ES3031608T3 - Compositions comprising amino acids for use in the treatment of mitochondrial dysfunction-related neurodegenerative diseases - Google Patents

Abstract

Composición para su uso en la prevención y/o tratamiento de enfermedades neurodegenerativas relacionadas con disfunción mitocondrial, comprendiendo la composición un agente activo, conteniendo dicho agente activo los aminoácidos leucina, isoleucina, valina, treonina, lisina y ácido cítrico, ácido succínico, ácido málico. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones que comprenden aminoácidos para su uso en el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas relacionadas con la disfunción mitocondrial

Campo de la invención

La presente descripción se refiere en general a composiciones que comprenden aminoácidos. Más particularmente, la descripción se refiere a composiciones que comprenden aminoácidos para su uso en medicina, en particular para su uso en el tratamiento de enfermedades relacionadas con la disfunción mitocondrial.

Antecedentes

Las mitocondrias son orgánulos celulares cuya función principal es la fosforilación oxidativa, un proceso mediante el cual la energía derivada del metabolismo de la glucosa o de los ácidos grasos se convierte en trifosfato de adenosina (ATP). El ATP se utiliza entonces para impulsar diversas reacciones biosintéticas que requieren energía y otras actividades metabólicas.

La disfunción mitocondrial puede afectar a cualquier tejido con la consiguiente gran variedad de síntomas, dependiendo del grado de implicación de los diferentes tejidos.

Las enfermedades derivadas de la disfunción mitocondrial pueden incluir, por ejemplo, la inflamación mitocondrial debida al mal funcionamiento del potencial de membrana mitocondrial, los trastornos funcionales debidos al estrés oxidativo, TAL como por la acción de especies reactivas de oxígeno (ROS) o de radicales libres, los trastornos funcionales debidos a mutaciones genéticas y las enfermedades debidas a la deficiencia funcional de los mecanismos de fosforilación oxidativa para la producción de energía.

Las mitocondrias se deterioran con la edad, perdiendo actividad respiratoria, acumulando daños en su ADN (ADNmt) y produciendo cantidades excesivas de especies reactivas de oxígeno (ROS).

Pruebas recientes apuntan a la implicación de la disfunción mitocondrial en varias enfermedades, incluyendo los trastornos metabólicos y cardiovasculares relacionados con la edad (aterosclerosis), además de las principales enfermedades neurodegenerativas, tal como la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson y la enfermedad de Huntington, y a la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC).

La disfunción mitocondrial también se ha encontrado en la obesidad y en los trastornos relacionados, incluyendo la diabetes mellitus de tipo 2, la hipertensión arterial, la dislipidemia, la insuficiencia cardíaca, la enfermedad renal y la osteoporosis.

En particular, la sarcopenia, definida como una de las causas más importantes de deterioro funcional y pérdida de independencia en los adultos mayores debido a la pérdida involuntaria de masa y fuerza muscular esquelética, y característica clave del llamado síndrome de fragilidad, se debe a la reducción de la masa y la función mitocondrial. Además, la caquexia o síndrome de desgaste se define como una pérdida involuntaria de peso corporal, atrofia muscular, fatiga y debilidad. La caquexia se observa en personas con cáncer, SIDA, enfermedad celíaca, EPOC, esclerosis múltiple, artritis reumatoide, insuficiencia cardíaca congestiva, tuberculosis y anorexia nerviosa. No se ha encontrado ningún fármaco o nutriente para prevenir y/o tratar esta enfermedad.

Así, dada la epidemia de obesidad en todo el mundo y el creciente envejecimiento de la población, los pacientes más frecuentes en el próximo futuro serán los sujetos ancianos obesos y sarcopénicos.

Las estrategias para aliviar los déficits relacionados con la edad en la biogénesis y la actividad mitocondrial incluyen la restricción calórica (RC) y el ejercicio físico moderado, que promueven la supervivencia en los mamíferos. Se ha comprobado que la RC prolonga la esperanza de vida en buen estado de salud (esperanza de vida), gracias a la prevención de trastornos inflamatorios, cardiovasculares, oncológicos y neurodegenerativos. La RC promueve la expresión de los genes implicados en la biogénesis mitocondrial y mejora la función mitocondrial en células y tejidos senescentes o dañados (Nisoli et al., 2005) .

Aunque la RC tiene efectos beneficiosos en los seres humanos, es poco probable que este régimen dietético se adopte de forma generalizada en los ancianos.

Como solución alternativa para proporcionar los beneficios de la restricción dietética sin reducción de la ingesta calórica se administró en mamíferos una composición específica que comprende aminoácidos, como se desvela por ejemplo enel documento EP 2 196 203 B1. Además, el documento US 6 537 969 prevé una composición que comprende uno o más de ácido cítrico, ácido succínico, ácido málico para su uso en el tratamiento de trastornos de la función mitocondrial alterada, tales como los trastornos de la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Huntington y la enfermedad de Parkinson.

Sumario de la invención

La invención es como se define en las reivindicaciones.

La presente descripción tiene como objetivo proporcionar nuevas composiciones a base de aminoácidos particularmente eficaces para promover la biogénesis mitocondrial y mejorar la función mitocondrial en un sujeto.

De acuerdo con la presente descripción, el objeto anterior se consigue gracias al objeto específicamente recordado en las reivindicaciones siguientes, que se entienden como parte integrante de la presente divulgación.

Una realización de la presente descripción proporciona una composición para promover la biogénesis mitocondrial y mejorar la función mitocondrial en un individuo, comprendiendo la composición un agente activo, conteniendo dicho agente activo los aminoácidos leucina, isoleucina, valina, treonina, lisina y ácido cítrico, ácido succínico, ácido málico.

En una o más realizaciones, el agente activo de la composición contiene además uno o más aminoácidos seleccionados en el grupo que consiste en histidina, fenilalanina, metionina, triptófano, cisteína y tirosina.

La composición se usa en el tratamiento y/o la prevención de enfermedades neurodegenerativas, tales como la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson y la enfermedad de Huntington.

Breve descripción de los dibujos

La invención se describirá ahora, sólo a modo de ejemplo, con referencia a las figuras adjuntas, en las que:

• La figura 1 muestra el contenido de ADN mitocondrial (ADNmt) analizado por medio de PCR cuantitativa en cardiomiocitos HL-1 tratados con diferentes composiciones con base en aminoácidos durante 48 horas (48 h, 2 d). La PCR cuantitativa se realiza por triplicado y se normaliza con respecto al ADN genómico que codifica la GAPDH (n = 3, media ± SEM). El valor de las células no tratadas (CT) se toma como 1,0 (*p < 0,05 frente a las células no tratadas, #p < 0,05 frente a BCAAem y B2).

• La figura 2 muestra los niveles de ARNm del marcador de biogénesis mitocondrial (Tfam, PGC-1a, Cyt c) analizados mediante PCR cuantitativa en cardiomiocitos HL-1 tratados con composiciones basadas en aminoácidos durante 24 horas (1 d). La PCR cuantitativa se realiza por triplicado y se normaliza con respecto a GAPDH (n = 3, media ± SEM). *p < 0,05 frente a las células no tratadas, expresado como 1,0. #p < 0,05 frente a BCAAem.

• La figura 3 muestra los niveles del marcador de biogénesis mitocondrial (Tfam, PGC-1a, Cyt c) analizados por PCR cuantitativa en cardiomiocitos HL-1 tratados con composiciones con base en aminoácidos durante 48 h (2 d). La PCR cuantitativa se realiza por triplicado y se normaliza con respecto a GAPDH (n = 3, media ± SEM). *p < 0,05 frente a las células no tratadas, expresado como 1,0. #p < 0,05 frente a BCAAem.

• La Figura 4 muestra los niveles de ARNm del factor 15 similar a Krüppel (KFL15) y del miembro de la familia de la proteína fosfatasa 2C dirigida a la matriz mitocondrial (PP2CM), que son proteínas que regulan el catabolismo de los aminoácidos de cadena ramificada (BCAA). PP2CM y KFL15 se han analizado mediante PCR cuantitativa en cardiomiocitos HL-1 tratados con composiciones con base en aminoácidos durante 24 horas (1 d) o 48 horas (2 d). La PCR cuantitativa se realiza por triplicado y se normaliza con respecto a GAPDH (n = 3, media ± SEM). *p < 0,05 frente a células no tratadas, expresado como 1,0; #p < 0,05 frente a BCAAem y B2.

• La figura 5 muestra una evaluación de la tasa de consumo de oxígeno (TCO). Consumo de oxígeno en cardiomiocitos HL-1 tratados con composiciones con base en aminoácidos o DETA-NO durante 48 horas. ****p < 0,001 frente a la célula no tratada; ////////p < 0,001 frente a BCAAem y B2.

Descripción detallada de las realizaciones preferidas

En la siguiente descripción, se dan numerosos detalles específicos para proporcionar una comprensión completa de las realizaciones. Las realizaciones pueden practicarse sin uno o más de los detalles específicos, o con otros métodos, componentes, materiales, etc. En otros casos, no se muestran ni se describen en detalle estructuras, materiales u operaciones bien conocidas para evitar que se oculten aspectos de las realizaciones.

La referencia a lo largo de esta memoria descriptiva a "una realización" o "la realización" significa que un rasgo, estructura o característica particular descrita en relación con la realización está incluida en al menos una realización. Por lo tanto, las apariciones de las frases "en una realización" o "en una realización" en diversos lugares a lo largo de esta memoria descriptiva no se refieren necesariamente a la misma realización. Además, los rasgos, estructuras o características particulares pueden combinarse de cualquier manera adecuada en una o más realizaciones. Los títulos que figuran en la presente memoria descriptiva se utilizan únicamente por comodidad y no interpretan el alcance o significado de las realizaciones.

La composición desvelada en la presente memoria descriptiva comprende un agente activo, conteniendo el agente activo los aminoácidos leucina, isoleucina, valina, treonina, lisina y los ácidos cítrico, succínico y málico.

Una composición que comprende aminoácidos - como se desvela en el documento EP 2196203 B1 - fue administrada en mamíferos como solución alternativa para proporcionar los beneficios de la restricción calórica (RC); se ha demostrado que dicha composición de aminoácidos (denominada "BCAAem" en la presente divulgación) conduce a un aumento de la biogénesis mitocondrial tanto en los músculos cardíacos como en los esqueléticos (D'Antona et al., 2010). Estos efectos fueron mediados por la expresión de la óxido nítrico sintasa endotelial (eNOS) y la consiguiente producción de óxido nítrico (NO) (D'Antona et al., 2010).

El inventor de la presente solicitud descubrió sorprendentemente que al añadir ácidos específicos a una composición que comprende una combinación similar de leucina, isoleucina, valina, treonina y lisina se produce un aumento significativo de la función mitocondrial celular.

El inventor de la presente solicitud probó varias composiciones diferentes en cuanto a los ácidos que contienen y descubrió que las composiciones que comprenden como agente activo el ácido cítrico, el ácido succínico y el ácido málico en combinación con leucina, isoleucina, valina, treonina y lisina son muy eficaces para los fines indicados. De hecho, las composiciones que comprenden el agente activo arriba indicado, así como las composiciones que comprenden el agente activo arriba indicado que incluye más aminoácidos específicos (enumerados en la Tabla 1 a continuación) son significativamente más eficaces que la composición con base en aminoácidos previamente probada (BCAAm) para promover la biogénesis y la función mitocondrial.

Las composiciones se probaron en la línea celular del músculo cardíaco (HL-1), es decir, en células que representan un modeloin vitrode la funcionalidad cardíaca. Los resultados derivados del análisis de estos cardiomiocitos podrán utilizarse para verificar la eficacia de las nuevas composiciones en la prevención de la insuficiencia cardíaca.

En una o más realizaciones, la composición divulgada en el presente documento comprende un agente activo, conteniendo dicho agente activo ácido cítrico, ácido succínico y ácido málico en combinación con leucina, isoleucina, valina, treonina, lisina, en la que la relación en peso entre la cantidad total de ácido cítrico, ácido succínico y ácido málico y la cantidad total de los aminoácidos leucina, isoleucina, valina, treonina, lisina está comprendida entre 0,05 y 0,3, preferentemente entre 0,1 y 0,25.

En una o más realizaciones, el agente activo puede comprender además uno o más aminoácidos seleccionados en el grupo que consiste en histidina, fenilalanina, metionina, triptófano, cisteína, tirosina.

En otra realización, el agente activo de la composición divulgada en el presente documento puede incluir también ácido aspártico y/o ornitina L-alfa cetoglutarato (OKG).

De acuerdo con una realización, la composición comprende un agente activo, el agente activo consiste en leucina, isoleucina, valina, treonina, lisina, histidina, fenilalanina, metionina, triptófano, cisteína y opcionalmente tirosina, así como ácido cítrico, ácido succínico y ácido málico, siendo dichos aminoácidos los únicos contenidos en la composición.

En otra realización, la composición puede comprender los aminoácidos isoleucina, leucina y valina en una cantidad comprendida entre 35 % y 65 % en peso, preferentemente entre 42 % y 56 % en peso con respecto al peso del agente activo.

En una o más realizaciones, la relación en peso entre la leucina y el ácido cítrico está comprendida entre 5 y 1, preferentemente entre 2,50 y 3,50.

En otra realización, el peso o la cantidad molar de ácido cítrico es mayor que el peso o la cantidad molar de cada uno de los ácidos málico y succínico. Preferentemente, la cantidad en peso o molar de ácido cítrico es mayor que la cantidad global en peso o molar de ácido málico más ácido succínico. En otra realización, la relación en peso entre el ácido cítrico y la suma de ácido málico y ácido succínico está comprendida entre 1,0 y 4,0, preferentemente entre 1,5 y 2,5. En una realización preferida, la relación de peso ácido cítrico:ácido málico:ácido succínico está comprendida entre 10:1:1 y 2:1.5:15, preferentemente entre 7:1:1 y 1.5:1:1, más preferentemente entre 5:1:1 y 3:1:1. En una realización preferida, la proporción en peso de ácido cítrico:ácido málico:ácido succínico es de 4:1:1.

De acuerdo con algunas realizaciones de la presente divulgación, la relación molar isoleucina:leucina preferida está comprendida en el intervalo 0,2-0,7, preferentemente en el intervalo 0,30-0,60 y/o la relación peso valina:leucina preferida está comprendida en el intervalo 0,2-0,70, preferentemente en el intervalo 0,30-0,65.

En otra realización, la relación molar treonina:leucina está comprendida en el intervalo de 0,10-0,90, preferentemente en el intervalo de 0,20-0,70 y/o la relación de peso lisina:leucina está comprendida en el intervalo de 0,20-1,00, preferentemente en el intervalo de 0,40-0,90.

En una realización preferida, la relación entre la cantidad molar global de ácido cítrico, ácido málico, ácido succínico y la cantidad molar global de metionina, fenilalanina, histidina y triptófano es superior a 1,35.

En una o más realizaciones, la relación en peso entre la suma de ácido cítrico, ácido málico, ácido succínico y la suma de los aminoácidos de cadena ramificada leucina, isoleucina, valina está comprendida entre 0,1 y 0,4, preferentemente entre 0,15 y 0,35.

En otra realización, la cantidad global en peso de los aminoácidos de cadena ramificada leucina, isoleucina, valina más treonina y lisina es mayor que la cantidad global en peso de los tres ácidos cítrico, málico y succínico. Preferentemente, la cantidad en peso de los ácidos simples (ácido cítrico, ácido succínico o ácido málico) es inferior a la cantidad en peso de cada uno de los aminoácidos simples leucina, isoleucina, valina, treonina y lisina.

En otra realización, la cantidad molar global de lisina y treonina es mayor que la cantidad molar global de los tres ácidos cítrico, ácido succínico y ácido málico. Preferentemente, la relación entre la cantidad molar global de los tres ácidos cítrico, succínico y málico y la cantidad molar global de lisina y treonina está comprendida entre 0,1 y 0,7, preferentemente entre 0,15 y 0,55.

En una o más realizaciones, la composición desvelada en la presente memoria descriptiva comprende además vitaminas, preferentemente seleccionadas en el grupo de las vitaminas B, tales como la vitamina B1 y/o la vitamina Be. En otra realización de la presente divulgación, la composición puede incluir hidratos de carbono, aditivos y/o sustancias aromatizantes.

Además, en particular al preparar las composiciones de acuerdo con la presente divulgación, y específicamente el agente activo, se evita preferentemente el aminoácido arginina.

Además, otros aminoácidos preferentemente excluidos por la composición desvelada en la presente memoria descriptiva son serina, prolina, alanina.

Estos aminoácidos pueden ser contraproducentes o incluso perjudiciales en algunas concentraciones o proporciones estequiométricas dentro de la composición.

Los aminoácidos divulgados en la presente descripción pueden ser sustituidos por sus respectivos derivados farmacéuticamente aceptables, es decir, por sales.

En una o más realizaciones, las composiciones divulgadas en el presente documento están destinadas a un uso en medicina.

Como se verá claramente en lo sucesivo, la administración de las composiciones de acuerdo con la presente divulgación es particularmente eficaz para promover la biogénesis mitocondrial y la función mitocondrial.

Las composiciones desveladas en la presente memoria descriptiva se usan en el tratamiento y/o prevención de enfermedades neurodegenerativas relacionadas con la disfunción mitocondrial, preferentemente seleccionadas entre la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson y la enfermedad de Huntington.

De acuerdo con otra realización, las composiciones de aminoácidos pueden comprender excipientes farmacéuticamente aceptables, como por ejemplo proteínas, vitaminas, carbohidratos, edulcorantes naturales y artificiales y/o sustancias aromatizantes. En una realización preferida, los excipientes farmacéuticamente aceptables pueden seleccionarse entre las proteínas del suero, las maltodextrinas, la fructosa, el caseinato de calcio, el aceite de pescado, el ácido cítrico o sales de los mismos, la sucralosa, los ésteres de sacarosa, la vitamina D3 y las vitaminas del grupo B.

Para uso oral, las composiciones de acuerdo con la descripción pueden presentarse en forma de comprimidos, cápsulas, gránulos, gel, polvo gelificable, polvo.

Otras especificaciones, en términos de cantidades y proporciones entre los diversos aminoácidos previstos por las composiciones, están contenidas en las reivindicaciones adjuntas, que forman parte integral de la enseñanza técnica proporcionada en el presente documento en relación con la invención.

Ejemplos

La Tabla 1 muestra diferentes composiciones con base en aminoácidos ensayadas en células HL-1, tal y como se describe a continuación.

Específicamente, la composición BCAAem es la composición desvelada en el documentoEP 2196203 B1. La composición denominada "B2" tiene como agente activo una combinación de aminoácidos similar a la de la composición BCAAem pero incluyendo además ácido cítrico. Dicha composición también comprende las vitaminas B1 y B6.

Las composiciones denominadas alfa 5 (a5), alfa 6 (a6), alfa 7 (a7) comprenden un agente activo que contiene aminoácidos y ácido cítrico, ácido succínico y ácido málico. Además, el agente activo de la composición alfa 7 también comprende OKG (ornitina L-a cetoglutarato) y el aminoácido aspartato (ácido L-aspártico).

Tabla 1

Las composiciones de la Tabla 1 anterior pueden prepararse primero tamizando todos los componentes con una malla de 0,8. Para obtener una premezcla, cada ingrediente (en una cantidad <10 % en peso de la cantidad total) se pone en una bolsa de polietileno junto con una porción de L-lisina HCl para obtener el 10 % del peso de la composición total. A continuación, la bolsa se agita manualmente durante 5 minutos. A continuación, la premezcla se carga en una mezcladora (Planetaria) junto con el resto de los ingredientes y se mezcla durante un periodo de 15 minutos a 120 rpm para obtener una composición final homogénea.

Las composiciones enumeradas en la Tabla 1 se han administrado a cardiomiocitos HL-1 y la función mitocondrial se ha evaluado como se indica a continuación.

Métodos

Células y tratamientos

Cardiomiocitos HL-1 (regalo de W.C. Claycomb, New Orleans, School of Medicine) se colocaron en frascos recubiertos de fibronectina/gelatina y se cultivaron hasta alcanzar una confluencia del 70 %-80 % en medio Claycomb (JRH Biosciences) complementado con 100 pM de norepinefrina (a partir de una solución madre de 10 mM de norepinefrina [Sigma-Aldrich] disuelta en 30 mM de ácido L-ascórbico [Sigma-Aldrich]), 2 mM de L-glutamina, 100 U/ml de penicilina, 100 pg/ml de estreptomicina y 10% de FBS (JRH Biosciences), como se indica en Claycomb et al., 1998.

Las células fueron tratadas con 1% (p/v) de las composiciones (disueltas en el medio de Claycomb) mostradas en la Tabla 1 durante 24 h o 48 h.

Al final de estos períodos, se extrajo el ARNm y el ADN de las células o se utilizaron las células para evaluar el consumo de oxígeno. Las células de control fueron tratadas únicamente con el medio Claycomb.

Métodos de Expresión Génica y Biogénesis Mitocondrial

El ARN total se aisló de los cardiomiocitos HL-1 utilizando el RNeasy Mini Kit (Qiagen); un microgramo de ARN total se transcribió de forma inversa en ADNc utilizando el iScript cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad Laboratories) como se describe en D'Antona et al. (2010).

El nivel relativo del gen se calculó como 2-DDCT, en el que el DDCT correspondía a la diferencia entre el DCT de cualquiera de los tratamientos y el DCT del grupo no tratado, utilizando GAPDH como control interno. El algoritmo Delta-Delta-CT (DDCT) es un método de aproximación para determinar la expresión génica relativa con experimentos de PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR) (véase Livak y Schmittgen, 2001).

Los cebadores (secuencia reportada en la Tabla 2 abajo) fueron diseñados usando el software Beacon Designer 2.6 (Premier Biosoft International). Los valores se normalizaron con la expresión de la gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH).

Tabla 2

Para el análisis del ADN mitocondrial (ADNmt), se extrajo el ADN total con el kit de extracción de ADN QlAamp (QIAGEN).

El ADNmt se amplificó utilizando cebadores específicos para el gen del ADN mitocondrial (ADNmt) y se normalizó con respecto al ADN genómico mediante la amplificación del ADN del gen GAPDH. Los cebadores, diseñados con el software Beacon Designer 2.6 (Premier Biosoft International; Palo Alto, CA) se muestran en la Tabla 2 para el ADNg.

Análisis estadístico

Para todos los datos de expresión génica, se utilizaron pruebas t de muestras pareadas de dos lados para comparar los valores entre las células de control y las tratadas. Un valor p <0,05 se consideró estadísticamente significativo.

Consumo de oxígeno

Una cantidad de 1 ml de cardiomiocitos HL-1 tratados con las composiciones mostradas en la Tabla 1 se resuspendió en solución salina equilibrada de Hank (Sigma) y se centrifugó para transformar en pellas las células. También se complementó un número de células HL-1 con un donante de óxido nítico (NO), concretamente con la también llamada dietilentriamina-NO (DETA-NO; Sigma-Aldrich, Milán, Italia), como control positivo.

A continuación, las células se resuspendieron en un tampón de respiración (0,3 M de manitol, 10 mM de KCl, 5 mM de MgCl2, 10 mM de K2PO4, pH 7,4) a una densidad de 3,0*106/ml.

Las muestras se analizaron a 37°C en un recipiente hermético al gas equipado con un electrodo de oxígeno tipo Clark (Rank Brothers Ltd.) conectado a un registrador gráfico.

El electrodo de oxígeno se calibró asumiendo que la concentración de oxígeno en el medio de incubación era de 200 pmol/l a 37 °C.

El consumo de oxígeno se evaluó con una mezcla continua durante unos diez minutos. La pendiente del registrador de trazos se utilizó entonces para calcular el consumo de oxígeno. El contenido de oxígeno puede variar en función de la cantidad de células. Así, el contenido de proteínas, que se correlaciona directamente con el contenido celular, se ha utilizado para normalizar el consumo de oxígeno en las muestras celulares. El contenido de proteínas se determinó mediante el ensayo de proteínas de ácido bicinquínico (BCA).

Resultados

ADN mitocondrial (ADNmt)

El ADN mitocondrial (ADNmt) se evaluó primero en las células tratadas con las diferentes composiciones de aminoácidos para verificar sus efectos sobre la masa mitocondrial.

Como se muestra en la Fig.1, los cardiomiocitos HL-1 tratados con la composición a5 mostraron el aumento más significativo de ADNmt con respecto al ADNmt evaluado en las células de control (CT), en las células tratadas con B2 y, muy interesante, en las células tratadas con la composición BCAAem.

PGC-1a, Tfam y Cyt c

También se probó el efecto de las diferentes composiciones de aminoácidos sobre la biogénesis mitocondrial. En concreto, se evaluó la expresión por parte de los cardiomiocitos HL-1 de los siguientes marcadores:

• coactivador del receptor gamma activado por el proliferador de peroxisomas 1 -alfa (PGC-1a), el regulador maestro de la biogénesis mitocondrial,

• el factor de transcripción A del ADN mitocondrial (Tfam), el factor de transcripción del ADNmt que regula su replicación,

• complejo del citocromo (Cyt c), la proteína del complejo respiratorio.

La comparación entre los resultados obtenidos tras la administración de la composición BCAAem, la composición B2 (es decir, la composición similar a la composición BCAAem pero que también comprende ácido cítrico), a5 (es decir, la composición que comprende como agente activo además de los aminoácidos también los ácidos ácido cítrico, ácido succínico, ácido málico) mostró que la composición a5 fue la más eficaz para promover la expresión de los marcadores mencionados en las células de cardiomiocitos HL-1.

Además, se observó un efecto en el tiempo: tras una suplementación de 48 h con una composición a5 que comprendía los aminoácidos enumerados en la Tabla 1 junto con los tres ácidos carboxílicos indicados, efectivamente el aumento fue aún más pronunciado sobre los valores basales.

El aumento también fue estadísticamente significativo con respecto al valor de la composición de BCAAem para Tfam en comparación con el tratamiento de 24 horas (Fig. 2) y para PGC-1a y para Cyt c después del tratamiento de 48 horas (Fig. 3).

KFL15 y PP2CM

El factor 15 similar a Krüppel (KFL15) y el miembro de la familia de la proteína fosfatasa 2C dirigida a la matriz mitocondrial (PP2CM) son proteínas que regulan el catabolismo de los aminoácidos de cadena ramificada (BCAA). Los primeros pasos del catabolismo de los BCAA son comunes a los tres BCAA y requieren las enzimas mitocondriales BCAA aminotransferasa (BCAT) y el complejo de a-cetoácidos deshidrogenados de cadena ramificada (BCKDC). En el primer paso de la degradación, totalmente reversible, la BCAT mitocondrial transfiere el grupo amino de los BCAA a a-cetoglutarato para formar los correspondientes a-cetoácidos de cadena ramificada (BCKA) y glutamato. A continuación, la BCKDC cataliza la descarboxilación de los grupos carboxilo de los BCKA, para formar los correspondientes ésteres de acil-CoA de cadena ramificada.

Esta reacción es irreversible y, por lo tanto, compromete a los BCAA a la degradación.

La actividad de la BCKDC está regulada por la inhibición alostérica del producto final por NADH, a-cetoisocaproato y ésteres de acil-CoA de cadena ramificada.

La actividad de BCKDC está determinada por el estado de fosforilación de su subunidad reguladora E1a.

Cuando el nivel de BCAA es bajo, la E1a es hiperfosforilada por una quinasa BCKD, lo que lleva a la inhibición de la actividad de la BCKDC y a la preservación de los BCAA libres.

Cuando el nivel de BCAA es alto, E1a es desfosforilada por una proteína fosfatasa de tipo Ser/Thr dirigida a las mitocondrias denominada PP2C en las mitocondrias (PP2CM) o proteína fosfatasa, dependiente de Mg2+/Mn2+ 1K (PPM1K), lo que conduce a la activación de BCKDC y a la reducción de los BCAA totales (Bifari y Nisoli, 2016). Además, se descubrió que KLF15 aumenta la expresión de los genes BCAT, BCKDC y PP2CM en el corazón (Sun et al., 2016).

La evaluación de los niveles de ARNm de PP2CM y KFL15 mostró que la composición a5 aumentó los niveles de ARNm de PP2CM y KLF15 por encima del valor basal en los cardiomiocitos HL-1. El aumento fue significativo incluso sobre la composición de BCAAem (Fig. 4)

Estos resultados muestran que las composiciones que comprenden un agente activo, conteniendo el agente activo leucina, isoleucina, valina, treonina, lisina y ácido cítrico, ácido succínico y ácido málico, son muy eficaces para promover la función mitocondrial y activar más eficientemente la biogénesis mitocondrial incluso con respecto a la composición de BCAAem en células metabólicamente activas.

Consumo de oxígeno (OCR)

Se probó el consumo de oxígeno de las células HL-1 suplementadas con diferentes composiciones. También se probaron las células suplementadas con dietilentriamina-NO (DETA-NO) como control positivo. Se ha demostrado el efecto de DETA-NO en el aumento del consumo de oxígeno de las células (Nisoli et al., 2003). Se descubrió que el NO desencadena la biogénesis mitocondrial en células tan diversas como los adipocitos marrones y las células 3T3-L1, U937 y HeLa. Este efecto del óxido nítrico dependía de la guanosina cíclica 3',5'-monofosfato (cGMP) y estaba mediado por la inducción de PGC-1a, un regulador maestro de la biogénesis mitocondrial (Nisoli et al., 2003).

Después de 48h de tratamiento con DETA-NO, se observó un aumento del consumo de oxígeno, como se esperaba. Más notablemente, se observó un marcado aumento en el consumo de oxígeno cuando las células HL-1 fueron suplementadas con la composición a5 durante 48 horas, indicando así un aumento en la actividad mitocondrial (Fig. 5).

El aumento es significativamente mayor que el observado tras la administración de composiciones de B2 y BCAAem. En conjunto, estos resultados indican que las composiciones que comprenden como agente activo una combinación de leucina, isoleucina, valina, treonina, lisina, ácido cítrico, ácido succínico y ácido málico son significativamente más activas para promover la biogénesis mitocondrial, la función mitocondrial y el catabolismo de los BCAA en los cardiomiocitos HL-1.

Se cree que la composición alfa 6 (a6) y alfa 7 (a7), que proporciona un ingrediente activo que comprende los BCAA, la treonina y la lisina, así como el ácido cítrico, el ácido succínico y el ácido málico, logran ventajas similares.

Cabe destacar que el catabolismo de los BCAA, que están enriquecidos en la mezcla, además del Acetil-CoA, proporciona succinil-CoA. Esta última podría activar la reacción de la succinil-CoA sintetasa, que, a su vez, produce succinato como sustrato para la posterior reacción de la succinato deshidrogenasa.

Proporcionar succinato, junto con BCAA, en la mezcla podría por lo tanto también estimular la reacción de la succinato deshidrogenasa, impulsando así aún más el ciclo. Cabe destacar que la succinato deshidrogenasa, al proporcionar directamente FADH2, también forma parte de la cadena de transporte de electrones mitocondrial (complejo II). Por lo tanto, su estimulación por el succinato podría activar directamente los portadores redox mitocondriales y aumentar el potencial de la membrana, aumentando así el gradiente de protones, el consumo de oxígeno y la síntesis de ATP.

Al mismo tiempo, el suplemento de malato podría activar la reacción de la malato deshidrogenasa y aumentar los niveles de NADH; esto también proporcionaría sustratos para el complejo I y por lo tanto aumentaría los niveles de ATP, de la misma manera que el FADH2 derivado del succinato. Por otra parte, el malato podría estimular la actividad de la lanzadera de malato-aspartato. Esto favorecería la entrada en las mitocondrias de NADH también citosólico, que de otro modo sería impermeable a través de la membrana mitocondrial, con lo que estaría disponible para la oxidación mitocondrial. Esto aumentaría aún más la actividad mitocondrial y el consumo de oxígeno.

De lo anterior se desprende claramente cómo las composiciones de acuerdo con la presente divulgación son útiles para el tratamiento de condiciones patológicas que se distinguen por una función mitocondrial insuficiente en humanos y en animales.

Referencias

Bifari F, Nisoli E. Branched-chain amino acids differently modulate catabolic or anabolic states in mammals: a pharmacological point of view. Br J Pharmacol. 2016 Sep 17. doi: 10.1111/bph.13624. [Epub ahead of print].

Claycomb WC, Lanson NA Jr, Stallworth BS, Egeland DB, Delcarpio JB, Bahinski A, Izzo NJ Jr. HL-1 cells: a cardiac muscle cell line that contracts and retains phenotypic characteristics of the adult cardiomyocyte. Proc Natl Acad Sci USA 95: 2979-2984, 1998.

D'Antona G, Ragni M, Cardile A, Tedesco L, Dossena M, Bruttini F, Caliaro F, Corsetti G, Bottinelli R, Carruba MO, Valerio A, Nisoli E. Branched-chain amino acid supplementation promotes survival and supports cardiac and skeletal muscle mitochondrial biogenesis in middle-aged mice. Cell Metab. 12: 362-372, 2010.

Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods 25: 402-408, 2001.

Nisoli E, Clementi E, Paolucci C, Cozzi V, Tonello C, Sciorati C, Bracale R, Valerio A, Francolini M, Moncada S, Carruba MO. Mitochondrial biogenesis in mammals: the role of endogenous nitric oxide. Science: 299(5608):896-9, 2003.

Nisoli E, Tonello C, Cardile A, Cozzi V, Bracale R, Tedesco L, Falcone S, Valerio A, Cantoni O, Clementi E, Moncada S, Carruba MO. Calorie restriction promotes mitochondrial biogenesis by inducing the expression of eNOS. Science 310: 314-317, 2005.

Sun H, Olson KC, Gao C, Prosdocimo DA, Zhou M, Wang Z, Jeyaraj D, Youn JY, Ren S, Liu Y, Rau CD, Shah S, Ilkayeva O, Gui WJ, William NS, Wynn RM, Newgard CB, Cai H, Xiao X, Chuang DT, Schulze PC, Lynch C, Jain MK, Wang Y Catabolic Defect of Branched-Chain Amino Acids Promotes Heart Failure. Circulation 133: 2038-2049, 2016.

Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. Composición para su uso en el tratamiento y/o prevención de una enfermedad neurodegenerativa relacionada con la disfunción mitocondrial, la composición que comprende un agente activo, conteniendo dicho agente activo los aminoácidos leucina, isoleucina, valina, treonina, lisina y ácido cítrico, ácido succínico, ácido málico.

2. Composición para uso de acuerdo con la reivindicación 1, en la que la enfermedad neurodegenerativa relacionada con disfunción mitocondrial se selecciona en el grupo que consiste en enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington.

3. Composición para uso de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la que la relación en peso entre la suma de ácido cítrico, ácido málico, ácido succínico y la suma de los aminoácidos de cadena ramificada leucina, isoleucina, valina más lisina y treonina está comprendida entre 0,05 y 0,3, preferentemente entre 0,1 y 0,25.

4. Composición para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que la relación en peso entre la cantidad global de ácido cítrico, ácido málico, ácido succínico y la cantidad global de los aminoácidos de cadena ramificada leucina, isoleucina, valina está comprendida entre 0,1 y 0,4, preferentemente entre 0,15 y 0,35.

5. Composición para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que la relación en peso entre el ácido cítrico y la cantidad total de ácido málico y ácido succínico está comprendida entre 1,0 y 4,0, preferentemente entre 1,5 y 2,5.

6. Composición para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que la relación en peso de ácido cítrico:ácido málico:ácido succínico está comprendida entre 10:1:1 y 2:1,5:1,5, preferentemente entre 7:1:1 y 1,5:1:1, más preferentemente entre 5:1:1 y 3:1:1.

7. Composición para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que dicho agente activo comprende además al menos un aminoácido seleccionado en el grupo que consiste en histidina, fenilalanina, metionina, triptófano, tirosina, cisteína.

8. Composición para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que dicho agente activo comprende además histidina, fenilalanina, metionina, triptófano, cisteína y opcionalmente tirosina.

9. Composición para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que la relación entre la cantidad molar global de ácido cítrico, ácido málico, ácido succínico y la cantidad molar global de metionina, fenilalanina, histidina y triptófano es superior a 1,35.

10. Composición para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que la relación entre la cantidad molar global de los tres ácidos ácido cítrico, ácido succínico, ácido málico y la cantidad molar global de lisina y treonina está comprendida entre 0,10 y 0,70, preferentemente entre 0,15 y 0,55.

11. Composición para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que el peso o la cantidad molar de ácido cítrico es superior al peso o la cantidad molar global tanto de ácido málico como de ácido succínico.

12. Composición para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que la relación en peso entre leucina y ácido cítrico está comprendida entre 5 y 1, preferentemente entre 2,50 y 3,50.

13. Composición para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicho agente activo no contiene arginina.

14. Composición para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la composición comprende además una o más vitaminas, preferentemente seleccionadas en el grupo de las vitaminas B, más preferentemente vitamina B1 y/o vitamina B6.