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ES2895752T3 - Anticuerpos biespecíficos anti-hapteno/anti-receptor de la barrera hematoencefálica, complejos de los mismos y su uso como lanzaderas a través de la barrera hematoencefálica - Google Patents

Anticuerpos biespecíficos anti-hapteno/anti-receptor de la barrera hematoencefálica, complejos de los mismos y su uso como lanzaderas a través de la barrera hematoencefálica Download PDF

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ES2895752T3
ES2895752T3 ES14835556T ES14835556T ES2895752T3 ES 2895752 T3 ES2895752 T3 ES 2895752T3 ES 14835556 T ES14835556 T ES 14835556T ES 14835556 T ES14835556 T ES 14835556T ES 2895752 T3 ES2895752 T3 ES 2895752T3
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ES
Spain
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antibody
seq
amino acid
payload
variable domain
Prior art date
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Active
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ES14835556T
Other languages
English (en)
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Ulrich Brinkmann
Guy Georges
Olaf Mundigl
Jens Niewoehner
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
F Hoffmann La Roche AG
Original Assignee
F Hoffmann La Roche AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Abstract

Un conjugado covalente que comprende i) un anticuerpo biespecífico, que tiene una primera especificidad de unión, que se une específicamente a una carga útil haptenilada, y una segunda especificidad de unión, que se une específicamente a un receptor de la barrera hematoencefálica, y ii) una carga útil haptenilada, en el que la carga útil haptenilada se une específicamente mediante la primera especificidad de unión, en el que el conjugado covalente tiene un enlace disulfuro entre la carga útil haptenilada y un residuo de cisteína en un residuo de aminoácido en la CDR2 en la primera especificidad de unión que se une específicamente a la carga útil haptenilada, en el que la CDR2 es la CDR2 de cadena pesada, la carga útil haptenilada se selecciona del grupo que consiste en cargas útiles biotiniladas, cargas útiles teofiliniladas, cargas útiles digoxigeniladas y cargas útiles fluoresceiniladas y la cisteína se encuentra en la posición 52b o 53 de acuerdo con la numeración de Kabat, o en el que la CDR2 es la CDR2 de cadena ligera, cuando la carga útil haptenilada es una carga útil helicarilada, y la cisteína se encuentra en la posición 55 o 51 de acuerdo con la numeración de Kabat, y en el que el receptor de la barrera hematoencefálica es el receptor de transferrina (TfR) o la proteína 8 relacionada con el receptor de lipoproteínas de baja densidad (LRP8).

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos biespecíficos anti-hapteno/anti-receptor de la barrera hematoencefálica, complejos de los mismos y su uso como lanzaderas a través de la barrera hematoencefálica
En el presente documento se informa de anticuerpos biespecíficos anti-hapteno/anti-receptor de la barrera hematoencefálica, complejos no covalentes así como covalentes de los mismos con cargas útiles hapteniladas y el uso de los anticuerpos así como de sus complejos como lanzaderas a través de la barrera hematoencefálica.
Antecedentes de la invención
Los principales obstáculos para la aplicación terapéutica de polipéptidos son su solubilidad limitada, estabilidad in vivo, semivida sérica corta y su rápida eliminación de la circulación sanguínea.
Se informan diferentes enfoques para abordar esto. Un enfoque para mejorar la farmacocinética/estabilidad y el comportamiento biofísico de los polipéptidos terapéuticos es fusionarlos con entidades que estabilizan el polipéptido, lo mantienen en solución y prolongan su semivida. Ejemplos de dichas entidades son la seroalbúmina humana o las regiones Fc de inmunoglobulina humana. Otro enfoque para mejorar la farmacocinética/estabilidad y el comportamiento biofísico de los polipéptidos terapéuticos es la conjugación química o enzimática con polímeros, por ejemplo, mediante PEGilación o HESilación.
El documento US 5.804.371 informa de péptidos marcados con hapteno y su uso en un procedimiento inmunológico de detección. Un péptido marcado con digoxigenina (bradiquinina) y su aplicación al inmunoanálisis quimioluminoenzimático de bradiquinina en tejidos inflamados han sido descritos por Decarie A., et al. (Péptidos 15 (1994) 511-518).
En el documento WO 2004/065569 se informa de anticuerpos multifuncionales.
En el documento WO 2011/003780 se informa de anticuerpos de unión a digoxigenina biespecíficos.
En el documento WO 2012/093068 se informa de una composición farmacéutica de un complejo de un anticuerpo anti-DIG y digoxigenina que se conjuga con un péptido.
En el documento WO 2014/006124 se informa de complejos covalentes de anticuerpos anti-hapteno y una carga útil haptenilada.
La generación de variantes humanizadas del anticuerpo de unión a digoxigenina se ha descrito en detalle en los documentos WO 2011/003557 y WO 2011/003780.
Los anticuerpos monoclonales tienen un gran potencial terapéutico para el tratamiento de enfermedades neurológicas o del sistema nervioso central (SNC), pero su paso al cerebro está restringido por la barrera hematoencefálica (BHE). Estudios anteriores han demostrado que un porcentaje muy pequeño (aproximadamente un 0,1 %) de una IgG que circula en la circulación sanguínea cruza a través de la BHE al s Nc (Felgenhauer, Klin. Wschr. 52 (1974) 1158-1164), donde la concentración en el SNC del anticuerpo puede ser insuficiente para permitir un efecto fuerte.
Se ha informado que al definir el modo de unión de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une específicamente a un receptor de la barrera hematoencefálica (RBHE) para que sea monovalente, se puede obtener un módulo de lanzadera a través de la BHE con propiedades de transcitosis de BHE en el documento WO 2014/033074.
Se ha informado que al usar un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une específicamente a un RBHE con afinidad por el medio, se puede obtener un módulo de lanzadera de BHE con propiedades de transcitosis de BHE en el documento WO 2012/075037.
Se ha informado que al usar un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que tiene una proporción específica de valores de CE50 determinados a diferentes valores de pH, se puede obtener un módulo de lanzadera de BHE con propiedades de transcitosis de BHE en el documento WO 2012/143379.
Pardridge, W. M. informa de la genomanipulación de productos biofarmacéuticos para el suministro al cerebro con caballos de Troya moleculares (Bioconjug. Chem. 19 (2008) 1327-1338). Feng, Ji-Ming, et al. (Neurometh. 45 (2010) 15-34) informan del transporte de fármacos mediado por receptor a través de la BHE. 45 (2010) 15-34). Zhou, Q-H., et al. informan del suministro de un radiofármaco peptídico al cerebro con una proteína de fusión IgG-avidina (Bioconjug. Chem. 22 (2011) 1611-1618). Manich, G., et al. (Eur. J Pharm. Sci. 49 (2013) 556-564) informan del estudio de la transcitosis de un anticuerpo anti-receptor de transferrina con una carga Fab' a través de la barrera hematoencefálica en ratones.
Sumario de la invención
La invención se define por las reivindicaciones. Todo lo que queda fuera del alcance de las reivindicaciones se presenta solo como información.
En el presente documento, se informa de un módulo lanzadera a través de la barrera hematoencefálica (módulo lanzadera a través de la BHE) que es un anticuerpo biespecífico con una primera especificidad de unión por un hapteno y una segunda especificidad de unión por un receptor de la barrera hematoencefálica (RBHE). Dicho módulo lanzadera a través de la BHE reconoce una diana de superficie celular que se puede someter a transcitosis en la barrera hematoencefálica (tal como TfR, LRP u otras dianas, RBHE) y se une simultáneamente a cargas útiles hapteniladas.
Se ha descubierto que no es necesario cumplir otros requisitos con respecto a la valencia de unión, el formato de anticuerpo ni las afinidades de unión al RBHE.
También se ha descubierto que no se requiere que el módulo lanzadera basado en anticuerpo biespecífico como se informa en el presente documento se libere de las células endoteliales de la barrera hematoencefálica para mediar la transcitosis de la carga útil haptenilada. En cambio, la carga útil haptenilada, que forma un complejo con/está unida al módulo lanzadera basado en anticuerpo biespecífico, cuando se une al RBHE, se libera del módulo lanzadera basado en anticuerpo biespecífico dentro de la célula de la BHE, es decir, en el sistema vesicular intracelular, se separa del módulo lanzadera, y posteriormente se exocita de la célula de la BHE al cerebro dejando atrás el anticuerpo biespecífico en la célula de la BHE. Esto también es aplicable cuando se usa un complejo covalente.
El módulo lanzadera basado en anticuerpos biespecíficos como se informa en el presente documento es muy variable en términos de valencia de especificidad de unión así como de afinidad de la especificidad de unión a RBHE. Simultáneamente, permite la liberación de la carga útil del módulo lanzadera.
En el presente documento se divulga un anticuerpo biespecífico que comprende una primera especificidad de unión que se une específicamente a una carga útil haptenilada y una segunda especificidad de unión que se une específicamente a un receptor de la barrera hematoencefálica.
En el presente documento se divulga un complejo no covalente que comprende un anticuerpo biespecífico, que tiene una primera especificidad de unión que se une específicamente a una carga útil haptenilada y una segunda especificidad de unión que se une específicamente a un receptor de la barrera hematoencefálica y una carga útil haptenilada, en el que la carga útil haptenilada se une específicamente mediante la primera especificidad de unión.
La presente invención se basa en un conjugado covalente que comprende i) un anticuerpo biespecífico, que tiene una primera especificidad de unión que se une específicamente a una carga útil haptenilada y una segunda especificidad de unión que se une específicamente a un receptor de la barrera hematoencefálica y ii) una carga útil haptenilada, en el que la carga útil haptenilada se une específicamente mediante la primera especificidad de unión, y que tiene un enlace covalente entre la carga útil haptenilada y la primera especificidad de unión que se une específicamente a la carga útil haptenilada.
En un modo de realización, la carga útil haptenilada se selecciona del grupo que comprende cargas útiles biotiniladas, cargas útiles teofiliniladas, cargas útiles digoxigeniladas, cargas útiles carboraniladas, cargas útiles fluoresceiniladas, cargas útiles helicariladas y cargas útiles bromodesoxiuridiniladas.
Un aspecto de la invención es un conjugado covalente que comprende
i) un anticuerpo biespecífico, que tiene una primera especificidad de unión, que se une específicamente a una carga útil haptenilada, y una segunda especificidad de unión, que se une específicamente a un receptor de la barrera hematoencefálica, y
ii) una carga útil haptenilada,
en el que la carga útil haptenilada se une específicamente mediante la primera especificidad de unión,
en el que el conjugado covalente tiene un enlace disulfuro entre la carga útil haptenilada y un residuo de cisteína en un residuo de aminoácido en la CDR2 en la primera especificidad de unión que se une específicamente a la carga útil haptenilada, en el que la CDR2 es la CDR2 de cadena pesada, la carga útil haptenilada se selecciona del grupo que consiste en cargas útiles biotiniladas, cargas útiles teofiliniladas, cargas útiles digoxigeniladas, cargas útiles fluoresceiniladas y la cisteína se encuentra en la posición 52b o 53 de acuerdo con la numeración de Kabat, o en el que la CDR2 es la CDR2 de cadena ligera, cuando la carga útil haptenilada es una carga útil helicarilada, y la cisteína se encuentra en la posición 55 o 51 de acuerdo con la numeración de Kabat, y
en el que el receptor de la barrera hematoencefálica es el receptor de transferrina (TfR) o la proteína 8 relacionada con el receptor de lipoproteínas de baja densidad (LRP8).
En un modo de realización de todos los aspectos, el conjugado covalente es un conjugado covalente no permanente. En un modo de realización, el conjugado covalente es un conjugado covalente escindible intracelularmente.
En un modo de realización, el anticuerpo biespecífico está libre de función efectora.
Un aspecto de la invención es un conjugado covalente que comprende
i) un anticuerpo biespecífico, que tiene una primera especificidad de unión, que se une específicamente a una carga útil haptenilada, y una segunda especificidad de unión, que se une específicamente al receptor de transferrina, y
ii) una carga útil haptenilada,
en el que la carga útil haptenilada se une específicamente mediante la primera especificidad de unión,
en el que el conjugado covalente tiene un enlace disulfuro entre la carga útil haptenilada y un residuo de cisteína en un residuo de aminoácido en la CDR2 en la primera especificidad de unión que se une específicamente a la carga útil haptenilada, en el que la CDR2 es la CDR2 de cadena pesada, la carga útil haptenilada se selecciona del grupo que consiste en cargas útiles biotiniladas, cargas útiles teofiliniladas, cargas útiles digoxigeniladas y cargas útiles fluoresceiniladas y la cisteína se encuentra en la posición 52b o 53 de acuerdo con la numeración de Kabat, o en el que la CDR2 es la CDR2 de cadena ligera, cuando la carga útil haptenilada es una carga útil helicarilada, y la cisteína se encuentra en la posición 55 o 51 de acuerdo con la numeración de Kabat, y
en el que el receptor de la barrera hematoencefálica es el receptor de transferrina (TfR) o la proteína 8 relacionada con el receptor de lipoproteínas de baja densidad (LRP8), y
en el que el anticuerpo biespecífico comprende
a) un sitio de unión para la carga útil haptenilada y un sitio de unión para el receptor de transferrina, o b) dos sitios de unión para la carga útil haptenilada y un sitio de unión para el receptor de transferrina, o c) un sitio de unión para la carga útil haptenilada y dos sitios de unión para el receptor de transferrina, o d) dos sitios de unión para la carga útil haptenilada y dos sitios de unión para el receptor de transferrina.
En un modo de realización, el anticuerpo biespecífico es un anticuerpo de longitud completa que comprende dos sitios de unión.
En un modo de realización, el anticuerpo biespecífico es un anticuerpo de longitud completa al que se han fusionado uno o dos scFv o scFab y que comprende tres o cuatro sitios de unión.
En un modo de realización, el anticuerpo biespecífico es un fragmento de anticuerpo. En un modo de realización, el fragmento de anticuerpo se selecciona de F(ab')2 y diacuerpos.
En un modo de realización, el anticuerpo biespecífico es un anticuerpo humanizado o un anticuerpo humano.
En un modo de realización, el anticuerpo biespecífico está libre de función efectora. En un modo de realización, el anticuerpo biespecífico no tiene una región Fc funcional. En un modo de realización, el anticuerpo biespecífico no tiene una región Fc. En un modo de realización, el anticuerpo biespecífico tiene una región Fc de la subclase IgG1 humana con las mutaciones L234A, L235A y P329G, en el que las posiciones se determinan de acuerdo con la numeración de la región Fc de Kabat (índice EU de Kabat). En un modo de realización, el anticuerpo biespecífico tiene una región Fc de la subclase IgG4 humana con las mutaciones S228P, L235E y P329G, en el que las posiciones se determinan de acuerdo con la numeración de la región Fc de Kabat (índice EU de Kabat).
En un modo de realización, el anticuerpo biespecífico comprende
a) un sitio de unión para la carga útil haptenilada y un sitio de unión para el receptor de la barrera hematoencefálica, o
b) dos sitios de unión para la carga útil haptenilada y un sitio de unión para el receptor de la barrera hematoencefálica, o
c) un sitio de unión para la carga útil haptenilada y dos sitios de unión para el receptor de la barrera hematoencefálica, o
d) dos sitios de unión para la carga útil haptenilada y dos sitios de unión para el receptor de la barrera hematoencefálica.
En los casos b) y c) del modo de realización previo, una cadena pesada del anticuerpo biespecífico comprende una mutación de tipo "ojal" y la otra cadena respectiva comprende una mutación de tipo "botón".
En un modo de realización preferente, el anticuerpo biespecífico comprende dos sitios de unión para la carga útil haptenilada y dos sitios de unión para el receptor de la barrera hematoencefálica.
En un modo de realización, la carga útil haptenilada comprende un conector entre el hapteno y la carga útil. En un modo de realización, el conector es un conector peptídico. En un modo de realización, el conector es un conector químico (conector no peptídico).
Se ha descubierto que mediante el acoplamiento covalente de una carga útil haptenilada a un anticuerpo anti-hapteno se puede lograr una estabilización y una mejora de la propiedad farmacocinética de la carga útil.
En un modo de realización de todos los aspectos, el anticuerpo biespecífico y la carga útil haptenilada comprenden cada uno un grupo funcional mediante el cual tras la unión de la carga útil haptenilada mediante el anticuerpo biespecífico se forma un enlace covalente entre la carga útil haptenilada y el anticuerpo biespecífico.
En un modo de realización de todos los aspectos, la carga útil haptenilada comprende un grupo funcional en el hapteno o si está presente en el conector entre el hapteno y la carga útil. En un modo de realización, el grupo funcional es un tiol o una maleimida o un haloacetilo. En un modo de realización, el grupo funcional en el hapteno o si está presente en el conector es un grupo tiol.
En un modo de realización, el enlace covalente es un enlace disulfuro y se forma sin la adición de agentes activos redox.
Se ha descubierto que se puede usar cualquier carga útil en la carga útil haptenilada tras la derivatización con un conector universal que comprende el grupo funcional para la formación del enlace covalente entre la carga útil haptenilada y un residuo de aminoácido en la CDR2 de cadena pesada del anticuerpo. La localización del grupo funcional en el conector universal tiene la ventaja de que no es necesario genomanipular la síntesis y la posición del grupo funcional en la CDR2 de cadena pesada del anticuerpo si se cambia la carga útil.
Se ha descubierto que se puede usar cualquier carga útil en la carga útil helicarilada tras la derivatización de la secuencia de aminoácidos helicar con una cisteína que comprende el grupo funcional para la formación del enlace disulfuro covalente entre la carga útil helicarilada y el residuo de cisteína en la CDR2 de cadena ligera del anticuerpo. La localización del residuo de cisteína (grupo funcional tiol) en la secuencia de aminoácidos de motivo helicar tiene la ventaja de que no es necesario genomanipular la síntesis y la posición del residuo de cisteína en la CDR2 de cadena ligera del anticuerpo si se cambia la carga útil.
En un modo de realización de todos los aspectos, se forma exactamente un enlace covalente por CDR2.
En un modo de realización de todos los aspectos, la carga útil se selecciona de un resto de unión, un resto de marcado y un resto biológicamente activo.
En un modo de realización de todos los aspectos, el resto biológicamente activo se selecciona del grupo que comprende anticuerpos, polipéptidos, ligandos naturales de una o más dianas del SNC, versiones modificadas de ligandos naturales de una o más dianas del SNC, aptámeros, ácidos nucleicos inhibidores (es decir, ARN inhibidores pequeños (ARNip) y ARN de horquilla corta (ARNhc)), ácidos nucleicos bloqueados (ANB), ribozimas y moléculas pequeñas, o fragmentos activos de cualquiera de los anteriores.
En un modo de realización de todos los aspectos, la carga útil es un ácido nucleico o un derivado de ácido nucleico. En un modo de realización, el ácido nucleico es un ARNi o un ANB.
En un modo de realización de todos los aspectos, la carga útil es un polipéptido.
En un modo de realización de todos los aspectos, la carga útil es un anticuerpo de longitud completa o un fragmento de anticuerpo.
En un modo de realización de todos los aspectos, la carga útil haptenilada es un anticuerpo de anti-alfa sinucleína haptenilado de longitud completa.
En un modo de realización de todos los aspectos, la carga útil haptenilada es un fragmento de anticuerpo anti-alfa sinucleína haptenilado que se une específicamente a la alfa-sinucleína.
En un modo de realización de todos los aspectos, el hapteno es la biotina.
En un modo de realización de todos los aspectos, el anticuerpo comprende en el dominio variable de la cadena pesada las HVR de SEQ ID NO: 243 a 245 y en el dominio variable de la cadena ligera las HVR de SEQ ID NO: 246 a 248. En un modo de realización de todos los aspectos, el anticuerpo comprende en el dominio variable de la cadena pesada las HVR de SEQ ID NO: 249, 250 y 245 y en el dominio variable de la cadena ligera las HVR de SEQ ID NO: 251 a 253.
En un modo de realización de todos los aspectos, el anticuerpo comprende un dominio variable de la cadena pesada que consiste en la SEQ ID NO: 254 y un dominio variable de la cadena ligera que consiste en la SEQ ID NO: 255. En un modo de realización de todos los aspectos, el anticuerpo se ha obtenido humanizando un anticuerpo que comprende un dominio variable de la cadena pesada que consiste en la SEQ ID NO: 254 y un dominio variable de la cadena ligera que consiste en la SEQ ID NO: 255.
En un modo de realización de todos los aspectos, el anticuerpo es un anticuerpo humanizado y comprende en el dominio variable de la cadena pesada las HVR de SEQ ID NO: 243 a 245 y en el dominio variable de la cadena ligera las HVR de SEQ ID NO: 246 a 248, en el que en cada HVR se pueden cambiar hasta 3 residuos de aminoácidos. En un modo de realización de todos los aspectos, el anticuerpo es un anticuerpo humanizado y comprende en el dominio variable de la cadena pesada las h Vr de SEQ ID NO: 249, 250 y 245 y en el dominio variable de la cadena ligera las HVR de SEQ ID NO: 251 a 253, en el que en cada HVR se pueden cambiar hasta 3 residuos de aminoácidos. En un modo de realización de todos los aspectos, el anticuerpo es un anticuerpo humanizado y el dominio variable de la cadena pesada se deriva de un dominio variable de la cadena pesada que consiste en la SEQ ID NO: 254 y un dominio variable de la cadena ligera se deriva de un dominio variable de la cadena ligera que consiste en la SEQ ID NO: 255.
En un modo de realización de todos los aspectos, el anticuerpo se une al mismo epítopo como un anticuerpo que comprende en la cadena pesada las HVR de SEQ ID NO: 256 a 258 y en la cadena ligera las HVR de SEQ ID NO: 259 a 261.
En un modo de realización de todos los aspectos, el anticuerpo se une al mismo epítopo como un anticuerpo que comprende en la cadena pesada las HVR de SEQ ID NO: 262, 263 y 258 y en la cadena ligera las HVR de Se Q ID NO: 264 a 266.
En un modo de realización de todos los aspectos, el anticuerpo comprende un dominio variable de la cadena pesada que consiste en la SEQ ID NO: 267 y un dominio variable de la cadena ligera que consiste en la SEQ ID NO: 268. En un modo de realización de todos los aspectos, el anticuerpo se ha obtenido humanizando un anticuerpo que comprende un dominio variable de la cadena pesada que consiste en la SEQ ID NO: 267 y un dominio variable de la cadena ligera que consiste en la SEQ ID NO: 268.
En un modo de realización de todos los aspectos, el anticuerpo es un anticuerpo humanizado y comprende en el dominio variable de la cadena pesada las h Vr de SEQ ID NO: 256 a 258 y en el dominio variable de la cadena ligera las HVR de SEQ ID NO: 259 a 261, en el que en cada HVR se pueden cambiar hasta 3 residuos de aminoácidos. En un modo de realización de todos los aspectos, el anticuerpo es un anticuerpo humanizado y comprende en el dominio variable de la cadena pesada las h Vr de SEQ ID NO: 262, 263 y 258 y en el dominio variable de la cadena ligera las HVR de SEQ ID NO: 264 a 266, en el que en cada HVR se pueden cambiar hasta 3 residuos de aminoácidos. En un modo de realización de todos los aspectos, el anticuerpo es un anticuerpo humanizado y el dominio variable de la cadena pesada se deriva de un dominio variable de la cadena pesada que consiste en la SEQ ID NO: 267 y un dominio variable de la cadena ligera se deriva de un dominio variable de la cadena ligera que consiste en la SEQ ID NO: 268.
En un modo de realización de todos los aspectos, el anticuerpo se une al mismo epítopo como un anticuerpo que comprende en la cadena pesada las HVR de SEQ ID NO: 269 a 271 y en la cadena ligera las HVR de SEQ ID NO: 272 a 274.
En un modo de realización de todos los aspectos, el anticuerpo se une al mismo epítopo como un anticuerpo que comprende en la cadena pesada las HVR de SEQ ID NO: 269, 275 y 271 y en la cadena ligera las HVR de Se Q ID NO: 276 a 278.
En un modo de realización de todos los aspectos, el anticuerpo comprende un dominio variable de la cadena pesada que consiste en la SEQ ID NO: 279 y un dominio variable de la cadena ligera que consiste en la SEQ ID NO: 280. En un modo de realización de todos los aspectos, el anticuerpo se ha obtenido humanizando un anticuerpo que comprende un dominio variable de la cadena pesada que consiste en la SEQ ID NO: 279 y un dominio variable de la cadena ligera que consiste en la SEQ ID NO: 280.
En un modo de realización de todos los aspectos, el anticuerpo es un anticuerpo humanizado y comprende en el dominio variable de la cadena pesada las h Vr de SEQ ID NO: 269 a 271 y en el dominio variable de la cadena ligera las HVR de SEQ ID NO: 272 a 274, en el que en cada HVR se pueden cambiar hasta 3 residuos de aminoácidos. En un modo de realización de todos los aspectos, el anticuerpo es un anticuerpo humanizado y comprende en el dominio variable de la cadena pesada las h Vr de SEQ ID NO: 269, 275 y 271 y en el dominio variable de la cadena ligera las HVR de SEQ ID NO: 276 a 278, en el que en cada HVR se pueden cambiar hasta 3 residuos de aminoácidos. En un modo de realización de todos los aspectos, el anticuerpo es un anticuerpo humanizado y el dominio variable de la cadena pesada se deriva de un dominio variable de la cadena pesada que consiste en la SEQ ID NO: 279 y un dominio variable de la cadena ligera se deriva de un dominio variable de la cadena ligera que consiste en la SEQ ID NO: 280.
En un modo de realización de todos los aspectos, la carga útil haptenilada es un anticuerpo anti-tau(pS422) humano de longitud completa haptenilado.
En un modo de realización de todos los aspectos, la carga útil haptenilada es un fragmento de anticuerpo antitau(pS422) humano haptenilado que se une específicamente a la tau humana fosforilada en la serina en la posición 422.
En un modo de realización de todos los aspectos, el hapteno es la biotina.
En un modo de realización de todos los aspectos, el anticuerpo anti-tau(pS422) humano comprende
a) en el dominio variable de la cadena pesada, las HVR de SEQ ID NO: 230, 239 y 232, o
b) en el dominio variable de la cadena pesada, las HVR de SEQ ID NO: 230, 231 y 232.
En un modo de realización de todos los aspectos, el anticuerpo comprende además
a) en el dominio variable de la cadena ligera, las HVR de SEQ ID NO: 234, 235 y 236, o
b) en el dominio variable de la cadena ligera, las HVR de SEQ ID NO: 233, 229 y 236.
En un modo de realización de todos los aspectos, el anticuerpo comprende
a) en el dominio variable de la cadena pesada, las HVR de SEQ ID NO: 230, 239 y 232, y en el dominio variable de la cadena ligera, las HVR de SEQ ID NO: 234, 235 y 236, o
b) en el dominio variable de la cadena pesada, las HVR de SEQ ID NO: 230, 231 y 232, y en el dominio variable de la cadena ligera, las HVR de SEQ ID NO: 233, 229 y 236, o
c) en el dominio variable de la cadena pesada, las HVR de SEQ ID NO: 230, 231 y 232, y en el dominio variable de la cadena ligera, las HVR de SEQ ID NO: 234, 235 y 236.
En un modo de realización de todos los aspectos, el anticuerpo comprende
a) un dominio variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 241 y un dominio variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 238, o
b) un dominio variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 240 y un dominio variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 237, o
c) un dominio variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 240 y un dominio variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 238, o
d) un dominio variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 242 y un dominio variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 238.
En un modo de realización de todos los aspectos, la carga útil haptenilada es un anticuerpo anti-Abeta haptenilado de longitud completa.
En un modo de realización de todos los aspectos, la carga útil haptenilada es un fragmento de anticuerpo anti-Abeta haptenilado que se une específicamente a Abeta humana.
En un modo de realización de todos los aspectos, el hapteno es la biotina.
En un modo de realización de todos los aspectos, el anticuerpo anti-Abeta comprende en el dominio variable de la cadena pesada las HVR de SEQ ID NO: 281, 282 y 283.
En un modo de realización de todos los aspectos, el anticuerpo comprende además en el dominio variable de la cadena ligera las HVR de SEQ ID NO: 284, 285 y 286.
En un modo de realización de todos los aspectos, el anticuerpo comprende en el dominio variable de la cadena pesada las HVR de SEQ ID NO: 281,282 y 283 y en el dominio variable de la cadena ligera las HVR de SEQ ID NO: 284, 285 y 286.
En un modo de realización de todos los aspectos, el anticuerpo comprende
a) un dominio variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 287 y un dominio variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 290, o
b) un dominio variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 288 y un dominio variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 291, o
c) un dominio variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 289 y un dominio variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 292.
En un modo de realización de todos los aspectos, la carga útil es una molécula pequeña (resto biológicamente activo no polipeptídico).
En un modo de realización de todos los aspectos, el resto biológicamente activo es un polipéptido. En un modo de realización, el polipéptido consiste en 5 a 500 residuos de aminoácidos. En un modo de realización, el polipéptido comprende de 10 a 450 residuos de aminoácidos. En un modo de realización, el polipéptido comprende de 15 a 400 residuos de aminoácidos. En un modo de realización, el polipéptido comprende de 18 a 350 residuos de aminoácidos. En un modo de realización de todos los aspectos, el anticuerpo biespecífico comprende una primera especificidad de unión que se une específicamente a una carga útil digoxigenilada (especificidad de unión anti-digoxigenina; especificidad de unión anti-DIG) y una segunda especificidad de unión que se une específicamente al receptor de transferrina (humano) (especificidad de unión anti-receptor de transferrina (humano); especificidad de unión anti-(h)TfR) o a la proteína 8 relacionada con el receptor de lipoproteínas de baja densidad (especificidad de unión antiproteína 8 relacionada con el receptor de lipoproteínas de baja densidad; especificidad de unión anti-LRP8).
En un modo de realización de todos los aspectos, el anticuerpo biespecífico tiene dos especificidades de unión que se unen específicamente a la carga útil digoxigenilada (dos especificidades de unión anti-digoxigenina) y dos especificidades de unión que se unen específicamente al receptor de transferrina (humano) (dos especificidades de unión anti-receptor de transferrina (humano)) o a la proteína 8 relacionada con el receptor de lipoproteínas de baja densidad (especificidad de unión anti-proteína 8 relacionada con el receptor de lipoproteínas de baja densidad). En un modo de realización de todos los aspectos, la especificidad de unión que se une específicamente a una carga útil digoxigenilada es un par de un dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo y un dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo que comprende (a) una CDR1 de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 01, (b) una CDR2 de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 02, (c) una CDR3 de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 03, (d) una CDR1 de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 05, (e) una CDR2 de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 06, y (f) una CDR3 de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 07.
En un modo de realización de todos los aspectos, la especificidad de unión que se une específicamente a una carga útil digoxigenilada es una especificidad de unión humanizada.
En un modo de realización de todos los aspectos, la especificidad de unión que se une específicamente a una carga útil digoxigenilada comprende CDR como en cualquiera de los modos de realización anteriores y una región estructural humana aceptora (por ejemplo, una región estructural de inmunoglobulina humana o una región estructural consenso humana).
En un modo de realización de todos los aspectos, la especificidad de unión que se une específicamente a una carga útil digoxigenilada es un par de un dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo y un dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo que comprende (a) una CDR1 de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 09 o 25, (b) una CDR2 de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 o 26, (c) una CDR3 de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 o 27, (d) una CDR1 de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 o 29, (e) una CDR2 de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 o 30, y (f) una CDR3 de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 o 31.
En un modo de realización de todos los aspectos, la especificidad de unión que se une específicamente a una carga útil digoxigenilada es un par de un dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo y un dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo que comprende una secuencia de dominio variable de la cadena pesada (VH) que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 04 o 12 o 20 o 28. En determinados modos de realización, una secuencia de VH que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad contiene sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservadoras), inserciones o deleciones en relación con la secuencia de referencia, pero un anticuerpo anti-digoxigenina que comprenda esa secuencia retiene la capacidad de unirse a digoxigenina. En determinados modos de realización, se han sustituido, insertado y/o delecionado un total de 1 a 10 aminoácidos en la SEQ ID NO: 01 o 09 o 17 o 25. En determinados modos de realización, las sustituciones, inserciones o deleciones se producen en regiones fuera de las CDR (es decir, en las FR). Opcionalmente, el anticuerpo antidigoxigenina comprende la secuencia de VH en la SEQ ID NO: 01 o 09 o 17 o 25, que incluye modificaciones postraduccionales de esa secuencia.
En un modo de realización de todos los aspectos, la especificidad de unión que se une específicamente a una carga útil digoxigenilada es un par de un dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo y un dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo que comprende además un dominio variable de la cadena ligera (VL) que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 08 o 16 o 24 o 32. En determinados modos de realización, una secuencia de VL que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad contiene sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservadoras), inserciones o deleciones en relación con la secuencia de referencia, pero un anticuerpo anti-digoxigenina que comprenda esa secuencia retiene la capacidad de unirse a digoxigenina. En determinados modos de realización, se han sustituido, insertado y/o delecionado un total de 1 a 10 aminoácidos en la SEQ ID NO: 08 o 16 o 24 o 32. En determinados modos de realización, las sustituciones, inserciones o deleciones se producen en regiones fuera de las CDR (es decir, en las FR). Opcionalmente, el anticuerpo anti-digoxigenina comprende la secuencia de VL en la SEQ ID NO: 08 o 16 o 24 o 32, que incluye modificaciones postraduccionales de esa secuencia.
En un modo de realización de todos los aspectos, el anticuerpo biespecífico comprende una primera especificidad de unión que se une específicamente a una carga útil biotinilada (especificidad de unión anti-biotina; especificidad de unión anti-BI) y una segunda especificidad de unión que se une específicamente al receptor de transferrina (humano) (especificidad de unión anti-receptor de transferrina (humano); especificidad de unión anti-(h)TfR) o a la proteína 8 relacionada con el receptor de lipoproteínas de baja densidad (especificidad de unión anti-proteína 8 relacionada con el receptor de lipoproteínas de baja densidad; especificidad de unión anti-LRP8).
En un modo de realización de todos los aspectos, el anticuerpo biespecífico tiene dos especificidades de unión que se unen específicamente a la carga útil biotinilada (dos especificidades de unión anti-biotina) y dos especificidades de unión que se unen específicamente al receptor de transferrina (humano) (dos especificidades de unión anti-receptor de transferrina (humano)) o a la proteína 8 relacionada con el receptor de lipoproteínas de baja densidad (especificidad de unión anti-proteína 8 relacionada con el receptor de lipoproteínas de baja densidad).
En un modo de realización de todos los aspectos, la especificidad de unión que se une específicamente a una carga útil biotinilada es un par de un dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo y un dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo que comprende (a) una CDR1 de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 33, (b) una CDR2 de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 34, (c) una CDR3 de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 35, (d) una CDR1 de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 37, (e) una CDR2 de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 38, y (f) una CDR3 de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 39.
En un modo de realización de todos los aspectos, la especificidad de unión que se une específicamente a una carga útil biotinilada es una especificidad de unión humanizada.
En un modo de realización de todos los aspectos, la especificidad de unión que se une específicamente a una carga útil biotinilada comprende CDR como en cualquiera de los modos de realización anteriores y una región estructural humana aceptora (por ejemplo, una región estructural de inmunoglobulina humana o una región estructural consenso humana).
En un modo de realización de todos los aspectos, la especificidad de unión que se une específicamente a una carga útil biotinilada es un par de un dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo y un dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo que comprende (a) una CDR1 de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 41 o 57, (b) una CDR2 de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 42 o 58, (c) una CDR3 de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 43 o 59, (d) una CDR1 de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 45 o 61, (e) una CDR2 de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 46 o 62, y (f) una CDR3 de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 47 o 63.
En un modo de realización de todos los aspectos, la especificidad de unión que se une específicamente a una carga útil biotinilada es un par de un dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo y un dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo que comprende una secuencia de dominio variable de la cadena pesada (VH) que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 36 o 44 o 52 o 60. En determinados modos de realización, una secuencia de VH que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad contiene sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservadoras), inserciones o deleciones en relación con la secuencia de referencia, pero un anticuerpo anti-biotina que comprenda esa secuencia retiene la capacidad de unirse a biotina. En determinados modos de realización, se han sustituido, insertado y/o delecionado un total de 1 a 10 aminoácidos en la SEQ ID NO: 36 o 44 o 52 o 60. En determinados modos de realización, las sustituciones, inserciones o deleciones se producen en regiones fuera de las CDR (es decir, en las FR). Opcionalmente, el anticuerpo anti-biotina comprende la secuencia de VH en la SEQ ID NO: 36 o 44 o 52 o 60, que incluye modificaciones postraduccionales de esa secuencia.
En un modo de realización de todos los aspectos, la especificidad de unión que se une específicamente a una carga útil biotinilada es un par de un dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo y un dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo que comprende además un dominio variable de la cadena ligera (VL) que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 40 o 48 o 56 o 64. En determinados modos de realización, una secuencia de VL que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad contiene sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservadoras), inserciones o deleciones en relación con la secuencia de referencia, pero un anticuerpo anti-biotina que comprenda esa secuencia retiene la capacidad de unirse a biotina. En determinados modos de realización, se han sustituido, insertado y/o delecionado un total de 1 a 10 aminoácidos en la SEQ ID NO: 40 o 48 o 56 o 64. En determinados modos de realización, las sustituciones, inserciones o deleciones se producen en regiones fuera de las CDR (es decir, en las FR). Opcionalmente, el anticuerpo anti-biotina comprende la secuencia de VL en la SEQ ID NO: 40 o 48 o 56 o 64, que incluye modificaciones postraduccionales de esa secuencia.
En un modo de realización de todos los aspectos, el anticuerpo biespecífico comprende una primera especificidad de unión que se une específicamente a una carga útil teofilinilada (especificidad de unión anti-teofilina; especificidad de unión anti-TEO) y una segunda especificidad de unión que se une específicamente al receptor de transferrina (humano) (especificidad de unión anti-receptor de transferrina (humano); especificidad de unión anti-(h)TfR) o a la proteína 8 relacionada con el receptor de lipoproteínas de baja densidad (especificidad de unión anti-proteína 8 relacionada con el receptor de lipoproteínas de baja densidad; especificidad de unión anti-LRP8).
En un modo de realización de todos los aspectos, el anticuerpo biespecífico tiene dos especificidades de unión que se unen específicamente a la carga útil teofilinilada (dos especificidades de unión anti-teofilina) y dos especificidades de unión que se unen específicamente al receptor de transferrina (humano) (dos especificidades de unión anti-receptor de transferrina (humano)) o a la proteína 8 relacionada con el receptor de lipoproteínas de baja densidad (especificidad de unión anti-proteína 8 relacionada con el receptor de lipoproteínas de baja densidad).
En un modo de realización de todos los aspectos, la especificidad de unión que se une específicamente a una carga útil teofilinilada es un par de un dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo y un dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo que comprende (a) una CDR1 de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 65, (b) una CDR2 de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 66, (c) una CDR3 de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 67, (d) una CDR1 de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 69, (e) una CDR2 de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 70, y (f) una CDR3 de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 71.
En un modo de realización de todos los aspectos, la especificidad de unión que se une específicamente a una carga útil teofilinilada es una especificidad de unión humanizada.
En un modo de realización de todos los aspectos, la especificidad de unión que se une específicamente a una carga útil teofilinilada comprende CDR como en cualquiera de los modos de realización anteriores y una región estructural humana aceptora (por ejemplo, una región estructural de inmunoglobulina humana o una región estructural consenso humana).
En un modo de realización de todos los aspectos, la especificidad de unión que se une específicamente a una carga útil teofilinilada es un par de un dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo y un dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo que comprende (a) una CDR1 de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 73 o 89, (b) una CDR2 de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 74 o 90, (c) una CDR3 de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 75 o 91, (d) una CDR1 de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 77 o 93, (e) una CDR2 de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 78 o 94, y (f) una CDR3 de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 79 o 95.
En un modo de realización de todos los aspectos, la especificidad de unión que se une específicamente a una carga útil teofilinilada es un par de un dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo y un dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo que comprende una secuencia de dominio variable de la cadena pesada (VH) que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 68 o 76 o 84 o 92. En determinados modos de realización, una secuencia de VH que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad contiene sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservadoras), inserciones o deleciones en relación con la secuencia de referencia, pero un anticuerpo anti-teofilina que comprenda esa secuencia retiene la capacidad de unirse a teofilina. En determinados modos de realización, se han sustituido, insertado y/o delecionado un total de 1 a 10 aminoácidos en la SEQ ID NO: 68 o 76 o 84 o 92. En determinados modos de realización, las sustituciones, inserciones o deleciones se producen en regiones fuera de las CDR (es decir, en las FR). Opcionalmente, el anticuerpo anti-teofilina comprende la secuencia de VH en la SEQ ID NO: 68 o 76 o 84 o 92 que incluye modificaciones postraduccionales de esa secuencia.
En un modo de realización de todos los aspectos, la especificidad de unión que se une específicamente a una carga útil teofilinilada es un par de un dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo y un dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo que comprende además un dominio variable de la cadena ligera (VL) que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 72 o 80 o 88 o 96. En determinados modos de realización, una secuencia de VL que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad contiene sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservadoras), inserciones o deleciones en relación con la secuencia de referencia, pero un anticuerpo anti-teofilina que comprenda esa secuencia retiene la capacidad de unirse a teofilina. En determinados modos de realización, se han sustituido, insertado y/o delecionado un total de 1 a 10 aminoácidos en la SEQ ID NO: 72 o 80 o 88 o 96. En determinados modos de realización, las sustituciones, inserciones o deleciones se producen en regiones fuera de las CDR (es decir, en las FR). Opcionalmente, el anticuerpo anti-teofilina comprende la secuencia de VL en la SEQ ID NO: 72 o 80 o 88 o 96, que incluye modificaciones postraduccionales de esa secuencia.
En un modo de realización de todos los aspectos, el anticuerpo biespecífico comprende una primera especificidad de unión que se une específicamente a una carga útil fluoresceinilada (especificidad de unión anti-fluoresceína; especificidad de unión anti-FLUO) y una segunda especificidad de unión que se une específicamente al receptor de transferrina (humano) (especificidad de unión anti-receptor de transferrina (humano); especificidad de unión anti-(h)TfR) o a la proteína 8 relacionada con el receptor de lipoproteínas de baja densidad (especificidad de unión antiproteína 8 relacionada con el receptor de lipoproteínas de baja densidad; especificidad de unión anti-LRP8).
En un modo de realización de todos los aspectos, el anticuerpo biespecífico tiene dos especificidades de unión que se unen específicamente a la carga útil fluoresceinilada (dos especificidades de unión anti-fluoresceína) y dos especificidades de unión que se unen específicamente al receptor de transferrina (humano) (dos especificidades de unión anti-receptor de transferrina (humano)) o a la proteína 8 relacionada con el receptor de lipoproteínas de baja densidad (especificidad de unión anti-proteína 8 relacionada con el receptor de lipoproteínas de baja densidad).
En un modo de realización de todos los aspectos, la especificidad de unión que se une específicamente a una carga útil fluoresceinilada es un par de un dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo y un dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo que comprende (a) una CDR1 de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 97, (b) una CDR2 de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 98, (c) una CDR3 de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 99, (d) una CDR1 de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 101, (e) una CDR2 de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 102, y (f) una CDR3 de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 103.
En un modo de realización de todos los aspectos, la especificidad de unión que se une específicamente a una carga útil fluoresceinilada es una especificidad de unión humanizada.
En un modo de realización de todos los aspectos, la especificidad de unión que se une específicamente a una carga útil fluoresceinilada comprende CDR como en cualquiera de los modos de realización anteriores y una región estructural humana aceptora (por ejemplo, una región estructural de inmunoglobulina humana o una región estructural consenso humana).
En un modo de realización de todos los aspectos, la especificidad de unión que se une específicamente a una carga útil fluoresceinilada es un par de un dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo y un dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo que comprende (a) una CDR1 de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 105 o 113, (b) una CDR2 de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 106 o 114, (c) una CDR3 de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 107 o 115, (d) una CDR1 de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 109 o 117, (e) una CDR2 de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ
ID NO: 110 o 118, y (f) una CDR3 de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:
111 o 119.
En un modo de realización de todos los aspectos, la especificidad de unión que se une específicamente a una carga útil fluoresceinilada es un par de un dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo y un dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo que comprende una secuencia de dominio variable de la cadena pesada (VH) que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 108 o 116. En determinados modos de realización, una secuencia de VH que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad contiene sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservadoras), inserciones o deleciones en relación con la secuencia de referencia, pero un anticuerpo anti-fluoresceína que comprenda esa secuencia retiene la capacidad de unirse a fluoresceína. En determinados modos de realización, se han sustituido, insertado y/o delecionado un total de 1 a 10 aminoácidos en SEQ ID NO: 108 o 116. En determinados modos de realización, las sustituciones, inserciones o deleciones se producen en regiones fuera de las CDR (es decir, en las FR). Opcionalmente, el anticuerpo antifluoresceína comprende la secuencia de VH en la SEQ ID NO: 108 o 116, que incluye modificaciones postraduccionales de esa secuencia.
En un modo de realización de todos los aspectos, la especificidad de unión que se une específicamente a una carga útil fluoresceinilada es un par de un dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo y un dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo que comprende además un dominio variable de la cadena ligera (VL) que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 112 o 120. En determinados modos de realización, una secuencia de VL que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad contiene sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservadoras), inserciones o deleciones en relación con la secuencia de referencia, pero un anticuerpo anti-fluoresceína que comprenda esa secuencia retiene la capacidad de unirse a fluoresceína. En determinados modos de realización, se han sustituido, insertado y/o delecionado un total de 1 a 10 aminoácidos en
SEQ ID NO: 112 o 120. En determinados modos de realización, las sustituciones, inserciones o deleciones se producen en regiones fuera de las CDR (es decir, en las FR). Opcionalmente, el anticuerpo anti-fluoresceína comprende la secuencia de VL en la SEQ ID NO: 112 o 120, que incluye modificaciones postraduccionales de esa secuencia.
En el presente documento se divulga una formulación farmacéutica que comprende el anticuerpo biespecífico como se informa en el presente documento y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
En el presente documento se divulga una formulación farmacéutica que comprende el complejo no covalente como se informa en el presente documento y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Un aspecto como se informa en el presente documento es una formulación farmacéutica que comprende el conjugado covalente de acuerdo con la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Un aspecto de la invención es el conjugado covalente de acuerdo con la invención para su uso como un medicamento.
En el presente documento se divulga el uso del conjugado covalente como se informa en el presente documento como agente de diagnóstico.
En el presente documento se divulga el uso del conjugado covalente como se informa en el presente documento para incrementar la estabilidad de una carga útil.
En el presente documento se divulga el uso del conjugado covalente como se informa en el presente documento para incrementar la actividad de una carga útil.
En el presente documento se divulga el uso del conjugado covalente como se informa en el presente documento para incrementar la semivida in vivo de una carga útil.
Un aspecto como se informa en el presente documento es el uso del conjugado covalente como se informa en el presente documento en el tratamiento de una enfermedad, en el que la enfermedad es cáncer o un trastorno neurológico.
En un modo de realización, el trastorno neurológico se selecciona de la enfermedad de Alzheimer (EA) (que incluye, pero no se limita a, deterioro cognitivo leve y EA prodrómica), apoplejía, demencia, distrofia muscular (DM), esclerosis múltiple (EM), esclerosis lateral amiotrófica (e La ), fibrosis quística, síndrome de Angelman, síndrome de Liddle, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Pick, enfermedad de Paget, cáncer (por ejemplo, cáncer que afecta al SNC o al cerebro) y lesión cerebral traumática.
En el presente documento se divulga el uso del complejo covalente como se informa en el presente documento para el suministro dirigido de una carga útil haptenilada a través de la barrera hematoencefálica.
En un modo de realización, la carga útil haptenilada tiene una mayor actividad biológica en ausencia del anticuerpo biespecífico como se informa en el presente documento que en presencia del anticuerpo biespecífico como se informa en el presente documento. En un modo de realización, la actividad biológica es dos veces mayor en ausencia del anticuerpo biespecífico. En un modo de realización, la actividad biológica es diez veces mayor en ausencia del anticuerpo biespecífico.
En resumen, la invención proporciona:
Un conjugado covalente que comprende
i) un anticuerpo biespecífico, que tiene una primera especificidad de unión, que se une específicamente a una carga útil haptenilada, y una segunda especificidad de unión, que se une específicamente a un receptor de la barrera hematoencefálica, y
ii) una carga útil haptenilada,
en el que la carga útil haptenilada se une específicamente mediante la primera especificidad de unión, en el que el conjugado covalente tiene un enlace disulfuro entre la carga útil haptenilada y un residuo de cisteína en un residuo de aminoácidos en la CDR2 en la primera especificidad de unión que se une específicamente a la carga útil haptenilada, en el que la CDR2 es la CDR2 de cadena pesada, la carga útil haptenilada se selecciona del grupo que consiste en cargas útiles biotiniladas, cargas útiles teofiliniladas, cargas útiles digoxigeniladas y cargas útiles fluoresceiniladas y la cisteína se encuentra en la posición 52b o 53 de acuerdo con la numeración de Kabat, o en el que la CDR2 es la CDR2 de cadena ligera, cuando la carga útil haptenilada es una carga útil helicarilada, y la cisteína se encuentra en la posición 55 o 51 de acuerdo con la numeración de Kabat, y
en el que el receptor de la barrera hematoencefálica es el receptor de transferrina (TfR) o la proteína 8 relacionada con el receptor de lipoproteínas de baja densidad (LRP8).
Además, los siguientes aspectos descritos en el presente documento caracterizan adicionalmente el conjugado mencionado anteriormente, ya sea solo o en combinación:
El conjugado mencionado anteriormente, en el que el anticuerpo biespecífico es un anticuerpo de longitud completa que comprende dos sitios de unión.
El conjugado mencionado anteriormente, en el que el anticuerpo biespecífico es un anticuerpo de longitud completa al que se han fusionado uno o dos scFv o scFab y que comprende tres o cuatro sitios de unión.
El conjugado mencionado anteriormente, en el que el anticuerpo biespecífico es un fragmento de anticuerpo, preferentemente seleccionado de entre F(ab')2 y diacuerpos.
El conjugado mencionado anteriormente, en el que el anticuerpo biespecífico es un anticuerpo humanizado o un anticuerpo humano.
El conjugado mencionado anteriormente, en el que el anticuerpo biespecífico está libre de función efectora.
El conjugado mencionado anteriormente, en el que el anticuerpo biespecífico no tiene región Fc funcional.
El conjugado mencionado anteriormente, en el que el anticuerpo biespecífico no tiene región Fc.
El conjugado mencionado anteriormente, en el que el anticuerpo biespecífico tiene una región Fc de la subclase IgG1 humana con las mutaciones L234A, L235A y P329G, en el que las posiciones se determinan de acuerdo con la numeración de la región Fc de Kabat (índice Eu de Kabat).
El conjugado mencionado anteriormente, en el que el anticuerpo biespecífico tiene una región Fc de la subclase IgG4 humana con las mutaciones S228P, L235E y P329G, en el que las posiciones se determinan de acuerdo con la numeración de la región Fc de Kabat (índice EU de Kabat).
El conjugado mencionado anteriormente, en el que el anticuerpo biespecífico comprende
a) un sitio de unión para la carga útil haptenilada y un sitio de unión para el receptor de la barrera hematoencefálica, o
b) dos sitios de unión para la carga útil haptenilada y un sitio de unión para el receptor de la barrera hematoencefálica, o
c) un sitio de unión para la carga útil haptenilada y dos sitios de unión para el receptor de la barrera hematoencefálica, o
d) dos sitios de unión para la carga útil haptenilada y dos sitios de unión para el receptor de la barrera hematoencefálica.
El conjugado mencionado anteriormente, en el que el anticuerpo biespecífico comprende dos sitios de unión para la carga útil haptenilada y dos sitios de unión para el receptor de la barrera hematoencefálica.
El conjugado mencionado anteriormente, en el que la carga útil haptenilada comprende un conector entre el hapteno y la carga útil.
El conjugado mencionado anteriormente, en el que el conector es un conector peptídico.
El conjugado mencionado anteriormente, en el que el conector es un conector químico (conector no peptídico). El conjugado mencionado anteriormente, en el que el anticuerpo biespecífico y la carga útil haptenilada comprenden cada uno un grupo funcional mediante el cual tras la unión de la carga útil haptenilada mediante el anticuerpo biespecífico se forma un enlace covalente entre la carga útil haptenilada y el anticuerpo biespecífico.
El conjugado mencionado anteriormente, en el que la carga útil haptenilada comprende un grupo funcional en el hapteno o si está presente en el conector entre el hapteno y la carga útil.
El conjugado mencionado anteriormente, en el que el grupo funcional en el hapteno o si está presente en el conector es un grupo tiol.
El conjugado mencionado anteriormente, en el que el enlace covalente se encuentra entre un residuo de cisteína en la CDR2 del anticuerpo y el grupo tiol en la carga útil haptenilada.
El conjugado mencionado anteriormente, en el que el enlace covalente es un enlace disulfuro y se forma sin la adición de agentes activos redox.
El conjugado mencionado anteriormente, en el que se forma exactamente un enlace covalente por CDR2.
El conjugado mencionado anteriormente, en el que la carga útil se selecciona de un resto de unión, un resto de marcado y un resto biológicamente activo.
El conjugado mencionado anteriormente, en el que el resto biológicamente activo se selecciona del grupo que comprende anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, conjugados de anticuerpo, polipéptidos, ligandos naturales de una o más dianas del SNC, versiones modificadas de ligandos naturales de una o más dianas del SNC, aptámeros, ácidos nucleicos inhibidores (es decir, ARN inhibidores pequeños (ARNip) y ARN de horquilla corta (ARNhc)), ácidos nucleicos bloqueados (ANB), ribozimas y moléculas pequeñas, o fragmentos activos de cualquiera de los anteriores. El conjugado mencionado anteriormente, en el que la carga útil es un ácido nucleico o un derivado de ácido nucleico. El conjugado mencionado anteriormente, en el que el ácido nucleico es un ARNi o un ANB.
El conjugado mencionado anteriormente, en el que la carga útil es una molécula pequeña (resto biológicamente activo no polipeptídico).
El conjugado mencionado anteriormente, en el que el resto biológicamente activo es un polipéptido.
El conjugado mencionado anteriormente, en el que el polipéptido consiste en 5 a 500 residuos de aminoácidos. El conjugado mencionado anteriormente, en el que el polipéptido comprende de 10 a 450 residuos de aminoácidos. El conjugado mencionado anteriormente, en el que el polipéptido comprende de 15 a 400 residuos de aminoácidos.
El conjugado mencionado anteriormente, en el que el polipéptido comprende de 18 a 350 residuos de aminoácidos.
El conjugado mencionado anteriormente, en el que el anticuerpo biespecífico comprende una primera especificidad de unión que se une específicamente a una carga útil digoxigenilada (especificidad de unión anti-digoxigenina; especificidad de unión anti-DIG) y una segunda especificidad de unión que se une específicamente al receptor de transferrina (humano) (especificidad de unión anti-receptor de transferrina (humano); especificidad de unión anti-(h)TfR) o a la proteína 8 relacionada con el receptor de lipoproteínas de baja densidad (especificidad de unión antiproteína 8 relacionada con el receptor de lipoproteínas de baja densidad; especificidad de unión anti-LRP8).
El conjugado mencionado anteriormente, en el que el anticuerpo biespecífico tiene dos especificidades de unión que se unen específicamente a la carga útil bromodesoxiuridinilada (dos especificidades de unión anti-bromodesoxiuridina) y dos especificidades de unión que se unen específicamente al receptor de transferrina (humano) (dos especificidades de unión anti-receptor de transferrina (humano)) o a la proteína 8 relacionada con el receptor de lipoproteínas de baja densidad (especificidad de unión anti-proteína 8 relacionada con el receptor de lipoproteínas de baja densidad).
El conjugado mencionado anteriormente, en el que la especificidad de unión que se une específicamente a una carga útil digoxigenilada es un par de un dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo y un dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo que comprende (a) una CDR1 de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 01, (b) una CDR2 de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 02, (c) una CDR3 de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 03, (d) una CDR1 de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 05, (e) una CDR2 de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 06, y (f) una CDR3 de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 07.
El conjugado mencionado anteriormente, en el que la especificidad de unión que se une específicamente a una carga útil digoxigenilada es una especificidad de unión humanizada.
El conjugado mencionado anteriormente, en el que la especificidad de unión que se une específicamente a una carga útil digoxigenilada comprende CDR como en cualquiera de los modos de realización anteriores y una región estructural humana aceptora (por ejemplo, una región estructural de inmunoglobulina humana o una región estructural consenso humana).
El conjugado mencionado anteriormente, en el que la especificidad de unión que se une específicamente a una carga útil digoxigenilada es un par de un dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo y un dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo que comprende (a) una CDR1 de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 09 o 25, (b) una CDR2 de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 o 26, (c) una CDR3 de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 o 27, (d) una CDR1 de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 o 29, (e) una CDR2 de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 o 30, y (f) una CDR3 de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 o 31.
El conjugado mencionado anteriormente, en el que la especificidad de unión que se une específicamente a una carga útil digoxigenilada es un par de un dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo y un dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo que comprende una secuencia de dominio variable de la cadena pesada (VH) que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 04 o 12 o 20 o 28.
El conjugado mencionado anteriormente, en el que una secuencia de VH que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad contiene sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservadoras), inserciones o deleciones en relación con la secuencia de referencia, pero un anticuerpo antidigoxigenina que comprenda esa secuencia retiene la capacidad de unirse a digoxigenina.
El conjugado mencionado anteriormente, en el que se han sustituido, insertado y/o delecionado un total de 1 a 10 aminoácidos en la SEQ ID NO: 01 o 09 o 17 o 25.
El conjugado mencionado anteriormente, en el que las sustituciones, inserciones o deleciones se producen en regiones fuera de las CDR.
El conjugado mencionado anteriormente, en el que el anticuerpo anti-digoxigenina comprende la secuencia de VH en la SEQ ID NO: 01 o 09 o 17 o 25, que incluye modificaciones postraduccionales de esa secuencia.
El conjugado mencionado anteriormente, en el que la especificidad de unión que se une específicamente a una carga útil digoxigenilada es un par de un dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo y un dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo que comprende además un dominio variable de la cadena ligera (VL) que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 08 o 16 o 24 o 32.
El conjugado mencionado anteriormente, en el que una secuencia de VL que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad contiene sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservadoras), inserciones o deleciones en relación con la secuencia de referencia, pero un anticuerpo antidigoxigenina que comprenda esa secuencia retiene la capacidad de unirse a digoxigenina.
El conjugado mencionado anteriormente, en el que se han sustituido, insertado y/o delecionado un total de 1 a 10 aminoácidos en la SEQ ID NO: 08 o 16 o 24 o 32. Opcionalmente, las sustituciones, inserciones o deleciones se producen en regiones fuera de las CDR (es decir, en las FR).
El conjugado mencionado anteriormente, en el que el anticuerpo anti-digoxigenina comprende la secuencia de VL en la SEQ ID NO: 08 o 16 o 24 o 32, que incluye modificaciones postraduccionales de esa secuencia.
El conjugado mencionado anteriormente, en el que el anticuerpo biespecífico comprende una primera especificidad de unión que se une específicamente a una carga útil biotinilada (especificidad de unión anti-biotina; especificidad de unión anti-BI) y una segunda especificidad de unión que se une específicamente al receptor de transferrina (humano) (especificidad de unión anti-receptor de transferrina (humano); especificidad de unión anti-(h)TfR) o a la proteína 8 relacionada con el receptor de lipoproteínas de baja densidad (especificidad de unión anti-proteína 8 relacionada con el receptor de lipoproteínas de baja densidad; especificidad de unión anti-LRP8).
El conjugado mencionado anteriormente, en el que el anticuerpo biespecífico tiene dos especificidades de unión que se unen específicamente a la carga útil biotinilada (dos especificidades de unión anti-biotina) y dos especificidades de unión que se unen específicamente al receptor de transferrina (humano) (dos especificidades de unión anti-receptor de transferrina (humano)) o a la proteína 8 relacionada con el receptor de lipoproteínas de baja densidad (especificidad de unión anti-proteína 8 relacionada con el receptor de lipoproteínas de baja densidad).
El conjugado mencionado anteriormente, en el que la especificidad de unión que se une específicamente a una carga útil biotinilada es un par de un dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo y un dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo que comprende (a) una CDR1 de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 33, (b) una CDR2 de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 34, (c) una CDR3 de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 35, (d) una CDR1 de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 37, (e) una CDR2 de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 38, y (f) una CDR3 de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 39.
El conjugado mencionado anteriormente, en el que la especificidad de unión que se une específicamente a una carga útil biotinilada es una especificidad de unión humanizada.
El conjugado mencionado anteriormente, en el que la especificidad de unión que se une específicamente a una carga útil biotinilada comprende CDR como en cualquiera de los modos de realización anteriores y una región estructural humana aceptora (por ejemplo, una región estructural de inmunoglobulina humana o una región estructural consenso humana).
El conjugado mencionado anteriormente, en el que la especificidad de unión que se une específicamente a una carga útil biotinilada es un par de un dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo y un dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo que comprende (a) una CDR1 de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 41 o 57, (b) una CDR2 de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 42 o 58, (c) una CDR3 de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 43 o 59, (d) una CDR1 de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 45 o 61, (e) una CDR2 de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 46 o 62, y (f) una CDR3 de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 47 o 64.
El conjugado mencionado anteriormente, en el que la especificidad de unión que se une específicamente a una carga útil biotinilada es un par de un dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo y un dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo que comprende una secuencia de dominio variable de la cadena pesada (VH) que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 36 o 44 o 52 o 60.
El conjugado mencionado anteriormente, en el que una secuencia de VH que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad contiene sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservadoras), inserciones o deleciones en relación con la secuencia de referencia, pero un anticuerpo anti-biotina que comprenda esa secuencia retiene la capacidad de unirse a biotina.
El conjugado mencionado anteriormente, en el que se han sustituido, insertado y/o delecionado un total de 1 a 10 aminoácidos en la SEQ ID NO: 36 o 44 o 52 o 60. Opcionalmente, las sustituciones, inserciones o deleciones se producen en regiones fuera de las CDR (es decir, en las FR).
El conjugado mencionado anteriormente, en el que el anticuerpo anti-biotina comprende la secuencia de VH en la SEQ ID NO: 36 o 44 o 52 o 60, que incluye modificaciones postraduccionales de esa secuencia.
El conjugado mencionado anteriormente, en el que la especificidad de unión que se une específicamente a una carga útil biotinilada es un par de un dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo y un dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo que comprende además un dominio variable de la cadena ligera (VL) que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 40 o 48 o 56 o 64.
El conjugado mencionado anteriormente, en el que una secuencia de VL que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad contiene sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservadoras), inserciones o deleciones en relación con la secuencia de referencia, pero un anticuerpo anti-biotina que comprenda esa secuencia retiene la capacidad de unirse a biotina.
El conjugado mencionado anteriormente, en el que se han sustituido, insertado y/o delecionado un total de 1 a 10 aminoácidos en la SEQ ID NO: 40 o 48 o 56 o 64. Opcionalmente, las sustituciones, inserciones o deleciones se producen en regiones fuera de las CDR (es decir, en las FR).
El conjugado mencionado anteriormente, en el que el anticuerpo anti-biotina comprende la secuencia de VL en la SEQ ID NO: 40 o 48 o 56 o 64, que incluye modificaciones postraduccionales de esa secuencia.
El conjugado mencionado anteriormente, en el que el anticuerpo biespecífico comprende una primera especificidad de unión que se une específicamente a una carga útil teofilinilada (especificidad de unión anti-teofilina; especificidad de unión anti-TEO) y una segunda especificidad de unión que se une específicamente al receptor de transferrina (humano) (especificidad de unión anti-receptor de transferrina (humano); especificidad de unión anti-(h)TfR) o a la proteína 8 relacionada con el receptor de lipoproteínas de baja densidad (especificidad de unión anti-proteína 8 relacionada con el receptor de lipoproteínas de baja densidad; especificidad de unión anti-LRP8).
El conjugado mencionado anteriormente, en el que el anticuerpo biespecífico tiene dos especificidades de unión que se unen específicamente a la carga útil teofilinilada (dos especificidades de unión anti-teofilina) y dos especificidades de unión que se unen específicamente al receptor de transferrina (humano) (dos especificidades de unión anti-receptor de transferrina (humano)) o a la proteína 8 relacionada con el receptor de lipoproteínas de baja densidad (especificidad de unión anti-proteína 8 relacionada con el receptor de lipoproteínas de baja densidad).
El conjugado mencionado anteriormente, en el que la especificidad de unión que se une específicamente a una carga útil teofilinilada es un par de un dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo y un dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo que comprende (a) una CDR1 de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 65, (b) una CDR2 de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 66, (c) una CDR3 de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 67, (d) una CDR1 de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 69, (e) una CDR2 de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 70, y (f) una CDR3 de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 71.
El conjugado mencionado anteriormente, en el que la especificidad de unión que se une específicamente a una carga útil teofilinilada es una especificidad de unión humanizada.
El conjugado mencionado anteriormente, en el que la especificidad de unión que se une específicamente a una carga útil teofilinilada comprende CDR como en cualquiera de los modos de realización anteriores y una región estructural humana aceptora (por ejemplo, una región estructural de inmunoglobulina humana o una región estructural consenso humana).
El conjugado mencionado anteriormente, en el que la especificidad de unión que se une específicamente a una carga útil teofilinilada es un par de un dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo y un dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo que comprende (a) una CDR1 de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 73 o 89, (b) una CDR2 de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 74 o 90, (c) una CDR3 de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 75 o 91, (d) una CDR1 de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 77 o 93, (e) una CDR2 de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 78 o 94, y (f) una CDR3 de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 79 o 95.
El conjugado mencionado anteriormente, en el que la especificidad de unión que se une específicamente a una carga útil teofilinilada es un par de un dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo y un dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo que comprende una secuencia de dominio variable de la cadena pesada (VH) que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 68 o 76 o 84 o 92.
El conjugado mencionado anteriormente, en el que una secuencia de VH que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad contiene sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservadoras), inserciones o deleciones en relación con la secuencia de referencia, pero un anticuerpo anti-teofilina que comprenda esa secuencia retiene la capacidad de unirse a teofilina.
El conjugado mencionado anteriormente, en el que se han sustituido, insertado y/o delecionado un total de 1 a 10 aminoácidos en la SEQ ID NO: 68 o 76 o 84 o 92. Opcionalmente, las sustituciones, inserciones o deleciones se producen en regiones fuera de las CDR (es decir, en las FR).
El conjugado mencionado anteriormente, en el que el anticuerpo anti-teofilina comprende la secuencia de VH en la SEQ ID NO: 68 o 76 o 84 o 92, que incluye modificaciones postraduccionales de esa secuencia.
El conjugado mencionado anteriormente, en el que la especificidad de unión que se une específicamente a una carga útil teofilinilada es un par de un dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo y un dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo que comprende además un dominio variable de la cadena ligera (VL) que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 72 o 80 o 88 o 96.
El conjugado mencionado anteriormente, en el que una secuencia de VL que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad contiene sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservadoras), inserciones o deleciones en relación con la secuencia de referencia, pero un anticuerpo anti-teofilina que comprenda esa secuencia retiene la capacidad de unirse a teofilina.
El conjugado mencionado anteriormente, en el que se han sustituido, insertado y/o delecionado un total de 1 a 10 aminoácidos en la SEQ ID NO: 72 o 80 o 88 o 96. Opcionalmente, las sustituciones, inserciones o deleciones se producen en regiones fuera de las CDR (es decir, en las FR).
El conjugado mencionado anteriormente, en el que el anticuerpo anti-teofilina comprende la secuencia de VL en la SEQ ID NO: 72 o 80 o 88 o 96, que incluye modificaciones postraduccionales de esa secuencia.
El conjugado mencionado anteriormente, en el que el anticuerpo biespecífico comprende una primera especificidad de unión que se une específicamente a una carga útil fluoresceinilada (especificidad de unión anti-fluoresceína; especificidad de unión anti-FLUO) y una segunda especificidad de unión que se une específicamente al receptor de transferrina (humano) (especificidad de unión anti-receptor de transferrina (humano); especificidad de unión anti-(h)TfR) o a la proteína 8 relacionada con el receptor de lipoproteínas de baja densidad (especificidad de unión antiproteína 8 relacionada con el receptor de lipoproteínas de baja densidad; especificidad de unión anti-LRP8).
El conjugado mencionado anteriormente, en el que el anticuerpo biespecífico tiene dos especificidades de unión que se unen específicamente a la carga útil fluoresceinilada (dos especificidades de unión anti-fluoresceína) y dos especificidades de unión que se unen específicamente al receptor de transferrina (humano) (dos especificidades de unión anti-receptor de transferrina (humano)) o a la proteína 8 relacionada con el receptor de lipoproteínas de baja densidad (especificidad de unión anti-proteína 8 relacionada con el receptor de lipoproteínas de baja densidad).
El conjugado mencionado anteriormente, en el que la especificidad de unión que se une específicamente a una carga útil fluoresceinilada es un par de un dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo y un dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo que comprende (a) una CDR1 de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 97, (b) una CDR2 de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 98, (c) una CDR3 de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 99, (d) una CDR1 de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 101, (e) una CDR2 de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 102, y (f) una CDR3 de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 103.
El conjugado mencionado anteriormente, en el que la especificidad de unión que se une específicamente a una carga útil fluoresceinilada es una especificidad de unión humanizada.
El conjugado mencionado anteriormente, en el que la especificidad de unión que se une específicamente a una carga útil fluoresceinilada comprende CDR como en cualquiera de los modos de realización anteriores y una región estructural humana aceptora (por ejemplo, una región estructural de inmunoglobulina humana o una región estructural consenso humana).
El conjugado mencionado anteriormente, en el que la especificidad de unión que se une específicamente a una carga útil fluoresceinilada es un par de un dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo y un dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo que comprende (a) una CDR1 de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 105 o 113, (b) una CDR2 de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 106 o 114, (c) una CDR3 de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 107 o 115, (d) una CDR1 de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 109 o 117, (e) una CDR2 de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 110 o 118, y (f) una CDR3 de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 111 o 119.
El conjugado mencionado anteriormente, en el que la especificidad de unión que se une específicamente a una carga útil fluoresceinilada es un par de un dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo y un dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo que comprende una secuencia de dominio variable de la cadena pesada (VH) que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 75 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 108 o 116.
El conjugado mencionado anteriormente, en el que una secuencia de VH que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 75 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad contiene sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservadoras), inserciones o deleciones en relación con la secuencia de referencia, pero un anticuerpo antifluoresceína que comprenda esa secuencia retiene la capacidad de unirse a fluoresceína.
El conjugado mencionado anteriormente, en el que se han sustituido, insertado y/o delecionado un total de 1 a 10 aminoácidos en la SEQ ID NO: 108 o 116. Opcionalmente, las sustituciones, inserciones o deleciones se producen en regiones fuera de las CDR (es decir, en las FR).
El conjugado mencionado anteriormente, en el que el anticuerpo anti-fluoresceína comprende la secuencia de VH en la SEQ ID NO: 108 o 116, que incluye modificaciones postraduccionales de esa secuencia.
El conjugado mencionado anteriormente, en el que la especificidad de unión que se une específicamente a una carga útil fluoresceinilada es un par de un dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo y un dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo que comprende además un dominio variable de la cadena ligera (VL) que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 75 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 112 o 120.
El conjugado mencionado anteriormente, en el que una secuencia de VL que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 75 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad contiene sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservadoras), inserciones o deleciones en relación con la secuencia de referencia, pero un anticuerpo antifluoresceína que comprenda esa secuencia retiene la capacidad de unirse a fluoresceína.
El conjugado mencionado anteriormente, en el que se han sustituido, insertado y/o delecionado un total de 1 a 10 aminoácidos en la SEQ ID NO: 112 o 120. Opcionalmente, las sustituciones, inserciones o deleciones se producen en regiones fuera de las CDR (es decir, en las Fr ).
El conjugado mencionado anteriormente, en el que el anticuerpo anti-fluoresceína comprende la secuencia de VL en la SEQ ID NO: 112 o 120, que incluye modificaciones postraduccionales de esa secuencia.
El conjugado mencionado anteriormente, en el que la carga útil es un anticuerpo haptenilado o un fragmento de anticuerpo haptenilado de longitud completa.
El conjugado mencionado anteriormente, en el que la carga útil haptenilada es un anticuerpo anti-alfa sinucleína de longitud completa haptenilado.
El conjugado mencionado anteriormente, en el que la carga útil haptenilada es un fragmento de anticuerpo anti-alfa sinucleína haptenilado que se une específicamente a la alfa-sinucleína.
El conjugado mencionado anteriormente, en el que el hapteno es la biotina.
El conjugado mencionado anteriormente, en el que el anticuerpo comprende en el dominio variable de la cadena pesada las HVR de SEQ ID NO: 243 a 245 y en el dominio variable de la cadena ligera las HVR de SEQ ID NO: 246 a 248.
El conjugado mencionado anteriormente, en el que el anticuerpo comprende en el dominio variable de la cadena pesada las HVR de SEQ ID NO: 249, 250 y 245 y en el dominio variable de la cadena ligera las HVR de SEQ ID NO: 251 a 253.
El conjugado mencionado anteriormente, en el que el anticuerpo comprende un dominio variable de la cadena pesada que consiste en la SEQ ID NO: 254 y un dominio variable de la cadena ligera que consiste en la SEQ ID NO: 255.
El conjugado mencionado anteriormente, en el que el anticuerpo se ha obtenido humanizando un anticuerpo que comprende un dominio variable de la cadena pesada que consiste en la SEQ ID NO: 254 y un dominio variable de la cadena ligera que consiste en la SEQ ID NO: 255.
El conjugado mencionado anteriormente, en el que el anticuerpo es un anticuerpo humanizado y comprende en el dominio variable de la cadena pesada las HVR de SEQ ID NO: 243 a 245 y en el dominio variable de la cadena ligera las HVR de SEQ ID NO: 246 a 248, en el que en cada HVR se pueden cambiar hasta 3 residuos de aminoácidos. El conjugado mencionado anteriormente, en el que el anticuerpo es un anticuerpo humanizado y comprende en el dominio variable de la cadena pesada las HVR de SEQ ID NO: 249, 250 y 245 y en el dominio variable de la cadena ligera las HVR de SEQ ID NO: 251 a 253, en el que en cada HVR se pueden cambiar hasta 3 residuos de aminoácidos. El conjugado mencionado anteriormente, en el que el anticuerpo es un anticuerpo humanizado y el dominio variable de la cadena pesada se deriva de un dominio variable de la cadena pesada que consiste en la SEQ ID NO: 254 y un dominio variable de la cadena ligera se deriva de un dominio variable de la cadena ligera que consiste en la SEQ ID NO: 255.
El conjugado mencionado anteriormente, en el que el anticuerpo se une al mismo epítopo como un anticuerpo que comprende en la cadena pesada las HVR de SEQ ID NO: 256 a 258 y en la cadena ligera las HVR de SEQ ID NO: 259 a 261.
El conjugado mencionado anteriormente, en el que el anticuerpo se une al mismo epítopo como un anticuerpo que comprende en la cadena pesada las HVR de SEQ ID NO: 262, 263 y 258 y en la cadena ligera las HVR de Se Q ID NO: 264 a 266.
El conjugado mencionado anteriormente, en el que el anticuerpo comprende un dominio variable de la cadena pesada que consiste en la SEQ ID NO: 267 y un dominio variable de la cadena ligera que consiste en la SEQ ID NO: 268. El conjugado mencionado anteriormente, en el que el anticuerpo se ha obtenido humanizando un anticuerpo que comprende un dominio variable de la cadena pesada que consiste en la SEQ ID NO: 267 y un dominio variable de la cadena ligera que consiste en la SEQ ID NO: 268.
El conjugado mencionado anteriormente, en el que el anticuerpo es un anticuerpo humanizado y comprende en el dominio variable de la cadena pesada las HVR de SEQ ID NO: 256 a 258 y en el dominio variable de la cadena ligera las HVR de SEQ ID NO: 259 a 261, en el que en cada HVR se pueden cambiar hasta 3 residuos de aminoácidos. El conjugado mencionado anteriormente, en el que el anticuerpo es un anticuerpo humanizado y comprende en el dominio variable de la cadena pesada las HVR de SEQ ID NO: 262, 263 y 258 y en el dominio variable de la cadena ligera las HVR de SEQ ID NO: 264 a 266, en el que en cada HVR se pueden cambiar hasta 3 residuos de aminoácidos. El conjugado mencionado anteriormente, en el que el anticuerpo es un anticuerpo humanizado y el dominio variable de la cadena pesada se deriva de un dominio variable de la cadena pesada que consiste en la SEQ ID NO: 267 y un dominio variable de la cadena ligera se deriva de un dominio variable de la cadena ligera que consiste en la SEQ ID NO: 268.
El conjugado mencionado anteriormente, en el que el anticuerpo se une al mismo epítopo como un anticuerpo que comprende en la cadena pesada las HVR de SEQ ID NO: 269 a 271 y en la cadena ligera las HVR de SEQ ID NO: 272 a 274.
El conjugado mencionado anteriormente, en el que el anticuerpo se une al mismo epítopo como un anticuerpo que comprende en la cadena pesada las HVR de SEQ ID NO: 269, 275 y 271 y en la cadena ligera las HVR de Se Q ID NO: 276 a 278.
El conjugado mencionado anteriormente, en el que el anticuerpo comprende un dominio variable de la cadena pesada que consiste en la SEQ ID NO: 279 y un dominio variable de la cadena ligera que consiste en la SEQ ID NO: 280. El conjugado mencionado anteriormente, en el que el anticuerpo se ha obtenido humanizando un anticuerpo que comprende un dominio variable de la cadena pesada que consiste en la SEQ ID NO: 279 y un dominio variable de la cadena ligera que consiste en la SEQ ID NO: 280.
El conjugado mencionado anteriormente, en el que el anticuerpo es un anticuerpo humanizado y comprende en el dominio variable de la cadena pesada las HVR de SEQ ID NO: 269 a 271 y en el dominio variable de la cadena ligera las HVR de SEQ ID NO: 272 a 274, en el que en cada HVR se pueden cambiar hasta 3 residuos de aminoácidos. El conjugado mencionado anteriormente, en el que el anticuerpo es un anticuerpo humanizado y comprende en el dominio variable de la cadena pesada las HVR de SEQ ID NO: 269, 275 y 271 y en el dominio variable de la cadena ligera las HVR de SEQ ID NO: 276 a 278, en el que en cada HVR se pueden cambiar hasta 3 residuos de aminoácidos. El conjugado mencionado anteriormente, en el que el anticuerpo es un anticuerpo humanizado y el dominio variable de la cadena pesada se deriva de un dominio variable de la cadena pesada que consiste en la SEQ ID NO: 279 y un dominio variable de la cadena ligera se deriva de un dominio variable de la cadena ligera que consiste en la SEQ ID NO: 280.
El conjugado mencionado anteriormente, en el que la carga útil haptenilada es un anticuerpo anti-tau(pS422) humano de longitud completa haptenilado.
El conjugado mencionado anteriormente, en el que la carga útil haptenilada es un fragmento de anticuerpo antitau(pS422) humano haptenilado que se une específicamente a la tau humana fosforilada en la serina en la posición 422.
El conjugado mencionado anteriormente, en el que el hapteno es la biotina.
El conjugado mencionado anteriormente, en el que el anticuerpo anti-tau(pS422) humano comprende
a) en el dominio variable de la cadena pesada, las HVR de SEQ ID NO: 230, 239 y 232, o
b) en el dominio variable de la cadena pesada, las HVR de SEQ ID NO: 230, 231 y 232.
El conjugado mencionado anteriormente, en el que el anticuerpo comprende además
a) en el dominio variable de la cadena ligera, las HVR de SEQ ID NO: 234, 235 y 236, o
b) en el dominio variable de la cadena ligera, las HVR de SEQ ID NO: 233, 229 y 236.
El conjugado mencionado anteriormente, en el que el anticuerpo comprende
a) en el dominio variable de la cadena pesada, las HVR de SEQ ID NO: 230, 239 y 232, y en el dominio variable de la cadena ligera, las HVR de SEQ ID NO: 234, 235 y 236, o
b) en el dominio variable de la cadena pesada, las HVR de SEQ ID NO: 230, 231 y 232, y en el dominio variable de la cadena ligera, las HVR de SEQ ID NO: 233, 229 y 236, o
c) en el dominio variable de la cadena pesada, las HVR de SEQ ID NO: 230, 231 y 232, y en el dominio variable de la cadena ligera, las HVR de SEQ ID NO: 234, 235 y 236.
El conjugado mencionado anteriormente, en el que el anticuerpo comprende
a) un dominio variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 241 y un dominio variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 238, o
b) un dominio variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 240 y un dominio variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 237, o
c) un dominio variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 240 y un dominio variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 238, o
d) un dominio variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 242 y un dominio variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 238.
El conjugado mencionado anteriormente, en el que la carga útil haptenilada es un anticuerpo anti-Abeta de longitud completa haptenilado.
El conjugado mencionado anteriormente, en el que la carga útil haptenilada es un fragmento de anticuerpo anti-Abeta haptenilado que se une específicamente a Abeta humana.
El conjugado mencionado anteriormente, en el que el hapteno es la biotina.
El conjugado mencionado anteriormente, en el que el anticuerpo anti-Abeta comprende en el dominio variable de la cadena pesada las HVR de SEQ ID NO: 281, 282 y 283.
El conjugado mencionado anteriormente, en el que el anticuerpo comprende además en el dominio variable de la cadena ligera las HVR de SEQ ID NO: 284, 285 y 286.
El conjugado mencionado anteriormente, en el que el anticuerpo comprende en el dominio variable de la cadena pesada las HVR de SEQ ID NO: 281, 282 y 283 y en el dominio variable de la cadena ligera las HVR de SEQ ID NO: 284, 285 y 286.
El conjugado mencionado anteriormente, en el que el anticuerpo comprende
a) un dominio variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 287 y un dominio variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 290, o
b) un dominio variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 288 y un dominio variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 291, o
c) un dominio variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 289 y un dominio variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 292.
Además, se describe una formulación farmacéutica que comprende el conjugado mencionado anteriormente y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Además, el conjugado mencionado anteriormente se describe en el presente documento para su uso como medicamento.
El uso del conjugado mencionado anteriormente en el tratamiento de una enfermedad se describe en el presente documento, en el que la enfermedad es cáncer o un trastorno neurológico.
Dicho trastorno neurológico se selecciona de la enfermedad de Alzheimer (EA) (que incluye, pero no se limita a, deterioro cognitivo leve y EA prodrómica), apoplejía, demencia, distrofia muscular (DM), esclerosis múltiple (EM), esclerosis lateral amiotrófica (ELA), fibrosis quística, síndrome de Angelman, síndrome de Liddle, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Pick, enfermedad de Paget, cáncer (por ejemplo, cáncer que afecta al SNC o al cerebro) y lesión cerebral traumática.
Descripción de las figuras
Figura 1: Procedimiento de digoxigenilación (conjugación de digoxigenina a) de péptidos (figura 1A). Ejemplos de un marcador digoxigenilado (fluoróforo Dig-Cy5; figura 1B) y de un polipéptido digoxigenilado (derivado de PYY (DIG-PYY); figura 1C).
Figura 2: Esquema de un complejo de un anticuerpo anti-digoxigenina bivalente monoespecífico y un conjugado de digoxigenina-Cy5 (figura 2A) y de un complejo de un anticuerpo anti-digoxigenina bivalente monoespecífico y un conjugado de digoxigenina-polipéptido (figura 2B). Esquema de un complejo de un anticuerpo anti-digoxigenina tetravalente biespecífico y un conjugado de digoxigenina-polipéptido (figura 2C).
Figura 3: Cromatograma de exclusión por tamaño (registrado a 280 nm) de un complejo que comprende un anticuerpo anti-digoxigenina y digoxigenina que se conjuga con un péptido (DIG-PYY) que muestra un solo pico de un complejo de tamaño definido.
Figura 4: A: Modelo estructural de un Fab anti-digoxigenina (izquierda) que muestra que la digoxigenina (circulada) se captura en un bolsillo profundo que está formado por las CDR de las regiones de VH y VL. B: Modelo estructural de un Fab anti-biotina (derecha) que muestra que la biocitinamida (circulada) se captura en un bolsillo profundo que está formado por las CDR de las regiones de VH y VL.
Figura 5: Comparación de la unión de anticuerpos anti-biotina humanizados recombinantes con y sin la mutación VH53C introducida. Las propiedades de unión se analizaron mediante tecnología de resonancia de plasmón superficial (RPS) usando un instrumento BIAcore T100 o BIAcore 3000, a) anticuerpo anti-biotina humanizado. Unión de ARNip biotinilado a anticuerpo anti-biotina humanizado, KD = 624 pM; b) anticuerpo anti-biotina con mutación de Cys53 humanizado. Unión de ARNip biotinilado, KD = 643 pM; concentraciones de ARNip: 0,14, 0,41, 1,23, 3,70, 11,1, 33,3 y 100 nM; concentración de anticuerpos anti-biotina: 2nM; chip de sensor CM3; unión del anticuerpo por medio del anticuerpo Fc anti-IgG humana
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Figura 6: La introducción de funcionalidades SH en el hapteno así como en el anticuerpo en posiciones apropiadas permite que el anticuerpo y el hapteno formen un enlace covalente que da como resultado un conjugado.
Figura 7: Esquema del patrón de bandas de autofluorescencia de SDS-PAGE (sin tinción adicional del gel de SDS-PAGE):
A: Si no se forma un enlace covalente entre el anticuerpo y el conjugado hapteno-fluoróforo, tanto en condiciones reductoras como no reductoras, se puede detectar una banda autofluorescente al peso molecular del conjugado hapteno-fluoróforo libre.
B: Si se forma un enlace covalente entre el anticuerpo y el conjugado hapteno-fluoróforo en condiciones no reductoras, se puede detectar una banda autofluorescente al peso molecular combinado del anticuerpo y el conjugado hapteno-fluoróforo. En condiciones reductoras, los puentes disulfuro en el conjugado del anticuerpo y el conjugado hapteno-fluoróforo (compuesto haptenilado) se escinden y se puede detectar una banda autofluorescente al peso molecular del conjugado hapteno-fluoróforo libre.
Figura 8: Formación de conjugados de anticuerpos con mutación de Cys de unión a hapteno con conjugados de marcador fluorescente de hapteno-Cys (compuesto haptenilado) en presencia de agentes activos redox: agente de oxidación (disulfuro de glutatión, GSSG) y agente reductor (ditioeritritol, DTE): La complejación de anticuerpos y el enlace covalente posterior en posiciones definidas se detecta mediante señales de fluorescencia en análisis de SDS PAGE. Se realizaron análisis de SDS-PAGE no reductores (imágenes superiores) y reductores (imágenes inferiores) como se describe en el ejemplo 11. Los haptenos unidos covalentemente a anticuerpos son detectables como señales unidas a proteínas de mayor tamaño en las posiciones apropiadas en condiciones no reducidas. Estas señales se desprenden de la proteína tras la reducción y son visibles como pequeñas entidades en condiciones reductoras.
Izquierda: imagen de fluorescencia
Derecha: tinción con azul de Coomassie
Serie 1: anticuerpo anti-digoxigenina con mutación de 52bC
Serie 2: anticuerpo anti-digoxigenina con residuo natural en la posición 52b
(A) acoplamiento covalente con DTE 3 mM y GSSG 10 mM;
(B) acoplamiento covalente con DTE 0,3 mM y GSSG 1 mM;
(C) acoplamiento covalente con DTE 0,03 mM y GSSG 0,1 mM.
Figura 9: Formación de complejos de anticuerpos con mutación de Cys de unión a hapteno con conjugados de marcador fluorescente de hapteno-Cys en presencia únicamente de un agente de oxidación (disulfuro de glutatión, GSSG) pero en ausencia de agentes reductores o en ausencia de ambos: La complejación de anticuerpos y el enlace covalente posterior en posiciones definidas se detecta mediante señales de fluorescencia en análisis de SDS PAGE. Se realizaron análisis de SDS-PAGE no reductores (imágenes superiores) y reductores (imágenes inferiores) como se describe en el ejemplo 12. Los haptenos unidos covalentemente a anticuerpos son detectables como señales unidas a proteínas de mayor tamaño en las posiciones apropiadas en condiciones no reducidas. Estas señales se desprenden de la proteína tras la reducción y son visibles como pequeñas entidades en condiciones reductoras.
Izquierda: imagen de fluorescencia
Derecha: tinción con azul de Coomassie
Serie 1: anticuerpo anti-digoxigenina con mutación de 52bC
Serie 2: anticuerpo anti-digoxigenina con residuo natural en la posición 52b
(A) sin aditivos
(B) acoplamiento covalente con GSSG 1 mM;
(C) acoplamiento covalente con GSSG 0,1 mM.
Figura 10: Estructura de Ac-PYY(PEG3-Cys-4Abu-NH2).
Figura 11: Estructura de DIG-3-cme-eda-Cy5.
Figura 12: Estructura de DIG-maleimida-Cy5.
Figura 13: Estructura de DIG-eda-Cys-Cy5.
Figura 14: Estructura de DIG-Ahx-Cys-Cy5.
Figura 15: Estructura de DIG-Cys-MR121.
Figura 16: Estructura de Ac-PYY(PEG3-Dig).
Figura 17: Estructura de Ac-PYY(PEG3-Cys-4Abu-Dig).
Figura 18: Estructura de PEG3-PYY(PEG3-Cys-4Abu-Dig).
Figura 19: Estructura de Dy636-eda-Btn.
Figura 20: Estructura de Dy636-Ser-Btn.
Figura 21: Estructura de Dy636-Cys-Btn.
Figura 22: Estructura de Cy5-Cys-Btn.
Figura 23: Estructura de Cy5-Ser-Btn.
Figura 24: Estructura de Ac-PYY(PEG2-Btn).
Figura 25: Estructura de Ac-PYY-PEG3-Cys-p-Ala-Btn).
Figura 26: Estructura de Ac-PYY-PEG3-Ser-PEG2-Btn).
Figura 27: Estructura de Ac-PYY-PEG3-Cys-PEG2-Btn.
Figura 28: Estructura de Ac-PYY(PEG3-Cys-4-Abu-5-Fluo).
Figura 29: Estructura de Ac-PYY(PEG3-Cys-PEG2-5-Fluo).
Figura 30: Esquema para la generación de Ac-PYY(PEG2-Btn).
Figura 31: Esquema para la generación de Ac-PYY(PEG3-Cys-p-Ala-Btn).
Figura 32: Esquema para la generación de Ac-PYY(PEG3-Cys-4-Abu-Dig).
Figura 33: Estructura de rayos X de anticuerpo anti-biotina murino en complejo con biocitinamida. Los residuos de aminoácidos que interactúan con la biocitinamida se muestran en una representación ramificada. Figura 34: Resultados del estudio farmacocinético en sangre in vivo con conjugados covalentes y complejos no covalentes en comparación con antígeno/hapteno no acomplejados; se muestra la intensidad de fluorescencia relativa restante (%, marcas continuas) de la fluorescencia mediada por Cy5 de los complejos no covalentes de biotina-Cy5 (figura 34A) y conjugados covalentes (puente disulfuro) (figura 35B), así como de biotina-Ser-Cy5 no complejada (asterisco); la señal de fluorescencia en el punto de tiempo t = 0,08 h se estableció en 100 %; adicionalmente, se muestra la cantidad relativa restante de IgG humana en las muestras de suero de ratón (marcas discontinuas); la concentración sérica de IgG (mg/ml) en t = 0,08 h se estableció en 100 %.
Figura 35: Inmunoelectrotransferencia de la determinación de la cantidad de polipéptido PYY digoxigenilado en el suero de ratones.
Figura 36: Análisis de complejación accionada por afinidad de compuestos haptenilados con anticuerpos antihapteno.
La complejación de anticuerpos y el enlace covalente posterior en posiciones definidas se dirigen mediante señales de fluorescencia en análisis de SDS PAGE, que se llevaron a cabo como se describe en el ejemplo 20.
Izquierda: imagen fluorescente con muestras no reducidas (lado izquierdo del gel) y reducidas (lado derecho del gel).
Derecha: tinción con azul de Coomassie.
1: anticuerpo anti-digoxigenina humanizado biotina-Cys-Cy5
2: anticuerpo anti-digoxigenina humanizado VH52bC biotina-Cys-Cy5
3: anticuerpo anti-biotina humanizado biotina-Cys-Cy5
4: anticuerpo anti-biotina humanizado VH53C biotina-Cys-Cy5
Las flechas blancas marcan el exceso (desacoplado) de biotina-Cys-Cy5, que es significativamente mayor cuando se usa el anticuerpo anti-digoxigenina VH52bC, porque la reacción de conjugación no es accionada por afinidad en este caso.
Figura 37: Posiciones de cisteína y patrones disulfuro dentro de la región Fab, necesarios para formar un anticuerpo de unión a Dig con cisteína adicional en la posición 52b para el acoplamiento de carga útil covalente dirigido, dirigido al sitio y mediado por hapteno. (A) Cisteínas y patrón disulfuro en los dominios de VH y CH1, y en los dominios de VL y CL que se requieren para formar fragmentos Fab funcionales. (B) Cisteínas y patrón disulfuro en los dominios de VH y CH1, y en los dominios de VL y CL que se requieren para formar fragmentos Fab funcionales con cisteína adicional en la posición 52b para el acoplamiento de carga útil covalente dirigido, dirigido al sitio y mediado por hapteno. (C y D) Potencial para formar enlaces disulfuro incorrectos dentro del dominio de VH de la variante de VH52b que daría como resultado anticuerpos no funcionales mal plegados. E) Ejemplo de un enlace disulfuro interdominio incorrecto potencial dentro de la región Fv de la variante de VH52b, que daría como resultado anticuerpos no funcionales mal plegados.
Figura 38: Posiciones de cisteína y patrones disulfuro requeridos para formar un Fv monocatenario estabilizado con disulfuro de unión a Dig con cisteína adicional en la posición 52b para el acoplamiento de carga útil covalente dirigido, dirigido al sitio mediado por hapteno. (A) Cisteínas en los dominios de VH y VL que se requieren para formar scFv funcionales, dsscFv y dsscFv con mutación de 52b. (B) patrón correcto de enlaces disulfuro que se deben formar para generar scFv funcionales, dsscFv y dsscFv con mutación de 52b. (C) Potencial para formar enlaces disulfuro incorrectos que darían como resultado scFv no funcionales mal plegados. (D) Potencial para formar enlaces disulfuro incorrectos que darían como resultado dsscFv no funcionales mal plegados. (E) Potencial para formar enlaces disulfuro incorrectos que darían como resultado dsscFv no funcionales mal plegados con mutación de 52b.
Figura 39: Composición de un derivado de anticuerpo biespecífico de LeY-Dig como vehículo de liberación para cargas útiles acopladas de forma covalente.
Figura 40: Expresión y purificación de derivados de anticuerpos anti-hapteno biespecíficos para el suministro dirigido de cargas útiles acopladas de forma covalente.
(A) Para los análisis de inmunoelectrotransferencia, los sobrenadantes de cultivo celular se sometieron a SDS PAGE (NuPAGE 4-12 % Bis-Tris Gel (1,0 mm x 12 pocillos) (Invitrogen; n.° de cat. NP0322) y las proteínas se transfirieron posteriormente a las membranas de transferencia de Immobilon (Immobilon-P) (Millipore; n.° de cat. IPVH07850), PVDF con tamaño de poro: 0,45 pm. Los derivados de anticuerpos se detectaron mediante el anticuerpo anti-cadena ligera de Kappa humana)-fosfatasa alcalina producido en cabra, (purificado por afinidad), Sigma (n.° de cat. A3813) a una dilución de 1:1000 y el anticuerpo anti-IgG humana (específico de Fc)-fosfatasa alcalina producido en cabra, Sigma (n.° de cat. A9544) a una dilución de 1:1000. El sustrato BCIP/NBT-sustrato de líquido azul (Sigma, n.° de cat. B3804) se aplicó para el desarrollo de la inmunoelectrotransferencia. Carril 1: marcador de peso molecular; Carriles 2 y 3: anticuerpo de control con cadena pesada no modificada; Carril 4: anticuerpo biespecífico de LeY-Dig(52bC) con cadena H extendida.
(B) Los análisis de SDS-PAGE (NuPAGE 4-12 % Bis-Tris Gel [Invitrogen] y la tinción posterior con azul brillante de Coomassie demuestran la pureza de las preparaciones de proteínas y visualizan las cadenas polipeptídicas relacionadas con la IgG con los tamaños moleculares aparentes que corresponden a sus pesos moleculares calculados. Carril 1: marcador de peso molecular; Carril 2: anticuerpo biespecífico de LeY-Dig(52bC) con cadena H extendida reducida; Carril 3: anticuerpo biespecífico de LeY-Dig(52bC) con cadena pesada extendida no reducida;
(C) La cromatografía de exclusión por tamaño (Superdex 200) demuestra homogeneidad y falta de agregados en las preparaciones de proteínas del derivado de anticuerpo biespecífico de LeY-Dig(52bC) después de la purificación de la proteína A.
Figura 41: Resultados del estudio farmacocinético en sangre in vivo con conjugados covalentes y complejos no covalentes en comparación con el compuesto de hapteno no complejado Dig-Cy5; se muestra la intensidad de fluorescencia restante relativa (%) de los complejos no covalentes Dig-Cy5 (panel superior), conjugados covalentes Dig-Cys-Cy5 (puente disulfuro) (panel inferior), así como de Dig-Cy5 no complejados (triángulos grises); la señal de fluorescencia en el punto de tiempo t = 0,08 h se estableció en 100 %; adicionalmente, se muestra la cantidad restante relativa de IgG humana en las muestras de suero de ratón; la concentración sérica de IgG (mg/ml) en t = 0,08 h se estableció en 100 %.
Figura 42: La farmacocinética in vivo de la fluorescencia de Cy5 se determinó mediante formación de imágenes oculares no invasivas después de la inyección de complejos no covalentes o de conjugados covalentes (con puentes disulfuro) que contienen biotina-Cy5 o biotina-Cys-Cy5, respectivamente, o de biotina-Cy5 no complejada; rombo continuo: biotina-Cy5; cuadrado continuo: complejo de anticuerpo anti-biotina biotina-Cy5; triángulo: conjugado de anticuerpo anti-biotina biotina-Cy5.
Figura 43: a) Composición, estructura y peso molecular de teofilina-Cys-Cy5; b) La cromatografía de exclusión por tamaño demuestra la pureza y homogeneidad de las variantes de anticuerpos de unión a teofilina purificadas; el pico # 2 muestra el producto purificado, la falta del pico # 1 indica que dichas preparaciones están libres de agregados; c) formación de complejos covalentes entre anticuerpos de unión a teofilina y teofilina-Cys-Cy5 como se demuestra por SDS PAGE no reductor (carriles izquierdos) y reductor (carriles derechos); Cy5 aparece acoplado a la cadena H en condiciones no reductoras solo en muestras que contienen teofilina-Cys-Cy5 y anticuerpo con mutación de Cys; estos conjugados covalentes se desintegran tras la reducción (carriles derechos); Carriles 1: marcador de peso molecular; 2-4 no reductor -2: anticuerpo anti-teofilina (sin mutación de Cys) teofilina-Cys-Cy5 (complejo); 3: anticuerpo anti-teofilina-cys_55 teofilina-Cys-Cy5 (conjugado); 4: anticuerpo anti-teofilina-cys_54 teofilina-Cys-Cy5 (conjugado); 5-7 reductor - 5: anticuerpo antiteofilina (sin mutación de Cys) teofilina-Cys-Cy5 (complejo); 6: anticuerpo anti-teofilina - cys_55 teofilina-Cys-Cy5 (conjugado); 7: anticuerpo anti-teofilina-cys_54 teofilina-Cys-Cy5 (conjugado).
Figura 44: La formación de complejos covalentes entre anticuerpos de unión a biotina y biotina-Cys-Cy5 se demuestra mediante SDS PAGE no reductor y reductor; la reacción de acoplamiento se realizó en suero murino a 37 °C durante 1 hora. Cy5 aparece acoplado a la cadena H en condiciones no reductoras solo en muestras que contenían biotina-Cys-Cy5 y anticuerpo con mutación de Cys; estos conjugados covalentes se desintegran tras la reducción (carriles derechos); carriles 1: marcador de peso molecular; 2-3 no reductor - 2: anticuerpo anti-biotina (sin mutación de Cys) biotina-Cys-Cy5 (complejo); 3: anticuerpo anti-biotina-Cys biotina-Cys-Cy5 (conjugado); 4-5 reductor - 5: anticuerpo anti-biotina (sin mutación de Cys) biotina-Cys-Cy5 (complejo); 6: anticuerpo anti-biotina-Cys biotina-Cys-Cy5 (conjugado).
Figura 45: La farmacocinética in vivo de la fluorescencia de Cy5 se determinó mediante formación de imágenes oculares no invasivas después de la inyección de anticuerpos formadores de complejos no covalentes o de anticuerpos formadores de conjugados covalentes (con puentes disulfuro), seguido de la inyección de biotina-Cy5; rombo continuo: solo biotina-Cy5 administrada, círculo continuo: biotina-Cy5 administrada 24 horas después de la administración del anticuerpo anti-biotina (formación del complejo in vivo); cuadrado continuo: biotina-Cys-Cy5 administrada 24 horas después de la administración del anticuerpo anti-biotina-Cys (formación de conjugado in vivo).
Figura 46: La estructura de la proteína del fragmento Fab del anticuerpo anti-biotina murino se determinó en un complejo con biocitinamida: el hapteno complejado se sitúa muy cerca de un grupo de aminoácidos cargado negativamente; la biotina que, como hapteno, se deriva para el acoplamiento de la carga útil en su grupo carboxilo, se une con buena eficacia ya que no hay repulsión de carga en esta posición (debido a la falta del grupo COOH); por el contrario, la biotina libre (normal) no se puede unir eficazmente al anticuerpo porque su grupo carboxilo estaría muy cerca de este grupo de carga negativa y, por lo tanto, es rechazado.
Figura 47: Esquema de composición del módulo lanzadera a través de la barrera hematoencefálica.
Figura 48: Perfiles de SEC y SDS PAGE de módulos lanzadera a través de la barrera hematoencefálica producidos en el ejemplo 27.
Figura 49: Resultados del análisis FACS, usando células hCMEC/D3 como línea celular derivada de BHE que expresa TfR y Dig-Cy5 como carga útil fluorescente.
Figura 50: Transcitosis y liberación de células endoteliales de módulos lanzadera a través de la barrera hematoencefálica de anticuerpos biespecíficos de unión a haptenos; A: ensayo de transwell de anticuerpo anti-CD33-dig, ELISA de huFc; B: ensayo de transwell de anticuerpo anti-TfR1, ELISA de huFc; C: ensayo de transwell de anticuerpo anti-TfR1-Dig, ELISA de huFc; D: ensayo de transwell de anticuerpo anti-TfR2, ELISA de huFc; E: ensayo de transwell de anticuerpo anti-TfR2-Dig, ELISA de huFc.
Figura 51: A: composición y cuantificación de complejos no covalentes de carga útil haptenilada de anticuerpos biespecíficos; B: transcitosis y liberación de células endoteliales de cargas útiles hapteniladas usando anticuerpos biespecíficos con afinidad reducida por TfR (A: ensayo de transwell anti-CD33-Dig+Dig-ADN, qPCR; B: ensayo de transwell anti-CD33-Bio+Bio-ADN, qPCR; C: ensayo de transwell anti-TfR2-Dig+Dig-ADN, qPCR; D: ensayo de transwell anti-TfR2-Bio+Bio-ADN, qPCR).
Figura 52: Transcitosis y liberación de células endoteliales de cargas útiles hapteniladas aplicando módulos lanzadera a través de la barrera hematoencefálica no liberables con alta afinidad por TfR; A: ensayo de transwell anti-TrF1-Dig+Dig-ADN, qPCR; B: ensayo de transwell de anticuerpo anti-TfR1-Bio+Bio-ADN, qPCR).
Figura 53: Unión, absorción y separación intracelular de cargas útiles hapteniladas de módulos lanzadera a través de la barrera hematoencefálica no liberables con alta afinidad por TfR; se muestra la separación subcelular de cargas útiles fluorescentes hapteniladas complejadas con anticuerpos biespecíficos en células hCMEC/D3 después de tres horas de incubación a 37 °C. DIG-ADN-CY5 o Bio-ADN-Cy5 (gris oscuro) aparecen en vesículas intracelulares nítidas que no se superponen con el anticuerpo biespecífico internalizado de unión anti-digoxigenina o anti-biotina (gris medio).
Figura 54: El gel de SDS PAGE del acoplamiento del anticuerpo 0155 con la variante con cisteína 2 de la secuencia de aminoácidos del motivo helicar usando un exceso 2,5 molar del compuesto que contiene la secuencia de aminoácidos de motivo helicar forma el complejo covalente 0156; 1 = variante con cisteína 2 de la secuencia de aminoácidos del motivo helicar; 2 = anticuerpo 0019; 3 = anticuerpo 0155.
Figura 55: Gel de SDS PAGE del acoplamiento del anticuerpo 0157 con la variante con cisteína 1 de la secuencia de aminoácidos del motivo helicar; 1 = variante con cisteína 1 de la secuencia de aminoácidos del motivo helicar (oxidada); 2 = acoplamiento de control (oxidado); 3 = conjugado covalente (oxidado); 4 = marcador de peso molecular; 5 = conjugado covalente (reducido); 6 = acoplamiento de control (reducido); 7 = variante con cisteína 1 de la secuencia de aminoácidos del motivo helicar (reducida).
Figura 56: Cromatograma SEC del anticuerpo 0155, la molécula de exotoxina de pseudomonas LR8M que contiene la variante con cisteína 1 de la secuencia de aminoácidos del motivo helicar con el residuo de lisina C terminal delecionado de SEQ ID NO: 28 y el conjugado covalente del mismo.
Figura 57: Análisis de la eficacia de la conjugación por SDS-CE, Caliper, para las muestras no reducidas.
Figura 58: A: El análisis por SEC-MALLS se realizó para identificar y caracterizar complejos de anticuerpos biespecíficos anti-TfR/BrdU con ADN marcado con BrdU, así como anticuerpo biespecífico libre y BrdU-ADN libre. Los complejos eluyen de la columna a un peso molecular de 244,9 kDa, el anticuerpo biespecífico libre se detecta a un peso molecular de 215,4 kDa y el BrdU-ADN libre se detecta a un peso molecular de 16,4 kDa.
B: El análisis por SEC-MALLS se realizó para identificar y caracterizar complejos de anticuerpos biespecíficos anti-TfR/BrdU con ADN marcado con BrdU, así como anticuerpo biespecífico libre y BrdU-ADN libre. Los complejos muestran un radio hidrodinámico de 6,8 nm, mientras que el anticuerpo biespecífico libre muestra un radio hidrodinámico de 6,2 nm.
Figura 59: A: El análisis por SEC-MALLS se realizó para identificar y caracterizar complejos de anticuerpos biespecíficos anti-TfR/biotina con anticuerpo anti-ptau marcado con biotina, así como anticuerpo biespecífico libre y anticuerpo anti-ptau libre marcado con biotina. Los complejos muestran un radio hidrodinámico de 8,0 nm, mientras que el anticuerpo biespecífico libre muestra un radio hidrodinámico de 6,2 nm y el anticuerpo anti-ptau marcado con biotina libre muestra un radio hidrodinámico de 5,5 nm.
B: El análisis por SEC-MALLS se realizó para identificar y caracterizar complejos de anticuerpos biespecíficos anti-TfR/biotina con anticuerpo anti-ptau marcado con biotina, así como anticuerpo biespecífico libre y anticuerpo anti-ptau libre marcado con biotina. Los complejos eluyen de la columna a un peso molecular de 501 kDa, el anticuerpo biespecífico libre se detecta a un peso molecular de 205 kDa y el anticuerpo anti-ptau marcado con biotina libre se detecta a un peso molecular de 150 kDa.
C: No se forman complejos si se usa la combinación incorrecta de hapteno y anticuerpo anti-hapteno.
Figura 60: Los complejos de anticuerpo anti-ptau marcado con biotina y anticuerpo biespecífico anti-CD33/biotina (panel superior izquierdo) y anticuerpo anti-ptau marcado con biotina libre (panel superior derecho) no se endocitan eficazmente (lisado celular, línea) y no se transportan al compartimiento basolateral (columna izquierda, gris claro) o al compartimiento apical (columna derecha, negro) (carga de 3,8 pg/ml).
La complejación del anticuerpo anti-ptau marcado con biotina con el anticuerpo biespecífico anti-TfR/biotina 1 (panel inferior izquierdo) o el anticuerpo biespecífico anti-TfR/biotina 2 (panel inferior derecho) media la endocitosis eficaz (lisado celular, línea) y el transporte posterior del anticuerpo anti-ptau marcado con biotina al compartimento basolateral (columna izquierda, gris claro), así como nuevamente al compartimento apical (columna derecha, negro) (carga de 3,8 pg/ml).
Figura 61: Ensayo de Transwell de transcitosis y liberación a partir de células endoteliales de cargas útiles hapteniladas y de módulos lanzadera de la barrera hematoencefálica de anticuerpos biespecíficos de unión a hapteno; usando anticuerpos biespecíficos con afinidad reducida hacia TfR (TfR2) y anticuerpos biespecíficos de no unión (anti-CD33) y usando carga útil de oligonucleótidos 34mer (oligonucleótido S1)
A, B, C, D: cuantificación de qPCR de la carga útil de ADN
E, F, G, H: cuantificación de ELISA del módulo lanzadera de la barrera hematoencefálica (anticuerpo biespecífico)
A, E: oligonucleótido S1 anti-TfR2-Bio Bio-ADN
B, F: oligonucleótido S1 anti-CD33-Bio Bio-ADN
C, G:oligonucleótido S1 anti-TfR2-Dig Dig-ADN
D, H: oligonucleótido S1 anti-CD33-Dig Dig-ADN.
Figura 62: Ensayo de Transwell de transcitosis y liberación a partir de células endoteliales de cargas útiles hapteniladas y de módulos lanzadera de la barrera hematoencefálica de anticuerpos biespecíficos de unión a hapteno; usando anticuerpos biespecíficos con afinidad reducida hacia TfR (TfR2) y anticuerpos biespecíficos de no unión (anti-CD33) y usando carga útil de oligonucleótidos 28mer (oligonucleótido S2)
A, B, C, D, H: cuantificación de qPCR de la carga útil de oligonucleótido
E, F, G: cuantificación de ELISA del módulo lanzadera de la barrera hematoencefálica (anticuerpo biespecífico)
A, E: oligonucleótido S2 anti-TfR2-Bio Bio-ADN
B, F: oligonucleótido S2 anti-CD33-Bio Bio-ADN
C, G:oligonucleótido S2 anti-TfR2-Dig Dig-ADN
D: oligonucleótido S2 anti-CD33-Dig Dig-ADN
H: solo carga útil del oligonucleótido S2 de Dig-ADN.
Figura 63: Ensayo de Transwell de transcitosis y liberación a partir de células endoteliales de cargas útiles hapteniladas y de módulos lanzadera de la barrera hematoencefálica de anticuerpos biespecíficos de unión a hapteno; usando anticuerpos biespecíficos con alta afinidad hacia TfR (TfR1) y usando carga útil de oligonucleótidos 34mer (oligonucleótido S1) o carga útil de oligonucleótidos 28mer (oligonucleótido S2)
A, B, C, D: cuantificación de qPCR de la carga útil de ADN
E, F, G, H: cuantificación de ELISA del módulo lanzadera de la barrera hematoencefálica (anticuerpo biespecífico)
A, E: oligonucleótido S1 anti-TfR1-Bio Bio-ADN
B, F: oligonucleótido S1 anti-TfR1-Dig Dig-ADN
C, G:oligonucleótido S2 anti-TfR1-Bio Bio-ADN
D, H: oligonucleótido S2 anti-TfR1-Dig Dig-ADN.
Descripción detallada de la invención
I. Definiciones
Como se usa en el presente documento, las posiciones aminoacídicas de todas las regiones y dominios constantes de la cadena pesada y ligera se numeran de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat descrito en Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a ed., Public Health Service, National Institutes de Health, Bethesda, MD (1991) y se denomina "numeración de acuerdo con Kabat" en el presente documento. Específicamente el sistema de numeración de Kabat (véanse las páginas 647-660) de Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a ed., Public Health Service, National Institutes de Health, Bethesda, MD (1991) se usa para el dominio constante de la cadena ligera CL del isotipo kappa y lambda y el sistema de numeración del índice EU de Kabat (véanse las páginas 661-723) se usa para los dominios constantes de la cadena pesada (CH1, bisagra, CH2 y CH3).
Una "región estructural humana aceptora" para los propósitos en el presente documento es una región estructural que comprende la secuencia de aminoácidos de una región estructural del dominio variable de la cadena ligera (VL) o una región estructural del dominio variable de la cadena pesada (VH) derivada de una región estructural de inmunoglobulina humana o una región estructural consenso humana, como se define a continuación. Una región estructural humana aceptora "derivada de" una región estructural de inmunoglobulina humana o una región estructural consenso humana puede comprender la misma secuencia de aminoácidos de la misma, o puede contener cambios en la secuencia de aminoácidos. En algunos modos de realización, el número de cambios de aminoácidos es de 10 o menos, 9 o menos, 8 o menos, 7 o menos, 6 o menos, 5 o menos, 4 o menos, 3 o menos, o 2 o menos. En algunos modos de realización, la región estructural humana aceptora de VL tiene una secuencia idéntica a la secuencia de la región estructural de inmunoglobulina humana de VL o la secuencia de la región estructural consenso humana.
El término "aminoácido" indica el grupo de a-aminoácidos carboxi, ya sea natural, es decir, que se puede codificar directamente o en forma de precursor por un ácido nucleico, o no natural. Los aminoácidos individuales naturales se codifican por ácidos nucleicos que consisten en tres nucleótidos, denominados codones o tripletes de bases. Cada aminoácido se codifica por al menos un codón. Esto se conoce como "degeneración del código genético". El término "aminoácido" como se usa dentro de esta solicitud indica los a-aminoácidos carboxi naturales que comprenden alanina (código de tres letras: ala, código de una letra: A), arginina (Arg, R), asparagina (Asn, N), ácido aspártico (Asp, D), cisteína (Cys, C), glutamina (Gln, Q), ácido glutámico (Glu, E), glicina (Gly, G), histidina (His, H), isoleucina (Ile, I), leucina (Leu, L), lisina (Lys, K), metionina (Met, M), fenilalanina (Phe, F), prolina (Pro, P), serina (Ser, S), treonina (Thr, T), triptófano (Trp, W), tirosina (Tyr, Y) y valina (Val, V). Ejemplos de aminoácidos no naturales incluyen, pero no se limitan a, Aad (ácido alfa-aminoadípico), Abu (ácido aminobutírico), Ach (ácido alfa-aminociclohexano-carboxílico), Acp (ácido alfa-aminociclopentano-carboxílico), Acpc (ácido 1-aminociclopropano-1-carboxílico), Aib (ácido alfaaminoisobutírico), Aic (ácido 2-aminoindano-2-carboxílico; también llamado 2-2-Aic), 1-1-Aic (ácido 1-aminoindano-1-carboxílico), (ácido 2-aminoindano-2-carboxílico), alilglicina (AllylGly), aloisoleucina (alo-Ile), Asu (ácido alfaaminosubérico, ácido 2-aminooctanodioc), Bip (ácido 4-fenil-fenilalanina-carboxílico), BnHP ((2S,4R)-4-hidroxiprolina), Cha (beta-ciclohexilalanina), Cit (citrulina), ciclohexilglicina (Chg), ciclopentilalanina, beta-ciclopropilalanina, Dab (ácido 1,4-diaminobutírico), Dap (ácido 1,3-diaminopropiónico), p (ácido 3,3-difenilalanina-carboxílico), 3,3 difenilalanina, di-n-propilglicina (Dpg), 2-furilalanina, homociclohexilalanina (HoCha), homocitrulina (HoCit), homocicloleucina, homoleucina (HoLeu), homoarginina (HoArg), homoserina (HoSer), hidroxiprolina, Lys (Ac), (1) Nal (1 -naftil-alanina), (2) Nal (2-naftil alanina), 4-MeO-Apc (ácido 1-amino-4-(4-metoxifenil)-ciclohexano-1-carboxílico), norleucina (Nle), Nva (norvalina), omatina, 3-Pal (ácido alfa-amino-3-piridilalanina-carboxílico), 4- Pal (ácido alfaamino-4-piridilalanina-carboxílico), 3,4,5, F3-Phe (3,4,5-trifluoro-fenilalanina), 2,3,4,5,6, F5-Phe (2, 3,4,5,6-pentafluoro-fenilalanina), Pqa (ácido 4-oxo-6-(1-piperazinil)-3(4H)-quinazolina-acético (CAS 889958-08-1)), piridilalanina, quinolilalanina, sarcosina (Sar), tiazolilalanina, tienilalanina, Tic (ácido alfa-amino-1,2,3,4, tetrahidroisoquinolina-3-carboxílico), Tic(OH), Tle (tercbutilglicina); y Tyr(Me).
El término "variante de secuencia de aminoácidos" se refiere a polipéptidos que tienen secuencias de aminoácidos que difieren hasta cierto punto de una secuencia de aminoácidos nativa/original/natural. Normalmente, las variantes de secuencia de aminoácidos poseerán al menos aproximadamente un 70 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos nativa/original/natural. En un modo de realización, la variante tiene aproximadamente un 80 % o más de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos nativa/original/natural. En un modo de realización, la variante tiene aproximadamente un 90 % o más de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos nativa/original/natural. En un modo de realización, la variante tiene aproximadamente un 95 % o más de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos nativa/original/natural. En un modo de realización, la variante tiene aproximadamente un 98 % o más de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos nativa/original/natural. Las variantes de secuencia de aminoácidos poseen sustituciones, deleciones y/o inserciones en determinadas posiciones dentro de la secuencia de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos nativa/original/natural. Los aminoácidos se pueden designar mediante los nombres convencionales, códigos de una letra y de tres letras.
El término "anticuerpo" en el presente documento se usa en el sentido más amplio y engloba diversas estructuras de anticuerpos, incluyendo pero sin limitarse a anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) y fragmentos de anticuerpo siempre que presenten la actividad y especificidad de unión a antígeno deseada.
El término "fragmento de anticuerpo" indica una molécula distinta de un anticuerpo intacto que comprende una parte de un anticuerpo intacto que se une específicamente al antígeno al que también se une específicamente el anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen, pero no se limitan a Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2 , diacuerpos, anticuerpos lineales, moléculas de anticuerpo monocatenario (por ejemplo, scFv), anticuerpos de cadena pesada única (VHH) y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo.
La digestión con papaína de los anticuerpos produce dos fragmentos de unión a antígeno idénticos, llamados fragmentos "Fab", cada uno con un único sitio de unión a antígeno, y un fragmento "Fc" residual, cuyo nombre refleja su capacidad de cristalizar fácilmente. El tratamiento con pepsina proporciona un fragmento F(ab')2 que tiene dos sitios de unión a antígeno y todavía puede reticular el antígeno.
El fragmento Fab también contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab' difieren de los fragmentos Fab en la adición de unos pocos residuos en el extremo carboxílico del dominio CH1 de la cadena pesada, incluyendo una o más cisteínas de la región de bisagra del anticuerpo. Fab'-SH es la denominación en el presente documento para Fab' en el que el/los residuo(s) de cisteína de los dominios constantes tienen al menos un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpo F(ab')2 se produjeron originalmente como pares de fragmentos Fab' que tienen cisteínas bisagra entre ellos. También son conocidos otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpo.
"Fv" es el fragmento de anticuerpo mínimo que contiene un sitio de reconocimiento de antígeno y de unión a antígeno completo. Esta región consiste en un dímero de un dominio variable de una cadena pesada y de una cadena ligera en estrecha asociación no covalente. Es en esta configuración en la que las tres regiones hipervariables de cada dominio variable interactúan para definir un sitio de unión a antígeno en la superficie del dímero de VH-VL. Conjuntamente, las seis regiones hipervariables confieren especificidad de unión a antígeno al anticuerpo. Sin embargo, incluso un dominio variable único (o la mitad de un Fv que comprenda solo tres regiones hipervariables específicas para un antígeno) tiene la capacidad de reconocer y unirse al antígeno, aunque con una afinidad más baja que todo el sitio de unión.
El término "biotina", abreviado como "BI", indica ácido 5-[(3aS,4S,6aR)-2-oxohexahidro-1H-tieno[3,4-d]imidazol-4-il]pentanoico. La biotina también se conoce como vitamina H o coenzima R.
El término "carga útil biotinilada" indica una entidad conjugada que comprende un resto de biotina, opcionalmente un conector y una carga útil. El conector puede ser cualquier conector, tal como por ejemplo un conector peptídico o un conector químico.
El término "anticuerpos biespecíficos" indica anticuerpos que tienen dos especificidades de unión (antígeno/hapteno) diferentes. En un modo de realización, anticuerpos biespecíficos como se informan en el presente documento, son específicos para dos antígenos diferentes, es decir, un antígeno hapteno y un antígeno no hapteno.
El término "bromodesoxiuridina", abreviado como "BrdU", indica 5-bromo-2'-desoxiuridina. La bromodesoxiuridina también se conoce como broxuridina, BudR, BrdUrd.
El término "carga útil bromodesoxiuridinilada" indica una entidad conjugada que comprende un resto de bromodesoxiuridina, opcionalmente un conector y una carga útil. El conector puede ser cualquier conector, tal como por ejemplo un conector peptídico o un conector químico.
El término anticuerpo "quimérico" se refiere a un anticuerpo en el que una parte de la cadena pesada y/o ligera se deriva de una fuente o especie particular, mientras que el resto de la cadena pesada y/o ligera se deriva de una fuente o especie diferente.
La "clase" de un anticuerpo se refiere al tipo de dominio constante o región constante que posee su cadena pesada. Existen cinco clases principales de anticuerpos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de estas se pueden dividir además en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2. Los dominios constantes de la cadena pesada que se corresponden con las diferentes clases de inmunoglobulinas se llaman a, 6, £, y, y M, respectivamente.
El término "agente citotóxico" como se usa en el presente documento se refiere a una sustancia que inhibe o previene una función celular y/o provoca la muerte o destrucción celular. Un agente citotóxico es una carga útil específica. Los agentes citotóxicos incluyen, pero no se limitan a, isótopos radiactivos (por ejemplo, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, p 32, Pb212 y los isótopos radiactivos de Lu); agentes o fármacos quimioterápicos (por ejemplo, metotrexato, adriamicina, alcaloides de la vinca (vincristina, vinblastina, etopósido), doxorubicina, melfalán, mitomicina C, clorambucilo, daunorubicina u otros agentes intercalantes); agentes inhibidores del crecimiento; enzimas y fragmentos de las mismas tales como enzimas nucleolíticas; antibióticos; toxinas tales como toxinas de molécula pequeña o toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, incluyendo fragmentos y/o variantes de las mismas; y los diversos agentes antitumorales o anticancerosos divulgados a continuación.
El término "digoxigenina", abreviado como "DIG", indica 3-[(3S,5R,8R,9S,10S,12R,13S,14S,17R)-3,12,14-trihidroxi-10,13-dimetil-1,2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,15,16,17-tetradecahidro-ciclopenta[a]-fenantren-17-il]-2H-furan-5-ona (número CAS 1672-46-4). La digoxigenina (DIG) es un esteroide que se encuentra exclusivamente en las flores y las hojas de las plantas Digitalis purpurea, Digitalis orientalis y Digitalis lanata (dedalera) (Polya, G., Biochemical targets of plant bioactive compounds, CRC Press, Nueva York (2003) p. 847).
El término "carga útil digoxigenilada" indica una entidad conjugada que comprende un resto de digoxigenina, opcionalmente un conector y una carga útil. El conector puede ser cualquier conector, tal como por ejemplo un conector peptídico o un conector químico.
El término "funciones efectoras" indica las actividades biológicas atribuibles a la región Fc de un anticuerpo, que varían con la clase de anticuerpo. Los ejemplos de funciones efectoras de anticuerpos incluyen: unión a C1q y citotoxicidad dependiente del complemento (CDC); unión al receptor de Fc; citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC); fagocitosis; regulación por disminución de receptores de superficie celular (por ejemplo, receptor de linfocitos B) y activación de linfocitos B. Una región Fc sin función efectora (= región Fc sin efector) comprende mutaciones en la secuencia de aminoácidos que anulan la unión de la región Fc a los receptores de C1q o Fcy.
El término "cantidad eficaz" de un agente, por ejemplo, una formulación farmacéutica, indica una cantidad eficaz, en las dosificaciones y durante periodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado terapéutico o profiláctico deseado.
El término "región Fc" en el presente documento se usa para definir una región C terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina que contiene al menos una parte de la región constante. El término incluye regiones Fc de secuencia natural y regiones Fc variantes. En un modo de realización, una región Fc de la cadena pesada de IgG humana se extiende de Cys226, o de Pro230, al extremo carboxílico de la cadena pesada. Sin embargo, la lisina C terminal (Lys447) de la región Fc puede estar presente o no. A menos que se especifique de otro modo en el presente documento, la numeración de los residuos aminoacídicos en la región Fc o región constante se realiza de acuerdo con el sistema de numeración EU, también llamado índice EU, como se describe en Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md (1991), NIH Publication 91-3242.
El término "fluoresceína", abreviado como "FLUO", indica 6-hidroxi-9-(2-carboxifenil)-(3H)-xanten-3-ona, de forma alternativa ácido 2-(6-hidroxi-3-oxo-(3H)-xanten-9-il)-benzoico. La fluoresceína también se conoce como resorcinolftaleína, C.I. 45350, disolvente amarillo 94, amarillo D y C n.° 7, angiofluor, amarillo Japón 201, o amarillo jabón.
El término "carga útil fluoresceinilada" indica una entidad conjugada que comprende un resto de fluoresceína, opcionalmente un conector y una carga útil. El conector puede ser cualquier conector, tal como por ejemplo un conector peptídico o un conector químico.
El término "región estructural", abreviado como "FR", indica residuos de aminoácidos de dominio variable de la cadena pesada y ligera distintos de los residuos de la región hipervariable (HVR). La FR de un dominio variable consiste en general en cuatro dominios de FR: FR1, FR2, FR3 y f R4. En consecuencia, las secuencias de HVR y FR aparecen en general en la siguiente secuencia en VH (o VL): FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
El término "residuo de cisteína artificial" indica un residuo de aminoácido de cisteína que ha sido genomanipulado en un anticuerpo (original) o polipéptido (original), que tiene un grupo funcional tiol (SH), y que no está emparejado como un puente disulfuro intramolecular. No obstante, el residuo de cisteína artificial se puede emparejar como puente disulfuro intermolecular, por ejemplo, con glutatión.
El término "anticuerpo de longitud completa" indica un anticuerpo que tiene una estructura sustancialmente similar a una estructura de anticuerpo natural o que tiene cadenas pesadas que contienen una región Fc como se define en el presente documento. Los anticuerpos IgG naturales son glucoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150.000 dáltones, compuestas por dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas que se unen con enlaces disulfuro. Desde el extremo N al C, cada cadena pesada tiene una región variable (VH), también llamada dominio pesado variable o dominio variable de la cadena pesada, seguida de tres dominios constantes (CH1, CH2 y CH3). De forma similar, desde el extremo N al C, cada cadena ligera tiene una región variable (VL), también llamada dominio ligero variable o dominio variable de la cadena ligera, seguida de un dominio ligero constante (CL). La cadena ligera de un anticuerpo se puede asignar a uno de dos tipos, llamados kappa (k) y lambda ( A), en base a la secuencia de aminoácidos de su dominio constante.
Un "anticuerpo de longitud completa" es un anticuerpo que comprende un dominio de VL y VH, así como un dominio constante de la cadena ligera (CL) y los dominios constantes de la cadena pesada, CH1, CH2 y CH3. Los dominios constantes pueden ser dominios constantes de secuencia natural (por ejemplo, dominios constantes de secuencia natural humana) o variantes de secuencia de aminoácidos de los mismos. El anticuerpo de longitud completa puede tener una o más "funciones efectoras", lo cual se refiere a las actividades biológicas atribuibles a la región constante Fc (una región Fc de secuencia natural o una región Fc de variante de secuencia de aminoácidos) de un anticuerpo. Los ejemplos de funciones efectoras de anticuerpo incluyen la unión a C1q; citotoxicidad dependiente de complemento; unión al receptor de Fc; citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC); fagocitosis; y regulación por disminución de receptores de la superficie celular tales como el receptor de linfocitos B y BCR.
El término "hapteno" indica una molécula pequeña que puede provocar una respuesta inmunitaria solo cuando está unida a un vehículo grande tal como una proteína. Los haptenos ejemplares son anilina, ácido o-, m- y paminobenzoico, quinona, histamina-succinil-glicina (HSG), hidralazina, halotano, indio-DTPA, fluoresceína, biotina, digoxigenina, teofilina, bromodesoxiuridina y dinitrofenol. En un modo de realización, el hapteno es biotina o digoxigenina o teofilina o fluoresceína o bromodesoxiuridina.
El término "carga útil haptenilada" indica un hapteno que se conjuga (covalentemente) con una carga útil. Los derivados de hapteno activados se pueden usar como materiales de partida para la formación de dichos conjugados. En un modo de realización, el hapteno se conjuga (en un modo de realización por medio de su grupo 3-hidroxi) con la carga útil por medio de un conector. En un modo de realización, el conector comprende a) uno o más (en un modo de realización, de tres a seis) grupos metileno-carboxi-metilo (-CH 2-C(O)-), y/o b) de 1 a 10 (en un modo de realización, de 1 a 5) residuos de aminoácido (en un modo de realización, seleccionados de glicina, serina, glutamato, p-alanina, ácido Y-aminobutírico, ácido £-aminocaproico o lisina), y/o c) uno o más (en un modo de realización, uno o dos) compuestos que tienen la fórmula estructural NH2-[(CH2)nO]xCH2-CH2-COOH en la que n es 2 o 3 y x es de 1 a 10, en un modo de realización de 1 a 7. El último elemento da como resultado (al menos en parte) un conector (parte) de fórmula -NH-[(CH2)nO]xCH2-CH2-C(O)-. Un ejemplo de dicho compuesto es, por ejemplo, el ácido 12-amino-4,7,10-trioxadodecanoico (da como resultado un conector TEG (trietilenglicol)). En un modo de realización, el conector comprende además un grupo maleimido. El conector tiene un efecto estabilizador y solubilizante ya que contiene cargas y/o puede formar puentes de hidrógeno. Además, puede facilitar estéricamente la unión del anticuerpo antihapteno a la carga útil haptenilada. En un modo de realización, el conector se conjuga con una cadena lateral de un aminoácido de la carga útil (en un modo de realización, un polipéptido) (por ejemplo, conjugado a la cadena lateral de una lisina o cisteína por medio de un grupo amino o tiol). En un modo de realización, el conector se conjuga con el extremo amino o el extremo carboxilo de la carga útil (en un modo de realización, un polipéptido). La posición de conjugación del conector con la carga útil se selecciona típicamente para que esté en una región donde la conjugación al conector no afecte la actividad biológica de la carga útil. Por lo tanto, la posición de unión del conector depende de la naturaleza de la carga útil y de los elementos de estructura relevantes que son responsables de la actividad biológica de la carga útil. La actividad biológica de la carga útil a la que se une el hapteno se puede someter a prueba antes y después de la conjugación en un ensayo in vitro.
Los términos "célula huésped", "línea de células huésped" y "cultivo de células huésped" se usan de manera intercambiable y se refieren a células en las que se ha introducido ácido nucleico exógeno, incluyendo la descendencia de dichas células. Las células huésped incluyen "transformantes" y "células transformadas" que incluyen la célula transformada primaria y la descendencia derivada de la misma independientemente del número de pases. La descendencia puede no ser completamente idéntica en contenido de ácido nucleico a una célula original, sino que puede contener mutaciones. La descendencia mutante que tiene la misma función o actividad biológica que la cribada o seleccionada en la célula transformada originalmente se incluye en el presente documento.
Un "anticuerpo humano" es uno que posee una secuencia de aminoácidos que se corresponde con la de un anticuerpo producido por un ser humano o una célula humana o derivado de una fuente no humana que utiliza repertorios de anticuerpos humanos u otras secuencias que codifican anticuerpos humanos. Esta definición de un anticuerpo humano excluye específicamente un anticuerpo humanizado que comprende residuos de unión a antígeno no humanos.
Un anticuerpo "humanizado" se refiere a un anticuerpo quimérico que comprende residuos de aminoácido de HVR no humanas y residuos de aminoácido de FR humanas. En determinados modos de realización, un anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en los que todas o sustancialmente todas las HVR (por ejemplo, CDR) corresponden a las de un anticuerpo no humano, y todas o sustancialmente todas las FR corresponden a las de un anticuerpo humano. Un anticuerpo humanizado opcionalmente puede comprender al menos una parte de una región constante de anticuerpo derivada de un anticuerpo humano. Una "forma humanizada" de un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo no humano, se refiere a un anticuerpo que se ha sometido a humanización.
El término "región hipervariable" o "HVR", como se usa en el presente documento, se refiere a cada una de las regiones de un dominio variable de anticuerpo que son hipervariables en secuencia ("regiones determinantes de la complementariedad" o "CDR") y/o forman bucles estructuralmente definidos ("bucles hipervariables") y/o contienen los residuos de contacto con antígeno ("contactos con antígeno"). En general, los anticuerpos comprenden seis HVR; tres en el VH (H1, H2, H3) y tres en el VL (L1, L2, L3).
Las HVR en el presente documento incluyen
(a) los bucles hipervariables que se producen en los residuos de aminoácido 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26­ 32 (H1), 53-55 (H2) y 96-101 (H3) (Chothia, C. y Lesk, A.M., J. Mol. Biol. 196 (1987) 901-917);
(b) las CDR que se producen en los residuos aminoacídicos 24-34 (L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 31-35b (H1), 50-65 (H2) y 95-102 (H3) (Kabat E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5,a ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242,);
(c) los contactos con antígeno que se producen en los residuos de aminoácido 27c-36 (L1), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35b (H1), 47-58 (H2) y 93-101 (H3) (MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996)); y
(d) combinaciones de (a), (b) y/o (c), incluyendo los residuos de aminoácido de HVR46-56 (L2), 47-56 (L2), 48-56 (L2), 49-56 (L2), 26-35 (H1), 26-35b (H1), 49-65 (H2), 93-102 (H3) y 94-102 (H3).
Un "individuo" o "sujeto" es un mamífero. Los mamíferos incluyen, pero no se limitan a, animales domésticos (por ejemplo, vacas, ovejas, gatos, perros y caballos), primates (por ejemplo, seres humanos y primates no humanos, tales como monos), conejos y roedores (por ejemplo, ratones y ratas). En determinados modos de realización, el individuo o sujeto es un ser humano.
Un anticuerpo "aislado" es uno que se ha separado de un componente de su entorno natural. En algunos modos de realización, se purifica un anticuerpo a más de un 95 % o 99 % de pureza como se determina, por ejemplo, por electroforesis (por ejemplo, SDS-PAGE, isoelectroenfoque [IEF], electroforesis capilar) o cromatografía (por ejemplo, HPLC de intercambio iónico o de fase inversa). Para una revisión de los procedimientos para evaluar la pureza de los anticuerpos, véase, por ejemplo, Flatman, S. et al., J. Chrom. B848 (2007) 79-87.
Un ácido nucleico "aislado" se refiere a una molécula de ácido nucleico que se ha separado de un componente de su entorno natural. Un ácido nucleico aislado incluye una molécula de ácido nucleico contenida en células que contienen habitualmente la molécula de ácido nucleico, pero la molécula de ácido nucleico está presente de forma extracromosómica o en una localización cromosómica que es diferente de su localización cromosómica natural.
El término "anticuerpo monoclonal" como se usa en el presente documento se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos y/o se unen al mismo epítopo, excepto por posibles anticuerpos variantes, por ejemplo, que contienen mutaciones naturales o que surgen durante la producción de una preparación de anticuerpos monoclonales, estando presentes dichas variantes en general en cantidades insignificantes. Al contrario que con las preparaciones de anticuerpos policlonales, que típicamente incluyen anticuerpos diferentes dirigidos frente a diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal de una preparación de anticuerpos monoclonales se dirige frente a un único determinante en un antígeno. Por tanto, el modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como que se ha obtenido de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no se ha de interpretar como que requiere la producción del anticuerpo por ningún procedimiento particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que se van a usar de acuerdo con la presente invención se pueden preparar por una variedad de técnicas, incluyendo, pero sin limitarse al procedimiento de hibridoma, procedimientos de ADN recombinante, procedimientos de presentación en fagos y procedimientos que utilizan animales transgénicos que contienen todos o parte de los locus de inmunoglobulina humana, describiéndose en el presente documento dichos procedimientos y otros procedimientos ejemplares para preparar anticuerpos monoclonales.
El término "anticuerpo monoespecífico" indica un anticuerpo que tiene uno o más sitios de unión, cada uno de los cuales tiene la misma especificidad de unión, es decir, se une al mismo antígeno o hapteno.
Un "anticuerpo no marcado" se refiere a un anticuerpo que no está conjugado a un resto heterólogo (por ejemplo, un resto citotóxico) o radiomarcador. El anticuerpo no marcado puede estar presente en una formulación farmacéutica.
El término "prospecto del envase" se usa para referirse a las instrucciones incluidas habitualmente en los envases comerciales de productos terapéuticos que contienen información sobre las indicaciones, uso, dosificación, administración, politerapia, contraindicaciones y/o advertencias en relación con el uso de dichos productos terapéuticos.
El término "carga útil" indica cualquier molécula o combinación de moléculas que se pueden conjugar con un hapteno. El término "carga útil" indica además un resto cuya actividad biológica se desea administrar en/dentro de y/o localizar en una célula o tejido. Las cargas útiles incluyen, pero no se limitan a, marcadores, agentes quimioterápicos, agentes antiangiogénicos, citotoxinas (por ejemplo, exotoxina de Pseudomonas, ricina, abrina, toxina diftérica y similares), citocinas, profármacos, enzimas, factores de crecimiento, factores de transcripción, fármacos, radionucleidos, ligandos, anticuerpos o fragmentos de los mismos, liposomas, nanopartículas, partículas virales, citocinas y similares.
Un "agente quimioterápico" es un compuesto químico útil en el tratamiento del cáncer. Los ejemplos de agentes quimioterápicos incluyen agentes alquilantes tales como tiotepa y ciclosfosfamida (CYTOXAN™); alquil sulfonatos tales como busulfán, improsulfán y piposulfán; aziridinas tales como benzodopa, carbocuona, meturedopa y uredopa; etileniminas y metilamilaminas que incluyen altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida y trimetilomelamina; mostazas de nitrógeno tales como clorambucil, clornafazina, clorofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de óxido de mecloretamina, melfalán, novembichina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo; nitroureas tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina; antibióticos tales como aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, caliqueamicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorrubicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorrubicina, epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicinas, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorrubicina; antimetabolitos tales como metotrexato y 5-fluorouracilo (5-FU); análogos de ácido fólico tales como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina, 5-FU; andrógenos tales como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; antiadrenales tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; reforzador de ácido fólico tal como ácido frolínico; aceglatona; glucósido de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; amsacrina; bestrabucil; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diazicuona; elfornitina; acetato de eliptinio; etoglucido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinan; lonidamina; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamol; nitracrina; pentostatina; fenameto; pirarubicina; ácido podofilínico; 2-etilhidrazida; procarbazina; PSK®; razoxano; sizofirán; espirogermanio; ácido tenuazónico; triazicuona; 2,2', 2"-triclorotietilamina; uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobroman; gacitosina; arabinósido ("Ara-C "); ciclofosfamida; tiotepa; taxanos, por ejemplo, paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ) y docetaxel (TAXOTERE®, Rh6ne-Poulenc Rorer, Antony, Francia); clorambucilo; gemcitabina; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platino tales como cisplatina y carboplatina; vinblastina; platino; etopósido (VP-16); ifosfamida; mitomicina C; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina; navelbina; novantrona; tenipósido; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; CPT-II; inhibidor de la topoisomerasa 35 RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); ácido retinoico; esperamicinas; capecitabina; especitabina; y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores. También se incluyen en esta definición agentes antihormonales que actúan para regular o inhibir la acción hormonal en tumores tales como antiestrógenos, incluyendo por ejemplo tamoxifeno, raloxifeno, 4(5)-imidazoles inhibidores de aromatasa, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno, LY117018, onapristona y toremifeno (Fareston); y antiandrógenos tales como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida y goserelina; y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores.
Un "agente antiangiogénico" se refiere a un compuesto que bloquea, o interfiere en algún grado en, el desarrollo de los vasos sanguíneos. El agente antiangiogénico puede ser, por ejemplo, una molécula pequeña o un anticuerpo que se une a un factor de crecimiento o receptor del factor de crecimiento implicado en promover la angiogénesis. En un modo de realización, el factor antiangiogénico es un anticuerpo que se une al factor de crecimiento endotelial vascular (FCEV).
El término “citocina” es un término genérico para las proteínas liberadas por una población celular que actúan sobre otra célula como mediadores intercelulares. Ejemplos de dichas citocinas son linfocinas, monocinas y hormonas polipeptídicas tradicionales. Se incluyen entre las citocinas hormonas del crecimiento tales como hormona del crecimiento humana; hormona del crecimiento humana N-metionil y hormona del crecimiento bovina; hormona paratiroidea; tiroxina; insulina; proinsulina; relaxina; prorrelaxina; hormonas glucoproteínicas tales como hormona foliculoestimulante (FSH), hormona estimulante del tiroides (TSH) y hormona luteinizante (LH); factor de crecimiento hepático; factor de crecimiento de fibroblastos; prolactina; lactógeno placentario; factor de necrosis tumoral a y P; sustancia inhibidora muleriana; péptido asociado a gonadotropina de ratón; inhibina; activina; factor de crecimiento endotelial vascular; integrina; trombopoyetina (TPO); factores de crecimiento nervioso tales como NGF-p; factor de crecimiento plaquetario; factores de crecimiento y transformación (TGF) tales como TGF-a y TGF-p; factores de crecimiento de tipo insulínico I y II; eritropoyetina (EPO); factores osteoinductores; interferones tales como interferón a y P y y; factores estimuladores de colonias (CSF) tales como CSF de macrófagos (M-CSF); CSF de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) y CSF de granulocitos (G-CSF); interleucinas (IL) tales como IL-I, IL-1 a, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-IO, IL-II, IL-12; un factor de necrosis tumoral tal como TNF-a o TNF-P; y otros factores polipeptídicos, incluyendo LIF y ligando de kit (KL). Como se usa en el presente documento, el término citocina incluye proteínas de fuentes naturales o procedentes de cultivos celulares recombinantes y equivalentes biológicamente activos de las citocinas de secuencia natural.
El término "fMLP" indica el tripéptido que consiste en N-formilmetionina, leucina y fenilalanina. En un modo de realización, el resto efector es fMLP o un derivado del mismo.
El término "profármaco" se refiere a un precursor o forma derivada de una sustancia farmacéuticamente activa que es menos citotóxica para células tumorales en comparación con el fármaco original y se puede activar o convertir enzimáticamente en la forma original más activa. Véase, por ejemplo, Wilman, "Prodrugs in Cancer Chemotherapy" Biochemical Society Transactions, vol. 14, 615th Meeting Belfast (1986) págs. 375-382 y Stella et al., "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery", Directed Drug Delivery, Borchardt, et al., (eds.), pp. 247-267, Humana Press (1985). Los profármacos que se pueden usar como resto efector incluyen, pero no se limitan a, profármacos que contienen fosfato, profármacos que contienen tiofosfato, profármacos que contienen sulfato, profármacos que contienen péptidos, profármacos modificados con aminoácidos D, profármacos glucosilados, profármacos que contienen b-lactama, profármacos que contienen fenoxiacetamida opcionalmente sustituida o profármacos que contienen fenilacetamida opcionalmente sustituida, 5-fluorocitosina y otros profármacos de 5-fluorouridina que se pueden convertir en el fármaco libre citotóxico más activo. Los ejemplos de fármacos citotóxicos que se pueden derivatizar en una forma de profármaco para su uso en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, los agentes quimioterápicos descritos en el presente documento.
El término "agente citotoxina" se refiere a una sustancia que inhibe o previene una función celular y/o provoca la muerte o destrucción celular. Las citotoxinas incluyen, pero no se limitan a, isótopos radioactivos (por ejemplo, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radioactivos de Lu); agentes o fármacos quimioterápicos (por ejemplo, metotrexato, adriamicina, alcaloides de la vinca (vincristina, vinblastina, etopósido), doxorrubicina, melfalán, mitomicina C, clorambucilo, daunorrubicina u otros agentes intercalantes); agentes inhibidores del crecimiento; enzimas y fragmentos de las mismas, tales como enzimas nucleolíticas; antibióticos; toxinas, tales como toxinas de moléculas pequeñas o toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, incluyendo fragmentos y/o variantes de las mismas; y los diversos agentes antitumorales o antineoplásicos divulgados en el presente documento.
"Porcentaje (%) de identidad de secuencia de aminoácidos" con respecto a una secuencia polipeptídica de referencia se define como el porcentaje de residuos aminoacídicos en una secuencia candidata que son idénticos a los residuos aminoacídicos en la secuencia polipeptídica de referencia, después de alinear las secuencias e introducir huecos, en caso necesario, para lograr el porcentaje máximo de identidad de secuencia, y sin considerar ninguna sustitución conservadora como parte de la identidad de secuencia. Se puede lograr la alineación para los propósitos de determinar el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos de diversas formas que están dentro de la habilidad en la técnica, por ejemplo, usando un programa informático disponible públicamente, tal como el programa informático BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR). Los expertos en la técnica pueden determinar los parámetros apropiados para alinear secuencias, incluyendo cualquier algoritmo necesario para lograr la máxima alineación sobre la longitud completa de las secuencias que se comparan. Sin embargo, para los propósitos en el presente documento, los valores de % de identidad de secuencia de aminoácidos se generan usando el programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2. El programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2 se creó por Genentech, Inc., y el código fuente se ha presentado con la documentación de usuario en la Oficina de Derechos de Autor de EE. UU., Washington D.C., 20559, donde está registrado con el n.° de registro de derechos de autor de EE. UU. TXU510087. El programa ALIGN-2 está disponible públicamente de Genentech, Inc., South San Francisco, California, o se puede compilar a partir del código fuente. El programa ALIGN-2 se debe compilar para su uso en un sistema operativo UNIX, incluyendo UNIX V4.0D digital. Todos los parámetros de comparación de secuencias se establecen por el programa ALIGN-2 y no varían.
En situaciones donde se emplea ALIGN-2 para las comparaciones de secuencias de aminoácidos, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos dada A con respecto a, con o frente a una secuencia de aminoácidos dada B (que se puede parafrasear de forma alternativa como una secuencia de aminoácidos dada A que tiene o comprende un determinado % de identidad de secuencia de aminoácidos con respecto a, con o frente a una secuencia de aminoácidos dada B) se calcula como sigue:
100 veces la fracción X/Y
donde X es el número de residuos aminoacídicos puntuados como emparejamientos idénticos por el programa de alineación de secuencias ALIGN-2 en esa alineación del programa de A y B, y donde Y es el número total de residuos aminoacídicos de B. Se apreciará que, cuando la longitud de la secuencia de aminoácidos A no es igual a la longitud de la secuencia de aminoácidos B, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de A con respecto a B no igualará el % de identidad de secuencia de aminoácidos de B con respecto a A. A menos que se indique específicamente de otro modo, todos los valores de % de identidad de secuencia de aminoácidos usados en el presente documento se obtienen como se describe en el párrafo inmediatamente precedente usando el programa informático ALIGN-2.
El término "formulación farmacéutica" se refiere a una preparación que está en tal forma que permite que la actividad biológica de un ingrediente activo contenido en la misma sea eficaz, y que no contiene componentes adicionales que sean inaceptablemente tóxicos para un sujeto al que se le administraría la formulación.
Un "vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a un ingrediente en una formulación farmacéutica, distinto de un ingrediente activo, que no es tóxico para un sujeto. Un vehículo farmacéuticamente aceptable incluye, pero no se limita a, un tampón, excipiente, estabilizante o conservante.
Un "polipéptido" es un polímero que consiste en aminoácidos unidos por enlaces peptídicos, bien producido de forma natural o sintética. Los polipéptidos de menos de aproximadamente 20 residuos de aminoácido se pueden denominar "péptidos", mientras que las moléculas que consisten en dos o más polipéptidos o que comprenden un polipéptido de más de 100 residuos de aminoácido se pueden denominar "proteínas". Un polipéptido también puede comprender componentes distintos de aminoácido, tales como grupos carbohidratados, iones de metal o ésteres de ácido carboxílico. Los componentes distintos de aminoácido se pueden añadir por la célula, en la que se expresa el polipéptido, y pueden variar con el tipo de célula. Los polipéptidos se definen en el presente documento en términos de su estructura de la cadena principal de aminoácido o del ácido nucleico que codifica los mismos. Las adiciones, tales como grupos carbohidratados, en general, no se especifican, pero, no obstante, pueden estar presentes.
Todas las secuencias de polipéptidos se escriben de acuerdo con la convención en general aceptada con lo que el residuo de aminoácido alfa N terminal está a la izquierda y el residuo de aminoácido alfa C terminal está a la derecha. Como se usa en el presente documento, el término "N terminal" se refiere al grupo alfa-amino libre de un aminoácido en un polipéptido, y el término "C terminal" se refiere al extremo de ácido a-carboxílico libre de un aminoácido en un polipéptido. Un polipéptido que es N terminal con un grupo se refiere a un polipéptido que porta un grupo en el nitrógeno alfa-amino del residuo de aminoácido N terminal. Un aminoácido que es N terminal con un grupo se refiere a un aminoácido que porta un grupo en el nitrógeno alfa-amino.
A menos que se indique de otro modo con un prefijo "D", por ejemplo, D-Ala o N-Me-D-Ile, o escrito en minúsculas, por ejemplo, a, i, 1, (versiones D de Ala, Ile, Leu), la estereoquímica del carbono alfa de los aminoácidos y residuos aminoacilo en los polipéptidos descritos en la presente memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas es la configuración natural o "L". Las designaciones "R" y "S" de Cahn-Ingold-Prelog se usan para especificar la estereoquímica de los centros quirales en determinados sustituyentes acilo en el extremo N de los polipéptidos. La designación "R, S" pretende indicar una mezcla racémica de las dos formas enantioméricas. Esta nomenclatura sigue la descrita en Cahn, R.S., et al., Angew. Chem. En t. Ed. Engl. 5 (1966) 385-415.
El término "Fv monocatenario", abreviado como "scFv" indica un fragmento de anticuerpo que comprende los dominios VH y VL del anticuerpo, en el que estos dominios están presentes en una única cadena polipeptídica. En un modo de realización, el polipéptido Fv comprende además un conector polipeptídico entre los dominios VH y VL que posibilita que el scFv forme la estructura deseada para la unión a antígeno. Para una revisión de los scFv, véase Plueckthun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore (Eds), Springer-Verlag, Nueva York, págs. 269-315 (1994).
El término "teofilina", abreviado como "THEO", indica 1,3-dimetil-7H-purina-2,6-diona. La teofilina también se conoce como dimetilxantina.
El término "carga útil teofilinilada" indica una entidad conjugada que comprende un resto de teofilina, opcionalmente un conector y una carga útil. El conector puede ser cualquier conector, tal como por ejemplo un conector peptídico o un conector químico.
El término "tratamiento" (y variaciones gramaticales del mismo, tales como "tratar" o "que trata") indica una intervención clínica en un intento de alterar la evolución natural del individuo que se trata, y que se puede realizar para la profilaxis o bien durante el trascurso de análisis clínicos. Los efectos deseables del tratamiento incluyen, pero no se limitan a, prevención de la aparición o recidiva de la enfermedad, alivio de los síntomas, disminución de cualquier consecuencia patológica directa o indirecta de la enfermedad, prevención de metástasis, disminución de la tasa de progresión de la enfermedad, mejora o atenuación del estado de la enfermedad y remisión o mejora del pronóstico. En algunos modos de realización, los anticuerpos de la invención se usan para retrasar el desarrollo de una enfermedad o para ralentizar la progresión de una enfermedad.
El término "x-valente", por ejemplo, "monovalente" o "bivalente" o "trivalente" o "tetravalente", indica la presencia de un número específico de sitios de unión, es decir, "x", en una molécula de anticuerpo. Como tales, los términos "bivalente", "tetravalente" y "hexavalente" indican la presencia de dos sitios de unión, cuatro sitios de unión y seis sitios de unión, respectivamente, en una molécula de anticuerpo. Los anticuerpos biespecíficos como se informa en el presente documento son al menos "bivalentes" y pueden ser "trivalentes" o "multivalentes" (por ejemplo, "tetravalentes" o "hexavalentes"). En un modo de realización, el anticuerpo biespecífico como se informa en el presente documento es bivalente, trivalente o tetravalente. En un modo de realización, el anticuerpo biespecífico es bivalente. En un modo de realización, el anticuerpo biespecífico es trivalente. En un modo de realización, el anticuerpo biespecífico es tetravalente.
En determinados aspectos y modos de realización, los anticuerpos como se informa en el presente documento, tienen dos o más sitios de unión y son biespecíficos. Es decir, los anticuerpos pueden ser biespecíficos incluso en casos donde haya más de dos sitios de unión (es decir, que el anticuerpo sea trivalente o multivalente). El término "anticuerpos biespecíficos" incluye, por ejemplo, anticuerpos monocatenarios multivalentes, diacuerpos y triacuerpos, así como anticuerpos que tienen la estructura de dominio constante de anticuerpos de longitud completa a los que se unen otros sitios de unión a antígeno (por ejemplo, Fv monocatenario, un dominio VH y/o un dominio VL, Fab o (Fab)2) por medio de uno o más conectores peptídicos. Los anticuerpos pueden ser de longitud completa de una única especie, o ser quimerizados o estar humanizados. Para un anticuerpo con más de dos sitios de unión a antígeno, algunos sitios de unión pueden ser idénticos, siempre que la proteína tenga sitios de unión para dos antígenos diferentes. Es decir, mientras que un primer sitio de unión es específico para un hapteno, un segundo sitio de unión es específico para un antígeno no hapteno, y viceversa.
El término "región variable" indica el dominio de una cadena pesada o ligera de anticuerpo que está implicado en la unión del anticuerpo a su antígeno. Los dominios variables de la cadena pesada y de la cadena ligera (VH y VL, respectivamente) de un anticuerpo natural tienen, en general, estructuras similares, comprendiendo cada dominio cuatro regiones estructurales (FR) conservadas y tres regiones hipervariables (HVR). (Véase, por ejemplo, Kindt, T.J. et al., Kuby Immunology, 6.a ed., W.H. Freeman and Co., N.Y. [2007], página 91). Un único dominio VH o VL puede ser suficiente para conferir especificidad de unión a antígeno. Además, los anticuerpos que se unen a un antígeno particular se pueden aislar usando un dominio VH o VL de un anticuerpo que se une al antígeno para cribar una colección de dominios VL o VH complementarios, respectivamente. Véanse, por ejemplo, Portolano, S. et al., J. Immunol. 150 (1993) 880-887; Clackson, T. et al., Nature 352 (1991) 624-628).
El término "vector" indica una molécula de ácido nucleico que puede propagar otro ácido nucleico al que se enlaza. El término incluye el vector como una estructura de ácido nucleico autorreplicante, así como el vector incorporado en el genoma de una célula huésped en la que se ha introducido. Determinados vectores pueden dirigir la expresión de los ácidos nucleicos a los que se enlazan de forma funcional. Dichos vectores se denominan en el presente documento "vectores de expresión".
II. Conjugados como se informa en el presente documento
En el presente documento, se informa de un módulo lanzadera a través de la barrera hematoencefálica (módulo lanzadera a través de la BHE) que es un anticuerpo biespecífico con una primera especificidad de unión por un hapteno y una segunda especificidad de unión por un receptor de la barrera hematoencefálica (RBHE). Dicho módulo lanzadera a través de la BHE reconoce una diana de superficie celular que se puede someter a transcitosis en la barrera hematoencefálica (tal como TfR, LRP u otras dianas, RBHE) y se une simultáneamente a cargas útiles hapteniladas.
Se ha descubierto que no es necesario cumplir otros requisitos con respecto a la valencia de unión, el formato de anticuerpo ni las afinidades de unión al RBHE.
También se ha descubierto que no se requiere que el módulo lanzadera basado en anticuerpo biespecífico como se informa en el presente documento se libere de las células endoteliales de la barrera hematoencefálica para mediar la transcitosis de la carga útil haptenilada. En cambio, la carga útil haptenilada, que forma un complejo con/está unida al módulo lanzadera basado en anticuerpo biespecífico, cuando se une al RBHE, se libera del módulo lanzadera basado en anticuerpo biespecífico dentro de la célula de la BHE, es decir, en el sistema vesicular intracelular, se separa del módulo lanzadera, y posteriormente se exocita de la célula de la BHE al cerebro dejando atrás el anticuerpo biespecífico en la célula de la BHE.
El módulo lanzadera basado en anticuerpos biespecíficos como se informa en el presente documento es muy variable en términos de valencia de especificidad de unión así como de afinidad de la especificidad de unión a RBHE. Simultáneamente, permite la liberación de la carga útil del módulo lanzadera.
Complejos no covalentes
El anticuerpo biespecífico como se informa en el presente documento se usa como un vehículo de liberación de carga útil haptenilada para una carga útil terapéutica o de diagnóstico. La carga útil terapéutica o de diagnóstico se conjuga con el hapteno y, por tanto, forma un complejo con el sitio de unión al hapteno del anticuerpo biespecífico como se informa en el presente documento. Este complejo está definido y es estable y suministra específicamente la carga útil haptenilada a una célula o tejido diana. Dado que la carga útil terapéutica o de diagnóstico haptenilada forma un complejo de manera no covalente con el anticuerpo biespecífico, la carga útil haptenilada está, por una parte, unida a su vehículo de liberación (=anticuerpo biespecífico) durante su tiempo en la circulación, pero también se puede, por otra parte, liberar eficazmente después de la internalización o transcitosis. La conjugación con el hapteno se puede efectuar sin interferir con la actividad de la carga útil terapéutica o de diagnóstico. El anticuerpo biespecífico no contiene una adición covalente inusual y, por lo tanto, obvia cualquier riesgo de inmunogenicidad. Por lo tanto, este sencillo procedimiento de complejación se puede usar para cualquier carga útil en combinación con solo un anticuerpo anti-hapteno, por ejemplo, péptidos, proteínas, moléculas pequeñas, reactivos de formación de imágenes y ácidos nucleicos. Los complejos de cargas útiles de diagnóstico o terapéuticas hapteniladas con el anticuerpo biespecífico como se informa en el presente documento que contienen sitios de unión específicos al hapteno confieren un comportamiento biofísico benigno y una mejora en los parámetros farmacocinéticos a la carga útil de diagnóstico o terapéutica, por ejemplo, a polipéptidos o moléculas pequeñas de diagnóstico o terapéuticos. Además, dichos complejos son capaces de dirigir la carga de suministro a las células o tejidos que presentan el antígeno reconocido por la segunda especificidad de unión del anticuerpo biespecífico.
El direccionamiento específico y el suministro de ácidos nucleicos hacia y dentro de los tejidos y células diana es una tarea importante. Para aplicaciones terapéuticas, se desean entidades definidas homogéneas. En algunos ejemplos se ha mostrado el suministro de ácido nucleico mediado por anticuerpo o fragmento de anticuerpo (por ejemplo, Lieberman et al., Nat. Biotechnol. 23 (2005) 709). Resulta de particular interés el direccionamiento específico y el suministro de moléculas de ARN bicatenario (ARNbc) hacia y dentro de los tejidos y células diana. Se ha demostrado que las moléculas de ácido ribonucleico bicatenario (ARNds) bloquean la expresión génica en un mecanismo regulador altamente conservado conocido como interferencia de ARN (ARNi). Los ARNbc se pueden conjugar con anticuerpos con buena estabilidad para asegurar un direccionamiento específico y evitar la liberación sistémica inespecífica. Por otra parte, el ARNbc se debe liberar en o dentro de las células diana para permitir la entrada en la célula.
El anticuerpo biespecífico como se informa en el presente documento se puede usar como vehículo de liberación de ácidos nucleicos (ADN o ARN). Por tanto, la presenta invención proporciona una plataforma de administración específica para el tratamiento génico dirigido, la administración de ARNi dirigida y la administración de LNA dirigida.
Se puede usar un complejo de un ácido nucleico haptenilado y un anticuerpo biespecífico como se informa en el presente documento para la administración dirigida específica de ácidos nucleicos a células o tejidos. El ácido nucleico retiene su funcionalidad a pesar de estar haptenilado, así como al estar complejado por el anticuerpo. Además, el sitio de unión al receptor de la barrera hematoencefálica del anticuerpo biespecífico conserva su especificidad y afinidad de unión en presencia del ácido nucleico haptenilado complejado. Los complejos de ácidos nucleicos haptenilados con el anticuerpo biespecífico como se informa en el presente documento se pueden usar para dirigir los ácidos nucleicos específicamente a células que expresan el receptor de la barrera hematoencefálica. Por lo tanto, las células que son reconocidas por el receptor de la barrera hematoencefálica o el cerebro después de la transcitosis son dirigidas selectivamente por los ácidos nucleicos; por lo tanto, las actividades causadas por los ácidos nucleicos (por ejemplo, RNAi o citotoxicidad mediada por ácido nucleico) se mejoran en las células que expresan el receptor de la barrera hematoencefálica o el cerebro. Estas actividades se mejoran aún más mediante la aplicación adicional de agentes moduladores de endosomas dirigidos. Los ácidos nucleicos no solo se administran específicamente a las células que expresan antígenos, sino que también se internalizan en las células diana. Dado que los ácidos nucleicos haptenilados se acoplan de una manera no covalente al anticuerpo biespecífico como se informa en el presente documento, la carga útil (es decir, los ácidos nucleicos) se puede liberar después de la internalización o transcitosis.
Para mediar en su actividad (por ejemplo, la destrucción específica de ARNm por ARNip), los ácidos nucleicos terapéuticos o de diagnóstico tienen que acceder al citoplasma de sus células diana. Un factor importante para el suministro de actividad de ácido nucleico específico es que las moléculas no solo se suministran a las células, sino que también se debe transferir una cantidad suficiente de ácidos nucleicos al citoplasma de estas células. Para eso, estas moléculas tienen que penetrar una membrana biológica al menos una vez. Dado que los agentes biológicos no pasan fácilmente a través de las membranas, este proceso es un obstáculo que se debe superar para el suministro eficaz de la actividad del ácido nucleico. Los medios para superar este obstáculo pueden ser la penetración de membrana, la translocación de proteínas a través de las membranas o los mecanismos de escape de endosoma o de escape vesicular que pueden implicar procesos de alteración de la membrana.
Debido a sus propiedades químicas y físicas, tales como el peso molecular y la arquitectura de los dominios que incluye modificaciones secundarias, el procesamiento posterior de los anticuerpos es muy complicado. Por ejemplo, no solo se requieren soluciones concentradas para fármacos formulados, sino también para intermediarios en el procesamiento posterior (DSP), para lograr bajos volúmenes para la gestión económica y el almacenamiento de aplicaciones.
Al incrementar la concentración del anticuerpo se puede observar una tendencia a formar agregados. Estos anticuerpos agregados tienen características deterioradas en comparación con el anticuerpo aislado. La agregación de los anticuerpos como se informa en el presente documento se puede reducir mediante la introducción de enlaces disulfuro entre los dominios variables de las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos monocatenarios conectados al anticuerpo original bivalente monoespecífico. Esta estabilidad mejorada no solo es útil durante el procedimiento de producción, sino también para el almacenamiento de los anticuerpos. En un modo de realización, el enlace disulfuro entre los dominios variables de los anticuerpos monocatenarios comprendidos en el anticuerpo biespecífico como se informa en el presente documento se selecciona independientemente para cada anticuerpo monocatenario, de:
i) la posición 44 del dominio variable de la cadena pesada a la posición 100 del dominio variable de la cadena ligera,
ii) posición 105 del dominio variable de la cadena pesada a posición 43 del dominio variable de la cadena ligera, o
iii) la posición 101 del dominio variable de la cadena pesada a la posición 100 del dominio variable de la cadena ligera.
En un modo de realización, el enlace disulfuro entre los dominios variables de los anticuerpos monocatenarios comprendidos en el anticuerpo biespecífico como se informa en el presente documento está entre la posición 44 del dominio variable de la cadena pesada y la posición 100 del dominio variable de la cadena ligera.
En un modo de realización, el enlace disulfuro entre los dominios variables de los anticuerpos monocatenarios comprendidos en el anticuerpo biespecífico como se informa en el presente documento está entre la posición 105 del dominio variable de la cadena pesada y la posición 43 del dominio variable de la cadena ligera.
Conjugados covalentes
Se ha descubierto que mediante el acoplamiento covalente de una carga útil haptenilada a un anticuerpo anti-hapteno se puede lograr una estabilización y una mejora de la propiedad farmacocinética de la carga útil.
Los conjugados covalentes de una carga útil haptenilada y un anticuerpo anti-hapteno pueden conferir un comportamiento biofísico benigno y mejores propiedades farmacocinéticas al polipéptido. Además, en caso de que se use un anticuerpo biespecífico, los conjugados se pueden usar para dirigir el polipéptido a las células que presentan el antígeno que es reconocido por la segunda especificidad de unión del anticuerpo biespecífico. Dichos conjugados se componen de una especificidad de unión a anti-hapteno y una especificidad de unión a antígeno (no hapteno). La proporción estequiométrica de anticuerpo a carga útil haptenilada depende del formato del anticuerpo biespecífico y puede ser 1:1, 1:2, 2:1, 2:2, 2:4 y 4:2 (anticuerpo:polipéptido de hapteno).
Se desea que la carga útil conserve una buena actividad biológica a pesar de estar conjugada con el hapteno, así como estar conjugada con el anticuerpo. También se desea (en el caso de módulos de direccionamiento biespecíficos) que el sitio de unión a la diana de la superficie celular del anticuerpo biespecífico conserve su especificidad y afinidad de unión en presencia de la carga útil haptenilada conjugada de forma covalente.
El grupo reactivo en la carga útil haptenilada puede ser cualquier grupo reactivo, tal como por ejemplo una maleimida, por ejemplo, N-etil maleimida (NEM), una yodoacetamida, un disulfuro de piridilo u otro compañero de conjugación reactivo (véase, por ejemplo, Haugland, 2003, Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes, Inc.; Brinkley, 1992, Bioconjugate Chem. 3:2; Garman, 1997, Non-Radioactive Labeling: A Practical Approach, Academic Press, London; Means (1990) Bioconjugate Chem. 1:2; Hermanson, G. in Bioconjugate Techniques (1996) Academic Press, San Diego, págs. 40-55 y 643-671).
El grupo reactivo en el anticuerpo se limita a aquellos que se pueden generar de forma selectiva, es decir, según su posición específica. Por lo tanto, se limita a los grupos de cadena lateral de los residuos de aminoácidos cisteína, serina, asparagina, glutamina, tirosina, lisina, arginina, ácido aspártico y ácido glutámico.
Para la formación de un conjugado covalente entre el anticuerpo y la carga útil haptenilada, ambos compuestos se deben modificar mediante la introducción de un grupo reactivo. Tras la unión de la carga útil haptenilada por el anticuerpo, los dos grupos reactivos se acercan, lo que permite la formación de un enlace covalente. La modificación es la introducción de una funcionalidad de tiol en cada uno de los compuestos. El compuesto de tiol es un residuo de cisteína.
La posición que comprende el grupo funcional debe cumplir simultáneamente dos requisitos: (i) las posiciones de acoplamiento deben estar próximas a la región de unión de la especificidad de unión al anti-hapteno del anticuerpo para utilizar el efecto de posicionamiento del hapteno para el acoplamiento dirigido, y (ii) la posición de mutación y acoplamiento se debe situar de manera que la propia unión del hapteno no se vea afectada. Estos requisitos para encontrar una posición adecuada se "contradicen" de facto entre sí porque el requisito (i) se cumple mejor con una posición cercana al sitio de unión, mientras que el requisito (ii) se logra de forma más segura mediante posiciones que están alejadas del sitio de unión.
A pesar de estos requisitos virtualmente excluyentes, se identificaron posiciones que se pueden mutar sin afectar el posicionamiento del hapteno y que, sin embargo, permiten simultáneamente el acoplamiento covalente dirigido.
La primera posición se localiza en la posición VH52b o en la posición VH53, respectivamente, de acuerdo con la numeración de Kabat del dominio variable de la cadena pesada. Si el anticuerpo tiene una CDR2 de VH corta, que no tiene residuos intermitentes, tal como 52a, 52c, 52c y 52d, la posición es 53 (numeración y alineación de acuerdo con el esquema de numeración y las reglas de Kabat para el dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo). Si el anticuerpo tiene una CDR2 de VH larga que comprende los residuos 52a y 52b, y opcionalmente otros residuos como 52c y 52d, etc., la posición es 52b (numeración y alineación de acuerdo con el esquema de numeración y las reglas de Kabat para el dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo).
Se ha descubierto que cualquier carga útil se puede usar en la carga útil haptenilada (en el caso de una carga útil haptenilada seleccionada del grupo que consiste en cargas útiles biotiniladas, cargas útiles teofiliniladas, cargas útiles digoxigeniladas y cargas útiles fluoresceiniladas) tras la derivatización con un conector universal que comprende el grupo funcional para la formación del enlace covalente entre la carga útil haptenilada y un residuo de aminoácido en la CDR2 de cadena pesada del anticuerpo. La localización del grupo funcional en el conector universal tiene la ventaja de que no es necesario genomanipular la síntesis y la posición del grupo funcional en la CDR2 de cadena pesada del anticuerpo si se cambia la carga útil.
Se ha descubierto además que se puede usar cualquier carga útil en la carga útil helicarilada tras la derivatización de la secuencia de aminoácidos helicar con una cisteína que comprende el grupo funcional para la formación del enlace disulfuro covalente entre la carga útil helicarilada y el residuo de cisteína en la CDR2 de cadena ligera del anticuerpo. La localización del residuo de cisteína (grupo funcional tiol) en la secuencia de aminoácidos de motivo helicar tiene la ventaja de que no es necesario genomanipular la síntesis y la posición del residuo de cisteína en la CDR2 de cadena ligera del anticuerpo si se cambia la carga útil.
La segunda posición se localiza en la posición VH28 de acuerdo con la numeración de Kabat.
Por ejemplo, en la estructura del anticuerpo anti-digoxigenina, el hapteno se une en un bolsillo profundo formado por residuos hidrófobos. En este estudio cristalográfico se usó un conjugado de digoxigenina-Cy5 fluorescente, en el que el fluoróforo, así como el conector entre la digoxigenina y Cy5 no eran visibles en la estructura debido a una alta flexibilidad y el desorden resultante en el cristal. Sin embargo, el conector y Cy5 se unen al O32 de digoxigenina que apunta en la dirección de la CDR2 de la cadena pesada. La distancia entre O32 de digoxigenina y el Ca del residuo de aminoácido en la posición 52b de acuerdo con Kabat es de aproximadamente 10,5 A.
Se ha descubierto que las posiciones son posiciones "universales", es decir, la posición es aplicable a cualquier anticuerpo (anti-hapteno) o cualquier carga útil helicarilada, respectivamente, y, por tanto, no es necesario comenzar desde cero cada vez que un nuevo complejo covalente se tiene que generar, por ejemplo, proporcionando la estructura cristalina y determinando la posición apropiada que permite el acoplamiento covalente posicionado con el hapteno.
Los anticuerpos modificados como se informa en el presente documento conservan la capacidad de unión al hapteno (antígeno) de sus homólogos de anticuerpos originales (es decir, naturales). Por tanto, el anticuerpo genomanipulado es capaz de unirse específicamente a haptenos (antígenos).
Los términos "sitio de unión que se une específicamente a" o "un anticuerpo que se une específicamente a" indican que la molécula que comprende el sitio de unión o un anticuerpo puede formar un complejo con otra molécula de una manera específica. La unión se puede detectar en un ensayo in vitro, tal como en un ensayo de resonancia de plasmón (BIAcore, GE-Healthcare Uppsala, Suecia). La afinidad de la formación del complejo se define mediante los términos ka (constante de velocidad para la asociación de los compuestos para formar el complejo), Kd (constante de disociación, disociación del complejo) y Kd (kD/ka). Unir o unir específicamente quiere decir una afinidad de unión (Kd ) de aproximadamente 10-7 M o menos.
Se ha descubierto que la formación de un enlace covalente entre un anticuerpo modificado con cisteína y una carga útil haptenilada modificada con cisteína que porta el residuo de cisteína en el conector entre el hapteno y la carga útil o dentro del hapteno o dentro de la carga útil tiene lugar tras la unión del anticuerpo a la carga útil haptenilada sin el requisito de la adición de agentes reductores y/u oxidantes si el enlace formado es un enlace disulfuro. Por tanto, el puente disulfuro entre los dos compuestos se forma espontáneamente tras la formación del complejo no covalente. Por lo tanto, un procedimiento para la formación de un complejo covalente como se informa en el presente documento simplemente requiere la mezcla de los dos compuestos. El único requisito previo para la formación del enlace disulfuro es una orientación apropiada de los dos compuestos entre sí.
El reemplazo del residuo de aminoácido en la posición VH52b y VH53, respectivamente, (de acuerdo con el esquema de numeración de Kabat) con un residuo de Cys dio como resultado derivados de anticuerpos con secuencias de región variable de cadena pesada que se enumeran en la SEQ ID NO: 20 y 28 para el anticuerpo anti-digoxigenina-VH52bC, en la SEQ ID NO: 84 y 92 para el anticuerpo anti-teofilina-VH53C, en la SEQ ID No : 52 y 60 para el anticuerpo anti-biotina-VH53C, en la SEQ ID NO: 108 para el anticuerpo anti-fluoresceína-VH52bC y en la SEQ ID NO: 226 para el anticuerpo anti-bromodesoxiuridina-VH53C.
El reemplazo del residuo de aminoácido del dominio variable de la cadena pesada en la posición VH28 (de acuerdo con el esquema de numeración de Kabat) con un residuo de Cys dio como resultado derivados de anticuerpos con secuencias de región variable de cadena pesada que se enumeran en la SEQ ID NO: 116, 124, 132, 140, 148, 156 y 164, respectivamente.
Otra posición que se identificó como punto de modificación es la posición VH28 de acuerdo con la numeración de Kabat.
El reemplazo del aminoácido en la posición VH28 de acuerdo con Kabat con derivados de anticuerpos generados por Cys con secuencias de región variable de cadena pesada que se enumeran es SEQ ID NO: 124 y 132 para el anticuerpo anti-digoxigenina-VH28C, en la SEQ ID NO: 156 y 164 para el anticuerpo anti-teofilina-VH28C, en la SEQ ID NO: 140 y 148 para el anticuerpo anti-biotina-VH28C, en la Se Q ID NO: 116 para el anticuerpo anti-fluoresceína-VH28C, y en la SEQ ID NO: 227 para el anticuerpo anti-bromodesoxiuridina-VH28C.
Los análisis de ESI-MS demuestran que la conjugación de anticuerpos covalentes de carga útil haptenilada (carga útil = péptido terapéutico) da como resultado un conjugado de tamaño definido que es más grande que el anticuerpo no complejado o el péptido no complejado.
Tabla 1: tabla TIC
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1) HC con ácido piroglutámico N terminal
2) HC sin Lys C terminal
3) HC con N -> D en el sitio de glucosilación debido a la desglucosilación
4) LC con ácido piroglutámico N terminal
Los resultados de los experimentos in vivo muestran que los vehículos lanzadera de la BHE biespecíficos de unión a hapteno y TfR se unen al anticuerpo de carga útil haptenilado y permiten el transporte de la carga útil a través de la BHE. Los resultados de estos experimentos también muestran que la carga útil puede liberarse del vehículo lanzadera y, posteriormente, unirse a y acumularse en su diana en el cerebro.
Afinidad por el anticuerpo
En determinados modos de realización, el anticuerpo en el conjugado de acuerdo con la invención tiene una constante de disociación (Kd) de < 10 nM, < 1 nM, < 0,1 nM, < 0,01 nM o < 0,001 nM (por ejemplo, de aproximadamente 10-8 M o menos, por ejemplo, de aproximadamente 10-8 M a aproximadamente 10-13 M, por ejemplo, de aproximadamente 10-9 M a aproximadamente 10-13 M).
En un modo de realización, se mide la Kd mediante un ensayo de unión a antígeno radiomarcado (RIA) realizado con la versión Fab de un anticuerpo de interés y su antígeno como se describe mediante el siguiente ensayo. La afinidad de unión en solución de Fab por el antígeno se mide equilibrando Fab con una concentración mínima de antígeno marcado con (125I) en presencia de una serie de valoraciones de antígeno no marcado, capturando a continuación el antígeno unido con una placa recubierta con anticuerpo anti-Fab (véase, por ejemplo, Chen Y. et al., J. Mol. Biol. 293 (1999) 865-881). Para establecer las condiciones para el ensayo, se recubren placas de múltiples pocillos MICROTITER® (Thermo Scientific) durante la noche con 5 pg/ml de un anticuerpo anti-Fab de captura (Cappel Labs) en carbonato de sodio 50 mM (pH 9,6) y posteriormente se bloquean con seroalbúmina bovina al 2 % (p/v) en PBS durante de dos a cinco horas a temperatura ambiente (aproximadamente 23 °C). En una placa no adsorbente (n.° 269620 de Nunc), se mezcla [125I]-antígeno 100 pM o 26 pM con diluciones seriadas de un Fab de interés (por ejemplo, consecuente con la evaluación del anticuerpo anti-VEGF, Fab-12, en Presta L.G. et al., Cancer Res. 57 (1997) 4593­ 4599). A continuación, se incuba el Fab de interés durante la noche; sin embargo, la incubación puede continuar durante un periodo más largo (por ejemplo, de aproximadamente 65 horas) para garantizar que se alcanza el equilibrio. Después de esto, se transfieren las mezclas a la placa de captura para su incubación a temperatura ambiente (por ejemplo, durante una hora). A continuación, se retira la solución y se lava la placa ocho veces con polisorbato 20 (TWEe N-20®) al 0,1 % en PBS. Cuando las placas se han secado, se añaden 150 pl/pocillo de centelleador (MICROSCINT-20™; Packard) y se cuentan las placas en un contador gamma TOPCOUNT™ (Packard) durante diez minutos. Se eligen concentraciones de cada Fab que dan menos de o igual a un 20 % de unión máxima para su uso en ensayos de unión competitiva.
De acuerdo con otro modo de realización, Kd se mide usando ensayos de resonancia de plasmón superficial usando un BIACORE®-2000 o un BIACORE®-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) a 25 °C con chips c M5 de antígeno inmovilizado a ~10 unidades de respuesta (UR). En resumen, se activan chips de biosensor de dextrano carboximetilado (CM5, BIACORE, Inc.) con clorhidrato de N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. El antígeno se diluye con acetato de sodio 10 mM, pH 4,8, hasta 5 pg/ml (aproximadamente 0,2 pM) antes de la inyección a un caudal de 5 pl/minuto para lograr aproximadamente 10 unidades de respuesta (UR) de proteína acoplada. Después de la inyección del antígeno, se inyecta etanolamina 1 M para bloquear los grupos sin reaccionar. Para las mediciones cinéticas, se inyectan diluciones en serie de dos veces de Fab (de 0,78 nM a 500 nM) en PBS con tensioactivo polisorbato 20 (TWEEN-20™)(PBST) al 0,05 % a 25 °C a un caudal de aproximadamente 25 pl/min. Se calculan las tasas de asociación (kas) y las tasas de disociación (kdis) usando un modelo simple de unión uno a uno de Langmuir (programa informático de evaluación de BIACORE® , versión 3,2) ajustando simultáneamente los sensogramas de asociación y disociación. La constante de disociación en equilibrio (Kd) se calcula como la proporción kdis/kas. Véase, por ejemplo, Chen, Y. et al., J. Mol. Biol.
293 (1999) 865-881. Si la velocidad de asociación supera 106 M_1 s_1 mediante el ensayo de resonancia de plasmones superficiales anterior, entonces la velocidad de asociación se puede determinar usando una técnica de extinción fluorescente que mide el incremento o disminución en la intensidad de emisión de fluorescencia (excitación = 295 nm; emisión = 340 nm, paso de banda 16 nm) a 25 °C de un anticuerpo (forma Fab) antiantígeno 20 nM en PBS, pH 7,2, en presencia de concentraciones crecientes de antígeno como se mide en un espectrómetro, tal como un espectrofotómetro equipado con interrupción de flujo (Aviv Instruments) o un espectrofotómetro SLM-AMINCO™ serie 8000 (ThermoSpectronic) con una cubeta agitada.
Fragmentos de anticuerpo
En determinados modos de realización, un anticuerpo en un conjugado de acuerdo con la invención es un fragmento de anticuerpo. Los fragmentos de anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, fragmentos Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv y scFv y conjugados de los mismos, y otros fragmentos descritos a continuación siempre que los fragmentos sean bivalentes y biespecíficos o se combinan para formar un polipéptido de fusión de fragmento de anticuerpo bivalente biespecífico. Para una revisión de determinados fragmentos de anticuerpo, véase Hudson, P.J., et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134. Para un análisis de los fragmentos scFv, véase, por ejemplo, Plueckthun, A., en: The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore (eds.), Springer-Verlag, Nueva York (1994), págs. 269-315; véanse también el documento WO 93/16185; y las patentes de EE. UU. n.° 5.571.894 y 5.587.458. Para un análisis de los fragmentos Fab y F(ab')2 que comprenden residuos de epítopos de unión al receptor de rescate y que tienen un incremento en la semivida in vivo véase el documento US 5.869.046.
Los diacuerpos son fragmentos de anticuerpo con dos sitios de unión a antígeno que pueden ser bivalentes o biespecíficos. Véanse, por ejemplo, los documentos EP0404 097; WO 1993/01161; Hudson, P.J. et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134; y Holliger, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448. También se describen triacuerpos y tetracuerpos en Hudson, P.J., et al., Nat. Med. 9 (20039 129-134).
Los anticuerpos de dominio único son fragmentos de anticuerpo que comprenden todo o una parte del dominio variable de la cadena pesada o todo o una parte del dominio variable de la cadena ligera de un anticuerpo. En determinados modos de realización, un anticuerpo de un dominio único es un anticuerpo de un dominio único humano (Domantis, Inc., Waltham, MA; véase, por ejemplo, el documento US 6.248.516).
Se pueden preparar fragmentos de anticuerpo por diversas técnicas, incluyendo, pero sin limitarse a, digestión proteolítica de un anticuerpo intacto, así como la producción por células huésped recombinantes (por ejemplo, E. coli o fago), como se describe en el presente documento.
Anticuerpos quiméricos y humanizados
En determinados modos de realización, el anticuerpo en un conjugado de acuerdo con la invención es un anticuerpo quimérico. Se describen determinados anticuerpos quiméricos, por ejemplo, en el documento US 4.816.567; y Morrison, S.L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855). En un ejemplo, un anticuerpo quimérico comprende una región variable no humana (por ejemplo, una región variable derivada de un ratón, rata, hámster, conejo o primate no humano, tal como un mono) y una región constante humana. En otro ejemplo, un anticuerpo quimérico es un anticuerpo "con clase cambiada" en el que se ha cambiado la clase o subclase de la del anticuerpo original. Los anticuerpos quiméricos incluyen fragmentos de unión a antígeno de los mismos.
En determinados modos de realización, un anticuerpo quimérico es un anticuerpo humanizado. Típicamente, un anticuerpo no humano se humaniza para reducir la inmunogenicidad en seres humanos, mientras conserva la especificidad y afinidad del anticuerpo no humano original. En general, un anticuerpo humanizado comprende uno o más dominios variables en los que las HVR, por ejemplo, las CDR (o partes de las mismas), se derivan de un anticuerpo no humano y las FR (o partes de las mismas) se derivan de secuencias de anticuerpos humanos. Un anticuerpo humanizado también comprenderá opcionalmente al menos una parte de una región constante humana. En algunos modos de realización se sustituyen algunos residuos de FR de un anticuerpo humanizado por los residuos correspondientes de un anticuerpo no humano (por ejemplo, el anticuerpo del que se derivan los residuos de HVR), por ejemplo, para restablecer o mejorar la especificidad o afinidad del anticuerpo.
Los anticuerpos humanizados y los procedimientos para prepararlos se revisan, por ejemplo, en Almagro, J.C. y Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633, y se describen adicionalmente, por ejemplo, en Riechmann, I. et al., Nature 332 (1988) 323-329; Queen, C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033; patentes de EE. UU. n.° 5.821.337, 7.527.791,6.982.321 y 7.087.409; Kashmiri, S.V. et al., Methods 36 (2005) 25-34 (que describe el injerto de SDR (a-CDR)); Padlan, E.A., Mol. Immunol 28 (1991) 489-498 (que describe el "remodelado"); Dall'Acqua, W.F. et al., Methods 36 (2005) 43-60 (que describe el "reordenamiento de FR"); y Osbourn, J. et al., Methods 36 (2005) 61-68 y Klimka, A. et al., Br. J. Cancer 83 (2000) 252-260 (que describe el enfoque de "selección guiada" para reordenamiento de FR).
Las regiones estructurales humanas que se pueden usar para la humanización incluyen, pero no se limitan a: regiones estructurales seleccionadas usando el procedimiento de "mejor ajuste" (véase, por ejemplo, Sims, M.J. et al., J. Immunol. 151 (1993) 2296-2308; regiones estructurales derivadas de la secuencia consenso de anticuerpos humanos de un subgrupo particular de regiones variables de la cadena ligera o pesada (véase, por ejemplo, Carter, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289; y Presta, L.G. et al., J. Immunol. 151 (1993) 2623-2632); regiones estructurales maduras (mutadas somáticamente) humanas o regiones estructurales de la línea germinal humana (véase, por ejemplo, Almagro, J.C. y Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633); y regiones estructurales derivadas del cribado de colecciones de FR (véase, por ejemplo, Baca, M. et al., J. Biol. Chem. 272 (1997) 10678­ 10684 y Rosok, M.J. et al., J. Biol. Chem. 271 (1996) 22611-22618).
Anticuerpos humanos
En determinados modos de realización, el anticuerpo en un conjugado de acuerdo con la invención es un anticuerpo humano. Se pueden producir anticuerpos humanos usando diversas técnicas conocidas en la técnica. Los anticuerpos humanos se describen en general en van Dijk, M.A. y van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Pharmacol. 5 (2001) 368-374 y Lonberg, N., Curr. Opin. Immunol. 20 (2008) 450-459.
Se pueden preparar anticuerpos humanos administrando un inmunógeno a un animal transgénico que se ha modificado para producir anticuerpos humanos intactos o anticuerpos intactos con regiones variables humanas en respuesta a una exposición antigénica. Dichos animales típicamente contienen todos o una parte de los locus de inmunoglobulina humana, que remplazan los locus de inmunoglobulina endógena, o que están presentes de forma extracromosómica o integrados aleatoriamente en los cromosomas del animal. En dichos ratones transgénicos, los locus de inmunoglobulina endógena en general se han inactivado. Para un análisis de los procedimientos para obtener anticuerpos humanos de animales transgénicos, véase Lonberg, N., Nat. Biotech. 23 (2005) 1117-1125. Véanse también, por ejemplo, los documentos US 6.075.181 y US 6.150.584 que describen la tecnología XENOMOUSE™; el documento u S 5.770.429, que describe la tecnología HUMAB®; el documento US 7.041.870, que describe la tecnología K-M MOUSE®, y el documento US 2007/0061900, que describe la tecnología VELOCIMOUSE®). Las regiones variables humanas de anticuerpos intactos generados por dichos animales se pueden modificar además, por ejemplo, por combinación con una región constante humana diferente.
También se pueden preparar anticuerpos humanos por procedimientos basados en hibridoma. Se han descrito líneas celulares de mieloma humano y heteromieloma humano-murino para la producción de anticuerpos monoclonales humanos. (Véase, por ejemplo, Kozbor, D., J. Immunol. 133 (1984) 3001-3005; Brodeur, B.R. et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., Nueva York (1987), págs. 51-63 y Boerner, P. et al., J. Immunol. 147 (1991) 86-95). Los anticuerpos humanos generados por medio de la tecnología de hibridoma de linfocito B humano también se describen en Li, J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103 (2006) 3557-3562. Los procedimientos adicionales incluyen los descritos, por ejemplo, en la patente de EE. UU. n.° 7.189.826 (que describe la producción de anticuerpos IgM monoclonales humanos a partir de líneas celulares de hibridoma) y Ni, J., Xiandai Mianyixue 26 (2006) 265-268 (que describe hibridomas humano-humano). La tecnología de hibridoma humano (tecnología Trioma) también se describe en Vollmers, H.P. y Brandlein, S., Histology and Histopathology 20 (2005) 927-937 y Vollmers, H.P. y Brandlein, S., Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology 27 (2005) 185-191.
También se pueden generar anticuerpos humanos aislando secuencias de dominio variable del clon Fv seleccionadas de colecciones de presentación en fagos derivadas de humano. A continuación, se pueden combinar dichas secuencias de dominio variable con un dominio constante humano deseado. Las técnicas para seleccionar anticuerpos humanos de colecciones de anticuerpos se describen a continuación.
Anticuerpos derivados de colecciones
Los anticuerpos en el conjugado de acuerdo con la invención se pueden aislar cribando colecciones combinatorias para anticuerpos con la actividad o actividades deseadas. Por ejemplo, una variedad de procedimientos son conocidos en la técnica para generar colecciones de presentación en fagos y cribar dichas colecciones para determinar los anticuerpos que poseen las características de unión deseadas. Dichos procedimientos se revisan, por ejemplo, en Hoogenboom, H.R. et al., Methods in Molecular Biology 178 (2001) 1-37 y se describen adicionalmente, por ejemplo, en McCafferty, J. et al., Nature 348 (1990) 552-554; Clackson, T. et al., Nature 352 (1991) 624-628; Marks, J.D. et al., J. Mol. Biol. 222 (1992) 581-597; Marks, J.D. y Bradbury, A., Methods in Molecular Biology 248 (2003) 161-175; Sidhu, S.S. et al., J. Mol. Biol. 338 (2004) 299-310; Lee, C.V. et al., J. Mol. Biol. 340 (2004) 1073-1093; Fellouse, F.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 (2004) 12467-12472; y Lee, C.V. et al., J. Immunol. Methods 284 (2004) 119-132.
En determinados procedimientos de presentación en fagos, los repertorios de los genes VH y VL se clonan por separado mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y se recombinan aleatoriamente en colecciones de fagos, que después se pueden cribar para determinar los fagos que se unen a los antígenos como se describe en Winter, G. et al., Ann. Rev. Immunol. 12 (1994) 433-455. Típicamente, los fagos presentan fragmentos de anticuerpo, como fragmentos Fv monocatenarios (scFv) o bien como fragmentos Fab. Las colecciones de fuentes inmunizadas proporcionan anticuerpos de alta afinidad para el inmunógeno sin el requisito de construir hibridomas. De forma alternativa, se puede clonar el repertorio sin exposición previa (por ejemplo, a partir de un ser humano) para proporcionar una única fuente de anticuerpos para una amplia gama de antígenos propios y no propios sin ninguna inmunización como se describe en Griffiths, A.D. et al., EMBo J. 12 (1993) 725-734. Finalmente, también se pueden preparar sintéticamente colecciones sin exposición previa clonando segmentos de genes V no reordenados a partir de células madre y usando cebadores de PCR que contienen una secuencia aleatoria para codificar las regiones CDR3 altamente variables y conseguir el reordenamiento in vitro, como se describe en Hoogenboom, H.R. y Winter, G., J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388. Las publicaciones de patente que describen colecciones de fagos-anticuerpos humanos incluyen, por ejemplo: la patente de EE. UU. n.° 5.750.373 y las publicaciones de patente de EE. UU. n.os 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936 y 2009/0002360.
Los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo aislados de colecciones de anticuerpos humanos se consideran anticuerpos humanos o fragmentos de anticuerpo humano en el presente documento.
Formatos de anticuerpos
Los anticuerpos y fragmentos de anticuerpos descritos anteriormente se pueden combinar de múltiples formas para generar diferentes formatos de anticuerpos.
Por ejemplo, se pueden fusionar uno o más fragmentos de anticuerpo scFv al extremo C de una o más cadenas polipeptídicas de un anticuerpo completo. Especialmente en cada extremo C de la cadena pesada o en cada extremo C de la cadena ligera se puede fusionar un fragmento de anticuerpo scFv.
Por ejemplo, se pueden fusionar uno o más fragmentos Fab de anticuerpo al extremo C de una o más cadenas polipeptídicas de un anticuerpo completo. Especialmente en cada extremo C de la cadena pesada o en cada extremo C de la cadena ligera se puede fusionar un fragmento Fab de anticuerpo.
Por ejemplo, un scFv y un fragmento Fab de anticuerpo se pueden fusionar con los extremos N de una región Fc de anticuerpo.
Por ejemplo, un fragmento scFv o Fab de anticuerpo se puede fusionar con un extremo N de una región Fc de anticuerpo y un fragmento scFv o Fab de anticuerpo se puede fusionar con el extremo C de la otra cadena respectiva de una región Fc de anticuerpo.
Anticuerpos multiespecíficos
Se ha desarrollado una amplia variedad de formatos de anticuerpos recombinantes, por ejemplo, anticuerpos biespecíficos tetravalentes por fusión de, por ejemplo, un formato de anticuerpo IgG y dominios monocatenarios (véase, por ejemplo, Coloma, M.J., et. al., Nature Biotech. 15 (1997) 159-163; documento WO 2001/077342; y Morrison, S.L., Nature Biotech. 25 (2007) 1233-1234).
También se han desarrollado otros varios formatos en los que la estructura del núcleo del anticuerpo (IgA, IgD, IgE, IgG o IgM) ya no se conserva, tal como dia-, tria- o tetracuerpos, minicuerpos, varios formatos monocatenarios (scFv, Bis-scFv) que se pueden unir a dos o más antígenos (Holliger, P., et. al., Nature Biotech. 23 (2005) 1126-1136; Fischer, N., Léger, O., Pathobiology 74 (2007) 3-14; Shen, J., et. al., Journal of Immunological Methods 318 (2007) 65-74; Wu, C., et al., Nature Biotech. 25 (2007) 1290-1297).
Todos de dichos formatos usan conectores para fusionar el núcleo del anticuerpo (IgA, IgD, IgE, IgG o IgM) a otra proteína de unión (por ejemplo, scFv) o bien para fusionar, por ejemplo, dos fragmentos Fab o scFv (Fischer, N., y Leger, O., Pathobiology 74 (2007) 3-14). Se debe tener en cuenta que se puede desear conservar funciones efectoras, tales como, por ejemplo, la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) o la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC), que están mediadas a través de la unión del receptor de Fc, manteniendo un alto grado de similitud con los anticuerpos naturales.
En el documento WO 2007/024715 se informa de inmunoglobulinas de dominio variable dual como proteínas de unión multivalentes y multiespecíficas genomanipuladas. En el documento US 6.897.044 se informa de un procedimiento para la preparación de dímeros de anticuerpos biológicamente activos. En el documento US 7.129.330 se informa de una construcción de anticuerpo FV multivalente que tiene al menos cuatro dominios variables que están unidos entre sí por medio de conectores peptídicos. En el documento US 2005/0079170 se informa de estructuras de unión a antígeno diméricas y multiméricas. En el documento US 6.511.663 se informa de una proteína de unión a antígeno monoespecífica trivalente o tetravalente que comprende tres o cuatro fragmentos Fab unidos entre sí covalentemente por una estructura de conexión, cuya proteína no es una inmunoglobulina natural. En el documento WO 2006/020258 se informa de anticuerpos biespecíficos tetravalentes que se pueden expresar eficazmente en células procariotas y eucariotas, y son útiles en procedimientos terapéuticos y de diagnóstico. En el documento US 2005/0163782 se informa de un procedimiento para separar o sintetizar preferentemente dímeros que están unidos por medio de al menos un enlace disulfuro intercatenario de dímeros que no están unidos por medio de al menos un enlace disulfuro intercatenario de una mezcla que comprende los dos tipos de dímeros polipeptídicos. En el documento US 5.959.083 se informa de receptores tetravalentes biespecíficos. En el documento WO 2001/077342 se informa de anticuerpos genomanipulados con tres o más sitios de unión a antígeno funcionales.
En el documento WO 1997/001580 se informa de polipéptidos de unión a antígeno multiespecíficos y multivalentes. El documento WO 1992/004053 informa de homoconjugados, típicamente preparados a partir de anticuerpos monoclonales de la clase IgG que se unen al mismo determinante antigénico, que están unidos covalentemente por reticulación sintética. En el documento WO 1991/06305 se informa de anticuerpos monoclonales oligoméricos con alta avidez por el antígeno,
en donde los oligómeros, típicamente de la clase IgG, se secretan teniendo dos o más monómeros de inmunoglobulina asociados entre sí para formar moléculas de IgG tetravalentes o hexavalentes. En el documento US 6.350.860 se informa de anticuerpos derivados de ovejas y construcciones de anticuerpos genomanipulados, que se pueden usar para tratar enfermedades en las que la actividad de interferón gamma es patógena. En el documento US 2005/0100543 se informa de construcciones que se pueden dirigir a dianas que son vehículos multivalentes de anticuerpos biespecíficos, es decir, cada molécula de una construcción que se puede dirigir a dianas puede servir como un vehículo de dos o más anticuerpos biespecíficos. En el documento WO 1995/009917 se informa de anticuerpos tetravalentes biespecíficos genomanipulados. En el documento WO 2007/109254 se informa de moléculas de unión estabilizadas que consisten en o comprenden un scFv estabilizado.
En determinados modos de realización, el anticuerpo en un conjugado de acuerdo con la invención es un anticuerpo multiespecífico, por ejemplo, un anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos multiespecíficos son anticuerpos monoclonales que tienen especificidades de unión por al menos dos sitios diferentes. En determinados modos de realización, una de las especificidades de unión es por un hapteno y la otra es por cualquier otro antígeno (no hapteno). Los anticuerpos biespecíficos también se pueden usar para localizar agentes citotóxicos en las células. Se pueden preparar anticuerpos biespecíficos como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpo.
Las técnicas para preparar anticuerpos multiespecíficos incluyen, pero no se limitan a, la coexpresión recombinante de dos pares de cadena pesada y cadena ligera de inmunoglobulina que tienen especificidades diferentes (véase Milstein, C. y Cuello, A.C., Nature 305 (1983) 537-540, el documento w O 93/08829, y Traunecker, A. et al., e Mb O J.
10 (1991) 3655-3659), y genomanipulación de tipo "botón en ojal (knob-in-hole)" (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 5.731.168). También se pueden preparar anticuerpos multiespecíficos genomanipulando los efectos de conducción electrostática para preparar moléculas heterodiméricas de Fc de anticuerpo (documento WO 2009/089004); reticulando dos o más anticuerpos o fragmentos (véanse, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 4.676.980, y Brennan, M. et al., Science 229 (1985) 81-83); usando cremalleras de leucinas para producir anticuerpos biespecíficos (véase, por ejemplo, Kostelny, S.A. et al., J. Immunol. 148 (1992) 1547-1553); usando la tecnología de "diacuerpos" para preparar fragmentos de anticuerpo biespecífico (véase, por ejemplo, Holliger, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448); y usando dímeros de Fv monocatenarios (scFv) (véase, por ejemplo, Gruber, M. et al., J. Immunol. 152 (1994) 5368-5374); y preparando anticuerpos triespecíficos como se describe, por ejemplo, en Tutt, A. et al., J. Immunol. 147 (1991) 60-69).
En un modo de realización, los dominios CH3 de las cadenas pesadas del anticuerpo biespecífico bivalente se alteran por la tecnología "botón en ojal" que se describe en detalle con varios ejemplos, por ejemplo, en el documento WO 96/027011, el documento WO 98/050431, Ridgway J.B., et al., Protein Eng. 9 (1996) 617-621, y Merchant, A.M., et al., Nat. Biotechnol. 16 (1998) 677-681. En este procedimiento, las superficies de interacción de los dos dominios CH3 se alteran para incrementar la heterodimerización de ambas cadenas pesadas que contienen estos dos dominios CH3. Cada uno de los dos dominios CH3 (de las dos cadenas pesadas) puede ser el "botón", mientras que el otro es el "ojal". La introducción de un puente disulfuro estabiliza los heterodímeros (Merchant, A.M, et al., Nature Biotech. 16 (1998) 677-681, Atwell, S., et al. J. Mol. Biol. 270 (1997) 26-35) e incrementa el rendimiento.
En un modo de realización de todos los aspectos, el anticuerpo biespecífico se caracteriza por que
- el dominio CH3 de una cadena pesada y el dominio CH3 de la otra cadena pesada se encuentran cada uno en una interfase que comprende una interfase original entre los dominios CH3 del anticuerpo,
en el que dicha interfase se altera para promover la formación del anticuerpo biespecífico, en el que la alteración se caracteriza por que
a) se altera el dominio CH3 de una cadena pesada,
de modo que, dentro de la interfase original, el dominio CH3 de una cadena pesada que se encuentra con la interfase original del dominio CH3 de la otra cadena pesada dentro del anticuerpo biespecífico,
se reemplaza un residuo de aminoácido con un residuo de aminoácido que tiene un mayor volumen de cadena lateral, generando de este modo una protuberancia dentro de la interfase del dominio CH3 de una cadena pesada que se puede situar en una cavidad dentro de la interfase del dominio CH3 de la otra cadena pesada, y
b) se altera el dominio CH3 de la otra cadena pesada,
de modo que dentro de la interfase original del segundo dominio CH3 que se encuentra con la interfase original del primer dominio CH3 dentro del anticuerpo biespecífico,
se reemplaza un residuo de aminoácido con un residuo de aminoácido que tiene un volumen de cadena lateral más pequeño, generando de este modo una cavidad dentro de la interfase del segundo dominio CH3 dentro de la que se puede situar una protuberancia dentro de la interfase del primer dominio CH3.
Por tanto, los anticuerpos en un modo de realización se caracterizan por que
- el dominio CH3 de la primera cadena pesada del anticuerpo de longitud completa y el dominio CH3 de la segunda cadena pesada del anticuerpo de longitud completa se encuentran cada uno en una interfase que comprende una alteración en la interfase original entre los dominios CH3 del anticuerpo,
en el que i) en el dominio CH3 de la primera cadena pesada
se reemplaza un residuo de aminoácido con un residuo de aminoácido que tiene un mayor volumen de cadena lateral, generando de este modo una protuberancia dentro de la interfase del dominio CH3 de una cadena pesada que se puede situar en una cavidad dentro de la interfase del dominio CH3 de la otra cadena pesada
y en el que ii) en el dominio CH3 de la segunda cadena pesada
se reemplaza un residuo de aminoácido con un residuo de aminoácido que tiene un volumen de cadena lateral más pequeño, generando de este modo una cavidad dentro de la interfase del segundo dominio CH3 dentro de la que se puede situar una protuberancia dentro de la interfase del primer dominio CH3.
En un modo de realización, el residuo de aminoácido que tiene un mayor volumen de cadena lateral se selecciona del grupo que consiste en arginina (R), fenilalanina (F), tirosina (Y), triptófano (W).
En un modo de realización, el residuo de aminoácido que tiene un volumen de cadena lateral más pequeño se selecciona del grupo que consiste en alanina (A), serina (S), treonina (T), valina (V).
En un modo de realización, ambos dominios CH3 se alteran adicionalmente mediante la introducción de cisteína (C) como aminoácido en las posiciones correspondientes de cada dominio CH3, de modo que se pueda formar un puente disulfuro entre ambos dominios CH3.
En un modo de realización preferente, el anticuerpo multiespecífico comprende la mutación aminoacídica T366W en el primer dominio CH3 de la cadena "botón" y las mutaciones aminoacídicas T366S, L368A, Y407V en el segundo dominio CH3 de la cadena "ojal". También se puede usar un puente disulfuro intercatenario adicional entre los dominios CH3 (Merchant, A.M., et al., Nature Biotech. 16 (1998) 677-681), por ejemplo, introduciendo la mutación aminoacídica Y349C en el dominio CH3 de la cadena "ojal" y la mutación aminoacídica E356C o la mutación aminoacídica S354C en el dominio CH3 de la cadena "botón".
En un modo de realización, el anticuerpo biespecífico comprende las mutaciones Y349C, T366W en uno de los dos dominios CH3 y las mutaciones E356C, T366S, L368A, Y407V en el otro de los dos dominios CH3. En un modo de realización, el anticuerpo biespecífico comprende las mutaciones Y349C, T366W en uno de los dos dominios CH3 y las mutaciones S354C, T366S, L368A, Y407V en el otro de los dos dominios CH3 (la mutación Y349C adicional en un dominio CH3 y la mutación E356C o S354C adicional en el otro dominio CH3 que forma un puente disulfuro intercatenario) (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat (Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991))). También se pueden usar de forma alternativa o adicionalmente otras tecnologías de botón en ojal, como se describe en el documento EP 1 870 459 A1. Por tanto, otro ejemplo para el anticuerpo biespecífico son las mutaciones R409D y K370E en el dominio CH3 de la cadena "botón" y las mutaciones D399K y E357K en el dominio CH3 de la cadena "ojal" (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat (Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991))).
En un modo de realización, el anticuerpo biespecífico comprende una mutación T366W en el dominio CH3 de la cadena "botón" y las mutaciones T366S, L368A, Y407V en el dominio CH3 de la cadena "ojal" y, adicionalmente, las mutaciones R409D, K370E en el dominio CH3 de la cadena "botón" y las mutaciones D399K, E357K en el dominio CH3 de la cadena "ojal".
En un modo de realización, el anticuerpo biespecífico comprende las mutaciones Y349C, T366W en uno de los dos dominios CH3 y las mutaciones S354C, T366S, L368A e Y407V en el otro de los dos dominios CH3, o el anticuerpo biespecífico comprende las mutaciones Y349C, T366W en uno de los dos dominios CH3 y las mutaciones S354C, T366s , L368A e Y407V en el otro de los dos dominios CH3 y, adicionalmente, las mutaciones R409D, K370E en el dominio CH3 de la cadena "botón" y las mutaciones D399K, E357K en el dominio CH3 de la cadena "ojal". Dichas mutaciones de botón y ojal en el dominio CH3 se usan típicamente en regiones constantes de la cadena pesada humana de SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 171 o SEQ ID NO: 172 (alotipos de subclase IgG1 humana (caucásicos y afroamericanos o mutantes L234A/L235A y L234A/L235A/P329G), SEQ ID NO: 173, SEQ ID NO: 174 o SEQ ID n O: 175 (subclase de IgG4 humana o mutantes S228P, L235E y s 228P/L235E/P329G) (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)).
En un modo de realización, el anticuerpo biespecífico comprende regiones constantes de la cadena pesada humana de SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 171 o SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO: 173, SEQ ID NO: 174 o SEQ ID NO: 175 que incluye además dichas mutaciones de "botón" y "ojal" en el dominio CH3 (por ejemplo, mutaciones Y349C, T366W en uno de los dos dominios CH3 y mutaciones S354C, T366S, L368A, Y407V en el otro de los dos dominios CH3) (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md (1991)).
También se incluyen en el presente documento anticuerpos genomanipulados con tres o más sitios de unión a antígeno funcionales, incluyendo los "anticuerpos pulpo" (véase, por ejemplo, el documento US 2006/0025576).
El anticuerpo o fragmento en el presente documento también incluye un "Fab de doble acción" o "DAF" que comprende un sitio de unión a antígeno que se une a un hapteno, así como otro antígeno diferente (véase el documento US 2008/0069820, por ejemplo).
El anticuerpo o fragmento en el presente documento también incluye anticuerpos multiespecíficos descritos en los documentos WO 2009/080251, WO 2009/080252, WO 2009/080253, WO 2009/080254, WO 2010/112193, WO 2010/115589, WO 2010/136172, WO 2010/145792 y WO 2010/145793.
En un modo de realización preferente, el anticuerpo multiespecífico (que comprende un dominio CH3 en cada cadena pesada) comprende las mutaciones aminoacídicas S354C, T366W en uno de los dos dominios CH3 y las mutaciones aminoacídicas Y349C, T366S, L368A, Y407V en el otro de los dos dominios CH3 (la mutación aminoacídica S354C adicional en un dominio CH3 y la mutación aminoacídica Y349C en el otro dominio CH3 que forma un puente disulfuro intercatenario) (numeración de acuerdo con Kabat).
Otras técnicas de modificaciones de CH3 para garantizar la heterodimerización se contemplan como alternativas y se describen por ejemplo, en los documentos WO 96/27011, WO 98/050431, EP 1870459, WO 2007/110205, WO 2007/147901, WO 2009/089004, WO 2010/129304, WO 2011/90754, WO 2011/143545, WO 2012/058768, WO 2013/157954, WO 2013/096291.
En un modo de realización se usa el enfoque de heterodimerización descrito en el documento EP 1870 459 A1. Este enfoque se basa en la introducción de sustituciones/mutaciones de aminoácidos cargados con la carga opuesta en posiciones aminoacídicas específicas en la interfase de los dominios CH3/CH3 entre ambas cadenas pesadas. En un modo de realización preferente, el anticuerpo multiespecífico comprende las mutaciones aminoacídicas R409D, K370E en el dominio CH3 de la primera cadena pesada (del anticuerpo multiespecífico) y las mutaciones aminoacídicas D399K, E357K en el segundo dominio CH3 de la segunda cadena pesada (del anticuerpo multiespecífico) (numeración de acuerdo con Kabat).
En otro modo de realización, el anticuerpo multiespecífico comprende la mutación aminoacídica T366W en el dominio CH3 de la cadena "botón" y las mutaciones aminoacídicas T366S, L368A, Y407V en el dominio CH3 de la cadena "ojal" y, adicionalmente, las mutaciones aminoacídicas R409D, K370E en el dominio CH3 de la cadena "botón" y las mutaciones aminoacídicas D399K, E357K en el dominio CH3 de la cadena "ojal".
En otro modo de realización, el anticuerpo multiespecífico comprende las mutaciones aminoacídicas S354C, T366W en uno de los dos dominios CH3 y las mutaciones aminoacídicas Y349C, T366S, L368A, Y407V en el otro de los dos dominios CH3 o el anticuerpo multiespecífico comprende las mutaciones aminoacídicas Y349C, T366W en uno de los dos dominios CH3 y las mutaciones aminoacídicas S354C, T366S, L368A, Y407V en el otro de los dos dominios CH3 y, adicionalmente, las mutaciones aminoacídicas R409D, K370E en el dominio CH3 de la cadena "botón" y las mutaciones aminoacídicas D399K, E357K en el dominio CH3 de la cadena "ojal".
En un modo de realización se usa el enfoque de heterodimerización descrito en el documento WO 2013/157953. En un modo de realización, el primer dominio CH3 comprende la mutación aminoacídica T366K y el segundo dominio CH3 comprende la mutación aminoacídica L351D. En otro modo de realización, el primer dominio CH3 comprende además la mutación aminoacídica L351K. En otro modo de realización, el segundo dominio CH3 comprende además una mutación aminoacídica seleccionada de Y349E, Y349D y L368E (preferentemente L368E).
En un modo de realización se usa el enfoque de heterodimerización descrito en el documento WO 2012/058768. En un modo de realización, el primer dominio CH3 comprende las mutaciones aminoacídicas L351Y, Y407A y el segundo dominio CH3 comprende las mutaciones aminoacídicas T366A, K409F. En otro modo de realización, el segundo dominio CH3 comprende otra mutación aminoacídica en la posición T411, D399, S400, F405, N390 o K392, por ejemplo, seleccionada de a) T411N, T411R, T411Q, T411K, T411D, T411E o T411W, b) D399R, D399W, D399Y o D399K, c) S400E, S400D, S400R o S400K, F405I, F405M, F405T, F405S, F405V o F405W, N390R, N390K o N390D, K392V, K392M, K392R, K392L, K392F o K392E. En otro modo de realización, el primer dominio CH3 comprende las mutaciones aminoacídicas L351Y, Y407A y el segundo dominio CH3 comprende las mutaciones aminoacídicas T366V, K409F. En otro modo de realización, el primer dominio CH3 comprende la mutación aminoacídica Y407A y el segundo dominio CH3 comprende las mutaciones aminoacídicas T366A, K409F. En otro modo de realización, el segundo dominio CH3 comprende además las mutaciones aminoacídicas K392E, T411E, D399R y S400R.
En un modo de realización se usa el enfoque de heterodimerización descrito en el documento WO 2011/143545, por ejemplo, con la modificación aminoacídica en una posición seleccionada del grupo que consiste en 368 y 409.
En un modo de realización se usa el enfoque de heterodimerización descrito en el documento WO 2011/090762, que también usa la tecnología de botón en ojal descrita anteriormente. En un modo de realización, el primer dominio CH3 comprende la mutación aminoacídica T366W y el segundo dominio CH3 comprende la mutación aminoacídica Y407A. En un modo de realización, el primer dominio CH3 comprende la mutación aminoacídica T366Y y el segundo dominio CH3 comprende la mutación aminoacídica Y407T.
En un modo de realización, el anticuerpo multiespecífico es de isotipo IgG2 y se usa el enfoque de heterodimerización descrito en el documento WO 2010/129304.
En un modo de realización se usa el enfoque de heterodimerización descrito en el documento WO 2009/089004. En un modo de realización, el primer dominio CH3 comprende la sustitución del residuo de aminoácido K392 o N392 por un aminoácido cargado negativamente (por ejemplo, ácido glutámico (E) o ácido aspártico (D), preferentemente K392D o N392D) y el segundo dominio CH3 comprende la sustitución del residuo de aminoácido D399, E356, D356 o E357 por un aminoácido cargado positivamente (por ejemplo, lisina (K) o arginina (R), preferentemente D399K, E356K, D356K o E357K, y más preferentemente D399K y E356K). En otro modo de realización, el primer dominio CH3 comprende además la sustitución del residuo de aminoácido K409 o R409 por un aminoácido cargado negativamente (por ejemplo, ácido glutámico (E) o ácido aspártico (D), preferentemente K409D o R409D). En otro modo de realización, el primer dominio CH3 comprende además o de forma alternativa la sustitución del residuo de aminoácido K439 y/o K370 por un aminoácido cargado negativamente (por ejemplo, ácido glutámico (E) o ácido aspártico (D)).
En un modo de realización se usa el enfoque de heterodimerización descrito en el documento W02007/147901. En un modo de realización, el primer dominio CH3 comprende las mutaciones aminoacídicas K253E, D282K y K322D y el segundo dominio CH3 comprende las mutaciones aminoacídicas D239K, E240K y K292D.
En un modo de realización se usa el enfoque de heterodimerización descrito en el documento W02007/110205.
En un modo de realización, la primera especificidad de unión del anticuerpo biespecífico es a un hapteno y la segunda especificidad de unión es a un antígeno no hapteno. En un modo de realización, el antígeno no hapteno se selecciona de los marcadores leucocitarios, CD2, CD3, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8, CD11a, b, c, CD13, CD14, CD18, CD19, CD22, CD23, CD27 y su ligando, CD28 y sus ligandos B7.1, B7.2, B7.3, CD29 y su ligando, CD30 y su ligando, CD40 y su ligando gp39, CD44, CD45 e isoformas, CD56, CD58, CD69, CD72, CTLA- 4, LFA-1 y TCR; los antígenos de histocompatibilidad, MHC de clase I o II, los antígenos de Lewis Y, SLex, SLey, SLea y SLeb; las integrinas, VLA-1, VLA-2, VLA-3, VLA-4, VLA-5, VLA-6, aVp3 y LFA-1, Mac-1 y pl50,95, aVpi, gplIblIIa, aR p3, a6p4, aVp6 y aV 62 7; las selectinas, L-selectina, P-selectina y E-selectina y sus contrarreceptores VCAM-1, ICAM-1, ICAM-2 y LFA-3; las interleucinas, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14 e IL-15; el receptor de interleucina se selecciona del grupo que consiste en IL-1R, IL-2R, IL-3R, IL-4R, IL-5R, IL-6R, IL-7R, IL-8R, IL-9R, IL-10R, IL-11R, IL-12R, IL-13R, IL-14R e IL-15R; la quimiocina se selecciona del grupo que consiste en PF4, RANTES, MIP1a, MCP1, NAP-2, Groa, Grop e IL-8; el factor de crecimiento se selecciona del grupo que consiste en TNFalfa, TGFbeta, TSH, VEGF/VPF, VEGFA, VEGFB, VEGF111, VEGF121, VEGF165, VEGF189, VEGF206, PTHrP, familia de EGF, familia de PDGF, endotelina, fibrosina (FSF-1), péptido liberador de gastrina y laminina humana (GRP), PLGF, HGH, HGHR; el receptor del factor de crecimiento se selecciona del grupo que consiste en TNFalfaR, RGFbetaR, TSHR, VEGFR/VPFR, EGFR, PTHrPR, familia de PDGFR, EPO-R, GCs F-R y otros receptores hematopoyéticos; el receptor de interferón se selecciona del grupo que consiste en IFNCaR, IFNpR e IFNAR; la Ig y su receptor se seleccionan del grupo que consiste en IgE, FcyRI y FcyRII; el antígeno tumoral se selecciona del grupo que consiste en her2-neu, mucina, CEA y endosialina; el alérgeno se selecciona del grupo que consiste en antígeno de ácaros del polvo doméstico, antígenos lol p1 (hierba) y urushiol; el polipéptido vírico se selecciona del grupo que consiste en glucoproteínas B, H y gCIII de CMV, glucoproteínas de la envoltura del VIH-1, glucoproteínas de la envoltura del RSV, glicoproteínas de envoltura de VHS, glucoproteínas de envoltura de VPH, antígenos de superficie de la familia de la hepatitis; la toxina se selecciona del grupo que consiste en endotoxina de pseudomonas y osteopontina/uropontina, veneno de serpiente, veneno de araña y conotoxina de veneno de abeja; el factor sanguíneo se selecciona del grupo que consiste en complemento C3b, complemento C4a, complemento C4b-9, factor Rh, fibrinógeno, fibrina e inhibidor del crecimiento asociado a la mielina; y la enzima se selecciona del grupo que consiste en polipéptido de transferencia de éster de colesterol, metaloproteasas de matriz unidas a la membrana y descarboxilasa de ácido glutámico (GAD).
Variantes de anticuerpo
En el presente documento se divulgan variantes de secuencia de aminoácidos de los anticuerpos proporcionados. Por ejemplo, puede ser deseable mejorar la afinidad de unión y/u otras propiedades biológicas del anticuerpo. Se pueden preparar variantes de secuencia de aminoácidos de un anticuerpo introduciendo modificaciones apropiadas en la secuencia de nucleótidos que codifica el anticuerpo o por síntesis peptídica. Dichas modificaciones incluyen, por ejemplo, deleciones de, y/o inserciones en y/o sustituciones de residuos dentro de las secuencias de aminoácidos del anticuerpo. Se puede realizar cualquier combinación de deleción, inserción y sustitución para llegar a la construcción final, siempre que la construcción final posea las características deseadas, por ejemplo, unión a antígeno.
a) Variantes de sustitución, inserción y deleción
Se divulgan variantes de anticuerpo que tienen una o más sustituciones aminoacídicas. Los sitios de interés para la mutagénesis de sustitución incluyen las HVR y las FR. Se pueden introducir sustituciones aminoacídicas en un anticuerpo de interés y cribar los productos para determinar una actividad deseada, por ejemplo, conservación/mejora de unión a antígeno, disminución en inmunogenicidad o mejora en ADCC o CDC.
Tabla 2
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Los aminoácidos se pueden agrupar de acuerdo con propiedades de cadena lateral comunes:
(1) hidrófobos: norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) hidrófilos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) ácidos: Asp, Glu;
(4) básicos: His, Lys, Arg;
(5) residuos que influyen en la orientación de la cadena: Gly, Pro;
(6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe.
Las sustituciones no conservadoras supondrán intercambiar un miembro de una de estas clases por otra clase. Un tipo de variante de sustitución implica sustituir uno o más residuos de la región hipervariable de un anticuerpo original (por ejemplo, un anticuerpo humanizado o humano). En general, la(s) variante(s) resultante(s) seleccionada(s) para estudio adicional tendrá(n) modificaciones (por ejemplo, mejoras) en determinadas propiedades biológicas (por ejemplo, incremento en afinidad, reducción en inmunogenicidad) en relación con el anticuerpo original y/o habrá(n) conservado sustancialmente determinadas propiedades biológicas del anticuerpo original. Una variante de sustitución ejemplar es un anticuerpo de afinidad madurada que se puede generar convenientemente, por ejemplo, usando técnicas de maduración de la afinidad basadas en presentación en fagos, tales como las descritas en el presente documento. En resumen, se mutan uno o más residuos de HVR y los anticuerpos variantes se presentan en fagos y se criban para determinar una actividad biológica particular (por ejemplo, afinidad de unión).
Se pueden realizar alteraciones (por ejemplo, sustituciones) en las HVR, por ejemplo, para mejorar la afinidad del anticuerpo. Se pueden realizar dichas alteraciones en “puntos calientes” de la HVR, es decir, residuos codificados por codones que se someten a una mutación con frecuencia alta durante el proceso de maduración somática (véase, por ejemplo, Chowdhury, P.S., Methods Mol. Biol. 207 (2008) 179-196), y/o SDR (a-CDR), sometiendo a prueba el v H o VL variante resultante para determinar la afinidad de unión. Se ha descrito la maduración de la afinidad por la construcción y reselección de colecciones secundarias, por ejemplo, en Hoogenboom, H.R. et al., en Methods in Molecular Biology 178 (2002) 1-37. En la maduración de la afinidad, se introduce diversidad en los genes variables elegidos para la maduración por cualquiera de una variedad de procedimientos (por ejemplo, PCR propensa a error, reordenamiento de cadenas o mutagénesis dirigida por oligonucleótidos). A continuación, se crea una segunda colección. A continuación, se criba la colección para identificar cualquier variante de anticuerpo con la afinidad deseada. Otro procedimiento para introducir diversidad implica enfoques dirigidos a HVR, en los que se aleatorizan varios residuos de HVR (por ejemplo, 4-6 residuos a la vez). Se pueden identificar específicamente residuos de HVR implicados en la unión a antígeno, por ejemplo, usando modelado o mutagénesis por barrido de alanina. La CDR3 de la cadena pesada y la CDR3 de la cadena ligera en particular a menudo son las dianas.
Se pueden producir sustituciones, inserciones o deleciones dentro de una o más HVR, siempre que dichas alteraciones no reduzcan sustancialmente la capacidad del anticuerpo de unirse al antígeno. Por ejemplo, se pueden realizar alteraciones conservadoras (por ejemplo, sustituciones conservadoras como se proporciona en el presente documento) que no reduzcan sustancialmente la afinidad de unión en HVR. Dichas alteraciones pueden estar fuera de los "puntos calientes" de la HVR o las SDR. En las secuencias de VH y VL variantes proporcionadas anteriormente, cada HVR está inalterada o bien no contiene más de una, dos o tres sustituciones aminoacídicas.
Un procedimiento útil para la identificación de residuos o regiones de un anticuerpo que se puede seleccionar para la mutagénesis se llama "mutagénesis por barrido de alanina" como se describe en Cunningham, B.C. y Wells, J.A., Science 244 (1989) 1081-1085. En este procedimiento se identifica un residuo o grupo de residuos diana (por ejemplo, residuos cargados, tales como Arg, Asp, His, Lys y Glu) y se reemplazan por un aminoácido neutro o cargado negativamente (por ejemplo, alanina o polialanina) para determinar si la interacción del anticuerpo con el antígeno se ve afectada. Se pueden introducir otras sustituciones en las localizaciones de aminoácidos que demuestren sensibilidad funcional a las sustituciones iniciales. De forma alternativa, o adicionalmente, una estructura cristalina de un complejo antígeno-anticuerpo para identificar los puntos de contacto entre el anticuerpo y el antígeno. Dichos residuos de contacto y residuos adyacentes se pueden seleccionar o eliminar como candidatos para sustitución. Se pueden cribar variantes para determinar si contienen las propiedades deseadas.
Las inserciones en la secuencia de aminoácidos incluyen fusiones amino y/o carboxiterminales que varían en longitud de un residuo a polipéptidos que contienen cien o más residuos, así como inserciones intrasecuenciales de residuos aminoacídicos individuales o múltiples. Los ejemplos de inserciones terminales incluyen un anticuerpo con un residuo de metionilo N terminal. Otras variantes de inserción de la molécula de anticuerpo incluyen la fusión en el extremo N o C del anticuerpo con una enzima (por ejemplo, para ADEPT) o un polipéptido que incrementa la semivida en suero del anticuerpo.
b) Variantes de glucosilación
En determinados modos de realización se altera un anticuerpo comprendido en un conjugado de acuerdo con la invención para incrementar o disminuir el grado en el que el anticuerpo se glucosila. La adición o deleción de sitios de glucosilación en un anticuerpo se puede lograr convenientemente alterando la secuencia de aminoácidos de modo que se crean o se retiran uno o más sitios de glucosilación.
Cuando el anticuerpo comprende una región Fc, se puede alterar el carbohidrato unido a la misma. Los anticuerpos naturales producidos por células de mamífero típicamente comprenden un oligosacárido biantenario ramificado que se une, en general, por un enlace N a Asn297 del dominio CH2 de la región Fc. Véase, por ejemplo, Wright, A. y Morrison, S.L., TIBTECH15 (1997) 26-32. El oligosacárido puede incluir diversos carbohidratos, por ejemplo, manosa, N-acetilglucosamina (GlcNAc), galactosa y ácido siálico, así como una fucosa unida a una GlcNAc en el "tallo" de la estructura de oligosacárido biantenario. En algunos modos de realización, se pueden realizar modificaciones del oligosacárido en un anticuerpo para crear variantes de anticuerpo con una mejora en determinadas propiedades.
En un modo de realización, se proporcionan variantes de anticuerpo que tienen una estructura carbohidratada que carece de fucosa unida (directa o indirectamente) a una región Fc. Por ejemplo, la cantidad de fucosa en dicho anticuerpo puede ser de un 1 % a un 80 %, de un 1 % a un 65 %, de un 5 % a un 65 % o de un 20 % a un 40 %. La cantidad de fucosa se determina calculando la cantidad promedio de fucosa dentro de la cadena glucídica en Asn297, en relación con la suma de todas las glucoestructuras unidas a Asn297 (por ejemplo, estructuras complejas, híbridas y de alto contenido en manosa) como se mide por espectrometría de masas mA l DI-TOF, como se describe en el documento WO 2008/077546, por ejemplo. Asn297 se refiere al residuo de asparagina localizado en aproximadamente la posición 297 en la región Fc (numeración EU de los residuos de la región Fc); sin embargo, Asn297 también se puede localizar aproximadamente ± 3 aminoácidos corriente arriba o corriente abajo de la posición 297, es decir, entre las posiciones 294 y 300, debido a variaciones de secuencia insignificantes en los anticuerpos. Dichas variantes de fucosilación pueden tener una mejora en la función ADCC. Véanse, por ejemplo, los documentos US 2003/0157108; US 2004/0093621. Los ejemplos de publicaciones relacionadas con variantes de anticuerpo "desfucosilado" o "carente de fucosa" incluyen: los documentos US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO 2005/053742; WO 2002/031140; Okazaki, A., et al., J. Mol. Biol. 336 (2004) 1239-1249; Yamane-Ohnuki, N., et al., Biotech. Bioeng. 87 (2004) 614-622. Los ejemplos de líneas celulares que pueden producir anticuerpos desfucosilados incluyen células CHO Lec13 carentes de fucosilación de proteínas (Ripka, J. et al., Arch. Biochem. Biophys. 249 (1986) 533-545; los documentos US 2003/0157108; y WO 2004/056312, en especial en el ejemplo 11) y líneas celulares con desactivación génica, tales como el gen de alfa-1,6-fucosiltransferasa, FUT8, células CHO con desactivación génica (véanse, por ejemplo, Yamane-Ohnuki, N. et al., Biotech. Bioeng. 87 (2004) 614-622; Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng. 94 (2006) 680­ 688; y el documento WO 2003/085107).
Se proporcionan además variantes de anticuerpos con oligosacáridos bisecados, por ejemplo, en las que un oligosacárido biantenario unido a la región Fc del anticuerpo se biseca por GlcNAc. Dichas variantes de anticuerpo pueden tener una reducción en la fucosilación y/o una mejora en la función ADCC. Se describen ejemplos de dichas variantes de anticuerpo, por ejemplo, en el documento WO 2003/011878; la patente de EE. UU. n.° 6.602.684 y el documento US 2005/0123546. También se proporcionan variantes de anticuerpo con al menos un residuo de galactosa en el oligosacárido unido a la región Fc. Dichas variantes de anticuerpo pueden tener una mejora en la función CDC. Dichas variantes de anticuerpo se describen, por ejemplo, en los documentos WO 1997/30087; WO 1998/58964; y WO 1999/22764.
c) Variantes de la región Fc
Se pueden introducir una o más modificaciones de aminoácidos en la región Fc de un anticuerpo proporcionado en el presente documento, generando de este modo una variante de la región Fc. La variante de la región Fc puede comprender una secuencia de la región Fc humana (por ejemplo, una región Fc de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 humana) que comprende una modificación aminoacídica (por ejemplo, una sustitución) en una o más posiciones aminoacídicas.
En el presente documento se divulga una variante de anticuerpo que posee algunas pero no todas las funciones efectoras, lo que le convierte en un candidato deseable para aplicaciones en las que la semivida del anticuerpo in vivo es importante, aunque determinadas funciones efectoras (tales como complemento y ADCC) son innecesarias o perjudiciales. Se pueden realizar ensayos de citotoxicidad in vitro y/o in vivo para confirmar la reducción/disminución de las actividades CDC y/o ADCC. Por ejemplo, se pueden realizar ensayos de unión a receptor de Fc (FcR) para garantizar que el anticuerpo carece de unión a FcyR (por tanto probablemente carece de actividad ADCC), pero conserva su capacidad de unión a FcRn. Las principales células mediadoras de la CCDA, los linfocitos NK, expresan solamente FcRIII, mientras que los monocitos expresan FcyRI, FcyRII y FcyRIII. La expresión de FcR en células hematopoyéticas se resume en la tabla 3 en la página 464 de Ravetch, J.V. y Kinet, J.P., Annu. Rev. Immunol. 9 (1991) 457-492. Ejemplos no limitantes de ensayos in vitro para evaluar la actividad de ADCC de una molécula de interés se describen en la patente de EE. UU. n.° 5.500.362 (véase, por ejemplo, Hellstrom, I., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986) 7059-7063; y Hellstrom, I., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985) 1499-1502); la patente de EE. UU. n.° 5.821.337 (véase Bruggemann, M., et al., J. Exp. Med. 166 (1987) 1351-1361). De forma alternativa, se pueden emplear procedimientos de ensayo no radioactivo (véase, por ejemplo, el ensayo de citotoxicidad no radioactivo ACTI™ para citometría de flujo [CellTechnology, Inc. Mountain View, CA]; y el ensayo de citotoxicidad no radioactivo CytoTox 96® [Promega, Madison, WI]). Las células efectoras útiles para dichos ensayos incluyen leucocitos monomorfonucleares en sangre periférica (PBMC) y linfocitos citolíticos naturales (NK). De forma alternativa, o adicionalmente, se puede evaluar in vivo la actividad ADCC de la molécula de interés, por ejemplo, en un modelo animal tal como el divulgado en Clynes, R. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (1998) 652-656. También se pueden llevar a cabo ensayos de unión a C1q para confirmar que el anticuerpo no se puede unir a C1q y por tanto carece de actividad CDC. Véase, por ejemplo, ELISA de unión de C1q y c 3c en los documentos w O 2006/029879 y WO 2005/100402. Para evaluar la activación del complemento, se puede realizar un ensayo de CDC (véanse, por ejemplo, Gazzano-Santoro, H., et al., J. Immunol. Methods 202 (1996) 163-171; Cragg, M.S., et al., Blood 101 (2003) 1045­ 1052; y Cragg, M.S. y M.J. Glennie, Blood 103 (2004) 2738-2743). También se pueden realizar determinaciones de unión a FcRn y eliminación/semivida in vivo usando procedimientos conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Petkova, S.B. et al., Int. Immunol. 18 (2006) 1759-1769).
Los anticuerpos con función efectora reducida incluyen aquellos con sustitución de uno o más de los residuos de la región Fc 238, 265, 269, 270, 297, 327 y 329 (patente de EE. UU. n.° 6.737.056). Dichos mutantes Fc incluyen mutantes Fc con sustituciones en dos o más de las posiciones aminoacídicas 265, 269, 270, 297 y 327, incluyendo el llamado mutante Fc "DANA" con sustitución de los residuos 265 y 297 con alanina (patente de EE. UU. n.° 7.332.581).
Se describen determinadas variantes de anticuerpo con una mejora o disminución en la unión a FcR. (Véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 6.737.056; el documento WO 2004/056312, y Shields, R.L. et al., J. Biol. Chem.
276 (2001) 6591-6604).
Una variante de anticuerpo puede comprender una región Fc con una o más sustituciones aminoacídicas que mejoran la ADCC, por ejemplo, las sustituciones en las posiciones 298, 333 y/o 334 de la región Fc (numeración EU de los residuos).
Se hacen alteraciones en la región Fc, que dan como resultado una unión a C1q y/o una citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) alteradas (es decir, bien mejoradas o disminuidas), por ejemplo, como se describe en la patente de EE. UU. n.° 6.194.551, el documento WO 99/51642 e Idusogie, E.E., et al., J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184.
Se describen anticuerpos con un incremento en las semividas y una mejora en la unión al receptor de Fc neonatal (FcRn), que es responsable de la transferencia de IgG maternas al feto (Guyer, R.L., et al., J. Immunol. 117 (1976) 587-593, y Kim, J.K., et al., J. Immunol. 24 (1994) 2429-2434) en el documento US 2005/0014934. Estos anticuerpos comprenden una región Fc con una o más sustituciones en la misma que mejoran la unión de la región Fc a FcRn. Dichas variantes de Fc incluyen las de sustituciones en uno o más de los residuos de la región Fc: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 o 434, por ejemplo, sustitución del residuo 434 de la región Fc (patente de EE. UU. n.° 7.371.826).
Véanse también Duncan, A.R. y Winter, G., Nature 322 (1988) 738-740; los documentos US 5.648.260; US 5.624.821; y WO 94/29351 en relación con otros ejemplos de variantes de la región Fc.
En un modo de realización preferente, el anticuerpo comprende en ambas cadenas pesadas las mutaciones L234A, L235A y P329G (numeración de acuerdo con el índice EU).
d) Variantes de anticuerpos genomanipulados con cisteína
Puede ser deseable crear anticuerpos genomanipulados con cisteína, por ejemplo, "tioMAb", en los que uno o más residuos de un anticuerpo se sustituyen por residuos de cisteína. En modos de realización particulares, los residuos sustituidos se producen en sitios accesibles del anticuerpo. Al sustituir esos residuos con cisteína, los grupos tiol reactivos se sitúan de este modo en sitios accesibles del anticuerpo y se pueden usar para conjugar el anticuerpo a otros restos, tales como restos de fármaco o restos de conector-fármaco, para crear un inmunoconjugado, como se describe además en el presente documento. En determinados modos de realización se puede sustituir uno cualquiera o más de los siguientes residuos con cisteína: V205 (numeración de Kabat) de la cadena ligera; A118 (numeración EU) de la cadena pesada; y S400 (numeración EU) de la región Fc de la cadena pesada. Se pueden generar anticuerpos genomanipulados con cisteína como se describe, por ejemplo, en la patente de EE. UU. n.° 7.521.541.
e) Derivados de anticuerpos
Un anticuerpo divulgado en el presente documento se puede modificar además para que contenga restos no proteínicos adicionales que son conocidos en la técnica y están fácilmente disponibles. Los restos adecuados para la derivatización del anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, polímeros hidrosolubles. Los ejemplos no limitantes de polímeros hidrosolubles incluyen, pero no se limitan a, polietilenglicol (PEG), copolímeros de etilenglicol/propilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano, poli(alcohol vinílico), polivinilpirrolidona, poli-1,3-dioxolano, poli-1,3,6-trioxano, copolímero de etileno/anhídrido maleico, poliaminoácidos (homopolímeros o bien copolímeros aleatorios) y dextrano o poli(n-vinilpirrolidona)polietilenglicol, homopolímeros de polipropilenglicol, copolímeros de óxido de polipropileno/óxido de etileno, polioles polioxietilados (por ejemplo, glicerol), poli(alcohol vinílico) y mezclas de los mismos. El polietilenglicol-propionaldehído puede tener ventajas en la fabricación debido a su estabilidad en agua. El polímero puede ser de cualquier peso molecular y puede ser ramificado o no ramificado. El número de polímeros unidos al anticuerpo puede variar y, si se une más de un polímero, pueden ser moléculas iguales o diferentes. En general, el número y/o tipo de polímeros usados para la derivatización se puede determinar en base a consideraciones incluyendo, pero sin limitarse a, las propiedades o funciones particulares del anticuerpo que se van a mejorar, ya sea si el derivado de anticuerpo se usará en un tratamiento en condiciones definidas, etc.
Compuestos haptenilados
El hapteno en un conjugado de acuerdo con la invención se puede conjugar, si no es por sí mismo una de las moléculas, con un agente terapéutico (fármaco), un agente citotóxico (por ejemplo, una toxina tal como la doxorrubicina o la toxina de la tos ferina), un fluoróforo tal como un tinte fluorescente como la fluoresceína o la rodamina, un agente quelante para un metal radioterapéutico o de formación de imágenes, un marcador peptidilo o no peptidilo o un marcador de detección o un agente modificador del aclaramiento tal como diversos isómeros de polietilenglicol, un péptido que se une a un tercer componente u otro carbohidrato o agente lipófilo. Dicho conjugado se denomina compuesto haptenilado. La conjugación puede ser directa o por medio de un conector intermedio.
a) Restos terapéuticos
El resto de fármaco (D) del conjugado hapteno-fármaco (ADC, fármaco haptenilado) puede ser cualquier compuesto, resto o grupo que tenga un efecto citotóxico o citostático. Los restos de fármaco incluyen: (i) agentes quimioterápicos que pueden funcionar como inhibidores de microtúbulos, inhibidores de mitosis, inhibidores de topoisomerasa o intercaladores de ADN; (ii) toxinas proteicas, que pueden funcionar enzimáticamente; y (iii) radioisótopos.
Los restos de fármaco ejemplares incluyen, pero no se limitan a, una maitansinoide, una auristatina, una dolastatina, un tricoteceno, CC1065, una caliqueamicina y otros antibióticos enediinos, un taxano, una antraciclina y estereoisómeros, isósteres, análogos o derivados de los mismos.
Las toxinas proteicas incluyen la cadena A de la difteria, los fragmentos activos que no se unen de la toxina de la difteria, la cadena A de la exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), la cadena A de la ricina (Vitetta et al. (1987) Science, 238:1098), la cadena A de la abrina, la cadena A de la modecina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII y PAP -5), inhibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y los tricotecenos (documento WO 93/21232).
Los radioisótopos terapéuticos incluyen 32P, 33P, 90Y, 125I, 1311, 131 In, 153Sm, 186Re, 188Re, 211 At, 212B, 212Pb e isótopos radiactivos de Lu.
El radioisótopo u otros marcadores se pueden incorporar de formas conocidas (Fraker et al. (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80:49-57; "Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy" Chatal, CRC Press 1989). El ácido 1-isotiocianatobencil-3-metildietilentriaminopentaacético (MX-DTPA) marcado con carbono 14 es un agente quelante ejemplar para la conjugación del radionúclido al complejo (documento WO 94/11026).
b) Marcadores
El compuesto haptenilado puede ser un marcador haptenilado. Se puede usar cualquier resto de marcador que se pueda unir covalentemente al hapteno (véase, por ejemplo, Singh et al. (2002) Anal. Biochem. 304:147-15; Harlow E. y Lane, D. (1999) Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Lundblad R. L. (1991) Chemical Reagents for Protein Modification, 2.a ed. CRC Press, Boca Ratón, Florida). El marcador puede funcionar para: (i) proporcionar una señal detectable; (ii) interactuar con un segundo marcador para modificar la señal detectable proporcionada por el primer o segundo marcador, por ejemplo, para proporcionar FRET (transferencia de energía por resonancia de fluorescencia); (iii) afectar a la movilidad, por ejemplo, movilidad electroforética o permeabilidad celular, por carga, hidrofobicidad, forma u otros parámetros físicos, o (iv) proporcionar un resto de captura, por ejemplo, para modular la complejación iónica.
Los conjugados que comprenden un marcador haptenilado como se informa en el presente documento pueden ser útiles en ensayos de diagnóstico, por ejemplo, para detectar la expresión de un antígeno de interés en células, tejidos o suero específicos. Para aplicaciones de diagnóstico, se usará un anticuerpo biespecífico en el que la primera especificidad de unión se une a una diana y la segunda especificidad de unión se une a un marcador haptenilado. El hapteno se marcará típicamente con un resto detectable. Están disponibles numerosos marcadores que se pueden agrupar en general en las siguientes categorías:
(a) radioisótopos (radionúclidos), tales como 3H, 11C, 14C, 18F, 32P, 35S, 64Cu, 68Gn, 86Y, 89Zr, 99TC, 111In, 123I, 124I, 125i, 1311, 133Xe, 177Lu, 211At o 131Bi. Los conjugados marcados con radioisótopos son útiles en experimentos de formación de imágenes dirigidos a receptores. El antígeno (hapteno) se puede marcar con reactivos de ligando que unen, quelan o complejan de otro modo un metal radioisotópico usando las técnicas descritas en Current Protocols in Immunology (1991) volúmenes 1 y 2, Coligen et al., Ed. Wiley-Interscience, Nueva York, NY, Pubs. Los ligandos quelantes que pueden formar complejos con un ion metálico incluyen DOTA, DOTP, DOTMA, DTPA y TETA (Macrocyclics, Dallas, Tex). Los radionúclidos se pueden dirigir por medio de la complejación con el complejo como se informa en el presente documento (Wu et al., Nature Biotechnology 23(9) (2005) 1137-1146). La formación de imágenes de receptores diana con complejos marcados con radionúclidos puede proporcionar un marcador de vía de activación mediante la detección y cuantificación de la acumulación progresiva de complejos o anticuerpos terapéuticos correspondientes en tejido tumoral (Albert et al. (1998) Bioorg. Med. Chem. Lett. 8:1207-1210).
Complejos de quelato metálico adecuados como marcadores para experimentos de formación de imágenes (documentos US 2010/0111856; US 5.342.606; US 5.428.155; US 5.316.757; US 5.480.990; US 5.462.725; US 5.428.139; US 5.385.893; US 5.739.294; US 5.750.660; US 5.834.456; Hnatowich et al., J. Immunol. Methods 65 (1983) 147-157; Meares et al., Anal. Biochem. 142 (1984) 68-78; Mirzadeh et al., Bioconjugate Chem. 1 (1990) 59-65; Meares et al., J. Cancer (1990), Suppl. 10:21-26; Izard et al., Bioconjugate Chem. 3 (1992) 346-350; Nikula et al., Nucl. Med. Biol. 22 (1995) 387-90; Camera et al., Nucl. Med. Biol. 20 (1993) 955-62; Kukis et al., J. Nucl. Med. 39 (1998) 2105-2110; Verel et al., J. Nucl. Med. 44 (2003) 1663-1670; Camera et al., J. Nucl. Med. 21 (1994) 640-646; Ruegg et al., Cancer Res. 50 (1990) 4221-4226; Verel et al., J. Nucl. Med. 44 (2003) 1663-1670; Lee et al., Cancer Res. 61 (2001) 4474-4482; Mitchell, et al., J. Nucl. Med. 44 (2003) 1105-1112; Kobayashi et al. Bioconjugate Chem. 10 (1999) 103-111; Miederer et al., J. Nucl. Med. 45 (2004) 129-137; DeNardo et al., Clinical Cancer Research 4 (1998) 2483­ 90; Blend et al., Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals 18 (2003) 355-363; Nikula et al. J. Nucl. Med. 40 (1999) 166-76; Kobayashi et al., J. Nucl. Med. 39 (1998) 829-36; Mardirossian et al., Nucl. Med. Biol. 20 (1993) 65-74; Roselli et al., Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals, 14 (1999) 209-20).
(b) Marcadores fluorescentes tales como quelatos de tierras raras (quelatos de europio), tipos de fluoresceína que incluyen FITC, 5-carboxifluoresceína, 6-carboxifluoresceína; tipos de rodamina que incluyen TAMRA; dansilo; lisamina; cianinas; ficoeritrinas; rojo de Texas; y análogos de los mismos. Los marcadores fluorescentes se pueden conjugar con el antígeno (hapteno) usando las técnicas divulgadas en Current Protocols in Immunology, supra, por ejemplo. Los tintes fluorescentes y los reactivos de marcadores fluorescentes incluyen los que están disponibles comercialmente en Invitrogen/Molecular Probes (Eugene, Oregón, EE.UU.) y Pierce Biotechnology, Inc. (Rockford, iii.).
Marcadores de detección tales como tintes fluorescentes y tintes luminiscentes (Briggs et al. "Synthesis of Functionalised Fluorescent Dyes and Their Coupling to Amines and Amino Acids", J. Chem. Soc., Perkin-Trans. 1 (1997) 1051-1058) proporcionan una señal detectable y son aplicables, en general, para el marcaje, especialmente, con las siguientes propiedades: (i) el conjugado marcado debe producir una señal muy alta con bajo fondo de modo que pequeñas cantidades de conjugado se puedan detectar con sensibilidad tanto en ensayos sin células como basados en células; y (ii) el conjugado marcado debe ser fotoestable de modo que la señal fluorescente se pueda observar, monitorear y registrar sin un fotoblanqueo significativo. Para aplicaciones que impliquen la unión a la superficie celular de conjugados marcados con membranas o superficies celulares, especialmente células vivas, los marcadores deben (iii) tener una buena solubilidad en agua para lograr una concentración de conjugado eficaz y sensibilidad de detección y (iv) no son tóxicas para las células vivas, de modo que no se interrumpan los procesos metabólicos normales de las células o se cause la muerte celular prematura.
(c) Se encuentran disponibles o se divulgan diversos marcadores enzimáticos de sustrato (véase, por ejemplo, el documento US 4.275.149). En general, la enzima cataliza una alteración química de un sustrato cromógeno que se puede medir usando diversas técnicas. Por ejemplo, la enzima puede catalizar un cambio de color en un sustrato, que se puede medir espectrofotométricamente. De forma alternativa, la enzima puede alterar la fluorescencia o la quimioluminiscencia del sustrato. El sustrato quimioluminiscente se excita electrónicamente por una reacción química y puede a continuación emitir luz que se puede medir (usando un quimioluminómetro, por ejemplo) o dona energía a un aceptador fluorescente. Los ejemplos de marcadores enzimáticos incluyen luciferasas (por ejemplo, luciferasa de luciérnaga y luciferasa bacteriana; documento US 4.737.456), luciferina, 2,3-dihidroftalazindionas, malato deshidrogenasa, ureasa, peroxidasa tal como peroxidasa de rábano picante (HRP), fosfatasa alcalina (AP), 3-galactosidasa, glucoamilasa, lisozima, sacárido oxidasas (por ejemplo, glucosa oxidasa, galactosa oxidasa y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa), oxidasas heterocíclicas (tal como uricasa y xantina oxidasa), lactoperoxidasa, microperoxidasa y similares. Las técnicas para conjugar enzimas con polipéptidos se describen en O'Sullivan et al. "Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay", en Methods in Enzym. (ed. por J. Langone e IT Van Vunakis), Academic Press, New York, 73 (1981) 147-166.
Los ejemplos de combinaciones enzima-sustrato (documento US 4.275.149; documento US 4.318.980) incluyen, por ejemplo:
(i) peroxidasa de rábano picante (HRP) con peroxidasa de hidrógeno como sustrato, en el que la peroxidasa de hidrógeno oxida un precursor de tinte (por ejemplo, ortofenilendiamina (OPD) o clorhidrato de 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB));
(ii) fosfatasa alcalina (AP) con fosfato de para-nitrofenilo como sustrato cromogénico; y
(iii) (3-D-galactosidasa ((3-D-Gal) con un sustrato cromógeno (por ejemplo, p-nitrofenil- (3-D-galactosidasa) o sustrato fluorogénico 4-metilumbeliferil-(3-D-galactosidasa).
El conjugado marcado como se informa en el presente documento se puede emplear en cualquier procedimiento de ensayo conocido, tal como ELISA, ensayos de unión competitiva, ensayos de tipo sándwich directos e indirectos y ensayos de inmunoprecipitación (Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques (1987) págs. 147-158, CRC Press, Inc.).
Los conjugados marcados, como se informa en el presente documento, son útiles como sondas y biomarcadores de formación de imágenes mediante los diversos procedimientos y técnicas de formación de imágenes biomédicas y moleculares, tales como: (i) IRM (imagen por resonancia magnética); (ii) MicroCT (tomografía computarizada); (iii) SPECT (tomografía computarizada por emisión de fotón único); (iv) PET (tomografía por emisión de positrones) Tinianow, J. et al., Nuclear Medicine and Biology, 37 (3) (2010) 289-297; Chen et al., Bioconjugate Chem. 15 (2004) 41-49; documento US 2010/0111856 (v) bioluminiscencia; (vi) fluorescencia; y (vii) ecografía. La inmunocentellografía es un procedimiento de formación de imágenes en el que se administran conjugados marcados con sustancias radiactivas a un paciente animal o humano y se toma una fotografía de los sitios del cuerpo donde se localiza el conjugado (documento US 6.528.624). Los biomarcadores de formación de imágenes se pueden medir y evaluar objetivamente como un indicador de procesos biológicos normales, procesos patógenos o respuestas farmacológicas a una intervención terapéutica. Los biomarcadores pueden ser de varios tipos: Los marcadores de tipo 0 son marcadores de evolución natural de una enfermedad y se correlacionan longitudinalmente con índices clínicos conocidos, por ejemplo, evaluación de IRM de la inflamación sinovial en la artritis reumatoide. Los marcadores de tipo I capturan el efecto de una intervención de acuerdo con un mecanismo de acción, aunque el mecanismo no esté asociado con el resultado clínico. Los marcadores de tipo II funcionan como criterios de valoración sustitutos en los que el cambio o la señal del biomarcador predice un beneficio clínico para "validar" la respuesta dirigida, tal como la erosión ósea medida en la artritis reumatoide mediante TC. Por tanto, los biomarcadores de formación de imágenes pueden proporcionar información terapéutica farmacodinámica (FC) sobre: (i) expresión de una proteína diana, (ii) unión de un agente terapéutico a la proteína diana, es decir, selectividad, y (iii) datos farmacocinéticos de aclaramiento y semivida. Las ventajas de los biomarcadores de formación de imágenes in vivo en relación con los biomarcadores glutaraldehído), compuestos bis-azido (tales como bis-(p-azidobenzoil)hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (tales como bis-(p-diazoniobenzoil)etilendiamina), diisocianatos (tales como 2,6-diisocianato de tolueno) y compuestos de flúor bis-activos (tales como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Por ejemplo, se puede preparar una inmunotoxina de ricina como se describe en Vitetta, E.S. et al., Science 238 (1987) 1098-1104. El ácido 1-isotiocianatobencil-3-metildietilentriaminopentaacético (MX-DTPA) marcado con carbono 14 es un agente quelante ejemplar para la conjugación del radionúclido al anticuerpo. Véase el documento WO 94/11026. El conector puede ser un "conector escindible" que facilite la liberación de un fármaco citotóxico en la célula. Por ejemplo, se puede usar un conector lábil a ácidos, un conector sensible a peptidasa, un conector fotolábil, un conector dimetilo o un conector que contiene disulfuro (Chari, R. V. et al., Cancer Res. 52 (1992) 127-131; patente de EE. UU. n.° 5.208.020).
Los inmunoconjugados o CAF en el presente documento contemplan expresamente, pero no se limitan a, dichos conjugados preparados con reactivos de reticulación, incluyendo, pero sin limitarse a, BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SlAB, sulfo-SMCC y sulfo-SMPB, y SVSB ((4-vinilsulfona)benzoato de succinimidilo), que están disponibles comercialmente (por ejemplo, de Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., EE. UU.).
Conector
El término "conector" indica un resto bifuncional o multifuncional que se puede usar para conjugar (unir) el antígeno (por ejemplo, un hapteno) a otros restos, tales como marcadores o fármacos detectables. Los conjugados de antígeno (hapteno) se pueden preparar convenientemente usando un conector que tenga funcionalidad reactiva para unirse al fármaco, al antígeno (hapteno) y al anticuerpo anti-hapteno.
En un modo de realización, un conector tiene un sitio reactivo que tiene un grupo electrófilo que es reactivo con un grupo nucleófilo presente en el anticuerpo anti-hapteno. Un grupo tiol de cisteína en el anticuerpo, por ejemplo, es reactivo con un grupo electrófilo en un conector y forma un enlace covalente con un conector. Los grupos electrófilos útiles incluyen, pero no se limitan a, otros grupos tiol, maleimida y haloacetamida (véase, por ejemplo, el procedimiento de conjugación en la página 766 de Klussman et al., Bioconjugate Chemistry 15(4) (2004) 765-773).
Ejemplos de grupos funcionales de reacción con tiol incluyen, pero no se limitan a, tiol, maleimida, alfa-haloacetilo, ésteres activados tales como ésteres de succinimida, ésteres de 4-nitrofenilo, ésteres de pentafluorofenilo, ésteres de tetrafluorofenilo, anhídridos, cloruros de ácido, cloruros de sulfonilo, isocianatos e isotiocianatos.
El conector puede comprender residuos de aminoácidos que unen el antígeno (hapteno) a la carga útil. Los residuos de aminoácidos pueden formar una unidad de dipéptido, tripéptido, tetrapéptido, pentapéptido, hexapéptido, heptapéptido, octapéptido, nonapéptido, decapéptido, undecapéptido o dodecapéptido. Los residuos de aminoácidos incluyen los análogos de aminoácidos naturales, así como los no naturales, tales como, por ejemplo, citrulina o paminoácidos, tales como, por ejemplo, p-alanina o ^-aminoácidos, tales como ácido 4-amino-butírico.
En otro modo de realización, el conector tiene un grupo funcional reactivo que tiene un grupo nucleófilo que es reactivo con un grupo electrófilo presente en el antígeno (hapteno) o el anticuerpo (anticuerpo anti-hapteno). Los grupos electrófilos útiles incluyen, pero no se limitan a, grupos carbonilo aldehído y cetona. El heteroátomo de un grupo nucleófilo de un conector puede reaccionar con un grupo electrófilo en el hapteno o el anticuerpo y formar un enlace covalente con un antígeno (hapteno) o el anticuerpo. Los grupos nucleófilos útiles en un conector incluyen, pero no se limitan a, hidrazida, oxima, amino, hidrazina, tiosemicarbazona, carboxilato de hidrazina y arilhidrazida. El grupo electrófilo de un antígeno (hapteno) proporciona un sitio conveniente para la unión a un conector.
Típicamente, se pueden preparar conectores de tipo peptídico formando un enlace peptídico entre dos o más aminoácidos y/o fragmentos peptídicos. Dichos enlaces peptídicos se pueden preparar, por ejemplo, de acuerdo con el procedimiento de síntesis en fase líquida (véase E. Schroder y K. Lubke, "The Peptides", volumen 1, (1965) págs.
76-136, Academic Press) que se conoce bien en el campo de la química de péptidos.
En otro modo de realización, el conector se puede sustituir con grupos que modulan la solubilidad o reactividad. Por ejemplo, un sustituyente cargado tal como sulfonato (SO3 -) o amonio o un polímero tal como PEG, puede incrementar la solubilidad en agua del reactivo y facilitar la reacción de acoplamiento del reactivo del conector con el antígeno (hapteno) o el resto de fármaco, o facilitar la reacción de acoplamiento dependiendo de la ruta sintética empleada.
Los conjugados que comprenden un fármaco o marcador como se informa en el presente documento contemplan expresamente, pero no se limitan a, complejos preparados con reactivos del conector: BMPEO, BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC, y sulfo-SMPB y SVSB (succinimidil-(4-vinilsulfona) benzoato) e incluyendo reactivos de bis-maleimida: DTME, BMB, BMDB, BMH, BMOE, BM (PEO)3 y BM(PEO)4 , que están disponibles comercialmente en Pierce Biotechnology, Inc. Los reactivos de bis-maleimida permiten la unión de, por ejemplo, un grupo tiol a un resto de fármaco que contiene tiol, marcador o conector intermedio, de forma secuencial o concurrente. Otros grupos funcionales además de la maleimida, que son reactivos con, por ejemplo, un grupo tiol, incluyen yodoacetamida, bromoacetamida, vinilpiridina, disulfuro, disulfuro de piridilo, isocianato e isotiocianato.
Un conector ejemplar incluye un reactivo de conector de dipéptido de valina-citrulina (val-cit o vc) que tiene un extensor de maleimida y un espaciador autoinmolativo de para-aminobencilcarbamoilo (PAB), y un reactivo de conector de dipéptido phe-lys(Mtr) que tiene una unidad extensora de maleimida y un espaciador autoinmolativo de paminobencilo.
Los grupos tiol de cisteína son nucleófilos y capaces de reaccionar para formar enlaces covalentes con grupos electrófilos en reactivos de conector y compuestos haptenilados que incluyen: (i) ésteres activos, tales como ésteres NHS, ésteres HOBt, haloformiatos y haluros de ácido; (ii) haluros de alquilo y bencilo, tales como haloacetamidas; (iii) aldehídos, cetonas, grupos carboxílico y maleimido; y (iv) disulfuros, incluyendo piridil disulfuros, por medio de intercambio de sulfuro. Los grupos nucleófilos en un compuesto haptenilado incluyen, pero no se limitan a: grupos amina, tiol, hidroxilo, hidracida, oxima, hidracina, tiosemicarbazona, carboxilato de hidracina y arilhidracida capaces de reaccionar para formar enlaces covalentes con grupos electrófilos en restos de conector y reactivos de conector.
III. Ácido nucleico
El ADN que codifica la variante de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo como se divulga en el presente documento o como está comprendido en un conjugado de acuerdo con la invención se puede preparar mediante una variedad de procedimientos conocidos en la técnica. Estos procedimientos incluyen, pero no se limitan a, preparación mediante mutagénesis dirigida al sitio (o mediada por oligonucleótidos), mutagénesis por PCR y mutagénesis en casete de un ADN preparado anteriormente que codifica el polipéptido. También se pueden construir variantes de anticuerpos recombinantes mediante manipulación de fragmentos de restricción o mediante PCR de extensión solapada con oligonucleótidos sintéticos. Los cebadores mutagénicos codifican el/los reemplazo(s) del codón de cisteína. Se pueden emplear técnicas de mutagénesis estándar para generar ADN que codifique dichos anticuerpos genomanipulados modificados. Se puede encontrar orientación general en Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989; y Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing y Wiley-Interscience, Nueva York, N.Y., 1993.
IV. Expresión y purificación
Los anticuerpos se pueden producir usando composiciones y procedimientos recombinantes, por ejemplo, como se describe en el documento US 4.816.567. En un modo de realización, se proporciona un ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo descrito en el presente documento. Dicho ácido nucleico puede codificar una secuencia de aminoácidos que comprende el VL y/o una secuencia de aminoácidos que comprende el VH del anticuerpo (por ejemplo, las cadenas ligera y/o pesada del anticuerpo). En otro modo de realización, se proporcionan uno o más vectores (por ejemplo, vectores de expresión) que comprenden dicho ácido nucleico. En otro modo de realización se proporciona una célula huésped que comprende dicho ácido nucleico. En un modo de realización de este tipo, una célula huésped comprende (por ejemplo, se ha transformado con): (1) un vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende el VL del anticuerpo y una secuencia de aminoácidos que comprende el VH del anticuerpo, o (2) un primer vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende el VL del anticuerpo y un segundo vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende el VH del anticuerpo. En un modo de realización, la célula huésped es eucariota, por ejemplo, una célula de ovario de hámster chino (CHO) o una célula linfocítica (por ejemplo, célula Y0, NS0, Sp20). En un modo de realización, se proporciona un procedimiento de preparación de un anticuerpo como se informa en el presente documento, en el que el procedimiento comprende cultivar una célula huésped que comprende un ácido nucleico que codifica el anticuerpo, como se proporciona anteriormente, en condiciones adecuadas para la expresión del anticuerpo y recuperar opcionalmente el anticuerpo de la célula huésped (o medio de cultivo de células huésped).
Para la producción recombinante de un anticuerpo como se informa en el presente documento, el ácido nucleico que codifica un anticuerpo, por ejemplo, como se describe anteriormente, se aísla e inserta en uno o más vectores para su clonación y/o expresión adicional en una célula huésped. Dicho ácido nucleico se puede aislar y secuenciar fácilmente usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas oligonucleotídicas que se pueden unir específicamente a genes que codifican las cadenas pesada y ligera del anticuerpo).
Las células huésped adecuadas para la clonación o expresión de vectores que codifican el anticuerpo incluyen las células procariotas o eucariotas descritas en el presente documento. Por ejemplo, se pueden producir anticuerpos en bacterias, en particular, cuando no se necesitan la glucosilación ni la función efectora de Fc. Para la expresión de los fragmentos de anticuerpo y polipéptidos en bacterias, véanse, por ejemplo, los documentos US 5.648.237, US 5.789.199 y US 5.840.523. (Véase también Charlton, K.A., en: Methods in Molecular Biology, vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2003), págs. 245-254, que describe la expresión de fragmentos de anticuerpo en E. coli). Después de la expresión, se puede aislar el anticuerpo de la pasta de células bacterianas en una fracción soluble y se puede purificar adicionalmente.
Además de los procariotas, los microbios eucariotas, tales como los hongos filamentosos o levaduras, son huéspedes de clonación o expresión adecuados para vectores que codifican el anticuerpo, incluyendo cepas de hongos y levaduras en las que sus vías de glucosilación se han "humanizado", dando como resultado la producción de un anticuerpo con un patrón de glucosilación parcial o completamente humano. Véanse Gerngross, T.U., Nat. Biotech.
22 (2004) 1409-1414; y Li, H. et al., Nat. Biotech. 24 (2006) 210-215.
Las células huésped adecuadas para la expresión del anticuerpo glucosilado también derivan de organismos pluricelulares (invertebrados y vertebrados). Los ejemplos de células de invertebrado incluyen células vegetales y de insecto. Se han identificado numerosas cepas de baculovirus que se pueden usar conjuntamente con células de insecto, en particular para la transfección de células de Spodoptera frugiperda.
También se pueden utilizar cultivos de células vegetales como huéspedes. Véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.° 5.959.177, 6.040.498, 6.420.548, 7.125.978 y 6.417.429 (que describen la tecnología PLANTIBODIES™ para producir anticuerpos en plantas transgénicas).
También se pueden usar células de vertebrado como huéspedes. Por ejemplo, pueden ser útiles líneas celulares de mamífero que se adaptan para cultivar en suspensión. Otros ejemplos de líneas celulares huésped de mamífero útiles son línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7); línea de riñón embrionario humano (células 293 o 293 como se describe, por ejemplo, en Graham, F.L. et al., J. Gen Virol. 36 (1977) 59-74); células de riñón de cría de hámster (BHK); células de Sertoli de ratón (células TM4 como se describe, por ejemplo, en Mather, J.P., Biol. Reprod.
23 (1980) 243-252); células de riñón de mono (CV1); células de riñón de mono verde africano (VERO-76); células de carcinoma de cuello uterino humano (HELA); células de riñón canino (MDCK); células de hígado de rata búfalo (BRL3A); células de pulmón humano (W138); células de hígado humano (Hep G2); células de tumor mamario de ratón (MMT060562); células TRI, como se describe, por ejemplo, en Mather, J.P. et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68; células MRC5; y células FS4. Otras líneas de células huésped de mamífero útiles incluyen células de ovario de hámster chino (CHO), incluyendo células CHO DHFR' (Urlaub, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216­ 4220); y líneas celulares de mieloma, tales como Y0, NS0 y Sp2/0. Para una revisión de determinadas líneas de células huésped de mamífero adecuadas para la producción de anticuerpos, véase, por ejemplo, Yazaki, P. y Wu, A.M., Methods in Molecular Biology, vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2004), págs. 255-268.
V. Procedimientos y composiciones para diagnóstico y detección
En determinados modos de realización, cualquiera de los conjugados de acuerdo con la invención es útil para detectar la presencia de una o más moléculas diana en una muestra biológica. El término "detectar" como se usa en el presente documento engloba la detección cuantitativa o cualitativa. En un modo de realización, una muestra biológica comprende una célula o tejido.
En un modo de realización, se proporciona un conjugado de acuerdo con la invención para su uso en un procedimiento de diagnóstico o detección. En determinados modos de realización, el procedimiento comprende poner en contacto la muestra biológica con un anticuerpo o conjugado como se informa en el presente documento en condiciones que permitan la unión del anticuerpo o del conjugado a la diana, y detectar si se forma un complejo entre el anticuerpo o el conjugado y la diana. Dicho procedimiento puede ser un procedimiento in vitro o in vivo.
En determinados modos de realización, se proporcionan conjugados marcados. Los marcadores incluyen, pero no se limitan a, marcadores o restos que se detectan directamente (tales como marcadores fluorescentes, cromóforos, electrodensos, quimioluminiscentes y radioactivos), así como restos, tales como enzimas o ligandos, que se detectan indirectamente, por ejemplo, a través de una reacción enzimática o interacción molecular. Los marcadores ejemplares incluyen, pero no se limitan a, los radioisótopos 32P, 14C, 125I, 3H y 131I, fluoróforos, tales como quelatos de tierras raras o fluoresceína y sus derivados, rodamina y sus derivados, dansilo, umbeliferona, luciferasas, por ejemplo, luciferasa de luciérnaga y luciferasa bacteriana (documento US 4.737.456), luciferina, 2,3-dihidroftalacindionas, peroxidasa de rábano picante (HRP), fosfatasa alcalina, p-galactosidasa, glucoamilasa, lisozima, oxidasas de sacáridos, por ejemplo, glucosa oxidasa, galactosa oxidasa y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, oxidasas heterocíclicas, tales como uricasa y xantina oxidasa, acopladas con una enzima que emplea peróxido de hidrógeno para oxidar un precursor de tinte, tal como HRP, lactoperoxidasa o microperoxidasa, biotina/avidina, marcadores de espín, marcadores de bacteriófagos, radicales libres estables y similares.
VI. Formulaciones farmacéuticas
Las formulaciones farmacéuticas de un conjugado de acuerdo con la invención se preparan mezclando dicho anticuerpo o conjugado que tiene el grado de pureza deseado con uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables opcionales (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16.a edición, Osol, A. (ed.) (1980)), en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los vehículos farmacéuticamente aceptables, en general, no son tóxicos para los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas e incluyen, pero no se limitan a: tampones tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes, incluyendo ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencilamonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquilparabenos tales como metil o propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como seroalbúmina, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos, incluyendo glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; glúcidos tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sal tales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos Zn-proteína) y/o tensioactivos no iónicos tales como polietilenglicol (Pe G). Los vehículos farmacéuticamente aceptables ejemplares en el presente documento incluyen además agentes de dispersión de fármacos intersticiales tales como glucoproteínas hialuronidasas activas a pH neutro solubles (sHASEGP), por ejemplo, glucoproteínas hialuronidasas a pH-20 solubles humanas, tales como rhuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.). Determinadas sHASEGP ejemplares y procedimientos de uso, incluyendo rhuPH20, se describen en las publicaciones de patente de EE. UU. n.° 2005/0260186 y 2006/0104968. En un aspecto, una sHASEGP se combina con una o más glucosaminoglucanasas adicionales tales como condroitinasas.
Las formulaciones de anticuerpo liofilizadas ejemplares se describen en el documento US 6.267.958. Las formulaciones de anticuerpo acuosas incluyen las descritas en los documentos US 6.171.586 y WO 2006/044908, incluyendo las últimas formulaciones un tampón histidina-acetato.
La formulación en el presente documento también puede contener más de un ingrediente activo según sea necesario para la indicación particular que se está tratando, preferentemente aquellos con actividades complementarias que no se vean afectadas de forma adversa entre sí. Dichos ingredientes activos están presentes adecuadamente en combinación en cantidades que son eficaces para el propósito pretendido.
Los principios activos se pueden atrapar en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial, por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y microcápsulas de poli(metilmetacrilato), respectivamente, en sistemas de administración de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Dichas técnicas se divulgan en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16.a edición, Osol, A. (ed.) (1980).
Se pueden preparar preparaciones de liberación mantenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación mantenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el anticuerpo o conjugado, estando dichas matrices en forma de artículos conformados, por ejemplo, películas o microcápsulas.
Las formulaciones que se van a usar para la administración in vivo son, en general, estériles. La esterilidad se puede lograr fácilmente, por ejemplo, por filtración a través de membranas de filtración estériles.
VII. Procedimientos y composiciones terapéuticos
Cualquiera de los conjugados informados en el presente documento se puede usar en procedimientos terapéuticos.
En un aspecto, se proporciona un conjugado de acuerdo con la invención para su uso como medicamento. En otros aspectos, se proporciona un conjugado como se informa en el presente documento para su uso en el tratamiento de una enfermedad. Un "individuo" de acuerdo con cualquiera de los modos de realización anteriores puede ser un ser humano.
En otro aspecto, la invención proporciona formulaciones farmacéuticas que comprenden cualquiera de los conjugados de acuerdo con la invención, por ejemplo, para su uso en cualquiera de los procedimientos terapéuticos anteriores. En un modo de realización, una formulación farmacéutica comprende cualquiera de los conjugados de acuerdo con la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En otro modo de realización, una formulación farmacéutica comprende cualquiera de los conjugados de acuerdo con la invención y al menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo, como se describe a continuación.
Los conjugados de acuerdo con la invención se pueden usar solos o bien en combinación con otros agentes en un tratamiento. Por ejemplo, un anticuerpo o conjugado como se informa en el presente documento se puede coadministrar con al menos un agente terapéutico adicional.
Dichas politerapias indicadas anteriormente engloban la administración combinada (donde se incluyen dos o más agentes terapéuticos en la misma formulación o en formulaciones separadas) y la administración separada, en cuyo caso, la administración del anticuerpo de la invención se puede producir antes, simultáneamente y/o después de la administración del agente y/o adyuvante terapéutico adicional. También se pueden usar anticuerpos y conjugados como los informados en el presente documento en combinación con radioterapia.
Un conjugado de acuerdo con la invención (y cualquier agente terapéutico adicional) se puede administrar por cualquier medio adecuado, que incluye la administración parenteral, intrapulmonar e intranasal y, si se desea para el tratamiento local, la administración intralesional. Las infusiones parenterales incluyen administración intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal o subcutánea. La dosificación puede ser por cualquier vía adecuada, por ejemplo, por inyecciones, tales como inyecciones intravenosas o subcutáneas, dependiendo en parte de si la administración es breve o crónica. En el presente documento se contemplan diversas pautas posológicas incluyendo, pero sin limitarse a, administraciones individuales o múltiples durante diversos puntos temporales, administración por inyección intravenosa rápida e infusión pulsada.
Los conjugados de acuerdo con la invención se formularán, dosificarán y administrarán de forma consecuente con las buenas prácticas médicas. Los factores que se deben tener en consideración en este contexto incluyen el trastorno particular que se está tratando, el mamífero particular que se está tratando, el estado clínico del paciente individual, la causa del trastorno, el sitio de administración del agente, el procedimiento de administración, la programación de la administración y otros factores conocidos por los médicos. El anticuerpo o conjugado, no necesariamente, pero opcionalmente se formula con uno o más agentes usados actualmente para prevenir o tratar el trastorno en cuestión. La cantidad eficaz de dichos otros agentes depende de la cantidad de anticuerpo o conjugado presente en la formulación, del tipo de trastorno o tratamiento y de otros factores analizados anteriormente. Estos se usan en general en las mismas dosificaciones y con las vías de administración como se describe en el presente documento, o aproximadamente de un 1 a un 99 % de las dosificaciones descritas en el presente documento, o en cualquier dosificación y por cualquier vía que se determine empíricamente/clínicamente que sea apropiada.
Para la prevención o tratamiento de la enfermedad, la dosificación apropiada de un conjugado de acuerdo con la invención (cuando se usa solo o en combinación con uno o más de otros agentes terapéuticos adicionales) dependerá del tipo de enfermedad que se va a tratar, el tipo de anticuerpo o conjugado, la gravedad y evolución de la enfermedad, si se administra el anticuerpo o conjugado con propósitos preventivos o terapéuticos, tratamiento previo, anamnesis del paciente y respuesta al anticuerpo o conjugado y el criterio del médico especialista. El anticuerpo o conjugado se administra adecuadamente al paciente de una vez o durante una serie de tratamientos. Dependiendo del tipo y gravedad de la enfermedad, de aproximadamente 1 pg/kg a 15 mg/kg (por ejemplo, 0,5 mg/kg - 10 mg/kg) de anticuerpo o conjugado puede ser una dosificación candidata inicial para su administración al paciente, ya sea, por ejemplo, por una o más administraciones separadas o por infusión continua. Una dosificación diaria típica podría variar de aproximadamente 1 pg/kg a 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Para administraciones repetidas durante varios días o más, dependiendo de la afección, el tratamiento en general se mantendría hasta que se produzca una supresión deseada de los síntomas de enfermedad. Una dosificación ejemplar del anticuerpo o conjugado estaría en el intervalo de aproximadamente 0,05 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg. Por tanto, se pueden administrar al paciente una o más dosis de aproximadamente 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4,0 mg/kg o 10 mg/kg (o cualquier combinación de las mismas). Dichas dosis se pueden administrar de forma intermitente, por ejemplo, cada semana o cada tres semanas (por ejemplo, de modo que el paciente recibe de aproximadamente dos a aproximadamente veinte, o por ejemplo, aproximadamente seis dosis del anticuerpo). Se puede administrar una dosis de carga mayor inicial, seguida de una o más dosis menores. Sin embargo, pueden ser útiles otras pautas de dosificación. La progresión de este tratamiento se sigue fácilmente por técnicas y ensayos convencionales.
Se entiende que cualquiera de las formulaciones o procedimientos terapéuticos anteriores se puede llevar a cabo usando un inmunoconjugado de la invención en lugar de o además de un anticuerpo o un conjugado como se informa en el presente documento.
VIII. Artícu los de fabricación
En el presente documento se divulga un artículo de fabricación que contiene materiales útiles para el tratamiento, prevención y/o diagnóstico de los trastornos descritos anteriormente. El artículo de fabricación comprende un recipiente y una ficha técnica o prospecto del envase en o asociado con el recipiente. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, frascos, viales, jeringuillas, bolsas de solución i.v., etc. Los recipientes se pueden formar de una variedad de materiales tales como vidrio o plástico. El recipiente contiene una composición que por sí misma o combinada con otra composición es eficaz para tratar, prevenir y/o diagnosticar la afección y que puede tener una vía de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica). Al menos un agente activo de la composición es un anticuerpo o un complejo como se informa en el presente documento. La ficha técnica o prospecto del envase indica que la composición se usa para tratar la afección de elección. Además, el artículo de fabricación puede comprender (a) un primer recipiente con una composición contenida en el mismo, en el que la composición comprende un anticuerpo o un complejo como se informa en el presente documento; y (b) un segundo recipiente con una composición contenida en el mismo, en el que la composición comprende otro agente citotóxico o de otro modo terapéutico. El artículo de fabricación en este modo de realización de la invención puede comprender además un prospecto del envase que indique que las composiciones se pueden usar para tratar una afección particular. De forma alternativa, o adicionalmente, el artículo de fabricación puede comprender además un segundo (o tercer) recipiente que comprende un tampón farmacéuticamente aceptable, tal como agua bacteriostática para inyectables (BWFI), solución salina tamponada con fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. Puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y de usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas y jeringuillas.
Se entiende que cualquiera de los artículos de fabricación anteriores puede incluir un inmunoconjugado de la invención en lugar de o además de un conjugado como se informa en el presente documento.
Los siguientes ejemplos, figuras y secuencias se proporcionan para ayudar a la comprensión de la presente invención, cuyo verdadero alcance se expone en las reivindicaciones adjuntas.
Ejemplos
Ejemplo 1
Aislam iento y caracterización de ADNc que codifican los dom inios VH y VL de un anticuerpo anti-digoxigenina murino y un anticuerpo anti-biotina murino de clase de IgG1 con cadena ligera kappa de hibridoma de ratón El aislamiento y caracterización de los ADNc que codifican los dominios VH y VL de los anticuerpos anti-digoxigenina, la preparación del ARN, la generación de fragmentos de ADN, la clonación de los fragmentos de ADN en plásmidos y la determinación de las secuencias de ADN y aminoácidos se describieron en los documentos WO 2011/003557 y w O 2011/003780, respectivamente.
La información de la secuencia de proteínas y (ADN) de los dominios VH y VL de los anticuerpos de unión a hapteno murino se obtuvo directamente a partir de clones de hibridoma. Las etapas experimentales realizadas posteriormente fueron (i) el aislamiento del ARN de las células de hibridoma que producen anticuerpos, (ii) la conversión de este ARN en ADNc, la transferencia a VH y VL que portan fragmentos de PCR, y (iii) la integración de estos fragmentos de PCR en vectores plásmidos para la dispersión en E. coli y la determinación de sus secuencias de ADN (y proteína deducida). Preparación de ARN a partir de células de hibridoma:
Se preparó ARN a partir de 5 x106 células de hibridoma que expresan anticuerpo aplicando el RNAeasy-Kit (Qiagen). En resumen, las células sedimentadas se lavaron una vez en PBS y se sedimentaron y posteriormente se volvieron a suspender para lisis en 500 pl de tampón RLT (+ p-ME). Las células se lisaron completamente pasándolas a través de un Qiashredder (Qiagen) y a continuación se sometieron al procedimiento de purificación mediado por matriz (columnas ETOH, RNAeasy) como se describe en el manual del fabricante. Después de la última etapa de lavado, se recuperó el ARN de las columnas en 50 pl de agua libre de ARNasa. La concentración del ARN recuperado se determinó cuantificando A260 y A280 de muestras diluidas de 1:20. La integridad (calidad, grado de degradación) de las muestras de ARN aisladas se analizó mediante electroforesis en gel de ARN desnaturalizante en geles de formamida-agarosa (véase el manual de Maniatis). Se obtuvieron bandas discretas que representan los ARN ribosomales 18s y 28s intactos y la pureza (y proporciones de intensidad de aproximadamente 2:1) de estas bandas indicaron una buena calidad de las preparaciones de ARN. Los ARN aislados de hibridoma se congelaron y almacenaron a -80 °C en alícuotas.
Generación de fragmentos de ADN que codifican VH y VH mediante PCR de RACE, clonación de estos fragmentos de ADN en plásmidos y determinación de sus secuencias de ADN y aminoácidos
Los ADNc para las reacciones de PCR (de RACE) posteriores se prepararon a partir de preparaciones de ARN aplicando las tecnologías descritas en la solicitud de patente internacional WO 2012/093068. Posteriormente, los fragmentos de PCR que codifican VH y VL se aislaron mediante extracción en gel de agarosa y posterior purificación mediante técnicas estándar de biología molecular. Los fragmentos de PCR purificados generados por PWO se insertaron en el vector pCR bluntlI TOPO aplicando el kit pCR bluntlI TOPO (Invitrogen) siguiendo exactamente las instrucciones del fabricante. Las reacciones de ligación de TOPO se transformaron en células competentes monoestables de Topo 10 de E. coli. Después de esto, los clones de E. coli que contenían vectores con insertos que contienen VL o VH se identificaron como colonias en placas de agar de LB-Kanamicina. Se prepararon plásmidos a partir de estas colonias y se confirmó la presencia del inserto deseado en el vector mediante digestión de restricción con EcoR1. Debido a que la cadena principal del vector contiene sitios de reconocimiento de restricción EcoR1 que flanquean cada lateral del inserto, los plásmidos que portan insertos se definieron por tener insertos liberables EcoR1 de aproximadamente 800 bp (para VL) o 600 bp (para VH). La secuencia de ADN y la secuencia de proteínas deducida de VL y VH se determinaron mediante secuenciación automatizada de ADN en múltiples clones para VH y VL. La secuencia de VL murina del anticuerpo anti-biotina se representa en la SEQ ID NO: 40. La secuencia de VH murina del anticuerpo anti-biotina se representa en la SEQ ID NO: 36.
La secuencia de VL murina del anticuerpo anti-digoxigenina se representa en la SEQ ID NO: 08. La secuencia de VH murina del anticuerpo anti-digoxigenina se representa en la SEQ ID NO: 04.
Ejemplo 2
Aislam iento y caracterización de ADNc que codifican los dom inios VH y VL de un anticuerpo anti-teofilina murino de clase IgG1 con cadena ligera kappa de hibridoma de ratón
Las secuencias del anticuerpo anti-teofilina se obtuvieron como se explica en el ejemplo 1.
La secuencia de VL murina del anticuerpo anti-teofilina se representa en la SEQ ID NO: 72. La secuencia de VH murina del anticuerpo anti-teofilina se representa en la SEQ ID NO: 68.
Ejemplo 3
Humanización de los dom inios VH y VL del anticuerpo anti-digoxigenina murino y del anticuerpo anti-biotina
La generación de variantes humanizadas del anticuerpo de unión a digoxigenina se ha descrito en detalle en los documentos WO 2011/003557 y WO 2011/003780. El anticuerpo murino de unión a biotina muM33 se humanizó de forma similar como sigue:
La generación y caracterización de secuencias codificantes y secuencias de aminoácidos que comprenden los dominios VH y Vl de un anticuerpo anti-biotina murino de la clase IgG1 con cadena ligera kappa de hibridoma de ratón se describen en los documentos WO 2011/003557 y WO 2011/003780. En base a esta información, se generó un anticuerpo anti-biotina humanizado correspondiente (huM33) en base a la combinación de la región estructural de la línea germinal humana IGHV1-69-02 e IGKV1-27-01. Para VL, no fue necesario integrar ninguna retromutación en la región estructural de la IGKV1-27-01 humana y el elemento J humano de la línea germinal IGKJ2-01. El VH humanizado se basa en la línea germinal IGHV1-69-02 humana y el elemento J humano de la línea germinal IGHJ4-01-3. Se introdujeron dos retromutaciones en la región estructural 1 en la posición 24 (A24S) y en la región estructural 3 en la posición 73 (K73T). La secuencia de aminoácidos del VH humanizado se representa en la SEQ ID NO: 44 y la secuencia de aminoácidos del VL humanizado se muestra en la SEQ ID NO: 48.
Ejemplo 4
Humanización de los dom inios VH y VL del anticuerpo anti-teofilina murino
El anticuerpo de unión a teofilina murina se humanizó como sigue: se generó un anticuerpo anti-teofilina humanizado basado en la combinación de la región estructural de línea germinal humana IGHV4-31-02 e IGKV2-30-01. El VH humanizado se basa en la línea germinal IGHV4-31-02 humana y el elemento J humano de la línea germinal IGHJ4-01-3. Se introdujo una retromutación en la región estructural 3 en la posición 71 (V71R). El VL humanizado se basa en la línea germinal IGHV2-30-01 humana y el elemento J humano de la línea germinal IGKJ2-01. Se introdujo una retromutación en la región estructural 2 en la posición 46 (R46L). La secuencia de aminoácidos del VH humanizado se representa en la SEQ ID NO: 76 y la secuencia de aminoácidos del VL humanizado se muestra en la SEQ ID NO: 80.
Ejemplo 5
Determinación de la estructura de cristalización y rayos X de la región de unión de la región Fv de antidigoxigenina murina en presencia de digoxigenina, y de la región de unión de la región Fv de anti-biotina murina en presencia de biotina
La determinación de la estructura del fragmento Fab del anticuerpo de unión a digoxigenina se ha descrito en detalle en los documentos WO 2011/003557 y WO 2011/003780, también publicados (3RA7) en Metz, S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 108 (2011) 8194-8199.
Se determinó la estructura del anticuerpo anti-biotina murino. Por lo tanto, los fragmentos Fab se generaron mediante digestión con proteasas de las IgG purificadas y posteriormente se purificaron, aplicando procedimientos bien conocidos del estado de la técnica (digestión con papaína).
Para la cristalización del fragmento Fab apo (Fab purificados) en His-HCl 20 mM, NaCl 140 mM, pH 6,0 se concentraron a 13 mg/ml. Las gotas de cristalización se establecieron a 21 °C mezclando 0,2 pl de solución proteica con 0,2 pl de solución de depósito en experimentos de gotas asentadas por difusión de vapor. Aparecieron cristales de Tris 0,1 M pH 8,5, cloruro de cobalto 0,01 M, polivinilpirrolidona K15 al 20 % en 5 días y crecieron hasta un tamaño final de 0,3 mm x 0,06 mm x 0,03 mm en 8 días.
Los cristales se recogieron con glicerol al 15 % como crioprotector y a continuación se congelaron instantáneamente en N2 líquido. Las imágenes de difracción se recogieron con un detector Pilatus 6M a una temperatura de 100K en la línea de haz X10SA de Swiss Light Source y se procesaron con los programas XDS (Kabsch, W., J. Appl. Cryst. 26 (1993) 795-800) y se ajustaron a escala con SCALA (obtenido de BRUKER AXS), proporcionando datos con una resolución de 2,22 A. Este cristal de fragmento Fab pertenece al grupo espacial monoclínico P21 con dimensiones celulares de a = 90,23 A, b = 118,45Á, c = 96,79Á y p = 117,53° y contiene cuatro moléculas Fab por unidad asimétrica cristalográfica (véase la tabla 3).
Se usaron programas cristalográficos estándar del paquete de software CCP4 para resolver la estructura mediante reemplazo molecular con la entrada de PDB 3PQP como modelo de búsqueda, para calcular la densidad de electrones y para refinar la estructura de rayos X (CCP4, Collaborative Computational Project, Acta Crystallogr. D, 760-763 (1994) ). Los modelos estructurales se reconstruyeron en la densidad de electrones usando COOt (Emsley, P., et al., Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 60 (2010) 486-501). Las coordenadas se refinaron con REFMAC5 (Murshudov, G.N., et al., Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 53 (1997) 240-55) y con autoBUSTER (Global Phasing Ltd.).
Tabla 3: Recopilación de datos y estadísticas de refinamiento estructural para el apocristal de fragmento Fab de muM33 monoclínico
Figure imgf000065_0001
1 Los valores entre paréntesis se refieren a los periodos de mayor resolución.
2 Rfusión =1 | I-<I> | / I \ donde I es la intensidad.
3 Rcrist=1 | Fo-<Fc> | / !F 0 donde Fo es la amplitud de factor estructural observada y Fc es la calculada.
4 Rlibre se calculó en base al 5 % de los datos totales omitidos durante el refinamiento.
5 Calculado con PROCHECK [Laskowski, R.A., et al., J. Appl. Crystallogr. 26, 283-291 (1993)].
Para la cristalización del fragmento Fab en un complejo con un derivado de biotina, los cristales apo del fragmento Fab usados para los experimentos de impregnación se derivaron de ácido succínico 0,8 M dentro de los 3 días posteriores al cribado y crecieron hasta un tamaño final de 0,25 mm x 0,04 mm x 0,04 mm en 5 días. Se disolvió la biocitinamida a 100 mM en agua. Posteriormente, el compuesto se diluyó a una concentración de trabajo de 10 mM en una solución de cristalización y se aplicó a los cristales en la gota de cristalización. Los cristales se lavaron tres veces con 2 pl de solución de compuesto 10 mM y finalmente se incubaron durante 16 h con biocitinamida a 21 °C.
Los cristales se recogieron con glicerol al 15 % como crioprotector y a continuación se congelaron instantáneamente en N2 líquido. Las imágenes de difracción se recogieron con un detector Pilatus 6M a una temperatura de 100 K en la línea de haz X10SA de Swiss Light Source y se procesaron con los programas XDS (Kabsch, W., J. Appl. Cryst. 26 (1993) 795-800) y se ajustaron a escala con SCALA (obtenido de BRUKER AXS), proporcionando datos con una resolución de 2,35 A. Este cristal de fragmento Fab pertenece al grupo espacial monoclínico P21 con dimensiones celulares de a = 89,09 A, b = 119,62 A, c = 96,18 A y p = 117,15° y contiene cuatro moléculas Fab por unidad asimétrica cristalográfica (véase la tabla 4).
Se usaron programas cristalográficos estándar del paquete de software CCP4 para resolver la estructura mediante reemplazo molecular con las coordenadas del fragmento Fab apo como modelo de búsqueda, para calcular la densidad de electrones y para refinar la estructura de rayos X a una resolución de 2,5 A (CCP4). Los modelos estructurales se reconstruyeron en la densidad de electrones usando COOT Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W.G. & Cowtan, K. Features and development of COOT. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 60, 486-501 (2010)). Las coordenadas se refinaron con REFMAC5 (Murshudov, G.N., et al., Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 53, 240-255 (1997)) y con autoBUSTER (Global Phasing Ltd.).
Tabla 4: Recopilación de datos y estadísticas de refinamiento estructural para el cristal del complejo de biocitinamida del fragmento Fab de muM33 monoclínico
Figure imgf000066_0001
1 Los valores entre paréntesis se refieren a los periodos de mayor resolución.
2 Rfusión =1 | I-<I> | / I \ donde I es la intensidad.
3 Rcrist=1 | Fo-<Fc> | / !F 0 donde Fo es la amplitud de factor estructural observada y Fc es la calculada.
4 Rlibre se calculó en base al 5 % de los datos totales omitidos durante el refinamiento.
5 Calculado con PROCHECK [Laskowski, R.A., MacArthur, M.W., Moss, D.S. & Thornton, J.M. PROCHECK: un programa para comprobar la calidad estereoquímica de la estructura proteica. J. Appl. Crystallogr. 26, 283-291 (1993)].
El resultado de la determinación estructural experimental se muestra en la figura 33. La forma cristalina del complejo contenía cuatro complejos biocitinamida:Fab anti-biotina independientes en la unidad asimétrica, con la biocitinamida unida de forma similar por todas las moléculas Fab. La biocitinamida se une en un bolsillo formado por las CDR 1 y 3 de la cadena pesada y las 3 CDR de la cadena ligera. El bolsillo de unión del ligando se define mediante los residuos ASN29, ASP31, THR32, PHE33, GLN35, TRP99 y TRP106 de la cadena pesada y ASN31, TYR32, LEU33, SER34, TYR49, SER50, PHE91 y TYR96 de la cadena ligera. El grupo principal de la biotina forma enlaces de hidrógeno con residuos de CDR2 y CDR1 en un extremo del bolsillo: El N3 de la biocitinamida interactúa con el hidroxil-oxígeno de Ser50, mientras que el O22 está en contacto con el nitrógeno amida de la cadena principal del mismo residuo. Además, el O22 de la biocitinamida también está unido por enlaces de hidrógeno al oxígeno del grupo hidroxilo de Ser34. Además de esto, se observan interacciones hidrófobas entre la biocitinamida y las cadenas laterales aromáticas que recubren el bolsillo de unión. El enlace amida en el extremo de la cola alifática (CH2)4 de la biotina se apila sobre PHE33 de la CDR1 de la cadena pesada y se estabiliza mediante un enlace de hidrógeno adicional al nitrógeno amida de la cadena principal de PHE33 y a Asp31. Esto posiciona el nitrógeno amida, que es el sitio de enlace con la entidad activa, de manera que los átomos que siguen al nitrógeno apunten fuera del bolsillo de unión hacia el disolvente.
Los resultados de la determinación experimental de la región de unión a una resolución de 2,5 A permiten la caracterización del modo de unión del ligando a su anticuerpo, que es un requisito previo para el modelado detallado y la mejora adicional por medio de la genomanipulación proteica de los módulos de unión a la biotina recombinante.
Ejemplo 6
Definición y generación de anticuerpos anti-hapteno con funcionalidades introducidas para la conjugación covalente
Se realizó la derivatización de las secuencias de VH y VL humanizadas del anticuerpo anti-hapteno descrito a n t e r i o r m e n t e p a r a g e n e r a r c o m p u e s t o s q u e p e r m i t e n e l a c o p l a m i e n t o c o v a l e n t e d e a n t í g e n o s / h a p t e n o s a l a n t i c u e r p o e n u n a p o s ic i ó n d e f in id a .
L a e s t r u c t u r a d e t e r m i n a d a e x p e r i m e n t a l m e n t e d e u n f r a g m e n t o F a b a n t i - d i g o x i g e n i n a u n id o a d i g o x i g e n i n a ( 3 R A 7 ) ( M e t z , S . e t a l . , P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U S A 108 ( 20 11 ) 8 19 4 - 8 19 9 ) s e u s ó p a r a i d e n t i f i c a r p o s i c i o n e s e n c u y a s a l t e r a c i o n e s p e r m i t e n q u e s e p r o d u z c a u n a r e a c c ió n d e a c o p l a m i e n t o d i r i g i d a a l s i t i o e n t r e e l a n t i c u e r p o y s u a n t í g e n o / h a p t e n o c o m p l e j a d o . L a e s t r u c t u r a d e l f r a g m e n t o F a b d e a n t i - b i o t i n a u n id o a b i o c i t i n a m i d a ( v é a s e e l e j e m p lo 5 ) s e u s ó p a r a c o n f i r m a r la p o s ic i ó n c o r r e c t a d e l r e s i d u o d e c i s t e í n a i n t r o d u c i d o p a r a e l f r a g m e n t o d e a n t i c u e r p o d e u n ió n a b i o t in a y p r o p o r c i o n a r la p r u e b a d e la a p l i c a b i l i d a d g e n e r a l d e la p o s ic i ó n o p o s i c i o n e s i d e n t i f i c a d a s .
L a s p o s i c i o n e s q u e s e v a n a m u t a r d e b e n c u m p l i r s i m u l t á n e a m e n t e d o s r e q u is i t o s : ( i ) la s p o s i c i o n e s d e a c o p l a m i e n t o d e b e n e s t a r p r ó x i m a s a la r e g ió n d e u n ió n p a r a u t i l i z a r e l e f e c t o d e p o s i c i o n a m i e n t o d e a n t í g e n o / h a p t e n o p a r a e l a c o p l a m i e n t o d i r i g id o , y ( i i ) la p o s ic i ó n d e m u t a c ió n y a c o p l a m i e n t o s e d e b e s i t u a r d e m a n e r a q u e la p r o p i a u n ió n d e l a n t í g e n o / h a p t e n o n o s e v e a a f e c t a d a . E s t o s r e q u i s i t o s p a r a e n c o n t r a r u n a p o s ic i ó n a d e c u a d a s e ' ' c o n t r a d i c e n ' ' d e f a c t o e n t r e s í p o r q u e e l r e q u is i t o ( i ) s e c u m p l e m e j o r c o n u n a p o s ic i ó n c e r c a n a a l s i t i o d e u n ió n , m i e n t r a s q u e e l r e q u is i t o ( i i ) s e lo g r a d e f o r m a m á s s e g u r a m e d i a n t e p o s i c i o n e s q u e e s t á n a le j a d a s d e l s i t i o d e u n ió n .
A p e s a r d e e s t o s r e q u i s i t o s p r á c t i c a m e n t e e x c l u y e n t e s , s e p u d ie r o n i d e n t i f i c a r p o s i c i o n e s q u e s e p u e d e n m u t a r s in a f e c t a r la p o s ic i ó n d e l h a p t e n o y q u e , s in e m b a r g o , p e r m i t e n s i m u l t á n e a m e n t e e l a c o p l a m i e n t o c o v a l e n t e d i r i g i d o d e u n c o m p u e s t o h a p t e n i la d o .
L a p r i m e r a p o s ic i ó n s e lo c a l i z a e n la p o s ic i ó n V H 52 b o V H 53 d e a c u e r d o c o n la n u m e r a c i ó n d e K a b a t d e p e n d i e n d o d e la l o n g i t u d r e a l d e la C D R 2 d e l a n t i c u e r p o r e s p e c t i v o . E n la e s t r u c t u r a d e l a n t i c u e r p o a n t i - d i g o x i g e n i n a , e l h a p t e n o s e u n e e n u n b o ls i l l o p r o f u n d o f o r m a d o p o r r e s i d u o s h id r ó f o b o s . E n e s t e e s t u d i o c r i s t a l o g r á f i c o s e u s ó u n c o n j u g a d o d e d i g o x i g e n i n a - C y 5 f l u o r e s c e n t e , e n e l q u e e l f l u o r ó f o r o , a s í c o m o e l c o n e c t o r e n t r e la d i g o x i g e n i n a y C y 5 n o e r a n v i s i b l e s e n la e s t r u c t u r a d e b i d o a u n a a l t a f l e x i b i l i d a d y e l d e s o r d e n r e s u l t a n t e e n e l c r i s t a l . S in e m b a r g o , e l c o n e c t o r y C y 5 s e u n e n a l O 32 d e d i g o x i g e n i n a q u e a p u n t a e n la d i r e c c i ó n d e la C D R 2 d e la c a d e n a p e s a d a . L a d is t a n c i a e n t r e O 32 ( v é a s e a r r i b a ) d e d i g o x i g e n i n a y e l C a d e l r e s i d u o d e a m i n o á c i d o e n la p o s ic i ó n 52 b d e a c u e r d o c o n la n u m e r a c i ó n d e K a b a t e s d e a p r o x i m a d a m e n t e 10 , 5 A .
E l r e e m p l a z o d e l a m i n o á c i d o e n la p o s ic i ó n V H 5 2 b / V H 5 3 c o n d e r i v a d o s d e a n t i c u e r p o s g e n e r a d o s p o r C y s c o n s e c u e n c i a s d e r e g ió n v a r i a b l e d e c a d e n a p e s a d a q u e s e e n u m e r a n c o m o S E Q ID N O : 20 y 28 p a r a e l a n t i c u e r p o a n t i -d i g o x i g e n i n a V H 52 b C , S E Q ID N O : 84 y 92 p a r a e l a n t i c u e r p o a n t i - t e o f i l i n a V H 53 C , s E q iD N O : 52 y 60 p a r a e l a n t i c u e r p o a n t i - b i o t i n a V H 53 C , y S E Q ID N O : 108 p a r a e l a n t i c u e r p o a n t i - f l u o r e s c e í n a V H 52 b C .
O t r a p o s ic i ó n q u e s e id e n t i f i c ó c o m o p u n t o d e m o d i f i c a c i ó n e s la p o s ic i ó n V H 2 8 d e a c u e r d o c o n la n u m e r a c i ó n d e K a b a t .
E n c o n s e c u e n c i a , s e i n t r o d u j o u n a c i s t e í n a e n la p o s ic i ó n V H 28 d e K a b a t . E l r e e m p l a z o d e l a m i n o á c i d o e n la p o s ic i ó n V H 2 8 c o n d e r i v a d o s d e a n t i c u e r p o s g e n e r a d o s p o r C y s c o n s e c u e n c i a s d e r e g ió n v a r i a b l e d e c a d e n a p e s a d a q u e s e e n u m e r a n c o m o S E Q ID N O : 124 y 132 p a r a e l a n t i c u e r p o a n t i - d i g o x i g e n i n a V H 28 C , S E Q ID N O : 156 y 164 p a r a e l a n t i c u e r p o a n t i - t e o f i l i n a V H 28 C , S E Q ID N o : 140 y 148 p a r a e l a n t i c u e r p o a n t i - b i o t i n a V H 28 C , y S E Q ID N o : 116 p a r a e l a n t i c u e r p o a n t i - f l u o r e s c e í n a V H 28 C .
S e h a d e s c u b i e r t o q u e u n a d e e s t a s p o s i c i o n e s e s u n a p o s ic i ó n " u n i v e r s a l " , e s d e c i r , la p o s ic i ó n e s a p l i c a b l e a c u a l q u i e r a n t i c u e r p o y , p o r t a n t o , n o e s n e c e s a r i o c o m e n z a r d e s d e c e r o c a d a v e z q u e u n n u e v o a n t i c u e r p o s e t i e n e q u e m o d i f i c a r p r o p o r c i o n a n d o la e s t r u c t u r a c r i s t a l i n a y d e t e r m i n a n d o la p o s ic i ó n a p r o p i a d a q u e p e r m i t e e l a c o p l a m i e n t o c o v a l e n t e p o s i c i o n a d o c o n e l h a p t e n o .
L a m u t a c ió n V H 5 2 b C o V H 53 C , r e s p e c t i v a m e n t e , d e a c u e r d o c o n la n u m e r a c i ó n d e la r e g ió n v a r i a b l e d e la c a d e n a p e s a d a d e K a b a t , s e p o d r í a u s a r p a r a c a d a a n t i c u e r p o d e u n ió n a h a p t e n o ( a n t i c u e r p o a n t i - h a p t e n o ) . A u n q u e lo s a n t i c u e r p o s y e s t r u c t u r a s d e s u s b o l s i l l o s d e u n ió n s o n b a s t a n t e d i v e r s o s , s e h a d e m o s t r a d o q u e la m u t a c ió n V H 52 b C / V H 5 3 C s e p u e d e u s a r p a r a la u n ió n c o v a l e n t e d e a n t í g e n o s / h a p t e n o s a a n t i c u e r p o s q u e s e u n e n a d i g o x i g e n i n a , b io t in a , f l u o r e s c e í n a y t e o f i l i n a .
L a s e n t i d a d e s d e u n ió n q u e e s t á n c o m p u e s t a s p o r e s t a s s e c u e n c i a s s e p o d r í a n e x p r e s a r y p u r i f i c a r c o n p r o t e í n a A e s t á n d a r y c r o m a t o g r a f í a d e e x c l u s i ó n p o r t a m a ñ o ( v é a s e e l e j e m p l o 7 ) . L a s m o l é c u l a s r e s u l t a n t e s e r a n c o m p l e t a m e n t e f u n c i o n a l e s y c o n s e r v a b a n la a f i n i d a d h a c ia s u s h a p t e n o s a f i n e s d e la m i s m a m a n e r a q u e s u s m o l é c u l a s o r i g i n a l e s n o m o d i f i c a d a s . E s t o s e d e m o s t r ó m e d i a n t e e x p e r i m e n t o s d e r e s o n a n c i a d e p la s m ó n s u p e r f i c i a l ( R P S ) ( v é a s e e l e j e m p l o 9 ) .
Ejemplo 7
Composición, expresión y purificación de anticuerpos anti-hapteno recombinantes
S e c o m b i n a r o n r e g io n e s v a r i a b l e s d e a n t i c u e r p o a n t i - h a p t e n o m u r i n o y h u m a n i z a d o c o n r e g io n e s c o n s t a n t e s d e o r ig e n h u m a n o p a r a f o r m a r a n t i c u e r p o s q u i m é r i c o s o h u m a n i z a d o s m o n o o b i e s p e c í f i c o s .
Figure imgf000068_0001
10 E n g e n e r a l , p a r a g e n e r a r u n a n t i c u e r p o h u m a n i z a d o d e la c l a s e I g G q u e t i e n e la e s p e c i f i c i d a d d e u n ió n d e l a n t i c u e r p o a n t i - h a p t e n o m u r i n o ( o r i g in a l ) , la s e c u e n c i a d e V H h u m a n i z a d a s e f u s i o n ó e n la r e g ió n e s t r u c t u r a l a l e x t r e m o N d e C H 1 - b i s a g r a - C H 2 - C H 3 d e u n a r e g ió n F c h u m a n a d e la s u b c l a s e I g G 1 . D e f o r m a s im i la r , la s e c u e n c i a d e V L h u m a n i z a d a s e f u s i o n ó e n e l m a r c o a l e x t r e m o N d e la r e g ió n c o n s t a n t e C L k a p p a h u m a n a .
15 P a r a g e n e r a r d e r i v a d o s d e a n t i c u e r p o s b i e s p e c í f i c o s q u e c o n t i e n e n la e s p e c i f i c i d a d d e u n ió n a l h a p t e n o , a s í c o m o la s e s p e c i f i c i d a d e s p a r a o t r a s d ia n a s , e l a n t i c u e r p o a n t i - h a p t e n o , u n s c F v o u n f r a g m e n t o F a b s e f u s i o n ó e n e l m a r c o a l e x t r e m o C d e la c a d e n a p e s a d a d e lo s a n t i c u e r p o s d e s c r i t o s a n t e r i o r m e n t e . E n m u c h o s c a s o s , e l s c F v a n t i - h a p t e n o a p l i c a d o s e e s t a b i l i z ó a d e m á s m e d i a n t e la i n t r o d u c c i ó n d e u n e n l a c e d i s u l f u r o V H 44 - V L 1 0 0 q u e s e h a d e s c r i t o p r e v i a m e n t e ( p o r e je m p lo , R e i t e r , Y . , e t a l . , N a t u r e b i o t e c h n o l o g y 14 ( 1 996 ) 1239 - 1245 ) .
20
Plásmidos de expresión
L o s p l á s m i d o s d e e x p r e s i ó n q u e c o m p r e n d e n c a s e t e s d e e x p r e s i ó n p a r a la e x p r e s i ó n d e la s c a d e n a s p e s a d a y l i g e r a s e e n s a m b l a r o n p o r s e p a r a d o e n v e c t o r e s d e e x p r e s i ó n d e c é l u l a s d e m a m í f e r o .
25
D e e s t e m o d o , lo s s e g m e n t o s g é n i c o s q u e c o d i f i c a n lo s e l e m e n t o s i n d i v i d u a l e s s e u n i e r o n c o m o s e d e s c r i b e a n t e r i o r m e n t e .
L a i n f o r m a c i ó n g e n e r a l s o b r e la s s e c u e n c i a s d e n u c l e ó t i d o s d e la s c a d e n a s l i g e r a y p e s a d a h u m a n a s a p a r t i r d e la s 30 q u e s e p u e d e d e d u c i r e l u s o d e l c o d ó n s e p r o p o r c i o n a e n : K a b a t , E . A . , e t a l . , S e q u e n c e s o f P r o t e i n s o f I m m u n o l o g i c a l I n t e r e s t , 5 . a e d . , P u b l i c H e a l t h S e r v ic e , N a t io n a l I n s t i t u t e s o f H e a l t h , B e t h e s d a , M D ( 1991 ) , n . ° p u b l i c a c i ó n N 1H 91 ­ 3242 .
L a u n id a d d e t r a n s c r i p c i ó n d e la c a d e n a l i g e r a k s e c o m p o n e d e lo s s i g u i e n t e s e le m e n t o s :
35
- e l p o t e n c i a d o r y p r o m o t o r t e m p r a n o i n m e d i a t o d e l c i t o m e g a l o v i r u s h u m a n o ( h C M V ) ,
- u n a 5 ' - U T s i n t é t i c a q u e i n c lu y e u n a s e c u e n c i a d e K o z a k ,
40 - u n a s e c u e n c i a s e ñ a l d e la c a d e n a p e s a d a d e in m u n o g l o b u l i n a m u r i n a q u e i n c lu y e e l i n t r ó n d e s e c u e n c i a s e ñ a l , - e l A D N c d e la c a d e n a l i g e r a v a r i a b l e c l o n a d o d i s p u e s t o c o n u n s i t i o d e r e s t r i c c ió n B s m l ú n ic o e n e l e x t r e m o 5 ' y u n s i t i o d a d o r d e e m p a l m e y u n s i t i o d e r e s t r i c c i ó n N o t l ú n ic o e n e l e x t r e m o 3 ',
45 - la r e g ió n c o n s t a n t e d e l g e n k h u m a n o g e n ó m i c o , q u e in c lu y e e l p o t e n c i a d o r d e Ig -K d e r a t ó n d e in t r ó n 2 ( P ic a r d , D . y S c h a f f n e r , W . N a t u r e 307 ( 1 98 4 ) 80 - 82 ) , y
- la s e c u e n c i a s e ñ a l d e p o l i a d e n i l a c i ó n ( " p o l i A " ) K d e in m u n o g l o b u l i n a h u m a n a .
50 L a u n id a d d e t r a n s c r i p c i ó n d e la c a d e n a p e s a d a y 1 s e c o m p o n e d e lo s s i g u i e n t e s e le m e n t o s :
- e l p o t e n c i a d o r y p r o m o t o r t e m p r a n o i n m e d i a t o d e l c i t o m e g a l o v i r u s h u m a n o ( h C M V ) ,
- u n a 5 ' - U T s i n t é t i c a q u e i n c lu y e u n a s e c u e n c i a d e K o z a k ,
55
- u n a s e c u e n c i a s e ñ a l d e la c a d e n a p e s a d a d e in m u n o g l o b u l i n a m u r i n a m o d i f i c a d a q u e i n c lu y e e l i n t r ó n d e s e c u e n c i a s e ñ a l ,
- e l A D N c d e la c a d e n a p e s a d a v a r i a b l e m o n o e s p e c í f i c o c l o n a d o o e l A D N c d e la c a d e n a p e s a d a v a r i a b l e d e s c F v d e f u s i ó n b i e s p e c í f i c o c l o n a d o d i s p u e s t o c o n u n s i t i o d e r e s t r i c c i ó n B s m l ú n ic o e n 5 ' y u n s i t io d a d o r d e e m p a l m e y u n 60 s i t i o d e r e s t r i c c i ó n N o t l ú n ic o e n e l e x t r e m o 3 ',
- la r e g ió n c o n s t a n t e d e l g e n d e c a d e n a p e s a d a y 1 h u m a n a g e n ó m i c a , q u e i n c lu y e e l p o t e n c i a d o r p d e Ig d e r a tó n ( N e u b e r g e r , M .S . , E M B O J . 2 ( 19 83 ) 1373 - 1 378 ) , y
65 - la s e c u e n c i a s e ñ a l d e p o l i a d e n i l a c i ó n d e i n m u n o g l o b u l i n a - Y l h u m a n a ( " p o l i A " ) .
A d e m á s d e l c a s e t e d e e x p r e s i ó n d e la c a d e n a l i g e r a k o c a d e n a p e s a d a y 1 , e s t o s p lá s m i d o s c o n t ie n e n - u n g e n d e r e s i s t e n c i a a h ig r o m ic in a ,
- u n o r i g e n d e r e p l i c a c ió n , o r iP , d e l v i r u s d e E p s t e i n - B a r r ( V E B ) ,
- u n o r i g e n d e r e p l i c a c i ó n d e l v e c t o r p U C 18 q u e p e r m i t e la r e p l i c a c i ó n d e e s t e p l á s m i d o e n E . c o l i y
- u n g e n d e p - t a l a c t a m a s a q u e c o n f i e r e r e s i s t e n c i a a la a m p i c i l i n a e n E . c o l i .
Técnicas de ADN recombinante
L a c l o n a c i ó n s e r e a l i z ó u s a n d o t é c n i c a s d e c l o n a c i ó n e s t á n d a r c o m o s e d e s c r i b e e n S a m b r o o k e t a l . , 1999 ( s u p r a ) . T o d o s lo s r e a c t i v o s b i o l ó g i c o s m o l e c u l a r e s e s t a b a n d i s p o n i b l e s c o m e r c i a l m e n t e ( s i n o s e in d i c a d e o t r o m o d o ) y s e u s a r o n d e a c u e r d o c o n la s i n s t r u c c i o n e s d e l f a b r i c a n t e .
E l A D N q u e c o n t i e n e s e c u e n c i a s c o d i f i c a n t e s , m u t a c i o n e s u o t r o s e l e m e n t o s g e n é t i c o s s e s in t e t i z ó p o r G e n e a r t A G , R e g e n s b u r g .
S e d e t e r m i n a r o n la s s e c u e n c i a s d e A D N p o r s e c u e n c i a c i ó n d e d o b l e h e b r a r e a l i z a d a e n S e q u i S e r v e ( S e q u i S e r v e G m b H , A l e m a n i a ) .
Análisis de la secuencia de ADN y proteínas y gestión de datos de secuencia
Expresión de anticuerpos anti-hapteno y derivados
L o s a n t i c u e r p o s a n t i - h a p t e n o s e e x p r e s a r o n m e d i a n t e t r a n s f e c c i ó n t r a n s i t o r i a d e c é l u l a s d e r iñ ó n e m b r i o n a r i o h u m a n o 2 93 ( H E K 2 93 ) e n s u s p e n s i ó n . P a r a e s o , s e c o n s t r u y e r o n c a d e n a s l i g e r a s y p e s a d a s d e lo s c o r r e s p o n d i e n t e s a n t i c u e r p o s m o n o o b i e s p e c í f i c o s e n v e c t o r e s d e e x p r e s i ó n q u e l l e v a b a n m a r c a d o r e s d e s e l e c c i ó n p r o c a r i o t a s y e u c a r i o t a s c o m o s e e x p l i c a a n t e r i o r m e n t e . E s t o s p l á s m i d o s s e a m p l i f i c a r o n e n E . c o l i , s e p u r i f i c a r o n y p o s t e r i o r m e n t e s e a p l i c a r o n p a r a t r a n s f e c c i o n e s t r a n s i t o r i a s . S e u s a r o n t é c n i c a s d e c u l t i v o c e l u l a r e s t á n d a r p a r a la m a n i p u l a c i ó n d e la s c é l u l a s c o m o s e d e s c r i b e e n C u r r e n t P r o t o c o l s in C e l l B i o l o g y ( 2000 ) , B o n i f a c in o , J . S . , D a s s o , M ., H a r f o r d , J . B . , L i p p i n c o t t - S c h w a r t z , J . y Y a m a d a , K . M . ( e d s . ) , J o h n W i l e y & S o n s , In c .
L a s c é l u l a s s e c u l t i v a r o n e n m e d io d e e x p r e s i ó n a p r o p i a d o a 37 ° C / C O 2 a l 8 % . E l d í a d e la t r a n s f e c c i ó n , la s c é lu l a s s e s e m b r a r o n e n m e d i o f r e s c o a u n a d e n s i d a d d e 1 - 2 x 106 c é l u l a s v ia b l e s / m l . L o s c o m p l e j o s d e A D N c o n r e a c t i v o s d e t r a n s f e c c i ó n s e p r e p a r a r o n e n m e d i o O p t i - M E M I ( I n v i t r o g e n , E E . U U . ) q u e c o m p r e n d e 25 0 p g d e A D N p l a s m í d i c o d e c a d e n a p e s a d a y l i g e r a e n u n a p r o p o r c i ó n m o l a r d e 1 :1 p a r a u n v o l u m e n d e t r a n s f e c c i ó n f i n a l d e 25 0 m l. L o s s o b r e n a d a n t e s d e c u l t i v o c e l u l a r q u e c o n t i e n e n a n t i c u e r p o m o n o e s p e c í f i c o o b i e s p e c í f i c o s e a c l a r a r o n 7 d í a s d e s p u é s d e la t r a n s f e c c i ó n m e d i a n t e c e n t r i f u g a c i ó n a 14 .000 g d u r a n t e 30 m i n u t o s y f i l t r a c i ó n a t r a v é s d e u n f i l t r o e s t é r i l ( 0 , 22 p m ) . L o s s o b r e n a d a n t e s s e a l m a c e n a r o n a - 20 ° C h a s t a s u p u r i f i c a c ió n .
P a r a d e t e r m i n a r la c o n c e n t r a c i ó n d e a n t i c u e r p o s y d e r i v a d o s e n lo s s o b r e n a d a n t e s d e c u l t i v o c e lu l a r , s e a p l i c ó c r o m a t o g r a f í a H P L C d e a f in id a d . P a r a e s o , e l s o b r e n a d a n t e d e c u l t i v o c e l u l a r q u e c o n t i e n e a n t i c u e r p o m o n o o b i e s p e c í f i c o o d e r i v a d o s d e l m is m o q u e s e u n e a la p r o t e í n a A s e a p l i c ó a u n a c o l u m n a A / 20 d e A p p l i e d B io s y s t e m s P o r o s e n u n a s o l u c i ó n q u e c o m p r e n d í a K H 2 P O 4 20 0 m M , c i t r a t o d e s o d i o 100 m M , a u n p H d e 7 , 4 . L a e lu c i ó n d e l m a t e r i a l c r o m a t o g r á f i c o s e r e a l i z ó a p l i c a n d o u n a s o l u c i ó n q u e c o m p r e n d í a N a C l 200 m M , á c i d o c í t r i c o 100 m M , a u n p H d e 2 , 5 . S e u s ó u n s i s t e m a H P L C U l t iM a t e 300 0 ( D io n e x ) . S e c u a n t i f i c ó la p r o t e í n a e l u i d a p o r a b s o r b a n c i a U V e i n t e g r a c i ó n d e á r e a s d e p ic o s . U n a n t i c u e r p o Ig G 1 p u r i f i c a d o s i r v i ó c o m o p a t r ó n .
Purificación de anticuerpos anti-hapteno que se unen a digoxigenina, fluoresceína, teofilina o biotina S i e t e d í a s d e s p u é s d e la t r a n s f e c c i ó n , s e r e c o g i e r o n lo s s o b r e n a d a n t e s d e c é l u l a s H E K 293 . E l a n t i c u e r p o r e c o m b i n a n t e ( o d e r i v a d o s ) c o n t e n i d o e n e l m is m o s e p u r i f i c ó d e l s o b r e n a d a n t e e n d o s e t a p a s m e d i a n t e c r o m a t o g r a f í a d e a f i n i d a d u s a n d o c r o m a t o g r a f í a d e a f in id a d d e p r o t e í n a A - S e p h a r o s e ™ ( G E H e a l t h c a r e , S u e c i a ) y c r o m a t o g r a f í a d e e x c l u s i ó n p o r t a m a ñ o S u p e r d e x 20 0 . E n r e s u m e n , l o s s o b r e n a d a n t e s d e c u l t i v o c la r i f i c a d o s q u e c o n t e n í a n a n t i c u e r p o s e a p l i c a r o n e n u n a c o l u m n a d e p r o t e í n a A M a b S e l e c t S u R e ( 5 - 50 m l ) e q u i l i b r a d a c o n t a m p ó n P B S ( N a 2 H P O 4 10 m M , K H 2 P O 4 1 m M , N a C l 137 m M y K C l 2 , 7 m M , p H 7 , 4 ) . L a s p r o t e í n a s n o u n i d a s s e la v a r o n c o n t a m p ó n d e e q u i l i b r io . L o s a n t i c u e r p o s ( o d e r i v a d o s ) s e e l u y e r o n c o n t a m p ó n d e c i t r a t o 50 m M , p H 3 , 2 . L a s f r a c c i o n e s q u e c o n t e n í a n p r o t e í n a s e n e u t r a l i z a r o n c o n 0 ,1 m l d e t a m p ó n T r i s 2 M , p H 9 , 0. A c o n t i n u a c i ó n , la s f r a c c i o n e s d e p r o t e í n a e l u i d a s s e c o m b i n a r o n , s e c o n c e n t r a r o n c o n u n d i s p o s i t i v o d e f i l t r o c e n t r í f u g o A m i c o n U l t r a ( M W C O : 30 K , M i l l i p o r e ) y s e c a r g a r o n e n u n a c o l u m n a d e f i l t r a c i ó n e n g e l S u p e r d e x 20 0 H i L o a d 26 / 6 0 ( G E H e a l t h c a r e , S u e c i a ) e q u i l i b r a d a c o n h i s t i d i n a 20 m M , N a C l 140 m M , a p H 6 , 0 . L a c o n c e n t r a c i ó n d e p r o t e í n a s d e lo s a n t i c u e r p o s p u r i f i c a d o s y s u s d e r i v a d o s s e d e t e r m i n ó d e t e r m i n a n d o la d e n s i d a d ó p t i c a ( D O ) a 280 n m , c o n la D O a 320 n m c o m o la c o r r e c c i ó n d e f o n d o , u s a n d o e l c o e f i c i e n t e d e e x t i n c i ó n m o l a r c a l c u l a d o a p a r t i r d e la s e c u e n c i a d e a m i n o á c i d o s d e a c u e r d o c o n P a c e e t a l . , P r o t e in S c ie n c e , 4 ( 1 995 ) 24 11 - 24 23 . L a s f r a c c i o n e s d e a n t i c u e r p o s m o n o m é r i c o s s e c o m b i n a r o n , s e c o n g e l a r o n r á p i d a m e n t e y s e a lm a c e n a r o n a - 80 ° C . P a r t e d e la s m u e s t r a s s e p r o p o r c i o n ó p a r a a n á l i s i s y c a r a c t e r i z a c i ó n d e p r o t e í n a s p o s t e r io r e s .
Figure imgf000070_0001
E n c o n d i c i o n e s r e d u c t o r a s , la s c a d e n a s p o l i p e p t í d i c a s r e l a c i o n a d a s c o n la I g G s e i d e n t i f i c a r o n d e s p u é s d e S D S - P A G E e n t a m a ñ o s m o l e c u l a r e s a p a r e n t e s a n á l o g o s a lo s p e s o s m o l e c u l a r e s c a l c u l a d o s . L o s n iv e l e s d e e x p r e s i ó n d e t o d a s la s c o n s t r u c c i o n e s s e a n a l i z a r o n m e d i a n t e la p r o t e í n a A . L o s r e n d i m i e n t o s p r o m e d i o d e p r o t e í n a e s t u v i e r o n e n t r e 6 m g y 35 m g d e p r o t e í n a p u r i f i c a d a p o r l i t r o d e s o b r e n a d a n t e d e c u l t i v o c e l u l a r e n d ic h o s e x p e r i m e n t o s d e e x p r e s i ó n t r a n s i t o r i a n o o p t i m i z a d o s .
Ejemplo 8
Generación de compuestos haptenilados
P a r a la g e n e r a c i ó n d e c o m p u e s t o s p a r a la c o m p l e j a c i ó n n o c o v a l e n t e , a s í c o m o p a r a la c o n j u g a c i ó n ( c o m p l e j a c i ó n c o v a l e n t e ) e s n e c e s a r i o ( i ) a c o p l a r e l h a p t e n o p o r m e d i o d e c o n e c t o r e s a d e c u a d o s a l c o m p u e s t o ( = c a r g a ú t i l ) , y ( i i ) a s e g u r a r q u e s e p r o d u z c a e l a c o p l a m i e n t o d e u n a m a n e r a q u e p e r m i t a q u e e l c o m p u e s t o c o n s e r v e s u f u n c i o n a l i d a d . a) conjugados hapteno-polipéptido:
C u a l q u i e r p o l i p é p t i d o s e p u e d e d e r i v a t i z a r e n N o C t e r m i n a l o e n u n a p o s ic i ó n d e c a d e n a l a t e r a l p o r e l c o n e c t o r p o r t a d o r d e h a p t e n o s i e m p r e q u e s e p u e d a i n t r o d u c i r u n r e s i d u o r e a c t i v o , t a l c o m o u n r e s i d u o d e c i s t e í n a , e n e l c o n e c t o r e n t r e e l p o l i p é p t i d o y e l h a p t e n o . E s p e c i a l m e n t e , e l p o l i p é p t i d o p u e d e c o m p r e n d e r r e s i d u o s d e a m i n o á c i d o s n o n a t u r a le s .
L o s c o m p u e s t o s h a p t e n i l a d o s e j e m p l a r e s s e e n u m e r a n e n la s i g u i e n t e t a b l a 5.
Tabla 5
Figure imgf000071_0001
A b r e v i a t u r a s : 4 A b u = á c id o 4 - a m i n o - b u t í r i c o A h x = á c i d o a m in o h e x a n o i c o
B t n = b i o t in i l o
c m e = c a r b o x i m e t i l
C y 5 = i n d o d i c a r b o c i a n i n a , c i a n i n a - 5
D a d o o = 1 , 8 - d i a m i n o - 3 , 6 - d i o x o - o c t a n o
D C M = d i c l o r o m e t a n o
D i g ( O S u ) = d i g o x i g e n i n a - 3 - c a r b o x i l m e t i l - N - h i d r o x i s u c c i n i m i d a
D y 63 6 = f l u o r ó f o r o
e d a = e t i l e n d i a m i n a
F lu o = 5 - c a r b o x i - f l u o r e s c e í n a
H A T U = 0 -( 7 - A z a - 1 H - b e n z o t r i a z o l - 1 - i l ) - 1 , 1 , 3 , 3 - h e x a f l u o r o f o s f a t o d e t e t r a m e t i l u r o n i o
H F I P = 1 , 1 , 1 , 3 , 3 , 3 , - h e x a f l u o r o - 2 - p r o p a n o l
M m t = 4 - m e t o x i t r i t i l o
M R 121 = f l u o r ó f o r o d e o x a z in a
M T B E = t e r c . B u t i l - m e t i l - é t e r
N M M = N - m e t i l - m o r f o l i n a
N M P = N - m e t i l - 2 - p i r r o l i d o n a
P E G 2 = á c i d o 8 - a m i n o - 3 , 6 - d i o x a - o c t a n o i c o
P E G 3 = á c i d o 1 2 - a m i n o - 4 , 7 , 1 0 - t r i o x a d o d e c a n o i c o
O 2 O C = á c i d o 8 - a m i n o - 3 , 6 - d i o x a - o c t a n o i c o
P ip = p ip e r i d i n a
P q a = á c id o 4 - o x o - 6 - p i p e r a z i n a - 1 - i l - 4 H - q u i n a z o l i n a - 3 - i l ) - a c é t i c o
T B T U = t e t r a f l u o r o b o r a t o d e 2 -( 1 H - b e n z o t r i a z o l - 1 - i l ) - 1 , 1 , 3 , 3 - t e t r a m e t i l u r o n i o
T C E P = T r i s ( 2 - c l o r o e t i l o ) f o s f a t o
T F E = 2 , 2 , 2 , t r i f l u o r o e t a n o l
T I S = T r i i s o p r o p i l s i l a n o
E n la s f i g u r a s 30 , 31 y 32 s e m u e s t r a u n e s q u e m a d e l p r o c e d i m i e n t o d e a c o p l a m i e n t o y lo s r e a c t i v o s e m p l e a d o s . U n p o l i p é p t i d o e j e m p l a r q u e s e h a u s a d o e n e l p r e s e n t e d o c u m e n t o e r a u n d e r i v a d o a g o n i s t a d e l r e c e p t o r d e l n e u r o p é p t i d o - 2 . E s t e p o l i p é p t i d o e s u n a n á l o g o d e l p é p t i d o t i r o s i n a t i r o s i n a o p é p t i d o p a n c r e á t i c o Y Y , a b r e v i a d o c o m o P Y Y ( 3 - 36 ) c o m o s e in f o r m a e n e l d o c u m e n t o W O 20 0 7 / 06 58 08 . S e d i g o x i g e n i l ó p o r m e d io d e la l i s in a d e l r e s id u o d e a m i n o á c i d o e n la p o s ic i ó n 2. E l p o l i p é p t i d o P Y Y d i g o x i g e n i l a d o s e d e n o m i n a D I G - P Y Y e n e l s i g u i e n t e t e x t o i n d e p e n d i e n t e m e n t e d e la c a d e n a l a t e r a l q u e u n e e l p o l i p é p t i d o a l r e s i d u o d e d ig o x i g e n i n a .
O t r o s c o m p u e s t o s e j e m p l a r e s s o n lo s t i n t e s f l u o r e s c e n t e s n o p e p t í d i c o s C y 5 , D y 6 36 y M R 121 . E s t o s c o m p u e s t o s s e p u e d e n a c o p l a r a lo s s i s t e m a s d e c o n e c t o r q u e c o n t i e n e n d i g o x i g e n i n a o b i o t in a p o r m e d i o d e la q u í m i c a d e l é s t e r N H S .
i) Procedimiento general para la generación del precursor de conjugación de polipéptidos derivados de PYY(3-36)
P r o t o c o l o e s t á n d a r p a r a d e r i v a d o s d e P Y Y e n u n s i n t e t i z a d o r m ú l t i p le a u t o m a t i z a d o :
S i n t e t i z a d o r : S i n t e t i z a d o r m ú l t i p le S Y R O I ( M u l t i S y n T e c h G m b H , W i t t e n ) c o n s i s t e m a d e a g i t a c i ó n d e v ó r t i c e R e s in a : 20 0 m g d e T e n t a G e l S R A M ( 0 , 2 5 m m o l / g ) , R A P P P o ly m e r e , T u b i n g a , j e r i n g a d e p lá s t i c o d e 10 m l c o n u n a f r i t a d e t e f l ó n c o m o r e c i p i e n t e d e r e a c c ió n
S o l u c i o n e s m a d r e :
a m i n o á c i d o s F m o c : 0 , 5 M e n D M F o N M P
R e a c t i v o d e d e s b l o q u e o : p i p e r i d i n a a l 30 % e n D M F
A c t i v a d o r : T B T U y H A T U 0 , 5 M , r e s p e c t i v a m e n t e
B a s e : N M M a l 50 % e n N M P
A c o p l a m i e n t o :
a m i n o á c i d o F m o c : 519 p l
B a s e : 116 p l
A c t i v a d o r : 519 p l
T i e m p o d e r e a c c ió n : a c o p l a m i e n t o d o b le : 2 x 30 m in
D e s b l o q u e o d e F m o c :
R e a c t i v o d e d e s b l o q u e o : 1200 p l
T i e m p o d e r e a c c ió n : 5 m in 12 m in
L a v a d o :
D i s o l v e n t e : 1200 p l
V o l u m e n : 1300 p l
T i e m p o d e r e a c c ió n : 5 x 1 m in
E s c is i ó n f in a l :
R e a c t i v o d e e s c i s i ó n : 8 m l d e T F A / t i o a n i s o l / t i o c r e s o l / T I S ( 9 5 : 2 , 5 : 2 , 5 : 3 )
T i e m p o d e r e a c c ió n : 4 h
T r a t a m i e n t o f in a l : L a s o l u c i ó n d e e s c i s i ó n s e f i l t r ó y s e c o n c e n t r ó h a s t a 1 - 2 m l y e l p é p t i d o s e p r e c i p i t ó m e d ia n t e a d i c i ó n d e M T B E . E l s ó l i d o b la n c o s e r e c o g i ó p o r c e n t r i f u g a c i ó n , s e la v ó 2 v e c e s c o n M T B E y s e s e c ó .
Resina de Ac-IK-Pqa-R(Pbf)H(Trf)Y(tBu)LN(Trt)W(Boc)VT(But)R(Pbf)Q(Trt)-MeArg(Mtr)-Y(tBu)-TentaGel S RAM (SEQ ID NO: 176)
Figure imgf000073_0001
P a r a la e l i m i n a c i ó n d e l g r u p o M m t , e l p é p t i d o s e t r a t ó c o n D C M / H F I P / T F E / T I S ( 6 , 5 : 2 : 1 : 0 , 5 ) , 2 x 1 h , p r o p o r c i o n a n d o e l p r e c u r s o r d e s b l o q u e a d o p a r c ia l d e r e s in a d e A c - I K - P q a - R ( P b f ) H ( T r t ) Y ( t B u ) L N ( T r t ) W ( B o c ) V T ( B u t ) R ( P b f ) Q ( T r t ) -M e A r g ( M t r ) - Y ( t B u ) - T e n t a G e l S R A M d e s p u é s d e l a v a r c o n D M F .
Ac-PYY(PEG3-Dig)/Ac-IK(PEG3-Dig)-Pqa-R , IV IM V V 1 RQ-MeArg-Y-NH2(SEQ ID NO: 177)
P a r a la s ín t e s i s , v é a s e t a m b i é n e l d o c u m e n t o W O 20 12 / 09 30 68 .
Figure imgf000074_0002
ii) Generación de los polipéptidos derivados de PYY(3-36) digoxigenilados con un conector que contiene cisteína
Ac-IK(PEG3-Cys-4Abu-NH2)-Pqa-R,IV1 NVVV 1 RQ-MeArg-Y-NH2 (SEQ ID NO: 178)
Figure imgf000074_0001
d o b l e a c o p l a m i e n t o m a n u a l c o n 66 , 5 m g ( 3 e q u i v . ) á c id o F m o c - 1 2 - a m i n o - 4 , 7 , 1 0 - t r i o x a d o d e c a n o i c o ( e s p a c i a d o r P E G 3 ) , 57 , 0 m g ( 3 e q u i v . ) H A T U y 16 , 7 p l ( 3 e q u i v . ) N M M e n 1 , 2 m l d e D M F d u r a n t e 2 x 30 m in . D e s p u é s d e la v a d o s c o n D M F ( 5 x 1 m in ) , e l g r u p o F m o c s e e s c i n d i ó c o n P i p / D M F a l 30 % y la r e s i n a s e la v ó c o n D M F u s a n d o e l p r o t o c o l o e s t á n d a r .
L o s s i g u i e n t e s d o b l e s a c o p l a m i e n t o s d e F m o c - C y s ( T r t ) - O H y F m o c - 4 - A b u - O H s e r e a l i z a r o n a u t o m á t i c a m e n t e e n e l s i n t e t i z a d o r S Y R O 1 p o r m e d i o d e l p r o t o c o l o c o m o s e d e s c r i b e e n e l p r o t o c o l o e s t á n d a r p a r a d e r i v a d o s d e P Y Y e n u n s i n t e t i z a d o r m ú l t i p l e a u t o m a t i z a d o . F in a l m e n t e , la r e s in a s e la v ó c o n D M F , E t O H , M T B E y s e s e c ó .
L a e s c i s i ó n d e la r e s i n a s e r e a l i z ó c o n 8 m l d e T F A / t i o a n i s o l / t i o c r e s o l / T I S ( 9 5 : 2 , 5 : 2 , 5 : 3 ) d u r a n t e 4 h . L a s o l u c i ó n d e e s c i s i ó n s e f i l t r ó y s e c o n c e n t r ó h a s t a 1 - 2 m l y e l p é p t i d o s e p r e c i p i t ó m e d i a n t e a d ic i ó n d e M T B E . E l s ó l i d o b la n c o s e r e c o g i ó p o r c e n t r i f u g a c i ó n , s e la v ó 2 v e c e s c o n M T B E y s e s e c ó .
E l p r o d u c t o b r u t o s e p u r i f i c ó m e d i a n t e H P L C p r e p a r a t i v a d e f a s e in v e r s a d a n d o u n s ó l id o i n c o l o r o . R e n d i m i e n t o : 28 , 0 m g .
P r o t o c o l o d e p u r i f i c a c ió n
H P L C : S h i m a d z u L C - 8 A c o n d e t e c t o r U V - V i s S P D - 6 A
D i s o l v e n t e A : T F A a l 0 , 05 % e n a g u a
D i s o l v e n t e B : T F A a l 0 , 05 % e n a c e t o n i t r i l o / a g u a a l 80 %
C o l u m n a : U l t r a S e p E S , R P - 18 , 10 p m , 25 0 x 20 m m ( S E P S E R V , B e r l í n )
C a u d a l : 15 m l / m in
D e t e c c i ó n : 23 0 n m
G r a d i e n t e : 2 0 - 50 % B e n 30 m in
D a t o s a n a l í t i c o s :
H P L C : S h i m a d z u L C - 9 A c o n d e t e c t o r d e m a t r i z d e f o t o d i o d o s S P D - M 6 A
D i s o l v e n t e A : T F A a l 0 , 05 % e n a g u a
D i s o l v e n t e B : T F A a l 0 , 05 % e n a c e t o n i t r i l o / a g u a a l 80 %
C o l u m n a : U l t r a S e p E S , R P - 18 , 7 p m , 2 50 x 3 m m ( S E P S E R V , B e r l í n )
C a u d a l : 0 , 6 m l / m in
G r a d i e n t e : 5 - 80 % B e n 30 m in
E M : E s p e c t r ó m e t r o d e m a s a d e t i e m p o d e v u e l o S h i m a d z u A X I M A L i n e a r ( M A L D I - T O F ) , l o s p e s o s m o l e c u l a r e s s e c a l c u l a n c o m o m a s a p r o m e d io
m /z : c a lc u l a d o , p a r a C 1 2 2 H 1 8 5 N 3 70 2 8 S = 26 50 , 13 ; o b t e n id o : 2 65 0 , 3
Ac-IK(PEG3-Cys-4Abu-Dig)-Pqa-R ,IY 1 -N W V 1 RQ-MeArg-Y-NH2 (SEQ ID NO: 179)
Figure imgf000075_0001
A e s t a s o l u c i ó n s e le a ñ a d i e r o n 7 , 3 m g d e d i g o x i g e n i n a - 3 - c a r b o x i m e t i l - W - h i d r o x i s u c c i n i m i d a ( D i g - O S u ) d i s u e l t o s e n 1 00 p l d e D M F y s e a g i t ó la m e z c l a d u r a n t e 5 h a t e m p e r a t u r a a m b ie n t e . P o s t e r i o r m e n t e , s e a ñ a d i e r o n 16 , 9 m g a d i c i o n a l e s d e D i g - O S u d i s u e l t o s e n 100 p l d e D M F y s e a g i t ó d u r a n t e 2 h . S e a ñ a d i ó o t r a c a n t i d a d d e 6 , 9 m g e n 100 p l d e D M F y s e a g i t ó d u r a n t e 18 h . P a r a la r e d u c c i ó n d e l d í m e r o s e a ñ a d i ó T C E P , s e a g i t ó d u r a n t e 3 h y la s o lu c i ó n s e u s ó d i r e c t a m e n t e p a r a la p u r i f i c a c i ó n p o r m e d i o d e H P L C p r e p a r a t i v a d e f a s e in v e r s a .
D a t o s a n a l í t i c o s :
L a s c o n d i c i o n e s f u e r o n la s m is m a s q u e c o m o s e d e s c r i b e p a r a la S E Q ID N O : 178
G r a d i e n t e p a r a H P L C p r e p a r a t i v a : 38 - 58 % B e n 30 m in .
R e n d i m i e n t o : 5 , 3 m g
m /z : c a lc u l a d o , p a r a C 147H 219N 37 O 34 S = 3080 , 7 ; o b t e n id o : 307 9 , 8
PEG3-IK(PEG3-Cys-4Abu-Dig)-Pqa-RIIVI-N>VVV 1 KQ_MeArg-Y-NH2 (SEQ10 NO: 180)
S í n t e s i s a u t o m a t i z a d a e n f a s e s ó l i d a d e la s e c u e n c i a P Y Y u n id a a la r e s in a :
Figure imgf000075_0002
PEG2-IK(PEG3-Cys-Abu-NH2)-Pqa-K,IYI-NWV 1 RQ_MeArg-Y-NH2 (SEQ10 NO: 182)
P a r a la e l i m i n a c i ó n d e l g r u p o iv D d e , la r e s in a p e p t í d i c a ( P E G 2 - I K ( i v D d e ) - P q a -R ( P b f ) H ( T r t ) Y ( t B u ) L N ( T r t ) W ( B o c ) V T ( t B u ) R ( P b f ) Q ( T r t ) - M e A r g ( M t r ) - Y ( t B u ) - T e n t a G e l - R A M ; S E Q ID N O : 181 ) s e h i n c h ó c o n D M F d u r a n t e 30 m in , y p o s t e r i o r m e n t e s e t r a t ó c o n u n a s o l u c i ó n a l 2 % d e h i d r a t o d e h i d r a c i n a e n D M F ( 60 m l ) d u r a n t e 2 h . D e s p u é s d e l a v a r la r e s in a e x t e n s a m e n t e c o n i s o p r o p a n o l y D M F , s e a ñ a d i ó u n a s o l u c i ó n d e á c id o F m o c - 1 2 - a m i n o - 4 , 7 , 1 0 - t r i o x a d o d e c a n o i c o ( e s p a c i a d o r P E G 3 ) ( 887 m g , 2 m m o l ) , H B T U ( 2 m m o l ) , H O B t ( 2 m m o l ) y u n a d i i s o p r o p i l e t i l a m i n a d e 2 M ( 2 m l, 4 m m o l ) e n D M F ( 3 m l ) y la m e z c l a s e a g i t ó d u r a n t e 3 h . L a r e s in a s e la v ó c o n D M F y e l g r u p o F m o c s e e s c i n d i ó c o n u n a m e z c l a d e p i r i d in a a l 20 % e n D M F . P o s t e r i o r m e n t e , la r e s in a s e t r a t ó c o n u n a m e z c l a d e F m o c - C y s ( T r t ) - O H ( 1 , 2 g ; 2 m m o l ) , H B T U / H O B t ( 2 m m o l c a d a u n o ) y D I P E A ( 4 m m o l ) d u r a n t e 2 h . L a resina se lavó con DMF y el grupo Fmoc se escindió con una mezcla de piridina al 20 % en DMF y ácido Fmoc-4-aminobutírico (0,65 g, 2 mmol) activado con HBTU/HOBt (2 mmol cada uno) y se acopló (2 h) DIPEA (4 mmol). El grupo Fmoc N terminal se eliminó con piperidina al 20 % en NMP y la resina se lavó repetidamente con DMF. Posteriormente, la resina se trató con una mezcla de ácido trifluoroacético, agua y triisopropilsilano (19 ml: 0,5/ml: 0,5 ml) durante 2,5 h. La solución de escisión se filtró y el péptido se precipitó mediante la adición de éter diisopropílico frío (0 °C) (300 ml) para proporcionar un sólido incoloro, que se lavó repetidamente con éter diisopropílico. El producto bruto se volvió a disolver en una mezcla de ácido acético/agua y se liofilizó y purificó mediante HPLC preparativa de fase inversa empleando un gradiente de acetonitrilo/agua que contenía TFA al 0,1 % (columna Merck Chromolith prep RP-18e, 100 x 25 mm).
HPLC analítica: tR = 8,6 min (Merck Chromolith Performance RP-18e, 100 x 4,6 mm, agua TFA al 0,1 % ^ acetonitrilo/agua TFA al 0,1 %, 80:20, 25 min); ESI-MS (modo de iones positivos): m/z: calculado para C127H195N37O31S: 2768,3; obtenido: 1385,0 [M+2H]2+, calculado: 1385,1; 923,7[M+3H]3+, calculado: 923,8; 693,1[M+4H]4+, calculado: 693,1.
Figure imgf000076_0001
A una solución de péptido PEG2-IK (PEG3-Cys-Abu-NH2)-Pqa-RM Y I-N W V I RQ-MeArg-Y-NH2 (SEQ ID NO: 182, 4,1 mg, 1,48 pmol) en DMF (3 ml) se le añadió digoxigenina-3-carboximetil-N-hidroxisuccinimida (0,81 mg, 1,48 pmol) disuelta en NMP (1 ml). Se añadió trietilamina (0,41 pl, 97,6 pmol) en DMF y se removió la mezcla durante 2 horas a temperatura ambiente. El producto bruto se purificó mediante HPLC preparativa de fase inversa empleando un gradiente de acetonitrilo/agua que contenía TFA al 0,1 % (columna Merck Chromolith prep RP-18e, 100 x 25 mm) para proporcionar el péptido PEG3-Cys-4Abu-Dig (1,2 mg, 0,375 pmol, 25 %) como un sólido incoloro.
HPLC analítica: tR = 10,2 min (Merck Chromolith Performance RP-18e, 100 x 4,6 mm, agua TFA al 0,1 % ^ acetonitrilo/agua TFA al 0,1 %, 80:20, 25 min); ESI-MS (modo de iones positivos): m/z: calculado para C152H229N37O37S: 3198,8; obtenido: 1067,3[M+3H]3+, calculado: 1067,3.
iii) Generación de polipéptidos derivados de PYY(3-36) con biotina o con biotina y conector que contiene cisteína:
Ac-IK(PEG2-biotina)-Pqa-R ,IY 1 N W V 1 RQ-MeArg-Y-amida/Ac-PYY(PEG2-Biot) (SEQ ID NO: 184)
Comenzando con la resina de péptido precursor común (SEQ ID NO: 176), el péptido se acopló manualmente 2 veces con 57,8 mg (3 equiv.) ácido Fmoc-8-amino-dioxaoctanoico (espaciador PEG2), 48,2 mg (3 equiv.) TBTU y 33,3 pl (6 equiv.) NMM en 1,2 ml de DMF, 30 min cada uno y se lavó con DMF. El grupo Fmoc se escindió con Pip/DMF al 30 % usando el protocolo estándar descrito para SEQ ID NO: 176, la resina se lavó con DMF y se trató durante 2 h con una solución de biotina-OBt en NMP (48,9 mg de biotina (4 equiv.), 64,2 mg de TBTU (4 equiv.) y 44,4 pl de NMM (8 equiv.) en 1,2 ml de NMP, preactivación 3 min). Después de lavar con DMF, EtOH y MTBE, se secó la resina peptídica.
La escisión final se realizó como se describe anteriormente. El producto bruto se purificó mediante HPLC preparativa de fase inversa empleando un gradiente de B al 22-52 % en 30 min dando un sólido. Rendimiento: 42 mg.
Protocolo de purificación
HPLC: Shimadzu LC-8A con detector UV-Vis SPD-6A
Disolvente A: TFA al 0,05 % en agua
Disolvente B: TFA al 0,05 % en acetonitrilo/agua al 80 %
Columna: UltraSep ES, RP-18, 10 pm, 250 x 20 mm (SEPSERV, Berlín)
Caudal: 15 ml/min
Detección: 230 nm
Datos analíticos:
HPLC: Shimadzu LC-9A con detector de matriz de fotodiodos SPD-M6A
Disolvente A: TFA al 0,05 % en agua
Disolvente B: TFA al 0,05 % en acetonitrilo/agua al 80 %
Columna: UltraSep ES, RP-18, 7 pm, 250 x 3 mm (SEPSERV, Berlín)
C a u d a l : 0 , 6 m l / m in
G r a d i e n t e : 5 - 80 % B e n 30 m in
E M : E s p e c t r ó m e t r o d e m a s a d e t i e m p o d e v u e l o S h i m a d z u A X I M A L i n e a r ( M A L D I - T O F ) , l o s p e s o s m o l e c u l a r e s s e c a l c u l a n c o m o m a s a p r o m e d io
m /z : c a lc u l a d o , p a r a C 122H 181N 37 O 27 S = 263 0 , 10 ; o b t e n id o : 2 63 1 , 5
Ac-IK(PEG3-Cys-p-Ala-biotina)-Pqa- RHYI.MVVTRQ -MeArg-Y-NH2/Ac-PYY(PEG3-Cys-p-Ala-Biot) (SEQ ID NO: 185)
Figure imgf000077_0001
T r a s d o b l e s a c o p l a m i e n t o s d e F m o c - C y s ( T r t ) - O H y F m o c - p - A l a - O H r e a l i z a d o s a u t o m á t i c a m e n t e e n e l s i n t e t i z a d o r S Y R O 1 p o r m e d io d e l p r o t o c o l o e s t á n d a r , u n a s o lu c i ó n d e b i o t i n a - O B t e n N M P ( p r e p a r a d a a p a r t i r d e 48 , 9 m g d e b i o t i n a ( 4 e q u iv . ) , s e a ñ a d i e r o n m a n u a l m e n t e 64 , 2 m g d e T B T U ( 4 e q u i v . ) y 44 , 4 j l d e N M M ( 8 e q u i v . ) e n 1 , 2 m l d e N M P , p r e a c t i v a c i ó n 3 m in ) y s e a g i t ó a t e m p e r a t u r a a m b ie n t e . D e s p u é s d e 2 h , la r e s in a s e la v ó c o n D M F , E t O H , M T B E y s e s e c ó .
L a e s c i s i ó n f i n a l s e r e a l i z ó c o m o s e d e s c r i b e a n t e r i o r m e n t e . E l p r o d u c t o b r u t o s e p u r i f i c ó m e d i a n t e H P L C p r e p a r a t i v a d e f a s e i n v e r s a c o m o s e d e s c r i b e p a r a la S E Q ID N O : 184 d a n d o u n s ó l i d o in c o l o r o . R e n d i m i e n t o : 4 1 , 4 m g
D a t o s a n a l í t i c o s :
G r a d i e n t e p a r a H P L C p r e p a r a t i v a : 2 8 - 5 8 % B e n 30 m in .
m /z : c a lc u l a d o , p a r a C 131H 197N 39 O 30 S 2 = 286 2 , 4 ; o b t e n id o : 28 62 , 4
Ac-IK(PEG3-Cys-PEG2-biotina)-Pqa-K , IY IN W V 1 RQ-MeArg-Y-NH2/Ac-PYY(PEG3-Cys-PEG2-Biot) (SEQ ID NO: 186)
Figure imgf000077_0002
d o b l e a c o p l a m i e n t o c o n F m o c - P E G 3 - O H ( p o r m e d i o d e l p r o t o c o l o e s t á n d a r ) ,
d o b l e a c o p l a m i e n t o d e F m o c C y s ( T r t ) - O H ( p o r m e d i o d e l p r o t o c o l o e s t á n d a r ) ,
d o b l e a c o p l a m i e n t o d e F m o c - P E G 2 - O H c o n 57 , 8 m g ( 3 e q u i v . ) á c i d o F m o c - 8 - a m i n o - d i o x a o c t a n o i c o ( e s p a c i a d o r P E G 2 ) , 48 , 2 m g ( 3 e q u i v . ) T B T U y 33 , 3 j l ( 6 e q u i v . ) N M M e n 1 , 2 m l d e D M F , 2 x 30 m in y b i o t i n i l a c i ó n c o n u n a s o lu c i ó n d e 4 8 , 9 m g d e b io t in a ( 4 e q u iv . ) , 6 4 , 2 m g d e Tb t U ( 4 e q u i v . ) y 4 4 , 4 j l d e N M M ( 8 e q u i v . ) e n 1 , 2 m l d e N M P , ( 3 m in d e p r e a c t i v a c i ó n ) , a c o p l a m i e n t o ú n i c o d e 2 h .
L a e s c is ió n d e la r e s in a , la p u r i f i c a c i ó n y e l a n á l i s i s s e r e a l i z a r o n c o m o s e d e s c r i b e e n la S E Q ID N O : 184 . R e n d i m i e n t o : 4 7 , 7 m g
D a t o s a n a l í t i c o s :
L a s m is m a s c o n d i c i o n e s q u e p a r a la S E Q ID N O : 184 . G r a d i e n t e p a r a H P L C p r e p a r a t i v a : 2 5 - 4 5 % B e n 30 m in . m /z : c a lc u l a d o , p a r a C 134 H 203 N 39 O 32 S 2 = 2936 , 5 ; o b t e n id o : 29 37 , 8
iv ) G e n e r a c i ó n d e p o l i p é p t i d o s d e r i v a d o s d e P Y Y ( 3 - 36 ) c o n u n a f l u o r e s c e í n a o c o n u n c o n e c t o r q u e c o n t ie n e f l u o r e s c e í n a y c i s t e í n a
Ac-IK(PEG 3-Cys-4-Abu-5-Fluo)-Pqa-RHYI.M VVTRQ )_MeArg-Y-NH2/Ac-PYY(PEG3-Cys-4-Abu-5-Fluo) (SEQ ID NO: 187)
Figure imgf000077_0003
ID NO: 179. Para mareaje, se añadió una solución de 54,2 mg de 5-carboxifluoresceína, 33,1 mg de HOBt y 35,6 |jl de DIC en DMF y se agitó durante 18 h a temperatura ambiente.
La escisión de la resina, la purificación y el análisis se realizaron como se describe en la SEQ ID NO: 179. Rendimiento: 41.6 mg
Datos analíticos:
Gradiente para HPLC preparativa: 29-49 % B en 30 min.
m/z: calculado, para C143H195N37O34S = 3008,44; obtenido: 3007,2
Ac-IK(PEG3-Cys-PEG2-5-Fluo)-Pqa-R ,IV I M V V I RQ-MeArg-Y-NH2/Ac-PYY(PEG3-Cys-PEG2-5-Fluo) (SEQ ID NO: 188)
Comenzando con la resina precursora de Ac-IK-Pqa-R(Pbf)H(Trt)Y(tBu)LN(Trt)W(Boc)VT(But)R(Pbf)Q(Trt)-MeArg(Mtr)-Y(tBu)-TentaGel S RAM (SEQ ID NO: 176), la síntesis peptídica continuó con las siguientes etapas: doble acoplamiento con Fmoc-PEG3-OH (por medio del protocolo estándar),
doble acoplamiento de Fmoc Cys(Trt)-OH (por medio del protocolo estándar),
Fmoc-PEG2-OH de doble acoplamiento (véase la SEQ ID NO: 186).
Para el marcaje, la resina peptídica se agitó durante 18 h con una solución de 56,7 mg de 5-carboxifluoresceína, 34,6 mg de HOBt y 37,3 j l de DIC en DMF. La escisión de la resina, la purificación y el análisis se realizaron como se describe en la SEQ ID NO: 185. Rendimiento: 41,7 mg
Datos analíticos:
Gradiente para HPLC preparativa: 34-64 % B en 30 min.
m/z: calculado, para C145H199N37O36S1 = 3068,5; obtenido: 3069,2
b) Tintes fluorescentes marcados con hapteno:
i) Generación de Cy5 digoxigenilado
Véase el documento WO 2012/093068.
ii) Generación de Dig-Cys-MR121
En un matraz Erlenmeyer, se hinchó resina de 1,2-diaminopropano tritilo (250 mg, 0,225 mmol, con una carga de 0,9 mmol/g) con DMF (5 ml) durante 30 min. Posteriormente, se añadió una solución de Fmoc-Cys(Trt)-OH (395 mg, 0,675 mmol) en DMF (2 ml) y una solución de HATU (433 mg, 1,2375 mmol) y HOAt (164 mg, 1,2375 mmol) en DMF (8 ml) a la resina. A esta suspensión se le añadió DIPEA (385 jl, 2,25 mmol) y la mezcla se removió durante 16 h a temperatura ambiente, se filtró y se lavó repetidamente con DMF. Después de la etapa de acoplamiento, los grupos amino que no reaccionaron se taponaron mediante tratamiento con una mezcla de Ac2 O (20 %) en DMF seguido de una etapa de lavado con DMF. La eliminación del grupo Fmoc N terminal se logró mediante el tratamiento de la resina con piperidina (20 %) en DMF durante 2 horas. Posteriormente, la resina se lavó a fondo con DMF e isopropanol, y nuevamente con DMF y a continuación se trató con una solución de MR121 (25 mg, 0,05 mmol) en DIPEA al 1 % en DMF (10 ml) durante 16 h. Después de filtrar y lavar con DMF, la resina se trató con una mezcla de ácido trifluoroacético, agua y triisopropilsilano (9 ml: 9 ml: 1 ml) durante 3 h. La solución de escisión se filtró, se concentró a presión reducida y el sólido resultante se purificó mediante HPLC preparativa de fase inversa empleando un gradiente de acetonitrilo/agua que contenía TFA al 0,1 % (columna Merck Chromolith prep RP-18e, 100 x 25 mm) y se liofilizó. HPLC analítica: tR= 7,7 min (Merck Chromolith Performance RP-18e, 100 x 4,6 mm, agua TFA al 0,1 % ^ acetonitrilo/agua TFA al 0,1 %, 80:20, 25 min. Posteriormente, se disolvió una parte de este intermedio (10,0 mg, 17.6 jm ol) en DMF (1 ml) y una solución de digoxigenina-3-carboximetil-N-hidroxisuccinimida (9,6 mg, 17,6 jm ol) en DMF (1 ml) y trietilamina al 1 % en DMF (2 ml) y la mezcla se agitó durante 16 h. La solución se concentró posteriormente y el compuesto diana se purificó mediante HPLC preparativa de fase inversa empleando un gradiente de acetonitrilo/agua que contenía TFA al 0,1 % (columna Merck Chromolith prep RP-18e, 100 x 25 mm). Rendimiento: 1,0 mg. HPLC analítica: ír = 10,1 min (Merck Chromolith Performance RP-18e, 100 x 4,6 mm, agua TfA al 0,1 % ^ acetonitrilo/agua TFA al 0,1 %, 80:20, 25 min. ESI-MS (modo de iones positivos): m/z: calculado para [M]: 996,3; obtenido: 995,8 [M]1+.
[M+H]+; 737,0 [M+2H]2+.
vi) Generación de Biotina-Cvs-Dy636
Etapa 1: Biotina-O2Oc-Cys-O2Oc-DADOO-NH2
Sobre una resina de tritilo de O-bis-(aminoetil)etilenglicol (352 mg, 0,25 mmol, de 0,71 mmol/g de carga, Novabiochem) Fmoc-O2Oc-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-O2Oc-OH (todo de Iris Biotech), y DMTr-D-Biotina (Roche) se acoplaron consecutivamente. La síntesis de péptidos se realizó de acuerdo con protocolos establecidos (FastMoc 0,25 mmol) en un sintetizador de péptidos automatizado de Applied Biosystems ABI 433A usando química de Fmoc (como se describe para la SEQ ID NO: 180).
Después de la síntesis, la resina se lavó a fondo con DMF, metanol, diclorometano y se secó al vacío. A continuación, la resina se colocó en un matraz Erlenmeyer y se trató con una mezcla de ácido trifluoroacético, agua y triisopropilsilano (9,5 ml: 250 pl: 250 pl) durante 2 h a temperatura ambiente. La solución de escisión se filtró y el péptido se precipitó mediante la adición de éter diisopropílico frío (0 °C) (100 ml) para proporcionar un sólido incoloro, que se lavó repetidamente con éter diisopropílico. El producto bruto se volvió a disolver en agua, se liofilizó y posteriormente se purificó mediante HPLC preparativa de fase inversa empleando un gradiente de acetonitrilo/agua que contiene TFA al 0,1 % (columna Merck Chromolith prep RP-18e, 100 x 25 mm) dando como resultado un incoloro después de la liofilización. Rendimiento: 79 mg (41 %). HPLC analítica: tR= 5,3 min (Merck Chromolith Performance RP-18e, 100 x 3 mm, agua TFA al 0,1 % ^ acetonitrilo/agua TFA al 0,1 %, 80:20, 25 min. ESI-MS (modo de iones positivos): m/z: calculado para [M]: 767,9; obtenido: 768,4 [M+H]+ ; 384,8 [M+2H]2+ .
Etapa 2: Biotina-O2OC-Cys(TNB)-O2OC-DADOO-NH2
El péptido (30 mg, 39 pmol) se disolvió en tampón de fosfato de potasio 100 mM, pH 7,5 (4 ml) y se añadió 5,5'-ditiobis(2-ácido nitrobenzoico) (77 mg, 195 pmol). La mezcla se agitó durante 30 minutos a temperatura ambiente y posteriormente se purificó mediante HPLC preparativa de fase inversa empleando un gradiente de acetonitrilo/agua que contenía TFA al 0,1 % (columna Merck Chromolith prep RP-18e, 100 x 25 mm) dando como resultado un amarillo después de la liofilización. Rendimiento: 31 mg (83 %). HPLC analítica: tR= 5,4 min (Merck Chromolith Performance RP-18e, 100 x 3 mm, agua TFA al 0,025 % ^ acetonitrilo/agua TFA al 0,023 %, 80:20, 25 min. ESI-MS (modo de iones positivos): m/z: calculado para [M]: 965,1; obtenido: 965,4 [M+H]+ ; 483,3 [M+2H]2+ .
Etapa 3: Biotina-O2Oc-Cys(TNB)-O2Oc-DADOO-Dy-636
El péptido protegido con TNB (1,35 mg, 1,4 pmol) se disolvió en tampón de fosfato de potasio 200 mM, pH 7,5 (291 pl). Se disolvió éster NHS de Dy-636 (1 mg, 1,2 pmol, Dyomics) en agua (291 pl) y se añadió a la solución peptídica.
La solución de reacción se agitó durante 1 hora a temperatura ambiente y posteriormente se purificó mediante HPLC preparativa de fase inversa empleando un gradiente de acetonitrilo/agua que contenía TFA al 0,1 % (columna Merck Chromolith prep RP-18e, 100 x 25 mm) dando como resultado un sólido azul después de la liofilización. Rendimiento:
1 mg (50 %). HPLC analítica: tR= 9,0 min (Merck Chromolith Performance RP-18e, 100 x 3 mm, agua TFA al 0,025
% ^ acetonitrilo/agua TFA al 0,023 %, 80:20, 25 min. ESI-MS (modo de iones positivos): m/z: calculado para [M]:
1686,0; obtenido: 1686,7 [M+H]+; 844,2 [M+2H]2+ .
Etapa 4: Biotina-O2Oc-Cys-O2Oc-DADOO-Dy-636 (Bi-Cys-Dy-636)
El péptido protegido con TNB y marcado con tinte (1 mg, 0,6 pmol) se disolvió en una mezcla de tampón de fosfato de potasio 200 mM, pH 7,5 (250 pl) y agua (192 pl). Se añadió una solución de clorhidrato de tris(2-carboxietil)fosfina 100 mM (58 pl) y la mezcla de reacción se agitó durante 30 minutos a temperatura ambiente. La purificación se realizó mediante HPLC preparativa de fase inversa empleando un gradiente de acetonitrilo/agua que contiene TFA al 0,1 % (columna Merck Chromolith prep RP-18e, 100 x 25 mm) dando como resultado un sólido azul después de la liofilización. Rendimiento: 0,7 mg (79 %). HPLC analítica: tR= 8,6 min (Merck Chromolith Performance RP-18e, 100 x
3 mm, agua TFA al 0,025 % ^ acetonitrilo/agua TFA al 0,023 %, 80:20, 25 min. ESI-MS (modo de iones positivos): m/z: calculado para [M]: 1488,9; obtenido: 1488,6 [M+H]+ ; 745,1 [M+2H]2+ .
vii) Generación de Biotina-Cys-Cy5
Etapa 1: Biotina-O2Oc-Cys-O2Oc-DADOO-NH2
Sobre una resina de tritilo de O-bis-(aminoetil)etilenglicol (352 mg, 0,25 mmol, de 0,71 mmol/g de carga, Novabiochem) Fmoc-O2Oc-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-O2Oc-OH (todo de Iris Biotech), y DMTr-D-Biotina (Roche) se acoplaron consecutivamente. La síntesis de péptidos se realizó de acuerdo con protocolos establecidos (FastMoc 0,25 mmol) en un sintetizador de péptidos automatizado de Applied Biosystems ABI 433A usando química de Fmoc (como se describe para la SEQ ID NO: 180).
Después de la síntesis, la resina se lavó a fondo con DMF, metanol, diclorometano y se secó al vacío. A continuación, la resina se colocó en un matraz Erlenmeyer y se trató con una mezcla de ácido trifluoroacético, agua y triisopropilsilano (9,5 ml: 250 pl: 250 pl) durante 2 h a temperatura ambiente. La solución de escisión se filtró y el péptido se precipitó mediante la adición de éter diisopropílico frío (0 °C) (100 ml) para proporcionar un sólido incoloro, que se lavó repetidamente con éter diisopropílico. El producto bruto se volvió a disolver en agua, se liofilizó y posteriormente se purificó mediante HPLC preparativa de fase inversa empleando un gradiente de acetonitrilo/agua que contiene TFA al 0,1 % (columna Merck Chromolith prep RP-18e, 100 x 25 mm) dando como resultado un sólido incoloro después de la liofilización. Rendimiento: 79 mg (41 %). HPLC analítica: tR= 5,3 min (Merck Chromolith Performance RP-18e, 100 x 3 mm, agua TFA al 0,1 % ^ acetonitrilo/agua TFA al 0,1 %, 80:20, 25 min. ESI-MS (modo de iones positivos): m/z: calculado para [M]: 767,9; obtenido: 768,4 [M+H]+ ; 384,8 [M+2H]2+.
Etapa 2: Biotina-O2Oc-Cys(TNB)-O2Oc-DADOO-NH2
El péptido (30 mg, 39 pmol) se disolvió en tampón de fosfato de potasio 100 mM, pH 7,5 (4 ml) y se añadió 5, 5'-ditiobis(2-ácido nitrobenzoico) (77 mg, 195 pmol). La mezcla se agitó durante 30 minutos a temperatura ambiente y posteriormente se purificó mediante HPLC preparativa de fase inversa empleando un gradiente de acetonitrilo/agua que contenía TFA al 0,1 % (columna Merck Chromolith prep RP-18e, 100 x 25 mm) dando como resultado un sólido amarillo después de la liofilización. Rendimiento: 31 mg (83 %). HPLC analítica: tR= 5,4 min (Merck Chromolith Performance RP-18e, 100 x 3 mm, agua TFA al 0,025 % ^ acetonitrilo/agua TFA al 0,023 %, 80:20, 25 min. ESI-MS (modo de iones positivos): m/z: calculado para [M]: 965,1; obtenido: 965,4 [M+H]+ ; 483,3 [M+2H]2+ .
Etapa 3: Biotina-O2Oc-Cys(TNB)-O2Oc-DADOO-Cy5
El péptido protegido con TNB (9,9 mg, 10,3 pmol) se disolvió en tampón de fosfato de potasio 200 mM, pH 7,5 (1026 pl). Se disolvió éster NHS de Cy5-Mono (6,5 mg, 8,2 pmol, GE Healthcare) en agua (1026 pl) y se añadió a la solución peptídica. La solución de reacción se agitó durante 2 horas a temperatura ambiente y posteriormente se purificó mediante HPLC preparativa de fase inversa empleando un gradiente de acetonitrilo/agua que contenía TFA al 0,1 % (columna Merck Chromolith prep RP-18e, 100 x 25 mm) dando como resultado un sólido azul después de la liofilización. Rendimiento: 10 mg (80 %). HPLC analítica: tR= 7,2 min (Merck Chromolith Performance RP-18e, 100 x 3 mm, agua TFA al 0,025 % ^ acetonitrilo/agua TFA al 0,023 %, 80:20, 25 min. ESI-MS (modo de iones positivos): m/z: calculado para [M]: 1603,9; obtenido: 1604,9 [M+H]+ ; 803,1 [M+2H]2+ .
Etapa 4: Biotina-O2Oc-Cys-O2Oc-DADOO-Cy5 (Bi-Cys-Cy5)
El péptido protegido con TNB y marcado con tinte (10 mg, 6,1 pmol) se disolvió en una mezcla de tampón de fosfato de potasio 200 mM, pH 7,5 (1522 pl) y agua (1218 pl). Se añadió una solución de clorhidrato de tris(2-carboxietil)fosfina 100 mM (304 pl) y la mezcla de reacción se agitó durante 30 minutos a temperatura ambiente. La purificación se realizó mediante HPLC preparativa de fase inversa empleando un gradiente de acetonitrilo/agua que contiene TFA al 0,1 % (columna Merck Chromolith prep RP-18e, 100 x 25 mm) dando como resultado un sólido azul después de la liofilización. Rendimiento: 7,6 mg (86 %). HPLC analítica: tR= 6,4 min (Merck Chromolith Performance RP-18e, 100 x 3 mm, agua TFA al 0,025 % ^ acetonitrilo/agua TFA al 0,023 %, 80:20, 25 min. ESI-MS (modo de iones positivos): m/z: calculado para [M]: 1406,8; obtenido: 1406,8 [M+H]+ ; 704,0 [M+2H]2+ .
viii) Generación de biotina-Ser-Cy5
Etapa 1: Biotina-O2Oc-Ser-O2Oc-DADOO-NH2
En un resina de tritilo de O-bis-(aminoetil)etilenglicol (176 mg, 0,125 mmol, de 0,71 mmol/g de carga, Novabiochem) Fmoc-O2Oc-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-O2Oc-OH (todo de Iris Biotech), y DMTr-D-Biotina (Roche) se acoplaron consecutivamente. La síntesis de péptidos se realizó de acuerdo con protocolos establecidos (FastMoc 0,25 mmol) en un sintetizador de péptidos automatizado de Applied Biosystems ABI 433A usando química de Fmoc (como se describe para la SEQ ID NO: 180).
Después de la síntesis, la resina se lavó a fondo con DMF, metanol, diclorometano y se secó al vacío. A continuación, la resina se colocó en un matraz Erlenmeyer y se trató con una mezcla de ácido trifluoroacético, agua y triisopropilsilano (9,5 ml: 250 pl: 250 pl) durante 2 h a temperatura ambiente. La solución de escisión se filtró y el péptido se precipitó mediante la adición de éter diisopropílico frío (0 °C) (80 ml) para proporcionar un sólido incoloro, que se lavó repetidamente con éter diisopropílico. El producto bruto se volvió a disolver en agua, se liofilizó y posteriormente se purificó mediante HPLC preparativa de fase inversa empleando un gradiente de acetonitrilo/agua que contiene TFA al 0,1 % (columna Merck Chromolith prep RP-18e, 100 x 25 mm) dando como resultado un sólido incoloro después de la liofilización. Rendimiento: 56 mg (60 %). HPLC analítica: tR= 4,5 min (Merck Chromolith Performance RP-18e, 100 x 3 mm, agua TFA al 0,1 % ^ acetonitrilo/agua TFA al 0,1 %, 80:20, 25 min. ESI-MS (modo de iones positivos): m/z: calculado para [M]: 751,9; obtenido: 752,4 [M+H]+ ; 376,9 [M+2H]2+ .
Etapa 2: Biotina-O2Oc-Ser-O2Oc-DADOO-Cy5 (Bi-Ser-Cy5)
El péptido (5,7 mg, 7,6 pmol) se disolvió en tampón de fosfato de potasio 200 mM, pH 7,5 (789 pl). Se disolvió Cy5MonoNHS-éster (5 mg, 6,3 jmol, GE Healthcare) en agua (789 |jl) y se añadió a la solución peptídica. La solución de reacción se agitó durante 2 horas a temperatura ambiente y posteriormente se purificó mediante HPLC preparativa de fase inversa empleando un gradiente de acetonitrilo/agua que contenía TFA al 0,1 % (columna Merck Chromolith prep RP-18e, 100 x 25 mm) dando como resultado un sólido azul después de la liofilización. Rendimiento: 6 mg (58 %). HPLC analítica: tR= 6,1 min (Merck Chromolith Performance RP-18e, 100 x 3 mm, agua TFA al 0,025 % ^ acetonitrilo/agua TFA al 0,023 %, 80:20, 25 min. ESI-MS (modo de iones positivos): m/z: calculado para [M]: 1390,72; obtenido: 1391,2 [M+H]+ .
Ejemplo 9
Unión del anticuerpo anti-biotina humanizado recombinante al compuesto marcado con biotina (compuesto haptenilado)
Para determinar si el procedimiento de humanización y la posterior introducción de mutaciones de cisteína dieron como resultado derivados que habían retenido la actividad de unión completa, se realizaron los siguientes experimentos.
Las propiedades de unión de los derivados de anticuerpos anti-biotina recombinantes se analizaron mediante tecnología de interferometría de biocapa (BLI) usando un instrumento Octet QK (Fortebio Inc.). Este sistema está bien establecido para el estudio de las interacciones moleculares. La tecnología BLI se basa en la medición del patrón de interferencia de la luz blanca reflejada de la superficie de una punta de biosensor y una referencia interna. La unión de las moléculas a la punta del biosensor está dando como resultado un cambio en el patrón de interferencia que se puede medir. Para analizar si el procedimiento de humanización descrito anteriormente disminuyó la capacidad del anticuerpo anti-biotina para unirse a la biotina, se compararon directamente las propiedades de las versiones quimérica y humanizada del anticuerpo en cuanto a su capacidad para unirse a una proteína biotinilada. Los estudios de unión se llevaron a cabo mediante la captura de anticuerpo anti-biotina en biosensores de captura de en anticuerpos anti-Fc de_huIgG (AHC) (Fortebio Inc.). En primer lugar, los biosensores se incubaron en una solución de anticuerpo con una concentración de 0,5 mg/ml en histidina 20 mM, NaCl 140 mM, pH 6,0 durante 1 min. Después de esto, los biosensores se incubaron durante 1 min en PBS 1x pH 7,4 para alcanzar un valor de referencia estable. La unión se midió incubando los biosensores recubiertos con anticuerpo en una solución que contenía proteína biotinilada con una concentración de 0,06 mg/ml en histidina 20 mM, NaCl 140 mM, pH 6,0 durante 5 min. Se monitoreó la disociación durante 5 min en PBS 1x pH 7,4. Las curvas de unión resultantes para anticuerpos anti-biotina quiméricos y humanizados se compararon directamente.
La versión humanizada del anticuerpo mostró una unión igual o incluso mejor del antígeno biotinilado que del anticuerpo quimérico. Lo mismo es cierto para el anticuerpo humanizado con la mutación Cys en la posición VH53 de Kabat. La proteína biotinilada mostró una unión inespecífica residual a los biosensores que se redujo cuando los biosensores se recubrieron con Herceptin, que no se une a la biotina. Por tanto, la funcionalidad del anticuerpo antibiotina se conservó en su variante humanizada (que se define por las secuencias como se representa en las SEQ ID NO: 44 y 48, SEQ ID NO: 60 y 64).
Resonancia de plasmón superficial
La medición por resonancia de plasmón superficial se realizó en un instrumento BIAcore® T200 (GE Healthcare Biosciences A b , Suecia) a 25 °C. Alrededor de 4300 unidades de resonancia (UR) del sistema de captura (10 jg/m l de anticuerpo de captura anti-Fc de IgG humana del kit de captura de anticuerpos humanos, b R-1008-39, GE Healthcare Biosciences AB, Suecia) se acoplaron en un chip CM3 (GE Healthcare, BR-1005-36) a pH 5,0 usando el kit de acoplamiento de amina estándar suministrado por GE Healthcare (BR-1000-50). El tampón de migración para el acoplamiento de amina fue HBS-N (HEPES10 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, GE Healthcare, BR-1006-70). El tampón de migración y dilución para el estudio de unión seguido fue PBS-T (solución salina tamponada con fosfato 10 mM que incluye Tween20 al 0,05 %) pH 7,4. El anticuerpo anti-biotina humanizado se capturó inyectando una solución 2 nM durante 60 s a un caudal de 5 jl/min. El ARNip biotinilado se diluyó con PBS-T a concentraciones de 0,14­ 100 nM (series de dilución 1:3). La unión se midió inyectando cada concentración durante 180 s a un caudal de 30 gl/min, tiempo de disociación de 600 s. La superficie se regeneró lavando durante 30 s con una solución de MgCl2 3 M a un caudal de 5 jl/min. Los datos se evaluaron usando el programa informático BIAevaluation (GE Healthcare Biosciences AB, Suecia). Se corrigieron las diferencias en el índice de refracción aparente sustrayendo la respuesta obtenida de una superficie de anticuerpo anti-Fc de IgG humana. También se restaron las inyecciones del blanco (= doble referencia). Para el cálculo de k D y parámetros cinéticos se usó el modelo 1:1 de Langmuir.
El análisis de unión cinética por resonancia de plasmón superficial (RPS) se llevó a cabo para las SEQ ID NO: 44 y 48 del anticuerpo anti-biotina humanizado y las SEQ ID NO: 60 y 64 de VH53C de anticuerpo anti-biotina humanizado. Se capturaron los anticuerpos anti-biotina a una concentración de 2 nM por el anticuerpo anti-Fc de IgG humana que estaba unido a un chip sensor de CM3. La unión del ARNip biotinilado (PM: 13868 Da) se registró a concentraciones de 0,41, 1,23, 3,7, 11,1, 33,3, 100 y 300 nM. Las mediciones se llevaron a cabo por duplicado. El Kd calculado para el anticuerpo anti-biotina humanizado y VH53C de anticuerpo anti-biotina humanizado eran de 0,633 nM y 0,654 nM, respectivamente.
Ejemplo 10
Generación de complejos no covalentes de compuestos haptenilados con anticuerpos anti-hapteno
Procedimiento general:
L a g e n e r a c i ó n d e c o m p l e j o s d e a n t i c u e r p o s a n t i - h a p t e n o c o n c o m p u e s t o s h a p t e n i l a d o s ( = h a p t e n o s c o n j u g a d o s a u n a c a r g a ú t i l ) d a r á c o m o r e s u l t a d o c o m p l e j o s d e f i n i d o s y s e g a r a n t i z a r á q u e e l c o m p u e s t o ( = c a r g a ú t i l ) e n e s t o s c o m p l e j o s c o n s e r v e s u a c t i v id a d . P a r a la g e n e r a c i ó n d e c o m p l e j o s d e c o m p u e s t o s h a p t e n i l a d o s c o n e l r e s p e c t i v o a n t i c u e r p o a n t i -h a p t e n o , e l c o m p u e s t o h a p t e n i l a d o s e d i s o l v i ó e n H 2 O a u n a c o n c e n t r a c i ó n f i n a l d e 1 m g / m l . E l a n t i c u e r p o s e c o n c e n t r ó h a s t a u n a c o n c e n t r a c i ó n f i n a l d e 1 m g / m l ( 4 , 85 p M ) e n t a m p ó n d e h i s t i d i n a 20 m M , N a C l 140 m M , p H = 6 , 0 . L a c a r g a ú t i l h a p t e n i l a d a y e l a n t i c u e r p o s e m e z c l a r o n a u n a p r o p o r c ió n m o l a r 2 :1 ( c o m p u e s t o a a n t i c u e r p o ) p i p e t e a n d o a r r i b a y a b a j o y s e i n c u b a r o n d u r a n t e 15 m i n u t o s a t . a .
D e f o r m a a l t e r n a t i v a , e l c o m p u e s t o h a p t e n i l a d o s e d i s o l v i ó e n D M F a l 100 % a u n a c o n c e n t r a c i ó n f i n a l d e 10 m g / m l . E l a n t i c u e r p o s e c o n c e n t r ó h a s t a u n a c o n c e n t r a c i ó n f i n a l d e 10 m g / m l e n T r i s - H C l 50 m M , E D T A 1 m M , p H = 8 , 2 . E l c o m p u e s t o h a p t e n i l a d o y e l a n t i c u e r p o s e m e z c l a r o n a u n a p r o p o r c i ó n m o l a r 2 , 5 :1 ( c o m p u e s t o a a n t i c u e r p o ) p i p e t e a n d o a r r i b a y a b a j o y s e i n c u b a r o n d u r a n t e 60 m in u t o s a t . a . y 350 r p m .
Procedimiento ejemplar para la formación de complejos de tintes fluorescentes haptenilados y el complejo de anticuerpos anti-hapteno - digoxigenina-Cy5 no covalente
C o m o c o m p o n e n t e s d e a n t i c u e r p o s s e u s a r o n a n t i c u e r p o s a n t i - d i g o x i g e n i n a m u r i n o s y h u m a n i z a d o s o d e r i v a d o s d e a n t i c u e r p o s a n t i - d i g o x i g e n i n a b i e s p e c í f i c o s . P a r a la g e n e r a c i ó n d e c o m p l e j o s d e C y 5 d i g o x i g e n i l a d o c o n lo s a n t i c u e r p o s a n t i - d i g o x i g e n i n a , s e d i s o l v i ó e l c o n j u g a d o C y 5 - d i g o x i g e n i n a e n P B S a u n a c o n c e n t r a c i ó n f i n a l d e 0 , 5 m g / m l . E l a n t i c u e r p o s e u s ó e n u n a c o n c e n t r a c i ó n d e 1 m g / m l ( a p r o x i m a d a m e n t e 5 p M ) e n u n t a m p ó n c o m p u e s t o d e h i s t i d i n a 20 m M y N a C l 140 m M , p H 6. S e m e z c l a r o n C y 5 d i g o x i g e n i l a d o y a n t i c u e r p o e n u n a p r o p o r c i ó n m o l a r d e 2 :1 ( C y 5 d i g o x i g e n i l a d o f r e n t e a a n t i c u e r p o ) . E s t e p r o c e d i m i e n t o d io c o m o r e s u l t a d o u n a p r e p a r a c i ó n h o m o g é n e a d e c o m p l e j o s d e c o m p o s i c i ó n d e f in id a .
L a r e a c c i ó n d e c o m p l e j a c i ó n s e p u e d e m o n i t o r e a r d e t e r m i n a n d o la f l u o r e s c e n c i a ( 65 0 / 66 7 n m ) d e l f l u o r ó f o r o a s o c i a d o c o n e l a n t i c u e r p o e n u n a c o l u m n a d e e x c l u s i ó n p o r t a m a ñ o . L o s r e s u l t a d o s d e e s t o s e x p e r i m e n t o s d e m u e s t r a n q u e la c o m p l e j a c i ó n s o lo s e p r o d u c e s i e l a n t i c u e r p o c o n t i e n e e s p e c i f i c i d a d e s d e u n ió n p a r a la d ig o x i g e n i n a . L o s a n t i c u e r p o s s in e s p e c i f i c i d a d e s d e u n ió n a la d i g o x i g e n i n a n o s e u n e n a l c o n j u g a d o d e d i g o x i g e n i n a - C y 5 . S e p u e d e o b s e r v a r u n a s e ñ a l c r e c i e n t e p a r a lo s a n t i c u e r p o s b i v a l e n t e s a n t i - d i g o x i g e n i n a h a s t a u n a p r o p o r c i ó n d e c o n j u g a d o d e d ig o x i g e n i n a -C y 5 a a n t i c u e r p o d e 2 : 1 . D e s p u é s d e e s t o , la s s e ñ a l e s d e f l u o r e s c e n c i a d e p e n d i e n t e s d e la c o m p o s i c i ó n a l c a n z a n u n a m e s e t a .
Procedimiento ejemplar para la formación de complejos de tintes fluorescentes haptenilados y el complejo de anticuerpos anti-hapteno - biotina-Cy5/anticuerpo anti-biotina quimérico (subclase de IgG humana)
P a r a la g e n e r a c i ó n d e c o m p l e j o s d e C y 5 d e r i v a t i z a d o c o n b io t in a ( B i o t i n a - C y s - C y 5 ) q u e c o n t i e n e n u n c o n e c t o r c i s t e i n i l a d o , s e d i s o l v i e r o n 0 , 16 m g d e B i o t i n a - C y s - C y 5 e n D M F a l 100 % a u n a c o n c e n t r a c i ó n d e 10 m g / m l . S e u s ó 1 m g d e a n t i c u e r p o e n u n a c o n c e n t r a c i ó n d e 10 ,1 m g / m l ( a p r o x i m a d a m e n t e 69 p M ) e n u n t a m p ó n c o m p u e s t o d e T r i s -H C l 50 m M , E D T A 1 m M , p H 8 , 2 . S e m e z c l a r o n b i o t i n a - C y s - C y 5 y a n t i c u e r p o e n u n a p r o p o r c i ó n m o l a r d e 2 , 5 :1 ( B i o t i n a - C y s - C y 5 a a n t i c u e r p o ) y s e i n c u b a r o n d u r a n t e 60 m in a t e m p e r a t u r a a m b ie n t e , a g i t a n d o a 350 r p m . E l c o n j u g a d o r e s u l t a n t e s e a n a l i z ó m e d i a n t e S D S - P A G E c o m o s e d e s c r i b e e n e l e j e m p l o 11 a . L a d e t e c c i ó n d e la f l u o r e s c e n c i a s e l le v ó a c a b o c o m o s e d e s c r i b e e n e l e j e m p l o 11 a .
Procedimiento ejemplar para la formación de conjugados de tintes fluorescentes biotinilados y anticuerpos anti-biotina - Biotina-Ser-Cy5/anticuerpo anti-biotina humanizado:
P a r a la g e n e r a c i ó n d e c o m p l e j o s d e C y 5 d e r i v a t i z a d o c o n b io t in a ( b i o t i n a - S e r - C y 5 ) q u e c o n t i e n e n u n r e s i d u o d e s e r in a d e n t r o d e l c o n e c t o r , s e d i s o l v i e r o n 0 , 61 m g d e b i o t i n a - S e r - C y 5 e n h i s t i d i n a 20 m M , N a C l 140 m M , p H 6 , 0 a u n a c o n c e n t r a c i ó n d e 10 m g / m l . S e u s a r o n 18 , 5 m g d e l a n t i c u e r p o a n t i - b i o t i n a e n u n a c o n c e n t r a c i ó n d e 10 m g / m l ( a p r o x i m a d a m e n t e 69 p M ) e n u n t a m p ó n c o m p u e s t o d e T r i s - H C l 50 m M , E D T A 1 m M , p H 8 , 2 . S e m e z c l a r o n b i o t i n a -C y s - C y 5 y a n t i c u e r p o e n u n a p r o p o r c i ó n m o l a r d e 2 , 5 :1 ( b i o t i n a - C y s - C y 5 a a n t i c u e r p o ) y s e i n c u b a r o n d u r a n t e 60 m in a t e m p e r a t u r a a m b ie n t e , a g i t a n d o a 350 r p m . A c o n t i n u a c i ó n , la m u e s t r a s e s o m e t i ó a c r o m a t o g r a f í a d e e x c l u s i ó n p o r t a m a ñ o u s a n d o u n a c o l u m n a d e g r a d o d e p r e p a r a c i ó n d e a l t a c a r g a S u p e r d e x 20 0 16 / 60 ( G E H e a l t h c a r e ) c o n u n c a u d a l d e 1 , 5 m l / m in e h i s t i d in a 20 m M , N a C l 140 m M , p H 6 , 0 c o m o f a s e m ó v i l . L a s f r a c c i o n e s p ic o s e r e c o g i e r o n y a n a l i z a r o n m e d i a n t e S D S - P A G E p a r a d e t e r m i n a r s u p u r e z a . L a p r o p o r c i ó n d e t i n t e a a n t i c u e r p o s e c a l c u l ó ( 1 ) m id ie n d o la a b s o r b a n c i a d e la s m u e s t r a s a la l o n g i t u d d e o n d a d e 28 0 n m ( p r o t e í n a ) y 6 50 n m ( C y 5 ) ; ( 2 ) u s a n d o la f ó r m u l a : A 650 d e p r o t e í n a m a r c a d a / s ( C y 5 ) * c o n c e n t r a c i ó n d e p r o t e í n a ( M ) = m o le s d e t i n t e p o r m o l d e p r o t e í n a , d o n d e s ( C y 5 ) = 25 0 0 00 M '1 c m -1 , A 650 d e l c o m p l e j o = 47 , 0 y la c o n c e n t r a c i ó n d e p r o t e í n a e s d e 86 , 67 p M . L a p r o p o r c i ó n r e s u l t a n t e d e t i n t e f r e n t e a la m o l é c u l a d e a n t i c u e r p o f u e d e 2 , 17 , lo q u e in d i c a q u e t o d o s lo s p a r á t o p o s d e a n t i c u e r p o s s e s a t u r a n c o n m o l é c u l a s d e b io t in a - C y 5 .
Procedimiento ejemplar para la formación de complejos de polipéptidos haptenilados y anticuerpos antihapteno - complejo de digoxigenina-PYY(3-36)/anticuerpo anti-digoxigenina
Para la generación de complejos no covalentes de polipéptidos digoxigenilados con un anticuerpo anti-digoxigenina, el anticuerpo derivado de hibridoma murino (liofilizado de KPO4 10 mM, NaCl 70 mM; pH 7,5) se disolvió en 12 ml de agua y se dializó contra una solución que comprendía histidina 20 mM, NaCl 140 mM, pH 6,0 para proporcionar 300 mg (2 x 10-6 mol) en 11 ml de tampón (c = 27,3 mg/ml). El conjugado de digoxigenina-PYY(3-36) (11,57 mg, 4 x 10-6 mol, 2 eq.) se añadió en 4 porciones de 2,85 mg en 1 h y se incubó durante otra hora a temperatura ambiente. Una vez completada la reacción de complejación, los complejos se purificaron mediante cromatografía de exclusión por tamaño por medio de una columna Superdex 200 26/60 Gl (320ml) en histidina 20 mM, NaCl 140 mM, pH 6,0 a un caudal de 2,5 ml/min. El complejo eluido se recogió en fracciones de 4 ml, se reunió y se esterilizó sobre un filtro de 0,2 pm para dar 234 mg del complejo a una concentración de 14,3 mg/ml. De forma similar, para la generación de complejos del anticuerpo anti-digoxigenina humanizado, la concentración del anticuerpo se ajustó a 10,6 mg/ml (9,81 mg, 6,5 x 10-8 mol en 0,93 ml) en histidina 20 mM, NaCl 140 mM, pH 6,0. Se añadieron 0,57 mg = 1,97 x 10­ 7 mol = 3,03 eq. del polipéptido digoxigenilado (DIG-PYY) a la solución de anticuerpo como liofilizado. El polipéptido y el anticuerpo se incubaron durante 1,5 h a temperatura ambiente. El exceso de polipéptido se eliminó mediante cromatografía de exclusión por tamaño por medio de una columna Superose 6 10/300 GL en histidina 20 mM, NaCl 140 mM, pH 6,0 a un caudal de 0,5 ml/min. El complejo eluido se recogió en fracciones de 0,5 ml, se reunió y se esterilizó sobre un filtro de 0,2 pm para dar 4,7 mg del complejo a una concentración de 1,86 mg/ml.
El complejo de polipéptido haptenilado y anticuerpo anti-hapteno resultante se definió como una molécula de tipo IgG monomérica por medio de la aparición de un pico único en una cromatografía de exclusión por tamaño. El complejo resultante se definió como una molécula de tipo IgG monomérica, que transportaba dos derivados de digoxigenina-PYY por molécula de anticuerpo. La composición definida de estos complejos peptídicos se confirmó mediante cromatografía de exclusión por tamaño, que también indicó la ausencia de agregados de proteínas. La composición definida (y la proporción 2:1 de polipéptido y proteína) de estos complejos peptídicos biespecíficos se confirmó adicionalmente mediante SEC-MALLS (cromatografía de exclusión por tamaño-dispersión de luz multiángulo). Para el análisis por SEC-MALLS, se aplicaron 100-500 pg de la muestra respectiva a una columna de exclusión por tamaño Superdex 200 10/300 GL con un caudal de 0,25-0,5 ml/min con PBS1x a pH 7,4 como fase móvil. La dispersión de la luz se detectó con un detector MiniDawn TREOS/QELS de Wyatt, el índice de refracción se midió con un detector Optilab rEX de Wyatt. Los datos resultantes se analizaron usando el programa informático ASTRA (versión 5,4/3/14). Los resultados de los análisis por SEC-MALLS proporcionan información sobre la masa, el radio y el tamaño del complejo. Estos datos se compararon luego con los del correspondiente anticuerpo no complejado. Los resultados de estos experimentos demuestran que la exposición de PYY digoxigenilado al anticuerpo anti-digoxigenina da como resultado complejos que contienen dos derivados digoxigenina-PYY por cada molécula de anticuerpo. Por tanto, PYY digoxigenilado se puede complejar con el anticuerpo anti-digoxigenina en sitios definidos (región de unión) y con una estequiometría definida.
La caracterización del complejo mediante estudios de resonancia de plasmón superficial proporcionó pruebas adicionales de que la reacción de complejación generó moléculas definidas y completamente complejadas. El anticuerpo anti-digoxigenina se puede unir al chip de SPR, dando como resultado incrementos de la señal. La posterior adición del conjugado digoxigenina-PYY da como resultado incrementos adicionales de la señal hasta que todos los sitios de unión están completamente ocupados. En estas condiciones, la adición de más digoxigenina-PYY no incrementa más la señal. Esto indica que la reacción complejante es específica y que las señales no son causadas por la adherencia no específica del polipéptido digoxigenilado.
Procedimiento ejemplar para la formación de complejos de polipéptidos haptenilados y el complejo de anticuerpos anti-hapteno - Ac-PYY-PEG3-Cys-p-Ala-Biot/anticuerpo anti-biotina quimérico
Para la generación de complejos no covalentes de polipéptido-PYY biotinilado que contiene un conector cisteinilado, se disolvieron 0,19 mg de Ac-PYY-PEG3-Cys-p-Ala-Biot en DMF al 100 % a una concentración de 10 mg/ml. El anticuerpo se usó en una concentración de 10,7 mg/ml (aproximadamente 73 pM) en un tampón compuesto por Tris-HCl 50 mM, EDTA 1 mM, pH 8,2. Se mezclaron Ac-PYY-PEG3-Cys-p-Ala-Biot y el anticuerpo a una proporción molar de 2,5:1 (Ac-PYY-PEG3-Cys-p-Ala-Biot a anticuerpo) y se incubaron durante 60 min a temperatura ambiente y 350 rpm. El complejo resultante se definió como una molécula de tipo IgG monomérica por medio de la aparición de un pico único en una cromatografía de exclusión por tamaño (monómero al 95 %). El complejo resultante se analizó adicionalmente mediante SDS-PAGE y posterior análisis por inmunoelectrotransferencia. Se mezclaron 10 pg del complejo con tampón de muestra LDS4x (Invitrogen) y se incubaron a 95 °C durante 5 min. La muestra se aplicó a un gel de poliacrilamida Bis-Tris al 4-12 % (NuPAGE, Invitrogen) que se desarrolló durante 35 min a 200 V y 120 mA. Las moléculas que se separaron en el gel de poliacrilamida se transfirieron a una membrana de PVDF (tamaño de poro de 0,2 pm, Invitrogen) durante 40 min a 25 V y 160 mA. La membrana se bloqueó en leche descremada al 1 % (p/v) en PBST 1x (PBS 1x Tween20 al 0,1 %) durante 1 h a temperatura ambiente. La membrana se lavó 3 veces durante 5 min en PBST1x y posteriormente se incubó con un conjugado de estreptavidina-POD (2900 U/ml, Roche) que se usó en una dilución 1:2000. La detección de estreptavidina-POD unida a biotina en la membrana se llevó a cabo usando el sustrato de inmunoelectrotransferencia Lumi-Light (Roche).
Procedimiento ejemplar para la formación de complejos de polipéptidos haptenilados y anticuerpos antihapteno - complejo de Ac-PYY-PEG3-Cys-PEG2-Biot)/anticuerpo anti-biotina quimérico
Figure imgf000085_0001
Procedimiento ejemplar para la formación de complejos de polipéptidos haptenilados y anticuerpos antihapteno - complejo de Ac-PYY(PEG3-Cys-PEG2-5-Fluo)/anticuerpo anti-fluoresceína quimérico
P a r a la g e n e r a c i ó n d e c o m p l e j o s n o c o v a l e n t e s d e p o l i p é p t i d o - P Y Y c o n j u g a d o c o n f l u o r e s c e í n a q u e c o n t i e n e u n c o n e c t o r c i s t e in i l a d o , s e d is o l v i e r o n 0 , 33 m g d e A c - P Y Y ( P E G 3 - C y s - P E G 2 - 5 - F l u o ) e n D M F a l 100 % a u n a c o n c e n t r a c i ó n d e 10 m g / m l . E l a n t i c u e r p o s e u s ó e n u n a c o n c e n t r a c i ó n d e 9 , 99 m g / m l ( a p r o x i m a d a m e n t e 68 p M ) e n u n t a m p ó n c o m p u e s t o d e T r i s - H C l 50 m M , E D T A 1 m M , p H 8 , 2 . S e m e z c l a r o n A c - P Y Y ( P E G 3 - C y s - P E G 2 - 5 - F l u o ) y a n t i c u e r p o a u n a p r o p o r c i ó n m o l a r 2 , 5 :1 ( A c - P Y Y ( P E G 3 - C y s - P E G 2 - 5 - F l u o ) a a n t i c u e r p o ) y s e i n c u b a r o n d u r a n t e 60 m in u t o s a t . a . y 350 r p m . E l c o m p l e j o r e s u l t a n t e s e d e f i n i ó c o m o 76 % d e m o l é c u l a d e t i p o I g G m o n o m é r i c a y 24 % d e a g r e g a d o s s o l u b l e s d i m é r i c o s m e d i a n t e c r o m a t o g r a f í a d e e x c l u s i ó n p o r t a m a ñ o . E l c o m p l e j o r e s u l t a n t e s e a n a l i z ó a d i c i o n a l m e n t e m e d i a n t e S D S - P A G E y p o s t e r i o r d e t e c c i ó n d e f l u o r e s c e n c i a r e l a c i o n a d a c o n f l u o r e s c e í n a e n e l g e l d e p o l i a c r i l a m i d a . S e m e z c l a r o n 8 p g d e l c o m p l e j o c o n t a m p ó n d e m u e s t r a L D S 4 x ( I n v i t r o g e n ) y s e i n c u b a r o n a 95 ° C d u r a n t e 5 m in . L a f l u o r e s c e n c i a r e l a c i o n a d a c o n la f l u o r e s c e í n a s e r e g i s t r ó u s a n d o u n d i s p o s i t i v o L u m i I m a g e r F 1 ( R o c h e ) a u n a l o n g i t u d d e o n d a d e e x c i t a c i ó n d e 64 5 n m .
Ejemplo 11
Generación de conjugados covalentes definidos de tintes o polipéptidos haptenilados con un anticuerpo antihapteno VH52bC/VH53C en presencia de agentes redox
Procedimiento ejemplar para la formación de conjugados de tintes fluorescentes haptenilados y anticuerpos anti-hapteno - Dig-Cys-Ahx-Cy5/anticuerpo anti-digoxigenina VH52bC
Figure imgf000085_0002
S e m o s t r ó la f o r m a c i ó n d e e n l a c e s d is u l f u r o e s p e c í f i c o s d e l s i t i o p a r a e l a n t i c u e r p o a n t i - d i g o x i g e n i n a V H 52 b C ( f ig .8 , g e l e s e n la p a r t e s u p e r io r , c a r r i l e s 1 A - C ) c o n u n a s e ñ a l d e f l u o r e s c e n c i a d e f o n d o b a ja c u a n d o s e u s ó a n t i c u e r p o a n t i -d i g o x i g e n i n a s in u n a c i s t e í n a e n C D R 2 ( c a r r i l e s 2 A - C ) . L a s s e ñ a l e s d e f o n d o e n la s r e a c c i o n e s d e c o n t r o l s e p u e d e n e x p l i c a r m e d i a n t e e l a c o p l a m i e n t o d e D i g - C y s - A h x - C y 5 c o n c i s t e í n a s q u e n o r m a l m e n t e e s t á n im p l i c a d a s e n la f o r m a c i ó n d e e n l a c e s d is u l f u r o e n t r e c a d e n a s d e a n t i c u e r p o s . L a s c a n t i d a d e s c r e c i e n t e s d e r e a c t i v o s r e d o x r e d u c e n s u s t a n c i a l m e n t e lo s p u e n t e s d is u l f u r o q u e c o n e c t a n la s c a d e n a s l i g e r a y p e s a d a d e a n t i c u e r p o s , p r o d u c i e n d o p r i n c i p a l m e n t e 3 / 4 a n t i c u e r p o s ( - 1 x L C ) , d í m e r o s H C ( - 2 x L C ) y 1 / 2 a n t i c u e r p o s ( 1 x H C 1 x L C ) . E n la p a r t e i n f e r i o r d e l g e l s e p u e d e d e t e c t a r la f l u o r e s c e n c i a d e D i g - C y s - A h x - C y 5 q u e n o e s t a b a u n id a c o v a l e n t e m e n t e a l a n t i c u e r p o . L o s g e le s d e la p a r t e i n f e r i o r d e la f i g u r a 8 m u e s t r a n q u e t r a s la r e d u c c i ó n d e la s m u e s t r a s , n o s e p u e d e d e t e c t a r f l u o r e s c e n c i a r e l a c i o n a d a c o n C y 5 c e r c a d e la s c a d e n a s l i g e r a y p e s a d a d e l a n t i c u e r p o , lo q u e in d i c a q u e e l e n la c e c o v a l e n t e s e f o r m ó d e h e c h o m e d i a n t e u n p u e n t e d is u l f u r o . L a s t i n c i o n e s d e C o o m a s s i e d e c a d a g e l m u e s t r a n q u e la c a n t i d a d t o t a l d e p r o t e í n a e n c a d a c a r r i l e r a ig u a l .
Procedimiento ejemplar para la formación de conjugados de tintes fluorescentes haptenilados y anticuerpos anti-hapteno - Dig-Cys-Cy5/anticuerpo anti-digoxigenina VH52bC
Figure imgf000086_0001
Procedimiento ejemplar para la formación de conjugados de polipéptidos haptenilados y anticuerpos antihapteno - PEG3-PYY(PEG3-Cvs-4Abu-Dig)/anticuerpo anti-digoxigenina humanizado VH52bC
P a r a la g e n e r a c i ó n d e c o n j u g a d o s d e p o l i p é p t i d o P Y Y d e r i v a t i z a d o d e d i g o x i g e n i n a q u e c o n t i e n e u n c o n e c t o r c i s t e i n i l a d o , s e d i s o l v i e r o n 1 , 4 m g d e P E G 3 - P Y Y ( P E G 3 - C y s - 4 A b u - D i g ) e n D M F a l 100 % a u n a c o n c e n t r a c i ó n d e 10 m g / m l . S e u s ó 1 m g d e a n t i c u e r p o e n u n a c o n c e n t r a c i ó n d e 10 m g / m l ( a p r o x i m a d a m e n t e 68 p M ) e n u n t a m p ó n c o m p u e s t o d e T r i s - H C l 5 m M , EDt A 1 m M , G S H 1 m M , G S S G 5 m M , p H 8 , 2 . S e m e z c l a r o n P E G 3 - P Y Y ( P E G 3 - C y s -4 A b u - D i g ) y e l a n t i c u e r p o a u n a p r o p o r c i ó n m o l a r d e 2 :1 ( P E G 3 - P Y Y ( P E G 3 - C y s - 4 A b u - D i g ) a a n t i c u e r p o ) y s e i n c u b a r o n d u r a n t e 60 m in a t e m p e r a t u r a a m b i e n t e y s e a g i t a r o n a 100 r p m . E l c o n j u g a d o r e s u l t a n t e s e a n a l i z ó m e d i a n t e e s p e c t r o m e t r í a d e m a s a s . E l 43 % d e la s e s p e c i e s d e t e c t a d a s s e id e n t i f i c ó c o m o a n t i c u e r p o a c o p l a d o a 2 m o l é c u l a s p o l i p e p t í d i c a s , e l 46 % f u e a n t i c u e r p o a c o p l a d o a 1 m o l é c u l a p o l i p e p t í d i c a y e l 11 % s e i d e n t i f i c ó c o m o a n t i c u e r p o d e s a c o p l a d o .
Ejemplo 12
Generación de conjugados covalentes definidos de tintes y polipéptidos haptenilados con un anticuerpo antihapteno VH52bC/VH53C en ausencia de agentes redox
P a r a la g e n e r a c i ó n d e a n t i c u e r p o s c o v a l e n t e s a n t i - h a p t e n o / p o l i p é p t i d o h a p t e n i l a d o o c o n j u g a d o s d e t i n t e s h a p t e n i l a d o s u n id o s p o r d i s u l f u r o e s n e c e s a r i o ( i ) a c o p l a r e l h a p t e n o ( p o r e je m p lo , d i g o x i g e n i n a , f l u o r e s c e í n a , b io t in a o t e o f i l i n a ) p o r m e d i o d e u n g r u p o r e a c t i v o a d e c u a d o ( t a l c o m o , c i s t e í n a , m a l e i m i d a ) q u e c o n t i e n e c o n e c t o r e s a l p o l i p é p t i d o o t i n t e q u e p e r m i t e q u e e l p o l i p é p t i d o s e e x p o n g a p o r e n c i m a d e la s u p e r f i c i e d e l a n t i c u e r p o y , p o r lo t a n t o , c o n s e r v e s u a c t i v i d a d , y ( i i ) g e n e r a r c o n j u g a d o s c o v a l e n t e s e s p e c í f i c o s d e l s i t i o d e lo s p o l i p é p t i d o s h a p t e n i l a d o s c o n e l a n t i c u e r p o a n t i - h a p t e n o c o n u n a m u t a c i ó n c o n c i s t e í n a ( = a n t i c u e r p o V H 5 2 b C / V H 5 3 C ) e n e l q u e s e c o n s e r v a la a c t i v i d a d b io l ó g i c a d e l p o l i p é p t i d o , y ( i i i ) l l e v a r a c a b o la r e a c c ió n e n a u s e n c i a d e u n a g e n t e r e d u c t o r p a r a e v i t a r la r e d u c c i ó n d e lo s p u e n t e s d i s u l f u r o i n t e r c a t e n a r i o s d e l a n t i c u e r p o .
Procedimiento general:
L a g e n e r a c i ó n d e c o n j u g a d o s d e a n t i c u e r p o s a n t i - h a p t e n o c o n c o m p u e s t o s h a p t e n i l a d o s d a r á c o m o r e s u l t a d o c o n j u g a d o s c o n e s t e q u i o m e t r í a d e f i n i d a y s e d e b e r á g a r a n t i z a r q u e e l c o m p u e s t o d e e s t o s c o n j u g a d o s c o n s e r v e s u a c t i v i d a d . P a r a la g e n e r a c i ó n d e c o n j u g a d o s d e c o m p u e s t o s h a p t e n i l a d o s c o n e l r e s p e c t i v o a n t i c u e r p o a n t i - h a p t e n o s e d i s o l v i ó e l c o m p u e s t o h a p t e n i l a d o e n D M F a l 100 % a u n a c o n c e n t r a c i ó n f i n a l d e 10 m g / m l . E l a n t i c u e r p o a n t i -h a p t e n o V H 5 2 b C / V H 5 3 C s e l l e v ó a u n a c o n c e n t r a c i ó n d e 10 m g / m l e n T r i s - H C l 50 m M , E D T A 1 m M , p H = 8 , 2 . E l c o m p u e s t o h a p t e n i l a d o y e l a n t i c u e r p o a n t i - h a p t e n o V H 5 2 b C / V H 5 3 C s e m e z c l a r o n a u n a p r o p o r c i ó n m o l a r d e 2 , 5 :1 ( c o m p u e s t o a a n t i c u e r p o ) p i p e t e a n d o a r r i b a y a b a j o y s e i n c u b a r o n d u r a n t e 60 m i n u t o s a t e m p e r a t u r a a m b i e n t e y 35 0 r p m .
U n p o l i p é p t i d o c o n j u g a d o c o n e l h a p t e n o p o r m e d io d e u n c o n e c t o r q u e c o n t i e n e c i s t e í n a s e d e n o m i n a h a p t e n o - C y s -p o l i p é p t i d o o p o l i p é p t i d o - C y s - h a p t e n o e n lo s ig u i e n t e . E l p o l i p é p t i d o p u e d e t e n e r u n e x t r e m o N l i b r e o u n e x t r e m o N t a p o n a d o , p o r e je m p lo , c o n u n g r u p o a c e t i l o ( p o l i p é p t i d o A c - C y s - h a p t e n o ) o u n r e s i d u o d e P E G ( P E G - p o l i p é p t i d o - C y s -h a p t e n o ) .
U n t i n t e f l u o r e s c e n t e c o n j u g a d o c o n e l h a p t e n o p o r m e d io d e u n c o n e c t o r q u e c o n t i e n e c i s t e í n a s e d e n o m i n a t i n t e -C y s - h a p t e n o o h a p t e n o - C y s - t i n t e e n lo s ig u i e n t e .
Procedimiento ejemplar para la formación de conjugados de tintes fluorescentes haptenilados y anticuerpos anti-hapteno-Dig-Cys-Ahx-Cy5/anticuerpo anti-digoxigenina VH52bC
L a s m u e s t r a s s e p r e p a r a r o n e x a c t a m e n t e c o m o s e d e s c r i b e e n e l e j e m p l o 11 a , c o n la d i f e r e n c i a d e q u e lo s c o m p l e j o s d e a n t i c u e r p o - D i g - C y s - A h x - C y 5 s e t r a n s f i r i e r o n a u n t a m p ó n q u e n o c o n t e n í a c o m p u e s t o s r e d o x , G S S G 0 ,1 m M ( g l u t a t i ó n o x i d a d o ) o G S S G 1 m M . L o s g e l e s d e p o l i a c r i l a m i d a r e s u l t a n t e s , e s c a n e a d o s p o r f l u o r e s c e n c i a y t e ñ i d o s c o n C o o m a s s i e , s e m u e s t r a n e n la f i g u r a 9. L a s t r e s c o n d i c i o n e s m u e s t r a n u n a e s p e c i f i c i d a d s i m i l a r p a r a la f o r m a c i ó n d e e n l a c e s d i s u l f u r o e s p e c í f i c o s d e l s i t i o ( f i g u r a 9 , g e le s s u p e r i o r e s , c a r r i l e s 1 A - C ) c o n u n b a jo n i v e l d e r e a c c i o n e s d e f o n d o ( f i g u r a 9 , c a r r i l e s 2 A - C ) . E s t o c o n f i r m a q u e la f o r m a c i ó n d e l e n l a c e d is u l f u r o s e p u e d e lo g r a r s in la n e c e s id a d d e a g e n t e s r e d u c t o r e s . E s t o e s t a b i l i z a s i g n i f i c a t i v a m e n t e e l a n t i c u e r p o / r e d u c e la d e s i n t e g r a c i ó n d e l a n t i c u e r p o , y a q u e s o l o s e d e t e c t a n c a n t i d a d e s r e s i d u a l e s d e 3 / 4 a n t i c u e r p o s ( - 1 x L C ) , d í m e r o s d e H C ( - 2 x L C ) y 1 / 2 a n t i c u e r p o s ( 1 x H C 1 x L C ) e n c o m p a r a c i ó n c o n e l e j e m p l o 11.
Procedimiento ejemplar para la formación de conjugados de tintes fluorescentes haptenilados y anticuerpos anti-hapteno - Dig-Cys-Cy5/anticuerpo anti-digoxigenina VH52bC
L a s m u e s t r a s s e p r e p a r a r o n e x a c t a m e n t e c o m o s e d e s c r i b e e n e l e j e m p l o 11 b , c o n la d i f e r e n c i a d e q u e s e m e z c la r o n 1 3 , 3 n m o l d e a n t i c u e r p o c o n 2 e q u i v a l e n t e s m o l a r e s d e D i g - C y s - C y 5 a u n a c o n c e n t r a c i ó n f i n a l d e a n t i c u e r p o d e 10 m g / m l e n a u s e n c i a d e r e a c t i v o s r e d o x .
Procedimiento ejemplar para la formación de conjugados de tintes fluorescentes haptenilados y anticuerpos anti-hapteno - Biotina-Cys-Cy5/anticuerpo anti-biotina quimérico VH53C
P a r a la g e n e r a c i ó n d e c o n j u g a d o s d e C y 5 d e r i v a t i z a d o c o n b io t in a q u e c o n t i e n e n u n c o n e c t o r c i s t e i n i l a d o , s e d is o l v i e r o n 0 , 16 m g d e B i o t i n a - C y s - C y 5 e n D M F a l 100 % a u n a c o n c e n t r a c i ó n d e 10 m g / m l . S e u s ó 1 m g d e l a n t i c u e r p o a n t i - b i o t i n a V H 53 C e n u n a c o n c e n t r a c i ó n d e 9 , 7 m g / m l ( a p r o x i m a d a m e n t e 68 p M ) e n u n t a m p ó n c o m p u e s t o d e T r i s -H C l 50 m M , E D T A 1 m M , p H 8 , 2. L a b i o t i n a - C y s - C y 5 y e l a n t i c u e r p o s e m e z c l a r o n e n u n a p r o p o r c i ó n m o l a r d e 2 , 5 :1 ( A c - B i o t i n a - C y s - C y 5 a a n t i c u e r p o ) y s e i n c u b a r o n d u r a n t e 60 m i n u t o s a t e m p e r a t u r a a m b ie n t e , a g i t a n d o a 350 r p m . E l c o n j u g a d o r e s u l t a n t e s e a n a l i z ó m e d i a n t e S D S - P A G E c o m o s e d e s c r i b e e n e l e j e m p l o 11 a . L a d e t e c c i ó n d e la f l u o r e s c e n c i a s e l le v ó a c a b o c o m o s e d e s c r i b e e n e l e j e m p l o 11 a .
Procedimiento ejemplar para la formación de conjugados de tintes fluorescentes haptenilados y anticuerpos anti-hapteno - Biotina-Cys-Cy5/anticuerpo anti-biotina humanizado VH53C
P a r a la g e n e r a c i ó n d e c o n j u g a d o s d e C y 5 d e r i v a t i z a d o c o n b io t in a q u e c o n t i e n e n u n c o n e c t o r c i s t e i n i l a d o , s e d is o l v i e r o n 0 , 16 m g d e B i o t i n a - C y s - C y 5 e n D M F a l 100 % a u n a c o n c e n t r a c i ó n d e 10 m g / m l . S e u s ó 1 m g d e l a n t i c u e r p o a n t i - b i o t i n a h u m a n i z a d o V H 53 C e n u n a c o n c e n t r a c i ó n d e 7 , 4 m g / m l ( a p r o x i m a d a m e n t e 51 p M ) e n u n t a m p ó n c o m p u e s t o p o r T r i s - H C l 50 m M , E D T A 1 m M , p H 8 , 2 . L a b i o t i n a - C y s - C y 5 y e l a n t i c u e r p o s e m e z c l a r o n e n u n a p r o p o r c i ó n m o l a r d e 2 , 5 :1 ( A c - B i o t i n a - C y s - C y 5 a a n t i c u e r p o ) y s e i n c u b a r o n d u r a n t e 60 m i n u t o s a t e m p e r a t u r a a m b i e n t e , a g i t a n d o a 350 r p m . E l c o n j u g a d o r e s u l t a n t e s e a n a l i z ó m e d i a n t e S D S - P A G E c o m o s e d e s c r i b e e n e l e j e m p l o 11 a . L a d e t e c c i ó n d e la f l u o r e s c e n c i a s e l l e v ó a c a b o c o m o s e d e s c r i b e e n e l e j e m p l o 11 a .
Procedimiento ejemplar para la formación de conjugados de polipéptidos haptenilados y anticuerpos antihapteno - Ac-PYY(PEG3-Cys-4Abu-Dig)/anticuerpo anti-digoxigenina humanizado VH52bc
P a r a la g e n e r a c i ó n d e c o n j u g a d o s d e p o l i p é p t i d o d e P Y Y d e r i v a t i z a d o d e d i g o x i g e n i n a q u e c o n t i e n e n u n c o n e c t o r c i s t e i n i l a d o , s e d i s o l v i e r o n 2 , 4 m g d e A c - P Y Y ( P E G 3 - C y s - 4 A b u - D i g ) e n a c e t a t o a l 20 % a u n a c o n c e n t r a c i ó n d e 5 m g / m l . S e u s a r o n 10 m g d e a n t i c u e r p o a n t i - d i g o x i g e n i n a h u m a n i z a d o V H 5 2 b C ( 6 8 , 4 n m o l ) e n u n a c o n c e n t r a c i ó n d e 1 9 , 5 m g / m l ( a p r o x i m a d a m e n t e 133 p M ) e n u n t a m p ó n c o m p u e s t o p o r h i s t i d in a 20 m M , N a C l 140 m M , p H 6 , 0 . S e m e z c l a r o n A c - P Y Y ( P E G 3 - C y s - 4 A b u - D i g ) y e l a n t i c u e r p o a u n a p r o p o r c i ó n m o l a r d e 2 :1 ( A c - P Y Y ( P E G 3 - C y s - 4 A b u -D i g ) a a n t i c u e r p o ) y s e i n c u b a r o n d u r a n t e 60 m in a t e m p e r a t u r a a m b ie n t e , y s e a g i t ó a 100 r p m . E l c o n j u g a d o r e s u l t a n t e s e a n a l i z ó m e d i a n t e e s p e c t r o m e t r í a d e m a s a s . E l 7 , 4 % d e la s e s p e c i e s d e t e c t a d a s s e id e n t i f i c ó c o m o a n t i c u e r p o a c o p l a d o a 2 m o l é c u l a s p e p t í d i c a s , e l 40 % e r a a n t i c u e r p o a c o p l a d o a 1 m o l é c u l a p e p t í d i c a y e l 52 % s e id e n t i f i c ó c o m o a n t i c u e r p o n o a c o p la d o .
Procedimiento ejemplar para la formación de conjugados de polipéptidos haptenilados y anticuerpos antihapteno - Ac-PYY(PEG3-Cys-pAla-Biot)/anticuerpo anti-biotina quimérico VH53C
P a r a la g e n e r a c i ó n d e c o n j u g a d o s d e p o l i p é p t i d o d e P Y Y d e r i v a t i z a d o d e b i o t in a q u e c o n t i e n e n u n c o n e c t o r c i s t e i n i l a d o , s e d i s o l v i e r o n 0 , 19 m g d e A c - P Y Y ( P E G 3 - C y s - p A l a - B i o t ) e n D M F a l 100 % a u n a c o n c e n t r a c i ó n d e 10 m g / m l . S e u s ó 1 m g d e l a n t i c u e r p o q u i m é r i c o a n t i - b i o t i n a V H 53 C e n u n a c o n c e n t r a c i ó n d e 9 , 7 m g / m l
( a p r o x i m a d a m e n t e 67 p M ) e n u n t a m p ó n c o m p u e s t o p o r T r i s - H C l 50 m M , E D T A 1 m M , p H 8 , 2 . S e m e z c l a r o n A c -p Y Y [ P E G 3 - C y s - p A l a - B i o t y e l a n t i c u e r p o e n u n a p r o p o r c i ó n m o l a r d e 2 , 5 :1 ( A c - P Y Y [ P E G 3 - C y s - p A l a - B i o t ] a a n t i c u e r p o ) y s e i n c u b a r o n d u r a n t e 60 m i n u t o s a t e m p e r a t u r a a m b i e n t e , a g i t a n d o a 350 r p m . E l c o n j u g a d o r e s u l t a n t e s e a n a l i z ó m e d i a n t e e s p e c t r o m e t r í a d e m a s a s . E l 87 , 7 % d e la s e s p e c i e s d e t e c t a d a s s e id e n t i f i c ó c o m o a n t i c u e r p o a c o p l a d o a 2 m o l é c u l a s p e p t í d i c a s , e l 12 , 3 % s e i d e n t i f i c ó c o m o a n t i c u e r p o a c o p l a d o a 1 m o l é c u l a p e p t íd i c a .
Procedimiento ejemplar para la formación de conjugados de polipéptidos haptenilados y anticuerpos antihapteno - Ac-PYY(PEG3-Cys-PEG2-Biot)/anticuerpo anti-biotina quimérico VH53C
P a r a la g e n e r a c i ó n d e c o n j u g a d o s d e p o l i p é p t i d o d e P Y Y d e r i v a t i z a d o d e b i o t in a q u e c o n t i e n e n u n c o n e c t o r c i s t e i n i l a d o , s e d is o l v i e r o n 0 , 16 m g d e A c - P Y Y ( P E G 3 - C y s - P E G 2 - B i o t ) e n D M F a l 100 % a u n a c o n c e n t r a c i ó n d e 10 m g / m l . S e u s ó 1 m g d e l a n t i c u e r p o q u i m é r i c o a n t i - b i o t i n a V H 53 C e n u n a c o n c e n t r a c i ó n d e 9 , 9 m g / m l
( a p r o x i m a d a m e n t e 68 p M ) e n u n t a m p ó n c o m p u e s t o p o r T r i s - H C l 50 m M , E D T A 1 m M , p H 8 , 2 . S e m e z c l a r o n A c -P Y Y [ P E G 3 - C y s - P E G 2 - B i o t y e l a n t i c u e r p o e n u n a p r o p o r c i ó n m o l a r d e 2 , 5 :1 ( A c - P Y Y [ P E G 3 - C y s - P E G 2 - B i o t ] a a n t i c u e r p o ) y s e i n c u b a r o n d u r a n t e 60 m i n u t o s a t e m p e r a t u r a a m b i e n t e , a g i t a n d o a 350 r p m . E l c o n j u g a d o r e s u l t a n t e s e a n a l i z ó m e d i a n t e e s p e c t r o m e t r í a d e m a s a s . E l 100 % d e la s e s p e c i e s d e t e c t a d a s s e id e n t i f i c ó c o m o a n t i c u e r p o a c o p l a d o a 2 m o l é c u l a s p e p t í d i c a s .
Procedimiento ejemplar para la formación de conjugados de polipéptidos haptenilados y anticuerpos antihapteno - Ac-PYY(pEG3-Cys-pAla-Biot)/anticuerpo anti-biotina humanizado VH53C
P a r a la g e n e r a c i ó n d e c o n j u g a d o s d e p o l i p é p t i d o d e P Y Y d e r i v a t i z a d o d e b i o t in a q u e c o n t i e n e n u n c o n e c t o r c i s t e i n i l a d o , s e d i s o l v i e r o n 0 , 06 m g d e A c - P Y Y ( P E G 3 - C y s - p A l a - B i o t ) e n D M F a l 100 % a u n a c o n c e n t r a c i ó n d e 10 m g / m l . S e u s a r o n 0 , 8 m g d e l a n t i c u e r p o a n t i - b i o t i n a h u m a n i z a d o V H 53 C e n u n a c o n c e n t r a c i ó n d e 9 m g / m l
( a p r o x i m a d a m e n t e 62 p M ) e n u n t a m p ó n c o m p u e s t o p o r T r i s - H C l 50 m M , E D T A 1 m M , p H 8 , 2 . S e m e z c l a r o n A c -p Y Y [ P E G 3 - C y s - p A l a - B i o t y e l a n t i c u e r p o e n u n a p r o p o r c i ó n m o l a r d e 2 , 5 :1 ( A c - P Y Y [ P E G 3 - C y s - p A l a - B i o t ] a a n t i c u e r p o ) y s e i n c u b a r o n d u r a n t e 60 m i n u t o s a t e m p e r a t u r a a m b i e n t e , a g i t a n d o a 350 r p m . E l c o n j u g a d o r e s u l t a n t e s e a n a l i z ó m e d i a n t e e s p e c t r o m e t r í a d e m a s a s . E l 6 2 , 2 % d e la s e s p e c i e s d e t e c t a d a s s e id e n t i f i c ó c o m o a n t i c u e r p o a c o p l a d o a 2 m o l é c u l a s p e p t í d i c a s , e l 33 , 9 % s e i d e n t i f i c ó c o m o a n t i c u e r p o a c o p l a d o a 1 m o l é c u l a p e p t í d i c a y e l 3 , 9
% s e id e n t i f i c ó c o m o a n t i c u e r p o d e s a c o p l a d o .
Procedimiento ejemplar para la formación de conjugados de polipéptidos haptenilados y anticuerpos antihapteno - Ac-PYY(PEG3-Cys-PEG2-Biot)/anticuerpo anti-biotina humanizado v H53C
P a r a la g e n e r a c i ó n d e c o n j u g a d o s d e p o l i p é p t i d o d e P Y Y d e r i v a t i z a d o d e b i o t in a q u e c o n t i e n e n u n c o n e c t o r c i s t e i n i l a d o , s e d is o l v i e r o n 0 , 08 m g d e A c - P Y Y ( P E G 3 - C y s - P E G 2 - B i o t ) e n D M F a l 100 % a u n a c o n c e n t r a c i ó n d e 10 m g / m l . S e u s a r o n 0 , 8 m g d e l a n t i c u e r p o a n t i - b i o t i n a h u m a n i z a d o V H 53 C e n u n a c o n c e n t r a c i ó n d e 9 m g / m l
( a p r o x i m a d a m e n t e 62 p M ) e n u n t a m p ó n c o m p u e s t o p o r T r i s - H C l 50 m M , E D T A 1 m M , p H 8 , 2 . S e m e z c l a r o n A c -P Y Y [ P E G 3 - C y s - P E G 2 - B i o t y e l a n t i c u e r p o e n u n a p r o p o r c i ó n m o l a r d e 2 , 5 :1 ( A c - P Y Y [ P E G 3 - C y s - P E G 2 - B i o t ] a a n t i c u e r p o ) y s e i n c u b a r o n d u r a n t e 60 m i n u t o s a t e m p e r a t u r a a m b i e n t e , a g i t a n d o a 350 r p m . E l c o n j u g a d o r e s u l t a n t e s e a n a l i z ó m e d i a n t e e s p e c t r o m e t r í a d e m a s a s . E l 71 , 4 % d e la s e s p e c i e s d e t e c t a d a s s e id e n t i f i c ó c o m o a n t i c u e r p o a c o p l a d o a 2 m o l é c u l a s p e p t í d i c a s , e l 26 % s e i d e n t i f i c ó c o m o a n t i c u e r p o a c o p l a d o a 1 m o l é c u l a p e p t í d i c a y e l 2 , 5 % s e id e n t i f i c ó c o m o a n t i c u e r p o d e s a c o p l a d o .
Procedimiento ejemplar para la formación de conjugados de polipéptidos haptenilados y anticuerpos antihapteno - Ac-PYY(PEG3-Cys-PEG2-Fluo)/anticuerpo anti-fluoresceína VH52bC
P a r a la g e n e r a c i ó n d e c o n j u g a d o s d e p o l i p é p t i d o d e P Y Y d e r i v a d o d e b i o t i n a q u e c o n t i e n e n u n c o n e c t o r c i s t e in i l a d o , s e d i s o l v i e r o n 0 , 33 m g d e A c - P Y Y [ P E G 3 - C y s - P E G 2 - F l u o e n D M F a l 100 % a u n a c o n c e n t r a c i ó n d e 10 m g / m l . S e u s ó
1 m g d e l a n t i c u e r p o a n t i - f l u o r e s c e í n a V H 5 2 b C e n u n a c o n c e n t r a c i ó n d e 9 , 3 m g / m l ( a p r o x i m a d a m e n t e 63 p M ) e n u n t a m p ó n c o m p u e s t o d e T r i s - H C l 50 m M , E D T A 1 m M , p H 8 , 2 . S e m e z c l a r o n A c - P Y Y [ P E G 3 - C y s - P E G 2 - F l u o y e l a n t i c u e r p o e n u n a p r o p o r c i ó n m o l a r d e 2 , 5 :1 ( A c - P Y Y [ P E G 3 - C y s - P E G 2 - F l u o ] a a n t i c u e r p o ) y s e i n c u b a r o n d u r a n t e 60 m i n u t o s a t e m p e r a t u r a a m b ie n t e , a g i t a n d o a 3 50 r p m . E l c o n j u g a d o r e s u l t a n t e s e a n a l i z ó m e d i a n t e e s p e c t r o m e t r í a d e m a s a s . E l 95 % d e la s e s p e c i e s d e t e c t a d a s s e i d e n t i f i c ó c o m o a n t i c u e r p o a c o p l a d o a 2 m o l é c u l a s p e p t í d i c a s , e l 5 % s e id e n t i f i c ó c o m o a n t i c u e r p o a c o p l a d o a 1 m o l é c u l a p e p t íd i c a .
Procedimiento ejemplar para la formación de conjugados de polipéptidos haptenilados y anticuerpos antihapteno - Ac-PYY(PEG3-Cys-PEG2-Fluo)/anticuerpo anti-fluoresceína VH28C
P a r a la g e n e r a c i ó n d e c o n j u g a d o s d e p o l i p é p t i d o d e P Y Y d e r i v a d o d e b i o t i n a q u e c o n t i e n e n u n c o n e c t o r c i s t e in i l a d o ,
i n y e c t a d o s p r e v i a m e n t e 24 h o r a s c o n e l a n t i c u e r p o a n t i - b i o t i n a - C y s ( e s d e c i r , u n a n t i c u e r p o q u e c o n t i e n e la m u t a c ió n d e C y s c o m o s e in f o r m a e n e l p r e s e n t e d o c u m e n t o p a r a e l a c o p l a m i e n t o d e c a r g a ú t i l c o v a l e n t e ) a u m e n t a r o n a ú n m á s . E n e s t a s m u e s t r a s , lo s n i v e l e s r e l a t i v o s d e C y 5 n o s o lo f u e r o n m á s a l t o s q u e lo s d e l c o m p u e s t o n o c o m p l e j a d o , s in o t a m b i é n m á s a l t o s q u e lo s n i v e l e s d e C y 5 c o m p l e j a d o ( p e r o n o u n id o p o r e n l a c e s d is u l f u r o ) . P o r t a n t o , la s c a r g a s ú t i l e s u n i d a s p o r d i s u l f u r o c o m p l e j a d a s c o n h a p t e n o ( q u e s e f o r m a n e n c o n d i c i o n e s p r e v i a s a la p r e s e l e c c i ó n in v i v o ) s o n m á s e s t a b l e s e n la c i r c u l a c i ó n y p u e d e n a l c a n z a r n i v e l e s d e e x p o s i c i ó n m á s a l t o s q u e la s c a r g a s ú t i l e s c o m p l e j a d a s n o c o v a l e n t e s .
Ejemplo 15
Los polipéptidos en conjugados y en complejos con anticuerpos anti-hapteno conservan la funcionalidad
S e h a d e m o s t r a d o p r e v i a m e n t e q u e lo s p o l i p é p t i d o s q u e f o r m a n p a r t e d e c o n j u g a d o s n o c o v a l e n t e s d e h a p t e n o y p o l i p é p t i d o y q u e f o r m a n c o m p l e j o s c o n a n t i c u e r p o s a n t i - h a p t e n o c o n s e r v a n la f u n c i o n a l i d a d ( d o c u m e n t o s w O 2 01 1 / 00 35 57 , W O 2 01 1 / 00 3 7 80 y W O 2 01 2 / 0 93 06 8 ) . P a r a d e m o s t r a r q u e lo s p é p t i d o s a c o p l a d o s c o n s e r v a n la f u n c i o n a l i d a d t a m b i é n t r a s e l a c o p l a m i e n t o d i s u l f u r o c o v a l e n t e , s e c o m p a r ó la a c t i v i d a d b io l ó g i c a d e p o l i p é p t i d o s c o m p l e j a d o s c o n a n t i c u e r p o a n t i - d i g o x i g e n i n a y s u s c o n j u g a d o s d i s u l f u r o c o n e l a n t i c u e r p o a n t i - d i g o x i g e n i n a V H 52 b C .
L a f u n c i o n a l i d a d t e r a p é u t i c a m e n t e d e s e a d a d e lo s p é p t i d o s d e r i v a d o s d e P Y Y s e u n e a e i n t e r f i e r e c o n la s e ñ a l i z a c i ó n d e s u r e c e p t o r a f í n N P Y 2 . L a s e ñ a l i z a c i ó n p o r m e d i o d e l r e c e p t o r N P Y 2 s e i m p l i c a e n y / o r e g u l a lo s p r o c e s o s m e t a b ó l i c o s .
P a r a e v a l u a r s i la c o m p l e j a c i ó n o la c o n j u g a c i ó n d e S S d e l p o l i p é p t i d o D i g - P Y Y c o n e l a n t i c u e r p o a n t i - d i g o x i g e n i n a o la c o n j u g a c i ó n d e l p o l i p é p t i d o D i g - C y s - P Y Y c o n e l a n t i c u e r p o a n t i - d i g o x i g e n i n a V H 52 b C , r e s p e c t i v a m e n t e , a f e c t a n s u a c t i v i d a d , s e e v a l ú a s u c a p a c i d a d p a r a in h i b i r la a c u m u l a c i ó n d e A M P c e s t i m u l a d a p o r f o r s k o l i n a e n c é l u l a s H E K 293 q u e e x p r e s a n e l r e c e p t o r d e N P Y 2 ( e n s a y o d e A M P c ) .
L a s i g u i e n t e T a b l a 6 m u e s t r a lo s r e s u l t a d o s d e lo s e n s a y o s d e A M P c q u e s e r e a l i z a r o n p a r a e v a l u a r la a c t i v id a d b i o l ó g i c a d e P Y Y ( 3 - 36 ) , s u a n á l o g o m o d i f i c a d o e s p e c í f i c o d e l r e c e p t o r Y 2 m o P Y Y , s u v a r i a n t e D ig c o m p l e j a d a c o n a n t i c u e r p o s y s u d e r i v a d o D i g - C y s c o n j u g a d o c o n d is u l f u r o .
Tabla 6
Figure imgf000090_0002
Figure imgf000090_0001
P a r a r e a l i z a r e l e n s a y o , e l p r i m e r d í a s e d e s c a r t ó e l m e d io y s e la v a r o n la s c é l u l a s m o n o c a p a c o n 10 m l d e P B S p o r m a t r a z ( T 225 ) . D e s p u é s d e d e c a n t a r c o n P B S , s e u s a r o n 5 m l d e V E R S E N E ( G ib c o , n . ° d e c a t . 150 4006 ) p a r a d e s p r e n d e r la s c é l u l a s ( 5 m in a 37 ° C ) . S e g o l p e ó s u a v e m e n t e e l m a t r a z y s e c o m b i n ó la s u s p e n s i ó n c e lu l a r . C a d a m a t r a z s e e n j u a g ó c o n 10 m l d e m e d io d e s i e m b r a y s e c e n t r i f u g ó a 1000 r p m d u r a n t e 5 m in . L a s u s p e n s i ó n s e c o m b i n ó y s e c o n t ó . L a s u s p e n s i ó n s e v o l v i ó a s u s p e n d e r e n m e d i o d e s i e m b r a a u n a d e n s i d a d d e 2 , 0 x 105 c é l u l a s / m l p a r a H E K 29 3 / h N P Y 2 R . S e t r a n s f i r i e r o n 50 m i c r o l i t r o s d e c é l u l a s ( H E K 2 9 3 / h N P Y 2 R - 10 .000 c é l u l a s / p o c i l l o ) a la p la c a d e 38 4 p o c i l l o s u s a n d o u n d i s p e n s a d o r d e g o t a s m ú l t i p le s . L a s p la c a s s e i n c u b a r o n a 37 ° C d u r a n t e la n o c h e . E l s e g u n d o d ía , s e c o m p r o b ó q u e la s c é l u l a s t u v i e r a n u n a c o n f l u e n c i a d e l 7 5 - 8 5 % . S e d e j ó q u e e l m e d io y l o s r e a c t i v o s a l c a n z a r a n la t e m p e r a t u r a a m b ie n t e . A n t e s d e q u e s e p r e p a r a r a n la s d i l u c i o n e s , s e d e jó c a l e n t a r la s o l u c i ó n m a d r e d e c o m p u e s t o e s t i m u l a n t e e n d i m e t i l s u l f ó x i d o ( D M S O , S ig m a , n . ° d e c a t . D 265 0 ) h a s t a 32 ° C d u r a n t e 5 - 10 m in . L a s d i l u c i o n e s s e p r e p a r a r o n e n D M E M / F 1 2 c o n 3 - i s o b u t i l - 1 - m e t i l x a n t i n a 0 , 5 m M (|Bm X, C a l b i o c h e m , n . ° d e c a t . 4 1 0 9 5 7 ) y 0 , 5 m g / m l d e B S A . L a c o n c e n t r a c i ó n f i n a l d e D M S O e n e l m e d i o d e e s t i m u l a c i ó n f u e d e l 1 ,1 % c o n u n a c o n c e n t r a c i ó n d e f o r s k o l i n a d e 5 p M . E l m e d i o c e l u l a r s e r e t i r ó c o n u n a s u a v e i n v e r s i ó n d e la p la c a c e l u l a r s o b r e u n a t o a l l a d e p a p e l . S e c o l o c a r o n 50 p l d e m e d io d e e s t i m u l a c i ó n p o r p o c i l l o ( c a d a c o n c e n t r a c i ó n s e r e a l i z ó e n c u a t r o r e p e t i c i o n e s ) . L a s p la c a s s e i n c u b a r o n a t e m p e r a t u r a a m b i e n t e d u r a n t e 30 m in y la s c é l u l a s s e e x a m i n a r o n a l m i c r o s c o p i o p a r a d e t e r m i n a r s u t o x i c i d a d . D e s p u é s d e 30 m in d e t r a t a m i e n t o , s e d e s c a r t ó e l m e d i o d e e s t i m u l a c i ó n y s e a ñ a d i e r o n 50 p l / p o c i l l o d e t a m p ó n d e l is is d e e n s a y o ( p r o p o r c i o n a d o e n e l k i t d e T r o p ix ) . L a s p la c a s s e i n c u b a r o n d u r a n t e 45 m in a 37 ° C . S e t r a n s f i r i e r o n 20 p l d e l l i s a d o d e la s p la c a s d e e s t i m u l a c i ó n a la s p la c a s d e a n t i c u e r p o p r e r r e v e s t i d a s ( 384 p o c i l l o s ) d e l k i t d e T r o p ix . S e a ñ a d i e r o n 10 p l d e c o n j u g a d o d e A P y 20 p l d e a n t i c u e r p o a n t i - A M P c . S e i n c u b a r o n la s p la c a s a t e m p e r a t u r a a m b i e n t e d u r a n t e 1 h o r a . A c o n t i n u a c i ó n , l a s p la c a s s e la v a r o n 5 v e c e s c o n t a m p ó n d e la v a d o , 70 p l p o r p o c i l l o p a r a c a d a la v a d o . L a s p la c a s s e r e t i r a r o n p a r a s u s e c a d o . S e a ñ a d i e r o n 30 p l / p o c i l l o d e s o l u c i ó n d e p o t e n c i a d o r / s u s t r a t o d e C S P D / S a p p h i r e - I I R T U y s e i n c u b ó d u r a n t e 45 m in a t e m p e r a t u r a a m b i e n t e ( a g i t a c i ó n ) . S e m id i ó la s e ñ a l d u r a n t e 1 s / p o c i l l o e n u n lu m i n ó m e t r o ( V I C T O R - V ) .
Figure imgf000091_0001
Ejemplo 16
Estabilidad sérica de complejos de Cy5 biotinilado con anticuerpo anti-biotina humanizado en comparación con conjugados covalentes de Cy5 biotinilado con anticuerpo anti-biotina humanizado VH53C
E l o b j e t i v o d e la t e c n o l o g í a d e m o d i f i c a c i ó n d e p é p t i d o s d e s c r i t a e s m e j o r a r la a p l i c a b i l i d a d t e r a p é u t i c a d e lo s p é p t id o s . L o s p r i n c i p a l e s o b s t á c u l o s p a r a la a p l i c a c i ó n t e r a p é u t i c a d e p é p t i d o s s o n a c t u a l m e n t e u n a e s t a b i l i d a d l im i t a d a in v i v o y / o u n a s e m i v i d a s é r i c a c o r t a y s u r á p i d a e l i m i n a c i ó n . L o s p a r á m e t r o s f a r m a c o c i n é t i c o s d e lo s c o n j u g a d o s d e a n t i c u e r p o s d e f l u o r ó f o r o s s e d e t e r m i n a r o n in v i v o y s e c o m p a r a r o n c o n la f a r m a c o c i n é t i c a d e lo s c o m p l e j o s d e a n t i c u e r p o - f l u o r ó f o r o n o c o v a l e n t e s . P o r lo t a n t o , ( i ) e l a n t i c u e r p o a n t i - b i o t i n a V H 53 C s e c o n j u g ó c o v a l e n t e m e n t e c o n e l f l u o r ó f o r o b i o t i n i l a d o B i o t - C y s - C y 5 , ( i i ) s e g e n e r ó u n c o m p l e j o n o c o v a l e n t e d e l a n t i c u e r p o a n t i - b i o t i n a c o n e l f l u o r ó f o r o b i o t i n i l a d o B io t - C y 5 , ( i i i ) lo s c o m p u e s t o s c o n j u g a d o s c o v a l e n t e m e n t e y lo s c o m p u e s t o s c o m p l e j a d o s n o c o v a l e n t e m e n t e s e a d m i n i s t r a r o n a a n i m a l e s y ( i v ) la s c o n c e n t r a c i o n e s s é r i c a s d e lo s c o m p u e s t o s a lo l a r g o d e l t i e m p o e n e s t o s a n i m a l e s s e m i d ie r o n m e d i a n t e la d e t e r m i n a c i ó n d e la f l u o r e s c e n c i a d e C y 5 ( A 650 ) , y la d e l a n t i c u e r p o c o r r e s p o n d i e n t e m e d i a n t e u n p r o c e d i m i e n t o d e E L I S A q u e d e t e c t a e s p e c í f i c a m e n t e e l a n t i c u e r p o h u m a n iz a d o .
Procedim iento experimental
Figure imgf000091_0002
P a r a d e t e r m i n a r la c a n t i d a d d e c o m p u e s t o ( f l u o r ó f o r o ) e n e l s u e r o e n lo s p u n t o s d e t i e m p o d a d o s , s e u s a n la s p r o p i e d a d e s f l u o r e s c e n t e s d e C y 5 : la f l u o r e s c e n c i a d e C y 5 e n m u e s t r a s s é r i c a s s e m id ió e n c u b e t a s d e c u a r z o d e 120 p l a t e m p e r a t u r a a m b i e n t e u s a n d o u n e s p e c t r o f o t ó m e t r o d e f l u o r e s c e n c i a C a r y E c l i p s e ( V a r ia n ) . L a lo n g i t u d d e o n d a d e e x c i t a c i ó n f u e d e 640 n m , la e m is ió n s e m id ió a 667 n m . L a s m u e s t r a s d e s u e r o s e d i l u y e r o n e n 1 x P B S p a r a a l c a n z a r u n i n t e r v a lo a p r o p i a d o d e in t e n s i d a d d e e m is ió n . E l s u e r o s a n g u í n e o d e u n r a t ó n n o t r a t a d o e n la m is m a d i l u c i ó n e n 1 x P B S q u e la m u e s t r a r e s p e c t i v a s e u s ó c o m o s o n d a e n b l a n c o y n o m o s t r ó n i n g u n a s e ñ a l d e f l u o r e s c e n c i a .
Figure imgf000091_0003
L a f i g u r a 34 m u e s t r a lo s n i v e l e s s é r i c o s d e B io - C y 5 a s í c o m o lo s n i v e l e s s é r i c o s d e I g G h u m a n a e n r a t o n e s t r a t a d o s
Figure imgf000092_0001
Ejemplo 17
Estabilidad sérica de complejos de digoxigenina-Cy5 con anticuerpo anti-digoxigenina humanizado en comparación con conjugados covalentes de digoxigenina-Cys-Cy5 con anticuerpo anti-digoxigenina humanizado
Figure imgf000092_0002
L o s r e s u l t a d o s d e e s t o s e x p e r i m e n t o s d e m u e s t r a n q u e p a r a la d i g o x i g e n i n a - C y 5 m e n o s d e l 10 % d e la f l u o r e s c e n c i a q u e s e a p l i c ó ( v a l o r d e 5 m i n u t o s ) e r a d e t e c t a b l e 2 h o r a s d e s p u é s d e la i n y e c c i ó n . E n p u n t o s d e t i e m p o p o s t e r i o r e s , 4 h o r a s y 24 h o r a s , r e s p e c t i v a m e n t e , d e s p u é s d e la i n y e c c i ó n , n o s e d e t e c t a r o n s e ñ a l e s d e d i g o x i g e n i n a - C y 5 n o c o m p l e j a d a s ( v é a s e la f i g u r a 41 , t r i á n g u l o s g r i s e s e n a m b o s g r á f i c o s ) . A d i f e r e n c i a d e l c o m p u e s t o n o c o m p l e j a d o , e l c o m p u e s t o c o m p l e j a d o c o n a n t i c u e r p o e r a d e t e c t a b l e a n i v e l e s m u c h o m á s a l t o s y e n p u n t o s d e t i e m p o p o s t e r i o r e s ( f i g u r a 41 , g r á f i c o s u p e r i o r ) . E s t o i n d i c a q u e la c o m p l e j a c i ó n d e a n t i c u e r p o s a u m e n t a s i g n i f i c a t i v a m e n t e la s e m i v i d a s é r i c a d e l p e q u e ñ o c o m p u e s t o d i g o x i g e n i n a - C y 5 . A d e m á s , l a s c a r g a s ú t i l e s u n i d a s c o v a l e n t e m e n t e m u e s t r a n u n a m a y o r e s t a b i l i d a d s é r i c a e n c o m p a r a c i ó n c o n lo s c o m p l e j o s n o u n id o s c o v a l e n t e m e n t e . U n a c o m p a r a c i ó n d i r e c t a d e lo s n i v e l e s d e d i g o x i g e n i n a - C y 5 y lo s n i v e l e s d e a n t i c u e r p o s i n d i c a la p é r d i d a d e c a r g a ú t i l c o m p l e j a d a d e l a n t i c u e r p o a lo l a r g o d e l t i e m p o , c o n n iv e l e s d e C y 5 q u e d i s m i n u y e n m á s r á p id o q u e lo s n i v e l e s d e a n t i c u e r p o s . P o r e l c o n t r a r io , l o s c o n j u g a d o s d e d i g o x i g e n i n a u n i d o s c o v a l e n t e m e n t e m o s t r a r o n s e m i v i d a s s é r i c a s d e C y 5 e I g G c a s i i d é n t i c a s ( f i g u r a 41 , g r á f i c o i n f e r io r ) . E s t o in d i c a q u e la s c a r g a s ú t i l e s u n i d a s p o r d i s u l f u r o p e r m a n e c e n c o n e c t a d a s d e f o r m a e s t a b l e a lo s a n t i c u e r p o s m i e n t r a s q u e lo s c o m p l e j o s n o c o v a l e n t e s s e d is o c i a n c o n e l t i e m p o .
Ejemplo 18
Estabilidad sérica de un polipéptido digoxigenilado complejado con anticuerpo anti-digoxigenina humanizado
Figure imgf000092_0003
L a d e t e r m i n a c i ó n d e la c a n t i d a d d e p é p t i d o d i g o x i g e n i l a d o e n e l s u e r o e n lo s p u n t o s d e t i e m p o d a d o s f u e d i f í c i l e n c o m p a r a c i ó n c o n la d e t e c c i ó n d e D i g - C y 5 y a q u e n o s e d i s p o n í a d e m e d i o s d i r e c t o s p a r a d e t e c t a r e l p o l i p é p t i d o e n la s m u e s t r a s s é r i c a s . P o r lo t a n t o , s e e s t a b l e c i ó u n e n s a y o r e l a c i o n a d o c o n la i n m u n o e l e c t r o t r a n s f e r e n c i a p a r a d e t e c t a r p é p t i d o d i g o x i g e n i l a d o e n s u e r o . E n u n a p r i m e r a e t a p a , la s m u e s t r a s s é r i c a s s e s e p a r a r o n a l r e d u c i r S D S - P A G E . D e b i d o a q u e la p r e p a r a c i ó n d e la m u e s t r a in c lu y ó la e x p o s i c i ó n d e l s u e r o a a l t a s c o n c e n t r a c i o n e s d e S D S y a g e n t e s r e d u c t o r e s , lo s c o n j u g a d o s d e D i g - p o l i p é p t i d o c o m p l e j a d o s s e p u e d e n l i b e r a r d e l a n t i c u e r p o a n t i - d i g o x i g e n i n a ( c o m p l e t a m e n t e d e s n a t u r a l i z a d o / d e s p l e g a d o ) , m i e n t r a s q u e lo s c o n j u g a d o s c o v a l e n t e s p e r m a n e c e n u n id o s . P a r a m e d i a r la l i b e r a c i ó n d e l p o l i p é p t i d o d e l c o m p l e j o d e a n t i c u e r p o s n o c o v a l e n t e s y s e p a r a r lo s c o m p o n e n t e s in d i v i d u a l e s m e d i a n t e S D S - P A G E , s e d i l u y e r o n 2 p l d e c a d a m u e s t r a s é r i c a e n 18 p l d e h i s t i d i n a 20 m M / N a C l 140 m M , p H 6 , 0 ,
Figure imgf000093_0001
L o s r e s u l t a d o s d e e s t o s a n á l i s i s s e m u e s t r a n e n la f i g u r a 35 A y B . S e h a d e t e r m i n a d o la p r e s e n c i a / c a n t i d a d d e l p o l i p é p t i d o d e d i g o x i g e n i n a e n s u e r o m u r i n o e n d i f e r e n t e s m o m e n t o s . L o s r a t o n e s q u e h a b í a n r e c i b i d o p é p t id o s c o m p l e j a d o s c o n a n t i c u e r p o s ( f ig . 35 a la i z q u i e r d a ) m o s t r a r o n s e ñ a l e s f u e r t e s e n e l m o m e n t o m á s t e m p r a n o ( 5 m i n u t o s d e s p u é s d e la a d m i n i s t r a c i ó n ) . E s t a s s e ñ a l e s e r a n c l a r a m e n t e a s i g n a b l e s , c o m o lo m u e s t r a e l t a m a ñ o y la l o c a l i z a c i ó n e n la m a n c h a d e lo s c o n t r o l e s . E n s u e r o s d e r a t o n e s q u e s e t r a t a r o n c o n p o l i p é p t i d o s c o m p l e j a d o s c o n a n t i c u e r p o , la s s e ñ a l e s a s o c i a d a s c o n p o l i p é p t i d o s f u e r o n m á s f u e r t e s e n lo s m o m e n t o s t e m p r a n o s y d i s m i n u y e r o n c o n e l t i e m p o . S in e m b a r g o , e l p o l i p é p t i d o t o d a v í a e r a d e t e c t a b l e c o n b u e n a s s e ñ a l e s e n t o d o s lo s m o m e n t o s e in c lu s o 24 h o r a s d e s p u é s d e la a d m i n i s t r a c i ó n .
E n r a t o n e s q u e r e c i b i e r o n p o l i p é p t i d o s n o c o m p l e j a d o s , a p e n a s s e d e t e c t ó n i n g u n a s e ñ a l a s o c i a b l e a l p o l i p é p t i d o p e q u e ñ o i n c lu s o e n e l p u n t o d e t i e m p o m á s t e m p r a n o . L a f i g u r a 35 m u e s t r a a la d e r e c h a q u e , e n c o n d i c i o n e s d e e x p o s i c i ó n n o r m a le s , n o e s v i s i b l e n in g ú n p o l i p é p t i d o l i b r e e n la m a n c h a . L a m e j o r a d e l c o n t r a s t e d e la t r a n s f e r e n c i a r e v e l ó la p r e s e n c i a d e a lg ú n p o l i p é p t i d o 5 m in u t o s d e s p u é s d e la a d m i n i s t r a c i ó n , s in e m b a r g o , s o lo e n c a n t i d a d e s í n f i m a s . E n m o m e n t o s p o s t e r i o r e s , n o s e d e t e c t ó n i n g u n a b a n d a p o l i p e p t í d i c a d e f in id a .
S e p u e d e o b s e r v a r q u e , d e f o r m a s i m i l a r a l h a p t e n o - C y 5 n o c o m p l e j a d o , e l p o l i p é p t i d o n o c o m p l e j a d o t i e n e u n a s e m i v i d a m u y c o r t a e n e l s u e r o d e r a t o n e s . L o s r a t o n e s q u e r e c i b i e r o n lo s m is m o s p o l i p é p t i d o s p e r o e n f o r m a d e c o m p l e j o s d e a n t i c u e r p o s , m u e s t r a n la p r e s e n c i a d e e s t o s p o l i p é p t i d o s e n e l s u e r o d u r a n t e u n p e r í o d o d e t i e m p o m a y o r . V e i n t i c u a t r o h o r a s d e s p u é s d e la i n y e c c i ó n , t o d a v í a s e p u e d e d e t e r m i n a r e l p o l i p é p t i d o e n e l s u e r o d e e s t o s r a t o n e s .
Ejemplo 19
Medición in vivo en tiempo real de la semivida sérica y los niveles de exposición de conjugados haptenoanticuerpo unidos covalentemente y complejos no covalentes
P a r a a n a l i z a r a ú n m á s la s p r o p i e d a d e s f a r m a c o c i n é t i c a s d e lo s c o m p u e s t o s d e h a p t e n o c o m p l e j a d o s n o c o v a l e n t e m e n t e e n c o m p a r a c i ó n c o n lo s c o m p u e s t o s d e h a p t e n o u n id o s c o v a l e n t e m e n t e , s e d e t e r m i n ó la c i n é t i c a in v i v o d e u n c o m p l e j o o c o n j u g a d o in y e c t a d o e n t r e b io t i n a - C y 5 o b i o t i n a - C y s - C y 5 y e l c o r r e s p o n d i e n t e a n t i c u e r p o a n t i -b i o t i n a m e d i a n t e u n a t e c n o l o g í a d e f o r m a c i ó n d e i m á g e n e s ó p t i c a n o i n v a s i v a , q u e r e v e ló la f l u o r e s c e n c i a d e C y 5 e n lo s c a p i l a r e s d e l o jo d e lo s a n im a le s . L o s v a l o r e s s e n o r m a l i z a r o n a l v a l o r d e 10 m in , q u e s e e s t a b l e c i ó c o m o 100 % . L o s r e s u l t a d o s d e e s t o s e x p e r i m e n t o s s e m u e s t r a n e n la f i g u r a 42 : la b io t i n a - C y 5 n o c o m p l e j a d a p o r s í m i s m a t i e n e u n a s e m i v i d a s é r i c a c o r t a y n i v e l e s d e e x p o s i c i ó n b a jo s . L a b io t i n a - C y 5 c o m p l e j a d a c o n a n t i c u e r p o q u e n o e s t a b a u n i d a c o v a l e n t e m e n t e s e p u d o d e t e c t a r a n i v e l e s m u c h o m á s a l t o s y c o n u n a s e m i v i d a p r o lo n g a d a . L a c a r g a ú t i l u n id a c o v a l e n t e m e n t e m o s t r ó u n a e s t a b i l i d a d s é r i c a i n c lu s o m a y o r , i n d i c a d a p o r n i v e l e s s é r i c o s m á s a l t o s e n c o m p a r a c i ó n c o n lo s c o m p l e j o s u n id o s n o c o v a l e n t e m e n t e . E s t o s e x p e r i m e n t o s c o n f i r m a n q u e la s c a r g a s ú t i l e s c o n e n l a c e s d i s u l f u r o c o v a l e n t e s s o n m á s e s t a b l e s e n la c i r c u l a c i ó n y p u e d e n a l c a n z a r n i v e l e s d e e x p o s i c i ó n m á s a l t o s q u e la s c a r g a s ú t i l e s c o m p l e j a d a s n o c o v a l e n t e m e n t e .
Ejemplo 20
Complejación de péptidos y conjugación covalente con anticuerpos que se unen a diferentes haptenos
L a a p l i c a c i ó n d e m ó d u l o s d e u n ió n a h a p t e n o p a r a a c o p l a r c o m p u e s t o s h a p t e n i l a d o s ( = c a r g a s ú t i l e s ) a v e h í c u l o s d e d i r e c c i o n a m i e n t o e s u n a p o s i b i l i d a d t é c n i c a m e d i a n t e la c u a l s e p u e d e r e a l i z a r e l s u m i n i s t r o m e d i a d o p o r h a p t e n o s . E l c o n c e p t o s e p u e d e e x p a n d i r a h a p t e n o s a d i c i o n a l e s u o t r a s e n t i d a d e s q u e c a p t u r a n c o m p u e s t o s y lo s c o n e c t a n a l m ó d u l o d e d i r e c c i o n a m i e n t o . P o r e je m p lo , p a r a e l s u m i n i s t r o o e s t a b i l i z a c i ó n d e p o l i p é p t id o s , s e p u e d e n a p l i c a r a n t i c u e r p o s m o n o o b i e s p e c í f i c o s q u e s e u n e n a d i g o x i g e n i n a u o t r o s h a p t e n o s p a r a e s t a b i l i z a r y o p t i m i z a r d e f o r m a f a r m a c o c i n é t i c a a lo s p o l i p é p t i d o s t e r a p é u t i c o s .
L o s r e q u i s i t o s p r e v i o s p a r a la a p l i c a c i ó n c o m o m ó d u l o s d e c a p t u r a d e p o l i p é p t i d o s s o n ( i ) q u e e l a c o p l a m i e n t o d e c o m p u e s t o s a l h a p t e n o n o in t e r f i e r a g r a v e m e n t e c o n la a c t i v i d a d d e l p o l i p é p t i d o y ( i i ) la p o s i b i l i d a d d e u n a u n i ó n / c o m p l e j a c i ó n e f i c a z d e l a n t i c u e r p o a lo s c o m p u e s t o s h a p t e n i la d o s .
L a u n ió n d i r i g i d a a h a p t e n o e s u n r e q u i s i t o p r e v io p a r a e l a c o p l a m i e n t o c o v a l e n t e e f i c a z d e t i n t e s o p o l i p é p t i d o s h a p t e n i l a d o s c o n u n a n t i c u e r p o c i s t e i n i l a d o a n t i - h a p t e n o .
P a r a d e m o s t r a r q u e la c o m p l e j a c i ó n p o r a f in id a d d e lo s c o m p u e s t o s h a p t e n i l a d o s c o n lo s a n t i c u e r p o s a n t i - h a p t e n o e s u n r e q u i s i t o p r e v i o p a r a la f o r m a c i ó n e f i c a z d e e n l a c e s d is u l f u r o , s e in c u b ó b i o t i n a - C y s - C y 5 c o n e l a n t i c u e r p o a n t i -d i g o x i g e n i n a h u m a n i z a d o y e l a n t i c u e r p o a n t i - d i g o x i g e n i n a h u m a n i z a d o V H 53 C . L a in c u b a c ió n d e b i o t i n a - C y s - C y 5 c o n e l a n t i c u e r p o a n t i - b i o t i n a h u m a n i z a d o y e l a n t i c u e r p o a n t i - b i o t i n a h u m a n i z a d o V H 53 C s e l l e v ó a c a b o c o m o r e a c c ió n d e c o n t r o l .
Figure imgf000094_0001
L a s m u e s t r a s n o r e d u c i d a s m u e s t r a n la f o r m a c i ó n d e u n e n l a c e d is u l f u r o c o v a l e n t e e s p e c í f i c o d e l s i t i o p a r a e l a n t i c u e r p o a n t i - b i o t i n a h u m a n i z a d o V H 53 C ( f i g .36 , c a r r i l 4 ) c o n u n a s e ñ a l d e f l u o r e s c e n c i a d e f o n d o m u y b a ja c u a n d o s e u s ó a n t i c u e r p o a n t i - b i o t i n a h u m a n i z a d o s in u n a c i s t e í n a e n C D R 2 ( f ig . 36 , c a r r i l 3 ) . L a b i o t i n a - C y s - C y 5 t a m b i é n s e a c o p l ó c o v a l e n t e m e n t e a l a n t i c u e r p o a n t i - d i g o x i g e n i n a h u m a n i z a d o V H 5 2 b C ( f i g .36 , c a r r i l 2 ) c o n u n a s e ñ a l d e f o n d o b a ja c u a n d o s e u s ó e l a n t i c u e r p o a n t i - d i g o x i g e n i n a h u m a n i z a d o ( f i g .36 , c a r r i l 1 ) , p e r o c o n u n n iv e l d e e f i c a c ia s i g n i f i c a t i v a m e n t e m e n o r . E s t o s e p u e d e d e d u c i r d e l e x c e s o d e b i o t i n a - C y s - C y 5 q u e s e d e t e c t a e n la p a r t e i n f e r i o r d e l g e l ( f l e c h a s ) . E n e l c a s o d e l a n t i c u e r p o a n t i - d i g o x i g e n i n a h u m a n i z a d o V H 5 2 b C s e p u e d e d e t e c t a r s i g n i f i c a t i v a m e n t e m á s b i o t i n a - C y s - C y 5 d e s a c o p l a d a ( c a r r i l 2 ) q u e c o n e l a n t i c u e r p o a n t i - b i o t i n a h u m a n i z a d o V H 53 C ( c a r r i l 4 ) . T r a s la r e d u c c i ó n d e la s m u e s t r a s , n o s e p u e d e d e t e c t a r f l u o r e s c e n c i a r e l a c i o n a d a c o n C y 5 c e r c a d e la s c a d e n a s l i g e r a y p e s a d a d e l a n t i c u e r p o , lo q u e in d i c a q u e e l e n l a c e c o v a l e n t e s e f o r m ó d e h e c h o m e d i a n t e u n p u e n t e d is u l f u r o . L a s t i n c i o n e s d e C o o m a s s i e d e c a d a g e l m u e s t r a n q u e la c a n t i d a d t o t a l d e p r o t e í n a e n c a d a c a r r i l e r a ig u a l .
Ejemplo 21
La unión dirigida a hapteno es un requisito previo para el acoplamiento covalente eficaz de tintes o polipéptidos haptenilados con un anticuerpo cisteinilado anti-hapteno
P a r a d e m o s t r a r q u e la c o m p l e j a c i ó n p o r a f in id a d d e lo s c o m p u e s t o s h a p t e n i l a d o s c o n lo s a n t i c u e r p o s a n t i - h a p t e n o e s u n r e q u i s i t o p r e v i o p a r a la f o r m a c i ó n e f i c a z d e e n l a c e s d is u l f u r o , e l p é p t i d o n o h a p t e n i l a d o A c - P Y Y ( P E G 3 - C y s - 4 A b u -N H 2 ) ( B i o s y n t h a n 1763 .1 , S E Q ID N O : 178 ) s e i n c u b ó c o n e l a n t i c u e r p o a n t i - d i g o x i g e n i n a h u m a n i z a d o V H 5 2 b C y e l a n t i c u e r p o a n t i - d i g o x i g e n i n a h u m a n i z a d o . S e d is o l v i e r o n 1 , 4 m g d e A c - P Y Y ( P E G 3 - C y s - 4 A b u - N H 2 ) e n D M F a l 100 % a u n a c o n c e n t r a c i ó n d e 10 m g / m l . S e u s a r o n 2 m g d e c a d a a n t i c u e r p o e n u n a c o n c e n t r a c i ó n d e 11 - 13 m g / m l ( a p r o x i m a d a m e n t e 75 - 89 p M ) e n u n t a m p ó n c o m p u e s t o p o r T r i s - H C l 50 m M , E D T A 1 m M , p H 8 , 2 . S e m e z c l a r o n A c -p Y Y ( P E G 3 - C y s - 4 A b u - N H 2 ) y lo s a n t i c u e r p o s e n u n a p r o p o r c i ó n m o l a r d e 2 , 1 :1 ( A c - P Y Y ( P E G 3 - C y s - 4 A b u - N H 2 a a n t i c u e r p o ) ) . E l p é p t i d o s e a ñ a d i ó e n 3 p o r c i o n e s m i e n t r a s la s o l u c i ó n s e a g i t a b a a 500 r p m c o n u n a b a r r a a g i t a d o r a . E n t r e c a d a a d ic i ó n , la s m u e s t r a s s e i n c u b a r o n d u r a n t e 5 m in a 20 0 r p m . D e s p u é s d e la a d ic i ó n d e la ú l t im a p a r t e , la s m u e s t r a s s e i n c u b a r o n d u r a n t e 1 h o r a a t e m p e r a t u r a a m b i e n t e y 20 0 r p m .
E l c o m p l e j o / c o n j u g a d o r e s u l t a n t e s e d e f in ió c o m o u n a m o l é c u l a s i m i l a r a I g G m o n o m é r i c a a l 97 % y a g r e g a d o s s o l u b l e s d i m é r i c o s a l 3 % p a r a e l c o n j u g a d o d e A c - P Y Y ( P E G 3 - C y s - 4 A b u - N H 2 ) : a n t i c u e r p o a n t i - d i g o x i g e n i n a h u m a n i z a d o V H 5 2 b C y c o m o m o n o m é r i c o a l 100 % p a r a e l c o m p l e j o d e A c - P Y Y ( P E G 3 - C y s - 4 A b u - N H 2 ) : a n t i c u e r p o a n t i - d i g o x i g e n i n a h u m a n i z a d o p o r m e d io d e c r o m a t o g r a f í a d e e x c l u s i ó n p o r t a m a ñ o . A d e m á s , e l c o m p l e j o / c o n j u g a d o r e s u l t a n t e s e a n a l i z ó m e d i a n t e e s p e c t r o m e t r í a d e m a s a s . P a r a e l c o n j u g a d o d e A c - P Y Y ( P E G 3 - C y s - 4 A b u -N H 2 ) : a n t i c u e r p o a n t i - d i g o x i g e n i n a h u m a n i z a d o V H 5 2 b C e l 17 % d e la s e s p e c i e s d e t e c t a d a s s e i d e n t i f i c ó c o m o a n t i c u e r p o a c o p l a d o a 2 m o l é c u l a s p e p t í d i c a s , e l 51 % s e i d e n t i f i c ó c o m o a n t i c u e r p o a c o p l a d o a 1 m o l é c u l a p e p t í d i c a y e l 32 % s e id e n t i f i c ó c o m o a n t i c u e r p o s in p é p t i d o a c o p la d o . P a r a e l c o m p l e j o d e A c - P Y Y ( P E G 3 - C y s - 4 A b u -N H 2 ) : a n t i c u e r p o a n t i - d i g o x i g e n i n a h u m a n i z a d o , s e d e s a c o p l ó e l 100 % d e l a n t i c u e r p o .
Ejemplo 22
Patrones d isu lfuro que se requieren para la formación de anticuerpos de unión a hapteno funcionales plegados apropiadamente con una mutación de cisteína para el acoplamiento de carga ú til covalente Ejemplo 26
Genomanipulación de módulos lanzadera a través de la barrera hematoencefálica
L o s m ó d u l o s l a n z a d e r a a t r a v é s d e la b a r r e r a h e m a t o e n c e f á l i c a b i e s p e c í f i c o s d e u n ió n a h a p t e n o s s e g e n e r a r o n f u s i o n a n d o F v m o n o c a t e n a r i o s d e u n ió n a h a p t e n o s e s t a b i l i z a d o s c o n p u e n t e s d is u l f u r o a l e x t r e m o C d e lo s d o m i n i o s C H 3 d e lo s a n t i c u e r p o s a n t i - T f R . S e a p l i c a r o n d i s e ñ o s y t e c n o l o g í a s s i m i l a r e s a lo s d e s c r i t o s p r e v i a m e n t e ( v é a s e , p o r e je m p lo , e l d o c u m e n t o P C T / E P 2 01 3 / 06 410 0 ) . E n la f i g u r a 47 s e m u e s t r a u n e j e m p l o d e la c o m p o s i c i ó n d e e s t o s m ó d u l o s l a n z a d e r a a t r a v é s d e la b a r r e r a h e m a t o e n c e f á l i c a .
L o s m ó d u l o s la n z a d e r a a t r a v é s d e la b a r r e r a h e m a t o e n c e f á l i c a r e c o n o c e n d i a n a s d e s u p e r f i c i e c e l u l a r q u e s e p u e d e n s o m e t e r a t r a n s c i t o s i s e n c é l u l a s e n d o t e l i a l e s d e la b a r r e r a h e m a t o e n c e f á l i c a ( r e c e p t o r d e la b a r r e r a h e m a t o e n c e f á l i c a ) .
Figure imgf000097_0001
L o s e j e m p l o s p a r a la c o m p o s i c i ó n d e s e c u e n c i a d e e s t o s v e h í c u l o s la n z a d e r a s e e n u m e r a n c o m o S E Q ID N O : 193 ( L C d e a n t i c u e r p o a n t i - T f R 1 ) , S E Q ID N O : 194 ( H C d e a n t i c u e r p o a n t i - T f R 1 c o n j u g a d a c o n e l f r a g m e n t o s c F v d e a n t i c u e r p o a n t i - d i g o x i g e n i n a ) , S E Q ID N O : 195 ( H C d e a n t i c u e r p o a n t i - T f R 1 c o n j u g a d a c o n e l f r a g m e n t o s c F v d e a n t i c u e r p o a n t i - b i o t i n a ) , S E Q ID N O : 196 ( L C d e a n t i c u e r p o a n t i - T f R 2 ) , S E Q ID N O : 197 ( H C d e a n t i c u e r p o a n t i - T f R 2 c o n j u g a d a c o n e l f r a g m e n t o s c F v d e a n t i c u e r p o a n t i - d i g o x i g e n i n a ) , S E Q ID N O : 198 ( H C d e a n t i c u e r p o a n t i - T f R 2 c o n j u g a d a c o n f r a g m e n t o s c F v d e a n t i c u e r p o a n t i - b i o t i n a ) .
Ejemplo 27
Expresión y purificación de anticuerpos biespecíficos (módulos lanzadera a través de la barrera hematoencefálica)
L o s a n t i c u e r p o s b i e s p e c í f i c o s d e l m ó d u l o la n z a d e r a a t r a v é s d e la b a r r e r a h e m a t o e n c e f á l i c a s e p r o d u j e r o n e n c é lu l a s d e m a m í f e r o e n m e d i o s l i b r e s d e s u e r o d e f i n i d o s c o m o s e d e s c r i b e p r e v i a m e n t e ( v é a s e a n t e r i o r m e n t e ) . L a s c é lu l a s e n s u s p e n s i ó n H E K 29 3 s e t r a n s f e c t a r o n d e f o r m a t r a n s i t o r i a c o n p l á s m i d o s d e e x p r e s i ó n q u e c o d i f i c a n la s c a d e n a s L y H p a r a g e n e r a r c u l t i v o s q u e e x p r e s a n e l a n t i c u e r p o b i e s p e c í f i c o d e l m ó d u l o l a n z a d e r a a t r a v é s d e la b a r r e r a h e m a t o e n c e f á l i c a .
P a r a g e n e r a r m ó d u l o s la n z a d e r a a t r a v é s d e la b a r r e r a h e m a t o e n c e f á l i c a q u e s e u n e n a la c a r g a ú t i l d i g o x i g e n i l a d a q u e s e u n e n a T f R c o n a l t a a f in id a d , lo s p l á s m i d o s d e e x p r e s i ó n q u e c o n t i e n e n S E Q ID N O : 193 q u e c o d i f i c a n á c id o n u c l e i c o / c a s e t e d e e x p r e s i ó n s e c o t r a n s f e c t a r o n c o n p l á s m i d o s d e e x p r e s i ó n q u e c o n t i e n e n S E Q ID N O : 194 q u e c o d i f i c a n á c id o n u c l e i c o / c a s e t e d e e x p r e s ió n .
P a r a g e n e r a r m ó d u l o s l a n z a d e r a a t r a v é s d e la b a r r e r a h e m a t o e n c e f á l i c a q u e s e u n e n a la c a r g a ú t i l b i o t i n i l a d a q u e s e u n e n a T f R c o n a l t a a f in id a d , l o s p l á s m i d o s d e e x p r e s i ó n q u e c o n t i e n e n S E Q ID N O : 193 q u e c o d i f i c a n á c id o n u c l e i c o / c a s e t e d e e x p r e s i ó n s e c o t r a n s f e c t a r o n c o n p l á s m i d o s d e e x p r e s i ó n q u e c o n t i e n e n S E Q ID N O : 195 q u e c o d i f i c a n á c id o n u c l e i c o / c a s e t e d e e x p r e s ió n .
P a r a g e n e r a r m ó d u lo s la n z a d e r a a t r a v é s d e la b a r r e r a h e m a t o e n c e f á l i c a q u e s e u n e n a la c a r g a ú t i l d i g o x i g e n i l a d a q u e s e u n e n a T f R c o n b a ja a f in id a d , l o s p l á s m i d o s d e e x p r e s i ó n q u e c o n t i e n e n S E Q ID N O : 196 q u e c o d i f i c a n á c id o n u c l e i c o / c a s e t e d e e x p r e s i ó n s e c o t r a n s f e c t a r o n c o n p l á s m i d o s d e e x p r e s i ó n q u e c o n t i e n e n S E Q ID N O : 197 q u e c o d i f i c a n á c id o n u c l e i c o / c a s e t e d e e x p r e s ió n .
P a r a g e n e r a r m ó d u l o s l a n z a d e r a a t r a v é s d e la b a r r e r a h e m a t o e n c e f á l i c a q u e s e u n e n a la c a r g a ú t i l b i o t i n i l a d a q u e s e u n e n a T f R c o n b a ja a f in id a d , lo s p l á s m i d o s d e e x p r e s i ó n q u e c o n t i e n e n S E Q ID N O : 196 q u e c o d i f i c a n á c id o n u c l e i c o / c a s e t e d e e x p r e s i ó n s e c o t r a n s f e c t a r o n c o n p l á s m i d o s d e e x p r e s i ó n q u e c o n t i e n e n S E Q ID N O : 198 q u e c o d i f i c a n á c id o n u c l e i c o / c a s e t e d e e x p r e s ió n .
L o s a n t i c u e r p o s b i e s p e c í f i c o s s e p u r i f i c a r o n d e lo s s o b r e n a d a n t e s d e c é lu l a s e n s u s p e n s i ó n H E K 293 q u e s e h a b í a n t r a n s f e c t a d o d e f o r m a t r a n s i t o r i a c o n p lá s m i d o s d e e x p r e s i ó n q u e c o d i f i c a n la s c a d e n a s L y H m e d i a n t e c r o m a t o g r a f í a c o n p r o t e í n a A ( v é a s e a n t e r i o r m e n t e ) . P o s t e r i o r m e n t e , s e a p l i c ó u n a c r o m a t o g r a f í a d e e x c l u s i ó n p o r t a m a ñ o ( S E C ) p a r a o b t e n e r a n t i c u e r p o s b i e s p e c í f i c o s l i b r e s d e a g r e g a d o s o c o n t a m i n a n t e s . L o s e j e m p l o s d e p u r e z a y c o m p o s i c i ó n d e lo s m ó d u l o s l a n z a d e r a a t r a v é s d e la b a r r e r a h e m a t o e n c e f á l i c a p u r i f i c a d o s s e m u e s t r a n c o m o p e r f i l e s d e S E C y S D S P A G E e n la f i g u r a 48.
Ejemplo 28
Los módulos lanzadera a través de la barrera hematoencefálica biespecíficos de unión a haptenos se unen simultáneamente a las cargas útiles hapteniladas y al receptor de la barrera hematoencefálica
Figure imgf000098_0001
E s t o s r e s u l t a d o s m u e s t r a n q u e lo s m ó d u l o s l a n z a d e r a b i e s p e c í f i c o s a t r a v é s d e la b a r r e r a h e m a t o e n c e f á l i c a d e u n ió n a h a p t e n o s s e u n e n e s p e c í f i c a m e n t e a s u s d i a n a s e n la s u p e r f i c i e d e la s c é l u l a s e n d o t e l i a l e s . A d e m á s , e s t o s a n t i c u e r p o s b i e s p e c í f i c o s s e u n e n s i m u l t á n e a m e n t e a c a r g a s ú t i l e s h a p t e n i l a d a s y , p o r lo t a n t o , p u e d e n d i r i g i r l a s h a c ia la s c é l u l a s e n d o t e l i a l e s d e la b a r r e r a h e m a t o e n c e f á l i c a .
Ejemplo 29
El modo de unión al receptor del módulo lanzadera a través de la barrera hematoencefálica influye en la liberación de las células endoteliales cerebrales
U s a m o s c é l u l a s e n d o t e l i a l e s c e r e b r a l e s ( h C M E C / D 3 ) p a r a i n v e s t i g a r la u n ió n c e l u l a r y la t r a n s c i t o s i s d e lo s m ó d u lo s l a n z a d e r a c o m o s e i n f o r m a e n e l p r e s e n t e d o c u m e n t o . E s t u d i o s p r e v i o s ( C r e p i n e t a l . , 2010 ; L e s l e y e t a l . , 1989 , d o c u m e n t o W O 20 12 / 07 50 37 , d o c u m e n t o W O 2 01 4 / 0 3 3 07 4 ) in f o r m a r o n d e q u e la v a l e n c i a y la a f i n i d a d d e lo s a n t i c u e r p o s d e u n ió n a T f R in f lu y e n e n la e f i c a c i a d e la u n ió n a , la t r a n s c i t o s i s a t r a v é s d e y la l i b e r a c i ó n d e la s c é lu l a s e n d o t e l i a l e s d e la b a r r e r a h e m a t o e n c e f á l i c a . P a r a in v e s t i g a r la u n ió n c e l u l a r y la t r a n s c i t o s i s e n h C M E C / D 3 , la s c é lu l a s h C M E C / D 3 c u l t i v a d a s e n i n s e r t o s d e f i l t r o s e i n c u b a r o n a p i c a l m e n t e c o n e l a n t i c u e r p o b i e s p e c í f i c o o e l a n t i c u e r p o o r i g i n a l ( s in s c F v d e u n ió n a h a p t e n o c o m o c o n t r o l e s ) d u r a n t e 1 h a 37 ° C . L a s m o n o c a p a s c e l u l a r e s s e l a v a r o n a t e m p e r a t u r a a m b i e n t e e n m e d i o s in s u e r o a p i c a l m e n t e ( 400 p l ) y b a s o l a t e r a l m e n t e ( 160 0 p l ) t r e s v e c e s d u r a n t e 3 ­ 5 m in c a d a u n a . T o d o s lo s v o l ú m e n e s d e l a v a d o s e r e c o g i e r o n p a r a c o n t r o l a r la e f i c a c i a d e la e l i m i n a c i ó n d e l l i g a n d o o a n t i c u e r p o n o u n id o . S e a ñ a d i ó m e d io p r e c a l e n t a d o a la c á m a r a a p ic a l y lo s f i l t r o s s e t r a n s f i r i e r o n a u n a p la c a n u e v a d e 12 p o c i l l o s ( b l o q u e a d a d u r a n t e la n o c h e c o n P B S q u e c o n t e n í a B S A a l 1 % ) q u e c o n t e n í a 1600 p l d e m e d io p r e c a l e n t a d o . E n e s t e p u n t o , la s c é l u l a s s e l i s a r o n e n a l g u n o s d e lo s f i l t r o s e n 500 p l d e t a m p ó n R I P A ( S ig m a , M ú n ic h , A l e m a n i a , # R 027 8 ) p a r a d e t e r m i n a r la a b s o r c i ó n e s p e c í f i c a . L o s f i l t r o s r e s t a n t e s s e i n c u b a r o n a 37 ° C y la s m u e s t r a s d e c é l u l a s y d e m e d i o s b a s o l a t e r a l e s y a p i c a l e s s e r e c o g i e r o n e n d i v e r s o s p u n t o s d e t i e m p o p a r a d e t e r m i n a r la l i b e r a c i ó n a p ic a l y / o b a s o la t e r a l . E l c o n t e n i d o d e a n t i c u e r p o s e n la s m u e s t r a s s e c u a n t i f i c ó u s a n d o u n E L I S A d e I g G a l t a m e n t e s e n s ib le . L o s r e s u l t a d o s d e e s t o s a n á l i s i s s e m u e s t r a n e n la f i g u r a 50 : lo s a n t i c u e r p o s a n t i - T f R b iv a l e n t e s d e a l t a a f i n i d a d ( T f R 1 ) s e u n e n e f i c a z m e n t e a la s c é lu l a s , p e r o n o s e l i b e r a n a lo s c o m p a r t i m e n t o s a p ic a l o b a s o la t e r a l . D e la m i s m a m a n e r a , lo s a n t i c u e r p o s b i e s p e c í f i c o s q u e c o n t i e n e n lo s s i t i o s d e u n ió n a T f R d e a l t a a f in id a d ( T f R 1 - D ig , T f R 1 - B i o ) s e u n e n e f i c a z m e n t e a la s c é lu l a s , p e r o n o s e l i b e r a n a lo s c o m p a r t i m e n t o s a p ic a l o b a s o l a t e r a l . P o r e l c o n t r a r i o , lo s a n t i c u e r p o s a n t i - T f R b i v a l e n t e s c o n a f i n i d a d r e d u c i d a ( T f R 2 ) s e u n e n e f i c a z m e n t e a la s c é l u l a s y p o s t e r i o r m e n t e s e l i b e r a n c o n e l t i e m p o a lo s c o m p a r t i m i e n t o s a p ic a l o b a s o l a t e r a l . L o s a n t i c u e r p o s b i e s p e c í f i c o s q u e c o n t i e n e n lo s s i t i o s d e u n ió n a T f R b i v a l e n t e s d e a f i n i d a d r e d u c i d a ( T f R 2 - D ig , T f R 2 - B i o ) t a m b i é n s e u n e n e f i c a z m e n t e a la s c é l u l a s y s e l i b e r a n a lo s c o m p a r t i m e n t o s a p ic a l o b a s o l a t e r a l e n e l m i s m o g r a d o q u e e l a n t i c u e r p o o r ig in a l . L o s a n t i c u e r p o s b i e s p e c í f i c o s d e c o n t r o l ( C D 33 - D i g , C D 3 3 - B i o ) q u e s e u n e n a u n a n t í g e n o q u e n o e s t á p r e s e n t e e n h C M E C / D 3 n o s e u n e n a e s t a s c é l u l a s y , p o r lo t a n t o , t a m p o c o s e l i b e r a n c o n e l t i e m p o a lo s c o m p a r t i m i e n t o s a p ic a l o b a s o la t e r a l .
c u a n d o s e a p l i c a n m ó d u l o s la n z a d e r a q u e n o s e l ib e r a n .
Ejemplo 32
Las cargas útiles hapteniladas se separan de los módulos lanzadera a través de la barrera hematoencefálica dentro de compartimentos vesiculares
Figure imgf000100_0001
Ejemplo 33
Péptido YY que contiene la secuencia de aminoácidos del motivo HeliCar
E l p é p t i d o Y Y e s u n p é p t i d o c o r t o ( 36 a m i n o á c i d o s ) l i b e r a d o p o r l a s c é l u l a s e n e l í l e o n y e l c o lo n e n r e s p u e s t a a la a l i m e n t a c i ó n . E n h u m a n o s p a r e c e r e d u c i r e l a p e t i t o . L a f o r m a m á s c o m ú n d e P Y Y c i r c u l a n t e e s P Y Y 3 -36 , q u e s e u n e a l r e c e p t o r Y 2 ( Y 2 R ) d e la f a m i l i a d e r e c e p t o r e s Y . E l P Y Y s e e n c u e n t r a e n la s c é l u l a s L e n la m u c o s a d e l t u b o g a s t r o i n t e s t i n a l , e s p e c i a l m e n t e e n í l e o n y c o lo n . A d e m á s , s e e n c u e n t r a u n a p e q u e ñ a c a n t i d a d d e P Y Y , a p r o x i m a d a m e n t e u n 1 - 10 % , e n e l e s ó f a g o , e s t ó m a g o , d u o d e n o y y e y u n o . E n la c i r c u la c ió n , la c o n c e n t r a c i ó n d e P Y Y a u m e n t a d e s p u é s d e la i n g e s t ió n d e a l i m e n t o s y d i s m i n u y e d u r a n t e e l a y u n o . E l P Y Y e j e r c e s u a c c i ó n a t r a v é s d e r e c e p t o r e s N P Y ; i n h i b e la m o t i l i d a d g á s t r i c a y a u m e n t a la a b s o r c i ó n d e a g u a y e l e c t r o l i t o s e n e l c o lo n . E l P Y Y y m i m é t i c o s d e P Y Y s e h a n u s a d o p a r a t r a t a r la o b e s id a d .
E l P Y Y s e m o d i f i c ó p a r a c o m p r e n d e r la s e c u e n c i a d e a m i n o á c i d o s d e l m o t i v o h e l i c a r y s e c o m p l e j ó c o n u n a n t i c u e r p o c o n t r a la s e c u e n c i a d e a m i n o á c i d o s d e l m o t i v o h e l i c a r p a r a a p r o v e c h a r la s p r o p i e d a d e s f a r m a c o c i n é t i c a s d e l a n t i c u e r p o y e v i t a r la i n e s t a b i l i d a d i n t r í n s e c a d e l P Y Y .
Formación de complejos no covalentes
L a i n v e s t i g a c i ó n e s t r u c t u r a l d e l p é p t i d o P Y Y 3-36 ( N y g a a r d , R . , e t a l . , B io c h e m . 45 ( 2 006 ) 83 50 - 8 35 7 ; S E Q ID N O : 211 ) r e v e l a u n m o t i v o h e l i c o i d a l ( s e c u e n c i a d e a m i n o á c i d o s d e l m o t i v o s i m i l a r a h e l i c a r ) p a r a lo s a m i n o á c i d o s c e n t r a le s . C o m o la i s o l e u c i n a N t e r m i n a l y e l e x t r e m o C m o d i f i c a d o s e h a n d e s c r i t o c o m o e s e n c i a l e s p a r a la a c t i v i d a d f u n c i o n a l d e l p é p t id o , la h é l i c e c e n t r a l s e m o d i f i c ó p a r a r e f l e j a r lo s a m i n o á c i d o s d e la s e c u e n c i a d e a m i n o á c i d o s d e l m o t i v o h e l i c a r .
P Y Y ( 3 - 36 ) 3 36 ( S E Q ID N O : 211 ) IKPEAPGE DASPEE LMAYYAS LRHY LXLVTRQRYNH2
M o t i v o h e l i c a r AHLENEVARLKK
P Y Y h e l i c a r IKPEAPGEDASPEAHLANEVARLHYLNLVTRQRYNH2
( S E Q ID N O : 212 ) ( Y N H 2 = t i r o s i n a a m i d a )
Figure imgf000101_0002
E l a n t i c u e r p o c o n t r a la s e c u e n c i a d e a m i n o á c i d o s d e l m o t i v o h e l i c a r d e Ig G 1 c o m p l e t a s e p r o d u j o e n c é l u l a s H E K 293 t r a n s f e c t a n d o d o s p l á s m i d o s q u e c o n t e n í a n la s r e g i o n e s v a r i a b l e s d e la c a d e n a p e s a d a y la c a d e n a l i g e r a in s e r t a d a s e n u n v e c t o r q u e c o n t i e n e e l d o m i n i o c o n s t a n t e d e Ig G 1 h u m a n a y e l d o m i n i o c o n s t a n t e d e l a m b d a h u m a n a , r e s p e c t i v a m e n t e . E l a n t i c u e r p o c o n t r a la s e c u e n c i a d e a m i n o á c i d o s d e l m o t i v o h e l i c a r ( 0 019 ) s e p u r i f i c ó m e d i a n t e p r o c e d i m i e n t o s e s t á n d a r u s a n d o c r o m a t o g r a f í a c o n p r o t e í n a A . U n e x p e r i m e n t o d e e s p e c t r o s c o p í a d e m a s a s c o n f i r m ó la i d e n t i d a d d e l a n t i c u e r p o 0019 .
E l c o m p l e j o e n t r e e l a n t i c u e r p o 001 9 y e l p é p t i d o P Y Y m o d i f i c a d o P Y Y _ h e l i c a r s e o b t u v o in v i t r o a p l i c a n d o u n p e q u e ñ o e x c e s o d e l p é p t i d o a la s o l u c i ó n d e a n t i c u e r p o . S e f o r m ó e l c o m p l e j o 0052 . L a e s t e q u i o m e t r í a d e l c o m p l e j o s e d e t e r m i n ó m e d i a n t e e x p e r i m e n t o s a n a l í t i c o s s E C - M A L L S c o m o 1 , 6 p é p t i d o s c o m p l e j a d o s e n u n a n t i c u e r p o b iv a l e n t e . E l a n t i c u e r p o 0019 , e l P Y Y ( 3 - 36 ) n a t u r a l , e l P Y Y _ h e l i c a r y e l c o m p l e j o 0052 s e s o m e t i e r o n a p r u e b a p a r a d e t e r m i n a r s u e f e c t o s o b r e la f a m i l i a d e r e c e p t o r e s Y 2 .
Figure imgf000101_0001
C o m o s e d e m o s t r ó ( H o f f m a n n , E . , e t a l . , J . C o n t . R e l . 171 ( 2013 ) 48 - 56 ) , lo s p é p t i d o s c o m p l e j a d o s p o r u n a n t i c u e r p o t i e n e n u n a s e m i v i d a p r o l o n g a d a in v i v o . A d e m á s , y s o r p r e n d e n t e m e n t e , e l c o m p l e j o d e m u e s t r a u n a a f in id a d l i g e r a m e n t e m e j o r p o r e l r e c e p t o r N P Y 2 R e n c o m p a r a c i ó n c o n e l p é p t i d o n o c o m p l e j a d o ; e l a n t i c u e r p o e s t a b i l i z a e l p o l i p é p t i d o y p r e s e n t a e l p é p t i d o e n s u c o n f o r m a c i ó n b i o l ó g i c a m e n t e a c t i v a f i ja .
Formación de complejos covalentes (enlace d isu lfuro covalente)
P a r a in c r e m e n t a r la e s t a b i l i d a d in v i t r o e in v i v o d e l c o m p l e j o e n t r e e l a n t i c u e r p o c o n t r a la s e c u e n c i a d e a m i n o á c i d o s d e l m o t i v o h e l i c a r y e l c o m p u e s t o q u e c o n t i e n e la s e c u e n c i a d e a m i n o á c i d o s d e l m o t i v o h e l i c a r , s e h a u s a d o la f o r m a c i ó n d e u n p u e n t e d i s u l f u r o t r a s la u n ió n .
L a p r i m e r a e t a p a e s u n a e t a p a d e r e c o n o c i m i e n t o e s p e c í f i c o ( i n t e r a c c i ó n d e a l t a a f in id a d ) , e s d e c i r , la f o r m a c i ó n d e l c o m p l e j o e n t r e e l c o m p u e s t o q u e c o n t i e n e la s e c u e n c i a d e a m i n o á c i d o s d e l m o t i v o h e l i c a r y e l a n t i c u e r p o c o n t r a la s e c u e n c i a d e a m i n o á c i d o s d e l m o t i v o h e l i c a r . E s t a v a s e g u i d o e n la s e g u n d a e t a p a p o r u n r e o r d e n a m i e n t o e s p o n t á n e o d e u n p u e n t e d i s u l f u r o p a r a f o r m a r e l c o m p l e j o c o v a l e n t e d e e s t a b i l i d a d m e jo r a d a .
C o m o e l p é p t i d o 12 - m e r o ( s e c u e n c i a d e a m i n o á c i d o s d e l m o t i v o h e l i c a r ) e s u n a e n t i d a d r e l a t i v a m e n t e r í g i d a ( a l m e n o s c u a n d o e s t á c o m p l e j a d a p o r u n a n t i c u e r p o e s p e c í f i c o c o n t r a la s e c u e n c i a d e a m i n o á c i d o s d e l m o t i v o h e l i c a r ) , s e h a d e s c u b i e r t o q u e s e t i e n e q u e u s a r u n d i s e ñ o e s t r u c t u r a l m e n t e e s p e c í f i c o p a r a e l p u e n t e d i s u l f u r o . C o m o la f o r m a c i ó n d e l c o m p l e j o y e l a c o p l a m i e n t o c o v a l e n t e e f e c t u a d o d e s p u é s d e e s t o s e r e a l i z a n e n t r e d o s e n t i d a d e s p r o d u c i d a s d e f o r m a r e c o m b i n a n t e , lo s r e s i d u o s d e c i s t e í n a a r t i f i c i a l e s i n t r o d u c i d o s p a r a la f o r m a c i ó n d e u n e n l a c e d is u l f u r o c o v a l e n t e n o s e p r o d u c e n n e c e s a r i a m e n t e c o m o r e s id u o s d e c i s t e í n a l ib r e s , s in o q u e s e e x p r e s a n e n u n a f o r m a r e d u c id a , e s d e c i r , c o n j u g a d o s a u n a m i n o á c i d o c i s t e í n a u h o m o c i s t e í n a l ib r e .
L a p o s ic i ó n e n la s e c u e n c i a d e a m i n o á c i d o s d e l d o m i n i o v a r i a b l e d e l a n t i c u e r p o c o n t r a la s e c u e n c i a d e a m i n o á c i d o s d e l m o t i v o h e l i c a r d o n d e s e i n t r o d u c e e l r e s i d u o d e c i s t e í n a l ib r e a r t i f i c i a l e s c r í t i c a . U n a c i s t e í n a n o e x p u e s t a e n la s e c u e n c i a d e a m i n o á c i d o s d e l d o m i n i o v a r i a b l e d e l a n t i c u e r p o t i e n e m á s p r o b a b i l i d a d d e e x p r e s a r s e c o m o u n a c i s t e í n a l i b r e ( n o c o n j u g a d a ) , m i e n t r a s q u e u n r e s i d u o d e c i s t e í n a e x p u e s t o c e r c a d e l b o ls i l l o d e u n ió n p u e d e a n u l a r la u n ió n d e l p é p t i d o 12 - m e r o ( s e c u e n c i a d e a m i n o á c i d o s d e l m o t i v o h e l i c a r ) d e b i d o a u n im p e d i m e n t o e s t é r i c o in d u c i d o p o r la c o n j u g a c i ó n d e c i s t e í n a a u n r e s t o a d i c i o n a l c o m o u n a c i s t e í n a l ib r e .
a ) C o m p l e j o s c o n u n c o m p u e s t o f l u o r e s c e n t e q u e c o n t i e n e la s e c u e n c i a d e a m i n o á c i d o s d e l m o t i v o h e l i c a r P a r a i d e n t i f i c a r u n a p o s ic i ó n a d e c u a d a q u e t e n g a u n r ie s g o m í n i m o d e im p e d i m e n t o e s t é r i c o y u n a f u e r t e r e d u c c i ó n d e la a f in id a d , s e h a n s o m e t i d o a p r u e b a d i f e r e n t e s p o s i c i o n e s p a r a la i n t r o d u c c i ó n d e l r e s i d u o d e c i s t e í n a a r t i f i c i a l e n la s e c u e n c i a d e a m i n o á c i d o s d e l m o t i v o h e l i c a r . E l r e s i d u o d e c i s t e í n a s e h a in t r o d u c i d o e n e l e x t r e m o C d e l 12 - m e r o ( s e c u e n c i a d e a m i n o á c i d o s d e l m o t i v o h e l i c a r ) p a r a q u e la m a y o r p a r t e d e l p a r a t o p o n o c a m b ie . L o s p é p t i d o s s e h a n s i n t e t i z a d o y f u s i o n a d o a u n m o t i v o f l u o r e s c e n t e .
N a t u r a l : AH L E KEY A R L K K ( S E Q ID N O : 202 )
V a r i a n t e c o n c i s t e í n a 1: A H LE K E V A R C K K ( S E Q ID N O : 203 )
> A H L E N E V A R C K K ( 5 - F l u o ) - O H
V a r i a n t e c o n c i s t e í n a 2 : AH LE N E V A R LC K ( S E Q ID N O : 204 )
A H L E N E V A R LC K ( 5 - F l u o ) - O H x T F A
E n e l a n t i c u e r p o s e h a r e a l i z a d o u n d is e ñ o e s t r u c t u r a l p a r a p e r m i t i r la f o r m a c i ó n d e l p u e n t e d i s u l f u r o p a r a a m b o s p é p t i d o s d i s e ñ a d o s , i n c l u y e n d o c a d a u n o u n a c i s t e í n a e n u n e n t o r n o 3 D d i f e r e n t e .
E l p é p t i d o h e l i c o i d a l 12 - m e r o A H L E N E V A R L K K ( s e c u e n c i a d e a m i n o á c i d o s d e l m o t i v o h e l i c a r ) s e m o d e l a e n lo s d o m i n i o s V H y V H . E n e l e x t r e m o C d e l p é p t i d o s e id e n t i f i c a n c o m o p o s ib le s p o s i c i o n e s lo s r e s i d u o s L 10 y K 11 y e n e l d o m i n i o v a r i a b l e d e la c a d e n a l i g e r a s e id e n t i f i c a n la s p o s i c i o n e s n 55 y G 51 d e a c u e r d o c o n la n u m e r a c i ó n d e K a b a t p a r a la c a d e n a l ig e r a .
E l d o m i n i o v a r i a b l e d e la c a d e n a p e s a d a d e l a n t i c u e r p o c o n t r a la s e c u e n c i a d e a m i n o á c i d o s d e l m o t i v o h e l i c a r ( 001 9 ) t i e n e la s e c u e n c i a d e a m i n o á c i d o s :
Q A W T Q E P S L T V S P G G T V T L TC G S S TG A V T TSNYASW VQQ K P G Q A F T G L I GGTNNRAPWT P A R FS G S LLG G K A A L T L S G A Q P ED EA EYY C ALW YSNHW VF G G G T K LT V L
( S E Q I D N O : 205 ) .
E l d o m i n i o v a r i a b l e d e la c a d e n a l i g e r a d e l a n t i c u e r p o c o n t r a la s e c u e n c i a d e a m i n o á c i d o s d e l m o t i v o h e l i c a r ( 001 9 ) t i e n e la s e c u e n c i a d e a m i n o á c i d o s :
D A W T Q E S A L T T S P G E T V T L TC R S S TG A V T TSNYASW VQE K P D H L P T G L I GGTNNRARGV P A R F S G S L IG D K A A L T IT G A Q T E D E A IY F C ALW YSNHW VF G G G T K LT V L
( S E Q ID N O : 206 ) .
L a v a r i a n t e N 55 C d e l d o m i n i o v a r i a b l e d e la c a d e n a l i g e r a d e l a n t i c u e r p o c o n t r a la s e c u e n c i a d e a m i n o á c i d o s d e l m o t i v o h e l i c a r ( 015 5 ) t i e n e la s e c u e n c i a d e a m i n o á c i d o s :
D A W T Q E S A L T T S P G E T V T L TC R S S TG A V T TSNYASW VQE K P D H L P T G L I G G T N tR A P G V P A R F S G S L IG D K A A L T T T G A Q T E D E A IY F C ALWYSNHWVF
G G G T K LT V L
( S E Q ID N O : 207 ) .
L a v a r i a n t e N 51 C d e l d o m i n i o v a r i a b l e d e la c a d e n a l i g e r a d e l a n t i c u e r p o c o n t r a la s e c u e n c i a d e a m i n o á c i d o s d e l m o t i v o h e l i c a r ( 015 7 ) t i e n e la s e c u e n c i a d e a m i n o á c i d o s :
D A W T Q E S M . T T S P G E T V T L TCR5 5 -G A V T TSNYASWVQE K P D H L E T G L I CGTNKRAPGV P A A F S G S L IG D K A A L T IT G A Q T E D E A IY F C ALW YSNIIW VF G G G TKLTV L
( S E Q ID N O : 208 ) .
i) Conjugado covalente del compuesto que contiene la secuencia de aminoácidos del motivo helicar con el anticuerpo 0155
E l a n t i c u e r p o b i v a l e n t e 0155 s e e x p r e s a e n c é l u l a s H E K 293 d e f o r m a s i m i l a r a s u m o l é c u l a o r ig in a l Y 2 R ( b c k ) - 0 01 9 s in c i s t e í n a l ib r e . E l a n t i c u e r p o m o d i f i c a d o s e p u r i f i c a u s a n d o e l m i s m o p r o t o c o l o u s a d o p a r a e l a n t i c u e r p o 0019 . E l a n á l i s i s p o r e s p e c t r o m e t r í a d e m a s a s m u e s t r a q u e la m a s a d e l a n t i c u e r p o d e s g l u c o s i l a d o d e t e r m i n a d a e x p e r i m e n t a l m e n t e e s d e 142 .001 D a . E s t o e x c e d e la m a s a c a l c u l a d a e n 25 9 D a . L a s c a d e n a s r e d u c i d a s t i e n e n u n a m a s a d e t e r m i n a d a e x p e r i m e n t a l m e n t e d e 4 8 .1 67 D a ( c a d e n a p e s a d a c o m p le t a , c a l c u l a d a = 4 8 .16 8 D a , C y s = S H , e x t r e m o C = - K ) y 2 2 .7 20 D a ( c a d e n a l i g e r a c o m p l e t a , N 55 C , c a l c u l a d a = 22 .7 2 0 D a , C y s = S H ) . L a s s e c u e n c i a s d e la s c a d e n a s s e c o n f i r m a r o n d e s p u é s d e la r e d u c c ió n .
E l a n t i c u e r p o 015 5 s e a c o p l ó a la v a r i a n t e c o n c i s t e í n a 2 d e la s e c u e n c i a d e a m i n o á c i d o s d e l m o t i v o h e l i c a r u s a n d o u n e x c e s o 2 , 5 m o l a r d e l c o m p u e s t o q u e c o n t i e n e la s e c u e n c i a d e a m i n o á c i d o s d e l m o t i v o h e l i c a r e n D M F a l 100 % p a r a f o r m a r e l c o m p l e j o c o v a l e n t e 0156 .
E n la S D S - P A G E ( c o n d i c i o n e s d e d e s n a t u r a l i z a c i ó n , v é a s e la f i g u r a 54 ) s o lo s e o b s e r v a f l u o r e s c e n c i a e n e l a n t i c u e r p o 015 5 ; e n c o n d i c i o n e s r e d u c t o r a s s o lo e s v i s i b l e e l p é p t i d o p e q u e ñ o .
Resultados:
L a c o n j u g a c i ó n c o v a l e n t e d e l c o m p u e s t o f l u o r e s c e n t e q u e c o n t i e n e la s e c u e n c i a d e a m i n o á c i d o s d e l m o t i v o h e l i c a r c o n e l a n t i c u e r p o c o n t r a la s e c u e n c i a d e a m i n o á c i d o s d e l m o t i v o h e l i c a r f u e e x i t o s a . U n t o t a l d e a p r o x i m a d a m e n t e u n 43 % d e l a n t i c u e r p o c o n t r a la s e c u e n c i a d e a m i n o á c i d o s d e l m o t i v o h e l i c a r s e c o n j u g ó c o v a l e n t e m e n t e a d o s s e c u e n c i a s d e a m i n o á c i d o s d e l m o t i v o h e l i c a r , a p r o x i m a d a m e n t e u n 40 % d e l a n t i c u e r p o c o n t r a la s e c u e n c i a d e a m i n o á c i d o s d e l m o t i v o h e l i c a r s e c o n j u g ó c o v a l e n t e m e n t e a u n a s e c u e n c i a d e a m i n o á c i d o s d e l m o t i v o h e l i c a r , y a p r o x i m a d a m e n t e u n 17 % d e l a n t i c u e r p o c o n t r a la s e c u e n c i a d e a m i n o á c i d o s d e l m o t i v o h e l i c a r n o s e c o n ju g ó . E l c o n j u g a d o q u e c o m p r e n d e d o s s e c u e n c i a s d e a m i n o á c i d o s d e l m o t i v o h e l i c a r s e m o d i f i c a a a p r o x i m a d a m e n t e u n 50 % . E s t a e s p e c i e n o s e h a t e n i d o e n c u e n t a p a r a la c u a n t i f i c a c i ó n . C o m o y a s e d e t e r m i n ó p a r a e l m a t e r ia l d e p a r t i d a , e l a n t i c u e r p o s in s e c u e n c i a d e a m i n o á c i d o s d e l m o t i v o h e l i c a r c o n t i e n e d o s m o d i f i c a c i o n e s d e a p r o x i m a d a m e n t e 1 28 D a . E l a n t i c u e r p o c o n j u g a d o a u n a s e c u e n c i a d e a m i n o á c i d o s d e l m o t i v o h e l i c a r t i e n e s o lo u n a m o d i f i c a c i ó n d e a p r o x i m a d a m e n t e 128 D a .
ii) Conjugado covalente del compuesto que contiene la secuencia de aminoácidos del motivo helicar con el anticuerpo 0157
D e f o r m a s i m i l a r a l a n t i c u e r p o 0155 , e l a n t i c u e r p o 015 7 s e e x p r e s a p r i n c i p a l m e n t e c o m o u n a f o r m a c i s t e i n i l a d a . E l a n á l i s i s p o r e s p e c t r o m e t r í a d e m a s a s m u e s t r a q u e la m a s a d e l a n t i c u e r p o d e s g l u c o s i l a d o d e t e r m i n a d a e x p e r i m e n t a l m e n t e e s d e 141 .863 D a . E s t o e x c e d e la m a s a c a l c u l a d a e n 3 D a . E l a n t i c u e r p o e s t á p r i n c i p a l m e n t e p r e s e n t e e n f o r m a h o m o c i s t e i n i l a d a s i m p l e o d o b le . L a s c a d e n a s r e d u c i d a s t i e n e n u n a m a s a d e t e r m i n a d a e x p e r i m e n t a l m e n t e d e 4 8 .1 68 D a ( c a d e n a p e s a d a c o m p le t a , c a l c u l a d a = 4 8 .16 8 D a , C y s = S H , e x t r e m o C = - K ) y 2 2 .7 77 D a ( c a d e n a l i g e r a c o m p l e t a , N 51 C , c a l c u l a d a = 22 .7 77 D a , C y s = S H ) . L a s s e c u e n c i a s d e la s c a d e n a s s e c o n f i r m a r o n d e s p u é s d e la r e d u c c ió n .
E l a c o p l a m i e n t o d e l a n t i c u e r p o 0157 c o n la v a r i a n t e c o n c i s t e í n a 1 d e la s e c u e n c i a d e a m i n o á c i d o s d e l m o t i v o h e l i c a r n o d io c o m o r e s u l t a d o e l c o m p l e j o c o v a l e n t e e s p e r a d o . N o s e o b s e r v a f l u o r e s c e n c i a e n e l c a r r i l e s p e r a d o , s in o e n la r e f e r e n c i a q u e d e b e r í a s e r n e g a t i v a e n e s t e e x p e r i m e n t o ( v é a s e la f i g u r a 55 ) .
E l a n t i c u e r p o 015 7 s e i n c u b ó c o n la v a r i a n t e c o n c i s t e í n a 1 d e la s e c u e n c i a d e a m i n o á c i d o s d e l m o t i v o h e l i c a r . C o m o c o n t r o l , e l a n t i c u e r p o 001 9 s e in c u b ó c o n la m is m a v a r i a n t e c o n c i s t e í n a 1 d e la s e c u e n c i a d e a m i n o á c i d o s d e l m o t i v o h e l i c a r .
Resultados:
L a c o n j u g a c i ó n c o v a l e n t e d e l c o m p u e s t o f l u o r e s c e n t e q u e c o n t i e n e la s e c u e n c i a d e a m i n o á c i d o s d e l m o t i v o h e l i c a r c o n e l a n t i c u e r p o c o n t r a la s e c u e n c i a d e a m i n o á c i d o s d e l m o t i v o h e l i c a r n o f u e e x i t o s a . S in e s t a r l im i t a d o s p o r e s t a t e o r í a , s e s u p o n e q u e e n e s t e c a s o la c i s t e i n i l a c i ó n d e l a n t i c u e r p o e s d e m a s i a d o p r o f u n d a e n e l b o ls i l l o d e u n ió n p a r a p e r m i t i r q u e e l c o m p u e s t o f l u o r e s c e n t e q u e c o n t i e n e la s e c u e n c i a d e a m i n o á c i d o s d e l m o t i v o h e l i c a r s e u n a e f i c a z m e n t e y p r o p o r c i o n e e l g r u p o t i o l n u c l e ó f i l o e n u n a p o s ic i ó n a d e c u a d a p a r a a t a c a r a la C 51 .
b ) C o m p l e j o s c o n u n p o l i p é p t i d o r e c o m b i n a n t e q u e c o n t i e n e la s e c u e n c i a d e a m i n o á c i d o s d e l m o t i v o h e l i c a r L a m e t o d o l o g í a b a s a d a e n h e l i c a r s e v u e l v e p a r t i c u l a r m e n t e a t r a c t i v a c u a n d o s e c o n s i d e r a la f o r m a c i ó n d e u n c o m p l e j o c o v a l e n t e c o n u n p o l i p é p t i d o q u e c o n t i e n e la s e c u e n c i a d e a m i n o á c i d o s d e l m o t i v o h e l i c a r p r o d u c i d o d e f o r m a r e c o m b in a n t e .
Figure imgf000104_0001
AHLENBVASLCK; AHLENEVARLCK ; S E Q ID N O : 2 0 3 ) f u s i o n a d a a l e x t r e m o N .
L a m o l é c u l a d e e x o t o x i n a d e P s e u d o m o n a s L R 8 M q u e c o n t i e n e la v a r i a n t e c o n c i s t e í n a 1 d e la s e c u e n c i a d e a m i n o á c i d o s d e l m o t i v o h e l i c a r c o n e l r e s i d u o d e l i s in a C t e r m i n a l d e l e c i o n a d o ( 0236 ; S E Q ID N O : 2 13 ) s e h a p r o d u c id o e n E . c o l i y s e h a p u r i f i c a d o u s a n d o u n a c o m b i n a c i ó n d e c r o m a t o g r a f í a d e in t e r c a m b i o a n i ó n i c o y S E C ( v é a s e , p o r e je m p lo , e l d o c u m e n t o W O 20 11 / 03 20 22 ) .
E l a n t i c u e r p o 015 5 s e c o n j u g a c o v a l e n t e m e n t e c o n la m o lé c u la d e e x o t o x i n a d e P s e u d o m o n a s L R 8 M q u e c o n t i e n e la v a r i a n t e c o n c i s t e í n a 1 d e la s e c u e n c i a d e a m i n o á c i d o s d e l m o t i v o h e l i c a r c o n e l r e s i d u o d e l i s in a C t e r m i n a l d e l e c i o n a d o d e S E Q ID N O : 213 . E l c r o m a t o g r a m a d e S E C s e m u e s t r a e n la f i g u r a 56. L a e f i c a c i a d e la c o n j u g a c i ó n s e a n a l i z a p o r S D S - C E , C a l ip e r , p a r a la s m u e s t r a s n o r e d u c id a s . ( V é a s e la f i g u r a 57 ) .
U n t o t a l d e a p r o x i m a d a m e n t e u n 4 % d e l a n t i c u e r p o c o n t r a la s e c u e n c i a d e a m i n o á c i d o s d e l m o t i v o h e l i c a r s e c o n j u g ó c o v a l e n t e m e n t e a d o s p o l i p é p t i d o s d e S E Q ID N O : 213 , a p r o x i m a d a m e n t e u n 41 % d e l a n t i c u e r p o c o n t r a la s e c u e n c i a d e a m i n o á c i d o s d e l m o t i v o h e l i c a r s e c o n j u g ó c o v a l e n t e m e n t e a u n p o l i p é p t i d o d e S E Q ID N O : 213 , y a p r o x i m a d a m e n t e u n 55 % d e l a n t i c u e r p o c o n t r a la s e c u e n c i a d e a m i n o á c i d o s d e l m o t i v o h e l i c a r n o s e c o n ju g ó . E n c o n c l u s i ó n , e l a n t i c u e r p o m o n o c l o n a l c o n t r a la s e c u e n c i a d e a m i n o á c i d o s d e l m o t i v o h e l i c a r s e p u e d e u s a r p a r a c o m p l e j a r p é p t id o s , m o l é c u l a s p e q u e ñ a s c o n c o n e c t o r p e p t í d i c o y p r o t e í n a s r e c o m b i n a n t e s p o r m e d io d e u n r e c o n o c i m i e n t o d e a l t a a f i n i d a d d e u n a s e c u e n c i a d e a m i n o á c i d o s d e l m o t i v o h e l i c a r 12 - m e r o . L o s p é p t i d o s c o n p r o p e n s i ó n a p l e g a r s e c o m o h é l i c e s e p u e d e n m o d i f i c a r p a r a im i t a r la s e c u e n c i a d e a m i n o á c i d o s d e l m o t i v o h e l i c a r 1 2 - m e r o o r ig i n a l AHLENEV A R L k k ( S E Q ID N O : 2 0 2 ) y , p o s t e r i o r m e n t e , p u e d e n f o r m a r c o m p l e j o s c o n e l a n t i c u e r p o m o n o c l o n a l c o n t r a la s e c u e n c i a d e a m i n o á c i d o s d e l m o t i v o h e l i c a r . A d e m á s d e la c o m p l e j a c i ó n d e a l t a a f in id a d , s e p e r m i t e la c o n j u g a c i ó n c o v a l e n t e c o n u n a v a r i a n t e c o n c i s t e í n a d e S E Q ID N O : 20 2 q u e c o n t i e n e u n a c i s t e í n a y u n a n t i c u e r p o c o n t r a la s e c u e n c i a d e a m i n o á c i d o s d e l m o t i v o h e l i c a r m o d i f i c a d o q u e c o n t i e n e u n a c i s t e í n a e n la s C D R p o r m e d io d e la f o r m a c i ó n d e u n e n l a c e d is u l f u r o e s t a b le . L a s p r o t e í n a s r e c o m b i n a n t e s e x p r e s a d a s p o r u n s i s t e m a d i f e r e n t e s e p u e d e n c o n j u g a r p o s t e r i o r m e n t e in v i t r o s in c o n d i c i o n e s d e r e a c c i ó n p a r t i c u l a r e s , p e r o p o r m e d i o d e r e o r d e n a m i e n t o e s p o n t á n e o d e u n p u e n t e d is u l f u r o .
Ejemplo 34
Anticuerpos biespecíficos de unión a BrdU a partir de complejos con cargas útiles que contienen BrdU S e a p l i c a r o n a n á l i s i s p o r S E C - M A L L S p a r a e v a l u a r s i e l a n t i c u e r p o b i e s p e c í f i c o d e u n ió n a l r e c e p t o r d e t r a n s f e r r i n a ( T f R ) y a b r o m o d e s o x i u r i d i n a ( B r d U ) ( b s A b ) s e p u e d e u n i r a c a r g a s ú t i l e s q u e c o n t i e n e n B r d U y e n q u é m e d id a . P o r lo t a n t o , s e a ñ a d i ó B r d U - A D N a b s A b a n t i - T f R - B r d U e n u n a p r o p o r c i ó n e s t e q u i o m é t r i c a 2 :1 ( 350 p g ; 2 , 5 m g / m l ) y s e i n c u b ó d u r a n t e 30 m in a t e m p e r a t u r a a m b i e n t e p a r a la f o r m a c i ó n d e c o m p l e j o s d e b s A b / c a r g a ú t i l . C o m o r e a c t i v o s d e c o n t r o l p r e p a r a m o s a n t i c u e r p o b i e s p e c í f i c o l ib r e ( 2 , 5 m g / m l ) y B r d U - A D N l i b r e ( 3 , 2 m g / m l ) . E l B r d U - A D N ( B r d U -A C C A A G C C T A G A G A G G A G C A A T A C A A C A G T A C A T A T CGC G TG G T A A G C GT ; S E Q ID N O : 22 8 ) c o n t e n í a u n a B r d U p o r c a d a m o l é c u l a d e A D N e n e l e x t r e m o 5 ' d e l A D N . L o s c o m p l e j o s y l o s r e a c t i v o s d e c o n t r o l s e a l m a c e n a r o n a - 80 ° C h a s t a e l a n á l i s i s .
L o s c o m p l e j o s y l o s r e a c t i v o s d e c o n t r o l g e n e r a d o s p o r e s t e m e d io s e s o m e t i e r o n a a n á l i s i s p o r S E C - M A L L S p a r a i d e n t i f i c a r y c a r a c t e r i z a r e l a n t i c u e r p o b i e s p e c í f i c o l ib r e , la c a r g a ú t i l l ib r e y c o m p l e j o s d e a m b o s . E l a n á l i s i s p o r S E C -M A L L S s e r e a l i z ó e n u n H P L C D i o n e x U l t i m a t e 300 0 e q u i p a d o c o n d e t e c t o r e s m i n i D a w n T R E O S / Q E L S y O p t i l a b r E X d e W y a t t . L o s a n a l i t o s s e d i s o l v i e r o n a 1 m g / m l e n t a m p ó n d e P B S p H 7 , 4 , s e a p l i c a r o n a u n a c o l u m n a S u p e r d e x 20 0 1 0 / 3 00 G L a u n c a u d a l d e 0 , 5 m l / m in y s e e l u y e r o n c o n t a m p ó n d e P B S p H 7 , 4 d u r a n t e 60 m in .
L o s r e s u l t a d o s d e e s t o s a n á l i s i s ( q u e s e m u e s t r a n e n la f i g u r a 58 ) i n d i c a n q u e e l A D N q u e c o n t i e n e B r d U f o r m a c o m p l e j o s d e f i n i d o s c o n e l a n t i c u e r p o b i e s p e c í f i c o . E s t o s c o m p l e j o s e lu y e n d e la c o l u m n a a u n P M d e 2 44 , 9 k D a ( F i g u r a 58 A ) y m u e s t r a n u n r a d io h i d r o d i n á m i c o d e 6 , 8 n m ( F i g u r a 58 B ) , lo q u e p e r m i t e e l c á l c u l o d e u n a p r o p o r c ió n e s t e q u i o m é t r i c a d e a p r o x i m a d a m e n t e d o s ( 1 , 8 ) m o l é c u l a s d e A D N p o r c a d a m o l é c u l a d e a n t i c u e r p o b i e s p e c í f i c o . E n c o m p a r a c i ó n c o n e s o , e l a n t i c u e r p o b i e s p e c í f i c o l ib r e s e d e t e c t ó a u n P M d e 2 15 , 4 k D a y s u r a d io h id r o d i n á m i c o s e d e t e r m i n ó c o m o 6 , 2 n m . S e d e t e c t ó B r d U - A D N l ib r e a u n P M d e 16 , 4 k D a .
P o r t a n t o , s e d e m o s t r ó q u e e l A D N q u e c o n t i e n e B r d U e s t á u n id o e f i c a z m e n t e y d e f o r m a e s t e q u i o m é t r i c a p o r e l a n t i c u e r p o b i e s p e c í f i c o a n t i - T f R / B r d U , d a n d o c o m o r e s u l t a d o c o m p l e j o s e n u n a p r o p o r c i ó n m o l a r d e 2 : 1 .
Ejemplo 35
Los anticuerpos biespecíficos de unión a biotina se unen a las IgG que contienen biotina
Figure imgf000105_0001
L o s r e s u l t a d o s d e e s t o s a n á l i s i s ( q u e s e m u e s t r a n e n la f i g u r a 59 ) in d i c a n q u e la B I O - p t a u f o r m a c o m p l e j o s d e f i n i d o s c o n e l a n t i c u e r p o b i e s p e c í f i c o . E s t o s c o m p l e j o s e l u y e n d e la c o l u m n a a u n P M d e 501 k D a ( f i g u r a 5 9 A ) y m u e s t r a n u n r a d io h i d r o d i n á m i c o d e 8 , 0 n m ( f i g u r a 59 B ) . E n c o m p a r a c i ó n c o n e s o , e l a n t i c u e r p o b i e s p e c í f i c o l ib r e s e d e t e c t ó a u n P M d e 20 5 k D a y s u r a d io h i d r o d i n á m i c o s e d e t e r m i n ó c o m o 6 , 2 n m . S e d e t e c t ó la B I O - p t a u l ib r e a u n P M d e 150 k D a y s u r a d io h id r o d i n á m i c o s e m id ió c o m o 5 , 5 n m .
L o s c o m p l e j o s s e f o r m a n e s p e c í f i c a m e n t e p o r i n t e r a c c i ó n e n t r e la b io t in a y e l r e s t o d e u n ió n a b io t in a d e l a n t i c u e r p o b i e s p e c í f i c o , p o r q u e e l a n t i c u e r p o b i e s p e c í f i c o d e u n ió n a d i g o x i g e n i n a n o f o r m a c o m p l e j o s c o n B I O - p t a u ( f i g u r a 59 C ) . Ejemplo 36
Transcitosis de anticuerpo anti-ptau marcado con biotina
Figure imgf000105_0002
Ejemplo 38
Evaluación de la funcionalidad in vivo de vehículos lanzadera que se unen al receptor de hapteno y transferrina para el sum inistro de la carga útil a través de la barrera hematoencefálica
S e a p l i c a n e x p e r i m e n t o s c o n a n i m a l e s p a r a e v a l u a r e n q u é g r a d o lo s v e h í c u l o s l a n z a d e r a q u e s e u n e n a l r e c e p t o r b i e s p e c í f i c o d e h a p t e n o y t r a n s f e r r i n a p e r m i t e n e l s u m i n i s t r o d e c a r g a ú t i l a t r a v é s d e la b a r r e r a h e m a t o e n c e f á l i c a ( B H E ) in v i v o . L a c a r g a ú t i l q u e s e t r a n s p o r t a y d e t e c t a e n e l c e r e b r o e s u n d e r i v a d o d e a n t i c u e r p o d e u n ió n a f o s f o -t a u m o n o b i o t i n i l a d o . L a d i a n a d e e s t e a n t i c u e r p o ( la p r o t e í n a t a u ) s e lo c a l i z a e n e l c e r e b r o . P o r e s o , e l a n t i c u e r p o n e c e s i t a a t r a v e s a r la b a r r e r a h e m a t o e n c e f á l i c a p a r a a c c e d e r a s u d ia n a . P o r lo t a n t o , e s t e a n t i c u e r p o s e a p l i c a c o m o c a r g a ú t i l p a r a e l e x p e r i m e n t o in v i v o . L o s v e h í c u l o s l a n z a d e r a q u e s e c o m b i n a n c o n la c a r g a ú t i l s e c o m p o n e n d e la m i s m a m a n e r a o d e m a n e r a s i m i l a r a lo s d e s c r i t o s y a p l i c a d o s p a r a e l e x p e r i m e n t o in v i t r o e n lo s e j e m p l o s p r e s e n t a d o s a n t e r i o r m e n t e , p e r o t i e n e n r e g io n e s d e u n ió n q u e s e u n e n a l r e c e p t o r d e t r a n s f e r r i n a m u r i n o e n l u g a r d e a l h o m ó lo g o h u m a n o . E l m o t i v o p a r a c a m b i a r la e s p e c i f i c i d a d e s q u e e l s i s t e m a d e a n á l i s i s d e t r a n s c i t o s i s d e B H E c u l t i v a d a ( e n s a y o s t r a n s w e l l , v é a s e a r r i b a ) a p l i c a c é l u l a s h u m a n a s c o n T f R h u m a n o , m i e n t r a s q u e lo s e x p e r i m e n t o s c o n a n i m a l e s s e r e a l i z a n e n r a t o n e s , q u e p o s e e n u n T f R m u r i n o e n la B H E .
L o s v e h í c u l o s l a n z a d e r a d e u n ió n a h a p t e n o ( p o r e je m p lo , b i o t i n a ) q u e r e c o n o c e n e l T f R m u r i n o s e c o m p l e j a n c o n a n t i c u e r p o s d e u n ió n a p T a u b i o t i n i l a d o s y p o s t e r i o r m e n t e s e a p l i c a n a r a t o n e s T a u P S 2 A P P . D e f o r m a a l t e r n a t i v a , lo s v e h í c u l o s l a n z a d e r a q u e s e u n e n a h a p t e n o ( p o r e je m p lo , b i o t i n a ) q u e r e c o n o c e n T f R m u r i n o t a m b i é n s e p u e d e n i n y e c t a r e n r a t o n e s T a u P S 2 A P P s e g u i d o p o s t e r i o r m e n t e p o r la i n y e c c i ó n d e a n t i c u e r p o s q u e s e u n e n a p T a u b i o t i n i l a d o s e n p u n t o s d e t i e m p o p o s t e r i o r e s ( = c o n f i g u r a c i ó n d e p r e d i r e c c i o n a m i e n t o ) .
L o s g r u p o s d e r a t o n e s s e t r a t a n e l d í a 1 c o n u n a d o s i s ú n ic a d e a n t i - C D 4 p a r a i n d u c i r i n m u n o t o l e r a n c i a , s e g u id o p o s t e r i o r m e n t e p o r u n a in y e c c i ó n in t r a v e n o s a s e m a n a l d e s u s t a n c i a s d e p r u e b a d u r a n t e 10 - 12 s e m a n a s :
G r u p o A : s in t r a t a m i e n t o
G r u p o B : s o lo a n t i c u e r p o d e u n ió n a p - t a u ( b i o t i n i l a d o )
G r u p o C : a n t i c u e r p o d e u n ió n p - t a u b i o t i n i l a d o c o m p l e j a d o c o n a n t i c u e r p o a n t i - T f R / b i o t i n a b i e s p e c í f i c o ( v e h í c u l o l a n z a d e r a )
G r u p o D : a n t i c u e r p o d e u n ió n a p - t a u u n id o c o v a l e n t e m e n t e a u n a n t i c u e r p o a n t i - T f R
L o s r a t o n e s d e l g r u p o A s e s a c r i f i c a n e l d í a 0 p a r a o b t e n e r u n g r u p o d e r e f e r e n c ia . L o s g r u p o s r e s t a n t e s r e c ib e n a d m i n i s t r a c i o n e s i n t r a v e n o s a s s e m a n a l e s d e l c o m p u e s t o r e s p e c t i v o d u r a n t e u n t o t a l d e 12 s e m a n a s y s e s a c r i f i c a n u n a s e m a n a d e s p u é s d e la ú l t im a a d m i n i s t r a c i ó n .
P a r a d e t e r m i n a r la t r a n s f e r e n c i a d e l a n t i c u e r p o d e c a r g a ú t i l a t r a v é s d e la B H E , c a d a c e r e b r o d e r a t ó n s e s e c c i o n a s a g i t a l m e n t e e n d o s h e m i s f e r i o s y s e u s a c o m o s ig u e :
( 1 ) h e m i s f e r i o d e r e c h o : i n m u n o h i s t o q u í m i c a d e a g r e g a d o s q u e c o n t i e n e n p t a u
Figure imgf000107_0001

Claims (5)

REIVINDICACIONES
1. U n c o n j u g a d o c o v a l e n t e q u e c o m p r e n d e
i) u n a n t i c u e r p o b i e s p e c í f i c o , q u e t i e n e u n a p r im e r a e s p e c i f i c i d a d d e u n ió n , q u e s e u n e e s p e c í f i c a m e n t e a u n a c a r g a ú t i l h a p t e n i l a d a , y u n a s e g u n d a e s p e c i f i c i d a d d e u n ió n , q u e s e u n e e s p e c í f i c a m e n t e a u n r e c e p t o r d e la b a r r e r a h e m a t o e n c e f á l i c a , y
i i ) u n a c a r g a ú t i l h a p t e n i la d a ,
e n e l q u e la c a r g a ú t i l h a p t e n i l a d a s e u n e e s p e c í f i c a m e n t e m e d i a n t e la p r i m e r a e s p e c i f i c i d a d d e u n ió n , e n e l q u e e l c o n j u g a d o c o v a l e n t e t i e n e u n e n l a c e d i s u l f u r o e n t r e la c a r g a ú t i l h a p t e n i l a d a y u n r e s i d u o d e c i s t e í n a e n u n r e s i d u o d e a m i n o á c i d o e n la C D R 2 e n la p r i m e r a e s p e c i f i c i d a d d e u n ió n q u e s e u n e e s p e c í f i c a m e n t e a la c a r g a ú t i l h a p t e n i l a d a , e n e l q u e la C D R 2 e s la C D R 2 d e c a d e n a p e s a d a , la c a r g a ú t i l h a p t e n i l a d a s e s e l e c c i o n a d e l g r u p o q u e c o n s i s t e e n c a r g a s ú t i l e s b i o t in i l a d a s , c a r g a s ú t i l e s t e o f i l i n i l a d a s , c a r g a s ú t i l e s d ig o x i g e n i l a d a s y c a r g a s ú t i le s f l u o r e s c e i n i l a d a s y la c i s t e í n a s e e n c u e n t r a e n la p o s ic i ó n 52 b o 53 d e a c u e r d o c o n la n u m e r a c i ó n d e K a b a t , o e n e l q u e la C D R 2 e s la C D R 2 d e c a d e n a l ig e r a , c u a n d o la c a r g a ú t i l h a p t e n i l a d a e s u n a c a r g a ú t i l h e l i c a r i l a d a , y la c i s t e í n a s e e n c u e n t r a e n la p o s ic i ó n 55 o 51 d e a c u e r d o c o n la n u m e r a c i ó n d e K a b a t , y
e n e l q u e e l r e c e p t o r d e la b a r r e r a h e m a t o e n c e f á l i c a e s e l r e c e p t o r d e t r a n s f e r r i n a ( T f R ) o la p r o t e í n a 8 r e la c i o n a d a c o n e l r e c e p t o r d e l i p o p r o t e í n a s d e b a ja d e n s i d a d ( L R P 8 ) .
2. E l c o n j u g a d o d e a c u e r d o c o n la r e i v i n d i c a c i ó n 1 , e n e l q u e e l a n t i c u e r p o b i e s p e c í f i c o e s t á l i b r e d e f u n c i ó n e f e c t o r a .
3. E l c o n j u g a d o d e a c u e r d o c o n u n a c u a l q u i e r a d e la s r e i v i n d i c a c i o n e s 1 a 2 , e n e l q u e e l a n t i c u e r p o b i e s p e c í f i c o c o m p r e n d e
a ) u n s i t io d e u n ió n p a r a la c a r g a ú t i l h a p t e n i l a d a y u n s i t i o d e u n ió n p a r a e l r e c e p t o r d e la b a r r e r a h e m a t o e n c e f á l i c a , o
b ) d o s s i t i o s d e u n ió n p a r a la c a r g a ú t i l h a p t e n i l a d a y u n s i t i o d e u n ió n p a r a e l r e c e p t o r d e la b a r r e r a h e m a t o e n c e f á l i c a , o
c ) u n s i t i o d e u n ió n p a r a la c a r g a ú t i l h a p t e n i l a d a y d o s s i t i o s d e u n ió n p a r a e l r e c e p t o r d e la b a r r e r a h e m a t o e n c e f á l i c a , o
d ) d o s s i t i o s d e u n ió n p a r a la c a r g a ú t i l h a p t e n i l a d a y d o s s i t i o s d e u n ió n p a r a e l r e c e p t o r d e la b a r r e r a h e m a t o e n c e f á l i c a .
4. U n a f o r m u l a c i ó n f a r m a c é u t i c a q u e c o m p r e n d e e l c o n j u g a d o d e a c u e r d o c o n u n a c u a l q u i e r a d e la s r e i v i n d i c a c i o n e s 1 a 3 y u n v e h í c u l o f a r m a c é u t i c a m e n t e a c e p t a b l e .
5. E l c o n j u g a d o d e a c u e r d o c o n u n a c u a l q u i e r a d e la s r e i v i n d i c a c i o n e s 1 a 3 p a r a s u u s o c o m o m e d ic a m e n t o . 6 . E l c o n j u g a d o d e a c u e r d o c o n u n a c u a l q u i e r a d e la s r e i v i n d i c a c i o n e s 1 a 3 p a r a s u u s o e n e l t r a t a m i e n t o d e l c á n c e r o d e u n t r a s t o r n o n e u r o ló g ic o .
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