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CN111655292A - 细胞生物制品及其治疗用途 - Google Patents

细胞生物制品及其治疗用途 Download PDF

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CN111655292A
CN111655292A CN201880088039.XA CN201880088039A CN111655292A CN 111655292 A CN111655292 A CN 111655292A CN 201880088039 A CN201880088039 A CN 201880088039A CN 111655292 A CN111655292 A CN 111655292A
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CN
China
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cellular
biological product
cell
cells
composition
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CN201880088039.XA
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G.A.冯马尔特赞
J.M.米尔维德
J.R.鲁宾斯
M.T.米
N.W.斯特宾斯
M.K.吉布森
N.F.戈登
B.张
K.M.特鲁多
B.J.哈特利
T.R.普提里
K.马达维亚尼
J.V.沙
M.康纳
P.A.琼斯
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Flagship Pioneering Innovations V Inc
Original Assignee
Flagship Pioneering Innovations V Inc
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Filing date
Publication date
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Abstract

本公开内容提供了例如细胞生物制品组合物及其使用方法。细胞生物制品可以用于例如将蛋白质或核酸递送至靶细胞。

Description

细胞生物制品及其治疗用途
相关申请
本申请要求2017年12月7日提交的美国序列号62/595,841的优先权，其以其整体通过引用并入本文。
发明背景
去核细胞保留许多生物学特性，但失去其分裂能力。
发明概述
在一些方面，本公开提供了细胞生物制品，例如去核细胞或具有失活核的细胞。细胞生物制品可以用于例如将细胞生物制品的腔或脂质双层中的货物递送至靶细胞。货物包括例如治疗性蛋白质、核酸和小分子。
在一些方面，本公开提供了纯化的细胞生物制品组合物，其包含来自源细胞，例如哺乳动物源细胞，例如人源细胞的细胞生物制品，其中细胞生物制品具有部分或完全的核失活(例如核去除)，并且
其中以下的一个或多个：
i)细胞生物制品包含外源剂，例如治疗剂，例如以至少1,000个拷贝的拷贝数，例如，如通过实施例31的测定法所测量的；
ii)细胞生物制品包含脂质，其中CL、Cer、DAG、HexCer、LPA、LPC、LPE、LPG、LPI、LPS、PA、PC、PE、PG、PI、PS、CE、SM和TAG的一种或多种在源细胞中相应脂质水平的75％内；
iii)细胞生物制品包含与源细胞的蛋白质组学组成相似的蛋白质组学组成，例如使用实施例30的测定法测定；
iv)细胞生物制品能够进行信号转导，例如传输细胞外信号，例如响应于胰岛素的AKT磷酸化，或响应于胰岛素的葡萄糖(例如标记的葡萄糖，例如2-NBDG)摄取，例如比阴性对照(例如，在不存在胰岛素的情况下在其他方面相似的细胞生物制品)多至少10％，例如使用实施例48的测定法测定；
v)当施用于受试者例如小鼠时，细胞生物制品靶向组织，例如肝、肺、心脏、脾、胰腺、胃肠道、肾、睾丸、卵巢、脑、生殖器官、中枢神经系统、外周神经系统、骨骼肌、内皮、内耳或眼，例如其中24小时后所施用的细胞生物制品的群体中至少0.1％或10％的细胞生物制品存在于靶组织中，例如通过实施例71的测定法测定；或
vi)源细胞选自嗜中性粒细胞、粒细胞、间充质干细胞、骨髓干细胞、诱导性多能干细胞、胚胎干细胞、原粒细胞、成肌细胞、肝细胞或神经元，例如视网膜神经元细胞。
在一些方面，本公开还提供纯化的细胞生物制品组合物，其包含细胞生物制品，其中：
i)细胞生物制品来自源细胞，例如哺乳动物源细胞，并且
ii)细胞生物制品是去核细胞或具有部分或完全的核失活(例如核去除)的细胞。
在一些方面，本公开还提供纯化的细胞生物制品组合物，其包含细胞生物制品和外源剂(例如治疗剂)，其中：
iii)细胞生物制品来自源细胞，例如哺乳动物源细胞，并且
iv)细胞生物制品是去核细胞或具有部分或完全的核失活(例如核去除)的细胞。
在一些方面，本公开还提供纯化的细胞生物制品组合物，例如冷冻的细胞生物制品组合物，其包含细胞生物制品，其中：
i)细胞生物制品来自源细胞，例如哺乳动物源细胞，并且
ii)细胞生物制品是去核细胞或具有部分或完全的核失活(例如核去除)的细胞，
其处于小于4、0、-4、-10、-12、-16、-20、-80或-160C的温度。
在一些实施方案中，细胞生物制品不是来自红系细胞或血小板。
在一些实施方案中，存在以下的一个或多个：
i)细胞生物制品不是来自红系细胞或血小板；
ii)细胞生物制品包含去核细胞；
iii)细胞生物制品包含失活的核；
iv)细胞生物制品以至少或不超过10、50、100、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000或1,000,000,000拷贝的拷贝数包含外源剂或治疗剂(例如外源治疗剂)，例如，如通过实施例31的测定法所测量的；
v)细胞生物制品包含与源细胞的脂质组成基本上类似的脂质组成，或其中CL、Cer、DAG、HexCer、LPA、LPC、LPE、LPG、LPI、LPS、PA、PC、PE、PG、PI、PS、CE、SM和TAG中的一个或多个在源细胞中的对应脂质水平的10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％或75％内；
vi)细胞生物制品包含与源细胞的蛋白质组学组成类似的蛋白质组学组成，例如使用实施例30的测定法测定；
vii)细胞生物制品包含在源细胞中的对应比率的10％、20％、30％、40％或50％内的脂质:蛋白质的比率，例如使用实施例37的测定法所测量；
viii)细胞生物制品包含在源细胞中的对应比率的10％、20％、30％、40％或50％内的蛋白质:核酸(例如DNA)的比率，例如使用实施例38的测定法所测量；
ix)细胞生物制品包含在源细胞中的对应比率的10％、20％、30％、40％或50％内的脂质:核酸(例如DNA)的比率，例如使用实施例39的测定法所测量；
x)细胞生物制品于受试者，例如小鼠中的半衰期在参考细胞(例如源细胞)的半衰期的1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％内，例如通过实施例60的测定法测定；
xi)细胞生物制品跨膜运输葡萄糖(例如标记的葡萄糖，例如2-NBDG)，例如比阴性对照(例如在不存在葡萄糖的情况下在其他方面相似的细胞生物制品)多至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％，例如如使用实施例64的测定法所测量；
xii)细胞生物制品包含在参考细胞(例如源细胞或小鼠胚胎成纤维细胞)中的酯酶活性的1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％内的腔中的酯酶活性，例如使用实施例51的测定法测定；
xiii)细胞生物制品包含在参考细胞(例如源细胞)中的柠檬酸合酶活性的1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％内的代谢活性水平，例如如实施例53中所述；
xiv)细胞生物制品包含在参考细胞(例如源细胞)中的呼吸水平的1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％内的呼吸水平(例如耗氧速率)，例如如实施例54中所述；
xv)细胞生物制品包含至多18,000、17,000、16,000、15,000、14,000、13,000、12,000、11,000或10,000MFI的膜联蛋白-V染色水平，例如使用实施例55的测定法测定，或其中相比于实施例55的测定法中的用甲萘醌处理的在其他方面相似的细胞生物制品的膜联蛋白-V染色水平，细胞生物制品包含低至少5％、10％、20％、30％、40％或50％的膜联蛋白-V染色水平，或其中相比于实施例55的测定法中的用甲萘醌处理的巨噬细胞的膜联蛋白-V染色水平，细胞生物制品包含低至少5％、10％、20％、30％、40％或50％的膜联蛋白-V染色水平，
xvi)细胞生物制品具有源细胞的miRNA含量水平的至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大的miRNA含量水平，例如通过实施例27的测定法测定；
xvii)细胞生物制品具有源细胞的可溶性:不溶性蛋白质的比率的1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大内的可溶性:不溶性蛋白质的比率，例如在源细胞的可溶性:不溶性蛋白质的比率的1％-2％、2％-3％、3％-4％、4％-5％、5％-10％、10％-20％、20％-30％、30％-40％、40％-50％、50％-60％、60％-70％、70％-80％或80％-90％内，例如通过实施例35的测定法测定；
xviii)细胞生物制品具有的LPS水平为细胞生物制品的脂质含量的小于5％、1％、0.5％、0.01％、0.005％、0.0001％、0.00001％或更小，例如通过实施例36的测定法所测量；
xix)细胞生物制品具有的LPS水平为源细胞的LPS含量的小于5％、1％、0.5％、0.01％、0.005％、0.0001％、0.00001％或更小，例如根据质谱法所测量，例如在实施例36的测定法中；
xx)细胞生物制品能够进行信号转导，例如传输细胞外信号，例如响应于胰岛素的AKT磷酸化，或响应于胰岛素的葡萄糖(例如标记的葡萄糖，例如2-NBDG)摄取，例如比阴性对照(例如不存在胰岛素的在其他方面相似的细胞生物制品)多至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％，例如使用实施例48的测定法测定；
xxi)细胞生物制品在向例如小鼠的受试者施用时靶向组织，例如肝、肺、心脏、脾、胰腺、胃肠道、肾、睾丸、卵巢、脑、生殖器官、中枢神经系统、外周神经系统、骨骼肌、内皮、内耳或眼，例如其中在24、48或72小时之后，施用的细胞生物制品群体中至少0.1％、0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的细胞生物制品存在于靶组织中，例如通过实施例71的测定法测定；
xxii)相比于由参考细胞(例如源细胞或骨髓基质细胞(BMSC))诱导的近分泌信号传导水平，细胞生物制品具有大至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的近分泌信号传导水平，例如通过实施例56的测定法测定；
xxiii)相比于由参考细胞(例如源细胞或巨噬细胞)诱导的旁分泌信号传导水平，细胞生物制品具有大至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％的旁分泌信号传导水平，例如通过实施例57的测定法测定；
xxiv)相比于参考细胞(例如源细胞或C2C12细胞)中聚合肌动蛋白的水平，细胞生物制品以在1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％内的水平聚合肌动蛋白，例如通过实施例58的测定法测定；
xxv)细胞生物制品具有的膜电位在参考细胞(例如源细胞或C2C12细胞)的膜电位的约1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％内，例如通过实施例59的测定法测定，或其中细胞生物制品具有约-20至-150mV、-20至-50mV、-50至-100mV或-100至-150mV的膜电位；
xxvi)细胞生物制品能够从血管外渗，例如以源细胞的外渗速率的至少1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的速率，例如使用实施例42的测定法测定，例如其中源细胞为嗜中性粒细胞、淋巴细胞、B细胞、巨噬细胞或NK细胞；
xxvii)细胞生物制品能够穿过细胞膜，例如内皮细胞膜或血脑屏障；
xxviii)细胞生物制品能够分泌蛋白质，例如以比参考细胞(例如小鼠胚胎成纤维细胞)大至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的速率，例如使用实施例47的测定法测定；
xxix)细胞生物制品符合药物或良好生产规范(GMP)标准；
xxx)细胞生物制品是根据良好生产规范(GMP)制备的；
xxxi)细胞生物制品具有的病原体水平低于预定参考值，例如基本上不含病原体；
xxxii)细胞生物制品具有的污染物水平低于预定参考值，例如基本上不含污染物；
xxxiii)细胞生物制品具有低免疫原性，例如如本文所述；
xxxiv)源细胞选自嗜中性粒细胞、粒细胞、间充质干细胞、骨髓干细胞、诱导性多能干细胞、胚胎干细胞、原粒细胞、成肌细胞、肝细胞或神经元，例如视网膜神经元细胞；或
xxxv)源细胞是除293细胞、HEK细胞、人内皮细胞或人上皮细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞或干细胞外。
在一些实施方案中，存在以下中的一个或多个：
i)源细胞选自内皮细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、粒细胞、白细胞、干细胞(例如间充质干细胞、骨髓干细胞、诱导性多能干细胞、胚胎干细胞)、原粒细胞、成肌细胞、肝细胞或神经元，例如视网膜神经元细胞；
ii)细胞器选自线粒体、高尔基体、溶酶体、内质网、液泡、内体、顶体、自噬体、中心粒、糖酵解酶体、乙醛酸循环体、氢化酶体、黑色素体、纺锤剩体、刺丝囊、过氧化物酶体、蛋白酶体、囊泡和应激颗粒；
iii)细胞生物制品具有的大小大于5μm、10μm、20μm、50μm或100μm；
i)细胞生物制品、组合物或制剂具有除在1.08g/ml与1.12g/ml之间外的密度，例如细胞生物制品、组合物或制剂具有的密度为1.25g/ml+/-0.05，例如通过实施例21的测定法所测量；
iv)细胞生物制品未被循环中的清除系统或肝窦中的库普弗(Kupffer)细胞捕获；
v)源细胞是除293细胞外；
vi)源细胞不是转化或永生化的；
vii)源细胞使用除腺病毒介导的永生化以外的方法来转化或永生化，例如通过自发突变或端粒酶表达永生化；
viii)细胞生物制品不包含Cre或GFP，例如EGFP；
ix)细胞生物制品进一步包含除Cre或GFP，例如EGFP以外的外源蛋白质
x)细胞生物制品进一步包含外源核酸(例如RNA，例如mRNA、miRNA或siRNA)或外源蛋白质(例如抗体，例如抗体)，例如在腔中；或
xi)细胞生物制品不包含线粒体。
在一些方面，本公开还提供细胞生物制品组合物，其包含多个本文所述的细胞生物制品。
在一些方面，本公开还提供药物组合物，其包含本文所述的细胞生物制品组合物和药学上可接受的载体。
在一些方面，本公开还提供适于施用于人类受试者的药物组合物，其包含细胞生物制品和药学上可接受的载体，其中：
i)细胞生物制品来自源细胞，例如哺乳动物源细胞，并且
ii)细胞生物制品是去核细胞或具有部分或完全核失活(例如核去除)的细胞。
在某些方面，本公开还提供向人类受试者、靶组织或细胞施用细胞生物制品组合物的方法，其包括向人类受试者施用包含多个本文所述的细胞生物制品的细胞生物制品组合物、本文所述的细胞生物制品组合物或本文所述的药物组合物或使靶组织或细胞与其接触，从而向受试者施用细胞生物制品组合物。在某些方面，本公开还提供向受试者(例如人类受试者)施用细胞生物制品组合物的方法，其包括向受试者施用细胞生物制品组合物，其中：(i)细胞生物制品来自源细胞，例如哺乳动物源细胞，(ii)细胞生物制品是去核细胞或具有部分或完全核失活(例如核去除)的细胞，并且(iii)细胞生物制品不是来自红系细胞或血小板，从而向受试者施用细胞生物制品组合物。
在某些方面，本公开还提供向受试者、靶组织或细胞递送治疗剂(例如多肽、核酸、代谢物、细胞器或亚细胞结构)的方法，其包括向受试者施用包含多个本文所述的细胞生物制品的细胞生物制品组合物、本文所述的细胞生物制品组合物或本文所述的药物组合物或使靶组织或细胞与其接触，其中细胞生物制品组合物以使得治疗剂被递送的量和/或时间施用。在某些方面，本公开还提供向受试者递送治疗剂的方法，其包括向受试者施用细胞生物制品组合物，其中：(i)细胞生物制品来自源细胞，例如哺乳动物源细胞，(ii)细胞生物制品是去核细胞或具有部分或完全核失活(例如核去除)的细胞，(iii)细胞生物制品不是来自红系细胞或血小板，并且(iv)细胞生物制品包含治疗剂，从而向受试者递送治疗剂。
在某些方面，本公开还提供调控，例如增强受试者、靶组织或细胞的生物学功能的方法，其包括向受试者施用包含多个本文所述的细胞生物制品的细胞生物制品组合物、本文所述的细胞生物制品组合物或本文所述的药物组合物或使靶组织或细胞与其接触，从而调控受试者的生物学功能。在某些方面，本公开还提供调控，例如增强受试者的生物学功能的方法，其包括向受试者施用细胞生物制品组合物，其中：(i)细胞生物制品来自源细胞，例如哺乳动物源细胞，(ii)细胞生物制品是去核细胞或具有部分或完全核失活(例如核去除)的细胞，并且(iii)细胞生物制品不是来自红系细胞或血小板，从而调控受试者的生物学功能。
在某些方面，本公开还提供将功能递送或靶向至受试者的方法，其包括向受试者施用包含多个包含所述功能的本文所述的细胞生物制品的细胞生物制品组合物、本文所述的细胞生物制品组合物或本文所述的药物组合物，其中细胞生物制品组合物以使得受试者中的功能被递送或靶向的量和/或时间施用。在实施方案中，受试者患有癌症、炎性病症、自身免疫性疾病、慢性疾病、炎症、器官功能受损、感染性疾病、变性性病症、遗传性疾病或损伤。
在某些方面，本公开还提供将功能递送或靶向至受试者的方法，其包括向受试者施用细胞生物制品组合物，其中：(i)细胞生物制品来自源细胞，例如哺乳动物源细胞，(ii)细胞生物制品是去核细胞或具有部分或完全核失活(例如核去除)的细胞，并且(iii)细胞生物制品不是来自红系细胞或血小板，从而将功能递送或靶向至受试者。
在某些方面，本公开还提供制备细胞生物制品组合物的方法，其包括：
a)提供源细胞，例如哺乳动物源细胞；
b)从源细胞产生细胞生物制品；和
c)配制细胞生物制品，例如配制为适合于向受试者施用的药物组合物。
在一些实施方案中，本公开提供了制备细胞生物制品组合物的方法，其包括
a)提供多个源细胞，例如哺乳动物源细胞；
b)从多个源细胞产生至少105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014或1015个细胞生物制品，例如通过去核进行。
在一些方面，本公开提供制备药物细胞生物制品组合物的方法，其包括：
a)提供根据权利要求1-82中任一项的细胞生物制品组合物或权利要求83或84的药物组合物；和
b)配制细胞生物制品组合物，例如配制为适合于向受试者施用的药物组合物。
在一些方面，本公开提供制备细胞生物制品组合物的方法，其包括：
a)提供，例如产生多个本文所述的细胞生物制品或本文所述的细胞生物制品组合物；和
b)测定来自细胞生物制品组合物或多个的细胞生物制品的一个或多个以确定是否符合一个或多个(例如2、3或更多个)标准。在实施方案中，标准选自：
i)细胞生物制品包含拷贝数为至少或不超过10、50、100、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000或1,000,000,000个拷贝的治疗剂，例如通过实施例31的测定法所测量；
ii)细胞生物制品包含与源细胞的脂质组成基本上类似的脂质组成，或其中CL、Cer、DAG、HexCer、LPA、LPC、LPE、LPG、LPI、LPS、PA、PC、PE、PG、PI、PS、CE、SM和TAG中的一个或多个在源细胞中的对应脂质水平的10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％或75％内；
iii)细胞生物制品包含与源细胞的蛋白质组学组成类似的蛋白质组学组成，例如使用实施例30的测定法测定；
iv)细胞生物制品包含在源细胞中的对应比率的10％、20％、30％、40％或50％内的脂质:蛋白质的比率，例如使用实施例37的测定法所测量；
v)细胞生物制品包含在源细胞中的对应比率的10％、20％、30％、40％或50％内的蛋白质:核酸(例如DNA)的比率，例如使用实施例38的测定法所测量；
vi)细胞生物制品包含在源细胞中的对应比率的10％、20％、30％、40％或50％内的脂质:核酸(例如DNA)的比率，例如使用实施例39的测定法所测量；
vii)细胞生物制品于受试者，例如小鼠中的半衰期在参考细胞(例如源细胞)的半衰期的1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％内，例如通过实施例60的测定法测定；
viii)细胞生物制品跨膜运输葡萄糖(例如标记的葡萄糖，例如2-NBDG)，例如比阴性对照(例如在不存在葡萄糖的情况下在其他方面相似的细胞生物制品)多至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％，例如使用实施例49的测定法所测量；
ix)细胞生物制品包含在参考细胞(例如源细胞或小鼠胚胎成纤维细胞)中的酯酶活性的1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％内的腔中的酯酶活性，例如使用实施例51的测定法；
x)细胞生物制品包含在参考细胞(例如源细胞)中的柠檬酸合酶活性的1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％内的代谢活性水平，例如如实施例53中所述；
xi)细胞生物制品包含在参考细胞(例如源细胞)中的呼吸水平的1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％内的呼吸水平(例如耗氧速率)，例如如实施例54中所述；
xii)细胞生物制品包含至多18,000、17,000、16,000、15,000、14,000、13,000、12,000、11,000或10,000MFI的膜联蛋白-V染色水平，例如使用实施例55的测定法，或其中相比于实施例55的测定法中的用甲萘醌处理的在其他方面相似的细胞生物制品的膜联蛋白-V染色水平，细胞生物制品包含低至少5％、10％、20％、30％、40％或50％的膜联蛋白-V染色水平，或其中相比于实施例55的测定法中的用甲萘醌处理的巨噬细胞的膜联蛋白-V染色水平，细胞生物制品包含低至少5％、10％、20％、30％、40％或50％的膜联蛋白-V染色水平，
xiii)相比于源细胞，细胞生物制品具有的miRNA含量水平为至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大，例如通过实施例27的测定法；
xiv)相比于源细胞，细胞生物制品具有的可溶性:不溶性蛋白质的比率在1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大内，例如在源细胞的1％-2％、2％-3％、3％-4％、4％-5％、5％-10％、10％-20％、20％-30％、30％-40％、40％-50％、50％-60％、60％-70％、70％-80％或80％-90％内，例如通过实施例35的测定法；
xv)细胞生物制品具有细胞生物制品的脂质含量的小于5％、1％、0.5％、0.01％、0.005％、0.0001％、0.00001％或更小的LPS水平，例如通过实施例36的测定法所测量；
xvi)细胞生物制品具有源细胞的LPS含量的小于5％、1％、0.5％、0.01％、0.005％、0.0001％、0.00001％或更小的LPS水平，例如根据质谱法所测量，例如在实施例36的测定法中；
xvii)细胞生物制品能够进行信号转导，例如传输细胞外信号，例如响应于胰岛素的AKT磷酸化，或响应于胰岛素的葡萄糖(例如标记的葡萄糖，例如2-NBDG)摄取，例如比阴性对照(例如不存在胰岛素的在其他方面相似的细胞生物制品)多至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％，例如使用实施例48的测定法测定；
xviii)相比于由参考细胞(例如源细胞或骨髓基质细胞(BMSC))诱导的近分泌信号传导水平，细胞生物制品具有大至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的近分泌信号传导水平，例如通过实施例56的测定法；
xix)相比于由参考细胞(例如源细胞或巨噬细胞)诱导的旁分泌信号传导水平，细胞生物制品具有大至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％的旁分泌信号传导水平，例如通过实施例57的测定法；
xx)相比于参考细胞(例如源细胞或C2C12细胞)中聚合肌动蛋白的水平，细胞生物制品以在1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％内的水平聚合肌动蛋白，例如通过实施例58的测定法测定；
xxi)细胞生物制品具有在参考细胞(例如源细胞或C2C12细胞)的膜电位的约1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％内的膜电位，例如通过实施例59的测定法测定，或其中细胞生物制品具有约-20至-150mV、-20至-50mV、-50至-100mV或-100至-150mV的膜电位；
xxii)细胞生物制品能够分泌蛋白质，例如以比参考细胞(例如小鼠胚胎成纤维细胞)大至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的速率，例如使用实施例47的测定法测定；或
xxiii)细胞生物制品具有低免疫原性，例如如本文所述；和
c)(任选地)如果符合标准中的一个或多个，则批准释放多个细胞生物制品或细胞生物制品组合物。
在一些方面，本公开还提供制备细胞生物制品组合物的方法，其包括：
a)提供，例如产生多个本文所述的细胞生物制品或本文所述的细胞生物制品组合物；和
b)测定来自多个或细胞生物制品组合物的细胞生物制品的一个或多个以确定以下因素中的一个或多个的存在或水平：
i)免疫原性分子，例如免疫原性蛋白质，例如如本文所述；
ii)病原体，例如细菌或病毒；或
iii)污染物；和
c)(任选地)如果因素中的一个或多个低于参考值，则批准释放多个细胞生物制品或细胞生物制品组合物。
本文的任何方面，例如上述的细胞生物制品、细胞生物制品组合物和方法可以与本文的一个或多个实施方案(例如下文的实施方案)组合。
在一些实施方案中，细胞生物制品能够将分泌试剂，例如分泌蛋白递送至靶位点(例如细胞外区域)(例如递送)。类似地，在一些实施方案中，本文的方法包括递送如本文所述的分泌试剂。在实施方案中，分泌蛋白是内源或外源的。在实施方案中，分泌蛋白包含蛋白质治疗剂，例如抗体分子、细胞因子或酶。在实施方案中，分泌蛋白包含自分泌信号传导分子或旁分泌信号传导分子。在实施方案中，分泌试剂包含分泌性颗粒。
在一些实施方案中，细胞生物制品能够修饰靶肿瘤细胞(例如修饰)。类似地，在一些实施方案中，本文的方法包括修饰靶肿瘤细胞。在实施方案中，细胞生物制品包含免疫刺激配体、抗原呈递蛋白或促凋亡蛋白。
在一些实施方案中，细胞生物制品包含免疫调控剂，例如免疫刺激剂。
在一些实施方案中，细胞生物制品能够分泌试剂，例如蛋白质(例如分泌)。在一些实施方案中，试剂(例如分泌试剂)被递送到受试者的靶位点。在一些实施方案中，试剂是不能以重组方式制备或难以以重组方式制备的蛋白质。在一些实施方案中，分泌蛋白质的细胞生物制品来自选自MSC或软骨细胞的源细胞。
在一些实施方案中，细胞生物制品在其膜上包含一个或多个细胞表面配体(例如1、2、3、4、5、10、20、50或更多个细胞表面配体)。类似地，在一些实施方案中，本文的方法包括将一个或多个细胞表面配体呈递至靶细胞。在一些实施方案中，具有细胞表面配体的细胞生物制品来自选自嗜中性粒细胞(例如，且靶细胞为肿瘤浸润性淋巴细胞)、树突细胞(例如，且靶细胞为未处理T细胞)或嗜中性粒细胞(例如，且靶细胞为肿瘤细胞或病毒感染的细胞)的源细胞。在一些实施方案中，细胞生物制品包含膜复合物，例如包含至少2、3、4或5个蛋白质的复合物，例如同二聚体、异二聚体、同三聚体、异三聚体、同四聚体或异四聚体。在一些实施方案中，细胞生物制品包含抗体，例如毒性抗体，例如细胞生物制品能够将抗体递送至靶位点，例如通过归巢至靶位点。在一些实施方案中，源细胞为NK细胞或嗜中性粒细胞。
在一些实施方案中，细胞生物制品能够引起靶细胞的细胞死亡。在一些实施方案中，细胞生物制品来自NK源细胞。
在一些实施方案中，细胞生物制品或靶细胞能够吞噬(例如吞噬病原体)。类似地，在一些实施方案中，本文的方法包括引起吞噬。
在一些实施方案中，细胞生物制品感测其局部环境且对其作出反应。在一些实施方案中，细胞生物制品能够感测代谢物、白介素或抗原的水平。
在实施方案中，细胞生物制品能够进行趋化作用、外渗或一种或多种代谢活性。在实施方案中，代谢活性选自犬尿氨酸(kyneurinine)、葡糖新生、前列腺素脂肪酸氧化、腺苷代谢、尿素循环和产热呼吸。在一些实施方案中，源细胞为嗜中性粒细胞且细胞生物制品能够归巢至损伤部位。在一些实施方案中，源细胞为巨噬细胞且细胞生物制品能够吞噬。在一些实施方案中，源细胞为棕色脂肪组织细胞且细胞生物制品能够进行脂解。
在一些实施方案中，细胞生物制品包含多种试剂(例如至少2、3、4、5、10、20或50种试剂)。在一些实施方案中，第一试剂和第二试剂形成复合物，其中任选地复合物进一步包含一个或多个另外的细胞表面受体。在一些实施方案中，试剂包含或编码抗原或抗原呈递蛋白。在一个实施方案中，试剂包含蛋白质、核酸、细胞器或代谢物。
在一些实施方案中，细胞生物制品包含膜蛋白或编码膜蛋白的核酸。
在一些实施方案中，受试者需要再生。在一些实施方案中，受试者罹患癌症、自身免疫性疾病、感染性疾病、代谢疾病、神经变性性疾病或遗传性疾病(例如酶缺乏症)。
在一些实施方案中：
ii)源细胞是除293细胞、HEK细胞、人内皮细胞或人上皮细胞外的；
iii)细胞生物制品、组合物或制剂具有除在1.08g/ml与1.12g/ml之间外的密度，例如，
iv)细胞生物制品、组合物或制剂具有的密度为1.25g/ml+/-0.05，例如通过实施例21的测定法所测量；
v)细胞生物制品未被循环中的清除系统或肝窦中的库普弗细胞捕获；
vi)细胞生物制品具有的直径大于5μm、6μm、7μm、8μm、10μm、20μm、50μm、100μm、150μm或200μm。
在一些实施方案中，细胞生物制品包含去核细胞。在一些实施方案中，细胞生物制品包含失活的核。在一些实施方案中，细胞生物制品不包含功能性核。
在一些实施方案中，细胞生物制品以至少或不超过10、50、100、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000或1,000,000,000个拷贝的拷贝数包含治疗剂，例如通过实施例31的测定法所测量。在一些实施方案中，细胞生物制品以至少10、50、100、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000或1,000,000,000个拷贝的拷贝数包含蛋白质治疗剂，例如通过实施例31的测定法所测量。在一些实施方案中，细胞生物制品以至少10、50、100、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000或1,000,000,000个拷贝的拷贝数包含核酸治疗剂。在一些实施方案中，细胞生物制品以至少10、50、100、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000或1,000,000,000个拷贝的拷贝数包含DNA治疗剂。在一些实施方案中，细胞生物制品以至少10、50、100、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000或1,000,000,000个拷贝的拷贝数包含RNA治疗剂。在一些实施方案中，细胞生物制品以至少10、50、100、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000或1,000,000,000个拷贝的拷贝数包含外源治疗剂。在一些实施方案中，细胞生物制品以至少10、50、100、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000或1,000,000,000个拷贝的拷贝数包含外源蛋白质治疗剂。在一些实施方案中，细胞生物制品以至少10、50、100、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000或1,000,000,000个拷贝的拷贝数包含外源核酸(例如DNA或RNA)治疗剂。
在一些实施方案中，细胞生物制品包含与源细胞的脂质组成基本上类似的脂质组成，或其中CL、Cer、DAG、HexCer、LPA、LPC、LPE、LPG、LPI、LPS、PA、PC、PE、PG、PI、PS、CE、SM和TAG中的一个或多个在源细胞中的对应脂质水平的10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％内。
在一些实施方案中，细胞生物制品具有的心磷脂:神经酰胺的比率在源细胞中的心磷脂:神经酰胺的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或具有的心磷脂:二酰甘油的比率在源细胞中的心磷脂:二酰甘油的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或具有的心磷脂:己糖基神经酰胺的比率在源细胞中的心磷脂:己糖基神经酰胺的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或具有的心磷脂:溶血磷脂酸酯的比率在源细胞中的心磷脂:溶血磷脂酸酯的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或具有的心磷脂:溶血磷脂酰胆碱的比率在源细胞中的心磷脂:溶血磷脂酰胆碱的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或具有的心磷脂:溶血磷脂酰乙醇胺的比率在源细胞中的心磷脂:溶血磷脂酰乙醇胺的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或具有的心磷脂:溶血磷脂酰甘油的比率在源细胞中的心磷脂:溶血磷脂酰甘油的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或具有的心磷脂:溶血磷脂酰肌醇的比率在源细胞中的心磷脂:溶血磷脂酰肌醇的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或具有的心磷脂:溶血磷脂酰丝氨酸的比率在源细胞中的心磷脂:溶血磷脂酰丝氨酸的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或具有心磷脂:磷脂酸酯的比率在源细胞中的心磷脂:磷脂酸酯的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或具有的心磷脂:磷脂酰胆碱的比率在源细胞中的心磷脂:磷脂酰胆碱的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或具有的心磷脂:磷脂酰乙醇胺的比率在源细胞中的心磷脂:磷脂酰乙醇胺的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或具有的心磷脂:磷脂酰甘油的比率在源细胞中的心磷脂:磷脂酰甘油的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或具有的心磷脂:磷脂酰肌醇的比率在源细胞中的心磷脂:磷脂酰肌醇的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或具有的心磷脂:磷脂酰丝氨酸的比率在源细胞中的心磷脂:磷脂酰丝氨酸的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或具有的心磷脂:胆固醇酯的比率在源细胞中的心磷脂:胆固醇酯的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或具有的心磷脂:鞘磷脂的比率在源细胞中的心磷脂:鞘磷脂的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或具有的心磷脂:三酰甘油的比率在源细胞中的心磷脂:三酰甘油的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或具有的磷脂酰胆碱:神经酰胺的比率在源细胞中的磷脂酰胆碱:神经酰胺的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或具有的磷脂酰胆碱:二酰甘油的比率在源细胞中的磷脂酰胆碱:二酰甘油的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或具有的磷脂酰胆碱:己糖基神经酰胺的比率在源细胞中的磷脂酰胆碱:己糖基神经酰胺的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或具有的磷脂酰胆碱:溶血磷脂酸酯的比率在源细胞中的磷脂酰胆碱:溶血磷脂酸酯的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或具有的磷脂酰胆碱:溶血磷脂酰胆碱的比率在源细胞中的磷脂酰胆碱:溶血磷脂酰胆碱的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或具有的磷脂酰胆碱:溶血磷脂酰乙醇胺的比率在源细胞中的磷脂酰胆碱:溶血磷脂酰乙醇胺的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或具有的磷脂酰胆碱:溶血磷脂酰甘油的比率在源细胞中的磷脂酰胆碱:溶血磷脂酰甘油的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或具有的磷脂酰胆碱:溶血磷脂酰肌醇的比率在源细胞中的磷脂酰胆碱:溶血磷脂酰肌醇的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或具有的磷脂酰胆碱:溶血磷脂酰丝氨酸的比率在源细胞中的磷脂酰胆碱:溶血磷脂酰丝氨酸的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或具有的磷脂酰胆碱:磷脂酸酯的比率在源细胞中的心磷脂:磷脂酸酯的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或具有的磷脂酰胆碱:磷脂酰乙醇胺的比率在源细胞中的磷脂酰胆碱:磷脂酰乙醇胺的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或具有的心磷脂:磷脂酰甘油的比率在源细胞中的磷脂酰胆碱:磷脂酰甘油的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或具有的磷脂酰胆碱:磷脂酰肌醇的比率在源细胞中的磷脂酰胆碱:磷脂酰肌醇的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或具有的磷脂酰胆碱:磷脂酰丝氨酸的比率在源细胞中的磷脂酰胆碱:磷脂酰丝氨酸的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或具有的磷脂酰胆碱:胆固醇酯的比率在源细胞中的磷脂酰胆碱:胆固醇酯的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或具有的磷脂酰胆碱:鞘磷脂的比率在源细胞中的磷脂酰胆碱:鞘磷脂的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或具有的磷脂酰胆碱:三酰甘油的比率在源细胞中的磷脂酰胆碱:三酰甘油的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或具有的磷脂酰乙醇胺:神经酰胺的比率在源细胞中的磷脂酰乙醇胺:神经酰胺的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或具有的磷脂酰乙醇胺:二酰甘油的比率在源细胞中的磷脂酰乙醇胺:二酰甘油的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或具有的磷脂酰乙醇胺:己糖基神经酰胺的比率在源细胞中的磷脂酰乙醇胺:己糖基神经酰胺的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或具有的磷脂酰乙醇胺:溶血磷脂酸酯的比率在源细胞中的磷脂酰乙醇胺:溶血磷脂酸酯的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或具有的磷脂酰乙醇胺:溶血磷脂酰胆碱的比率在源细胞中的磷脂酰乙醇胺:溶血磷脂酰胆碱的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或具有的磷脂酰乙醇胺:溶血磷脂酰乙醇胺的比率在源细胞中的磷脂酰乙醇胺:溶血磷脂酰乙醇胺的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或具有的磷脂酰乙醇胺:溶血磷脂酰甘油的比率在源细胞中的磷脂酰乙醇胺:溶血磷脂酰甘油的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或具有的磷脂酰乙醇胺:溶血磷脂酰肌醇的比率在源细胞中的磷脂酰乙醇胺:溶血磷脂酰肌醇的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或具有的磷脂酰乙醇胺:溶血磷脂酰丝氨酸的比率在源细胞中的磷脂酰乙醇胺:溶血磷脂酰丝氨酸的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或具有的磷脂酰乙醇胺:磷脂酸酯的比率在源细胞中的磷脂酰乙醇胺:磷脂酸酯的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或具有的磷脂酰乙醇胺:磷脂酰甘油的比率在源细胞中的磷脂酰乙醇胺:磷脂酰甘油的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或具有的磷脂酰乙醇胺:磷脂酰肌醇的比率在源细胞中的磷脂酰乙醇胺:磷脂酰肌醇的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或具有的磷脂酰乙醇胺:磷脂酰丝氨酸的比率在源细胞中的磷脂酰乙醇胺:磷脂酰丝氨酸的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或具有的磷脂酰乙醇胺:胆固醇酯的比率在源细胞中的磷脂酰乙醇胺:胆固醇酯的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或具有的磷脂酰乙醇胺:鞘磷脂的比率在源细胞中的磷脂酰乙醇胺:鞘磷脂的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或具有的磷脂酰乙醇胺:三酰甘油的比率在源细胞中的磷脂酰乙醇胺:三酰甘油的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或具有的磷脂酰丝氨酸:神经酰胺的比率在源细胞中的磷脂酰丝氨酸:神经酰胺的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或具有的磷脂酰丝氨酸:二酰甘油的比率在源细胞中的磷脂酰丝氨酸:二酰甘油的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或具有的磷脂酰丝氨酸:己糖基神经酰胺的比率在源细胞中的磷脂酰丝氨酸:己糖基神经酰胺的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或具有的磷脂酰丝氨酸:溶血磷脂酸酯的比率在源细胞中的磷脂酰丝氨酸:溶血磷脂酸酯的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或具有的磷脂酰丝氨酸:溶血磷脂酰胆碱的比率在源细胞中的磷脂酰丝氨酸:溶血磷脂酰胆碱的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或具有的磷脂酰丝氨酸:溶血磷脂酰乙醇胺的比率在源细胞中的磷脂酰丝氨酸:溶血磷脂酰乙醇胺的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或具有的磷脂酰丝氨酸:溶血磷脂酰甘油的比率在源细胞中的磷脂酰丝氨酸:溶血磷脂酰甘油的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或具有的磷脂酰丝氨酸:溶血磷脂酰肌醇的比率在源细胞中的磷脂酰丝氨酸:溶血磷脂酰肌醇的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或具有的磷脂酰丝氨酸:溶血磷脂酰丝氨酸的比率在源细胞中的磷脂酰丝氨酸:溶血磷脂酰丝氨酸的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或具有的磷脂酰丝氨酸:磷脂酸酯的比率在源细胞中的磷脂酰丝氨酸:磷脂酸酯的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或具有的磷脂酰丝氨酸:磷脂酰甘油的比率在源细胞中的磷脂酰丝氨酸:磷脂酰甘油的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或具有的磷脂酰丝氨酸:磷脂酰肌醇的比率在源细胞中的磷脂酰丝氨酸:磷脂酰肌醇的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或具有的磷脂酰丝氨酸:胆固醇酯的比率在源细胞中的磷脂酰丝氨酸:胆固醇酯的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或具有的磷脂酰丝氨酸:鞘磷脂的比率在源细胞中的磷脂酰丝氨酸:鞘磷脂的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或具有的磷脂酰丝氨酸:三酰甘油的比率在源细胞中的磷脂酰丝氨酸:三酰甘油的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或具有的鞘磷脂:神经酰胺的比率在源细胞中的鞘磷脂:神经酰胺的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或具有的鞘磷脂:二酰甘油的比率在源细胞中的鞘磷脂:二酰甘油的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或具有的鞘磷脂:己糖基神经酰胺的比率在源细胞中的鞘磷脂:己糖基神经酰胺的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或具有的鞘磷脂:溶血磷脂酸酯的比率在源细胞中的鞘磷脂:溶血磷脂酸酯的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或具有的鞘磷脂:溶血磷脂酰胆碱的比率在源细胞中的鞘磷脂:溶血磷脂酰胆碱的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或具有的鞘磷脂:溶血磷脂酰乙醇胺的比率在源细胞中的鞘磷脂:溶血磷脂酰乙醇胺的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或具有的鞘磷脂:溶血磷脂酰甘油的比率在源细胞中的鞘磷脂:溶血磷脂酰甘油的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或具有的鞘磷脂:溶血磷脂酰肌醇的比率在源细胞中的鞘磷脂:溶血磷脂酰肌醇的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或具有的鞘磷脂:溶血磷脂酰丝氨酸的比率在源细胞中的鞘磷脂:溶血磷脂酰丝氨酸的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或具有的鞘磷脂:磷脂酸酯的比率在源细胞中的鞘磷脂:磷脂酸酯的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或具有的鞘磷脂:磷脂酰甘油的比率在源细胞中的鞘磷脂:磷脂酰甘油的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或具有的鞘磷脂:磷脂酰肌醇的比率在源细胞中的鞘磷脂:磷脂酰肌醇的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或具有的鞘磷脂:胆固醇酯的比率在源细胞中的鞘磷脂:胆固醇酯的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或具有的鞘磷脂:三酰甘油的比率在源细胞中的鞘磷脂:三酰甘油的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或具有的胆固醇酯:神经酰胺的比率在源细胞中的胆固醇酯:神经酰胺的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或具有的胆固醇酯:二酰甘油的比率在源细胞中的胆固醇酯:二酰甘油的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或具有的胆固醇酯:己糖基神经酰胺的比率在源细胞中的胆固醇酯:己糖基神经酰胺的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或具有的胆固醇酯:溶血磷脂酸酯的比率在源细胞中的胆固醇酯:溶血磷脂酸酯的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或具有的胆固醇酯:溶血磷脂酰胆碱的比率在源细胞中的胆固醇酯:溶血磷脂酰胆碱的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或具有的胆固醇酯:溶血磷脂酰乙醇胺的比率在源细胞中的胆固醇酯:溶血磷脂酰乙醇胺的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或具有的胆固醇酯:溶血磷脂酰甘油的比率在源细胞中的胆固醇酯:溶血磷脂酰甘油的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或具有的胆固醇酯:溶血磷脂酰肌醇的比率在源细胞中的胆固醇酯:溶血磷脂酰肌醇的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或具有的胆固醇酯:溶血磷脂酰丝氨酸的比率在源细胞中的胆固醇酯:溶血磷脂酰丝氨酸的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或具有的胆固醇酯:磷脂酸酯的比率在源细胞中的胆固醇酯:磷脂酸酯的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或具有的胆固醇酯:磷脂酰甘油的比率在源细胞中的胆固醇酯:磷脂酰甘油的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或具有的胆固醇酯:磷脂酰肌醇的比率在源细胞中的胆固醇酯:磷脂酰肌醇的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或具有的胆固醇酯:三酰甘油的比率在源细胞中的胆固醇酯:三酰甘油的比率的10％、20％、30％、40％或50％内。
在一些实施方案中，细胞生物制品包含与源细胞的蛋白质组学组成类似的蛋白质组学组成，例如使用实施例30的测定法测定。在一些实施方案中，细胞生物制品包含在源细胞中的对应比率的10％、20％、30％、40％或50％内的脂质:蛋白质的比率，例如使用实施例37的测定法所测量。在一些实施方案中，细胞生物制品包含在源细胞中的对应比率的10％、20％、30％、40％或50％内的蛋白质:核酸(例如DNA或RNA)的比率，例如使用实施例38的测定法所测量。在一些实施方案中，细胞生物制品包含在源细胞中的对应比率的10％、20％、30％、40％或50％内的脂质:核酸(例如DNA)的比率，例如使用实施例39的测定法所测量。在一些实施方案中，细胞生物制品包含大于源细胞中的对应比率的脂质:核酸(例如DNA)的比率，例如大至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，例如使用实施例39的测定法所测量。
在一些实施方案中，细胞生物制品于受试者(例如小鼠)中的半衰期在参考细胞(例如源细胞)的半衰期的1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％内，例如通过实施例60的测定法测定。在一些实施方案中，细胞生物制品于受试者(例如小鼠)中的半衰期为至少1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、12小时或24小时，例如在人类受试者或小鼠中，例如通过实施例60的测定法测定。在一些实施方案中，细胞生物制品于受试者(例如小鼠)中的半衰期为小于24小时、48小时或72小时，例如通过实施例60的测定法测定。在一些实施方案中，治疗剂于受试者中的半衰期比细胞生物制品的半衰期更长，例如长至少10％、20％、50％、2倍、5倍或10倍。例如，细胞生物制品可将治疗剂递送至靶细胞，且治疗剂可在细胞生物制品不再存在或可检测之后存在。
在一些实施方案中，细胞生物制品跨膜运输葡萄糖(例如标记的葡萄糖，例如2-NBDG)，例如比阴性对照(例如在不存在葡萄糖的情况下在其他方面相似的细胞生物制品)多至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％，例如使用实施例49的测定法所测量。在一些实施方案中，细胞生物制品于腔中的酯酶活性在参考细胞(例如源细胞或小鼠胚胎成纤维细胞)中的酯酶活性的1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％内，例如使用实施例51的测定法。在一些实施方案中，细胞生物制品的代谢活性水平在参考细胞(例如源细胞)中的柠檬酸合酶活性的1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％内，例如如实施例53中所述。在一些实施方案中，细胞生物制品的呼吸水平(例如耗氧速率)在参考细胞(例如源细胞)中的呼吸水平的1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％内，例如如实施例54中所述。在一些实施方案中，细胞生物制品包含至多18,000、17,000、16,000、15,000、14,000、13,000、12,000、11,000或10,000MFI的膜联蛋白-V染色水平，例如使用实施例55的测定法，或其中相比于实施例55的测定法中的用甲萘醌处理的在其他方面相似的细胞生物制品的膜联蛋白-V染色水平，细胞生物制品包含低至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的膜联蛋白-V染色水平，或其中相比于实施例55的测定法中的用甲萘醌处理的巨噬细胞的膜联蛋白-V染色水平，细胞生物制品包含低至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的膜联蛋白-V染色水平。
在一些实施方案中，相比于源细胞，细胞生物制品的miRNA含量水平为至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大，例如通过实施例27的测定法。在一些实施方案中，细胞生物制品的miRNA含量水平为源细胞的miRNA含量水平的至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大(例如源细胞的miRNA含量水平的至多100％)，例如通过实施例27的测定法。在一些实施方案中，细胞生物制品的总RNA含量水平为源细胞的总RNA含量水平的至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大(例如源细胞的总RNA含量水平的至多100％)，例如通过实施例80的测定法所测量。在一些实施方案中，相比于源细胞，细胞生物制品的可溶性:不溶性蛋白质的比率在1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大内，例如在源细胞的1％-2％、2％-3％、3％-4％、4％-5％、5％-10％、10％-20％、20％-30％、30％-40％、40％-50％、50％-60％、60％-70％、70％-80％或80％-90％内，例如通过实施例35的测定法。在一些实施方案中，细胞生物制品具有的LPS水平为细胞生物制品的脂质含量的小于5％、1％、0.5％、0.01％、0.005％、0.0001％、0.00001％或更小，例如通过实施例36的测定法所测量。在一些实施方案中，细胞生物制品具有的LPS水平为源细胞的LPS含量的小于5％、1％、0.5％、0.01％、0.005％、0.0001％、0.00001％或更小，例如根据质谱法所测量，例如在实施例36的测定法中。在一些实施方案中，细胞生物制品能够进行信号转导，例如传输细胞外信号，例如响应于胰岛素的AKT磷酸化，或响应于胰岛素的葡萄糖(例如标记的葡萄糖，例如2-NBDG)摄取，例如比阴性对照(例如不存在胰岛素的在其他方面相似的细胞生物制品)多至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％，例如使用实施例48的测定法。在一些实施方案中，细胞生物制品在向例如小鼠的受试者施用时靶向组织，例如肝、肺、心脏、脾、胰腺、胃肠道、肾、睾丸、卵巢、脑、生殖器官、中枢神经系统、外周神经系统、骨骼肌、内皮、内耳或眼，例如其中在24、48或72小时之后，施用的细胞生物制品群体中至少0.1％、0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的细胞生物制品存在于靶组织中，例如通过实施例71的测定法。在一些实施方案中，相比于由参考细胞(例如源细胞或骨髓基质细胞(BMSC))诱导的近分泌信号传导水平，细胞生物制品具有大至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的近分泌信号传导水平，例如通过实施例56的测定法。在一些实施方案中，细胞生物制品具有的近分泌信号传导水平比参考细胞(例如源细胞或骨髓基质细胞(BMSC))中的近分泌信号传导水平大至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％(例如至多100％)，例如通过实施例56的测定法。在一些实施方案中，相比于由参考细胞(例如源细胞或巨噬细胞)诱导的旁分泌信号传导水平，细胞生物制品具有大至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％的旁分泌信号传导水平，例如通过实施例57的测定法。在一些实施方案中，细胞生物制品具有的旁分泌信号传导水平为由参考细胞(例如源细胞或骨髓基质细胞(BMSC))诱导的旁分泌信号传导水平的至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％(例如至多100％)，例如通过实施例57的测定法。在一些实施方案中，相比于参考细胞(例如源细胞或C2C12细胞)中聚合肌动蛋白的水平，细胞生物制品以在1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％内的水平聚合肌动蛋白，例如通过实施例58的测定法。在一些实施方案中，细胞生物制品具有的膜电位在参考细胞(例如源细胞或C2C12细胞)的膜电位的约1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％内，例如通过实施例59的测定法，或其中细胞生物制品具有约-20至-150mV、-20至-50mV、-50至-100mV或-100至-150mV的膜电位，或其中细胞生物制品具有小于-1mv、-5mv、-10mv、-20mv、-30mv、-40mv、-50mv、-60mv、-70mv、-80mv、-90mv、-100mv的膜电位。在一些实施方案中，细胞生物制品能够从血管外渗，例如以源细胞的外渗率的至少1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的速率，例如使用实施例42的测定法，例如其中源细胞为嗜中性粒细胞、淋巴细胞、B细胞、巨噬细胞或NK细胞。在一些实施方案中，细胞生物制品能够趋化，例如为相比于参考细胞(例如巨噬细胞)的至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％(例如至多100％)，例如使用实施例43的测定法。在一些实施方案中，细胞生物制品能够吞噬，例如相比于参考细胞(例如巨噬细胞)的至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％(例如至多100％)，例如使用实施例45的测定法。在一些实施方案中，细胞生物制品能够穿过细胞膜，例如内皮细胞膜或血脑屏障。在一些实施方案中，细胞生物制品能够分泌蛋白质，例如以比参考细胞(例如小鼠胚胎成纤维细胞)大至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的速率，例如使用实施例47的测定法。在一些实施方案中，细胞生物制品能够分泌蛋白质，例如以相比于参考细胞(例如小鼠胚胎成纤维细胞)的至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％(例如至多100％)的速率，例如使用实施例47的测定法。
在一些实施方案中，细胞生物制品不能转录或具有参考细胞(例如源细胞)的转录活性的小于1％、2.5％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的转录活性，例如使用实施例9的测定法。在一些实施方案中，细胞生物制品不能进行核DNA复制或具有参考细胞(例如源细胞)的核DNA复制的小于1％、2.5％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的核DNA复制，例如使用实施例10的测定法。在一些实施方案中，细胞生物制品缺乏染色质或具有参考细胞(例如源细胞)的染色质含量的小于1％、2.5％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的染色质含量，例如使用实施例25的测定法。
在一些实施方案中，通过与参考细胞比较来描述细胞生物制品的特征。在实施方案中，参考细胞为源细胞。在实施方案中，参考细胞为HeLa、HEK293、HFF-1、MRC-5、WI-38、IMR 90、IMR 91、PER.C6、HT-1080或BJ细胞。在一些实施方案中，通过与参考细胞群体，例如源细胞群体，或HeLa、HEK293、HFF-1、MRC-5、WI-38、IMR 90、IMR 91、PER.C6、HT-1080或BJ细胞群体比较来描述细胞生物制品群体的特征。
在一些实施方案中，细胞生物制品符合药物或良好生产规范(GMP)标准。在一些实施方案中，细胞生物制品是根据良好生产规范(GMP)制备的。在一些实施方案中，细胞生物制品具有的病原体水平低于预定参考值，例如基本上不含病原体。在一些实施方案中，细胞生物制品具有的污染物水平低于预定参考值，例如基本上不含污染物。在一些实施方案中，细胞生物制品具有低免疫原性，例如如本文所述。
在一些实施方案中，源细胞为内皮细胞、成纤维细胞、血细胞(例如巨噬细胞、嗜中性粒细胞、粒细胞、白细胞)、干细胞(例如间充质干细胞、脐带干细胞、骨髓干细胞、造血干细胞、诱导性多能干细胞，例如衍生自受试者细胞的诱导性多能干细胞)、胚胎干细胞(例如来自胚胎卵黄囊、胎盘、脐带、胎儿皮肤、青少年皮肤、血液、骨髓、脂肪组织、红细胞生成组织、造血组织的干细胞)、成肌细胞、实质细胞(例如肝细胞)、肺泡细胞、神经元(例如视网膜神经元细胞)、前体细胞(例如视网膜前体细胞、原粒细胞、髓样前体细胞、胸腺细胞、性母细胞、原巨核细胞、幼巨核细胞、成黑色素细胞、淋巴母细胞、骨髓前体细胞、正常红细胞或成血管细胞)、祖细胞(例如心脏祖细胞、卫星细胞、放射状胶质细胞、骨髓基质细胞、胰腺祖细胞、内皮祖细胞、母细胞)或永生化细胞(例如HeLa、HEK293、HFF-1、MRC-5、WI-38、IMR 90、IMR 91、PER.C6、HT-1080或BJ细胞)。在一些实施方案中，源细胞不是293细胞、HEK细胞、人内皮细胞或人上皮细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞或干细胞。
在一些实施方案中，细胞生物制品包含货物，例如治疗剂，例如内源治疗剂或外源治疗剂。在一些实施方案中，治疗剂选自以下中的一种或多种：蛋白质，例如酶、跨膜蛋白、受体、抗体；核酸，例如DNA、染色体(例如人类人工染色体)、RNA、mRNA、siRNA、miRNA或小分子。在一些实施方案中，治疗剂是除线粒体以外的细胞器，例如选自以下的细胞器：细胞核、高尔基体、溶酶体、内质网、液泡、内体、顶体、自噬体、中心粒、糖酵解酶体、乙醛酸循环体、氢化酶体、黑色素体、纺锤剩体、刺丝囊、过氧化物酶体、蛋白酶体、囊泡和应激颗粒。在一些实施方案中，细胞器是线粒体。
在一些实施方案中，细胞生物制品、组合物或制剂具有<1、1-1.1、1.05-1.15、1.1-1.2、1.15-1.25、1.2-1.3、1.25-1.35或>1.35g/ml的密度，例如通过实施例21的测定法。
在一些实施方案中，按蛋白质质量计，细胞生物制品组合物包含小于0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、4％、5％或10％源细胞，或小于0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、4％、5％或10％的细胞具有功能性核。在一些实施方案中，细胞生物制品组合物中至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的细胞生物制品包含细胞器，例如线粒体。
在一些实施方案中，细胞生物制品进一步包含外源治疗剂。在一些实施方案中，外源治疗剂选自以下中的一种或多种：蛋白质，例如酶、跨膜蛋白、受体、抗体；核酸，例如DNA、染色体(例如人类人工染色体)、RNA、mRNA、siRNA、miRNA或小分子。
在一些实施方案中，细胞生物制品或细胞生物制品组合物被冷藏或冷冻。在实施方案中，细胞生物制品不包含功能性核，细胞生物制品组合物包含不具有功能性核的细胞生物制品。在实施方案中，按蛋白质质量计，细胞生物制品组合物包含小于0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、4％、5％或10％源细胞，或小于0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、4％、5％或10％的细胞具有功能性核。在实施方案中，细胞生物制品组合物已在所述温度下维持至少1、2、3、6或12小时；1、2、3、4、5或6天；1、2、3或4周；1、2、3或6个月；或1、2、3、4或5年。在实施方案中，细胞生物制品组合物具有的活性为维持于所述温度之前的群体的活性的至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％，例如通过本文所述的测定法。
在实施方案中，细胞生物制品组合物在低于4C的温度下稳定至少1、2、3、6或12小时；1、2、3、4、5或6天；1、2、3或4周；1、2、3或6个月；或1、2、3、4或5年。在实施方案中，细胞生物制品组合物在低于-20C的温度下稳定至少1、2、3、6或12小时；1、2、3、4、5或6天；1、2、3或4周；1、2、3或6个月；或1、2、3、4或5年。在实施方案中，细胞生物制品组合物在低于-80C的温度下稳定至少1、2、3、6或12小时；1、2、3、4、5或6天；1、2、3或4周；1、2、3或6个月；或1、2、3、4或5年。
在实施方案中，以下中的一个或多个：
i)源细胞是除293细胞外的；
ii)源细胞不是转化或永生化的；
iii)源细胞使用除腺病毒介导的永生化以外的方法来转化或永生化，例如通过自发突变或端粒酶表达永生化；
iv)治疗剂是除Cre或EGFP外的；
v)治疗剂为核酸(例如RNA，例如mRNA、miRNA或siRNA)或外源蛋白质(例如抗体，例如抗体)，例如在腔中；或
vi)细胞生物制品不包含线粒体。
在实施方案中，以下中的一个或多个：
i)源细胞是除293或HEK细胞外的；
ii)源细胞不是转化或永生化的；
iii)源细胞使用除腺病毒介导的永生化以外的方法来转化或永生化，例如通过自发突变或端粒酶表达永生化；
iv)细胞生物制品具有除在40与150nm之间外的大小，例如大于150nm、200nm、300n、400nm或500nm。
在实施方案中，以下中的一个或多个：
i)治疗剂是由源细胞表达的可溶性蛋白质；
ii)细胞生物制品在其腔中包含选自酶、抗体或抗病毒多肽的多肽；
iii)细胞生物制品不包含外源治疗性跨膜蛋白；或
iv)细胞生物制品不包含CD63或GLUT4。
在实施方案中，细胞生物制品：
i)不包含病毒、无感染性或不在宿主细胞中繁殖；
ii)不是VLP(病毒样颗粒)；
iii)不包含病毒结构蛋白，例如病毒壳体蛋白，例如病毒核壳蛋白，或其中病毒壳体蛋白的量为总蛋白质的小于10％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.2％或0.1％，例如通过实施例41的测定法；
iv)不包含病毒基质蛋白；
v)不包含病毒非结构蛋白；
vi)包含每囊泡的小于10、50、100、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000或1,000,000,000个拷贝的病毒结构蛋白；或
vii)细胞生物制品不是病毒体。
在实施方案中，细胞生物制品上治疗剂或外源剂的拷贝数与病毒结构蛋白的拷贝数的比率为至少1000000:1、100000:1,10000:1、1000:1、100:1和50:1、50:1和20:1、20:1和10:1、10:1和5:1或1:1。在实施方案中，细胞生物制品上治疗剂或外源剂的拷贝数与病毒结构蛋白的拷贝数的比率为至少1,000,000:1、100,000:1、10,000:1、1,000:1、100:1、50:1、20:1、10:1、5:1或1:1。在实施方案中，细胞生物制品上治疗剂或外源剂的拷贝数与病毒基质蛋白的拷贝数的比率为至少1000000:1、100000:1,10000:1、1000:1、100:1和50:1、50:1和20:1、20:1和10:1、10:1和5:1或1:1。在实施方案中，细胞生物制品上治疗剂或外源剂的拷贝数与病毒基质蛋白的拷贝数的比率为至少1,000,000:1、100,000:1、10,000:1、1,000:1、100:1、50:1、20:1、10:1、5:1或1:1。
在实施方案中，以下中的一个或多个：
i)细胞生物制品不包含与水不混溶的液滴；
ii)细胞生物制品包含水性腔和亲水性外部；
iii)细胞器选自线粒体、高尔基体、溶酶体、内质网、液泡、内体、顶体、自噬体、中心粒、糖酵解酶体、乙醛酸循环体、氢化酶体、黑色素体、纺锤剩体、刺丝囊、过氧化物酶体、蛋白酶体、囊泡和应激颗粒。
在实施方案中，以下中的一个或多个：
i)细胞生物制品不是通过用治疗或诊断物质加载细胞生物制品而制备；
ii)源细胞未加载治疗或诊断物质；
iii)细胞生物制品不包含多柔比星、地塞米松、环糊精；聚乙二醇、microRNA，例如miR125、VEGF受体、ICAM-1、E-选择蛋白，氧化铁、荧光蛋白，例如GFP或RFP、纳米颗粒或RNA酶，或不包含前述中的任一种的外源形式；或
iv)细胞生物制品进一步包含具有一个或多个翻译后修饰，例如糖基化的外源治疗剂。
在实施方案中，细胞生物制品为单层或多层的。
在实施方案中，细胞生物制品具有在源细胞的大小的约0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％内的大小，例如通过实施例18的测定法所测量。在实施方案中，细胞生物制品具有源细胞大小的小于约0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％的大小，例如通过实施例18的测定法所测量。在实施方案中，细胞生物制品具有在源细胞的大小的约0.01％-0.05％、0.05％-0.1％、0.1％-0.5％、0.5％-1％、1％-2％、2％-3％、3％-4％、4％-5％、5％-10％、10％-20％、20％-30％、30％-40％、40％-50％、50％-60％、60％-70％、70％-80％或80％-90％内的大小，例如通过实施例18的测定法所测量。在实施方案中，细胞生物制品具有源细胞的大小的小于约0.01％-0.05％、0.05％-0.1％、0.1％-0.5％、0.5％-1％、1％-2％、2％-3％、3％-4％、4％-5％、5％-10％、10％-20％、20％-30％、30％-40％、40％-50％、50％-60％、60％-70％、70％-80％或80％-90％的大小，例如通过实施例18的测定法所测量。在实施方案中，细胞生物制品具有源细胞的大小的约0.01％-0.05％、0.05％-0.1％、0.1％-0.5％、0.5％-1％、1％-2％、2％-3％、3％-4％、4％-5％、5％-10％、10％-20％、20％-30％、30％-40％、40％-50％、50％-60％、60％-70％、70％-80％或80％-90％的大小，例如通过实施例18的测定法所测量。在实施方案中，细胞生物制品具有的直径为至少约10nm、20nm、30nm、40nm、50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、150nm、200nm或250nm，例如通过实施例20的测定法所测量。在实施方案中，细胞生物制品的直径为约10nm、20nm、30nm、40nm、50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、150nm、200nm或250nm(例如±20％)，例如通过实施例20的测定法所测量。在实施方案中，细胞生物制品具有的直径为至少约500nm、750nm、1,000nm、1,500nm、2,000nm、2,500nm、3,000nm、5,000nm、10,000nm或20,000nm，例如通过实施例20的测定法所测量。在实施方案中，细胞生物制品具有的平均大小为约500nm、750nm、1,000nm、1,500nm、2,000nm、2,500nm、3,000nm、5,000nm、10,000nm或20,000nm(例如±20％)，例如通过实施例20的测定法所测量。在一些实施方案中，细胞生物制品群体的平均大小为小于80nm、100nm、200nm、500nm、1000nm、1200nm、1400nm或1500nm。
在实施方案中，以下中的一个或多个：
i)细胞生物制品不是外来体；
ii)细胞生物制品是微囊泡；
iii)细胞生物制品具有的大小为至少80nm、100nm、200nm、500nm、1000nm、1200nm、1400nm或1500nm，或细胞生物制品群体具有的平均大小为至少80nm、100nm、200nm、500nm、1000nm、1200nm、1400nm或1500nm；
iv)细胞生物制品包含一个或多个细胞器，例如线粒体、高尔基体、溶酶体、内质网、液泡、内体、顶体、自噬体、中心粒、糖酵解酶体、乙醛酸循环体、氢化酶体、黑色素体、纺锤剩体、刺丝囊、过氧化物酶体、蛋白酶体、囊泡和应激颗粒；
v)细胞生物制品包含细胞骨架或其组分，例如肌动蛋白、Arp2/3、形成蛋白、冠蛋白、抗肌萎缩蛋白、角蛋白、肌球蛋白或微管蛋白；
vi)细胞生物制品、组合物或制剂不具有1.08-1.22g/ml的浮选密度或具有至少1.18-1.25g/ml或1.05-1.12g/ml的密度，例如在蔗糖梯度离心测定法中，例如如Théry等人,“Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatantsand biological fluids.”Curr Protoc Cell Biol.2006Apr；第3章:第3.22节中所述；
vii)细胞生物制品包含与源细胞相比富含神经酰胺或鞘磷脂或其组合的脂质双层，或与源细胞相比未富含(例如耗竭)糖脂、游离脂肪酸或磷脂酰丝氨酸或其组合的脂质双层；
viii)细胞生物制品包含磷脂酰丝氨酸(PS)或CD40配体或PS和CD40配体二者，例如当在实施例40的测定法中测量时；
ix)通过Kanada M,et al.(2015)Differential fates of biomoleculesdelivered to target cells via extracellular vesicles.Proc Natl Acad SciUSA112:E1433–E1442的测定法，相比于源细胞，细胞生物制品富含PS，例如在细胞生物制品群体中，至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％对PS呈阳性；
x)细胞生物制品基本上不含乙酰胆碱酯酶(AChE)，或含有小于0.001、0.002、0.005、0.01,0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50、100、200、500或1000个AChE活性单元/μg蛋白质，例如通过实施例52的测定法测定；
xi)细胞生物制品基本上不含四次穿膜蛋白(Tetraspanin)家族蛋白质(例如CD63、CD9或CD81)、ESCRT相关蛋白(例如TSG101、CHMP4A-B或VPS4B)、Alix、TSG101、MHCI、MHCII、GP96、辅肌动蛋白-4、mitofilin、syntenin-1、TSG101、ADAM10、EHD4、syntenin-1、TSG101、EHD1、flotilin-1、热激70-kDa蛋白(HSC70/HSP73、HSP70/HSP72)或其任何组合，或含有小于0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、5％、或10％的任何单个外来体标志物蛋白和/或小于0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％或25％的任何所述蛋白的总外来体标志物蛋白，或相比于源细胞脱富集(derich for)这些蛋白质中的任何一种或多种，或未富含这些蛋白质中的任何一种或多种，例如通过实施例32的测定法测定；
xii)细胞生物制品包含的甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的水平低于500、250、100、50、20、10、5或1ng GAPDH/μg总蛋白质或低于源细胞中的GAPDH水平，例如比源细胞中以ng/μg计的GAPDH/总蛋白质水平低小于1％、2.5％、5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，例如使用实施例33的测定法测定；
xiii)细胞生物制品富含一种或多种内质网蛋白(例如钙联接蛋白)、一种或多种蛋白酶体蛋白或一种或多种线粒体蛋白或其任何组合，例如其中钙联接蛋白的量为小于500、250、100、50、20、10、5或1ng钙联接蛋白/μg总蛋白质，或其中相比于源细胞，细胞生物制品包含少1％、2.5％、5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的以ng/μg计的钙联接蛋白/总蛋白质，例如使用实施例34的测定法测定；
xiv)细胞生物制品包含外源剂(例如外源蛋白质、mRNA或siRNA)，例如使用实施例27或28的测定法所测量；或
xviii)细胞生物制品可以通过原子力显微术在云母表面上固定化至少30分钟，例如通过Kanada M,et al.(2015)Differential fates of biomolecules delivered totarget cells via extracellular vesicles.Proc Natl Acad Sci USA112:E1433–E1442的测定法测定。
在实施方案中，以下中的一个或多个：
i)细胞生物制品是外来体；
ii)细胞生物制品不是微囊泡；
iii)细胞生物制品具有的大小为小于80nm、100nm、200nm、500nm、1000nm、1200nm、1400nm或1500nm，或细胞生物制品群体的平均大小为至少80nm、100nm、200nm、500nm、1000nm、1200nm、1400nm或1500nm；
iv)细胞生物制品不包含细胞器；
v)细胞生物制品不包含细胞骨架或其组分，例如肌动蛋白、Arp2/3、形成蛋白、冠蛋白、抗肌萎缩蛋白、角蛋白、肌球蛋白或微管蛋白；
vi)细胞生物制品、组合物或制剂具有1.08-1.22g/ml的浮选密度，例如在蔗糖梯度离心测定法中，例如如Théry等人,“Isolation and characterization of exosomesfrom cell culture supernatants and biological fluids.”Curr Protoc CellBiol.2006Apr；第3章:第3.22节中所述；
vii)相比于源细胞，脂质双层未富含(例如耗竭)神经酰胺或鞘磷脂或其组合，或相比于源细胞，脂质双层富含糖脂、游离脂肪酸或磷脂酰丝氨酸或其组合；
viii)细胞生物制品不包含磷脂酰丝氨酸(PS)或CD40配体或PS和CD40配体二者或就源细胞而言耗竭磷脂酰丝氨酸(PS)或CD40配体或PS和CD40配体二者，例如当在实施例40的测定法中测量时；
ix)通过Kanada M,et al.(2015)Differential fates of biomoleculesdelivered to target cells via extracellular vesicles.Proc Natl Acad SciUSA112:E1433–E1442的测定法，相比于源细胞，细胞生物制品未富含(例如耗竭)PS，例如在细胞生物制品群体中，小于20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％对PS呈阳性；
x)细胞生物制品包含乙酰胆碱酯酶(AChE)，例如至少0.001、0.002、0.005、0.01,0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50、100、200、500或1000个AChE活性单位/μg蛋白质，例如通过实施例52的测定法；
xi)细胞生物制品包含四次穿膜蛋白家族蛋白质(例如CD63、CD9或CD81)、ESCRT相关蛋白(例如TSG101、CHMP4A-B或VPS4B)、Alix、TSG101、MHCI、MHCII、GP96、辅肌动蛋白-4、mitofilin、syntenin-1、TSG101、ADAM10、EHD4、syntenin-1、TSG101、EHD1、flotilin-1、热激70-kDa蛋白(HSC70/HSP73、HSP70/HSP72)或其任何组合，或含有大于0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、5％、或10％的任何单个外来体标志物蛋白和/或小于0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％或25％的任何所述蛋白的总外来体标志物蛋白，或相比于源细胞富含这些蛋白质中的任何一种或多种，例如通过实施例32的测定法；
xii)细胞生物制品包含的甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的水平高于500、250、100、50、20、10、5或1ng GAPDH/μg总蛋白质或低于源细胞中的GAPDH水平，例如比源细胞中以ng/μg计的GAPDH/总蛋白质水平大至少1％、2.5％、5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，例如使用实施例33的测定法；
xiii)细胞生物制品未富含(例如耗竭)一种或多种内质网蛋白(例如钙联接蛋白)、一种或多种蛋白酶体蛋白或一种或多种线粒体蛋白或其任何组合，例如其中钙联接蛋白的量为小于500、250、100、50、20、10、5或1ng钙联接蛋白/μg总蛋白质，或其中相比于源细胞，细胞生物制品包含少1％、2.5％、5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的以ng/μg计的钙联接蛋白/总蛋白质，例如使用实施例34的测定法；或
xiv)细胞生物制品不能通过原子力显微术在云母表面上固定化至少30分钟，例如通过Kanada M等人(2015)Differential fates of biomolecules delivered to targetcells via extracellular vesicles.Proc Natl Acad Sci USA112:E1433–E1442的测定法。
在实施方案中，以下中的一个或多个：
i)细胞生物制品不包含VLP；
ii)细胞生物制品不包含病毒；
iii)细胞生物制品不包含具有复制能力的病毒；
iv)细胞生物制品不包含病毒蛋白质，例如病毒结构蛋白，例如壳体蛋白或病毒基质蛋白；
v)细胞生物制品不包含来自包膜病毒的壳体蛋白；
vi)细胞生物制品不包含核壳蛋白；或
vii)细胞生物制品不包含病毒融合剂。
在实施方案中，细胞生物制品包含胞质溶胶。
在实施方案中，以下中的一个或多个：
i)细胞生物制品或源细胞在植入至受试者内时不形成畸胎瘤，例如通过实施例74的测定法；
ii)细胞生物制品能够趋化，例如在相比于参考细胞(例如巨噬细胞)的1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更大内，例如使用实施例43的测定法；
iii)细胞生物制品能够在例如损伤部位归巢，其中细胞生物制品来自人类细胞，例如使用实施例44的测定法，例如其中源细胞为嗜中性粒细胞；或
iv)细胞生物制品能够吞噬，例如其中可在使用实施例45的测定法中在0.5、1、2、3、4、5或6小时内检测到通过细胞生物制品的吞噬，例如其中源细胞为巨噬细胞。
在实施方案中，在向受试者(例如人类受试者)施用之后，细胞生物制品或细胞生物制品组合物保留任何特征中的一、二、三、四、五、六个或更多个持续5天或更短，例如4天或更短、3天或更短、2天或更短、1天或更短，例如约12-72小时。
在实施方案中，细胞生物制品具有以下特征中的一个或多个：
a)包含来自源细胞的一种或多种内源蛋白，例如膜蛋白或胞质蛋白；
b)包含至少10、20、50、100、200、500、1000、2000或5000种不同的蛋白质；
c)包含至少1、2、5、10、20、50或100种不同的糖蛋白；
d)细胞生物制品中至少10质量％、20质量％、30质量％、40质量％、50质量％、60质量％、70质量％、80质量％或90质量％的蛋白质为天然存在的蛋白质；
e)包含至少10、20、50、100、200、500、1000、2000或5000种不同的RNA；或
f)包含至少2、3、4、5、10或20种不同的脂质，例如选自CL、Cer、DAG、HexCer、LPA、LPC、LPE、LPG、LPI、LPS、PA、PC、PE、PG、PI、PS、CE、SM和TAG。
在实施方案中，细胞生物制品已经经操作以具有以下特性中的一、二、三、四、五种或更多种，或细胞生物制品不是天然存在的细胞且具有以下特性中的一、二、三、四、五种或更多种，或其中核不天然地具有以下特性中的一、二、三、四、五种或更多种：
a)部分核失活导致核功能降低至少50％、60％、70％、80％、90％或更多，例如转录或DNA复制降低或二者均降低，例如其中通过实施例9的测定法来测量转录且通过实施例10的测定法来测量DNA复制；
b)细胞生物制品不能转录或具有的转录活性为参考细胞(例如源细胞)的转录活性的小于1％、2.5％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，例如使用实施例9的测定法；
c)细胞生物制品不能进行核DNA复制或具有的核DNA复制为参考细胞(例如源细胞)的核DNA复制的小于1％、2.5％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，例如使用实施例10的测定法；
d)细胞生物制品缺乏染色质或具有的染色质含量为参考细胞(例如源细胞)的染色质含量的小于1％、2.5％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，例如使用实施例25的测定法；
e)细胞生物制品缺乏核膜或具有参考细胞(例如源细胞或Jurkat细胞)的核膜的量的小于50％、40％、30％、20％、10％、5％、4％、3％、2％或1％，例如通过实施例24的测定法；
f)细胞生物制品缺乏功能性核孔复合物或具有降低的核输入或输出活性，例如通过实施例24的测定法，降低至少50％、40％、30％、20％、10％、5％、4％、3％、2％或1％，或细胞生物制品缺乏一种或多种核孔蛋白，例如NUP98或Importin 7；
g)细胞生物制品不包含组蛋白或具有的组蛋白水平为源细胞(例如H1、H2a、H2b、H3或H4)的组蛋白水平的小于1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，例如通过实施例25的测定法；
h)细胞生物制品包含小于20、10、5、4、3、2或1个染色体；
i)核功能被消除；
j)细胞生物制品为去核的哺乳动物细胞；
k)通过机械力、通过辐射或通过化学消融将核去除或失活(例如挤压)；或
l)细胞生物制品来自完全或部分去除DNA的哺乳动物细胞，例如在间期或有丝分裂期间。
在实施方案中，细胞生物制品包含mtDNA或载体DNA。在实施方案中，细胞生物制品不包含DNA。
在实施方案中，源细胞为原代细胞、永生化细胞或细胞系(例如原粒细胞细胞系，例如C2C12)。在实施方案中，细胞生物制品来自源细胞，所述源细胞具有修饰的基因组，例如具有降低的免疫原性(例如通过基因组编辑，例如以去除MHC蛋白)。在实施方案中，源细胞来自用免疫抑制剂处理的细胞培养物。在实施方案中，源细胞为基本上非免疫原性的，例如使用本文所述的测定法。在实施方案中，源细胞包含外源剂，例如治疗剂。在实施方案中，源细胞为重组细胞。
在实施方案中，细胞生物制品进一步包含外源剂，例如治疗剂，例如蛋白质或核酸(例如DNA、染色体(例如人类人工染色体)、RNA，例如mRNA或miRNA)。在实施方案中，外源剂以由细胞生物制品所包含的至少或不超过10、20、50、100、200、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000或1,000,000,000个拷贝存在。在实施方案中，外源剂以每细胞生物制品至少或不超过10、20、50、100、200、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000或1,000,000个拷贝的平均水平存在。在实施方案中，细胞生物制品具有改变(例如提高或降低)水平的一种或多种内源分子，例如蛋白质或核酸，例如由用siRNA或基因编辑酶处理源细胞(例如哺乳动物源细胞)所致。在实施方案中，内源分子以由细胞生物制品所包含的至少或不超过10、20、50、100、200、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000或1,000,000,000个拷贝存在。在实施方案中，外源分子以每细胞生物制品至少或不超过10、20、50、100、200、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000或1,000,000个拷贝的平均水平存在。在实施方案中，内源分子(例如RNA或蛋白质)以比其于源细胞中的浓度大至少1、2、3、4、5、10、20、50、100、500、103、5.0×103、104、5.0×104、105、5.0×105、106、5.0×106、1.0×107、5.0×107或1.0×108的浓度存在。
在实施方案中，试剂(例如治疗剂)选自蛋白质、蛋白质复合物(例如包含至少2、3、4、5、10、20或50个蛋白质，例如至少2、3、4、5、10、20或50个不同的蛋白质)多肽、核酸(例如DNA、染色体或RNA，例如mRNA、siRNA或miRNA)或小分子。在实施方案中，外源剂包含位点特异性核酸酶，例如Cas9分子、TALEN或ZFN。
在实施方案中，细胞生物制品包含融合剂。在实施方案中，融合剂为病毒融合剂或哺乳动物融合剂。在实施方案中，融合剂为蛋白质融合剂、脂质融合剂、化学融合剂或小分子融合剂。
在实施方案中，细胞生物制品结合或作用于靶细胞。在实施方案中，靶细胞是除HeLa细胞外的，或靶细胞不是转化或永生化的。
在涉及细胞生物制品组合物的一些实施方案中，多个细胞生物制品为相同的。在一些实施方案中，多个细胞生物制品为不同的。在一些实施方案中，多个细胞生物制品来自一个或多个源细胞。在一些实施方案中，多个细胞生物制品中的至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％具有在细胞生物制品组合物中的细胞生物制品的平均直径的10％、20％、30％、40％或50％内的直径。在一些实施方案中，多个细胞生物制品中的至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％具有在细胞生物制品组合物中的细胞生物制品的平均体积的10％、20％、30％、40％或50％内的体积。在一些实施方案中，细胞生物制品组合物具有源细胞群体的大小分布变化性的10％、50％或90％内的小于约90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、5％的大小分布变化性，例如基于实施例19。在一些实施方案中，多个细胞生物制品中的至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的细胞生物制品具有的治疗剂拷贝数在细胞生物制品组合物中的细胞生物制品的平均治疗剂拷贝数的10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％内。在一些实施方案中，细胞生物制品组合物包含至少105、106、107、108、109或1010个细胞生物制品。在一些实施方案中，细胞生物制品组合物的体积为至少1μl、2μl、5μl、10μl、20μl、50μl、100μl、200μl、500μl、1ml、2ml、5ml或10ml。
在实施方案中，本文所述的药物组合物具有以下特征中的一个或多个：
a)药物组合物符合药物或良好生产规范(GMP)标准；
b)药物组合物是根据良好生产规范(GMP)制备的；
c)药物组合物具有低于预定参考值的病原体水平，例如基本上不含病原体；
d)药物组合物具有低于预定参考值的污染物水平，例如基本上不含污染物；或
e)药物组合物具有低免疫原性，例如如本文所述。
在实施方案中，生物学功能选自：
a)调控，例如抑制或刺激酶；
b)调控，例如提高或降低受试者中分子(例如蛋白质、核酸或代谢物、药物或毒素)的水平，例如通过抑制或刺激合成或通过抑制或刺激因子降解；
c)调控，例如提高或降低靶细胞或组织的存活力；或
d)调控蛋白质状态，例如增加或减少蛋白质的磷酸化，或调控蛋白质构象；
e)促进损伤愈合；
f)调控，例如增加或减少两个细胞之间的相互作用；
g)调控，例如促进或抑制细胞分化；
h)改变受试者中因子(例如蛋白质、核酸、代谢物、药物或毒素)的分布；
i)调控，例如增加或减少免疫应答；或
j)调控，例如增加或减少细胞向靶组织的募集。
在本文的治疗方法的一些实施方案中，多个细胞生物制品具有局部作用。在一些实施方案中，多个细胞生物制品具有远端作用。
在一些实施方案中，受试者患有癌症、炎性病症、自身免疫性疾病、慢性疾病、炎症、器官功能受损、感染性疾病、代谢疾病、变性性病症、遗传性疾病(例如遗传缺陷、或显性遗传性疾病症)或损伤。在一些实施方案中，受试者患有感染性疾病且细胞生物制品包含感染性疾病的抗原。在一些实施方案中，受试者具有遗传缺陷且细胞生物制品包含受试者缺乏的蛋白质、或编码所述蛋白质的核酸(例如mRNA)、或编码所述蛋白质的DNA、或编码所述蛋白质的染色体、或包含编码所述蛋白质的核酸的核。在一些实施方案中，受试者患有显性遗传性疾病症，并且细胞生物制品包含显性突变体等位基因的核酸抑制剂(例如siRNA或miRNA)。在一些实施方案中，受试者患有显性遗传性病症，并且细胞生物制品包含显性突变体等位基因的核酸抑制剂(例如siRNA或miRNA)，并且细胞生物制品还包含编码不被核酸抑制剂靶向的突变基因的非突变等位基因的mRNA。在一些实施方案中，受试者需要疫苗接种。在一些实施方案中，受试者需要再生，例如损伤部位的再生。
在一些实施方案中，向受试者施用细胞生物制品组合物至少1、2、3、4或5次。
在一些实施方案中，向受试者全身(例如经口、胃肠外、皮下、静脉内、肌肉内、腹膜内)或局部施用细胞生物制品组合物。在一些实施方案中，向受试者施用细胞生物制品组合物，使得细胞生物制品组合物到达选自以下的靶组织：肝、肺、心脏、脾、胰腺、胃肠道、肾、睾丸、卵巢、脑、生殖器官、中枢神经系统、外周神经系统、骨骼肌、内皮、内耳或眼。在一些实施方案中(例如其中受试者患有自身免疫性疾病)，细胞生物制品组合物与免疫抑制剂，例如糖皮质激素、细胞抑制剂、抗体或抑免蛋白调节剂共同施用。在一些实施方案中(例如其中受试者患有癌症或感染性疾病)，细胞生物制品组合物与免疫刺激剂，例如佐剂、白介素、细胞因子或趋化因子共同施用。在一些实施方案中，施用细胞生物制品组合物引起受试者的靶细胞中的基因的上调或下调，例如其中细胞生物制品包含转录激活物或阻遏物、翻译激活物或阻遏物或表观遗传激活物或阻遏物。
在本文的制备方法的一些实施方案中，方法包括使源细胞的核失活。
在实施方案中，细胞生物制品组合物包含至少105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014或1015个细胞生物制品。在实施方案中，细胞生物制品组合物包含至少10ml、20ml、50ml、100ml、200ml、500ml、1L、2L、5L、10L、20L或50L。在实施方案中，方法包括对哺乳动物细胞去核，例如通过化学去核、使用机械力(例如使用过滤器或离心机)、细胞骨架的至少部分破坏或其组合。在实施方案中，方法包括在源细胞中表达融合剂或其他膜蛋白。在实施方案中，方法包括以下中的一个或多个：囊泡化、低渗处理、挤压或离心。在实施方案中，方法包括在源细胞中遗传表达外源剂或将外源剂加载至源细胞或细胞生物制品中。在实施方案中，方法包括使源细胞与编码多肽剂的DNA接触，例如在使细胞核失活，例如使源细胞去核之前。在实施方案中，方法包括使源细胞与编码多肽剂的RNA接触，例如在使核失活，例如使源细胞去核之前或之后。在实施方案中，方法包括将治疗剂(例如核酸或蛋白质)引入至细胞生物制品中，例如通过电穿孔。
在实施方案中，细胞生物制品来自哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞具有修饰的基因组，例如以降低免疫原性(例如通过基因组编辑，例如以去除MHC蛋白)。在实施方案中，方法进一步包含使步骤a)的源细胞与免疫抑制剂接触，例如在使核失活，例如使细胞去核之前或之后。
在一些实施方案中，如果确定可检测水平，例如高于参考值的值，则丢弃含有多个细胞生物制品或细胞生物制品组合物的样品。
本发明的其他特征、目标和优势将在具体实施方式和附图以及权利要求书中显而易见。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解相同的含义。本文提及的所有公开案、专利申请、专利和其他参考文献都以全文引用的方式并入。举例来说，本文中，例如本文的任何表中提及的所有GenBank、Unigene和Entrez序列都以引用的方式并入。除非另外规定，否则本文中，包括本文的任何表中指定的序列登录号均指截至2017年5月8日的当前数据库条目。当一个基因或蛋白质引用多个序列登录号时，涵盖所有的序列变异体。另外，材料、方法和实施例仅仅是说明性的并且不打算是限制性的。
附图简述
当结合附图阅读时将更好地理解本发明的以下详细描述。出于说明本发明的目的，在本文所述的图式中示出了某些实施方案，其为当前示例的。然而，应理解，本发明不限于图式中示出的实施方案的精确布置和仪器。
图1定量了对于内质网，用染料对细胞生物制品的染色。
图2定量了对于线粒体，用染料对细胞生物制品的染色。
图3定量了对于溶酶体，用染料对细胞生物制品的染色。
图4定量了对于F-肌动蛋白，用染料对细胞生物制品的染色。
图5示出来自注射了细胞生物制品的小鼠的指定组织的显微术图像。白色指示代表RFP荧光细胞，指示将蛋白质货物体内递送至细胞。
图6示出鼠类肌肉组织中的tdTomato荧光的显微术图像，表明通过细胞生物制品将蛋白质货物递送至肌细胞。
图7是一系列图像，示出了通过指定的施用途径将促融合性细胞生物制品成功地体内递送至鼠组织，导致靶向细胞表达萤光素酶。
发明详述
本发明描述了细胞生物制品，例如去核细胞或具有失活核的细胞。细胞生物制品可以用于例如将细胞生物制品的腔或脂质双层中的货物递送至靶细胞。货物包括例如治疗性蛋白质、核酸和小分子。
定义
如本文所用，“细胞膜”是指衍生自细胞，例如源细胞或靶细胞的膜。
如本文所用，“颗粒体(chondrisome)”为从天然细胞或组织来源的线粒体网络衍生和分离或纯化的亚细胞装置。“颗粒体制剂”具有生物活性(可与细胞或组织相互作用或对其起作用)和/或药物活性。
如本文所用，“细胞生物制品”是指包含腔和细胞膜的细胞的一部分，或具有部分或完全核失活的细胞。在一些实施方案中，细胞生物制品包含细胞骨架组分、细胞器和核糖体中的一个或多个。在实施方案中，细胞生物制品为去核细胞、微囊泡或细胞影(cellghost)。
如本文所用，“胞质溶胶”是指细胞的细胞质的水性组分。胞质溶胶可以包含蛋白质、RNA、代谢物和离子。
如本文所用，“外源剂”是指如下的试剂：i)不天然存在，如具有相对于内源蛋白改变(例如通过插入、缺失或取代)的序列的蛋白质，或ii)不天然存在于其中安置有外源剂的细胞生物制品的天然存在的源细胞中。
如本文所用，“融合剂”是指在两个膜封闭腔之间产生相互作用的试剂或分子。在实施方案中，融合剂促进膜融合。在其他实施方案中，融合剂在两个腔(例如细胞生物制品的腔与靶细胞的细胞质)之间产生连接，例如孔隙。在一些实施方案中，融合剂包含两个或更多个蛋白质的复合物，例如其中任一蛋白质都不单独具有促融合活性。
如本文所用，“膜封闭制剂”是指将货物封闭在腔或穴中的两亲性脂质双层。在一些实施方案中，货物相对于腔或穴是外源的。在其他实施方案中，货物相对于腔或穴是内源的，例如相对于源细胞是内源的。
如本文所用，“线粒体生物发生”表示增加线粒体的生物量的过程。线粒体生物发生包括增加细胞中线粒体的数目和/或大小。
如本文所用，术语“纯化的”意指从自然状态改变或取出。例如，天然存在于活体动物中的细胞或细胞片段不是“纯化的”，但从其自然状态的共存材料部分或完全分离的相同细胞或细胞片段是“纯化的”。纯化的细胞生物制品组合物可以以基本上纯的形式存在，或可存在于非天然环境，例如培养基，如包含细胞的培养基中。
如本文所用，“源细胞”是指衍生细胞生物制品的细胞。
细胞生物制品
在一个实施方案中，细胞生物制品为来自MSC或星形胶质细胞的囊泡。
在一个实施方案中，细胞生物制品为外来体。
示例性外来体和其他膜封闭体描述于例如US2016137716中，其以其整体通过引用并入本文。在一些实施方案中，细胞生物制品包含例如可获自细胞的囊泡，例如微囊泡、外来体、凋亡体(apoptotic body)(来自凋亡细胞)、微粒(其可衍生自例如血小板)、核外粒体(ectosome)(可衍生自例如血清中的嗜中性粒细胞和单核细胞)、前列腺体(可获自前列腺癌细胞)、心脏体(cardiosome)(可衍生自心肌细胞)等。
示例性外来体和其他膜封闭体还描述于WO/2017/161010、WO/2016/077639、US20160168572、US20150290343和US20070298118中，其各自以其整体通过引用并入本文。在一些实施方案中，细胞生物制品包含细胞外囊泡、纳米囊泡或外来体。在实施方案中，细胞生物制品包含细胞外囊泡，例如细胞衍生的囊泡，其包含封闭内部空间的膜且具有比衍生其的细胞更小的直径。在实施方案中，细胞外囊泡具有的直径为20nm至1000nm。在实施方案中，细胞生物制品包含凋亡体、细胞片段、通过直接或间接操作衍生自细胞的囊泡、囊泡化细胞器和由活细胞产生的囊泡(例如通过具有质膜的晚期内体的直接质膜出芽或融合)。在实施方案中，细胞外囊泡衍生自活的或死的生物体、外植的组织或器官或培养的细胞。在实施方案中，细胞生物制品包含纳米囊泡，例如细胞衍生的小(例如直径在20-250nm之间，或直径在30-150nm之间)囊泡，所述囊泡包含封闭内部空间的膜，且通过直接或间接操作由所述细胞产生。在一些情况下，纳米囊泡的产生可导致源细胞的破坏。纳米囊泡可以包含脂质或脂肪酸和多肽。在实施方案中，细胞生物制品包含外来体。在实施方案中，外来体为细胞衍生的小(例如直径在20-300nm之间，或直径在40-200nm之间)囊泡，所述囊泡包含封闭内部空间的膜，且通过直接质膜出芽或通过晚期内体与质膜的融合由所述细胞产生。在实施方案中，外来体的产生不会导致源细胞的破坏。在实施方案中，外来体包含脂质或脂肪酸和多肽。
示例性外来体和其他膜封闭体还描述于US 20160354313中，其以其整体通过引用并入本文。在实施方案中，细胞生物制品包含生物相容性递送模块、外来体(例如直径为约30nm至约200nm)、微囊泡(例如直径为约100nm至约2000nm)、凋亡体(例如直径为约300nm至约2000nm)、膜颗粒、膜囊泡、外来体样囊泡、核外粒体样囊泡、核外粒体或外型囊泡(exovesicle)。
在一个实施方案中，细胞生物制品为微囊泡。在一个实施方案中，细胞生物制品为细胞影。在一个实施方案中，囊泡为质膜囊泡，例如巨质膜囊泡。
细胞生物制品可以由若干不同类型的脂质，例如两亲性脂质，如磷脂制备。细胞生物制品可以包含脂质双层作为最外表面。此双层可以由一个或多个相同或不同类型的脂质构成。实例包括但不限于磷脂，如磷酸胆碱和磷酸肌醇。特定实例包括但不限于DMPC、DOPC和DSPC。
细胞生物制品可主要由天然磷脂和脂质，如1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(DSPC)、鞘磷脂、卵磷脂酰胆碱和单唾液酸神经节苷脂构成。在实施方案中，细胞生物制品仅包含磷脂且在血浆中较不稳定。然而，在实施方案中，用胆固醇操作脂膜可增加稳定性且减少囊封的生物活性化合物向血浆中的快速释放。在一些实施方案中，细胞生物制品包含1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)，例如以增加稳定性(关于综述，参见例如Spuch and Navarro,Journal of Drug Delivery,vol.2011,Article ID 469679,12页,2011.doi:10.1155/2011/469679)。
在一些实施方案中，细胞生物制品包含或富含影响膜曲率的脂质(参见例如Thiamet al.,Nature Reviews Molecular Cell Biology,14(12):775-785,2013)。一些脂质具有小的亲水性头基和大的疏水性尾，其通过集中于局部区域而促进融合孔的形成。在一些实施方案中，细胞生物制品包含或富含负曲率脂质，如胆固醇、磷脂酰乙醇胺(PE)、甘油二酯(DAG)、磷脂酸(PA)、脂肪酸(FA)。在一些实施方案中，细胞生物制品不包含正曲率脂质、耗竭正曲率脂质或具有少量正曲率脂质，如溶血磷脂酰胆碱(LPC)、磷脂酰肌醇(Ptdlns)、溶血磷脂酸(LPA)、溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)、单酰基甘油(MAG)。
在一些实施方案中，将脂质添加至细胞生物制品。在一些实施方案中，将脂质添加至培养的源细胞，所述源细胞在形成细胞生物制品之前或期间将脂质掺入其膜中。在一些实施方案中，将脂质以脂质体的形式添加至细胞或细胞生物制品。在一些实施方案中，甲基-β环葡聚糖(methyl-betacyclodextrane,mβ-CD)用于富含或耗竭脂质(参见例如Kainuet al,Journal of Lipid Research,51(12):3533-3541,2010)。
细胞生物制品可以包含但不限于单独的DOPE(二油酰基磷脂酰乙醇胺)、DOTMA、DOTAP、DOTIM、DDAB，或与胆固醇一起产生DOPE和胆固醇、DOTMA和胆固醇、DOTAP和胆固醇、DOTIM和胆固醇以及DDAB和胆固醇。制备多层囊泡脂质的方法为本领域中已知的(参见例如美国专利第6,693,086号，其关于多层囊泡脂质制备的教导通过引用并入本文)。尽管当脂质膜与水溶液混合时，细胞生物制品的形成可以是自发的，但其也可以通过使用均质机、超声发生器或挤压设备施加呈震动形式的力来加速(关于综述，参见例如Spuch andNavarro,Journal of Drug Delivery,vol.2011,Article ID 469679,12pages,2011.doi:10.1155/2011/469679)。可通过挤压通过具有减小大小的过滤器来制备挤压脂质，如Templeton et al.,Nature Biotech,15:647-652,1997中所述，其关于挤压脂质制备的教导通过引用并入本文。
在另一个实施方案中，脂质可以用于形成细胞生物制品。脂质，包括但不限于DLin-KC2-DMA4、C12-200和共脂质二硬脂酰磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG-DMG可使用自发囊泡形成程序配制(参见例如Novobrantseva,Molecular Therapy-Nucleic Acids(2012)1,e4；doi:10.1038/mtna.2011.3)。Tekmira公开案描述脂质囊泡和脂质囊泡制剂的各个方面(参见例如美国专利第7,982,027号；第7,799,565号；第8,058,069号；第8,283,333号；第7,901,708号；第7,745,651号；第7,803,397号；第8,101,741号；第8,188,263号；第7,915,399号；第8,236,943号和第7,838,658号，以及欧洲专利第1766035号；第1519714号；第1781593号和第1664316号)，其全部通过引用并入本文且可以用于和/或适用于本发明。
在一些实施方案中，本文所述的细胞生物制品可包括一种或多种聚合物。聚合物可以是可生物降解的。可使用本领域中已知的方法来合成可生物降解的聚合物囊泡。用于合成聚合物囊泡的示例性方法由Bershteyn et al.,Soft Matter 4:1787-1787,2008和US2008/0014144A1描述，其关于微粒合成的特定教示内容通过引用并入本文。
可使用的示例性合成聚合物包括但不限于脂族聚酯、聚乙二醇(PEG)、聚(乳酸)(PLA)、聚(乙醇酸)(PGA)、乳酸和乙醇酸的共聚物(PLGA)、聚己内酯(PCL)、聚酸酐、聚(原酸)酯、聚氨基甲酸酯、聚(丁酸)、聚(戊酸)和聚(丙交酯-共-己内酯)，和天然聚合物，如白蛋白、海藻酸盐和其他多糖，包括葡聚糖和纤维素、胶原蛋白、其化学衍生物，包括取代、添加化学基团(如烷基、亚烷基)、羟基化、氧化和本领域的技术人员常规进行的其他修饰)、白蛋白和其他亲水蛋白、玉米醇溶蛋白和其他谷醇溶蛋白和疏水蛋白、其共聚物和混合物。一般来说，这些材料在体内通过酶水解或暴露于水、通过表面或整体侵蚀而降解。
融合剂
在一些实施方案中，本文所述的细胞生物制品(例如包含囊泡或细胞的一部分)包括一种或多种融合剂，例如以便于细胞生物制品融合至膜，例如细胞膜。这些组合物也可包括在合成期间或之后进行的表面修饰，以包括一种或多种融合剂，例如融合剂可与靶细胞互补。表面修饰可以包含对膜的修饰，例如将脂质或蛋白质插入膜中。融合剂包括但不限于基于蛋白质、基于脂质和基于化学物的融合剂。
在一些实施方案中，细胞生物制品不包含融合剂。在一些实施方案中，细胞生物制品不包含外源融合剂。
生成细胞生物制品的方法
细胞生物制品的组合物可以从培养的细胞，例如培养的哺乳动物细胞，例如培养的人类细胞产生。细胞可以为祖细胞或非祖(例如分化的)细胞。细胞可以为原代细胞或细胞系(例如本文所述的哺乳动物，例如人类细胞系)。在实施方案中，培养的细胞为祖细胞，例如骨髓基质细胞、骨髓源性成年祖细胞(MAPC)、内皮祖细胞(EPC)、母细胞、在室管膜下区中形成的中间祖细胞、神经干细胞、肌肉干细胞、卫星细胞、肝干细胞、造血干细胞、骨髓基质细胞、表皮干细胞、胚胎干细胞、间充质干细胞、脐带干细胞、前体细胞、肌肉前体细胞、成肌细胞、心肌细胞、神经前体细胞、神经胶质前体细胞、神经元前体细胞、成肝细胞。
在一些实施方案中，源细胞为内皮细胞、成纤维细胞、血细胞(例如巨噬细胞、嗜中性粒细胞、粒细胞、白细胞)、干细胞(例如间充质干细胞、脐带干细胞、骨髓干细胞、造血干细胞、诱导性多能干细胞，例如衍生自受试者细胞的诱导性多能干细胞)、胚胎干细胞(例如来自胚胎卵黄囊、胎盘、脐带、胎儿皮肤、青少年皮肤、血液、骨髓、脂肪组织、红细胞生成组织、造血组织的干细胞)、成肌细胞、实质细胞(例如肝细胞)、肺泡细胞、神经元(例如视网膜神经元细胞)、前体细胞(例如视网膜前体细胞、原粒细胞、髓样前体细胞、胸腺细胞、性母细胞、原巨核细胞、幼巨核细胞、成黑色素细胞、淋巴母细胞、骨髓前体细胞、正常红细胞或成血管细胞)、祖细胞(例如心脏祖细胞、卫星细胞、放射状胶质细胞、骨髓基质细胞、胰腺祖细胞、内皮祖细胞、母细胞)或永生化细胞(例如HeLa、HEK293、HFF-1、MRC-5、WI-38、IMR 90、IMR 91、PER.C6、HT-1080或BJ细胞)。
培养的细胞可来自上皮、结缔组织、肌肉或神经组织或细胞，以及其组合。细胞生物制品可由来自任何真核(例如哺乳动物)器官系统的培养的细胞产生，例如来自心血管系统(心脏、血管系统)；消化系统(食道、胃、肝脏、胆囊、胰脏、肠、结肠、直肠和肛门)；内分泌系统(下丘脑、脑下垂体、松果体或松果体腺体、甲状腺、甲状旁腺、肾上腺)；排泄系统(肾脏、输尿管、膀胱)；淋巴系统(淋巴、淋巴结、淋巴管、扁桃体、腺样体、胸腺、脾脏)；皮肤系统(皮肤、头发、指甲)；肌肉系统(例如骨骼肌)；神经系统(脑、脊髓、神经)；生殖系统(卵巢、子宫、乳腺、睾丸、输精管、精囊、前列腺)；呼吸系统(咽、喉、气管、支气管、肺、隔膜)；骨骼系统(骨骼、软骨)以及其组合。在实施方案中，细胞来自高度有丝分裂的组织(例如高度有丝分裂的健康组织，如上皮、胚胎组织、骨髓、肠隐窝)。在实施方案中，组织样品为高代谢组织(例如骨骼组织、神经组织、心肌细胞)。
在一些实施方案中，细胞来自年轻的供体，例如25岁、20岁、18岁、16岁、12岁、10岁、8岁龄、5岁龄、1岁龄或更小的供体。在一些实施方案中，细胞来自胎儿组织。
在一些实施方案中，细胞衍生自受试者且施用至相同受试者或具有类似基因特征(signature)(例如MHC匹配的)的受试者。
在某些实施方案中，细胞具有长度为大于3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000或10000个核苷酸(例如长度在4,000-10,000个核苷酸之间、长度在6,000-10,000个核苷酸之间)的平均大小的端粒。
细胞生物制品可以从总体上根据本领域已知的方法培养的细胞产生。在一些实施方案中，细胞可在2个或更多个“期”中培养，例如生长期，其中在一定条件下培养细胞以倍增和增加培养物的生物量，和“生产”期，其中细胞在一定条件下培养以改变细胞表型(例如最大化线粒体表型、增加线粒体的数目或大小、增加氧化磷酸化状态)。还可以存在“表达”期，其中在一定条件下培养细胞，以使试剂，例如外源剂的表达最大化且限制其他期中不期望的融合。
在一些实施方案中，从例如在生长期或生产期期间同步化的细胞产生细胞生物制品。例如，可通过从培养基消除血清(例如持续约12-24小时)或通过在培养基中使用DNA合成抑制剂，如胸苷、氨基喋呤、羟基脲和胞嘧啶阿拉伯糖苷而使细胞在G1期同步化。用于哺乳动物细胞周期同步化的其他方法为已知的且公开于例如Rosner et al.2013.NatureProtocols 8:602–626中(具体地Rosner中的表1)。
在一些实施方案中，可评估细胞且任选地富含期望的表型或基因型，以用作如本文所述的细胞生物制品组合物的来源。例如，可评估细胞且任选地富含例如以下中的一个或多个，例如在培养之前、在培养期间(例如在生长期或生产期期间)或在培养之后但在细胞生物制品产生之前：膜电位(例如-5至-200mV的膜电位；心磷脂含量(例如在总脂质的1-20％之间)；胆固醇、磷脂酰乙醇胺(PE)、甘油二酯(DAG)、磷脂酸(PA)或脂肪酸(FA)含量；遗传质量>80％、>85％、>90％；或货物表达或含量。
在一些实施方案中，从细胞克隆产生细胞生物制品，所述细胞克隆基于所期望的表型或基因型而鉴别、选择或挑选以用作本文所述的细胞生物制品组合物的来源。例如，基于低线粒体突变负荷、长端粒长度、分化状态或特定基因特征(例如与接受体匹配的基因特征)而鉴别、选择或挑选细胞克隆。
本文所述的细胞生物制品组合物可由来自一种细胞或组织来源或来源组合的细胞生物制品构成。例如，细胞生物制品组合物可以包含来自异基因(xenogenetic)来源(例如动物，前述物种的细胞的组织培养物)、同种异体、自体、来自产生不同蛋白质浓度和分布的特定组织(肝脏、骨骼、神经、脂肪等)、来自不同代谢状态(例如糖酵解、呼吸)的细胞的细胞生物制品。组合物还可以包含处于不同代谢状态(例如偶联或非偶联)的细胞生物制品，如本文中其他地方所描述。
在一些实施方案中，通过诱导外来体、微囊泡、膜囊泡、细胞外膜囊泡、质膜囊泡、巨质膜囊泡、凋亡体、溶酶体、线粒体粒子(mitoparticle)、核细胞(pyrenocyte)或其他膜封闭囊泡的出芽来产生细胞生物制品。
在一些实施方案中，通过诱导细胞去核而产生细胞生物制品。可以使用如遗传、化学(例如使用放线菌素D，参见Bayona-Bafaluyet al.,“A chemical enucleation methodfor the transfer of mitochondrial DNA toρ°cells”Nucleic Acids Res.2003Aug 15；31(16):e98)、机械方法(例如挤压或抽吸，参见Lee et al.,“A comparative study onthe efficiency of two enucleation methods in pig somatic cell nucleartransfer:effects of the squeezing and the aspiration methods.”AnimBiotechnol.2008；19(2):71-9)或其组合的测定法来进行去核。去核不仅是指完全去除核，而且还指将核从其典型位置移开，使得细胞含有核但它是非功能的。
在实施方案中，制备细胞生物制品包含产生细胞影、巨质膜囊泡或凋亡体。在实施方案中，细胞生物制品组合物包含细胞影、巨质膜囊泡和凋亡体中的一个或多个。
在一些实施方案中，通过诱导细胞片段化而产生细胞生物制品。在一些实施方案中，细胞片段化可使用以下方法进行，所述方法包括但不限于：化学方法、机械方法(例如离心(例如超速离心或密度离心)、冻融或超声处理)或其组合。
在一个实施方案中，细胞生物制品可以通过以下方法中的任一种、全部或组合由源细胞(例如如本文所述)产生：
i)诱导线粒体粒子、外来体或其他膜封闭囊泡的出芽；
ii)通过以下方法中的任一种或其组合诱导核失活，例如去核：
a)遗传方法；
b)化学方法，例如使用放线菌素D；或
c)机械方法，例如挤压或抽吸；或
ⅲ)诱导细胞片段化，例如通过以下方法中的任一种或其组合：
a)化学方法；
b)机械方法，例如离心(例如超速离心或密度离心)；冻融；或超声处理。
为了避免疑问，应理解，在许多情况下，实际用于制备细胞生物制品的源细胞在制备细胞生物制品之后将不可以用于测试。因此，源细胞与细胞生物制品之间的比较不需要测定经实际修饰(例如去核)以制备细胞生物制品的源细胞。确切地，取而代之测定与源细胞在其他方面相似的细胞，例如来自相同培养物、相同基因型、相同组织类型或其任何组合。
在细胞生物制品生成之前对细胞的修饰
在一个方面中，在细胞生物制品生成之前对细胞进行修饰，如对受试者、组织或细胞的修饰。例如，此类修饰可以有效地改变货物的结构或功能或靶细胞的结构或功能。
物理修饰
在一些实施方案中，在产生细胞生物制品之前物理修饰细胞。
在一些实施方案中，在产生细胞生物制品之前用化学剂处理细胞。
在一些实施方案中，在产生具有一个或多个共价或非共价连接位点的细胞生物制品之前物理修饰细胞，所述连接位点用于细胞表面上的增强细胞生物制品对器官、组织或细胞类型的靶向的合成或内源小分子或脂质。
在实施方案中，细胞生物制品包含提高或降低水平的内源分子。例如，细胞生物制品可以包含内源分子，所述内源分子也天然存在于天然存在的源细胞中，但其水平高于或低于细胞生物制品中的水平。在一些实施方案中，多肽由源细胞或细胞生物制品中的外源核酸表达。在一些实施方案中，多肽从来源分离并且被加载至源细胞或细胞生物制品中或与源细胞或细胞生物制品缀合。
在一些实施方案中，在产生细胞生物制品之前用化学剂处理细胞以增加内源剂于细胞中的表达或活性。在一个实施方案中，小分子可增加内源剂的转录激活物的表达或活性。在另一个实施方案中，小分子可降低内源剂的转录阻遏物的表达或活性。在另一个实施方案中，小分子为增加内源剂表达的表观遗传修饰剂。
在一些实施方案中，在产生细胞生物制品之前用例如CRISPR活化剂对细胞进行物理修饰，以增加或提高试剂的浓度。
在一些实施方案中，物理修饰细胞以增加或减少细胞器，例如线粒体、高尔基体、内质网、细胞内囊泡(如溶酶体、自噬体)的数量，或增强所述细胞器的结构或功能。
遗传修饰
在一些实施方案中，在产生细胞生物制品之前对细胞进行遗传修饰，以增加内源剂于细胞中的表达。在一个实施方案中，遗传修饰可增加内源剂的转录激活物的表达或活性。在另一个实施方案中，遗传修饰可降低内源剂的转录阻遏物的表达或活性。在一些实施方案中，激活物或阻遏物是与通过向导RNA靶向到内源剂的转录激活物或阻遏物连接的核酸酶无活性的cas9(dCas9)。在另一个实施方案中，遗传修饰表观遗传修饰内源基因以增加其表达。在一些实施方案中，表观遗传激活物是与通过向导RNA靶向到内源剂的表观遗传修饰剂连接的核酸酶无活性的cas9(dCas9)。
在一些实施方案中，在产生细胞生物制品之前对细胞进行遗传修饰，以增加外源剂于细胞中的表达，例如转基因的递送。在一些实施方案中，在产生细胞生物制品之前将核酸，例如DNA、mRNA或siRNA转移至细胞，例如以增加或减少用于器官、组织或细胞靶向的细胞表面分子(蛋白质、聚糖、脂质或低分子量分子)的表达。在一些实施方案中，核酸靶向试剂的阻遏物，例如shRNA、siRNA构建体。在一些实施方案中，核酸编码阻遏物或试剂的抑制剂。
在一些实施方案中，方法包括将编码试剂的外源核酸引入源细胞中。外源核酸可以是例如DNA或RNA。在一些实施方案中，外源DNA可以为线性DNA、环状DNA或人工染色体。在一些实施方案中，DNA以附加体形式维持。在一些实施方案中，DNA整合至基因组中。外源RNA可以为化学修饰的RNA，例如可以包含一种或多种骨架修饰、糖修饰、非规范碱基或帽。骨架修饰包括例如硫代磷酸酯、N3’亚磷酰胺、硼烷磷酸酯、膦酰基乙酸酯、硫代-PACE、吗啉代亚磷酰胺或PNA。糖修饰包括例如2'-O-Me、2′F、2′F-ANA、LNA、UNA和2'-O-MOE。非规范碱基包括例如5-溴-U和5-碘-U、2,6-二氨基嘌呤、C-5丙炔基嘧啶、二氟甲苯、二氟苯、二氯苯、2-硫尿苷、假尿苷和二氢尿苷。帽包括例如ARCA。另外的修饰论述于例如Deleavey et al.,“Designing Chemically Modified Oligonucleotides for Targeted Gene Silencing”Chemistry&Biology Volume 19,Issue 8,24August 2012,Pages 937-954，其以其整体通过引用并入本文。
在一些实施方案中，在产生细胞生物制品之前对细胞进行遗传修饰，以改变(即，上调或下调)信号传导途径(例如Wnt/β-连环蛋白途径)的表达。在一些实施方案中，在产生细胞生物制品之前对细胞进行遗传修饰，以改变(例如上调或下调)一种或多种所关注基因的表达。在一些实施方案中，在产生细胞生物制品之前对细胞进行遗传修饰，以改变(例如上调或下调)一种或多种所关注核酸(例如miRNA或mRNA)的表达。在一些实施方案中，在产生细胞生物制品之前将核酸，例如DNA、mRNA或siRNA转移至细胞，例如以增加或减少信号传导途径、基因或核酸的表达。在一些实施方案中，核酸靶向信号传导途径、基因或核酸的阻遏物，或抑制信号传导途径、基因或核酸。在一些实施方案中，核酸编码上调或下调信号传导途径、基因或核酸的转录因子。在一些实施方案中，激活物或阻遏物是与通过向导RNA靶向到信号传导途径、基因或核酸的转录激活物或阻遏物连接的核酸酶无活性的cas9(dCas9)。在另一个实施方案中，遗传修饰表观遗传修饰内源信号传导途径、基因或核酸以使其表达。在一些实施方案中，表观遗传激活物是与通过向导RNA靶向到信号传导途径、基因或核酸的表观遗传修饰剂连接的核酸酶无活性的cas9(dCas9)。在一些实施方案中，在产生细胞生物制品之前对细胞的DNA进行编辑，以改变(例如上调或下调)信号传导途径(例如Wnt/β-连环蛋白途径)、基因或核酸的表达。在一些实施方案中，使用向导RNA和CRISPR-Cas9/Cpf1或其他基因编辑技术编辑DNA。
可使用重组方法对细胞进行遗传修饰。可使用重组方法获得编码期望基因的核酸序列，诸如例如通过从表达基因的细胞筛选文库、通过从已知包括基因的载体衍生基因或通过从含有其的细胞和组织直接分离(使用标准技术)。或者，可以合成方式产生所关注基因，而不是克隆所述基因。
天然或合成核酸的表达通常通过将编码所关注基因的核酸与启动子可操作地连接，且将构建体并入至表达载体中来实现。载体可适合于在真核细胞中进行复制和整合。典型的克隆载体含有适用于表达期望核酸序列的转录与翻译终止子、起始序列和启动子。
在一些实施方案中，可以用一个或多个表达区，例如基因对细胞进行遗传修饰。在一些实施方案中，可以用外源基因(例如能够表达外源基因产物，如RNA或多肽产物)和/或外源调控核酸对细胞进行遗传修饰。在一些实施方案中，可以用编码相对于靶细胞内源的基因产物的外源序列和/或能够调控内源基因表达的外源调控核酸对细胞进行遗传修饰。在一些实施方案中，可以用外源基因和/或调控外源基因表达的调控核酸对细胞进行遗传修饰。在一些实施方案中，可以用外源基因和/或调控内源基因表达的调控核酸对细胞进行遗传修饰。本领域技术人员应理解，本文所述的细胞可经遗传修饰以表达多种编码蛋白质或调控分子的外源基因，其可例如作用于靶细胞的内源或外源基因组的基因产物。在一些实施方案中，此类基因赋予细胞生物制品以特征，例如调控其针对靶细胞的活性。在一些实施方案中，可对细胞进行遗传修饰以表达内源基因和/或调控核酸。在一些实施方案中，内源基因或调控核酸调控其他内源基因的表达。在一些实施方案中，细胞可经遗传修饰以表达内源基因和/或调控核酸，所述内源基因和/或调控核酸与其他染色体上的内源基因和/或调控核酸型式不同地(例如诱导性地、组织特异性地、组成性地或以更高或更低水平)表达。
启动子元件(例如增强子)调控转录起始的频率。通常，这些元件位于起始位点上游30-110bp的区域，尽管最近已显示许多启动子也含有起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间距通常是灵活的，以使得当元件相对于彼此反转或移动时，启动子功能得以保留。在胸苷激酶(tk)启动子中，启动子元件之间的间距可在活性开始下降之前增加至相隔50bp。取决于启动子，似乎单个元件可协同或独立地起作用以活化转录。
合适的启动子的一个实例是立即早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。此启动子序列为强组成型启动子序列，能够驱动与其可操作连接的任何聚核苷酸序列的高水平表达。合适的启动子的另一个实例为延伸生长因子-1α(EF-1α)。但是，还可使用其他组成型启动子序列，包括但不限于猿病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复序列(LTR)启动子、MoMuLV启动子、禽白血病病毒启动子、埃巴病毒(Epstein-Barr virus)立即早期启动子、劳氏肉瘤病毒(Rous sarcoma virus)启动子、以及人类基因启动子，如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红蛋白启动子和肌酸激酶启动子。
另外，本发明不应限于使用组成型启动子。诱导型启动子也被认为是本发明的一部分。诱导型启动子的使用提供了一种分子开关，所述分子开关能够在需要此类表达时接通与其可操作连接的聚核苷酸序列的表达，或在不需要表达时关断所述表达。诱导型启动子的实例包括但不限于组织特异性启动子、金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。在一些实施方案中，在产生细胞生物制品之前，例如在产生细胞生物制品之前3、6、9、12、24、26、48、60或72小时上调试剂的表达。
要引入来源中的表达载体还可含有选择标志物基因或报告基因或二者，以便于从寻求被转染或通过病毒载体感染的细胞群体鉴别和选择表达细胞。在其他方面，选择标志物可携带在单独的DNA片段上且用于共转染程序。选择标志物和报告基因均可侧接有适当的调控序列，以使得能够在宿主细胞中表达。适用的选择标志物包括例如抗生素抗性基因，如neo等。
报告基因可以用于鉴别潜在转染的细胞和评估调控序列的功能性。一般来说，报告基因是如下的基因：不存在于接受体来源中或不被接受体来源表达，并且编码通过一些易于检测的特性(例如酶活性)来表现表达的多肽。在DNA已引入接受体细胞之后的合适时间测定报告基因的表达。合适的报告基因可包括编码萤光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌的碱性磷酸酶或绿色荧光蛋白基因的基因(例如Ui-Tei et al.,2000FEBSLetters 479:79-82)。合适的表达系统是众所周知的且可使用已知技术制备或商业上获得。一般来说，将具有最小5’侧翼区，显示最高水平的报告基因表达的构建体鉴别为启动子。此类启动子区可与报告基因连接且用于评估试剂调控启动子驱动的转录的能力。
在一些实施方案中，细胞可以经遗传修饰以改变一种或多种蛋白质的表达。一种或多种蛋白质的表达可在特定的时间被修饰，例如来源的发育或分化状态。在一个实施方案中，本发明包括从经遗传修饰以改变一种或多种蛋白质的表达的细胞来源产生的细胞生物制品。一种或多种蛋白质的表达可局限于一个或多个特定位置或遍及整个来源。
在一些实施方案中，细胞可被工程化改造以表达靶向蛋白质的胞质酶(例如蛋白酶、磷酸酶、激酶、脱甲基酶、甲基转移酶、乙酰基酶)。在一些实施方案中，胞质酶通过改变翻译后修饰来影响一种或多种蛋白质。蛋白质的翻译后蛋白质修饰可影响对营养物可用性和氧化还原条件的反应性和蛋白质-蛋白质相互作用。在一个实施方案中，本发明包括细胞生物制品，其包含具有改变的翻译后修饰，例如翻译后修饰增加或减少至少10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、75％、80％、90％或更多的一种或多种蛋白质。
将修饰引入至细胞中的方法包括物理、生物和化学方法。参见例如Geng.&Lu,Microfluidic electroporation for cellular analysis and delivery.Lab on aChip.13(19):3803-21.2013；Sharei,A.et al.A vector-free microfluidic platformfor intracellular delivery.PNAS vol.110no.6.2013；Yin,H.et al.,Non-viralvectors for gene-based therapy.Nature Reviews Genetics.15:541–555.2014。修饰用于产生本文所述的细胞生物制品的细胞的合适方法包括例如扩散、渗透、渗透脉冲、渗透休克、低渗溶解、低渗透析、离子电泳作用、电穿孔、超声处理、显微注射、钙沉淀、膜插入、脂质介导的转染、去污剂处理、病毒感染、受体介导的内吞作用、蛋白质转导域的使用、颗粒发射、膜融合、冻融、机械破坏和过滤。
确认遗传修饰的存在包括多种测定法。此类测定法包括例如分子生物测定法，如Southern印迹法和Northern印迹法、RT-PCR和PCR；生物化学测定法，如检测特定肽的存在或不存在，例如通过免疫学手段(ELISA和Western印迹)或通过本文所述的测定法。
对线粒体生物发生的修饰
在一些实施方案中，本文所述的方法包含：
(a)提供多个已与线粒体生物发生的调控剂接触的源细胞，例如使多个源细胞与线粒体生物发生的调控剂(例如(i)调控mtDNA扩增的试剂，(ii)调控线粒体脂质合成的试剂，或(iii)调控核编码的线粒体蛋白生产的试剂或其组合)接触，和
(b)从多个细胞分离细胞生物制品。
在实施方案中，线粒体生物发生的调控剂上调或刺激线粒体生物发生。在其他实施方案中，线粒体生物发生的调控剂下调或抑制线粒体生物发生。
在实施方案中，调控mtDNA扩增的试剂为促进或抑制mtDNA扩增的试剂。在实施方案中，调控线粒体脂质合成的试剂为促进或抑制线粒体脂质合成的试剂。在实施方案中，调控核编码的线粒体蛋白生产的试剂为促进或抑制核编码的线粒体蛋白生产的试剂。
在实施方案中，促进mtDNA扩增的试剂包含：参与mtDNA扩增的蛋白质、上调参与mtDNA复制的蛋白质的蛋白质或脱氧核糖核苷酸或其前体。在实施方案中，促进线粒体脂质合成的试剂为脂质合成基因。在实施方案中，促进核编码的线粒体蛋白生产的试剂为转录因子。
在实施方案中，抑制mtDNA扩增的试剂包含:参与mtDNA扩增的蛋白质的抑制剂(例如拓扑异构酶抑制剂、插入剂、下调参与mtDNA扩增的蛋白质的siRNA、下调参与mtDNA扩增的蛋白质的靶向核酸酶、干扰参与mtDNA扩增的蛋白质的基因的CRISPR/Cas9分子)、下调参与mtDNA复制的蛋白质的蛋白质或其脱氧核糖核苷酸类似物或前体。在实施方案中，抑制线粒体脂质合成的试剂为脂质合成基因的抑制剂。在实施方案中，抑制核编码的线粒体蛋白生产的试剂为转录阻遏物。
在实施方案中，调控线粒体生物发生包含调控表4的蛋白质。在实施方案中，调控线粒体生物发生包含调控上调、下调、刺激或抑制直接控制基因(例如主调控因子或DNA结合因子)。在实施方案中，调控线粒体生物发生包含上调、下调、刺激或抑制表4的直接控制基因(例如表4的主调控因子或表4的DNA结合因子)。在实施方案中，调控线粒体生物发生包含上调、下调、刺激或抑制间接控制基因(例如活化因子或抑制因子)。在实施方案中，调控线粒体生物发生包含上调、下调、刺激或抑制表4的间接控制基因(例如表4的活化因子或表4的抑制因子)。在实施方案中，调控线粒体生物发生包含上调或下调代谢物，例如表4的代谢物。
在实施方案中，促进或抑制线粒体脂质合成的试剂能够引起或导致线粒体膜中的脂质比例改变。在实施方案中，调控线粒体脂质合成的试剂使得以下线粒体脂质之一的比例增加或减少：心磷脂、磷脂酰甘油、磷脂酰乙醇胺、磷脂酸、CDP-二酰甘油、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、胆固醇或神经酰胺，例如增加或减少至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。
在一些实施方案中，方法包括提供(i)、(ii)和(iii)中的一个、两个或全部三个。在一些实施方案中，方法包括提供(i)、(ii)和(iii)中的两个，例如(i)和(ii)、(i)和(iii)或(ii)和(iii)。在一些实施方案中，方法包括以足以刺激线粒体生物发生的水平提供(i)、(ii)和(iii)中的一个、两个或全部三个之一。
在实施方案中，方法包括调控(例如刺激)mtDNA扩增(例如至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％)。在实施方案中，调控mtDNA扩增在没有脂质合成和核编码的线粒体蛋白生产中的一个或两个的可检测调控(例如刺激)的情况下发生。在实施方案中，方法包括调控(例如刺激)脂质合成(例如至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％)。在实施方案中，调控在没有mtDNA扩增和核编码的线粒体蛋白生产中的一个或两个的可检测调控(例如刺激)的情况下发生。在实施方案中，方法包括调控(例如刺激)核编码的线粒体蛋白生产(例如至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％)。在实施方案中，调控核编码的线粒体蛋白生产在没有脂质合成和mtDNA扩增中的一个或两个的可检测调控(例如刺激)的情况下发生。
在实施方案中，方法包括调控(例如刺激)mtDNA扩增和脂质合成(例如各自独立地为至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％)。在实施方案中，调控mtDNA扩增和脂质合成在没有核编码的线粒体蛋白生产的可检测调控(例如刺激)的情况下发生。在实施方案中，方法包括调控(例如刺激)mtDNA扩增和核编码的线粒体蛋白生产(例如各自独立地为至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％)。在实施方案中，调控mtDNA扩增和核编码的线粒体蛋白生产在没有脂质合成的可检测调控(例如刺激)的情况下发生。在实施方案中，方法包括调控(例如刺激)脂质合成和核编码的线粒体蛋白生产(例如各自独立地为至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％)。在实施方案中，调控脂质合成和核编码的线粒体蛋白生产在没有mtDNA扩增的可检测调控(例如刺激)的情况下发生。
在实施方案中，方法包括调控(例如刺激)mtDNA扩增、脂质合成和核编码的线粒体蛋白生产(例如各自独立地为至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％)。
在实施方案中，线粒体生物发生的调控剂为线粒体生物发生的刺激剂。在实施方案中，线粒体生物发生的调控剂为褐变的刺激剂。在实施方案中，褐变的刺激剂为PGC1a。在实施方案中，褐变的刺激剂为醌、FGF21、鸢尾素、爱帕琳(apelin)或异丙肾上腺素。在实施方案中，对多个源细胞或衍生自多个源细胞的细胞生物制品组合物测定褐变，例如通过ELISA测定UCP1表达，例如如Spaethling et al"Single-cell transcriptomics andfunctional target validation of brown adipocytes show their complex roles inmetabolic homeostasis."in:FASEB Journal,Vol.30,Issue 1,pp.81-92,2016中所述。
在实施方案中，对多个源细胞或衍生自多个源细胞的细胞生物制品组合物测定mtDNA扩增、线粒体脂质合成或核编码的线粒体蛋白生产或其任何组合的存在或水平。
源细胞可与线粒体生物发生的调控剂以足以增加源细胞中的线粒体生物发生的量和时间(例如增加至少10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、75％、80％、90％或更多)接触。此类线粒体生物发生的调控剂描述于例如Cameron et al.2016.Development ofTherapeutics That Induce Mitochondrial Biogenesis for the Treatment of Acuteand Chronic Degenerative Diseases.DOI:10.1021/acs.jmedchem.6b00669中。在实施方案中，在生长期期间和/或在生产期期间将线粒体生物发生的调控剂添加至源细胞培养物。在实施方案中，在源细胞培养物具有预定的目标密度时添加线粒体生物发生的调控剂。
在一个实施方案中，线粒体生物发生的调控剂是从天然产物或其合成等效物提取的试剂，所述试剂足以增加源细胞中的线粒体生物发生。此类试剂的实例包括白藜芦醇、表儿茶素、姜黄素、植物雌激素(例如染料木黄酮黄豆苷元、吡咯并喹啉、醌、香豆雌酚和雌马酚(equol))。
在另一个实施方案中，线粒体生物发生的调控剂为足以增加源细胞中的线粒体生物发生、源细胞中的线粒体的代谢物，例如初级或次级代谢物。此类代谢物，例如初级代谢物包括醇(如乙醇)、乳酸和某些氨基酸，且次级代谢物包括通过修饰初级代谢物产生的有机化合物，描述于“Primary and Secondary Metabolites.”BoundlessMicrobiology.Boundless,26May,2016中。
在一个实施方案中，线粒体生物发生的调控剂为足以增加源细胞中的线粒体生物发生或源细胞中的线粒体的能量来源，例如糖、ATP、氧化还原辅因子，如NADH和FADH2。此类能源来源，例如丙酮酸盐/酯或棕榈酸盐/酯描述于Mehlman,M.Energy Metabolism andthe Regulation of Metabolic Processes in Mitochondria；Academic Press,1972中。
在一个实施方案中，线粒体生物发生的调控剂为足以增加源细胞中的线粒体生物发生的转录因子调控剂。此类转录因子调控剂的实例包括：噻唑啉二酮(例如罗格列酮(rosiglitazone)、吡格列酮(pioglitazone)、曲格列酮(troglitazone)和环格列酮(ciglitazone))、雌激素(例如17β-雌二醇、孕酮)和雌激素受体激动剂；SIRT1活化剂(例如SRT1720、SRT1460、SRT2183、SRT2104)。
在一个实施方案中，线粒体生物发生的调控剂为足以增加源细胞中的线粒体生物发生的激酶调控剂。实例包括：AMPK和AMPK活化剂，如AICAR、二甲双胍、苯乙双胍、A769662；和ERK1/2抑制剂，如U0126、曲美替尼(trametinib)。
在一个实施方案中，线粒体生物发生的调控剂为足以增加源细胞中的线粒体生物发生的环核苷酸调控剂。实例包括NO-cGMP-PKG途径的调控剂(例如，一氧化氮(NO)供体，如硝普钠、(±)S-亚硝基-N-乙酰青霉胺(SNAP)、二乙胺NONO盐(DEA-NONOate)、二亚乙基三胺-NONO盐(DETA-NONOate)；sGC刺激剂和活化剂，如西纳西呱(cinaciguat)、利奥西呱(riociguat)和BAY41-2272；和磷酸二酯酶(PDE)抑制剂，如扎普司特(zaprinast)、西地那非(sildenafil)、乌地那非(udenafil)、他达拉非(tadalafil)和伐地那非(vardenafil))和cAMP-PKA-CREB轴的调控剂，如磷酸二酯酶(PDE)抑制剂，如咯利普兰(rolipram)。
在一个实施方案中，线粒体生物发生的调控剂为足以增加源细胞中的线粒体生物发生的G蛋白偶联受体(GPCR)的调控剂，如GPCR配体。
在一个实施方案中，线粒体生物发生的调控剂为足以增加源细胞中的线粒体生物发生的大麻素-1受体调控剂。实例包括泰伦那班(taranabant)和利蒙诺班(rimonobant)。
在一个实施方案中，线粒体生物发生的调控剂为足以增加源细胞中的线粒体生物发生的5-羟色胺受体调控剂。实例包括α-甲基-5-羟色胺、DOI、CP809101、SB242084、血清素再摄取抑制剂，如氟西汀(fluoxetine)、α-甲基5HT、1-(2,5-二甲氧基-4-碘苯基)-2-氨基丙烷、LY334370和LY344864。
在一个实施方案中，线粒体生物发生的调控剂为足以增加源细胞中的线粒体生物发生的β肾上腺素能受体调控剂。实例包括肾上腺素、去甲肾上腺素、异丙肾上腺素、美托洛尔(metoprolol)、福莫特罗(formoterol)、非诺特罗(fenoterol)和丙卡特罗(procaterol)。
在一个实施方案中，源细胞被修饰，例如遗传修饰以表达线粒体生物发生的转录激活物，例如转录因子或转录共激活物，如PGC1α。在一些实施方案中，细胞表达PGC1α(例如过表达内源PGC1α或表达外源PGC1α)。
表4.线粒体生物发生的转录控制。参见例如Scarpulla et al.,“Transcriptional integration of mitochondrial biogenesis”Trends inEndocrinology&Metabolism,Volume 23,Issue 9,p459–466,September 2012；Hock etal.“Transcriptional control of mitochondrial biogenesis and function.”AnnuRev Physiol.2009；71:177-203.Santra et al.,“Ketogenic Treatment ReducesDeleted Mitochondrial DNAs in Cultured Human Cells”Ann Neurol.2004Nov；56(5):662-9.Kanabus et al.,“The pleiotropic effects of decanoic acid treatment onmitochondrial function in fibroblasts from patients with complex I deficientLeigh syndrome”J Inherit Metab Dis.2016May；39(3):415-26，其各自以其整体通过引用并入本文。
Figure BDA0002607347370000571
Figure BDA0002607347370000581
Figure BDA0002607347370000591
细胞生物制品修饰
在一个方面中，对细胞生物制品进行修饰。此类修饰可有效地(例如)改善靶向、功能或结构。
在一些实施方案中，配体通过存在于细胞生物制品表面上的官能性化学基团(羧酸、醛、胺、硫氢基和羟基)缀合至细胞生物制品表面。
此类反应性基团包括但不限于马来酰亚胺基团。例如，可合成细胞生物制品以包括马来酰亚胺缀合的磷脂，如但不限于DSPE-MaL-PEG2000。
在一些实施方案中，合成或天然的小分子或脂质可共价或非共价连接至细胞生物制品表面。
在一些实施方案中，细胞生物制品通过加载经修饰的蛋白质而修饰(例如实现新颖的功能性、改变翻译后修饰、结合线粒体膜和/或线粒体膜蛋白、形成具有异源功能的可切割蛋白质、形成预定用于蛋白水解降解的蛋白质、测定试剂的位置和水平或将试剂以载体形式递送)。在一个实施方案中，本发明包括加载有修饰的蛋白质的细胞生物制品。
在一些实施方案中，外源蛋白质非共价结合至细胞生物制品。蛋白质可包括用于释放的可切割域。在一个实施方案中，本发明包括细胞生物制品，其包含具有可切割域的外源蛋白质。
在一些实施方案中，细胞生物制品用预定用于蛋白水解降解的蛋白质修饰。多种蛋白酶识别特定的蛋白质氨基酸序列并且靶向蛋白质以进行降解。这些蛋白质降解酶可以用于特异性降解具有蛋白水解降解序列的蛋白质。在一个实施方案中，本发明包括细胞生物制品，其包含受调控水平的一种或多种蛋白质降解酶，例如蛋白质降解酶增加或减少至少10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、75％、80％、90％或更大。
如本文所述，可将非融合剂添加剂添加至细胞生物制品以对其结构和/或特性进行修饰。例如，可将胆固醇或鞘磷脂添加至膜，以帮助稳定结构且防止内部货物泄漏。另外，可由氢化的卵磷脂酰胆碱或卵磷脂酰胆碱、胆固醇和磷酸二鲸蜡酯制备膜。(关于综述，参见例如Spuch and Navarro,Journal of Drug Delivery,vol.2011,Article ID 469679,12页,2011.doi:10.1155/2011/469679)。
在一些实施方案中，细胞生物制品在外表面上包含一个或多个靶向基团(例如靶向蛋白)以靶向特定的细胞或组织类型(例如心肌细胞)。这些靶向基团包括但不限于受体、配体、抗体等。这些靶向基团在靶细胞的表面上结合其配偶体。在实施方案中，靶向蛋白特异性针对本文所述的靶细胞，例如皮肤细胞、心肌细胞、肝细胞、肠细胞(例如小肠细胞)、胰腺细胞、脑细胞、前列腺细胞、肺细胞、结肠细胞或骨髓细胞上的细胞表面标志物。
在一些实施方案中，本文所述的细胞生物制品经诊断剂官能化。诊断剂的实例包括但不限于正电子发射断层扫描(PET)、计算机辅助断层扫描(CAT)、单光子发射计算机断层扫描、x射线、荧光透视法以及磁共振成像(MRI)中所用的市售成像剂；以及造影剂。适用作MRI中的造影剂的材料的实例包括钆螯合物，以及铁、镁、锰、铜和铬。
将官能团引入至细胞生物制品的另一个实例为在后制备期间，通过将细胞生物制品和配体与同双官能或异双官能性交联剂直接交联。此程序可使用合适的化学物质和一类交联剂(如本文所论述的CDI、EDAC、戊二醛等)或在制备之后通过细胞生物制品表面的化学修饰将配体偶联至细胞生物制品表面的任何其他交联剂。这还包括方法，其中两亲性分子，如脂肪酸、脂质或功能稳定剂可以被动地吸附并粘附至细胞生物制品表面，从而引入官能性端基以系栓至配体。
货物
在一些实施方案中，本文所述的细胞生物制品包括货物，例如亚细胞货物。
在一些实施方案中，本文所述的细胞生物制品包括货物，例如治疗剂，例如内源治疗剂或外源治疗剂。
在一些实施方案中，货物在衍生细胞生物制品的细胞中不天然表达。在一些实施方案中，货物在衍生细胞生物制品的细胞中天然表达。在一些实施方案中，货物为在衍生细胞生物制品的细胞中天然表达的野生型核酸或蛋白质的突变体，或为在衍生细胞生物制品的细胞中天然表达的突变体核酸或蛋白质的野生型。
在一些实施方案中，货物通过在衍生细胞生物制品的细胞中的表达(例如从通过转染、转导或电穿孔引入的DNA的表达)而加载至细胞生物制品中。在一些实施方案中，货物从整合至基因组中或以附件体形式维持的DNA表达。在一些实施方案中，货物的表达为组成性的。在一些实施方案中，货物的表达为诱导性的。在一些实施方案中，直接在产生细胞生物制品之前诱导货物的表达。
在一些实施方案中，通过电穿孔将货物加载至细胞生物制品中，加载至细胞生物制品自身中或衍生细胞生物制品的细胞中。在一些实施方案中，通过转染将货物加载至细胞生物制品中，加载至细胞生物制品自身中或衍生细胞生物制品的细胞中。
在一些实施方案中，细胞生物制品组合物(例如药物组合物)包含以下的一个或多个：线粒体(例如如国际申请PCT/US16/64251中所述)、线粒体、细胞器(例如线粒体、溶酶体、核、细胞膜、细胞质、内质网、核糖体、液泡、内体、剪接体、聚合酶、壳体、顶体、自噬体、中心粒、糖酵解酶体、乙醛酸循环体、氢化酶体、黑色素体、纺锤剩体、肌原纤维、刺丝囊、过氧化物酶体、蛋白酶体、囊泡、应激颗粒和细胞器网络)，或去核细胞，例如包含前述物质中的任一种的去核细胞。
在实施方案中，线粒体具有如例如国际申请PCT/US16/64251中所描述的一种或多种特性，所述申请以其整体通过引用并入本文，包括实施例和发明内容。
在一些实施方案中，货物可包括一种或多种核酸序列、一种或多种多肽、核酸序列和/或多肽的组合、一种或多种细胞器和其任何组合。在一些实施方案中，货物可包括一种或多种细胞组分。在一些实施方案中，货物包括一种或多种胞质和/或核组分。
在一些实施方案中，货物包括核酸，例如DNA、nDNA(核DNA)、mtDNA(线粒体DNA)、蛋白质编码DNA、基因、操作子、染色体、基因组、转座子、逆转录转座子、病毒基因组、内含子、外显子、经修饰的DNA、mRNA(信使RNA)、tRNA(转移RNA)、经修饰的RNA、微RNA、siRNA(小干扰RNA)、tmRNA(转移信使RNA)、rRNA(核糖体RNA)、mtRNA(线粒体RNA)、snRNA(小核RNA)、小核仁RNA(snoRNA)、SmY RNA(mRNA反式剪接RNA)、gRNA(向导RNA)、TERC(端粒酶RNA组分)、aRNA(反义RNA)、顺式NAT(顺式天然反义转录物)、CRISPR RNA(crRNA)、lncRNA(长非编码RNA)、piRNA(piwi相互作用RNA)、shRNA(短发夹RNA)、tasiRNA(反式作用siRNA)、eRNA(增强子RNA)、卫星RNA、pcRNA(蛋白质编码RNA)、dsRNA(双链RNA)、RNAi(干扰RNA)、circRNA(环状RNA)、重编程RNA、适体和其任何组合。在一些实施方案中，核酸为野生型核酸。在一些实施方案中，蛋白质为突变体核酸。在一些实施方案中，核酸为多个核酸序列的融合物或嵌合体。
在一些实施方案中，使用基因编辑技术，例如向导RNA和CRISPR-Cas9/Cpf1，或使用不同的靶向核酸内切酶(例如锌指核酸酶、转录激活物样核酸酶(TALEN))编辑细胞生物制品中的DNA或衍生细胞生物制品的细胞中的DNA，以校正基因突变。在一些实施方案中，基因突变与受试者的疾病相关。DNA编辑物的实例包括小插入/缺失、大缺失、模板DNA的基因校正或DNA的大插入。在一些实施方案中，用非同源末端连接(NHEJ)或同源性定向修复(HDR)来实现基因编辑。在一些实施方案中，编辑物为基因敲除。在一些实施方案中，编辑物为基因敲入。在一些实施方案中，DNA的两个等位基因都被编辑。在一些实施方案中，单个等位基因被编辑。在一些实施方案中，产生多个编辑物。在一些实施方案中，细胞生物制品或细胞衍生自受试者，或与受试者遗传匹配，或与受试者免疫学相容(例如具有类似MHC)。
在一些实施方案中，货物可包括核酸。例如，货物可以包含增强内源蛋白的表达的RNA，或抑制内源蛋白的蛋白质表达的siRNA或miRNA。例如，内源蛋白可调控靶细胞中的结构或功能。在一些实施方案中，货物可包括编码工程化蛋白质的核酸，所述工程化蛋白质调控靶细胞中的结构或功能。在一些实施方案中，货物是靶向调控靶细胞中的结构或功能的转录激活物的核酸。
在一些实施方案中，货物包括多肽，例如酶、结构多肽、信号传导多肽、调控多肽、转运多肽、感觉多肽、运动多肽、防御多肽、贮存多肽、转录因子、抗体、细胞因子、激素、分解代谢多肽、合成代谢多肽、蛋白水解多肽、代谢多肽、激酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶、连接酶、酶调控剂多肽、蛋白质结合多肽、脂质结合多肽、膜融合多肽、细胞分化多肽、表观遗传多肽、细胞死亡多肽、核转运多肽、核酸结合多肽、重编程多肽、DNA编辑多肽、DNA修复多肽、DNA重组多肽、转座酶多肽、DNA整合多肽、靶向核酸内切酶(例如锌指核酸酶、转录激活物样核酸酶(TALEN)、cas9和其同源物)、重组酶和其任何组合。在一些实施方案中，蛋白质靶向细胞中的蛋白质以进行降解。在一些实施方案中，蛋白质通过将蛋白质定位于蛋白酶体而靶向细胞中的蛋白质以进行降解。在一些实施方案中，蛋白质为野生型蛋白质。在一些实施方案中，蛋白质为突变体蛋白。在一些实施方案中，蛋白质为融合或嵌合蛋白。
在一些实施方案中，货物包括小分子，例如离子(例如Ca2+、Cl-、Fe2+)、碳水化合物、脂质、活性氧类、活性氮类、类异戊二烯、信号传导分子、血红素、多肽辅因子、受电子化合物、给电子化合物、代谢物、配体和其任何组合。在一些实施方案中，小分子为与细胞中的靶标相互作用的药物。在一些实施方案中，小分子靶向细胞中的蛋白质以进行降解。在一些实施方案中，小分子通过将蛋白质定位于蛋白酶体而靶向细胞中的蛋白质以进行降解。在一些实施方案中，小分子为蛋白水解靶向嵌合体分子(PROTAC)。
在一些实施方案中，货物包括蛋白质、核酸或代谢物，例如多个多肽、多个核酸、多个小分子的混合物；核酸、多肽和小分子的组合；核糖核蛋白复合物(例如Cas9-gRNA复合物)；多个转录因子、多个表观遗传因子、重编程因子(例如Oct4、Sox2、cMyc和Klf4)；多个调控RNA；和其任何组合。
在一些实施方案中，货物包括一种或多种细胞器，例如颗粒体、线粒体、溶酶体、核、细胞膜、细胞质、内质网、核糖体、液泡、内体、剪接体、聚合酶、壳体、顶体、自噬体、中心粒、糖酵解酶体、乙醛酸循环体、氢化酶体、黑色素体、纺锤剩体、肌原纤维、刺丝囊、过氧化物酶体、蛋白酶体、囊泡、应激颗粒、细胞器网络和其任何组合。
在一些实施方案中，货物富集于细胞生物制品或细胞膜。在一些实施方案中，通过经由肽信号序列靶向到膜来富集货物。在一些实施方案中，货物通过与膜相关的蛋白质、脂质或小分子结合而富集。在一些实施方案中，货物通过与膜相关的蛋白质、脂质或小分子二聚化而富集。在一些实施方案中，货物为嵌合的(例如嵌合蛋白或核酸)并且包含介导与膜相关的蛋白质、脂质或小分子的结合或二聚化的域。所关注的膜相关的蛋白质包括但不限于具有与细胞膜稳定缔合(例如结合、整合等)的域(即，膜结合域)的任何蛋白质，其中此类域可包括肉豆蔻酰基化域、法呢基化域、跨膜域等。所关注的特定膜相关的蛋白质包括但不限于：肉豆蔻酰基化蛋白质，例如p 60v-src等；法呢基化蛋白质，例如Ras、Rheb和CENP-E,F(通过结合磷脂酰丝氨酸，一种细胞膜双层的脂质组分而结合特定脂质双层组分(例如膜联蛋白V)的蛋白质)等；膜锚蛋白；跨膜蛋白，例如转铁蛋白受体和其部分；和膜融合蛋白。在一些实施方案中，膜相关的蛋白质含有第一二聚化域。第一二聚化域可以是例如直接结合至货物的第二二聚化域或通过二聚化介体结合至第二二聚化域的域。在一些实施方案中，货物含有第二二聚化域。第二二聚化域可以是例如直接或通过二聚化介体与膜相关的蛋白质的第一二聚化域二聚化(例如稳定缔合，如通过非共价键合相互作用，直接或通过介体)的域。关于二聚化域，这些域是直接或通过二聚化介体参与结合事件的域，其中结合事件使得产生膜相关的蛋白质与靶蛋白的所需多聚(例如二聚)复合物。第一和第二二聚化域可以是同二聚体，使得它们由氨基酸的相同序列构成，或异二聚体，使得它们由氨基酸的不同序列构成。二聚化域可变化，其中所关注的域包括但不限于：靶生物分子的配体，如特异性结合至所关注的特定蛋白质的配体(例如蛋白质：蛋白质相互作用域)，如SH2域、Paz域、RING域、转录激活物域、DNA结合域、酶催化域、酶调控域、酶亚单位、定位至定义的细胞位置的域、定位域的识别域、如下URL所列的域：pawsonlab.mshri.on.ca/index.php？option＝com_content&task＝view&id＝30&Itemid＝63/，等等。在一些实施方案中，第一二聚化域结合核酸(例如mRNA、miRNA、siRNA、DNA)且第二二聚化域为货物上存在的核酸序列(例如第一二聚化域为MS2且第二二聚化域为MS2 RNA的高亲和力结合环)。可使用起二聚化介体作用的任何方便的化合物。极其多种化合物，包括天然存在的和合成的物质可以用作二聚化介体。选择二聚化介体的适用且可易于观察或测量的标准包括：(a)配体为生理学上可接受的(即，对使用所述配体的细胞或动物没有过度毒性)；(b)其具有合理的治疗剂量范围；(c)其可根据需要穿过细胞膜和其他膜(其中在一些情况下，其可能能够介导从细胞外部的二聚化)，和(D)以对于所需应用合理的亲和力结合至其所设计用于的嵌合蛋白的靶域。第一个期望标准是化合物在生理上是相对惰性的，但其具有二聚化介体活性。在一些情况下，配体将为非肽和非核酸。另外的二聚化域描述于例如US20170087087和US20170130197中，其各自以其整体通过引用并入本文。
颗粒体的特征
在一个方面，细胞生物制品组合物(例如药物)包含衍生自线粒体的细胞来源的分离的颗粒体(例如颗粒体制剂)。
在另一方面，细胞生物制品组合物(例如药物组合物)包含衍生自线粒体的细胞来源的分离的、修饰的颗粒体(例如修饰的颗粒体制剂)。
在另一方面，细胞生物制品组合物(例如药物组合物)包含表达外源蛋白质的颗粒体(例如颗粒体制剂)。
本文公开的包括颗粒体(例如颗粒体制剂)、方法和用途的另外的特征和实施方案包括以下中的一个或多个。
在一些实施方案中，颗粒体(或组合物中的颗粒体)具有以下特征中的一种或多种(2、3、4、5、6、7、8、9或更多种，例如全部)：
颗粒体外膜完整性，其中组合物在添加还原型细胞色素c后在4态速率下展现<20％(例如<15％、<10％、<5％、<4％、<3％、<2％、<1％)的耗氧速率增加；
遗传质量>80％，例如>85％、>90％、>95％、>97％、>98％、>99％，其中颗粒体制剂的“遗传质量”意指对于表5中描述的所有基因座，映射至野生型等位基因的测序读段的％；
1-15，例如2-15、5-15、2-10、2-5、10-15的谷氨酸盐/苹果酸盐RCR 3/2；
1-30、1-20、2-20、5-20、3-15、10-30的谷氨酸盐/苹果酸盐RCR 3/4o；
1-15、2-15、5-15、1-10、10-15的琥珀酸盐/鱼藤酮RCR 3/2；
1-30、1-20、2-20、5-20、3-15、10-30的琥珀酸盐/鱼藤酮RCR 3/4o；
1-10(例如1-5)的棕榈酰肉碱和苹果酸盐RCR3/2 3态/2态呼吸控制比(RCR3/2)；
心磷脂含量0.05-25(.1-20、.5-20、1-20、5-20、5-25、1-25、10-25、15-25)100*pmol/pmol总脂质；
基因组浓度0.001-2(例如.001-1、.01-1、.01-.1、.01-.05、.1-.2)mtDNA μg/mg蛋白质；或
>1000(例如>1,500、>2000、>2,500、>3,000、>4,000、>5000、>10,000、>25,000、>50,000、>100,000、>200,000、>500,000)的mtDNA/核DNA的相对比。
在一些实施方案中，颗粒体(或组合物中的颗粒体)具有以下特征中的一种或多种(2、3、4、5、6或更多种)：
组合物中的颗粒体的平均大小均值为150-1500nm，例如200-1200nm，例如500-1200nm，例如175-950nm；
组合物中的颗粒体具有1.1-6，例如1.5-5的多分散性(D90/D10)。在实施方案中，来自培养的细胞来源(例如培养的成纤维细胞)的组合物中的颗粒体具有2-5，例如2.5-5的多分散性(D90/D10)；
颗粒体外膜完整性，其中组合物在添加还原型细胞色素c后在4态速率下展现<20％(例如<15％、<10％、<5％、<4^、<3％、<2％、<1％)的耗氧速率增加；
1-8mOD/μg总蛋白质，例如3-7mOD/μg总蛋白质、1-5mOD/μg总蛋白质的复合物I水平。在实施方案中，来自培养的细胞来源(例如培养的成纤维细胞)的制剂的线粒体具有1-5mOD/μg总蛋白质的复合物I水平；
0.05-5mOD/μg总蛋白质，例如0.1-4mOD/μg总蛋白质，例如0.5-3mOD/μg总蛋白质的复合物II水平。在实施方案中，来自培养的细胞来源(例如培养的成纤维细胞)的制剂的线粒体具有0.05-1mOD/μg总蛋白质的复合物II水平；
1-30mOD/μg总蛋白质，例如2-30、5-10、10-30mOD/μg总蛋白质的复合物III水平。在实施方案中，来自培养的细胞来源(例如培养的成纤维细胞)的线粒体具有1-5mOD/μg总蛋白质的复合物III水平；
4-50mOD/μg总蛋白质，例如5-50，例如10-50、20-50mOD/μg总蛋白质的复合物IV水平。在实施方案中，来自培养的细胞来源(例如培养的成纤维细胞)的颗粒体具有3-10mOD/μg总蛋白质的复合物IV水平；
基因组浓度0.001-2(例如.001-1、.01-1、.01-.1、.01-.05、.1-.2)mtDNA μg/mg蛋白质；
制剂的膜电位为-5至-200mV，例如-100至-200mV、-50至-200mV、-50至-75mV、-50至-100mV。在一些实施方案中，制剂的膜电位为小于-150mV、小于-100mV、小于-75mV、小于-50mV，例如-5至-20mV；
小于100nmol羰基/mg颗粒体蛋白(例如小于90nmol羰基/mg颗粒体蛋白、小于80nmol羰基/mg颗粒体蛋白、小于70nmol羰基/mg颗粒体蛋白、小于60nmol羰基/mg颗粒体蛋白、小于50nmol羰基/mg颗粒体蛋白、小于40nmol羰基/mg颗粒体蛋白、小于30nmol羰基/mg颗粒体蛋白、小于25nmol羰基/mg颗粒体蛋白、小于20nmol羰基/mg颗粒体蛋白、小于15nmol羰基/mg颗粒体蛋白、小于10nmol羰基/mg颗粒体蛋白、小于5nmol羰基/mg颗粒体蛋白、小于4nmol羰基/mg颗粒体蛋白、小于3nmol羰基/mg颗粒体蛋白的蛋白质羰基水平；
<20％mol/mol ER蛋白(例如>15％、>10％、>5％、>3％、>2％、>1％)mol/mol ER蛋白；
>5％mol/mol颗粒体蛋白(在MitoCarta数据库(Calvo等人,NAR 2015l doi:10.1093/nar/gkv1003)中鉴别为线粒体的蛋白质)，例如>10％、>15％、>20％、>25％、>30％、>35％、>40％、>50％、>55％、>60％、>65％、>70％、>75％、>80％、>90％mol/mol线粒体蛋白)；
>0.05％mol/mol的MT-CO2、MT-ATP6、MT ND5和MT-ND6蛋白(组合)(例如>0.1％、>05％、>1％、>2％、>3％、>4％、>5％、>7、>8％、>9％、>10、>15％mol/mol的MT-CO2、MT-ATP6、MT-ND5和MT-ND6蛋白)；
遗传质量>80％，例如>85％、>90％、>95％、>97％、>98％、>99％；
mtDNA/核DNA的相对比为>1000(例如>1,500、>2000、>2,500、>3,000、>4,000、>5000、>10,000、>25,000、>50,000、>100,000、>200,000、>500,000)；
内毒素水平<0.2EU/μg蛋白质(例如<0.1、0.05、0.02、0.01EU/μg蛋白质)；
基本上不存在外源性非人类血清；
1-15，例如2-15、5-15、2-10、2-5、10-15的谷氨酸盐/苹果酸盐RCR 3/2；
1-30、1-20、2-20、5-20、3-15、10-30的谷氨酸盐/苹果酸盐RCR 3/4o；
1-15、2-15、5-15、1-10、10-15的琥珀酸盐/鱼藤酮RCR 3/2；
1-30、1-20、2-20、5-20、3-15、10-30的琥珀酸盐/鱼藤酮RCR 3/4o；
0.05-100nmol/min/mg总蛋白质(例如.05-50、.05-20、.5-10、.1-50、1-50、2-50、5-100、1-20nmol/min/mg总蛋白质)的复合物I活性；
0.05-50nmol/min/mg总蛋白质(例如.05-50、.05-20、.5-10、.1-50、1-50、2-50、5-50、1-20nmol/min/mg总蛋白质)的复合物II活性；
0.05-20nmol/min/mg总蛋白质(例如.05-50、.05-20、.5-10、.1-50、1-50、2-50、5-100、1-20nmol/min/mg总蛋白质)的复合物III活性；
0.1-50nmol/min/mg总蛋白质(例如.05-50、.05-20、.5-10、.1-50、1-50、2-50、5-50、1-20nmol/min/mg总蛋白质)的复合物IV活性；
1-500nmol/min/mg总蛋白质(例如10-500、10-250、10-200、100-500nmol/min/mg总蛋白质)的复合物V活性；
0.01-50pmol H2O2/μg蛋白质/hr(例如.05-40、.05-25、1-20、2-20、.05-20、1-20pmol H2O2/μg蛋白质/hr)的活性氧类(ROS)生产水平；
0.05-5(例如.5-5、.5-2、1-5、1-4)mOD/min/μg总蛋白质的柠檬酸合酶活性；
0.05-10(例如.1-10、.1-8、.5-8、.1-5、.5-5、.5-3、1-3)mOD/min/μg总蛋白质的α酮戊二酸脱氢酶活性；
0.1-100(例如.5-50、1-100、1-50、1-25、1-15、5-15)mOD/min/μg总蛋白质的肌酸激酶活性；
0.1-10(例如.5-10、.5-8、1-10、1-8、1-5、2-3)mOD/min/μg总蛋白质的丙酮酸脱氢酶活性；
0.1-50(例如5-50、.1-2、.1-20、.5-30)mOD/min/μg总蛋白质的顺乌头酸酶活性。在实施方案中，来自血小板的颗粒体制剂中的顺乌头酸酶活性为.5-5mOD/min/μg总蛋白质。在实施方案中，来自培养的细胞，例如成纤维细胞的颗粒体制剂中的顺乌头酸酶活性为5-50mOD/min/μg总蛋白质；
0.05-50(例如.05-40、.05-30、.05-10、.5-50、.5-25、.5-10、1-5)pmol O2/min/μg颗粒体蛋白的最大脂肪酸氧化水平；
1-10(例如1-5)的棕榈酰肉碱和苹果酸盐RCR3/2 3态/2态呼吸控制比(RCR3/2)；
1-1000(例如10-1000、10-800、10-700、50-1000、100-1000、500-1000、10-400、100-800)nmol Om/min/mg蛋白/ΔGATP的电子传递链效率(以kcal/mol计)；
50,000-2,000,000pmol/mg(例如50,000-1,000,000；50,000-500,000pmol/mg)的总脂质含量；
0.8-8(例如1-5、2-5、1-7、1-6)pmol/pmol的双键/总脂质的比率；
50-100(例如60-80、70-100、50-80)100*pmol/pmol的磷脂/总脂质的比率；
0.2-20(例如.5-15、.5-10、1-10、.5-10、1-5、5-20)100*pmol/pmol的磷酸鞘脂/总脂质的比率；
神经酰胺含量0.05-5(例如.1-5、.1-4、1-5、.05-3)100*pmol/pmol总脂质；
心磷脂含量0.05-25(.1-20、.5-20、1-20、5-20、5-25、1-25、10-25、15-25)100*pmol/pmol总脂质；
0.05-5(例如.1-5、1-5、.1-3、1-3、.05-2)100*pmol/pmol总脂质的溶血磷脂酰胆碱(LPC)含量；
0.005-2(例如.005-1、.05-2、.05-1)100*pmol/pmol总脂质的溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)含量；
10-80(例如20-60、30-70、20-80、10-60m 30-50)100*pmol/pmol总脂质的磷脂酰胆碱(PC)含量；
0.1-10(例如.5-10、1-10、2-8、1-8)100*pmol/pmol总脂质的磷脂酰胆碱-醚(PCO-)含量；
磷脂酰乙醇胺(PE)含量1-30(例如2-20、1-20、5-20)100*pmol/pmol总脂质；
磷脂酰乙醇胺-醚(PE O-)含量0.05-30(例如.1-30、.1-20、1-20、.1-5、1-10、5-20)100*pmol/pmol总脂质；
磷脂酰肌醇(PI)含量0.05-15(例如.1-15、.1-10、1-10、.1-5、1-10、5-15)100*pmol/pmol总脂质；
磷脂酰丝氨酸(PS)含量0.05-20(例如.1-15、.1-20、1-20、1-10、.1-5、1-10、5-15)100*pmol/pmol总脂质；
鞘磷脂(SM)含量0.01-20(例如.01-15、.01-10、.5-20、.5-15、1-20、1-15、5-20)100*pmol/pmol总脂质；
三酰甘油(TAG)含量0.005-50(例如.01-50、.1-50、1-50、5-50、10-50、.005-30、.01-25、.1-30)100*pmol/pmol总脂质；
PE：LPE比30-350(例如50-250、100-200、150-300)；
PC：LPC比30-700(例如50-300、50-250、100-300、400-700、300-500、50-600、50-500、100-500、100-400)；
PE 18：n(n>0)含量0.5-20％(例如1-20％、1-10％、5-20％、5-10％、3-9％)pmolAA/pmol脂质类；
PE 20：4含量0.05-20％(例如1-20％、1-10％、5-20％、5-10％)pmol AA/pmol脂质类；
PC 18：n(n>0)含量5-50％(例如5-40％、5-30％、20-40％、20-50％)pmol AA/pmol脂质类；
PC 20：4含量1-20％(例如2-20％、2-15％、5-20％、5-15％)pmol AA/pmol脂质类。
在某些实施方案中，颗粒体(或组合物中的颗粒体)在向接受体细胞、组织或受试者施用后具有以下特征中的一个或多个(对照可以为阴性对照(例如尚未施用组合物的对照组织或受试者)，或施用之前的基线，例如施用组合物之前的细胞、组织或受试者)：
相对于对照增加接受体细胞的基础呼吸至少10％(例如>15％、>20％、>30％、>40％、>50％、>60％、>70％、>80％、>90％)；
组合物中的线粒体被至少1％(例如至少2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％)的接受体细胞吸收；
组合物中的颗粒体被吸收并维持接受体细胞中的膜电位；
组合物中的颗粒体在接受体细胞中存留至少6小时，例如至少12小时、18小时、24小时、2天、3天、4天、1周、2周、1个月、2个月、3个月、6个月；
增加接受体细胞、组织或受试者中的ATP水平(例如至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％或更多，例如相比于参考值，例如对照值，例如未处理的对照)；
降低接受体细胞、组织或受试者中的凋亡(例如至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％或更多，例如相比于参考值，例如对照值，例如未处理的对照)；
降低接受体细胞、组织或受试者中的细胞脂质水平(例如至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％或更多，例如相比于参考值，例如对照值，例如未处理的对照)；
增加接受体细胞、组织或受试者中的膜电位(例如至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％或更多，例如相比于参考值，例如对照值，例如未处理的对照)；
增加接受体细胞、组织或受试者中的非偶联呼吸(例如至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、509％、60％、70％、80％、90％或更多，例如相比于参考值，例如对照值，例如未处理的对照)；
增加接受体细胞、组织或受试者中的PI3K活性(例如至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、509％、60％、70％、80％、90％或更多，例如相比于参考值，例如对照值，例如未处理的对照)；
降低接受体细胞、组织或受试者中的还原应激(例如至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、509％、60％、70％、80％、90％或更多，例如相比于参考值，例如对照值，例如未处理的对照)；
减少受试者的细胞、组织(例如目标受试者的血清)中的活性氧类(例如H2O2)(例如至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、509％、60％、70％、80％、90％或更多，例如相比于参考值，例如对照值，例如未处理的对照)；
相对于对照降低接受体细胞的细胞脂质水平至少5％(例如>10％、>15％、>20％、>30％、>40％、>50％、>60％、>70％、>80％、>90％)；
相对于对照增加接受体细胞的非偶联呼吸至少5％(例如>10％、>15％、>20％、>30％、>40％、>50％、>60％、>70％、>80％、>90％)；
相对于对照，将接受体细胞中的线粒体通透性转换孔(MPTP)形成降低至少5％，且不增加超过10％；
相对于对照增加接受体细胞中的Akt水平至少10％(例如>10％、>15％、>20％、>30％、>40％、>50％、>60％、>70％、>80％、>90％)；
相对于对照降低受体细胞中的总NAD/NADH比至少5％(例如>10％、>15％、>20％、>30％、>40％、>50％、>60％、>70％、>80％、>90％)；
相对于对照降低接受体细胞中的ROS水平至少5％(例如>10％、>15％、>20％、>30％、>40％、>50％、>60％、>70％、>80％、>90％)；
相对于对照增加患有心肌缺血的受试者中的缩短分数至少5％(例如>10％、>15％、>20％、>30％、>40％、>50％、>60％、>70％、>80％、>90％)；
相对于对照增加患有心肌缺血的受试者的舒张末期容积至少5％(例如>10％、>15％、>20％、>30％、>40％、>50％、>60％、>70％、>80％、>90％)；
相对于对照降低患有心肌缺血的受试者的收缩末期容积至少5％(例如>10％、>15％、>20％、>30％、>40％、>50％、>60％、>70％、>80％、>90％)；
相对于对照降低缺血性心肌梗塞面积至少5％(例如>10％、>15％、>20％、>30％、>40％、>50％、>60％、>70％、>80％、>90％)；
相对于对照增加患有心肌缺血的受试者的心搏出量至少5％(例如>10％、>15％、>20％、>30％、>40％、>50％、>60％、>70％、>80％、>90％)；
相对于对照增加患有心肌缺血的受试者的射血分数至少5％(例如>10％、>15％、>20％、>30％、>40％、>50％、>60％、>70％、>80％、>90％)；
相对于对照增加患有心肌缺血的受试者的心输出量至少5％(例如>10％、>15％、>20％、>30％、>40％、>50％、>60％、>70％、>80％、>90％)；
相对于对照增加患有心肌缺血的受试者的心脏指数至少5％(例如>10％、>15％、>20％、>30％、>40％、>50％、>60％、>70％、>80％、>90％)；
相对于对照降低患有心肌缺血的受试者的血清CKNB水平至少5％(例如>10％、>15％、>20％、>30％、>40％、>50％、>60％、>70％、>80％、>90％)；
相对于对照降低患有心肌缺血的受试者中的血清cTnI水平至少5％(例如>10％、>15％、>20％、>30％、>40％、>50％、>60％、>70％、>80％、>90％)；
相对于对照降低患有心肌缺血的受试者中的血清过氧化氢至少5％(例如>10％、>15％、>20％、>30％、>40％、>50％、>60％、>70％、>80％、>90％)；
相对于对照降低受试者中的血清胆固醇水平和/或甘油三酯至少5％(例如>10％、>15％、>20％、>30％、>40％、>50％、>60％、>70％、>80％、>90％)；
在一些实施方案中，细胞生物制品包含具有以下特征中的一个或多个的颗粒体，例如从线粒体来源分离的颗粒体：
组合物中的颗粒体具有150-1500nm之间的平均大小；
组合物中的颗粒体具有1.1至6的多分散性(D90/D10)；
组合物中的颗粒体的颗粒体外膜完整性在添加还原型细胞色素c后在4态速率下展现<20％的耗氧速率增加；
1-8mOD/μg总蛋白质的复合物I水平；
0.05-5mOD/μg总蛋白质的复合物II水平；
1-30mOD/μg总蛋白质的复合物III水平；
4-50mOD/μg总蛋白质的复合物IV水平；
基因组浓度0.001-2mtDNA μg/mg蛋白质；和/或
组合物中的颗粒体的膜电位为-5至-200mV。
在一些实施方案中，细胞生物制品包含具有以下特征中的一个或多个的颗粒体，例如从线粒体来源分离的颗粒体：
小于100nmol羰基/mg颗粒体蛋白的蛋白质羰基水平。
<20％mol/mol ER蛋白
>5％mol/mol线粒体蛋白(MitoCarta)；
>0.05％mol/mol的MT-CO2、MT-ATP6、MT-ND5和MT-ND6蛋白；
遗传质量>80％；
mtDNA/核DNA的相对比>1000；
内毒素水平<0.2EU/μg蛋白质；和/或
基本上不存在外源性非人类血清。
在一些实施方案中，细胞生物制品包含具有以下特征中的一个或多个的颗粒体，例如从线粒体来源分离的颗粒体：
1-15的谷氨酸盐/苹果酸盐RCR 3/2；
1-30的谷氨酸盐/苹果酸盐RCR 3/4o；
1-15的琥珀酸盐/鱼藤酮RCR 3/2；
1-30的琥珀酸盐/鱼藤酮RCR 3/4o；
0.05-100nmol/min/mg总蛋白质的复合物I活性；
0.05-50nmol/min/mg总蛋白质的复合物II活性；
0.05-20nmol/min/mg总蛋白质的复合物III活性；
0.1-50nmol/min/mg总蛋白质的复合物IV活性；
1-500nmol/min/mg总蛋白质的复合物V活性；
0.01-50pmol H2O2/μg蛋白质/hr的活性氧类(ROS)生产水平；
0.05-5mOD/min/μg总蛋白质的柠檬酸合酶活性；
0.05-10mOD/min/μg总蛋白质的α酮戊二酸脱氢酶活性；
0.1-100mOD/min/μg总蛋白质的肌酸激酶活性；
0.1-10mOD/min/μg总蛋白质的丙酮酸脱氢酶活性；
0.1-50mOD/min/μg总蛋白质的顺乌头酸酶活性；
0.05-50pmol O2/min/μg线粒体蛋白的最大脂肪酸氧化水平；
1-10的棕榈酰肉碱和苹果酸盐RCR3/2 3态/2态呼吸控制比(RCR 3/2)；和/或
1-1000nmol O2/min/mg蛋白质/ΔGATP的电子传递链效率(以kcal/mol计)。
在一些实施方案中，细胞生物制品包含具有以下特征中的一个或多个的颗粒体，例如从线粒体来源分离的颗粒体：
50,000-2,000,000pmol/mg的总脂质含量；
0.8-8pmol/pmol的双键/总脂质的比率；
50-100 100*pmol/pmol的磷脂/总脂质的比率；
0.2-20 100*pmol/pmol的磷酸鞘脂/总脂质的比率；
神经酰胺含量0.05-5 100*pmol/pmol总脂质；
心磷脂含量0.05-25 100*pmol/pmol总脂质；
0.05-5 100*pmol/pmol总脂质的溶血磷脂酰胆碱(LPC)含量；
0.005-2 100*pmol/pmol总脂质的溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)含量；
10-80 100*pmol/pmol总脂质的磷脂酰胆碱(PC)含量；
磷脂酰胆碱-醚(PC O-)含量0.1-10 100*pmol/pmol总脂质；
磷脂酰乙醇胺(PE)含量1-30 100*pmol/pmol总脂质；
磷脂酰乙醇胺-醚(PE O-)含量0.05-30 100*pmol/pmol总脂质；
磷脂酰肌醇(PI)含量0.05-15 100*pmol/pmol总脂质；
磷脂酰丝氨酸(PS)含量0.05-20 100*pmol/pmol总脂质；
鞘磷脂(SM)含量0.01-20 100*pmol/pmol总脂质；
三酰甘油(TAG)含量0.005-50 100*pmol/pmol总脂质；
PE：LPE比30-350；
PC：LPC比30-700；
PE 18：n(n>0)含量0.5-20％pmol AA/pmol脂质类；
PE 20：4含量0.05-20％pmol AA/pmol脂质类；
PC 18：n(n>0)含量5-50％pmol AA/pmol脂质类；和/或
PC 20：4含量1-20％。
在一些实施方案中，细胞生物制品包含具有以下特征中的一个或多个的颗粒体，例如从线粒体来源分离的颗粒体：
增加接受体细胞的基础呼吸至少10％；
组合物中的线粒体被至少1％的接受体细胞吸收；
组合物中的线粒体被吸收并维持接受体细胞中的膜电位；
组合物中的线粒体存留于接受体细胞中至少6小时；
降低接受体细胞的细胞脂质水平至少5％；
增加接受体细胞的非偶联呼吸至少5％；
将接受体细胞中的线粒体通透性转换孔(MPTP)形成降低至少5％，且不增加超过10％；
增加接受体细胞中的Akt水平至少10％；
降低接受体细胞中的总NAD/NADH比至少5％；和/或
降低接受体细胞中的ROS水平至少5％。
在一些实施方案中，包含颗粒体的细胞生物制品进一步具有以下特征中的一个或多个：
使患有心肌缺血的受试者的缩短分数增加至少5％；
使患有心肌缺血的受试者的舒张末期体积增加至少5％；
使患有心肌缺血的受试者的收缩末期体积降低至少5％；
使缺血性心肌梗塞面积降低至少5％；
使患有心肌缺血的受试者的心搏出量增加至少5％；
使患有心肌缺血的受试者的射血分数增加至少5％；
使患有心肌缺血的受试者的心输出量增加至少5％；
使患有心肌缺血的受试者的心脏指数增加至少5％；
使患有心肌缺血的受试者的血清CKNB水平降低至少5％；
使患有心肌缺血的受试者的血清cTnI水平降低至少5％；和/或
使患有心肌缺血的受试者的血清过氧化氢降低至少5％。
在实施方案中，包含颗粒体的细胞生物制品稳定至少6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、5天、7天、10天、14天、21天、30天、45天、60天、90天、120天、180天或更长时间(例如在4℃、0℃、-4℃、或-20℃、-80℃下)。
在实施方案中，包含试剂(例如颗粒体)的细胞生物制品可以包含例如天然、合成或工程化的囊封材料，如基于脂质的材料、囊泡、外来体、脂筏、网格蛋白包被的囊泡或血小板(线粒体粒子)、MSC或星形胶质细胞微囊泡膜。
在实施方案中，包含颗粒体的细胞生物制品以150-20,000μg蛋白质/ml；150-15,000μg/ml；200-15,000μg/ml；300-15,000μg/ml；500-15,000μg/ml；200-10,000μg/ml；200-5,000μg/ml；300-10,000μg/ml；>200μg/ml；>250μg/ml；>300μg/ml；>350μg/ml；>400μg/ml；>450μg/ml；>500μg/ml；>600μg/ml；>700μg/ml；>800μg/ml；>900μg/ml；>1mg/ml；>2mg/ml；>3mg/ml；>4mg/ml；>5mg/ml；>6mg/ml；>7mg/ml；>8mg/ml；>9mg/ml；>10mg/ml；>11mg/ml；>12mg/ml；>14mg/ml；>15mg/ml(且例如≤20mg/ml)在组合物中。
在实施方案中，包含颗粒体的细胞生物制品在接受体动物，例如接受体哺乳动物，如人类中不产生非所需的免疫应答(例如不显著增加接受体中IL-1-β、IL-6、GM-CSF、TNF-α的水平或淋巴结大小)。
对货物的修饰包括例如如国际申请PCT/US16/64251中所述的对颗粒体或颗粒体来源的修饰。在一些实施方案中，细胞生物制品包含使用本文所述的制备药物组合物的方法制备的颗粒体。
在一些实施方案中，本文所述的细胞生物制品组合物，例如包含线粒体或颗粒体的细胞生物制品组合物能够具有以下中的一个或多个(例如2、3或4个)：
a)增加靶细胞中的最大呼吸，例如其中最大呼吸的增加为至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、90％、2倍、3倍、4倍或5倍，或10％-20％、20％-30％、30％-40％、40％-50％、50％-60％、60％-70％、70％-80％、80％-90％、90％-100％、1倍-2倍、2倍-3倍、3倍-4倍或4倍-5倍；
b)增加靶细胞中的备用呼吸容量(spare respiratory capacity)，例如其中备用呼吸容量的增加为至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、2倍、3倍、4倍或5倍，或10％-20％、20％-30％、30％-40％、40％-50％、50％-60％、60％-70％、70％-80％、80％-90％、90％-100％、1倍-2倍、2倍-3倍、3倍-4倍或4倍-5倍；
c)刺激靶细胞中的线粒体生物发生，例如其中刺激线粒体生物发生包含增加线粒体生物量至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、2倍、3倍、4倍或5倍，或10％-20％、20％-30％、30％-40％、40％-50％、50％-60％、60％-70％、70％-80％、80％-90％、90％-100％、1倍-2倍、2倍-3倍、3倍-4倍或4倍-5倍；或
d)调控(例如刺激或抑制)靶细胞中核基因的转录，例如其中核基因的转录物水平的变化为至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、2倍、3倍、4倍或5倍，或10％-20％、20％-30％、30％-40％、40％-50％、50％-60％、60％-70％、70％-80％、80％-90％、90％-100％、1倍-2倍、2倍-3倍、3倍-4倍或4倍-5倍。
免疫原性
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，细胞生物制品组合物为基本上非免疫原性的。可以定量免疫原性，例如如本文所述。
在一些实施方案中，细胞生物制品组合物具有细胞的膜对称性，所述细胞为或已知为基本上非免疫原性的，例如干细胞、间充质干细胞、诱导性多能干细胞、胚胎干细胞、塞特利氏细胞(sertoli cell)或视网膜色素上皮细胞。在一些实施方案中，细胞生物制品具有的免疫原性比干细胞、间充质干细胞、诱导性多能干细胞、胚胎干细胞、塞特利氏细胞或视网膜色素上皮细胞的免疫原性高不超过5％、10％、20％、30％、40％或50％，如根据本文所述的测定法所测量。
在一些实施方案中，相比于参考细胞，例如在其他方面与源细胞相似的未修饰的细胞，或Jurkat细胞，细胞生物制品组合物包含升高水平的免疫抑制剂。在一些实施方案中，升高的水平为至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、2倍、3倍、5倍、10倍、20倍、50倍或100倍。在一些实施方案中，细胞生物制品组合物包含参考细胞中不存在的免疫抑制剂。在一些实施方案中，相比于参考细胞，例如在其他方面与源细胞相似的未修饰的细胞，或Jurkat细胞，细胞生物制品组合物包含降低水平的免疫活化剂。在一些实施方案中，降低的水平为相比于参考细胞的至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％。在一些实施方案中，免疫活化剂基本上不存在于细胞生物制品中。
在一些实施方案中，细胞生物制品组合物包含膜，所述膜具有与源细胞，例如基本上非免疫原性的源细胞基本上类似(例如根据蛋白质组学所测量)的组成。在一些实施方案中，细胞生物制品组合物包含膜，所述膜包含源细胞的膜蛋白的至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％。在一些实施方案中，细胞生物制品组合物包含膜，所述膜包含以源细胞膜上的膜蛋白的表达水平的至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％表达的膜蛋白。
在一些实施方案中，细胞生物制品组合物，或衍生细胞生物制品组合物的源细胞具有以下特征中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个或更多个：
a.相比于参考细胞，例如在其他方面与源细胞相似的未修饰的细胞，或HeLa细胞，MHC I类或MHC II类的表达为小于50％、40％、30％、20％、15％、10％或5％或更小；
b.相比于参考细胞，例如在其他方面与源细胞相似的未修饰的细胞，或本文所述的参考细胞，包括但不限于以下的一种或多种共刺激蛋白的表达为小于50％、40％、30％、20％、15％、10％或5％或更小：LAG3、ICOS-L、ICOS、Ox40L、OX40、CD28、B7、CD30、CD30L 4-1BB、4-1BBL、SLAM、CD27、CD70、HVEM、LIGHT、B7-H3或B7-H4；
c.抑制巨噬细胞吞噬的表面蛋白(例如CD47)的表达，例如通过本文所述的方法可检测的表达，例如相比于参考细胞，例如在其他方面与源细胞相似的未修饰的细胞，或Jurkat细胞，抑制巨噬细胞吞噬的表面蛋白(例如CD47)的表达为大于1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍或更大；
d.可溶性免疫抑制细胞因子(例如IL-10)的表达，例如通过本文所述的方法可检测的表达，例如相比于参考细胞，例如在其他方面与源细胞相似的未修饰的细胞，或Jurkat细胞，可溶性免疫抑制细胞因子(例如IL-10)的表达为大于1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍或更大；
e.可溶性免疫抑制蛋白(例如PD-L1)的表达，例如通过本文所述的方法可检测的表达，例如相比于参考细胞，例如在其他方面与源细胞相似的未修饰的细胞，或Jurkat细胞，可溶性免疫抑制蛋白(例如PD-L1)的表达为大于1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍或更大；
f.相比于参考细胞，例如在其他方面与源细胞相似的未修饰的细胞，或U-266细胞，可溶性免疫刺激细胞因子，例如IFN-γ或TNF-a的表达为小于50％、40％、30％、20％、15％、10％或5％或更小；
g.相比于参考细胞，例如在其他方面与源细胞相似的未修饰的细胞，或A549细胞或SK-BR-3细胞，内源性免疫刺激抗原，例如Zg16或Hormad1的表达为小于50％、40％、30％、20％、15％、10％或5％或更小；
h.相比于参考细胞，例如在其他方面与源细胞相似的未修饰的细胞，或Jurkat细胞，HLA-E或HLA-G的表达，例如通过本文所述的方法可检测的表达；
i.表面糖基化概况，例如含有唾液酸，其用以例如抑制NK细胞活化；
j.相比于参考细胞，例如在其他方面与源细胞相似的未修饰的细胞，或Jurkat细胞，TCRα/β的表达为小于50％、40％、30％、20％、15％、10％或5％或更小；
k.相比于参考细胞，例如在其他方面与源细胞相似的未修饰的细胞，或HeLa细胞，ABO血型的表达为小于50％、40％、30％、20％、15％、10％或5％或更小；
l.相比于参考细胞，例如在其他方面与源细胞相似的未修饰的细胞，或Jurkat细胞，次要组织相容性抗原(MHA)的表达为小于50％、40％、30％、20％、15％、10％或5％或更小；或
m.相比于参考细胞，例如在其他方面与源细胞相似的未修饰的细胞，或Jurkat细胞，具有少于10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更少的线粒体MHA，或没有检测到的线粒体MHA。
在实施方案中，共刺激蛋白为4-1BB、B7、SLAM、LAG3、HVEM或LIGHT，且参考细胞为HDLM-2。在一些实施方案中，共刺激蛋白为BY-H3且参考细胞为HeLa。在一些实施方案中，共刺激蛋白为ICOSL或B7-H4，且参考细胞为SK-BR-3。在一些实施方案中，共刺激蛋白为ICOS或OX40，且参考细胞为MOLT-4。在一些实施方案中，共刺激蛋白为CD28，且参考细胞为U-266。在一些实施方案中，共刺激蛋白为CD30L或CD27，且参考细胞为Daudi。在一些实施方案中，细胞生物制品组合物基本上不引发免疫系统，例如先天免疫系统的免疫原性应答。在实施方案中，免疫原性应答可以被定量，例如如本文所述。在一些实施方案中，先天免疫系统的免疫原性应答包含先天免疫细胞的应答，所述先天免疫细胞包括但不限于NK细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、树突细胞、肥大细胞或γ/δT细胞。在一些实施方案中，先天免疫系统的免疫原性应答包含补体系统的应答，所述补体系统包括可溶性血液组分和膜结合组分。
在一些实施方案中，细胞生物制品组合物基本上不引发免疫系统，例如适应性免疫系统的免疫原性应答。在实施方案中，免疫原性应答可以被定量，例如如本文所述。在一些实施方案中，适应性免疫系统的免疫原性应答包含适应性免疫细胞的免疫原性应答，包括但不限于T淋巴细胞(例如CD4 T细胞、CD8 T细胞和或γ-δT细胞)或B淋巴细胞的数目或活性的变化，例如增加。在一些实施方案中，适应性免疫系统的免疫原性应答包括增加的可溶血液组分水平，包括但不限于细胞因子或抗体(例如IgG、IgM、IgE、IgA或IgD)的数目或活性的变化，例如增加。
在一些实施方案中，将细胞生物制品组合物进行修饰以具有降低的免疫原性。免疫原性可以被定量，例如如本文所述。在一些实施方案中，细胞生物制品组合物具有的免疫原性比参考细胞，例如在其他方面与源细胞相似的未修饰的细胞，或Jurkat细胞的免疫原性低小于5％、10％、20％、30％、40％或50％。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，细胞生物制品组合物衍生自源细胞，例如具有修饰的基因组(例如使用本文所述的方法修饰)的哺乳动物细胞，以降低(例如减少)免疫原性。免疫原性可以被定量，例如如本文所述。
在一些实施方案中，细胞生物制品组合物衍生自哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞耗竭以下中的一、二、三、四、五、六、七个或更多个(例如具有其敲除)：
a.MHC I类、MHC II类或MHA；
b.一种或多种共刺激蛋白，包括但不限于：LAG3、ICOS-L、ICOS、Ox40L、OX40、CD28、B7、CD30、CD30L 4-1BB、4-1BBL、SLAM、CD27、CD70、HVEM、LIGHT、B7-H3或B7-H4；
c.可溶性免疫刺激细胞因子，例如IFN-γ或TNF-a；
d.内源性免疫刺激抗原，例如Zg16或Hormad1；
e.T细胞受体(TCR)；
f.编码ABO血型的基因，例如ABO基因；
g.驱动免疫活化的转录因子，例如NFkB；
h.控制MHC表达的转录因子，例如II类反式激活物(CIITA)、Xbox 5的调控因子(RFX5)、RFX相关蛋白(RFXAP)或RFX锚蛋白重复序列(RFXANK；也称为RFXB)；或
i.TAP蛋白，例如TAP2、TAP1或TAPBP，其降低MHC I类表达。
在一些实施方案中，细胞生物制品衍生自具有遗传修饰的源细胞，所述遗传修饰使得免疫抑制剂，例如以下中的一种、两种、三种或更多种的表达增加(例如其中在遗传修饰之前，细胞不表达因子)：
a.抑制巨噬细胞吞噬的表面蛋白，例如CD47；例如相比于参考细胞，例如在其他方面与源细胞相似的未修饰的细胞，或Jurkat细胞增加的CD47的表达；
b.可溶性免疫抑制细胞因子，例如IL-10，例如相比于参考细胞，例如在其他方面与源细胞相似的未修饰的细胞，或Jurkat细胞增加的IL-10的表达；
c.可溶性免疫抑制蛋白，例如PD-1、PD-L1、CTLA4或BTLA；例如相比于参考细胞，例如其它方面与细胞来源类似的未修饰的细胞，或Jurkat细胞增加的免疫抑制蛋白的表达；
d.致耐受性蛋白，例如ILT-2或ILT-4激动剂，例如HLA-E或HLA-G或任何其他内源性ILT-2或ILT-4激动剂，例如相比于参考细胞，例如其它方面与细胞来源类似的未修饰的细胞，或Jurkat细胞增加的HLA-E、HLA-G、ILT-2或ILT-4的表达；或
e.抑制补体活性的表面蛋白，例如补体调控蛋白，例如结合衰变加速因子的蛋白(DAF，CD55)，例如因子H(FH)样蛋白-1(FHL-1)，例如C4b结合蛋白(C4BP)，例如补体受体1(CD35)，例如膜辅因子蛋白(MCP，CD46)，例如Profectin(CD59)，例如抑制经典和旁路补体途径CD/C5转化酶的蛋白，例如调控MAC装配的蛋白；例如相比于参考细胞，例如在其他方面与源细胞相似的未修饰的细胞，或Jurkat细胞增加的补体调控蛋白的表达。
在一些实施方案中，增加的表达水平为相比于参考细胞高至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、2倍、3倍、5倍、10倍、20倍、50倍或100倍。
在一些实施方案中，细胞生物制品衍生自源细胞，所述源细胞被修饰以具有降低的免疫活化剂的表达，例如以下中的一、二、三、四、五、六、七、八个或更多个：
a.相比于参考细胞，例如在其他方面与源细胞相似的未修饰的细胞，或HeLa细胞，MHC I类或MHC II类的表达为小于50％、40％、30％、20％、15％、10％或5％或更小；
b.相比于参考细胞，例如在其他方面与源细胞相似的未修饰的细胞，或本文所述的参考细胞，包括但不限于以下的一种或多种共刺激蛋白的表达为小于50％、40％、30％、20％、15％、10％或5％或更小：LAG3、ICOS-L、ICOS、Ox40L、OX40、CD28、B7、CD30、CD30L 4-1BB、4-1BBL、SLAM、CD27、CD70、HVEM、LIGHT、B7-H3或B7-H4；
c.相比于参考细胞，例如在其他方面与源细胞相似的未修饰的细胞，或U-266细胞，可溶性免疫刺激细胞因子，例如IFN-γ或TNF-a的表达为小于50％、40％、30％、20％、15％、10％或5％或更小；
d.相比于参考细胞，例如在其他方面与源细胞相似的未修饰的细胞，或A549细胞或SK-BR-3细胞，内源性免疫刺激抗原，例如Zg16或Hormad1的表达为小于50％、40％、30％、20％、15％、10％或5％或更小；
e.相比于参考细胞，例如在其他方面与源细胞相似的未修饰的细胞，或Jurkat细胞，T细胞受体(TCR)的表达为小于50％、40％、30％、20％、15％、10％或5％或更小；
f.相比于参考细胞，例如在其他方面与源细胞相似的未修饰的细胞，或HeLa细胞，ABO血型的表达为小于50％、40％、30％、20％、15％、10％或5％或更小；
g.相比于参考细胞，例如在其他方面与源细胞相似的未修饰的细胞，或Jurkat细胞，驱动免疫活化的转录因子，例如NFkB的表达为小于50％、40％、30％、20％、15％、10％或5％或更小；
h.相比于参考细胞，例如在其他方面与源细胞相似的未修饰的细胞，或Jurkat细胞，控制MHC表达的转录因子，例如II类反式激活物(CIITA)、Xbox 5的调控因子(RFX5)、RFX相关蛋白(RFXAP)或RFX锚蛋白重复序列(RFXANK；也称为RFXB)的表达为小于50％、40％、30％、20％、15％、10％或5％或更小；或
i.相比于参考细胞，例如在其他方面与源细胞相似的未修饰的细胞，或HeLa细胞，降低MHC I类表达的TAP蛋白，例如TAP2、TAP1或TAPBP的表达为小于50％、40％、30％、20％、15％、10％或5％或更小。
在一些实施方案中，相比于未修饰的细胞，例如尚未修饰的间充质干细胞，衍生自哺乳动物细胞(例如间充质干细胞)，使用表达shRNA的慢病毒修饰以降低MHC I类表达的细胞生物制品组合物具有较低的MHC I类表达。在一些实施方案中，相比于未修饰的细胞，例如尚未修饰的间充质干细胞，衍生自哺乳动物细胞(例如间充质干细胞)，使用表达HLA-G的慢病毒修饰以增加HLA-G表达的细胞生物制品组合物具有增加的HLA-G表达。
在一些实施方案中，细胞生物制品组合物衍生自基本上没有免疫原性的源细胞，例如哺乳动物细胞，其中源细胞以0pg/mL至>0pg/mL的水平刺激(例如诱导)T细胞IFN-γ分泌，例如通过IFN-γELISPOT测定法在体外所测定。
在一些实施方案中，细胞生物制品组合物衍生自源细胞，例如哺乳动物细胞，其中哺乳动物细胞来自用免疫抑制剂，例如糖皮质激素(例如地塞米松)、细胞抑制剂(例如甲氨喋呤)、抗体(例如莫罗单抗(Muromonab)-CD3)或抑免蛋白调节剂(例如环孢菌素或雷帕霉素)处理的细胞培养物。
在一些实施方案中，细胞生物制品组合物衍生自源细胞，例如哺乳动物细胞，其中哺乳动物细胞包含外源剂，例如治疗剂。
在一些实施方案中，细胞生物制品组合物衍生自源细胞，例如哺乳动物细胞，其中哺乳动物细胞为重组细胞。
在一些实施方案中，细胞生物制品衍生自哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞经遗传修饰以表达病毒免疫逃避蛋白(immunoevasins)，例如hCMV US2或US11。
在一些实施方案中，用聚合物，例如降低免疫原性和免疫介导的清除的生物相容性聚合物(例如PEG)来共价或非共价修饰细胞生物制品的表面，或衍生细胞生物制品的哺乳动物细胞的表面。
在一些实施方案中，用唾液酸，例如含有NK抑制性聚糖表位的包含唾液酸的糖聚合物来共价或非共价修饰细胞生物制品的表面，或衍生细胞生物制品的哺乳动物细胞的表面。
在一些实施方案中，用酶处理，例如用糖苷酶，例如α-N-乙酰半乳糖胺酶(α-N-acetylgalactosaminidase)处理细胞生物制品的表面，或衍生细胞生物制品的哺乳动物细胞的表面以去除ABO血型
在一些实施方案中，用酶处理细胞生物制品的表面，或衍生细胞生物制品的哺乳动物细胞的表面以产生与接受体的血型匹配的ABO血型，例如诱导与接受体的血型匹配的ABO血型的表达。
评估免疫原性的参数
在一些实施方案中，细胞生物制品组合物衍生自源细胞，例如哺乳动物细胞，其基本上没有免疫原性，或被修饰(例如使用本文所述的方法修饰)以降低免疫原性。源细胞和细胞生物制品组合物的免疫原性可通过本文所述的任何测定法来确定。
在一些实施方案中，相比于参考细胞，例如在其他方面与源细胞相似的未修饰的细胞，细胞生物制品组合物的体内移植物存活率增加，例如增加1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大。在一些实施方案中，在适当动物模型，例如本文所述的动物模型中通过如本文所述的测量体内移植物存活的测定法来确定移植物存活。
在一些实施方案中，相比于参考细胞，例如在其他方面与源细胞相似的未修饰的细胞，细胞生物制品组合物的畸胎瘤形成增加，例如增加1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大。在一些实施方案中，在适当动物模型，例如本文所述的动物模型中通过如本文所述的测量畸胎瘤形成的测定法来确定畸胎瘤形成。
在一些实施方案中，相比于参考细胞，例如在其他方面与源细胞相似的未修饰的细胞，细胞生物制品组合物的畸胎瘤存活增加，例如增加1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大。在一些实施方案中，细胞生物制品组合物在畸胎瘤存活测定法中存活一或多天。在一些实施方案中，在适当动物模型，例如本文所述的动物模型中通过如本文所述的测量畸胎瘤存活的测定法来确定畸胎瘤存活。在一个实施方案中，如实施例中所述，通过固定组织(例如冷冻或福尔马林固定)的成像分析，例如IHC染色、荧光染色或H&E来测量畸胎瘤形成。在一些实施方案中，固定组织可以用以下抗体中的任何一种或全部来染色：抗人类CD3、抗人类CD4或抗人类CD8。
在一些实施方案中，相比于参考细胞，例如在其他方面与源细胞相似的未修饰的细胞，细胞生物制品组合物的向移植物或畸胎瘤中的CD8+T细胞浸润降低，例如降低1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大。在一个实施方案中，在适当动物模型，例如本文所述的动物模型中通过如本文所述的测量CD8+T细胞浸润的测定法，例如组织学分析来确定CD8 T细胞浸润。在一些实施方案中，衍生自细胞生物制品组合物的畸胎瘤在0％、0.1％、1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的组织学组织切片的50x像场中具有CD8+T细胞浸润。
在一些实施方案中，相比于参考细胞，例如在其他方面与源细胞相似的未修饰的细胞，细胞生物制品组合物的向移植物或畸胎瘤中的CD4+T细胞浸润降低，例如降低1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大。在一些实施方案中，在适当动物模型，例如本文所述的动物模型中通过如本文所述的测量CD4+T细胞浸润的测定法，例如组织学分析来确定CD4 T细胞浸润。在一些实施方案中，衍生自细胞生物制品组合物的畸胎瘤在0％、0.1％、1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的组织学组织切片的50x像场中具有CD4+T细胞浸润。
在一些实施方案中，相比于参考细胞，例如在其他方面与源细胞相似的未修饰的细胞，细胞生物制品组合物的向移植物或畸胎瘤中的CD3+NK细胞浸润降低，例如降低1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大。在一个实施方案中，在适当动物模型，例如本文所述的动物模型中通过如本文所述的测量CD3+NK细胞浸润的测定法，例如组织学分析来确定CD3+NK细胞浸润。在一些实施方案中，衍生自细胞生物制品组合物的畸胎瘤在0％、0.1％、1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的组织学组织切片的50x像场中具有CD3+NK T细胞浸润。
在一些实施方案中，相比于在将参考细胞，例如在其他方面与源细胞相似的未修饰的细胞一次或多次植入至适当动物模型，例如本文所述的动物模型中之后的体液反应，细胞生物制品组合物的免疫原性降低，如根据在将衍生的细胞生物制品一次或多次植入至适当动物模型，例如本文所述的动物模型中之后的体液反应的降低所测量。在一些实施方案中，通过抗细胞抗体滴度，例如抗细胞生物制品抗体滴度，例如通过ELISA来测量血清样品中的体液反应的降低。在一些实施方案中，相比于来自施用未修饰的细胞的动物的血清样品，来自施用细胞生物制品组合物的动物的血清样品的抗细胞抗体滴度降低1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大。在一些实施方案中，来自施用细胞生物制品组合物的动物的血清样品具有增加的抗细胞抗体滴度，例如与基线相比增加了1％、2％、5％、10％、20％、30％或40％，例如其中基线是指在施用细胞生物制品组合物之前来自相同动物的血清样品。
在一些实施方案中，相比于参考细胞，例如在其他方面与源细胞相似的未修饰的细胞，细胞生物制品组合物的巨噬细胞吞噬作用降低，例如巨噬细胞吞噬作用降低1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大，其中巨噬细胞吞噬作用的降低是通过体外测定吞噬作用指数来确定，例如如实施例66中所述。在一些实施方案中，当在巨噬细胞吞噬作用的体外测定法中与巨噬细胞一起温育时，细胞生物制品组合物具有0、1、10、100或更大的吞噬作用指数，例如通过实施例66的测定法所测量。
在一些实施方案中，相比于参考细胞，例如在其他方面与源细胞相似的未修饰的细胞或间充质干细胞，源细胞的细胞毒性介导的通过PBMC的细胞溶解降低，例如细胞溶解降低1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大，例如使用实施例67的测定法测定。在实施方案中，源细胞表达外源HLA-G。
在一些实施方案中，相比于参考细胞，例如在其他方面与源细胞相似的未修饰的细胞，细胞生物制品组合物的NK介导的细胞溶解降低，例如NK介导的细胞溶解降低1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大，其中通过铬释放测定法或铕释放测定法在体外测定法NK介导的细胞溶解。
在一些实施方案中，相比于参考细胞，例如在其他方面与源细胞相似的未修饰的细胞，细胞生物制品组合物的CD8+T细胞介导的细胞溶解降低，例如CD8 T细胞介导的细胞溶解降低1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大，其中通过铬释放测定法或铕释放测定法在体外测定CD8 T细胞介导的细胞溶解。在实施方案中，如实施例69中所述地测量活化和/或增殖。
在一些实施方案中，相比于参考细胞，例如在其他方面与源细胞相似的未修饰的细胞，细胞生物制品组合物的CD4+T细胞增殖和/或活化降低，例如降低1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大，其中在体外测定CD4 T细胞增殖(例如修饰或未修饰的哺乳动物源细胞，和CD4+T细胞与CD3/CD28戴诺珠粒(Dynabeads)的共培养测定法)，例如如实施例70中所述。
在一些实施方案中，相比于参考细胞，例如在其他方面与源细胞相似的未修饰的细胞，细胞生物制品组合物的T细胞IFN-γ分泌降低，例如T细胞IFN-γ分泌降低1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大，其中在体外测定T细胞IFN-γ分泌，例如通过IFN-γELISPOT。
在一些实施方案中，相比于参考细胞，例如在其他方面与源细胞相似的未修饰的细胞，细胞生物制品组合物的免疫原性细胞因子分泌降低，例如免疫原性细胞因子分泌降低1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大，其中使用ELISA或ELISPOT在体外测定免疫原性细胞因子分泌。
在一些实施方案中，相比于参考细胞，例如在其他方面与源细胞相似的未修饰的细胞，细胞生物制品组合物使得免疫抑制细胞因子的分泌增加，例如免疫抑制细胞因子的分泌增加1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大，其中使用ELISA或ELISPOT在体外测定免疫抑制细胞因子的分泌。
在一些实施方案中，相比于参考细胞，例如在其他方面与源细胞相似的未修饰的细胞，细胞生物制品组合物的HLA-G或HLA-E的表达增加，例如HLA-G或HLA-E的表达增加1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大，其中使用流式细胞术，例如FACS在体外测定HLA-G或HLA-E的表达。在一些实施方案中，细胞生物制品组合物衍生自源细胞，所述源细胞经修饰以具有增加的HLA-G或HLA-E的表达，例如相比于未修饰的细胞，例如HLA-G或HLA-E的表达增加1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大，其中使用流式细胞术，例如FACS在体外测定HLA-G或HLA-E的表达。在一些实施方案中，衍生自具有增加的HLA-G表达的修饰的细胞的细胞生物制品组合物在畸胎瘤形成测定法，例如如本文所述的畸胎瘤形成测定法中展现降低的免疫原性，例如根据降低的免疫细胞浸润所测量。
在一些实施方案中，相比于参考细胞，例如在其他方面与源细胞相似的未修饰的细胞，细胞生物制品组合物的T细胞抑制剂配体(例如CTLA4、PD1、PD-L1)的表达增加，例如T细胞抑制剂配体的表达增加1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大，其中使用流式细胞术，例如FACS在体外测定T细胞抑制剂配体的表达。
在一些实施方案中，相比于参考细胞，例如在其他方面与源细胞相似的未修饰的细胞，细胞生物制品组合物的共刺激配体的表达降低，例如共刺激配体的表达降低1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大，其中使用流式细胞术，例如FACS在体外测定共刺激配体的表达。
在一些实施方案中，相比于参考细胞，例如在其他方面与源细胞相似的未修饰的细胞或HeLa细胞，细胞生物制品组合物的MHC I类或MHC II类的表达降低，例如MHC I类或MHC II类的表达降低1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大，其中使用流式细胞术，例如FACS在体外测定MHC I类或II类的表达。
在一些实施方案中，细胞生物制品组合物衍生自基本上非免疫原性的细胞来源，例如哺乳动物细胞来源。在一些实施方案中，免疫原性可以被定量，例如如本文所述。在一些实施方案中，哺乳动物细胞来源包含以下特征中的任何一个、全部或组合：
a.其中源细胞是从自体细胞来源获得的；例如从将接受(例如施用)细胞生物制品组合物的接受体获得的细胞；
b.其中源细胞是从与接受体，例如将接受(例如施用)细胞生物制品组合物的本文所述的接受体具有匹配(例如相似)性别的同种异体细胞来源获得的；
c.其中源细胞是从HLA与接受体的HLA匹配(例如在一个或多个等位基因处)的同种异体细胞来源获得的；
d.其中源细胞是从作为HLA纯合子的同种异体细胞来源获得的；
e.其中源细胞是从缺乏(或与参考细胞相比水平降低)MHC I类和II类的同种异体细胞来源获得的；或
f.其中源细胞是从已知基本上非免疫原性的细胞来源，包括但不限于干细胞、间充质干细胞、诱导性多能干细胞、胚胎干细胞、塞特利氏细胞或视网膜色素上皮细胞获得的。
在一些实施方案中，待施用细胞生物制品组合物的受试者具有或已知具有与细胞生物制品反应的预先存在的抗体(例如IgG或IgM)，或关于所述抗体进行测试。在一些实施方案中，待施用细胞生物制品组合物的受试者不具有可检测水平的与细胞生物制品反应的预先存在的抗体。抗体的测试描述于例如实施例62中。
在一些实施方案中，已接受细胞生物制品组合物的受试者具有或已知具有与细胞生物制品反应的抗体(例如IgG或IgM)，或关于所述抗体进行测试。在一些实施方案中，已接受细胞生物制品组合物(例如至少一次、两次、三次、四次、五次或更多次)的受试者不具有可检测水平的与细胞生物制品反应的抗体。在实施方案中，抗体水平在两个时间点之间不升高超过1％、2％、5％、10％、20％或50％，第一时间点在第一次施用细胞生物制品之前，且第二时间点在一次或多次施用细胞生物制品之后。抗体的测试描述于例如实施例63中。
其他治疗剂
在一些实施方案中，向受试者，例如接受体，例如本文所述的接受体共同施用细胞生物制品组合物与其他试剂，例如治疗剂。在一些实施方案中，共同施用的治疗剂为免疫抑制剂，例如糖皮质激素(例如地塞米松)、细胞抑制剂(例如甲氨蝶呤)、抗体(例如莫罗单抗-CD3)或抑免蛋白调节剂(例如环孢菌素或雷帕霉素)。在实施方案中，免疫抑制剂降低免疫介导的细胞生物制品清除。在一些实施方案中，细胞生物制品组合物与免疫刺激剂，例如佐剂、白介素、细胞因子或趋化因子共同施用。
在一些实施方案中，在相同时间施用，例如同时施用细胞生物制品组合物和免疫抑制剂。在一些实施方案中，在施用免疫抑制剂之前施用细胞生物制品组合物。在一些实施方案中，在施用免疫抑制剂之后施用细胞生物制品组合物。
在一些实施方案中，免疫抑制剂为小分子，如布洛芬、对乙酰氨基酚、环孢灵(cyclosporine)、他克莫司、雷帕霉素、麦考酚酯、环磷酰胺、糖皮质激素、西罗莫司、硫唑嘌呤(azathriopine)或甲氨蝶呤。
在一些实施方案中，免疫抑制剂为抗体分子，包括但不限于：莫罗诺单抗(muronomab)(抗CD3)、达利珠单抗(Daclizumab)(抗IL12)、巴利昔单抗(Basiliximab)、英利昔单抗(Infliximab)(抗TNFa)或利妥昔单抗(rituximab)(抗CD20)。
在一些实施方案中，相比于单独施用细胞生物制品组合物，共同施用细胞生物制品组合物与免疫抑制剂使得细胞生物制品组合物在受试者中的持久性增强。在一些实施方案中，相比于单独施用时细胞生物制品组合物的持久性，共同施用的细胞生物制品组合物的持久性增强至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更久。在一些实施方案中，相比于单独施用时细胞生物制品组合物的持久性，共同施用的细胞生物制品组合物的持久性增强至少1、2、3、4、5、6、7、10、15、20、25或30天或更久。
递送
包含本文所述的细胞生物制品的组合物可以施用或靶向至循环系统、肝系统、肾系统、心肺系统、中枢神经系统、外周神经系统、肌肉骨胳系统、淋巴系统、免疫系统、感觉神经系统(视觉、听觉、嗅觉、触觉、味觉)、消化系统、内分泌系统(包括脂肪组织代谢调控)和生殖系统。
在实施方案中，将本文所述的细胞生物制品组合物离体递送至细胞或组织，例如人类细胞或组织。在一些实施方案中，将组合物递送至处于受伤状态(例如由于创伤、疾病、缺氧、缺血或其他损伤)的离体组织。
在一些实施方案中，将细胞生物制品组合物递送至离体移植物(例如组织外植体或用于移植的组织，例如人类静脉，肌肉骨胳移植物(如骨骼或肌腱)、角膜、皮肤、心脏瓣膜、神经；或分离或培养的器官，例如要向人类移植的器官，例如人类心脏、肝脏、肺脏、肾脏、胰脏、肠、胸腺、眼睛)。组合物改善移植物的活力、呼吸或其他功能。组合物可在移植之前、期间和/或之后递送至组织或器官。
在一些实施方案中，将本文所述的细胞生物制品组合物离体递送至衍生自受试者的细胞或组织。在一些实施方案中，向受试者重新施用细胞或组织(即，细胞或组织为自体的)。
细胞生物制品可以作用于来自任何哺乳动物(例如人类)组织，例如来自上皮、结缔组织、肌肉或神经组织或细胞，以及其组合的细胞。细胞生物制品可递送至任何真核(例如哺乳动物)器官系统，例如心血管系统(心脏、血管系统)；消化系统(食道、胃、肝脏、胆囊、胰脏、肠、结肠、直肠和肛门)；内分泌系统(下丘脑、脑下垂体、松果体或松果体腺体、甲状腺、甲状旁腺、肾上腺)；排泄系统(肾脏、输尿管、膀胱)；淋巴系统(淋巴、淋巴结、淋巴管、扁桃体、腺样体、胸腺、脾脏)；皮肤系统(皮肤、头发、指甲)；肌肉系统(例如骨骼肌)；神经系统(脑、脊髓、神经)；生殖系统(卵巢、子宫、乳腺、睾丸、输精管、精囊、前列腺)；呼吸系统(咽、喉、气管、支气管、肺、隔膜)；骨骼系统(骨骼、软骨)以及其组合。
在实施方案中，细胞生物制品在向受试者施用时靶向组织，例如肝脏、肺脏、心脏、脾脏、胰脏、胃肠道、肾脏、睾丸、卵巢、大脑、生殖器官、中枢神经系统、外周神经系统、骨骼肌、内皮、内耳、脂肪组织(例如棕色脂肪组织或白色脂肪组织)或眼，例如其中在24、48或72小时之后，施用的细胞生物制品群体中至少0.1％、0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的细胞生物制品存在于靶组织中，例如通过实施例71的测定法。
在实施方案中，细胞生物制品可以作用于来自干细胞或祖细胞来源的细胞，例如骨髓基质细胞、骨髓源性成年祖细胞(MAPC)、内皮祖细胞(EPC)、母细胞、在室管膜下区中形成的中间祖细胞、神经干细胞、肌肉干细胞、卫星细胞、肝干细胞、造血干细胞、骨髓基质细胞、表皮干细胞、胚胎干细胞、间充质干细胞、脐带干细胞、前体细胞、肌肉前体细胞、成肌细胞、心肌细胞、神经前体细胞、神经胶质前体细胞、神经元前体细胞、成肝细胞。
使用方法
本文所述的药物组合物的施用可通过口服、吸入、经皮或胃肠外(包括静脉内、瘤内、腹膜内、肌肉内、腔内和皮下)施用。细胞生物制品可单独施用或被配制为药物组合物。
细胞生物制品可以单位剂量组合物，如单位剂量经口、胃肠外、经皮或吸入组合物的形式施用。此类组合物是通过混合制备的，并且适合于经口、吸入、经皮或胃肠外施用，并且因此可呈片剂、胶囊、口服液体制剂、粉末、颗粒、口含剂、可重构散剂、可注射和可输注溶液或悬浮液或栓剂或气雾剂的形式。
在一些实施方案中，本文所述的细胞生物制品组合物的递送可诱导或阻断细胞分化、去分化或转分化。靶哺乳动物细胞可以是前体细胞。或者，靶哺乳动物细胞可以是分化细胞，并且细胞命运改变包括驱动去分化为多能前体细胞，或阻断此类去分化。在需要细胞命运改变的情况下，在使得诱导细胞命运改变的条件下将有效量的编码细胞命运诱导分子或信号的本文所述的细胞生物制品引入至靶细胞中。在一些实施方案中，本文所述的细胞生物制品适用于将细胞亚群从第一表型重编程为第二表型。此类重编程可以为临时或永久的。任选地，重编程诱导靶细胞采取中间表型。
还提供减少靶细胞群体中的细胞分化的方法。例如，在使得组合物减少前体细胞分化的条件下，使含有一种或多种前体细胞类型的靶细胞群体与本文所述的细胞生物制品组合物接触。在某些实施方案中，靶细胞群体含有哺乳动物受试者中的受损组织或受外科手术影响的组织。前体细胞为例如基质前体细胞、神经前体细胞或间充质前体细胞。
包含货物的本文所述的细胞生物制品组合物可以用于将此类货物递送至细胞组织或受试者。通过施用本文所述的细胞生物制品组合物来递送货物可修饰细胞蛋白表达水平。在某些实施方案中，施用的组合物引导一种或多种货物(例如多肽或mRNA)的上调(经由细胞中的表达、细胞中的递送或细胞内的诱导)，其提供在递送多肽的细胞中基本上不存在或降低的功能活性。例如，缺失的功能活性可在本质上为酶的、结构的或调控的。在相关实施方案中，施用的组合物引导一种或多种多肽的上调，其增加(例如协同地)在上调多肽的细胞中存在但基本上缺乏的功能活性。在某些实施方案中，施用的组合物引导一种或多种货物(例如多肽、siRNA或miRNA)的下调(经由细胞中的表达、细胞中的递送或细胞内的诱导)，其抑制在递送多肽、siRNA或miRNA的细胞中存在或上调的功能活性。例如，上调的功能活性可在本质上为酶的、结构的或调控的。在相关实施方案中，施用的组合物引导一种或多种多肽的下调，其降低(例如协同地)在下调多肽的细胞中存在或上调的功能活性。在某些实施方案中，施用的组合物引导某些功能活性的上调和其他功能活性的下调。
在实施方案中，细胞生物制品组合物(例如包含线粒体或DNA的细胞生物制品组合物)介导对靶细胞的作用，且所述作用持续至少1、2、3、4、5、6或7天、2、3或4周、或1、2、3、6或12个月。在一些实施方案中(例如其中细胞生物制品组合物包含外源蛋白质)，所述作用持续小于1、2、3、4、5、6或7天、2、3或4周、或1、2、3、6或12个月。
离体应用
在实施方案中，将本文所述的细胞生物制品组合物离体递送至细胞或组织，例如人类细胞或组织。在实施方案中，组合物改善离体细胞或组织的功能，例如改善细胞活力、呼吸或其他功能(例如本文所述的另一功能)。
在一些实施方案中，将组合物递送至处于损伤状态(例如由于创伤、疾病、缺氧、缺血或其他损伤)的离体组织。
在一些实施方案中，将组合物递送至离体移植物(例如组织外植体或用于移植的组织，例如人类静脉，肌肉骨胳移植物(如骨骼或肌腱)、角膜、皮肤、心脏瓣膜、神经；或分离或培养的器官，例如要向人类移植的器官，例如人类心脏、肝脏、肺脏、肾脏、胰脏、肠、胸腺、眼睛)。组合物可在移植之前、期间和/或之后递送至组织或器官。
在一些实施方案中，将组合物递送、施用或与细胞(例如细胞制剂)接触。细胞制剂可以为细胞疗法制剂(意图向人类受试者施用的细胞制剂)。在实施方案中，细胞制剂包含表达嵌合抗原受体(CAR)，例如表达重组CAR的细胞。表达CAR的细胞可以是例如T细胞、自然杀伤(NK)细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、调控T细胞。在实施方案中，细胞制剂为神经干细胞制剂。在实施方案中，细胞制剂为间充质干细胞(MSC)制剂。在实施方案中，细胞制剂为造血干细胞(HSC)制剂。在实施方案中，细胞制剂为胰岛细胞制剂。
体内使用
可以向受试者，例如哺乳动物，例如人类施用本文所述的细胞生物制品组合物。在此类实施方案中，受试者可处于特定疾病或病况(例如本文所述的疾病或病况)的风险下、可具有所述疾病或病况的症状或可诊断患有或鉴别为患有所述疾病或病况。
在一些实施方案中，细胞生物制品来源来自施用细胞生物制品组合物的相同受试者。在其他实施方案中，它们为不同的。例如，细胞生物制品和接受体组织的来源可以为自体的(来自相同受试者)或异源的(来自不同受试者)。在任一情况下，本文所述的细胞生物制品组合物的供体组织可以为与接受体组织不同的组织类型。例如，供体组织可以为肌肉组织且接受体组织可以为结缔组织(例如脂肪组织)。在其他实施方案中，供体组织和接受体组织可以为相同或不同类型，但来自不同器官系统。
本文所述的细胞生物制品组合物可以向患有癌症、自身免疫性疾病、感染性疾病、代谢疾病、神经变性性疾病或遗传性疾病(例如酶缺乏)的受试者施用。在一些实施方案中，受试者需要再生。
在一些实施方案中，细胞生物制品与抑制膜融合的蛋白质的抑制剂共同施用。例如，Suppressyn为抑制细胞-细胞融合的人类蛋白质(Sugimoto et al.,“A novel humanendogenous retroviral protein inhibits cell-cell fusion”Scientific Reports 3:1462DOI:10.1038/srep01462)。因此，在一些实施方案中，细胞生物制品与sypressyn的抑制剂，例如siRNA或抑制抗体共同施用。
非人类应用
本文所述的组合物还可以用于类似地调控包括但不限于以下的多种其他生物体的细胞或组织功能或生理学：农场或役用动物(马、牛、猪、鸡等)、宠物或动物园动物(猫、狗、蜥蜴、鸟类、狮、虎和熊等)、水产养殖动物(鱼、蟹、虾、牡蛎等)、植物物种(树、农作物、观赏花卉等)、发酵物种(酵母等)。本文所述的细胞生物制品组合物可以从此类非人类来源制备且向非人类靶细胞或组织或受试者施用。
细胞生物制品组合物对于靶标可以为自体的、同种异体的或异种的。
本文引用的所有参考文献和出版物均通过引用并入本文。
提供以下实施例以进一步说明本发明的一些实施方案，但并不打算限制本发明的范围；通过其示例性性质应了解，可替代地使用本领域技术人员已知的其他程序、方法或技术。
实施例
实施例1：通过囊泡形成和离心产生和分离细胞生物制品
此实施例描述通过囊泡化和离心来产生和分离细胞生物制品。这是可分离细胞生物制品的方法之一。
如下制备细胞生物制品。将大致4x106个HEK-293T细胞在10cm皿中接种于完全培养基(DMEM+10％FBS+Pen/Strep)中。在接种之后一天，将15μg转基因表达质粒或病毒递送至细胞。在转基因表达的足够时段之后，将培养基用补充有100μM ATP的新鲜培养基小心地替换。在转基因表达之后48-72小时收获上清液，通过过滤通过0.45μm过滤器澄清，且在150,000×g下超速离心1小时。将粒化的材料重悬于冰冷的PBS中过夜。将细胞生物制品重悬于所需的缓冲液中以进行实验。
参见例如Mangeot et al.,Molecular Therapy,vol.19no.9,1656–1666,Sept.2011。
实施例2：生成和分离巨质膜细胞生物制品
此实施例描述通过囊泡化和离心来产生和分离细胞生物制品。这是可分离细胞生物制品的方法之一。如下制备细胞生物制品。
简单来说，将任选地表达转基因的HeLa细胞在缓冲液(10mM HEPES、150mM NaCl、2mM CaCl2，pH 7.4)中洗涤两次，重悬于溶液(1mM DTT、12.5mM三聚甲醛和1mM N-乙基马来酰亚胺于GPMV缓冲液中)中，且在37℃下温育1小时。通过首先在100×g下离心10分钟来去除细胞，且接着在4℃下在20,000×g下收获细胞生物制品1小时而使细胞生物制品从细胞澄清。将细胞生物制品重悬于所需的缓冲液中以进行实验。
参见例如Sezgin E et al.Elucidating membrane structure and proteinbehavior using giant membrane plasma vesicles.Nat.Protocols.7(6):1042-512012。
实施例3：生成和分离细胞生物制品影
此实施例描述通过低渗处理和离心来产生和分离细胞生物制品。这是可产生细胞生物制品的方法之一。
首先，主要通过使用低渗处理将细胞生物制品从间充质干细胞(109个细胞)分离，使得细胞破裂且形成细胞生物制品。根据特定实施方案，细胞重悬于低渗溶液Tris-镁缓冲液(TM，例如在4℃下为pH 7.4或pH 8.6，用HCl进行pH调控)中。通过相差显微术来监测细胞溶胀。一旦细胞溶胀且形成细胞生物制品，将悬浮液置于均质机中。通常，约95％细胞破裂为足够的，如通过细胞计数和标准AOPI染色所测量。接着将膜/细胞生物制品置于蔗糖(0.25M或更高)中进行保存。或者，细胞生物制品可由本领域中已知溶解细胞的其他方法形成，如轻度超声处理(Arkhiv anatomii,gistologii i embriologii；1979,Aug,77(8)5-13；PMID:496657)、冻融(Nature.1999,Dec 2；402(6761):551-5；PMID:10591218)、弗氏压碎(French-press)(Methods in Enzymology,Volume 541,2014,Pages 169-176；PMID:24423265)、针传代或在含去污剂的溶液中增溶。
为了避免粘附，将细胞生物制品置于塑料管中且离心。产生层压的团粒，其中最顶部的浅灰色薄层包括大多细胞生物制品。但是，整个团粒被加工以增加产率。可重复离心(例如在4℃下以3,000rpm持续15分钟)和洗涤(例如20体积的Tris镁/TM-蔗糖pH 7.4)。
在下一步中，通过以不连续的蔗糖密度梯度浮选来分离细胞生物制品级分。洗涤的团粒残留少量过剩的上清液，所述团粒现在包括细胞生物制品、核和不完全破裂的全细胞。向悬浮液添加另外的含60％w/w蔗糖的TM，pH8.6，以在折射计上得到45％蔗糖的读数。在此步骤之后，所有溶液均为TM pH8.6。将15ml悬浮液置于SW-25.2硝酸纤维素管中且通过分别添加40％和35％w/w蔗糖的15ml层，且接着添加5ml TM-蔗糖(0.25M)而在悬浮液上形成不连续梯度。接着将样品在4℃下以20,000rpm离心10分钟。核沉淀物形成团粒，在40％-45％界面收集不完全破裂的全细胞，且在35％-40％界面收集细胞生物制品。收集且合并来自多个管的细胞生物制品。
参见例如国际专利公开案WO2011024172A2。
实施例4：通过挤压产生细胞生物制品
此实施例描述通过挤压穿过膜制备细胞生物制品。
简单来说，造血干细胞在37℃悬浮液中，在含有蛋白酶抑制剂混合液(Set V，Calbiochem 539137-1ML)的无血清培养基中的密度为1×106个细胞/毫升。用鲁尔锁注射器吸出细胞且一次穿过一次性的5mm针筒过滤器进入清洁的管中。如果膜结垢且变得堵塞，则将其放在一边且附接新的过滤器。在整个细胞悬浮液穿过过滤器之后，使5mL无血清培养基穿过用于所述过程的所有过滤器，以洗涤通过过滤器的任何残留物质。溶液接着与挤压的细胞生物制品在滤液中组合。
细胞生物制品可通过遵循相同方法以介于5mm至0.2mm范围内的越来越小的过滤器孔隙大小继续挤压而使大小进一步减小。当完成最终挤压时，悬浮液通过离心(所需的时间和速度因大小而异)粒化且重悬于培养基中。
另外，此过程可以使用肌动蛋白细胞骨架抑制剂来补充，以减少现有细胞骨架结构对挤压的影响。简单来说，将1×106个细胞/毫升悬浮液在具有500nM Latrunculin B(ab144291，Abcam,Cambridge,MA)的无血清培养基中温育且在37℃下在5％CO2存在下温育30分钟。在温育之后，添加蛋白酶抑制剂混合液且将细胞抽吸至鲁尔锁注射器中，如先前所述地进行挤压。
将细胞生物制品粒化且在PBS中洗涤一次以去除细胞骨架抑制剂，随后重悬于培养基中。
实施例5：分离从细胞自由释放的细胞生物制品微囊泡
此实施例描述通过离心分离细胞生物制品。这是可分离细胞生物制品的方法之一。
通过差速离心从细胞分离细胞生物制品。首先通过在>100,000×g下超速离心1小时来使培养基(DMEM+10％胎牛血清)澄清不含小粒子。澄清的培养基接着用于生长小鼠胚胎成纤维细胞。通过以200×g离心10分钟而使细胞与培养基分离。收集上清液且依序以500×g离心10分钟两次、以2,000×g离心15分钟一次、以10,000×g离心30分钟一次以及以70,000×g离心60分钟一次。在最终离心步骤期间将自由释放的细胞生物制品粒化、重悬于PBS中且以70,000×g再粒化。将最终团粒重悬于PBS中。
另外参见Wubbolts R et al.Proteomic and Biochemical Analyses of HumanB Cell-derived Exosomes:Potential Implications for their Function andMultivesicular Body Formation.J.Biol.Chem.278:10963-10972 2003。
实施例6：源细胞的物理去核以产生细胞生物制品
此实施例描述通过细胞骨架失活和离心来进行去核以产生细胞生物制品。这是可以修饰细胞生物制品的方法之一。
从哺乳动物原代或永生化细胞系分离细胞生物制品。通过用肌动蛋白骨架抑制剂处理和超速离心来使细胞去核。简单来说，收集C2C12细胞、粒化且重悬于含有12.5％Ficoll 400(F2637，Sigma,St.Louis MO)和500nM Latrunculin B(ab144291，Abcam,Cambridge,MA)的DMEM中且在37℃+5％CO2下温育30分钟。将悬浮液小心地层铺到含有增加浓度的DMEM于Ficoll400中的溶液(15％、16％、17％、18％、19％、20％，每层3mL)的超速离心管中，所述溶液已在5％CO2存在下在37℃下平衡过夜。将Ficoll梯度液在37C下在Ti-70转子(Beckman-Coulter,Brea,CA)中以32,300RPM旋转60分钟。在超速离心之后，将发现于16-18％的Ficoll的细胞生物制品去除，用DMEM洗涤且重悬于DMEM中。
进行如实施例23中所述的用Hoechst 33342的用于核含量的染色，接着使用流式细胞术和/或成像以确认核的射出。
实施例7：通过照射修饰细胞生物制品
以下实施例描述用γ照射修饰细胞生物制品。不受理论束缚，γ照射可引起DNA中的双链断裂且驱动细胞经历凋亡。
首先，在汇合密度以下在组织培养瓶或板上的单层中培养源细胞(例如通过培养或涂铺细胞)。接着从汇合瓶中去除培养基，用不含Ca2+和Mg2+的HBSS冲洗细胞，且用胰蛋白酶处理以从培养基质去除细胞。接着将细胞团粒重悬于10ml不含青霉素/链霉素的组织培养基中且转移至100mm培养皿(Petri dish)中。团粒中的细胞数应等于将获自150cm2烧瓶上的10-15个汇合MEF培养物的细胞数。细胞接着暴露于来自γ辐射源的4000拉德以产生细胞生物制品。接着洗涤细胞生物制品且重悬于待使用的最终缓冲液或培养基中。
实施例8：通过化学处理来修饰细胞生物制品
以下实施例描述用丝裂霉素C处理来修饰细胞生物制品。不受任何具体理论束缚，丝裂霉素C处理通过失活细胞周期来修饰细胞生物制品。
首先，在汇合密度下从组织培养瓶或板中的单层培养细胞(例如通过培养或涂铺细胞)。将1mg/ml丝裂霉素C储备溶液添加至培养基以达到10μg/ml的最终浓度。接着将板放回到温育箱中2至3小时。接着从汇合瓶中去除培养基，用不含Ca2+和Mg2+的HBSS冲洗细胞，且用胰蛋白酶处理以从培养基质去除细胞。接着洗涤细胞且重悬于待使用的最终缓冲液或培养基中。
参见例如Mouse Embryo Fibroblast(MEF)Feeder Cell Preparation,CurrentProtocols in Molecular Biology.David A.Conner 2001。
实施例9：细胞生物制品中缺乏转录活性
此实施例定量相比于用于细胞生物制品产生的亲本细胞(例如源细胞)，细胞生物制品中的转录活性。在一个实施方案中，相比于亲本细胞(例如源细胞)，细胞生物制品中的转录活性将为较低或不存在的。
细胞生物制品为递送治疗剂的基础。可以高效率递送至细胞或局部组织环境的治疗剂(如miRNA、mRNA、蛋白质和/或细胞器)可以用于调控在接受体组织中通常不活跃或在病理性低或高水平下活跃的途径。在一个实施方案中，细胞生物制品不能转录，或细胞生物制品的转录活性小于其亲本细胞的观察结果将证实已充分发生了核物质的去除。
通过先前实施例中所述的任一种方法来制备细胞生物制品。接着在37℃和5％CO2下持续1小时将足够数量的细胞生物制品和用于产生细胞生物制品的亲本细胞在6孔低附着多孔板中涂铺至含有20％胎牛血清、1×青霉素/链霉素和可荧光标记的炔烃-核苷EU的DMEM中。对于阴性对照，也将足够数量的细胞生物制品和亲本细胞在多孔板中涂铺于含有20％胎牛血清、1×青霉素/链霉素但不具有炔烃-核苷EU的DMEM中。
在1小时温育之后，遵循制造商的成像试剂盒(ThermoFisher Scientific)说明书对样品进行处理。将包括阴性对照的细胞和细胞生物制品样品用1×PBS缓冲液洗涤三次且重悬于1×PBS缓冲液中且通过流式细胞仪(Becton Dickinson,San Jose,CA,USA)，使用488nm氩气激光激发，和530+/-30nm发射进行分析。BD FACSDiva软件用于采集和分析。将光散射通道设定为线性增益，且将荧光通道设定为对数标度，在每种条件下分析最少10,000个细胞。
在一个实施方案中，由于省略了炔烃-核苷EU，阴性对照中如根据530+/-30nm发射所测量的转录活性将为空。在一些实施方案中，相比于亲本细胞，细胞生物制品的转录活性将为小于约70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、5％、4％、3％、2％、1％或更小。
另外参见Proc Natl Acad Sci U S A,2008,Oct 14；105(41):15779-84.doi:10.1073/pnas.0808480105.Epub 2008Oct 7。
实施例10：细胞生物制品中缺乏DNA复制或复制活性
此实施例定量细胞生物制品中的DNA复制。在一个实施方案中，相比于细胞，细胞生物制品将以低速率复制DNA。
通过先前实施例中所述的任一种方法来制备细胞生物制品。通过并入可荧光标记的核苷酸(ThermoFisher Scientific#C10632)来评估细胞生物制品和亲本细胞DNA复制活性。在用二甲亚砜制备EdU储备溶液之后，将细胞生物制品和相等数目的细胞与EdU以10μM的最终浓度一起温育2小时。样品接着使用3.7％PFA固定15分钟，用1×PBS缓冲液，pH 7.4洗涤且在0.5％去污剂于1×PBS缓冲液，pH 7.4中的溶液中渗透15分钟。
在渗透之后，将悬浮于含有0.5％去污剂的PBS缓冲液中的细胞生物制品和细胞用1×PBS缓冲液，pH 7.4洗涤且在21℃下在反应混合液、1×PBS缓冲液、CuSO4(组分F)、叠氮化物-Fluor 488、1×反应缓冲液添加剂中温育30分钟。
用与上文相同地处理但在1×反应混合液中没有叠氮化物-Fluor488的样品制备了细胞生物制品和细胞DNA复制活性的阴性对照。
接着将细胞和细胞生物制品样品洗涤且重悬于1×PBS缓冲液中且通过流式细胞术分析。用FACS细胞仪(Becton Dickinson,San Jose,CA,USA)以488nm氩气激光激发进行流式细胞术，且收集530+/-30nm发射光谱。FACS分析软件用于采集和分析。将光散射通道设定为线性增益，且将荧光通道设定为对数标度，在每种条件下分析最少10,000个细胞。基于每个样品中叠氮化物-Fluor488的中值强度来计算相对DNA复制活性。在正向和侧向散射通道中捕获所有事件(或者，可应用门来仅选择细胞生物制品群体)。通过从细胞生物制品的中值荧光强度值减去对应阴性对照样品的中值荧光强度值来确定细胞生物制品的标准化荧光强度值。接着将细胞生物制品样品的标准化的相对DNA复制活性相对于对应有核细胞样品进行标准化，以产生DNA复制活性的定量测量值。
在一个实施方案中，细胞生物制品具有的DNA复制活性低于亲本细胞。
还参见Salic,2415-2420,doi:10.1073/pnas.0712168105。
实施例11：用核酸货物电穿孔以修饰细胞生物制品
此实施例描述用核酸货物对细胞生物制品进行电穿孔。
通过先前实施例中所述的任一种方法来制备细胞生物制品。将大致109个细胞生物制品和1μg核酸(例如RNA)在电穿孔缓冲液(1.15mM磷酸钾pH 7.2、25mM氯化钾、60％碘克沙醇w/v于水中)中混合。使用单一4mm比色管，使用电穿孔系统(BioRad,165-2081)对细胞生物制品进行电穿孔。将细胞生物制品和核酸在400V、125μF和∞欧姆下电穿孔，且将比色管立即转移至冰上。在电穿孔之后，将细胞生物制品用PBS洗涤，重悬于PBS中，且保持于冰上。
参见例如Kamerkar et al.,Exosomes facilitate therapeutic targeting ofoncogenic KRAS in pancreatic cancer,Nature,2017。
实施例12：用蛋白质货物电穿孔以修饰细胞生物制品
此实施例描述用蛋白质货物对细胞生物制品进行电穿孔。
通过先前实施例中所述的任一种方法来制备细胞生物制品。使用电穿孔转染系统(Thermo Fisher Scientific)将大致5×106个细胞生物制品用于电穿孔。为了形成预混液(master mix)，将24μg纯化的蛋白质货物添加至重悬缓冲液(提供于试剂盒中)。将混合物在室温下温育10分钟。同时，将细胞生物制品转移至无菌试管中且在500×g下离心5分钟。吸出上清液且将团粒重悬于1ml不含Ca2+和Mg2+的PBS中。接着将具有蛋白质货物的缓冲液用于重悬细胞生物制品的团粒。细胞生物制品悬浮液接着用于优化条件，其在脉冲电压、脉冲宽度和脉冲数方面不同。在电穿孔之后，将细胞生物制品用PBS洗涤，重悬于PBS中，且保持于冰上。
参见例如Liang et al.,Rapid and highly efficiency mammalian cellengineering via Cas9 protein transfection,Journal of Biotechnology 208:44-53,2015。
实施例13：化学处理细胞生物制品以用核酸货物修饰
此实施例描述通过化学处理将核酸货物加载至细胞生物制品中。
通过先前实施例中所述的任一种方法来制备细胞生物制品。通过在4C下以10,000g离心5分钟使大致106个细胞生物制品粒化。接着将粒化的细胞生物制品重悬于具有20μg DNA的TE缓冲液(10mM Tris-HCl(pH 8.0)，0.1mM EDTA)中。将细胞生物制品：DNA溶液用温和的去污剂处理以提高DNA在整个细胞生物制品膜中的渗透率(试剂B，Cosmo Bio Co.,LTD,目录号ISK-GN-001-EX)。将溶液再次离心且将团粒重悬于具有带正电的肽，如硫酸鱼精蛋白的缓冲液中，以增加载有DNA的细胞生物制品与靶接受体细胞之间的亲和力(试剂C，Cosmo Bio Co.,LTD,目录号ISK-GN-001-EX)。在DNA加载之后，将加载的细胞生物制品在使用之前保持于冰上。
另外参见Kaneda,Y.,et al.,New vector innovation for drug delivery:development of fusigenic non-viral particles.Curr.Drug Targets,2003。
实施例14：化学处理细胞生物制品以用蛋白质货物修饰
此实施例描述通过化学处理将蛋白质货物加载至细胞生物制品中。
通过先前实施例中所述的任一种方法来制备细胞生物制品。通过在4C下以10,000g离心5分钟使大致106个细胞生物制品粒化。接着将粒化的细胞生物制品重悬于具有带正电的肽，如硫酸鱼精蛋白的缓冲液中，以增加细胞生物制品与货物蛋白质之间的亲和力(试剂A，Cosmo Bio Co.,LTD,目录号ISK-GN-001-EX)。随后，将10μg货物蛋白质添加至细胞生物制品溶液，接着添加温和的去污剂以增加蛋白质在整个细胞生物制品膜中的渗透率(试剂B，Cosmo Bio Co.,LTD,目录号ISK-GN-001-EX)。将溶液再次离心且将团粒重悬于具有带正电的肽，如硫酸鱼精蛋白的缓冲液中，以增加加载有蛋白质的细胞生物制品与靶接受体细胞之间的亲和力(试剂C，Cosmo Bio Co.,LTD,目录号ISK-GN-001-EX)。在蛋白质加载之后，将加载的细胞生物制品在使用之前保持于冰上。
另外参见Yasouka,E.,et al.,Needleless intranasal administration ofHVJ-E containing allergen attenuates experimental allergicrhinitis.J.Mol.Med.,2007。
实施例5：转染细胞生物制品以用核酸货物修饰
此实施例描述将核酸货物转染至细胞生物制品中。通过先前实施例中所述的任一种方法来制备细胞生物制品。
5×106个细胞生物制品维持于Opti-Mem中。将0.5μg核酸与25μl Opti-MEM培养基混合，接着添加25μl含有2μl脂质转染试剂2000的Opti-MEM。将核酸、Opti-MEM和脂质转染试剂的混合物维持在室温下15分钟，接着添加至细胞生物制品。整个溶液通过轻轻地旋转板且在37C下温育6小时而混合。接着将细胞生物制品用PBS洗涤，重悬于PBS中且保持于冰上。
另外参见Liang et al.,Rapid and highly efficiency mammalian cellengineering via Cas9 protein transfection,Journal of Biotechnology 208:44-53,2015。
实施例16：转染细胞生物制品以用蛋白质货物修饰
此实施例描述将蛋白质货物转染至细胞生物制品中。
通过先前实施例中所述的任一种方法来制备细胞生物制品。5×106个细胞生物制品维持于Opti-Mem中。将0.5μg纯化蛋白与25μl Opti-MEM培养基混合，接着添加25μl含有2μl脂质转染试剂3000的Opti-MEM。将蛋白质、Opti-MEM和脂质转染试剂的混合物维持在室温下15分钟，接着添加至细胞生物制品。整个溶液通过轻轻地旋转板且在37C下温育6小时而混合。接着将细胞生物制品用PBS洗涤，重悬于PBS中且保持于冰上。
另外参见Liang et al.,Rapid and highly efficiency mammalian cellengineering via Cas9 protein transfection,Journal of Biotechnology 208:44-53,2015。
实施例17：具有脂质双层结构的细胞生物制品
此实施例描述细胞生物制品的组合物。在一个实施方案中，细胞生物制品组合物将包含在中心具有腔的脂质双层结构。
不希望受理论束缚，细胞生物制品的脂质双层结构促进与靶细胞的融合，且允许细胞生物制品加载不同的治疗剂。
使用先前实施例中所述的方法新制细胞生物制品。阳性对照为天然细胞系(HEK293)，且阴性对照为冷DPBS和膜破裂的HEK293细胞制剂，其已穿过36号针50次。
将样品在Eppendorf管中短暂离心，且小心地去除上清液。接着将预温热的固定液(2.5％戊二醛于0.05M二甲胂酸盐与0.1M NaCl的缓冲液，pH 7.5中；使用前保持于37℃下30分钟)添加至样品团粒且保持在室温下20分钟。在固定之后，将样品用PBS洗涤两次。将四氧化锇溶液添加至样品团粒且温育30分钟。在用PBS冲洗一次之后，添加30％、50％、70％和90％己烯二醇(hexylene glycol)且涡旋洗涤，每次15分钟。接着在涡旋下添加100％己烯二醇3次，每次10分钟。
将树脂与己烯二醇以1:2的比率组合，且接着添加至样品且在室温下温育2小时。在温育之后，将溶液用100％树脂替换且温育4-6小时。用新鲜的100％树脂再重复此步骤一次。接着将其用100％新鲜树脂替换，将水平调控为约1-2mm深度，且烘烤8-12小时。切开Eppendorf管且将与样品一起浇铸的环氧树脂片再烘烤16-24小时。接着将环氧树脂铸件切割成小块，记下具有细胞的一侧。使用市售的5分钟环氧树脂胶将小片粘合到块上以进行切片。透射电子显微镜(JOEL,USA)用于在80kV的电压下对样品成像。
在一个实施方案中，细胞生物制品将显示与阳性对照(HEK293细胞)类似的脂质双层结构，且在DPBS对照中未观察到明显的结构。在一个实施方案中，在破坏的细胞制剂中将不会观察到管腔结构。
实施例18：测量细胞生物制品的平均大小
此实施例描述细胞生物制品平均大小的测量。
通过先前实施例中所述的任一种方法来制备细胞生物制品。使用市售的系统(iZON Science)测量细胞生物制品以确定平均大小。将系统与软件(根据制造商的说明)和纳米孔一起使用，纳米孔被设计成分析40nm至10μm大小范围内的颗粒。将细胞生物制品和亲本细胞重悬于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中以达到0.01-0.1μg蛋白质/mL的最终浓度范围。如下表中所指示地调控其他仪器设置：
表6：细胞生物制品测量参数和设置
测量参数 设置
压力 6
纳米孔类型 NP300
校准样品 CPC400_6P
黄金标准分析 否
捕获助手 无
在分离后的2小时内分析所有细胞生物制品。在一个实施方案中，相比于亲本细胞，细胞生物制品的大小将在约1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大内。
实施例19：测量细胞生物制品的平均大小分布
此实施例描述测量细胞生物制品的大小分布。
通过先前实施例中所描述的任一种方法产生细胞生物制品，且使用如先前实施例中描述的市售系统进行测试以确定颗粒的平均大小。在一个实施方案中，将以大约中值为中心的10％、50％和90％的细胞生物制品的大小阈值相比于亲本细胞以评估细胞生物制品大小分布。
在一个实施方案中，细胞生物制品将在10％、50％或90％的样品内具有亲本细胞的大小分布变化性的小于约90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、5％或更小。
实施例20：细胞生物制品的平均体积
此实施例描述测量细胞生物制品的平均体积。不希望受理论束缚，改变细胞生物制品的大小(例如体积)可使其对于不同的货物加载、治疗设计或应用为通用的。
如先前实施例中所述地制备细胞生物制品。阳性对照为HEK293细胞或具有已知大小的聚苯乙烯珠粒。阴性对照为穿过36号针大致50次的HEK293细胞。
如先前实施例中所述的用透射电子显微镜分析用于确定细胞生物制品的大小。测量细胞生物制品的直径且接着计算体积。
在一个实施方案中，细胞生物制品将具有大致50nm或更大直径的平均大小。
实施例21：细胞生物制品的平均密度
通过如Théry et al.,Curr Protoc Cell Biol.2006Apr；Chapter 3:Unit 3.22中所述的连续蔗糖梯度离心测定法来测量细胞生物制品密度。如先前实施例中所述地获得细胞生物制品。
首先，制备蔗糖梯度。分别通过混合4ml HEPES/蔗糖储备溶液和1ml HEPES储备溶液或0.5ml HEPES/蔗糖储备溶液和4.5ml HEPES储备溶液来产生2M和0.25蔗糖溶液。将这两个部分装入关闭所有挡板的梯度仪中，2M蔗糖溶液在具有磁力搅拌棒的近端隔室中，且0.25M蔗糖溶液在远端隔室中。将梯度仪置于磁性搅拌板上，打开近端与远端隔室之间的挡板且开启磁性搅拌板。如下制备HEPES储备溶液：2.4g N-2-羟基乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸(HEPES；最终20mM)，300H2O，用10N NaOH将pH调控至7.4且最后用H2O将体积调控至500ml。如下制备HEPES/蔗糖储备溶液：2.4g羟基乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸(HEPES；最终20mM)，428g无蛋白酶的蔗糖(ICN；最终2.5M)，150ml H2O，用10N NaOH将pH调控至7.4且最后用H2O将体积调控至500ml。
将细胞生物制品重悬于2ml HEPES/蔗糖储备溶液中且倒入SW 41离心管的底部。将外管置于SW 41管中，恰好在2ml细胞生物制品上方。打开外挡板，且将连续的2M(底部)至0.25M(顶部)蔗糖梯度缓慢倒入细胞生物制品的顶部上。SW 41管在倒入梯度时降低，以使得管路始终略高于液体顶部。
所有具有梯度的管彼此平衡，或与具有相同重量的蔗糖溶液的其他管平衡。将梯度液在4℃下在制动器设置于低位的SW 41旋转铲斗转子中以210,000×g离心过夜(≥14小时)。
使用微量移液器从上到下收集十一份1ml级分且置于用于TLA-100.3转子的3ml管中。将样品放在一旁，且在96孔板的单独孔中将50μl的每一级分用于测量折射率。板用粘性箔覆盖以防止蒸发且在室温下储存不超过1小时。折射计用于测量10至20μl的来自96孔板中储存的材料的每一级分的折射率(因此测量蔗糖浓度和密度)。
在可以从Beckman网站下载的超速离心目录中可获得将折射率转换为g/ml的表格。
接着准备每一级分用于蛋白质含量分析。将2毫升20mM HEPES，pH 7.4添加至每个1ml梯度级分，且通过上下移液2至3次而混合。每个管的一侧标有永久性标志物，且将管置于TLA-100.3转子，标志物侧朝上。
将具有稀释的级分的3ml管在110,000×g，4℃下离心1小时。TLA-100.3转子容纳六个管，因此每个梯度进行两次离心，将其他管保持于4℃下直至其可离心。
从每个3ml管吸出上清液，在团粒顶部留一滴。团粒很可能不可见，但可以从管上的标志物推断出其位置。将不可见的团粒重悬且转移至微量离心管。将每个重悬的级分的一半用于通过双金鸡宁酸(bicinchoninic acid)测定法进行蛋白质含量分析，如另一实施例中所述。这提供跨细胞生物制品制剂的各个梯度级分的分布。此分布用于确定细胞生物制品的平均密度。将另外一半体积的级分储存于-80℃下且一旦蛋白质分析展现跨级分的细胞生物制品分布便用于其他目的(例如功能分析，或通过免疫分离进一步纯化)。
在一个实施方案中，使用此测定法，细胞生物制品的平均密度将为1.25g/ml+/-0.05标准差。在一个实施方案中，细胞生物制品的平均密度将在1-1.1、1.05-1.15、1.1-1.2、1.15-1.25、1.2-1.3或1.25-1.35范围内。在一个实施方案中，细胞生物制品的平均密度将小于1或大于1.35。
实施例22：测量细胞生物制品中的细胞器含量
此实施例描述检测细胞生物制品中的细胞器。
如本文所述地制备细胞生物制品。为了检测内质网(ER)和线粒体，将细胞生物制品或C2C12细胞用1μM ER染色剂(E34251，Thermo Fisher,Waltham,MA)和1μM线粒体染色剂(M22426，Thermo Fisher Waltham,MA)染色。为了检测溶酶体，将细胞生物制品或细胞用50nM溶酶体染色剂(L7526，Thermo Fisher,Waltham,MA)染色。
将染色的细胞生物制品在流式细胞仪(Thermo Fisher,Waltham,MA)上运行且根据下表测量每种染料的荧光强度。通过比较染色的细胞生物制品与未染色的细胞生物制品(阴性对照)和染色的细胞(阳性对照)的荧光强度来验证细胞器的存在。
在去核后5小时，内质网(图1)、线粒体(图2)和溶酶体(图3)的细胞生物制品染色呈阳性。
表7：细胞生物制品染色
染色剂 Attune激光/滤光片 激光波长 发射滤光片(nm)
Hoechst 33342 VL1 405 450/40
ER-Tracker Green BL1 488 530/30
MitoTracker Deep Red FM RL1 638 670/14
LysoTracker Green BL1 488 530/30
实施例23：测量细胞生物制品中的核含量
此实施例描述测量细胞生物制品中的核含量的一个实施方案。为了验证细胞生物制品不含核，将细胞生物制品用1μg·mL-1Hoechst 33342和1μM CalceinAM(C3100MP，Thermo Fisher,Waltham,MA)染色且将染色的细胞生物制品在Attune NXT流式细胞仪(Thermo Fisher,Waltham,MA)上运行以根据下表确定每种染料的荧光强度。在一个实施方案中，将通过比较染色的细胞生物制品与未染色的细胞生物制品和染色的细胞的平均荧光强度来验证存在胞质溶胶(CalceinAM)和不存在细胞核(Hoechst 33342)。
表8：流式细胞仪设置
染色剂 Attune激光/滤光片 激光波长 发射滤光片(nm)
Hoechst 33342 VL1 405 450/40
Calcein AM BL1 488 530/30
实施例24：测量细胞生物制品中的核包膜含量
此实施例描述测量去核的细胞生物制品中的核包膜含量。核包膜从细胞的细胞质分离DNA。
在一个实施方案中，纯化的细胞生物制品组合物包含已如本文所述去核的哺乳动物细胞，如HEK-293Ts(293[HEK-293](
Figure BDA0002607347370001071
CRL-1573TM)。此实施例描述不同核膜蛋白的定量，作为测量在细胞生物制品产生之后剩余的完整核膜的量的代替。
在此实施例中，将10×106个HEK-293Ts和等量的由10×106个HEK-293Ts制备的细胞生物制品用3.7％PFA固定15分钟，用1×PBS缓冲液，pH 7.4洗涤且同时渗透，且接着使用含有1％牛血清白蛋白和0.5％
Figure BDA0002607347370001072
X-100的1×PBS缓冲液，pH 7.4阻断15分钟。在渗透之后，将细胞生物制品和细胞与不同的一级抗体，例如(抗RanGAP1抗体[EPR3295](Abcam-ab92360)、抗NUP98抗体[EPR6678]-核孔标志物(Abcam-ab124980)、抗核孔复合物蛋白抗体[Mab414]-(Abcam-ab24609)、抗输入蛋白7抗体(Abcam-ab213670)一起在4℃下温育12小时，所述一级抗体以制造商建议的浓度在含有1％牛血清白蛋白和0.5％
Figure BDA0002607347370001073
X-100的1×PBS缓冲液，pH 7.4中稀释。接着将细胞生物制品和细胞用1×PBS缓冲液，pH 7.4洗涤，且与适当的荧光二级抗体一起在21℃下温育2小时，所述二级抗体检测先前指定的一级抗体，以制造商建议的浓度在含有1％牛血清白蛋白和0.5％去污剂的1×PBS缓冲液，pH 7.4中稀释。接着将细胞生物制品和细胞用1×PBS缓冲液洗涤，重悬于300μL含有1μg/mlHoechst33342的1×PBS缓冲液，pH 7.4中，通过20μm FACS管过滤且通过流式细胞术分析。
阴性对照使用相同染色程序产生，但不添加一级抗体。在FACS细胞仪(BectonDickinson,San Jose,CA,USA)上以488nm氩气激光激发进行流式细胞术，且收集530+/-30nm发射光谱。FACS采集软件用于采集和分析。将光散射通道设定为线性增益，且将荧光通道设定为对数标度，在每种条件下分析最少10,000个细胞。相对完整的核膜含量是基于每个样品中荧光的中值强度计算所得的。在正向和侧向散射通道中捕获所有事件。
通过从细胞生物制品的中值荧光强度值减去对应阴性对照样品的中值荧光强度值来确定细胞生物制品的标准化荧光强度值。接着将细胞生物制品样品的标准化荧光相对于对应有核细胞样品进行标准化，以产生完整核膜含量的定量测量值。
在一个实施方案中，相比于有核的亲本细胞，去核的细胞生物制品将包含小于1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％荧光强度或核包膜含量。
实施例25：测量细胞生物制品中染色质水平
此实施例描述测量去核的细胞生物制品中的染色质。
DNA可浓缩成染色质以使其在细胞核内适合。在一个实施方案中，通过本文所描述的任一种方法产生的纯化的细胞生物制品组合物将包含低水平的染色质。
使用ELISA以特异性针对组蛋白H3或组蛋白H4的抗体测定通过先前描述的任一种方法制备的去核的细胞生物制品和阳性对照细胞(例如亲本细胞)的染色质含量。组蛋白为染色质的主要蛋白质组分，且H3和H4为主要的组蛋白。
使用商业试剂盒(例如Abcam组蛋白提取试剂盒(ab113476))或本领域已知的其他方法从细胞生物制品制剂和细胞制剂提取组蛋白。将这些等分试样储存在-80C下直至使用。通过在测定法缓冲液的溶液中将纯化的组蛋白(H3或H4)稀释为1至50ng/μl来制备标准连续稀释液。测定法缓冲液可源自由制造商供应的试剂盒(例如Abcam组蛋白H4总定量试剂盒(ab156909)或Abcam组蛋白H3总定量试剂盒(ab115091))。将测定法缓冲液添加至用抗组蛋白H3或抗H4抗体涂布的48或96孔板的每个孔，且将样品或标准对照添加至孔以使每个孔的总体积达到50μl。接着将板覆盖且在37℃下温育90至120分钟。
在温育之后，准备结合至与板连接的抗组蛋白抗体的任何组蛋白用于检测。吸出上清液且将板用150μl洗涤缓冲液洗涤。接着将包括抗组蛋白H3或抗H4捕获抗体的捕获缓冲液以50μl的体积和1μg/mL的浓度添加至板。接着将板在室温下在定轨振荡器上温育60分钟。
随后，将板吸出且使用洗涤缓冲液洗涤6次。接着将可被捕获抗体活化的信号报告分子添加至每个孔。将板覆盖且在室温下温育30分钟。接着将板吸出且使用洗涤缓冲液洗涤4次。通过添加终止溶液来终止反应。读取板中的每个孔在450nm处的吸光度，且根据450nm处的吸光度相对于标准样品中组蛋白的浓度的标准曲线计算每个样品中组蛋白的浓度。
在一个实施方案中，细胞生物制品样品将包含有核的亲本细胞的组蛋白浓度的小于1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。
实施例26：测量细胞生物制品中的DNA含量
此实施例描述相对于有核对应物的细胞生物制品中的DNA量的定量。在一个实施方案中，细胞生物制品将具有比有核对应物少的DNA。通过测量总DNA或特定管家基因的水平来确定核酸水平。在一个实施方案中，具有减少的DNA含量或基本上缺少DNA的细胞生物制品将不能复制、分化或转录基因，确保当向受试者施用时其剂量和功能不改变。
通过先前实施例中所述的任一种方法来制备细胞生物制品。如根据细胞生物制品和源细胞的蛋白质所测量的相同质量的制剂用于分离总DNA(例如使用试剂盒，如QiagenDNeasy目录号69504)，接着使用标准光谱法测定DNA浓度，以评估DNA的吸光度(例如使用Thermo Scientific NanoDrop)。
在一个实施方案中，去核的细胞生物制品中的DNA的浓度将为亲本细胞中的小于约50％、40％、30％、20％、10％、5％、4％、3％、2％、1％或更小。
或者，可使用半定量实时PCR(RT-PCR)在有核细胞与细胞生物制品之间比较特定管家基因(如GAPDH)的浓度。从亲本细胞和细胞生物制品分离总DNA且如本文所述地测量DNA浓度。使用以下反应模板用PCR试剂盒(Applied Biosystems，目录号4309155)进行RT-PCR：
SYBR Green Master Mix：10μL
0.45μM正向引物：1μL
0.45μM反向引物：1μL
DNA模板：10ng
PCR级水：可变
正向和反向引物获自Integrated DNA Technologies。下表详述引物对和其相关序列：
表9：引物序列
Figure BDA0002607347370001101
实时PCR系统(Applied Biosystems)用于通过以下方案进行扩增和检测：
变性，94℃2分钟
以下顺序的40个循环：
变性，94℃15秒
结合，延伸，60℃1分钟
用GAPDH DNA的连续稀释液制备Ct相对于DNA浓度的标准曲线且用于将来自细胞生物制品PCR结果的Ct核值相对于DNA的特定量(ng)标准化。
在一个实施方案中，去核的细胞生物制品中的GAPDH DNA的浓度将为亲本细胞中的小于约50％、40％、30％、20％、10％、5％、4％、3％、2％、1％或更小。
实施例27：测量细胞生物制品中的miRNA含量
此实施例描述细胞生物制品中的微RNA(miRNA)的定量。在一个实施方案中，细胞生物制品包含miRNA。
miRNA为控制信使RNA(mRNA)翻译成蛋白质的速率(以及其他活动)的调控元件。在一个实施方案中，携带miRNA的细胞生物制品可以用于将miRNA递送至靶位点。
通过先前实施例中所述的任一种方法来制备细胞生物制品。如先前所述地制备来自细胞生物制品或亲本细胞的RNA。至少一个miRNA基因选自www.sanger.ac.uk/Software/Rfam/mirna/index.shtml处的Sanger Center miRNA Registry。如Chen et al,NucleicAcids Research,33(20),2005中所述地制备miRNA。通过Thermo Fisher(A25576，Waltham,MA)可获得所有TaqMan miRNA测定法。
根据制造商的说明书对miRNA cDNA进行qPCR，且使用实时PCR系统如本文所述地产生和分析CT值。
在一个实施方案中，细胞生物制品的miRNA含量将为其亲本细胞的至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大。
实施例28：定量细胞生物制品中的内源RNA或合成RNA的表达
此实施例描述定量具有改变的表达的内源RNA或在细胞生物制品中表达的合成RNA的水平。
细胞生物制品或亲本细胞被工程化以改变介导对细胞生物制品的细胞功能的内源或合成RNA的表达。
转座酶载体(System Biosciences,Inc.)包括嘌呤霉素抗性基因的开放阅读框架连同蛋白质试剂的克隆片段的开放阅读框架。使用电穿孔器(Amaxa)和293T细胞系特异性核转染试剂盒(Lonza)将载体电穿孔至293Ts中。
在含有20％胎牛血清和1×青霉素/链霉素的DMEM中用嘌呤霉素选择3-5天后，通过先前实施例中所描述的任一种方法由稳定表达的细胞系制备细胞生物制品。
如先前实施例中所述地分离个别的细胞生物制品且定量每个细胞生物制品的蛋白质试剂或RNA。
在一个实施方案中，细胞生物制品将具有每个细胞生物制品至少1、2、3、4、5、10、20、50、100、500、103、5.0×103、104、5.0×104、105、5.0×105、106、5.0×106或更多个RNA。
实施例29：测量细胞生物制品中的脂质组成
此实施例描述定量细胞生物制品的脂质组成。在一个实施方案中，细胞生物制品的脂质组成与衍生其的细胞类似。脂质组成影响细胞生物制品和细胞的重要生物物理参数，如大小、静电相互作用和胶体特性。
脂质测量是基于质谱法。通过先前实施例中所述的任一种方法来制备细胞生物制品。
如(Sampaio,et al.,Proc Natl Acad Sci,2011,Feb 1；108(5):1903–7)所述，在脂质分析服务机构(Dresden,Germany)进行基于质谱法的脂质分析。使用两步氯仿/甲醇程序提取脂质(Ejsing,et al.,Proc Natl Acad Sci,2009,Mar17；106(7):2136–41)。用以下的内部脂质标准混合物加标样品:心磷脂16:1/15:0/15:0/15:0(CL)、神经酰胺18:1；2/17:0(Cer)、二酰甘油17:0/17:0(DAG)、己糖基神经酰胺18:1；2/12:0(HexCer)、溶血磷脂酸酯17:0(LPA)、溶血磷脂酰胆碱12:0(LPC)、溶血磷脂酰乙醇胺17:1(LPE)、溶血磷脂酰甘油17:1(LPG)、溶血磷脂酰肌醇17:1(LPI)、溶血磷脂酰丝氨酸17:1(LPS)、磷脂酸酯17:0/17:0(PA)、磷脂酰胆碱17:0/17:0(PC)、磷脂酰乙醇胺17:0/17:0(PE)、磷脂酰甘油17:0/17:0(PG)、磷脂酰肌醇16:0/16:0(PI)、磷脂酰丝氨酸17:0/17:0(PS)、胆固醇酯20:0(CE)、鞘磷脂18:1；2/12:0；0(SM)和三酰甘油17:0/17:0/17:0(TAG)。
在提取之后，将有机相转移至输液板且在速度真空浓缩器中干燥。将第一步干提取物重悬于含7.5mM乙酸铵的氯仿/甲醇/丙醇(1:2:4，V:V:V)中且将第二步干提取物重悬于甲胺于氯仿/甲醇中的33％乙醇溶液(0.003:5:1；V:V:V)中。所有液体处理步骤均使用用于有机溶剂的机器人平台进行，所述平台具有用于移液的防液滴控制特征(HamiltonRobotics)。
在配备有离子源(Advion Biosciences)的质谱仪(Thermo Scientific)上通过直接输注来分析样品。在单次采集中，以正离子和负离子模式分析样品，其中MS的分辨率为Rm/z＝200＝280000且串联MS/MS实验的分辨率为Rm/z＝200＝17500。MS/MS由包含列表触发，所述列表涵盖以1Da增量扫描的对应MS质量范围(Surma,et al.,Eur J lipid SciTechnol,2015,Oct；117(10):1540–9)。将MS和MS/MS数据组合，以监测作为铵加合物的CE、DAG和TAG离子；作为乙酸盐加合物的PC、PC O-；和作为去质子化阴离子的CL、PA、PE、PE O-、PG、PI和PS。仅MS用于监测作为去质子化阴离子的LPA、LPE、LPE O-、LPI和LPS；作为乙酸盐的Cer、HexCer、SM、LPC和LPC O-。
用内部开发的脂质鉴别软件分析数据，如以下参考文献中所述(Herzog,et al.,Genome Biol,2011,Jan 19；12(1):R8；Herzog,et al.,PLoS One,2012,Jan；7(1):e29851)。仅将信噪比>5，且信号强度比对应空白样品中高5倍的脂质鉴别考虑用于进一步的数据分析。
将细胞生物制品脂质组成与亲本细胞的脂质组成相比。在一个实施方案中，如果亲本细胞中>50％的鉴别的脂质存在于细胞生物制品中，则细胞生物制品和亲本细胞将具有类似的脂质组成，且在那些鉴别的脂质中，细胞生物制品中的水平将为亲本细胞中的对应脂质水平的>25％。
实施例30：测量细胞生物制品中的蛋白质组学组成
此实施例描述定量细胞生物制品的蛋白质组成。在一个实施方案中，细胞生物制品的蛋白质组成将与衍生其的细胞类似。
通过先前实施例中所述的任一种方法来制备细胞生物制品。将细胞生物制品重悬于溶解缓冲液(7M脲、2M硫脲、4％(w/v)Chaps于50mM Tris中，pH8.0)中且在室温下在偶尔涡旋的情况下温育15分钟。接着通过在冰浴中超声处理5分钟将混合物溶解且以13,000RPM短暂离心5分钟。通过比色测定法(Pierce)确定蛋白质含量且将每个样品的蛋白质转移至新试管中且用50mM Tris pH 8平衡体积。
将蛋白质在65℃下用10mM DTT还原15分钟且在室温下在黑暗中用15mM碘乙酰胺烷基化30分钟。通过逐渐添加6体积的冷(-20℃)丙酮使蛋白质沉淀，且在-80℃下温育过夜。用冷(-20℃)甲醇洗涤蛋白质团粒3次。将蛋白质重悬于50mM Tris pH 8.3中。
随后，在消化的前4小时内在37℃下在搅拌下将胰蛋白酶/lysC添加至蛋白质。将样品用50mM Tris pH 8稀释，且将0.1％脱氧胆酸钠与更多胰蛋白酶/lysC一起添加以在37℃下在搅拌下消化过夜。停止消化且通过添加2％v/v甲酸来去除脱氧胆酸钠。将样品涡旋且通过以13,000RPM离心1分钟来清除。通过逆相固相萃取(SPE)来纯化肽且干燥。将样品在20μl的3％DMSO、0.2％甲酸的水溶液中复原且通过LC-MS分析。
为了进行定量测量，还在仪器上运行蛋白质标准品。将标准肽(Pierce，等摩尔，LC-MS级，#88342)稀释至4、8、20、40和100fmol/μl且通过LC-MS/MS进行分析。对于每种浓度，计算每种蛋白质的5个最佳肽(每个肽3个MS/MS过渡)的平均AUC(曲线下面积)以产生标准曲线。
用高分辨率质谱仪(ABSciex，Foster City,CA,USA)进行采集，所述质谱仪配备有具有25μm iD毛细管的电喷雾接口且与微超高效液相色谱仪(μUHPLC)(Eksigent,RedwoodCity,CA,USA)耦接。分析软件用于控制仪器以及进行数据处理和采集。将源电压设置为5.2kV且维持于225℃下，将气帘气设置为27psi，将气体一设置为12psi且将气体二设置为10psi。对于蛋白质数据库，以信息相关采集(IDA)模式进行采集，且对于样品，以SWATH采集模式进行采集。在维持于60℃下的0.3μm i.d.，2.7μm粒子，150mm长的逆相色谱柱(AdvanceMaterials Technology,Wilmington,DE)上进行分离。样品通过环路过满注入5μL环路中。对于120分钟(样品)LC梯度，移动相包括以下：流动速率为3μL/min的溶剂A(0.2％v/v甲酸和3％DMSO v/v于水中)和溶剂B(0.2％v/v甲酸和3％DMSO于EtOH中)。
对于蛋白质的绝对定量，使用每种蛋白质的5个最佳肽(每个肽3MS/MS离子)的AUC的总和产生标准曲线(5点，R2>0.99)。为了产生用于样品分析的数据库，对12个样品中的每一个运行DIAUmpire算法且与输出MGF文件合并到一个数据库中。此数据库与软件(ABSciex)一起使用，以使用5个过渡/肽和5个肽/蛋白质最大值定量每个样品中的蛋白质。如果计算的评分高于1.5或FDR<1％，则将肽视为被充分测量。将每个充分测量的肽的AUC的总和绘制于标准曲线上，且报告为fmol。
接着如下地分析所得蛋白质定量数据，以确定已知类别的蛋白质的蛋白质水平和比例：酶被鉴别为用酶委员会(EC)编号注释的蛋白质；ER相关蛋白被鉴别为具有ER而非线粒体的Gene Ontology(GO；http://www.geneontology.org)细胞区室分类的蛋白质；外来体相关蛋白被鉴别为具有外来体而非线粒体的Gene Ontology细胞区室分类的蛋白质；且线粒体蛋白被鉴别为在MitoCarta数据库中被鉴别为线粒体的蛋白质(Calvo等人,NAR2015l doi:10.1093/nar/gkv1003)。将这些类别中的每一个的摩尔比确定为每类中的所有蛋白质的摩尔量的总和除以每个样品中所有鉴别的蛋白质的摩尔量的总和。
将细胞生物制品蛋白质组学组成相比于亲本细胞蛋白质组学组成。在一个实施方案中，当>50％的鉴别的蛋白质存在于细胞生物制品中时，将观察到细胞生物制品与亲本细胞之间类似的蛋白质组学组成，且在那些鉴别的蛋白质中，水平为亲本细胞中的对应蛋白质水平的>25％。
实施例31：定量每细胞生物制品的内源或合成蛋白水平
此实施例描述定量细胞生物制品中的内源或合成蛋白货物。在一个实施方案中，细胞生物制品包含内源或合成蛋白货物。
细胞生物制品或亲本细胞被工程化，以改变内源蛋白的表达或表达介导治疗性或新颖细胞功能的合成货物。
转座酶载体(System Biosciences,Inc.)包括嘌呤霉素抗性基因的开放阅读框架连同蛋白质试剂的克隆片段的开放阅读框架，任选地翻译融合至绿色荧光蛋白(GFP)的开放阅读框架。使用电穿孔器(Amaxa)和293T细胞系特异性核转染试剂盒(Lonza)将载体电穿孔至293Ts中。
在含有20％胎牛血清和1×青霉素/链霉素的DMEM中用嘌呤霉素选择3-5天后，通过先前实施例中所描述的任一种方法由稳定表达的细胞系制备细胞生物制品。
如上文所述地根据质谱定量内源蛋白的改变的表达水平或未融合至GFP的合成蛋白的表达水平。在一个实施方案中，细胞生物制品将具有每个细胞生物制品至少1、2、3、4、5、10、20、50、100、500、103、5.0×103、104、5.0×104、105、5.0×105、106、5.0×106个或更多个蛋白质试剂分子。
或者，将纯化的GFP在含有20％胎牛血清和1×青霉素/链霉素的DMEM中连续稀释以产生蛋白质浓度的标准曲线。使用GFP光立方(469/35激发滤光片和525/39发射滤光片)在荧光计(BioTek)中测量标准曲线和细胞生物制品样品的GFP荧光，以计算细胞生物制品中的GFP分子的平均摩尔浓度。接着将摩尔浓度转换成GFP分子的数目除以每个样品的细胞生物制品的数目以获得每个细胞生物制品的蛋白质试剂分子的平均数目。
在一个实施方案中，细胞生物制品将具有每个细胞生物制品至少1、2、3、4、5、10、20、50、100、500、103、5.0×103、104、5.0×104、105、5.0×105、106、5.0×106个或更多个蛋白质试剂分子。
实施例32：测量细胞生物制品中的外来体蛋白的标志物
此测定法描述样品制剂的蛋白质组学组成的定量，且定量了已知是外来体的特异性标志物的蛋白质的比例。
根据标准生物样品处理程序，将细胞生物制品粒化且冷冻运送至蛋白质组学分析中心。
将细胞生物制品解冻以用于蛋白质提取和分析。首先，将其重悬于溶解缓冲液(7M脲、2M硫脲、4％(w/v)chaps于50mM Tris中，pH 8.0)中且在室温下在偶尔涡旋的情况下温育15分钟。接着通过在冰浴中超声处理5分钟将混合物溶解且以13,000RPM短暂离心5分钟。通过比色测定法(Pierce)测定总蛋白质含量且将来自每个样品的100μg蛋白质转移至新试管中且用50mM Tris pH8调控体积。
将蛋白质在65℃下用10mM DTT还原15分钟且在室温下在黑暗中用15mM碘乙酰胺烷基化30分钟。接着通过逐渐添加6体积的冷(-20℃)丙酮使蛋白质沉淀，且在-80℃下温育隔夜。
将蛋白质粒化，用冷(-20℃)甲醇洗涤3次，且重悬于50mM Tris pH 8中。在消化的前4小时内在37℃下在搅拌下将3.33μg胰蛋白酶/lysC添加至蛋白质。将样品用50mM TrispH 8稀释，且将0.1％脱氧胆酸钠与另外3.3μg胰蛋白酶/lysC一起添加以在37℃下在搅拌下消化过夜。停止消化且通过添加2％v/v甲酸来去除脱氧胆酸钠。将样品涡旋且通过以13,000RPM离心1分钟来清除。
通过逆相固相萃取(SPE)来纯化蛋白质且干燥。如先前所述，将样品在3％DMSO、0.2％甲酸的水溶液中复原且通过LC-MS进行分析。
分析所得的蛋白质定量数据，以确定已知外来体标志物蛋白质的蛋白质水平和比例。确切地说：四次穿膜蛋白家族蛋白质(例如CD63、CD9或CD81)、ESCRT相关蛋白(例如TSG101、CHMP4A-B或VPS4B)、Alix、TSG101、MHCI、MHCII、GP96、辅肌动蛋白-4、mitofilin、syntenin-1、TSG101、ADAM10、EHD4、syntenin-1、TSG101、EHD1、flotilin-1、热激70-kDa蛋白(HSC70/HSP73、HSP70/HSP72)。将这些外来体标志物蛋白质相对于所有测量的蛋白质的摩尔比确定为以上列出的每种特定外来体标志物蛋白质的摩尔量除以每个样品中所有鉴别的蛋白质的摩尔量的总和且表示为％。
类似地，将所有外来体标志物蛋白质相对于所有测量的蛋白质的摩尔比确定为以上列出的所有特定外来体标志物蛋白质的摩尔量的总和除以每个样品中所有鉴别的蛋白质的摩尔量的总和且表示为总数的％。
在一个实施方案中，使用此方法，样品将包含小于5％的任何单独的外来体标志物蛋白质和小于15％的总外来体标志物蛋白质。
在一个实施方案中，任何单独的外来体标志物蛋白质将以小于0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％或10％存在。
在一个实施方案中，所有外来体标志物蛋白质的总和将为小于0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％或25％。
实施例33：测量细胞生物制品中的GAPDH
此测定法描述定量细胞生物制品中的甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的水平，和与亲本细胞相比，细胞生物制品中的GAPDH的相对水平。
根据制造商的说明，使用用于GAPDH的标准市售ELISA(ab176642，Abcam)在亲本细胞和细胞生物制品中测量GAPDH。
以用于测量GAPDH的样品的相同体积，如先前所述地通过双金鸡宁酸测定法来类似地测量总蛋白质水平。在实施方案中，使用此测定法，细胞生物制品中的GAPDH/总蛋白质的的水平将为<100ng GAPDH/μg总蛋白质。类似地，从亲本细胞到细胞生物制品的GAPDH水平相对于总蛋白质的降低将为大于10％降低。
在一个实施方案中，以ng GAPDH/μg总蛋白质计的制剂中的GAPDH含量将为小于500、小于250、小于100、小于50、小于20、小于10、小于5或小于1。
在一个实施方案中，从亲本细胞到制剂的以ng/μg计的GAPDH/总蛋白质的降低将为大于1％、大于2.5％、大于5％、大于10％、大于15％、大于20％、大于30％、大于40％、大于50％、大于60％、大于70％、大于80％或大于90％。
实施例34：测量细胞生物制品中的钙联接蛋白
此测定法描述定量细胞生物制品中的钙联接蛋白(CNX)水平，和与亲本细胞相比，细胞生物制品中的CNX的相对水平。
根据制造商的说明，使用用于钙联接蛋白的标准市售ELISA(MBS721668，MyBioSource)在起始细胞和制剂中测量钙联接蛋白。
以用于测量钙联接蛋白的样品的相同体积，如先前所述地通过双金鸡宁酸测定法来类似地测量总蛋白质水平。在实施方案中，使用此测定法，细胞生物制品中的钙联接蛋白/总蛋白质的的水平将为<100ng钙联接蛋白/μg总蛋白质。类似地，在实施方案中，从亲本细胞到细胞生物制品的钙联接蛋白水平相对于总蛋白质的增加将为大于10％增加。
在一个实施方案中，以ng钙联接蛋白/μg总蛋白质计的制剂中的钙联接蛋白含量将为小于500、250、100、50、20、10、5或1。
在一个实施方案中，从亲本细胞到制剂的以ng/μg计的钙联接蛋白/总蛋白质的减少将为大于1％、2.5％、5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。
实施例35：比较细胞生物制品中可溶性与不溶性蛋白质质量
此实施例描述定量细胞生物制品中的可溶性：不溶性蛋白质质量比。在一个实施方案中，细胞生物制品中的可溶性：不溶性蛋白质质量比将与有核细胞类似。
通过先前实施例中所述的任一种方法来制备细胞生物制品。使用标准双金鸡宁酸测定法(BCA)(例如使用市售的PierceTMBCA蛋白质测定法试剂盒，Thermo Fischer产品编号23225)测试细胞生物制品制剂以确定可溶性：不溶性蛋白质的比。通过将制备的细胞生物制品或亲本细胞以1×10^7个细胞或细胞生物制品/mL的浓度悬浮于PBS中，且以1600g离心以将细胞生物制品或细胞制备团粒来制备可溶性蛋白质样品。以可溶蛋白质级分形式收集上清液。
通过剧烈移液且在具有2％Triton-X-100的PBS中涡旋来溶解团粒中的细胞生物制品或细胞。溶解的级分表示不溶性蛋白质级分。
使用供应的BSA，每孔0至20μg(一式三份)来产生标准曲线。细胞生物制品或细胞制剂被稀释，使得测量的量在标准范围内。一式三份地分析细胞生物制品制剂且使用平均值。将可溶性蛋白质浓度除以不溶性蛋白质浓度以得到可溶性：不溶性蛋白质比。
在一个实施方案中，相比于亲本细胞，细胞生物制品可溶性：不溶性蛋白质比将在1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大内。
实施例36：测量细胞生物制品中的LPS
此实施例描述定量与亲本细胞相比，细胞生物制品中的脂多糖(LPS)的水平。在一个实施方案中，细胞生物制品将具有相比于亲本细胞较低水平的LPS。
LPS是细菌膜的组分和先天免疫应答的强力诱导剂。
如先前实施例中所述，LPS测量是基于质谱。
在一个实施方案中，细胞生物制品的脂质含量的小于5％、1％、0.5％、0.01％、0.005％、0.0001％、0.00001％或更小将为LPS。
实施例37：细胞生物制品中的脂质与蛋白质的比率
此实施例描述定量细胞生物制品中的脂质质量与蛋白质质量的比率。在一个实施方案中，细胞生物制品将具有与有核细胞类似的脂质质量与蛋白质质量的比率。
总脂质含量计算为在先前实施例中概述的脂质组学数据集中鉴别的所有脂质的摩尔含量的总和。通过如本文所述的双金鸡宁酸测定法来测量细胞生物制品的总蛋白质含量。
或者，脂质与蛋白质的比率可被描述为特定脂质种类与特定蛋白质的比率。特定脂质种类选自先前实施例中产生的脂质组学数据。特定蛋白质选自先前实施例中产生的蛋白质组学数据。所选脂质种类和蛋白质的不同组合用于定义特定的脂质：蛋白质比率。
实施例38：细胞生物制品中的蛋白质与DNA的比率
此实施例描述定量细胞生物制品中的脂质质量与DNA质量的比率。在一个实施方案中，细胞生物制品将具有比细胞大得多的蛋白质质量与DNA质量的比率。
如先前实施例中所述地测量细胞生物制品和细胞的总蛋白质含量。如先前实施例中所述地测量细胞生物制品和细胞的DNA质量。接着通过将总蛋白质含量除以总DNA含量来确定蛋白质与总核酸的比率，以得到典型细胞生物制品制剂的在给定范围内的比率。
或者，通过使用半定量实时PCR(RT-PCR)将核酸水平定义为特定管家基因，如GAPDH的水平来确定蛋白质与核酸的比率。
接着通过将总蛋白质含量除以总GAPDH DNA含量来确定蛋白质与GAPDH核酸的比率，以定义典型细胞生物制品制剂的蛋白质：核酸比率的特定范围。
实施例39：细胞生物制品中的脂质与DNA的比率
此实施例描述定量与亲本细胞相比，细胞生物制品中的脂质与DNA的比率。在一个实施方案中，与亲本细胞相比，细胞生物制品将具有更大的脂质与DNA的比率。
此比率被定义为总脂质含量(在以上实施例中概述)或特定脂质种类。在特定脂质种类的情况下，范围取决于所选的特定脂质种类。特定脂质种类选自前述实施例中产生的脂质组学数据。如前述实施例中所述地测定核酸含量。
使用相对于核酸含量标准化的所选脂质种类的不同组合来定义特定细胞生物制品制剂的特征性的特定脂质：核酸比率。
实施例40：分析细胞生物制品上的表面标志物
此测定法描述鉴别细胞生物制品上的表面标志物。
根据标准生物样品处理程序，将细胞生物制品粒化且冷冻运送至蛋白质组学分析中心。
为了鉴别细胞生物制品上存在或不存在表面标志物，将其用针对磷脂酰丝氨酸和CD40配体的标志物染色且使用FACS系统(Becton Dickinson)通过流式细胞术分析。为了检测表面磷脂酰丝氨酸，用膜联蛋白V测定法(556547，BD Biosciences)如制造商所述地测定法产物。
简单来说，将细胞生物制品用冷PBS洗涤两次且接着以1×10^6个细胞生物制品/ml的浓度重悬于1×结合缓冲液中。将10％的重悬液转移至5ml培养管中且添加5μl FITC膜联蛋白V。将细胞轻轻地涡旋且在室温(25℃)下在黑暗中温育15分钟。
并行地，将单独的10％的重悬液转移至不同管中作为未染色的对照。将1×结合缓冲液添加至每个试管中。在1小时内通过流式细胞术分析样品。
在一些实施方案中，使用此测定法，染色的细胞生物制品群体的平均值将被确定为高于未染色的细胞的平均值，表明细胞生物制品包含磷脂酰丝氨酸。
类似地，对于CD40配体，根据制造商的说明将以下单克隆抗体添加至另外10％的洗涤的细胞生物制品：PE-CF594小鼠抗人类CD154克隆TRAP1(563589，BD Pharmigen)。简单来说，使用饱和量的抗体。并行地，将单独的10％的细胞生物制品转移至不同管中作为未染色的对照。将管在室温下以400×g离心5分钟。倒出上清液且将团粒用流式细胞术洗涤溶液洗涤两次。将0.5ml的1％多聚甲醛固定剂添加至每个管。将每个管短暂涡旋且储存在4℃下，直至在流式细胞仪上进行分析。
在一个实施方案中，使用此测定法，染色的细胞生物制品群体的平均值将高于未染色的细胞的平均值，表明细胞生物制品包含CD40配体。
实施例41：分析细胞生物制品中的病毒壳体蛋白
此测定法描述样品制剂的组成分析，且评估衍生自病毒壳体来源的蛋白质的比例。
根据标准生物样品处理程序，将细胞生物制品粒化且冷冻运送至蛋白质组学分析中心。
将细胞生物制品解冻以用于蛋白质提取和分析。首先，将其重悬于溶解缓冲液(7M脲、2M硫脲、4％(w/v)chaps于50mM Tris中，pH 8.0)中且在室温下在偶尔涡旋的情况下温育15分钟。接着通过在冰浴中超声处理5分钟将混合物溶解且以13,000RPM短暂离心5分钟。通过比色测定法(Pierce)测定总蛋白质含量且将来自每个样品的100μg蛋白质转移至新试管中且用50mM Tris pH8调控体积。
将蛋白质在65℃下用10mM DTT还原15分钟且在室温下在黑暗中用15mM碘乙酰胺烷基化30分钟。接着通过逐渐添加6体积的冷(-20℃)丙酮使蛋白质沉淀，且在-80℃下温育隔夜。
将蛋白质粒化，用冷(-20℃)甲醇洗涤3次，且重悬于50mM Tris pH 8中。在消化的前4小时内在37℃下在搅拌下将3.33μg胰蛋白酶/lysC添加至蛋白质。将样品用50mM TrispH 8稀释，且将0.1％脱氧胆酸钠与另外3.3μg胰蛋白酶/lysC一起添加以在37℃下在搅拌下消化过夜。停止消化且通过添加2％v/v甲酸来去除脱氧胆酸钠。将样品涡旋且通过以13,000RPM离心1分钟来清除。
通过逆相固相萃取(SPE)来纯化蛋白质且干燥。如先前所述，将样品在3％DMSO、0.2％甲酸的水溶液中复原且通过LC-MS进行分析。
将病毒壳体蛋白相对于所有测量的蛋白质的摩尔比确定为所有病毒壳体蛋白的摩尔量除以每个样品中所有鉴别的蛋白质的摩尔量的总和且表示为％。
在一个实施方案中，使用此方法，样品将包含少于10％病毒壳体蛋白。在一个实施方案中，样品将包含少于0.5％、1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％或90％病毒壳体蛋白。
实施例42：测量细胞生物制品从血管的外渗
此实施例描述用体外微流体系统测试的跨内皮单层的细胞生物制品外渗的定量(J.S Joen et al.2013,journals.plos.org/plosone/article？id＝10.1371/journal.pone.0056910)。
细胞从血管系统外渗至周围组织中。不希望受理论束缚，外渗为细胞生物制品到达血管外组织的一种方式。
系统包括三个可独立寻址的介质通道，所述通道由可将ECM模拟凝胶注入其中的腔室分隔。简单来说，微流体系统具有模制的PDMS(聚二甲基硅氧烷；Silgard 184；DowChemical,MI)，通过其钻取进入口且结合至盖玻璃以形成微流体通道。通道截面大小为1mm(宽度)×120μm(高度)。为了增强基质粘附，PDMS通道用PDL(聚D-赖氨酸氢溴酸盐；1mg/ml；Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)溶液涂布。
随后，将I型胶原蛋白(BD Biosciences，San Jose,CA,USA)溶液(2.0mg/ml)伴以磷酸盐缓冲盐水(PBS；Gibco)和NaOH通过四个单独的填充口注入装置的凝胶区域中，且温育30分钟以形成水凝胶。当凝胶聚合时，立即将内皮细胞培养基(获自如Lonza或Sigma的供应商)移至通道中以防止凝胶脱水。吸出培养基后，将稀水凝胶(BD science)溶液(3.0mg/ml)引入至细胞通道中且使用冷培养基将过量的水凝胶溶液洗掉。
将内皮细胞引入至中间通道中且使其沉降以形成内皮。内皮细胞接种后两天，将细胞生物制品或巨噬细胞(阳性对照)引入至相同通道中，内皮细胞已在所述通道中形成完整单层。引入细胞生物制品以使其粘附且跨单层转移至凝胶区域中。将培养物保持于37℃和5％CO2下的含湿气温育箱中。细胞生物制品的GFP表达型式用于使得能够通过荧光显微镜进行活细胞成像。第二天，将细胞固定且在腔室中使用DAPI染色对细胞核染色，且使用共聚焦显微镜对多个所关注区域成像以确定多少细胞生物制品穿过了内皮单层。
在一个实施方案中，DAPI染色将指示在接种后，细胞生物制品和阳性对照细胞能够穿过内皮屏障。
实施例43：测量细胞生物制品的趋化性细胞运动性
此实施例描述细胞生物制品趋化性的定量。细胞可通过趋化性而朝向或远离化学梯度移动。在一个实施方案中，趋化性将使细胞生物制品归巢至损伤部位或追踪病原体。如下地测定通过先前实施例中所述的任一种方法产生的纯化的细胞生物制品组合物的趋化能力。
根据制造商提供的协议在DMEM培养基(ibidi.com/img/cms/products/labware/channel_slides/S_8032X_Chemotaxis/IN_8032X_Chemotaxis.pdf)中，将足够数量的细胞生物制品或巨噬细胞(阳性对照)装入显微镜玻片孔中。将细胞生物制品在37℃和5％CO2下放置1小时以使其附着。在细胞附着后，将DMEM(阴性对照)或含DMEM的MCP1化学引诱剂加载至中心通道的相邻储集器中，且使用Zeiss倒置宽视野显微镜对细胞生物制品连续成像2小时。使用ImageJ软件(Rasband,W.S.,ImageJ,U.S.National Institutes of Health,Bethesda,Maryland,USA,http://rsb.info.nih.gov/ij/,1997–2007)分析图像。用手动跟踪插件(Fabrice Cordelières,Institut Curie,Orsay,France)获取每个观察到的细胞生物制品或细胞的迁移协调数据。趋化图和迁移速度由趋化和迁移工具(ibidi)确定。
在一个实施方案中，细胞生物制品的平均累积距离和迁移速度将在阳性对照细胞对趋化因子的反应的1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更大内。细胞对趋化因子的反应描述于例如Howard E.Gendelman etal.,Journal of Neuroimmune Pharmacology,4(1):47-59,2009中。
实施例44：测量细胞生物制品的归巢潜力
此实施例描述将细胞生物制品归巢至损伤部位。细胞可以从远端位点迁移和/或积聚于特定位点，例如归巢至位点。通常，位点为损伤部位。在一个实施方案中，细胞生物制品将归巢至，例如迁移至或积聚于损伤部位。
通过使用30G针以2μg/mL的浓度肌肉内(IM)注射至右胫骨前肌(TA)中而向8周龄C57BL/6J小鼠(Jackson Laboratories)投配黑牙蛇毒素(notexin，NTX)(AccurateChemical&Scientific Corp)，一种肌肉毒素的无菌生理盐水。通过使用化学脱毛剂对区域脱毛45秒，接着用水冲洗3次而制备胫骨前肌(TA)上的皮肤。选择此浓度以确保肌纤维的最大变性，以及对其卫星细胞、晕倒轴突和血管的最小损伤。
在NTX注射后的第1天，小鼠接受表达萤火虫萤光素酶的细胞生物制品或细胞的静脉内注射。通过先前实施例所述的任一种方法从稳定表达萤火虫萤光素酶的细胞产生细胞生物制品。生物发光成像系统(Perkin Elmer)用于在注射后0、1、3、7、21和28处获得生物发光的整个动物图像。
在成像前五分钟，小鼠接受以150mg/kg剂量腹膜内注射的生物发光底物(PerkinElmer)以使萤光素酶可视化。成像系统被校准以补偿所有装置设置。使用辐射光子(Radiance Photons)测量生物发光信号，且将总通量(Total Flux)用作测量值。通过围绕ROI的信号产生感兴趣区域(ROI)，以得到以光子/秒计的值。对用NTX处理的TA肌肉和对侧TA肌肉都评估了ROI，且计算NTX处理的TA肌肉与未用NTX处理的TA肌肉之间的光子/秒的比，作为归巢至NTX处理的肌肉的量度。
在一个实施方案中，细胞生物制品和细胞中的NTX处理的TA肌肉与未用NTX处理的TA肌肉之间的光子/秒的比将大于1，表明表达萤光素酶的细胞生物制品在损伤处的位点特异性积聚。
参见例如Plant et al.,Muscle Nerve 34(5)L 577-85,2006。
实施例45：测量细胞生物制品的吞噬活性
此实施例表明细胞生物制品的吞噬活性。在一个实施方案中，细胞生物制品具有吞噬活性，例如能够吞噬。细胞参与吞噬作用，吞噬粒子，使得能够隔离和破坏外来侵入物，如细菌或死细胞。
通过先前实施例中所述的任一种方法产生的纯化的细胞生物制品组合物包含来自具有部分或完全核失活的哺乳动物巨噬细胞的细胞生物制品，能够吞噬(通过病原体生物颗粒所测定)。根据以下方案，通过使用荧光吞噬作用测定法来进行此评估。
将巨噬细胞(阳性对照)和细胞生物制品在收获后立即涂铺于单独的共聚焦玻璃底培养皿中。将巨噬细胞和细胞生物制品在DMEM+10％FBS+1％P/S中温育1小时以附着。如制造商的协议中所指示地将荧光素标记的大肠杆菌K12和非荧光素标记的大肠杆菌K-12(阴性对照)添加至巨噬细胞/细胞生物制品，且温育2小时。在2小时之后，通过添加锥虫蓝将游离的荧光颗粒淬灭。通过共聚焦显微镜在488激发下对由吞噬粒子发出的细胞内荧光成像。使用image J软件对吞噬阳性细胞生物制品的数目进行定量。
在引入生物颗粒后2小时，吞噬细胞生物制品的平均数目为至少30％，且在阳性对照巨噬细胞中为大于30％。
实施例46：测量细胞生物制品穿过细胞膜或血脑屏障的能力
此实施例描述穿过血脑屏障的细胞生物制品的定量。在一个实施方案中，细胞生物制品将穿过(例如进入和离开)血脑屏障，例如以递送至中枢神经系统。
对八周龄C57BL/6J小鼠(Jackson Laboratories)静脉内注射表达萤火虫萤光素酶的细胞生物制品或白细胞(阳性对照)。通过先前实施例中所述的任一种方法，从稳定表达萤火虫萤光素酶的细胞或不表达萤光素酶的细胞(阴性对照)产生细胞生物制品。生物发光成像系统(Perkin Elmer)用于在细胞生物制品或细胞注射后1、2、3、4、5、6、8、12和24小时获得生物发光的全动物图像。
在成像前五分钟，小鼠接受以150mg/kg剂量腹膜内注射的生物发光底物(PerkinElmer)以使萤光素酶可视化。成像系统被校准以补偿所有装置设置。使用辐射光子测量生物发光信号，且将总通量用作测量值。通过围绕ROI的信号产生感兴趣区域(ROI)，以得到以光子/秒计的值。所选的ROI为包括大脑的区域周围的小鼠的头。
在一个实施方案中，相比于不表达萤光素酶的阴性对照细胞生物制品，注射表达萤光素酶的细胞或细胞生物制品的动物中的ROI中的光子/秒将更大，表明表达萤光素酶的细胞生物制品积聚于大脑内或周围。
实施例47：测量细胞生物制品的蛋白质分泌的潜力
此实施例描述通过细胞生物制品的分泌的定量。在一个实施方案中，细胞生物制品将能够分泌，例如分泌蛋白质。细胞可通过分泌来处置或排出物质。在一个实施方案中，细胞生物制品将通过分泌在其环境中化学相互作用和通信。
使用来自ThermoFisher Scientific的Gaussia萤光素酶快速测定法(目录号16158)确定细胞生物制品以给定速率分泌蛋白质的能力。将通过先前实施例中所述的任一种方法产生的小鼠胚胎成纤维细胞(阳性对照)或细胞生物制品在生长培养基中温育，且通过首先以1600g粒化5分钟且接着收集上清液来每15分钟收集培养基样品。将收集的样品吸移至透明底96孔板中。接着根据制造商的说明书制备测定法缓冲液的工作溶液。
简单来说，将考伦特嗪(colenterazine)，一种萤光素或发光分子与快速测定法缓冲液混合且将混合物吸移至含有样品的96孔板的每个孔中。缺乏细胞或细胞生物制品的阴性对照孔包括生长培养基或测定法缓冲液以确定背景Gaussia萤光素酶信号。另外，制备纯化的Gaussia萤光素酶(Athena Enzyme Systems,目录号0308)的标准曲线以便每小时将发光信号转化为Gaussia萤光素酶分泌的分子。
使用500毫秒积分来测定板的发光。从所有样品减去背景Gaussia萤光素酶信号且接着计算Gaussia萤光素酶标准曲线的线性最佳拟合曲线。如果样品读数在标准曲线内不拟合，则将其适当稀释且再测定。使用此测定法，确定细胞生物制品以给定范围内的速率(分子/小时)分泌Gaussia萤光素酶的能力。
在一个实施方案中，细胞生物制品将能够以阳性对照细胞的1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更大的速率分泌蛋白质。
实施例48：测量细胞生物制品的信号转导潜力
此实施例描述细胞生物制品中的信号转导的定量。在一个实施方案中，细胞生物制品能够进行信号转导。细胞可通过信号级联(如磷酸化)在称为信号转导的过程中从细胞外环境发送和接收分子信号。通过先前实施例中所述的任一种方法产生的纯化的细胞生物制品组合物包含来自具有部分或完全核失活的哺乳动物细胞的细胞生物制品，能够进行胰岛素诱导的信号转导。通过测量AKT磷酸化水平，胰岛素受体信号级联中的关键途径和响应于胰岛素的葡萄糖摄取来评估胰岛素诱导的信号转导。
为了测量AKT磷酸化，将细胞，例如小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)(阳性对照)和细胞生物制品涂铺于48孔板中且在37℃和5％CO2下的含湿气温育箱中放置2小时。在细胞粘附后，将胰岛素(例如10nM)或不含胰岛素的阴性对照溶液添加至含有细胞或细胞生物制品的孔中后维持30分钟。在30分钟后，由细胞生物制品或细胞制得蛋白质溶解物，且通过蛋白质印迹法测量胰岛素刺激和对照未刺激的样品中的磷酸化AKT水平。
如在葡萄糖摄取部分中所阐述，通过使用标记的葡萄糖(2-NBDG)来测量响应于胰岛素或阴性对照溶液的葡萄糖摄取。(S.Galic et al.,Molecular Cell Biology 25(2):819-829,2005)。
在一个实施方案中，相比于阴性对照，细胞生物制品将增强AKT磷酸化和响应于胰岛素的葡萄糖摄取至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更大。
实施例49：测量细胞生物制品跨细胞膜转运葡萄糖的能力
此实施例描述2-NBDG(2-(N-(7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑-4-基)氨基)-2-脱氧葡萄糖)的水平的定量，2-NBDG为一种可以用于监测活细胞中的葡萄糖摄取，且因此测量跨脂质双层的主动转运的荧光葡萄糖类似物。在一个实施方案中，此测定法可以用于测量葡萄糖摄取的水平和跨细胞生物制品的脂质双层的主动转运。
通过先前实施例中所述的任一种方法来产生细胞生物制品组合物。接着将足够数量的细胞生物制品在不含葡萄糖，具有20％胎牛血清和1×青霉素/链霉素的DMEM中在37℃和5％CO2下温育2小时。在2小时葡萄糖饥饿时段之后，改变培养基以使其包括不含葡萄糖的DMEM、20％胎牛血清、1×青霉素/链霉素和20μM 2-NBDG(ThermoFisher)且再在37℃和5％CO2下温育2小时。
相同地处理阴性对照细胞生物制品，除了添加等量的DMSO来代替2-NBDG。
接着将细胞生物制品用1×PBS洗涤三次且重悬于适当缓冲液中，且转移至96孔成像板。接着使用GFP光立方体(469/35激发滤光片和525/39发射滤光片)在荧光计中测量2-NBDG荧光，以定量在1小时加载时段内已跨细胞生物制品膜转运且累积于细胞生物制品中的2-NBDG的量。
在一个实施方案中，相比于阴性(DMSO)对照，经2-NBDG处理的细胞生物制品中的2-NBDG荧光将更高。用525/39发射滤光片的荧光测量将与存在的2-NBDG分子的数目相关。
实施例50：细胞生物制品的腔与水溶液可混溶
此实施例评估细胞生物制品腔与水溶液，如水的混溶性。
如先前实施例中所述地制备细胞生物制品。对照为具有低渗溶液、高渗溶液或正常渗透溶液的透析膜。
将细胞生物制品、阳性对照(正常渗透溶液)和阴性对照(低渗溶液)与低渗溶液(150mOsmol)一起温育。在将每个样品暴露于水溶液之后，在显微镜下测量细胞大小。在一个实施方案中，相比于阴性对照，细胞生物制品和阳性对照大小在低渗溶液中增加。
将细胞生物制品、阳性对照(正常渗透溶液)和阴性对照(高渗溶液)与高渗溶液(400mOsmol)一起温育。在将每个样品暴露于水溶液之后，在显微镜下测量细胞大小。在一个实施方案中，相比于阴性对照，细胞生物制品和阳性对照大小在高渗溶液中将减小。
将细胞生物制品、阳性对照(低渗或高渗溶液)和阴性对照(正常渗透)与正常渗透溶液(290mOsmol)一起温育。在将每个样品暴露于水溶液之后，在显微镜下测量细胞大小。在一个实施方案中，相比于阴性对照，正常渗透溶液中的细胞生物制品和阳性对照大小将保持基本上相同。
实施例51：测量细胞生物制品的胞质溶胶中的酯酶活性
此实施例描述细胞生物制品中的酯酶活性的定量，作为代谢活性的替代。通过钙黄绿素-AM染色的定量评估来确定细胞生物制品中的胞质酯酶活性(Bratosin et al.,Cytometry 66(1):78-84,2005)。
膜渗透性染料钙黄绿素-AM(Molecular Probes,Eugene OR USA)制备为10mM的二甲亚砜储备溶液和100mM的PBS缓冲液，pH 7.4的工作溶液。将通过先前实施例中所述的任一种方法产生的细胞生物制品或阳性对照亲本小鼠胚胎成纤维细胞悬浮于PBS缓冲液中，且与钙黄绿素-AM工作溶液(钙黄绿素-AM中的最终浓度：5mM)一起在37℃下在黑暗中温育30分钟，且接着在PBS缓冲液中稀释以立即进行钙黄绿素荧光保留的流式细胞分析。
如(Jacob et al.,Cytometry 12(6):550-558,1991)中所述，用皂苷将细胞生物制品和对照亲本小鼠胚胎成纤维细胞实验性透化为零酯酶活性的阴性对照。将细胞生物制品和细胞在含有0.05％叠氮化钠的1％皂苷于PBS缓冲液，pH 7.4中的溶液中温育15分钟。由于质膜透化的可逆性质，在用于另外的染色和洗涤步骤的所有缓冲液中均包括皂苷。在皂苷透化后，将细胞生物制品和细胞悬浮于含有0.1％皂苷和0.05％叠氮化钠PBS缓冲液中且与钙黄绿素-AM一起温育(37C在黑暗中持续45分钟)至5mM的最终浓度，用相同的含有0.1％皂苷和0.05％叠氮化钠的PBS缓冲液洗涤三次，且通过流式细胞术进行分析。在FACS细胞仪(Becton Dickinson，San Jose,CA,USA)上进行流式细胞术分析，在530+/-30nm处收集488nm氩气激光激发和发射。FACS软件用于采集和分析。将光散射通道设定为线性增益，且将荧光通道设定为对数标度，在每种条件下分析最少10,000个细胞。基于每个样品中的钙黄绿素-AM的强度计算相对酯酶活性。在正向和侧向散射通道中捕获所有事件(或者，可应用门来仅选择细胞生物制品群体)。通过减去对应的阴性对照皂苷处理的样品的荧光强度(FI)值来确定细胞生物制品的FI值。将细胞生物制品样品的标准化酯酶活性相对于对应的阳性对照细胞样品进行标准化，以产生胞质酯酶活性的定量测量值。
在一个实施方案中，相比于阳性对照细胞，细胞生物制品制剂将具有在1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更大内的酯酶活性。
另外参见Bratosin D,Mitrofan L,Palii C,Estaquier J,Montreuil J.Novelfluorescence assay using calcein-AM for the determination of humanerythrocyte viability and aging.Cytometry A.2005Jul；66(1):78-84；和Jacob BC,Favre M,Bensa JC.Membrane cell permeabilisation with saponin andmultiparametric analysis by flow cytometry.Cytometry 1991；12:550–558。
实施例52：测量细胞生物制品中的乙酰胆碱酯酶活性
使用遵循先前描述的程序(Ellman,et al.,Biochem.Pharmacol.7,88,1961)的试剂盒(MAK119，SIGMA)且根据制造商的建议测量乙酰胆碱酯酶活性。
简单来说，将细胞生物制品悬浮于含1.25mM乙酰硫代胆碱的PBS，pH 8中，与含0.1mM 5,5-二硫基-双(2-硝基苯甲酸)的PBS，pH 7混合。在室温下进行温育，但在开始光学密度读取之前，将细胞生物制品和底物溶液在37℃下预温热10分钟。
用板读取器分光光度计(ELX808，BIO-TEK instruments,Winooski,VT,USA)在450nm处监测吸收变化10分钟。单独地，样品用于通过双金鸡宁酸测定法来确定细胞生物制品的蛋白质含量以进行标准化。使用此测定法，细胞生物制品被确定为具有<100AChE活性单位/μg蛋白质。
在一个实施方案中，AChE活性单位/μg蛋白质值将小于0.001、0.01、0.1、1、10、100或1000。
实施例53：测量细胞生物制品中的代谢活性水平
此实施例描述细胞生物制品中的柠檬酸合酶活性的测量的定量。
柠檬酸合酶为三羧酸(TCA)循环内的一种酶，其催化草酰乙酸(OAA)与乙酰辅酶A之间的反应以产生柠檬酸盐。在乙酰辅酶A水解后，会释放具有硫醇基的辅酶A(CoA-SH)。硫醇基与化学试剂5,5-二硫基双-(2-硝基苯甲酸)(DTNB)反应，以形成5-硫基-2-硝基苯甲酸(TNB)，其为可以分光光度法在412nm处测量的黄色产物(Green 2008)。市售的试剂盒，如Abcam人类柠檬酸合酶活性测定法试剂盒(产品编号ab119692)提供了执行此测量所需的所有试剂。
根据制造商的建议进行分析。如下制备细胞生物制品样品溶解物：收集通过先前实施例中所述的任一种方法产生的细胞生物制品且将其在提取缓冲液(Abcam)中在冰上溶解20分钟。在离心之后收集上清液，且通过双金鸡宁酸测定法(BCA，ThermoFisherScientific)评估蛋白质含量，且将制剂保持于冰上直至引发以下定量方案。
简单来说，将细胞生物制品溶解物样品在提供的微量培养板孔中的1×温育缓冲液(Abcam)中稀释，其中一组孔仅接受1×温育缓冲液。将板密封且在室温下在振荡下以300rpm温育4小时。接着从孔中吸出缓冲液且添加1×洗涤缓冲液。再次重复此洗涤步骤。接着将1×活性溶液添加至每个孔，且通过每20秒测量412nm处的吸光度持续30分钟，且在读取之间振荡而在微孔板读取器上分析板。
从所有孔减去背景值(仅具有1×温育缓冲液的孔)，且将柠檬酸合酶活性表示为每微克加载的细胞生物制品溶解物样品每分钟吸光度的变化(ΔmOD@412nm/min/μg蛋白质)。仅使用动力学测量的100-400秒的线性部分来计算活性。
在一个实施方案中，相比于对照细胞，细胞生物制品制剂将具有在1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更大内的合酶活性。
参见例如Green HJ et al.Metabolic,enzymatic,and transporter responsein human muscle during three consecutive days of exercise and recovery.Am JPhysiol Regul Integr Comp Physiol 295:R1238-R1250,2008。
实施例54：测量细胞生物制品中的呼吸水平
此实施例描述细胞生物制品中的呼吸水平的测量的定量。细胞中的呼吸水平可以为氧消耗的量度，氧消耗促进代谢。通过Seahorse细胞外通量分析仪(Agilent)测量细胞生物制品呼吸的耗氧率(Zhang 2012)。
将通过先前实施例中所述的任一种方法产生的细胞生物制品或细胞接种于96孔Seahorse微孔板(Agilent)中。将微孔板短暂离心以将孔底部的细胞生物制品和细胞制备团粒。如下起始耗氧量测定法:通过去除生长培养基，用含有25mM葡萄糖和2mM谷氨酰氨(Agilent)的低缓冲DMEM基本培养基代替且在37℃下温育微孔板60分钟以使温度和pH平衡。
接着在细胞外通量分析仪(Agilent)中测定微孔板，所述测定法仪测量紧贴在粘附细胞生物制品和细胞周围的培养基中的细胞外氧和pH的变化。在获得稳态耗氧量(基础呼吸速率)和细胞外酸化速率后，将抑制ATP合酶的寡霉素(5μM)和将线粒体解偶联的质子离子载体FCCP(羰基氰化物4-(三氟甲氧基)苯腙；2μM)添加至微孔板的每个孔，以获得最大耗氧率的值。
最后，添加5μM抗霉素A(线粒体复合物III的抑制剂)以确认呼吸变化主要是由于线粒体呼吸。从所有耗氧量测量值中减去添加抗霉素A后的最低耗氧率，以去非除线粒体呼吸组分。分析中不包括对寡霉素(耗氧率相比于基础至少降低25％)或FCCP(耗氧率相比于基础至少增加50％)的反应不恰当的细胞样品。接着将细胞生物制品呼吸水平测量为pmolO2/min/1e4细胞生物制品。
接着将此呼吸水平标准化为对应的细胞呼吸水平。在一个实施方案中，相比于对应的细胞样品，细胞生物制品将具有至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更大的呼吸水平。
参见例如Zhang J,Nuebel E,Wisidagama DRR,et al.Measuring energymetabolism in cultured cells,including human pluripotent stem cells anddifferentiated cells.Nature protocols.2012；7(6):10.1038/nprot.2012.048.doi:10.1038/nprot.2012.048。
实施例55：测量细胞生物制品的磷脂酰丝氨酸水平
此实施例描述膜联蛋白-V结合至细胞生物制品表面的水平的定量。
染色细胞可在细胞表面上显示磷脂酰丝氨酸，其为程序性细胞死亡途径中细胞凋亡的标志物。膜联蛋白-V结合至磷脂酰丝氨酸，且因此，膜联蛋白-V结合为细胞活力的代理。
如本文所述地产生细胞生物制品。为了检测凋亡信号，用5％膜联蛋白V荧光剂594(A13203，Thermo Fisher,Waltham,MA)对细胞生物制品或阳性对照细胞染色。每组(详述于下表中)包括用凋亡诱导剂甲萘醌处理的实验组。将甲萘醌以100μM甲萘醌添加4小时。所有样品在流式细胞仪(Thermo Fisher,Waltham,MA)上运行，且用YL1激光在561nm的波长和585/16nm的发射滤光片测量荧光强度。通过比较所有组中的膜联蛋白V的荧光强度来定量细胞外磷脂酰丝氨酸的存在。
阴性对照未染色的细胞生物制品对膜联蛋白V染色不呈阳性。
在一个实施方案中，细胞生物制品能够响应于甲萘醌上调细胞表面上的磷脂酰丝氨酸显示，表明非甲萘醌刺激的细胞生物制品未经历凋亡。在一个实施方案中，用甲萘醌刺激的阳性对照细胞展示比未用甲萘醌刺激的细胞生物制品更高水平的膜联蛋白V染色。
表10：膜联蛋白V染色参数
实验组 膜联蛋白V信号的平均荧光强度(和标准差)
未染色的细胞生物制品(阴性对照) 941(937)
染色的细胞生物制品 11257(15826)
染色的细胞生物制品+甲萘醌 18733(17146)
染色的巨噬细胞+甲萘醌(阳性对照) 14301(18142)
实施例56：测量细胞生物制品中近分泌信号传导水平
此实施例描述细胞生物制品中的近分泌信号传导的定量。
细胞可通过近分泌信号传导形成细胞接触依赖性信号传导。在一个实施方案中，细胞生物制品中近分泌信号传导的存在将证明细胞生物制品可刺激、抑制与其紧邻的细胞且与所述细胞通信。
通过先前实施例中所述的任一种方法从具有部分或完全核失活的哺乳动物骨髓基质细胞(BMSC)产生的细胞生物制品通过巨噬细胞中的近分泌信号传导触发IL-6分泌。将原代巨噬细胞与BMSC共培养。首先将骨髓源性巨噬细胞接种至6孔板中，且温育24小时，接着将原代小鼠BMS源性细胞生物制品或BMSC细胞(阳性对照亲本细胞)置于具有10％FBS的DMEM培养基中的巨噬细胞上。在不同时间点(2、4、6、24小时)收集上清液且通过ELISA测定法分析IL-6分泌。(Chang J.等人,2015)。
在一个实施方案中，通过增加培养基中的巨噬细胞分泌的IL-6水平来测量由BMSC细胞生物制品诱导的近分泌信号传导的水平。在一个实施方案中，近分泌信号传导的水平将为由阳性对照骨髓基质细胞(BMSC)诱导的水平的至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更大。
实施例57：测量细胞生物制品中旁分泌信号传导水平
此实施例描述细胞生物制品中的旁分泌信号传导的定量。
细胞可通过旁分泌信号传导与局部微环境中的其他细胞通信。在一个实施方案中，细胞生物制品将能够旁进行分泌信号传导，例如以与其局部环境中的细胞通信。在一个实施方案中，细胞生物制品通过以下方案经由旁分泌衍生的分泌在内皮细胞中触发Ca2+信号传导的能力将通过钙指示剂fluo-4AM来测量Ca2+信号传导。
为了制备实验板，将鼠类肺微血管内皮细胞(MPMVEC)涂铺于0.2％明胶涂布的25mm玻璃底共聚焦培养皿上(80％汇合)。将MPMVEC在室温下在含有2％BSA和0.003％普朗尼克酸(pluronic acid)的ECM中温育30分钟，最终浓度为5μM fluo-4AM(Invitrogen)，以允许加载fluo-4AM。在加载之后，将MPMVEC用含有苯磺唑酮的成像溶液(含有0.25％BSA的ECM)洗涤，以使染料损失降至最低。在加载fluo-4之后，将500μl预温热的实验成像溶液添加至板，且通过Zeiss共聚焦成像系统对板进行成像。
在单独的试管中，将新鲜分离的鼠类巨噬细胞在培养基(DMEM+10％FBS)中用1μg/ml LPS处理或不用LPS处理(阴性对照)。在刺激后，通过先前实施例中所述的任一种方法从巨噬细胞产生细胞生物制品。
接着在含有2％BSA和0.003％普朗尼克酸的ECM中用cell tracker red CMTPX(Invitrogen)标志物细胞生物制品或亲本巨噬细胞(阳性对照)。接着将细胞生物制品和巨噬细胞洗涤且重悬于实验成像溶液中。将标记的细胞生物制品和巨噬细胞添加至共聚焦板中装有fluo-4AM的MPMVEC上。
使用具有氩离子激光源的Zeiss共聚焦成像系统每3秒记录一次绿色和红色荧光信号，持续10-20分钟，其中分别针对fluo-4AM和cell tracker red荧光在488和561nm激发。使用成像软件分析Fluo-4荧光强度变化(Mallilankaraman,K.et al.,J Vis Exp.(58):3511,2011)。从LPS刺激的细胞生物制品和细胞组中减去阴性对照细胞生物制品和细胞组中测量的Fluo-4强度水平。
在一个实施方案中，相比于阳性对照细胞组，细胞生物制品，例如活化的细胞生物制品将诱导至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更大的Fluo-4荧光强度增加。
实施例58：针对细胞生物制品的运动性测量使肌动蛋白聚合的能力
此实施例描述细胞生物制品中的细胞骨架组分(如肌动蛋白)的定量。在一个实施方案中，细胞生物制品包含如肌动蛋白的细胞骨架组分，且能够进行肌动蛋白聚合。
细胞将肌动蛋白(其为细胞骨架组分)用于运动性和其他细胞质过程。细胞骨架对于产生运动驱动力和协调运动过程至关重要
如本文所述地使C2C12细胞去核。将获自12.5％和15％Ficoll层的细胞生物制品合并且标志物为‘轻’，同时将来自16-17％层的细胞生物制品合并且标志物为‘中等’。将细胞生物制品或细胞(亲本C2C12细胞，阳性对照)重悬于DMEM+Glutamax+10％胎牛血清(FBS)中，涂铺于24孔超低附着板(#3473，Corning Inc,Corning,NY)中且在37℃+5％CO2下温育。定期(5.25小时、8.75小时、26.5小时)获取样品且用165μM若丹明鬼笔环肽染色(阴性对照不染色)，且在流式细胞仪(#A24858，Thermo Fisher,Waltham,MA)上用FC激光YL1(561nm，具有585/16滤光片)测量以测量F-肌动蛋白细胞骨架含量。测量细胞生物制品以及未染色的细胞生物制品和染色的亲本C2C12细胞中若丹明鬼笔环肽的荧光强度。
细胞生物制品荧光强度在所有时间点均大于阴性对照(图4)，且细胞生物制品能够以与亲本C2C12细胞类似的速率聚合肌动蛋白。
通过市售的ELISA系统(Cell Signaling Technology and MyBioSource)，根据制造商的说明书测量其他细胞骨架组分，如下表中所列的那些。
表11：细胞骨架组分
Figure BDA0002607347370001341
Figure BDA0002607347370001351
接着将100μL适当稀释的溶解物从微孔板条添加至适当的孔中。将微孔用胶带密封且在37C下温育2小时。在温育之后，去除密封胶带且丢弃内含物。每个微孔用200μL的1×洗涤缓冲液洗涤四次。在每次单独洗涤之后，将板在吸水布上敲打，以便从每个孔中去除残留的洗涤溶液。但是，孔在实验期间的任何时候都不是完全干燥的。
随后，将100μl复原的检测抗体(绿色)添加至每个单独的孔中，阴性对照孔除外。接着将孔密封且在37℃下温育1小时。在温育完成之后重复洗涤程序。将100μL复原的HRP连接的二级抗体(红色)添加至每个孔中。将孔用胶带密封且在37℃下温育30分钟。接着去除密封胶带且重复洗涤程序。接着将100μL TMB底物添加至每个孔中。将孔用胶带密封，接着在37℃下温育10分钟。一旦最终温育完成，将100μL终止溶液添加至每个孔中且将板轻轻摇动几秒。
在添加终止溶液的30分钟内进行所述测定法的分光光度法分析。用无绒组织擦拭孔的底面且接着在450nm处读取吸光度。在一个实施方案中，已用检测抗体染色的细胞生物制品样品将在450nm处吸收比阴性对照细胞生物制品样品更多的光，且比已用检测抗体染色的细胞样品吸收更少的光。
实施例59：测量细胞生物制品的平均膜电位
此实施例描述细胞生物制品的线粒体膜电位的定量。在一个实施方案中，包含线粒体膜的细胞生物制品将维持线粒体膜电位。
线粒体代谢活性可通过线粒体膜电位来测量。使用市售的染料TMRE定量细胞生物制品制剂的膜电位，以评估线粒体膜电位(TMRE：四甲基若丹明，乙酯，过氯酸盐，Abcam，目录号T669)。
通过先前实施例中所述的任一种方法来产生细胞生物制品。在生长培养基(具有10％胎牛血清的无酚红DMEM)中以6等份(未处理和FCCP处理的一式三份)稀释细胞生物制品或亲本细胞。将样品的一个等分试样与FCCP一起温育，FCCP是消除线粒体膜电位且防止TMRE染色的解偶联剂。对于FCCP处理的样品，将2μM FCCP添加至样品且在分析之前温育5分钟。接着用30nM TMRE对细胞生物制品和亲本细胞进行染色。对于每个样品，还并行地制备未染色的(无TMRE)样品。将样品在37℃下温育30分钟。接着将样品在具有488nm氩激光的流式细胞仪上分析，且在530+/-30nm处收集激发和发射。
基于TMRE的强度计算膜电位值(以毫伏，mV计)。在正向和侧向散射通道中捕获所有事件(或者，可应用门来排除小碎屑)。通过从未处理和FCCP处理的样品的几何平均值减去未染色的样品的荧光强度的几何平均值来将未处理和FCCP处理的样品的荧光强度(FI)值标准化。使用标准化荧光强度值用修正的能斯特方程式(Nernst equation)(参见下文)来计算每种制剂的膜电位状态，所述方程式可以用于基于TMRE荧光来确定细胞生物制品或细胞的线粒体膜电位(因为TMRE以能斯特方式在线粒体中积聚)。
用下式计算细胞生物制品或细胞膜电位：(mV)＝-61.5*log(FI未处理-标准化/FIFCCP处理-标准化)。在一个实施方案中，对来自C2C12小鼠成肌细胞的细胞生物制品制剂使用此测定法，细胞生物制品制剂的膜电位状态将在亲本细胞的约1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更大内。在一个实施方案中，膜电位的范围为约-20至-150mV。
实施例60：测量受试者中细胞生物制品的持久性半衰期
此实施例描述细胞生物制品半衰期的测量。
细胞生物制品衍生自表达gaussia萤光素酶的细胞，通过先前实施例中所述的任一种方法产生，且在缓冲溶液中制备纯、1:2、1:5和1:10稀释液。将缺少细胞生物制品的缓冲溶液用作阴性对照。
将每个剂量静脉内施用至三只八周龄雄性C57BL/6J小鼠(JacksonLaboratories)。在静脉内施用细胞生物制品后1、2、3、4、5、6、12、24、48和72小时从眶后静脉收集血液。在实验结束时通过CO2吸入将动物处死。
将血液在室温下离心20分钟。立即将血清样品冷冻于-80℃下直至生物分析。接着，在将样品与Gaussia萤光素酶底物(Nanolight,Pinetop,AZ)混合后，将每个血液样品用于进行Gaussia萤光素酶活性测定法。简单来说，将考伦特嗪，一种荧光素或发光分子与快速测定法缓冲液混合且将混合物吸移至含有血液样品的96孔板的孔中。缺少血液的阴性对照孔含有测定法缓冲液以确定背景Gaussia萤光素酶信号。
另外，制备阳性对照纯化的Gaussia萤光素酶(Athena Enzyme Systems,目录号0308)的标准曲线以便每小时将发光信号转化为Gaussia萤光素酶分泌的分子。使用500毫秒积分来测定板的发光。从所有样品减去背景Gaussia萤光素酶信号且接着计算Gaussia萤光素酶标准曲线的线性最佳拟合曲线。如果样品读数在标准曲线内不拟合，则将其适当稀释且再测定。将来自1、2、3、4、5、6、12、24、48和72小时处获取的样品的萤光素酶信号内插至标准曲线。使用一室模型的以下方程式计算消除速率常数ke(h-1):C(t)＝C0×e-kext，其中C(t)(ng/mL)为时间t(h)处的细胞生物制品浓度且C0为在时间＝0时的细胞生物制品浓度(ng/mL)。将消除半衰期t1/2,e(h)计算为ln(2)/ke。
在一个实施方案中，细胞生物制品的半衰期将为阴性对照细胞的至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更大。
实施例61：在免疫抑制下的细胞生物制品寿命
此实施例描述当细胞生物制品组合物与免疫抑制药物共同施用时，细胞生物制品组合物的免疫原性的定量。
刺激免疫应答的疗法有时会降低治疗功效或对受体产生毒性。在一个实施方案中，细胞生物制品将为基本上非免疫原性的。
将通过先前实施例中所述的任一种方法产生的细胞生物制品的纯化组合物与免疫抑制药物共同施用，且通过细胞生物制品的体内寿命来测定免疫原性特性。将足够数量的萤光素酶标记的细胞生物制品连同他克莫司(TAC，4毫克/千克/天；Sigma Aldrich)，或媒剂(阴性对照)或无任何其他试剂(阳性对照)局部注射至正常小鼠的腓肠肌中。接着在注射后1、2、3、4、5、6、12、24、48和72小时处对小鼠进行体内成像。
简单来说，将小鼠用异氟醚麻醉且以每千克体重375mg的剂量腹膜内施用D-荧光素。在成像时，将动物置于不透光的室内，且取决于生物发光的发射强度，以5秒至5分钟的积分时间收集从移植到动物体内的表达萤光素酶的细胞生物制品发射的光子。在上述的各个时间点重复扫描相同小鼠。BLI信号以光子/秒(总通量)为单位定量且呈现为log[光子/秒]。通过比较使用或不使用TAC的强度和细胞生物制品注射来分析数据。
在实施方案中，在最终时间点，测定法将显示TAC共同施用组中的细胞生物制品寿命相对于单独的细胞生物制品和媒剂组增加。除了细胞生物制品寿命增加以外，在一些实施方案中，将观察到在每个时间点，来自细胞生物制品加TAC组的BLI信号相对于细胞生物制品加媒剂或单独的细胞生物制品增加。
实施例62：测量对细胞生物制品具有反应性的预先存在的IgG和IgM抗体
此实施例描述使用流式细胞术测量的预先存在的抗细胞生物制品抗体滴度的定量。
细胞生物制品的免疫原性的一个量度是抗体反应。识别细胞生物制品的抗体可以能够限制细胞生物制品活性或寿命的方式结合。在一个实施方案中，本文所述的细胞生物制品的一些受体将具有结合且识别细胞生物制品的预先存在的抗体。
在此实施例中，使用细胞生物制品测试抗细胞生物制品抗体滴度，所述细胞生物制品使用异种源细胞通过先前实施例中所述的任一种方法产生。在此实施例中，对未用细胞生物制品治疗的小鼠评估抗细胞生物制品抗体的存在。值得注意的是，通过对方案进行优化，本文所述的方法可同样适用于人类、大鼠、猴。
阴性对照为已耗竭IgM和IgG的小鼠血清，且阳性对照为衍生自小鼠的血清，所述小鼠已接受产生自异种源细胞的细胞生物制品的多次注射。
为了评估结合至细胞生物制品的预先存在的抗体的存在，来自未用细胞生物制品治疗的小鼠的血清首先通过加热至56℃后维持30分钟而去补体，且随后在含有3％FCS和0.1％NaN3的PBS中稀释33％。将等量的血清和细胞生物制品(1×102-1×108个细胞生物制品/毫升)悬浮液在4℃下温育30分钟且经小牛血清缓冲用PBS洗涤。
通过将细胞与特异性针对小鼠IgM(BD Bioscience)的Fc部分的PE缀合的山羊抗体一起在4℃下温育45分钟而对IgM异种反应抗体染色。值得注意的是，也可使用抗小鼠IgG1或IgG2二级抗体。将来自所有组的细胞用含有2％FCS的PBS洗涤两次且接着在FACS系统(BD Biosciences)上进行分析。通过使用对数扩增来收集荧光数据且表示为平均荧光强度。
在一个实施方案中，阴性对照血清将显示与无血清或单独的次级对照类似的可忽略的荧光。在一个实施方案中，阳性对照将显示比阴性对照更多的荧光，且比无血清或单独的次级对照更多。在一个实施方案中，在发生免疫原性的情况下，来自未用细胞生物制品治疗的小鼠的血清将显示比阴性对照更多的荧光。在一个实施方案中，在不发生免疫原性的情况下，来自未用细胞生物制品治疗的小鼠的血清将显示与阴性对照相比类似的荧光。
实施例63：在多次施用细胞生物制品后测量IgG和IgM抗体反应
此实施例描述在多次施用修饰的细胞生物制品后，修饰的细胞生物制品的体液反应的定量。在一个实施方案中，修饰的细胞生物制品(例如通过本文所述的方法修饰)将在多次(例如超过一次，例如2次或更多次)施用修饰的细胞生物制品后具有降低的(例如相比于施用未修饰的细胞生物制品降低的)体液反应。
细胞生物制品的免疫原性的一个量度是抗体反应。在一个实施方案中，重复注射细胞生物制品可使得产生抗细胞生物制品抗体，例如识别细胞生物制品的抗体。在一个实施方案中，识别细胞生物制品的抗体可以能够限制细胞生物制品活性或寿命的方式结合。
在此实施例中，在一次或多次施用细胞生物制品后检查抗细胞生物制品抗体滴度。通过先前实施例中的任一个产生细胞生物制品。细胞生物制品由以下产生：未修饰的间充质干细胞(下文称为MSC)、经慢病毒介导的HLA-G表达修饰的间充质干细胞(下文称为MSC-HLA-G)和经慢病毒介导的空载体表达修饰的间充质干细胞(下文称为MSC-空载体)。血清取自不同的群体：全身和/或局部注射1、2、3、5、10次媒剂(未用细胞生物制品治疗的组)、MSC细胞生物制品、MSC-HLA-G细胞生物制品或MSC-空载体细胞生物制品注射液的小鼠。
为了评估抗细胞生物制品抗体的存在和丰度，来自小鼠的血清首先通过加热至56℃后维持30分钟去补体且随后在具有3％FCS和0.1％NaN3的PBS中稀释33％。将等量的血清和细胞生物制品(1×102-1×108个细胞生物制品/毫升)在4℃下温育30分钟且经小牛血清缓冲用PBS洗涤。
通过将细胞与特异性针对小鼠IgM(BD Bioscience)的Fc部分的PE缀合的山羊抗体一起在4℃下温育45分钟而对细胞生物制品反应性IgM抗体染色。值得注意的是，也可使用抗小鼠IgG1或IgG2二级抗体。将来自所有组的细胞用含有2％FCS的PBS洗涤两次且接着在FACS系统(BD Biosciences)上进行分析。通过使用对数扩增来收集荧光数据且表示为平均荧光强度。
在一个实施方案中，相比于MSC细胞生物制品或MSC-空载体细胞生物制品，MSC-HLA-G细胞生物制品将在注射后具有降低的抗细胞生物制品IgM(或IgG1/2)抗体滴度(如根据FACS上的荧光强度所测量)。
实施例64：修饰细胞生物制品源细胞以表达耐受蛋白以降低免疫原性
此实施例描述衍生自修饰的细胞来源的细胞生物制品中的免疫原性的定量。在一个实施方案中，与衍生自未修饰的细胞来源的细胞生物制品相比，衍生自修饰的细胞来源的细胞生物制品具有降低的免疫原性。
刺激免疫应答的疗法有时会降低治疗功效或对受体产生毒性。在一个实施方案中，向受试者施用基本上非免疫原性的细胞生物制品。在一个实施方案中，可测定细胞来源的免疫原性作为细胞生物制品免疫原性的代替。
使用慢病毒介导的HLA-G表达或空载体(阴性对照)表达修饰的iPS细胞的免疫原性特性测定如下。将足够数量的iPS细胞作为潜在的细胞生物制品细胞来源在后侧腹皮下注射至C57/B6小鼠中，且给予适当量的时间以允许畸胎瘤形成。
一旦形成畸胎瘤便收集组织。将准备用于荧光染色的组织在OCT中冷冻，且将准备用于免疫组织化学和H&E染色的组织固定于10％缓冲福尔马林中且包埋于石蜡中。根据一般免疫组织化学方案，将组织切片用抗体多克隆兔抗人类CD3抗体(DAKO)、小鼠抗人类CD4mAb(RPA-T4，BD PharMingen)、小鼠抗人类CD8 mAb(RPA-T8，BD PharMingen)染色。通过使用适当的检测试剂，即抗小鼠次级HRP(Thermofisher)或抗兔次级HRP(Thermofisher)检测这些抗体。
使用基于过氧化物酶的可视化系统(Agilent)实现检测。通过对使用光学显微镜以20×视野检查的25、50或100个组织切片中存在的浸润CD4+T细胞、CD8+T细胞CD3+NK细胞取平均值来分析数据。在一个实施方案中，与表达HLA-G的iPSC相比，未修饰的iPSC或表达空载体的iPSC将在检查的视野中存在更高数目的浸润CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD3+NK细胞。
在一个实施方案中，细胞生物制品的免疫原性特性将基本上等同于源细胞。在一个实施方案中，相对于未修饰的对应物，衍生自用HLA-G修饰的iPS细胞的细胞生物制品将具有降低的免疫细胞浸润。
实施例65：修饰细胞生物制品源细胞以敲降免疫原性蛋白质以降低免疫原性
此实施例描述衍生自细胞来源的细胞生物制品组合物的产生的定量，所述细胞生物制品组合物已被修饰以降低具有免疫原性的分子的表达。在一个实施方案中，细胞生物制品可衍生自细胞来源，所述细胞生物制品已被修饰以降低具有免疫原性的分子的表达。
刺激免疫应答的疗法会降低治疗功效或对受体产生毒性。因此，免疫原性对于安全和有效的治疗细胞生物制品是重要特性。某些免疫活化剂的表达可产生免疫应答。MHC I类代表免疫活化剂的一个实施例。
在此实施例中，通过先前实施例中所述的任一种方法产生细胞生物制品。细胞生物制品由以下产生：未修饰的间充质干细胞(下文称为MSC，阳性对照)、经慢病毒介导的靶向shRNA的MHC I类的表达修饰的间充质干细胞(下文称为MSC-shMHC I类)和经慢病毒介导的非靶向加扰shRNA的表达修饰的间充质干细胞(下文称为MSC加扰，阴性对照)。
使用流式细胞术对细胞生物制品测定MHC I类的表达。将适当数目的细胞生物制品洗涤且重悬于PBS中，与针对MHC I类的荧光结合的单克隆抗体(Harlan Sera-Lab,Belton,UK)的1:10-1:4000稀释液一起保持于冰上30分钟。将细胞生物制品在PBS中洗涤三次且重悬于PBS中。使用与等稀释的同型对照抗体一起温育且适当荧光结合的细胞生物制品制剂的相等的等分试样来确定非特异性荧光。在流式细胞仪(FACSort，Becton-Dickinson)中测定细胞生物制品且用流程分析软件(Becton-Dickinson)来分析数据。
比较衍生自MSC、MSC-shMHC I类、MSC-加扰的细胞生物制品的平均荧光数据。在一个实施方案中，相比于MSC和MSC-加扰，衍生自MSC-shMHC I类的细胞生物制品将具有较低的MHC I类表达。
实施例66：修饰细胞生物制品源细胞以逃避巨噬细胞吞噬作用
此实施例描述通过修饰的细胞生物制品逃避吞噬作用的定量。在一个实施方案中，修饰的细胞生物制品将通过巨噬细胞逃避吞噬作用。
细胞参与吞噬作用，吞噬粒子，使得能够隔离和破坏外来侵入物，如细菌或死细胞。在一些实施方案中，细胞生物制品被巨噬细胞吞噬将降低细胞生物制品的活性。
通过前述实施例中所述的任一种方法来产生细胞生物制品。细胞生物制品由以下产生：缺少CD47的CSFE标记的哺乳动物细胞(下文称为NMC，阳性对照)、使用慢病毒介导的CD47 cDNA的表达工程化以表达CD47的CSFE标记的细胞(下文称为NMC-CD47)和使用慢病毒介导的空载体对照的表达工程化的CSFE标记的细胞(下文称为NMC-空载体，阴性对照)。
根据以下方案通过吞噬作用测定法来确定巨噬细胞介导的免疫清除的降低。将巨噬细胞在收获后立即涂铺于共聚焦玻璃底培养皿中。将巨噬细胞在DMEM+10％FBS+1％P/S中温育1小时以附着。如方案中所指示地将适当数目的衍生自NMC、NMC-CD47、NMC-空载体的细胞生物制品添加至巨噬细胞，且温育2小时。
2小时后，将培养皿温和地洗涤且检查细胞内荧光。通过共聚焦显微镜在488激发下对由吞噬粒子发出的细胞内荧光成像。使用成像软件对吞噬阳性巨噬细胞的数目进行定量。数据被表示为吞噬指数＝(吞噬细胞的总数/计数的巨噬细胞的总数)×(含有吞噬细胞的巨噬细胞的数目/计数的巨噬细胞的总数)×100。
在一个实施方案中，相对于衍生自NMC或NMC-空载体的细胞生物制品，当巨噬细胞与衍生自NMC-CD47的细胞生物制品一起温育时，吞噬指数将减小。
实施例67：修饰细胞生物制品源细胞以降低由PBMC细胞溶解介导的细胞毒性
此实施例描述衍生自细胞的细胞生物制品的产生，所述细胞被修饰以具有降低的归因于PBMC细胞溶解的细胞毒性。
在一个实施方案中，细胞毒性介导的PBMC对源细胞或细胞生物制品的细胞溶解是细胞生物制品的免疫原性的量度，因为溶解将降低(例如抑制或终止)细胞生物制品的活性。
在此实施例中，通过先前实施例中所述的任一种方法产生细胞生物制品。细胞生物制品由以下产生：未修饰的间充质干细胞(下文称为MSC，阳性对照)、经慢病毒介导的HLA-G表达修饰的间充质干细胞(下文称为MSC-HLA-G)和经慢病毒介导的空载体表达修饰的间充质干细胞(下文称为MSC-空载体，阴性对照)。
PMBC介导的细胞生物制品溶解是通过如Bouma,et al.Hum.Immunol.35(2):85-92；1992&van Besouw et al.Transplantation 70(1):136-143；2000中所述的铕释放测定法确定的。将PBMC(下文称为效应细胞)从适当供体分离，且在37C下在圆底96孔板中用同种异体γ照射的PMBC和200IU/mL IL-2(proleukin,Chiron BV Amsterdam,TheNetherlands)刺激7天。将细胞生物制品用铕-二亚乙基三胺五乙酸盐(DTPA)(sigma,St.Louis,MO,USA)标志物。
在第7天，通过在涂铺之后，以1000:1-1:1与1:1.25-1:1000范围内的效应细胞/靶细胞比将63Eu标记的细胞生物制品与效应细胞一起在96孔板中温育1、2、3、4、5、6、8、10、15、20、24、48小时来进行细胞毒性介导的溶解测定法。在温育后，将板离心且将上清液样品转移至具有低背景荧光的96孔板(荧光免疫板，Nunc,Roskilde,Denmark)。
随后，将增强溶液(PerkinElmer,Groningen,The Netherlands)添加至每个孔。用时间分辨荧光计(Victor 1420多标志物计数器,LKB-Wallac,Finland)测量释放的铕。荧光以每秒计数(CPS)表示。通过将适当数目(1×102-1×108)的细胞生物制品与1％triton(sigma-aldrich)一起温育适当量的时间来确定由靶细胞生物制品释放的铕的最大百分比。通过在没有效应细胞的情况下温育标记的靶细胞生物制品来测量由靶细胞生物制品自发释放的铕。接着将泄漏百分比计算为:(自发释放/最大释放)×100％。最后，将细胞毒性介导的溶解的百分比计算为％溶解＝[(测量的溶解-自发溶解-自发释放)/(最大释放-自发释放)]×100％。通过观察随不同效靶比而变的溶解百分比来分析数据。
在一个实施方案中，相比于MSC或MSC-加扰产生的细胞生物制品，由MSC-HLA-G细胞产生的细胞生物制品将在特定时间点具有减小的靶细胞溶解百分比。
实施例68：修饰细胞生物制品源细胞以降低NK溶解活性
此实施例描述衍生自细胞来源的细胞生物制品组合物的产生，所述细胞生物制品组合物已被修饰以降低细胞毒性介导的通过NK细胞的细胞溶解。在一个实施方案中，细胞毒性介导的源细胞或细胞生物制品通过NK细胞的细胞溶解是细胞生物制品的免疫原性的量度。
在此实施例中，通过先前实施例中所述的任一种方法产生细胞生物制品。细胞生物制品由以下产生:未修饰的间充质干细胞(下文称为MSC，阳性对照)、经慢病毒介导的HLA-G表达修饰的间充质干细胞(下文称为MSC-HLA-G)和经慢病毒介导的空载体表达修饰的间充质干细胞(下文称为MSC-空载体，阴性对照)。
NK细胞介导的细胞生物制品溶解是通过如Bouma,et al.Hum.Immunol.35(2):85-92；1992&van Besouw et al.Transplantation 70(1):136-143；2000中所述的铕释放测定法确定的。将NK细胞(下文称为效应细胞)根据Crop et al.Cell transplantation(20):1547-1559；2011中的方法从适当供体分离，且在37C下在圆底96孔板中用同种异体γ照射的PMBC和200IU/mL IL-2(proleukin,Chiron BV Amsterdam,The Netherlands)刺激7天。将细胞生物制品用铕-二亚乙基三胺五乙酸盐(DTPA)(sigma,St.Louis,MO,USA)标志物。
在第7天，通过在涂铺之后，以1000:1-1:1与1:1.25-1:1000范围内的效应细胞/靶细胞比将63Eu标记的细胞生物制品与效应细胞一起在96孔板中温育1、2、3、4、5、6、8、10、15、20、24、48小时来进行细胞毒性介导的溶解测定法。在温育后，将板离心且将上清液样品转移至具有低背景荧光的96孔板(荧光免疫板，Nunc,Roskilde,Denmark)。
随后，将增强溶液(PerkinElmer,Groningen,The Netherlands)添加至每个孔。用时间分辨荧光计(Victor 1420多标志物计数器,LKB-Wallac,Finland)测量释放的铕。荧光以每秒计数(CPS)表示。通过将适当数目(1×102-1×108)的细胞生物制品与1％triton(sigma-aldrich)一起温育适当量的时间来确定由靶细胞生物制品释放的铕的最大百分比。通过在没有效应细胞的情况下温育标记的靶细胞生物制品来测量由靶细胞生物制品自发释放的铕。接着将泄漏百分比计算为：(自发释放/最大释放)×100％。最后，将细胞毒性介导的溶解的百分比计算为％溶解＝[(测量的溶解-自发溶解-自发释放)/(最大释放-自发释放)]×100％。通过观察随不同效靶比而变的溶解百分比来分析数据。
在一个实施方案中，相比于MSC或MSC-加扰产生的细胞生物制品，由MSC-HLA-G细胞产生的细胞生物制品将在适当时间点具有减小的溶解百分比。
实施例69：修饰细胞生物制品源细胞以降低CD8杀伤T细胞溶解
此实施例描述衍生自细胞来源的细胞生物制品组合物的产生，所述细胞生物制品组合物已被修饰以降低细胞毒性介导的通过CD8+T细胞的细胞溶解。在一个实施方案中，细胞毒性介导的源细胞或细胞生物制品通过CD8+T细胞的细胞溶解是细胞生物制品的免疫原性的量度。
在此实施例中，通过先前实施例中所述的任一种方法产生细胞生物制品。细胞生物制品由以下产生：未修饰的间充质干细胞(下文称为MSC，阳性对照)、经慢病毒介导的HLA-G表达修饰的间充质干细胞(下文称为MSC-HLA-G)和经慢病毒介导的空载体表达修饰的间充质干细胞(下文称为MSC-空载体，阴性对照)。
CD8+T细胞介导的细胞生物制品溶解是通过如Bouma,et al.Hum.Immunol.35(2):85-92；1992&van Besouw et al.Transplantation 70(1):136-143；2000中所述的铕释放测定法确定的。将CD8+T细胞(下文称为效应细胞)根据Crop et al.Cell transplantation(20):1547-1559；2011中的方法从适当供体分离，且在37C下在圆底96孔板中用同种异体γ照射的PMBC和200IU/mL IL-2(proleukin,Chiron BV Amsterdam,The Netherlands)刺激7天。将细胞生物制品用铕-二亚乙基三胺五乙酸盐(DTPA)(sigma,St.Louis,MO,USA)标志物。
在第7天，通过在涂铺之后，以1000:1-1:1与1:1.25-1:1000范围内的效应细胞/靶细胞比将63Eu标记的细胞生物制品与效应细胞一起在96孔板中温育1、2、3、4、5、6、8、10、15、20、24、48小时来进行细胞毒性介导的溶解测定法。在温育后，将板离心且将20μl上清液转移至具有低背景荧光的96孔板(荧光免疫板，Nunc,Roskilde,Denmark)。
随后，将增强溶液(PerkinElmer,Groningen,The Netherlands)添加至每个孔。用时间分辨荧光计(Victor 1420多标志物计数器,LKB-Wallac,Finland)测量释放的铕。荧光以每秒计数(CPS)表示。通过将适当数目(1×102-1×108)的细胞生物制品与1％triton(sigma-aldrich)一起温育适当量的时间来确定由靶细胞生物制品释放的铕的最大百分比。通过在没有效应细胞的情况下温育标记的靶细胞生物制品来测量由靶细胞生物制品自发释放的铕。接着将泄漏百分比计算为:(自发释放/最大释放)×100％。最后，将细胞毒性介导的溶解的百分比计算为％溶解＝[(测量的溶解-自发溶解-自发释放)/(最大释放-自发释放)]×100％。通过观察随不同效靶比而变的溶解百分比来分析数据。
在一个实施方案中，相比于MSC或MSC-加扰产生的细胞生物制品，由MSC-HLA-G细胞产生的细胞生物制品将在适当时间点具有减小的溶解百分比。
实施例70：修饰细胞生物制品源细胞以降低T细胞活化
此实施例描述修饰的细胞生物制品的产生，所述细胞生物制品将具有如通过混合淋巴细胞反应(MLR)评估的降低的T细胞活化和增殖。
T细胞增殖和活化是细胞生物制品的免疫原性的量度。通过细胞生物制品组合物在MLR反应中刺激T细胞增殖可表明体内T细胞增殖的刺激。
在一个实施方案中，如通过混合淋巴细胞反应(MLR)所评估，从修饰的源细胞产生的细胞生物制品具有降低的T细胞活化和增殖。在一个实施方案中，从修饰的源细胞产生的细胞生物制品不在体内产生免疫应答，因此维持细胞生物制品组合物的功效。
在此实施例中，通过先前实施例中所述的任一种方法产生细胞生物制品。细胞生物制品由以下产生：未修饰的间充质干细胞(下文称为MSC，阳性对照)、经慢病毒介导的IL-10表达修饰的间充质干细胞(下文称为MSC-IL-10)和经慢病毒介导的空载体表达修饰的间充质干细胞(下文称为MSC-空载体，阴性对照)。
BALB/c和C57BL/6脾细胞用作刺激或应答细胞。值得注意的是，这些细胞的来源可与常用的人源性刺激/应答细胞交换。另外，任何哺乳动物纯化的同种异体CD4+T细胞群体、CD8+T细胞群体或CD4-/CD8-可以用作应答群体。
通过机械解离使用完全磨砂的载玻片分离小鼠脾细胞，接着用溶解缓冲液(Sigma-Aldrich,St-Louis,MO)溶解红细胞。在实验之前，用20Gy的γ射线照射刺激细胞以防止其与应答细胞反应。接着通过将等量的刺激和应答细胞(或替代浓度，同时维持1:1比率)添加至含完全DMEM-10培养基的圆底96孔板来制备共培养物。在不同的时间间隔(t＝0、6、12、24、36、48小时)将适量的细胞生物制品(以1×101-1×108范围内的若干浓度)添加至共培养物。
通过添加1μCi的[3H]-胸苷(Amersham,Buckinghamshire,UK)以允许掺入来评估增殖。在t＝2、6、12、24、36、48、72小时处将[3H]-胸苷添加至MLR，且在2、6、12、18、24、36和48小时的延长培养之后使用96孔细胞收集器(Inoteck,Bertold,Japan)将细胞收集至玻璃纤维过滤器上。所有T细胞增殖实验均一式三份地进行。使用microbeta lLuminescence计数器(Perkin Elmer,Wellesley,MA)测量[3H]-胸苷掺入。结果可表示为每分钟计数(cpm)。
在一个实施方案中，相比于MSC-空载体或MSC未修饰的细胞生物制品对照，MSC-IL10细胞生物制品将显示T细胞增殖的减少。
实施例71：测量受试者中的靶向潜力
此实施例评估细胞生物制品靶向特定身体部位的能力。在一个实施方案中，细胞生物制品可靶向特定身体部位。靶向是将治疗剂的活性限制于一个或多个相关治疗部位的方式。
向八周龄C57BL/6J小鼠(Jackson Laboratories)静脉内注射表达萤火虫萤光素酶的细胞生物制品或细胞。通过先前实施例中所述的任一种方法，从稳定表达萤火虫萤光素酶的细胞或不表达萤光素酶的细胞(阴性对照)产生细胞生物制品。在细胞生物制品或细胞注射后1、2、3、4、5、6、8、12和24小时对小鼠组进行安乐死。
在安乐死前五分钟，小鼠接受以150mg/kg剂量腹膜内注射的生物发光底物(Perkin Elmer)以使萤光素酶可视化。生物发光成像系统被校准以补偿所有装置设置。接着使小鼠安乐死且收集肝脏、肺脏、心脏、脾脏、胰脏、胃肠道和肾脏。成像系统(PerkinElmer)用于获得这些离体器官的生物发光图像。使用辐射光子(Radiance Photons)测量生物发光信号，且将总通量(Total Flux)用作测量值。通过围绕离体器官产生感兴趣区域(ROI)，以得到以光子/秒计的值。计算目标器官(例如肝脏)与非目标器官(例如来自肺脏、心脏、脾脏、胰脏、胃肠道和肾脏的光子/秒的总和)之间的光子/秒的比，作为靶向肝脏的量度。
在一个实施方案中，在细胞生物制品和细胞中，肝脏与其他器官之间的光子/秒的比均将大于1，这将表明细胞生物制品靶向肝脏。在一个实施方案中，阴性对照动物将在所有器官中显示低得多的光子/秒。
实施例72：测量受试者中通过细胞生物制品的外源剂递送
此实施例描述受试者中包含外源剂的细胞生物制品的递送的定量。通过先前实施例中所述的任一种方法，从表达Gaussia萤光素酶的细胞或从不表达萤光素酶的细胞(阴性对照)制备细胞生物制品。
将阳性对照细胞或细胞生物制品静脉内注射至小鼠中。使用26号胰岛素注射针在5-8秒内递送细胞生物制品或细胞。使用体内成像系统(Xenogen Corporation,Alameda,CA)在注射后1、2或3天对小鼠进行体内生物发光成像。
在即将使用之前，在酸化甲醇中制备考伦特嗪，一种荧光素或发光分子(5mg/ml)且立即注射至小鼠尾静脉中。使用XGI-8气体麻醉系统在加热台上对小鼠进行连续麻醉。
通过在紧接在静脉内尾静脉注射考伦特嗪(4μg/g体重)后的5分钟内获取光子计数来获得生物发光成像。使用软件(Xenogen)分析获取的数据且将其覆叠于光视图图像上。使用自动信号强度轮廓工具产生感兴趣区域(ROI)且通过相同动物的背景减除进行标准化。使用三个滤光片在580、600和620nm的波长与3-10分钟暴露时间下进行连续数据采集，以定位小鼠体内的生物发光光源。
此外，在每个时间点，通过腹部触诊收集尿液样品。
从每只小鼠的尾静脉获得血液样品(50μl)，放入肝素化或EDTA管中。对于血浆分离，将血液样品在4℃下以1.3×g离心25分钟。
接着，在将样品与50μM Gaussia萤光素酶底物(Nanolight,Pinetop,AZ)混合之后，使用5μl血液、血浆或尿液样品进行Gaussia萤光素酶活性测定法。
在一个实施方案中，阴性对照样品将对萤光素酶呈阴性，且阳性对照样品将来自施用细胞的动物。在一个实施方案中，来自施用表达Gaussia萤光素酶的细胞生物制品的动物的样品将在每个样品中对萤光素酶呈阳性。
参见例如El-Amouri SS et al.,Molecular biotechnology 53(1):63-73,2013。
实施例73：跨细胞生物制品的脂质双层的主动转运
此实施例描述2-NBDG(2-(N-(7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑-4-基)氨基)-2-脱氧葡萄糖)的水平的定量，2-NBDG为一种可以用于监测活细胞中的葡萄糖摄取且因此监测跨脂质双层的主动转运的荧光葡萄糖类似物。在一个实施方案中，此测定法可以用于测量葡萄糖摄取的水平和跨细胞生物制品的脂质双层的主动转运。
通过先前实施例中所述的任一种方法来产生细胞生物制品组合物。接着将足够数量的细胞生物制品在不含葡萄糖的DMEM、20％胎牛血清和1×青霉素/链霉素中在37℃和5％CO2下温育2小时。在2小时葡萄糖饥饿时段之后，改变培养基以使其包括不含葡萄糖的DMEM、20％胎牛血清、1×青霉素/链霉素和20μM 2-NBDG(ThermoFisher)且在37℃和5％CO2下温育2小时。相同地处理阴性对照细胞生物制品，除了添加等量的DMSO(用于2-NBDG的媒剂)来代替2-NBDG。
接着将细胞生物制品用1×PBS洗涤三次且重悬于适当缓冲液中，且转移至96孔成像板。接着使用GFP光立方体(469/35激发滤光片和525/39发射滤光片)在荧光计中测量2-NBDG荧光，以定量在1小时加载时段内已跨细胞生物制品膜转运且累积于细胞生物制品中的2-NBDG的量。
在一个实施方案中，相比于阴性(DMSO)对照，经2-NBDG处理的细胞生物制品中的2-NBDG荧光将更高。用525/39发射滤光片的荧光测量将与存在的2-NBDG分子的数目相关。
实施例74：评估施用细胞生物制品后的畸胎瘤形成
此实施例描述不存在通过细胞生物制品形成畸胎瘤。在一个实施方案中，细胞生物制品在向受试者施用时将不会导致畸胎瘤形成。
通过先前实施例中所描述的任一种方法来产生细胞生物制品。将细胞生物制品、肿瘤细胞(阳性对照)或媒剂(阴性对照)在PBS中皮下注射至小鼠(12-20周龄)的左侧腹中。在细胞生物制品、肿瘤细胞或媒剂注射后的八周，通过用卡尺测量测定肿瘤体积而每周分析畸胎瘤(例如肿瘤)生长2-3次。
在一个实施方案中，通过卡尺测量，施用细胞生物制品或媒剂的小鼠将不具有可测量的肿瘤形成，例如畸胎瘤。在一个实施方案中，用肿瘤细胞处理的阳性对照动物将展示可观的肿瘤(例如畸胎瘤)大小，如通过卡尺在八周的观察中所测量。
实施例75：细胞生物制品将活性蛋白体内递送至受试者的受体细胞
此实施例表明细胞生物制品可以向受试者体内递送蛋白质。这通过核编辑蛋白Cre的递送例示。一旦在细胞内部，Cre易位至细胞核，在其中重新组合且切除两个LoxP位点之间的DNA。当两个LoxP位点之间的DNA为终止密码子且在远端荧光蛋白(如红色荧光蛋白tdTomato)的上游时，可以用显微镜测量Cre介导的重组。
将购自Takara(Cre Recombinase Gesicles，Takara产品631449)的含有CRE和融合剂VSV-G的细胞生物制品注入B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm9(CAG-tdTomato)Hze/J小鼠(JacksonLaboratories品系007909)中。以表14中所述的解剖部位、注射体积和注射部位向动物注射。不具有tdTomato且注射细胞生物制品的小鼠(FVB.129S6(B6)-GT(ROSA)26Sortm1(Luc)Kael/J，Jackson Laboratories品系005125)和未注射细胞生物制品的B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J小鼠用作阴性对照。
表14：注射参数
Figure BDA0002607347370001501
注射后两天处死动物且收集样品。将样品固定于2％PFA中8小时，在30％蔗糖中固定过夜，且运送以立即包埋于OCT中且切成切片。将切片用DAPI染色(针对细胞核)。用显微镜对DAPI和tdTomato荧光成像。
表14中所列的所有解剖部位均展示tdTomato荧光(图5)。另外，使用荧光显微镜检查tdTomato确认了向肌肉组织的递送(图6)。阴性对照小鼠没有任何具有tdTomato荧光的组织。此结果表明细胞生物制品能够在各种解剖部位打开小鼠细胞中的tdTomato荧光，且如果未用细胞生物制品治疗小鼠或如果小鼠的基因组中不具有tdTomato，则不会发生这种情况。因此，融合性细胞生物制品将活性Cre重组酶体内递送至小鼠细胞的细胞核。
还显示不同施用途径可体内递送细胞生物制品至组织。将购自Takara的含有CRE和融合剂VSV-G的细胞生物制品(Cre Recombinase Gesicles，Takara产品631449)肌肉内(50μl至右胫骨肌前肌)、腹膜内(50μl至腹膜腔)和皮下(50μl在背部皮肤下)注射至FVB.129S6(B6)-GT(ROSA)26Sortm1(Luc)Kael/J(Jackson Laboratories品系005125)。
通过使用化学脱毛剂将区域脱毛45秒，接着用水冲洗3次而分别准备用于肌肉内、腹膜内和皮下注射的腿部、腹侧和背部皮肤。
在注射后第3天，体内成像系统(Perkin Elmer)用于获得生物发光的全动物图像。在成像前五分钟，小鼠接受以150mg/kg剂量腹膜内注射的生物发光底物(Perkin Elmer)以使萤光素酶可视化。成像系统被校准以补偿所有装置设置。
通过所有三种途径施用均引起发光(图7)，表明将活性Cre重组酶成功地体内递送至小鼠细胞。
总之，细胞生物制品能够将活性蛋白体内递送至受试者的细胞。
实施例76：细胞生物制品中超声处理介导的核酸加载
此实施例描述通过超声处理将核酸有效负载加载至细胞生物制品中。超声处理方法公开于例如Lamichhane,TN,et al.,Oncogene Knockdown via Active Loading ofSmall RNAs into Extracellular Vesicles by Sonication.Cell Mol Bioeng,(2016)中，其全部内容通过引用并入本文。
通过先前实施例中所述的任一种方法来制备细胞生物制品。将大约106个细胞生物制品与5-20μg核酸混合且在室温下温育30分钟。接着使用以40kHz操作的水浴超声发生器(Brason型号#1510R-DTH)将细胞生物制品/核酸混合物在室温下超声处理30秒。接着将混合物置于冰上一分钟，接着以40kHz进行第二轮超声处理30秒。接着将混合物在4℃下以16,000g离心5分钟以将含核酸的细胞生物制品制备团粒。去除含有未合并的核酸的上清液且将团粒重悬于磷酸盐缓冲盐水中。在DNA加载之后，将细胞生物制品在使用之前保持于冰上。
实施例77：细胞生物制品中超声处理介导的蛋白质加载
此实施例描述通过超声处理将蛋白质有效负载加载至细胞生物制品中。超声处理方法公开于例如Lamichhane,TN,et al.,Oncogene Knockdown via Active Loading ofSmall RNAs into Extracellular Vesicles by Sonication.Cell Mol Bioeng,(2016)中，其全部内容通过引用并入本文。
通过先前实施例中所述的任一种方法来制备细胞生物制品。将大约106个细胞生物制品与5-20μg蛋白质混合且在室温下温育30分钟。接着使用以40kHz操作的水浴超声发生器(Brason型号#1510R-DTH)将细胞生物制品/蛋白质混合物在室温下超声处理30秒。接着将混合物置于冰上一分钟，接着以40kHz进行第二轮超声处理30秒。接着将混合物在4C下以16,000g离心5分钟以将含蛋白质的细胞生物制品制备团粒。去除含有未合并的蛋白质的上清液且将团粒重悬于磷酸盐缓冲盐水中。在蛋白质加载之后，将细胞生物制品在使用之前保持于冰上。
实施例78：细胞生物制品中疏水载体介导的核酸加载
此实施例描述通过疏水载体将核酸有效负载加载至细胞生物制品中。疏水性加载的示例性方法公开于例如Didiot et al.,Exosome-mediated Delivery ofHydrophobically Modified siRNA for Huntingtin mRNA Silencing,MolecularTherapy 24(10):1836–1847,(2016)中，其全部内容通过引用并入本文。
通过本文实施例中所述的任一种方法来制备细胞生物制品。RNA分子的3'端缀合至生物活性疏水缀合物(三乙二醇-胆固醇)。通过在以500rpm振荡的情况下在37℃下温育90分钟，将大致106个细胞生物制品(1ml)与10μmol/l的siRNA缀合物在PBS中混合。疏水载体介导RNA与细胞生物制品膜的结合。在一些实施方案中，一些RNA分子被并入细胞生物制品的腔中，且一些存在于细胞生物制品的表面上。通过在4℃下在台式超速离心机中使用TLA-110转子以100,000g超速离心1小时，将未加载的细胞生物制品与加载有RNA的细胞生物制品分离。未加载的细胞生物制品保留在上清液中，且加载有RNA的细胞生物制品形成团粒。将加载有RNA的细胞生物制品重悬于1ml PBS中，且在使用之前保持于冰上。
实施例79：加工细胞生物制品
此实施例描述细胞生物制品的加工。通过先前实施例中所述的任一种方法产生的细胞生物制品可以被进一步加工。
在一些实施方案中，细胞生物制品首先被均质化，例如通过超声处理。例如，超声处理方案包括使用将微探针振幅设置于8的MSE超声发生器(InstrumentationAssociates,N.Y.)进行5秒超声处理。在一些实施方案中，此短时间超声处理足以使得细胞生物制品的质膜破裂成均匀大小的细胞生物制品。在这些条件下，细胞器膜不会被破坏且将其通过离心(3,000rpm，15min4℃)去除。接着如实施例6中所述地通过差速离心纯化细胞生物制品。
将细胞生物制品挤压通过可商购的聚碳酸酯膜(例如购自Sterlitech,Washington)或可商购自Pall Execia,France的不对称陶瓷膜(例如Membralox)是将细胞生物制品大小减小为相对明确定义的大小分布的有效方法。通常，悬浮液循环通过膜一次或多次，直至实现所需细胞生物制品大小分布。细胞生物制品可挤压通过依次更小的孔隙膜(例如400nm、100nm和/或50nm孔隙大小)以实现大小的逐渐减小和均匀分布。
在一些实施方案中，在细胞生物制品生产的任何步骤，但通常在均质化、超声处理和/或挤压步骤之前，可将医试剂(如治疗剂)添加至反应混合物，使得所得细胞生物制品囊封医试剂。
实施例80：测量细胞生物制品和源细胞中的总RNA
此实施例描述定量细胞生物制品相对于有核对应物(例如源细胞)中的RNA的量的方法。在一个实施方案中，细胞生物制品将具有与有核对应物类似的RNA水平。在此测定法中，通过测量总RNA来确定RNA水平。
通过先前实施例中所述的任一种方法来制备细胞生物制品。如根据细胞生物制品和源细胞的蛋白质所测量的相同质量的制剂用于分离总RNA(例如使用试剂盒，如QiagenRNeasy目录号74104)，接着使用标准光谱法测定RNA浓度，以评估RNA的吸光度(例如使用Thermo Scientific NanoDrop)。
在一个实施方案中，以蛋白质的质量计，细胞生物制品中的RNA的浓度将为源细胞的5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％。

Claims (114)

1.纯化的细胞生物制品组合物，其包含来自源细胞，例如哺乳动物源细胞，例如人源细胞的细胞生物制品，其中所述细胞生物制品具有部分或完全的核失活(例如核去除)，其中所述细胞生物制品不是来自红系细胞或血小板，并且
其中以下的一个或多个：
i)所述细胞生物制品包含外源剂或治疗剂(例如外源治疗剂)，例如为至少1,000个拷贝的拷贝数，例如，如通过实施例31的测定法所测量的；
ii)所述细胞生物制品包含脂质，其中CL、Cer、DAG、HexCer、LPA、LPC、LPE、LPG、LPI、LPS、PA、PC、PE、PG、PI、PS、CE、SM和TAG的一种或多种在所述源细胞中相应脂质水平的75％以内；
iii)所述细胞生物制品包含与所述源细胞的蛋白质组学组成相似的蛋白质组学组成，例如使用实施例30的测定法测定；
iv)所述细胞生物制品能够进行信号转导，例如传输细胞外信号，例如响应于胰岛素的AKT磷酸化，或响应于胰岛素的葡萄糖(例如标记的葡萄糖，例如2-NBDG)摄取，例如比阴性对照，例如在不存在胰岛素的情况下在其他方面相似的细胞生物制品多至少10％，例如使用实施例48的测定法测定；
v)当施用于受试者例如小鼠时，所述细胞生物制品靶向组织，例如肝、肺、心脏、脾、胰腺、胃肠道、肾、睾丸、卵巢、脑、生殖器官、中枢神经系统、外周神经系统、骨骼肌、内皮、内耳或眼，例如其中24小时后所施用的细胞生物制品的群体中至少0.1％或10％的所述细胞生物制品存在于所述靶组织中，例如通过实施例71的测定法测定；或
vi)所述源细胞选自嗜中性粒细胞、粒细胞、间充质干细胞、骨髓干细胞、诱导性多能干细胞、胚胎干细胞、原粒细胞、成肌细胞、肝细胞或神经元，例如视网膜神经元细胞。
2.纯化的细胞生物制品组合物，其包含细胞生物制品和外源剂，例如治疗剂，其中：
i)所述细胞生物制品来自源细胞，例如哺乳动物源细胞，
ii)所述细胞生物制品是去核细胞或具有部分或完全核失活(例如核去除)的细胞，并且
iii)所述细胞生物制品不是来自红系细胞或血小板。
3.纯化的细胞生物制品组合物，例如冷冻的细胞生物制品组合物，其包含细胞生物制品，其中：
i)所述细胞生物制品来自源细胞，例如哺乳动物源细胞，
ii)所述细胞生物制品是去核细胞或具有部分或完全核失活(例如核去除)的细胞，并且
iii)所述细胞生物制品不是来自红系细胞或血小板，
其处于小于4、0、-4、-10、-12、-16、-20、-80或-160C的温度。
4.前述权利要求中任一项的细胞生物制品组合物，其中以下的一个或多个：
i)所述细胞生物制品包含以下脂质与蛋白质的比率，其在所述源细胞中相应比率的10％、20％、30％、40％或50％内，例如，如使用实施例37的测定法所测量的；
ii)所述细胞生物制品包含以下蛋白质与核酸(例如DNA)的比率，其在所述源细胞中相应比率的10％、20％、30％、40％或50％内，例如，如使用实施例38的测定法所测量的；
iii)所述细胞生物制品包含以下脂质与核酸(例如DNA)的比率，其在所述源细胞中相应比率的10％、20％、30％、40％或50％内，例如，如使用实施例39的测定法所测量的；
iv)所述细胞生物制品在受试者中例如小鼠中具有以下半衰期，其在参考细胞例如所述源细胞的半衰期的90％内，例如通过实施例60的测定法测定；
v)所述细胞生物制品将葡萄糖(例如标记的葡萄糖，例如2-NBDG)跨膜运输，例如比阴性对照，例如在不存在葡萄糖的情况下在其他方面相似的细胞生物制品多至少10％，例如，如使用实施例49的测定法所测量的；
vi)所述细胞生物制品在腔中包含以下酯酶活性，其在参考细胞，例如所述源细胞或小鼠胚胎成纤维细胞中的酯酶活性的90％内，例如使用实施例51的测定法测定；
vii)所述细胞生物制品包含以下代谢活性水平，其在参考细胞例如所述源细胞中的代谢活性(例如柠檬酸合酶活性)的90％内，例如，如实施例53中所述；
viii)所述细胞生物制品包含以下呼吸水平(例如耗氧率)，其在参考细胞例如所述源细胞中的呼吸水平的90％内，例如，如实施例54中所述；
ix)所述细胞生物制品包含至多18,000、17,000、16,000、15,000、14,000、13,000、12,000、11,000或10,000MFI的膜联蛋白-V染色水平，例如使用实施例55的测定法测定，或者其中所述细胞生物制品包含以下膜联蛋白-V染色水平，其比在实施例55的测定法中用甲萘醌处理的在其他方面相似的细胞生物制品的膜联蛋白-V染色水平低至少5％、10％、20％、30％、40％或50％，或者其中所述细胞生物制品包含以下膜联蛋白-V染色水平，其比在实施例55的测定法中用甲萘醌处理的巨噬细胞的膜联蛋白-V染色水平低至少5％、10％、20％、30％、40％或50％；
x)所述细胞生物制品具有比所述源细胞的miRNA含量水平至少1％的miRNA含量水平，例如通过实施例27的测定法测定；
xi)所述细胞生物制品具有在所述源细胞的可溶性蛋白质:非可溶性蛋白质比率的90％内的可溶性蛋白质:非可溶性蛋白质比率，例如通过实施例35的测定法测定；
xii)所述细胞生物制品具有小于所述细胞生物制品的脂质含量的5％的LPS水平，例如，如通过实施例36的测定法所测量的；
xiii)所述细胞生物制品具有比由参考细胞，例如所述源细胞或骨髓基质细胞(BMSC)诱导的近分泌信号传导的水平高至少5％的近分泌信号传导水平，例如通过实施例56的测定法测定；
xiv)所述细胞生物制品具有比由参考细胞，例如所述源细胞或巨噬细胞诱导的旁分泌信号传导的水平高至少5％的旁分泌信号传导水平，例如通过实施例57的测定法测定；
xv)所述细胞生物制品以与参考细胞例如所述源细胞或C2C12细胞中聚合的肌动蛋白的水平相比在5％内的水平的聚合肌动蛋白，例如通过实施例58的测定法测定；
xvi)所述细胞生物制品具有参考细胞例如所述源细胞或C2C12细胞的膜电位的约5％内的膜电位，例如通过实施例59的测定法测定，或者其中所述细胞生物制品具有约-20至-150mV、-20至-50mV、-50至-100mV或-100至-150mV的膜电位；
xvii)所述细胞生物制品能够从血管中外渗，例如以与所述源细胞相同类型的细胞的外渗速率的至少1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的速率外渗，例如使用实施例42的测定法测定，例如其中所述源细胞是嗜中性粒细胞、淋巴细胞、B细胞、巨噬细胞或NK细胞；
xviii)所述细胞生物制品能够穿过细胞膜，例如内皮细胞膜或血脑屏障，例如以与所述源细胞相同类型的细胞的速率的至少1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的速率穿过细胞膜；
xix)所述细胞生物制品能够分泌蛋白质，例如以比参考细胞例如小鼠胚胎成纤维细胞高至少5％的速率分泌，例如，使用实施例47的测定法测定；
xx)所述细胞生物制品符合药物或良好生产规范(GMP)标准；
xxi)所述细胞生物制品根据良好生产规范(GMP)制备；
xxii)所述细胞生物制品具有低于预定参考值的病原体水平，例如，基本上不含病原体；
xxiii)所述细胞生物制品具有低于预定参考值的污染物水平，例如，基本上不含污染物；
xxiv)所述细胞生物制品具有低免疫原性，例如，如本文所述；
xxv)所述源细胞是除293细胞、HEK细胞、人内皮细胞或人上皮细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞或干细胞外；
xxvi)所述细胞生物制品、组合物或制剂具有除在1.08g/ml和1.12g/ml之间外的密度；
xxvii)所述细胞生物制品、组合物或制剂具有1.25g/ml+/-0.05的密度，例如，如通过实施例21的测定法所测量的；
xxviii)所述细胞生物制品不被循环中的清除系统或肝窦中的库普弗细胞捕获；或
xxix)所述细胞生物制品具有大于5um、6um、7um、8um、10um、20um、50um、100um、150um或200um的直径。
5.前述权利要求中任一项的细胞生物制品组合物，其包含货物，例如治疗剂，例如内源治疗剂或外源治疗剂。
6.权利要求5的细胞生物制品组合物，其中所述治疗剂选自以下的一种或多种：蛋白质，例如酶、跨膜蛋白质、受体、抗体；核酸，例如DNA、染色体(例如人类人工染色体)、RNA、mRNA、siRNA、miRNA或小分子。
7.权利要求5的细胞生物制品组合物，其中所述治疗剂是细胞器，例如选自以下的细胞器：线粒体、高尔基体、溶酶体、内质网、液泡、内体、顶体、自噬体、中心粒、糖酵解酶体、乙醛酸循环体、氢化酶体、黑色素体、纺锤剩体、刺丝囊、过氧化物酶体、蛋白酶体、囊泡和应激颗粒。
8.前述权利要求中任一项的细胞生物制品组合物，其具有<1、1-1.1、1.05-1.15、1.1-1.2、1.15-1.25、1.2-1.3、1.25-1.35或>1.35g/ml的密度，例如通过实施例21的测定法测定。
9.前述权利要求中任一项的细胞生物制品组合物，其是去核细胞。
10.前述权利要求中任一项的细胞生物制品组合物，其包含选自以下的一种或多种的外源治疗剂：蛋白质，例如酶、跨膜蛋白、受体、抗体；核酸，例如DNA、染色体(例如人类人工染色体)、RNA、mRNA、siRNA、miRNA或小分子。
11.前述权利要求中任一项的细胞生物制品组合物，其包含按蛋白质质量计小于0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、4％、5％或10％源细胞或少于0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、4％、5％或10％的细胞具有功能性核。
12.权利要求3的细胞生物制品组合物，其已经于所述温度维持了至少1、2、3、6或12小时；1、2、3、4、5或6天；1、2、3或4周；1、2、3或6个月；或1、2、3、4或5年。
13.权利要求3的细胞生物制品组合物，其具有于所述温度维持之前的群体活性的至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的活性，例如使用本文所述的测定法测定。
14.权利要求3的细胞生物制品组合物，其于小于4C的温度持续至少1、2、3、6或12小时；1、2、3、4、5或6天；1、2、3或4周；1、2、3或6个月；或1、2、3、4或5年是稳定的。
15.权利要求3的细胞生物制品组合物，其于小于-20C的温度持续至少1、2、3、6或12小时；1、2、3、4、5或6天；1、2、3或4周；1、2、3或6个月；或1、2、3、4或5年是稳定的。
16.权利要求3的细胞生物制品组合物，其于小于-80C的温度持续至少1、2、3、6或12小时；1、2、3、4、5或6天；1、2、3或4周；1、2、3或6个月；或1、2、3、4或5年是稳定的。
17.前述权利要求中任一项的细胞生物制品组合物，其中以下的一个或多个：
i)所述源细胞是除293细胞外；
ii)所述源细胞不是转化或永生化的；
iii)使用除腺病毒介导的永生化以外的方法对所述源细胞进行转化或永生化，例如通过自发突变或端粒酶表达来永生化；
iv)所述治疗剂是除Cre或EGFP外；
v)所述治疗剂是核酸(例如RNA，例如mRNA、miRNA或siRNA)或外源蛋白质(例如抗体，例如抗体)，例如在腔中；或
vi)所述细胞生物制品不包含线粒体。
18.前述权利要求中任一项的细胞生物制品组合物，其中以下的一个或多个：
i)所述源细胞是除293细胞或HEK细胞外；
ii)所述源细胞不是转化或永生化的；
iii)使用除腺病毒介导的永生化以外的方法对所述源细胞进行转化或永生化，例如通过自发突变或端粒酶表达来永生化；或
iv)所述细胞生物制品具有除在40和150nm之间外的大小，例如大于150nm、200nm、300n、400nm或500nm。
19.前述权利要求中任一项的细胞生物制品组合物，其中以下的一个或多个：
i)所述治疗剂是由所述源细胞表达的可溶性蛋白质；
ii)所述细胞生物制品在其腔中包含选自以下的多肽：酶、抗体或抗病毒多肽；
iii)所述细胞生物制品不包含外源治疗性跨膜蛋白；或
iv)所述细胞生物制品不包含CD63或GLUT4。
20.前述权利要求中任一项的细胞生物制品组合物，其中所述细胞生物制品：
i)不包含病毒，不是传染性的或不在宿主细胞中繁殖；
ii)不是VLP(病毒样颗粒)；
iii)不包含病毒结构蛋白，例如病毒壳体蛋白，例如病毒核壳蛋白，或其中病毒壳体蛋白的量小于总蛋白的10％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.2％或0.1％，例如通过实施例41的测定法测定；
iv)不包含病毒基质蛋白；
v)不包含病毒非结构蛋白；
vi)包含少于10、50、100、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000、1,000,000,000个拷贝的病毒结构蛋白；或
vii)不是病毒体。
21.前述权利要求中任一项的细胞生物制品组合物，其中以下之一或两者：
i)所述细胞生物制品上所述外源剂的拷贝数与病毒结构蛋白的拷贝数的比率为至少1000000:1、100000:1、10000:1、1000:1、100:1和50:1、50:1和20:1、20:1和10:1、10:1和5:1、或1:1；
ii)所述细胞生物制品上所述外源剂的拷贝数与病毒基质蛋白的拷贝数的比率为至少1000000:1、100000:1、10000:1、1000:1、100:1和50:1、50:1和20:1、20:1和10:1、10:1和5:1、或1:1。
22.前述权利要求中任一项的细胞生物制品组合物，其为单层或多层的。
23.前述权利要求中任一项的细胞生物制品组合物，其中：
i)所述细胞生物制品不包含与水不混溶的液滴；
ii)所述细胞生物制品包含水性腔和亲水性外部；或
iii)所述细胞器选自线粒体、高尔基体、溶酶体、内质网、液泡、内体、顶体、自噬体、中心粒、糖酵解酶体、乙醛酸循环体、氢化酶体、黑色素体、纺锤剩体、刺丝囊、过氧化物酶体、蛋白酶体、囊泡和应激颗粒。
24.前述权利要求中任一项的细胞生物制品组合物，其中：
i)所述细胞生物制品不是通过用治疗或诊断物质加载所述细胞生物制品而制备的；
ii)所述源细胞未加载治疗或诊断物质；
iii)所述细胞生物制品不包含多柔比星、地塞米松、环糊精；聚乙二醇、microRNA，例如miR125、VEGF受体、ICAM-1、E-选择蛋白，氧化铁、荧光蛋白，例如GFP或RFP、纳米颗粒或RNA酶，或不包含任何前述物质的外源形式；或
iv)所述细胞生物制品进一步包含具有一种或多种翻译后修饰，例如糖基化的外源治疗剂。
25.前述权利要求中任一项的细胞生物制品组合物，其中所述细胞生物制品具有所述源细胞的大小的约0.01％-0.05％、0.05％-0.1％、0.1％-0.5％、0.5％-1％、1％-2％、2％-3％、3％-4％、4％-5％、5％-10％、10％-20％、20％-30％、30％-40％、40％-50％、50％-60％、60％-70％、70％-80％或80％-90％的大小，例如，如通过实施例18的测定法所测量的。
26.前述权利要求中任一项的细胞生物制品组合物，其中所述细胞生物制品具有至少约10nm、20nm、30nm、40nm、50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、150nm或200nm的直径，例如，如通过实施例20的测定法所测量的。
27.前述权利要求中任一项的细胞生物制品组合物，其中：
i)所述细胞生物制品不是外来体；
ii)所述细胞生物制品是微囊泡；
iii)所述细胞生物制品具有至少80nm、100nm、200nm、500nm、1000nm、1200nm、1400nm或1500nm的大小，或者细胞生物制品的群体具有至少80nm、100nm、200nm、500nm、1000nm、1200nm、1400nm或1500nm的平均大小；
iv)所述细胞生物制品包含一个或多个细胞器，例如线粒体、高尔基体、溶酶体、内质网、液泡、内体、顶体、自噬体、中心粒、糖酵解酶体、乙醛酸循环体、氢化酶体、黑色素体、纺锤剩体、刺丝囊、过氧化物酶体、蛋白酶体、囊泡和应激颗粒；
v)所述细胞生物制品包含细胞骨架或其组分，例如肌动蛋白、Arp2/3、形成蛋白、冠蛋白、抗肌萎缩蛋白、角蛋白、肌球蛋白或微管蛋白；
vi)所述细胞生物制品、组合物或制剂不具有1.08–1.22g/ml的浮选密度，或具有至少1.18–1.25g/ml或1.05–1.12g/ml的密度，例如在蔗糖梯度离心测定法中，例如，如Théry等人,“Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatantsand biological fluids.”Curr Protoc Cell Biol.2006年4月；第3章:第3.22节中所述；
vii)所述细胞生物制品包含与所述源细胞相比富含神经酰胺或鞘磷脂或其组合的脂质双层，或者所述脂质双层与所述源细胞相比未富含(例如耗竭)糖脂、游离脂肪酸或磷脂酰丝氨酸或其组合；
viii)所述细胞生物制品包含磷脂酰丝氨酸(PS)或CD40配体或PS和CD40配体两者，例如当在实施例40的测定法中测量时；
ix)所述细胞生物制品与所述源细胞相比富含PS，例如在细胞生物制品的群体中至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％对PS呈阳性；
x)所述细胞生物制品基本上不含乙酰胆碱酯酶(AChE)，或含有小于0.001、0.002、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50、100、200、500或1000个AChE活性单位/ug的蛋白质，例如通过实施例52的测定法测定；
xi)所述细胞生物制品基本上不含四次穿膜蛋白家族蛋白质(例如CD63、CD9或CD81)、ESCRT相关蛋白(例如TSG101、CHMP4A-B或VPS4B)、Alix、TSG101、MHCI、MHCII、GP96、辅肌动蛋白4、mitofilin、syntenin-1、TSG101、ADAM10、EHD4、syntenin-1、TSG101、EHD1、flotilin-1、热激70-kDa蛋白(HSC70/HSP73、HSP70/HSP72)或其任何组合，或者含有少于0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、5％或10％的任何单个外来体标志物蛋白和/或少于0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％或25％的任何所述蛋白质的总外来体标志物蛋白，或者与所述源细胞相比脱富集这些蛋白质的任何一种或多种，或未富含这些蛋白质的任何一种或多种，例如通过实施例32的测定法测定；
xii)所述细胞生物制品包含低于500、250、100、50、20、10、5或1ng GAPDH/ug总蛋白质或低于所述源细胞中GAPDH的水平，例如小于1％、2.5％、5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，小于所述源细胞中以ng/ug计每总蛋白质的GAPDH的水平的甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的水平，例如，使用实施例33的测定法测定；
xiii)所述细胞生物制品富含一种或多种内质网蛋白(例如钙联接蛋白)，一种或多种蛋白酶体蛋白，或一种或多种线粒体蛋白，或其任何组合，例如，其中钙联接蛋白的量大于500、250、100、50、20、10、5或1ng钙联接蛋白/ug总蛋白质，或者其中所述细胞生物制品包含与所述源细胞相比多1％、2.5％、5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的以ng/ug计的每总蛋白质的钙联接蛋白，例如使用实施例34的测定法测定；
xiv)所述细胞生物制品包含外源剂(例如，外源蛋白质、mRNA或siRNA)，例如，如使用实施例27或28的测定法所测量；或
xv)所述细胞生物制品能够通过原子力显微术在云母表面上固定化至少30分钟。
28.前述权利要求中任一项的细胞生物制品组合物，其中：
i)所述细胞生物制品是外来体；
ii)所述细胞生物制品不是微囊泡；
iii)所述细胞生物制品具有小于80nm、100nm、200nm、500nm、1000nm、1200nm、1400nm或1500nm的大小，或者细胞生物制品的群体具有至少80nm、100nm、200nm、500nm、1000nm、1200nm、1400nm或1500nm的平均大小；
iv)所述细胞生物制品不包含细胞器；
v)所述细胞生物制品不包含细胞骨架或其组分，例如肌动蛋白、Arp2/3、形成蛋白、冠蛋白、抗肌萎缩蛋白、角蛋白、肌球蛋白或微管蛋白；
vi)所述细胞生物制品、组合物或制剂具有1.08–1.22g/ml的浮选密度，例如在蔗糖梯度离心测定法中；
vii)所述细胞生物制品包含与所述源细胞相比未富含(例如耗竭)神经酰胺或鞘磷脂或其组合的脂质双层，或者所述脂质双层与所述源细胞相比富含糖脂、游离脂肪酸或磷脂酰丝氨酸或其组合；
viii)所述细胞生物制品相对于所述源细胞不包含或耗竭磷脂酰丝氨酸(PS)或CD40配体或PS和CD40配体两者，例如当在实施例40的测定法中测量时；
ix)所述细胞生物制品与所述源细胞相比未富含(例如耗竭)PS，例如在细胞生物制品的群体中小于20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％对PS呈阳性；
x)所述细胞生物制品包含乙酰胆碱酯酶(AChE)，例如至少0.001、0.002、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50、100、200、500或1000个AChE活性单位/ug的蛋白质，例如通过实施例52的测定法测定；
xi)所述细胞生物制品包含四次穿膜蛋白家族蛋白质(例如CD63、CD9或CD81)、ESCRT相关蛋白(例如TSG101、CHMP4A-B或VPS4B)、Alix、TSG101、MHCI、MHCII、GP96、辅肌动蛋白4、mitofilin、syntenin-1、TSG101、ADAM10、EHD4、syntenin-1、TSG101、EHD1、flotilin-1、热激70-kDa蛋白(HSC70/HSP73、HSP70/HSP72)或其任何组合，例如，含有多于0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、5％或10％的任何单个外来体标志物蛋白和/或少于0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％或25％的任何所述蛋白质的总外来体标志物蛋白，或者与所述源细胞相比富含这些蛋白质的任何一种或多种，通过实施例32的测定法测定；
xii)所述细胞生物制品包含高于500、250、100、50、20、10、5或1ng GAPDH/ug总蛋白质或低于所述源细胞中GAPDH的水平，例如至少1％、2.5％、5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，大于所述源细胞中以ng/ug计的每总蛋白质的GAPDH水平的甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的水平，例如，使用实施例33的测定法测定；
xiii)所述细胞生物制品未富含(例如耗竭)一种或多种内质网蛋白(例如钙联接蛋白)，一种或多种蛋白酶体蛋白，或一种或多种线粒体蛋白，或其任何组合，例如，其中钙联接蛋白的量小于500、250、100、50、20、10、5或1ng钙联接蛋白/ug总蛋白质，或者其中所述细胞生物制品包含与所述源细胞相比少1％、2.5％、5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％以ng/ug计的每总蛋白质的钙联接蛋白，例如使用实施例34的测定法测定；
xiv)所述细胞生物制品不能通过原子力显微术在云母表面上固定化至少30分钟。
29.前述权利要求中任一项的细胞生物制品组合物，其中：
i)所述细胞生物制品不包含VLP；
ii)所述细胞生物制品不包含病毒；
iii)所述细胞生物制品不包含具有复制能力的病毒；
iv)所述细胞生物制品不包含病毒蛋白质，例如病毒结构蛋白，例如壳体蛋白或病毒基质蛋白；
v)所述细胞生物制品不包含来自包膜病毒的壳体蛋白；
vi)所述细胞生物制品不包含核壳蛋白；或
vii)所述细胞生物制品不包含病毒融合剂。
30.前述权利要求中任一项的细胞生物制品，其中所述细胞生物制品包含胞质溶胶。
31.前述权利要求中任一项的细胞生物制品，其中：
i)所述细胞生物制品在植入受试者中时不形成畸胎瘤，例如通过实施例74的测定法测定；
ii)所述细胞生物制品能够趋化，例如与参考细胞例如巨噬细胞相比，以至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％的速度，例如使用实施例43的测定法测定；
iii)所述细胞生物制品能够归巢，例如在损伤部位处，其中所述细胞生物制品来自人细胞，例如，使用实施例44的测定法测定，例如其中所述源细胞是嗜中性粒细胞；或
iv)所述细胞生物制品能够吞噬，例如其中在使用实施例45的测定法中在0.5、1、2、3、4、5或6小时内可检测到所述细胞生物制品的吞噬，例如其中所述源细胞是巨噬细胞。
32.前述权利要求中任一项的细胞生物制品组合物，其在施用于受试者例如人类受试者后将任何特征的一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个保留5天或更短，例如4天或更短、3天或更短、2天或更短、1天或更短，例如约12-72小时。
33.前述权利要求中任一项的细胞生物制品组合物，其中所述细胞生物制品具有以下特征的一个或多个：
a)包含来自源细胞的一种或多种内源蛋白，例如膜蛋白或胞质蛋白；
b)包含至少10、20、50、100、200、500、1000、2000或5000种不同的蛋白质；
c)包含至少1、2、5、10、20、50或100种不同的糖蛋白；
d)以所述细胞生物制品中的所述蛋白质的质量计，至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％是天然存在的蛋白质；
e)包含至少10、20、50、100、200、500、1000、2000或5000种不同的RNA；或
f)包含至少2、3、4、5、10或20种不同的脂质，例如选自CL、Cer、DAG、HexCer、LPA、LPC、LPE、LPG、LPI、LPS、PA、PC、PE、PG、PI、PS、CE、SM和TAG。
34.前述权利要求中任一项的细胞生物制品组合物，其中所述细胞生物制品已经经操作以具有一个、两个、三个、四个、五个或更多以下特性，或者其中所述细胞生物制品不是天然存在的细胞或者其中所述核不是天然的并且具有一个、两个、三个、四个、五个或更多以下特性：
a)所述部分核失活导致核功能减少至少50％、60％、70％、80％、90％或更多，例如减少转录或DNA复制或两者，例如其中通过实施例9的测定法测量转录并且通过实施例10的测定法测量DNA复制；
b)所述细胞生物制品不能够转录或者具有参考细胞例如所述源细胞的转录活性的小于1％、2.5％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的转录活性，例如使用实施例9的测定法测定；
c)所述细胞生物制品不能够核DNA复制或者具有参考细胞例如所述源细胞的核DNA复制的小于1％、2.5％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的核DNA复制，例如使用实施例10的测定法测定；
d)所述细胞生物制品缺乏染色质或者具有参考细胞例如所述源细胞的染色质含量的小于1％、2.5％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的染色质含量，例如使用实施例25的测定法测定；
e)所述细胞生物制品缺乏核膜或者具有小于50％、40％、30％、20％、10％、5％、4％、3％、2％或1％的参考细胞例如所述源细胞或Jurkat细胞的核膜的量，例如通过实施例24的测定法测定；
f)所述细胞生物制品缺乏功能性核孔复合物，或者具有减少的核输入或输出活性，例如通过实施例24的测定法测定，减少至少50％、40％、30％、20％、10％、5％、4％、3％、2％或1％，或者所述细胞生物制品缺乏一种或多种核孔蛋白，例如NUP98或输入蛋白7；
g)所述细胞生物制品不包含组蛋白，或者具有小于1％的所述源细胞的组蛋白(例如H1、H2a、H2b、H3或H4)水平的组蛋白水平，例如通过实施例25的测定法测定；
h)所述细胞生物制品包含少于20、10、5、4、3、2或1条染色体；
i)核功能得以消除；
j)所述细胞生物制品是去核的哺乳动物细胞；
k)所述核是去除或失活的，例如通过机械力、通过辐射或通过化学消融挤压；或
l)所述细胞生物制品来自哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞具有完全或部分去除的DNA，例如在间期或有丝分裂期间去除。
35.前述权利要求中任一项的细胞生物制品组合物，其中所述细胞生物制品包含mtDNA或载体DNA。
36.前述权利要求中任一项的细胞生物制品组合物，其不包含DNA。
37.前述权利要求中任一项的细胞生物制品组合物，其中所述源细胞是内皮细胞、成纤维细胞、血细胞(例如巨噬细胞、嗜中性粒细胞、粒细胞、白细胞)、干细胞(例如间充质干细胞、脐带干细胞、骨髓干细胞、造血干细胞、诱导性多能干细胞，例如衍生自受试者细胞的诱导性多能干细胞)、胚胎干细胞(例如来自胚胎卵黄囊、胎盘、脐带、胎儿皮肤、青少年皮肤、血液、骨髓、脂肪组织、红细胞生成组织、造血组织的干细胞)、成肌细胞、实质细胞(例如肝细胞)、肺泡细胞、神经元(例如视网膜神经元细胞)、前体细胞(例如视网膜前体细胞、原粒细胞、髓样前体细胞、胸腺细胞、性母细胞、原巨核细胞、幼巨核细胞、成黑色素细胞、淋巴母细胞、骨髓前体细胞、正常红细胞或成血管细胞)、祖细胞(例如心脏祖细胞、卫星细胞、放射状胶质细胞、骨髓基质细胞、胰腺祖细胞、内皮祖细胞、母细胞)或永生化细胞(例如HeLa、HEK293、HFF-1、MRC-5、WI-38、IMR 90、IMR 91、PER.C6、HT-1080或BJ细胞)。
38.前述权利要求中任一项的细胞生物制品组合物，其中所述源细胞是原代细胞、永生化细胞或细胞系(例如原粒细胞系，例如C2C12)。
39.前述权利要求中任一项的细胞生物制品组合物，其中所述细胞生物制品来自具有经修饰的基因组，例如具有降低的免疫原性(例如，通过基因组编辑以去除MHC复合物)的源细胞。
40.前述权利要求中任一项的细胞生物制品组合物，其中所述源细胞来自用抗炎信号处理的细胞培养物。
41.前述权利要求中任一项的细胞生物制品组合物，其中所述源细胞是基本上非免疫原性的，例如，使用本文所述的测定法测定。
42.前述权利要求中任一项的细胞生物制品组合物，其中所述源细胞包含外源剂，例如治疗剂。
43.前述权利要求中任一项的细胞生物制品组合物，其中所述源细胞是重组细胞。
44.前述权利要求中任一项的细胞生物制品组合物，其中所述细胞生物制品进一步包含外源剂，例如治疗剂，例如蛋白质或核酸(例如RNA，例如mRNA或miRNA)。
45.前述权利要求中任一项的细胞生物制品组合物，其中所述外源剂以由所述细胞生物制品所包含的至少或不超过10、20、50、100、200、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000或1,000,000个拷贝存在，或者以每细胞生物制品至少或不超过10、20、50、100、200、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000或1,000,000个拷贝的平均水平存在。
46.前述权利要求中任一项的细胞生物制品组合物，其中所述细胞生物制品具有改变的，例如增加或降低的一种或多种内源分子例如蛋白质或核酸的水平，例如由于用siRNA或基因编辑酶对所述源细胞例如哺乳动物源细胞进行处理。
47.前述权利要求中任一项的细胞生物制品组合物，其中所述内源分子以由所述细胞生物制品所包含的至少或不超过10、20、50、100、200、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000或1,000,000个拷贝存在，或者以每细胞生物制品至少或不超过10、20、50、100、200、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000或1,000,000个拷贝的平均水平存在。
48.前述权利要求中任一项的细胞生物制品组合物，其中所述内源分子(例如RNA或蛋白质)以比其在所述源细胞中的浓度大至少1、2、3、4、5、10、20、50、100、500、103、5.0x103、104、5.0x104、105、5.0x105、106、5.0x106、1.0x107、5.0x107或1.0x108的浓度存在。
49.前述权利要求中任一项的细胞生物制品组合物，其中所述试剂例如治疗剂选自蛋白质、蛋白质复合物(例如包含至少2、3、4、5、10、20或50种蛋白质，例如至少2、3、4、5、10、20或50种不同的蛋白质)、多肽、核酸(例如DNA、染色体或RNA，例如mRNA、siRNA或miRNA)或小分子。
50.前述权利要求中任一项的细胞生物制品组合物，其中所述外源剂包含位点特异性核酸酶，例如Cas9分子、TALEN或ZFN。
51.前述权利要求中任一项的细胞生物制品组合物，其中所述细胞生物制品不包含融合剂。
52.权利要求1-50中任一项的细胞生物制品组合物，其包含融合剂。
53.权利要求52的细胞生物制品组合物，其中所述融合剂置于所述细胞生物制品的膜中。
54.权利要求52的细胞生物制品组合物，其中所述融合剂是蛋白质融合剂、脂质融合剂、化学融合剂或小分子融合剂。
55.前述权利要求中任一项的细胞生物制品组合物，其中所述细胞生物制品与靶细胞结合或作用于靶细胞。
56.权利要求55的细胞生物制品组合物，其中所述靶细胞是除HeLa细胞外，或者所述靶细胞不是转化或永生化的。
57.细胞生物制品组合物，其包含多个根据前述权利要求中任一项的细胞生物制品。
58.权利要求57的细胞生物制品组合物，其中所述多个细胞生物制品相同。
59.权利要求57的细胞生物制品组合物，其中所述多个细胞生物制品不同。
60.权利要求57-59中任一项的细胞生物制品组合物，其中所述多个细胞生物制品来自一个或多个源细胞。
61.权利要求57-60中任一项的细胞生物制品组合物，其中所述多个中的至少50％的细胞生物制品具有所述细胞生物制品组合物中所述细胞生物制品的平均直径的10％、20％、30％、40％或50％内的直径。
62.权利要求57-61中任一项的细胞生物制品组合物，其中所述多个中的至少50％的细胞生物制品具有所述细胞生物制品组合物中所述细胞生物制品的平均体积的10％、20％、30％、40％或50％内的体积。
63.权利要求57-62中任一项的细胞生物制品组合物，其中所述多个中的至少50％的细胞生物制品具有所述细胞生物制品组合物中所述细胞生物制品中平均治疗剂拷贝数的10％、20％、30％、40％或50％内的治疗剂的拷贝数。
64.权利要求57-63中任一项的细胞生物制品组合物，其包含至少105、106、107、108、109或1010个细胞生物制品。
65.权利要求57-64中任一项的细胞生物制品组合物，其体积为至少1ul、2ul、5ul、10ul、20ul、50ul、100ul、200ul、500ul、1ml、2ml、5ml或10ml。
66.药物组合物，其包含前述权利要求中任一项的细胞生物制品组合物和药学上可接受的载体。
67.适于施用于人类受试者的药物组合物，其包含细胞生物制品和药学上可接受的载体，其中：
i)所述细胞生物制品来自源细胞，例如哺乳动物源细胞，
ii)所述细胞生物制品是去核细胞或具有部分或完全核失活(例如核去除)的细胞，并且
iii)所述细胞生物制品不是来自红系细胞或血小板。
68.权利要求66或67的药物组合物，其具有以下特征的一个或多个：
a)所述药物组合物符合药物或良好生产规范(GMP)标准；
b)根据良好生产规范(GMP)制备所述药物组合物；
c)所述药物组合物具有低于预定参考值的病原体水平，例如，基本上不含病原体；
d)所述药物组合物具有低于预定参考值的污染物水平，例如，基本上不含污染物；或
e)所述药物组合物具有低免疫原性，例如，如本文所述。
69.将细胞生物制品组合物施用于受试者例如人类受试者的方法，其包括将权利要求1-65中任一项的细胞生物制品组合物或权利要求66-68中任一项的药物组合物施用于所述受试者，从而将所述细胞生物制品组合物施用于所述受试者。
70.将细胞生物制品组合物施用于受试者例如人类受试者的方法，其包括将细胞生物制品组合物施用于所述受试者，其中：
i)所述细胞生物制品来自源细胞，例如哺乳动物源细胞，
ii)所述细胞生物制品是去核细胞或具有部分或完全核失活(例如核去除)的细胞，并且
iii)所述细胞生物制品不是来自红系细胞或血小板，
从而将所述细胞生物制品组合物施用于所述受试者。
71.将治疗剂递送至受试者的方法，其包括将权利要求1-65中任一项的细胞生物制品组合物或权利要求66-68中任一项的药物组合物施用于所述受试者，其中以使得所述治疗剂被递送的量和/或时间施用所述细胞生物制品组合物。
72.将治疗剂递送至受试者的方法，其包括将细胞生物制品组合物施用于所述受试者，其中：
i)所述细胞生物制品来自源细胞，例如哺乳动物源细胞，
ii)所述细胞生物制品是去核细胞或具有部分或完全核失活(例如核去除)的细胞，
iii)所述细胞生物制品不是来自红系细胞或血小板，并且
iv)所述细胞生物制品包含所述治疗剂，
从而将所述治疗剂递送至所述受试者。
73.调控例如增强受试者中生物学功能的方法，其包括将权利要求1-65中任一项的细胞生物制品组合物或权利要求66-68中任一项的药物组合物施用于所述受试者，从而调控所述受试者中的所述生物学功能。
74.调控例如增强受试者中生物学功能的方法，其包括将细胞生物制品组合物施用于所述受试者，其中：
i)所述细胞生物制品来自源细胞，例如哺乳动物源细胞，
ii)所述细胞生物制品是去核细胞或具有部分或完全核失活(例如核去除)的细胞，并且
iii)所述细胞生物制品不是来自红系细胞或血小板，
从而调控所述受试者中的所述生物学功能。
75.权利要求73或74的方法，其中所述生物学功能选自：
a)调控例如抑制或刺激酶；
b)调控例如增加或降低所述受试者中分子(例如蛋白质、核酸或代谢物、药物或毒素)的水平，例如通过抑制或刺激所述因子的合成或通过抑制或刺激所述因子的降解来进行；
c)调控例如增加或降低靶细胞或组织的存活力；或
d)调控蛋白质状态，例如增加或降低所述蛋白质的磷酸化，或调控所述蛋白质构象；
e)促进损伤愈合；
f)调控例如增加或降低两个细胞之间的相互作用；
g)调控例如促进或抑制细胞分化；
h)改变所述受试者中因子(例如蛋白质、核酸、代谢物、药物或毒素)的分布；
i)调控例如增加或降低免疫应答；或
j)调控例如增加或降低细胞向靶组织的募集。
76.将功能递送至受试者的方法，其包括将细胞生物制品组合物施用于所述受试者，所述细胞生物制品组合物包含权利要求1-65中任一项的细胞生物制品组合物或权利要求66-68中任一项的药物组合物，其中以使得所述功能在所述受试者中得到递送的量和/或时间施用所述细胞生物制品组合物。
77.将功能递送至受试者的方法，其包括将细胞生物制品组合物施用于所述受试者，其中：
i)所述细胞生物制品来自源细胞，例如哺乳动物源细胞，
ii)所述细胞生物制品是去核细胞或具有部分或完全核失活(例如核去除)的细胞，并且
iii)所述细胞生物制品不是来自红系细胞或血小板，
从而将所述功能递送至所述受试者。
78.将功能靶向到受试者的方法，其包括将细胞生物制品组合物施用于所述受试者，所述细胞生物制品组合物包含权利要求1-65中任一项的细胞生物制品组合物或权利要求66-68中任一项的药物组合物，其中以使得所述功能在所述受试者中得到靶向的量和/或时间施用所述细胞生物制品组合物。
79.将功能靶向到受试者的方法，其包括将细胞生物制品组合物施用于所述受试者，其中：
i)所述细胞生物制品来自源细胞，例如哺乳动物源细胞，
ii)所述细胞生物制品是去核细胞或具有部分或完全核失活(例如核去除)的细胞，并且
iii)所述细胞生物制品不是来自红系细胞或血小板，
从而将所述功能靶向到所述受试者。
80.权利要求69-79中任一项的方法，其中所述受试者是人类受试者。
81.权利要求69-80中任一项的方法，其中所述多个细胞生物制品具有局部作用。
82.权利要求69-80中任一项的方法，其中所述多个细胞生物制品具有远端作用。
83.权利要求69-82中任一项的方法，其中所述受试者患有癌症、炎性病症、自身免疫性疾病、慢性疾病、炎症、器官功能受损、感染性疾病、变性性病症、遗传性疾病(例如隐性遗传性病症或显性遗传性病症)或损伤。
84.权利要求83的方法，其中所述受试者患有癌症，并且所述细胞生物制品包含新抗原。
85.权利要求83的方法，其中所述受试者患有感染性疾病，并且所述细胞生物制品包含所述感染性疾病的抗原。
86.权利要求83的方法，其中所述受试者患有遗传缺陷，并且所述细胞生物制品包含所述受试者缺乏的蛋白质或编码所述蛋白质的核酸(例如mRNA)。
87.权利要求83的方法，其中所述受试者患有显性遗传性病症，并且所述细胞生物制品包含显性突变体等位基因的核酸抑制剂(例如siRNA或miRNA)。
88.权利要求69-87中任一项的方法，其中所述受试者需要疫苗接种。
89.权利要求69-88中任一项的方法，其中所述受试者需要再生，例如损伤部位的再生。
90.权利要求69-89中任一项的方法，其中将所述细胞生物制品组合物施用于所述受试者至少1、2、3、4或5次。
91.权利要求69-90中任一项的方法，其中将所述细胞生物制品组合物系统地(例如，口服、肠胃外、皮下、静脉内、肌内、腹膜内)或局部地施用于所述受试者。
92.权利要求69-91中任一项的方法，其中将所述细胞生物制品组合物施用于所述受试者，使得所述细胞生物制品组合物到达选自以下的靶组织：肝、肺、心脏、脾、胰腺、胃肠道、肾、睾丸、卵巢、脑、生殖器官、中枢神经系统、外周神经系统、骨骼肌、内皮、内耳或眼。
93.权利要求69-92中任一项的方法，其中所述细胞生物制品组合物与免疫抑制剂例如糖皮质激素、细胞抑制剂、抗体或抑免蛋白调节剂共施用。
94.权利要求69-92中任一项的方法，其中所述细胞生物制品组合物与免疫刺激剂例如佐剂、白介素、细胞因子或趋化因子共施用。
95.权利要求69-94中任一项的方法，其中所述细胞生物制品组合物的施用导致所述受试者中的靶细胞中基因的上调或下调，例如其中所述细胞生物制品包含转录激活物或阻遏物、翻译激活物或阻遏物、或转录的表观遗传激活物或阻遏物。
96.制备药物细胞生物制品组合物的方法，其包括：
a)提供源细胞，例如哺乳动物源细胞；
b)从所述源细胞产生细胞生物制品；和
c)配制所述细胞生物制品，例如配制为适于施用于受试者的药物组合物。
97.权利要求96的方法，其包括使所述源细胞的核失活。
98.制备细胞生物制品组合物的方法，其包括：
a)提供多个源细胞，例如哺乳动物源细胞；
b)从所述多个源细胞产生至少105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014或1015个细胞生物制品，例如通过去核进行。
99.制备药物细胞生物制品组合物的方法，其包括：
a)提供根据权利要求1-65中任一项的细胞生物制品组合物或根据权利要求66-68中任一项的药物组合物；和
b)配制所述细胞生物制品组合物，例如配制为适于施用于受试者的药物组合物。
100.权利要求99的方法，其中所述细胞生物制品组合物包含至少105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014或1015个细胞生物制品。
101.权利要求99或100的方法，其中所述细胞生物制品组合物包含至少10ml、20ml、50ml、100ml、200ml、500ml、1L、2L、5L、10L、20L或50L。
102.权利要求99-101中任一项的方法，其包括对所述哺乳动物源细胞进行去核，例如通过化学去核，使用机械力，例如使用过滤器或离心机，细胞骨架的至少部分破坏进行。
103.权利要求96-102中任一项的方法，其包括以下的一个或多个：囊泡化、低渗处理、挤压或离心。
104.权利要求96-103中任一项的方法，其包括在所述细胞中遗传表达外源剂或将所述外源剂加载到所述源细胞或细胞生物制品中。
105.权利要求96-104中任一项的方法，其包括使所述源细胞与编码多肽剂的DNA接触，例如在使所述核失活，例如使所述源细胞去核之前。
106.权利要求96-105中任一项的方法，其包括使所述源细胞与编码多肽剂的RNA接触，例如在使所述核失活，例如使所述源细胞去核之前或之后。
107.权利要求96-106中任一项的方法，其包括将治疗剂(例如核酸或蛋白质)引入到细胞生物制品中，例如通过电穿孔。
108.权利要求96-107中任一项的方法，其中所述源细胞是内皮细胞、成纤维细胞、血细胞(例如巨噬细胞、嗜中性粒细胞、粒细胞、白细胞)、干细胞(例如间充质干细胞、脐带干细胞、骨髓干细胞、造血干细胞、诱导性多能干细胞，例如衍生自受试者细胞的诱导性多能干细胞)、胚胎干细胞(例如来自胚胎卵黄囊、胎盘、脐带、胎儿皮肤、青少年皮肤、血液、骨髓、脂肪组织、红细胞生成组织、造血组织的干细胞)、成肌细胞、实质细胞(例如肝细胞)、肺泡细胞、神经元(例如视网膜神经元细胞)、前体细胞(例如视网膜前体细胞、原粒细胞、髓样前体细胞、胸腺细胞、性母细胞、原巨核细胞、幼巨核细胞、成黑色素细胞、淋巴母细胞、骨髓前体细胞、正常红细胞或成血管细胞)、祖细胞(例如心脏祖细胞、卫星细胞、放射状胶质细胞、骨髓基质细胞、胰腺祖细胞、内皮祖细胞、母细胞)或永生化细胞(例如HeLa、HEK293、HFF-1、MRC-5、WI-38、IMR 90、IMR 91、PER.C6、HT-1080或BJ细胞)。
109.权利要求96-108中任一项的方法，其中所述细胞生物制品来自具有经修饰的基因组，例如具有降低的免疫原性(例如，通过基因组编辑以去除MHC复合物)的哺乳动物细胞。
110.权利要求96-109中任一项的方法，其中所述源细胞来自用抗炎信号处理的细胞培养物。
111.权利要求96-110中任一项的方法，其进一步包括使步骤a)的所述源细胞与抗炎信号接触，例如在使所述核失活，例如使所述细胞去核之前或之后。
112.制备细胞生物制品组合物的方法，其包括：
a)提供，例如产生，根据权利要求1-65中任一项的细胞生物制品组合物；和
b)测定来自所述细胞生物制品组合物的一种或多种细胞生物制品，以确定是否符合以下标准的一个或多个(例如2个、3个或全部)：
i)所述细胞生物制品以至少1,000个拷贝的拷贝数包含治疗剂，例如，如通过实施例31的测定法所测量的；
ii)所述细胞生物制品包含脂质组合物，其中CL、Cer、DAG、HexCer、LPA、LPC、LPE、LPG、LPI、LPS、PA、PC、PE、PG、PI、PS、CE、SM和TAG的一种或多种在所述源细胞中相应脂质水平的75％内；
iii)所述细胞生物制品包含与所述源细胞相似的蛋白质组学组成，例如使用实施例30的测定法测定；
iv)所述细胞生物制品包含在所述源细胞中相应比率的10％、20％、30％、40％或50％内的脂质与蛋白质的比率，例如，如使用实施例37的测定法所测量；
v)所述细胞生物制品包含在所述源细胞中相应比率的10％、20％、30％、40％或50％内的蛋白质与核酸(例如DNA)的比率，例如，如使用实施例38的测定法所测量；
vi)所述细胞生物制品包含在所述源细胞中相应比率的10％、20％、30％、40％或50％内的脂质与核酸(例如DNA)的比率，例如，如使用实施例39的测定法所测量；
vii)所述细胞生物制品在受试者中，例如小鼠中具有在参考细胞，例如所述源细胞的半衰期的90％内的半衰期，例如通过实施例60的测定法测定；
viii)所述细胞生物制品将葡萄糖(例如标记的葡萄糖，例如2-NBDG)跨膜运输，例如比阴性对照，例如，在不存在葡萄糖的情况下在其他方面相似的细胞生物制品多至少10％，例如，如使用实施例49的测定法所测量；
ix)所述细胞生物制品在腔中包含以下酯酶活性，其在参考细胞，例如所述源细胞或小鼠胚胎成纤维细胞中的酯酶活性的90％内，例如使用实施例51的测定法测定；
x)所述细胞生物制品包含以下代谢活性水平，其在参考细胞例如所述源细胞中的代谢活性(例如柠檬酸合酶活性)的90％内，例如，如实施例53中所述；
xi)所述细胞生物制品包含以下呼吸水平(例如耗氧率)，其在参考细胞例如所述源细胞中的呼吸水平的90％内，例如，如实施例54中所述；
xii)所述细胞生物制品包含至多18,000、17,000、16,000、15,000、14,000、13,000、12,000、11,000或10,000MFI的膜联蛋白-V染色水平，例如使用实施例55的测定法测定，或者其中所述细胞生物制品包含以下膜联蛋白-V染色水平，其比在实施例55的测定法中用甲萘醌处理的在其他方面相似的细胞生物制品的膜联蛋白-V染色水平低至少5％、10％、20％、30％、40％或50％，或者其中所述细胞生物制品包含以下膜联蛋白-V染色水平，其比在实施例55的测定法中用甲萘醌处理的巨噬细胞的膜联蛋白-V染色水平低至少5％、10％、20％、30％、40％或50％；
xiii)所述细胞生物制品具有比所述源细胞的miRNA含量水平至少1％的miRNA含量水平，例如通过实施例27的测定法测定；
xiv)所述细胞生物制品具有在所述源细胞的比率的90％内的可溶性蛋白质:非可溶性蛋白质比率，例如通过实施例35的测定法测定；
xv)所述细胞生物制品具有小于细胞生物制品的脂质含量的5％的LPS水平，例如，如通过实施例36的测定法所测量；
xvi)所述细胞生物制品能够进行信号转导，例如传输细胞外信号，例如响应于胰岛素的AKT磷酸化，或响应于胰岛素的葡萄糖(例如标记的葡萄糖，例如2-NBDG)摄取，例如比阴性对照，例如在不存在胰岛素的情况下在其他方面相似的细胞生物制品多至少10％，例如使用实施例48的测定法测定；
xvii)所述细胞生物制品具有比由参考细胞，例如所述源细胞或骨髓基质细胞(BMSC)诱导的近分泌信号传导的水平高至少5％的近分泌信号传导水平，例如通过实施例56的测定法测定；
xviii)所述细胞生物制品具有比由参考细胞，例如所述源细胞或巨噬细胞诱导的旁分泌信号传导的水平高至少5％的旁分泌信号传导水平，例如通过实施例57的测定法测定；
xix)所述细胞生物制品以与参考细胞，例如所述源细胞或C2C12细胞中聚合的肌动蛋白的水平相比在5％内的水平的聚合肌动蛋白，例如通过实施例58的测定法测定；
xx)所述细胞生物制品具有参考细胞，例如所述源细胞或C2C12细胞的膜电位的约5％内的膜电位，例如通过实施例59的测定法测定，或者其中所述细胞生物制品具有约-20至-150mV、-20至-50mV、-50至-100mV或-100至-150mV的膜电位；
xxi)所述细胞生物制品能够分泌蛋白质，例如以比参考细胞，例如小鼠胚胎成纤维细胞高至少5％的速率，例如使用实施例47的测定法测定；或
xxii)所述细胞生物制品具有低免疫原性，例如，如本文所述；和
c)(任选地)如果符合所述标准的一个或多个，则批准释放所述细胞生物制品组合物。
113.制备细胞生物制品组合物的方法，其包括：
a)提供，例如产生，根据权利要求1-65中任一项的细胞生物制品组合物；和
b)测定来自所述细胞生物制品组合物的一种或多种细胞生物制品，以确定以下因素的一个或多个的存在或水平：
i)免疫原性分子，例如免疫原性蛋白质，例如，如本文所述；
ii)病原体，例如细菌或病毒；或
iii)污染物；和
c)(任选地)如果所述因素的一个或多个低于参考值，则批准释放所述细胞生物制品组合物。
114.权利要求113的方法，其中如果确定可检测的水平，例如高于参考值的值，则丢弃含有所述细胞生物制品组合物的样品。
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