RS63422B1 - Kompozicije koje sadrže aminokiseline za upotrebu u lečenju bolesti povezanih sa mitohondrijalnom disfunkcijom - Google Patents

Description

Oblast pronalaska

[0001] Ovaj opis se uopšteno odnosi na kompozicije koje sadrže aminokiseline. Tačnije, opis se odnosi na kompozicije koje sadrže aminokiseline za upotrebu u medicini, posebno za upotrebu u lečenju bolesti povezanih sa mitohondrijalnom disfunkcijom

Pozadina pronalaska

[0002] Mitohondrije su ćelijske organele čija je primarna funkcija oksidativna fosforilacija, proces kroz koji se energija dobijena iz metabolizma glukoze ili masnih kiselina pretvara u adenozin trifosfat (ATP). ATP se zatim koristi za pokretanje različitih biosintetičkih reakcija koje zahtevaju energiju i druge metaboličke aktivnosti.

[0003] Mitohondrijalna disfunkcija može da utiče na bilo koje tkivo sa rezultujućim velikim brojem simptoma, u zavisnosti od toga u kojoj meri su različita tkiva uključena.

[0004] Bolesti koje proističu iz mitohondrijalne disfunkcije mogu uključivati, na primer, oticanje mitohondrija usled potencijalnog kvara mitohondrijske membrane, funkcionalne poremećaje usled oksidativnog stresa kao što je dejstvo reaktivnih vrsta kiseonika (ROS) ili slobodnih radikala, funkcionalne poremećaje usled genetskih mutacija i bolesti usled funkcionalnog nedostatka mehanizama oksidativne fosforilacije za proizvodnju energije.

[0005] Mitohondrije propadaju sa starenjem, gube respiratornu aktivnost, akumuliraju oštećenja njihove DNK (mtDNK) i proizvode prekomerne količine reaktivnih vrsta kiseonika (ROS).

[0006] Nedavni dokazi ukazuju na uključenost mitohondrijalne disfunkcije u nekoliko bolesti, uključujući metaboličke i kardiovaskularne poremećaje povezane sa starenjem (aterosklerozu), pored glavnih neurodegenerativnih bolesti kao što su Alchajmerova bolest, Parkinsonova bolest i Hantingtonova bolest i hronična opstruktivna plućna bolest bolest (HOBP).

[0007] Mitohondrijalna disfunkcija je takođe pronađena kod gojaznosti i srodnih poremećaja, uključujući dijabetes melitus tipa 2, visok krvni pritisak, dislipidemiju, srčanu insuficijenciju, bolest bubrega i osteoporozu.

[0008] Naročito, sarkopenija, definisana kao jedan od najvažnijih uzroka funkcionalnog opadanja i gubitka nezavisnosti kod starijih osoba zbog nevoljnog gubitka skeletne mišićne mase i snage, i ključna karakteristika tzv. sindroma slabosti, nastaje zbog smanjena masa i funkcija mitohondrija. Pored toga, kaheksija ili sindrom trošenja se definiše kao nenamerni gubitak telesne težine, atrofija mišića, umor i slabost. Kaheksija se primećuje kod ljudi sa rakom, AIDS-om, celijakijom, HOBP, multiplom sklerozom, reumatoidnim artritisom, kongestivnom srčanom insuficijencijom, tuberkulozom i anoreksijom nervozom. Nisu pronađeni lekovi ili hranljive materije za sprečavanje i/ili lečenje ovog stanja.

[0009] Dakle, imajući u vidu svetske epidemije gojaznosti i sve veće starenje stanovništva, najčešći pacijenti u sledećoj budućnosti biće sarkopeni, gojazni stariji subjekti.

[0010] Strategije za ublažavanje deficita povezanih sa uzrastom u mitohondrijalnoj biogenezi i aktivnosti uključuju ograničenje kalorija (CR) i umerenu fizičku vežbu, koja promoviše preživljavanje kod sisara. Utvrđeno je da CR produžava očekivani životni vek uz dobro zdravlje (zdravstveni vek), kroz prevenciju inflamatornih, kardiovaskularnih, kancera i neurodegenerativnih poremećaja. CR promoviše ekspresiju gena uključenih u mitohondrijalnu biogenezu i poboljšava funkciju mitohondrija u starenju ili oštećenim ćelijama i tkivima (”Nisoli et al., 2005”).

[0011] Iako CR ima korisne efekte na ljude, malo je verovatno da će takav režim ishrane biti široko prihvaćen kod starijih osoba.

[0012] Kao alternativno rešenje za obezbeđivanje prednosti ograničenja u ishrani bez smanjenja kalorijskog unosa, specifična kompozicija koja sadrži aminokiseline je davana sisarima, kao što je otkriveno na primer u EP 2196203 B1.

Suština pronalaska

[0013] Ovaj opis ima za cilj da obezbedi nove kompozicije zasnovane na amino kiselinama koje su posebno efikasne u promovisanju mitohondrijalne biogeneze i poboljšanju mitohondrijalne funkcije kod subjekta.

[0014] Prema sadašnjem opisu, gornji cilj je postignut zahvaljujući predmetu koji je posebno pomenut u patentnim zahtevima koji slede, koji se shvataju kao sastavni deo ovog otkrića.

[0015] Primena ovog opisa obezbeđuje kompoziciju za promovisanje mitohondrijalne biogeneze i poboljšanje mitohondrijalne funkcije kod subjekta, kompozicija koja sadrži aktivni agens, pomenuti aktivni agens koji sadrži aminokiseline leucin, izoleucin, valin, treonin, lizin i limunsku kiselinu , jantarna kiselina, jabučna kiselina u određenim težinskim odnosima.

[0016] U jednoj ili više primena, aktivni agens kompozicije dalje sadrži jednu ili više amino kiselina odabranih u grupi koju čine histidin, fenilalanin, metionin, triptofan, cistein i tirozin.

[0017] U jednoj ili više primena, kompozicija koja je ovde otkrivena može da se koristi u medicini.

[0018] U poželjnoj primeni, kompozicija je namenjena za upotrebu u lečenju i/ili prevenciji bolesti povezane sa mitohondrijalnom disfunkcijom, koja se bira između sarkopenije i srčane insuficijencije.

[0019] U drugoj poželjnoj primeni, kompozicija se može koristiti u lečenju i/ili prevenciji neurodegenerativnih bolesti povezanih sa mitohondrijalnom disfunkcijom, kao što su Alchajmerova bolest, Parkinsonova bolest i Hantingtonova bolest.

[0020] U daljoj primeni, kompozicija se može koristiti u lečenju i/ili prevenciji bolesti povezane sa mitohondrijalnom disfunkcijom, odabranih između ateroskleroze, dijabetesa tipa 2, bolesti bubrega, HOBP i osteoporoze.

[0021] U jednoj ili više primena, kompozicija se može koristiti u lečenju i/ili prevenciji kliničkih situacija pothranjenosti, posebno u lečenju i/ili prevenciji pothranjenosti proteina i kaheksije.

Kratak opis crteža

[0022] Pronalazak će sada biti opisan, samo kao primer, pozivajući se na priložene slike, pri čemu:

- Slika 1 prikazuje sadržaj mitohondrijalne DNK (mtDNK) analiziran pomoću kvantitativne PCR u HL-1 kardiomiocitima tretiranim različitim kompozicijama na bazi amino kiselina tokom 48 sati (48 sati, 2 dana). Kvantitativni PCR je izveden u tri primerka i normalizovan na kodiranje genomske DNK za GAPDH (n = 3, srednja vrednost ± SEM). Vrednost netretiranih ćelija (CT) se uzima kao 1,0 (*p < 0,05 u odnosu na netretirane ćelije, #p < 0,05 u odnosu na BCAAem i B2).

- Slika 2 prikazuje nivoe mRNK markera mitohondrijske biogeneze (Tfam, PGC-1a, Cit c) analizirane pomoću kvantitativne PCR u HL-1 kardiomiocitima tretiranim kompozicijama na bazi amino kiselina tokom 24 sata (1 d). Kvantitativni PCR je izveden u tri primerka i normalizovan na GAPDH (n = 3, srednja vrednost ± SEM). *p < 0,05 u odnosu na netretirane ćelije, izraženo kao 1,0. #p < 0,05 protiv BCAAem.

- Slika 3 prikazuje nivoe markera mitohondrijalne biogeneze (Tfam, PGC-1a, Cit c) analizirane kvantitativnim PCR u HL-1 kardiomiocitima tretiranim kompozicijama na bazi amino kiselina tokom 48 sati (2 dana). Kvantitativni PCR je izveden u tri primerka i normalizovan na GAPDH (n = 3, srednja vrednost ± SEM). *p < 0,05 u odnosu na netretirane ćelije, izraženo kao 1,0. #p < 0,05 protiv BCAAem.

- Slika 4 prikazuje nivoe mRNA Kruppelovog faktora 15 (KFL15) i člana porodice protein fosfataze 2C ciljanog na mitohondrijalni matriks (PP2CM), koji su proteini koji regulišu katabolizam aminokiselina razgranatog lanca (BCAA). PP2CM i KFL15 su analizirani kvantitativnim PCR u HL-1 kardiomiocitima tretiranim kompozicijama na bazi aminokiselina tokom 24 sata (1 dan) ili 48 sati (2 dana). Kvantitativni PCR je izveden u tri primerka i normalizovan na GAPDH (n = 3, srednja vrednost ± SEM). *p < 0,05 u odnosu na netretirane ćelije, izraženo kao 1,0; #p < 0,05 u odnosu na BCAAem i B2.

- Slika 5 prikazuje procenu brzine potrošnje kiseonika (OCR). Potrošnja kiseonika u HL-1 kardiomiocitima tretiranim kompozicijama na bazi amino kiselina ili DETA-NO tokom 48 sati. ****p < 0,001 u odnosu na netretiranu ćeliju; ####p < 0,001 u odnosu na BCAAem i B2.

Detaljan opis poželjnih primena

[0023] U sledećem opisu, dati su brojni specifični detalji da bi se obezbedilo temeljno razumevanje primena. Primene se mogu praktikovati bez jednog ili više specifičnih detalja, ili sa drugim metodama, komponentama, materijalima, itd. U drugim slučajevima, dobro poznate strukture, materijali ili operacije nisu prikazani ili opisani detaljno kako bi se izbeglo prikrivanje aspekata primena.

[0024] Referenca u ovoj specifikaciji na "jedna primena" ili "primena" znači da je određena karakteristika, struktura ili karakteristika opisana u vezi sa realizacijom uključena u najmanje jednu varijantu. Prema tome, pojavljivanje fraza "u jednoj primeni" ili "u primeni" na različitim mestima u ovoj specifikaciji ne mora nužno da se odnosi na istu varijantu. Štaviše, posebne karakteristike, strukture ili karakteristike mogu se kombinovati na bilo koji pogodan način u jednoj ili više primena. Naslovi dati su samo radi pogodnosti i ne tumače obim ili značenje primena.

[0025] Kompozicija ovde otkrivena sadrži aktivni agens, aktivni agens koji sadrži aminokiseline leucin, izoleucin, valin, treonin, lizin i kiseline limunsku kiselinu, jantarnu kiselinu, jabučnu kiselinu pri čemu je limunska kiselina:jabučna kiselina:jantarna kiselina težina odnos se sastoji između 10:1:1 i 2:1,5:1,5, poželjno između 7:1:1 i 1,5:1:1, poželjnije između 5:1:1 i 3:1:1.

[0026] Kompozicija koja sadrži aminokiseline - kao što je otkriveno u EP 2 196 203 B1 je primenjena kod sisara kao alternativno rešenje da bi se obezbedila korist od ograničenja kalorija (CR); takav zasnovani sastav aminokiselina (koji se naziva "BCAAem" u ovom opisu) pokazao je da vodi povećanu mitohondrijalnu biogenezu kako u srčanim tako i u skeletnim mišićima (D'Antona et al., 2010). Ovi efekti su posredovani ekspresijom endotelne sintaze azot-oksida (eNOS) i posledičnom proizvodnjom azot-oksida (NO) (”D'Antona et al., 2010”).

[0027] Pronalazač je u ovom pronalasku kao iznenađujuće otkrio da dodavanjem specifičnih kiselina u kompoziciju koja sadrži sličnu kombinaciju leucina, izoleucina, valina, treonina i lizina dolazi do značajnog povećanja mitohondrijalne funkcije ćelije.

[0028] Pronalazač trenutne aplikacije testirao je brojne kompozicije različite u smislu kiselina koje se u njima nalaze i otkrio da su kompozicije koje kao aktivni agens sadrže limunsku kiselinu, jantarnu kiselinu i jabučnu kiselinu u kombinaciji sa leucinom, izoleucinom, valinom, treoninom i lizino je veoma efikasan za naznačene svrhe. Zaista, kompozicije koje sadrže gore navedeno aktivno sredstvo, kao i kompozicije koje sadrže gore navedeno aktivno sredstvo uključujući dalje specifične aminokiseline (navedene u tabeli 1 ispod) su značajno efikasnije od prethodno testirane kompozicije zasnovane na amino kiselinama (BCAAm) u promovisanju mitohondrijalne biogeneze i funkcija.

[0029] Kompozicije su testirane na ćelijskoj liniji srčanog mišića (HL-1), tj. ćelijama koje predstavljaju in vitro model srčane funkcionalnosti. Rezultati dobijeni analizom ovih kardiomiocita mogu se koristiti za verifikaciju efikasnosti novih kompozicija u prevenciji srčane insuficijencije.

[0030] U jednoj ili više primena, kompozicija koja je ovde otkrivena sadrži aktivno sredstvo, navedeno aktivno sredstvo koje sadrži limunsku kiselinu, jantarnu kiselinu i jabučnu kiselinu u kombinaciji sa leucinom, izoleucinom, valinom, treoninom, lizinom, pri čemu je težinski odnos između ukupnih količina limunske kiseline, jantarne kiseline i jabučne kiseline i ukupna količina aminokiselina leucin, izoleucin, valin, treonin, lizin je između 0,05 i 0,3, poželjno između 0,1 i 0,25.

[0031] U jednoj ili više primena, aktivni agens može dalje da sadrži jednu ili više amino kiselina odabranih u grupi koju čine histidin, fenilalanin, metionin, triptofan, cistein, tirozin.

[0032] U sledećoj varijanti, aktivni agens kompozicije koja je ovde otkrivena može takođe uključiti asparaginsku kiselinu i/ili ornitin L-alfa ketoglutarat (OKG).

[0033] Prema jednoj primeni, kompozicija sadrži aktivni agens, aktivni agens koji se sastoji od leucina, izoleucina, valina, treonina, lizina, histidina, fenilalanina, metionina, triptofana, cisteina i opciono tirozina, kao i limunske kiseline, limunske kiseline kiselinu i jabučnu kiselinu, pri čemu su navedene amino kiseline jedine aminokiseline sadržane u kompoziciji.

[0034] U daljoj primeni, kompozicija može da sadrži aminokiseline izoleucin, leucin i valin u količini između 35% i 65% po težini, poželjno između 42% i 56% po težini u odnosu na masu aktivnog sredstva.

[0035] U jednoj ili više primena, težinski odnos između leucina i limunske kiseline je između 5 i 1, poželjno između 2,50 i 3,50.

[0036] Z Težina ili molarna količina limunske kiseline je veća od težine ili molarne količine svake od jabučne kiseline i jantarne kiseline. Poželjno, težina ili molarna količina limunske kiseline je veća od težine ili molarne ukupne količine jabučne kiseline plus jantarne kiseline. U daljem izvođenju, težinski odnos između limunske kiseline i zbira jabučne kiseline i jantarne kiseline je između 1,0 i 4,0, poželjno između 1,5 i 2,5. U poželjnom izvođenju, težinski odnos limunska kiselina:jabučna kiselina:jantarna kiselina je između 7:1:1 i 1,5:1:1, poželjnije između 5:1:1 i 3:1:1. U poželjnom izvođenju, težinski odnos limunska kiselina:jabučna kiselina:jantarna kiselina je 4:1:1.

[0037] Prema nekim primenama ovog otkrića, poželjni molarni odnos izoleucin:leucin se nalazi u opsegu 0,2-0,7, poželjno u opsegu 0,30-0,60 i/ili poželjni težinski odnos valin:leucin se nalazi u opsegu 0,2-0,70, poželjno u opsegu 0,30-0,65.

[0038] U daljoj primeni, molarni odnos treonin:leucin je u opsegu od 0,10-0,90, poželjno u opsegu 0,20-0,70 i/ili težinski odnos lizin:leucin je u opsegu od 0,20-1,00 poželjno u opsegu 0,40-0,90.

[0039] U poželjnoj primeni, odnos između ukupne molarne količine limunske kiseline, jabučne kiseline, jantarne kiseline i ukupne molarne količine metionina, fenilalanina, histidina i triptofana je veći od 1,35.

[0040] U jednoj ili više primena, težinski odnos između zbira limunske kiseline, jabučne kiseline, jantarne kiseline i zbira amino kiselina razgranatog lanca leucina, izoleucina, valina je između 0,1 i 0,4, poželjno između 0,15 i 0,35.

[0041] U daljoj primeni, ukupna težinska količina amino kiselina razgranatog lanca leucin, izoleucin, valin plus treonin i lizin je veća od ukupne masene količine tri kiseline limunske kiseline, jabučne kiseline, jantarne kiseline. Poželjno, težinska količina pojedinačnih kiselina (limunska kiselina, jantarna kiselina ili jabučna kiselina) je manja od masene količine svake od pojedinačnih aminokiselina leucina, izoleucina, valina, treonina i lizina.

[0042] U daljoj primeni, ukupna molarna količina lizina i treonina je veća od ukupne molarne količine tri kiseline limunske, jantarne i jabučne kiseline. Poželjno, odnos između ukupne molarne količine tri kiseline limunske kiseline, jantarne kiseline, jabučne kiseline i ukupne molarne količine lizina i treonina je između 0,1 i 0,7, poželjno između 0,15 i 0,55.

[0043] U jednoj ili više primena, kompozicija koja je ovde otkrivena dalje sadrži vitamine, poželjno odabrane iz grupe vitamina B, kao što je vitamin B1i/ili vitamin B6.

[0044] U daljoj primeni ovog pronalaska, kompozicija može uključivati ugljene hidrate, aditive i/ili aromatične supstance.

[0045] Dalje, posebno kada se pripremaju kompozicije prema ovom pronalasku, a posebno aktivni agens, poželjno je izbegavati aminokiselinu arginin.

[0046] Dodatno, dalje aminokiseline koje su poželjno isključene kompozicijom koja je ovde otkrivena su serin, prolin, alanin.

[0047] Takve amino kiseline mogu biti kontraproduktivne ili čak štetne u nekim koncentracijama ili stehiometrijskim odnosima unutar kompozicije.

[0048] Amino kiseline otkrivene u ovom opisu mogu biti zamenjene odgovarajućim farmaceutski prihvatljivim derivatima, naime solima.

[0049] U jednoj ili više primena, ovde otkrivene kompozicije su namenjene za upotrebu u medicini.

[0050] Kao što će se jasno pokazati u daljem tekstu, primena kompozicija prema ovom pronalasku je posebno efikasna u promovisanju mitohondrijalne biogeneze i mitohondrijalne funkcije.

[0051] U poželjnoj primeni, otkrivene kompozicije mogu da se koriste u lečenju i/ili prevenciji bolesti povezane sa mitohondrijalnom disfunkcijom, izabranom između sarkopenije i srčane insuficijencije.

[0052] U drugoj poželjnoj primeni, ovde otkrivene kompozicije mogu se koristiti u lečenju i/ili prevenciji neurodegenerativnih bolesti povezanih sa mitohondrijskom disfunkcijom, poželjno odabranih između Alchajmerove bolesti, Parkinsonove bolesti i Hantingtonove bolesti.

[0053] U daljoj primeni, kompozicije se mogu koristiti u lečenju i/ili prevenciji bolesti povezane sa mitohondrijalnom disfunkcijom, izabranih u grupi koju čine ateroskleroza, dijabetes tipa 2, bolesti bubrega, COPD i osteoporoza.

[0054] U jednoj ili više primena, kompozicija se može koristiti u lečenju i/ili prevenciji kliničkih situacija pothranjenosti, posebno u lečenju i/ili prevenciji pothranjenosti proteina i kaheksije.

[0055] Prema daljoj primeni, aminokiselinske kompozicije mogu sadržati farmaceutski prihvatljive ekscipijente, kao što su na primer proteini, vitamini, ugljeni hidrati, prirodni i veštački zaslađivači i/ili aromatične supstance. U poželjnoj primeni, farmaceutski prihvatljivi ekscipijenti mogu biti izabrani između proteina surutke, maltodekstrina, fruktoze, kalcijum kazeinata, ribljeg ulja, limunske kiseline ili njenih soli, sukraloze, estara saharoze, vitamina D3, vitamina B grupe.

[0056] Za oralnu upotrebu, kompozicije prema opisu mogu biti u obliku tableta, kapsula, granula, gela, praha za geliranje, praha.

[0057] Dalje specifikacije, u smislu količina i odnosa između različitih aminokiselina predviđenih u kompozicijama, sadržane su u priloženim patentnim zahtevima, koji čine sastavni deo tehničkog učenja datog ovde u vezi sa pronalaskom.

PRIMERI

[0058] Tabela 1 prikazuje različite kompozicije zasnovane na amino kiselinama testirane na HL-1 ćelijama kao što je otkriveno u nastavku.

[0059] Konkretno, BCAAem kompozicija je kompozicija otkrivena u EP 2196203 B1.

[0060] Kompozicija nazvana "B2" ima kao aktivni agens kombinaciju aminokiselina sličnu onoj u BCAAem kompoziciji, ali dalje uključuje limunsku kiselinu. Takav sastav takođe sadrži vitamine B1 i B6.

[0061] Kompozicije nazvane alfa 5 (α5), alfa 6 (α6), alfa 7 (α7) sadrže aktivni agens koji sadrži aminokiseline i limunsku kiselinu, jantarnu kiselinu i jabučnu kiselinu. Pored toga, aktivni agens kompozicije alfa 7 takođe sadrži OKG (ornitin L-α ketoglutarat) i aminokiselinu aspartat (L-asparaginsku kiselinu).

Tabela 1

[0062] Kompozicije iz Tabele 1 iznad mogu se prvo pripremiti prosejavanjem svih komponenti sa sitom 0.8. Da bi se dobila predmešavina, svaki sastojak (u količini <10% težine ukupne količine) se stavlja u polietilensku kesu zajedno sa delom L-lizin HCl tako da se dobije 10% težine ukupne količine. sastav. Kesa se zatim ručno mućka 5 minuta. Predsmeša se zatim ubacuje u mikser (Planetaria) zajedno sa ostatkom sastojaka i meša tokom perioda od 15 minuta na 120 obrtaja u minuti da bi se dobila homogena konačna kompozicija.

[0063] Kompozicije navedene u tabeli 1 su davane na HL-1 kardiomiocite i mitohondrijalna funkcija je procenjena kao što je otkriveno u nastavku.

METODE

Ćelije i tretmani

[0064] HL-1 kardiomiociti (poklon od ”WC. Calycomb, Nev Orleans, School of Medicine”) su stavljeni u boce obložene fibronektinom/želatinom, uzgajane do 70%-80% konfluencije u Claicomb medijumu (JRH Biosciences) dopunjenom sa 100 µM norepinefrin (iz osnovnog rastvora norepinefrina [Sigma-Aldrich] od 10 mM rastvorenog u 30 mM L-askorbinske kiseline [Sigma-Aldrich]), 2 mM L-glutamina, 100 U/ml penicilina, 100 µg/ml/ml (JRH Biosciences) kako je otkriveno u Claicomb et al., 1998.

[0065] Ćelije su tretirane sa 1% (w/v) kompozicija (rastvorenih u tzv. ”Claycomb” medijumu) prikazanih u Tabeli 1 tokom 24 h ili 48 h.

[0066] Na kraju ovih perioda, mRNA i DNK su ekstrahovani iz ćelija ili su ćelije korišćene za procenu potrošnje kiseonika. Kontrolne ćelije su tretirane samo tzv. ”Claycomb” medijumom.

Ekspresija gena i metode mitohondrijalne biogeneze

[0067] Ukupna RNK je izolovana iz HL-1 kardiomiocita korišćenjem ”RNeasiy Mini Kit (Qiagen)”; jedan mikrogram ukupne RNK je reverzno transkribovan u cDNK korišćenjem ”iScript” kompleta za sintezu cDNK (”Bio-Rad Laboratories”) kao što je opisano u ”D'Antona et al. (2010)”.

[0068] Relativni nivo gena je izračunat kao 2<-DDCT>, u kome je DDCT odgovarao razlici između DCT bilo kojeg tretmana i DCT netretirane grupe koristeći GAPDH kao internu kontrolu. Algoritam Delta-Delta-CT (DDCT) je metoda aproksimacije za određivanje relativne ekspresije gena pomoću kvantitativnih PCR (qRT-PCR) eksperimenata u realnom vremenu (videti ”Livak and Schmittgen, 2001”).

[0069] Prajmeri (sekvenca prikazana u Tabeli 2 ispod) su dizajnirani korišćenjem softvera ”Beacon Designer 2.6” (”Premier Biosoft International”). Vrednosti su normalizovane ekspresijom gliceraldehid 3-fosfat dehidrogenaze (GAPDH).

Tabela 2

[0070] Za analizu mitohondrijalne DNK (mtDNK), ukupna DNK je ekstrahovana sa QIAamp kompletom za ekstrakciju DNK (QIAGEN).

[0071] mtDNK je amplifikovana korišćenjem prajmera specifičnih za gen mitohondrijalne DNK (mtDNK) i normalizovana na genomsku DNK amplifikacijom DNK gena GAPDH. Prajmeri, dizajnirani korišćenjem softvera ”Beacon Designer 2.6” (”Premier Biosoft International; Palo Alto, Kalifornija”) prikazani su u tabeli 2 za gDNK.

Statističke analize

[0072] Za sve podatke o ekspresiji gena, korišćeni su dvostrani t testovi uparenog uzorka da se uporede vrednosti između kontrolnih i tretiranih ćelija. P vrednost <0,05 se smatra statistički značajnom.

Potorošnja kiseonika

[0073] Količina od 1 ml HL-1 kardiomiocita tretiranih kompozicijama prikazanim u Tabeli 1 je ponovo suspendovana u Hankovom izbalansiranom rastvoru soli (Sigma) i centrifugirana do ćelija u obliku peleta. Jedan broj HL-1 ćelija je takođe dopunjen donorom nitnog oksida (NO), posebno dietilentriaminom-NO koji se takođe naziva (”DETA-NO; Sigma-Aldrich, Milano, Italija”), kao pozitivna kontrola.

[0074] Zatim su ćelije ponovo suspendovane u puferu za disanje (0,3 M manitol, 10 mM KCl, 5 mM MgCl2, 10 mM K2PO4, pH 7,4) pri gustini od 3,0 × 106/ml.

[0075] Uzorci su analizirani na 37°C u gasootpornoj posudi opremljenoj kiseonikom tipa ”Clark” (”Rank Brothers Ltd.”) povezanom sa snimačem grafikona.

[0076] Kiseonička elektroda je kalibrisana pod pretpostavkom da je koncentracija kiseonika u medijumu za inkubaciju 200 µmol/l na 37°.

[0077] Potrošnja kiseonika je procenjena uz kontinuirano mešanje oko deset minuta. Nagib registratora tragova je zatim korišćen za izračunavanje potrošnje kiseonika. Sadržaj kiseonika može da varira u zavisnosti od količine ćelija. Dakle, sadržaj proteina, koji direktno korelira sa sadržajem ćelije, korišćen je za normalizaciju potrošnje kiseonika u ćelijskim uzorcima. Sadržaj proteina je određen korišćenjem testa proteina bicinhoninske kiseline (BCA).

REZULTATI

Mitohondrijalna DNK (mtDNK)

[0078] Mitohondrijalna DNK (mtDNK) je prvo procenjena u ćelijama tretiranim različitim sastavima aminokiselina kako bi se potvrdili njihovi efekti na mitohondrijalnu masu.

[0079] Kao što je prikazano na slici 1, HL-1 kardiomiociti tretirani a5 kompozicijom pokazali su najznačajnije povećanje mtDNK u odnosu na mtDNK procenjenu u kontrolnim ćelijama (CT), u ćelijama tretiranim B2 i, što je veoma interesantno, u ćelijama tretiran BCAAem sastavom.

PGC-1α,Tfam and Cyt c

[0080] Efekat različitih sastava aminokiselina je takođe testiran na mitohondrijalnu biogenezu. Konkretno, procenjena je ekspresija HL-1 kardiomiocita sledećih markera:

- gama koaktivator 1-alfa receptora aktiviranog proliferatorom peroksizoma (PGC-1α), glavni regulator mitohondrijalne biogeneze,

- faktor A transkripcije mitohondrijalne DNK (Tfam), faktor transkripcije mtDNK koji reguliše replikaciju mtDNK, - kompleks citokroma (Cyt c), protein respiratornog kompleksa.

[0081] Poređenje rezultata dobijenih nakon primene BCAAem kompozicije, kompozicije B2 (tj. kompozicije slične BCAAem kompoziciji, ali koja takođe sadrži limunsku kiselinu), α5 (tj. kompozicije koja kao aktivni agens osim aminokiselina sadrži i kiseline limunska kiselina, jantarna kiselina, jabučna kiselina) su pokazali da je α5 kompozicija najefikasnija u promovisanju ekspresije navedenih markera u ćelijama kardiomiocita HL-1.

[0082] Štaviše, primećen je efekat vremenskog toka: nakon suplementacije od 48 sati sa α5 kompozicijom koja sadrži aminokiseline navedene u Tabeli 1 zajedno sa tri naznačene karboksilne kiseline, povećanje je zaista bilo još izraženije u odnosu na bazalne vrednosti.

[0083] Povećanje je takođe bilo statistički značajno u odnosu na vrednost sastava BCAAem za Tfam u poređenju sa tretmanom od 24 sata (slika 2) i za PGC-1α i za Cyt c nakon tretmana od 48 sati (slika 3).

KFL15 and PP2CM

[0084] Kruppelov faktor 15 (KFL15) i član porodice protein fosfataze 2C ciljane na mitohondrijalni matriks (PP2CM) su proteini koji regulišu katabolizam aminokiselina razgranatog lanca (BCAA).

[0085] Prvi koraci u BCAA katabolizmu su zajednički za tri BCAA i zahtevaju mitohondrijalne enzime BCAA aminotransferazu (BCAT) i kompleks dehidrogenaze a-keto kiseline (BCKDC) razgranatog lanca.

[0086] U prvom i potpuno reverzibilnom koraku degradacije, mitohondrijski BCAT prenosi amino grupu sa BCAA na αketoglutarat da bi se formirale odgovarajuće a-keto kiseline (BCKA) i glutamat.

[0087] Nakon toga, BCKDC katalizuje dekarboksilaciju karboksilnih grupa BCKA, da bi se formirali odgovarajući acil-CoA estri razgranatog lanca.

[0088] Ova reakcija je ireverzibilna i stoga dovodi do razgradnje BCAA.

[0089] BCKDC aktivnost je regulisana alosteričnom inhibicijom krajnjeg proizvoda NADH, α-ketoizokaproatom i acil-CoA estrima razgranatog lanca.

[0090] BCKDC aktivnost je određena statusom fosforilacije njegove regulatorne podjedinice E1a.

[0091] Kada je nivo BCAA nizak, E1a je hiperfosforilisan BCKD kinazom, što dovodi do inhibicije BCKDC aktivnosti i očuvanja slobodnih BCAA.

[0092] Kada je nivo BCAA visok, E1a se defosforiliše pomoću mitohondrijalno ciljane Ser/Thr protein fosfataze tipa PP2C u mitohondrijima (PP2CM) ili protein fosfataze, Mg2+/Mn2+ zavisne od 1K, dovodeći do BCKDCiv akta i smanjenje ukupnih BCAA (”Bifari and Nisoli, 2016”).

[0093] Pored toga, utvrđeno je da KLF15 povećava ekspresiju gena BCAT, BCKDC i PP2CM u srcu (”Sun et al., 2016”).

[0094] Procena nivoa mRNA PP2CM i KFL15 pokazala je da sastav a5 povećava nivoe PP2CM i KLF15 mRNA u odnosu na bazalnu vrednost u HL-1 kardiomiocitima. Povećanje je bilo značajno čak i u odnosu na sastav BCAAem (slika 4).

[0095] Ovi rezultati pokazuju da su kompozicije koje sadrže aktivni agens, aktivni agens koji sadrži leucin, izoleucin, valin, treonin, lizin i limunsku kiselinu, jantarnu kiselinu i jabučnu kiselinu, veoma efikasni u promovisanju mitohondrijalne funkcije i efikasnije aktiviraju mitohondrijalnu biogenezu čak i s obzirom na sastav BCAAem u metabolički aktivnim ćelijama.

Potrošnja kiseonika (OCR)

[0096] Testirana je potrošnja kiseonika HL-1 ćelija dopunjenih različitim kompozicijama. Takođe su testirane ćelije sa dodatkom dietilentriamina-NO (DETA-NO) kao pozitivne kontrole. Pokazan je efekat DETA-NO na povećanje potrošnje kiseonika u ćelijama (”Nisoli et al., 2003”). Utvrđeno je da NO pokreće mitohondrijalnu biogenezu u ćelijama koje su različite kao što su smeđi adipociti i ćelije 3T3-L1, U937 i HeLa. Ovaj efekat azotnog oksida zavisio je od cikličnog gvanozin 3',5'-monofosfata (cGMP) i bio je posredovan indukcijom PGC-1α, glavnog regulatora mitohondrijalne biogeneze (”Nisoli et al., 2003”).

[0097] Posle 48h tretmana DETA-NO, primećen je porast potrošnje kiseonika, kako se očekivalo.

[0098] Najvažnije, primećeno je značajno povećanje potrošnje kiseonika kada su HL-1 ćelije dopunjene α5 kompozicijom tokom 48 sati, što ukazuje na porast mitohondrijalne aktivnosti (Slika 5).

[0099] Povećanje je značajno veće od onog uočenog nakon primene kompozicija B2 i BCAAem.

[0100] Uzeti zajedno, ovi rezultati pokazuju da su kompozicije koje kao aktivni agens sadrže kombinaciju leucina, izoleucina, valina, treonina, lizina, limunske kiseline, jantarne kiseline i jabučne kiseline značajno aktivnije u promovisanju mitohondrijalne biogeneze, mitohondrijalne funkcije i BCAA katabolizma. u HL-1 kardiomiocitima.

[0101] Veruje se da kompozicija alfa 6 (α6) i alfa 7 (α7), koja obezbeđuje aktivni sastojak koji sadrži BCAA, treonin i lizin, kao i limunsku kiselinu, jantarnu kiselinu i jabučnu kiselinu, ima slične prednosti.

[0102] Treba napomenuti da katabolizam BCAA, koji su obogaćeni smešom, pored acetil-CoA, obezbeđuje sukcinil-CoA. Ovo poslednje bi moglo da aktivira reakciju sukcinil-CoA sintetaze, koja zauzvrat proizvodi sukcinat kao supstrat za naknadnu reakciju sukcinat dehidrogenaze.

[0103] Obezbeđivanje sukcinata, zajedno sa BCAA, u smeši bi stoga takođe moglo stimulisati reakciju sukcinat dehidrogenaze, čime bi se dodatno pojačao ciklus. Treba napomenuti da je sukcinat dehidrogenaza, direktno obezbeđujući FADH2, takođe deo mitohondrijalnog lanca transporta elektrona (kompleks II). Njegova stimulacija sukcinatom bi stoga mogla direktno da aktivira mitohondrijalne redoks nosače i poveća membranski potencijal, čime se povećava protonski gradijent, potrošnja kiseonika i sinteza ATP-a.

[0104] U isto vreme, suplement malata može aktivirati reakciju malat dehidrogenaze i povećati nivoe NADH; ovo bi takođe obezbedilo supstrate za kompleks I i samim tim povećalo nivoe ATP-a, na isti način kao FADH2izveden iz sukcinata. S druge strane, malat bi mogao da stimuliše aktivnost malat-aspartatnog šatla. Ovo bi pogodovalo ulasku takođe citosolnog NADH u mitohondrije, koji bi inače bili nepropusni kroz mitohondrijalnu membranu, čime bi bili dostupni za mitohondrijalnu oksidaciju. Ovo bi dodatno povećalo mitohondrijalnu aktivnost i potrošnju kiseonika.

[0105] Iz prethodnog, jasno proizilazi kako su kompozicije prema ovom pronalasku korisne za lečenje patoloških stanja koja se razlikuju po nedovoljnoj mitohondrijalnoj funkciji kod ljudi i životinja.

REFERENCE

[0106]

”Bifari F, Nisoli E.” Aminokiseline razgranatog lanca različito moduliraju katabolička ili anabolička stanja kod sisara: farmakološka tačka gledišta. ”Br J Pharmacol. 17. septembar 2016. doi: 10.1111/bph.13624. [Epub ahead of print]”. ”Claicomb VC, Lanson NA Jr, Stallvorth BS, Egeland DB, Delcarpio JB, Bahinski A, Izzo NJ Jr.” HL-1 ćelije: ćelijska linija srčanog mišića koja se kontrahuje i zadržava fenotipske karakteristike kardiomiocita odraslih. ”Proc Natl Acad Sci USA 95: 2979-2984, 1998”.

”D'Antona G, Ragni M, Cardile A, Tedesco L, Dossena M, Bruttini F, Caliaro F, Corsetti G, Bottinelli R, Carruba MO, Valerio A, Nisoli E.” Suplementacija aminokiselina razgranatog lanca promoviše preživljavanje i podržava srčane i mitohondrijalna biogeneza skeletnih mišića kod sredovečnih miševa. ”Cell Metab. 12: 362-372, 2010”.

”Livak KJ, Schmittgen TD”. Analiza relativnih podataka o ekspresiji gena korišćenjem kvantitativne PCR u realnom vremenu i 2(-Delta Delta C(T)) metode. Metode 25: 402-408, 2001.

”Nisoli E, Clementi E, Paolucci C, Cozzi V, Tonello C, Sciorati C, Bracale R, Valerio A, Frankolini M, Moncada S, Carruba MO”. Mitohondrijska biogeneza kod sisara: uloga endogenog azotnog oksida. ”Science: 299(5608):896-9, 2003”.

”Sun H, Olson KC, Gao C, Prosdocimo DA, Zhou M, Vang Z, Jeiaraj D, Ioun JI, Ren S, Liu I, Rau CD, Shah S, Ilkaieva O, Gui VJ, Villiam NS, Vinn RM, Nevgard CB , Cai H, Ksiao Ks, Chuang DT, Schulze PC, Linch C, Jain MK, Vang I”. Katabolički defekt aminokiselina razgranatog lanca promoviše srčanu insuficijenciju. Tiraž 133: 2038-2049, 2016. US2014/315788

1

1

Claims (14)

Patentni zahtevi:

1. Kompozicija za promovisanje mitohondrijalne biogeneze i poboljšanje mitohondrijalne funkcije kod subjekta, kompozicija koja sadrži aktivno sredstvo, navedeno aktivno sredstvo koje sadrži amino kiseline leucin, izoleucin, valin, treonin, lizin i limunsku kiselinu, jantarnu kiselinu, jabučnu kiselinu,

naznačena time što je težinski odnos limunska kiselina : jabučna kiselina : jantarna kiselina, između 10:1:1 i 2:1,5:1,5, poželjno između 7:1:1 i 1,5:1:1, poželjnije između 5:1:1 i 3:1:1.

2. Kompozicija prema patentnom zahtevu 1, pri čemu je težinski odnos između zbira limunske kiseline, jabučne kiseline, jantarne kiseline i zbira amino kiselina razgranatog lanca leucina, izoleucina, valina plus lizina i treonina, između 0.05 i 0.3, poželjno između 0.1. i 0.25.

3. Kompozicija prema bilo kojem od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu je težinski odnos između ukupne količine limunske kiseline, jabučne kiseline, jantarne kiseline i ukupne količine amino kiselina razgranatog lanca leucina, izoleucina, valina, između 0.1 i 0.4, poželjno između 0.15 i 0.35.

4. Kompozicija prema bilo kojem od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu je težinski odnos između limunske kiseline i zbira jabučne kiseline i jantarne kiseline između 1.0 i 4.0, poželjno između 1.5 i 2.5.

5. Kompozicija prema bilo kojem od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu pomenuti aktivni agens dalje sadrži najmanje jednu amino kiselinu izabranu iz grupe koju čine histidin, fenilalanin, metionin, triptofan, tirozin, cistein.

6. Kompozicija prema bilo kojem od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu pomenuti aktivni agens dalje sadrži histidin, fenilalanin, metionin, triptofan, cistein i opciono tirozin.

7. Kompozicija prema bilo kojem od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu je odnos između ukupne molarne količine limunske kiseline, jabučne kiseline, jantarne kiseline i ukupne molarne količine metionina, fenilalanina, histidina i triptofana veći od 1.35.

8. Kompozicija prema bilo kojem od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu je odnos između ukupne molarne količine tri kiseline limunske kiseline, jantarne kiseline, jabučne kiseline i ukupne molarne količine lizina i treonina između 0.10 i 0.70, poželjno između 0.15 i 0.55.

9. Kompozicija prema bilo kojem od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu je težina ili molarna količina limunske kiseline veća od ukupne težine ili molarne količine obe, jabučne kiseline i jantarne kiseline.

10. Kompozicija prema bilo kojem od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu je težinski odnos između leucina i limunske kiseline između 5 i 1, poželjno između 2.50 i 3.50.

11. Kompozicija prema bilo kojem od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu je pomenuti aktivni agens oslobođen od arginina.

12. Kompozicija prema bilo kojem od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu kompozicija dalje sadrži jedan ili više vitamina, poželjno odabranih iz grupe vitamina B, poželjnije vitamin B1 i/ili vitamin B6.

13. Kompozicija prema bilo kojem od patentnih zahteva od 1 do 12, za upotrebu u medicini.

14. Kompozicija prema bilo kojem od patentnih zahteva od 1 do 13, za upotrebu u lečenju i/ili prevenciji bolesti povezane sa mitohondrijalnom disfunkcijom, izabranom između sarkopenije i srčane insuficijencije.