MX2011010159A

MX2011010159A - Anticuerpos multiespecificos que comprenden anticuerpos de longitud completa y fragmentos fab de cadena sencilla.

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Publication number: MX2011010159A
Application number: MX2011010159A
Authority: MX
Inventors: Erhard Kopetzki; Ulrich Brinkmann; Pablo Umana; Peter Bruenker; Jan Olaf Stracke; Joerg Thomas Regula; Christian Klein; Rebecca Croasdale; Ekkehard Moessner; Juergen Michael Schanzer
Original assignee: Roche Glycart Ag
Priority date: 2009-04-02
Filing date: 2010-03-30
Publication date: 2011-10-17
Also published as: ZA201106666B; HK1167669A1; US20100256338A1; AU2010230563A1; RU2598248C2; BRPI1014089A2; AR076018A1; PE20120591A1; EP2414391B1; US9382323B2; CN102369215A; JP2012522493A; KR101431318B1; CL2011002380A1; KR20110130525A; JP5501439B2; EP2414391A1; IL214756A0; WO2010112193A1; TW201040265A

Abstract

La presente invención está relacionada con anticuerpos multiespecíficos, especialmente anticuerpos biespecíficos que comprenden anticuerpos de longitud completa y fragmentos Fab de cadena sencilla, métodos para su producción, composiciones farmacéuticas que contienen los anticuerpos, y usos de los mismos.

Description

ANTICUERPOS MULTIESPECIFICOS QUE COMPRENDEN ANTICUERPOS DE LONGITUD COMPLETA Y FRAGMENTOS FAB DE CADENA SENCILLA Campo de la Invención La presente invención está relacionada con anticuerpos multiespecíficos, especialmente anticuerpos biespecífieos que comprenden anticuerpos de longitud completa y fragmentos Fab de cadena sencilla, a los métodos para su producción, a composiciones farmacéuticas que contienen los anticuerpos, y a la utilización de los mismos.

Antecedentes de la Invención Se han desarrollado una gran variedad de formatos de anticuerpo multiespecífico recombinante en los últimos tiempos, por ejemplo, anticuerpos biespecífieos tetravalentes, por ejemplo, mediante la fusión de un formato de anticuerpo IgG y dominios de cadena sencilla (véase por ejemplo, Coloma, M.J., et al, Nature Biotech 15 (1997) 159-163; WO2001077342; y Morrison, S.L., Nature Biotech 25 (2007) 1233-1234) .

También se han desarrollado otros nuevos formatos en el que la estructura núcleo del anticuerpo (IgA, IgD, IgE, IgG o IgM) no se conserva, como los dia- , tria- o tetra-anticuerpos, minianticuerpos o varios formatos de cadena sencilla (scFv, Bis-scFv) , que son capaces de unirse a dos o más antígenos, que se han desarrollado (Holliger P, et al, Ref.: 223055 Nature Biotech 23 (2005) 1126-1136, 2005; Fischer N. , Léger 0., Pathobiology 74 (2007) 3-14; Shen J, et al, Journal of Immunological Métodos 318 (2007) 65-74; u, C. et al Nature Biotech 25 (2007) 1290-1297) .

Todos estos formatos utilizan enlazantes para fusionar el núcleo del anticuerpo (IgA, IgD, IgE, IgG o IgM) a otra proteína de unión (por ejemplo, scFv) o para fusionar por ejemplo, dos fragmentos Fab o scFv. (Fischer N. , Léger O., Pathobiology 74 (2007) 3-14) . Debe tenerse en cuenta que quizá uno quiera retener funciones efectoras, como por ejemplo, la citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) o citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (CCDA) , que están mediadas por la unión del receptor Fe, al mantener un alto grado de similitud con los anticuerpos que aparecen en la naturaleza.

En O 2007/024715 se describen inmunoglobulinas de dominio variable dual como proteínas de unión multivalentes y multiespecíficas construidas. Se describe un proceso para la preparación de dímeros de anticuerpo biológicamente activos en US 6,897,044. Se describen construcciones de Fv multivalente de anticuerpo con al menos cuatro dominios variables que están unidos entre ellos mediante enlazantes peptídicos en la US 7,129,330. Se describen estructuras diméricas y multiméricas de antígeno en US 2005/0079170. Se describen proteínas de unión a antígeno tri- o tetra-valentes monoespecíficas que comprende tres o cuatro fragmentos Fab unidos a cada uno covalentemente mediante una estructura conectora, cuya proteína no es una inmunoglobulina natural en US 6,511,663. En WO 2006/020258 se describen anticuerpos tetravalentes biespecíficos que pueden expresarse eficientemente en células procariotas y eucariotas, y son útiles en los métodos terapéuticos y de diagnóstico. Un método para separar o sintetizar de forma preferente los dímeros que están unidos mediante al menos un puente disulfuro intercadena de los dímeros que no están unidos mediante al menos un puente disulfuro intercadena de una mezcla que comprende los dos tipos de dímeros de polipéptido se describe en US 2005/0163782. Los receptores tetravalentes biespecíficos se describen en US 5,959,083. Los anticuerpos construidos con tres o más sitios de unión funcional a antígeno se describen en WO 2001/077342.

Los polipéptidos de unión a antígeno multiespecífieos y multivalentes se describen en WO 1997/001580. WO 1992/004053 describe homoconjugados, preparados normalmente a partir de anticuerpos monoclonales de la clase IgG que se unen al mismo determinante antigénico unidos de forma covalente mediante reticulación sintética. Los anticuerpos monoclonales oligoméricos con gran avidez por los antígenos se describen en WO 1991/06305 mientras que los oligómeros, normalmente de la clase IgG, se secretan con dos o más monómeros de inmunoglobulina asociados para formar moléculas de IgG tetravalentes o hexavalentes . Los anticuerpos derivados de oveja y las construcciones de anticuerpos se describen en US 6,350,860, que pueden utilizarse para tratar enfermedades en las que la actividad del interferón gamma es patogénica. En US 2005/0100543 se describen construcciones susceptibles de ser diana que son transportadores multivalentes de anticuerpos biespecífieos, es decir, cada molécula de una construcción susceptible de ser diana puede servir de transportador de dos o más anticuerpos biespecíficos . Los anticuerpos modificados genéticamente tetravalentes biespecíficos se describen en O 1995/009917. En WO 2007/109254 se describen moléculas de unión estabilizadas que consisten en o comprenden un scFv estabilizado.

Müller, D., et al., Handbook of Therapeutic antibodies, Parte III, Capítulo 2, (2008) 345-378 se refiere a anticuerpos biespecíficos , por ejemplo a anticuerpos de longitud completa a los que se fusionan dos fragmentos scFv mediante un enlazante peptídico en el C-terminal de la cadena pesada (véase también WO 1995/009917). Hust, M. , et al., BMC Biotechnology (2007) 7 se refiere a fragmentos Fab (scFab) de cadena sencilla.

No obstante, en vista de diferentes problemas y aspectos de los anticuerpos multiespecífieos (como por ejemplo, propiedades farmacocinéticas y biológicas, estabilidad, agregación, rendimiento de expresión) existe una necesidad de otros formatos de anticuerpo multiespecífico alternativos. Especialmente anticuerpos tetravalentes biespecíficos descritos en WO 1995/009917 y Müller D., et al., Handbook of Therapeutic antibodies, Parte III, Capítulo 2, (2008) 345-378 mostraron solo rendimientos de expresión muy bajos.

Sumario de la Invención Un primer aspecto de la presente invención es un anticuerpo multiespecífico que comprende a) un anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a un primer antígeno y que consta de dos cadenas pesadas de anticuerpo, dos cadenas ligeras de anticuerpo; y b) uno o más fragmentos Fab de cadena sencilla que se unen específicamente a entre uno y cuatro antígenos más (preferiblemente que se unen específicamente a otro antígeno) , en el que los fragmentos Fab de cadena sencilla bajo b) están fusionados al anticuerpo de longitud completa bajo a) mediante un péptido conector en el C- o N- terminal de la cadena pesada o ligera de dicho anticuerpo de longitud completa.

Un aspecto preferible de la presente invención es un anticuerpo multiespecífico que comprende a) un anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a un primer antígeno y que consta de dos cadenas pesadas de anticuerpo dos cadenas ligeras de anticuerpo; y b) de uno a cuatro fragmentos Fab de cadena sencilla que se unen específicamente a entre uno y cuatro antígenos más (preferiblemente que se unen específicamente a otro antígeno) , en el que los fragmentos Fab de cadena sencilla bajo b) están fusionados al anticuerpo de longitud completa bajo a) mediante un péptido conector en el C- o N- terminal de la cadena pesada o ligera del anticuerpo de longitud completa.

Preferiblemente el anticuerpo multiespecífico comprende uno o dos fragmentos Fab de cadena sencilla que se unen a un segundo antígeno (anticuerpo biespecífico) .

Preferiblemente el anticuerpo multiespecífico comprende dos fragmentos Fab de cadena sencilla que se unen a un segundo antígeno (anticuerpo biespecífico) .

Preferiblemente el anticuerpo multiespecífico comprende dos fragmentos Fab de cadena sencilla que se unen a un segundo antígeno y a un tercer antígeno (anticuerpo triespecífico) .

Otro aspecto de la invención es una molécula de ácido nucleico que codifica una cadena del anticuerpo multiespecífico en el que se fusiona un fragmento Fab de cadena sencilla con el C- o N- terminal de la cadena pesada o ligera del anticuerpo de longitud completa.

Aún otros aspectos de la invención son una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo multiespecífico.

Los anticuerpos multiespecíficos de acuerdo con la invención, muestran propiedades valiosas como una alta estabilidad, baja tendencia a la agregación (Véase el Ejemplo 2 (por ejemplo, si se compara con un anticuerpo de longitud completa al que se fusionan dos fragmentos scFv mediante un péptido enlazante al extremo C terminal de la cadena pesada (véase WO 1995/009917 o Müller D. , et al., Handbook of Therapeutic antibodies, Parte III, Capítulo 2, (2008) 345- 378) . Los anticuerpos multiespecíficos de acuerdo con la invención por un lado muestran nuevas propiedades debido a que se unen a diferentes antígenos, y por otro lado son adecuados para la producción y formulación farmacéutica debido a su buena estabilidad, baja agregación y propiedades farmacocinéticas y biológicas valiosas. Debido a su núcleo de Ig y de la capacidad a ser producidas en sistemas de expresión de mamíferos, aún retienen sus propiedades de anticuerpos naturales como CCDA y CDC.

Breve Descripción de las Secuencias de aminoácidos Los siguientes ejemplos, listado de secuencias y figuras se proporcionan como apoyo para un mejor entendimiento de la presente invención, cuyo verdadero alcance se fija en las reivindicaciones anexas. Se entiende que pueden realizarse modificaciones en los procedimientos indicados sin alejarse del espíritu de la invención.

SEC ID NO: 1 CDR3 de la cadena pesada, HUMAB-Clon 18 <IGF-1R> SEC ID NO: 2 CDR2 de la cadena pesada, HUMAB-Clon 18 <IGF-1R> SEC ID NO: 3 CDR1 de la cadena pesada, HUMAB-Clon 18 <IGF-1R> SEC ID NO: 4 CDR3 de la cadena ligera, HUMAB-Clon 18 <IGF-1R> SEC ID NO: 5 CDR2 de la cadena ligera, HUMAB-Clon 18 <IGF-1R> SEC ID NO: 6 CDR1 de la cadena ligera, HUMAB-Clon 18 <IGF-1R> SEC ID NO: 7 dominio variable de la cadena pesada, HUMAB-Clon 18 <IGF-1R> SEC ID NO: 8 cadena ligera variable dominio, HUMAB-Clon 18 <IGF-1R> SEC ID NO: 9 CDR3 de la cadena pesada, <EGFR>ICR62 humanizado SEC ID NO: 10 CDR2 de la cadena pesada, <EGFR>ICR62 humanizado SEC ID NO: 11 CDR1 de la cadena pesada, <EGFR>ICR62 humanizado SEC ID NO: 12 CDR3 de la cadena ligera, <EGFR>ICR62 humanizado SEC ID NO: 13 CDR2 de la cadena ligera, <EGFR>ICR62 humanizado SEC ID NO: 14 CDR1 de la cadena ligera, <EGFR>ICR62 humanizado SEC ID NO: 15 dominio variable de la cadena pesada, <EGFR>ICR62-I-HHD humanizado SEC ID NO: 16 dominio variable de la cadena ligera, <EGFR>ICR62 humanizado -I-KC SEC ID NO: 17 región constante de la cadena pesada humana derivada de IgGl SEC ID NO: 18 región constante de la cadena pesada humana derivada de IgG4 SEC ID NO: 19 región constante de la cadena ligera kappa Breve Descripción de las Figuras Figura 1 Estructura esquemática de un anticuerpo de longitud completa sin el dominio CH4 que se une específicamente a un primer antígeno 1 con dos pares de cadena pesada y ligera que comprende los dominios variables y constantes en el orden normal.

Figura 2 Estructura esquemática de los cuatro posible fragmentos Fab de cadena sencilla que se unen específicamente por ejemplo, a un Segundo antígeno 2.

Figura 3 Estructura esquemática de un anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención que comprende un anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a un primer antígeno 1 y dos cadenas Fab sencillas que se unen específicamente a un segundo antígeno 2- ejemplo tetravalente biespecífico .

Figura 4 Anticuerpos biespecíficos de acuerdo con la invención que comprenden un anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a IGF- IR y dos cadenas Fab sencillas idénticas que se unen específicamente a moléculas EGFR - ScFab-XGFRl A, B, C, y D y niveles de expresión tras la purificación.

A: scFab (VH-CHl-enlazante-VL-CL) fusionado al C-terminal de la cadena pesada.

B: scFab (VH-CHl-enlazante-VL-CL con puente disulfuro VH44-VL100 adicional fusionado) al C- terminal de la cadena pesada .

C: scFab (VH-CHl-enlazante-VL-CL) fusionado al C-terminal de la cadena ligera.

D: scFab (VH-CHl-enlazante-VL-CL con puente disulfuro VH44-VL100 adicional fusionado) al C-terminal de la cadena ligera .

Figura 5 Anticuerpos biespecíficos de acuerdo con la invención que comprenden un anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a EGFR y dos cadenas Fab sencillas idénticas que se unen específicamente a moléculas IGF- IR - ScFab-XGFR2 A, B , C, y D.

A: scFab (VH-CHl-enlazante-VL-CL) fusionado al C-terminal de la cadena pesada.

C: scFab (VH-CHl-enlazante-VL-CL) fusionado al C-terminal de la cadena ligera D: scFab (VH-CHl-enlazante-VL-CL con puente disulfuro VH44-VL100 adicional fusionado) al C-terminal de la cadena ligera .

Figura 6 Estructura esquemática de un anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención que comprende un anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a un primer antígeno 1 y un Fab de cadena sencilla que se une específicamente a un segundo antígeno 2 - ejemplo trivalente biespecífico con superhélices .

Figura 7 Estructura esquemática de un anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención que comprende un anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a un primer antígeno 1 un Fab de cadena sencilla que se une específicamente a un segundo antígeno 2 y un Fab de cadena sencilla que se une específicamente a un tercer antígeno 3-ejemplo tetravalente triespecífico con superhélices.

Figura 8 Análisis por SDS-PAGE de Fab de cadena sencilla que contiene derivados de anticuerpo biespecífico scFab-XGFRi . 1: scFab-XGFRl_4720 (No reducido) 2: scFab-XGFRl_4721 (No reducido) 3: scFab-XGFRl_4720 (reducido) 4: scFab-XGFRl_4721 (reducido) Figuras 9a y 9b Análisis por HP-SEC de scFab que contiene derivados scFab-XGFRl de anticuerpo biespecífico.

Fig. 9a: scFab-XGFRl-4720 ; 7.7 %, Agrega (marcado dentro de la caja) .

Fig. 9b: scFab-XGFRl-4721 ; 3.5 %, Agrega (marcado dentro de la caja) Figuras 10a a lOd Unión de scFab-XGFRl y scFab-XGFR2 a EGFR e IGF1R.

Fig. 10a: Diagrama de Biacore-unión de scFab-XGFRl_2720 a EGFR, KD = 2 n .

Fig. 10b: Diagrama de Biacore-unión de scFab-XGFRl_2720 a IGF- IR, KD = 2 nM.

Fig. 10c : Diagrama de Biacore-unión de scFab-XGFR2_2720 a EGFR, KD = 0.5 nM.

Fig. lOd: Diagrama de Biacore-unión de scFab-XGFR2_2720 a IGF-1R, KD = 11 nM.

Figura 11 Esquema - unión de scFab-XGFR a células analizado mediante ensayos de competición con FACS siguiendo el procedimiento general: -añadir Mab <IGF1R> marcado con -Alexa647 (1 µg/mL) + scFab-XGFR sin marcar (100 g/mL - 0.001 g/mL) en paralelo, -45 min. de incubación en hielo, lavar y eliminar los anticuerpos no unidos, -fijar con HCHO al 1%, después con FACS .

Figuras 12a a 12c Unión de scFab-XGFR_2721 y <IGF1R> Clon 18 parental a células analizado mediante ensayos de competición con FACS.

Fig 12a: Comparación de los valores de CI50 del <IGF-1R> Clon 18 (0.18 g/ml) y SCFab-XGFR_2721 (0.15 g/ml) .

Fig 12b: Curva de unión de <IGF-lR>Clon 18 (punto de giro 0.11 g/ml) - eje y = RLU; eje x concentración de anticuerpo ( g/ml) .

Fig 12c: Curva de unión de scFab-XGFR_2721 (punto de giro 0.10 g/ml) - eje y = RLU; eje x concentración de anticuerpo ( g/ml) .

Figura 13 Regulación negativa de IGFl-R en células H322M tras 24 h de incubación con diferentes variantes de scFab-XGFR (?????) .

Figura 14 Regulación negativa de EGFR en células H322M tras 24 h de incubación con diferentes variantes de scFab-XGFR (100??) .

Figura 15 Inhibición de la proliferación a partir de células H322M con diferentes variantes de scFab-XGFR (?????) .

Descripción detallada de la invención Un primer aspecto de la presente invención es un anticuerpo multiespecífico que comprende a) un anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a un primer antígeno y que consta de dos cadenas pesadas de anticuerpo, dos cadenas ligeras de anticuerpo; y b) uno o más fragmentos Fab de cadena sencilla que se unen específicamente a entre uno y cuatro antígenos más (preferiblemente que se unen específicamente a otro antígeno) , en el que los fragmentos Fab de cadena sencilla bajo b) están fusionados al anticuerpo de longitud completa bajo a) mediante un péptido conector en el C- o N- terminal de la cadena pesada o ligera del anticuerpo de longitud completa.

En una modalidad uno o dos fragmentos Fab idénticos de cadena sencilla que se unen a un segundo antígeno están fusionados al anticuerpo de longitud completa mediante un péptido conector en el C-terminal de las cadenas pesadas o ligeras del anticuerpo de longitud completa.

En una modalidad uno o dos fragmentos Fab idénticos de cadena sencilla que se unen a un segundo antígeno están fusionados al anticuerpo de longitud completa mediante un péptido conector en el C-terminal de las cadenas pesadas de dicho anticuerpo de longitud completa.

En una modalidad uno o dos fragmentos Fab idénticos de cadena sencilla que se unen a un segundo antígeno están fusionados al anticuerpo de longitud completa mediante un péptido conector en el C-terminal de las cadenas ligeras del anticuerpo de longitud completa.

En una modalidad dos fragmentos Fab idénticos de cadena sencilla que se unen a un segundo antígeno están fusionados al anticuerpo de longitud completa mediante un péptido conector en el C-terminal de cada cadena pesada o ligera del anticuerpo de longitud completa.

En una modalidad dos fragmentos Fab idénticos de cadena sencilla que se unen a un segundo antígeno están fusionados al anticuerpo de longitud completa mediante un péptido conector en el C-terminal de cada cadena pesada del anticuerpo de longitud completa.

En una modalidad dos fragmentos Fab idénticos de cadena sencilla que se unen a un segundo antígeno están fusionados al anticuerpo de longitud completa mediante un péptido conector en el C-terminal de cada cadena ligera del anticuerpo de longitud completa.

El término "anticuerpo de longitud completa" significa un anticuerpo que consiste en dos "cadenas pesadas de anticuerpo de longitud completa" y dos "cadenas ligeras de anticuerpo de longitud completa" (véase Fig. 1) . Una "cadena pesada de anticuerpo de longitud completa" es un polipéptido que consiste de un dominio variable de la cadena pesada de un anticuerpo en dirección N-terminal a C-terminal (VH) , un dominio constante 1 de la cadena pesada de un anticuerpo (CH1) , una región bisagra de un anticuerpo (HR) , un dominio constante 2 de la cadena pesada de un anticuerpo (CH2), y un dominio constante 3 de la cadena pesada de un anticuerpo (CH3 ) , abreviado como VH-CH1-HR-CH2 -CH3 ; y opcionalmente un dominio constante 4 de la cadena pesada de un anticuerpo (CH4) en el caso de un anticuerpo de la subclase IgE. Preferiblemente la "cadena pesada de anticuerpo de longitud completa" es un polipéptido que consiste en VH, CH1, HR, CH2 y CH3 en dirección de N-terminal a C-terminal. Una "cadena ligera de un anticuerpo de longitud completa" es un polipéptido que consiste en un dominio variable de una cadena ligera de un anticuerpo (VL) en dirección N-terminal a C-terminal, y de un dominio constante de una cadena ligera de un anticuerpo (CL) , abreviado como VL-CL. El dominio constante de una cadena ligera de anticuerpo (CL) puede ser ? (kappa) o ? (lambda) . Las dos cadenas de anticuerpo de longitud completa están unidas a través de puentes disulfuro inter-polipéptido entre el dominio CL y el dominio CH1 y entre las regiones bisagra de las cadenas pesadas del anticuerpo de longitud completa. Ejemplos de anticuerpos de longitud completa típicos son los anticuerpos naturales como IgG (por ejemplo, IgGl e IgG2) , Ig , IgA, IgD, y IgE. Los anticuerpos de longitud completa de acuerdo con la invención pueden provenir de una especie única por ejemplo, humano, o pueden ser quimeras o anticuerpos humanizados . Los anticuerpos de longitud completa de acuerdo con la invención comprenden dos sitios de unión a antígeno cada uno formado or un par de VH y VL, los cuales se unen ambos específicamente al mismo antígeno. El C-terminal de la cadena pesada o ligera del anticuerpo de longitud completa denota el último aminoácido en el C-terminal de la cadena pesada o ligera. El N-terminal de la cadena pesada o ligera del anticuerpo de longitud completa denota el último aminoácido en el N-terminal de la cadena pesada o ligera.

Un "fragmento Fab de cadena sencilla" (véase Fig. 2) es un polipéptido que consiste en un dominio variable de la cadena pesada de un anticuerpo (VH) , un dominio constante 1 de anticuerpo (CH1) , un dominio variable de una cadena ligera de un anticuerpo (VL) , de un dominio constante de una cadena ligera de un anticuerpo (CL) y un enlazante, en el que los dominios de anticuerpo y el enlazante poseen uno de los siguientes órdenes en la dirección N-terminal a C-terminal: a) VH-CHl-enlazante-VL-CL, b) VL-CL-enlazante-VH-CHl , c) VH-CL-enlazante-VL-CHl o d) VL-CH1-enlazante-VH-CL; y en el que el enlazante es un polipéptido de al menos 30 aminoácidos, preferiblemente entre 32 y 50 aminoácidos. Los fragmentos Fab de cadena sencilla a) VH-CHl-enlazante-VL-CL, b) VL-CL-enlazante-VH-CHl, c) VH-CL-enlazante-VL-CHl y d) VL-CH1-enlazante-VH-CL, se estabilizan mediante el puente disulfuro natural entre el dominio CL y el dominio CH1. El término "N-terminal" denota el último aminoácido del N-terminal. El término "C-terminal" denota el último aminoácido del C-terminal.

En una modalidad preferida los dominios de anticuerpo y el enlazante en el fragmento Fab de cadena sencilla poseen uno de los siguientes órdenes en la dirección N-terminal a C-terminal : a) VH-CHl-enlazante-VL-CL, o b) VL-CL-enlazante-VH-CHl, más preferiblemente VL-CL-enlazante-VH-CHl .

En otra modalidad preferible los dominios de anticuerpo y el enlazante en el fragmento Fab de cadena sencilla poseen uno de los siguientes órdenes en la dirección N-terminal a C-terminal: a) VH-CL-enlazante-VL-CHl o b) VL-CHl-enlazante-VH-CL . Opcionalmente en el fragmento Fab de cadena sencilla, además del puente disulfuro natural entre el dominio CL y el dominio CH1, también el dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo (VH) y el dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo (VL) están estabilizados por la introducción de un puente disulfuro entre las siguientes posiciones: i) posición 44 del dominio variable de la cadena pesada a la posición lOOdominio variable de la cadena ligera, ii) posición 105 del dominio variable de la cadena pesada a la posición 43 del dominio variable de la cadena ligera, o iii) posición 101 del dominio variable de la cadena pesada a la posición 100 del dominio variable de la cadena ligera (numeración siempre de acuerdo al índice EU de Kabat) .

La estabilización adicional de disulfuros de los fragmentos Fab de cadena sencilla se logra mediante la introducción de un puente disulfuro entre los dominios variables VH y VL de los fragmentos Fab de cadena sencilla. Las técnicas para introducir puentes disulfuro no naturales para la estabilización de un Fv de cadena sencilla se describen por ejemplo, en WO 94/029350, Rajagopal V., et al, Prot. Engin. 10 (1997) 1453-59; Kobayashi, H., et al; Nuclear Medicine & Biology, Vol . 25, (1998) 387-393; o Schmidt, et al, Oncogene (1999) 18, 1711 -1721. En una modalidad el puente disulfuro opcional entre los dominios variables de los fragmentos Fab de cadena sencilla comprendido en el anticuerpo de acuerdo con la invención está entre la posición 44 del dominio variable de la cadena pesada y la posición 100 del dominio variable de la cadena ligera. En una modalidad el puente disulfuro opcional entre los dominios variables de los fragmentos Fab de cadena sencilla comprendidos en el anticuerpo de acuerdo con la invención está entre la posición 105 del dominio variable de la cadena pesada y la posición 43 del dominio variable de la cadena ligera (numeración siempre de acuerdo al índice EU de Kabat) .

En una modalidad, es preferible el fragmento Fab de cadena sencilla sin la estabilización adicional con disulfuros entre los dominios variables VH y VL de los fragmentos Fab de cadena sencilla.

El término "conector peptídico" tal como se utiliza en la invención denota un péptido con secuencias de aminoácidos, que son preferiblemente de origen sintético. Estos conectores peptídicos de acuerdo con la invención se utilizan para fusionar los fragmentos Fab de cadena sencilla con los extremos C- o N- terminal del anticuerpo de longitud completa para formar un anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención. Preferiblemente los conectores peptídicos bajo b) son péptidos con una secuencia de aminoácidos con una longitud de al menos 5 aminoácidos, preferiblemente con una longitud de 5 a 100, más preferiblemente de 10 a 50 aminoácidos. En una modalidad el péptido conector es (GxS)n o (GxS)nGm con G = glicina, S = serina, y (x = 3, n= 3, 4, 5 o 6, y m= 0, 1, 2 o 3) o (x = 4, n= 2, 3, 4 o 5 y m= 0, 1, 2 o 3), preferiblemente x = 4 y n= 2 o 3, más preferiblemente con x = 4, n= 2. En una modalidad el péptido conector es (G4S)2.

El término "enlazante" tal como se utiliza en la invención denota un péptido con secuencias de aminoácidos, que son preferiblemente de origen sintético. Estos péptidos de acuerdo con la invención se utilizan para enlazar a) VH-CH1 a VL-CL, b) VL-CL a VH-CH1, c) VH-CL a VL-CH1 o d) VL-CH1 a VH-CL para formar los siguientes fragmentos Fab de cadena sencilla de acuerdo con la invención a) VH-CHl-enlazante-VL-CL, b) VL-CL-enlazante-VH-CHl, c) VH-CL-enlazante-VL-CHl o d) VL-CHl-enlazante-VH-CL . El enlazante dentro de los fragmentos Fab de cadena sencilla es un péptido con una secuencia de aminoácidos con una longitud de al menos 30 aminoácidos, preferiblemente con una longitud de 32 a 50 aminoácidos. En una modalidad el enlazante es (GxS)n con G = glicina, S = serina, (x =3, n= 8 , 9 o 10 y m= 0, 1, 2 o 3) o (x = 4 y n= 6, 7 o 8 y m= 0, 1, 2 o 3), preferiblemente con x = 4, n= 6 o 7 y m= 0, 1, 2 o 3, más preferiblemente con x = 4, n= 7 y m= 2. En una modalidad el enlazante es (G4S)6G2.

A cada C- o N- terminal de la cadena pesada o ligera del anticuerpo de longitud completa, sólo uno de los fragmentos Fab de cadena sencilla bajo b) puede fusionarse a la vez. Así, hasta ocho fragmentos Fab de cadena sencilla pueden fusionarse al anticuerpo de longitud completa. Preferiblemente el anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención comprende de uno a cuatro fragmentos Fab de cadena sencilla. Más preferiblemente el anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención comprende dos fragmentos Fab idénticos de cadena sencilla (preferiblemente VL-CL-enlazante-VH-CHl) que ambos están fusionados a los dos C-terminal de las dos cadenas pesadas o a los dos C-terminal de las dos cadenas ligeras del anticuerpo de longitud completa bajo a) . La fusión resulta en dos péptidos de fusión idénticos (tanto i) cadena pesada y fragmento Fab de cadena sencilla o ii) cadena ligera y fragmento Fab de cadena sencilla) que están coexpresados con i) la cadena ligera o la cadena pesada del anticuerpo de longitud completa para proporcionar el anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención (véase Fig. 3, 4 y 5) .

En otra modalidad preferible el anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención comprende dos fragmentos Fab idénticos de cadena sencilla (preferiblemente VH-CHl-enlazante-VL-CL) que ambos están fusionados a los dos extremos N-terminal de las dos cadenas pesadas o a los dos extremos N-terminal de las dos cadenas ligeras del anticuerpo de longitud completa bajo a) . La fusión resulta en dos péptidos de fusión idénticos (tanto i) cadena pesada y fragmento Fab de cadena sencilla o ii) cadena ligera y fragmento Fab de cadena sencilla) que están coexpresados con i) la cadena ligera o la cadena pesada del anticuerpo de longitud completa para proporcionar el anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención.

Ambas partes del anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención comprende un sitio de unión a antígenos (el anticuerpo de longitud completa de acuerdo con la invención comprende dos, y cada fragmento Fab de cadena sencilla comprende un sitio de unión a antígeno) . Los términos "sitio de unión" o "sitio de unión a antígeno" tal como se usa aquí denota la(s) región (es) del anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención a los que se une específicamente el correspondiente antígeno. Los sitios de unión a antígeno tanto en el anticuerpo de longitud completa o en el fragmento Fab de cadena sencilla se forman cada uno mediante una pareja que consiste en un dominio variable de una cadena ligera de un anticuerpo (VL) y un dominio variable de la cadena pesada de un anticuerpo (VH) .

Los sitios de unión a antigenos que se unen específicamente al antígeno deseado (por ejemplo, EGFR) pueden derivar de a) anticuerpos conocidos del antígeno (por ejemplo anticuerpos anti-EGFR) o b) de nuevos anticuerpos o fragmentos de anticuerpo obtenidos mediante métodos de inmunización de novo utilizando entre otros la proteína del antígeno o el ácido nucleico o fragmentos de los mismos o mediante presentación de fagos .

Un sitio de unión a antígeno de un anticuerpo de la invención contiene seis regiones determinantes de la complementariedad (CDR) que contribuyen en variar los grados de afinidad del sitio de unión al antígeno. Existen tres CDR de los dominios variables de la cadena pesada (CDRH1, CDRH2 y CDRH3) y tres CDR de los dominios variables de la cadena ligera (CDRL1, CDRL2 y CDRL3 ) . La extensión de los CDR y las regiones marco (FR) se determina mediante comparación de una base de datos compilada de secuencias de aminoácidos en las que aquellas regiones se han definido de acuerdo con la variabilidad entre las secuencias.

La especificidad de anticuerpo se refiere al reconocimiento selectivo del anticuerpo para un epítopo particular de un antígeno. Los anticuerpos naturales, por ejemplo, son monoespecíficos . El término anticuerpo "multiespecífico" tal como se usa aquí denota un anticuerpo que posee dos o más sitios de unión a antígenos de los que al menos dos se unen a diferentes antígenos o a diferentes epítopos del mismo antígeno. Los "anticuerpos biespecífieos" de acuerdo con la invención son anticuerpos que poseen dos especificidades de unión a antígeno diferentes. Los anticuerpos de la presente invención son por ejemplo, multiespecífieos para al menos dos antígenos diferentes, es decir EGFR como primer antigeno e IGF- IR como segundo antígeno. En una modalidad de la invención el anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención es biespecífico . En otra modalidad de la invención el anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención es triespecífico .

El término anticuerpo "monoespecífico" tal como se usa aquí denota un anticuerpo que posee uno o más sitios de unión que se une cada uno al mismo epítopo del mismo antígeno.

El término "valente" tal como se utiliza dentro de la presente solicitud denota la presencia de un número especificado de sitios de unión en una molécula de anticuerpo. Un anticuerpo natural por ejemplo o un anticuerpo de longitud completa de acuerdo con la invención posee dos sitios de unión y es bivalente. Como tal, los términos "trivalente", "tetravalente", "pentavalente" y "hexavalente" denotan la presencia de dos sitios de unión, tres sitios de unión, cuatro sitios de unión, cinco sitios de unión, y seis sitios de unión, respectivamente, en una molécula de anticuerpo. Los anticuerpos multiespecífieos de acuerdo con la invención son al menos "trivalentes" . Preferiblemente son "trivalentes", "tetravalentes", "pentavalentes" o "hexavalentes" , más preferiblemente son "trivalentes" o "tetravalentes" .

Los anticuerpos de la presente invención poseen tres o más sitios de unión y son multiespecíficos , preferiblemente biespecíficos o triespecífieos . Como los anticuerpos multiespecíficos de acuerdo con la invención pueden ser biespecíficos aún en los casos en los que hay más de tres sitios de unión (es decir que el anticuerpo sea tetravalente, pentavalente o hexavalente o multivalente) . Para un anticuerpo con más de dos sitios de unión a antígeno, algunos sitios de unión pueden ser idénticos, de forma que la proteína posea sitios de unión para dos antígenos diferentes.

Otra modalidad de la presente invención es un anticuerpo multiespecífico que comprende a) un anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a un primer antígeno y que consiste en: aa) dos cadenas pesadas idénticas de anticuerpo que consisten en un dominio variable de la cadena pesada de un anticuerpo (VH) , en dirección N-terminal a C-terminal, un dominio constante 1 de la cadena pesada de un anticuerpo (CH1) , una región bisagra de un anticuerpo (HR) , un dominio constante 2 de la cadena pesada de un anticuerpo (CH2) , y un dominio constante 3 de la cadena pesada de un anticuerpo (CH3) ; y ab) dos cadenas ligeras idénticas de anticuerpo que consisten en un dominio variable de una cadena ligera de un anticuerpo (VL) , en dirección N-terminal a C-terminal, y de un dominio constante de una cadena ligera de un anticuerpo (CL) (VL-CL) ; y b) de uno a cuatro fragmentos Fab de cadena sencilla que se unen específicamente a entre uno y cuatro antígenos más (preferiblemente que se unen específicamente a otro antígeno) , en el que los fragmentos Fab de cadena sencilla consisten en un dominio variable de la cadena pesada de un anticuerpo (VH) y un dominio constante 1 de anticuerpo (CH1) , un dominio variable de una cadena ligera de un anticuerpo (VL) , de un dominio constante de una cadena ligera de un anticuerpo (CL) y un enlazante, y en el que los dominios de anticuerpo y el enlazante poseen uno de los siguientes órdenes en la dirección N-terminal a C-terminal: ba) VH-CHl-enlazante-VL-CL, bb) VL-CL-enlazante-VH-CHl , be) VH-CL-enlazante-VL-CHl o bd) VL-CHl-enlazante-VH-CL; en el que el enlazante es un péptido de al menos 30 aminoácidos, preferiblemente entre 32 y 50 aminoácidos ,- y en el que los fragmentos Fab de cadena sencilla bajo b) están fusionados al anticuerpo de longitud completa bajo a) mediante un péptido conector en el C- o N- terminal de la cadena pesada o ligera del anticuerpo de longitud completa; en el que el péptido conector es un péptido de al menos 5 aminoácidos, preferiblemente entre 10 y 50 aminoácidos.

Dentro de esta modalidad, preferiblemente uno o dos, más preferiblemente dos, fragmentos Fab de cadena sencilla ba) VH-CHl-enlazante-VL-CL o bb) VL-CL-enlazante-VH-CHl , preferiblemente bb) VL-CL-enlazante-VH-CHl, que se unen específicamente a un segundo antígeno están fusionados al anticuerpo de longitud completa mediante un péptido conector en el C-terminal de la cadena pesada del anticuerpo de longitud completa, y los fragmentos Fab de cadena sencilla no están estabilizados por disulfuros.

Una modalidad de la invención es un anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención, en el que uno o dos fragmentos Fab de cadena sencilla que se unen a un segundo antígeno están fusionados al anticuerpo de longitud completa mediante un péptido conector en el C-terminal de las cadenas pesadas del anticuerpo de longitud completa (anticuerpo biespecífico) .

Preferiblemente el anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención comprende dos fragmentos Fab idénticos de cadena sencilla que se unen a un segundo antígeno, en el que ambos están fusionados a los extremos C- o N terminal de la cadena pesada o de la cadena ligera. (anticuerpo biespecífico) .

Una modalidad de la invención es un anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención, en el que dos fragmentos Fab idénticos de cadena sencilla VL-CL-enlazante-VH-CH1 o VH-CHl-enlazante-VL-CL, preferiblemente VL-CL-enlazante-VH-CHl, que se unen a un segundo antígeno están fusionados con su N-terminal al anticuerpo de longitud completa mediante un péptido conector en los dos C-terminal de las dos cadenas pesadas o en los dos C-terminal de las dos cadenas ligeras de dicho anticuerpo de longitud completa (anticuerpo biespecífico, tetravalente) . En una modalidad preferible el anticuerpo multiespecífico (preferiblemente el anticuerpo biespecífico, tetravalente) de acuerdo con la invención contiene un IgG de longitud completa y dos fragmentos Fab idénticos de cadena sencilla de acuerdo con la invención tal como se ha descrito antes y se une específicamente a IGF-IR humano así como a EGFR humano. Estas moléculas se basan preferiblemente en el sitio de unión a antígenos de los anticuerpos anti-IGF-lR humanos <IGF-1R> HUMAB Clon 18 (DSM ACC 2587; WO 2005/005635, abreviado como <IGF-lR>Clon 18 o <IGF-1R> AK18) y <EGFR>ICR62 humanizado (WO 2006/082515 abreviado como <EGFR>ICR62) . Estas moléculas simultáneamente están dirigidas e interfieren con la acción de dos receptores de tirosina quinasas sobre las células tumorales . Esta actividad dual provoca una actividad antitumoral marcadamente mejorada en comparación con los anticuerpos que interfieren solo con uno de los receptores . El diseño, composición, generación y caracterización de las moléculas se muestra en los Ejemplos 1 - 6 Así en una modalidad el anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención se caracteriza en que i) el anticuerpo de longitud completa se une específicamente a IGF1R y comprende en el dominio variable de la cadena pesada una región CDR3 de SEC ID NO: 1, una región CDR2 de SEC ID NO : 2, y una región CDR1 de SEC ID NO: 3, y en el dominio variable de la cadena ligera una región CDR3 de SEC ID NO : 4 , una región CDR2 de SEC ID NO : 5 , y una región CDR1 de SEC ID NO: 6; y ii) el fragmento Fab de cadena sencilla se une específicamente a EGFR y comprende en el dominio variable de la cadena pesada una región CDR3 de SEC ID NO: 9, una región CDR2 de SEC ID NO: 10, y una región CDR1 de SEC ID NO: 11, y en el dominio variable de la cadena ligera una región CDR3 de SEC ID NO: 12, una región CDR2 de SEC ID NO: 13, y una región CDR1 de SEC ID NO: 14.

En una modalidad el anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención se caracteriza en que i) el anticuerpo de longitud completa se une específicamente a IGF-IR y comprende como dominio variable de la cadena pesada la SEC ID NO: 7, y como dominio variable de la cadena ligera SEC ID NO: 8, y ii) el fragmento Fab de cadena sencilla se une específicamente a EGFR y comprende como dominio variable de la cadena pesada la SEC ID NO: 15, y como dominio variable de la cadena ligera una SEC ID NO: 16.

En una modalidad el anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención se caracteriza en que i) el anticuerpo de longitud completa se une específicamente a EGFR y comprende en el dominio variable de la cadena pesada una región CDR3 de la SEC ID NO: 9, una región CDR2 de, SEC ID NO: 10, y una región CDRl de SEC ID NO: 11, y en el dominio variable de la cadena ligera una región CDR3 de SEC ID NO: 12, una región CDR2 de SEC ID NO: 13, y una región CDRl de SEC ID NO: 14; y ii) el fragmento Fab de cadena sencilla se une específicamente a IGF-IR y comprende en el dominio variable de la cadena pesada una región CDR3 de SEC ID NO: 1, una región CDR2 de SEC ID NO: 2, y una región CDRl de SEC ID NO: 3, y en el dominio variable de la cadena ligera una región CDR3 de SEC ID NO : 4, una región CDR2 de SEC ID NO: 5, y una región CDRl de SEC ID NO: 6.

En una modalidad el anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención se caracteriza en que i) el anticuerpo de longitud completa se une específicamente a EGFR y comprende como dominio variable de la cadena pesada la SEC ID NO: 15, y como dominio variable de la cadena ligera una SEC ID NO: 16, y ii) el fragmento Fab de cadena sencilla se une específicamente a IGF1R y comprende como dominio variable de la cadena pesada la SEC ID NO: 7, y como dominio variable de la cadena ligera SEC ID NO: 8.

Una modalidad de la invención es un anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención, en el que dos fragmentos Fab idénticos de cadena sencilla VL-CL-enlazante-VH-CH1 o VH-CHl-enlazante-VL-CL, preferiblemente VL-CL-enlazante-VH-CHl , que se unen a un segundo antígeno están fusionados con su C-terminal al anticuerpo de longitud completa mediante un péptido conector en los dos extremos N-terminal de las dos cadenas pesadas o en los dos extremos N-terminal de las dos cadenas ligeras de el anticuerpo de longitud completa.

Una modalidad de la invención es un anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención, en el que un fragmento Fab de cadena sencilla que se une a un segundo antígeno está fusionado al anticuerpo de longitud completa mediante un péptido conector al extremo C o N-terminal de una cadena pesada o una cadena ligera del anticuerpo de longitud completa. Una modalidad de la invención es un anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención, en el que un fragmento Fab de cadena sencilla que se une a un segundo antígeno está fusionado al anticuerpo de longitud completa mediante un péptido conector al N-terminal de una cadena pesada o una cadena ligera del anticuerpo de longitud completa. Una modalidad de la invención es un anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención, en el que un fragmento Fab de cadena sencilla que se une a un segundo antígeno está fusionado al anticuerpo de longitud completa mediante un péptido conector en el C-terminal de una cadena pesada o una cadena ligera del anticuerpo de longitud completa (véase por ejemplo, la Fig. 6) .

Preferiblemente el anticuerpo' multiespecífico de acuerdo con la invención comprende dos fragmentos Fab de cadena sencilla que se unen a un segundo antígeno y a un tercer antígeno (anticuerpo triespecífico) (véase por ejemplo, la Fig. 7) .

En otro aspecto de la presente invención el anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención comprende a) un anticuerpo de longitud completa que se une a un primer antígeno que consiste en dos cadenas pesadas idénticas de anticuerpo VH-CH1-HR-CH2-CH3 y dos cadenas ligeras idénticas de anticuerpo VL-CL ; y b) de uno a cuatro fragmentos Fab de cadena sencilla ba) VH-CHl-enlazante-VL-CL o bb) VL-CL-enlazante-VH-CHl , que se unen a entre uno y cuatro antígenos adicionales, en el que los fragmentos Fab de cadena sencilla están unidos al anticuerpo de longitud completa mediante un péptido conector en el C- o N- terminal de la cadena pesada y ligera de el anticuerpo de longitud completa.

Los anticuerpos de longitud completa de la invención comprenden regiones constantes de inmunoglobulinas de una o más clases de inmunoglobulina . Las clases de inmunoglobulina incluye los isotipos de IgG, IgM, IgA, IgD, e IgE y, en el caso de IgG e IgA, sus subtipos. En una modalidad preferible, un anticuerpo de longitud completa de la invención posee una estructura de dominio constante de un anticuerpo de tipo IgG.

Los términos "anticuerpo monoclonal" o "composición de anticuerpo monoclonal" tal como se usa aquí se refieren a una preparación de moléculas de anticuerpo de una composición de aminoácidos única.

El término "anticuerpo quimérico" se refiere a un anticuerpo que comprende una región variable, es decir, una región de unión, de una fuente o especie y al menos una porción de una región constante derivada de una fuente o especie diferente, preparada normalmente mediante técnicas de ADN recombinante . Los anticuerpos quiméricos que comprenden una región variable murina y una región constante humana son preferibles. Otras formas preferibles de "anticuerpos quiméricos" abarcados por la presente invención son aquellas en las que la región constante se ha modificado o cambiado de la del anticuerpo original para generar las propiedades de acuerdo con la invención, especialmente respecto a la unión de Clq y/o unión del receptor Fe (FcR) . Los anticuerpos quiméricos también están referidos como "anticuerpos de cambio de clase" . Los anticuerpos quiméricos son el producto de genes de inmunoglobulina expresados que comprenden segmentos de ADN que codifican regiones variables de inmunoglobulina y segmentos de ADN que codifican regiones constantes de inmunoglobulina. Los métodos para producir anticuerpos quiméricos implican técnicas convencionales de ADN recombinante y transfección génica bien conocidas en el arte previo. Véase, por ejemplo, Morrison, S.L., et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855; N° de Patente US 5.202.238 y 5.204.244.

El término "anticuerpo humanizado" se refiere a anticuerpos en los que las regiones marco o "regiones determinantes de complementariedad" (CDR) se han modificado para comprender las CDR de una inmunoglobulina de diferente especificidad comparada con la de la inmunoglobulina parental. En una modalidad preferible, una CDR murina se inserta en una región marco de un anticuerpo humano para preparar el "anticuerpo humanizado" .Véase, por ejemplo, Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323-327; y Neuberger, M.S., et al., Nature 314 (1985) 268-270. Las CDR particularmente preferibles corresponden a aquellas que representan las secuencias que reconocen los antígenos mencionados anteriormente para los anticuerpos quiméricos.

Otras formas de "anticuerpos humanizados" incluidos en la presente invención son aquellos en los que la región constante se ha modificado o cambiado de forma adicional respecto a la del anticuerpo original para generar las propiedades de acuerdo con la invención, especialmente respecto a la unión de Clq y/o la unión del receptor dé Fe (FcR) .

El término "anticuerpo humano", como se utiliza aquí, pretende incluir anticuerpos con las regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana. Los anticuerpos humanos son bien conocidos en la materia (van Dijk, M.A. , y van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Chem. Biol . 5 (2001) 368-374). Los anticuerpos humanos también pueden producirse en animales transgénicos (por ejemplo, ratones) que sean capaces, tras una inmunización, de producir un repertorio completo o una selección de anticuerpos humanos en ausencia de producción de inmunoglobulinas endógenas. La transferencia del conjunto de genes de la inmunoglobulina de línea germinal humana a la línea germinal de tales ratones de mutantes resultará en la producción de anticuerpos humanos tras la exposición al antígeno (véase, por ejemplo, Jakobovits, A., et al., Proc . Nati. Acad. Sci. USA 90 (1993) 2551-2555; Jakobovits, A., et al., Nature 362 (1993) 255-258; Brueggemann, M. , et al . , Year Immunol. 7 (1993) 33-40). Los anticuerpos humanos también pueden producirse en bibliotecas de presentación de fagos (Hoogenboom, H.R., y Winter, G. , J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388; Marks, J.D., et al., J. Mol. Biol. 222 (1991) 581-597) . Las técnicas de Colé et al . y Boerner et al. también están disponibles para la preparación de anticuerpos humanos monoclonales (Colé, S.P.C., et al., Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, Alan R. Liss, (1985) 77; y Boerner, P., et al., J. Immunol . 147 (1991) 86-95). Como ya se ha mencionado para los anticuerpos quiméricos y humanizados de acuerdo con la invención, el término "anticuerpo humano" como se usa aquí también comprende aquellos anticuerpos que están modificados en la región constante para generar las propiedades de acuerdo con la invención, especialmente respecto a la unión de Clq y/o la unión de FcR, por ejemplo, mediante "cambio de clase", es decir, el cambio o mutación de las partes Fe (por ejemplo, mutación de IgGl a IgG4 y/o IgGl/IgG4.) En caso que el anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención comprenda uno o tres fragmentos Fab de cadena sencilla (o en el caso de dos fragmentos no idénticos de cadena sencilla que estén unidos ambos al extremo C- o N-terminal de la cadena pesada o ligera) que resulta en péptidos de fusión heterodiméricos , los dominios CH3 del anticuerpo de longitud completa de acuerdo con la invención pueden alterarse mediante la tecnología de "superhélice" que se describe con detalle con varios ejemplos por ejemplo en la patente WO 96/027011, Ridgway J.B., et al., Protein Eng 9 (1996) 617-621; y Merchant, A.M., et al., Nat Biotechnol 16 (1998) 677-681. En este método las superficies de interacción de los dos dominios CH3 se han alterado para aumentar la heterodimerización de ambas cadenas pesadas que contienen estos dos dominios CH3. Cada uno de los dos dominios CH3 (de las dos cadenas pesadas) puede ser el "dominio sobre enrrollado", mientras el otro es el "dominio en forma de horquilla" . La introducción de un puente disulfuro estabiliza los heterodímeros (Merchant A.M, et al, Nature Biotech 16 (1998) 677-681; Atwell S, Ridgway JB, Wells JA, Cárter P.( J Mol Biol 270 (1997) 26-35) y aumenta el rendimiento.

Así, en un aspecto de la invención el anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención comprende sólo un fragmento Fab de cadena sencilla y además se caracteriza en que el dominio CH3 de una cadena pesada y el dominio CH3 de la otra cadena pesada se encuentran en una interfase que comprende una interfase original entre los dominios CH3 del anticuerpo; en el que la interfase está alterada para promover la formación del anticuerpo biespecífico, bivalente, en el que la alteración se caracteriza en que: a) el dominio CH3 de una cadena pesada está alterado, de forma que en la interfase original del dominio CH3 de una cadena pesada que se encuentra con la interfase original del dominio CH3 de la otra cadena pesada dentro del anticuerpo biespecífico, bivalente, un residuo aminoacídico se sustituye por un residuo aminoacídico con un volumen de cadena lateral superior, por lo que genera una protuberancia en la interfase del dominio CH3 de una cadena pesada que puede posicionarse en una cavidad de la interfase del dominio CH3 de la otra cadena pesada y b) el dominio CH3 de la otra cadena pesada está alterado, de forma que en la interfase original del segundo dominio CH3 que se encuentra con la interfase original del primer dominio CH3 del anticuerpo biespecífico, trivalente, un residuo aminoacídico se sustituye por un residuo aminoacídico con un volumen de cadena lateral inferior, por lo que genera una cavidad en la interfase del segundo dominio CH3 en la que una protuberancia de la superficie del primer dominio CH3 puede posicionarse.

Preferiblemente, el residuo aminoacídico con una cadena lateral de mayor volumen se selecciona de entre el grupo que consiste en arginina (R) , fenilalanina (F) , tirosina (Y) y triptófano (W) .

Preferiblemente, el residuo aminoacídico con una cadena lateral de menor volumen se selecciona de entre el grupo que consiste en alanina (A) , serina (S) , treonina (T) y valina (V) .

En un aspecto de la invención ambos dominios CH3 se alteran además mediante la introducción de cisteína (C) como aminoácido en las correspondientes posiciones de cada dominio CH3 de forma que puede formarse un puente disulfuro entre ambos dominios CH3.

En una modalidad preferida, el anticuerpo multiespecífico comprende sólo un fragmento Fab de cadena sencilla y es un anticuerpo biespeclfico trivalente. El anticuerpo biespeclfico trivalente, comprende una mutación T366W en el dominio CH3 de la "cadena sobre enrrollada" y mutaciones T366S, L368A, Y407V en el dominio CH3 de la "cadena en forma de horquilla" . También puede utilizarse un puente disulfuro intercadena adicional entre los dominios CH3 (Merchant, A.M, et al., Nature Biotech 16 (1998) 677-681) por ejemplo, mediante la introducción de una mutación Y349C en el dominio CH3 de la "cadena sobre enrrollada" y una mutación E356C o una mutación S354C en el dominio CH3 de la "cadena en forma de horquilla". Así, en otra modalidad preferible, el anticuerpo biespecífico trivalente, comprende mutaciones Y349C, T366W en uno de los dos dominios CH3 y mutaciones E356C, T366S, L368A, Y407V en los otros dos dominios CH3 o el anticuerpo biespecífico trivalente, comprende mutaciones Y349C, T366 en uno de los dos dominios CH3 y mutaciones S354C, T366S, L368A, Y407V en los otros dos dominios CH3 (la mutación Y349C adicional en un dominio CH3 y la mutación E356C o S354C adicional en el otro dominio CH3 forma un puente disulfuro intercadena) (la numeración siempre de acuerdo con el índice EU de Kabat) . También pueden utilizarse otras tecnologías de superhélice como se describe en la PE 1870459A1, de forma alternativa o adicional. Un ejemplo preferible para el anticuerpo biespecífico trivalente, son las mutaciones R409D; K370E en el dominio CH3 de las "cadenas sobre enrrolladas" y las mutaciones D399K; E357K en el dominio CH3 de la "cadena en forma de horquilla" (la numeración siempre de acuerdo con el índice EU de Kabat) .

En otra modalidad preferida el anticuerpo biespecífico trivalente, (anticuerpo multiespecífico que comprende solo un fragmento Fab de cadena sencilla) comprende una mutación T366W en el dominio CH3 de la "cadena sobre enrrollada" y mutaciones T366S, L368A, Y407V en el dominio CH3 de la "cadena en forma de horquilla" y adicionalmente mutaciones R409D; K370E en el dominio CH3 de la "cadena sobre enrrollada" y mutaciones D399K; E357K en el dominio CH3 de la "cadena en forma de horquilla" .

En otra modalidad preferida el anticuerpo biespecífico trivalente, (anticuerpo multiespecífico que comprende sólo un fragmento Fab de cadena sencilla) comprende las mutaciones Y349C, T366W en uno de los dos dominios CH3 y mutaciones S354C, T366S, L368A, Y407V en el otro de los dos dominios CH3 o el anticuerpo biespecífico trivalente, comprende mutaciones Y349C, T366W en uno de los dos dominios CH3 y mutaciones S354C, T366S, L368A, Y407V en el otro de los dos dominios CH3 y adicionalmente mutaciones R409D; K370E en el dominio CH3 de la "cadena sobre enrrollada" y mutaciones D399K; E357K en el dominio CH3 de la "cadena en forma de horquilla" .

Así, una modalidad de la invención es un anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención, en el que un fragmento Fab de cadena sencilla que se une a un segundo antígeno está fusionado a el anticuerpo de longitud completa mediante un péptido conector en el extremo C- o N-terminal de una cadena pesada o una cadena ligera del anticuerpo de longitud completa (preferiblemente el C-terminal de una cadena pesada) , en el que el anticuerpo de longitud completa comprende una mutación T366W en uno de los dos dominios CH3 y mutaciones T366S, L368A, Y407V en el otro de los dos dominios CH3. Otra modalidad de la invención es un anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención , en el que un fragmento Fab de cadena sencilla que se une a un segundo antígeno está fusionado al anticuerpo de longitud completa mediante un péptido conector en el extremo C- o N-terminal de una cadena pesada o una cadena ligera del anticuerpo de longitud completa (preferiblemente el C-terminal de una cadena pesada) , en el que el anticuerpo de longitud completa comprende mutaciones Y349C, T366W en uno de los dos dominios CH3 y mutaciones S354C, T366S, L368A, Y407V en el otro de los dos dominios CH3. (véase por ejemplo, la Fig. 6). Otra modalidad de la invención es un anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención, en el que un fragmento Fab de cadena sencilla que se une a un segundo antígeno está fusionado al anticuerpo de longitud completa mediante un péptido conector en el extremo C- o N-terminal de una cadena pesada o una cadena ligera del anticuerpo de longitud completa (preferiblemente el C-terminal de una cadena pesada) , en el que el anticuerpo de longitud completa comprende mutaciones Y349C, T366W en uno de los dos dominios CH3 y mutaciones S354C, T366S, L368A, Y407V en el otro de los dos dominios CH3.

El término "anticuerpo humano recombinante" , como se utiliza aquí, pretende incluir todos los anticuerpos humanos que se han preparado, expresado, creado o aislado mediante medios recombinantes , como los anticuerpos aislados a partir de una célula huésped como una célula NSO o CHO o a partir de un animal (por ejemplo, un ratón) que es transgénico para los genes de la inmunoglobulina humana o anticuerpos expresados utilizando un vector de expresión recombinante transfectado en una célula huésped. Tales anticuerpos humanos recombinantes tienen las regiones variables y constantes reorganizadas. Los anticuerpos recombinantes humanos de acuerdo con la invención se han sometido una hipermutación somática in vivo. Por lo tanto, las secuencias de aminoácido de las regiones VH y VL de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, aunque son derivadas y están relacionadas con las secuencias VH y VL de la línea germinal humana, pueden no aparecer naturalmente en un repertorio de anticuerpos de línea germinal humana in vivo.

El "dominio variable" (dominio variable de una cadena ligera (VL) , región variable de una cadena pesada (VH) ) como se usa aquí indica cada par de cadenas ligeras y pesadas que están directamente involucradas en la unión del anticuerpo al antígeno. Los dominios de las cadenas ligeras y pesadas variables humanas tienen la misma estructura general y cada dominio comprende cuatro regiones marco (FR) cuyas secuencias están ampliamente conservadas, conectadas por tres "regiones hipervariables" (o regiones determinantes de complementariedad, CDR) . Las regiones marco adoptan una conformación de lámina ß y las CDR pueden formar bucles que conectan la estructura de lámina ß . Las CDR de cada cadena se mantienen en su estructura tridimensional a través de las regiones marco y formar junto con las CDR de la otra cadena el punto de unión del antígeno. Las regiones CDR3 de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo juegan un papel particularmente importante en la especificidad/afinidad de la unión de los anticuerpos de acuerdo con la invención y por lo tanto proporcionan otro objeto de la invención.

Los términos "región hipervariable" o "porción de unión del antígeno de un anticuerpo", como se utiliza aquí, se refiere a los residuos aminoacídicos de un anticuerpo que son responsables de la unión del antígeno. La región hipervariable comprende los residuos aminoacídicos de las "regiones determinantes de complementariedad" o "CDR" . Las regiones "marco" o "FR", como se utilizan aquí, son aquellas regiones del dominio variable diferentes de los residuos de la región hipervariable. Por lo tanto, las cadenas ligeras y pesadas de un anticuerpo comprenden de N- a C-terminal los dominios FR1, CDR1, FR2 , CDR2 , FR3 , CDR3 y FR4. Las CDR de cada cadena están separadas por tales aminoácidos marco. Especialmente, la CDR3 de la cadena pesada es la región que contribuye la mayor parte de la unión del antígeno. Las regiones CDR y FR se determinan de acuerdo con la definición estándar de Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) .

Como se utiliza aquí, el término "unión" o "se une específicamente a" se refiere a la unión del anticuerpo a un epítopo del antígeno en un ensayo in vitro, preferiblemente en un ensayo de resonancia de plasmón (BIAcore, GE-Healthcare Uppsala, Suecia) con antígeno salvaje purificado. La afinidad de unión está definida por los términos ka (tasa constante para la asociación del anticuerpo del complejo anticuerpo/antígeno) , kD (constante de disociación) , y KD (kD/ka) . Unión o que se unen específicamente significa una afinidad de unión (KD) de 10 " 8 mol/ 1 o inferior, preferiblemente 10 ~ 9 M a 10 " 13 mol/ 1 . Así, un anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención se une específicamente a cada antígeno para el que es específico con una afinidad de unión (KD) de 10 " 8 mol/ 1 o menos, preferiblemente 10 ~ 9 M a 10 " 13 mol/ 1 .

La unión del anticuerpo a FCYRI I I puede investigarse mediante un ensayo BIAcore (GE-Healthcare Uppsala, Suecia) . La afinidad de unión está definida por los términos ka (tasa constante para la asociación del anticuerpo del complejo anticuerpo/antígeno) , kD (constante de disociación) , y KD (kD/ka) El término "epítopo" incluye cualquier determinante de polipéptido capaz de unirse específicamente a un anticuerpo. En ciertas modalidades, los determinantes de epítopo incluyen agrupamientos de superficie químicamente activos de moléculas como aminoácidos, cadenas laterales de azúcares, fosforilo o sulfonilo, y en ciertas modalidades, pueden tener características estructurales específicas tridimensionales o características de carga específicas. Un epítopo es una región de un antígeno que se une mediante un anticuerpo.

En ciertas modalidades, se dice que un anticuerpo se une específicamente a un antígeno cuando este reconoce preferentemente su antígeno diana en una mezcla compleja de proteínas y/o macromoléculas .

El término "región constante" tal como se utiliza en la presente solicitud denota la suma de los dominios de un anticuerpo diferente de la región variable. La región constante no está involucrada directamente en la unión de un antígeno, pero presenta varias funciones efectoras. Dependiendo de la secuencia de aminoácidos de la región constante de sus cadenas pesadas, los anticuerpos se dividen en las clases: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varios de estos pueden además dividirse en subclases, como IgGl, IgG2 , IgG3 , y IgG4 , IgAl y IgA2. Las regiones constantes de la cadena pesada que corresponden con las diferentes clases de anticuerpos se denominan a, d, e, ? y µ respectivamente. Las regiones constantes de la cadena ligera (CL) que pueden encontrarse en las cinco clases de anticuerpo se denominan (kappa) y ? (lambda) .

El término "región constante de origen humano" tal como se utiliza en la presente solicitud denota una región constante de cadena pesada de una anticuerpo de la subclase IgGl, IgG2, IgG3 , o IgG4 humano y/o una región constante de cadena ligera kappa o lambda. Tales regiones constantes son bien conocidas en el estado de la técnica y por ejemplo, se describen en Kabat, E.A., (véase por ejemplo, Johnson, G. y Wu, T.T., Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218; Kabat, E.A., et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 72 (1975) 2785-2788).

Mientras que los anticuerpos de la subclase IgG4 muestran unión reducida al receptor Fe (FcYRIIIa) , los anticuerpos de otras subclases de IgG muestran una fuerte unión. No obstante, Pro238, Asp265, Asp270, Asn297 (pérdida de carbohidrato de Fe), Pro329, Leu234, Leu235, Gly236, Gly237, Ile253, Ser254, Lys288, Thr307, Gln311, Asn434, y His435 son residuos que, si se alteran, proporcionan también una unión reducida al receptor de Fe (Shields, R.L., et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604; Lund, J., et al., FASEB J. 9 (1995) 115-119; Morgan, A., et al., Immunology 86 (1995) 319-324; PE 0 307 434) .

En una modalidad un anticuerpo de acuerdo con la invención posee una unión reducida a FcR si se compara con un anticuerpo IgGl y el anticuerpo parental de longitud completa es respecto a la unión a FcR de la subclase IgG4 o de la subclase IgGl o IgG2 con una mutación en S228, L234, L235 y/o D265, y/o contiene la mutación PVA236. En una modalidad las mutaciones en el anticuerpo parental de longitud completa son S228P, L234A, L235A, L235E y/o PVA236. En otra modalidad las mutaciones en el anticuerpo parental de longitud completa están en IgG4 S228P y en IgGl L234A y L235A. Las regiones constantes de la cadena pesada se muestran en la SEC ID N° : 17 y 18. En una modalidad la región constante de la cadena pesada del anticuerpo parental de longitud completa es SÉC ID N° : 17 con las mutaciones L234A y L235A. En otra modalidad la región constante de la cadena pesada del anticuerpo parental de longitud completa es SEC ID N° : 18 con la mutación S228P. En otra modalidad la región constante de la cadena ligera del anticuerpo parental de longitud completa es una región kappa de cadena ligera de SEC ID N° : 19 o región lambda de cadena ligera. Preferiblemente la región constante de la cadena pesada del anticuerpo parental de longitud completa es SEC ID N° : 17 o SEC ID N° : 18 con la mutación S228P.

La región constante de un anticuerpo está directamente involucrada en la CCDA (citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos) y la CDC (citotoxicidad dependiente de complemento) . La activación del complemento (CDC) está iniciada mediante la unión del factor Clq del complemento a la región constante de la mayoría de subclases de anticuerpo IgG. La unión de Clq a un anticuerpo es provocada mediante las interacciones proteína-proteína definidas en los denominados sitios de unión. Tales sitios de unión a la región constante son conocidos en la técnica y están descritos por ejemplo, en Lukas, T.J., et al., J. Immunol . 127 (1981) 2555-2560; Brunhouse, R. y Cebra, J.J., Mol. Immunol. 16 (1979) 907-917; Burton, D.R., et al., Nature 288 (1980) 338-344; Thommesen, J.E., et al., Mol. Immunol. 37 (2000) 995-1004; Idusogie, E.E., et al., J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184; Hezareh, M. , et al . , J. Virol . 75 (2001) 12161-12168; Morgan, A. , et al . , Immunology 86 (1995) 319-324; y EP 0 307 434. Los sitios de unión a región constante están, por ejemplo, caracterizados mediante los aminoácidos L234, L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331, y P329 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) .

El término "citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (CCDA)" se refiere a la lisis de células tumorales humanas diana mediante un anticuerpo de acuerdo con la invención en presencia de células efectoras . La CCDA se mide preferiblemente mediante el tratamiento de una preparación de células que expresan el antígeno con un anticuerpo de acuerdo con la invención en presencia de células efectoras como CMSP recién aisladas o células efectoras purificadas de la capa leucoplaquetar, como los monocitos o las células (NK) o una línea celular NK en crecimiento permanente.

El término "citotoxicidad dependiente de complemento (CDC)" denota un proceso iniciado por la unión del factor de complemento Clq a la parte Fe de la mayoría de subclases de anticuerpo IgG. La unión de Clq a un anticuerpo está provocada por interacciones proteína-proteína definidas en el denominado sitio de unión. Los sitios de unión a la parte Fe son conocidos en el estado de la técnica (ver más arriba) . Los sitios de unión a la parte Fe se caracterizan, por ejemplo, por los aminoácidos L234, L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331, y P329 (numerados de acuerdo con el índice EU de Kabat) . Los anticuerpos de la subclase IgGl, IgG2, y IgG3 normalmente muestran activación del complemento que incluye la unión de Clq y C3 , mientras que IgG4 no activa el sistema del complemento y no une Clq y/o C3.

En otra modalidad el anticuerpo multiespecifico de acuerdo con la invención se caracteriza en que el anticuerpo de longitud completa es de la subclase IgGl humana, o de la subclase IgGl humana con las mutaciones L234A y L235A.

En otra modalidad el anticuerpo multiespecifico de acuerdo con la invención se caracteriza en que el anticuerpo de longitud completa es de la subclase IgG2 humana.

En otra modalidad el anticuerpo multiespecifico de acuerdo con la invención se caracteriza en que el anticuerpo de longitud completa es de la subclase IgG3 humana.

En otra modalidad el anticuerpo multiespecifico de acuerdo con la invención se caracteriza en que el anticuerpo de longitud completa es de la subclase IgG4 humana o, de la subclase IgG4 humana con la mutación S228P adicional.

Preferiblemente el anticuerpo multiespecifico de acuerdo con la invención se caracteriza en que el anticuerpo de longitud completa es de la subclase IgGl humana, de la subclase IgG4 humana con la mutación S228P adicional.

En otra modalidad el anticuerpo multiespecifico de acuerdo con la invención se caracteriza en que el anticuerpo de longitud completa está modificado (tanto por mutaciones en las regiones Fe o mediante glicomodificaciones) de forma que aumenta la afinidad hacia el receptor Illa Fc-gamma humano para aumentar su competencia para mediar la CCDA. Los métodos para aumentar la CCDA de anticuerpos mediante la reducción de la cantidad de fucosa se describe por ejemplo, en WO 2005/018572, WO 2006/116260, WO 2006/114700, O 2004/065540, WO 2005/011735, WO 2005/027966, WO 1997/028267, US 2006/0134709, US 2005/0054048, US 2005/0152894, WO 2003/035835, WO 2000/061739 Niwa R. et al., J. Immunol. Methods 306 (2005) 151-160; Shinkawa, T. et al, J Biol Chem, 278 (2003) 3466-3473; WO 03/055993 o US2005/0249722. Por lo tanto, en una modalidad de la invención el anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención se caracteriza en que el anticuerpo de longitud completa es un anticuerpo afucosilado de isotipo igGl o IgG3 en el que la cantidad de fucosa es del 60% o inferior a la cantidad total de oligosacáridos (azúcares) en la Asn297 (lo que indica que al menos el 40% o más de los oligosacáridos de la región Fe en la Asn297 están afucosilados) .

El anticuerpo de acuerdo con la invención se produce mediante métodos recombinantes . Así, un aspecto de la presente invención es un ácido nucleico que codifica el anticuerpo de acuerdo con la invención y otro aspecto es una célula que comprende el ácido nucleico que codifica un anticuerpo de acuerdo con la invención. Los métodos para la producción recombinante son ampliamente conocidos en la materia y comprende la expresión de proteínas en células procariotas y eucariotas con el posterior aislamiento del anticuerpo y normalmente la purificación de una pureza farmacéuticamente aceptable. Para la expresión de los anticuerpos anteriormente mencionados en una célula huésped, los ácidos nucleicos que codifican las correspondientes cadenas pesadas y ligeras modificadas se insertan en vectores de expresión mediante métodos estándar. La expresión se realiza en células huésped apropiadas procariotas o eucariotas como las células CHO, células NSO, células SP2/0, células HEK293, células COS, células de levadura o E. coli, y el anticuerpo se recupera de la células (del sobrenadante o de las células tras una lisis) . Los métodos generales para la producción recombinante de anticuerpos son bien conocidos en la materia y se describen, por ejemplo, en los artículos de revisión de Makrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202; Geisse, S., et al., Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282; Kaufman, R.J., Mol. Biotechnol . 16 (2000) 151-161; erner, R.G., Drug Res. 48 (1998) 870-880.

Los anticuerpos multiespecífieos de acuerdo con la invención se separan de forma adecuada del medio de cultivo mediante procedimientos de purificación de inmunoglobulina convencionales como, por ejemplo, proteína A-Sepharose, cromatografía con hidroxiapatita, electroforesis en gel, diálisis o cromatografía de afinidad. Los ADN y ARN que codifican los anticuerpos monoclonales se puede aislar fácilmente y secuenciarse utilizando los procedimientos habituales. Las células de hibridoma pueden utilizarse como fuente de tales ADN y ARN. Una vez aislados, los ADN pueden insertarse en vectores de expresión, que entonces se transfectan en células huésped como las células HEK 293, células CHO o células de mieloma que de otro modo no producirían las proteínas de inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales recombinantes en las células huésped.

Las variantes (o mutantes) de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo multiespecífico se preparan mediante la introducción de cambios de nucleótido apropiados en el ADN del anticuerpo, o mediante síntesis de nucleótidos . Tales modificaciones pueden realizarse, no obstante, solo en un intervalo muy limitado, por ejemplo, como se ha descrito antes. Por ejemplo, las modificaciones no alteran las características del anticuerpo mencionado antes como el isotipo de IgG y la unión a antígeno, pero puede mejorar el rendimiento de la producción recombinante , estabilidad de la proteína o facilitar la purificación.

El término "célula huésped" tal como se utiliza en la presente solicitud denota cualquier tipo de sistema celular que puede diseñarse para generar los anticuerpos de acuerdo con la presente invención. En una modalidad se utilizan las células HEK293 y células CHO como células huésped.

Tal como se usa aquí, las expresiones "célula", "línea celular", y "cultivo celular" se utilizan de forma intercambiable y todas estas designaciones incluyen a la progenie. Así, las palabras "transformantes" y "células transformadas" incluyen la primera célula objeto y los cultivos derivados de la misma sin tener en cuenta el número de transferencias. También se entiende que toda la progenie no será precisamente idéntica en el contenido de ADN, debido a las mutaciones deliberadas o inadvertidas. La variante de progenie que posee la función o actividad biológica para la que se ha seleccionado en la célula transformada original está incluida. Cuando se pretendan designaciones diferentes, quedará claro por el contexto.

La expresión en células NSO se describe mediante, por ejemplo, Barnes, L.M., et al., Cytotechnology 32 (2000) 109-123; y Barnes, L.M. , et al., Biotech. Bioeng. 73 (2001) 261-270. La expresión transitoria se describe en, por ejemplo, Durocher, Y., et al., Nucí. Acids. Res. 30 (2002) E9. La clonación de dominios variables se describe en Orlandi, R. , et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86 (1989) 3833-3837; Cárter, P., et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289; y Norderhaug, L. , et al . , J. Immunol. Methods 204 (1997) 77-87. Un sistema de expresión transitoria preferible (HEK 293) se describe en Schlaeger, E. J. , y Christensen, K. ( en Cytotechnology 30 (1999) 71-83, y en Schlaeger, E. J. , en J. Immunol. Methods 194 (1996) 191-199.

Las secuencias control que son adecuadas para procariotas, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia operador y un punto de unión del ribosoma. Las células eucariotas utilizan promotores, potenciadores y señales de poliadenilación.

Un ácido nucleico está "ligado de forma operativa" si está situado en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN de una presecuencia o líder secretor está ligado de forma operativa al ADN de un polipéptido si se expresa como preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o potenciador está ligado de forma operativa a una secuencia codificante si afecta a la transcripción de la secuencia; o un lugar de unión a ribosomas está ligado de forma operativa a una secuencia codificante si está posicionado de forma que facilita la traducción. Generalmente, "ligado de forma operativa" significa que las secuencias de ADN ligadas están contiguas, y en el caso de un líder secretor, contiguas y en marco de lectura. Sin embargo, los potenciadores no tienen que estar contiguos. La unión se consigue mediante una ligación en las dianas de restricción convenientes. Si tales dianas no existen, se utilizan adaptadores o enlazantes sintéticos oligonucleotídicos de acuerdo con la práctica convencional .

La purificación de anticuerpos se realiza para eliminar los componentes celulares u otros contaminantes, por ejemplo, otros ácidos nucleicos celulares o proteínas, mediante técnicas estándar, lo que incluye tratamiento alcalino/SDS , gradiente de CsCl, cromatografía en columna, electroforesis en gel de agarosa y otras técnicas bien conocidas en la materia. Véase Ausubel, F. , et al., ed. Current Protocols in 9 Molecular Biology, Greene Publishing y Wiley Interscience , New York (1987) . Estos métodos están bien establecidos y utilizados ampliamente para la purificación de inmunoglobulinas , y se utilizan tanto solos como en combinación. Tales métodos son, por ejemplo, la cromatografía de afinidad utilizando proteínas derivadas de microbios (por ejemplo la cromatografía de afinidad con proteína A o proteína G) , cromatografía de intercambio iónico (por ejemplo de intercambio catiónico (resinas de carboximetilo) , intercambio aniónico (resinas de aminoetilo) y de intercambio de tipo mixto), adsorción tiofílica (por ejemplo con beta-mercaptoetanol y otros ligandos SH) , cromatografía de interacción hidrofóbica o adsorción aromática (por ejemplo con fenil-sefarosa, resinas aza-arenofílicas , o ácido m- aminofenilborónico) , cromatografía de afinidad a quelatos metálicos (por ejemplo con material de afinidad al Ni (II) y Cu(II)), cromatografía de exclusión por tamaño y métodos electroforáticos preparativos (como gel de electroforesis , electroforesis capilar) (Vijayalakshmi, M.A. , Appl . Biochem. Biotech. 75 (1998) 93-102).

El término "transformación" como se usa aquí se refiere a un proceso de transferencia de vectores/ácido nucleico a una célula huésped. Si se utilizan como células huésped células sin grandes barreras de pared celular, la transfección se realiza por ejemplo, mediante el método de precipitación con fosfato de calcio como se describe en Graham, F.L., y Van der Eb, A.J., Virology 52 (1973) 456-467. Sin embargo, también pueden utilizarse otros métodos para introducir ADN en las células como mediante inyección nuclear o fusión de protoplastos. Si se utilizan células procariotas o células que tienen paredes celulares sustanciales, un método de transfección es por ejemplo, el tratamiento con calcio utilizando cloruro de calcio como se describe en Cohén, S. N, et al, PNAS . 69 (1972) 2110-2114 .

Como se utiliza aquí, "expresión" se refiere al proceso mediante el cual un ácido nucleico se transcribe a ARNm y/o el proceso mediante el cual el ARNm trascrito (también denominado tránscrito) se traduce a continuación a péptidos, polipéptidos o proteínas. Los tránscritos y los polipéptidos codificados se denominan de forma colectiva producto génico. Si el polinucleótido se deriva de un ADN genómico, la expresión en una célula eucariota puede incluir el corte y empalme del ARNm.

Un "vector" es una molécula de ácido nucleico, en particular auto-replicativa, que transfiere una molécula de ácido nucleico insertada en y/o entre células huésped. El término incluye vectores que funcionan principalmente en la inserción de ADN o ARN en una célula (por ejemplo, integración cromosómica) , replicación de vectores que funcionan principalmente en la replicación de ADN o ARN, y vectores de expresión que funcionan en la transcripción y/o traducción de ADN o ARN. También se incluyen los vectores que proporcionan más de una de las funciones descritas .

Un "vector de expresión" es un polinucleótido que, si se introduce en una célula huésped apropiada, puede transcribirse y traducirse a un polipéptido. Un "sistema de expresión" normalmente se refiere a una célula huésped adecuada que comprende un vector de expresión que puede funcionar para dar lugar al producto de expresión deseado.

No se ha encontrado que los anticuerpos multiespecíficos de acuerdo con la invención posean características mejoradas como actividad biológica o farmacológica, propiedades farmacocinéticas o toxicidad. Pueden utilizarse por ejemplo, para el tratamiento de enfermedades como el cáncer.

Un aspecto de la invención es una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo de acuerdo con la invención. Otro aspecto de la invención es el uso de un anticuerpo de acuerdo con la invención para la fabricación de una composición farmacéutica. Otro aspecto de la invención es un método para la fabricación de una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo de acuerdo con la invención. En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición, por ejemplo, una composición farmacéutica, que contiene un anticuerpo de acuerdo con la presente invención, formulado junto con un transportador farmacéutico.

Una modalidad de la invención es el anticuerpo multiespecifico, preferiblemente anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención para el tratamiento del cáncer.

Otro aspecto de la invención es la composición farmacéutica para el tratamiento del cáncer.

Otro aspecto de la invención es el uso de un anticuerpo de acuerdo con la invención para la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer.

Otro aspecto de la invención es un método de tratamiento de pacientes que padecen de cáncer mediante la administración de un anticuerpo de acuerdo con la invención a un paciente que necesita el tratamiento.

Tal como se utiliza aquí, "transportador farmacéutico" incluye cualquier disolvente, medio de dispersión, recubrimiento, agente antibacteriano y antifúngico, agente isotónico y retardante de la absorción, y similares que sea fisiológicamente compatible. Preferiblemente, el transportador es adecuado para la administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, parenteral, espinal o epidérmica (por ejemplo, mediante inyección o infusión) .

Una composición de la presente invención puede administrarse mediante una serie de métodos conocidos en la técnica. Como podrá apreciarse por el experto en la materia, la ruta y/o modo de administración variará dependiendo de los resultados deseados . Para administrar un compuesto de la invención mediante ciertas rutas de administración, será necesario recubrir el compuesto con, o coadministrar el compuesto con, un material para prevenir su inactivación. Por ejemplo, el compuesto puede administrarse a un sujeto en un portador apropiado, por ejemplo, liposomas, o un diluyente. Los diluyentes farmacéuticamente aceptables incluyen soluciones amortiguadoras salinas y acuosas. Los transportadores farmacéuticos incluyen soluciones estériles acuosas o dispersiones y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones inyectables estériles o dispersiones. La utilización de los medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es conocida en la técnica .

Las frases "administración parenteral" y "administrado por vía parenteral" como se utiliza aquí, indica los modos de administración diferentes de la administración enteral y tópica, normalmente mediante inyección, e incluye, sin limitación, inyección e infusión intravenosa, intramuscular, intraarterial , intratecal, intracapsular, intraorbital , intracardiaca, intradérmica, intraperitoneal , transtraqueal , subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal , epidural e intraesternal .

El término cáncer como se utiliza aquí se refiere a enfermedades proliferativas , como los linfornas, leucemias linfocíticas , cáncer de pulmón, cáncer de pulmón de células grandes (NSCL) , cáncer de pulmón de células bronquioloalveolares , cáncer de huesos, cáncer de páncreas, cáncer de piel, cáncer de cabeza y cuello, melanoma cutáneo o intraocular, cáncer uterino, cáncer de ovarios, cáncer rectal, cáncer de la región anal, cáncer de estómago, cáncer gástrico, cáncer de colon, cáncer de mama, carcinoma de las trompas de falopio, carcinoma endometrial, carcinoma cervical, carcinoma de vagina, carcinoma de vulva, Enfermedad de Hodgkin, cáncer de esófago, cáncer del intestino delgado, cáncer del sistema endocrino, cáncer de tiroides, cáncer paratiroidal , cáncer de glándula adrenal, sarcoma de tejido blando, cáncer de uretra, cáncer de pene, cáncer de próstata, cáncer de vejiga, cáncer de riñon o uréter, carcinoma de células renales, carcinoma de la pelvis renal, mesotelioma, cáncer hepatocelular, cáncer biliar, neoplasias del sistema nervioso central (SNC) , tumores del eje espinal, glioma del tronco cerebral, glioblastoma multiforme, astrocitomas , schwanomas, ependimonas, meduloblastomas , meningiomas, carcinomas de células escamosas, adenoma pituitario y sarcoma de Ewing, lo que incluye versiones refractarias de cualquiera de los cánceres anteriores, o una combinación de uno o más de los cánceres anteriores.

Estas composiciones pueden también contener adyuvantes como conservantes, agentes humectantes, agentes emulsificantes y agentes dispersantes. La prevención de la presencia de microorganismos puede asegurarse mediante procedimientos de esterilización, supra, y mediante la inclusión de varios agentes antibacterianos y antifúngicos , por ejemplo, parabeno, clorobutanol , fenol, ácido sórbico, y similares. Será también deseable incluir agentes isotónicos, como azúcares, cloruro sódico, y similares en las composiciones. Además, la absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable puede hacerse con la inclusión de agentes que retrasan la absorción como el monoestearato de aluminio y gelatina.

Independientemente de la ruta de administración seleccionada, los compuestos de la presente invención, que pueden utilizarse en una forma hidratada adecuada, y/o las composiciones farmacéuticas de la presente invención, se formulan en formas de dosificación farmacéuticamente aceptables mediante métodos convencionales conocidos por los expertos en la materia.

Los niveles de dosificación actuales de los ingredientes activos en las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden variarse para obtener una cantidad del ingrediente activo que sea efectiva para lograr la respuesta terapéutica deseada para un paciente particular, la composición, y el modo de administración, sin ser tóxico para el paciente. El nivel de dosis seleccionado dependerá de la variedad de factores farmacocinéticos lo que incluye la actividad de las composiciones particulares empleadas de la presente invención, la ruta de administración, el tiempo de administración, la tasa de excreción del compuesto particular a ser empleado, la duración del tratamiento, otros fármacos, compuestos y/o materiales utilizados en combinación con las composiciones particulares empleadas, la edad, sexo, peso, condición, salud general e historial médico previo del paciente a tratar, y factores similares bien conocidos en el campo de la medicina.

La composición debe ser estéril y fluida hasta el punto en que la composición pueda liberarse mediante una jeringa. Además de agua, el transportador preferible es una solución salina amortiguada isotónica.

Puede mantenerse la fluidez adecuada, por ejemplo, mediante el uso de recubridores como la lecitina, manteniendo el tamaño de partícula necesario en el caso de la dispersión y mediante el uso de surfactantes . En muchos casos, es preferible incluir en la composición agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes como el manitol o el sorbitol, y cloruro de sodio.

Procedimiento Experimental Ejemplos Materiales y métodos generales Puede encontrarse información general relacionada con las secuencias de nucleótido de las cadenas ligeras y pesadas de las inmunoglobulinas humanas en: Kabat, E. A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) . Los aminoácidos de las cadenas de anticuerpo están numerados y se denominan de acuerdo con la numeración EU (Edelman, G.M., et al . , Proc . Nati. Acad. Sci. USA 63 (1969) 78-85; Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, (1991)).

Técnicas de ADN Recombinante Se utilizaron métodos estándar para manipular el ADN, como se describe en Sambrook, J. et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989. Se utilizaron reactivos de biología molecular de acuerdo con las instrucciones del fabricante .

Síntesis Génica Los segmentos génicos deseados se prepararon a partir de oligonucleótidos generados mediante síntesis química. Los segmentos génicos de 600-1800 pb de longitud, que están flanqueados por sitios únicos de escisión de las endonucleasas de restricción, se ensamblaron mediante hibridación y ligación de los oligonucleótidos, lo que incluye la amplificación mediante PCR, y a continuación se clonaron mediante las dianas de restricción indicadas, por ejemplo BamHl/BstEII , BamHl/BsiWI, BstEIl/Notl o Bsi I/Notl en un peADN 3.1/Zeo(+) (Invitrogen) basado en el vector de clonaje pUC. Las secuencias de ADN de los fragmentos génicos subclonados se confirmaron mediante secuenciación de ADN. Los fragmentos de síntesis génica se ordenaron de acuerdo con las especificaciones proporcionadas en Geneart (Regensburg, Alemania) .

Determinación de la secuencia de ADN Las secuencias de ADN se determinaron mediante una secuenciación de doble cadena realizada en Sequiserve GmbH (Vaterstetten, Alemania) .

Análisis de la secuencia de ADN y proteína y gestión de los datos de secuencias Se utilizó el paquete de software del GCG (Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin) versión 10.2 y el Vector NT1 Advance suite versión 9.1 de Invitrogen para la creación de secuencias, mapeado, análisis, anotación e ilustración. Técnicas de cultivo celular Se utilizaron técnicas de cultivo celular estándar como se describe en Current Protocols in Cell Biology (2000) , Bonifacino, J.S., Dasso, . , Harford, J.B., Lippincott-Schwartz, J. y Yamada, K.M. (Ed.), John iley & Sons, Inc. Expresión transitoria de variantes de inmunoglobulina en células HEK293F Los anticuerpos multiespecíficos se expresaron mediante transfección transitoria de células de riñon embrionario humano 293-F utilizando el sistema de Expresión FreeStyle™ 293 de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Invitrogen, USA) . Brevemente, las células FreeStyle™ 293-F en suspensión se cultivaron en medio de expresión FreeStyle™ 293 a 37°C/ C02 8 % y las células se sembraron en medio fresco a una densidad de l-2xl06 células viables/ml el día de la transfección. Los complejos ADN-293fectin™ se prepararon en medio Opti-MEM® I (Invitrogen, USA) utilizando 333 µ? de 293fectin™ (Invitrogen, Alemania) y 250 g de ADN de plásmido de cadena pesada y ligera en una proporción molar 1 : 1 para un volumen de transfección final de 250 mi. Los sobrenadantes de cultivo celular que contienen anticuerpos biespecífieos se clarificaron 7 días tras la transfección mediante centrifugación a 14000 g durante 30 minutos y se filtraron a través de un filtro estéril (0.22 µp?) . Los sobrenadantes se almacenaron a -20°C hasta su purificación.

Determinación de proteínas La concentración de proteína en los anticuerpos purificados y derivados se determinó analizando la densidad óptica (DO) a 280 nm con la DO a 320nm como corrección de ruido de fondo, utilizando el coeficiente de extinción molar calculado en base a la secuencia de aminoácidos de acuerdo con Pace, C.N. et. al., Protein Science, 4 (1995) 2411-1423. Determinación de la concentración de anticuerpos en los sobrenadantes La concentración de anticuerpos y derivados en los sobrenadantes de cultivos celulares se midió mediante cromatografía HPLC de afinidad. Brevemente, los sobrenadantes de cultivos celulares que contenían anticuerpos y derivados que se unen a Proteína A se cargaron en una columna Poros A/20 de Applied Biosystems en KH2P0 200 mM, citrato de sodio 100 mM, pH 7.4 y se eluyeron de la matriz con NaCl 200 mM, ácido cítrico 100 mM, pH 2.5 en un sistema HPLC UltiMate 3000 (Dionex) . La proteína eluída se cuantificó mediante absorbancia UV y la integración de las áreas de los picos . Un anticuerpo IgGl estándar purificado sirvió como estándar.

Purificación de proteínas Los anticuerpos secretados se purificaron a partir del sobrenadante en dos pasos mediante cromatografía de afinidad utilizando Proteína A-Sepharose™ (GE Healthcare, Suecia) y cromatografía de exclusión por tamaño Superdex200. Brevemente, los sobrenadantes del cultivo clarificado que contiene anticuerpo biespecífico y triespecífico se aplicaron en una columna HiTrap Proteína A HP (5 mi) equilibrada con amortiguador PBS (Na2HP0410 mM, KH2P04 1 mM, NaCl 137 mM y KCl 2.7 mM, pH 7.4) . Las proteínas no unidas se eliminaron por lavados con solución amortiguadora de equilibrio. Los anticuerpos biespecíficos se eluyeron con solución amortiguadora de citrato 0.1 M, pH 2.8, y las fracciones que contienen proteína se neutralizaron con 0.1 mi de Tris 1M, pH 8.5. Después, las fracciones de proteína eluídá se juntaron, se concentraron con un dispositivo de filtro centrífugo Amicon Ultra (MWCO: 30 K, Millipore) en un volumen de 3 mi y se cargaron en una columna de filtración en gel Superdex200 HiLoad 120 mi 16/60 (GE Healthcare, Suecia) equilibrada con Histidina 20mM, NaCl 140 mM, pH 6.0. Las fracciones de anticuerpo monomérico se juntaron, se congelaron muy rápido y se almacenaron a -80°C. Se proporcionaron partes de las muestras para un posterior análisis de proteína y caracterización.

Análisis de proteínas purificadas La concentración de proteína de muestras de proteína purificada se determinó midiendo la densidad óptica (DO) a 280 nm, utilizando el coeficiente de extinción molar calculado en base de las secuencia de aminoácidos. La pureza de los anticuerpos biespecíficos se analizó mediante SDS-PAGE en presencia y ausencia de un agente reductor (1,4-ditiotreitol 5 mM) y se tiñó con azul brillante de Coomassie. El sistema de geles preparados NuPAGE® (Invitrogen, USA) se utilizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante (geles de Tris-Glicina al 4-20%) . El contenido agregado de las muestras de anticuerpo biespecífico se analizó mediante SEC de alto rendimiento en un sistema UltiMate 3000 HPLC (Dionex) utilizando una columna analítica Superdex 200 de exclusión por tamaño (GE Healthcare, Suecia) en KH2P04 200 mM, KC1 250 mM, pH 7,0 amortiguador de reacción a 25°C. Se inyectó 25 g de proteína en la columna en una tasa de flujo de 0.5 ml/min y se eluyó de forma isocrática durante 50 minutos. Para el análisis de estabilidad, se prepararon concentraciones de 0.1 mg/ml, 1 mg/ml y 3 mg/ml de proteínas purificadas y se incubaron a 4°C, 37°C durante 7 días y después se analizaron mediante SEC de alto rendimiento. La integridad de la estructura de aminoácidos de las cadenas ligera y pesada reducidas del anticuerpo biespecífico se verificó mediante espectrometría de masas por NanoElectropulverización Q-TOF tras eliminar los N-glicanos mediante tratamiento enzimático con Péptido-N-Glucosidasa F (Roche Molecular Biochemicals) .

Ejemplo 1 Diseño de moléculas de anticuerpos multieapecífieos de acuerdo con la invención que reconocen el receptor de IGF1 humano así como el receptor de EGF humano A continuación, se ejemplifican como una modalidad de los anticuerpos tetravalentes biespecífieos de la invención que comprenden un anticuerpo de longitud completa que se une a un primer antígeno (IGF- IR o EGFR) con dos fragmentos Fab de cadena sencilla que se unen a un segundo antígeno diferente (diferente de IGF- IR o EGFR) conectado mediante un péptido conector al anticuerpo de longitud completa (ambos fragmentos Fab de cadena sencilla en los dos C-terminal de la cadena pesada o en los dos C- terminal de la cadena ligera) . Los dominios de anticuerpo y el enlazante en el fragmento Fab de cadena sencilla poseen el siguiente orden en la dirección N-terminal a C-terminal: VL-CL-enlazante-VH-CHl .

Como dominio variable de la cadena pesada VH para el sitio de unión a antígeno <IGF-1R>, se utilizó la SEC ID NO: 15. Como dominio variable de la cadena ligera VL para el sitio de unión a antígeno <IGF-1R>, se utilizó la SEC ID NO: 16.

Como dominio variable de la cadena pesada VH para el sitio de unión a antígeno <EGFR>, se utilizó la SEC ID NO: 7. Como dominio variable de la cadena ligera VL para el sitio de unión a antígeno <EGFR>, se utilizó la SEC ID NO: 8.

Mediante la síntesis génica y las técnicas de biología molecular recombinante , VL-CL y VH-CH1, que comprende la VH y VL del correspondiente sitio de unión a antígeno se unieron mediante un enlazante de cadena sencilla de tipo glicina serina (G4S)n, para proporcionar un fragmento Fab de cadena sencilla VL-CL-enlazante-VH-CHl, que está unido al C-terminal de la cadena ligera o pesada del anticuerpo utilizando un enlazante (G4S)n.

Opcionalmente , los residuos de cisteina se introdujeron en el dominio VH (lo que incluye la posición Kabat 44,) y VL (lo que incluye la posición Kabat 100) del fragmento Fab de cadena sencilla de acuerdo con las técnicas que se han descrito antes (por ejemplo, WO 94/029350; Reiter Y., et al, Nature biotechnology 14 (1996) 1239-1245; Young N.M., et al, FEBS Letters 377 (1995) 135-139; o Rajagopal V., et al, Protein Engineering 10 (1997) 1453-59) .

Todas estas moléculas se produjeron de forma recombinante , se purificaron y se caracterizaron y se analizó la expresión de proteína, la estabilidad y la actividad biológica.

Un resumen del diseño del anticuerpo multiespecífico que se aplicó para generar anticuerpos tetravalentes, biespecíficos <EGFR- IGF- 1R> , <IGF-1R-EGFR > se proporciona en la Tabla 1. Para este estudio, se utiliza el término "scFab-Ab" para describir las diferentes entidades tetravalentes de proteína. Una representación de los formatos diseñados se muestran en la Figura 4 y 5 y se listan en la Tabla 1.

Tabla 1 -Diferentes formatos anticuerpos tetravalentes biespecíficos anti IGF1R y anti EGFR con uniones en C-terminal de fragmentos Fab de cadena sencilla y la correspondiente nomenclatura scFab-Ab- .

Ejemplo 2 Expresión y Purificación de moléculas de anticuerpo biespecífico scFabXGFRl <EGFR-IGF1R> Se construyeron las cadenas ligera y pesada de los correspondientes anticuerpos biespecíficos en vectores de expresión portadores de marcadores de selección procariotas y eucariotas . Estos plásmidos se amplificaron en E.coli, se purificaron, y posteriormente se transfectaron para una expresión transitoria de proteínas recombinantes en células HEK293F (utilizando el sistema Freestyle de Invitrogen) . Tras 7 días, los sobrenadantes de las células HEK 293 se recogieron y se purificaron mediante proteína A y cromatografía de exclusión por tamaño. La homogeneidad de todas las construcciones de anticuerpo biespecífico se confirmó mediante SDS-PAGE bajo condiciones no reductoras y reductoras. Bajo condiciones reductoras (Figura 8), las cadenas de polipéptido portadoras de fusiones scFab en C- y N-terminal mostró tras el SDS-PAGE unos tamaños moleculares aparentes análogos a los pesos moleculares calculados. Los niveles de expresión de todas las construcciones se analizaron mediante HPLC proteína A y fue similar a los rendimientos de expresión de IgG "estándar", o en algunos casos algo inferior. El rendimiento medio de proteína estuvo entre 1.5 y 10 mg de proteína por litro de sobrenadante de cultivo celular en los experimentos de expresión transitoria no optimizada (Figuras 4 y 5) .

El análisis por cromatografía HP de exclusión por tamaño de las proteínas purificadas mostró cierta tendencia a agregar en moléculas recombinantes . Para enfrentarse a los problemas de agregación de los anticuerpos biespecíficos , se aplicó estabilización entre VH y VL de las porciones de unión adicionales con disulfuros. Por eso se introdujeron sustituciones únicas de cisteína en las VH y VL de los scFab en determinadas posiciones (posiciones VH44/VL100 de acuerdo con el esquema de numeración Kabat) . Estas mutaciones permiten la formación de disulfuros intercadena estables entre VH y VL, que a su vez estabilizan el módulo resultante de scFab con disulfuros. La introducción de los disulfuros VH44/VL100 en scFabs no interfieren significativamente con los niveles de expresión de proteína y en algún caso incluso mejora el rendimiento de expresión (ver Figuras 4 y 5) .

Los anticuerpos biespecíficos se expresaron mediante transfección transitoria de células de riñon embrionario humano 293 -F utilizando el sistema de Expresión FreeStyle™ 293 de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Invitrogen, USA) . Brevemente, se cultivaron las células 293-F en suspensión FreeStyle™ en medio de expresión FreeStyle™ 293 a 37°C/C02 8 % y las células se sembraron en medio fresco a una densidad de l-2xl06 células viables/ml el día de la transfección. Los complejos de ADN-293fectin™ se prepararon en medio Opti-MEM® I (Invitrogen, USA) utilizando 333 µ? de 293fectin™ (Invitrogen, Alemania) y 250 µg de ADN de plásmido de cadena pesada y ligera en una proporción molar 1:1 para un volumen de transfección final de 250 mi. Los sobrenadantes de cultivo celular que contienen anticuerpos biespecífieos se clarificaron 7 días tras la transfección mediante centrifugación a 14000 g durante 30 minutos y se filtraron a través de un filtro estéril (0,22 m) . Los sobrenadantes se almacenaron a -20°C hasta su purificación.

Los anticuerpos secretados se purificaron del sobrenadante en dos pasos mediante cromatografía de afinidad utilizando Proteína A-Sepharose™ (GE Healthcare, Suecia) y cromatografía de exclusión Superdex200 por tamaño. Brevemente, los sobrenadantes de los cultivos clarificados que contienen anticuerpos biespecífieos y triespecíficos se aplicaron en una columna HiTrap Proteína A HP (5 mi) equilibrada con solución amortiguadora PBS (Na2HP04 10 mM, KH2P04 1 mM, NaCl 137 mM y KCl 2.7 mM, pH 7,4). Las proteínas no unidas se eliminaron mediante lavados con solución amortiguadora de equilibrio. Los derivados de anticuerpo se eluyeron con solución amortiguadora de citrato 0.1 M, pH 2.8, y las fracciones que contienen proteína se neutralizaron con 0.1 mi Tris 1 M, pH 8.5. Después, las fracciones de proteína eluída se juntaron, se concentraron con un Dispositivo de filtro por centrifugación Amicon Ultra (MWCO: 30 K, Millipore) en un volumen de 3 mi y se cargaron en una columna de filtración en gel Superdex200 HiLoad 120 mi 16/60 (GE Healthcare, Suecia) equilibrada con Histidina 20mM, NaCl 140 mM, H 6.0. Las fracciones de anticuerpo monomérico se juntaron, se congelaron rápidamente y se almacenaron a -80°C. Parte de las muestras se proporcionaron para un posterior análisis de las proteínas y caracterización. Ejemplos de análisis mediante SDS-PAGE de las proteínas purificadas y perfiles de cromatografía HP de exclusión por tamaño (SEC) de derivados de anticuerpo biespecífico se muestran en las Figuras 8 y 9.

La Figura 5 muestra los rendimientos de expresión que se observaron en los sistemas de expresión transitoria: Todos los derivados de anticuerpo diseñados pueden expresarse y purificarse en cantidades suficientes para un posterior análisis.

Por razones comparativas se preparó y denominó un anticuerpo tetravalente biespecífico basado en un anticuerpo de longitud completa al que están fusionados dos fragmentos scFv mediante un enlazante peptídico en el C- terminal de la cadena pesada como se describe en WO 1995/009917 y Müller D., et al, Handbook of Therapeutic antibodies, Parte III, Capítulo 2, (2008) 345-378. En lugar del scFab que porta en lugar de. Como dominio variable de la cadena pesada VH para el sitio de unión a antígeno <IGF-1R> se utilizó la SEC ID NO: 15. Como dominio variable de la cadena ligera VL para el sitio de unión a antígeno <IGF-1R> se utilizó la SEC ID NO: 16. Como dominio variable de la cadena pesada VH para el sitio de unión a antígeno <EGFR> se utilizó la SEC ID NO: 7. Como dominio variable de la cadena ligera para el sitio de unión a antígeno <EGFR> se utilizó la SEC ID NO: 8. Esta molécula de comparación se denominó XGFR1_2320 (y también se describe en PCT PCT/EP2009/006782) .

La molécula Fv biespecífica XGFR1-2320 de cadena sencilla posee un rendimiento final tras la purificación de 0.27 mg mientras que la correspondiente molécula Fab XGFR1- 2720 de cadena sencilla posee un rendimiento final de 6.8 mg (ver Figura 4, Compuesto A), que representa un aumento del rendimiento de más de 200 veces.

Ejemplo 3 Estabilidad y tendencia de agregación de las moléculas scFab- XGFR de anticuerpo biespecífico <EGFR-IGF1R> Se realizó un análisis por cromatografía HP de exclusión por tamaño para determinar la cantidad de agregados presentes en la preparación de derivados de anticuerpo recombinante . Para ello, se analizaron muestras de anticuerpo biespecífico mediante SEC de alto rendimiento en un Sistema UltiMate 3000 HPLC (Dionex) utilizando una columna analítica de exclusión por tamaño Superdex 200 (GE Healthcare, Suecia) . Las Figuras 9a y 9b muestran un ejemplo de estos análisis. Los agregados aparecen como un pico u hombro separado antes de las fracciones que contienen el derivado de anticuerpo monomérico. Para este trabajo, se definió moléculas "monoméricas" deseadas las compuestas por 2 heterodímeros de cadenas ligera y pesada con scFabs conectado a ambas. La integridad de la estructura de aminoácidos de las cadenas ligera y pesada reducidas de las proteínas de fusión del anticuerpo biespecífico se verificó mediante espectrometría de masas por NanoElectropulverización Q-TOF tras eliminar los N-glicanos mediante tratamiento enzimático con Péptido-N-Glucosidasa F (Roche Molecular Biochemicals) .

El análisis por cromatografía HP de exclusión por tamaño de las proteínas purificadas bajo diferentes condiciones (variando la concentración y el tiempo) mostraron - en comparación con las IgG normales - una ligera tendencia a agregar para moléculas que contienen scFab. Esta ligera tendencia a la agregación que observamos para algunas moléculas puede mejorar mediante la introducción del puente disulfuro VH44/VL100 intercadena en los módulos scFab.

Ejemplo 4 Unión de moléculas de anticuerpo scFab biespecífico <EGFR- IGF1R> a los RTK de EGFR e IGF1R Se comparó la unión de los módulos de scFab y de los sitios de unión a antígenos de los retenidos en el módulo IgG de longitud completa de los diferentes formatos scFab-XGFR de anticuerpos biespecífieos con la unión de las IgG "salvajes" de los módulos de unión y anticuerpos biespecíficos de los que derivan. Estos análisis se llevaron a cabo aplicando Resonancia de plasmón en superficie (Biacore) , así como un ELISA celular.

Las propiedades de unión de los anticuerpos biespecíficos <IGF-1R-EGFR> se analizaron mediante tecnología de resonancia de plasmón en superficie (SPR) utilizando un instrumento Biacore T100 (Biacore AB, Uppsala) . Este sistema está bien establecido para el estudio de interacciones moleculares. Permite una monitorización continua en tiempo real de unión de ligando/analito y así la determinación de las constantes de tasa de asociación (ka) , constantes de tasa de disociación (kd) , y constantes de equilibrio (KD) en varios ajustes de ensayo. La tecnología SPR está basada en la medición del índice de refracción cerca de la superficie de un chip biosensor cubierto de oro. Los cambios en el índice de refracción indican cambios en la masa en la superficie provocados por la interacción de ligando inmovilizado con analito inyectado en la solución. Si las moléculas se unen al ligando inmovilizado en la superficie la masa aumenta, en el caso de disociación la masa disminuye.

Se inmovilizó anticuerpo de captura anti-IgG humana en la superficie de un chip biosensor Cl utilizando química de acoplamiento a amina. El flujo de células se activó con una mezcla 1:1 de N-hidroxisuccinimida 0.1 M y 3-(N,N-dimetilamino) propil-N-etilcarbodiimida 0.1 M en una tasa de flujo de 5 µ?/min. El anticuerpo anti-IgG humano se inyectó en acetato sódico, pH 5.0 a 10 g/ml, que resultó en una densidad de superficie de aproximadamente 200 RU. Un flujo de células de referencia control se trató de la misma manera pero solamente con soluciones amortiguadoras vehículo en lugar del anticuerpo de captura. Las superficies se bloquearon con una inyección de etanolamina 1M /HC1 pH 8.5. Los anticuerpos biespecífieos se diluyeron en HBS-P y se inyectaron a una tasa de flujo de 5 µ?/min. El tiempo de contacto (fase de asociación) fue de 1 min para los anticuerpos a una concentración entre 1 y 5 nM. Se inyectó EGFR-ECD a concentraciones increméntales de 1.2, 3.7, 11.1, 33.3, 100 y 300 nM, IGF-1R a concentraciones de 0.37, 1.11, 3.33, 10, 30 y 90 nM. El tiempo de contacto (fase de asociación) fue de 3 min, el tiempo de disociación (lavados con solución amortiguadora de reacción) 5 min para ambas moléculas en una tasa de flujo de 30 µ?/min. Todas las interacciones se realizaron a 25°C (temperatura estándar) . La solución de regeneración de ácido fosfórico 0.85% e hidróxido sódico 5 mM se inyectó cada una durante 60 s a un flujo de 5 µ?/min para eliminar cualquier proteína no unida de forma covalente tras cada ciclo de unión. Las señales se detectaron a una tasa de una señal por segundo. Las muestras se inyectaron a concentraciones increméntales.

Ejemplos de unión simultánea de anticuerpos biespecíficos <IGF-1R-EGFR> a EGFR y IGF1R se muestran en las Figuras 10a-10d.

Tabla 2: Afinidades (KD) de anticuerpos biespecíficos (scFab-XGFR1_2720 y scFab-XGFR2_2720) a EGFR y IGF-1R Los análisis de unión y competición basados en FACS en células cultivadas, pueden también aplicarse para valorar la capacidad de unión a RTK de los derivados del anticuerpo biespecífico que están expuestos en la superficie celular. La Figura 11 muestra el ajuste experimental que se utilizó para analizar las capacidades de unión de los derivados biespecífico XGFR que contienen scFab sobre células cancerígenas A549. Para estos ensayos de competición celular, las células A549 que expresan los antígenos EGFR así como IGF1R se despegaron y contaron. Se sembraron 1.5xl0e5 células por pocilio de una placa de 96 pocilios cónicos. Las células se centrifugaron (1500 rpm, 4°C, 5 min.) y se incubaron durante 45 min. en hielo en 50 iL de una serie de dilución del correspondiente anticuerpo biespecífico en PBS con FCS 2% (suero fetal bovino) que contiene 1 pg/mL de anticuerpo específico anti IGFIR marcado con Alexa 647. Las células se centrifugaron de nuevo y se lavaron dos veces con 200 pL de PBS que contiene FCS al 2%. Finalmente, las células se resuspendieron en una solución BD CellFix (BD Biosciences) y se incubaron durante al menos 10 min. en hielo. La intensidad de fluorescencia media (ifm) de las células se determinó mediante citometría de flujo (FACS Canto) . La ifm se determinó al menos por duplicados de dos tinciones independientes. El espectro de citometría de flujo se procesó además utilizando el programa FlowJo de (TreeStar) . La mitad de la unión máxima se determinó utilizando XLFit 4.0 (IDBS) y la respuesta a dosis el modelo de un sitio 205.

Los resultados de estos ensayos que se muestran en las Figuras 12a-12c demuestran la funcionalidad de unión de los derivados de anticuerpo que contiene scFab biespecífico en las superficies de las células tumorales . Por ejemplo, la CI50 en los experimentos de competición del derivado de anticuerpo biespecífico scFab-XGFRl_2721 fue de 0.11 ug/ml mientras que la CI50 del anticuerpo monoespecífico fue más de un 50% superior (0.18 ug/ml) . Este aumento de la actividad en los ensayos de competición del derivado biespecífico scFab-XGFR_2721 en comparación con el anticuerpo parental sugiere que la molécula biespecífica se une mejor a las superficies celulares que el anticuerpo monoespecífico .

Ejemplo 5 Regulación negativa de EGFR así como IGF1R- mediante moléculas de anticuerpo scFab-XGFR biespecífico <EGFR-IGF- 1R> Los anticuerpos anti-IGF-lR humanos <IGF-1R> HUMAB Clon 18 (DS ACC 2587) inhiben la señalización de IGFR1 y los anticuerpos anti-EGFR de rata humanizados <EGFR>ICR62 inhiben la señalización mediante EGFR. Para evaluar la actividad inhibidora potencial de las diferentes variantes de scFab-XGFR1, se analizó el grado de regulación negativa del receptor de ambos .

Para poder detectar los efectos del anticuerpo de la invención en la cantidad de receptor de IGF-I (IGF- IR) en células tumorales, se realizaron experimentos de seguimiento a lo largo del tiempo y posterior análisis ELISA con anticuerpos específicos de IGF-IR y EGFR.

Una placa de 6 pocilios se inoculó con 1 mi por pocilio de células tumorales humanas (H322M, 5 x 105 células/ml) en medio RPMI 1640 suplementado con FCS 10% (PAA, N° Cat . E15-039) y PenStrep 1%. Se añadieron 3 mi de medio a cada pocilio y las células se cultivaron durante 24 horas a 37°C y 5% C02.

El medio se retiró con cuidado y se sustituyó por 2ml de anticuerpos XGFR 100 nM diluidos en Medio RPMI-VM. En los pocilios control, el medio se sustituyó por medio y solución amortiguadora sin anticuerpo y medio con anticuerpos control (<IGF-1R> HUMAB Clon 18 y <EGFR>ICR62 concentración final 100 nM) . Las células se incubaron a 37°C y 5% C02 y las placas individuales se retiraron para un posterior procesado a las 24 horas .

El medio se retiró con cuidado mediante aspiración y las células se lavaron con lml de PBS . Se añadieron 300 µ?/pocillo de solución amortiguadora de lisis frío MES (MES, Na3V04 10 mM, e inhibidor de proteasa Complete®) . Al cabo de una hora las células se despegaron en hielo utilizando un rascado de células (Corning, N° Cat . 3010) y el contenido del pocilio se transfirió a tubos de reacción Eppendorf . Se eliminaron los fragmentos celulares mediante centrifugación durante 10 minutos a 13000 rpm y 4°C.

Detección de EGFR Las placas microtituladas de 96 pocilios (PMT) se prepararon de acuerdo con el protocolo (DuoSet ELISA para EGFR Humano, RnD systems N° Cat. DY231) . El anticuerpo de cabra anti-EGFR Humano 144 pg/ml en PBS se diluyó 1:180 en PBS y se añadió 100 µ?/pocillo a la PMT. La PMT se incubó durante la noche a temperatura ambiente con agitación. Las placas se lavaron 3 veces con PBS suplementado con Tween®20 al 0.1% y se bloquearon con 300 µ?/pocillo de PBS, solución de BSA al 3% y Tween®20 al 0.1% durante 1 hora (h) a temperatura ambiente (TA) con agitación. Las placas se lavaron 3 veces con PBS suplementado con Tween®20 al 0.1%.

La cantidad de proteína en los lisados celulares se determinó utilizando el equipo BCA Protein Assay de (Pierce) , los lisados celulares se ajustaron entonces a la concentración de proteína de 0.04 mg/ml con solución amortiguadora de lisis MES suplementado con Na3V0 100 mM 1:100 e inhibidor de proteasa Complete® 1:20 y 100 µ? por pocilio del lisado se añadió, a la PMT previamente preparada. Para la medición del ruido de fondo, se añadieron 100 µ? de solución amortiguadora de lisis al pocilio en la PMT.

Se utilizó una segunda concentración de lisado celular a 0.025 mg/ml el lisado se diluyó 1:2 y se añadieron 100 µ? por pocilio a la PMT previamente preparada. La PMT se incubó durante otras 2 horas a TA con agitación y después se lavaron 3 veces con PBS con una solución de Tween®20 al 0.1%.

El anticuerpo de detección para EGFR era un anticuerpo biotinilado de cabra anti-EGFR humano a una concentración de 36 µg/ml diluido 1:180 en PBS, BSA al 3% y Tween®20 al 0.2%. Se añadió 100 µ? por pocilio y se incubó a TA durante 2 horas con agitación. La PMT se lavó después tres veces con 200 µ? por pocilio de PBS con solución de Tween®20 al 0.1%. Se añadió entonces 100 µ? por pocilio del anticuerpo secundario Estreptavidina-HRP 1:200 en PBS, BSA al 3% y Tween®20 al 0.2% y se incubó con agitación durante 20 minutos a TA. La placa se lavó después seis veces con PBS con solución de Tween®20 al 0.1%. Se añadió 100 µ? por pocilio de 3,3' -5,5'-Tetrametilbencidina (Roche, BM-Blue ID-N° : 11484581) y se incubó durante 20 minutos a TA con agitación. Se paró la reacción de color al añadir 25 µ? por pocilio de H2S04 1M y se incubó durante otros 5 minutos a TA. La absorbancia se midió a 450nm.

Detección de IGF-1R La PMT de estreptavidina (Roche ID. N° : 11965891001) se preparó añadiendo 100 µ? por pocilio del anticuerpo AKla-Biotinilado (Genmab, Dinamarca) que se diluyó 1:200 en PBS, BSA 3% y Tween®20 0.2%. La PMT de estreptavidina se incubó durante 1 hora a TA con agitación y después se lavó tres veces con 200 µ? por pocilio de PBS con una solución de Tween®20 al 0.1%.

La cantidad de proteína en los lisados celulares se determinó utilizando el equipo BCA Protein Assay (Pierce) , los lisados celulares se ajustaron entonces a la concentración de proteína de 0.04 mg/ml con Tris 50mM pH 7.4, Na3V04 100 mM 1:100 e inhibidor de proteasa Complete0 1:20 y se añadió 100 µ? por pocilio del lisado a la PMT de estreptavidina previamente preparada.

Se utilizó una segunda concentración de lisado celular a 0.15 mg/ml el lisado se diluyó y se añadió 100 µ? por pocilio a la PMT de estreptavidina previamente preparada. Para la medición del ruido de fondo se añadió 100 µ? de solución amortiguadora de lisis al pocilio en la PMT de estreptavidina .

La PMT se incubó durante otra hora a TA con agitación y después se lavó 3 veces con PBS con una solución de Tweens20 al 0.1%.

El anticuerpo de detección para IGF-IR fue un anticuerpo de conejo anti ??G-^ß humano (Santa Cruz Biotechnology, N° Cat. sc-713) diluido 1:750 en PBS, BSA al 3% y Tweens20 al 0.2%. Se añadió 100 µ? por pocilio y se incubó a TA durante 1 hora con agitación. La PMT se lavó después tres veces con 200 µ? por pocilio de PBS con una solución de Tween^O al 0.1%. Se añadió después el anticuerpo secundario de conejo IgG-POD (Cell signaling N° de Cat. 7074) 1:4000 en PBS, BSA al 3% y Tweene20 al 0.2%, se añadió 100 µ? por pocilio y se incubó con agitación durante 1 hora a TA. La placa se lavó después seis veces con PBS con una solución de Tween^O al 0.1%. Se añadió 100 µ? por pocilio de 3 , 3 ' -5 , 5 ' -Tetrametilbencidina (Roche, BM-Blue ID-N° : 11484581) y se incubó durante 20 minutos a TA con agitación. Se paró la reacción de color al añadir 25 µ? por pocilio de H2S04 1M y se incubó durante otros 5 minutos a TA. La absorbancia se midió a 450nm.

Los resultados de la detección de la regulación negativa del receptor por las moléculas XGFR que contiene scFab biespecíficos en comparación con los anticuerpos monoespecíficos parentales <EGFR>ICR62 y HUMAB-Clon 18 <IGF-1R> en células A549 se muestran en las Figuras 13 y 14. Los anticuerpos biespecíficos scFab-XGFR regulan negativamente ambos EGFR e IGF1R. Esto muestra que se retiene por completo la funcionalidad (funcionalidad biológica) y mediación del fenotipo de los módulos de unión. La Figura 14 también indica que, de forma sorprendente, los anticuerpos biespecíficos scFab-XGFR_2720 muestran una regulación negativa mejorada de EGFR en comparación con el anticuerpo parental <EGFR>ICR62 sólo.

El hecho de que variantes de XGFR1 que contienen scFab cuando se aplican a los mismos ensayos en molaridades idénticas, mostraron las mismas actividades o mejores que los anticuerpos de tipo salvaje indica que las moléculas de scFab-XGFRl son capaces de interferir con ambas rutas de señalización.

Ejemplo 6 Inhibición del crecimiento mediado scFab-XGFRl y scFab-XGFR2 de líneas celulares tumorales in vitro El anticuerpo anti-IGF-lR humano <IGF-1R> HUMAB Clon 18 (DSM ACC 2587) inhibe el crecimiento en líneas celulares tumorales que expresan el IGF1R ( O 2005/005635) . De forma similar, los anticuerpos de rata humanizados anti-EGFR <EGFR>ICR62 han mostrado inhibir el crecimiento en líneas celulares tumorales que expresan EGFR (WO 2006/082515) . Para evaluar la actividad inhibidora potencial de las diferentes variantes de scFab-XGFRl en los ensayos de crecimiento de líneas celulares tumorales, se analizó el grado de inhibición en células H322M que expresan EGFR así como IGFIR.

Las células H322M (5000 células/pocilio) se cultivaron en medio RPMI 1640 suplementado con FCS al 10% en placas cubiertas de poli-HE A (poli (2-hidroxietilmetacrilato) ) para prevenir la adherencia a la superficie de plástico. Bajo estas condiciones las células H322M forman esferoides densos que crecen tridimensionalmente (una propiedad que se denomina independencia de anclaje) . Estos esferoides se parecen mucho a la histoarquitectura tridimensional y organización de los tumores sólidos in-situ. Los cultivos esferoides se incubaron durante 7 días en presencia de anticuerpos 100 nM. El ensayo de luminescencia Celltiter Glow se utilizó para medir la inhibición del crecimiento. Cuando los cultivos de esferoides H322M se trataron con <IGF-1R> HUMAB-Clon 18, pudo observarse una inhibición en el crecimiento.

Figura 15 muestra que la aplicación de <IGF-1R> HUMAB- Clon 18 ????? redujo el crecimiento celular en un 72%, y que la aplicación de <EGFR>ICR62 ????? redujo el crecimiento celular en un 77% en el mismo ensayo. La aplicación simultánea de ambos anticuerpos (en las mismas concentraciones 100 nM) resultó en un descenso completo de la viabilidad celular (inhibición del 100%) . Esto indica que la interferencia simultánea con ambas rutas de RTK tiene un efecto más profundo en las líneas celulares tumorales que la interferencia con tan solo una ruta. La aplicación de varias variantes de scFab-XGFRl a una concentración molar de 100 nM resultó en una mayor inhibición del crecimiento que fue más pronunciada que la observada con sólo moléculas únicas. De hecho, a una concentración de anticuerpo de 100 nM, varias variantes de scFab-XGFRl mostraron una inhibición completa (100%) del crecimiento celular, mientras que la aplicación de módulos únicos provocó solo la inhibición parcial.

Se concluye que las moléculas de scFab-XGFRl poseen un profundo aumento de la actividad inhibidora del crecimiento en comparación con las igG que solo interfieren con la señalización de EGFR o de IGF1R.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Un anticuerpo multiespecífico caracterizado porque comprende a) un anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a un primer antígeno y que consta de dos cadenas pesadas de anticuerpo, dos cadenas ligeras de anticuerpo; y b) uno o más fragmentos Fab de cadena sencilla que se unen a uno o más antígenos, en el que los fragmentos Fab de cadena sencilla bajo b) están fusionados al anticuerpo de longitud completa bajo a) mediante un péptido conector en el C- o N- terminal de la cadena pesada o ligera del anticuerpo de longitud completa.

2. El anticuerpo multiespecífico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende a) un anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a un primer antígeno y que consta de dos cadenas pesadas de anticuerpo, dos cadenas ligeras de anticuerpo; y b) de uno a cuatro fragmentos Fab de cadena sencilla que se unen a entre uno y cuatro antígenos adicionales, en el que los fragmentos Fab de cadena sencilla bajo b) están fusionados al anticuerpo de longitud completa bajo a) mediante un péptido conector en el C- o N- terminal de la cadena pesada o ligera de el anticuerpo de longitud completa.

3. El anticuerpo multiespecífico de conformidad con las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado porque uno o dos fragmentos Fab de cadena sencilla que se unen a un segundo antígeno están fusionados al anticuerpo de longitud completa mediante un péptido conector en el C-terminal de las cadenas pesadas del anticuerpo de longitud completa.

. El anticuerpo multiespecífico de conformidad con las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado porque un fragmento Fab de cadena sencilla que se une a un segundo antígeno está fusionado al anticuerpo de longitud completa mediante un péptido conector en el C-terminal de una cadena pesada o una cadena ligera del anticuerpo de longitud completa.

5. El anticuerpo multiespecífico de conformidad con las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado porque dos fragmentos Fab idénticos de cadena sencilla VL-CL-enlazante-VH-CHl o VH-CHl-enlazante-VL-CL, que se unen a un segundo antígeno están fusionados con su N-terminal al anticuerpo de longitud completa mediante un péptido conector en los dos C-terminal de las dos cadenas pesadas o en los dos C-terminal de las dos cadenas ligeras de el anticuerpo de longitud completa.

6. El anticuerpo multiespecífico de conformidad con las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado porque dos fragmentos Fab idénticos de cadena sencilla VL-CL-enlazante-VH-CHl o VH-CHl-enlazante-VL-CL, que se unen a un segundo antígeno están fusionados con su C-terminal al anticuerpo de longitud completa mediante un péptido conector en los dos extremos N-terminal de las dos cadenas pesadas o en los dos extremos N-terminal de las dos cadenas ligeras de el anticuerpo de longitud completa.

7. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende un anticuerpo de conformidad con las reivindicaciones 1 a 6

8. Un ácido nucleico caracterizado porque codifica un anticuerpo multiespecífico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.