PT116062B - Bis-pirimidinonas como inibidores da xantina oxidase para o tratamento de condições patológicas causadas por hiperuricemia - Google Patents

Abstract

A PRESENTE INVENÇÃO CONSISTE NA UTILIZAÇÃO DE BIS-PIRIRNIDINONAS COM A FÓRMULA GERAL (I) , OS SEUS TAUTÓRNEROS E/ OU OS SEUS RESPETIVOS SAIS CORNO INIBIDORES DA XANTINA OXIDASE (XO), TENDO UTILIDADE NO TRATAMENTO DE CONDIÇÕES PATOLÓGICAS CAUSADAS POR HIPERURICERNIA, ENTRE AS QUAIS SE DESTACA A GOTA . X FÓRMULA (I) NAS BIS-PIRIRNIDINONAS COM A FÓRMULA GERAL (I), R1 , R2 E RJ SÃO VÁRIOS TIPOS DE RADICAIS E TANTO X CORNO Y SÃO UM HETEROÁTORNO, CORNO DESCRITO NO PRESENTE DOCUMENTO. A INVENÇÃO DESTACA-SE PELA CAPACIDADE DESTES COMPOSTOS INIBIREM A ATIVIDADE DA ENZIMA XANTINA OXIDASE, DEMONSTRANDO, EM ALGUNS CASOS, URNA POTÊNCIA SUPERIOR À DO PRINCIPAL FÁRMACO INIBIDOR DESTA ENZIMA UTILIZADO NA CLÍNICA, O ALOPURINOL. A UTILIZAÇÃO DESTES COMPOSTOS APRESENTA CORNO VANTAGENS UM BAIXO CUSTO DE PRODUÇÃO, ASSIM CORNO ELEVADA RAPIDEZ E SIMPLICIDADE NA SUA SÍNTESE QUÍMICA E BONS RENDIMENTOS REACIONAIS. FOI AINDA DEMONSTRADO QUE ESTES COMPOSTOS NÃO APRESENTAM CITOTOXICIDADE MARCADA EM FIBROBLASTOS NORMAIS DA DERME HUMANA. DESTA FORMA, A PRESENTE INVENÇÃO É ÚTIL NO TRATAMENTO E PREVENÇÃO DE PATOLOGIAS CARATERIZADAS POR UM AUMENTO DA CONCENTRAÇÃO PLASMÁTICA DE ÁCIDO ÚRICO, POR LEVAR A UMA REDUÇÃO DA SUA FORMAÇÃO MEDIANTE A INIBIÇÃO DA ATIVIDADE ENZIMÁTICA DA XANTINA OXIDASE.

Description

DESCRIÇÃO

Bis-pirimidinonas como inibidores da Xantina Oxidase para o tratamento de condições patológicas causadas por hiperuricemia

Domínio técnico da invenção

A presente invenção diz respeito a uma nova aplicação de bispirimidinonas com a fórmula geral (I) . Estes compostos destacamse por terem propriedades inibitórias da atividade da enzima xantina oxidase (XO), não apresentando citotoxicidade marcada em fibroblastos normais da derme humana (NHDF - do inglês, normal human dermal fíbroblasts).

Sumário da invenção

A presente invenção consiste na utilização de bis-pirimidinonas com a fórmula geral (I) na inibição da atividade da enzima XO. Como exemplos representativos, incluem-se bis-pirimidinonas, sendo os heteroátomos X e Y o calcogénio enxofre, contendo hidrogénio ou grupos etilo nos substituintes Ri e R2 e apresentando na posição R3 vários radicais hidrocarbonados, sendo descrita a sua síntese e caraterização estrutural, bem como a avaliação da sua ação inibitória da enzima XO e da sua citotoxicidade em células normais humanas. 0 estudo da inibição da atividade da enzima XO por parte destes compostos evidenciou um efeito inibitório marcado, demonstrando-se, em alguns casos, uma potência superior à do fármaco comercial alopurinol, utilizado como referência. 0 estudo do efeito do composto mais promissor na proliferação de NHDF não evidenciou citotoxicidade relevante às concentrações enzimaticamente ativas, o que demonstra a seletividade da sua ação inibitória da XO em relação a efeitos tóxicos na proliferação de células humanas.

Assim, a presente invenção é útil no tratamento e prevenção da doença denominada por gota e pode ser utilizada noutras doenças associadas a um excesso de ácido úrico no organismo, apresentando-se como uma alternativa a outros fármacos utilizados no controlo destas patologias que têm sido associados a diversos efeitos adversos.

Estado da técnica

A hiperuricemia é a existência de níveis elevados de ácido úrico no sangue. Tendo em conta a baixa solubilidade do ácido úrico ao pH fisiológico, poderá haver deposição do mesmo no organismo, particularmente nas articulações, sob a forma de cristais de urato, o que pode levar à condição clínica gota. Não obstante ainda não haver muitos estudos que comprovem uma relação direta entre a modulação dos níveis de ácido úrico no organismo e a redução do risco de outras doenças, é denotada uma associação entre a hiperuricemia e diversas outras patologias. São exemplos a hipertensão arterial, doenças cardiovasculares, insuficiência renal, síndrome metabólica, diabetes mellítus e dislipidemia.

Atualmente, a redução dos elevados níveis de ácido úrico no organismo passa principalmente por: 1) diminuição da sua biossíntese, mediante a inibição da atividade da enzima XO; ou

2) pelo aumento da sua excreção, através da inibição da sua reabsorção renal por parte do transportador de aniões orgânicos URAT1. Como inibidores da XO, destaca-se a utilização dos fármacos alopurinol e febuxostate, enquanto na inibição da URAT1 destaca-se o lesinurad. Destas abordagens, a inibição da síntese de ácido úrico é, de longe, a mais efetiva e a mais utilizada na clínica.

Porém, a utilização do alopurinol está associada a inúmeros efeitos adversos, como desconforto gastrointestinal, toxicidade renal, erupção cutânea e eosinofilia. Recentemente, o febuxostate foi associado a um aumento do risco de morte por doenças coronárias em relação ao tratamento com alopurinol. Por este motivo, foi sugerido que o febuxostate passasse a ser um fármaco de segunda linha de tratamento. Por fim, a utilização do lesinurad foi aprovada para utilização em combinação com inibidores da XO, apenas quando estes não são totalmente eficazes, sendo contraindicado em pacientes com insuficiência renal grave, em recetores de transplantes renais ou em pacientes sujeitos ao processo de diálise. Deste modo, continua a ser importante e necessário o desenvolvimento de novos inibidores da XO mais seguros e eficazes.

No campo da utilização de pirimidinonas como agentes redutores dos níveis de ácido úrico no organismo, os documentos WO2015/073317 e US20150133477 divulgam a utilização de metabolitos e derivados do ácido 5-(N-fenilcarboxamido)-2tiobarbitúrico (merbarone) com atividade inibitória da XO e do URAT1. Ainda neste âmbito, e tendo por base a estrutura do merbarone, foram patenteados os derivados do ácido barbitúrico e tiobarbitúrico como agentes bifuncionais, diminuindo os níveis do ácido úrico no soro e sangue através da inibição da XO e do URAT1, conforme descrito nos documentos US20170197923 e US20190117 654. Nesta área, os referidos documentos apresentam compostos derivados de pirimidinonas para a redução dos níveis de ácido úrico, enquanto que a presente invenção apresenta bispirimidinonas. As bis-pirimidinonas começaram por se destacar como constituintes de camadas fotocondutoras em placas eletrofotográficas, conforme descrito no documento US4882248. Adicionalmente, 5,5'-arilidenobisbarbituratos e 5,5'arilidenobistiobarbituratos, assim como os respetivos sais, foram patenteados como contendo atividades antimicrobianas, antivirais, anticlamidiais e imunomodulatórias, conforme descrito no documento EP1043318A1. Os derivados bistiobarbituratos contendo substituintes fenilos e sob a forma de sais de dietilamónio, foram patenteados por Barakat et al. como agentes antidiabéticos, de acordo com o documento US9527820. Mais recentemente, Victor Veniaminovich et al. patentearam o método para obtenção da forma liofilizada do 5,5'(4-nitrofenilo)metanobistiobarbiturato, levando ao aumento da sua solubilidade em água e estabilidade de armazenamento, mantendo a sua atividade hepatoprotetora e diminuindo a toxicidade, de acordo com o documento WO2019070169. Por outro lado, bis-pirimidinonas derivadas do ácido N, Ndietiltiobarbitúrico foram também descritas como potenciais inibidores da urease por Rahim et al. (Chinese Chemical Letters, 2016, 27 693-697) e potenciais antibacterianos por Sharma et al. (ChemMedChem, 2018, 13, 1923-1930). Desta forma, nenhum dos referidos documentos reclama a atividade de bis-pirimidinonas como inibidoras da XO demonstrada na presente invenção.

Descrição geral da invenção

A presente invenção diz respeito à utilização inovadora de bispirimidinonas com a fórmula geral (I) (figura 1) como agentes inibidores da atividade da enzima XO.

Nesta fórmula geral (I), os seus tautómeros e/ou respetivos sais, Ri, R2 e R3 são vários tipos de radicais que, dependente ou independentemente uns dos outros, podem ser hidrogénio ou radicais hidrocarbonados tais como alquilo, arilo, heteroalquilo, heteroarilo, formilo, alquilcarbonilo, arilcarbonilo, heteroarilcarbonilo, alcoxicarbonilo, alquilaminocarbonilo ou dialquilaminocarbonilo. X e Y são um heteroátomo que, dependente ou independentemente um do outro, podem ser, por exemplo, oxigénio, enxofre, selénio, telúrio e azoto.

Nesta fórmula, um radical hidrocarbonado pode ser linear, ramificado ou cíclico, saturado, parcialmente saturado ou insaturado. Exemplos são os radicais alquilo, alcenilo, alcinilo, cicloalquilo, cicloalcenilo, cicloalcinilo, heteroalquilo, héteroalcenilo, heteroalcinilo, arilo ou heteroarilo. Termos combinados tais como cicloalquilalcenilo, cicloalcinilalquilo ou arilalcenilo são considerados para serem incluídas nesta definição. Estes radicais hidrocarbonados podem estar substituídos por um ou mais, iguais ou diferentes, heteroátomos do grupo constituído por: fósforo, oxigénio, enxofre, azoto, flúor, cloro, bromo ou iodo. Nestes radicais hidrocarbonados substituídos, os heteroátomos podem estar localizados em qualquer posição do radical hidrocarbonado. De acordo com esta definição, o heteroátomo pode também funcionar como átomo de ligação à restante parte da molécula. 0 heteroátomo também pode estar presente numa ligação simples, dupla ou tripla.

Como exemplos representativos de bis-pirimidinonas, preparadas mediante reação de condensação entre ácidos tiobarbitúricos e aldeídos, são aqui apresentadas bis-pirimidinonas dissubstituídas nas posições Ri e R2 com grupos etilo ou hidrogénio (figura 2), apresentando na posição R3 vários radicais hidrocarbonados e contendo o heteroátomo de enxofre em

X e Y.

Todas as bis-pirimidinonas apresentadas nesta patente revelam atividade inibitória da enzima XO à concentração de 30 μΜ e a maioria delas também à concentração de 5 μΜ (figura 3). Destas bis-pirimidinonas, algumas demonstram uma potência para a inibição da atividade da enzima XO superior à do fármaco utilizado na clínica, o alopurinol.

Descrição das Figuras

Figura 1: Representação esquemática da estrutura geral das bispirimidinonas inibidoras da XO, onde X e Y são um heteroátomo, Ri, R2 e R3 são hidrogénio ou radicais hidrocarbonados.

Figura 2: Representação esquemática da preparação das bispirimidinonas apresentadas como exemplos representativos, incluindo as dissubstituídas nas posições Ri e R2 com grupos etilo ou hidrogénio, apresentando na posição R3 vários radicais hidrocarbonados, onde t.a. corresponde a temperatura ambiente.

Figura 3: Representação esquemática da percentagem de inibição da atividade da enzima XO por parte das bis-pirimidinonas apresentadas como exemplos representativos e do alopurinol, fármaco utilizado como referência, às concentrações de 30 e 5 μΜ.

Figura 4: Representação esquemática da percentagem de inibição da atividade da enzima XO a várias concentrações, por parte das 6 bis-pirimidinonas mais potentes e do alopurinol como fármaco de referência.

Figura 5: Representação esquemática do efeito do exemplo 9 na viabilidade celular em fibroblastos normais da derme humana, a várias concentrações.

Descrição detalhada da invenção

Seguidamente, é descrita a preparação e a caracterização estrutural parcial de compostos considerados exemplos representativos para ilustrar os vários aspetos da presente invenção. Os exemplos apresentados não devem ser interpretados como limitações às reivindicações. A avaliação da ação inibitória da atividade enzimática da XO e da ação citotóxica em NHDF, é também descrita nesta secção.

A descrição da síntese das bis-pirimidinonas esquematizada na figura 2 permite conhecer em detalhe o método utilizado para a obtenção destes compostos. Assim, seguidamente descreve-se a síntese dos compostos obtidos por reação de condensação entre ácidos tiobarbitúricos e aldeídos.

Exemplo 1

5,5'-(Fenilmetileno)bis(1,3-dietil-6-hidroxi-2-tioxo-2,3 dihidropirimidina-4(1H) -ona)

A mistura do ácido N,N-dietiltiobarbitúrico (2,0 mmol, 400,6 mg) e do benzaldeído (1,0 mmol, 106,1 mg, 101,6 pL) em etanol (5,0 mL) foi agitada à temperatura ambiente durante 2h. O sólido obtido foi filtrado, lavado com etanol frio e éter de petróleo

40-60°C, seco e recristalizado de etanol. 0 sólido amarelo obtido foi filtrado e seco por forma a obter 434,9 mg (rendimento 89%) do composto pretendido.

p.f.: 177-179°C.

RMN de ³H (400 MHz, CDC1₃) δ (ppm) 7,32 (t, J = 7,7 Hz, 2H) , 7,26 (t, J= Hz, 1H) , 7,13 (d, J= 7,9 Hz, 2H) , 5,68 (s, 1H) , 4,76 - 4,50 (m, 8H) , 1,38 (t, J= 7,0 Hz, 6H) , 1,29 (t, J = 7, 0 Hz, 6H) .

RMN de ¹³C (101 MHz, CDCI3) δ (ppm) 174,7, 163, 8, 162,4, 135, 6, 128, 6, 126, 9, 126, 4, 97, 6, 45, 3, 44,7, 35, 0, 12,2, 12, 1.

Exemplo 2

5,5'-(p-Tolimetileno)bis(1,3-dietil-6-hidroxi-2-tioxo-2,3dihidropirimidina-4(1H)-ona)

A mistura do ácido N,N-dietiltiobarbitúrico (2,0 mmol, 400,6 mg) e do 4-metilbenzaldeido (1,0 mmol, 120,2 mg, 118,0 pL) em etanol (5,0 mL) foi agitada à temperatura ambiente durante 2h. O sólido obtido foi filtrado, lavado com etanol frio e éter de petróleo 40-60°C, seco e recristalizado de etanol. O sólido amarelo obtido foi filtrado e seco por forma a obter 397,1 mg (rendimento 79%) do composto pretendido.

p.f.: 163-164°C.

RMN de ³H (400 MHz, CDCI3) δ (ppm) 7,12 (d, J = 8.1 Hz, 2H) , 7,00 (d, J= 8.3 Hz, 2H) , 5,63 (s, 1H) , 4,91 - 4,47 (m, 8H) , 2,34 (s, 3H) , 1,38 (t, J= 7.0 Hz, 6H) , 1,29 (t, J= 7.0 Hz, 6H) .

RMN ¹³C (101 MHz, CDCI3) δ (ppm) 174,7, 163, 8, 162,3, 136, 5, 132,4, 129,3, 126,3, 97,7, 45,2, 44,7, 34,7, 21,1, 12,2, 12,1.

Exemplo 3

4-(Bis(1,3-dietil-6-hidroxi-4-oxo-2-tioxo-l,2,3,4tetrahidropirimidin-5-il)metil)benzonitrilo

A mistura do ácido N,N-dietiltiobarbitúrico (2,0 mmol, 400,6 mg) e do 4-formilbenzonitrilo (1,0 mmol, 131,1 mg) em etanol (5,0 mL) foi agitada à temperatura ambiente durante 2h. O sólido obtido foi filtrado, lavado com etanol frio e éter de petróleo 40-60°C, seco e recristalizado de etanol. O sólido branco obtido foi filtrado e seco por forma a obter 400,6 mg (rendimento 78%) do composto pretendido.

p.f.: 199-200°C.

RMN de ³Η (400 MHz, CDC1₃) δ (ppm) 7,62 (d, J = 8,5 Hz, 2H) , 7,27 (d, J= 8,5 Hz, 2H) , 5,66 (s, 1H) , 4,90 - 4,42 (m, 8H) , 1,37 (t, J= 7,0 Hz, 6H), 1,28 (t, J= 7,0 Hz, 6H).

RMN de ¹³C (101 MHz, CDCI3) δ (ppm) 174,7, 163, 9, 162,4, 141, 8, 132,4, 127,4, 118,7, 110,9, 96,7, 45,4, 44,8, 35,4, 12,1, 12,1.

Exemplo 4

5,5'-((4-Nitrofenil)metileno)bis(1,3-dietil-6-hidroxi-2-tioxo2,3-dihidropirimidina-4(1H) -ona)

A mistura do ácido N,N-dietiltiobarbitúrico (2,0 mmol, 400,6 mg) e do 4-nitrobenzaldeido (1,0 mmol, 151,1 mg) em etanol (5,0 mL) foi agitada à temperatura ambiente durante 2h. O sólido obtido foi filtrado, lavado com etanol frio e éter de petróleo 40-60°C, seco e recristalizado de etanol. O sólido amarelo obtido foi filtrado e seco por forma a obter 416,2 mg (rendimento 78%) do composto pretendido.

p.f.: 202-204°C.

RMN de ³H (400 MHz, CDCI3) δ (ppm) 8,18 (d, J = 8, 9 Hz, 2H) , 7,33 (d, J= 8,9 Hz, 2H) , 5,69 (s, 1H) , 4,77 - 4,38 (m, 8H) , 1,37 (t, J= 7,0 Hz, 6H), 1,29 (t, J= 7,0 Hz, 6H).

RMN de ¹³C (101 MHz, CDCI3) δ (ppm) 174,7, 163, 9, 162,4, 146, 9, 143, 9, 127,6, 123, 8, 96, 8, 45, 4, 44, 8, 35, 4, 12,1, 12, 1.

Exemplo 5

N-(4-(bis(1,3-dietil-6-hidroxi-4-oxo-2-tioxo-l,2,3,4tetrahidropirimidin-5-il)metil)fenil)acetamida

A mistura do ácido N,N-dietiltiobarbitúrico (2,0 mmol, 400,6 mg) e do N- (4-formilf enil) acetamida (1,0 mmol, 167,2 mg) em etanol (5,0 mL) foi agitada à temperatura ambiente durante 2h. O sólido obtido foi filtrado, lavado com etanol frio e éter de petróleo 40-60°C, seco e recristalizado de etanol. O sólido amarelo obtido foi filtrado e seco por forma a obter 485,6 mg (rendimento 89%) do composto pretendido.

p.f.: 178-179°C.

RMN de ³H (400 MHz, CDCI3) δ (ppm) 7,47 (d, J = 8,3 Hz, 2H) , 7,17 (s, 1H) , 7,06 (d, J= 8,1 Hz, 2H) , 5,62 (s, 1H) , 4,74 4,52 (m, 8H) , 2,17 (s, 3H) , 1,37 (t, J= 6,9 Hz, 6H) , 1,28 (t, J = 7, 0 Hz, 6H) .

RMN de ¹³C (101 MHz, CDCI3) δ (ppm) 174,5, 168, 8, 163, 6, 162,1, 137,3, 130, 6, 126, 7, 119, 6, 97,4, 45, 1, 44,5, 34,5, 24,4, 12,0, 11,9.

Exemplo 6

5, 5' -( (4-Bromofenil)metileno)bis(1,3-dietil-6-hidroxi-2-tioxo2,3-dihidropirimidina-4(1H)-ona)

A mistura do ácido N,N-dietiltiobarbitúrico (2,0 mmol, 400,6 mg) e do 4-bromobenzaldeido (1,0 mmol, 185,0 mg) em etanol (5,0 10 mL) foi agitada à temperatura ambiente durante 2h. 0 sólido obtido foi filtrado, lavado com etanol frio e éter de petróleo 40-60°C, seco e recristalizado de etanol. 0 sólido branco obtido foi filtrado e seco por forma a obter 363,2 mg (rendimento 64%) do composto pretendido.

p.f. 169-170°C.

RMN de ³Η (400 MHz, CDC1₃) δ (ppm) 7,43 (dt, J = 8,6, 2,6, 1,9 Hz, 2H) , 7,01 (dt, J = 8,6, 2,7, 1,8 Hz, 2H) , 5,59 (s, 1H) , 4,81 - 4,45 (m, 8H) , 1,37 (t, J= 7,0 Hz, 6H) , 1,29 (t, J= 7,0 Hz, 6H).

RMN de ¹³C (101 MHz, CDCI3) δ (ppm) 174,7, 163, 9, 162,3, 134,9, 131,7, 128,3, 120,8, 97,2, 45,3, 44,7, 34,8, 12,2, 12,1.

Exemplo 7

5, 5'-( (3-Hidroxifenil)metileno)bis(1,3-dietil-6-hidroxi-2tioxo-2,3-dihidropirimidin-4(1H)-ona)

A mistura do ácido N,N-dietiltiobarbitúrico (2,0 mmol, 400,6 mg) e do 3-hidroxibenzaldeido (1,0 mmol, 123,9 mg) em etanol (5,0 mL) foi agitada à temperatura ambiente durante 2h. O sólido obtido foi filtrado, lavado com etanol frio e éter de petróleo 40-60°C, seco e recristalizado de etanol. O sólido amarelo obtido foi filtrado e seco por forma a obter 183,9 mg (rendimento 73%) do composto pretendido.

p.f.: 189-191°C.

RMN de ³H (400 MHz, CDCI3) δ (ppm) 7,12 (t, J = 7, 9 Hz, 1H) , 6,68 (ddt, J= 8,0, 2,1, 1,0 Hz, 1H) , 6,60 (dt, J= 8,2, 1,9, 0,9 Hz, 1H) , 6,58 (dd, J= 2,1, 1,0 Hz, 1H) , 5,58 (s, 1H) , 4,75 - 4,44 (m, 8H) , 1,34 (t, J= 7,0 Hz, 6H) , 1,26 (t, J= 7,0 Hz, 6H) .

RMN de ¹³C (101 MHz, CDC1₃) δ (ppm) 174,6, 163, 6, 162,3, 157,4, 137,2, 129, 3, 117,5, 113, 9, 113, 8, 97,5, 77,5, 77,2, 76, 8, 45, 1, 44, 6, 34,8, 12,1, 12,0.

Exemplo 8

5,5'-((2-Nitrofenil)metileno)bis(1,3-dietil-6-hidroxi-2-tioxo2,3-dihidropirimidina-4(1H)-ona)

A mistura do ácido N,N-dietiltiobarbitúrico (2,0 mmol, 400,6 mg) e do 2-nitrobenzaldeido (1,0 mmol, 151,1 mg) em etanol (5,0 mL) foi agitada à temperatura ambiente durante 2h. O sólido obtido foi filtrado, lavado com etanol frio e éter de petróleo 40-60°C, seco e recristalizado de etanol. O sólido cor salmão obtido foi filtrado e seco por forma a obter 474,9 mg (rendimento 89%) do composto pretendido.

p.f.: 172-173°C.

RMN de ³H (400 MHz, CDCI3) δ (ppm) 7,56 (dd, J = 7,8, 1,4 Hz,

1H) , 7,52 (td, J= 7,7, 1,5 Hz, 1H) , 7,42 (tt, J= 7,6, 1,1 Hz,

1H) , 7,28 (dt, J= 7,9, 1,1 Hz, 1H) , 6,11 (s, 1H) , 4,63 (q, J = 7,0 Hz, 4H) , 4,59 - 4,47 (m, 4H) , 1,36 (t, J= 7,0 Hz, 6H) ,

1,28 (t, J = 7,0 Hz, 6H).

RMN de ¹³C (101 MHz, CDCI3) δ (ppm) 174, 6, 163, 8, 162,2, 150,2, 131,4, 129,6, 129,4, 128,2, 124,2, 96,7, 45,2, 44,7, 32,8, 12,0, 11,9.

Exemplo 9

5, 5' -( (2-Bromofenil)metileno)bis(1,3-dietil-6-hidroxy-2-tioxo2,3-dihidropirimidina-4(1H)-ona)

A mistura do ácido N,N-dietiltiobarbitúrico (2,0 mmol, 400,6 mg) e do 2-bromobenzaldeido (1,0 mmol, 185,0 mg) em etanol (5,0 mL) foi agitada à temperatura ambiente durante 2h. 0 sólido obtido foi filtrado, lavado com etanol frio e éter de petróleo 40-60°C, seco e recristalizado de etanol. 0 sólido branco obtido foi filtrado e seco por forma a obter 448,3 mg (rendimento 79%) do composto pretendido.

p.f.: 165-167°C.

RMN de ³Η (400 MHz, CDC1₃) δ (ppm) 7,56 (dd, J = 7,6, 1,1 Hz,

1H) , 7,33 - 7,24 (m, 2H) , 7,18 - 7,03 (m, 1H) , 5,61 (s,lH),

4,65 (q, J= 6,9 Hz, 4H) , 4,58 (m, 4H) , 1,36 (t, J= 7,0 Hz,

6H), 1,29 (t, J = 7,0 Hz, 6H).

RMN de ¹³C (101 MHz, CDCI3) δ (ppm) 174,5, 163, 6, 162,2, 135, 2, 134,5, 129,7, 128,8, 127,2, 123,1, 98,1, 45,2, 44,7, 36,5, 12,2, 12,1.

Exemplo 10

5,5'-((2,3-diclorofenil)metileno)bis(1,3-dietil-6-hidroxi-2tioxo-2,3-dihidropirimidin-4(1H)-ona)

A mistura do ácido N,N-dietiltiobarbitúrico (2,0 mmol, 400,6 mg) e do 2,3-diclorobenzaldeido (1,0 mmol, 184,2 mg) em etanol (5,0 mL) foi agitada à temperatura ambiente durante 2h. O sólido obtido foi filtrado, lavado com etanol frio e éter de petróleo 40-60°C, seco e recristalizado de etanol. O sólido amarelo obtido foi filtrado e seco por forma a obter 406,9 mg (rendimento 73%) do composto pretendido.

p.f.: 175-177°C.

RMN de ³H (400 MHz, CDCI3) δ (ppm) 7,43 (dd, J = 7,6, 1,1 Hz, 1H) , 7,24 (dd, J= 7,9, 1,1 Hz, 1H) , 7,20 (t, J= 7,9 Hz, 1H) , 5,70 (s, 1H) , 4,77 - 4,42 (m, 8H) , 1,35 (t, J= 7,0 Hz, 6H) , 1,29 (t, J = 7,0 Hz, 6H).

RMN de ¹³C (101 MHz, CDCI3) δ (ppm) 174,5,

163,5, 162,3,

136, 5,

134,3, 131,7, 129, 6, 127,8, 126, 9, 98,0, 77,5, 77,2, 76, 8, 45, 3,

44,8, 35,4, 12,2, 12,1.

Exemplo 11

5,5'-((2,4-diclorofenil)metileno)bis(1,3-dietil-6-hidroxi-2tioxo-2,3-dihidropirimidin-4(1H) -ona)

A mistura do ácido N,N-dietiltiobarbitúrico (2,0 mmol, 400,6 mg) e do 2,4-diclorobenzaldeido (1,0 mmol, 178,6 mg) em etanol (5,0 mL) foi agitada à temperatura ambiente durante 2h. O sólido obtido foi filtrado, lavado com etanol frio e éter de petróleo 40-60°C, seco e recristalizado de etanol. O sólido amarelo obtido foi filtrado e seco por forma a obter 351,2 mg (rendimento 63%) do composto pretendido.

p.f.: 172-173°C.

RMNde¹H (400 MHz, CDCI3) δ (ppm) 7,37 (d, J=2,0Hz, 1H) , 7,24 (dd, J= 8,6, 2,1 Hz, 1H) , 7,20 (d, J= 8,6 Hz, 1H) , 5,63 (s, 1H) , 4, 68 - 4,54 (m, 8H) , 1,35 (t, J= 7,0 Hz, 6H) , 1,29 (t, J = 6,9 Hz, 6H) .

RMN de ¹³C (101 MHz, CDCI3) δ (ppm) 174.5, 163.5, 162.3, 134.1, 133.7, 132.5, 130.6, 130.5, 126.9, 97.8, 45.3, 44.8, 34.4, 12.2, 12.1.

Exemplo 12

5, 5' -( (5-Hidroxi-2-nitrofenil)metileno)bis(1,3-dietil-6hidroxi-2-tioxo-2,3-dihidropirimidina-4(1H)-ona)

A mistura do ácido N,N-dietiltiobarbitúrico (2,0 mmol, 400,6 mg) e do 5-hidroxi-2-nitrobenzaldeido (1,0 mmol, 167,1 mg) em etanol (5,0 mL) foi agitada à temperatura ambiente durante 2h.

sólido obtido foi filtrado, lavado com etanol frio e éter de petróleo 40-60°C, seco e recristalizado de etanol. 0 sólido amarelo obtido foi filtrado e seco por forma a obter 505,7 mg (rendimento 92%) do composto pretendido.

p.f. 167-169°C.

RMN de ³Η (400 MHz, CDC1₃) δ (ppm) 7,60 (d, J = 8, 6 Hz,1H) ,

6,78 (dd, J= 8,6, 2,5 Hz, 1H) , 6,71 (d, J= 2,2 Hz, 1H) ,6,15 (s, 1H) , 4,63 (q, J= 7,0 Hz, 4H) , 4,54 (m, 4H) , 1,37 (t,J =

7,0 Hz, 6H) , 1,28 (t, J = 6,9 Hz, 6H) .

RMN de ¹³C (101 MHz, CDCI3) δ (ppm) 174,3, 163,5, 161, 9, 160, 8, 142,0, 132,5, 127,2, 117, 0, 113, 9, 97,0, 45, 0, 44, 6, 33, 0, 12,0, 11,8.

Exemplo 13

5, 5' - ((2,4-Dinitrofenil)metileno)bis(1,3-dietil-6-hidroxi-2tioxo-2,3-dihidropirimidina-4(1H) -ona)

A mistura do ácido N,N-dietiltiobarbitúrico (2,0 mmol, 400,6 mg) e do 2,4-dinitrobenzaldeido (1,0 mmol, 196,1 mg) em etanol (5,0 mL) foi agitada à temperatura ambiente durante 2h. O sólido obtido foi filtrado, lavado com etanol frio e éter de petróleo 40-60°C, seco e recristalizado de etanol. O sólido branco obtido foi filtrado e seco por forma a obter 434,0 mg (rendimento 75%) do composto pretendido.

p.f.: 169-170°C.

RMN de ³H (400 MHz, CDCI3) δ (ppm) 8,41 (d, J = 2,3 Hz, 1H),

8,37 (dd, J= 8,7, 2,4 Hz, 1H), 7,52 (dd, J= 8,7, 1,3 Hz,1H),

6,11 (s, 1H) , 4,63 (q, J= 7,0 Hz, 4H) , 4,59 - 4,46 (m, 4H),

1,37 (t, J= 7,0 Hz, 6H) , 1,29 (t, J= 7,0 Hz, 6H) .

RMN de ¹³C (101 MHz, CDCI3) δ (ppm) 174, 6, 163, 8,

162,2, 149, 9,

146, 9, 137,1, 131,2, 125, 7, 119, 6, 96, 0, 45, 3, 44,9, 33,3, 12,0, 11,9.

Exemplo 14

5, 5 ' -( (6-Nitrobenzo[d] [1,3]dioxol-5-il)metileno)bis(l,3dietil-6-hidroxi-2-tioxo-2,3-dihidropirimidin-4(1H)-ona)

A mistura do ácido N,N-dietiltiobarbitúrico (2,0 mmol, 400,6 mg) e do 6-nitrobenzo[d][1,3]dioxolo-5-carbaldeido (1,0 mmol, 199,1 mg) em etanol (5,0 mL) foi agitada à temperatura ambiente durante 2h. O sólido obtido foi filtrado, lavado com etanol frio e éter de petróleo 40-60°C, seco e recristalizado de etanol. O sólido amarelo obtido foi filtrado e seco por forma a obter 429,4 mg (rendimento 77%) do composto pretendido.

p.f.: 148-149°C.

RMN de ³H (400 MHz, CDCI3) δ (ppm) 7,11 (s, 1H) , 6,67 (d, J = 1,1 Hz, 1H) , 6,11 (s, 2H) , 6,10 (d, J = 1,1 Hz, 1H) , 4,68 4,46 (m, 8H) , 1,36 (t, J= 7,0 Hz, 6H) , 1,28 (t, J= 7,0 Hz, 6H) .

RMN de ¹³C (101 MHz, CDCI3) δ (ppm) 174,5, 163, 8, 162, 1, 150,4, 146,7, 144,1, 125,8, 109,2, 105,8, 103,1, 97,1, 45,2, 44,7, 32,8, 12,0, 11,9.

Exemplo 15

5,5'-(Piridin-3-ilmetileno)bis(1,3-dietil-6-hidroxi-2-tioxo2,3-dihidropirimidin-4(1H) -ona)

A mistura do ácido N,N-dietiltiobarbitúrico (2,0 mmol, 400,6 mg) e do 3-piridinocarboxaldeido (1,0 mmol, 109,3 mg, 95,9 pL) em etanol (5,0 mL) foi agitada à temperatura ambiente durante

2h. 0 sólido obtido foi filtrado, lavado com etanol frio e éter de petróleo 40-60°C, seco e recristalizado de etanol. 0 sólido amarelo obtido foi filtrado e seco por forma a obter 264,4 mg (rendimento 54%) do composto pretendido.

p.f.: 253-254°C.

RMN de ³H (400 MHz, DMSO-de) δ (ppm) 8,69 (d, J = 5, 6 Hz, 1H) , 8,58 (s, 1H) , 8,27 (d, J= 8,2 Hz, 1H) , 7,92 (dd, J= 8,2, 5,5 Hz, 1H) , 6,43 (s, 1H) , 4,44 (qd, J= 13,0, 6,4 Hz, 8H) , 1,17 (t, J = 6,8 Hz, 12H) .

RMN de ¹³C (101 MHz, DMSO-de) δ (ppm) 174,7, 161, 1, 144,7, 143,2, 140,1, 139,2, 126,7, 94,2, 43,1, 32,2, 12,3.

Exemplo 16

5,5'-((5-Clorofuran-2-il)metileno)bis(1,3-dietil-6-hidroxi-2tioxo-2,3-dihidropirimidin-4(1H)-ona)

A mistura do ácido N,N-dietiltiobarbitúrico (2,0 mmol, 400,6 mg) e do 5-cloro-2-furaldeido (1,0 mmol, 133,2 mg) em etanol (5,0 mL) foi agitada à temperatura ambiente durante 2h. O sólido obtido foi filtrado, lavado com etanol frio e éter de petróleo 40-60°C, seco e recristalizado de etanol. O sólido amarelo obtido foi filtrado e seco por forma a obter 374,5 mg (rendimento 73%) do composto pretendido.

p.f.: 151-152°C.

RMN de ³H (400 MHz, CDC1₃) δ (ppm) 6,13 (d, J = 3,3 Hz, 1H) , 6,07 (dd, J = 3,4, 1,7 Hz, 1H) , 5,52 (d, J = 1,8 Hz, 1H) , 4,73 - 4,51 (m, 8H) , 1,36 (t, J = 7,0 Hz, 6H) , 1,30 (t, J = 7,0 Hz, 6H) .

RMN de ¹³C (101 MHz, CDCI3) δ (ppm) 174, 8, 163,2, 162,2, 148,7, 135,2, 109,9, 107,1, 95,8, 45,2, 44,7, 31,4, 12,1, 12,1.

Exemplo 17

5,5'-(2-Metil-3-fenilprop-2-eno-l,l-diil)bis(1,3-dietil-6hidroxi-2-tioxo-2,3-dihidropirimidin-4(1H)-ona)

A mistura do ácido N,N-dietiltiobarbitúrico (2,0 mmol, 400,6 mg) e do a-metilcinamaldeido (1,0 mmol, 150,5 mg, 145,1 pL) em etanol (5,0 mL) foi agitada à temperatura ambiente durante 2h. O sólido obtido foi filtrado, lavado com etanol frio e éter de petróleo 40-60°C, seco e recristalizado de etanol. O sólido amarelo obtido foi filtrado e seco por forma a obter 264,3 mg (rendimento 50%) do composto pretendido.

p.f.: 145-146°C.

RMN de ³H (400 MHz, CDC1₃) δ (ppm) 7,34 (t, J = 7, 8 Hz, 2H) , 7,25 - 7,19 (m, 3H) , 6,27 (s, 1H) , 5,01 (q, J= 2,7, 1,4 Hz, 1H), 4,77 - 4,51 (m, 8H), 1,77 (t, J= 1,3 Hz, 3H), 1,36 (t, J = 7,0 Hz, 6H) , 1,31 (t, J= 7,0 Hz, 6H) .

RMN de ¹³C (101 MHz, CDCI3) δ (ppm) 174, 6, 163, 6, 162,4, 138,0, 131,2, 129, 0, 128,3, 126, 7, 126, 6, 97,5, 45, 3, 44,7, 38,3, 17,2, 12,2, 12,1.

Exemplo 18

5,5'-((2-Nitrofenil)metileno)bis(6-hidroxi-2-tioxo-2,3dihidropirimidin-4(1H) -ona)

A mistura de ácido tiobarbitúrico (2,0 mmol; 231,8 mg) e 2nitrobenzaldeido (1,0 mmol; 152,3 mg) em etanol (5 mL) , foi colocada em refluxo durante 5 horas e 30 minutos. O sólido precipitado foi filtrado e lavado com etanol frio e éter de petróleo 40-60 °C. O sólido amarelo obtido foi seco, por forma a obter 202,3 mg (rendimento 48%) do composto pretendido.

p.f.: 230-231 °C.

RMN de ³H (400 MHz, DMSO-de) δ (ppm) 11,62 (s, 4H),

7,53 (d, 1H,

J = 7,8 Hz), 7,47 (t, 1H, J = 7,6 Hz), 7,33 (t, 1H, J = 7,6 Hz) , 6,11 (s, 1H) .

RMN de ¹³C (101 MHz, DMSO-de) δ (ppm) 173, 1, 162, 6, 149, 7, 135, 6,

131,1, 129, 4, 126, 7, 123, 6, 94,7, 28,8.

De modo a avaliar a atividade de todos os compostos em estudo, estes foram dissolvidos em dimetilsulfóxido (DMSO) na concentração de 10 mM e mantidos a 4°C até à sua utilização.

A atividade inibitória da XO foi avaliada através da quantificação espetrofotométrica da formação de ácido úrico a 295 nm. Assim, para cada ensaio e em cada poço de uma microplaca de Elisa de 96 poços, procedeu-se à adição de 50 pL da solução de teste e 50 pL da solução de XO a 0,1 U/mL. O tampão dihidrogenofosf ato a 50 mM (pH 7,4) foi utilizado para a diluição de todas as soluções utilizadas. A microplaca foi em seguida incubada à temperatura de 37°C durante 5 minutos. Após esse tempo, foram adicionados 150 pL de uma solução de xantina a 420 pM, preparada por diluição de uma solução-mãe a 10 mM em hidróxido de sódio 25 mM. A microplaca foi novamente colocada em incubação por um período de 10 minutos, sendo a absorvância registada a cada minuto. Antes de cada leitura, foi efetuada uma agitação lenta, linear e automática durante 20 segundos.

De modo a obter apenas a absorvância associada ao ácido úrico, utilizou-se como branco uma solução constituída por 50 pL da solução de teste, 50 pL de tampão e 150 pL da solução de xantina. Adicionalmente, como controlo negativo, utilizou-se o tampão dihidrogenofosfato e como controlo positivo o fármaco utilizado na clínica, alopurinol. Para cada composto, calculou-se a percentagem de inibição utilizando a fórmula a seguir apresentada.

ΐ de Inibição — [1 (AbSamostra AbSbranco) / AÓScontrolo negativo] X 100

Onde:

AbSamostra corresponde a 50 pL da solução de teste, 50 pL da solução de XO e 150 pL da solução de xantina.

AbSbranco corresponde a 50 pL da solução de teste, 50 pL de tampão e 150 pL da solução de xantina.

AbScontroio negativo corresponde a 50 pL de tampão, 50 pL da solução de XO e 150 pL da solução de xantina.

A solução de teste corresponde à solução de cada um dos compostos em estudo.

Inicialmente, de forma a identificar os inibidores da XO mais promissores, foi efetuada uma triagem à concentração de 30 pM. Os resultados de inibição enzimática observados encontram-se apresentados na figura 3. Os compostos que apresentaram inibição da XO superior a 80%, próximo do fármaco de referência alopurinol, foram posteriormente testados a uma segunda concentração de 5 pM. Os compostos que mantiveram a percentagem de inibição superior a 80%, juntamente com o fármaco utilizado na clínica (alopurinol), foram selecionados para o estudo de IC₅o.

De forma a calcular os valores de IC50 de cada um dos compostos em estudo, foram utilizadas sete concentrações diferentes nas soluções de teste, variando entre 1 nM e 100 pM. Para o controlo alopurinol, foram utilizadas concentrações de 0,5, 1, 5, 10, 25, 50 e 100 pM. No caso das pirimidinonas em estudo, foram utilizadas concentrações de 0,1, 0,5, 1, 2,5, 5, 10 e 50 pM. Os resultados obtidos encontram-se representados na figura 4. Nesta figura está evidenciada a percentagem de inibição da XO para as pirimidinonas mais potentes, com valores de IC50 calculados de 0,62, 1,40 e 2,62 μΜ para os exemplos 9, 11 e 17, respetivamente. Os respetivos valores representam uma potência superior ao fármaco utilizado na clínica, o alopurinol, em cerca de 16, 7 e 3 vezes, respetivamente.

Um dos parâmetros principais a ter conta no desenvolvimento de novas moléculas farmacologicamente ativas é a sua toxicidade em células humanas saudáveis. Neste contexto, a citotoxicidade da bis-pirimidinona com melhor atividade inibitória da XO (exemplo 9) foi avaliada pelo ensaio do brometo de 3-(4,5-dimetiltiazole2-il)-2,5-difeniltetrazólio (MTT) em NHDF. Este é um ensaio colorimétrico quantitativo, em que a quantidade de MTT reduzido pelas células, originando o seu derivado formazano, é determinada espetrofotometricamente a 570 nm e é considerada proporcional ao número de células viáveis.

A linha celular foi cultivada em frascos de cultura de 75 cm² e mantida a 37 °C numa incubadora sob atmosfera húmida com 5% de CO2, em meio de cultura Roswell Park Memorial Instítute (RPMI) suplementado com 2 mM de D-glutamina, 10 mM de ácido 2-(4-(2hidroxietil)1-piperazinil]-etanossulfónico (HEPES), 1 mM de piruvato de sódio e completado com 10% soro fetal bovino (SFB) e 1% de antibiótico/antimicótico (AB) . Após atingir cerca de 90% de confluência, as células foram tripsinizadas, contadas e semeadas em placas de 96 poços (2xl0⁴ células/mL, 100 pL/poço), com o meio de cultura completo. Após 48h, foram tratadas com seis concentrações (0, 1, 1, 10, 50, 100 e 200 μΜ) da bispirimidinona em estudo durante 72h. As células não tratadas com composto foram utilizadas como controlo. Passado o tempo de incubação, o meio dos poços foi removido, e substituído por meio fresco sem SFB e AB e com solução de MTT 5 mg/mL. Após esta adição, as células foram novamente incubadas a 37 °C durante 4h. De seguida, o meio foi totalmente removido, os cristais de formazano foram dissolvidos em DMSO e a absorvância foi determinada num leitor de microplacas a 570 nm. A extensão de morte celular foi expressa como percentagem de viabilidade celular relativamente às células utilizadas como controlo. A experiência foi realizada em quadruplicado e o valor de IC50 foi calculado a partir da curva de concentração-resposta por cálculos de ajuste sigmoide. Os resultados da citotoxicidade do exemplo 9 em células NHDF estão expressos como valores médios ± erro padrão da média e representados na figura 5.

A informação representada na figura 5 demonstra que o composto do exemplo 9 não apresenta citotoxicidade para as células humanas NHDF à concentração ativa para a inibição da XO. De facto, verifica-se um valor de IC50 cerca de 90 vezes superior para a viabilidade celular em NHDF em relação aos valores obtidos para a inibição da enzima XO (56,09 versus 0,62 μΜ). Os valores de viabilidade celular observados em células normais são encorajadores no que respeita à segurança no potencial futuro uso deste tipo de compostos como agentes hipouricémicos.

Exemplos de aplicação

A presente invenção consiste na utilização de bis-pirimidinonas com a fórmula geral (I), os seus tautómeros e/ou os seus respetivos sais, no tratamento de condições patológicas causadas por hiperuricemia, com destaque para a gota. Isto devese fundamentalmente ao facto destas pirimidinonas, particularmente o composto do exemplo 9, inibirem marcadamente a enzima XO, o principal alvo terapêutico validado no tratamento da gota. Além disso, foi demonstrada seletividade de ação para o composto do exemplo 9, uma vez que não apresenta citotoxicidade para as células NHDF à concentração ativa para 22 a inibição da XO. Assim, a invenção é suscetível de aplicação industrial uma vez que a prevalência na sociedade de condições patológicas causadas por hiperuricemia, principalmente a gota, é elevada, constituindo as bis-pirimidinonas potenciais alternativas terapêuticas aos fármacos atualmente usados na clínica, para os quais são conhecidos efeitos secundários relevantes. Além disso, a preparação destas pirimidinonas é rápida, simples e permite obter elevados rendimentos reacionais, tendo um baixo custo, o que aumenta o seu interesse industrial.

Covilhã, 04 de fevereiro de 2021

Claims (6)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Bis-pirimidinonas para uso no tratamento e prevenção de condições patológicas causadas por hiperuricemia, caraterizadas por serem inibidores da atividade da enzima xantina oxidase e por apresentarem seletividade de ação em relação aos seus efeitos citotóxicos em células normais humanas.
2. 2. Bis-pirimidinonas para uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizadas pelo facto dos compostos serem da fórmula geral (I), bem como os seus tautómeros e/ou respetivos sais.
3. 3. Bis-pirimidinonas para uso de acordo com as reivindicações 1 e 2, caracterizadas pelo facto dos substituintes X e Y serem selecionados de heteroátomos e os grupos Ri, R2 e R3 serem hidrogénio ou selecionados de radicais hidrocarbonados.
4. 4. Bis-pirimidinonas para uso de acordo com a reivindicação 3, caracterizadas pelo facto dos substituintes X e Y serem selecionados de enxofre, os grupos Ri e R2 serem hidrogénio ou etilo e o grupo R3 ser um radical alcenilo, arilo ou heteroarilo.
5. 5. Bis-pirimidinonas para uso de acordo com as reivindicações 1 a 4, caracterizadas por reduzirem a produção de ácido úrico no organismo.
6. 6. Bis-pirimidinonas para uso de acordo com as reivindicações 1 a 5, caracterizadas pelo facto dos compostos não apresentarem toxicidade em fibroblastos normais da derme humana às concentrações mínimas necessárias para inibirem completamente a enzima xantina oxidase.

   Covilhã, 22 de outubro de 2021.