CN101146522A - 蛋白质输送系统 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种类病毒粒子(VLP)，其具有质膜衍生的脂质双分子层包膜，该VLP进一步包括能够形成包膜VLP的病毒结构蛋白，或其片段或衍生物，促融合蛋白及重组靶蛋白。本发明还描述了使用上述VLP将重组靶蛋白输送到细胞的方法，上述VLP、包含VLP的组合物及成套元件的医疗用途以及上述VLP的制造方法，同时还公开了用于上述VLP制造方法的载体和寄主细胞。

Description

蛋白质输送系统

技术领域

本发明涉及非基因物质到细胞的输送，尤其涉及蛋白质物质到细胞的输送。

背景技术

目前，遗传性或后天性疾病，比如囊性纤维化或癌症的基因疗法普遍涉及两种治疗序列的输送方法之一。第一种方法使用裸核酸或非病毒载体，其通常是胶囊化的脂质体或脂质体复合物。第二种方法使用病毒载体。病毒载体可以是非结合的，如腺病毒(Ad)或疱疹病毒(HSV)；病毒载体也可以是结合的，如腺伴随病毒(AAV)与变性病毒(例如MLV)。在Ad与HSV的情况下，治疗基因的表达只是瞬时的。在结合载体的情况下，如变性病毒或AAV，表达是长期的(理论上细胞寿命期限)。

这些基因治疗方法具有几个缺点。裸核酸或与脂质体复合的核酸到细胞的传输效率是极低的。逆转录载体可以结合进受体基因组的致瘤区域，这种结合可能导致白血病及或癌症。非结合载体的致癌风险低，然而其只能保证治疗基因的瞬时表达，因此仅具有短暂的治疗价值。病毒载体必然引起抗体中和或遭遇其受体中原有抗体，这限制基因转移的效率和转导细胞生命期限。所有病毒载体，即使是有复制缺陷的，在理论上都具有恢复复制型，和/或与同时存在于相同受体中的同样或相关族系的另一病毒重组的可能性。尽管这种情况发生的可能性较小，它还是可能产生具有未知复制能力、致病性与繁殖潜力的新病毒种类。最终，所有这些技术都涉及一般意义上的遗传物质，尤其是DNA到受体细胞的传输。这种物质的传输涉及生物学风险，因此要求对生物安全性的慎重考虑。

为了解决这些问题，正在开发更安全更有效的核酸传输的合成载体。对病毒载体的修饰工作也正在进行，以减少其免疫影响，并控制其在宿主细胞中的聚集位点。与体外基因治疗相结合的干细胞技术也正在开发。

有许多具体的情况，例如，在细胞分化或组织发育中，只需要某个特定的基因的瞬时表达。举例来说，人体中肺腺泡的形成是产后的现象，其可以被在此期间发生的几种类型的攻击所改变。这种攻击包括高压氧治疗，机械通气，细菌或病毒感染。支气—管肺发育不良(BPD)是肺泡发展的病变，这是在早产新生儿中出现的主要的呼吸困难并发症。肺泡上皮细胞的异常增生与肺部微脉管化的发育异常在BPD生理病理学中起了至关重要的作用。刺激肺泡上皮细胞增生并控制细胞凋亡的角质细胞生长因素(KGF)和控制微脉管化过程的血管内皮生产因子(VEGF)是涉及正常肺泡发育的两个主要因子，已经发现当BPD发生时，这些因子的表达减少。因此，这些因子是基因治疗的潜在靶点。肺泡发育的瞬时性导致短暂的治疗时间，这特别适合于通过非结合载体，例如腺病毒，进行的瞬时转基因表达。

其它瞬时基因表达的实例在组织分化与增生的过程中是常见的，细胞基因或生长因子受体在细胞周期的某些时期活化与去活化，这两种情况引起了事件顺序的微调。

在许多存在单一遗传性缺陷的单一瞬时表达的蛋白质中，突变基因的野生型等位基因的瞬时表达可以充分修正这种遗传缺陷引起的整个病理。

一种替代方法是非缺陷的生物活性基因产物，肽和/或天然构象的蛋白质的直接传输(Ford等.Gene Ther.2001，8：1-4；Dalkara等，Mol.Ther.2004，9：964-969)。虽然传输的药剂不会与基于载体的核酸持续到同样程度，但是其应该能够持续足够长时间，从而在短暂的治疗时间内具有效力。

治疗蛋白质到细胞的输送具有核酸输送所不具有的某些优点。由于这些蛋白质可以被选中以在翻译后修饰(例如糖化，磷酸化)存在的情况下正确地携带它们，并具有与受体相同的起源，其将很好地与受体相容并且不会引起任何免疫原反应。这将允许反复的给药。如上所述，基于基因治疗的病毒的主要缺点是载体的免疫原性：不但载体可以促使对其本身的即时有害反应，而且免疫防护可以发展到超过一定程度，而致使病毒载体的反复给药变得无效。治疗蛋白质的致癌结合也是不可能的，对所有病毒载体都没有这种情况。而且，治疗蛋白的输送意味着转录，翻译与翻译后修饰以及胞内输送/靶向对准到具体的细胞区室(例如受体与细胞表面分子的质膜，或核转录因子的原子核)的细胞运转的被跳过。可以预测这将减少对细胞的压力。

虽然希望如此，但是运送足够数量的蛋白质到细胞却难以实现。已经尝试过脂质体调节技术：Owais等(Eur.J.Biochem，2000，Vol 267：3946-3956)已经用脂质体中的促融合脂类促进与受体细胞的融合并导致胶囊化的蛋白质的输送。在专利US 5631237中，仙台病毒(Sendai virus)蛋白质被用于促进脂质体与受体细胞的融合。

发明内容

本发明采取一种替换方法来解决非遗传物质到细胞的输送问题。尤其是利用类病毒粒子(VLPs)作为膜结合蛋白与非膜结合蛋白的运载工具。

VLPs的结构类似病毒粒子，但是没有病毒基因组。因此，其不能复制，没有致病性。该粒子通常包含至少一种类型的来自病毒的结构蛋白质。在大多数情况下，这种蛋白质会形成蛋白质衣壳(例如VLPs包含变性病毒，腺病毒或噬菌体结构蛋白质)。在某些情况下，该衣壳也被包裹在源自细胞的脂质双分子层里，其中组装VLP已经被释放(例如，VLPs包括人类免疫缺乏病毒结构蛋白质，诸如Gag)。

当编码某种病毒结构蛋白的基因在未受到其它病毒基因感染的宿主细胞中过度表达时，通常形成VLPs。在胞质液中，按照类似于bona fide病毒粒子的组装过程，结构蛋白质组装进入VLP中。当然，没有其它病毒基因在场，真正的病毒粒子不能形成。VLPs的形成导致其从宿主细胞中释放。这可能是通过细胞溶解作用进行的。在VLPs来自包膜病毒的情况时，这个过程是通过从宿主细胞出芽，这造成VLP被脂质双分子层包裹。

现在已经发现包膜的类病毒粒子可以被设计成促融合的，并因此能将膜结合与非膜结合的蛋白质都输送到细胞。

因此，一方面，本发明提供一种具有质膜衍生的脂质双分子层包膜的类病毒粒子(VLP)，该VLP进一步的包括：

a)能形成包膜VLP的病毒结构蛋白质，或其片段或衍生物；

b)促融合蛋白质；

c)重组靶蛋白。

术语“质膜衍生的脂质双分子层包膜”是指从VLP已经被释放的宿主细胞的质膜衍生的脂质双分子层。该包膜部分或全部地包裹VLP。VLP最好完全地(或几乎完全地)包裹在包膜内。脂质双分子层将具有相当于宿主细胞质膜组合物的高分子组成。双分子层中同样的脂类、蛋白质与碳水化合物的比例将很相似。这样的大分子包括跨膜受体和通道(比如受体激酶和离子通道)，细胞骨架蛋白质(比如肌动蛋白)，脂质或连接碳水化合物的蛋白质，磷脂(比如磷脂酰胆碱，丝氨酸磷脂和脑磷酯)及胆固醇。该组合物将是复杂的并有别于诸如脂质体的人工双分子层制剂的典型成分。脂质体通常包括少量不同类型的脂类。这是在这些脂类的水悬浮液经超声后自发形成。脂质体将包裹一部分水溶液，因此脂质体可以通过包裹水溶液中的酶作用物而在内部充填那些物质。脂质体也可以用植入双分子层的跨膜蛋白质制造，然而技术限制表明，可以被归入脂质体的蛋白质的数量与多样性被严重缩减。因此，考虑到其复杂性，技术人员会认为它与本发明的VLPs的质膜衍生的脂质双分子层具有明显差异。

而且，脂质体形成的自发性导致组分(即脂类与蛋白质)大量无序的与均匀的排列。相反，由于是从本身具有有序性的质膜衍生得到，本发明的VLPs的脂质双分子层组分将合理地排序。

在优选实施例中，本发明的VLP的质膜衍生的脂质双分子层包含至少四种，更优选至少六种，最优选至少八种不同类型的脂类。其中优选的脂类类型是丝氨酸磷脂。本发明VLPs的脂质双分子层包含20％到60％丝氨酸磷脂，更优选为30％到50％，最优选为大约40％。

在另一个优选实施例中，本发明的VLP的质膜衍生的脂类双分子层包含至少四种，更优选至少六种，最优选至少八种不同类型的蛋白质。

“类病毒粒子”，其意思是类似病毒粒子的结构，但是缺少病毒基因组，不能复制并且没有致病性。该粒子通常包含至少一种类型的来自病毒的结构蛋白质。优选仅一种结构蛋白质存在。最优选没有其它的病毒的非结构组分存在。本发明的VLPs包括质膜衍生的脂类双分子层包膜。

“病毒结构蛋白质”是一种蛋白质，其有助于衣壳蛋白或病毒的蛋白质核心的整体结构。本发明的病毒结构蛋白质可以从能形成包膜VLPs的任何病毒获得。这些通常是来自天然包膜病毒的蛋白质。这种病毒包括，但是不局限于，逆转录病毒(例如HIV，Moloney小鼠白血病病毒，猫白血病病毒，Rous肉瘤病毒)，冠状病毒，疱疹病毒，嗜肝DNA病毒及正黏液病毒(例如流感病毒)。然而，天然的非包膜的病毒也可以形成包膜VLPs，这些也包括在本发明中。天然非包膜病毒包括小核粮核酸病毒，呼肠孤病毒，腺病毒，乳头瘤病毒和细小病毒。

优选结构蛋白质是逆转录病毒Gag蛋白质。特别优选的结构蛋白质的是对应于HIV-1 Gag基因的蛋白质。这是因为Gag VLPs的制造与组装是很高效的，并且这些VLPs具有低的细胞毒性。慢病毒属HIV-1的Gag基因为多蛋白Pr55Gag解码，该多蛋白Pr 55Gag是结构蛋白质p17载体(MA)，p24衣壳(CA)，p7壳包核酸(NC)与p6的前体。Gag在成熟时被切为独立蛋白质，HIV-1的传染性病毒体，然而，在Gag VLPs中Gag保持为单一的蛋白质，因为没有要求的病毒蛋白酶。机理依据及Gag VLP形成中涉及的蛋白质在先有技术中进行了广泛的论述。(见Carrière等，1995，Virol.75：2366-2377；Wilk等，2001，3.Virol.75：759-77130；US 2002/0052040；Chazal与Gerlier，2003Microbiol.Molec.Biol.Rev.67：226-237；Hong与Boulanger，1993J.Virol.67：2787-2798；Royer等，1992 J，Virol.66：3230-3235；Spearman等，1994 J.Virol.68：3232-3242及其引用的参考资料)

因此，在优选实施例中，本发明提供一种具有质膜衍生的脂质双分子层包膜的VLP，该VLP进一步包括：

a)能形成包膜VLP的HIV-1 Gag，或其片段或衍生物；

b)促融合蛋白质；

c)重组靶蛋白。

如同HIV-1 Gag的情况，术语“结构蛋白质”包含的是亲结构蛋白质，其中结构蛋白质是经亲蛋白质或结构多蛋白翻译后分裂制造的，其中多结构蛋白质源自于单一缩多氨酸。这些蛋白质可能不需要被切开就能形成VLP。

在本发明中包括的这些天然结构蛋白质的片段与衍生物保持形成VLPs的能力。技术人员会知道如何确定具体的片段或衍生物是否保持形成VLPs的能力。例如见Carrière等，1995 J.Virol.69：2366-2377与Wilk等，2001J.Virol.75：759-77130及其引用的参考资料(例如Fcke等，1993，J.Virol.67,4972-4980)提供的关于识别保持形成VLPs能力的Gag区域与片段的指导。这种技术可以很容易地应用于其他病毒结构蛋白。这些天然序列的衍生物，通常具有至少40％，优选50％或60％或以上，尤其是70％或80％或以上的与天然序列的序列同源性。为了实施本发明，按照对该技术通常理解，“序列同源性”并不是用来仅指序列一致性，而且是指氨基酸的使用，在相似的物理特性，诸如电荷与极性的基础上，这些氨基酸是可互换的。用来自相同物理组的氨基酸在一个信号序列之内的氨基酸的取代被认为是保守性置换，预计不会改变信号肽的活性。因此只用异亮氨酸完全替换亮氨酸将被认为具有起动程序的100％“序列同源性”。合适的基团是，甘氨酸与丙氨酸；丝氨酸，苏氨酸，天门冬酰胺，谷氨酰胺与半胱氨酸；赖氨酸精氨酸与组氨酸；谷氨酸与天冬氨酸；缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，甲硫氨酸，缬氨酸与异亮氨酸；苯基丙氨酸，色氨酸与酪氨酸；甲硫氨酸与亮氨酸。序列同源性可以计算为以下论述的“序列一致性”，但是允许以上讨论的保守性置换。

优选地，天然的病毒结构蛋白质的衍生物或其活化片段显示与天然结构蛋白质或其部分至少50％，优选地至少60％或70％，比如选至少80％序列一致性(例如用SWISS-PROT蛋白质序列数据库，用具有可变Pam因子的FASTApep-cmp，并且gap creation penalty设为12.0，gap extension penalty设为4.0，时段具有2氨基酸测定的那样)。

天然的结构蛋白质，或其片段或衍生物，可以用作融合蛋白，它具有属于不同种类，子群族或病毒亚科的结构蛋白质的一种或更多的结构域的(例如慢病毒属与spumavirus；见Carrière等，supra)，或具有非病毒蛋白质序列。

VLP通常包括病毒结构蛋白的多重拷贝(Briggs，J.A.，等，2004.Nat.Struct.Mol.Biol.11：672-675)。优选地，VLP将包括病毒结构蛋白的至少2000次拷贝，更优选为至少3000次拷贝，最优选为至少4000次拷贝。

术语“促融合蛋白”是指一种病毒蛋白质，其可以促使VLP的质膜衍生的包膜与受体细胞膜融合。正是这个机理导致VLP的蛋白质组分进入到胞质液。众所周知，核糖核酸病毒与变性病毒的包膜糖蛋白结合到细胞受体，并引发融合。因此这些蛋白质是这些病毒的传染性的原因。促融合蛋白质的其它实例包括，但是不局限于，流行性感冒血球凝集素(HA)，呼吸道合胞病毒融合蛋白标记物(RSVFP)，蜱传脑炎病毒(IBEV)的E蛋白与登革热病毒，Semliki Forest virus的E1蛋白(SFV)，狂犬病病毒与水泡性口膜炎病毒(VSV)的G蛋白与baculovirusgp 64(Guibinga GH Friedmann T.，2004，Mol.Ther.11：645-651)。这些蛋白质的功能等效片段或衍生物也可以使用。功能等效片段或衍生物应当保留野生型蛋白质的至少50％，更优选至少75％，最优选为至少90％的促融合活性。

特别优选的是水泡性口膜炎病毒的包膜糖蛋白(VSV-G)。VSV-G具有高度促融合活性，并且实际上所有哺乳动物细胞可以通过其质膜糖蛋白的碳水化物部分结合VSV-G。没有希望按照理论被结合，VSV-G-细胞表面交互作用的分子机制由附件组成，其跟随细胞膜与病毒包膜之间的膜融合步骤。这种方法已经被流感病毒血球凝集素与宿主细胞质膜很好地证明(Hunter，E.1997.Viral entry andreceptors(病毒进入与受体)，in Retroviruses(在逆转录病毒中)，Cold SpringHarbor Laboratory Press(冷泉港实验室出版)，New York(纽约)。)。

因此，在另一个优选实施例中，本发明提供具有质膜衍生的脂质双分子层包膜的VLP，该VLP进一步的包括：

a)能够形成包膜VLP的病毒结构蛋白，或其片段或衍生物；

b)能够促进包膜与受体细胞膜的融合的水泡性口膜炎病毒的包膜糖蛋白(VSV-G)，或其片段或衍生物；

c)重组靶蛋白。

优选的促融合蛋白是与病毒结构蛋白异种的。术语“异种的”是指正被讨论的蛋白质的生物学来源与具有不同的生物学来源的每一蛋白质来源的事实。例如，如果结构蛋白质是HIV1结构蛋白质，那么促融合蛋白质不是HIV1促融合蛋白质。

在具体的优选实施例中，本发明提供一种具有质膜衍生的脂质双分子层包膜的VLP，该VLP进一步的包括：

a)能够形成包膜VLP的HIV 1 Gag，或其片段或衍生物；

b)能够促进包膜与受体细胞膜的融合的水泡性口膜炎病毒的包膜糖蛋白(VSV-G)，或其片段或衍生物；

c)重组靶蛋白。

促融合蛋白质可以是上述天然蛋白质之一的片段或衍生物。这些天然序列的衍生物将具有至少40％，优选为50或60％或以上，特别是70或80％或以上天然序列的序列同源性。

优选地，天然的病毒结构蛋白质的衍生物或其活化片段显示与天然结构蛋白质或其部分至少50％，优选地至少60％或70％，比如至少80％序列一致性(例如用SWISS-PROT蛋白质序列数据库，用具有可变Pam因子的FASTA pep-cmp，并且gap creation penalty设为12.0，gap extension penalty设为4.0，时段具有2氨基酸)。

通过重组体，这意味着靶蛋白是通过重组体编码序列编码的，而不是天然的存在于释放VLPs的受体的质膜衍生的脂质双分子层中。

术语“靶蛋白”是指输送到受体细胞的蛋白质。这种蛋白质可能包括受体细胞中未发现的蛋白质，受体细胞中发现的不同种类或克隆版本的蛋白质。本发明优选的靶蛋白与受体细胞中发现的蛋白质状态相同，其表达方式是翻译后修饰，这与受体细胞中发现的相同。这种修饰包括糖化或添加辅酶基或形成四级结构的脂类修饰。最优选的将是野生型蛋白质，其相当于在变异形式中发现的或受体细胞缺乏的蛋白质。

重组靶蛋白可能是膜蛋白或非膜蛋白。膜蛋白的非限制性的例子，包括离子通道，诸如囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)，具有酪氨酸激酶活性的受体诸如PDGF-受体与SCF-R受体(干细胞生长因子受体，或c-kit或CD117)，G-蛋白联接受体，诸如肾上腺素能受体。非膜蛋白的非限制性实例包括胞质蛋白，诸如肌动蛋白，Ras，BRK 1/2与核内蛋白，诸如类固醇受体与组蛋白。优选并入本发明的VLPs的膜蛋白是具有单一跨膜结构域(又名类型1膜蛋白)的蛋白和具有短的胞质尾区的蛋白。类型1膜蛋白的特别优选实例是SCF-R受体。虽然不是类型1膜蛋白，CFTR蛋白也是膜蛋白特别优选的实例，其结合进本发明的VLPs。

因此，在最优选实施例中，本发明提供一种具有质膜衍生的脂质双分子层包膜的VLP，该VLP进一步的包括：

a)能够形成包膜VLP的HIV 1 Gag，或其片段或衍生物，；

b)能够促进包膜与受体细胞膜融合的水疱性口腔炎病毒的包膜糖蛋白(VSV-G)或其片段或衍生物；

c)重组CFTR。

如上所述，VSV-G是广谱促融合蛋白质。那么应当根据组织/细胞专一性要求选择更具体的促融合蛋白。

另外，VSV-G可以修饰，以达到要求的专一性程度。本领域技术人员可以设计VSV使其具有所期待的专一性。下面用举例的方式，对二个方法进行描述。

第一，至少一个具体细胞配基可以用遗传学方法插入至少一个易受影响的VSV-G的回路。细胞特异性配体(S)将从靶细胞或组织的现有文献资料，或噬菌体对理想靶细胞生物淘洗的直接实验测定来获得。这种技术是本领域技术人员所熟知的(gaden等，J.virol.2004，78：7227-7247)。

第二，在细胞特异性配体的插入会对VSV-G的膜融合功能有害的情况下，细胞特异性配体可以用遗传学方法插入HIV-1 EnvGp 160的可变形的回路，与VSV-G在VLP表面上共表达。可以使用重组体腺病毒，Ad-EnvGp16O-L。预计EnvGp 160将容易地结合进Gag VLPs(Wyma等，2000 J.Virol，74：9381-9387 andYu等，1992 J.Virol.66：4966-4971)。

在另一方面，本发明提供一种将重组体靶蛋白传输到受体细胞的方法，该方法包括：

a)提供上文所定义的一种VLP；

b)将受体细胞暴露到上述的VLP。

如上所述，重组体靶蛋白可以是膜结合蛋白。质膜衍生的脂质双分子层包膜病毒类粒子通过质膜的出芽与摘除从产品细胞中释放。这是文献记录的方法(Chazal和Gerlier，supra，Spearman等，supra；Sakalian和Hunter，1998 Adv.Exp.Med.Biol.440：329-339)。经出芽，VLPs被一些宿主细胞的质膜包裹。因此，包膜包括宿主细胞衍生的质膜蛋白质。如果设计宿主细胞表达质膜中的重组体膜蛋白，那么重组蛋白质将结合进质膜衍生的脂质双分子层包膜病毒类粒子。于是重组体靶膜蛋白到受体细胞的输送将通过促融合蛋白质调节的膜融合发生。为获得这种VLP传送，重组体膜蛋白可以简单地用受体细胞培养。为了优化靶蛋白进入VLP的结合，可以修饰重组体靶膜蛋白(特别是用多重跨膜结构域或长胞质尾区的那些蛋白)。例如，当其序列被插入膜蛋白的细胞质结构域中时，HIV-1 gp 41中的缩氨酸序列可以帮助膜蛋白进入基于VLPs的HIV-1 Gag的结合(Wyma，D.J.等，2000，J.Virol.74：938 1-9387；Lee S.F.等，2000，J.Biol.Chem.275：15809-15819)。为优化膜蛋白进入VLPs的结合的而做的进一步的修饰实例是，将符合活化T-细胞(LAT)蛋白缩氨酸序列的缩氨酸序列插入膜蛋白的细胞质结构域中(AlexanderM等，2004，J.Virol，78：1685-1696).

因此，在优选实施例中，本发明的重组体靶蛋白是已经在细胞质结构域中用至少一个帮助膜蛋白结合进VLPs的缩氨酸序列修饰的膜蛋白。在进一步的优选实施例中，重组体靶蛋白是已经在细胞质结构域中用至少一个来自帮助膜蛋白结合进VLPs的HIV-1 gp 41或LAT的缩氨酸序列修饰的膜蛋白。

VLP膜(“供体膜”)与受体细胞膜(“受体膜”)的融合是通过促融合蛋白引起的，并导致重组体膜蛋白到受体细胞膜的传输。重组体膜蛋白到受体细胞膜的直接膜到膜传输应该维护其最适宜生物活性与功能性所需的局部浓度(例如质膜生物化学微环境，公认的伴侣蛋白质等等)。

如果膜蛋白不是通常出现在质膜中(例如出现在细胞器膜中的蛋白质)，技术人员应具有能力设计这种蛋白质，促进其瞄准质膜而不是其在细胞中天然存在的场所。

诸如上述的蛋白质转移法优点超过基因传输。膜蛋白经常是复合蛋白质。CFTR蛋白是这种蛋白质的指示物。作为Cl-通道，CFTR蛋白是横跨膜糖蛋白，并与疾病囊性纤维化(CF)有关。CFTR具有多重跨膜结构域，二个传送调节区域的胞质内结构域(胞内域)，其相当于N-与C-端，以及胞外或胞外域。胞外域与胞内域两者都是分别通过糖化与磷酸化翻译后修饰的。CFTR的生物活性要求不同类型翻译后修饰与质膜寻址，两个特点接着要求严格的胞内折叠与三维结构修正，以及意义明确的胞内通道。而且，编码序列(超过1,400氨基酸残基)的长度使其不可能与所有其调控的上游与下游元素一起克隆。考虑到CFTR蛋白质分子的复杂性，可以预言，使用病毒或非病毒载体的人类CFTR基因的可调型表达将遇到某些困难。通过在设计制造本发明的VLPs的适合宿主细胞中表达这种蛋白质，该蛋白质在其修正的膜范围内作为适当地表达与修正的CFTR，结合进VLP。因此该蛋白质以可能达到的最好的构形给药。

为了能输送非膜结合蛋白质，通过用能够结合到病毒结构蛋白的蛋白质作为融合蛋白标记物，表达靶蛋白。例如，如果病毒结构蛋白质是HIV-1 Gag，那么HIV-1的Vpr蛋白质的N-或C-端能被使用。Vpr已经显示与Gag的p6结构域C-端的相互作用，Gag与Vpr-X(Vpr的融合蛋白标记物与公认的靶蛋白)的化学计量比已经被认为是壳体化的。(Zhu等，2004 Retrovirology 1：26-31.).Vpr-X将作为p6结合的内部蛋白在Gag粒子的核心内被输送。

经过VLP的包膜与受体细胞膜之间的融合，VLP的内部核心将在胞质液中分离。这接着使结构蛋白质与融合蛋白(例如Gag的p6结构域与Vpr-X融合蛋白的Vpr半族)之间蛋白质-蛋白质相互作用不稳定，释放融合蛋白。可以利用蛋白质融合到靶蛋白的自然特性。例如，Vpr载有核定位信号，自然运送至细胞核。因此，vpr标记的蛋白质将被运送到细胞核。技术人员将会知道这些融合蛋白及其性质的潜在候选者。例如，Vif，FIIV-1病毒粒子的一种辅助蛋白质，也与Gag相互作用，并可以与Gag有效地共壳体化。(Bardy等，2001 J.Gen.Virol.82：2719-2733.；Bouyac等，1997 J.Virol.71：9358-9365；Huvent等，1998 J.Gen.Virol.79：1069-1081).Vif不具有核定位信号。因此被输送的重组蛋白质可以融合到Vif，导致与主要通过Vpr瞄准的核区室不同的到细胞区室的输送。

可以输送到细胞活体内、活体外或体外。细胞可以是隔离的，或与其它的细胞一起培养的，或正在组织中。

另一个方面，本发明提供一种蛋白质治疗的方法，上述方法包括：

a)提供上文所定义的一种VLP；

b)将细胞暴露到上述VLP中，VLP的剂量应当足以诱导出与治疗蛋白质相关的治疗效果。

通常，蛋白质治疗包括蛋白质输送到细胞，以获得治疗效果。细胞中这些蛋白质往往是不足的。不足意味着细胞没有足够数量的功能正常的蛋白。这表明细胞有可能完全不表达蛋白质，但是也表明细胞表达蛋白质的突变版本。通过输送治疗数量的蛋白质到缺乏该蛋白质的细胞，这种缺乏引起通的疾病状态可能反转。这种方法的候选者包括CFTR蛋白质。

因此在优选实施例中，发明提供一种治疗囊性纤维化的蛋白质治疗方法。

另外，治疗蛋白质可以是蛋白质药物，虽然向不缺乏治疗蛋白质的细胞给药，但是细胞仍然将受益于暴露到治疗蛋白中。

在蛋白质治疗方法中VLP的给药方式将根据治疗的疾病而改变，因为不同的疾病要求VLP在身体内不同的位点给药。例如囊性纤维化的治疗可能涉及呼吸道的气道上皮的给药。这将在CF-病人，婴儿与幼童的寿命中及早有益地规定，以免肺与呼吸道发展中的畸形，而且避免这种疾病中常见的机会感染的内在并发症的出现。

通常，VLP以药用可接受的组合物形式给药。因此本发明也提供药物组合物，其包括上述定义的VLP和至少一种药用可接受的载体，稀释剂或赋形剂。

在这种组合物中VLP可以由配方按重量计算从0.05％到99％组成，更优选的是0.1％到10％。

“药用可接受的”意思是该成分必须与组合物的其它成分兼容，而且承受者生理上可接受。药物组合物可以按照本领域熟知的与在文献中广泛描述的任何常规方法配制。因此，活性成分可以与任选的其它的活性物质结合，具有一种或更多的传统的载体，稀释剂及或赋形剂，制造传统医学制剂，诸如药片，药丸，粉末，锭剂，香袋，扁囊剂，酏剂，悬浮液，乳液，溶液栓剂，无菌可注射的溶液，无菌包装粉末，等等。优选方式是调整该组合物使其适合通过注射或喷雾给药。

适合的载体，赋形剂与稀释剂的实例是乳糖，右旋糖，蔗糖，山梨糖醇，甘露糖醇，淀粉，阿拉伯胶，磷酸钙，藻酸，黄芪胶，明胶，硅酸钙，微晶纤维素，聚乙烯吡咯烷酮，纤维素，水糖浆，水，水/乙醇，水/乙二醇，羟基苯酸盐，滑石，硬脂酸镁，矿物油或脂肪物质诸如硬脂或其适合的混合物。另外组合物可以包括脱模剂，润湿剂，乳化剂，悬浮剂，防腐剂，脱硫剂，调味剂等等。也可以采用本领域一些公知技术进行配制以便在向病人给药后，可以实现活性成分的快速，持续或延缓释放。

另外，在植入或重新植入之前，VLP(或组合物)可以细胞体外给药。例如，一种应用是，在对从其身体获取干细胞的病人身上重新给药前，将生长因子受体传输到干细胞，给与其放大和体外扩增的能力。干细胞体外生长是困难的过程，培养通常稳定在3×10⁹细胞的高峰水平，在该水平干细胞停止分裂。用本发明的蛋白质的传输方法，通过将生长因子受体输送到高峰水平的干细胞，可以引起这些细胞的进一步增殖。

SCF-R受体(干细胞生长因子受体，或c-kit，或CD117)是公认的候选者。干细胞预先暴露于携带具有特定配基(SCF)的SCF-R的本发明所述的VLPs，这种干细胞的治疗将重新刺激那些干细胞的生长。这个过程可以重复若干次，获得10¹¹干细胞水平，这对肝癌的活体内治疗是必要的。除了SCFR，膜受体也发挥功能，刺激干细胞的增殖，例如EGFR。另外，Hox4或端粒末端转移酶可以通过Vpr或Vif标记胞内输送，通过干细胞生长转录激活获得相同的目标。

另一种应用是，使用本发明的胞内蛋白质的输送方法，传输特定的免疫原的蛋白(例如肿瘤抗原)到体外树突状细胞(DC)，因此将这些抗原处理成免疫原的肽，并用MHC级-II分子在细胞表面表达。当治疗-DC在活体内再给药时，这些免疫原的肽的MHC-级II的代表将引起或再强化到肿瘤细胞的免疫反应。还有一个体外应用包括，将特定组织的细胞表面分子输送到从病人身体分离出的干细胞，确保将干细胞重新瞄准系统给药的特定器官。

在一个方面，本发明提供治疗中使用的上述定义的VLP。上面描述的组合物也可以用于治疗。优选用于治疗以蛋白质缺乏为特征的疾病，最优选的是囊性纤维化的治疗。

在另一个方面，本发明提供上述定义的VLP在制造治疗囊性纤维化的药物中的应用。

本发明的VLP也可以用作疫苗或在免疫疗法使用。在这种情况下，结合进VLP包膜的重组蛋白质将由于其具有免疫原的潜力而被选择。在疫苗或免疫疗法中，使用本发明的VLPs的优点是，重组体膜蛋白处于膜磷脂与相邻蛋白质的天然范围内，其具有修正的翻译后修饰(例如其糖化状态)，并且其处于天然构象。当向要求的受体给药时，这些是在场的免疫原抗原表位和生成的高度反应并特异性抗体的近似完美的参数。

使用本发明的VLPs的典型免疫规程将包括后续使用VLP结合蛋白质的促进剂的可溶解蛋白质初次给药，然后是使用代表免疫原的抗原表位的合成肽的第二促进剂。本规程中，步骤被颠倒或重复，这些改变也是预期的。这种策略可以被用于人类病人(免疫疗法，种痘)，以及实验动物，肯定会制造实验室活体外使用的或用于人类或兽医学的诊断试剂盒的制造的高度反应的抗体。

除了药用可接受的载体、稀释剂与前述的赋形剂，疫苗组合物将进一步的包括佐剂。非限制性实例包括免疫刺激核酸，肽葡聚糖，脂多糖，lipoteichonic酸，咪唑喹啉化合物，鞭毛蛋白，脂蛋白，免疫刺激有机分子，未加甲醇的含CpG低聚核苷酸或其混合物。

本发明的VLPs也可以用于消耗溶液中不良的可溶性因子。可以设计VLPs表达被消耗的可溶性因子的受体。然后通过受体与可溶性因子之间复合物的形成，VLP将可溶性因子从溶液中分离。应用前景是抗血管生成的癌症生物制剂疗法。通常组织的脉管化，尤其是具有肿块是通过几个可溶性因子，例如VEGF(血管内皮细胞生长因子)或其它的血管生成因子，强制控制的。VEGF与其特定受体(VEGF-R)在内皮细胞表面的相互作用的任何阻碍，将引起肿瘤脉管化的低水平以及由于产生的缺氧症造成的肿瘤退化。传输膜插入及表面暴露的VEGF-R(或任何其它血管生成因子的受体)的VLPs将与内皮细胞表面表达的相同受体竞争。这种VLPs的瘤体注射将消耗循环VEGF(或其它的血管生成因子)的胞外载体，并阻碍新生血管的发生及由此的肿瘤扩散。

本领域技术人员将容易理解这些治疗技术可以怎样用于活体外情况，因此作为研究具有实验体系价值的蛋白质输送的体外研究工具，本发明具有重大的实用性。

如上所述，当过量表达的病毒结构蛋白质组装并从宿主细胞出芽时，本发明的VLPs形成。

因此，在另一个方面，本发明提供如上定义的VLP的制造方法，上述的方法包括将能形成包膜VLP的病毒结构蛋白质，或其片段或衍生物与促融合蛋白及重组靶蛋白在一个体外培养的细胞株中共表达，并将VLP从培养基中分离。

宿主细胞可以是任何细胞，优选真核生物的，尤其是哺乳动物的。最优选的细胞是和将与VLP融合的细胞同源或兼容的细胞。优选处于培养期的细胞。在某些情况，编码(i)能够形成包膜VLP的病毒结构蛋白质或其片段或衍生物；(ii)促融合蛋白质，和/或(iii)重组体靶蛋白的核酸可以分别稳定整合，成对或一起进入细胞的基因组，该细胞应是能够活体外连续生长的稳固的细胞株。这种细胞株将更适宜不受干扰地表达VLP或其中组分。

在另一个方面，本发明提供一株体外宿主细胞株，其包括：

a)编码能够形成包膜VLP的病毒结构蛋白质，或其片段或衍生物的核酸；

b)编码促融合蛋白质的核酸；

c)编码重组体靶蛋白的核酸。

本发明的另一个方面的内容是一种核酸载体，其包括

a)编码能够形成包膜VLP的病毒结构蛋白质，或其片段或衍生物的序列；

b)编码的促融合蛋白质的序列；

c)可以插入靶蛋白的编码序列的克隆位点。

结合编码靶蛋白的序列，这种载体是本发明的进一步的方面；上述载体的表达产物能够形成如上所述的VLP。这种载体可以从任何熟知的病毒载体(例如腺病毒，AAV，HSV，牛痘病毒或杆状病毒载体)或非病毒载体(例如质粒或酵母人工染色体)获得。

在优选实施例中，载体进一步包含至少一种选自下列允许序列真实功能的位置；复制起点，选择性标记，转录起点转录增强子，转录诱导剂，转录控制元件，3′未翻译的控制序列，5′未翻译的控制序列以及允许靶蛋白产物检测及或提纯的序列。具体附加序列的选择将依赖宿主细胞类型。

进一步，本发明提供成套元件，包括上述定义的载体与(设计的)宿主细胞株。另外，该成套元件可以包括

a)一个稳定的宿主细胞株，该细胞株包含编码能够形成包膜VLP的病毒结构蛋白或其片段或衍生物的核酸以及编码促融合蛋白的核酸；

b)适于宿主细胞株的最终转染的载体，该宿主细胞株包含编码靶蛋白的序列。

为特定的方面，对所叙述的优选实施例可以做细节上的必要的修改。

在另一个方面，本发明提供具有质膜衍生的脂质双分子层的VLP，上述的VLP进一步包括至少一种病毒结构蛋白质或其片段或衍生物，能够形成包膜病毒类粒子与重组体膜结合的靶蛋白，其中靶蛋白位于病毒类粒子的包膜中。

任何诸如此类优选的病毒结构蛋白质与以上论述的膜结合靶蛋白应用于本发明的这个方面。

组合物，宿主细胞，制造方法，医学应用，装备与载体的前述讨论运用必要的改变到本发明的这个方面。

本发明的这个方面的VLPs特别适用于种痘或免疫疗法规程，疫苗组合物与设计用于消耗不良的可溶性因子的溶液的规程。因此，本发明关于促融合VLPs的这些方面的前述讨论同样适用于本发明的这个方面的VLPs。

附图说明

图1：

(a)控制Sf9细胞的电子显微镜(EM)分析；

(b-d)杆状病毒感染的Sf9细胞，通过用重组体杆状AcMNP V-Gag活体外感染的昆虫细胞显示出芽的高效率与Gag载体的大量生产。

(a，b)细胞表面扫描电镜照片，显示不受感染的细胞(a)的质膜的比较的光滑外侧面，与Gag表达的细胞(b)表面上看得见的囊泡或(芽)在数量上对比。如同在超薄切片(c，d)上观测到的那样，这些芽相当于Gag VLP。

(c，d)AcMNP V-Gag感染的细胞的超薄切片的透射式电子显微镜分析，在二个不同的放大倍数显示。双层膜下的物质的高密度电子区由Pr55 Gag多蛋白分子构成，其构成Gag粒子的内部核心。

棒在(a)与(b)中代表500nm，在(c)中100nm，在(d)中1mm。

图2：感染重组体，Gag表达的人类腺病毒，Ad 5-Gag的哺乳动物细胞的部分的透射式电子显微镜分析。

注意Gag粒子在胞外介质中释放。棒代表200nm。

图3：具有病毒糖蛋白VSV-G的Gag载体假模标本。Gag粒子(VLP)的SDS-PAGE与免疫印迹分析。纯化的Gag粒子用SDS变性，在变性的聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)中做电泳，蛋白质传输到硝化纤维膜，用单克隆抗体(mAb)抗-Gag或抗-VSV-G检测，在VSV-G-假模标本Gag载体的蔗糖-D2O中超速离心法分析。缺陷同时与抗-Gag与抗-VSV-GmAbs起反应。注意Pr55Gag与VSV-G62-kDa信号的共沉降。

(B)，在(A)中使用抗-Gag(路线1)或抗-VSV-G(路线2)mAb获得的Gag粒子的峰值的免疫印迹分析；MM，预染分子量标准。路线1右边的虚线指示Gag自发分裂产物。

图4：具有VSV-G的Gag载体假模标本的EM分析。

(a)从Sf9细胞共表达的Pr 55Gag与VSV-G出芽的Gag粒子。

(b)控制，从Sf9细胞单一表达的Pr 55Gag出芽的Gag粒子。注意(b)显示的“光滑”Gag粒子与(a)显示的“绒毛状的”Gag粒子之间在膜包裹粒子形态上的差异；“绒毛状的”方面很可能符合插入膜的VSV-G分子，这体现在图3蛋白质印迹中。

图5：非基因膜到膜蛋白输送的原理示意图。

在画面的左上角用图解法地代表的是生产者细胞，表达Pr 55Gag，VSV-G糖蛋白(作为促膜融合的假模标本药剂)，被传输的靶蛋白(即C1通道/CFTR分子，用GFP标记(GFP-CFTR))。在组装与出芽以及胞外释放之后，输送膜插入的GFP-CFTR分子的VSV-G-假模标本Gag粒子将与靶细胞活体外培养，这在画面右下角描述。VSV-G将促使准病毒膜“供体膜”与受体细胞的质膜(“受体膜”)的融一种嵌合基因被结合进VLPs，该基因为在CFTR蛋白质的N-端融合到具有GFP结构域CFTR的绿色荧光蛋白质(GFP)编码。GFP半族标记的CFTR能够迅速识别，并使标记的蛋白质能够迅速建立。融合基因GFP-CFTR在两个不同的表达系统中克隆，(i)杆状病毒AcMNPV，形成重组体杆状病毒AcMNPV-GFPCFTR，(ii)在腺病毒类型5(Ad 5)中产生重组病毒Ad 5-GFP-CFTR。该蛋白质被观测到定位在细胞质膜。通过表达质粒携带的相似GFP标记的结构已经报道具有与非标记蛋白质CFTR相同的功能GFP-CFTR，作为任何其它的细胞表面分子或受体，于是将直接地可用，没有进一步的细胞代谢过程就可以获得其可溶性配位体。

图6：非基因Gag-Vpr调节的胞内蛋白质的输送原理示意图。

画面的左上角，用图示法代表的是生产者细胞表达的Pr 55Gag，VSV-G糖蛋白(作为促膜融的假模标本药剂)，被传输的Vpr融合的靶蛋白(Vpr-X)。在Gag-Gag与Gag Vpr-X(经过Pr 55Gag的p6结构域)交互作用及粒子组装后，胞外出芽释放的VSV-G假模标本Gag粒子将与靶细胞活体外培养，如同画面右下角描述。VSV-G将促使准病毒膜“供体膜”与靶细胞的质膜(“受体膜”)之间的融合。在膜融合之后，Gag粒子将在靶细胞的胞质液内分离，Vpr-X融合蛋白标记物将通过Vpr-NLS调节通道被传输到细胞核。

图7：逆转录Gag多蛋白与非逆转录促融合VSVG糖蛋白两者都在质膜上并在膜包膜类病毒粒子中被共壳体化，通过二者的共表达诱发昆虫细胞合胞体。其中，

(a)相差显微技术，注意在细胞-细胞融合前的瓣状体方面。

(b)电子显微镜检查，注意在左边的巨大多核细胞，在右边的正常单核细胞。

图8：GFP-CFTR到人类A549细胞的传输，通过包括VSV-G糖蛋白的GagVLPs调节。在质膜及与VSV-G共本地化时，GFP标志被看作通过RITC标记的抗VSV-G抗体的形象化。细胞核的DAPI染色显示在画面的左边底部。

具体实施方式

本发明将根据下列非限制实例进一步描述：

实施例1：CFTR-GFP VLPs的制造

一种嵌合基因被结合进VLPs，该基因为在CFTR蛋白质的N-端融合到具有GFP结构域CFTR的绿色荧光蛋白质(GFP)编码。GFP半族标记的CFTR能够迅速识别，并使标记的蛋白质能够迅速建立。融合基因GFP-CFTR在两个不同的表达系统中克隆，(i)杆状病毒AcMNPV，形成重组体杆状病毒AcMNPV-GFPCFTR，(ii)在腺病毒类型5(Ad 5)中产生重组病毒Ad 5-GFP-CFTR。该蛋白质被观测到定位在细胞质膜。通过表达质粒携带的相似GFP标记的结构已经报道具有与非标记蛋白质CFTR相同的功能(Haggie等.，2002，J.Biol.Chem.277：16419-16425和Loffing-Cueni等，2001，Am.J.Physiol.Cell Physiol.281：C1889-1897.20).GFP-CFTR克隆被证明是活化的与有功能的(Robert等，2004，J.Biol.Chem.279：21160-21168.)，如同Ad 5-GFP-CFTR克隆修复有CFTR缺陷的细胞C1-通道的活性。作为阴性对照，CFTR的生物学非活性突变株，CFTRAF508被使用。

Sf 9细胞被三种重组体杆状病毒AcMNPV Gag，AcMNPV-VSV-G与AcMNPV-GFP-CFTR共感染。经过出芽，携带VSV-G的Gag病毒类粒子可以在蔗糖-D20梯度中用超速离心方法从培养上清液中分离出来(Huvent等，1998 J.Gen.Virol.79：1069-1081.)这已经被本领域技术人员熟知。简要地说，在感染后60-72小时之间收集培养基。收获的培养基在4以2,500转/分钟离心10分钟，收集包含VLPs的上清液，抛弃细胞团块。

然后，上清液(大约11ml)是在适合SW41贝克曼(Beckman)转子的超速离心机离心管里用1ml PBS中20％蔗糖缓冲液分层。接着，离心管在4℃以30,000转/分钟离心1小时。这个离心步骤从大量的培养基(大约60ml)中，浓缩VLPs。弃去上清液，细胞团块再次悬浮在PBS(200μl/块)，再悬浮的细胞团块在4℃放置过夜。然后汇集再悬浮的细胞团块，通过30-50蔗糖-D2O梯度进行第二次离心作用。

蔗糖梯度(30-50％ w/v)是用NaOH缓冲到pH7.2的氘水(D2O)的50％蔗糖溶液与10mM Tris-HCl，pH7.2，150mM NaCl，5.7mM Na2EDTA的30％蔗糖溶液制造。设计适合贝克曼(Beckman)SW41转子的超速离心机离心管中，用梯度混合器制造梯度。VLPs(大约1.5ml)在蔗糖梯度上分层，离心管在4℃以28,000转/分钟离心18小时。在离心操作的结尾，观察到宽的乳白色条带与模糊条带。宽条带对应Gag粒子，而模糊条带主要由杆状病毒组成。VLPs的采集是，用注射器刺穿离心管，针恰好在宽条带的下面，提取大约500μl的宽条带。

汇集提取的全部VLP条带，在PBS中稀释5倍。然后，稀释液在4以30,000转/分钟2小时，使VLPs团聚下沉。弃去上清液，VLPs再次悬浮在PBS(200μl)中。在4℃过夜后，弃去团块。然后对VLP制造进行定量(按照mg蛋白质)。

实施例2：透射电子显微镜

用图例说明所示的病毒感染细胞，感染复数(MOl)为25。在感染48小时后通过离心沉降结块，收集用于电子显微镜(EM)检查的细胞。然后细胞团块用0.1mpH7.5磷酸盐缓冲液的2.5％戊二醛固定，用osmium tetroxicle后固定，用鞣酸(在H2O中0.5％)处理。脱水后，样品是嵌入环氧树脂(Epon)中(Epon-812，Fulham，Latham，纽约)。提取剖面，用2.6％碱性柠檬酸铅-0.5％部分Sections乙酸双氧铀在50％乙醇中染色，在Jeol 1200-EX电子显微镜下检验。

实施例3：扫描电子显微镜

细胞在载玻片上生长，用图例说明的病毒感染，感染复数(MOI)为25。固定和后固定与透射EM描述的相同。然后细胞用液体CO2临界点干燥，涂盖黄金，用Zeiss DSM 950电子显微镜检验。

实施例4：Gag VIP分析—超速离心分析

回收从Sf 9细胞质膜释放的Gag VLPs，通过蔗糖D2O梯度用超速离心法分析(Huvent I.等，1998，J.Gen.Virol.79：1069-1081)。线性梯度(总体积10ml，30-50％ w/v)在Beckman SW 41转子中，以28,000转/分钟离心18小时，在NaOH将pH值调到7.2的D2O中制造50％蔗糖溶液，用pH7.2，150mM NaCl，5.7mM Na2EDTA的10mM Tris-HCl制造30％蔗糖溶液。从离心管顶部收集0.5ml部分，使用不连续的缓冲系统在10％丙烯酰胺凝胶中用SDS-PAGE分析该蛋白质。(Laemmli，1970，Nature，227：680-685)。

Gag VLP分析-免疫印迹分析

对蛋白质进行上述电泳，电子传输到硝化纤维膜(Hybond-ECL，Amersham)。在室温下在包含0.05％吐温20(TBS-T)的Tris缓冲盐水(20mM Tris-HCl，pH7.5,150mM NaCl)中用5％脱脂乳阻滞后，通过与抗-Gag(实验室制造的兔多克隆抗体)或抗-VSVg(单克隆抗-VSVg，Sigma)反应，检测Gag与VSVg蛋白质，随后碱性磷酸酶标记的抗-IgG共轭。用5-溴-4-氯代-3-氮茚基磷酸盐toluidinium与氮蓝四唑(Euromedex)进行缺陷的显色。

实施例5：VLPs调节的蛋白质传输与免疫荧光显微术分析

从上述蔗糖-D2O梯度纯化Gag VLPs。然后纯化的Gag VLPs在DMEM培养基(Invitrogen)中稀释，并加入到盖玻片上生长的A549细胞中。细胞在37℃用VLPs培养1小时，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)清洗三次。然后细胞在室温下用PBS的2％多聚甲醛固定10分钟。接着，在室温下用PBS中1％牛血清清蛋白阻滞细胞，用抗-VSVg(1∶1000稀释)培养1小时。在室温下细胞用碱性蕊香红标记的二抗-鼠抗体(Sigma)培养1小时。然后在固定在滑片上用装备有AxioCam数字式摄象机的Axiovert135倒置显微镜观测之前，细胞用DAPI(4′，6-二脒基-2-苯基吲哚；Sigma)培养。

Claims (27)

1.一种类病毒粒子(VLP)，其具有质膜衍生的脂质双分子层包膜，该VLP进一步的包括：

a)能形成包膜VLP的病毒结构蛋白质，或其片段或衍生物；

b)一种促融合蛋白质；

c)一种重组体靶蛋白。

2.根据权利要求1所述的VLP，其特征在于所述的质膜衍生的脂质双分子层包膜包含至少四种，更优选至少六种，更优选至少八种不同的脂类类型。

3.根据权利要求1或2所述的VLP，其特征在于所述的质膜衍生的脂质双分子层包膜包含丝氨酸磷脂。

4.根据上述权利要求中任一权利要求所述的VLP，其特征在于所述的质膜质膜衍生的脂质双分子层包膜包括至少四种，更优选至少六种，最优选至少八种不同类型的蛋白质。

5.根据上述权利要求中任一权利要求所述的VLP，其特征在于所述的病毒结构蛋白质来自一种病毒，该病毒来自一种病毒族，该病毒族选自逆转录病毒，Coronaviriclae，疱疹病毒，嗜肝DNA病毒和正黏液病毒。

6.根据权利要求5所述的VLP，其特征在于所述的病毒结构蛋白质是来自HIV-1的一种结构蛋白质。

7.根据权利要求6所述的VLP，其特征在于所述的病毒结构蛋白质是HIV-1Pr 55Gag。

8.根据上述权利要求中任一权利要求所述的VLP，其特征在于所述的VLP包括至少病毒结构蛋白质的2000个拷贝，更优选至少3000个拷贝，最优选至少4000个拷贝。

9.根据上述权利要求中任一权利要求所述的VLP，其特征在于所述的促融合蛋白选自血球凝集素，呼吸道合胞病毒融合蛋白，蜱传脑炎病毒与登革热病毒的B蛋白，Semliki Forest virus病毒的E1蛋白，狂犬病病毒与水疱性口腔炎病毒的G蛋白，杆状病毒gp 64，或上述蛋白的功能等效片段或衍生物。

10.根据权要求9所述的VLP，其特征在于所述的促融合蛋白质是水疱性口腔炎病毒的G蛋白。

11.根据上述权利要求中任一权利要求所述的VLP，其特征在于所述的促融合蛋白质是与病毒结构蛋白质异种的。

12.根据上述权利要求中任一权利要求所述的VLP，其特征在于所述的重组体靶蛋白是一种膜蛋白。

13.根据权利要求12所述的VLP，其特征在于所述的膜蛋白是一种具有单一跨膜结构域的膜蛋白。

14.根据权利要求1到11中任一项权利要求所述的VLP，其特征在于所述的重组体靶蛋白选自CFTR，SCF-R，EGFR与Hox 4。

15.一种将重组体靶蛋白递送到受体细胞的方法，该方法包括：

a)提供上述任一权利要求所定义的VLP；

b)将受体细胞暴露到上述的VLP。

16.一种蛋白质治疗方法，该方法包括：

a)提供上述任一权利要求所定义的VLP；

b)将细胞暴露到上述VLP中，VLP的剂量应当足以诱导出与治疗蛋白质相关的治疗效果。

17.根据权利要求16所述的蛋白质治疗方法，其特征在于所述的蛋白质治疗方法适用于囊性纤维化的治疗。

18.一种药物组合物，其包括任何上述权利要求定义的VLP和至少一种药用可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

19.按照上述权利要求中任一权利要求定义的VLP在治疗上的用途。

20.按照权利要求14所定义的VLP在制造用于治疗囊性纤维化的药物中的应用。

21.一种用于制造按照上述权利要求中任一权利要求定义的VLP的方法，该方法包括将能形成包膜VLP的病毒结构蛋白质，或其片段或衍生物与促融合蛋白及重组靶蛋白在一个体外培养的细胞株中共表达，并将VLP从培养基中分离。

22.一株体外宿主细胞株，其包括：

a)编码能够形成包膜VLP的病毒结构蛋白质，或其片段或衍生物的核酸；

b)编码促融合蛋白质的核酸；

c)编码重组体靶蛋白的核酸。

23.一种核酸载体，其包括：

a)编码能够形成包膜VLP的病毒结构蛋白质，或其片段或衍生物的序列；

b)编码的促融合蛋白质的序列；

c)可以插入靶蛋白的编码序列的克隆位点。

24.根据权利要求23所述的核酸载体，其特征在于该载体进一步包括下列项目中的至少一种：复制起点，选择性标记，转录起点，转录增强子，转录诱导剂，转录控制元件，3’端未翻译的控制序列，5’端未翻译的控制序列与允许检测和/或把蛋白产物提纯的序列。

25.一套元件，包括权利要求21或22定义的一种载体与一种宿主细胞株。

26.一套元件，其包括：

a)一个稳定的宿主细胞株，该细胞株包含编码能够形成包膜VLP的病毒结构蛋白或其片段或衍生物的核酸以及编码促融合蛋白的核酸；

b)适于宿主细胞株的最终转染的载体，该宿主细胞株包含编码靶蛋白的序列。

27.一种VLP，其具有质膜衍生的脂质双分子层包膜，该VLP进一步包括至少一个能够形成包膜VLP的病毒结构蛋白质或其片段或衍生物，以及一个与重组体膜结合的靶蛋白，其中所述的靶蛋白位于该病毒类粒子的包膜里。

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