interfejs se sastoji, bar delom, od domena CH-3 konstantnog domena antitela. U ovom postupku, jedan ili više malih bočnih lanaca aminokiselina sa interfejsa prvog molekula antitela se zameni sa većim bočnim lancima (npr. tirozinom ili triptofanom). Na površini interfejsa se stvaraju kompenzatorne "šupljine” identične ili slične veličine sa strane velikih lanaca molekula drugog antitela, zamenom velikih bočnih lanaca aminokiselina sa manjim (npr. alanin ili treonin). Ovo predstavlja mehanizam za povećanje prinosa heterodimera, u odnosu na neželjene krajnje proizvode, kao što su homodimeri.

Bispecifična antitela su umreženo povezana ili "heterokonjugovana” antitela. Na primer, jedno od antitela u heterokonjugatu se može kuplovati na avidin, a drugo na biotin. Ova antitela, na primer, su predložena da ciljaju ćelije imunosistema u neželjenim ćelijama (U.S. Patent No. 4,676,980) i za tretman HIV infekcije (WO91/00360, VVO92/200373 i EP 03089). Heterokonjugati antitela se mogu napraviti korišćenjem bilo koje od metoda unakrsnog vezivanja. Pogodni agensi za unakrsno vezivanje su dobro poznati u stanju tehnike, a opisani su u U.S. Patent No. 4,676,980, zajedno sa brojnim tehnikama ukrštenog vezivanja.

Tehnike za generisanje bispecifičnih antitela iz fragmenata antitela takođe su opisane u literaturi. Na primer, bispecifična antiela se mogu dobiti korišćenjem hemijskog povezivanja. Brennan et al., Science, 1985, 229, 81 opisuju proceduru u kojoj se nedirnuta antitela proteolitički cepaju, pa se generišu fragmenti F(ab’)2. Ovi fragemnti se redukuju u prisustvu ditiolnog agensa za kompleksiranje, natrijum-arsenita, da se stabilizuju susedni ditioli i spreči intramolekulsko stvaranje disulfida. Generisani fragmenti Fab’ se zatim konvertuju u derivate tionitrobenzoata (TNB). Jedan od derivata Fab’-TNB se zatim ponovo konvertuje u Fab’-tiol, redukcijom sa merkaptoetilaminom, pa pomeša u ekvimolskom odnosu sa drugim Fab’-TNB derivatom, formirajući bispecifično antitelo. Dobijena bispecifična antitela se mogu koristiti kao agensi za selektivnu imobilizaciju enzima.

Nedavni napredak je olakšao direktno izolovanje Fab’-SH fragmenata iz E. coli, koji se mogu hemijski kuplovati da formiraju bispecifična antitela. Shalaby et al., J. Exp. Med., 1992, T75, 217-225 opisuju proizvodnju molekula potpuno humanizovanog bispecifičnog antitela (F(ab’)2. Svaki fragemnt Fab’ se odvojeno izlučuje iz E. coli, pa podvrgne direktnom hemijskom kuplovanju in vitro, uz formiranje bispecifičnog antitela. Ovako formirano bispecifično antitelo je u stanju da se vezuje za ćelije koje povećano izlučuju receptor VEGF i normalne humane T ćelije, a isto tako kao starter za litičke aktivnosti humanih citotoksičnih limfocita, protiv ciljeva u humanom kanceru dojke.

Razne tehnike pravljena i izolovanja fragmenata bispecifičnog antitela, direktno iz kulture rekombinantnih ćelija, takođe su opisane. Na primer, bispecifična antitela se proizvode korišćenjem leucinskog ziper-mehanizma. Kostelny et al., J. Immunol., 1992, 148(5), 1547-1553. Leucinski ziper-peptidi iz proteina Fos i Jun se povezuju sa delovima Fab’ raznih antitela pomoću fuzije gena. Homodimeri antitela se redukuju u savitljivoj oblasti, formirajući monomere, a zatim ponovo oksidišu, formirajući heterodimere antitela. Ova metoda se može takođe koristiti za dobijanje homodimera antitela. Tehnologija ”dia-tela”, koju su opisali Hollinger et al., Proc. natl. Acad. Sci. USA., 1993, 90, 6444-6448, daje alternativni mehanizam za pravljenje fragmenata bispecifičnih antiteta. Ovi fragmenti sadrže teški lanac varijabilnog domena (VH) povezan sa lakim lancem varijabilnog domena (VL) preko linkera, koji je suviše kratak da dozvoli sparivanje između dva domena istog lanca. Prema tome, VHi VLdomeni jednog fragmenta, prinuđeni su da se sparuju sa komplementarnim VLi VHdomenima drugog fragmenta, čime se formiraju dva mesta za vezivanje antigena. Sledeća strategija za pravljenje fragmenata bispecifičnih antitela je upotrebom dimera jednog lanca Fv (sFV), i ona je opisana. Videti Gruber et al., J. Immunol., 1994, 152, 5368.

Razmatraju se antitela sa više od dve valencije. Na primer, mogu se dobiti trispecifična antitela. Tutt et al., J. Immunol., 1991, U147U, 60.

(vii) Kroienie funkcije efektora

Može biti poželjno da se antitelo iz ovog pronalaska modifikuje u pogledu funkcije efektora, tako da se, na primer, pojača efikasnost antitela u tretiranju kancera. Na primer, mogu se uvesti ostaci cisteina u region Fc, čime se u ovom regionu omogućava formiranje disulfidne veze unutar lanca. Tako generisano homodimerno antitelo može imati poboljšanu spsosbnost internalizacije i/ili poboljšano ubijanje ćelija posredovano komplementom i ćelijsku citotoksičnost, zavisnu od antitela (ADCC). Videti Caron et al., J. Exp. Med., 1992, 176, 1191- 1195, i Shopes, B., J. Immunol., 1992, 148.2918-2922. Homodimerna antitela sa pojačanom aktivnošću protiv tumora mogu se dobiti takođe korišćenjem heterobifunkcionalnih unakrsnih linkera, kao što su opisali VVolff et al., Cancer Res., 1993, 53, 2560-2565. Alternativno, može se skrojiti antitelo koje ima dvojne regione Fc, pa time ima pojačanu lizu komplementa i sposobnosti ADCC. Videti Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design, 1989, 3, 219-230.

(viii) Imunokonjugati

Ovaj pronalazak se odnosi na imunokonjugate koji sadrže ovde opisano antitelo, konjugovano sa citotoksičnim agensom, kao što je hemoterapeutski agens, toksin (npr. enzimatski aktivan toksin bakterijskog, gljivičnog, biljnog ili životinjskog porekla, ili njegovi fragmenti), ili radioaktivni izotop (tj. radiokonjugat).

Hemoterapeutski agensi korisni za generisanje ovakvih imunokonjugata opisani su gore. Enzimatski aktivni toksini i njihovi fragmenti, koji se mogu upotrebiti, su lanac A difterije, nevezujući aktivni fragemnti toksina difterije, A lanac egzotoksina (iz Pseudomonas aeruginosa), A lanac ricina, A lanac abrina, A lanac modecina, alfa-sarcin, proteini Aleurites fordii, proteini diantina, proteini Phytolaca americana (PAPI, PAPII i PAP-S), inhibitor momordica charantia, curcin, crotin, inhibitor sapaonaria officinalis, gelonin, mitogellin, restrictocin, fenomicin, enomicin i tricothecen-i. Razni radionuklidi su dostupni za proizvodnju antitela-radiokonjugata. Primeri su<212>Bi,<131>l,<131>ln,<90>Y i<186>Re.

Konjugati antitela i citotoksičnog agensa se prave korišćenjem raznih agenasa za kuplovanje bifunkcionalnih proteina, kao što su N-sukcinimidil-3-(2piridilditiol)propionat (SPDP), iminotiolan (IT), bifukcionalni derivati imidoestara (kao što je dimetiladipimidat HCI), aktivni estri (kao što je disukcinimidil suberat), aldehidi (kao što je glutaraldehid), bis-azido jedinjenja (kao što je bis(pazidobenzoil)heksandiamin), bis-diazonijum derivati (kao što je bis-(pdiazonijumbenzoil)-etilendiamin), diizocijanati (kao što je toluen 2,6-diizocijanat) i bis-aktivna jedinjenja fluora (kao što je 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzen). Na primer, imunotoksin ricin-a se može dobiti kao što su opisali Vietta et al., Science, 1987, 238, 1098. Primer agensa za helatiranje, za konjugovanje radionukleotida sa antitelom, je 1-izotiocijanato-3-metildietilen triaminpenta- sirćetna kiselina obeležena sa ugljenikom-14 (MX-DTPA). Videti WO 94/1126.

U sledećoj realizaciji antielo se može konjugovati sa "receptorom” (kao što je streptavidin), za upotrebu u prethodnom ciljanju tumora, gde se ovaj konjugat antitelo-receptor ordinira pacijentu, pa sledi uklanjanje nevezanog konjugata iz krvotoka, korišćenjem agensa za čisšćenje, pa ordiniranje "liganda” (npr. avidin) koji je konjugovan sa citotoksičnim agensom (npr. radionukleotidom).

(ix) Imunolipozomi

Ovde opisano antitelo se može formulisati takođe kao imunolipozomi. Lipozomi, koji sadrže antitelo, dobijaju se metodama koje su poznate u stanju tehnike, kao što su one koje su opisali Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1985, 82, 3688; Hwang et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1980, 77, 4030; i U. S. Patent-i No.4,485,045 i 4,544,545. Lipozomi sa poboljšanim vremenom cirkulacije opisani su u U. S. Patent No.5,013,556.

Naročito korisni lipozomi se mogu generisati metodom isparavanja reversne faze, sa lipidnom komponentom koja se sastoji od fosfatidilholina, holesterola i pomoću PEG derivatizovanog fosfatidiletanolamina (PEG-PE). Lipozomi se ekstrudiraju kroz filtre definisane veličine pora, dajući lipozome željenog prečnika. Fragmenti Fab’ antitela iz ovog pronalaska mogu se konjugovati sa lipozomima, kao što su opisali Martin et al., J. Biol. Chem., 1982, 257, 286-288, preko reakcije unutrašnje izmene disulfida. Hemoterapeutski agens (kao što je

Doxorubicin) može opciono da se sadrži unutar lipozoma. Videti Gabizon et al., J. National Cancer Inst., 1989, 81(19), 1484.

(x) Terapija prolekom zavisna od antitela, posredovana enzimom (ADEPT) Antitelo iz ovog pronalaska može se takođe koristiti u ADEPT (od engl. Antibody Dependent Enzyme Mediated Prodrug Therapy) konjugovanjem antitela sa enzimom koji aktivira prolek, koji konvertuje prolek (npr. peptidil hemoterapeutski agens, videti WO 81/01145) u aktivni lek protiv kancera. Videti naprimer, WO 88/07378 i U. S. Patent No.4,975,278.

Enzimatska komponenta imunokonjugata, koja je korisna u ADEPT, obuhvata bilo koji enzim koji je u stanju da deluje na prolek na takav način da ga konvertuje u njegov aktivniji, citotoksični oblik.

Enzimi koji su korisni u postupku iz ovog pronalaska su, ali bez ograničavanja, alkalna fosfataza, koja je korisna za kovertovanje prolekova koji sadrže fosfat u slbodne lekove; arilsulfataza, koja je korisna za konvertovanje prolekova koji sadrže sulfat u slobodne lekove; citozin deaminaza, koja je korisna za konvetovanje netoksičnog 5-fluorocitozina u lek protiv kancera 5-fluorouracil; proteaze, kao što je seratia proteaza, termolizin, subtilizin, karboksipeptidaze i katepsini (kao što je katepsin B i L), koji su korisni za konvertovanje prolekova koji sadrže peptid u slobodne lekove; D-alanilkarboksipeptidaze, korisne za konvertovanje prolekova koji koriste supstituente D-aminokiseline; enzimi za cepanje ugljenih hidrata, kao što su β-galaktozidaza i neuraminidaza, koji su korisni za konvertovanje glikozilovanih prolekova u slobodne lekove; p- laktamaza, korisna za konvertovanje leova koji su derivatizovani sa β-laktamima u slobodne lekove; i penicilin amidaze, kao što je penicilin V amidaza ili penicilin G amidaza, korisne za invetovanje leka derivatizovanog na azotu njihovog amina sa fenoksiacetil ili fenilacetil grupama, respektivno, u slobodne lekove. Alternativno, antitela sa enzimatskom aktivnošću, poznata takođe kao ”abzimi”, mogu se koristiti za konvertovanje prolekova iz ovog pronalaska u slobodne

aktivne lekove (videti npr., Massey, Nature, 1987, 328, 457-458). Konjugati antitelo-abzim mogu se dobiti kao što je ovde opisano za oslobađanje abzima u populaciju ćelija tumora.

Enzimi iz ovog pronalaska se mogu kovalentno vezati za antitelo tehnikama koje su dobro poznate u stanju tehnike, kao što je upotreba heterobifunkcionalnih reagenasa za unakrsno vezivanje, koji su diskutovani gore. Alternativno, mogu se konstruisati fuzioni proteini, koji sadrže najmanje jedan ragion za vezivanje antigena antitela iz ovog pronalaska, povezanog sa bar funkcionalno aktivnim delom enzima iz ovog pronalaska, koristeći tehnike rekombinantne DNK, koje su dobro poznate u stanju tehnike (videti npr. Neuberger et al., Nature, 1984, 312, 604-608.

(xi) Fuziie antitelo-spaseni receptor za vezivanie epitopa U nekim realizacijama ovog pronalaska može biti poželjno da se upotrebi fragment antitela, pre nego nedirnuto antitelo, naprimer, da bi se poboljšala penetracija u tumor. U tom slučaju može biti poželjno da se modifikuje fragment antitela da bi se povećao njegov poluživot u serumu. Ovo se može postići, na primer, ugradnjom spasenog receptora za vezivanje epitopa u fragment antitela (npr. mutacijom odgovarajućeg regiona u fragmentu antitela, ili ugradnjom epitopa u peptidni privesak, koji se zatim fuzioniše sa fragmentm antitela, na bilo kom od krajeva ili u sredini, npr. pomoću DNK ili sintezom peptida).

Poželjno je da spaseni receptor za vezivanje peptida čini region u kome bilo koji, jedan ili više ostataka aminokiselina iz jedne ili dve petlje domena Fc biva prebačen u analogni položaj u fragmentu antitela. Još je poželjnije da se prebace tri ili više ostataka iz jedne ili dve petlje domena Fc. Još je poželjnije da se epitop uzme iz CH2 domena Fc regiona (npr. iz IgG), pa prebaci u CH1, CH3 ili VHregion, ili u više od jednog takvog regiona antitela. Alternativno, epitop se uzima iz domena CH2 Fc regiona, pa se prebaci u CL region VLregiona, ili oba, u fragmentu antitela.

(xii) Druge kovalentne modifikaciie antitela

Obimom ovog pronalaska buhvaćene su i kovalentne modifikacije antitela. One se mogu napraviti hemijskom sintezom ili enzimatiskim ili hemijskim cepanjem antitela, ako su moguća. Druge vrste kovalentnih modifikacija antitela se unose u molekul reagovanjem ciljanih ostataka aminokiselina antitela sa organskim agensima za derivatizaciju, koji su u stanju da reaguju sa odabranim bočnim lancima ili sa ostacima na N- ili C-kraju.

Cisteinilni ostaci najčešće reaguju sa a-haloacetatima (i odgovarajućim aminima), kao što su hlorosirćetna kiselina ili hloroacetamid, dajući karboksimetil ili karboksiamidometil derivate. Cisteinilni ostaci derivatizuju se takođe reakcijom sa bromotrifluoroacetonom, a-bromo-β-(5-imidozoil)propionskom kiselinom, hloroacetilfosfatom, N-alkilmaleimidima, 3-nitro-2-piridildisulfidom, metil 2-piridildisulfidom, p-hioromerkuribenzoatom, 2-hloromerkuri-4-nitrofenolom ili hloro-7-nitrobenzo-2-oksa-1,3-diazolom.

Histidilni ostaci se derivatizuju reakcijom sa dietilpirokarbonatom, pri pH 5,5-7,0, zato što je ovaj agens relativno specifičan za histidilni bočni lanac. Koristan je takođe i para-bromofenacilbromid; poželjno je da se reakcija obavlja u 0,1 M natrijum-kakodilatu, pri pH 6,0.

Lizinil i ostaci sa amino kraja reaguju sa ćilibarnim ili drugim anhidridom karboksilne kiseline. Derivatizacija sa ovim agensima ima efekt vraćanja naboja lizinil ostacima. Drugi pogodni reagensi za derivatizaciju ostataka koji sadrže aamino, su imidoestri, kao što je metil pikolinimidat, piridoksal fosfat, piridoksal, hloroborohidrid, trinitrobenzensulfonska kiselina, O-metilizourea, 2,4-pentadion i reakcija sa glioksilatom katalizovana transmitazom.

Arginil ostaci se modifikuju reakcijom sa jednim ili nekoliko konvencionalnih reagenasa, među njima sa fenilglioksalom, 2,3-butandionom, 1,2-cikloheksandionom i ninhidrinom. Derivatizacija argininskih ostataka zahteva da se reakcija obavlja pod alkalnim uslovima, zbog visoke vrednosti pKagvanidinske funkcionalne grupe. Pored toga, ovi reagensi mogu da reaguju sa grupama lizina, isto kao i sa arginin epsilon-amino grupom.

Specifične modifikacije tirozil ostataka se mogu načiniti sa posebnim interesovanjem za uvođenje spektralni oznaka u tirozil ostatke, reakcijom sa aromatičnim diazonijum jedinjenjima ili tetranitrometanom. Najčešće, koriste se N-acetilimidazol i tetranitrometan, formirajući O-acetiltirozil vrste i 3-nitro derivate, respektivno. Tirozil ostaci se joduju, koristeći<125>l ili<131>1, za dobijanje obeleženih proteina, za upotrebu u radioimuno testovima.

Karboksilne bočne grupe (aspartil ili glutamil) se selektivno modifikuju reakcijom sa karbodiimidima (R-N=C=N-R’), gde su R i R’ različite alkil grupe, kao što su 1 -cikloheksil-3-(2-morfolinil-4-etil)karbodiimid ili 1 -etil-3-(4-azonia-4,4-dimetilpentil)karbodiimid. Pored toga, aspartil i glutamil ostaci se konvertuju u asparaginil i glutaminil ostatke reakcijom sa amonijum jonima.

Glutaminil i aparaginil ostaci se često deaminuju u odgovarajuće glutamil i aspartil ostatke, respektivno. Ovi ostaci se deaminuju pod neutralnim ili baznim uslovima. Deaminovani oblik ovih ostataka spada u obim ovog pronalaska.

Druge modifikacije su hidroksilovanje prolina i lizina, fosforilovanje hidroksilnih grupa seril ili treonilo stataka, metilovanje a-amino grupa lizina, arginina i histidina u bočnim lancima (T.E. Creighton, "Proteins: Structure and Molecular Properties”, W.H. Frreman & Co., San Francisco, str.79-86 (1983)), acetilovanje amina sa N-kraja i amidovanje bilo koje karboksilne grupe sa C-kraja.

Druga vrsta kovalentnih modifikacija obuhvata hemijsko ili enzimatsko kuplovanje glikozida na antitelo. Ovo su pogodne procedure zato što ne zahtevaju stavaranje antitela u ćelijma domaćina, koje imaju sposobnosti glikozilovanja za N- ili O-vezana glikozilovanja. Zavisno od načina kuplovanja koji se koristi, šećer (ili šećeri) se mogu vezati za: (a) arginin i histidin; (b) slobodne karboksilne grupe; (c) slobodne sulfhidril grupe, kao što su one u

cisteinu; (d) slobodne hidroksilne grupe, kao što su one u serinu, treoninu ili hidroksiprolinu; (e) aromatične osatke, kao što su oni u fenilalaninu, tirozinu ili triptofanu; ili (f) amidnu grupu glutamina. Ove metode su opisane u WO 87/05330, objavljenom 11. septembra 1987, i u Aplin i Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., 1981, str.259-306.

Uklanjanje bilo kog ostatka ugljenog hidrata prisutnog u antitelu može se obaviti hemijski ili enzimatski. Hemijsko glikozilovanje zahteva izlaganje antitela jedinjenju trifluorometansulfonske kisleine, ili ekvivalentnom jedinjenju. Ovaj tretman vodi cepanju većine ili svih šećera, izuzev vezujućih šećera (N- acetilglikozamin ili N-acetilgalaktozamin), uz ostavljanje antitela nedurnitim. Hemijsko glikozilovanje su opisali Hakimuddin et al., Arch. Biochem. Biophys., 1987, 258.52, i Edge et al, Anal. Biochem., 1981, 118, 131. Enzimatsko cepanje ostataka ugljenih hidrata na antitelima se može postići upotrebom raznih endo-i egzo-glikozidaza, kao što su opisali Thotakura et al, Meth. Enzymoi, 1987, 138, 350.

Sledeća vrsta kovalentne modifikacije antitela se sastoji od vezivanja antitela za jedan od raznih ne-proteinskih polimera, npr. polietilenglikol, polipropilenglikol ili za polioksialkilene, na način opisan u U.S. Patent-ima No. 4,640,835, 4,495,689, 4,301,144, 4,670,417, 4,791.192 ili 4,179,337.

B. Vektori ćeliie domaćina i rekombinantne metode

Anti-VEGF antitelo iz ovog pronalaska se može proizvesti rekombinantno, koristeći tehnike i materijale koji su lako dostupni.

Za rekombinantno dobijanje anti-VEGF antitela, izoluje se nukleinska kiselina koja ga kodira, pa se umetne u vektor koji može da se replikuje za dalje kloniranje (amplifikacija DNK) ili da se izlučuje. DNK koja klonira monoklonalno antitelo se lako izoluje i sekvencionira, korišćenjem konvencionalnih procedura (npr. korišćenjem oligonukleotidnih proba koje su u stanju da specifično vežu

gene koji kodiraju teški i laki lanac tog antitela). Dostupni su mnogi vektori. Komponente vektora obično su, ali bez ograničavanja, jedno ili više od sledećih: signalna sekvencija, početak replikacije, jedan ili više marker gena, element za pojačanje, promoter i transkripcija završetka sekvencije.

(i) Komoonenta signalne sekvenciie

Antitelo iz ovog pronalaska se može dobiti rekombinantno, ne samo direktno, već i kao fuzioni polipeptid sa heterolognim polipetidom, koji je poželjno signalna sekvencija drugog polipeptida, koji ima specifično mesto cepanja sa N-kraja zrelog proteina ili polipeptida. Odabrana heterologna signalna sekvencija poželjno je da je ona koja se prepoznaje i procesuira (tj. cepa pomoću signalne peptidaze) u ćelijama domaćina. Za prokariotske ćelije domaćina, koje ne prepoznaju i ne procesuiraju nativnu signalnu sekvenciju antitela, signalna sekvencija se zamenjuje sa odabranom prokariotskom signalnom sekvencijom, na primer, iz grupe alkalne fosfataze, penicilinaze, Ipp ili vodećih enterotoskina II, stabilnih prema toploti. Za lučenje kvasca nativna signalna sekvencija se može sustituisati sa, npr. vodećom invertazom kvasca, vodećim a-faktorom (uključujući vodeće a-faktore Saccharomyces i Kluyveromyces), ili vodećom kiselom fosfatazom, vodeće glukoamilaze C. albicans, ili signalom opisanim u WO 90/13646. Kod izlučivanja u ćelijama sisara, dostupne su signalne sekvencije sisara, kao i vođe virusnih izlučivanja, na primer, signal herpes simpleksa gD.

DNK za ovakav prekursorski region se povezuje sa okvirom za očitavanje DNK, koji kodira antitelo.

(ii) Poreklo komoonente za kopiranie

Vektori i za izlučivanje i za kloniranje sadrže sekvenciju nukleinske kiseline koja omogućava vektoru da se kopira u jednoj ili više odabranih ćelija domaćina. Obično, kod vektora za kloniranje ova sekvencija je ona koja omogućava vektoru da se kopira nezavisno od hromozomalne DNK domaćina, i obuhvata početke kopiranja ili autonomne sekvencije za kopranje. Ove sekvencije su dobro poznate za razne bakterije, kvasce i viruse. Početak kopiranja iz plazmida pB322 je pogodan za većinu gram-negativnih bakterija, početak 2p plazmida je pogodan za kvasac, a razni virusni počeci (SV40, polioma, adenovirus, VSV ili BPV) su korisni za kloniranje vektora u ćelijama sisara. Obično početak komponente kopiranja nije potreban za vektore izlučivanja sisara (tipično, početak SV40 može da se koristi samo zato što sadrži rani promoter).

(iii) Izbor komponente gena

Vektori za izlučivanje i kloniranje mogu da sadrže gen za selekciju, koji se takođe naziva selektabilni marker. Tipični geni za selekciju kodiraju proteine koji: (a) pružaju otpor antibioticima ili drugim toksinima, npr. ampicilinu, neomicinu, metotreksatu ili tetraciklinu; (b) su komplementarni pomanjkanju u ishrani, ili (c) dostavljaju kritične hranljive sastojke, koji nisu dostupni iz kompleksnog medijuma, npr. gen koji kodira D-alanin racemazu za Bacilli.

Jedan primer sheme selekcije koristi lek da zaustavi rast ćelije domaćina. One ćelije koje su uspešno transformisane sa heterolognim genom, stvaraju protein koji pruža rezistenciju leku, pa tako preživljavaju režime selekcije. Primeri takve dominantne selekcije koriste lekove neomicin, mikofenolnu kiselinu i higromicin.

Drugi primer pogodnih selektabilnih markera za ćelije sisara su oni koji omogućavaju identifikaciju ćelija sposobnih da preuzmu nukleinsku kiselinu antitela, kao što su DHFR, timidin kinaza, metalotionein-l i -II, poželjno metalotioneinski geni primata, adenozin deaminaza, ornitin dekarboksilaza, itd.

Na primer, ćelije koje su transformisane sa selekcionim genom DHFR, prvo se identifikuju kultivisanjem svih transformanata u medijumu kulture koji sadrži metotreksat (Mtx), kompetitivni antagonist DHFR. Kada se koristi divlji tip DHFR, odgovarajuća ćelija domaćina je soj ćelija jajnika kineskog hrčka (CHO), kome nedostaje aktivnost prema DHFR.

Alternativno, ćelije domaćina (naročito divljih tipova domaćina, koje sadrže endogeni DHFR) transformisane ili istovremeno transformisane sa sekvencijama DNK koje kodiraju antielo, protein divljeg tipa DHFR i drugi selektabini marker, kao što je aminoglikozid 3’-fosfotransferaza (APH), mogu se odabrati po rastu ćelija u medijumu koji sadrži selekconi agens za selektabilni marker, kao što je aminoglikozidni antibiotik, npr. kanamicin, neomicin ili G418. Videti U.S. Patent No.

4,965,199.

Pogodna selekcija gena za upotrebu u kvascu je gen trp1, prisutan u plazmidu kvasca YRp7 (Stinchcomb et al., Nature, 1979, 282, 39). Gen trp1 obezbeđuje marker za selekciju mutantnog soja kvasca, kome nedostaje svojstvo rasta u triptofanu, na primer ATCC No. 44076 ili PEP4-1. Jones, Gentics, 1977, 85, 12. Prisustvo trp1 oštećenja u genomu ćelija domaćina kvasca obezbeđuje efikasnu sredinu za detektovanje transformacije za rast u odsustvu triptofana. Slično, sojevi kvasca deficitarni u Leu2 (ATCC 20,622 ili 38,626) se nadopunjuju poznatim plazmidima koji nose gen Leu2.

Pored toga, vektori koji se izvode iz cirkularnog plazmida pKD1 od 1,6 µm, mogu se korisititi za transformaciju kvasaca Ktuyveromyces. Alternativno, sistem izlučivanja na veliko, za proizvodnju rekombinantnog telećeg himozina, objavljen je za K. lactis. Van der Berg, Bio/Technology, 1990, 8, 135. Opisani su takođe stabilni vektori za izlučivanje višestrukih kopija, kod izlučivanja zrelog rekombinantnog humanog seruma albumina, pomoću industrijskih sojeva Kluyveromyces. Fleer et al., Bio/Technology, 1991, 9, 968-975.

(iv) Promoter kao komoonenta

Vektori za izlučivanja i kloniranje obično sadrže promoter, koji prepoznaje organizam domaćina, a operaivno je povezan sa nukleinskom kiselinom antitela. Promoteri pogodni za upotrebu u prokariotskim domaćinima su phoA promoter, promoterski sistemi p-laktamaze i laktoze, alkalna fosfataza, promoterski sistem triptofana (trp) i hibridni promoteri kao što je promoter tac. Međutim, pogodni su i drugi poznati bakterijski promoteri. Promoteri za upotrebu u bakterijskim sistemima sadrže takođe Shine-Dalgarno-vu (S.D.) sekvenciju, operabilno povezanu sa DNK koja kodira antitelo.

Poznate su sekvencije promotera za eukariote. Virtuelno, svi geni eukariota imaju region bogat sa AT, lociran prbližno 25 do 30 baza uzlazno od mesta gde je inicirana transkripcija. Druga sekvencija, koja se nalazi 70 do 80 baza uzlazno od početka transkripcije mnogih gena, je region CNCAAT, gde N može biti bilo koji nukleotid. Na kraju 3’ većine eukariotskih gena je sekvencija AATAAA, koja može biti signal za adiciju poli A repa na kraj 3’ kodirajuće sekvencije. Sve ove sekvencije se pogodno umeću u eukaritoske vektore izlučivanja.

Primeri pogodnih sekvencija za promociju, za upotrebu u kvascima kao domaćinima, su promoteri za 3-fosfoglicerat kinazu ili druge glikolitičke enzime, kao što su enolaza, gliceriladehid-3-fosfat dehidrogenaza, heksokinaza, piruvat dekarboksilaza, fosfofruktokinaza, glukoza-6-fosfat izomeraza, 3-fosfoglicerat mutaza, piruvat kinaza, tiozafosfat izomeraza, fosfoglukoza izomeraza i glukokinaza.

Drugi promoteri kvasca, koji su induktibilni promoteri, koji imaju dodatnu pogodnost transkripcije, konrolisane uslovima rasta, su regioni promotera za alkohol dhidrogenazu 2, izocitohrom C i fosfatazu, degradativne enzime povezane sa metabolizmom azota, metalotionein, gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenazu i enzimi odgovorni za iskorišćenje maltoze i galaktoze. Pogodni vektori i promoteri za upotrebu u izlučivanju kvasaca opisani su još u EP 73,657. Pogodno je da se sa promoterima kvasca koriste i pojačavači kvasca.

Transkripcija antiela iz vektora u ćelijama domaćina sisara je kontrolisana, na primer, promoterima dobijenim iz genoma virusa, kao što su virus polioma, virus kokošjih boginja, adenovirus (kao što je Adenovirus 2), virus goveđe papilome, virus ptičjeg sarkoma, citomegalovirus, retrovirus, virus hepatitisa-B i najpoželjnije majmunski virus (SV 40), iz heterolognih sisarskih promotera, npr.

aktin promotera ili promotera imunoglobulina, promotera toplotnog šoka, pod uslovom da su ti promoteri kompatibilni sa sistemima ćelija domaćina.

Rani i kasni promoteri virusa SV40 pogodno je da se dobijau kao restrikcioni fragment SV40, koji takođe sadrži početak za kopiranje virusa SV40. Neposredni rani promoter humanog citomegalovirusa pogodno se dobija kao restrikcioni fragment Hindlll E. Sistem za izlučivanje DNK u domaćinu sisaru, korišćenjem virusa goveđeg papiloma kao vektora, opisan je u U.S. Patent-u No. 4,419,446. Modifikacija ovog sistema je opisana u U.S. Patent-u No.4,601,978. Videti takođe Reyes et al., Nature, 1982, 297, 598-601 za izlučivanje cDNK humanog (β-interferona u mišjim ćelijama, pod kontrolom timidin kinaze kao promotera, iz virusa herpes simpleks. Alternativno, kao promoter može se koristiti virus Rous-ovog sarkoma sa ponavljanjem dugačkog kraja.

(v) Element pojačavača kao komponenta

Transkripcija DNK koja kodira antitelo iz ovog pronalaska kod viših eukariota često se povećava umetanjem sekvencije pojačavača u vektor. Poznate su mnoge sekvencije pojačavača iz gena sisara (globin, elastaza, albumin, a- fetoprotein i insulin). Međutim, tipično će se koristiti neki pojačavač iz virusa eukariotskih ćelija. Primeri su pojačavač SV40, sa kraja početka kopiranja (bp 100-270), citomegalovirus kao rani promoter pojačavač, pojačavač poliome sa kraja početka za kopiranje i pojačavači adenovirusa. Videti takođe, Yaniv, Nature, 1982, 297, 17-18, za elemente pojačavanja aktivacije kod eukariotskih promotera. Pojačavač može biti priključen vektoru, u položaju 5’ ili 3’ sekvencije koja kodira antitelo, ali je poželjno da bude lociran na mestu 5’ od promotera.

(vi) Komponenta zavreštka transkripcije

Vektori za izlučivanje, koji se koriste u eukariotskim ćelijama domaćina (kvasci, gljivice, insekti, biljke, životinje, humana bića, ili nukleotidovane ćelije iz drugih višećelijskih organizama) takođe sadrže sekvencije neophodne za završavanje transkripcije i stabilizovanje mRNK. Ove sekvencije su obično dostupne iz 5’, a ponekad 3’, ne-transliranih regiona euakritoskih ili virusnih DNK ili cDNK. Ovi regioni sadrže segmente nukleotida koji su transkribovani kao poliadenilovani fragmenti u ne-transliranim delovima mRNK, koja kodira antitielo. Jedna korisna komponenta za završetak transkripcije je region poliadenilovanja goveđeg hormona rasta. Videti WO 94/11026 i vektore za izlučivanjekoji su tamo opisani.

(vii) Izbori transformacija ćelija domaćina

Pogodne ćelije domaćina za kloniranje ili izlučivanje DNK u vektorima su ćelije prokariota, kvasaca ili viših eukariota, opisanih ovde. Pogodni prokarioti za ovu svrhu su eubakterije, kao što su gram-negativni i gram-pozitivni organizmi, na primer, enterobakterije, kao što su Escherichia, npr. E. coli, Enterobacter, Ervvinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, npr. Salmonella typhimurium, Serratia, npr, Serratia marcescans, i Shigella, kao i Bacilil, kao što su B. subtilis i B. lichenformis (npr. B. lichenformis 41 P,opisan u DD 266,710, objavljen 12. aprila 1989), Pseudomonas, kao što je P. aeruginosa, i Streptomyces. Jedan poželjan domaćin za kloniranje E. coli, je E. coli 294 (ATCC 31,446), mada su pogodni i drugi sojevi, kao što su E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31,537) i E. coli W3110 (ATCC 27,325). Ovo su ilustrativni primeri, a ne ograničavajući.

Pored prokariota, eukaritoski mikrobi, kao što su vlaknaste gljivice ili kvasci, pogodni su za kloniranje ili izlučivanje u domaćinimaa za vektore koji kodiraju antitelo. Među nižim eukaritoima kao mikroorganizam domaćin najčešće se koristi Saccharomyces cerevisiae, običan pekarski kvasac, Međutim, i brojni drugi rodovi, vrste i sojevi su uobičajeno dostupni i ovde korisni, kao što su Schizosaccharomyces pombe; Kluyveromyces domaćini, kao što su na primer K. lactis, K.fragilis (atcc 12,424), K. bulgaricus (ATCC 16,045), K. wickeramii (ATCC 24,178), K. waltii (ATCC 56,500), K, drosophilarum (ATCC 36,906), K. thermotolerans i K. mandanus; yarrowia (EP 402,226); Pichia pastoris (EP 183,070); Candida; Trichoderma reesia (EP 244,234); Neurospora crassa; Schwanniomyces, kao što je Schwanniomyces occidentalis; i vlaknaste glivice,

kao što su Neurospora, Penicillium, Tolypocladium i Aspergilus domaćini, kao što je A. nidulans i A. niger.

Pogodne ćelije domaćina za ilzučivanje glikozilovanog antitela izvode se iz višećelijskih organizama. Primeri ćelija beskičmenjaka su ćelije biljaka i insekata. Brojni sojevi i varijante bakulovirusa i odgovarajućih dopustivih ćelija insekata kao domaćina, identifikovane su iz domaćina kao što su Spodoptera frugiperda (gusenica), Aedes aegypti (komarac), Aedes albopictus (komarac), drosophila melanogaster (voćna mušića) i Bombyx mori. Javno su dostupni razni virusni sojevi za transficiranje, npr. L-1 varijanta Autographa californica NPV i Bm-5-soj Bombyx mori NPV, pa se ti virusi mogu koristiti kao virus u skladu sa ovim pronalaskom, naročito za transficiranje ćelija Spodoptera frugiperda. Kulture ćelija biljaka, pamuka, kukuruza, krompira, soje, petunije, paradajza i duvana, mogu se takođe koristiti kao domaćini.

Međutim, najveće intersovanje je za ćelije kičmenjaka i razmnožavanje ćelija kičmenjaka u kulturi (kultura tkiva) i postalo je rutinska procedura. Primeri korisnih ćelija domaćina sisara su soj CV1 majmunskog bubrega, transformisan sa SV40 (CIS-7, ATCC 1651); soj bubrega humanog embriona (ćelije 293 ili ćelije 293 sub-klonirane za rast u suspenzionoj kulturi, Graham et al., J. Gen. Virol, 1977, 36, 59); ćelije bubrega mladunca hrčka (BHK, ATCC CCI 10); ćelije jajnika kineskog hrčka/-DHFR (CHO, Urlaub et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1980, 77, 4216); Sertolijeve ćelije miša (TM4, Mather, Biol. Reprod., 190, 23, 243-251); ćelije majmunskog bubrega (Cvi ATCC CCL 70); ćelije bubrega afričkog zelenog majmuna (VERO-76, ATCC CRL-1587); cervikalne ćelije humanog karcinoma (HELA, ATCC CCL2); ćelije psećeg bubrega (MDCK, ATCC CCI 34); ćelije jetre bufalo pacova (BRL 3A, ATCC CRL 1442); ćelije humanih pluća (W138, ATCC CCL 75); ćelije humane jetre (HEP G2, HB 8065); tumor mišje dojke (MMT 060562, ATCC CCL 51); TRI ćelije (Mather et al., Annals N.A. Acad. Sci., 1982, 383.44-68); ćelije MRC 5; ćelije FS4; i soj humanog hepatoma (Hep G2).

Ćelije domaćina, transformisane sa gore opisanim vektorima za izlučivanje i kloniranje, za proizvodnju antitela i kultivisanje u konvencionalnim hranljivim medijumima, odgovrajuće modifkovane sa promoterima za indukciju, odabranim transformantima, ili pojačavanjem gena koji kodiraju željene sekvencije.

(viii) Kultivisanje ćelija domaćina

Ćelije domaćina, koje se koriste za proizvodnju antitela iz ovog pronalaska, mogu se kultivisati u raznim medijumima. Za kultivisanje ćelija domaćina pogodni su komercijalno dostupni medijumi, kao što su: Ham’s F10 (sigma), minimalni esencijalni medijum (MEM) (Sigma), RPMI-1640 (Sigma) i Dulbeco’s Modified Eagles Medium ((DMEM, Sigma). Pored toga, svaki od medijuma koje su opisali Ham et al, Meth. Enz., 1979, 58, 44; Barnes et al, Anal. Biochem., 1980, 102, 255; U. S. Patent-i No.4,767,704, 4,657,866, 4,927,762, 4,560,655 ili

5,122,469; WO 90/03430; WO 97/00195; ili U.S. Patent Re.30,985, mogu se koristiti kao medijum kulture za ćelije domaćina. Svakom od ovih medija, ako je potrebno, mogu se dodati hormoni i/ili faktori rasta (kao što su insulin, transferin ili faktor rasta epiderma), soli (kao što su natrijum-hlorid, kalcijum, magnezijum i fosfati), puferi (kao što je HEPES), nukleotidi (kao što su adenozin i timidin), antibiotici (kao što je lek GENTAMYCIN™), elementi u tragovima (definisani kao neorganska jedinjenja, obično prisutni u konačnim koncentracijama unutar mikromolarnog opsega) i glukoza, ili ekvivalentni izvor energije. Bilo koji drugi dodatak se može takođe uključiti sa odgovarajućom koncentracijom, što je poznato verziranima u stanje struke. Uslovi kultivisanja, kao što su temperatura, pH i slično, su oni koji su ranije korišćeni sa ćelijama domaćina izabranim za izlučivanje, a oni su jasni uobičajeno verziranom stručnjaku.

(ix) Prečišćavanje antitela

Kada se koriste rekombinantne tehnike, antielo se može proizvoditi unutarćelijski, u prostoru plazme, ili direktno izlučivati u medijum. Ukoliko se antitelo proizvodi unutarćelijski, kao prvi korak, ukloni se zrnasti otpad, bilo ćelija domaćina ili lizovanih fragmenata, na primer centrifugiranjem ili ultrafiltracijom. Carter et al., Bio/Technology, 1992, 10, 163-167 opisuju proceduru izolovanja antitela, koja se izlučuju u prostor periplazme E. coli. Ukratko, otkravi se ćelijska pasta u prisustvu natrijum-acetata (pH 3,5), EDTA i fenilmetilsulfonilfluorida (PMSF), tokom oko 30 min. Ćelijski otpad se ukloni centrifugiranjem. Ukoliko je antitelo izlučeno u medijum, supernatanti ovih sistema za izlučivanje se obično prvo koncentrišu, korišćenjem komercijalno dostupnih filtera sa koncentrisanej proteina, na primer, aparat za ultrafiltraciju Amicon ili Millipore Pellicon. Inhibitor proteaze, kao što je PMSF može se dodati u bilo koji od prethodnih koraka, da se inhibira proteoliza, a antibiotici se mogu dodati da se spreči rast sporednih kontaminanata.

Preparat antiela, dobijenog iz ćelija, može se prečistiti, na primer, hromatografijom na hidroksiapatitu, gel elektroforezom, dijalizom i afinitetnom hromatografijom, pri čemu je poželjna tehnika prečišćavanja afintetna hromatografija. Pogodnost proteina A kao afinitetnog liganda, zavisi od vrste i izotipa bilo kog od domena imunoglobulina Fc, koji je prisutan u antitelu. Protein A se može koristiti za prečišćavanje antitela koja se zasnivaju na humanim γ1, γ2 ili γ4 teškim lancima (Lindmark et al, J. Immunol. Meth., 1983, 62, 1-13). Protein G se preporučuje za sve mišje izotipove i za humani y3 (Guss et al, EMBO J., 1986, 5, 1567-1575). Matrica na koju se vezuje afinitetni ligand najčešće je agaroza, ali dostupne su i druge matrice. Mehanički stabilne matrice, kao što je staklo sa kontrolisanim porama, ili poli(stirendivinil)benzen, dozvoljavaju veće protoke i kraća vremena obrade, nego što se mogu postići sa agarozom. Ukoliko antitelo sadrži domen CH-3, za prečišćavanje se koristi Bakerbond ABX<™>smola (J.T. Baker, Phillipsburg, NJ). Druge tehnike za prečišćavanje proteina, kao što je filtracija na jonoizmenjivačkoj koloni, taloženje etanolom, HPLC sa reversnom fazom, hromatografija na silicijum-dioksidu, hromatografija na heparinu SEPHAROSE™, hromatografija na anjonskim ili katjonskim jonoizmenjivačkim smolama (kao što je kolona sa poliasparaginskom kiselinom), hromatofokusiranje, SDS-PAGE i taloženje sa amonijum-sulfatom, takođe su dostupne, zavisno od antitela koje treba da se izoluje.

Posle bilo kog od preliminarnih koraka prečišćavanja, smeša koja sadrži anti- VEGF antitelo i zagađivače se može podvrći hromatografiji sa hidrofobnom interkacijom pri niskom pH, koristeći za eluiranje pufer sa pH između 2,5-4,5, poželjno pri niskoj koncentraciji soli (npr. od oko 0-0,25 M soli).

III. Farmaceutske formulaciie

Terapeutske formulacije antitela, koje se koriste u skladu sa ovim pronalaskom, pripremaju se za skladištenje, mešanjem antitela koje ima željeni stepen čistoće sa opcionim farmaceutski prihvatljivim nosačima, dodacima i stabilizatorima ("Remington’s Pharmaceutical Sciences” 16. izdanje, uredn. Osol A., 1980), u obliku liofilizovanih formulacija ili rastvora u vodi. Prihvatljivi nosači, dodaci ili stabilizatori su netoksični za primaoce u dozama i koncentracijama u kojima se koriste, a to su puferi, kao što su fosfatni, citratni i druge organske kiseline; antioksidanti, uključujući askorbisku kiselinu i metionin; prezervativi (kao što je oktadecilmetilbenzilamonijum-hlorid; heksametonijum-hlorid; benzalkonijumhlorid; benzetonijum-hlorid; fenol, butil ili benzilalkohol, alkil parabeni, kao što su metil- ili propil-paraben; katehol; rezorcinol; cikloheksanol; 3-pentanol i n-krezol); polipeptidi niske molekulske težine (manje od oko 10 ostataka); proteini, kao što je serumski albumin, želatin ili imunoglobulin; hidrofilni polimeri, kao što je polivinilpirolidon; aminokiseline, kao što su glicin, glutamin, asparagin, histidin, arginin ili lizin; monosaharidi, disaharidi i drugi ugljeni hidrati, uključujući glukozu, manozu ili dekstrine; agensi za helatiranje, kao što je EDTA; šećeri, kao što su saharoza, manitol, trehaloza ili sorbitol; kontra-joni koji formiraju soli, kao što je natrijum; kompleksi metala (npr. kompleksi Zn-protein); i/ili nejonski surfaktanti, kao što su TVVEEN<™>, PLURONICS™ ili polietilenglikol (PEG). Poželjne liofilizovane formulacije anti-VEGF antitela su opisane u WO 97/04801, koje su izričito ovde priključene kroz citat.

Ova formulacija može takođe da sadrži više nego jedno aktivno jedinjenje, a prema potrebi za posmatranu indikaciju koja se tretira, poželjna su ona sa komplemetarnim aktivnostima, koja ne utiču štetno jedno na drugo. Na primer, može biti poželjno da se doda još antitela koja vezuju EGFR, VEGF (npr. antitelo koje vezuje razne epitope na VEGF), VEGFR ili ErbB2 (npr. Flerceptin<®>), sve u jednoj formulaciji. Alternativno, ili dodatno, preparat može da sadrži citotoksični agens, citokin, inhibitorni agens rasta i/ili mali molekul, antagonist VEGFR. Pogodno je da su ovakvi molekuli prisutni u kombinaciji, u količinama koje su efikasne za namenjenu svrhu.

Aktivni sastojci mogu biti takođe uklopljeni u mikrokapsule, na primer, tehnikama koacervacije ili međufaznom polimerizacijom, na primer u mikrokapsule od hidroksimetilceluloze ili želatina i mikrokapsule od poli-(metilmetakrilata), respektivno, u koloidne sisteme za oslobađanje leka (na primer, lipozomi, mikrosfere albumina, mikroemulzije, nanočestice i nanokapsule) ili u makroemulzije. Ove tehnike su opisane u "Remington’s Pharmaceutical Sciences” 16. izdanje, uredn. Osol A.,(1980).

Formulacije koje se koriste za ordiniranje in vivo moraju biti sterilne. Ovo se lako ostvaruje filtriranjem kroz sterilne membrane za filtriranje.

Mogu se dobiti preparati sa uzdržanim oslobađanjem. Pogodni primeri preparata sa uzdržanim oslobađanjem su polupropustljive matrice od čvrstih hidrofobnih polimera koje sadrže antitelo, matrice koje su u formi oblikovanih artikala, npr. filmova ili mikrokapsula. Primeri matrica za uzdržano oslobađanje su poliestri, hidrogelovi (na primer poli(2-hidroksietil)-metakrilat), ili poli(vinilalkohol)), polilaktidi (U. S. Patent No., 3,773,919), kopolimeri L-glutaminske kiseline i yetil-L-glutamata, etilen-vinilacetat koji se ne razgrađuje, razgradivi kopolimeri mlečne kiseline i glikolne kiseline, kao što je LUPRON DEPOT<™>(injektibilne mikrosfere, koje se sastoje od kopolimera mlečna kiselina-glikolna kiselina i leuprolid-acetata) i poli-D-(-)-3-hidroksibuterna kiselina. lako polimeri, kao što su etilen-vinilacetat i mlečna kiselina-glikolna kiselina, omogućavaju oslobađanje molekula tokom i preko 100 dana, neki hidrogelovi oslobađaju proteine u kraćim vremenskim periodima. Kada su kapsulirana, antitela ostaju dugo vremena u telu, i mogu se denaturisati ili načiniti agregate, kao posledica izloženosti vlazi

na 37°C, što dovodi do gubitka biološke aktivnosti i mogućih izmena u imunogenicitetu. Mogu se smisliti racionalne strategije za stabilizovanje, zavisno od posmatranog mehanzima. Na primer, ako se otkrije da je mehanizam agregacije unutarmolekulsko stvaranje veze S-S, preko tio-disulfidne unutarnje izmene, stabilizacija se može postići modifikacijom sulfhidril ostataka, liofilizovanjem iz kiselih rastvora, kontrolog sadržaja vlage, korišćenjem odgovarajućih aditiva i razvijanjem specifičnih sastava polimerne matrice.

IV. Terapeutske upotrebe anti-VEGF antitela

Podrazumeva se, u skladu sa ovim pronalaskom, da se sa anti-VEGF antitelima mogu tretirati razni neoplazmi ili ne-neoplazmička stanja, koja karakteriše patološka angiogeneza. Ne-neoplazmička stanja koja su podložna tretmanu su reumatoidni artritis, psorijaza, ateroskleroza, dijabetska i druge proliferativne retinopatije, uključujući prevremenu retinopatiju, retrolentalna fibroplazija, neovaskularni glaukom, starosna makularna degeneracija, hiperplazija tiroide (uključujući Grave-ovu bolest), transplantacija rožnjače i drugog tkiva, hronična inflamacija, nefrotični sindrom, preklampsija, asciti, perikardijalna efuzija (kao što je ona povezana sa perikarditisom) i efuzija pleure.

Poželjno je da se antiela iz ovog pronalaska koriste u tretmanu tumora, kod kojih angiogeneza igra važnu ulogu pri rastu tumora, uključujući kancere i benigne tumore. Primeri kancera koji treba ovde da se tretiraju su, ali bez ograničavanja, karcinom, limfom, blastom, sarkom i leukemija. Određeniji primeri ovih kancera su kancer skvamoznih ćelija, kancer pluća (uključujući kancer malih ćelija pluća, kancer ne-malih ćeija pluća, adenokarcinom pluća i skvamozni karcinom pluća), kancer peritoneuma, hepatocelularni kancer, gastrični ili stomači kancer (uključujući gastrointestinalni kancer), kancer pankreasa, glioblastom, cervikalni kancer, kancer jajnika, kancer jetre, kancer bešike, hepatom, kancer dojke, kancer debelog creva, kolorektalni kancer, karcinom endometrijuma ili materice, karcinom pljuvačne žlezde, bubrežni ili renalni kancer, kancer jetre, kancer prostate, kancer vulve, kancer tiroide, hepatički karcinom i razne vrste kancera

glave i vrata, kao i limfom B-ćelija (uključujući folikularni ne-Hodgkin-ov limfom niskog intenziteta (NHL); mali limfocitni (SL) NHL; folikularni NHL srednjeg intenziteta; difuzni NHL srednjeg intenziteta; imunioblastni NHL visokog intenziteta; limfoblastni NHL visokog intenziteta; NHL malih ćelija bez odvajanja visokog intenziteta; masivno obolenje NHL; limfom obloge ćelije; limfom povezan sa AIDS-om; i Waldestrom-ova makroglobulinemija); hronična limfocitna leukemija (CLL); akutna limfoblastna leukemija (ALL); leukemija kosmatih ćelija; hronična mijeloblastna leukemija i limfoproliferativni poremećaj posle transplantacije (PTLD), kao i abnormalna vaskularna proliferacija povezana sa fakomatozama, edem (kao što je onaj koji je povezan sa tumorima mozga) i Meigs-ov sindrom. Određenije, kanceri koji su podložni tretmanu sa antitelima iz ovog pronalaska su kancer dojke, kolorektalni kancer, rektalni kancer, kancer ne-malih ćelija pluća, ne-Hodgkin-ov limfom (NHL), kancer renalnih ćelija, kancer prostate, kancer jetre, kancer pankreasa, sarkom mekog tkiva, Kaposi-ev sarkom, karcinoidni karcinom, kancer glave i vrata, melanom, kancer jajnika, mezoteliom i višestruki mijelom. Poželjnije je da se postupci iz ovog pronalaska koriste za tretiranje kancera kod humanog pacijenta.

Ovaj pronalazak obuhvata antiangiogenu terapiju, novu strategiju tretmana kancera, usmerenu na inhibiranje razvoja krvnih sudova tumora, potrebnih za snabdevanje hranljivim sastojcima koji pomažu rast tumora. Pošto je angiogeneza uključena i u primarni rast tumora i u metstaze, antiangiogenezni tretman, koji pruža ovaj pronalazak, u stanju je da inhibira neoplazmički rast tumora na primarnom mestu, kao i da spreči metastaze tumora na sekundarnim mestima, pre nego što se dozvoli napad na tumore sa drugim terapeutskim agensima.

Kombinovane terapije

Podrazumeva se da kada se antitela iz ovog pronalaska koriste za tretiranje raznih bolesti, kao što su tumori, da se mogu kombinovati sa drugim terapeutskim agensima, pogodnim za istu ili sličnu bolest. Kada se koriste za

tretiranje kancera, antitela iz ovog pronalaska se mogu koristiti u kombinaciji sa konvencionalnim terapijama kancera, kao što su hirurgija, radioterapija, hemoterapija ili njihove kombinacije.

U nekima spektima, drugi terapeutski agensi, koji su korisni u kombinovanoj terapiji kancera sa antitelom iz ovog pronalaska, su drugi anti-angiogeni agensi. Identifikovani su i poznati u stanju tehnike mnogi anti-angiogeni agensi, uključujući one koje su naveli Carmeliet i Jain (2000). Poželjno je da se antitelo iz ovog pronalaska koristi u kombinaciji sa drugim antagonistom VEGF ili antagonistom receptora VEGF, kao što su varijante VEGF, rastvorni fragmenti receptora VEGF, aptameri koji su u stanju da blokiraju VEGF ili VEGFR, neutrališuća anti-VEGFR antitela, inhibitori niske molekulske težine VEGF tirozin kinaza i bilo koja od njihovih kombinacija. Alternativno, ili dodatno, pacijentu se istovremeno mogu ordinirati dva ili više anti-VEGF antitela.

U nekim drugim aspektima, neki drugi terapeutski agensi, korisni za kombinovanu terapiju tumora sa antitelom iz ovog pronalaska, su antagonisti drugih faktora uključenih u rast tumora, kao što su EGFR, rbB2 (poznat takođe kao Her2), ErbB3, ErbB4 ili TNF. Ponekad može biti korisno da se pacijentu ordinira takođe jedan ili više citokina. U poželjnoj realizaciji VEGF antitelo se istovremeno ordinira sa inhibitornim agensom rasta. Na primer, inhibitorni agens rasta se može ordinirati prvi, pa ga sledi VEGF antitelo. Međutim, moguće je i istovremeno ordiniranje ili ordiniranje prvo VEGF antitela. Pogodne doze za inhibitorne agense rasta su one koje se danas koriste, a mogu se sniziti zahvaljujući kombinovanom dejstvu (sinergija) inhibitornog agensa rasta i anti- VEGF antitela.

Hemoterapeutski agensi

U nekim aspektima ovaj pronalazak daje postupak za tretiranje kancera ordiniranjem efikasne količine anti-VEGF antitela i jednog ili više hemoterapeutskih agenasa pacijentu koji je podložan ili je sa dijagnozom kancera. Razni hemoterapeutski agensi se mogu koristiti u postupcima

kombinovanog tretmana iz ovog pronalaska. Primeri i lista, ali bez ograničavanja, hemoterapeutskih agenasa koji se podrazumevaju, data ja ovde u odeljku Definicije.

Onaj ko je uobičajeno verziran u stanje tehnike shvata da će odgovarajuće doze hemoterapeutskih agenasa biti obično oko onih koje se već koriste u kliničkim terapijama, kada se ovi hemoterapeutici ordiniraju sami ili u kombinaciji sa drugim hemoterapeuticima. Verovatno je da dolazi do variranja u doziranju, zavisno od stanja koje se tretira. Lekar koji ordinira tretman u stanju je da odredi odgovarajuću dozu pojedinačno svakom subjektu.

Primera radi, standardni hemoterapeutski tretmani za metastazirani kolorektalni kancer opisani su u nastavku.

U jednoj poželjnoj realizaciji, postupci iz ovog pronalaska se koriste za tretiranje kolorektalnog kancera, uključujući metastazirani kolorektalni kancer. Kolorektalni kancer je treći od najčešćih uzroka smrtnosti od kancera u SAD. Procenjuje se da je približno 129.000 novih slučajeva kolorektalnog kancera dijagnostikovano, i da se dogodilo 56.000 smrtnih slučajeva usled kolorektalnog kancera, tokom 1999 godine u SAD, Landis et al., CancerJ. Clin., 1999, 49, 8.31. Približno 70% pacijenata sa kolorektalnim kancerom imaju bolest koja je potencijalno izlečiva hirurškim zahvatom, August et al., Cancer Metastasis Rev., 1984, 3, 303-24. Međutim, slaba je prognoza za 30%, koji imaju podmaklu ili metastaziranu bolest, i za 20% onih sa recidivom posle hirurškog zahvata. Medijana za preživljavanje onih sa metastaziranom bolešću je 12-14 meseci, "Advanced Colorectal Cancer Meta-Analysis Project”, J. Clin. Oncol, 1992, 10, 896-903.

Do nedavno, standardan tretman metastaziranog kolorektalnog kancera u SAD bila je hemoterapija sa 5-fluoruracilom (5-FU), plus biohemijski modulator 5-FU, leucovorin, "Advanced Colorectal Cancer Meta-Analysis Project”, J. Clin. Oncol., 1992, 10, 896-903; Moertel, N. Eng. J. Med., 1994, 330, 1136-42. Kombinacija 5-FU/leucovorin retko daje prolazno smanjivanje kolorektalnih

tumora, ali nije pokazano da produžava preživljavanje, u poređenju sa samim 5- FU (Advanced Colorectal Cancer Meta-Analysis Project”, J. Clin. Oncoi, 1992, 10, 896-903), a nije pokazano ni da 5-FU produžava preživljavanje u poređenju sa neefikasnom terapijom plus najbolja nega, Ansfield et al,, Cancer, 1977, 39, 34-40. Nedostatak dokazanog poboljšanja preživljavanja sa 5FU/leucovorin-om, može delom biti usled neadekvatno dimenzionisanih kliničkim ispitivanja. U velikom, naasumičnom ispitivanju pacijenata, koji su primali adjuvantsku hemoterapiju posle hirurgije kolorektalnog kancera, 5-FU/leucovorin je pokazao produženo preživljavanje, u poređenju sa lomustine-om (MeCCNU), vincristine- om i 5-FU (MOF; Wolmark et al., J. Clin. Oncoi, 1993, H, 1879-87).

U SAD uobičajeno se ordinira hemoterapija sa 5-FU/leucovorinom, u skladu sa jednim od dva protokola: režim Mayo Clinic i režim Rosvvell Park. Režim Mayo Clinic se sastoji od intenzivnog kursa 5-FU plus niska doza leucovorin-a (425 mg/m<2>5-FU plus 20 mg/m<2>leucovorin-a, svakodnevno ordiniranje intravenoznom injekcijom (iv) tokom 5 dana, sa ponavljanjem ovog kursa u intervalima od 4 do 5 nedelja), Buroker et al., J. Clin. Oncol, 1994, 12, 14-20. Režim Rosvvell Park je nedeljni, i sastoji se od 5-FU plus visoka doza leucovorin-a (500-600 mg/m<2>5-FU, ordiniranog iv injekcijom, plus 500 mg/m<2>leucovorina, ordiniranog kroz 2 satnu infuziju, svakog dana u nedeji tokom 6 nedelja, sa ponavljanjem ovog kursa svakih 8 nedelja), Petrelli et al,, J. Clin. Oncol., 1989, 7, 1419-26. Klinička ispitivanja poređenja režima Mayo Clinic i Rosvvell Park nisu pokazala razliku u efikasnosti, ali nisu bile ni u sanju da to urade, Buroker et al., J. Clin. Oncoi, 1994, 12, 14-20; Poon et al., J. Clin. Oncoi, 199, t, 1407-18. Profili toksičnosti ova dva režima su različiti, pri ćemu režim Mayo Clinic dovodi do više leukopenije i stomatitisa, a režim Rosvvell Park dovodi do čestih dijareja. Pacijenti sa novo dijagnostikovanim metastaziranim kolorektalnim kancerom, koji primaju bilo koji od ovih režima, mogu očekivati medijanu vremena napredovanja bolesti od 4-5 meseci, a medijanu preživljavanja 12-14 meseci, Petrelli et al., J. Clin. Oncol., 1989, 7, 1419-26; ("Advanced Colorectal Cancer Meta-Analysis Project”, J. Clin. Oncoi, 1992, 10, 896-903; Buroker et al., J. Clin. Oncol., 1994, 12, 14-20; Cocconi et al., J. Clin. Oncol., 1998, 16, 2943-52.

Nedavno se pojavila nova prvostepena terapija za metastazirani kolorektalni kancer. Dva nasumična klinička ispitivanja, svaki sa približno 400 pacijenata, vrednovala su irinotecan, u kombinaciji sa 5-FU/leucovorin-om, Salz et al., Proc. ASCO, 1999,18, 233a; Douillard et al., Lancet, 2000, 355, 1041-7. U obe studije kombinacija irinotecan/5-FU/leucovorin je pokazala statistički signifikantan porast preživljavanja (od 2,2 i 3,3 meseca), vreme napedovanja bolesti i mere odgovora, u poređenju samo sa 5-Fu/leucovorin-om. Korist od irinotecan-a ima cenu u povećanoj toksičnosti; dodatak irinotecan-a u 5-FU/leucovorin je, prema National Cancer Institute Common Toxicity Criteria (NCI-CTC), povezan sa pojavom dijareje sa ocenom 3-4, povraćanja sa ocenom 3-4, neutropenije sa ocenom 4, i astenijom, u poređenju samo sa 5-FU/leucovorin-om. Postoji takođe dokaz koji pokazuje da irinotecan, kao sam agens, produžava preživljavanje, Cunningham et al, Lancet, 1998, 352, 1413-18; Rougier et al., Lancet., 1998, 352, 1407-12. Dve nasumične studije su pokazale da irinotecan produžava preživljavanje kod pacijenata koji imaju napredovanje bolesti posle terapije sa 5- FU. Jedna studija je poredila irinotecan sa najboljom negom održavanja i pokazalo se produžavanje preživljavanja od 2,8 meseci; druga studija je poredila irinotecan sa infuzionim 5-FU, i pokazala produženje preživljavanja za 2,2 meseca. Pitanje da li irinotecan ima veći efekt na preživljavanje pojedinačno ili kao prateće davanje, nije ispitana na dobro kontrolisan način.

Doziranie i ordiniranie

Antitela i hemoterapeutski agensi iz ovog pronalaska ordiniraju se humanom pacijentu u skladu sa poznatim metodama, kao što su intravenozno ordiniranje, kao bolus ili kao kontinualna infuzija tokom nekog perioda vremena, pa intramuskularno, intraperitonealno, intracerebrospinalno, subkutano, intraartikularno, intrasinovijalno, intratekalno, oralno, površinskim ili inhalacionim putem. Poželjno ordiniranje antitela je intravenozno i subkutano.

U jednoj realizaciji, tretman iz ovog pronalaska je kombinovano ordiniranje anti-VEGF antitela i jednog ili više hemoterapeutskih agenasa. Ovaj pronalazak obuhvata i ordiniranje koktela različitih hemoterapeutskih agenasa. Kombinovano ordiniranje je zajedničko ordiniranje, koje koristi odvojene formulacije ili jedinstvenu farmaceutsku formulaciju i konsekutivno ordiniranje bilo kojim redom, pri čemu je poželjno da postoji period vremena u kome oba (ili svi) aktivni agensi simultano ispoljavaju njihove biološke aktivnosti. Šeme dobijanja i doziranja za takav hemoterapeutski agens mogu da se koriste u skladu sa instrukcijama proizvođača, ili kako je empirijski određeno od strane verziranog stručnjaka. Šeme primanja i doziranja hemoterapije su takođe opisane u ”Chemotherapy Service”, uredn. M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992). Hemoterapeutski agens može da prethodi ili da sledi ordiniranje antitela, ili se može davati istovremeno sa njim.

Za prevenciju ili tretman bolesti, odgovarajuće doziranje antitela će zavisiti od vrste bolesti koja treba da se tretira, koja je ranije definisana, ozbiljnostii toka bolesti, da li se antitelo ordinira u preventivne ili terapeutske svrhe, od prethodne terapije, kliničke istorije pacijenta i odgovora na antitelo, i diskrecije vodećeg lekara. Pogodno je da se antitelo ordinira pacijentu samo jedanput ili kroz seriju tretmana. U režimu kombinacione terapije preparati iz ovog pronalaska se ordiniraju u terapeutski efikasnoj ili sinergističkoj količini. Kako se ovde koristi, terapeutski efikasna količina je ona koja zajedničkim ordiniranjem anti-VEGF antitela i jednog ili više terapeutskih agenasa, ili ordiniranjem preparata iz ovog pronalaska, dovodi do umanjenja ili inhibicije ciljane bolesti ili stanja. Terapeutski sinergistička količina je ona količina anti-VEGF antitela i jednog ili više terapeutskih agenasa koja je neophodna da sinergistički ili signifikantno umanji ili eliminiše stanje ili simptome povezane sa posmatranom bolešću.

Zavisno od vrste i ozbiljnosti bolesti, oko 1 µg/kg do 50 mg/kg (npr.0,1-20 mg/kg) antitela je kandidat za početnu dozu ordiniranja pacijentu, bilo, na primer, kroz jedno ili više odvojenih ordiniranja, ili kontinulanom infuzijom. Tipična dnevna doza se može kretati od oko 1 p/kg do oko 100 mg/kg ili više,

zavisno od gore pomenutih faktora. Za ponovljeno ordiniranje tokom nekoliko dana ili duže, zavisno od stanja, tretman se zadržava dok se ne pojave simptomi željenog suzbijana bolesti. Međutim, od koristi mogu biti i drugačiji režimi doziranja. U poželjnom aspektu, antitelo iz ovog pronalaska se ordinira svakih dve do tri nedelje, sa dozom koja se kreće od oko 5 mg/kg do oko 15 mg/kg. Poželjnije je da se ovakav režim doziranja koristi u kombinaciji sa režimom hemoterapije, kao prvostepene terapije za tretiranje metastaziranog kolorektalnog kancera. U nekim aspektima, hemoterapeutski režim tradicionalno obuhvata povremeno ordiniranje sa visokom dozom. U nekim drugim aspektima, hemoterapeutski agensi se ordiniraju korišćenjem manjih i češćih doza, bez planiranih prekida (”metronomska hemoterapija”). Napredovanje terapije iz ovog pronalaska lako se prati konvencionalnim tehnikama i testovima.

Dalje informacije o podesnim dozama date su u Primerima koji slede.

Efikasnost tretmana

Glavna prednost tretmana iz ovog pronalaska je sposobnost dobijanja zapaženih anti-kancer efekata kod humanog pacijenta, bez izazivanja značajnije toksičnosti ili štetnih efekata, tako da u celini pacijent ima korist od ovog tretmana. Efikasnost tretmana iz ovog pronalaska se može meriti u raznim završnim tačkama, koje se obično koriste za ocenjivanje tretmana kancera, uključujući, ali bez ograničavanja, masu ili smanjivanje veličine tumora, vreme napredovanja, trajanje preživljavanja, napredovanje slobodnog preživljavanja, meru ukupnog odgovora, trajanje odgovora i kvalitet života. Zato što anti-angiogenični agensi iz ovog pronalaska ciljaju na vaskulaturu tumora, a ne nephodno na same ćelije neoplazma, oni predstavljaju jedinstvenu klasu lekova protiv kancera, pa stoga mogu da zahtevaju i jedinstvene mere i definicije kliničkih odgovora na lekove. Na primer, smanjenje tumora za više od 50% u 2-dimenzionalnoj analizi je standardan prekid za deklarisanje odgovora. Međutim, anti-VEGF antitelo iz ovog pronalaska može da izazove inhibiciju širenja metastaze, bez smanjenja primarnog tumora, ili može da pokaže jednostavno tumorostatički efekt. Prema

tome, treba da se koriste novi pristupi određivanju efikasnosti anti-angiogene terapije, uključujući na primer, merenje markera angiogeneze u plazmi ili urinu i merenje odgovora preko radiološkog prikazivanja.

U jednoj realizaciji ovaj pronalazak se može upotrebiti za povećanje trajanja preživljavanja humanog pacijenta podložnog kanceru ili sa dijagnozom kancera. Trajanje preživljavanja se definiše kao vreme od prvog ordiniranja leka do smrti. U poželjnom aspektu, anti-VEGF antitelo iz ovog pronalaska se ordinira humanom pacijenu u kombinaciji sa jednim ili više hemoterapetskih agenasa, čime se trajanje preživljavanja tog pacijenta efikasno povećava, u poređenju sa samo hemoterapijom. Na primer, grupa pacijenata tretirana sa anti-VEGF antitelom, kombinovano sa hemoterapeutskim koktelom od najmanje dva, a poželjno tri hemoterapeutska agensa, ima medijanu trajanja preživljavanja koja je najmanje oko 2 meseca, poželjno između oko 2 i oko 5 meseci duža nego za grupu pacijenata tretiranu samo sa istim hemoterapeutskim koktelom, a pomenuto povećanje je statistički signifikantno. Trajanje preživljavanja se može takođe meriti odnosom pokazatelja opasnosti (HR, od engl. hazard ratio) tretirane grupe u odnosu na kontrolnu grupu, koji predstavlja rizik od smrti pacijenta za vreme tretmana. Poželjno je da kombinovani tretman anti-VEGF antitela i jednog ili više hemoterapeutskih agenasa signifikantno smanjuje rizik od smrti, za najmanje oko 30% (tj. slojeviti HR je oko 0,70), poželjno za najmanje 35% (tj. slojeviti HR je oko 65), kada se poredi samo sa hemoterapijom.

U još jednoj realizaciji, tretman iz ovog pronalaska signifikantno povećava meru odgovora u grupi humanih pacijenata podložnih kanceru ili sa dijagnostikovanim kancerom, koji su tretirani raznim terapeutskim agensima. Mera odgvora se definiše procentom tretiranih pacijenata koji su odgovorili na tretman. U jednom aspektu, kombinovani tretman iz ovog pronalaska, koji koristi anti-VEGF antitelo i jedan ili više hemoterapeutskih agenasa, signifikantno povećava meru odgovora u grupi tretiranih pacijenata, u poređenju sa grupom koja je tretirana

samo hemoterapijom, a pomenuto povećanje ima hi-na-kvadrat p-vrednost manju od 0,005.

U jednom aspektu, ovaj pronalazak daje postupke za povećanje trajanja odgovora u grupi humanih pacijenata ili u grupi humanih pacijenata podložnih kanceru ili sa dijagnostikovanim kancerom. Trajanje odgovora se definiše vremenom od početnog odgovora do napredovanja bolesti. U kombinovanom tretmanu iz ovog pronalaska, koji koristi anti-VEGF antitelo i jedan ili više hemoterapeutskih agenasa, dobijen je poželjan statistički signifikantan porast od najmanje 2 meseca u trajanju odgovora.

Bezbednost tretmana

Ovaj pronalazak daje postupke za efikasno tretiranje kancera, bez značajnih štetnih efekata za humanog pacijenta koji predstavlja predmet tretmana. Klinički ishodi tretmana iz ovog pronalaska su donekle neočekivani, po tome što štetni efekti, za koje se mislilo da su povezani sa anti-angiogenim terapijama, nisu opaženi tokom tretmana u skladu sa ovim pronalaskom. Na primer, ranija klinička ispitivanja su ukazivala da tretman sa anti-VEGF antitelima može da izazove trombozu (koja u nekim slučajevima može biti fatalna), hipertenziju, proteinuriju i epistaksu (krvarenje iz nosa). Međutim, kombinovana terapija iz ovog pronalaska, koja koristi anti-VEGF antitelo kombinovano sa hemoterapijskim koktelom, koji sadrži najmanje dva, a poželjno tri hemoterapeutska agensa, ne povećava značajno pojavu ovih štetnih događanja, kada se poredi sa samom hemoterapijom. Dakle, tretman iz ovog pronalaska neočekivano sadrži sporedne efekte na prihvatljivom nivou, a istovremeno signifikantno poboljšava efikasnost protiv kancera.

V. Proizvodni artikli

U sledećoj realizaciji ovog pronalaska, daje se proizvodni artikl, koji sadrži materijale korisne u tretmanu gore opisanih poremećaja. Ovaj proizvodni artikl se sastoji od kontejnera, nalepnice i umetka pakovanja. Pogodni kontejneri su na primer, bočice, fiole, špricevi itd. Ovi kontejneri se mogu praviti od raznih materijala, kao što su staklo i plastika. Ovaj kontejner sadrži preparat koji je efikasan za tretiranje stanja i može imati sterilni pristupni ulaz (na primer, kontejner može biti kesa ili fiola za intravenozni rastvor, koja ima zapušač koji se može probosti sa iglom za hipodermične injekcije). Najmanje jedan aktivni agens u ovom preparatu je anti-VEGF antitelo. Nalepnica na njemu, ili povezana sa kontejnerom ukazuje da se taj preparat upotrebljava za tretiranje odabranog stanja. Ovaj proizvodni artikl može još da sadrži i drugi kontejner, koji sadrži farmaceutski prihvatljiv pufer, kao što je slani fosfatni pufer, Ringer-ov rastvor ili rastvor dekstroze. On može da sadrži i druge materijale, poželjne sa komercijalnog stanovišta i stanovišta korisnika, uključujući druge pufere, razblaživače, filtre, igle i špriceve. Pored toga, ovaj proizvodni artikl sadrži umetak pakovanja sa uputstvima za upotrebu, uključujući na primer, upozorenje da se taj preparat ne sme upotrebljavati u kombinaciji sa anticiklinskom vrstom hemoterapeutskog agensa, npr. doksorubicinom ili epirubicinom, ili upućuje korisnika tog preparata, da se pacijentu ordinira preparat anti-VEGF antitela, kao jedan preparat protiv neoplazma.

Deponovani materijali

Sledeći soj ćelija hibridoma je deponovan, u skladu sa odredbama Budapest Treaty i sa American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, USA:

Oznaka antitela ATCC No. Datum deponovanja

A4.6.1 ATCC HB-10709 29. mart 1991.

Namera je da sledeći primeri samo ilustruju praktikovanje ovog pronalaska, a ne da se daju kao ograničenje. Opisi svih patenata i naučne literature koji su ovde citirani, izričito su, u celini priključeni kroz citat.

VI. Primeri

Primer 1

Dodavanje anti-VEGF antitela u injekciju Irinotecan/Fluorouracil/Leucovorin u prvostepni metastazirani koiorektalni kancer

Sprovedena je Faza III aktivno kontrolisanog, u više centara, nasumičnog ispitivanja, da se oceni efikasnost i bezbednost bevacizumab-a, kada se daje u standardnoj pvostepenoj terapiji, koja se koristi u tretiranju metastaziranog kolorektanog kancera. Ovo ispitivanje je uključilo preko 900 pacijenata, sa histološki potvrđenim, prethodno netretiranim, dvodimenzionalnim, merljivim metastaziranim kolorektalnim kancerom.

Metode i materijali Anti-VEGF

antitelo bevacizumab

Anti-VEGF antitelo "Bevacizumab (BV)”, poznato takođe kao "rhuMAb VEGF” ili ”Avastin<™”,>je rekombinantno humanizovano anti-VEGF monoklonalno antitelo, generisano u skladu sa postupkom koji su dali Presta et al., Cancer Res., 1997, 57, 4593-4599. Ono sadrži regione mutiranog humanog skeleta lgG1 i regione za vezivanje antigena koji određuju komplementarnost, iz mišjeg anti-hVEGF monoklonalnog antitela A4.6.1, koje blokira vezivanje humanog VEGF za njegove receptore. U.S. Patent No. 6,582,959; WO 98/45331. Približno 93% sekvencije aminokiselina bevacizumaba, uključujući glavninu regiona skeleta, je izvedeno iz humanog lgG1, a oko 7% sekvencije je izvedeno iz mišjeg antitela A4.6.1. Bevacizumab ima masu molekula od oko 149.000 daltona i glikozilovan je.

Identiteti polipetida i glikozilovanih mesta su izvedeni iz sastava aminokiselina i mape peptida. Karakteristike veličine i naboja ovog molekula i čistoća kliničkih šarži je demonstrirana pomoću natrijum-dodecilsulfat-poliakrilamidne gelelektroforeze, ili kapilarne elektroforeze sejanja ne-gela, izoelektričnim fokusiranjem, kao i izmenom jona i hromatografijom sa izdvajanjem po veličini. Aktivnost bevacizumaba je kvantitativno određena pomoću testa vezivanja imunosorbenta spojenog sa enzimom, ili testa receptora kinaze za rekombinantni humani VEGF.

Bevaciumab je dobijen tehnologijom rekombinantne DNK, koristeći genetskim inžinjeringom skrojen soj ćelija jajnika kineskog hrčka. Ovaj protein se očisti od medijuma kulture ćelije rutinskim metodama hromatografije na koloni i filtriranjem. Konačni proizvod se tesira na kvalitet, identitet, sigurnost, čistoću, snagu, jačinu i dodatke/hemijski sastav, u skladu sa uputstvima U. S. Food and Drug Administration. Čistoća bevacizumaba je >95%. Bevacizumab se isporučuje kao bistra do blago opalescentna sterilna tečnost, spremna za parenteralno ordiniranje.

Izbor pacijenata

Pogodni pacijenti imaju histološki potvrđen metastazirani kolorektalni karcinom, sa dvodimenzionalno merljivim oboljenjem. Drugi kriterijumi za uključivanje su starost od najmanje 18 godina, Eastern Cooperative Oncology Group (ECOG) status učinka 0 ili 1 (Oken et al., Am. J. Clin. Oncol., 1982, 5, 649-55), očekivano trajanje života više od tri meseca i pismena informacija o saglasnosti. Takođe je zahtevana adekvatna hematološka, hepatička u renalna funkcija (uključujući urinarno izlučivanje ne više od 500 mg proteina na dan).

Kriterijumi za isključivanje su obuhvatili prethodnu hemoterapiju ili biološku terapiju za metastaze oboljenja (adjuvantna i radiosenzibilna upotreba fluoropirimidina, sa ili bez leucovorina ili levamisola, više od 12 meseci pre nego je dozvoljen pristup ispitivanju), potvrda o radioterapiji 14 dana pre početka tretmana ovog ispitivanja, veći hirurški zahvat 28 dana pre početka tretmana ovog ispitivanja, klinički signifikantna kardiovaskularna bolest, klinički ustanovljen ascit, trudnoća ili dojenje, regularna upotreba aspirina (više od 325 mg na dan) ili druog ne-steroidnog antiinflamatornog agensa, urođena predispozicija krvarenja ili koagulopatije, ili potreba za celom dozom za antikoagulaciju, i poznate metastaze centralnog nervnog sistema.

Plan ispitivanja

Prihvaćeni pacijenti su uključeni u tretman uz upotrebu dinamičkog algoritma slučajnog usrednjavanja, koji je načinjen da se postigne ukupna ravnoteža između grupa; usrednjavanje je raslojeno prema ispitivačkom centru, prema osnovnim podacima ECOG statusa učinka (0 prema 1), mestu primarne bolesti (debelo crevo ili rektum) i broja metastaziranih mesta (jedno prema više od jednog).

Na početku, pacijenti su nasumično raspoređeni u odnosu 1:1:1 za primanje IFL plus placebo, IFL plus bevacizumab ili fluorouracil i leucovorin plus bevacizumab (Tabela 1), a svaki je nastavio terapiju do napredovanja bolesti, ili pojave neprihvatljivih štetnih efekata, ili maksimalno do 96 nedelja.

Privremeno analiza je planirana da se obavi pošto 300 pacijenata prođe usrednjavanje, kada je potpunim uvidom odbor za praćenje potpunim uvidom nezavisnih podataka ocenjivao bezbednost termana IFL plus bevacizumab, na bazi svih dostupnih informacija o bezbednosti, uključujući broj smrti u svakoj grupi, ali bez informacija povezanih sa odgovorom tumora. Ako je ovaj odbor za praćenje podataka ne bi našao neobična štetna događanja koja bi se mogla

pripisati dodavanju bevacizumaba u IFL, upisivanje pacijenata u grupu namenjenu primanju fluorouracila i leucovorina plus bevacuzumab je prekinuto, a dodatni pacijenti su nasumično, u odnosu 1:1, imenovani da primaju ili IFL plus placebo, ili IFL plus bevacizumab, Međutim, ukoliko je odbor za praćenje podataka zaključio da je profil bezbednosti za IFL plus bevaciumab bio neprihvatljiv, imenovanja za taj tretman su prekidana, a pacijenti su umesto toga nasumično imenovani, u odnosu 1:1, za primanje ili kombinacije fluorouracila i leucovorina plus bevacizumab, ili IFL plus placebo.

Odgovori i napredovanje tumora je određivano korišćenjem Kriterijuma za ocenjivanje odgovora čvrstih tumora. Therasse et al., J. Natl. Cancer Inst., 2000, 92, 205-16. U vreme kada bolest napreduje, otkrije se pacijentu angažovanje za tretman, pa mu se može ponuditi drugostepeni tretman. Ovi pacijenti u grupi angažovanoj za tretman koja sadrži bevacizumab, imali su opciju da nastave sa bevacizumabom tokom drugostepenog tretmana. Nisu dozvoljeni prelazi u grupi kojoj je davan IFL plus placebo. Pacijenti angažovani za tretman koji sadrži bevacizumab nisu imali znake progresivne bolesti na kraju perioda ispitivanja od 96 nedelja i mogli su da nastave sa primanjem bevacizumaba u odvojenom nastavku ispitivanja. Pacijenti u grupi koja je primala bevacizumab, kojima je potvrđen kompletan odgovor ili neprihvatljivi štetni efekti od hemoterapije, mogli su da prekinu hemoterapiju i primaju samo bevacizumab.

Bevacizumab (ili placebo) je ordiniran istovremeno sa hemoterapijom. Doze bevacizumaba i hemoterapije su preračunavane, ako se menjala masa pacijenata najmanje za 10 procenata tokom ovog ispitivanja. Standardne modifikacije doze unutar ciklusa i između ciklusa, bile su dozvoljene za irinotecan i fluorouracil (prema umetku u pakovanju), kod pacijenata sa štetnim efektima povezanim sa tretmanom. Doze leucovorina i bevacizumaba nisu menjane.

U analizi preživljavanja i naknadnog tretmana, svi pacijenti su praćeni do smrti, prestanka praćenja ili završetka ispitivanja.

Procene

Posle određivanja polazne osnove, stanje tumora je ocenjivano svakih 6 nedelja tokom prve 24 nedelje ispitivanja, a zatim na svakih 12 nedelja tokom preostalog dela terapije. Svi potpuni i delimični odgovori su zahtevali potvrdu najmanje 4 nedelje nakon što su prvi put opaženi.

Bezbednost je ocenjivana na osnovu izveštaja o štetnim događanjima, rezultatima laboratorijskih testova i merenjima znakova vitalnosti. Štetni efekti su podeljeni u kategorije u skladu sa Uobičajenim kriterijumima toksičnosti iz National Cancer Institute, verzija 2, gde 1. stepen ukazuje na blage štetne efekte,

2. stepen na umerene štetne efekte, a 3. stepen na ozbiljne štetne efekte, dok 4. stepen na štetne efekte koji ugrožavaju život. Prethodno specificirane mere bezbednosti bile su uključene u pojavu svih štetnih efekata, svih ozbiljno štetnih efekata i štetnih efekata koji su bili povezani sa bevacizumabom - hipertenzija, tromboza, krvarenje 3. i 4. stepena i proteinurija, kao i dijareja 3. i 4. stepena, i promene u odnosu na polaznu osnovu u raznim laboratorijskim vrednostima i znacima vitalnosti.

Da bi se pratila bezbednost režima IFL plus placebo i IFL plus bevacizumab tokom čitavog ispitivanja su praćeni pojava smrti, ozbiljno štetnih efekata, dijareje 3. ili 4. stepena, krvarenja 3. ili 4. stepena iz bilo kog izvora, i tromboza, u odboru za praćenje kroz potpuni uvid u podatke o bezbednosti, ili do završetka regrutovanja ili do vremena privremene analize efikasnosti.

Statistička analiza

Primarna mera rezultata bilo je trajanje ukupnog preživljavanja; preživljavanje je mereno bez obzira na naknadne tretmane. Nije bilo ukrštanja između grupa. Korišćene su tehnike analize preživljavanja, kao što je Kaplan-Meier-ova metoda, test log-položaja u redu, i Cox-ov model proporcionalne opasnosti. Sekundarne mere rezultata bile su preživljavanje bez progresije, objektivne mere odgovora (potpuni i delimični odgovori), tajanje odgovora i kvalitet života.

Za pacijente koji su bili živi u vremenu analize, podaci o preživljavanju su bili cenzurisani u vreme poslednjeg kontakta. Preživljavanje bez napredovanja se definiše vremenom od usrednjavanja do napredovanja bolesti ili smtri tokom ispitivanja, stim što je smrt tokom ispitivanja definisana kao bilo koja smrt koja se dogodila unutar 30 dana posle poslednje doze bevacizumaba ili hemoterapije. Za pacijente bez napredovanja bolesti u vremenu završetka analize, podaci o preživljavanju bez napredovanja su cenzurisani sa poslednjim ocenjivanjem satusa tumora, ili sa nultim danom, ukoliko ocenjivanje nije obavljano posle polazne osnove. Pacijenti bez adekvatnih podataka o praćenju bili su kategorisani kao da nemaju odgovor.

Da bi se detektovao pokazatelj opasnosti od 0,75 za smrt u grupi kojoj je davan IFL plus bevacizumab, u poređenju sa kontrolnom grupom, zahtevano je približno 385 smrti. Sva izračunavanja su obavljena sa testom log-položaja u grupi i sadržala su dvostrane P vrednosti, sa alfa-vrednošću od 0,05, statističkom snagom 80 procenata i jednom privremenom analizom efikasnosti.

Privremene analize su obavljane na način potpunog uvida. Privremena analiza bezbednosti je sprovedena posle nasumičnog ocenjivanja približno 100 pacijenata u svakoj grupi. Druga privremena analiza bezbednosti i efikasnosti je obavljena pošto su se dogodile 193 smrti (polovina od zahtevanog broja slučajeva).

Analize efikasnosti su obavljene u skladu sa principom namera-prema-tretmanu. Analize bezbednosti su obuhvatile sve pacijente koji su primili bar jednu dozu ispitivane medikacije.

Rezultati

Karakteristike pacijenata

Tokom perioda od oko dvadeset meseci, 923 pacijenta je podvrgnuto nasumičnom usrednjavanju na 164 mesta u SAD, Australiji i Novom Zelandu.

Pošto je 313 pacijenata nasumično imenovano u jednu od tri grupe, 100 za IFL plus placebo, 103 za IFL plus bevacizumab i 110 za fluorouracil, leucovorin i bevacizumab - imenovanja u grupu kojoj je davan fluorouracil, leucovorin i bevacizumab su zaustavljena (rezultati za ovu grupu nisu objavljeni). Protokol je zahtevao ovaj korak posle prve privemene analize bezbednosti, kada je zaključeno da režim IFL plus bevacizumab ima prihvatljiv profil bezbednosti i da se imenovanja u ovu grupu mogu nastaviti.

Analiza namera-prema-tretmanu primarnog završetka ukupnog preživljavanja je obuhvatila 411 pacijenata u grupi IFL plus placebo, a 402 pacijenta u grupi kojoj je davan IFL plus bevacizumab, Tabela 2 pokazuje odabrane demografske i polazne-osnovne karakteristike, koje su dobro uravnotežene između grupa. Slični brojevi pacijenata u svakoj grupi su za one koji su imali pethodno hirurški zahvat ili su primili terapiju zračenja, ili adjuvantnu hemoterapiju za kolorektalni kancer.

Tretman

Medijana trajanja terapije bila je 27,6 nedelja za grupu kojoj je davan IFL plus placebo, a 40,4 nedelje za grupu kojoj je davan IFL plus bevacizumab. Procenat planirane doze irinotecana, koji je davan, bio je sličan u ove dve grupe (78 % u grupi kojoj jedavan IFL plus placebo, i 73% u grupi kojoj je davan IFL plus bevacizumab).

Sa danom prestanka dobijanja podataka, 33 pacijenta iz grupe kojoj je davan IFL plus placebo i 71 iz grupe kojoj je davan IFL plus bevacizumab, još uvek su uzimali propisanu inicijalnu terapiju. Mere upotrebe drugostepenih terapija , koje su mogle da utiču na preživljavanje, kao što su oxaliplatin ili metastazektomija, dobro su uravnotežene između ove dve grupe. U obe grupe približno 50 procenata pacijenata je primalo neki oblik drugostepene terapije; 25 procenata svih pacijenata primalo je oxaliplatin, a manje od 2 procenta pacijenata je podvrgnuto metastazektomiji.

Efikasnost

Medijana trajanja ukupnog preživljavanja, primarna završna tačka, je signifikantno duža za grupu kojoj je davan IFL plus bevacizumab, nego za grupu kojoj je davan IFL plus placebo (20,3 meseca u odnosu na 15,6 meseci), što odgovara pokazatelju opasnosti od smrti od 0,66 (P<0,001) (Tabela 3 i Slika 1), ili smanjenju od 34 % rizika od smrti u grupi sa bevacizumabom. Mera jednogodišnjeg preživljavanja je 74,3 % u grupi kojoj je davan IFL plus bevacizmab, a 63,4 % u grupi kojoj je davan IFL plus placebo (P<0,001). U podgrupi pacijenata koja je primala drugostepeni tretman sa oxaliplatin-om,

medijana trajanja ukupnog preživljavanja bila je 25,1 mesec u grupi kojoj je davan IFL plus bevacizumab, a 22,2 meseca u grupi kojoj je davan IFL plus placebo.

Dodavanje bevacizumaba u IFL je povezano sa povećanjem medijane trajanja preživljavanja bez napredovanja (10,6 meseci u odnosu na 6,2 meseca; pokazatelj opasnosti za napredovanje je 0,54, u poređenju sa grupom kojoj je davan IFL plus placebo; P<0,001); mera odgovora (44,8% u odnosu na 34,8%; P=0,004); i medijana trajanja odgovora (10,4 meseca prema 7,1 meseci; pokazatelj opasnosti za napredovanje je 0,62; P=0,001) (Tabela 3). Slika 2 pokazuje Kaplan-Meier-ove procene preživljavanja bez napredovanja. Efekti tretmana su saglasni u prethodno naznačenim grupama, uključujući one koje su definisane prema starosti, polu, rasi, statusu učinka prema ECOG, lokaciji primarnog tumora, prisustvu ili odsustvu prethodne adjuvantne terapije, trajanju metastazirane bolesti, broju metastaziranih mesta, godinama dijagnoze kolorektalnog kancera, prisustva ili odsustva prethodne radioterapije, tereta osnovnog podatka za tumor i koncentracija albumina, alkalne fosfataze i laktat dehidrogenaze u serumu.

Bezbednost

Tabela 4 predstavlja pojavu odabranih štetnih efekata 3. i 4. stepena, za vreme propisanog tretmana, bez podešavanja za medijanu trajanja terapije (27,6 nedelja za grupu kojoj je davan IFL plus placebo i 40,4 nedelje za grupu kojo je davan IFL plus bevacizmab). Pojava bilo kog od štetnih efekata 3. ili 4. stepena bila je približno za 10 procentnih poena viša među pacijentima koji su primali UFL plus bevacizumab, nego kod pacijenata koji su primali IFL plus placebo, većinom zahvaljujući porastu pojave hipertenzije 3. stepena (koja je zahtevala tretman) i malom porastu pojave dijareje i leukopenije 4. stepena. Međutim, ne postoji signifikantna razlika u pojavi štetnih efekata koji dovode do hospitalizacije ili do prekidanja ispitivanog tretmana, ili u meri 60-dnevne smrti usled bilo kog razloga.

Prva i druga faza ispitivanja je identifikovala štetne efekte, koji su možda povezani sa bevacizumabom: hemoragiju, tromboemboliu, proteinuriju i hipertenziju. Međutim, u ovom ispitivanju, samo je pojava hipertenzije jasno porasla u grupi kojoj je davan IFL plus bevacizumab, u poređenju sa grupom kojoj je davan IFL plus placebo. Sve epizode hipertenzije su bile pogodne za tretman sa standardnim oralnim antihipertenzivnim agensima (npr. blokatorima kalcijumovog kanala, inhibitorima enzima za konverziju angiotenzina i diureticima). Nije bilo prekida u terapiji sa bevacizumabom, hipertenzivnih kriza, ili smrti povezanih sa hipertenzijom, kod grupe sa bevacizumabom.

Mere proteinurije 2. i 3. stepena (nije bilo epizoda proteinurije 4. stepena ili nefrotičkog sindroma), i krvarenja 3. i 4. stepena u bilo kom od slučajeva, bile su slične u ove dve grupe, mada su sva tri slučaja krvarenja 4. stepena bila u grupi IFL plus bevacuzumab. Pojava svih venskih i arterijskih trombolitičkih događanja iznosila je 10,4 % u grupi kojoj je davan IFL plus bevacizumab, a 16,2 % u grupi kojoj je davan IFL plus placebo (P=0,26).

Gastrointestinalna perforacija se dogodila kod 6 pacijenata (,15 %) koji su primali IFL plus bevacizumab. Jedan pacijent je umro kao direktna poseldica ovog događanja, dok se drugih pet oporavilo (troje od njih je bilo u stanju da ponovo počne tretman, bez naknadnih komplikacija). Od šestoro pacijenata sa perforacijom, troje je imalo potpun ili delimičan odgovor na IFL plus bevacizumab. Faktori, različiti od ispitivanog tretmana, koji mogu biti povezani sa gastrointestinalnom perforacijom su hirirgija debelog creva unutar prethodna dva meseca, kod dva pacijenta, i bolest peptičkog čira kod jednog pacijenta.

Rezultati III faze studije daju direktnu potvrdu širokoj upotrebi anti-angiogenih agenasa u tretmanu kancera. Dodatak bevacizumaba, anti-VEGF antitela, hemoterapiji IFL, potvrđuje klinički i statistički značajno poboljšanje pacijenata sa kancerom, mereno na primer, ukupnim preživljavanjem, preživljavanjem bez napredovanja, merom odgovora i trajanja odgovora. Povećanje od 4,7 meseci medijane trajanja preživljavanja, pripisano bevacizumabu, je veliko, veće nego što je opaženo u bilo kojoj 3. fazi tretmana kolorekatalnog kancera. Goldberg et al., J. Clin. Oncoi, 2004, 22, 23-30. Medijana preživljavanja od 20,3 meseca, kod populacije tretirane sa bevacizumabom, dogodila se uprkos ograničene dostupnosti oxalilplatin-e za drugostepenu terapiju, tokom ovog ispitivanja.

U poređenju samo sa IFL, režim IFL plus bevacizumab je povećao preživljavanje bez napredovanja sa medijane od 6,2 meseca, na 10,6 meseci, ukupnu meru preživljanjavnja sa 34,8 % na 44,8 % i medijanu trajanja odgovora sa 7,1 meseci na 10,4 meseca. Ova poboljšanja su klinički značajna. Nije predviđeno da će apsolutno poboljšanje u meri odgovora od 10 % sa IFL plus bevacizumab, biti povezano sa povećanjem preživljavanja ove veličine. Ovo opažanje ukazuje da je primarni mehanizam bevacizumaba inhibicija rasta, a ne citoredukcija.

Ova klinička korist je praćena relativno skromnim povećanjem sporednih efekata usled tretmana, sa kojima se lako operiše. Postoji apsolutni porast od približno 10 % u ukupnim pojavama štetnih efekata 3. i 4. stepena, koji se većinom mogu pripisati hipertenziji koja zahteva tretman, dijareji i leukopeniji. Dodavanjem bevacizumaba u IFL nije signifikantno porasla mera smrti unutar 60 dana, iz bilo kog razloga, hospitalizacija ili prekid tretmana.

Prethodna 1. i 2. faza kliničkog tretmana su ukazale da tretman sa bevacizumabom, samim ili sa hemoterapijom, dovodi do pojave tromboze, krvarenja, proteinurije i hipertenzije. Kabbinavar et al., J. Clin. Oncol., 2003, 2A, 60-65; Yang et al., New Eng. J. Med., 2003, 349, 427-34. Sa izuzetkom hipertenzije, višak ovih sporednih efekata nije pronađan, u poređenju sa njihovim javljanjem u grupi kojoj je davan IFL plus placebo, čime se ističe značaj nasumičnih placebo-kontrolisanih ispitivanja za ocenjivanje bezbednosti i efikasnosti. Jedan novi potencijalno štetan efekat koji se dogodio, bilo je gastrointestinalno krvarenje. Ova komplikacija je neuobičajena i ima varijabilne kliničke prezentacije. Ozbiljne komplikacije utrobe, naročito kod pacijenata sa

neutropenijom, objavljene su za IFL i druge režime hemoterapije kolorektalnog kancera, a u jednoj seriji, objavljene su fistule kod preko 2% pacijenata tretiranih sa režimima na bazi fluorouracila. Saltz et al, New Engl. J. Med., 2000, 343, 905- 914; Rithenberg et al., J. Clin.Oncol., 2001, 19, 3801-7; Tebbutt et al., Gut, 2003, 52, 568-73. Ovo se nije dogodilo u grupi kojoj je davan IFL plus placebo, dok je opaženo šest slučajeva u grupi kojoj je davan IFL plus bevacizumab (1,5 %), ponekad pri pojavi ukupnih odgovora na tumor. Mada je troje od šestoro pacijenata bilo u stanju da ponovo počne tretman, bez naknadnih komplikacija, jedan pacijent je umro, a dva su trajno prekinula terapiju, kao posledica ovih komplikacija.

Mada su prethodna ispitivanja na životinjama i rane faze kliničkih ispitivanja ukazivali na upotrebu anti-angiogene terapije u tretiranju kancera, ovo ispitivanje je pokazalo po pvri put da upotreba angiogenog inhibitora, kao što je anti-VEGF antitelo, zaista dovodi do statistički signifikantnih i klinički značajnih korisnih rezultata za pacijente od kancera.

Primer 2

Dodavanje Bevacizumaba u bolus injekciiu 5-FU/Leucovorin

prvostepenog metastaziranog kolorektalnog kancera

Ova II faza nasumičnog ispitivanja poredi bevacizumab plus 5-fluorouracil i leucovorin (5-FU/LV) sa placebo plus 5-FU/LV, kao prvostepenom terapijom kod pacijenata koji se smatraju ne-optimalnim kandidatima za prvostepeno ordiniranje irinotecana.

Patenti i postupci

Podobnost pacijenata

Pacijenti sa histološki potvrđenim, ranije netretiranim, merljivo metastaziranim kolorektalnim kancerom su podobni, iako prema proceni ovog pronalazača, nisu optimalni kandidati za prvostepenu terapiju koja sadrži irinotecan, a imaju najmanje jednu od sledećih karakteristika: starost iznad 65 godina, ECOG PS 1 ili 2, serumski albumin jednak ili manji od 3,5 g/dL, ili prethodnu radioterapiju abdomena i karlice. Pacijenti su isključeni ukoliko su bili podvrgnuti većim hirurškim zahvatima ili otvorenoj biopsiji, ili su imali značajnu traumatsku povredu unutar 28 dana pre početka ispitivanja; predviđen veći hirurški zahvat tokom trajanja ovog ispitivanja; trenutno koriste ili su nedavno koristili terapeutske antikoagulante (izuzev ako se zahtevaju za preparirani kateter), trombolitičku terapiju ili hronični, svakodnevni tretman aspirinom (≥325 mg/dan), ili nesteroidne anti-inflamatorne indikacije; imaju ozbiljnu ranu, koja ne zarasta, čir ili frakturu kosti; imaju istoriju ili dokaz o metastazama u CNS; su trudni ili u fazi dojenja; ili imaju proteinuriju ili klinički značajno poremećenu osnovnu renalnu funkciju. Svi pacijenti su dali pisanu saglasnost za njihovo učešće.

Plan ispitivanja i tretmani

Korišćen je sistem interaktivnog odgovora na glas da bi se nasumično rasporedili podobni pacijenti u jednu od dve grupe za tretman: 5-FU/LV plus placebo ili 5-FU/LV plus Bevacizumab. Korišćen je dinamički algoritam nasumičnosti da se postigne ukupna ravnoteža unutar svake od sledećih kategorija: centar ispitivanja, osnovni podatak za status učinka prema ECOG (0 prema ≥1), mesto primarne bolesti (debelo crevo ili rektum) i broj mesta metastaza (1 prema >1). Tretman 5-FU/LV, sastojao se od 500 mg/m<2>LV tokom 2 h i 500 mg/m<2>5-FU kao bolus usred infuzije LV (režim Rosvvell Park-a; Petrelli et al., J. Clin. Oncol, 1989, 7, 1419-1426), ordiniran svaki dan nedeljno, tokom prvih 6 nedelja svakog ciklusa od 8 nedelja. Hemoterapija je nastavljena do završetka ispitivanja (96 nedelja) ili napredovanja bolesti. Bevacizumab, 5 mg/kg ili placebo, ordinirani su svakih 2 nedelje. Pacijentima u grupi sa bevacizumabom, koji su imali potvrđen kompletan odgovor ili su iskusili neprihvatljivu toksičnost, kao rezultat tretmana hemoterapijom, bilo je dozvoljeno da prekinu sa 5-FU/LV, i nastave primanje samo bevacizumaba kao prvostepenog tretmana. U vreme napredovanja bolesti, pacijentima je bila objašnjena njihova saglasnost za tretman, pa su mogli primati bilo koji drugostepeni tretman, po izboru istraživača. Samo pacijenti koji su

nasumično bili odabrani za grupu bevacizumaba, mogli su primati bevacizumab kao komponentu drugostepenog tremana. Po završetku isptivanja, pacijenti su praćeni u pogledu bilo kakvog naknadnog tretmana i preživljavanja, svakih 4 meseca, do smrti, prestanka praćenja ili zavreštka ispitivanja.

Ocene ispitivanja

Pacijenti su podvrgavani oceni stanja tumora na početku, kao osnovni podatak, i po završetku svakog ciklusa od 8 nedelja, koristeći odgovrajuće radiografske tehnike, tipično spiralni CT skener. Odgovor tumora, ili napredovanje je određivao i istraživač i nezavisna radiološka služba (NRS), koristeći kriterijume za ocenu odgovora čvrstih tumora, koje su dali Therasse et al. (2000). Ocenjivanje u NRS je obavljano bez znanja o saglasnosti za tretman ili procene istraživača. Pored toga, pacijenti su ispunjavali upitnik Functional Assesment of Cancer Therapy -Colorectal (FACT-CO), Verzija 4, što je valjano pomagalo u oceni kvaliteta života (QOL) kod pacijenata sa kolorektalnim kancerom, na početku i pre svakog ciklusa tretmana, dok je napredovala bolest. Ward et al., Qual. Life Res., 1999, 8, 181-195.

Bezbednost je ocenjivana iz izveštaja o štetnim efektima, iz laboratorijskih rezultata testa i merenja vitalnih znakova. Štetni efekti i abnormalni laboratorijski rezultati su kategorisani, korišćenjem kriterijuma iz National Cancer Institute Common Toxicity Criteria NCI-CTC), Version 2. Pethodno specificirane mere bezbednosti su obuhvatale četiri štetna događanja od posebnog interesa (hipertenzija, proteinurija, tromboza i krvarenje), na bazi nalaza prethodnih kliničkih ispitivanja bevacizumaba.

Statistička analiza

Mera primarnog ishoda je trajanje ukupnog preživljavanja. Mere sekundarnog ishoda su preživljavanje bez napredovanja bolesti, mera objektivnog odgovora (kompletnog i delimičnog), trajanje odgovora i promena FACT-C QOL rezultata. Trajanje preživljavanja se definiše kao vreme od nasumičnog usrednjavanja do smrti. Za žive pacijente u vreme analize, trajanje preživljavanja se cenzuriše sa datumom poslednjeg kontakta. Preživljavanje bez napredovanja bolesti se definiše kao vreme od nasumičnog usrednjavanja do početka napredovanja bolesti, a smrt prilikom ispitivanja se definiše kao smrt usled bilo kog uzroka unutar 30 dana od poslednje doze ispitivanog leka ili hemoterapije. Za žive pacijente, bez napredovanja bolesti u vreme analize, preživljavanje bez napredovanja se cenzuriše sa poslednjim ocenjivanjem tumora, ili sa 1. danom ispitivanog tretmana, ukoliko nije obavljeno ocenjivanje nakon polaznog- osnovnog. U analizi objektivnog odgovora, pacijenti bez ocene tumora su kategorisani kao oni bez odgovora. Napredovanje bolesti i analize odgovora su zasnovane na ocenama IRF. Promena u kvalitetu života je analizirana kao vreme do pogoršanja u QOL (TDQ), definisano dužinom vremena od nasumičnog usrednjavanja do najranijeg smanjenja od ≥3-stepena ispod polazne osnove, na skali kancera debelog creva specifične pod-skale FACT-C (CCS) za napredovanje bolesti ili smrti tokom ispitivanja. TDQ se takođe određuje za TOI- C (zbir CCS, fizičkog i funkcionalnog zadovoljstva) i za ukupan FACT-C za promene od polazne osnove za 7 do 9 stepni, respektivno.

Da bi se detektovao pokazatelj opasnosti od 0,61 za smrt u grupi 5-FU/LV/ bevacizumab, relativno prema grupi 5-FU/LV/placebo, bilo je potrebno približno 133 smrti. Za računanja je predpostavljen dvodelni test, log-poredak, pri nivou signifikantnosti od 0,05, sa 80% snage, i dve privremene analize. Privremene analize su sprovedene pomoću potpunog uvida u nezavisne podatke odbora za praćenje podataka (DMC). Privremena analiza bezbednosti je sprovedena posle 44 smrti, a druga analiza bezbednosti i efikasnosti je obavljena posle 89 smrti. Privremena analiza efikasnosti je kontrolisana od strane formalne grupe za pravila sekvencijalnog zaustavljanja, zasnovanog na O’Brien-Fleming-ovoj potrošnoj funkciji. Kaplan-Meier-ova metodologija je primenjena kod procene medijane preživljavanja, preživljavanja bez napredovanja i trajanja vremena odgovora za svaku grupu ovog tretmana. Pokazatelji opasnosti za grupu sa bevacizumabom, relativno prema grupi sa placebom, određivani su korišćenjem

slojevitog Cox-ovog modela proporcionalnih opasnosti. Dvostrani, slojeviti logpozicije test je korišćen pri poređenju ove dve grupe. Slojevita analiza obuhvata polaznu osnovu statusa učinka prema ECOG, mesto primarne bolesti i broj metastaziranih mesta. Mere objektivnog odgovora su poređene pomoću testa hina-kvadrat. Kao analiza za ispitivanje, Cox-ov model proporcionalnih opasnosti je korišćen za procenu efekta faktora rizika na modifikacije efekta tretmana za trajanje preživljavanja i preživljavanje bez napredovanja. Analize efikasnosti su obavljane na populaciji namera-za-tretman, definisanoj nasumično usrednjenim pacijentima. Analize bezbednosti su obuhvatile sve pacijente koji su primili bar jednu dozu ispitivanog leka.

Rezultati

Karakteristike pacijenata

U periodu od 23 meseca, 209 pacijenata je nasumično usrednjeno na 60 mesta u SAD i Australiji/Novom Zelandu. Za analizu namera-za-tretman primarne završne tačke (ukupno preživljavanje) bilo je 105 pacijenata u grupi 5-FU/LV/placebo i 104 pacijenta u grupi 5-FU/LV/bevacizumab. Odabrane demografske i polazne osnovne karakteristike, slične onima iz Primera 1, razumno su uravnotežene između tretiranih grupa. Niski serumski albumin (≤3,5 g/dL) u polaznoj osnovi, bio je manje uobičajen u grupi sa bevacizumabom, nego u placebo grupi.

Tretman

Medijana trajanja terapije bila je 23 nedelje u grupi 5-FU/LV/placebo, a 31 nedelju u grupi 5-FU/LV/bevacizumab, a jačina doze 5-FU (procent od planirane doze 5-FU koji je stvarno primljen) u dve grupe bila je slična (92% prema 84%), tokom trajanja kursa. Sa danom prekida, 1 pacijent u grupi 5-FU-LV/placebo i 7 pacijenata u grupi 5-FU/LV/bevacizumab je ostalo na prihvaćenoj početnoj terapiji. Naknadne terapije, koje bi mogle uticati na preživljavanje, korišćene su kod približno 50% pacijenata u obe grupe, mada je više pacijenata u grupi 5- FU/LV/placebo tretirano sa aktivnim agensima irinotecan-om i oxaliplatin-om.

Efikasnost

Ukupno preživljavanje kao primarni cilj, bilo je duže u grupi 5- FU/LV/bevacizumab (medijana 16,6 meseci), nego u grupi 5-FU/LV/placebo (medijana, 12,9 meseci), što pokazuje trend prema signifikantnosti. Pokazatelj opasnosti od smrti, procenjeno je da je 0,79 (95% Cl, 0,56 do 1,1; P=0,16; Tabela 5 i Slika 4). Dodatak bevacizumaba u 5-FU/LV prati porast medijane preživljavanja bez napredovanja (9,2 prema 5,5 meseci; pokazatelj opasnosti = 0,50; 95% Cl, 0,34 do 0,73; P=0,0002, Tabela 5 i Slika 4), mera odgovora (16,0% prema 15,2 %, P=0,055) i medijana trajanja odgovora (9,2 meseca prema 6,8 meseci; pokazatelj opasnosti = 0,42; 95% Cl, 0,15 do 1,17; P=0,088). Dalja analiza efekta tretmana na ukupno preživljavanje sa karakteristikama polazne osnove, pokazala je da pacijeni sa niskim serumskim albuminom (≤3,5 g/dL) u polaznoj osnovi, izgleda da imaju signifikantnu korist pri preživljavanju (pokazatelj opasnosti = 0,46; 95% Cl, 0,29 do 0,74; P=0,001).

CCS, bila je 3,0 meseca u grupi 5-FU/LV/placebo, a 3,1 mesec u grupi 5-FU/LV/bevacuzumab (pokazatelj opasnosti = 0,79, P=0188). Medijana TDQ za pacijente tretirane sa placebom i pacijente tretirane sa bevacizumabom, mereno kao sekundarne mere TDQ bila je 1,2 i 3,2 meseca (TOI-C; pokazatelj opasnosti = 0,71, P=0,048) i 2,6 i 3,6 meseci (ukupno FACT-C; pokazatelj opasnosi = 0,66, P=0,016).

Bezbednost

Ukupno 204 pacijenta (104 iz 5-FU/LV/placebo i 100 iz 5-FU/LV/bevacizumab), koji su primili bar jednu dozu ispitivanog leka, činilo je populaciju za bezbednost. Porast od 16% (71% prema 87%) u ukupnim toksičnostima 3. i 4. stepena, je opažen kod kod pacijenata koji su primali bevacizumab. Štetni efekti, koji dovode do smrti ili prekida ispitivanja, bili su slični kod obe grupe, kao što su bili i štetni efekti, za koje se zna da su povezani sa 5-FU/LV (naročito dijareja i leukopenija). Dva pacijenta, oba u grupi 5-FU/LV/bevacizumab, doživela su perforaciju utrobe. Ovi događaji su se desili 110. i 338. dana tretmana, i za oba je utvrđeno hirurškim ispitivanjem da su povezani sa divertikulumom debelog creva. Jedan pacijent je umro kao posledica ove komplikacije. Ranija klinička ispitivanja su ukazivala na hemoragiju, tromboemboliju, proteinuriju i hipertenziju kao moguće toksčnosti povezane sa bevacizumabom. Međutim, u ovom ispitivanju, nije opažen porast venske tromboze, krvarenje ≥3. stepena, ili proteinurija koja je klinički signifikantna (>3. stepena). Arterijski trombotički slučajevi (infarkt miokarda, šlog ili trombotički slučajevi u perifernim arterijama) dogodili su se kod 10 pacijenata u grupi 5-FU/LV/bevacizumab, u poređenju sa 5 pacijenata u grupi 5-FU/LV/placebo.

Grupa 5-FU/LV/placebo imala je veći mortalitet unutar 60 dana usled bilo kog uzroka, u poređenju sa grupom 5-FU/LV/bevacizumab (13,5 % prema 5,0%). Smrti usled napredovanja bolesti u prvih 60 dana bile su slične (5,8% prema 4,0%) u ove dve grupe. U grupi 5-FU/LV/placebo smrti unutar 60 dana, koje nisu usled napedovanja bolesti, pripisane su sledećem: srčana smetnja (1), sepsa (3), dijareja (2), respiratorni problem (1) i pulmonarna embolija (1). U grupi 5-FU/LV/bevacizumab, jedina rana smrt koja nije usled napredovanja bolesti, pripisana je infarktu miokarda.

Rezultati ovog kliničkog testa pokazuju još da bevacizumab, humanizovano monoklonalno antitelo protiv VEGF, pruža značajnu kliničku korist, kada se daje kao prvostepena hemoterapija u tretmanu metastaziranog kolorektalnog kancera. Kada se poredi sa samim 5-FU/LV, dodatak bevacizumaba produžava medijanu preživljavanja za 3,7 meseci, preživljavanje bez napredovanja bolesti za 3,7 meseci, a trajanje odgovora za 2,4 meseca, i porast mere odgovora za 11%.

Ovi rezultati treba da se posmatraju u kontekstu ispitivanja populacije. Specifično su odabrani pacijenti koji su bili loši kandidati za prvostepenu terapiju koja sadrži irinotecan, ili zbog male verovatnoće od koristi, ili zbog velike verovatnoće od toksičnosti koju prati tretman. Pažljiva analiza ključnih ispitivanja irinotecan-a je pokazala da je klinička korist od ovog agensa bila ograničena na pacijente sa normalnim statusom učinka prema ECOG (PS=0). Poodmakla starost, prethodna radijaciona terapija karlice, nepovoljan status učinka i nizak serumski albumin, objavljeno je da povećavaju toksičnost povezanu sa irinotecan-om. Pacijentima sa ovim karakteristikama potrebne su alternativne terapeutske opcije. Retrospektivna analiza podgrupe iz ispitivanja manje, nasumične II faze, koja je obavljena ranije radi ocenjivanja bevacizumaba i 5-FU/LV za CRC, sa isticanjem bevacizumaba, pružila je bitan efekt tretmana u podgrupi pacijenata sa osnovnim podatkom za PS 1 ili 2 (medijana preživljavanja 6,3 meseca u odnosu na 15,2), u podgrupi starosti >65 godina (11,2 meseca prema 17,7 meseci), a u grupi sa serumskim albuminom <3,5 (8,1 meseci prema 14,1 mesec). Ovi rezultati su nas ohrabrili da planiramo ovo ispitivanje, uključujući specifično populaciju sa lošom prognozom i usmeravajući ispitivanje na otkrivanje efekta jednog širokog tretmana na preživljavanje. Bili smo veoma uspešni u prijavljivanju populacije koja je različita od one u kojoj je paralelno sprovedno ključno ispitivanje

IFL/placebo u odnosu na IFL/bevacizumab. Poređenje sa ovim ključnim ispitivanjem, pokazalo je da pacijenti iz sadašnjeg ispitivanja imaju veću medijanu starosti (72 prema 61 godina) i u suštini više pacijenata je imalo status učinka >0 (72% prema 43%) i albumin ≤3,5 mg/dL (46% prema 33%).

Uprkos populaciji visokog rizika, proizašlo je da se režim 5-FU/LV/bevacizumab dobro podnosi. Dobro opisani štetni efekt hipertenzija 3. stepena povezana sa bevacizumabom, opažena je kod 16% pacijenata u grupi 5-FU/LV/bevacizumab, u odnosu na 3% u grupi 5-FU/LV/placebo. Nije se dogodio ni jedan slučaj hipertenzije 4. stepena. Proteinurija, bilo kog stepena, opažena je kod 38% u grupi 5-FU/LV/bevacizumab, prema 19% u grupi 5-FU/LV/placebo; međutim, samo kod jednog pacijenta u grupi sa bevacizumabom se razvila proteinurija 3. stepena, a nije bilo slučajeva proteinurije 4. stepena. Kod pacijenata tretiranih sa bevacizumabom nije opažen porast krvarenja 3. i 4. stepena ili venskih trombolitičkih slučajeva. Postojao je nesklad u pojavi arterijskih trombolitičkih slučajeva: 10% u grupi 5-FU/LV/bevacizumab, u poređenju sa 4,8% u grupi 5-FU/LV/placebo. Sličan nesklad je opažen i u ključnom ispitivanju bevacizumaba (1,0% u grupi IFL/placebo, a 3,3% u grupi IFL/bevacizumab). Poodmakla starost populacije koja je obuhvaćena sadašnjim ispitivanjem, možda je doprinela većoj ukupnoj pojavi ovog štetnog slučaja, međutim treba primetiti da je ovaj nesklad prisutan u oba ispitivanja. Da bi se dalje definisala pojava i potencijalni faktori rizika za ove i druge neuobičajene štetne slučajeve povezane sa terapijom bevacizumaba, možda bi bilo potrebno obaviti široka ispitivanja bezbednosti.

U zaključku, ovi podaci pokazuju da bevacizumab, kada se kombinuje sa bolus injekcijom 5-FU/LV, pruža bitnu kliničku korist pacijentima koji ranije nisu tretirali metastazirani kolorektalni kancer, a koji se smatraju lošim kandidatima za terapiju koja sadrži irinotecan. Zajedno sa rezultatima ključnog ispitivanja, ovi podaci pojačavaju dokaz da terapija sa 5-FU/LV koja sadrži bevacizumab, treba

da se smatra standardnom opcijom početnog tretmana metastaziranog koiorektalnog kancera.

Claims (46)

Dos. 21023 PATENTNI ZAHTEVI

1. Postupak za tretiranje kancera u humanom pacijentu, naznačen time, što se sastoji od ordiniranja tom pacijentu efikasne količine anti-VEGF antitela i preparata protiv neoplazma, gde pomenuti preparat protiv neoplazma sadrži najmanje jedan hemoterapeutski agens.

2. Postupak prema Zahtevu 1, naznačen time, što se kancer bira iz grupe koju čine kancer dojke, kolorektalni kancer, rektalni kancer, kancer pluća ne- malih ćelija, ne-Hodgkin-ov limfom (NHL), kancer renalnih ćelija, kancer prostate, kancer jetre, kancer pankreasa, sarkom mekog tkiva, Kaposi-ev sarkom, karcinoidni karcinom, kancer glave i vrata, melanom, kancer jajnika, mezoteliom i višestruki mijelom.

3. Postupak prema Zahtevu 1, naznačen time, što je kancer metastazirao.

4. Postupak prema Zahtevu 1, naznačen time, što pacijent ranije nije tretiran.

5. Postupak prema Zahtevu 1, naznačen time, što se hemoterapeutski agens bira iz grupe koju čine agensi za alkilovanje, antimetabolici, analozi folne kiseline, analozi pirimidina, analozi purina i srodni inhibitori, vinca alkaloidi, epipodopiilotoksini, antibiotici, L-asparaginaza, inhibitor topoizomeraze, interferoni, koordinacioni kompleksi platine, urea supstituisana antracendionom, derivati metilhidrazina, adrenokortikalni supresant, adrenokortikosteroidi, progestini, estrogeni, antiestrogen, androgeni, antiandrogen i analog hormona koji oslobađa gonadotropin.

6. Postupak prema Zahtevu 5, naznačen time, što se hemoterapeutski agens bira iz grupe koju čine 5-fluorouracil (5-FU), leucovorin, irinotecan, oxaliplatin, capecitabin, paclitaxel i doxetaxel.

7. Postupak prema Zahtevu 1, naznačen time, što preparat protiv neoplazma sadrži kombinaciju od najmanje dva hemoterapeutska agensa.

8. Postupak prema Zahtevu 7, naznačen time, što preparat protiv neoplazma sadrži 5-FU i leucovorin.

9. Postupak prema Zahtevu 7, naznačen time, što preparat protiv neoplazma sadrži 5-FU, leucovorin i irinotecan.

10. Postupak prema Zahtevu 1, naznačen time, što po završetku tretmana sa anti-VEGF antitelom i preparatom protiv neoplazma, pacijent dalje prima hemoterapeutski tretman sa najmanje jednim hemoterapeutskim agensom.

11. Postupak prema Zahtevu 10, naznačen time, što se hemoterapeutski agens, koji se koristi za dalji hemoterapeutski tretman, bira iz grupe koju čine 5- FU, leucovorin, irinotecan, oxaliplatin, capecitabin, paclitaxel i doxetaxel.

12. Postupak prema Zahtevu 11, naznačen time, što hemoterapeutski agens predstavlja oxaliplatin.

13. Postupak prema Zahtevu 1, naznačen time, što pomenuto anti-VEGF antitelo vezuje isti epitop kao i monoklonalno anti-VEGF antitelo A4.6.1, koje proizvodi hibridoma ATCC FIB 10709.

14. Postupak prema Zahtevu 1, naznačen time, što anti-VEGF antitelo predstavlja neko humano antitelo.

15. Postupak prema Zahtevu 1, naznačen time, što anti-VEGF antitelo predstavlja neko humanizovano antitelo.

16. Postupak prema Zahtevu 15, naznačen time, što anti-VEGF antitelo predstavlja humanizovano A4.6.1 antitelo ili njego fragment.

17. Postupak prema Zahtevu 1, naznačen time, što se anti-VEGF antitelo ordinira intravenozno.

18. Postupak prema Zahtevu 1, naznačen time, što se anti-VEGF antitelo ordinira pacijentu sa oko 5 mg/kg svake 2 do 3 nedelje.

19. Postupak prema Zahtevu 1, naznačen time, što zajedničko ordiniranje anti-VEGF antitela i preparata protiv neoplazma efikasno povećava trajanje preživljavanja humanog pacijenta.

20. Postupak prema Zahtevu 19, naznačen time, što se trajanje preživljavanja pacijenta povećava za najmanje oko 2 meseca, ako se poredi sa drugim pacijentom, koji je tretiran samo sa preparatom protiv neoplazma.

21. Postupak prema Zahtevu 1, naznačen time, što zajedničko ordiniranje anti-VEGF antitela i preparata protiv neoplazma efikasno povećava trajanje preživljavanja humanog pacijenta bez napredovanja bolesti.

22. Postupak prema Zahtevu 21, naznačen time, što se preživljavanje humanog pacijenta bez napredovanja bolesti povećava za najmanje oko 2 meseca, ako se poredi sa drugim pacijentom koji je tretiran samo sa tim preparatom protiv neoplazma.

23. Postupak prema Zahtevu 1, naznačen time, što zajedničko ordiniranje anti-VEGF antitela i preparata protiv neoplazma efikasno povećava meru odgovora u grupi humanih pacijenata.

24. Postupak prema Zahtevu 23, naznačen time, što se mera odgovora grupe humanih pacijenata signifikantno povećava, sa hi-na-kvadrat p-vrednošću manjom od 0,005, ako se poredi sa drugom grupom pacijenata tetiranom samo sa tim preparatom protiv neoplazma.

25. Postupak prema Zahtevu 1, naznačen time, što zajedničko ordiniranje anti-VEGF antitela i preparata protiv neoplazma efikasno povećava trajanje odgovora humanog pacijenta.

26. Postupak prema Zahtevu 25, naznačen time, što se trajanje odgovora pacijenta povećava za oko 2 meseca, ako se poredi sa drugim pacijentom koji je tretiran samo sa tim preparatom protiv neoplazma.

27. Postupak za tretiranje humanog pacijenta koji je podložan ili sa dijagnozom kolorektalnog kancera, naznačen time, što se tom pacijentu ordiniraju efikasne količine anti-VEGF antitela.

28. Postupak prema Zahtevu 27, naznačen time, što je kolorektalni kancer metastazirao.

29. Postupak prema Zahtevu 27, naznačen time, što pomenuto anti-VEGF antitelo vezuje isti epitop kao i monoklonalno anti-VEGF antitelo A4.6.1, koje proizvodi hibridoma ATCC HB 10709.

30. Postupak prema Zahtevu 27, naznačen time, što anti-VEGF antitelo predstavlja neko humano antitelo.

31. Postupak prema Zahtevu 27, naznačen time, što anti-VEGF antitelo predstavlja neko humanizovano antitelo.

32. Postupak prema Zahtevu 31, naznačen time, što anti-VEGF antitelo predstavlja humanizovano A4.6.1 antitelo ili njego fragment.

33. Postupak prema Zahtevu 27, naznačen time, što se anti-VEGF antitelo ordinira intravenoznom infuzijom.

34. Postupak prema Zahtevu 27, naznačen time, što se anti-VEGF antitelo ordinira pacijentu sa oko 5 mg/kg svake 2 do 3 nedelje.

35. Postupak prema Zahtevu 27, naznačen time, što se pacijentu ordinira još jedan ili više hemoterapeutskih agenasa.

36. Postupak prema Zahtevu 1, naznačen time, što se hemoterapeutski agens bira iz grupe koju čine agensi za alkilovanje, antimetabolici, analozi folne kiseline, analozi pirimidina, analizi purina i srodni inhibitori, vinca alkaloidi, epipodopiilotoksini, antibiotici, L-asparaginaza, inhibitor topoizomeraze, interferoni, koordinacioni kompleksi platine, urea supstituisana antracendionom, derivati metilhidrazina, adrenokortikalni supresant, adrenokortikosteroidi, progestini, estrogeni, antiestrogen, androgeni, antiandrogen i analog hormona koji oslobađa gonadotropin.

37. Postupak prema Zahtevu 35, naznačen time, što se hemoterapeutski agens bira iz grupe koju čine 5-fluorouracil, leucovorin, irinotecan, oxaliplatin, capecitabin, paclitaxel i doxetaxel.

38. Postupak za tretiranje humanog pacijenta ili grupe humanih pacijenata sa metastaziranim kolorektalnim kancerom, naznačen time, što se pacijentu ordinira efikasna količina preparata anti-VEGF antitela i preparata protiv neoplazma, gde pomenuti preparat protiv neoplazma sadrži hemoterapeutske agense na bazi fluorouracila, tako da zajedničko ordiniranje anti-VEGF antitela i tog preparata protiv neoplazma dovodi do statistički signifikantnog i klinički značajnog poboljšanja tretiranog pacijenta, koje se meri trajanjem preživljavanja, preživljavanjem bez napredovanja bolesti, merom odgovora ili trajanjem odgovora.

39. Postupak prema Zahtevu 38, naznačen time, što preparat protiv neoplazma sadrži 5-FU, leucovorin i irinotecan.

40. Postupak prema Zahtevu 39, naznačen time, što preparat protiv neoplazma ima režim koji se sastoji od 500 mg/m<2>5-FU, 20 mg/m<2>leucovorin-a i 125 mg/m<2>irinotecan-a, a ordinira se pacijentu ponavljanjem 6-to nedeljnih ciklusa, koga čini ordiniranje svake nedelje tokom 4 nedelje, pa sledi 2 nedelje pauze, pri čemu se anti-VEGF antitelo ordinira pacijentu sa 5 mg/kg svake druge nedelje.

41. Postupak prema Zahtevu 38, naznačen time, što preparat protiv neoplazma sadrži 5-FU i leucovorin.

42. Postupak prema Zahtevu 41, naznačen time, što se 5-FU i leucovorin ordiniraju pacijentu, svaki sa 500 mg/m<2>, ponavljanjem 8-mo nedeljnog ciklusa, koga čini ordiniranje svake nedelje tokom 4 nedelje, pa sledi 2 nedelje pauze, a anti-VEGF antitelo se ordinira pacijentu sa 5 mg/kg svake druge nedelje.

43. Postupak prema Zahtevu 41, naznačen time, što je za humanog pacijenta koji se ne smatra optimalnim kandidatom sa prvostepenu terapiju sa irinotecanom.

44. Postupak prema Zahtevu 38, naznačen time, što preparat protiv neoplazma sadrži 5-FU, leucovorin i oxaliplatin.

45. Proizvodni artikl, naznačen time, što se sastoji od kontejnera, preparata unutar ovog kontejnera koji sadrži anti-VEGF antitelo, i umetka u pakovanje koji upućuje korisnika ovog preparata da se pacijentu sa kancerom ordinira preparat anti-VEGF antitela i preparat protiv neoplazma koji sadrži najmanje jedan hemoterapeutski agens.

46. Komplet za tretiranje kancera u humanom pacijentu, naznačen time, što se sastoji od paketa koga čini preparat anti-VEGF antitela i uputstvo za upotrebu preparata anti-VEGF antitela, i preparat protiv neoplazma koji sadrži najmanje jedan hemoterapeutski agens za tretiranje kancera u pacijentu.