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ES2956241T3 - Método para la transducción de células NK - Google Patents

Método para la transducción de células NK Download PDF

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ES2956241T3
ES2956241T3 ES18830244T ES18830244T ES2956241T3 ES 2956241 T3 ES2956241 T3 ES 2956241T3 ES 18830244 T ES18830244 T ES 18830244T ES 18830244 T ES18830244 T ES 18830244T ES 2956241 T3 ES2956241 T3 ES 2956241T3
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cell
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baev
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ES18830244T
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Rafijul Bari
Markus Granzin
Wing Leung
Nina Möker
Volker Huppert
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Original Assignee
Miltenyi Biotec GmbH
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Abstract

La presente invención describe un método in vitro para transferir material biológico a células NK activadas con una partícula de vector retroviral pseudotipada o una partícula similar a virus de la misma, que comprende las etapas a) activación de células NK, y b) adición de dicho vector retroviral pseudotipado. partícula o partícula similar a virus de la misma a dichas células NK activadas, en donde dicha partícula de vector retroviral pseudotipada o partícula similar a virus de la misma comprende una glicoproteína de envoltura de retrovirus endógeno de babuino (BaEV) modificada que es capaz de unirse y fusionarse con una membrana celular hematopoyética, transfiriendo así material biológico a dichas células NK activadas. Preferiblemente, la activación de las células NK se realiza mediante la adición de una citoquina de la familia IL-1 a las células NK. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Método para la transducción de células NK
Campo de la invención
La presente invención se refiere generalmente al campo de la transferencia de ácidos nucleicos a células, en particular a la transferencia de ácidos nucleicos a células citolíticas naturales (NK) activadas.
Antecedentes de la invención
Las células citolíticas naturales (en adelante también abreviadas como "células NK" (por sus siglas en inglés Natural Killer)) son una población única de linfocitos que son capaces de detectar y destruir células infectadas por virus y células degeneradas de forma maligna, también conocidas como células tumorales. Además, las células NK producen y secretan citoquinas tras el contacto con células tumorales. Esta característica funcional convierte a las células NK en un fármaco atractivo para el tratamiento del cáncer. Los ensayos clínicos han destacado el potencial del uso clínico de las células NK (Miller et al. 2005; Rubnitz et al. 2010; Childs y Berg 2013).
El uso de células NK de donantes para pacientes ("uso alogénico") requiere métodos de separación celular para separar los efectos deseados de las células NK de los efectos contraindicadores no deseados de las células no NK, p. ej. células T. Esos métodos están bien establecidos (Leung 2014) y pueden automatizarse dentro de sistemas cerrados, estériles (Apel et al. 2013).
La manipulación genética es una estrategia prometedora para modificar aún más las propiedades de las células NK con una variedad de implicaciones clínicas, p. ej. en el tratamiento del cáncer (Childs y Carlsten 2015). El uso de células inmunitarias que expresan receptores de antígenos quiméricos (CAR), por ejemplo, es una opción de tratamiento prometedora para el cáncer, como se muestra en ensayos clínicos con células T CAR. Las células NK CAR pueden ser una buena alternativa a las células T CAR; sin embargo, la manipulación genética de las células NK primarias representa un desafío técnico importante (Klingemann 2014).
Los enfoques de transfección, tales como la electroporación, dan como resultado un suministro eficiente de transgenes, pero la expresión del transgén es transitoria. Por lo tanto, la transfección de células NK no se puede utilizar para aplicaciones clínicas cuando se requiere un efecto duradero. Además, la transfección produce altas tasas de muerte celular, lo que representa otra desventaja importante.
Por otro lado, la transducción de células NK basada en vectores virales es una opción para la modificación genética duradera. La transducción retroviral de células NK es posible, pero requiere títulos de virus elevados, mientras que la eficiencia sigue siendo baja (Suerth et al. 2015). Aún más importante, debido a la mutagénesis por inserción de vectores retrovirales, el uso clínico de enfoques retrovirales es un problema crítico de seguridad con efectos genotóxicos puestos de manifiesto en estudios clínicos (Aiuti y Roncarolo 2009; Aiuti et al. 2009).
Sin embargo, dentro del grupo de vectores retrovirales, los vectores lentivirales son menos genotóxicos y representan una opción más segura para aplicaciones clínicas (Montini et al. 2009; Papayannakos y Daniel 2013). Desafortunadamente, incluso después de la estimulación con diferentes combinaciones de citoquinas y el uso de títulos elevados de vectores lentivirales, solo se puede transducir aproximadamente el 10% de las células NK, lo que puede explicarse por los mecanismos de defensa antivirales de las células NK (Sutlu et al. 2012). Esta eficiencia de transducción se puede aumentar hasta aproximadamente 40% utilizando títulos elevados de vectores lentivirales junto con sulfato de protamina y BX795, un inhibidor del complejo TBK1/IKKe (Sutlu et al. 2012). Sin embargo, TBK1 es esencial para la mitosis y, en general, se sabe que BX795 produce la detención del ciclo celular, lo que da como resultado la no proliferación de células (Pillai et al. 2015; Bai et al. 2015). Por lo tanto, los efectos secundarios críticos y no deseados hacen que BX795 no sea adecuado para la transducción clínica de células NK, donde se requiere con urgencia una transducción estable y una funcionalidad adecuada de las células NK, incluida una proliferación celular robusta.
En la publicación internacional WO2013/045639A1 se describe un método para la transducción de células T y B HSC quiescentes y en reposo utilizando un vector viral pseudotipado con una glicoproteína de envoltura de retrovirus endógeno de babuino (BaEV) modificada.
En conclusión, los métodos y/o sistemas de partículas de vectores virales para la modificación genética eficiente y duradera de células NK, que pueden aplicarse clínicamente para terapia, representan una necesidad urgente que no está cubierta por el estado de la técnica actual.
Sumario de la invención
La invención se expone en el conjunto de reivindicaciones adjunto.
Sorprendentemente, se descubrió que después de la activación, las células NK humanas primarias pueden transducirse eficientemente usando partículas de vectores de retrovirus tales como partículas de vectores lentivirales pseudotipadas con una glicoproteína de envoltura de retrovirus endógeno de babuino (BaEV) modificada como se describe en el presente documento, incluso sin la necesidad de inhibidores de mecanismos de defensa antivirales de células NK, mientras que las células NK en reposo no pueden ser transducidas eficientemente por estas partículas de vectores. La transducción es detectable incluso con títulos bajos de partículas de vectores retrovirales, tal como títulos de partículas de vectores lentivirales, y puede alcanzar más de 90%, lo que no se ha visto con otras partículas de vectores virales descritas hasta ahora. El uso de títulos bajos de partículas de vectores da como resultado una mejor practicabilidad en comparación con los métodos de la técnica anterior. Por ejemplo, la partícula de vector lentiviral con proteína de envoltura de Babuino modificada como se describe en el presente documento proporciona una eficiencia de transducción mucho mayor (7-10 veces mayor) que las partículas de vectores con proteína de envoltura de VSV-G. El método de transducción descrito en el presente documento no desencadena la muerte celular ni muestra otros efectos tóxicos en las células NK transducidas. Además, el método no afecta a la mitosis de las células NK, por lo que las células NK transducidas son altamente proliferativas durante mucho tiempo, al mismo nivel que sus homólogas no transducidas. Considerado en conjunto, la ausencia de efectos secundarios no deseados y la naturaleza clínicamente compatible de la partícula de vector retroviral pseudotipada utilizada, tal como la partícula de vector lentiviral, hace que el método descrito en el presente documento sea único para la modificación genética estable de células NK para aplicaciones terapéuticas.
Inesperadamente, la activación de células NK humanas y el uso de partículas de vectores retrovirales pseudotipadas con glicoproteína de envoltura de retrovirus endógeno de babuino (BaEV) modificada como se describe en el presente documento dan como resultado frecuencias altas de células NK transducidas. Preferiblemente, las células NK se activan mediante agentes estimulantes, ya sea en forma soluble o unidos a la superficie, o mediante células nutrientes, incluidas partes de células nutrientes, tales como partículas de membrana. Más preferiblemente, las células NK se activan mediante al menos un factor de crecimiento tal como una citoquina o combinaciones de factores de crecimiento tales como citoquinas, p. ej. citoquinas de cadena gamma común que incluyen, pero no se limitan a, IL-2, IL-7, IL-15, IL-21 o citoquinas de la familia IL-1 que incluyen, pero no se limitan a IL-1 alfa, IL1 beta, IL-18, IL-33, Il-36, IL37 e IL38. Aún más sorprendentemente, la eficacia de la transducción se puede aumentar aún más combinando diferentes citoquinas junto con una citoquina de la familia IL-1, p. ej. IL-2 y/o IL-15 junto con una citoquina de la familia IL-1 tal como IL-18, IL-33 o IL-1beta. La adición de citoquina de la familia IL-1, tal como IL-18, IL-33 o IL-1beta, a otras citoquinas conocidas que activan las células NK, conduce a una activación a corto plazo de las células NK, lo que permite transducir las células NK de manera eficiente antes que con el uso de métodos de activación de NK de la técnica anterior, es decir, sin la presencia de una citoquina de la familia IL-1. Es un hallazgo sorprendente que, en las condiciones descritas en el presente documento, el porcentaje de células NK activadas transducidas con las partículas de vector viral pseudotipadas con glicoproteína de la envoltura de retrovirus endógeno de babuino (BaEV) modificada como se describe en el presente documento no sólo es muy alto, sino que también permanece estable durante varias semanas sin reducción de la expresión transgénica. La duración de la expresión transgénica se puede mantener durante, p. ej. 2, 4, 6, 8 o más semanas. Los ácidos nucleicos también pueden transferirse dentro de la célula NK activada mediante una partícula similar a virus pseudotipada con glicoproteína de envoltura endógena de babuino (BaEV) modificada como se describe en el presente documento en lugar de la partícula de vector viral.
Aún más sorprendentemente, el enriquecimiento de células NK CX3CR1 negativas antes de la activación y transducción de estas células NK a partir de una muestra que comprende células NK CX3CR1 negativas y CX3CR1 positivas da como resultado una proliferación y transducción superiores con las partículas de vectores virales pseudotipadas con glicoproteína de la envoltura de retrovirus endógeno de babuino (BaEV) modificada como se describe en el presente documento. El enriquecimiento de células NK CX3CR1 negativas se puede lograr separando las células CX3CR1 positivas y CX3CR1 negativas de una muestra o población de células NK que comprende células CX3CR1 negativas y CX3CR1 positivas.
El método para la transducción de células NK activadas como se describe en el presente documento también puede implementarse completamente como un procedimiento automatizado, preferiblemente en un sistema cerrado en condiciones GMP.
Breve descripción de los dibujos
FIG. 1: El vector pseudotipado con BaEV permite una alta transducción de células NK, como lo demuestra la expresión de GFP, pero las células NK deben activarse
FIG. 2 A: Las células T CD3+ y células NK CD3-/CD56+ utilizadas en los experimentos se aislaron de PBMC dando como resultado poblaciones de células altamente purificadas.
FIG. 2 B: La transducción de células T con un vector lentiviral pseudotipado con VSV-G funciona, mientras que es extremadamente ineficiente para las células NK incluso con títulos altos
FIG. 2 C: La transducción con el vector lentiviral pseudotipado con VSV-G para la línea celular NK-92 es igualmente ineficiente que para las células NK primarias, pero sorprendentemente NK-92 se puede transducir eficientemente con el vector pseudotipado con BaEV.
FIG. 2 D: Tanto las células T como las células NK primarias activadas se pueden transducir de manera muy eficiente con un vector lentiviral pseudotipado con envoltura de babuino.
FIG. 3 A: Sorprendentemente, la activación corta de células NK con IL-33 permite tasas de transducción más altas de las células NK con el vector pseudotipado con BaEV que sin IL-33.
FIG. 3 B: Al igual que con el vector pseudotipado con BaEV, la activación corta de células NK con IL-33 aumenta las tasas de transducción de células NK incluso cuando se utiliza el vector lentiviral pseudotipado con VSV-G.
FIG. 4: La activación de células NK con IL-18 aumentó la tasa de transducción de células NK de manera similar a la IL-33
FIG. 5: Las células NK activadas transducidas con el vector pseudotipado con BaEV muestran la misma tasa de expansión que las células NK no transducidas, lo que demuestra que la transducción en sí no induce la muerte celular y no afecta la proliferación celular.
FIG. 6: La expresión transgénica después de transducción de células NK con el vector pseudotipado con BaEV es estable durante mucho tiempo
FIG. 7 A: La activación de las células NK y el uso del pseudotipado con BaEV permite tasas de transducción muy altas, lo que permite generar células NK con alta expresión de CAR.
FIG. 7 B: Diferentes células diana muestran diferentes perfiles de expresión para el marcador de superficie CD19, lo que las convierte en objetivos adecuados para ensayos funcionales de células NK que expresan CD19-CAR.
FIG. 7 C: El método de transducción permite la generación de células NK que expresan CD19-CAR con un alto potencial citotóxico inalterado demostrado mediante la destrucción de células K562, y una actividad citotóxica específica de CD19 significativamente mayor, demostrada mediante la destrucción de células RS4;11 CD19 positivas y Raji
FIG. 8: Se sometieron células NK naíve así como activadas a transferencia Western para comprobar la expresión del receptor de envoltura de babuino ASCT2. Las células NK activadas, pero no las naíve expresaron el receptor de la envoltura de babuino ASCT2.
FIG. 9 A: Los ensayos de transducción y proliferación celular mostraron que sólo las células NK proliferativas, pero no las quiescentes, son transducibles con un vector lentiviral pseudotipado de babuino.
FIG. 9 B: Los subconjuntos proliferativos y transducibles de células NK son CD56brillante. Por el contrario, las células NK no proliferativas y no transducibles son CD56oscuro.
FIG. 10: La comparación de varios receptores de células NK entre el subconjunto de células NK proliferadas y transducidas, proliferativas pero no transducidas y quiescentes mostró que las células NK quiescentes tenían un fenotipo significativamente diferente al de las células NK proliferativas. Las células proliferativas eran más brillantes para CD56 con una tendencia a una menor expresión de CD16, mayor expresión de los receptores activadores NKp30, NKp44 y NKG2D, así como mayor expresión de TRAIL y NKG2A.
FIG. 11 A-B: Cribado de marcadores de proteína de superficie celular de un subconjunto proliferado y quiescente de células NK. Se utilizaron células NK de 5 donantes para analizar 371 marcadores de superficie mediante citometría de flujo. En comparación directa con las células NK quiescentes, las células NK proliferativas y positivas para GFP expresaron 32 marcadores a un nivel superior y 5 marcadores a un nivel inferior (FIG. 11 A). El marcador más obvio para el subconjunto de células NK proliferativas y transducibles fue la ausencia de expresión de CX3CR1 y una alta frecuencia de células que expresan fuertemente TRAIL (FIG. 11A y 11 B).
FIG. 12 A: Se separaron diferentes subconjuntos de células NK basado en su expresión de CX3CR1 usando separación por MCAS antes de la transducción y el cultivo. Sin separación, la expresión de CX3CR1 entre las células NK derivadas de sangre del donante era de 86% y las células NK CX3CR1neg era 14%. Después de la separación, la frecuencia media de células NK CX3CR1neg se redujo a 2% mediante el enriquecimiento de CX3CR1, mientras que el agotamiento del marcador, por otro lado, condujo al enriquecimiento de 91% de población de células NK CX3CR1neg.
FIG. 12 B: Poco después del cultivo de las fracciones de células NK separadas se observaron diferencias significativas en la proliferación. Entre los subconjuntos de células NK no separadas, enriquecidas en CX3CR1 (positivas para CX3CR1) y empobrecidas en CX3CR1 (negativas para CX3CR1), el porcentaje de proliferación de células NK fue de 28, 11 y 81, respectivamente.
FIG. 12 C: La fracción de células NK CX3CR1neg es altamente transducible. 2 días después de la transducción de la fracción de células NK separadas, la tasa de transducción de los subconjuntos de células NK no separadas, CX3CR1enriquecidas y CX3CR1ag°tadas fueron 21%, 7% y 69%, respectivamente.
FIG. 13: Expresión de un receptor de antígeno quimérico (CAR) diez días después de la transducción lentiviral de células NK usando un vector lentiviral pseudotipado con BaEV e IL-1beta
Descripción detallada de la invención
En un aspecto, la presente invención proporciona un método in vitro para transferir uno o más ácidos nucleicos a células NK activadas con una partícula de vector retroviral pseudotipada o una partícula similar a virus del mismo, que comprende las etapas
a) Activación de células NK, y
b) Adición de dicha partícula de vector retroviral pseudotipada o partícula similar a virus del mismo a dichas células NK activadas,
en donde dicha partícula de vector retroviral pseudotipada o partícula similar a virus del mismo comprende una glicoproteína de envoltura de retrovirus endógeno de babuino (BaEV) modificada que es capaz de unirse y fusionarse con una membrana de célula hematopoyética, transfiriendo así material biológico a dichas células NK activadas,
en donde dicha glicoproteína de envoltura de retrovirus endógeno de babuino (BaEV) modificada que es capaz de unirse y fusionarse con una membrana de célula hematopoyética es:
una glicoproteína de envoltura quimérica que comprende o consiste en una fusión del dominio transmembrana y extracelular de una glicoproteína de envoltura de retrovirus endógeno de babuino (BaEV) y el dominio de cola citoplasmática de una glicoproteína de envoltura de virus de leucemia murina (MLV); o una glicoproteína de envoltura de BaEV modificada en donde el dominio de cola citoplasmática carece del péptido R inhibidor de fusión.
Dicho método, en donde dichas células NK son células NK humanas.
Dicho método, en donde dichas células NK a activar están en una muestra que comprende células NK, p. ej. una muestra de sangre completa o una muestra de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) que, p. ej. se puede obtener de la capa leucocitaria.
Dicho método, en donde antes de dicha activación de células NK, las células NK pueden enriquecerse en células NK CX3CR1 negativas a partir de una población o muestra que comprende células NK CX3CR1 positivas y CX3CR1 negativas.
Dicho enriquecimiento de células NK CX3CR1 negativas o subconjuntos/subpoblaciones de células NK CX3CR1 negativas se puede realizar mediante agotamiento de las células CX3CR1 negativas en un procedimiento de separación de una muestra o población que comprende células NK CX3CR1 positivas y CX3CR1 negativas, en donde la fracción agotada es la fracción objetivo que comprende las células CX3CR1 negativas, p.ej. mediante métodos de separación tales como métodos de separación de células, p. ej. MACS® (Miltenyi Biotec GmbH) o separación de células activadas por fluorescencia, tal como citometría de flujo, utilizando anticuerpos anti-CX3CR1 o fragmentos de los mismos.
Se prefiere transducir una subpoblación de células NK CX3CR1 negativas (o una célula NK CX3CR1 negativa) con el método descrito en el presente documento ya que logra tasas de transducción extremadamente altas (véase el Ejemplo 9).
Dicho método, en donde dichas células NK que se van a activar en la etapa a) son células NK CX3CR1 negativas.
Preferiblemente, dichas células NK CX3CR1 negativas comprenden menos de 20%, 15%, 10%, 5% o 1% de células NK CX3CR1 positivas en una composición que comprende células NK que se usa para ser activadas dentro del método como se describe en el presente documento.
Las partículas de vector retroviral pseudotipadas o partículas similares a virus del mismo que comprenden glicoproteínas de envoltura de retrovirus endógeno de babuino (BaEV) modificadas que son capaces de unirse y fusionarse con una membrana de célula hematopoyética son bien conocidas en la técnica y se describen, por ejemplo, en la publicación internacional WO2013/045639A1.
Dicho método, en donde dicha activación de dichas células NK se puede lograr mediante la adición de al menos una citoquina o células nutrientes o partículas de membrana de células nutrientes o con un reactivo de activación de células NK a dichas células NK. Habitualmente, después de 2 a 3 días, el efecto de la activación de las células NK conduce a la proliferación de las células NK.
Dicho método, en donde dicha al menos una citoquina se selecciona del grupo que consiste en citoquinas de cadena gamma común que incluyen, pero no se limitan a, IL-2, IL-7, IL-15, IL-21 o citoquinas de la familia IL-1 que incluyen, pero no se limitan a IL-1 a (IL-1 alfa), IL1b (IL-1beta), IL-18, IL-33, Il-36, IL37 e Il38.
Dicha al menos una citoquina puede ser IL-2.
Dicha al menos una citocina puede ser IL-15.
Dichas citoquinas pueden ser IL-2 e IL15.
Dicho método, en donde una citoquina o una combinación de citoquinas que activan las células NK (tales como IL-2 y/o Il-15) se combina con una citoquina de la familia IL-1, conduciendo así a una activación más temprana (“una activación a corto plazo”) de dichas células NK en comparación con la activación sin la citoquina de la familia IL-1.
Dicho método, en donde dicha activación de células NK se logra mediante la adición de una combinación de citoquinas que comprende al menos una citoquina que activa las células NK y una citoquina de la familia IL-1, lo que lleva a una activación a corto plazo de las células NK.
Dicho método, en donde dicha combinación de citoquinas es IL-2 y/o IL-15 y una citoquina de la familia IL-1. El uso de una o más citoquinas que activan las células NK (tal como IL-2 y/o IL-15) junto con una citoquina de la familia IL-1 (tal como IL-18 o IL-33) conduce a una activación a corto plazo que reduce p. ej. el período entre el inicio de un procedimiento de cultivo para la activación de células NK y el punto de inicio que permite una transducción eficiente de las células NK activadas con la partícula de vector retroviral como se describe en el presente documento. Sorprendentemente, la combinación de una citoquina de la familia IL-1 y una o más citoquinas que activan células NK (tales como IL-2 y/o IL-15) y la transducción con la partícula de vector retroviral como se describe en el presente documento conduce a tasas de transducción más altas en comparación con la transducción de la partícula de vector retroviral en células NK que han sido activadas en un procedimiento más largo, es decir, que no se beneficiaron del procedimiento de activación a corto plazo inducido por la presencia de una citocina de la familia IL-1 tal como IL-18, IL-33 o IL-1beta.
Dicha citoquina de la familia IL-1 se puede seleccionar del grupo que consiste en IL-1 alfa, IL-1 beta, IL-1 Ra, IL-18, IL-36Ra, IL-36alfa, IL-37, IL-36beta, IL-36gamma, IL-38 e IL-33. Preferiblemente, dicha citoquina de la familia IL-1 puede ser IL-18, IL-33 o IL-1 beta.
Dicho método, en donde dicha citoquina de la familia IL-1 es IL-18, que conduce así a una activación a corto plazo en el espacio de 1 hora, 2 horas, 4 horas, 8 horas, 12 horas, 18 horas, 24 horas (1 día), 28 horas, 36 horas, 42 horas o 48 horas (2 días).
Dicho método, en donde dicha citoquina de la familia IL-1 es IL-33, que conduce así a una activación a corto plazo en el espacio de 1 hora, 2 horas, 4 horas, 8 horas, 12 horas, 18 horas, 24 horas (1 día), 28 horas, 36 horas, 42 horas o 48 horas (2 días).
La adición de una citoquina de la familia IL-1 tal como IL-18, IL-33 o IL-1beta, p. ej. al comienzo de un sistema de cultivo celular junto con otras citoquinas que se sabe que activan las células NK en un medio que comprende células NK conduce a una activación de dichas células NK tan pronto como en 1 hora, 2 horas, 4 horas, 8 horas, 12 horas, 18 horas, 24 horas (1 día), 28 horas, 36 horas, 42 horas o 48 horas (2 días) después de la adición de dicha citoquina de la familia IL-1. Por lo tanto, la adición de una citoquina de la familia IL-1 a las células NK, preferiblemente en un medio de cultivo celular, conduce en el espacio de 1 hora, 2 horas, 4 horas, 8 horas, 12 horas, 18 horas, 24 horas (1 día), 28 horas, 36 horas, 42 horas o 48 horas (2 días). a una activación a corto plazo de las células NK.
Las citoquinas descritas anteriormente se pueden administrar a un medio de cultivo celular que comprende dichas células NK en concentraciones bien conocidas por el experto en la técnica y que se usan comúnmente. Dicho método, en donde dicha activación de dichas células NK se puede lograr mediante la adición de una citoquina de la familia IL-1 sin otras citoquinas o células nutrientes o partículas de membrana de células nutrientes o con un reactivo de activación de células NK a dichas células NK.
Dicho método, en donde dicha activación de dichas células NK se puede lograr mediante la adición de una citoquina IL-1 junto con células nutrientes o partículas de membrana de células nutrientes o con un reactivo de activación de células NK a dichas células NK.
Dicho método, en donde la eficiencia de transducción de las células NK por dicha partícula de vector retroviral pseudotipada es al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80% o al menos 90%.
Dicho método, en donde dicha partícula de vector retroviral o partícula similar a virus del mismo es una partícula de vector lentiviral o partícula similar a virus del mismo.
Dicho método, en donde dicho método se realiza en un procedimiento automatizado en un sistema cerrado.
En un aspecto, que no forma parte de la invención, la presente descripción proporciona una partícula de vector retroviral pseudotipada o una partícula similar a virus del mismo para su uso en el tratamiento de un ser humano que padece un trastorno, mediante la transferencia de material biológico in vivo a una célula NK activada, en donde dicha partícula de vector retroviral pseudotipada o partícula similar a virus del mismo comprende una glicoproteína de envoltura de retrovirus endógeno de babuino (BaEV) modificada como se describe en el presente documento que es capaz de unirse y fusionarse con una membrana de célula hematopoyética, transfiriendo así material biológico a dichas células NK activadas.
El trastorno puede ser un trastorno que se puede tratar o es tratable con dichas células NK.
En un aspecto adicional , que no forma parte de la invención, la presente descripción proporciona una combinación de composiciones para usar en el tratamiento de un ser humano que padece un trastorno transfiriendo material biológico in vivo a células NK activadas, que comprende
a) Una primera composición que comprende al menos una citoquina que activa las células NK, y
b) Una composición que comprende una partícula de vector retroviral pseudotipada o partícula similar a virus del mismo, en donde dicha partícula de vector retroviral pseudotipada o partícula similar a virus del mismo comprende una glicoproteína de la envoltura de retrovirus endógeno de babuino (BaEV) modificada como se describe en el presente documento que es capaz de unirse a y fusionarse con una membrana de célula hematopoyética
El trastorno puede ser un trastorno que se puede tratar o es tratable con dichas células NK.
Dicha combinación de composiciones, en donde dicha primera composición comprende una combinación de citoquinas que comprende al menos una citoquina que activa las células NK y una citoquina de la familia IL-1. Dicha combinación de composiciones, en donde dicha combinación de citoquinas comprende IL-2 y/o IL-15 y una citoquina de la familia IL-1.
Dicha combinación de composiciones, en donde dicha citoquina de la familia IL-1 es IL-18, IL-33 o IL-1beta.
Dicha combinación de composiciones para preparar células NK modificadas.
Dicha combinación de composiciones, en donde dicho material biológico es un ácido nucleico que codifica un receptor de antígeno quimérico.
En otro aspecto, que no forma parte de la invención, la presente descripción proporciona el uso de una partícula de vector retroviral pseudotipada o partícula similar a virus del mismo para transferir material biológico a una célula NK activada, en donde dicha partícula de vector retroviral pseudotipada o partícula similar a virus del mismo comprende una glicoproteína de la envoltura de retrovirus endógeno de babuino (BaEV) modificada, como se describe en el presente documento, que es capaz de unirse y fusionarse con una membrana de célula hematopoyética.
Dicho uso de una partícula de vector retroviral pseudotipada o partícula similar a virus del mismo para preparar células NK modificadas.
Dicho uso de una partícula de vector retroviral pseudotipada o partícula similar a virus del mismo, en donde dicho material biológico es un ácido nucleico que codifica un receptor de antígeno quimérico.
En un aspecto adicional, que no forma parte de la invención, la presente descripción proporciona una célula NK transducida y/o modificada que se puede obtener mediante el método descrito en el presente documento.
Dicha célula NK modificada, en donde dicha célula NK está modificada para expresar un receptor de antígeno quimérico.
En un aspecto, la presente descripción, que no forma parte de la invención, proporciona una composición farmacéutica de células NK modificadas obtenidas mediante los métodos descritos en el presente documento.
Dicha composición farmacéutica, en donde dichas células NK modificadas expresan un receptor de antígeno quimérico.
Todas las definiciones, características y realizaciones definidas en el presente documento con respecto a un aspecto de la invención, p. ej. el primer aspecto de la invención, también se aplica mutatis mutandis en el contexto de los otros aspectos de la invención como se describe en el presente documento.
Definiciones
A menos que se definan de otra manera, los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto en la técnica a la que pertenece esta invención.
Retroviridae es una familia de virus con un genoma de ARN monocatenario, diploide y de sentido positivo que se transcribe de forma inversa en un ADN intermedio que luego se incorpora al genoma de la célula hospedante. Los virus derivados de Retroviridae son partículas envueltas con un diámetro de 80-120 nm.
Los vectores (retro-/lenti-/gammaretro-) virales son partículas virales con replicación deficiente que se derivan de la familia de virus correspondiente. Contienen proteínas Gag y Pol, un genoma de ARN monocatenario y normalmente están pseudotipados con proteínas de envoltura heterólogas derivadas de otros virus, p. ej. con una glicoproteína de la envoltura de retrovirus endógeno de babuino (BaEV) como se describe en el presente documento. El genoma de ARN de dichos vectores virales no contiene ningún gen viral para producir progenie viral, sino elementos psi y LTR que se requieren para el empaquetamiento eficiente y la transcripción inversa en ADN. El ADN intermedio puede contener un gen de interés bajo el control de un promotor adecuado, por ejemplo, el promotor de CMV y el gen de interés se expresa tras la integración de dicho ADN en el genoma de la célula hospedante. El proceso de entrar en la célula hospedante, suministrar el genoma de ARN, integración y expresión del gen de interés se llama transducción. Los requisitos mínimos de un vector viral basado en gammaretrovirus o lentivirus se han descrito bien en la técnica.
Además, se han desarrollado vectores retrovirales deficientes en integrasa (ID-RV) que no pueden integrar el genoma del vector retroviral en el genoma de la célula hospedante. Los ID-RV se derivan de vectores retrovirales convencionales, pero no contienen o contienen una forma mutada de integrasa retroviral. Tras entrar en la célula hospedante, el genoma del vector retroviral se transcribe de manera inversa en el citoplasma y es suministrado al núcleo, pero no se integra de manera estable en el genoma de la célula hospedante. Los ID-RV son herramientas útiles para expresar el gen de interés de forma transitoria. La definición de vectores retrovirales y de transducción también se extiende a los vectores retrovirales deficientes en integración y su aplicación.
Lentivirus es un género de Retroviridae que causa enfermedades crónicas y mortales caracterizadas por largos períodos de incubación, en el ser humano y otras especies de mamíferos. El lentivirus más conocido es el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), que puede infectar eficazmente células que no se dividen, por lo que los vectores retrovirales derivados de lentivirus son uno de los métodos más eficaces de suministro de genes. Gammaretroviridae es un género de la familia Retroviridae. Las especies representativas son el virus de la leucemia murina y el virus de la leucemia felina.
Las partículas similares a virus (VLP) se parecen a las partículas virales, pero no infectan ni transducen porque no contienen material genético viral que codifique las proteínas de la partícula similar a virus. En particular, las VLP en el contexto de vectores retrovirales no contienen moléculas de ácido nucleico psi positivas. Algunas partículas similares a virus pueden contener ácido nucleico distinto de su genoma. La expresión de proteínas estructurales virales, tales como de la envoltura o la cápside, puede dar como resultado el ensamblaje de partículas similares a virus (VLP). Al igual que en el caso de los vectores retrovirales, las VLP también se pueden pseudotipar utilizando las mismas construcciones de envoltura que para los vectores retrovirales. Las VLP se pueden utilizar para suministrar proteínas pero también ácidos nucleicos al citoplasma de las células diana. En particular, las VLP son útiles como vacunas. La expresión "captación de VLP", como se utiliza en el presente documento, se refiere a la unión de una VLP a la membrana de la célula diana, liberando así moléculas de ácido nucleico, proteínas o péptidos en la célula diana. El término "activación" como se usa en el presente documento se refiere a inducir cambios fisiológicos con una célula que aumentan la función, proliferación y/o diferenciación de la célula diana.
El término "pseudotipar" o "pseudotipado" como se usa en el presente documento se refiere a una partícula de vector que lleva glicoproteínas de envoltura derivadas de otros virus que tienen envolturas. Por tanto, la gama de hospedantes de los vectores lentivíricos o partículas de vectores de la presente invención se puede ampliar o alterar dependiendo del tipo de receptor de superficie celular utilizado por la glicoproteína.
Para generar vectores retrovirales, las proteínas gag, pol y env necesarias para ensamblar la partícula de vector se proporcionan en trans mediante una línea celular de empaquetamiento, por ejemplo, HEK-293T. Esto generalmente se logra mediante la transfección de la línea celular de empaquetamiento con uno o más plásmidos que contienen los genes gag, pol y env. Para la generación de vectores pseudotipados, el gen env, originalmente derivado del mismo retrovirus que los genes gag y pol y como molécula de ARN o vector de expresión, se intercambia por la(s) proteína(s) de la envoltura de un virus con envoltura diferente.
El retrovirus endógeno de babuino o BaEV es un retrovirus de tipo C presente en múltiples copias provirales en el ADN de los babuinos. En la publicación internacional WO2013045639A1 se describen en detalle la glicoproteína de la envoltura de BaEV de tipo natural (glucoproteína de la envoltura de BaEV no modificada) y las glicoproteínas de la envoltura de BaEV que tienen mutaciones definidas (modificaciones) que se incorporaron a un nivel más alto en la superficie lentiviral que la glicoproteína de BaEV de tipo natural.
La expresión "glicoproteína de la envoltura de BaEV" como se usa en el presente documento se refiere a la forma natural de la glicoproteína de la envoltura de BaEV o a un mutante de dicha glicoproteína de la envoltura de BaEV de tipo natural que es al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, o al menos 99% idéntica a dicha glicoproteína de envoltura de BaEV de tipo natural, con la condición de que dicha glicoproteína mutante conserve la capacidad de la glicoproteína de tipo natural de unirse y fusionarse con la membrana de células hematopoyéticas.
Preferiblemente, la glicoproteína de envoltura de BaEV de tipo natural consiste en la secuencia SEQ ID NO: 1. Como sabe el experto en la técnica, la glicoproteína de envoltura de BaEV está constituida por un dominio de cola citoplásmica, un dominio transmembrana y un dominio extracelular. El experto en la técnica puede determinar fácilmente las regiones correspondientes al dominio de cola citoplasmática, el dominio transmembrana y el dominio extracelular en la secuencia de la glicoproteína de la envoltura. Normalmente, el dominio de cola citoplasmática se encuentra entre los aminoácidos 530 a 564 de la glicoproteína de la envoltura de BaEV de tipo natural. Normalmente, el dominio transmembrana se encuentra entre los aminoácidos 507 a 529 de la glicoproteína de la envoltura de BaEV de tipo natural. Normalmente, el dominio extracelular se encuentra entre los aminoácidos 1 a 506 de la glicoproteína de la envoltura de BaEV de tipo natural.
En una realización particular de la invención, el dominio de cola citoplásmica de la glicoproteína de la envoltura de BaEV está desprovisto del péptido R inhibidor de la fusión.
En el contexto de la invención, la expresión "péptido R inhibidor de la fusión" se refiere a la porción C-terminal del dominio de cola citoplasmática de la glicoproteína de la envoltura que alberga una señal de endocitosis de tirosina -YXXL -(SEQ ID NO: 2) y que es escindida por la proteasa viral durante la maduración del virión, mejorando así la fusión de la membrana de la glicoproteína de la envoltura. El péptido R inhibidor de la fusión de la glicoproteína de la envoltura de BaEV se localiza típicamente entre los aminoácidos 547 y 564 de la glicoproteína de la envoltura de BaEV de tipo natural.
Por lo tanto, en una realización particularmente preferida, la glicoproteína de la envoltura de BaEV modificada en donde el dominio de la cola citoplasmática está desprovisto del péptido R inhibidor de la fusión comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 3.
En otra realización particular, el dominio de cola citoplasmática de la glicoproteína de la envoltura de BaEV se reemplaza por el dominio de cola citoplasmática de una glicoproteína de la envoltura de virus de la leucemia murina (MLV).
La glicoproteína de la envoltura de virus de la leucemia murina es preferiblemente la de la cepa 4070A.
En el contexto de la invención, la expresión "glicoproteína de la envoltura de MLV" se refiere a la forma natural de la glicoproteína de la envoltura de MLV o a un mutante de dicha glicoproteína de la envoltura de MLV de tipo natural que es al menos 80%, al menos 85%, al menos un 90%, al menos un 95%, al menos un 99% idéntica a dicha glicoproteína de la envoltura de MLV de tipo natural, siempre que dicha glicoproteína mutante conserve la capacidad de la glicoproteína de la envoltura de tipo natural de interaccionar con proteínas del núcleo viral, en particular proteínas del núcleo lentivirales.
El experto en la técnica puede determinar fácilmente la región correspondiente al dominio de cola citoplasmática en la secuencia de la glicoproteína de la envoltura. Normalmente, el dominio de cola citoplásmica de la glicoproteína de la envoltura de MLV se encuentra entre los aminoácidos 622 y 654 de la glicoproteína de la envoltura de MLV de tipo natural.
Por lo tanto, en una realización particularmente preferida, la glicoproteína de envoltura quimérica que comprende o consiste en una fusión del dominio transmembrana y extracelular de una glicoproteína de envoltura de BaEV y el dominio de cola citoplasmática de una glicoproteína de envoltura de MLV comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 4.
Tal como se pretende en el presente documento, la expresión "material biológico" se refiere a uno o más compuestos capaces de alterar la estructura y/o la función de una célula. En el contexto de la presente invención, se define que el material biológico es uno o más ácidos nucleicos, que en el caso de partículas de vectores lentivirales pueden estar comprendidos dentro del genoma de la partícula de vector.
Como se pretende en el presente documento, "transferir" se refiere a la capacidad de la partícula de vector o partícula similar a vector para suministrar inicialmente el material biológico, es decir, en el contexto de la presente invención, el uno o más ácidos nucleicos, a la membrana o al citoplasma de la célula diana, tras unirse a la célula diana. En el presente documento, normalmente la célula diana es una célula NK.
La expresión "células citolíticas naturales (células NK)", como se usa en el presente documento, son células NK normalmente humanas y se definen como linfocitos granulares grandes (LGL) y constituyen el tercer tipo de células diferenciadas de los linfocitos B y T que generan progenitores linfoides comunes. Se sabe que las células NK se diferencian y maduran en la médula ósea, ganglios linfáticos, bazo, amígdalas y timo, donde luego entran a la circulación. Las células NK se diferencian de las células T citolíticas naturales (NKT) fenotípicamente, por su origen y por sus respectivas funciones efectoras; a menudo, la actividad de las células NKT promueve la actividad de las células NK al secretar IFNy. A diferencia de las células NKT, las células NK no expresan receptores de antígenos de células T (TCR) ni marcadores pan-T CD3 ni receptores de células B de inmunoglobulinas (Ig) de superficie, pero normalmente expresan los marcadores de superficie CD16 (FcyRIII) y CD56 en seres humanos, NK1.1 o NK1.2 en ratones C57BL/6. Hasta el 80% de las células NK humanas también expresan CD8. Se pueden establecer líneas de células NK en crecimiento continuo a partir de pacientes con cáncer y las líneas de células NK comunes son, por ejemplo, NK-92, NKL e YTS.
Los términos “título” o “eficiencia de transducción” se utilizan como un medio para caracterizar y comparar partículas de vector con respecto a su capacidad para transducir sus células diana. Por lo tanto, las partículas de vector que tienen un “título mayor” o una “eficacia de transducción mayor” son capaces de transducir un mayor número de células en un volumen de partículas de vector dado que otras partículas de vector con el mismo volumen.
La expresión “célula NK activada” como se usa en el presente documento se refiere a un cambio de las células en comparación con las células NK naíve, recién aisladas y no activadas por una condición estimulante, que se pone de manifiesto en un perfil de expresión génica modificado o señalización celular modificada, que conduce a células NK con propiedades celulares diferentes en comparación con las células NK no activadas. Las “células NK activadas” pueden, por ejemplo, aumentar la expresión de ciertos receptores de superficie, tales como NKp44, NKG2D, DNAM-1 o TRAIL, o cambiar la expresión de receptores de citoquinas, por ejemplo, regular por aumento CD25. Las células NK activadas pueden cambiar su fase del ciclo celular de células quiescentes en G0 a G1, S o G2, y pueden comenzar a proliferar o proliferar más rápido.
La expresión “células NK CX3CR1 negativas” o células NK CX3CR1neg” o “células NK CX3CR1-“ o “células NK agotadas en CX3CR1” o “células NK CX3CR1agotadas “ se refieren a una población de células NK que no expresan el marcador CX3CR1 en su superficie celular.
El receptor 1 de quimioquina CX3C (CX3CR1), también conocido como el receptor de fractalquina o receptor 13 acoplado a proteína G (GPR13), es una proteína que en seres humanos es codificada por el gen CX3CR1. Como sugiere el nombre, este receptor se une a la quimiocina CX3CL1 (también llamada neurotactina o fractalquina).
La expresión “activación a corto plazo”, tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a la posibilidad de una activación más rápida de las células NK mediante la adición de una citoquina de la familia Il-1, p. ej. a los medios de cultivo celular que comprenden células NK que se van a activar en comparación con la activación de células NK estándar usando, p. ej., diferentes citoquinas que se sabe que activan las células NK, pero ninguna citoquina de la familia IL-1. La activación de las células NK se produce en presencia de una familia de IL-1 ya después de 1 hora, 2 horas, 4 horas, 8 horas, 12 horas, 18 horas, 24 horas (1 día), 28 horas, 36 horas, 42 horas o 48 horas (2 días).
La expresión “reactivo de activación de células NK” se refiere a una molécula tal como una partícula, perla o nanomatriz que tiene acoplado a la misma uno o más agentes estimuladores que proporcionan señales de activación a las células Nk tales como anticuerpos estimulantes contra CD2 y CD335. Un ejemplo de tal reactivo de activación de células NK es el kit de activación/expansión de células NK de Miltenyi Biotec (Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Alemania, n.° de pedido 130-094-483) o la nanomatriz descrita en el documento EP2824112B1.
La familia de la interleuquina-1 (familia IL-1) es un grupo de 11 citoquinas que desempeña un papel central en la regulación de las respuestas inmunitarias e inflamatorias a infecciones o agresiones estériles.
Dichas citoquinas de la familia IL-1 son IL-1 alfa, IL-1beta, IL-1 Ra, IL-18, IL-36Ra, IL-36alfa, IL-37, IL-36beta, IL-36gamma, IL-38 e IL-33. Como se describe en el presente documento, la adición de una citoquina de la familia IL-1 a un procedimiento de activación de células NK estándar (técnica anterior) usando, p. ej., otras citoquinas acelera la activación de las células NK, lo que lleva a una activación a corto plazo de las células NK.
La citoquina de la familia IL-1 también puede ser una variante de la misma que tiene algunos aminoácidos eliminados, añadidos o reemplazados mientras todavía conserve la función de la citoquina. Por lo tanto, en esta definición se incluyen variantes de la secuencia de aminoácidos de la citoquina de tipo natural que tienen una identidad de secuencia de al menos 70%, o al menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% o 99% a nivel de secuencia de aminoácidos. En el contexto de la presente invención, la "identidad de secuencia" se puede determinar usando alineamientos por pares usando programas de alineamiento para secuencias de aminoácidos bien conocidos en la técnica.
La citoquina de la familia IL-1 también puede ser un fragmento funcional de la citoquina de longitud completa que tiene una identidad de secuencia de al menos 70%, o al menos 75%, o al menos 80%, o al menos 85%, o al menos 90%, o al menos 95%, o al menos 97%, o al menos 98%, o al menos 99% a nivel de la secuencia de aminoácidos con la parte correspondiente de dicha citoquina de longitud completa ("citoquina de la familia Il-1 o un fragmento funcional de la misma).
En general, están incluidas en esta definición todas las variaciones de aminoácidos (es decir, sustituciones, adiciones o eliminaciones de aminoácidos de la citoquina de la familia Il-1) que no conducen a la pérdida de las características de la citoquina de la familia Il-1 como se describe en el presente documento.
El término "expresión", tal como se utiliza en el presente documento, se define como la transcripción y/o traducción de una secuencia de nucleótidos particular dirigida por su promotor en una célula.
La expresión "células nutrientes" se refiere a células que se añaden a un cultivo de células diana (es decir, aquí células citolíticas naturales) para apoyar su supervivencia y/o crecimiento. Las células nutrientes proporcionan una matriz extracelular intacta y funcional y factores asociados a la matriz y secretan citoquinas conocidas y desconocidas en el medio condicionado. Normalmente las células nutrientes tienen el crecimiento detenido para evitar su proliferación en el cultivo, pero se mantiene su supervivencia. La detención del crecimiento se puede lograr mediante irradiación con una dosis eficaz o tratamiento con una dosis eficaz de sustancias químicas tales como la mitomicina C. Hay varios tipos de células nutrientes, incluidas las células mononucleares de sangre periférica irradiadas (en adelante también abreviadas como "PBMC"), PBMC agotadas de células NK, líneas celulares cancerosas, líneas celulares cancerosas modificadas genéticamente y linfocitos inmortalizados mediante infección natural con el virus de Epstein-Barr (en adelante también abreviado como "EBV").
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "cultivo" incluye proporcionar las condiciones químicas y físicas (p. ej., temperatura, gas) que se requieren para el mantenimiento de las células NK y factores de crecimiento. A menudo, el cultivo de células NK incluye proporcionar a las células NK las condiciones para su expansión (proliferación). Ejemplos de condiciones químicas que pueden mantener la expansión de las células NK incluyen, pero no se limitan a, tampones, suero, nutrientes, vitaminas, antibióticos, citoquinas y otros factores de crecimiento que se proporcionan habitualmente (o se pueden administrar manualmente) al medio de cultivo celular adecuado para la expansión de células NK. En una realización, el medio de cultivo de células NK incluye medio de investigación NK MACS (Miltenyi Biotec GmbH) suplementado con suero humano tipo AB al 5% (Life Technologies), IL-2 500 U/ml (Miltenyi) y IL-1510 ng/ml (Miltenyi). Otros medios adecuados para usar para expandir células NK son bien conocidos en la técnica.
La expresión “medio de cultivo celular”, tal como se utiliza en el presente documento, incluye líquidos que proporcionan las condiciones químicas que son necesarias para el mantenimiento de las células NK. Ejemplos de condiciones químicas que pueden mantener la expansión de las células NK incluyen, pero no se limitan a, soluciones, tampones, suero, componentes del suero, nutrientes, vitaminas, citoquinas y otros factores de crecimiento que se proporcionan habitualmente en (o se pueden administrar manualmente al) medio de cultivo celular. Los medios adecuados para usar para cultivar células NK como se conoce en la técnica incluyen NK MACS (Miltenyi), TexMACS (Miltenyi), CellGro SCGM (CellGenix), X-Vivo 10, X-Vivo 15, BINKIT NK Cell Initial Medium (Cosmo Bio EE. UU.), AIM-V (Invitrogen), DMEM/F12, medio de cultivo de células NK (Upcyte Technologies). Los términos "IL-2" e "IL-15", tal como se usan en el presente documento, se refieren a las citoquinas Interleuquina-2 e Interleuquina-15 y derivados de las mismas, p. ej. IL-2 superquina, proteína de fusión de toxina diftérica IL-2 o sushi de IL-15Ra.
El término IL-2 y/o IL-15 generalmente se refiere a miembros de la familia de citoquinas del haz de hélice 4a que se unen a los receptores heterotriméricos para IL2 e IL15 que comparten la cadena gamma común e IL2/IL15Rp (también conocido como IL2Rp, CD122).
La expresión "añadir (repetidamente) una concentración eficaz de IL-2 y/o IL-15" como se usa en el presente documento se refiere a concentraciones de IL-2 en dicho medio de cultivo celular entre 1 U/ml y 5000 U/ml, preferiblemente entre 10 U/ml y 1000 U/ml, más preferiblemente entre 50 y 500 U/ml, y/o se refiere a concentraciones de IL-15 en dicho medio de cultivo celular entre 0,1 y 1000 ng/ml, preferiblemente entre 1 y 200 ng/ml, más preferiblemente entre 10 y 100 ng/ml. Normalmente, la concentración de IL-2 y/o IL-15 disminuye con el tiempo durante el procedimiento de cultivo, por lo tanto, IL-2 y/o IL-15 se pueden añadir repetidamente al medio de cultivo celular para mantener los niveles de la(s) citoquina(s) en la(s) concentración(es) efectiva(s). Habitualmente, se pueden volver a añadir IL-2 y/o IL-15 al cultivo celular mediante un cambio del medio de cultivo celular. En este contexto "repetidamente" significa al menos una repetición dentro de todo el procedimiento de cultivo. No es necesario añadir IL-2 y/o IL-15 al inicio del procedimiento de cultivo, pero al menos en el primer cambio de medio, es decir, después de 7 días. Sin embargo, es ventajosa la adición de IL-2 y/o IL-15 al comienzo del procedimiento de cultivo.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "expansión" o "proliferación" se refiere al crecimiento celular y a la multiplicación del número de células. La expansión o proliferación, como se usa en el presente documento, se refiere a un mayor número de células NK que se producen durante el procedimiento de cultivo.
Las expresiones "procedimiento de cultivo" o "cultivo" como se usan en el presente documento se refieren al cultivo y expansión de células NK, en donde el día de inicio (punto de partida) del procedimiento de cultivo, es decir, la expansión de células NK, se define como el día 0. El procedimiento de cultivo puede durar tanto tiempo como lo desee el operador y puede realizarse siempre que el medio de cultivo celular tenga condiciones que permitan que las células sobrevivan y/o crezcan y/o proliferen.
La expresión "comienzo del procedimiento de cultivo" como se usa en el presente documento se refiere al inicio del procedimiento de expansión mediante la adición de factores de crecimiento tales como IL-2 y/o IL-15 al medio de cultivo celular, es decir, las células se inician para empezar su procedimiento de proliferación. La adición de una citoquina de la familia IL-1, tal como IL-18 o IL-33, acelera el procedimiento de activación de las células NK y prepara para una transducción eficiente, por lo que la citoquina de la familia IL-1 debe administrarse al medio junto con otras citoquinas bien conocidas que activan las células Nk . Preferiblemente, la concentración eficaz de una citoquina de la familia IL-1 se añade una vez al medio de cultivo celular únicamente. Alternativamente, la concentración eficaz de una citoquina de la familia IL-1 se añade repetidamente, p. ej. dos veces o más frecuentemente, a dicho medio de cultivo celular.
La expresión "añadir (repetidamente) una concentración eficaz de una citoquina de la familia IL-1" como se usa en el presente documento se refiere a concentraciones de dicha citoquina de la familia IL-1 en dicho medio de cultivo celular entre 1 U/ml y 5000 U/ml, preferiblemente entre 10 U/ml y 1000 U/ml, más preferiblemente entre 50 y 500 U/ml. La expresión "partículas de membrana de células nutrientes" como se usa en el presente documento se refiere a preparaciones de membrana de las células nutrientes que contienen las moléculas de superficie estimulantes de las células NK de las células nutrientes. Se pueden utilizar partículas de membrana de las células nutrientes para evitar posibles desventajas de las células nutrientes vivas. Las partículas de membrana de células nutrientes pueden producirse mediante lisis y alteración de las células usando cavitación con nitrógeno seguida del aislamiento y purificación de la fracción de membrana celular mediante centrifugación en gradiente de densidad, descrita a modo de ejemplo por Oyer et al. (Oyer 2015). Normalmente, en el método descrito en el presente documento, las células nutrientes pueden reemplazarse por partículas de membrana de dichas células nutrientes. Preferiblemente, las partículas de membrana deberían usarse en cantidades que sean comparables a estas cantidades que pueden obtenerse mediante las células nutrientes vivas usadas. Preferiblemente, la concentración de partículas de membrana usadas puede estar entre 100 y 400 gg/ml, más preferiblemente entre 150 y 250 gg/ml. La adición de partículas de membrana se puede realizar con tanta frecuencia como la adición de células nutrientes vivas.
Las expresiones "célula modificada" y "célula modificada genéticamente" (en el presente documento especialmente células NK) tal como se usan en el presente documento se pueden usar indistintamente. Los términos significan contener y/o expresar un gen extraño o una secuencia de ácido nucleico que a su vez modifica el genotipo o fenotipo de la célula o su progenie. Especialmente, las expresiones se refieren al hecho de que las células pueden manipularse mediante métodos recombinantes bien conocidos en la técnica para expresar de manera estable o transitoria péptidos o proteínas que no se expresan en estas células en el estado natural. La expresión "sistema cerrado" como se usa en el presente documento se refiere a cualquier sistema cerrado que reduzca el riesgo de contaminación del cultivo celular mientras se realizan procedimientos de cultivo tales como la introducción de nuevo material y se realizan etapas de cultivo celular tales como proliferación, diferenciación, activación y/o separación de células. Un sistema de este tipo permite operar en condiciones GMP o similares a GMP ("estéril"), dando como resultado composiciones celulares que son clínicamente aplicables. En el presente documento a modo de ejemplo, se utiliza el CliniMACS Prodigy® (Miltenyi Biotec GmbH, Alemania) como sistema cerrado. Este sistema se describe en la publicación internacional W02009/072003. Pero no se pretende limitar el uso del método de la presente invención al CliniMACS® Prodigy. Las expresiones "método automatizado" o "procedimiento automatizado", tal como se utilizan en el presente documento, se refieren a cualquier procedimiento que se automatiza mediante el uso de dispositivos y/o computadoras y software de computadora que de otro modo serían o podrían ser realizados manualmente por un operador. Los métodos (procedimientos) que han sido automatizados requieren menos intervención humana y menos tiempo humano para su ejecución. En algunos casos, el método de la presente invención se automatiza si al menos una etapa del presente método se realiza sin ningún apoyo o intervención humana. Preferiblemente, el método de la presente invención está automatizado si todas las etapas del método como se describe en el presente documento se realizan sin apoyo o intervención humana. Preferiblemente el procedimiento automatizado se implementa en un sistema cerrado tal como CliniMACS® Prodigy. Los CAR comprenden un fragmento variable monocatenario (scFv) de un anticuerpo específico para un determinado antígeno diana acoplado a través de regiones bisagra y transmembrana a dominios citoplasmáticos de moléculas de señalización celular. Los restos de activación de linfocitos más comunes incluyen un dominio coestimulador celular (p. ej., CD28, CD137, OX40, ICOS y CD27) en tándem con un resto desencadenante celular (p. ej., CD3Z). La inmunoterapia adoptiva mediada por CAR permite que las células injertadas con CAR reconozcan directamente el antígeno deseado en las células diana de una manera no restringida por HLA.
Realizaciones
En una realización de la invención, un ácido nucleico transgénico, p. ej. un ácido nucleico que codifica un receptor de antígeno quimérico se transfiere a una célula NK activada con una partícula de vector retroviral, p. ej. una partícula de vector lentiviral, que está pseudotipada con una glicoproteína de envoltura de retrovirus endógeno de babuino (BaEV) modificada que es capaz de unirse y fusionarse con una membrana de célula hematopoyética.
Dicha partícula de vector retroviral pseudotipada, p. ej. la partícula de vector lentiviral comprende una glicoproteína de envoltura quimérica que comprende o consiste en una fusión del dominio transmembrana y extracelular de una glicoproteína de envoltura de retrovirus endógeno de babuino (BaEV) y el dominio de cola citoplasmática de una glicoproteína de envoltura de virus de leucemia murina (MLV) o una glicoproteína de la envoltura de BaEV modificada en donde el dominio de cola citoplasmática carece del péptido R inhibidor de la fusión.
Las células NK en un medio de cultivo celular que comprende células NK se activan, p. ej. mediante la adición de IL-2 y/o IL-15 al medio. Después de 2 a 5 días, el efecto de la activación de las células NK conduce a la proliferación de las células NK. Luego dicha partícula de vector retroviral pseudotipada, p. ej. partícula de vector lentiviral se puede añadir al medio, es decir, a las células NK activadas. Las células NK activadas son transducidas por dicha partícula de vector, se expanden en el medio y expresan el transgén, p. ej. el receptor de antígeno quimérico.
Estas células NK modificadas pueden usarse para tratar a un sujeto que lo necesite.
En otra realización de la invención, un ácido nucleico transgénico, p. ej. un ácido nucleico que codifica un receptor de antígeno quimérico se transfiere a una célula NK activada con una partícula de vector retroviral, p. ej. una partícula de vector lentiviral, que está pseudotipada con una glicoproteína de envoltura de retrovirus endógeno de babuino (BaEV) modificada que es capaz de unirse y fusionarse con una membrana de célula hematopoyética.
Dicha partícula de vector retroviral pseudotipada, p. ej. la partícula de vector lentiviral comprende una glicoproteína de envoltura quimérica que comprende o consiste en una fusión del dominio transmembrana y extracelular de una glicoproteína de envoltura de retrovirus endógeno de babuino (BaEV) y el dominio de cola citoplasmática de una glicoproteína de envoltura de virus de leucemia murina (MLV) o una glicoproteína de envoltura de BaEV modificada en donde el dominio de cola citoplasmática carece del péptido R inhibidor de la fusión.
Las células NK en un medio de cultivo celular que comprende células NK se activan mediante la adición de IL-2 y/o IL-15 y una citoquina de la familia IL-1, p. ej. IL-18 o IL-33 al medio. Después de 1 hora, 2 horas, 4 horas, 8 horas, 12 horas, 18 horas, 24 horas (1 día), 28 horas, 36 horas, 42 horas o 48 horas (2 días) las células NK están activadas. Luego dicha partícula de vector retroviral pseudotipada, p. ej. una partícula de vector lentiviral se añade al medio, es decir, a las células NK activadas. Las células NK activadas son transducidas por dicha partícula de vector, se expanden en el medio y expresan el transgén, p. ej. el receptor de antígeno quimérico.
Estas células NK modificadas pueden usarse para tratar a un sujeto que lo necesite.
En una realización de la invención, dichas células NK en un medio de cultivo celular que comprende una población de células NK pueden ser células NK que se purifican mediante agotamiento de CD3 y enriquecimiento de CD56 utilizando un separador de células a escala clínica (CliniMACS plus, Miltenyi Biotec, Alemania). Estas células NK purificadas se transducen con la partícula de vector retroviral o partícula similar a virus del mismo como se define en la reivindicación 1.
En una realización de la invención, dichas células NK en un medio de cultivo celular que comprende una población de células NK pueden purificarse mediante agotamiento de CD3 y enriquecimiento de CD56, incluidas todas las etapas de marcador magnético en un sistema completamente cerrado (CliniMACS Prodigy®, Miltenyi Biotec, Alemania).
Estas células NK purificadas se transducen con la partícula de vector retroviral o la partícula similar a virus del mismo como se define en la reivindicación 1.
En una realización de la invención, dichas células NK en un medio de cultivo celular que comprende una población de células NK pueden ser células NK que se purifican a partir de una muestra de sangre humana tal como PBMC mediante separación celular magnética negativa. Las células NK se separan mediante el uso de perlas magnéticas acopladas a un cóctel de anticuerpos o fragmentos de los mismos que se unen a células no NK. La fracción negativa que comprende una población enriquecida de células NK se añade luego a un medio de cultivo celular adecuado para la activación de células NK y la transducción posterior, es decir, el medio comprende Il-2 y/o IL-15 y/o IL-18.
Estas células NK purificadas se transducen con la partícula de vector retroviral o partícula similar a virus del mismo como se define en la reivindicación 1.
En una realización de la invención, dichas células NK en un medio de cultivo celular que comprende una población de células NK pueden ser células NK que se purifican de sangre humana completa mediante separación celular magnética negativa y sedimentación de eritrocitos como se describe, p. ej., en la publicación internacional WO2013076070A1 (kit de aislamiento de células NK MACSxpress®, Miltenyi Biotec).
Estas células NK purificadas se transducen con la partícula de vector retroviral o la partícula similar a virus del mismo como se define en la reivindicación 1.
En una realización de la invención, dichas células NK en un medio de cultivo celular que comprende una población de células NK pueden ser células NK que son subpoblaciones purificadas de células NK. Estas células NK purificadas se transducen con la partícula de vector retroviral o la partícula similar a virus del mismo como se define en la reivindicación 1.
En una realización de la invención, dichas células NK en un medio de cultivo celular que comprende una población de células NK pueden ser células NK que son subpoblaciones de células NK CX3CR1 negativas purificadas. Estas células NK purificadas se transducen con la partícula de vector retroviral o la partícula similar a virus del mismo como se define en la reivindicación 1.
En una realización de la invención, dichas células NK en un medio de cultivo celular que comprende una población de células NK pueden ser células NK que son subpoblaciones de células NK KLRG1 o CD57 negativas purificadas. Estas células NK purificadas se transducen con la partícula de vector retroviral o la partícula similar a virus del mismo como se define en la reivindicación 1.
En una realización de la invención, dichas células NK en un medio de cultivo celular que comprende una población de células NK pueden ser células NK que son subpoblaciones de células NK NKG2C positivas purificadas. Estas células NK purificadas se transducen con la partícula de vector retroviral o la partícula similar a virus del mismo como se define en la reivindicación 1.
En una realización de la invención, dichas células NK en un medio de cultivo celular que comprende una población de células NK pueden ser células NK que son subpoblaciones de células NK de memoria purificadas. Estas células NK purificadas se transducen con la partícula de vector retroviral o la partícula similar a virus del mismo como se define en la reivindicación 1.
En una realización de la invención, dichas células NK en un medio de cultivo celular que comprende una población de células NK pueden ser células NK que son células NK de tipo memoria inducidas por citoquinas. Estas células NK se transducen con la partícula de vector retroviral o la partícula similar a virus del mismo como se define en la reivindicación 1.
En una realización de la invención, dichas células NK en un medio de cultivo celular que comprende una población de células NK pueden ser células NK que son subpoblaciones de células NK purificadas positivas para moléculas KIR individuales o positivas para moléculas KIR específicas. Estas células NK purificadas se transducen con la partícula de vector retroviral o la partícula similar a virus del mismo como se define en la reivindicación 1.
En una realización de la invención, dichas células NK en un medio de cultivo celular que comprende una población de células NK pueden ser células NK que son subpoblaciones de células NK purificadas que son específicas para péptidos virales. Estas células NK purificadas se transducen con la partícula de vector retroviral o la partícula similar a virus del mismo como se define en la reivindicación 1.
En una realización de la invención, dichas células NK en un medio de cultivo celular que comprende una población de células NK pueden ser células NK que están enriquecidas en una subpoblación secretora de citoquinas y quimiocinas. Estas células NK enriquecidas se transducen con la partícula de vector retroviral o la partícula similar a virus del mismo como se define en la reivindicación 1.
En una realización de la invención, dichas células NK en un medio de cultivo celular que comprende una población de células NK pueden ser células NK que son subpoblaciones aisladas usando un separador de células activado por fluorescencia. Estas células NK aisladas se transducen con la partícula de vector retroviral o la partícula similar a virus del mismo como se define en la reivindicación 1.
En una realización de la invención, dichas células NK en un medio de cultivo celular que comprende una población de células NK pueden ser células NK que son subpoblaciones aisladas usando un separador de células basado en microchip tal como MACSQuant Tyto® (Miltenyi Biotec GmbH). Estas células NK aisladas se transducen con la partícula de vector retroviral o la partícula similar a virus del mismo como se define en la reivindicación 1.
En una realización de la invención, dichas células NK en un medio de cultivo celular que comprende una población de células NK se transducen con la partícula de vector retroviral o la partícula similar a virus del mismo como se define en la reivindicación 1 para expresar un receptor de antígeno quimérico (CAR).
En una realización de la invención, dichas células NK en un medio de cultivo celular que comprende una población de células NK se transducen con la partícula de vector retroviral o la partícula similar a virus del mismo como se define en la reivindicación 1 para expresar un receptor de antígeno quimérico (CAR) que se une a una proteína marcada, tal como un anticuerpo biotinilado.
En una realización de la invención, dichas células NK en un medio de cultivo celular que comprende una población de células NK pueden ser células NK que se transducen con la partícula de vector retroviral o la partícula similar a virus del mismo como se define en la reivindicación 1 para expresar un receptor de células T (TCR).
En una realización de la invención, dichas células NK en un medio de cultivo celular que comprende una población de células NK pueden ser células NK que se transducen con la partícula de vector retroviral o la partícula similar a virus del mismo como se define en la reivindicación 1 para expresar uno o múltiples receptores de quimioquinas.
En una realización de la invención dichas células NK en un medio de cultivo celular que comprende una población de células NK pueden ser células NK que se transducen con la partícula de vector retroviral o la partícula similar a virus del mismo como se define en la reivindicación 1 para expresar una versión de mayor o menor afinidad de los receptores de células NK que la que se encuentra de forma natural. Dichos receptores de células NK pueden seleccionarse del grupo de receptores CD16, CD314/NKG2D, CD335/NKp46, NKp44, NKp30, CD226/DNAM-1 o similares a inmunoglobulina de células citolíticas.
En una realización de la invención, dichas células NK en un medio de cultivo celular que comprende una población de células NK pueden ser células NK que se transducen con la partícula de vector retroviral o la partícula similar a virus del mismo como se define en la reivindicación 1 para expresar una molécula inmunorreguladora tal como PD-L1, CTLA-4, LAG-3, CD39 o CD73.
En una realización de la invención dichas células NK en un medio de cultivo celular que comprende una población de células NK pueden ser células NK que se transducen con la partícula de vector retroviral o la partícula similar a virus del mismo como se define en la reivindicación 1 para aumentar o disminuir la expresión de receptores inhibidores, tales como las moléculas KIR, NKG2A, PD-1 o A2AR.
En una realización de la invención, dichas células NK en un medio de cultivo celular que comprende una población de células NK pueden ser células NK que se transducen con la partícula de vector retroviral o la partícula similar a virus del mismo como se define en la reivindicación 1 para producir citoquinas, tales como IL-2 o IL-15.
En una realización de la invención dichas células NK en un medio de cultivo celular que comprende una población de células NK pueden ser células NK que se transducen con la partícula de vector retroviral o la partícula similar a virus del mismo como se define en la reivindicación 1 para expresar un péptido terapéutico o proteína terapéutica, tal como un anticuerpo terapéutico.
En una realización de la invención, dichas células NK en un medio de cultivo celular que comprende una población de células NK pueden ser células NK que se transducen con la partícula de vector retroviral o la partícula similar a virus del mismo como se define en la reivindicación 1 para expresar una proteína para el seguimiento de células, tal como GFP para seguimiento fluorescente o luciferasa para el seguimiento quimioluminiscente con luciferina.
En una realización de la invención, dichas células NK son células NK infiltrantes de tumores aisladas de una biopsia de tumor. Estas células NK aisladas se transducen con la partícula de vector retroviral o la partícula similar a virus del mismo como se define en la reivindicación 1.
En una realización de la invención, dichas células NK se generan a partir de células progenitoras hematopoyéticas CD34+ de sangre de cordón umbilical en un procedimiento de cultivo celular. Estas células NK generadas se transducen con la partícula de vector retroviral o la partícula similar a virus del mismo como se define en la reivindicación 1.
En una realización de la invención, dichas células NK se generan a partir de células madre pluripotentes inducidas en un procedimiento de cultivo celular. Estas células NK generadas se transducen con la partícula de vector retroviral o la partícula similar a virus del mismo como se define en la reivindicación 1.
En una realización de la invención, dichas células NK se aíslan de la sangre de un donante seleccionado por su alta funcionalidad de células NK. Estas células NK aisladas y seleccionadas se transducen con la partícula de vector retroviral o la partícula similar a virus del mismo como se define en la reivindicación 1.
En una realización de la invención, dichas células NK se aíslan de la sangre del cordón umbilical. Estas células NK aisladas se transducen con la partícula de vector retroviral o la partícula similar a virus del mismo como se define en la reivindicación 1.
Ejemplos
Ejemplo 1: Sorprendentemente, el vector lentiviral pseudotipado con glicoproteína de la envoltura de babuino (BaEV) muestra una alta eficiencia de transducción de células NK primarias cuando las células NK se han preactivado. Para el aislamiento de células NK de capas leucocitarias, la preparación de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se realizó mediante centrifugación en gradiente de densidad estándar utilizando Ficoll-Paque PLUS (GE Healthcare). Se aplicó un kit de aislamiento de células NK humanas (Miltenyi Biotec) para el enriquecimiento intacto de células NK a partir de PBMC. Las células NK aisladas se dividieron en tres grupos, se activaron durante diferentes duraciones y se transdujeron con vectores lentivirales pseudotipados con BaEV que contenían GFP. Todas las transducciones se realizaron con vectofusina 10 ng/ml (Miltenyi Biotec) y espinoculación siguiendo el protocolo del fabricante. El primer grupo de células NK se transdujo inmediatamente después del aislamiento (sin activación). El segundo grupo de células NK se cultivó en medio NK MACS (Miltenyi Biotec) que contenía suero AB al 5%, IL-2 500 U/ml e IL-15 10 ng/ml durante 1 día (activadas en IL-2+IL-15 durante 1 día) y luego se transdujo. El tercer grupo de células NK se cultivó en medio NK Ma CS (Miltenyi Biotec) que contenía suero AB al 5%, IL-2 500 U/ml e IL-15 10 ng/ml durante 2 días (activadas en IL-2+IL-15 durante 2 días) y luego se transdujeron. Como control para cada grupo transducido, las células NK se cultivaron en las mismas condiciones que las células transducidas, excepto que no se añadió ningún vector viral (no transducidas). Tres días después de la transducción, las células NK no activadas mostraron solo 2,44% de transducción (sin activación, panel inferior izquierdo de la Figura 1). Por otro lado, los grupos de células NK que se cultivaron en medio NK MACS (Miltenyi Biotec) que contenía suero AB al 5%, IL-2500 U/ml e IL-15 10 ng/ml durante 1 día y 2 días, mostraron 14,59% y 22,61% de expresión de GFP, respectivamente (FIG. 1, transducidas, panel medio e inferior derecho). En cada grupo, las células NK no transducidas no mostraron ninguna expresión de GFP (FIG. 1, paneles superiores, no transducidas).
Ejemplo 2: La transducción de células NK activadas con BaEV es significativamente mayor que con VSV-G, estable durante mucho tiempo y no induce muerte celular.
Se aislaron células NK primarias como se describe en el Ejemplo 1, dando como resultado células NK CD3- y CD56+ puras (FIG. 2 A). Las células T se aislaron de las mismas muestras de sangre usando MicroPerlas contra CD4 y MicroPerlas contra CD8 de Miltenyi según el manual del usuario, lo que dio como resultado células T CD3 positivas puras (FIG. 2 A). Después del aislamiento, las células NK se activaron durante 2 días en medio NK MACS con suero AB al 5%, IL-1510 ng/ml e IL-2500 U/ml. Después del aislamiento, las células T se activaron durante 2 días en medio TexMACS con IL-2200 U/ml y T Cell Transact human de Miltenyi, según el manual del usuario. Luego, las células T primarias activadas y las células NK, así como la línea celular NK-92, se transdujeron con líquidos sobrenadantes que contenían vectores lentivirales que codificaban la expresión de GFP, ya sea pseudotipados con envoltura de VSV-G o pseudotipados con BaEV. Tres días después de la transducción con partículas virales pseudotipadas con VSV-G, las células NK mostraron solo aproximadamente 2% de expresión de GFP incluso con títulos de virus altos, mientras que las células T mostraron una alta expresión de GFP de aproximadamente 77% en las mismas condiciones (FIG. 2 B). Esta observación confirma que la transducción de células NK con vectores lentivirales pseudotipados con VSV-G es ineficiente, mientras que funciona para otros tipos de células, incluidas las células T. Sorprendentemente, 3 días después de la transducción de la línea celular NK NK-92 con el vector viral pseudotipado con BaEV, se observó una alta expresión de GFP de casi 100%, mientras que la expresión de GFP con VSV-G, similar a las células NK primarias, fue ineficaz (FIG. 2 C). Las células NK-92 se mantuvieron en condiciones de activación en medio NK MACS que contenía IL-2200 U/ml. En línea con la observación en NK-92, una tasa sorprendentemente alta de 60% de las células NK primarias activadas expresaron GFP cuando se aplicó la transducción con el vector pseudotipado con BaEV, alcanzando tasas de transducción comparables a las de las células T (FIG. 2 D). Es importante destacar que las tasas de expansión, es decir, el aumento en el número de células a lo largo del tiempo, fueron comparables para las células NK no transducidas y las células NK transducidas con el pseudotipado con BaEV, lo que indica que el método de transducción no induce la muerte celular ni afecta a la proliferación de las células NK (FIG. 5). Esto es diferente de otros métodos de modificación genética, tales como la electroporación, donde el tratamiento produce altos grados de muerte celular. Además, otros métodos de modificación genética, tales como la electroporación, sólo permiten la expresión transitoria del transgén. Es de destacar que, después de la transducción con el vector lentiviral pseudotipado con BaEV, el porcentaje constantemente alto de células NK que expresaban el transgén se mantuvo estable durante semanas (FIG. 6).
Ejemplo 3: Sorprendentemente, la activación corta de células NK con IL-33 permite tasas de transducción de células NK más altas que sin IL-33
Se aislaron células NK primarias como se describe en el Ejemplo 1. Se activaron células NK purificadas durante 2 días en medio NK MACS con suero AB al 5% que contenía IL-2 (500 U/ml) e IL-15 (10 ng/ml) o IL-2 (500 U/ml), IL-15 (10 ng/ml) e IL-33 (30 U/ml). El día 2, las células se transdujeron con vectores lentivirales pseudotipados con envoltura de babuino (BaEV) (FIG. 3A) o VSV-G (FIG. 3B) que contenía un gen de interés. Las transducciones se realizaron como se describe en el ejemplo 1. Las células no transducidas se cultivaron en las mismas condiciones que las células transducidas. Después de la transducción, las células se cultivaron en medio sin IL-33. La expresión transgénica en células NK transducidas se detectó con un anticuerpo monoclonal específico dirigido contra el producto génico de interés los días 3, 8 y 14, después de la transducción. La expresión transgénica el día 3 después de la transducción, sin IL-33 fue 16,62 y con IL-33 fue 21,27%, respectivamente (FIG. 3A, paneles inferiores izquierdos). La expresión transgénica el día 8 después de la transducción, sin IL-33 fue de 32,59% y con IL-33 fue de 45,03%, respectivamente (FIG. 3A, paneles centrales). El día 14 después de la transducción, la expresión transgénica fue de 33,66% sin IL-33 y de 60,17% con IL-33 (FIG. 3A, paneles inferiores derechos). Este resultado sugiere que la estimulación previa de las células NK con IL-33 tiene un efecto aditivo sobre la transducción. Las células NK no transducidas mostraron un nivel muy bajo de tinción de anticuerpos (menos de 1%, Figura 3A, paneles superiores). Aunque el vector lentiviral pseudotipado con envoltura de VSV-G mostró una eficiencia de transducción significativamente menor en comparación con el vector pseudotipado de babuino, el efecto aditivo de IL-33 sigue siendo significativo (FIG. 3B).
Ejemplo 4: IL-18 aumentó las tasas de transducción de células NK, similar a IL-33, lo que implica una función general para las citoquinas de la familia IL-1
Se aislaron células NK primarias de 3 donantes diferentes como se describe en el Ejemplo 1. Después del aislamiento, las células NK de los mismos donantes se activaron durante 2 días en medio NK MACS con suero AB al 5%, IL-15 10 ng/ml y IL-2500 U/ml ya sea con la adición de IL-1820 ng/ml o sin IL-18. Luego, las células NK primarias activadas se transdujeron con un vector lentiviral que codifica GFP, pseudotipado con BaEV. Después de la transducción, las células se cultivaron en medio de cultivo sin IL-18 pero con IL-2 e IL-15. Tres días después de la transducción, las células NK mostraron una expresión media de GFP de 40% cuando se preactivaron sin IL-18, mientras que las células NK de los mismos donantes mostraron una expresión de GFP significativamente mayor de 66% cuando se preactivaron con IL-18 (FIG. 4).
Ejemplo 5: El uso del vector lentiviral pseudotipado con BaEV hace posible transducir eficientemente células NK activadas con un CAR CD19 para la destrucción específica de células diana CD19 positivas.
Las células T que expresan CAR condujeron a resultados muy positivos en ensayos clínicos para el tratamiento de la leucemia de células B CD19 positivas. Dado que las células NK CAR pueden ser una alternativa a las células T CAR, se transdujeron células NK con un CAR contra CD19, como una aplicación de ejemplo para la transducción de células NK. Se aislaron células NK primarias de 4 donantes diferentes como se describe en el Ejemplo 1. Después del aislamiento, las células NK de los mismos donantes se activaron durante 2 días en medio NK MACS con suero AB al 5%, IL-15 10 ng/ml y IL-2500 U/ml. Luego, las células NK primarias activadas se transdujeron con un vector lentiviral que codifica CD19-CAR. La construcción de CAR "CD19B" utilizada y su expresión en células T después de la transducción con VSV-G se han descrito anteriormente (Schneider et al. 2017). Para la transducción de células NK, se generó y utilizó un vector lentiviral pseudotipado con BaEV para esta construcción. Siete días después de la transducción, se analizaron la expresión de CAR y la citotoxicidad de las células NK. En detalle, después de la incubación de células NK durante 48 h en medio de cultivo sin suero, se determinó la expresión de CD19-CAR mediante la unión de Fc CD19 humano recombinante (R&D Systems), 25 μg/ml durante 30 min, y la detección mediante citometría de flujo usando un mAb murino conjugado con APC contra Fc (Miltenyi Biotec). En promedio, la expresión del CD19-CAR fue de 70% entre las células NK de diferentes donantes, alcanzando algunos donantes una tasa de transducción de 90% (FIG. 7 A). La destrucción de células diana de diferentes líneas celulares diana se analizó mediante un ensayo basado en citometría de flujo. Las células diana se marcaron con CellTrace Violet (Life Technologies) y se sembraron 2x103 células por pocillo en placas de fondo redondo de 96 pocillos. Luego, se añadieron medio como control o células NK en diferentes relaciones de NK a diana. Después de 24 h, las células diana positivas para CellTrace Violete se cuantificaron mediante citometría de flujo. La diferencia entre las células diana viables en muestras con células NK y las muestras correspondientes sin células NK se definió como dianas destruidas. Las células K562 no expresan CD19 (FIG. 7 B), pero pueden considerarse un objetivo estándar para ensayar el potencial citotóxico general de las células NK debido a su sensibilidad a la citotoxicidad natural de las células NK. Como se esperaba, tanto las células NK CAR como las células NK no transducidas destruyeron las células K562 de manera muy eficiente de la misma manera dependiente de la dosis, lo que demuestra que la citotoxicidad natural independiente de CD19 no se ve afectada por la transducción (Figura 7 C). A diferencia de las células K562, las células RS4;11 expresan CD19 (Figura 7 B), pero son completamente insensibles a la citotoxicidad natural de las células NK. Por consiguiente, las células NK no transducidas no pudieron destruir las células RS4;11, mientras que las células NK CD19-CAR destruían RS4;11 tan eficientemente como las células K562, lo que demuestra la alta funcionalidad y especificidad del CD19 CAR usado (Figura 7 B). Las células Raji son CD19 positivas (Figura 7 B), pero a diferencia de RS4;11, son sensibles a la citotoxicidad natural de las células NK activadas, aunque en menor grado que las células K562. Por lo tanto, las células NK no transducidas ya eran capaces de destruir las células Raji de una manera dependiente de la dosis; sin embargo, la destrucción de las células Raji por las células NK CD19 CAR fue significativamente mayor, lo que implica un efecto aditivo de la destrucción específica de CD-19. En conclusión, la transducción de células NK con un vector lentiviral pseudotipado con BaEV hizo posible generar eficientemente células NK que expresan CAR CD19 con una destrucción mejorada, específica de CD19 de las células diana leucémicas.
Ejemplo 6: Las células NK activadas pero no las naíve expresaron el receptor para la envoltura de babuino ASCT2.
Las células NK se activaron cultivándolas en medio NK MACS (Miltenyi Biotec GmbH) con IL-2 e IL-15 durante 2 días. Tanto las células naíve como las activadas se lisaron en tampón de lisis RIPA y se sometieron a análisis de transferencia Western usando anticuerpo contra ASCT2. Este resultado mostró que el receptor para la envoltura de babuino, ASCT2, solo se expresa después de la activación de las células NK (FIG. 8), pero no en las células NK naíve, lo que sugiere que las células NK necesitan estar activadas para ser transducidas con un vector lentiviral pseudotipado de babuino.
Ejemplo 7: Las células NK proliferativas pero no las quiescentes son transducibles.
Las células NK se marcaron con colorante de proliferación, se lavaron exhaustivamente y luego se transdujeron con un vector lentiviral pseudotipado de babuino que contenía GFP. La proliferación y transducción de células se determinaron 4 días después del inicio de la proliferación y transducción mediante citometría de flujo. Los resultados sugieren que sólo las células NK proliferativas, pero no las quiescentes, son transducibles con un vector lentiviral pseudotipado de babuino (FIG. 9A). Las células NK transducidas con GFP se tiñeron con anticuerpo anti-CD56 y se acotaron los tres grupos de células NK (GFP+, GFP- proliferadas, quiescentes) para determinar el nivel de expresión de CD56 (FIG. 9B). Todas las células Nk proliferadas y transducidas eran CD56brillante mientras que las células NK quiescentes no transducidas eran CD56oscuro sugiriendo que el subconjunto de NK CD56oscuro no era proliferativo ni transducible. A continuación, se compararon además otros receptores de células NK entre el subconjunto de células NK proliferadas y transducidas, proliferativas pero no transducidas y quiescentes (FIG. 10). Las células NK se marcaron con colorante de proliferación, se lavaron exhaustivamente y luego se transdujeron con vector lentiviral pseudotipado de babuino que contenía GFP. El día 4 después de la transducción, las células se tiñeron con anticuerpo monoclonal contra diferentes receptores de células NK y las expresiones se determinaron usando citometría de flujo. Se muestra la expresión de marcadores de células NK comúnmente conocidos entre los diferentes subconjuntos (FIG.
10). La expresión de NKp46, DNAM-1, CD94 y NKG2C era comparable entre todos los diferentes subconjuntos de células NK. Dentro de la fracción de células proliferativas, la diferencia de expresión de diferentes marcadores de células NK entre las células GFP+ y GFP- no fueron significativas. Sin embargo, según la expresión de varios marcadores, las células NK quiescentes tenían un fenotipo significativamente diferente al de las células NK proliferativas. Las células proliferativas eran más brillantes para CD56 con una tendencia a una menor expresión de CD16, una mayor expresión de los receptores activadores NKp30, NKp44 y NKG2D, así como una mayor expresión de TRAIL y NKG2A (FIG. 10).
Ejemplo 8: El subconjunto de células NK CX3CR1neg es altamente proliferativo y transducible.
Se utilizaron células NK de 5 donantes para analizar 371 marcadores de superficie mediante citometría de flujo. Se analizaron las diferencias entre los perfiles de marcadores de las células NK quiescentes y las células NK proliferativas, que se dividieron además en la población que expresaba GFP y una población negativa para GFP. A partir del cribado, se determinaron los marcadores que distinguían mejor entre las células NK quiescentes que no expresan GFP y las células NK quiescentes que pueden ser transducidas y expresar GFP. En general, en comparación directa con las células NK quiescentes, las células NK proliferativas y positivas para GFP expresaron 32 marcadores en un nivel más alto y 5 marcadores en un nivel más bajo (FIG. 11 A). De estos marcadores, algunos no sólo diferían en el nivel de expresión sino también en la frecuencia de las células NK que expresaban el marcador específico. Lo más obvio fue la ausencia de expresión de CX3CR1 y una alta frecuencia de células que expresaban fuertemente TRAIL entre las células NK proliferativas y positivas para GFP (FIG. 11 B).
Ejemplo 9: El subconjunto de células NK CX3CR1neg es altamente transducible con un vector lentiviral pseudotipado de babuino y podría usarse como marcador.
De las moléculas de superficie que mejor se correlacionaban con la proliferación y la transducción, se seleccionó CX3CR1 para realizar más investigaciones y ensayar si este marcador puede discriminar directamente entre subconjuntos de células NK con diferentes capacidades de proliferación y transducción. Se separaron diferentes subconjuntos de células NK en función de su expresión de CX3CR1 mediante separación MCAS antes de la transducción y el cultivo. Sin separación, la expresión de CX3CR1 entre las células NK derivadas de sangre de diferentes donantes era de 86%, lo que significa que solo una pequeña fracción de aproximadamente 14% de todas las células NK no expresaron CX3CR1 (Figura 5A). Después de la separación, la frecuencia media de las células NK CX3CR1neg se pudo reducir a 2% mediante el enriquecimiento de CX3CR1, mientras que el agotamiento del marcador, por otro lado, condujo a 91% de células NK CX3CR1neg (FIG. 12A). Poco después del cultivo y la transducción de las fracciones de células NK separadas de manera diferente, se observaron diferencias significativas con respecto a la expresión transgénica y la tasa de proliferación (FIG. 12B, 12C). Entre la fracción no separada, las tasas de proliferación y expresión de GFP fueron de 28% y 21%, respectivamente. Al mismo tiempo, la fracción enriquecida en CX3CR1 con un contenido marginal de células negativas para CX3CR1 contenía solo 11% de células proliferativas y 7% de células positivas para GFP. Sorprendentemente, entre la fracción agotada en CX3CR1 con una alta frecuencia inicial de células NK CX3CR1neg ya el 81% estaban proliferando y 69% eran positivas para GFP. Incluso dentro de la fracción enriquecida en CX3CR1, la proliferación y la expresión de GFP se observaron principalmente en el resto de células CX3CR1neg (FIG. 12C). En conjunto, los experimentos identificaron un subconjunto de células NK altamente proliferativas que pueden transducirse eficientemente con LV pseudotipado con BaEV. Este subconjunto de células NK podría definirse claramente por la ausencia de expresión de CX3CR1 y esta característica podría usarse para el enriquecimiento previo de células NK transducibles.
Ejemplo 10: IL-1beta aumentó las tasas de transducción de células NK.
Se aislaron células NK recientes de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y se estimularon con IL-2/IL-15 o IL-2/IL-15/IL-1 p (IL-1beta) durante tres días. El día 2 después de la activación, los linfocitos se transdujeron con una multiplicidad de infección (MOI) de 3. Al día siguiente, las células se lavaron y la expansión continuó durante 7 días adicionales en presencia de IL-2/IL-15. Para detectar la frecuencia de células Nk genéticamente modificadas, las células se marcaron con un anticuerpo anti-idiotipo biotinilado que se dirige específicamente al dominio scFv del CAR. La detección del conjugado de biotina se realizó utilizando un marcado de mAb secundario anti-biotina-PE. El porcentaje de células positivas se indica en cada gráfico de puntos que muestra que las células NK recientes estimuladas con IL-2, IL-15 e IL-1beta dan como resultado tasas de transducción superiores en comparación con IL-2/IL-15 sin IL-1beta (68% vs. 52%). Los resultados son representativos de 3 experimentos independientes.
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Claims (10)

REIVINDICACIONES
1. Un método in vitro para transferir uno o más ácidos nucleicos a células NK activadas con una partícula de vector retroviral pseudotipada o una partícula similar a virus del mismo, que comprende las etapas
a) Activación de células NK, y
b) Adición de dicha partícula de vector retroviral pseudotipada o partícula similar a virus del mismo a dichas células NK activadas,
en donde dicha partícula de vector retroviral pseudotipada o partícula similar a virus del mismo comprende una glicoproteína de envoltura de retrovirus endógeno de babuino (BaEV) modificada que es capaz de unirse y fusionarse con una membrana de célula hematopoyética, transfiriendo así material biológico a dichas células NK activadas, en donde dicha glicoproteína de envoltura de retrovirus endógeno de babuino (BaEV) modificada que es capaz de unirse y fusionarse con una membrana de célula hematopoyética es:
una glicoproteína de envoltura quimérica que comprende o consiste en una fusión del dominio transmembrana y extracelular de una glicoproteína de envoltura de retrovirus endógeno de babuino (BaEV) y el dominio de cola citoplasmática de una glicoproteína de envoltura de virus de leucemia murina (MLV); o
una glicoproteína de envoltura de BaEV modificada en donde el dominio de cola citoplasmática carece del péptido R inhibidor de la fusión.
2. El método según la reivindicación 1, en donde antes de dicha activación de células NK, las células NK se enriquecen en células NK CX3CR1 negativas a partir de una muestra que comprende células NK CX3CR1 positivas y CX3CR1 negativas.
3. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en donde dicha activación de dichas células NK se logra mediante la adición de al menos una citoquina o células nutrientes o partículas de membrana de células nutrientes o con un reactivo de activación de células NK a dichas células NK.
4. El método según la reivindicación 3, en donde dicha al menos una citoquina es IL-2 y/o IL-15.
5. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dicha activación de células NK se consigue mediante la adición de una combinación de citoquinas que comprende al menos una citoquina que activa células NK y una citoquina de la familia IL-1, conduciendo de ese modo a una activación a corto plazo de las células NK.
6. El método según la reivindicación 5, en donde dicha combinación de citoquinas es IL2 y/o IL-15 y una citoquina de la familia IL-1.
7. El método según la reivindicación 6, en donde dicha citoquina de la familia IL-1 es IL-18, IL-33 o IL-1beta.
8. El método según la reivindicación 2, en donde la eficacia de transducción de las células NK mediante dicha partícula de vector retroviral pseudotipada es de al menos 50%.
9. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde dicha partícula de vector retroviral o partícula similar a virus del mismo es una partícula de vector lentiviral o partícula similar a virus del mismo.
10. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde dicho método se realiza en un procedimiento automatizado en un sistema cerrado.
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