ES2283298T3 - Analogos de l-ribo-lna. - Google Patents
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Abstract
Oligómero que comprende al menos un análogo de nucleósido con la **Fórmula** general, en donde X se selecciona de entre -O-, -S-, -N(RN*)-, -C(R6R6*)-; B se selecciona de entre hidrógeno, hidroxilo, C1-4-alcoxilo opcionalmente sustituido, C1-4-alquilo opcionalmente sustituido, C1-4-aciloxilo opcionalmente sustituido, nucleobases, intercaladores del ADN, grupos fotoquímicamente activos, grupos termoquímicamente activos, grupos quelantes, grupos indicadores, y ligandos; P designa la posición radical para un enlace internucleósidos a un monómero sucesivo, o un grupo 5''-terminal, tal enlace intenucleósidos o grupo 5''-terminal incluyendo opcionalmente el sustituyente R5 o, de forma igualmente aplicable, el sustituyente R5*; P* designa un enlace internucleósidos a un monómero precedente, o un grupo 3''-terminal.
Description
Análogos de
L-ribo-LNA.
La presente invención se refiere al campo de los
análogos de nucleósidos bicíclicos configurados como
L-ribo, y a la síntesis de tales análogos de
nucleósidos, los cuales son útiles en la formación de
oligonucleótidos sintéticos capaces de formar dúplexes de
nucleobases específicas con ácidos nucleicos complementarios de
hebra simple y doble hebra. La invención también se refiere al
campo de los análogos de nucleósidos bicíclicos configurados como
L-ribo, los cuales pueden usarse como drogas
terapéuticas, y los cuales pueden incorporarse en
oligonucleótidos.
Los oligonucleótidos sintéticos son compuestos
usados ampliamente en campos dispares tales como la biología
molecular y los diagnósticos y terapias basados en el ADN.
Para ser útiles en el amplio rango de diferentes
aplicaciones esbozados más arriba, los oligonucleótidos deben
satisfacer un número elevado de diferentes requisitos. Por ejemplo,
como agentes terapéuticos, un oligonucleótido útil debe ser capaz
de penetrar la membrana celular, tener una buena resistencia a las
nucleasas extra- e intracelulares, y tener preferiblemente la
capacidad de reclutar enzimas endógenos tales como la RNAsa H. En
el diagnóstico basado en ADN y en la biología molecular, son
importantes otras propiedades, tales como, por ejemplo, la
capacidad de los oligonucleótidos para actuar como sustratos
eficientes para un amplio rango de diferentes enzimas desarrollados
para actuar sobre ácidos nucleicos naturales, tales como, por
ejemplo, las polimerasas, las quinasas, las ligasas y las
fosfatasas. No obstante, la propiedad fundamental de los
oligonucleótidos, la cual subyace todos los usos, es su capacidad
para reconocer e hibridarse, de forma específica para la secuencia,
con ácidos nucleicos de hebra simple complementarios, empleando el
enlace de hidrógeno de Watson-Crick
(A-T y G-C), u otros esquemas de
enlaces de hidrógeno tales como el modo de Hoogsteen. Hay dos
términos importante, afinidad y especificidad, usados comúnmente
para caracterizar las propiedades de hibridación de un
oligonucleótido determinado. La afinidad es una medida de la fuerza
de unión del oligonucleótido a su secuencia diana complementaria
(expresada como la termoestabilidad (T_{m}) del dúplex). Cada par
de nucleobases en el dúplex contribuye a la termoestabilidad y, por
tanto, la afinidad incrementa con el mayor tamaño (número de
nucleobases) del oligonucleotido. La especificidad es una medida de
la capacidad del oligonucleótido para discriminar entre una
secuencia diana completamente complementaria y una mal emparejada.
En otras palabras, la especificidad es una medida de la pérdida de
afinidad asociada con los pares de nucleobases mal emparejados en
la diana.
Para un tamaño de oligonucleótido constante, la
especificidad aumenta con un número creciente de emparejamientos
erróneos entre el oligonucleótido y su diana (es decir, el
porcentaje de emparejamientos erróneos aumenta). A la inversa, la
especificidad disminuye cuando se incrementa el tamaño del
oligonucleótido con un número constante de emparejamientos erróneos
(es decir, el porcentaje de emparejamientos erróneos disminuye).
Dicho de otro modo, un incremento en la afinidad de un
oligonucleótido ocurre a expensas de la especificidad, y
viceversa.
Dada la escasez de oligonucleótidos naturales,
son altamente deseables las nuevas estrategias para potenciar la
especificidad y afinidad para las terapias y diagnósticos basados en
ADN, y, en general, para las técnicas de biología molecular.
Se sabe que los oligonucleótidos experimentar
una transición conformacional en el curso de su hibridación con una
secuencia diana, desde la estructura de hélice relativamente
aleatoria del estado de hebra simple, hasta la estructura ordenada
del estado dúplex.
Por tanto, la restricción conformacional se ha
aplicado durante los últimos años a los oligonucleótidos en la
búsqueda de análogos que exhibieran propiedades de hibridación
mejoradas en comparación con los
(2'-desoxi)oligonucleótidos no modificados.
Por ejemplo, los nucleósidos biciclo [3.3.0] con un puente
C-3',C-5'-etano
adicional (M. Tarköy, M. Bolli, B. Schweizer y C. Leumann, Helv.
Chem. Acta, 76:481 (1993); Tarköy y C. Leumann, Angew. Chem.,
Int. Ed. Engl., 32:1432 (1993); M. Egli, P. Lubini, M. Dobler y
C. Leumann, J. Am. Chem. Soc., 115:5855 (1993); M. Tarköy,
M. Bolli y C. Leumann, Helv. Chem. Acta, 77:716 (1994); M.
Bolli y C. Leumann, Angew. Chem., Int. Ed. Engl., 34:694
(1995); M. Bolli, P. Lubini y C. Leumann, Helv. Chem. Acta,
78:2077 (1995); J. C. Litten, C. Epple y C. Leumann, Bioorg.
Med. Chem. Lett., 5:1231 (1995); J. C. Litten y C. Leumann,
Helv. Chem. Acta, 79:1129 (1996); M. Bolli, J. C. Litten, R.
Schültz y C. Leumann, Chem. Biol., 3:197 (1996); M. Bolli, H.
U. Trafelet y C. Leumann, Nucleic Acids Res., 24:4660
(1996)), los nucleósidos bicarbociclo [3.1.0] con un puente
C-1',C-6'- ó
C-6',C-4'-metano
adicional (K.-H. Altmann, R. Kesselring, E. Francotte y G. Rihs,
Tetrahedron Lett., 35:2331 (1994); K.-H. Altmann, R.
Imwinkelried, R. Kesselring y G. Rihs, Tetrahedron Lett.,
35:7625 (1994); V. E., Marquez, M. A. Siddiqui, A. Ezzitouni, P.
Russ, J. Wang, R. W. Wagner y M. D. Matteucci, J. Med.
Chem., 39:3739 (1996); A. Ezzitouni y V. E., Marquez, J.
Chem. Soc. Perkin Trans., 1, 1073 (1997)), los nucleósidos
biciclo [3.3.0] y [4.3.0] que contienen un anillo
C-2',C-3'-dioxalano
adicional como un dímero con un nucleósido no modificado, en donde
el anillo adicional es parte del enlace internucleosídico que
remplaza un enlace fosfodiéster natural (R. J. Jones, S.
Swaminathan, J. F. Millagan, S. Wadwani, B. S. Froehler y M.
Matteucci, J. Am. Chem. Soc., 115:9816 (1993); J. Wang y M.
D. Matteucci, Bioorg. Med. Chem. Lett., 7:229 (1997)), los
dímeros que contienen un nucleósido biciclo[3.1.0] con un
puente
C-2',C-3'-metano
como parte de enlaces internucleósidos del tipo amida- y
sulfonamida (C. G. Yannopoulus, W. Q. Zhou, P. Nower, D. Peoch, Y.
S. Sanghvi y G. Just, Synlett, 378 (1997)), los análogos de
nucleósido biciclo[3.3.0] derivados con glucosa e
incorporados en medio de un trímero a través de enlaces
internucleósidos de formoacetal (C. G. Yannopoulus, W. Q. Zhou, P.
Nower, D. Peoch, Y. S. Sanghvi y G. Just, Synlett, 378
(1997)) y nucleósidos bicíclicos [4.3.0]- y [3.3.0] con anillos de
cinco y seis miembros conectados en
C-2',C-3' (P. Nielsen, H. M.
Pfundheller, J. Wengel, Chem. Commun., 826 (1997); P.
Nielsen, H. M. Pfundheller, J. Wengel, XII International
Roundtable: Nucleosides, Nucleotides and Their Biological
Applications; La Jolla, California, 15-19 de
septiembre, 1996; Póster PPI 43) se han sintetizado e incorporado
en oligodesoxinucleótidos. Desafortunadamente, los oligonucleótidos
que comprenden estos análogos forman, en la mayoría de los casos,
dúplex menos estables con los ácidos nucleicos complementarios en
comparación con los oligonucleótidos no modificados. En los casos en
los que se observó una mejora moderada en la estabilidad del
dúplex, está se refiere sólo a un ADN o un ARN diana, o se refiere
a oligonucleótidos completa pero no parcialmente modificados, o
viceversa.
Una valoración de la mayoría de los análogos
descritos está adicionalmente complicada por la ausencia de datos
sobre los análogos con nucleobases G, A y C, y a la ausencia de
datos que indiquen la especificidad y modo de hibridación. En
muchos casos, la síntesis de los análogos monoméricos descritos es
muy complexa, mientras que en otros casos la síntesis de los
oligonucleótidos completamente modificados es incompatible con la
química estándar del fosforamidito ampliamente usada.
Recientemente, se han descrito oligómeros que
comprenden Ácidos Nucleicos Bloqueados (Locked Nucleic Acids, LNA)
(Nielsen, P., Pfundheller, H. M., Olsen, C. E. y Wengel, J., J.
Chem. Soc. Perkin Trans., 1:3423 (1997); Nielsen, P.,
Pfundheller, H. M., Wengel, J., Chem. Commun., 9:825 (1997);
Christensen, N. K., Petersen, M., Nielsen, P., Jacobsen, J. P. y
Wengel, J., J. Am. Chem. Soc., 120:5458 (1998); Koshkin, A.
A. y Wengel, J., J. Org. Chem., 63:2778 (1998); Obika, S.,
Morio, K.-I., Hari, Y. e Imanishi, T., Bioorg. Med. Chem.
Lett., 515 (1999)). De forma interesante, la incorporación de
monómeros de LNA conteniendo un puente
2'-O,4'-C-metileno
en una secuencia oligonucleotídica condujo a una mejora sin
precedentes en la capacidad de hibridación del oligonucleótido
modificado (Singh, S. K., Nielsen, P., Koshkin, A. A., Olsen, C. E.
y Wengel, J., Chem. Commun., 455 (1998); Koshkin, A. K.,
Singh, S. K., Nielsen, P., Rajwanshi, V. K., Kumar, R., Meldgaard,
M., Olsen, C. E., y Wengel, J., Tetrahedron, 54:3607 (1998);
Koshkin, A. A. Rajwanshi, V. K., y Wengel, J., Tetrahedron
Lett., 39:4381 (1998); Singh, Sanjay K. y Wengel, J., Chem.
Commun., 1247 (1998); Kumar, R., Singh, S. K., Koshkin, A. A.,
Rajwanshi, V. K., Meldgaard, M., y Wengel, J., Bioorg. Med. Chem.
Lett., 8:2219 (1998); Obika, S. et al., Tetrahedron
Lett., 38:8735 (1997); Obika, S. et al., Tetrahedron
Lett., 39:5401 (1998); Singh, S. K., Kumar, R., y Wengel, J.,
J. Org. Chem., 63:6078 (1998); Koshkin, A. A., Nielsen, P.,
Meldgaard, M., Rajwanski, V. K., Singh, S. K., y Wengel, J., J.
Am. Chem. Soc., 120:13252 (1998); Singh, S. K., Kumar, R., y
Wengel, J., J. Org. Chem., 63:10035 (1998)). Los
oligonucleótidos que comprenden estos monómeros de LNA y el análogo
2'-tio-LNA correspondiente forman
dúplex con ADN y ARN complementarios, con estabilidad térmicas no
observadas previamente para oligonucleótidos modificados con
nucleósidos bi- o tricíclicos (\DeltaT_{m}/modificación = +3 a
+11ºC), y muestran una selectividad mejorada.
En una serie de artículos, Seela et al.
han estudiado el xilo-ADN (Figura 1, Base =
adenin-9-ilo,
citosin-1-ilo,
guanin-9-ilo o
timin-1-ilo) comprendiendo uno o más
monómeros de
2'-desoxi-\beta-D-xilofuranosil
nucleótido (Rosemeyer, H.; Seela, F., Helv. Chem. Acta,
74:748 (1991); Rosemeyer, H., Krecmerova, M., Seela, F., Helv.
Chem. Acta, 74:2054 (1991); Seela, F., Wörner, Rosemeyer, H.,
Helv. Chem. Acta, 77:883 (1994); Seela, F., Heckel, M.,
Rosemeyer, H., Helv. Chem. Acta, 79:1451 (1996); Rosemeyer,
H., Seela, F., Nucleosides Nucleotides, 14:1041 (1995);
Schoeppe, A., Hinz, H.-J., Rosemeyer, H., Seela, F., Eur. J.
Biochem., 239:33 (1996)). Comparados con los correspondientes
oligonucleótidos naturales de
2'-desoxi-\beta-D-ribofuranosilo,
el xilo-ADN generalmente presenta una estructura
secundaria parecida a una imagen especular, una formación de dúplex
entrópicamente favorable, una estabilidad incrementada hacia las
exonucleasas, y, para los oligonucleótidos que comprenden un
pequeño número de monómeros de
2'-deoxi-\beta-D-xilofuranosilo,
una afinidad térmica disminuida hacia el ADN complementario
(Rosemeyer, H., Seela, F., Helv. Chem. Acta, 74:748 (1991);
Rosemeyer, H., Krecmerova, M., Seela, F., Helv. Chem. Acta,
74:2054 (1991); Seela, F., Wörner, Rosemeyer, H., Helv. Chem.
Acta, 77:883 (1994); Seela, F., Heckel, M., Rosemeyer, H.,
Helv. Chem. Acta, 79:1451 (1996)).
WO99/14226 describe los
D-enantiómeros de análogos de oligonucleótidos y
nucleósidos bloqueados bi- y tricíclicos (LNA). También se
describen los oligonucleótidos que comprenden estos elementos.
En base a lo anterior y a la destacada propiedad
de los monómeros de LNA con puente
2'-O,4'-C-metileno,
se decidió sintetizar oligonucleótidos que comprendieran uno o más
monómeros de nucleótido de
2'-O,4'-C-metileno-\alpha-L-ribofuranosilo.
El modelado por ordenador de monómeros
\alpha-L-ribo-LNA
indica también una conformación del tipo S del anillo de furanosa.
Por tanto, el objetivo de este trabajo fue sintetizar monómero de
nucleótido
2'-O,4'-C-metileno-\alpha-L-ribofuranosilo,
y estudiar la estabilidad térmica de oligonucleótidos que
comprendieran este monómero. Los resultados muestran que el
L-ribo-LNA modificado es útil para
apuntar con elevada afinidad a ácidos nucleicos complementarios.
Cuando se toma en consideración la estereoquímica invertida en
C-3' y C-4', éste es un hecho
sorprendente.
Por tanto, los presentes inventores han
proporcionado ahora análogos de nucleósidos LNA novedosos
(L-ribo-LNA) y oligonucleótidos que
tienen incluidos en ellos análogos de nucleósidos
L-ribo-LNA. Los análogos de
nucleósido L-ribo-LNA se han
sintetizado con timina como la nucleobase, pero pueden sintetizarse
fácilmente con las otras cuatro nucleobases, proporcionando de ese
modo un conjunto completo de análogos de nucleósido para su
incorporación en oligonucleótidos.
La presente invención se refiere a oligómeros
que comprenden al menos un análogo de nucleósido (a partir de ahora
denominado "L-ribo-LNA") con la
fórmula I general,
en donde X se selecciona de entre
-O-, -S-, -N(R^{N\text{*}})-,
-C(R6R6*)-;
B se selecciona de entre hidrógeno, hidroxilo,
C_{1-4}-alcoxilo opcionalmente
sustituido, C_{1-4}-alquilo
opcionalmente sustituido,
C_{1-4}-aciloxilo opcionalmente
sustituido, nucleobases, intercaladores del ADN, grupos
fotoquímicamente activos, grupos termoquímicamente activos, grupos
quelantes, grupos indicadores, y ligandos;
P designa la posición radical para un enlace
internucleósidos a un monómero sucesivo, o un grupo
5'-terminal, tal enlace internucleósidos o grupo
5'-terminal incluyendo opcionalmente el sustituyente
R^{5} o, de forma igualmente aplicable, el sustituyente
R^{5\text{*}};
P* designa un enlace internucleósidos a un
monómero precedente, o un grupo 3'-terminal;
R^{2\text{*}} y R^{4\text{*}} designan
birradicales consistente en 1-4 grupos/átomos
seleccionados de entre -C(R^{a}R^{b})-,
-C(R^{a})=C(R^{a})-, -C(R^{a})=N-, -O-,
-Si(R^{a})_{2}-, -S-, -SO_{2}-,
-N(R^{a})-, y >C=Z,
en donde Z se selecciona de entre -O-, -S-, y
-N(R^{a})-, y R^{a} y R^{b} se seleccionan cada uno
independientemente de entre el hidrógeno,
C_{1-2}-alquilo opcionalmente
sustituido, C_{2-12}-alquenilo
opcionalmente sustituido,
C_{2-12}-alquinilo opcionalmente
sustituido, hidroxilo,
C_{1-12}-alcoxilo,
C_{2-12}-alqueniloxilo, carboxilo,
C_{1-12}-alcoxicarbonilo,
C_{1-12}-alquilcarbonilo, formilo,
arilo, ariloxi-carbonilo, ariloxilo, arilcarbonilo,
heteroarilo, heteroariloxi-carbonilo,
heteroariloxilo, heteroarilcarbonilo, amino, mono- y
di(C_{1-6}-alquil)amino,
carbamoilo, mono- y
di(C_{1-6}-alquil)-amino-carbonilo,
amino-C_{1-6}-alquilaminocarbonilo,
mono- y
di(C_{1-6}-alquil)amino-C_{1-6}-alquil-aminocarbonilo,
C_{1-6}-alquilcarbonilamino,
carbamido, C_{1-6}-alcanoiloxilo,
sulfono,
C_{1-6}-alquilsulfoniloxilo,
nitro, azido, sulfanilo,
C_{1-6}-alquitio, halógeno,
intercaladores del ADN, grupos intercaladores del ADN, grupos
fotoquímicamente activos, grupos termoquímicamente activos, grupos
quelantes, grupos indicadores, y ligandos, en donde arilo y
heteroarilo pueden estar opcionalmente sustituidos, y en donde dos
sustituyentes geminales R^{a} y R^{b} juntos pueden designar
una olefina de metileno (=CH_{2}) opcionalmente sustituida.
cada uno de los sustituyentes R^{1\text{*}},
R^{2}, R^{3\text{*}}, R^{5}, R^{5\text{*}}, R^{6}, y
R^{6\text{*}} que está presente se selecciona independientemente
de entre el hidrógeno,
C_{1-2}-alquilo opcionalmente
sustituido, C_{2-12}-alquenilo
opcionalmente sustituido,
C_{2-12}-alquinilo opcionalmente
sustituido, hidroxilo,
C_{1-12}-alcoxilo,
C_{2-12}-alqueniloxilo, carboxilo,
C_{1-12}-alcoxicarbonilo,
C_{1-12}-alquilcarbonilo, formilo,
arilo, ariloxi-carbonilo, ariloxilo, arilcarbonilo,
heteroarilo, heteroariloxi-carbonilo,
heteroariloxilo, heteroarilcarbonilo, amino, mono- y
di(C_{1-6}-alquil)amino,
carbamoilo, mono- y
di(C_{1-6}-alquil)-amino-carbonilo,
amino-C_{1-6}-alquilaminocarbonilo,
mono- y
di(C_{1-6}-alquil)amino-C_{1-6}-alquil-aminocarbonilo,
C_{1-6}-alquilcarbonilamino,
carbamido, C_{1-6}-alcanoiloxilo,
sulfono,
C_{1-6}-alquilsulfoniloxilo,
nitro, azido, sulfanilo,
C_{1-6}-alquitio, halógeno,
intercaladores del ADN, grupos intercaladores del ADN, grupos
fotoquímicamente activos, grupos termoquímicamente activos, grupos
quelantes, grupos indicadores, y ligandos, en donde arilo y
heteroarilo pueden estar opcionalmente sustituidos, y en donde dos
sustituyentes geminales juntos pueden designar oxo, tioxo, imino, u
metileno opcionalmente sustituido, o juntos pueden formar un
birradical spiro, consistente de una cadena de alquileno de
1-5 átomos de carbono, la cual está interrumpida
opcionalmente y/o terminada por uno o más heteroátomos/grupos
seleccionados de entre -O-, -S-, y -(NR^{N})-, en donde R^{N}
se seleccionan de entre hidrógeno y
C_{1-4}-alquilo, y en donde dos
sustituyente adyacente (no geminales) pueden designar un enlace
adicional resultante en un doble enlace; y R^{N\text{*}}, cuando
está presente, se selecciona de entre hidrógeno y
C_{1-4}-alquilo;
y sus sales básicas y sales por adición de
ácido.
La presente invención se refiere además a
análogos de nucleósido (L-ribo-LNA)
con la fórmula general II.
en donde el sustituyente B se
selecciona de entre nucleobases, intercaladores del ADN, grupos
fotoquímicamente activos, grupos termoquímicamente activos, grupos
quelantes, grupos indicadores, y
ligandos;
X se selecciona de entre -O-, -S-,
-N(R^{N\text{*}})-, -C(R^{6}R^{6\text{*}})-;
cada uno de Q y Q^{\text{*}} se selecciona
independientemente de entre hidrógeno, azido, halógeno, ciano,
nitro, hidroxilo, Prot-O-, Act-O-,
mercapto, Prot-S-, Act-S-,
C_{1-6}-alquiltio, amino,
Prot-N(R^{H})-,
Act-N(R^{H})-, mono- ó
di(C_{1-6}-alquil)amino,
C_{1-6}-alcoxi opcionalmente
sustituido, C_{1-6}-alquilo
opcionalmente sustituido,
C_{2-6}-alquenilo opcionalmente
sustituido, C_{2-6}-alqueniloxi
opcionalmente sustituido,
C_{2-6}-alquinilo opcionalmente
sustituido, C_{2-6}-alquiniloxi
opcionalmente sustituido, monofosfato, difosfato, trifosfato,
intercaladores del ADN, grupos fotoquímicamente activos, grupos
termoquímicamente activos, grupos quelantes, grupos indicadores,
ligandos, carboxilo, sulfono, hidroximetilo,
Prot-O-CH_{2}-,
Act-O-CH_{2}-, aminometilo,
Prot-N(R^{H})-CH_{2}-,
Act-N (R^{H})-CH_{2}-,
carboximetilo, sulfonometilo, en donde Prot es un grupo protector
respectivamente para -OH, -SH y -NH(R^{H}), Act es un grupo
de activación respectivamente para -OH, -SH y -NH(R^{H}),
y y R^{H} se selecciona de entre hidrógeno y
C_{1-6}-alquilo;
y R^{2\text{*}} y R^{4\text{*}} juntos
designan un birradical seleccionado de entre -O-,
-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{r+s+1}-,
-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{r}-O-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{s}-,
-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{r}-S-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{s}-, -(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{r}-N(R^{\text{*}})-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{s}-, -O-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{r+s}-O-, -S-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{r+s}-O-, -O-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{r+s}-S-, -N (R^{\text{*}})-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{r+s}-O-, -O-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{r+s} N(R^{\text{*}})-, -S-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{r+s}-S-, -N(R^{\text{*}})-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{r+s}-N(R^{\text{*}})-, -N(R^{\text{*}})-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{r+s}-S-, y -S-
(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{r+s}-N(R^{\text{*}})-;
-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{r}-S-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{s}-, -(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{r}-N(R^{\text{*}})-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{s}-, -O-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{r+s}-O-, -S-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{r+s}-O-, -O-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{r+s}-S-, -N (R^{\text{*}})-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{r+s}-O-, -O-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{r+s} N(R^{\text{*}})-, -S-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{r+s}-S-, -N(R^{\text{*}})-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{r+s}-N(R^{\text{*}})-, -N(R^{\text{*}})-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{r+s}-S-, y -S-
(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{r+s}-N(R^{\text{*}})-;
en donde cada R^{\text{*}} se selecciona
independientemente de entre hidrógeno, azido, halógeno, ciano,
nitro, hidroxilo, mercapto, amino, mono- o
di(C_{1-6}-alquil)amino,
C_{1-6}-alcoxi opcionalmente
sustituido, C_{1-6}-alquilo
opcionalmente sustituido, intercaladores del ADN, grupos
fotoquímicamente activos, grupos termoquímicamente activos, grupos
quelantes, grupos indicadores, y ligandos, y/o dos R^{\text{*}}
adyacentes (no geminales) pueden juntos designar un doble enlace, y
cada uno de r y s es 0-3, a condición de que la suma
r+1 sea 1-4;
cada uno de los sustituyentes R^{1\text{*}},
R^{2}, R^{3\text{*}}, R^{5}, R^{5\text{*}}, R^{6}, y
R^{6\text{*}} se selecciona independientemente de entre el
hidrógeno, C_{1-2}-alquilo
opcionalmente sustituido,
C_{2-12}-alquenilo opcionalmente
sustituido, C_{2-12}-alquinilo
opcionalmente sustituido, hidroxilo,
C_{1-12}-alcoxilo,
C_{2-12}-alqueniloxilo,
carboxilo,
C_{1-12}-alcoxicarbonilo,
C_{1-12}-alquilcarbonilo, formilo,
arilo, ariloxi-carbonilo, ariloxilo,
arilcarbonilo, heteroarilo, heteroariloxi-carbonilo,
heteroariloxilo, heteroarilcarbonilo, amino, mono- y
di(C_{1-6}-alquil)amino,
carbamoilo, mono- y
di(C_{1-6}-alquil)-amino-carbonilo,
amino-C_{1-6}-alquilaminocarbonilo,
mono- y
di(C_{1-6}-alquil)amino-C_{1-6}-alquil-aminocarbonilo,
C_{1-6}-alquilcarbonilamino,
carbamido, C_{1-6}-alcanoiloxilo,
sulfono,
C_{1-6}-alquilsulfoniloxilo,
nitro, azido, sulfanilo,
C_{1-6}-alquitio, halógeno,
intercaladores del ADN, grupos intercaladores del ADN, grupos
fotoquímicamente activos, grupos termoquímicamente activos, grupos
quelantes, grupos indicadores, y ligandos, en donde arilo y
heteroarilo pueden estar opcionalmente sustituidos, y en donde dos
sustituyentes geminales juntos pueden designar oxo, tioxo, imino, u
metileno opcionalmente sustituido, o juntos pueden formar un
birradical spiro, consistente de una cadena de alquileno de
1-5 átomos de carbono, la cual está interrumpida
opcionalmente y/o terminada por uno o más heteroátomos/grupos
seleccionados de entre -O-, -S-, y -(NR^{N})-, en donde R^{N}
se seleccionan de entre hidrógeno y
C_{1-4}-alquilo, y en donde dos
sustituyente adyacente (no geminales) pueden designar un enlace
adicional resultante n un doble enlace; y R^{N\text{*}}, cuando
está presente, se selecciona de entre hidrógeno y
C_{1-4}-alquilo;
y sus sales básicas y sales por adición de
ácido.
a condición de que cualquier grupo químico
(incluyendo cualquier nucleobase) que sea reactivo en las
condiciones que predominan en la síntesis de oligonucleótidos tenga
opcionalmente protegido su grupo funcional.
La presente invención se refiere también al uso
de los análogos de nucleósido
(L-ribo-LNA) para la preparación de
oligómeros, y el uso de los oligómeros, así como de los análogos de
nucleósido (L-ribo-LNA) en
diagnósticos, investigación en biología molecular, y en terapia.
Cuando se usa en la presente invención, el
término "L-ribo-LNA"
("L-ribo-configurated Locked
Nucleoside Analogues") se refiere a análogos bloqueados de
nucleósido configurado como L-ribo, bien
incorporados en el oligómero de la invención (fórmula general I),
bien como especies químicas discretas (fórmula general II). El
término "L-ribo-LNA monomérico"
se refiere específicamente al último caso.
Tal y como se ha mencionado más arriba, la
presente invención, entre otros, se refiere a oligómeros
(oligonucleótidos) novedosos que comprenden uno o más análogos de
nucleósidos bicíclicos configurados como L-ribo (a
partir de ahora denominado
"L-ribo-LNA").
Cada uno de los
L-ribo-LNA posibles incorporados en
un oligómero (oligonucleótido) tiene la fórmula general I,
en donde X se selecciona de entre
-O- (el motivo L-ribofuranosa), -S-,
-N(R^{N\text{*}})-, -C(R^{6}R^{6\text{*}})-,
en donde R^{6}, R^{6\text{*}}, y R^{N\text{*}} son como se
define más adelante. Por tanto, los
L-ribo-LNA incorporados en el
oligómero comprenden un anillo de 5 miembros como una parte esencial
de la estructura
bicíclica.
Entre los posibles anillos de 5 miembros, las
situaciones en las que X designa -O-, -S- y
-N(R^{N\text{*}})- parecen ser especialmente interesantes,
y la situación en donde X es -O- parece ser particularmente
interesante.
El sustituyente B puede designar un grupo que,
cuando el oligómeros está complejado con ADN o ARN, es capaz de
interaccionar (por ejemplo, mediante puentes de hidrógeno, o enlaces
covalentes, o interacción electrónica) con ADN o ARN, especialmente
nucleobases del ADN o ARN. Alternativamente, el sustituyente B puede
designar un grupo que actúa como una marca o un informador, o el
sustituyente B puede designar un grupo (por ejemplo, hidrógeno),
que se espera que tenga pocas o ningunas interacciones con el ADN o
ARN. Por tanto, el sustituyente B se selecciona preferiblemente de
entre hidrógeno, hidroxilo,
C_{1-4}-alcoxilo opcionalmente
sustituido, C_{1-4}-alquilo
opcionalmente sustituido,
C_{1-4}-aciloxilo opcionalmente
sustituido, nucleobases, intercaladores del ADN, grupos
fotoquímicamente activos, grupos termoquímicamente activos, grupos
quelantes, grupos indicadores, y ligandos.
En el contexto actual, el término
"nucleobase" abarca las nucleobases que existen de forma
natural, así como las nucleobases que existen de forma no natural.
Debería estar claro para el especialista en el campo que varias
nucleobases que se habían considerado que "existían de forma no
natural", posteriormente se han hallado en la naturaleza. Por
tanto, "nucleobase" incluye no sólo los heterociclos de purina
y pirimidina conocidos, sino también los análogos heterocíclicos y
los tautómeros de los mismos. Son ejemplos ilustrativos de
nucleobases, la adenina, guanina, timina, citosina, uracilo, purina,
xantina, diaminopurina,
8-oxo-N^{6}-metiladenina,
7-deazaxantina, 7-deazaguanina,
N^{4},N^{4}-etanocitosina,
N^{6},N^{6}-etano-2,6-diaminopurina,
5-metilcitosina,
5-(C^{3}-C^{6})-alquinilcitosina,
5-fluorouracilo, 5-bromouracilo,
pseudoiso-citosina,
2-hidroxi-5-metil-4-triazolopiridina,
isocitosina, isoguanina, inosina, y las nucleobases que "existen
de forma no natural" descritas en Benner et al., Patente
Estadounidense nº 5.432.272. Se pretende que el término
"nucleobase" abarque la totalidad de estos ejemplos, así como
los análogos y tautómeros de los mismos. La adenina, guanina,
timina, citosina y uracilo son nucleobases especialmente
interesantes, las cuales se consideran como las nucleobases que
existen de forma natural en relación a la aplicación terapéutica y
de diagnóstico en
humanos.
humanos.
Cuando se usa en la presente invención, el
término "intercalador del ADN" significa un grupo que puede
intercalarse en la hélice, dúplex o tríplex, del ADN o ARN. Son
ejemplos de partes funcionales de intercaladores del ADN: las
acridinas, el antraceno, las quinonas tales como la antraquinona, el
indol, la quinolina, la isoquinolina, las dihidroquinonas, las
antraciclinas, la tetraciclinas, el azul de metileno, la
antraciclinona, los psoralenos, las coumarinas, los haluros de
etidio, la dinemicina, los complejos de metales tales como el
1,10-fenantrolina-cobre, las
tris(4,7-difenil-1,10-fenantrolina)rutenio-cobalto-enedinas
tales como la calcheamicina, las porfirinas, la distamicina, la
netropcina, el viologen, la daunomicina. Son ejemplos especialmente
interesantes las acridinas, las quinonas tales como la antraquinona,
el azul de metileno, los psoralenos, las coumarinas, y los haluros
de etidio.
En el contexto actual, el término "grupos
fotoquímicamente activos" abarca compuestos que son capaces de
experimentar reacciones químicas a partir de su irradiación con luz.
Son ejemplos ilustrativos de grupos funcionales del presente grupo,
las quinonas, especialmente la
6-metil-1,4-naftoquinona,
la antraquinona, la naftoquinona, y la
1,4-dimetil-antraquinona, las
diazirinas, las azidas aromáticas, las benzofenonas, los
psoralenos, los compuestos diazo, y los compuestos diazirino.
En el contexto actual, el término "grupos
termoquímicamente activos" se define como un grupo funcional que
es capaz de experimentar la formación inducida termoquímicamente de
enlace covalente con otros grupos. Son ejemplos ilustrativos de
parte funcionales de grupos termoquímicamente reactivos: los ácidos
carboxílicos, los ésteres de ácidos carboxílicos tales como los
ésteres activados, los haluros de ácidos carboxílicos tales como
los fluoruros de ácido, los cloruros de ácido, los bromuros de
ácido, y los yoduros de ácido, las azidas del ácido carboxílico,
las hidrazidas del ácido carboxílico, los ácidos sulfónicos, los
ésteres de ácidos sulfónicos, los haluros de ácidos sulfónicos, las
semicarbazidas, las tiosemicarbazidas, los aldehídos, las cetonas,
los alcoholes primarios, los alcoholes secundarios, los alcoholes
terciarios, los fenoles, los haluros de alquilo, los tioles, los
disulfuros, las aminas primarias, las aminas secundarias, las aminas
terciarias, las hidrazinas, los epóxidos, las maleimidas, y los
derivados del ácido
borónico.
borónico.
En el contexto actual, el término "grupo
quelante" significa una molécula que comprende más de un sitio
de unión, y que frecuentemente se une a otra molécula, átomo o ion a
través de más de un sitio de unión a la vez. Son ejemplos de partes
funcionales de grupos quelantes: el ácido iminodiacético, el ácido
nitrilotriacético, el ácido etilendiamina tetraacético (EDTA), el
ácido aminofosfónico, etc.
En el contexto actual, el término "grupo
indicador" significa un grupo que es detectable, bien por sí
mismo o como parte de una serie de detección. Son ejemplos de partes
funcionales de grupos indicadores: la biotina, la digoxigenina, los
grupos fluorescentes (grupos que son capaces de absorber radiación
electromagnética, por ejemplo, luz o rayos X, de una cierta
longitud de onda, y que posteriormente remiten la energía absorbida
como radiación de mayor longitud de onda; son ejemplos ilustrativos
el dansilo
(5-dimetilamino)-1-naftalensulfonilo),
DOXYL
(N-oxil-4,4-dimetiloxazolidina),
PROXYL
(N-oxil-2,2,5,5-tetrametilpirrolidina),
TEMPO
(N-oxil-2,2,6,6-tetrametilpiperidina),
dinitrofenilo, acridinas, coumarinas, Cy3 y Cy5 (marcas registradas
por Biological Detection Systems, Inc.), eritrosina, ácido
coumárico, umbeliferona, Rojo de Texas, rodamina, tetrametil
rodamina, Rox,
7-nitrobenzo-2-oxa-1-diazol
(NBD), pireno, fluoresceína, europio, rutenio, samario, y otros
metales térreos raros), marcas radioisotópicas, marcas
quimioluminiscentes (marcas que son detectables a través de la
emisión de luz durante una reacción química), marcas de espín (un
radical libra (por ejemplo, nitróxidos orgánicos sustituidos) u
otras sondas paramagnéticas (por ejemplo, Cu^{2+}, Mg^{2+})
unidas a una molécula biológica, que son detectables mediante el
uso de la espectroscopia de resonancia de espín electrónico),
enzimas (tales como las peroxidasas, las fosfatasas alcalinas, las
\beta-galactosidasas, y las oxidasas de glucosa),
los antígenos, los anticuerpos, los haptenos (grupos que son
capaces de combinarse con un anticuerpo, pero que no pueden iniciar
una respuesta inmune por sí mismos, tales como péptidos y hormonas
esteroideas), sistemas portadores para la penetración de la
membrana celular, tales como: los residuos de ácido graso, las
porciones esteroideas (colesterol), la vitamina A, la vitamina D,
la vitamina E, el ácido fólico, los péptidos para receptores
específicos, los grupos para mediar la endocitosis, el factor de
crecimiento epidérmico (EGF), la bradiquinina, y el factor de
crecimiento derivado de plaquetas (PDGF). Son ejemplos
especialmente interesantes la biotina, la fluoresceína, el Rojo de
Texas, la rodamina, el dinitrofenilo, la digoxigenina, el rutenio,
el europio, el Cy5 y el Cy3.
En el contexto presente, "ligando"
significa algo que se une. Los ligandos pueden comprender grupos
funcionales tales como: grupos aromáticos (tales como benceno,
piridina, naftaleno, antraceno y fenantreno), grupos
heteroaromáticos (tales como tiofeno, furano, tetrahidrofurano,
piridina, dioxano y pirimidina), ácidos carboxílicos, ésteres de
ácidos carboxílicos, haluros de ácidos carboxílicos, azidas de
ácidos carboxílicos, hidrazidas de ácidos carboxílicos, ácidos
sulfónicos, ésteres de ácidos sulfónicos, haluros de ácidos
sulfónicos, semicarbazidas, tiosemicarbazidas, aldehídos, cetonas,
alcoholes primarios, alcoholes secundarios, alcoholes terciarios,
fenoles, haluros de alquilo, tioles, disulfuros, aminas primarias,
aminas secundarias, aminas terciarias, hidrazinas, epóxidos,
maleimidas, grupos alquilos C_{1}-C_{20}
opcionalmente interrumpidos o terminados con uno o más heteroátomos
tales como átomos de oxígeno, átomos de nitrógeno, y/o átomos de
azufre, comprendiendo opcionalmente hidrocarburos aromáticos o
mono/poliinsaturados, polioxietilenos tales como el
polietilenglicol, oligo/poliamidas tales como la
poli-\beta-alanina, poliglicina,
polilisina, péptidos, oligo/polisacáridos, oligo/polifosfatos,
toxinas, antibióticos, venenos celulares, y esteroides, y también
"ligandos por afinidad", es decir, grupos funcionales o
biomoléculas que tienen una afinidad específica por sitios sobre
determinadas proteínas, anticuerpos, poli- y oligosacáridos, y
otras biomoléculas.
Será evidente para el especialista capacitado en
el campo que los ejemplos específicos mencionados mas arriba bajo
intercaladores del ADN, grupos fotoquímicamente activos, grupos
termoquímicamente activos, grupos quelantes, grupos indicadores, y
ligandos, corresponden a la parte "activa/funcional" de los
grupos en cuestión. Para el especialista en la técnica, es evidente
además que los intercaladores del ADN, grupos fotoquímicamente
activos, grupos termoquímicamente activos, grupos quelantes, grupos
indicadores, y ligandos, se encuentran típicamente representados en
la forma M-K-, en donde M es la parte
"activa/funcional" del grupo en cuestión, y en donde K es un
espaciador a través del cual la parte "activa/funcional" está
unida al anillo de 5 miembros. Por tanto, debería sobrentenderse
que el grupo B, en el caso en el que B se selecciona de entre
intercaladores del ADN, grupos fotoquímicamente activos, grupos
termoquímicamente activos, grupos quelantes, grupos indicadores, y
ligandos, tiene la forma M-K-, en donde M es
respectivamente la parte "activa/funcional" del intercalador
del ADN, grupo fotoquímicamente activo, grupo termoquímicamente
activo, grupo quelante, grupo indicador, y ligando, y en donde K es
un espaciador opcional que comprende 1-50 átomos,
preferiblemente 1-30 átomos, en particular
1-15 átomos, entre el anillo de 5 miembros y la
parte "activa/funcional".
En el contexto presente, el término
"espaciador" significa un grupo distanciador termoquímica y
fotoquímicamente no activo, y se usa para unir dos o más porciones
diferentes de los tipos definidos más arriba. Los espaciadores se
seleccionan en base a una variedad de características, incluyendo su
hidrofobicidad, hidrofilicidad, flexibilidad y longitud molecular
(por ejemplo, ver Hermanson et. al., "Immobilized Affinity
Ligand Techniques", Academic Press, San Diego, California
(1992), p. 137 y siguientes). Generalmente, la longitud de los
espaciadores es inferior o aproximadamente de 400 A, en algunas
aplicaciones es preferiblemente inferior a 100 A. Por tanto, el
espaciador comprende una cadena de átomos de carbono, opcionalmente
interrumpida o terminado con uno o más heteroátomos, tales como
átomos de oxígeno, átomos de nitrógeno, y/o átomos de azufre. Por
tanto, el espaciador K puede comprender una o más funcionalidades
amida, éster, amino, éter, y/o tioéter, y opcionalmente
hidrocarburos aromáticos o mono/poliinsaturados, polioxietileno tal
como polietilenglicol, oligo/poliamidas tales como
poli-\beta-alanina, poliglicina,
polilisina, y péptidos en general, oligosacáridos,
oligo/polifosfatos. Además, el espaciador puede consistir en
unidades combinadas del mismo. La longitud del espaciador puede
variar, tomando en consideración la ubicación y orientación
espacial, necesaria o deseada, de la parte "activa/funcional"
del grupo en cuestión, en relación con el anillo de 5 miembros. En
realizaciones particularmente interesantes, el espaciador incluye
un grupo químicamente separable. Los ejemplos de tales grupos
químicamente separables incluyen los grupos disulfuro, separables
en condiciones reductoras, los fragmentos peptídicos separables
mediante peptidasas, y demás.
En una realización de la presente invención, K
designa un único enlace, de forma que la parte
"activa/funcional" del grupo en cuestión está unida
directamente al anillo de 5 miembros.
En una realización preferida, el sustituyente B
en las Fórmulas generales I y II se selecciona preferiblemente de
entre nucleobases, en particular, de entre adenina, guanina, timina,
citosina y uracilo.
En los oligómeros de la presente invención
(Fórmula I), P designa la posición radical de un enlace
internucleósido a un monómero sucesivo, o un grupo
5'-terminal. La primera posibilidad se aplica cuando
el L-ribo-LNA en cuestión no es el
"monómero" 5'-terminal, mientras que la última
posibilidad se aplica cuando el
L-ribo-LNA en cuestión es el
"monómero" 5'-terminal. Debería sobrentenderse
(lo cual debería estar claro también a partir de la definición de
enlace internucleósido y grupo 5'-terminal de más
adelante) que tal enlace internucleósido o grupo
5'-terminal puede incluir el sustituyente R^{5}
(o, igualmente aplicable: el sustituyente R^{5\text{*}}),
formando de ese modo un doble enlace con el grupo P.
(5'-terminal se refiere a la posición
correspondiente al átomo de carbono 5' de una porción ribosa en un
nucleósido).
Por otra parte, P* designa la posición radical
de un enlace internucleósido a un monómero precedente, o a un grupo
3'-terminal. De forma análoga, la primera
posibilidad se aplica cuando el
L-ribo-LNA en cuestión no es el
"monómero" 3'-terminal, mientras que la última
posibilidad se aplica cuando el
L-ribo-LNA en cuestión es el
"monómero" 3'-termina
(3'-terminal se refiere a la posición
correspondiente al átomo de carbono 3' de una porción ribosa en un
nucleósido).
En el contexto actual, el término
"monómero" se refiere a los nucleósidos que existen de forma
natural, a los nucleósidos que existen de forma no natural, a los
PNA, los LNA, y demás, así como a los
L-ribo-LNA. Por tanto, el término
"monómero sucesivo" se refiere al monómero vecino en la
dirección 5'-terminal, y el "monómero
precedente" se refiere al monómero vecino en la dirección
3'-terminal. Tales monómeros sucesivo y precedente,
vistos de la posición de un monómero de
L-ribo-LNA, pueden ser nucleósidos
que existen de forma natural o nucleósidos que existen de forma no
natural, o incluso monómeros de
L-ribo-LNA.
En consecuencia, en el contexto presente (tal y
como puede derivarse de las definiciones anteriores), el término
"oligómero" significa un oligonucleótido modificado mediante la
incorporación de uno o más
L-ribo-LNA.
La parte crucial de la presente invención es la
configuración como L-ribo del anillo de 5 miembros,
combinado con la condición de que R^{2\text{*}} y R^{4\text{*}}
juntos designan un birradical que forma un anillo fusionado sobre
el anillo de 5 miembros.
En los grupos que constituyen los birradicales,
Z se selecciona de entre -O-, -S-, y -N(R^{a})-, y
R^{a} y R^{b} se seleccionan cada uno independientemente de
entre el hidrógeno,
C_{1-2}-alquilo opcionalmente
sustituido, C_{2-12}-alquenilo
opcionalmente sustituido,
C_{2-12}-alquinilo opcionalmente
sustituido, hidroxilo,
C_{1-12}-alcoxilo,
C_{2-12}-alqueniloxilo, carboxilo,
C_{1-12}-alcoxicarbonilo,
C_{1-12}-alquilcarbonilo,
formilo, arilo, ariloxi-carbonilo, ariloxilo,
arilcarbonilo, heteroarilo,
heteroariloxi-carbonilo, heteroariloxilo,
heteroarilcarbonilo, amino, mono- y
di(C_{1-6}-alquil)amino,
carbamoilo, mono- y
di(C_{1-6}-alquil)-amino-carbonilo,
amino-C_{1-6}-alquilaminocarbonilo,
mono- y
di(C_{1-6}-alquil)amino-C_{1-6}-alquil-aminocarbonilo,
C_{1-6}-alquilcarbonilamino,
carbamido, C_{1-6}-alcanoiloxilo,
sulfono,
C_{1-6}-alquilsulfoniloxilo,
nitro, azido, sulfanilo,
C_{1-6}-alquitio, halógeno,
intercaladores del ADN, grupos fotoquímicamente activos, grupos
termoquímicamente activos, grupos quelantes, grupos indicadores, y
ligandos, (en donde los últimos grupos pueden incluir un espaciador
tal y como se ha definido para el sustituyente B), en donde arilo y
heteroarilo pueden estar opcionalmente sustituidos. Además, dos dos
sustituyentes geminales R^{a} y R^{b} juntos pueden designar una
olefina de metileno (=CH_{2}), opcionalmente sustituida con uno o
dos sustituyentes, tal y como se definieron como sustituyentes
opcionales para arilo).
En el contexto actual, es decir, en la presente
descripción y reivindicaciones, la orientación de los birradicales
es tal que el lado izquierdo representa el sustituyente con el
número más bajo, y el lado derecho representa el sustituyente con
el número más elevado, por tanto, cuando R^{2\text{*}} y
R^{4\text{*}} designan juntos un birradical
"-O-CH_{2}-", se entenderá que el átomo de
oxígeno representa R^{\text{*}}, por tanto, el átomos de oxígeno
está unido, por ejemplo, a la posición R^{2\text{*}}, y el grupo
metileno representa R^{4\text{*}}.
Considerando las posibilidades interesantes para
la estructura del birradical o birradicales en el o los
L-ribo-LNA incorporados en los
oligómeros de la presente invención, se cree que el o los
birradicales constituidos por pares de sustituyente no geminales se
seleccionan preferiblemente de entre
-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{r}-Y-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{s}-,
-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{r}-Y-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{s}-Y-,
-Y-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{r+s}-Y-,
-Y-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{r}-Y-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{s}-,
-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{r+s}, -Y-,
-Y-Y-, en donde cada Y se selecciona
independientemente de entre -O-, -S-,
-Si(R^{\text{*}})2-, -N (R^{\text{*}})-, >C=O,
-C(=O)-N(R^{\text{*}})-, y
-N(R^{\text{*}})-C(=O)-, cada
R^{\text{*}} se selecciona independientemente de entre hidrógeno,
halógeno, azido, ciano, nitro, hidroxilo, mercapto, amino, mono- o
di(C_{1-6}-alquil)amino,
C_{1-6}-alcoxi opcionalmente
sustituido, C_{1-6}-alquilo
opcionalmente sustituido, intercaladores del ADN, grupos
fotoquímicamente activos, grupos termoquímicamente activos, grupos
quelantes, grupos indicadores, y ligandos, y/o dos R^{\text{*}}
adyacentes (no geminales) pueden juntos designar un doble enlace, y
cada uno de r y s es 0-4, a condición de que la suma
r+1 sea 1-4; Son situaciones particularmente
interesantes aquellas en donde cada birradical se selecciona
independientemente de entre -Y-,
-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{r+s}-,
-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{r}-Y-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{s}-,
y
-Y-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{r+s}-Y-,
en donde cada uno de r y s es 0-3, a condición de
que la suma r+1 sea 1-4.
Son oligómeros particularmente interesantes
aquellos en donde se cumplen los siguientes criterios: y
R^{2\text{*}} y R^{4\text{*}} juntos designan un birradical
seleccionado de entre -O-, -S-, -N(R^{\text{*}})-,
-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{r+s+1}-,
-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{r}-O-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{s}-,
-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{r}
-S-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{s}-, -(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{r}-N(R^{\text{*}})-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{s}-, -O-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{r+s}-O-, -S-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{r+s}-O-, -O-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{r+s}-S-, -N(R^{\text{*}})-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{r+s}
-O-, -O-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{r+s}-N(R^{\text{*}})-, -S-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{r+s}-S-, -N(R^{\text{*}})-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{r+s}-N(R^{\text{*}})-, -N(R^{\text{*}})-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{r+s}-S-, y -S-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{r+s}-N(R^{\text{*}})-; en donde cada uno de r y s es 0-3, a condición de que la suma r+1 sea 1-4, y en donde R se selecciona de entre hidrógeno, hidroxilo, C_{1-6}-alcoxi opcionalmente sustituido, C_{1-6}-alquilo opcionalmente sustituido, intercaladores del ADN, grupos fotoquímicamente activos, grupos termoquímicamente activos, grupos quelantes, grupos indicadores, y ligandos, y cualesquier sustituyentes R^{\text{*}} restantes son hidrógeno.
-S-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{s}-, -(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{r}-N(R^{\text{*}})-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{s}-, -O-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{r+s}-O-, -S-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{r+s}-O-, -O-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{r+s}-S-, -N(R^{\text{*}})-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{r+s}
-O-, -O-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{r+s}-N(R^{\text{*}})-, -S-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{r+s}-S-, -N(R^{\text{*}})-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{r+s}-N(R^{\text{*}})-, -N(R^{\text{*}})-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{r+s}-S-, y -S-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{r+s}-N(R^{\text{*}})-; en donde cada uno de r y s es 0-3, a condición de que la suma r+1 sea 1-4, y en donde R se selecciona de entre hidrógeno, hidroxilo, C_{1-6}-alcoxi opcionalmente sustituido, C_{1-6}-alquilo opcionalmente sustituido, intercaladores del ADN, grupos fotoquímicamente activos, grupos termoquímicamente activos, grupos quelantes, grupos indicadores, y ligandos, y cualesquier sustituyentes R^{\text{*}} restantes son hidrógeno.
En una realización preferida, un grupo
R^{\text{*}} en el birradical de al menos un LNA se selecciona de
entre intercaladores del ADN, grupos fotoquímicamente activos,
grupos termoquímicamente activos, grupos quelantes, grupos
indicadores, y ligandos (en donde los últimos grupos pueden incluir
un espaciador tal como el definido para el sustituyente B).
En otra realización preferida, un grupo
R^{\text{*}} en el birradical de al menos un LNA se selecciona de
entre hidrógeno, hidroxilo,
C_{1-6}-alcoxi opcionalmente
sustituido, C_{1-6}-alquilo
opcionalmente sustituido, intercaladores del ADN, grupos
fotoquímicamente activos, grupos termoquímicamente activos, grupos
quelantes, grupos indicadores, y ligandos, y cualesquier
sustituyentes R^{\text{*}} restantes son hidrógeno.
Con referencia a los sustituyentes
R^{1\text{*}}, R^{2}, R^{3\text{*}}, R^{5}, R^{5\text{*}},
R^{6}, y R^{6\text{*}} presentes, se seleccionan
independientemente de entre el hidrógeno,
C_{1-2}-alquilo opcionalmente
sustituido, C_{2-12}-alquenilo
opcionalmente sustituido,
C_{2-12}-alquinilo opcionalmente
sustituido, hidroxilo,
C_{1-12}-alcoxilo,
C_{2-12}-alqueniloxilo, carboxilo,
C_{1-12}-alcoxicarbonilo,
C_{1-12}-alquilcarbonilo, formilo,
arilo, ariloxi-carbonilo, ariloxilo, arilcarbonilo,
heteroarilo, heteroariloxi-carbonilo,
heteroariloxilo, heteroarilcarbonilo, amino, mono- y
di(C_{1-6}-alquil)amino,
carbamoilo, mono- y
di(C_{1-6}-alquil)-amino-carbonilo,
amino-C_{1-6}-alquilaminocarbonilo,
mono- y
di(C_{1-6}-alquil)amino-C_{1-6}-alquil-aminocarbonilo,
C_{1-6}-alquilcarbonilamino,
carbamido, C_{1-6}-alcanoiloxilo,
sulfono,
C_{1-6}-alquilsulfoniloxilo,
nitro, azido, sulfanilo,
C_{1-6}-alquitio, halógeno,
intercaladores del ADN, grupos intercaladores del ADN, grupos
fotoquímicamente activos, grupos termoquímicamente activos, grupos
quelantes, grupos indicadores, y ligandos (en donde los últimos
grupos pueden incluir un espaciador tal y como se ha definido para
el sustituyente B), en donde arilo y heteroarilo pueden estar
opcionalmente sustituidos, y en donde dos sustituyentes geminales
juntos pueden designar oxo, tioxo, imino, u metileno opcionalmente
sustituido, o juntos pueden formar un birradical spiro, consistente
de una cadena de alquileno de 1-5 átomos de
carbono, la cual está opcionalmente interrumpida y/o terminada por
uno o más heteroátomos/grupos seleccionados de entre -O-, -S-, y
-(NR^{N})-, en donde R^{N} se seleccionan de entre hidrógeno y
C_{1-4}-alquilo, y en donde dos
sustituyente adyacente (no geminales) pueden designar un enlace
adicional resultante en un doble enlace; y R^{N\text{*}}, cuando
está presente, se selecciona de entre hidrógeno y
C_{1-4}-alquilo.
Preferiblemente, cada uno de los sustituyentes
R^{1\text{*}}, R^{2}, R^{3\text{*}}, R^{5}, R^{5\text{*}},
R^{6}, y R^{6\text{*}} del
L-ribo-LNA, que está presente, se
selecciona independientemente de entre hidrógeno,
C_{1-6}-alquilo,
C_{2-6}-alquenilo opcionalmente
sustituido, hidroxilo,
C_{1-6}-alcoxilo,
C_{2-6}-alqueniloxilo, carboxilo,
C_{1-6}-alcoxicarbonilo,
C_{1-6}-alquilcarbonilo, formilo,
amino, mono- y
di(C_{1-6}-alquil)amino,
carbamoilo, mono- y
di(C_{1-6}-alquil)-amino-carbonilo,
C_{1-6}-alquilcarbonilamino,
carbamido, azido,
C_{1-6}-alcanoiloxilo, sulfono,
sulfanilo, C_{1-6}-alquiltio,
intercaladores del ADN, grupos fotoquímicamente activos, grupos
termoquímicamente activos, grupos quelantes, grupos indicadores, y
ligandos, en donde dos sustituyentes geminales juntos pueden
designar oxo, y en donde R^{N\text{*}}, cuando está presente, se
selecciona de entre hidrógeno y
C_{1-4}-alquilo.
En una realización preferida de la presente
invención, X se selecciona de entre -O-, -S-, y -NRN^{\text{*}}-,
en particular de -O-, y cada uno de los sustituyentes
R^{1\text{*}}, R^{2}, R^{3\text{*}}, R^{5},
R^{5\text{*}}, R^{6}, y R^{6\text{*}} del
L-ribo-LNA, que están presentes,
designa un hidrógeno.
\newpage
En una realización aún más preferida de la
presente invención, X es O, los R^{1\text{*}}, R^{2}, R^{3},
R^{5}, y R^{5\text{*}} designan un hidrógeno, y R^{2\text{*}}
y R^{4\text{*}} de un L-ribo-LNA
incorporado en un oligómero designan juntos un birradical,
seleccionado de entre -O-,
-(CH_{2})_{0-1}-O-(CH_{2})_{1-3}-,
-(CH_{2})_{0-1}-S-(CH_{2})_{1-3}-,
-(CH_{2})_{0-1}-N(R^{N})-(CH_{2})_{1-3}-,
y -(CH_{2})_{2-4}-, en particular de
entre -O-CH_{2}-, -S-CH_{2}- y
-NRH-CH_{2}-. Generalmente, con el debida
consideración a los resultados obtenidos hasta la fecha, se
prefiere que el birradical que constituye R^{2\text{*}} y
R^{4\text{*}} forme un puente de dos átomos, es decir, el
birradical forma un anillo de cinco miembros con el anillo de
furanosa (X=O).
En una realización de la presente invención, el
birradical es -(CH_{2})_{2-4}-.
Para estas interesantes realizaciones, se
prefiere que los L-ribo-LNA tengan
la Fórmula general Ia siguiente,
\vskip1.000000\baselineskip
Es también interesante, como un aspecto distinto
de la presente invención, la variante de la Fórmula Ia en donde B
está en la "configuración b".
Los oligómeros de la invención típicamente
comprenden 1-10000
L-ribo-LNA de la Fórmula general Ia
(de la más detallada Fórmula general Ia), y 0-10000
nucleósidos seleccionados de entre nucleósidos que existen de forma
natural y análogos de nucleósidos. La suma del número de nucleósidos
y el número de L-ribo-LNA (n) es
al menos 2, preferiblemente al menos 3, en particular al menos 5,
especialmente al menos 7, tal como en el rango
2-15000, preferiblemente en el rango
2-100, tal como 3-100, en particular
en el rango 2-50, tal como 3-50 ó
5-50 ó 7-50.
Se ha hallado que los oligómeros parcialmente
modificados con L-ribo-LNA se
hibridan con fuerza (con afinidad incrementada) al ADN y ARN. Se
cree actualmente que los oligómeros completamente modificados con
L-ribo-LNA, y los oligómeros
consistentes de monómeros de
L-ribo-LNA junto con otros análogos
de nucleótidos configurados como L-ribo, darán
lugar a propiedades de hibridación comparables.
En el contexto actual, el término
"nucleósido" significa un glicósido de una base heterocíclica.
El término "nucleósido" se usa ampliamente con la finalidad de
incluir los nucleósidos que existen de forma no natural, los
nucleósidos que ocurren de forma natural, así como otros análogos de
nucleósido.
Son ejemplos ilustrativos de nucleósidos los
ribonucleósidos que comprenden una porción ribosa, así como los
desoxirribonucleósidos que comprenden una porción desoxirribosa. En
relación a las bases de tales nucleósidos, debería sobrentenderse
que éstas pueden ser cualquiera de las bases que existen de forma
natural, por ejemplo, adenina, guanina, citosina, timina y uracilo,
así como cualesquiera variantes modificadas de las mismas o
cualesquiera bases no naturales.
Cuando se consideran las definiciones y los
nucleósidos conocidos (que ocurren de forma natural o de forma no
natural) y los análogos de nucleósidos (incluyendo los análogos bi-
y tricíclicos conocidos), es evidente que un oligómero puede
comprender uno o más L-ribo-LNA (los
cuales pueden ser idénticos o diferentes, tanto con respecto a la
selección de sustituyente, como con respecto a la selección del
birradical), y uno o más análogos de nucleósidos y/o nucleósido. En
el presente contexto, "oligonucleótido" significa una cadena
sucesiva de nucleósidos conectados a través de enlaces
internucleósidos, sin embargo, debe sobrentenderse que una
nucleobase en una o más unidades nucleotídicas (monómeros) en un
oligómero (oligonucleótido) puede haberse modificado con un
sustituyente B tal y como se definió más arriba.
Los oligómeros pueden ser lineales, ramificados
o cíclicos. En el caso de un oligómero ramificado, los puntos de
ramificación pueden estar ubicados en un nucleósido, en un enlace
internucleósidos, o, en una realización fascinante, en un
L-ribo-LNA. Se cree que en el último
caso, los sustituyentes R^{2} y R^{3\text{*}} pueden designar
un grupo P^{\text{*}} que designa un enlace internucleósido a un
monómero precedente, en particular, R^{2} designa un
P^{\text{*}} adicional.
Tal y como se ha mencionado más arriba, los
L-ribo-LNA de un oligómero están
conectados con otros monómeros a través de un enlace
internucleósido. En el contexto presente, el término "enlace
internucleósidos" significa un enlace consistente en 2 a 4,
preferiblemente 3, grupos/átomos seleccionados de entre -CH_{2}-,
-O-, -S-, -NR^{H}-, >C=O, >C=NR^{H}, >C=S,
-Si(R'')2-, -SO-, -S(O)_{2}-,
-P(O)_{2}-, -PO(BH_{3})-,
-P(O,S)-, -P(S)_{2}-, -PO(R'')-,
-PO(OCH_{3})-, y -PO(NHR^{H})-, en donde R^{H}
se selecciona de entre hidrógeno y
C_{1-4}-alquilo, y R'' se
selecciona de entre
C_{1-6}-alquilo y fenilo. Son
ejemplos ilustrativos de tales enlaces internucleósidos:
-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-,
-CH_{2}-CO-CH_{2}-,
-CH_{2}-CHOH-CH_{2}-,
-O-CH_{2}-O-,
-O-CH_{2}-CH_{2}-,
-O-CH_{2}-CH= (incluyendo R^{5}
cuando se usa como enlace a un monómero sucesivo),
-CH_{2}-CH_{2}-O-,
-NR^{H}-CH_{2}-CH_{2}-,
-CH_{2}-CH_{2}-NR^{H}-,
-CH_{2}-NR^{H}-CH_{2}-,
-O-CH_{2}-CH_{2}-NR^{H}-,
-NR^{H}-CO-O-,
-NRH-CO-NR^{H}-,
-NR^{H}-CS-NR^{H}-,
-NR^{H}-C(=NRH)-NR^{H}-,
-NR^{H}-CO-CH_{2}-NR^{H}-,
-O-CO-O-,
-O-CO-CH_{2}-O-,
-O-CH_{2}-CO-O-,
-CH_{2}-CO-NR^{H}-,
-O-CO-NR^{H}-,
-NR^{H}-CO-CH_{2}-,
-O-CH_{2}-CO-NR^{H}-,
-O-CH_{2}-CH_{2}-NR^{H}-,
-CH=N-O-,
-CH_{2}-NR^{H}-O-,
-CH_{2}-O-N= (incluyendo R^{5}
cuando se usa como enlace a un monómero sucesivo),
-CH_{2}-O-NR^{H}-,
-CONR^{H}-CH_{2}-,
-CH_{2}-NR^{H}-O-, -CH_{2}-NR^{H}-CO-, -O-NR^{H}-CH_{2}-, -O-NR^{H}-, -O-CH_{2}-S-, -S-CH_{2}-O-, -CH_{2}-CH_{2}-S-, -OCH_{2}-CH_{2}-S-,
-S-CH_{2}-CH= (incluyendo R^{5} cuando se usa como enlace a un monómero sucesivo), -S-CH_{2}-CH_{2}-, -SCH_{2}-CH_{2}-O-, -S-CH_{2}-CH_{2}-S-, -CH_{2}-S-CH_{2}-, -CH_{2}-SO-CH_{2}-, -CH_{2}-SO_{2}-CH_{2}-, -O-SO-O-, -O-S(O)_{2}-O-, -O-S(O)_{2}-CH_{2}-,
-O-S(O)_{2}-NRH-, -NRH-S(O)_{2}-CH_{2}-, -O-S(O)_{2}-CH_{2}-, -O-P(O)_{2}-O-, -O-P(O,S)-O-, -O-P(S)_{2}-O-, -S-P(O)_{2}-O-, -S-P(O,S)-O-, -S-P(S)_{2}-O-, -O-P(O)_{2}-S-, -O-P(O,S)-S-, -O-P(S)_{2}-S-, -S-P(O)_{2}-S-, -S-P(O,S)-S-, -S-P(S)_{2}-S-, -O-PO(R'')-O-, -OPO (OCH_{3})-O-, -O-PO(OCH_{2}CH_{3})-O-, -O-PO(OCH_{2}CH_{2}S-R)-O-, -O-PO(BH_{3})-O-, -O-PO(NHR^{N})-O-, -O-P(O)_{2}-NR^{H}-, -NR^{H}-P(O)2-O-, -O-P(O,NR^{H})-O-, -CH_{2}-P(O)_{2}-O-, -O-P(O)_{2}-CH_{2}-, y -O-Si(R'')_{2}-O-; entre los cuales son especialmente preferidos: -CH_{2}-CO-NR^{H}-, -CH_{2}-NR^{H}-O-, -S-CH_{2}-O-, -O-P(O)_{2}-O-, -O-P(O,S)-O-, -O-P(S)_{2}-O-,
-NR^{H}-P(O)_{2}-O-, -O-P(O,NR^{H})-O-, -O-PO(R'')-O-, -O-PO(CH_{3})-O-, y -O-PO(NHR^{N})-O-, en donde R^{H} se selecciona de entre hidrógeno y C_{1-4}-alquilo, y R'' se selecciona de entre C_{1-6}-alquilo y fenilo. Se proporcionan ejemplos ilustrativos adicionales en Mesmaeker et. al., Current Opinion in Structural Biology, 5:343-355 (1995). El lado izquierdo del enlace internucleósido está unido al anillo de 5-miembros como sustituyente P^{\text{*}}, mientras que el lado derecho está unido a la posición 5' de un monómero precedente.
-CH_{2}-NR^{H}-O-, -CH_{2}-NR^{H}-CO-, -O-NR^{H}-CH_{2}-, -O-NR^{H}-, -O-CH_{2}-S-, -S-CH_{2}-O-, -CH_{2}-CH_{2}-S-, -OCH_{2}-CH_{2}-S-,
-S-CH_{2}-CH= (incluyendo R^{5} cuando se usa como enlace a un monómero sucesivo), -S-CH_{2}-CH_{2}-, -SCH_{2}-CH_{2}-O-, -S-CH_{2}-CH_{2}-S-, -CH_{2}-S-CH_{2}-, -CH_{2}-SO-CH_{2}-, -CH_{2}-SO_{2}-CH_{2}-, -O-SO-O-, -O-S(O)_{2}-O-, -O-S(O)_{2}-CH_{2}-,
-O-S(O)_{2}-NRH-, -NRH-S(O)_{2}-CH_{2}-, -O-S(O)_{2}-CH_{2}-, -O-P(O)_{2}-O-, -O-P(O,S)-O-, -O-P(S)_{2}-O-, -S-P(O)_{2}-O-, -S-P(O,S)-O-, -S-P(S)_{2}-O-, -O-P(O)_{2}-S-, -O-P(O,S)-S-, -O-P(S)_{2}-S-, -S-P(O)_{2}-S-, -S-P(O,S)-S-, -S-P(S)_{2}-S-, -O-PO(R'')-O-, -OPO (OCH_{3})-O-, -O-PO(OCH_{2}CH_{3})-O-, -O-PO(OCH_{2}CH_{2}S-R)-O-, -O-PO(BH_{3})-O-, -O-PO(NHR^{N})-O-, -O-P(O)_{2}-NR^{H}-, -NR^{H}-P(O)2-O-, -O-P(O,NR^{H})-O-, -CH_{2}-P(O)_{2}-O-, -O-P(O)_{2}-CH_{2}-, y -O-Si(R'')_{2}-O-; entre los cuales son especialmente preferidos: -CH_{2}-CO-NR^{H}-, -CH_{2}-NR^{H}-O-, -S-CH_{2}-O-, -O-P(O)_{2}-O-, -O-P(O,S)-O-, -O-P(S)_{2}-O-,
-NR^{H}-P(O)_{2}-O-, -O-P(O,NR^{H})-O-, -O-PO(R'')-O-, -O-PO(CH_{3})-O-, y -O-PO(NHR^{N})-O-, en donde R^{H} se selecciona de entre hidrógeno y C_{1-4}-alquilo, y R'' se selecciona de entre C_{1-6}-alquilo y fenilo. Se proporcionan ejemplos ilustrativos adicionales en Mesmaeker et. al., Current Opinion in Structural Biology, 5:343-355 (1995). El lado izquierdo del enlace internucleósido está unido al anillo de 5-miembros como sustituyente P^{\text{*}}, mientras que el lado derecho está unido a la posición 5' de un monómero precedente.
De lo anterior se deduce que el grupo P puede
designar también un grupo 5'-terminal en el caso en
que el L-ribo-LNA en cuestión es el
monómero 5'-terminal. Son ejemplos de tales grupos
5'-terminales: el hidrógeno, hidroxilo,
C_{1-6}-alquilo opcionalmente
sustituido, C_{1-6}-alcoxilo
opcionalmente sustituido,
C_{1-6}-alquilcarboniloxilo
opcionalmente sustituido, ariloxilo opcionalmente sustituido,
monofosfato, difosfato, trifosfato, y -W-A', en
donde W se selecciona de entre -O-, -S-, y -N(R^{H})-, en
donde R^{H} se selecciona de entre hidrógeno y
C_{1-6}-alquilo, y en donde A' se
selecciona de entre intercaladores del ADN, grupos fotoquímicamente
activos, grupos termoquímicamente activos, grupos quelantes, grupos
indicadores, y ligandos (en donde los últimos grupos pueden incluir
un espaciador tal como el definido para el sustituyente B).
En la presente descripción y reivindicaciones,
los términos "monofosfato", "difosfato", y
"trifosfato" significan grupos respectivamente con las
fórmulas:
-O-P(O)_{2}-O-,
-O-P(O)_{2}-O-P(O)_{2}-O-,
y
-OP(O)_{2}-O-P(O)_{2}-O-P(O)_{2}-O-.
En una realización particularmente interesante,
el grupo P designa un grupo 5'-terminal seleccionado
de entre monofosfato, difosfato y trifosfato. Es especialmente
interesante como sustrato la variante trifosfato de la Fórmula II,
tal como para enzimas, especialmente aquéllos activos sobre ácidos
nucleicos.
Análogamente, el grupo P^{\text{*}} puede
designar un grupo 3'-terminal en el caso en el que
el L-ribo-LNA en cuestión es el
monómero 3'-terminal. Son ejemplos de tales grupos
3'-terminales: el hidrógeno, hidroxilo,
C_{1-6}-alcoxilo opcionalmente
sustituido,
C_{1-6}-alquilcarboniloxilo
opcionalmente sustituido, ariloxilo opcionalmente sustituido, y
-W-A', en donde W se selecciona de entre -O-, -S-, y
-N(R^{H})-, en donde R^{H} se selecciona de entre
hidrógeno y C_{1-6}-alquilo, y en
donde A' se selecciona de entre intercaladores del ADN, grupos
fotoquímicamente activos, grupos termoquímicamente activos, grupos
quelantes, grupos indicadores, y ligandos (en donde los últimos
grupos pueden incluir un espaciador tal como el definido para el
sustituyente B).
En una realización preferida de la presente
invención, el oligómero tiene la siguiente Fórmula III:
IIIG-[Nu-L]_{n(0)}-\{[(L-ribo-LNA)-L]_{m(q)}-[Nu-L]_{n(q)}\}_{q}-G*
en
donde,
q es 1-50;
cada uno de n(0), ..., n(q) es
independientemente 0-10000;
cada uno de m(1), ..., m(q) es
independientemente 1-10000;
a condición de que la suma de n(0), ...,
n(q) y m(1), ..., m(q) sea
2-15000;
G designa un grupo
5'-terminal;
cada Nu designa independientemente un nucleósido
seleccionado a partir de nucleósidos de existen de forma natural y
análogos de nucleósidos;
cada L-ribo-LNA
designa independientemente un análogo de nucleósido;
cada L designa designa independientemente un
enlace internucleósido entre dos grupos seleccionados de entre Nu y
L-ribo-LNA, o L junto con
G^{\text{*}} designan un grupo 3'-terminal; y cada
(L-ribo-LNA)-L
designa independientemente un análogo de nucleósido con la Fórmula
general I definida más arriba, o, preferiblemente, con la Fórmula
Ia tal y como se definió más arriba.
En esta realización, así como de forma general,
la presente invención proporciona la fascinante posibilidad de
incluir L-ribo-LNA con diferentes
nucleobases, en particular, con nucleobases seleccionadas de entre
timina, citosina y uracilo, y nucleobases seleccionadas de entre
adenina y guanina. El oligómero puede comprender, en una
realización, al menos un L-ribo-LNA
en donde B (en la Fórmula I ó Ia) se selecciona de entre el grupo
que comprende adenina y guanina, y al menos un
L-ribo-LNA en donde B se selecciona
de entre el grupo que comprende timina, citosina y uracilo.
Aparte de los oligómeros definidos más arriba,
la presente invención también proporciona
L-ribo-LNA monoméricos útiles, por
ejemplo, en la preparación de oligómeros, como sustratos para, por
ejemplo, polimerasas de ácido nucleico, quinasas de
polinucleótidos, transferasas terminales, y como agentes
terapéuticos, ver más adelante. Los
L-ribo-LNA monoméricos corresponden
en la estructura conjunta (especialmente en cuanto a los posibles
birradicales) a los L-ribo-LNA
definidos como constituyentes en los oligómeros, sin embargo, en
relación a los grupos P y P', los
L-ribo-LNA monoméricos difieren
ligeramente, tal y como se explicará. Además, los
L-ribo-LNA monoméricos pueden
comprender grupos protectores del grupo funcional, especialmente en
los casos en los que los L-ribo-LNA
monoméricos deben incorporarse en los oligómeros mediante síntesis
química.
La invención se refiere además a nucleósidos
L-ribo-LNA monoméricos
(L-ribo-LNA) con la Fórmula general
II:
en donde el sustituyente B se
selecciona de entre nucleobases, intercaladores del ADN, grupos
fotoquímicamente activos, grupos termoquímicamente activos, grupos
quelantes, grupos indicadores, y ligandos; X se selecciona de entre
-O-, -S-, -N(R^{N\text{*}})-, y -C(R6R6*)-,
preferiblemente de entre -O-, -S-, y
-N(R^{N\text{*}})-;
cada uno de Q y Q^{\text{*}} se selecciona
independientemente de entre hidrógeno, azido, halógeno, ciano,
nitro, hidroxilo, Prot-O-, Act-O-,
mercapto, Prot-S-, Act-S-,
C_{1-6}-alquiltio, amino,
Prot-N(R^{H})-,
Act-N(R^{H})-, mono- ó
di(C_{1-6}-alquil)amino,
C_{1-6}-alcoxi opcionalmente
sustituido, C_{1-6}-alquilo
opcionalmente sustituido,
C_{2-6}-alquenilo opcionalmente
sustituido, C_{2-6}-alqueniloxi
opcionalmente sustituido,
C_{2-6}-alquinilo opcionalmente
sustituido, C_{2-6}-alquiniloxi
opcionalmente sustituido, monofosfato, difosfato, trifosfato,
intercaladores del ADN, grupos fotoquímicamente activos, grupos
termoquímicamente activos, grupos quelantes, grupos indicadores,
ligandos, carboxilo, sulfono, hidroximetilo,
Prot-O-CH_{2}-,
Act-O-CH_{2}-, aminometilo,
Prot-N(R^{H})-CH_{2}-,
Act-N (R^{H})-CH_{2}-,
carboximetilo, sulfonometilo, en donde Prot es un grupo protector
respectivamente para -OH, -SH y -NH(R^{H}), Act es un grupo
de activación respectivamente para -OH, -SH y -NH(R^{H}),
y R^{H} se selecciona de entre hidrógeno y
C_{1-6}-alquilo;
R^{2\text{*}} y R^{4\text{*}} juntos
designan un birradical seleccionado de entre -O-, -S-,
-N(R^{\text{*}})-,
-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{r+s+1}-,
-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{r}-O-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})s-,
-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{r}-S-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{s}-,
-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}}),
-N(R^{\text{*}})-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{s}-,
-O-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{r+s}-O-,
-S-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{r+s}-O-,
-O-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{r+s}-S-,
-N
(R^{\text{*}})-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{r+s}-O-,
-O-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{r+s}-N(R^{\text{*}})-,
-S-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{r+s}-S-,
-N(R^{\text{*}})-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{r+s}-N(R^{\text{*}})-,
-N(R^{\text{*}})-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{r+s}-S-,
y -S-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{r+s}-N(R^{\text{*}})-; en donde R^{\text{*}} es tal y como se definió más arriba para los oligómeros; y cada un de los sustituyentes R^{1\text{*}}, R^{2}, R^{3\text{*}}, R^{5}, y R^{5\text{*}}, que no están implicados en Q ó Q^{\text{*}}, son tal y como se definió más arriba para los oligómeros.
y -S-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{r+s}-N(R^{\text{*}})-; en donde R^{\text{*}} es tal y como se definió más arriba para los oligómeros; y cada un de los sustituyentes R^{1\text{*}}, R^{2}, R^{3\text{*}}, R^{5}, y R^{5\text{*}}, que no están implicados en Q ó Q^{\text{*}}, son tal y como se definió más arriba para los oligómeros.
Los L-ribo-LNA
monoméricos comprenden también su sales básicas y sus sales por
adición de ácido.
Además, debería sobrentenderse que cualquier
grupo químico (incluyendo cualquier nucleobase) que sea reactivo en
las condiciones que predominan en la síntesis química de
oligonucleótidos, tenga opcionalmente protegido su grupo funcional,
tal y como se conoce en el estado de la técnica. Esto significa que
grupos tales como los grupos hidroxilo, amino, carboxilo, sulfono y
mercapto, así como las nucleobases, de un
L-ribo-LNA monomérico tienen su
grupo funcional opcionalmente protegido. La protección (y la
desprotección) se realiza según procedimientos conocidos por los
especialistas en el estado de la técnica (ver, por ejemplo, Greene,
T. W. y Wuts, P. G. M., "Protective Groups in Organic
Synthesis", 2ª ed., John Wiley, N.Y. (1991), y M.J. Gait,
Oligonucleotide Synthesis, IRL Press, 1984).
Son ejemplos ilustrativos de grupos protectores
de hidroxilo, los tritilos (Tr) opcionalmente sustituido (Tr),
tales como el 4,4'-dimetoxitritilo (DMT),
4-monometoxitritilo (MMT), y tritilo,
9-(9-fenil)xantenilo (pixilo) opcionalmente
sustituido, etoxocarboniloxilo opcionalmente sustituido,
p-fenilazofeniloxicarboniloxi, tetrahidropiranilo
(thp), 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc),
metoxitetrahidropiranilo (mthp), sililoxilos tales como el
trimetilsililo (TMS), el triisopropilsililo (TIPS),
tert-butildimetilsililo (TBDMS), trietilsililo
(TES) y fenildimetilsililo, benciloxicarbonilos o éteres de
benciloxicarbonilos sustituidos, tales como el
2-bromo-benciloxicarbonilo,
tert-butiléteres, alquiléteres tales como el
metiléter, acetales (incluyendo dos grupos hidroxilos), aciloxilos
tales como el acetilo o los acetilos sustituidos con halógenos, por
ejemplo, cloroacetilo o fluoroacetilo, isobutirilo, pivaloilo,
benzoilo y benzoilo sustituido, metoximetilo (MOM), benciléteres o
benciléteres sustituidos, tales como el
2,6-diclorobencilo
(2,6-Cl_{2}Bzl). Alternativamente, el grupo
hidroxilo puede protegerse mediante el anclado a un soporte sólido,
opcionalmente a través de un engarce.
Son ejemplos ilustrativos de grupos protectores
de amino, el Fmoc (fluorenilmetoxicarbonilo), BOC
(tert-butoxicarbonilo), trifluoroacetilo,
aliloxicarbonilo (alloc, AOC), benciloxicarbonilo (Z, Cbz),
benciloxicarbonilos sustituidos tales como el
2-cloro-benciloxicarbonilo
(2-ClZ), monometoxitritilo (MMT), dimetoxitritilo
(DMT), ftaloilo, y 9-(9-fenil)xantenilo
(pixilo).
Son ejemplos ilustrativos de grupos protectores
de carboxilos, los alilésteres, metilésteres, etilésteres,
2-cianoetilésteres, trimetilsililésteres,
bencilésteres (Obzl), 2-adamantilésteres
(O-2-Ada), ciclohexilésteres
(OcHex), 1,3-oxazolinas, oxazoler,
1,3-oxazolidinas, amidas o hidrazidas.
Son ejemplos ilustrativos de grupos protectores
de mercaptos, el tritilo (Tr), acetamidometilo (acm),
trimetilacetamidometilo (Tacm),
2,4,6-trimetoxibencilo (Tmob),
tert-butilsulfenilo (StBu),
9-fluorenilmetilo (Fm),
3-nitro-2-piridinesulfenilo
(Npys), y 4-metilbencilo (Meb).
Además, puede ser necesario o deseable proteger
cualquiera nucleobase incluida en un
L-ribo-LNA monomérico,
especialmente cuando el L-ribo-LNA
monomérico ha de incorporarse en un oligómero de la invención. En el
contexto actual, el término "nucleobases protegidas" significa
que la nucleobase en cuestión es portadora de un grupo protector
seleccionado de entre los grupos que son bien conocidos para un
especialista en la técnica (ver, por ejemplo, "Protocols for
Oligonucleotides and Analogs", vol 20, (Ed. Sudhir Agrawal),
Humana Press, 1993, Totowa, NJ; S. L. Beaucage y R. P. Iyer,
Tetrahedron, 49:6123 (1993); S. L. Beaucage y R. P. Iyer,
Tetrahedron, 48:2223 (1992); y E. Uhlmann y A. Peyman,
Chem. Rev., 90:543 (1990)). Son ejemplos ilustrativos el
benzoilo, isobutirilo, tert-butilo,
tert-butiloxicarbonilo,
4-cloro-benciloxicarbonilo,
9-fluorenilmetilo,
9-fluorenilmetiloxicarbonilo,
4-metoxibenzoilo,
4-metoxitrifenilmetilo, triazolo opcionalmente
sustituido, p-toluensulfonilo, sulfonilo
opcionalmente sustituido, isopropilo, amidinas opcionalmente
sustituidas, tritilo opcionalmente sustituido, fenoxiacetilo, acilo
opcionalmente sustituido, pixilo, tetrahydropyranilo, sililéteres
opcionalmente sustituido, y
4-metoxibenciloxicarbonilo. Capítulo 1 en
"Protocols for oligonucleotide conjugates", Methods in
Molecular Biology, vol 26, (Ed. Sudhir Agrawal), Humana Press,
1993, Totowa, NJ., y S. L. Beaucage y R. P. Iyer,
Tetrahedron, 48:2223 (1992) describen ejemplos apropiados
adicionales.
En una realización preferida, el grupo B en un
L-ribo-LNA monomérico se selecciona
preferiblemente de entre nucleobases y nucleobases protegidas.
En una realización de los
L-ribo-LNA monoméricos de la
presente invención, uno de Q y Q^{\text{*}}, preferiblemente
Q^{\text{*}}, designa un grupo seleccionado de entre
Act-O-, Act-S-,
Act-N(R^{H})-,
Act-O-CH_{2}-,
Act-S-CH_{2}-,
Act-N(R^{H})-CH_{2}-, y
el otro de Q y Q^{\text{*}}, preferiblemente Q, designa un grupo
seleccionado de entre hidrógeno, azido, halógeno, ciano, nitro,
hidroxilo, Prot-O-, mercapto,
Prot-S-,
C_{1-6}-alquiltio, amino,
Prot-N(R^{H})-, mono- ó
di(C_{1-6}-alquil)amino,
C_{1-6}-alcoxi opcionalmente
sustituido, C_{1-6}-alquilo
opcionalmente sustituido,
C_{2-6}-alquenilo opcionalmente
sustituido, C_{2-6}-alqueniloxi
opcionalmente sustituido,
C_{2-6}-alquinilo opcionalmente
sustituido, C_{2-6}-alquiniloxi
opcionalmente sustituido, monofosfato, difosfato, trifosfato,
intercaladores del ADN, grupos fotoquímicamente activos, grupos
termoquímicamente activos, grupos quelantes, grupos indicadores,
ligandos, carboxilo, sulfono, hidroximetilo,
Prot-O-CH_{2}-, aminometilo,
Prot-N(R^{H})-CH_{2}-,
carboximetilo, sulfonometilo, y R^{H} se selecciona de entre
hidrógeno y C_{1-6}-alquilo.
En el caso descrito más arriba, el grupo Prot
designa respectivamente un grupo protector para -OH, -SH, y
-NH(R^{H}). Tales grupos protectores se seleccionan
respectivamente del mismo conjunto que se definió más arriba para
los grupos protectores de hidroxilo, el grupo protector de mercapto,
y los grupos de protección de aminos, tomando en consideración, sin
embargo, la necesidad de un grupo protector estable y reversible.
Sin embargo, se prefiere que cualquier grupo protector para -OH se
seleccione de entre tritilos opcionalmente sustituidos, tales como
el dimetoxitritilo (DMT), monometoxitritilo (MMT), y tritilo, y
9-(9-fenil)xantenilo (pixilo), opcionalmente
sustituido, tetrahidropiranilo (thp) (otros grupos protectores de
hidroxilo apropiados se describen en Agrawal, editor, "Protocols
for Oligonucleotide Conjugates"; Methods in Molecular
Biology, vol. 26, Humana Press, Totowa, NJ (1994) y
Protocols for Oligonucleotides and Analogs, vol 20, (editor
Sudhir Agrawal), Humana Press, 1993, Totowa, NJ), o se protegen
como acetal; que cualquier grupo protector para -SH se selecciona
de entre el tritilo, tal como el dimetoxitritilo (DMT),
monometoxitritilo (MMT), y tritilo, y
9-(9-fenil)xantenilo (pixilo), opcionalmente
sustituido, tetrahidropiranilo (thp) (en Agrawal et al. (ver
más arriba) se describen grupos protectores de mercapto apropiados
adicionales para la síntesis de oligonucleótidos); y que cualquier
grupo protector para el -NH(R^{H}) se selecciona de entre
tritilo, tal como el dimetoxitritilo (DMT), monometoxitritilo
(MMT), y el tritilo, y el
9-(9-fenil)xantenilo (pixilo), opcionalmente
sustituido, tretrahidropiranilo (thp) (en Agrawal (ver más arriba)
se describen también grupos protectores adicionales apropiados para
la síntesis de oligonucleótidos fosforamiditos).
En la realización anterior, así como para
cualquier L-ribo-LNAs monomérico
definido en la presente invención, Act designa respectivamente un
grupo de activación para -OH, -SH, y -NH(R^{H}). Tales
grupos de activación se seleccionan, por ejemplo, de entre
O-fosforamidito opcionalmente sustituido,
O-fosfotriéster opcionalmente sustituido,
O-fosfodiéster opcionalmente sustituido,
H-fosfonato opcionalmente sustituido, y
O-fosfonato opcionalmente sustituido.
En el contexto actual, el término
"fosforamidito" significa un grupo con la fórmula
-P(OR^{x})-N(R^{y})2, en
donde R^{x} designa un grupo alquilo opcionalmente sustituido, por
ejemplo, metilo, 2-cianoetilo, o bencilo, y cada
uno de R^{y} designa grupos alquilos opcionalmente sustituidos,
por ejemplo, etilo o isopropilo, o el grupo
-N(R^{y})2 forma un grupo morfolino
(-N(CH_{2}CH_{2})_{2}O). R^{x} preferiblemente
designa 2-cianoetilo, y los dos R^{y} son
preferiblemente idénticos y designan isopropilo. Por tanto, un
fosforamidito especialmente relevante es el
N,N-diisopropil-O-(2-cianoetil)fosforamidito.
Debería sobrentenderse que los grupos
protectores usados en la presente invención para un único
L-ribo-LNA monomérico o varios
L-ribo-LNA monoméricos pueden
seleccionarse de forma que cuando este/estos
L-ribo-LNA estén incorporados en un
oligómero de la invención, será posible realizar una desprotección
simultánea o una desprotección secuencial de los grupos
funcionales. Esta última situación abre la posibilidad de introducir
de forma regioselectiva uno o varios grupos
"activos/funcionales", tales como intercaladores del ADN,
grupos fotoquímicamente activos, grupos termoquímicamente activos,
grupos quelantes, grupos indicadores, y ligandos, en donde tales
grupos pueden unirse a través de un espaciador, tal y como se
describió más arriba.
En una realización preferida, Q se selecciona de
entre hidrógeno, azido, halógeno, ciano, nitro, hidroxilo,
Prot-O-, mercapto, Prot-S-,
C_{1-6}-alquiltio, amino,
Prot-N(R^{H})-, mono- ó
di(C_{1-6}-alquil)amino,
C_{1-6}-alcoxi opcionalmente
sustituido, C_{1-6}-alquilo
opcionalmente sustituido,
C_{2-6}-alquenilo opcionalmente
sustituido, C_{2-6}-alqueniloxilo
opcionalmente sustituido,
C_{2-6}-alquinilo opcionalmente
sustituido, C_{2-6}-alquiniloxi
opcionalmente sustituido, monofosfato, difosfato, trifosfato,
intercaladores del ADN, grupos fotoquímicamente activos, grupos
termoquímicamente activos, grupos quelantes, grupos indicadores,
ligandos, carboxilo, sulfono, hidroximetilo,
Prot-O-CH_{2}-, aminometilo,
Prot-N(R^{H})-CH_{2}-,
carboximetilo, sulfonometilo, en donde Prot es un grupo protector
respectivamente para -OH, -SH y -NH(R^{H}), y R^{H} se
selecciona de entre hidrógeno y
C_{1-6}-alquilo; y Q^{\text{*}}
se selecciona de entre hidrógeno, azido, halógeno, ciano, nitro,
hidroxilo, Act-O-, mercapto, Act-S-,
C_{1-6}-alquiltio, amino,
Act-N(R^{H})-, mono- ó
di(C_{1-6}-alquil)amino,
C_{1-6}-alcoxi opcionalmente
sustituido, C_{1-6}-alquilo
opcionalmente sustituido,
C_{2-6}-alquenilo opcionalmente
sustituido, C_{2-6}-alqueniloxilo
opcionalmente sustituido,
C_{2-6}-alquinilo opcionalmente
sustituido, C_{2-6}-alquiniloxi
opcionalmente sustituido, monofosfato, difosfato, trifosfato,
intercaladores del ADN, grupos fotoquímicamente activos, grupos
termoquímicamente activos, grupos quelantes, grupos indicadores,
ligandos, carboxilo, sulfono, en donde Act es un grupo de activación
respectivamente para -OH, -SH y -NH(R^{H}), y R^{H} se
selecciona de entre hidrógeno y
C_{1-6}-alquilo.
Los L-ribo-LNA
monoméricos de la Fórmula general II pueden, al igual que los
L-ribo-LNA incorporados en
oligómeros, representar varios estereoisómeros. Por tanto, se cree
que las variantes estereoquímicas descritas más arriba para los
L-ribo-LNA incorporados en
oligómeros son igualmente aplicables en le caso de
L-ribo-LNA monoméricos (no
obstante, debería destacarse que P debería remplazarse entonces con
Q).
En una realización preferida de la presente
invención, el LNA monomérico tiene la Fórmula general IIa
en donde los sustituyentes se
definen como más
arriba:
Además, en relación a las definiciones de los
sustituyentes, birradicales, R^{\text{*}}, etc, también se
aplican las mismas realizaciones preferidas tal y como se definieron
más arriba para el oligómero de la invención.
En una realización particularmente interesante
de los L-ribo-LNA monoméricos de la
presente invención, B designa una nucleobase, preferiblemente una
nucleobase seleccionada de entre timina, citosina, uracilo, adenina
y guanina (en particular, adenina y guanina), X es -O-, R^{2}' y
R^{4\text{*}} juntos designan un birradical seleccionado de
entre
-(CH_{2})_{0-1}-O-(CH_{2})_{1-3}-, -(CH_{2})_{0-1}-S-(CH_{2})_{1-3}-, y -(CH_{2})_{0-1}-N(R^{N})-(CH_{2})_{1-3}-, en particular -O-CH_{2}-, -S-CH_{2}- y -R^{N}-CH_{2}-, en donde R^{N} se selecciona de entre hidrógeno y C_{1-4}-alquilo, Q designa Prot-O-, Q^{\text{*}} designa Act-OH, y R^{1\text{*}}, R^{2}, R^{3\text{*}}, R^{5}, y R^{5\text{*}} designan cada uno hidrógeno. En esta realización, R^{N} puede seleccionarse también de entre intercaladores del ADN, grupos fotoquímicamente activos, grupos termoquímicamente activos, grupos quelantes, grupos indicadores, y ligandos.
-(CH_{2})_{0-1}-O-(CH_{2})_{1-3}-, -(CH_{2})_{0-1}-S-(CH_{2})_{1-3}-, y -(CH_{2})_{0-1}-N(R^{N})-(CH_{2})_{1-3}-, en particular -O-CH_{2}-, -S-CH_{2}- y -R^{N}-CH_{2}-, en donde R^{N} se selecciona de entre hidrógeno y C_{1-4}-alquilo, Q designa Prot-O-, Q^{\text{*}} designa Act-OH, y R^{1\text{*}}, R^{2}, R^{3\text{*}}, R^{5}, y R^{5\text{*}} designan cada uno hidrógeno. En esta realización, R^{N} puede seleccionarse también de entre intercaladores del ADN, grupos fotoquímicamente activos, grupos termoquímicamente activos, grupos quelantes, grupos indicadores, y ligandos.
En una realización adicional particularmente
interesante de los L-ribo-LNA de la
presente invención, B designa una nucleobase, preferiblemente una
nucleobase seleccionada de entre timina, citosina, uracilo, adenina
y guanina (en particular, adenina y guanina), X es -O-, R^{2}' y
R^{4\text{*}} juntos designan un birradical seleccionado de
entre
-(CH_{2})_{0-1}-O-(CH_{2})_{1-3}-, -(CH_{2})_{0-1}-S-(CH_{2})_{1-3}-, y -(CH_{2})_{0-1}-N(R^{N})-(CH_{2})_{1-3}-, en particular -O-CH_{2}-, -S-CH_{2}- y -R^{N}-CH_{2}-, en donde R^{N} se selecciona de entre hidrógeno y C_{1-4}-alquilo, Q se selecciona de entre hidroxilo, mercapto, C_{1-6}-alquiltio, amino, mono- o di(C_{1-6}-alquil)amino, C_{1-6}-alcoxilo opcionalmente sustituido, C_{2-6}-alqueniloxilo opcionalmente sustituido, C_{2-6}-alquiniloxilo opcionalmente sustituido, monofosfato, difosfato, y trifosfato, Q* se selecciona de entre hidrógeno, azido, halógeno, ciano, nitro, hidroxilo, mercapto, C_{1-6}-alquiltio, amino, mono- o di(C_{1-6}-alquil)amino, C_{1-6}-alcoxilo opcionalmente sustituido, C_{1-6}-alquilo opcionalmente sustituido, C_{2-6}-alquenilo opcionalmente sustituido, C_{2-6}-alqueniloxilo opcionalmente sustituido, C_{2-6}-alquinilo opcionalmente sustituido, y C_{2-6}-alquiniloxilo opcionalmente sustituido, R^{3\text{*}} se selecciona de entre hidrógeno, C_{1-6}-alquilo opcionalmente sustituido, C_{2-6}-alquenilo opcionalmente sustituido, y C_{2-6}-alquinilo opcionalmente sustituido, y R^{1\text{*}}, R^{2}, R^{3\text{*}}, R^{5}, y R^{5\text{*}} designan cada uno hidrógeno. También aquí, R^{N} puede seleccionarse también de entre intercaladores del ADN, grupos fotoquímicamente activos, grupos termoquímicamente activos, grupos quelantes, grupos indicadores, y ligandos.
-(CH_{2})_{0-1}-O-(CH_{2})_{1-3}-, -(CH_{2})_{0-1}-S-(CH_{2})_{1-3}-, y -(CH_{2})_{0-1}-N(R^{N})-(CH_{2})_{1-3}-, en particular -O-CH_{2}-, -S-CH_{2}- y -R^{N}-CH_{2}-, en donde R^{N} se selecciona de entre hidrógeno y C_{1-4}-alquilo, Q se selecciona de entre hidroxilo, mercapto, C_{1-6}-alquiltio, amino, mono- o di(C_{1-6}-alquil)amino, C_{1-6}-alcoxilo opcionalmente sustituido, C_{2-6}-alqueniloxilo opcionalmente sustituido, C_{2-6}-alquiniloxilo opcionalmente sustituido, monofosfato, difosfato, y trifosfato, Q* se selecciona de entre hidrógeno, azido, halógeno, ciano, nitro, hidroxilo, mercapto, C_{1-6}-alquiltio, amino, mono- o di(C_{1-6}-alquil)amino, C_{1-6}-alcoxilo opcionalmente sustituido, C_{1-6}-alquilo opcionalmente sustituido, C_{2-6}-alquenilo opcionalmente sustituido, C_{2-6}-alqueniloxilo opcionalmente sustituido, C_{2-6}-alquinilo opcionalmente sustituido, y C_{2-6}-alquiniloxilo opcionalmente sustituido, R^{3\text{*}} se selecciona de entre hidrógeno, C_{1-6}-alquilo opcionalmente sustituido, C_{2-6}-alquenilo opcionalmente sustituido, y C_{2-6}-alquinilo opcionalmente sustituido, y R^{1\text{*}}, R^{2}, R^{3\text{*}}, R^{5}, y R^{5\text{*}} designan cada uno hidrógeno. También aquí, R^{N} puede seleccionarse también de entre intercaladores del ADN, grupos fotoquímicamente activos, grupos termoquímicamente activos, grupos quelantes, grupos indicadores, y ligandos.
Un aspecto de la invención es proporcionar
varios derivados de los L-ribo-LNA
para su incorporación en fase sólida y/o fase en solución a un
oligómero. Como un ejemplo ilustrativo, los monómeros apropiados
para la incorporación de
(1R,3R,4S,7R)-7-hidroxi-1-hidroximetil-3-(timin-1-il)-2,5-dioxabiciclo[2.2.1]heptano,
(1R,3R,4S,7R)-7-hidroxi-1-hidroximetil-3-(citosin-1-il)-2,5-dioxabiciclo[2.2.1]heptano,
(1R,3R,4S,7R)-7-hidroxi-1-hidroximetil-3-(uracil-1-il)-2,5-dioxabiciclo
[2.2.1]heptano,
(1R,3R,4S,7R)-7-hidroxi-1-hidroximetil-3-(guanin-1-il)-2,5-dioxabiciclo[2.2.1]heptano,
y
(1R,3R,4S,7R)-7-hidroxi-1-hidroximetil-3-(adenin-1-il)-2,5-dioxabiciclo[2.2.1]heptano,
usando la estrategia del fosforamidito, la estrategia del
fosfotriéster, y la estrategia del H-fosfonato son,
respectivamente, el
(1R,3R,4S,7R)-7-(2-cianoetoxi(diisopropil-amino)fosfinoxi)-1-(4,4'-dimetoxitritiloximetil)-3-(timin-1-il)-2,5-dioxabiciclo[2.2.1]heptano,
(1R,3R,4S,7R)-7-hidroxi-1-(4,4'-dimetoxitritiloximetil)-3-(timin-1-il)-2,5-dioxabiciclo[2.2.1]heptano-7-O-(2-clorofenilfosfato),
y
(1R,3R,4S,7R)-7-hidroxi-1-(4,4'-dimetoxitritiloximetil)-3-(timin-1-il)-2,5-dioxabiciclo[2.2.1]heptano-7-O-(H-fosfonato)
y, respectivamente, los análogos
3-(citosin-1-il),
3-(uracil-1-il),
3-(adenin-1-il) y
3-(guanin-1-il) de los mismos.
Además, los análogos en los que el birradical metilenoxilo de los
monómeros se sustituye con un metilentio, un metilenamino, o un
birradical 1,2-etileno, también se espera que
constituyan variantes particularmente interesantes dentro de la
presente invención. Se cree que los análogos metilentio y
metilenamino son igualmente aplicables como el análogo
metilenoxilo, y, por tanto, los reactivos específicos
correspondientes a los mencionados para la incorporación de
(1R,3R,4S,7R)-7-hidroxi-1-hidroximetil-3-(timin-1-il)-2,5-dioxabiciclo[2.2.1]heptano,
(1R,3R,4S,7R)-7-hidroxi-1-hidroximetil-3-(citosin-1-il)-2,5-dioxabiciclo[2.2.1]heptano,
(1R,3R,4S,7R)-7-hidroxi-1-hidroximetil-3-(uracil-1-il)-2,5-dioxabiciclo
[2.2.1]heptano,
(1R,3R,4S,7R)-7-hidroxi-1-hidroximetil-3-(guanin-1-il)-2,5-dioxabiciclo[2.2.1]heptano,
y
(1R,3R,4S,7R)-7-hidroxi-1-hidroximetil-3-(adenin-1-il)-2,5-dioxabiciclo[2.2.1]heptano,
deberían considerarse como monómeros reactivos particularmente
interesantes dentro de la presente invención. Para el análogo
metilenamino debería destacarse que la amina secundaria puede portar
un sustituyente seleccionado de entre
C_{1-6}-alquilos, tal como el
metilo y bencilo,
C_{1-6}-alquilcarbonilos
opcionalmente sustituidos, tal como el trifluoroacetilo,
arilcarbonilos opcionalmente sustituidos, y heteroarilcarbonilos
opcionalmente sustituidos.
Es también interesante, como un aspecto distinto
de la presente invención, la variante de la Fórmula II o IIa en
donde B está en la "configuración b".
En una realización preferida, se sintetizó un
\alpha-L-ribo-LNA
que contenía un puente metileno
2'-O,4'-C, mediante el siguiente
procedimiento: bencilación de
4-C-hidroximetil-\alpha-D-xilofuranosa
1 (T.F. Tam y B. Fraser-Ried, Can. J. Chem.,
57:2818 (1979)) proporcionó el derivado
di-O-benzoilo 2, el cual se
convirtió posteriormente en la furanosa
1,2-di-O-acetilada 3
mediante acetolisis usando ácido acético al 80%, seguida por
acetilación Empleando una metodología de Vorbrüggen modificada (H.
Vorbrüggen, K. Krolikiewicz y B. Bennua, Chem. Ber.,
114:1234 (1981); H. Vorbrüggen y G. Höfle, Chem. Ber.,
114:1256 (1981)), el nucleósido de timina configurado en \beta 4
se obtuvo de forma estereoselectiva mediante la sililación in
situ del acoplamiento mediado por timina y trimetilsililo. El
tratamiento del compuesto 43 con metóxido sódico resultó en la
desacilación para rendir el triol del nucleósido 5. La protección
con 4,4'-dimetoxitritilo, seguida por una
tosilación, proporcionó el derivado 7 del nucleósido
5'-O-4,4'-dimetoxitritilo
protegido. El cierre del anillo inducido por base proporcionó el
derivado 8 del nucleósido bicíclico. La desbencilación rindió el
análogo 9 del nucleósido bicíclico, el cual se transformó en el
derivado de fosforamidito 10 para la síntesis de oligonucleótido. El
procedimiento de acoplamiento usado en el ejemplo es sólo uno de
los posibles procedimientos, tal y como será evidente para una
persona experta en la materia.
Como una ruta alternativa, puede usarse la
secuencia sintética mostrada en la Figura 3 (Ejemplos
12-14). De este modo, el nucleósido 5 se
trimetilsililó para rendir el nucleósido 11, el cual puedo ciclarse
usando NaOH/EtOH/H_{2}O. En las condiciones experimentales
usadas, se observó la conversión concomitante del grupo mesiloxilo
restante a un grupo hidroxilo, rindiendo el nucleósido 12. Se espera
que la protección estándar con DMT, tal y como se esbozó en el
Ejemplo 14, rinda el nucleósido 8, un intermediario conveniente
hacia la síntesis del derivado 10 de fosforamidito del nucleósido
\alpha-L-ribo-LNA
(Figura 2).
Se pretende que el ejemplo descrito sea
ilustrativo de los procedimientos y ejemplos de esta invención. Las
estructuras de los compuestos sintetizados se verificaron usando
1D-RMN.
Los procedimientos descritos en los Esquemas 1,
2 y 3 pueden probablemente usarse para sintetizar nucleósidos
\alpha-L-ribo-LNA
derivados de otras bases pirimidínicas distintas de la timina, por
ejemplo, el uracilo, la citosina, el uracilo sustituido en 5, la
citosina sustituida en 5, así como otras pirimidinas sustituidas de
otro modo. Alternativamente, los derivados de uracilo pueden
convertirse en los correspondientes derivados de citosina, y los
derivados de timina en los correspondientes derivados de
5-metilcitosina, usando procedimientos bien
conocidos (Koshkin, A. A., Singh, S. K., Nielsen, P., Rajwanshi, V.
K., Kumar, R., Meldgaard, M., Olsen, C. E., Wengel, J.,
Tetrahedron, 54:3607 (1998); Obika, S., Nanbu, D., Hari, Y.,
Andoh, J., Morio, K., Doi, T., Imanishi, T., Tetrahedron
Lett., 39:5401 (1998)).
Para la síntesis de derivados de nucleósido
\alpha-L-ribo-LNA
de purinas pueden idearse un cierto número de procedimientos
sintéticos apropiados. Debería destacarse que el término
"cara-\alpha", cuando se menciona más abajo,
se refiere a la cara-\alpha de los monómeros de
nucleósido de ARN naturales, que el término
"cara-\beta", cuando se menciona más abajo,
se refiere a la cara-\beta de los monómeros de
nucleósido de ARN naturales, y que el término "nucleósido de
\beta-purina" o "nucleósido de
\beta-pirimidina" significa que las nucleobases
están colocadas como en los monómeros de nucleósidos de ARN
naturales. Como un ejemplo de una posible ruta sintética hacia los
derivados de nucleósidos de
\alpha-L-ribo-LNA
de purina, puede utilizarse la ciclización de análogos configurados
como arabino (grupo 2'-OH colocado en la
cara-\beta del anillo de furanosa). Estos
nucleósidos pueden prepararse a partir de los correspondientes
nucleósidos matriz configurados como arabino, a través de la
oxidación en 5', la condensación del aldol, y la reducción.
Las manipulaciones y activación del grupo
protector del grupo 5'-OH (colocado en la
cara-\beta del anillo de furanosa) debería
preparar entonces para la ciclización deseada tal y como se mencionó
más arriba. Alternativamente, la oxidación en 2' del grupo
2'-OH de los derivados
4'-C-hidroximetilos de los
nucleósidos ribofuranosilo de \beta-purina (con
los grupos 2'-OH y 3'-OH colocados
en la cara-\alpha del anillo de furanosa, y el
3'-OH colocado en la cara-\beta
del anillo de furanosa (o, alternativamente, en la
cara-\alpha del anillo de furanosa) con la
inversión concomitante en C3'), seguida por la reducción
estereoselectiva (usando, por ejemplo, NaBH_{4}) debería
suministrar el nucleósido deseado con la configuración invertida en
el átomo de carbono 2'. Las manipulaciones y activación del grupo
protector del grupo 5'-OH (colocado en la
cara-\beta del anillo de furanosa) debería
preparar entonces para la ciclización deseada tal y como se
mencionó más arriba. Pueden anticiparse otros procedimientos que
serán útiles para la inversión de la configuración en el átomo de
carbono 2' de los derivados
4'-C-hidrometilo de los nucleósido
ribofuranosilos de \beta-purina (con los grupos
2'-OH y 3'-OH colocados en la
cara-\alpha del anillo de furanosa, y el
3'-OH colocado en la cara-\beta
del anillo de furanosa, o, alternativamente, en la
cara-\alpha, con la inversión concomitante en
C3', del anillo de furanosa), por ejemplo, la reacción de Mitsunobu
o las reacciones de desplazamiento nucleofílico de derivados
2'-O-activados (por ejemplo,
derivados 2'-O-mesilo,
2'-O-tosilo, o
2'-O-trifluorometanosulfonilo) con
O-nucleófilos como el acetato, el benzoato, el
alcóxido y similares. La desprotección posterior para proporcionar
un derivado
5'-hidroxi-4'-C-hidroximetilo,
la activación para preparar la ciclización (por ejemplo, mediante
mono- o dimesilación, mono- o ditosilación, o mono- o
ditrifluorometanosulfonación), la ciclización (después de la
desprotección del grupo 2'-OH, si es necesario), y
las desprotecciones deberían suministrar los nucleósidos
\alpha-L-ribo de purina deseados.
Debería destacarse que las bases de purina preferiblemente deberían
protegerse en los monómeros diana, y que esto puede conseguirse
durante la ruta sintética escogida, o como el último paso, mediante
la trimetilsililación, la protección del grupo amino libre de las
bases purínicas, y la desililación. Los derivados
4'-C-hidroximetilo de partida de los
nucleósidos \beta-purina pueden, en una
realización, prepararse mediante acoplamiento del derivado de
furanosa 3 (Figura 1) con derivados de adenina o guanina
convenientemente protegidos, siguiendo los procedimientos de
acoplamiento conocidos del tipo Vorbrüggen (ver, por ejemplo, la
síntesis del nucleósido 4; Figura 1) (Koshkin, A. A., Singh, S. K.,
Nielsen, P., Rajwanshi, V. K., Kumar, R., Meldgaard, M., Olsen, C.
E., Wengel, J., Tetrahedron, 54:3607 (1998)).
Se anticipa que la inversión de la configuración
tal como se ha descrito más arriba puede realizarse sobre
nucleósidos ribofuranosilos de \beta-purina
naturales (con el grupo 2'-OH colocado en la
cara-\alpha del anillo de furanosa, y el grupo
3'-OH colocado en la cara-\beta
del anillo de furanosa, o, alternativamente, en la
cara-\alpha del anillo de furanosa, con la
inversión concomitante en C3'), con la introducción del grupo
4'-C-hidroximetilo adicional, para
continuar a partir de ese punto usando procedimientos conocidos, por
ejemplo, los descritos más arriba. También se puede esperar que las
reacciones enzimáticas o químicas de transglicosilación, sobre
nucleósidos de pirimidina convenientemente derivatizados y
protegidos, bien nucleósidos furanosilo de
\beta-pirimidina configurados como arabino,
nucleósidos furanosilo de
4'-C-hidroximetil-\beta-pirimidina
configurados como arabino, o nucleósidos
\alpha-L-ribo-LNA
de pirimidina ya ciclizados, sean rutas sintéticas posibles hacia
los derivados de nucleósidos
\alpha-L-ribo-LNA
de purina. Alternativamente, la
4-C-hidroximetilación, la inversión
de la configuración en el átomo de carbono 2, y la ciclización, o
uno de estos procedimientos, o dos de estos procedimientos (el que
sea necesario depende del material de partida aplicado) puede
realizarse partiendo de una furanosa o hexosa. Posteriormente,
antes o después de la ciclización, el acoplamiento con diferentes
bases (purinas o pirimidinas - protegidas si es necesario)
proporcionará derivados de nucleósidos útiles para la síntesis de
nucleósidos
\alpha-L-ribo-LNA
de pirimidina o purina, después de las necesarias manipulaciones de
los grupos protectores y/o de las activaciones del grupo OH. Aún
debería ser posible otro procedimiento para sintetizar nucleósidos
\alpha-L-ribo-LNA
de pirimidina o purina, la construcción directa de la nucleobase
deseada, en dos o más pasos químicos) a partir de un derivado
furanosilo convenientemente derivatizado, por ejemplo, una
furanosilamina.
En una realización preferida, los procedimientos
descritos en los Ejemplos 15, 16 y 17 (Figura 4) pueden usarse para
preparar los monómeros de
\alpha-L-LNA de purina, por
ejemplo, los derivados de adenina o guanina. Por tanto, el azúcar 3
se acopló con N-6-benzoiladenina
para proporcionar el nucleósido 13, el cual se desacetiló
selectivamente y se convirtió posteriormente en el derivado
2'-O-trifluorometanosulfonilo. La
reacción concomitante con acetato potásico proporciono el derivado
2'-O-acetilo 14 con inversión en
C2'. La completa desacilación, seguida por la reprotección de la
porción adenina, la mesilación selectiva de los dos grupos
hidroxilos primarios, y el tratamiento con hidróxido sódico en
agua:dioxano rindió el nucleósido 15 de adenina
\alpha-L-LNA. La protección con
DMT del nucleósido 15, seguida por la desbencilación y la
3'-O-fosfitilación (Koshkin, A. A.,
Singh, S. K., Nielsen, P., Rajwanshi, V. K., Kumar, R., Meldgaard,
M., Olsen, C. E., Wengel, J., Tetrahedron, 54:3607 (1998))
es una ruta posible para obtener el derivado fosforamidito 16. La
desbencilación de 15 seguida por la protección selectiva con DMT
del grupo hidroxilo primario y la
3'-O-fosfitilación es otro ruta que
rinde el derivado fosforamidito 16.
Todos los métodos y procedimientos descritos más
arriba para la síntesis de los nucleósidos de purina
\alpha-L-ribo-LNA
son también aplicables como procedimientos alternativos para la
síntesis de nucleósidos de pirimidina
\alpha-L-ribo-LNA.
Los procedimientos descritos más arriba para la
síntesis de nucleósidos de purina y pirimidina
\alpha-L-ribo-LNA
conducen de forma natural a procedimientos útiles para la síntesis
de derivados 2'-amino y 2'-tio de
nucleósidos
\alpha-L-ribo-LNA.
Como un ejemplo, la ciclización mediante el ataque de un grupo
2'-amino o 2'-tio, ubicado en la
cara \beta del anillo de furanosa, sobre un grupo
5'-OH convenientemente activado, debería
proporcionar los nucleósidos pirimidínicos 2'-amino
o 2'-tio
\alpha-L-ribo-LNA.
Alternativamente, la ciclización mediante el ataque de un grupo
5'-amino o 5'-tio, ubicado en la
cara \beta del anillo de furanosa, sobre un grupo
2'-OH convenientemente activado, y ubicado en la
cara \alpha del anillo de furanosa, debería proporcionar los
nucleósidos pirimidínicos o purínicos 2'-amino o
2'-tio
\alpha-L-ribo-LNA.
Como otro procedimiento, la ciclización de derivados
convenientemente activados, protegidos y configurados, por ejemplo,
nucleósidos
2'-O,5'-O-dimesilo,
2'-O,5'-O-ditosilo,
ó
2'-O,5'-O-ditrifluorometanosulfonilo,
usando amino o tio nucleófilos (por ejemplo, respectivamente
benzilamina y tioacetato potásico) debería proporcionar los
derivados 2'-amino y 2'-tio de
nucleósidos \alpha-L-LNA. De igual
modo, un ataque por parte de un grupo 5'-OH,
ubicado en la cara \beta del anillo de furanosa, sobre un grupo
2'-OH convenientemente activado, y ubicado en la
cara \alpha del anillo de furanosa, debería proporcionar los
nucleósidos pirimidínicos o purínicos
\alpha-L-ribo-LNA
originales.
Se espera que el procedimiento usado para la
oligomerización de los nucleósidos pirimidínicos
\alpha-L-ribo-LNA
pueda usarse exitosamente también para los nucleósidos purínicos
\alpha-L-ribo-LNA.
Alternativamente, también debería ser aplicable cualquier
procedimiento para la síntesis automatizada o en fase de solución de
oligonucleótidos y análogos, por ejemplo, el procedimiento del
fosfotriéster, el procedimiento del H-fosfonato, o
cualquier variante del procedimiento del fosforamidito usado para
la oligomerización de los nucleósidos pirimidínicos de
\alpha-L-ribo-LNA.
Los oligo- y polinucleótidos lineales,
ramificados (M. Groetli y B. S. Sproat, J. Chem. Soc. Chem.
Commun., 495 (1995); R. H. E., Hudson y M. J. Damha, J. Am.
Chem. Soc., 115:2119 (1993); M. Von Büren, G. V. Petersen, K.
Rasmussen, G. Brandenburg, J. Wengel y F. Kirpekar,
Tetrahedron, 51:8491 (1995)) y circulares (G. Prakash y E.
T. Kool, J. Am. Chem. Soc., 114:3523 (1992)) de la invención
pueden producirse usando las técnicas de polimerización de la
química de ácidos nucleicos, que son bien conocidas por una persona
con formación ordinaria en las técnicas de la química orgánica. La
química del fosforamidito (S. L. Beaucage y R. P. Iyer,
Tetrahedron, 49:6123 (1993); S. L. Beaucage y R. P. lyer,
Tetrahedron, 48:2223 (1992)) se usó, pero, por ejemplo,
también pueden usarse la química del H-fosfonato, la
química de l fosfotriéster, o la síntesis química. Las condiciones
de acoplamiento estándares para la estrategia del fosforamidito se
modificaron ligeramente al usar hidrocloruro de piridina en vez de
1H-tetrazola como un reactivo altamente eficiente para
activar los fosforamiditos de nucleósido durante la síntesis del
oligonucleótido, y una prolongación del tiempo de acoplamiento de
entre 10 a 30 minutos.
Una vez sintetizada la secuencia deseada, la
desprotección y la separación del soporte sólido (separación del
soporte sólido y la supresión de los grupos protectores usando
amoniaco concentrado en metanol, a temperatura ambiente, durante 12
horas), y la purificación posterior en fase inversa usando cartuchos
desechables disponibles comercialmente (lo que incluye la
destritilación), rindió el producto oligomérico final.
Alternativamente, la purificación de los oligonucleótidos de
L-ribo-LNA puede efectuarse usando
la HPLC en fase inversa desechable, y/o la precipitación a partir
de etanol o butanol. La electroforesis en gel capilar se usó para
verificar la pureza y la composición de los análogos de
oligonucleótidos sintetizados, sin embargo, la pureza y la
composición se pueden verificar también usando HPLC en fase inversa
y MALDI-MS.
Generalmente, la presente invención proporciona
el uso de los L-ribo-LNA, tal y como
se han definido en la presente, para la preparación de
oligonucleótidos modificados con
L-ribo-LNA. Debe sobrentenderse que
los oligonucleótidos modificados con
L-ribo-LNA pueden comprender
nucleósidos normales (es decir, nucleósidos que existen de forma
natural, tales como los ribonucleósidos y/o los
desoxirribonucleósidos), así como nucleósidos modificados
diferentes de los definidos con la Fórmula general II.
Además, los materiales de soporte sólido que
tienen inmovilizado sobre sí un LNA opcionalmente con una
nucleobase protegida, y opcionalmente con un 5'-OH
protegido, son especialmente interesantes como material para la
síntesis de oligonucleótidos modificados con LNA, en los que se
incluye un monómero de LNA en el extremo 3'. En este caso, el
material del soporte sólido preferiblemente es CPG, por ejemplo, un
material de CPG fácilmente (comercialmente) disponible, sobre el
cual se ha fijado un LNA, opcionalmente con una nucleobase protegido
y opcionalmente con un 5'-OH protegido, usando las
condiciones establecidas por el suministrador para ese material
concreto. Puede usarse el soporte CPG Universal de BioGenex
(BioGenex, EE.UU.). El grupo protector del 5'-OH
puede ser, por ejemplo, un grupo DMT. El grupo funcional en 3'
debería escogerse con la debida consideración a las condiciones
aplicables al material CPG en cuestión.
La presente invención describe el sorprendente
hallazgo de que los derivados
L-ribo-LNA, cuando se incorporan en
oligonucleótidos parcialmente modificados, disminuyen la afinidad de
estos oligonucleótidos modificados por ambos, el ADN y el ARN
complementarios, en comparación con los oligonucleótidos sin
modificar. No obstante, cuando se incorporan en oligonucleótidos
completamente modificado con
L-ribo-LNA, se observa un
incremento dramático en las propiedades de hibridación con ambos,
ADNss y ARNss complementarios. El
\alpha-L-ribo-LNA,
una variante especial de los
L-ribo-LNA, además de las
propiedades descritas tiene la capacidad de discriminar entre
dianas de ARN y ADN cuando se hibrida. Dependiendo de la aplicación,
el uso de oligonucleótido de
L-ribo-LNA completamente
modificados, ofrece, por tanto, la fascinante posibilidad de, o bien
incrementar enormemente la afinidad de un oligonucleótido estándar
sin comprometer su especificidad (oligonucleótido de tamaño
constante), incrementar significativamente la especificidad sin
comprometer la afinidad (reducción en el tamaño del
oligonucleótido), o hibridarse específicamente a dianas de ARN.
Se cree también que los oligonucleótidos
modificados con L-ribo-LNA, además
de mejorar enormemente sus propiedades de hibridación, muestran
muchas de las útiles propiedades fisicoquímicas de los
oligonucleótidos de ADN y ARN normales. Las posibilidades incluyen,
una excelente solubilidad, una respuesta de los oligonucleótidos
modificados con LNA a las sales como el cloruro sódico y cloruro de
tetrametilamonio que imita la de los oligonucleótidos no
modificados, la capacidad de los oligonucleótidos modificados con
LNA para actuar como cebadores de una variedad de polimerasas, la
capacidad de los nucleótidos modificados con LNA para actuar como
cebadores en una reacción de amplificación de una diana usando una
polimerasa del ADN termoestable, la capacidad de los
oligonucleótidos modificados con LNA para actuar como un sustrato de
la quinasa de polinucleótidos de T4, la capacidad de los LNA
biotinilados para capturar amplicones de la PCR de forma específica
para la secuencia sobre una superficie sódica recubierta de
estreptoavidina, la capacidad de los oligonucleótidos modificados
con LNA inmovilizados para capturar amplicones de forma específica
según la secuencia, y de forma muy importante, la capacidad de los
oligonucleótidos modificados con LNA para apuntar específicamente
según la secuencia ADN de doble hebra mediante invasión de la
hebra. Por tanto, es evidente para alguien con la formación
ordinaria en el campo, que estos novedosos análogos de nucleósido
son herramientas extremadamente útiles para mejorar en general las
prestaciones de las técnicas terapéuticas, de diagnósticos y de la
biología molecular basadas en oligonucleótidos.
Un objeto de la presente invención es
proporcionar L-ribo-LNA monoméricos
de la invención, los cuales pueden incorporarse en oligonucleótidos
usando procedimientos y equipamiento bien conocido por alguien
experto en el campo de la síntesis de oligonucleótidos.
Otro objeto de la presente invención es
proporcionar oligonucleótidos (oligómeros) modificados total o
parcialmente con L-ribo-LNA, los
cuales son capaces de hibridarse, de forma específica para una
secuencia, con oligonucleótidos complementarios, formando dúplex o
triplexes de afinidad sustancialmente mayor que los complejos
correspondientes formados por oligonucleótidos no modificados.
Otro objeto de la presente invención es usar
oligonucleótidos completamente modificados con
L-ribo-LNA para obtener una
especificidad mejorada de los oligonucleótidos sin comprometer la
eficacia.
Otro objeto de la presente invención es
proporcionar oligonucleótidos completa o parcialmente modificados,
que comprenden tanto L-ribo-LNA,
como nucleósidos normales, y otros análogos de nucleósidos.
Un objeto adicional de la presente invención es
explotar la elevada afinidad de los
L-ribo-LNA para crear
oligonucleótidos completamente modificados de afinidad extrema, los
cuales son capaces de unirse a sus secuencias diana en un molécula
de ADNds por medio del "desplazamiento de la hebra".
Un objeto adicional de la invención es
proporcionar diferentes clases de
L-ribo-LNA, los cuales, cuando se
incorporan en los oligonucleótidos, difieren en su afinidad por sus
nucleósidos complementarios. Esto puede conseguirse, por ejemplo,
sustituyendo las nucleobases normales G, A, T, C y U con derivados
que tengan, por ejemplo, sus posibilidades de puentes de hidrógeno
alteradas.
Otro objeto de la presente invención es
proporcionar oligonucleótidos modificados con
L-ribo-LNA, los cuales son más
resistentes a las nucleasas que sus homólogos no modificados.
Otro objeto de la presente invención es
proporcionar oligonucleótidos modificados con
L-ribo-LNA, los cuales pueden
discriminar entre dianas de ADN y ARN cuando se están hibridando. Se
ha mostrado sorprendentemente mediante mediciones de la T_{m} que
la T_{m} de un
\alpha-L-ribo-LNA
respecto oligonucleótidos de ARN está incrementada 5,7ºC por
modificación, en comparación con sólo 2,7ºC por modificación
respecto el ADN complementario (tal y como se muestra en el Ejemplo
11, Tabla 3). Por tanto, los oligos de
\alpha-L-ribo-LNA
tendrán una afinidad incrementada hacia el ARN en comparación con
el ADN, permitiendo que se creen condiciones en las cuales el
\alpha-L-ribo-LNA
se hibridará específicamente a un ARN determinado, pero no a un ADN
que tenga la misma secuencia de bases. Esta capacidad para
discriminar entre ARN y ADN puede explotarse en un cierto número de
situaciones descritas más abajo.
Otro objeto de la presente invención es
proporcionar oligonucleótidos que pueden reclutar la RNAsaH.
Un objeto adicional de la presente invención es
proporcionar L-ribo-LNA que pueden
actuar como sustratos para las polimerasas de ADN y ARN,
permitiendo de ese modo que los análogos se incorporen en una cadena
de ácido nucleico en crecimiento, o que actúen como terminadores de
cadena.
Un objeto adicional de la presente invención es
proporcionar L-ribo-LNA que pueden
actuar como agentes terapéuticos. Se conocen muchos ejemplos de
análogos de nucleósidos terapéuticos, y pueden sintetizarse
derivados similares de los análogos de nucleósido descritos en la
presente invención usando los procedimientos conocidos a partir de
la literatura (E. De Clercq, J. Med. Chem., 38:2491 (1995);
P. Herdewijn y E. De Clercq: "Classical Antiviral Agents and
Design of New Antiviral Agents", en: A Textbook of Drug Design
and Development; Editores P. Krogsgaard-Larsen,
T. Liljefors y U. Madsen; Harwood Academic Publishers, Amsterdam,
1996, p. 425; I. K. Larsen: "Anticancer Agents". En: A
Textbook of Drug Design and Development; Editores P.
Krogsgaard-Larsen, T. Liljefors y U. Madsen;
Harwood Academic Publishers, Amsterdam, 1996, p. 460).
Se ha demostrado que el ARN de doble cadena
posee actividad antivírica y actividad supresora de tumores (Sharp
et al., Eur. J. Biochem.,
230(1):97-103 (1995),
Lengyel-P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
U.S.A., 90(13):5893-5895 (1993), y
Laurent-Crawford et al., AIDS Res. Hum.
Retroviruses, 8(2):285-290 (1992)). Es
probable que los LNA de doble cadena puedan imitar el efecto de los
ARN de doble cadena terapéuticamente activos, y en consecuencia
tales LNA de doble cadena tienen un potencial como drogas
terapéuticas.
Cuando se usa en la presente invención, el
término "ácido nucleico natural" se refiere a ácidos nucleicos
en el sentido más amplio, como, por ejemplo, los ácidos nucleicos
presentes en células intactas de cualquier origen, o los virus o
los ácidos nucleicos liberados a partir de tales fuentes mediante
medios químicos o físicos, o los ácidos nucleicos derivados a
partir de tales fuentes primarias por medio de la amplificación. El
ácido nucleico puede ser de hebra simple, doble, o parcialmente
doble, y puede ser una especie relativamente pura o una mezcla de
diferentes ácidos nucleicos. Puede ser también un componente de una
muestra biológica cruda que comprende otros ácidos nucleicos y
otros componentes celulares. Por otra parte, el término "ácidos
nucleicos sintéticos" se refiere a cualquier ácido nucleico
producido mediante síntesis química.
La presente invención también proporciona el uso
de oligonucleótidos modificados con
L-ribo-LNA en la terapia y
diagnóstico basados en ácido nucleico, y en la biología molecular.
Los oligonucleótidos modificados con
L-ribo-LNA pueden usarse en la
detección, identificación, captura, caracterización, cuantificación
y fragmentación de ácidos nucleicos naturales o sintéticos, y como
agentes bloqueadores de la traducción y transcripción in
vivo e in vitro. En muchos casos, será interesante unir
varias moléculas a los oligonucleótidos modificados con
L-ribo-LNA. Tales moléculas pueden
unirse a cualquier extremo del oligonucleótido, o pueden unirse a
una o más posiciones internas. Alternativamente, pueden unirse al
oligonucleótido a través de espaciadores unidos al extremo 5' ó 3'.
Son grupos representativos de tales moléculas: los intercaladores
del ADN, los grupos fotoquímicamente activos, los grupos
termoquímicamente activos, los grupos quelantes, los grupos
indicadores, y los ligandos; Generalmente, todos los procedimientos
para marcar con estas moléculas oligonucleótidos de ADN y ARN no
modificados pueden usarse también para marcar oligonucleótidos
marcados con L-ribo-LNA. De igual
modo, todos los procedimientos para detectar oligonucleótidos
marcados generalmente se aplican a los oligonucleótidos modificados
con L-ribo-LNA y marcados.
Por tanto, un oligonucleótido modificado con
L-ribo-LNA puede usarse para el
marcaje de células, en donde la marca permite que las células se
puedan distinguir o separar de células no marcadas.
El término "desplazamiento de la hebra" se
refiere a un proceso en donde un oligonucleótido se une a su
secuencia diana complementaria en un ADN o ARN de doble hebra, para
desplazar la otra hebra de dicha hebra diana.
En un aspecto de la presente invención, los
oligonucleótidos modificados con
L-ribo-LNA y capaces de realizar el
"desplazamiento de la hebra" se explotan en el desarrollo de
drogas farmacéuticas novedosas en la estrategia del
"antígeno". En contraste con los oligonucleótidos capaces de
formar hélices triples, tales oligonucleótidos de "desplazamiento
de la hebra" permiten apuntar a cualquier secuencia en un ADNds,
y hacerlo a fuerza iónica y pH fisiológicos.
Los oligonucleótidos de "desplazamiento de la
hebra" puede usarse también ventajosamente en la estrategia
antisentido en casos en los que la secuencia diana de ARN es
inaccesible debido a los puentes de hidrógeno intramoleculares.
Tales estructuras pueden ocurrir en ARNm y pueden causar problemas
significativos cuando se intenta "cerrar" la traducción del
ARNm mediante la estrategia de antisentido.
Otras clases de ARN celulares, como por ejemplo
los ARNt, ARNr, ARNsn y ARNsc, comprenden estructuras
intramoleculares que son importantes por su función. Estas clases de
ARN altamente estructurados no codifican proteínas, sino que (en
forma de partículas de ARN/proteínas) participan en un conjunto de
funciones celulares, tales como el plegado del ARNm, la
poliadenilación, la traducción, la edición, el mantenimiento de la
integridad de los extremos de los cromosomas. Debido a su elevado
grado de estructura, que dificulta o incluso impide que los
oligonucleótidos normales se hibriden eficientemente, ha sido
difícil hasta la fecha usar estas clases de ARN como dianas
antisentido. Sin embargo, con los nuevos y sorprendente resultados
de los
\alpha-L-ribo-LNA
presentados en la presente invención, apuntar a estos ARN con los
\alpha-L-ribo-LNA
es una posibilidad, tal y como se describe más abajo.
Se sabe que un cierto número de antibióticos
interactúan con los ribosomas bacterianos e inhiben de ese modo la
traducción. Se sabe que algunos antibióticos (por ejemplo, la
estreptomicina, la tetraciclina, la espectinomicina, la edeína, la
higromicina y las neomicinas) se unen a regiones específicas sobre
el ARNr 16S bacteriano (Moazed D y Noller HF, Nature,
327(6121):389 (1987)). De forma similar, otros antibióticos
(por ejemplo, el cloramfenicol, la eritromicina, la carbomicina, y
la vernamicina B) interactúan con regiones específicas sobre el
ARNs 23 S bacteriano (Moazed D y Noller HF, Biochimie,
69(8):879 (1987)). Una estrategia similar parece realizable
también en organismos superiores (Spangler EA y Blackburn EH, J.
Biol. Chem., 260(10):6334 (1985)).
Además, se sabe que los PNA (PNA, Ácidos
péptido-nucleicos) son moléculas que interactúan
específicamente con el ADN en un tipo de emparejamiento
Watson-Crick, y que lo hacen con una estabilidad
térmica (T_{m}) algo incrementada. Dirigidos a sitios funcionales
y accesibles en el ARN ribosómico, pueden inhibir la traducción en
Escherichia coli (Good L y Nielsen PE, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 95(5):2073 (1998)), indicando que los
oligonucleótidos de afinidad elevada, los cuales se unen a ciertos
sitios del ARN, pueden imitar el efecto de los antibióticos que se
unen al ARNr. Puesto que los LNA se unen al ARN con un T_{m} aún
mayor que la de los PNA, es altamente probable que puedan diseñarse
LNA que se unan específicamente al ARNr bacteriano e inhiban la
traducción en la bacteria. Como una extensión de esta estrategia,
puede ser posible explotar las pequeñas pero significativas
diferencias en las secuencias de ARNr entre organismos superiores,
para diseñar LNA-oligos que inhiban la traducción
en unos, pero no en los otros. Una aplicación de esta estrategia
sería desarrollar LNA específicamente, los cuales inhiban la
traducción en Plasmodium spp. (los parásitos de la malaria),
Schistosoma spp. (que causa la Bilharzia), diversas filarias
(causantes de la Elefantiasis y de la Ceguera del Río),
anquilostomas (causantes de anemia) y otros parásitos
patogénicos.
El uso de monómeros de
L-ribo-LNA de elevada afinidad
debería facilitar la construcción de sondas antisentido con la
termoestabilidad suficiente para hibridarse efectivamente a tales
ARN dianas. Por tanto, en una realización preferida, el
L-ribo-LNA se usa para conferir una
afinidad suficiente al oligonucleótido para permitir que se hibride
con esas clases de ARN, modulando de ese modo la función cualitativa
y/o cuantitativa de las partículas en las que se halla el ARN.
Los oligonucleótidos modificados con
L-ribo-LNA a usarse en terapias
antisentido se diseñan con el doble propósito de la elevada
afinidad y de la capacidad para reclutar la RNAsaH. Esto puede
conseguirse, por ejemplo, teniendo segmentos de
L-ribo-LNA flanqueando un segmento
de ADN central no modificado. Además, la capacidad especial del
\alpha-L-ribo-LNA
para discriminar entre el ARN y el ADN puede explotarse sen varias
aplicaciones antisentido terapéuticas generales, a causa de la
preferencia de los
\alpha-L-ribo-LNA
por el ARN. Mediante el diseño de oligonucleótidos de
\alpha-L-ribo-LNA
específicos para el ARN de interés, se evita la unión no específica
a fragmentos de ADN con una secuencia de nucleótidos similar a la
del ARN diana, impidiéndose de ese modo la asociación estable de
los oligonucleótidos de
\alpha-L-ribo-LNA
con el ADN cromosómico, la cual podría cambiar la estructura del
ADN e inducir, por tanto, mutaciones en el gen en cuestión. Este
cambio en la estructura del ADN y las mutaciones asociadas pueden
causar efectos tóxicos secundarios no deseados.
Aún otra realización de la presente invención es
diseñar ribozimas con especificidad incrementada. Los ribozimas son
oligodesoxirribonucleótidos, y análogos de los mismos, que combinan
la actividad catalítica de la ARNasa con la capacidad de tener una
interacción específica para la secuencia con una diana de ARN
complementario. Han atraído mucho interés como moléculas
terapéuticas, y parece probable que las características atractivas
de los oligonucleótidos de
\alpha-L-ribo-LNA
puedan usarse para mejorar el diseño de ribozimas dirigido contra
ARN específicos.
Aún otra realización de la presente invención
son oligonucleótidos de L-ribo-LNA
que interaccionan específicamente con nucleoproteínas celulares,
las cuales contienen ARN como un componente integrado y esencial de
la proteína activa, dos ejemplos de las cuales son los ribosomas y
la telomerasa. La capacidad de los oligonucleótidos de
\alpha-L-ribo-LNA
para inhibir la telomerasa puede aplicarse a aplicaciones
importantes.
Los cromosomas de los eucariotas superiores
(incluyendo el hombre) son lineales. La estructura primaria (la
secuencia de ADN) de los extremos del cromosoma ha sido elucidada, y
parece ser que las secuencias de ADN de todos los extremos de
cromosomas -en un organismo determinado- consisten en una unidad
sencilla que se repite con un extremo de hebra simple que
sobresale. El extremo del cromosoma se denomina telómero. En el
hombre, los telómeros contienen tiradas largar de múltiples
repeticiones de doble hebra de la secuencia
5'-TTAGGG-3' (secuencia en una
hebra, en la dirección desde el centrómero hacia el extremo del
cromosoma). Puesto que todas las polimerasas de ADN requieren tanto
la hebra de plantilla como el cebador de oligonucleótido para
iniciar la síntesis de una hebra de ADN complementario, la
polimerasa de ADN no es capaz por sí misma de replicar los extremos
finales de los cromosomas. Esto conduce a un acortamiento progresivo
de los cromosomas cuando los cromosomas se replican. Mirando la
longitud de los telómeros en células somáticas normales, la
longitud del telómero pare ser más corta durante cada ciclo de
replicación, hasta que el telómero tiene solamente de
5-15 k.b. de longitud. Cuando los telómeros son tan
cortos, las células cesan normalmente de dividirse y entran
gradualmente en la fase de senescencia. La única excepción a esto
son las células madre. Las células madre son células especializadas
que son capaces de continuar dividiéndose durante la vida de un
organismo. De forma interesante, los telómeros de las células madre
continúan siendo largos (10-15 kb). Esto se debe a
la actividad de un enzima particular, la telomerasa. La telomerasa
es un enzima único, el cual es capaz de prolongar específicamente
el extremo sobresaliente de hebra única del telómero, permitiendo de
ese modo que los telómeros tengan una longitud estable. La
telomerasa es un enzima ribonucleoproteína, es decir, una proteína
que contiene un ARN, y que depende del ARN para su actividad
enzimática. La estructura de la telomerasa es algo similar a la de
la transcriptasa inversa - una proteína vírica que también es capaz
de sintetizar ADN usando un ARN como plantilla.
La capacidad enzimática de la telomerasa para
prolongar el telómero depende de la correcta posición del extremo
3' del telómero libre sobre la molécula de ARN. Las moléculas que
son capaces de interaccionar específicamente con el extremo final
del telómero, o quizás con el componente de ARN de la telomerasa,
inhibirán el enzima. El
\alpha-L-ribo-LNA
puede diseñarse para satisfacer estos requisitos. Esto será
interesante en la terapia del cáncer -excepto para las células
madre-, puesto que las células somáticas normales no contienen
actividad telomerasa detectable, lo que supone un amplio contraste
con las células de cáncer, la mayoría de las cuales contiene
actividad telomerasa fácilmente detectable. Las células cancerosas
son inmortales, no envejecen, sino que continúan proliferando y
forman masas tumorales hasta que el organismo muere. La evidencia
global hasta la fecha sugiere que la actividad telomerasa es
esencial para la inmortalización de las células cancerosas. De
forma interesante, los telómeros de las células cancerosas son
sustancialmente más cortos que los telómeros de las células madre,
indicando que las células cancerosas alcanzarían la "barrera de la
longitud del telómero" antes que las células madre, y sugiriendo
que un fármaco que inhiba específicamente la actividad telomerasa
es útil como fármaco anticáncer.
En relación a esto, será un aspecto importante
explotar las propiedades excepcionales del
\alpha-L-ribo-LNA
para diseñar oligómeros de
\alpha-L-ribo-LNA
dirigidos contra partes específicas del componente ARN de la
telomerasa, con el propósito de inhibir la actividad telomerasa de
las células cancerosas humanas.
Otra realización de la presente invención es el
uso de oligonucleótidos de
L-ribo-LNA, especialmente de
oligonucleótidos de
\alpha-L-ribo-LNA,
como aptámeros. Esta prometedora nueva clase de oligonucleótidos
terapéuticos se selecciona in vitro para unirse
específicamente a una diana determinada con elevada afinidad, como,
por ejemplo, los receptores de ligando. Sus características de
unión son probablemente un reflejo de la capacidad de los
oligonucleótidos para formar estructuras tridimensionales mantenidas
juntas mediante el emparejamiento intramolecular de las
nucleobases. Es altamente probable que los aptámeros que contienen
oligonucleótidos de
\alpha-L-ribo-LNA
puedan presentar características ventajosas que pueden explotarse
con fines terapéuticos.
En algunos casos, puede ser ventajoso regular a
la baja la expresión de un gen, mientras que en otros casos puede
ser ventajoso activarlo. Tal como mostraron Moellegaard et
al. (Moellegaard, N. E.; Buchardt, O.; Egholm, M.; Nielsen, P.
E., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 91:3892 (1994)), los
oligómeros capaces de "desplazamiento de la hebra" pueden
funcionar como activadores de la transcripción del ARN. En un
aspecto de la presente invención, los LNA capaces de
"desplazamiento de la hebra" se usan para activar genes de
interés terapéutico.
En la quimioterapia de numerosas infecciones
víricas y cánceres, varias formas de nucleósidos y análogos de
nucleósidos han probado ser efectivas. Los nucleósidos de
L-ribo-LNA son potencialmente útiles
como tales fármacos basados en nucleósidos.
En un cierto número de casos, se ha descrito que
el ARN de doble hebra (ARNds) tiene actividades farmacéuticas
específicas. Los dúplex que implican oligonucleótidos completamente
modificados con L-ribo-LNA son
potencialmente útiles como tales fármacos de doble hebra, y es
además altamente posible que los oligonucleótidos de
\alpha-L-ribo-LNA
de doble hebra añadan moléculas importantes al repertorio de
moléculas parecidas al ARN de doble hebra biológicamente
activas.
El potencial terapéutico de los LNA de doble
hebra (DS-LNA) puede, por tanto, estar en el
tratamiento del cáncer o de las infecciones víricas, tal y como se
explica más abajo.
Se ha descrito que varios tipos de
DS-ARN, bien sólo o en sinergia con el
interferón-gamma, inhiben el crecimiento de varios
tipos de células cancerosas (Borecky et al., Tex Rep Biol
Med, 41:575 (1981); Sharp et al., Eur J Biochem,
230(1):97 (1995)). Los DS-ARN inhiben el
crecimiento de las células cancerosas en cultivo, así como en
tumores en animales de experimentación. Al menos dos enzimas
activables por el ARN de doble hebra parecen estar implicados en la
actividad supresora de tumores del DS-ARN, la
proteína quinasa activable por el ARN de doble hebra y la
ribonucleasa L (Lengyel-P, Proc. Natl. Acad Sci
USA, 90(13):5893 (1993)). Mientras que la PKR es
activada directamente por el DS-ARN, la RNasa L es
activada por el DS-ARN a través de la
(2'-5')oligoadenilato sintetasa, la cual está
latente a menos que sea activada por el DS-ARN. El
DS-ARN también induce la actividad de las células
asesinas naturales (NK), y esta actividad probablemente contribuye a
la actividad antitumoral del DS-ARN.
Aunque el DS-ARN que ocurre de
forma natural típicamente está asociado con la infección por virus,
se ha demostrado también que el DS-ARN posee
actividad anti-vírica. El DS-ARN ha
demostrado su actividad contra los virus de la inmunodeficiencia
humana VIH-1 y VIH-2 (Haines et
al., J Cell Biochem, 46(1):9 (1991)). El
DS-ARN, y por tanto los DS-LNA,
pueden por tanto ser un candidato potencial como fármaco terapéutico
en el tratamiento del SIDA.
El DS-ARN aun ha de probas su
eficacia clínica en la práctica. Sin embargo, las células de
mamífero contienen un cierto número de nucleasas específicas para
el DS-ARN, y quizá a causa de estas actividades el
DS-ARN es rápidamente eliminado de los pacientes. El
LNA es bastante parecido al ARN, y comparte la mayoría de las
características químicas del ARN (Koshkin et al.,
Tetrahedron, 54:3607 (1998)), el LNA forma dúplex estable y
el cambio estructural del ARN al LNA es bastante sutil. Por tanto,
es probable que LNA de doble hebra adecuados puedan imitar el
efecto de cierto DS-ARN y, en consecuencia, activar
la PKR y/o (2'-5')oligoadenilato sintetasa, y
puesto que se ha probado que el LNA presenta estabilidad
exonucleótica (Singh et al., Chem. Commun., 455
(1998)) es posible que las moléculas de DS-LNA
puedan presentar una eficacia terapéutica mejorada en comparación
con el DS-ARN.
Esta invención también concierne a una
composición farmacéutica que comprende un oligonucleótido,
modificado con L-ribo-LNA,
farmacéuticamente activo, o un monómero de
L-ribo-LNA farmacéuticamente activo,
tal y como se definieron más arriba, en comparación con un portador
farmacéuticamente aceptable.
Tales composiciones pueden estar en una forma
adaptada a la administración oral, parenteral (intravenosa,
intraperitoneal), intramuscular, rectal, intranasal, dérmica,
vaginal, bucal, ocular, o pulmonar, preferiblemente en una forma
adaptada a la administración oral, y tales composiciones pueden
prepararse de una forma bien conocida por el especialista en la
técnica, por ejemplo, como se describe de forma general en
"Remington's Pharmaceutical Sciences", 17ª edición, Alfonso R.
Gennaro (Ed.), Mark Publishing Company, Easton, PA, EE.UU., 1985 y
en ediciones más recientes, y en las monografías en la serie
"Drugs and the Pharmaceutical Sciences", Marcel Dekker.
Se han desarrollado varios procedimientos
diagnósticos y de biología molecular que utilizan conjuntos de
diferentes oligonucleótidos para analizar simultáneamente un ácido
nucleico diana en busca de la presencia de un plétora de mutaciones
posibles. Típicamente, los conjuntos de oligonucleótidos están
inmovilizados en un patrón determinado sobre un soporte sólido, de
forma que la presencia de una mutación determinada en el ácido
nucleico diana puede revelarse por la posición sobre el soporte
sólido en donde se hibrida. Una importante condición previa para el
uso exitoso de conjuntos de diferentes oligonucleótidos en el
análisis de ácidos nucleicos, es que todos sean específicos para su
secuencia diana concreta en la única condición de hibridación
aplicada. Puesto que la afinidad y especificidad de los
oligonucleótidos estándares por sus secuencias diana
complementarias dependen intensamente de su secuencia y tamaño,
hasta la fecha ha sido difícil satisfacer este criterio.
Además, se han desarrollado un cierto número de
técnica para caracterizar los diversos tipos de ARN que las células
pueden contener. Una estrategia común para la caracterización es la
hibridación del ácido nucleico, los ejemplos de tales técnicas son:
la hibridación in situ, la hibridación por transferencia de
puntos, la hibridación por la transferencia de puntos inversa, la
hibridación Northern, y la transcripción inversa con la reacción en
cadena de la polimerasa (RT-PCR). Estas técnicas se
preparar a menudo sobre muestra que contienen tanto ADN como ARN, y
frecuentemente este hecho crea problemas en los ensayos, los cuales
podrían evitarse fácilmente si existieran sondas que fueran
convenientemente discriminatorias entre el ADN y el ARN. Este es un
problema, en particular, en las hibridaciones in situ
realizadas sobre varios especímenes de tejido. Con sus propiedades
de hibridación altamente discriminatorias hacia el ARN, se puede
diseñar un
\alpha-L-ribo-LNA
oligo que se hibride específicamente con el ARN en la muestra,
eliminándose de ese modo la posibilidad de resultados erróneos
obtenidos de la hibridación con ADN irrelevantes con la misma
secuencia de nucleótidos.
Por tanto, en una realización preferida, los
L-ribo-LNA pueden usarse como un
medio para incrementar la afinidad y/o especificidad de las sondas,
y como un medio para igualar la afinidad de diferentes
oligonucleótidos por sus secuencias complementarias. Tal y como se
describe en la presente invención, la modulación de la afinidad
puede conseguirse mediante, por ejemplo, la sustitución de
nucleósidos seleccionados en el oligonucleótido con un
L-ribo-LNA portador de una
nucleobase similar. En concreto, esto se aplica a los
oligonucleótidos de
\alpha-L-ribo-LNA.
En otra realización preferida, se explota lo
elevada afinidad y especificidad de los oligonucleótidos
modificados con L-ribo-LNA en la
captura específica de secuencia y en la purificación de ácidos
nucleicos naturales o sintéticos. En un aspecto, los ácidos
nucleicos naturales o sintéticos se ponen en contacto con el
oligonucleótido modificado con
L-ribo-LNA e inmovilizado sobre una
superficie sólida. En este caso, la hibridación y la captura
ocurren simultáneamente. Los ácidos nucleicos capturados pueden, por
ejemplo, detectarse, caracterizarse, cuantificarse o amplificarse
directamente sobre la superficie mediante una variedad de
procedimientos bien conocidos en el estado de la técnica, o pueden
liberarse de la superficie antes de que ocurra tal caracterización
o amplificación, sometiendo el oligonucleótido modificado,
inmovilizado, y al ácido nucleico capturado a condiciones de
deshibridación, tales como, por ejemplo, el calor o usando tampones
de baja fuerza iónica.
El soporte sólido puede escogerse de entre un
amplio rango de materiales poliméricos, tales como, por ejemplo, el
CPG (vidrio de poro controlado), el polipropileno, el poliestireno,
el policarbonato o el polietileno, y puede adoptar una variedad de
formas, tales como, por ejemplo, un tubo, una placa de
microvaloración, una palillo, una cuenta, un filtro, etc. El
oligonucleótido modificado con
L-ribo-LNA puede inmovilizarse
sobre el soporte sólido a través de sus extremos 5' ó 3' (o a través
del extremo de engarces unidos al extremo 5' ó 3') mediante una
variedad de procedimientos químicos o fotoquímicos empleados
usualmente en la inmovilización de oligonucleótidos, o mediante
acoplamiento no covalente, tal como, por ejemplo, a través de unión
de oligonucleótidos modificados con
L-ribo-LNA biotinilado para
inmovilizar la estreptoavidina. Un procedimiento preferido para
inmovilizar los oligonucleótidos modificados con
L-ribo-LNA sobre diferentes soportes
sólidos es fotoquímico, usando una antraquinona fotoquímicamente
activa unida al extremo 5' ó 3' del oligonucleótido modificado
(opcionalmente a través de engarces), tal y como se describe en (WO
96/31557). Por tanto, la presente invención proporciona también una
superficie portadora de un oligonucleótido modificado con LNA.
En otro aspecto, el oligonucleótido modificado
con L-ribo-LNA porta un ligando
unido covalentemente a uno de los extremos 5' ó 3'. En este caso,
el oligonucleótido modificado con
L-ribo-LNA se pone en contacto con
los ácidos nucleicos naturales o sintéticos en solución, después de
lo cual, los híbridos formados se capturan sobre un soporte sólido
portando moléculas que pueden unir específicamente el ligando.
En todavía otro aspecto, los oligonucleótidos
modificados con L-ribo-LNA capaces
de realizar el "desplazamiento de la hebra", se usan en la
captura de ácidos nucleicos naturales y sintéticos sin
desnaturalización previa. Tales oligonucleótidos modificados son
particularmente útiles en los casos en los que es difícil o
imposible acceder a la secuencia diana mediante oligonucleótidos
normales debido a la formación rápida de estructuras
intramoleculares estables. Son ejemplos de ácidos nucleicos que
contienen tales estructuras: el ARNr, ARNt, ARNsn y el ARNsc.
En otra realización preferida, los
oligonucleótidos modificados con
L-ribo-LNA diseñados con el
propósito de especificidad elevada se usan como cebadores en la
secuenciación de ácidos nucleicos, y como cebadores en cualquiera
de las diversas reacciones de amplificación bien conocidas, tal como
la reacción de la PCR. Tal y como se muestra en la presente
invención, el diseño de los oligonucleótidos modificados con
L-ribo-LNA determina si
experimentarán una amplificación de diana exponencial o lineal. Los
productos de la reacción de amplificación pueden analizarse
mediante una variedad de procedimientos aplicables al análisis de
los productos de amplificación generados con cebadores de ADN
normales. En el caso concreto en el que los cebadores de
oligonucleótidos modificados con
L-ribo-LNA se diseñan para
experimentar una amplificación lineal, los amplicones resultantes
portarán extremos de hebra simple que pueden apuntarse mediante
sondas complementarias sin desnaturalización. Tales extremos pueden
usarse, por ejemplo, para capturar amplicones mediante otros
oligonucleótidos modificados con
L-ribo-LNA complementarios y unidos
a una superficie sólida.
En otro aspecto, los oligos modificados con
L-ribo-LNA capaces de
"desplazamiento de la hebra" se usan como cebadores en
reacciones de amplificación lineal o exponencial. Se espera que el
uso de tales oligos potencie los rendimientos globales de amplicón,
mediante la competición efectiva con la rehibridación del amplicón
en las últimas etapas de la reacción de amplificación. Demers et
al. (Nucl. Acid Res., 23:3050-3055
(1995)) descubren el uso de oligos de elevada afinidad, no
extensibles, como un medio para incrementar el rendimiento global
de una reacción de la PCR. Se cree que los oligómeros elicitan estos
efectos interfiriendo con la rehibridación del amplicón en las
etapas finales de la reacción de la PCR. Se espera que los oligos
modificados con L-ribo-LNA y
bloqueados en su extremo 3' proporcionen la misma ventaja. El
bloqueo del extremo 3' puede conseguirse de numerosas formas, como,
por ejemplo, intercambiando el grupo 3' hidroxilo con hidrógeno o
fosfato. Tales oligos modificados con
L-ribo-LNA y bloqueados en 3' pueden
usarse también para amplificar selectivamente secuencias de ácidos
nucleicos estrechamente relacionadas, de forma similar a la descrita
por Yu et al. (Biotechniques,
23:714-716 (1997)).
En años recientes, se han inventado nuevas
clases de sondas que pueden usarse en, por ejemplo, la detección en
tiempo real de amplicones generados mediante reacciones de
amplificación de una diana. Una de tales clases de sondas se ha
denominado "Balizas Moleculares". Estas sondas se sintetizar
como oligonucleótidos parcialmente
auto-complementarios que comprenden un fluoróforo en
un extremo y una molécula atenuadora en el otro extremo. Cuando
está libre en solución, la sonda se pliega en una estructura en
horquilla (guiada por las regiones
auto-complementarias), lo que ubica el atenuador lo
suficientemente cerca del fluoróforo como para atenuar su señal
fluorescente. A partir de la hibridación con su ácido nucleico
diana, la horquilla se abre separando de ese modo el fluoróforo y
el atenuador, y dando lugar a una señal fluorescente.
Otra clase de sondas se ha denominado "sondas
Taqman". Estas sondas también comprenden un fluoróforo y una
molécula atenuadora. Sin embargo, al contrario que las Balizas
Moleculares, la capacidad de los atenuadores para atenuar la señal
fluorescente procedente del fluoróforo se mantiene después de la
hibridación de la sonda a su secuencia diana. En cambio, la señal
fluorescente se genera después de la hibridación mediante la
separación de cualquiera del atenuador o fluoróforo de la sonda por
medio de la acción de la actividad 5'-exonucleasa
de una polimerasa, la cual ha iniciado la síntesis a partir de un
cebador ubicado 5' respecto el sitio de unión de la sonda
Taqman.
La elevada afinidad por el sitio diana es una
característica importante en ambos tipos de sondas y, en
consecuencia, tales sondas tienden a ser bastante largas
(típicamente de 30 a 40 meros). Como resultado, se hallan problemas
significativos en la producción de sondas de elevada calidad. Por
tanto, en una realización preferida, el LNA se usa para mejorar la
producción y posteriores prestaciones de las sondas Taqman y de las
Balizas Moleculares, reduciendo su tamaño mientras que retienen la
afinidad requerida.
En un aspecto adicional, los
L-ribo-LNA se usan para construir
pares de afinidad (sean oligonucleótidos total o parcialmente
modificados). Las constantes de afinidad pueden ajustarse fácilmente
a lo largo de un amplio rango, y pueden diseñarse y sintetizarse un
vasto número de pares de afinidad. Una parte del par de afinidad
puede unirse a la molécula de interés (por ejemplo, proteínas,
amplicones, enzimas, polisacáridos, anticuerpos, haptenos,
péptidos, PNA, etc.) mediante procedimientos estándares, mientras
que la otra parte del par de afinidad puede unirse a, por ejemplo,
un soporte sólido, tal como cuentas, membranas, placas de
microvaloración, palillos, tubos, etc. El soporte sólido puede
escogerse de entre un amplio rango de materiales poliméricos, tales
como, por ejemplo, el polipropileno, el poliestireno, el
policarbonato o el polietileno. Los pares de afinidad pueden usarse
en el aislamiento selectivo, en la purificación, en la captura, y en
la detección de una diversidad de las moléculas diana mencionadas
más arriba.
El principio de capturar una molécula marcada
con L-ribo-LNA por medio de la
interacción con otro oligonucleótido de
L-ribo-LNA complementario (bien
total o parcialmente modificado) puede usarse para crear un número
infinito de nuevos pares de afinidad.
En otra realización preferida, se explota lo
elevada afinidad y especificidad de los oligonucleótidos
modificados con L-ribo-LNA en la
construcción de sondas útiles para la hibridación in situ.
Por ejemplo, el L-ribo-LNA puede
usarse para reducir el tamaño de las sondas de ADN tradicionales
mientras que se mantiene la afinidad requerida, incrementándose de
ese modo las cinéticas de las sondas y su capacidad para penetrar
el espécimen de muestra.
Otra realización de la presente invención es el
uso de oligonucleótidos de
L-ribo-LNA, especialmente de
oligonucleótidos de
\alpha-L-ribo-LNA,
en procedimientos de purificación específicos para el ARN. Los
procedimientos tradicionalmente empleados para aislar ácidos
nucleicos procedentes de células procariotas, células eucariotas, o
de muestras biológicas complejas, usan solventes orgánicos tales
como el fenol y el cloroformo. Estos aislamientos de ácidos
nucleico típicamente empiezan con una digestión enzimática de la
muestra, realizada con proteasas, seguidas por la lisis celular
usando detergentes iónicos, y a continuación la extracción con fenol
o una combinación fenol/cloroformo. Las fases orgánica y acuosa se
separan, y los ácidos nucleicos que se han repartido en la fase
acuosa se recuperan mediante la precipitación con alcohol. No
obstante, el fenol, o una mezcla fenol/cloroformo, es corrosivo
para la piel humana, y se considera un residuo peligroso, el cual
debe manipularse cuidadosamente y desecharse correctamente.
Adicionalmente, las extracciones estándares usando los
procedimientos de fenol/cloroformo resultan en mezclas de ARN y
ADN. Por tanto, es ventajoso preparar el aislamiento del ácido
nucleico explotando la capacidad del
\alpha-L-ribo-LNA
para discriminar entre el ARN y el ADN, obteniéndose de ese modo
muestras de ADN puro.
La presente invención también proporciona un
equipo para el aislamiento, purificación, amplificación, detección,
identificación, cuantificación, o captura de ácidos nucleicos
naturales o sintéticos, en donde el equipo comprende un cuerpo de
reacción, y uno o más oligonucleótidos (oligómeros) modificados con
L-ribo-LNA, tal y como se describen
en la presente invención. Los oligonucleótidos modificados con
L-ribo-LNA están preferiblemente
inmovilizados sobre dicho cuerpo de reacción.
La presente invención también proporciona un
equipo para el aislamiento, purificación, amplificación, detección,
identificación, cuantificación, o captura de ácidos nucleicos
naturales o sintéticos, en donde el equipo comprende un cuerpo de
reacción, y uno o más L-ribo-LNA,
tal y como se describen en la presente invención. Los
L-ribo-LNA están preferiblemente
inmovilizados sobre dichos cuerpos de reacción (por ejemplo, usando
las técnicas de inmovilización descritas más arriba).
Para los equipos de la invención, el cuerpo de
reacción es preferiblemente un material de soporte sólido,
seleccionado, por ejemplo, de entre el vidrio de borosilicato, el
vidrio soda-lima, el poliestireno, policarbonato,
polipropileno, polietileno, tereftalato de polietilenglicol,
polivinilacetato, polivinilpirrolidona, polimetilmetacrilato y
polivinilcloruro, preferiblemente poliestireno y policarbonato. El
cuerpo de reacción puede adoptar la forma de un tubo para
espécimen, un vial, un portaobjetos, una lámina, una película, una
cuenta, un precipitado, un disco, una placa, un anillo, una barra,
una red, un filtro, una bandeja, una placa de microvaloración, un
palillo, o un palillo con múltiples palas.
Los equipos están típicamente acompañados por
una hoja de instrucciones escritas detallando las condiciones
óptimas para usar el equipo.
Las reacciones se llevaron a cabo en una
atmósfera de nitrógeno cuando se usaron solventes anhidros. La
cromatografía en columna se llevó a cabo en columnas de vidrio
usando gel de sílice 60 (0,040-0,063 mm). Después
de la cromatografía en columna, las fracciones que contenían
producto se mezclaron, se evaporaron a sequedad bajo presión
reducida, y se secaron bajo vacío para rendir el producto. Después
de secar las fases orgánicas usando Na_{2}SO_{4}, se llevó a
cabo la filtración. Se usó éter de petroleo del intervalo de
destilación 60-80ºC. Los valores de desplazamiento
químico \delta están en ppm relativas al tetrametilsilano como
referencia interna (RMN de ^{1}H y ^{13}C), y son relativas al
H_{3}PO_{4} al 85% (RMN de ^{31}P). Los microanálisis se
realizaron en el "The Microanalytical Laboratory", Departamento
de Química, Universidad de Copenague.
Las siguientes descripciones específicas están
acompañadas por las Figuras 1-4 y las Tablas
1-3.
A una solución enfriada en hielo y agitada de
3-O-bencil-4-C-hidroximetil-1,2-isopropilideno-\alpha-D-glucofuranosa
(1) (5,00 g, 0,016 mol) en piridina anhidra (60 cm^{3}) se le
añadió cloruro de bencilo (4,1 cm^{3}, 0,035 mol). Después de
agitarla a temperatura ambiente durante 4 h, se enfrió la mezcla de
reacción a 0ºC, se añadió H_{2}O (50 cm^{3}), y se extrajo la
mezcla con diclorometano (100 cm^{3} \times 3). La fase
orgánica combinada se lavó con soluciones acuosas saturadas de
hidrógeno carbonato sódico (30 cm^{3} \times 3) y salmuera (20
cm^{3} \times 3), se secó (Na_{2}SO_{4}) y se evaporó a
sequedad bajo presión reducida. El residuo se purificó mediante
cromatografía en columna de gel de sílice usando primero éter de
petroleo/diclorometano (1:1, v/v), y a continuación
diclorometano/metanol (99:1, v/v) como eluyente para rendir la
furanosa 2 (7,50 g, 90%) como un aceite amarillento, después de la
evaporación de los solventes bajo presión reducida. \delta_{H}
(CDCl_{3}) 8,02-7,23 (15H, m), 6,08 (1H, d, J
4,2), 4,81-4,50 (7H, m), 4,22 (1H, d, J 1,0), 1,59
(3H, s), 1,37 (3H, s). \delta_{C} (CDCl_{3}) 166,1, 165,8,
136,7, 133,1, 133,0, 129,9, 129,7, 129,6, 129,5, 128,5, 128,4,
128,3, 128,0, 127,9, 113,3, 105,4, 86,4, 85,1, 83,8, 72,3, 64,3,
63,8, 27,0, 26,4. FAB-MS m/z 521 [M+H]^{+}.
Hallado (%) C, 69,1; H, 5,9; C_{30}H_{32}O_{8} requiere C,
69,2; H, 6,2.
Una solución de la furanosa 2 (7,40 g, 0,014
mol) en ácido acético al 80% (60 cm^{3}) se agitó durante 9 h a
90ºC. La mezcla se evaporó a sequedad bajo presión reducida y el
residuo se coevaporó con tolueno (10 cm^{3} \times 3) y se
disolvió en piridina anhidra (80 cm^{3}). Se añadió anhídrido
acético (5,5 cm^{3}) y se agitó la solución durante 46 h a
temperatura ambiente. La mezcla se evaporó a sequedad bajo presión
reducida, y el residuo se coevaporó con tolueno (10 cm^{3}
\times 3) y se disolvió en diclorometano (150 cm^{3}). La
solución se lavó con soluciones acuosas saturadas de hidrógeno
carbonato sódico (30 cm^{3} \times 3) y salmuera (20 cm^{3}
\times 3), se secó (Na_{2}SO_{4}) y se concentró bajo
presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía en
columna de gel de sílice usando primero éter de
petroleo/diclorometano (1:1, v/v), y a continuación
diclorometano/metanol (99:1, v/v) como eluyente para rendir la
mezcla anomérica 3 (a:b = 3:1, 7,33 g, 92%) como un aceite claro,
después de la evaporación de los solventes bajo presión reducida.
Este aceite se usó en el paso siguiente sin purificación adicional.
\delta_{C} (CDCl_{3}) 169,4, 169,0, 165,8, 165,6, 137,0,
133,2, 133,1, 133,0, 129,6, 129,5, 129,2, 128,3, 127,8, 127,7,
127,4, 99,4, 92,3, 87,0, 83,2, 82,2, 80,7, 77,4, 76,9, 76,3, 73,2,
72,4, 20,9, 20,8, 20,6, 20,3. FAB-MS m/z 562
[M]^{+}.
A una suspensión agitada de la mezcla anomérica
3 (7,26 g, 0,013 mol) y timina (3,25 g, 0,028 mol) en acetonitrilo
anhidro (80 cm^{3}) se le añadió
N,O-bis(trimetilsilil)acetamida (19,1
cm^{3}, 0,077 mol). La mezcla de reacción se agitó a 60ºC durante
1 h y entonces se enfrió hasta 0ºC. Se añadió triflato de
trimetilsililo (4,1 cm^{3}, 0,023 mol) gota a gota durante 10
min, y posteriormente se calentó la mezcla durante 22 h con
reflujo. Después de enfriarla hasta temperatura ambiente, se añadió
una solución acuosa saturada de hidrógeno carbonato sódico (30
cm^{3}), y se realizó la extracción usando diclorometano (100
cm^{3} \times 3). La fase orgánica combinada se lavó con
soluciones acuosas saturadas de hidrógeno carbonato sódico (30
cm^{3} \times 3) y salmuera (50 cm^{3} \times 3), se
secó (Na_{2}SO_{4}), y se concentró bajo presión reducida. El
residuo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de
sílice usando diclorometano/metanol (0,5-2,0%
metanol, v/v) como eluyente para rendir el nucleósido 4 (6,88 g,
85%) como un material sólido blanco, después de la evaporación de
los solventes bajo presión reducida. \delta_{H} (CDCl_{3})
8,97 (1H, br s), 8,04-7,23 (16H, m), 6,37 (1H, d, J
3,6), 5,42 (1H, t, J 3,1), 4,89-4,56 (6H, m), 4,22
(1H, d, J 2,6), 2,13 (3H, s), 1,74 (1H, d, J 0,8). \delta_{C}
(CDCl_{3}) 169,9, 166,0, 165,7, 163,4, 150,4, 136,2, 135,2, 133,5,
133,4, 129,8, 129,7, 129,6, 129,5, 129,0, 128,6, 128,4, 128,2,
112,0, 87,4, 86,0, 81,3, 80,3, 72,6, 63,1, 62,9, 20,8, 12,3.
FAB-MS m/z 629 [M+H]^{+}. Hallado (%) C,
64,4; H, 4,9; N, 4,4; C_{34}H_{32}N_{2}O_{10},0,25H_{2}O
requiere C, 64,5; H, 5,1; N, 4,4.
A una solución agitada del nucleósido 4 (9,00 g,
0,014 mol) en metanol (130 cm^{3}) se le añadió metóxido sódico
(3,87 g, 0,0716 mol). La mezcla de reacción se agitó a temperatura
ambiente durante 4 h, y entonces se neutralizó con ácido
clorhídrico diluido. La mezcla se evaporó a sequedad bajo presión
reducida, seguida por coevaporación usando tolueno (15 cm^{3}
\times 3). El residuo se purificó mediante cromatografía en
columna de gel de sílice usando diclorometano/metanol
(4-15% metanol, v/v) como eluyente para rendir el
nucleósido triol 5 (4,82 g, 89%) como un material sólido blanco,
después de la evaporación de los solventes bajo presión reducida.
\delta_{H} (CD_{3}OD) 7,89 (1H, d, J 1,2),
7,40-7,24 (5H, m), 5,97 (1H, d, J 6,2),
4,83-4,65 (2H, m), 4,53 (1H, t, J 6,2), 4,21 (1H,
d, J 6,2), 3,84 (1H, d, J 12,0), 3,63 (1H, d, J 12,0), 3,59 (2H, d,
J 2,6), 1,82 (1H, d, J 1,1). \delta_{C} (CD_{3}OD) 164,4,
150,9, 137,5, 136,6, 127,5, 127,0, 126,9, 109,8, 86,7, 86,4, 82,8,
78,0, 72,1, 62,3, 61,1, 10,5 (CH_{3}). FAB-MS m/z
379 [M+H]^{+}. Hallado (%) C, 56,2; H, 6,0; N, 7,0;
C_{18}H_{22}N_{2}O_{7},0,25H_{2}O requiere C, 56,5; H,
5,9; N, 7,3.
\vskip1.000000\baselineskip
A una solución del nucleósido
1-(3-O-bencil-4-C-hidroximetil-\beta-D-xilofuranosil)timina
5 (5,38 g, 14,2 mmol) en tetrahidrofurano anhidro (400 cm^{3}) se
le añadió AgNO_{3} (2,66 g, 15,7 mmol) seguido por piridina
anhidra (5,7 cm^{3}) y cloruro de
4,4'-dimetoxitritilo (5,30 g, 15,6 mmol). La mezcla
se agitó a oscuras, bajo nitrógeno, durante 18 horas, a temperatura
ambiente. La reacción se detuvo mediante la adición de una solución
acuosa saturada de hidrógeno carbonato sódico (10 cm^{3}), y la
mezcla resultante se extrajo con diclorometano. La fase orgánica
combinada se evaporó a sequedad bajo presión reducida, y el residuo
se coevaporó con tolueno y se purificó mediante cromatografía en
columna de gel de sílice usando diclorometano/metanol/piridina (0,5%
metanol; 0,5% piridina, v/v) como eluyente para rendir el
nucleósido 6 (3,13 g, 31%) como una espuma blanca después de la
evaporación de los solventes. \delta_{C}
((CD_{3})_{2}SO) 164,1 (C-4), 158,4,
145,1, 138,5, 137,0, 135,9, 135,7, 130,1, 130,1, 129,2, 128,5,
128,5, 128,2, 128,1, 127,7, 127,6, 127,0, 125,7, 113,5 (DMT,
bencilo, C-6), 151,4 (C-2), 110,1
(C-5), 85,8, 85,2, 84,6, 83,5 (C-1',
C-3', C-4', DMT), 76,8
(C-2'), 72,3 (CH_{2}Ph), 65,2
(C-5''), 62,1 (C-5'), 55,4 (2
\times CH_{3}O), 12,6 (5-CH_{3}).
\vskip1.000000\baselineskip
A una solución del nucleósido 6 (2,79 g, 3,9
mmol) en piridina anhidra (50 cm^{3}) se le añadió una cantidad
catalítica de 4-(N,N-dimetilamino)piridina y
cloruro de p-toluensulfonilo (6,50 g, 34 mmol). La
mezcla se agitó a oscuras, durante 24 horas, a temperatura ambiente,
bajo nitrógeno. La reacción se detuvo mediante la adición de una
solución acuosa saturada de hidrógeno carbonato sódico (100
cm^{3}), y la mezcla resultante se extrajo con diclorometano. La
fase orgánica combinada se lavó con soluciones acuosas saturadas de
hidrógeno carbonato sódico (3 \times 75 cm^{3}) y cloruro
sódico (2 \times 75 cm^{3}). La fase orgánica separada se
secó (Na_{2}SO_{4}) y se evaporó a sequedad bajo presión
reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna
de gel de sílice usando diclorometano/metanol/piridina (0,5%
metanol; 0,5% piridina, v/v) como eluyente para proporcionar el
nucleósido 7 (2,40 g, 62%) como una espuma amarillenta después de
la evaporación de los solventes. \delta_{C}
((CD_{3})_{2}SO) 163,2 (C-4), 158,2,
145,9, 145,1,144,3, 136,8, 135,0, 134,9, 134,8, 131,8, 131,6,
130,2, 130,0, 129,7, 128,2, 127,9, 127,8, 127,6, 127,5, 127,5,
127,4, 126,8, 113,3 (DMT, C-6, 2 \times Ts,
bencilo), 150,2 (C-2), 110,8 (C-5),
95,0, 86,2 (DMT, C-4'), 82,2, 81,9
(C-1', C-2'), 81,2
(C-3'), 72,9 (CH_{2}Ph), 79
(C-5''), 64 (C-5'), 55,1 (2
\times CH_{3}O), 21,2, 21,2 (2 \times CH_{3}), 12,0
(5-CH_{3}).
\vskip1.000000\baselineskip
A una solución del nucleósido 7 (3,87 g, 3,92
mmol) en una mezcla de etanol y H_{2}O (1:1, v/v) se le añadió
una solución acuosa de NaOH (2 M, 8 cm^{3}). La mezcla se calentó
con reflujo durante 24 h, y después de enfriarla se extrajo con
diclorometano. La fase orgánica combinada se lavó con una solución
acuosa saturada de hidrógeno carbonato sódico (2 \times 75
cm^{3}), y se evaporó a sequedad bajo presión reducida. El
residuo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de
sílice usando diclorometano/metanol/piridina (0,5% metanol; 0,5%
piridina, v/v) como eluyente para proporcionar el nucleósido 8 (2,10
g, 81%) como una espuma blanca después de la evaporación de los
solventes. \delta_{C} ((CD_{3})_{2}SO) 163,8
(C-4), 158,2, 158,1, 144,7, 137,7, 135,9, 135,2,
135,1, 129,8, 129,7, 128,3, 127,9, 127,7, 127,7, 127,4, 126,7,
113,35 (DMT, bencilo, C-6) 150,3
(C-2), 108,1 (C-5), 88,4, 85,5
(C-4', DMT), 86,4 (C-1'), 79,5
(C-2'), 76,3 (C-3'), 72,6
(C-5'), 71,2 (CH_{2}Ph), 58,9
(C-5''), 55,1 (2 \times CH_{3}O), 12,4
(5-CH_{3}).
\vskip1.000000\baselineskip
A una solución del nucleósido 8 (1,09 g, 1,65
mmol) en metanol (30 cm^{3}) se le añadió formato amónico (0,33
g, 5,29 mmol). Se añadió una cantidad catalítica de Pd/C suspendido
en metanol (10 cm^{3}), y se calentó la mezcla durante 2 h con
reflujo. Después de enfriarla hasta temperatura ambiente, la mezcla
se evaporó a sequedad bajo presión reducida, y el residuo se
coevaporó con tolueno y se purificó mediante cromatografía en
columna de gel de sílice usando diclorometano/metanol/piridina (2%
metanol; 0,5% piridina, v/v) como eluyente para rendir el
nucleósido 9 (0,76 g, 80%) como un material sólido blanco después de
la evaporación de los solventes. \delta_{C}
((CD_{3})_{2}SO) 163,9 (C-4), 158,2,
144,8, 135,8, 135,4, 135,3, 129,8, 127,9, 127,7, 126,8, 113,3 (DMT,
C-6), 150,4 (C-2), 108,0
(C-5), 89,2, 85,4 (C-4', DMT), 86,4
(C-1'), 78,9 (C-2'), 72,9
(C-3'), 72,3 (C-5'), 59,9
(C-5''), 55,1 (2 \times CH_{3}O), 12,5
(5-CH_{3}).
A una solución del nucleósido 9 (420 mg, 0,73
mmol) en diclorometano anhidro (4 cm^{3}) se le añadió
N,N-diisopropiletilamina (0,4 cm^{3}) y
2-cianoetil-N,N-diisopropilfosforamidocloridito
(0,4 cm^{3}). La mezcla se agitó a oscuras, bajo nitrógeno,
durante 18 horas, a temperatura ambiente. La reacción se detuvo
mediante la adición de metanol, y la mezcla se diluyó con acetato de
etilo (10 cm^{3}), se lavó con soluciones acuosas saturadas de
hidrógeno carbonato sódico (3 \times 10 cm^{3}) y cloruro
sódico (2 \times 10 cm^{3}) y se evaporó a sequedad bajo
presión reducida. El residuo se coevaporó con acetonitrilo anhidro,
y se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice
usando éter de petroleo/acetato de etilo/piridina
(30-40% acetato de etilo; 0,2% piridina, v/v) como
eluyente para rendir un aceite. Este aceite se disolvió en
diclorometano (1 cm^{3}), y se precipitó un producto a partir de
éter de petroleo (20 cm^{3}) a -40ºC con agitación enérgica. El
precipitado se recolectó mediante filtración, y se coevaporó con
acetonitrilo anhidro para rendir el nucleósido 10 (117 mg, 21%)
como una espuma blanca. d_{P} (CH_{3}CN) 149,9, 149,3.
Los L-ribo-LNA y
los oligonucleótidos de referencia se prepararon en un Sintetizador
de ADN Biosearch 8750. El acoplamiento del amidito 10 se realizó
mediante "acoplamiento a mano" (mezclando previamente el
amidito y el activador en acetonitrilo en una jeringa; enjuagando
el reactor en columna aproximadamente dos veces cada minuto a lo
largo del tiempo de acoplamiento aplicado; soportes sólidos de CPG).
La síntesis de los L-ribo-LNA se
llevó a cabo usando hidrocloruro de piridina como activador
(10-30 min de tiempo de acoplamiento; los
rendimientos del acoplamiento paso a paso para el amidito 10 fueron
del 96-99%). Los
2'-desoxinucleósido-2-cianoetil-N,N-diisopropilfosforamiditos
sin modificar se acoplaron mediante el uso de programa de ADN
estándar del sintetizador, excepto para los acoplamientos que
seguían inmediatamente a un monómero X, los cuales se realizaron de
acuerdo con el programa de ARN del sintetizador. Una vez
completadas las secuencias, la desprotección usando amoniaco
concentrado en metanol (32% (p/p), temperatura ambiente, 12 h) de
los oligos
5'-O-DMT-ON, y la
purificación posterior en fase inversa (cartuchos comercialmente
disponibles (Cruachem); el procedimiento incluye la destritilación),
rindió los productos oligoméricos finales. Sin embargo, en el caso
de los oligonucleótidos no modificados y los
L-ribo-LNA que comprendían sólo un
monómero X, el grupo 5'-O-DMT se
eliminó en el sintetizador inmediatamente después de completarse la
secuencia. El tratamiento posterior con amoniaco concentrado en
metanol (32% (p/p), 12 h, 55ºC) y la precipitación con etanol
rindieron los oligómeros producto. La electroforesis en gel capilar
se usó para analizar la pureza de los
L-ribo-LNA sintetizados.
La termoestabilidad de los oligonucleótidos
modificados con L-ribo-LNA se
determinó espectrofotométricamente usando un espectrofotómetro
equipado con un elemento Peltier termorregulado. Las mezclas de
hibridación de 1 ml se prepararon usando una solución de tampón
medio salino (10 mM Na_{2}HPO_{4}, pH 7,0, 100 mM NaCl, 0,1 mM
EDTA), y cantidades equimolares (1 \muM o 1,5 \muM) de los
diferentes oligonucleótidos modificados con
L-ribo-LNA y sus oligonucleótidos de
ADN o ARN complementarios. Como referencias se prepararon mezclas de
hibridación idénticas usando los oligonucleótidos no modificados.
Se registró la absorbancia a 260 nm mientras se incrementaba la
temperatura linealmente entre 10-90ºC (1ºC/min). Las
temperaturas de fusión (valores de T_{m}) se obtuvieron como los
máximos (\pm 1ºC) de la primera derivada de las curvas de fusión.
Las Tablas 1-3 resumen los resultados (los
L-ribo-LNA están marcados con
negrita). La Figura 2 ilustra el
L-ribo-LNA monomérico usado.
A partir de la Tabla 1 puede observarse que la
incorporación de uno o más monómeros X de
\alpha-L-ribo-LNA
en una secuencia de oligonucléotido (A) y (B) no cambia la afinidad
de unión de los
\alpha-L-ribo-LNA
hacia el ADN complementario, mientras que la afinidad de unión
hacia el ARN complementario está fuertemente incrementada.
La Tabla 2 muestra los estudios de unión de LNA
diastereoisoméricos de homo-timina hacia el ARN
(rA14), ARN con un único emparejamiento erróneo
(5'-r(A_{6}CA_{7})), ARN enantiomérico
(ent-rA_{14}), y ARN enantiomérico con un único
emparejamiento erróneo
(ent-5'-r(A_{6}CA_{7})).
La Tabla 3 muestra los estudios de unión de ADN
9-meros de secuencia mixta, LNA y
\alpha-L-ribo-LNA.
A una solución del nucleósido 5 (1100 mg, 2,91
mmol) en tetrahidrofurano anhidro (20 cm^{3}) se le añadió
piridina anhidra (5 cm^{3}), seguida por cloruro de
metanosulfonilo (1,2 ml, 15,5 mmol). La mezcla se agitó en una
atmósfera de nitrógeno durante 18 horas, a temperatura ambiente. La
mezcla de reacción se evaporó a sequedad bajo presión reducida y se
disolvió en acetato de etilo. La fase orgánica se lavó con una
solución acuosa saturada de hidrógeno carbonato sódico (3 \times
10 cm^{3}) y se secó (Na_{2}SO_{4}). La fase orgánica se
evaporó a sequedad bajo presión reducida. El residuo se purificó
mediante cromatografía en columna de gel de sílice usando
diclorometano/metanol (2% metanol, v/v) como eluyente para
proporcionar el nucleósido 11 (908 mg, 51%). \delta_{C}
(CDCl_{3}) 163,3, 150,6, 135,6, 134,6, 128,7, 128,3, 112,2, 87,9,
85,0, 83,1, 80,9, 77,2, 76,9, 76,6, 73,3, 66,6, 66,2, 38,6, 37,6,
37,6, 12,2.
A una solución del nucleósido 11 (329 mg, 0,54
mmol) en etanol/agua (10 cm^{3}, 1:1, v/v) se le añadió NaOH 6 M
(aq) (0,9 ml, 5,4 mmol). La mezcla se sometió a reflujo a 80ºC
durante 43 h, seguida por evaporación a sequedad bajo presión
reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna
de gel de sílice usando diclorometano/metanol (2,4% metanol, v/v)
como eluyente para proporcionar el nucleósido 12 (85 mg, 44%).
\delta_{C} ((CD_{3})_{2}SO) 163,8, 150,3, 138,0,
135,8, 128,3, 127,7, 127,5, 108,0, 90,2, 86,5, 86,4, 79,3, 76,5,
72,5, 71,2, 57,2, 40,2, 40,0, 39,8, 39,6, 39,4, 39,2, 39,0,
12,3.
La protección con DMT estándar del grupo
hidroxilo primario del nucleósido 12 (por ejemplo, usando el mismo
procedimiento que para la preparación del nucleósido 6 mediante la
protección con FTM del grupo hidroxilo primario del nucleósido 5)
rendirá el nucleósido 8, el cual puede usarse en la síntesis del
derivado fosforamidito de nucleósido
\alpha-L-ribo-LNA
10 (ver la Figura 2 y los ejemplos relevantes).
Se disolvió el azúcar 3 (2,05 g) en acetonitrilo
anhidro (30 ml). Se añadieron
N-6-benzoiladenina (1,86 g) seguida
por SnCl_{4} (1,3 ml), y la mezcla resultante se agitó a
temperatura ambiente durante 3,7 h, transcurridas las cuales se
añadió una solución acuosa saturada de NaHCO_{3} hasta la
neutralización. Después de la filtración a través de Celite, el
filtrado se lavó sucesivamente con una solución acuosa saturada de
NaHCO_{3} (3 \times 150 ml) y H_{2}O (2 \times 150 ml),
se secó (Na_{2}SO_{4}), y se evaporó a sequedad bajo presión
reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna
de gel de sílice (40-60% NaOAc en éter de
petroleo) para rendir un intermediario del nucleósido completamente
protegido (1,40 g, rendimiento del 52%). Este intermediario (1,29
g) se disolvió en metanol (35 ml), y se añadió una solución saturada
de NH_{3} en metanol (35 ml). Después de agitarla a 0ºC durante
2,3 h, se evaporó la mezcla a sequedad bajo presión reducida, y el
residuo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de
sílice (1% de metanol en diclorometano) para rendir un
intermediario, el cual se disolvió en diclorometano anhidro (40 ml).
Después de enfriarla hasta -50ºC, se añadió piridina anhidra (3 ml)
junto con triflurorometanosulfónico anhídrido (0,65 ml). Después de
agitarla durante 50 min, se añadió triflurorometanosulfónico
anhídrido (0,65 ml) adicional, y se continuó la agitación a -10ºC
durante 1 h. Se añadió diclorometano (100 ml) y se realizó el lavado
usando una solución acuosa saturada de NaHCO_{3} (3 \times
100 ml). La fase orgánica separada se secó (Na_{2}SO_{4}) y se
evaporó a sequedad bajo presión reducida para rendir un
intermediario. Este intermediario se disolvió en tolueno (20 ml) y
KOAc (0,85 g), y se añadió
18-corona-6 (0,92 g), y la mezcla
resultante se agitó a 80ºC durante 7 h, transcurridas las cuales,
la evaporación a sequedad bajo presión reducida rindió un residuo,
el cual se purificó mediante cromatografía en columna de gel de
sílice (0-1,5% metanol en diclorometano) para
rendir el nucleósido 14 (1,1 g, 84% para tres pasos). \delta_{C}
(CDCl_{3}) 168,8, 165,8, 142,7, 136,0, 133,5, 133,3, 132,7,
129,6, 129,6, 128,8, 128,6, 128,5, 128,4, 128,4, 128,1, 127,8, 83,8,
82,2, 78,4, 74,3, 70,8, 64,7, 63,4, 20,5. MS (m/z) 742,0
[M+H]^{+}.
El nucleósido 14 (3,05 g) se disolvió en una
solución saturada de NH_{3} en metanol (200 ml), y se agitó a
temperatura ambiente durante 4 días, transcurridos los cuales se
añadió una solución acuosa al 33% de NH_{3} (60 ml), y se
continuó la agitación durante 4 h. La mezcla se evaporó a sequedad
bajo presión reducida para rendir un intermediario, el cual se
disolvió en piridina anhidra (100 ml). Se añadió TMSCI (7,8 ml) y
se continuó la agitación a temperatura ambiente durante 5 h. Después
de enfriarla hasta 0ºC, se añadió cloruro de benzoilo (2,4 ml), y
se continuó la agitación a temperatura ambiente durante 16 h. Se
añadió H_{2}O (50 ml), seguida, 5 min más tarde, por una solución
acuosa saturada al 25% de NH_{3} (25 ml). Después de agitarla
durante 20 min a temperatura ambiente, se evaporó la mezcla a
sequedad bajo presión reducida, y el residuo se purificó mediante
cromatografía en columna de gel de sílice (2-5% de
metanol en diclorometano) para rendir un intermediario (1,76 g, 87%
a lo largo de los dos pasos). Este intermediario (326 mg) se
disolvió en piridina anhidra (50 ml), y se añadió cloruro de mesilo
(0,11 ml) a 0ºC con agitación. Después de agitarla durante 2 h, se
añadió H_{2}O (5 ml) y se redujo el volumen de la mezcla hasta
aproximadamente el 50% mediante evaporación bajo presión reducida.
Se añadió diclorometano (100 ml), y se realizó el lavado con una
solución acuosa saturada de NaHCO_{3} (3 \times 20 ml). Se
secó la fase orgánica (Na_{2}SO_{4}) y se evaporó a sequedad
bajo presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía
en columna de gel de sílice (2-4% metanol en
diclorometano) para rendir un intermediario (284 mg). Este
intermediario (354 mg) se disolvió en una mezcla de dioxano (15
ml), H_{2}O (15 ml) y NaOH 2 M (5,5 ml). Después de agitarla
durante 72 h bajo reflujo, se añadió una solución al 7% (p/p) se
HCl en dioxano hasta la neutralización. El lavado se realizó con una
solución acuosa saturada de NaHCO_{3} (2 \times 100 ml), y la
fase orgánica se secó (Na_{2}SO_{4}) y evaporó a sequedad bajo
presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía en
columna de gel de sílice (0-4% metanol en
diclorometano) para rendir el nucleósido bicíclico 15 (24 mg).
\delta_{C} ((CD_{3})_{2}SO) 156,0, 152,6, 149,4,
138,8, 138,0, 128,3, 127,7, 127,5, 118,3, 89,7, 83,9, 79,7, 77,0,
73,0, 71,2, 57,2. \delta_{H} ((CD_{3})_{2}SO) 8,38
(1H, s), 8,14 (1H, s), 7,40-7,30 (7H, m), 6,37 (1H,
s), 5,06 (1H, t, J 5,8 Hz), 4,73-4,66 (3H, m), 4,46
(1H, s), 4,15 (1H, d, J 8,4 Hz), 4,04 (1H, d, J 8,2 Hz), 3,75 (2H,
d, J 5,7 Hz).
Se espera que la protección con DMT del
nucleósido 15, seguida por la desbencilación y la
3'-O-fosfitilación proporcionen el
derivado fosforamidito 16. Otra ruta posible que rinde el 16 a
partir del nucleósido 15 es la desbencilación de 15 seguida por la
protección selectiva con DMT del grupo hidroxilo primario y la
eventual 3'-O-fosfitilación. Las
reacciones esbozadas en este ejemplo siguen procedimientos
estándares (Consulta, por ejemplo: Koshkin, A. A., Singh, S. K.,
Nielsen, P., Rajwanshi, V. K., Kumar, R., Meldgaard, M., Olsen, C.
E., Wengel, J., Tetrahedron, 54:3607 (1998)).
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Claims (63)
1. Oligómero que comprende al menos un
análogo de nucleósido con la Fórmula general I
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en donde X se selecciona de entre
-O-, -S-, -N(R^{N\text{*}})-,
-C(R6R6*)-;
B se selecciona de entre hidrógeno, hidroxilo,
C_{1-4}-alcoxilo opcionalmente
sustituido, C_{1-4}-alquilo
opcionalmente sustituido,
C_{1-4}-aciloxilo opcionalmente
sustituido, nucleobases, intercaladores del ADN, grupos
fotoquímicamente activos, grupos termoquímicamente activos, grupos
quelantes, grupos indicadores, y ligandos;
P designa la posición radical para un enlace
internucleósidos a un monómero sucesivo, o un grupo
5'-terminal, tal enlace intenucleósidos o grupo
5'-terminal incluyendo opcionalmente el sustituyente
R^{5} o, de forma igualmente aplicable, el sustituyente
R^{5\text{*}};
P* designa un enlace internucleósidos a un
monómero precedente, o un grupo 3'-terminal;
R^{2\text{*}} y R^{4\text{*}} juntos
designan un birradical consistente en 1-4
grupos/átomos seleccionados de entre -C(R^{a}R^{b})-,
-C(R^{a})=C(R^{a})-, -C(R^{a})=N-, -O-,
-Si(R^{a})2-, -S-, -SO_{2}-, -N(R^{a})-,
y >C=Z, en donde Z se selecciona de entre -O-, -S-, y
-N(R^{a})-, y R^{a} y R^{b} se seleccionan cada uno
independientemente de entre el hidrógeno,
C_{1-2}-alquilo opcionalmente
sustituido, C_{2-12}-alquenilo
opcionalmente sustituido,
C_{2-12}-alquinilo opcionalmente
sustituido, hidroxilo,
C_{1-12}-alcoxilo,
C_{2-12}-alqueniloxilo,
carboxilo,
C_{1-12}-alcoxicarbonilo,
C_{1-12}-alquilcarbonilo, formilo,
arilo, ariloxi-carbonilo, ariloxilo,
arilcarbonilo, heteroarilo, heteroariloxi-carbonilo,
heteroariloxilo, heteroarilcarbonilo, amino, mono- y
di(C_{1-6}-alquil)amino,
carbamoilo, mono- y
di(C_{1-6}-alquil)-amino-carbonilo,
amino-C_{1-6}-alquilaminocarbonilo,
mono- y
di(C_{1-6}-alquil)amino-C_{1-6}-alquil-aminocarbonilo,
C_{1-6}-alquilcarbonilamino,
carbamido, C_{1-6}-alcanoiloxilo,
sulfono,
C_{1-6}-alquilsulfoniloxilo,
nitro, azido, sulfanilo,
C_{1-6}-alquitio, halógeno,
intercaladores del ADN, grupos intercaladores del ADN, grupos
fotoquímicamente activos, grupos termoquímicamente activos, grupos
quelantes, grupos indicadores, y ligandos, en donde arilo y
heteroarilo pueden estar opcionalmente sustituidos, y en donde dos
sustituyentes geminales R^{a} y R^{b} juntos pueden designar una
olefina de metileno (=CH_{2}) opcionalmente sustituida;
cada uno de los sustituyentes R^{1\text{*}},
R^{2}, R^{3\text{*}}, R^{5}, R^{5\text{*}}, R^{6}, y
R^{6\text{*}} que está presente se selecciona independientemente
de entre el hidrógeno,
C_{1-2}-alquilo opcionalmente
sustituido, C_{2-12}-alquenilo
opcionalmente sustituido,
C_{2-12}-alquinilo opcionalmente
sustituido, hidroxilo,
C_{1-12}-alcoxilo,
C_{2-12}-alqueniloxilo, carboxilo,
C_{1-12}-alcoxicarbonilo,
C_{1-12}-alquilcarbonilo, formilo,
arilo, ariloxi-carbonilo, ariloxilo, arilcarbonilo,
heteroarilo, heteroariloxi-carbonilo,
heteroariloxilo, heteroarilcarbonilo, amino, mono- y
di(C_{1-6}-alquil)amino,
carbamoilo, mono- y
di(C_{1-6}-alquil)-amino-carbonilo,
amino-C_{1-6}-alquilaminocarbonilo,
mono- y
di(C_{1-6}-alquil)amino-C_{1-6}-alquil-aminocarbonilo,
C_{1-6}-alquilcarbonilamino,
carbamido, C_{1-6}-alcanoiloxilo,
sulfono,
C_{1-6}-alquilsulfoniloxilo,
nitro, azido, sulfanilo,
C_{1-6}-alquitio, halógeno,
intercaladores del ADN, grupos intercaladores del ADN, grupos
fotoquímicamente activos, grupos termoquímicamente activos, grupos
quelantes, grupos indicadores, y ligandos, en donde arilo y
heteroarilo pueden estar opcionalmente sustituidos, y en donde dos
sustituyentes geminales juntos pueden designar oxo, tioxo, imino, u
metileno opcionalmente sustituido, o juntos pueden formar un
birradical spiro, consistente de una cadena de alquileno de
1-5 átomos de carbono, la cual está interrumpida
opcionalmente y/o terminada por uno o más heteroátomos/grupos
seleccionados de entre -O-, -S-, y -(NR^{N})-, en donde R^{N}
se seleccionan de entre hidrógeno y
C_{1-4}-alquilo, y en donde dos
sustituyente adyacente (no geminales) pueden designar un enlace
adicional resultante en un doble enlace; y R^{N\text{*}}, cuando
está presente, se selecciona de entre hidrógeno y
C_{1-4}-alquilo;
y sales básicas y sales por adición de ácido de
los mismos.
2. Oligómero según la reivindicación 1, que
comprende 1-10.000
L-ribo-LNA de la Fórmula general I,
y 0-10.000 nucleósidos seleccionados de entre
nucleósidos que existen de forma natural y análogos de nucleósidos,
a condición de que la suma del número de nucleósidos y el número de
L-ribo-LNA es al menos 2,
preferiblemente al menos 3, tal como en el rango de
2-15.000.
3. Oligómero según la reivindicación 2, en
donde al menos un L-ribo-LNA
comprende una nucleobase como el sustituyente B.
4. Oligómero según la reivindicación 2, en
donde el oligonucleótido comprende al menos 7, preferiblemente al
menos 9, in particular al menos 11, especialmente al menos 13
monómeros de L-ribo-LNA
sucesivos.
5. Oligómero según la reivindicación 2, en
donde todos los monómeros de nucleósido de un oligómero son
L-ribo-LNA.
6. Oligómero según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en donde el/los
L-ribo-LNA tiene/tienen la
siguiente Fórmula Ia
en donde P, P*, B, X,
R^{1\text{*}}, R^{2}, R^{2\text{*}}, R^{3\text{*}},
R^{4\text{*}}, R^{5}, y R^{5\text{*}} son tal y como se
definieron en la reivindicación
1.
7. Oligómero según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, en donde X se selecciona de entre
-(CR^{6}R^{6\text{*}})-, -O-, -S-, y
-N(R^{N\text{*}})-, preferiblemente -O-, -S-, y
-N(R^{N\text{*}})-, en particular -O-.
8. Oligómero según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, en donde el birradical constituido por
R^{2\text{*}} y R^{4\text{*}} se selecciona de entre
-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{r}-Y-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{s}-,
-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{r}-Y-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{s}-Y-,
-Y-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{r+s}-Y-,
-Y-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{r}-Y-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{s}-,
-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{r+s}, -Y-, -Y-Y-, en donde cada Y se selecciona independientemente de entre -O-, -S-, -Si(R^{\text{*}})2-, -N (R^{\text{*}})-, >C=O, -C(=O)-N(R^{\text{*}})-, y -N(R^{\text{*}})-C(=O)-, cada R^{\text{*}} se selecciona independientemente de entre hidrógeno, halógeno, azido, ciano, nitro, hidroxilo, mercapto, amino, mono- o di(C_{1-6}-alquil)amino, C_{1-6}-alcoxi opcionalmente sustituido, C_{1-6}-alquilo opcionalmente sustituido, intercaladores del ADN, grupos fotoquímicamente activos, grupos termoquímicamente activos, grupos quelantes, grupos indicadores, y ligandos, y/o dos R^{\text{*}} adyacentes (no geminales) pueden juntos designar un doble enlace, y cada uno de r y s es 0-4, a condición de que la suma r+1 sea 1-4.
-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{r+s}, -Y-, -Y-Y-, en donde cada Y se selecciona independientemente de entre -O-, -S-, -Si(R^{\text{*}})2-, -N (R^{\text{*}})-, >C=O, -C(=O)-N(R^{\text{*}})-, y -N(R^{\text{*}})-C(=O)-, cada R^{\text{*}} se selecciona independientemente de entre hidrógeno, halógeno, azido, ciano, nitro, hidroxilo, mercapto, amino, mono- o di(C_{1-6}-alquil)amino, C_{1-6}-alcoxi opcionalmente sustituido, C_{1-6}-alquilo opcionalmente sustituido, intercaladores del ADN, grupos fotoquímicamente activos, grupos termoquímicamente activos, grupos quelantes, grupos indicadores, y ligandos, y/o dos R^{\text{*}} adyacentes (no geminales) pueden juntos designar un doble enlace, y cada uno de r y s es 0-4, a condición de que la suma r+1 sea 1-4.
9. Oligómero según la reivindicación 8, en
donde el birradical se selecciona de entre -Y-,
-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{r+s}-,
-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{r}-Y-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{s}-,
e
-Y-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{r+s}-Y-,
en donde cada uno de r y s es 0-3, a condición de
que la suma r+1 sea 1-4.
10. Oligómero según la reivindicación 9, en
donde el birradical se selecciona de entre -O-, -S-,
-N(R^{\text{*}})-, -(CR^{\text{*}}
R^{\text{*}})_{r+s+1}-, -(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{r}-O-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})s-, -(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{r}-S-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{s}-, -(CR^{\text{*}}R^{\text{*}}), -N(R^{\text{*}})-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{s}-, -O-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{r+s}-O-, -S-(CR^{\text{*}}
R^{\text{*}})_{r+s}-O-, -O-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{r+s}-S-, -N(R^{\text{*}})-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{r+s}-O-, -O-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{r+s}-N(R^{\text{*}})-, -S-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{r+s}-S-, -N(R^{\text{*}})-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{r+s}-N
(R^{\text{*}})-, -N(R^{\text{*}})-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{r+s}-S-, y -S-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{r+s}-N(R^{\text{*}})-, en donde cada uno de r y s es 0-3, a condición de que la suma r+s sea 1-4, y en donde X se selecciona de entre -O-, -S-, y -N(R^{H})-, en donde R^{H} designa hidrógeno o C_{1-4}-alquilo.
R^{\text{*}})_{r+s+1}-, -(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{r}-O-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})s-, -(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{r}-S-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{s}-, -(CR^{\text{*}}R^{\text{*}}), -N(R^{\text{*}})-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{s}-, -O-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{r+s}-O-, -S-(CR^{\text{*}}
R^{\text{*}})_{r+s}-O-, -O-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{r+s}-S-, -N(R^{\text{*}})-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{r+s}-O-, -O-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{r+s}-N(R^{\text{*}})-, -S-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{r+s}-S-, -N(R^{\text{*}})-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{r+s}-N
(R^{\text{*}})-, -N(R^{\text{*}})-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{r+s}-S-, y -S-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{r+s}-N(R^{\text{*}})-, en donde cada uno de r y s es 0-3, a condición de que la suma r+s sea 1-4, y en donde X se selecciona de entre -O-, -S-, y -N(R^{H})-, en donde R^{H} designa hidrógeno o C_{1-4}-alquilo.
11. Oligómero según la reivindicación 10, en
donde X es O, R^{2} se selecciona de entre hidrógeno, hidroxilo,
y C_{1-6}-alcoxilo opcionalmente
sustituido, y R^{1\text{*}}, R^{3\text{*}}, R^{5}, y
R^{5\text{*}} designan hidrógeno.
12. Oligómero según la reivindicación 11, en
donde el birradical se selecciona de entre -O-,
-(CH_{2})_{0-1}-O-
(CH_{2})_{1-3}-, -(CH_{2})_{0-1}-S-(CH_{2})_{1-3}-, y -(CH_{2})_{0-1}-N(R^{N})-(CH_{2})_{1-3}-, tal como -O-CH_{2}-, -S-CH_{2}- y -N(R^{N})-CH_{2}-.
(CH_{2})_{1-3}-, -(CH_{2})_{0-1}-S-(CH_{2})_{1-3}-, y -(CH_{2})_{0-1}-N(R^{N})-(CH_{2})_{1-3}-, tal como -O-CH_{2}-, -S-CH_{2}- y -N(R^{N})-CH_{2}-.
13. Oligómero según la reivindicación 11 ó
reivindicación 12, en donde B se selecciona de entre las
nucleobases.
14. Oligómero según la reivindicación 8, en
donde el birradical es
-(CH_{2})_{2-4}-.
15. Oligómero según una cualquiera de las
reivindicaciones 8 a 10, en donde un R^{\text{*}} se selecciona de
entre hidrógeno, hidroxilo,
C_{1-6}-alcoxi opcionalmente
sustituido, C_{1-6}-alquilo
opcionalmente sustituido, intercaladores del ADN, grupos
fotoquímicamente activos, grupos termoquímicamente activos, grupos
quelantes, grupos indicadores, y ligandos, y cualesquier
sustituyentes R^{\text{*}} restantes son hidrógeno.
16. Oligómero según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 15, en donde cualesquier enlaces
internucleósido de los L-ribo-LNA
se selecciona de entre enlaces consistentes de 2 a 4,
preferiblemente 3, grupos/átomos seleccionados de entre -CH_{2}-,
-O-, -S-, -NR^{H}-, >C=O, >C=NR^{H}, >C=S,
-Si(R'')2-, -SO-, -S(O)_{2}-,
-P(O)_{2}-, -P(O,S)-,
-P(S)_{2}-, -PO(R'')-,
-PO(OCH_{3})-, y -PO(NHR^{H})-, en donde R^{H}
se selecciona de entre hidrógeno y
C_{1-4}-alquilo, y R'' se
selecciona de entre
C_{1-6}-alquilo y fenilo.
17. Oligómero según la reivindicación 16, en
donde cualquier enlace internucleósido de los
L-ribo-LNA se selecciona de entre
-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-,
-CH_{2}-CO-CH_{2}-,
-CH_{2}-CHOH-CH_{2}-,
-O-CH_{2}-O-,
-O-CH_{2}-CH_{2}-,
-O-CH_{2}-CH=,
-CH_{2}-CH_{2}-O-,
-NR^{H}-CH_{2}-CH_{2}-,
-CH_{2}-CH_{2}-NR^{H}-,
-CH_{2}-NR^{H}-CH_{2}-,
-O-CH_{2}-CH_{2}-NR^{H}-,
-NR^{H}-CO-O-,
-NR^{H}-CO-NR^{H}-,
-NR^{H}-CSNR^{H}-, -NR^{H}-C(=NR^{H})-NR^{H}-, -NR^{H}-CO-CH_{2}-NR^{H}-, -O-CO-O-, -O-CO-CH_{2}-O-, -O-CH_{2}-CO-O-, -CH_{2}-CO-NR^{H}-, -OCO-NR^{H}-, -NR^{H}-CO-CH_{2}-, -O-CH_{2}-CO-NR^{H}-, -O-CH_{2}-CH_{2}-NR^{H}-, -CH=N-O-, -CH_{2}-NR^{H}-O-, -CH_{2}-O-N=, -CH_{2}-ONR^{H}-, -CO-NR^{H}-CH_{2}-, -CH_{2}-NR^{H}-O-, -CH_{2}-NR^{H}-CO-, -O-NR^{H}-CH_{2}-, -O-NR^{H}-, -O-CH_{2}-S-, -S-CH_{2}-O-, -CH_{2}-CH_{2}-S-, -O-CH_{2}-CH_{2}-S-, -S-CH_{2}-CH=, -S-CH_{2}-CH_{2}-, -S-CH_{2}-CH_{2}-O-, -S-CH_{2}-CH_{2}-S-, -CH_{2}-S-CH_{2}-, -CH_{2}-SO-CH_{2}-, -CH_{2}-SO_{2}-CH_{2}-, -O-SO-O-, -O-S(O)_{2}-O-, -O-S(O)_{2}-CH_{2}-, -O-S(O)_{2}-NR^{H}-, -NR^{H}-S(O)_{2}-CH_{2}-, -O-S (O)_{2}-CH_{2}-, -O-P(O)_{2}-O-, -O-P(O,S)-O-, -O-P(S)_{2}-O-, -S-P(O)_{2}-O-, -S-P(O,S)-O-, -S-P(S)_{2}-O-, -O-P(O)_{2}-S-, -O-P (O,S)-S-, -O-P(S)_{2}-S-, -S-P(O)_{2}-S-, -S-P(O,S)-S-, -S-P(S)_{2}-S-, -O-PO(R'')-O-, -O-PO(OCH_{3})-O-, -O-PO(BH_{3})-O-, -O-PO(NHR^{N})-O-, -O-P(O)2-NR^{H}-, -NR^{H}-P(O)_{2}-O-, -O-P(O,NR^{H})-O-, y -O-Si(R'')_{2}-O-.
-NR^{H}-CSNR^{H}-, -NR^{H}-C(=NR^{H})-NR^{H}-, -NR^{H}-CO-CH_{2}-NR^{H}-, -O-CO-O-, -O-CO-CH_{2}-O-, -O-CH_{2}-CO-O-, -CH_{2}-CO-NR^{H}-, -OCO-NR^{H}-, -NR^{H}-CO-CH_{2}-, -O-CH_{2}-CO-NR^{H}-, -O-CH_{2}-CH_{2}-NR^{H}-, -CH=N-O-, -CH_{2}-NR^{H}-O-, -CH_{2}-O-N=, -CH_{2}-ONR^{H}-, -CO-NR^{H}-CH_{2}-, -CH_{2}-NR^{H}-O-, -CH_{2}-NR^{H}-CO-, -O-NR^{H}-CH_{2}-, -O-NR^{H}-, -O-CH_{2}-S-, -S-CH_{2}-O-, -CH_{2}-CH_{2}-S-, -O-CH_{2}-CH_{2}-S-, -S-CH_{2}-CH=, -S-CH_{2}-CH_{2}-, -S-CH_{2}-CH_{2}-O-, -S-CH_{2}-CH_{2}-S-, -CH_{2}-S-CH_{2}-, -CH_{2}-SO-CH_{2}-, -CH_{2}-SO_{2}-CH_{2}-, -O-SO-O-, -O-S(O)_{2}-O-, -O-S(O)_{2}-CH_{2}-, -O-S(O)_{2}-NR^{H}-, -NR^{H}-S(O)_{2}-CH_{2}-, -O-S (O)_{2}-CH_{2}-, -O-P(O)_{2}-O-, -O-P(O,S)-O-, -O-P(S)_{2}-O-, -S-P(O)_{2}-O-, -S-P(O,S)-O-, -S-P(S)_{2}-O-, -O-P(O)_{2}-S-, -O-P (O,S)-S-, -O-P(S)_{2}-S-, -S-P(O)_{2}-S-, -S-P(O,S)-S-, -S-P(S)_{2}-S-, -O-PO(R'')-O-, -O-PO(OCH_{3})-O-, -O-PO(BH_{3})-O-, -O-PO(NHR^{N})-O-, -O-P(O)2-NR^{H}-, -NR^{H}-P(O)_{2}-O-, -O-P(O,NR^{H})-O-, y -O-Si(R'')_{2}-O-.
18. Oligómero según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 17, en donde cada uno de los sustituyentes
R^{1\text{*}}, R^{2}, R^{3\text{*}}, R^{5}, R^{5\text{*}},
R^{6}, y R^{6\text{*}} del
L-ribo-LNA, que está presente, se
selecciona independientemente de entre hidrógeno,
C_{1-6}-alquilo,
C_{2-6}-alquenilo opcionalmente
sustituido, hidroxilo,
C_{1-6}-alcoxilo,
C_{2-6}-alqueniloxilo, carboxilo,
C_{1-6}-alcoxicarbonilo,
C_{1-6}-alquilcarbonilo, formilo,
amino, mono- y
di(C_{1-6}-alquil)amino,
carbamoilo, mono- y
di(C_{1-6}-alquil)-amino-carbonilo,
C_{1-6}-alquilcarbonilamino,
carbamido, azido,
C_{1-6}-alcanoiloxilo, sulfono,
sulfanilo, C_{1-6}-alquiltio,
intercaladores del ADN, grupos fotoquímicamente activos, grupos
termoquímicamente activos, grupos quelantes, grupos indicadores, y
ligandos, en donde dos sustituyentes geminales juntos pueden
designar oxo, y en donde R^{N\text{*}}, cuando está presente, y
no se está implicado en un birradical, se selecciona de entre
hidrógeno y C_{1-4}-alquilo.
19. Oligómero según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 18, en donde X se selecciona de entre -O-,
-S-, y -NR^{N\text{*}}-, y cada uno de los sustituyentes
R^{1\text{*}}, R^{2}, R^{3\text{*}}, R^{5},
R^{5\text{*}}, R^{6}, y R^{6\text{*}} del
L-ribo-LNA, que están presentes,
designa un hidrógeno.
20. Oligómero según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 19, en donde P es un grupo
5'-terminal seleccionado de entre hidrógeno,
hidroxilo, C_{1-6}-alquilo
opcionalmente sustituido,
C_{1-6}-alcoxilo opcionalmente
sustituido,
C_{1-6}-alquilcarboniloxilo
opcionalmente sustituido, ariloxilo opcionalmente sustituido,
monofosfato, difosfato, trifosfato, y -W-A', en
donde W se selecciona de entre -O-, -S-, y -N(R^{H})-, en
donde R^{H} se selecciona de entre hidrógeno y
C_{1-6}-alquilo, y en donde A' se
selecciona de entre intercaladores del ADN, grupos fotoquímicamente
activos, grupos termoquímicamente activos, grupos quelantes, grupos
indicadores, y ligandos.
21. Oligómero según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 20, en donde P^{\text{*}} es un grupo
3'-terminal seleccionado de entre hidrógeno,
hidroxilo, C_{1-6}-alquilo
opcionalmente sustituido,
C_{1-6}-alcoxilo opcionalmente
sustituido,
C_{1-6}-alquilcarboniloxilo
opcionalmente sustituido, ariloxilo opcionalmente sustituido, y
-W-A', en donde W se selecciona de entre -O-, -S-, y
-N(R^{H})-, en donde R^{H} se selecciona de entre
hidrógeno y C_{1-6}-alquilo, y en
donde A' se selecciona de entre intercaladores del ADN, grupos
fotoquímicamente activos, grupos termoquímicamente activos, grupos
quelantes, grupos indicadores, y ligandos.
22. Oligómero según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 21, que tiene la siguiente Fórmula III:
IIIG-[Nu-L]_{n(0)}-\{[(L-ribo-LNA)-L]_{m(q)}-[Nu-L]_{n(q)}\}_{q}-G*
en
donde,
q es 1-50;
cada uno de n(0), ..., n(q) es
independientemente 0-10000;
cada uno de m(1), ..., m(q) es
independientemente 1-10000;
a condición de que la suma de n(0), ...,
n(q) y m(1), ..., m(q) sea
2-15000;
G designa un grupo
5'-terminal;
cada Nu designa independientemente un nucleósido
seleccionado a partir de nucleósidos de existen de forma natural y
análogos de nucleósidos;
cada L-ribo-LNA
designa independientemente un análogo de nucleósido; cada L designa
designa independientemente un enlace internucleósido entre dos
grupos seleccionados de entre Nu y
L-ribo-LNA, o L junto con
G^{\text{*}} designan un grupo 3'-terminal;
cada
L-ribo-LNA-L designa
independientemente un análogo de nucleósido con la Fórmula general
I.
23. Análogo de nucleósido
(L-ribo-LNA) de la Fórmula general
II.
en donde el sustituyente B se
selecciona de entre nucleobases, intercaladores del ADN, grupos
fotoquímicamente activos, grupos termoquímicamente activos, grupos
quelantes, grupos indicadores, y
ligandos;
X se selecciona de entre -O-, -S-,
-N(R^{N\text{*}})-, -C(R^{6}R^{6\text{*}})-;
cada uno de Q y Q^{\text{*}} se selecciona
independientemente de entre hidrógeno, azido, halógeno, ciano,
nitro, hidroxilo, Prot-O-, Act-O-,
mercapto, Prot-S-, Act-S-,
C_{1-6}-alquiltio, amino,
Prot-N(R^{H})-,
Act-N(R^{H})-, mono- ó
di(C_{1-6}-alquil)amino,
C_{1-6}-alcoxi opcionalmente
sustituido, C_{1-6}-alquilo
opcionalmente sustituido,
C_{2-6}-alquenilo opcionalmente
sustituido, C_{2-6}-alqueniloxi
opcionalmente sustituido,
C_{2-6}-alquinilo opcionalmente
sustituido, C_{2-6}-alquiniloxi
opcionalmente sustituido, monofosfato, difosfato, trifosfato,
intercaladores del ADN, grupos fotoquímicamente activos, grupos
termoquímicamente activos, grupos quelantes, grupos indicadores,
ligandos, carboxilo, sulfono, hidroximetilo,
Prot-O-CH_{2}-,
Act-O-CH_{2}-, aminometilo,
Prot-N(R^{H})-CH_{2}-,
Act-N (R^{H})-CH_{2}-,
carboximetilo, sulfonometilo, en donde Prot es un grupo protector
respectivamente para -OH, -SH y -NH(R^{H}), Act es un grupo
de activación respectivamente para -OH, -SH y -NH(R^{H}),
y R^{H} se selecciona de entre hidrógeno y
C_{1-6}-alquilo; y
R^{2\text{*}} y R^{4\text{*}} juntos
designan un birradical seleccionado de entre -O-,
-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{r+s+1}-,
-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{r}-O-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{s}-,
-(CR^{\text{*}}
R^{\text{*}})_{r}-S-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{s}-, -(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{r}-N(R^{\text{*}})-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{s}-, -O-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{r+s}-O-, -S-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{r+s}-O-, -O-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{r+s}-S-, -N (R^{\text{*}})-(CR^{\text{*}}
R^{\text{*}})_{r+s}-O-, -O-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{r+s} N(R^{\text{*}})-, -S-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{r+s}-S-, -N(R^{\text{*}})-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{r+s}-N(R^{\text{*}})-, -N(R^{\text{*}})-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{r+s}-S-, y -S-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{r+s}-N(R^{\text{*}})-;
R^{\text{*}})_{r}-S-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{s}-, -(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{r}-N(R^{\text{*}})-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{s}-, -O-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{r+s}-O-, -S-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{r+s}-O-, -O-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{r+s}-S-, -N (R^{\text{*}})-(CR^{\text{*}}
R^{\text{*}})_{r+s}-O-, -O-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{r+s} N(R^{\text{*}})-, -S-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{r+s}-S-, -N(R^{\text{*}})-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{r+s}-N(R^{\text{*}})-, -N(R^{\text{*}})-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{r+s}-S-, y -S-(CR^{\text{*}}R^{\text{*}})_{r+s}-N(R^{\text{*}})-;
en donde cada R^{\text{*}} se selecciona
independientemente de entre hidrógeno, azido, halógeno, ciano,
nitro, hidroxilo, mercapto, amino, mono- o
di(C_{1-6}-alquil)amino,
C_{1-6}-alcoxi opcionalmente
sustituido, C_{1-6}-alquilo
opcionalmente sustituido, intercaladores del ADN, grupos
fotoquímicamente activos, grupos termoquímicamente activos, grupos
quelantes, grupos indicadores, y ligandos, y/o dos R^{\text{*}}
adyacentes (no geminales) pueden juntos designar un doble enlace, y
cada uno de r y s es 0-3, a condición de que la suma
r+1 sea 1-4;
cada uno de los sustituyentes R^{1\text{*}},
R^{2}, R^{3\text{*}}, R^{5}, R^{5\text{*}}, R^{6}, y
R^{6\text{*}} se selecciona independientemente de entre el
hidrógeno, C_{1-2}-alquilo
opcionalmente sustituido,
C_{2-12}-alquenilo opcionalmente
sustituido, C_{2-12}-alquinilo
opcionalmente sustituido, hidroxilo,
C_{1-12}-alcoxilo,
C_{2-12}-alqueniloxilo,
carboxilo,
C_{1-12}-alcoxicarbonilo,
C_{1-12}-alquilcarbonilo, formilo,
arilo, ariloxi-carbonilo, ariloxilo,
arilcarbonilo, heteroarilo, heteroariloxi-carbonilo,
heteroariloxilo, heteroarilcarbonilo, amino, mono- y
di(C_{1-6}-alquil)amino,
carbamoilo, mono- y
di(C_{1-6}-alquil)-amino-carbonilo,
amino-C_{1-6}-alquilaminocarbonilo,
mono- y
di(C_{1-6}-alquil)amino-C_{1-6}-alquil-aminocarbonilo,
C_{1-6}-alquilcarbonilamino,
carbamido, C_{1-6}-alcanoiloxilo,
sulfono,
C_{1-6}-alquilsulfoniloxilo,
nitro, azido, sulfanilo,
C_{1-6}-alquitio, halógeno,
intercaladores del ADN, grupos intercaladores del ADN, grupos
fotoquímicamente activos, grupos termoquímicamente activos, grupos
quelantes, grupos indicadores, y ligandos, en donde arilo y
heteroarilo pueden estar opcionalmente sustituidos, y en donde dos
sustituyentes geminales juntos pueden designar oxo, tioxo, imino, u
metileno opcionalmente sustituido, o juntos pueden formar un
birradical spiro, consistente de una cadena de alquileno de
1-5 átomos de carbono, la cual está interrumpida
opcionalmente y/o terminada por uno o más heteroátomos/grupos
seleccionados de entre -O-, -S-, y -(NR^{N})-, en donde R^{N}
se seleccionan de entre hidrógeno y
C_{1-4}-alquilo, y en donde dos
sustituyente adyacente (no geminales) pueden designar un enlace
adicional resultante en un doble enlace; y R^{N\text{*}}, cuando
está presente, se selecciona de entre hidrógeno y
C_{1-4}-alquilo;
y sus sales básicas y sales por adición de
ácido.
y a condición de que cualquier grupo químico
(incluyendo cualquier nucleobase) que sea reactivo en las
condiciones que predominan en la síntesis de oligonucleótidos tenga
opcionalmente protegido su grupo funcional.
24. Análogo de nucleósido según la
reivindicación 23, en donde B se selecciona de entre las nucleobases
y nucleobases con el grupo funcional protegido.
25. Análogo de nucleósido según la
reivindicación 23 ó reivindicación 24, en donde X se selecciona de
entre -O-, -S-, y -N(R^{N\text{*}})-.
26. Análogo de nucleósido según una
cualquiera de las reivindicaciones 23 a 25, en donde cada uno de los
sustituyentes R^{1\text{*}}, R^{2}, R^{3\text{*}}, R^{5},
R^{5\text{*}}, R^{6}, y R^{6\text{*}}, que está presente, se
selecciona independientemente de entre hidrógeno,
C_{1-6}-alquilo,
C_{2-6}-alquenilo opcionalmente
sustituido, hidroxilo,
C_{1-6}-alcoxilo,
C_{2-6}-alqueniloxilo, carboxilo,
C_{1-6}-alcoxicarbonilo,
C_{1-6}-alquilcarbonilo, formilo,
amino, mono- y
di(C_{1-6}-alquil)amino,
carbamoilo, mono- y
di(C_{1-6}-alquil)-amino-carbonilo,
C_{1-6}-alquilcarbonilamino,
carbamido, azido,
C_{1-6}-alcanoiloxilo, sulfono,
sulfanilo, C_{1-6}-alquiltio,
intercaladores del ADN, grupos fotoquímicamente activos, grupos
termoquímicamente activos, grupos quelantes, grupos indicadores, y
ligandos, en donde dos sustituyentes geminales juntos pueden
designar oxo, y en donde R^{N\text{*}}, cuando está presente, y
no se está implicado en un birradical, se selecciona de entre
hidrógeno y C_{1-4}-alquilo, a
condición de que cualquier hidroxilo, amino,
mono(C_{1-6}-alquil)amino,
sulfanilo, y carboxilo esté opcionalmente protegido.
27. Análogo de nucleósido según una
cualquiera de las reivindicaciones 23 a 26, cada uno de los
sustituyentes R^{1\text{*}}, R^{2}, R^{3\text{*}}, R^{5},
R^{5\text{*}}, R^{6} y R^{6\text{*}}, que está presente,
designa hidrógeno.
28. Análogo de nucleósido según una
cualquiera de las reivindicaciones 23 a 27, en donde Q se selecciona
independientemente de entre hidrógeno, azido, halógeno, ciano,
nitro, hidroxilo, Prot-O-, mercapto,
Prot-S-,
C_{1-6}-alquiltio, amino,
Prot-N(R^{H})-, mono- ó
di(C_{1-6}-alquil)amino,
C_{1-6}-alcoxi opcionalmente
sustituido, C_{1-6}-alquilo
opcionalmente sustituido,
C_{2-6}-alquenilo opcionalmente
sustituido, C_{2-6}-alqueniloxilo
opcionalmente sustituido,
C_{2-6}-alquinilo opcionalmente
sustituido, C_{2-6}-alquiniloxi
opcionalmente sustituido, monofosfato, difosfato, trifosfato,
intercaladores del ADN, grupos fotoquímicamente activos, grupos
termoquímicamente activos, grupos quelantes, grupos indicadores,
ligandos, carboxilo, sulfono, hidroximetilo,
Prot-O-CH_{2}-, aminometilo,
Prot-N(R^{H})-CH_{2}-,
carboximetilo, sulfonometilo, en donde Prot es un grupo protector
respectivamente para -OH, -SH y -NH(R^{H}), y R^{H} se
selecciona de entre hidrógeno y
C_{1-6}-alquilo; y Q^{\text{*}}
se selecciona de entre hidrógeno, azido, halógeno, ciano, nitro,
hidroxilo, Act-O-, mercapto,
Act-S-,
C_{1-6}-alquiltio, amino,
Act-N(R^{H})-, mono- ó
di(C_{1-6}-alquil)amino,
C_{1-6}-alcoxi opcionalmente
sustituido, C_{1-6}-alquilo
opcionalmente sustituido,
C_{2-6}-alquenilo opcionalmente
sustituido, C_{2-6}-alqueniloxilo
opcionalmente sustituido,
C_{2-6}-alquinilo opcionalmente
sustituido, C_{2-6}-alquiniloxi
opcionalmente sustituido, monofosfato, difosfato, trifosfato,
intercaladores del ADN, grupos fotoquímicamente activos, grupos
termoquímicamente activos, grupos quelantes, grupos indicadores,
ligandos, carboxilo, sulfono, en donde Act es un grupo de
activación respectivamente para -OH, -SH y -NH(R^{H}), y
R^{H} se selecciona de entre hidrógeno y
C_{1-6}-alquilo.
29. Análogo de nucleósido según una
cualquiera de las reivindicaciones 23 a 28, en donde X es O, R^{2}
se selecciona de entre hidrógeno, hidroxilo, y
C_{1-6}-alcoxilo opcionalmente
sustituido, y R^{1\text{*}}, R^{3\text{*}}, R^{5}, y
R^{5\text{*}} designan hidrógeno.
30. Análogo de nucleósido según una
cualquiera de las reivindicaciones 23 a 29, en donde el birradical
se selecciona de entre -O-,
-(CH_{2})_{0-1}-O-(CH_{2})_{1-3}-,
-(CH_{2})_{0-1}-S-(CH_{2})_{1-3}-,
y
-(CH_{2})_{0-1}-N(R^{N})-(CH_{2})_{1-3}-.
31. Análogo de nucleósido según la
reivindicación 30, en donde el birradical se selecciona de entre
-O-CH_{2}-, -S-CH_{2}- y
-N(R^{N})-CH_{2}-.
32. Análogo de nucleósido según una
cualquiera de las reivindicaciones 23 a 31, en donde el birradical
es
-(CH_{2})_{2-4}-, preferiblemente -(CH_{2})_{2}-.
-(CH_{2})_{2-4}-, preferiblemente -(CH_{2})_{2}-.
33. Conjugado de un oligonucleótido
(oligómero) modificado con
L-ribo-LNA, tal y como se definió en
una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, y un compuesto
seleccionado de entre las proteínas, amplicones, enzimas,
polisacáridos, anticuerpos, haptenos, péptidos y PNA.
34. Uso de un
L-ribo-LNA tal y como se definió en
una cualquiera de las reivindicaciones 23 a 32 para la preparación
de un oligonucleótido (oligómero) modificado con
L-ribo-LNA según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 22.
35. Uso según la reivindicación 34, en donde
la incorporación de L-ribo-LNA
modula la capacidad del oligonucleótido para actuar como un
sustrato para los enzimas activos de ácidos nucleicos.
36. Uso de un
L-ribo-LNA, tal y como se definió en
una cualquiera de las reivindicaciones 23 a 32, para la preparación
de un conjugado de un oligonucleótido modificado con
L-ribo-LNA, y un compuesto
seleccionado de entre las proteínas, amplicones, enzimas,
polisacáridos, anticuerpos, haptenos, péptidos y PNA.
37. Uso de un
L-ribo-LNA, tal y como se definió en
una cualquiera de las reivindicaciones 23 a 32, como un sustrato
para enzimas activos sobre ácidos nucleicos.
38. Uso según la reivindicación 37, en donde
el L-ribo-LNA se usa como un
sustrato para las polimerasas de ADN y ARN.
39.
L-ribo-LNA, tal y como se definió en
una cualquiera de las reivindicaciones 23 a 32, para uso como un
agente terapéutico.
40. Uso de uno o más
L-ribo-LNA, tal y como se definieron
en una cualquiera de las reivindicaciones 23 a 32, en la
construcción de una superficie sólida sobre la cual se unen
oligonucleótidos modificados con LNA y de diferentes
secuencias.
41. Uso de oligómeros modificados con
L-ribo-LNA (ribozimas), tal y como
se definieron en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, en
el corte específico para la secuencia de ácidos nucleicos diana.
42. Oligonucleótido (oligómero) modificado
con L-ribo-LNA, tal y como se
definió en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, para su
uso en terapia, tal como un antisentido, un
anti-gen, o un gen activador terapéutico.
43. Oligonucleótido modificado con
L-ribo-LNA según la reivindicación
42 para su uso en terapia, en donde el oligonucleótido modificado
con LNA recluta la RNAsaH.
44. Complejos de más de un oligonucleótido
(oligómero) modificado con
L-ribo-LNA, estando definido dicho
oligonucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22,
para su uso en terapia, tal como un antisentido, un
anti-gen, o un gen activador terapéutico.
45. Oligonucleótido (oligómero) modificado
con
\alpha-L-ribo-LNA,
tal y como se definió en una cualquiera de las reivindicaciones 6 a
22, para su uso en terapia, en donde el oligonucleótido modificado
con
\alpha-L-ribo-LNA
interacciona específicamente con ARN seleccionado de entre el grupo
consistente en ARNt, ARNr, ARNsn y ARNsc, inhibiendo de ese modo
cualquiera de los siguientes procesos celulares, seleccionados de
entre el grupo consistente en traducción, ayuste del ARN,
procesamiento del ARN, y otros procesos celulares esenciales.
46. Oligonucleótido (oligómero) modificado
con L-ribo-LNA, tal y como se
definió en una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 22, para su
uso en diagnósticos, tales como para el aislamiento, purificación,
amplificación, detección, identificación, cuantificación, o captura
de ácidos nucleicos naturales o sintéticos.
47. Oligonucleótido (oligómero) modificado
con
\alpha-L-ribo-LNA,
tal y como se definió en una cualquiera de las reivindicaciones 6 a
22, para su uso en diagnósticos, tales como para el aislamiento,
purificación, amplificación, detección, identificación,
cuantificación, o captura de ácidos nucleicos naturales o
sintéticos, siendo dicho oligonucleótido modificado con
\alpha-L-ribo-LNA
capaz de discriminar entre ARN y ADN, permitiendo de ese modo la
hibridación selectiva con el ARN diana.
48. Oligonucleótido modificado con
L-ribo-LNA, según la reivindicación
46 o reivindicación 47, en donde el oligonucleótido comprende un
grupo fotoquímicamente activo, un grupo termoquímicamente activo, un
grupo quelante, un grupo indicador, o un ligando, que facilitan la
detección directa o indirecta del oligonucleótido, o la
inmovilización del oligonucleótido sobre un soporte sólido.
49. Oligonucleótido modificado con
L-ribo-LNA, según la reivindicación
48, en donde el grupo fotoquímicamente activo, el grupo
termoquímicamente activo, el grupo quelante, el grupo indicador, o
el ligando incluyen un espaciador (K), comprendiendo dicho
espaciador un grupo separable químicamente.
50. Oligonucleótido modificado con
L-ribo-LNA, según la reivindicación
49, en donde el grupo fotoquímicamente activo, el grupo
termoquímicamente activo, el grupo quelante, el grupo indicador, o
el ligando, están unidos a través de un birradical (es decir, como
R^{\text{*}}) de al menos uno de los LNA del oligonucleótido.
51. Oligonucleótido modificado con
L-ribo-LNA, según la reivindicación
50 para uso en diagnósticos tales como para la captura y detección
de ácidos nucleicos que existen de forma natural o son sintéticos,
de hebra doble o hebra simple, tales como el ARN o el ADN.
52. Oligonucleótido modificado con
L-ribo-LNA, según la reivindicación
47 para uso en diagnósticos, tales como para la purificación de
ácidos nucleicos que existen de forma natural, de hebra doble o
hebra simple, tales como el ARN o el ADN.
53. Oligonucleótido (oligómero) modificado
con L-ribo-LNA, tal y como se
definió en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, para su
uso como un aptámero en el diagnóstico molecular.
54. Uso no terapéutico de un oligonucleótido
(oligómero) modificado con
L-ribo-LNA, tal y como se definió
en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, como un aptámero
en procesos catalíticos mediador por ARN.
55. Uso no terapéutico de un oligonucleótido
(oligómero) modificado con
L-ribo-LNA, tal y como se definió
en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, como un aptámero
en la unión específica de antibióticos, fármacos, aminoácidos,
péptidos, proteínas estructurales, receptores de proteínas, enzimas
de proteínas, sacáridos, polisacáridos, cofactores biológicos,
ácidos nucleicos, o trifosfatos.
56. Uso no terapéutico de un oligonucleótido
(oligómero) modificado con
L-ribo-LNA, tal y como se definió
en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, como un aptámero
en la separación de enantiómeros a partir de mezclas racémicas
mediante unión estereoespecífica.
57. Uso no terapéutico de un oligonucleótido
(oligómero) modificado con
L-ribo-LNA, tal y como se definió
en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, para el etiquetado
de células.
58. Uso de un
L-ribo-LNA, tal y como se definió en
una cualquiera de las reivindicaciones 23 a 32, con propósitos
diagnósticos.
59. Uso de un oligonucleótido (oligómero)
modificado con L-ribo-LNA, tal y
como se definió en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22,
para hibridar los ARN celulares no codificantes de proteínas, tales
como el ARNt, ARNr, ARNsn y ARNsc, in vivo o in
vitro.
60. Uso de un oligonucleótido (oligómero)
modificado con L-ribo-LNA, tal y
como se definió en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22,
en la construcción de un oligonucleótido que comprende un fluoróforo
y un atenuador, ubicados de tal forma que el estado hibridado del
oligonucleótido puede distinguirse del estado no unido del
oligonucleótido mediante un incremento en la señal fluorescente
procedente de la sonda.
61. Equipo para el aislamiento,
purificación, amplificación, detección, identificación,
cuantificación, o captura de ácidos nucleicos naturales o
sintéticos, comprendiendo el equipo un cuerpo de reacción, y uno o
más oligonucleótidos (oligómeros) modificados con
L-ribo-LNA tal y como se definieron
en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22.
62. Equipo para el aislamiento,
purificación, amplificación, detección, identificación,
cuantificación, o captura de ácidos nucleicos naturales o
sintéticos, comprendiendo el equipo un cuerpo de reacción, y uno o
más L-ribo-LNA, tal y como se
definieron en una cualquiera de las reivindicaciones 23 a 32.
63. Equipo según la reivindicación 62, en
donde los L-ribo-LNA están
inmovilizados sobre dicho cuerpo de reacciones.
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