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KR100584177B1 - 체중 변조물질,상응하는 핵산 및 단백질,및 이들의 진단 및 치료학적 용도 - Google Patents

체중 변조물질,상응하는 핵산 및 단백질,및 이들의 진단 및 치료학적 용도 Download PDF

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KR100584177B1
KR100584177B1 KR1019970701038A KR19970701038A KR100584177B1 KR 100584177 B1 KR100584177 B1 KR 100584177B1 KR 1019970701038 A KR1019970701038 A KR 1019970701038A KR 19970701038 A KR19970701038 A KR 19970701038A KR 100584177 B1 KR100584177 B1 KR 100584177B1
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제프리 엠. 프라이드맨
이잉 장
리카르토 프로엔카
마르게리타 마페이
제프리 엘. 할라이스
케탄 가지왈라
스텐펀 케이. 벌리
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더 락커펠러 유니버시티
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Abstract

본 발명은 일반적으로 동물 및 인간을 포함한 포유동물의 체중을 조절하는데 관한 것이며, 더욱 특히는 본 발명에서 체중 변조물질 (modulator)로서 확인된 물질, 및 이러한 변조물질이 적용될 수 있는 진단 및 치료학적 용도에 관한 것이다.

Description

체중 변조물질, 상응하는 핵산 및 단백질, 및 이들의 진단 및 치료학적 용도
본 발명은 일반적으로 동물 및 인간을 포함한 포유동물의 체중을 조절하는데 관한 것이며, 더욱 특히는 본 발명에서 체중 변조물질 (modulator)로서 확인된 물질, 및 이러한 변조물질이 적용될 수 있는 진단 및 치료학적 용도에 관한 것이다.
순체질량 (lean body mass)에 비해 체지방이 과도한 것으로 정의되는 비만은 중요한 생리학적 및 의학적 이환상태와 연관이 있으며, 후자의 의학적 이환상태에는 고혈압, 증가된 혈중 지질, 및 타입 Ⅱ 또는 비인슐린-의존성 당뇨병 (NIDDM)이 포함된다. 미국에는 연령이 65세인 집단의 18%를 포함하여 6백만 내지 1000만명의 NIDDM 환자가 있다 [Harris et al., Int. J. Obes., 11:275-283 (1987)]. NIDDM이 있는 남성의 약 45% 및 여성의 70%는 비만이며, 이들의 당뇨병은 체중감소에 의해서 실질적으로 개선되거나 해소된다 [Harris, Diabetes Care, 14(3):639-648 (1991)]. 후술하는 바와 같이, 비록 소인성 유전자가 확인되지는 않았지만 비만 및 NIDDM은 둘다 강력한 유전성이다. 이들 대사적으로 관련된 질환의 분자유전적 근거는 중요하지만, 이해가 불충분한 문제이다.
영양 에너지의 동화, 저장 및 이용은 후생동물의 생존에 중심적인 복잡한 항상성 시스템을 구성한다. 땅에서 거주하는 포유동물에서는 대량의 대사연료를 트리글리세라이드로서 지방조직에 저장하는 것이 음식물 결핍의 기간에 생존하는데 결정적이다. 유기체의 크기 및 형태를 지속적으로 변화시키지 않으면서 에너지 저장을 고정수준으로 유지시키고자 하는 욕구는 에너지 섭취와 소비 사이에 균형을 이루는 것을 필요로 한다. 그러나, 에너지 군형을 조절하는 분자기전은 아직 밝혀지지 않았다. 영양정보를 변환시키고 에너지 균형을 조절하는 분자를 분리하는 것은 건강과 질병에 있어서의 체중조절을 이해하는데 중요하다.
지방과다의 개인적 수준은 대부분 유전적으로 결정된다. 일란성 및 이란성 쌍동이 또는 양자와 그들의 생물학적 부모 사이의 체중 및 지방과다의 합치율(concordance rate)에 대한 검사는 비만의 유전율 (0.4-0.6)이 정신분열증, 알콜중독 및 아테롬성 경화증과 같이 통상적으로 상당한 유전적 성분을 갖는 것으로 생각되는 다수의 다른 형질의 유전율을 초과하는 것을 시사하였다 [Stunkard et al., N. Engl. J. Med., 322:1483-1487 (1990)]. 에너지 소비의 비율에 있어서의 가족간 유사성도 또한 보고되었다 [Bogardus et al., Diabetes, 35:1-5 (1986)]. 지리학적으로 구분된 집단에서의 유전적 분석은 비교적 소수의 유전자가 체조성 변화의 30-50%의 원인이 되는 것을 시사하고 있다 [Moll et al., Am. J. Hum. Genet., 49:1243-1255 (1991)]. 그러나, 일반적 집단에서 비만증의 원인이 되는 유전자중의 어떤 것도 정확한 염색체 위치가 유전적으로 확인되지 않았다.
비만증의 설치류 모델은 7개의 외관적 단일-유전자 돌연변이를 포함한다. 가장 집중적으로 연구된 마우스 비만 돌연변이는 ob (비만) 및 db (당뇨병) 유전자이다. 동일한 유전적 스트레인 배경 (genetic strain background) 상에 존재하는 경우에, ob 및 db는 구별할 수 없는 대사적 및 행동적 표현형을 나타내며, 이것은 이들 유전자가 동일한 생리적 경로에서 작용할 수 있음을 시사한다 [Coleman et al., Diabetologia, 14:141-148 (1978)]. 어느 하나의 돌연변이에 대해 동형접합성인 마우스는 과식성이고 저대사성이며, 이것은 1 개월 째에 현저한 비만 표현형을 유도한다. 이들 동물의 체중은 (대조군 마우스에서는 30-35 g인데 비해서) 60-70 g에서 안정화하는 경향이 있다. ob 및 db 동물은 돌연변이로 인한 일차 결함을 확인하기 어렵게 만드는 무수한 다른 호르몬성 및 대사성 변화를 나타낸다 [Bray et al., Am. J. Clin. Nutr., 50:891-902 (1989)].
각각의 설치류 비만 모델은 인간에게서 타입 Ⅱ 당뇨병의 경우와 유사한 탄수화물 대사의 변화를 수반한다. 일부의 경우에, 당뇨병의 중증도는 부분적으로 배경 마우스 스트레인에 따라 좌우된다 [Leiter, Endocrinology, 124:912-922 (1989)]. ob 및 db 둘다인 경우에, 유사유전자형 (congenic) C57BL/Ks 마우스는 궁극적인 β 세포 괴사 및 도 (isiet) 위축이 있는 중증의 당뇨병을 발현하여 상대적 인슐린결핍증을 야기시킨다. 반대로, 유사유전자형 C57BL/6J ob 및 db 마우스는 결국에 인간 타입 Ⅱ 당뇨병과 유사한 β 세포 비대에 의해서 상쇄되는 일시적인 인슐린-저항성 당뇨병을 발현시킨다.
ob 및 db 마우스의 표현형은 당뇨병의 발현과는 다른 방식으로 인간 비만증과 공통점이 있다 - 돌연변이 마우스는 야윈 대조군의 경우에 비해서 더 많이 먹고 더 적은 에너지를 소비한다 (비만 인간의 경우와 같음). 이 표현형은 또한, 복측 정중 시상하부의 병변을 갖는 동물에서 나타나는 것과 매우 유사하며, 이것은 두가지 돌연변이가 모두 중추신경계 내에서 영양정보에 적절하게 통합되거나 반응하는 능력을 저해할 수 있음을 시사한다. 이 가설은, ob 마우스는 순환 포만인자가 결여되어 있고 db 마우스는 ob 인자의 영향에 대해서 저항성이 있음 (아마도 ob 수용체 결손에 기인할 수 있음)을 시사하는 부생실험 (parabiosis experiment) [Coleman, Diabetologia, 9:294-298 (1973)]의 결과에 의해서 지지된다. 이들 실험은 이들 돌연변이 마우스에서 비만증이 체조성 (body composition)을 조절하는 가정된 피드백 메카니즘의 구심성 루프 및/또는 통합성 중추에서의 다양한 결함으로부터 일어날 수 있다는 결론을 유도한다.
분자 및 고전적 유전자 마커 (marker)를 사용하여 ob 및 db 유전자를 각각 근위 염색체 (proximal chromosome) 6 및 중앙염색체 (midchromosome) 4에 위치하게 하였다 [Bahary et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 87:8642-8646 (1990); Friedman et al., Genomics, 11:1054-1062 (1991)]. 두경우에 모두, 돌연변이는 인간과 신테니 (syntheny)인 마우스 지놈의 부분에 위치하며, 이것은 ob 및 db의 인간 동족체가 있다면 이들은 각각 인간 염색체 7q 및 1p에 위치할 것임을 시사하는 것이다. db 유전자에서의 결함은 다른 포유동물 종에서 비만증을 일으킬 수 있다: 주커 (Zucker) fa/fa 랫트와 브라운 노르웨이 (Brown Norway) +/+ 랫트 사이의 유전자 교잡시에 fa 돌연변이 (랫트 염색체 5)는 마우스에서 db 의 측면에 위치하는 동일한 로커스 (loci)에 의해서 인접된다 [Truett et al., Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 88:7806-7809 (1991)].
수많은 인자가 체중에 영향을 미치는 것으로 보이기 때문에 어떤 인자가, 더욱 특히는 어떤 항상성 메카니즘이 체중에 대해서 일차적으로 결정적인 것인지를 예견할 수는 없다. 따라서, 본 발명의 기초가 되는 주된 문제는 포유동물의 지방 과다 및 지방 함량의 조절을 허용하는 체중의 변조물질 (modulator)을 제공하는 것이다.
도 1 (A 내지 E)은 쥐의 OB cDNA에 대해 유도된 핵산 서열 (SEQ ID NO: 1) 및 유추된 아미노산 서열 (SEQ ID NO: 2)를 도시하고 있다. 39 염기쌍 5' 리더에 이어서 예상되는 167 아미노산 개방 판독 프레임 및 약 3.7 kb 3' 비해독 서열이 존재하였다. (이전에 출원된 미합중국특허출원 제 08/347,563 호 (1994. 11. 30 출원) 및 특허출원 제 08/438,431 호 (1995. 5. 10 출원)에서는, 그후에 추가의 58-염기 5' 비-코드화 서열이 클로닝 인공산물 (cloning artifact)인 것으로 결정되었다. 이 인공산물은 코드화 부분, 현재 도 1에 도시되어 있는 39 염기 5' 비-코드화 부분 또는 유전자의 3' 비-코드화 부분상에 존재하지 않는다.) 3' 비해독 서열의 총 약 2500 염기쌍이 도시되어 있다. SigSeq 컴퓨터 프로그램을 사용하고 관찰함으로써 예상되는 단백질 서열을 분석한 결과는 시그날 서열 (밑줄 침)이 존재함을 시사한다. cDNA의 마이크로불균질성 (microheterogeneity)은, cDNAs의 약 70%는 코돈 49에서 글루타민 코돈을 가지며 30%는 갖지 않음을 나타내었다 (참조, 이하의 도 5 및 6). 이 아미노산은 C57BL/6J ob/ob 마우스 (1J 마우스)에서 돌연변이된 아르기닌 코돈으로서 밑줄을 그어 표시한다.
도 2 (A 및 B)는 인간 OB cDNA에 대해 유도된 핵산 서열 (SEQ ID NO: 3)을 도시하고 있다. 뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드 46을 시작부위로 하고 뉴클레오타이드 550에서 종결시켜 1 부터 701 까지 번호를 붙였다.
도 3은 도 2A 및 B의 핵산 서열에 상응하는 인간 OB 유전자에 대해 유도된 전체 유추된 아미노산 서열 (SEQ ID NO: 4)를 도시하고 있다. 아미노산은 1 부터 167 까지 번호를 붙였다. 시그날 서열 절단부위는 아미노산 21 (Ala) 다음에 위치하기 때문에 성숙 단백질은 아미노산 22 (Val) 부터 아미노산 167 (Cys) 까지에 걸쳐 있다.
도 4는 쥐 (SEQ ID NO: 2)와 인간 (SEQ ID NO: 4)의 유추된 아미노산 서열을 비교하여 나타내었다. 인간 OB 유추된 아미노산 서열의 서열은 마우스의 서열과 매우 동족성이었다. 보존적 변화는 대쉬 (dash)로 나타내며, 비보존적 변화는 별표로 나타낸다. 가변적 글루타민 코돈은 C57BL/6J ob/ob (1J) 마우스에서 넌센스(nonsense) 돌연변이의 위치로서 밑줄을 쳐서 나타낸다. 전체적으로, 여기에서는 코돈 22 (여분의 시그날 서열 바로 하류임)에서의 발린과 위치 117에서의 시스테인 사이에서 단지 8개의 치환이 관찰되었지만, 아미노산 수준에서 83% 동일성이 있다.
도 5는 도 3에 도시된 바와 같은 쥐의 OB 유전자에 대해 유도되지만 위치 49에서 글루타민이 결여된 전체 길이 아미노산 서열 (SEQ ID NO: 5)을 도시하고 있다. 아미노산은 1 부터 166 까지 번호를 붙였다. 시그날 서열 절단부위는 아미노산 21 (Ala) 다음에 (및, 따라서 글루타민 49 결실 전에) 위치하기 때문에 성숙 단백질은 아미노산 22 (Val) 부터 아미노산 166 (Cys) 까지에 걸쳐 있다.
도 6은 도 4에 도시된 바와 같은 인간의 OB 유전자에 대해 유도되지만 위치 49에서 글루타민이 결여된 전체 유추된 아미노산 서열 (SEQ ID NO: 6)을 도시하고 있다. 아미노산은 1 부터 166 까지 번호를 붙였다. 시그날 서열 절단부위는 아미노산 21 (Ala) 다음에 (및, 따라서 글루타민 49 결실 전에) 위치하기 때문에 성숙 단백질은 아미노산 22 (Val) 부터 아미노산 166 (Cys) 까지에 걸쳐 있다.
도 7에서 (A)는 쥐의 염색체에서 ob의 위치의 물리적 지도 및 YAC 및 P1 클로닝 지도이다. "M 및 N"은 MulI 및 NotI 제한부위에 상응한다. 번호들은 획득된 1606 감수분열체의 ob의 부분에서의 재조합체인 개체 동물에 상응한다. Met, Pax 4, D6Rck39, D6Rck13 및 Cpa는 DNA 프로브에 결합한 ob의 부분에서의 위치에 관한 것이다. YACs는 프로브로서 D6Rck13 및 Pax-4를 사용하여 분리되었으며, 말단은 벡토렛트 (vectorette) PCR 및/또는 플라스미드 말단 구제를 사용하여 회복되었으며, 다시 새로운 YACs를 분리시키는데 사용되었다. (B)는 생성된 YAC 콘티그(contig)이다. 이 콘티그에서 YACs 중의 하나인 Y902A0925는 키메라성이었다. 재조합 동물의 유전자형을 결정하기 위해서 사용된 각각의 프로브는 괄호안에 나타낸다. (6)은 YAC 107에 상응하며; (5)는 M16(+) (또는 M16(pLUS))에 상응하고; (4)는 adu(+)에 상응하며; (3)은 aad(pICL)에 상응하고; (2)는 53(pICL)에 상응하며; (1)은 53(+)에 상응한다. (C)는 선택된 YAC 말단 프로브에 의해서 분리된 박테리오파아지 P1 클론의 P1 콘티그이다. ob 유전자는 YAC YB6S2F12의 원위 말단 (말단(4)) (대용으로, 여기에서는 adu(+)라고 불리움)을 사용하여 분리된 P1 클론 내에서 분리되었다.
도 8은 PCR 증폭되고 특정화된 네번째 엑손 트랩핑 실험의 192개의 독립적인 분리체의 에티듐브로마이드 염색의 사진을 나타낸다.
도 9는 ob를 수반하는 것으로 의심되는 PCR-증폭된 클론의 에티듐브로마이드 염색의 사진이다. 인공산물을 수반하지 않는 7개의 클론의 각각은 PCR을 사용하여 재증폭시켰으며, TBE 내의 1% 아가로즈 겔 상에서 전기영동하여 에티듐브로마이드로 염색하였다. 크기 마커 (size marker)(맨왼쪽의 번호를 안 붙인 레인)는 시판품으로 이용할 수 있는 "1 kB 래더 (ladder)"이다. 레인 1은 "HIV 서열"을 함유하는 클론 1D12이다. 레인 2는 ob 부분을 제외한 신규한 클론인 클론 1F1이다. 레인 3은 클론 1H3이다. 레인 4는 1F1과 동일한 클론 2B2이다. 레인 5는 ob 엑손을 함유하는 클론 2G7이다. 레인 6은 1F1과 동일한 클론 2G11이다. 레인 7은 삽입물을 함유하지 않는 클론 2H1이다.
도 10은 OB 유전자의 일부분에 대해 코드화한 엑손을 포함하는 2G7 클론의 서열 (SEQ ID NO: 7)을 나타낸다. 이 엑손을 증폭시키기 위해서 사용된 프라이머 서열은 도면에서 네모로 표시하였다 (SEQ ID NOS: 8 및 9).
도 11의 (A)는 2G7 프라이머 및 액틴 프라이머를 사용한 동일한 마우스의 다양한 조직으로부터의 mRNA의 역전사-PCR 분석을 나타낸 것이다. RT-PCR 반응은 제 1 스트랜드 cDNA 합성을 위한 프라이머로서 올리고 dT를 사용하여 역전사된 총 RNA 100 ng을 사용하여 수행하였다. PCR 증폭은 1' 동안 94˚ 변성; 1' 동안 55˚ 하이브리드화; 및 사이클 당, 1'초 자가연장과 함께 2' 동안 72℃ 연장으로 35 사이클 동안 수행하였다. RT-PCR 생성물은 1×TBE 완충액 중에서 주행하는 2% 저융점 아가로즈겔에서 분할시켰다. (B)는 프로브로서 PCR 표지된 2G7을 사용하여 마우스의 다양한 기관으로부터 유래한 mRNA의 노던 블럿 (Northern blot)을 수행한 것을 나타낸 것이다. 각각의 조직으로부터 유래하는 총 RNA 10 ㎍을 포름알데히드와 함께 아가로즈겔 상에서 전기영동하였다. 프로브를 래피드 하이브 (Rapid Hybe; Amersham) 내에서 65℃에서 하이브리드화시켰다. 자가방사기록 시그날은 1시간의 노출 후에 명백하였으며, 실험은 24시간 노출의 결과를 나타내었다.
도 12의 (A)는 열거된 마우스 스트레인 각각으로부터 유래하는 지방세포 (백색 지방조직 (white adipose cells)) RNA 상에서의 RT-PCR 반응으로부터의 에티듐 브로마이드 염색을 나타낸 것이다. 각각의 샘플에 대한 총 RNA (100 ng)를 올리고 dT 및 역전사효소를 사용하여 역전사시키고, 생성된 단일-스트랜드 cDNA를 2G7 프라이머 (하부 밴드) 또는 액틴 프라이머 (상부 밴드)를 사용하여 PCR 증폭시켰다. 2G7 및 액틴 프라이머는 둘다 동일한 PCR 반응에 포함되었다. 생성물은 1% 아가로즈 TBE 겔 상에서 주행시켰다. (B)는 (A)에 상응하는 노던 분석을 나타낸 것이다. 지정된 각각의 스트레인으로부터 유래하는 지방세포 (백색 지방조직) RNA 10 ㎍을 빼내서 상기 도 11B에서와 같이 PCR 표지된 2G7 프로브로 프로브화시켰다. 2G7 mRNA의 수준에 있어서의 약 20-배 증가는 여윈 한배 새끼 (lean littermate)에 비해서 C57BL/6J ob/ob (1J) 스트레인으로부터 유래하는 백색 지방 RNA에서 명백하였다. RT-PCR 및 노던 실험 둘다에서는 2 주일의 노출 후에도 SM/Ckc-+Dac ob 21 /ob 21 (2J) 마우스로부터 유래하는 2G7 RNA에는 검출가능한 시그날이 없었다. 24시간 자가방사기록 노출을 나타내었다. 동일한 필터를 액틴 프로브 (패널의 하부 부분)에 대해 하이브리드화시켰다.
도 13은 2J 동물로부터 ob mRNA의 부재를 확인하는 추가의 2J 동물 및 대조 동물의 노던 분석을 나타낸 것이다. 노던 분석은 도 11 및 12에서와 같이 수행하였다. 이 경우에, 대조용 RNA는 지방 특이적 전사물인 ap2였다. 여기에서는 ap2 밴드의 변화하는 밀도에 대한 유의성은 없었다.
도 14는 돌연변이 스트레인 cDNA에서 조숙 정지코돈 (넌센스 돌연변이)의 도입을 유도하는 점돌연변이의 부분에서 C57BL/6J (정상) 및 C57BL/6J ob/ob (1J) 마우스의 DNA 서열을 비교한 것이다. ob/ob 마우스는 위치 105에서 아르기닌 잔기를 변화시킨 C→T 돌연변이를 가졌다. 이 염기 변화는 자동 DNA 서열분석기(sequencer)로부터의 출력정보로서 나타난다. RT-PCR은 5' 및 3' 비해독 부분으로부터의 프라이머를 사용하여 두가지 스트레인 (+/+ 및 ob/ob)으로부터 유래하는 백색 지방 RNA를 사용하여 수행하였다. PCR 반응생성물을 겔 정제하고, 코드화 서열의 두개의 스트랜드에 따라 프라이머와 함께 어플라이드 바이오시스템스, 인코포레이티드 (Applied Biosystems, Inc.) 373A 자동 서열분석기를 사용하여 수동으로 서열을 직접 분석하였다.
도 15의 (A)는 열거된 각각의 마우스 스트레인으로부터 유래하는 지놈 DNA의 사우던 블럿을 나타낸 것이다. 약 5 ㎍의 DNA (간, 신장 또는 비장으로부터 제조된 지놈 DNA로부터 유도됨)를 지시된 제한효소로 제한분해시켰다. 그후에 DNA를 1% 아가로즈 TBE 겔 중에서 전기영동시키고, PCR 표지된 2G7로 프로브화시켰다. BglII에 의한 제한분해로 SM/Ckc-+ Dac ob 21 /ob 21 (2J) DNA 내에서 약 9 kB (최대) BglII 단편의 크기의 증가를 밝혀내었다. RFLPs는 어떤 다른 제한효소에 의해서도 검출할 수 없었다. 지놈 DNA의 예비적 제한지도작성은 다형성 BglII 부위가 전사개시부위의 약 7 kB 상류임을 나타내었다. 시험한 다른 효소들 중의 어떤 것도 mRNA 개시부위를 지나서 확장되지 않았다. (B)는 SM/Ckc-+ Dac ob 21 /ob 21 스트레인에서 BglII 다형성의 분리를 나타낸 것이다. 동일 세대의 유사유전자형 SM/Ckc-+ Dac ob 21 /ob 21 (2J) 콜로니로부터 유래하는 6개의 비만 및 5개의 여윈 자손은 (A)에서 보는 바와 같이 BglII 다형성을 기록함으로써 유전자형이 결정되었다. 표현형적으로 비만인 모든 동물은 다형성 BglII 단편의 더 큰 대립유전자에 대해서 동형접합성이었다. "대조" 레인의 DNA는 SM/Ckc-+ Dac ob 21 /ob 21 콜로니와는 별도로 사육된 무관한 SM/Ckc-+Dac +/+ 마우스로부터 제조되었다.
도 16은 프로브로서 OB cDNA를 사용하는, 열거된 종으로부터 유래하는 EcoRI 분해된 지놈 DNA의 사우던 블럿 (즉, 주블럿 (zoo blot))이다. 하이브리드화 시그날은 중등도로 엄격한 하이브리드화 후에도 모든 척추동물 샘플에서 검출가능하였다. 이 실험에서 고양이 DNA는 약간 분해되었다. 제한된 DNA는 1% 아가로즈 TBE 겔 상에서 주행시키고, 프로브화를 위한 이모빌론막 (imobilon membrane)에 전이시켰다. 필터를 65℃에서 하이브리드화시키고, 65℃에서 2×SSC/0.2% SDS로 20분 동안 2회 세척하고, 코닥 (Kodak; Rochester, N.Y.) X-OMAT 필름을 사용하여 3일 동안 노출시켰다.
도 17은 벡터 pET-15b (Novagen)의 발현 클로닝 부분 (SEQ ID NOS.: 11 및 12)을 나타낸 것이다.
도 18은 His-태그 (tag)에 대한 재조합 성숙 쥐 ob 융합 (A) 및 His-태그에 대한 성숙 인간 OB 융합 (B)에 대한 His-결합수지 (Ni) 칼럼으로부터의 용출물에 대한 분석을 나타낸 것이다. 세균은 각각 벡터 pETM9 및 pETH14로 형질전환시켰다. 최적조건에서 1 mM IPTG에서 유도하면, 형질전환된 세균은 주로 봉입체(inclusion body) 내에서, 100-200 ㎍/㎖의 OB 융합단백질을 생산할 수 있었다. 봉입체는 6 M 구아니딘-HCl 또는 우레아에 의해서 가용화되었으며, 융합단백질 (용해 상등액에 존재함)을 우레아와 함께 10 ㎖의 1× 결합완충액내의 His-결합수지(Ni) 칼럼 상에 부하시켰다. 칼럼을 20 μM, 60 μM 및 300 μM 이미다졸의 5 ㎖ 분취액으로 단계적으로 용출시키고, 마지막으로 스트립 완충액 (strip buffer)으로 용출시켰다. 분취액에 대하여 15% 아크릴아미드겔 상에서 OB 폴리펩타이드 융합의 존재 여부를 분석하였다. 각각의 레인은 100 ㎕의 세균 추출물의 등량을 함유한다.
도 19에서 (A)는 OB RNA의 시험관내 해독을 나타낸 것이다. 인간 OB cDNA를 pGEM 벡터 내에 서브클로닝시켰다. 플라스미드를 선형으로 만들고, 플러스 스트랜드 DNA를 Sp6 폴리머라제를 사용하여 합성하였다. 시험관내 합성된 RNA를 개의 췌장 마이크로좀막의 존재 또는 부재 하에서 해독하였다. 반응에 마이크로좀막을 첨가하는 것은 일차 해독생성물 보다 약 2 kD 더 작은 제 2 해독생성물의 출현을 유도하였다. 코드화된 시그날 서열이 결여된 인터로이킨-1α RNA의 해독생성물의 크기는 마이크로좀막의 첨가에 의해서 변화되지 않았다. 이들 데이타는 작용적 시그날 서열의 존재를 시사하였다. (B)는 프로테이나제 K의 존재 또는 부재 하에서의 시험관내 해독을 나타낸 것이다. 프로테아제 처리는 18 kD 일차 해독생성물의 완전한 단백분해를 야기시켰으며, 그 반면에 16 kD 처리된 형태는 영향을 받지 않았다. 0.1% 트리톤 (TRITON)-X100에 의한 마이크로좀의 투과성화 (permeabilization)로 처리된 형태가 프로테아제 민감성이 되도록 하였다. 이들 결과는 생성물이 마이크로좀의 루멘 (lumen)으로 해독되었음을 시사한다.
도 20 (A 내지 E)은 인간 OB 유전자의 서열 (SEQ ID NOs: 22 및 24)을 나타낸 것이다. (F)는 쥐의 OB 유전자의 개략도이다. (G)는 인간 OB 유전자의 개략도이다. (F) 및 (G) 둘다에서, 출발 및 정지 코돈은 밑줄을 쳐서 표시하였다. 여기에서 인간 유전자 내에는 마우스 제 1 인트론에 대해 동족성인 제 1 인트론의 증거는 없지만, 그의 존재는 배제될 수 없다.
도 21은 피치아 (Pichia) 효모 내에서 OB의 재조합체 발현을 획득하기 위해서 사용된 클로닝 방법 중의 하나의 개략도를 나타낸 것이다. (A)는 α-교배인자 (mating factor) 시그날 서열을 갖는 OB의 발현벡터를 나타낸 것이다. (B)는 XhoI 부위 및 추정상의 KEX-2 및 STE-13 절단부위를 나타내는 아미노산 서열 (SEQ ID NO: 26), 및 KEX-2 절단 이후에 존재하는 N-말단 여분의 아미노산 (SEQ ID NO: 27)을 포함하는 재조합 융합단백질의 구조에 대한 개략도이다. (C)는 성숙 ob 폴리펩타이드 서열 (SEQ ID NO: 28)의 바로 상류에 KEX-2 절단부위 및 XhoI 절단부위에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 작제물을 제조하는 것을 포함하여 성숙 OB를 제조하는 대체방법을 나타낸 것이다.
도 22는 피치아 (Pichia) 내에서의 대체 발현방법을 나타낸 것이다. (A)는 α-교배인자 시그날 서열 (SEQ ID NO: 33)의 조절 하에서 pET 발현시스템으로부터 채택된 His-태그를 갖는 OB 융합의 발현벡터이다. (B)는 3개의 여분의 N-말단 아미노산 잔기를 갖는 OB를 수득할 수 있는 것으로 α-교배인자 시그날 서열, 추정상의 KEX-2 및 STE-13 절단부위, His-태그, 및 트롬빈 절단부위를 포함하는, His-태그를 함유하는 재조합 OB 융합단백질의 구조의 개략도이다.
도 23의 (A)는 형질전환된 피치아 (pichia) 효모 내에서 쥐의 OB (둘다 마이크로불균질 형태, 즉 Gln 49 함유 및 결실된 형태)의 발현에 대한 PAGE 분석을 나타낸 것이다. 약 16 kD의 예상되는 밴드는 형질전환된 효모 배양액 내에서 볼 수 있지만 (제 2 및 3 레인), 비-형질전환된 효모로부터의 배양액 내에서는 볼 수 없다 (제 1 레인). (B)는 약한 양이온 교환제인 카복시메틸 셀룰로즈 상에서의 부분적으로 정제된 재조합 OB 폴리펩타이드의 PAGE 분석을 나타낸 것이다. 약 16 kD의 밴드는 250 mM NaCl에 의해서 용출된 칼럼으로부터의 분획 3 및 4에서 확실히 볼 수 있다. 레인 1은 부하된 샘플이며; 레인 2는 관통액 (flow-through)이고; 레인 3-5는 250 mM NaCl로 용출된 분획들이다.
도 24는 OB 단백질이 마우스 혈장 내에서 순환함을 나타낸다. (A)는 마우스 혈액으로부터의 면역침강반응을 나타낸 것이다. 0.5 ㎖의 마우스 혈장을 비컨쥬게이트화된 세파로즈로 전정화시키고, 세파로즈 4B 비드에 컨쥬게이트된 면역정제된 안티-OB 항체와 함께 밤새 배양하였다. 면역침강물을 15% SDS-PAGE 겔 상에서 분리하고, 전이시킨 다음, 안티-OB 항체로 웨스턴 블럿팅시켰다. 단백질은 약 16 kD의 분자량을 가지고 효모 내에서 발현된 성숙 마우스 ob 단백질과 동일한 위치로 이동하였다. 단백질은 C57BL/6J ob/ob 마우스로부터 유래한 혈장 내에는 부재하였으며, 야생형 마우스에 비해서 C57BLB/Ks db/db 마우스로부터 유래하는 혈장 내에서는 10-배로 증가하였다. db 마우스는 OB 단백질을 과잉생산하고, 이차적으로 그의 효과에 대해 저항한다고 제안되었다. (B)는 지방질 랫트에서 OB의 증가된 수준을 나타낸 것이다. 지방질 랫트는 랫트 염색체 5 상에서의 열성 돌연변이의 결과로 비만이다. 유전자 데이타는 db 마우스에서 돌연변이된 동일한 유전자에 있어서의 결손을 시사하였다. 지방질 랫트 및 여윈 한배새끼로부터 유래하는 혈장을 면역침강시키고 웨스턴 블럿 상에서 주행시켰다. OB의 순환 수준에 있어서의 20-배 증가는 돌연변이체 동물에서 나타난다. (C)는 마우스 혈장 내의 OB 단백질의 정량 분석을 나타낸 것이다. 증가량의 재조합 마우스 단백질을 ob 마우스로부터 유래하는 100 λ의 혈장에 첨가하고 면역침강시켰다. 웨스턴 블럿 상에서의 시그날 강도를 야생형 마우스로부터 유래하는 100 λ의 혈장으로부터의 강도와 비교하였다. 시그날 강도에 있어서의 선형 증가는 증가량의 재조합 단백질에 의해서 나타났으며, 이것은 면역침강이 항체 과잉의 조건 하에서 수행되었음을 입증하는 것이다. 유사한 시그날은 야생형 혈장 샘플 및 마우스 혈장 내에서 순환 수준이 약 20 ng/㎖임을 시사하는 2 ng의 재조합 단백질을 갖는 샘플에서 나타났다. (D)는 지방조직 추출물 내의 OB 단백질을 나타낸 것이다. 마우스 지방조직의 세포질 추출물을 db 및 야생형 마우스로부터 제조하였다. 웨스턴 블럿은 db 마우스로부터 제조된 추출물에서 16 kD 단백질의 증가된 수준을 나타내었다.
도 25는 OB 단백질이 인간 혈장 내에서 다양한 수준으로 순환한다는 것을 나타낸다. (A)는 인간 혈장의 웨스턴 블럿이다. 혈장 샘플은 6명의 여윈 지원자로부터 수득되었다. 면역침강반응 및 웨스턴 블럿팅으로 효모 내에서 발현된 재조합 146 아미노산 인간 단백질과 크기가 동일한 면역반응성 16 kD 단백질의 존재가 밝혀졌다. 6개의 샘플 각각에서 다양한 수준의 단백질이 나타났다. (B)는 인간 ob의 ELISA (효소 결합된 면역검정시험)를 나타낸 것이다. 미량역가 플레이트(microtiter plate)를 면역정제된 안티-인간 OB 항체로 피복시켰다. 기지량의 재조합 단백질을 플레이트에 가하고, 면역정제된 바이오티닐화 안티-ob 항체를 사용하여 검출하였다. 414 nm에서의 흡광도를 OB의 기지의 농도에 대비해서 도시하여 표준곡선을 수득하였다. 생성된 표준곡선은 이 시험이 1 ng/㎖ 또는 그 이상의 인간 OB 단백질을 검출할 수 있었음을 나타내었다. (C)는 인간 혈장 내에서 OB 단백질의 정량분석을 나타낸 것이다. ELISA 면역검정시험은 6명의 여윈 지원자로부터 수득한 100 λ의 혈장 및 패널 B에서 사용된 표준품을 사용하여 수행하였다. OB 단백질의 수준은 HP1에서 2 ng/㎖ 부터 HP6에서 15 ng/㎖ 까지의 범위인 것으로 나타났다. 이들 데이타는 패널 A에서의 웨스턴 블럿 데이타와 상관관계가 있었다.
도 26은 OB 단백질이 분자간 또는 분자내 디설파이드 결합을 형성하는 것을 나타낸다. (A)는 환원 및 비환원 조건 하에서의 웨스턴 블럿이다. 마우스 및 인간 혈장의 웨스턴 블럿은 샘플 완충액에 환원제를 첨가하거나 첨가하지 않고 반복 수행하였다. 샘플 완충액으로부터 β-머캅토에탄올을 생력하는 경우에, db 혈장으로부터의 면역침강물은 16 kD 및 32 kD의 겉보기 분자질량으로 이동한다. 완충액에 대한 β-머캅토에탄올의 첨가로 32 kD 부위의 소실이 유도된다 (도 24 참조). 이 결과는 마우스 단백질이 효모인 피치아 패스토리스 (Pichia pastoris) 내에서 발현되는 경우에 반복해서 나타난다. 이 경우에, 마우스 OB 단백질은 다이머의 위치로 이동한다. 환원조건 하에서, 정제된 재조합 마우스 단백질은 16 kD의 겉보기 분자량에 의해서 이동하는데, 이것은 32 kD 분자형태가 하나 또는 두개의 분자간 디설파이드 결합의 결과임을 시사하는 것이다. 생체내 및 피치아 패스토리스(Pichia pastoris) 내에서 발현된 인간 단백질은 환원 및 비환원 조건 하에서 16 kD의 분자질량으로 이동한다 (데이타는 제시되지 않음). (B)는 효모 내에서 발현된 인간 단백질이 분자내 디설파이드 결합을 함유함을 나타내는 것이다. 분비된 단백질은 일반적으로 피치아 패스토리스 (Pichia pastoris) 발현시스템 내에서 발현되는 경우에 그들의 정확한 입체배위를 나타낸다. 146 아미노산 성숙 인간 단백질은 피치아 패스토리스 (Pichia pastoris) 내에서 발현되고, 효모 배지로부터 IMAC 및 겔여과를 포함하는 2-단계 정제 프로토콜에 의해서 정제되었다. 정제된 재조합 단백질을 시아노겐 브로마이드 절단시키기 전 및 후에 질량분광분석하였다. 시아노겐 브로마이드는 메티오닌 잔기의 카복시 말단에서 절단시킨다. 재조합 효모 단백질의 분자질량은 16,024±3 Da (계산된 분자질량 = 16,024 Da)이었다. 시아노겐 브로마이드는 아미노산 75, 89 및 157에서 단백질 서열 내의 3개의 메티오닌 뒤에서 절단한다. 측정된 질량 8435.6 Da를 갖는 시아노겐 브로마이드 단편은 cys-117과 cys-167 사이에서 디설파이드 결합에 의해서 연결된 아미노산 90-157 및 158-167에 상응한다 (계산된 분자질량 = 8434.5 Da). N.D. = 검출되지 않음.
도 27은 생물활성 재조합 단백질의 제조를 도시한 것이다. 145 아미노산 성숙 마우스 OB 단백질에 상응하는 뉴클레오타이드 서열을 pET 15b 발현벡터 내에 클로닝시켰다. 이 pET 벡터는 클로닝된 서열의 상류에 폴리히스티딘 트랙트 (tract) (His-태그)를 삽입시킴으로써 고정화된 금속 친화성 크로마토그라피 (Immobilized Metal Affinity Chromatography; IMAC)를 사용한 효율적인 정제를 가능하게 한다. 재조합 세균 단백질은 우선 세균 용해시킨 후에 불용성 막 분획 내로 분배된시킨다. 막분획을 구아니듐 하이드로클로라이드를 사용하여 가용화시키고 IMAC 칼럼 상에 부하시켰다. 단백질은 나타낸 바와 같이 이미다졸의 농도를 증가시키면서 단계적으로 용출시켰다. 용출된 단백질을 후술한 바와 같이 재중첩시키고, 트롬빈으로 처리하여 His-태그를 제거하였다. 가용성 단백질의 최종 수율은 세균배양물 ㎖당, 45 ng이었다.
도 28은 OB 단백질의 생물학적 효과를 나타낸다. 시간의 경과에 따른 사료 섭취 (패널 A-C) 및 체중 (패널 D-F)을 나타내었다. 10마리의 동물의 그룹에는 OB 단백질을 5 mg/kg/일의 용량으로 매일 복강내 주사하거나 (까만 사각형), PBS를 매일 주사하거나 (까만 동그라미) 또는 처리를 하지 않았다 (까만 삼각형). 처리그룹에는 C57B1/6J ob/ob 마우스 (패널 A 및 D), C57B1/Ks db/db 마우스 (패널 B 및 E) 및 CBA/J+/+ 마우스 (패널 C 및 F)가 포함되었다. 마우스의 사료 섭취는 매일 측정하였으며, 체중은 지시된 바와 같이 3 내지 4일 간격으로 기록하였다. (그람 단위의 체중의 스케일은 야생형 마우스에 대비해서 ob 및 db 마우스의 경우에 상이하다.) 단백질을 투여한 ob 마우스의 사료 섭취는 첫번째 주사 후에 감소되었으며, 4일 후에는 허위 (sham) 주사그룹에서 나타나는 수준의 약 40% 수준으로 안정화되었다 (p< 0.001). 이들 동물의 체중은 평균 1.3 그람/일로 감소하였으며, 3주일 후에는 출발 체중의 약 60% 수준으로 안정화되었다 (p< .0001). 단백질의 효과는 db 마우스에서 입증할 수 없었다. CBA/J 마우스에서는 체중에 대한 작지만 명백한 효과가 2시점 빠른 시점에서 관찰되었다 (p< .02). 각각의 측정치의 표준오차는 바아 (bar)로 표시되며, 이들 결과의 통계학적 유의성은 표 1에 나타내었다.
도 29는 ob 마우스의 페어 급식 (fair feeding)의 결과를 나타낸다. (A) 4마리의 C57B1/6J ob/ob 마우스의 그룹에게는 재조합 단백질을 투여하는 ob 마우스의 그룹에 의해서 소비되는 것과 동등한 양의 사료를 공급하였다. 두가지 그룹 모두의 경우에 체중 손실은 5, 8 및 12일 이후에 계산하였다. 사료-제한된 마우스 (선을 그은 바아)는 단백질을 투여한 ob 마우스 (까만 바아) 보다 체중을 덜 손실하였다 (p< .02). 이 결과는 OB 단백질의 체중-감소 효과가 사료 섭취 및 에너지 소비 둘다에 영향을 미친 결과임을 시사한다. (B)는 처리된 ob 마우스의 사진이다. 두마리의 C57B1/6J ob/ob 마우스가 도시되어 있다. 좌측의 마우스는 PBS를 투여받았으며, 체중은 출발 체중이었던 65 그람이었다. 우측의 마우스는 재조합 OB 단백질을 매일 주사로 투여하였다. 이 동물의 출발 체중도 또한 65 그람이었으며, 단백질 처리 후에 체중은 38 그람이 되었다. (C)는 처리 및 비처리된 ob 마우스의 간을 나타낸 것이다. 여기에는 처리 및 비처리된 C57B1/6J ob/ob 마우스로부터 유래하는 간을 나타내었다. PBS를 투여한 마우스로부터 유래하는 간은 지방질 간의 육안적 외관을 가졌으며, 5.04 그람으로 평량되었다. 재조합 ob 단백질을 투여한 마우스로부터 유래한 간은 정상적인 외관을 가졌으며 2.23 그람으로 평량되었다.
도 30은 지방조직에 대한 ob의 동일계 (in situ) 하이브리드화를 나타낸 것이다. 센스 및 안티센스 ob RNA는 시험관내에서 Sp6 및 T7 폴리머라제 및 디곡시게닌을 사용하여 표지하였다. 표지된 RNAs를 8주령의 C57B1/Ks 마우스 (표지된 야생형) 및 C57B1/Ks db/db 마우스 (표지된 db)의 부고환 지방패드 (epididymal fat pad)로부터 유래하는 지방조직의 파라핀 포매된 절편에 하이브리드화되었다. 이 도면에서, 지질 소적은 세포 내에서 염색되지 않은 소포로 나타난다. 세포질은 세포 주위의 얇은 테두리이며, 세포막과 구별할 수 없다. 영역 내에서 모든 지방세포에 대한 하이브리드화는 단지 안티센스 프로브를 사용하여 단지 야생형 절편에서만 검출되었으며, 크게 증가된 수준은 db/db 동물로부터 유래하는 조직 절편에서 나타났다.
도 31은 OB RNA가 생체내 및 시험관내에서 지방세포에서 발현되는 것을 나타낸다. 몇가지 상이한 공급원으로부터 유래한 총 RNA (10 ㎍)를 전기영동시키고, 블럿팅시킨 다음, ob 프로브에 하이브리드화시켰다. 우선, 콜라게나제 분해시킨 후에 세포 부력에 있어서의 차이를 사용하여 지방세포를 정제하였다. OB RNA는 지방세포 분획 내에만 존재하였다. 레인 S는 스트로모바스큘라 (stromovascular) 분획을 나타내고, A는 지방세포 분획을 나타낸다. 또한, OB RNA는 비분화된 3T3-442 전지방세포 (preadipocyte) 세포 레인 U에서 발현되지 않았다. 이들 세포라인으로부터 유래하는 분화된 지방세포는 분명하게 검출가능한 수준의 OB mRNA를 발현하였다 (레인 D).
도 32는 OB RNA가 모든 지방조직 저장부 (depots) 내에서 발현됨을 나타낸다. 시험한 모든 지방조직 저장부는 ob RNA를 발현하였다. 비록 여기에서 상이한 실험에서는 시그날의 수준이 가변적이었지만, 서혜부 지방패드는 다소 더 낮은 RNA 수준을 발현하였다. (도 31A) 레인 (1) 부고환 (2) 서혜부 (3) 복부 (4) 자궁방결합조직 지방패드. 갈색 지방은 또한 낮은 수준의 OB RNA를 발현하였다. (도 31B) 갈색 지방 내에서 OB 발현의 수준은 일주일 동안 4℃에서 사육된 동울에서는 변화하지 않았지만, 저온 유도성인 것으로 알려져 있는 갈색 지방 특이적 UCP RNA의 풍부성은 5-배 증가하였다.
도 33은 db/db 및 금 티오글루코즈 처리된 마우스에서의 OB RNA의 발현을 도시한 것이다. 금 티오글루코즈 (GTG) 및 db/db 처리된 마우스의 자궁방결합조직 지방패드로부터 유래하는 총 RNA를 전기영동시키고, 노던 블럿팅시켰다. 단일 용량으로 투여된 GTG는 특이적 시상하부 병변을 유도함으로써 비만을 야기시키는 것으로 알려져 있다. (A)에서는 한달된 CBA 암컷 마우스를 GTG (.2 mg/g)로 처리하였으며, 대조동물 (< 5 g)에 비해서 처리된 동물에서 > 20 g의 증가를 일으켰다. (B)에서는 db/db 및 GTG 처리된 마우스로부터의 RNA에 대한 OB 프로브의 하이브리드화가 대조 RNA (액틴 또는 GAPDH)에 비해서 ob RNA의 풍부성에서 20-배의 증가를 나타내었다.
도 34는 인간 RNA의 노던 블럿분석을 나타낸다. 인간 지방조직 (FAT, 패널 A)으로부터 유래하는 10 mg의 총 RNA 및 다른 인간 조직 (패널 B)으로부터 유래하는 2 mg의 폴리A + RNA를 함유하는 노던 블럿을 지시된 바와 같이 인간 ob 또는 인간 β-액틴 프로브에 하이브리드화시켰다. 약 4.5 kb에서의 강한 시그날이 지방조직 총 RNA에 의해서 나타났다. 폴리A + RNA에 대한 하이브리드화는 심장 (HE) 및 태반 (PL)에서 검출가능한 시그날을 나타낸 반면에, OB RNA는 뇌 (BR), 폐 (LU), 간 (LI), 골격근 (SM), 신장 (KI) 및 췌장 (PA)에서 검출되지 않았다. 각각의 경우에, 자가방사기록 노출의 길이가 지시된다. 주목할 것은, 태반 RNA에서 관찰되는 저분자량 밴드의 발생 (예를들어, 대체 스플리싱, RNA 분해)은 알려져 있지 않다.
도 35는 인간 OB 유전자를 함유하는 YAC 콘티그 및 8개의 미소위성 마커(microsatellite marker)를 나타낸다. SEGMAP/버젼 3.29 [Green et al., PCR Methods Applic., 1:77-90 (1991)]에 의해서 유추되는 바와 같은 인간 OB 유전자를 함유하는 염색체 7의 부분의 YAC-기본 STS-함유 지도가 도시되어 있다. 19개의 독특하게 정리된 STSs (참조 표 3)는 상부를 따라서 열거하였다. 8개의 미소위성-특이적 STSs는 별표로 표시하였다 (참조 표 4). 또한, Pax4 및 OB 유전자에 상응하는 STSs 및 콘티그에 대한 중심절 (centromere; CEN) 및 7q 말단소립 (telomere; TEL)의 예상되는 위치도 나타내었다. 43개의 YAC 클론의 각각은 수평 바아로 나타내었으며, 그의 명칭은 좌측에 기재하고 추정된 YAC 크기 (펄스드-필드 겔 전기영동 (pulsed-field gel electrophoresis)에 의해서 kb로 측정됨)는 괄호 안에 제시하였다. YAC 내에 STS의 존재는 적절한 위치에서 검은 동그라미로 표시하였다. STS가 YAC의 삽입 말단에 상응하는 경우에는, 사각형을 상부를 따라서 (STS 명칭에 인접하여) 및 이것이 유도되는 YAC의 끝에서 모두, 상응하는 동그라미의 주위에 배치시킨다. 하부 (수평 대쉬 라인 아래)에서 5개의 YACs의 경우에는, (설정된 STS 순서를 기준으로하여) 존재하는 것으로 예상된 한개 또는 그 이상의 STS(s)가 검출되지 않았으며 (적어도 2회의 상응하는 STS-특이적 PCR 검정방법(들)에 의해서 개개 YACs를 시험함으로써 평가됨), 이들은 적절한 위치에서 흰 동그라미로 도시하였다. 대부분의 YACs는 인간-햄스터 하이브리드 세포-유도된 라이브러리로부터 분리되었으며 [Green et al., Genomics, 25:170-183 (1995)], 그들의 원래 명칭도 기재하였다. 나머지 YACs는 총 인간 지놈 라이브러리로부터 분리되었으며, 그들의 원래 라이브러리 위치는 표 3에 제시하였다. 박스 (box)는 FISH 분석에 의해서 7q31.3에 위치하는 것으로 확인된 3개의 YACs (yWSS691, yWSS999 및 yWSS2935)의 명칭 주위에 배치시켰다. 콘티그는 그의 "컴퓨터로 측정되지 않은 형태(uncomputed form)"에서 나타나며, 여기에서는 클론 오버랩 (overlap) 또는 STS 간격 (spacing)을 추정하기 위해서 YAC 크기를 사용하지 않으며, 따라서 모든 STSs는 등거리 방식으로 간격을 두었다. YAC 크기를 사용하여 인접한 STSs의 각각의 쌍 사이의 상대적 간격 및 클론 오버랩의 정도를 추정한 '컴퓨터로 측정된 형태'에서, 총 YAC 콘티그는 2 Mb에 걸쳐서 연장되는 것으로 보인다.
상세한 설명
본 발명은 포유동물 체중의 조절에 참여하는 능력을 나타내는 것으로 본 발명에서 ob 폴리펩타이드 또는 렙틴이라고 부르는 단백질, 및 그의 변성 변이체, 예를들어, 특정한 발현시스템 내에서 발현시키기 위한 최적 코돈을 통합시킨 것을 포함하는 단백질을 코드화한 핵산을 설명 및 발견하는데 관한 것이다. 본 발명의 목적하는 핵산은 체중 및 지방과다의 조절에 중요한 역할을 하는 것으로 가정되는 쥐 및 인간 OB 폴리펩타이드에 상응하는 코드화 서열을 나타낸다. 본 명세서에 제시된 데이타는, 본 발명의 핵산의 폴리펩타이드 생성물이 이것을 발현하는 세포에 의해서 분비되며, 폴리펩타이드는 호르몬으로서 작용하는 것을 시사한다. 추가의 실험데이타는 OB 폴리펩타이드가 ob 유전자의 돌연변이를 수반하는 마우스에서 비만증을 치료하는데 매우 효과적임을 입증한다. 또한, 큰 볼루스 (bolus) 용량 또는 중간 정도의 연속적 용량의 OB 폴리펩타이드는 정상 (야생형) 마우스에서 체중 감소를 일으킨다.
또한, 본 명세서의 실시예에서는 본 명세서에서 "렙틴"으로 대신하여 불리우는 OB 폴리펩타이드가 마우스, 랫트 및 인간 혈장 내에서 순환한다는 것을 입증한다. 렙틴은 ob/ob 마우스로부터 유래하는 혈장 내에는 존재하지 않으며, db/db 마우스로부터 유래하는 혈장 내에는 10-배 더 높은 농도로 존재하고, fa/fa 랫트 내에는 20-배 더 높은 농도로 존재한다. 가장 중요하게는, 재조합 렙틴을 매일 주사하는 것은 ob/ob 마우스의 체질량은 현저하게 감소시키고, 야생형 마우스의 체중에는 유의적인 영향을 미치며, db/db 마우스에 대해서는 영향을 미치지 않는다.
추가의 관점에서, 하나의 종으로부터 유래하는 OB 폴리펩타이드는 다른 종에서도 생물학적으로 활성이 있다. 특히, 인간 OB 폴리펩타이드는 마우스에서 활성이 있다.
본 발명의 주된 관점에서, 본 발명은 포유동물 체중의 변조물질로서 작용하는 물질을 확인하는데 관한 것이다. 특히, 본 발명은 마우스 및 인간 둘다에서 OB 유전자 또는 그의 코드화 부분에 상응하는 특정한 핵산, 및 이들 핵산에 의해서 발현된 상응하는 폴리펩타이드의 분리, 정제 및 서열분석에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 도 1A 내지 E (SEQ ID NO: 1) 및 도 2A 및 B (SEQ ID NO: 3)에 기술된 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산, 및 그의 변성 변이체, 대립유전자 및 단편 (이들은 모두 체중 및 지방과다를 변조시키는 활성을 갖는다)의 발견을 포함한다. OB 유전자에 대한 본 발명의 핵산의 대응성은 비만증, 및 체중의 비정상이 원인 요인인 그밖의 다른 질병 및 기능부전과 같은 상태에 대한 그들의 유의적인 영향을 예견하는 것이다. 본 발명은 본 발명의 핵산에 의해서 발현된 단백질, 및 특히 도 1A 내지 E (SEQ ID NO: 2), 도 3 (SEQ ID NO: 4), 도 5 (SEQ ID NO: 5) 및 도 6 (SEQ ID NO: 6)에 기술된 단백질 및 이들의 보존 변이체, 활성 단편 및 동족성 소분자에 까지 확대된다.
전술한 바와 같이, 체중조절 변조물질 펩타이드 또는 그들의 결합 파트너, 또는 이들과 유사하거나 이들에 대해 길항작용을 나타내거나 이들의 생산을 조절하는 그밖의 다른 리간드 또는 약제는 체중의 비정상적인 변동 또는 지방과다를 단독으로, 또는 암 또는 AIDS와 같은 나쁜 의학적 상태의 일부분으로서 일으킨 환자에게 이들을 치료하기 위해서 다양한 수단에 의해서 투여하기에 효과적인 농도로 적합한 캐리어와 함께 약제학적 조성물로 제조될 수 있다. 다양한 투여기술이 이용될 수 있으며, 이들 중에는 경구투여, 비내 또는 경점막 투여의 다른 형태, 피하, 정맥내 및 복강내 주사와 같은 비경구적 기술, 카테터삽입 등이 있다. 인식인자 또는 그들의 서브유니트 (subunits)의 평균적 양은 달라질 수 있으며, 특히 전문의 또는 수의사의 추천 및 처방에 따라서 이루어져야 한다.
상기한 바에 따라, 체중 변조물질의 활성을 모사하거나 길항하는데 효과적인 잠재적 약물을 선별하는 검정 시스템이 제조될 수 있다. 체중 변조물질을 시험 시스템 내에 도입시킬 수 있으며, 예상되는 약물도 또한 생성된 세포배양물 내로 도입시킬 수 있고, 그후에 배양물을 검사하여 예상되는 약물의 단독 첨가로 인하여, 또는 첨가된 양의 공지의 체중 변조물질의 효과로 인하여 세포의 활성에 어떤 변화가 있는지 여부를 관찰한다.
전술한 바와 같이, 본 발명에 기술된 OB 유전자의 분자 클로닝에 의해서 분자 수준에서 포유동물 체중을 변조시키는 작용을 하는 물질의 부류를 확인한다. 본 발명의 변조물질의 발견은 비만을 포함한 (단, 이들로 제한되는 것은 아니다) 영양적 질환, 암과 연관된 체중 손실의 진단 및 치료, 및 고혈압, 심장병 및 타입 II 당뇨병과 같이 비만증과 연관된 질환의 치료에 중요한 관련이 있다. 또한, 가축의 체중을 변조시키기를 원하는 사람이 있는 경우에 유전자 생성물에 대해서 잠재적인 농업적 용도도 있다. 마지막으로, 본 발명의 하나 또는 그 이상의 변조물질이 분비된 분자인 만큼, 이들은 발현 클로닝의 기술을 사용하여 이들의 수용체를 분리시키는데 생화학적으로 사용될 수 있다. OB 유전자를 구체적으로 참고로 한 이하의 설명은 본 발명의 일부분을 이루는 변조물질의 부류에 대한 일반적인 적용 가능성을 포함하며, 따라서 이러한 설명의 정도 및 범위에 따라 이루어진다.
상기 언급한 바와 같이, OB 폴리펩타이드의 작용적 활성은 유전자도입에 의해서 평가될 수 있다. 이러한 점에서 유전자도입 (transgenic) 마우스 모델이 사용될 수 있다. ob 유전자는 유전자도입 마우스를 사용한 상보성 시험(complementation study)에서 사용될 수 있다. 바이러스성 벡터를 포함한 유전자 도입 벡터, 또는 후보 유전자의 야생형 로커스 (locus)에 상응하는 코스미드 클론 (또는 파아지 클론)은 분리된 ob 유전자를 사용하여 작제될 수 있다. 코스미드는 공지된 방법 [Jaenisch, Science, 240:1468-1474 (1988)]을 사용하여 유전자도입 마우스에 도입될 수 있다. 작제물은 C57BL/6J ob/ob X DBA 이종교배 (intercross)의 F1 자손 사이의 이종교배로부터 유도된 수정란 내로 도입된다. 이들 교배는 F1 동물을 발생시키기 위해서 C57BL/6J ob/ob 난소 이식조직의 사용을 필요로 한다. DBA/2J 마우스는 난소 이식조직을 사용하는 경우에 중요한 노나고우티 코트 칼라(nonagouti coat color)를 갖기 때문에, 이들이 대비스트레인 (ocunterstrain)으로 사용된다. 코스미드 유전자도입 동물 내의 ob 로커스에서의 유전자형은 돌연변이에 인접하며 선조 스트레인들 사이에서 다형성인 긴밀하게 연결된 RELPs 또는 미소 위성을 사용하여 동물을 형별함으로써 결정될 수 있다. 상보성은 특정한 작제물이 유전적으로 비만인 F2 동물 (RFLP 분석에 의해서 점수를 매긴 것으로)이 마르고 비 당뇨병이 되도록 하는 경우에 입증될 수 있다. 이러한 상황하에서, 상보성의 최종적인 증명에는 도입유전자 (transgene)를 보유하는 ob/ob 또는 db/db 동물을 ob/ob 또는 db/db 난소 이식조직에 대해서 교배시키는 것이 필요하다. 이러한 교배시에, 도입유전자를 보유하지 않는 모든 N2 동물은 비만이며 인슐린 내성/당뇨병인 반면에, 도입유전자를 보유하는 동물은 마르고 혈장 내에서 정상적인 글루코즈 및 인슐린 농도를 가질 수 있다. 유전적 개념에서, 도입유전자는 억제자 돌연변이로 작용한다.
그 대신에, OB 유전자는 야생형 동물에서 안티센스 배향으로 발현되는 경우에 그들의 표현형적 효과를 검사함으로써 시험할 수 있다. 이러한 시도에서, 야생형 대립유전자의 발현은 억제되어 돌연변이체 표현형을 유도한다. RNA·RNA 듀플렉스 (duplex) 형성 (안티센스-센스)은 mRNA의 정상적인 취급을 방해하여 야생형 유전자 효과의 부분적이거나 완전한 제거를 야기시킨다. 기술은 조직배양 시에 TK 합성을 억제하고 드로소필라 (Drosophila) 내에서의 크루펠 (Kruppel) 돌연변이 및 마우스에서의 쉬베러 (Shiverer) 돌연변이의 표현형을 생성시키기 위해서 사용되어 왔다 [Izant et al., Cell, 36:1007-1015 (1984); Green et al., Annu. Rev. Biochem., 55:569-597 (1986); Katsuki., Science, 241:593-595 (1988)]. 이러한 시도의 중요한 잇점은 필요한 유전자의 단지 작은 부분만이 완전한 동족성 mRNA의 발현의 효과적인 억제를 위해서 발현된다는 점이다. 안티센스 도입유전자는 올바른 세포 타입에서 발현된 그 자신의 포르모터 또는 또 다른 프로모터의 조절 하에 위치하며, SV40 폴리A 부위의 상류에 위치한다. 이 도입유전자를 사용하여 유전자 도입 마우스를 생성시킬 수 있다. 유전자도입 마우스는 또한 ob 이형접합체가 안티센스 작제물의 효과에 더 민감한지 아닌지를 시험하기 위해서 난소 이식조직과 교배시킬 수도 있다.
장기적으로, OB 유전자 생성물 (OB 폴리펩타이드 또는 단백질)의 생화학적 기능의 설명은 그의 활성에 영향을 미치는 소분자 작용제 및 길항제를 확인하는데 유용하다.
본 명세서 전반에 걸쳐서 사용된 다양한 용어들은 본 명세서에서, 예를들어 이하에 기술된 정의를 갖는다.
용어 "체중 변조물질", "변조물질", "변조물질들" 및 구체적으로 열거되지 않는 모든 변형어는 본 명세서에서 상호교환하여 사용될 수 있으며, 본 출원 및 특허청구범위 전반에 걸쳐서 사용된 것으로서 하나의 경우에는 뉴클레오타이드, 및 단일 또는 다수의 단백질 둘다를 포함한 단백질성 물질 둘다를 의미한다. 더욱 구체적으로, 전술한 용어들은 본 명세서에 기술되고 도 1A 내지 E (SEQ ID NO:1) 및 도 2A 및 B (SEQ ID NO:3)에 제시된 서열을 갖는 DNA 및 뉴클레오타이드에 까지 확대된다. 마찬가지로, 본 명세서에 기술되고 도 1A 내지 E (SEQ ID NO:2) 및 도 3 (SEQ ID NO:4)에 제시된 아미노산 서열 데이타를 갖는 단백질도 본 명세서 및 특허청구범위에서 모든 물질에 관하여 기술된 활성의 프로필을 갖기 때문에 마찬가지로 고려된다. 따라서, 실질적으로 균질의 동족체 및 대립유전자 변이체를 포함하여 실질적으로 동등하거나 변형된 활성을 나타내는 뉴클레오타이드도 마찬가지로 포함된다. 마찬가지로, 예를들어 부위-지향된 돌연변이유발에 의해서 의도적으로 또는 변조물질을 생산하는 숙주 내에서의 돌연변이를 통해서 우연히 변형된 단백질을 포함하여 실질적으로 동등하거나 변형된 활성을 나타내는 단백질도 마찬가지로 포함된다.
"A" (여기에서, "A"는 단일 단백질, DNA 분자, 벡터, 재조합 숙주세포 등이다)를 함유하는 조성물은, 조성물 내의 적어도 약 75 중량%의 단백질, DNA, 벡터 (A 및 B가 속하는 종의 카테고리에 따라서)가 "A"인 경우에는 실질적으로 "B" (여기에서 "B"는 하나 또는 그 이상의 오염성 단백질, DNA 분자, 벡터 등이지만, A의 라세미 형태는 제외된다)를 함유하지 않는다. 바람직하게는, "A"는 조성물 내에 적어도 약 90 중량%의 A+B 종을 함유하며, 가장 바람직하게는 적어도 약 99 중량%를 함유한다. 또한, 실질적으로 오염물질을 함유하지 않는 조성물이 해당하는 종의 활성 또는 특징을 갖는 단일 분자량 종 만을 함유하는 것이 바람직하다.
OB 폴리펩타이드
천연적으로 존재하는 폴리펩타이드를 의미하는 용어 "단백질", 및 "폴리펩타이드"는 본 명세서에서 ob 유전자 생성물 및 그의 변이체와 관련하여 상호교환하여 사용된다. 용어 "성숙 단백질" 또는 "성숙 폴리펩타이드"는 특히 시그날 서열 (또는 융합단백질 파트너)이 제거된 OB 유전자 생성물을 의미한다.
상기 언급한 바와 같이, 특정의 구체예에서 본 발명의 ob 폴리펩타이드에는 본 명세서에 기술된 아미노산 서열, 예를들어 SEQ ID NOS: 2, 4, 5, 6 등을 갖는 것이 포함되며, 여기에는 보존적 아미노산 치환에 의해서 변형된 ob 폴리펩타이드 및 그의 생물학적으로 활성인 단편, 동족체 및 유도체가 포함된다. 본 발명에서 사용된 용어 "생물학적으로 활성"은 예를들어, 수용체, 항체 또는 그밖의 다른 인식분자에 대한 특이적 결합; 분자 수준에서 시그날 형질도입 경로의 활성화; 및/또는 생체내에서 천연 ob 폴리펩타이드에 의해서 매개된 생리적 효과의 유도 (또는 길항제에 의한 억제)를 포함한 (단 이들로 제한되는 것은 아니다) 폴리펩타이드의 특이적 효과를 의미하는 것이다. 단편, 동족체 및 유도체를 포함한 OB 폴리펩타이드는 합성적으로, 예를들어 고체상 또는 용액상 펩타이드 합성의 잘 알려진 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 바람직하게는, 고체상 합성기술이 이용된다. 대체방법으로, 본 발명의 OB 폴리펩타이드는 이하에 기술한 바와 같이 잘 알려진 유전자조작 기술을 사용하여 제조될 수도 있다. 또 다른 구체예에서, OB 폴리펩타이드는 더욱 바람직하게는 OB 수용체에서의 돌연변이 또는 "지방질"에 상응하는 돌연변이에 관련된 비만증를 일으킨 비만인 사람과 같이 폴리펩타이드를 과발현한 피검자로부터 유래하는, 혈장, 혈청 또는 뇨, 바람직하게는 인간 혈장, 혈청 또는 뇨와 같은 (단, 이들로 제한되는 것은 아니다) 생물학적 유체로부터 예를들어, 면역친화성 정제에 의해서 정제될 수 있다.
OB 폴리펩타이드의 단편
특정한 구체예에서, 본 발명은 OB 폴리펩타이드의 천연적으로 존재하는 단편이 중요할 수 있는 것으로 상각한다. 펩타이드 서열은 빈번하게 단백분해적 절단에 대한 표적이 되는 다수의 부위, 예를들어 아르기닌 잔기를 포함한다. 전체 길이 폴리펩타이드는 하나 또는 그 이상의 이러한 부위에서 절단되어 생물학적으로 활성인 단편을 형성시킬 수도 있는 가능성이 있다. 이러한 생물학적으로 활성인 단편은 OB 폴리펩타이드의 작용적 활성에 대해 작용적이거나 길항적으로 작용하여 체중을 감소시킬 수 있다.
OB 폴리펩타이드의 동족체
본 발명은 특히, 예를들어 OB 수용체와 같은 ob 펩타이드의 특이적 결합 파트너에 결합하는 OB 폴리펩타이드의 생물학적 활성을 나타낼 수 있다는 특징을 갖는 OB 펩타이드의 동족체의 제조를 포함한다. 한가지 구체예에서, 동족체는 OB 활성에 대해 작용적이며, 즉 이것은 ob 펩타이드와 유사하게 작용한다. 바람직하게는, OB 작용제가 천연 단백질 보다 더 효과적이다. 예를들어, OB 작용제 동족체는 더 큰 친화성을 가지고 OB 수용체에 결합할 수 있거나, 또는 생체내에서 더 긴 반감기를 나타낼 수 있거나, 또는 둘다를 나타낼 수 있다. 그럼에도 불구하고, 천연 단백질 보다 덜 효과적인 OB 작용제 동족체도 또한 포함된다. 또 다른 구체예에서, 동족체는 OB 활성에 대해 길항작용을 한다. 예를들어, OB 수용체에 결합하지만 시그날 형질도입을 유도하지 않는 OB 동족체는 수용체에 대한 천연 OB의 결합을 경쟁적으로 억제하여 생체내에서 OB 활성을 저하시킬 수 있다. 이러한 OB 길항제 동족체도 또한 ob 펩타이드와는 상이한 특성, 예를들어, 생체내에서 더 긴 (또는 더 짧은) 반감기, OB 수용체에 대한 더 큰 (또는 더 작은) 결합친화성, 또는 둘다를 나타낼 수 있다.
한가지 구체예에서, OB 펩타이드의 동족체는 구조 또는 작용에 필수적이 아닌 폴리펩타이드 상의 위치에 존재하는 아미노산을 치환시킴으로써 변형된 OB 펩타이드이다. 예를들어, 인간의 OB 펩타이드는 마우스에서 생물학적으로 활성인 것으로 공지되어 있기 때문에, 쥐의 아미노산 서열과 비교하여 인간 서열에 있어서 분기된 아미노산 잔기의 치환도 마찬가지로 OB 펩타이드의 유용한 동족체를 수득할 수 있다. 예를들어, 인간으로부터 위치 53 또는 위치 98 또는 두가지 위치 모두 (도 4에 도시된 미처리된 펩타이드 서열에서)에 존재하는 세린 잔기는 예를들어 글리신, 알라닌, 발린, 시스테인, 메티오닌 또는 트레오닌에 의해 치환될 수 있다. 유사하게, 위치 번호 92 (도 4)에 존재하는 아르기닌 잔기는 예를들어 아스파라긴, 라이신, 히스티딘, 글루타민, 글루탐산, 아스파르틴산, 세린, 트레오닌, 메티오닌 또는 시스테인으로 치환될 수 있다. 계속해서 도 4를 참고로 하여, 치환시킬 수 있는 것으로 보이는 인간 OB 펩타이드 내의 다른 아미노산은 위치 118의 히스티딘, 위치 121의 트리프토판, 위치 122의 알라닌, 위치 126의 글루탐산, 위치 127의 트레오닌, 위치 128의 로이신, 위치 132의 글리신, 위치 139의 글리신, 위치 159의 트리프토판, 및 위치 166의 글리신이다. 또 다른 구체예에서는 잔기 121 내지 128 (도 4에 도시된 바와 같이) 중의 하나 또는 그 이상을 예를들어, 글리신 또는 알라닌으로 치환시킬 수도 있거나, 위치 123으로 세린 또는 위치 125에서 로이신을 제외하고는 잔기 중의 일부를 치환시킬 수도 있다.
또 다른 구체예에서 OB 폴리펩타이드의 동족체, 바람직하게는 인간 OB 폴리펩타이드는 폴리펩타이드의 절단된 형태이다. 예를들어, 잔기 49의 글루타민은 필수적인 것이 아니며, 펩타이드로부터 결실될 수 있는 것으로 이미 입증되었다. 유사하게, 위치 121-128에서 분기된 아미노산 잔기의 전부 또는 일부를 결실시키는 것이 가능할 수도 있다. 또한, 본 발명은 생물학적 활성에 필요한 최소의 아미노산 서열을 갖는 OB 동족체를 제공하는 것을 포함한다. 이것은 예를들어, OB-특이적 항체에 결합하거나, 천연 OB 폴리펩타이드의 활성을 억제하거나, 또는 천연 OB 펩타이드의 활성에 작용하는 능력에 대한 OB의 단편의 활성을 시험함으로써 용이하게 결정될 수 있다. 한가지 구체예에서, 본 발명은 (도 4에 도시된 바와 같이) 시스테인 잔기 117과 167 사이에서 형성되는 디설파이드 결합에 의해서 형성된 루프(loop) 구조로 구성된 절단된 OB 폴리펩타이드를 제공한다. 또 다른 구체예에서, 절단된 동족체는 잔기 22 (추정상의 시그날 펩타이드 절단부위 다음에 위치함) 부터 53 (제한된 단백분해에 이어서 OB 폴리펩타이드의 질량분광분석을 수행함으로써 검출된 가요성 루프 부분 바로 앞의 아미노산 잔기; 참조 Cohen et al., Protein Science, 4:1088 (1995)) 까지의 아미노산에 상응한다. 또 다른 구체예에서, 절단된 동족체는 잔기 61 (OB 폴리펩타이드의 제한된 단백분해/질량분광분석에 의해서 검출된 것으로서 가요성 루프 부분 바로 다음의 잔기) 부터 아미노산 잔기 116 (첫번째 시스테인 잔기 바로 앞의 잔기) 까지의 아미노산에 상응한다. 또 다른 구체예에서, 절단된 동족체는 잔기 61 부터 아미노산 잔기 167 까지의 아미노산에 상응한다.
더구나, 잔기번호 54 내지 60에서의 추정상의 가요성 루프의 잔기 중의 하나 또는 그 이상이 치환된다. 예를들어, 가요성 루프 구조가 단백질의 유도체화에 바람직한 부위이기 때문에 하나 또는 그 이상의 잔기는 예를들어, 폴리머에 대한 교차결합을 위해서 라이신, 글루탐산, 또는 시스테인 (바람직하게는 라이신)으로 치환될 수 있다. 대용으로, 가요성 루프 위치에서의 잔기는 단백분해에 대해서 더 내성이지만, 가요성 구조는 보유하는 아미노산 잔기, 예를들어 하나 또는 그 이상의 프롤린에 의해서 치환될 수도 있다. 또 다른 구체예에서는, 단백질을 분해, 예를들어 단백분해에 대해 더 내성이 되도록 만들기 위해서 더 유도체화될 수 있는 아미노산에 의한 치환도 포함된다.
전술한 단편의 크기는 대략적인 것이고, 제시된 절단된 동족체의 각각의 말단 또는 양 말단으로부터, 또는 폴리펩타이드 또는 그의 단편의 내부로부터, 한개 내지 약 5개의 아미노산이 포함되거나 결실될 수 있지만, 단 디설파이드 결합된 루프 동족체에서 시스테인 잔기는 반드시 유지되어야 한다는 것은 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 인식될 수 있다.
쥐의 OB 펩타이드는 50% α-나선 함유물을 함유하며, 인간 OB 폴리펩타이드는 대략적인 생리적 조건하에서 재조합 펩타이드의 환상 이색성 (circular dichroism)에 의해 검출되는 것으로서 약 60% α-나선 함유물을 함유하는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 또 다른 구체예에서 아미노산 잔기는 α-나선 구조를 형성시키거나, 더 안정한 α-나선 구조를 형성시키는 증가된 경향을 나타내는 OB 폴리펩타이드의 동족체를 형성시키는 잔기에 의해서 치환될 수 있다. 예를들어, Glu, Ala, Leu, His, Trp가 천연 OB 폴리펩타이드 내에 존재하는 아미노산 잔기에 대한 치환체로서 도입되는 경우에 α-나선 구조가 바람직할 수 있다. 바람직하게는, 보존적 아미노산 치환, 예를들어 잔기(들) 29, 30, 44, 61, 76, 100 및/또는 106 (도 4에 도시된 바와 같음)에서 아스파르틴산을 글루탐산(들) (Glu)으로 치환시키고; 이소로이신(들)을 로이신으로 치환시키고; 글리신 또는 발린 또는 분기된 아미노산을 알라닌으로 (예를들어, 인간 OB 폴리펩타이드의 위치 53에서 세린을 알라닌으로) 치환시키고; 아르기닌 또는 라이신을 히스티딘으로 치환시키고; 티로신 및/또는 페닐알라닌을 트리프토판으로 치환시키는 것이 이용된다. α-나선 구조의 정도, 또는 더욱 중요하게는 안정성을 증가시킴으로써 더 큰 활성, 증가된 결합친화성 또는 더 긴 반감기를 갖는 OB 동족체를 수득할 수 있다. 특이적 구체예에서, 아미노산 잔기 22 내지 53에 상응하는 OB 펩타이드의 부분의 나선 형성 잠재성은 증가된다. 또 다른 구체예에서는, 아미노산 잔기 61-116의 나선-형성 잠재성 또는 안정성이 증가된다. 또 다른 구체예에서, 아미노산 117 내지 167에 상응하는 디설파이드 루프 구조의 나선 형성 잠재성도 증가된다. 또한, 전술한 영역의 하나 이상에서 증진된 α-나선 잠재성 또는 안정성을 함유하는 OB 동족체도 포함된다. 추가의 구체예에서는, 안정한 구조를 결핍시키는 폴리펩타이드 단편의 더 큰 경향을 보상하는 구조-형성, 예를들어 나선-형성 아미노산 잔기를 통합시킨 절단된 OB 폴리펩타이드 동족체가 생성된다.
단편과 같은 동족체는 예를들어, 체중 변조제인 펩타이드 물질의 펩신 분해에 의해서 생산될 수 있다. 뮤테인과 같은 다른 동족체는 체중 변조제인 펩타이드 코드화 서열의 표준 부위-지시된 돌연변이유발에 의해서 생산될 수 있다. 소분자와 같이 "체중 변조활성"을 나타내는 동족체는 촉진제로서 작용하든 억제제로서 작용하든지 공지된 생체내 및/또는 시험관내 검정시험에 의해서 확인될 수 있다.
OB 폴리펩타이드의 소분자 동족체 및 펩타이드유사체 (peptidomimetics)
ob 폴리펩타이드, 바람직하게는 인간 OB 폴리펩타이드의 구조는 본 기술분야에서 공지된 다양한 방법에 의해서 분석될 수 있다. 단백질 서열은 친수성 분석에 의해서 특정화될 수 있다 [예를들어, Hopp et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:3824 (1981)]. 친수성 프로필을 사용하여 중첩된 (folded) 폴리펩타이드의 내부에 매몰된 부분을 지시할 수 있는 OB 폴리펩타이드의 소수성 및 친수성 부분, 및 폴리펩타이드의 외부 상에서 접근하기 쉬운 부분을 확인할 수 있다. 추가로, 이차 구조 분석 [예를들어, Chou et al., Biochem., 13:222 (1974)]을 또한 수행하여 특이적 이차구조를 나타내는 OB 폴리펩타이드의 부분을 확인할 수도 있다. 이차구조 예상을 포함한 예견되거나 결정된 구조의 조작은 본 기술분야에서 이용할 수 있는 컴퓨터 소프트웨어 프로그램을 사용하여 성취할 수 있다.
제조합 OB 폴리펩타이드의 풍부한 공급원을 제공함으로써 본 발명에서는 폴리펩타이드의 정량적인 구조결정이 가능하다. 특히, 핵자기공명 (NMR), 적외선 (IR), 라만 (Raman) 및 자외선 (UV), 특히 환상 이색성 (CD), 분광학적 분석을 위해서 충분한 물질이 제공된다. 특히, NMR은 그들의 천연환경에 더욱 근접하게 비슷한 해당하는 분자의 매우 강력한 구조분석을 제공한다 [Marion et al., Biochim. Biophys. Res. Comm., 113:967-974 (1983); Bar et al., J. Magn. Reson., 65:355-360 (1985); Kimura et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:1681-1685 (1980)]. 구조분석의 다른 방법이 또한 사용될 수도 있다. 이들에는 X-선 결정학이 포함되나 이것으로 제한되지는 않는다 [Engstom, Biochem. Exp. Biol., 11:7-13 (1974)].
추가의 구체예에서, OB 폴리펩타이드의 동족체는 이것이 천연 OB 폴리펩타이드 또는 그의 특이적 단편에 대해 특이적인 항체와 교차반응하는지 여부를 결정하기 위해서 시험할 수 있다. 교차-반응성의 정도는 단백질의 구조적 상동성 또는 유사성에 대한 정보, 또는 단편-특이적 항체를 생성시키기 위해서 사용된 폴리펩타이드의 일부분에 상응하는 부분의 입수용이성에 대한 정보를 제공한다.
OB 동족체에 대한 선별
폴리펩타이드의 동족체에 대한 선별을 위한 다양한 선별기술이 본 기술분야에서 공지되어 있다. 화학물질의 다양한 라이브러리를 이용할 수 있다. 따라서, 본 발명은 OB 폴리펩타이드의 동족체에 대한 이러한 라이브러리, 예를들어 이하에 더 상세히 기술하는 바와 같이 수년간의 연구에 의해서 생성된 합성 화합물의 라이브러리, 천연 화합물의 라이브러리 및 조합된 라이브러리를 선별하는 것을 포함한다. 한가지 구체예에서, 본 발명은 안티-OB 폴리펩타이드 항체, 바람직하게는 안티-인간 ob 폴리펩타이드 항체에 결합하는 화합물에 대한 이러한 라이브러리를 선별하는 것을 포함한다. 또 다른 관점에서, 일단 OB 수용체가 확인되면 (이하 참조), 본 기술분야에서 공지된 어떠한 선별기술이라도 OB 수용체 작용제 또는 길항제를 선별하는데 사용될 수 있다. 본 발명은 소분자 리간드 또는 리간드 동족체 및 유사체에 대한 선별, 및 생체내에서 OB 수용체에 결합하여 이 수용체에 작용하거나 길항하여 활성화시키는 천연 리간드에 대한 선별을 포함한다.
수용체의 일차 서열 및 그 서열과 공지의 기능을 갖는 단백질과의 유사성에 대한 지식은 단백질의 작용제 또는 길항제에 대한 초기의 단서를 제공할 수 있다. 길항제의 확인 및 선별은 예를들어, X-선 결정학, 중성자 회절, 핵자기공명 분광학 및 구조결정을 위한 그밖의 다른 기술을 사용하여 단백질의 구조적 특징을 결정함으로써 더 용이하게 된다. 이들 기술은 작용제 및 길항제의 합리적 디자인 또는 확인을 제공한다.
또 다른 접근방법은 재조합 박테리오파아지를 사용하여 큰 라이브러리를 생성시키는 것이다. "파아지 방법 (phage method)" [Scott et al., Science, 249:386-390 (1990); Cwirla et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6378-6382 (1990); Devlin et al., Science, 249:404-406 (1990)]을 사용하여 매우 큰 라이브러리를 작제할 수 있다 (106-108 화학적 물질). 두번째 접근방법에서는 주로 화학적 방법이 사용되는데 그의 예로는 가이센 (Geysen) 방법 [Geysen et al., Molecular Immunology, 23:709-715 (1986); Geysen et al., J. Immunologic Method, 102:259-274 (1987)] 및 포더 (Foder) 등의 최근의 방법 [Foder et al., Science, 251:767-773 (1991)]이 있다. 또한, 문헌 [Furka et al., 14th International Congress of Biochemistry, Volume 5, Abstract FR:013 (1988); Furka, Int. J. Peptide Protein Res., 37:487-493 (1991); Houghton, 미합중국특허 제 4,631,211 호 (1986. 12월에 특허됨); 및 Rutter et al., 미합중국특허 제 5,010,175 호 (1991. 4. 23에 특허됨)]에는 작용제 또는 길항제로서 시험할 수 있는 펩타이드의 혼합물을 생성시키는 방법이 기술되어 있다.
또 다른 관점에서, 합성 라이브러리 [Needels et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:10700-10704 (1993); Lam et al., 국제특허공보 WO 92/00252, 이들은 그들 각각의 내용이 본 명세서에 참고로 포함되어 있다)] 등을 사용하여 본 발명에 따르는 OB 수용체 리간드를 선별할 수 있다. 이러한 라이브러리에 의해, OB 수용체를 실제로 클로닝하지 않으면서 수용체를 발현하는 세포를 사용하여 수용체 길항제를 검출할 수 있다.
대용으로, OB 수용체 리간드 결합영역의 재조합 형태를 발현하는 세포에 대한 가용성 리간드의 결합에 대한 시험이 수행될 수 있다. 가용성 리간드는 재조합 또는 합성 OB 폴리펩타이드로서 용이하게 제공될 수 있다.
선별방법은 OB 수용체를 발현하는 재조합 세포에 의해서, 또는 대용으로 상술한 바와 같이 , 예를들어 재조합적으로 생산된 정제된 수용체 단백질을 사용하여 수행될 수 있다. 예를들어, 분자의 리간드-결합부분을 포함하는 표지된 가용성이거나 가용화된 OB 수용체의 리간드를 결합시키는 능력을 사용하여 전술한 문헌에 기술된 바와 같이 라이브러리를 선별할 수 있다.
OB 폴리펩타이드의 유도체
일반적으로, 본 발명의 단백질 (여기에서, 용어 "단백질"은 달리 지시되지 않는 한 "폴리펩타이드"를 포함하는 의미로 사용된다)은 단백질 부위에 하나 또는 그 이상의 화학적 부위를 부착시킴으로써 유도체화될 수 있다. 화학적으로 변형된 유도체는 동맥내, 복강내, 근육내, 피하, 정맥내, 경구, 비내, 직장, 구강, 설하, 폐, 국소, 경피 투여 또는 다른 경로의 투여를 위해서 더 제제화될 수 있다. 생물학적 활성 단백질의 화학적 변형은 치료학적 단백질의 안정성 및 순환시간을 상승시키고 면역원성을 저하시키는 것과 같은 특정한 환경하에서 추가의 잇점을 제공하는 것으로 확인되었다. [참조: 미합중국특허 제 4,179,337 호 (Davis et al., 1979. 12. 18에 특허됨; 검토를 위한 참조: Abuchowski et al., "Soluble Polymer-Enzyme Adducts", in Enzymes as Drugs, pp. 367-383, Holcenberg and Roberts, eds., Wiley-Interscience, New York, NY (1981)] 단백질 변형 및 융합단백질을 기술하는 검토용 문헌도 있다 [Francis, Focus on Growth Factors, 3:4-10 (1992)].
유도체화를 위한 화학적 부위
유도체화를 위해 적합한 화학적 부위는 수용성 폴리머 중에서 선택될 수 있다. 선택된 폴리머는 이것이 부착되는 단백질이 생리적 환경과 같은 수성 환경에서 침전하지 않도록 수용성이어야 한다. 바람직하게는, 최종생성물 제제의 치료학적 용도를 위해서 폴리머는 약제학적으로 허용되어야 한다. 본 기술분야에서 숙련된 전문가는 폴리머/단백질 컨쥬게이트가 치료학적으로 사용될 지 여부, 및 그렇다면 목적하는 용량, 순환시간, 단백분해에 대한 내성, 및 그밖의 다른 고려사항과 같은 고려사항을 기초로 하여 목적하는 폴리머를 선택할 수 있다. 본 발명의 단백질 및 펩타이드의 경우에, 이들은 본 명세서에서 제시된 시험방법을 사용하여 확인될 수 있다.
폴리머 분자
수용성 폴리머는 예를들어 폴리에틸렌 글리콜, 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 코폴리머, 카복시메틸셀룰로즈, 덱스트란, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-디옥솔란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/무수 말레산 코폴리머, 폴리아미노산 (호모폴리머 또는 랜덤 코폴리머), 및 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 호모폴리머, 폴리프로필렌 옥사이드/에틸렌 옥사이드 코폴리머, 폴리옥시에틸화 폴리올 및 폴리비닐 알콜로 구성된 그룹으로부터 선택될 수 있다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드는 물 중에서의 그의 안정성으로 인해서 제조시에 잇점을 제공할 수 있다.
폴리머는 어떤 분자량의 것이라도 될 수 있으며, 분지되거나 분지되지 않을 수 있다. 폴리에틸렌 글리콜의 경우에 바람직한 분자량은 취급 및 제조의 용이성을 위해서 약 2 kDa 내지 약 100 kDa이다 (여기에서, 용어 "약"은 폴리에틸렌 글리콜의 제조시에 일부의 분자는 언급된 분자량 보다 크거나 다소 작을 수 있음을 시사하는 것이다). 목적하는 치료학적 프로필 (예를들어, 목적하는 서방성의 기간, 있다면 생물학적 활성에 대한 영향, 취급의 용이성, 항원성의 정도 또는 결여, 및 치료학적 단백질 또는 동족체에 대한 폴리에틸렌 글리콜의 그밖의 다른 공지의 효과)에 따라서 그밖의 다른 크기가 사용될 수도 있다.
폴리머/단백질 비
이렇게 부착된 폴리머 분자의 수는 다양할 수 있으며, 본 기술분야에서 숙련된 전문가는 기능에 대한 영향을 확인할 수 있다. 이것은 모노-유도체화시킬 수 있거나, 동일하거나 상이한 화학적 부위 (예를들어, 다양한 중량의 폴리에틸렌 글리콜과 같은 폴리머)를 갖는 디-, 트리-, 테트라-유도체화 또는 유도체화의 몇가지 조합이 제공될 수도 있다. 단백질 (또는 펩타이드) 분자에 대한 폴리머 분자의 비율은 반응혼합물 중에서의 그들의 농도와 마찬가지로 달라질 수 있다. 일반적으로, (과잉의 미반응 단백질 또는 폴리머가 존재하지 않는 반응의 효율의 면에서) 최적의 비는 목적하는 유도체화의 정도 (예를들어, 모노, 디-, 트리- 등), 선택된 폴리머의 분자량, 폴리머가 분지되었는지 분지되지 않았는지 여부, 및 반응조건과 같은 인자들에 의해서 결정될 수 있다.
단백질에 대한 화학적 부위의 부착
폴리에틸렌 글리콜 분자 (또는 다른 화학적 부위)는 단백질의 작용성 또는 항원성 영역에 대한 영향을 고려하여 단백질에 부착되어야 한다. 본 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 이용할 수 있는 다수의 부착방법 (예를들어, 본 명세서에 참고로 포함된 EP 0 401 384 (G-CSF에 대한 PEG의 커플링))이 있다 [참조: Malik et al., Exp. Hematol., 20:1028-1035 (1992) (트레실 클로라이드를 사용한 GM-CSF의 페질화 (pegylation)를 보고함)]. 예를들어, 폴리에틸렌 글리콜은 유리 아미노 또는 카복실 그룹과 같은 반응성 그룹에 의해서 아미노산 잔기를 통해 공유적으로 결합될 수 있다. 반응성 그룹은 활성화된 폴리에틸렌 글리콜 분자가 결합될 수 있는 것이다. 유리 아미노 그룹을 갖는 아미노산 잔기는 라이신 잔기 및 N-말단 아미노산 잔기를 포함할 수 있으며, 유리 카복실 그룹을 갖는 것에는 아스파르틴산 잔기, 글루탐산 잔기 및 C-말단 아미노산 잔기가 포함될 수 있다. 설프히드릴 그룹이 또한, 폴리에틸렌 글리콜 분자(들)을 부착시키기 위한 반응성 그룹으로 사용될 수도 있다. 치료학적 목적에 바람직한 것은 N-말단 또는 라이신 그룹에서의 부착과 같은 아미노 그룹에서의 부착이다. 수용체 결합이 필요한 경우에는 수용체 결합에 중요한 잔기에서의 부착은 피해야 한다.
N-말단에서 화학적으로 변형된 단백질
구체적으로, N-말단에서 화학적으로 변형된 단백질을 필요로 할 수 있다. 본 발명의 조성물의 예로 폴리에틸렌 글리콜을 사용하는 경우에, 이것은 다양한 폴리에틸렌 글리콜 분자 (분자량, 분지도 등에 의해서), 반응혼합물 중의 단백질 (또는 펩타이드) 분자에 대한 폴리에틸렌 글리콜 분자의 비율, 수행되는 페질화 반응의 형태, 및 선택된 N-말단에서 페질화된 단백질을 수득하는 방법으로부터 선택할 수 있다. N-말단에서 페질화된 제제를 수득하는 (즉, 필요에 따라, 이 부위를 다른 모노페질화된 부위로부터 분리시키는) 방법은 페질화된 단백질 분자의 집단으로부터 N-말단에서 페질화된 물질을 정제시킴으로써 이루어질 수 있다. 선택적인 N-말단 화학적 변형은 특정한 단백질에서의 유도체화를 위해서 이용할 수 있는 다양한 형태의 일급 아미노 그룹 (라이신 대 N-말단)의 상이한 반응성을 이용하는 환원적 알킬화 반응에 의해서 수행될 수 있다. 적절한 반응조건 하에서, 카보닐 그룹을 함유하는 폴리머에 의한 N-말단에서 단백질의 실질적으로 선택적인 유도체화가 이루어진다. 예를들어, 라이신 잔기의 ε-아미노 그룹과 단백질의 N-말단 잔기의 α-아미노 그룹 사이의 pKa 차이를 이용할 수 있는 pH에서 반응을 수행함으로써 단백질을 선택적으로 N-말단에서 페질화시킬 수 있다. 이러한 선택적 유도체화에 의해서 단백질에 대한 수용성 폴리머의 부착이 조절되며; 폴리머와의 컨쥬게이션은 주로 단백질의 N-말단에서 일어나고, 라이신 측쇄 아미노 그룹과 같은 다른 반응성 그룹의 유의적인 변화는 일어나지 않는다. 환원적 알킬화를 이용함으로써, 수용성 폴리머는 상술한 형태를 가질 수 있으며, 단백질에 커플링시키기 위한 단일의 반응성 알데히드를 가져야 한다. 단일의 반응성 알데히드를 함유하는 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드가 사용될 수 있다.
OB 폴리펩타이드와 연관된 핵산
상술한 바와 같이, 본 발명은 ob 폴리펩타이드를 코드화한 핵산, 및 OB 유전자에 대한 연관된 지놈 비-코드화 서열 5', 3' 및 인트론에 관한 것이다. 즉, 본 발명에 따르면 본 기술분야에서 통상적인 분자생물학, 미생물학 및 재조합 DNA 기술이 사용될 수 있다. 이러한 기술은 문헌에 상세히 설명되어 있다 [참조예: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989); Glover ed., DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II, MRL Press, Ltd., Oxford, U.K. (1985); Gait ed., Oligonucleotide Synthesis, Oxford University Press (1984); Hames et al., eds., Nucleic Acid Hybridization, Springer-Verlag (1985); Hames et al., eds., Transcription And Translation, Oxford University Press (1984); Freshney ed., Animal Cell Culture, Oxford University Press (1986); Immobilized Cells And Enzymes, IRL Press (1986); Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning, Wiley, New York (1984)]. 본 발명에 특히 적합한 것은 잘 알려져 있는 폴리머라제 연쇄반응 (PCR) 기술을 기본으로하여 운전자 또는 핵산을 분리, 클로닝, 서열분석, 분석 및 특정화하는 방법이다.
"레플리콘 (replicon)"은 생체내에서 DNA 복제의 자율적 유니트로서 작용하는, 즉 그 자신의 조절하에서 복재할 수 있는 유전자 요소 (예를들어, 플라스미드, 염색체, 바이러스)이다.
"벡터"는 부착된 절편의 복제를 일으키도록 또 다른 DNA 절편이 부착될 수 있는 플라스미드, 파아지 또는 코스미드와 같은 레플리콘이다.
"카셋트 (cassette)"는 특이적 제한부위에서 벡터 내로 삽입될 수 있는 DNA의 절편을 의미한다. DNA의 절편은 목적하는 폴리펩타이드를 코드화하며, 카셋트 및 제한부위는 전사 및 해독을 위한 적절한 판독프레임 내에 카세트의 삽입이 보장되도록 디자인된다.
"이종 (heterologous)" DNA는 세포 내에, 또는 세포의 염색체 부위 내에 천연적으로 위치하지 않는 DNA를 의미한다. 바람직하게는, 이종 DNA는 세포에 대한 외래 유전자를 포함한다.
외인성 또는 이종 DNA가 세포 내부에 도입되는 경우에, 세포는 이러한 DNA에 의해서 "형질감염"된 것이다. 형질감염된 DNA가 표현형적 변화를 일으킨 경우에, 세포는 외인성 또는 이종 DNA에 의해서 "형질전환"된 것이다. 바람직하게는, 형질전환 DNA는 염색체 DNA 내로 통합 (공유적으로 결합)되어 세포의 지놈을 구성하여야 한다.
"클론 (clone)"은 유사분열에 의해서 단일 세포 또는 공통 선조로부터 유도된 세포의 집단이다.
"핵산 분자"는 단일-스트랜드 형태이거나 이중-스트랜드 나선 형태에서 리보뉴클레오사이드 (아데노신, 구아노신, 유리딘 또는 시티딘; "RNA 분자") 또는 데옥시리보뉴클레오사이드 (데옥시아데노신, 데옥시구아노신, 데옥시티미딘 또는 데옥시시티딘; "DNA 분자")의 포스페이트 에스테르 폴리머 형태를 의미한다. 이중-스트랜드 DNA-DNA, DNA-RNA 및 RNA-RNA 나선이 있을 수 있다. 용어 핵산 분자, 특히 DNA 또는 RNA 분자는 단지 분자의 일차 및 이차 구조를 의미하며, 이것을 특별한 삼차 또는 사차 형태로 제한하는 것은 아니다. 따라서, 이 용어는 특히 선형 또는 원형 DNA 분자 (예를들어, 제한단편), 플라스미드 및 염색체 내에서 발견되는 이중-스트랜드 DNA를 포함한다. 특별한 이중-스트랜드 DNA 분자의 구조를 설명함에 있어서, 서열은 본 명세서에서 DNA의 비해독된 스트랜드 (즉, mRNA에 대해서 동족성인 서열을 갖는 스트랜드)를 따라서 5'에서 3' 방향의 서열 만을 제시하는 표준협약에 따라 기술될 수 있다. "재조합 DNA 분자"는 분자생물학적 조작이 수행된 DNA 분자이다.
핵산 분자의 단일-스트랜드 형태가 온도 및 용액 이온강도의 적절한 조건하에서 다른 핵산 분자에 어니일링할 수 있는 경우에, 핵산 분자는 cDNA, 지놈 DNA 또는 RNA와 같은 또 다른 핵산 분자에 "하이브리드화"할 수 있다 (참조: Sambrook et al., 1989, 상기 참조). 온도 및 이온강도의 조건은 하이브리드화의 "엄밀성(stringency)"을 결정한다. 동족성 핵산에 대한 예비선별을 위해서는, 55℃의 Tm에 상응하는 낮은 엄밀성의 하이브리드화 조건이 사용될 수 있다 (예를들어, 5×SSC, 0.1% SDS, 0.25% 밀크, 및 포름아미드 없음; 또는 30% 포름아미드, 5×SSC, 0.5% SDS). 중등도의 엄밀한 하이브리드화 조건은 더 높은 Tm에 상응하며, 예를들어 40% 포름아미드와 5× 또는 6×SSC이다. 높은 엄밀성의 하이브리드화 조건은 제일 높은 Tm에 상응하며, 예를들어 50% 포름아미드, 5× 또는 6×SCC이다. 하이브리드화는 두개의 핵산이 상보적 서열을 함유하는 것을 필요로 하지만, 하이브리드화의 엄밀성에 따라서는 염기들 사이에서의 미스매치 (mismatch)가 이루어질 수도 있다. 핵산을 하이브리드화시키기 위한 적절한 엄밀성은 본 기술분야에서 잘 알려져 있는 변수인 핵산의 길이 및 상보성의 정도에 따라 좌우된다. 두개의 뉴클레오타이드 서열 사이의 유사성 또는 상동성의 정도가 크면 클수록, 이들 서열을 갖는 핵산의 하이브리드를 위한 Tm의 값은 더 크다. 핵산 하이브리드화의 상대적 안정성 (더 높은 Tm에 상응함)은 다음과 같은 순서로 저하한다: RNA:RNA, DNA:RNA, DNA:DNA. 길이가 100 뉴클레오타이드 보다 큰 하이브리드의 경우에 Tm을 계산하는 식이 유도되었다 [참조: Sambrook et al., 1989, 상기 참조, 9.50-0.51). 더 짧은 핵산, 예를들어 올리고뉴클레오타이드에 의한 하이브리드화의 경우에는 미스매치의 위치가 더 중요해 지며, 올리고뉴클레오타이드의 길이는 그의 특이성을 결정한다 (참조: Sambrook et al., 1989, 상기 참조, 11.7-11.8). 바람직하게는, 하이브리드화 가능한 핵산을 위한 최소 길이는 적어도 약 10 뉴클레오타이드이며, 더욱 바람직하게는 적어도 약 15 뉴클레오타이드이고, 가장 바람직하게는 길이가 적어도 약 20 뉴클레오타이드이다.
"동족성 재조합"은 염색체 내에 벡터의 외래 DNA 서열을 삽입하는 것을 의미한다. 바람직하게는, 벡터는 동족성 재조합을 위한 특이적 염색체 부위를 표적으로 한다. 특이적인 동족성 재조합의 경우에, 벡터는 염색체의 서열에 대해 상동성이 있는 충분히 긴 부위를 함유하여 염색체 내로 벡터의 상보적 결합 및 이입이 가능하도록 한다. 상동성 부분이 더 길고 서열 유사성의 정도가 더 클수록 동족성 재조합의 효율을 증가시킬 수 있다.
DNA "코드화 서열"은 적절한 조절서열의 조절하에 위치하는 경우에 시험관내 또는 생체내의 세포내에서 폴리펩타이드로 전사되거나 해독되는 이중-스트랜드 DNA 서열이다. 코드화 서열의 경계는 5' (아미노) 말단에서의 출발코돈 및 3' (카복시) 말단에서의 해독정지코돈에 의해서 결정된다. 코드화 서열은 원핵성 서열, 진핵성 mRNA로부터의 cDNA, 진핵성 (예를들어, 포유동물) DNA로부터의 지놈 DNA 서열, 및 합성 DNA 서열 까지를 포함할 수 있으나, 이들로 제한되는 것은 아니다. 코드화 서열을 진핵세포에서 발현시키고자 하는 경우에, 폴리아데닐화 시그날 및 전사종결서열은 통상적으로 코드화 서열에 대해 3'에 위치할 수 있다.
OB 코드화 및 측면 (flanking) 서열의 분리
본 발명에 포함되는 핵산은 지적된 바와 같이 본 명세서에서 도 1A 내지 D (SEQ ID NO:2), 도 3 (SEQ ID NO:4), 도 5 (SEQ ID NO:5) 및 도 6 (SEQ ID NO:6)에 기술된 것과 같은 펩타이드를 발현시키도록 코드화하는 다른 핵산에 까지 확대된다. 따라서, 특이적 DNA는 ob 유전자에 관하여 분리되고 서열분석되지만, 어떠한 동물세포라도 잠재적으로 본 발명의 펩타이드를 코드화한 유전자의 분자 클로닝을 위한 핵산 공급원으로서 이용될 수 있다. DNA는 화학적 합성에 의해서, cDNA 클로닝에 의해서, 또는 목적하는 세포로부터 정제된 지놈 DNA 또는 그의 단편을 클로닝함으로써 클로닝된 DNA (예를들어, DNA "라이브러리")로부터 본 기술분야에서 공지된 표준방법에 의해서 수득할 수 있다 [참조예: Sambrook et al., 1989, 상기 참조; Glover, 1985, 상기 참조). 지놈 DNA로부터 유도된 클론은 코드화 부분 이외에 조절 및 인트론 DNA 부분을 함유할 수 있으며; cDNA로부터 유도된 클론은 인트론 서열을 함유하지 않는다. 공급원이 무엇이든지, 유전자는 유전자의 증식을 위해서 적합한 벡터 내에서 분자적으로 클로닝되어야 한다.
지놈 DNA로부터 유전자의 분자클로닝에 있어서는, 지놈 DNA를 cDNA 서열로부터 선택된 프라이머 (primer)를 사용하여 증폭시킬 수 있다. 대용으로는, DNA 단편이 생성되는데, 이들 중의 일부는 목적하는 유전자를 코드화한다. DNA는 다양한 제한효소를 사용하여 특정 부위에서 절단될 수 있다. 또한, 망간의 존재하에서 DNase를 사용하여 DNA를 단편으로 만들 수도 있거나, DNA를 예를들어, 초음파 처리에 의해서 물리적으로 전단시킬 수도 있다. 그후에, 선형 DNA 단편은 아가로즈 및 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 및 칼럼 크로마토그라피를 포함하는 (단, 이들로 제한되는 것은 아니다) 표준기술에 의해서 크기에 따라 분리시킬 수 있다.
일단 DNA 단편이 생성되면, 목적하는 ob 또는 ob-양 유전자를 함유하는 특이적 DNA 단편의 확인은 여러가지의 방식으로 수행될 수 있다. 예를들어, ob 또는 ob-양 유전자 또는 그의 특이적 RNA의 일부분, 또는 그의 단편의 일정량을 이용할 수 있고 정제 및 표지할 수 있다면, 생성된 DNA 단편은 표지된 프로브에 대한 핵산 하이브리드화에 의해서 선별될 수 있다 [Benton et al., Science, 196:180 (1977); Grunstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72:3961 (1975)]. 본 발명은 본 명세서에 기술된 특이적 서열로부터 편리하게 제조될 수 있는 이러한 핵산 프로브, 예를들어 도 1A 내지 E (SEQ ID NO:1) 또는 도 2A 및 B (SEQ ID NO:3)에 도시된 서열의 적어도 10개, 바람직하게는 15개의 뉴클레오타이드 단편에 상응하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 하이브리드화 가능한 프로브를 제공한다. 바람직하게는, 본 발명의 변조물질 펩타이드에 대해 매우 독특한 단편이 선택된다. 프로브에 대한 상당한 상동성을 갖는 이들 DNA 단편이 하이브리화하게 된다. 상기 언급한 바와 같이, 상동성의 정도가 크면 클수록 사용될 수 있는 하이브리드화 조건은 더 엄밀하게 된다. 한가지 구체예에서는, 엄밀성이 낮은 하이브리드화 조건을 사용하여 동족성 변조물질 펩타이드를 확인한다. 그러나, 바람직한 관점에서는 본 발명에서 실험적으로 입증된 바와 같이, 본 발명의 변조물질 펩타이드를 코드화한 핵산은 중등도로 엄밀한 조건하에서, 도 1A 내지 E (SEQ ID NO:1) 또는 도 2A 및 B (SEQ ID NO:3)에 도시된 것과 같은 뉴클레오타이드 서열 또는 그의 하이브리드화 가능한 단편을 갖는 핵산에 하이브리드화하며, 더욱 바람직하게는 고도로 엄밀한 조건하에서 하이브리드화한다.
대체용으로, 유전자의 존재는 그의 발현된 생성물의 물리적, 화학적 또는 면역학적 특성을 기초로 하는 검정방법에 의해서 검출될 수 있다. 예를들어, 본 발명의 변조물질 펩타이드에 대해 공지된 것과 유사하거나 동일한 전기영동적 이동, 등전집속거동 (isoelectric focusing behavior), 단백분해적 분해지도, 티로신 포스파타제 활성 또는 항원 특성을 갖는 것과 같은 단백질을 생산하는 cDNA 클론, 또는 적절한 mRNAs를 하이브리드화-선택하는 DNA 클론을 선택할 수 있다. 예를들어, 본 발명의 항체를 사용하여 편리하게 다른 공급원으로부터의 변조물질 펩타이드의 동족체를 선별할 수 있다.
본 발명의 변조물질 펩타이드를 코드화한 유전자는 mRNA 선택에 의해서, 즉 핵산 하이브리드화에 이은 시험관내 해독에 의해서 확인될 수도 있다. 이 방법에서는 단편을 사용하여 하이브리드화에 의해 상보적 mRNAs를 분리시킨다. 이러한 DNA 단편은 이용가능하며 정제된 변조물질 DNA를 나타낼 수 있다. 분리된 mRNAs의 생성물의 시험관내 해독산물의 면역침강분석 또는 기능검정시험 (예를들어, 티로신 포스파타제 활성)은 mRNA를 확인하며, 따라서 목적하는 서열을 함유하는 상보적 DNA 단편을 확인한다. 또한, 특이적 mRNAs는 변조물질 펩타이드에 대해서 특이적으로 지향된 고정화 항체에 세포로부터 분리된 폴리솜 (polysome)을 흡착시킴으로써 선택될 수 있다.
방사성표지된 변조물질 펩타이드 cDNA는 (흡착된 폴리솜으로부터) 선택된 mRNA를 주형으로 사용하여 합성될 수 있다. 그후에 방사성표지된 mRNA 또는 cDNA는 다른 지놈 DNA 단편으로부터 동족성 변조물질 펩타이드 DNA 단편을 확인하기 위한 프로브로서 서용될 수 있다.
상기 언급한 바와 같이, 본 발명에 기술된 바와 같은 체중 변조물질 펩타이드를 코드화한 DNA 서열은 클론화되는 것이 아니라 합성적으로 제조될 수 있다. DNA 서열은 체중 변조물질 펩타이드 아미노산 서열에 대한 적절한 코돈에 의해서 디자인될 수 있다. 일반적으로, 서열이 발현에 사용된다면 누구나 목적하는 숙주를 위한 바람직한 코돈을 선택할 수 있다. 완전서열은 표준방법에 의해서 제조된 오버랩핑 (overlapping) 올리고뉴클레오타이드로부터 조립되어 완전 코드화 서열 내로 조립된다 [참조예: Edge, Nature, 292:756 (1981); Nambair et al., Science, 223:1299 (1984); Jay et al., J. Biol. Chem., 259:6311 (1984)].
합성 DNA 서열은 상술한 바와 같이 체중 변조물질 동족체를 발현하는 유전자의 편리한 작제를 가능하게 한다. 대체용으로, DNA 코드화 동족체는 천연 OB 유전자 또는 cDNAs의 부위-지향된 돌연변이유발에 의해서 제조될 수 있으며, 동족체는 통상적인 폴리펩타이드 합성을 이용하여 직접 제조될 수 있다.
비천연적인 아미노산을 단백질에 부위-특이적으로 혼입시키는 일반적인 방법은 문헌 (Noren et al., Science, 244:182-188 (1989))에 기술되어 있다. 이 방법을 사용하여 비천연적인 아미노산을 갖는 ob 폴리펩타이드의 동족체를 생성시킬 수 있다.
비-코드화 핵산
본 발명은 해독수준에서 체중 변조물질 단백질의 발현을 저해하기 위해서 사용될 수 있는 안티센스 뉴클레오타이드 및 리보자임의 제조에 까지 확대된다. 이 방법은 안티센스 핵산 및 리보자임을 이용하여 그 mRNA를 안티센스 핵산으로 차폐시키거나 이것을 리보자임으로 절단함으로써 특이적 mRNA의 해독을 차단한다.
안티센스 핵산은 특이적 mRNA 분자의 적어도 일부분에 대해서 상보적인 DNA 또는 RNA 분자이다 [참조: Weintraub, Sci. Am., 262:40-46 (1990); Marcus-Sekura, Anal. Biochem., 172:289-295 (1988)]. 세포내에서, 이들은 그 mRNA에 하이브리드화하여 이중-스트랜드 분자를 형성한다. 세포는 이 이중-스트랜드 형태로 복합체를 형성한 mRNA를 해독하지 못한다. 따라서, 안티센스 핵산은 mRNA가 단백질로 발현하는 것을 방해한다. AUG 개시코돈에 대해 하이브리드화하는 약 15개의 뉴클레오타이드 및 분자로 된 올리고머가 합성이 쉽고, 이들을 체중 변조물질 펩타이드-생성 세포 내도 도입시킬 경우에 더 큰 분자보다 더 적은 문제를 제기할 것으로 보이기 때문에 이들이 특히 효율적이다. 안티센스 방법은 시험관내에서 다수의 유전자의 발현을 억제하기 위해서 사용되어 왔다 [Marcus-Sekura, 1988, 상기 참조; Hambor et al., J. Exp. Med., 168:1237-1245 (1988)].
리보자임은 DNA 제한 엔도뉴클레아제와 다소 유사한 방식으로 다른 단일-스트랜드 RNA 분자를 특이적으로 절단하는 능력을 갖는 RNA 분자이다. 리보자임은 특정한 mRNAs가 그들 자신의 이트론을 잘라내는 능력을 갖는다는 관찰결과에 의해서 발견되었다. 이들 RNAs의 뉴클레오타이드 서열을 변형시킴으로써, 연구자들은 RNA 분자내에서 특이적 뉴클레오타이드 서열을 인식하고 그것을 절단하는 분자를 조작할 수 있게 되었다 [Cech, J. Am. Med. Assoc., 260:3030-3034 (1988)]. 이들은 서열-특이적이기 때문에 특정한 서열을 갖는 mRNAs 만이 단지 불활성화된다.
연구자들은 두가지 타입의 리보자임인 테트라하이메나 (Tetrahymena)-타입 및 "햄머헤드 (hammerhead)"-타입을 확인하였다. 테트라하이메나-타입 리보자임은 4-염기 서열을 인식하는 반면에, "햄머헤드"-타입은 11- 내지 18-염기 서열을 인식한다. 인식서열이 길면 길수록 이것이 표적 mRNA 종 내에서 독점적으로 나타나는 것이 더 가능하다. 따라서, 햄머헤드-타입 리보자임이 특이적 mRNA 종을 불활성화시키는데 테트라하이메나-타입 리보자임 보다 더 바람직하며, 18 염기 인식서열이 더 짧은 인식서열 보다 더 바람직하다.
따라서, 본 명세서에 기술된 DNA 서열을 사용하여 그에 대한 안티센스 분자 및 체중 변조물질 단백질 및 그들의 리간드에 대한 mRNAs를 절단하는 리보자임을 제조할 수 있으며, 이렇게 함으로써 ob 유전자의 발현을 억제하고 증가된 체중 증가 및 지방과다를 유도할 수 있다.
또 다른 구체예에서는, OB 핵산의 코드화 및 상보적 스트랜드에 대해서, 또는 코드화 부분쪽으로 OB 유전자 5', 3' 또는 내부 (인트론)의 비-코드화 부분에 대해서 상보적인 짧은 올리고뉴클레오타이드가 본 발명에 의해서 제공된다. 이러한 핵산은 ob 유전자에서 돌연변이의 존재 또는 OB mRNA의 발현 수준을 평가하기 위한 프로브로서, 즉 직접적으로 표지된 올리고뉴클레오타이드 프로브로서 또는 폴리머라제 연쇄반응을 위한 프라이머로서 유용하다. 바람직하게는 본 발명의 비-코드화 핵산은 인간 OB 유전자로부터 유래한다.
특정한 구체예에서, 비-코드화 핵산은 예를들어, OB 폴리펩타이드의 더 높은 수준의 발현을 제공하거나, 또는 OB 폴리펩타이드의 적절한 수준의 발현을 방지하는 ob 유전자 조절서열내에서의 돌연변이를 극복하도록, OB 유전자에 근접하여 증폭성 유전자 및/또는 다른 조절서열을 통합시키기 위한 동족성 재조합을 제공한다 [참조: 1991. 5. 16에 공개된 국제특허공보 WO 91/06666 (Skoultchi); 1991. 7. 11에 공개된 국제특허공보 WO 91/09955 (Chappel); 또한, 1990. 11. 29에 공개된 국제특허공보 WO 90/14092 (Kucherlapati and Campbell)].
OB 폴리펩타이드의 생산: 발현 및 합성
전사 및 해독 조절서열은 숙주세포내에서 코드화 서열의 발현을 제공하는 프로모터, 인핸서 (enhancer), 터미네이터 (terminator) 등과 같은 DNA 조절서열이다. 진핵세포에서는 폴리아데닐화 시그날이 조절서열이다.
RNA 폴리머라제가 코드화 서열을 mRNA로 전사시킨 다음에, 이 mRNA가 트랜스-RNA 접합되고 코드화 서열에 의해서 코드화된 단백질로 해독되는 경우에, 코드화 서열은 전사 및 해독 조절서열의 "조절하"에 있다.
"시그날 서열"은 세포의 표면상에서 발현될 단백질의 코드화 서열의 시작부위에 포함된다. 이 서열은 숙주세포가 폴리펩타이드를 전좌시키도록 지시하는, 성숙 폴리펩타이드에 대한 N-말단의 시그날 펩타이드를 코드화 한다. 본 발명에서 사용되는 것으로 용어 "전좌 시그날 서열 (translocation signal sequence)"은 이러한 종류의 시그날 서열을 의미한다. 전좌 시그날 서열은 진핵 및 원핵세포에 대해서 고유적인 다양한 단백질과 연관되어 확인될 수 있으며, 종종 두가지 타입 모두의 유기체에서 작용적이다.
발현 조절서열이 해당 DNA 서열의 전사 및 해독을 조절하고 제어하는 경우에, 이 DNA 서열은 발현 조절서열에 "작동적으로 연결"된다. 용어 "작동적으로 연결"은 발현될 DNA 서열의 전방에 적절한 출발 시그날 (예를들어, ATG)을 가지고, 발현 조절서열의 조절하에서 DNA 서열의 발현 및 DNA 서열에 의해서 코드화된 목적하는 생성물의 생산이 가능하도록 정확한 판독프레임 (reading frame)을 유지시키는 것을 포함한다. 재조합 DNA 분자내로 삽입시키는 원하는 유전자가 적절한 출발 시그날을 함유하지 않는다면, 이러한 출발 시그날은 유전자를 갖는 판독 프레임에서 그의 상류 (5')에 삽입될 수 있다.
"프로모터 서열"은 세포내에서 RNA 폴리머라제를 결합시킬 수 있고 하류 (3' 방향) 코드화 서열의 전사를 개시시킬 수 있는 DNA 조절부위이다. 본 발명을 정의할 목적으로, 프로모터 서열은 전사개시부위에 의해서 그의 3' 말단에서 결합되며, 배경량 이상으로 검출가능한 수준에서 전사를 개시시키는데 필요한 최소 수의 염기 또는 요소를 포함하도록 상향으로 (5' 방향)으로 연장된다. 프로모터 서열내에서 전사개시부위 (편리하게는 예를들어, 뉴클레아제 S1에 의해 위치를 확인함으로써 정의됨), 및 RNA 폴리머라제의 결합의 원인이 되는 단백질 결합영역 (공통서열)이 존재할 수 있다.
본 발명의 또 다른 특징은 본 명세서에 기술된 DNA 서열의 발현이다. 본 기술분야에서 잘 알려진 바와 같이, DNA 서열은 이들을 적절한 발현벡터내에서 발현조절서열에 작동적으로 연결시키고, 이 발현벡터를 이용하여 적절한 단세포 숙주를 형질전환시킴으로써 발현될 수 있다.
물론, 발현조절서열에 본 발명의 DNA 서열을 작동적으로 연결시키는데는 DNA 서열의 일부분을 이미 포함하지 않는 경우에, DNA 서열의 상류에서 정확한 판독프레임내에 개시코돈 ATG를 제공하는 것이 포함된다.
광범한 종류의 숙주/박현벡터 조합이 본 발명의 DNA 서열을 발현시키는데 사용될 수 있다. 유용한 발현벡터는 예를들어, 염색체성, 비염색체성 및 합성 DNA 서열의 절편으로 구성될 수 있다. 적합한 벡터에는 SV40의 유도체 및 공지의 세균성 플라스미드, 예를들어 이. 콜라이 (E. coli) 플라스미드 col E1, pCR1, pBR322, pMB9, pUC 또는 pUC 플라스미드 유도체, 예를들어 pGEX 벡터, pET 벡터, pmal-c, pFLAG 등 및 이들의 유도체, RP4와 같은 플라스미드; 파아지 DNAs, 예를들어 파아지 λ의 다수의 유도체, 예를들어 NM989, 및 그밖의 다른 파아지 DNA, 예를들어 M13 및 섬유상 단일-스트랜드 파아지 DNA; 2μ 플라스미드 또는 그의 유도체와 같은 효모 플라스미드; 곤충 또는 포유동물 세포에서 유용한 벡터와 같은 진핵세포에서 유용한 벡터; 파아지 DNA 또는 그밖의 다른 발현조절서열을 이용하여 변형된 플라스미드와 같이 플라스미드와 파아지 DNAs의 조합으로부터 유도된 벡터 등이 포함된다. 바람직한 구체예에서, ob의 발현은 메틸영양성 (methylotrophic) 효모, 예를들어 피치아 패스토리스 (Pichia pastoris) 효모에서 이루어진다 [참조예: 1990년 4월 5일에 공개된 국제특허공보 WO 90/03431 (Brierley et al.); 1990년 9월 20일에 공개된 국제특허공보 WO 90/10697 (Siegel et al.)]. 이하의 특정한 구체예에서, 발현벡터는 α-교배인자 시그날 서열의 조절하에서 ob의 발현이 이루어지도록 조작된다.
광범한 종류의 발현조절서열 - 즉, 그 서열에 작동적으로 연결되어 있는 DNA 서열의 발현을 조절하는 서열 -중의 어떤 것이라도 이들 벡터에서 본 발명의 DNA 서열을 발현시키는데 사용될 수 있다. 이러한 유용한 발현조절서열은 예를들어, SV40, CMV, 백시니아, 폴리오마 또는 아데노바이러스의 초기 또는 후기 프로모터, lac 시스템, trp 시스템, TAC 시스템, TRC 시스템, LTR 시스템, 파아지 λ의 주 오퍼레이터 및 프로모터 부분, fd 외피단백질의 조절부분, 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 그밖의 다른 해당효소에 대한 프로모터, 산 포스파타제 (예를들어, Pho5)의 프로모터, 메틸영양성 효모의 AOX 1 프로모터, 효소 α-교배인자의 프로모터, 및 원핵 또는 진핵세포 또는 이들의 바이러스의 유전자의 발현을 조절하는 것으로 알려져 있는 그밖의 다른 서열, 및 이들의 다양한 조합을 포함한다.
광범한 종류의 단세포성 숙주세포도 또한 본 발명의 DNA 서열을 발현시키는데 유용하다. 이들 숙주에는 잘 공지되어 있는 진핵 및 원핵성 숙주, 예를들어, 이. 콜라이 (E. coli), 슈도모나스 (Pseudomonas), 바실루스 (Bacillus), 스트렙토마이세스 (Streptomyces)의 스트레인; 효모 (사카로마이세스 (Saccharomyces), 및 피치아 (Pichia), 칸디다 (Candida), 한세눌라 (Hansenula) 및 토룰롭시스 (Torulopsis)와 같은 메틸영양성 효모)와 같은 진균; 및 CHO, R1.1, B-W 및 LM 세포와 같은 동물세포, 아프리칸 그린멍키 (African Green Monkey) 신장세포 (예를들어, COS 1, COS 7, BSC1, BSC40 및 BMT10), 곤충세포 (예를들어, Sf9) 및 조직배양물중의 인간세포 및 식물세포가 포함될 수 있다.
모든 벡터, 발현조절서열 및 숙주가 본 발명의 DNA 서열을 발현시키는데 동등하게 잘 작용하는 것은 아닌 것으로 이해될 수 있다. 모든 숙주가 동일한 발현시스템에 의해서 동등하게 잘 작용하는 것도 아니다. 그러나, 본 기술분야에서 숙련된 전문가라면 본 발명의 범위를 벗어나지 않으면서 목적하는 발현을 성취하기 위해서 과도한 실험이 없이 적절한 벡터, 발현조절서열 및 숙주를 선택할 수 있을 것이다. 예를들어, 벡터를 선택함에 있어서는 숙주가 반드시 고려되어야 하는데, 이는 벡터가 숙주내에서 작용하여야 하기 때문이다. 벡터의 카피수 (copy number), 그 카피수를 조절하는 능력, 및 항생제 마커 (marker)와 같이 벡터에 의해서 코드화되는 다른 단백질의 발현도 또한 고려될 것이다.
발현조절서열을 선택함에 있어서는, 다양한 인자가 통상적으로 고려된다. 이들에는 예를들어, 시스템의 상대적 강도, 그의 조절가능성, 및 특히 잠재적인 제 2 구조의 관점에서는, 발현될 특정의 DNA 서열 또는 유전자와 그의 상화성이 포함된다. 적합한 단세포성 숙주는 예를들어, 선택된 벡터와 그들의 상화성, 그들의 분비특징, 단백질을 정확하게 중첩시키는 그들의 능력, 및 그들의 발효 필요조건, 및 발현될 DNA 서열에 의해서 코드화된 생성물의 숙주에 대한 독성 및 발현생성물의 정제의 용이성을 고려하여 선택된다.
이들 및 그밖의 다른 인자들을 고려하여, 본 기술분야에서 숙련된 전문가들은 발효시에 또는 대규모 동물배양시에 본 발명의 DNA 서열을 발현시킬 수 있는 다양한 벡터/발현조절서열/숙주 조합을 작제할 수 있을 것이다.
특정한 구체예에서는 OB 융합단백질이 발현될 수 있다. OB 융합단백질은 OB 폴리펩타이드의 적어도 작용적으로 활성인 부분에 펩타이드 결합을 통해서 연결된 비-OB 단백질의 적어도 작용적으로 활성인 부분을 포함한다. 비-ob 서열은 OB 서열에 대하여 아미노- 또는 카복시-말단으로 될 수 있다. 더욱 바람직하게는, 단백 분해적으로 불활성인 OB 융합단백질의 안정한 발현을 위해서 비-OB 융합단백질의 부분은 펩타이드 결합을 통해서 OB 단백질의 아미노-말단에 연결된다. 이러한 융합단백질을 코드화한 재조합 DNA 분자는 OB 코드화 서열에서 프레임내에 연결된 비-OB 단백질의 적어도 작용적으로 활성인 부분을 코드화한 서열을 포함하며, 바람직하게는 OB-비-OB 접합부에서 바람직하게는 특이적 프로테아제, 예를들어 트롬빈 또는 인자 Xa에 대한 절단부위를 코드화한다. 특정한 구체예에서, 융합단백질은 에스케리키아 콜라이 (Escherichia coli) 또는 피치아 패스토리스 (P. pastoris)내에서 발현된다.
이하의 특정한 구체예에서, 벡터는 세균 발현시스템 및 효모 (피치아 (Pichia)) 발현시스템에서, gln-49에 대한 코돈의 존재 또는 부재하에, 융합단백질로서 쥐 및 인간 ob 유전자를 발현하도록 제조되었다. ob 유전자는 예를들어, PCR 및 신규의 프라이머를 사용하여 엔도뉴클레아제 절단부위를 갖도록 제조되었다. 이 기술에 의해서는 점돌연변이를 포함하는 가능성이 더 크기 때문에, PCR에 의해서 생성된 서열을 확인하는 것이 바람직하다. 히스티딘 태그 (His-tag) 및 단백분해적 절단부위를 함유하는 플라스미드가 사용된다. 히스티딘의 존재는 Ni-킬레이트화 칼럼상에서 또는 친화성 정제에 의해서 재조합 단백질을 선택적으로 분리시키는 것을 가능하게 한다. 이하의 특정한 구체예에서 단백분해적 절단부위인 트롬빈 절단부위는 프로테아제, 예를들어 트롬빈에 의한 처리가 전체 길이의 성숙 (즉, 시그날 서열이 결여된) OB 폴리펩타이드를 유리시킬 수 있도록 조작된다.
또 다른 관점에서는, pGEX 벡터 [Smith et al., Gene 67:31 (1988)]가 사용될 수 있다. 이 벡터는 일본주혈흡충 글루타치온 S-트랜스퍼라제 cDNA를 목적하는 서열에 융합시킨다. 세균 단백질을 수집하고, 재조합 단백질은 환원된 글루타치온 친화성 칼럼상에서 신속하게 정제할 수 있다. 이어서, GST 캐리어를 부위-특이적 프로테아제에 의한 분해에 의해서 융합단백질로부터 절단시킬 수 있다. 절단시킨 후에, 캐리어와 비절단된 융합단백질은 글루타치온 아가로즈상에 흡수시킴으로써 제거할 수 있다. 시스템에서는 코드화된 단백질이 수용액중에 불용성인 경우에 때때로 어려움이 야기된다.
세균시스템에서 재조합 단백질의 발현은 발현된 단백질의 부정확한 중첩 (folding)을 일으킴으로써 재중첩 (refolding)이 필요할 수 있다. 재조합 단백질은 절단하기 전 또는 후에 재중첩되어 작용적으로 활성인 OB 폴리펩타이드를 형성시킬 수 있다. OB 폴리펩타이드는 (i) 단백질을 환원제를 함유하는 변성 완충액내에서 배양한 다음에, (ii) 단백질을 산화제를 함유하고, 바람직하게는 또한, 단백질 안정화제 또는 무질서유발제 (chaotropic agent) 또는 둘다를 함유하는 완충액 내에서 배양하는 단계에 의해서 재중첩될 수 있다. 적합한 산화환원 (redox; reducing/oxidizing)제 쌍은 환원된 글루타치온/글루타치온 디설파이드, 시스틴/시스테인, 시스타민/시스테아민, 및 2-머캅토에탄올/2-하이드록시에틸디설파이드를 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 특정의 관점에서, 융합단백질은 환원 완충액으로 교환하기 전에 우레아와 같은 변성제내에 가용화될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 단백질은 또한, 환원완충액으로 교환하기 전에, 예를들어 이온교환 또는 Ni-킬레이트화 크로마토그라피에 의해서 정제된다. 변성제에는 우레아 및 구아니딘-HCl이 포함되나, 이들로 제한되는 것은 아니다. 재조합 단백질은 그후에, 0.1 M 트리스-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA, 0.15 M NaCl, 0.3 M 산화된 글루타치온과 같은 (그러나, 이들로 제한되는 것은 아니다) 산화제를 함유하는 산화완충액내로 대략 적어도 10-배, 더욱 바람직하게는 약 100-배 희석시킨다. 그후, 융합단백질을 산화완충액중에서 실온에서 약 1 내지 약 24시간, 바람직하게는 약 2 내지 약 16시간 동안 배양한다. 산화완충액은 단백질 안정화제, 예를들어 당, 알콜 또는 암모늄 설페이트를 함유할 수도 있다. 산화완충액은 추가로 저농도의 무질서유발제를 함유하여 부정확한 분자간 상호작용을 불안정화시키고, 이에 따라 적절한 중첩을 촉진시킬 수 있다. 적합한 무질서유발제에는 세정제, 폴리올, L-아르기닌, 구아니딘-HCl 및 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)이 포함되나, 이들로 제한되는 것은 아니다. 단백질의 변성을 피하기 위해서 무질서유발제를 충분히 낮은 농도로 사용하는 것이 중요하다. 재중첩된 단백질은 적어도 약 10-배 까지, 더욱 바람직하게는, 이것이 산화완충액으로 희석되었을 때의 양까지 농축될 수 있다.
세균발효공정은 또한, 허용할 수 없는 수준의 내독소를 함유하는 재조합 단백질 제제를 생성시킬 수도 있다. 따라서, 본 발명은 예를들어, 내독소-특이 항체 또는 그밖의 다른 내독소 결합분자를 사용하여 이러한 내독소를 제거하는 것을 포함한다. 내독소의 존재는 E-TOXATE 시약 (Sigma, St. Louis, Missouri)을 이용하거나, 또는 생물학적 검정법에 의한 것과 같은 표준기술에 의해서 결정될 수 있다.
특정의 실시예 이외에도, 본 발명자들은 ob 단백질을 발현하는 바클로바이러스, 포유동물 및 효모 발현시스템의 사용을 고려한다. 예를들어, 바큘로바이러스 발현시스템에는 pVL941 (BamH1 클로닝 부위; Summers), pVL1393 (BamH1, SmaI, XbaI, EcoR1, NotI, XmaIII, BglII 및 PstI 클로닝 부위; Invitrogen), pVL1392 (BglII, PstI, NotI, XmaIII, EcoRI, XbaI, SmaI 및 BamH1 클로닝 부위; Summers 및 Invitrogen), 및 pBlueBacIII (BamH1, BglII, PstI, NcoI, 및 HindIII 클로닝 부위, 청/백 재조합 스크리닝이 가능함; Invitrogen)와 같은 (단, 이들로 제한되는 것은 아니다) 비-융합 전이벡터, 및 pAc700 (BamH1 및 KpnI 클로닝 부위, 여기에서 BamH1 인식부위는 개시코돈으로 시작한다; Summers), pAc701 및 pAc702 (판독 프레임이 상이한 것을 제외하고는 pAc700과 동일함), pAc360 (폴리헤드린 개시코돈의 하류에서 BamH1 클로닝 부위 36 염기쌍; Invitrogen (195)) 및 pBlueBacHisA, B, C (BamH1, BglII, PstI, NcoI 및 HindIII 클로닝 부위를 갖는 세가지 상이한 판독 프레임, ProBond 정제 및 플라그의 청/백 재조합 스크리닝을 위한 N-말단 펩타이드; Invitrogen (220))와 같은 (단, 이들로 제한되는 것은 아니다) 융합 전이벡터 둘다가 포함된다.
본 발명에서 사용하도록 고려되는 포유동물 발현벡터에는 디하이드로폴레이트 리덕타제 (DHFR) 프로모터와 같은 유도성 프로모터를 갖는 벡터, 예를들어, DHFR 벌현벡터를 갖는 발현벡터, 또는 pED (PstI, SalI, SbaI, SmaI 및 EcoRI 클로닝 부위, 벡터는 클로닝된 유전자 및 DHFR 둘다를 발현한다; 참조 Kaufman, Current Protocols in Molecular Biology, 16.12 (1991))와 같은 DHFR/메토트렉세이트 공증폭 벡터가 포함된다. 대용으로는, pEE14 (HindIII, XbaI, SmaI, SbaI, EcoRI 및 BclI 클로닝 부위, 여기에서 벡터는 글루타민 신타제 및 클로닝된 유전자를 발현한다; Celltech)와 같은 글루타민 신테타제/메티오닌 설폭시민 공증폭 벡터가 있다. 또 다른 구체예에서는, pREP4 (BamH1, SfiI, XhoI, NotI, NheI, HindIII, NheI, PvuII 및 KpnI 클로닝 부위, 구성적 RSV-LTR 프로모터, 하이그로마이신 선택가능한 마커; Introgen), pCEP4 (BamH1, SfiI, XhoI, NotI, NheI, HindIII, NheI, PvuII 및 KpnI 클로닝 부위, 구성적 hCMV 즉시형 초기유전자 (immediate early gene), 하이그로마이신 선택가능한 마커; Invitrogen), pMEP4 (KpnI, PvuI, NheI, HindIII, NotI, XhoI, SfiI, BamH1 클로닝 부위, 유도성 메탈로티오네인 IIa 유전자 프로모터, 하이그로마이신 선택가능한 마커; Invitrogen), pREP8 (BamH1, XhoI, NotI, HindIII, NheI 및 KpnI 클로닝 부위, RSV-LTR 프로모터, 히스티디놀 선택가능한 마커; Invitrogen), pREP9 (KpnI, NheI, HindIII, NotI, XhoI, SfiI 및 BamHI 클로닝 부위, RSV-LTR 프로모터, G418 선택가능한 마커, Invitrogen), 및 pEBVHis (RSV-LTR 프로모터, 하이그로마이신 선택가능한 마커, ProBond 수지를 통해서 정제할 수 있으며 엔테로키나제에 의해서 절단된 N-말단 펩타이드; Invitrogen)와 같이 엡스타인 바르 바이러스 (Epstein Barr Virus; EBV)의 조절하에서 에피솜성 발현을 지시하는 벡터가 사용될 수도 있다. 본 발명에서 사용하기 위한 선택가능한 포유동물 발현벡터에는 pRc/CMV (HindIII, BstXI, NotI, SbaI 및 ApaI 클로닝 부위, G418 선택; Invitrogen), pRc/RSV (HindIII, SpeI, BstXI, NotI, XbaI 클로닝 부위, G418 선택; Invitrogen) 등이 포함된다. 본 발명에 따라서 사용하기 위한 백시니아 바이러스 포유동물 발현벡터 (참고, Kaufman, 1991, 상기 참조)에는 pSC11 (SmaI 클로닝 부위, TK- 및 β-gal 선택), pMJ601 (SalI, SmaI, AflI, NarI, BspMII, BamHI, ApaI, NheI, SacII, KpnI 및 HindIII 클로닝 부위; TK- 및 β-gal 선택), 및 pTKgptF1S (EcoRI, PstI, SalI, AccI, HindII, SbaI, BamHI 및 Hpa 클로닝 부위; TK 또는 XPRT 선택)이 포함되나, 이들로 제한되는 것은 아니다.
효모 발현시스템도 또한 본 발명에 따라서 OB 폴리펩타이드를 발현시키는데 사용될 수 있다. 예를들어, 단지 두가지 언급되는 비-융합 pYES2 벡터 (XbdI, SphI, ShoI, NotI, GstXI, EcoRI, BstXI, BamH1, SacI, Kpn1 및 HindIII 클로닝 부위; Invitrogen) 또는 융합 pYESHisA, B, C (XbaI, SphI, ShoI, NotI, BstXI, EcoRI, BamH1, SacI, Kpn1 및 HindIII 클로닝 부위, ProBond 수지로 정제되고 엔테로키나제에 의해서 절단된 N-말단 펩타이드; Invitrogen)가 본 발명에 따라서 사용될 수 있다.
체중 변조물질 펩타이드 동족체가 본 발명의 범위내에서 유도된 뉴클레오타이드 서열로부터 제조될 수 있는 것으로 또한 이해된다.
OB 폴리펩타이드의 재조합체 발현 이외에도, 본 발명은 고체상 펩타이드 합성의 잘 공지되어 있으며 고도로 개발된 기술을 사용하여 OB 폴리펩타이드 또는 그의 단편의 제조를 의도하고, 완전히 이루어질 수 있게 한다. 본 발명은 ob 폴리펩타이드 또는 그의 단편을 제조하기 위해서 통상적인 Boc 및 Fmoc 둘다 뿐만 아니라 그밖의 다른 보호그룹 전략을 사용하는 것도 포함한다. 시스테인 측쇄를 재중첩시키고 산화시키는 다양한 기술도 또한 본 기술분야에서 잘 알려져 있다.
OB 폴리펩타이드에 대한 항체
본 발명에 따르면, 재조합적으로 또는 화학적 합성에 의해서 생성된 OB 폴리펩타이드, 및 융합단백질을 포함하는 그의 단편 또는 그밖의 다른 유도체 또는 동족체를 면역원으로 사용하여 OB 폴리펩타이드를 인식하는 항체를 생성시킬 수도 있다. 이러한 항체에는 폴리클로날, 모노클로날, 키메라성, 단일쇄, Fab 단편 및 Fab 발현 라이브러리가 포함되나, 이들로 제한되는 것은 아니다.
분자가 면역글로불린 (항체) 또는 T 세포 항원 수용체와 같은 면역시스템의 항원인식분자와 특이적으로 상호작용할 수 있는 경우에, 이 분자는 "항원성"이다. 항원성 폴리펩타이드는 적어도 약 5개, 바람직하게는 적어도 약 10개의 아미노산을 함유한다. 분자의 항원성 부분은 항체 또는 T 세포 수용체 인식에 대하여 면역우성인 부분일 수 있거나, 항원성 부분을 면역화를 위한 캐리어 분자에 컨쥬게이트시킴으로써 분자에 대한 항체를 생성시키는데 사용되는 부분일 수 있다. 항원성인 분자는 그 자체가 면역원성일 필요는 없으며, 즉 캐리어가 없이 면역반응을 유발시킬 수 있을 필요는 없다.
"항체"는 특이적 에피토프 (epitope)를 결합시키는, 항체 및 그의 단편을 포함하는 면역글로불린이다. 이 용어는 폴리클로날, 모노클로날 및 키메라성 항체 (여기에서 마지막으로 언급된 것은 미합중국특허 제 4,816,397 및 4,816,567 호에 더욱 상세히 기술되어 있다) 뿐만 아니라, Fab, F(ab')2 및 F(v) (단일쇄 항체를 포함)를 포함한 항체의 항원결합부분을 포함한다. 따라서, 본 명세서에서 사용된 그의 다양한 문법적 형태에서 문구 "항체분자"는 완전 면역글로불린 분자 및 항체 결합부위를 함유하는 면역글로불린 분자의 면역학적으로 활성인 부분 둘다를 포함한다. "항체결합부위"는 특이적으로 항원을 결합시키는 중쇄 및 경쇄 가변성 및 고가변성 부분으로 이루어진 항체분자의 구조적 부분이다.
전형적인 항체분자는 완전 면역글로불린 분자, 실질적으로 완전한 면역글로불린 분자, 및 본 발명에 기술된 치료학적 방법에서 사용하기에 바람직한 부분인 Fab, Fab', F(ab')2 및 F(v)로 본 기술분야에서 공지된 부분을 포함한, 파라토프(paratope)를 함유하는 면역글로불린 분자의 부분이다.
항체분자의 Fab 및 F(ab')2 부분은 잘 알려져 있는 방법에 의해서 실질적으로 완전한 항체분자상에서, 각각 파파인 및 펩신의 단백분해적 반응에 의해 제조된다 (참조예: 미합중국특허 제 4,342,566 호 (Theofilopolous et al.)). Fab' 항체 분자 부분도 또한 잘 공지되어 있으며, F(ab')2 부분으로부터 두개의 중쇄 부분을 연결시키는 디설파이드 결합을 머캅토에탄올에 의해서 환원시키고, 이어서 생성된 단백질 머캅탄을 요오도아세트아미드와 같은 시약으로 알킬화시킴으로써 생성된다. 본 발명에서는 완전 항체분자를 함유하는 항체가 바람직하다.
그의 다양한 문법적 형태로 사용된 문구 "모노클로날 항체"는 특정의 항원과 면역반응할 수 있는 단지 한가지 종의 항체결합부위 만을 갖는 항체를 의미한다. 따라서, 모노클로날 항체는 전형적으로는 그것과 면역반응하는 어떠한 항원에 대해서도 단일 결합친화성을 나타낸다. 따라서, 모노클로날 항체는 각각 상이한 항원에 대해서 면역특이적인 항체결합부위를 다수 갖는 항체분자를 함유할 수 있으며, 예를들어, 이중특이성 (키메라성) 모노클로날 항체이다.
용어 "보조제 (adjuvant)"는 항원에 대한 면역반응을 증진시키는 화합물 또는 혼합물을 의미한다. 보조제는 항원을 서서히 방출하는 조직 저장소 (tissue depot)로서 작용할 수 있으며, 또한 면역반응을 비특이적으로 증진시키는 림프양 시스템 활성화제로서 작용할 수도 있다 [Hood et al., in Immunology, p. 384, Second Ed., Benjamin/Cummings, Menlo Park, California (1984)]. 종종, 보조제의 부재하에서 항원 단독으로 일차 공격하는 것은 체액성 또는 세포성 면역반응을 야기시키는데 실패할 수 있다. 보조제에는 완전 프로인트 보조액, 불완전 프로인트 보조액, 사포닌, 수산화알루미늄과 같은 무기 겔, 라이소레시틴, 플루로닉 폴리올, 다음이온 (polyanion), 펩타이드, 오일 또는 하이드로카본 에멀젼과 같은 표면활성물질, 키홀 림펫 헤모시아닌 (keyhole limpet hemocyanins), 디니트로페놀, 및 BCG (bacille Calmette-Guerin) 및 코리네박테리움 파르붐 (Corynebacterium parvum)과 같은 잠재적으로 유용한 인간 보조제가 포함되나, 이들로 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는, 보조제는 약제학적으로 허용된다.
본 기술분야에서 공지된 다양한 방법이 OB 폴리펩타이드, 또는 그의 단편, 유도체 또는 동족체에 대한 폴리클로날 항체의 생산을 위해서 사용될 수 있다. 항체의 생산을 위해서는, OB 폴리펩타이드, 또는 그의 유도체 (예를들어, 단편 또는 융합단백질)를 주사함으로써 토끼, 마우스, 랫트, 양, 염소 등을 포함하는 (단, 이들로 제한되는 것은 아니다) 다양한 숙주 동물을 면역시킬 수 있다. 한가지 구체예에서는, OB 폴리펩타이드 또는 그의 단편을 면역원성 캐리어, 예를들어 소 혈청 알부민 (BSA) 또는 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH)에 컨쥬게이트시킬 수 있다. 숙주 종에 따라서 프로인트 보조액 (완전 및 불완전), 수산화알루미늄과 같은 무기 겔, 라이소레시틴, 플루로닉 폴리올, 다음이온, 펩타이드, 오일 에멀젼, 키홀 림펫 헤모시아닌, 디니트로페놀, 및 BCG (bacille Calmette-Guerin) 및 코리네박테리움 파르붐 (Corynebacterium parvum)과 같은 잠재적으로 유용한 인간 보조제를 포함한 (단, 이들로 제한되는 것은 아니다) 다양한 보조제를 사용하여 면역반응을 증가시킬 수도 있다.
OB 폴리펩타이드, 또는 그의 단편, 동족체 또는 유도체에 대향하는 모노클로날 항체의 제조를 위해서는 배양물중의 연속 세포 라인 (cell lines)에 의해서 항체분자의 생산을 제공하는 어떠한 기술이라도 사용될 수 있다. 이들에는 콜러 (Kohler et al., Nature, 256:495-497 (1975))에 의해서 최초로 개발된 하이브리도마 기술, 및 트리오마 (trioma) 기술, 인간 B-세포 하이브리도마 기술 [Kozbor et al., Immunology Today, 4:72 (1983)], 및 인간 모노클로날 항체를 생산하기 위한 EBV-하이브리도마 기술 [Cole et al., in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, pp. 77-96, Alan R. Liss, Inc., (1985)]이 포함되나, 이들로 제한되는 것은 아니다. 불멸성 항체-생성 세포 라인은 융합 이외의 기술, 예를들어, 종양원성 DNA에 의한 B 림프구의 직접 형질전환, 또는 엡스타인-바르 바이러스에 의한 형질감염에 의해서 발생시킬 수 있다 [참조예: M. Schreier et al., "Hybridoma Techniques" (1980); Hammerling et al., "Monoclonal Antibodies And T-cell Hybridomas" (1981); Kennett et al., "Monoclonal Antibodies" (1980); 또한, 미합중국특허 제 4,341,761; 4,399,121; 4,427,783; 4,444,887; 4,451,570; 4,466,917; 4,472,500; 4,491,632; 및 4,493,890 호].
본 발명의 추가의 구체예에서, 모노클로날 항체는 무균동물에서 최근의 기술(PCT/US90/02545)을 이용하여 생산될 수 있다. 본 발명에 따르면, 인간 항체가 사용될 수 있으며, 인간 하이브리도마를 사용하거나 [Cote et al., Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 80:2026-2030 (1983)], 또는 시험관내에서 EBV 바이러스에 의해서 인간 B 세포를 형질전환시킴으로써 (Cole et al., 1985, 상기 참조) 수득될 수 있다. 실제로, 본 발명에 따르면 ob 폴리펩타이드에 대해 특이적인 마우스 항체분자로부터의 유전자를 적절한 생물학적 활성의 인간 항체분자로부터의 유전자와 함께 스플리싱시킴으로써 "키메라성 항체"를 생산하기 위해서 개발된 기술 [Morrison et al., J. Bacteriol., 159-870 (1984); Neuberger et al., Nature, 312:604-608 (1984); Takeda et al., Nature, 314:452-454 (1985)]이 사용될 수 있으며; 이러한 항체는 본 발명의 범주내에 포함된다. 이러한 인간 또는 인간화된 항체는 그들 자체가 이종발생성 항체 보다 훨씬 덜 면역반응, 특히 앨러지 반응을 유도할 것이기 때문에, 인간 또는 인간화된 키메라성 항체가 인간 질병 또는 질환 (이하에 기술 됨)의 치료에 사용하는데 바람직하다.
본 발명에 따르면, 단일쇄 항체의 생산을 위해서 기술된 기술 (미합중국특허 제 4,946,778 호)은 OB 폴리펩타이드-특이적 단일쇄 항체를 생산하도록 조정될 수 있다. 본 발명의 추가의 구체예에서는 Fab 발현 라이브러리의 제작을 위해서 기술된 기술 [Huse et al., Science, 246:1275-1281 (1989)]을 이용하여 ob 폴리펩타이드 또는 그의 유도체 또는 동족체에 대한 목적하는 특이성을 갖는 모노클로날 Fab 단편을 빠르고 용이하게 확인할 수 있다.
항체분자의 이디오타입 (idiotype)을 함유하는 항체 단편은 공지의 기술에 의해서 생성될 수 있다. 예를들어, 이러한 단편에는 항체분자의 펩신 분해에 의해서 생산될 수 있는 F(ab')2 단편; F(ab')2 단편의 디설파이드 브릿지를 환원시킴으로써 생성될 수 있는 Fab' 단편, 및 항체분자를 파파인과 환원제로 처리함으로써 생성될 수 있는 Fab 단편이 포함되나, 이들로 제한되는 것은 아니다.
항체의 생산시에, 목적하는 항체에 대한 스크리닝은 본 기술분야에서 공지된 기술, 예를들어, 방사성면역측정법 (radioimmunoassay), ELISA (효소-결합 면역흡착검사 (enzyme-linked immunosorbent assay)), "샌드위치 (sandwich)" 면역측정법, 면역방사계측시험 (immunoradiometric assays), 겔확산 침강소반응 (gel diffusion precipitin reactions), 면역확산시험 (immunodiffusion assays), 동일계 면역측정법 (예를들어, 콜로이드성 금, 효소 또는 방사성 동위원소 표지물을 사용), 웨스턴 블럿 (Western blots), 침강반응 (precipitation reactions), 응집시험 (agglutination assays)(예를들어, 겔 응집시험, 적혈구 응집시험), 보체결합시험 (complement fixation assays), 면역형광측정법 (immunofluorescence assays), 단백질 A 시험, 및 면역전기영동시험 (immunoelectrophoresis assays) 등에 의해서 수행될 수 있다. 한가지 구체예에서, 항체결합은 일차 항체상에서 표지물을 검출함으로써 검출된다. 또 다른 구체예에서, 일차 항체는 일차 항체에 대한 이차 항체 또는 시약의 결합을 검출함으로써 검출된다. 추가의 구체예에서는 이차 항체가 표지된다. 면역측정법에서 결합을 검출하는 다수의 수단이 본 기술분야에서 공지되어 있으며, 이들은 본 발명의 범위내에 있다. 예를들어, OB 폴리펩타이드의 특이적 에피토프를 인식하는 항체를 선택하기 위해서는 이러한 에피토프를 함유하는 OB 폴리펩타이드 단편에 결합하는 생성물에 대해 생성된 하이브리도마를 시험할 수 있다. 동물의 특정한 종으로부터 OB 폴리펩타이드에 대해 특이적인 항체를 선택하기 위해서는, 해당 동물 종의 세포에 의해서 발현되거나, 그로부터 분리된 OB 폴리펩타이드와의 양성 결합을 기초로하여 선택할 수 있다.
전술한 항체들은 OB 폴리펩타이드의 국재화 (localization) 및 활성에 관하여 본 기술분야에서 공지된 방법, 예를들어, 웨스턴 블럿팅, 동일계에서의 OB 폴리펩타이드 이미지화, 적절한 생리학적 샘플내에서의 그의 수준 측정 등의 방법에서 사용될 수 있다.
특정한 구체예에서는 OB 폴리펩타이드의 활성을 작용화시키거나 그에 대해서 길항하는 항체가 생성될 수 있다. 이러한 항체는 리간드를 확인하기 위한 후술하는 시험방법을 사용하여 시험할 수 있다.
특정한 구체예에서, 항체는 토끼를 단백질 서열에 의해서 예견된 합성 펩타이드로, 또는 세균성 발현벡터를 사용하여 제조된 재조합 단백질로 면역시킴으로써 발현된다. 합성 펩타이드의 선택은 상술한 바와 같이 예견된 단백질 구조를 주의해서 분석한 후에 이루어진다. 특히, 추정상의 절단부위들 사이의 펩타이드 서열이 선택된다. 합성 펩타이드를 카보디이미드를 사용하여 KLH 헤모시아닌 또는 BSA와 같은 캐리어에 컨쥬게이트시키고, 프로인트 보조액내에서 사용하여 토끼를 면역시킨다. 재조합 단백질을 제조하기 위해서는, pGEX 벡터를 사용하여 폴리펩타이드를 발현시킬 수 있다 (Smith et al., 1988, 상기 참조). 대용으로, 친수성 영역만을 사용하여 융합단백질을 생성시킬 수도 있다. 발현된 단백질을 다량으로 제조하여, 프로인트 보조액내에서 토끼를 면역시키는데 사용할 수 있다.
또 다른 특정한 구체예에서는, 재조합 OB 폴리펩타이드를 사용하여 닭을 면역시키고, 난황으로부터 예를들어, OB-칼럼상에서의 친화성 정제에 의해서 닭 안티-OB 폴리펩타이드를 회수한다. 바람직하게는, 면역화에 사용된 닭은 특정 병원체 미감염 (specific pathogen free; SPF) 조건하에서 유지시킨다.
또 다른 구체예에서, 렙틴에 대한 항체는 순환 OB 단백질이 결여되고, 따라서 이들이 폴리펩타이드에 대해서 허용될 수 없을 것이기 때문에 안티-OB 폴리펩타이드 반응을 발생시킬 수 있을 것으로 예상되는 ob/ob 마우스, 및 야생형 마우스에서 생성된다. 두가지 그룹의 마우스로부터 유래하는 비장세포를 골수종 세포와 융합시켜 모노클로날 항체에 대한 하이브리도마를 제조할 수 있다.
또 다른 구체예에서는 재조합 OB 폴리펩타이드를 사용하여 토끼를 면역시키고, 추후에 사용하기 전에 폴리클로날 항체를 면역정제한다. 정제된 항체는 특히, 혈청 또는 혈장내에 순환 OB 폴리펩타이드가 존재하는지 여부를 검출하기 위한 반-정량적 시험에 특히 유용하다.
변조물질 펩타이드에 대향하여 생산된 모노클로날 항체의 패널은 다양한 특성, 즉 아이소타입 (isotype), 에피토프, 친화성 등에 대하여 스크리닝될 수 있다. 특히 중요한 것은 변조물질 펩타이드의 활성을 중화시키는 모노클로날 항체이다. 이러한 모노클로날 항체는 체중 변조물질에 대한 활성측정방법에서 용이하게 확인될 수 있다. 고친화성 항체는 또한, 천연 또는 재조합 변조물질의 면역친화성 정제가 가능한 경우에 유용하다.
바람직하게는, 본 발명의 진단 및 치료방법에서 사용된 항-변조물질 항체는 친화성-정제된 폴리클로날 항체이다. 더욱 바람직하게는, 항체는 모노클로날 항체(mAb)이다. 또한, 본 발명에서 사용된 항-변조물질 항체분자는 전체 항체분자의 Fab, Fab', F(ab')2 또는 F(v) 부분의 형태인 것이 바람직하다.
진단적 관계
본 발명은 또한, 본 발명의 체중 변조물질에 의해서 매개된 활성을 야기시키는 능력을 참고로하여, 체중 비정상 또는 지방과다에 대하여 영향을 미치는 조건 및/또는 자극의 존재를 검출하는 방법을 포함한 다양한 진단적 적용분야에 관한 것이다. 전술한 바와 같이, 체중 변조물질 펩타이드는 다양한 공지기술에 의해 그들 자신에 대한 항체를 생산시키는데 사용될 수 있으며, 그후에 이러한 항체를 분리하여 의심스러운 표적세포에서 특정한 전사활성의 존재 여부에 대한 시험에서와 같이 이용할 수 있다. 대용으로, 본 발명의 핵산이 진단시에 사용될 수도 있다.
항체-기본 진단
이미 시사한 바와 같이, 본 발명에서 유용한 진단방법은 항-변조물질 항체, 바람직하게는 친화성-정제된 폴리클로날 항체, 더욱 바람직하게는 mAb와 같은 변조물질 단백질에 대한 길항제의 유효량을 포함하는 시험방법을 이용하여 세포성 샘플 또는 매질을 검사하는 것으로 이루어진다. 또한, 본 발명에서 사용된 항-변조물질 항체분자는 Fab, Fab', F(ab')2 또는 F(v) 부분 또는 전체 항체분자의 형태인 것이 바람직하다. 전술한 바와 같이, 이 방법을 이용할 수 있는 환자에는 암, AIDS, 비만, 또는 비정상적인 체중이 특징이거나 요인인 그밖의 다른 상태를 앓고 있는 환자가 포함된다. 변조물질을 분리하고 항-변조물질 항체를 유도하는 방법 및 표적 세포의 검사를 돕기 위해서 항-변조물질 항체의 능력을 측정하고 최적화시키는 방법은 모두 본 기술분야에서 잘 알려져 있다.
또한, 폴리클로날 및 모노클로날 항체 둘다를 포함하는 항체, 및 체중 변조물질 및 그밖의 다른 인식인자 및/또는 그들의 서브유니트의 생산 및 활성을 변조시키는 약물은 특정의 진단적 적용분야를 가질 수 있으며, 예를들어, 체중의 이상이 나타나거나 나타날 것 같은 상태를 검출하고/하거나 측정하는 목적으로 이용될 수 있다. 예를들어, 변조물질 펩타이드 또는 그들의 활성단편은 예를들어, 융합된 마우스 비장림프구 및 골수종 세포를 이용하는 하이브리도마 기술과 같은 공지의 기술에 의해서 다양한 세포성 매질내에서 그들 자체에 대한 폴리클로날 및 모노클로날 항체 둘다를 생산하는데 사용될 수 있다. 이들 기술은 이하에서 상세히 기술한다. 마찬가지로, 본 발명의 수용체 인식인자의 활성(들)을 모사하거나 활성에 대해 길항하는 소분자가 발견되거나 합성될 수 있으며, 진단적 및/또는 치료학적 프로토콜에서 사용될 수 있다.
세포내에 체중 변조물질이 존재하는 것은 이러한 결정에 이용가능한 통상의 면역학적 방법에 의해서 확인될 수 있다. 다수의 유용한 방법이 공지되어 있다. 특히 유용한 세가지의 이러한 방법은 검출가능한 표지물로 표지된 수용체 인식인자, 검출가능한 표지물로 표지된 항체 Ab1, 또는 검출가능한 표지물로 표지된 항체 Ab2를 이용한다. 이 방법들은 다음의 반응식으로 요약될 수 있으며, 여기에서 별표는 그 입자가 표지된 것을 나타내고, "WM"은 체중 변조물질을 의미한다:
A. WM* + Ab1 = WM*Ab1
B. WM + Ab* 1 = WMAb1 *
C. WM + Ab1 + Ab2 * = Ab1WMAb2 *
이러한 방법 및 이들의 적용은 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 익숙한 것이며, 따라서 본 발명의 범위내에서 이용될 수 있다. "경쟁적" 방법인 방법 A는 미합중국특허 제 3,654,090 및 3,850,752 호에 기술되어 있다. 방법 B는 잘 알려져 있는 경쟁적 시험기술의 대표적인 것이다. 방법 C인 "샌드위치" 방법은 미합중국특허 제 RE 31,006 및 4,016,043 호에 기술되어 있다. "이중 항체 (double antibody)" 또는 "DASP" 방법과 같은 그밖의 다른 방법들도 공지되어 있다.
각각의 경우에, 체중 변조물질은 하나 또는 그 이상의 항체(들) 또는 결합 파트너와 컴플렉스를 형성하며, 컴플렉스의 하나의 구성원은 검출가능한 표지물로 표지된다. 컴플렉스가 형성된다는 사실 및, 필요한 경우에 그의 양은 표지물의 검출에 적용할 수 있는 공지의 방법에 의해서 결정될 수 있다.
상기한 바로부터, Ab2의 특징적 특성은 이것이 Ab1과 반응할 수 있다는 것임을 알수 있다. 이것은 하나의 포유동물 종에서 야기된 Ab1은 항체 Ab2를 야기시키는 항원으로 다른 종에서 사용되기 때문이다. 예를들어, Ab2는 항원으로서 토끼 항체를 사용하여 염소에서 야기될 수 있다. 따라서, Ab2는 염소에서 야기된 안티-토끼 항체일 수 있다. 본 명세서의 기술 및 특허청구범위를 목적으로, Ab1은 일차 또는 항-체중 변조물질 항체라 칭하며, Ab2는 이차 항체 또는 안티-Ab1 항체라 칭한다.
이들 시험을 위해서 가장 통상적으로 사용된 표지물은 방사성 원소, 효소, 자외선에 노출되는 경우에 형광을 나타내는 화학물질 등이다.
다수의 형광성 물질이 공지되어 있으며, 표지물로 이용될 수 있다. 이들에는 예를들어, 플루오레세인, 로다민 및 아루아민이 포함된다. 특정한 검출성 물질은 염소에서 제조되고 이소티오시아네이트를 통해서 플루오레세인에 컨쥬게이트된 안티-토끼 항체이다.
체중 변조물질 또는 그들의 결합 파트너는 또한 방사성 원소에 의해서 또는 효소에 의해서 표지될 수도 있다. 방사성 표지물은 현재 이용되고 있는 어떠한 계수방법에 의해서라도 검출될 수 있다. 바람직한 동위원소는 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125I, 131I 및 186Re로부터 선택될 수 있다.
효소 표지물도 마찬가지로 유용하며, 현재 이용되고 있는 비색법, 분광광도법, 형광분광광도법, 전류적정법 또는 가스정량법중의 어떤 것에 의해서라도 검출될 수 있다. 효소는 카보디이미드, 디이소시아네이트, 글루타르알데히드 등과 같은 브릿지 분자와의 반응에 의해서 선택된 입자에 컨쥬게이트된다. 이들 방법에서 사용될 수 있는 다수의 효소가 공지되어 있고 이용될 수 있다. 바람직한 것은 퍼옥시다제, β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, β-D-갈락토시다제, 우레아제, 글루코즈 옥시다제와 퍼옥시다제 및 알칼라인 포스파타제이다. 미합중국특허 제 3,654,090; 3,850,752; 및 4,016,043 호는 선택적 표지물질 및 표지방법에 대한 그들의 기술내용에 대한 예로 인용된다.
본 발명의 추가의 구체예에서, 의료전문가에 의해서 사용하기에 적합한 시험 키트는 의심스러운 표적세포에 예정된 전사활성 또는 예정된 전사활성 가능성의 존재 또는 부재를 결정하기 위해서 제조될 수 있다. 상술한 시험기술에 따라서, 이러한 키트의 한가지 부류는 적어도 표지된 체중 변조물질 또는 그의 결합 파트너, 예를들어 그에 대해 특이적인 항체, 및 물론 선택된 방법, 예를들어 "경쟁적", "샌드위치", "DASP" 등의 방법에 따른 사용법을 포함한다. 키트는 또한 완충제, 안정화제 등과 같은 부수적 시약을 함유할 수도 있다.
따라서, (a) 검출가능한 표지물에 대해서 본 발명의 체중 변조물질 또는 그에 대한 특이적 결합 파트너를 직접 또는 간접적으로 부착시킴으로써 수득된 예장된 양의 적어도 하나의 표지된 면역화학적 반응성 성분; (b) 그밖의 다른 시약; 및 (c) 키트의 사용법 설명서를 포함하여, 세포에서 예정된 전사활성의 존재 또는 가능성을 입증하기 위해서 시험키트가 제조될 수 있다.
더욱 구체적으로, 진단적 시험키트는 (a) 일반적으로 고체상에 결합되어 면역흡착제를 형성하거나, 대용으로 적합한 태그에 결합된 기지량의 상술한 바와 같은 체중 변조물질 (또는 결합 파트너), 또는 다수의 이러한 최종생성물 등 (또는 그들의 결합 파트너) 각각중의 하나; (b) 필요에 따라, 그밖의 다른 시약; 및 (c) 키트의 사용법 설명서를 포함할 수 있다.
추가의 변형으로, 시험키트는 상기 언급된 목적으로 제조되어 사용될 수 있으며, 이것은 예정된 프로토콜 (예를들어, "경쟁적", "샌드위치", "이중 항체" 등)에 따라서 가동하며, 다음의 성분들을 함유한다:
(a) 체중 변조물질을 검출가능한 표지물에 커플링시킴으로써 수득된 표지된 성분;
(b) 적어도 하나의 시약이 (i) 표지된 성분 (a)와 결합할 수 있는 리간드, (ii) 표지된 성분 (a)의 결합 파트너와 결합할 수 있는 리간드, (iii) 측정될 성분(들)중의 적어도 하나와 결합할 수 있는 리간드, 및 (iv) 측정될 성분(들)중의 적어도 하나의 결합 파트너중의 적어도 하나와 결합할 수 있는 리간드로 구성된 그룹으로부터 선택된 리간드 또는 고정화된 리간드인 하나 또는 그 이상의 추가의 면역화학적 시약; 및
(c) 체중 변조물질과 그에 대한 특이적 결합 파트너 사이의 면역화학반응의 하나 또는 그 이상의 성분의 검출 및/또는 측정을 위한 프로토콜을 수행하는 사용 설명서.
핵산-기본 진단법
이하의 실시예에서 입증되는 바와 같이, 본 발명의 핵산을 사용하여 비만 표현형을 야기시키는 OB 폴리펩타이드의 결함과 연관된 결함을 검출할 수 있다. 예를들어, 핵산 프로브 (예를들어, 노던 분석 (Northern analysis) 또는 RT-PCR 분석에서)를 사용하여 db/db 마우스 (결핍이 OB 수용체의 결여로 인한 경우)에서 또는 돌연변이가 비전사된 mRNA를 생성시키는 경우에서와 같이, 비만 표현형이 OB mRNA의 발현의 결여, 또는 비작용성 OB mRNA의 발현과 연관되는지 여부를 측정할 수 있다. 또한, 본 발명의 핵산-기본 진단기술을 항체-기본 기술과 함께 사용하여 추가로 비만 또는 식욕부진 표현형의 분자적 이해를 제공할 수 있다.
최근에 분리된 인간 cDNA 클론은 본 발명에 제시된 바와 같이 서열이 결정되었다. 이것은 인간 유전자의 완전 서열 (참조: 도 20A 내지 C; SEQ ID NO:22)의 결정을 용이하게 한다. 인간 OB 유전자의 인트론으로부터 DNA 서열이 수득되었으며 (도 20), 이들을 사용하여 모든 경우에 본 명세서에서 전술한 프로토콜에 따라서 OB 유전자의 돌연변이 또는 대립유전자 변이체를 확인하기 위하여 인간 지놈 DNA로부터의 OB 유전자의 코드화 서열을 PCR 증폭시키도록 PCR 프라이머를 제조하였다. 인간 지놈 OB를 증폭시키기 위한 특이적 PCR 프라이머는 이하의 구체적인 실시예에 기술되어 있다.
현재의 가설은 ob 유전자에서 이형접합성 돌연변이는 약/중등도의 비만과 연관될 수 있는 한편, 동형접합성 돌연변이는 비만에 대한 몇가지 DNA 서열-기본 진단시험과 연관될 수 있다는 것이다. 이것이 사실이라면, 이것은 비만이 발생할 위험이 있는 인간의 확인을 가능하게 할 수 있으며, 증가된 체중이 완전히 나타나기 전에 약물 치료 및/또는 생활양식 변화의 적용을 가능하게 할 수 있다.
그 대신에, 인간 OB의 돌연변이체 형태에 의해서 분리되는 미소위성(microsatellites)의 존재가 진단에 사용될 수 있다. 이러한 관점에서는 도 20A 내지 C에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 기본으로하는 프라이머를 포함하는 다양한 PCR 프라이머가 사용될 수 있다.
OB 유전자는 또한, 영양장애에 있어서의 그의 코드화된 RNA 및 단백질을 측정하는데 진단적으로 유용할 수 있다. 특히 영양장애시에는, OB RNA 및/또는 그의 코드화된 단백질이 조절되지 않는지, 또는 하향조절되는지 여부를 아는 것이 중요할 것이다. 따라서, 비만인 사람이 OB의 증가된 수준을 갖는다면, 문제는 OB의 하류인 것으로 보이는 반면에, OB가 감소된다면, 부적합하게 낮은 수준의 OB가 비만의 원인이 될 수 있는 것으로 보인다 (OB 유전자에서 결함이 있던지 없던지). 반대로, 체중이 줄어든 암 또는 AIDS 환자가 증가된 OB 수준을 갖는다면, 부적합하게 높은 OB의 발현이 체중 손실의 원인인 것으로 결론을 내릴 수 있다.
클로닝된 인간 cDNA는 인간 OB RNA의 수준을 측정하기 위해서 사용될 수 있다. 또한, 재조합 인간 단백질을 제조하여 지방 및 아마도, OB 단백질의 혈장 수준을 측정할 수 있는 면역시험법을 진행시킬 수 있다.
치료학적 관계
본 발명의 폴리펩타이드, 핵산 및 항체는 중요한 치료학적 잠재성을 갖는다. 바람직하게는, 약제학적으로 허용되는 캐리어, 희석제 또는 부형제중의 이러한 성분의 치료학적 유효량을 투여한다.
문구 "약제학적으로 허용되는"은 인간에게 투여되었을 때, 생리학적으로 허용되며, 통상적으로는 위장 업셋 (gastric upset), 현기증등과 같은 앨리지성 또는 유사하게 부적합한 반응을 발생시키지 않는 분자물질 및 조성물을 의미한다. 바람직하게는, 본 발명에서 사용되는 것으로서, 용어 "약제학적으로 허용되는"은 동물, 더욱 특히는 인간에게서 사용하도록 연방정부 또는 주정부의 관리기관에 의해서 공인되거나, 미국약전 또는 그밖에 일반적으로 인정되는 약전에 개시된 것을 의미한다. 용어 "캐리어"는 화합물과 함께 투여되는 희석제, 보조제, 부형제 또는 비히클을 의미한다. 이러한 약제학적 캐리어는 물, 및 낙화생유, 대두유, 광유, 호마유 등과 같은 석유, 동물, 식물 또는 합성 기원의 오일을 포함한 오일과 같은 멸균 액체일 수 있다. 물 또는 용액 식염용액 및 수성 덱스트로즈 및 글리세롤 용액이 특히, 주사용 용액을 위한 캐리어로서 바람직하게 사용된다. 적합한 약제학적 캐리어는 문헌 [Martin, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1990)]에 기술되어 있다.
문구 "치료학적 유효량"은 본 발명에서 숙주의 활성, 기능 및 반응에 있어서 임상적으로 유의적인 결핍을 적어도 약 15% 까지, 바람직하게는 적어도 50% 까지, 더욱 바람직하게는 적어도 90% 까지 감소시키며, 가장 바람직하게는 방지하는데 충분한 양을 의미하는 것으로 사용된다. 대용으로, 치료학적 유효량은 숙주에서 임상적으로 유의적인 상태의 개선을 야기시키는데 충분하다.
재조합 OB 폴리펩타이드의 투여는 체중 손실, 특히 지방조직의 감소를 야기시킨다. OB 폴리펩타이드는 표준 세균 및/또는 포유동물 발현벡터를 사용하여 합성적으로 제조될 수 있거나, 혈장 또는 혈청으로부터 정제될 수 있으며, 이들은 모두 본 명세서에서 상세히 전술한 바와 같다. 대용으로, 천연 OB 폴리펩타이드의 증가된 발현은 상기에서 기술한 바와 같은 동족성 재조합기술에 의해서 유도될 수 있다.
(생성되는 항체, 억제제, 중화항체의 이용 또는 안티센스 분자에 의한) OB 폴리펩타이드 활성의 감소는 체중 증가를 야기시키며, 이것은 암, AIDS 또는 신경성 식욕부진과 연관된 체중 손실의 치료를 위해서 바람직할 것이다. OB 활성의 변조는 (그의 활성을 증가시킴으로써) 체중을 감소시키거나, 또는 (그의 활성을 감소시킴으로써) 체중을 증가시키는데 유용할 수 있다.
폴리펩타이드-기본 치료학적 방법
가장 간단한 분석에서, OB 유전자는 포유동물, 특히 마우스 및 인간에서 체중을 결정한다. OB 유전자 생성물 및 따라서, 동종분자 (cognate molecules)는 지방조직이 뇌 및 다른 기관과 연결되는 시그날화 경로 (signaling pathway)의 일부분인 것으로 보인다. OB 폴리펩타이드는 그 자체가 시그날화 분자, 즉 호르몬인 것으로 믿어진다.
OB 폴리펩타이드, 또는 그의 작용적 활성단편 또는 그의 길항제는 경구적으로 또는 비경구적으로, 바람직하게는 비경구적으로 투여될 수 있다. 대사항상성은 연속적인 과정이기 때문에, ob 폴리펩타이드의 조절방출형 투여가 바람직하다. 예를들어, 폴리펩타이드는 정맥내 주입, 이식가능한 삼투성 펌프 (implantable osmotic pump), 경피 패취, 리포좀, 또는 그밖의 다른 투여방식을 사용하여 투여될 수 있다. 한가지 구체예에서는, 펌프가 사용될 수 있다 [Langer et al., eds., Medical Applications of Controlled Release, CRC Pres., Boca Raton, FIorida (1974); Sefton, CRC Cit. Ref. Biomed. Eng., 14:201 (1987); Buchwald et al., Surgery, 88:507 (1980); Saudek et al., N. Engl., J. Med., 321:574 (1989)]. 또 다른 구체예에서는, 폴리머성 물질이 사용될 수 있다 [Langer, 1974, 상기 참조; Sefton, 1987, 상기 참조; Smolen et al., eds., Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Wiley, New York (1984); Ranger et al., J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem., 23:61 (1983); 또한 Levy et al., Science, 228:190 (1985); During et al., Ann. Neurol., 25:351 (1989); Howard et al., J. Neurosurg., 71:105 (1989) 참조]. 추가의 또 다른 구체예에서는, 조절방출형 시스템을 치료표적, 즉 뇌에 근접하게 배치시킴으로써 전신적 용량의 단지 일부분 만이 필요하도록 할 수 있다 [참조예: Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, vol. 2, pp. 115-138 (1984)]. 그밖의 조절방출형 시스템은 문헌 [Langer, Science, 249:1527-1533 (1990)]에 의한 검토에서 언급되었다. 또 다른 구체예에서, 치료학적 화합물은 소포체, 특히 리포좀내에서 송달될 수 있다 [참조예: Langer, 1990, 상기 참조; Treat et al., in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353-365 (1989); Lopez-Berestein, 동일 문헌, pp. 317-327; 동일 문헌을 전반적으로 참조].
추가의 관점에서, OB 유전자에 의해서 형질전환되고 폴리펩타이드를 높은 수준으로 발현하는 재조합 세포는 ob 폴리펩타이드를 필요로하는 피검자에게 이식될 수 있다. 바람직하게는, 거부반응을 피하기 위해서 OB로 형질전환된 자가유래 세포를 이식하며; 또는 대용으로, 가용성 인자를 생성하는 비-자가유래 세포를 면역인식 및 거부반응을 방지하는 폴리머 매트릭스내에서 보호하는 기술이 이용될 수도 있다.
OB 폴리펩타이드는 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내 또는 피하의 투여경로로 송달될 수 있다. 대용으로, 적절하게 제제화된 OB 폴리펩타이드는 비내 또는 경구 투여에 의해서 투여될 수 있다. OB의 지속적인 공급은 치료학적 유효량 (즉, 피검자에게서 대사변화를 유도하는데 유효한 용량)을 필요한 간격, 예를들어, 매일, 12시간 마다, 등의 간격으로 제공함으로써 보장될 수 있다. 이들 파라메터는 치료되는 질병상태의 중증도, 실행된 식사변화와 같은 그밖의 다른 작용, 환자의 체중, 연령 및 성별, 및 본 기술분야에서 숙련된 전문가에 의한 우수한 표준 의료기술에 따라서 용이하게 결정될 수 있는 그밖의 다른 기준에 따라서 좌우된다.
약제학적 조성물
본 발명의 또 다른 추가의 관점에서는 상기의 약제학적 조성물이 제공된다. 이러한 약제학적 조성물은 주사용, 또는 경구, 폐, 비내 또는 그밖의 다른 투여형태로 투여하기 위한 것일 수 있다. 일반적으로, 본 발명에는 약제학적으로 허용되는 희석제, 보존제, 가용화제, 유화제, 보조제 및/또는 캐리어와 함께 본 발명의 단백질 또는 유도체 생성물의 유효량을 함유하는 약제학적 조성물이 포함된다. 이러한 조성물은 다양한 완충제 함량 (예를들어, 트리스-HCl, 아세테이트, 포스페이트), pH 및 이온강도를 갖는 희석제; 세정제 및 가용화제와 같은 첨가제 (예를들어, 트윈 (Tween) 80, 폴리소르베이트 80); 항산화제 (예를들어, 아스코르빈산, 나트륨 메타비설파이트); 보존제 (예를들어, 티메로살, 벤질알콜); 및 벌크화 성분 (bulking substances) (예를들어, 락토즈, 만니톨)을 포함하며; 폴리락트산, 폴리글리콜산 등과 같은 폴리머 화합물의 미립상 제제내에 또는 리포좀내에 물질을 혼입시킬 수도 있다. 히알우론산이 사용될 수도 있다. 이러한 조성물은 본 발명의 단백질 및 유도체의 물리적 상태, 안정성, 생체내 방출율 및 생체내 청소율에 영향을 미칠 수 있다 [참조예: Martin, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042) pages 1435-1712; 본 발명에 참고로 포함됨]. 조성물은 액체 형태로 제조될 수 있거나, 또는 동결건조된 형태와 같은 건조된 분말의 형태일 수도 있다.
경구적 송달
본 발명에서는 문헌 [Martin, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042), Chapter 89; 본 발명에 참고로 포함됨]에 일반적으로 기술된 경구용 고체 투약형의 사용이 고려된다. 고체 투약형에는 정제, 캅셀제, 환제, 트로치 (troches) 또는 로젠지 (lozenges), 카세 (cachets) 또는 펠릿 (pellets)이 포함된다. 또한, 리포좀 또는 프로테이노이드 (proteinoid) 캅셀화 (encapsulation)를 사용하여 본 발명의 조성물을 제제화시킬 수도 있다 (예를들어, 미합중국특허 제 4,925,673 호에 보고된 프로테이노이드 미소구 (microspheres)로서). 리포좀 캅셀화가 사용될 수도 있으며, 리포좀은 다양한 폴리머에 의해서 유도체화될 수도 있다 (예를들어, 미합중국특허 제 5,013,556 호). 치료를 위해서 이용가능한 고체 투약형에 대한 설명은 문헌 [Marshall, in Modern Pharmaceutics, Chapter 10, Banker and Rhodes ed., (1979); 본 발명에 참고로 포함됨]에 제시되어 있다. 일반적으로, 제제는 단백질 (또는 화학적으로 변형된 단백질), 및 위의 환경으로부터는 보호하고 장내에서 생물학적 활성물질이 방출되도록 하는 불활성 성분을 포함할 수 있다.
또한, 특히 상기의 유도체화된 단백질의 경구 투약형이 고려된다. 단백질은 유도체의 경구 송달이 효과적이도록 화학적으로 변형될 수 있다. 일반적으로, 고려되는 화학적 변형은 단백질 (또는 펩타이드) 분자 그자체에 적어도 하나의 부위를 부착시키는 것이며, 여기에서 이러한 부위는 (a) 단백분해의 억제; 및 (b) 위 또는 장으로부터 혈류내로의 흡수를 가능하게 한다. 또한, 단백질의 전반적인 안정성의 증가 및 신체내에서의 순환시간의 증가가 요구된다. 이러한 부위의 예로는 폴리에틸렌 글리콜, 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜의 코폴리머, 카복시메틸 셀룰로즈, 덱스트란, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 피롤리돈 및 폴리프롤린이 포함된다 [참조: Abuchowski et al., 1981. 상기 참조; Newmark et al., J. Appl. Biochem., 4:185-189 (1982)]. 사용될 수 있는 그밖의 다른 폴리머는 폴리-1,3-디옥솔란 및 폴리-1,3,6-티옥소칸이다. 상기 언급한 바와 같은 약제학적 용도에 바람직한 것은 폴리에틸렌 글리콜 부위이다.
단백질 (또는 유도체)의 경우에, 방출 위치는 위, 소장 (십이지장, 공장 또는 회장), 또는 대장일 수 있다. 본 기술분야에서 숙련된 전문가라면 위내에서는 용해하지 않지만 물질을 십이지장이나 장내의 다른 곳에서 방출할 수 있는 제제를 이용할 수 있다. 바람직하게는, 단백질 (또는 유도체)을 보호하거나, 생물학적 활성물질을 장내와 같이 위 환경을 넘어서서 방출시킴으로써 방출이 위 환경의 유해한 영향을 피할 수 있어야 한다.
전체의 위액 내성을 보장하기 위해서는 적어도 pH 5.0에 불투과성인 코팅이 필수적이다. 장용성 코팅으로 사용되는 더욱 통상적인 불활성 성분의 예는 셀룰로즈 아세테이트 트리멜리테이트 (CAT), 하이드록시프로필메틸셀룰로즈 프탈레이트 (HPMCP), HPMCP 50, HPMCP 55, 폴리비닐 아세테이트 프탈레이트 (PVAP), 유드라짓 (Eudragit) L30D, 아쿠아테릭 (Aquateric), 셀룰로즈 아세테이트 프탈레이트 (CAP), 유드라짓 (Eudragit) L, 유드라짓 S 및 셀락 (Shellac)이다. 이들 코팅은 혼합필름으로 사용될 수도 있다.
코팅 또는 코팅의 혼합물은 또한, 위에 대향하여 보호하기를 원하지 않는 정제에 대해서 사용될 수도 있다. 이것에는 당 (sugar) 코팅, 또는 정제를 더 잘 삼킬수 있도록 만드는 코팅이 포함될 수 있다. 캅셀제는 건조한 치료제, 즉 분말을 송달하기 위한 경질 외피 (shell)(예를들어, 젤라틴)로 구성될 수 있으며; 액체 형태인 경우에는 연질 젤라틴 외피가 사용될 수 있다. 카세의 외피물질은 농축 전분 또는 그밖의 다른 식용종이일 수 있다. 환제, 로젠지, 성형된 정제 또는 정제 연마물의 경우에는 습식괴 형성기술 (moist massing techniques)이 사용될 수 있다.
치료제는 약 1 mm의 입자크기를 갖는 과립 또는 펠릿 형태의 미세한 다미립자로서 제제내에 포함될 수 있다. 캅셀제 투여를 위한 물질의 제제는 또한 분말, 약하게 압축된 플러그 (plugs)로서, 또는 정제로도 이루어질 수 있다. 치료제는 압축시킴으로써 제조될 수 있다.
착색제 및 방향제가 모두 포함될 수 있다. 예를들어, 단백질 (또는 유도체)은 (예를들어, 리포좀 또는 미소구 캅셀화와 같은 방법에 의해서) 제제화된 다음에, 추가로 착색제 및 방향제를 함유하는 냉동음료와 같은 식용제품내에 포함될 수 있다.
치료제의 용적은 불활성 물질로 희석하거나 증가시킬 수 있다. 이들 희석제에는 탄수화물, 특히 만니톨, α-락토즈, 무수 락토즈, 셀룰로즈, 슈크로즈, 개질된 덱스트란 및 전분이 포함될 수 있다. 삼인산칼슘, 탄산마그네슘 및 염화나트륨을 포함한 특정의 무기염류가 충진제로서 사용될 수도 있다. 몇가지 시판품으로 이용할 수 있는 희석제는 패스트-플로 (Fast-Flo), 엠덱스 (Emdex), STA-Rx 1500, 엠콤프레스 (Emcompress) 및 아비셀 (Avicell)이다.
붕해제는 치료제를 고체 투약형으로 제제화하는 경우에 포함될 수 있다. 붕해제로 사용되는 물질에는 전분을 기본으로하는 시판 붕해제인 엑스플로탑(Explotab)을 포함하는 전분이 포함되나, 이들로 제한되는 것은 아니다. 나트륨 전분 글리콜레이트, 앰버라이트 (Amberlite), 나트륨 카복시메틸셀룰로즈, 울트라 마일로펙틴, 나트륨 알기네이트, 젤라틴, 오렌지 필 (orange peel), 산 카복시메틸 셀룰로즈, 천연 스폰지 및 벤토나이트가 모두 사용될 수 있다. 또 다른 형태의 부형제는 불용성 양이온 교환수지이다. 분말화된 고무는 붕해제로서 및 결합제로서 사용될 수 있으며, 이들에는 한천 (agar), 카라야 (karaya) 또는 트라가칸트 (tragacanth)와 같은 분말화된 고무가 포함될 수 있다. 알긴산 및 그의 나트륨 염도 또한 붕해제로서 유용하다.
결합제를 사용하여 치료제를 함께 결속시켜 경질 정제를 형성시킬 수 있으며, 이것에는 아라비아, 트라가칸트, 전분 및 젤라틴과 같은 천연 생성물로부터 선택된 물질이 포함된다. 그밖의 다른 것에는 메틸 셀룰로즈 (MC), 에틸 셀룰로즈 (EC) 및 카복시메틸 셀룰로즈 (CMC)가 포함된다. 폴리비닐 피롤리돈 (PVP) 및 하이드록시프로필메틸 셀룰로즈 (HPMC) 둘다가 치료제를 과립화시키기 위해서 알콜성 용액으로 사용될 수 있다.
감마제 (antifrictional agent)를 치료제의 제제내에 포함시켜 제제화 공정 중에 점착하는 것을 방지시킬 수 있다. 윤활제는 치료제와 주형 벽 사이의 층으로 사용될 수 있으며, 이들에는 스테아르산의 마그네슘 및 칼슘염을 포함한 스테아르산, 폴리테트라플루오로에틸렌 (PTFE), 액체 파라핀, 식물유 및 왁스가 포함될 수 있으나, 이들로 제한되는 것은 아니다. 나트륨 라우릴 설페이트, 마그네슘 라우릴 설페이트, 다양한 분자량의 폴리에틸렌 글리콜, 및 카르보왁스 (Carbowax) 4000 및 6000과 같은 가용성 윤활제가 사용될 수도 있다.
제제화중에 약물의 유동특성을 개선시킬 수 있고, 압축공정중에 재배열을 도와주는 활주제 (glidants)가 첨가될 수도 있다. 활주제에는 전분, 탈크, 발열성 실리카 (pyrogenic silica) 및 수화 실리코알루미네이트가 포함될 수 있다.
치료제가 수성 환경내에 용해하는 것을 돕기 위해서는 수화제로서 계면활성제가 첨가될 수 있다. 계면활성제에는 나트륨 라우릴 설페이트, 디옥틸 나트륨 설포석시네이트 및 디옥틸 나트륨 설포네이트와 같은 음이온성 세정제가 포함될 수 있다. 양이온성 세정제가 사용될 수도 있으며, 이것에는 벤잘코늄 클로라이드 또는 벤제토늄 클로라이드가 포함될 수 있다. 제제내에 계면활성제로서 포함될 수 있는 잠재적인 비이온성 세정제의 목록에는 라우로마크로골 400, 폴리옥실 40 스테아레이트, 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유 10, 50 및 60, 글리세롤 모노스테아레이트, 폴리소르베이트 40, 60, 65 및 80, 슈크로즈 지방산 에스테르, 메틸 셀룰로즈 및 카복시메틸 셀룰로즈가 있다. 이들 계면활성제는 단백질 또는 유도체의 제제중에 단독으로 또는 다양한 비의 혼합물로 존재할 수 있다.
잠재적으로 단백질 (또는 유도체)의 흡수를 증진시키는 첨가제는 예를들어, 지방산인 올레산, 리놀레산 및 리놀렌산이다.
조절방출형 제제가 바람직할 수 있다. 약물은 확산 또는 침출기전에 의해서 방출을 허용하는 불활성 매트릭스, 즉 고무내에 혼입시킬 수 있다. 서서히 변질하는 매트릭스도 또한 제제내에 혼입될 수 있다. 본 발명의 치료제의 또 다른 조절 방출형은 오로스 (Oros) 치료학적 시스템 (Alza Corp.)을 기본으로하는 방법에 의한 것인데, 즉 삼투효과에 의해서 물은 유입시키고 약물은 단일의 작은 개구부를 통해서 밀어내는 반투과성 막내에 약물을 봉입시킨다. 몇가지 장용성 코팅도 또한 지속방출효과를 갖는다.
그밖의 다른 코팅이 제제에 사용될 수도 있다. 이들에는 코팅팬 (coating pan)에서 적용될 수 있는 여러가지 당이 포함된다. 치료제는 또한, 필름-코팅 정제로 제조될 수도 있으며; 이러한 경우에 사용된 물질은 2 그룹으로 분류된다. 첫번째 그룹은 비장용성 (nonenteric) 물질이며, 메틸 셀룰로즈, 에틸 셀룰로즈, 하이드록시에틸 셀룰로즈, 메틸하이드록시-에틸 셀룰로즈, 하이드록시프로필 셀룰로즈, 하이드로시프로필-메틸 셀룰로즈, 나트륨 카복시-메틸 셀룰로즈, 프로비돈 및 폴리에틸렌 글리콜이 포함된다. 두번째 그룹은 통상적으로 프탈산의 에스테르인 장용성 물질로 구성된다.
물질의 혼합물을 사용하여 최적 필름 코팅을 제공할 수 있다. 필름 코팅은 팬 코팅기내에서 또는 유동층에서, 또는 압축코팅에 의해서 수행될 수 있다.
폐내 송달
본 발명에서는 본 발명의 단백질 (또는 그의 유도체)의 폐내 송달도 고려된다. 단백질 (또는 유도체)은 흡입하는 중에 포유동물의 폐에 송달되고, 폐 상피내 층을 가로질러 횡단하여 혈류로 들어간다. 이에 대한 그밖의 다른 보고는 문헌 [Adjei et al., Pharmaceutical Research, 7(6):565-569 (1990); Adjei et al., International Journal of Pharmaceutics, 63:135-144 (1990) (류프롤라이드 아세테이트); Braquet et al., Journal of Cardiovascular Pharmacology, 13(suppl. 5):143-146 (1989) (엔도텔린-1); Hubbard et al., Annals of Internal medicine, 3(3):206-212 (1989) (α1-안티트립신); Smith et al., J. Clin. Invest., 84:1145-1146 (1989) (α1-프로테이나제); Oswein et al., "Aerosolization of Proteins", Proceedings of Symposium on Respiratory Drug Delivery II, Keystone, Colorado, (1990. 3) (재조합 인간 성장호르몬); Debs et al., J. Immunol., 140:3482-3488 (1988); 및 Platz et al., 미합중국특허 제 5,284,656 호 (과립구 콜로니 촉진인자)]에 포함되어 있다. 본 발명을 실행하는 경우에는, 모두 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 친숙한 연무기 (nebulizers), 정량식 흡입기 (metered-dose inhalers) 및 분말 흡입기 (powder inhalers)를 포함하는, 치료제의 폐내 송달을 위해서 고안된 광범한 종류의 기계적 장치의 사용이 고려된다.
본 발명의 실행에 적합한 시판품으로 이용할 수 있는 장치의 몇가지 구체적인 예는 울트라벤트 (Ultravent) 연무기 (제조자: Mallinckrodt, Inc., St, Louis, Missouri); 아코른 (Acorn) II 연무기 (제조자: Marquest Medical Products, Englewood, Colorado); 벤톨린 (Ventolin) 정량식 흡입기 (제조자: Glaxo Inc., Research Triangle Park, North Carolina); 및 스핀할러 (Spinhaler) 분말 흡입기 (제조자: Fisons Corp., Bedford, Massachusetts)이다.
이러한 장치는 모두 단백질 (또는 유도체)의 분배에 적합한 제제의 사용이 필요하다. 일반적으로, 각각의 제제들은 사용되는 장치의 형태에 대해 특유한 것이며, 치료에 유용한 통상의 희석제, 보조제 및/또는 캐리어 이외에도 적절한 추진제 (propellant) 물질을 사용을 포함할 수 있다. 또한, 리포좀, 마이크로캅셀 또는 미소구, 포접 컴플렉스 (inclusion complex), 또는 다른 형태의 캐리어의 사용도 고려된다. 화학적으로 변형된 단백질은 또한 화학적 변형의 형태 또는 사용되는 장치의 형태에 따라서 다양한 제제로 제조될 수도 있다.
젯트 또는 초음파 연무기에 의해서 사용하기에 적합한 제제는 일반적으로, 용액의 ㎖당, 생물학적 활성단백질 약 0.1 내지 25 ㎎의 농도로 물에 용해된 단백질 (또는 유도체)을 함유할 수 있다. 제제는 또한 완충제 및 단순 당 (simple sugar)(예를들어, 단백질 안정화 및 삼투압의 조절을 위해서)을 포함할 수도 있다. 연무기 제제는 또한, 에어로졸의 형성시에 용액의 분무화에 의해서 야기된 단백질의 표면 유도된 응집을 감소시키거나 방지하는 계면활성제를 함유할 수도 있다.
정량식 흡입기 장치에 의해서 사용되는 제제는 일반적으로 계면활성제의 도움을 받아서 추진제내에 현탁된 단백질 (또는 유도체)을 함유하는 미분된 분말을 함유한다. 추진제는 트리클로로플루오로메탄, 디클로로디플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄올 및 1,1,1,2-테트라플루오로에탄, 또는 이들의 배합물을 포함한 클로로플루오로카본, 하이드로클로로플루오로카본, 하이드로플루오로카본, 또는 하이드로카본과 같이 이러한 목적으로 사용되는 통상적인 물질일 수 있다. 적합한 계면활성제에는 소르비탄 트리올리에이트 및 대두 레시틴이 포함된다. 올레산이 계면활성제로서 또한 유용할 수도 있다.
분말 흡입기 장치로부터 분배시키기 위한 제제는 단백질 (또는 유도체)을 함유하는 미분된 건조 분말로 이루어질 수 있으며, 또한 락토즈, 소르비톨, 슈크로즈 또는 만니톨과 같은 벌크화제를 장치로부터 분말의 분산을 촉진시키는 양으로, 예를들어 제제의 50 내지 90 중량%의 양으로 포함할 수 있다. 단백질 (또는 유도체)은 가장 유리하게는 원위 폐 (distal lung)에 가장 효과적으로 송달하기 위해서 10 ㎛ (또는 미크론) 미만, 가장 바람직하게는 0.5 내지 5 ㎛의 평균입자크기를 갖는 미립상 형태로 제조되어야 한다.
비내 송달
단백질 (또는 유도체)의 비내 송달도 또한 고려된다. 비내 송달은 생성물을 폐내에 침착시킬 필요없이 치료학적 생성물을 코에 투여한 직후에 단백질이 혈류로 통과하도록 한다. 비내 송달을 위한 제제는 이들을 덱스트란 또는 사이클로덱스트란과 함께 함유한다.
치료방법, 의약의 제조방법
본 발명의 또 다른 추가의 관점에서는 치료방법 및 의약의 제조방법이 제공된다. 본 발명의 유도체의 투여에 의해서 완화되거나 변조되는 상태는 상기에 언급한 것이다.
투여용량
상기의 모든 분자의 경우에, 추가의 시험이 수행됨에 따라서 다양한 환자에게서 다양한 상태를 치료하기에 적절한 투여용량 수준에 관한 정보를 얻을 수 있으며, 치료학적 환경, 수용주 (recipients)의 연령 및 일반적 건강상태를 고려하여 통상적으로 숙련된 작업자가 적절한 투여용량을 확인할 수 있다. 일반적으로, 주사 또는 주입의 경우에, 투여용량은 체중 kg당, 생물학적 활성단백질 0.01 ㎍ (화학적 변형이 없이 단백질 단독의 질량을 계산하여)와 10 mg/kg (동일한 기준) 사이일 수 있다. 투약 스케줄은 사용되는 단백질 또는 유도체의 순환 반감기, 폴리펩타이드가 볼루스 투약 (bolus dose) 또는 연속주입에 의해서 송달되는지 여부, 및 사용되는 제제에 따라서 달라질 수 있다.
다른 화합물과 함께 투여
비만과 연관된 치료를 위해서는 본 발명의 단백질 (또는 유도체)을 비만에 부수적으로 나타나는 당뇨병 (예를들어, 인슐린), 고혈압, 고콜레스테롤 및 그밖의 다른 유해한 상태의 치료에 사용되는 것과 같이 그밖의 다른 비만의 임상적 합병증을 치료하는데 사용되는 하나 또는 그 이상의 약제학적 조성물과 함께 투여될 수 있다. 또한, 그외의 식욕억제제, 예를들어, 암페타민이 공동투여될 수도 있다. 투여는 동시에 (예를들어, 본 발명의 단백질과 인슐린의 혼합물의 투여) 이루어질 수 있거나, 순차적으로 이루어질 수도 있다.
핵산-기본 치료학적 치료방법
OB 유전자는 인간 지방세포내에 도입되어 비만을 위한 유전자 치료법을 제공할 수 있다. 이러한 치료법은 체중을 감소시키는 것으로 예상된다. 이와는 반대로, 인간 지방세포내에 안티센스 구조물을 도입시키는 것은 활성 OB 폴리펩타이드의 수준을 감소시켜 신체 지방과다를 증가시키는 것으로 예상될 수 있다.
한가지 구체예에서, OB 폴리펩타이드를 코드화한 유전자는 생체내에서 바이러스성 벡터내로 도입시킨다. 이러한 벡터는 단순포진 바이러스 (HSV), 유두종 바이러스, 엡스타인 바르 바이러스 (EBV), 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스 (AAV) 등과 같은 (그러나, 이들로 제한되는 것은 아니다) 약독화 또는 결손 DNA 바이러스를 포함한다. 완전히 또는 거의 완전히 바이러스성 유전자가 결여된 결손 바이러스가 바람직하다. 결손 바이러스는 세포내에 도입시킨 후에 감염성이 없다. 결손 바이러스성 벡터를 사용함으로써 벡터가 다른 세포를 감염시킬 수 있다는 염려없이 특이적인 국소영역에서 세포에 대한 투여가 가능할 수 있다. 따라서, 지방 조직이 특이적으로 표적화될 수 있다. 특정한 벡터의 예로는 결손 헤르페스 바이러스 1 (defective herpes virus 1; HSV1) 벡터 [Kaplitt et al., Molec. Cell. Neurosci., 2:320-330 (1991)], 문헌 [Stratford-Perricaudet et al., J. Clin. Inves., 90:626-630 (1992)]에 기술된 벡터와 같은 약독화 아데노바이러스 벡터, 및 결손 아데노-관련 바이러스 벡터 [Samulski et al., J. Virol., 61:3096-3101 (1987); Samulski et al., J. Virol., 63:3822-3828 (1989)]가 포함되나, 이들로 제한되는 것은 아니다.
또 다른 구체예에서, 유전자는 예를들어, 문헌 [Anderson et al., 미합중국 특허 제 5,399,346 호; Mann et al., Cell, 33:153 (1983); Temin et al., 미합중국특허 제 4,650,764 호; Temin et al., 미합중국특허 제 4,980,289 호; Markowitz et al., J. Virol., 62:1120 (1988); Temin et al., 미합중국특허 제 5,124,263 호; 국제특허공보 제 WO 95/07358 호, 1995. 3. 16에 공개 (Dougherty et al.) ; 및 Kuo et al., Blood, 82:845 (1993)]에 기술된 바와 같이 레트로바이러스성 벡터에 도입될 수 있다.
대용으로, 벡터는 리포펙션 (lipofection)에 의해서 생체내에 도입될 수 있다. 지난 10년 동안, 시험관내에서 핵산의 캅셀화 및 형질감염을 위한 리포좀의 사용이 증가되어 왔다. 리포좀 매개된 형질감염이 직면하게 되는 어려움 및 위험을 제한하도록 고안된 합성 양이온성 지질을 사용하여 마커를 코드화한 유전자의 생체내 형질감염을 위한 리포좀을 제조할 수 있다 [Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:7413-7417 (1987); 참조 Mackey et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:8027-8031 (1988)]. 양이온성 지질의 사용은 음으로 하전된 핵산의 캅셀화를 촉진시킬 수 있으며, 또한 음으로 하전된 세포막과의 융합을 촉진시킬 수도 있다 [Felgner et al., Science, 337:387-388 (1989)]. 생체내에서 특이적 기관내에 외인성 유전자를 도입시키는데 리포펙션을 사용하는 것은 특정의 실질적인 잇점을 갖는다. 특이적 세포에 대한 리포좀의 분자 표적화는 잇점의 한가지 영역을 나타낸다. 특정 세포 형태에 형질감염을 지시하는 것은 췌장, 간, 신장 및 뇌와 같이 세포 불균질성이 있는 조직에서 특히 이로울 수 있음이 명백하다. 지질은 표적화를 목적으로 하여 다른 분자에 화학적으로 커플링될 수 있다 (참조: Mackey et al., 1988, 상기 참조). 표적화된 펩타이드, 예를들어 호르몬 또는 신경전달물질, 및 항체와 같은 단백질, 또는 비-펩타이드 분자는 화학적으로 리포좀에 커플링될 수 있다.
또한, 벡터는 생체내에서 노출된 (naked) DNA 플라스미드로서 도입시킬 수도 있다. 유전자 치료법을 위한 노출된 DNA 벡터는 본 기술분야에서 공지된 방법, 예를들어 형질감염, 전기천공법 (electroporation), 미량주사, 형질도입, 세포융합, DEAE 덱스트란, 인산칼슘 침강반응, 유전자 총의 사용, 또는 DNA 벡터 수송체(transporter)의 사용에 의해서 목적하는 숙주세포내로 도입될 수 있다 [참조예: Wu et al., J. Biol. Chem., 267:963-967 (1992); Wu et al., J. Biol. Chem., 263:14621-14624 (1988); Hartmut et al., 캐나다 특허출원 제 2,012,311 호, 1990. 3. 15 출원].
농업분야
OB 유전자는 또한 가축으로부터 분리될 수도 있으며, 이에 의해서 상응하는 OB 폴리펩타이드가 수득된다. 이하의 구체적인 실시예에서, 쥐의 OB 유전자로부터 유도된 프로브를 대다수의 동물 종으로부터 유래하는 상응하는 동종성 코드화 서열에 하이브리드화시킨다. 인간 치료법의 경우에 언급한 바와 같이, 재조합 단백질을 또한 제조하여 가축에게 투여할 수도 있다. 폴리펩타이드의 투여를 수행하여 육우, 돼지, 가금, 양 등과 같은 더 여윈 식용동물을 생산할 수 있다. 바람직하게는, 자가유래 OB 폴리펩타이드를 투여하지만, 본 발명에는 안티-자가유래 폴리펩타이드의 투여도 마찬가지로 포함된다. OB 폴리펩타이드는 약 160개의 아미노산 잔기로 구성되기 때문에, 이것은 고도로 면역원성은 아닐 수 있다. 따라서, 비-자가유래 폴리펩타이드의 투여는 면역반응을 일으키지 않을 수도 있다.
대용으로, 유전자이식 (transgenic) 가축에 클로닝된 유전자를 도입시키면 OB 이식유전자를 과발현시킴으로써 체중 및 지방과다를 잠제적으로 감소시킬 수 있다. 이를 성취하기 위한 가장 간단한 방법은 그 자신 또는 또 다른 지방 특이적 프로모터를 사용하여 OB 이식유전자를 지방에 대해 표적화시키는 것일 수 있다.
반대로, 체지방의 증가가 푸아그라 (foie gras)를 만들기 위해서 코브 육우(Kobe beef) 또는 지방간을 발생시키기 위한 것과 같은 그밖의 다른 환경에서는 바람직할 수 있다. 이것은 안티센스 OB 이식유전자를 지방에 대해서 표적화시키거나, 유전자 녹아웃 (knockout) 기술을 사용함으로써 성취될 수 있다. 대용으로, 지방의 백분율로 체중의 증가를 원하는 경우에는, OB 폴리펩타이드의 억제제 또는 길항제가 투여될 수 있다. 이러한 억제제 또는 길항제에는 폴리펩타이드와 반응성인 항체, 및 OB 수용체와 결합하지만 OB 수용체를 활성화시키지는 않는 폴리펩타이드의 단편, 즉, OB 폴리펩타이드의 길항체가 포함된다.
미용 분야
OB 폴리펩타이드는 건강상의 잇점 이외에도 미용적 용도로 사용하는데 중요한 가치를 갖는다. 특히, 그의 유도체 및 작용동족체를 포함한 본 발명의 OB 폴리펩타이드는 동물에서 지방세포 침착의 비율 및 양을 변조시키는데 유용하기 때문에, 이들은 보기 싫은 지방조직, 즉 필수적으로 비만 상태에 달하는 것은 아니지만, 그럼에도 불구하고 개인의 외관을 손상시키는 복부, 둔부, 대퇴부, 목 및 턱에서의 지방 침착을 감소시키는데 유용하다. 지방 감소효과는 부분적으로 식욕의 감소, 즉 식품 섭취의 감소에 의해서, 또는 기초대사의 증가에 의해서 또는 둘다에 의해서 이루어지는 것으로 생각된다. 즉, 본 발명의 OB 폴리펩타이드 또는 그의 유도체 또는 작용동족체는 지방 침착을 변조시키든지, 식욕을 감소시키든지, 또는 둘다이든지 간에 지방조직 침착물에서 미용적 변화를 일으키기 위해서 피검자에게 투여하는데 유용하다.
또한, 본 발명의 조성물 및 방법은 신체의 전반적인 외관을 변화시키도록 고안된 미용외과수술 (예를들어, 지방조직을 흡인하거나 제거함으로써 체질량을 감소시키도록 고안된 지방흡입술 또는 레이저 수술), 운동 (특히 달리기 및 웨이트 트레이닝 (weight training)), 저지방 식사, 최면법, 생체피드백 (biofeedback)과 같은 다양한 방법과 함께 사용될 수 있는데, 이러한 방법의 예로 지방조직의 백분율을 감소시키고 신체의 외관을 개선시키도록 시도할 수 있다.
따라서, 본 발명은 지방 변조량의 OB 폴리펩타이드 또는 그의 유도체 또는 작용동족체를 미용적 지방조직 변조를 원하는 개체에게 투여하여 전반적인 신체외관을 개선시킴을 특징으로하여 개체에게서 미용적 지방조직 변조를 일으키는 방법에 관한 것이다. 특정의 관점에서, 지방조직 변조는 식욕억제의 결과이다. 바람직하게는, 지방조직 변조는 지방조직의 감소이다.
추가의 구체예에서, 본 발명은 신체외관을 변화시키는 방법을 미용적 지방조직 변조를 원하는 개체에 대한 지방 변조량의 OB 폴리펩타이드 또는 그의 유도체 또는 작용동족체의 투여와 조합시킴으로써 전반적인 신체외관을 개선시킴을 특징으로하여 미용적 지방조직 손실을 일으키는 방법에 관한 것이다.
OB 수용체
OB 인자의 소분자 작용제 및 길항제의 개발은 그의 수용체의 분리에 의해서 크게 촉진될 수 있다. 이것은 활성 OB 폴리펩타이드를 제조하고, 이것을 사용하여 표준방법을 사용하는 발현 라이브러리를 선별함으로써 이루어질 수 있다. 발현 라이브러리에서 수용체 결합은 세균이나 포유동물 발현벡터를 사용하여 제조된 재조합 폴리펩타이드를 투여하고, 발현 라이브러리의 세포에 대한 재조합 폴리펩타이드의 단기간 및 연속적 투여의 효과를 관찰하거나, 세포에 대한 OB 폴리펩타이드의 결합을 직접 검출함으로써 시험할 수 있다.
현재, OB 수용체는 시상하부 및 아마도 간에 위치하는 것으로 믿어지기 때문에, 바람직하게는 이들 조직으로부터의 cDNA 라이브러리는 표준 발현 클로닝 벡터에서 작제될 수 있다. 다음에 이들 cDNA 클론은 푸울 (pool)로서 COS 세포에 도입시킬 수 있으며, 생성된 형질전환체를 활성 리간드를 사용하여 선별하여 OB 수용체를 발현하는 COS 세포를 확인할 수 있다. 그후, 클로닝된 수용체를 회수하기 위해서 양성 클론을 분리시킬 수 있다. 클로닝된 수용체를 OB 리간드 (이것은 호르몬으로 추정됨)와 함께 사용하여 OB의 소분자 변조물질을 선별하는데 필요한 성분을 개발할 수 있다.
본 발명에 따라서 이용되는 특정한 시험시스템은 수용체 시험방법으로 공지되어 있다. 수용체 시험방법에서는, 시험할 물질을 적절히 표지한 다음에 특정한 세포성 시험 콜로니를 일정량의 표지된 물질 및 비표지된 물질 둘다와 함께 배양한 후에, 결합시험을 수행하여 표지된 물질이 세포 수용체에 결합하는 정도를 측정한다. 이 방법에서는, 물질들간의 친화성에 있어서의 차이가 확인될 수 있다.
따라서, 정제된 양의 체중 변조물질을 방사성표지하고, 예를들어 그에 대한 항체 또는 그밖의 다른 억제제와 배합시킬 수 있으며, 그 후에 결합시험을 수행할 수 있다. 그후, 다양한 양의 표지 및 비표지된 비결합 체중 변조물질을 함유하는 용액을 제조한 다음, 세포 샘플을 접종하고, 그후에 배양할 수 있다. 그후, 생성된 세포 단일층을 세척하고, 가용화시킨 다음, < 5%의 표준오차를 수득하기에 충분한 시간 동안 감마 계수기 (gamma counter)에서 계수한다. 그후, 이들 데이타를 스캐챠드 분석 (Scatchard analysis)으로 처리한 다음에, 물질 활성에 관한 관찰 및 고찰을 이끌어 낼 수 있다. 전술한 것은 예시적인 것이지만, 이것은 시험한 물질의 세포결합능이 식별할 수 있는 특징으로 작용할 수 있는 경우에, 수용체 시험을 수행하고 이용할 수 있는 방식을 설명하는 것이다. 다시 말하면, 수용체 시험 방법은 db 수용체와 같은 본 발명의 변조물질에 대한 특이 수용체의 확인에 특히 유용하다.
본 발명에 따라서 유용하며 고려되는 추가의 시험방법은 "시스/트랜스" 시험 방법으로 알려져 있다. 간략하면, 이 시험방법은 두개의 유전자 구조물을 사용하는데, 이중의 하나는 일반적으로 적절한 세포라인내로 형질감염되는 경우에 문제의 특정한 수용체를 연속적으로 발현하는 플라스미드이고, 두번째 것은 수용체/리간드 컴플렉스의 조절하에서 루시퍼라제와 같은 수용체를 발현하는 플라스미드이다. 따라서, 예를들어, 화합물을 특정한 수용체에 대한 리간드로서 평가하기를 원하는 경우에, 플라스미드중의 하나는 선택된 세포라인에서 수용체의 발현을 유도하는 구조물인 반면에, 두번째 플라스미드는 특정한 수용체에 대한 반응요소가 삽입되어 있는 루시퍼라제 유전자에 연결된 프로모터를 가질 수 있다. 시험하는 화합물이 수용체에 대한 작용제인 경우에, 리간드는 수용체와 컴플렉스를 형성할 수 있으며, 생성된 컴플렉스는 반응요소와 결합하여 루시퍼라제 유전자의 전사를 개시시킨다. 그후에, 생성된 화학발광을 광도측정법에 의해서 측정하고, 용량반응곡선을 수득하여 공지의 리간드와 용량반응곡선과 비교한다. 전술한 프로토콜은 미합중국특허 제 4,981,784 호 및 PCT 국제공개 제 WO 88/03168 호 (이들의 목적은 숙련된 전문가에 의해서 참고로 한다)에 상세히 기술되어 있다.
일단 OB 수용체 유전자 서열을 발현하는 재조합체가 확인되면, 재조합 OB 수용체를 분석할 수 있다. 이것은 수용체의 방사성 표지에 이어서 겔 전기영동, 면역시험법, 리간드 결합 등에 의해서 분석하는 것을 포함하여 OB 수용체의 물리적 또는 기능적 특성을 기본으로한 시험방법에 의해서 이루어진다. 또한, ob 수용체에 대한 항체가 상술한 바와 같이 생성될 수도 있다.
OB 수용체의 구조는 본 기술분야에서 공지된 다양한 방법에 의해서 분석할 수 있다. 바람직하게는, 다양한 영역, 특히 OB 결합부위의 구조를 분석한다. 구조분석은 다른 공지의 단백질, 특히 호르몬 및 단백질 수용체와의 서열 유사성을 확인함으로써 수행될 수 있다. 유사성 (또는 동종성)의 정도는 OB 수용체 또는 그의 영역의 구조 및 기능을 예견하기 위한 기초를 제공할 수 있다, 특정한 구체예에서, 서열 비교는 예를들어, FASTA 및 FASTP 프로그램을 사용하여 진뱅크(GenBank)에 있는 서열에 의해서 수행할 수 있다 [Pearson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:2444-48 (1988)].
단백질 서열은 친수성 분석에 의해서 더 특정화될 수 있다 (예를들어, Hopp et al., 1981, 상기 참조). 친수성 프로필을 사용하여 OB 수용체 단백질의 소수성 및 친수성 부분을 확인할 수 있으며, 이것은 다시 세포질외, 막결합 및 세포질내 부분을 나타낼 수 있다.
이차 구조분석 (예를들어, Chou et al., 1974, 상기 참조)을 또한 수행하여 특이적 이차구조를 나타내는 OB 수용체의 부분을 확인할 수 있다.
조작, 해독, 및 이차 구조 예견 및 개방판독 프레임 예견 및 플로팅(plotting)도 또한 본 기술분야에서 이용할 수 있는 컴퓨터 소프트웨어 프로그램을 사용하여 수행할 수 있다.
재조합 OB 폴리펩타이드의 풍부한 공급원 및 OB 수용체 (즉, db 유전자 생성물)을 분리시킬 기회를 제공함으로써, 본 발명은 OB 폴리펩타이드 및 OB 수용체, 또는 그의 영역의 활성배좌 (active conformation)의 정량적인 구조결정을 할 수 있다. 특히, 핵자기공명 (NMR), 적외선 (IR), 라만 (Raman) 및 자외선 (UV), 특히 원편광 이색성 (CD), 분광학적 분석을 위한 충분한 물질이 제공된다. 특히, NMR은 그들의 천연적 환경과 더 밀접하게 유사한 용액내에서 분자의 매우 강력한 구조분석을 제공한다 (Marion et al., 1983, 상기 참조; Bar et al., 1985, 상기 참조; Kimura et al., 1980, 상기 참조). 구조분석의 다른 방법이 사용될 수도 있다. 이들에는 X-선 결정학이 포함되나, 이것으로 제한되는 것은 아니다 (Engstom, 1974, 상기 참조).
더욱 바람직하게는, OB 폴리펩타이드 및 OB 수용체의 공결정 (co-crystals)을 시험할 수 있다. 공결정의 분석으로 결합에 대한 상세한 정보가 제공되며, 이것은 다시 리간드 작용제 및 길항제의 이상적인 디자인을 가능하게 한다. 특히 NMR 또는 X-선 방법과 관련하여서는 컴퓨터 모델링이 또한 사용될 수도 있다 [Fletterick et al., eds., Computer Graphics and Molecular Modeling, in Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1986)].
본 발명의 OB 수용체를 코드화한 유전자의 확인 및 분리는 천연 공급원으로부터 분리될 수 있는 것보다 더 다량으로, 또는 세포의 형질감염 또는 형질전환후에 발현된 수용체의 활성을 나타내도록 특별히 조작된 인디케이터 세포 (indicator cells)내에서 수용체의 발현을 제공한다. 따라서, OB 폴리펩타이드의 구조를 기초로한 작용제 및 길항제의 이상적 디자인 이외에도 본 발명은 본 기술분야에서 공지된 다양한 선별시험방법을 사용하여 OB 수용체의 특이적 리간드를 확인하는 대체방법을 제공한다.
본 발명은 이하의 실시예를 참고로하여 더 잘 이해될 수 있으며, 이들 실시예는 본 발명의 예로 제시된 것이며 본 발명을 제한하는 것은 아니다.
발명의 요약
본 발명에 따르면, 동물, 특히 포유동물의 지방과다 및 지방 함량을 조절하는 문제는 본 명세서에 기술된 바와 같은 비만 (OB) 폴리펩타이드 및 이들 폴리펩타이드에 대해 코드화된 핵산 분자를 제공함으로써 해결되었다. 본 발명은 첫번째로, 체중 및 지방과다를 변조, 즉 제어 및 조절하는데 유용한 분리된 폴리펩타이드, 및 OB 폴리펩타이드의 제조합체 생산을 허용할 뿐 아니라 그들 자체가 체중을 변조시키는데 유용한 이러한 폴리펩타이드를 코드화한 핵산 서열을 제공한다.
본 발명의 비만 (OB) 폴리펩타이드는 약 145 내지 약 167개의 아미노산을 가지며, 동물, 특히 포유동물에서 체중을 변조시킬 수 있고, 동일한 생물학적 활성을 갖는 그의 단편을 포함한 대립유전자 변이체 또는 유사체를 포함한다. 폴리펩타이드는 재조합 방법 또는 화학적 합성방법에 의해서 제조될 수 있다. 현재 바람직한 OB 폴리펩타이드에는 SEQ ID NOS: 2, 4, 5 또는 6의 아미노산 서열을 갖는 것, 또는 그의 단편을 포함한 대립유전자 변이체 또는 유사체가 포함된다.
본 발명의 OB 폴리펩타이드의 면역원성 단편에는 Val-Pro-Ile-Gln-Lys-Val-Gln-Asp-Asp-Thr-Lys-Thr-Leu-Ile-Lys-Thr (SEQ ID NO: 18); Leu-His-Pro-Ile-Leu-Ser-Leu-Ser-Lys-Met-Asp-Gln-Thr-Leu-Ala (SEQ ID NO: 19); Ser-Lys-Ser-Cys-Ser-Leu-Pro-Gln-Thr-Ser-Gly-Leu-Gln-Lys-Pro-Glu-Ser-Leu-Asp (SEQ ID NO: 20); 및 Ser-Arg-Leu-Gln-Gly-Ser-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Gln-Gln-Leu-Asp-Val-Ser-Pro-Glu-Cys (SEQ ID NO: 21)이 포함된다.
인간 OB 폴리펩타이드 유사체에는 아미노산 53, 56, 71, 85, 89, 92, 95, 98, 110, 118, 121, 122, 126, 127, 128, 129, 132, 139, 157, 159, 163 및 166 (SEQ ID NO: 4의 넘버링에 따름)중의 하나 또는 그 이상이 SEQ ID NO: 2에서 기술된 것과 같은 마우스 OB 폴리펩타이드의 분기된 이미노산 또는 알라닌과 같은 다른 아미노산으로 치환된 SEQ ID NOS: 4 및 6의 인간 아미노산 서열을 갖는 것이 포함된다. 이러한 유사체는 또한 (a) 위치 53에서 세린 잔기가 글리신, 알라닌, 발린, 시스테인, 메티오닌 또는 트레오닌으로 치환되고; (b) 위치 98에서 세린 잔기가 글리신, 알라닌, 발린, 시스테인, 메티오닌 또는 트레오닌으로 치환되고; (c) 위치 번호 92에서 아르기닌 잔기가 아스파라긴, 라이신, 히스티딘, 글루타민, 글루타민산, 아스파르틴산, 세린, 트레오닌, 메티오닌 또는 시스테인의 특허청구범위 제 5 항 내지 7 항의 변이된 동족체는 변이위치가 명확하게 특정되지 않았다는 심사관님의 지적으로 치환된 것을 포함한다. 본 발명에 따르는 OB 폴리펩타이드 유사체는 바람직하게는 SEQ ID NO: 2, 4, 5 또는 6으로 기술된 인간 OB 폴리펩타이드 아미노산 서열에 대해서 83% 또는 그 이상의 아미노산 서열 상동성을 갖는다.
본 발명에 따르는 추가의 인간 OB 폴리펩타이드 유사체는 SEQ ID NOS: 4 및 6의 아미노산 서열을 가지며, (a)글루타민산으로 치환된 하나 또는 그 이상의 아스파르틴산 잔기; (b) 로이신으로 치환된 하나 또는 그 이상의 이소로이신 잔기; (c) 알라닌으로 치환된 하나 또는 그 이상의 글리신 또는 발린 잔기; (d) 히스티딘으로 치환된 하나 또는 그 이상의 아르기닌 잔기; (e) 트리프토판으로 치환된 하나 또는 그 이상의 티로신 또는 페닐알라닌 잔기; (f) 글리신 또는 알라닌으로 치환된 잔기 121 내지 128 (SEQ ID NO: 4의 넘버링에 따름)중의 하나 또는 그 이상; 및 (g) 라이신, 글루타민산, 시스테인 또는 프롤린으로 치환된 위치 54 내지 60 또는 118 내지 166 (SEQ ID NO: 4의 넘버링에 따름)에서의 하나 또는 그 이상의 잔기를 갖는다.
본 발명에 따르는 바람직한 인간 OB 폴리펩타이드 절단된 유사체에는 (SEQ ID NO: 4의 넘버링에 따라) (a) 위치 121 내지 128에서 하나 또는 그 이상의 잔기가 결실되고; (b) 잔기 1-116이 결실되고; (c) 잔기 1-21 및 54 내지 167이 결실되며; (d) 잔기 1-60 및 117 내지 167이 결실되고; (e) 잔기 1-60이 결실되며; (f) 잔기 1-53이 결실된 것; 및 (g) 잔기 1-21이 결실된 서브파트 (a)의 유사체가 포함된다. 21 아미노산 "시그날" 서열 (예를들어, SEQ ID NO: 4의 아미노산 1 내지 21)이 결여된 본 발명의 OB 폴리펩타이드 및 ob 폴리펩타이드 유사체는 (1) 메티오닌, (2) 글리신-세린-히스티딘-메티오닌 서열 (SEQ ID NO: 38), (3) 메티오닌-글리신-세린-세린-히스티딘-히스티딘-히스티딘-히스티딘-히스티딘-히스티딘-세린-세린-글리신-로이신-발린-프롤린-아르기닌-글리신-세린-히스티딘-메티오닌 서열 (SEQ ID NO: 98), (4) 로이신-글루타민산-라이신-아르기닌-글루타민산-알라닌-글루타민산-알라닌 서열 (SEQ ID NO: 26), (5) 글루타민산-알라닌-글루타민산-알라닌 서열 (SEQ ID NO: 27), (6) 로이신-글루타민산-라이신-아르기닌 서열 (SEQ ID NO: 28), (7) 메티오닌-글리신-세린-세린-히스티딘-히스티딘-히스티딘-히스티딘-히스티딘-히스티딘-세린-세린-글리신-로이신-발린-프롤린-아르기닌-글리신-세린-프롤린 서열 (SEQ ID NO: 99) 및 (8) 글리신-세린-프롤린 서열과 같은 N-말단 아미노산 또는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
본 발명에 따르는 OB 폴리펩타이드의 유도체는 여기에 부착된, 폴리에틸렌글리콜과 같은 수용성 폴리머를 포함하는 하나 또는 그 이상의 화학적 부위를 갖는다. 폴리에틸렌글리콜 유도체화된 유도체는 모노-, 디-, 트리- 또는 테트라페질화, 예를들어 N-말단 모노페질화 (monopegylated)될 수 있다. 본 발명의 ob 폴리펩타이드의 바람직한 N-말단 모노페질화 유도체에는 임의로 21 위치에 (페질화된) 메티오닌을 갖는, SEQ ID NO: 4의 아미노산 잔기 22 내지 167 또는 SEQ ID NO: 6의 잔기 22 내지 166을 함유하는 OB 폴리펩타이드가 포함된다.
본 발명에 의해서 제공된 분리된 핵산 분자는 상술한 바와 같이, 단편을 포함한, OB 폴리펩타이드, 대립유전자 또는 유사체를 코드화한다. 구체적으로는, 포유동물에서 체중을 변조시키는 생물학적 활성을 갖는 OB 폴리펩타이드의 발현을 보장하는데 사용하기 위한 것으로, (a) SEQ ID NOS: 1 및 3으로 기술된 DNA 분자 또는 그의 단편; (b) (a)에서 정의된 DNA 분자에 하이브리드화하는 DNA 분자 또는 그의 하이브리드화 가능한 단편; 및 (c) 전술한 DNA 분자 중의 어떤 것에 의해서라도 코드화된 아미노산 서열에 대한 발현을 코드화한 DNA 분자로 구성된 그룹으로부터 선택된 DNA 분자가 제공된다. 이러한 분자의 예는 SEQ ID NOS: 22 및 24의 인간 지놈 DNA 분자이다.
본 발명에 따르는 바람직한 DNA 분자는 (a) SEQ ID NO: 2; (b) SEQ ID NO: 2의 아미노산 22 내지 167; (c) SEQ ID NO: 4; (d) SEQ ID NO: 4의 아미노산 22 내지 167; (e) SEQ ID NO: 5; (f) SEQ ID NO: 5의 아미노산 22 내지 166; 및 (g) SEQ ID NO: 6; 및 (h) SEQ ID NO: 6의 아미노산 22 내지 166으로 기술된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드, 및 전술한 바와 같은 N-말단 아미노산 또는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 코드화한다. 예를들어, 바람직한 DNA 분자는 SEQ ID NO: 3의 단백질 코드화 서열로 기술된 서열을 가지며, 특히 아미노산 22 내지 167을 코드화한 서열로 기술된 서열을 갖는다.
본 발명의 DNA 분자에 하이브리드화 가능한 검출가능하게 표지된 핵산 분자가 또한 제공되며, 여기에는 인트론 (intron), 5' 비-코드화 부분 및 3' 비-코드화 부분으로 구성된 그룹으로부터 선택된 OB 핵산의 비-코드화 부분에 하이브리드화 가능한 핵산 분자가 포함된다. 본 발명은 또한, SEQ ID NOS: 29 내지 32에 기술된 올리고뉴클레오타이드와 같은 ob 폴리펩타이드를 코드화한 인간 지놈 DNA를 증폭시키기 위한 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 제공한다.
본 발명에 의해서 제공된 벡터는 상술한 바와 같은 본 발명에 따르는 DNA 분자를 함유하며, 바람직하게는 발현조절서열과 작동가능하게 결합된 DNA 분자를 포함하는 발현벡터의 형태를 갖는다. 본 발명의 단세포성 숙주세포는 본 발명의 DNA 분자로, 또는 상술한 바와 같은 벡터로 형질전환되거나 형질감염된다. 바람직한 숙주세포에는 세균, 효모, 포유동물 세포, 식물 세포, 곤충 세포, 및 조직배양되는 인간 세포가 포함된다. 예를들어, 이러한 숙주세포는 이. 콜라이 (E. coli), 슈도모나스 (Pseudomonas), 바실루스 (Bacillus), 스트렙토마이세스 (Streptomyces), 효모, CHO, R1.1, B-W, L-M, COS 1, COS 7, BSC1, BSC40, BMT10 및 Sf9 세포로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 현재 바람직한 효모 숙주에는 사카로마이세스(Saccharomyces), 피치아 (Pichia), 칸디다 (Candida), 한세눌라 (Hansenula) 및 토룰롭시스 (Torulopsis)가 포함된다. 또한, ob 폴리펩타이드 코드화 DNA 서열을 함유하며, ob 폴리펩타이드 코드화 서열에 작용적으로 인접하여 발현조절서열을 삽입시키는 것으로 구성되는 동족성 재조합 과정을 이용함으로써 ob 폴리펩타이드의 더 고도의 발현이 가능하도록 시험관내에서 변형된 포유동물 세포가 제공된다. 발현조절서열은 ob 폴리펩타이드를 발현시키거나 아닐 수 있으며, 세포 내에서 돌연변이 ob 폴리펩타이드 조절서열을 대체시킬 수 있다.
본 발명은 (a) 상술한 바와 같은 세포를 ob 폴리펩타이드의 발현을 제공하는 조건하에서 배양하고; (b) 발현된 ob 폴리펩타이드를 회수하는 단계를 포함하여 ob 폴리펩타이드를 제조하는 방법을 제공한다. 이 방법은 또한 (c) 폴리펩타이드를 Ni-킬레이트화 칼럼 상에서 크로마토그라피시키고; (d) 폴리펩타이드를 겔여과에 의해서 정제하는 단계를 수반할 수도 있다. 바람직한 구체예에서, 이 방법은 단계 (c)와 단계 (d) 사이에 ob 폴리펩타이드를 강한 양이온교환 칼럼 상에서 크로마토그라피시키는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명의 ob 폴리펩타이드에 대해 특이적인 표지 및 비표지된 모노클로날 및 폴리클로날 항체, 및 본 발명의 모노클로날 항체를 생산하는 불멸세포 (immortal cells)를 제공한다. 본 발명에 따르는 항체의 제조에는 (a) 캐리어 (carrier) 단백질에 ob 폴리펩타이드를 컨쥬게이트시키고; (b) 숙주동물을 보조제 (adjuvant)와 혼합된 단계 (a)의 OB 폴리펩타이드 단편-캐리어 단백질 컨쥬게이트로 면역시키고; (c) 면역된 숙주동물로부터 항체를 수득하는 단계를 포함한다.
본 발명은 (a) OB 폴리펩타이드를 함유하는 것으로 의심되는 샘플을 항체 및 OB 폴리펩타이드를 함유하는 반응 컴플렉스의 형성을 허용하는 조건하에서 OB 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 (바람직하게는 고체 지지체에 결합된) 항체와 접촉시키고; (b) 샘플 내에서 항체 및 ob 폴리펩타이드를 함유하는 반응 컴플렉스의 형성을 검출하는 단계 (여기에서, 반응 컴플렉스의 형성이 검출되는 것은 샘플 내에 OB 폴리펩타이드가 존재하는 것을 시사한다)를 포함하여, 샘플 내에서 OB 폴리펩타이드의 존재를 측정하는 방법을 제공한다. 이에 상응하게 (a) 상술한 방법에 따라 생물학적 샘플 내에서 반응 컴플렉스의 형성을 검출하고; (b) 형성된 반응 컴플렉스의 양 (여기에서, 반응 컴플렉스의 양은 생물학적 샘플 내의 OB 폴리펩타이드의 수준에 상응한다)을 평가하는 단계를 포함하여, 생물학적 샘플 내의 OB 폴리펩타이드의 수준을 평가하는 시험관내 방법을 제공한다. 본 발명에 따라 OB 폴리펩타이드의 상승 또는 감소된 수준과 연관된 질병의 존재를 검출 또는 진단하는 경우에, 상술한 바와 같은 평가가 이루어지며, 검출된 수분은 정상적인 피검자 또는 더 빠른 시기의 피검자에게서 존재하는 OB 폴리펩타이드의 수준과 비교한다. 정상 수준 또는 이전의 수준에 비해서 OB 폴리펩타이드의 수준이 증가한 것은 OB 폴리펩타이드의 상승된 수준과 연관된 질병을 시사하며, 정상적인 수준에 비해서 OB 폴리펩타이드의 수준이 감소한 것은 OB 폴리펩타이드의 감소된 수준과 연관된 질병을 시사한다. 이에 상응하게, OB 폴리펩타이드의 상승되거나 감소된 수준과 연관된 질병의 치료학적 치료를 받고 있는 포유류 피검자로부터 다양한 시점에서 수득한 일련의 생물학적 샘플 내에서 OB 폴리펩타이드의 수준을 상술한 바와 같이 평가하는 것을 포함하여, 포유류 피검자에게서 OB 폴리펩타이드의 상승되거나 감소된 수준과 연관된 질병의 치료학적 치료를 모니터하는 시험관내 방법이 제공된다.
본 발명에 따르는 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 캐리어와 함께 상술한 바와 같은 OB 폴리펩타이드를 함유하며, 동물의 체중을 감소시키기 위한 치료학적 방법에서 유용하다. 동물의 체중을 증가시키는 치료학적 방법에서 사용하기 위한 본 발명의 추가의 약제학적 조성물은 바람직하게는 OB 폴리펩타이드에 결합하여 OB 폴리펩타이드의 활성을 중화시키는 항체, OB 폴리펩타이드 수용체에 결합하지만 이 수용체를 활성화시키지 않는 ob 폴리펩타이드의 단편, 및 OB 폴리펩타이드의 소분자 길항제로 구성된 그룹으로부터 선택된 OB 폴리펩타이드의 길항제를 함유한다. 본 발명은 또한, 개체의 신체 외관 (body appearance)을 개선시키는 화장방법에 유용한 것으로, 개체의 체중을 감소 또는 증가시키기 위한 상응하는 신체 외관 개선용 화장품 조성물을 제공한다. 이러한 화장품 조성물은 개체의 체중을 목적하는 수준까지 변조시키는데 충분한 용량으로 개체에게 투여된다.
본 발명은 또한, 동물의 체중을 변형 (예를들어, 유전자 요법)시키는 의약의 제조를 위한 본 발명의 핵산 분자, 및 본 발명에 따르는 OB 폴리펩타이드를 코드화한 핵산에 하이브리드화 가능한 안티센스 핵산 분자의 용도에 관한 것이다. 또한, 동물의 체중을 변형시키는 의약의 제조를 위한 본 발명애 따르는 OB 폴리펩타이드 또는 길항제의 용도가 제공된다. 이렇게 개발된 의약은 당뇨병, 고혈압 및 고콜레스테롤로 구성된 그룹으로부터 선택된 질병의 치료시에, 및 이러한 질병을 치료하기 위한 의약과의 병용요법의 부분으로서 포유동물의 체중을 변형시키기 위해서 사용될 수 있다. 이러한 의약은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 피하, 비내, 경구 또는 폐 송달시스템을 포함하는 치료학적 방법에서 사용될 수 있다.
본 명세서에 제시된 데이타는, 본 발명의 OB 폴리펩타이드는 그들의 형태로 주로 포유동물 지방세포로부터 분비되며, 폴리펩타이드는 호르몬으로서 작용한다는 것을 나타낸다.
본 발명의 실시예는 OB 폴리펩타이드 (본 명세서에서 다른 식으로는 "렙틴(leptin)"이라 불리움)가 마우스, 랫트 및 인간 혈장 내에서 순환한다는 것을 설명한다. 렙틴은 ob/ob 마우스의 혈장 내에는 부재하며, db/db 마우스의 혈장 내에는 10-배 더 높은 농도로 존재하고 fa/fa 랫트에는 20-배 더 큰 농도로 존재한다. 가장 중요한 것으로, 재조합 렙틴을 매일 주사하는 것은 ob/ob 마우스의 체질량을 현저하게 감소시키고, 야생형 마우스의 체중에 현저하게 영향을 미치며, db/db 마우스에는 영향을 미치지 않는다.
추가의 관점에서, 하나의 종으로부터 유래하는 ob 폴리펩타이드는 또 다른 종에서 생물학적으로 활성이 있다. 특히, 인간 OB 폴리펩타이드는 마우스에서 활성이 있다.
첫번째로, 본 발명의 변조물질은 이하에서 정의되는 바와 같이 체중 조절의 변조물질로서 작용하는 폴리펩타이드 (이 폴리펩타이드는 도 1A 내지 E (SEQ ID NO: 2), 도 3 (SEQ ID NO: 4), 도 5 (SEQ ID NO: 5) 및 도 6 (SEQ ID NO: 6)에 기술된 것과 같은 아미노산 서열을 함유한다) 그 자체, 또는 그의 보존된 변이체 또는 단편, 특히 시그날 펩타이드가 결실된 단편 (본 명세서에서 다른 식으로 성숙 OB 폴리펩타이드라고 불리움)을 코드화한 재조합 DNA 분자 (예를들어, cDNA 또는 cDNA 또는 분리된 지놈 DNA를 함유하는 벡터) 또는 클로닝된 유전자 (즉, 분리된 지놈 DNA), 또는 그의 변성 변이체를 포함한 핵산 분자를 함유한다. 특정의 구체예에서는, 쥐와 인간 ob 폴리펩타이드의 두개의 변이체에 대한 아미노산 서열이 제공된다. 두가지 폴리펩타이드는 모두, mRNA 스플리싱 이상 (splicing anomaly)으로부터 일어날 수 있는 글루타민 49가 결실된 형태로 발견된다. 다양한 종으로부터 유래하는 OB 폴리펩타이드는 매우 동족성일 수 있으며; 도 4에서 보는 바와 같이 쥐와 인간 OB 폴리펩타이드는 80% 이상의 동족성이 있다.
핵산 분자, 재조합 DNA 분자 또는 클로닝된 유전자는 뉴클레오타이드 서열을 가질 수 있거나, 도 1A 내지 E (SEQ ID NO: 1) 및 도 2A 및 B (SEQ ID NO: 3)에 나타낸 DNA 코드화 서열에 대해 상보적일 수 있다. 특히, 이러한 DNA 분자는 염색체로부터 분리된 cDNA 또는 지놈 DNA일 수 있다. 본 발명의 핵산 분자는 또한 DNA 및 인트론 DNA 서열의 5' 및 3' 측면서열 (flanking sequence)에 상응할 수도 있다. 따라서, 본 발명은 또한 본 발명의 도 1A 내지 E (SEQ ID NO: 1) 및 도 2A 및 B (SEQ ID NO: 3)의 서열로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산, 및 변성 변이체, 대립유전자 변이체 및 유사한 동족성 분자의 확인에 관한 것이다.
본 발명의 핵산 분자는 포스페이트 또는 포스페이트 동족체, 예를들어, 티오포스페이트 결합을 갖는 그의 합성 변이체를 포함한 DNA 또는 RNA일 수 있다. 단일-스트랜드 및 이중-스트랜드 서열 둘다가 본 발명에 포함된다.
본 발명은 추가로 분자 프로브 (probe)로서, 또는 폴리머라제 연쇄반응 (PCR) 증폭을 위한 프라이머 (primer)로서 사용하기 위한 핵산 분자, 즉 도 1A 내지 E (SEQ ID NO: 1), 도 2A 및 B (SEQ ID NO: 3) 및 도 20A 내지 C (SEQ ID NOs: 22 및 24)에 나타낸 서열의 일부분에 상응하는 서열; 또는 코드화 서열의 5' 및 3' 측면서열; 또는 지놈 DNA의 인트론 서열을 갖는 합성 또는 천연 올리고뉴클레오타이드를 제공한다. 특히, 본 발명은 적어도 약 10개의 뉴클레오타이드를 갖는 핵산 분자를 포함하는데, 여기에서 핵산 분자의 서열은 도 1A 내지 E (SEQ ID NO: 1), 도 2A 및 B (SEQ ID NO: 3) 및 도 20A 내지 C (SEQ ID NOs: 22 및 24)의 뉴클레오타이드 서열 내의 동일한 수의 뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열, 또는 그에 대해 상보적인 서열에 상응한다. 더욱 바람직하게는, 분자의 핵산 서열은 적어도 15개의 뉴클레오타이드를 갖는다. 가장 바람직하게는, 핵산 서열은 적어도 20개의 뉴클레오타이드를 갖는다. 올리고뉴클레오타이드가 프로브인 본 발명의 구체예에서, 올리고뉴클레오타이드는 예를들어, 방사핵종 (radionuclide) (예를들어, 32P) 또는 효소에 의해서 검출가능하게 표지된다.
추가의 관점에서, 본 발명은 ob 폴리펩타이드를 코드화한 본 발명의 핵산을 함유하는 클로닝 벡터; 및 발현조절서열에 작동가능하게 결합된, ob 폴리펩타이드를 코드화한 본 발명의 핵산 분자를 함유하는 세균, 곤충 또는 포유동물 발현벡터를 제공한다. 따라서, 본 발명은 추가로 적절한 발현벡터로 형질감염되거나 형질전환된 세균 세포, 효모 세포, 곤충 세포 또는 포유동물 세포와 같은 숙주세포, 및 이에 따라 본 발명의 변조물질의 제조시에 상기 언급한 작제물의 용도에 관한 것이다.
또 추가의 관점에서, 본 발명은 ob 폴리펩타이드에 결합하는 항체에 관한 것이다. 이러한 항체는 전체-길이 (full-length) 폴리펩타이드 또는 그의 항원성 단편에 대항하여 생성될 수 있다. 한가지 관점에서, 이러한 항체는 ob 폴리펩타이드의 작용적 (즉, 체중 및 지방조성을 변조시키는) 활성을 억제한다. 또 다른 관점에서, 항체는 혈장 또는 혈청 내의 순환 ob 폴리펩타이드의 수준을 결정하기 위해서 사용될 수 있다. 또한 추가의 관점에서, 부위-특이적 항체, 특히 모노클로날 항체는 OB 폴리펩타이드 구조의 프로브로서 사용될 수 있다.
전술한 모든 물질들은 본 발명에서 체중 및 지방 조성의 변조물질로서 간주되며, 그 자체로 다양한 상황에서 사용될 수 있다. 특히, 본 발명은 핵산 분자 및 펩타이드 둘다를 포함하는 본 발명에서 정의된 변조물질을 사용하는 것을 전제로하는 진단적 및 치료학적 적용 및 특정의 농업적 적용 모두를 포함한다. 더구나, 체중의 변조는 비만증 또는 반대로 악액질이 원치않는 신체 조건인 상태가 본 발명의 하나 또는 그 이상의 변조물질의 투여에 의해서 치료될 수 있다는 특정의 치료학적 관계 및 잇점을 수반한다.
따라서, 도 1A 내지 E의 서열 (SEQ ID NO: 1), 도 2A 및 B의 서열 (SEQ ID NO: 3) 및 이들의 변성 및 대립유전자 변이체로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산에 의해서 코드화된 단백질의 발현을 조절하는 것을 포함하여 포유동물의 체중을 변조시키는 방법이 제안된다. 이러한 조절은 유전자요법에 의해서 문제의 뉴클레오타이드를 환자 또는 숙주의 지방 세포 내에 도입시켜 비만증을 조절하거나 감소시킴으로써 이루어질 수 있다. 반대로, 안티센스 분자와 같은 뉴클레오타이드에 대한 길항제의 제조 및 투여는 신경성 식욕부진, 암 또는 AIDS와 같이 과도한 체중손실이 연루된 상태가 존재하거나 치료중인 경우에 지시되고 수행될 수 있다. 이러한 작제물은 뉴클레오타이드와 유사한 방식으로 직접 지방 세포 내로 도입되어 이러한 변화를 일으킬 수 있다.
상응하게, 도 1A 내지 E, 3, 5 및 6 (SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 및 SEQ ID NO: 6)에 의해서 정의된 단백질, 보존된 변이체, 그의 활성 단편, 및 동족성 소분자는 치료학적 목적으로 직접 투여하여 과도한 체지방 또는 체중 증가를 감소 또는 조절하도록 제제화될 수 있다. 상응하게, 그의 단편과 같은 언급된 단백질 물질에 대한 항체 및 그밖의 다른 길항제를 제조하고 유사하게 투여하여 보존효과를 획득할 수도 있다. 따라서, 본 발명은 유리하게는 본 발명의 OB 폴리펩타이드, 또는 대체용으로 그의 길항제를 약제학적으로 허용되는 캐리어 또는 부형제와의 혼합물로 함유하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명의 OB 폴리펩타이드는 그의 화장효과 (cosmetic effect)를 위해서, 예를들어, 지방 침착을 감소시킴으로써 신체 외관을 개선시키기 위해서 투여될 수도 있다. OB 폴리펩타이드는 그의 화장효과를 위해서 독립적으로, 또는 그밖의 다른 화장방법, 예를들어 수술과 병용하여 사용될 수 있다.
본 발명의 뉴클레오타이드 및 상응하는 펩타이드의 진단적 용도는 진단적 및 치료학적 적용분야 둘다에서 유용한 활성 뉴클레오타이드 물질의 레퍼토리(repertoire)를 개발하기 위해서 그의 대립유전자 변이체의 추가의 돌연변이를 확인하기 위해서 핵산을 사용하는데 까지 확대된다. 특히, 비만증과 관련하여 개체가 위험한 상태에 있는 잠재성을 결정하도록 환자의 상태를 더 정확하게 정량하기 위해서 요구될 수 있는 문제의 뉴클레오타이드의 동형접합성 및 이형접합성 돌연변이 둘다가 확인될 수 있다. 구체적으로, 이형접합성 돌연변이는 현재 경증 내지는 중등도의 비만증과 관련하여 검토되고 있으며, 그 반면에 동형접합성 돌연변이는 더 현저하고 중증인 비만상태와 연관된다. 그후에, 벤치마크 (benchmarks)로서 상기 언급한 확인된 물질을 이용하여 상응하는 DNA 시험을 수행함으로써 식사나 그밖의 다른 개인적 습관에 있어서의 변화를 지시할 수 있도록 하기 위해서 특정한 경향에 대하여 정확한 장기간의 예측을 용이하게 하거나, 또는 이러한 상태를 회피할 수 있도록 치료학적 개입을 지시할 수 있다.
본 발명의 진단적 유용성은 시험 피검자로부터 수취된 세포 샘플 또는 생물학적 추출물 (또는 샘플) 내의 본 발명의 변조물질의 존재 및 범위를 측정하여 이러한 시험샘플 내의 핵산 (지놈 DNA 또는 mRNA) 및/또는 단백질의 수준을 확인할 수 있는 방법에 까지 확대된다. 뉴클레오타이드의 증가된 활성 및 생성된 단백질의 존재가 비만을 억제하는 피검자의 능력을 반영하는 것이라고 한다면, 비만 피검자에게서 이러한 결과를 검토하는 전문의는 본 발명의 뉴클레오타이드의 존재 및 활성에 관한, 기능부전 이외의 인자가 비만상태의 원인임을 결정할 수 있을 것이다. 반대로, 뉴클레오타이드 및/또는 발현된 단백질의 억제된 수준은 이러한 비만 상태를 치료하기 위해서 반드시 이러한 수준을 상승시켜야 하는 것을 시사하며, 이에 따라 적절한 치료학적 방식이 제공될 수 있다.
또한, 도 1A 내지 E 및 2A 및 B에서 발견되고 제시된 뉴클레오타이드는 상기에서 간략하게 언급한 바와 같이 상응하는 RNA의 측정에 유용한 cDNA를 나타낸다. 마찬가지로, 도 1A 내지 E 및 3의 폴리펩타이드에 상응하는 재조합 단백질 물질을 제조하고, 예를들어 지방 및/또는 OB 단백질의 혈장 수준을 측정할 목적으로, 또는 시상하부와 같은 조직 상에서 OB에 대한 수용체의 존재 및 수준을 검출하기 위해서, 예를들어 방사성면역측정법에서 사용하기 위해 적절하게 표지될 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명에 제시된 뉴클레오타이드 및 상응하는 단백질의 확인 뿐 아니라, 이러한 물질에 대한 수용체의 설명을 포함한다. 이와 관련하여서는 도 1A 내지 E, 3, 5 및/또는 6의 폴리펩타이드를 제조하여 활성 수용체를 분리시키는데 적절한 발현 라이브러리를 선별하는데 이용할 수 있다. 그후에, 수용체를 클로닝한 다음에, 수용체를 단독으로 또는 리간드와 함께 본 발명의 변조물질과 유사한 활성을 가질 수 있는 소분자를 선별하는데 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 이러한 요법이 적절한 경우에 다양한 투여방식을 위한 제제로 제조된 본 발명에 따르는 특정한 변조물질, 바람직하게는 서열이 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 및 SEQ ID NO: 6에 제시된 폴리펩타이드, 그들의 항체, 그의 상응하는 소분자 작용제 또는 길항제, 또는 활성 단편을 함유하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 이러한 제제는 약제학적으로 허용되는 캐리어, 또는 필요에 따라 그밖의 다른 보조제를 포함할 수 있으며, 각각의 경우에 임상의 또는 전문의에 이해서 결정되는 유효용량 범위로 제조된다.
따라서, 본 발명의 주목적은 본 발명에서 정의된 것으로서, 포유동물에서 지방과다 및 지방 함량의 조절 및 변화와 연관된 특정의 특성 및 활성을 나타내는 순수한 형태의 체중 변조물질을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가의 목적은 이러한 변조물질의 수준에 있어서의 변화가 특정화 특징이거나 일 수 있는 병리학적 상태를 효과적으로 진단 및 모니터하는 수단으로서, 본 발명에 기술된 바와 같이 체중 조절의 변조물질을 검출 및 측정하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적은 포유동물에서 본 발명의 변조물질의 활성을 모사하거나 억제하는데 잠재적으로 효과적인 약물, 약제 등과 같은 물질을 선별하는 방법 및 이와 관련된 시험 시스템을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 추가의 목적은 포유동물에서 체중 및 지방 함량을 조절하고/조절하거나, 체중의 비정상적인 억제 또는 증가가 특징적인 특징인 특정의 병리학적 상태를 치료하는 포유동물의 치료방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가의 목적은 하나 또는 그 이상의 변조물질, 결합 파트너 또는 이들의 생산을 조절할 수 있거나 그들의 활성을 모사하거나 길항할 수 있는 약제를 함유하거나 기본으로 하는, 유전자 치료 프로토콜에서 사용하기 위한 유전자 작제물 및/또는 상응하는 치료방법을 위한 약제학적 조성물을 제조하는 것이다.
그밖의 다른 목적 및 잇점은 이하의 예시적인 도면을 참고로 하여 기술되는 이하의 설명으로부터 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 명백해 질 것이다.
이하에서는 본 발명의 좋은 예가 되는 유전자 물질을 확인하는데 사용되는 방법을 개략적으로 나타낸다. 이 시도에는 4가지 연속단계가 포함된다: A) 유전자 지도작성, B) 물리적 지도작성, C)후보물질 유전자 분리, 및 D) 돌연변이 검출. 목표하는 쥐 유전자가 분리되었음을 확인 (단계 D)한 이후에, 동종성 인간 유전자를 찾아내고, 쥐 및 인간 유전자 및 추정상의 단백질 둘다를 특정화히였다. 단계들은 이하에서 더 상세히 요약하였다.
A. 유전자 지도작성
ob 돌연변이를 유전자 교배시에 분리시키고, 표준 결합분석을 사용하여 RFLPs (제한단편 길이 다형성 (restriction fragment length polymorphisms))에 따른 돌연변이의 위치를 결정하였다. 이들 데이타는 근위 마우스 염색체 6상에서 ~ 5cM 간격으로 OB 유전자를 배치시켰다. (5cM은 100 마리의 동물당, 5개의 겉보기 유전자 교차형 (crossovers)에 상응하는 유전자 거리 (genetic distance)의 측정치이다.) 총 771개의 정보적 감수분열체 (informative meioses)가 생성되었으며, 후속 유전자 지도작성에서 사용되었다 (Friedman et al., 1991, 상기 참조). OB에 대비해서 지도가 작성된 로커스 (genetic loci)는 모두 이미 공개되었다. 기술된 두개의 가장 근접한 RFLPs가 카복시펩티다제 (carboxypeptidase) 및 met 종양원 유전자로부터 유도된 프로브에 의해서 규정되었다.
대체로 유전자 마커의 어떤 것도 단단히 결합하고 있지 않았기 때문에, 상술한 실험의 유전적 해답은 ob를 클로닝하는데 부적합하였다. 필수적인 단단하게 연결된 RFLPs를 확인하기 위해서, 추가의 프로브를 분리시키고 유전자 교배를 확대시켰다. 염색체 현미해부 (chromosome microdissection)로 공지되어 있는 방법을 사용하여 근위 마우스 염색제 6으로부터 DNA의 무작위 편을 분리시켰다 [Bahary et al., Mammalian Genome, 4:511-515 (1993)]. 개별적인 클로닝된 프로브를 ob에 대한 단단한 결합에 관하여 시험하였다. 이들 시험을 기초로하여, 하나의 프로브인 psd3이라고도 불리우는 D6Rck13이 OB에 대한 그의 유전적 근접성 때문에 추가의 분석을 위해서 선택되었다.
이 프로브는, 바하리 (Bahary)등이 보고한 바와 같이 D6Rck13이 835 마리의 모든 동물에서 비재조합체임을 시사하는 종간 또는 아종간 교잡으로부터의 835 ob 자손의 유전자형을 결정하는데 사용하였다. 물리적 지도작성의 과정에서, YAC 53A6으로부터 유도된 코스미드 서브클론으로부터 새로운 다형성 마커가 확인되었다. 이 새로운 마커는 D6Rck13과 OB 유전자 사이에 위치하였으며, 종내 이중교배 및 역교배로부터의 추가의 771 정보적 감수분열체의 유전자형을 결정하는데 사용하였다. 단일 동물 #167은 ob 와 D6Rck39 사이의 재조합 교잡을 갖는 것으로 확인되었다. 이들 시험은 D6Rck39/D6Rck13이 ob로부터 ~ 0.06 cM임을 나타내었다. 추가의 프로브 Pax4는 ob에 .12 cM 근접하였음을 나타내었다. Pax4는 두마리의 동물 #111 및 #420에서의 재조합형이었다. Pax4는 그루스 (Gruss)와 공동연구자들에 의해서 근위 마우스 염색체 6으로 이미 지도가 작성된 가유전자이다 [Gruss et al., Genomics, 11:424-434 (1991)]. 이것을 기초로하여, OB 유전자는 Pax4와 D6Rck13 사이에서 ~ 0.2 cM의 간격에 존재하는 것으로 결정되었다. 이로 인해서 OB를 분리시키기 위해서 노력할 때 삽입 (interposing) DNA를 클론화시키는 노력을 하게 되었다.
B. 물리적 지도작성
이 간격에서 DNA의 클로닝은 종종 길이가 백만 염기쌍 보다 더 긴 연속적 DNA의 긴 스트레치 (stretches)를 클로닝하도록 할 수 있는 비교적 새로운 클로닝 벡터인 효모 인공염색체 (YACs)를 사용한다.
효모 인공염색체는 D6Rck13과 Pax4를 사용하여 분리되었다. 이것은 정제된 DNA 프로브를 제조하고, 이들을 사용하여 상응하는 YACs를 분리시킴으로써 수행되었다. 이들 YACs (#8, #16, #107 및 #24)를 분리하여, 일차적으로 특정화시켰으며, 수득된 결과를 기초로하여 YAC 16가 가장 멀리 연장된, 즉 ob에 가장 가까운 YAC인 것으로 결론을 내렸다. 그후, YAC #16의 주말단을 회복시켰으며, 이 말단은 Pax4 보다는 ob에 더 근접한 것으로 결정되었다. 이 말단을 16M(+)이라 부른다. 이 프로브는 동물 #420 (Pax4였으므로)에서의 재조합체가 아닌 것으로 나타났기 때문에 이러한 결론에 도달하였다. 이 말단의 서열을 결정하고, PCR 시험을 수행하는데 사용하였다. 이 PCR 시험을 사용하여 YAC 라이브러리를 선별하였다. 4개의 양성 클론이 분리되었다. 후속단계로 말단-구제 (end-rescuing), 제한지도 작성, 펄스필드 겔전기영동 (pulse field gel electrophoresis), 및 유전자 교배를 사용한 사우던 블럿 (Southern blots)에 의해서 이들 YACs를 특정화시킴으로써 이들 YACs중의 두개, 즉 adu 및 aad가 후속 시험에 중요한 것으로 결정되었다. YAC aad는 가장 멀리 연장된 550 kB 비키메라성 YAC이다. 따라서, 이 YAC의 원위말단인 aad(pICL)을 사용하여 물리적 지도를 완성하였다. YAC adu는 370 kb 비키메라성 YAC이며, 그의 원위말단 adu(+)는 동물 #111 및 #167을 포함한 유전자 교배체의 모든 ob 자손에서 비재조합체인 것으로 결정되었으며, 이것은 OB 유전자가 이 YAC내에 존재할 수 있음을 시사하는 것이다.
이들 두개의 말단 aad(pICL) 및 adu(+)에 대한 PCR 시험을 수행하고, 물리적 지도작성을 계속하기 위해서 추가의 YACs 및 P1 클론을 분리시키는데 사용하였다. 이 노력에 의해서 분리된 중요한 P1 클론에는 498, 499, 500 (aad(pICL)로부터 유도된 프로브를 사용하여 분리됨) 및 322, 323 및 324 (adu(+)로부터 유도된 프로브를 사용함)가 포함되었다.
한편, D6Rck13에 의해서 분리된 YACs (53A6, 25A8, 25A9, 25A10)가 특정화되었다. 이들 시험으로 53A6이 aad YAC쪽으로 가깝게 가장 멀리 연장하는 것으로 결정되었다. 53A6과 aad 사이의 갭 (gap)의 크기는 ~ 70 kB인 것으로 측정되었다. 그후에, 53A6의 주말단인 53(pICL)을 사용하여 3개의 이용가능한 YAC 라이브러리 및 P1 라이브러리를 선별하였다. 중요한 P1 클론인 325를 분리하였다. 이 P1 클론은 상술한 바와 같이 aad(pICL)에 의해서 분리된 P1 클론과 중복되었으며, 따라서 53(pICL)과 aad(pICL) 사이의 갭을 채우는데 이용되었다. 결과적으로, 길이가 ~ 2.5 백만 염기쌍이며 YACs 및 P1 클론을 함유하고 Pax4, 16M(+), adu(+), aad (pICL), 53(pICL), D6Rck39 및 D6Rck13에 걸쳐 있는 전체 콘티그 (contig)가 클로닝되었다. 동물 #111 및 #167에서 보이는 재조합 부위의 지도를 주의해서 작성함으로써 OB가 400 kB 간격으로 위치한 것으로 결론을 내렸다. OB 유전자를 분리하기 위한 실용적인 DNA 공급원을 제공하기 위해서 이러한 비재조합 부위를 포함하는 약 500 kB가 총 24 P1 클론에서 분리되었다. 후에 유용한 클론으로 확인된 322 및 323을 포함하는 이들 P1 클론은 엑손 트랩핑 (exon trapping)을 위해서 사용되었다.
OB를 갖는 염색체의 부분의 물리적 지도는 도 7A에 나타내었다. 도 7B는 YAC 콘티그를 나타낸 것이다. 도 7C는 P1 콘티그를 나타낸다.
C. 후보물질 유전자의 분리
이 간격에서 유전자를 분리하기 위해서 사용된 방법은 엑손 트랩핑이었다. 이 방법은 시험 작제물내로 도입된 지놈 DNA내의 작용적 스플라이스 수용체 및 공여체 서열을 선별함으로써 엑손 DNA (즉, 코드화 서열)를 확인하기 위한 시판 벡터를 사용하였다. 이들 P1 클론으로부터 유도된 DNA를 성장시키고, 엑손 트랩핑 벡터내에 서브클로닝시켰다. 이들 클론은 블루스크립트 (Bluescript) 벡터내로 클로닝된 짧은 삽입물이었다. 각각의 클론은 삽입물에 접하고 있는 플라스미드 서열에 상응하는 PCR 프라이머를 사용하여 PCR 증폭시켰다. PCR 증폭은 플라스미드를 보유하는 세균상에서 직접 수행하였다. 반응은 바이오메크 로보트 (Biomek robot)를 사용하여 설정하였다. PCR 생성물을 에티듐 브로마이드를 함유하는 TBE 완충액내의 1% 아가로즈 겔상에서 전기영동시켰다. 엑손 트랩핑 기술을 변형시켜 P1 클론으로부터 오염성 이. 콜라이 (E. coli) DNA를 제거하고, 트랩핑된 추정상의 엑손의 80-90%를 초과하는 풍부한 인공적 엑손을 선별해내었다. 엑손 트랩핑 벡터는 HIV 서열을 포함하며, 이들 벡터 서열의 짧은 분절이 이 인공산물에 상응한다.
엑손 트랩핑 실험은 다양한 P1 클론을 사용하여 수행하였다. 그후, 엑손 트랩핑 생성물을 PCR에 의해서 증폭시키고, 선별하여 서열을 분석하였다. 추정상의 "엑손"의 서열을 블라스트 (Blast) 컴퓨터 프로그램을 사용하여 진뱅크 (Genbank)에서의 서열과 비교하였다. 약 15개의 엑손을 RT-PCR, 노던 (Northern) 분석 및 주 블럿 (zoo blot)에 의해 상응하는 RNA 또는 보유된 서열의 존재여부를 추가로 시험하기 위해서 선택하였다. 15개의 추정상의 엑손중의 7개 325-2, 323-9, 322-5, D1-F7, 1H3 및 2G7은 RNA 전사물을 코드화시키는 것으로 밝혀졌다. 325-2는 고환 특이적 유전자이며; 323-8 및 323-9는 마찬가지로, 뇌와 신장에서 주로 발현된 동일한 유전자로부터의 두개의 엑손이다. IH3 및 322-5는 두개의 저수준 뇌 전사물을 나타낸다. D1-F7은 편재하는 발현패턴을 갖는 이전에 클로닝된 유전자 이노신 모노포스페이트 데하이드로게나제 (IMPDH)로부터의 엑손이다. 이들 유전자중의 어떤 것도 OB를 코드화하지 않는 것으로 보였다. OB 엑손인 2G7은 이하에서 더 기술한다.
OB 유전자를 엑손 트랩핑하기 위한 3가지의 성공하지 못한 노력이 있은 후에, 중요한 OB 부분으로부터의 모든 P1s로부터 DNA를 푸울에 저류시킴으로써 또 다른 시도가 이루어졌다. 이들에는 P1s: 258, 259, 322, 323, 324, 325, 498, 499, 500, 653, 654 등이 포함된다. 그후에, P1s 258, 260, 322, 498 및 499를 엑손 트랩핑 벡터내에 서브클로닝시키고, 이어서 세균성 클론을 사용하여 몇개의 플레이트를 제조하였으며, 이들은 각각 추정상의 엑손을 함유하였다. 추정사의 OB 후보물질을 나타내는 약 192개의 클론을 수득하였다. 상기에서 언급한 바와 같이, 다수의 분리체가 벡터로부터 유도된 두개의 트랩핑된 엑손을 함유하는 안정된 인공산물이 관찰되었다. 따라서, 클론은 그들의 크기, 및 이 인공산물에 상응하는 DNA 프로브의 하이브리드화가 겔의 사우던 블럿상의 상응하는 밴드에 하이브리드화하였다는 사실 둘다에 의해서 확인되었다. 이러한 방식으로, 192개의 클론중의 185개가 추가의 평가로부터 배제되었다. 크기만을 기초로 한 인공산물의 배제는 불가능한데, 이는 이것이 결국에는 OB에 상응하는 엑손의 배제를 유도할 수 있기 때문이다.
따라서, 192개의 엑손중에서 총 7개의 엑손을 추가의 시험을 위해서 선택하였다. 7개의 엑손의 서열을 결정하기 위한 주형을 제조하고, 서열분석을 수행하였다. 7개의 엑손에 대한 서열을 분석하였으며, 7개는 동일하고 하나는 명백한 인공산물인 것으로 확인되었다. 특히, 클론 1D12는 "HIV 서열", 즉 인공산물 밴드를 함유하였다. 이것은 추가의 분석을 위해서 3개의 엑손 1F1, 2G7 및 1H3을 남겨두었다. 1F1은 임계적 부분을 벗어나서 지도가 작성되었기 때문에 제외되었다. 1H3 및 2G7 둘다에 대한 PCR 프라이머를 선택하여 합성하였다.
2G7상의 엑손의 서열을 결정하였으며, 도 10에 나타내었다 (SEQ ID NO: 7). 2G7에 대한 PCR 프라이머를 선택하여 합성하였다. PCR 프라이머에 상응하는 서열의 부분은 밑줄을 그어 표시하였다. 사용된 프라이머는 다음과 같다:
5' CCA GGG CAG GAA AAT GTG (Tm = 60.0℃) (SEQ ID NO: 8)
3' CAT CCT GGA CTT TCT GGA TAG G (Tm = 60.0℃) (SEQ ID NO: 9)
이들 프라이머는 다음과 같은 PCR 조건을 사용하여 지놈 DNA를 증폭시켰다: 표준 PCR 완충액중에서 2' 동안 55℃에서 어닐링 (annealing), 2' 동안 72℃에서 연장, 1' 동안 94℃에서 변성을 25-30 사이클. 이들 프라이머는 또한, 냉 dCTP의 양을 상응하게 감소시키면서 PCR 반응에 32P-dCTP를 포함시킴으로써 표지된 프로브를 생성시키는데 사용하였다.
RT-PCR은 다양한 조직 RNAs상에서 수행되었으며, 2G7은 시험한 조직들중에서 백색 지방에서만 독점적으로 발현되는 것으로 결론을 내렸다 (도 11A). 그후에, 32P-표지된 2G7을 조직 RNAs의 노던 블럿에 하이브리드화시켰으며 (도 11B), 그의 RNA는 지방조직에서는 높은 수준으로 발현되었지만, 다른 모든 조직에서는 발현되지 않거나 매우 낮은 수준으로 발현되는 것으로 나타났다 (여기에서 시그날은 조직 제제를 오염시킨 지방으로 인한 것일 수 있다). 언급된 각각의 조직으로부터 유래하는 10 ㎍의 총 RNA를 포름알데히드를 사용하여 아가로즈 겔상에서 전기영동시켰다. 프로브를 표준 하이브리드화 완충액인 래피드 하이브 (Rapid Hybe; Amersham) 중에서 65℃에서 블럿에 하이브리드화시켰다. RNA의 크기는 약 4.9 kB였다. 이 시점에서, 2G7은 OB에 대한 생존가능한 후보물질 유전자인 것으로 간주되었으며, 더 분석하였다.
D. 돌연변이 검출
2G7이 OB 유전자를 코드화한 것임을 확인하기 위하여는, 야생형 동물과 비교하여 돌연변이체에서 이 유전자의 DNA 서열의 RNA 발현의 수준에서의 차이를 입증하는 것이 필요하였다. ob 유전자의 두개의 별개의 돌연변이, 즉 C57BL/6J ob/ob (1J) 및 Ckc/Smj ob/ob (2J)를 시험을 위해서 이용할 수 있다. 이들은 이하에서 각각 1J 및 2J라고 불리운다. (시험한 마우스 스트레인을 칭하는데 약식 명칭이 사용된다. 이 명세서 및 도면 전체에 걸쳐서, C57BL/6J 는 C57BL/6J +/+를 의미하며, CKC/smj는 SM/Ckc-+ Dac -+/+를 나타내고; CKC/Smj ob/ob는 SM/Ckc-+ Dac -ob 21 /ob 21 을 나타낸다.) RNA는 1J, 2J 및 대조동물로부터 분리된 지방조직으로부터 제조되었다. 각각의 샘플에 대한 총 RNA를 DNase로 처리한 다음, 프라이머로서 올리고-dT 및 역전사효소를 사용하여 역전사시켰다. 그후, 생성된 단일-스트랜드 cDNA를 하부 밴드의 경우에는 2G7 프라이머 (조건은 상기에 나타내었다)를 사용하고, 상부 밴드의 경우에는 시판품으로 이용할 수 있는 액틴 프라이머를 사용하여 PCR 증폭시켰다. RT-PCR 생성물을 1% 아가로즈 TBE 겔상에서 주행시키고, 에티듐 브로마이드로 염색하였다 (도 12A). RT-PCR을 사용하여, 2G7 mRNA는 1J 및 그밖의 모든 대조용 마우스에서 발현되는 반면에, 2J 마우스에서는 이것이 완전히 결실되었음을 확인하였다. 30 사이클의 증폭후에는 시그날이 검출되지 않았다. 이 실험은 2G7이 OB 유전자로부터의 엑손에 상응하였다는 직접적인 증거를 제공하였다.
2J 돌연변이는 비교적 새롭고 유사유전자형 스트레인으로서 유지되기 때문에, 이 결과는 2G7이 OB 유전자로부터의 엑손임을 나타내는 첫번째의 유용한 증거였다. 돌연변이는 프로모터 부분에 위치하여 mRNA 합성의 전체적인 불발을 유도할 수 있다. 이러한 RT-PCR 실험에서 1J 마우스에 시그날이 존재하는 것은 1J가 RNA 샘플의 크기에 있어서의 막대한 변화를 초래하지 않는 점돌연변이를 수반할 것임을 시사하였다. 또한, 2G7 mRNA는 RT-PCR에 의해서 시험하였을 때, 4마리의 추가의 2J 동물에서는 부재하였다.
이 결과는 노던 블럿 (Northern blot)상에서 확인되었다 (도 12B). 지방세포 RNA는 각각의 스트레인 (C57B1/6J, 1J, CKC/smj, 및 2J)으로부터 제조되었다. 10 ㎍의 이들 RNAs를 배출시켜 블럿팅하였다. PCR 반응에서 32P-dCTP를 사용하여 도 11에서 물질, 즉 밴드를 증폭시킴으로써 PCR-표지된 2G7 프로브를 사용하여 블럿을 프로브화하였다. 액틴은 부하된 RNA의 양에 대한 대조물이다. 액틴 시그날은 모든 샘플에서 상당히 유사하다. mRNA는 지방세포에 대하여 특이적이기 때문에, OB 시그날은 뇌에는 존재하지 않는다.
노던 분석의 결과는 2G7 특이적 RNA가 2J 마우스에 부재하는 것을 입증한다. ob RNA는 CKC/smj ob/ob 마우스에 부재하는데, 이는 이 비만 돌연변이 스트레인에서 유전자는 RNA가 만들어지지 않도록 분열되기 때문이다. 또한, 2G7 RNA의 수준은 db/db 지방 뿐만 아니라 1J에서 ~ 10-20배로 증가하였다. 이들 결과는 OB가 순환 호르몬을 코드화하거나, 체중을 변조시키는 지방세포로부터의 시그날의 생성에 관여한다는 가설과 부합하는 것이다. 이들 결과는 2G7이 OB 유전자라는 결론을 지지하였으며, 1J 마우스가 점돌연변이, 대체로는 조숙한 해독종결을 유도하는 넌센스 돌연변이를 갖는 것으로 예상하였다.
이들 노던 결과는 4마리의 상이한 2J 동물로부터 유래한 지방세포 RNA 제제를 사용하여 반복되었다 (도 13). 이 시험에서, ap2는 도 12B에서 액틴과 거의 동일한 대조군으로 사용된 지방-특이적 전사물이다. ap2 밴드의 변화하는 밀도에 대해서는 유의성이 없다. ap2는 공지된 ap2 서열로부터 PCR 프라이머를 디자인함으로써 표지되었다. 후, 지방세포 RNA의 RT-PCR 생성물은 PCR 표지와 동일한 프로토콜을 사용하여 재표지하였다. 이 분석은 표준 동형접합성 또는 이형접합성 동물에서 OB mRNA의 존재 및 2J 돌연변이 동물에서는 그의 부재를 나타낸다.
돌연변이는 1J 마우스에서 확인되었다. 돌연변이는 아미노산 108에서 아르기닌의 명백한 조숙 정지코돈으로의 변화를 야기시키며, 모든 가능한 경우에 ob mRNA의 높은 발현수준에도 불구하고 1J 돌연변이 (도 14)의 원인이 되는 C에서 T로의 염기 변화이다 (참조: 도 12 및 13, C57BL/6J ob/ob 레인).
더욱 최근에, 사우던 블럿 (Southern blots)을 사용하여 2J 돌연변이는 RNA 발현을 완전하게 폐지시키는 것으로 보이는 OB의 5' 말단에서 검출가능한 DNA 변화의 결과인 것으로 결론을 내렸다. 이러한 가능한 재배열의 정확한 성질은 아직 결정되지 않았다.
돌연변이체 ob가 독특한 단편 패턴을 수득하였는지 여부를 결정하기 위하여, 4개의 상이한 제한 엔도뉴클레아제를 사용하여 CKC/smj (SM/Ckc-+ Dac ) 및 C57BL/6J 마우스로부터 DNA의 지놈 사우던 블럿을 수행하였다 (도 15A). 약 10 ㎍의 DNA (간, 신장 또는 비장으로부터 제조된 지놈 DNA로부터 유도됨)를 제시된 제한효소로 분해시켰다. 그후, DNA를 1% 아가로즈 TBE 겔내에서 전기영동시켰다. DNA를 이모빌론 막 (imobilon membrane)에 옮기고, PCR-표지된 2G7 프로브에 하이브리드화시켰다. 주밴드 (key band)는 CKC/smj ob/ob (SM/Ckc-+ DAC ob 21 /ob 21 ) DNA에 대한 BglII 분해물에서 최상부 밴드이다. 이 밴드는 다른 스트레인에서 보다 더 고분자량의 것이며, 이 스트레인에서의 돌연변이를 시사한다.
도 15B는 ob 21 /+ ×ob 21 /+ 교잡종의 자손으로부터의 지놈 DNA의 BglII 분해물의 사우던 불럿이다. DNAs중의 일부는 단지 상부 밴드 만을 가지며, 일부는 하부 밴드 만을 가고, 일부는 둘다를 갖는다. 상부 밴드 만을 갖는 동물은 동종-비만, 즉 ob 21 /ob 21 이다. 이들 데이타는 도 15A에 나타낸 다형성 (즉, 돌연변이)은 유전적인 면에서 이탈하는 것을 나타낸다.
실시예 1: OB 의 cDNA 클로닝 및 서열 결정
표지된 2G7 PCR 프로브를 사용하여, 쥐의 지방세포 λgt11 cDNA 라이브러리 (스위스 마우스 #ML3005b의 고환 지방패드로부터 Clonetech 5'-STRETCH cDNA)로부터 총 50개의 마우스 cDNA 클론, 및 인간 지방세포 λgt10 cDNA 라이브러리 (복부 #HL1108a로부터 Clonetech 5'-STRETCH cDNA)로부터 30개의 교차 하이브리드화 인간 cDNA 클론을 분리하였다. 라이브러리 스크리닝은 플라크 리프트 방법 (plaque lift procedure)을 사용하여 수행하였다. 플라크 리프트로부터의 필터를 오토클레이브 방법을 사용하여 변성시켰다. 필터를 PCR-표지된 2G7 프로브 (Rapid Hybe 완충액, 65℃, 밤새)를 사용하여 중복해서 하이브리드화시켰다. 2-4시간 전하이브리드화한 후에, 필터를 65℃에서 2×SSC, 2% SDS중에서 30분 동안 2회 세척하고, x-선 필름에 노출시켰다. 복제된 포지티브 (positives)를 플라크 정제하였다. 플라크 정제된 파아지는 시판품으로 이용할 수 있는 벡터 프라이머, 예를들어 λgt10 및 λgt11을 사용하여 PCR-증폭시켰다. 생성된 PCR 생성물은 어느 하나의 말단에 소량의 벡터 서열을 갖는 각각의 파아지에 대한 cDNA 삽입물에 상응하였다. 밴드를 겔 정제하고, ABI 자동화 서열분석기 및 DNA 폴리머라제를 프로브화하는 벡터 프라이머를 사용하여 서열을 결정하였다.
그후, 원 서열분석 데이타를 염기별로 수작업으로 검사하여 컴퓨터 프로그램으로부터 잘못 판독된 것을 보정하였다. 정확한 데이타를 이용할 수 있게 되면, 하류 프라이머를 합성하여 서열분석을 계속하는데 사용하였다. 이러한 실험은 각각의 이용가능한 cDNA 크론이 서열분석되어 콘티그로 합성될 때 까지 반복하였다. 현재까지, mRNA의 5' 말단으로부터 ~ 3000 염기쌍이 수집되었다. cDNA 클론중의 하나를 mRNA의 5' 말단까지 연장시키는데, 이것은 그의 서열이 지방조직 RNA의 5' RACE 생성물의 경우와 동일하였기 때문이다 (데이타는 나타내지 않음).
서열 데이타는 167 아미노산 개방 판독프레임이 존재하는 것을 나타내었다 (도 1). 코작 (Kozak) 해독개시 공통서열은 ATG의 3개의 염기 상류의 아데노신 잔기와 함께 존재하였다. cDNA의 두가지 부류는 단일 글루타민 코돈의 포함 또는 배제로 인하여 상이한 것으로 확인되었다. 이 잔기는 2G7 엑손의 스플라이스 수용체 쪽으로 바로 3' 위치에서 확인된다. 글루타민의 CAG 코돈은 존재가능한 AG 스플라이스 수용체 서열을 포함하기 때문에, 이하에서 보는 바와 같이 cDNA의 서브셋트에는 명백한 3개의 염기쌍의 결실로 인하여 스플라이스 수용체 부위에서 미끄러짐이 존재하는 것으로 보인다.
(page 103, line 12-19의 서열)
[내용: with glutamine 글루타민 존재
splice accepter site 스를라이스 수용체 부위
without glutamine 글루타민 부재
splice accepter site 스플라이스 수용체 부위]
상기의 서열에서 "ag"는 글루타민 코돈의 상류의 가정된 인트론 서열에 상응하며, AG는 추정상의 대용 스플라이스 부위이다. 이 글루타민 잔기는 분자의 고도로 보존된 부분에 위치하며, 생물학적 활성에 대한 그의 중요성은 아직 알려지지 않고 있다.
추정상의 N-말단 시그날 서열이 검출되었으며, 그의 시그날 절단부위는 아미노산 위치 21에서 알라닌 잔기 쪽으로의 카복시-말단인 것으로 예상된다. 이 추정상의 시그날 서열은 폰헤이진 (von Heijne)의 방법에 컴퓨터 알고리즘을 적용함으로써 확인되었다. 이 기술을 사용하여, 가장 가능성이 있는 시그날 서열을 이하의 서열을 갖는 것으로 아미노산 1-23에 상응하는 폴리펩타이드 코드화 부분에서 확인되었으며, 여기에서 화살표는 추정상의 시그날 서열 절단부위를 나타낸다:
MCWRPLCRFLWLWSYLSYVQA ↑VP (SEQ ID NO: 10)
아미노산 서열의 나머지는 주로 친수성이었으며, N-말단 시그날 서열 이외의 어떤 명백한 구조적 모티브 또는 막 스팬닝 영역 (membrane spanning domains)을 갖지 않았다. 특히, 본 발명자들은 N-결합된 글리코실화에 대한 공통서열 또는 예상된 처리된 단백질에서 단백질 절단을 시사하는 이염기성 아미노산 서열을 확인하지 못하였다 (Sabatini et al., The metabolic basis of inherited disease, pp. 177-223, C.V. Scriver et a1. eds., McGraw-Hill, New York). 블라스트와 블럭 프로그램 (Blast and Block program)을 사용한 데이타 베이스 탐색은 어떠한 동종서열도 확인하지 못하였다.
인간 지방조직 RNA는 노던 블럿상에서 분석하였으며, 마우스 ob 유전자와 유사한 크기의 RNA종이 검출되었다. cDNA 클론의 서열결정 및 분석으로, 인간 OB는 또한 167 아미노산 폴리펩타이드를 코드화하는 것으로 밝혀졌다 (도 2A 및 B 및 도 3). 3개의 염기쌍 결실이 존재 또는 부재하는 두가지 부류의 cDNA는 인간에게서도 마찬가지로 나타났다 (도 6). 마우스 및 인간 OB 유전자는 예상된 코드화 부분에서 고도로 동종성이었으나, 이용가능한 3' 및 5' 비해독 부분에서는 단지 30%의 동종성만을 가졌다. N-말단 시그날 서열은 또한 인간 OB 폴리펩타이드에도 존재하였다. 인간과 마우스의 OB 폴리펩타이드 서열의 비교로 두개의 분자는 아미노산 수준에서 전반적으로 83% 동일성을 공유하는 것으로 나타났다 (도 4). 두가지 종으로부터 유래하는 성숙 단백질의 N-말단은 N-말단 100 아미노산 잔기중에서 단지 6개의 보존적 및 3개의 비보존적 아미노산 치환을 갖는 것으로 더 더욱 높은 동종성을 공유한다.
지놈 DNA는 마우스, 랫트, 토끼, 보울 (vole), 고양이, 소, 양, 돼지, 인간, 닭, 뱀장어, 및 드로소필라 (Drosophila)로부터 분리되었으며, EcoRI에 의해서 제한분해되었다. 분해물을 1% 아가로즈 TBE 겔상에서 전기영동하였다. 그후, DNA를 이모빌론 막에 옮기고, PCR-표지된 2G7 프로브로 프로브화하였다. 필터를 65℃에서 하이브리드화시키고, 65℃에서 2×SSC, 0.2% SDS로 20분 동안 2회 세척하였으며, 즉 여기에서는 두개의 완충제 변화가 있었다. 이들 데이타는 OB가 척추동물들에서는 보존되는 것을 시사한다 (도 16). 이와 관련하여 뱀장어 DNA에는 2+ 시그날이 존재하는 것으로 나타났으며, 여기에서 뱀장어는 어류이다.
요약하면, 이용가능한 증거들은 체중 및 지방과다가 생리학적으로 조절된다는 것을 나타낸다. 7년 전에, 이 시스템의 키 성분들중의 두가지, 즉 OB 및 DB 유전자를 확인하기 위한 노력이 시작되었다. 본 실시예에서 볼 수 있는 바와 같이, 본 발명에서 OB 유전자는 체중을 조절하는데 주된 역할을 하는 지방 특이적 유전자로 확인되었다. 거의 대부분이 분비된 호르몬인 이 유전자의 생성물은 인간 및 인간 이외의 동물에서 영양질환의 진단 및 치료를 위한 중요한 결과를 가질 수 있다.
실시예 2: 세균에서 OB의 발현
ob를 코드화 한 쥐 및 인간 cDNAs 둘다는 pET-15b 발현벡터 (Noagen)내로 클로닝하였다. 이 벡터는 lac 오퍼레이터와 함께 T7 프로모터를 함유하며, 코드화 서열 삽입부위의 바로 상류에 트롬빈 절단부위 및 히스티딘 태그 (His-tag)를 함유하는 융합단백질을 발현한다 (도 17) (SEQ ID NOS:11 및 12).
마우스 및 인간 cDNAs는, 시그날 서열의 말단에서 알라닌이 3' 부분에서 별개의 서열인 것으로서 NdeI 부위로 변화되도록 변형되었다. NdeI 부위의 삽입은 신규한 프라이머와 함께 PCR을 사용하여 수행되었다:
Mnde-5' (쥐의 5' 프라이머):
Figure pct00001
Mnde-3' (쥐의 3' 프라이머):
Figure pct00002
Hnde-5' (인간의 5' 프라이머):
Figure pct00003
Hnde-3' (인간의 3' 프라이머):
Figure pct00004
프라이머는 PCR 단편의 각각의 말단에서 NdeI 제한부위를 도입시킨 중앙에서 6-염기쌍 미스매취를 함유한다. 마우스나 인간의 cDNA를 보유하는 파아지를 이들 프라이머를 사용하여 PCR 증폭시켰다. PCR 생성물을 NdeI로 분해시키고, 1% 저융점 아가로즈 겔상에서 겔 정제하였다. 겔 정제된 밴드를 pET 벡터내로 서브클로닝하였다. 생성된 플라스미드는 돌연변이가 클로닝의 PCR 증폭단계 중에 도입되지 않는 것이 확실하도록 서열을 분석하였다. 코드화되고 글루타민 49가 결여된 인간 및 쥐 cDNA에 대한 작제물이 제조되었다. 특히, 시그날 서열이 삭제되고, His-태그에 융합된 인간 또는 마우스 OB 코드화 서열을 함유하는 pET 15b 작제물을 PCR 클로닝 방법을 사용하여 제조하였다. 작제물을 서열분석하여 PCR 증폭단계 중에 OB 유전자의 코드화 부분내에는 어떠한 서열 오차도 도입되지 않았음을 확실히 하였다.
두개의 생성된 플라스미드 작제물인 pETM9 및 pETH14를 선택하여 세균 발현 숙주를 형질전환시켰다. 최적 조건하에서 1 mM IPTG를 도입시키면 형질전환된 세균은 100-300 ㎍/㎖의 OB 융합을 생성시킬 수 있었다. 대부분의 OB 융합단백질은 봉입체에서 확인되었다. 6M 구아니딘-HCl 또는 우레아로 가용화시킨 후에, 융합단백질을 His-결합 (Ni-킬레이트화) 수지칼럼을 통해서 정제하였다. OB 융합단백질의 칼럼 정제 (결합, 세척 및 용출을 포함)를 위한 조건은 실험적으로 설정되었다. OB 융합단백질을 5 mM 이미다졸/6M 구아니딘-HCl에서 수지에 결합시키고, 20 mM 이미다졸/6M 구아니딘-HCl 이하에서 결합된 채로 유지시킨다. 단백질을 60 mM 이미다졸/6M 구아니딘에서 수지로부터 용출시킬 수 있다 (도 18A, B). 정제된 인간 및 마우스 OB 융합단백질을 둘다 PBS 중에서 더 투석하여 제제로부터 구아니딘-HCl을 제거한 다음에, 폴리클로날 항체를 유도하기 위해서 사용하였다.
융합단백질 생성물의 생물학적 활성을 시험하기 위해서, 정제된 단백질에 대한 재중첩 조건 (refolding conditions)을 시험하여 밝혀내었다. 이것에는 1 M 구아니딘 용액중에서 융합단백질의 초기 투석에 이어서, 0.4 M 아르기닌 용액에 의한 희석이 포함된다. His-태그는 생물학적 기능에 대한 분석시험을 하기 전에 융합단백질로부터 제거하였다. 태그의 제거는 융합단백질을 인체 태반으로부터 유래하는 트롬빈으로 처리함으로써 수행되었다.
또한, 시그날 서열을 뺀 인간 및 마우스 OB 유전자 코드화 서열은 각각 PCR 클로닝 방법을 사용하여 pET 12c 벡터내로 삽입된다. 이들 작제물은 합성된 OB 융합단백질을 세균 숙주세포의 원형질외극 (periplasmic space)내로 향하게 할 수 있다. 원형질외극으로부터 회수된 OB 융합단백질은 다른 숙주 단백질로부터 정제하기 위해서 단지 간단한 겔여과 만을 필요로 할 수 있으며, 이러한 공정중에 변성되지 않는다.
실시예 3: OB 폴리펩타이드에 대한 항체의 제조
리클로날 체를 생성시키기 위 재조 단백질의 용도 이외에도, 추론된 쥐의 OB 서열로부터 유래 는 4개의 펩타이드 서열의 셋트를 면역원성 플롯 소프트웨어 (GCG Package)를 사용하여 확인하였다. 4개의 카복실 말단 펩타이드 단편은 다음과 같다:
(SEQ ID NO:18):
Figure pct00005
(SEQ ID NO:19):
Figure pct00006
(SEQ ID NO:20):
Figure pct00007
(SEQ ID NO:21):
Figure pct00008
이들 펩타이드를 KLH에 컨쥬게이트시키고, 펩타이드-KLH 컨쥬게이트를 표준기술을 사용하여 토끼를 면역시키는데 사용하였다. 각각의 펩타이드에 대해 특이적인 폴리클로날 항혈청을 토끼로부터 회수한다.
실시예 4: OB 폴리펩타이드의 시험관내 전좌 (translocation)
작용적 시그날 서열의 존재를 확인하기 위하여, 전체 개방 판독프레임을 포함한 인간 cDNA를 pGEM 백터내에 서브클로닝시켰다. 적합한 마우스 서브클론은 회수되지 않았기 때문에 이 실험에서는 인간 cDNA 만을 사용하였다. 양성 스트랜드 인간 ob RNA를 Sp6 폴리머라제를 사용하여 전사시키고, 개의 췌장 마이크로좀 막의 존재 및 부재하에서 시험관내 해독반응에서 사용하였다. 일차 해독생성물은 ~ 10 kD의 겉보기 분자량으로 이동하였으며, 이것은 cDNA 서열에 의해서 예상되는 것과 일치한다. 반응에서 마이크로좀 막의 봉입은 해독의 전반적인 효율을 ~ 5-배 억제하였다. 그럼에도 불구하고, OB 일차 해독생성물의 약 50-70%는 막제제의 존재하에서 약 2 kD 까지 절단되었으며, 이것은 시그날 서열이 작용적임을 시사하는 것이다 (도 19A). 시그날 서열을 코드화하지 않는 인터로이킨-1α RNA의 일차 해독생성물의 크기는 마이크로좀 막이 반응에 포함된 경우에는 변화되지 않았다. OB 단백질의 전좌가 일어났음을 확인하기 위해서, 시험관내 해독생성물을 프로테이나제-K로 처리하였다. 프로테아제 처리는 18 kD 일차 해독생성물의 완전한 단백분해를 유도한 반면에, 16 kD 처리된 형태는 효소처리에 의해서 영향을 받지 않았으며, 이것은 이 형태가 마이크로좀의 루멘내로 전좌하였음을 시사하는 것이다 (도 19B). 이들 데이타는 OB가 분비된 단백질이라는 가설과 모순되지 않는 것이다.
시그날 서열을 절단한 후에, 두개의 시스테인 잔기는 분자가 다른 분비된 폴리펩타이드의 특징인 디설파이드 결합을 함유하는 가능성을 야기시키는 예상된 단백질내에 잔류할 수 있다 [Shen et al., Science, 224:168-171 (1984)].
실시예 5: OB 유전자의 특정화
인간에게서 비만증과 OB 유전자에 있어서의 유전자 변형 사이의 상관관계를 정립하기 위하여, 인간 OB 유전자의 서열을 결정하였다 (도 20A 내지 C) (SEQ ID NOS:22 및 24). 인간 코드화 서열로부터의 특이적인 프라이머를 사용하여 인간 P1 라이브러리를 선별하였다. 3개의 상이한 P1 클론을 수득하고, 성장시키고, 제 1 및 제 2 코드화 엑손 사이의 스플리싱 부위의 측면에 있는 프라이머를 사용하여 PCR 증폭시켰다. 약 2 kb의 전체 인트론 부분을 증폭시키고, 부분적으로 서열을 결정하였다 (참조, 도 20A; SEQ ID NO:22 및 24에서 나타낸 바와 같음).
쥐 및 인간 유전자 둘다의 유전자 구조는 PCR 시험방법 및 그밖의 다른 표준기술을 사용하여 특정화시켰다. 마우스 OB 유전자는 3개의 엑손으로 구성되는 것으로 밝혀졌으며, 이들 중의 두번째 및 세번째 것이 코드화 서열을 설명하는 것이다 (도 20D). 인간 OB 유전자의 코드화 부분은 동일한 구조를 공유하지만, 인간 유전자는 5' 엑손 및 인트론이 결여되어 있다 (도 20E).
인간 유전자의 인트론 서열로부터 생성된 프라이머의 두개의 셋트를 제조하였다 (도 20A 내지 C). 프라이머의 서열은 다음과 같다 (F 및 R은 각각 정방향 및 역방향을 의미한다):
Figure pct00009
DNA 샘플은 다양한 공급원으로부터 수득되었으며, 이들 프라이머의 셋트는 심하게 비만증인 사람들로부터 유래하는 인간 지놈 DNA를 증폭시키는데 사용된다. PCR 생성물을 저융점 아가로즈 겔상에서 주행시키고, 밴드를 떼어 내어 아가라제(agarase)로 분해시켰다. 서열은 ABI 373A DNA 서열분석기 및 Taq 디데옥시 터미네이터 키트 (ABI, Perkin-Elmer)를 사용하여 수득하였다. 현재까지는 환자 샘플로부터 ob 유전자에서 하나의 점돌연변이가 검출되었다. 이 돌연변이는 첫번재 엑손에 존재하며, 아미노산 서열을 변화시키지 않는다. 예비시험 데이타는 삽입서열이 또 다른 환자의 첫번째 엑손에 존재할 수도 있음을 시사한다.
Taq DNA 폴리머라제 대신에 시쿼나제 (Sequenase)를 사용하는 상이한 자동화 서열분석 방법을 사용하여 돌연변이 검출을 위해서 더 용이하게 판독할 수 있는 서열을 수득할 수도 있다.
실시예 6: 효모내에서 OB의 발현
OB의 위치적 클로닝에 따라서, OB 단백질이 음식물 섭취 및 체중을 감소시키는 생리적 기전을 밝히는 것이 중요하게 되었다. 이러한 방향에서 첫번째 단계는 발현시스템을 사용하여 작용적 단백질을 재조합적으로 생산하는 것이었다. 성공적인 세균 발현시스템 이외에, 효모 발현시스템도 또한 선택되었다. 효모 발현은 OB를 발현시키기 위한 몇가지 흥미로운 특징을 갖는다. 가장 중요한 것은, 생물학적으로 활성인 진핵 단백질이 생산되는 것이 더 가능할 것이라는 점이다. OB 폴리펩타이드는 포유동물 세포에 의해서 분비된다. 단백질 분비는 모든 진핵생물에 대해서 매우 유사하며, 이것은 효모 분비기구 (secretory apparatus)가 세균 분비경로보다는 포유동물 분비경로와 훨씬 더 유사한 것을 의미한다. 특히, 포유동물 세포에서 나타나는 OB의 단백질 변형은 또한 효모 분비시스템을 통한 발현시에도 마찬가지로 볼 수 있다. 또한, 단백질 중첩은 분비기구를 통해서 통과시에 수행되며, 따라서 효모 분비기구를 통한 ob의 송달은 천연 생물학적 활성을 갖는 적절히 중첩된 단백질을 제공할 수 있다. 이것은 OB의 경우에 유의적인데, 이는 두개의 시스테인 잔기가 디설파이드 브릿지 (bridge)를 형성할 수 있기 때문이다. 분비경로와는 반대로, 세포 세포질의 환원적 환경은 디설파이드 브릿지의 형성을 방지하며, 따라서 이 디설파이드 결합이 생체내에서 형성하도록 하기 위해서는 OB가 분비경로를 통해서 통과하는 것이 필수적이다. 그밖의 다른 이점은 효모 조작의 용이성 및 신속성, 벡터 및 스트레인의 입수용이성, 및 효모 재조합기술에 있어서의 막대한 실험으로 수행된다는 점이다.
피치아 패스토리스 (Pichia pstoris) 시스템은 다음의 4가지 이유로 선택되었다: (1) 이것은 사카로마이세스 세레비지에 (S. cerevisiae)와 같은 다른 효모 시스템 보다 더 높은 수준의 이종단백질 발현을 가지며; (2) 단백질 글리코실화는 사카로마이세스 세레비지에 (S. cerevisiae)에서 보다는 피치아 패스토리스 (P. pastoris)에서 포유동물 시스템과 더 유사하고 (비록 글리코실화 부위가 컴퓨터 조사를 사용하여 ob에서 검출되지 않았지만, 비인지된 부위에서 글리코실화의 가능성은 여전히 존재하였다); (3) 피치아 패스토리스 (P. pastoris)는 천연적으로 매우 적은 단백질을 분비하고, 따라서 이것은 일반적으로 발현된 외래단백질을 간단하게 정제하며; (4) 벡터 및 효모 스트레인을 시판품 (Invitrogen으로부터)으로 이용할 수 있다. 효모 발현벡터를 생성시키는 두가지 방식은 도 21 및 22에 나타내었다.
선택된 벡터는 pPIC.9였다. 이 벡터는 클로닝 부위에서 클로닝된 유전자에 의해 코드화된 단백질을 분비경로에 의해서 분비되도록 지시하는 α-교배인자 프리프로 (prepro) 코드화 서열의 바로 하류에 클로닝 부위를 함유한다. 이 벡터의 다른 중요한 특징은, 효모를 벡터로 형질전환시킨 후에 히스티딘-결핍 배지상에서 증식시킨 효모 영양요구성 스트레인을 사용하여 벡터를 이용하기 위해 선택할 수 있는 HIS4 유전자이다. 클로닝 방식은 다음과 같았다: PCR로 그의 3' 말단에 예상된 리더 펩타이드 절단부위 바로 다음에 OB의 서열에 대해 상보적인 서열을 함유하며, 그의 대부분의 5' 말단에는 벡터의 α-교배인자 서열의 3' 말단에 대해 상보적인 서열을 함유하는 5' 프라이머를 사용하여 OB cDNA를 증폭시킨다. 5' 프라이머는 또한 XhoI 부위를 함유한다. 3' 프라이머는 그의 3' 말단에 OB의 마지막 몇개의 아미노산에 대해 상보적인 서열을 갖고 그의 5' 말단에는 EcoRI 부위를 갖도록 디자인되었다. PCR 증폭시킨 후에, PCR 생성물을 XhoI 및 EcoRI로 분해시키고, 유사하게 분해된 pPIC.9내로 클로닝시켰다. 각각의 경우에 코돈 94에 글루타민을 갖거나 갖지 않는 마우스 및 인간 OB cDNAs 둘다를 클로닝한 후에, 모두 4개의 작제물에 대하여 각각의 클론을 분리시키고, 서열을 결정하여 작제물이 정확한 배열 및 프레임으로 클로닝되었으며, PCR 증폭단계로 인한 돌연변이를 함유하지 않음을 입증하였다. 정확한 서열을 갖는 클론을 동정한 이후에, 이들을 히스티딘 영양요구 변이주인 피치아 패스토리스 (P. pastoris) 스트레인 GS115에서 형질전환시켰다.
두개의 마우스 OB 작제물의 경우에는, 형질전환된 효모 클론을 단백질 발현에 관하여 스크리닝하였다. 형질전환된 효모가 OB를 함유한다는 증거로, DNA 도트-블럿 시험 및 콜로니 하이브리드화 시험을 수행하였으며, 이들 둘다는 형질전환된 효모내에서는 OB 서열을 나타내었지만 형질전환되지 않은 효모내에서는 나타내지 않았다. 또한, 형질전환된 효모는 배양배지내로 16 kDa 단백질을 분비하였으며, 그 반면에 형질전환되지 않은 효모는 이 크기의 단백질을 분비하지 않았다 (도 23A). 이것은 OB의 예상된 크기이다. 마우스 작제물 둘다에 대한 개개 클론은 OB에 대한 높은 발현체 (expressors)인 것으로 확인되었으며, 현재의 정제방식은 ob를 균일하게 정제하기 위해 개발중인 것이다. 한가지 방식은 양이온 교환칼럼상에서 OB를 정제하는 것이었으며 (도 23B); 예비 데이타는 강력한 양이온 교환제가 유용할 수 있음을 시사한다. 그러나, 양이온 교환 크로마토그라피한 후에 추정상의 ob 생성물은 손실된다. 이것은 샘플중에 프로테아제가 존재하는 것을 시사한다.
이러한 문제점을 극복하기 위한 한가지 방식은 효모내에서 발현시키기 위한 ob-His-태그 융합물을 제조하는 것이다 (도 22). 추가의 평가로, His-태그가 없는 OB는 Ni-킬레이트화 칼럼과 단단하게 회합하는 것을 입증하였다. Ni-킬레이트화시키고, 이어서 겔여과함으로써 이루어지는 OB 폴리펩타이드의 정제로 질량분광분석에 충분한 순도의 생성물을 수득하였다. 질량분광분석은 발현된 단백질의 분자량이 예상된 분자량과 동일함을 증명하며, 이것은 OB가 피치아 (Pichia)내에서 성공적으로 발현되었음을 강력하게 입증하는 것이다.
그러나, Ni-킬레이트화/겔여과 정제 프로토콜은 OB 폴리펩타이드를 충분히 순수한 형태로 수득하지 못한다. 추가의 소분자가 존재한다. 이것은 단백분해 활성이 공극용적내의 Ni-킬레이트화 칼럼으로부터 용출하는 것을 나타낸다. 따라서, Ni-킬레이트화에 이어서 양이온 교환 (소분자 오염물을 제거함)을 수행하고, 이어서 겔여과를 수행하는 3-단계 정제법이 계획된다.
효모를 진탕 플라스크내에서 성장시키는 경우에, SDS-PAGE 겔의 쿠마시 블루(Coomassie blue) 염색에 의한 발현수준은 약 10 ㎎/ℓ를 나타내는 것으로 추정된다. 이들 수준은 발효용기내에서 증가하는 것으로 예상되며, 본 발명자들은 더 대량의 단백질을 수득할 목적으로 발효를 개시시키고자 한다. 인간 OB 작제물과 관련하여서는, 높은 복제수의 OB 유전자를 함유하는 형질전환된 효모 클론이 확인되었으며, 이들은 OB 단백질을 발현하는 것으로 예상된다. 항체가 생성되기 때문에, 이들을 사용하여 분비된 16 kDa 단백질의 동일성을 확인할 수 있을 것이다.
실시예 7: 세균내에서 Ob 융합단백질의 높은 수준의 발현
동결기 원액 (freezer stocks)의 제조:
탄소 공급원을 함유하지 않는 멸균된 M9ZB 배지의 두개의 4 ㎖ 분취액 각각에 40 ㎕의 원액 덱스트로즈 (0.4 g/㎖, 필터 멸균됨), 10 ㎕의 암피실린 원액 (200 mg/㎖) 및 5 ㎕의 클로람페니콜 원액 (34 mg/㎖, 에탄올중)을 첨가하였다. 노바겐 (Novagen) pET-14b 벡터내의 클로닝된 마우스 및 인간 OB1 DNA를 갖는 각각의 에스케리키아 콜라이 (E. coli)의 단일 콜로니를 사용하여 이들을 접종하였다. 튜브를 37℃에서 밤새 배양하였다.
0.5 ㎖의 밤새 배양물을 사용하여 덱스트로즈, 암피실린 및 클로람페니콜을 갖는 50 ㎖의 M9BZ 배지를 접종하였다. 이들을 30℃에서 배양하고, 600 nm에서의 흡광도 (A600)를 주기적으로 모니터하였다. 약 1-1.2의 A600에서 배양물의 175 ㎕ 분취액을 2 ㎖ 에펜도르프 튜브 (eppendorf tubes)내에서 25 ㎕의 60% 글리세롤과 혼합시키고, 액체 질소중에서 순간동결시켜 -80℃에서 저장하였다.
배양물 성장:
0.5 ㎖의 40% 덱스트로즈, 125 ㎕의 암피실린 원액 및 50 ㎕의 클로람페니콜 원액을 갖는 50 ㎖의 M9ZB 배지를 1 ㎖의 동결기 원액으로 접종하고, 30℃에서 배양하였다. 1-1.2의 A600에서, 10 ㎖의 이 배양물을 사용하여 덱스트로즈, 암피실린 및 클로람페니콜을 갖는 500 ㎖의 M9ZB 배지를 함유하는 4개의 2 L 플라스크 각각을 접종하였다. 이들을 0.5 mM IPTG의 최종농도로 약 1-1.2의 A600이 유도될 때 까지 30℃에서 배양하였다. 배양물을 밤새 배양하였다. 세포는 4000 rpm에서 20분동안 원심분리시킴으로써 수거하였다. 이 발현시스템은 총단백질의 상당히 높은 백분율로 재조합 OB 폴리펩타이드를 수득하였으며, 이것은 에스케리키아 콜라이 (E. coli)의 그람/리터와 거의 비슷한 수준이다.
세포 융해 및 봉입체의 재현탁:
세포 페이스트 (paste)를 최소 용적의 20 mM HEPES, pH 7.2, 10% 글리세롤, 0.1 M KCl, 5 mM MgCl2, 1% 아프로티닌, 1 mM PMSF, 5 ㎍/㎖ 로이펩틴 및 50 ㎍/㎖ DNase I에 재현탁시켰다. 현탁액은 액체 질소 및 미온수 (lukewarm water)를 사용하여 3회 동결 해빙시켰다. 융해된 세포를 18000 rpm에서 30분 동안 원심분리하고, 20 mM HEPES, pH 7.5, 0.1 M NaCl에 재현탁시켰다. 현탁액을 초음파 처리하고, 트리톤 (Triton) X100을 최종농도 2%로 첨가하였다. 이것을 15분 동안 18000 rpm에서 원심분리하였다. 이러한 사이클을 2회 더 수행한 후에, 3개의 사이클의 트리톤 비함유 세척액을 제공하였다. 마지막으로, 펠릿을 초음파 처리에 의해서 6 M GdHCl (구아니딘-HCl), 20 mM HEPES, pH 7.5에 용해시키고, 이어서 원심분리하였다. 더 정제하기 위해서 상등액을 사용하였다.
OB 단백질을 고정화 금속이온 친화성 크로마토그라피 (IMAC)에 의해서 비중첩된 상태로 정제하였다. 용액을 50 mM NiSO4의 5 칼럼 용적으로 충전시키고, 6 M GdHCl, 20 mM HEPES, pH 7.5중에서 평형화시킨 파마시아 (Pharmacia) 킬레이트화 고속유동 세파로즈의 40 ㎖ 칼럼에 적용하였다. 칼럼을 6 M GdHCl, 30 mM 이미다졸, 20 mM HEPES, pH 7.5로 세척하였다. 마지막으로, 단백질을 0.2 M 이미다졸을 함유하는 동일한 완충액으로 용출시켰다. 6 M GdHCl중의 비중첩된 단백질은 나트륨 아세테이트 (NaAc)를 10 mM 까지 첨가하고 아세트산으로 pH를 약 4.5로 조정한 후에 4℃에서 저장하였다.
단백질의 재중첩 (refolding) 및 정제:
100 mg의 단백질을 함유하는 6 M GdHCl 용액을 67 ㎕의 1 M 디티오트레이톨(DTT)로 처리하고, 6 M GdHCl, 10 mM NaAc, pH 4.5를 사용하여 약 67 ㎖로 희석하였다. 이것을 실온에서 약 1시간 동안 교반하면서 방치하였다. 그후, 이것을 교반하면서 4 L의 20% 글리세롤, 2.5 mM CaCl2, 20 mM 트리스 (Tris), pH 8.4 완충액 중에서 희석하였다. 적절히 교반한 후에, 용액을 더 이상 교반하지 않으면서 실온에서 약 8시간 동안 방치하였다. 그후, 2000 유니트의 정제된 소 트롬빈 (트롬보스타트 (thrombostat)로부터, Parke-Davis 제품)을 첨가하고, 용액을 온화하게 교반하면서 방치하였다. 2.5시간 후에, 2000 유니트의 트롬빈을 재첨가하고, 히스티딘-태그의 절단을 3시간 더 계속하였다. 트롬빈 절단은 PMSF를 0.1 mM의 최종농도로 첨가함으로써 억제하였다. 용액을 여과하여 4℃에서 저장하였다.
절단된 단백질은 1 M KCl, 20% 글리세롤, 20 mM HEPES, pH 8.4 완충액중에서 평형화시킨 상기한 것과 동일한 IMAC 칼럼상에서 더 정제하였다. 단백질 용액을 부하시킨 후에, 이것을 동일한 완충액으로 세척하고, 절단된 단백질을 1 M KCl, 20% 글리세롤, 40 mM 이미다졸, 20 mM HEPES, pH 8.4로 용출시켰다. 절단되지 않은 단백질은 0.2 M 이미다졸로 용출시켰다.
정제된 절단된 단백질을 농축시키고, 50-100 mM EDTA, 10 mM 칼륨 페리시아 나이드로 처리하고 (불완전 산화반응을 완결시키기 위함), 슈퍼덱스 (superdex) 75 16/60 칼럼상에서 겔여과하였다. 이 방법을 사용한 수율은 출발 펩타이드의 50%에 가까웠다.
일단 정제한 후에, 발현된 단백질은 몇가지 방법에 의해서 특정화되었다. 물리적 특징은 구조의 균질성을 측정하기 위한 동적 광산란을 포함하며, 적절한 중첩의 척도로 사용된다. 광산란 데이타는 인간 OB 폴리펩타이드가 주로 또는 독점적으로 모노머로서 발현되는 반면에, 쥐 OB 폴리펩타이드는 모노머 뿐만 아니라 다이머로서도 존재할 수 있음을 시사한다.
엘만스 시약 (Ellman's reagent)을 사용한 시험 및 질량분광분석으로 시스테인 잔기는 단백질내에서 디설파이드 결합을 형성한다는 것을 확인한다. 폴리펩타이드의 이 산화된 형태를 후술하는 바와 같이 마우스에게 투여하여, 생물학적 활성을 입증하였다.
원편광 이색성 (circular dichroism)을 사용하여 단백질의 구조기하학을 대략적으로 측정하였다. 생리적 완충액 (pH 약 8, 대략적으로 생리적 이온강도)중에서의 CD 스펙트럼은 인간 OB 폴리펩타이드가 약 60%의 α-나선구조 및 약 40%의 무작위 코일 구조를 갖는 것을 시사한다. 쥐의 OB 폴리펩타이드는 CD 분광법에 의해서 약 50%의 α-나선 및 50%의 무작위 코일을 갖는 것으로 확인되었다.
제한된 단백분해에 이은 질량분광법 (Cohen et al., 1995, 상기 참조)을 사용하여 단백분해를 일으키기 쉬운 OB 폴리펩타이드의 부분을 확인하였다. 이 분석으로 아미노산 잔기 54 내지 60의 가요성 루프구조의 존재를 입증하였다 (도 4에 도시된 바와 같음). 이 가요성 루프는 α-나선과 같은 규정된 2˚ 구조의 두개의 영역을 연결하는 것 같다.
이하의 실시예에서 보는 바와 같이, 중요하게는 정제된 단백질의 생체활성은 적어도 2주일의 기간에 걸쳐서 삼투압 펌프 (예를들어, Alza Corporation (Palo Alto, CA)의 알젯트 (ALZET) 삼투압 펌프)를 통해서, 또는 매일 볼루스 (bolus) 용량으로 마른 설취류 및 비만 설치류 둘다에 단백질을 투여함으로써 시험하고, 급식 거동 (feeding behaviour) 및 체중에 대한 영향을 관찰하였다.
실시예 8: OB 폴리펩타이드 (렙틴 (Leptin))의 체중 감소효과
마우스 OB 로커스의 유전자 생성물은 체중을 조절하는데 중요한 역할을 한다. 본 실시예는 OB 단백질이 마우스, 랫트 및 인간의 혈장내에서 순환하는 것을 입증한다. 세가지 종 모두에서 순환형은 SDS-PAGE에 의해서, 시그날 서열이 없는 추론된 폴리펩타이드 서열과 동일한 분자량을 가지며, 이것은 생체내에서 단백질이 시그날 서열을 절단한 후에는 처리되지 않음을 시사하는 것이다. OB 단백질은 C57/B16J ob/ob 마우스의 혈장에는 부재하였으며, 대조군에 비해서 db/db 마우스의 혈장에는 10배 더 고농도로 존재하고 fa/fa 랫트의 혈장에는 20배 더 높은 수준으로 존재하였다. 이것은, 이들 비만동물 돌연변이체가 OB의 효과에 대해 저항성임을 시사하는 것이다. 6명의 여윈 인간 피검자의 그룹에서 OB 단백질의 혈장 수준에는 7배의 차이가 있었다. 재조합 마우스 OB 단백질의 매일 주사는 ob/ob 마우스에서는 체질량 (body mass)을 현저하게 감소시켰으며, 야생형 마우스의 체중에 대해서는 유의적인 효과를 가지고, db/db 마우스에 대해서는 효과가 없었다. 이들 데이타는 OB 로커스의 유전자 생성물이 체중을 조절하는 엔도크린 기능을 나타냄을 시사한다.
재료 및 방법
토끼를 프로인트 보조액 (Freund's adjuvant; HRP, Inc.)중의 재조합 단백질로 면역시켰다. 면역정제된 안티-마우스 OB 항체는 문헌 [Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1988)]에 기술된 바와 같이 항혈청을 재조합 단백질에 컨쥬게이트된 세파로즈 4B 칼럼상에 통과시킴으로써 제조되었다. 마우스 혈장의 면역침강반응은 다음과 같이 수행되었다: 약 2.5 mM EDTA를 함유하는 마우스, 랫트 및 인간으로부터 유래하는 0.5 ㎖의 혈청을 2시간 동안 진탕하면서 실온에서 비컨쥬게이트된 세파로즈-4B로 전세정하였다. 세파로즈를 회전시켜 제거하고, 충진된 세파로즈의 ㎖당, 1 mg의 농도로 친화성-정제된 항체를 함유하는 항체-컨쥬게이트된 세파로즈의 50% 슬러리 50 ㎖를 첨가하였다. 0.5 ㎖의 2×RIPA 완충액을 첨가하여 다음과 같은 최종 결합조건을 제공하였다: 50 mM 트리스-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl, 1% NP-40, 0.1% SDS, 0.5% 나트륨 데옥시콜레이트 및 0.025% 나트륨 아지드. 반응은 진탕하면서 4℃에서 밤새 수행하였다. 항체-컨쥬게이트된 세파로즈를 RIPA 완충액으로 8회 세척하고, 이어서 PBS로 3회 세정한 다음, 15% SDS-PAGE상에서 주행시켰다. 단백질을 니트로셀룰로즈에 전이시키고, 재조합 단백질에 대한 비오티닐화 면역정제된 항체를 사용하여 웨스턴 블럿팅하였다. 사용된 이차항체는 HRP-스트렙타비딘이었으며, 검출을 위해서 ECL이 사용되었다.
마우스 혈청내에서 OB의 양을 정량분석하기 위해서, 재중첩된 재조합 마우스 OB 단백질의 증가량 (0.01, 0.1, 0.5, 2.0, 15.0 ng)을 100 λ의 C57BL/6J ob/ob 혈장에 첨가하고, 단백질 A 세파로즈 컨쥬게이트된 항체와 함께 3시간 동안 4℃에서 배양하였다. 완충액 A (10 mM 나트륨 포스페이트 완충액, pH 7.4; 100 mM NaCl; 1% 트리톤 X-100, 5 mM EDTA, 1 mM PMSF)로 광범하게 세척한 후에, 샘플을 샘플 완충액에 재현탁시켜 15% SDS-PAGE상에 부하시키고, 니트로셀룰로즈막에 전이시켰다. 웨스턴 블럿팅은 일차항체로서 면역정제된 비오티닐화 안티-아미노-말단항체 및 이차항체로서 HRP-스트렙타비딘을 사용하여 수행하였으며, 이어서 ECL 검출을 수행하였다.
세포질 추출물은 폴리트론 및 다운스 (dounce) 균질화에 의해서 NDS 완충액(10 mM 트리스, pH 7.5, 10 mM NaCl, 60 mM ICCI, 0.15 mM 스페르민, 0.5 mM 스페르미딘, 14 mM β-머캅토에탄올, 0.5 m EGTA, 2 mM EDTA, 0.5% NP-40)중에서 지방조직을 균질화시킴으로써 제조하였으며, 핵의 제거는 700 g으로 원심분리시킴으로써 수행되었다.
면역침강반응은, 면역정제된 안티-인간 OB 항체를 사용하는 것을 제외하고는 상술한 바와 같이 수행되었다. ELISA의 경우에는, 면역정제된 안티-인간 OB 항체의 1 mg/㎖ 용액 100 ㎖를 보레이트 완충된 PBS 용액에 용해시키고, 4℃에서 미량 역가 (Corning cat. #2595) 플레이트에 밤새 적용하였다. 그후, 플레이트를 0.05% 트윈 20을 함유하는 보레이트 식염수 용액으로 4회 세척하고, 과량의 액체를 제거하였다. 플레이트를 웰당, 0.3% 젤라틴을 함유하는 보레이트 식염수 완충액 240 ㎖와 함께 2시간 동안 실온에서 배양함으로써 차단시킨 다음에, 세척하고 건조시켰다. 100 ㎖ 용적의 재중첩된 인간 OB 단백질 또는 혈장 샘플중의 어느 하나의 기지량을 각각의 웰중에서 4℃로 밤새 배양하였다. 세척한 후에, 플레이트를 100 ㎖의 비오티닐화 면역정제된 안티-인간 항체 (젤라틴-보레이트 완충용액중에서 0.1 mg/㎖)와 함께 실온에서 4시간 동안 배양하였다. 세척한 후에, 플레이트에 호스 래디쉬 퍼옥시다제 (horse radish peroxidase; HRP)-스트렙타비딘을 첨가하였다 (보레이트 완충액중의 0.1 mg/㎖, 0.3% 젤라틴). 그후, 검출을 위해서 HRP 기질용액 (ABTS, 0.3 mg/㎖ 및 H2O2, 시트르산중의 0.01%)을 사용하고, 414 nM에서 O.D.를 측정하여 항체결합을 정량분석하였다.
마우스 및 인간 OB 유전자 코드화 서열은 OB cDNA 서열을 함유하는 플라스미드로부터 PCR 증폭시키고, pPIC.9 플라스미드 (Invitrogen)내에서 서브클로닝하였다. 사용된 인간 5' 프라이머는 이하의 SEQ ID NO:34였고, 3' 프라이머는 SEQ ID NO:35였다:
Figure pct00010
마우스의 경우에는 5' 프라이머가 SEQ ID NO:36이었으며, 3' 프라이머는 SEQ ID NO:37이었다:
Figure pct00011
마우스 및 인간 둘다에 대한 5' 프라이머는 5' 말단에 XhoI 부위 및 벡터 pPIC.9내에 존재하는 α-교배인자 시그날 서열의 마지막 4개의 아미노산에 대한 코드화 서열을 함유한다. 이 벡터는 이종발현된 유전자가 세포로부터 배양배지내로 분비되도록 지시한다. 5' PCR 프라이머는 또한 시그날 서열 절단부위 다음 및 아미노산 위치 21에서의 알라닌 전에, OB 유전자 개방 판독프레임의 첫번째 19개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 3' 프라이머는 그의 5' 말단에 EcoRI 부위를 함유하며, 이것은 바로 이어서 추정상의 OB 정지코돈에 대해 상보적인 서열로 이어진다. PCR 조건은 다음과 같았다: 94℃에서 1분 동안 변성, 55℃에서 1분 동안 어니일링, 및 72℃에서 2.5분 동안 연장. 저사이클 PCR (15 사이클) 및 교정 (proof-reading) 폴리머라제 PFU (Stratagene)를 사용하여 PCR-발생된 돌연변이의 수를 제한하였다. PCR 생성물을 XhoI 및 EcoRI로 분해시키고, 유사하게 분해된 벡터 pPIC.9내에 클로닝하였다. 모든 작제물을 두개의 스트랜드 상에서 서열분석하여 PCR-발생된 돌연변이가 부재함을 확인하였다. 클론을 스페로플라스트 방법(spheroplast method)에 의해 피치아 패스토리스 (Pichia pastoris) (His-)에서 형질전환시키고, 히스티딘 결핍 배지상에서 선별하였다. 콜로니 하이브리드화 시험방법에 의해서 대략 200개의 마우스 및 인간 클론을 높은 복제수의 통합에 관하여 선별하였다. 높은 복제수의 클론은 그후, 우선적으로 형질전환된 효모의 배양배지내에 존재하는 신규한 16 kD 단백질의 존재를 나타내는 쿠마시 염색에 의해서 OB 발현에 대하여 시험하였다. 16 kD 밴드는 세균적으로 발현된 OB 단백질에 대항하여 생성된 항체를 사용하여 OB인 것으로 확인되었다. 재조합 단백질은 후술하는 2-단계 정제방법에 의해서 정제하였다. 질량분광법 및 시아노겐 브로마이드 처리는 문헌 (Beavis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6873-6877 (1990))에 기술된 바와 같이 수행되었다.
시그날 서열쪽으로 C-말단인 마우스 및 인간 OB 유전자의 전체 OB 코드화 서열을 pET15b 발현벡터 (Novagen)에 서브클로닝하고, T7 RNA 폴리머라제 시스템[Studier et al., Meth. Enzymology, 185:80-89 (1990)]를 사용하여 에스케리키아 콜라이 (Escherichia coli) [BL21(DE3)p1YsS]에서 과발현시켰다. 595 nM에서 흡광도 0.7 까지 30℃에서 성장시키고 0.5 mM 이소프로필-β-D-티오갈락토-피라노사이드로 밤새 유도한 세포를 저속 원심분리에 의해서 수거하였다. 융해는 3 사이클의 동결 해빙에 의해서 수행하였으며, DNA 분해는 DNaseI을 사용하여 수행되었다. 막추출은 초음파 처리 및 세정제 가용화에 의해서 수행하였으며, 최종 봉입체 펠릿은 6 M 구아니딘-HCl, 20 mM HEPES, pH 8.4에 용해시켰다. 재조합 OB 단백질은 Ni-이온 친화성 칼럼을 사용하고 증가량의 이미다졸로 세척하는 IMAC에 의해서 변성조건하에서 정제하였다. 그후에, 정제된 변성 OB 단백질은 6 M 구아니딘-HCl, 10 mM 나트륨 아세테이트 (NaAc), pH 5중에서 저장하고, 실온에서 1시간 동안 1 mM DTT를 사용하여 환원시켰다. 변성은 환원된 단백질을 20% 글리세롤, 5 mM CaCl2, 5mM NaAc, pH 5로 희석하고, 완전히 혼합시키고, 실온에서 8-12시간 동안 배양함으로써 수행하였다. 변성시킨 후에, 트리스를 10 mM 까지 첨가하여 pH를 8.4로 조정하고, 헥사-히스티딘 태그를 트롬빈 절단에 의해서 제거하였다. 절단되고 복원된 단백질을 IMAC에 의해서 재정제하여 트롬빈 및 비절단된 융합단백질로부터 생성물을 분리시켰다. 절단되고 복원된 단백질은 40 mM 이미다졸에서 Ni-이온 친화성 칼럼으로부터 용출하는 반면에, 트롬빈은 저류되지 않으며 비절단된 융합단백질은 0.2 mM 이미다졸에서 용출한다. 그후, 생성물을 농축시키고, 100 mM EDTA 및 10 mM 칼륨 훼리시아나이드로 처리하고, 파마시아 슈퍼덱스 (Pharmacia superdex) 75 16/60 칼럼을 사용하여 겔여과에 의해서 더 정제하였다.
엘만스 시험은 문헌 (Ellman, Arch. Biochem. Biophys., 82:70-77 (1959))에 기술한 바와 같이 수행하였다. 엘만스 시약은 39.6 mg의 5,5'-디티오-비스(2-니트로벤조산) (DTNB)을 10 ㎖의 0.05 M 포스페이트, pH 8에 용해시킴으로써 제조하였다. 검정곡선은 412 nm에서 10-120 mM 유리 설프히드릴 (환원된 DTT의 1 mM 저장용액을 사용)의 농도범위에서 작제하였다. 각각의 시험은 0.02 ㎖의 엘만스 시약 및 0.5 ㎖의 총 반응혼합물을 사용하여 수행하였다. 측정된 흡광계수는 유리 설프히드릴 그룹에 대하여 12974 M-1cm-1였으며 (상관계수 0.99987), 이것은 13600 M-1cm-1의 미리 보고된 값의 5% 이내이다.
최종 반응혼합물에서 약 24 mM의 가능한 유리 설프히드릴 농도에 상응하는 2 mg/㎖의 순수한 겔여과된 단백질 50 ㎖에 대해서 엘만스 시험을 수행하였다. 생성된 용액은 약 0.02의 A412를 나타내었으며, 이것은 단백질내의 두개의 시스테인 잔기가 시스틴을 형성하는 산화된 상태로 존재하는 것을 시사하거나, 또는 그들의 유리 설프히드릴 그룹이 중첩된 단백질의 접근할 수 없는 코어내에 완전히 매립되는 것을 시사한다. 6 M 구아니딘-HCl의 존재하에 비중첩된 단백질에 대해서 동일한 시험을 수행하여 동일한 결과가 수득되었다.
마우스를 병원체가 없는 환경하에서 개별적으로 우리에 넣고, 1.30 kcal/gm의 에너지 함량을 가지며, 35% (w/w) 실험실 설치류 식이 (Laboratory Rodent Diet) 5001 (PMP Feeds, Inc.), 5.9% (w/w) 타피오카 푸딩 혼합물 (tapioca pudding mix) (General Foods) 및 59.1% 물을 함유하는 식이에 순응시켰다. 식이를 오토클레이브에 의해서 멸균시키고, 100 mm 페트리 디쉬의 상부에 고정된 60 mm 플라스틱 디쉬내에 충진시켰다. 타피오카는 식이를 호상 혼합물로 만들고, 이것은 동물이 우리내에 사료를 흩뿌리는 것을 어렵게 만든다. 100 mm 리드 (lid)로 동물에 의해서 흩어진 소량의 사료를 회수한다. 사료의 새로운 디쉬를 매일 아침에 우리내에 넣고, 그 전날의 디쉬는 꺼내어 평량하였다. 중량에 있어서의 차이는 매일의 사료 소비의 척도를 제공하였다. 사료 섭취 및 체중에 대한 재조합 단백질의 영향은 마우스의 세가지 스트레인에서 측정하였다: C57Bl/6J ob/ob, C57 B1/Ks db/db 및 CBA/J +/+ (이들은 Jackson Laboratory로부터 구입하였음). 각각의 스트레인으로부터 30마리의 마우스를 10마리 씩의 그룹으로 분류하였다. 각각의 스트레인으로부터 하나의 그룹에는 매일, 300 ㎕의 PBS중의 5 mg/g/일의 용량으로 재중첩된 세균 ob 단백질을 복강내 (i.p.) 주사하였다. 두번째 그룹에는 동일한 용량의 PBS를 복강내 주사하였다. 이들 대조용 마우스에는 재조합 단백질의 PBS 투석물 (dialysate)을 주사하였다. PBS는 액티클린 (Acticlean) ETOX 칼럼을 사용하여 내독소를 제거하였다. 세번째 그룹의 동물에게는 주사를 하지 않았다. 사료 섭취는 매일 기록하였으며, 체중 측정치는 3.5 주일 간격으로 규칙적으로 기록하였다. 페어 (pair) 급식실험을 위해서는, ob 마우스의 별도의 그룹의 사료 섭취를 단백질을 공급한 ob 마우스에 의해서 소비된 것과 일일 기준으로 비교하였다.
결과
OB 단백질은 마우스, 랫트 및 인간 혈장내에서 순환한다.
재조합 마우스 및 인간 OB 단백질을 pET 15b 세균성 발현벡터 (Novagen)를 사용하고, 배양배지내로 직접 재조합 단백질을 분비하는 효모 발현시스템인 피치아 패스토리스 (Pichia pastoris)내로 클로닝시킴으로써 제조하였다. 효모내에서 발현된 ob 단백질은 시그날 서열쪽으로 카복시-말단인 146개의 아미노산을 포함한다. 토끼는 세균성 단백질 (HRP, Inc.)로 면역시켰다. 항체를 면역정제하고 (Research Genetics), 혈장 및 지방조직으로부터의 단백질의 면역침강반응 및 웨스턴 블럿에 사용하였다.
마우스 혈장으로부터의 OB 단백질은 SDS-PAGE에 의해서 16 kD의 겉보기 분자량으로 이동한다. 전기영동적 이동성은 시그날 서열을 제거한 후에 효모에 의해서 분비된 재조합 OB 단백질과 동일하다 (도 24A). 단백질은 코돈 105에서 넌센스 돌연변이를 갖는 C57BL/6J ob/ob 마우스로부터의 혈장에서는 검출되지 않았다. 몇가지 상이한 항혈청들은 cDNA 서열에 의해서 예상되는 절단된 105 잔기 폴리펩타이드쇄를 확인하는데 실패하였다.
순환하는 단백질의 수준에 있어서의 10-배 증가가 대조용 동물과 대비하여 db/db 마우스에서 관찰되었다 (도 24A). 야생형 및 fa/fa 랫트로부터의 혈장의 면역침강반응은 야생형에 비해 돌연변이 랫트에서 OB 단백질의 수준이 20-배 증가함을 나타내었다 (도 24B). db 돌연변이는 ob 마우스에서 보는 것과 동일한 비만 표현형을 야기시킨다 (Bahary et al., 1990, 상기 참조). 지방성 랫트는 db와 동종인 유전자에서의 열성 돌연변이의 결과로 비만이다 (Truett et al., 1991, 상기 참조). 마우스 혈장내의 OB의 수준을 정량하기 위해서, 증가량의 재조합 단백질을 혈청에 첨가하고, 면역침강시켰다 (도 24C). 웨스턴 블럿상에서 시그날 강도의 선형 증가는 재조합 단백질의 양이 증가함에 따라서 나타났다. 마우스 혈장내의 천연 단백질의 시그날 강도를 표준품과 비교하면 야생형 마우스에 존재하는 OB 단백질의 순환수준은 약 20 ng/㎖인 것으로 나타났다. 이들 데이타는 면역침강반응과 웨스턴 블럿이 항체 과잉의 조건하에서 수행되었음을 입증하는 것이다. OB 단백질의 증가된 수준은 또한, 대조군에 비해서 db/db 마우스로부터의 지방조직의 단백질 추출물에도 나타났다 (도 24D). 분비된 단백질에 대해서 예상되는 바와 같이, 지방조직으로부터의 단백질은 조 막분획으로 분류되었다 (데이타는 나타내지 않음).
25 미만의 체질량지수 (Body Mass Index; BMI = 체중/길이2)를 갖는 6명의 마른 인간 피검자로부터의 혈장 샘플은 인간 단백질에 대한 면역정제된 항체를 사용하여 면역침강시켰다. 면역침강된 물질은 효모내에서 발현된 146 아미노산 인간 단백질에 대해서 나타난 것과 동일한 전기영동적 이동성으로 이동하였다. 시그날의 강도는 6가지 샘플들 사이에서 유의적으로 변화하였다 (도 25A). 자가방사선 사진의 밀도측정은 개체 HP1과 HP6에 있어서의 수준에서 약 5-배의 차이를 나타내었으며, 다른 피검자에게서는 중간 수준을 나타내었다. 효소결합면역검정법(ELISA)은 표준품으로서 재중첩된 세균성 단백질 및 면역정제된 항체를 사용하여 이루어졌다 (이하 참조). 생성된 표준곡선은 도 25B에 나타내었다. 이 시험방법을 사용하여, 6개의 인간 혈장샘플에서 OB 단백질의 혈장 수준은 2-15 ng/㎖ 사이에서 변화하였다 (도 25C). HP6으로부터의 혈장내에서 OB 단백질의 수준은 면역검정법의 선형범위를 벗어났으며, ≥15 ng/㎖이다. 이들 정량적 차이는 웨스턴 블럿에서 보는 것과 연관이 있었다.
예비 데이타는 렙틴이 적어도 부분적으로 또 다른 단백질 또는 단백질들과 컴플렉스를 형성하여 순환할 수 있음을 시사한다. 이러한 결론은 재조합 표준물과 비교한 혈청에 대한 적정곡선의 형상의 불균일성을 기초로 한 것이었다. ELISA 및 SDS-PAGE에 의해서 모니터하면서 변성 및 비변성 조건하에서 겔여과 HPLC하여 토끼 안티-OB 칼럼상에서 면역정제된 대량의 렙틴의 분석은 OB 폴리펩타이드가 고분자량 컴플렉스와 마찬가지로 행동함을 시사하였다. 그러나, 이들 데이타는 예비적인 것으로만 남아 있으며, OB 결합 단백질이 있다면 이것은 아직 특정화되지 않고 있다.
OB 단백질의 구조적 특징
OB 단백질은 두개의 시스테인 잔기를 가지고 있기 때문에, 이것은 생체내에서 산화조건하에 분자내 또는 분자간 디설파이드 결합을 형성할 수 있다. 웨스턴 블럿을 샘플 완충액에 환원제를 첨가하거나 첨가하지 않고 반복하였다. 두가지 조건하에서, 인간 혈청내의 OB 단백질은 모노머로서 이동하였다 (데이타는 제시되지 않음). 비환원 조건하에서, db 마우스 혈청으로부터 면역침강된 단백질은 16 kD의 모노머 및 약 32 kD의 다이머 둘다의 경우와 일치하는 위치에서 검출되었다 (도 26A). 고분자량 부위는 환원조건하에서 소실되었으며, 이것은 마우스 OB의 분획이 분자내 디설파이드 결합의 형성을 통해서 고분자량 종으로 순환하는 것을 시사한다. 마우스 OB의 약 80%는 약 16 kD 단백질로 순환하고 약 32 kD 형태로 20%가 순환한다.
동일한 분자형태는 마우스 및 인간 단백질이 피치아 패스토리스 (Pichia pastoris)에서 발현되는 경우에 나타난다 [Abrams et al., Immunol. Rev.,:5-24 (1992)]. 이들 연구에서, 146 아미노산 성숙 OB 단백질에 상응하는 DNA 서열을 pPIC.9 벡터 (Invitrogen)내에서 효모 α-교배인자 시그날 서열의 하류에서 클로닝하였다. OB 단백질을 마우스 및 인간 단백질을 발현하는 스트레인의 효모 배지로부터 정제하고, 환원 및 비환원 조건하에서 전기영동하였다 (도 26A). 마우스 단백질은 비환원 조건하에서는 효모내에서 주로 다이머로 발현되며, 환원제의 존재하에서는 모노머로서만 발현되었다. 재조합 인간 단백질은 두가지 조건 모두하에서 모두 모노머의 위치로 이동하였다 (데이타는 나타내지 않음).
피치아 (Pichia)내에서 발현된 정제된 인간 단백질은 질량분광법 1990 (Beavis, 1990, 상기 참조)에 의해서 결정된 것으로서 16,024±3 Da의 분자질량을 가졌다. 이 값은 단일의 분자내 디설파이드 브릿지를 함유하는 단백질의 아미노산 서열로부터 계산된 질량과 일치한다 (16,024 Da). 단백질의 시아노겐 브로마이드 절단생성물의 매트릭스-보조 레이저 탈착 질량분광분석은 시스테인 117 및 167이 분자내 디설파이드 결합을 통해서 연결된 것을 시사한다 (도 26B). 시아노겐 브로마이드는 메티오닌 잔기에 대한 카복시 말단을 절단한다.
생물활성 재조합 단백질의 제조 및 특정화
마우스 OB 단백질은 이. 콜라이 (E. coli)내에서 pET 15b 플라스미드로부터 트롬빈 절단부위를 함유하는 20 잔기 N-말단 헥사-히스티딘 태그를 갖는 불용성 융합단백질로 발현되었다. 세균성 봉입체를 구아니딘-HCl를 사용하여 가용화시키고, 고정화된 금속이온 친화성 크로마토그라피 (IMAC)를 사용한 변성조건하에서 정제하였다 (도 27). 정제되고 변성된 융합단백질을 환원시키고, 희석하고, 실온에서 수용액중에서 재중첩하도록 하였다. 트롬빈 절단시킨 후에, 4개의 추가의 N-말단 잔기 (Gly-Ser-His-Met; SEQ ID NO:38)를 함유하는 복원된 마우스 OB 단백질을 SDS-PAGE 및 질량분광분석에 의해서 판단되는 바와 같이 > 98% 균일성이 되도록 IMAC에 의해서 재정제하였다. 매트릭스-보조 레이저 탈착 질량분광분석은 16,414±3 Da의 측정된 질량을 제공하였다 (예상된 질량= 16,415 Da). 환원 및 비환원 SDS-PAGE 겔은 둘다 16 kD의 겉보기 분자량을 갖는 단일 분자종을 나타내었다 (데이타는 제시되지 않음).
DP801 분자크기 검출기 (Molecular Size Detector; Protein Solutions, Inc.)를 사용한 동적 광산란은 복원된 마우스 OB 단백질이 대부분 모노머성이고, 약간의 더 높은 등급의 응집체가 있음을 입증하였다. 단백질을 EDTA로 처리하고, 화학적으로 산화시켰다. 그후, 고분자량 종을 겔여과에 의해서 제거하였다. 추가의 동적 광산란은 정제되고 복원된 재조합 마우스 OB 단백질이 단분산되었음을 입증하였다. 포스페이트 완충된 식염수 (PBS)에 대한 투석에 이어서, 세균성 내독소를 액티클린 (Acticlean) ETOX 칼럼 (Sterogene Bioseparations, Inc.)을 사용하여 제거하였다. 단백질의 최종 수율은 45 mg/ℓ였다.
엘만스 시험을 정제되고 복원된 재조합 마우스 OB 단백질상에서 수행하여 그의 산화상태를 평가하였다 (Ellman, 1959, 상기 참조). 복원된 단백질 및 6 M 구아니딘-HCl에 의해서 비중첩된 단백질은 둘다 < 0.5%의 유리 설프히드릴 함량을 나타내었으며, 이것은 모노머성 생성물이 분자내 디설파이드 결합을 함유하는 것을 입증하는 것이다. 이것은 재중첩된 세균성 단백질의 시아노겐 브로마이드 절단생성물의 질량분광분석에 의해서 확인되었다 (데이타는 제시되지 않음).
OB 단백질의 생물활성. 정제되고 복원된 재조합 마우스 OB 단백질을 10 마리의 C57B1/6J ob/ob (16주령), C57B1/Ks db/db (12주령) 및 CBA/J +/+ (8주령) 마우스의 그룹에 5 mg/kg/일의 용량으로 매일 복강내 주사함으로써 투여하였다. 동일한 수의 동물에게는 PBS를 매일 주사하였다. 대조군 주사를 위해서 사용된 PBS는 단백질의 평형화 이후의 투석물로부터 유도되었다. 3가지 마우스 스트레인으로부터의 10마리의 추가의 동물에게는 주사를 하지 않았다. 개개 동물의 사료 섭취는 매일 모니터하였으며, 동물의 체중은 3일 또는 4일의 간격으로 기록하였다. 마우스의 9마리 그룹 각각으로부터의 사료 섭취 및 체중에 대한 누적결과는 도 28A 내지 F에 나타내었으며, 데이타의 통계학적 유의성은 표 1에 나타내었다. 단백질을 주사한 C57B1/6J ob/ob 마우스의 사료 섭취는 첫번째 주사한 후에 현저하게 감소하였으며, PBS를 주사한 동물의 섭취의 약 40%에 해당하는 수준에서 안정화하였을 때인 5일째 까지 지속적으로 감소하였다 (p < 0.001). 모사품 (sham)을 주사한 OB 마우스는 3주일의 시험기간에 걸쳐서 체중 손실을 나타내지 않았다. 단백질을 투여한 C57B1/6J ob/ob 마우스는 5일 후에 그들의 체중의 약 10%을 손실하였다 (p < 0.001). 이들 동물은 단백질을 투여한 ob 동물의 체중이 그들의 초기 체중의 평균 60% 까지 감소하는 시점인 3주일의 처리기간에 걸쳐서 체중 손실을 지속적으로 나타내었다 (p < 0.001). 별도의 ob 마우스의 그룹은 단백질을 투여한 ob 마우스에 대비해서 짝을 지어 급식하였다. 도 29B에서의 데이타는 짝을 지어 급식한 마우스가 재조합 단백질을 투여한 동물 보다 체중을 훨씬 덜 손실하였음을 나타낸다 (p < 0.02). 단백질이나 비히클을 주사로 투여한 두마리 마우스의 사진은 단백질 처리로 인한 외관에서의 육안적 차이를 나타낸다 (도 29B). 단백질의 효과를 더 확실히 하기 위해서, 각 그룹에서 두마리의 마우스에 대한 부검을 수행하였다. 단백질을 투여한 ob 마우스의 육안검사는 체지방 뿐 아니라 간의 크기의 현격한 감소를 나타내었다. db 및 야생형 마우스의 간중량은 처리에 의해서 변화되지 않았다. PBS를 주사한 ob 마우스로부터의 간은 재조합 단백질을 투여한 동물에서 2.23 및 2.03 그람인데 비해서 5.04 및 5.02 그람인 것으로 중량이 측정되었다. ob 마우스의 엷은 지방간 특징에 대비하여, 단백질을 투여한 ob 마우스로부터의 간은 정상 간의 더 진한 색의 특징을 획득하였다 (도 29C). 간의 조직학적 절편은 비처리된 동물이 지방간을 가졌고, 단백질 처리된 동물에서는 이것이 현저하게 개선되었음을 나타내었다 (데이타는 제시되지 않음).
ob 마우스와는 달리, 비히클을 투여하는 대조군에 비해 단백질을 투여한 C57BL/Ks db/db 마우스에서 체중 또는 사료 섭취는 현저한 차이를 나타내지 않았다 (도 28A 내지 F, 표 1). db/db 마우스의 세가지 그룹 모두에서는 처리기간중에 2-5 그람이 손실되었다. db 마우스의 평균 혈중 글루코즈는 혈당측정기 (glucometer)를 사용하여 측정되었으며, 모든 마우스에서 ≥500 mg/㎗이었고, 이것은 이들 동물이 비만증에 대해서 이차적으로 당뇨병을 발생시켰음을 시사하는 것이다. db 마우스의 주사는 2주일 후에 종료하였다.
야생형 마우스에서는 재조합 ob 단백질을 투여한 후에 체중에 있어서 작지만 유의적인 감소가 있었다 (도 28A-F, 표 1). 단백질 주사의 5일 후에, 처리된 마우스는 평균 0.5 그람을 손실한 반면에, 대조군 마우스는 0.4 그람을 획득하였다 (p < 0.02). 2회의 후속 시점에서, 단백질을 투여한 동물은 PBS를 매일 주사한 마우스 보다 훨씬 더 작은 중량이었다. 체중 변화의 유의성은 후기 시점에서 감소하였다. 체중이 손실된 동물에서의 사료 섭취는 대조군 동물과 크게 상이하지 않았다. PBS의 주사는 주사를 하지 않은 마우스에 비해서 ob, db 및 야생형 마우스에서의 사료 섭취 및 체중에 대해 작지만 유의적인 영향을 나타내었다 (p < 0.05).
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검토
OB 로커스 (locus)의 단백질 생성물에 대한 내분비기능은 콜맨 (Coleman)에 의해서 최초로 제안되었는데, 콜맨은 ob/ob 마우스의 체중이 정상 또는 db 마우스에 대한 부생적 유합 (parabiotic union) 이후에 감소되었음을 나타내었다 (Coleman et al., 1978, 상기 참조). 상기 언급된 결과는 OB 단백질이 혈류내에서 순환하고 재조합 단백질의 주사가 체중을 감소시키는 것을 나타냄으로써 이 가설을 지지한다. OB 유전자에 의해서 코드화된 유전자 생성물의 분자량은 약 16 kD이며, 이것은 시그날 서열쪽으로 카복시-말단인 146 아미노산 서열에 해당한다. 재조합 OB 단백질은 피치아 패스토리스 (Pichia pastoris)내에서 발현되는 경우에 변형되지 않는다. 피치아 (Pichia)내에서 포유동물 유전자의 발현은 정확한 단백질 구조의 형성을 야기시킨다 [Cregg et al., Bio/Technology, 11:905-914 (1993)]. 이들 발견은 OB 단백질이 글리코실화되지 않으며, 생체내에서 후해독 처리되지 않음을 시사한다. 데이타는 OB 단백질이 혈장 또는 지방조직내에서 그 자체에 또는 다른 단백질에 비공유적으로 결합되는 가능성을 배제하지 않는다. 단백질의 단백분해적 절단이 제외되지는 않았지만, OB 단백질의 저분자량 형태는 4가지 안티-펩타이드 항체를 포함하여 사용된 어떠한 항혈청에 의해서도 검출되지 않았다.
OB 단백질은 두개의 시스테인 잔기를 가지며, 인간에게서는 모노머로, 마우스에서는 모노머 및 다이머로 순환한다. 분비된 분자에 대표적인 분자내 디설파이드 결합은 인간 단백질이 피치아 패스토리스 (Pichia pastoris)내에서 발현되는 경우에 나타나며, 이것은 생체내에 존재할 것 같음을 시사하는 것이다. 이것은 분자내 디설파이드 결합을 갖는 재조합 세균성 단백질의 생물활성에 의해서 지지된다. 마우스 OB 단백질은 혈장내에서 모노머로서 및 다이머로서 발견할 수 있다. 모노머 및 다이머는 마우스 OB 단백질이 효모내에서 발현되는 경우에 나타나며, 이것은 다이머를 형성하는 마우스 단백질의 경향이 인체에 대비한 일차 서열에 있어서의 차이의 결과임을 나타내는 것이다. 모노머가 생물활성을 갖는 다는 것은 명백하지만, 다이머의 기능적 활성은 알려지지 않았다.
ob 마우스에서 사료 섭취 및 체중에 대한 OB 단백질의 영향은 현격하다. 3 주일을 처리한 후에, 재조합 단백질을 매일 주사한 ob 마우스는 그들의 체중의 40%를 상실하였으며, 대조동물 만큼의 사료의 40%를 소비하였다. 더구나, 처리된 ob 마우스의 체중은 실험이 종료되는 시점에도 여전히 평형화되지 않았다. 짝을 이룬 급식실험의 결과는 체중 손실이 사료 섭취 및 에너지 소비 둘다에 대한 영향의 결과임을 시사한다. 따라서, 칼로리 섭취가 단백질을 투여하는 ob 마우스의 섭취로 제한된 ob 마우스의 별도의 그룹은 단백질을 투여하는 동물보다 훨씬 덜 체중을 손실하였다. OB 단백질의 투여일 이내에 야생형 마우스의 수준 보다 더 낮은 수준까지 ob/ob 마우스에서의 사료 섭취를 감소시키는 것은 이들이 그의 효과에 대해서 특히 민감한 것을 나타낸다. 실제로, OB 수용체는 이들 동물에서 상향조절될 수 있다. 처리된 ob 마우스의 사료 섭취는 5일의 처리후에 비교적 일정하게 되었다. 이것이 단백질이 정류상태 수준에 도달한 결과인 경우라면, 이것은 단백질이 비교적 긴 반감기를 갖는 것을 시사하는 것이다 [The Pharmacological Basis of Therapeutics, pp. 19-45, Goodman and Gilman, eds., Pergamon Press, New York, (1990)]. 이 결과는 부생실험으로부터의 데이타와 일치한다 [Coleman et al., 1978, 상기 참조; Weigle, Int. J. Obesity, 12:567-578 (1988)].
야생형 마우스의 체중에 대한 재조합 단백질의 영향은 시험의 처음 2주일 동안에 작지만 통계학적으로 유의적이었다. 단백질을 투여하는 야생형 마우스와 PBS를 투여한 야생형 마우스간의 체중의 차이는 추후의 시점에도 지속되었지만, 데이타의 통계학적 유의성은 3주일 후에 크게 감소하였다. 초기의 체중 손실은 사료 섭취에 있어서의 차이로 인한 것이 아닐 수 있었다. 아마도, 사료 섭취의 측정은 처리중에 체중에 있어서의 1 그람 차이를 야기시키는 감소를 검출할 정도로 충분히 정확하지는 않았다. 이들 관찰결과는 야생형 설치류가 db 마우스, fa 랫트, 시상하부 병소를 갖는 랫트 및 고칼로리 식이에 의해서 비만이 발생한 랫트에 부생적 유합시킴으로써 결합되는 이전의 실험의 결과와는 상이하다 [Coleman et al., 1978, 상기 참조; Harris et al., 1987, 상기 참조; Harris et al., "Physiological and metabolic changes in parabiotic partners of obese rats", in Hormones, Thermogenesis and Obesity, Lardy and Straatmen, eds., Elsevier Science Publishing Co., New York (1989); Hervey, J. Physiol., 145:336-352 (1959)]. 각각의 경우에, 야생형 동물은 식욕부진이 되었으며, 대량의 체중을 상실하였다. OB 단백질의 수준은 db 마우스 및 fa 랫트에서 증가하고, OB RNA의 수준은 시상하부 병소를 갖는 마우스에서 증가하기 때문에, 야생형 마우스는 OB가 충분히 높은 수준으로 혈장내에 순환하는 경우에 OB에 대해 반응할 수 있을 것 같다. 여기에서 보고된 결과는 투여된 단백질의 수준이 내인성 수준 이하여서 약간 더 작은 체중으로의 평형화를 유도하는 가능성과 일치하는 것이다. 처리된 마우스에서 OB 단백질의 순환 수준의 정량화는 이 문제를 해소시킬 수 있다. 마우스 단백질의 면역검정이 아직 이용될 수는 없지만, 면역침강반응은 순환 OB 단백질의 수준이 단백질을 투여하는 야생형 마우스에서 실질적으로 상승되지 않았음을 시사하였다.
야생형 마우스에 대한 단백질의 더 작은 영향 및 db 마우스에서 반응의 부재는 처리가 비특이적이거나 기피성인 영향을 갖는 것으로 만드는 것 같지는 않다. 모든 db 마우스는 이들이 ob 단백질을 투여하든지 투여하지 않든지 간에 처리기간 중에 소량의 체중을 상실하였다. db 동물은 현저하게 고혈당성이었으며, 체중 손실은 당뇨병의 결과인 것으로 보이지만 실험적 프로토콜은 아니다. C57BL/Ks db/db 마우스는 종종 당뇨병을 발현하며, 이 시험에서 사용된 동물의 연령이 되면 소량의 체중이 손실되기 시작한다 (Coleman et al., 1978, 상기 참조). 유사한 연령의 C57B1/6J ob/ob 마우스는 현저한 고혈당증을 발현하지 않았다. 이들 표현형적 차이는 돌연변이를 수반하는 스트레인 (C57B1/6J 대 C57Bl/Ks)에서의 유전적 차이의 결과인 것으로 생각되었다 (Coleman et al., 1978, 상기 참조).
C57B1/6J ob/ob 마우스에서 OB 유전자의 cDNA 서열에 의해서 예상되는 절단된 105 아미노산 단백질을 검출하는데 실패하는 것은 돌연변이 단백질이 붕괴되거나, 해독되지 않음을 시사하는 것이다. 그러나, 사용된 항혈청이 이 절단된 단백질을 검출하지 못할 가능성은 제외될 수 없다. 야생형에 비해서 db 마우스에서 ob 단백질의 수준이 10-배 증가하는 것이 관찰되는 것은 ob 단백질이 그의 효과에 대한 저항성이 있는 경우에는 과생산된다는 것을 시사한다. 이들 데이타는 OB mRNA의 연구와 연관된다. 언급한 바와 같이, 이전의 실험들은 동종성 염색체 부분에 위치하는 마우스 db 및 랫트 fa 유전자의 돌연변이가 체중을 억제하는 혈장인자의 과생산을 야기시킨다는 것을 나타내었다 (Truett et al., 1991; 상기 참조; Coleman, 1978, 상기 참조; Hervey, 1959, 상기 참조). 두가지 경우에 모두, 돌연변이 동물은 OB 단백질의 영향에 대하여 내성이 있음을 시사하였다. 이러한 가능성은 OB 단백질이 db 마우스에 투여한 경우에 체중 또는 사료 섭취에 영향을 미치지 않는다는 관찰결과에 의해서 확인된다.
인간에게서의 비만증은 호르몬에 대하여 비교적 비반응성인 개체에서 혈장내의 OB 단백질의 증가된 수준과 연관될 수 있다. 한편, OB의 감소된 발현도 또한 비만증을 야기시킬 수 있으며, 이 경우에는 단백질이 "정상" (즉, 부적합하게 낮은) 수준으로 나타날 수 있다. 따라서, 인간 혈장내에서 OB 단백질의 수준은 비만증의 다양한 형태에 대한 마커가 될 수 있다. BMI < 25인 여윈 피검자의 소그룹의 경우에는, 순환 OB 단백질의 낮은 나노그람 수준이 ELISA에 의해서 검출될 수 있다. 유의적으로, 다양한 농도가 나타났으며, 이것은 발현의 수준 및/또는 단백질에 대한 민감성이 체중을 결정하는 역할을 할 수 있음을 시시한다.
OB 단백질의 작용부위는 알려지지 않았다. 단백질은 사료 섭취 및 에너지 소비 둘다에 영향을 미치며, 이 발견은 두가지 시스템의 변경이 체중을 조절하는 작용을 한다는 것을 시사하는 임상시험과 일치한다 [Leibel et al., N. Engl. J. Med., 332:621-628 (1995); Keesey et al., "Metabolic defense of the body weight set-point," in Association for Research in Nervous and Mental Disease, pp. 87-96, Stunkard and Stellar, eds., Raven Press, New York, (1984)]. 시상하부는 체중을 조절하는 경로에서 OB의 하류에 있을 수 있지만, 다양한 기관에 대한 직접적인 효과가 있을 수도 있다.
실시예 9: 시상하부의 병변 및 db 로커스에서 돌연변이를 갖는 마우스에서 OB RNA의 지방세포에서의 증가된 발현
최근에 클로닝된 마우스 비만유전자 (OB)의 유전자 생성물은 지방조직 질량을 조절하는데 중요한 역할을 한다. OB RNA는 갈색지방을 포함하는 몇가지 다양한 지방세포 저장소 (depots) 각각에서 마우스 지방세포에 의해 생체내에서 특이적으로 발현된다. 또한, 이것은 분화하도록 유도된 배양된 3T3-442A 전지방세포에서도 발현된다. 시상하부의 병소를 갖는 마우스 및 db 로커스에서의 마우스 돌연변이체는 지방조직에서 20-배 더 높은 수준의 OB RNA를 발현한다. 이들 데이타는 db 유전자 및 시상하부 둘다가 지방조직 질량을 조절하는 경로에서 OB 유전자의 하류에 있음을 시사하며, db 로커스가 OB 수용체를 코드화함을 시사하는 이전의 실험과 일치한다. db/db 및 병소가 있는 마우스에서, OB RNA의 발현수준에 있어서의 정량적 차이는 지방세포의 지질 함량과 연관되어 있다. 지방세포내에서 OB 유전자의 발현수준을 조절하는 분자는 그의 작용부위에서 OB의 영향을 매개하는 분자이기 때문에 체중을 결정하는데 중요한 역할을 할 수 있을 것이다.
재료 및 방법
동일계 하이브리드화
야생형 (wt) 및 db 마우스의 동일한 복강부분으로부터의 백색 지방조직을 문헌 (Richardson et al., Growth, Development ＆ Aging, 56:149-157 (1992))에 기술된 변형된 방법에 따라서 동시에 처리하였다. 간략하게는, 조직을 4℃에서 2시간동안 부앵용액 (Bouin's solution)내에 고정시켰다. 그후, 이들을 4℃에서 10%부터 100% 까지의 증가농도의 에탄올로 각각 5분 동안씩 연속처리하여 탈수시켰다. 조직을 크실렌 (1시간) 및 파라핀 (2시간)과 함께 65℃에서 더 배양하였다. 매립된 wt 및 db/db 지방조직을 절편으로 만든 후에 동일한 조건에 의해서 장착하였다. 절편을 65℃에서 1시간 동안 굽고, 크실렌으로 처리하고, 에탄올을 사용하여 100%부터 50% 까지 각각 3분 동안씩 실온에서 계열희석시켰다. OB 유전자의 안티센스 RNA 프로브는 Sp6 RNA 폴리머라제 프로모터 상류의 선형화된 OB 유전자 코드화 서열의 시험관내 전사에 의해서 합성되었다. 동일계 하이브리드화는 문헌 (Schaeren-Wiemers, et al., Histochemistry, 100:431-440 (1993))에 기술된 바에 따라 정확하게 수행하였다.
RNA 제조 및 세포배양
총 RNA 및 노던 블럿은 기술한 바와 같이 준비하였다. 간질성 혈관세포 및 지방세포를 로드벨 (Rodbell)에 따라서 제조하고, 두가지 분획으로부터 RNA를 문헌(Dani et al., Mol. Cell. Endocrinol., 63:199-208 (1989); Rodbell, J. Biol. Chem. 239:375-380 (19))에 따라서 제조하였다. 서브-클로닝한 후에, 3T3-F442 세포를 10% 태자 소혈청을 함유하는 둘베코 변형 이글배지 (표준배지로 정의함)에서 성장시켰다 [Dani et al., "Molecular biology techniques in the study of adipocyte differentiation", in Obesity in Europe vol. 88, pp. 371-376, Bjorntorp and Rossner, Eds., John Libbey Company Ltd., London, England (1989)]. 합류점에서, 세포를 2 nM 트리요오도티로닌 (T3) 및 17 nM 인슐린이 보충된 표준배지내에서 처리하였다. 12일 후에, 상기한 바와 같이 RNA를 제조하였다.
금 티오글루코즈 처리 (GTG)
2개월령의 암컷 CBA/J 마우스를 생리식염수중의 0.2 mg/g의 용량으로 오로티오글루코즈 (aurothioglucose; Sigma Catalog No. A0632)를 1회 복강내 주사함으로써 처리하였다. 대조용 동물에게는 생리식염수를 주사하였다. 마우스는 처리한지 1개월 후에 체중을 측정하였다. GTG 처리 후에 체중이 20 그람 이상 증가한 이들 처리된 동물로부터 지방조직 RNA를 분리하였다.
결과
최근에 OB 유전자는 지방조직내에서 발현되는 것으로 밝혀졌다 [Zhang et al., Nature, 372:425-432 (1994)]. 지방조직은 지방세포, 전지방세포, 섬유아세포 및 혈관세포를 포함하는 다수의 세포 타입으로 구성되기 때문에, 동일계 하이브리드화는 센스 및 안티센스 OB 리보프로브 (riboprobes)를 사용하여 정상동물로부터의 부고환 지방패드의 절편에 대하여 수행하였다 [Richardson et al., 1992, 상기 참조; Wasserman, "The concept of the fat organ" in Rodahl, Issekutz, fat as a tissue", pp. 22-92, McGraw Hill, New York (1964)]. 안티센스 프로브를 사용하는 경우에, 절편내의 모든 지방세포에서 양성 시그날이 검출될 수 있었다 (도 30 - Wt로 표시됨). 안티센스 프로브가 뇌의 절편에 하이브리드화된 경우에는 시그날이 나타나지 않았다 (데이타는 제시되지 않음). C57B1/Ks db/db 마우스로부터의 지방조직의 절편에 대한 안티센스 프로브의 하이브리드화는 크게 증가하였으며, 이것은 OB RNA의 지방세포 특이적 발현을 확인하고 이들 동물에서 지방세포당, OB RNA 수준의 큰 증가를 입증하는 것이다 (도 30 - db/db로 표시됨). db 로커스에서의 마우스 돌연변이체는 C57B1/6J ob/db 마우스에서 볼 수 있는 것과 표현형적으로 동일한 증후군의 일부로서 대단히 비만이다 (Bahary et al., 1990, 상기 참조).
OB RNA는 지방세포로부터 분리된 지방조직 간질세포에 의해서 합성되지 않았다. 예상한 바와 같이, 지방세포 분획내의 세포는 노던 블럿을 사용하여 OB RNA를 발현하였다 (도 31). 동일한 결과는 RT-PCR을 사용하여 수득되었다 (데이타는 제시되지 않음). 이들 데이타는 단지 지방세포 만이 OB 유전자를 발현한다는 결론을 지지한다. 배양된 지방세포로부터의 데이타도 이 결론을 증명한다. 이들 시험에서, 3T3-F442A 세포는 지방세포로의 분화를 유도하는 세포 프로그램의 일부분으로서 지질 축적을 유도하는 조건을 사용하여 배양하였다. OB RNA는 기하급수적으로 성장하는 세포에서는 발현되지 않았으며, 초기에 마커 (markers)를 발현한 유합성 3T3-F442A 전지방세포에서도 발현되지 않았지만, 이들 세포의 지방세포로의 분화는 검출가능한 수준의 OB RNA의 발현을 유도하였다 (도 31) [Dani et al., J. Biol. Chem., 264:10119-10125 (1989)]. OB RNA의 수준은 배양조건에 대해 매우 민감하며, 따라서 인슐린에 노출되지 않은 후기 후-유합성 세포에서는 메세지가 관찰되지 않았다.
하이브리드화 시험은 OB RNA가 생체내에서 부고환, 자궁방결합조직, 복부, 신장주위, 및 서혜부 지방패드를 포함한 몇가지 다양한 지방 저장소에서 발현되는 것을 나타낸다 (도 32A). 각각의 저장소에서 발현의 정확한 수준은 다소 가변적이었지만, 서혜부 및 자궁방결합조직 지방이 더 낮은 수준의 OB RNA를 발현한다. OB RNA는 또한, 갈색 지방조직에서도 발현되지만, 발현 수준은 다른 지방조직 조장소에 비해서 갈색 지방이 약 50-배 더 낮다. 이들 정량적 차이는 이미 보고된 다양한 지방세포 저장소들간의 세포 크기에 있어서의 차이와 대략적으로 상관관계가 있다 [Johnson et al., J. Lipid Res., 13:2-11 (1972)]. 갈색 지방에서 OB RNA의 양은 냉노출에 의해서 영향을 받지 않는다 (도 32B). 이 실험에서, 커플링되지 않은 단백질 RNA (UCP)의 수준은 냉노출시킨 후에 갈색 지방에서 증가하였지만, ob RNA의 수준은 변화하지 않았다 [Jacobsson et al., J. Biol. Chem., 260:16250-16254 (1985)]. 융집체에서, 이들 데이타는 모든 지방세포가 OB RNA를 생성할 수 있음을 입증하며, 상이한 지방 저장소에서의 발현의 수준은 가변적임을 나타낸다. 이들 데이타는 코드화된 단백질의 수준은 총 지방조직 질량과 상관관계가 있을 수 잇다는 가능성을 지지한다.
db/db 마우스 및 시상하부의 병소를 갖는 마우스에서 OB RNA의 수준이 측정되었다. 복측정중 시상하부 (VMH)의 병소는 ob/ob 및 db/db 마우스에서 나타나는 것과 유사한 증후군의 일부로서 비만을 야기시킨다 [Bray et al., Metabolism, 24:99-117 (1975)]. 부생실험은 이러한 병소가 사료 섭취 및 체중을 억제하는 혈액-유래 인자의 과발현을 유도한다는 것을 지지한다 (Hervey, 1959, 상기 참조). 유사한 결과는 db 로커스에서의 마우스 돌연변이체가 정상 마우스에 대해 부생되는 경우에 나타나며, 이것은 OB 수용체가 db 로커스에 의해서 코드화될 수 있음을 시사하는 것이다 (Coleman et al., 1978, 상기 참조). 따라서, VMH 병변 및 db 돌연변이로 인한 비만증은 OB 단백질의 영향에 대한 내성의 결과일 수 있다. 그렇다면, 지방조직에서 OB RNA의 수준에 있어서의 이차적인 증가가 예상될 수 있다.
시상하부 병변은 화학적 금 티오글루코즈 (GTG)를 사용하여 암컷 CBA 마우스에서 유도되었다 [Debons et al., Fed. Proc., 36:143-147 (1977)]. 이 처리는 주로 복측정중 시상하부 (VMH)에서 특이적 시상하부 병변을 야기시키며, 수주일이내에 비만으로 추후 발전된다. 통상적으로, 체중 gm당, 0.2 mg의 GTG를 1회 복강내 주사하여 4주일 이내에 비만증의 발생을 야기시킨다. 1개월령의 암컷 CBA/J 마우스 (20-25 그람)를 GTG로 처리하고, 처리된 동물 및 대조 동물의 후속 체중증가를 나타낸다 (표 2). db/db 마우스로부터 및 > 20 gm이 증가한 이들 GTG 처리된 동물로부터 지방조직 RNA를 제조하였다. 노던 블럿은 정상 동물과 비교하여 2개월령의 db/db 및 GTG-처리된 마우스에서 OB RNA 수준의 20-배 증가를 나타내었다 (도 33).
Figure pct00013
2개월령의 암컷 CBA/J 미우스를 금 티오글루코즈 (GTG)로 처리하였다. 금 티오글루코즈 (Sigma A0632)는 생리식염수 용액으로하여 2.0 mg/g의 용량으로 복강내 투여하였다. 대조군 및 주사한 동물의 체중은 주사하기 전 및 주사한 지 1개월 후에 기록하였다. 동물을 우리에 5마리 집어 넣고 사료는 마음대로 먹게 하였다. 주사한 지 1개월후에 증가된 체중의 양은 표 2에 나타내었다. 주사한 지 1개월 후에 20 g 이상 체중이 증가한 동물을 추가의 시험을 위해서 선택하였다.
검토
마우스 OB 유전자의 유전자 생성물은 마우스 및 인간 혈장내에서 순환하여, 여기에서 지방조직 질량을 조절하는 작용을 할 수 있다. OB의 발현조절 및 작용기전에 대한 추가의 시험은 체중을 조절하는 생리적 경로에 대한 이해를 하는데 중요한 관계를 갖는다.
본 실시예는 OB 유전자 생성물이 모든 지방조직 저장소에서 지방세포에 의해서 독점적으로 발현되는 것을 나타낸다. 이 결과는 OB 유전자의 단백질 생성물이 신체의 지질 비축과 상호 관계가 있다는 가능성과 일치한다. 또한, OB RNA는 db 마우스 및 시상하부 병변을 갖는 마우스에서 20배 상향조절된다. 지방세포 세포크기는 이들 동물에서 대략 5-배 증가하기 때문에, 이들 동물에서 세포당 OB RNA의 수준의 실제 증가는 20-배 보다 훨씬 더 클 것으로 보인다 (참조 도 30) (Debons et al., 1977, 상기 참조). 이들 데이타는 체중을 조절하는 경로에서 ob 유전자 및 시상하부를 OB의 하류에 배치하며, OB 수용체가 db 로커스에서 코드화된다는 가설과 일치한다 [Coleman et al., Diabetologia 14:141-148 (1978)]. OB 수용체 및/또는 db 유전자의 분자 클로닝은 이 조직을 회복시킬 수 있다. db/db 및 GTG-처리된 마우스에서 OB RNA 수준의 증가는 또한, 지방 세포에서 OB 유전자 생성물의 비 세포-자율성 기능을 시사한다 [Ashwell et al., Proc. R. Soc. Lond., 195:343-353 (1977); Ashwell et al., Diabetologia, 15:465-470]. 즉, 코드화된 단백질이 지방 세포에 직접 작용하여 성장 또는 분화를 억제한다면, GTG 처리된 마우스에서 야생형 OB 유전자의 과발현은 야윈 표현형을 야기시킬 수 있다.
이들 데이타에 대한 가장 엄밀한 설명은, OB 단백질이 지방세포에 의해서 분비되고 시상하부에 대해 직접적으로 또는 간접적으로 작용하는 엔도크린 시그날링 분자로 작용한다는 것이다. 시상하부에 대한 직접적인 영향은 OB 유전자 생성물이 혈액뇌장벽을 가로질러서 통과하도록 하는 기전이 존재하는 것을 필요로 한다. 뇌실주위 기관 및/또는 특이적 수송자 (transporters)를 포함하는 기전은 OB 유전자에 의해서 코드화된 크기의 분자가 뇌에 접근하도록 하용할 수 있다 [Johnson et al., FASEB J., 7:678-686 (1983); Baura et al., J. Clin. Invest., 92:1824-1830 (1993); Pardridge, Endocrine Reviews, 7:314-330 (1986)]. 그러나, 이 가설은 단백질이 혈액뇌장벽을 가로지를 수 있도록 하는 수단이 확인될 때 까지는 주의해서 고려되어야 하였다. 더구나, 다른 표적기관에 대해서 있을 수 있는 영향을 평가하는 것이 필요할 수 있다.
OB 유전자의 발현 수준에 있어서의 정량적 변화의 원인이 되는 지방세포 시그날(들)은 아직 알려지지 않았지만, 지방세포 세포 크기의 차이와 상관관계가 있다. db/db 마우스로부터의 지방세포는 대략 1.0 ㎍ 지질/세포의 세포 크기를 갖는 정상 마우스로부터의 지방세포에 비해 5배가 더 크다 (Johnson et al., 1972, 상기 참조). 이전의 증거들은 지방세포 지질 함량 및/또는 크기가 체중을 결정하는데 중요한 파라메터라고 시사하였다 [Faust et al., Am. J. Physiol., 235:279-286 (1978); Faust et al., Science, 197:393-396 (1977)]. 각각의 지방세포는 낮은 수준의 OB RNA를 발현하고, 이것은 더 나아가 세포 크기에 비례하여 증가하는 것을 알 수 있었다. 또한, 세포 크기는 인지된 파라메터가 아니며, 단지 db/db 및 VMH - 병변 마우스로부터의 지방세포내에서 OB 유전자의 발현을 증가시키는 세포내 시그날과 상관관계가 있을 수 있다. 어떤 경우든, OB RNA의 합성을 조절하는 시그날 형질도입 경로의 성분들이 체중을 결정하는데 중요한 것으로 보인다. OB의 발현 수준을 감소시키는 유전적 및 환경적 영향은 코드화된 단백질에 대한 감수성을 감소시키는 영향을 미칠 수 있기 때문에 체중을 증가시키는 작용을 한다. OB 유전자의 발현 수준을 조절하는 특이분자는 아직 알려지지 않았으며, OB RNA의 수준에 있어서의 정량적 변화를 유도하는 유전자 조절의 수준(들)의 결정 및 OB 유전자의 조절요소의 검사를 기다리고 있다. 지방세포에서 OB 유전자의 발현을 조절하는 분자 및 그의 작용부위에서 코드화된 단백질의 영향을 매개하는 분자의 동정은 체중을 조절하는 생리적 기전을 이해하는데 큰 기여를 할 수 있다.
실시예 10: 염색체 7의 RNA 발현패턴 및 물리적, 세포유전적 및 유전적 지도상에서의 지도작성
OB RNA는 인간 지방조직에서 높은 수준으로 발현되며, 태반 및 심장에서는 실질적으로 더 낮은 수준으로 발현된다. 인간 OB 유전자는 염색체 7q31.3으로부터 유도된 큰 효모 인공염색체 (YAC) 콘티그상에 위치시킨다. 마우스-인간 비교 지도 작성을 기초로 하여 유전자의 상대적 위치를 확인하는 이외에도, 이 시험은 인간 OB 유전자에 물리적으로 가깝게 근접하여 8개의 확립된 미소위성 마커(microsatellite markers)를 확인하였다. 마우스 OB에서의 돌연변이는 인간에게서의 병적인 비만과 매우 유사한 증후군을 야기시킬 수 있기 때문에, 이들 유전자 마커는 유전된 형태의 인간 비만증에서 OB 유전자의 가능한 역할을 시험하기 위한 중요한 도구가 된다.
재료 및 방법
노던 블럿 분석
총 RNA는 문헌 (Chirgwin et al., Biochem., 18:5294-5299 (1979))의 방법을 사용하여 지방조직으로부터 제조되었다. 노던 블럿, 방사성표지 및 하이브리드화는 문헌 (Zhang et al., 1994, 상기 참조)에 기술된 바와 같이 수행하였다. 폴리A+ RNA (인간 MTN, 인간 MTN II 및 인간 태아 MTN II)의 노던 블럿은 방사성표지된 인간 액틴 프로브를 생성시키는데 사용된 PCR 프로브와 같이 클론테크 (CLONETECH, Palo Alto, CA)로부터 획득하였다.
STS 개발
서열 태그-부위 (sequence tagged-site; STS)-특이적 PCR 시험은 필수적으로 문헌 [(Green et al., PCR Methods Applic., 1991; Green et al., Genomics, 11:548-564 (1991); Green, "Physical mapping of human chromosomes: generation of chromosome-specific sequence-tagged sites", in Methods in Molecular Genetics Vol. 1, Gene and Chromosome Analysis (Part A), pp. 192-210, Adolph ed., Academic Press, Inc., San Diego (1993); Green et al., Hum. Mol. Genet., 3:489-501 (1994)]에 기술된 바와 같이 개발되고 최적화되었다. 각각의 STS는 접두어 'sWSS'에 이어서 고유의 번호를 사용하여 명명하였다. 본 발명에서 보고된 19가지의 STSs에 대한 상세한 사항은 표 3에 제시하였으며, 추가의 정보 (예를들어 PCR 반응조건, 완전 DNA 서열)는 진뱅크 (GenBank) 및/또는 지놈 데이타 베이스 (Genome Data Base; GDB)에서 입수할 수 있다. 미소위성-특이적 STSs의 경우에, PCR 시험에서 사용된 올리고뉴클레오타이드 프라이머 (표 3)는 유전자형 분석을 위위해서 사용된 것 (표 4)에 상응하거나, 진뱅크에서 입수할 수 있는 DNA 서열을 사용하여 (가장 빈번하게는 컴퓨터 프로그램 OSP를 사용하여) 디자인된 것 [Hillier et al., PCR Methods Applic., 1:124-128 (1991)]에 상응하였다. 표 3은 인간 OB 유전자를 함유하는 YAC 콘티그에서의 STSs를 설명한 것이다.
Figure pct00015
인간 OB 유전자를 함유하는 YAC 콘티그에 위치하는 19개의 염색체 7-특이적 STSs (도 35)가 제시되어 있다. 각각의 경우에, 지정된 'sWSS' 명칭, 해당하는 별명, GDB-지정된 로커스 명칭, STS 공급원, PCR 프라이머 서열, STS 크기 및 GDB 동정번호가 기재되어 있다. STSs의 공급원은 다음과 같다: 'YAC 말단' (YAC의 분리된 삽입체 말단) (Green, 1993, 상기 참조), '람다 클론' (무작위적인 염색체 7-특이적 람다 클론) (Green et al., 1991, 상기 참조; Green, 1993, 상기 참조), '유전자 마커' (미소위성 마커, 표 2 참조) (Green et al., 1994, 상기 참조), 'YAC 삽입체' (YAC 삽입체로부터의 무작위적인 분절), 및 '유전자' (유전자-특이적 STS). 유전자 마커를 함유하는 YACs의 검출은 다형성 트랙트 (polymorphic tract) 그 자체의 증폭을 필요로 하지 않기 때문에, 몇가지 유전자 마커-특이적 STSs의 경우에 YACs를 확인하기 위해서 사용된 PCR 프라이머 (이 표에 기재됨)는 유전자형 분석을 수행하기 위해서 사용된 것과는 상이하다는 점을 주목하여야 한다. sWSS494, sWSS883, sWSS1529 및 sWSS2619 (50℃를 사용하였음), sWSS999 및 sWSS1174 (60℃를 사용하였음) 및 sWSS808 (65℃를 사용하였음)을 제외하고는 지정된 PCR 시험은 모두 55℃의 어니일링 온도를 이용하였다. STS-특이적 PCR 시험에 관한 추가의 상세한 사항은 GDB에서 이용할 수 있다.
Figure pct00016
인간 OB 유전자를 함유하는 YAC 콘티그에 위치하는 8개의 미소위성 마커 (도 35)가 제시되어 있다. 각각의 경우에, 마커 명칭 (표 3에서 별명으로 제시됨), 미소위성 모티프 (motif)의 형태 (테트라뉴클레오타이드- '테트라' 반복단위 또는 (CA)n 반복단위), GDB-지정된 로커스 명칭, PCR-기본 유전자형 분석을 위해서 사용된 프라이머 서열, 및 GDB 동정번호가 제시되어 있다. PCR 시험 및 다형성에 관한 추가의 상세한 사항은 GDB에서 이용할 수 있다.
인간 OB-특이적 STS (sWSS2619)는 cDNA의 3' 비해독 부분으로부터 수득된 DNA 서열을 사용하여 디자인되었다. 인간 Pax4-특이적 STS (sWSS808)는 다음의 전략을 사용하여 개발되었다. 마우스 Pax4 유전자에 대해서 특이적인 올리고뉴클레오타이드 프라이머 (GGCTGTGTGAGCAAGATCCTAGGA) (SEQ ID NO:63) 및 (GGGAGCCTTGTCCTGGGTACAAAG) (SEQ ID NO:93) [Walther et al., 1991, Genomics 11:424-434) (1991)]를 사용하여 인간 지놈 DNA로부터의 204-bp 단편 (이것은 마우스 지놈 DNA으로부터의 생성된 것과 동일한 크기의 생성물이었다)을 증폭시켰다. 유사한 크기 (200-bp)의 생성물이 또한 효모 DNA로부터 증폭되었기 때문에, 이 PCR 시험은 상응하는 YACs를 동정하는데에는 적합하지 않았다. 그러나, 인간 DNA로부터 생성된 PCR 생성물의 DNA 서열분석은 분석된 156 염기들중의 20개의 위치에서 치환을 나타내었다 (데이타는 나타내지 않음). 이 인간-특이적 서열을 사용하여 새로운 프라이머 (TTGCCAGGCAAAGAGGGCTGGAC) (SEQ ID NO:64)를 디자인하였으며, 상기의 마우스 Pax4-특이적 프라이머중의 첫번째 것과 함께 사용되었다 (참조 표 3). 생성된 인간 Pax4-특이적 PCR 시험은 효모 DNA로부터의 주요 생성물을 증폭시키지 않았으며, 따라서 상응하는 YACs를 동정하기 위해서 사용되었다.
PCR-기본 스크리닝에 의한 YACs의 동정
도 35에 도시된 YACs의 대부분은 PCR-기본 스크리닝 전략을 사용하여 인간 염색체 7 DNA ('염색체 7 YAC 자원') (Green et al., 1995, 상기 참조)에 대해서 매우 풍부한 클론의 수집물로부터 유도되었다 [Green et al., 1995, 상기 참조; Greena et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:1213-1217 (1990)]. 몇가지 경우에, 클론은 CEPH [Dausset et al., Behring Inst. Mitt., 91:13-20 (1992); Albertsen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:4256-4260 (1990)] 또는 ICI [Anand et al., Nucl. Acids Res., 17:3425-3433 (1989); Anand et al., Nucl. Acids Res. 18:1951-1956 (1990)]에서 작제된 이용가능한 총 인간 지놈 YAC 라이브러리의 PCR-기본 스크리닝 (Greena et al., 1990, 상기 참조)에 의해서 분리되었다. 각각의 YAC는 접두어 'yWSS'에 이어서 고유의 번호를 사용하여 명명하였다.
결과 및 검토
노던 블럿 분석에 의한 인간 OB 유전자의 조직발현의 검사로 OB RNA가 인간 지방조직에서는 높은 수준으로 발현되고 태반 및 심장에서는 훨씬 더 낮은 수준으로 발현되는 것이 밝혀졌다 (도 34). RNA의 크기 (약 4.5 kb)는 인간 및 마우스에서 뿐만 아니라 발현조직의 각각에서 동등하였다. 이들 시험에서는 5-배 더 큰 시그날이 2 ㎍의 폴리A+ 태반 RNA에서와 마찬가지로 10 ㎍의 총지방조직 RNA에서 나타났다. 5-배 더 작은 시그날은 태반에 비해서 심장으로부터의 폴리A+ RNA에서 나타났다. OB RNA의 수준은 지방조직에서 보다 태반에서 약 250-배 더 낮은 것으로 추정된다. 이 실험에서, OB RNA는 뇌, 폐, 간, 골격근, 신장 및 췌장을 포함하는 분석한 어떤 다른 조직에서도 검출되지 않았다. 추가의 실험은 비장, 흉선, 전립선, 고환, 난소, 소장, 대장, 말초혈액 백혈구 또는 태아의 뇌, 간 또는 신장에서 OB RNA를 나타내지 않았다 (데이타는 제시되지 않음). 이들 후자의 조직에서 또는 시험하지 않은 다른 조직에서 OB는 검출불가능한 수준 (노던 블럿 분석에 의해서)으로 발현될 가능성이 있다. 인간에게서 관찰된 발현의 패턴은 OB RNA가 지방조직내에서 거의 독점적으로 검출되는 마우스의 경우와는 다소 상이하다.
마우스 및 인간 지놈내에서 OB 유전자 부분의 비교 지도작성. 마우스 OB 유전자는 인간 염색체 7q의 일부분과 동종성인 부분에서 근위 염색체 6상에 위치한다. 이 분절내의 유전자는 다음을 포함한다 (근위에서부터 원위로): Met 원종양 유전자, 낭포성 섬유증 막전달 전도조절자 (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator; Cftr), 페어드 박스-함유 유전자 4 (Pax4), OB, 및 카복시펩티다제 A (Cpa) (Zhang et al., 1994, 상기 참조; Friedman et al., 1991, 상기 참조). 마우스에서는, 유전자 지도작성을 사용하여 Pax4가 ob에 단단하게 연결된다는 것을 입증하였다 [Walther et al., 1991, 상기 참조; Zhang et al., 1994, 상기 참조]. OB와 Pax4 사이의 물리적 간격은 대략적으로 1 메가염기쌍 (megabase pairs; Mb)인 것으로 확인되었다 (Zhang et al., 1994, 상기 참조). 이들 비교 지도작성 시험을 기초로 하여, 인간 OB 유전자는 염색체 7q상에서 Pax4와 CPA 사이에 위치하는 것으로 예상되었다. 또한, 인간 CFTR [Heng et al., Cell Genet., 62:108-109 (1993)] 및 Pax4 [Tamura et al., Cytogenet. Cell Genet., 66:132-134 (1994)]는 형광성 동일계 하이브리드화 (FISH)에 의해서 7q31.3 및 7q32에 각각 위치하였기 때문에, 인간 OB 유전자의 가장 가능한 세포유전적 위치는 7q31.3-q32 경계에 인접할 수 있다.
인간 염색체 7상에서 OB 유전자의 지도작성
인간 OB 유전자의 3' 비해독 부분의 소분절을 증폭시키는 STS (sWSS2619)를 사용하여 인간 염색체 7 DNA가 매우 풍부한 YAC 클론의 수집물을 선별하였으며(Green et al., 1995a, Genomics 25:170-183), 9개의 YACs를 동정하였다 (yWss691, yWSS1332, yWSS1998, yWSS2087, yWSS3319, yWSS3512, yWSS4875, yWSS4970 및 yWSS5004). 이들 YACs가 진정한 인간 OB 유전자를 함유하는 것을 입증하기 위해서, 두개의 추가의 실험을 수행하였다. 첫째로, 각각의 YACs를 제 2 인간 OB-특이적 PCR 시험을 사용하여 시험하였으며, 이들은 모두 양성인 것으로 확인되었다 (데이타는 제시되지 않음). 둘째로, 각각의 클론으로부터의 효모 DNA를 EcoRI로 분해시키고, 인간 OB cDNA-유도된 프로브를 사용하여 겔-전이 하이브리드화에 의해 분석하였다. 모든 경우에, 단일의 하이브리드화 밴드가 나타났으며; 이 밴드는 YACs 및 인간 OB 유전자를 함유하는 것으로 알려져 있는 P1 클론에서 동일한 크기였다 (데이타는 제시되지 않음).
컴퓨터 프로그램 세그맵 (SEGMAP) (Green and Green, 1991, 상기 참조) 및 본 발명자들에 의해서 염색체 7에 대해 생성된 그밖의 다른 YAC-기본 STS-함량 데이타 (Green et al., 1991, 상기 참조; Green et al., 1994, 상기 참조; Green et al., 1995, 상기 참조)를 사용하여, 인간 OB 유전자가 도 35에 도시된 YAC 콘티그 내에 존재하는 것을 확인하였다. 구체적으로, 이 콘티그는 43개의 오버랩 YACs 및 19개의 독특하게 정돈된 STSs로 구성된다. 19개의 STSs 각각에 대한 상세한 사항은 표 3에 제시되어 있다. OB-특이적 STS 이외에도, 콘티그는 또한 인간 Pax4 유전자에 대해 특이적인 STS (sWSS808) (Tamura et al., 1994, 상기 참조; Stapleton et al., 1993, Nature Genet. 3:292-298), 염색체 7-특이적 YACs로부터 유도된 7개의 STSs, 염색체 7-특이적 람다 클론으로부터 유도된 2개의 STSs, 및 중요하게는 8개의 미소위성-특이적 STSs를 함유한다. 유전자형 분석을 위해서 사용된 프라미어의 서열을 포함한 이들 8개의 유전자 마커에 대한 추가의 상세한 사항은 표 2에 제시되어 있다. 여기에서는, 콘티그 전체에 걸쳐서 과도한 YAC-기본 연결성이 존재하며 (즉, 여기에는 STSs의 인접한 쌍 각각을 연결하는 2개 또는 그 이상의 YACs가 존재한다), 이것은 도 35에 나타낸 STSs의 상대적 순서를 강력하게 지지하는 것이다.
도 35에 도시된 바와 같이, 인간 OB-함유 YAC 콘티그의 예상된 배향은 sWSS1734가 동원체성인 최대의 STS (즉, CFTR에 가장 가까움)인 반면에, sWSS2367은 종말성인 최대의 STS (즉, CPA에 가장 가까움)가 되도록 되어 있다. 이 배향은 현저하게, 마우스 및 인간 DNA에 존재하는 신테니성 (synthenic) 블럭내에 Pax4가 근위에 존재하고 OB는 원위에 존재한다는 비교용 지도작성 데이타를 기본으로 한다(Zhang et al., 1994, 상기 참조). OB 유전자는 OB-특이적 STS (sWSS2619)의 배열을 기초로 하여 콘티그의 종말성 말단에 가깝게 위치한다.
도 35에 나타낸 콘티그는 YAC 크기를 고려하지 않고 (이렇게 함으로써 STSs는 서로에 대해서 등거리로 표시된다) 세그맵에 의해서 추론된 것인 반면에, YAC 크기를 고려한 세그맵에 의한 데이타의 유사한 분석은 콘티그에 의해서 포함되는 부분의 전체 크기는 바로 2 Mb 이상임을 나타내었다 (데이타는 제시되지 않음). 즉, 8개의 미소위성-특이적 STSs (표 4)는 모두 대략 2 Mb에 걸친 지놈 간격내에 포함되는 반면에, 콘티그의 종말성 말단에 가장 근접한 3개 (sWSS1392, sWSS1148 및 sWSS2367)는 특히 OB 유전자 그 자체에 근접한다 (아마도 약 500 kb 정도로 작은 간격내에 위치한다). 실제로, 후자의 STSs 3개 모두는 인간 OB-함유 YACs중의 적어도 하나에 존재한다. 여기에서, 인간 Pax4 (sWSS808)과 ob (sWSS2619) 사이의 간격은 대략 400 kb인 것으로 추정되는 반면에, 이 부분은 마우스에서 약 1 Mb에 걸쳐 있는 것으로 예상되었다 (Zhang et al., 1994, 상기 참조). 마지막으로, 콘티그내의 YACs중의 3개 (yWSS691, yWSS999 및 yWSS2935)는 또한 FISH에 의해서 분석되었으며, 각각은 7q31.3에 대해서만 독점적으로 하이브리드화하는 것으로 확인되었다. 이들 YACs중의 하나 (yWSS691)는 OB-특이적 STS를 함유하는 반면에, 다른 2개의 클론은 Pax4-특이적 SRS를 함유한다. 후자의 결과는 일반적으로 7q32에 대한 인간 Pax4의 이전의 세포유전학적 지정과 일치한다 (Tamura et al., 1994, 상기 참조). 이들 데이타를 기초로 하여, 인간 OB 유전자는 세포유전학적 밴드 7q31.3으로 지정될 수 있다.
실시예 11: 인간 OB 폴리펩타이드는 마우스에서 생물학적으로 활성이다.
10마리의 ob/ob 마우스의 그룹을 10 ㎍/g/일의 재조합 (세균성) 인간 및 쥐 OB 폴리펩타이드 또는 식염수를 복강내 주사함으로써 처리하였다. 4일 후에, 식염수를 투여한 그룹은 0.3 g이 증가하였다. 쥐 OB를 투여한 그룹은 3.2 g이 손실되었다. 인간 OB를 투여한 그룹은 2 g이 손실되었다 (식염수 대조군과 비교하여 p < 0.01). 이들 그룹은 또한 사료 섭취에 대하여도 시험하였다. 사료 섭취에 대한 데이타는 표 5에 제시하였으며; 체질량에 대한 데이타는 표 6에 제시하였다.
Figure pct00017
Figure pct00018
이들 데이타는 인간 OB가 마우스에서 생물학적으로 활성이 있음을 설명하는 것이다.
실시예 12: 고용량의 OB는 야생형 마우스에 영향을 미친다.
야생형 마우스 (C57B16J +/?)는 재조합 쥐 OB를 10 ㎍/g/일로 복강내 주사하여 처리하고, 체질량을 매 4일 마다 측정하였다. 결과는 표 7에 제시하였다.
Figure pct00019
이들 데이타는 OB가 훨씬 더 작은 정도이기는 하지만, 비만 (ob/ob) 마우스뿐만 아니라 야생형의 체질량에 영향을 미치는 것을 설명하는 것이다.
실시예 13: 연속 펌프주입에 의해 투여된 OB 폴리펩타이드
본 실시예는 OB 폴리펩타이드의 연속주입이 정상 마우스에서 체중손실을 야기시킨다는 것을 설명한다. 정상 (비-비만) 마우스에게는 삼투압 펌프주입을 통해서 쥐 ob 폴리펩타이드를 투여하였다. 0.5 mg 단백질/체중 kg/일의 용량은 주입 6일째 까지 기준선 체중으로부터 4.62% 손실 (+/- 1.34%)을 야기시켰다.
재료 및 방법
동물
본 실시예에서는 야생형 (+/+) C57B16 마우스를 사용하였다. 마우스를 단독-수용하고, 인간의 조건하에서 유지시켰다. 시작 시점에서 마우스의 연령은 8주였으며, 동물은 체중이 안정화되었다. 각각의 코호트 (cohort) (비히클 대 단백질)를 위해서 10마리의 마우스를 사용하였다.
사료 급여 및 체중 측정
마우스에게는 일상적인 블럭 먹이를 사용하는 것 보다 사료 섭취를 더 정확하고 민감하게 측정할 수 있게 하는 분말화된 사료 급여기 (Allentown Caging and Equipment)에서 분쇄된 설치류 먹이 (PMI Feeds, Inc.)를 주었다. 체중은 6일의 기간 동안 매일 동일 시간 (오후 2시)에 측정하였다. 주입하기 전일의 체중을 기준 체중으로 정의하였다.
쥐 OB DNA의 클로닝
이. 콜라이 (E. coli)에서 발현시키기 위한 쥐 OB DNA의 클로닝은 다음과 같이 수행하였다. 문헌 (Zhang et al., 1994, 상기 참조, 즉 상기 실시예 1 참조)에 나타난 공개된 펩타이드 서열로부터 추론된 DNA 서열을 이. 콜라이 (E. coli) 최적 코돈을 사용하여 역으로 해독하였다. 말단 클로닝 부위는 XbaI에서 BamHI 까지였다. 코드화 부분의 전방에 리보좀 결합 인핸서 및 강력한 리보좀 결합부위가 포함되었다. 이중의 DNA 서열을 표준기술을 사용하여 합성하였다. 정확한 클론은 재조합 단백질의 발현 및 정주 플라스미드 (resident plasmid)내에서 정확한 OB DNA 서열의 존재를 입증함으로써 확인되었다. 아미노산 서열 (및 DNA 서열)은 다음과 같다:
재조합 쥐 met OB (이중나선) DNA 및 아미노산 서열 (SEQ ID NOS:94 및 95):
Figure pct00020
발현벡터 및 숙주 스트레인
단백질을 생산하기 위해서 사용된 플라스미드 발현벡터는 pCFM1656 (ATCC (American Type Culture Collection) 기탁번호 69576)이었다. 상기의 DNA를 XbaI 및 BamHI에 의해서 선형화된 발현벡터 pCFM1656에 연결시키고, 이. 콜라이 (E. coli) 숙주 스트레인 FM5에 형질전환시켰다. 이. 콜라이 (E. coli) FM5 세포는 이. 콜라이 (E. coli) K-12 스트레인으로부터 암젠사 (Amgen Inc., Thousand Oaks, CA)에서 유도되었으며 [Bachmann et al., Bacteriol. Rev., 40:116-167 (1976)], 통합된 람다 파아지 억제유전자 cI857 [Sussman et al., C. R. Acad. Sci., 254:1517-1579 (1962)]를 함유한다. 벡터 생산, 세포 형질전환 및 콜로니 선택은 표준방법, 예를들어 문헌 (Sambrook et al., 1989, 상기 참조)에 기술된 방법에 의해서 수행되었다. 숙주세포는 LB 배지내에서 성장시켰다.
단백질 또는 비히클의 투여
본 실험에서는 일반적으로 약 0.9 ㎎/㎖ 포스페이트 완충식염수, pH 7.4 의 농도로 재조합 쥐 OB 폴리펩타이드를 사용하였다. 사용된 아미노산 서열 (및 DNA 서열)은 바로 상기에 제시하였다. 단백질 또는 비히클 (포스페이트 완충 식염수, pH 7.4)은 삼투압 펌프주입에 의해서 투여하였다. 알젯트 (Alzet) 삼투압 미니펌프 (Alza, Palo Alto, CA, 모델 번호 1007D)는 수술에 의해서 각각의 마우스에서 견갑골 부위의 피하 포켓내에 배치시켰다. 펌프는 0.5 mg 단백질/kg 체중/일의 용량에 대하여 시간당 용액상태의 단백질 0.5 ㎖가 투여되도록 조정되었다. 대조용 동물에게는 알젯트 삼투압 미니펌프를 통해서 포스페이트 완충 식염수 (pH 7.4)를 주입하였다.
발효공정. 공급-배취 (fed-batch) 방법으로 알려져 있는 3-기 발효 프로토콜을 사용하여 단백질을 제조하였다. 배지 조성은 이하에 기술하였다.
배취 (Batch). 질소 및 포스페이트 공급원을 발효용기 (Biolafitte, 12 리터 용적)내에서 (35분 동안, 18-20 psi에서 온도를 122℃로 상승시킴으로써) 멸균시켰다. 냉각시킨 후에 탄소, 마그네슘, 비타민 및 미량금속 공급원을 무균적으로 첨가하였다. (LB 육즙내에서 성장시킨) 500 ㎖의 상기 재조합 쥐 단백질-생산 세균의 밤새 발효액 (16시간 또는 그 이상)을 발효기에 첨가하였다.
사료 (Feed) I. 4.0-6.0 O.D.600 사이에 도달한 후에 사료 I을 배양물에 첨가하였다. 글루코즈는 성장율 (μ)을 조절하기 위해서 제한속도로 첨가하였다. 자동화 시스템 (Distributive Control System이라고 불리움)은 성장율이 0.15 세대 hr-1이 되도록 프로그래밍하였다.
사료 II. O.D.가 30에 도달하면 온도를 서서히 42℃로 상승시키고 사료를 후술하는 사료 Ⅱ로 변화시켰다. 그후, 발효를 매 2시간 마다 샘플을 채취하면서 10시간 동안 계속하였다. 10시간 후에, 발효기의 내용물을 20℃ 이하로 냉각시키고 원심분리에 의해서 수거하였다.
배지 조성:
배취: 10 g/L 효모 추출물
5.25 g/L (NH4)2SO4
3.5 g/L K2HPO4
4.0 g/L KH2PO4
5.0 g/L 글루코즈
1.0 g/L MgSO4·7H2O
2.0 ㎖/L 비타민 용액
2.0 ㎖/L 미량금속 용액
1.0 ㎖/L P2000 소포제
사료 I: 50 g/L 박토-트립톤
50 g/L 효모 추출물
450 g/L 글루코즈
8.75 g/L MgSO4·7H2O
10 ㎖/L 비타민 용액
10 ㎖/L 미량금속 용액
사료 Ⅱ: 200 g/L 박토-트립톤
100 g/L 효모 추출물
110 g/L 글루코즈
비타민 용액 (Batch, 사료 I): 0.5 g의 비오틴, 0.4 g의 엽산 및 4.2 g의 리보플라빈을 450 ㎖의 H2O 및 3 ㎖의 10 N NaOH에 용해시키고, H2O를 가하여 500 ㎖로 만들었다. 14 그람의 피리독신-HCl 및 61 그람의 나이아신을 150 ㎖의 H2O 및 50 ㎖의 10 N NaOH에 용해시키고, H2O를 가하여 250 ㎖로 만들었다. 44 그람의 판토텐산을 200 ㎖의 H2O에 용해시키고, 250 ㎖로 조정하였다. 세가지 용액을 배합시켜 총용적을 10 리터로 만들었다.
미량금속 용액 (Batch, 사료 I):
염화제이철 (FeCl3·6H2O): 27 g/L
염화아연 (ZnCl2·4H2O): 2 g/L
염화코발트 (CoCl2·6H2O): 2 g/L
나트륨몰리브데이트 (NaMoO4·2H2O): 2 g/L
염화칼슘 (CaCl2·2H2O): 1 g/L
황산구리(Ⅱ) (CuSO4·5H2O): 1.9 g/L
붕산 (H3BO3): 0.5 g/L
염화망간 (MnCl2·4H2O): 1.6 g/L
나트륨시트레이트 디하이드레이트: 73.5 g/L
쥐 OB 폴리펩타이드에 대한 정제방법
정제는 다음의 단계들로 수행되었다 (달리 언급되지 않는 한, 다음의 단계들은 4℃에서 수행되었다):
1. 세포 페이스트: 이. 콜라이 (E. coli) 세포 페이스트를 5배 용적의 7 mM EDTA, pH 7.0에 현탁시켰다. EDTA내의 세포는 미소유동화기 (microfluidizer)를 통해서 2회 통과시킴으로써 더 파쇄하였다. 파쇄된 세포를 J5-4.2 로토 (rotor)를 갖는 베크만 (Beckman) JB-6 원심분리기에서 1시간 동안 4.2k rpm으로 원심분리하였다.
2. 봉입체 세척 #1: 상기에서 수득한 상등액을 제거하고, 펠릿을 5배 용적의 7 mM EDTA, pH 7.0에 재현탁시키고 균질화시켰다. 이 혼합물을 단계 1에서와 같이 원심분리하였다.
3. 봉입체 세척 #2: 상기에서 수득한 상등액을 제거하고, 펠릿을 10배 용적의 20 mM 트리스, pH 8.5, 10 mM DTT 및 1% 데옥시콜레이트에 재현탁시키고 균질화시켰다. 이 혼합물을 단계 1에서와 같이 원심분리하였다.
4. 봉입체 세척 #3: 상기에서 수득한 상등액을 제거하고, 펠릿을 10배 용적의 증류수에 재현탁시키고 균질화시켰다. 이 혼합물을 단계 1에서와 같이 원심분리하였다.
5. 재중첩: 펠릿을 실온에서 15 용적의 10 mM HEPES, pH 8.5, 1% 나트륨 사르코신 (N-라우릴 사르코신)으로 재중첩시켰다. 60분 후에, 용액을 60 mM 황산구리가 되도록 한 다음에 밤새 교반하였다.
6. 사르코신의 제거: 재중첩 혼합물을 5 용적의 10 mM 트리스 완충액, pH 7.5로 희석하고, 단계 1에서와 같이 원심분리하였다. 상등액을 수집하여 1시간 동안 교반하면서 클로라이드 형태의 20-50 메쉬 다우엑스 (Dowex) 1-X4 수지 (희석된 재중첩 혼합물의 총용적의 0.066%로)와 혼합시켰다. 이 혼합물을 칼럼에 붓고, 용출액을 수집하였다. 사르코신의 제거는 HPLC에 의해서 확인되었다.
7. 산 침전: 이전의 단계로부터 수득한 용출액을 수집하고, pH를 pH 5.5로 조정한 다음에 실온에서 30분 동안 배양하였다. 이 혼합물을 단계 1에서와 같이 원심분리하였다.
8. 양이온 교환 크로마토그라피: 이전의 단계에서 수득한 상등액의 pH를 pH 4.2로 조정하고, CM 세파로즈 고속유동 (CM Sepharose Fast Flow)상에 부하하였다. 20 칼럼 용적의 염구배는 20 mM NaOAc, pH 4.2, 0 M 부터 1.0 M 까지의 NaCl이 사용되었다.
9. HIC 크로마토그라피: 상기 단계에서 수득한 피크 분획 (자외선 분석으로 확인됨)의 CM 세파로즈 푸울 (Sepharose pool)을 0.2 M 황산암모늄이 되도록 조정하였다. 20 칼럼 용적의 역 염구배로는 0.4 M 부터 0 M 까지의 황산암모늄을 함유하는 5 mM NaOAc, pH 4.2가 사용되었다. 이 물질을 농축시키고 PBS내로 투석여과 하였다.
결과
이하에 제시된 것은 C57B16J 마우스 (8주령)에서 기준선 체중으로부터 차이의 백분율 (%)이다:
Figure pct00021
제시된 바와 같이, 6일의 연속주입 방식의 마지막에 OB 폴리펩타이드를 투여한 동물은 기준선에 비해서 그들의 체중의 4%를 상실하였다. 이것은 복강내 (i.p.) 주사한 경우에 관찰된 것에 비해서 실질적으로 더 빠른 체중 손실이다. 재조합 쥐 OB 폴리펩타이드를 10 mg/kg 용량으로 매일 복강내 주사한 야생형 (정상) 마우스에서 32-일의 주사기간의 종료시에는 단지 2.6-3.0%이 체중 손실이 관찰되었으며, 이것은 투약 스케쥴중의 어떤 시점에서도 4% 이상은 아니었다 (데이타는 제시되지 않음). 본 데이타는 연속주입에 의해서 20-배 더 적은 용량 (0.5 mg/kg 대 10 mg/kg)이 더 단기간 이내에 더 많은 체중 손실을 획득한 것을 나타낸다.
여기에 제시된 결과는 통계학적으로 유의적이며, 예를들어 p < .0001로 - 4.62%였다.
실시예 14: 재조합 인간 OB 폴리펩타이드 동족체의 클로닝 및 발현
본 실시예는 OB 폴리펩타이드의 동족성 재조합 인간 변형체 (version)의 조성물 및 제조방법을 제공한다.
OB DNA의 인간 변형체는 상기 실시예 13에서와 같이 20개의 코돈 치환이 디자인된 이중 DNA (합성 올리고뉴클레오타이드로부터 제조됨)로 MluI와 BamHI 부위 사이의 부분을 치환시킴으로써 쥐 OB DNA로부터 작제되었다. 마우스 성숙 위치 35에서의 아르기닌 및 마우스 성숙 위치 74에서의 로이신에 대한 코돈은 변화되지 않았다. MluI 부위는 이하의 서열에서 실선 이하에 나타내었다. 이 DNA를 상술한 바와 같이 재조합 쥐 단백질과 동일한 방식으로 pCFM 1656 벡터 (ATCC 기탁번호 69576)내에 삽입하였다.
재조합 인간 met OB (이중-나선) DNA 및 아미노산 서열 (SEQ ID NOS: 96 및 97)
Figure pct00022
발효
재조합 인간 OB 폴리펩타이드를 생산하기 위한 상기 숙주세포의 발효는 재조합 쥐 재료에 대하여 상술한 바와 같은 조건 및 조성물을 사용하여 수행되었다. 결과는 재조합 인간 OB 물질 (및 소량의 세균성 단백질)의 수율 (그람/리터) 및 정정제에 대하여 분석하고, 상호 연관시켜 세균성 발현을 분석하였다:
Figure pct00023
재조합 인간 ob 폴리펩타이드의 정제
재조합 인간 단백질은 상기 실시예 13에서와 같이 재조합 쥐 단백질을 정제하는데 사용된 것과 유사한 방법을 사용하여 정제할 수 있다. 재조합 인간 OB 폴리펩타이드를 제조하기 위해서, 단계 7로부터의 상등액의 pH를 pH 5.0으로 조정하고 이것을 CM 세파로즈 고속유동 칼럼상에 부하시킴으로써 단계 8을 수행하였다. 20 칼럼 용적 염구배는 20 mM NaOAc, pH 5.5, 0 M 부터 0.5 M 까지의 NaCl로 수행하였다. 단계 9는 CM 세파로즈 푸울을 물로 4-배 희석하고, pH를 7.5로 조정함으로써 수행되었다. 이 혼합물을 0.7 M 황산암모늄으로 만들었다. 20 칼럼 용적 역염구배는 5 mM NaOAc, pH 5.5, 0.2 M 부터 0 M 까지의 황산암모늄으로 수행하였다. 다른 방법으로 상기의 단계는 동일하였다.
실시예 15: 용량반응 시험
추가의 시험은 OB 단백질의 연속투여에 대한 용량반응이 있음을 입증하는 것이었다. 이 시험에서, 야생형 마우스 (비-비만, CD-1 마우스, 체중 35-40 g)에게는 실시예 12 및 13과 유사한 방법을 사용하여 재조합 쥐 OB 단백질을 투여하였다. 결과는 다음과 같았다 (상기한 바와 같이 측정된 기준선과 비교한 체중 손실율 %):
Figure pct00024
제시된 바와 같이, 0.03 mg/kg/일로부터 1 mg/kg/일 까지 용량을 증가시키면 체중 손실은 3.5%에서부터 7.5% 까지 증가하였다. 14일 째에 1 mg/kg/일의 용량은 체중의 14% 손실을 야기시켰다는 것도 또한 주목할 만 하다.
실시예 16: ob/ob 마우스의 체조성에 대한 렙틴의 영향
16주령의 C57B1/6J ob/ob 마우스를 33일 동안 5 ㎍/g/일의 쥐 렙틴 또는 비히클로 처리하거나, 처리하지 않았다. 두번째 실험에서는 7주령의 ob/ob 마우스를 12일 동안 10 ㎍/g/일의 인간 렙틴, 쥐 렙틴 또는 비히클로 처리하였다. 마우스를 희생시키고, 총 체중, 체조성, 인슐린 수준 및 글루코즈 수준을 평가하였다. 이들 실험으로부터의 데이타는 표 11에 기재하였다.
Figure pct00025
체조성 데이타는 3가지 신체의 사항, 즉 지방질량, 순체질량 및 수분질량에 대한 렙틴의 영향을 나타낸 것이다. 이 데이타는 렙틴이 체지방질량을 현저하게 감소시키며, 순체질량에 대한 한계효과를 갖는다는 것을 나타낸다. 그러나, 순체질량에 대한 영향은 통계학적으로 유의적이지 않다.
렙틴 처리 및 대조 (비처리) 마우스에서 인슐린 및 글루코즈 수준의 비교는 렙틴이 혈당 및 인슐린 수준을 감소시킴으로써 당뇨병의 이들 증상을 완화시키는 것을 나타낸다.
실시예 17: 야생형 마우스에 대한 렙틴의 고용량 효과
ob/ob 마우스 (C57B1/6J+/-)의 여윈 대조군에게 10 ㎍/g의 쥐 렙틴 또는 비히클(PBS)을 하루에 한번 복강내 주사하고, 그 다음 2주일에 걸쳐서 체중 및 사료 섭취를 측정하였다. 여기에서는 4일 이후부터 체중의 현저한 저하 및 첫번째 주일 동안의 사료 섭취에 있어서의 현저한 감소가 있었다. 그러나, 일주일 후에 사료 섭취의 수준은 마우스의 두 그룹간에 구별할 수 없게 되었다. 2주일이 끝나면 동물을 희생시키고, 체조성을 결정하였다. 체조성 분석의 결과는 표 12에 기재하였다. 이 데이타는 렙틴을 투여하는 동물과 PBS를 투여한 동물에서의 체지방의 감소를 대비하여 나타낸 것이다.
Figure pct00026
두번째 실험은 야생형 C57B1/6J 마우스에 대해서 12.5 ㎍/g의 쥐 렙틴을 하루에 2회 복강내 주사한 효과를 나타내었다. 여기에서는 폴리펩타이드의 1일 2회 주사와 연관되어 체중 및 사료 섭취의 현저한 감소가 있었다. 이 실험의 경우에, 동물은 대사챔버내에 두었다. 사료는 분말화된 퓨리나 (Purina) #5001 챠우 다이어트 (chow diet)로 구성되었다. 이 먹이는 챠우 다이어트, 타피오카 및 물로 구성된 식이를 사용한 이전의 실험과는 상이하였다. 따라서, 대사챔버내에서 사용된 사료는 더 높은 칼로리 함량을 가졌으며, 이것은 왜 소비된 사료의 양이 수분-함유 식이를 사용한 동물의 경우와 상이한지를 설명하는 것이다.
이하에는 상기의 기술내용, 특히 실험방법 및 검토와 관련된 참고문헌의 리스트가 제시되어 있다.
Figure pct00027
Figure pct00028
본 발명은 그의 의의 또는 필수적인 특징을 벗어나지 않으면서 다른 형태로 구체화되거나 다른 방식으로 수행될 수 있다. 따라서, 본 발명의 기술내용은 모든 관점에서 예시적인 것이며 제한적인 것이 아닌 것으로 간주되며, 본 발명의 범위는 첨부된 특허청구의 범위로 나타내고, 동등한 의미 및 범위내에 속하는 모든 변화는 여기에 포함되는 것으로 해석된다.
다수의 참고문헌이 본 명세서에 전반적으로 인용되었으며, 이들 각각은 그 내용 그대로 참고로 본 발명에 포함된다.
특허청구된 본 발명은 상기의 명세서 및 용이하게 입수할 수 있는 참고문헌 및 출발물질에 따라서 실시할 수 있다. 그럼에도 불구하고, 본 출원인은 1995년 8월 9일에 다음의 기탁물을 특허절차를 목적으로 하는 미생물 기탁물의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약의 규정에 따라서 ATCC (American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, 20852-1178, U.S.A.)에 기탁하였다: 플라스미드 pETH14를 보유하는 이. 콜라이 (E. coli) H14, 기탁번호 69880; 및 플라스미드 pETM9를 보유하는 이. 콜라이 (E. coli) M9, 기탁번호 69879.
Figure pct00029
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Figure pct00080
Figure pct00081

Claims (67)

  1. SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 또는 SEQ ID NO:6으로 나타낸 아미노산 서열을 포함하며, 동물의 체중을 변조시킬 수 있는 약 145 내지 약 167개의 아미노산을 갖는 비만 (OB) 폴리펩타이드, 또는 체중을 변조시킬 수 있는 그의 단편을 포함하는 대립유전자 변이체 또는 유사체.
  2. 제 1 항에 있어서, OB 폴리펩타이드의 면역원성 단편.
  3. Val-Pro-Ile-Gln-Lys-Val-Gln-Asp-Asp-Thr-Lys-Thr-Leu-Ile-Lys-Thr (SEQ ID NO:18); Leu-His-Pro-Ile-Leu-Ser-Leu-Ser-Lys-Met-Asp-Gln-Thr-Leu-Ala (SEQ ID NO: 19); Ser-Lys-Ser-Cys-Ser-Leu-Pro-Gln-Thr-Ser-Gly-Leu-Gln-Lys-Pro-Glu-Ser-Leu-Asp (SEQ ID NO:20); 및 Ser-Arg-Leu-Gln-Gly-Ser-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Gln-Gln-Leu-Asp-Val-Ser-Pro-Glu-Cys (SEQ ID NO:21)로 구성된 그룹으로부터 선택된 OB 폴리펩타이드의 면역원성 단편.
  4. 제 1 항에 있어서, 아미노산 53, 56, 71, 85, 89, 92, 95, 98, 110, 118, 121, 122, 126, 127, 128, 129, 132, 139, 157, 159, 163, 및 166 (SEQ ID NO:4의 넘버링에 따름)으로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 인간 OB 폴리펩타이드 유사체.
  5. 제 4 항에 있어서, 치환이 SEQ ID NO:2로 기술된 마우스 OB 폴리펩타이드의 분기된 아미노산에 의해서 이루어진 인간 OB 폴리펩타이드 유사체.
  6. 제 4 항에 있어서, 치환이 알라닌에 의해서 이루어진 인간 OB 폴리펩타이드 유사체.
  7. 제 4 항에 있어서, (a) 위치 53 (SEQ ID NO:4의 넘버링에 따름)에서 세린 잔기는 글리신, 알라닌, 발린, 시스테인, 메티오닌, 또는 트레오닌으로 치환되고; (b) 위치 98 (SEQ ID NO:4의 넘버링에 따름)에서 세린 잔기는 글리신, 알라닌, 발린, 시스테인, 메티오닌, 또는 트레오닌으로 치환되며; (c) 위치 92 (SEQ ID NO:4의 넘버링에 따름)에서 아르기닌 잔기는 아스파라긴, 리신, 히스티딘, 글루타민, 글루타민산, 아스파르틴산, 세린, 트레오닌, 메티오닌, 또는 시스테인으로 치환된 폴리펩타이드로 구성된 그룹으로부터 선택된 인간 OB 폴리펩타이드 유사체.
  8. 제 1 항에 있어서, SEQ ID NO:4 또는 SEQ ID NO:5에 기술된 아미노산 서열을 갖는 인간 OB 폴리펩타이드에 대해서 83% 또는 그 이상의 아미노산 서열 상동성을 갖는 인간 OB 폴리펩타이드 유사체.
  9. 제 1 항에 있어서, (a) 하나 또는 그 이상의 아스파르틴산 잔기가 글루타민산에 의해서 치환되고; (b) 하나 또는 그 이상의 이소로이신 잔기가 로이신에 의해서 치환되며; (c) 하나 또는 그 이상의 글리신 또는 발린 잔기가 알리닌에 의해서 치환되고; (d) 하나 또는 그 이상의 아르기닌 잔기가 히스티딘에 의해서 치환되며; (e) 하나 또는 그 이상의 티로신 또는 페닐알라닌 잔기가 트리프토판에 의해서 치환되고; (f) 위치 121 내지 128 (SEQ ID NO:4의 넘버링에 따름) 중의 하나 또는 그 이상의 잔기가 글리신 또는 알라닌에 의해서 치환되며; (g) 위치 54 내지 60 또는 118 내지 166 (SEQ ID NO:4의 넘버링에 따름) 중의 하나 또는 그 이상의 잔기가 리신, 글루타민산, 시스테인 또는 프롤린에 의해서 치환된 폴리펩타이드로 구성된 그룹으로부터 선택된 인간 OB 폴리펩타이드 유사체.
  10. 제 1, 2, 4, 5 또는 8 항에 있어서, (a) 잔기 1 내지 21이 결실된 폴리펩타이드; 및 (b) 위치 21에 메티오닌을 갖거나, 위치 18 내지 21에 글리신-세린-히스티딘-메티오닌 서열 SEQ ID NO:38을 갖거나, 또는 위치 1 내지 21 위치에 메티오닌-글리신-세린-세린-히스티딘-히스티딘-히스티딘-히스티딘-히스티딘-히스티딘-세린-세린-글리신-로이신-발린-프롤린-아르기닌-글리신-세린-히스티딘-메타오닌 서열 (SEQ ID NO:98)을 갖는 상기 (a)의 폴리펩타이드로 구성된 그룹으로부터 선택된 OB 폴리펩타이드.
  11. 제 1, 2, 4, 5 또는 8 항에 있어서, (a) 잔기 1 내지 21이 결실된 폴리펩타이드; 및 (b) 위치 14 내지 21에 로이신-글루타민산-리신-아르기닌-글루타민산-알라닌-글루타민산-알라닌 서열 (SEQ ID NO:26)을 갖거나, 위치 18 내지 21에 글루타민산-알라닌-글루타민산-알라닌 서열 (SEQ ID NO:27)을 갖거나, 위치 18 내지 21에 로이신-글루타민산-리신-아르기닌 서열 (SEQ ID NO:28)을 갖거나, 위치 2 내지 21에 메티오닌-글리신-세린-세린-히스티딘-히스티딘-히스티딘-히스티딘-히스티딘-히스티딘-세린-세린-글리신-로이신-발린-프롤린-아르기닌-글리신-세린-프롤린 서열 (SEQ ID NO:99)을 갖거나, 또는 위치 18 내지 21에 글리신-세린-프롤린 서열을 갖는 상기 (a)의 폴리펩타이드로 구성된 그룹으로부터 선택된 OB 폴리펩타이드.
  12. 제 6, 7, 8 또는 9 항에 있어서, (a) 잔기 1 내지 21이 결실된 폴리펩타이드; 및 (b) 위치 21에 메티오닌을 갖거나, 위치 18 내지 21에 글리신-세린-히스티딘-메티오닌 서열 (SEQ ID NO:38)을 갖거나, 위치 1 내지 21에 메티오닌-글리신-세린-세린-히스티딘-히스티딘-히스티딘-히스티딘-히스티딘-히스티딘-세린-세린-글리신-로이신-발린-프롤린-아르기닌-글리신-세린-히스티딘-메티오닌 서열 (SEQ ID NO:98)을 갖거나, 위치 14 내지 21에 로이신-글루타민산-리신-아르기닌-글루타민산-알라닌-글루타민산-알라닌 서열 (SEQ ID NO:26)을 갖거나, 위치 18 내지 21에 글루타민산-알라닌-글루타민산-알라닌 서열 (SEQ ID NO:27)을 갖거나, 위치 18 내지 21에 로이신-글루타민산-리신-아르기닌 서열 (SEQ ID NO:28)을 갖거나, 위치 2 내지 21에 메티오닌-글리신-세린-세린-히스티딘-히스티딘-히스티딘-히스티딘-히스티딘-히스티딘-세린-세린-글리신-로이신-발린-프롤린-아르기닌-글리신-세린-프롤린 서열 (SEQ ID NO:99)을 갖거나, 또는 위치 18 내지 21에 글리신-세린-프롤린 서열을 갖는 상기 (a)의 폴리펩타이드로 구성된 그룹으로부터 선택된 OB 폴리펩타이드.
  13. 제 1 항에 있어서, (a) 위치 121 내지 128에서 하나 또는 그 이상의 잔기가 결실된 폴리펩타이드; (b) 잔기 1-116이 결실된 폴리펩타이드; (c) 잔기 1-21 및 54 내지 167이 결실된 폴리펩타이드; (d) 잔기 1-60 및 117 내지 167이 결실된 폴리펩타이드; (e) 잔기 1-60이 결실된 폴리펩타이드; (f) 잔기 1-53이 결실된 폴리펩타이드; (g) 잔기 1-21이 결실된 상기 (a)의 유사체; 및 (h) (1) 메티오닌, (2) 글리신-세린-히스티딘-메티오닌 서열 (SEQ ID NO:38), (3) 메티오닌-글리신-세린-세린-히스티딘-히스티딘-히스티딘-히스티딘-히스티딘-히스티딘-세린-세린-글리신-로이신-발린-프롤린-아르기닌-글리신-세린-히스티딘-메티오닌 서열 (SEQ ID NO:98), (4) 로이신-글루타민산-리신-아르기닌-글루타민산-알라닌-글루타민산-알라닌 서열 (SEQ ID NO:26), (5) 글루타민산-알라닌-글루타민산-알라닌 서열 (SEQ ID NO:27), (6) 로이신-글루타민산-리신-아르기닌 서열 (SEQ ID NO:28), (7) 메티오닌-글리신-세린-세린-히스티딘-히스티딘-히스티딘-히스티딘-히스티딘-히스티딘-세린-세린-글리신-로이신-발린-프롤린-아르기닌-글리신-세린-프롤린 서열 (SEQ ID NO:99) 및 (8) 글리신-세린-프롤린 서열로 구성된 그룹으로부터 선택된 N-말단 아미노산 또는 아미노산 서열을 갖는 상기 (a) 내지 (g)의 유사체로 구성된 그룹 (여기에서, 넘버링은 SEQ ID NO:4의 넘버링에 따름)으로부터 선택된 인간 OB 폴리펩타이드 절단 유사체.
  14. 제 1 항 내지 13 항중의 어느 하나에 따르는 재조합 OB 폴리펩타이드.
  15. 제 1 항 내지 13 항중의 어느 하나에 따르는 화학적으로 합성된 OB 폴리펩타이드.
  16. 하나 또는 그 이상의 화학적 부위가 부착되어 있는, 제 1 항 내지 15 항중의 어느 하나에 따르는 OB 폴리펩타이드의 유도체.
  17. 제 16 항에 있어서, 화학적 부위가 수용성 폴리머인 유도체.
  18. 제 17 항에 있어서, 수용성 폴리머가 폴리에틸렌 글리콜인 유도체.
  19. 제 18 항에 있어서, 모노-, 디-, 트리- 또는 테트라-페질화된 유도체.
  20. 제 19 항에 있어서, N-말단 페질화된 유도체.
  21. 제 20 항에 있어서, SEQ ID NO:4의 아미노산 잔기 22 내지 167, 또는 SEQ ID NO:6의 잔기 22 내지 166을 갖는 OB 폴리펩타이드인 유도체.
  22. 제 20 항에 있어서, SEQ ID NO:4의 잔기 22 내지 167 또는 SEQ ID NO:6의 잔기 22 내지 166의 아미노산 서열을 가지며, 위치 21에 메티오닌을 갖는 OB 폴리펩타이드인 유도체.
  23. 제 1 항, 2 항 내지 5 항, 8 항 및 10 항중의 어느 하나에 따르는 OB 폴리펩타이드를 코드화한 분리된 핵산 분자.
  24. 제 6, 7, 9, 11, 12 및 13 항중의 어느 하나에 따르는 OB 폴리펩타이드를 코드화한 분리된 핵산 분자.
  25. (a) SEQ ID NOS: 1 및 3에 기술된 DNA 분자 또는 그의 단편; (b) (a)에 기술된 DNA 분자에 하이브리드화는 DNA 분자 또는 그의 하이브리드화 가능한 단편; 및 (c) 상기 (a) 및 (b)의 DNA 분자에 의하여 코드화된 아미노산 서열에 대한 발현을 코드화한 DNA 분자로 구성된 그룹으로부터 선택되며, 포유동물에서 체중을 변조시키는 생물학적 활성을 갖는 OB 폴리펩타이드의 발현을 제공하는데 사용하기 위한 DNA 분자.
  26. 제 25 항에 있어서, SEQ ID NOS: 22 및 24의 인간 지놈 DNA 분자인 DNA 분자.
  27. 제 23 항에 있어서, (a) SEQ ID NO:2; (b) SES ID NO:2의 아미노산 22 내지 167; (c) SEQ ID NO:4; (d) SEQ ID NO:4의 아미노산 22 내지 167; (e) SEQ ID NO:5; (f) SEQ ID NO:5의 아미노산 22 내지 166; (g) SEQ ID NO:6; (h) SEQ ID NO:6의 아미노산 22 내지 166; 및 (i) (1) 메티오닌, (2) 글리신-세린-히스티딘-메티오닌 서열 (SEQ ID NO:38), 및 (3) 메티오닌-글리신-세린-세린-히스티딘-히스티딘-히스티딘-히스티딘-히스티딘-히스티딘-세린-세린-글리신-로이신-발린-프롤린-아르기닌-글리신-세린-히스티딘-메티오닌 서열 (SEQ ID NO:98)로 구성된 그룹으로부터 선택된 N-말단 아미노산 또는 아미노산 서열을 갖는 상기 (b), (d), (f) 또는 (h)의 아미노산 서열로 기술된 아미노산 서열로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 코드화한 DNA 분자.
  28. 제 27 항에 있어서, (1) 로이신-글루타민산-리신-아르기닌-글루타민산-알라닌-글루타민산-알라닌 서열 (SEQ ID NO:26), (2) 글루타민산-알라닌-글루타민산-알라닌 서열 (SEQ ID NO:27), (3) 로이신-글루타민산-리신-아르기닌 서열 (SEQ ID NO:28), (4) 메티오닌-글리신-세린-세린-히스티딘-히스티딘-히스티딘-히스티딘-히스티딘-히스티딘-세린-세린-글리신-로이신-발린-프롤린-아르기닌-글리신-세린-프롤린 서열 (SEQ ID NO:99) 및 (5) 글리신-세린-프롤린 서열로 구성된 그룹으로부터 선택된 N-말단 아미노산 서열을 갖는 (b), (d), (f) 또는 (h)의 아미노산을 코드화한 DNA분자.
  29. 제 23 항에 있어서, SEQ ID NO:3의 단백질 코드화 서열로 기술된 서열을 포함하는 DNA 분자.
  30. 제 23 항에 있어서, SEQ ID NO:3의 아미노산 22 내지 167을 코드화한 서열로 기술된 서열을 포함하는 DNA 분자.
  31. SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:3으로 기술된 DNA 분자에 대해 하이브리드화할 수 있는 검출가능하게 표지된 핵산 분자.
  32. 인트론, 5' 비코드화 부분 및 3' 비코드화 부분으로 구성된 그룹으로부터 선택된 OB 핵산의 비코드화 부분에 대해 하이브리드화할 수 있는 핵산.
  33. OB 폴리펩타이드를 코드화한 인간 지놈 DNA를 증폭시키기 위한 올리고뉴클레오타이드 프라이머.
  34. 제 31 항에 있어서, HOB 1gF 5'-CCCAAGAAGCCCATCCTG-3' (SEQ ID NO:29); HOB 1gR 5'-GACTATCTGGGTCCAGTGCC-3' (SEQ ID NO:30); HOB 2gF 5'-CCACATGCTGAGCACTTGTT-3' (SEQ ID NO:31); 및 HOB 2gR 5'-CTTCAATCCTGGAGATACCTGG-3' (SEQ ID NO:32)로 구성된 그룹으로 선택되는 올리고뉴클레오타이드.
  35. 제 23 항 내지 30 항중의 어느 하나에 따르는 DNA 분자를 함유하는 벡터.
  36. 발현조절서열과 작동적으로 결합된 제 23, 25, 29 또는 30 항에 따르는 DNA 분자를 함유하는 발현벡터.
  37. 발현조절서열과 작동적으로 결합된 제 26 또는 28 항에 따르는 DNA 분자를 함유하는 발현벡터.
  38. 발현조절서열과 작동적으로 결합된 제 24 항에 따르는 DNA 분자를 함유하는 발현벡터.
  39. 제 23 항 또는 24 항의 DNA 분자 또는 제 35 항 내지 38 항중의 어느 하나에 따르는 발현벡터에 의해서 형질전환되거나 형질감염된 단세포 숙주.
  40. 제 39 항에 있어서, 세균, 효모, 포유동물 세포, 식물 세포, 곤충 세포, 및 조직배양액중의 인간 세포로 구성된 그룹으로부터 선택되는 단세포 숙주.
  41. 제 39 항에 있어서, 이, 콜라이 (E. coli), 슈도모나스 (Pseudomonas), 바실루스 (Bacillus), 스트렙토마이스 (Streptomyces), 효모, CHO, R1.1, B-W, LM, COS 1, COS 7, BSC1, BSC40, BMT10 및 Sf9 세포로 구성된 그룹으로부터 선택되는 단세포 숙주.
  42. 제 39 항에 있어서, 사카로마이세스 (Saccharomyces), 피치아 (Pichia), 칸디다 (Candida), 한세눌라 (Hansenula) 및 토룰롭시스 (Torulopsis)로 구성된 그룹으로부터 선택된 효모 숙주인 단세포 숙주.
  43. OB 폴리펩타이드 코드화 서열에 작용적으로 근접하여 발현조절서열을 삽입시키는 것으로 구성된 동종성 재조합 방법을 이용하여 OB 폴리펩타이드의 높은 발현이 가능하도록 시험관내에서 변형되고, OB 폴리펩타이드 코드화 DNA 서열을 함유하는 포유동물 세포.
  44. 제 43 항에 있어서, 발현조절서열이 OB 폴리펩타이드 발현조절서열이고, 동종성 재조합 방법이 돌연변이 OB 폴리펩타이드 발현조절서열을 대체시킨 세포.
  45. 제 44 항에 있어서, 발현조절서열 삽입물이 OB 폴리펩타이드 조절서열이 아닌 세포.
  46. (a) OB 폴리펩타이드의 발현을 제공하는 조건하에서 제 39 항 내지 45 항중의 어느 하나에 따르는 세포를 배양하고; (b) 발현된 OB 폴리펩타이드를 회수하는 단계를 포함하여, OB 폴리펩타이드를 제조하는 방법.
  47. 제 46 항에 있어서, 세포가 세균 또는 효모인 방법.
  48. 제 46 항 또는 47 항에 있어서, 추가로 (c) Ni-킬레이트화 칼럼상에서 OB 폴리펩타이드를 크로마토그라피하고; (d) OB 폴리펩타이드를 겔여과에 의해서 정제하는 단계를 포함하는 방법.
  49. 제 48 항에 있어서, 추가로 단계 (c)의 후 및 단계 (d)의 전에 강양 이온 교환칼럼상에서 OB 폴리펩타이드를 크로마토그라피하는 단계를 포함하는 방법.
  50. 제 1 항 내지 15 항중의 어느 하나에 따르거나, 제 46 항 내지 49 항 중의 어느 하나에 따르는 방법에 의해서 생성된 OB 폴리펩타이드에 대해 특이적인 항체.
  51. 제 50 항에 있어서, 모노클로날 또는 폴리클로날 항체인 항체.
  52. 제 51 항에 있어서, 검출가능한 표지물로 표지된 항체.
  53. 제 51 항에 따르는 모노클로날 항체를 생산하는 불멸 세포주.
  54. (a) 제 1 항 내지 15 항중의 어느 하나에 따르거나, 제 46 항 내지 49 항중의 어느 하나에 따르는 방법에 의해서 생성되는 OB 폴리펩타이드를 캐리어 단백질에 컨쥬게이트시키고; (b) 보조제와 혼합시킨 단계 (a)의 OB 폴리펩타이드 단편-캐리어 단백질 컨쥬게이트로 숙주 동물을 면역시키고; (c) 면역된 숙주 동물로부터 항체를 수득하는 단계를 포함하여, OB 폴리펩타이드에 대해 특이적인 항체를 제조하는 방법.
  55. (a) OB 폴리펩타이드를 함유하는 것으로 의심되는 샘플을 항체와 OB 폴리펩타이드를 함유하는 반응 컴플렉스의 형성을 가능하게 하는 조건하에서, OB 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체와 접촉시키고; (b) 샘플내에서 항체와 OB 폴리펩타이드로 이루어진 반응 컴플렉스의 형성을 검출 (여기에서, 반응 컴플렉스의 형성의 검출은 샘플내에서 OB 폴리펩타이드의 존재를 시사한다)하는 단계를 포함하여, 샘플내에서 OB 폴리펩타이드의 존재를 측정하는 방법.
  56. 제 55 항에 있어서, 항체가 고체상 지지체에 결합되는 방법.
  57. (a) 제 55 항 또는 56 항의 방법에 따라 생물학적 샘플내에서 반응 컴플렉스의 형성을 검출하고; (b) 형성된 반응 컴플렉스의 양 (여기에서, 반응 컴플렉스의 양은 생물학적 샘플내의 OB 폴리펩타이드의 수준에 상응한다)을 평가하는 단계를 포함하여, 생물학적 샘플내의 OB 폴리펩타이드의 수준을 평가하는 시험관내 방법.
  58. (a) 제 57 항에 따라 포유동물 피검자로부터의 생물학적 샘플내에서 OB 폴리펩타이드의 수준을 평가하고; (b) 단계 (a)에서 검출된 수준을 정상 피검자 또는 더 조기의 피검자에게서 존재하는 OB 폴리펩타이드의 수준과 비교 (여기에서, 정상 수준에 비해서 OB 폴리펩타이드의 수준이 증가한 것은 OB 폴리펩타이드의 증가된 수준과 연관된 질병을 시사하며, 정상 수준에 비해서 OB 폴리펩타이드의 수준이 감소한 것은 OB 폴리펩타이드의 감소된 수준과 연관된 질병을 시사한다)하는 단계를 포함하여, 포유동물 피검자에게서 OB 폴리펩타이드의 증가되거나 감소된 수준과 연관된 질병의 존재를 검출 또는 진단하는 시험관내 방법.
  59. 제 57 항의 방법에 따라 OB 폴리펩타이드의 증가되거나 감소된 수준과 연관된 질병에 대하여 치료학적 치료를 행하는 포유동물 피검자로부터 다양한 시점에서 수득한 일련의 생물학적 샘플내에서 OB 폴리펩타이드의 수준을 평가하는 단계를 포함하여, 포유동물 피검자에게서 OB 폴리펩타이드의 증가되거나 감소된 수준과 연관된 질병의 치료학적 치료를 모니터하는 시험관내 방법.
  60. 제 1 항 내지 15 항중의 어느 하나에 따르거나 제 46 항 내지 49 항 중의 어느 하나에 따르는 방법에 의해서 생성된 OB 폴리펩타이드 및 약제학적으로 허용되는 캐리어를 함유하는, 체중 변조제로 유용한 약제학적 조성물.
  61. 제 60 항에 있어서, 동물의 체중을 감소시키기 위한 약제학적 조성물.
  62. 제 1 항 내지 15 항중의 어느 하나에 따르거나 제 46 항 내지 49 항 중의 어느 하나에 따르는 방법에 의해서 생성된 OB 폴리펩타이드의 길항제 및 약제학적으로 허용되는 캐리어를 함유하는, 동물의 체중 증가용 약제학적 조성물.
  63. 제 62 항에 있어서, 길항제가 OB 폴리펩타이드에 결합하거나 그의 활성을 중화시키는 항체, OB 폴리펩타이드 수용체에 결합하지만 이 수용체를 활성화시키지는 않는 OB 폴리펩타이드의 단편, 및 OB 폴리펩타이드의 소분자 길항제로 구성된 그룹으로부터 선택되는 약제학적 조성물.
  64. 제 1 항 내지 15 항중의 어느 하나에 따르거나 제 46 항 내지 49 항 중의 어느 하나에 따르는 방법에 의해서 생성된 OB 폴리펩타이드 및 허용되는 캐리어를 함유하는, 개체의 체중을 감소시키기 위한 신체 외관 개선용 화장품 조성물.
  65. 제 1 항 내지 15 항중의 어느 하나에 따르거나 제 46 항 내지 49 항 중의 어느 하나에 따르는 방법에 의해서 생성된 OB 폴리펩타이드의 길항제 및 허용되는 캐리어를 함유하는 개체의 체중을 증가시키기 위한, 신체 외관 개선용 화장품 조성물.
  66. 제 65 항에 있어서, 길항제가 OB 폴리펩타이드에 결합하거나 그의 활성을 중화시키는 항체, OB 폴리펩타이드 수용체에 결합하지만 이 수용체를 활성화시키지는 않는 OB 폴리펩타이드의 단편, 및 OB 폴리펩타이드의 소분자 길항제로 구성된 그룹으로부터 선택되는 화장품 조성물.
  67. 제 63 항 내지 66 항중의 어느 하나에 따르는 화장품 조성물을 개체의 체중을 원하는 수준으로 변조시키는데 충분한 투여용량으로 개체에게 투여하여 개체의 신체 외관을 개선시키는 화장방법.
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