CZ295018B6

CZ295018B6 - Modulátory tělesné hmotnosti, odpovídající nukleové kyseliny a proteiny

Info

Publication number: CZ295018B6
Application number: CZ1997460A
Authority: CZ
Inventors: Jeffrey M. Friedman; Yiying Zhang; Ricardo Proenca; Margherita Maffei; Jeffrey L. Halaas; Ketan Gajiwala; Stephan K. Burley
Original assignee: The Rockefeller University
Priority date: 1994-08-17
Filing date: 1995-08-17
Publication date: 2005-05-18
Also published as: EE04377B1; CN1162978A; BR9508596A; FI121709B; CA2195955C; HUT78052A; NO323847B1; SK287191B6; JPH09506264A; DE19531931A1; FI970656A0; EP0777732B1; PL319021A1; GB9516947D0; IL162093A0; WO1996005309A3; BG101228A; OA10596A; EP0777732A1; GEP20022701B

Abstract

Řešení se týká látek označovaných jako modulátory hmotnosti, a nukleotidových sekvencí, které exprimují modulátorové proteiny, případně degenerovaných variant těchto nukleotidových sekvencí, a systému regulace tělesné hmotnosti savců. Nukleotidové sekvence představují geny, kódující dvě izoformy myšího a lidského OB polypeptidu, který hraje klíčovou roli při regulaci tělesné hmotnosti adipozity. Dále uvádí syntetické nebo přirozené oligonukleotidy, využitelné jako proby nebo jako primery pro amplifikaci polymerázovou řetězovou reakcí (PCR), klonovací vektor, obsahující nukleové kyseliny; a bakteriální, hmyzí nebo savčí expresní vektor, obsahující nukleové kyseliny, operativně připojené k expresní kontrolní sekvenci. Dále se týká bakteriálních nebo savčích buněk, transfektovaných nebo transformovaných expresním vektorem, a využití těchto systémů při produkci modulátorů a rovněž poskytuje protilátky k OB polypeptidu.ŕ

Description

Modulátory tělesné hmotnosti, odpovídající nukleové kyseliny a proteiny

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká regulace tělesné hmotnosti lidí a zvířat, zejména se týká modulátorů tělesné hmotnosti, jejich diagnostického a terapeutického využití.

Dosavadní stav techniky

Obezita, definovaná jako nadbytek tělesného tuku v přirozené tělesné hmotě, je spjata s vážnými psychologickými a zdravotními obtížemi, jako je hypertenze, zvýšená hladina tuků v krvi, diabetes mellitus typu II nebo diabetes mellitus, nezávislý na inzulínu (NIDDM). Ve Spojených státech trpí NIDDM 6 až 10 miliónů pacientů včetně 18 % populace, starší 65 let [Harris et al., Int. J. Oběs., 11:275-283 (1987)]. Přibližně 45 % mužů a 70 % žen, trpících NIDDM, je obézní a jejich diabetes lze podstatně zmírnit nebo zcela vyléčit snížením tělesné hmotnosti [Harris, Diabetes Care, 14(3):639-648 (1991)]. Jak bude uvedeno dále, jsou obezita a NIDDM silně dědičné, ačkoli geny, nesoucí příslušnou predispozici, ještě nebyly identifikovány. Molekulárně genetická podstata těchto metabolických poruch je významný, leč zatím málo objasněný problém.

Asimilace uchování a využití energie ze živin je součást komplexního vnitřního systému, velmi důležitého pro existenci mnohobuněčných živočichů. Pro pozemní savce jsou velké zásoby metabolického paliva, např. triglyceridů, v tukových tkáních kritické pro překonání období bez potravy. Nutnost udržovat energetické zásoby na stálé hladině, aniž by průběžně docházelo ke změnám ve velikosti a tvaru těla, vyžaduje rovnováhu mezi příjmem a výdejem energie. Mechanizmy regulace energetické rovnováhy na molekulární úrovni je však nutné teprve objasnit. Izolace molekul, které vedou nutriční informace a ovlivňují energetickou rovnováhu, bude klíčem k pochopení regulace tělesné hmotnosti zdravého i nemocného organizmu.

Individuální hladina adipozity je do značné míry dána geneticky. Sledování míry shody v tělesné hmotnosti a adipozitě mezi mono- a dizygotními dvojčaty, adoptivními dětmi a jejich biologickými rodiči ukázalo, že dědičnost obezity (0,4-0,8) převyšuje dědičnost mnoha jiných vlastností, obvykle považovaných za dědičné, jako je schizofrenie, alkoholismus a ateroskleróza [Stunkjard et al., N. Engl. J. Med., 322:1483-1487 (1990)]. Podobnosti z hlediska míry výdajů energie mezi příbuznými byly též popsány [Bogardus et al., Diabetes, 35:1-5 (1986)]. Genetická analýza u geograficky ohraničených populací naznačila, že relativně malý počet genů je příčinou 30-50 % různosti v tělesné stavbě [Moll et al., Am. J. Hum. Genet., 49:1243-1255 (1991)]. Genetické mapování a chromozomální umístění genu, zodpovědného za obezitu populace, však dosud nebylo provedeno.

Na hlodavčích obezitních modelech bylo nalezeno sedm zřejmých mutací v jednom genu. Nejlépe jsou prostudované mutace na myších obezitních modelech v genech OB (obezity) a DB (diabetes). Pokud jsou OB a DB přítomny v geneticky stejném druhu, je výsledkem metabolicky a behaviorálně nerozlišitelný fenotyp, což naznačuje, že tyto geny působí stejnou fyziologickou cestou [Coleman et al., Diabetologia, 14:141-148 (1978)]. Homozygótní myši od obou mutací jsou hyperalergické a hypometabolické a vyvinou obézní fenotyp, patrný už ve stáří jednoho měsíce. Jejich hmotnost se stabilizuje na 60 až 70 g (proti 30 až 35 g u kontrolních myší). OB a DB zvířata manifestují nesčetné další hormonální a metabolické změny, které ztěžují rozpoznání primární poruchy, vyvolané mutací [Bray et al., Am. J. Clin. Nutr., 50:891-902 (1989)].

Na všech hlodavčích obezitních modelech byly pozorovány změny v metabolizmu uhlovodíků, připomínající lidský diabetes typ II. V některých případech závisí stupeň diabetes z části na historii myšího kmene [Leiter, Endocrinology, 124:912-922 (1989)]. Jak OB tak DB kongenní C57B1/Ks myši vyvinuly těžký diabetes s konečnou nekrózou β buněk a atrofií ostrůvků, vedou cí k relativní inzulinopenii. Naproti tomu OB i DB kongenní C57B1/6J myši vyvinuly přechodný inzulin-rezistentní diabetes, který může být kompenzován hypertrofíí β buněk, připomínající lidský diabetes typ II.

Fenotyp OB a DB myší připomíná lidskou obezitu jinak než rozvinutý diabetes - mutantní myši přijímají více potravy a vydávají méně energie než hubené kontrolní myši (podobně jako obézní lidé). Tento fenotyp též připomíná zvířata s porušeným ventromediálním hypotalamem, což naznačuje, že obě mutace interferují se schopností správně přijímat nebo reagovat na nutriční informace v rámci centrálního nervového systému. Tuto hypotézu podporují i výsledky parabiotických experimentů [Coleman, Diabetologia, 9:294-298 (1973)], podle nichž OB myši mají nedostatečný cirkulující faktor pocitu sytosti a DB myši jsou rezistentní vůči účinkům OB faktoru (pravděpodobně díky defektu OB receptoru). Z experimentů vyplývá, že obezita mutantních myší může vést k různým defektům v aferentní kličce a/nebo integračním centru předpokládaného zpětnovazebného mechanizmu, regulujícího stavbu těla.

S využitím molekulárních a klasických genetických markérů byly mapovány OB a DB geny a bylo zjištěno, že se nacházejí na počátku chromozomu 6, respektive v polovině chromozomu 4 [Bahary et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 87:8642-8646 (1990); Friedman et al., Genomics, 11:1054-1062 (1991)]. V obou případech zasahují mutace oblasti myšího genomu, shodné s lidskými, což znamená, že pokud existují lidské homology OB a DB, pravděpodobně budou mutace zasahovat lidské chromozómy 7q, respektive lp. Defekty OB genu vedou k obezitě i u dalších druhů savců: u geneticky křížených krys Zucker FA/FA s Brown Norwy +/+ je FA mutace (krysí chromozom 5) napadena ve stejném místě jako u DB myší [Truett et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 88:7806-7809 (1991)].

Vzhledem k nesčetným faktorům, které mohou ovlivňovat tělesnou hmotnost, nebylo možné předvídat, které faktory a zejména které homeostatické mechanizmy primárně určují tělesnou hmotnost. Základním předmětem předkládaného vynálezu jsou tedy modulátory tělesné hmotnosti se schopností regulovat adipozitu a obsah tuků u savců.

Podstata vynálezu

Podstatou vynálezu je obezitní polypeptid OB, obsahující 145 až 167 aminokyselin, který moduluje tělesnou hmotnost zvířat, kde tento obezitní polypeptid OB obsahuje aminokyselinové sekvence SEQ ID č. 2, 4, 5 nebo 6.

Podle předkládaného vynálezu je problém regulace adipozity a obsahu tuků u zvířat, zejména savců, řešen na úrovni obezitních (OB) polypeptidů a nukleových kyselin, které tyto peptidy kódují. Předkládaný vynález poprvé poskytuje izolované polypeptidy, schopné modulovat, tj. kontrolovat a regulovat, tělesnou hmotnost a adipozitu. Předkládaný vynález rovněž přináší sekvence nukleových kyselin, kódujících tyto polypeptidy, což umožňuje rekombinantní produkci OB polypeptidů i použití samotných nukleových kyselin jako modulátorů tělesné hmotnosti.

Obezitní (OB) polypeptidy předkládaného vynálezu, obsahující 145 až 167 aminokyselin, modulují tělesnou hmotnost zvířat, zejména savců. Mezi OB polypeptidy patří i jejich alelické varianty nebo analogy včetně fragmentů, které mají stejnou biologickou aktivitu. OB polypeptidy lze připravit rekombinantními nebo chemickými postupy. Výhodné předkládané OB polypeptidy jsou polypeptidy s aminokyselinovou sekvencí SEQ ID č. 2, 4, 5 nebo 6 a jejich alelické varianty nebo analogy včetně fragmentů.

Imunogenní fragmenty OB polypeptidů předkládaného vynálezu zahrnují: Val-Pro-Ile-GlnLys-Val-Gln-Asp-Asp-Thr-Lys-Thr-Leu-Ile-Lys-Thr (SEQ ID č. 18); Leu-His-Pro-Ile-LeuSer-Leu-Ser-Lys-Met-Asp-Gln-Thr-Leu-Ala (SEQ ID č.19); Ser-Lys-Ser-Cys-Ser-LeuPro-Gln-Thr-Ser-Gly-Leu-Gln-Lys-Pro-Glu-Ser-Leu-Asp (SEQ ID č.20); a Ser-Arg-Leu-2CZ 295018 B6

Gln-Gly-Ser-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Gln-Gln-Leu-Asp-Val-Ser-Pro-Glu-Cys (SEQ ID č.21).

Lidské analogy OB polypeptidů mají aminokyselinovou sekvenci, odpovídající SEQ ID č. 4 a 6, v nichž je jedna nebo několik aminokyselin z aminokyselin 53, 56, 71, 85, 89, 92, 95, 98, 110, 118, 121, 122, 126, 127, 128, 129, 132, 139, 157, 159, 163 a 166 (číslováno dle SEQ ID č. 4), substituováno jinými aminokyselinami, například divergentními aminokyselinami myšího OB polypeptidů SEQ ID č. 2 nebo alaninem. Lidské analogy OB polypeptidů zahrnují polypeptidy, v nichž je: (a) serin v poloze 53 substituován glycinem, alaninem, valinem, cysteinem, methioninem nebo threoninem; (b) serin v poloze 98 substituován glycinem, alaninem, valinem, cysteinem, methioninem nebo threoninem; a (c) arginin v poloze 92 substituován asparaginem, lysinem, histidinem, glutaminem, kys. glutamovou, aspartovou, serinem, threoninem, methioninem nebo cysteinem. Analog OB polypeptidů předkládaného vynálezu je výhodně z 83 % nebo více sekvenčně homologní se sekvencí lidského OB polypeptidů SEQ ID č. 2, 4, 5 nebo 6.

Dodatečné lidské analogy OB polypeptidů mají aminokyselinovou sekvenci SEQ ID č. 4 a 6 a mají: (a) jeden nebo několik zbytků kys. aspartové substituováno kys. glutamovou; (b) jeden nebo několik zbytků izoleucinu substituovaného leucinem; (c) jeden nebo několik zbytků glycinu nebo valinu substituováno alaninem; (d) jeden nebo několik zbytků argininu substituováno histidinem; (e) jeden nebo několik zbytků tyrosinu nebo fenylalaninu substituováno tryptofanem; (f) jeden nebo několik zbytků v polohách 121 až 128 (číslováno podle SEQ ID č. 4) substituováno glycinem nebo alaninem; (g) jeden nebo několik zbytků v polohách 54 až 60 nebo 118 až 166 (číslováno podle SEQ ID č. 4) substituováno lysinem, kys. glutamovou, cysteinem nebo prolinem.

Výhodné zkrácené analogy lidského OB polypeptidů předkládaného vynálezu zahrnují polypeptidy (číslováno podle SEQ ID č. 4) v nichž: (a) je deletován jeden nebo několik zbytků v polohách 121 až 128; (b) jsou deletovány zbytky 1 až 116; (c) jsou deletovány zbytky 1 až 21 a 54 až 167; (d) jsou deletovány zbytky 1 až 60 a 117 až 167; (e) jsou deletovány zbytky 1 až 60; (f) jsou deletovány zbytky 1 až 53; a (i) analog podle bodu (a), v němž jsou deletovány zbytky 1 až 21. Předkládané OB polypeptidy a OB analogy, které nemají 21 aminokyselinovou „signální“ sekvenci (např. aminokyseliny 1 až 21, číslováno podle SEQ ID č. 4), mohou obsahovat N-terminální aminokyselinu nebo aminokyselinovou sekvenci, jako jsou (1) methionin, (2) glycin-serinhistidin-methionin (SEQ ID č. 38), (3) methionin-glycin-serin-serin-histidin-histidin-histidinhistidin-histidin-histidin-serin-serin-glycin-leucin-valin-prolin-arginin-glycm-serin-histidinmethionin (SEQ ID č. 98), (4) leucin-kys.glutamová-lysin-arginin-kys.glutamová-alaninkys.glutamová-alanin (SEQ ID č. 26), (5) kys.glutamová-alanin-kys.glutamová-alanin (SEQ ID č. 27), (6) leucin-kys.glutamová-lysin-arginin (SEQ ID č. 28), (7) methionin-glycin-serinserin-histidin-histidin-histidin-histidin-histidin-histidin-serin-serin-glycin-leucin-valinprolin-arginin-glycin-serin-prolin (SEQ ID č. 99) a (8) glycin-serin-prolin.

Deriváty předkládaného OB polypeptidů obsahují jednu nebo několik navázaných chemických skupin včetně polymerů, rozpustných ve vodě, jako je polyethylenglykol. Polypeptidy derivatizováné polyethyíenglykolem mohou být mono-, di—, tri- nebo tetrapegylované, např. N-terminální monopegyláty. Výhodné N-terminální monopegyláty OB polypeptidů předkládaného vynálezu zahrnují OB polypeptidy, obsahující aminokyseliny 22 až 167 ze SEQ ID č. 4, nebo aminokyseliny 22 až 166 ze SEQ ID č. 6, a případně ještě (pegylovaný) methionin vpoloze 21.

Izolované molekuly nukleových kyselin předkládaného vynálezu kódují OB polypeptid, jeho alelickou variantu nebo analog včetně fragmentů. Zejména důležité jsou molekuly DNA, které zajišťují expresi biologicky aktivního OB polypeptidů s aktivitou modulátoru tělesné hmotnosti u savců, tedy DNA ze skupiny, zahrnující: (a) molekuly DNA o sekvenci, odpovídající SEQ ID č. 1 a 3, nebo jejich fragmenty; (b) molekuly DNA, hybridizující fragmenty; a (c) molekuly DNA, kódující expresi aminokyselinové sekvence, kódované DNA, definovanou v bodech (a) a (b). Ilustrativním příkladem je lidská genomová DNA o sekvenci SBQ ID č. 22 a 24.

-3 CZ 295018 B6

Výhodné DNA molekuly předkládaného vynálezu kódují polypeptid o aminokyselinové sekvenci: (a) SEQ ID č. 2; (b) aminokyseliny 22 až 167 ze SEQ ID č. 2; (c) SEQ ID č. 4; (d) aminokyseliny 22 až 167 ze SEQ ID č. 4; (e) SEQ ID č. 5; (f) aminokyseliny 22 až 166 ze SEQ ID č. 5; a (g) SEQ ID č. 6; (h) aminokyseliny 22 až 166 ze SEQ ID č. 6, stejně jako polypeptidy, obsahující N-terminální aminokyselinu nebo sekvenci aminokyselin, jak byly uvedeny výše. Například výhodná DNA předkládaného vynálezu je DNA, kódující polypeptid o aminokyselinové sekvenci SEQ ID č. 3, zejména sekvenci aminokyselin 22 až 167.

Předkládaný vynález dále poskytuje detekovatelně značené molekuly nukleových kyselin, které hybridizují s předkládanou DNA i s nekódujícími oblastmi nukleových kyselin OB. Nekódující oblasti OB DNA pocházejí ze skupiny, zahrnující intron, 5'-nekódující oblast a 3'-nekódující oblast. Předkládaný vynález dále zahrnuje oligonukleotidické primery, sloužící k amplifíkaci lidské genomové DNA, kódující OB polypeptidy, jako např. oligonukleotidy o sekvenci SEQ ID č. 29 až 32.

Předkládaný vynález dále poskytuje vektory, obsahující předkládanou DNA, výhodně expresní vektory, v nichž je předkládaná DNA operativně připojena k expresní kontrolní sekvenci. Tyto vektory nebo předkládaná DNA slouží k transformaci nebo transfekci jednobuněčných hostitelských buněk. Výhodnými hostiteli jsou bakterie, kvasinky, buněčné tkáně savčích, rostlinných a hmyzích buněk. Vhodné hostitelské buňky lze volit ze skupiny, zahrnující E. coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, kvasinky, CHO, Rl.l, B-W, L-M, COS 1, COS 7, BSC1, BSC40, BMT10 a Sf9. Mezi výhodné hostitelské kvasinky patří Saccharomyces, Pichia, Candida, Hansenula a Torulopsis. Předkládaný vynález dále poskytuje savčí buňky, obsahující DNA, kódující OB polypeptid, které byly in vitro modifikovány k vyšší expresi OB polypeptidu homologní rekombinantní technikou, spočívající v inzerci expresní regulační sekvence do funkční blízkosti sekvence, kódující OB polypeptid. Expresní regulační sekvence může ale nemusí být expresní sekvencí OB polypeptidu a může v buňce nahrazovat mutantní regulační sekvenci OB polypeptidu.

Předkládaný vynález poskytuje postupy přípravy OB polypeptidu, zahrnující: (a) kultivaci buněk v podmínkách, umožňujících expresi OB polypeptidu; a (b) způsob odebírání exprimovaného polypeptidu. Postup může být doplněn ještě dalšími kroky: (c) chromatografie polypeptidu na Ni-chelatační koloně; a (d) purifikace polypeptidu gelovou filtrací. Podle výhodného provedení vynálezu lze mezi kroky (c) a (d) zařadit ionexovou chromatografii OB polypeptidu na koloně silného katexu.

Předkládaný vynález dále poskytuje značené i neznačené monoklonální a polyklonální protilátky, specifické k předkládanému OB polypeptidu a nesmrtelné buněčné linie, produkující předkládané monoklonální protilátky. Příprava protilátek předkládaného vynálezu zahrnuje: konjugaci OB polypeptidu k proteinovému nosiči; (b) imunizaci hostitele směsí konjugátu fragment OB polypeptidu/proteinový nosič podle kroku (a) a adjuvans; a (c) způsob odebrání protilátky z imunizovaného zvířete.

Předkládaný vynález dále poskytuje postupy stanovení přítomnosti OB polypeptidu ve vzorku, zahrnující: (a) kontakt vzorku, obsahujícího předpokládaný OB polypeptid, s protilátkou (výhodně navázanou na pevný nosič), která specificky váže OB polypeptid v podmínkách, podporujících tvorbu reakčního komplexu OB polypeptid-protilátka; a (b) detekce tvorby reakčního komplexu OB polypeptid-protilátka ve vzorku, potvrzující přítomnost OB polypeptidu. Vynález poskytuje rovněž postupy in vitro stanovení hladiny OB polypeptidu v biologickém vzorku, zahrnující: (a) detekci tvorby reakčního komplexu v biologickém vzorku, jak je popsáno výše; a (b) stanovení množství vzniklého reakčního komplexu, které odpovídá hladině OB polypeptidu, přítomného ve vzorku. Při zjištění nebo diagnóze onemocnění, spojeného se zvýšenou hladinou OB polypeptidu předkládaného vynálezu, lze provést stanovení hladiny přítomného OB polypeptidu a provést porovnání s hladinou OB polypeptidu normálního subjektu, nebo se starší hodnotou hladiny OB polypeptidu testovaného subjektu. Zvýšená hladina OB polypeptidu proti normálu nebo starší

-4CZ 295018 B6 hodnotě naznačuje onemocnění, doprovázené zvýšenou hladinou OB polypeptidu a snížená hladina OB polypeptidu proti normálu nebo starší hodnotě naznačuje onemocnění, doprovázené sníženou hladinou OB polypeptidu. Předkládaný vynález umožňuje monitorovat in vitro postup terapie chorob, souvisejících se zvýšenou nebo sníženou hladinou OB polypeptidu u savců, spočívající ve stanovení obsahu OB polypeptidu v sérii biologických vzorků, odebraných pacientovi v různých časových fázích léčby.

Farmaceutické přípravky předkládaného vynálezu obsahují OB polypeptid a farmaceuticky přijatelný nosič. Jsou určené na léčebné postupy, zaměřené na snížení tělesné hmotnosti u savců. Další farmaceutické přípravky předkládaného vynálezu jsou určené na léčebné postupy, zaměřené na zvýšení tělesné hmotnosti u savců. Tyto přípravky obsahují antagonistu OB polypeptidu, výhodně voleného ze skupiny, zahrnující: protilátky, které váží OB polypeptid a neutralizují jeho aktivitu; fragment OB polypeptidu, který váže ale neaktivuje OB receptor; malé molekuly antagonistů OB polypeptidu. Předkládaný vynález dále poskytuje kosmetické přípravky, snižující nebo zvyšující tělesnou hmotnost, určené na vylepšení tělesného vzhledu. Kosmetické přípravky se podávají v dostatečných dávkách, umožňujících regulaci tělesné hmotnosti na požadovanou úroveň.

Předkládaný vynález dále zahrnuje použití nukleových kyselin i anti-sense nukleových kyselin, hybridizujících snukleovou kyselinou, kódující OB polypeptidu, pro výrobu léčiv (např. na genovou terapii), modifikujících tělesnou hmotnost u savců. Vynález rovněž zahrnuje použití předkládaných antagonistů OB polypeptidu pro přípravu léčiv, modifikujících tělesnou hmotnost u savců. Vyvinutá léčiva lze použít na modifikaci tělesné hmotnosti u savců při léčbě poruch ze skupiny, zahrnující diabetes, vysoký krevný tlak, vysoký obsah cholesterolu, a jako součást kombinované terapie spolu s léčivem, určeným na tato onemocnění. Tato léčiva lze podávat intravenózně, intraarteriálně, intraperitoneálně, intramuskulárně, subkutánně, nazálně, perorálně nebo pulmonálně.

Z předkládaných údajů vyplývá, že OB polypeptidy předkládaného vynálezu jsou sekretovány savčími adipocyty a plní hormonální funkce.

Uváděné příklady ukazují, že OB polypeptid, alternativně označován jako „leptin“, cirkuluje v myší, krysí a lidské plazmě. Leptin nebyl nalezen v plazmě OB/OB myší a je přítomen v desetinásobné koncentraci v plazmě DB/DB myší a v dvacetinásobné koncentraci v plazmě FA/FA krys. Každodenní injekce rekombinantního leptinu dramaticky snižuje tělesnou hmotnost OB/OB myší, podstatně ovlivňuje tělesnou hmotnost divokých myší a nemá žádný účinek na DB/DB myši.

Dalším rysem předkládaného OB polypeptidu je, že polypeptid, pocházející z jednoho živočišného druhuje aktivní i v jiném druhu. Konkrétně lidský OB polypeptid je aktivní v myších.

Modulátory předkládaného vynálezu zahrnují nukleové kyseliny, jako jsou rekombinantní DNA molekuly (např. cDNA nebo vektor, obsahující cDNA, nebo izolovaná genomová DNA) nebo klonované geny (tj. izolovaná genomová DNA), nebo jejich degenerované varianty, kódující polypeptidy s aktivitou modulátorů regulace tělesné hmotnosti, nebo konzervativní varianty či fragmenty těchto polypeptidů, zejména fragmenty s chybějícím signálním peptidem (alternativně označované jako maturované OB polypeptidy) o aminokyselinové sekvenci SEQ ID č. 2 (obr. 1 (A až E)), SEQ ID č. 4 (obr. 3), SEQ ID č. 5 (obr. 5) a SEQ ID č. 6 (obr. 6). Konkrétně jsou uvedeny aminokyselinové sekvence dvou variant myšího a lidského OB polypeptidu. U obou polypeptidů byl deletován glutamin v poloze 49, což může být výsledkem anomálního spojování mRNA. OB polypeptidy z různých biologických druhů mohou být vysoce homologní, podle obr. 4 jsou myší a lidský OB polypeptid homologní z více než 80 %.

Předkládané nukleové kyseliny, rekombinantní molekuly DNA nebo klonované geny mají kódující nukleotidovou sekvenci SEQ ID č. 1 (obr. 1 (A až E)) a SEQ ID č. 3 (obr. 2 (A a B)), nebo jsou k těmto sekvencím komplementární. Tyto molekuly nukleových kyselin mohou být cDNA nebo genomová DNA izolovaná z chromozomu. Předkládané nukleové kyseliny mohou mít též

-5CZ 295018 B6 sekvenci, odpovídající 5' a 3' okrajovým sekvencím kódující DNA a sekvencím intronů DNA. Předkládaný vynález zahrnuje i identifikaci nukleových kyselin o sekvencích SEQ ID č. 1 (obr 1 (A až E)) a SEQ ID č. 3 (obr. 2 (A a B)), jejich degenerovaných variant, alelických variant a dalších příbuzných molekul.

Předkládané nukleové kyseliny jsou molekuly DNA nebo RNA, včetně příslušných syntetických variant, obsahujících fosfátové nebo analogové, např. thiofosfátové vazby. Uvažovány jsou sekvence jednovláknového i dvouvláknového uspořádání řetězců.

Předkládaný vynález dále zahrnuje nukleové kyseliny, použitelné jako molekulové proby nebo jako primery pro polymerázovou řetězovou reakci (PCR), tj. syntetické nebo přirozené oligonukleotidy o nukleotidové sekvenci, odpovídající části sekvencí SEQ ID č. 1 (obr. 1 (A až E)) a SEQ ID č. 3 (obr. 2 (A a B)) a SEQ ID č. 22 a 24 (obr. 20 (A až C)); nebo 5' a 3' okrajovým sekvencím kódující DNA; nebo sekvencím intronů genomové DNA. Předkládaný vynález uvažuje molekuly DNA o minimální délce 10 nukleotidů, odpovídající stejně dlouhým úsekům ze sekvencí SEQ ID č. 1 (obr. 1 (A až E)) a SEQ ID č. 3 (obr. 2 (A a B)) a SEQ ID č. 22 (obr. 20 (A až C)), nebo příslušných komplementárních sekvencí. Sekvence obsahuje nejvýhodněji nejméně 20 nukleotidů. Podle provedení vynálezu, kde byl oligonukleotid použit jako proba, byl tento oligonukleotid detekovatelně značen, např. radioizotopem (³²P) nebo enzymem.

Předkládaný vynález dále přináší klonovací vektor, obsahující předkládané nukleové kyseliny, kódující OB polypeptid; a bakteriální, hmyzí nebo savčí expresní vektor, obsahující předkládané nukleové kyseliny, kódující OB polypeptid, v operativní vazbě s expresní kontrolní sekvencí. Předkládaný vynález se tedy rovněž týká hostitelských buněk, jako jsou bakterie, kvasinky, hmyzí nebo savčí buňky, transfekovaných nebo transformovaných příslušným expresním vektorem a využití těchto systémů pro výrobu předkládaných modulátorů tělesné hmotnosti.

Předkládaný vynález dále zahrnuje protilátky, které váží OB polypeptid. Tyto protilátky lze generovat imunizací celým polypeptidem, nebo antigenním fragmentem. Lze je použít jako inhibitory funkce polypeptidu (tj. modulace tělesné hmotnosti a obsahu tuku v těle). Protilátky lze rovněž použít při stanovování hladiny polypeptidu v oběhu, tj. v plazmě nebo séru. Oblastně specifické protilátky, zvláště monoklonální protilátky, lze využít jako proby struktury OB polypeptidu.

Všechny výše uvedené látky lze jako modulátory tělesné hmotnosti a obsahu tuku v těle použít v řadě souvislostí. Konkrétně, celý soubor zde definovaných modulátorů tělesné hmotnosti, včetně nukleových kyselin a peptidů, má diagnostické i terapeutické využití a využití v zemědělství. Modulaci tělesné hmotnosti, zprostředkovanou podáním jednoho nebo několika předkládaných modulátorů, lze specificky terapeuticky využít v případech nežádoucí obezity nebo naopak kachexie.

Modulace tělesné hmotnosti savců spočívá v regulaci exprese proteinu, kódovaného nukleovou kyselinou ze skupiny sekvencí SEQ ID č. 1 (obr. 1 (A až E)) a SEQ ID č. 3 (obr. 2 (A a B)) a jejich degenerovaných a alelických variant. Zavedení těchto sekvencí genovou terapií do tukových buněk pacienta nebo hostitele vede k regulaci či snížení obezity. Naopak podání antagonistů nukleotidových sekvencí, jako jsou anti-sense molekuly, je indikováno v případech významných ztrát hmotnosti, například při léčbě mentální anorexie, rakovině nebo AIDS. Stejně jako nukleové kyseliny jsou antagonistní přípravky zaváděny přímo do tukových buněk, kde vyvolávají plánované změny.

Proteiny o sekvencích SEQ ID č.l, SEQ ID č.4, SEQ ID č.5 a SEQ ID č.6 (obr. 1 (A až E), 3, 5 a 6), jejich konzervativní varianty, aktivní fragmenty a příbuzné malé molekuly, lze tedy přímo terapeuticky využít při snižování nebo regulaci nadměrného množství tuku nebo hmotnostního přírůstku. Na druhé straně lze k uvedeným proteinům připravit protilátky a jiné antagonistní přípravky a podávat je v případech, kdy je požadován opačný účinek. Předkládaný vynález je tedy výhodně zaměřen na farmaceutické přípravky, obsahující předkládaný OB polypeptid nebo naopak příslušného antagonistů a farmaceuticky přijatelný nosič nebo excipient.

-6CZ 295018 B6

Předkládaný OB polypeptid lze rovněž podávat jako součást kosmetických přípravků, např. pro vylepšení tělesného vzhledu snížením tukových zásob. OB polypeptid lze užívat samostatně nebo jako součást kosmetického postupu, např. kosmetického chirurgického zákroku.

Diagnostické použití předkládaných nukleotidových sekvencí a odpovídajících peptidů rozšiřuje význam nukleových kyselin při identifikaci dalších mutací jejich alelických variant, neboť tak vzniká soubor aktivního materiálu, využitelného pro diagnostické i léčebné účely. Konkrétně lze rozpoznat homozygótní i heterozygótní nukleotidické mutace, přesněji kvantifikovat stav pacientů a určit riziko rozvoje obezity. V současné době se zdá, že heterozygótní mutace jsou spojeny s mírnou až střední obezitou a homozygótní mutace jsou spojeny s pokročilejší až vážnou obezitou. S využitím souboru aktivního materiálu lze provádět odpovídající testování DNA a usnadnit dlouhodobou prognózu určitých tendencí, tak aby bylo možné odvrátit hrozící rizikový stav včasným zavedením změn ve stravování i jiných osobních zvycích, nebo přímo zahájením terapie.

Diagnostické využití předkládaného vynálezu zahrnuje i postupy stanovení a kvantifikace předkládaných modulátorů v buněčných vzorcích nebo biologických extraktech (nebo vzorcích), odebraných u testovaných subjektů; a to jak hladiny nukleových kyselin (genomová DNA nebo mRNA), tak proteinů. Je-li známo, že zvýšená aktivita nukleotidových sekvencí a přítomnost příslušného proteinu odráží schopnost pacienta inhibovat obezitu, může ošetřující lékař při analýze příslušných výsledků u obézní osoby stanovit, jaký jiný faktor než dysfunkce, vyvolaná přítomností a aktivitou nukleotidových sekvencí předkládaného vynálezu, mohl obezitu ovlivnit. Na druhé straně snížené hladiny nukleotidových sekvencí a/nebo expresních proteinů naznačují, že léčba obezity vyžaduje jejich zvýšení a že je nutné vypracovat příslušný terapeutický plán.

Stanovené nukleotidové sekvence, uvedené na obr. 1 (A až E) a 2 (A a B), představují cDNA, využitelnou pro stanovení odpovídající mRNA. Podobně lze připravit rekombinantní proteiny, odpovídající polypeptidům na obr. 1 (A až E) a 3), příslušně je označit a použít např. pro stanovení tuku a/nebo OB proteinu v plazmě radioimunoesejí, nebo při detekci a kvantifikaci OB receptorů v tkáních, např. v hypotalamu.

Předkládaný vynález se zabývá nejen identifikací předkládaných nukleotidových sekvencí a odpovídajících proteinů, ale též objasněním jejich receptorů. Tento úkol vyžaduje připravit polypeptidy na obr. 1 (A až E), 3, 5 a/nebo 6 a využít je pro prohledání příslušné expresní knihovny a pro izolaci aktivních receptorů. Receptory lze dále klonovat a využít samotné nebo spolu s ligandem pro vyhledávání malých molekul s předpokládanou modulátorovou aktivitou.

Předkládaný vynález se dále týká farmaceutických přípravků, obsahujících předkládané modulátory, výhodně polypeptidy o sekvencích SEQ ID č. 2, SEQ ID č. 4, SEQ ID č. 5 a SEQ ID č. 6, jejich protilátky, odpovídající malé agonistní nebo antagonistní molekuly nebo aktivní fragmenty. Tyto farmaceutické přípravky jsou formulovány tak, aby vyhovovaly různým cestám administrace podle terapeutického záměru. Přípravky dále obsahují farmaceuticky přijatelné nosiče nebo jiná adjuvans a jsou připravovány v rozmanitých dávkových rozmezích účinné složky tak, aby je ve všech případech mohl ošetřující lékař snadno předepsat.

Hlavním předmětem předkládaného vynálezu jsou modulátory tělesné hmotnosti, jak zde byly definovány, v dostatečně čisté formě, vykazující požadované charakteristiky a aktivitu regulátorů adipozity a tělesného obsahu tuků u savců.

Dalším předmětem předkládaného vynálezu jsou způsoby detekce a stanovení modulátorů tělesné hmotnosti pro efektivní diagnostiku a monitorování patologických stavů, souvisejících se změnami hladin těchto modulátorů.

-7CZ 295018 B6

Dalším předmětem předkládaného vynálezu je způsob vyhledání a z něho vycházející testovací systém pro vyhledání látek, jako jsou léčiva, činidla, apod., které napodobují nebo inhibují aktivitu předkládaných modulátorů u savců.

Dalším předmětem předkládaného vynálezu je způsob léčby savců, spočívající v regulaci tělesné hmotnosti a tělesného obsahu tuků u savců a/nebo způsob léčby některých patologických stavů, pro něž je charakteristické abnormální snížení nebo zvýšení tělesné hmotnosti.

Dalším předmětem předkládaného vynálezu je příprava genetických systémů pro genovou terapii a/nebo příslušných farmaceutických přípravků, které obsahují nebo vycházejí z jednoho nebo několika modulátorů, jejich vazebných partnerů, činidel, regulujících jejich produkci nebo napodobujících či inhibujících jejich aktivitu.

Další předměty předkládaného vynálezu a jeho přínos budou odborníkům v oboru zřejmé z následujícího přehledu a vysvětlujících obrázků.

Stručný popis obrázků

Obr. 1 (A až E) uvádí nukleotidovou sekvenci SEQ ID č. 1 a odpovídající aminokyselinovou sekvenci SEQ ID č. 2, odvozené pro myší OB cDNA. Po prvních 39 bp od 5' konce následuje předpovězených 167 aminokyselin otevřeného čtecího rámce a přibližně 3,7 kB 3' nepřeložené sekvence. (V předcházející patentové přihlášce poř. č. 08/347 563, předložené 30. 11. 1994 a poř. č. 08/438 431, předložené 10. 5. 1995, bylo určeno, že dodatečná 58 bp dlouhá 5'-nekódující sekvence je artefaktem klonování. Tento artefakt nemá žádný vztah ke kódující oblasti, ani k 39 bp 5'-nekódující oblasti, uvedené na obr. 1, nebo k 3'-nekódující oblasti genu.) Je uvedeno celé množství asi 2500 bp 3' nepřeložené sekvence. Analýza předpovězené aminokyselinové sekvence, provedená ručně i na počítači v programu SigSeq, naznačuje přítomnost signální sekvence (podtrženo). Byla pozorována mikroheterogenita cDNA; přibližně 70 % cDNA kyselin má glutaminový kodon v poloze 49 a 30 % kyselin jej nemá (viz obr. 5 a 6, dále). Aminokyselina glutamin je podtržena, podobně jako argininový kodon, který je uC57Bl/6J OB/OB myší (myši 1J) mutován.

Obr. 2 (A až B) uvádí nukleotidovou sekvenci SEQ ID č. 3, odvozenou pro lidskou OB cDNA. Nukleotidy jsou očíslovány od 1 do 701, startovací místo je v poloze 46 a terminační v poloze 550.

Obr. 3 uvádí celou vydedukovanou aminokyselinovou sekvenci SEQ ID č. 4, odvozenou pro lidský OB gen, odpovídající nukleotidové sekvenci na obr. 2 (A a B). Aminokyseliny jsou očíslovány od 1 do 167. Signální sekvence štěpného místa následuje za aminokyselinou 21 (Ala), takže maturovaný protein začíná aminokyselinou 22 (Val) a končí aminokyselinou 167 (Cys).

Obr. 4 uvádí srovnání myší (SEQ ID č. 2) a lidské (SEQ ID č. 4) vydedukované aminokyselinové sekvence. Vydedukovaná aminokyselinová sekvence lidského OB proteinu je vysoce homologní s myším OB proteinem. Konzervativní změny jsou označeny pomlčkou, nekonzervativní změny hvězdičkou. Variabilní glutaminový kodon je podtržen stejně jako nonsense mutace u C57B1/6J OB/OB myší (1J). Na úrovni aminokyselin byla pozorována 83% identita, ačkoliv bylo nalezeno pouze osm substitucí v oblasti mezi valinem na kodonu 22 (po směru, hned za signální sekvencí) a cysteinem v poloze 117.

Obr. 5 uvádí celou aminokyselinovou sekvenci SEQ ID č. 5, odvozenou pro myší OB gen, jak je uveden na obr. 3, s chybějícím glutaminem v poloze 49. Aminokyseliny jsou očíslovány od 1 do 166. Signální sekvence štěpného místa následuje za aminokyselinou 21 (Ala) (tudíž, s delecí glutaminu 49), maturovaný protein začíná aminokyselinou 22 (Val) a končí aminokyselinou 166 (Cys).

-8CZ 295018 B6

Obr. 6 uvádí celou vydedukovanou aminokyselinovou sekvenci (SEQ ID č. 6), odvozenou pro lidský OB gen a odpovídající nukleotidové sekvenci na obr. 4, s chybějícím glutaminem v poloze 49. Aminokyseliny jsou očíslovány od 1 do 166. Signální sekvence štěpeného místa následuje za aminokyselinou 21 (Ala) (tudíž, s delecí glutaminu 49), maturovaný protein začíná aminokyselinou 22 (Val) a končí aminokyselinou 167 (Cys).

Obr. 7 (A) Fyzická mapa umístění OB na myším chromozomu a klonovací mapy YAC a Pl. „M a N“ odpovídá restrikčním místům Mul\ a Notl. Číslování odpovídá jednotlivým zvířatům, u nichž byla nalezena rekombinantní oblast OB po 1606 meiózách. Označení Met, Pax 4, D6Rck39, D6Rckl3 a Cpa se vztahují k vazebným místům DNA prob v rámci oblasti OB. YAC byly izolovány pomocí prob D6Rckl3 a Pax 4, konce byly obnoveny s využitím vektoretu PCR a/nebo uvolněním plazmidu a použity opět při izolaci dalších YAC. (B) Výsledná sada YAC. Jedna oblast YAC této sady, Y902A0925, byla chimémí. Proby, použité při analýze genotypu rekombinantních zvířat, jsou uvedeny v závorkách. (6) je YAC 107, (5) je M16(+) nebo M16(pLUS); (4) je adu(+); (3) je a<7č/(pICL); (2) je 53(pICL); a (1) je 53(+). (C) Pl sada klonů bakteriofágu Pl, izolovaná pomocí vybraných YAC koncových prob.Gen OB byl izolován v Pl klonu s využitím vzdáleného konce YAC YB6S2F12 (konec (4)) (alternativně označený jako adu(+)).

Obr. 8 ukazuje fotografii 192 nezávislých izolátů po obarvení ethidium bromidem ze čtvrtého experimentu, zaměřeného na vyhledání exonů po amplifikaci PCR a jejich charakterizaci.

Obr. 9 ukazuje fotografii PCR-amplifikovaných klonů s předpokládaným OB po obarvení ethidium bromidem. Každý ze 7 klonů, který neobsahuje artefakt, byl opakovaně PCR-amplifíkován a rozdělen elektroforézou na 1 % agarózovém gelu v TBE a obarven ethidium bromidem. Markér velikosti (levá neočíslovaná dráha) je komerční „1 kB ladder“. Dráha 1 — klon 1D12 obsahující „HIV sekvenci“. Dráha 2 — klon 1F1, nový klon z oblasti mimo OB. Dráha 3 — klon 1H3. Dráha 4 — klon 2B2, identický s 1F1. Dráha 5 — klon 2G7, obsahující OB exon. Dráha 6 — klon 2G11, identický s 1F1. Dráha 7 — klon 2H1 neobsahující inzert.

Obr. 10 uvádí sekvenci klonu 2G7 (SEQ ID č. 7), která obsahuje exon kódující část genu OB. Primární sekvence, použitá pro amplifikaci tohoto exonu, je označena rámečkem SEQ ID č. 8 a 9.

Obr. 11 (A) Reverzní transkripční PCR-analýza mRNA z různých tkání jedné myši s využitím primeru 2G7 a primeru aktinového. Reakce RT-PCR byly prováděny na 100 ng celkové RNA, reverzně přepsané do prvního řetězce cDNA, při syntéze byl jako primer použit oligo-dT. PCR amplifikace byla prováděna v 35 cyklech, v následujících podmínkách: denaturace 94 °C, 1 min; hybridizace 55 °C, 1 min; a extenze 72 °C, 2 min s 1 min druhé autoextenze v každém cyklu. Produkty RT-PCR byly analyzovány elektroforézou v 2% agarózovém gelu při nízkém bodu tání v 1 x TBE pufru. (B) Northernové blotování mRNA z různých orgánů myši s PCR značenou probou 2G7. 10 pg celkové RNA z každé jednotlivé tkáně bylo rozděleno elektroforézou na agarózovém gelu s formaldehydem. Proba byla hybridizována při 65 °C v Rapid Hybe (Amersham). Autoradiografícké signály byly patrné po 1 h expozice; uvedený výsledek je po 24h expozici.

Obr. 12 (A) Elektroforetický záznam, obarvený ethidium bromidem z RT-PCR reakce, provedené na RNA z tukových buněk (bílá adipózní tkáň) jednotlivých myších kmenů. Totální RNA (100 ng) z každého vzorku byla reverzně přepsána s využitím oligo-dT a reverzní transkriptázy a výsledná jednovláknová cDNA byla amplifikována PCR s 2G7 primery (nižší pásy) nebo s aktinovými primery (vyšší pásy). Oba typy primerů, 2G7 i aktin, byly v PCR reakci použity současně. Produkty byly analyzovány na 1% agarózovém gelu v TBE. (B) Northemová analýza odpovídající bodu (A). RNA (10 pg) z tukových buněk (bílá adipózní tkáň) jednotlivých myších kmenů byla rozdělena elektroforézou a analyzována pomocí PCR značených prob 2G7 jako na obr. 11B. Přibližně 20-ti násobný vzrůst hladiny 2G7 mRNA byl patrný u RNA z bílé tukové tkáně myší C57B1/6J OB/OB (1J) proti hubeným zvířatům ze stejného vrhu. Ani

-9CZ 295018 B6 v jednom z experimentů, RT-PCR nebo northemovém, se neobjevil detekovatelný signál pro 2G7 v RNA z myší SM/Cke-+^Dac ob^{2 J} / ob^{2 J}, dokonce ani po dvoutýdenní expozici. Uvedený výsledek je po 24h expozici. Stejný filtr byl hybridizován s aktinovou probou (dolní část obrazu).

Obr. 13 ukazuje northemovou analýzu dodatečných zvířat 2J a kontrol, potvrzující nepřítomnost OB mRNA u zvířat 2J. Northemová analýza byla provedena podle popisu obr. 11 a 12. Jako kontrola byla použita RNA ap2, transkript z tukové tkáně. Různá intenzita pásů ap2 není významná.

Obr. 14 porovnává DNA sekvenci C57B1/6J (normálních) a C57B1/6J OB/OB (1J) myší v oblasti bodové mutace, která vede ke vzniku prematurovaného stop kodonu (nonsence mutace) v cDNA mutantního kmenu. U myši OB/OB došlo k mutaci C-»T a tedy ke změně argininu v poloze 105. Změna báze byla potvrzena automatickým sekvenátorem DNA. Na RNA z bílé tukové tkáně obou druhů myší (+/+ a OB/OB) byla provedena RT-PCR s primery z 5' a 3' nepřeložených oblastí. Produkty RT-PCR byly purifíkovány na gelu a sekvenovány ručně i na automatickém sekvenátoru Applied Biosystems, lne. 373A s primery podél obou vláken kódující sekvence.

Obr. 15 (A) Southernovo blotování genomové DNA z jednotlivých myších kmenů. Přibližně 5 pg DNA (DNA izolovaná z jater, ledvin nebo sleziny) bylo štěpeno restrikčním enzymem. Poté byla DNA rozdělena elektroforézou na 1% agarózovém gelu vTBE a analyzována PCR značenou probou 2G7. Restrikční štěpení Bgl\\ odhalilo vzrůst fragmentu BglW o velikosti přibližně 9 kB (největší) v DNA, pocházející z SM/Ckc-+^Dac ob^{2 J} / ob^{2 J} (2J). U žádného dalšího restrikčního enzymu nebyly RFLP detekovatelné. Předběžné restrikční mapování genomové DNA naznačilo, že polymorfní místo Bgl\\ je 7 kB proti směru od startovacího místa. Žádný z ostatních testovaných enzymů nezasáhl oblast ze startovacím místem mRNA. (B) Segregace BglW polymorfismu u kmene SM/Ckc-+^Dac ob^{2 J} / ob^{2 J}. U šesti obézních a pěti hubených potomků jedné generace koisogenní kolonie SM/Ckc-+^Dac ob^{2 J} / ob²¹ byl analyzován genotyp vypočtením skóre Bgl\\ polymorfismu podle bodu (A). Všechna fenotypově obézní zvířata byla homozygótní na většině alel polymorfního Bglll fragmentu. V kontrolní dráze byla použita DNA, izolovaná z nepříbuzných myší SM/Ckc-+^Dac+/+, pěstovaných odděleně od kolonie SM/Ckc-+^Dac ob^{2 J} / ob^{2 J}.

Obr. 16 ukazuje Southernovo blotování £coRI digestu genomové DNA, izolované z uvedených druhů, s využitím OB cDNA jako proby (tj. zoo blot). Hybridizační signály byly detekovatelné ve vzorcích od všech obratlovců už při mírných hybridizačních podmínkách. Kočičí DNA byla v tomto experimentu mírně degradována. Rozštěpená DNA byla rozdělena elektroforézou na 1% agarózovém gelu v TBE a přenesena na membránu pro další analýzu probou. Filtr byl hybridizován při 65 °C a promyt 2 x SSC/0,2 % SDS při 65 °C, 2 x 20 min a exponován 3 dny s filmem Kodak (Rochester, N.Y.) X-OMAT.

Obr. 17 ukazuje expresní klonovací oblast vektoru pET-15b (Novagen) (SEQ ID č. 11 a 12).

Obr. 18 ukazuje výsledky analýzy eluátu z Ni-chelatační kolony, plněné pryskyřicí s afinitou k histidinu, pro rekombinantní maturovaný myší OB, fúzní s His-tag (A) a pro maturovaný lidský OB, fúzní s His-tag (B). Bakterie byly transformovány vektory pETM9 nebo pETH14. Po indukci 1 mmol IPTG za optimálních podmínek produkovaly bakterie 100 až 300 pg/ml OB fúzního proteinu nitrobuněčně. Buňky byly rozpuštěny v 6 mol.f¹ guanidin hydrochloridu nebo močovině a fúzní protein (přítomný v supernatantu po lýze) byl nanesen na sloupec (Ni), plněný pryskyřicí s afinitou k histidinu ve 10 ml 1 x vazebném pufru s močovinou (10 ml). Sloupec byl postupně eluován 5 ml aliquoty 20 pmol.f¹, 60 pmol.f¹ a 300 pmol.f¹ imidazolu a nakonec vymývacím pufrem. Aliquoty byly analyzovány na přítomnost OB fúzního polypeptidu na 15% akrylamidovém gelu. Do každé dráhy byl nanesen ekvivalent 100pl bakteriálního extraktu.

-10CZ 295018 B6

Obr. 19 (A) In vitro translace OB RNA. Lidská OB cDNA byla subklonována do vektoru pGEM. Plazmid byl linearizován a syntetizován plus řetězec RNA s využitím Sp6 polymerázy. RNA syntetizovaná in vitro byla přeložena v přítomnosti nebo v nepřítomnosti psích pankreatických mikrozomálních membrán. Po translaci in vitro byl pozorován primární translační produkt přibližně 18 kD. Přidání mikrozomálních membrán do reakce vedlo ke vzniku druhého translačního produktu, menšího asi o 2 kD. Velikost translačního produktu RNA z interleukinu-ΐα, který neobsahuje zakódovanou signální sekvenci, zůstala po přidání mikrozomálních membrán nezměněna.

Z uvedených dat vyplývá přítomnost funkční signální sekvence. (B) In vitro translace v přítomnosti nebo nepřítomnosti proteinázy-K. Štěpení proteázou vedlo k úplné proteolýze primárního translačního produktu 18 kD, zatímco produkt 16 kD zůstal nezměněn. Permeabilizace mikrozomů účinkem 0,1 % TRITON-X100 způsobilo citlivost produktu 16 kD k proteolýze. Výsledky naznačují, že produkt byl translokován do lumenu mikrozomů.

Obr. 20 (A až E): Sekvence lidského OB genu SEQ ID č. 22 a 24. (F): Schematický diagram myšího OB genu. (G): Schematický diagram lidského OB genu. V obou diagramech (F) i (G) jsou podtrženy startovací a stop kodony. Homologie prvního intronu lidského OB genu s prvním intronem myšího OB genu nebyla potvrzena, ale není vyloučena.

Obr. 21 uvádí schematickou kresbu strategie klonování rekombinantní exprese OB v kvasinkách Pichia. (A) Expresní vektor OB, obsahující signální sekvenci α-párovacího faktoru. (B) schématická kresba struktury rekombinantního fúzního proteinu, zahrnující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID č. 26 s označením míst Xhol a předkládaných štěpených míst KEX-2 a STE-13, a N-koncový přesah, vzniklý po štěpení KEX-2 (SEQ ID č. 27). (C) Alternativní strategie produkce maturovaného OB, zahrnující přípravu aminokyselinové sekvence, odpovídající štěpeným místům ATzol a KEX-2, umístěným po směru hned za maturovanou sekvencí OB polypeptidů (SEQ ID č. 28).

Obr. 22 Alternativní expresní strategie v Pichia. (A) expresní vektor fúzního OB sHis-tag, přejatý z expresního systému pET, řízený signální sekvencí α-párovacího faktoru (SEQ ID č. 33). Schematická kresba struktury rekombinantního fúzního proteinu OB s His-tag, se signální sekvencí α-párovacího faktoru, předpokládanými štěpnými místy KEX-2 a STE-13, místem His-tag a trombinovým štěpným místem, tedy proteinu OB s přesahem tří N-koncových aminokyselin.

Obr. 23 PAGE analýza exprese myšího OB (obou mikroheterogenních forem, tj. si bez Gin v poloze 49) v transformovaných kvasinkách Pichia. Očekávaný pás okolo 16 kD je patrný v kultivačním médiu transformovaných kvasinek (druhá a třetí dráha), v kultivačním médiu netransformovaných kvasinek (první dráha) patrný není. (B) PAGE analýza částečně purifikovaného rekombinantního OB polypeptidů po částečné purifikaci na karboxymethylcelulóze (slabý katex). Pruh okolo 16 kD je dobře viditelný ve třetí a čtvrté frakci z kolony, které byly eluovány 250 mmol.r¹ NaCl. Dráha 1 — nanesený vzorek; dráha 2 — promývání; dráhy 3-5 — frakce, eluované 250 mmol.T¹ NaCl.

Obr. 24 ukazuje cirkulaci OB proteinu v myší plazmě. (A) Imunoprecipitace z myší krve. 0,5 ml myší plazmy bylo předčištěno s nekonjugovanou sefarózou a inkubováno přes noc s imunopurifíkovanými anti-OB protilátkami navázanými na sefaróze 4B. Imunoprecipitát byl oddělen na 15% SDS-PAGE gelu, přenesen a provedeno westernové blotování s anti-OB protilátkami. Protein o molekulové hmotnosti okolo 16 kD migroval do stejné vzdálenosti jako maturovaný myší OB protein, exprimovaný v kvasinkách. V plazmě myší C57B1/6J OB/OB protein přítomen nebyl, avšak proti divokým myším vzrostl desetinásobně v plazmě myší C57B1/Ks DB/DB. U myší DB se předpokládá nadprodukce OB proteinu, doprovázející rezistenci vůči jeho účinkům. (B) Zvýšené hladiny OB u obézních krys. Obezita u krys je výsledkem recesivní mutace na krysím chromozomu 5. Podle genetických údajů lze předpokládat defekt na stejném mutovaném

-11 CZ 295018 B6 genu jako u DB myší. Byla provedena imunoprecipitace a westernové blotování plazmy z obézních a hubených krys ze stejného vrhu. U mutantních zvířat byl zjištěn dvacetinásobný vzrůst hladiny OB. (C) Kvantitativní stanovení OB proteinu v myší plazmě. Zvyšující se dávky rekombinantního myšího proteinu byly přidávány k 100 λ plazmy z OB myší a provedena imunoprecipitace. Intenzita signálů na westernových blotech byla porovnána s intenzitou analogických signálů, získaných pro 100 λ plazmy z divokých myší. U zvyšujících se dávek rekombinantního proteinu byl pozorován lineární růst intenzity signálů, což dokazuje, že nadbytek protilátek vedl k imunoprecipitaci. Podobné signály byly patrné i ve vzorcích plazmy u divokých myší a podle vzorku s obsahem 2 ng rekombinantního proteinu bylo stanoveno, že hladina cirkulujícího proteinu v plazmě u myší je přibližně 20 ng/ml. (D) OB protein v extraktech z adipózní tkáně. Byly připraveny cytoplazmatické extrakty z myší adipózní tkáně DB a divokých myší. Výsledky westernového blotování ukázaly vzrůst hladiny proteinu 16 kD v extraktech, připravených z DB myší.

Obr. 25 ukazuje kolísavé cirkulační hladiny OB proteinu v lidské plazmě. (A) Westernové blotování lidské plazmy. Od šesti hubených dobrovolníků byly odebrány vzorky plazmy. Imunoprecipitace a westernové blotování ukázaly přítomnost imunoreaktivního proteinu 16 kD, který měl stejnou velikost jako rekombinantní lidský protein 146 aminokyselin, exprimovaný v kvasinkách. V každém ze šesti vzorků byly pozorovány kolísavé hladiny proteinu. (B) ELISA (Enzyme Linked Immunoassay) lidského OB. Mikrotitrační plotny byly potaženy imunopurifíkovanými lidskými anti-OB protilátkami. Známá množství rekombinantního proteinu byla nanášena na plotny a detekována s využitím imunopurifikovaných biotinylovaných anti-OB protilátek. Hodnota absorbance při 414 nm byla vynesena proti známým koncentracím OB a stanovena standardní křivka. Z výsledné standardní křivky vyplývá citlivost testu od 1 ng/ml lidského OB proteinu. (C) Kvantitativní stanovení OB proteinu v lidské plazmě. ELISA imunoesej byla provedena na 100 λ plazmy od šesti hubených dobrovolníků a na standardním vzorku z oddílu (B). Byly pozorovány hladiny OB proteinu v rozmezí 2 ng/ml pro HP1 až 15 ng/ml pro HP6. Tyto údaje jsou v korelaci s výsledky westernového blotování v oddíle (A).

Obr. 26 ukazuje, že OB protein obsahuje inter- nebo intramolekulární disulfídické můstky. (A) Westernové blotování v redukujících a neredukujících podmínkách. Westernové blotování bylo opakovaně prováděno na myší a lidské plazmě s a bez přidání redukujících činidel ke stejným vzorkům. Když byl v pufru vynechán β-merkaptoethanol, imunoprecipitáty z DB plazmy migrovaly spolu s molekulovými hmotnostmi 16 kD a 32 kD. Přidání β-merkaptoethanolu do pufru vedlo ke zmizení hmotnosti 32 kD (viz obr. 24). Stejný výsledek byl získán i pro myší protein, exprimovaný v kvasinkách Pichia pastoris. V prvním případě migroval myší OB protein jako dimer. V redukujících podmínkách migroval purifíkovaný rekombinantní myší protein jako molekulová hmotnost 16 kD, což znamená, že molekulovou formu 32 kD způsobují jeden nebo dva disulfídické můstky. Lidský protein, exprimovaný in vivo a v Pichia pastoris, migroval s molekulovou hmotností 16 kD v redukujících i v neredukujících podmínkách (údaje nejsou uvedeny). (B) Lidský protein, exprimovaný v kvasinkách, obsahuje intramolekulární disulfidický můstek. Proteiny, exprimované v expresním systému s Pichia pastoris, obvykle zachovávají správnou konformaci. 146 aminokyselinový maturovaný lidský protein byl exprimován v Pichia pastoris a dvoustupňové purifíkován z kvasinkového média postupem IMAC a gelovou filtrací. Purifikované proteiny byly analyzovány hmotností spektroskopií před a po bromkyanovém štěpení. Bromkyan štěpí v místě karboxylového konce methioninu. Molekulová hmotnost rekombinantního kvasinkového proteinu byla 16,024 ± 3 Da (vypočtená molekulová hmotnost: 16,024 Da). Bromkyan štěpí sekvenci proteinu za třemi methioniny v polohách 75, 89 a 157. Bromkyanový fragment o stanovené molekulové hmotnosti 8435,6 Da odpovídá aminokyselinám 90-157 a 158-167, spojeným disulfidickým můstkem mezi cys-117 a cys-167 (vypočtená molekulová hmotnost: 8434,5 Da). N.D. = nedetekováno.

Obr. 27 ukazuje přípravu bioaktivního rekombinantního proteinu. Nukleotidová sekvence, odpovídající 145 aminokyselinám maturovaného myšího OB proteinu, byla klonována do expresního vektoru pET 15b. Vektor pET obsahuje polyhistidinovou oblast (His-tag) v protisměru od klonované sekvence, což umožňuje účinnou purifíkaci s využitím IMAC (Immobilized Metal

- 12CZ 295018 B6

Affinity Chromatography). Rekombinantní protein byl po bakteriální lýze obsažen nejprve v nerozpustné membránové frakci. Membránová frakce byla rozpuštěna guanidinium hydrochloridem a nanesena na sloupec IMAC. Protein byl postupně eluován rostoucí koncentrací imidazolu. Eluovaný protein byl v dalším kroku prostorově přeuspořádán a působením trombinu odštěpena oblast His-tag, jak je uvedeno dále. Konečný výtěžek rozpustného proteinu byl 45 ng/ml bakteriální kultury.

Obr. 28 ukazuje biologické účinky OB proteinu. Časový průběh příjmu potravy (grafy A až C) a tělesné hmotnosti (grafy D až F). Skupiny po deseti zvířatech dostávaly denně intraperitoneální injekce OB proteinu v dávce 5 mg/kg/den (plné čtverečky), nebo injekce PBS (plné kroužky) nebo nic (plné trojúhelníčky). Pokusné skupiny zahrnovaly myši C57B1/6H OB/OB (grafy A a D), myši C57B1/Ks DB/DB (grafy B a E) a myši CBA/J +/+ (grafy C a F). Příjem potravy u myší byl denně monitorován a tělesná hmotnost zaznamenávána v tří až čtyřtýdenních intervalech. (Stupnice tělesné hmotnosti v gramech je odlišná pro divoké myši vs. myši OB a DB.) Příjem potravy u OB myší, které dostávaly protein, se po první injekci snížil a po čtyřech dnech se stabilizoval na 40% úrovni proti skupině, která dostávala placebo (p<.001). Tělesná hmotnost těchto zvířat se snižovala průměrně o 1,3 g/den a po třech týdnech se stabilizovala na 60 % počáteční hmotnosti (p<.0001). U DB myší nebyl pozorován žádný účinek proteinu. Malý ale zaznamenatelný účinek byl pozorován u myší CBA/J ve dvou raných časových bodech (p<.02). Standardní chyba u každého stanovení je označena úsečkou a statistická významnost výsledků je uvedena v tabulce 1.

Obr. 29 ukazuje výsledky párového krmení OB myší. (A) Skupina čtyř myší C57B1/6H OB/OB byla krmena stejným množstvím potravy, jaké spotřebovala skupina OB myší, léčená rekombinantním proteinem. Hmotnostní úbytek u obou skupin byl stanovován po pěti, osmi a dvanácti dnech. Myši s omezeným přísunem potravy ztrácely méně hmotnosti (šrafované sloupce) než myši, léčené proteinem (plné sloupce) (p<.02). Z výsledků vyplývá, že vliv OB proteinu na snížení hmotnosti je souhrnem vlivů na příjem potravy a výdej energie. (B) Fotografie léčené OB myši. Na obrázku jsou dvě C57B1/6J OB/OB myši. Myš na levé straně dostávala PBS a vážila 65 g, což byla její počáteční hmotnost. Myš napravo dostávala denně injekce rekombinantního OB proteinu. Její počáteční hmotnost byla rovněž 65 g a po třítýdenní léčbě proteinem hmotnost klesla na 38 g. (C) Játra léčené a neléčené OB myši. Na obrázku jsou játra léčené a neléčené C57B1/6J OB/OB myši. Játra z myši, která dostávala PBS, jsou veliká a tučná a váží 5,04 g. Játra z myši, která dostávala rekombinantní OB protein, mají normální vzhled a váží 2,23 g.

Obr. 30 ukazuje in šitu hybridizaci OB k adipózní tkáni. OB RNA (vlákno sense i anti-sense) byla označena in vitro s využitím Sp6 a T7 polymerázy a digoxigeninu. Značená vlákna RNA byla přihybridizována k řezům adipózní tkáně z epididymálních tukových zásob, zalitých do parafínu, pocházejících z osmitýdenních C5B1/Ks myší (značeno divoký typ) a C57B1/Ks DB/DB myší (značeno DB). Na obrázku jsou vidět tukové kapky jako nezbarvené vakuoly uvnitř buněk. Cytoplazma je tenký lem na okraji buněk a je neodlišitelná od buněčné membrány. Hybridizace v celém poli adipocytů byla detekována na tkáňových řezech z divokých myší pouze s použitím antisense proby a značně zvýšené hladiny byly pozorovány na tkáňových řezech DB/DB zvířat.

Obr. 31 ukazuje expresi OB RNA vadipocytech in vivo a in vitro. Totální RNA (10 pg) z několika různých zdrojů byla rozdělena elektroforézou, blotována a hybridizována s OB probou. Nejprve byl pro purifikaci adipocytů využit rozdíl ve vznosnosti buněk po štěpení kolagenázou. OB RNA se vyskytovala pouze ve frakci adipocytů. OB RNA nebyla exprimována v nediferencovaných preadipocytárních buňkách 3T3-442, dráha U. Diferencované adipocyty těchto buněčných linií exprimovaly zřetelně detekovatelné hladiny OB mRNA (dráha D).

Obr. 32 ukazuje, že k expresi OB RNA dochází ve všech adipózních tkáňových depotech. Všechny testované adipózní tkáňové depoty exprimovaly OB RNA. Ingvinální tukové zásoby exprimovaly poněkud nižší hladiny RNA, ale v různých pokusech byly pozorovány proměnlivé

- 13CZ 295018 B6 hladiny signálů. (Obr. 31 A) dráhy (1) epididymální (2) ingvinální (3) abdominální (4) parametriální tukové zásoby. Hnědý tuk rovněž exprimoval nízké hladiny OB RNA. (Obr. 31 B) Hladiny exprese OB RNA v hnědém tuku zůstaly nezměněné u zvířat, žijících při 4 °C po dobu 1 týdne, zatímco vzrostl pětinásobně nadbytek specifické UCP RNA, indukované chladem.

Obr. 33 ukazuje expresi OB RNA u myší DB/DB a u myší po aplikaci aurothioglukózy. Totální RNA z parametriálních tukových zásob z myší po aplikaci aurothioglukózy (GTG) a z myší DB/DB byla elektroforeticky rozdělena a provedeno northemové blotování. Je známo, že podání jedné dávky GTG vyvolá obezitu indukováním specifické hypotalamické léze. (A) CBA myším samicím, stáří jeden měsíc, bylo aplikováno GTG (0,2 mg/g), což vedlo k výslednému zvýšení hmotnosti o >20 g proti kontrolní skupině (<5 g). (B) Podle hybridizace OB proby k RNA z DB/DB a GTG myší byl zjištěn dvacetinásobný vrůst OB RNA proti kontrolní RNA (aktin nebo GAPDH).

Obr. 34 ukazuje analýzu lidské RNA northernovým blotováním. Northemové bloty, obsahující 10 mg totální RNA z lidských adipózních tkání (FAT, obr. A) a 2 mg póly A + RNA z jiných lidských tkání (graf B), byly hybridizovány s lidskou OB probou nebo s lidskou β-aktinovou probou. Intenzivní signály v oblasti 4,5 kb byly patrné u totální RNA z adipózní tkáně. Hybridizace s póly A + RNA odhalila detekovatelné signály u srdce (HE) a placenty (PL), zatímco OB RNA nebyla detekována v mozku (BR), plicích (LU), játrech (LI), kosterním svalstvu (SM), ledvinách (KI) a slinivce (PA). U všech pokusů je poznamenána délka autoradiografické expozice. Původ nízkomolekulárních pásů u placentální RNA (např. alternativní splicing, degradece RNA) není znám.

Obr. 35 představuje sadu YAC, obsahujících lidský OB gen a 8 mikrosatelitních markérů. Genetická mapa oblasti chromozomu 7 s lidským OB genem obsahuje oblasti STS, vycházející z YAC a byla vydedukována pomocí SEGMAP/verze 3.29 [Green et al., PCR Methods Applic., 1:77-90 (1991)]. 19 jedinečně uspořádaných oblastí STS (viz tabulka 3) je uvedeno v horní části. 8 STS specifických k mikrosatelitům je označeno hvězdičkami (viz tabulka 4). Rovněž jsou označeny STS odpovídající Pax4 a OB genu, stejně jako předpovězené relativní polohy centromeru (CEN) a 7q telomeru (TEL). Všech 43 klonů YAC je znázorněno horizontální čárou se jménem vlevo a odhadem velikosti v závorce (v kb, podle pulzní gelové elektroforézy). Přítomnost STS v YAC je naznačena plnými kroužky v příslušných polohách. Pokud STS odpovídá inzertovanému konci YAC, je kolem odpovídajícího kroužku zakreslen čtverec, jak v horní části v blízkosti názvů STS, tak na konci YAC, z něhož bylo STS odvozeno. U 5 YAC ve spodní části (pod horizontální přerušovanou čarou) nebyla předpokládaná přítomnost 1 nebo několika STS (vycházející ze stanoveného pořadí) potvrzena (podle odpovídajících STS-specifickými PCR testů s jednotlivými YAC, provedených dvakrát) a polohy těchto STS jsou označeny prázdnými kroužky. Většina YAC byla izolována z knihovny, odvozené z hybridních buněk, pocházejících z lidí a křečků [Green et al., Genomics, 25:170-183 (1995)], původní názvy jsou zachovány. Ostatní YAC byly izolovány z totálních lidských genomových knihoven a jejich původ je uveden v tabulce 3. Tři YAC, jejichž názvyjsou vyznačeny rámečkem (yWSS691, yWSS999, yWSS2935), byly vyhledány FISH analýzou, mapovány do oblasti 7q31.1. Sada není uvedena v „poměrných“ velikostech, z velikostí YAC nelze odhadnout přesahy klonů nebo STS spacing, všechny STS jsou proto umístěny ekvidistantně. V „poměrné“ formě lze z velikostí YAC odhadnout relativní vzdálenosti, oddělující každý pár sousedních STS, stejně jako rozsah přesahu klonů, totální sada YAC má pak rozpětí přes 2 Mb.

Podrobný popis

Předkládaný vynález se týká objasnění a objevu proteinu, označovaného jako OB polypeptid nebo leptin, nukleových kyselin, kódujících tento protein, i jejich degenerovaných variant, např. které obsahují optimální kodony pro expresi v určitém expresním systému. Předkládané proteiny se účastní regulace tělesné hmotnosti savců. Předkládané nukleové kyseliny představují kódující

- 14CZ 295018 B6 sekvence, odpovídající myšímu a lidskému OB polypeptidů, který má klíčovou úlohu v regulaci tělesné hmotnosti a adipozity. Předkládané údaje naznačují, že polypeptidický produkt předkládaných nukleových kyselin je vylučován buňkami, které jej exprimují a že tento polypeptid působí jako hormon. Další experimentální údaje dokládají, že OB polypeptid je velmi účinný při léčbě obezity u myších nositelů mutovaného OB genu. Vysoká dávka nebo mírné kontinuální dávky OB polypeptidů vedou ke snížení tělesné hmotnosti i u normálních myší (divokého typu).

Předkládané příklady dokládají, že OB polypeptid, alternativně označovaný jako „leptin“, se vyskytuje v oběhu v myší, krysí i lidské plazmě. Leptin se nevyskytuje v plazmě OB/OB myší, je přítomen v desetinásobné koncentraci v plazmě DB/DB myší a ve dvacetinásobné koncentraci v plazmě FA/FA krys. Nejpodstatnější je, že denní injekce rekombinantního leptinu podstatně snižují tělesnou hmotnost OB/OB myší, významně ovlivňují tělesnou hmotnost divokých myší, ale nemají žádný účinek na DB/DB myši.

OB polypeptid, pocházející zjednoho druhu, je biologicky aktivní i v jiném druhu. Konkrétně lidský OB polypeptid aplikován myším, vykazuje aktivitu.

Předkládaný vynález je primárně zaměřen na identifikaci látek, které působí jako modulátory tělesné hmotnosti savců. Předkládaný vynález se konkrétně týká izolace, purifikace a sekvenování nukleových kyselin, odpovídajících lidskému i myšímu OB genu nebo jeho kódující sekvenci i izolace, purifikace a sekvenování odpovídajících exprimovaných polypeptidů. Vynález přináší objev nukleových kyselin o nukleotidových sekvencích SEQ ID č. 1 (obr. 1 (A až E)) a SEQ ID č. 3 (obr. 2 (A a B)) a jejich degenerovaných variant, alel a fragmentů, které vykazují aktivitu modulátorů tělesné hmotnosti a adipozity. Souvislost předkládaných kyselin s OB genem je podstatou jejich významného vlivu na obezitu i jiná onemocnění a poruchy, které jsou doprovázeny abnormální tělesnou hmotností. Vynález se dále týká proteinů, exprimovaných předkládanými nukleovými kyselinami, zejména proteinů SEQ ID č. 2 (obr. 1 (A až E)), SEQ ID č. 4 (obr. 3), SEQ ID č. 5 (obr. 5) a SEQ ID č. 6 (obr. 6) i příslušných konzervativních variant, aktivních fragmentů a malých příbuzných molekul.

Jak již bylo diskutováno dříve, peptidy, modulující tělesnou hmotnost, jejich vazebné protějšky nebo jiné ligandy a činidla, napodobující či inhibující jejich aktivitu nebo ovlivňující jejich produkci, lze použít ve farmaceutických přípravcích. Farmaceutické přípravky dále obsahují vhodný nosič a účinnou látku ve vhodném množství podle cesty podání a jsou určeny pacientům s abnormálními změnami tělesné hmotnosti nebo adipozity. Tyto farmaceutické přípravky lze podávat samostatně nebo jako doplňující léky při léčbě jiných chorobných stavů, jako je rakovina nebo AIDS. Přípravky lze podávat různými cestami, např. perorálně, nazálně nebo dalšími sliznicemi, parenterálně např. subkutánními, intravenózními nebo intraperitoneálními injekcemi či katetrizací a pod. Průměrná množství rekogničních faktorů či jejich podjednotek jsou proměnlivá a musí vycházet z doporučení a předpisu kvalifikovaného lékaře či veterináře.

Z výše uvedených faktů vychází testovací systém pro vyhledání potenciálních léčiv, která mají napodobovat či inhibovat aktivitu modulátorů tělesné hmotnosti. Testovací systém pracuje jednak se známým modulátorem hmotnosti a jednak s testovaným léčivem, které se zavede do výsledné buněčné kultury. Pak se sledují rozdíly aktivity v buňkách při podání předpokládaného léčiva a vlivem přidaného množství známého modulátoru hmotnosti.

Molekulární klonování OB genu, jak je zde uvedeno, vedlo k objevu skupiny látek, které na molekulové úrovni modulují tělesnou hmotnost savců. Objev předkládaných modulátorů je významný z hlediska diagnózy a léčby nutričních poruch, včetně, ale nejen léčby obezity, váhového úbytku, doprovázejícího rakovinu, ale i léčby chorob, doprovázejících obezitu, jako je vysoký krevní tlak, srdeční choroby a diabetes typ II. Předkládané genové produkty jsou dále potenciálně využitelné v zemědělství při modulaci tělesné hmotnosti hospodářských zvířat. Konečně, předkládané modulátory, jako sekretované látky, lze biochemicky využít při izolaci

- 15CZ 295018 B6 příslušných receptorů, pomocí technologie expresního klonování. Následující pojednání, zaměřené na OB gen, platí obecně pro celou třídu modulátorů předkládaného vynálezu.

Funkční aktivita OB genu se vyhodnocuje transgenovým postupem. Je vhodné použít transgenní myší model. Při komplementačních studiích na transgenních myších se používá OB gen. S izolovaným OB genem se konstruují transgenní vektory, včetně virových vektorů nebo kosmidových klonů (nebo fágových klonů), odpovídající lokusu sledovaného genu divokého typu. Kosmidy se pak zavedou do transgenních myší popsanými postupy [Jaenisch, Science, 240:1468-1474 (1988)]. Konstrukty se zavádějí do oplodněných vajec, odvozených z potomků FI křížení C57B1/6J OB/OB a DBA. Kvůli vzniku FI zvířat je nutno při křížení použít C57B1/6J OB/OB ovariální transplantáty. Jako protějšek se používají myši DBA/2J, neboť mají zbarvení nonaguti, což je pro ovariální transplantáty důležité. Genotyp v OB lokusu u kosmidových transgenních myší lze určit vytypováním zvířat stěsně spojenými RFLP nebo mikrosatelity, které po stranách obklopují mutaci a které jsou mezi rodičovskými kmeny polymorfní. Komplementace se projeví, pokud určitý konstrukt způsobí, že geneticky obézní F2 zvířata (dle skóre z RFLP analýzy) jsou hubená a nediabetická. Za těchto okolností konečný důkaz komplementace vyžaduje, aby se OB/OB nebo DB/DB myši nesoucí transgen spojily s OB/OB nebo DB/DB ovariálními transplantáty. Při tomto křížení všechna N2 zvířata, která nenesou transgen, budou obézní a inzulín rezistentní/diabetická, zatímco zvířata, nesoucí transgen, budou hubená a budou mít normální koncentrace glukózy i inzulínu v plazmě. V genetickém smyslu působí transgen jako supresor mutace.

Alternativně lze OB geny testovat podle vlivu na fenotyp po expresi v anti-sense orientaci u zvířat divokého typu. V tomto přístupu dochází k supresi alely divokého typu a vzniku mutantního fenotypu. Tvorba duplexu RNA-RNA (anti-sense - sense) zabraňuje normálnímu chování mRNA, což vede k částečné nebo úplné eliminaci účinku genu divokého typu. Tento postup byl použit při inhibici syntézy TK v tkáňové kultuře a při produkci fenotypů mutace Kruppel u Drosophila, a mutace Shiverer u myší [Izant et al., Cell, 36:569-597 (1986); Katsuki et al., Science, 241:593-595 (1988)]. Výhodou tohoto přistupuje, že je třeba exprimovat jen malé množství genu pro dosazení efektivní inhibice exprese celé příbuzné mRNA. Umístění anti-sense transgenu je řízeno jeho vlastním promotorem nebo jiným promotorem, exprimovaným v příslušném typu buněk a nachází se v protisměru od místa SV40 póly A. Tento transgen se využije při přípravě transgenních myší. Transgenní myši budou rovněž spojeny s ovariálními transplantáty, aby bylo možno zjistit, zda jsou OB heterozygoti citlivější k účinkům anti-sense konstruktů.

Vyřešení biochemické funkce produktů OB genu (OB polypeptid nebo protein) má z dlouhodobého hlediska význam pro identifikaci malých agonistních i antagonistních molekul, ovlivňujících jeho aktivitu.

Dále jsou uvedeny definice některých výrazů, používaných v následujícím popisu.

Výrazy „modulátor tělesné hmotnosti“, „modulátor“, „modulátory“ a další variace jsou používány záměnné a v předkládané přihlášce se vztahují k nukleotidickému i bílkovinnému materiálu, jako jsou jednoduché i multiplitní proteiny. Konkrétně tyto výrazy zahrnují nukleotidy a DNA o sekvencích SEQ ID č. 1 (obr. 1 (A až E)) a SEQ ID č. 3) obr. 2 (A a B)) a analogicky proteiny o aminokyselinové sekvenci SEQ ID č. 2 (obr. 1 (A až E)) a SEQ ID č. 4 (obr. 3). Výrazy rovněž zahrnují profil aktivit materiálů, uvedených zde i v nárocích. Zahrnuty jsou tedy nukleotidy s ekvivalentní nebo pozměněnou aktivitou, včetně homologních analogů a alelických variant. Podobně jsou zahrnuty proteiny s ekvivalentní nebo pozměněnou aktivitou, včetně záměrně modifikovaných proteinů, např. cílenou mutagenezí, nebo náhodně modifikovaných proteinů, vznikajících v mutovaných hostitelských buňkách, produkujících modulátory.

Přípravek obsahující „A“ (kde „A“ je jednoduchý protein, molekula DNA, vektor, rekombinantní hostitelská buňka, atd.) v podstatě neobsahuje „B“ (kde „B“ obsahuje jeden nebo několik

-16CZ 295018 B6 kontaminujících proteinů, DNA molekul, vektorů, atd., vyjma racemických forem „A“), pokud alespoň 75 % hmotn. proteinů, DNA, vektorů, atd. (podle příslušné kategorie A a B) v přípravku jsou složky „A“. „A“ výhodně obsahuje nejméně 90 % hmotn. A+B v přípravku, nejvýhodněji 99 % hmotn. Je rovněž výhodné, pokud přípravek, který v podstatě není kontaminován, obsahuje látky pouze jedné molekulové hmotnosti o charakteristické aktivitě předkládaných sloučenin.

OB polypeptidy

Výrazy „protein“, vztahující se k přirozeným polypeptidům, a „polypeptid“ jsou používány záměnné jako produkty OB genu a jejich varianty. Výrazy „maturovaný protein“ nebo „maturovaný polypeptid“ se týkají zejména produktů OB genu (nebo příslušného fůzního proteinu), z nichž byla odstraněna signální sekvence.

V konkrétním provedení vynálezu obsahují předkládané OB polypeptidy aminokyselinové sekvence, uvedené dále, tj. SEQ IDč. 2, 4, 5, 6, atd., případně sekvence, modifikované substitucemi konzervativních, aminokyselin, včetně příslušných biologicky aktivních fragmentů, analogů a derivátů. Výraz „biologicky aktivní“ se týká některých typických vlastností polypeptidu, jako je (ne výhradně) specifická vazba např. k receptoru, protilátce nebo jiné rekogniční molekule; aktivace přenosových cest signálů na molekulární úrovni; a/nebo indukce (nebo inhibice antagonisty) fyziologických účinků, zprostředkovaných in vivo přirozeným OB polypeptidem. OB polypeptidy, včetně fragmentů, analogů a derivátů, lze připravit synteticky, tj. s využitím známých postupů peptidové syntézy na pevné fázi nebo v roztoku. Výhodné jsou syntetické postupy na pevné fázi. Alternativně lze předkládané OB polypeptidy připravovat známými postupy genového inženýrství, jak bude popsáno dále. OB polypeptidy lze podle předkládaného vynálezu purifikovat např. imunoafinitní chromatografií z biologických tekutin, jako jsou (ne výhradně) plazma, sérum, moč, výhodně lidská plazma, sérum nebo moč, výhodněji pocházející ze subjektu se zvýšenou produkcí polypeptidu, jako je obézní osoba s mutací OB receptoru nebo osoba postižená obezitou, vztahující se k „obézní“ mutaci.

Fragmenty OB polypeptidu

Předkládaný vynález uvažuje i některé důležité přirozeně se vyskytující fragmenty OB polypeptidy. Sekvence polypeptidu zahrnuje řadu běžných proteolytických míst, např. argininové zbytky. Je možné, že polypeptid plné délky je v jednom nebo v několika takových místech štěpen na biologicky aktivní fragmenty. Tyto buď zesilují nebo zeslabují funkci OB polypeptidu, který způsobu snižování tělesné hmotnosti.

Analogy OB polypeptidu

Předkládaný vynález se týká přípravy analogů OB polypeptidu, které mají stejnou biologickou aktivitu jako OB polypeptid, tj. váží specifické vazebné partnery OB polypeptidu, jako je např. OB receptor. Analog OB mohou agonizovat funkci OB polypeptidu, tj. působit ve stejném směru. Je výhodné, pokud jsou agonisté OB účinnější než přirozený protein. OB agonista může například vázat OB receptor s vyšší afinitou, nebo může mít delší poločas in vivo, případně obojí. Vynález ovšem zahrnuje i OB agonisty, které jsou méně účinné než přirozený protein. Jiné analogy působí proti aktivitě OB. Příkladem je analog OB, který se váže k receptoru OB, ale neindukuje přenos signálu a působí proto jako kompetitivní inhibitor přirozeného OB receptoru tím, že snižuje aktivitu OB in vivo. Antagonistní analog OB mohou mít jiné vlastnosti než OB peptid, např. delší (nebo kratší) poločas in vivo, vyšší (nebo nižší) vazebnou afinitu k OB receptoru, případně obojí.

Analogem OB peptidů může být OB polypeptid, modifikovaný substitucemi aminokyselin v polohách, které nejsou pro polypeptid z funkčního nebo strukturního hlediska významné. Například protože je známo, že lidský OB polypeptid je biologicky účinný v myších, povedou pravděpodobně substituce aminokyselin, kterými se lidská sekvence odlišuje od myší

-17CZ 295018 B6 (divergentních aminokyselin), k funkčním analogům OB polypeptidu. Například serin lidské OB sekvence v poloze 53 nebo 98, případně v obou polohách (podle sekvence na obr. 4), může být substituován např. glycinem, alaninem, valinem, cysteinem, methioninem nebo threoninem. Podobně arginin v poloze 92 (obr. 4) lidské sekvence může být substituován např. asparaginem, lysinem, histidinem, glutaminem, kys. glutamovou, aspartovou, serinem, threoninem, methioninem nebo cysteinem. V aminokyselinové sekvenci lidského polypeptidu na obr. 4 lze substituovat ještě další aminokyseliny, jako histidin v poloze 118, tryptofan v poloze 121, alanin v poloze 122, kyselinu glutamovou v poloze 126, threonin v poloze 127, leucin v poloze 128, glycin v poloze 132, glycin v poloze 139, tryptofan v poloze 159 a glycin v poloze 166. Podle jiného provedení lze substituovat jednu nebo několik aminokyselin v polohách 121 až 128 (obr. 4), např. glycinem nebo alaninen, i jiné aminokyseliny vyjma šeřinu v poloze 123 nebo leucinu v poloze 125.

Jiným analogem OB polypeptidu, výhodně lidského OB polypeptidu, může být zkrácená forma polypeptidu. Například glutamin v poloze 49 není esenciální a lze jej z peptidů odstranit. Podobně lze odstranit některé divergentní aminokyseliny v polohách 121 až 128. Předkládaný vynález uvažuje i analog OB s minimální aminokyselinovou sekvencí, nezbytnou pro biologickou funkci. Minimální sekvenci lze snadno určit, např. testem schopnosti fragmentu OB vázat OB-specifické protilátky, testem inhibice přirozeného OB polypeptidu nebo naopak agonizace přirozeného OB polypeptidu. Konkrétní provedení předkládaného vynálezu poskytuje zkrácený polypeptid, jehož strukturu tvoří smyčka, udržovaná disulfídickým můstkem mezi cysteinovými zbytky 117 a 167 (obr. 4). Jiné provedení poskytuje zkrácený analog, obsahující aminokyseliny 22 (za předpokládaným signálem pro štěpené místo) až 53 (zbytek přímo předcházející oblast flexibilní smyčky, jak byla detekována omezenou proteolýzou a hmotovou spektroskopií OB polypeptidu; viz Cohen et al., Protein Science, 4:1088 (1995)). V jiném provedení obsahuje zkrácený analog aminokyseliny 61 (zbytek přímo předcházející oblast flexibilní smyčky, jak byla detekována omezenou proteolýzou a hmotovou spektroskopií OB polypeptidu) až 116 (zbytek přímo předcházející první cystein). V jiném provedení obsahuje zkrácený analog aminokyseliny 61 až 167.

Další analog OB polypeptidu zahrnuje substituce jednoho nebo několika zbytků na předkládané flexibilní smyčce, např. zbytků 54 až 60. Jeden nebo několik zbytků může být substituováno např. lysinem, kyselinou glutamovou nebo cysteinem (výhodně lysinem) kvůli síťování např. na polymer, protože flexibilní smyčkové struktury jsou výhodnými místy derivatizace proteinu. Alternativně lze substituovat zbytky flexibilní smyčky aminokyselinami, odolnějšími vůči proteolýze, ale které přitom nenaruší flexibilní strukturu smyčky, např. jedním nebo několika proliny. Podle jiného provedení vynálezu lze provést substituce aminokyselinami, které lze dále derivatizovat na formy, odolnější vůči degradaci, např. proteolýze.

Odborníkovi v oboru je zřejmé, že velikosti výše uvedených fragmentů jsou přibližně a že oba konce polypeptidu, vnitřní část jeho řetězce i fragmenty i citované zkrácené analogy lze prodloužit nebo zkrátit o jednu až pět aminokyselin za předpokladu, že cysteinové zbytky, tvořící disulfídický můstek smyčkových analogů, zůstanou zachovány.

Podle analýzy spekter cirkulámího dichroismu rekombinantních peptidů v téměř fyziologických podmínkách bylo zjištěno, že myší OB peptid obsahuje 50 % α-helikální složky a lidský OB polypeptid 60 % α-helikální složky. Jiné provedení vynálezu tedy uvažuje substituce aminokyselin takovými zbytky, které vedou k OB analogům s vyšším sklonem tvorby oc-helikální struktury nebo se sklonem tvorby stabilnější α-helikální struktury. Například a-helikální strukturu zvýhodňuje zavedení substituentů Glu, Ala, Leu, His, Trp do přirozeného OB polypeptidu. Výhodné jsou substituce konzervativních aminokyselin, např. substituce aspartátu(ů) v polohách 29, 30, 44, 61, 76, 100 a/nebo 106 (podle obr. 4) kyselinou glutamovou (Glu), substituce izoleucinu(ů) leucinem; substituce glycinu nebo valinu nebo kterékoliv divergentní aminokyseliny alaninem (např. substituce šeřinu v poloze 53 lidského OB polypeptidu alaninem), substituce argininu nebo lysinu histidinem a substituce tyrosinu a/nebo fenylalaninu tryptofanem.

- 18CZ 295018 B6

Zvýšení podílu, nebo výhodněji stability α-helikální struktury může vést k analogu OB, který bude mít vyšší aktivitu, zvýšenou vazebnou afinitu nebo delší poločas. Konkrétní provedení vynálezu poskytuje OB polypeptid s vyšším sklonem tvorby α-helikální struktury v oblasti aminokyselin 22 až 53. Jiné provedení vynálezu poskytuje OB polypeptid s vyšším sklonem tvorby α-helikální struktury nebo stabilnější α-helikální struktury v oblasti aminokyselin 61 až 116. Jiné provedení vynálezu poskytuje OB polypeptid s vyšším sklonem tvorby a-helikální struktury v oblasti aminokyselin 117 až 167, odpovídající smyčce, držené disulfidickým můstkem. Vynález dále uvažuje OB analogy, zahrnující ještě další (než výše uvedené) domény s vyšším sklonem tvorby α-helikální struktury nebo stabilnější α-helikální struktury.

Jiné provedení vynálezu poskytuje zkrácené analogy OB polypeptidu, které obsahují strukturotvorné aminokyselinové zbytky, např. podporující tvorbu α-helikální struktury, což kompenzuje nižší strukturní stabilitu polypeptidických fragmentů.

Analogy, jako jsou fragmenty, lze získávat např. pepsinovým štěpením peptidových modulátorů hmotnosti. Jiné analogy, muteiny, lze získávat standardní cílenou mutagenezí nukleotidových sekvencí, kódujících peptidové modulátory hmotnosti. Typ aktivity, promotorové či inhibiční, lze u analogů, vykazujících „aktivitu modulátorů hmotnosti“, např. u malých molekulových analogů, identifikovat in vivo i in vitro známými testy.

Malé molekulové analogy a peptidominetika OB polypeptidu

Strukturu OB polypeptidu, výhodně lidského OB polypeptidu, lze analyzovat různými známými postupy oblasti techniky. Sekvenci proteinu lze charakterizovat analýzou hydrofílity [např. Hopp et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 78:3824 (1981)]. Hydrofilní profil slouží k identifikaci hydrofobních a hydrofílních oblastí OB polypeptidu, což umožní charakterizovat vnitřní oblasti polypeptidu se správným prostorovým uspořádáním i přístupné oblasti na povrchu OB polypeptidu. Dále lze analyzovat sekundární strukturu [např. Chou et al., Biochem., 13:222 (1974)], která umožní rozpoznat oblasti OB polypeptidu, zodpovědné za specifické sekundární strukturní rysy. Při vypracování předpokládané nebo reálné struktury, včetně sekundární struktury, lze použít počítačové programy oblasti techniky.

Díky tomu, že předkládaný vynález poskytuje bohatý zdroj rekombinantního OB polypeptidu, lze provádět kvantitativní strukturní charakterizaci polypeptidu. Konkrétně vynález poskytuje dostatečné množství látky pro spektrální analýzy, jako jsou nukleární magnetická rezonance (NMR), infračervená spektroskopie (IR), Ramanova spektroskopie a ultrafialová spektroskopie (UV), zejména pro cirkulámí dichroismus (CD). NMR spektroskopie umožňuje velmi významnou strukturní analýzu molekul v roztoku, tedy v prostředí které se blíží přirozeným podmínkám [Marion et al., Biochim Biophys. Res. Comm., 113:967-974 (1983); Bar et al., J. Magn. Reson., 65:355-360 (1985); Kimura et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 77:1681-1685 (1980)]. Dalším typem strukturní analýzy je např. rentgenová krystalografie [Engstom, Biochem. Exp. Biol., 11:713 (1974)].

Podle dalšího provedení vynálezu lze testovat OB polypeptid z hlediska křížové reakce s protilátkou pro přirozený OB polypeptid nebo jeho specifický fragment. Stupeň křížové reaktivity poskytuje informaci o strukturní homologii nebo podobnosti proteinů, nebo o přístupnosti oblastí, odpovídajících částem polypeptidu, které byly použity při generaci specifických protilátek.

Vyhledávám OB analogů

V oblasti techniky existuje řada postupů pro vyhledávání analogů OB polypeptidu, jsou dostupné různé soubory chemikálií. Předkládaný vynález samozřejmě uvažuje vyhledávání OB analogů v souborech, jako jsou např. soubory syntetických sloučenin, vznikající lety výzkumu, soubory přirozených sloučenin a kombinované soubory, jak bude podrobněji popsáno dále. V konkrétním

- 19CZ 295018 B6 provedení vynálezu byly v knihovnách vyhledávány sloučeniny, které se váží k anti-OB protilátkám, výhodně k protilátkám proti lidskému OB polypeptidů. Po identifikaci OB receptoru (viz dále) lze použít kterýkoliv testovací postup, známý v oblasti techniky pro vyhledávání agonistů nebo antagonistů OB receptoru. Předkládaný vynález uvažuje vyhledávání malých molekul ligandů nebo ligandových analogů a látek, jež je napodobují, i vyhledávání přirozených ligandů, které se váží k OB receptoru, agonizují či antagonizují jeho aktivaci in vivo.

Znalost primární sekvence receptoru a míry její podobnosti se sekvencemi známých proteinů může být první stopou k řešení otázky, zda jde o agonistů či antagonistů proteinu. Identifikace a vyhledávání antagonistů jsou dále usnadněny po vypracování strukturní charakteristiky proteinu, např. pomocí rentgenové krystalografie, neutronové difrakce, nukleární magnetické rezonance a dalších postupů strukturní analýzy. Tyto postupy umožňují racionální navrhování nebo identifikaci agonistů a antagonistů.

Jiný přístup využívá pro tvorbu velkých souborů rekombinantní bakteriofág. „Fágovým postupem“ [Scott et al., Science, 249:386-390 (1990)); Cwirla et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 87:6378-6382 (1990); Devlin et al., Science, 249:404-406 (1990)] lze konstruovat i velmi rozsáhlé soubory (ΙΟ⁶—10⁸ chemických individuí). Jiný přístup vychází primárně z chemických postupů, např. Geysenův postup [Geysen et al., Molecular Immunology, 23:709-715 (1986); Geysen et al., J. Immunologic Method, 102:259-274 (1987)] nebo nový Fodorův postup [Fodor et al., Science, 251:767-773 (1991). Postup přípravy směsi peptidů na testování agonistů či antagonistů je popsán v článcích Furka et al., 14^,h Intemational Congress of Biochemistry, Volume 5, Abstract FR:013 (1988); Furka, Int. J. Peptide Protein Res., 37:487-493 (1991); Houghton (Patent US 4 631 211, vydaný v prosinci 1986) a Rutter et al. (Patent US 5 010 175, vydaný v dubnu 1991).

Jiný přístup využívá pro vyhledávání OB receptorových ligandů předkládaného vynálezu syntetické soubory [Needels et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 90:10700-10704 (1993); Lam et al., Intemational Patent Publication WO 92/00252, uvedeno v odkazech], V těchto souborech se detekují antagonisté OB receptoru na buňkách, exprimujících receptor, bez nutnosti skutečně OB receptor klonovat.

Alternativně lze testovat vazbu rozpustného ligandů k buňkám, které exprimují rekombinantní formy vazebné domény ligandů OB receptoru. Jako rozpustné ligandy mohou vhodně posloužit rekombinantní nebo syntetický polypeptid.

Vyhledávání lze provádět na rekombinantních buňkách, které exprimují OB receptor, nebo alternativně s purifikovaným receptorovým proteinem, např. připraveným rekombinantním postupem. Pro prohledání souboru, jak je uvedeno v předcházejících odkazech, lze využít schopnost značeného, rozpustného nebo rozpuštěného OB receptoru vázat ligand, přičemž tento receptor musí obsahovat část molekuly, která zajišťuje vazbu k ligandů.

Deriváty OB polypeptidů

Předkládaný protein (pojem „protein“ zahrnuje i „polypeptid“ pokud není stanoveno jinak) lze derivatizovat zavedením jedné nebo několika chemických skupin do molekuly proteinu. Chemicky modifikované deriváty lze dále použít do přípravků, určených na intraarteriální, intraperitoneální, intramuskulámí, subkutánní, intravenózní, perorální, nazální, rektální, bukální, sublingvální, pulmonální, topickou, transdermální, apod. podávání. Bylo zjištěno, že chemicky poskytovat i další výhody, např. vyšší stabilitu a mohou déle přetrvávat v oběhu nebo mít sníženou imunogenitu. Viz patent US 4 179 337, Davis et al., vyd. 18. 12. 1979. Přehled viz Abuchowski et al., „Soluble Polymer-Enzyme Adducts“ v Enzymes as Drugs, str. 367-383, Holcenberg, Roberts vyd., Wiley-Interscience, New York, NY, (1981). Přehledný článek o modifikaci proteinů a fúzních proteinů viz Francis, Focus on Growth Factors 3:4-10 (1992).

-20CZ 295018 B6

Chemické skupiny pro derivatizaci

Chemické skupiny, vhodné pro derivatizaci, lze volit mezi polymery, rozpustnými ve vodě. Rozpustnost ve vodě je nutná proto, aby se derivatizovaný protein ve vodném fyziologickém prostředí nesrážel. Pro terapeutické účely je vhodné, aby polymer konečného produktu derivatizace byl farmaceuticky přijatelný. Zkušený odborník v oboru bude schopen zvolit vhodný polymer s ohledem na možné terapeutické využití konjugátu polymer/protein, požadovanou dávku, dobu přetrvání v oběhu, rezistenci k proteolýze i jiná kritéria. U předkládaných proteinů a peptidů lze splnění takových kritérií zjistit pomocí uvedených testů.

Polymerní molekuly

Polymery rozpustné ve vodě lze volit ze skupiny látek, zahrnující například polyethylenglykol, kopolymery ethylenglykol/propylenglykol, karboxymethylcelulózu, dextran, polyvinylalkohol, polyvinylpyrrolidon, poly-1,3-dioxolan, poly-l,3-trioxan, kopolymer ethylen/maleinanhydrid, polyaminokyseliny (homopolymery nebo náhodné kopolymery) a dextran nebo poly(n-vinyl pyrrolidon)polyethylenglykol, homopolymer polypropylenglykolu, kopolymery polypropylenoxid/ethylenoxid, polyoxyethylované polyoly a polyvinylalkohol. Polyethylenglykol propionaldehyd je při zpracování výhodný vzhledem ke stabilitě ve vodě.

Polymery mohou mít libovolnou molekulovou hmotnost, mohou být rozvětvené i nerozvětvené. Z hlediska snadného zpracování je výhodná molekulová hmotnost polyethylenglykolu 2 kDa až 100 kDa (molekulová hmotnost polyethylenglykolu, použitého v přípravcích, se může mírně lišit od uvedené hodnoty). Lze však zvolit i jiné molekulové hmotnosti podle terapeutického záměru (např. doba protrahovaného uvolňování léčiva, případné vlivy na biologickou aktivitu, jednoduchost při manipulaci, stupeň antigenicity či její nepřítomnost a další známé účinky polyethylenglykolu na terapeutický protein nebo analog).

Poměr polymer/protein

Počet navázaných polymerních molekul na protein je variabilní, odborník v oboru je schopen rozhodnout z hlediska funkčnosti. Lze mono-derivatizovat, nebo di-, tri-, tetra-derivatizovat, případně volit kombinace derivatizaci, použít jednu nebo různé chemické skupiny (např. polymery, např. různé molekulové hmotnosti polyethylenglykolů). Poměr molekul polymeru k molekulám proteinu (peptidů) je proměnlivý podle jejich koncentrací v reakční směsi. Optimální poměr (za předpokladu úplné reakce, kdy v reakční směsi nezbydou žádné nezreagované proteiny ani polymery) je dán faktory, jako požadovaný stupeň derivatizace (tj. mono-, di-, tri—, atd.), molekulová hmotnost zvoleného polymeru, je-li polymer rozvětvený nebo nerozvětvený, reakční podmínky.

Navázání chemické skupiny na protein

Tyto vazby molekul polyethylenglykolu (nebo jiné chemické skupiny) na protein by měly být voleny s ohledem na funkční nebo antigenní domény proteinu. V oboru techniky existuje řada způsobů provádění vazeb, např. EP 0 401 384, uvedeno v odkazech (vazba PEG na G-CSF). Viz též Malík et al., Exp. Hematol., 20:1028-1035 (1992) (týkající se pegylace GM-CSF pomocí tesyl chloridu). Polyethylenglykol lze například navázat na aminokyselinový zbytek vmiste reaktivní skupiny, jako je volná aminoskupina nebo karboxylová skupina. Reaktivní skupiny jsou ty, knimž se může aktivovaný polyethylenglykol navázat. Aminokyselinové zbytky svolnou aminoskupinou jsou například lysinové zbytky, N-koncové aminokyseliny, aminokyselinové zbytky s volnou karboxylovou skupinou jsou například zbytky kyseliny aspartové, glutamové a C-koncové aminokyseliny. Pro vazbu polyethylenglykolu lze jako reaktivní skupiny rovněž využít sulfhydrylové skupiny. Pro terapeutické účely jsou výhodné vazby, využívající aminofunkci, např. na N-konci nebo s lysinovými zbytky. Chemické skupiny by neměly být navazovány na zbytky, důležité pro receptorové vazby, pokud mají receptorové vazby vznikat.

-21 CZ 295018 B6

Chemicky modifikované proteiny na N-konci

V některých případech je žádoucí chemicky modifikovat N-konec proteinu. Například při modifikaci polyethylenglykolem lze volit různé polyethylenglykolové molekuly (podle molekulové hmotnosti, rozvětvení, atd.), lze volit poměr molekul polyethylenglykolu k proteinu (nebo peptidu) v reakční směsi, typ pegylační reakce a postup izolace pegylovaného proteinu na N-konci. Izolaci N-koncově pegylovaného derivátu (tj. oddělení tohoto derivátu od ostatních monopegylátů) lze provést purifikací N-koncově pegylovaného materiálu od ostatních pegylovaných molekul protein. Dále lze provést selektivní N-koncovou chemickou modifikaci reduktivní alkylaci, která využívá rozdílné reaktivity různých typů derivatizovatelných primárních aminoskupin určitého proteinu (lysin proti N-konci). Za určitých specifických reakčních podmínek lze dosáhnout v podstatě selektivní derivatizace N-konce proteinu polymerem s karbonylovou skupinou. Například lze selektivně pegylovat protein na N-konci při určité hodnotě pH, která umožní využít výhodného rozdílu v pK_a pro epsilon-aminoskupinu lysinového zbytku a a-aminoskupinu N-koncového zbytku. Tímto způsobem lze ovlivnit navázání polymeru, rozpustného ve vodě, k proteinu: konjugace s polymerem proběhne převážně na N-konci proteinu a nezasáhne významně ostatní reaktivní skupiny, jako je např. aminoskupina postranního lysinového řetězce. Při reduktivní alkylaci lze použít ve vodě rozpustný polymer výše uvedeného typu, musí ovšem obsahovat karbonylovou skupinu pro kondenzační reakci s proteinem. Lze použít například polyethylenglykol propionaldehyd, nesoucí jednu reaktivní aldehydickou skupinu.

Nukleové kyseliny, související s OB polypeptidem

Předkládaný vynález se týká rovněž nukleových kyselin, kódujících OB polypeptidy, i dalších genomových nekódujících sekvencí 5', 3' nebo intronů, souvisejících s OB genem. Podle předkládaného vynálezu lze v této oblasti využívat běžné molekulárně biologické a mikrobiologické postupy i postupy, využívající rekombinantní DNA, jak je v oblasti techniky známo. Tyto postupy jsou plně popsány v literatuře. Viz např. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. vyd., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989); Glover vyd., DNA Cloning: A Practical Approach, vol I a II, MRL Press, Ltd, Oxford, U.K. (1985); Gait ed., Oligonucleotide Synthesis, Oxford University Press (1984); Hames et al., vyd., Nucleic Acid Hybridization, Springer-Verlag (1985); Hames et al., vyd., Transcription and Translation, Oxford University Press (1984); Freshney vyd., Animal Cell. Culture, Oxford University Press (1986); Immobilized Cells And Enzymes, IRL Press (1986); Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning, Wiley, New York (1984). Mezi zvláště důležité postupy předkládaného vynálezu patří postupy izolace, klonování, sekvenování, analýzy a charakterizace genu nebo nukleové kyseliny, využívající známý postup polymerázové řetězové reakce (PCR).

„Replikon“ je genetický prvek (např. plazmid, chromozom, virus), který působí jako autonomní jednotka při replikaci DNA in vivo, tj. řídí vlastní replikaci.

„Vektor“ je replikon, např. plazmid, fág nebo kosmid, k němuž může být připojen jiný segment DNA, který je potom replikován spolu s ním.

„Kazeta“ je segment DNA, který může být inzertován do vektoru ve specifických restrikčních místech. Segment DNA kóduje zvolený polypeptid a kazeta a restrikční místa jsou naplánovány tak, aby byla zajištěna inzerce kazety do příslušného čtecího rámce pro transkripci a translaci.

„Heterologní“ DNA je DNA, která je buňce cizí, nebo je v jejím chromozomu umístěna nepřirozeně. Heterologní DNA výhodně obsahuje cizí gen.

Buňka byla „transfektována“ exogenní nebo heterologní DNA, pokud taková DNA byla zavedena dovnitř buňky. Buňka byla „transformována“ exogenní nebo heterologní DNA, pokud

-22CZ 295018 B6 transfektovaná DNA vedla ke změně fenotypu. Je výhodné, pokud se transformační DNA integruje (kovalentně váže) do chromozomální DNA a stane se součástí buněčného genomu.

„Klon“ je populace buněk, vzniklá mitotickým dělením zjedné buňky nebo ze společného předka.

„Molekula nukleové kyseliny“ je polymerní forma fosfátových esterů ribonukleosidů (adenosin, guanosin, uridin nebo cytidin; „molekuly RNA“) nebo deoxyribonukleosidů (deoxyadenosin, deoxyguanosin, deoxythymidin nebo deoxycytidin; „molekuly DNA“), vyskytující se vjednovláknové nebo dvouvláknové šroubovicové formě. Přirozeně se vyskytují šroubovice DNADNA, DNA-RNA a RNA-RNA. Výraz „molekula nukleové kyseliny“ se týká pouze primární a sekundární struktury molekuly, nevymezuje žádné konkrétní formy terciární či kvartérní struktury. Výraz tedy zahrnuje dvouvláknovou DNA, která se mj. nalézá v lineárních i cirkulárních molekulách DNA (např. restrikční fragmenty), v plazmidech i chromozomech. Při diskutování struktury konkrétní dvouvláknové molekuly DNA jsou sekvence popisovány běžným způsobem ve směru 5' -> 3' netranskribovaného vlákna DNA (tj. vlákno o homologní sekvenci k mRNA). „Molekula rekombinantní DNA“ je molekula DNA, upravená molekulárně biologickými postupy.

Molekula nukleové kyseliny „hybridizuje“ s jinou molekulou nukleové kyseliny, např. s cDNA, genomovou DNA nebo RNA, pokud se jednovláknová forma molekuly nukleové kyseliny může anelovat kjiné molekule nukleové kyseliny v příslušných podmínkách, tj. za určité teploty a iontové síly roztoku (viz Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. vyd., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989)). Teplota a iontová síla roztoku jsou kritérii „přísnosti“ hybridizace. Pro předběžné vyhledávání homologních nukleových kyselin jsou voleny málo „přísné“ hybridizační podmínky, odpovídající T_m při 55 °C (např. 5 x SSC, 0,1 % SDS, 0,25 % mléko a žádný formamid; nebo 30 % formamid, 5 x SSC, 0,1 % SDS). Mírně „přísné“ hybridizační podmínky odpovídají vyšší T_m, např. 50 % formamid, 5 x nebo 6 x SSC. Podmínkou hybridizace jsou dvě nukleové kyseliny o komplementárních sekvencích, podle „přísnosti“ hybridizačních podmínek však může někdy nastat chybné párování bází. Vhodná „přísnost“ podmínek hybridizace konkrétních nukleových kyselin závisí na jejich délce a stupni komplementarity, což jsou proměnné veličiny v oblasti techniky známé. Čím větší je stupeň podobnosti nebo homologie mezi dvěma nukleotidovými sekvencemi, tím vyšší hodnotu T_m mají vzniklé hybridní molekuly. Relativní stabilita (podle hodnoty T_m) hybridních nukleových kyselin klesá v pořadí: RNA:RNA, DNA:RNA, DNA:DNA. Pro hybridní molekuly o délce, přesahující 100 nukleotidů, byly odvozeny rovnice pro výpočet T_m (viz Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. vyd., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989), 9.50-0.51). Při hybridizaci kratších úseků nukleových kyselin, např. oligonukleotidů, je poloha případných chybných párů důležitější a délka oligonukleotidů je pro specifítu hybridizace určující (viz Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2. vyd., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989), 11.ΤΙ 1.8). Minimální výhodná délka pro hybridizaci nukleových kyselin je nejméně 10 nukleotidů; výhodněji 15 nukleotidů, nejvýhodněji 20 nukleotidů.

„Homologní rekombinace“ je inzerce vektoru s cizí sekvencí DNA do chromozomu. Je výhodné, pokud je vektor nasměrován do určitého místa chromozomu, specifického pro homologní rekombinaci. Při specifické homologní rekombinaci musí vektor obsahovat dostatečně dlouhé oblasti homologní sekvence s chromozomem, aby bylo zajištěno komplementární navázání vektoru na chromozom. Delší homologní oblasti a vyšší stupeň sekvenční podobnosti zvyšuje účinnost homologní rekombinace.

„Kódující sekvence“ DNA je sekvence dvouvláknové DNA, která je v buňce transkribována a překládána do polypeptidu in vitro nebo in vivo, pokud je ovšem vhodně umístěna vzhledem k příslušným regulačním sekvencím. Kódující sekvence je ohraničena startovacím kodonem na5' (amino) konci a stop-kodonem translace na 3' (karboxylovém) konci. Kódující sekvence může zahrnovat, ne výhradně, prokaryontní sekvence, cDNA zeukaryontní mRNA, eukaryontní

-23 CZ 295018 B6 genomovou DNA (např. savčí) i syntetické sekvence DNA. Pokud je kódující sekvence určena pro expresi v eukaryontních buňkách, je obvykle na 3' konci umístěna polyadenylová signální sekvence a terminační sekvence pro translaci.

Izolace kódujících a okrajových sekvencí OB

Nukleové kyseliny předkládaného vynálezu zahrnují nukleové kyseliny, kódující expresi peptidů o sekvencích SEQ ID č. 2 (obr. 1 (A až D)), SEQ ID č. 4 (obr. 3), SEQ ID č. 5 (obr. 5) a SEQ ID č. 6 (obr. 6). Zatímco specifická DNA byla izolována a sekvenována ve vztahu k OB genu, může libovolná živočišná buňka posloužit jako zdroj nukleových kyselin pro molekulární klonování genu, kódujícího peptidy předkládaného vynálezu. DNA lze získat známými standardními postupy z klonované DNA (např. z DNA „knihovny“), chemickou syntézou, klonováním cDNA nebo klonováním genomové DNA nebo jejích fragmentů, purifíkovaných z příslušné buňky (viz např. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. vyd., Cold Spring Harbor Laboratory Press, ColdSpring Harbor, New York (1989); Glover ed., DNA Cloning: A Practical Approach, vol I a II, MRL Press, Ltd, Oxford, U.K. (1985)). Klony odvozené z genomové DNA mohou obsahovat vedle kódujících sekvencí i regulační a intronové oblasti DNA; klony odvozené od cDNA neobsahují intronové sekvence. Bez ohledu na zdroj lze gen molekulárně nakloňovat do vektoru, vhodného na propagaci genu.

Při molekulárním klonování genu z genomové DNA lze genomovou DNA amplifikovat s využitím primerů, pocházejících ze sekvencí cDNA. Alternativně lze generovat fragmenty DNA, z nichž některé kódují požadovaný gen. DNA lze štěpit ve specifických štěpných místech restrikčními enzymy. Rovněž lze k fragmentaci DNA použít DNázu v přítomnosti manganu, nebo DNA mechanicky polámat, např. sonikací. Lineární fragmenty DNA se pak rozdělí podle velikostí standardními postupy, jako jsou, ne výhradně, elektroforéza na polyakrylamidovém nebo agarózovém gelu a sloupcová chromatografíe.

Ze souboru připravených fragmentů DNA lze specifické fragmenty, obsahující požadovaný OB nebo příbuzný gen, identifikovat mnoha způsoby. Například, je-li k dispozici purifikovatelné a označitelné množství části OB genu, nebo příbuzného genu nebo příslušné RNA, či jejího fragmentu, lze provést prohledávání generovaných fragmentů DNA postupem hybridizace ke značené probě [Benton et al., Science, 196:180 (1977); Grunstein et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 72:3961 (1975)]. Předkládaný vynález poskytuje proby nukleových kyselin, které lze pohodlně připravit z uvedených specifických sekvencí, jako je např., hybridizační proba o nukleotidové sekvenci, odpovídající nejméně 10, výhodně 15-ti nukleotidovému fragmentu ze sekvence SEQ ID č. 1 (obr. 1 (A až E)) nebo SEQ ID č. 3 (obr. 2 (A a B)). Je výhodné, aby zvolený fragment byl vysoce specifický pro modulátorové peptidy předkládaného vynálezu. Dobře hybridizovat budou DNA fragmenty, jejichž sekvence je v podstatě homologní s probou. Jak bylo uvedeno výše, s rostoucím stupněm sekvenční homologie lze zpřísňovat hybridizační podmínky. Při konkrétním provedení vynálezu byly pro identifikaci homologního modulátorového peptidu zvoleny málo „přísné“ hybridizační podmínky. Výhodnější je, pokud nukleová kyselina, kódující předkládaný modulátorový peptid, hybridizuje s nukleotidovými sekvencemi SEQ ID č. 1 (obr. 1 (A až E)) nebo SEQ ID č. 3 (obr. 2 (A a B)), případně s jejich fragmenty, ve středně „přísných“ podmínkách, výhodněji ve vysoce „přísných“ podmínkách, jak je též ukázáno v příkladech.

Alternativně lze gen detekovat testy, vycházejícími z fyzikálních, chemických nebo imunologických vlastností analyzovaných expresních produktů. Například lze selektovat klony cDNA, nebo klony DNA produkující protein a hybridizující s náležitými mRNA, podle podobnosti se známými modulátorovými peptidy předkládaného vynálezu, např. mají blízkou nebo identickou elektroforetickou pohyblivost, blízké nebo identické vlastnosti při izoelektrické fokusaci, proteolytické mapování, tyrosin fosfatázovou aktivitu nebo antigenní vlastnosti. Například protilátky předkládaného vynálezu lze pohodlně použít pro vyhledávání homologních modulátorových peptidů z jiných zdrojů.

-24CZ 295018 B6

Gen, kódující předkládaný modulátorový peptid, může být identifikován rovněž na základě mRNA selekce, tj. hybridizací nukleových kyselin a následnou translací in vitro. Při tomto postupu se fragmenty používají k izolaci komplementárních mRNA pomocí hybridizace. Tyto fragmenty DNA představují dostupnou purifíkovanou modulátorovou DNA. Imunoprecipitační nebo funkční analýza (např. test tyrosin fosfatázové aktivity) produktů translace in vitro, produktů izolovaných molekul mRNA umožňuje identifikovat mRNA a tudíž komplementární fragmenty DNA o hledané sekvenci. Specifické mRNA lze rovněž selektovat adsorpcí polyzomů, izolovaných z buněk na imobilizované protilátky, specifické k modulátorovému peptidů.

Radioaktivně značenou cDNA modulátorového peptidů lze syntetizovat na templátu selektované mRNA (z adsorbovaných polyzomů). Radioaktivně značená mRNA nebo cDNA se pak využívá jako proba pro vyhledávání homologních fragmentů DNA modulátorového peptidů mezi ostatními fragmenty genomové DNA.

Sekvenci DNA, kódující peptidové modulátory hmotnosti, je vhodnější připravit synteticky než klonováním. Sekvenci DNA lze naplánovat podle kodonů, odpovídajících sekvenci aminokyselin peptidů modulátoru hmotnosti. Tento přístup umožňuje výběr výhodnějších kodonů s ohledem na zvoleného expresního hostitele. Celá sekvence je složena z přesahujících oligonukleotidů, připravených standardními postupy a spojena do úplné kódující sekvence. Viz např. Edge, Nátuře, 292:756 (1981); Nambairef al., 223:1299(1984); JayefaZ., J. Biol. Chem., 259:6311 (1984).

Syntetické DNA usnadňují konstrukci genů, které mohou exprimovat analogy modulátorů hmotnosti. Alternativně DNA kódující analogy může být připravena cíleně specifickou mutagenezí nativních OB genů nebo cDNA, analogy lze rovněž připravit přímo běžnou peptidovou syntézou.

Obecný postup pro cíleně specifickou inkorporaci nepřirozených aminokyselin do proteinu je popsán v Nořen et al., Science, 244:182-188 (1989). Tímto postupem lze připravovat analogy OB polypeptidu, obsahující nepřirozené aminokyseliny.

Nekódující nukleové kyseliny

Předkládaný vynález zahrnuje i přípravu anti-sense nukleotidů a ribozymů, zasahujících do exprese proteinů modulátoru hmotnosti na úrovni translace. Anti-sense nukleové kyseliny a ribozymy blokují translaci specifické mRNA tím, že ji buď maskují nebo štěpí ribozymem.

Anti-sense nukleové kyseliny jsou molekuly DNA nebo RNA, komplementární alespoň k části specifické molekuly mRNA [viz Weintraub, Sci. Am., 262:40-46 (1990)]. V buňce s touto mRNA hybridizují za vzniku dvouvláknového komplexu. Buňka není schopna předkládat mRNA, vytvářející takovýto dvouvláknový komplex. Tímto způsobem zasahují anti-sense nukleové kyseliny v místě mRNA do exprese proteinu. Zejména účinné jsou oligomery délky 15 nukleotidů a molekuly, hybridizující s iniciačním kodonem AUG, neboť jsou lehce syntetizovatelné a představují menší problém při zavádění do buněk, produkujících modulátory tělesné hmotnosti, než velké molekuly. Anti-sense postupy byly použity při inhibování exprese řady genů in vitro [Marcus-Sekura, (1988); Hambor et al., J. Exp. Med., 168:1237-1245 (1988)].

Ribozymy jsou molekuly RNA, které specificky štěpí jiné jednovláknové molekuly RNA, podobně jako restrikční endonukleázy štěpí DNA. Ribozymy byly objeveny na základě pozorování, že určité mRNA vyštěpují své vlastní introny. Modifikací nukleotidové sekvence takovýchto mRNA dokázali vědci sestrojit molekuly, které rozpoznávají a štěpí specifické nukleotidové sekvence RNA [Cech, J. Am. Med. Assoc., 260:3030-3034 (1988)]. Díky sekvenční specificitě dochází tedy k inaktivaci pouze určitých sekvencí mRNA.

Vynálezci identifikovali dva typy ribozymů, typ Tetrahymena a typ „hammerhead“. Ribozymy typu Tetrahymena rozpoznávají sekvenci čtyř bází, ribozymy „hammerhead“ rozpoznávají

-25CZ 295018 B6 sekvence 11 až 18 bází. Čím delší je rekogníční sekvence, tím je pravděpodobnější, že se bude vyskytovat výlučně v cílové mRNA. Proto jsou pro inaktivaci specifických mRNA výhodnější ribozymy „hammerhead“ než Tetrahymena a 18ti nukleotidové rekogníční sekvence jsou výhodnější než kratší.

Předkládané sekvence DNA lze tedy použít pro přípravu anti-sense molekul k mRNA proteinů modulátorů hmotnosti a jejich ligandů i pro přípravu ribozymů, které tuto mRNA štěpí; a tak inhibovat expresi OB genu a indukovat nárůst hmotnosti a adipozity.

Jiné provedení předkládaného vynálezu poskytuje krátké oligonukleotidy, komplementární ke kódujícím a komplementárním vláknům nukleové kyseliny OB, nebo k nekódujícím oblastem 5', 3', nebo krátké oligonukleotidy z kódující oblasti. Tyto oligonukleotidy slouží jako proby, buď jako přímo značené oligonukleotidické proby, nebo jako primery pro polymerázovou řetězovou reakci, pro vyhodnocování mutací v OB genu, nebo úrovně exprese OB mRNA. Nekódující nukleové kyseliny předkládaného vynálezu pocházejí výhodně z lidského OB genu.

V jiném provedení předkládaného vynálezu slouží nekódující nukleové kyseliny při homologní rekombinací pro integraci amplifikovatelného genu a/nebo jiných regulačních sekvencí do blízkosti OB genu, např. kvůli dosažení vyšší hladiny exprese OB polypeptidů, nebo kvůli zastínění mutace v regulační sekvenci OB genu, která brání patřičné úrovni exprese OB polypeptidu (viz Mezinárodní patentová publikace WO 91/06666, vyd. 16. 5. 1991, Skoultchi; Mezinárodní patentová publikace WO 91/09955, vyd. 11.7. 1991, Chappel; Mezinárodní patentová publikace WO 90/14092, vyd. 29. 11. 1990, Kucherlapati, Campbell).

Produkce OB polypeptidů: exprese a syntéza

Transkripční a translační kontrolní sekvence jsou regulační sekvence DNA, např. promotory, zesilovače, terminátory a pod., které zajišťují expresi kódující sekvence v hostitelské buňce. Eukaryontní buňky obsahují polyadenylátové signální kontrolní sekvence.

Kódující sekvence je v buňce „regulována“ transkripční a translační regulační sekvencí tehdy, jeli kódující sekvence přepsána RNA-polymerázou do mRNA, mRNA je sestříhána a přeložena do proteinu, kódovaného kódující sekvencí.

„Signální sekvence“ se vyskytuje na začátku kódující sekvence proteinu, který má být na povrchu buňky syntetizován. Tato sekvence kóduje signální polypeptid, který se nachází na N-konci maturovaného polypeptidů a řídí translokaci polypeptidů v hostitelské buňce. V souvislosti s uvedeným typem signální sekvence bývá používán i pojem „translokační signální sekvence“. Translokační signální sekvence lze nalézt v řadě různých přirozených eukaryontních i prokaryontních proteinů a často jsou funkční v obou typech organizmů.

Sekvence DNA je „operativně připojena“ k expresní kontrolní sekvenci tehdy, jestliže expresní kontrolní sekvence reguluje transkripci a translaci této DNA. Pojem „operativně připojena“ zahrnuje i to, že sekvence DNA, určená k expresi, má na začátku vhodný startovací signál (např. ATG), i to že zůstane zachován správný čtecí rámec, dovolující expresi sekvence DNA za regulace expresní kontrolní sekvencí a produktu požadovaného produktu, kódovaného touto sekvencí. Pokud je nutno inzertovat do rekombinantní DNA molekuly gen, který neobsahuje vhodný startovací signál, lze tento signál zavést do genu v protisměru (5') a spolu s genem inzertovat do čtecího rámce.

„Promotorové sekvence“ je regulační oblast DNA, která v buňce zajišťuje vazbu RNA polymerázy a iniciuje transkripci kódující sekvence po směru (směr 3'). Pro účely definování předkládaného vynálezu je promotorové sekvence ohraničena na 3' konci transkripčním iniciačním místem a v protisměru (směr-5') zahrnuje pouze minimální počet bází, který postačuje k iniciaci

-26CZ 295018 B6 detekovatelné hladiny transkripce nad pozadím. Promotorová sekvence obsahuje transkripční iniciační místo (příhodně definovatelné např. mapováním nukleázou Sl) a vazebné domény pro protein (souhlasné sekvence), zodpovědné za vazbu RNA polymerázy.

Předkládaný vynález se rovněž týká exprese uvedených sekvencí DNA. Jak je v oblasti techniky známo, podmínkou exprese sekvencí DNA je jejich operativní připojení k expresní kontrolní sekvenci ve vhodném expresním vektoru a využití tohoto vektoru pro transformaci příslušného jednobuněčného hostitele.

Podmínkou operativního připojení předkládané sekvence DNA k expresní kontrolní sekvenci je samozřejmě zajištění iniciačního kodonu ATG, pokud ne přímo části DNA sekvence, ve správném čtecím rámci v protisměru DNA sekvence.

Pro expresi předkládaných sekvencí DNA lze použít různé kombinace hostitelů a expresních vektorů. Použitelné expresní vektory jsou například segmenty chromozomálních, nechromozomálních a syntetických sekvencí DNA. Vhodnými vektory jsou deriváty SV40 a známé bakteriální plazmidy, např. plazmidy E. coli col El, pCRl, pBR322, pMB9, pUC nebo deriváty pUC, např. vektory pGEX, pET, pmal-c, pFLAG, atd., a deriváty uvedených vektorů, jako plazmid RP4; fágové DNA, např. četné deriváty fágu lambda, např. NM989, a jiná fágová DNA, např., Ml 3 a filamentózní jednovláknový fág DNA; kvasinkové plazmidy jako např. plazmid 2m a jeho deriváty; vektory, použitelné v eukaryontních buňkách, např. hmyzích či savčích; vektory, odvozené od kombinací plazmidové a fágové DNA, jako jsou plazmidy, využívající expresní kontrolní sekvence fágové nebo jiné DNA; a pod. Výhodné provedení vynálezu využívá expresi OB v methylotrofních kvasinkách, např. Pichia pastoris (viz Mezinárodní patentová přihláška WO 90/03431, vyd. 5. 4. 1990, Brierly et al.,; Mezinárodní patentová publikace WO 90/10697, vyd. 20. 9. 1990, Siegel et al.). V níže uvedeném provedení vynálezu byl konstruován vektor pro expresi OB, řízenou signální sekvencí α-párovacího faktoru.

Z velkého množství expresních kontrolních sekvencí - tj. sekvencí, které regulují expresi operativně připojené předkládané DNA - lze pro vektor, exprimující předkládanou sekvenci DNA, zvolit libovolnou expresní kontrolní sekvenci. Vhodné expresní kontrolní sekvence jsou např. časné nebo pozdní promotory SV40, CMV, vakcinie, polyoma nebo adenoviru, lac systém, trp systém, TAC systém, TRC systém, LTR systém, hlavní operátorové a promotorové oblasti fágu lambda, kontrolní oblasti fd coat proteinu, promotor pro 3-fosfoglycerát kinázu nebo jiné glykolytické enzymy, promotory kyselé fosfatázy (např. Pho5), promotor AOX1 methylotrofních kvasinek, promotory kvasinkového α-párovacího faktoru a jiné známé sekvence, které řídí expresi genů prokaryontních nebo eukaryontních buněk nebo jejich virů a různé kombinace uvedených promotorů.

Pro expresi předkládaných sekvencí DNA lze využít řadu různých jednobuněčných hostitelských buněk. Vhodnými hostiteli jsou známé eukaryontní a prokaryontní buňky jako např. kmeny E. coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces·, houby jako např. kvasinky (Saccharomyces a methylotrofní kvasinky jako Pichia, Candida, Hansenula a Torulopsis)·, a živočišné buňky jako CHO, Rl.l, B-W a LM, ledvinové buňky z africké Green Monkey (např. COS 1, COS 7, BSC1, BSC40 a BMT10), hmyzí buňky (např. Sf9) a lidské a rostlinné buňky v tkáňových kulturách.

Je zřejmé, že ne všechny vektory, expresní kontrolní sekvence ani hostitelské buňky budou exprimovat předkládané sekvence DNA stejným způsobem. Rovněž je zřejmé, že ne všechny hostitelské buňky budou pracovat stejně s jedním expresním systémem. Odborník v oboru však je schopen zvolit vhodné vektory, expresní kontrolní sekvence i hostitele pro dosažení požadované úrovně exprese v rámci předkládaného vynálezu, aniž musel nepřiměřeně experimentovat. Například při volbě vektoru musí být uvažován konkrétní hostitel, protože vektor musí v tomto hostiteli fungovat. Rovněž musí být uvažováno množství kopií vektoru, možnost ovlivňovat množství kopií i expresi jiných proteinů, kódovaných vektorem, jako jsou např. antibiotické markéry.

-27CZ 295018 B6

Při volbě expresní kontrolní sekvence je obvykle uvažována řada faktorů, jako např. relativní síla systému, možnost jeho regulace, kompatibilita systému s konkrétní sekvencí DNA nebo genů určených k expresi, zejména s ohledem na možné sekundární struktury. Vhodné jednobuněčné hostitele lze volit na základě úvah, jako např. kompatibilita hostitele se zvoleným vektorem, sekreční vlastnosti hostitele, schopnost hostitele vytvářet správné prostorové uspořádání proteinů, fermentační podmínky pro růst hostitele, stejně jako případná toxicita produktu, kódovaného sekvencemi DNA, určenými k expresi vůči hostiteli a obtížnost purifikace expresních produktů.

S ohledem na tyto i další faktory je odborník v oboru schopen sestrojit řadu kombinací vektor/expresní kontrolní sekvence/hostitel, které budou exprimovat předkládané sekvence DNA fermentačně, nebo ve velkém měřítku v živočišných kulturách.

V konkrétním provedení vynálezu byl exprimován fúzní protein OB. Fúzní protein OB obsahuje minimálně nejmenší funkční část proteinu, který není OB proteinem, spojenou peptidickou vazbou s minimálně nejmenší funkční částí OB polypeptidu. Ne-OB sekvence mohou být připojeny k amino- nebo karboxylovému konci OB. Z hlediska rezistence fúzního OB proteinu vůči proteolýze je výhodnější, pokud jsou ne-OB sekvence připojeny peptidickou vazbou kamino-konci OB proteinu. Rekombinantní molekula DNA, kódující fúzní protein, obsahuje sekvenci, kódující minimální funkční sekvenci ne-OB části, připojenou ve čtecím rámci k sekvenci, kódující OB a výhodně ještě sekvenci, kódující štěpné místo pro specifickou proteázu, např. trombin nebo Faktor Xa, výhodně v místě spoje OB s ne-OB. V tomto konkrétním provedení byl fúzní protein exprimován v Escherichia coli nebo v P. pastoris.

V konkrétním provedení byly připraveny vektory pro expresi myšího a lidského OB genu, s i bez kodonu pro gln-49, v bakteriálních i kvasinkových (Pichia) expresních systémech, vedoucí k expresi fúzních proteinů. Do OB genu bylo zavedeno štěpné místo pro endonukleázu, např. pomocí PCR a nových primerů. Sekvence připravené PCR je vhodné ověřovat, neboť při tomto postupu je vyšší pravděpodobnost vzniku bodových mutací. Vhodné je použít plazmid, obsahující His-tag a proteolytické štěpné místo. Přítomnost histidinu umožňuje selektivní izolaci rekombinantních proteinů na Ni-chelatační koloně, nebo afinitní purifíkaci. Specifické proteolytické místo, v konkrétním provedení štěpené místo pro trombin, je do proteinu zaváděno proto, aby štěpení proteázou, např. trombinem, uvolnilo plnou délku maturovaného OB polypeptidu (tj. bez signální sekvence).

V jiném provedení byl použit vektor pGEX [Smith et al., Gene 67:31—40 (1988)]. Tento vektor spojuje cDNA, kódující schistosoma japonicum glutathion S-transferázou s předkládanými sekvencemi DNA. Od bakteriálních proteinů lze rekombinantní proteiny snadno oddělit na redukované glutathion-afinitní koloně. GST nosič se poté z fúzního proteinu odštěpí specifickými proteázami. Po štěpení se nosič a nerozštěpený fúzní protein odstraní absorpcí na glutathionové agaróze. Nevýhodou tohoto systému může být případná nerozpustnost kódovaného proteinu ve vodném prostředí.

Rekombinantní proteiny, exprimované v bakteriálních systémech, mohou mít chybné prostorové uspořádání, vyžadující opravu. Rekombinantní protein lze nově prostorově uspořádat před nebo po štěpení na funkční OB polypeptid. Přeuspořádání OB polypeptidu se provádí (1) inkubací proteinu v denaturačním pufru s redukčním činidlem a poté (ii) inkubací proteinu v pufru s oxidačním činidlem a výhodně též s činidlem stabilizujícím protein nebo chaotropním činidlem, případně s oběma. Vhodnými páry redoxních činidel jsou, ne výhradně, redukovaný glutathion/glutathion disulfid, cystin/cystein, cystamin/cysteamin a 2-merkaptoethanol/2-hydroxyethyldisulfíd. V některém případě lze fúzní protein rozpustit působením denaturačního činidla, jako je močovina. Podle výhodného provedení lze protein před zavedením do redukčního pufru též puntíkovat, např. ionexovou nebo Ní-chelatační chromatografíí. Vhodnými denaturačními činidly jsou, ne výhradně, močovina a guanidin hydrochlorid. Rekombinantní protein se dále ÍOx, výhodněji ÍOOx naředí do oxidačního pufru, obsahujícího, ne výhradně, 0,1 mol.f¹ Tris-HCl pH 8,0; 0,1 mmol.l”¹ EDTA; 0,15 mol.T¹ NaCl; 0,3 mol.f¹ oxidovaný glutathion. Fúzní protein se

-28CZ 295018 B6 pak inkubuje 1 až 24 h, výhodně 2 až 16 h v oxidačním pufru při laboratorní teplotě. Oxidační pufr může obsahovat činidlo stabilizující protein, např. cukr, alkohol nebo síran amonný. Oxidační pufr může dále obsahovat v nízké koncentraci chaotropní činidlo, destabilizuj ící chybné intermolekulární interakce a napomáhá tak tvorbě správného prostorového uspořádání. Vhodnými chaotropními činidly jsou, ne výhradně, detergenty, polyoly, L-arginin, guanidin hydrochlorid a polyethylenglykol (PEG). Podstatné je zvolit dostatečně nízkou koncentraci chaotropního činidla, aby nedocházelo kdenaturaci proteinu. Nově uspořádaný protein lze zahustit nejméně lOx, výhodně tolikrát, kolikrát byl naředěn do oxidačního pufru.

Bakteriální fermentací může rovněž vznikat rekombinantní protein, doprovázený nepřijatelným množstvím endotoxinů. Proto se předkládaný vynález zabývá odstraňováním endotoxinů, např. pomocí protilátek, specifických k endotoxinů, nebo molekul, které endotoxin váží. Přítomnost endotoxinů lze stanovit standardními postupy, např. s využitím reagencií E-TOXATE (Sigma, St. Louis Missouri) nebo biologickými testy.

Kromě uvedených postupů uvažuje předkládaný vynález expresi OB proteinů v baculovirových, savčích a kvasinkových expresních systémech. Například v baculovirových expresních systémech lze využít nefúzní i fúzní transferové vektory; nefůzní transferové vektory jsou, ne výhradně, pVL941 (klonovací místo TtawHl; Summers), pVL1393 (klonovací místo Ea/wHl, Smál, Xbal, EcoR.1, Notl, Xmalll, BgRl a Pstl; Invitrogen), pVL1392 (klonovací místo EamHl, Smál, Xbal, EcoRl, Notl, Xmalll, BglII a Pstl; Summers a Invitrogen) a pBlue/tacIII (klonovací místo Tta/wHl, BgRl, Pstl, Ncol a HindlII, s možností rekombinantního screeningu modrá/bílá; Invitrogen) a fúzní transferové vektory jsou, ne výhradně, pAc700 (klonovací místo SawHl a Kpnl, kde rekogniční místo BamHI začíná s iniciačním kodonem; Summers), pAc701 a pAc702 (jako u pAc700, s odlišnými čtecími rámci), pAc360 (klonovací místoTta/wHl 36 pb po směru od polyhedrinového iniciačního kodonů Invitrogen(195)) a pBlueBacHis A, B, C (tři odlišné čtecí rámce, klonovací místo TtamHl, BgRl, Pstl, Ncol a HindlII, N-terminální peptid pro ProBond purifikaci a s možností rekombinantního screeningu modrá/bílá plaků; Invitrogen(220)).

Savčí expresní systémy, vhodné pro předkládaný vynález, zahrnují vektory s indukovatelnými promotory, jako je např. dihydrofolát reduktázový (DHFR) promotor, např. libovolný expresní vektor s DHFR expresním vektorem, nebo ko-amplifíkační vektor D/ZFÁ/methotrexat, jako je pED (klonovací místo Pstl, SaR, Sbal, Smál a EcoRI, vektorem exprimuje klonovaný gen \DHFR; viz Kaufman, Current Protocols in Molecular Biology, 16.12 (1991)). Alternativně, ko-amplifikační vektor glutamin syntetáza/methionin sulfoximin, jako je pEE14 (klonovací místo HindBR, Xbal, Smál, Sbal, EcoRI a Bell, vektor exprimuje glutamin syntetázu a klonovaný gen; Celltech). Podle jiného provedení lze použít vektor, který řídí episomální expresi v systému s virem Epstein-Barrové (EBV), např. pREP4 (klonovací místo BamHI, Sfil, Xhol, Notl, Nhel, HindlII, Nhel, Pvull a Kpnl, konstitutivní promotor RSV-LTR, hygromycinový selekční markér; Invitrogen), pCEP4 (klonovací místo BamHI, Sfil, Xhol, Notl, Nhel, HindlII, Nhel, Pvull a Kpnl, nejbližší konstitutivní gen hCMV, hygromycinový selekční markér; Invitrogen), pMEP4 (klonovací místo Kpnl, Pvul, Nhel, HindlII, Notl, Xhol, Sfil, BamHI, indukovatelný promotor genu pro methallothionein Ila, hygromycinový selekční markér; Invitrogen), pREP8 (klonovací místo EawíHl, Xhol, Notl, HindlII, Nhel a Kpnl, promotor RSV-LTR, histidinolový selekční markér; Invitrogen), pREP9 (klonovací místo Kpnl, Nhel, HindlII, Notl, Xhol, Sfil a BamHI, promotor RSV-LTR, selekční markér G418; Invitrogen) a pEBVHis (promotor RSV-LTR, hygromycinový selekční markér, N-terminální peptid purifikovatelný na nosiči ProBond a odštěpitelný enterokinázou; Invitrogen). Selekční savčí expresní vektory, vhodné pro předkládaný vynález, zahrnují pRc/CMV (klonovací místo HindlII, BstXl, Notl, Sbal a Apal, selekce G418; Invitrogen), pRc/RSV (klonovací místo HindlII, Spěl, BstXl, Notl, Xbal, selekce G418; Invitrogen) a další. Savčí expresní vektory viru Vakcínie (viz Kaufman, Current Protocols in Molecular Biology,16.12 (1991)), vhodné pro předkládaný vynález jsou, ne výhradně, pSCll (klonovací místo Smál, selekce TK- a pgal), pMJ601 (klonovací místo SaR, Smál, Afll, Narl, jRspMII, BamH\,Apdl, Nhel, >SacII, Kpnl a HindSR, selekce TK- a Pgal) a pTKgpFIS (klonovací místo EcoRI, Pstl, SaR, Accl, Hindll, Sbal, BamHI a Hpa, selekce TK nebo XPRT).

-29CZ 295018 B6

Podle předkládaného vynálezu lze k expresi OB polypeptidu použít rovněž kvasinkové expresní systémy. Například lze zvolit nefúzní vektor pYES2 (klonovací místo AZ>aI, Sphl, Shol, Notl, GstXl, EcóRl, BstXl, BamHl, Sad, Kpnl a Hindlll; Invitrogen) nebo fúzní pYESHis A, B, C (klonovací místo Xbal, Sphl, Shol, Notl, BstXl, EcoBI, BamHl, Sad, Kpnl a Hindlll, N-terminální peptid, purifikovatelný na nosiči ProBond a odštěpitelný enterokinázou; Invitrogen).

Peptidické modulátory tělesné hmotnosti lze syntetizovat na základě nukleotidových sekvencí, odvozených v rámci předkládaného vynálezu.

Vedle rekombinantní exprese předkládaný vynález počítá i se syntetickou přípravou OB polypeptidu a jeho fragmentů, využívající známé a vysoce vyvinuté postupy syntézy peptidů na pevné fázi. Vynález zahrnuje přípravu OB polypeptidu a jeho fragmentů s využitím strategie chránících skupin Boc a Fmoc i jiných. V oblasti techniky jsou též známy různé postupy pro úpravu prostorového uspořádání polypeptidu a oxidaci postranních cysteinových řetězců na disulfídickou vazbu.

Protilátky k OB polypeptidu

Předkládané OB polypeptidy, připravované rekombinantně nebo chemickou syntézou, jejich fragmenty i jiné deriváty a analogy včetně fúzních proteinů, lze použít jako immunogeny při generování protilátek, rozpoznávajících OB polypeptid. Mezi tyto protilátky patří, ne výhradně, polyklonální, monoklonální, chimérní a jednořetězcové protilátky, Fab fragmenty a Fab expresní knihovna.

Molekula je „antigenní“, pokud interaguje specificky s molekulou imunitního systému, rozpoznávající antigen, jako je např. imunoglobulin (protilátka) nebo receptor antigenů T-buňky. Antigenní polypeptid je tvořen nejméně 5, výhodně nejméně 10 aminokyselinami. Antigenní částí molekuly je ta část, která je pro rozpoznání protilátky nebo receptorů T-buňky imunodominantní, nebo část molekuly, která byla konjugována k nosiči při imunizačním generování. Antigenní molekula nemusí být sama o sobě imunogenní, tj. vyvolávající imunitní odpověď bez nosiče.

„Protilátka“ je libovolný imunoglobulin, včetně protilátek a jejich fragmentů, který se váže ke specifickému epitopu. Termín zahrnuje polyklonální, monoklonální, i chimérní protilátky, posledně jmenovanými se podrobněji zabývá patent US 4 816 397 a US 4 816 567, který se dále zabývá vazebnými místy pro antigen a částmi Fab, F(ab')₂ a F(v) (včetně jednořetězcových protilátek). Termín „molekula protilátky“ v různých tvarech, jak je zde užíván, tedy zahrnuje intaktní molekulu imunoglobulinu i imunologicky aktivní část molekuly imunoglobulinu svazebným místem. „Vazebné místo protilátky“ je strukturní část molekuly protilátky, tvořená hypervariabilní oblastí těžkého a lehkého řetězce, která specificky váže antigen.

Protilátky jsou například intaktní molekuly imunoglobulinů, v podstatě intaktní molekuly imunoglobulinů a části molekul imunoglobulinů, zahrnující paratop, včetně částí označovaných Fab, Fab', F(ab')₂ a F(v), což jsou důležité části molekuly protilátky z hlediska terapeutických postupů předkládaného vynálezu.

Fab a F(ab')₂ části molekul protilátek lze připravit proteolýzou papainem nebo pepsinem, provedenou na v podstatě intaktních molekulách protilátek, známými postupy. Viz např. patent US 4 342 566, Theofilopolous et al. Fab' části molekuly protilátky jsou též známé a lze je připravit z částí F(ab')₂ redukcí disulfidických vazeb, spojujících dva těžké řetězce, např. merkaptoethanolem a alkylaci vzniklého protein merkaptanů např. jodacetamidem. Pro předkládané účely jsou výhodné intaktní molekuly protilátek.

-30CZ 295018 B6 „Monoklonální protilátka“ je protilátka, která má pouze jeden typ vazebných míst schopných imunitně reagovat s určitým antigenem. Monoklonální protilátka typicky vykazuje jednotnou vazebnou afinitu ke všem antigenům, s nimiž imunitně reaguje. Monoklonální protilátka může být tvořena molekulou protilátky, která má řadu vazebných míst, každé imunospecifické k jinému antigenu; např. bispecifická (chimérní) monoklonální protilátka.

Výraz „adjuvans“ se vztahuje ke sloučenině či směsi, která zvyšuje imunitní odpověďk antigenu. Adjuvans může sloužit jako tkáňový depot pomalu uvolňující antigen a také jako aktivátor lymfatického systému, který nespecificky posiluje imunitní odpověď [Hood et al., Immunology, 384, 2. vyd., Benjmanin/Cummings, Menlo Park, Califomia (1984)]. Primární účinek samotného antigenu bez přítomnosti adjuvans často nepostačuje k vyvolání humorální nebo buněčné imunitní odpovědi. Adjuvans zahrnují, ne výhradně, kompletní Freundovo adjuvans, nekompletní Freundovo adjuvans, saponin, minerální gely, jako je hydroxid hlinitý, povrchově aktivní látky, jako je lysolecithin, pluronové polyoly, polyanionty, peptidy, olejové nebo uhlovodíkové emulze, keyhole límpet hemocyanin, dinitrofenol a potenciálně využitelná humánní adjuvans jako BCG (bacille Calmette-Gueriri) a Corynebacterium parvum. Adjuvans je výhodně farmaceuticky přijatelné.

V oblasti techniky existuje řada způsobů příprav polyklonálních protilátek k OB polypeptidu, jeho fragmentu, derivátu nebo analogu. Tvorbu protilátek lze vyvolat imunizací různých živočišných hostitelů injekcí OB polypeptidu nebo jeho derivátu (např. fragmentu nebo fúzního proteinu). Vhodnými hostiteli jsou, ne výhradně, králíci, myši, krysy, ovce, kozy, atd. Podle provedení vynálezu lze OB polypeptid nebo jeho fragment konjugovat s imunogenním nosičem, např. bovinním sérum albuminem (BSA) nebo keyhole límpet hemocyaninem (KLH). Podle druhu hostitele lze pro zvýšení imunitní odpovědi použít různá adjuvans, např. (ne výhradně) kompletní i nekompletní Freundovo adjuvans, minerální gely, jako je hydroxid hlinitý, povrchově aktivní látky, jako je lysolecithin, pluronové polyoly, polyanionty, peptidy, olejové emulze, keyhole limpet hemocyaniny, dinitrofenol a potenciálně využitelná humánní adjuvans jako BCG (bacille Calmette-Gueriri) a Corynebacterium parvum.

Při přípravě monoklonálních protilátek proti OB polypeptidu, jeho fragmentu, analogu nebo derivátu, lze použít libovolný způsob, využívající produkci niolekul protilátek v kulturách kontinuálních buněčných linií. Vhodné postupy zahrnují, ne výhradně, hybrídomový postup, původně vyvinutý Kohlerem et al., Nátuře, 256:495-497 (1975), triomový postup, hybrídomový postup na lidských B-buňkách [Kozbor et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, 77-96, Alan R. Liss, lne., (1985)]. Nesmrtelné buněčné linie, produkující protilátky, lze vytvořit i jinými postupy než fúzí, například přímou transformací B lymfocytů onkogenní DNA nebo transfekci virem Epstein-Barrové. Viz např. Schreier M., et al., „Hybridoma Techniques“ (1980); Hammerling et al., „Monoclonal Antibodies And T-cell Hybridomas“ (1981); Kennet et al., „Monoclonal Antibodies“, (1980); viz též patent US 4 341 761, US 4 399 121, US 4 427 783, US 4 444 887; US 4 451 570, US 4 466 917; US 4 472 500; US 4 491 632; a US 4 493 890.

V konkrétním provedení předkládaného vynálezu byly monoklonální protilátky produkovány na bezmikrobních zvířatech nedávno vypracovaným postupem (PCT/US 90/02545). Podle vynálezu lze použít lidské protilátky a získat je na lidských hybridomech [Cote et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 80:2026-2030 (1983)] nebo transformací lidských B-buněk EBV virem [Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, 77-96, Alan R. Liss, lne., (1985)]. Podle citovaného vynálezu lze využít postupy, vyvinuté pro produkci „chimémích protilátek“ [Morrson et al., J. Bacteriol., 159-870 (1984); Neurberger et al., Nátuře, 312:604-608 (1984); Takeda et al., Nátuře, 314:452-454 (1985)]. Tyto postupy vycházejí z genů pro molekuly myších protilátek, specifických k OB polypeptidu, a genů pro molekuly lidských protilátek příslušné biologické aktivity, upravených sestřihem; takovéto protilátky spadají rovněž do rámce předkládaného vynálezu. Lidské nebo humanizované chimérní protilátky jsou výhodnější pro terapii lidských onemocnění nebo poruch (popsáno výše), protože lidské nebo humanizované protilátky

-31 CZ 295018 B6 budou samy o sobě méně pravděpodobně vyvolávat imunitní odpověď, zejména alergickou ve srovnání s cizorodými protilátkami.

Předkládaný vynález dále využívá adaptovaného postupu pro přípravu jednořetězcových protilátek (patent US 4 946 778) k přípravě jednořetězcových protilátek, specifických k OB polypeptidu. Konkrétní provedení vynálezu využívá popsaného postupu pro konstrukci Fab expresní knihovny [Huse et al., Science, 246:1275-1281 (1989)], která umožňuje rychlé a snadné vyhledání monoklonálních Fab fragmentů o požadované specifitě k OB polypeptidu, jeho derivátům či analogům.

Fragmenty protilátek, které obsahují idiotyp molekuly protilátky, lze připravovat známými postupy. Takovýmito fragmenty jsou, ne výhradně, např. fragment F(ab')₂, který vzniká pepsinovým štěpením molekuly protilátky; Fab' fragmenty, připravené redukcí disulfidických můstků fragmentu F(ab')₂ a fragmenty Fab, vznikající papaionovým štěpením molekuly protilátky a následnou redukcí.

Pro výrobu protilátek se vyhledávání žádané protilátky provádí známými postupy oblasti techniky, např. radioimunoesejí, postupem ELISA (imunosorbentní test s navázaným enzymem), „sendvičovou“ imunoesejí, imunoradiometrickými testy, gelovou difuzní precipitační reakcí, imunodifuzními testy, imunoesejí in šitu (např.: skoloidním zlatém, enzymovým nebo radioizotopovým značením), westernovým blotováním, precipitační reakcí, aglutinačním testem (např. gelový aglutinační test, hemaglutinační test), komplementačním testem, imunofluorescentním testem, testem s proteinem A, imunoelektroforetickým testem, atd. Podle provedení vynálezu lze vazbu protilátky stanovit na základě detekce značené primární protilátky. Podle jiného provedení lze primární protilátku stanovit na základě detekce vazby sekundární protilátky nebo reagencie k primární protilátce. Podle dalšího provedení lze sekundární protilátku označit. Oblast techniky poskytuje řadu prostředků detekce vazby pro imunoesej, které vyhovují předkládanému vynálezu. Například při selekci protilátek, které rozpoznávají specifický epitop OB polypeptidu, lze testovat generované hybridomy podle produktu, který váže fragment OB polypeptidu, nesoucí tento epitop. Selekci protilátek, specifických k OB polypeptidu z určitého živočišného druhu, lze provést na základě pozitivní vazby s OB polypeptidem, exprimovaným nebo izolovaným z buněk tohoto živočišného druhu.

Výše uvedené protilátky lze použít pro lokalizaci a stanovení aktivity OB polypeptidu známými postupy oblasti techniky, jako je např. westernové blotování, stanovení OB polypeptidu in šitu, stanovení hladiny OB polypeptidu ve fyziologických vzorcích, atd.

V konkrétním provedení vynálezu byly generovány protilátky, agonizující nebo antagonizující aktivitu OB polypeptidu. Tento typ protilátek lze testovat výše uvedenými postupy na základě identifikace ligandů.

V konkrétním provedení vynálezu byly vyvinuty protilátky, produkované na králících, kteří byli imunizováni syntetickými peptidy s předem stanovenou aminokyselinovou sekvencí nebo rekombinantními proteiny, připravenými s využitím bakteriálních expresních vektorů. Výběr syntetických peptidů byl proveden na základě pečlivé analýzy předpovězené struktury proteinu. Konkrétně byly vybrány peptidové sekvence mezi předpokládanými štěpnými místy. Syntetické peptidy byly konjugovány k nosiči, např. KLH hemocyanin nebo BSA, reakcí s karbodiimidem a použity ve Freundově adjuvans k imunizaci králíků. Rekombinantní protein byl připraven s využitím vektoru pGEX [Smith et al., Gene 67:31—40 (1988)]. Alternativně lze generovat fúzní protein s použitím hydrofilních domén. Protein byl exprimován v potřebném množství pro imunizaci ve Freundově adjuvans.

V jiném konkrétním provedení vynálezu byl použit OB polypeptid k imunizaci kuřat a z vaječného žloutku izolovány kuřecí anti-OB protilátky, např. afínitní purifikací na OB-koloně. Kuřata, určená k imunizaci, byla výhodně udržována ve specifických podmínkách bez patogenů (SPF).

-32CZ 295018 B6

V jiném konkrétním provedení vynálezu byla tvorba protilátek proti leptinu vyvolána u OB/OB myší, u nichž se dala očekávat anti-OB odpověď, protože OB polypeptid vzhledem kjeho nepřítomnosti v oběhu netolerují; tvorba protilátek byla vyvolána rovněž u myší divokého typu. Slezínné buňky od obou skupin myší byly fúzovány s myelomovými buňkami za vzniku hybridomů pro monoklonální protilátky.

V jiném konkrétním provedení vynálezu byl použit rekombinantní polypeptid k imunizaci králíků a polyklonální protilátky byly před dalším použitím imunopurifikovány. Purifíkované protilátky jsou zejména vhodné pro semi-kvantitativní testy, zvláště pro stanovení cirkulujícího OB polypeptidu v plazmě nebo séru.

Prohledání souboru monoklonálních protilátek, vyprodukovaných proti modulátorovým peptidům, lze provést na základě různých vlastností, jako jsou izotyp, epitop, afinita, atd. Zvláště významné jsou monoklonální protilátky, neutralizující aktivitu modulátorových peptidů. Tyto monoklonální protilátky lze snadno identifikovat postupem, testujícím aktivitu modulátoru hmotnosti. Rovněž vhodné jsou protilátky s vysokou afinitou, pokud lze provést imunoafinitní purifikaci přirozeného nebo rekombinantního modulátoru.

Jako anti-modulátorové protilátky pro diagnostické a terapeutické účely předkládaného vynálezu se výhodně používají afinitně purifíkované polyklonální protilátky, výhodněji monoklonální protilátky (mAb). Dále je pro předkládané účely výhodné, pokud jsou molekuly anti-modulátorových protilátek tvořeny částmi celých molekul protilátek, sice částmi Fab, Fab', F(ab')2 nebo F(v).

Diagnostické využití

Předkládaný vynález se dále týká řady diagnostických aplikací, včetně postupů pro detekci podmínek a/nebo stimulů, které vyvolávají abnormální tělesnou hmotnost nebo adipozitu, se zřetelem na jejich působení, zprostředkovávané přítomnými modulátory hmotnosti. Jak již bylo uvedeno, existuje řada postupů, využívajících peptidové modulátory hmotnosti ke generaci protilátek, které lze pak izolovat a použít např. při zjišťování konkrétní transkripční aktivity u suspektních cílových buněk. Alternativně lze předkládané nukleové kyseliny použít diagnosticky.

Diagnostika založená na protilátkách

Diagnostické postupy předkládaného vynálezu využívají při testování buněčných vzorků nebo vzorků média efektivní množství antagonistů modulátorového proteinu, jako je např. anti-modulátorová protilátka, výhodně afinitně purifikovaná polyklonální protilátka, výhodněji mAb. Dále je pro předkládané účely výhodné, pokud jsou molekuly anti-modulátorových protilátek tvořeny částmi celých molekul protilátek, sice částmi Fab, Fab', F(ab')₂ nebo F(v). Jak již bylo uvedeno, předkládané postupy pomáhají pacientům, trpícím rakovinou, AIDS, obezitou nebo jinými stavy, pro něž je charakteristická abnormální tělesná hmotnost. Z oblasti techniky jsou známy postupy pro izolaci modulátorů hmotnosti a pro indukci anti-modulátorových protilátek, rovněž postupy pro stanovení anti-modulátorových protilátek a pro optimalizaci využití anti-modulátorových protilátek při vyšetřování cílových buněk.

Diagnostické využití mají dále polyklonální i monoklonální protilátky, léčiva regulující produkci nebo aktivitu modulátorů hmotnosti i jiné rekogniční faktory a/nebo jejich podjednotky. Tyto látky lze např. využít při detekci a/nebo kvantifikaci podmínek rozvinuté abnormální tělesné hmotnosti či rizikových podmínek pro její rozvoj. Například lze použít modulátorové peptidy nebo jejich aktivní fragmenty k vyvolání produkce polyklonálních i monoklonálních protilátek v řadě buněčných médií s využitím známých postupů, jako je například hybridomový postup, pracující např. s myšími slezinnými lymfocyty, fúzovanými s myelomovými buňkami. Tyto postupy jsou podrobněji popsány dále. Podobně lze nalézt či syntetizovat malé molekuly, napodobující nebo antagonizující aktivitu receptorových rekogničních faktorů předkládaného vynálezu a použít je v diagnostických a/nebo terapeutických postupech.

Přítomnost modulátorů hmotnosti lze potvrdit obvyklými imunologickými postupy. Existuje řada

detekovatelně označený, detekovatelně označenou protilátku ABi nebo detekovatelně označenou protilátku Ab₂. Tyto postupy lze shrnout do následujících rovnic, kde hvězdička znamená detekovatelně značení a „WM“ je modulátor hmotnosti:

A. WM* + Abj = WM*Abj

B. WM + Ab₂* = WMAb/

C. WM + Abi + Ab₂* = Ab]WMAb₂*

Zmiňované postupy a aplikace jsou v oblasti techniky známé a použitelné v rámci předkládaného 15 vynálezu. „Kompetitivní“ postup, postup A, je popsán v patentech US 3 654 090 a US 3 850 752.

Postup B představuje dobře známé kompetitivní testy. Postup C, „sendvičový“, je popsán v patentech RE 31,006 a US 4 016 043. Jiné vhodné postupy jsou „double antibody (dvojitá protilátka)“ nebo „DASP“.

Ve všech případech vytváří modulátor hmotnosti komplex s jednou nebo několika protilátkami či vazebnými partnery, přičemž jedna složka komplexu je detekovatelně značena. Vytvoření komplexu a případně jeho množství lze stanovit známými postupy na základě detekce značení.

Z výše uvedeného vyplývá, že charakteristickým rysem At^ je jeho reaktivita s Abi. Příčinou této 25 reaktivity je postup, při němž Ab] vypěstované na jednom savčím druhu, byly použity jako antigeny pro vyvolání produkce Ab₂ u jiného druhu. Například produkce Ab₂ byla vyvolána u koz s využitím králičích protilátek jako antigenů. Ab₂ jsou tedy proti—králičí protilátky, vypěstované na kozách. Pro účely popisu a nároků předkládaného vynálezu jsou Abi označovány jako primární protilátky nebo protilátky proti modulátoru hmotnosti a Ab₂ jsou označovány jako 30 sekundární nebo anti-Ab] protilátky.

Nejčastěji volené značení je radioaktivní, enzymové, UV-fluorescentními chemikáliemi, apod.

Je známa řada fluorescentních látek, vhodných pro značení. Jsou to například sloučeniny 35 fluorescein, rhodamin a auramin. Konkrétně anti-králičí protilátky, produkované na kozách, byly konjugovány přes izothiokyanát s fluoresceinem.

Pro modulátory hmotnosti nebo jejich vazebné partnery lze dále volit radioaktivní nebo enzymové značení. Radioaktivní značení je detekovatelně běžným scintilačním postupem. Výhodné 40 značení lze volit z izotypů ³H, ¹⁴C, ³²P, ³⁵S, ³⁶C1,^5lCr, ⁵⁷Co, ⁵⁸Co, ⁵⁹Fe, ⁹⁰Y, ¹²⁵1,¹³¹I a ¹⁸⁶Re.

Enzymové značení je rovněž vhodné a detekovatelně obvyklými postupy: kolorimetricky, spektrofotometricky, fluorospektrofotometricky, amperometricky nebo gasometricky. Enzym lze ke zvolené složce konjugovat pomocí „můstkové“ sloučeniny, jako je karbodiimid, diizokyanát, 45 glutaraldehyd apod. Pro tento postup existuje řada použitelných enzymů, vhodné jsou např.

peroxidáza, β-glukuronidáza, β-D-glukosidáza, β-D-galaktosidáza, ureáza, glukózová oxidáza s peroxidázou a alkalická fosfatáza. Alternativní značení a postupy jsou uvedeny v patentech US 3 654 090; US 3 850 752 a US 4 016 043.

V konkrétním provedení vynálezu byly připraveny testovací kity pro lékařské účely, určené k potvrzení nebo vyloučení předpokládané transkripční aktivity nebo předpokládané kapacity transkripční aktivity ve vyšetřovaných cílových buňkách. Podle uvedených testovacích postupů obsahuje kit minimálně značený modulátor hmotnosti nebo jinou složku komplexu, např. protilátku, specifickou k modulátoru hmotnosti, a návod k použití podle zvoleného testovacího postupu, např. „kompetitivní“, „sendvič“, „DASP“, apod. Kity mohou dále obsahovat okrajové reagencie, jako jsou pufry, stabilizátory, atd.

Testovací kity pro potvrzení nebo vyloučení předpokládané transkripční aktivity nebo předpokládané kapacity transkripční aktivity buněk, obsahují:

(a) předem stanovené množství alespoň jedné imunochemicky reaktivní složky, připravené přímým nebo nepřímým detekovatelným označením modulátoru hmotnosti nebo jeho vazebné složky;

(b) další reagencie; a (c) návod k použití kitu.

Diagnostický testovací kit konkrétně obsahuje:

(a) modulátor hmotnosti (nebo jeho vazebný partner) ve známém množství, jak je uvedeno výše, navázaný k pevnému nosiči za vzniku imunosorbentu, nebo alternativně navázaný k vhodnému koncovému produktu, nebo několika takovým koncovým produktům, atd. (nebo jejich vazebným partnerům), z každého jeden;

(b) případně jiné reagencie; a (c) návod k použití kitu.

Další možností je testovací kit, jak je uvedeno výše, který pracuje podle předem stanoveného postupu (např. „kompetitivní“, „sandvičový“, „double antibody“, atd.) a který obsahuje:

(a) značenou složku, získanou navázáním modulátoru hmotnosti na detekovatelnou sloučeninu;

(b) jednu nebo několik dalších imunoreagencií, z nichž alespoň jedna je ligand nebo imobilizovaný ligand, volený ze skupiny, obsahující:

(i) ligand, který může vázat značenou složku (a);

(ii) ligand, který může vázat vazebného partnera značené složky (a);

(iii) ligand, který může vázat alespoň jednu stanovovanou složku; a (iv) ligand, který může vázat alespoň jednoho vazebného partnera stanovované složky; a (c) návod pro detekci a/nebo stanovení jedné nebo několika složek imunochemické reakce mezi modulátorem hmotnosti a příslušným specifickým vazebným partnerem.

Diagnostika založená na nukleových kyselinách

Jak vyplývá z výše uvedeného, lze předkládaného nukleové kyseliny použít k detekci poruch, souvisejících s OB polypeptidem, které vedou k obézním fenotypům. Například proby nukleových kyselin lze použít (např. při northemové analýze nebo analýze RT-PCR) ke stanovení souvislosti obézního fenotypu s nedostatečnou expresí OB mRNA, nebo s expresí nefunkční OB mRNA, např. jako u myší DB/DB (kde příčinou poruchy je chybějící OB receptor), nebo ke zjištění, že mutace nepřepisuje mRNA. Navíc diagnostické postupy, založené na nukleových kyselinách předkládaného vynálezu, spolu s postupy, vycházejícími z protilátek, mohou napomoci dalšímu porozumění problematice obézního a anorektického fenotypu na molekulární úrovni.

Jak je zde uvedeno, byly stanoveny sekvence nedávno izolovaných klonů lidské cDNA. To zjednodušuje určení kompletní sekvence lidského genu (viz SEQ ID č. 22, obr. 20 (A až C)). Dále byly získány sekvence DNA intronů lidského OB genu (obr. 20) a použity k přípravě PCR primerů pro PCR amplifikaci kódující sekvence OB genu z lidské genomové DNA a pro identifikaci mutací nebo alelických variant OB genu. Postupy již byly podrobněji uvedeny výše. Konkrétní primery PCR pro amplifikaci lidské genomové OB DNA jsou uvedeny v příkladech.

-35 CZ 295018 B6

Podle současné hypotézy souvisí heterozygótní mutace OB genu s mímou/střední obezitou, zatímco homozygótní mutace souvisí podle několika diagnostických testů, založených na sekvenci DNA, s obezitou. Je-li tomu skutečně tak, umožní uvedený postup diagnostikovat pacienty s rizikem rozvoje obezity a včas zavést lékovou léčbu a/nebo změnu životního stylu, než se plně rozvine nárůst tělesné hmotnosti.

Alternativně lze pro diagnostiku využít mikrosatelity, segregující s mutantními formami lidského OB. Jsou to například různé PCR primery, včetně sekvencí, uvedených na obr. 20 (A až C).

OB gen lze rovněž využít pro stanovení kódované RNA a proteinu při diagnostice nutričních poruch. Důležité je zjistit, zdaje při určité nutriční poruše produkce OB RNA a/nebo kódovaného proteinu neregulována nebo snížena. Pokud je u obézní osoby zvýšená hladina OB, je problém dále, pokud je hladina snížena, může být toto příčinou obezity (ať už OB gen je či není defektní). Naproti tomu má-li pacient s rakovinou nebo AIDS, u něhož došlo k úbytku hmotnosti, zvýšené hladiny OB, lze vyvodit, že příčinou úbytku hmotnosti je nevhodně vysoká hladina exprese OB.

Při stanovení hladin lidské OB RNA lze použít klonovanou lidskou cDNA. Navíc lze připravit rekombinantní lidský protein a použít jej v imunotestu při stanovení OB proteinu v tuku a plazmě.

Terapeutické využití

Polypeptidy, nukleové kyseliny a protilátky předkládaného vynálezu mají významné terapeutické využití. Výhodně se podává terapeuticky účinné množství účinné látky ve farmaceuticky přijatelném nosiči, ředidle či excipientu.

Pojem „farmaceuticky přijatelný“ označuje látky a sloučeniny, které jsou fyziologicky tolerovány a nevyvolávají při podání pacientovi alergické nebo podobně nevhodné reakce, jako je nevolnost nebo závrať, apod. Pojem „farmaceuticky přijatelný“ výhodně znamená schválený regulačním federálním nebo státním úřadem nebo zahrnutý v seznamu U.S. Pharmacopeia či jiném všeobecně uznávaném lékopise pro zvířata a zejména pro lidi. Výraz „nosič“ zahrnuje ředidlo, adjuvans, excipient nebo přísadu, v nichž je účinná sloučenina podávána. Farmaceutickými nosiči jsou sterilní kapaliny, jako je voda a oleje, včetně olejů ropného, živočišného, rostlinného či syntetického původu, např. arašídový olej, sójový olej, minerální olej, sezamový olej, apod. Výhodnými nosiči, zejména pro injekční použití, jsou voda, roztoky, solné roztoky, vodná dextróza a glycerolové roztoky. Vhodné farmaceutické nosiče jsou popsány v Martin, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. vyd., Mack Publishing Co., Easton, PA, (1990).

Vyjádření „terapeuticky účinné množství“ je zde užíváno ve smyslu dostatečné množství, které sníží nejméně z 15 %, výhodně z 50 %, výhodněji z 90 % a nejvýhodněji zcela předejde klinicky významné nedostatečnosti v aktivitě, funkci a reaktivitě pacienta. Alternativně terapeuticky účinné množství je takové množství, které postačuje ke zlepšení klinicky významného stavu pacienta.

Podávání rekombinantního polypeptidu vede k úbytku hmotnosti, zejména k úbytku tukových tkání. OB polypeptid se připravuje pomocí standardních bakteriálních a/nebo savčích expresních vektorů, synteticky nebo purifikací z plazmy nebo séra, jak již bylo uvedeno dříve. Alternativně lze indukovat vyšší expresi přirozeného OB polypeptidu homologními rekombinantními postupy, jak již bylo rovněž uvedeno.

Snížení aktivity OB polypeptidu (působením antagonistů, inhibitorů, neutralizujících protilátek nebo anti-sense molekul) by mělo vést k přírůstku hmotnosti, jak je vhodné například při léčbě úbytku hmotnosti při rakovině, AIDS nebo mentální anorexii. Modulaci aktivity OB lze využít jak pro snížení tělesné hmotnosti (zvýšením aktivity), tak pro zvýšení tělesné hmotnosti (snížením aktivity).

-36CZ 295018 B6

Terapie využívajícípolypeptidy

Zjednodušeně lze tvrdit, že OB gen určuje tělesnou hmotnost savců, konkrétně myší a lidí. Produkty OB genu a příbuzné molekuly jsou součástí signální komunikační cesty mezi adipózní tkání a mozkem a dalšími orgány. Lze předpokládat, že OB polypeptid je sám o sobě signální molekulou, tj. hormonem.

OB polypeptid, jeho funkční fragmenty nebo antagonisté mohou být podávány perorálně nebo parenterálně, výhodně parenterálně. Protože metabolická homeostáza probíhá kontinuálně, je výhodné podávat OB polypeptid ve formě léčiva s řízeným uvolňováním. Polypeptid lze například podávat intravenózní infuzi, pomocí implantované osmotické pumpy, transdermální náplastí, v lipozomech, apod. V konkrétním provedení vynálezu byla použita pumpa [Langer et al., vyd., Medical Applications of Controlled Release, CRC Pres., Boča Raton, Florida (1974); Sefton, CRC Crit. Biomed. Eng., 14:201 (1987); Bichwald et al., Surgery, 88:507 (1980); Saudek et al., N. Engl. J. Med., 321:574 (1989)]. V jiném provedení byly zvoleny polymerní materiály [Langer et al., vyd., Medical Applications of Controlled Release, CRC Pres., Boča Raton, Florida (1974); Sefton, CRC Crit. Biomed. Eng., 14:201 (1987); Smolen et al., vyd., Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Wiley, New York (1984); Ranger et al., J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem., 23:61 (1983); Levý et al., Science, 228:190 (1985); During et al., Ann. Neurol., 25:351 (1989); Howard et al., J. Neurosurg., 71:105 (1989)]. V jiném provedení byl systém s řízeným uvolňováním umístěn do blízkosti terapeutického cíle, např. v případě mozku je dostačující pouze zlomek systémové dávky [Goodson, Medical Applications of ControlledRelease, díl 2, str. 115-138 (1984)]. Další systémy s řízeným uvolňováním léčiva jsou diskutovány v přehledném článku [Langer, Science 249:1527-1533 (1990)]. Podle jiného provedení byla terapeuticky účinná látka podávána ve vezikule, konkrétně v lipozomu [Langer, Science 249:1527-1533 (1990); Treat et al., Liposomes in the Therapy oflnfectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein a Fidler vyd., Liss, New York, str. 353-365 (1989); Lopez-Berestein a Fidler vyd., Liss, New York, str. 317-327 (1989); Lopez-Berestein a Fidler vyd., Liss, New York, (1989)].

Podle jiného přístupu byly pacientovi s nedostatkem OB polypeptidu transplantovány rekombinantní buňky, transformované OB genem, s vysokou hladinou exprese OB polypeptidu. Kvůli zabránění rejekci je výhodné transplantovat autologní buňky, transformované OB genem; nebo alternativně vypracovat postup ochrany, při němž neautologní buňky produkují rozpustné faktory uvnitř polymerní matrice, která je ochraňuje před rozpoznáním imunitním aparátem arejekcí.

OB polypeptid lze podávat intravenózně, intraarteriálně, intraperitoneálně, intramuskulárně nebo subkutánně. Alternativně lze OB polypeptid ve vhodném přípravku podávat nazálně či perorálně. Konstantní dodávání OB polypeptidu lze zajistit poskytováním terapeuticky účinné dávky (tj. dávky, která účinně indukuje metabolické změny u pacienta) v nutných intervalech, např. denně, po 12 hodinách, atd. Podmínky podávání záleží na vážnosti stavu léčeného onemocnění i jiných okolnostech, např. předepsané dietě, hmotnosti, věku, pohlaví apod., jak stanoví ošetřující lékař podle standardní lékařské praxe.

Farmaceutické přípravky

Předkládaný vynález se dále týká farmaceutických přípravků, které obsahují výše uvedené účinné sloučeniny. Farmaceutické přípravky jsou určeny na injekční, perorální, pulmonální, nazální i jiné formy podávání. Vynález zahrnuje přípravky, obsahující účinné množství proteinových produktů předkládaného vynálezu nebo jejich derivátů a farmaceuticky přijatelná ředidla, konzervační činidla, solubilizátory, emulzifíkátory, adjuvans a/nebo nosiče. Přípravky obsahují ředidla s různými pufry (např. Tris-HCl, acetátový, fosfátový), o různém pH a iontové síle; aditiva, jako jsou detergenty a solubilizátory (např. Tween 80, Polysorbate 80), anti-oxidanty (např. kys. askorbová, metabisulfit sodný), konzervační činidla (např. Thimersol, benzylalkohol)

-37CZ 295018 B6 a plnidla (např. laktóza, mannit). Složky přípravků lze inkorporovat jak ve formě částic do polymerních sloučenin, jako jsou polymemí kys. mléčná, polyglykolová, atd., nebo do lipozomů. Rovněž lze použít kys. hylauronovou. U takovýchto přípravků lze ovlivňovat fyzikální vlastnosti a stabilitu, řídit rychlost uvolňování léčiva nebo odstraňování nadbytečných proteinů a derivátů in vivo. Viz Martin, Remingtonů PharmceuticalSciences, 18. vyd., Mack Publishing Co., Easton, PA, 18042 (1990) str. 1435-1712. Přípravky mohou mít formu kapalin nebo prášků např. lyofilizátů.

Perorální podávání

Perorální pevné dávkové formy, vhodné pro předkládané účely, jsou obecně popsány v kap. 89, Martin, Remingtonů Pharmaceutical Sciences, 18. vyd., Mack Publishing Co., Easton, PA, 18042 (1990). Pevné lékové formy jsou tablety, kapsle, dražé, trošé a pastilky, tobolky nebo peletky. Předkládané přípravky lze rovněž enkapsulovat do proteinů (jako jsou např. protenoidní mikrosféry popsané v patentu US 4 925 673). Rovněž lze použít lipozomální enkapsulaci, případně lipozomy derivatizovat různými polymery (např. patent US 5 013 556). Vhodné pevné lékové formy jsou popsány v Marshall, Modem Pharmaceutics, kap. 10, Bankéř a Rhodes (ed.), (1979). Přípravky obvykle obsahují protein (nebo chemicky modifikovaný protein) a inertní přísady, které ochraňují biologicky účinné látky před žaludečním prostředím a uvolňují je ve střevě.

Specifický význam mají perorální lékové formy derivatizovaných proteinů. Protein lze chemicky modifikovat s ohledem na účinnost při perorálním podávání. Chemickou modifikací se obvykle rozumí navázání nejméně jedné chemické skupiny na molekulu proteinu (nebo peptidu), přičemž tato chemická skupina (a) inhibuje proteolýzu a (b) umožňuje přechod léčiva z žaludku nebo střeva do krve. Žádoucí vlastností je rovněž zvýšená stabilita proteinu a prodloužená doba setrvání v tělesném oběhu. Příkladem vhodných skupin jsou: polyethylenglykol, kopolymery ethylenglykolu s propylenglykolem, karboxymethylcelulóza, dextran, polyvinylalkohol, polyvinylpyrrolidon a polyprolin [Abuchowski et al., „Soluble Polymer-Enzyme Adducts“ v Enzymes as Drugs, str. 367-383, Holcenberg, Roberts vyd., Wiley-Interscience, New York, NY, (1981); Newmark et al., J. Appl. Biochem., 4:185-189 (1982). Jiné použitelné polymery jsou např. poly-1,3dioxolan a poly-l,3,6-trioxocan. Pro farmaceutické účely jsou výhodné chemické skupiny na bázi polyethylenglykolu.

Protein (nebo jeho derivát) může být uvolňován v žaludku, v tenkém střevě (duodenum, jejunum, ileum) nebo tlustém střevě. Odborník v oboru zná receptury přípravků, které nejsou rozpustné v žaludku a přitom uvolňují složky v duodenu nebo kdekoli jinde ve střevě. Uvolňované léčivo je výhodné před ničivým žaludečním prostředím chránit, ať už na úrovni samotného proteinu (nebo derivátu) nebo směrováním uvolňování biologicky aktivních látek mimo žaludeční prostředí, např. do střeva.

Úplnou ochranu před žaludečním prostředím zajistí potahování obalem, nepropustným od pH 5,0. Běžné inertní složky enterosolventních obalů jsou například celulóza acetát trimellitát (CAT), hydroxypropylmethylcelulóza ftalát (HPMCP), HPMCP 50, HPMCP 55, polyvinylftalát (PVAP), Eudragit L30D, Aquteric, celulóza acetát ftalát (CAP), Eudragit L, Eudragit S a Shellac. Tyto potahy lze použít jako směsné filmy.

Potahy nebo směsné potahy lze též aplikovat na tablety, ale v tomto případě potahy neplní funkci ochrany v žaludečním prostředí. Jsou na bázi cukerné, nebo usnadňují polykání. Kapsle s tvrdým obalem (např. želatina) slouží pro práškové formy léčiva, kapsle s měkkým želatinovým obalem jsou vhodné pro kapalné formy léčiva. Obal tobolek může být tvořen silnou vrstvou škrobu nebo jiného požívátelného papíru. Pro dražé, pastilky, formované nebo rozmělněné tablety lze použít postupy agregace za vlhka.

-38CZ 295018 B6

Terapeuticky účinná látka může být v přípravku obsažena jako jemné částice ve formě granulí nebo peletek o velikosti 1 mm. Přípravek lze tedy podávat jako prášek uzavřený v kapslích, jako lehce komprimované čípky i jako tablety. Lékovou formu lze připravit komprimací.

Přípravek dále může obsahovat barviva a aromatické přísady. Například protein (nebo derivát) v lékové formě (např. v lipozomu nebo v mikrosférách) může být složkou poživatelného výrobku, jako je např. chlazený nápoj, obsahující barviva a aromatické přísady.

Rovněž lze léčivo zředit nebo zvětšit jeho objem inertním materiálem. Vhodnými ředidly jsou uhlovodíky, zejména mannit, α-laktóza, bezvodá laktóza, celulóza, sacharóza, modifikované dextrany a škrob. Jako plnidla lze použít také některé anorganické soli, jako fosforečnan vápenatý, uhličitan hořečnatý a chlorid sodný. Komerčně dostupná ředidla jsou Fast-Flo, Emdex, STARx 1500, Emcompress a Avicell.

Pevné lékové formy mohou obsahovat dezintegrátory. Vhodnými dezintegrátory jsou například, ne výhradně, škrob i komerční dezintegrátor na bázi škrobu Explotab. Rovněž lze použít sodnou sůl škrobového glykolátu, Amberlit, sodnou sůl karboxymethylcelulózy, ultramylopektin, alginát sodný, želatinu, pomerančové slupky, kyselou karboxymethylcelulózu, přírodníhoubu a bentonit. Jiným typem dezintegrátorů jsou nerozpustné kationtové ionexové pryskyřice. Jako dezintegrátory a pojivá lze rovněž použít práškové pryskyřice, jako např. agar, Karaya nebo tragant. Jako dezintegrátory je také vhodná kys. alginová a její sodná sůl.

Jako pojivá, zpevňující tvar pevných tablet, lze do terapeutického přípravku začlenit přírodní materiály, jako je arabská guma, tragant, škrob a želatina. Jinými vhodnými pojivý jsou methylcelulóza (MC), ethylcelulóza (EC) a karboxymethylcelulóza (CMC). Při granulaci přípravku se používají alkoholické roztoky polyvinylpyrrolidonu (PVP) a hydroxypropylmethylcelulózy (HPMC).

Přípravek může dále obsahovat činidla, snižující tření, která zabraňují lepivosti lékových forem během výroby. Přípravek lze od povrchu matrice oddělit vrstvou maziva, jako jsou, ne výhradně, kys. stearová a její hořečnaté či vápenaté soli, polytetrafluorethylen (PTFE), kapalný parafín, rostlinné oleje a vosky. Rovněž vhodná jsou rozpustná maziva jako laurylsulfát sodný, laurylsulfát hořečnatý, polyethylenglykol o různých molekulových hmotnostech a Carbowax 4000 a 6000.

Přípravek může dále obsahovat glidanty, tj. činidla zlepšující tekutost a uspořádání prášků při komprimaci lékových forem během výroby. Vhodnými glidanty jsou škrob, talek, pyrogenní křemík a hydratovaný hlinitokřemičitan.

Jako zvlhčovadlo, usnadňující rozpustnost přípravku ve vodném prostředí, lze použít povrchově aktivní látky. Jsou to např. aniontové detergenty laurylsulfát sodný, dioktylsulfosukcinát sodný a dioktylsulfonát sodný; kationtové detergenty benzalkonium chlorid nebo benzethomium chlorid. Jako povrchově aktivní látky lze dále použít neiontové detergenty, jako jsou lauromacrogol 400, polyoxyl 40 stearát, polyoxyethylen hydrogenovaný kastorový olej 10, 50 a 60, glycerol monostearát, polysorbát, 40, 60, 65 a 80, estery sacharózy s mastnými kyselinami, methylcelulóza a karboxymethylcelulóza. Povrchově aktivní látky mohou být v přípravcích, obsahujících protein nebo jeho derivát, použity individuálně i ve směsích o různých poměrech.

Přísadami, které zvyšují vstřebávání proteinu (nebo derivátu), jsou například mastné kyseliny, jako kyselina olejová, linolová a linolenová.

V případě přípravku s regulovaným uvolňováním léčívaje vhodné léčivo inkorporovat do inertní matrice, která jej uvolňuje buď difúzí nebo vyluhováním, např. do pryskyřice. Přípravek může rovněž být obsažen v matrici, která je pomalu degradována. Jiný způsob regulace uvolňování léčiva je založen na Oros terapeutickém systému (Alza Corp.), tj. léčivo je uzavřeno v semipermeabilní membráně, která dovnitř propouští vodu a díky osmóze uvolňuje malými otvory molekuly léčiva. Některé enterosolventní potahy rovněž zpomalují uvolňování léčiva.

-39CZ 295018 B6

Pro přípravek lze volit i jiné potahové materiály, například cukry, používané v potahovacích pánvích. Léková forma může dále mít podobu tablety, potažené filmem; vhodné potahové materiály jsou v tomto případě dvou typů. Neenterosolventní potahy jako methylcelulóza, ethylcelulóza, hydroxyethylcelulóza, methylhydroxy-ethylcelulóza, hydroxypropylcelulóza, hydroxypropylmethylcelulóza, sodná sůl karboxy-methylcelulózy, povidon a polyethylenglykoly; druhým typem potahů jsou enterosolventní potahy, např. běžné estery kyseliny ftalové.

Optimálních vlastností potahu lze dosáhnout směsnými materiály. Potahování filmem lze provést v potahovací pánvi, ve fluidním loži nebo kompresním postupem.

Pulmonální podávání

Předkládané proteiny (i deriváty) lze dále podávat plicní cestou. Protein (nebo derivát) je inhalován do plic savců a skrze plicní epitel dopravován do krve. Odkazy na pulmonální podávání léčiv: Adjei et al., Pharmaceutical Research, 7(6): 565-569 (1990); Adjei et al., Intemational Jounal of Pharmaceutics, 63:135-144 (1990) (leuprolid acetát); Braquet et al., Journal of Cardiovascular Pharmacology, 13(suppl. 5):143-146 (1989) (endothelin-1); Hubbard et al., Annals oflnternal Medicine, 3(3):206-212 (1989) (αΐ-antitrypsin); Smith et al., J. Clin Invest., 84:1145-1146 (1989) (αΐ-proteináza); Oswein et al., „Aerosolization ofProteins“,Proceedings of Symposium on Respirátory Drug Delivery II, Keystone, Colorado, (březen 1990) (rekombinantní lidský růstový hormon); Debs et al., J. Immunol., 140:3482-3488 (1988) a Platz et al., U.S. Patent č. 5 284 656 (faktor stimulující kolonie granulocytů). Z praktického hlediska lze pro podávání předkládaných přípravků jmenovat nejrůznější mechanická zařízení pro pulmonální aplikaci léčiv, jako jsou například, ne výhradně, nebulizátory, dávkovači inhalátory a práškové inhalátory, odborníkům v oboru známé.

Komerčně dostupná zařízení, vhodná pro předkládaný vynález, jsou nebulizátor Utravent, vyráběný firmou Mallinckrodt, lne., St. Louis, Missouri; nebulizátor Acom II, vyráběný firmou Marquest Medical Products, Englewood, Colorado; dávkovači inhalátor Ventolin, vyráběný firmou Glaxo lne., Research Triangle Park, North Carolina; a práškový inhalátor Spinhaler, vyráběný firmou Fisons Corp., Bedford, Massachusetts.

Všechna uvedená zařízení vyžadují přípravky, které umožňují rozptylování proteinu (nebo derivátu). Každý typ zařízení vyžaduje specifický přípravek, který vedle běžně používaných ředidel, adjuvans a/nebo nosičů obsahuje vhodnou nosnou látku. Při tomto způsobu podávání lze použít i lipozomy, mikrokapsle i mikrosféry, inkluzní komplexy i jiné typy nosičů. Proteiny lze také chemicky modifikovat podle typu přípravku nebo zvoleného zařízení pro aplikaci.

Přípravky, určené pro nebulizátory, vystřikovací i ultrazvukové, typicky obsahují protein rozpuštěný ve vodě v koncentraci 0,1 až 25 mg biologicky aktivního proteinu v 1 ml roztoku. Přípravek může dále obsahovat pufr a jednoduchý cukr (např. pro stabilizaci proteinu a regulaci osmotického tlaku). Přípravky pro nebulizátory též mohou obsahovat povrchově aktivní látku, která snižuje nebo brání povrchově indukovanému shlukování proteinu při rozprašování roztoku na aerosol.

Přípravky, určené pro dávkovači inhalátory, obvykle obsahují jemný prášek proteinu (nebo derivátu), suspendovaný v nosném prostředí za pomoci povrchově aktivní látky. Nosné prostředí může být libovolný běžně používaný materiál, jako jsou směsné plně chlorované a fluorované uhlovodíky, směsné chlorované a fluorované uhlovodíky, fluorované uhlovodíky, uhlovodíky, včetně trichlorfluormethanu, dichlordifluormethanu, dichlortetrafluorethanolu a 1,1,1,2-tetrafluorethanu a jejich směsi. Vhodné povrchově aktivní látky jsou trioleát kys. sorbové a sójový lecithin. Vhodnou povrchově aktivní látkou je též kys. olejová.

Přípravky určené pro rozptylování z práškového inhalátoru obsahují jemný prášek proteinu (nebo derivátu) a plnivo, jako je laktóza, sorbit, sacharóza nebo mannit v množství, usnadňujícím

-40CZ 295018 B6 rozptylování prášku z přístroje., např. 50 až 90 % hmotn. přípravku. Je výhodné připravit protein (nebo derivát) ve formě malých částic o průměrné velikosti do 10 pm, z hlediska nej efektivnějšího dosažení vzdálených plicních laloků nejvýhodněji o velikosti 0,5 až 5 pm.

Nazální podáváni

Předkládané přípravky lze podávat i nazální cestou. Nazální podávání umožňuje přechod proteinu do krve přímo po aplikaci do nosu, bez ukládání produktu v plicích. Mezi přípravky, určené pro nazální podávání, jsou přípravky, obsahující dextran nebo cyklodextran.

Způsoby léčby, způsoby přípravy léčiva

Předkládaný vynález se dále týká léčebných postupů a způsobů přípravy léčiv. Podávání předkládaných derivátů může zmírnit či upravit některé zdravotní stavy pacientů, jak je uvedeno dále.

Dávkování

Informace o dávkování všech výše uvedených molekul vyplývají z pokračujících studií, týkajících se dávkování v různých podmínkách a pro různé pacienty, takže zkušený lékař bude schopen stanovit vhodné dávkování v souvislosti s celkovým postupem léčby, s ohledem na věk a celkový zdravotní stav pacienta. Injekční či infuzní dávky se zpravidla pohybují v rozmezí 0,01 pg až 10 mg biologicky účinného proteinu na 1 kg tělesné hmotnosti (hmotnost se vztahuje k samotnému nemodifikovanému proteinu). Rozvrh dávkování je variabilní a závisí na poločasu proteinu nebo derivátu v oběhu, na typu dávkování (jde-li o velké jednorázové množství či o kontinuální infuzi) a na zvoleném přípravku.

Podáváni společně s jinými sloučeninami

Při terapii obezity lze podávat předkládané proteiny (nebo deriváty) spolu s jedním či několika dalšími farmaceutickými přípravky, určenými na léčbu klinických komplikací obezity, jako jsou přípravky na léčbu diabetes (např. inzulín), vysokého krevního tlaku, zvýšené hladiny cholesterolu a dalších nepříznivých stavů, souvisejících s obezitou. Rovněž lze spolu s předkládanými proteiny podávat látky, potlačující chuť k jídlu, např. amfetaminy. Podávání může být simultánní (např. podávání směsi předkládaného proteinu s inzulínem) nebo oddělené.

Terapie využívající nukleové kyseliny

Genovou terapii obezity lze vyvolat zavedením OB genu do lidských tukových buněk. Lze předpokládat že povede ke snížení tělesné hmotnosti. Naopak zavedení anti-sense konstruktů do lidských tukových buněk by mělo snížit hladinu aktivního OB polypeptidu a zvýšit tělesnou adipozitu.

V konkrétním provedení vynálezu byl gen kódující OB polypeptid vnesen in vivo do virového vektoru. Takovéto vektory obsahují DNA oslabených nebo defektních virů, jako jsou např., ne výhradně, herpes simplex virus (HSV), papillomavirus, Epstain-Barrové virus (EBV), adenovirus, adeno-asociovaný virus (AAV), apod. Výhodné jsou defektní viry, které zcela nebo téměř neobsahují virové geny. Defektní virus není po vnesení do buňky infekční. Proto lze podávat vektory defektních virů specificky do buněk ve vybraných oblastech, bez obav z možné infekce dalších buněk. Účinek lze tedy specificky zaměřit na adipózní tkáně. Příkladem konkrétních vektorů jsou, ne výhradně, vektor z defektního herpes viru 1 (HSV1) [Kaplitt et al., Molec. Cell. Neurosci., 2:320-330 (1991)], vektor z oslabeného adenovirů, např. vektor popsaný v StratfordPerricaudet et al., J. Clin. Invest., 90:626-630 (1992) a vektor z defektního adeno-asociovaného viru [Samulski etal., J. Virol., 61:3096-3101 (1987); Samulski etal., J. Virol., 63:3822-3828 (1989)].

V jiném provedení vynálezu byl gen zaveden do vektoru retroviru, např. Anderson et al., patent US 5 399 346; Mann et al., Cell, 33:153 (1983); Temin et al., patent US 4 650 764; Temin et al.,

-41 CZ 295018 B6 patent US 4 980 289; Markowitz et al., J. Virol., 62:1120 (1988); Temin et a/.,patent US 5 124 263; Mezinárodní patentová přihláška č. WO 95/07358, vyd. 16. 3. 1995, Dougherty et al.; Kuo et al., Blood, 82:845 (1993).

Alternativně lze vektory in vivo zavádět lipofekcí. V posledních deseti letech se rozšířilo používání lipozomů pro enkapsulaci a transfekci nukleových kyselin in vitro. Syntetické kationtové lipidy, naplánované tak, aby snižovaly obtíže a rizika spojená s lipozomálně mediovanou transfekci, byly použity k přípravě lipozomů pro in vivo transfekci genu, kódujícího markér [Felgner et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 84:7413-7417 (1987); Mackey et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 85:8027-8031 (1988)]. Kationtové lipidy napomáhají enkapsulaci nukleových kyselin s negativním nábojem a usnadňují průchod negativně nabitými buněčnými membránami [Felgner et al., Science, 337:387-388 (1989)]. Vnášení exogenních genů do určitých orgánů lipofekcí in vivo přináší praktické výhody. Výhodná je možnost molekulárního nasměrování lipozomů do konkrétních cílových buněk. Je zřejmé, že nasměrování transfekce do konkrétních typů buněk je zejména výhodné v heterogenních buněčných tkáních, jako jsou slinivka, játra, ledviny a mozek. Pro účely cíleného účinku lze lipidy chemicky navázat k jiným molekulám Mackey et al., Proč. Nati. Acad. sci. USA, 85:8027-8031 (1988)]. Lipidy lze chemicky navázat k cíleným peptidům, např. hormonům nebo neurotransmiterům, proteinům, např. protilátkám, nebo nepeptidickým molekulám.

Dále lze vektor zavádět in vivo jako nahý DNA plazmid. Nahé DNA vektory pro genovou terapii se do cílových hostitelských buněk zavádějí známými postupy oblasti techniky, jako jsou např. transfekce, elektroporace, mikroinjekce, transdukce, buněčná fúze, DEAE dextran, kalcium fosfátová precipitace, genová puška, nebo přenašeč DNA vektoru [Wu et al., J. Biol. Chem., 267:963-967 (1992); Wu et al., J. Biol. Chem., 263:14621-14624 (1988); Hartmut et al., kanadská patentová přihláška č. 2 012 311, podaná 15. 3. 1990].

Zemědělské využití

OB gen lze rovněž izolovat z domácích zvířat a následně získat odpovídající OB polypeptid. Podle níže uvedeného příkladu proba, odvozená od myšího OB genu, hybridizuje s odpovídajícími kódujícími sekvencemi řady živočišných druhů. Podobně jako u humánní terapie lze připravit rekombinantní proteiny, určené pro domácí zvířata. Podáváním polypeptidů chovným zvířatům lze dosáhnout výroby libovolnějšího masa, např. hovězího, vepřového, drůbežího, skopového, atd. Výhodnější je podávání autologního polypeptidů, i když předkládaný vynález uvažuje i podávání neautologního polypeptidů. Vzhledem ktomu, že OB polypeptid obsahuje přibližně 160 aminokyselinových zbytků, nemusí být příliš imunogenní. Podávání neautologního polypeptidů by tedy nemuselo vyvolávat imunitní odezvu.

Alternativně zavedení klonovaných genů do transgenních domácích zvířat může při nadměrné expresi OB transgenu vést k podstatnému snížení tělesné hmotnosti a adipozity. Nejjednodušším prostředkem k dosažení tohoto cíle je nasměrování OB transgenu do tukové tkáně s využitím jeho vlastního promotoru nebo jiného promotoru, specifického pro tukovou tkáň.

Naopak v některých případech, jako např. při výrobě hovězího „Kobe beef“ nebo tučných jater na přípravu paštiky, je žádoucí zvýšené množství tělesného tuku. Toho lze dosáhnout cílením antisense OB transgenu do tukových tkání, nebo využitím knockoutové genové technologie. Alternativně lze zvýšení podílu tuku vyvolat podáním inhibitoru nebo antagonisty OB polypeptidů. Mezi inhibitory a antagonisty patří, ne výhradně, protilátky, reagující s polypeptidem a fragmenty polypeptidů, které se váží k OB receptorů, ale nevedou k aktivaci, tj. antagonisté OB polypeptidů.

Kosmetické využití

OB polypeptid má vedle terapeutického využití i zvláštní význam z kosmetického hlediska. Díky tomu, že OB polypeptidy předkládaného vynálezu, jejich deriváty a agonistní analogy mohou

-42CZ 295018 B6 modulovat rychlost ukládání tuku a jeho množství u zvířat, lze jimi vyvolat zmenšení nevzhledných tukových tkání, např. tukových zásob na břiše, bocích, stehnech, krku a bradě, které nemusí nezbytně souviset se sklonem k obezitě, ale nicméně poškozují vzhled. Snížení hmotnosti je částečně vyvoláno zmenšením chuti k jídlu, tj. zmenšeným příjmem potravy, zvýšením bazálního metabolizmu, nebo oběma způsoby. Proto lze podáváním předkládaného polypeptidu, jeho derivátů nebo agonistních analogů vyvolat kosmetické změny v tukových tkáňových depozitech, ať už modulací ukládání tuku, nebo snížením chuti kjídlu nebo oběma způsoby.

Předkládané přípravky a postupy použití mohou být součástí různých dalších postupů, např. kosmetické chirurgie, ovlivňující celkový vzhled (jako je např. liposukce nebo laserová chirurgie, snižující tělesnou hmotnost odsáváním nebo odnímáním tukové tkáně), tělocviku (zejména běh a vzpírání), nízkokalorické diety, hypnózy, biofeedback, což jsou příklady cest, kterými lze snižovat podíl tukové tkáně a zlepšovat tělesný vzhled.

Předkládaný vynález se tedy týká způsobů, ovlivňujících kosmetickou modulaci tukových tkání, které zahrnují podávání modulačního množství OB polypeptidu nebo jeho derivátu či agonistního analogu jedinci, který si přeje kosmeticky modulovat tukové tkáně a zlepšit svůj tělesný vzhled. Modulace tukové tkáně je do určité míry ovlivněna sníženou chutí k jídlu. Výhodná je modulace, zmenšující tukové tkáně.

Podle dalšího provedení se vynález týká způsobu vyvolání kosmetického úbytku tukové tkáně, který kombinuje postupy, ovlivňující změnu tělesného vzhledu s podáváním modulačního množství OB polypeptidu nebo jeho derivátu či agonistního analogu jedinci, který si přeje kosmeticky modulovat tukové tkáně a zlepšit svůj tělesný vzhled.

OB receptor

Vývoj malých agonistních a antagonistních molekul OB faktoru lze výrazně usnadnit po izolaci příslušného receptoru. Pro izolaci příslušného receptoru je nutné připravit aktivní OB polypeptid a na jeho základě prohledat standardním postupem expresní knihovnu. Vazba na receptor v expresní knihovně se testuje podáním rekombinantního polypeptidu, vyprodukovaného bakteriálními nebo savčími expresními vektory, buňkám expresní knihovny a sledováním účinků krátkodobého i kontinuálního podávání, nebo přímo detekováním vazby OB polypeptidu k buňkám.

Protože se v současné době obecně předpokládá, že se OB receptor nachází v hypotalamu a možná v játrech, je výhodné konstruovat cDNA knihovnu standardních expresních klonovacích vektorů zejména z těchto tkání. Klony cDNA se dále společně vnesou do COS buněk a mezi výslednými transformovanými buňkami se COS buňky, exprimující OB receptor, vyhledají pomocí testu s aktivním ligandem. Z vyizolovaných pozitivních klonů lze pak získat OB receptor. Nakloňovaný receptor se dále využívá spolu s OB ligandem (pravděpodobně jde o hormon) k vývoji dalších složek, nezbytných pro vyhledávání malých molekul modulátorů OB.

Zvláštní testovací systém, vhodný pro předkládaný vynález, je znám jako receptorový test. V tomto testu je testovaný materiál příslušně označen a testované buněčné kolonie naočkovány určitým množstvím značeného i neznačeného materiálu. Poté se provedou vazebné studie, stanovující rozsah navázání značeného materiálu k buněčným receptorům. Postup umožňuje stanovit rozdíly v afinitě materiálů.

Vazebné studie se tedy provádějí na určitém množství puntíkovaného modulátoru hmotnosti, kombinovaného např. s protilátkami nebo inhibitory. Jsou připraveny roztoky, obsahující různá množství značeného a neznačeného nekombinovaného modulátoru hmotnosti, dále jsou naočkovány buněčné vzorky a inkubovány. Výsledný buněčný jednovrstevný porost je pak opláchnut, rozpuštěn a počítán na gama počítadle po dobu, postačující k výsledné chybě < 5 %. Na získaných datech je provedena Scatchardova analýza, z níž lze vyvodit závěry, týkající se aktivity materiálů. Tento uvedený příklad ilustruje způsob provedení a použití receptorového testu, kdy

-43 CZ 295018 B6 vazebná schopnost testovaného materiálu k buňkám slouží jako rozlišující rys. Na druhé straně může být receptorový test velmi užitečný pro identifikaci specifických receptorů pro předkládané modulátory, např. DB receptorů.

Další vhodný test, uvažovaný v souvislosti s předkládaným vynálezem, je znám jako „cis/trans“ test. Stručně, tento test pracuje s dvěma genetickými konstrukty, jeden je obvykle plazmid, který po transfekci do zvolené buněčné linie kontinuálně exprimuje určitý studovaný receptor, a druhý konstrukt je plazmid, exprimující pod kontrolou komplexu receptor/ligand referenční látku, jako je např. luciferáza. Pokud je tedy např. určitá sloučenina hodnocena z hlediska schopnosti ligandové vazby k určitému receptorů, je jedním konstruktem plazmid, exprimující ve zvolené buněčné linii tento receptor, a druhý plazmid obsahuje promotor, operativně připojený k luciferázovému genu, přičemž do tohoto promotoru se již dříve začlení prvek, reagující na studovaný receptor. Pokud je testovaná sloučenina agonistou receptorů, bude ligand s receptorem vytvářet komplex a tento komplex vazbou k reagujícímu prvku bude iniciovat transkripci luciferázového genu. Výslednou chemiluminiscenci lze stanovit fotometricky a křivku dávkové závislosti přirovnat ke křivkám známých ligandů. Postup tohoto testu je podrobně uveden v patentu US

981 784 a mezinárodní publikaci PCT č. WO 88/03168.

Jakmile je identifikována rekombinanta, exprimující sekvenci genu pro OB receptor, lze analyzovat rekombinantní OB receptor. Analýzu lze provést na základě fyzikálních nebo funkčních vlastností OB receptorů, včetně radioaktivního značení receptorů a následné gelové elektroforézy, imunotestu, ligandové vazby, atd. Rovněž lze generovat protilátky k OB receptorů, jak již bylo výše uvedeno.

Strukturu OB genu lze analyzovat různými postupy oblasti techniky. Je výhodné analyzovat strukturu různých domén, zejména OB vazebného místa. Strukturní analýzu lze provést stanovením sekvenční podobnosti s jinými známými proteiny, zejména hormony a receptory proteinů. Stupeň podobnosti (nebo homologie) může být podkladem pro předpověď struktury a funkce OB receptorů, nebo jeho domény. V konkrétním provedení vynálezu bylo provedeno sekvenční porovnání se sekvencemi GenBanky s pomocí např. programů FASTA a FASP [Pearson et al. Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 85:2444-48 (1988)].

Sekvenci proteinu lze dále charakterizovat pomocí analýzy hydrofility [např. Hopp et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 78:3824 (1981)]. Z profilu hydrofility vyplývají hydrofobní a hydrofilní oblasti OB receptorového proteinu a následně extracytoplazmatické, vazebné membránové a intracytoplazmatické oblasti.

Dále lze provést analýzu sekundární struktury [např. Chou et al., Biochem., 13:222 (1974)], která umožní určit oblasti OB receptorů, určující specifické sekundární strukturní rysy.

využitím počítačových programů, dostupných v oblasti techniky, lze rovněž provést manipulaci, translaci a předpověď sekundární struktury stejně jako předpověď i zakreslení otevřeného čtecího rámce.

Předkládaný vynález poskytuje hojný zdroj OB polypeptidů a způsob izolace OB receptorů, a tím umožňuje kvantitativní strukturní stanovení aktivní konformace OB polypeptidů a OB receptorů nebo jejich domén. Vynález poskytuje dostatečné množství materiálu pro spektroskopické analýzy, jako je nukleární magnetická rezonance (NMR), infračervená spektroskopie (IR), Ramanova spektroskopie, ultrafialová spektroskopie (UV) a zejména cirkulární dichroismus (CD). NMR je velmi účinným nástrojem strukturní analýzy molekul v roztoku, což je prostředí velmi blízké přirozeným podmínkám [Marion et al., Biochim Biophys. Res. Comm., 113:967-974 (1983); Bar et al., J. Magn. reson., 65:355-360 (1985); Kimura et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 77:16811685 (1980)]. Strukturní analýzu lze provést i jinými způsoby, jako je např., ne výhradně, rentgenová krystalografie [Engstom, Biochem. Exp. Biol., 11:7-13 (1974)].

-44CZ 295018 B6

Výhodnější je studovat směsné krystaly OB polypeptidu a OB receptoru. Analýza směsných krystalů poskytuje podrobnou informaci o vazbě, což dále umožňuje racionální navrhování ligandových agonistů i antagonistů. Dále lze provádět modelování na počítači, zejména ve spojení sNMR a rentgenovou analýzou [Fletterick et al., vyd., „Computer Graphics and Molecular Modeling“, v Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1986)].

Identifikace a izolace genu, kódujícího OB receptor předkládaného vynálezu umožňuje exprimovat větší množství receptoru, než je množství izolovatelné z přírodních zdrojů, nebo exprimovat receptor v indikátorových buňkách, které jsou speciálně sestrojeny tak, aby indikovaly aktivitu exprimovaného receptoru po transfekci nebo transformaci buněk. Vedle racionálního navrhování agonistů a antagonistů OB, které vychází ze struktury OB polypeptidu, uvažuje předkládaný vynález i alternativní postup, identifikací ligandů OB receptoru na základě různých prohledávacích testů oblasti techniky.

Vynález je dále podrobněji vysvětlen na následujících ilustrativních příkladech, které v žádném směru nejsou jeho vymezením.

Příklady provedení vynálezu

Následující část v hlavních rysech naznačuje způsoby identifikace genetického materiálu, uváděného v příkladech. Identifikace zahrnuje čtyři postupné kroky: A) genetické mapování, B) fyzické mapování, C) výběr genu pro izolaci, D) detekce mutací. Nejprve byl izolován myší gen (krok D), potvrzena jeho totožnost a poté vyhledán homologní lidský gen. Oba geny, lidský i myší a předpokládané proteiny byly charakterizovány. Tyto kroky jsou podrobněji rozvedeny dále.

A) Genetické mapování

Genetickým křížením byla segregována OB mutace a stanovena poloha mutace vzhledem kRFLP (polymorfismus délek restrikčních fragmentů) standardní vazebnou analýzou. Podle zjištěných údajů se OB gen nachází v 5 cm intervalu v blízkosti myšího chromozomu 6. (5 cM je míra genetické vzdálenosti, odpovídající 5 zřetelným zkřížením na 100 zvířat.) Bylo generováno celkem 771 informativních meióz a použito pro genetické mapování [Friedman et al., Genomics, 11:1054-1062 (1991)]. Genetická místa, která byla mapována vzhledem k OB, byla všechna publikována již dříve. Dvě nejbližší popsané RFLP byly definovány pomocí prob, odvozených od onkogenových genů, carboxypeptidázového a met.

Genetické rozřešení výše popsaných experimentů bylo nedostačující pro klon OB, protože žádný z genetických markérů se nedostal do těsné vazby. Pro identifikaci těsně navázaných RFLP byly izolovány další proby a rozšířeno genetické křížení. Náhodné části DNA z blízkosti myšího chromozomu 6 byly izolovány mikrodissekcí chromozomu [Bahary et al., Mammalian Genome, 4:511-515 (1993)]. Jednotlivé klonované proby byly testovány zhlediska těsnosti vazby s OB. Na základě těchto studií byla vytypována jedna proba, D6Rckl3, též označovaná jako psd3 a pro svou genetickou blízkosti k OB zvolena pro další analýzu.

Tato proba byla použita ke stanovení genotypu u 835 OB potomků z interspecifických a intersubspecifických křížení, z čehož vyplynulo, že D6Rckl3 je nonrekombinantní u všech 835 zvířat, jak popsal Bahary et al. V průběhu fyzického mapování byl identifikován nový polymorfní markér z kosmidového subklonu, odvozeného od YAC 53A6. Tento nový markér byl umístěn mezi D6Rckl3 a OB gen a použit ke stanovení genotypu dalších 771 informativních meióz z intraspecifických interkrosů a backkrosů. Bylo identifikováno jediné zvíře # 167, nesoucí rekombinantní křížení mezi OB a D6Rckl3. Studie naznačily, že D6Rck39/D6Rckl3 je 0,06 cM od OB. Další identifikovaná proba, Pax4, byla 0,12 cM od OB. Pax4 byla rekombinantní u dvou zvířat # 111 a # 420. Pax4 je pseudogen, který byl již dříve mapován do blízkosti myšího

-45 CZ 295018 B6 chromozomu 6 [Gruss et al., Genomics, 11:424-434 (1991)]. Na tomto základě bylo stanoveno, že OB gen se nachází v 0,2 cM intervalu mezi Pax4 a D6Rckl3. Toto zjištění vedlo ve snaze klonovat vsunutou DNA se záměrem izolovat OB gen.

B) Fyzické mapování

Pro klonování DNA z uvedeného intervalu byly použity uměle konstruované kvasinkové chromozomy (YAC), YAC je relativně nový klonovací vektor, umožňující klonování dlouhých vláken souvislé DNA, často delších než jeden milion párů bází.

Umělé kvasinkové chromozomy byly izolovány s využitím D6Rckl3 a Pax4. Nejprve byly připraveny purifíkované DNA proby a použity k izolaci odpovídajících YAC. Izolované YAC (# 8, # 16, # 107 a # 24) byly nejprve charakterizovány a zjištěno, že nejdále zasahoval YAC # 16, tj. dosahoval nejblíže k OB. Poté byl odebrán klíčový konec YAC # 16 a bylo zjištěno, že tento konec byl blíže k OB než Pax4. Konec byl označen jako 16M(+). Tento závěr umožnilo zjištění, že studovaná proba nebyla rekombinantní u zvířete # 420 (na rozdíl od proby Pax4). Konec 16M(+) byl sekvenován a použit do PCR testu. Pomocí PCR testu byl proveden screning knihovny YAC. Byly izolovány čtyři pozitivní klony. Následná charakterizace těchto klonů pomocí uvolnění konců, restrikčního mapování, pulzní gelové elektroforézy a southemového blotování s genetickými kříženími, určila dva YAC, důležité pro další studie, adu a aad. YAC aadye 550 kB dlouhý nechimémí YAC, dosahující nejdále. Proto byl nej vzdálenější konec tohoto YAC, aaJ(pICL) použit ke kompletaci fyzické mapy. YAC adu je 370 kB dlouhý nechimémí YAC a bylo zjištěno, že jeho nejvzdálenější konec, adu(+), je nonrekombinantní u všech OB potomků genetického křížení, včetně zvířat # 111 a # 167, což naznačuje, že se OB gen může nacházet v tomto YAC.

Pro tyto dva konce, aad(pICL) a adu(+), byl vyvinut PCR test a použit k izolaci dalších YAC a Pl klonů na doplnění fyzické mapy. Byly izolovány významné klony Pl, včetně 498, 499, 500 (izolovány probou odvozenou od óza<7(pICL)) a 322, 323 a 324 (izolovány probou odvozenou od adu(+)).

Mezitím byly charakterizovány YAC, izolované pomocí D6Rckl3 (53A6,25A8, 25A9, 25A10). Z těchto studií vyplynulo, že nejblíže k aad YAC zasahuje 53A6. Byla stanovena délka mezery mezi 53A6 a aad na 70 kB. Poté byl klíčový konec 53A6, 53(pICL), použit pro prohledávání tří dostupných knihoven YAC a knihovny Pl. Byl izolován kritický klon Pl, 325. Tento Pl klon přesahoval do Pl klonů, izolovaných pomocí aaJ(pICL) a proto překlenul mezeru mezi 53(pICL) a aaí/(pICL). Díky tomuto výsledku mohla být klonována celá sada, obsahující YAC a Pl klony, délky 2,5 milionu párů bází a zahrnující Pax4, 16M(+), adu(+), aot/(pICL), 53(pICL), D6Rck39 a D6Rckl3. Pečlivým mapováním míst rekombinace, zřejmých u zvířat # 11 a # 167, bylo vyvozeno, že se OB gen nachází v intervalu 400 kB. Kvůli získání funkčního zdroje DNA na izolaci OB genu bylo izolováno 500 kB, pokrývajících tuto nerekombinantní oblast v 24 klonech Pl. Tyto Pl klony, včetně 322 a 323, které, jak bylo později zjištěno, byly nejvhodnější, byly použity k zachycení exonu.

Fyzická mapa části chromozomu s OB je uvedena na obr. 7A. Obr. 7b představuje sadu YAC. Obr. 7C představuje sadu Pl.

C) Izolace vybraných genů

Pro izolaci genů v uvedeném intervalu byl zvolen postup zachycování exonu. Tento postup využívá komerční vektor k identifikaci exonů DNA (tj. kódujících sekvencí) tak, že vyhledává funkčně sestříhané akceptorové a donorové sekvence v genomové DNA, které byly zavedeny do testovaných konstruktů. DNA z klonů Pl byla napěstována a subklonována do vektoru, zachycujícího exon. Tyto klony pak tvořily krátké inzerty, nakloňované do Bluescript vektoru. Každý klon byl pomnožen PCR s využitím primerů o sekvencích, odpovídajících plazmidovým

-46CZ 295018 B6 sekvencím, ohraničujícím inzert. PCR pomnožení bylo provedeno přímo v bakteriích, obsahujících plazmid. Reakce byly prováděny na robotu Biomek. Produkty PCR byly rozděleny elektroforézou na 1% agarózovém gelu v TBE pufru s ethidium bromidem. Postup zachycování exonu byl modifikován tak, aby eliminoval kontaminující DNA zE. coli od klonů Pl, a odfiltroval velké množství artefaktních exonů, přesahující z 80 až 90 % hledané exony. Vektor zachycující exony obsahoval HIV sekvence; krátké úseky sekvencí tohoto vektoru jsou artefaktní.

Experiment se zachycováním exonu byl proveden na různých klonech Pl. Zachycené produkty byly pomnoženy PCR, selektovány a sekvenovány. Sekvence předpokládaných exonů byly porovnány se sekvencemi Genbanky pomocí počítačového programu Blast. Pro další testování RT-PCR, northernovou analýzu a zoo blot bylo vybráno 15 exonů a sledována přítomnost odpovídajících sekvencí RNA nebo konzervativních sekvencí. Bylo zjištěno, že sedm z patnácti předpokládaných exonů kódovalo RNA transkript, 325-2, 323-9, 322-5, D1-F7, 1H3 a 2G7. 325-2 je specifický testikulámí gen; 323-8 a 323-9 pravděpodobně pocházejí ze stejného genu, exprimovaného hlavně v mozku a ledvinách. IH3 a 322-5 jsou nekvalitní mozkové transkripty. D1-F7 je exon z předchozího klonovaného genu inosin monofosfát dehydrogenázy (IMPDH), který sloužil jako všudypřítomný expresní model. Žádný z těchto genů nekódoval OB. 2G7, xon OB, je diskutován později.

Po třech neúspěšných pokusech zachytit exon OB genu byl učiněn jiný pokus složit DNA ze všech Pl z kritické oblasti OB. Z klonů Pl byly zvoleny: 258, 259, 322, 323, 324, 325, 498, 499, 500, 653, 654 a další. Nato klony Pl 258, 260, 322, 498 a 499 byly subklonovány do vektoru, zachycujícího exon a následně bylo připraveno několik ploten s bakteriálními klony, z nichž každý obsahoval předpokládaný exon. Bylo získáno 192 klonů, představujících kandidáty OB. U řady izolátů byly pozorovány shodné artefakty, jak již bylo pozorováno dříve, neboť obsahovaly dva zachycené exony, odvozené z vektoru. Tyto artefakty byly identifikovány na základě velikostí a na základě faktu, že DNA proby, odpovídající těmto artefaktům, hybridizovaly s příslušnými pásy southemového blotu z gelu. Tímto postupem bylo z dalšího hodnocení vyloučeno 185 ze 192 klonů. Artefakty nebylo možno vyloučit pouze na základě velikostí, neboť by takový přístup mohl v důsledku vyloučit i exony, odpovídající OB.

Ze 192 exonů bylo tehdy pro další studie zvoleno sedm exonů. Byly připraveny templáty pro sekvenování sedmi exonů a exony sekvenovány. Sekvence sedmi exonů byly analyzovány a bylo zjištěno sedm identických sekvencí a jeden zřejmý artefakt. Konkrétně to byl klon 1D12, obsahující HIV sekvenci, tj. artefaktní pás. Do další analýzy postoupily tři exony: 1F1, 2G7 a 1H3. 1F1 byl vyloučen, neboť se nacházel mimo kritickou oblast. Byly vybrány a syntetizovány primery PCR pro 1H3 a 2G7.

Byla stanovena sekvence exonu na 2G7, jak je uvedeno na obr. 10 (SEQ ID č. 7). Byly vybrány a syntetizovány primery PCR pro 2G7. Úseky sekvencí, odpovídající PCR příměrům, jsou podtrženy. Sekvence použitých primerů:

5' CCA GGG CAG GAA AAT GTG (Tm = 60,0 °C) (SEQ ID č. 8)

3' CAT CCT GGA CTT TCT GGA TAG G (Tm = 60,0 °C) (SEQ ID č. 9)

S těmito primery byl amplifíkován genom DNA v následujících podmínkách pro PCR: 25-30 cyklů při 55 °C anelace 2', při 72 °C extenze 2', při 94 °C denaturace 1' ve standardním PCR pufru. Tyto primery byly rovněž použity pro přípravu značené proby; do PCR reakce byl zaveden ³²P-dCTP při současném snížení obsahu neznačeného dCTP.

Test RT-PCR byl proveden na vzorcích RNA z řady různých tkání a bylo zjištěno, že k expresi 2G7 docházelo výlučně v bílé tukové tkáni (obr. 11 A). Značený ³²P-2G7 byl hybridizován k northernovému blotu tkáňových RNA (obr. 11 B) a byly zjištěny vysoké hladiny exprese RNA

-47CZ 295018 B6 v tukové tkáni a nízké nebo nulové hladiny exprese ve všech ostatních tkáních (příčinou signálů mohla být kontaminace tkáňových preparátů). 10 pg totální RNA z každé uvedené tkáně bylo rozděleno elektroforézou na agarózovém gelu s formaldehydem. Próba byla hybridizována k blotu při 65 °C ve standardním hybridizačním pufru Rapid Hybe (Amersham). RNA měla velikost přibližně 4,9 kB. V tomto bodě bylo potvrzeno, že 2G7 pravděpodobně obsahuje gen OB, a provedeny další analýzy.

D) Detekce mutací

Kvůli potvrzení, že 2G7 skutečně kóduje OB gen, bylo nezbytné prokázat rozdílnou hladinu exprese sekvence DNA tohoto genu v mutantních zvířatech, proti expresi u zvířat divokého typu. Studie byla provedena na dvou dostupných separátních mutacích OB genu, C57B1/6J OB/OB (1J) a Ckc/smj OB/OB (2J) (dále označované jako 1J resp. 2J). Studované myší kmenyjsou dále označovány neformální nomenklaturou. V popise a obrázcích platí, že C57B1/6J je C57B1/6J +/+; CKC/smj je SM/Ckc-+^Dac-+/+; CKC/smj OB/OB je SM/Ckc-+^Dac-oZ>^{2 1} / ob^{2 J}). RNA byla izolována z tukových tkání zvířat 1J, 2J a kontrolní skupiny. Totální RNA z každého jednotlivého vzorku byla štěpena DNázou a reverzně přepsána s využitím oligo-dT jako primeru a reverzní transkriptázy. Výsledná jednovláknová cDNA byla pak amplifikována PCR s 2G7 jako primerem (podmínky viz výše) pro nižší pás nebo s komerčně dostupným aktinovým primerem pro vyšší pás. Produkty RT-PCR byly rozděleny na 1% agarózovém TBE gelu a obarveny ethidium bromidem (obr. 12 A). Z výsledků RT-PCR bylo zjištěno, že 2G7 mRNA byla exprimována ve zvířatech 1J a všech ostatních kontrolních myších a zcela chyběla u 2J myší. Po 30 amplifikačních cyklech nebyl zaznamenán jediný signál. Tento pokus přímo prokázal, že 2G7 odpovídá exonu OB genu.

Mutace 2J je relativně nová, je udržována jako koisogenní kmen a získaný výsledek byl prvním dostupným dokladem, že 2G7 je exonem OB genu. Mutace se pravděpodobně nachází v promotorové oblasti a zcela ruší syntézu mRNA. Pozitivní signál u myší 1J v RT-PCR experimentu naznačuje, že 1J mohou nést bodovou mutaci, která nepůsobí viditelnou změnu ve velikosti RNA. Navíc podle RT-PCR testů chyběla mRNA 2G7 u dalších čtyř 2J zvířat.

Tento výsledek byl potvrzen northernovým blotováním (obr. 12 B). Z tukových buněk jednotlivých kmenů (C57B1/6J, 1J, CKC/smj a 2J) byla izolována RNA. 10 pg RNA z každého vzorku bylo rozděleno a blotováno. Bloty byly hybridizovány s PCR-značenou probou 2G7, která byla připravena PCR amplifikační materiálu, tj. pásu na obr. 11, v přítomnosti ³²P-dCTP. Jako kontrola pro nanesené množství RNA byl použit aktin. Aktinový signál byl u všech vzorků stejný. Signál OB chyběl ve vzorku mozkové tkáně, protože mRNA je specifická pro tukové buňky.

Výsledky northernové analýzy potvrzují, že RNA specifická pro 2G7 se nevyskytuje u 2J myší. RNA OB se nevyskytuje u CKC/smj OB/OB myší, protože tento kmen obézní mutace má porušený gen a nedochází k syntéze RNA. Navíc u 1J i tlustých DB/DB je 10ti až 20tinásobně zvýšená hladina 2G7 RNA. Tyto výsledky podporují hypotézu, že OB buď kóduje oběhový hormon nebo odpovídá za vznik signálu z tukových buněk, který moduluje tělesnou hmotnost. Výsledky potvrzují, že 2G7 je OB gen a předpovídají, že u 1J myší je bodová, pravděpodobně nonsense mutace vedoucí k prematurované terminaci translace.

Výsledky northernové analýzy byly reprodukovány na preparátech RNA z tukových buněk ze čtyř různých 2J zvířat (obr. 13). V tomto testu byl jako kontrola, podobně jako aktin na obr. 12 B, použit transkript ap2, specifický pro tukové tkáně. Intenzita pruhů ap2 se prakticky nemění. Ap2 byl PCR-značen s využitím primerů z publikované sekvence ap2. Produkty RT-PCR RNA z tukových buněk byly značeny stejným postupem PCR-značení. Provedená analýza ukázala, že OB mRNA je běžně přítomna u homozygótních i heterozygótních zvířat a nepřítomna u 2J mutantních zvířat.

-48CZ 295018 B6

U 1J zvířat byla identifikována mutace. Jde o záměnu bází C na T, jejímž důsledkem je vznik prematurovaného stop kodonů v poloze 108 na místě argininu, což je pravděpodobně podstatou mutace 1J (obr. 14), nehledě na vysoké expresní hladiny OB mRNA (viz obr. 12 a 13, dráhy C57B1/6J OB/OB).

Nedávno bylo southemovým blotováním potvrzeno, že 2J mutace je důsledkem detekovatelné změny v DNA na 5' konci OB, která zřejmě zcela ruší expresi RNA. Přesnou povahu této změny je nutno teprve objasnit.

Stanovení, zda mutace OB vede k jednotnému charakteru fragmentů (obr. 15 A), bylo provedeno southemovým blotováním genomové DNA z CKC/smj (SM/Ckc-+^Dac) a C57B1/6J myší s využitím čtyř různých restrikčních endonukleáz. Přibližně 10 pg DNA (odvozené z genomové DNA z jater, ledvin nebo sleziny) bylo štěpeno uvedenými restrikčními enzymy. DNA byla rozdělena elektroforézou na 1% agarózovém TBE gelu. Poté byla DNA přenesena na imobilonovou membránu a hybridizována s PCR-značenou probou 2G7. Klíčovým pásem byl vrchní pás v Bgl\\ digestu u CKC/smj OB/OB (SM/Ckc-+^Dac OB^{2 J} / OB^{1 J}) DNA. Tento pás odpovídá fragmentu o vyšší molekulové hmotnosti proti ostatním kmenům a naznačuje přítomnost mutace.

Obr. 15 B představuje southernové blotování BglW digestu genomové DNA potomků křížení ob^{2 J} /+ x ob^{2 J} /+. U některých DNA byl přítomen pouze vrchní pás, u některých pouze nižší pás, některé DNA obsahovaly oba pásy. Zvířata, u nichž byl pozorován pouze vrchní pás, jsou allo-obézní, tj. ob^{2 J} / ob^{2 J}. Z uvedených údajů vyplývá, že polymorfísmus (tj. mutace) na obr. 15 A vede k segragaci v genetickém smyslu.

Příklad 1: Klonování cDNA a stanovení sekvence OB

S využitím PCR-značené proby 2G7 bylo izolováno celkem 50 myších cDNA klonů z knihovny cDNA z myších tukových buněk Xgtll (Clonetech 5'-STRETCH cDNA z testikulámích tukových tkání švýcarských myší #ML3005b) a 30 křížových hybridizujících lidských cDNA klonů z knihovny cDNA z lidských tukových buněk ZgtlO (Clonetech 5'-STRETCH abdominální cDNA #HL1108a). Prohledání knihovny bylo provedeno postupem plak lift. Filtry splaky byly denaturovány v autoklávu. Filtry byly duplicitně hybridizovány s PCR-značenou probou 2G7 (pufr Rapid Hybe, 65 °C, přes noc). Po 2-4 hodinách prehybridizace byly filtry promyty dvakrát po 30 min, 65 °C, roztoky 2 x SSC, 2 % SDS, a exponován rentgenový snímek. Pásy pozitivní v obou pokusech byly plakové purifikovány. Plakově purifikované fágy byly amplifikovány PCR s využitím komerčních vektorových primerů, např. XgtlO a Xgtll. Výsledné PCR produkty odpovídaly cDNA inzertům pro každý fág s malým množstvím vektorové sekvence na obou koncích. Pásy byly gelově purifikovány a sekvenovány s využitím automatického sekvenátoru ABI a vektorových primerů k sondování DNA polymerázy.

Primární sekvenční údaje byly překontrolovány manuálně, báze za bází, a opraveny přeslechy z počítačového programu. Podle správné sekvence byly syntetizovány primery po směru a využity k dalšímu sekvenování. Tyto pokusy byly opakovány tak dlouho, až byly všechny dostupné cDNA klony sekvenovány a syntetizovány do sady. Dosud bylo sestaveno asi 3000 párů bází od 5' konce mRNA. Jeden z cDNA klonů, dosahující k 5' konci mRNA, měl identickou sekvenci s 5'RACE produktem RNA z tukové tkáně (údaje neuvedeny).

Podle sekvenčních údajů byl nalezen 167 aminokyselin dlouhý otevřený čtecí rámec (obr. 1). Byla nalezena sekvence shodná s Kozákovou translační iniciační sekvencí, obsahující adenosin tři báze proti směru od ATG. Byly nalezeny dvě třídy cDNA, lišící se přítomností nebo nepřítomností jednoho glutaminového kodonů. Tento zbytek se nachází na 3' straně hned za sestříhaným akceptorovým místem pro 2G7 exon. Protože CAG kodon glutaminu je pravděpodobně zahrnut v AG sestříhané akceptorové sekvenci, zdá se, že v sestříhané akceptorové sekvenci došlo ke smyku, se zřetelnou deleci tří párů bází v podskupině cDNA, jak je uvedeno níže.

-49CZ 295018 B6 gin ser val ag CAG TCG GTA (s glutaminem) (SEQ ID č. 17) (sestříhané akceptorové místo) ser val ag CAG TCG GTA (bez glutaminu) (sestříhané akceptorové místo)

Sekvence „ag“ je předpokládaná intronová sekvence v protisměru od glutaminového kodonu, AG je předpokládané alternativní místo sestřihu. Tento glutaminový zbytek se nachází ve vysoce konzervativní oblasti molekuly a jeho význam pro biologickou aktivitu není dosud znám.

Dále byla detekována předpokládaná N-koncová signální sekvence, jejíž signální štěpné místo je předpokládaným karboxylovým koncem alaninového zbytku v poloze 21. Tato předpokládaná signální sekvence byla potvrzena pomocí počítačového algoritmu v postupu von Heijneho. V polypeptidové kódující oblasti byla tak identifikována nej pravděpodobnější signální sekvence jako oblast aminokyselin 1 až 23, tedy sekvence:

MCWRPLCRFLWLWSYLSYVQA | VP (SEQ ID č. 10), v níž svislá čára označuje předpokládanou signální sekvenci štěpného místa. Zbytek aminokyselinové sekvence je vysoce hydrofílní a vedle N-koncové sekvence nevytváří žádné další významnější strukturní tvary nebo klenuté membránové domény. Konkrétně nebyly nalezeny odpovídající sekvence pro N-glykosylaci nebo dibazické aminokyselinové sekvence, naznačující místa štěpení proteinu při předpokládaném zpracování proteinu (Sabatini et al., The metabolic basis of inhertited disease, str. 177-223, C. V. Scriver et al. vyd., McGraw-Hill, New York). Prohledávání databáze s využitím programů Blast a Block nevedlo k objevu žádných homologních sekvencí.

RNA z lidské tukové tkáně byla analyzována northemovým blotováním a byly detekovány druhy RNA o podobné velikosti jako myší OB gen. Sekvenování a analýza cDNA klonů ukázaly, že lidský OB rovněž kóduje 167 aminokyselin dlouhý polypeptid (obr. 2 A a B a obr. 3). Rovněž byly v lidské RNA nalezeny dvě třídy cDNA, zahrnující i nezahrnující deleci tří párů bází (obr. 6). Oba OB geny, myší i lidský, byly v předpokládané kódující oblasti vysoce homologní ale dostupné 3' a 5' nepředkládané oblasti byly homologní pouze z 30 %. Lidský OB polypeptid obsahuje rovněž N-koncovou signální sekvenci. Srovnání sekvence lidského a myšího OB polypeptidu ukázalo, že obě molekuly jsou na úrovni aminokyselin z 83 % identické (obr. 4). N-konce maturovaných proteinů obou druhů sdílejí ještě vyšší homologii, v jednom stu N-koncových aminokyselin bylo nalezeno pouze šest substitucí konzervativních aminokyselin a tři substituce nekonzervativních aminokyselin.

Genomová DNA, izolovaná z myši, krysy, králíka, hraboše, kočky, krávy, ovce, prasete, člověka, kuřete, úhoře a Drosofíly, byla štěpena restrikčním enzymem £coRl. Digesty byly rozděleny elektroforézou na 1 % agarózovém TBE gelu. DNA byla přenesena na imobilonovou membránu a hybridizována s PCR-značenou probou 2G7. Filtr byl hybridizován při 65 °C a promyt dvakrát po 20 min roztoky 2 x SSC, 2 % SDS, tj. došlo ke dvěma změnám pufru. Výsledky naznačují, že OB je mezi obratlovci konzervativní (obr. 16). Poznámka: DNA z úhoře obsahuje 2+ signál; úhoř je ryba.

Z dostupných dat lze souhrnně vyvodit, že tělesná hmotnost a adipozita je řízena fyziologicky. Před sedmi lety začaly studie, zaměřené na identifikaci dvou klíčových složek tohoto systému: OB a DB genů. Jak ukazuje příklad 1, OB gen byl nyní identifikován jako gen specifický pro tukové tkáně, který má klíčovou úlohu v regulaci tělesné hmotnosti. Produkt tohoto genu,

-50CZ 295018 B6 nejpravděpodobněji sekretorický hormon, je významný pro diagnostiku a léčbu nutričních poruch u lidí i zvířat.

Příklad 2: Exprese OB v bakteriích

Myší i lidské cDNA kódující OB byly klonovány do pET-15b expresního vektoru (Novagen). Tento vektor obsahuje promotor T7 ve spojení s lac operátorem a exprimuje fúzní protein, obsahující histidinový tag (His-tag) a trombinové štěpné místo v protisměru hned za inzertním místem kódující sekvence (SEQ ID č. 11 a 12; obr. 17).

Myší a lidské cDNA byly modifikovány, takže alanin na konci signální sekvence byl přeměně na Ndel místo, stejně jako separátní sekvence v 3' oblasti. Inzerce Ndel místa byla provedena postupem PCR s využitím nových primerů:

Mnde-5' (myší pět s čárkou primer):

CTTATGTTCA TATGGTGCCG ATCCAGAAAG TC (SEQ ID č. 13)

Mnde-3' (myší tři s čárkou primer):

TCCCTCTACA TATGTCTTGG GAGCCTGGTG GC (SEQ ID č. 14)

Hnde-5' (lidský pět s čárkou primer):

TCTATGTCCA TATGGTGCCG ATCCAAAAAG TC (SEQ ID č. 15)

Hnde-3' (lidský tři s čárkou primer): TTCCTTCCCA TATGGTACTC CTTGCAGGAA GA (SEQ ID č. 16)

Primery obsahují v prostředku 6 nesouhlasných párů bází, které zavádějí Ndel restrikční místa na oba konce PCR fragmentu. S využitím těchto primerů byly amplifíkovány postupem PCR fágy, obsahující myší nebo lidské cDNA. Produkty PCR byly štěpeny Ndel a gelově puntíkovány na 1% nízkotajícím agarózovém gelu. Purifikované pásy byly subklonovány do pET vektoru. Vzniklé plazmidy byly sekvenovány, aby bylo potvrzeno, že během PCR amplifikace nedošlo ke vzniku mutací. Byly připraveny konstrukty z lidské a myší cDNA, kódující a nekódující glutamin 49. Konkrétně s využitím PCR klonovacího postupu byly připraveny pET 15b konstrukty, obsahující lidskou nebo myší OB kódující sekvence bez signální sekvence, napojenou na His-tag. Konstrukty byly sekvenovány, aby bylo potvrzeno, že během PCR amplifíkačního kroku nebyly do kódující sekvence OB genu vneseny žádné chyby.

Pro transformaci bakteriálního expresního hostitele byly zvoleny dva plazmidové konstrukty, pETM9 a pETH14. Po indukci 1 mmol.f¹ IPTG za optimálních podmínek produkovaly transformované bakterie 100-300 pg/ml fúzního OB. Většina OB fúzního proteinu se nacházela uvnitř buněk. Po rozpuštění v 6 mol.f¹ guanidin hydrochloridu nebo močovině byl fúzní protein purifikován na sloupci (Ni-chelatační) pryskyřice vázající His. Podmínky purifíkace na koloně (vazba, promývání, eluce) byly staveny experimentálně. Fúzní protein OB byl navázán k nosiči ve směsi 5 mmol.f¹ imidazol / 6 mol.f¹ guanidin hydrochlorid a zůstal navázán až do 20 mmol.Γ¹ imidazol / 6 mol.f¹ guanidin hydrochloridu. Protein byl eluován při 60 mmol.f¹ imidazol / 6 mol.f¹ guanidin hydrochloridu (obr. 18 A, B). Poté byly oba purifikované proteiny, myší i lidský, dialyzovány proti PBS k odstranění guanidin hydrochloridu a použity na vypěstování polyklonálních protilátek.

Kvůli testování biologické aktivity připraveného fúzního proteinu byly vyvinuty a vyzkoušeny podmínky pro prostorové přeuspořádání proteinu. Postup zahrnuje dialýzu fúzního proteinu v 1 mol.f¹ guanidinovém roztoku a naředění 0,4 mol.f¹ argininovým roztokem. Před testováním biologické aktivity byl z fúzního proteinu odstraněn His-tag. Tag byl odštěpen z fúzního proteinu trombinem z lidské placenty.

-51 CZ 295018 B6

Kódující sekvence lidského a myšího OB genu bez signální sekvence byly jednotlivě inzertovány do pET 12c vektoru PCR klonovacím postupem. Tyto konstrukty v bakteriálním hostiteli směrují syntetizovaný OB fúzní protein do periplazmatického prostoru. Izolace OB fúzního proteinu z periplazmatického prostoru a jeho oddělení od ostatních protein hostitele pak vyžaduje pouze jednoduchou gelovou filtraci, při níž nedochází k denaturaci.

Příklad 3: Příprava protilátek proti OB polypeptidu

Kromě využití rekombinantního proteinu ke generování polyklonálních protilátek byl ve vydedukované sekvenci myšího OB identifikován soubor čtyř peptidových sekvencí, pomocí softwaru imunogenitních závislostí (sada programů GCG). Tyto čtyři fragmenty z karboxylového konce peptidů mají následující sekvence:

(SEQ ID č. 18): Val-Pro-Ile-Gln-Lys-Val-Gln-Asp-Asp-Thr-Lys-Thr-Leu-Ile-Lys-Thr (SEQ ID č. 19): Leu-His-Pro-Ile-Leu-Ser-Leu-Ser-Lys-Met-Asp-Gln-Thr-Leu-Ala (SEQ ID č. 20): Ser-Lys-Ser-Cys-Ser-Leu-Pro-Gln-Thr-Ser-Gly-Leu-Gln-Lys-Pro-Glu-Ser-Leu-Asp (SEQ IDč.21): Ser-Arg-Leu-Gln-Gly-Ser-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Gln-Gln-Leu-Asp-Val-Ser-Pro-Glu-Cys

Tyto peptidy byly konjugovány ke KLH a konjugáty peptid-KLH použity ke standardní imunizaci králíků. Z králíků pak byla odebrána polyklonální séra, specifická k jednotlivým peptidům.

Příklad 4: Translokace OB polypeptidu in vitro

Kvůli potvrzení přítomnosti funkční signální sekvence byla lidská cDNA, obsahující celý otevřený čtecí rámec, subklonována do vektoru pGEM. Tento pokus byl proveden pouze s lidskou cDNA, protože vhodné myší subklony nebyly izolovány. Pozitivní vlákno lidské OB RNA bylo přepsáno pomocí Sp6 polymerázy a použito pro translační reakci in vitro v přítomnosti i nepřítomnosti psích pankreatických mikrozomálních membrán. Primární translační produkt migroval spolu s molekulovou hmotností 18 kD, což je v souladu s předpokládanou sekvencí cDNA. Mikrozomální membrány inhibovaly celkovou účinnost translační reakce 5 x. Nicméně v přítomnosti membrán bylo 50 až 70 % primárního translačního produktu OB zkráceno o 2 kD, což naznačuje, že signální sekvence bylo funkční (obr. 19 A). Velikost primárního translačního produktu interleukinu-ΐα RNA, který nekóduje signální sekvenci, zůstala bez změny i při reakci v přítomnosti mikrozomálních membrán. Kvůli ověření, že proběhla translokace OB proteinu, byly produkty in vitro translace štěpeny proteinázou-K. Proteolýza primárního translačního produktu 18 kD proběhla úplně, ale opracovaný produkt 16 kD zůstal neštěpen, což naznačuje, že byl translokován do lumenu mikrozomů (obr. 19 B).

Po odštěpení signální sekvence zbývají v předpovězeném proteinu dva cysteinové zbytky, které umožňují vznik disulfidického můstku, charakteristického i pro jiné sekretorické polypeptidy [Shen et al., Science, 224:168-171 (1984)].

Příklad 5: Charakterizace OB genu

Kvůli zjištění závislosti obezity na genetických změnách OB genu u lidí byla stanovena sekvence lidského genu SEQ ID č. 22 a 24 (obr. 20 A až C). Knihovna lidských klonů Pl byla prohledána specifickými primery z lidské kódující sekvence. Byly nalezeny tři různé klony Pl, napěstovány a amplifíkovány PCR s využitím primerů z oblastí, ohraničujících místa sestřihu mezi prvním a

-52CZ 295018 B6 druhým kódujícím exonem. Byla amplifikována a částečně sekvenována celá intronová oblast 2 kD (viz obr. 20 A a SEQ ID č. 22 a 24).

Struktura myšího i lidského genu byla charakterizována PCR testy a dalšími standardními postupy. Myší OB gen je tvořen třemi exony, druhý a třetí exon obsahují kódující sekvenci (obr. 20 D). Kódující oblast lidského OB genu má stejnou strukturu; avšak u lidského genu chybí 5' exon a intron (obr. 20 E).

Z intronových sekvencí lidského genu byly odvozeny a připraveny dvě řady primerů (obr. 20 A až C). Následují sekvence primerů (F a R označují směr tam a zpět):

HO5 lgF 5'-CCCAAGAAGCCCACTCTG-3' (SEQ ID č. 29) HOB 1 gR 5-GACTATCTGGGTCCAGTGCC-3' (SEQIDě. 30)

HO5 2gF 5-CCACATGCTGAGCACTTGTT-3' (SEQ ID č. 31) HO52gR 5-CTTCAATCCTGGAGATACCTGG-3' (SEQIDč. 32)

Byly připraveny vzorky DNA ze čtyř různých zdrojů a uvedené řady primerů byly použity k amplifikaci lidské genomové DNA, odebrané od těžce obézních lidí. Produkty PCR byly rozděleny na 1% nízkotajícím agarózovém gelu, pásy vyříznuty a štěpeny agarázou. S použitím sekvenátoru DNA ABI 373 A a Taq dideoxy terminátorového kitu (ABI, Perkin-Elmer) byly stanoveny sekvence produktů PCR. Dosud byla nalezena jen jedna bodová mutace OB genu ve vzorku jednoho z pacientů. Tato mutace je v prvním exonu a nemění aminokyselinovou sekvenci. Ve vzorku od jiného pacienta, jak naznačují předběžné údaje, je přítomna inzertovaná sekvence v prvním exonu.

Přehlednější sekvence pro detekci mutací lze získat z jiného automatizovaného sekvenačního postupu, který místo Taq DNA polymerázy pracuje se sekvenázou.

Příklad 6: Exprese OB v kvasinkách.

Po pozičním nakloňování OB vznikla významná možnost odhalit fyziologický mechanizmus, kterým OB protein snižuje příjem potravy a tělesnou hmotnost. Prvním krokem této studie byla rekombinantní produkce funkčního proteinu s využitím expresního systému. Vedle úspěšného bakteriálního expresního systému byl použit i kvasinkový expresní systém. Kvasinkový expresní systém má pro expresi OB několik výhod. Nej důležitější je vysoká pravděpodobnost produkce biologicky aktivních eukaryontních proteinů. OB polypeptid je sekretován v savčích buňkách. Sekrece proteinů je u všech savců velmi podobná, z čehož vyplývá, že kvasinkový sekretorický aparát je bližší savčím sekretorickým cestám než bakteriální sekretorický aparát. Konkrétně proteinové modifikace OB, probíhající v savčích buňkách, budou pravděpodobně probíhat i při expresi v kvasinkovém sekretorickém systému. Navíc ke správnému prostorovému uspořádání proteinu dochází při průchodu sekretorickým aparátem a lze tedy předpokládat, že průchodem kvasinkovým sekretorickým aparátem vznikne protein se správným prostorovým uspořádáním a přirozenou biologickou aktivitou. Pro OB polypeptid je tento rys velmi významný vzhledem ke dvěma cysteinovým zbytkům, které mohou vytvářet disulfidickou vazbu. Na rozdíl od sekretorických cest, redukující prostředí buněčné cytoplazmy zabraňuje tvorbě disulfídických můstků; a proto je nezbytné, aby kvůli vzniku disulfídických vazeb in vivo OB procházel sekretorickými cestami. Dalšími výhodami kvasinkového expresního systému je jednoduchá a rychlá manipulace, dostupnost vektorů a kmenů a rozsáhlé zkušenosti v oblasti kvasinkové rekombinantní technologie.

Expresní systém Pichiapastoris byl zvolen z následujících čtyř důvodů: (1) vyšší hladina exprese heterologních proteinů ve srovnání sjinými kvasinkovými systémy, jako např. S. cerevisiae·, (2) glykosylace proteinu v systému Pichia pastoris je podobnější savčímu expresnínu systému, než glykosylace v systému 5. cerevisiae (ačkoliv při počítačové analýze nebyla u OB nalezena

-53 CZ 295018 B6 glykosylační místa, stále zůstává možnost, že dochází ke glykosylaci na neznámých místech); (3) Pichia pastoris sekretuje velmi málo vlastních proteinů a proto je obecně velmi jednoduché purifíkovat exprimovaný cizí protein; a (4) vektory a kvasinkové kmeny jsou komerčně dostupné (Invitrogen). Na obr. 21 a 22 jsou uvedeny dvě strategie přípravy expresních vektorů.

Byl zvolen vektor pPIC.9. Tento vektor obsahuje klonovací místo po směru hned vedle prepro kódující sekvence α-párovacího faktoru, která směruje sekreci proteinu kódovaného genem, nakloňovaným do tohoto klonovacího místa do sekretorických cest. Dalším významným rysem vektoru je HIS4 gen, umožňující selektivní vstřebání vektoru auxotrofním kmenem kvasinek, který se po transformaci pěstuje v histidin-defícientním médiu. Strategie klonování: PCR amplifíkace OB cDNA s 5'primerem, který na 3'konci obsahuje komplementární sekvenci k sekvenci OB, přímo následující za předpokládaným hlavním štěpeným místem peptidu a na 5'konci sekvenci, komplementární k vektorové sekvenci α-párovacího faktoru. 5'primer rovněž obsahuje místo XhoL 3'primer je navržen tak, aby obsahoval na 3'konci sekvenci komplementární k několika aminokyselinám OB a na 5'konci místo EcoRI. Produkt PCR amplifíkace byl štěpen Xho\ EcoRI a klonován do stejně štěpeného pPIC.9. Po nakloňování myší i lidské OB cDNA, v obou případech s i bez glutaminového kodonu 49, byly jednotlivé klony všech čtyř konstruktů izolovány a sekvenovány, aby bylo potvrzeno, že konstrukty byly klonovány ve správné orientaci, do správného čtecího rámce a že neobsahují žádné mutace, ev. vzniklé při amplifíkaci. Klony o správné sekvenci byly použity k transformaci P. pastoris kmen GS115, histidinový auxotrof.

V případě dvou myších konstruktů byly transformované klony kvasinek testovány na expresi proteinu. Jako důkaz, že transformované kvasinky obsahují OB, byl proveden test DNA dot-blot a test hybridizace kolonií; oba testy potvrdily přítomnost OB sekvence v transformovaných buňkách a nepřítomnost OB sekvence v buňkách netransformovaných. Transformované kvasinky sekretovaly protein 16 kDa do kultivačního média, u netransformovaných buněk protein o této velikosti nevznikal (obr. 23 A). 16 kDa je předpovězená velikost OB. Bylo zjištěno, že jednotlivé klony, obsahující myší konstrukty, exprimují vysoké hladiny OB, a byla vyvinuta strategie purifikace, vedoucí k homogennímu OB. Byla vyzkoušena purifikace OB na sloupci katexu (obr. 23 B); podle předběžných výsledků je vhodný silný katex. Po katexové chromatografií však nebyl očekávaný OB produkt nalezen, což naznačuje přítomnost proteáz ve vzorku.

Možným řešením tohoto problému je příprava fúzních OE-His-tag a jejich exprese v kvasinkách (obr. 22). OB polypeptid bez navázaného His-tag se afinitně váže na Ni-chelatační kolonu. Purifikace OB polypeptidu Ni-chelatací, následovaná gelovou filtrací, vedla k produktu o dostatečné čistotě pro hmotnostní spektroskopickou analýzu. Hmotnostní spektrum potvrdilo očekávanou molekulovou hmotnost exprimovaného proteinu, což je významný důkaz úspěšné exprese OB v P. pastoris.

Postup Ni-chelatace/gelová filtrace však nevede k dostatečně čistému OB polypeptidu. Ukázalo se, že jsou přítomny ještě malé molekuly. Ze zádrže Ni-chelatační kolony byla zřejmě eluována proteolytická aktivita. Proto byl navržen třístupňový purifikační postup: Ni-chelatace, katex (eliminující malé kontaminující molekuly) a gelová filtrace.

Odhad hladiny exprese pomocí barvení SDS-PAGE gelu Coomassieho modří vedl k hodnotě 10 mg/1 při pěstování kvasinek v třepačkách. Lze předpokládat, že ve fermentačních nádobách budou hladiny exprese vyšší, fermentace, vedoucí k větším množstvím proteinu, jsou již naplánovány. V oblasti lidských OB konstruktů byly identifikovány klony kvasinek, obsahující mnoho kopií OB genu, u nichž lze předpokládat expresi OB proteinu. Vyvinuté protilátky budou použity k potvrzení identity sekretovaného proteinu 16 kDa.

Příklad 7: Vysoká hladina exprese OB fúzního peptidu v bakteriích

Příprava zmražených zásobních kultur:

-54CZ 295018 B6

Do každého ze dvou 4 ml aliquotů sterilního média M9ZB bez zdroje uhlíku bylo přidáno 40 μΐ zásobního roztoku dextrózy (0,4 g/ml, sterilizováno filtrací, 10 μΐ zásobního roztoku ampicilinu (200 mg/ml) a 5 μΐ zásobního roztoku chloramfenikolu (34 mg/ml, ethanol). Takto upravená média byla naočkována jednou kolonií E. coli s nakloňovanou myší nebo lidskou (951 DNA ve vektoru pET-14b Novagen. Zkumavky byly inkubovány při 37 °C přes noc.

0,5 ml kultury, inkubované přes noc, bylo použito k naočkování 50 ml média M9ZB, obsahujícího dextrózu, ampicilin a chloramfenikol. Byla provedena inkubace při 30 °C a periodicky monitorována absorbance při 600 nm (A_6Oo). Při hodnotě A₆₀₀ 1 až 1,2 byl odebrán aliquot kultuiy 175 μΐ, smíchán s 25 μΐ 60% glycerolu v 2ml Eppendorfově zkumavce, rychle zmražen v kapalném dusíku a uchován při -80 °C.

Růst kultury:

ml média M9ZB, obsahujícího 0,5 ml 40 % dextrózy, 125 μΐ zásobního roztoku ampicilinu a 50 μΐ zásobního roztoku chloramfenikolu, bylo naočkováno zmraženou zásobní kulturou (1 ml) a inkubováno při 30 °C. Při hodnotě Agoo 1 až 1,2 bylo odebráno 10 ml kultury a použito k naočkování každé ze čtyř 21 baněk s 500 ml média M9ZB, obsahujícího dextrózu, ampicilin a chloramfenikol. Média byla inkubována při 30 °C k dosažení hodnoty A₆₀₀ 1 až 1,2 s konečnou koncentrací 0,5 mmol.l”¹ IPTG. Kultury byly inkubovány přes noc. Buňky byly izolovány centrifugací při 4000 ot/min, 20 min. Popsaný expresní systém vedl k výtěžku rekombinantního OB polypeptidu v poměrně vysokém procentuálním podílu z celkového množství proteinů; řádově gram/litr E. coli.

Buněčná lýza a resuspendování buněčných těl:

Buněčná pasta byla resuspendována v minimálním objemu 20 mmol.Γ¹ HEPES, pH 7,2, 10% glycerol, 0,1 mol.l”¹ KC1, 5 mmol.r¹ MgCl₂, 1 % aprotinin, 1 mmol.r¹ PMSF, 5 pg/ml leipeptin a 50 pg/ml DNaza I. Suspenze byla třikrát zmražena a rozehřátá v kapalném dusíku a vlažné vodě. Lýzované buňky byly centrifugovány při 18 000 ot/min, 30 min a resuspendovány v 20 mmol.r¹HEPES, pH 7,5, 0,1 mol.I“¹ NaCl. Suspenze byla sonikována a přidán Triton XI00 na výslednou koncentraci 2 %. Vzniklá směs byla centrifugována při 18 000 ot/min, 15 min. Po dvou takových cyklech bylo provedeno ještě trojnásobné praní bez Tritonu. Výsledná peleta byla zředěna 6 mol.l”¹ GdHCl (guanidin hydrochlorid), 20 mmol.r¹ HEPES, pH 7,5, směs sonikována a centrifugována. Supematant byl dále purifikován.

OB protein v nesprávném prostorovém uspořádání byl purifikován afínitní chromatografíí na nosiči s imobilizovaným kovovým iontem (IMAC). Roztok byl nanesen na 40ml chelatační kolonu Pharmacia s rychle tekoucí chelatační sefarózou, kolona promyta 5 x 40 ml 50 mmol.I“¹NiSO₄ a ekvilibrována 6 mol.l“¹ GdHCl, 20 mmol.l“¹ HEPES, pH 7,5. Kolona byla promyta 6 mol.l“¹ GdHCl, 30 mmol.l”¹ imidazol, 20 mmol.l”¹ HEPES, pH 7,5. Nakonec byl eluován protein stejným pufrem s obsahem 0,2 mol.l”¹ imidazolu. Protein v nesprávném prostorovém uspořádání byl uchován v 6 mol.l”¹ GdHCl při 4 °C po přidání octanu sodného na 10 mmol.l”¹a úpravě pH na 4,5 kyselinou octovou.

Prostorové přeuspořádání proteinu a purifikace:

mol.l”¹ GdHCl, obsahující 100 mg proteinu, se nechal reagovat s 67 μΐ 1 mol.l”¹ dithiothreitolu (DTT) a byl zředěn na 67 ml 6 mol.l”¹ GdHCl, 10 mmol.l”¹ NaAc, pH 4,5. Roztok byl míchán při laboratorní teplotě 1 h. Poté byl za míchání vlit do 4 1 20% glycerolu, 2,5 mmol.l“¹ CaCl₂, 20 mmol.l”¹ Tris, pH 8,4. Po důkladném promíchání byl roztok ponechán při laboratorní teplotě bez dalšího míchání. Dále bylo přidáno 2 000 jednotek purifikovaného bovinního trombinu (trombostaty, Parke-Davis) a roztok byl jemně promícháván. Po 2,5 h bylo přidáno znovu 2000 jednotek trombinu a štěpení histidine-tag pokračovalo ještě další tři hodiny. Štěpení

-55CZ 295018 B6 trombinem bylo ukončeno přídavkem PMSF na výslednou koncentraci 0,1 mmol.l Roztok byl přefiltrován a uchován při 4 °C.

Štěpený protein byl dále purifikován na stejné koloně IMAC, jak bylo uvedeno výše, ekvilibrované 1 mol.r¹ KC1, 20% glycerolem a 20 mmol.f¹ pufrem HEPES, pH 8,4. Po nanesení roztoku proteinu byla kolona promyta stejným pufrem, štěpený protein eluován roztokem 1 mol.F¹ KC1, 20% glycerol 40 mmol.l“¹ imidazol, 20 mmol.l“¹ HEPES, pH 8,4. Nerozštěpený protein byl eluován při 0,2 mol.F¹ imidazolu.

Purifíkovaný štěpený protein byl zahuštěn, nechal se reagovat s roztokem 50 až 100 mmol.l“¹EDTA a 10 mmol.l“¹ kyanoželezitanem draselným (kvůli dokončení možné neúplné oxidace) a přečištěn gelovou filtrací na koloně superdex 75 16/60. Výtěžek purifikace se blížil 50 % vzhledem k výchozímu proteinu.

Purifíkovaný expresní protein byl charakterizován několika postupy. Fyzikální charakterizace se provádí dynamickým rozptylem světla, který vypovídá o homogenitě struktury a je používán jako měřítko správného prostorového uspořádání proteinu. Z rozptylových údajů vyplývá, že lidský OB polypeptid je exprimován převážně nebo výlučně jako monomer, myší OB polypeptid jako dimer i monomer.

Testy s Ellmanovým činidlem a hmotnostní spektroskopie potvrdily, že cysteinové zbytky vytvářejí v molekule proteinu disulfídický můstek. Tato oxidovaná forma polypeptidu byla biologicky aktivní při testování na myších.

Cirkulámí dichroismus byl použit k hrubému stanovení geometrie struktury proteinu. CD struktura, měřená ve fyziologickém pufru (pH 8, fyziologická iontová sila roztoku), naznačují, že lidský ÓB polypeptid má z 60 % α-helikální a ze 40 % náhodně svinutou strukturu. Myší OB polypeptid má podle CD spekter z 50 % α-helikálni a z 50 % náhodně svinutou strukturu.

Identifikace oblastí polypeptidu, přístupných proteolýze, byla provedena omezenou proteolýzou a následnou hmotnostní spektroskopickou analýzou. Byla nalezena flexibilní struktura smyčky v oblasti aminokyselin 54 až 60 (obr. 4). Je pravděpodobné, že tato flexibilní smyčka spojuje dvě domény, definované 2° struktury, např. a-helix.

Biologická aktivita purifikovaného proteinu byla testována na hlodavcích podáním proteinu štíhlým i obézním zvířatům osmotickou pumpou (např. osmotická pumpa ALZET, Alza Corporation, Palo Alto, CA) nebo i.p. ve velkých denních dávkách po dobu nejméně dvou týdnů. Byl sledován účinek na stravovací zvyky a tělesnou hmotnost zvířat.

Příklad 8: Vliv OB polypeptidu (leptinu) na snížení tělesné hmotnosti

Produkt genu myšího OB lokusu má důležitou úlohu při regulaci tělesné hmotnosti. Uváděné příklady dokládají, že OB protein se nachází v plazmě v oběhu myší, krys a člověka. Oběhová forma OB proteinu u těchto tří živočišných druhů má stejnou molekulovou hmotnost (podle SDS-PAGE) jako vydedukovaná polypeptidová sekvence bez signální části, což naznačuje, že po odštěpení signální sekvence už protein není in vivo dále zpracováván. OB protein nebyl nalezen v plazmě myší C57/B16J OB/OB, vyskytoval se v desetinásobném nadbytku v plazmě myší DB/DB a dvacetinásobném nadbytku v plazmě krys FA/FA proti kontrole. Lze předpokládat, že tyto obézní mutace jsou vůči OB rezistentní. V plazmě, odebrané ve skupině šesti štíhlých lidí, byly nalezeny až sedminásobné rozdíly v hladinách OB proteinu. Denní injekce rekombinantního myšího OB proteinu vedly k dramatickému snížení tělesné hmotnosti u OB/OB myší, významně ovlivnily tělesnou hmotnost myší divokého typu ale neměly žádný účinek na myši typu DB/DB. Z těchto údajů vyplývá, že produkt genu OB lokusu endokrinně reguluje tělesnou hmotnost.

-56CZ 295018 B6

Materiály a postupy

Králíci byli imunizováni rekombinantním proteinem ve Freundově adjuvans (HRP, Inc.). Imunopurifikované protilátky proti myšímu OB byly izolovány z antiséra na koloně sefarózy-4B s konjugovaným rekombinantním proteinem [Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1988)]. Imunoprecipitace myší plazmy: 0,5ml vzorek plazmy myši, krysy a člověka, obsahující 2,5 mmol.F¹ EDTA, byl předčištěn na nekonjugované sefaróze-4B při laboratorní teplotě za stálého kolébání po dobu 2 h. Sefaróza byla odstraněna odstředěním a bylo přidáno 50 ml 50% suspenze sefarózy s konjugovanou protilátkou, obsahující afínitně purifikovanou protilátku v koncentraci 1 mg/ml sefarózy (originální balení). Dále byl přidán 1 až 0,5 ml 2 x RIPA pufru a dosaženo následujících výsledných vazebných podmínek: 50 mmol.F¹ Tris-HCl, pH 7,5, 100 mmol.F¹ NaCl, 1 % NP-40, 0,1 % SDS, 0,5 % deoxycholát sodný a 0,025 % azid sodný. Reakce probíhala přes noc při 4 °C za stálého kolíbání. Sefaróza, konjugovaná s protilátkou, byla osmkrát promyta pufrem RIPA, třikrát PBS a rozdělena na 15% SDS-PAGE. Proteiny byly přeneseny na nitrocelulózu a provedeno westernové blotování s biotinylovanou imunopurifíkovanou protilátkou proti rekombinantnímu proteinu. Jako sekundární protilátka byl použit HRP-streptavidin a detekce provedena ECL.

Kvantitativní stanovení množství OB v myším séru: Ke vzorkům 100 λ C57B1/6J OB/OB plazmy byla přidána vzrůstající množství prostorově přeuspořádaného rekombinantního myšího OB proteinu (0,01; 0,1; 0,5; 2,0; 15,0 ng) a vzorky inkubovány při 4 °C, 3 h s protilátkou, konjugovanou na sefaróze s proteinem A. Po důkladném promytí pufrem A (10 mmol.F¹ sodný fosfátový pufr, pH 7,4; 100 mmol.F¹ NaCl; 1 % Triton X-100, 5 mmol.F¹ EDTA, 1 mmol.F¹PMSF) byly vzorky resuspendovány ve stejném pufru, rozděleny na 15% SDS-PAGE a přeneseny na nitrocelulózovou membránu. Bylo provedeno westernové blotování s imunopurifikovanou biotinylovanou protilátkou proti amino-konci jako primární protilátkou a HRP-streptavidinem jako sekundární protilátkou a ECL detekce.

Cytoplazmatické extrakty byly připraveny homogenizací adipózní tkáně v NDS pufru (10 mmol.F¹ Tris, pH 7,5; 10 mmol.F¹ NaCl; 60 mmol.F¹ ICCI; 0,15 mmol.F¹ spermin; 0,5 mmol.F¹ spermidin; 14 mmol.F¹ β-merkaptoethanol; 0,5 mmol.F¹ EGTA; 2 mmol.F¹ EDTA; 0,5 NP-40) polytronovým a dounce postupem, jádra byla odstraněna centrifugací při 700 g.

Imunoprecipitace byly prováděny výše uvedeným postupem, pouze simunopurifikovanými protilátkami proti lidskému OB. Při testu ELISA bylo 100 ml roztoku 1 mg/ml imunopurifikované protilátky proti lidskému OB rozpuštěno v roztoku PBS, pufrovaném borátem, naneseno na mikrotitrační plotny (Corning kat. #2595) a inkubováno přes noc při 4 °C. Poté byly plotny promyty 4 x borátovým fyziologickým roztokem s obsahem 0,05 % Tween 20 a přebytek kapaliny byl odstraněn. Plotny byly blokovány 2 h inkubací při laboratorní teplotě s borátovým fyziologickým roztokem, obsahujícím 0,3 % želatiny, 240 ml na jamku, promyty a sušeny. V jednotlivých jamkách byly inkubovány lOOml roztoky, obsahující známé množství lidského OB proteinu ve správném prostorovém uspořádání nebo vzorku plazmy, přes noc při 4 °C. Po promytí byly plotny inkubovány se 100 ml roztoku imunopurifikované biotinylované protilátky proti lidskému OB (0,1 mg/ml v želatinovém roztoku, pufrovaném borátem), 4 h, při laboratorní teplotě. Po promytí byl do ploten přidán HRP-Streptavidin (HRP je peroxidáza z křenu) (0,1 mg/ml v borátovém pufru, 0,3 % želatiny). Pro detekci byl použit roztok substrátu pro HRP (ABTS, 0,3 mg/ml a H₂O₂, 0,01 % kyselina citrónová), navázání protilátky bylo kvantitativně stanoveno z hodnoty O.D. při 414 nm.

Myší a lidské kódující sekvence OB byly PCR amplifíkovány z plazmidů, obsahujících sekvence OB cDNA a subklonovány do plazmidu pPIC.9 (Invitrogen).

Byl použit lidský 5' primer o sekvenci: 5'GTATCTCTCGAGAAAAGAGTGCCCATCCAAAAAGTCCAAG 3' (SEQ ID č.34)

-57CZ 295018 B6 a 3'primer o sekvenci 5'GCGCGAATTCTCAGCACCCAGGGCTGAGGTC 3' (SEQ ID č.35).

Dále byl použit myší 5' primer o sekvenci: 5'GTATCTCTCGAGAAAAGAGTGCCTATCCAGAAAGTCCAGG 3' (SEQ ID č. 36) a 3'primer o sekvenci 5'GCGCGAATTCTCAGCATTCAGGGCTAACATC 3' (SEQ ID č.37).

Oba 5'primery, myší i lidský, obsahují Xhol místo na 5'konci a kódující sekvenci pro minimálně aminokyseliny signální sekvence α-párovacího faktoru z vektoru pPIC.9. Tento vektor směruje sekreci heterologně exprimovaných genů z buněk do kultivačního média. 5'primer PCR též obsahuje prvních 19 nukleotidů otevřeného čtecího rámce OB genu, nacházejícího se za signální sekvencí štěpného místa před alaninem v poloze 21. 3'primer obsahuje místo EcoRI na 5'konci a za ním hned následuje sekvence komplementární k předpokládanému stop kodonu OB. Podmínky PCR: denaturace 1 min při 94 °C, anelace 1 min při 55 °C a extenze 2,5 min při 72 °C. Počet mutací, vznikajících při PCR, byl omezen použitím polymerázy PFU (korekční polymeráza, Stratagen) a malým počtem cyklů PCR (15). Produkty PCR byly štěpeny Xhol a EcoRI a klonovány do stejně naštěpeného vektoru pPIC.9. Všechny konstrukty byly sekvenovány na obou vláknech, aby bylo potvrzeno, že neobsahují žádné PCR mutace. Klony byly použity k transformaci Pichia pastoris (His) sféroplastovým postupem a selektovány v histidin-defícientním médiu. Přibližně 200 myších a lidských klonů bylo testováno na přítomnost velkého počtu kopií integrované DNA postupem hybridizace na koloniích. U klonů s velkým počtem kopií byla pak testována exprese OB, nejprve Coomassieho barvením, které projeví přítomnost nového proteinu 16 kD v kultivačním médiu transformovaných kvasinek. S využitím protilátek, napěstovaných proti OB, exprimovanému v bakteriích, bylo prokázáno, že pás 16kD je OB. Rekombinantní proteiny byly dvoustupňové purifíkovány níže uvedeným postupem. Byla provedena hmotnostní spektrální analýza a reakce s bromkyanem, jak je popsáno v Beavis et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 87:6873-6877 (1990).

Celé kódující sekvence myšího i lidského genu OB na C-konci od signální sekvence byly subklonovány do expresního vektoru pET15b (Novagen) a exprimovány v E. coli [BL21(DE3)plYsS] s využitím systému sT7 RNA polymerázou [Studier et al., Meth. Enzymology, 185:80-89 (1990)]. Buňky napěstované při 30 °C do absorbance 0,7 při 595 nm a indukované přes noc 0,5 mmol.F¹ izopropyl-[3-D-thiogalakto-pyranosidem byly izolovány pomalou centrifugací. Byla provedena lýza třemi cykly mražení a tání a digesce DNA DNázou I. Membrány byly sonikovány, rozpuštěny detergentem a peleta buněčných těl byla rozpuštěna 6 mol.F¹ GdHCl, 20 mmol.F¹ HEPES, pH 8,4. Rekombinantní proteiny byly purifíkovány v denaturačních podmínkách postupem IMAC na Ni-afmitní koloně, eluce byla provedena rostoucí koncentrací imidazolu. Purifíkovaný denaturovaný OB protein byl uchován v 6 mol.T¹GdHCl, 10 mmol.F¹ octanu sodném (NaAc), pH 5 a redukován 1 mmol.F¹ DTT při laboratorní teplotě, 1 h. Denaturace byla provedena naředěním redukovaného proteinu do 20% glycerolu, mmol.F¹ CaCl₂, 5 mmol.F¹ NaAc, pH 5, za stálého míchání a inkubací při laboratorní teplotě 8 až 12 h. Po denaturaci bylo adjustováno pH na 8,4 přidáním Trisu na 10 mmol.F¹ a hexahistidinový tag byl odštěpen trombinem. Odštěpený a renaturovaný protein byl přečištěn postupem IMAC, produkt byl oddělen od trombinu a nerozštěpeného fúzního proteinu. Štěpený renaturovaný protein byl eluován z Ni-afmitní kolony při 40 mmol.F¹ imidazolu, trombin na koloně zadržen nebyl a nerozštěpený fúzní protein byl eluován 0,2 mol.F¹ imidazolem. Po zahuštění se produkt nechal reagovat s roztokem 100 mmol.F¹ EDTA a 10 mmol.F¹ kyanoželezitanem draselným a opět byl purifikován gelovou filtrací na koloně superdex 75 16/60 (Pharmacia).

Byl proveden Ellmanův test dle Ellman, Arch. Biochem. Biophys., 82:70-77 (1959). Ellmanovo činidlo bylo připraveno rozpuštěním 39,6 g 5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoové) kyseliny (DNTB) v 10 ml 0,05 mol.F¹ fosfátového pufru, pH 8. Byla konstruována kalibrační křivka v koncentračním rozmezí 10 až 120 mmol.F¹ volného sulfhydrylu (z 1 mmol.F¹ zásobního roztoku

-58CZ 295018 B6 redukovaného DTT) při 412 nm. Každý test byl proveden s 0,02 ml Ellmanova činidla a celým 0,5ml množstvím reakční směsi. Pro volnou sulfhydrylovou skupinu byl stanoven extinkční koeficient 12 974 mol“¹ cm“¹ (korelační koeficient 0,99987), což v rámci 5% souhlasí s dříve publikovanou hodnotou 13 600 mol“¹ cm“¹.

Ellmanův test byl proveden s 50 ml 2 mg/ml čistého gelově filtrovaného proteinu, což odpovídá možné koncentraci volných sulfhydrylových skupin 24 mmol.l“¹ v reakční směsi. Výsledný roztok měl hodnotu A₄₁₂ 0,02, což znamená, že protein obsahuje dva cysteinové zbytky v oxidovaném stavu jako cystin, nebo že cysteinové volné sulfhydrylové skupiny jsou zcela nepřístupně ukryty v jádru prostorově uspořádaného proteinu. Stejné výsledky byly získány z Ellmanova testu na neuspořádaném proteinu v 6 mol.l“¹ GdHCl.

Myši byly jednotlivě umístěny do klecí v nepatogenním prostředí a aklimatizovány na dietu, obsahující 35 % (obj/obj) Laboratory Rodent Diet 5001 (PMP Feeds, lne.,), 5,9 % (obj/obj) směsi tapiokového krému (generál Foods) a 59,1 % vody o energetickém obsahu 1,3 kcal/g. Dieta byla sterilizována autoklávem a balena do 60mm plastikových misek, které byly upevněny na vršky lOOmm Petriho misek. Vlivem tapioky získala potrava pastovitou konzistenci, takže ji zvířata nemohla roznášet po kleci. Ze lOOmm víčka bylo možné odebrat zpět i malé množství rozsypané potravy. Každé ráno dostávala zvířata čerstvou potravu a zbytky potravy z minulého dne byly odebírány a váženy. Hmotnostní rozdíly poskytly míru denního příjmu potravy. Účinky rekombinantního proteinu na příjem potravy a tělesnou hmotnost byly testovány na třech myších kmenech: C57B1/6H OB/OB, C57 Bl/Ks DB/DB a CBA/J +/+ z Jacksonovy laboratoře. 30 myší z každého kmene bylo rozděleno do skupin po deseti. První skupina od každého kmene dostávala denně intraperitoneální (i.p.) injekci bakteriálního OB proteinu ve správném prostorovém uspořádání v dávce 5 mg/g/den v 300 μΐ PBS. Druhá skupina od každého kmene, kontrolní, dostávala denně intraperitoneální (i.p.) injekci stejného objemu PBS. PBS pocházel z dialyzátu rekombinantního OB proteinu. Z PBS byl odstraněn endotoxin na koloně Acticlean ETOX. Třetí skupiny zvířat nedostávaly žádné injekce. Po dobu 3,5 týdne byl denně zaznamenáván příjem potravy a tělesná hmotnost. Pro párový experiment příjmu potravy byla zvláštní skupina OB myší krmena stejným množstvím potravy, jaké přijímala skupina OB myší s aplikovaným proteinem.

Výsledky

OB protein, cirkulující v myší, krysí a lidské plazmě

Lidský OB protein byl připraven s využitím pET 15b bakteriálního expresního vektoru (Novagen), nakloňovaného do Pichia pastoris v kvasinkovém expresním systému, který směruje sekreci rekombinantního proteinu přímo do kultivačního média. OB protein, exprimovaný v kvasinkách, obsahuje 146 aminokyselin C-koncových k signální sekvenci. Králíci byli imunizováni bakteriálním proteinem (HRP, lne.). Protilátky byly imunopurifikovány (Research Genetics) a použity pro imunoprecipitace a westernové blotování proteinu z plazmy a adipózní tkáně.

Podle SDS-PAGE migruje OB protein z myší plazmy s molekulovou hmotností 16 kD. Má stejnou elektroforetickou pohyblivost jako rekombinantní OB protein, sekretovaný kvasinkami po odštěpení signální sekvence (obr. 24A). Protein nebyl detekován v plazmě C57B1/6J OB/OB myší, u nichž byla v kodonu 105 nalezena nonsense mutace. Zkrácený 105 zbytek polypeptidického řetězce, předpovězeného podle sekvence cDNA, se ani využitím několika různých antisér, nepodařilo určit.

Desetinásobný vzrůst hladiny cirkulujícího proteinu proti kontrolním zvířatům byl pozorován u DB/DB myší (obr. 24 A). Imunoprecipitace plazmy z krys divokého typu a krys FA/FA odhalila dvacetinásobný vzrůst hladiny OB proteinu v mutaci proti divokému typu (obr. 24 b). Mutace DB vede k obéznímu fenotypu stejně jako myší mutace OB [Bahary et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 87:8642-8646 (1990)]. Tlusté krysy jsou obézní následkem recesivní mutace v genu, homologním kDB [Truett et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 88:7806-7809 (1991)]. Se záměrem

-59CZ 295018 B6 kvantifikovat hladinu OB v myší plazmě byla k séru přidávána rostoucí množství rekombinantního proteinu a provedena imunoprecipitace. S rostoucím množstvím rekombinantního proteinu byl pozorován lineární růst intenzity signálů na westernovém blotu. Porovnání intenzit přirozeného proteinu v myší plazmě a standardů naznačilo, že cirkulační hladina OB proteinu v myších divokého typu je přibližně 20 ng/ml. Imunoprecipitace a westernové blotování byly tedy provedeny v podmínkách s přebytkem protilátky. Vyšší hladiny OB proteinu lze též pozorovat v proteinových extraktech z adipózních tkání myší DB/DB proti kontrolám (obr. 24 D). Sekretorický protein byl dle předpokladu součástí surové membránové frakce (údaje nejsou uvedeny).

Vzorky plazmy, odebrané od šesti štíhlých lidí s indexem tělesné hmotnosti BMI < 25 (BMI=hmotnost/výška), byly imunoprecipitovány s imunopurifíkovanými protilátkami proti lidskému proteinu. Imunoprecipitovaný materiál migroval na elektroforéze s lidským proteinem 146 aminokyselin, který byl připraven expresí v kvasinkách. Intenzita signálů se u šesti studovaných vzorků výrazně lišila. Z denzitometrické analýzy autoradiografu vyplynul až pětinásobný rozdíl v hladinách proteinu mezi HP1 a HP6, hladiny u ostatních subjektů se pohybovaly uprostřed. Byl vypracován test ELISA s využitím imunopurifikované protilátky a bakteriálním proteinem ve správném prostorovém uspořádání jako standardem (viz níže). Výsledná standardní křivka je uvedena na obr. 25 B. Pomocí tohoto testu bylo stanoveno, že hladiny OB proteinu u šesti testovaných lidí se lišily v rozmezí 2 až 15 ng/ml (obr. 25 C). Hladina OB proteinu v plazmě HP6 s hodnotou > 15 ng/ml přesáhla lineární limitní hranici (obr. 25 C). Uvedené kvantitativní rozdíly korelují s rozdíly v intenzitách signálů na westernových blotech.

Z předběžných údajů vyplývá, že leptin může cirkulovat alespoň částečně jako komplex s jiným proteinem nebo několika proteiny. Tento závěr vychází z heterogenního tvaru titrační křivky pro sérum ve srovnání s křivkou pro rekombinantní standard. Analýza velkého množství leptinu, imunopurifikovaného gelově filtrační HPLC na koloně s navázanými králičími anti-OB protilátkami v denaturujících i nedenaturujících podmínkách a za monitorování postupem ELISA a SDS-PAGE naznačila, že se OB polypeptid chová stejně jako vysokomolekulární komplex. Tyto údaje však mají pouze předběžný charakter, neboť protein který váže OB, pokud vůbec takový existuje, je třeba nejprve charakterizovat.

Strukturní rysy OB proteinu

Dva cysteinové zbytky v OB proteinu mohou v oxidačních podmínkách in vivo vytvářet intra- nebo intermolekulární disulfidické můstky. Westernové blotování bylo opakovaně provedeno v přítomnosti i nepřítomnosti redukčního činidla v pufru testovaného vzorku. V obou případech OB protein lidského séra migroval jako monomer (údaje nejsou uvedeny). V neredukujících podmínkách protein, imunoprecipitovaný z DB myšího séra, byl detekován s monomerem 16 kD a dimerem 32 kD (obr. 26 A). V redukčních podmínkách vysokomolekulární látka zmizela, což znamená, že určitá část myšího OB cirkuluje jako vysokomolekulární látka, vázaná intermolekulámím disulfídickým můstkem. Přibližně 80 % myšího OB cirkuluje jako protein 16 kD a 20 % jako forma 32 kD.

Stejné molekulární formy vznikají při expresi myšího a lidského proteinu v Pichia pastoris [Abrams et al., Immunol. Rev., :5-24 (1992)]. V těchto studiích byla klonována sekvence DNA, odpovídající 146 aminokyselinám maturovaného OB proteinu po směru od kvasinkové signální sekvence α-párovacího faktoru do vektoru pPIC.9 (Invitrogen). OBA protein byl purifikován z kvasinkového kultivačního média kmenů, exprimujících myší a lidský protein a rozdělen elektroforézou v redukujících i neredukujících podmínkách (obr. 26 A). Myší protein byl v kvasinkách exprimován v neredukujících podmínkách převážně jako dimer, v přítomnosti redukčního činidla pouze jako monomer. Rekombinantní lidský protein migroval do polohy monomeru v obou případech (údaje nejsou uvedeny).

Podle hmotnostní spektroskopické analýzy měl purifikovaný lidský protein, exprimovaný v Pichia, molekulovou hmotnost 16 024±3 Da [Beavis et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA,

-60CZ 295018 B6

87:6873-6877 (1990)]. Tato hodnota je v souladu s molekulovou hmotností aminokyselinové sekvence proteinu s intramolekulárním disulfidickým můstkem (16 024 Da). Laserová desorpční hmotnostní spektroskopická analýza produktů bromkyanového štěpení proteinu naznačuje, že cysteiny 117 a 167 jsou spojeny intramolekulárním disulfidickým můstkem (obr. 26 B). Bromkyan štěpí proteiny od C-konce v místě methioninu.

Příprava a charakterizace bioaktivního rekombinantního proteinu

Myší OB byl exprimován v E. coli z plazmidu pET 15b jako nerozpustný fúzní protein, obsahující 20 aminokyselin a N-koncový hexa-histidinový tag se štěpením místem pro trombin. Bakteriální buněčná těla byla roz a punfikována v denaturujipuštěna guanidin hy<

cích podmínkách afínitní chromatogra/íí na nosiči s 'mobilizovaným kovem (W) (obr. M). Purifíkovaný denaturovaný fúzní protein byl redukován, naředěn a ponechán ve vodném roztoku při laboratorní teplotě, aby vzniklo správné prostorové uspořádání. Po trombinovém štěpení byl renaturovaný myší OB protein, obsahující čtyři dodatečné N-koncové zbytky (Gly-Ser-HisMet; SEQ ID č. 38), opět purifíkován postupem IMAC na 98 % homogenitu, podle SDS-PAGE a hmotnostní spektroskopické analýzy. Laserová desorpční hmotnostní spektroskopická analýza na matrici stanovila molekulovou hmotnost 16 414±3 Da (vypočtená hodnota - 16 415 Da). Na obou SDS-PAGE gelech, redukujícím i neredukujícím, byla patrna jednotná látka o molekulové hmotnosti 16 kD (údaje neuvedeny).

Na detektoru molekulové hmotnosti typ DP801 (Protein Solutions, lne.), který využívá dynamického rozptylu světla, bylo zjištěno, že renaturovaný myší OB protein byl převážně monomerní a obsahoval nemnoho agregátů vyššího řádu. Protein se nechal reagovat s EDTA a byl chemicky oxidován. Vysokomolekulární proteiny byly pak odstraněny gelovou filtrací. Další dynamický rozptyl světla potvrdil, že purifíkovaný, renaturovaný rekombinantní myší OB protein je monodisperzní. Po dialýze proti fyziologickému roztoku, pufrovanému fosfátem (PBS), byl odstraněn bakteriální endotoxin na koloně Acticlean ETOX (Sterogen Bioseparations, lne.). Výsledný výtěžek proteinu byl 45 mg/1.

Na purifíkovaném renaturovaném rekombinantním myším OB proteinu byl Ellmanovým testem stanoven oxidační stav [Ellman, Arch. Biochem. Biophys., 82:70-77 (1959)]. V renaturovaném proteinu i v proteinu, který se nechal reagovat s 6 mokl¹ GdHCl, byl stanoven obsah volných sulfhydrylových skupin < 0,5 %, což znamená, že monomerní produkt obsahuje intramolekulámí disulfídický můstek (obr. 26 B). Tento výsledek byl potvrzen i hmotnostní spektroskopickou analýzou produktů bromkyanového štěpení správně prostorově uspořádaného bakteriálního proteinu (údaje neuvedeny).

Bioaktivita OB proteinu

Purifíkovaný rekombinantní myší OB protein byl podáván intraperitoneální injekcí denně, v množství 5 mg/kg/den skupinám po deseti myších typů C57B1/6J OB/OB (věk 16 týdnů), C57 Bl/Ks DB/DB (věk 12 týdnů) a CBA/J +/+ (věk 8 týdnů). Stejnému počtu zvířat byl denně injekčně podáván PBS. PBS pro kontrolní injekce pocházel z dialyzátu po ekvilibraci proteinu. Deset dalších zvířat od každého kmene nedostávalo žádné injekce. U jednotlivých zvířat byl monitorován denní příjem potravy a ve tří- až čtyřdenních intervalech zaznamenávána hmotnost. Souhrnné výsledky příjmu potravy a tělesné hmotnosti pro každou z devíti skupin zvířat jsou uvedeny na obr. 28 A až F, statistický význam těchto údajů je uveden v tabulce 1. Příjem potravy u C57B1/6J OB/OB myší které dostávaly injekčně protein, se výrazně snížil po první injekci a stále se snižoval až do pátého dne. Poté se příjem potravy ustálil na 40 % příjmu potravy zvířat, které injekčně dostávaly PBS (p<0,001). Myši, které dostávaly placebo, během třítýdenního testu neztrácely hmotnost. U C57B1/6J OB/OB myší, léčených proteinem, došlo k 10% úbytku tělesné hmotnosti po 5 dnech (p<0,001). Během třítýdenního testu tato OB zvířata dále ztrácela hmotnost průměrně až na 60 % vzhledem k výchozí tělesné hmotnosti (p<0,0001). Zvláštní skupina zvířat byla krmena párově, tedy stejným množstvím potravy, jaké přijímaly OB myši, léčené proteinem.

-61 CZ 295018 B6

Údaje na obr. 29 B ukazují, že u párově krmených myší došlo k významně nižšímu úbytku hmotnosti než u zvířat, léčených rekombinantním proteinem (p<0,02). Na fotografii dvou myší injekčně léčených buď proteinem nebo pouze PBS je patrný podstatně odlišný vzhled myši léčené proteinem (obr. 29 B). Další účinky proteinu byly zjišťovány na pitvách dvou myší 5 z každé pokusné skupiny. Celková prohlídka OB myši léčené proteinem prokázala dramatické snížení obsahu tělesného tuku i velikosti jater. Hmotnost jater u DB a divokých myší zůstala při proteinové léčbě nezměněna. Játra OB myší, léčených injekčně pouze PBS, vážila 5,04 a 5,02 g, proti hodnotám 2,23 a 2,03 g u jater OB myší, léčených rekombinantním proteinem. Na rozdíl od bledých tučných jater OB myší získala játra OB myší, léčených proteinem, tmavší barvu, 10 charakteristickou pro zdravá játra (obr. 29 C). Z histologického vyšetření jater vyplynulo, že tučná játra neléčených zvířat byla vlivem proteinové léčby podstatně zlepšena (údaje neuvedeny).

Na rozdíl od myší OB typu nebyly pozorovány žádné významnější rozdíly v tělesné hmotnosti nebo příjmu potravy u myší typu €57ΒΙ/Κ.3Ζ7Β/Ζλ6, léčených proteinem, proti kontrolní skupině, 15 dostávající pouze nosič (obr. 28 A až F, tabulka 1). U všech tří skupin DB/DB myší došlo během pokusného období k úbytku hmotnosti o 2 až 5 g. Byla měřena průměrná hodnota glukózy v krvi DB/DB myší glukometrem a u všech myší stanovena hodnota > 500 mg/dl, což naznačuje, že u myší došlo vedle obezity k sekundárnímu rozvoji diabetes. Injekce myším DB byly po dvou týdnech přerušeny.

U divokých myší bylo pozorováno malé, ale významné snížení tělesné hmotnosti po podání rekombinantního proteinu (obr. 28 A až F, tabulka 1). Po pěti dnech proteinové léčby došlo u léčených myší k průměrnému úbytku hmotnosti 0,5 g, u neléčených myší došlo k přírůstku 0,4 g (p<0,02). Při dvou dalších následujících kontrolách vážila zvířata, léčená proteinem, 25 zřetelně méně, než zvířata, dostávající denně pouze injekce PBS. Rozdíl v tělesných hmotnostech se však postupem času zmenšoval. U zvířat s úbytkem hmotnosti nedocházelo k podstatnějšímu rozdílu v příjmu potravy proti neléčené skupině. Injekce PBS měly malý ale významný vliv na příjem potravy a tělesnou hmotnost u OB, DB i divokých myší proti skupinám, které nedostávaly žádné injekce (p<0,5).

Tabulka 1

skupina zvířat	typ léčby	ZMĚNA HMOTNOSTI
počet dní	n	střed	std. chyba	P
OB/OB	protein	1-5	10	-6,38000000	0,47628190	<0,001
	nosič		9	-0,14444444	0,24444444
	protein	1-12	10	-14,45000000	0,70793126	<0,001
	nosič		9	0,98888889	0,38058597
	protein	1-27	6	-24,28333333	0,69924563	<0,0001
	nosič		5	4,30000000	0,79874902
DB/DB	protein	1-5	10	-1,47000000	0,36939891	0,240
	nosič		10	-2,00000000	0,23142073
	protein	1-12	10	-3,75000000	0,77348418	0,610
	nosič		10	-4,19000000	0,34655447
CBA/J	protein	1-5	10	-0,48000000	0,17876117	0,006
	nosič		10	0,38000000	0,21489015
	protein	1-12	10	0,12000000	0,45748103	0,015
	nosič		10	1,20000000	0,18378732
	protein	1-27	5	1,98000000	0,48723711	<0,651
	nosič		6	2,23333333	0,20763215

-62CZ 295018 B6

Diskuse

Endokrinní funkce proteinového produktu OB lokusu byla poprvé navržena Colemanem, který ukázal, že u OB/OB myší došlo ke snížení tělesné hmotnosti vlivem parabiotického spojení s normálním nebo DB typem myší [Coleman et al., Diabetologia, 14:141-148 (1978)]. Výše uvedené výsledky podporují tuto hypotézu, neboť prokazují, že PB protein cirkuluje v krevním oběhu a že injekce rekombinantního proteinu vede k úbytku tělesné hmotnosti. Molekulová hmotnost produktu, kódovaného OB genem, je 16 kD, což odpovídá 146 aminokyselinové sekvenci carboxy-terminální k signální sekvenci. Rekombinantní OB protein není modifikován při expresi v Pichia pastoris. Exprese savčích genů v Pichia obvykle vede ke tvorbě správné struktury proteinu [Cregg et al., Bio/Technology, 11:905-914 (1993)]. Tato zjištění naznačují, že OB protein není in vivo glykosylován ani post-translačně zpracováván. Údaje nevylučují možnost, že je OB protein nekovalentně vázán sám k sobě nebo jiným proteinům, přítomným v plazmě nebo adipózní tkáni. Ačkoliv nelze vyloučit proteolýzu OB proteinu, nízkomolekulární formy OB nebyly detekovány žádným použitým antisérem včetně čtyř anti-peptidových protilátek.

OB protein, obsahující dva cysteinové zbytky, cirkuluje u člověka jako monomer a u myší jako monomer i dimer. Intramolekulámí disulfídický můstek, typický pro sekretorické molekuly, byl nalezen u lidského proteinu, exprimovaného v Pichia pastoris, což naznačuje, že je pravděpodobně přítomen i v proteinu in vivo. Tomu odpovídá i bioaktivita rekombinantního bakteriálního proteinu s intramolekulámím disulfídickým můstkem. Vmyší plazmě se OB protein vyskytuje jako monomer i dimer. Obě tyto formy lze nalézt při expresi myšího OB v kvasinkách. Sklon myšího OB proteinu vytvářet dimer je pravděpodobně důsledkem odlišností v primární sekvenci proti lidskému OB. Bioaktivita monomeru je zřejmá, funkční aktivita dimeru není zatímznáma.

Účinek OB proteiny na příjem potravy a tělesnou hmotnost OB myší je dramatický. Po třítýdenní léčbě došlo u OB myší, léčených denními injekcemi rekombinantního proteinu, ke 40% úbytku tělesné hmotnosti a 40% příjmu potravy při porovnání s kontrolní skupinou. Přitom v době skončení pokusu ještě nedošlo ke stabilizaci hmotnosti léčených OB myší. Pokus s párově krmenými zvířaty naznačil, že úbytek hmotnosti je souhrnem sníženého příjmu potravy a výdeje energie. U párově krmené skupiny OB myší totiž došlo k podstatně nižšímu úbytku hmotnosti proti léčené skupině. Snížení příjmu potravy u OB/OB myší na nižší úroveň než u myší divokého typu naznačuje, že OB myši jsou k účinkům OB zvláště citlivé. OB receptor těchto zvířat může být skutečně aktivnější. Příjem potravy OB myší se po pěti dnech léčby relativně stabilizoval. Pokud je tento jev výsledkem dosažení rovnovážné hladiny OB proteinu, lze předpokládat, že protein má relativně dlouhý poločas [The Pharmacological Basis of Therapeutics, str. 19-45, Goodman a Gilman, vyd., Pergamon Press, New York, (1990)]. Tento závěr je v souladu s výsledky parabiotických experimentů [Coleman et al., Diabetologia, 14:141-148 (1978), Weigle, In. J. Obesity, 12:567-578 (1988)].

Účinky rekombinantního proteinu na tělesnou hmotnost myší divokého typu byly malé ale statisticky významné během prvních dvou týdnů experimentu. Zatímco rozdíl v hmotnostech mezi skupinami divokých myší, léčených a neléčených proteinem, přetrvával, statistický význam těchto údajů po třech týdnech velmi klesl. Počáteční ztráta hmotnosti nemohla být vyvolána rozdílným příjem potravy. Měření příjmu potravy pravděpodobně nebylo dostatečně přesné, aby mohlo zaznamenat hmotnostní rozdíly v rozmezí 1 g během léčby. Tato pozorování se liší od výsledků starších experimentů, v nichž bylo hlodavci divokého typu parabioticky spojeni s myšmi DB, krysami FA, krysami s hypotalamickými lézemi a krysami, jejichž obezita byla vyvolána vysokokalorickou dietou [Coleman et al., Diabetologia, 14:141-148 (1978); Harris et al., Int. J. Oběs., 11:275-283 (1987); Harris et al., „Physiological and metabolic changes inparabiotic partners of obse rats“ v Hormones, Thermogenesis and Obesity, Lardy a Straatmen, vyd., Elsevier Science Publishing Co., New York (1989); Hervey, J. Physiol., 145:336-352 (1959)]. Ve všech případech došlo u divokých zvířat k anorexii a velkému úbytku hmotnosti. Protože vzrostly hladiny OB proteinu u DB myší, FA krys a vzrostla hladina OB RNA v myších s hypotalamickými lézemi, je pravděpodobné, že myši divokého typu jsou schopné odpovídat na

-63 CZ 295018 B6

OB polypeptid, cirkuluje-li v plazmě v dostatečně vysokém množství. Předkládaná zjištění podporují možnost, že protein byl podáván v množství pod endogenní hladinou a vedl k rovnovážnému stavu při poněkud nižší tělesné hmotnosti. Tento problém vyřeší kvantifikace cirkulačních hladin OB proteinu u léčených myší. Ač imunoesej myšího proteinu ještě není k dispozici, výsledky imunoprecipitace naznačují, že cirkulační hladiny OB proteinu nebyly u divokých myší, léčených proteinem, podstatně zvýšeny.

Z menšího účinku proteinu na myši divokého typu a žádné reakce DB myší lze předpokládat, že léčba pravděpodobně není nespecifická nebo způsobující pouhé nechutenství. U všech DB myší došlo během pokusu k malému úbytku hmotnosti, nezávisle na tom, zda dostávaly OB protein nebo ne. Zvířata DB byla výrazně hyperglykemická a úbytek hmotnosti nastal zřejmě vlivem diabetes a nikoli díky experimentu. U myší C57B1/Ks DB/DB dochází často k rozvoji diabetes a úbytku hmotnosti ve stáří, kdy byly rovněž použity v této studii [Coleman et al., Diabetologia, 14:141-148 (1978)], U myší C57B1/6J OB/OB stejného stáří nedochází k podstatnějšímu rozvoji hyperglykemie. Tyto fenotypové rozdíly jsou pravděpodobně výsledkem genetických odlišností mutantních kmenů (C57B1/6J vs. C57B1/Ks) [Coleman et al., Diabetologia, 14:141-148 (1978)].

Neúspěch v detekci zkráceného 105 aminokyselin dlouhého proteinu, předpovězeného ze sekvence cDNA OB genu v myších C57B1/6J OB/OB naznačuje, že mutantní protein je buď degradován, nebo není vůbec přeložen. Nelze však vyloučit ani možnost, že použitá antiséra nejsou pro detekci tohoto zkráceného proteinu vhodná. Pozorovaný desetinásobný vzrůst hladiny OB proteinu u DB myší proti divokému typu naznačuje, že při rezistenci vůči účinkům OB proteinu dochází k jeho nadprodukci. Tyto údaje korelují se studiemi OB mRNA. Z předcházejících experimentů vyplývá, že mutace DB myšího a FA krysího genu, lokalizované v homologních chromozomálních oblastech, vedou k nadprodukci plazmatického faktoru, potlačujícího tělesnou hmotnost [Truett et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 88:7806-7809 (1991); Coleman et al., Diabetologia, 14:141-148 (1978); Hervey, J. Physiol., 145:336-352 (1959)]]. V obou případech jsou mutantní zvířata pravděpodobně rezistentní vůči OB proteinu. Tento závěr podporuje i fakt, že OB protein nemá žádný vliv na tělesnou hmotnost či příjem potravy uDB myší.

Lidská obezita může souviset se zvýšenými hladinami OB proteinu v plazmě u jedinců, kteří relativně nereagují na hormon. Na druhé straně snížená exprese OB může rovněž vyvolávat obezitu, přitom však mohou být naměřeny „normální“ (tj. nepřiměřeně nízké) hladiny proteinu. Plazmatické hladiny OB proteinu jsou tudíž známkou různých forem obezity. U malé skupiny štíhlých jedinců s BMK25 lze detekovat (testem ELISA) nízké nanogramové hladiny cirkulačního OB proteinu. Je podstatné, že byly zaznamenány různé koncentrace OB, naznačující, že expresní hladina a/nebo citlivost vůči proteinu hraje významnou roli, určující tělesnou hmotnost.

Místo účinku OB proteinu není dosud známo. Protein ovlivňuje příjem potravy a výdej energie. To je zjištění, odpovídající klinickým studiím, podle nichž změny v obou systémech ovlivňují tělesnou hmotnost [Leibel et al., N. Engl. J. Med., 332:621-628 (1995); Kessey et al., „Metabolic defense of the body weight set-point,“ v Association for Research in Nervous and Mental Disease, str. 87-96 Stunkard a Stellar, vyd., Raven Press, New Yor (1984)]. Hypotalamus je pravděpodobně v hierarchii cest, regulujících tělesnou hmotnost, až za OB, ač ani přímé působení různých orgánů nelze vyloučit.

Příklad 9: Zvýšená exprese OB RNA v adipocytech myší s hypotalamickými lézemi a mutací v DB lokusu

Produkt nedávno klonovaného myšího genu obezity (OB) má důležitou úlohu v regulaci adipózní tkáňové hmoty. OB RNA je in vivo exprimována specificky v myších adipocytech, v každém z několika různých tukových buněčných depotech včetně hnědého tuku. OB RNA je rovněž exprimována nakultivovanými preadipocytárními buňkami 3T3-442A, u nichž byla indukována diferenciace. V adipózní tkáni myší s hypotalamickými lézemi i myší s mutacemi v DB lokusu

-64CZ 295018 B6 dochází k dvacetinásobně vyšší expresi OB RNA. Z toho vyplývá, že DB gen i hypotalamus jsou v hierarchii cest, regulujících adipózní tkáňovou hmotu, až za OB genem a že DB lokus kóduje OB receptor, jak naznačují předběžné experimenty. U DB/DB myší a myší s lézemi kvantitativně korelují rozdíly v expresní hladině OB RNA s obsahem tuků v adipocytech. Molekuly, regulující expresní hladinu OB genu v adipocytech, pravděpodobně určují tělesnou hmotnost, podobně jako molekuly, které zprostředkovávají účinek OB do cílového místa.

Materiály a postupy

Hybridizace in šitu

Bílé tukové tkáně z identických abdominálních oblastí divokých (wt) a DB myší byly souběžně zpracovány podle postupu Richardson et al., Growth, Development &Aging, 56:149-157 (1992). Stručně, tkáně byly fixovány v Bouinově roztoku, 2 h, 4 °C. Poté byly dehydratovány řadou postupných inkubací s ethanolem o rostoucí koncentraci z 10 na 100 % hmotn., každá inkubace trvala 5 min při 4 °C. Dále byly tkáně inkubovány s xylenem (1 h) a parafínem (2 h) při 65 °C. Zafixované wt i DB/DB tukové tkáně byly nařezány a ajustovány v podmínkách, jak je uvedeno dále. Řezy byly sušeny při 65 °C 1 h a inkubovány s xylenem a dále postupně s ethanolem o klesající koncentraci od 100 do 50 % hmotn., každá inkubace trvala 3 min při laboratorní teplotě. Antisense RNA proba OB genu byla syntetizována in vitro, transkripcí linearizované kódující sekvence OB genu v protisměru od Sp6 RNA polymerázového promotoru. Hybridizace in šitu byla provedena přesně podle Schaeren-Wiemers, et al., Histochemistry, 100:431-440 (1993).

Preparace RNA a buněčná kultura

Totální RNA a northernové bloty byly připraveny dle popisu. Stromatické cévní buňky a adipocyty byly připraveny podle Rodbella a RNA z obou frakcí byla připravena podle Dani et al., Mol. Cell. Endocrinol., 63:199-208 (1989); Rodbell, J. Biol. Chem., 239:375-380 (19). Po subklonování byly buňky 3T3-F442 napěstovány v Dulbeccově modifikaci. Eaglova média s obsahem 10 % fetálního hovězího séra (definováno jako standardní médium) [Dani et al., „Molecular biology techniques in the study of adipocyte differentiation“, v Obesity in Europe, díl 88, str. 371-376, Bjomtorp a Rossner, vyd., John Libbey Company Ltd., London, England (1989)]. Konfluentní buňky se nechaly reagovat ve standardním médiu, doplněném 2 nmol.l¹trijodthyroninem (T3) a 17 nmol.f¹ inzulínem. Po dvanácti dnech byla připravena RNA, jak je uvedeno výše.

Aplikace aurothioglukózy (GTG)

Dvouměsíčním myším samičkám CBA/J byla aplikována jednorázově intraperitoneální injekce aurothioglukózy (Sigma Catalog. No. A0632) v dávce 0,2 mg/g v normálním fyziologickém roztoku. Kontrolní zvířata dostala injekci normálního fyziologického roztoku. Jeden měsíc po aplikaci byly myši zváženy. Z adipózní tkáně zvířat, jejichž hmotnost po aplikaci GTG vzrostla o více než 20 g, byla izolována RNA.

Výsledky

Nedávno bylo zjištěno, že OB gen je exprimován v adipózní tkáni [Zhang et al., Nátuře, 372:425-432 (1994)]. Vzhledem ktomu, že adipózní tkáň je tvořena různými typy buněk, jako jsou adipocyty, preadipocyty, fíbroblasty a cévní buňky, byla provedena hybridizace in šitu na tkáňových řezech epididymálních tukových zásob z normálních zvířat s použitím sense a antisense OB RNA prob [Richardson et al., Growth, Development & Anging, 56:149-157 (1992); Wasserman, „ The concept of the fat organ “ v Rodahl, Issekutz, fat as a tissue, str. 22-92, McGraw Hill, New York (1964)]. U antisense prob byly detekovány pozitivní signály ve všech adipocytech tkáňového řezu (obr. 30 - značeno Wt). Signály nebyly zaznamenány při hybridizaci antisense proby v mozkovém tkáňovém řezu (údaje neuvedeny). Hybridizace antisense proby

-65 CZ 295018 B6 k tkáňovým řezům adipózní tkáně myší C57B1/Ks DB/DB byla podstatně vyšší, což odpovídá specifitě exprese OB RNA v adipocytech a také výraznému vzrůstu hladiny OB RNA v adipocytech těchto zvířat (obr. 30 - značeno DB/DB). Výrazná obezita myší s mutacemi v DB lokusu je součástí syndromu, který je fenotypově identický se syndromem, pozorovaným u myší C57B1/6J OB/OB [Bahary et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 87:8642-8646 (1990)].

OB RNA nebyla syntetizována v adipózní tkáni stromatických buněk, z níž byly odstraněny adipocyty. Podle northernových blotů, buňky adipocytové frakce dle očekávání exprimovaly OB RNA (obr. 31). Ke stejnému výsledku vedl i test RT-PCR (údaje neuvedeny). Tyto údaje dokazují, že exprese OB genu probíhá výhradně v adipocytech. Údaje z nakultivovaných adipocytů tento závěr rovněž potvrzují. Při těchto studiích byly kultivovány buňky 3T3-F442A v podmínkách, vedoucích k akumulaci tuků v rámci buněčné diferenciace na adipocyty. K expresi OB RNA nedocházelo ani v exponenciálně rostoucích buňkách, ani v konfluentních 3T3-F442A preadipocytárních buňkách, kde probíhala exprese časných markérů. Teprve po diferenciaci na adipocyty nastala exprese detekovatelných hladin OB RNA (obr. 31) [Dani et al., J. Biol. Chem., 264:10119-10125 (1989)]. Expresní hladina OB RNA je mimořádně citlivá na kultivační podmínky, exprese OB nebyla zjištěna u starších, post-konfluentních buněk, které nebyly vystaveny působení inzulínu.

Hybridizační studie prokázaly, že k expresi OB RNA in vivo dochází v řadě různých tukových depotů, včetně epididymálního, parametriálního, abdominálního, perirenálního a ingvinálního (obr. 32 A). Expresní hladiny v jednotlivých depotech byly poněkud proměnlivé, v ingvinálním a parametriálním nižší. Exprese OB RNA probíhá rovněž v hnědé adipózní tkáni, i když expresní hladina je asi 50 x nižší než v ostatních tkáňových depotech. Tyto kvantitativní rozdíly těsně korelují s dříve popsanými rozdíly mezi velikostmi buněk různých tukových depotů [Johnson et al., J. Lipid res., 13:2-11 (1972)]. Množství OB RNA v hnědém tuku není ovlivněno chladem (obr. 32 B). Experimentálně bylo zjištěno, že vlivem chladu vzrůstá hladina nepárující proteinové RNA (UCP) v hnědém tuku, ale hladina OB RNA zůstává nezměněna [Jacobsson et al., J. Biol. Chem., 260:16250-16254 (1985)]. V souhrnu tyto údaje potvrzují, že ve všech adipocytech vzniká OB RNA a její expresní hladina je v různých tukových depotech různá. Uvedené údaje podporují představu, podle níž hladina kódovaného proteinu koreluje s celkovou hmotou adipózní tkáně.

Hladiny OB RNA byly stanovovány u DB/DB myší a myší s hypotalamickými lézemi. Leze ventrikulárního hypotalamu (VHM) vedou k rozvoji obezity jako součásti syndromu, připomínajícího syndrom u myší OB/OB DB/DB [Bray et al., Metabolism, 24:99-117 (1975)]. Z parabiotických experimentů vyplývá, že tyto léze vedou k nadměrné expresi krevního faktoru, který potlačuje příjem potravy a tělesnou hmotnost [Hervey, J. Physiol., 145:336-352 (1959)]. Podobné výsledky byly zaznamenány při parabiotickém spojení myší s mutacemi v OB lokusu a normálních myší, což naznačuje, že OB receptor může být kódován DB lokusem [Coleman et al., Diabetologia, 14:141-148 (1978)]. Obezita, způsobená VHM lézemi a DB mutací, může být tedy důsledkem rezistence vůči účinkům OB proteinu. Pokud je tomu skutečně tak, lze předpokládat sekundární zvýšení hladin OB RNA v adipózní tkáni.

U samiček CBA myší byly působením aurothioglukózy (GTG) chemicky indukovány hypotalamické léze [Debons et al., Fed. Proč., 36:143-147 (1977)]. Aurothioglukóza způsobuje specifické hypotalamické léze, zejména ve ventrikulárním hypotalamu (VMH), s následným rozvojem obezity během několika týdnů. K vyvolání obezity během čtyř týdnů obvykle stačí jedna peritoneální injekce GTG v dávce 0,2 mg/g tělesné hmotnosti. GTG bylo injikováno samičkám myší CBA/J (20 až 25 g). Následný přírůstek hmotnosti pokusných a kontrolních zvířat je uveden v tabulce 2. Byla připravena RNA z adipózní tkáně myší DB/DB a myší po aplikaci GTG, jejichž hmotnost vzrostla o více než 20 g. Na northernových blotech byl pozorován dvacetinásobný vzrůst hladiny OB RNA u dvouměsíčních myší DB/DB a myší s aplikovaným GTG proti kontrolní skupině (obr. 33).

-66CZ 295018 B6

Tabulka 2

Přírůstek hmotnosti u myší po aplikaci GTG

	kontrola (n = 41)	GTG (n = 93)
< 10g	41,(100%)	4, (4 %)
10-20g	0, (0 %)	15,(16%)
>20g	0, (0 %)	74, (80 %)

Dvouměsíčním samičkám myší CBA/J bylo aplikováno GTG. Aurothioglukóza (Sigma A0632) byla podána intraperitoneálně v normálním fyziologickém roztoku v dávce 2,0 mg/g. Tělesná hmotnost kontrolních a pokusných zvířat byla zaznamenána před a jeden měsíc po aplikaci. Zvířata byla chována v klecích po pěti a krmena podle jejich chuti. Hmotnostní přírůstek jeden měsíc po injekci je uveden v tabulce 2. Zvířata s přírůstkem hmotnosti nad 20 g po jednom měsíci byla vybrána pro další studii.

Diskuse

Produkt myšího OB genu cirkuluje v myší a lidské plazmě, kde se pravděpodobně účastní regulace adipózní tkáňové hmoty. Studie regulace exprese a mechanizmu účinku OB budou významné pro další porozumění fyziologickým cestám regulacetělesné hmotnosti.

Předkládaný příklad ukazuje, že k expresi produktu OB genu dochází výlučně v adipocytech a ve všech adipózních depotech. Tento výsledek je v souladu s představou, že proteinový produkt OB genu koreluje s tělesnými zásobami tuku. Navíc dochází k dvacetinásobně vyšší expresi OB u DB myší a myší s hypotalamickými lézemi. U těchto zvířat dochází pravděpodobně i k vyššímu než dvacetinásobnému vzrůstu hladiny OB RNA, neboť adipocyty u těchto zvířat jsou přibližně pětkrát větší (viz obr. 30) [Debona et al., Fed. Proč.,36:143-147 (1977)]. Z těchto údajů vyplývá, že DB gen i hypotalamus jsou v hierarchii cest, regulujících adipózní tkáňovou hmotu, až za OB genem a že OB receptor je kódován v DB lokusu [Coleman et al., Diabetologia, 14:141-148 (1978)]. Tuto představuje objasní teprve molekulární klonování OB receptoru a/nebo DB genu. Zvýšená hladina OB RNA u DB/DB myší a u myší po aplikaci GTG dále naznačuje, že funkce produktu OB genu v tukových buňkách není autonomní [Ashwell et al., Proč. R. Soc. Lond., 195:343-353 (1977); Ashwell et al., Diabetologia, 15:465-470]. Protože, pokud by kódovaný protein působil přímo na tukové buňky a inhiboval jejich růst nebo diferenciaci, pak by nadprodukce divokého OB genu u myší po aplikaci GTG vedla ke štíhlému fenotypu.

Nejstřízlivější vysvětlení těchto údajů je, že OB protein působí jako endokrinní signální molekula, sekretovaná adipocyty a působí přímo či nepřímo na hypotalamus. Přímé působení na hypotalamus vyžaduje mechanizmus, který by umožňoval průchod produktu OB genu hematoencefalickou bariérou. Mechanizmy, zahrnující cirkumventrikulámí orgán, a/nebo specifické transportní molekuly umožňují přístup do mozku molekulám takové velikosti, jako produkty kódované OB genem [Johnson et al., FASEB J, 7:678-686 (1983); Baura et al., J. Clin. Invest., 92:1842-1830 (1993); Pardridge, Endocrine Reviews, 7:314-330 (1986)]. Tuto hypotézu je však nutno přijímat opatrně, dokud nebudou nalezeny prostředky, kterými by protein překonával hematoencefalickou bariéru. Navíc je nutno brát v úvahu možné účinky na jiné cílové orgány.

Signály tukových buněk, zodpovědné za kvantitativní rozdíly v expresních hladinách OB genu, zatím nejsou známy, ale korelují s rozdíly ve velikostech adipocytů. Adipocyty u DB/DB myší jsou pětinásobně větší než adipocyty normálních myší, obsahující přibližně 1,0 pg tuku na buňku [Johnson et al., J. Lipid res., 13:2-11 (1972)]. Podle předběžných výsledků je obsah tuku v tukové buňce a/nebo její velikost důležitým parametrem, určujícím tělesnou hmotnost [Faust et al., Science, 197:393-396 (1977)]. Je možné, že každá tuková buňka exprimuje nízkou hladinu OB RNA a ta se dále zvyšuje úměrně k velikosti buňky. Rovněž je však možné, že velikost

-67CZ 295018 B6 buňky není určujícím parametrem ale pouze koreluje s intracelulámím signálem, zvyšujícím expresi OB genu v adipocytech myší DB/DB a myší s VHM lézemi. V každém případě je pravděpodobné, že složky signální přenosové cesty, regulující syntézu OB RNA, určují tělesnou hmotnost. Genetické vlivy a vlivy prostředí, snižující hladinu exprese OB, budou zvyšovat tělesnou hmotnost, podobně jako faktory, které snižují citlivost na kódovaný protein. Specifické molekuly, regulující hladinu exprese OB genu, však zatím nejsou známy. Této problematice předchází vyřešení hladin(y) kontroly genu, které ovlivňují kvantitativní změny exprese OB RNA a výzkum regulačních prvků OB genu. Identifikace molekul, které regulují expresi OB genu v adipocytech a molekul, které zprostředkovávají účinky kódované proteinu v cílových místech, významně pomůže objasnit fyziologické mechanizmy regulace tělesné hmotnosti.

Příklad 10: Expresní vzor RNA a mapování na fyzické, cytogenetické a genetické mapě chromozomu 7

Exprese lidského OB probíhá na vysoké hladině v adipózních tkáních, nižší hladiny jsou v placentě a srdci. Lidský OB gen byl mapován na velkém souboru YAC (yeast artificial chromosome), odvozeném od chromozomu 7q31.3. Kromě ověření relativního umístění genu, které vycházelo ze srovnávacího mapování myšího a lidského genu, tato studie umožnila identifikovat 8 základních mikrosatelitních markérů v těsné blízkosti lidského OB genu. Vzhledem k tomu, že mutace myšího OB vedou k syndromu, připomínajícímu chorobnou obezitu u lidí, jsou tyto genetické markéry významnými prostředky pro stanovení úlohy OB genu v dědičných formách lidské obezity.

Materiály a postupy

Analýza northernovým blotováním

Totální RNA byla připravena z adipózní tkáně postupem Chirgwin et al., Biochem., 18:5294-5299 (1979). Northernové bloty, radioizotonové značení a hybridizace byly provedeny dle Zhanga et al., Nátuře, 372:425-432 (1994). Northernové bloty póly A⁺ RNA (lidský MTN, lidský MTN II a lidské fetální MTN II) byly získány od CLONETECH (Palo Alton, CA), podobně jako PCR primery na přípravu radioizotopově značené lidské aktinové proby.

Vývoj STS

PCR testy pro specifická sekvenčně značená místa (STS) byly vyvinuty a optimalizovány podle literatury [Green etal., PCR Methods Applic., 1991; Green etal., Genomics, 11:548-564 (1991); Green, „Physical mapping of human chromosomes: generation of chromosome-specific sequence-tagged sites“, v Methods in Molecular Genetics, díl. 1., Genbe and Chromosome Analysis (část A), str. 192-0210, Adolph vyd., Academie Press, lne., San Diego (1993); Green et al., Hum. Mol. Genet., 3:489-501 (1994)]. Název každého STS začíná předponou „sWSS“, za níž následuje specifické číslo. Podrobné informace o 19 uvedených STS jsou v tabulce 3, dodatečné informace (např. podmínky PCR reakce, kompletní sekvence DNA) jsou dostupné v GenBank a/nebo v Genom Data Base (GDB). Oligonukleotidické primery pro PCR vyhledání (tabulka 3) oblastí STS specifických k mikrosatelitům, odpovídají buď primerům, používaným pro analýzu genotypu (tabulka 4), nebo primerům, naplánovaným (často s využitím počítačového programu OSP) [Hillier et al., Per Methods Applic., 1:124-128 (1991)] podle DNA sekvencí GenBanky. Tabulka 3 ilustruje oblasti STS v souboru YAC, který obsahuje lidský OB gen.

-68CZ 295018 B6

Tabulka 3

Název STS	aneb	Lokus	Zdroj	Primery PCR	Velikost (bp)	SEQ ID č.	GDB ID č.
sWSS1734		D7S2185	Konec YAC	CAAGACAAATGAGATAAGG	72	39	G00-455-235
				AGAGTTACAGCTTTACAG		40
SWSS494		D7S2016	Klon lambda	CTAAACACCTTTCCATTCC	112	41	GOO-334-404
				TTATATTCACTTTTCCCCTCTC		42
SWSS883	UT528	D7S1498	Genetický	TGCAGTAAGCTGTGATTGAG	490	43	G00-445-262
			markér	GTGCAGCTTTAATTGTGAGC		44
sWSS2359	AFMaO65zg9	D7S1873	Genetický	AGTGTTGTGTTTCTCCTG	142	45	G00-45 5-247
			markér	AAAGGGGATGTGATAAGTG		46
SWSS2336	AFMal25whl	D7S1874	Genetický	GGTGTTACGTTTAGTTAC	112	47	G00-455-244
			markér	GGAATAATGAGAGAAGATTG		48
sWSS1218	AFM309yfl	D7S680	Genetický	GCTCAACTGACAGAAAAC	154	49	G00-307-733
			markér	GACTATGTAAAAGAAATGCC		50
SWSS1402		D7S1916	Konec YAC	AAAGGGCTTCTAATCTAC	137	51	G00-344-044
				CCTTCCAACTTCTTTGAC		52
SWSS999		D7S1674	Inzert YAC	TAAACCCCCTTTCTGTTC	105	53	G00-334-839
				TTGCATAATAGTCACACCC		54
SWSS1751		D7S186	Konec YAC	CCAAAATCAGAATTGTCAGAAG	186	55	G00-455-238
				AAACCGAAGTTCAGATACAG		56
sWSS1174	AFM218xfl0	D7S514	Genetický	AATATCTGACATTGGCAC	144	57	G00-207-700
			markér	TTAGACCTGAGAAAAGAG		58
SWSS2061		D7S2184	Konec YAC	GTTGCACAATACAAAATCC	200	59	G00-455-241
				CTTCCATTAGTGTCTTATAG		60
SWSS2588		D7S2187	Konec YAC	ATCACTACACACCTAATC	117	61	G00-455-253
				CCATTCTACATTTCCACC		62
SWSS808	Pax-4	PAX4	Gen	GGCTGTGTGAGCAAGATCCTA GGA	153	63	G00—455-259
				TTGCCAGGCAAAGAGGGCTGGAC		64
sWSS1392	AFM206xcl	D7S635	Genetický	CTCAGGTATGTCTTTATC	75	65	G00-307-815
			markér	TGTCTCTGCATTCTTTTC		66
SWSS1148	AFM199xhl2	D7S504	Genetický	GACACATACAAACACAG	60	67	G00-307-652
			markér	ATTGAGTTGAGTGTAGTAG		68
sWSS1529		D7S1943	Konec YAC	CAGGGATTTCTAATTGTC	116	69	G00-334-119
				AAAAGATGGAGGCTTTTG		70
sWSS2619	OB	OB	Gen	CGTTAAGGGAAGGAACTCTGG	106	71	G00-455-256
				TGGCTTAGAGGAGTCAGGGA		72
sWSS404		D7S1956	Klon lambda	ACCAGGGTCAATACAAAG	122	73	G00-234-251
				TAATGTGTCCTTCTTGCC		74
sWSS2367	AFMa345wc9	D7S1875	Genetický	CAATCCTGGCTTCATTTG	81	75	G00-455-250
			markér	AAGGTGGGTAGGATGCTA		76

oblastí STS specifických k chromozomu 7, mapovaných v souboru YAC, který obsahuje lidský OB gen, je uvedeno na seznamu (obr. 35). Pro každou oblast STS je uveden název „sWSS“, relevantní druhý název, GDB-název lokusu, zdroj STS, sekvence PCR primeru, velikost STS a GDB-identifikační číslo. Zdroje oblastí STS jsou následující: 'konec YAC' 10 (izolovaný koncový inzert YAC) [Green, „Physical mapping of human chromosomes: generation of chromosome-specific sequence-tagged sites“, v Methods in Molecular Genetics,á\\ 1., Genbe and Chromosome Analysis (část A), str. 192-0210, Adolph vyd., Academie Press, lne., San Diego (1993)], 'Lambda klon' (náhodný lambda klon specifický k chromozomu 7) [Green et al., PCR Methods Applic., 1991; Green et al., Genomics, 11:548-564 (1991); Green, „Physical 15 mapping of human chromosomes: generation of chromosome-specific sequence-tagged sites“,

-69CZ 295018 B6 v Methods in Molecular Genetics, díl 1., Genbe and Chromosome Analysis (část A), str. 192-0210, Adolph vyd., Academie Press, lne., San Diego (1993)], 'Genetický markér' (mikrosatelitový markér, viz tabulka 2) [Green et al., Hum. Mol. Genet., 3:489-501 (1994)], 'Yac insert' (náhodný segment z YAC inzertu) a 'Gen' (STS specifická ke genu). Je vhodné si uvědomit, že u některých oblastí STS, specifických ke genetickým markérům, se PCR primery, použité pro identifikaci YAC (ze seznamu v této tabulce), liší od primerů, použitých při analýze genotypu (tabulka 4), protože detekce YAC s určitým genetickým markérem nevyžaduje amplifíkaci polymorfní oblasti. Všechny uvedené PCR testy byly prováděny při teplotě anelace 55 °C vyjma testů sWSS494, sWSS883, sWSS1529, které byly provedeny při 50 °C, sWSS999 a sWSS1174, které byly provedeny-při 60 °C a sWSS808, který byl proveden při 65 °C. Další podrobnosti, týkající se STS-specifíckých testů PCR, jsou dostupné v GDB.

Tabulka 4

Mikrosatelitové markéry v oblasti YAC, obsahující lidský ob gen

Název markéru UT528	Typ Tetra.	Lokus D7S1498
AFMaO65zg9	(CA)„	D7S1873
AFMal25whl	(CA)„	D7S1874
AFM309yfl0	(CA)„	D7S680
AFM218xflO	(CA)„	D7S514
AFM206xcl	(CA)„	D7S635
AFM199xhl2	(CA)„	D7S504
AFMa345wc9	(CA)„	D7S1875

Primery TGCAGTAAGCTGTGATTGAG GTGCAGCTTTAATTGTGAGC AGCTTCAAGACTTTNAGCCT GGTCAGCAGCACTGTGATT TCACCTTGAGATTCCATCC AACACCGTGGTCTTATCAAA CATCCAAGTTGGCAGTTTTT AGATGCTGAATTCCCAGACA TGGGCAACACAGCAAA TGCAGTTAGTGCCAATGTCA CCAGGCCATGTGGAAC AGTTCTTGGCTTGCGTCAGT TCTGATTGCTGGCTGC GCGCGTGTGTATGTGAG AGCTCTTGGCAAACTCACAT GCCTAAGGGAATGAGACACA

SEQ ID	GDB ID
č.	č.
77	G00-312-446
78
79	G00-437-253
80
81	G00-437-263
82
83	G00-200-283
84
85	G00-188-404
86
87	G00-199-240
88
89	G00-188-280
90
91	G00-437-259
92

Na seznamu je uvedeno osm mikrosatelitových markérů, mapovaných v souboru YAC, který obsahuje lidský OB gen (obr. 35). Pro každou oblast STS je uveden název markéru (jako druhý název v tabulce 3), typ mikrosatelitového motivu (opakující se tetranukleotid-'Tetra' nebo opakující se (Ca)_n), GDB-název lokusu, sekvence primerů, použitého pro PCR analýzu genotypu a identifikační číslo GDB. Další podrobnosti, týkající se testů PCR a polymorfie, jsou dostupné v GDB.

STS oblasti (sWSS2619), specifické k lidskému OB genu, byly naplánovány podle sekvence DNA z 3'nepřeložené oblasti cDNA. Následující strategií byl vyvinut lidský STS (sWSS808), specifický k Pax4. Oligonukleotidické primery, specifické k myšímu genu Pax4 (GGCTGTGTGAGCAAGATCCTAGGA) (SEQ ID č. 63) a (GGAGCCTTGTCCTGGGTACAAAG) (SEQ ID č. 93) [Walther et al., Genomics, 11:424-434 (1991)], byly použity při amplifíkaci 204-bp dlouhého fragmentu z lidské genomové DNA (fragmentu o stejné velikosti jako produkt, generovaný z myší genomové DNA). Tento PCR test nebyl vhodný pro identifikaci odpovídajících YAC, neboť z kvasinkové DNA byly též amplifikovány podobně velké (200-bp) produkty. Nicméně analýza PCR produktů, generovaných z lidské DNA, odhalila 20 substitucí ve 156 analyzovaných bázích (údaje neuvedeny). Podle této sekvence, specifické k lidské DNA, byl naplánován nový primer (TTGCCAGGCAAAGAGGGCTGGAC) (SEQ ID č. 64) a použit spolu s prvním z výše uvedených primerů, specifických k Pax4 (yvz tabulka 3). Při výsledném PCR testu, specifickém k lidskému Pax4, již nedocházelo k významnější amplifíkaci produktů z kvasinkové DNA a proto byl použitelný pro identifikaci hledaných příslušných YAC.

Identifikace oblastí YAC pomocí PCR-screeningu.

-70CZ 295018 B6

Většina YAC, zobrazených na obr. 35, byla odvozena ze sbírky klonů vysoce obohacených DNA z lidského chromozomu 7 ('zdroj YAC - chromozóm 7') [Green et al., Genomics, 25:170-183 (1995)] PCR screeningem [Green et al., Genomics, 25:170-183 (1995); Green et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 87:1213-1217 (1990)]. V několika málo případech byly klony izolovány PCR-screeningem [Green et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 87:1213-1217 (1990)] z dostupné lidské genomové knihovny, obsahující totální YAC, konstruované vCEPH [Dausset et al., Behring Inst. Mitt., 91:13-20 (1992); Albertsen etal., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 87:4256-4260] nebo ICI [Anand et al., Nud. Acids Res., 17:3425-3433 (1989); Anand et al., Nucl. Acids Res., 18:1951-1956 (1990)]. Název každého YAC začíná předponou „yWSS“, následovanou specifickým číslem.

Výsledky a diskuse

Výzkum exprese lidského OB genu v tkáni analýzou northemových blotů ukázal, že v adipózní tkáni probíhá exprese OB RNA na vysoké hladině, zatímco expresní hladiny v placentě a srdci jsou podstatně nižší (obr. 34). Velikost RNA (4,5 kb) je u lidí i myší ekvivalentní, a rovněž ve všech exprimujících tkáních. Ve studiích byly pozorovány pětinásobně vyšší signály v 10 pg totální RNA z adipózní tkáně jako 2 pg póly A⁺ placentární RNA. Pětinásobně nižší signál póly A⁺ RNA byl pozorován v srdeční tkáni proti placentární. Bylo odhadnuto, že hladina OB RNA je asi 250krát nižší v placentě než v adipózní tkáni. V podmínkách experimentu nebyla OB RNA detekována v ostatních analyzovaných tkáních, tj. v mozku, plicích, játrech kosterním svalstvu, ledvinách a slinivce. Ani dodatečné pokusy neprokázaly přítomnost OB RNA ve slezině, týmu, prostatě, testikuíámí tkáni, vaječníku, tenkém střevě, tlustém střevě, periferních krevních leukocytech, nebo ve fetálních mozkových, jatemích nebo ledvinových tkáních (údaje neuvedeny). Je možné, že v těchto nebo dalších neanalyzovaných tkáních probíhá exprese OBRNA na hladinách, které nelze northemovým blotováním detekovat. Pozorovaný charakter exprese OB u lidí se proti myším mírně liší, neboť u myší exprese probíhá výlučně v adipózní tkáni.

Srovnávací mapování oblasti OB genu v myším a lidském genomu.

Myší OB gen se nachází v blízkosti chromozomu 6 v oblasti, která je homologní s částí lidského chromozomu 7q. Tento segment zahrnuje geny (od nejbližších ke vzdálenějším): Met protoonkogen, cystický fíbrózní regulátor transmembránové konduktance (Cfitr), párový „box-containing“ gen (Pax4), OB gen a gen pro karboxypeptidázu A (Cpa) [Zhang et al., Nátuře, 372:425-432 (1994); Friedman et al., Genomics, 11:1054-1062 (1991)]. U myší genetické mapování prokázalo, že Pax4 je těsně spojen s OB [Walther et al., Genomics, 11:424-434 (1991); Zhang et al., Nátuře, 372:425—432 (1994)]. Bylo zjištěno, že fyzická vzdálenost mezi OB a Pax4 je 1 Mb (milion párů bází) [Zhang et al., Nátuře, 372:425-432 (1994)]. Na základě srovnávacích mapovacích studií lze předpokládat, že lidský OB gen je umístěn mezi geny Pax4 a CPA na chromozomu 7q. Dále, protože lidský Cfitr [Heng et al., Cell Genet., 62:108-109 (1993)] a Pax4 [Tamura et al., Cytogenet. Cell Genet., 6:132-134 (1994)] byly mapovány fluorescenční hybridizací in sítu (FISH) do poloh 7q31.3 a 7q32, nachází se lidský OB gen cytogeneticky nejpravděpodobněji v blízkosti mezí 7q31.3-q32.

Mapování lidského OB genu na lidském chromozomu 7.

STS (sWSS619), amplifíkující malý segment 3'nepřeložené oblasti lidského OB genu, byl použit pro prohledání souboru YAC klonů, vysoce obohacených DNA lidského chromozomu 7 [Green et al., 1995a, Genomics 25:170-183] a bylo nalezeno 9 oblastí YAC (yWSS691, yWSS1332, yWSS1998, yWSS2087, yWSS3319, yWSS3512, yWSS4875, yWSS4970 a yWSS5004). Pro ověření, zda tyto YAC obsahují autentický lidský OB gen, byly provedeny dva dodatečné pokusy. V prvním byl každý YAC testován druhým PCR testem, specifickým k lidskému OB, a u všech YAC byl výsledek pozitivní (údaje neuvedeny). V druhém testu byla kvasinková DNA z každého klonu štěpena BcoRI a analyzována gel-transferovou hybridizací s využitím próby, odvozené od cDNA z lidského OB. Ve všech případech byl pozorován jednotný hybridizační pás;

-71 CZ 295018 B6 a tento pás měl stejnou velikost v klonech YAC i klonech Pl, o nichž je známo, že obsahují lidský OB gen (údaje neuvedeny).

Pomocí počítačového programu SEGMAP [Green et al., PCR Methods Applic., 1991; Green et al., Genomics, 11:548-564 (1991)] a dalších souborů dat, obsahujících oblasti STS, vycházející z YAC, které byly vytvořeny pro chromozom 7 [Green et al., Genomics, 11:548-564 (1991); Green et al., Hum. Mol. Genet., 3:489-501 (1994); Green et al., Genomics, 25:170-183 (1995)], bylo potvrzeno, že lidský OB gen je obsažen v sadě YAC (obr. 35). Konkrétně tato sada obsahuje 43 přesahujících oblastí YAC a 19 specificky uspořádaných oblastí STS. Podrobnosti, týkající se každé z 19 oblastí STS, jsou uvedeny v tabulce 3. Kromě STS, specifických k OB, sada dále obsahuje oblast STS (sWSS8085), specifickou k lidskému genu Pax4 [Tamura et al., Cytogenet. Cell. Genet., 6:132-134 (1994); Stapleton et al., Nátuře Genet. 3:292-298)], sedm oblastí STS, odvozených od YAC, specifických k chromozomu 7, dvě oblasti STS, odvozené od lambda klonů, specifických k chromozomu 7 a hlavně osm oblastí STS, specifických k mikrosatelitům. Dodatečné podrobné informace o těchto osmi genetických markérech, zahrnujících sekvence primerů, používaných pro analýzu genotypu, jsou uvedeny v tabulce 2. Podstatné je, že STS oblasti sady jsou významně propojeny oblastmi YAC (např. každá sousední dvojice oblastí STS je spojena dvěma nebo více oblastmi YAC), což důvěryhodně potvrzuje relativní pořadové uspořádání oblastí STS, jak je uvedeno na obr. 35.

Podle obr. 35 je předpokládaná orientace sady YAC, obsahující lidský OB, taková, že nejvíce centromerní STS je sWSS1734 (tj. nejblíže kCFTR), zatímco nejvíce telomemí STS je sWSS2367 (tj. nejblíže kCPA). Tato orientace převážně vychází z údajů srovnávacího mapování, podle nichž Pax4 předchází OB v rámci syntetického bloku v myší i lidské DNA [Zhang et al., Nátuře, 372:425-432 (1994)]. Podle umístění oblasti STS (sWSS2619), specifické k OB, se OB gen nachází v blízkosti telomemího konce sady.

Sada, uvedená na obr. 35, byla odvozena pomocí SEGMAP bez uvažování velikostí YAC (proto jsou oblasti STS v ekvidistantních vzdálenostech). Podobná analýza dat programem SEGMAP, která však uvažovala velikosti YAC, naznačila, že celková velikost oblasti, kterou sada pokrývá, přesahuje 2 Mb (údaje neuvedeny). Takže zatímco všech osm oblastí STS, specifických k mikrosatelitům (tabulka 4), je obsaženo v genomovém intervalu zhruba 2 Mb, tři STS, nejbližší telomernímu konci sady (sWSS1392, sWSS1148 a sWSS2367), se velmi blíží k samotnému OB genu (pravděpodobně v rámci intervalu 500 kb). Všechny tři posledně jmenované oblasti STS jsou obsaženy nejméně v jedné oblasti YAC, obsahující lidský OB. Odhaduje se, že interval mezi STS lidského Pax4 (sWSS808) a STS OB (sWSS2619) je asi 400 kb, zatímco u myší se tato oblast odhaduje na 1 Mb [Zhang et al., Nátuře, 372:425-432 (1994)]. Na závěr byly rovněž analyzovány tři oblasti YAC ze sady (yWSS691, yWSS999 a yWSS2935) postupem FISH a bylo zjištěno, že všechny hybridizují výlučně s 7q31.3. Jedna z těchto oblastí YAC (yWSS691) obsahuje STS specifickou k OB, druhé dva klony obsahují STS specifické k Pax4.

Tyto výsledky jsou v souladu s předcházejícím cytogenetickým přiřazením lidského Pax4 do oblasti 7q32 [Tamura et al., Cytogenet. Cell. Genet., 6:132-134 (1994)]. Podle těchto výsledků lze přiřadit lidský OB do cytogenetického pásu 7q31.3.

Příklad 11: Lidský OB polypeptid je biologicky aktivní v myších

Ve skupinách 10 myší OB/OB byl aplikován i.p. injekcí 10 pg/g/den rekombinantní (bakteriální) lidský a myší OB a fyziologický roztok. Po čtyřech dnech došlo ve skupině, dostávající fyziologický roztok, k přírůstku hmotnosti 0,3 g. Ve skupině s aplikovaným myším OB došlo k úbytku hmotnosti 3,2 g a ve skupině s lidským OB došlo k úbytku 2 g (p<0,01 proti kontrolní skupině s fyziologickým roztokem). U skupin myší byl sledován rovněž příjem potravy. Údaje o příjmu potravy jsou uvedeny v tabulce 5; údaje o tělesné hmotnosti v tabulce 6.

-72CZ 295018 B6

Tabulka 5

Denní příjem potravy (g) u pokusných myší OB/OB (hodnota ± stand. odch.)

	dny
aplikace	0	1	2	3	4	5	6	7
fyz. roztok	13,4 ±2,6	12,8	12,8	13,1	14,0	12,3	12,4	8,3
myší OB	14,9	3,7	4,4	5,1	8,9	8,1	8,7	3,5
lidský OB	14,3	10,3	8,7	7,0	8,9	5,3	3,8	13,0

Tabulka 6

Tělesná hmotnost a její změna u pokusných myší OB/OB (hodnota ± stand. odch.)

aplikace	hmotnost den 0	hmotnost den 4	změna (%) den 0-4	hmotnost den 6	změna (%) den 0-6
fyz. roztok	39,9±1,8	40,7±l,6	0,8±0,5	41,1±2,2	1,2±1,1
myší OB	39,5±2,1	36,2±2,0	-3,3±1,2	36,3±2,2	-3,1±1,2
lidský O	39,5±2,0	37,6±1,7	-2,0±l,0	36,1±1,3	-3,5±1,3

Údaje potvrzují biologickou aktivitu lidského OB v myších.

Příklad 12: Vysoká dávka OB působí na myši divokého typu

Divokým myším (C57B16J +/?) byl aplikován i.p. rekombinantní myší OB v dávce 10 pg/g/den a tělesná hmotnost byla sledována každé čtyři dny. Výsledky jsou uvedeny vtabulce 7.

Tabulka 7

Tělesná hmotnost (g) normálních myší při aplikaci OB

aplikace	hmotnost den 0	hmotnost den 4	hmotnost den 8	hmotnost den 12	hmotnost den 16
fyz. roztok	22,6±1,4	22,2±1,2	22,5±1,3	23	22,5
myší OB	22,4±1,5	20,6±l,5	20,8±l,3	20,8	21,8

Údaje dokládají, že OB působí na tělesnou hmotnost divokých myší podobně jako na hmotnost myší OB/OB, avšak v menším rozsahu.

Příklad 13: OB polypeptid, podávaný kontinuálně infuzní pumpou

Tento příklad ukazuje, že kontinuální infuze OB polypeptidu vede k úbytku hmotnosti u normálních myší. Normální (neobézní) myši dostávaly myší OB polypeptid infuzí osmotickou pumpou. Dávka 0,5 mg proteinu na 1 kg tělesné hmotnosti vyvolala úbytek 4,62% (+/- 1,34 %) od základní hmotnostní linie, šestý den od počátku infuze.

Materiály a postupy

Zvířata

Byly použity divoké myši (+/+) C57B16. Myši byly umístěny v klecích po jedné a chovány v příznivých podmínkách. Na počátku pokusu byly myši 8 týdnů staré a jejich hmotnost stabilní. Jednotlivé testy byly prováděny na deseti myších (nosič, vs. protein).

-73 CZ 295018 B6

Krmení a měření hmotnosti

Myši byly krmeny rozemletou potravou pro hlodavce (PMI Feeds, lne.) v krmítkách pro práškovou potravu (allentown Caging and Equipment), což dovoluje přesnější a citlivější měření příjmu potravy než obvyklá potrava v blocích. Hmotnost byla měřena každý den ve stejnou dobu (2:00 p.m), po dobu 6 dnů. Tělesná hmotnost v den před počátkem infuze byla zvolena za základní hmotnostní linii.

Klonování myší OB DNA

Postup klonování myší OB DNA do expresního hostitele E. coli: sekvence DNA, odvozená od publikované peptidové sekvence [Zhang et al., Nátuře, 372:425-432 (1994), Příklad 1], byla reverzně přepsána s využitím optimálních kodonů E. coli. Terminálními klonovacími místy byly Λ7>αΙ až TLz/mHI. Před kódující oblast byla zařazena sekvence, zesilující ribozomální vazbu a silné vazebné místo pro ribozom. Sekvence duplexu DNA byla syntetizována standardními postupy. Správné klony byly potvrzeny expresí rekombinantního proteinu a přítomností správné sekvence OB DNA v rezidentním plazmidů. Aminokyselinová sekvence a sekvence DNA:

Rekombinační myší met OB (dvouvláknová) DNA a aminokyselinová sekvence (SEQ ID č. 94 a 95):

TCTAGATTTGAGTTTTAACTTTTAGAAGGAGGAATAACATATGGTACCGATCCAGAAAGT

- ₊---------₊---------₊---------4---------- +---------₊68

AGATCTAAACTCAAAATTGAAAATCTTCCTCCTTATTGTATACCATGGCTAGGTCTTTCA

Μ V P I Q K V TCAGGACGACACCAAAACCTTAATTAAAACGATCGTTACGCGTATCAACGACATCAGTCA

----------μ---------H----------H-----------μ----------1 128

AGTCCTGCTGTGGTTTTGGAATTAATTTTGCTAGCAATGCGCATAGTTGCTGTAGTCAGT

QDDTKTLIKTIVTRINDISHCACCCAGTCGGTCTCCGCTAAACAGCGTGTTACCGGTCTGGACTTCATCCCGGGTCTGCA

129 -4----------+---------4-------------------+---------+188

GTGGGTCAGCCAGAGGCGATTTGTCGCACAATGGCCAGACCTGAAGTAGGGCCCAGACGT

TQSVSAKQRVTGLDFI PGLHCCCGATCCTAAGCTTGTCCAAAATGGACCAGACCCTGGCTGTATACCAGCAGGTGTTAAC

139 -4----------₊----------------------1-----------μ----------μ2-48

GGGCTAGGATTCGAACAGGTTTTACCTGGTCTGGGACCGACATATGGTCGTCCACAATTG

P ILSLS KMDQTI*AVYQQVI»T

CTCCCTGCCGTCCCAGAACGTTCTTCAGATCGCTAACGACCTCGAGAACCTTCGCGACCT

249 --4-----------1-----------μ----------μ---------+-------- 308

GAGGGACGGCAGGGTCTTGCAAGAAGTCTAGCGATTGCTGGAGCTCTTGGAAGCGCTGGA

SLPSQNVLQIANDI+ENLRDX,GCTGCACCTGCTGGCATTCTCCAAATCCTGCTCCCTGCCGCAGACCTCAGGTCTTCAGAA

309 — 4.----- — - — — 4. — -+- - — — — — — — — — 4- — — — — — — — -μ — ———————— 4-- - — — — — — _ 368

CGACGTGGACGACCGTAAGAGGTTTAGGACGAGGGACGGCGTCTGGAGTCCAGAAGTCTT

ΕΗΙ+ΕΑΓΞΚεσΞΒΡΟΤΞΟΙ+ΟΚACCGGAATCCCTGGACGGGGTCCTGGAAGCATCCCTGTACAGCACCGAAGTTGTTGCTCT

369 -------------1-----------μ---------4----------4-----------4---------428

TGGCCTTAGGGACCTGCCCCAGGACCTTCGTAGGGACATGTCGTGGCTTCAACAACGAGA

PES X.ÚGVLEASLYSTEVVAL

GTCCCGTCTGCAGGGTTCCCTTCAGGACATCCTTCAGCAGCTGGACGTTTCTCCGGAATG

429 -4-----------4----------4-........-4----------+---------4*--------- 488

CAGGGCAGACGTCCCAAGGGAAGTCCTGTAGGAAGTCGTCGACCTGCAAAGAGGCCTTAC

S R L Q G S LQDI LQQLDVSPE C

TTAATGGATCC

489 -4---------AATTACCTAGG

-74CZ 295018 B6

Expresní vektor a hostitelský kmen

Pro produkci proteinu byl použit plazmidový expresní vektor pCFM1656, Američan Type Culture Collection (ATCC), přírůstkové č. 69576. Výše uvedená DNA byla ligována do expresního vektoru pCFM1656, linearizovaného Xbal a Sa/wHI, a tento vektor byl použit k transformaci hostitelského kmene E. coli, FM5. Buňky E. coli FM5 byly odvozeny v Amgen Inc. Thousand Oaks, CA z kmene E. coli K-12 [Bachmann et al., Bacteriol. Rev., 40:116-167 (1976)] a obsahují integrovaný lambda fágový represor genu cl₈₅₇ [Sussman et al., C. R.. Acad Sci., 254:1517-1579 (1962)]. Příprava vektoru, transformace buněk a selekce kolonií byly provedeny standardními postupy, [např. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. vyd., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989)]. Hostitelské buňky byly pěstovány v LB médiu.

Podávání proteinu nebo nosiče

V předkládaných experimentech byl používán rekombinantní myší OB polypeptid obvykle v koncentraci 0,9 mg/ml, ve fosfátem pufrovaném fyziologickém roztoku, pH 7,4. Aminokyselinová sekvence (a sekvence DNA) jsou uvedeny výše. Protein nebo nosič (fosfátem pufrovaný fyziologický roztok, pH 7,4) byly podávány infuzně osmotickou pumpou. Každé pokusné myši byla voperována osmotická minipumpa Alzet (Alza, Palo Alto, CA, model č. 1007D) do podkožní kapsy v podlopatkové oblasti. Pumpy byly nastaveny na podávání 0,5 ml roztoku proteinu za hodinu, v dávce 0,5 mg proteinu na kg tělesné hmotnosti a den. Kontrolním zvířatům byl infuzně podáván fosfátem pufrovaný fyziologický roztok (pH 7,4) rovněž osmotickou minipumpouAlzet.

Fermentace. Protein byl připravován třístupňovou fermentací postupem „fed-batch“. Složení médií jsou uvedena dále.

Jedna dávka. Dusík a zdroj fosfátu byly sterilizovány (zvýšením teploty na 122 °C, 35 min, 18-20 psi) ve fermentačním tanku (Biolafitte, objem 12 1). Po ochlazení byly asepticky přidány zdroje uhlíku, hořčíku, vitaminů a stopových kovů. Dále byla do fermentačního zařízení přidána šestnáctihodinová kultura bakterií, produkujících myší rekombinantní protein v množství 500 ml (pěstovaná v LB médiu).

Dodání substrátu I. Po dosažení 4,0 - 6,0 O.D.₆oo byl do kultivační směsi přidán substrát I. Glukóza byla přidávána omezeně tak, aby byla řízena rychlost růstu (w). Pro dodávání byl využit automatizovaný systém (Distributive Control Systém), naprogramovaný na rychlost růstu 0,15 generace za hodinu.

Dodání substrátu II. Po dosažení 30 O.D.₆oo byla pomalu zvýšena teplota na 42 °C a začalo dodávání substrátu II (uvedeno níže). Fermentace dále pokračovala 10 h, každé 2 h byl odebrán vzorek. Po 10 h byl obsah fermentačního tanku ochlazen pod 20 °C a centrifugován.

Složení média

Dávka:

10 g/1	kvasinkový extrakt
5,25 g/1	(NH₄)₂SO₄
3,5 g/1	k₂hpo₄
4,0 g/1	kh₂po₄
5,0 g/1	glukóza
1,0 g/1	MgSO₄.7H₂O
2,0 ml/1	vitaminový roztok
2,0 ml/1	roztok stopových kovů
1,0 ml/1	protipěnivá přísada P2000

-75 CZ 295018 B6

Substrát I:

Substrát II:

g/1 g/1

450 g/1

10ml/l

200 g/1

100 g/1

110 g/1

Bacto-trypton kvasinkový extrakt glukóza vitaminový roztok roztok stopových kovů

Bacto-trypton kvasinkový extrakt glukóza

Vitaminový roztok (Dávka, Substrát I): 0,5 g biotinu, 0,4 g kyseliny listové a 4,2 g riboflavinu bylo rozpuštěno ve 450 ml H₂O a 3 ml 10 N NaOH a roztok byl doplněn vodou na 500 ml. 14 g pyridoxin-HCl a 61 g niacinu bylo rozpuštěno ve 150 ml H₂O a 50 ml 10N NaOH a roztok byl doplněn vodou na 250 ml. 54 g kyseliny pantotenové bylo rozpuštěno v 200 ml vody a doplněno vodou na 250 ml. Tyto tři roztoky byly smíchány a doplněny na celkový objem 101.

Roztok stopových kovů (Dávka, Substrát I):

chlorid železitý (FeCl₃.6H₂O): 27 g/1 chlorid zinečnatý (ZnCl₂.4H₂O): 2 g/1 chlorid kobaltnatý (CoC1₂.6H₂O): 2 g/1 molybdenan sodný (NaMoO₄.2H₂O): 2 g/1 chlorid vápenatý (CaCl₂.2H₂O): 1 g/1 síran měďnatý (CuSO₄.5H₂O): 1,9 g/1 kyselina boritá (H₃BO₃): 0,5 g/1 chlorid manganatý (MnCl₂.4H₂O): 1,6 g/1 citrát sodný dihydrát: 73,5 g/1

Purifikace myšího OB polypeptidů

Purifíkace byla provedena v následujících krocích (při 4 °C, pokud není uvedeno jinak):

1. Buněčná pasta. Pasta buněk E. coli byla suspendována v 5 objemech 7 mmol.F¹ EDTA, pH 7,0. Buněčná suspenze v EDTA byla ještě dále zjemněna dvěma průchody mikrofluidizačním zařízením. Rozrušené buňky byly centrifugovány při 4 200 ot/min, 1 h v centrifuze Beckman JB-6 s rotorem J5-4,2.

2. První promytí buněčných těl: Supematant z centrifugace byl odstraněn, peleta resuspendována v 5 objemech 7 mmolT¹ EDTA, pH 7,0 a suspenze homogenizována. Vzniklá směs byla centrifugována jako v kroku 1.

3. Druhé promytí buněčných těl: Supernatant z centrifugace kroku 2 byl odstraněn, peleta resuspendována v 10 objemech 20 mmol.F¹ Tris, pH 8,5, 10 mmol.F¹ DTT, a 1 % deoxycholátu a suspenze homogenizována. Vzniklá směs byla centrifugována jako v kroku 1.

4. Třetí promytí buněčných těl: Supematant z centrifugace kroku 3 byl odstraněn, peleta resuspendována v 10 objemech destilované vody a suspenze homogenizována. Vzniklá směs byla centrifugována jako v kroku 1.

5. Uspořádání prostorové struktury peptidu: Peleta byla suspendována v 15 objemech 10 mmol.F¹ HEPES, pH 8,5, 1 % sarkosinu (N-laurylsarkosin) při laboratorní teplotě. Po 60 min byl do roztoku přidán síran měďnatý na koncentraci 60 mmol.F¹ a směs byla míchána přes noc.

6. Odstranění sarkosinu. Směs z kroku 5 byla zředěna 5 objemy 10 mmol.F¹ Tris, pH 7,5 a centrifugována jako v kroku 1. Supernatant byl odebrán a míchán 1 h sDowexem 1-X4,

-76CZ 295018 B6

20-50 mesh, v chloridové formě (množství 0,066 % objemových vzhledem k celkovému množství zředěné směsi kroku 5). Směs s Dowexem byla nanesena na kolonu a eluát odebrán. Odstranění sarkosinu bylo potvrzeno HPLC.

7. Kyselé srážení. PH eluátu z předcházejícího kroku bylo upraveno na hodnotu 5,5 a eluát inkubován při laboratorní teplotě 30 min. Vzniklá směs byla centrifugována jako vkroku 1.

8. Chromatografie na katexu. PH supernatantu z předcházejícího kroku bylo upraveno na hodnotu 4,2 a roztok nanesen na kolonu rychle tekoucí CM Sefarózy. Kolona byla eluována dvaceti objemy sloupce, gradientem 0 až 1,0 mol.L¹ NaCl v 20 mmol.L¹ NaOAc, pH 4,2.

9. HIC chromatografie. Spojené frakce, obsahující produkt po chromatografií na CM Sefaróze (podle UV analýzy) z předcházejícího stupně, byly adjustovány na koncentraci 0,2 mol.L¹ síranu amonného. Byl proveden reverzní solný gradient s 20 objemy kolony od 0,4 do 0 mol.L¹ síranu amonného v 5 mmol.L¹ NaOAc, pH 4,2. Tento materiál byl koncentrován a diafiltrován do PBS.

Výsledky

V tabulce 8 jsou uvedeny hmotnostní rozdíly (%) od základní linie u osmitýdenních myší C547B16J:

Tabulka 8

Úbytek hmotnosti při kontinuální infuzi

Dny	nosič (PBS)	rekombinantní OB polypeptid
1-2	3,24 ± 1,13	1,68 ± 1,4
3-4	4,3 ± 0,97	-2,12 ±0,79
5-6	4,64 ± 0,96	-4,62 ±1,3

Jak je zřejmé, na konci 6 dne infúzního režimu došlo u zvířat po aplikaci OB proteinu k úbytku hmotnosti přes 4 % hmot, proti základní linii. To je podstatně rychlejší úbytek hmotnosti ve srovnání s i.p. injekční aplikací. Na konci 32-denního injekčního období došlo k 2,6 - 3,0 % úbytku hmotnosti u divokých (obyčejných) myší, které dostávaly denně i.p. injekci rekombinantního OB myšího polypeptidu v dávce 10 mg/kg. Hmotnostní úbytek, přesahující 4 %, nebyl během pokusu dosažen (údaje neuvedeny). Z předložených údajů vyplývá, že postup kontinuální infuze vede při 20ti násobně nižší dávce (0,5 mg/kg proti 10 mg/kg) k vyššímu úbytku hmotnosti a v kratší době.

Výsledky jsou statisticky významné, tj. -4,62 %, p<0,0001.

Příklad 14: Klonování a exprese rekombinantního analogu lidského OB polypeptidu

Tento příklad poskytuje přípravky a postupy přípravy rekombinantního analogu lidského OB polypeptidu.

Lidská verze OB DNA byla konstruována z myší OB DNA, jak je uvedeno v příkladu 13, nahrazením oblasti mezi místy Mlu\ BamlW duplexem DNA (připraveným ze syntetických oligonukleotidů). V duplexu bylo provedeno 20 kodonových substitucí. Nezměněny zůstaly kodony pro arginin v poloze 35 myšího maturovaného peptidů a leucin v poloze 74 myšího maturovaného peptidů. Takto upravená DNA byla inzertována do vektoru pCFM1656 (ATCC přírůstkové č. 69576) stejným postupem jako v případě myšího rekombinantního proteinu.

-77CZ 295018 B6

Rekombinantní lidský met OB (dvouvláknová) DNA a aminokyselinová sekvence (SEQ ID č. 96 a 97):

CATATGGTACCGATCCAGAAAGTTCAGGACGACACCAAAACCTTAATTAAAACGATCGTT

I ---------4-----------h ---- ------4 ---------4 · - - t- 60

GTATACCATGGCTAGGTCTTTCAAGTCCTGCTGTGGTTTTGGAATTAAlTTTGCrAGCAA

MVPIQKVQDDTKTLIKTIV

ACGCGTATCAACGACATCAGTCACACCCAGTCGGTGAGCTCTAAACAGCGTGTTACAGGC

---------4» — - - - 4 * --------+----------+- - - - — - -- -4.---------4. 120

TGCGCATAGTTGCTGTAGTCAGTGTGGGTCAGCCACTCGAGATTTGTCGCACAATGTCCG

TRINDISHTQSVSSKQRVTG

CTGGACTTCATCCCGGGTCTGCACCCGATCČTGACCTTGTCCAAAATGGACCAGACCCTG

121 ----4 ----- - — - 4.--.------4.---------4.- _ _ _ - - 4--------- - -4 180 gacctgaagtagggcccagacgtgggctaggactggaacaggttttacctggtctgggac

LDFIPGLHPILTLSKMDQTL

GCTGTATACCAGCAGATCTTAACCTCCATGCCGTCCCGTAACGTTCTTCAGATCTCTAAC

181 —-------4----------4---------4---------4---------4.- - — - _- -- 4 240

CGACATATGGTCGTCTAGAATTGGAGGTACGGCAGGGCATTGCAAGAAGTCTAGAGATTG

AVYQQILTSMPSRNVLQISN

GACCTCGAGAACCTTCGCGACCTGCTGCACGTGCTGGCATTCTCCAAATCCTGCCACCTG

241 .........+---------+.........+..... + --.......+.........+ 300

CTGGAGCTCTTGGAAGCGCTGGACGACGTGCACGACCGTAAGAGGTTTAGGACGGTGGAC

DLKNLRDLLHVLAFSKSCHL

CCATGGGCTTCAGGTCTTGAGACTCTGGACTCTCTGGGCGGGGTCCTGGAAGCATCCGGT

301 ---------4---.------4---- - — - -4·--- - — - -4---------4* - -------- + 360

GGTACCCGAAGTCCAGAACTCTGAGACCTGAGAGACCCGCCCCAGGACCTTCGTAGGCCA

PWASGLETLDSLGGVLEASG

TACAGCACCGAAGTTGTTGCTCTGTCCCGTCTGCAGGGTTCCCTrCAGGACATGCTTTGG

61 · — --4---------4 — ----4----------4------ - ---4---------4 420

ATGTCGTGGCTTCAACAACGAGACAGGGCAGACGTCCCAAGGGAAGTCCTGTACGAAACC ystevvalsrlqgslqdmlw cagctggacctgtctccgggttgttaatggatcc

421 ---------4.---------4. — - -- -- -- 4- -- - 454 gtcgacctggacagaggcccaacaattacctagg

QLDLSPGC*

Fermentace. Fermentace hostitelských buněk, produkujících rekombinantní lidský OB poly5 peptid, byla provedena ve stejných podmínkách, jak je uvedeno pro rekombinantní myší polypeptid. Bakteriální exprese byla analyzována na základě výtěžku (g/1) rekombinantního lidského OB proteinu (s minoritním množstvím bakteriálních proteinů), před purifíkací:

Tabulka 9

Analýza exprese lidského OB polypeptidů

Doba	OD 600 nm	Výtěžek (g/1)	Exprese (mg/OD.l)
Ind. + 2 h	47	1,91	41
Ind. + 4 h	79	9,48	120
Ind. + 6 h	95	13,01	137
Ind. + 8 h	94	13,24	141
Ind. + 10 h	98	14,65	149

-78CZ 295018 B6

Zkratky: Ind. + _ h jsou hodiny po indukci exprese proteinu dle příkladu 13 pro rekombinantní myší materiál spCFM1656; O.D.: optická hustota, změřená na spektrofotometru; mg/O.D.*l: výraz v jednotkách mg proteinu na O.D. a litr.

Purifikace rekombinantního lidského OB polypeptidů

Rekombinantní lidský protein byl purifíkován stejnými postupy jako rekombinantní myší protein, jak je uvedeno v příkladu 13. Při preparaci lidského rekombinantního OB polypeptidů byl proveden krok 8 adjustací pH supematantu z kroku 7 na pH 5,0 a nanesením tohoto roztoku na kolonu rychle tekoucí CM Sefarózy. Eluce byla provedena 20 objemy kolony gradientem 0 až 0,5 mol.Γ¹NaCl v 20 mmol.r¹ NaOAc, pH 5,5. V kroku 9 byly chromatografické frakce s produktem zředěny 4 objemy vody a pH adjustováno na 7,5. Tato směs byla adjustována na koncentraci 0,7 mol.f¹ síranu amonného. Byl proveden reverzní solný gradient s 20 objemy kolony od 0,2 do 0 mol.f¹ síranu amonného v 5 mmol.f¹ NaOAc, pH 5,5. Ostatní kroky byly shodné.

Příklad 15: Studie odpovědi organizmu na dávku

V další studii byla pozorována závislost odpovědi na dávku OB proteinu při kontinuálním podávání. Divoké myši (neobézní, myši CD-1, hmotnost 35X0 g) dostávaly rekombinantní myší OB protein podle příkladů 12 a 13. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 10 (úbytek hmotnosti v % proti základní linii, měřeno výše uvedeným způsobem):

Tabulka 10

Odpověď na dávku při kontinuálním podávání

Dávka	Dny	Úbytek tělesné hmotnosti [%]
0,03 mg/kg/den	2	3,5 %
1 mg/kg/den	2	7,5 %
1 mg/kg/den	4	14%

Jak je zřejmé, zvýšení dávky z 0,03 mg/kg/den na 1 mg/kg/den vyvolalo zvýšení hmotnostního úbytku z 3,5 % na 7,5 %. Rovněž stojí za povšimnutí, že 4. den vedla dávka 1 mg/kg/den ke 14% ztrátě hmotnosti.

Příklad 16: Účinek leptinu na tělesnou stavbu z myší DB/DB

Šestnáctitýdenní myši C57B1/6J dostávaly 5 mg/kg/den myšího leptinu, nosič nebo nic, po dobu 33 dní. Sedmitýdenní myši OB/OB dostávaly 10 mg/kg/den lidského leptinu, myšího leptinu nebo nosič, po dobu 12 dní. Poté byly usmrceny, stanovena celková tělesná hmotnost, složení těla, hladina inzulínu a glukózy. Údaje z tohoto experimentu jsou uvedeny v tabulce 11.

-79CZ 295018 B6

Tabulka 11

Tělesná hmotnost, složení, hladiny inzulínu a glukózy u myší po aplikaci leptinu

Aplikační skupina	16ti týdenní myši 5 mg/kg/den leptinu
Aplikace	myší leptin	nosič	kontrola
celková tělesná hmotnost	31,90 ±2,8	64,10 ±4,5	67,50 ± 6,2
tuk celkem	9,10 ± 1,7	38,30 ±4,0	40,87 ±6,1
[%]	28,40 ± 3,4	59,70 ±2,1	60,34 ± 3,7
štíhlá celkem	6,80 ± 1,0	7,60 ± 0,4	7,73 ± 0,5
hmota [%]	21,30 ± 1,7	11,90 ± 1,2	11,57 ± 1,6
voda celkem	16,00 ±0,8	18,20 ±0,7	18,90 ± 1,0
[%]	50,30 ±4,2	28,40 ± 1,0	28,10 ±2,2
inzulín (UlU/ml)	<2,0	<2,0	<2,0
glukóza (mg/dl)	170,0 ±20,9	337,0 ±30,3	317,5 ±51,0

Aplikační skupina	7mi týdenní myši 10 mg/kg/den leptinu
Aplikace	lidský leptin	myší leptin	nosič
celková tělesná hmotnost	31,00 ± 1,3	33,40 ± 1,3	42,70 ± 1,5
tuk celkem [%]
štíhlá celkem hmota [%]
voda celkem [%]
inzulín (UlU/ml)	<2,0	<2,0	21,4
glukóza (mg/dl)	258,3 ± 26,8	320,0 ± 44,0	789,0 ± 152,1

Složení těla dokumentuje účinek leptinu na tři tělesné složky: tukovou hmotu, štíhlou hmotu a obsah vody. Z údajů vyplývá, že leptin významně snižuje tukovou hmotu a má jen okrajový účinek na štíhlou hmotu. Tento okrajový účinek však není statisticky významný.

Srovnání hladin inzulínu a glukózy u myší po aplikaci leptinu a kontrolní skupiny naznačuje, že leptin snižuje obsah cukru i inzulínu v krvi, čímž příznivě ovlivňuje tyto diabetické příznaky.

Příklad 17: Účinek vysokých dávek leptinu na divoké myši

Štíhlé kontrolní myši OB/OB (C57B1/6J +/?) dostávaly jednou denně i.p. injekci 10 mg/kg myšího leptinu nebo nosič (PBS). Po dobu dvou týdnů byla monitorována tělesná hmotnost a příjem potravy. Bylo pozorováno významné snížení příjmu potravy v prvním týdnu. Po prvním týdnu již však hladiny příjmu potravy byly nerozlišitelné od kontrolní skupiny. Po dvou týdnech byla zvířata usmrcena a stanoveno složení těla. Výsledky analýzy složení těla jsou uvedeny v tabulce 12. Výsledky demonstrují snížení obsahu tuku u zvířat po aplikaci leptinu proti kontrolní skupině, která dostávala PBS.

-80CZ 295018 B6

Tabulka 12

Skupina	C57B1/6J	tělesná hmotnost	tuk celkem	[%]
protein	1	17,3	0,30	1,71 %
	2	20,5	2,39	11,65%
	3	16,9	0,34	1,99 %
	4	18,3	0,84	4,62 %
	5	17,7	0,44	2,51 %
	6	18,7	2,56	13,72%
	7	15,7	0,37	2,38 %
	8	16,4	0,29	1,79 %
	9 10	16,5 14,9	0,83	2,05 %
	průměr stand.	17,3	0,93	5,04 %
	odchylka	1,6	0,90	4,52 %
nosič	11	18,8	1,30	6,93 %
	12	17,6	2,17	12,34 %
	13	18,0	2,29	12,74 %
	14	19,6	3,79	19,34 %
	15	18,6	2,35	12,65 %
	16	17,3	1,96	11,32%
	17	19,3	1,38	7,12 %
	18	20,6	4,16	20,19%
	19 20	17,7 19,5	1,08	6,13 %
	průměr stand.	17,3	0,93	12,09 %
	odchylka	1,6	0,90	5,08 %

-81 CZ 295018 B6

Skupina	C57B1/6J	štíhlá hmota celkem	r%]	voda celkem	[%]
protein	1	5,00	12,93 %	12,00	69,36 %
	2	5,41	26,40 %	12,70	61,95 %
	3	4,76	28,19%	11,80	69,82 %
	4	5,16	28,17%	12,30	67,21 %
	5	4,96	28,00 %	12,30	69,49 %
	6	4,84	25,86 %	11,30	60,43 %
	7	4,53	28,83 %	10,80	68,79 %
	8	4,51	27,48 %	11,60	70,73 %
	9 10	4,67	28,29 %	11,00 10,40	66,67 % 69,80
	průměr stand.	4,87	27,79 %	11,62	67,43 %
	odchylka	0,30	1,05 %	0,74	3,52 %
nosič	11	5,00	26,58 %	12,50	66,49 %
	12	4,53	25,73 %	10,90	61,93 %
	13	4,61	25,59 %	11,10	61,67%
	14	4,61	23,52 %	11,20	57,14 %
	15	4,75	25,52 %	11,50	61,83 %
	16	4,54	26,25 %	10,80	62,43 %
	17	5,02	26,04 %	12,60	66,84 %
	18	4,94	23,98 %	11,50	55,83 %
	19 20	4,72	26,64 %	11,90 12,30	67,23 % 63 08
	průměr stand.	4,75	12,09 %	11,66	62,45 %
	odchylka	0,20	5,08 %	0,72	3,83 %

Druhý experiment dokumentuje účinek i.p. injekce 12,5 mg/kg myšího leptinu při aplikaci dvakrát denně na divoké myši C57B1/6J. Vlivem polypeptidu došlo k podstatnému snížení tělesné hmotnosti a příjmu potravy. Při tomto experimentu byla zvířata chována v metabolických komorách a krmena práškovou dietou Purina #5001. Tato dieta se lišila od předcházejících pokusů, kdy potrava obsahovala živiny, tapioku a vodu. Potrava použitá v metabolických komorách měla vyšší kalorický obsah, což vysvětluje rozdílné množství spotřebované potravy proti předchozím pokusům.

Následující seznam odkazů se týká předkládaného popisu a zejména experimentálních postupů a diskusí.

Bahary etal., Genomics, 11:33-47 (1991).

Bahary eZ a/., Genomics, 13:761-769(1992).

Bahary et al., Molecular mapping of mouše chromosomes 4 and 6: Use of a flow-sorted Robertonian chromosome (1991).

Blank et al., Mammalian Genome, 1:51-78 (1991).

Bogardus et al., Annals of the New York Academy of Sciences, 630:100-115 (1991).

Friedman etal., Mammalian Genome, 1:130-144 (1991).

Harris, FASEBJ., 4:3310-3318 (1990).

Jacobowitz et al., N. Engl. J. Med., 315:96-100 (1986).

Kessey, Obesity, str. 144-166, Stunkard vyd., Philadelphia, W. B. Sauders Co. (1980).

-82CZ 295018 B6

Kessey et al., Ann. Rev. Psychol., 37:109-133.22 (1986).

Liebel et al., „Genetic variation and nutrition in obesity: Approaches to the molecular genetics of obesity“, v Genetic Variation and Nutrition, str. 90-101.1, Simopoulos a Childs vyd.,

S. Karger, Basel (1990).

Siegel etal., Cytogenet. Cell Genet., 61(3):184-185 (1992).

Tento vynález může být proveden i alternativními postupy, aniž by došlo k odchýlení od jeho rámce či podstatných rysů. Je proto vhodné považovat předkládaný popis ve všech ohledech za ilustrativní a v žádném směru neomezující rozsah vynálezu, který je naznačen v přiložených patentových nárocích. Všechny významově ekvivalentní změny tedy spadají do rozsahu předkládaného vynálezu.

Všechny práce citované v popise jsou uvedeny v odkazech.

Předkládaný vynález je realizovatelný podle předloženého popisu a snadno přístupných odkazů a výchozích látek. Nicméně, přihlašovatel uložil 9. 7. 1995 v Američan Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, 20852-1178, U.S.A. podle pravidel Budapešťské dohody o mezinárodním uznání rejstříku mikroorganizmů pro účely patentových řízení: E. coli H14, obsahující plazmid pETH14, pod přírůstkovým číslem 69880; a E. coli M9, obsahující plazmid pETM9, pod přírůstkovým číslem 69879.

Průmyslová využitelnost

Předkládaný vynález přináší modulátory tělesné hmotnosti, látky bílkovinné a nukleotidové povahy, využitelné pro diagnostické a terapeutické účely humánního i veterinárního lékařství.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Obezitní polypeptid OB, obsahující 145 až 167 aminokyselin, který moduluje tělesnou hmotnost zvířat, kde tento obezitní polypeptid OB obsahuje aminokyselinové sekvence SEQ ID č. 2, 4, 5 nebo 6.
2. OB polypeptid podle nároku 1, obsahující jeden nebo více farmaceuticky akceptovatelných polymerů, rozpustných ve vodě, kněmu připojených.
3. Analog OB polypeptidu podle nároku 1, který má sekvenci z 83 % nebo více homologní s aminokyselinovou sekvencí OB polypeptidu SEQ ID č. 2,4, 5 nebo 6.
4. Imunogenní fragment OB polypeptidu, zvolený ze skupiny, zahrnující: Val-Pro-Ile-Gln-Lys-Val-Gln-Asp-Asp-Thr-Lys-Thr-Leu-Ile-Lys-Thr, SEQ ID č. 18, Leu-His-Pro-Ile-Leu-Ser-Leu-Ser-Lys-Met-Asp-Gln-Thr-Leu-Ala SEQ ID č. 19 Ser-Lys-Ser-Cys-Ser-Leu-Pro-Gln-Thr-Ser-Gly-Leu-Gln-Lys-Pro-Glu-Ser-Leu-Asp, SEQ ID č. 20,

Ser-Arg-Leu-Gln-Gly-Ser-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Gln-Gln-Leu-Asp-Val-Ser-Pro-GluCys, SEQ IDČ.21.

-83CZ 295018 B6
5. Analog lidského OB polypeptidů, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci SEQ ID č. 4 nebo SEQ ID č. 6, kde jedna nebo více aminokyselin ze skupiny, zahrnující aminokyseliny 53, 56, 71, 85, 89, 92, 95, 98, 110, 118, 121, 122, 126, 127, 128, 129, 132, 139, 157, 159, 163 a 166, číslováno podle SEQ ID č. 4, bylo substituováno jinou přirozenou aminokyselinou.
6. Analog lidského OB polypeptidů podle nároku 5, v němž substituce byly provedeny divergentními aminokyselinami myšího OB polypeptidů SEQ. ID č. 2 nebo SEQ. ID č. 5.
7. Analog lidského OB polypeptidů podle nároku 5, v němž substituce byla provedena alaninem.
8. Analog lidského OB polypeptidů podle nároku 5, vybraný ze skupiny, zahrnující polypeptidy, kde je:

(a) serinový zbytek v poloze 53 substituován glycinem, alaninem, valinem, cysteinem, methioninem nebo threoninem;

(b) serinový zbytek v poloze 98 substituován glycinem, alaninem, valinem, cysteinem, methioninem nebo threoninem; a (c) argininový zbytek v poloze 92 substituován asparaginem, lysinem, histidinem, glutaminem, kyselinou glutamovou, aspartovou, serinem, threoninem, methioninem nebo cysteinem.
9. Analog OB polypeptidů, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci ze SEQ ID č. 2, 4, 5 nebo 6, vybraný ze skupiny, zahrnující polypeptidy, kde je:

(a) jeden nebo několik zbytků kyseliny aspartové substituováno kyselinou glutamovou;

(b) jeden nebo několik zbytků izoleucinu substituováno leucinem;

(c) jeden nebo několik zbytků glycinu nebo valinu substituováno alaninem;

(d) jeden nebo několik zbytků argininu substituováno histidinem;

(e) jeden nebo několik zbytků tyrosinu nebo fenylalaninu substituováno tryptofanem;

(f) jeden nebo několik zbytků v polohách 121 až 128, podle číslování ze SEQ ID č. 4, substituováno glycinem nebo alaninem; a (g) jeden nebo několik zbytků v polohách 54 až 60 nebo 118 až 166, podle číslování ze SEQ ID č. 4, substituováno lysinem, kyselinou glutamovou, cysteinem nebo prolinem.
10. OB polypeptid podle kteréhokoliv z nároků 1, 2, 5 nebo 6, vybraný ze skupiny, zahrnující polypeptidy:

(a) mající zbytky 1 až 21 deletovány za vzniku maturovaného polypeptidů; a (b) polypeptidy podle bodu (a) dále mající methioninový zbytek bezprostředně na N-konci maturovaného polypeptidů, nebo sekvenci glycin-serin-histidin-methionin, SEQ ID č. 38, bezprostředně na N-konci maturovaného polypeptidů, nebo sekvenci methionin-glycin-serin-serin-histidin-histidín-histidin-histidin-histidin-histidinserin-serin-glycin-leucin-valin-prolin-arginin-glycin-serin-histidin-methionin,

SEQ ID č. 98, bezprostředně na N-konci maturovaného polypeptidů.
11. OB polypeptid podle kteréhokoliv z nároků 1, 2, 5 nebo 6, vybraný ze skupiny, zahrnující polypeptidy:

(a) mající zbytky 1 až 21 deletovány za vzniku maturovaného polypeptidů; a

-84CZ 295018 B6 (b) polypeptidy podle bodu (a) dále mající sekvenci leucin-kyselina glutamová-lysin-argininkyselina glutamová-alanin-kyselina glutamová-alanin, SEQ ID č. 26, bezprostředně na N-konci maturovaného polypeptidů, nebo sekvenci kyselina glutamová-alanin-kyselina glutamová-alanin, SEQ ID č. 27, bezprostředně na N-konci maturovaného polypeptidů, nebo sekvenci leucin-kyselina glutamová-lysin-arginin, SEQ ID č. 28, bezprostředně na N-konci maturovaného polypeptidů, nebo sekvenci methionin-glycin-serin-serin-histidin-histidin-histidin-histidin-histidin-histidinserin-serin-glycin-leucin-valin-prolin-arginin-glycin-serin-prolin, SEQ ID č. 99, bezprostředně na N-konci maturovaného polypeptidů, nebo sekvenci glycin-serin-prolin bezprostředně na N-konci maturovaného polypeptidů.
12. OB polypeptid podle kteréhokoliv z nároků 3, 7, 8 nebo 9, vybraný ze skupiny, zahrnující polypeptidy:

(a) mající zbytky 1 až 21 deletovány za vzniku maturovaného polypeptidů; a (b) polypeptidy podle bodu (a) mající methioninový zbytek bezprostředně na N-konci maturovaného polypeptidů, nebo sekvenci glycin-serin-histidin-methionin, SEQ ID C. 38, bezprostředně na N-konci maturovaného polypeptidů, nebo sekvenci methionin-glycin-serin-serin-histidin-histidin-histidin-histidin-histidin-histidinserin-serin-glycin-leucin-valin-prolin-arginin-glycin-serin-histidin-methionin, SEQ ID Č. 98, bezprostředně na N-konci maturovaného polypeptidů, nebo sekvenci leucin-kyselina glutamová-lysin-arginin-kyselina glutamová-alanin-kyselina glutamová-alanin, SEQ ID C. 26, v polohách 14 až 21, nebo sekvenci kyselina glutamová-alanin-kyselina glutamová-alanin, SEQ ID C. 27, bezprostředně na N-konci maturovaného polypeptidů, nebo sekvenci leucin-kyselina glutamová-lysin-arginin, SEQ ID Č. 28, bezprostředně na Nkonci maturovaného polypeptidů, nebo sekvenci methionin-glycin-serin-serin-histidin-histidin-histidin-histidin-histidin-histidinserin-serin-glycin-leucin-valin-prolin-arginin-glycin-serin-prolin, SEQ ID č. 99, bezprostředně na N-konci maturovaného polypeptidů, nebo sekvenci glycin-serin-prolin v polohách 18 až 21.
13. Zkrácený analog lidského nebo myšího OB polypeptidů, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci SEQ ID č. 2, 4, 5 nebo 6, kde tento analog je zkrácený delecí aminokyselinových zbytků, vybraných ze skupiny, podle číslování ze SEQ ID č. 4, skládající se z:

(a) jednoho nebo několika zbytků v polohách 121 až 128;

(b) zbytků 1 až 116;

(c) zbytků 1 až 21 a 54 až 167;

(d) zbytků 1 až 60 a 117 až 167;

(e) zbytků 1 až 60;

(f) zbytků 1 až 53;

(g) analogu podle bodu (a), v kterém jsou detekovány zbytky 1 až 21; a (h) analogu podle bodu (a) až (g), který má N-koncovou aminokyselinu nebo aminokyselinovou sekvenci, zvolenou ze skupiny, zahrnující:

(1) methionin,

-85CZ 295018 B6 (2) sekvenci glycin-serin-histidin-methionin, SEQ ID č. 38, (3) sekvenci methionin-glycin-serin-serin-histidin-histidin-histidin-histidin-histidinhistidin-serin-serin-glycin-leucin-valin-prolin-arginin-glycin-serin-histidinmethionin, SEQ ID č. 98, (4) sekvenci leucin-kyselina glutamová-lysin-arginin-kyselina glutamová-alaninkyselina glutamová-alanin, SEQ ID č. 26, (5) sekvenci kyselina glutamová-alanin-kyselina glutamová-alanin, SEQ ID č. 27, (6) sekvenci leucin-kyselina glutamová-lysin-arginin, SEQ ID č. 28, (7) sekvenci methionin-glycin-serin-serin-histidin-histidin-histidin-histidin-histidinhistidin-serin-serin-glycin-leucin-valin-prolin-arginin-glycin-serin-prolin, SEQ ID č. 99, (8) sekvenci glycin-serin-prolin.
14. Izolovaná molekula nukleové kyseliny, kódující OB polypeptid podle kteréhokoliv z nároků 1 až 9 nebo 13.
15. Izolovaná molekula nukleové kyseliny, kódující OB polypeptid podle nároku10.
16. Izolovaná molekula nukleové kyseliny, kódující OB polypeptid podle nároku11.
17. Izolovaná molekula nukleové kyseliny, kódující OB polypeptid podle nároku12.
18. Molekula DNA pro expresi OB polypeptidu podle nároku 1, který má biologickou aktivitu modulátoru tělesné hmotnosti zvířat, kde DNA je vybraná ze skupiny, zahrnující:

(a) molekuly DNA podle SEQ ID č. 1 a 3, (b) molekuly DNA, hybridizující s molekulami DNA, definovanými v bodu (a) za zmírněných přísných podmínek, a (c) molekuly DNA, kódující expresi aminokyselinové sekvence, kódované kteroukoliv z molekul DNA, definované výše.
19. Detekovatelně značená molekula nukleové kyseliny, která hybridizuje s molekulou DNA za zmírněných přísných podmínek podle nároku 14.
20. Detekovatelně značená molekula nukleové kyseliny, která hybridizuje za zmírněných přísných podmínek s molekulou DNA podle kteréhokoliv z nároků 15, 16 nebo 17.
21. Detekovatelně značená molekula nukleové kyseliny, která hybridizuje za zmírněných přísných podmínek s molekulou DNA podle nároku 18.
22. Vektor obsahující molekulu DNA, vybranou ze skupiny, zahrnující:

a) molekulu nukleové kyseliny podle nároku 14,

b) molekulu nukleové kyseliny podle nároku 14, operativně připojenou k expresní kontrolní sekvenci.
23. Vektor, obsahující molekulu DNA, vybranou ze skupiny zahrnující:

a) molekulu DNA podle kteréhokoliv z nároků 15,16 nebo 17,

b) molekulu DNA podle kteréhokoliv z nároků 15, 16 nebo 17, operativně připojenou k expresní kontrolní sekvenci.

-86CZ 295018 B6
24. Vektor, obsahující molekulu DNA, vybranou ze skupiny, zahrnující:

a) DNA molekulu podle nároku 18,

b) DNA molekulu podle nároku 18, operativně připojenou k expresní kontrolní sekvenci.

5
25. Protilátka, nebo její fragment vázající antigen, specifická k OB polypeptidu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 9 nebo 13.
26. Protilátka, nebo její fragment vázající antigen podle nároku 25, která je detekovatelně označená.

o
27. Farmaceutický prostředek, snižující tělesnou hmotnost zvířat, vy z n a č uj í c í se tím, že obsahuje OB polypeptid podle kteréhokoliv z nároků 1 až 9 nebo 13 a farmaceuticky přijatelný nosič.