ES2997183T3 - Thiophene derivatives as xanthine oxidase inhibitors and application thereof - Google Patents

Abstract

Una clase de inhibidores de la xantina oxidasa (XO) y su aplicación en la preparación de fármacos para el tratamiento de enfermedades relacionadas con la XO. Se describe específicamente un compuesto representado por la fórmula (I) y una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Derivados de tiofeno como inhibidores de xantina oxidasa y aplicación de los mismos

La presente divulgación reivindica la prioridad de los documentos de Patente:

CN201911049951.7, presentada el 30 de octubre de 2019, y

CN202010110482.1, presentada el 21 de febrero de 2020.

Campo de la invención

La presente divulgación se refiere a inhibidores de xantina oxidasa (XO), y a la aplicación de los mismos en la preparación de fármacos para el tratamiento de enfermedades relacionadas con XO. Se describe específicamente un compuesto representado por la fórmula (I) y una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

Antecedentes de la invención

La artritis gotosa es un tipo común y complejo de artritis. Cuando la concentración de ácido úrico en la sangre humana supera los 7 mg/dL, el ácido úrico se deposita en las articulaciones, cartílago y riñones como una sal monosódica, provocando un sistema inmunitario del cuerpo excesivo (sensibilizado) y, por lo tanto, provocando una inflamación dolorosa. Los sitios de ataque comunes son la articulación del dedo gordo, la articulación del tobillo, la articulación de la rodilla, etc. La hiperuricemia es la base patológica de la artritis gotosa. La hiperuricemia se refiere a una afección en la que el metabolismo de las sustancias de purina en el cuerpo humano se desordena, dando como resultado un aumento de la síntesis o una disminución de la excreción de ácido úrico en el cuerpo humano, y un nivel anormalmente alto de ácido úrico en la sangre. Internacionalmente, el diagnóstico de HUA se define como: en una dieta normal de purina, los niveles de ácido úrico en suero en ayunas en dos días diferentes: >400 pmol/L (6,8 mg/dL) para hombres y >360 pmol/L (6 mg/dL) para mujeres. Puede clasificarse en tres tipos: sub-excreción, sobreproducción y tipos mixtos. Los resultados de investigaciones clínicas han mostrado que el 90% de la hiperuricemia primaria pertenece al tipo de sub-excreción.

La hiperuricemia es inseparable de la gota, y es un factor de riesgo independiente para enfermedades metabólicas [diabetes, síndrome metabólico (MS), hiperlipidemia, etc.], enfermedad renal crónica, enfermedad cardiovascular y accidente cerebrovascular. Por lo tanto, reducir el nivel de ácido úrico en el cuerpo humano puede ser útil no solo para el tratamiento y la prevención de la hiperuricemia y la gota, sino también para reducir el riesgo de otras complicaciones asociadas con la hiperuricemia.

Existen dos fuentes de purina en el cuerpo humano: purina endógena de auto-síntesis o degradación de ácidos nucleicos (aproximadamente 600 mg/d) y purina exógena de la dieta de purina ingerida (aproximadamente 100 mg/d). En condiciones normales, el conjunto de ácido úrico en el cuerpo es 1200 mg, y la producción diaria de ácido úrico es de aproximadamente 700 mg, de los cuales 2/3 se excreta por los riñones, 1/3 se excreta por el intestino y una cantidad muy pequeña se excreta a través de las glándulas sudoríparas. Por lo tanto, los fármacos que reducen el ácido úrico utilizados comúnmente en la actualidad en la práctica clínica incluyen inhibidores de xantina oxidasa (tales como: alopurinol y febusteína, etc.) que inhiben la producción de ácido úrico e inhibidores de Urat1 (benbromarona y Resinard, etc.) que son uricosúricos.

La xantina oxidasa es una enzima con baja especificidad, que no solo puede catalizar la hipoxantina para formar xantina, y después generar ácido úrico, sino también catalizar directamente xantina para formar ácido úrico. Los inhibidores de xantina oxidasa son los fármacos de primera línea para el tratamiento de hiperuricemia. Actualmente, los principales fármacos en el mercado son alopurinol y febusteína. Sin embargo, dichos fármacos no pueden satisfacer las necesidades clínicas de todos los pacientes y tienen efectos secundarios significativos. El alopurinol es la única terapia reductora del ácido úrico disponible en todo el mundo, pero se ha asociado con graves sucesos adversos cutáneos. Las reacciones de hipersensibilidad grave relacionadas con alopurinol están estrechamente relacionadas con el antígeno leucocitario (HLA)-B*5801, y las personas chinas tienen una tasa positiva de HLA-B*5801 (6 % ~ 8 %) mayor que la de las personas blancas (~ 2 %) y tienen un mayor riesgo de aparición de la reacción de hipersensibilidad. El efecto de disminución del ácido úrico de la febusteína es mejor que el del alopurinol, pero a una dosis alta de 80 mg/día, del 40 % al 52 % de los pacientes no logran el objetivo esperado de disminución del ácido úrico y los ataques de gota aguda aumentan. En noviembre de 2017, la U.S. Food and Drug Administration emitió una afirmación de que el febuxostat puede aumentar realmente las muertes relacionadas con el corazón y por cualquier causa en comparación con alopurinol y se necesita un estudio adicional.

El PF-06743649 es el único inhibidor de doble diana de xantina oxidasa y Urat1 que ha entrado en la etapa de investigación clínica. Sin embargo, en el ensayo de fase clínica I, 2 sujetos desarrollaron efectos secundarios agudos de lesión renal inducida por PF-06743649 después de la administración. El análisis sugirió que esto podía estar relacionado con la precipitación de ácido úrico en los túbulos renales provocada por la mayor actividad inhibidora de Urat1 de PF-06743649 (Clin Rheumatol. 2016, 35, 2045-2051).

Según el análisis anterior, todavía existe una necesidad clínica no satisfecha de fármacos reductores del ácido úrico seguros y eficaces en el mercado.

El inhibidor de xantina oxidasa de la presente divulgación tiene buena actividad inhibidora de xantina oxidasa, y se espera que tenga un buen efecto de reducción del ácido úrico en la sangre del cuerpo humano.

Compendio de la invención

La presente divulgación proporciona un compuesto representado por la fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo,

en donde,

cada R1 se selecciona independientemente de H, halógeno, OH, NH2, CN, alquilo de C1-3, y alcoxi de C1-3, y el alquilo de C1-3 y el alcoxi de C1-3 están opcionalmente sustituidos con 1, 2 o 3 Ra;

n se selecciona de 0, 1,2, 3 y 4;

Ra se selecciona de H, F, Cl, Br, I, OH y NH2;

R2 se selecciona de H, halógeno, OH, NH2 y CN; y

el anillo A se selecciona de cicloalquilo de C5-6 y heterocicloalquilo de 5-6 miembros.

En algunos aspectos de la presente divulgación, cada uno de los R1 anteriores se selecciona independientemente de H, F, Cl, Br, I, OH, NH2, CH3, CH3CH2, y CH3O, y el CH3, el CH3CH2 y el CH3O están opcionalmente sustituidos con 1, 2 o 3 Ra y otras variables son como se definen en la presente divulgación.

En algunas realizaciones de la presente divulgación, cada uno de los R1 anteriores se selecciona independientemente de H, F, Cl, Br, I, OH, NH2, CH3, CH3CH2, CH3O, y CF3 y otras variables son como se definen en la presente divulgación. En algunas realizaciones de la presente divulgación, el anillo A anterior se selecciona de ciclopentilo, ciclohexilo, tetrahidrofuranilo, pirrolidinilo, tetrahidropiranilo, dioxanilo y piperidilo, y otras variables son como se definen en la presente divulgación.

En algunas realizaciones de la presente divulgación, el anillo A anterior se selecciona de ciclopentilo, ciclohexilo, tetrahidrofuranilo y dioxanilo, y otras variables son como se definen en la presente divulgación.

En algunas realizaciones de la presente divulgación, la unidad estructural anterior

se selecciona de

y otras variables son como se definen en la presente divulgación.

En algunas realizaciones de la presente divulgación, la unidad estructural anterior

y otras variables son como se definen en la presente divulgación.

En algunas realizaciones de la presente divulgación, el anillo A anterior se selecciona de ciclopentilo, ciclohexilo, tetrahidrofuranilo, pirrolidinilo, tetrahidropiranilo y piperidilo, y otras variables son como se definen en la presente divulgación.

En algunas realizaciones de la presente divulgación, el anillo A anterior se selecciona de ciclopentilo y ciclohexilo, y otras variables son como se definen en la presente divulgación.

Algunas realizaciones de la presente divulgación proporcionan el compuesto anterior representado por la fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo,

en donde,

cada R1 se selecciona independientemente de H, halógeno, OH, NH2, CN, alquilo de C1-3, y alcoxi de C1-3, y el alquilo de C1-3 y el alcoxi de C1-3 están opcionalmente sustituidos con 1, 2 o 3 Ra;

n se selecciona de 0, 1,2, 3 y 4;

Ra se selecciona de H, F, Cl, Br, I, OH y NH2;

R2 se selecciona independientemente de H, halógeno, OH, NH2 y CN; y

el anillo A se selecciona de cicloalquilo de C5-6 y heterocicloalquilo de 5-6 miembros.

En algunas realizaciones de la presente divulgación, el R1 anterior se selecciona de H, F, Cl, Br, I, OH, NH2, CH3, CH3CH2, y CH3O, y el CH3, el CH3CH2 y el CH3O están opcionalmente sustituidos con 1, 2 o 3 Ra, y otras variables son como se definen en la presente divulgación.

En algunas realizaciones de la presente divulgación, el R1 anterior se selecciona de H, F, Cl, Br, I, OH, NH2, CH3, CH3CH2, CH3O, y CF3, y otras variables son como se definen en la presente divulgación.

En algunas realizaciones de la presente divulgación, el anillo A anterior se selecciona de ciclopentilo, ciclohexilo, tetrahidrofuranilo, pirrolidinilo, tetrahidropiranilo y piperidilo, y otras variables son como se definen en la presente divulgación.

En algunas realizaciones de la presente divulgación, el anillo A anterior se selecciona de ciclopentilo y ciclohexilo, y otras variables son como se definen en la presente divulgación.

En algunas realizaciones de la presente divulgación, la unidad estructural anterior

y otras variables son como se definen en la presente divulgación.

En algunas realizaciones de la presente divulgación, la unidad estructural anterior

y otras variables son como se definen en la presente divulgación.

También hay algunas realizaciones de la presente divulgación que están formadas por cualquier combinación de las variables anteriores.

En algunas realizaciones de la presente divulgación, el compuesto anterior, que se selecciona de

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo,

en donde, Ri, n, y R2 son como se definen en la presente divulgación; y

Ei, E2, y E3 se seleccionan cada uno independientemente de CH2 y O.

La presente divulgación también proporciona compuestos representados por las siguientes fórmulas o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos:

En algunos aspectos de la presente divulgación, el compuesto anterior o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo es útil en la fabricación de un medicamento relacionado con un inhibidor de xantina oxidasa.

En algunos aspectos de la presente divulgación, el medicamento anterior relacionado con un inhibidor de xantina oxidasa es útil para el tratamiento de la artritis gotosa e hiperuricemia.

Efecto técnico

Como un inhibidor de xantina oxidasa, los compuestos de la presente divulgación tienen buena actividad inhibidora de xantina oxidasa. Los fármacos relacionados son útiles como inhibidores de fármacos para la artritis gotosa y la hiperuricemia, y tienen grandes perspectivas de aplicación en el tratamiento de la artritis gotosa y la hiperuricemia.

Definiciones y Términos

A menos que se especifique lo contrario, los siguientes términos y frases usados en la presente memoria pretenden tener los siguientes significados. Un término o frase específico no debe considerarse indefinido o poco claro en ausencia de una definición particular, sino que debe entenderse en el sentido convencional. Cuando aparece un nombre comercial en la presente memoria, se pretende que se refiera a su correspondiente producto o ingrediente activo del mismo.

El término "farmacéuticamente aceptable" se usa en la presente memoria en términos de aquellos compuestos, materiales, composiciones y/o formas de dosificación, que son adecuados para su uso en contacto con tejidos humanos y animales dentro del alcance de un criterio médico fiable, sin toxicidad, irritación, reacción alérgica u otros problemas o complicaciones excesivas, en consonancia con una relación beneficio/riesgo razonable.

El término "sal farmacéuticamente aceptable" se refiere a una sal del compuesto descrito en la presente memoria que se prepara haciendo reaccionar el compuesto que tiene un sustituyente específico descrito en la presente memoria con un ácido o base relativamente no tóxico. Cuando el compuesto descrito en la presente memoria contiene un grupo funcional relativamente ácido, se puede obtener una sal de adición de base poniendo el compuesto en contacto con una cantidad suficiente de base en una solución pura o un disolvente inerte adecuado. La sal de adición de base farmacéuticamente aceptable incluye una sal de sodio, potasio, calcio, amonio, amina orgánica o magnesio o sales similares. Cuando el compuesto descrito en la presente memoria contiene un grupo funcional relativamente básico, se puede obtener una sal de adición de ácido poniendo el compuesto en contacto con una cantidad suficiente de ácido en una solución pura o un disolvente inerte adecuado. Los ejemplos de la sal de adición de ácido farmacéuticamente aceptable incluyen una sal de ácido inorgánico, en donde el ácido inorgánico incluye, por ejemplo, ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido nítrico, ácido carbónico, bicarbonato, ácido fosfórico, monohidrógeno fosfato, dihidrógeno fosfato, ácido sulfúrico, hidrogeno sulfato, ácido yodhídrico, ácido fosforoso y similares; y una sal de ácido orgánico, en donde el ácido orgánico incluye, por ejemplo, ácido acético, ácido propiónico, ácido isobutírico, ácido maleico, ácido malónico, ácido benzoico, ácido succínico, ácido subérico, ácido fumárico, ácido láctico, ácido mandélico, ácido Itálico, ácido bencenosulfónico, ácido p-toluenosulfónico, ácido cítrico, ácido tartárico y ácido metanosulfónico y similares; y una sal de aminoácido (tal como arginina y similares), y una sal de un ácido orgánico tal como ácido glucurónico y similares. Ciertos compuestos específicos descritos en la presente memoria contienen grupos funcionales tanto básicos como ácidos y pueden convertirse en cualquier sal de adición de base o ácido.

La sal farmacéuticamente aceptable descrita en la presente memoria se puede preparar a partir del compuesto original que contiene un resto ácido o básico mediante métodos químicos convencionales. Generalmente, dicha sal puede prepararse haciendo reaccionar la forma de ácido o base libre del compuesto con una cantidad estequiométrica de una base o ácido apropiado en agua o un disolvente orgánico o una mezcla de los mismos.

El compuesto descrito en la presente memoria puede estar presente en una forma geométrica o estereoisomérica específica. La presente divulgación contempla todos estos compuestos, incluyendo isómero cis y trans, enantiómero (-) y (+), enantiómero (R) y (S), diastereómero, isómero (D), isómero (L) y mezcla racémica y otras mezclas, por ejemplo, una mezcla enriquecida en enantiómero o diastereómero, todos los cuales están incluidos dentro del alcance divulgado en la presente memoria. El sustituyente tal como alquilo puede tener un átomo de carbono asimétrico adicional. Todos estos isómeros y mezclas de los mismos están incluidos dentro del alcance descrito en la presente memoria.

A menos que se especifique lo contrario, el término "enantiómero" o "isómero óptico" se refiere a estereoisómeros que están en una relación especular entre sí.

A menos que se especifique lo contrario, el término "isómero cis-trans" o "isómero geométrico" se produce por la incapacidad de un doble enlace o un enlace sencillo entre los átomos de carbono que forman el anillo para girar libremente.

A menos que se especifique lo contrario, el término "diastereómero" se refiere a un estereoisómero que tiene dos o más centros quirales en una molécula y está en una relación no especular entre moléculas.

A menos que se especifique lo contrario, "(+)" significa dextroisómero, "(-)" significa levoisómero, y "(±)" significa racemato.

A menos que se especifique lo contrario, un enlace sólido en cuña ) y un enlace discontinuo en cuña (■•' ) indican la configuración absoluta de un estereocentro; un enlace solido recto ) y un enlace discontinuo recto(•''') indican la configuración relativa de un estereocentro; una línea ondulada ) indica un enlace sólido en cuña ) o un enlace discontinuo en cuña (■•’’' ); o una línea ondulada(***“ )indica un enlace sólido recto {*** ) o un enlace discontinuo recto ).

A menos que se especifique lo contrario, el término "enriquecido en un isómero", "enriquecido en isómero", "enriquecido en un enantiómero" o "enriquecido en enantiómero" significa que el contenido de un isómero o enantiómero es menor del 100 %, y el contenido del isómero o enantiómero es del 60 % o más, o del 70 % o más, o del 80 % o más, o del 90 % o más, o del 95 % o más, o del 96 % o más, o del 97 % o más, del 98 % o más, del 99 % o más, del 99,5 % o más, del 99,6 % o más, del 99,7 % o más, del 99,8 % o más, o del 99,9 % o más.

A menos que se especifique lo contrario, el término "exceso de isómero" o "exceso enantiomérico" se refiere a la diferencia entre los porcentajes relativos de dos isómeros o dos enantiómeros. Por ejemplo, si un isómero o enantiómero está presente en una cantidad del 90% y el otro isómero o enantiómero está presente en una cantidad del 10%, el exceso de isómero o enantiomérico (valor ee) es del 80%.

El isómero (R) y (S) ópticamente activo, o los isómeros D y L pueden prepararse usando síntesis quiral o reactivos quirales u otras técnicas convencionales. Si se va a obtener un tipo de enantiómero de cierto compuesto descrito en la presente memoria, el enantiómero deseado puro se puede obtener mediante síntesis asimétrica o acción derivada de un auxiliar quiral seguido de la separación de la mezcla diastereomérica resultante y la escisión del grupo auxiliar.

Alternativamente, cuando la molécula contiene un grupo funcional básico (tal como amino) o un grupo funcional ácido (tal como carboxilo), el compuesto reacciona con un ácido o base ópticamente activo apropiado para formar una sal del isómero diastereomérico que después se somete a resolución diastereomérica mediante el método convencional en la técnica para dar el enantiómero puro. Además, el enantiómero y el diastereómero se aíslan generalmente mediante cromatografía que utiliza una fase estacionaria quiral y opcionalmente se combina con un método de derivados químicos (por ejemplo, carbamato generado a partir de amina).

Los compuestos descritos en la presente memoria pueden contener una proporción no natural de isótopos atómicos en uno o más de los átomos que constituyen los compuestos. Por ejemplo, un compuesto puede marcarse con un radioisótopo tal como tritio (3H), yodo-125 (125I) o C-14 (14C). Para otro ejemplo, el hidrógeno puede sustituirse por hidrógeno pesado para formar un fármaco deuterado. El enlace entre deuterio y carbono es más fuerte que entre hidrógeno ordinario y carbono. En comparación con los fármacos no deuterados, los fármacos deuterados tienen ventajas de efectos secundarios tóxicos reducidos, estabilidad aumentada del fármaco, eficacia potenciada y semivida biológica prolongada de los fármacos. Todos los cambios en la composición isotópica de los compuestos descritos en la presente memoria, independientemente de la radiactividad, están incluidos dentro del alcance de la presente divulgación.

El término "sustituido" significa que uno o más de un átomo (s) de hidrógeno en un átomo específico están sustituidos por un sustituyente, incluyendo deuterio y variantes de hidrógeno, siempre que la valencia del átomo específico sea normal y el compuesto sustituido sea estable. Cuando el sustituyente es oxo (es decir, =O), significa que dos átomos de hidrógeno están sustituidos. Las posiciones en un anillo aromático no pueden estar sustituidas por oxo. El término "opcionalmente sustituido" significa que un átomo puede estar sustituido con un sustituyente o no, a menos que se especifique lo contrario, las especies y el número del sustituyente pueden ser arbitrarios siempre que puedan lograrse químicamente.

Cuando cualquier variable (tal como R) aparece en la constitución o estructura del compuesto más de una vez, la definición de la variable en cada aparición es independiente. Así, por ejemplo, si un grupo está sustituido con 0-2 R, el grupo puede estar opcionalmente sustituido con hasta dos R, en donde la definición de R en cada aparición es independiente. Además, una combinación del sustituyente y/o la variante del mismo se permite solo cuando la combinación da como resultado un compuesto estable.

Cuando el número de un grupo de enlace es 0, tal como -(CRR)0-, significa que el grupo de enlace es un enlace sencillo.

Cuando el número de sustituyentes es 0, significa que el sustituyente no existe. Por ejemplo, -A-(R)0 significa que la estructura es realmente -A.

Cuando un sustituyente está vacante, significa que el sustituyente no existe. Por ejemplo, cuando X en A-X está vacante, significa que la estructura es realmente A.

Cuando una de las variables es un enlace sencillo, significa que los dos grupos unidos por el enlace sencillo están conectados directamente. Por ejemplo, cuando L en A-L-Z representa un enlace sencillo, la estructura de A-L-Z es realmente A-Z.

Cuando el enlace de un sustituyente puede estar reticulado a dos o más átomos en un anillo, dicho sustituyente puede estar unido a cualquier átomo en el anillo, por ejemplo, la unidad estructural

significa que la sustitución con el sustituyente R puede producirse en cualquier posición del ciclohexilo o del ciclohexadieno. Cuando un sustituyente enumerativo no indica a través de qué átomo está unido al grupo sustituido, dicho sustituyente puede estar unido a través de uno cualquiera de sus átomos. Por ejemplo, un grupo piridilo como sustituyente puede estar unido al grupo sustituido a través de uno cualquiera de los átomos de carbono del anillo de piridina.

Cuando un grupo de enlace enumerativo no indica su dirección de enlace, su dirección de enlace es arbitraria. Por ejemplo, cuando el grupo de enlace L en

es -M-W-, el -M-W- puede estar unido al anillo A y al anillo B en la misma dirección que el orden de lectura de izquierda a derecha para constituir

o puede estar unido al anillo A y al anillo B en sentido inverso que el orden de lectura de izquierda a derecha para constituir

Una combinación de los grupos de enlace, sustituyentes y/o variantes de los mismos se permite sólo cuando dicha combinación puede dar como resultado un compuesto estable.

A menos que se especifique lo contrario, cuando un grupo tiene uno o más sitios conectables, uno cualquiera o más sitios del grupo pueden conectarse a otros grupos a través de enlaces químicos. Cuando la posición de conexión del enlace químico es variable, y hay átomo(s) de H en un sitio(s) conectable, cuando el sitio(s) conectable que tiene átomo(s) de H está conectado al enlace químico, el número de átomo(s) de H en este sitio disminuirá correspondientemente a medida que aumente el número del enlaces químicos conectados, y el grupo se convertirá en un grupo de valencia correspondiente. El enlace químico entre el sitio y otros grupos puede representarse por un / /

enlace sólido recto ( / ), un enlace discontinuo recto (-' ) o una línea ondulada ( ). Por ejemplo, el enlace sólido recto en -OCH3 indica que el grupo está conectado a otros grupos a través del átomo de oxígeno en el grupo; el enlace discontinuo recto en

indica que el grupo está conectado a otros grupos a través de dos extremos del átomo de nitrógeno en el grupo; la línea ondulada en

indica que el grupo está conectado a otros grupos a través de los átomos de carbono 1 y 2 en el grupo fenilo;

indica que cualquier sitio conectable en el grupo piperidilo puede estar conectado a otros grupos a través de un enlace químico, incluyendo al menos cuatro formas de conexión

incluso si un átomo de H está dibujado en -N-,

todavía incluye la forma de conexión

es justo que cuando un enlace químico está conectado, el H en este sitio se reducirá en uno, y el grupo se convertirá en el grupo piperidilo monovalente correspondiente.

A menos que se especifique lo contrario, el número de átomos en un anillo se define generalmente como el número de miembros del anillo, por ejemplo, "anillo de 5-7 miembros" se refiere a un "anillo" que tiene dispuestos 5-7 átomos en el anillo.

A menos que se especifique lo contrario, "anillo de 5-6 miembros" significa cicloalquilo, heterocicloalquilo, cicloalquenilo, heterocicloalquenilo, cicloalquinilo, heterocicloalquinilo, arilo o heteroarilo que consisten en 5 a 6 átomos en el anillo. Dicho anillo incluye un solo anillo, y también incluye sistemas de anillos bicíclicos tales como espiro, anillos condensados y con puente. A menos que se especifique lo contrario, el anillo contiene opcionalmente 1, 2 o 3 heteroátomos seleccionados independientemente de O, S y N. El anillo de 5-6 miembros incluye un anillo de 5 miembros, de 6 miembros y similares. "Anillo de 5-6 miembros" incluye, por ejemplo, fenilo, piridilo, piperidilo y similares; por otro lado, el término "heterocicloalquilo de 5-6 miembros" incluye piperidilo y similares, pero no incluye fenilo. El término “anillo” también incluye un sistema de anillo que contiene al menos un anillo, en donde cada anillo cumple independientemente la definición anterior.

A menos que se especifique lo contrario, "cicloalquilo de C5-6” significa un grupo hidrocarburo cíclico saturado que consiste en 5 a 6 átomos de carbono, que es un sistema de anillo monocíclico, que puede ser monovalente, divalente o polivalente. Ejemplos de grupos cicloalquilo de C5-6 incluyen, pero no se limitan a, ciclopentilo, ciclohexilo, y similares.

A menos que se especifique lo contrario, Cn-n+m o Cn-Cn+m incluye uno cualquiera de n a n+m carbonos. Por ejemplo,

C1-12 incluye C1 , C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9, C10, C11, y C12. C n-n+m o Cn- Cn n a n+m. Por ejemplo, C1-12 incluye C1-3, C1-6, C1-9, C3-6, C3-9, C3-12, C6-9, C6-12, C9-12, y similares. De manera similar, el anillo de n miembros a n+m miembros significa que el número de átomos en el anillo es de n a n+m. Por ejemplo, el anillo de 3 a 12 miembros incluye un anillo de 3 miembros, un anillo de 4 miembros, un anillo de 5 miembros, un anillo de 6 miembros, un anillo de 7 miembros, un anillo de 8 miembros, un anillo de 9 miembros, un anillo de 10 miembros, un anillo de 11 miembros y un anillo de 12 miembros. El anillo de n miembros a n+m miembros también significa que el número de átomos en el anillo incluye cualquier intervalo de n a n+m. Por ejemplo, el anillo de 3- a 12 miembros incluye un anillo de 3 a 6 miembros, un anillo de 3 a 9 miembros, un anillo de 5 a 6 miembros, un anillo de 5 a 7 miembros, un anillo de 6 a 7 miembros, un anillo de 6 a 8 miembros y un anillo de 6 a 10 miembros y similares.

A menos que se especifique lo contrario, el término "heterocicloalquilo de 5-6 miembros", por sí mismo o en combinación con otro término, se refiere a un grupo cíclico saturado compuesto de 5 a 6 átomos en el anillo respectivamente, en donde 1, 2, 3 o 4 átomos en el anillo son heteroátomos seleccionados independientemente de O,

S y N, y el resto son átomos de carbono, en donde el átomo de nitrógeno está opcionalmente cuaternizado, y los heteroátomos de nitrógeno y azufre pueden estar opcionalmente oxidados (es decir, NO y S(O)p, p es 1 o 2). Se incluyen sistemas monocíclicos y bicíclicos, en donde el sistema bicíclico incluye anillos espiro, condensados y con puente. Además, en términos del "heterocicloalquilo de 5-6 miembros", el heteroátomo puede ocupar la posición a través de la cual el heterocicloalquilo está unido al resto de la molécula. El heterocicloalquilo de 5-6 miembros incluye heterocicloalquilos de 5 miembros y 6 miembros. Los ejemplos del heterocicloalquilo de 5-6 miembros incluyen, pero no se limitan a, pirrolidinilo, pirazolidinilo, imidazolidinilo, tetrahidrotiofenilo (incluyendo tetrahidrotiofen-2 -ilo y tetrahidrotiofen-3-ilo etc.), tetrahidrofuranilo (incluyendo tetrahidrofuran-2-ilo etc.), tetrahidropiranilo, piperidilo (incluyendo 1 -piperidilo, 2-piperidilo y 3-piperidilo etc.), piperazinilo (incluyendo 1 -piperazinilo y 2-piperazinilo etc.), morfolinilo (incluyendo 3-morfolinilo y 4-morfolinilo etc.), dioxanilo, ditianilo, isoxazolidinilo, isotiazolidinilo, 1 ,2 -oxazinilo, 1 ,2 -tiazinilo, hexahidropiridazinilo, homopiperazinilo u homopiperidilo.

A menos que se especifique lo contrario, el término "alquilo de C1-3" se usa para indicar un grupo hidrocarbonado saturado lineal o ramificado que consiste en 1 a 3 átomos de carbono. El grupo alquilo de C1-3 incluye grupos alquilo de C1-2 y C2-3 y similares. Puede ser monovalente (por ejemplo, metilo), divalente (por ejemplo, metileno) o multivalente

(por ejemplo, metenilo). Ejemplos de grupos alquilo de C1-3 incluyen, pero no se limitan a, metilo (Me), etilo (Et), propilo (incluyendo n-propilo e isopropilo), y similares.

A menos que se especifique lo contrario, el término "alcoxi de C1-3'' significa grupos alquilo que contienen de 1 a 3 átomos de carbono y unidos al resto de una molécula mediante un átomo de oxígeno. El grupo alcoxi de C1-3 incluye grupos alcoxi de C1-2, C2-3, C3, y C2, y similares. Ejemplos de grupos alcoxi de C1-3 incluyen, pero no se limitan a, metoxi, etoxi, propoxi (incluyendo n-propoxi e isopropoxi), y similares.

El compuesto descrito en la presente memoria puede prepararse mediante una variedad de métodos sintéticos bien conocidos por el experto en la técnica, incluyendo la siguiente realización enumerativa, la realización formada por la siguiente realización enumerativa en combinación con otros métodos de síntesis química y la sustitución equivalente bien conocida por el experto en la técnica. La realización alternativa incluye, pero no se limita a la realización divulgada en la presente memoria.

Las estructuras de los compuestos de la presente divulgación pueden confirmarse mediante métodos convencionales bien conocidos por los expertos en la técnica. Si la presente divulgación se refiere a una configuración absoluta de un compuesto, la configuración absoluta puede confirmarse mediante técnicas convencionales en la técnica, tales como difracción de rayos X de monocristal (SXRD). En la difracción de rayos X de monocristal (SXRD), los datos de intensidad de difracción del monocristal cultivado se recogen usando un difractómetro Bruker D8 venture con una fuente de luz de radiación CuKa en un modo de barrido de barrido de 9 /w; después de recoger los datos relevantes,

la estructura cristalina se analiza adicionalmente mediante el método directo (Shelxs97) para confirmar la configuración absoluta.

Todos los disolventes usados en la presente divulgación están disponibles comercialmente.

La presente divulgación emplea las siguientes abreviaturas: DMSO representa dimetilsulfóxido; HCl representa ácido clorhídrico; y ACN representa acetonitrilo.

Los compuestos se nombran según los principios de nomenclatura generales en la técnica o mediante el software ChemDraw® y los compuestos disponibles comercialmente se nombran con sus nombres del directorio del proveedores.

Descripción detallada de la invención

La presente divulgación se describe en detalle a continuación por medio de ejemplos. Sin embargo, no se pretende que estos ejemplos tengan limitaciones desventajosas a la presente divulgación. La presente divulgación se ha descrito en detalle en la presente memoria, y las realizaciones también se divulgan en la presente memoria. Será evidente para los expertos en la técnica que se pueden realizar diversos cambios y modificaciones a las realizaciones descritas en la presente memoria sin apartarse del alcance descrito en la presente memoria

Ejemplo 1: Preparación del Compuesto 1

[0068]

Etapa 1: síntesis del compuesto 1-2

El Compuesto1-1(1,0 g, 3,46 mmol) se disolvió en un disolvente mixto de metanol (5 mL) y agua (5 mL), y después se añadió hidróxido de sodio (276,62 mg, 6,92 mmol). La solución de reacción resultante se agitó a 55°C durante 4 horas. El metanol se eliminó mediante evaporación rotatoria, y el residuo se ajustó a pH 2-3 con ácido clorhídrico 2M. Se precipitó una gran cantidad de sólido. El sólido se recogió por filtración para dar un producto bruto, que se añadió a acetato de etilo/éter de petróleo (V/V = 1:1, 3 mL) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 10 minutos. El sólido se recogió por filtración y se secó al vacío a 45°C durante 30 minutos para dar el compuesto1-2.1H NMR: (400 MHz, CDCla) 8: 3,06 - 3,00 (m, 2H), 2,59 - 2,52 (m, 2H), 1,81 - 1,68 (M, 4H); MS (ESI) : m/z 260,9 [M+H]+.

Etapa 2: síntesis del compuesto 1-3

El Compuesto1-2(390 mg, 1,49 mmol) se disolvió en diclorometano (2 mL) y después se añadió carbonildiimidazol (290,60 mg, 1,79 mmol). La solución de reacción resultante se agitó a 25°C durante 1 hora. La solución de reacción se vertió después en amoniaco acuoso (1,54 g, 7,47 mmol, 1,69 mL, contenido del 17%) y después se agitó vigorosamente durante 20 minutos. El disolvente se evaporó para dar el producto bruto, y después se purificó mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (acetato de etilo/éter de petróleo = 0~35 %) para dar el compuesto1-3.

1H NMR: (400 MHz, CDCla) 8: 5,56 (sa, 1H), 2,99 - 2,94 (m, 2H), 2,59 - 2,53 (m, 2H), 1,81 - 1,74 (m, 4H); MS (ESI): m/z 259,6 [M+H]+.

Etapa 3: síntesis del compuesto 1-4

El Compuesto1-3(271 mg, 1,04 mmol) se disolvió en N,N-dimetilformamida (1 mL), y la solución resultante se enfrió a 0°C, y después se añadió cloruro cianúrico (230,52 mg, 1,25 mmol) para proporcionar la solución de reacción final. Se retiró el baño de hielo y la solución de reacción se agitó a temperatura ambiente de 25°C durante 1 hora. La solución de reacción se diluyó con acetato de etilo (20 mL) y después se lavó con agua (3 mLx3). La fase orgánica se secó con una cantidad apropiada de sulfato de sodio anhidro, después se filtró y el disolvente se eliminó a presión reducida para dar el producto bruto. El producto bruto se purificó mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (acetato de etilo/éter de petróleo = 0~3 %) para dar el compuesto1-4.

Etapa 4: síntesis del compuesto 1-5

El Compuesto1-4(82 mg, 338,65 |jmol), ácido borónico1-4A(106,67 mg, 507,98 |jmol) y carbonato de potasio (93,61 mg, 677,31 jm ol) se disolvieron en un disolvente mixto de dioxano (2 mL) y agua (0,4 mL), y después se añadió dicloruro de 1,1'-bis(difenilfosfino)ferroceno]paladio (Pd(dppf)Cb) (24,78 mg, 33,87 jmol). Después de que el gas en el sistema se reemplazara completamente por nitrógeno, la solución de reacción se colocó en un baño de aceite a 110°C y se agitó durante 18 horas. El disolvente se evaporó para dar el producto bruto, que se purificó mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (acetato de etilo/éter de petróleo = 0~20%) para dar el compuesto1-5.

MS (ESI): m/z 327,9 [M+H]+.

Etapa 5: síntesis del compuesto 1-6

El Compuesto1-5(40 mg, 122,18 jm ol) se disolvió en diclorometano anhidro (0,5 mL) y se enfrió a 0°C con un baño de hielo, y después se añadió tribromuro de boro (61,22 mg, 244,35 jmol, 23,54 jL ) bajo nitrógeno. La solución de reacción obtenida se agitó a 25°C durante 2 horas. Se añadió agua (0,5 mL) para parar la reacción en un baño de hielo-agua, y después se añadió acetato de etilo (10 mL) y se agitó hasta disolución. La solución obtenida se lavó con agua (2 mLx2) y la fase orgánica se evaporó para dar el compuesto bruto1-6.El producto bruto se usó directamente en la siguiente etapa.

Etapa 6: síntesis del compuesto 1

El Compuesto1-6(37,83 mg, 120,71 jm ol) se disolvió en tetrahidrofurano (1 mL) y agua (1 mL), y después se añadió hidróxido de litio monohidrato (15,20 mg, 362,12 jmol). La solución de reacción resultante se agitó a 25°C durante 15 horas. El disolvente se eliminó a presión reducida, después el residuo se ajustó a pH 2-3 con ácido clorhídrico 1 M. El producto bruto se purificó mediante HPLC preparativa (columna cromatográfica: Venusil ASB Phenyl 150*30mm*5jm; fase móvil: [Agua (HCl al 0,05 %)-ACN]; ACN %: 65 %-95 %, 9 min) para dar el Compuesto1.

1H NMR: (400 MHz, MeOD-d4) 8: 7,96 (d,J= 8,0 Hz, 1H), 7,13 - 7,05 (m, 2H), 2,90 (t,J= 6,4 Hz, 2H), 2,83 (t,J= 6,4 Hz, 2H), 1,93 - 1,77 (m, 4H). MS (ESI): m/z 299,9 [M+H]+.

Ejemplo 2: Preparación del Compuesto 2

Etapa 1: síntesis del compuesto 2-2

El Compuesto2-1(2,5 g, 10,15 mmol) se disolvió en metanol (10 mL) y se añadieron agua (10 mL) e hidróxido de sodio (1,62 g, 40,61 mmol). La solución de reacción resultante se colocó en un baño de aceite a 40°C y se agitó durante 2 horas. La solución de reacción se concentró a presión reducida hasta la mitad del volumen, y se añadió agua (5 mL) al residuo. Se usó ácido clorhídrico 6 M para ajustar el pH = 2~3 con agitación, y precipitó una gran cantidad de sólido blanco. El sólido se recogió por filtración y se secó al vacío a 50°C durante 3 horas para dar el compuesto2-2.1H NMR (400 MHz, CDCb) 8: 7,28 (s, 1H), 3,30 (t,J= 7,0 Hz, 2H), 3,22 (t,J= 14,3 Hz, 2H), 2,25 (tt,J= 6,8, 13,4 Hz, 2H).

Etapa 2: síntesis del compuesto 2-3

El Compuesto2-2(500 mg, 2,29 mmol) se disolvió en diclorometano (5 mL) y después se añadió carbonildiimidazol (445,83 mg, 2,75 mmol). La solución de reacción resultante se agitó bajo nitrógeno durante 1 hora y después se vertió en agua amoniacal agitada vigorosamente (2,87 g, 22,91 mmol, 3,15 mL, contenido del 28 %) en tetrahidrofurano (5 mL). La solución de reacción se agitó durante 30 minutos, se concentró a presión reducida a 25°C y el residuo se extrajo con acetato de etilo (20 mLx3). Las fases orgánicas se combinaron y se evaporaron en un rotavapor para dar un producto bruto. El producto bruto se purificó mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (acetato de etilo/éter de petróleo = 0~45 %) para dar el compuesto2-3.1H NMR (400 MHz, CDCla ) 8: 7,10 (s, 1H), 5,58 (sa, 2H), 3,28 (t,J= 6,9 Hz, 2H), 3,21 (t,J= 14,4 Hz, 2H), 2,24 (tt,J= 6,9, 13,4 Hz, 2H).

Etapa 3: síntesis del compuesto 2-4

El Compuesto2-3(320 mg, 1,47 mmol) se disolvió en DMF (3 mL) y se enfrió a 0°C. Después, se añadió cloruro cianúrico (298,81 mg, 1,62 mmol) y la solución de reacción se agitó bajo nitrógeno durante 2 horas (se precipitó una gran cantidad de sólido blanco durante este tiempo). La solución de reacción se diluyó con acetato de etilo (50 mL), después se lavó con agua (10 mLx3) y salmuera saturada (10 mL), se secó con una cantidad apropiada de sulfato de sodio anhidro, se filtró y el disolvente se eliminó a presión reducida para dar el compuesto bruto2-4, que se usó directamente en la siguiente etapa. 1H NMR: (400 MHz, CDCla) 8: 7,25 (s, 1H), 3,21 (t,J= 14,3 Hz, 2H), 3,09 (t,J= 6,9 Hz, 2H), 2,28 (tt,J= 6,8, 13,2 Hz, 2H).

Etapa 4: síntesis del compuesto 2-5

El Compuesto2-4(290 mg, 1,46 mmol) se disolvió en ácido acético (2 mL) y después se añadió bromo líquido (348,94 mg, 2,18 mmol, 112,56 j L). La solución de reacción se agitó a 25°C durante 15 horas. La solución de reacción se eliminó a presión reducida y se añadió acetato de etilo (30 mL) al residuo. La mezcla se ajustó después a pH 7-8 con carbonato de sodio saturado. La fase orgánica se separó, y la fase acuosa se extrajo con acetato de etilo (30 mL). Las fases orgánicas combinadas se concentraron a presión reducida para dar un producto bruto. El producto bruto se purificó mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (acetato de etilo/éter de petróleo = 0~5%) para dar el compuesto2 -5.1H NMR: (400 MHz, CDCla) 8: 3,10 - 2,99 (m, 4H), 2,32 - 2,19 (m, 2H).

Etapa 5: síntesis del compuesto 2-6

El Compuesto2-5(140 mg, 503,39 jmol), boronato2-5A(178.39 mg, 553,73 jm ol) y carbonato de potasio (139,14 mg, 1,01 mmol) se disolvieron en dioxano (3 mL) y agua (0,6 mL) y después se añadió dicloruro de 1,1'-bis(difenilfosfino)ferroceno]paladio (Pd(dppf)Ch) (36,83 mg, 50,34 jmol). La solución de reacción se calentó a 105°C bajo nitrógeno y se agitó durante 15 horas. La solución de reacción se eliminó a presión reducida para dar un producto bruto, que se purificó mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (acetato de etilo/éter de petróleo = 0~25 %) para dar el compuesto2 -6.1H NMR: (400 MHz, CHCb) 8: 7,87 (d,J= 8,0 Hz, 1H), 7,28 (d,J= 1,6 Hz, 1H), 7,10 (dd,J= 1,6, 8,0 Hz, 1H), 5,0 (s, 2H), 3,3 (s, 3H), 3,55 (s, 3H), 3,23 (t,J= 14,4 Hz, 2H), 3,13 (t,J= 6,8 Hz, 2H), 2 ,39 2,24 (m, 2H).

Etapa 6: síntesis del compuesto 2-7

El Compuesto2-6(105 mg, 266,90 jm ol) se disolvió en tetrahidrofurano (2 mL) y después se añadió hidróxido de litio acuoso monohidrato (2 M, 533,80 j L). La solución de reacción resultante se agitó a 25°C durante 15 horas. Se eliminó el tetrahidrofurano de la solución de reacción a presión reducida a 40°C, y el residuo se ajustó a pH 2-3 con ácido clorhídrico 2 M. Se precipitó una gran cantidad de sólido. Se añadió acetato de etilo (50 mL) y la mezcla se agitó. Se separó el acetato de etilo, y la mezcla se evaporó en un rotavapor hasta sequedad para dar el Compuesto2-7.El producto bruto se usó directamente en la siguiente etapa.

Etapa 7: síntesis del compuesto 2

El Compuesto2-7(105 mg, 276,77 jm ol) se disolvió en metanol (1 mL) y después se añadió ácido clorhídrico (60,55 mg, 1,66 mmol, 59,36<j>L). La solución de reacción se volvió turbia, y la reacción se agitó a 25°C durante 3 horas. La solución de reacción se evaporó en un rotavapor hasta sequedad a 40°C, y el residuo obtenido se purificó mediante HPLC preparativa (columna cromatográfica: Venusil ASB Phenyl 150*30mm*5jm; fase móvil: [agua (HCl al 0,05 %)-ACN]; ACN %: 60 %-90 %, 9 min) para dar el compuesto2.

1H NMR (400 MHz, MeOD-d4) 8: 8,00 (d,J= 8,0 Hz, 1H), 7,13 - 7,04 (m, 2H), 3,35 - 3,32 (m, 2H), 3,12 (t,J= 7,2 Hz, 2H), 2,45 - 2,30 (m, 2H) ; MS (ESI) m/z: 334,02 [M-H]-.

Ejemplo 3: Preparación del Compuesto 3

Etapa 1: síntesis del compuesto 3-2

El Compuesto3-1(15,01 g, 82,36 mmol) se disolvió en N, N-dimetilformamida (80 mL) y después se añadió N-bromosuccinimida (23,46 g, 131,78 mmol). La mezcla se agitó a 25°C durante 12 h. El disolvente se eliminó a presión reducida, y el residuo se disolvió en acetato de etilo (60 mL), se lavó con agua (20 mL) y salmuera saturada (15 mL), y se secó sobre sulfato de sodio anhidro, y se filtró, y el filtrado se evaporó a presión reducida para eliminar el disolvente. Después, el residuo se purificó mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (acetato de etilo/éter de petróleo = 0~15 %) para dar el compuesto3-2.1H NMR (400 MHz, CDCb) 8: 3,76 (s, 3H), 2,91 (t,J= 7,2 Hz, 2H), 2,56 - 2,50 (m, 2H), 2,38 - 2,30 (m, 2H). MS (ESI): m/z 260,8 [M+H] .

Etapa 2: síntesis del compuesto 3-3

El Compuesto3-2(1,98 g, 7,58 mmol) se disolvió en una solución mixta de metanol (10 mL) y agua (10 mL) y después se añadió hidróxido de sodio (606,54 mg, 15,16 mmol). La mezcla de reacción se agitó a 50°C durante 1 hora. Después de que la reacción se completara, el disolvente se eliminó a presión reducida. Se añadió agua (20 mL) al residuo, seguido de lavado con acetato de etilo (10 mL). La fase acuosa se ajustó a pH 4~5 con ácido clorhídrico, y precipitó una gran cantidad de sólido gris-amarillo. Después de la filtración, la torta de filtro se lavó con agua (10 mL) y después se secó al vacío para dar el compuesto3-3.1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) 8: 13,09 (sa, 1H), 2,90 (t,J= 7,2 Hz, 2H), 2,58 - 2,53 (m, 2H), 2,39 - 2,33 (m, 2H); MS (ESI): m/z 246,8 [M+H] .

Etapa 3: síntesis del compuesto 3-4

El Compuesto3-3(1,57 g, 6,36 mmol) se disolvió en diclorometano (10 mL) y se añadió carbonildiimidazol (1,24 g, 7,63 mmol). La solución de reacción se agitó a 25°C durante 1,5 horas bajo nitrógeno, y después se vertió en una solución agitada de amoniaco acuoso (3 M, 21,19 mL) en tetrahidrofurano. La mezcla se agitó durante otras 0,5 h. El disolvente se eliminó a presión reducida y después se añadió acetato de etilo (20 mL). La mezcla resultante se lavó con agua (10 mL) y después salmuera saturada (5 mL), y la capa orgánica se secó sobre sulfato de sodio anhidro, se filtró y el filtrado se evaporó para eliminar el disolvente a presión reducida para dar un producto bruto. El producto bruto se purificó mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (acetato de etilo/éter de petróleo = 0~50%) para dar el compuesto3-4.1H NMR (400 MHz, DMSO-de) 87,60 - 6,90 (m, 2H), 2,93 (t,J= 8,0 Hz, 2H), 2,57 - 2,55 (m, 2H), 2,39 - 2,29 (m, 2H). MS (ESI): m/z 247,9 [M+H] .

Etapa 4: síntesis del compuesto 3-5

El Compuesto3-4(550 mg, 2,23 mmol) se disolvió en N,N-dimetilformamida (6 mL) y se añadió cloruro cianúrico (412,09 mg, 2,23 mmol) a 0°C. La solución de reacción se calentó a 25°C y se agitó bajo nitrógeno durante 2 horas. Se precipitó una gran cantidad de sólido blanco. La solución de reacción se diluyó con metil terc-butil éter (40 mL), después se lavó con agua (10 mL) y salmuera saturada (5 mL). Después la fase orgánica se secó sobre sulfato de sodio anhidro, se filtró y se eliminó el disolvente a presión reducida. El producto bruto se purificó mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (acetato de etilo/éter de petróleo = 0~20%) para dar el compuesto3-5.

1H NMR (400 MHz, CDCla) 8: 2,82 (t,J= 7,2 Hz, 2H), 2,59 - 2,52 (m, 2H), 2,44 - 2,35 (m, 2H).

Etapa 5: síntesis del compuesto 3-6

El Compuesto3-5(150 mg, 657,58 pmol), boronato3-5A(233,03 mg, 723,34 pmol) y dicloruro de 1,1'-bis(difenilfosfino)ferroceno]paladio (Pd(dppf)Cb) (48,12 mg, 65,76 pmol) se colocaron en el matraz de reacción, seguido de carbonato de potasio (181,76 mg, 1,32 mmol). Después, se añadió una mezcla de agua (0,6 mL) y dioxano (3 mL), y la solución de reacción se colocó en un baño de aceite a 105°C bajo nitrógeno durante 12 horas. El disolvente se eliminó a presión reducida para dar un producto bruto, que se purificó mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (acetato de etilo/éter de petróleo = 0~20%) para dar el compuesto3-6.1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) 8: 7,82 (d,J =8,0 Hz, 1H), 7,48 (s, 1H), 7,37 - 7,32 (m, 1H), 5,35 (s, 2H), 3,87 (s, 3H), 3,52 (s, 3H), 3,02 (t,J =8,0 Hz, 2H), 2,89 (t,J= 8,0 Hz, 2H), 2,61 - 2,51 (m, 2H).

Etapa 6: síntesis del compuesto 3-7

El Compuesto3-6(168 mg, 489,23 |jmol) se disolvió en tetrahidrofurano (5 mL) y después se añadió hidróxido de litio (2 M, 1,47 mL). La reacción se agitó a 23°C durante 2 horas. El pH se ajustó a 4~5 con ácido clorhídrico 2 M, y después se eliminó el tetrahidrofurano a presión reducida. Se añadió acetato de etilo (15 mL) al residuo, y la mezcla se lavó con agua (5 mL) y salmuera saturada (5 mL). La fase orgánica se secó con una cantidad apropiada de sulfato de sodio anhidro, se filtró y el disolvente se eliminó a presión reducida para dar el compuesto3-7bruto, que se usó directamente en la siguiente etapa. MS (ESI): m/z 329,9 [M+H] .

Etapa 7: síntesis del compuesto 3

El Compuesto3-7(160 mg, 485,78 jm ol) se disolvió en metanol (2 mL) y se añadió ácido clorhídrico (49,20 mg, 485,78 jmol, 48,23 jL , 36 % puro). Después la mezcla de reacción se agitó a 23°C durante 3 horas, el disolvente se eliminó a presión reducida para dar un producto bruto, que se purificó mediante HPLC preparativa (columna cromatográfica: Venusil ASB Phenyl 150*30mm*5jm; fase móvil: [agua (HCl al 0,05 %)-ACN]; ACN %: 55 %-85 %, 9 min) para dar el compuesto3.1H NMR (400 MHz, MeOD-d4) 8: 7,97 - 7,92 (m, 1H), 7,45 - 7,21 (m, 2H), 3,01 (t,J= 7,2 Hz, 2H), 2,89 (t,J= 7,2 Hz, 2H), 2,65 - 2,51 (m, 2H); MS (ESI): m/z 286,0 [M+H] .

Ejemplo 4: Preparación del Compuesto 4

Etapa 1: síntesis del compuesto 4-2

El Compuesto4-1(1 g, 7,03 mmol) se disolvió en tetrahidrofurano (20 mL) y se añadió gota a gota n-butil litio (2,5 M, 3,10 mL) a -78°C bajo nitrógeno. Después la mezcla se agitó a esta temperatura durante 30 minutos, se añadió gota a gota N,N-dimetilformamida (950,00 mg, 13,00 mmol, 1,00 mL). Después, la mezcla se calentó a 23°C durante 1 h. Se añadió ácido clorhídrico para ajustar el pH a 2~3, y se precipitó un sólido en la solución. El sólido precipitado se filtró, y la torta de filtro se lavó con 5 mL de agua, y después se secó al vacío para dar el compuesto4-2.1H NMR (400MHz,CDCla) 8: 9,94 (s, 1H) 6,82 (s, 1H) 4,37 - 4,41 (m, 2 H) 4,28 - 4,31 (m, 2H).

Etapa 2: síntesis del compuesto 4-3

El Compuesto4-2(200 mg, 1,18 mmol) se disolvió en DMF (3 mL) y se añadió N-bromosuccinimida (250,99 mg, 1,41 mmol), después la solución de reacción resultante se agitó a 23°C durante 48 horas. Después de que la reacción se completara, el disolvente se eliminó a presión reducida, y el residuo se diluyó con acetato de etilo (20 mL), y se lavó con agua (3 mL*2) y salmuera saturada (2 mL), y la fase orgánica se secó sobre sulfato de sodio anhidro. El disolvente se eliminó de nuevo a presión reducida para dar un producto bruto, que se purificó mediante cromatografía en columna (acetato de etilo/éter de petróleo = 0~20%) para dar el compuesto4-3.1H NMR (400MHz, CDCb) 8: 9,85 (s, 1H), 4,45 - 4,30 (m, 4H) ; LCMS m/z = 246,9 [M+H]+.

Etapa 3: síntesis del compuesto 4-4

El Compuesto4-3(215 mg, 863,17 jm ol) se disolvió en etanol (4 mL), y se añadió una solución acuosa de hidroxilamina (50 %, 114,04 mg, 1,73 mmol), después la solución de reacción se calentó a reflujo a 90°C durante 2 horas. Después de que la reacción se completara, el disolvente se eliminó directamente a presión reducida. Se añadió acetonitrilo (4 mL) y el disolvente se eliminó de nuevo para dar el compuesto4-4.MS (ESI): m/z 263,9 [M+H]+

Etapa 4: síntesis del compuesto 4-5

El Compuesto4-4(130 mg, 492,24 |jmol) se disolvió en acetonitrilo (5 mL) y se añadió cloruro de tionilo (234,25 mg, 1,97 mmol, 142,84 j l ) bajo nitrógeno. La mezcla se calentó a reflujo a 90°C durante 4 horas. El disolvente se eliminó a presión reducida y el residuo se purificó mediante cromatografía en columna (acetato de etilo/éter de petróleo = 0~30%) para dar el compuesto4-5.1H NMR (400 MHz, CDCls) 8: 4,32 - 4,41 (m, 4H); MS (ESI): m/z 247,0 [M+H]+.

Etapa 5: síntesis del compuesto 4

El Compuesto4-5(110 mg, 447,01 jmol),4-5A(138,71 mg, 491,71 jm ol) y carbonato de potasio (123,56 mg, 894,01 jm ol) se disolvieron en dioxano (2 mL)/agua (0,4 mL), y después se añadió Pd(dppf)Cl2 (32,71 mg, 44,70 jm ol) bajo nitrógeno. La solución de reacción resultante se calentó a 105°C durante 15 horas. La solución de reacción se concentró y se añadió ácido trifluoroacético (2 mL). La solución de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora y se concentró, y el residuo se disolvió en dimetilsulfóxido (3 mL) y se purificó mediante HPLC preparativa<(columna: Agela ASB 150*25mm*5jm; fase móvil: [agua (HCl al 0,05>%)-ACn]; AcN<%: 46 %-76 %, 9 min) para dar>el compuesto4.1H NMR (400 MHz, DMSO_de) 8: 7,86 (d,J= 8,4 Hz, 1H), 7,34 - 7,24 (m, 2H), 4,49 (d,J= 6,4 Hz, 4H). MS (ESI): m/z 302,0 [M-H]-.

Ejemplo 5: Preparación del Compuesto 5

Etapa 1: síntesis del compuesto 5-2

El Compuesto5-1(5 g, 21,09 mmol), 1,2-dibromoetano (31,70 g, 168,73 mmol, 12,73 mL) y carbonato de potasio (11,66 g, 84,36 mmol) se disolvieron en N,N-dimetilformamida (50 mL), y la mezcla se calentó a 85°C durante 4 horas. La solución de reacción se concentró y se añadieron 100 mL de acetato de etilo. La mezcla se agitó durante 10 minutos y se filtró, y el filtrado se concentró a presión reducida para dar un producto bruto. El producto bruto se purificó mediante cromatografía en columna (acetato de etilo/éter de petróleo = 0~2 %) para dar el compuesto5-2.1H NMR (400CDCb) 8: 7,41 (s, 1H) 4,49 (t,J= 6,8 Hz, 2H), 3,89 (s, 3H), 3,70 (t,J= 6,8 Hz, 2H).

Etapa 2: síntesis del compuesto 5-3

El Compuesto5-2(6,5 g, 18,89 mmol) se disolvió en tetrahidrofurano (60 mL), y la solución se agitó y se enfrió a -78°C. Después, se añadió gota a gota n-butil litio (2,5 M, 7,56 mL). Después, la mezcla de reacción se agitó a esta temperatura durante 2 horas. La reacción se paró mediante una solución saturada de cloruro de amonio (20 mL) y agua (30 mL) y la fase orgánica se separó. La fase acuosa se extrajo con acetato de etilo (50 mL), y las fases orgánicas combinadas se concentraron, el producto bruto se purificó mediante cromatografía en columna (acetato de etilo/éter de petróleo = 0~35 %) para dar el compuesto5-3.1H NMR (400MHz, CDCla) 8: 6,95 (s, 1H), 5,10 (t,J= 8,4 Hz, 2H), 3,86 (s, 3H), 3,04 (t,J= 8,4 Hz, 2H).

Etapa 3: síntesis del compuesto 5-4

El Compuesto5-3(620 mg, 3,37 mmol) se disolvió en N,N-dimetilformamida (5 mL) y después se añadió N-bromosuccinimida (898,56 mg, 5,05 mmol). La solución de reacción resultante se agitó a 25°C durante 24 horas. El disolvente se eliminó a presión reducida y el residuo se disolvió en acetato de etilo (50 mL). La solución se lavó con bisulfito de sodio saturado (10 mL) y salmuera saturada (10 mL). La fase orgánica se concentró, el producto bruto se purificó mediante cromatografía en columna (acetato de etilo/éter de petróleo = 0~25 %) para dar el compuesto5-4.

MS (ESI): m/z 262,9 [M+H]+.

Etapa 4: síntesis del compuesto 5-5

El Compuesto5-4(318 mg, 1,21 mmol) se disolvió en metanol (2 mL) y después se añadió una solución de hidróxido de sodio (2 M, 1,21 mL). La solución de reacción se agitó a 45°C durante 2 horas. La solución de reacción se concentró y se añadió agua (2 mL) al residuo. El pH se ajustó a aproximadamente 2-3 con ácido clorhídrico 6 M, y precipitó una gran cantidad de precipitado. Después de agitar durante 10 minutos, se recogió por filtración, y la torta de filtro se secó al vacío a 45°C durante 2 horas para dar el compuesto5-5. MS (ESI): m/z 248,9 [M+H]+.

Etapa 5: síntesis del compuesto 5-6

El Compuesto5-5(250 mg, 1,00 mmol) se disolvió en diclorometano (3 mL) y después se añadió carbonildiimidazol (244,12 mg, 1,51 mmol). La solución de reacción resultante se agitó bajo nitrógeno durante 1 hora. Después, la solución de reacción se vertió en agua amoniacal (1,30 g, 10,04 mmol, 1,43 mL, concentración del 27 %) en solución de tetrahidrofurano (5 mL) y la reacción se agitó durante 30 minutos. La solución de reacción se concentró y el residuo se disolvió en acetato de etilo (50 mL). La solución se lavó con agua (10 mL) y salmuera saturada (10 mL). La fase orgánica se secó con una cantidad apropiada de sulfato de sodio anhidro, y se filtró, y el filtrado se concentró a presión reducida para dar el compuesto5-6bruto, que se usó directamente en la siguiente etapa. MS (ESI): m/z 249,9 [M+H]+.

Etapa 6: síntesis del compuesto 5-7

El Compuesto5-6(230 mg, 927,06 pmol) se disolvió en N, N-dimetilformamida (3 mL), y después se añadió cloruro cianúrico (256,44 mg, 1,39 mmol). La solución de reacción resultante se agitó a 25°C durante 2 horas. La solución de reacción se diluyó con acetato de etilo (80 mL) y después se lavó con agua (20 mL) y salmuera saturada (20 mL). La fase orgánica se secó con una cantidad apropiada de sulfato de sodio anhidro, y se filtró, y el filtrado se concentró a presión reducida para dar un producto bruto. El producto bruto se purificó mediante cromatografía en columna (acetato de etilo/éter de petróleo = 0~15 %) para dar el compuesto5-7.MS (ESI): m/z 252,2 [M+Na]+.

Etapa 7: síntesis del compuesto 5-8

El Compuesto5-7(130 mg, 565,02 pmol),5-7A(308,70 mg, 847,53 pmol) y carbonato de potasio (195,22 mg, 1,41 mmol) se disolvieron en dioxano (1,5 mL) y agua (0,3 mL), y después se añadió Pd(dppf)Cl2 (82,69 mg, 113,00 pmol) bajo nitrógeno. La solución de reacción resultante se calentó a 110°C durante 15 horas. La solución de reacción se concentró y el residuo se purificó mediante cromatografía en columna (acetato de etilo/éter de petróleo = 0~25 %) para dar el compuesto5-8.MS (ESI): m/z 388,1 [M+H]+.

Etapa 8: síntesis del compuesto 5

El Compuesto5-8(140 mg, 361,34 pmol) se disolvió en diclorometano (0,5 mL) y después se añadió ácido trifluoroacético (412,01 mg, 3,61 mmol, 267,54 pL). La solución de reacción resultante se agitó a 25°C durante 2 horas. La solución de reacción se concentró y el residuo se disolvió en N,N-dimetilformamida (5 mL). La solución se purificó mediante HPLC preparativa (columna cromatográfica: Venusil ASB Phenyl 150*30mm*5pm; fase móvil: [agua (HCl al 0,05 %)-ACN]; ACN %: 45 %-75 %, 9 min) para dar el compuesto5.1H NMR (400 MHz, CD3DO) 8: 7,96 (d,J= 8,8 Hz, 1H), 7,20 - 7,05 (m, 2H), 5,20 (t,J= 8,0 Hz, 2H), 3,39 (t,J= 8,0 Hz, 2H). MS (ESI): m/z 286,0 [M-1]-.

Datos de la prueba biológica:

Ejemplo de ensayo 1: prueba de la actividad inhibidora de la xantina oxidasa

1.1 Propósito del ensayo

Se evaluaron los compuestos para determinar el nivel de inhibición de la actividad de la xantina oxidasa.

1.2 Reactivo

Los principales reactivos usados en este estudio incluyeron xantina (Sigma, Cat. No. X4002-1G, lot: SLBB5664V) y xantina oxidasa (Sigma, Cat. No. X4376-5UN, lot: SLBQ1518V).

1.3 Instrumento

El instrumento principal usado en este estudio es un lector de microplacas multifunción.

1.4 Método del ensayo

1)Se añadieron 50 pl de solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco a los pocillos de control de fondo de los compuestos y los pocillos de control positivo (HPE: 100 % de actividad inhibidora).

2)2 U/mL de xantina oxidasa se diluyeron con DPBS a 0,04 U/mL, y se añadieron 50 pL de xantina oxidasa a los pocillos del compuesto y los pocillos de control negativo (ZPE: 0% de actividad inhibidora) según la disposición del ensayo en la Figura 1.

3)Los compuestos se diluyeron en serie 3 veces con DMSO para 8 puntos, después el compuesto se diluyó con DPBS y se añadieron 50 pL de la mezcla a cada pocillo en pocillos triples. Se añadieron 50 pL de DPBS a cada pocillo de los pocillos de control positivo (HPE: 100 % de actividad inhibidora) y los pocillos de control negativo (ZPE: 0 % de actividad inhibidora).

4) Xantina 200 mM se diluyó a 300 pM con DPBS. Se añadieron 100 pL de xantina a cada pocilio según la disposición del ensayo en la Figura 1. La mezcla se trató previamente a temperatura ambiente durante 30 minutos. La concentración final de xantina oxidasa en cada pocillo fue de 0,01 U/mL, y la concentración final de DMSO en cada pocillo fue de 0,5%. Los pocillos de control positivo (HPE: 100 % de actividad inhibidora) contenían xantina pero no xantina oxidasa, y los pocillos de control negativo (ZPE: 0 % de actividad inhibidora) contenían xantina y xantina oxidasa. Los pocillos de control de fondo del compuesto contenían diversas concentraciones del compuesto y xantina pero sin xantina oxidasa.

5) Detección del valor de absorbancia a 290 nm con un espectrofotómetro.

6) Análisis de datos: calcular la inhibición de la xantina oxidasa en cada pocillo según la siguiente ecuación:

*ODmuestra de pruebaes el valor de la densidad óptica del pocillo de prueba de la actividad del compuesto, que contiene el compuesto, xantina y xantina oxidasa;

ODcompuesto de controles el valor de la densidad óptica de fondo del compuesto que se va a ensayar a diferentes concentraciones, que contiene el compuesto y xantina, sin xantina oxidasa;

DO<zpe>: el valor medio de la densidad óptica de los pocillos de control negativo, que contienen DMSO al 0,5%, xantina y xantina oxidasa;

DO<hpe>es el valor medio de la densidad óptica de los pocillos de control positivo, que contienen DMSO al 0,5% y xantina, sin xantina oxidasa.

7) Se usó el software GraphPad Prism para realizar el log(agonista) frente a respuesta - Análisis de ajuste no lineal de la pendiente variable sobre los datos de inhibición (% de inhibición) del compuesto para dar el valor de IC50del compuesto. Fórmula de ajuste:

Y = Abajo (Arriba-Abajo)/(l 10A((Log IC50 - X)*Pendiente))

1.5 Resultados del ensayo

Tabla 1. Resultados del ensayo de actividad inhibidora de la xantina oxidasa de los compuestos

Los resultados del ensayo muestran que los compuestos tienen buena actividad inhibidora de la xantina oxidasa. Ejemplo de ensayo 2: Prueba de la actividad inhibidora de los compuestos sobre la absorción de ácido úrico 1. Propósito del ensayo

En este estudio, se usaron líneas celulares transfectadas de manera estable con el gen Urat1 humano para evaluar la actividad inhibidora de los compuestos de prueba sobre la absorción de ácido úrico.

2. Materiales del ensayo

2.1 Líneas celulares

La línea celular transfectada de manera estable con el gen Uratl humano fue construida por WuXi AppTec. La línea celular transfectada de manera estable con el gen Urat1 humano (Urat1-MDCK) son células MDCK transfectadas con el gen Urat1 humano y obtenidas mediante cribado con G418. Se cultivaron células Urat1-MDCK en medio MEM que contenía suero bovino fetal (FBS) al 10%, penicilina 100 U/mL, estreptomicina 100 pg/mL, L-glutamina 2 mM y aminoácidos no esenciales al 1%, y G418250 pg/mL.

2.2 Reactivo

El principal reactivo usado en este estudio incluía Ácido úrico-14C (ARC, Cat. No. ARC-0513, Lot No. 200122).

2.3 Instrumento

El instrumento principal usado en este estudio fue un analizador de centelleo líquido (Perkin Elmer, Tri-Carb 4910TR).

3. Método del ensayo

3.1 Siembra celular

3.1.1 Las células Urat1-MDCK cultivadas en el matraz de cultivo celular T150 se digirieron con tripsina al 0,25%, después se ajustaron a una suspensión con 200000 células/mL con medio de cultivo reciente.

3.1.2 Las células se sembraron en una placa de cultivo celular de 48 pocillos a 0,5 mL por pocillo a una densidad celular final de 100000 células/pocillo.

3.1.3 La placa de cultivo celular se incubó en una incubadora durante la noche a 37°C, 5% de CO2.

3.2 Tratamiento con los compuestos y detección

3.2.1 Se hizo una dilución seriada de 5 veces de los compuestos en DMSO para 4 puntos, y la concentración diluida fue 200 veces la concentración final del ensayo. Los compuestos se diluyeron después 10 veces en tampón HBSS.

3.2.2 La solución madre concentrada 10 mM de ácido úrico-14C se diluyó a 1 mM con tampón HBSS.

3.2.3 Después de incubar la placa de cultivo celular durante la noche, se eliminó el medio de cultivo celular de la placa, y las células se lavaron tres veces con tampón HBSS seguido de la adición de 90 pl de tampón HBSS a cada pocillo.

3.2.4 Se añadieron a cada pocillo 5 pl de compuesto diluido, y las células se incubaron en una incubadora a 37°C, 5% de CO2 durante 20 minutos. La concentración final de DMSO en cada pocillo fue del 0,5%. El compuesto de prueba (10 pM) se usó como control de inhibición del 100 %, y se usó DMSo al 0,5 % como control de inhibición del 0 %.

3.2.5 Se añadieron 5 pL por pocillo de ácido úrico-14C a la placa celular, y la concentración final de ácido úrico en cada pocillo fue de 50 pM. Las células se incubaron en una incubadora a 37°C, 5% de CO2 durante 15 minutos. Las células se lavaron después 3 veces con tampón HBSS enfriado previamente.

3.2.6 Se añadieron 150 pL de NaOH 0, 1 M a cada pocillo para lisar las células durante 10 minutos.

3.2.7 El lisado celular se recogió en un vial de detección de centelleo líquido, y se añadieron 2 mL de fluido de centelleo a cada vial para la prueba.

3.2.8 El contenido de 14C de la muestra en cada tubo se detectó con un analizador de centelleo líquido.

3.2.9 Análisis de datos:

% de inhibición =(HC-CPD)/(HC- LC) x 100% *

*CPD es el valor de señal radiactiva del pocillo de compuesto;

HC es el valor medio de la señal radiactiva de los pocillos de control de inhibición del 0%;

LC es el valor medio de la señal radiactiva de los pocillos de control de inhibición del 100%.

3.2.10 Usando el software GraphPad Prism, el log(inhibidor) de regresión no lineal frente a la respuesta - Se adoptó el método de pendiente variable para ajustar la curva de dosis-respuesta según la siguiente fórmula, y se obtuvieron los valores de IC50 y IC90 de los compuestosfd .

Y = Abajo (Arriba-Abajo)/(l 10A((Log IC50 - X)*Pendiente))

4. Resultados del ensayo

Tabla 2. Actividad inhibidora de los compuestos sobre la absorción de ácido úrico

Conclusión: Los resultados del ensayo muestran que los compuestos de la presente divulgación tienen una buena actividad inhibidora sobre la absorción de ácido úrico

Ejemplo de ensayo 3: Estudio de estabilidad metabólica de hepatocitos (HMS)

1. Propósito del ensayo

Probar la estabilidad metabólica de la muestra de prueba en hepatocitos humanos y de rata.

2. Materiales del ensayo

2.1 Compuesto de prueba (10 mM), sustancia de control: 7-etoxicumarina (30 mM), 7-hidroxicumarina (sustancia de control, 30 mM)

2.2 Célula

2.3 Sistema tampón:

Medio de descongelación: medio E de Williams que contiene suero bovino fetal al 5%, solución de Percoll al 30% y otros materiales auxiliares

Medio de incubación: medio E de Williams (sin rojo fenol) que contiene L-glutamina 2 mM y ácido hidroxietilpiperazin etano sulfónico 25 mM.

Solución de parada: 200 ng/mL de tosilbutiramida y labetalol en acetonitrilo como patrones internos.

Solución de dilución: Agua ultrapura.

3. Método del ensayo

1) La cantidad exacta de compuesto de control positivo se disolvió en dimetilsulfóxido (DMSO) para dar una solución 30 mM

2) El compuesto de prueba 10 mM y el compuesto de control positivo 30 mM se diluyeron a 1 mM y 3 mM con DMSO en placas de 96 pocillos.

3) El compuesto de prueba 1 mM y el compuesto de control positivo 3 mM se diluyeron en soluciones de cuantificación 100 pM y 300 pM con acetonitrilo.

4) Las células crioconservadas se descongelaron, se disociaron y se suspendieron en medio de cultivo y después se diluyeron a 0,5 x 106 células/mL con medio de cultivo calentado previamente.

5) Se añadieron 198 pl de suspensión celular precalentada a una placa de 96 pocillos.

6) Se transfirieron 100 pl de solución de parada (acetonitrilo que contenía 200 ng/mL de tosilbutiramida y 200 ng/mL de labetalol como patrón interno) a un conjunto de placas de 96 pocillos marcadas previamente.

7) Se añadieron por duplicado 2 pl de compuesto de prueba 100 pM o solución de cuantificación de control positivo 300 pM a cada pocillo de la placa de 96 pocillos.

8) Las muestras T0 se mezclaron para lograr una suspensión uniforme durante aproximadamente 1 min, y después se transfirieron inmediatamente 20 pl de cada muestra a pocillos que contenían 100 pL de solución de parada enfriada con hielo seguido de mezcla.

9) Todas las placas se incubaron a 37°C en CO2 al 5% en una incubadora humidificada al 95%, con agitación constante a aproximadamente 600 rpm para la reacción.

10) A los 15, 30, 60 y 90 min, las muestras se mezclaron, y después se transfirieron 20 pL de cada muestra a pocillos que contenían 100 pL de solución de parada enfriada con hielo en cada punto de tiempo y se mezclaron.

11) Se prepararon placas de muestra de control medio (MC) (marcadas como T0-MC y T90-MC) a T0 y T90 añadiendo los mismos componentes a cada pocillo excepto para la suspensión celular. Se obtuvo la tabla de concentración final.

12) En cada punto de tiempo respectivo, la reacción se detuvo retirando la placa de la incubadora y mezclando con 100 pL de solución de parada enfriada con hielo.

13) Agitar en vórtex inmediatamente la placa en un agitador de placas a 500 rpm durante 10 minutos. Después, todas las placas de muestra se centrifugaron a 3220 x g a 4°C durante 20 minutos.

14) Después de la centrifugación, se transfirieron 35 pL/pocillo del sobrenadante de la placa de muestra a otro conjunto de placas de 96 pocillos marcadas previamente que contenían 70 pL de agua ultrapura según el diagrama de placas.

15) Las placas de ensayo se sellaron y se almacenaron a 4°C hasta el análisis de LC-MS-MS.

La relación residual del compuesto de prueba y el compuesto de control se obtuvo mediante la siguiente fórmula:

Relación del área máxima del compuesto

con el estándar interno en cualquier punto

Relación residual (%) = ----------------------------------------------------------------- x 100%

Relación del área máxima del compuesto

con el estándar interno a 0 minutos

La constante de velocidad de eliminación k del compuesto de prueba y el compuesto de control en hepatocitos se calculó representando gráficamente el logaritmo de la relación residual frente al tiempo, y la semivida (T1/2) y la velocidad de aclaramiento intrínseco in vitro (CLint) se obtuvieron usando la velocidad de eliminación k. La fórmula siguiente:

T\u— 0,693 /k

CL¡nt (hep) = K / Células por mL (millones de células/mL)

Cl-mt (hígado)= CL¡nt(hep)x relación peso a peso del hígado x número de hepatocitos por gramo de hígado

Los parámetros de las especies en la fórmula fueron los siguientes:

4. Resultados del ensayo

Los resultados se muestran en la Tabla 3.

Tabla 3. Velocidades de aclaramiento intrínseco de los compuestos en hígado humano y de rata

Conclusión: El compuesto 2 y el compuesto 3 tienen ambos un aclaramiento moderado en hepatocitos humanos y un aclaramiento elevado en hepatocitos de rata.

Ejemplo de ensayo 4. Prueba MDR1 de permeabilidad de membrana

1. Propósito del ensayo:

Las células MDR1-MDCK II son células de riñón canino Madin-Darby transfectadas con el gen MDR1 humano, que puede expresar de manera estable P-gp alta. El objetivo de este estudio fue probar la permeabilidad bidireccional de los compuestos a través del modelo de células MDR1-MDCK II y evaluar si se transportan por eflujo.

2. Cultivo celular

Se sembraron células MDR1-MDCK II (obtenidas de Piet Borst, Netherlands Cancer Institute) a una densidad de 2,5 x 105 células/mL sobre membrana de polietileno (PET) en un inserto de 96 pocillos durante 4-7 días hasta formar una monocapa de células de fusión.

3. Método del ensayo

Los compuestos de prueba se diluyeron en tampón de transporte (HBSS, Hepes 10 mM con DMSO, pH 7,4) a una concentración de 2 pM (DMSO <1%) y se aplicaron en el lado apical o basolateral de la monocapa celular. El compuesto a probar se probó por duplicado en la dirección de A a B o de B a A, digoxina se probó a 10 pM en la dirección de A a B o de B a A, mientras que nadolol y metoprolol se probaron a 2 pM de A a B. Las placas se incubaron en una incubadora con CO2 a 37±1°C en una humedad saturada de 5% de CO2 durante 2,5 horas sin agitación. Además, se determinó la relación de eflujo de cada compuesto, y para los compuestos de prueba y de referencia se llevó a cabo la cuantificación. El análisis se llevó a cabo mediante LC/MS/MS según la relación de área máxima de analito/IS. Después del ensayo de transporte, se usó el ensayo de exclusión amarillo luciferina para determinar la integridad de la monocapa celular. El tampón se eliminó de los compartimentos apical y basolateral, después se añadieron 75 pL de amarillo luciferina 100 pM al tampón de transporte y se añadieron 250 pL del tampón de transporte a los compartimentos apical y basolateral, respectivamente. La placa se incubó a 37°C, CO2 al 5% y humedad saturada durante 30 minutos sin agitación. Después de 30 minutos de incubación, se eliminaron 20 pL de muestra de amarillo luciferina del apical, seguido de la adición de 60 pL de tampón de transporte. Después, se recogió basolateralmente una muestra de amarillo luciferina de 80 pL. Se midieron las unidades de fluorescencia relativa (RFU) de amarillo luciferina a 425/528 nm (excitación/emisión) con un lector de microplacas Envision.

4. Cálculo de datos

El coeficiente de permeabilidad aparente (Papp, cm/s), la velocidad de eflujo y la velocidad de recuperación se calcularon usando las siguientes fórmulas.

El coeficiente de permeabilidad aparente (Papp, cm/s) se calculó usando la siguiente fórmula:

Papp " (dCr/dt) x Vr / ( A x C(>)

dCr/dt es la concentración acumulativa del compuesto en el extremo receptor durante la unidad de tiempo (pM/s); Vr es el volumen de la solución del extremo receptor (0,075 mL y 0,250 mL para los extremos apical y basal, respectivamente); A es el área superficial relativa (0,0804 cm2) de la monocapa celular; C0 es la concentración inicial (nM) de la sustancia de prueba en el extremo de administración o la relación de área máxima de la sustancia de referencia.

La relación de eflujo se calculó usando la siguiente fórmula:

Relación de eflujo =Papp (BA) / Papp (AB)

La velocidad de recuperación se calculó usando la siguiente fórmula:

% de recuperación= 100 * [(Vr * Cr) (Vd x C<¡)] / (Vd * Co)

C0 es la concentración inicial (nM) de la sustancia de prueba en el extremo de administración o la relación de área máxima de la sustancia de referencia; Vd es el volumen del final de administración (0,075 mL para el lado apical y 0,250 mL para el lado basal); Cd y Cr son la concentración final (nM) de la sustancia de prueba en el final de administración y el final del receptor o la relación de área máxima de la sustancia de referencia.

El porcentaje de amarillo luciferina en los poros basolaterales se calculó usando la siguiente fórmula:

% amarillo luciferina

en donde RFUApical y RFUBasolateral son los valores unitarios relativos de fluorescencia del amarillo luciferina en los poros apical y basolateral, respectivamente; VApical y VBasolateral son los volúmenes de los poros apical y basolateral (0,075 mL y 0,25 mL), respectivamente. % de amarillo luciferina debe ser menor que 2.

5. Resultados del ensayo

Los resultados se muestran en la Tabla 4.

Tabla 4. Datos de permeabilidad de membrana de los compuestos a células MDR1

Conclusión: El compuesto 2 y el Compuesto 3 tienen ambos una alta permeabilidad.

Ejemplo de ensayo 5. Prueba de actividad inhibidora de isoenzimas del citocromo P450

1. Propósito del ensayo

Se determinaron las actividades inhibidoras de los compuestos de prueba frente diferentes subtipos de isoenzimas del citocromo P450 humano.

2. Método del ensayo

Preparación de compuestos de prueba, inhibidor estándar (concentración final x 100) y soluciones de trabajo de sustrato mixtas; Microsomas (adquiridos de Corning Inc) congelados en un congelador a -80°C se sacaron y descongelaron. Se añadieron 20 pL del compuesto de prueba y la solución de inhibidor estándar a los pocilios correspondientes, y al mismo tiempo se añadieron 20 pL del disolvente correspondiente a los pocillos de control sin inhibidor (NIC) y los pocillos de control en blanco (Blanco); después se añadieron 20 pL de solución de sustrato mixta a los pocillos correspondientes, excepto los pocillos del blanco (añadiendo 20 pL de tampón fosfato (PB) a los pocillos del blanco); se preparó la solución de microsomas hepáticos humanos (marcando la fecha después del uso y volviendo a poner en el refrigerador inmediatamente), después se añadieron inmediatamente 158 pL de solución de microsomas hepáticos humanos a todos los pocillos; la placa de muestra anterior se incubó previamente en un baño de agua a 37°C, y después se preparó la solución de factor de coenzima (NADPH); 10 minutos después, se añadieron 20 pL de solución de NADPH a todos los pocillos. Después de agitar bien la placa de muestra, se incubó en un baño de agua a 37°C durante 10 minutos; en el punto de tiempo correspondiente, se añadieron 400 pL de solución de acetonitrilo fría (patrón interno: 200 ng/mL de tolbutamida y labetalol) para detener la reacción; después de mezclar bien la placa de muestra, se centrifugó a 4000 rpm durante 20 minutos para precipitar proteínas; se sacaron 200 pL de sobrenadante y se añadieron a 100 pL de agua, la mezcla se agitó bien y después se sometió a LC/MS/MS para la detección.

3. Resultados del ensayo

Los resultados se muestran en la Tabla 5.

Tabla 5. Valores de IC50 de los compuestos para la inhibición de isoenzimas de P450

Conclusión: Los compuestos probados tienen una actividad inhibidora muy baja sobre CYP1A2, CYP2C19, CYP2D6 y CYP3A4-M, y tienen una actividad inhibidora moderada sobre CYP2C9.

Ejemplo de ensayo 6: farmacocinética en ratas SD

1. Propósito del ensayo:

Farmacocinética de los compuestos de prueba en ratas SD

2. Materiales del ensayo:

Rata Sprague Dawley (macho, 180-350 g, 6-10 semanas de edad, Charles River Laboratories, Beijing)

3. Método del ensayo:

El compuesto 2 se mezcló con DMSO al 5%/Solutol al 10%/agua al 85%, y la mezcla se agitó y se agitó con vórtex para preparar una disolución transparente a 0,6 mg/mL para la administración del grupo de inyección, y se filtró mediante una membrana microporosa para su uso. El compuesto 2 se mezcló con DMSO al 5%/Solutol al 10%/agua al 85%, y la mezcla se agitó y se agitó con vórtex para preparar una disolución transparente a 1 mg/mL para administración oral. Se dividieron seis ratas SD macho en 2 grupos. Los animales del grupo 1 se administraron por vía intravenosa en una dosis única de 3 mg/kg, el vehículo fue DMSO al 5%/Solutol al 10%/agua al 85%, y el volumen de administración fue de 5 mL/kg. A los animales del segundo grupo se les administró el compuesto de prueba 2 mediante sonda oral en una dosis única de 10 mg/kg, el vehículo oral fue DMSO al 5%/Solutol al 10%/agua al 85% y el volumen oral fue de 10 mL/kg. Se recogió sangre completa a 0 (solamente el grupo de alimentación por sonda), 0,083 (solamente intravenosa), 0,25, 0,5, 1, 2, 4, 8 y 24 horas después de la administración. La sangre completa se centrifugó a 3200 g a 4°C durante 10 min para obtener plasma. Las concentraciones del Compuesto 2 y ácido úrico (solamente el grupo de alimentación oral) en plasma se determinaron mediante el método de LC/MS/MS, y los parámetros farmacocinéticos, tales como concentración máxima, tiempo hasta el máximo, velocidad de aclaramiento, vida media, área bajo la curva, biodisponibilidad, etc., se calcularon mediante el software Phoenix WinNonlin.

Los resultados del ensayo son como sigue en la Tabla 6:

Tabla 6. Datos farmacocinéticos del Compuesto 2 en ratas

Conclusión: El Compuesto 2 tiene buenas propiedades farmacocinéticas y alta biodisponibilidad oral, en donde, Co es la concentración inicial, T1/2 es la semivida de eliminación, Vdss es el volumen de distribución aparente en estado estacionario, Cl es el aclaramiento total, y AUC0-último es el área bajo la curva de concentración en plasma-tiempo desde el tiempo 0 hasta el último punto de tiempo cuantificable, AUC0-inf es el área bajo la curva de concentración en plasma-tiempo desde el tiempo 0 hasta el infinito extrapolado, Cmax es la concentración máxima, y Tmax es el tiempo hasta el máximo.

Claims (11)

1. REIVINDICACIONES 1. Un compuesto representado por la fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo,

   en donde, cada R1 se selecciona independientemente de H, halógeno, OH, NH2, CN, alquilo de C1-3, y alcoxi de C1-3, el alquilo de C1-3 y el alcoxi de C1-3 están opcionalmente sustituidos con 1, 2 o 3 Ra; n se selecciona de 0, 1,2, 3 y 4; Ra se selecciona de H, F, Cl, Br, I, OH y NH2; R2 se selecciona de H, halógeno, OH, NH2, y CN; el anillo A se selecciona de cicloalquilo de C5-6 y heterocicloalquilo de 5-6 miembros; y el heterocicloalquilo de 5-6 miembros contiene 1, 2, 3 o 4 heteroátomos o grupos heteroatómicos seleccionados independientemente de -NH-, -O- y N.
2. 2. El compuesto o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo según la reivindicación 1, en donde, cada R1 se selecciona independientemente de H, F, Cl, Br, I, OH, NH2, CH3, CH3CH2, y CH3O; y el CH3, el CH3CH2 y el CH3O están opcionalmente sustituidos con 1, 2 o 3 Ra.
3. 3. El compuesto o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo según la reivindicación 2, en donde, cada R1 se selecciona independientemente de H, F, Cl, Br, I, OH, NH2, CH3, CH3CH2, CH3O, y CF3.
4. 4. El compuesto o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo según la reivindicación 1, en donde el anillo A se selecciona de ciclopentilo, ciclohexilo, tetrahidrofuranilo, pirrolidinilo, tetrahidropiranilo, dioxanilo y piperidilo.
5. 5. El compuesto o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo según la reivindicación 4, en donde el anillo A se selecciona de ciclopentilo, ciclohexilo, tetrahidrofuranilo y dioxanilo.
6. 6. El compuesto o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde, la unidad estructural

   se selecciona de
7. 7. El compuesto o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo según la reivindicación 6, en donde, la unidad estructural

   se selecciona de
8. 8. El compuesto o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde el compuesto se selecciona de
9. en donde, R1 , n y R2 son como se definen en una cualquiera de las reivindicaciones 1-4; y Ei, E2, y E3 se seleccionan cada uno independientemente de CH2 y O. 9. Un compuesto representado por las siguientes fórmulas o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo,
10. 10. Un compuesto o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, para su uso en el tratamiento de enfermedades mediadas por xantina oxidasa.
11. 11. El compuesto para su uso según la reivindicación 10, en donde, la enfermedad se selecciona de artritis gotosa e hiperuricemia.