ES2887673T3 - Derivados de indolina sustituidos como inhibidores de la replicación vírica de dengue - Google Patents
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Abstract
Un compuesto de fórmula (I), incluida cualquiera de sus formas estereoquímicamente isoméricas, **(Ver fórmula)** donde R1 es fluoro, R2 es -CH2CH2OH, R3 es trifluorometilo, y R4 es hidrógeno, o R1 es fluoro, R2 es -CH2CH2OH, R3 es trifluorometilo, y R4 es metoxi, o R1 es fluoro, R2 es -CH2CH2OH, R3 es trifluorometoxi, y R4 es hidrógeno, o R1 es cloro, R2 es -CH2CH2OH, R3 es trifluorometilo, y R4 es hidrógeno, o R1 es cloro, R2 es -CH2CH2OH, R3 es trifluorometilo, y R4 es metoxi, o R1 es cloro, R2 es -CH2CH2OH, R3 es trifluorometoxi, y R4 es hidrógeno, o R1 es cloro, R2 es -(CH2)3COOH, R3 es trifluorometilo, y R4 es hidrógeno, o R1 es cloro, R2 es -(CH2)3COOH, R3 es trifluorometilo, y R4 es metoxi, o R1 es cloro, R2 es -(CH2)3COOH, R3 es trifluorometoxi,y R4 es hidrógeno; o una sal, solvato o polimorfo farmacéuticamente aceptable del mismo.
Description
DESCRIPCIÓN
Derivados de indolina sustituidos como inhibidores de la replicación vírica de dengue
La presente invención se refiere a derivados de indolina sustituidos, a métodos para prevenir o tratar infecciones virales por dengue mediante el uso de dichos compuestos y también se refiere a dichos compuestos para su uso como medicamento, más preferentemente, para su uso como medicamento para tratar o prevenir infecciones virales por dengue. La presente invención se refiere además a composiciones farmacéuticas o preparados combinados de los compuestos, a las composiciones o preparados para su uso como un medicamento, más preferentemente para la prevención o el tratamiento de infecciones virales por dengue. La invención también se refiere a procesos para la preparación de los compuestos.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Los flavivirus, los cuales son transmitidos por mosquitos o garrapatas, provocan infecciones potencialmente letales para el hombre, tales como la encefalitis y la fiebre hemorrágica. Se conocen cuatro serotipos distintos, pero estrechamente relacionados, del flavivirus dengue, denominados DENV-1, -2, -3 y -4. El dengue es endémico en la mayoría de las regiones tropicales y subtropicales en todo el mundo, predominantemente en áreas urbanas y semiurbanas. Según la Organización Mundial de la Salud (OMS), 2500 millones de personas, de las cuales mil millones son niños, corren el riesgo de sufrir una infección por VDEN (OMS, 2002). Se estima que en todo el mundo se producen cada año de 50 a 100 millones de casos de fiebre por dengue [FD], medio millón de casos de enfermedad por dengue grave (es decir, fiebre hemorrágica por dengue [FHD] y síndrome de choque por dengue [SCD]) y más de 20,000 muertes. La FHD se ha convertido en una de las principales causas de hospitalización y fallecimiento entre los niños en regiones endémicas. Por todo ello, el dengue representa la causa más común de enfermedad arbovírica. Debido a grandes brotes recientes en países situados en América Latina, sudeste asiático y Pacífico Occidental que incluye Brasil, Puerto Rico, Venezuela, Camboya, Indonesia, Vietnam, Tailandia), el número de casos de dengue ha aumentado drásticamente en los últimos años. No es solo el hecho de que el número de casos de dengue aumente a medida que la enfermedad se propaga a nuevas áreas, sino que los brotes tienden a ser más graves.
Aunque se han hecho progresos en el desarrollo de vacunas contra el dengue con la disponibilidad de la vacuna Dengvaxia®, se han encontrado muchas dificultades. Estas incluyen la existencia de un fenómeno denominado potenciación dependiente de anticuerpos (PDA). La recuperación de una infección provocada por un serotipo proporciona inmunidad de por vida frente a ese serotipo pero únicamente confiere una protección parcial y transitoria frente a una infección posterior provocada por uno de los otros tres serotipos.
Después de la infección con otro serotipo, los anticuerpos heterólogos preexistentes forman complejos con el serotipo de virus del dengue que provoca la nueva infección pero no neutralizan el patógeno. En su lugar, se cree que se facilita la entrada del virus en las células, lo cual da como resultado una replicación incontrolada del virus y títulos virales máximos mayores. Tanto en infecciones primarias como secundarias, unos títulos virales mayores están asociados con una enfermedad del dengue más grave. Puesto que los anticuerpos maternos pueden transmitirse fácilmente a los niños por la lactancia materna, esta podría ser una de las razones por las que los niños se ven más afectados que los adultos por la enfermedad grave por dengue.
En lugares en los que circulan simultáneamente dos o más serotipos, que también se denominan regiones hiperendémicas, el riesgo de enfermedad severa por dengue es significativamente superior debido a que existe un riesgo mayor de experimentar una infección secundaria más grave. Además, en una situación de hiperendemia, la probabilidad de que emerjan cepas más virulentas aumenta, lo cual a su vez aumenta la probabilidad de fiebre hemorrágica por dengue (FHD) o síndrome de choque por dengue.
Los mosquitos portadores del dengue, que incluyen Aedes aegypti y Aedes albopictus (mosquito tigre), se están desplazando hacia el norte del globo. Según los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades (CCPE) de los Estados Unidos (EE. UU.), en la actualidad ambos mosquitos son omnipresentes en el sur de Texas. La propagación hacia el norte de los mosquitos portadores del dengue no está confinada a los EE. UU., sino que también se ha observado en Europa.
Dengvaxia®, la vacuna para el dengue producida por Sanofi Pasteur se aprobó en primer lugar en México y mientras tanto, ha sido aprobada en más países. Sin embargo, la vacuna se puede mejorar considerablemente debido a que presenta una eficacia limitada, especialmente contra VDEN-1 y -2, una eficacia baja en sujetos no expuestos previamente al flavivirus y una pauta posológica prolongada.
Pese a estas limitaciones, la vacuna supone un punto de inflexión en las zonas endémicas puesto que ofrecerá protección a gran parte de la población, aunque probablemente no a bebés muy pequeños, quienes se ven muy afectados por el dengue. Además, la pauta posológica y la eficacia muy limitada en sujetos no expuestos previamente al flavivirus hacen que sea inadecuada y que probablemente no merezca la pena/no sea rentable para personas que viajen de zonas no endémicas a zonas endémicas de dengue. Las limitaciones mencionadas anteriormente de las vacunas contra el dengue son la razón por la que se necesita un agente antiviral contra el dengue que sea profiláctico
y se pueda aplicar previamente a la exposición.
Además, a día de hoy, no se dispone de fármacos antivirales específicos para el tratamiento o la prevención de una infección por el virus de la fiebre del dengue. Claramente, todavía existe una gran demanda médica no satisfecha de sustancias terapéuticas para la prevención o tratamiento de infecciones víricas en animales, más particular en humanos y especialmente para infecciones víricas provocadas por flavovirus, más en particular virus de Dengue. Es indispensable disponer de compuestos con una potencia antiviral satisfactoria, niveles bajos o nulos de efectos secundarios, una actividad de amplio espectro contra múltiples serotipos del virus del Dengue, una baja toxicidad y/o unas propiedades farmacocinéticas o farmacodinámicas satisfactorias.
El documento WO-2010/021878 divulga derivados de 2-fenilpirrolidina e indolina como antagonistas del receptor de mentol frío para el tratamiento de enfermedades inflamatorias y centrales. El documento WO-2013/045516 divulga derivados de indol e indolina para su uso en el tratamiento de infecciones virales por dengue.
A continuación, la presente invención proporciona compuestos, derivados de indolina sustituidos, que muestran una elevada y potente actividad contra los cuatro (4) serotipos del virus del dengue.
COMPENDIO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se basa en el descubrimiento inesperado de que al menos uno de los problemas mencionados anteriormente se puede resolver mediante los compuestos actuales de la invención.
La presente invención proporciona compuestos que se ha observado que poseen una potente actividad antiviral contra los cuatro (4) serotipos conocidos actualmente. La presente invención demuestra además que estos compuestos inhiben eficazmente la proliferación del virus del Dengue (VDEN). Por lo tanto, estos compuestos constituyen una clase útil de compuestos potentes que se pueden utilizar en el tratamiento y/o la prevención de infecciones virales en animales, mamíferos y seres humanos, más específicamente para el tratamiento y/o la prevención de infecciones con virus del Dengue.
La presente invención se refiere además al uso de tales compuestos como medicamentos y a su uso para la elaboración de medicamentos para tratar y/o prevenir infecciones virales, en particular con virus que pertenecen a la familia de los virus del Dengue en animales o mamíferos, más en particular en seres humanos. La invención también se refiere a métodos para preparar todos estos compuestos y a composiciones farmacéuticas que los comprenden en una cantidad eficaz.
La presente invención también se refiere a un método para el tratamiento o la prevención de infecciones virales por dengue en seres humanos mediante la administración de una cantidad eficaz de uno o más de tales compuestos, o una de sus sales farmacéuticamente aceptables, opcionalmente combinado con uno o más medicamentos diferentes, como otro agente antiviral, a un paciente que lo necesite.
Un aspecto de la invención es el suministro de compuestos de fórmula (I), incluyendo una forma estereoquímicamente isómera de los mismos,:
donde
R1 es fluoro, R2 es -CH2CH2OH, R3 es trifluorometilo, y R4 es hidrógeno, o
R1 es fluoro, R2 es -CH2CH2OH, R3 es trifluorometilo, y R4 es metoxi, o
R1 es fluoro, R2 es -CH2CH2OH, R3 es trifluorometoxi, y R4 es hidrógeno, o
R1 es cloro, R2 es -CH2CH2OH, R3 es trifluorometilo, y R4 es hidrógeno, o
R1 es cloro, R2 es -CH2CH2OH, R3 es trifluorometilo, y R4 es metoxi, o
R1 es cloro, R2 es -CH2CH2OH, R3 es trifluorometoxi, y R4 es hidrógeno, o
R1 es cloro, R2 es -(CH2HCOOH, R3 es trifluorometilo, y R4 es hidrógeno, o
R1 es cloro, R2 es -(CH2)3COOH, R3 es trifluorometilo, y R4 es metoxi, o
R1 es cloro, R2 es -(CH2)3COOH, R3 es trifluorometoxi,y R4 es hidrógeno;
o una sal, solvato o polimorfo farmacéuticamente aceptable del mismo.
Los compuestos anteriormente específicamente mencionados están seleccionados entre el grupo que comprende:
Parte de la invención actual es también una composición farmacéutica que comprende un compuesto mencionado anteriormente o una forma estereoisomérica, una sal, solvato o polimorfo farmacéuticamente aceptable del mismo, junto con uno o más excipientes, diluyentes o portadores farmacéuticamente aceptables.
Las sales farmacéuticamente aceptables de dichos compuestos incluyen las sales de adición de ácidos y de bases de los mismos. Las sales de adición de ácido adecuadas se forman a partir de ácidos que forman sales atóxicas. Las sales de adición de base adecuadas se forman a partir de bases que forman sales atóxicas.
Se entiende que las sales de ácido farmacéuticamente aceptables mencionadas anteriormente comprenden las formas activas de sal de adición de ácido no tóxica que los compuestos de fórmula (I) son capaces de formar. Estas sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptables se pueden obtener de manera conveniente tratando la forma de base con un ácido adecuado de este tipo. Los ácidos apropiados comprenden, por ejemplo, ácidos inorgánicos tales como ácido hidrohálico, por ejemplo, clorhídrico o bromhídrico, sulfúrico, nítrico, fosfórico y similares; o ácidos orgánicos tales como, por ejemplo, acético, propanoico, hidroxiacético, láctico, pirúvico, oxálico (es decir, etanodioico), malónico, succínico (es decir, ácido butano-dioico), maleico, fumárico, málico, tartárico, cítrico, metanosulfónico, etanosulfónico, bencenosulfónico, p-toluensulfónico, ciclámico, salicílico, p-amino-salicílico, ácido pamoico y ácidos similares.
Los compuestos de la invención también pueden existir en formas sin solvatar y solvatadas. El término "solvato" se utiliza en la presente para describir un complejo molecular que comprende el compuesto de la invención y una o más moléculas de un disolvente farmacéuticamente aceptables, por ejemplo, etanol.
El término "polimorfo" se refiere a la capacidad del compuesto de la invención de existir en más de una forma o
estructura cristalina.
Los compuestos de la presente invención se pueden administrar como productos amorfos o cristalinos. Se pueden obtener, por ejemplo, como masas compactas sólidas, polvos o películas mediante métodos tales como la precipitación, cristalización, liofilización, secado por pulverización o secado por evaporación. Se pueden administrar solos o combinados con uno o más compuestos de la invención diferentes o combinados con uno o más fármacos diferentes. En general, se administrarán como una formulación asociados con uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables. El término "excipiente" se utiliza en la presente para describir cualquier ingrediente que no sea el o los compuestos de la invención. La selección del excipiente depende en gran medida de factores tales como el modo particular de administración, el efecto del excipiente sobre la solubilidad y estabilidad, y la naturaleza de la forma farmacéutica.
Los compuestos de la presente invención o cualquiera de sus subgrupos se pueden formular en varias formas farmacéuticas con el fin de poderlos administrar. Como composiciones adecuadas, se pueden citar todas las composiciones empleadas normalmente para administrar fármacos por vía sistémica. Para preparar las composiciones farmacéuticas de esta invención, se combina una cantidad eficaz del compuesto particular, opcionalmente en forma de sal de adición, como principio activo, en mezcla íntima con un portador farmacéuticamente aceptable, pudiendo adoptar dicho portador una gran variedad de formas dependiendo de la forma del preparado que se desee para la administración. Estas composiciones farmacéuticas se encuentran deseablemente en una forma farmacéutica unitaria adecuada, por ejemplo, para administración oral o rectal. Por ejemplo, en la preparación de las composiciones en una forma farmacéutica oral, se puede emplear cualquiera de los medios farmacéuticos habituales tales como, por ejemplo, agua, glicoles, aceites, alcoholes y similares en el caso de preparados líquidos orales tales como suspensiones, jarabes, elixires, emulsiones y soluciones; o portadores sólidos tales como almidones, azúcares, caolín, diluyentes, lubricantes, aglutinantes, agentes desintegrantes y similares en el caso de polvos, pastillas, cápsulas y comprimidos. Debido a su fácil administración, los comprimidos y las cápsulas representan las formas farmacéuticas unitarias orales más convenientes, en cuyo caso se emplean obviamente portadores farmacéuticos sólidos. También se incluyen los preparados en forma sólida que se pueden convertir, poco antes de su uso, en formas líquidas.
Es especialmente ventajoso formular las composiciones farmacéuticas mencionadas anteriormente en forma farmacéutica unitaria por su facilidad de administración y uniformidad de dosificación. La expresión "forma farmacéutica unitaria", tal como se utiliza en la presente, se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosis unitarias, donde cada unidad contiene una cantidad predeterminada de principio activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado asociado con el portador farmacéutico requerido. Ejemplos de formas de dosificación unitaria de este tipo son comprimidos (incluyendo comprimidos con muesca o revestidos), cápsulas, píldoras, paquetes de polvos, obleas, supositorios, disoluciones o suspensiones inyectables y similares, y múltiples segregados de las mismas.
Los expertos en el tratamiento de enfermedades infecciosas serán capaces de determinar la cantidad eficaz a partir de los resultados de las pruebas que se presentan posteriormente en la presente. En general, se considera que una cantidad diaria eficaz sería de 0.01 mg/kg a 50 mg/kg de peso corporal, más preferentemente de 0.1 mg/kg a 10 mg/kg de peso corporal. Puede resultar apropiado administrar la dosis requerida como dos, tres, cuatro o más subdosis en intervalos adecuados a lo largo del día. Dichas subdosis se pueden formular como formas farmacéuticas unitarias, por ejemplo, que contengan de 1 a 1000 mg y, en particular, de 5 a 200 mg de principio activo por forma farmacéutica unitaria.
La dosis exacta y la frecuencia de administración dependen del compuesto particular de la invención utilizado, la afección particular que se esté tratando, la gravedad de la afección que se esté tratando, la edad, el peso y el estado físico general del paciente particular, así como también de otra medicación que pueda estar tomando el individuo, como bien sabrán los expertos en la técnica. Además, es obvio que la cantidad eficaz se puede reducir o incrementar dependiendo de la respuesta del sujeto tratado y/o dependiendo de la evaluación del médico que prescriba los compuestos de la presente invención. Por consiguiente, los intervalos de la cantidad eficaz que se han mencionado anteriormente son solamente orientativos y no se pretende que limiten el alcance ni el uso de la invención de ningún modo.
También se pretende que la presente exposición incluya cualquiera de los isótopos de los átomos presentes en los compuestos de la invención. Por ejemplo, los isótopos de hidrógeno incluyen tritio y deuterio, y los isótopos de carbono incluyen C-13 y C-14.
Los presentes compuestos utilizados en la presente invención también pueden existir en su forma estereoquímicamente isomérica, que define todos los posibles compuestos constituidos por los mismos átomos enlazados mediante la misma secuencia de enlaces pero que tienen estructuras tridimensionales diferentes, que no son intercambiables. A menos que se mencione o indique lo contrario, la designación química de los compuestos engloba la mezcla de todas las formas estereoquímicamente isoméricas posibles que dichos compuestos puedan poseer.
Dicha mezcla puede contener todos los diastereómeros y/o enantiómeros de la estructura molecular básica de dicho
compuesto. Se pretende que todas las formas estereoquímicamente isoméricas de los compuestos utilizados en la presente invención, tanto en forma pura como mezcladas con las otras, queden englobadas dentro del alcance de la presente invención, incluyendo cualquiera de las mezclas racémicas o racematos.
Las formas estereoisoméricas puras de los compuestos y los intermedios que se mencionan en la presente se definen como isómeros sustancialmente exentos de otras formas enantioméricas o diastereoméricas de la misma estructura molecular básica de dichos compuestos o intermedios. En particular, la expresión "estereoisoméricamente puro" se refiere a compuestos o intermedios que tienen un exceso estereoisomérico de al menos un 80% (es decir, un mínimo de un 90% de un isómero y un máximo de un 10% de los otros isómeros posibles) y hasta un exceso estereoisomérico de un 100% (es decir, un 100% de un isómero y nada de los demás), más concretamente, compuestos o intermedios que tienen un exceso estereoisomérico desde un 90% hasta un 100%, aún más concretamente que tienen un exceso estereoisomérico desde un 94% hasta un 100% y, aún más concretamente, que tienen un exceso estereoisomérico desde un 97% hasta un 100%. Las expresiones "enantioméricamente puro" y "diastereoméricamente puro" se deben interpretar de un modo similar, pero entonces haciendo referencia al exceso enantiomérico y el exceso diastereomérico de la mezcla en cuestión, respectivamente.
Pueden obtenerse formas estereoisoméricas puras de compuestos e intermedios utilizados en esta invención mediante la aplicación de procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, los enantiómeros se pueden separar unos de otros mediante la cristalización selectiva de sus sales diastereoméricas con ácidos o bases ópticamente activos. Algunos ejemplos de estos son el ácido tartárico, ácido dibenzoiltartárico, ácido ditoluoiltartárico y ácido alcanforsulfónico. Como alternativa, los enantiómeros se pueden separar mediante técnicas cromatográficas utilizando fases estacionarias quirales. Dichas formas estereoquímicamente isoméricas puras también pueden derivarse de las formas estereoquímicamente isoméricas puras correspondientes de los materiales de partida apropiados, siempre que la reacción se produzca de manera estereoespecífica. Preferentemente, si se desea obtener un estereoisómero específico, dicho compuesto se sintetizará mediante métodos de preparación estereoespecíficos. Estos métodos emplearán ventajosamente materiales de partida enantioméricamente puros.
Los compuestos de fórmula (I) de la presente invención tienen todos al menos un átomo de carbono quiral como se indica en la figura siguiente mediante el átomo de carbono marcado con *:
Debido a la presencia de dicho átomo de carbono quiral, un "compuesto de fórmula (I)" puede ser el enantiómero (R), el enantiómero (S), la forma racémica, o cualquier combinación posible de los dos enantiómeros individuales en cualquier proporción. Cuando la configuración absoluta (R) o (S) de un enantiómero no es conocida, este enantiómero también pude identificarse indicando si el enantiómero es dextrógiro (+) o levógiro(-) después de medir la rotación óptica específica de dicho enantiómero particular.
En un aspecto, la presente invención se refiere a un primer grupo de un compuesto de fórmula (I) donde los compuestos de fórmula (I) tienen la rotación específica (+).
En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un segundo grupo de compuestos de fórmula (I) donde los compuestos de fórmula (I) tienen la rotación específica (-).
Ejemplos
Métodos de LC/MS
La medición por cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) se realizó utilizando una bomba de CL, un haz de diodos (DAD) o un detector de Uv y una columna, según se especifique en los métodos respectivos. Cuando fue necesario, se incluyeron detectores adicionales (véase la tabla de los métodos a continuación).
El flujo procedente de la columna se introdujo en un espectrómetro de masas (MS), que estaba configurado con una fuente de iones a presión atmosférica. Es parte del conocimiento de un experto en la materia ajustar los parámetros ajustables (por ejemplo, intervalo de barrido, tiempo de permanencia, etc.) con el fin de obtener iones que permitan la
identificación del peso molecular (PM) monoisotópico nominal del compuesto. La adquisición de datos se llevó a cabo con el software adecuado.
Los compuestos se describen según sus tiempos de retención (Tr) experimentales e iones. Si no se especifica de otro modo en la tabla de datos, el ion molecular descrito corresponde a [M+H]+ (molécula protonada) y/o [M-H]- (molécula desprotonada). En el caso de que el compuesto no se pueda ionizar directamente, se especifica el tipo de aducto (es decir, [M+NH4]+, [M+HCOO]- , etc.). Para moléculas con patrones isotópicos múltiples (Br, Cl), el valor indicado es el obtenido para la masa isotópica más baja. Todos los resultados se obtuvieron con incertidumbres experimentales que están habitualmente asociadas al método usado.
En lo sucesivo en la presente, "SQD" significa detector de cuadrupolo único, "MSD" detector selectivo de masas, "TA" temperatura ambiente, "BEH" híbrido con puente de etilsiloxano/sílice, "DAD" detector de haz de diodos, "HSS" sílice de alta resistencia.
Códigos del método LC/MS (Flujo expresado en ml/min; temperatura de columna (T) en °C; tiempo de análisis en minutos).
Métodos de SFC/MS
La medición de SFC se llevó a cabo utilizando un sistema de cromatografía analítica de fluidos supercríticos (SFC) compuesto por una bomba binaria para suministrar dióxido de carbono (CO2) y un modificador, un dispositivo automático de toma de muestra, un horno para la columna, un detector de haz de diodos dotado de una celda de flujo de alta presión que resiste una presión de hasta 400 bar. Si se configura con un espectrómetro de masas (MS) el flujo desde la columna se lleva al (MS). Es parte del conocimiento de un experto en la materia ajustar los parámetros ajustables (por ejemplo, intervalo de barrido, tiempo de permanencia, etc.) con el fin de obtener iones que permitan la identificación del peso molecular (PM) monoisotópico nominal del compuesto. La adquisición de datos se llevó a cabo con el software adecuado.
Métodos analíticos de SFC/MS (flujo expresado en ml/min; temperatura de la columna (T) en °C; tiempo de análisis en minutos, contrapresión (BPR) en bar).
Puntos de fusión
Los valores son valores pico o intervalos de fusión y se obtienen con incertidumbres experimentales que están comúnmente asociadas con este método analítico.
DSC823e (indicado como DSC)
Para varios compuestos, los puntos de fusión se determinaron con un DSC823e (Mettler-Toledo). Se midieron los puntos de fusión con un gradiente de temperatura de 10 °C/minuto. La temperatura máxima fue 300 °C.
Rotaciones ópticas:
Las rotaciones ópticas se midieron en un polarímetro Perkin-Elmer 341 con una lámpara de sodio y se expresaron tal como se indica a continuación: [a]° (A, c g/100ml, disolvente, T°C).
[a]iT = (100a) / ( lx c) : donde l es la longitud del recorrido en dm y c es la concentración en g/100 ml para una muestra a una temperatura T (°C) y una longitud de onda A (en nm). Si la longitud de onda de la luz utilizada es de 589 nm (la línea D del sodio), entonces podría utilizarse el símbolo D en su lugar. El signo de la rotación (+ o -) debería proporcionarse siempre. Cuando se utiliza esta ecuación, la concentración y el disolvente siempre se proporcionan entre paréntesis después de la rotación. La rotación se indica utilizando grados y no se proporcionan unidades de concentración (se asume que son g/100 ml).
Abreviaturas usadas en la parte experimental
Ejemplo 1: síntesis de 2-(4-fluoro-2-(2-hidroxietoxi)fenil)-2-((3-metoxi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)-1 -(6-(trifluorometil)indolin-1-il)etan-1-ona (Compuesto 1) y separación quiral en los Enantiómeros 1A y 1B .
Síntesis del intermedio 1a:
Se calentó a reflujo una disolución de ácido 4-fluoro-2-metoxifenilacét¡co [CAS 886498-61-9] (10 g, 54.30 mmol) en EtOH (200 ml) y H2SO4 (2 ml) durante 12 horas. Se añadió agua y se concentró la mezcla a presión reducida hasta la mitad del volumen original. Se añadió hielo, se basificó la disolución con K2CO3 y se extrajo con EtOAc. Se lavó la fase orgánica con salmuera, se secó sobre MgSO4 , se filtró y se concentró el disolvente a presión reducida para proporcionar 2-(4-fluoro-2-metoxifenil)acetato de etilo 1a (11.6 g). Se usó el compuesto en la siguiente etapa sin purificación adicional.
Síntesis del intermedio 1b:
Se añadió tribromuro de boro (109.3 ml, 109.3 mmol) gota a gota a una disolución enfriada (-30°C) de 2-(4-fluoro-2-metoxifenil)acetato de etilo 1a (11.6 g, 54.7 mmol) en CH2Cl2 (300 ml). La reacción se agitó a -20 °C durante 1 h y se inactivó con CH3OH. Se ajustó el pH a 8 mediante la adición de una disolución acuosa saturada de NaHCO3. Se extrajo la disolución con CH2Cl2 y se secaron las fases orgánicas combinadas sobre MgSO4, se filtró y se concentró el disolvente a presión reducida para proporcionar 2-(4-fluoro-2-hidroxifenil)acetato de etilo 1b (10.8 g). Se usó el compuesto en la siguiente etapa sin purificación adicional.
Síntesis del intermedio 1c:
A una mezcla de 2-(4-fluoro-2-hidroxifenil)acetato de etilo 1b (1.24 g, 6.26 mmol) y carbonato de cesio (4.08 g, 12.5 mmol) en DMF (20 ml), se añadió el éter bencil 2-bromoetílico [CAS 1462-37-9] (1.61 g, 7.51 mmol). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante toda la noche. Se agregó agua y la mezcla se extrajo con EtOAc. La fase orgánica se secó con Na2SO4, se filtró y se concentró a presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía flash en gel de sílice utilizando un gradiente de CH2Cl2 (de un 15% a un 100%) en heptano para obtener 2-(2-(2-(benciloxi)etoxi)-4-fluorofenil)acetato de etilo 1c (1.55 g).
Síntesis del intermedio 1d:
A una disolución enfriada (-78 °C) de bis(trimetilsilil)amida de litio 1 M en THF (4.51 ml, 4.51 mmol), se añadió una disolución de 2-(2-(2-(benciloxi)etoxi)-4-fluorofenil)acetato de etilo 1c(0.750 g, 2.26 mmol) en THF (4 ml). Tras 1 hora a -78 °C, se añadió clorotrimetilsilano (0.458 ml, 3.61 mmol). Se agitó la mezcla de reacción a -78 °C durante 15 minutos. Se añadió W-bromosuccinimida (0.482 g, 2.71 mmol) y se continuó la agitación a -40 °C durante 2 horas. Se vertió la mezcla de reacción en H2O y se extrajo dos veces con EtOAc. Se combinaron las fases orgánicas, se secaron sobre Na2SO4 , se filtró y se concentró a presión reducida para proporcionar 2-(2-(2-(benciloxi)etoxi)-4-fluorofenil)-2-bromoacetato de etilo 1d (0.920 g) que se usó en la siguiente etapa sin purificación adicional.
Síntesis del intermedio 1e:
Una mezcla de 2-(2-(2-(benciloxi)etoxi)-4-fluorofenil)-2-bromoacetato de etilo 1d (0.920 g, 2.24 mmol) y 3-metoxi-5-(metilsulfonil)anilina [CAS 62606-02-4] (1.35 g, 6.71 mmol) en CH3CN (5 ml) y THF (5 ml) se agitó a 60 °C durante la noche. La mezcla de reacción se diluyó con EtOAc y se lavó con HCl 1 N. La fase orgánica se lavó con HCl 1 N, una solución acuosa saturada de NaHCO3, H2O y salmuera, se secó con Na2SO4, se filtró y se concentró a presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía instantánea en gel de sílice utilizando un gradiente de EtOAc (de un 5 % a un 50 %) en heptano para obtener 2-(2-(2-(benciloxi)etoxi)-4-fluorofenil)-2-((3-metoxi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)acetato de etilo 1e (0.870 g).
Síntesis del intermedio 1f:
Una mezcla de 2-(2-(2-(benciloxi)etoxi)-4-fluorofenil)-2-(3-metoxi-5(metilsulfonil)fenil)amino)acetato de etilo 1e (0.868 g, 1.63 mmol) y 10 % de paladio sobre carbón (0.180 g) en EtOAc (30 ml) se agitó a temperatura ambiente durante la noche bajo atmósfera de H2. La mezcla de reacción se filtró a través de celite®. El filtrado se concentró a presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía instantánea en gel de sílice utilizando un gradiente de EtOAc (de un 30 % a un 100 %) en heptano para obtener 2-(4-fluoro-2-(2-hidroxietoxi)fenil)-2-((3-metoxi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)acetato de etilo 1f.
Síntesis del intermedio 1 g :
A una disolución de 2-(4-fluoro-2-(2-hidroxietoxi)fenil)-2-((3-metoxi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)acetato de etilo 1f (0.910 g, 2.06 mmol) en Th F (6 ml), MeOH (6 ml) y H2O (6 ml) se añadió hidróxido de litio monohidratado (0.432 g, 10.3 mmol). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 h. La mezcla de reacción se concentró parcialmente a presión reducida para eliminar TFH y MeOH. El residuo se acidificó con HCl 1 N y se extrajo con CH2Cl2. Se secó la fase orgánica sobre Na2SO4, se filtró y se concentró a presión reducida para proporcionar ácido 2-(4-fluoro-2-(2-hidroxietoxi)fenil)-2-((3-metoxi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)acético 1g (0.736 g) que se usó en la siguiente etapa sin purificación adicional.
Síntesis del Compuesto 1 y separación quiral en los Enantiómeros 1A y 1B:
Método 1: A una disolución de ácido 2-(4-fluoro-2-(2-hidroxietoxi)fenil)-2-((3-metoxi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)acético 1g (0.200 g, 0.484 mmol) en DMF (4 ml) se añadieron HATU (0.184 g, 0.484 mmol), trietilamina (0.267 ml, 1.94 mmol) y 6-(trifluorometil)indolina [CAS 181513-29-1] (0.091 g, 0.484 mmol). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 4 h. La mezcla de reacción se diluyó con EtOAc y se lavó con HCl 1 N. La fase orgánica se lavó con una solución acuosa saturada de NaHCO3, H2O y salmuera, se secó con Na2SO4, se filtró y se concentró a presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía flash en gel de sílice utilizando un gradiente de EtOAc (de un 2% a un 40%) en CH2Cl2. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se concentraron a presión reducida. El residuo se purificó mediante TLC de preparación usando una mezcla de EtOAc (de un 50 %) en CH2Cl2 como eluyente. Purificación posterior por medio de HPLC de preparación (Columna: X-Bridge® C18 - 5 gm 100 x 19 mm, fase móvil: pH 10 disolución de NH4OAc en H2O, CH3CN) 2-(4-fluoro-2-(2-hidroxietoxi)fenil)-2-((3-metoxi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)-1 -(6-(trifluorometil)indolin-1 -il)etanona proporcionada (Compuesto 1,0.043 g) en forma de mezcla racémica.
Método 2: A una disolución de ácido 2-(4-fluoro-2-(2-hidroxietoxi)fenil)-2-((3-metoxi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)acético 1g (0.300 g, 0.726 mmol) en Me-THF (5.4 ml) bajo flujo de N2, se añadieron 6-(trifluorometil)indolina [c As 181513-29 1] (0.136 g, 0.726 mmol), N-diisopropiletilamina (264 gl, 1.596 mmol) y anhídrido propilfosfónico (653 gl, 1.09 mmol). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 16 h. La mezcla se vertió sobre agua y se extrajo con EtOAc. Se lavaron las fases orgánicas combinadas con una disolución de K2CO3 al 10 % en agua y con agua. Se secó la fase orgánica sobre MgSO4, se filtró y se concentró el disolvente a presión reducida. Se combinó esta fracción (0.47 g) con un segundo lote (cantidad total: 0.585 g) y se purificó por medio de cromatografía en columna sobre gel de sílice (15 40 gM, 24 g, CH2Cl2/MeOH 99.5/0.5). Se combinaron las fracciones puras y se concentró a presión reducida para proporcionar 2-(4-fluoro-2-(2-hidroxietoxi)fenil)-2-((3-metoxi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)-1-(6-(trifluorometil)indolin-1-il)etanona (Compuesto 1, 0.160 g) en forma de mezcla racémica.
Se separaron los enantiómeros del Compuesto 1 (160 mg) por medio de SFC Quiral de Preparación (Fase estacionaria: Chiralpak® AD-H 5 gm 250 x 20 mm, Fase móvil: 75 % de CO2, 25 % de EtOH (+0.3 % de iPrNH2)). El primer producto eluido (72 mg) se solidificó en heptano/éter diisopropílico para dar el Enantiómero 1A (50 mg). El segundo enantiómero eluido (80 mg) se solidificó en heptano/éter diisopropílico para dar el Enantiómero 1B (43 mg).
Compuesto 1:
1H RMN (300 MHz, DMSO-afe) 8 ppm 3.10 (s, 3 H) 3.22 (m, 2 H) 3.62 - 3.92 (m, 5 H) 3.97 - 4.22 (m, 3 H) 4.46 (m, 1 H) 4.98 (s a, 1 H) 5.82 (d, J=7.9 Hz, 1 H) 6.56 (s, 1 H) 6.62 (s, 1 H) 6.80 (t, J=7.7 Hz, 1 H) 6.92 (s, 1 H) 6.95 - 7.11 (m, 2 H) 7.29 - 7.53 (m, 3 H) 8.39 (s, 1 H)
LC-MS (método LC-C): TR 1.37 min, MH+ 583
Enantiómero 1A:
1H RMN (500 MHz, DMSO-afe) 5 ppm 3.10 (s, 3 H) 3.14 - 3.29 (m, 2 H) 3.73 (s, 3 H) 3.75 - 3.78 (m, 1 H) 3.78 - 3.89 (m, 1 H) 3.98 - 4.23 (m, 3 H) 4.37 - 4.55 (m, 1 H) 4.97 (t, J = 5.4 Hz, 1 H) 5.82 (d, J = 8.2 Hz, 1 H) 6.56 (s, 1 H) 6.62 (s, 1 H) 6.79 (dt, J = 2.2, 8.5 Hz, 1 H) 6.91 (s, 1 H) 6.98 - 7.04 (m, 2 H) 7.32 - 7.43 (m, 2 H) 7.46 (d, J = 7.9 Hz, 1 H) 8.39 (s, 1 H).
LC/MS (método LC-A): TR 3.04 min, MH+ 583
[ajo20: -49.6° (c 0.25, DMF)
SFC quiral (método SFC-A): TR 2.76 min, MH+ 583, pureza quiral 100%.
Enantiómero 1B:
1H RMN (500 MHz, DMSO-afe) 5 ppm 3.10 (s, 3 H) 3.14 - 3.29 (m, 2 H) 3.73 (s, 3 H) 3.75 - 3.78 (m, 1 H) 3.78 - 3.89 (m, 1 H) 3.98 - 4.23 (m, 3 H) 4.37 - 4.55 (m, 1 H) 4.97 (t, J = 5.4 Hz, 1 H) 5.82 (d, J = 8.2 Hz, 1 H) 6.56 (s, 1 H) 6.62 (s, 1 H) 6.79 (dt, J = 2.2, 8.5 Hz, 1 H) 6.91 (s, 1H) 6.98 - 7.04 (m, 2 H) 7.32 - 7.43 (m, 2 H) 7.46 (d, J = 7.9 Hz, 1 H) 8.39 (s, 1 H).
LC/MS (método LC-A): TR 3.04 min, MH+ 583
[a ]D20 : 51.7° (c 0.23, DMF)
SFC quiral (método SFC-A): TR 4.16 min, MH+ 583, pureza quiral 100%.
Ejemplo 2: síntesis de 2-(4-fluoro-2-(2-hidroxietoxi)fenil)-2-((3-metoxi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)-1 -(5-metoxi-6-(trifluorometil)indolin-1 -il)etanona (Compuesto 2) y separación quiral en los Enantiómeros 2A y 2B .
Separación Quiral
Enantiomeros 2A y 2B
Síntesis del intermedio 2a:
A una mezcla de 2-(4-fluoro-2-hidroxifenil)acetato de etilo 1b (10.6 g, 53.5 mmol) y carbonato de cesio (34.8 g, 106.9 mmol) en DMF (200 ml) a 10 °C, se añadió (2-bromoetoxi)(terc-butil)dimetilsilano [CAS 86864-60-0] (13.8 ml, 64.2 mmol). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante toda la noche. Se añadió H2O y la mezcla de reacción se extrajo con EtOAc. La fase orgánica se secó con MgSO4, se filtró y se concentró a presión reducida. Se purificó el residuo por medio de cromatografía instantánea sobre gel de sílice (15-40 gM, 40 g, heptano/EtOAc 80/20). Se combinaron las fracciones puras y se retiró el disolvente a presión reducida para proporcionar 2-(2-(2-((tercbutildimetilsilil)oxi)etoxi)-4-fluorofenil)acetato de etilo 2a (17.7 g).
Síntesis del intermedio 2b:
A una disolución 1 M de bis(trimetilsilil)amida de litio en THF (28.05 ml, 28.05 mmol), enfriada a -78 °C, se añadió una disolución de 2-(2-(2-((terc-butildimetilsilil)oxi)etoxi)-4-fluorofenil)acetato de etilo 2a (5 g, 14.03 mmol) en THF (30 ml). Tras agitar durante 1 horas a -78 °C, se añadió clorotrimetilsilano (2.85 ml, 22.44 mmol). Se agitó la mezcla de reacción a -78 °C durante 15 minutos. Se añadió W-bromosuccinimida (3 g, 16.83 mmol) en THF (30 ml) y se continuó la agitación a -55 °C durante 2 horas. Se vertió la mezcla de reacción en H2O y se extrajo dos veces con EtOAc. Se combinaron las fases orgánicas, se secaron sobre MgSO4, se filtró y se concentró a presión reducida para proporcionar 2-bromo-2-(2-(2-((terc-butildimetilsil)oxi)etoxi)-4-fluorofenil)acetato de etilo 2b (6.57 g) que se usó en la siguiente etapa sin purificación adicional.
Síntesis del intermedio 2c:
Se agitó una mezcla de 2-bromo-2-(2-(2-((terc-butildimetilsilil)oxi)etoxi)-4-fluorofenil)acetato de etilo 2b (3 g, 6.89 mmol), 3-metoxi-5-(metilsulfonil)anilina [CAS 62606-02-4] (2.08 g, 10.3 mmol) y diisopropiletilamina (2.37 ml, 13.8 mmol) en CH3CN (60 ml)a 50°C durante la noche. La mezcla de reacción se concentró a presión reducida. Se introdujo el residuo en EtOAc y se lavó con HCl 0.5 N y agua. La fase orgánica se secó con MgSO4, se filtró y se concentró a presión reducida. Se purificó el residuo por medio de cromatografía instantánea sobre gel de sílice (15-40 gM, 120 g, gradiente de heptano/EtOAc de 90/10 a 80/20) para proporcionar 2-(2-(2-((terc-butildimetilsilil)oxi)etoxi)-4-fluorofenil)-2-((3-metoxi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)acetato de etilo 2c (2.6 g).
Síntesis del intermedio 2d:
Se añadió hidróxido de litio monohidratado (205 mg, 4.8 mmol) gota a gota a una disolución de 2-(2-(2-((tercbutildimetilsilil)oxi)etoxi)-4-fluorofenil)-2-((3-metoxi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)acetato de etilo 2c (2.227 g, 4.09 mmol) en THF/CH3OH/H2O (1/1/1) (100 ml) a 10°C. Se agitó la reacción a temperatura ambiente durante 4 horas, y se diluyó con agua. Tras enfriar a 0 °C, se acidificó lentamente la disolución a pH 6 con HCl 0.5 N, y se extrajo con EtOAc. Se secó la fase orgánica sobre MgSO4, se filtró y se concentró el disolvente a presión reducida para proporcionar ácido 2-(2-(2-((terc-butildimetilsilil)oxi)etoxi)-4-fluorofenil)-2-((3-metoxi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)acético 2d (2 g). Se usó el compuesto en la siguiente etapa sin purificación adicional.
Síntesis del intermedio 2e:
Una mezcla de 1-metoxi-4-nitro-2-(trifluorometil)benceno [CAS 654-76-2] (24.5 g, 110.8 mmol) y 4-clorofenoxiacetonitrilo [CAS 3598-13-8] (20.4 g, 121.9 mmol) en DMF (100 ml) se añadió gota a gota durante 30 min a una solución agitada de tBuOK (27.35 g, 243.7 mmol) en DMF (100 ml) a -10 °C. Después de la adición, la solución de color púrpura se mantuvo a -10 °C durante 1 h. Se añadieron 500 ml de hielo-agua y 500 ml de HCl 6 N y el precipitado se retiró por filtración, se lavó con agua y se secó a presión reducida para proporcionar 40.4 g de 2-(5-metoxi-2-nitro-4-(trifluorometil)fenil)acetonitrilo 2e (usado como tal en la siguiente etapa).
Síntesis del intermedio 2f:
Una solución de 2-(5-metoxi-2-nitro-4-(trifluorometil)fenil)acetonitrilo 2e (26 g , 99.9 mmol) en etanol/agua (9/1) (500 ml) y AcOH (5.2 ml) se hidrogenó durante 1 h a una presión de 3.5 Bar con Pd al 10%/C (15.3 g) como catalizador. Se filtró la mezcla de reacción a través de un lecho de celite® y se lavó la torta filtrante con una mezcla de disolventes de CH2Cl2 y CH3OH. El filtrado se concentró a presión reducida. El residuo se filtró a través de un filtro de vidrio cargado con sílice 60-200 gm usando 80/20 de heptano/EtOAc como eluyente. Las fracciones que contenían el compuesto esperado se combinaron y el disolvente se concentró a presión reducida para dar 5-metoxi-6-(trifluorometil)-1 H-indol 2f (15.6 g).
Síntesis del intermedio 2g:
A 0 °C, se añadió gota a gota BH3-Piridina (23.5 ml, 232.4 mmol) a una solución de 5-metoxi-6-(trifluorometil)-1 H-indol 2f (10 g, 46.5 mmol) en EtOH (60 ml). Se añadió lentamente HCl 6 N (140 ml) mientras se mantenía la temperatura por debajo de 10 °C. La mezcla se agitó a 0 °C durante 2 h. Se añadió agua (200 ml) y la mezcla se basificó a pH 8-9 con una solución acuosa concentrada de NaOH (la temperatura de reacción se mantuvo por debajo de 20 °C). El
precipitado se retiró por filtración, se lavó con agua (dos veces) y se co-evaporó a presión reducida con tolueno para dar 5-metoxi-6-(trifluorometil)indolina 2g (9 g).
Síntesis del intermedio 2h:
A una disolución de ácido 2-(2-(2-((ferc-butildimetilsilil)oxi)etoxi)-4-fluorofenil)-2-((3-metoxi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)acético 2d (1 g, 1.90 mmol) en Dm F (10 ml), se añadieron HATU (1.08 g, 2.84 mmol), diisopropiletilamina (940 gl, 5.69 mmol) y 5-metoxi-6-(trifluorometil)indolina 2g(412 mg, 1.90 mmol). Se agitó la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante 4 h. Se diluyó la mezcla de reacción con agua. Se filtró el precipitado, se lavó con agua y se introdujo en EtOAc. Se lavó la fase orgánica con HCl 1N, agua, se secó sobre MgSCU, se filtró y se concentró el disolvente a presión reducida para proporcionar 2-(2-(2-((ferc-butildimetilsilil)oxi)etoxi)-4-fluorofenil)-2-((3-metoxi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)-1-(5-metoxi-6-(trifluorometil)indolin-1-il)etanona 2h (1.36 g, pureza por LC: 70 %). El compuesto crudo se utilizó directamente en el siguiente paso de reacción.
Síntesis del Compuesto 2 y separación quiral en los Enantiómeros 2A y 2B:
Se agitó una disolución de 2-(2-(2-((ferc-butildimetilsilil)oxi)etoxi)-4-fluorofenil)-2-((3-metoxi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)-1-(5-metoxi-6-(trifluorometil)indolin-1-il)etanona 2h (1.29 g, 1.77 mmol) en HCl 4M en dioxano (30 ml) y dioxano (100 ml), a temperatura ambiente durante 1 hora. Se retiró el disolvente a presión reducida. Se añadieron EtOAc y una solución acuosa al 10% de K2CO3. Se separó la fase orgánica, se secó sobre MgSO4 , se filtró y se concentró el disolvente a presión reducida. Se purificó el residuo por medio de cromatografía instantánea sobre gel de sílice (15-40 gm, 80 g, CH2Cl2/MeOH/NH4OH 99/1/0.1) para proporcionar, tras cristalización a partir de CH3CN, 2-(4-fluoro-2-(2-hidroxietoxi)fenil)-2-((3-metoxi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)-1-(5-metoxi-6-(trifluorometil)indolin-1-il)etanona (Compuesto 2 , 595 mg) en forma de racemato.
Se separaron los enantiómeros del Compuesto 2 (560 mg) por medio de SFC Quiral de Preparación (Fase estacionaria: Whelk O1 (S,S)® 5 gm 250 x 21.1 mm, fase móvil: 50 % de CO2 , 50 % de EtOH (+0.3 % de iPrNH2)). El primer enantiómero eluido (288 mg) se cristalizó a partir de CH3CN/éter diispropílico para dar el Enantiómero 2A (240 mg). El segundo enantiómero eluido (293 mg) se cristalizó a partir de CH3CN/éter diisopropílico para dar el Enantiómero 2B (232 mg).
Compuesto 2:
1H RMN (500 MHz, DMSO-afe) 8 ppm 3.09 (s, 3 H) 3.12 - 3.29 (m, 2 H) 3.73 (s, 3 H) 3.74 - 3.80 (m, 1 H) 3.80 - 3.90 (m, 4 H) 4.02 (td, J=10.4, 7.2 Hz, 1 H) 4.05 - 4.17 (m, 2 H) 4.42 (td, J=10.4, 6.2 Hz, 1 H) 4.97 (t, J= 5.7 Hz, 1 H) 5.79 (d, J=8.20 Hz, 1 H) 6.56 (s, 1 H) 6.61 (s, 1 H) 6.78 (td, J=8.51,2.52 Hz, 1 H) 6.90 (s, 1 H) 6.95 - 7.04 (m, 2 H) 7.24 (s, 1 H) 7.37 (dd, J=8.67, 6.78 Hz, 1 H) 8.35 (s, 1 H)
LC-MS (método LC-A): TR 3.02 min, MH+ 613
Punto de fusión: 215°C
Enantiómero 2A:
1H RMN (500 MHz, DMSO-afe) 5 ppm 3.09 (s, 3 H) 3.12 - 3.29 (m, 2 H) 3.73 (s, 3 H) 3.74 - 3.80 (m, 1 H) 3.80 - 3.90 (m, 4 H) 4.02 (td, J=10.4, 7.2 Hz, 1 H) 4.05 - 4.17 (m, 2 H) 4.42 (td, J=10.4, 6.2 Hz, 1 H) 4.97 (t, J= 5.7 Hz, 1 H) 5.79 (d, J=8.20 Hz, 1 H) 6.56 (s, 1 H) 6.61 (s, 1 H) 6.78 (td, J=8.51,2.52 Hz, 1 H) 6.90 (s, 1 H) 6.95 - 7.04 (m, 2 H) 7.24 (s, 1 H) 7.37 (dd, J=8.67, 6.78 Hz, 1 H) 8.35 (s, 1 H)
LC/MS (método LC-A): TR 3.00 min, MH+ 613
[a ]D20 : 53.5° (c 0.2392, DMF)
SFC quiral (método SFC-B): TR 1.43 min, MH+ 613, pureza quiral 100%.
Punto de fusión: 204°C
Enantiómero 2B:
1H RMN (500 MHz, DMSO-afe) 5 ppm 3.09 (s, 3 H) 3.12 - 3.29 (m, 2 H) 3.73 (s, 3 H) 3.74 - 3.80 (m, 1 H) 3.80 - 3.90 (m, 4 H) 4.02 (td, J=10.4, 7.2 Hz, 1 H) 4.05 - 4.17 (m, 2 H) 4.42 (td, J=10.4, 6.2 Hz, 1 H) 4.97 (t, J= 5.7 Hz, 1 H) 5.79 (d, J=8.20 Hz, 1 H) 6.56 (s, 1 H) 6.61 (t, J=1.73 Hz, 1 H) 6.78 (td, J=8.51,2.52 Hz, 1 H) 6.90 (s, 1 H) 6.95 - 7.04 (m, 2 H) 7.24 (s, 1 H) 7.37 (dd, J=8.67, 6.78 Hz, 1 H) 8.35 (s, 1 H)
LC/MS (método LC-A): TR 3.00 min, MH+ 613
[ajo20: -56.5° (c 0.255, DMF)
SFC quiral (método SFC-B): TR 1.72 min, MH+ 613, pureza quiral 99.8%.
Punto de fusión: 206°C
Ejemplo 3: síntesis de 2-(4-fluoro-2-(2-hidroxietoxi)fenil)-2-((3-metoxi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)-1 -(6-(trifluorometoxi)indolin-1-il)etanona (Compuesto 3) y separación quiral en los Enantiómeros 3A y 3B .
Síntesis del intermedio 3a:
A una disolución de ácido 2-(2-(2-((ferc-butildimetilsilil)oxi)etoxi)-4-fluorofenil)-2-((3-metoxi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)acético 2d (1 g, 1.90 mmol) en Dm F (10 ml), se añadieron HATU (1.08 g, 2.84 mmol), diisopropiletilamina (940 pl, 5.69 mmol) y 6-(trifluorometoxi)indolina [CAS 959235-95-1] (385 mg, 1.90 mmol). Se agitó la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante 4 h. Se diluyó la mezcla de reacción con agua. Se filtró el precipitado, se lavó con agua y se introdujo en EtOAc. Se lavó la fase orgánica con una disolución de K2CO3 al 10 % en agua, una disolución saturada de NaCl, agua, se secó sobre MgSO4, se filtró y se concentró a presión reducida para proporcionar 2-(2-(2-((ferc-butildimetilsilil)oxi)etoxi)-4-fluorofenil)-2-((3-metoxi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)-1-(6-(trifluorometoxi)indolin-1-il)etanona 3a (1.32 g). Se usó el compuesto bruto sin purificación en la siguiente etapa de reacción.
Síntesis del Compuesto 3 y separación quiral en los Enantiómeros 3A y 3B:
Se agitó una disolución de 2-(2-(2-((ferc-butildimetilsilil)oxi)etoxi)-4-fluorofenil)-2-((3-metoxi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)-1-(6-(trifluorometoxi)indolin-1-il)etanona 3a (1.17 g, 1.64 mmol) en HCl 4M en dioxano (3.3 ml) y dioxano (50 ml) a temperatura ambiente durante 1 hora. Se retiró el disolvente por medio de evaporación a presión reducida. Se añadieron EtOAc y una solución acuosa al 10 % de K2CO3. Se separó la fase orgánica, se secó sobre MgSO4, se filtró y se concentró el disolvente a presión reducida. Se purificó el residuo por medio de cromatografía instantánea sobre gel de sílice (15-40 pm, 40 g, CH2Cl2/MeOH 99.5/0.5) para proporcionar 2-(4-fluoro-2-(2-hidroxietoxi)fenil)-2-((3-metoxi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)-1 -(6-trifluorometoxi)indolin-1 -il)etanona (Compuesto 3, 508 mg) en forma de racemato. Se solidificó una muestra analítica del Compuesto 3 a partir de CH3CN/éter diisopropílico (35 mg). Se usó la cantidad restante para separar los enantiómeros del Compuesto 3 por medio de SFC Quiral de Preparación (Fase estacionaria: Chiralpak® AD-H 5 pm 250 x 20 mm, Fase móvil: 70 % de CO2, 30 % de EtOH (+0.3 % de iPrNH2)). El primer enantiómero eluido (166 mg) se solidificó en heptano/éter diisopropílico para dar el Enantiómero 3A (130 mg). El segundo enantiómero eluido (165 mg) se solidificó en heptano/éter diisopropílico para dar el Enantiómero 3B (110 mg).
Compuesto 3:
1H RMN (500 MHz, DMSO-ds) 8 ppm 3.10 (s, 3 H) 3.11 - 3.25 (m, 2 H) 3.73 (s, 3 H) 3.74 - 3.79 (m, 1 H) 3.79 - 3.88 (m, 1 H) 3.96 - 4.19 (m, 3 H) 4.45 (dt, J=6.3, 10.4 Hz, 1 H) 4.95 (t, J=5.52 Hz, 1 H) 5.81 (d, J=8.51 Hz, 1 H) 6.57 (s, 1 H) 6.62 (t, J=1.89 Hz, 1 H) 6.80 (td, J=8.43, 2.36 Hz, 1 H) 6.91 (s, 1 H) 6.96 - 7.05 (m, 3 H) 7.28 - 7.46 (m, 2 H) 8.05 (s, 1 H)
LC-MS (método LC-A): TR 3.15 min, MH+ 599
Enantiómero 3A:
1H RMN (500 MHz, DMSO-afe) 5 ppm 3.10 (s, 3 H) 3.11 - 3.25 (m, 2 H) 3.73 (s, 3 H) 3.74 - 3.79 (m, 1 H) 3.79 - 3.88 (m, 1 H) 3.96 - 4.19 (m, 3 H) 4.45 (dt, J=6.3, 10.4 Hz, 1 H) 4.97 (t, J=5.52 Hz, 1 H) 5.81 (d, J=8.51 Hz, 1 H) 6.57 (s, 1 H) 6.62 (t, J=1.89 Hz, 1 H) 6.80 (td, J=8.43, 2.36 Hz, 1 H) 6.91 (s, 1 H) 6.96 - 7.11 (m, 3 H) 7.28 - 7.46 (m, 2 H) 8.05 (s, 1 H)
LC/MS (método LC-A): TR 3.13 min, MH+ 599
[a ]D20 : -59.0° (c 0.2542, DMF)
SFC quiral (método SFC-C): TR 1.87 min, MH+ 599, pureza quiral 100%.
Enantiómero 3B:
1H RMN (500 MHz, DMSO-afe) 5 ppm 3.10 (s, 3 H) 3.11 - 3.25 (m, 2 H) 3.73 (s, 3 H) 3.74 - 3.79 (m, 1 H) 3.79 - 3.88 (m, 1 H) 3.96 - 4.19 (m, 3 H) 4.45 (dt, J=6.3, 10.4 Hz, 1 H) 4.97 (t, J=5.52 Hz, 1 H) 5.81 (d, J=8.51 Hz, 1 H) 6.57 (s, 1 H) 6.62 (t, J=1.89 Hz, 1 H) 6.80 (td, J=8.43, 2.36 Hz, 1 H) 6.91 (s, 1 H) 6.96 - 7.11 (m, 3 H) 7.28 - 7.46 (m, 2 H) 8.05 (s, 1 H)
LC/MS (método LC-A): TR 3.13 min, MH+ 599
[a ]D20 : 56.8° (c 0.2467, DMF)
SFC quiral (método SFC-C): TR 2.34 min, MH+ 599, pureza quiral 100%.
Ejemplo 4 (método 1): síntesis de 2-(4-cloro-2-(2-hidroxietoxi)fenil)-2-((3-metoxi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)-1 -(6-(trifluorometil)indolin-1 -il)etanona (Compuesto 4)
Síntesis del intermedio 4a:
A una mezcla de 2-(4-cloro-2-hidroxifenil)acetato de etilo [CAS 1261826-30-5] (2.82 g, 3.28 mmol) y carbonato de cesio (8.56 g, 26.3 mmol) en DMF (50 ml), se añadió el éter bencil 2-bromoetílico [CAS 1462-37-9] (2.29 g, 14.5 mmol). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 24 h. Se añadió H2O y la mezcla de reacción se extrajo con EtOAc. La fase orgánica se secó con Na2SO4, se filtró y se concentró a presión reducida. El residuo se
purificó mediante cromatografía flash en gel de sílice utilizando un gradiente de EtOAc (de un 2% a un 20%) en heptano para obtener 2-(2-(2-(benciloxi)etoxi)-4-clorofenil)acetato de etilo 4a (4.17 g).
Síntesis del intermedio 4b:
A una disolución enfriada (-78 °C) de bis(trimetilsilil)amida de litio 1 M en THF (11.0 ml, 11.0 mmol), se añadió una disolución de 2-(2-(2-(benciloxi)etoxi)-4-clorofenil)acetato de etilo 4a(1.82 g, 5.22 mmol) en THF (9 ml). Tras agitar durante 1 horas a -78 °C, se añadió clorotrimetilsilano (1.1 ml, 8.67 mmol). Se agitó la mezcla de reacción a -78 °C durante 15 minutos. Se añadió W-bromosuccinimida (1.11 g, 8.67 mmol) y se continuó la agitación a -78 °C durante 2 horas. Se vertió la mezcla de reacción en H2O y se extrajo dos veces con EtOAc. Se secó la fase orgánica sobre MgSO4, se filtró y se concentró a presión reducida para proporcionar 2-(2-(2-(benciloxi)etoxi)-4-clorofenil)-2-bromoacetato de etilo 4b (2.23 g) que se usó en la siguiente etapa sin purificación adicional.
Síntesis del intermedio 4c:
A una disolución de 2-(2-(2-(benciloxi)etoxi)-4-clorofenil)-2-bromoacetato de etilo 4b (2.23 g, 5.22 mmol) en CH3CN (22.5 ml) y THF (22.5 ml), se añadió 3-metoxi-5-(metilsulfonil)anilina [CAS 62606-02-4] (3.12 g, 15.5 mmol). Se agitó la mezcla de reacción a 60 °C durante toda la noche. La mezcla de reacción se concentró a presión reducida. El residuo se repartió entre EtOAc y HCl 1 N. La fase acuosa se extrajo con EtOAc. Las fases orgánicas se combinaron, se secaron sobre MgSO4, se filtraron y se concentraron a presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía instantánea en gel de sílice utilizando un gradiente de EtOAc (de un 0 % a un 40 %) en heptano para obtener 2-(2-(2-(benciloxi)etoxi)-4-clorofenil)-2-((3-metoxi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)acetato de etilo 4c (1.57 g).
Síntesis del intermedio 4d:
Una mezcla de 2-(2-(2-(benciloxi)etoxi)-4-clorofenil)-2-(3-metoxi-5(metilsulfonil)fenil)amino)acetato de etilo 4c (1.57 g, 2.86 mmol) y 10 % de paladio sobre carbón (0.320 g) en EtOAc (40 ml) se agitó a temperatura ambiente durante la noche bajo atmósfera de H2. La mezcla de reacción se filtró a través de celite®. El filtrado se concentró a presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía instantánea en gel de sílice utilizando un gradiente de EtOAc (de un 30 % a un 100 %) en heptano para obtener 2-(4-cloro-2-(2-hidroxietoxi)fenil)-2-((3-metoxi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)acetato de etilo 4d (1.13 g).
Síntesis del intermedio 4e:
A una disolución de 2-(4-cloro-2-(2-hidroxietoxi)fenil)-2-((3-metoxi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)acetato de etilo 4d (1.14 g, 2.49 mmol) en THF (8 ml), MeOH (8 ml) y H2O (8 ml) se añadió hidróxido de litio monohidratado (0.522 g, 12.5 mmol). Se agitó la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante 3 horas. Se añadieron HCl 1 N y EtOAc y se separaron las fases. La fase acuosa se extrajo con EtOAc. Se combinaron las fases orgánicas, se lavaron con salmuera, se secaron sobre MgSO4, se filtró y se concentró a presión reducida para proporcionar cuantitativamente ácido 2-(4-cloro-2-(2-hidroxietoxi)fenil)-2-((3-metoxi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)acético 4e que se usó en la siguiente etapa sin purificación adicional.
Síntesis del Compuesto 4:
A una disolución de 6-triflurorometilindolina [CAS 181513-29-1] (0.200 g, 1.07 mmol), ácido 2-(4-cloro-2-(2-hidroxietoxi)fenil)-2-((3-metoxi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)acético 4e (0.478 g, 1.11 mmol) y trietilamina (0.593 ml, 4.28 mmol) en DMF (10 ml) se añadió HATU (0.406 g, 1.07 mmol). La mezcla de reacción se agitó durante toda la noche. Se diluyó la mezcla de reacción con H2O y se sometió a extracción con acetato de etilo. La fase orgánica se lavó con HCl 1 N, una solución acuosa saturada de NaHCO3 y salmuera, se secó con MgSO4, se filtró y se concentró a presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía flash en gel de sílice utilizando un gradiente de EtOAc (de un 60% a un 70%) en heptano. Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se concentraron a presión reducida. Se purificó el residuo por medio de cromatografía instantánea sobre gel de sílice usando un gradiente de EtOAc (de un 0 % a un 25 %) en CH2Cl2 para proporcionar 2-(4-cloro-2-(2-hidroxietoxi)fenil)-2-((3-metoxi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)-1-(6-(trifluorometil)indolin-1-il)etan-1-ona (Compuesto 4 , 0.162 g) en forma de mezcla racémica.
Compuesto 4:
1H RMN (300 MHz, DMSO-ds) 8 ppm 3.11 (s, 3 H) 3.22 (m, 2 H) 3.67 - 3.88 (m, 5 H) 4.00 - 4.22 (m, 3 H) 4.44 (m, 1 H) 4.98 (t, J=5.5 Hz, 1 H) 5.83 (d, J=8.3 Hz, 1 H) 6.56 (s, 1 H) 6.63 (s, 1 H) 6.92 (s, 1 H) 7.04 (m, 2 H) 7.17 (m, 1 H) 7.31 -7.50 (m, 3 H) 8.38 (s, 1 H)
LC-MS (método LC-C): TR 1.89 min, MH+ 599
Ejemplo 4 (método 2): síntesis de 2-(4-cloro-2-(2-hidroxietoxi)fenil)-2-((3-metoxi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)-1 -(6-(trifluorometil)indolin-1-il)etanona (Compuesto 4) y separación quiral en los Enantiómeros 4A y 4B .
Síntesis del intermedio 4f:
A una solución de 2-(2-(2-(benciloxi)etoxi)-4-clorofenil)acetato de etilo 4a (4.17 g, 12.0 mmol) en una mezcla de EtOH (80 ml) y THF (40 ml), se añadió NaOH 0.5 N (72 ml, 36.0 mmol). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 3 h. La mezcla de reacción se concentró parcialmente a presión reducida para eliminar los disolventes orgánicos. El residuo se acidificó hasta un pH de 2-3 con HCl 1 N y la mezcla se extrajo con EtOAc. La fase orgánica se secó con MgSO4, se filtró y se concentró a presión reducida para obtener el ácido 2-(2-(2-(benciloxi)etoxi)-4-clorofenil)acético 4f (3.83 g).
Síntesis del intermedio 4g:
Una solución del ácido 2-(2-(2-(benciloxi)etoxi)-4-clorofenil)acético 4f (7.12 g, 22.2 mmol) en cloruro de tionilo (50 ml, 689 mmol) se agitó a temperatura ambiente durante 18 h. La mezcla de reacción se concentró a presión reducida y se evaporó conjuntamente con tolueno para obtener el cloruro de 2-(2-(2-(benciloxi)etoxi)-4-clorofenil)acetilo 4g (7.53 g), el cual se utilizó en el siguiente paso sin purificación adicional.
Síntesis del intermedio 4h:
Una disolución de cloruro de 2-(2-(2-(benciloxi)etoxi)-4-clorofenil)acetilo 4g (5.29 g, 15.6 mmol) en CH3CN (50 ml), se añadió gota a gota bajo atmósfera de N2-atm, a una mezcla en agitación de 6-(trifluorometil)indolina [CAS 181513-29 1] (2.92 g, 15.6 mmol) y bicarbonato de sodio (1.44 g, 17.1 mmol) en CH3CN (50 ml). Se agitó la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante 65 h y se vertió en agua (500 ml). Se extrajo el producto (2x) con Et2O. Las fases orgánicas combinadas se lavaron con salmuera, se secaron con MgSO4, se filtraron y se evaporaron a presión reducida. El residuo solidificó tras el reposo. Se agitó el producto en éter diisopropílico (25 ml), se filtró, se lavó (3x) con éter diisopropílico, y se secó a vacío a 45 °C para proporcionar 2-(2-(2-(benciloxi)etoxi)-4-clorofenil)-1-(6-(trifluorometil)indolin-1-il)etanona 4h (6.97 g).
Síntesis del intermedio 4i:
Se agitó una disolución de 2-(2-(2-(benciloxi)etoxi)-4-clorofenil)-1 -(6-(trifluorometil)indolin-1 -il)etanona 4h (1.0 g, 2.04 mmol) en 2-Me-THF (100 ml), se agitó bajo flujo de N2 y se enfrió a -78 °C. Se añadió, gota a gota, una disolución 1 M de bis(trimetilsilil)amida de litio en THF (4.08 ml, 4.08 mmol)y se agitó la mezcla resultante a -78 °C durante 15 minutos. Se añadió clorotrimetilsilano (417 |ul 3.27 mmol) gota a gota y la mezcla se agitó a -78 °C durante 15 min. Se añadió gota a gota una disolución de W-bromosuccinimida (400 mg, 2.25 mmol) en 2-Me-THF (25 ml) y se agitó la mezcla de reacción a -78 °C durante 50 minutos. Se añadió una disolución acuosa saturada de NH4Cl (40 ml) de una
vez, y se agitó la mezcla resultante sin enfriamiento hasta que la temperatura alcanzó 0 2C. Se añadió agua (10 ml) y se separaron las fases. Se secó la fase orgánica sobre MgSO4 , se filtró, se evaporó a presión reducida, y se co evaporó con CH3CN para proporcionar 2-(2-(2-(benciloxi)etoxi)-4-clorofenil)-2-bromo-1-(6-(trifluorometil)indolin-1-il)etanona 4i (1.16 g). Se usó el producto sin purificación adicional en la siguiente etapa.
Síntesis del intermedio 4j:
A una disolución agitada de 2-(2-(2-(benciloxi)etoxi)-4-clorofenil)-2-bromo-1-(6-(trifluorometil)indolin-1-il)etanona 4i (1.16 g, 2.04 mmol) en CH3CN (50 ml) bajo atmósfera de N2 , se añadieron 3-metoxi-5-(metilsulfonil)anilina [CAS 62606-02-4] (0.82 mg, 4.08 mmol), y diisopropiletilamina (703 gl, 4.08 mmol) y se agitó la mezcla de reacción a 60 °C durante 65 horas. Se enfrió la mezcla a temperatura ambiente y se vertió en el interior de H2O en agitación (250 ml). Se extrajo el producto (2x) con Et2O. Las fases orgánicas combinadas se secaron sobre MgSO4 , se filtraron y se evaporaron a presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía instantánea en gel de sílice (40 g) utilizando un gradiente de heptano/EtOAc/EtOH de 100/0/0 a 40/45/15. Se combinaron las fracciones deseadas y se evaporó el disolvente a presión reducida en un evaporador rotatorio® hasta un volumen residual de 35 ml. Se cristalizó el producto en reposo. El precipitado se filtró, se lavó (3x) con EtOAc/heptano 1/1 y se secó a vacío a 45°C para proporcionar 2-(2-(2-(benciloxi)etoxi)-4-clorofenil)-2-((3-metoxi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)-1-(6-(trifluorometil)indolin-1-il)etanona 4j (870 mg).
Síntesis del Compuesto 4 y separación quiral en los Enantiómeros 4A y 4B:
Se añadió una disolución de 2-(2-(2-(benciloxi)etoxi)-4-clorofenil)-2-((3-metoxi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)-1-(6-(trifluorometil)indolin-1-il)etanona 4j (210 mg, 0.28 mmol) en THF (30 ml), a una mezcla en agitación de Pd/C (0.5 g) en EtOAc (10 ml). Se hidrógeno la mezcla durante 10 minutos a temperatura ambiente a presión atmosférica. Se retiró el catalizador por medio de filtración sobre dicalite® y se evaporaron los disolventes a presión reducida. Se combinó el residuo con otro lote (cantidad total: 1.0 g) y se purificó por medio de HPLC de fase inversa (fase estacionaria: Kromasil C18 100A 5 um (Eka Nobel), fase móvil: Gradiente de un 50 % de bicarbonato de amonio (0.25 % en agua), 50 % de acetonitrilo a un 20 % de bicarbonato de amonio (0.25 % en agua), 80 % de acetonitrilo) dando lugar a un Compuesto 4 (700 mg). Se separaron los enantiómeros del Compuesto 4 (700 mg) por medio de separación Quiral en Fase Normal (Fase estacionaria: Whelk-O1 (SS) 5 gm con técnica de ahorro de pico de reciclaje, fase móvil: 100 % de etanol). Se combinaron las fracciones que contenían el primer enantiómero eluido y se evaporó a presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía instantánea en gel de sílice (4 g) utilizando un gradiente de heptano/EtOAc/EtOH de 100/0/0 a 40/45/15. Las fracciones deseadas se combinaron y se evaporaron, y se co evaporaron con MeOH. Se trituró el residuo a 45 °C en H2O (4 ml) y MeOH (1 ml), se filtró el precipitado, se lavó (3x) con H2O/MeOH 4/1 y se secó a vacío a 45 °C para proporcionar el Enantiómero 4A (197 mg). Se combinaron las fracciones que contenían el segundo enantiómero eluido y se evaporó a presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía instantánea en gel de sílice (4 g) utilizando un gradiente de heptano/EtOAc/EtOH de 100/0/0 a 40/45/15. Las fracciones deseadas se combinaron y se evaporaron, y se co-evaporaron con MeOH/agua. Se agitó al residuo en H2O (4 ml) y MeOH (1 ml), se filtró el precipitado, se lavó (3x) con H2O/MeOH 4/1, y se secó a vacío a 45 °C para proporcionar el Enantiómero 4B (209 mg).
Enantiómero 4A:
1H RMN (400 MHz, DMSO-afe) 5 ppm 3.10 (s, 3 H) 3.16 - 3.27 (m, 2 H) 3.68 - 3.85 (m, 5 H) 4.04 - 4.20 (m, 3 H) 4.44 (td, J=10.2, 6.6 Hz, 1 H) 4.94 (t, J=5.6 Hz, 1 H) 5.83 (d, J=8.4 Hz, 1 H) 6.56 (t, J=2.1 Hz, 1 H) 6.63 (t, J=1.8 Hz, 1 H) 6.91 (t, J=1.4 Hz, 1 H) 6.97 - 7.08 (m, 2 H) 7.17 (d, J=2.0 Hz, 1 H) 7.36 (d, J=8.1 Hz, 1 H) 7.39 (dd, J=7.9, 0.9 Hz, 1 H) 7.43 - 7.49 (m, 1 H) 8.38 (s a, 1 H)
LC/MS (método LC-D): TR 1.17 min, MH+ 599
[a ]D20 : 59.8° (c 0.435, DMF)
SFC quiral (método SFC-I): TR 2.84 min, MH+ 599, pureza quiral 100%.
Enantiómero 4B:
1H RMN (400 MHz, DMSO-ds ) 5 ppm 3.10 (s, 3 H) 3.16 - 3.26 (m, 2 H) 3.70 - 3.85 (m, 5 H) 4.02 - 4.19 (m, 3 H) 4.44 (td, J=10.2, 6.4 Hz, 1 H) 4.94 (t, J=5.6 Hz, 1 H) 5.83 (d, J=8.4 Hz, 1 H) 6.56 (t, J=2.0 Hz, 1 H) 6.63 (t, J=1.8 Hz, 1 H) 6.91 (t, J=1.7 Hz, 1 H) 6.99 - 7.07 (m, 2 H) 7.16 (d, J=2.0 Hz, 1 H) 7.36 (d, J=8.1 Hz, 1 H) 7.37 - 7.41 (m, 1 H) 7.44 -7.48 (m, 1 H) 8.38 (s, 1 H)
LC/MS (método LC-D): TR 1.17 min, MH+ 599
[a ]D20 : -56.4° (c 0.47, DMF)
SFC quiral (método SFC-I): TR 3.14 min, MH+ 599, pureza quiral 97.0%.
Ejemplo 5: síntesis de 2-(4-cloro-2-(2-hidroxietoxi)fenil)-2-((3-metoxi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)-1 -(5-metoxi-6-(trifluorometil)indolin-l -il)etanona (Compuesto 5) y separación quiral en los Enantiómeros 5A y 5B .
Separación Quiral
Enantiómeros 5A y 5B
Síntesis del intermedio 5a:
A una mezcla de 2-(4-cloro-2-hidroxifenil)acetato de etilo [CAS 1261826-30-5] (5.2 g, 24.2 mmol) y carbonato de cesio (15.8 g, 48.5 mmol) en DMF (90 ml) a 10 °C, se añadió (2-bromoetoxi)(terc-butil)dimetilsilano [CAS 86864-60-0] (6.26 ml, 29.1 mmol). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante toda la noche. Se agregó agua y la mezcla se extrajo con EtOAc. La fase orgánica se secó con MgSÜ4, se filtró y se concentró a presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía ultrarrápida en gel de sílice (15-40 |jm, 80 g, heptano/EtOAc 80/20). Se combinaron las fracciones puras y se retiró el disolvente a presión reducida para proporcionar 2-(2-(2-((tercbutildimetilsilil)oxi)etoxi)-4-clorofenil)acetato de etilo 5a (7.8 g).
Síntesis del intermedio 5b:
A una disolución enfriada (-78 °C) de bis(trimetilsilil)amida de litio 1 M en THF (41.8 ml, 41.8 mmol), se añadió una disolución de 2-(2-(2-((terc-butildimetilsilil)oxi)etoxi)-4-clorofenil)acetato de etilo 5a (7.8 g, 20.9 mmol) en THF (45 ml). Tras 1 hora a -70 °C, se añadió clorotrimetilsilano (4.24 ml, 33.5 mmol). Se agitó la mezcla de reacción a -70 °C durante 15 minutos. Se añadió W-bromosuccinimida (4.46 g, 25.1 mmol) en THF (45 ml) y se continuó la agitación a -55 °C durante 2 horas. Se vertió la mezcla de reacción en H2O y se extrajo dos veces con EtOAc. Se combinaron las fases orgánicas, se secaron sobre MgSO4, se filtró y se concentró a presión reducida para proporcionar 2-bromo-2-(2-(2-((terc-butildimetilsil)oxi)etoxi)-4-clorofenil)acetato de etilo 5b (10.1 g) que se usó en la siguiente etapa sin purificación adicional.
Síntesis del intermedio 5c:
Se agitó una mezcla de 2-bromo-2-(2-(2-((terc-butildimetilsilil)oxi)etoxi)-4-clorofenil)acetato de etilo 5b (4.75 g, 10.5 mmol), 3-metoxi-5-(metilsulfonil)anilina [c As 62606-02-4] (3.17 g, 15.8 mmol) y diisopropiletilamina (3.62 ml, 21.0 mmol) en CH3CN (90 ml)a 50°C durante la noche. La mezcla de reacción se concentró a presión reducida. Se introdujo el residuo en EtOAc y se lavó con HCl 0.5 N y agua. La fase orgánica se secó con MgSO4, se filtró y se concentró a presión reducida. Se purificó el residuo por medio de cromatografía instantánea sobre gel de sílice (15-40 gm, 120 g, gradiente de heptano/EtOAc de 90/10 a 80/20) para proporcionar 2-(2-(2-((terc-butildimetilsilil)oxi)etoxi)-4-clorofenil)-2-((3-metoxi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)acetato de etilo 5c (3.5 g).
Síntesis del intermedio 5d:
Se añadió por partes hidróxido de litio monohidratado (513 mg, 12.2 mmol) a una disolución de 2-(2-(2-((tercbutildimetilsilil)oxi)etoxi)-4-clorofenil)-2-((3-metoxi-5-(metilsulfonil)fenil)aminoacetato de etilo 5c (3.5 g, 6.12 mmol) en THF/CH3OH/H2O (1/1/1) (75 ml) a 10 °C. Se agitó la reacción a temperatura ambiente durante 2 h, se diluyó con agua y se enfrió a 0 °C. Se acidificó la disolución lentamente con HCl 0.5 N hasta pH 6, y se extrajo con EtOAc. Se secó la fase orgánica sobre MgSO4, se filtró y se concentró el disolvente a presión reducida para proporcionar ácido 2-(2-(2-((terc-butildimetilsilil)oxi)etoxi)-4-fluorofenil)-2-((3-metoxi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)acético 5d (2.85 g). Se usó el compuesto sin purificación adicional en la siguiente etapa.
Síntesis del intermedio 5e:
A una disolución de ácido 2-(2-(2-((terc-butildimetilsilil)oxi)etoxi)-4-clorofenil)-2-((3-metoxi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)acético 5d (1 g, 1.84 mmol) en DMF (10 ml), se añadieron HATU (1.05 g, 2.76 mmol), diisopropiletilamina (913 gl, 5.53 mmol) y 5-metoxi-6-(trifluorometil)indolina 2g(412 mg, 1.90 mmol). Se agitó la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante 2 h. Se diluyó la mezcla de reacción con agua. Se filtró el precipitado, se lavó con agua y se introdujo en EtOAc. Se lavó la fase orgánica con una disolución al 10 % de K2CO3 y agua, se secó sobre MgSO4, se filtró y se concentró el disolvente a presión reducida para proporcionar 2-(2-(2-((tercbutildimetilsilil)oxi)etoxi)-4-clorofenil)-2-((3-metoxi-5-(metilsulfonil)fenil)amino-1-(5-metoxi-6-(trifluorometil)indolin-1-il)etanona 5e (1.4 g). Se usó el compuesto sin purificación adicional en la siguiente etapa de reacción.
Síntesis del Compuesto 5 y separación quiral en los Enantiómeros 5A y 5B:
Bajo un flujo de N2, a 5°C, se añadió gota a gota HCl 4M en dioxano (4.71 ml, 18.8 mmol) a una disolución de 2-(2-(2-((terc-butildimetilsilil)oxi)etoxi)-4-clorofenil)-2-((3-metoxi-5-(metilsulfonil)fenil)amino-1-(5-metoxi-6-(trifluorometil)indolin-1 -il)etanona 5e (1.4 g, 1.88 mmol) en MeOH (25 ml). Se agitó la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante 1 h. Se enfrió la mezcla a 0 °C, se basificó con una disolución acuosa al 10 % de K2CO3 y se extrajo con EtOAc. Se separó la fase orgánica, se secó sobre MgSO4, se filtró y se concentró el disolvente a presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía instantánea en gel de sílice (15-40 gm, 40 g, CH2Cl2/heptano: 98.5/1.5). Se combinaron las fracciones puras y se concentró a presión reducida para proporcionar 2-(4-cloro-2-(2-hidroxietoxi)fenil)-2-((3-metoxi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)-1-(5-metoxi-6-(trifluorometil)indolin-1 -il)etanona (Compuesto 5 , 1.0 g) en forma de racemato. Se cristalizó una muestra analítica del Compuesto 5 a partir de MeOH (60 mg). Se usó la cantidad restante para separar los enantiómeros por medio de SFC Quiral de Preparación (Fase estacionaria: Chiralpak® IC 5 gm 250 x 30 mm, Fase móvil: 70 % de CO2, 30 % de EtOH (+0.3 % de iPrNH2)). El primer enantiómero eluido (400 mg) se solidificó en éter diisopropílico para dar el Enantiómero 5A (351 mg). El segundo enantiómero eluido (430 mg) se solidificó en éter diisopropílico para dar el Enantiómero 5B (336 mg).
Compuesto 5:
1H RMN (500 MHz, DMSO-ds) 8 ppm 3.10 (s, 3 H) 3.13 - 3.27 (m, 2 H) 3.73 (s, 3 H) 3.73 - 3.78 (m, 1 H) 3.78 - 3.84 (m, 1 H) 3.84 (s, 3 H) 3.98 - 4.22 (m, 3 H) 4.41 (dt, J=6.1, 10.1 Hz, 1 H) 4.95 (t, J=5.6 Hz, 1 H) 5.80 (d, J=8.08 Hz, 1 H) 6.55 (s, 1 H) 6.61 (s, 1 H) 6.90 (s, 1 H) 6.96 - 7.05 (m, 2 H) 7.16 (d, J=1.52 Hz, 1 H) 7.24 (s, 1 H) 7.35 (d, J=8.08 Hz, 1 H) 8.34 (s, 1 H)
LC-MS (método LC-A): TR 3.15 min, MH+ 629
Punto de fusión: 220°C
Enantiómero 5A:
1H RMN (400 MHz, DMSO-afe) 5 ppm 3.10 (s, 3 H) 3.13 - 3.27 (m, 2 H) 3.73 (s, 3 H) 3.73 - 3.78 (m, 1 H) 3.78 - 3.84 (m, 1 H) 3.84 (s, 3 H) 3.98 - 4.22 (m, 3 H) 4.41 (dt, J=6.1, 10.1 Hz, 1 H) 4.95 (t, J=5.6 Hz, 1 H) 5.80 (d, J=8.08 Hz, 1 H) 6.55 (s, 1 H) 6.61 (s, 1 H) 6.90 (s, 1 H) 6.96 - 7.05 (m, 2 H) 7.16 (d, J=1.52 Hz, 1 H) 7.24 (s, 1 H) 7.35 (d, J=8.08 Hz, 1 H) 8.34 (s, 1 H)
LC/MS (método LC-A): TR 3.13 min, MH+ 629
[ajo20: -60.4° (c 0.28, DMF)
SFC quiral (método SFC-D): TR 1.02 min, MH+ 629, pureza quiral 100%.
Enantiómero 5B:
1H RMN (400 MHz, DMSO-ds) 5 ppm 3.10 (s, 3 H) 3.13 - 3.27 (m, 2 H) 3.73 (s, 3 H) 3.73 - 3.78 (m, 1 H) 3.78 - 3.84 (m, 1 H) 3.84 (s, 3 H) 3.98 - 4.22 (m, 3 H) 4.41 (dt, J=6.1, 10.1 Hz, 1 H) 4.95 (t a, J=5.6 Hz, 1 H) 5.80 (d, J=8.08 Hz, 1 H) 6.55 (s, 1 H) 6.61 (s, 1 H) 6.90 (s, 1 H) 6.96 - 7.05 (m, 2 H) 7.16 (d, J=1.52 Hz, 1 H) 7.24 (s, 1 H) 7.35 (d, J=8.08 Hz, 1 H) 8.34 (s, 1 H)
LC/MS (método LC-A): TR 3.15 min, MH+ 629
[ajo20: 56.7° (c 0.3, DMF)
SFC quiral (método SFC-D): TR 1.22 min, MH+ 629, pureza quiral 99.7%.
Ejemplo 6 (método 1): síntesis de 2-(4-cloro-2-(2-hidroxietoxi)fenil)-2-((3-metoxi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)-1 -(6-(trifluorometoxi)indolin-1-il)etanona (Compuesto 6)
Síntesis del intermedio 6a:
A una disolución de ácido 2-(2-(2-((terc-butildimetilsilil)oxi)etoxi)-4-clorofenil)-2-((3-metoxi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)acético 5d (1.07 g, 1.97 mmol) en DMF (10 ml), se añadieron HATU (1.12 g, 2.95 mmol), diisopropiletilamina (976 gl, 5.91 mmol) y 6-(trifluorometoxi)indolina [CAS 959235-95-1] (400 mg, 1.97 mmol). Se agitó la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante 2 h. Se diluyó la mezcla de reacción con agua. Se filtró el precipitado, se lavó con agua y se introdujo en EtOAc. Se lavó la fase orgánica con una disolución al 10 % de K2CO3, agua, se secó sobre MgSO4, se filtró y se concentró el disolvente a presión reducida para proporcionar 2-(2-(2-((tercbutildimetilsilil)oxi)etoxi)-4-clorofenil)-2-((3-metoxi-5-(metilsulfonil)fenil)amino-1-(6-(trifluorometoxi)indolin-1-il)etanona 6a (1.36 g). Se usó el compuesto bruto sin purificación en la siguiente etapa de reacción.
Síntesis del Compuesto 6:
Bajo un flujo de N2, a 5°C, se añadió gota a gota HCl 4M en dioxano (4.66 ml, 18.6 mmol) a una disolución de 2-(2-(2-((terc-butildimetilsilil)oxi)etoxi)-4-clorofenil)-2-((3-metoxi-5-(metilsulfonil)fenil)amino-1-(6-(trifluorometoxi)indolin-1-il)etanona 6a (1.36 g, 1.87 mmol) en MeOH (25 ml). Se agitó la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante 1 h. Se enfrió la mezcla a 0 °C, se basificó con una disolución acuosa al 10 % de K2CO3 y se extrajo con EtOAc. Se separó la fase orgánica, se secó sobre MgSO4, se filtró y se concentró el disolvente a presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía instantánea en gel de sílice (15-40 gm, 40 g, CH2Cl2/heptano: 99.5/0.5). Se combinaron las fracciones puras y se retiró el disolvente a presión reducida para proporcionar 2-(4-cloro-2-(2-hidroxietoxi)fenil)-2-((3-metoxi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)-1 -(6-(trifluorometoxi)indolin-1 -il)etanona (Compuesto 6 , 540 g) en forma de racemato. Se obtuvo una muestra analítica del Compuesto 6 por medio de cristalización a partir de MeOH (34 mg).
Compuesto 6:
1H RMN (400 MHz, DMSO-ds) 8 ppm 3.07 - 3.23 (m, 5 H) 3.70 - 3.83 (m, 5 H) 4.06 - 4.19 (m, 3 H) 4.42 (td, J=10.23, 6.32 Hz, 1 H) 4.92 (t, J=5.31 Hz, 1 H) 5.81 (d, J=8.59 Hz, 1 H) 6.56 (s, 1 H) 6.61 (s, 1 H) 6.90 (s, 1 H) 6.99 - 7.05 (m, 3 H) 7.16 (d, J=2.02 Hz, 1 H) 7.30 - 7.40 (m, 2 H) 8.03 (s, 1 H)
LC-MS (método LC-A): TR 3.28 min, MH+ 615
Punto de fusión: 191 °C
Ejemplo 6 (método 2): síntesis de 2-(4-cloro-2-(2-hidroxietoxi)fenil)-2-((3-metoxi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)-1 -(6-(trifluorometoxi)indolin-1-il)etanona (Compuesto 6) y separación quiral en los Enantiómeros 6A y 6B .
A una disolución enfriada (-70 °C) de bis(trimetilsilil)amida de litio 1.5 M en THF (23 ml, 34.4 mmol) bajo flujo de N2, se añadió una disolución de 2-(2-(2-(benciloxi)etoxi)-4-clorofenil)acetato de etilo 4a(6 g, 17.2 mmol) en THF (35 ml). T ras 1 hora a -70 °C, se añadió clorotrimetilsilano (3.5 ml, 27.5 mmol). Se agitó la mezcla de reacción a -70 °C durante 15 minutos. Se añadió W-bromosuccinimida (3.7 g, 20.6 mmol) en THF (35 ml) y se continuó la agitación a -70 °C durante 2 horas. Se vertió la mezcla de reacción en H2O y se extrajo dos veces con EtOAc. Se combinaron las fases orgánicas, se secaron sobre MgSO4, se filtró y se concentró a presión reducida para proporcionar 2-(2-(2-(benciloxi)etoxi)-4-clorofenil)-2-bromoacetato de etilo 6b (8.2 g) que se usó en la siguiente etapa sin purificación adicional.
Síntesis del intermedio 6c:
Se agitó una mezcla de 2-(2-(2-(benciloxi)etoxi)-4-clorofenil)-2-bromoacetato 6b (7.36 g, 17.2 mmol), 3-metoxi-5-(metilsulfonil)anilina [CAS 62606-02-4] (5.2 g, 25.8 mmol) y diisopropiletilamina (5.9 ml, 25.8 mmol) en CH3CN (150 ml)a 50°C durante la noche. Se concentró el disolvente a presión reducida. El residuo se diluyó con EtOAc, se lavó con HCl 0.5 N y agua. La capa orgánica se secó con MgSO4, se filtró y se concentró a presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía instantánea en gel de sílice (15-40 gm, 220 g, CH2Cl2/heptano: 99/1). Se combinaron las fracciones puras y se retiró el disolvente a presión reducida para proporcionar 2-(2-(2-(benciloxi)etoxi)-4-clorofenil)-2-((3-metoxi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)acetato de etilo 6c (5.52 g).
Síntesis del intermedio 6d:
A 10 °C, se añadió hidróxido de litio monohidratado (845 mg, 20.1 mmol) a una disolución de 2-(2-(2-(benciloxi)etoxi)-4-clorofenil)-2-((3-metoxi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)acetato de etilo 6c (5.52 g, 10.1 mmol) en MeOH/THF/agua (1/1/1) (90 ml). Se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 2 h. Se diluyó la mezcla con agua con hielo y se enfrió a 0 °C. Se acidificó la mezcla resultante hasta pH 6-7 con HCl 0.5 N y se extrajo con EtOAc. Se combinaron las fases orgánicas, se secó sobre MgSO4 , se filtró y se concentró el disolvente a presión reducida para proporcionar ácido 2-(2-(2-(benciloxi)etoxi)-4-clorofenil)-2-((3-metoxi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)acético 6d (5.26 g). El compuesto se usó en la siguiente etapa de reacción sin purificación adicional.
Síntesis del intermedio 6e:
Se agitó una mezcla de 6-(trifluorometoxi)indolina [CAS 959235-95-1] (1.85 mg, 9.12 mmol), ácido 2-(2-(2-(benciloxi)etoxi)-4-clorofenil)-2-((3-metoxi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)acético 6c (5.69 g, 10.9 mmol), HATU (5.2 g, 13.7 mmol) y diisopropiletilamina (4.52 ml, 27.4 mmol) en DMF (40 ml), a temperatura ambiente durante 2 horas. Se diluyó la mezcla con agua. El precipitado se separó por filtración y se lavó con agua. Se introdujo el precipitado en EtOAc, se lavó con una disolución de K2CO3 al 10% en agua, agua, se secó sobre MgSO4 , se filtró y se evaporó el disolvente a presión reducida. La purificación se llevó a cabo mediante cromatografía flash en gel de sílice (15-40 gm, 220 g, heptano/EtOAc 70/30). Las fracciones puras se combinaron y se concentró a sequedad para proporcionar 2-(2-(2-(benciloxi)etoxi)-4-clorofenil)-2-((3-metoxi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)-1-(6-(trifluorometoxi)-indolin-1-il)etanona
6e (5.6 g).
Síntesis del Compuesto 6 y separación quiral en los Enantiómeros 6A y 6B:
Se hidrogenó una mezcla de 2-(2-(2-(benciloxi)etoxi)-4-clorofenil)-2-((3-metoxi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)-1-(6-(trifluorometoxi)indolin-1 -il)etanona 6e (5.6 g, 7.94 mmol) en EtOAc (100 ml) se hidrogenó a presión atmosférica de H2 en presencia de Pd/C al (10 %) (1.7 mg, 1.59 mmol) como catalizador durante 6 minutos (hasta el fin del consumo de H2). La reacción se diluyó con EtOAc y se filtró a través de un lecho de celite®. El filtrado se concentró a presión reducida para proporcionar 2-(4-cloro-2-(2-hidroxietoxi)fenil)-2-((3-metoxi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)-1 -(6-(trifluorometoxi)-indolin-1 -il)etanona (Compuesto 6) en forma de racemato (4.6 g, compuesto bruto). Los enantiómeros del Compuesto 6 se separaron mediante SFC quiral (Fase estacionaria: Chiralcel® OJ-H 5 gm 250 x 20 mm, fase móvil:
80 % de CO2 , 20 % de MeOH (+0.3 % de iPrNH2)). El primer enantiómero eluido (1.96 g) se purificó posteriormente mediante SFC quiral (fase estacionaria: Chiralpak® IA 5 gm 250 x 20 mm, Fase móvil: 74 % de CO2 , 26 % de iPrOH (+0.3 % de iPrNH2)), para proporcionar tras la precipitación a partir de heptano/éter diisopropílico, Enantiómero 6A (1.527 g). El segundo enantiómero eluido (2.10 mg) se solidificó en heptano/éter diisopropílico para dar el Enantiómero 6B (1.708 mg).
Enantiómero 6A:
1H RMN (500 MHz, DMSO-afe) 5 ppm 3.08 - 3.18 (m, 5 H) 3.70 - 3.83 (m, 5 H) 4.05 - 4.19 (m, 3 H) 4.43 (td, J=10.32, 6.46 Hz, 1 H) 4.97 (t, J=5.52 Hz, 1 H) 5.82 (d, J=8.20 Hz, 1 H) 6.56 (s, 1 H) 6.62 (s, 1 H) 6.91 (s, 1 H) 7.00 - 7.08 (m, 3 H) 7.16 (d, J=1.58 Hz, 1 H) 7.34 (d, J=8.20 Hz, 2 H) 8.04 (s, 1 H)
LC/MS (método LC-A): TR 3.32 min, MH+ 615
[a ]D20 : 64.3° (c 0.305, DMF)
SFC quiral (método SFC-E): TR 2.82 min, MH+ 615, pureza quiral 100%.
Enantiómero 6B:
1H RMN (500 MHz, DMSO-afe) 5 ppm 3.08 - 3.18 (m, 5 H) 3.70 - 3.83 (m, 5 H) 4.05 - 4.19 (m, 3 H) 4.43 (td, J=10.32, 6.46 Hz, 1 H) 4.97 (t, J=5.52 Hz, 1 H) 5.82 (d, J=8.20 Hz, 1 H) 6.56 (s, 1 H) 6.62 (s, 1 H) 6.91 (s, 1 H) 7.00 - 7.08 (m, 3 H) 7.16 (d, J=1.58 Hz, 1 H) 7.34 (d, J=8.20 Hz, 2 H) 8.04 (s, 1 H)
LC/MS (método LC-A): TR 3.31 min, MH+ 615
[a ]D20 : -53.7° (c 0.3, DMF)
SFC quiral (método SFC-E): TR 3.34 min, MH+ 615, pureza quiral 95.7%.
Ejemplo 7 : síntesis de ácido 4-(5-cloro-2-(1-((3-metoxi-5-(metilsulfonil)fenil)-amino)-2-oxo-2-(6-(trifluorometil)indolin-1-il)etil)fenoxi)butanoico (Compuesto 7) y separación quiral en los Enantiómeros 7A y 7B .
A una suspensión de 2-(4-cloro-2-hidroxifenil)acetato de etilo [CAS 1261826-30-5] (8.5 g, 39.6 mmol) y CS2CO3 (25.8 g, 79.2 mmol) en DMF (130 ml) a 10°C, se añadió gota a gota 4-bromobutanoato de ferc-butilo [CAS 110611-91-1] (7 ml, 39.6 mmol). La mezcla se agitó a la temperatura ambiente durante toda la noche. Se diluyó la mezcla con EtOAc y agua. Las fases se separaron. Se lavó la fase orgánica con agua, se secó sobre MgSO4, se filtró y se concentró el disolvente a presión reducida. La purificación se llevó a cabo mediante cromatografía flash en gel de sílice (15-40 gm, 120 g, heptano/EtOAc 90/10). Se combinaron las fracciones puras y se concentró a sequedad para proporcionar 4-(5-cloro-2-(2-etoxi-2-oxoetil)fenoxi)butanoato de ferc-butilo 7a (12.7 g).
Síntesis del intermedio 7b:
Se introdujo LiHMDS 1.5 M en THF (23.5 ml, 35.3 mmol) en un matraz, bajo flujo de N2 y se enfrió a -78°C. Se añadió gota a gota una disolución de 4-(5-cloro-2-(2-etoxi-2-oxoetil)fenoxi)butanoato de ferc-butilo 7a (6.3 g, 17.6 mmol) en THF (60 ml) y se agitó la mezcla a -78 °C durante 15 minutos. Se añadió clorotrimetilsilano (3.6 ml, 28.3 mmol). Trascurridos 15 minutos a -78 °C, se añadió W-bromosuccinimida (3.77 g, 21.2 mmol) en THF (40 ml) y se agitó la mezcla a -70 °C durante 1 hora. Se inactivó la reacción con agua y se extrajo con EtOAc. Se lavó la fase orgánica con agua, se secó sobre MgSO4, se filtró y se concentró el disolvente a presión reducida para proporcionar 4-(2-(1 -bromo-2-etoxi-2-oxoetil)-5-clorofenoxi)butanoato de ferc-butilo 7b (7.6 g). El compuesto se usó en la siguiente etapa de reacción sin purificación adicional.
Síntesis del intermedio 7c:
A una disolución de 4-(2-(1-bromo-2-etoxi-2-oxoetil)-5-clorofenoxi)butanoato de ferc-butilo 7b (7.6 g, 17.4 mmol) en CH3CN (140 ml) a temperatura ambiente, se añadió diisopropiletilamina (4.8 ml, 27.9 mmol) y posteriormente 3-metoxi-5-(metilsulfonil)anilina [CAS 62606-02-4] (4.2 g, 20.9 mmol). Se agitó la mezcla a 65 °C durante 24 horas. Se diluyó la mezcla con EtOAc, se lavó con HCl 0.5 N (dos veces) y agua. Se secó la fase orgánica sobre MgSO4, se filtró y se concentró el disolvente a presión reducida. La purificación se llevó a cabo mediante cromatografía flash en gel de sílice (15-40 gm, 120 g, heptano/EtOAc de 85/15 a 70/30). Se combinaron las fracciones puras y se concentró a sequedad para proporcionar 4-(5-cloro-2-(2-etoxi-1 -((3-metoxi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)-2-oxoetil)fenoxi)butanoato de ferc-butilo 7c (7.3 g).
Síntesis del intermedio 7d:
Se agitó una mezcla de 4-(5-cloro-2-(2-etoxi-1-((3-metoxi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)-2-oxoetil)fenoxi)butanoato de ferc-butilo 7c (7.3 g, 13.1 mmol) e hidróxido de litio monohidratado (1.65 g, 39.4 mmol) en THF/agua (1/1) (180 ml), a temperatura ambiente durante 3 horas. Se diluyó la mezcla con agua. Se acidificó lentamente la fase acuosa con HCl 3 N y se extrajo con EtOAc. Se secaron las fases orgánicas combinadas sobre MgSO4 , se filtró y se concentró el disolvente a presión reducida para proporcionar ácido 2-(2-(4-((ferc-butoxi)-4-oxobutoxi)-4-clorofenil)-2-(3-metoxi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)acético 7d (6.9 g). El producto se utilizó en el siguiente paso sin purificación adicional.
Síntesis del intermedio 7e:
Se agitó una mezcla de 6-(trifluorometil)indolina [CAS 181513-29-1] (390 mg, 2.08 mmol), ácido 2-(2-(4-(ferc-butoxi)-4-oxobutoxi)-4-clorofenil)-2-((3-metoxi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)acético 7d (1.1 g, 2.08 mmol), HATU (1.2 g, 3.12 mmol) y diisopropiletilamina (1 ml, 6.25 mmol) en DMF (40 ml), a temperatura ambiente durante 2 horas. Se diluyó la mezcla con agua. El precipitado se separó por filtración y se lavó con agua. Se introdujo el precipitado en EtOAc, se lavó con una disolución de K2CO3 al 10%, agua, se secó sobre MgSO4 , se filtró y se concentró el disolvente a presión reducida. Se purificó el residuo por medio de cromatografía instantánea sobre gel de sílice (15-40 gm, 80 g, CH2Cl2/MeOH/ 99.5/0.5) para proporcionar, tras cristalización a partir de CH3CN, 4-(5-cloro-2-(1-((3-metoxi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)-2-oxo-2-(6-(trifluorometil)indolin-1-il)etil)fenoxi)butanoato de ferc-butilo 7e (700 mg).
Síntesis del Compuesto 7 y separación quiral en los Enantiómeros 7A y 7B:
Se agitó una disolución de 4-(5-cloro-2-(1-((3-metoxi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)-2-oxo-2-(6-(trifluorometil)indolin-1-il)etil)fenoxi)butanoato de ferc-butilo 7e (0.6 mg, 0.143 mmol) en HCl 4 M en dioxano (6 ml) a 5 °C durante 3 horas y a temperatura ambiente durante 8 horas. Se retiró el disolvente a presión reducida y se cristalizó el producto a partir de éter diisopropílico para dar lugar a ácido 4-(5-cloro-2-(1-((3-metoxi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)-2-oxo-2-(6-(trifluorometil)indolin-1-il)etil)fenoxi)butanoico (Compuesto 7 , 530 mg) en forma de racemato. Los Enantiómeros se separaron mediante SFC quiral preparativa (Fase estacionaria: Chiralpak® IC 5 gm 250 x 30 mm, Fase móvil: 65 % de CO2 , 35 % de MeOH). El primer enantiómero eluido (264 mg) se cristalizó a partir de CH3CN/éter diispropílico para dar el Enantiómero 7A (207 mg). El segundo enantiómero eluido (269 mg) se cristalizó a partir de CH3CN/éter diisopropílico para dar el Enantiómero 7B (212 mg).
Compuesto 7:
1H RMN (500 MHz, DMSO-afe) 8 ppm 1.90 - 2.09 (m, 2 H) 2.31 - 2.43 (m, 2 H) 3.12 (s, 3 H) 3.17 - 3.28 (m, 2 H) 3.74 (s, 3 H) 3.88 - 4.07 (m, 1 H) 4.07 - 4.15 (m, 2 H) 4.35 - 4.45 (m, 1 H) 5.73 (d a, J=7.88 Hz, 1 H) 6.55 (s a, 1 H) 6.64 (s а, 1 H) 6.90 (s a, 1 H) 7.04 (s a, 2 H) 7.16 (s a, 1 H) 7.31 (d a, J=7.88 Hz, 1 H) 7.39 (d a, J=7.25 Hz, 1 H) 7.46 (d a, J=7.25 Hz, 1 H) 8.39 (s a, 1 H) 12.12 (s a, 1 H)
LC-MS (método LC-A): TR 2.73 min, MH+ 641
Punto de fusión: 210°C
Enantiómero 7A:
1H RMN (400 MHz, DMSO-afe) 5 ppm 1.99 (dq, J=13.26, 6.86 Hz, 2 H) 2.30 - 2.46 (m, 2 H) 3.10 (s, 3 H) 3.15 - 3.37 (m, 2 H) 3.74 (s, 3 H) 3.95 - 4.06 (m, 1 H) 4.07 - 4.17 (m, 2 H) 4.34 - 4.43 (m, 1 H) 5.72 (d, J=8.08 Hz, 1 H) 6.54 (s, 1 H) б. 63 (s, 1 H) 6.89 (s, 1 H) 6.99 - 7.05 (m, 2 H) 7.14 (d, J=1.52 Hz, 1 H) 7.31 (d, J=8.08 Hz, 1 H) 7.38 (d, J=7.58 Hz, 1 H) 7.45 (d, J=8.08 Hz, 1 H) 8.38 (s, 1 H) 12.09 (s a, 1 H)
LC/MS (método LC-A): TR 2.73 min, MH+ 641
[a ]D20 : -49.8° (c 0.225, DMF)
SFC quiral (método SFC-F): TR 3.13 min, no MS response, pureza quiral 100%.
Punto de fusión: 182°C
Enantiómero 7B:
1H RMN (400 MHz, DMSO-afe) 5 ppm 1.99 (dq, J=13.26, 6.86 Hz, 2 H) 2.30 - 2.46 (m, 2 H) 3.10 (s, 3 H) 3.15 - 3.37 (m, 2 H) 3.74 (s, 3 H) 3.95 - 4.06 (m, 1 H) 4.07 - 4.17 (m, 2 H) 4.34 - 4.43 (m, 1 H) 5.72 (d, J=8.08 Hz, 1 H) 6.54 (s, 1 H) 6.63 (s, 1 H) 6.89 (s, 1 H) 6.99 - 7.05 (m, 2 H) 7.14 (d, J=1.52 Hz, 1 H) 7.31 (d, J=8.08 Hz, 1 H) 7.38 (d, J=7.58 Hz, 1 H) 7.45 (d, J=8.08 Hz, 1 H) 8.38 (s, 1 H) 12.09 (s a, 1 H)
LC/MS (método LC-A): TR 2.73 min, MH+ 641
[a ]D20 : 49.3° (c 0.2333, DMF)
SFC quiral (método SFC-F): TR 4.34 min, Sin respuesta MS, pureza quiral 100%.
Punto de fusión: 180°C
Ejemplo 8 : síntesis de ácido 4-(5-cloro-2-(1-((3-metoxi-5-(metilsulfonil)fenil)-amino)-2-(5-metoxi-6-(trifluorometil)indolin-1 -il)-2-oxoetil)fenoxi)-butanoico (Compuesto 8) y separación quiral en los Enantiómeros 8A y 8B .
Se agitó una mezcla de 5-metoxi-6-(trifluorometil)indolina 2g (617 mg, 2.84 mmol), ácido 2-(2-(4-(ferc-butoxi)-4-oxobutoxi)-4-clorofenil)-2-((3-metoxi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)acético 7d (1.5 g, 2.84 mmol), Ha Tu (1.62 g, 4.26 mmol) y diisopropiletilamina (1.4 ml, 8.5 mmol) en DMF (60 ml), a temperatura ambiente durante 12 horas. Se diluyó la mezcla con agua. El precipitado se separó por filtración y se lavó con agua. Se introdujo el precipitado en EtOAc, se lavó con una disolución de K2CO3 al 10%, agua, se secó sobre MgSO4, se filtró y se concentró el disolvente a presión reducida. Se purificó el residuo por medio de cromatografía instantánea sobre gel de sílice (15-40 pm, 120 g, heptano/EtOAc 60/40) para proporcionar, tras cristalización a partir de éter de petróleo/éter diisopropílico, 4-(5-cloro-2-(1-((3-metoxi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)-2-(5-metoxi-6-(trifluorometil)indolin-1-il)-2-oxoetil)fenoxi)butanoato de ferc-butilo 8a (1.36 mg).
Síntesis del Compuesto 8 y separación quiral en los Enantiómeros 8A y 8B:
Se agitó una disolución de 4-(5-cloro-2-(1-((3-metoxi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)-2-(5-metoxi-6-(trifluorometil)indolin-1-il)-2-oxoetil)fenoxi)butanoato de ferc-butilo 8a (1.36 mg, 1.87 mmol) en HCl 4 M en dioxano (12 ml) a 5 °C durante 3 horas y a temperatura ambiente durante 14 horas. Se filtró el precipitado y se lavó con dioxano/éter diisopropílico para dar lugar a ácido 4-(5-cloro-2-(1-((3-metoxi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)-2-(5-metoxi-6-(trifluorometil)indolin-1-il)-2-oxoetil)fenoxi)butanoico (Compuesto 8, 1.2 mg) en forma de racemato (contaminado con el 2.2 % de intermedio 8a). Se purificó de forma adicional una pequeña parte(40 mg) por medio de SFC aquiral (Fase estacionaria: 2-etilpiridina 6 pm 150 x 21.2 mm, fase móvil: 60 % de CO2, 40 % de iPrOH) para dar lugar, tras cristalización a partir de CH3CN/éter diisopropílico, 28 mg del compuesto 8. Se usó la cantidad restante del Compuesto 8 para separar los enantiómeros por medio de SFC Quiral de Preparación (Fase estacionaria: Chiralpak® IC 5 pm 250 x 30 mm, Fase móvil: 60 % de CO2, 40 % de MeOH). El primer enantiómero eluido (340 mg) se solidificó en éter de petróleo/éter diisopropílico para dar el Enantiómero 8A (285 mg). El segundo enantiómero eluido (334 mg) se solidificó en éter de petróleo/éter diisopropílico para dar el Enantiómero 8B (210 mg).
Compuesto 8:
1H RMN (400 MHz, DMSO-ds) 8 ppm 1.95 - 2.08 (m, 2 H) 2.32 - 2.44 (m, 2 H) 3.08 - 3.27 (m, 5 H) 3.73 (s, 3 H) 3.84 (s, 3 H) 3.92 - 4.00 (m, 1 H) 4.12 (d a, J=3.54 Hz, 2 H) 4.32 - 4.40 (m, 1 H) 5.69 (d a, J=8.08 Hz, 1 H) 6.54 (s a, 1 H) 6.62 (s, 1 H) 6.87 (s, 1 H) 6.98 - 7.04 (m, 2 H) 7.14 (s, 1 H) 7.22 (s, 1 H) 7.31 (d, J=8.08 Hz, 1 H) 8.34 (s, 1 H) 12.07 (s a, 1 H)
LC-MS (método LC-A): TR 2.74 min, MH+ 671
Punto de fusión: 232°C
Enantiómero 8A:
1H RMN (500 MHz, DMSO-cfe) ó ppm 1.95 - 2.07 (m, 2 H) 2.35 - 2.47 (m, 2 H) 3.11 (s, 3 H) 3.15 - 3.31 (m, 2 H) 3.74 (s, 3H) 3.85 (s, 3 H) 3.91 - 4.02 (m, 1 H) 4.06 - 4.19 (m, 2 H) 4.37 (td, J=10.25, 6.31 Hz, 1 H) 5.70 (d, J=8.20 Hz, 1 H) 6.54 (s, 1 H) 6.63 (s, 1 H) 6.88 (s, 1 H) 7.02 (d, J=8.20 Hz, 2 H) 7.12 - 7.17 (m, 1 H) 7.23 (s, 1 H) 7.31 (d, J=8.20 Hz, 1 H) 8.34 (s, 1 H) 12.13 (s a, 1 H)
LC/MS (método LC-A): TR 2.75 min, MH+ 671
[a ]D20 : -52.9° (c 0.28, DMF)
SFC quiral (método SFC-G): TR 2.50 min, MH+ 671, pureza quiral 100%.
Enantiómero 8B:
1H RMN (500 MHz, DMSO-cfe) ó ppm 1.95 - 2.07 (m, 2 H) 2.35 - 2.47 (m, 2 H) 3.11 (s, 3 H) 3.15 - 3.31 (m, 2 H) 3.74 (s, 3H) 3.85 (s, 3 H) 3.91 - 4.02 (m, 1 H) 4.06 - 4.19 (m, 2 H) 4.37 (td, J=10.25, 6.31 Hz, 1 H) 5.70 (d, J=8.20 Hz, 1 H) 6.54 (s, 1 H) 6.63 (s, 1 H) 6.88 (s, 1 H) 7.02 (d, J=8.20 Hz, 2 H) 7.12 - 7.17 (m, 1 H) 7.23 (s, 1 H) 7.31 (d, J=8.20 Hz, 1 H) 8.34 (s, 1 H) 11.44 (s a, 1 H)
LC/MS (método LC-A): TR 2.73 min, MH+ 671
[a ]D20 : 46.4° (c 0.28, DMF)
SFC quiral (método SFC-G): TR 3.31 min, MH+ 671, pureza quiral 100%.
Ejemplo 9 : síntesis de ácido 4-(5-cloro-2-(1-((3-metoxi-5-(metilsulfonil)fenil)-amino)-2-oxo-2-(6-(trifluorometoxi)indolin-1-il)etil)fenoxi)butanoico (Compuesto 9) y separación quiral en los Enantiómeros 9A y 9B .
Síntesis del intermedio 9a:
Se agitó una mezcla de 6-(trifluorometoxi)indolina [CAS 959235-95-1] (577 mg, 2.84 mmol), ácido 2-(2-(4-(terc-butoxi)-4-oxobutoxi)-4-clorofenil)-2-((3-metoxi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)acético 7d (1.5 g, 2.84 mmol), hAt U (1.62 g, 4.26 mmol) y diisopropiletilamina (1.4 ml, 8.5 mmol) en DMF (60 ml), a temperatura ambiente durante 12 horas. Se diluyó la mezcla con agua. El precipitado se separó por filtración y se lavó con agua. Se introdujo el precipitado en EtOAc, se lavó con una disolución de K2CO3 al 10%, agua, se secó sobre MgSO4 , se filtró y se concentró el disolvente a presión reducida. Se purificó el residuo por medio de cromatografía instantánea sobre gel de sílice (15-40 pm, 120 g, heptano/EtOAc 60/40) para proporcionar, tras cristalización a partir de éter de petróleo/éter diisopropílico, 4-(5-cloro-2-(1 -((3-metoxi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)-2-oxo-2-(6-(trifluorometoxi)indolin-1-il)-etil)fenoxi)butanoato de terc-butilo 9a (1.02 mg).
Síntesis del Compuesto 9 y separación quiral en los Enantiómeros 9A y 9B:
Se agitó una disolución de 4-(5-cloro-2-(1-((3-metoxi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)-2-oxo-2-(6-(trifluorometoxi)indolin-1-il)-etil)fenoxi)butanoato de ferc-butilo 9a (1.02 mg, 1.43 mmol) en HCl 4 M en dioxano (10 ml) a 5 °C durante 3 horas y a temperatura ambiente durante 12 horas. Se filtró el precipitado y se lavó con dioxano/éter diisopropílico para dar lugar a ácido 4-(5-cloro-2-(1-((3-metoxi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)-2-oxo-2-(6-(trifluorometoxi)indolin-1-il)etil)fenoxi)butanoico (Compuesto 9 , 930 mg, 0.78 equivalentes. HCl, 0.08 equivalente. H2O, 0.162 equivalentes, dioxano (determinado por medio de valoración) en forma de racemato. Los Enantiómeros se separaron mediante SFC quiral preparativa (Fase estacionaria: Chiralpak® IC 5 gm 250 x 30 mm, Fase móvil: 70 % de CO2 , 30% de EtOH/iPrOH (50/50)). Se agitó el primer enantiómero eluido en una mezcla de HCl 1 N y EtOAc. Se separó la fase orgánica, se secó sobre MgSO4 , se filtró y se concentró el disolvente a presión reducida. El compuesto se cristalizó a partir de CHaCN/éter diisopropílico para dar el Enantiómero 9A (145 mg). Se agitó el segundo enantiómero eluido en una mezcla de HCl 1 N y EtOAc. Se separó la fase orgánica, se secó sobre MgSO4, se filtró y se concentró el disolvente a presión reducida. El compuesto se cristalizó a partir de CH3CN/éter diisopropílico para dar el Enantiómero 9B (156 mg).
Compuesto 9:
1H RMN (400 MHz, DMSO-ds ) 8 ppm 1.99 (dq, J=13.71,7.05 Hz, 2 H) 2.32 - 2.46 (m, 2 H) 3.08 - 3.20 (m, 5 H) 3.74 (s, 3 H) 4.00 (td, J=10.23, 7.33 Hz, 1 H) 4.07 - 4.15 (m, 2 H) 4.38 (td, J=10.23, 6.82 Hz, 1 H) 5.70 (s, 1 H) 6.54 (s, 1 H) 6.63 (s, 1 H) 6.88 (s, 1 H) 6.95 - 7.09 (m, 2 H) 7.14 (d, J=1.52 Hz, 1 H) 7.30 (d a, J=8.08 Hz, 1 H) 7.33 (d a, J=8.59 Hz, 1 H) 8.03 (s, 1 H)
LC-MS (método LC-A): TR 2.87 min, MH+ 657
Punto de fusión: 173°C
Enantiómero 9A:
1H RMN (500 MHz, DMSO-ds) 5 ppm 1.91 - 2.06 (m, 2 H) 2.32 - 2.44 (m, 2 H) 3.09 - 3.23 (m, 5 H) 3.74 (s, 3 H) 3.98 -4.16 (m, 3 H) 4.39 (td, J=10.17, 6.78 Hz, 1 H) 5.71 (d, J=8.20 Hz, 1 H) 6.55 (s, 1 H) 6.63 (s, 1 H) 6.89 (s, 1 H) 7.00 -7.08 (m, 2 H) 7.15 (s, 1 H) 7.30 (d, J=8.20 Hz, 1 H) 7.34 (d, J=8.20 Hz, 1 H) 8.04 (s, 1 H) 12.11 (s a, 1 H) LC/MS (método LC-A): TR 2.86 min, MH+ 657
[a ]D20 : -56.5° (c 0.255, DMF)
SFC quiral (método SFC-H): TR 4.85 min, MH+ 657, pureza quiral 100%.
Punto de fusión: 154°C
Enantiómero 9B:
1H RMN (500 MHz, DMSO-afe) 5 ppm 1.91 - 2.06 (m, 2 H) 2.32 - 2.44 (m, 2 H) 3.09 - 3.23 (m, 5 H) 3.74 (s, 3 H) 3.98 -4.16 (m, 3 H) 4.39 (td, J=10.17, 6.78 Hz, 1 H) 5.71 (d, J=8.20 Hz, 1 H) 6.55 (s, 1 H) 6.63 (s, 1 H) 6.89 (s, 1 H) 7.00 -7.08 (m, 2 H) 7.15 (s, 1 H) 7.30 (d, J=8.20 Hz, 1 H) 7.34 (d, J=8.20 Hz, 1 H) 8.04 (s, 1 H) 12.11 (s a, 1 H) LC/MS (método LC-A): TR 2.86 min, MH+ 657
[a ]D20 : 55.3° (c 0.302, DMF)
SFC quiral (método SFC-H): TR 6.34 min, MH+ 657, pureza quiral 100%.
Punto de fusión: 155°C
Tabla: compuestos preparados como se ha descrito anteriormente
ACTIVIDAD ANTIVIRAL DE LOS COMPUESTOS DE LA INVENCIÓN
Ensayo antiviral del VDEN-2
Se evaluó la actividad antiviral de todos los compuestos de la invención frente a la cepa 16681 del VDEN-2, la cual se marcó con la proteína fluorescente verde potenciada (eGPF). El medio de cultivo consiste en un medio esencial mínimo complementado con un 2% de suero bovino fetal inactivado térmicamente, un 0.04% de gentamicina (50 mg/ml) y L-glutamina 2 mM. Se suspendieron células Vero, obtenidas de ECACC, en el medio de cultivo y se añadieron 25 pL a placas de 384 pocillos (2500 células/pocillo), que ya contenían los compuestos antivirales. Habitualmente, estas placas contienen diluciones en serie con un factor de 5, de 9 etapas de dilución del compuesto de prueba con 200 veces la concentración final en DMSO al 100% (200 nl). Además, cada concentración del compuesto se evalúa por cuadruplicado (intervalo de concentración final: 25 pM - 0.000064 pM o 2.5 pM - 0.0000064 pM para los compuestos
más activos). Finalmente, cada placa contiene pocilios que se han asignado como controles del virus (que contienen células y virus en ausencia del compuesto), controles de las células (que contienen células en ausencia de virus y compuesto) y controles del medio (que contiene medio en ausencia de células, virus y compuestos). A los pocillos asignados como control del medio, se añadieron 25 pL de medio de cultivo en lugar de células Vero. Una vez que se añadieron las células a las placas, las placas se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente para permitir que las células se distribuyeran de manera homogénea dentro de los pocillos. A continuación, las placas se incubaron en una incubadora totalmente humidificada (37 °C, 5% de CO2) hasta el día siguiente. Después, se añadió la cepa 16681 del VDEN-2, marcada con eGFP, con una multiplicidad de infección (MDI) de 0.5. Por lo tanto, se añadieron 15 pl de suspensión del virus a todos los pocillos que contenían compuesto de prueba y a los pocillos asignados como control del virus. En paralelo, se añadieron 15 pL de medio de cultivo a los controles del medio y de las células. A continuación, las placas se incubaron durante 3 días en una incubadora totalmente humidificada (37 °C, 5% de CO2). El día de la lectura, se midió la fluorescencia de eGFP utilizando un microscopio de fluorescencia automático a 488 nm (láser azul). Utilizando un sistema de LIMS propio, se calcularon las curvas de respuesta a la dosis de inhibición para cada compuesto y se determinó la concentración eficaz que produce la mitad del efecto máximo (CE50). Por lo tanto, la inhibición porcentual (I) para cada concentración de prueba se calcula utilizando la siguiente fórmula: I = 100*(St -Sc c )/(Sv c -Sc c ); St , Sc c y Svc son las cantidades de señal de eGFP en los pocillos del compuesto de prueba, control de las células y control del virus, respectivamente. La CE50 representa la concentración de un compuesto con la que se inhibe la replicación del virus en un 50%, que se mide como una reducción del 50% de la intensidad de fluorescencia de eGFP en comparación con el control del virus. La CE50 se calcula utilizando una interpolación lineal (Tabla 1).
En paralelo, se evaluó la toxicidad de los compuestos en las mismas placas. Una vez que se realizó la lectura de la señal de eGFP, se añadieron 40 pL de ATPlite, un tinte de viabilidad celular, a todos los pocillos de las placas de 384 pocillos. El ATP está presente en todas las células metabólicamente activas y su concentración se reduce muy rápidamente cuando las células experimentan necrosis o apoptosis. El sistema de ensayo ATPLite se basa en la producción de luz provocada por la reacción de ATP con luciferasa y D-luciferina añadidas. Las placas se incubaron durante 10 minutos a temperatura ambiente. A continuación, las placas se midieron en un ViewLux. También se determinó la concentración que produce la mitad del efecto citotóxico máximo (CC50), definida como la concentración requerida para reducir la señal de luminiscencia en un 50% en comparación con la de los pocillos de control de las células. Finalmente, se determinó el índice de selectividad (IS) para los compuestos, que se calculó de la siguiente manera: IS = CC50/CE50.
Tabla 1: CEsn, CCsn e IS para los compuestos de la invención en el ensayo antiviral del VDEN-2
Ensayo de PCR cuantitativa con retrotranscriptasa tetravalente (RT-qPCR)
Se evaluó la actividad antiviral de los compuestos de la invención frente a la cepa TC974#666 del VDEN-1 (NCPV), la cepa 16681 del VDEN-2, la cepa H87 del VDEN-3 (NCPV) y la cepa H241 (NCPV) del VDEN-4 en un ensayo de RT-qPCR. Por lo tanto, se infectaron células Vero con el VDEN-1 o -2 o -3 o -4 en presencia o ausencia de compuestos de prueba. El día 3 después de la infección, las células se sometieron a lisis y los lisados celulares se utilizaron para preparar ADNc de tanto una diana viral (la 3’UTR del VDEN; Tabla 2) como un gen de referencia celular (p-actina, Tabla 2). Posteriormente, se realizó una PCR doble a tiempo real en un instrumento Lightcycler480. El valor de Cp generado es inversamente proporcional a la cantidad de expresión de ARN de estas dianas. La inhibición de la replicación del VDEN por un compuesto de prueba da como resultado un desplazamiento de Cp para el gen 3’UTR. Por otra parte, si un compuesto de prueba es tóxico para las células, se observará un efecto similar en la expresión de p-actina. El método de AACp comparativo se utiliza para calcular CE50, que se basa en la expresión génica relativa del gel diana (3’UTR) normalizada con el gen constitutivo celular (p-actina). Además, los valores de CC50 se determinan basándose en los valores de Cp adquiridos para el gen constitutivo de p-actina.
Tabla 2 : Cebadores y sondas utilizados para la RT-PCR cuantitativa a tiempo real.
El medio de cultivo consistió en un medio esencial mínimo complementado con un 2% de suero bovino fetal inactivado térmicamente, un 0.04 % de gentamicina (50 mg/ml) y L-glutamina 2 mM. Se suspendieron células Vero, obtenidas de ECACC, en el medio de cultivo y se añadieron 75 pL/pocillo en placas de 96 pocillos (10000 células/pocillo), que ya contenían los compuestos antivirales. Habitualmente, estas placas contienen una dilución en serie con un factor de 5, de 9 etapas de dilución del compuesto de prueba con 200 veces la concentración final en DMSO al 100% (500 nl; intervalo de concentración final: 25 pM - 0.000064 pM o 2.5 pM - 0.0000064 pM para los compuestos más activos). Además, cada placa contiene pocillos que se han asignado como controles del virus (que contienen células y virus en ausencia de compuesto) y controles de las células (que contienen células en ausencia de virus y compuesto). Una vez se añadieron las células a las placas, las placas se incubaron en una incubadora totalmente humidificada (37 °C, 5% de CO2) hasta el día siguiente. Se diluyeron los serotipos 1,2, 3 y 4 de los virus del dengue con el fin de obtener un Cp de ~22-24 en el ensayo. Por lo tanto, se añadieron 25 pL de suspensión de virus a todas las placas que contenían compuesto de ensayo y a los pocillos asignados como control de virus. En paralelo, se añadieron 25 pL de medio de cultivo a los controles de las células. A continuación, las placas se incubaron durante 3 días en una incubadora totalmente humidificada (37 °C, 5% de CO2). Después de 3 días, se retiró el sobrenadante de los pocillos y las células se lavaron dos veces con PBS enfriado con hielo (~ 100 pL). Los sedimentos de células dentro de las placas de 96 pocillos se almacenaron a -80 °C durante al menos 1 día. A continuación, se extrajo el ARN utilizando el kit de lisis Cells-to-CTTM, de acuerdo con las directrices del fabricante (Life Technologies). Los lisados celulares pueden almacenarse a -80 °C o utilizarse inmediatamente en la etapa de retrotranscripción.
En la preparación de la etapa de retrotranscripción, se preparó la mezcla A (tabla 3A) y se dispensaron 7.57 pl/pocillo en una placa de 96 pocillos. Después de la adición de 5 pL de los lisados celulares, se realizó una etapa de desnaturalización de cinco minutos a 75 °C (tabla 3B). Posteriormente, se añadieron 7.43 pl de mezcla B (tabla 3C) y se inició la etapa de retrotranscripción (tabla 3D) para generar ADNc.
Finalmente, se preparó una mezcla de RT-qPCR, mezcla C (tabla 4A), y se dispensaron 22.02 pL/pocillo en placas LightCycler qPCR de 96 pocillos en las que se añadieron 3 pL de ADNc y la qPCR se realizó de acuerdo con las condiciones de la tabla 4B en un LightCycler 480.
Utilizando el software LightCycler y un sistema LIMS propio, se calcularon las curvas de respuesta a la dosis para cada compuesto y se determinaron la concentración eficaz que produce la mitad del efecto máximo (CE50) y la concentración que produce la mitad del efecto citotóxico máximo (CC50) (Tablas 5-8).
Tabla 3: Síntesis de ADNc usando la Mezcla A, desnaturalización, la Mezcla B y retrotranscripción.
Tabla 4: Protocolo y mezcla de qPCR.
Tabla 5: CE50. CC50 e IS para los compuestos frente al serotipo 1 en los ensayos de RT-qPCR
Tabla 6: CE50. CC50 e IS para los compuestos frente al serotipo 2 en los ensayos de RT-qPCR
Claims (10)
1. Un compuesto de fórmula (I), incluida cualquiera de sus formas estereoquímicamente isoméricas,
donde
R1 es fluoro, R2 es -CH2CH2OH, R3 es trifluorometilo, y R4 es hidrógeno, o
R1 es fluoro, R2 es -CH2CH2OH, R3 es trifluorometilo, y R4 es metoxi, o
R1 es fluoro, R2 es -CH2CH2OH, R3 es trifluorometoxi, y R4 es hidrógeno, o
R1 es cloro, R2 es -CH2CH2OH, R3 es trifluorometilo, y R4 es hidrógeno, o
R1 es cloro, R2 es -CH2CH2OH, R3 es trifluorometilo, y R4 es metoxi, o
R1 es cloro, R2 es -CH2CH2OH, R3 es trifluorometoxi, y R4 es hidrógeno, o
R1 es cloro, R2 es -(CH2)3COOH, R3 es trifluorometilo, y R4 es hidrógeno, o
R1 es cloro, R2 es -(CH2)3COOH, R3 es trifluorometilo, y R4 es metoxi, o
R1 es cloro, R2 es -(CH2)3COOH, R3 es trifluorometoxi,y R4 es hidrógeno;
o una sal, solvato o polimorfo farmacéuticamente aceptable del mismo.
2. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, donde dicho compuesto está seleccionado entre
3. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, donde dicho compuesto tiene la rotación específica (+).
4. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, donde dicho compuesto está seleccionado entre:
5. Una composición farmacéutica que comprende un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, junto con uno o más excipientes, diluyentes o vehículos farmacéuticamente aceptables.
6. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 5, que comprende un segundo principio activo o más.
7. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 6, donde el segundo principio activo o más es un agente anti-vírico.
8. Un compuesto de fórmula (I) de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, para su uso como medicamento.
9. Un compuesto de fórmula (I) de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, para su uso en el tratamiento de la infección del Dengue y para prevenir o tratar enfermedades asociadas a la infección del Dengue.
10. Un compuesto de fórmula (I) para su uso de acuerdo con la reivindicación 9, donde la infección del Dengue es infección por los virus de las cepas DENV-1, DENV-2, DENV-3 o DENV-4.
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