ES2693167T3 - Administración directa de proteínas con microvesículas modificadas por ingeniería - Google Patents

Abstract

Una microvesícula secretada por una célula eucariota, en la que dicha microvesícula comprende una proteína de fusión de la membrana viral VSV-G y una proteína de interés, en la que dicha microvesícula no contiene ninguna proteína estructural viral, y en la que dicha proteína de interés no se une con enlace covalente a dicha proteína de fusión de la membrana viral VSV-G.

Description

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DESCRIPCION

Administracion directa de protemas con microvesmulas modificadas por ingeniena Sector de la tecnica

La presente divulgacion se refiere a administracion directa de protemas con microvesmulas modificadas por ingeniena.

Estado de la tecnica

La introduccion transitoria de protemas de interes en una celula diana es un desafm principal, con muchas aplicaciones en investigacion basica, ciencia aplicada y en el campo terapeutico.

Durante decadas, la introduccion de una protema de interes en una celula diana se ha conseguido indirectamente, mediante la introduccion de material genetico que codifica dicha protema de interes, conocido como transfeccion.

Durante anos se han desarrollado muchas tecnicas de transfeccion, tales como transfeccion con fosfato calcico, electroporacion y lipofeccion.

Sin embargo, estas tecnicas tienen varios inconvenientes que pueden limitar su uso. La introduccion de un gen que codifica una protema de interes en una celula diana depende de la maquinaria de transcripcion y traduccion de la celula diana. La expresion de la protema deseada es por lo tanto lenta, y se pueden observar varios efectos no deseados (toxicidad del propio reactivo de transfeccion, activacion de la respuesta al interferon, etc.).

Ademas, ciertos tipos de celulas, generalmente celulas que no se dividen tales como neuronas, se pueden transfectar escasamente. Para evitar este inconveniente mas recientemente se han desarrollado otras tecnicas de transferencia genetica conocidas como transduccion. La transduccion depende del uso de un vector viral para transferir material genetico a una celula diana. Para este efecto a menudo se usan sistemas basados en retrovirus. Sin embargo, estas tecnologfas adolecen de varios inconvenientes. En primer lugar, existe un riesgo sanitario asociado con el uso de vectores retrovirales, aunque dichos vectores retrovirales hayan sido inactivados. En segundo lugar, la produccion de partmulas retrovirales es muy tediosa y consume mucho tiempo. De hecho, implica la produccion de grandes cantidades de 4 o 5 plasmidos diferentes que codifican las diversas protemas necesarias para la formacion de las partmulas del vector viral. Por ultimo, los efectos observados en la celula diana no son inmediatos. Por lo general, la protema de interes se expresa en la celula objetivo despues de un retraso de al menos 24 horas, normalmente de 48 a 72 horas, durante la cual se realizan la transcripcion y la traduccion.

Los trabajos anteriores describieron la transferencia inesperada de protemas indicadoras mediante agentes testigo coproducidos con vectores retrovirales (Liu et al., Journal of virology 70, 2497-2502 (1996); Gallardo et al., Blood 90, 952-957 (1997). Por ejemplo, estos autores describieron la capacidad de su preparacion viral para administrar p- Galactosidasa en celulas diana que se sabe que no son permisivas para transferencia genetica mediada por retrovirus. Este artefacto de transduccion indeseable denominado pseudotransduccion condujo a una expresion transitoria de la protema transferida en la celula tratada, mientras que la transduccion retroviral asegura una expresion estable a largo plazo del transgen administrado. De forma interesante estos autores usaron vectores retrovirales pseudotipados con la protema G del Virus de la Estomatitis Vesicular (VSV-G) y observaron que la pseudotransduccion se produda espedficamente con partmulas retrovirales revestidas con VSV-G concentrado. Sin embargo, estos estudios no proporcionaron evidencias concluyentes del mecanismo subyacente a esta pseudotransduccion mediada por protema y se penso que la protema transferida estaba integrada de la manera mas probable en la envoltura viral (Schnell et al., PNAS, 1996, 93, 11359-11365). Por lo tanto, se pensaba que esta pseudotransduccion se limitaba a las protemas de membrana. Ademas, se crefa que no se podfa disociar a partir de transduccion retroviral mediada por genes.

Para obtener una administracion espedfica, controlada por el tiempo de una protema de interes en una celula diana, otra tecnica disponible es la microinyeccion en la celula diana. Sin embargo, esta tecnica requiere la obtencion de la protema de interes antes de la microinyeccion. Los peptidos se pueden obtener por smtesis qmmica, mientras que las protemas mas grandes requeriran procedimientos espedficos de produccion y purificacion. Por lo tanto, estos metodos son de coste elevado y son poco adecuados para usos a gran escala.

Otros estudios se han centrado en el suministro de protemas mediante su conjugacion con un peptido corto que media la transduccion de protemas, tal como el VIH tat y poliarginina. Sin embargo, estas tecnicas tambien son diffciles de desarrollar a gran escala, ya que dependen de protemas recombinantes.

Por lo tanto, en la tecnica todavfa existe una necesidad de un metodo rapido, seguro y eficaz para administrar una protema de interes en una celula diana.

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Objeto de la invencion

La invencion se define en las reivindicaciones.

La presente divulgacion se refiere a una celula eucariota que sobreexpresa una protema de fusion de la membrana viral y una protema de interes.

La presente divulgacion tambien se refiere a una microvesroula secretada por una celula eucariota de acuerdo con la divulgacion, en la que dicha microvesroula comprende dicha protema de fusion de la membrana viral y dicha protema de interes.

La presente divulgacion tambien se refiere a un metodo in vitro para administrar una protema de interes en una celula diana poniendo en contacto dicha celula diana con una microvesroula de acuerdo con la divulgacion que comprende dicha protema de interes.

Descripcion detallada de la invencion

Los inventores han descubierto que la sobreexpresion de una protema de fusion de la membrana viral en una celula eucariota que expresa una protema de interes puede conducir a la secrecion de microvesroulas que comprenden dicha protema de fusion de membrana y dicha protema de interes. Ademas, los inventores han demostrado que dichas microvesroulas se pueden usar para administrar dicha protema de interes de forma eficaz a una celula diana, sin alterar la funcion de dicha protema. Por lo tanto el metodo de la presente divulgacion es adecuado para una introduccion transitoria y rapida de una protema funcional en una celula diana.

Por lo tanto, la presente divulgacion se refiere a una celula eucariota que sobreexpresa una protema de fusion de la membrana viral y una protema de interes. Dicha celula eucariota es capaz de secretar microvesroulas que comprenden dicha protema de fusion de la membrana viral y dicha protema de interes.

En una realizacion, la celula eucariota de acuerdo con la divulgacion no expresa ninguna protema estructural viral y las microvesroulas secretadas por las celulas eucariotas de ese tipo no comprenden ninguna protema estructural viral. Por consiguiente, las microvesroulas de acuerdo con la divulgacion se diferencian en ese aspecto de las partroulas similares a virus (VLP) que se describen en la tecnica, por ejemplo, en el documento WO2006/059141, dichas VLP comprenden protemas estructurales virales, tales como VIH1 Gag.

Como se usa en el presente documento, la expresion "protema estructural viral" se refiere a protemas virales que contribuyen a la estructura general de la protema de la capside o del nucleo proteico de un virus. La expresion "protema estructural viral" incluye fragmentos o derivados funcionales de tal protema viral que contribuyen a la estructura de una protema de la capside o del nucleo proteico de un virus. Un ejemplo de protema estructural viral es VIH1 Gag. Las protemas de fusion de la membrana viral no se consideran protemas estructurales virales. Por lo general, dichas protemas estructurales virales se localizan dentro de las microvesroulas.

De hecho los inventores han mostrado que las microvesroulas que comprenden una protema de interes se pueden producir en celulas eucariotas que no expresa ninguna protema estructural viral pero que sobreexpresan una protema de fusion de membrana, tal como VSV-G u otras protemas fusogenicas, y dicha protema de interes.

Ademas, las microvesroulas de acuerdo con la divulgacion pueden no contener ningun acido nucleico que codifique la protema de interes. Por supuesto, no se puede excluir que en dichas microvesroulas estan contenidas trazas de acidos nucleicos, en particular trazas de ARNm de celulas productoras o incluso ADN que resulta de la transfeccion previa. Sin embargo, los inventores han demostrado que las trazas de acidos nucleicos de ese tipo (si existen) no pueden ser responsables de al menos un 90 % de la transferencia de la funcion de la protema por microvesroulas.

Por lo general la celula eucariota es una celula de mairnfero, tal como una celula humana, una celula de pollo o una celula de insecto. Los ejemplos de celulas de mai^ero adecuadas son, pero no se limitan a celulas HEK-293T, celulas COS7, celulas Hela y celulas HEK-293. Los ejemplos de celulas de insecto adecuadas incluyen, pero no se limitan a, celulas High5 y celulas Sf9. Las celulas de insecto presentan varias ventajas. En particular, estan desprovistas de protema humana indeseable, y su cultivo no requiere suero animal.

Por "sobreexpresion", se hace referencia a cualquier medio conocido en la tecnica para aumentar la cantidad de protema expresada por una celula dada. De manera practica, la protema de fusion de la membrana viral y la protema de interes se expresan en dichas celulas eucariota hasta un nivel de modo que dichas celulas eucariotas son capaces de secretar microvesroulas que comprenden dicha protema de fusion de la membrana viral y dicha protema de interes sin la necesidad de expresar ninguna protema estructural viral.

Por lo general, la sobreexpresion de la protema de fusion de la membrana viral y de la protema de interes se puede conseguir transfectando la celula eucariota con un vector de expresion que codifica la protema de fusion de la membrana viral y un vector de expresion que codifica la protema de interes.

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En otra realizacion, dicha celula eucariota de acuerdo con la divulgacion esta sobreexpresando VSV-G como una protema de fusion de la membrana viral y una protema de interes pero no sobre expresa ninguna otra protema viral, en particular ninguna protema estructural viral. De las microvesmula secretadas de acuerdo con dicha realizacion comprende VSV-G y dicha protema de interes pero no comprenden ninguna protema estructural viral.

En otra realizacion espedfica, las celulas eucariotas sobre expresa no solamente la protema de fusion de la membrana viral y dicha protema de interes. En esta realizacion, la expresion de la protema de fusion de la membrana viral, por ejemplo VSV-G, puede representar al menos 30 %, por ejemplo al menos un 50 %, de las protemas sobreexpresadas en las celulas.

En una realizacion, dicha protema de fusion de la membrana viral y dicha protema de interes se pueden codificar mediante dos vectores diferentes.

En una realizacion, de fusion de la membrana viral y dicha protema de interes pueden ser cortadas por un solo lector que contiene un casete de expresion bicistronico. En una realizacion relacionada; dicha protema de fusion de la membrana viral y dicha protema de interes no se unen en conjunto mediante enlace covalente.

En una realizacion, los vectores de expresion pueden incluir plasmidos de replicacion episomica y, por ejemplo, plasmidos que comprenden secuencia de origen de naturaleza viral tales como secuencias de ORI de SV40 u ORI de EBV.

La sobreexpresion a traves de vectores de expresion puede comprender cualquier metodo de transferencia genetica conocido en la tecnica de biologfa molecular. En una realizacion preferente, la sobreexpresion se obtiene por transfeccion de un ADN exogeno. Los metodos de transfeccion adecuados son metodos clasicos conocidos por la persona con experiencia, tales como transfeccion con fosfato calcico, transfeccion usando liposomas (tambien conocida como lipofeccion) o electroporacion. Dentro de la capacidad de la persona con experiencia esta seleccionar el metodo de transfeccion apropiado para una celula dada.

En una realizacion preferente, la sobreexpresion no se obtiene mediante transduccion viral.

La sobreexpresion puede ser sobreexpresion transitoria o sobreexpresion estable.

Cuando se usa sobre expresion transitoria, las celulas por lo general sobre expresan cantidades optimas de la protema de fusion de la membrana viral y/o la protema de interes entre 48 y 72 horas despues de a transfeccion.

El termino "sobreexpresion" tambien abarca la sobreexpresion de una protema endogena, es decir, una protema que se expresa de forma natural por la celula eucariota. La sobreexpresion puede consistir ya sea en la introduccion de copias adicionales del gen que codifica dicha protema o en la estimulacion de la expresion de la protema endogena. A modo de ejemplo, la celula eucariota se puede colocar en condiciones de cultivo conocidas por que aumentan la expresion de dicha protema endogena.

En una realizacion de la divulgacion, la celula eucariota sobreexpresa de 2 a 5 protemas de interes diferentes.

Por lo general, dicha protema de fusion de la membrana viral es una protema de fusion de la membrana viral de clase I tal como la hemaglutinina del virus de la gripe, una protema de fusion de la membrana viral de clase II o una protema de fusion de la membrana viral de clase III (para revision sobre protema de fusion de la membrana viral de clase III vease Backovic et al., Curr Opin Struct Biol 2009, 19 (2): 189-96 o Courtney et al., Virology Journal 2008, 5: 28).

En una realizacion preferente, dicha protema de fusion de la membrana viral es una protema de fusion de la membrana viral de clase I.

Los ejemplos de protemas de fusion de la membrana viral de clase I son protemas de Baculovirus F, en particular protemas F de los generos de nucleopolihedrovirus (NPV), tales como protema F de MNPV de Spodoptera exigua (SeMNPV) y protema F de MNPV de Lymantria dispar (LdMNPV).

En una realizacion preferente dicha protema de fusion de la membrana viral es una protema de fusion de la membrana viral de clase III.

Los ejemplos de protemas de fusion de la membrana viral de clase III son rabdovirus G (tal como la protema G fusogenica del Virus de la Estomatitis Vesicular (VSV-G)), gB del virus del herpes (tal como la glicoprotema B del virus 1 del Herpes Simplex (VHS-1 gB)), gB de EBV, gp64 de togotovirus G, baculovirus (tal como gp64 de NPV multiple de Autographa California (Ac-MNPV)), y la glicoprotema (BDV G) del virus de la enfermedad de Borna (BDV).

En una realizacion mas preferente, dicha protema de fusion de la membrana viral es VSV-G o gp64 de baculovirus.

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En una realizacion, dicha protema de fusion de la membrana viral es polipeptido de VSV-G como se define en GenBank AN: M35219.1, o cualquier fragmento funcional o sus derivados funcionales que retienen propiedades fusogenicas.

Como se usa en el presente documento, el termino "fusogenico" se refiere a una protema viral que puede inducir la fusion de la membrana plasmatica de las microvesroulas a la membrana de la celula diana.

En una realizacion de la divulgacion, laser eucariota de acuerdo con la divulgacion sobre expresa adicionalmente una protema que induce gemacion de la membrana. En esta realizacion, la produccion de microvesroulas se potencia.

Como se usa en el presente documento, la expresion "protema que induce gemacion de la membrana" se refiere a cualquier protema que pueda estimular la deformacion de las bicapas lipfdicas y median la formacion de vesroulas.

La capacidad de una protema de ensayo dada para inducir gemacion de la membrana se puede evaluar de acuerdo con el siguiente ensayo "A" in vitro: las celulas HEK293T se transfectan con la protema de ensayo o se transfectan de forma simulada con un vector vacro. 20 horas despues de a transfeccion, los medios celulares se reemplazan con medio que contiene R18 (20 p g/ml). R18, o cloruro de octadecil rodamina B, es un compuesto lipofilo que se uman membranas y emite fluorescencia a 590 nm despues de excitacion a 560 nm. Despues de 6 horas de incubacion, para permitir la incorporacion de R18 en membranas celulares, los medios se cambian por medio recien preparado sin R18. 72 horas despues de la transfeccion, los medios de las celulas transfectadas y de las celulas transfectadas de forma simulada se recogen, se aclaran y se analizan con un fluorometro. La cantidad de fluorescencia asociada a R18, normalizada con respecto al numero de celulas vivas de las que se hace el recuento con un ensayo a base de rezazurina, refleja la cantidad de membrana liberada por las celulas en cada condicion.

Se considera que una protema de ensayo induce gemacion de la membrana si aumenta la cantidad de fluorescencia asociada a R18 por celula, tal como se mide con el ensayo "A" que se ha mencionado anteriormente.

Se sabe que diversas protemas celulares y virales inducen gemacion de la membrana.

Los ejemplos de protemas celulares que inducen gemacion de la membrana son la protema PLP1 proteolipfdica (Trajkovic et al., 2008 Science, vol 3l9, p 1244-1247), el complejo API adaptador de clatrina (Camus et al., 2007. Mol Biol Cell vol 18, p3193-3203), protemas que modifican las propiedades lipfdicas tales como flopasa, escramblasa, protemas que facilitan la secrecion a traves de una ruta no clasica tal como TSAP6 (Yu et al., 2006 Cancer Res vol 66, p4795-4801) y CHMP4C (Yu et al., 2009, FEBS J. vol 276, p2201-2212).

Los ejemplos de protemas virales que inducen gemacion de la membrana son antagonistas de teterina/CD317 tales como la protema Vpu del VIH (Neil et al., 2008. Nature vol 451, p425-4431) y diversas protemas estructurales viral tales como GAG retroviral (Camus et al., 2007. Mol Biol Cell vol 18, p3193-3203) y VP40 del Ebola (Timmins et al., Virology 2001).

La gemacion de la membrana tambien se puede inducir modificando las condiciones de cultivo celular de la celula eucariota que sobreexpresa una protema de fusion de la membrana viral y una protema de interes, tales como temperatura, concentracion de Ca2+, etc.

Como se usa en el presente documento, dicha protema de interes puede ser cualquier protein o polipeptido que se desea transfectar a las celulas diana. En una realizacion, dicha protema de interes no comprende ninguna protema de fusion de la membrana viral o ningun fragmento de dicha protema de fusion de la membrana viral o derivados que mantienen las propiedades fusogenicas.

Generalmente dicha protema de interes puede ser una protema heterologa, por ejemplo, una protema de membrana, una protema citoplasmatica, una protema viral o una protema nuclear. Como se usa en el presente documento, el termino "heterologa" se refiera que dicha protema no se expresa a partir de un gen que se encuentra de forma natural en el genoma de las celulas eucariotas que sobre expresa en dicha protema de interes.

Como alternativa, dicha protema de interes puede ser una protema endogena, por ejemplo, una protema que se expresa de forma natural en cantidades elevadas en ciertas lmeas celulares. En esta realizacion, las lmeas celulares que expresan de forma natural una protema de interes en cantidades elevadas se modifican con ingeniena genetica para sobreexpresar adicionalmente la protema de fusion de membrana, tal como sobreexpresar adicionalmente la protema de fusion de membrana, tal como VSV-G, con el fin de producir microvesroulas que contienen dicha protema de interes y dicha protema de fusion de membrana.

Los ejemplos de protemas de membrana adecuadas son receptores de membrana, CD81, mCAT-1 (receptor Ecotropico), CXCR4 y protemas de asentamiento, CD4, CCR5, protemas ricas en acido sialico, claudinas, cD21, receptores de linfocitos T, receptores de linfocitos B, CFTR y TNFR1.

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Los ejemplos de protemas citoplasmaticas adecuadas son factores apoptoticos tales como BAX, BID, BAK, BAD, FasL y protemas fluorescentes tales como GFP, YPF, Venus, CFP, DsRojo, Rojo-Cereza y DsRed 2.

Los ejemplos de protemas virales son tat, rev, gp120, GP41 (VIH-1/2, VIS), vpx (VIS), tax, rex (HTLV-1), EB1, EBNA2, EBNA1, BHRF1 (EBV), NS3, NS5A, NS1, NS2, Core, E1, E2 (VCH), T pequenos, antfgeno de T grande (SV40), NS1, Neuraminidasa y HA (Gripe).

Los ejemplos de protemas nucleares son factores o cofactores de transcripcion, el transactivador de tetraciclina tTA, VP16 y protemas de fusion que contienen VP16, la CRE recombinasa, Cre-Ert2 recombinasa, FLP recombinasa o flipasa, Hin recombinasa, RecA/RAD51, Tre recombinasa, meganucleasas tales como I-Sce1, factores de transcripcion tales como GATA-1, FOG, NF-E2, TAL1/SCL, EKLF, FBI-1, RUNX1, PU.1, Receptor de acido Retinoico, receptor de vitamina B3, protemas de union a CCAAT/potenciador, Ikaros, Pax5, Janus Quinasa, E2A, Bcl-6, familia de EBF, Egr 2 y 3, KlF5, TcF4, MyoD, SUM-1, miogenina, myf-5, MRF4, Pitx2, Egr 2 y Egr 3, NFkB, API, AP2, factores de POU, Sp1/Sp3, bHLH, Engrailed 2, Foxgl, ELF3, Erm, Olf-1, Pax6, alfa-Pal/Nrf-1, Nurrl y Pitx3.

De forma ventajosa, los inventores han mostrado que la protema de interes detiene su funcionalidad una vez que se ha transferido en la celula diana. En particular, dicha protema de interes no se escinde en las diana. Por ejemplo, dicho receptor de membrana se localiza de forma correcta en la membrana celular despues de su administracion por microvesmulas con el fin de ser capaz de reconocer su correspondiente ligando. En otra realizacion, dicha protema de interes es un factor de transcripcion o correspondiente que se localiza de forma correcta en el nucleo despues de su administracion por microvesmulas con el fin de estimular o reprimir La transcripcion de genes regulados por dicho factor de transcripcion.

En una realizacion de la divulgacion, la protema de interes se puede modificar para su localizacion en la membrana de la celula.

En una realizacion la protema de interes no esta fusionada con la protema de fusion de la membrana viral. De forma ventajosa la protema de interes se puede modificar adicionalmente con el fin de ser liberada desde la membrana en una condicion acida mediante introduccion de un sitio de escision proteolftica que se puede escindir en condiciones acidas. Los ejemplos de sitios de escision proteolftica que se pueden escindir en condiciones acidas son el sitio de escision fluHA, el sitio de escision de protema F del virus Nipah fue sitio de escision de catepsina.

En una realizacion alternativa, la protema de interes no se fusiona con la protema de fusion de la membrana viral. De hecho, se ha mostrado que dicha protema de interes, cuando se sobreexpresa con la protema de fusion de la membrana viral, se puede localizar en las microvesmulas. Por lo general un motivo de farnesilo responsable de la farnesilacion de la protema y/o un motivo de miristilo responsable de la miristilacion de la protema se puede introducir con el fin de dirigir la protema a la membrana.

En una realizacion, la protema de fusion de la membrana viral y/o la protema de interes puede contener un etiqueta que permite la purificacion de las microvesmulas liberadas desde la celula eucariota. Dicha etiqueta se puede situar por ejemplo en el ectodominio de la protema de fusion de la membrana viral. Las etiquetas adecuadas incluyen, pero no se limitan a: etiqueta Flag, etiqueta HA, etiqueta GST, etiqueta His6. Dentro de la capacidad de la persona con experiencia en la materia esta seleccionar la etiqueta apropiada y el metodo de codificacion apropiados de dicha etiqueta. Los metodos de purificacion adecuados incluyen, pero no se limitan a, inmunoprecipitacion, cromatograffa por afinidad, y perlas magneticas revestidas con anticuerpo espedfico anti-etiqueta.

En una realizacion preferente, una celula eucariota de acuerdo con la divulgacion esta libre de virus, en particular, dicha celula eucariota no comprende ningun acido nucleico que codifica una protema estructural viral.

La presente divulgacion tambien se refiere a una microvesmula secretada por una celula eucariota de acuerdo con la divulgacion, en la que dicha microvesmula comprende dicha protema de fusion de la membrana viral y dicha protema de interes. En otra realizacion, dichas microvesmula se obtienen a partir de celulas eucariotas de acuerdo con la divulgacion que comprende dicha protema de interes que no se une con enlace covalente a dicha protema de fusion de la membrana viral.

Sin desear quedar ligado por la teona, se considera que dichas microvesmula son similares a exosoma y tienen un tamano entre 40 y 150 nm, por ejemplo entre 40 y 100 nm, por ejemplo un tamano medio de aproximadamente 100 nm. Por lo general una microvesmula de acuerdo con la divulgacion tiene una densidad entre 1,08 g/ml y 1,12 g/ml. Preferentemente una microvesmula de acuerdo con la divulgacion tiene una densidad entre 1,09 g/ml y 1,11 g/ml. Por lo general, dicha densidad se puede medir mediante sedimentacion en un gradiente continuo de iodixanol como se define en el Ejemplo 1.

Cuando se usa la sobreexpresion transitoria de la protema de fusion de la membrana viral y/o de la protema de interes, las microvesmulas por lo general se cosechan a partir del sobrenadante celular 48-72 horas despues de la transfeccion. Por lo general, las microvesmulas de acuerdo con la divulgacion se pueden aislar por filtracion (por

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ejemplo en filtros de poro de 0,45 pm) del sobrenadante celular de celulas eucariotas de acuerdo con la divulgacion y ultracentrifugacion por ejemplo, mediante ultracentrifugacion a 110000 g durante 1,5 horas. De forma ventajosa, las microvesmulas de acuerdo con la divulgacion se pueden congelar y almacenar a -80 °C sin perder su capacidad para transferir material a la celula diana.

En otra realizacion, dichas microvesmulas de acuerdo con la divulgacion no comprenden ningun acido nucleico que codifica dicha protema de interes.

En una realizacion preferente, una microvesmula de acuerdo con la divulgacion esta libre de virus.

Descrito en primer lugar para celulas del sistema inmunologico, las micro vesmulas liberadas de celulas se encuentran in vivo en muchos fluidos corporales (Simpson et al., Proteomics 8, 4083-4099 (2008)). Muchos estudios han resaltado el papel de estas microvesmulas en la modulacion de la respuesta inmunologica y la comunicacion intercelular.

Sin desear quedar ligado por la teona, se cree que las microvesmulas de la divulgacion son vesmulas similares a exosomas, y la presencia de la protema de fusion de la membrana viral permite que dichas microvesmulas administren de forma eficaz el material contenido en dichas microvesmula as a la celula diana.

La presente divulgacion tambien se refiere a un metodo in vitro para administrar una protema de interes en una celula diana poniendo en contacto dicha celula diana con una microvesmula de la divulgacion que comprende dicha protema de interes.

Los ejemplos de celulas diana son lmeas de celulas de laboratorio comunes tales como celulas Hela y derivados, celulas HEK293, celulas HEK293T, celulas NIH3T3 y derivados, celulas HepG2, celulas HUH7 y derivados, celulas de cancer de pulmon microdtico, celulas Caco-2, celulas L929, celulas A549, celulas MDCK, celulas THP 1, celulas U937, celulas Vero y celulas PC12; celulas CD34+ hematopoyeticas humanas purificadas a partir de medula osea, de sangre, de cordon umbilical; Celulas Dendnticas (DC) diferencias a partir de monocitos de sangre o de celulas CD34+; celulas humanas primarias purificadas a partir de sangre incluyendo linfocitos T (CD8 y CD4), linfocitos B (incluyendo linfocitos B de memoria), mastocitos, macrofagos, las DC, celulas NK; celulas de murino primarias purificadas a partir de sangre incluyendo linfocitos T (CD8 y CD4), linfocitos B (incluyendo linfocitos B de memoria), mastocitos, macrofagos, las DC, celulas NK; celulas MRC5 incluyendo fibroblastos humanos primarios, celulas IMR90; fibroblastos de murino primarios y celulas Madre Embrionarias (ES) de origen humano, murino, rata, pollo, conejo.

El tropismo de las microvesmulas de la divulgacion dependera del tropismo de la protema de fusion de la membrana viral usada.

Por ejemplo, VSV-G siendo pantropico, las microvesmulas de acuerdo con la divulgacion que comprenden VSV-G se dirigiran casi a cualquier celula. Las microvesmulas que comprenden una protema de fusion de la membrana viral con un tropismo para celulas del tracto respiratorio se usaran preferentemente para dirigirse a las celulas diana del tracto respiratorio.

En una realizacion preferente las microvesmulas de acuerdo con la divulgacion se producen in situ, mediante cocultivo de las celulas diana con celulas productoras de microvesmulas. En una realizacion espedfica, las celulas diana y las celulas productoras de microvesmulas se situan ffsicamente en dos compartimentos diferentes separados por una pared porosa, en los que dicha pared porosa tiene poros con un diametro mas pequeno que el diametro de las celulas eucariotas pero mayor que el diametro de las microvesmulas de interes. De forma ventajosa, las microvesmulas tal como se producen por las celulas eucariotas de acuerdo con la divulgacion se pueden difundir desde un compartimento al otro para alcanzar las celulas diana en el que pueden administrar las protemas de interes.

Esta tecnica permite la administracion de protemas en celulas diana, sin la necesidad de una etapa de aislamiento.

Por lo general en una celula diana se pueden administrar varias (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6...) protemas de interes diferentes poniendo en contacto dicha celula diana con varias microvesmulas de la divulgacion diferentes que comprenden dichas varias protemas de interes diferentes.

Por lo general, la puesta en contacto de dichas varias microvesmulas diferentes puede ser simultanea o secuencial.

A diferencia de la administracion genetica conseguida por multiples vectores virales, la administracion de protema con microvesmulas de acuerdo con la divulgacion es un metodo original para introducir rapidamente una funcion en una celula dirigida, sin implicacion de la maquinaria de transcripcion o cualquier proceso de integracion viral que limitan la transduccion en muchos tipos de celulas. Las microvesmulas de acuerdo con la divulgacion se podnan usar practicamente en cualquier tipo de celula incluyendo celulas de reposo o celulas totalmente diferenciadas.

A diferencia de las tecnicas de transferencia genetica clasicas tales como transfeccion genetica, el metodo de la

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divulgacion no depende de la transcripcion y la traduccion dentro de la celula diana, no altera el metabolismo celular. Por lo tanto, se cree que el metodo de acuerdo con la divulgacion no activa ninguna respuesta al interferon Y por lo tanto es un metodo mas espedfico para administrar una protema de interes a una celula diana.

Debido a las bajas cantidades de material administrado por las microvesmulas de acuerdo con la divulgacion y a su naturaleza no genetica, parece que las microvesmulas son utiles para aplicaciones en las que la presencia baja y transitoria de protemas puede conducir a efectos biologicos sorprendentes, es decir, a protemas que tienen una penetrancia biologica elevada.

La persona con experiencia en la materia se quedara rapidamente los pares apropiados de protemas de interes / celula diana, de acuerdo con cada objetivo espedfico. En lo sucesivo el presente documento se describen ejemplos no limitantes de aplicaciones de las celulas, microvesmulas y metodo de acuerdo con la divulgacion.

En un aspecto la divulgacion se refiere al uso in vitro de las microvesmulas de acuerdo con la divulgacion.

En un aspecto la divulgacion se refiere al uso in vivo de las microvesmulas de acuerdo con la divulgacion.

En un aspecto, la divulgacion se refiere al uso de una microvesmula de acuerdo con la divulgacion para aplicaciones no terapeuticas.

Por lo general, las microvesmulas de acuerdo con la divulgacion se pueden usar para introducir una protema de interes en una celula diana in vitro con el fin de estudiar el efecto fisiologico de dicha protema de interes. Existen muchas aplicaciones de la divulgacion posibles como herramientas para investigacion cientffica basica.

A modo de ejemplo, las celulas, microvesmulas, y metodo de acuerdo con la divulgacion se pueden usar con el fin de administrar cofactores espedficos necesarios para la induccion de sistemas de expresion inducibles. Por lo general las protemas de interes incluyen la Cre recombinasa (util para induccion del sistema cre/lox), el transactivador tTA (util para induccion del operador de tetraciclina). A menudo dichos cofactores son diffciles de introducir en celulas diana y es deseable controlar de forma precisa la cinetica de los sistemas inducibles controlando de forma precisa la administracion de la protema de interes.

Otro ejemplo es la administracion de una protema celular que regula la diferenciacion de la expansion celular o muerte, en un modelo celular in vitro. Por lo general, las celulas, microvesmulas y metodos de la divulgacion Se pueden usar para administrar un factor pro-apoptotico tal como Bax-2 y para identificar sistematicamente moleculas que modulan la apoptosis.

La divulgacion tambien se refiere a una microvesmula de acuerdo con la divulgacion para uso en terapia.

La divulgacion tambien se refiere a una microvesmula de acuerdo con la divulgacion para uso en la prevencion de rechazo de injerto.

Se ha mostrado que ciertas protemas de la superficie celular influyen en la capacidad migratoria o en el injerto de celulas madre hematopoyeticas (HSC). Por ejemplo, la administracion transitoria de CXCR4 puede ser util en terapia celular usando HSC como molecula de asentamiento con el fin de estimular el proceso del injerto. Podna ser deseable usar una transferencia genetica, que podna dar como resultado la transferencia de CXCR4 a todas las celulas descendientes. Por el contrario, el metodo de la divulgacion permite la transferencia de protemas transitoria y controlada solamente durante el tiempo necesario para que se produzca el injerto.

La divulgacion tambien se refiere a un metodo para inducir o potenciar la diferenciacion celular mediante la administracion de factores de transcripcion. En particular, las celulas y microvesmulas de la divulgacion se pueden usar para diferenciacion de megacariodtica, diferenciacion de celulas mieloides, diferenciacion de celulas linfoides, diferenciacion de NK, diferenciacion de astrocitos, maduracion de precursores oligodendrodticos, diferenciacion de celulas musculares, diferenciacion de queratinocitos, diferenciacion retiniana, diferenciacion de celulas eritroides, diferenciacion de adipocitos.

Otra posible aplicacion es la potenciacion de la infeccion viral mediante administracion de (co)receptores virales a celulas diana. Por ejemplo, las celulas y microvesmulas de la divulgacion se pueden usar para administrar receptores y correceptores del VHV, receptor del VHB, receptores del virus de la fiebre hemorragica, receptores y correceptores del VIH-1, y receptor del MLV-E.

En particular, la divulgacion se refiere a la administracion de un receptor, por ejemplo un receptor que hace que una celula sea transitoriamente permisiva para una partmula viral ecotropica.

A modo de ejemplo, las microvesmulas, celulas y metodo de la divulgacion se pueden usar para administrar un receptor ecotropico EcoR (tal como m-CAT1) a una celula diana con el fin de hacer que sea permisiva para un virus ecotropico. A continuacion cualquier gen de interes se puede administrar a la celula diana (que expresara el receptor

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ecotropico) a traves de una construccion viral ecotropica apropiada.

Como se usa en el presente documento, el termino "ecotropico" tiene su significado general en la tecnica. Un virus ecotropico es un retrovirus que se puede replicar solamente en el hospedador de la especie en la que se origina. De forma mas espedfica, la expresion "vivos ecotropico", como se usa en el presente documento, se refiere a un virus de roedor que solamente se puede replicar en una celula que expresa su receptor afm, el receptor eco tropico EcoR.

De forma ventajosa, dicho virus ecotropico es seguro para el manipulador ya que no puede infectar celulas humanas distintas a aquellas a las que se ha dirigido mediante una microvesmula que expresa el receptor viral ecotropico.

Por lo general, dicho virus ecotropico es un retrovirus basado en el virus Moloney y dicho receptor ecotropico es m- CAT1. Un ejemplo de un gen que codifica m-CAT1 se muestra en la secuencia de Referencia de NCBI con numero de registro en Genbank NM_007513.3.

Por consiguiente, la divulgacion se refiere a un metodo para administrar una protema de interes a una celula que comprende las etapas de:

- administrar un receptor viral ecotropico EcoR a una celula diana mediante una microvesmula que comprende una protema de fusion de la membrana viral, por ejemplo VSV-G y dicho receptor viral ecotropico EcoR; y,

- administrar una protema de interes a dicha celula diana mediante un virus ecotropico que comprende al menos un gen que codifica una protema de interes.

Ademas, las celulas y microvesmulas de la divulgacion pueden ser para potenciacion de la infeccion viral o produccion viral/vector mediante la administracion de protemas virales trans-activadas (incluyendo protemas del VHC, protemas del VHB, protemas del VIH-1/2 o protemas del VIS, protemas del virus de la fiebre hemorragica, protemas del virus de la gripe, protemas del EBV, protemas de SV40) para celulas que producen vivos.

Otra posible aplicacion es la administracion de un receptor que hace que una celula sea transitoriamente permisiva para una senal extracelular.

A modo de ejemplo, las microvesmulas, celulas y metodo de la divulgacion se pueden usar para introducir un TCR antiviral en linfocitos T como celulas diana, y para usar dichos linfocitos T por sus propiedades antitumorales (Cohen et al., Cancer Research, 2007, 67, 3898-3903; Johnson et al., J Immunol. 2006, 177, 6548-6559 y Zhao et al., J Immunol, 2005, 174, 4415-4423).

Por lo tanto, la divulgacion tambien se refiere a una microvesmula de acuerdo con la divulgacion para uso en el tratamiento de cancer.

En el campo de la vacunacion, como celulas de presentacion de antfgenos con el fin de estimular la respuesta inmunologica a menudo se usan celulas dendnticas (DC).

Sin embargo, las celulas dendnticas le existen como lmeas celulares y se deben obtener mediante cultivo primario.

La presente divulgacion proporciona las DC sustitutas que se pueden usar para fines de vacunacion. De hecho, el metodo de la divulgacion se puede usar para proporcionar lmeas de celulas productoras modificadas que producen microvesmulas que contienen MHC o factores de coestimulacion y/o antfgenos. Dichas microvesmulas se pueden usar con fines de vacunacion.

Las celulas, microvesmula sin metodos de la divulgacion tambien se pueden usar para administrar antfgenos espedficos para celulas de presentacion de antfgeno con el fin de estimular una respuesta inmunologica.

En lo sucesivo, la divulgacion se ilustrara por medio de los siguientes ejemplos y figuras.

Descripcion de las figuras

Figura 1: Incorporacion de YFP en microvesiculas portadoras de VSV-G

(A) Analisis de transferencia de Western de microvesmulas concentradas producidas por 293T-YFP transfectadas con pVSV-G (calle 1), pVSV-G V72 (calle 2), SwFlagEcoR (calle 3), SwFlagEcoR y pVSV-G (calle 4) y transfectadas de forma simulada (calle 5). Se realizaron inmunotinciones con los Mab dirigidos contra VSV-G (P5D4), la etiqueta Sigma (M2) que revela la version etiquetada de EcoR e YFP (GSN24).

(B) Analisis de FACS de celulas expuestas a las microvesiculas de las celulas que expresan VSV-G e YFP, en comparacion con celulas expuestas a microvesiculas de celulas que expresan YFP solo.

(C) Las celulas HEK se transfectaron con un plasmido codificante de la protema VSV-G de tipo silvestre (wt) o un

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mutante W72V con deficiencia de fusion (se sometieron a ensayo 2 clones de ADN). En el experimento tambien se incluyo una forma truncada de VSV-G sometida a delecion para su ectodominio. 48 h despues de la transfeccion, los sobrenadantes se cosecharon y las celulas se sometieron a lisis para un analisis de transferencia de Western. Todas las protemas estaban altamente expresadas en las celulas productoras. Sin embargo, en el sobrenadante solo se detecto el VSV-G de wt y no el mutante con deficiencia de fusion.

(D) Las celulas HEK se transfectaron como se ha mencionado anteriormente y se incubaron, 20 horas despues de la transfeccion, en un medio que contema 0,2 pg/ml de R18, un compuesto lipofilo fluorescente que se urna membranas, durante 6 horas. 72 horas despues de la transfeccion, los medios de los diferentes tipos celulares se recogieron, se aclararon y se analizaron con un fluorometro para cuantificar la cantidad de fluorescencia asociada a R18, lo que refleja la cantidad de membranas liberadas de sobrenadante. Los resultados se proporcionan como el valor de Rl8, normalizado por el numero de celulas vivas.

Figura 2: Analisis bioqmmico y funcional de microvesiculas revestidas con CD81/VSV-G

(A) Expresion de CD81 en celulas productoras 293T. Se uso un control isotfpico de IgG de raton (zona sombreada).

(B) Expresion de CD81 en celulas HepG2 expuestas a microvesiculas concentradas, una hora despues del tratamiento. Las celulas HepG2 no tratadas tambien se etiquetaron (control sombreado de color gris).

(C) Potenciacion de la transduccion de HCVpp en celulas HepG2 tratadas con diversas dosis de microvesiculas. Se produjeron YFO que codifican HCVpp en 293 celulas y se hizo una valoracion previa sobre celulas HUH 7.2 a 8x10e4 unidades de transduccion (UT) por ml. La figura proporciona las titulaciones de HepG2 que aumentan con la cantidad de microvesiculas a las que se han expuesto.

(D) Analisis de densidad de microvesiculas portadoras de CD81. Las microvesiculas se produjeron en celulas 293T cultivadas con cloruro de octadecilrrodamina B (R18), un fluoroforo que etiqueta lfpidos de membrana. Las microvesiculas concentradas se dejaron en un gradiente de iodixanol continuo y se centrifugaron 12 horas a 41000 rpm en un rotor SW41. A continuacion se recogieron 20 fracciones de 0,5 ml y 1/20 de cada fraccion se analizo mediante transferencia de Western en condiciones seminativas. Los inmunoetiquetados de VSV-G y CD81 se muestran para fracciones de 13 a 20 y estaban ausentes a partir de otras fracciones (no se muestra).

Figura 3: Caracterizacion de Gesfculas

(A) Florescencia asociada a la membrana infracciones recogidas despues de gradiente de iodixanol de densidad. Las gesfculas de VSV-G concentradas se dejaron en un gradiente de iodixanol continuo y se centrifugaron 3 horas. De la parte inferior del tubo se recogieron 20 fracciones de 500 pl, la fraccion 1 correspondiendo a una densidad de 1,46 y la fraccion 20 a una densidad de 1,07 tal como se indica. 1/5 de cada fraccion (100 pl) se peso y se transfirio a una placa de 96 pocillos antes de la analisis en un fluorometro. La figura proporciona los valores de emision a 590 nm despues de excitacion de R18 a 560 nm.

(B) Caracterizacion de Gesfculas portadoras de YFP y CD81

Panel de la parte superior: analisis de fluorescencia asociada a YFP en fracciones recogidas despues del gradiente de densidad. Las Gesfculas de VSV-G concentradas producidas en celulas positivas para YFP se dejaron en un gradiente de iodixanol continuo y se centrifugaron 3 horas. De la parte inferior del tubo se recogieron 20 fracciones de 500 pl, la fraccion 1 correspondiendo a una densidad de 1,3 y la fraccion 20 a una densidad de 1,09 tal como se indica. 1/5 de cada fraccion (en microlitros) se peso y se transfirio a una placa de 96 pocillos antes de la analisis en un fluorometro. La figura proporciona los valores de emision a 533 nm despues de excitacion de YFP a 495 nm.

Panel de la parte inferior: Analisis de pseudotransduccion de YFP en celulas humanas. 1/10 de cada fraccion se dejaron en 1x10e5 de celulas HEK cultivadas en una placa de 12 pocillos. 24 horas mas tarde, las celulas se analizaron por FACS. La figura indica la intensidad media de fluorescencia (MFI) de cada poblacion celular expuesta a las diferentes fracciones.

Figura 4: Administracion de EcoR en celulas humanas mediante Gesiculas portadoras de EcoR

(A) Representacion esquematica de plasmido que codifica mCAT-1 en el que pCMV representa el promotor de citomegalovirus humano temprano, USiT para un concatemero de tres secuencias repetidas dirigidas por un ARNsi universal, PA para la senal de poliadenilacion del VIS. El ARNm que se representa a continuacion esta equipado con la secuencia USiT, que hace que sea altamente sensible a la degradacion mediada por el ARNsi universal.

(B) Titulacion de vector lentiviral que codifica GFP pseudotipado con la envoltura Ecotropica de MLV en celulas 293T tratadas con Gesfculas de mCAT-1. Las celulas HEK 293T se trataron durante 1 hora a 37 °C con 2 pg

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(calle 1) o 4 |jg (calle 2) de Gesfculas concentradas. Despues de 2 lavados con PBS, las celulas se transdujeron con 100 jl de una preparacion de GFP lentivectores GFP pseudotipados con la envoltura Ecotropica de MLV (calles 1, 2 y 3) o con la envoltura del VSV-G (calle 4). Tris dfas despues de la transduccion, las celulas se analizaron por FACS y las titulaciones de la preparacion de lector se calcularon y se proporcionan como medio de 3 ensayos de transduccion diferentes.

Figura 5: analisis bioquimico y funcional de Gesiculas portadoras de mCAT-1

Las Gesfculas se prepararon despues de cotransfeccion de celulas HEK293T mediante VSV-G y una version etiquetada de mCAT-1, el receptor para la cepa ecotropica del virus de la leucemia murina. El medio celular se cambio 24 h despues y se recogio al d^a siguiente. Los sobrenadantes se aclararon antes de una ultracentrifugacion a 35000 rpm durante 1 h 30 en un rotor SW-41. El sedimento se volvio a suspender en PBS y se congelo antes del proceso de purificacion por densidad.

Centrifugacion zonal de tasa a traves de gradientes de iodixanol continuos: las vesfculas concentradas sin procesar se cubrieron en un gradiente Optiprep continuo (6 % de iodixanol en sacarosa 215 mM, EDTA 2 mM, 10 mM Tris HCl pH 8 / 56.4 % iodixanol en 5 mM sacarosa, 2 mM EDTA, Tris HCl 10 mM a pH 8) y se centrifugaron durante 12 horas a 41000 rpm en un rotor SW41. Las fracciones (0,5 ml) se recogieron de la parte inferior de los gradientes y se mantuvieron a 4 °C antes del analisis de transferencia de Western y el ensayo funcional. La densidad de las fracciones se midio pesando cuidadosamente 100 jl de cada fraccion.

La protema de las fracciones 12 a 20 se separo mediante SDS-PAGE usando geles de Bis-Tris NuPage al 4-12 % (Invitrogen) desarrollados en tampon MOPS. Se analizaron 5 jl de cada fraccion. Despues de electrotransferencia sobre una membrana de nitrocelulosa, las protemas se revelaron mediante un anticuerpo conjugado con peroxidasa dirigido contra VSV-G (P5D4 Sigma) diluido a 1/1000 o una anti-Flag conjugada con peroxidasa (Sigma) a 1/1000, ambos incubados una obra a temperatura ambiente.

Para evaluar la actividad biologica de las fracciones, se anadieron 30 jl de cada muestra a celulas 293T sembradas a 1x10e5 celulas por pocillo en una placa de 24 pocillos. Una hora mas tarde el medio se sustituyo por 200 jl de medio recien preparado suplementado con 200 jl de sobrenadante que contema lentivector codificante de GFP pseudotipado con la envoltura Ecotropica. 48 horas despues de la transduccion las celulas se sometieron a tripsina y los valores de fluorescencia (MFI) se analizaron por FACs.

Figura 6: Desaparicion de mCAT-1 transferido en celulas humanas tratadas con Gesicula

Las celulas HEK293T se expusieron a dosis de su saturacion de EcoR-Gesfculas durante 1 hora a 37 °C. Despues de dos lavados, las celulas se transdujeron con lentivectores de GFP pseudotipados con la envoltura Ecotropica 5 min, 12 horas, 24 horas o 45 horas despues de exposicion a Gesfcula. El mismo ensayo de transduccion se realizo en celulas 293T que expresan EcoR de forma estable para medir la disminucion progresiva de la titulacion del lentivector debido a la division de celula diana. Los resultados se proporcionan como el porcentaje de eficacia de transduccion con respecto al valor de transduccion obtenido en el momento 5 min (100 %). Todos los valores se corrigieron con respecto a la tasa de division celular.

Figura 7: La degradacion especifica del ARNm de EcoR no influye en la funcion de EcoR introducida por Gesiculas.

Validacidn funcional del si-mCAT.

Un ARNsi sintetico disenado contra mCAT-1 se transfecto en celulas humanas ademas de con un plasmido codificante de un mCAT-1 etiquetado. Las celulas si-mCAT y si-CTL se examinaron a continuacion para su expresion de mCAT y su permisividad a la transduccion con vectores lentivirales de control Ecotropico (EcoLV) (barras de color negro) y de control pantropico (gLV) (barras de color gris).

(A) Inmunotincion de mCAT-1 en celulas si-CTL y si-mCAT

(B) Ensayo de transduccion con lentivectores con GFP en celulas diana transfectadas con mCAT-1.

Los valores de transduccion se analizaron con FACS 72 horas despues de la transduccion y se establecieron en una eficacia de un 100 % para celulas si-CTL. Un 70 % de la transduccion de EcoLV se inhibe en celulas tratadas con si- mCAT mientras que la transduccion mediada por gLV casi se ve sin afectar (8 % de inhibicion).

La degradacion especifica del ARNm de mCAT en celulas diana apenas influye en la funcion de EcoR transferido por Gesiculas.

(C) Ensayo de transduccion con lentivectores Ecotropicos de GFP en celulas humanas tratadas con Gesiculas de mCAT. Las celulas tratadas con vesfculas de mCAT y portadoras de si-mCAT permanecen altamente

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permisivas con respecto a la transduccion de EcoLV (87 % del control). Esto indica que la funcion de EcoR esta proporcionada principalmente por la protema mCAT contenida en microvesmulas y no por el ARNm simultaneo ni por el ADN plasirndico.

Figura 8: Efecto de la cloroquina en transduccion lentiviral ecotropica en celulas modificadas con EcoR- Gesiculas.

Los vectores lentivirales que codifican YFP con la envoltura Ecotropica (Eco) se usaron para celulas HEK293T transductoras en las que la protema mCAT-1 se administro mediante Gesmulas de EcoR (EcoR-Ges) en presencia o ausencia de cloroquina (CQ), un farmaco que aumenta la pH endosomica (calle 3). Como un control, se usaron pseudotipos Ecotropicos para celulas 293T transductoras en las que la EcoR se expresa de forma estable (EcoR estable, calle 2). Para comprobar el efecto de CQ en la acidificacion endosomica, se usaron lentivectores de VSV-G para transducir celulas diana tratada solo con el farmaco, lo que ilustra la alta dependencia de pH de pseudotipos de VSV-G (calle 1) mientras que el pseudotipo ecotropico sigue siendo eficaz despues del tratamiento farmacologico. Los resultados se proporcionan como la eficacia de transduccion de YFP relativa en los diferentes tipos celulares tal como se mide con FACS 72 horas despues de la transduccion.

Figura 9: Administracion de tTa mediante Gesfculas

Para detectar la funcion de transcripcion de la protema de transactivacion de TET (tTAoff) los inventores crearan una lmea de celulas indicadoras que expresaban eGFP de forma estable bajo el control del operador TET. La transfeccion de tTA activo la expresion de eGFP en la lmea de celulas indicadoras (calle de tTA) en comparacion con celulas transfectar las de forma simulada. Las gesmulas producidas en celulas que sobreexpresan tTA y VSV-G (wt) o su montante V72 incompetente de fusion se concentraron y se dejaron en la lmea de celulas indicadoras a diferentes dosis. El aumento de la dosis de Gesmulas de tTA que alojan el VSV-G de wt dio como resultado un aumento de la expresion de GFP. Esta senal se pudo anular mediante la introduccion de Doxiciclina en el medio. Los resultados se proporcionan como MFI analizada por FACS 24 horas despues de la administracion de Gesmulas.

Figura 10: Eficacia de la transferencia de tTA mediada por Gesmula como una funcion del tiempo

La lmea de celulas indicadoras de HEK, Teo-GFP, se sembro en placas de 12 pocillos (1x10e5 celulas por pocillo) y se trataron con Gesmulas de tTA (50 |jg de total protein). El tiempo de exposicion vario de 5 minutos a 4 horas. Despues de la exposicion, el medio que contema vesmulas se descarto hoy las celulas se lavaron con PBS y se mantuvieron en cultivo para un analisis de GFP 24 horas mas tarde. La eficacia de la transferencia de tTA aumenta gradualmente con el tiempo de exposicion hasta 3 horas que es el tiempo optimo de exposicion.

Figura 11: La protema VSV-G potencia la liberacion de vesmulas y la liberacion de la protema de interes de celulas 293T

Liberacidn de proteins de membrana: el analisis WB de mCAT-1, una protema de dominio de multiples membranas incorporada en vesmulas producida con o sin VSV-G. El inmunoetiquetado de mCAT-1 en el sedimento de la vesmula muestra que la liberacion de mCAT-1 aumenta de forma radical cuando se introduce VSV-G en las celulas productoras.

Liberacion de proteins citoplasmatica: un analisis bioqmmico similar se realizo en diferentes lotes de preparaciones de vesmula, investigando la liberacion de la actina de la protema citoplasmatica. Los inventores observan que la VSV-G potencia ligeramente la liberacion de actina en comparacion con vesmulas simuladas.

Figura 12: Transferencia de protema mediada por gesicula en un experimento de cocultivo a traves de inserciones con un tamano de poro de 3 jm

Los inventores cultivaron, en el mismo medio, celulas transfectadas con diversas combinaciones de plasmidos con la lmea de celulas indicadoras de Teo-GFP indicador. Las celulas se con un filtro con un tamano de poro de 3 jm tal como se representa, las celulas productoras en la parte inferior de una placa de 6 pocillos y la lmea de celulas indicadoras en la insercion de la parte superior. Las celulas productoras se cotransfectaron con un plasmido de expresion de tTA ademas de con un ADN vehmulo, el plasmido que codifica VSV-G o una protema VSV-G con deficiencia de fusion. Despues de 48 horas de cocultivo, las inserciones se retiraron y la lmea de celulas indicadoras se sometio a tripsina y se analizo con FACS para evaluar la administracion de tTA. Los resultados se proporcionan como la MFI en la lmea de celulas Teo-GFP.

Figura 13: Caracterizacion de microvesiculas obtenidas a partir de celulas de insecto

Las microvesmulas de GFP se produjeron infectando celulas Sf9 durante 72 horas con baculovirus recombinante. Despues de concentracion, se dejaron en un gradiente de iodixanol y se centrifugaron durante 10 h a 215000 g para permitir la sedimentacion de vesmulas de acuerdo con su densidad. Las fracciones se recogieron de la parte inferior del tubo y su densidad se midio mediante pesada.

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El gradiente de densidad se puede observar en el grafico A, que vana de d = 1,3 a d = 1,05. Todas las fracciones se analizaron con un fluorometro para detectar GFP (Exc 485 Em 515), esencialmente detectado en la fraccion 21 (A, barras de color blanco). Las diluciones de las fracciones tambien se usaron para infectar celulas sf9 para identificar cuando sedimentaba el baculovirus. Tres dfas despues la infeccion, las celulas sf9 se analizaron por FACS y se hizo la titulacion del Baculovirus. Los resultados que se proporcionan en A (barras de color negro) indico que el virus habfa sedimentado.

(B) La capacidad de transferencia de GFP de cada fraccion se analizo. Estaba contenida en las fracciones 14 a 19, solapando parcialmente las fracciones que conteman el virus.

Figura 14: Ensayo de neutralizacion (NA) de microvesiculas de insecto tTa

Las microvesmulas de tTA se produjeron en celulas High5 infectadas con un baculovirus de tTA. Las vesmulas se concentraron y se volvieron a suspender en PBS y se diluyeron 10 veces para el ensayo realizado en 100 pl de PBS. SE incubaron 0,5 eq de tTA Fosfolfp 2 h a 37 °C con dilucion es en serie de anticuerpo anti gp64 (clon AcV1) o anticuerpo de control (GST). A continuacion las vesmulas se dejaron en una celula indicadora de tTA de HEK (que expresa GFP una vez que tTA se introduce en la celula). 24 horas mas tarde, las celulas expuestas a vesmulas se analizaron por FACS y la expresion de GFP se cuantifico. Los resultados se proporcionan como la MFI de la poblacion global.

Figura 15: Respuesta a la dosis usando microvesiculas de tTA

Las vesmulas de insecto tTA se concentraron y se purificaron como se ha descrito anteriormente se almacenaron a - 80 °C. El aumento de las dosis de las vesmulas se uso para administrar tTA en una lmea de celulas indicadoras de tTA de HEK, dando como resultado un aumento de la senal de GFP detectada en celulas diana 24 horas despues de las vesmulas. Las celulas tratadas con doxiciclina mostraron fluorescencia de fondo, lo que refleja la inducibilidad esperada del sistema TET.

Figura 16: La transferencia de tTA en celulas humanas se consigue con microvesiculas obtenidas a partir de celulas de insecto y no mediante baculovirus codificantes

(A) Construcciones de baculovirus

(B) Expresion de GFP de tTA dirigida por promotor en la lmea de celulas indicadoras de tTA

(C) Liberacion de GP64 y tTA en Gesmulas

(D) Expresion de GFP en la lmea de celulas indicadoras de tTA despues de tratamiento con microvesiculas purificadas con pH o CMV.

Ejemplos

Ejemplo 1

Resumen

El presente ejemplo describe la modificacion por ingeniena de vesmulas de tipo exosoma revestidas con la glicoprotema G del Virus de la Estomatitis Vesicular (VSV-G) y usadas para administrar protemas exogenas en celulas diana humanas. Estas partmulas sedimentan a una densidad de 1,1 g/ml y pueden empaquetar de forma eficaz protemas de la membrana citoplasmatica y de membrana asf como factores de transcripcion. Las moleculas a modo de modelo que incluyen la protema mCAT-1 de membrana y el transactivador de tet se administran de forma eficaz en celulas diana humanas despues de tratamiento con microvesiculas. La pseudotransduccion mediada por vesmulas condujo a la expresion de protema transitoria y no se debio a la transferencia de ARNm o ADN. Los inventores mostraron que la cloroquina, un farmaco que aumenta la pH endosomica, invalidaba la transferencia de protema lo que indica que la fusion inducida por VSV-G estaba implicada en el mecanismo de administracion.

La envoltura fusogenica de VSV-G es un determinante fundamental de la pseudotransduccion

Los inventores sometieron a ensayo y la expresion de VSV-G podna conducir a la produccion de partmulas capaces de pseudotransduccion. Las celulas HEK-293T que expresan YFP (293T-Y) de forma estable se transfectaron con pVSV-G, un vector de expresion eucariota. Los sobrenadantes se recogieron dos dfas mas tarde, se filtraron y se concentraron mediante ultracentrifugacion. Como un control, s el mismo proceso se aplico a sobrenadantes de celulas 293T-Y transfectadas de forma simulada. Las dos preparaciones concentradas se anadieron en celulas 293T sin tratamiento previo, que se lavaron despues de una hora de exposicion. 24 horas mas tarde, las celulas se sometieron a tripsina y se analizaron por FACS para medir la fluorescencia en las dos poblaciones. Los inventores fueron capaces de observar pseudotransduccion de YFP en celulas expuestas a la preparacion de VSV-G y no en

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celulas expuestas a la preparacion de control (figura 1-B). El analisis bioqmmico de las dos muestras desvelo que sedimentaban cantidades elevadas de YFP en la preparacion de VSV-G (figura 1-A calle 1) mientras que YFP era casi indetectable en la preparacion transfectada de forma simulada (calle 5). Estos datos indican que VSV-G es responsable de la liberacion intensa de pardculas que se pueden sedimentar que contienen componentes del citoplasma de celulas productoras. Ademas, parece que estas partfculas son capaces de administrar este material en celulas diana. Como las celulas se lavaron despues del tratamiento con partmulas y se cultivaron durante 24 horas antes del cargamento con tripsina y analisis, los inventores supusieron que la senal de YFP es intracelular y no es debida a las partfculas adsorbidas fluorescentes en la superficie de las celulas. Estas microvesmulas de VSV- G se denominaran Gesmulas a traves del ejemplo 1.

Observaciones adicionales: un mutante de aminoacido individual de VSVG incapaz de desencadenar fusion (VSVG V72) 14 se sometio a ensayo en este sistema y no se incorporo en el granulo sedimentado (figura 1 calle 2). Otro experimento de transferencia de Western indico que este mutante se expresaba en celulas productoras pero no detectables en el sobrenadante, a diferencia del wt-VSV-G detectable tanto en celulas como en sobrenadante (Figura 1C). Esto demuestra que la produccion de microvesmulas de VSV-G requiere una forma competente de fusion de VSV-G en la celula productora.

Pseudotransduccion de la proteina tetraspanina CD81

La transferencia de celula a celula de una proteina citoplasmatica tal como YFP mediante una preparacion concentrada apoya la idea de que las celulas 293T-Y han producido vesmulas portadoras de YFP rodeadas por una capa lipfdica y posiblemente revestidas con otras protemas de celulas 293T similares a las protemas de membrana. Para someter a ensayo esta hipotesis, los inventores prepararon un nuevo lote de Gesmulas mediante transfeccion de celulas 293T celulas con VSV-G y usaron esta preparacion concentrada para investigar la transferencia de la proteina CD81, una proteina tetraspanina caractenstica de exosomas y expresada abundantemente en celulas 293T (figura 2 A). El material resultante se aplico en celulas HepG2, una lmea de celulas de Idgado humano que carecen de CD81. Los inventores mostraron que las celulas HepG2 expuestas a Gesmulas durante una hora se teman de forma positiva despues de un inmunoetiquetado de CD81, lo que indica que la proteina se transfirio desde la celula productora a la celula diana (figura 2. B).

Se sabe que la introduccion de CD81 exogeno en HepG2 permite la transduccion de esta lmea celular por vectores retrovirales pseudotipados con la envoltura del VHC (HCVpp) (Zhang. et al., Journal of virology 78, 1448-1455 (2004)). De hecho CD81 se describe como uno de los receptores del VHC reconocidos por la glicoprotema E2. Por lo tanto para validar adicionalmente la transferencia de CD81, los inventores expusieron las celulas HepG2 a diversas dosis de Gesmulas y comprobaron su permisividad a la transduccion mediada por HCVpp en comparacion con celulas HepG2 sin tratamiento previo. Los inventores mostraron que la permisividad de HepG2 con respecto a la transduccion de HCVpp aumenta con la cantidad de Gesmulas introducidas en celulas (figura 2.C), lo que aumenta la titulacion de HCVpp hasta 5 veces en este experimento. Esto muestra que la proteina CD81 transferida retiene su capacidad de union al VHC incluso despues de transporte y transferencia a traves de Gesmulas.

Caracterizacion de las Gesfculas portadoras de YFP y CD81

Para caracterizar mejor el material responsable de la transferencia de proteina, se produjeron Gesmulas despues de la transfeccion de VSV-G en celulas humanas cultivadas con cloruro de octadecil rodamina B (R18), un fluoroforo lipofilo que etiqueta las membranas. Despues de una primera etapa de concentracion, las R18-Gesmulas se dejaron en un gradiente de iodixanol continuo y se centrifugaron 3 horas para permitir la separacion de fracciones de acuerdo con su densidad. Todas las fracciones de 1 a 20 recogidas se analizaron para su capacidad al emitir fluorescencia a 590 nm despues de excitacion a 560 nm, los valores de emision y excitacion para R18. Como se muestra en la figura 3A, la fluorescencia de R18 se detectan las fracciones 13 a 20 con un pico en la fraccion 17 que corresponde a una densidad de 1,11 g/ml.

En otro experimento, las Gesmulas producidas en celulas 293T-Y se procesaron del mismo modo que se dejaron en un gradiente antes del analisis de fluorescencia asociada a YFP en las diferentes fracciones recogidas. La Figura 3B indica que YFP se detectaba principalmente en las fracciones 17 y 18 que corresponden a densidades de 1,101,11. A continuacion los inventores examinaron la fraccion que era capaz de administrar YFP mediante pseudotransduccion. 1/10 de cada muestra se aplico en celulas 293T y las transferencias de fluorescencia se analizaron por FACS 24 horas mas tarde. Como se muestra en la figura 3, el determinante de la pseudotransduccion se sedimento esencialmente en la fraccion 17 (d = 1,11). En otro experimento, las Gesmulas se separaron y se analizaron mediante transferencia Western. El analisis de las fracciones de densidad desvelo que VSV-G y CD81 estaban claramente enriquecidas en las fracciones 17:18 que corresponden a densidades de 1,10 y 1,11 g/ml (figura 2 D). Como la molecula de CD81 se describe como un marcador para exosomas (Lamparski et al., Journal of immunological methods 270, 211-226 (2002)) los inventores pueden concluir que las Gesmulas que portan VSV-G son un tipo particular de vesmulas de tipo exosoma.

Combinados, los hallazgos de los inventores indican que, despues de la transfeccion de VSV-G, las celulas HEK 293T produdan Gesmulas rodeadas por membrana sedimentables a una densidad de 1,10-1,11 g/ml y que estas

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microvesmulas similares a exosomas contienen protemas tales como CD81 de las celulas productoras que se pueden administrar en celulas diana.

Transferencia de mCAT-1 mediada por gesiculas en celulas humanas.

De la misma manera que YFP o CD81 altamente expresadas se empaquetan en Gesmulas producidas por celulas 293T-Y/293T, los inventores sometieron a ensayo si cualquier protema sobreexpresada en la celula productora se podna incorporar de forma pasiva en Gesmulas emergentes y si se podnan administrar bajas cantidades de este material empaquetado en celulas diana humanas. Esta nocion se sometio a ensayo usando la protema mCAT-1 como un modelo, el transportador de aminoacido cationico de murino como el receptor para la envoltura Ecotropica EcoRI del virus de la leucemia murina (MLV). Un plasmido que codifica una version etiquetada de m CAT-1 se construyo (SwFlag EcoR representado en la figura 4) y se cotransfecto con VSV-G en celulas 293T-Y para producir Gesmulas concentradas portadoras de EcoR introducidas posteriormente en celulas humanas. Despues de una hora, las celulas expuestas se lavaron y se tineron de forma positiva para expresion de EcoR como se desvela mediante un analisis de FACS usando un anticuerpo anti Flag-FITC (no se muestra). Para validar adicionalmente la transferencia de mCAT-1, los inventores desarrollaron un ensayo de transduccion basado en lentivectores que codifican YFP pseudotipado con la envoltura Ecotropica de MLV. Debido al tropismo particular de esta glicoprotema, estos lentivectores pueden translucir de forma exclusiva celulas de murino/rata o celulas humanas en las que mCAT- 1 se expresa despues de la transfeccion. Si las Gesmulas de EcoR administran EcoR de forma eficaz en celulas humanas, estas debenan llegar a ser permisivas para una lentitransduccion de YFP Ecotropico.

Los resultados que se muestran en la figura 4 proporcionaron las titulaciones de una preparacion de lentivector Ecotropico despues de valoracion en celulas humanas tratadas o no con Gesmulas de EcoR. Aunque las celulas se limitan a transduccion con un lentivector Ecotropico (calle 3), las celulas tratadas con 2 |jg (calle 1) o 4 |jg (calle 2) de Gesmulas concentradas llegan a ser altamente permisivas a la transduccion Ecotropica. Para evitar la incorporacion de Gesmulas-protema G en lentivectores Ecotropicos en el medio de transduccion, las celulas tratadas con Gesmulas se lavaron dos veces antes de la transduccion.

La preparacion de Gesmulas de EcoR se dejo en un gradiente de densidad como se ha descrito anteriormente para identificar la fraccion responsable de la transferencia de mCAT-1. Las fracciones recogidas se analizaron mediante transferencia de Western y para su capacidad para mediar la transferencia de EcoR (Figura 5). En este experimento, los inventores muestran que la fraccion 17 que corresponde a una densidad de 1,10 esta altamente enriquecida en VSV-G y mCAT-1 y es la fraccion principal responsable de la transferencia de EcoR como se desvela mediante un ensayo de transduccion. Estos datos indican que las Gesmulas de EcoR que sedimentan a una densidad de 1,10 transfirieron la protema mCAT-1 en la membrana de celulas diana en las que se retiene su propiedad de union para la envoltura ecotropica.

Ademas, en el presente documento los inventores muestran que el contenido de Gesmula, y en particular la naturaleza de las protemas trasmitidas por la membrana de las Gesmulas se puede encontrar facilmente mediante transfeccion de celulas productoras.

Mecanica de administracion de EcoR por Gesiculas

Periodo de duration del mCA T-1 transferido

A continuacion los inventores examinaron el periodo de duracion del mCAT-1 transferido en celulas humanas variando el retraso entre la exposicion de Gesmulas y el ensayo de transduccion. Los resultados que se muestran en la figura 6 indican que la funcion del receptor Eco desaparecio de la superficie de las celulas 293T aproximadamente 50 horas despues de su transferencia mediada por Gesmula. Este excremento se reprodujo en diferentes tipos de celulas humanas incluyendo celulas Hela, HUH.7 (no se muestra) sin modificacion de la semivida del mCAT-1 transferido cerca de 24 horas. Esta corta duracion dar comodidad a la nocion de las protemas de administracion de Gesmulas y no ADN plasirndico que podnan contaminar la preparacion de Gesmulas. De hecho la codificacion de mCAT-1 por ADN plasirndico podna necesitar una transcripcion y una etapa de traduccion en las celulas diana, conduciendo a un maximo de expresion 48 h despues de su introduccion tal como se observa normalmente para experimentos de transfeccion.

La funcion de EcoR se proporciona mediante protemas recien preparadas incorporadas en Gesiculas.

Para investigar la naturaleza del material transferido con las vesmulas de mCAT-1, los inventores trataron celulas diana humanas con ARNsi dirigido contra el ARNm mCAT-1. Si las vesmulas administran ARNm o ADN que lo codifica, se podna degradar rapidamente en celulas tratadas con si-mCAT.

Tal como se desvela con una inmunotincion de mCAT-1 (Figura 7A), el ARNsi de mCAT-1 suprimio la expresion de mCAT despues de un experimento de cotransfeccion en celulas HEK. Ademas como la introduccion de este ARNsi especifico en celulas transfectadas con un plasmido mCAT-1 disminuyo fuertemente la capacidad de las celulas para ser transducidas con lentivectores ecotropicos (Figura 7B). Aunque los lentivectores pseudotipados de VSV-G

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(gLV) transdujeron de forma eficaz celulas tanto si-CTL como si-mCAT, la eficacia de transduccion conseguida con lentivectores ecotropicos (EcoLV) se inhibio en celulas si-mCAT (70 % de inhibicion). Estos datos indican que el si- mCAT influye de forma espedfica en la funcion del receptor mCAT-1 cuando este esta codificado por un plasmido.

A continuacion los inventores examinaron si el ARNsi de mCAT influya en la funcion del receptor administrado por microvesmulas de mCAT-1. Las celulas se transfectaron con los ARNsi de mCAT y de control y se trataron con vesmulas de mCAT-1 48 horas mas tarde. A continuacion se realizo un ensayo de transduccion con EcoLV para comprobar la funcion del receptor (Figura 7C). Tanto las celulas si-CTL como las celulas si-mCAT se transdujeron de forma eficaz con EcoLV, lo que indica que el si-mCAT fracasaba en gran medida en la supresion de la accion del receptor administrado por las vesmulas. Esto indica que las microvesmulas administraban esencialmente la funcion del receptor mediante transferencia de protemas recien preparadas y no de ARNm o ADN de plasmido contaminante.

La administracion de EcoR mediada por Gesicula depende de pH

Dado que la protema EcoR transferida es funcional como un receptor viral, esta implica su presencia en la superficie de la celula diana. Sin embargo, debido a la naturaleza de la envoltura de VSV-G, se espera que la fusion entre Gesmulas y membrana celular se produzca en los compartimentos acidos internos, liberando la protema EcoR dentro de la celula y no en la superficie en la que es funcional.

Para aumentar los conocimientos en el mecanismo de la transferencia de EcoR, los inventores trataron celulas diana 239T con cloroquina (CQ) antes del tratamiento con Gesmulas, un metodo que aumenta la pH endosomica y que se sabe que interrumpe la fusion de la membrana desencadenada por VSV-G. Como se muestra en la figura 8, los lentivectores pseudotipados para VSV-G son incapaces de transducir celulas tratadas con CQ (calle 1) mientras que los lentivectores Ecotropicos siguen siendo eficaces cuando se usan en 293T tratadas con farmacos que expresan mCAT-1 de forma constitutiva (calle 2). Estos datos ilustran la dependencia de pH. De forma interesante los investigadores muestran que CQ inhibe fuertemente la administracion de EcoR por gesmulas (calle 3). Dado que la transduccion con lentivectores indicadores ecotropicos no disminuye con CQ, este resultado refleja una insuficiencia mediada por CQ en el mecanismo celular que administra EcoR en la superficie.

Teniendo en cuenta estos datos, los inventores proponen un modelo en el que las Gesmulas despues de su internalizacion en la celula diana se transportan en los compartimentos endosomicos en los que la fusion de membranas se requiere para liberacion de EcoR. Las protemas, despues del destino de muchos receptores endogenos, se podnan reciclar posteriormente hacia la membrana celular.

Administracion del transactivador TET mediada por gesfculas

Ademas de la administracion de protemas citoplasmaticas y de membrana, los inventores exploraron la capacidad de las Gesmulas para empaquetar y administrar factores de transcripcion, protemas expresadas clasicamente en el nucleo. Con este fin se produjeron Gesmulas en celulas 293T cotransfectadas con un plasmido que codifica el transactivador TEToff (desactivado) (tTA), un factor de transcripcion sintetico que activan la transcripcion de su promotor afm, el operador Tet (TEO) y que se puede desactivar mediante introduccion de tetraciclina/doxiciclina en el medio de cultivo celular (Gossen et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 89, 5547-5551 (1992)). A continuacion las dosis crecientes de gesmulas cargadas con tTA se dejaron en celulas indicadoras que albergan un casete de expresion formado por el gen eGFP bajo el control del operador Tet. Los resultados que se muestran en la figura 9 indicar que la fluorescencia de la lmea celular indicadora se activa con Gesmulas de tTA 24 horas despues del tratamiento. La senal de fluorescencia aumenta con las dosis de gesmula y alcanzar la dosis mas elevada de aproximadamente un 50 % de la senal obtenida en una celula indicadora transfectada con una construccion de tTA. Los inventores observan que la activacion de la transcripcion en las celulas tratadas permanece sensible al tratamiento con Doxiciclina. Esto indica que la protema transactivadora tet se ha empaquetado de forma satisfactoria en Gesmulas y transferido una lmea celular indicadora.

Eficacia de la transferencia de tTA mediada por Gesicula como una funcion del tiempo de exposicion

La lmea de celulas indicadoras HEK, Teo-GFP, se sembro en placas de 12 pocillos (105 celulas) y se trataron con gesmulas de tTA (50 |jg de protema total por pocillo). El tiempo de exposicion vario de 5 minutos a 4 horas. Despues de la exposicion, el medio que contema vesmulas se descarto; las celulas se lavaron con PBS y se mantuvieron en cultivo para un analisis de GFP 24 horas mas tarde. La eficacia de la transferencia de tTA aumenta gradualmente con el tiempo de exposicion hasta 3 horas que es el tiempo de exposicion optimo (vease la Figura 10).

Metodos de produccion y dosificacion de gesiculas

Produccion y dosificacidn de EcoR-gesfculas

Las gesmulas humanas se produjeron mediante transfeccion de celulas HEK 293T usando el metodo de fosfato calcico. Las celulas se sembraron a 3 x 106 celulas en placas de 10 cm y se cotransfectaron con 15 jg de un

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plasmido codificante de VSV-G y 15 |jg del plasmido codificante de mCAT-1 por placa. El medio de transfeccion se reemplazo 24 h mas tarde por medio recien preparado que contema ATP (100 jM) y el sobrenadante que contema vesmulas se recogio 48 horas y 72 horas despues de la transfeccion, se convino, se filtro a traves de un filtro de 0,45 jm, y se ultracentrifugo durante 1 h 30 en un rotor SW41 a 25000 rpm (110000 g). Como alternativa la concentracion se puede realizar a 4500 g durante 10 horas. Por ultimo el material granulado se volvio a suspender en PBS cedio dando como resultado una concentracion de 200 veces.

Se realizaron grandes preparaciones usando seis placas de 10 cm y se generaron aproximadamente 400 jl de 200X vesmulas.

Se produjeron vesmulas portadoras de YFP/CD81 mediante transfeccion de 15 jg de plasmido VSV-G en celulas HEK-293T transducidas previamente mediante un lentivector de expresion de YFP.

Para cuantificar la cantidad de protemas en microvesmulas sedimentadas, los inventores desarrollaron un ensayo de ELISA que detectaba la protema mCAT-1 etiquetada. En resumen, las diluciones en serie de vesmulas se sometieron a lisis en PBS/Triton X100 a un 2 % y se revistieron durante una noche en una placa de 96 pocillos (NUNC.Maxisorp) en un tampon de revestimiento de carbonato (pH 9,6). Las diluciones en serie del peptido flag (Sigma) se revistieron en paralelo en un tampon sin Triton. Las protemas y el peptido se desvelaron despues de 1 h de incubacion de la placa lavada con un anticuerpo anti-Flag-HRP diluido a 1/1000 (M2 Sigma) y una revelacion final con el sustrato de TMB. Estos ensayos permitieron a los inventores dosificar la cantidad de protema marcada en la preparacion de vesmula.

Como alternativa, los inventores modificaron mediante ingeniena un ensayo de Elisa de VSV-G mediante el revestimiento de diluciones en serie del peptido de VSV-G reconocido por el anticuerpo anti-VSVG acoplado con HRP (P5D4. Sigma). Por lo tanto todas las vesmulas de VSV-G se pueden expresar como una masa equivalente de peptido de VSV-G por microlitro de la preparacion de vesmulas.

Discusion

Aqu los inventores desarrollaron una forma original y sencilla para transferir protemas citoplasmaticas y de membrana en celulas humanas mediante el uso de vesmulas de tipo exosoma modificadas mediante ingeniena. Esta tecnologfa de administracion de protema mediada por Gesmulas se uso adicionalmente para introducir un factor de transcripcion funcional en celulas humanas. La produccion de estas microvesmulas se consiguio mediante sobreexpresion de la protema de interes en celulas productoras de 293T cotransfectadas con VSV-G. Parece que VSV-G estimula la produccion de vesmulas a partir de celulas 293T tal como se revela con el analisis de sobrenadantes enriquecidos protemas de membrana asf como lfpidos de membrana y actina (Figura 11). Ademas, revistiendo las membranas de las microvesmulas, la protema G fusogenica aumenta su capacidad de ponerse en contacto con las celulas diana y permite una fusion muy eficaz entre partmulas y membranas celulares, un requisito previo para la liberacion del contenido de la microvesmula en las celulas diana.

Ejemplo 2

Transferencia de protema mediada por vesmula en un experimento de cocultivo a traves de inserciones de tamano de poro de 3 jm.

Los inventores cultivaron, en el mismo medio, celulas HEK transfectadas mediante diversas combinaciones de plasmido, junto con la lmea de celulas indicadoras Teo-GFP. Las celulas se separaron con un filtro con un tamano de poro de 3 jm tal como se representa, las celulas productoras en la parte inferior de una placa de 6 pocillos y en la lmea celular indicadora en la insercion de la parte superior. Las celulas productoras se cotransfectaron con un plasmido de expresion de tTA ademas de con un ADN vehmulo, el plasmido codificante de VSV-G o un VSV-G con defecto de fusion. Despues de 48 horas de cocultivo, las inserciones se retiraron y la lmea de celulas indicadoras se sometio a tripsina y se analizo mediante FACS para evaluar la administracion de tTA. Los resultados se proporcionan como la MFI en la lmea de celulas Teo-GFP (Figura 12).

Esta tecnica permite la administracion de protemas en celulas diana, sin la necesidad de una etapa de concentracion. Las vesmulas concentradas pueden ser toxicas dependiendo del tipo de celula diana. Las celulas diana se pueden cultivar en la las de la parte superior o de la parte inferior y se infunden varios dfas con celulas productoras de vesmulas para una administracion de protema constante. Las infusiones sucesivas se pueden realizar incluso si se tienen que introducir varios factores secuencialmente mediante transferencia facil de la insercion en otro bano que contiene vesmulas.

Ejemplo 3

Produccion y dosificacion de microvesiculas de celulas de insecto

La produccion de baculovirus se realizo usando el sistema de expresion de Baculovirus Bac-to-Bac (Invitrogen) de

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acuerdo con las instrucciones del fabricante. En resumen, los ADNc de interes se exploraron en la lanzadera pFAST-1 antes de recombinacion en bacterias DH10-BAC. Los ADN de Baculovirus se usaron a continuacion para transfectar celulas SF-9 para generar la primera reserva de baculo recogida 72 horas despues (pase 1). Esta reserva policlonal se amplifico adicionalmente para alcanzar una titulacion de 1 x 107 pfu/ml (pase 2) que se almaceno a 4 °C y se uso produccion de vesfculas.

Las microvesfculas de celulas de insecto se produjeron despues de infeccion con baculovirus (MOI 0,5-1) de 200 x 106 celulas HIGH5 cultivadas en suspension a 30 °C con agitacion en 100 ml de medio Express-five SFM suplementado con Glutamina (20 mM) y Penicilina-Estreptomicina (25 U de penicilina, 25 |jg de Estreptomicina/ml). 48 horas despues de la inoculacion, el medio se cosecho, se aclaro y se filtro dos veces a traves de un filtro con un tamano de poro de 0,45 jm antes de ultracentrifugacion en un rotor SW-32 a 24000 rpm (100.000 g). A continuacion el material sedimentado se volvio a suspender en PBS fno (100X de concentracion) y se almaceno a -80 °C.

Para una mejor purificacion, esta preparacion turbia se dejo en un gradiente de iodixanol discontinuo para permitir la separacion de fracciones de densidad discreta. El analisis biologico de las fracciones desvelo que las vesfculas activas eran capaces de transferir protemas albergadas sedimentadas a una densidad entre 1,09-1,11. Se prepararon vesfculas altamente purificadas despues de combinacion de estas fracciones y despues de una ultima etapa de concentracion de la combinacion suplementada con PBS fno (1 h a 30000 rpm en SW41).

Las vesfculas obtenidas a partir de celulas de insectos se cuantificaron con el kit de deteccion de PAP50 fosfolipfdico-enzimatico (Biomerieux) y con el ELISA de VSV-G que se ha descrito anteriormente.

Caracterizacion de microvesiculas obtenidas a partir de celulas de insecto

Las microvesiculas de GFP se produjeron como se ha descrito despues de la infeccion de celulas sf9 celulas durante 72 h con un baculovirus recombinante. Despues de concentracion, las vesfculas se dejaron en un gradiente de iodixanol y se centrifugaron a 215000 g durante 10 h para permitir sedimentacion de las vesfculas de acuerdo con su densidad. A continuacion las fracciones se recogieron desde la parte inferior del tubo y su densidad se midio mediante pesada. El gradiente de densidad se puede observar en el grafico de la Figura 13 A, que vana de d = 1,3 a 1,05. Todas las fracciones se analizaron mediante un fluorometro para detectar GFP (Exc 485 Em 515) esencialmente detectado en la fraccion 21 (barras de color blanco en la Figura 13 A). Las diluciones de las fracciones tambien se usaron para infectar celulas sf9 para identificar cuando sedimentaba el Baculovirus de GFP. Tris dfas despues de la infeccion, las celulas sf9 se analizaron mediante FACS y la titulacion de Baculovirus se calculo. Los resultados que se proporcionan en A (barras de color negro) indicaron que el virus sedimento entre la fraccion 13 y la fraccion 20 con un maximo para la fraccion 16. Los inventores tambien usaron las fracciones para administrar GFP en celulas humanas y para analizar la transferencia de fluorescencia 24 h despues (Figura 13 B). De forma interesante, los inventores encontraron que la capacidad de transferencia de GFP estaba contenida en las fracciones 14 a 19, solapando en parte las fracciones que conteman el virus.

Ensayo de neutralizacion (NA) de microvesiculas de insecto tTA.

Las microvesiculas de tTA se produjeron en celulas High5 infectadas con un baculovirus de tTA. Las vesfculas se concentraron y se volvieron a suspender en PBS y se diluyeron 10 veces para el ensayo realizado en 100 jl de PBS. Se incubaron 0,5 eq de Fosfolfp tTA durante 2 horas a 37 °C con diluciones en serie de anticuerpo anti gp64 (clon AcV1) o anticuerpo de control. A continuacion las vesfculas se dejaron en una celula indicadora de tTA de HEK (que expresa GFP una vez que tTA se introduce en la celula). 24 horas mas tarde, las celulas expuestas a vesfculas se analizaron con FACS y la expresion de GFP se cuantifico. Los resultados (vease la Figura 14) se proporcionan como la MFI de la poblacion global.

Respuesta a la dosis usando microvesiculas de insecto tTA.

Las microvesiculas de insecto tTA se concentraron y se purificaron como se ha descrito anteriormente y se almacenaron a -80 °C. El aumento de las dosis de las vesfculas se uso para administrar tTA en una lmea de celulas indicadoras de tTA de HEK, dando como resultado un aumento de la senal de GFP detectada en celulas diana 24 horas despues de las vesfculas. Las celulas tratadas con doxiciclina mostraron fondo de fluorescencia, lo que refleja la capacidad induccion esperada del sistema TET (vease la Figura 15).

Discusion

Los inventores han encontrado que la produccion de vesfculas obtenidas a partir de celulas humanas se consiguio despues de cotransfeccion de celulas productoras con el plasmido codificante de VSV-G y otro plasmido que codifica la protema de interes (YFP, mCAT-1, tTA...). Para aumentar el rendimiento del sistema de produccion, los inventores construyeron baculovirus recombinantes que codifican VSV-G y tTA y celulas de insecto infectadas altamente permisivas con respecto a infeccion por baculovirus. Ademas las celulas High5 y las celulas SF9 se pueden cultivar facilmente en suspension hasta 2 x 106/ml sin suero o incluso en medios sinteticos desprovistos de producto animal. En particular, los baculovirus no se replican en celulas humanas y la expresion que conduce al promotor de polihedrina del transgen es espedfica de celula de insecto y no es activa en celulas humanas.

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Los inventores encontraron que despues de la coinfeccion con tTA y VSVG, las celulas de insecto produjeron microvesmulas capaces de transferir tTA en celulas humanas. Los inventores tambien encontraron que VSV-G era util pero prescindible en este proceso, lo que sugiere que otra protema de fusion no podna sustituir. Este papel podna ser asumido por gp64, la glicoprotema de envoltura de Baculovirus que se expresan todas las celulas infectadas. Realizando un ensayo de neutralizacion, los inventores han mostrado que la administracion de la protema mediada por microvesmulas de insecto se podna neutralizar con un anticuerpo gp64.

Para caracterizar adicionalmente vesmulas de celula de insecto, los inventores dejaron vesmulas de insecto GFP en un gradiente de iodixanol para medir su densidad. Este proceso permite la separacion de diferentes materiales presentes en una mezcla de acuerdo con su respectiva densidad. Este experimento indico que la fraccion que contiene vesmulas se solapaba con las facciones que conteman baculovirus. Normalmente se admite que el baculovirus no se puede replicar en celulas humanas, sin embargo los inventores pueden imaginar que una ligera expresion de baculovirus codificantes de tTA podna producir eficiente tTA como para activar la expresion de GFP en las celulas diana indicadoras. Para comprobar esto, los inventores colocaron el promotor de polihedrina espedfica de insecto (pH) mediante el promotor de CMV o el de EFIa en el plasmido lanzadera (pFAST) usado para construir el Bac recombinante (construcciones representadas en la Figura 16 A). A diferencia de pH, esos promotores son altamente activos en celulas humanas tal como se desvelo mediante un experimento de transfeccion en la lmea de celulas indicadoras de GFP de HEK-Teo (Figura 16 B). A continuacion los inventores eligieron el promotor de CMV para generar dos baculovirus recombinantes (CMV1 y CMV2) amplificados posteriormente y usados para infectar en celulas sf9. Ambos CMV recombinantes infectaron las celulas sf9 de una manera tan eficaz como el pH recombinante. Esto se desvelo mediante un analisis de transferencia de Western realizado en lisados de celulas productoras (Figura 16 C). La protema gp64 de baculovirus se detecto claramente en lisados celulares independientemente de la naturaleza del promotor usado. Despues de la preparacion de las microvesmulas, los inventores realizaron la misma tincion en lisados de microvesmulas y se verifico que gp64 se detectaba en gran medida en las tres muestras, lo que muestra el reemplazo de CMV flrna de forma significativa ni en la infeccion con baculovirus en sf9 ni la liberacion del virus. Como se esperaba, los inventores encontraron que el pH recombinante expresaba niveles mas elevados de tTA en celulas sf9 en comparacion con los dos CMV recombinantes. Esto logicamente tema un impacto en la cantidad de tTA detectada en microvesmulas, considerablemente mas elevada en los lisados de pH. Por ultimo el aumento de las dosis de microvesmulas de pH-tTA y CMV-tTA se aplico sobre la lmea de celulas HEK-TeoGFP. El MFI que refleja la eficacia de la administracion de tTA se analizo con FACS 24 h mas tarde desvelando que las vesmulas producidas con el pH recombinante eran diez veces mas eficaces que las producidas con los CMV recombinantes (Figura 16 D). Esto muestra que una transferencia de tTA eficaz se correlaciona con niveles elevados de expresion de protema en las celulas productoras. Esto apoya la hipotesis de que la propia protema es transmitida por microvesmulas asociadas a baculovirus. Ademas, el aumento del rendimiento de transcripcion del baculovirus de tTA en la celula humana por intercambio de promotor no aumenta la disponibilidad de tTA en la diana, lo que muestra que la transcripcion dirigida por Baculovirus no es responsable (o esta muy poco implicada) de la funcion del tTA administrado. En general estos datos muestran que la transferencia de tTA en celulas humanas se consigue con microvesmulas de gp64 obtenidas a partir de celulas de insecto y no mediante baculovirus codificantes.

Claims (11)

1. 5

   10

   15

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   25

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   REIVINDICACIONES

   1. Una microvesmula secretada por una celula eucariota, en la que dicha microvesmula comprende una protema de fusion de la membrana viral VSV-G y una protema de interes, en la que dicha microvesmula no contiene ninguna protema estructural viral, y en la que dicha protema de interes no se une con enlace covalente a dicha protema de fusion de la membrana viral VSV-G.
2. 2. La microvesmula de la reivindicacion 1, que es una vesmula de tipo exosoma que tiene un tamano entre 40 y 150 nm.
3. 3. La microvesmula de la reivindicacion 1, que es una vesmula de tipo exosoma que tiene una densidad entre 1,08 g/ml y 1,12 g/ml.
4. 4. La microvesmula de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, obtenida por la filtracion y ultracentrifugacion de sobrenadantes celulares de celulas eucariotas, en la que dichas celulas eucariotas se han transfectado para sobreexpresion transitoria de dicha fusion de la membrana viral VSV-G y dicha protema de interes, y en la que dicha celula eucariota no expresa ninguna protema estructural viral y dicha protema de interes no se une con enlace covalente a dicha protema de fusion de la membrana viral VSV-G.
5. 5. Un metodo in vitro para administrar una protema de interes en una celula diana que comprende la etapa de poner en contacto dicha celula diana con microvesmulas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4.
6. 6. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 5, en el que dichas microvesmulas se producen in situ, mediante cocultivo de las celulas diana con las celulas productoras de microvesmulas.
7. 7. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 5 o 6, en el que varias protemas de interes diferentes se administran en una celula diana poniendo en contacto dicha celula diana con varias microvesmulas diferentes de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 4 que comprende dichas varias protemas de interes diferentes.
8. 8. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 5 o 6, en el que dicha protema de interes es un receptor de membrana.
9. 9. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 5 o 6, en el que dicha protema es un factor de transcripcion.
10. 10. Un uso in vitro de una microvesmula de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, para expresar de forma transitoria una funcion de protema de interes en una celula eucariota.
11. 11. Un metodo in vitro para hacer que una celula diana sea transitoriamente permisiva con respecto a una partmula viral ecotropica que comprende la etapa de administrar un receptor viral ecotropico (EcoR) a dicha celula diana mediante una microvesmula de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que dicha microvesmula comprende una protema de fusion de la membrana viral y dicho receptor viral ecotropico (EcoR).