JP5658031B2 - 薄膜凍結による安定したサブミクロンのペプチド又はタンパク質粒子の形成 - Google Patents

Description

本発明は、一般に粒子形成の分野、より具体的には、安定したサブミクロンタンパク質粒子の形成に関する。

本発明の範囲を限定することなく、安定したサブミクロンのペプチド及びタンパク質粒子を作製する方法との関連でその背景を説明する。

例えば、米国特許第６，７２３，３４７号明細書は、タンパク質粉末を作製する方法を教示する。該第’３４７号特許では、高レベルで高次元構造を保持する安定したタンパク質粉末を好都合に作製する方法であって、約−３００〜−１０℃／分の冷却速度でタンパク質含有溶液を凍結させるステップと、次いで、これを乾燥させるステップとを含む方法が記載されている。

別の例は、米国特許第６，２８４，２８２号明細書において見出すことができ、この中でMaa et al.は、医薬投与のために、タンパク質を噴霧凍結乾燥させる方法について教示している。Maaによる出願は、肺内送達による投与に適する治療用タンパク質の乾燥粉末製剤の噴霧凍結乾燥調製に関する。

さらに別の例は、「Process for Production of Nanoparticles and Microparticles by Spray Freezing into Liquid」という名称の米国特許第６，８６２，８９０号明細書において見出される。該第’８９０号特許は、溶解可能な材料のマイクロ粒子及びナノ粒子の作製システム及び作製法を提供する。該システム及び方法は、より急速な凍結時間を提供し、これにより、より均一な粒子サイズの分布、より小さな粒子、多孔性のより大きな粒子、及び粒子成分のより緊密な混合がもたらされる。該第’８９０号特許のシステム及び方法はまた、従来の方法及び粒子の調製法よりも大きな表面積を有する粒子も提供する。有効成分は水、１若しくは複数の溶媒、又はこれらの組合せと混合され、結果として得られる混合物は、極低温液体液面又は該液面下方に位置する断熱ノズルにより噴霧される。噴霧により凍結粒子が生成される。

さらに別の例は、「Porous particles for deep lung delivery」という名称の、Edwards et al.による米国特許第６，２５４，８５４号明細書において見出される。該第’８５４号特許は、肺系への薬剤送達のための改良多孔性粒子、並びにそれらの合成及び投与の方法を教示する。該多孔性粒子は、生体分解性材料から作製され、０．４ｇ／ｃｍ^３未満の質量密度を有する。該粒子は、生体分解性ポリマーなどの生体分解性材料から形成することができる。例えば、該粒子は、その中に少なくとも１つのアミノ酸基を組込む線状のαヒドロキシ酸ポリエステル骨格と、該ポリエステル骨格内のアミノ酸基から延びる少なくとも１つのポリ（アミノ酸）側鎖とからなる機能化されたポリエステルグラフトコポリマーから形成することができる。例えば、５μｍを超える、比較的大きな平均粒径を有する多孔性粒子を、肺の肺胞領域への治療作用物質の送達の増強に用いることができる。治療作用物質を組込む多孔性粒子は、気道への投与に効果的なエアゾール化によって、多種多様の治療作用物質の全身送達又は局所送達を可能とすることができる。

最後に米国特許第５，０１９，４００号明細書は、制御放出用マイクロスフェアの極低温成形を教示する。該第’４００号特許では、極低温を用いて、ポリマー−生物学的活性作用物質混合物を、生物学的活性及び材料を極めて高度に保持するポリマーマイクロスフェア内に凍結させてマイクロスフェアを調製する方法が記載されている。ポリマーは、溶媒中で溶解するか、又はマイクロ粒子の形態で溶媒中に分散しうる活性作用物質と共に、該溶媒中に溶解させる。ポリマー／活性作用物質混合物は、ポリマー／活性作用物質溶液の凝固点未満の温度で、液体非溶媒を含有する容器内に単独で噴霧されるか、又は液化気体と共に凍結及び重層される。低温液化気体又は液体は、ポリマー液滴を即時に凍結させる。該液滴及びポリマー用非溶媒が加熱されると、液滴中の溶媒が解凍され、非溶媒中に抽出される結果、硬化したマイクロスフェアが得られる。

タンパク質及びペプチドと共に用いられる場合における上記技法の欠点は、水分除去時にタンパク質及びペプチドが大きな蒸気−液体界面に曝露されるため、粒子サイズが約１μｍよりも小さくなると、タンパク質及びペプチドがしばしば凝集体を形成することである。これらの凝集体は、緩衝液中における再構成時に残存する。したがって、このような技法から生物学的に活性な微粉化タンパク質粉末を得ることはできない。

さらに、多くの場合、これらの方法では、粒子サイズ分布を制御することが困難である。ペプチド及びタンパク質の溶液から水分を除去して、サイズ分布の制御を伴い、タンパク質凝集体の形成を伴わない、微小粒子を作製する方法が必要とされる。

米国特許第６，７２３，３４７号明細書 米国特許第６，２８４，２８２号明細書 米国特許第６，８６２，８９０号明細書 米国特許第６，２５４，８５４号明細書 米国特許第５，０１９，４００号明細書

本発明者らは、安定したサブミクロン粒子、例えば、タンパク質粒子を作製しうる、少量（１ｍＬ未満）又は市販量のタンパク質溶液を凍結させる単純で効率的で頑健な方法の必要を認めた。

より具体的には、本発明は、水溶性の有効成分を１又は複数の溶媒中に溶解させ、体積当たりの面積が５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、さらに又は５００ｃｍ^−１未満の蒸気−液体界面に有効成分が曝露されるように液滴溶媒を噴霧又は滴下し、液滴を、液滴と表面との間に少なくとも３０℃の温度差を有する凍結表面と接触させることにより、ミクロンサイズ又はサブミクロンサイズの粒子を調製する組成物及び方法を含み、該表面が、液滴を、５００マイクロメートル未満の厚さ及び２５〜５００ｃｍ^−１の表面積対体積比を有する薄膜に凍結させる。一態様において、該方法は、凍結した材料から溶媒を除去して粒子を形成するステップをさらに含む。一態様において、液滴は、約５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、５００、１，０００、及び２，０００ミリ秒間の表面との接触により凍結する。別の態様において、液滴は、約５０及び１５０ミリ秒間の表面との接触により凍結する。別の態様において、液滴は、室温で２〜５ｍｍの粒径を有する。別の態様において、液滴は、表面上において厚さ５０〜５００マイクロメートルの薄膜を形成する。別の態様において、液滴は、５０〜２５０Ｋ／秒の冷却速度を有する。別の態様において、溶媒除去後の粒子は、１０、１５、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、又は２００ｍ^２／グラムの表面積を有する。

一実施形態において、有効成分はタンパク質又はペプチドであり、粒子は、粒子表面において、ペプチド又はペプチド又はタンパク質の５０％未満を有する。有効成分又は活性作用物質はタンパク質又はペプチドであり、粒子は、粒子表面において、ペプチド又はペプチド又はタンパク質の２５、１５、１０、又は５％未満を有する。別の態様において、粒子は、粒径がサブミクロンであり、粒径が１ミクロン未満の粒子繊維も含みうる。別の態様において、有効成分は、界面活性ペプチド又はペプチド又はタンパク質、ＤＮアーゼ、及びα−１−アンチトリプシン、インターロイキン、プロテアーゼ阻害剤、インターロイキン受容体、モノクローナル抗体、ムラミルジペプチド、カタラーゼ、ホスファターゼ、キナーゼ、受容体アンタゴニスト、受容体アゴニスト、ジスムターゼ、カルシトニン、ホルモン、インターフェロン、インスリン、成長因子、エリスロポエチン、ヘパリン、バソプレッシン、ペプチド、硫酸アルブテロール、硫酸テルブタリン；インスリン、グルカゴン様ペプチド、Ｃ−ペプチド、エリスロポエチン、カルシトニン、ヒト成長ホルモン、黄体化ホルモン、プロラクチン、副腎皮質刺激ホルモン、ロイプロリド、インターフェロンα−２ｂ、インターフェロンベータ−１ａ、サルグラモスチム、アルデスロイキン、インターフェロンα−２ａ、インターフェロンアルファ、ｎ３ α−ペプチド、又はプロテイナーゼ阻害剤；エチドロネート、ナファレリン、絨毛性ゴナドトロピン、プロスタグラジンＥ２、エポプロステノール、アカルボース、メトフォルミン、又はデスモプレッシン、シクロデキストリン、抗生剤；並びに薬理学的に許容される有機塩及び無機塩又はこれらの金属錯体を含む。

一実施形態において、表面は、極低温固体、極低温気体、極低温液体、又は極低温度若しくは溶媒の凝固点未満の温度に達する能力がある熱伝導流体により冷却される。別の態様において、溶媒は、糖、リン脂質、界面活性剤、ポリマー界面活性剤、小胞、コポリマー、ホモポリマー及び生体ポリマーを含むポリマー、分散補助剤、並びに血清アルブミンから選択される１又は複数の賦形剤をさらに含む。別の態様において、有効成分は酵素を含み、酵素の酵素活性は９０％を超える。別の態様において、有効成分はペプチド又はタンパク質を含み、ペプチド又はタンパク質の凝集が３％未満である。別の態様では、液滴と表面との間の温度差が、少なくとも５０℃である。

本発明はまた、水溶性の有効成分又は活性作用物質を１又は複数の溶媒中に溶解させ、体積当たりの面積が５０ｃｍ^−１未満の蒸気−液体界面に有効成分が曝露されるように液滴を噴霧又は滴下し、液滴を、液滴と表面との間に少なくとも３０℃の温度差を有する凍結表面と接触させることによってミクロンサイズ又はサブミクロンサイズの粒子を調製することにより調製される薬剤粒子を含む医薬製剤も含み、該表面が、液滴を、５００マイクロメートル未満の厚さ及び２５〜５００ｃｍ^−１の表面積対体積比を有する薄膜に凍結させる。

本発明の別の実施形態は、ミクロンサイズ又はサブミクロンサイズの溶媒粒子を調製する方法であって、溶媒中の水溶性ペプチド又はタンパク質の液滴を噴霧又は滴下するステップであって、液滴が体積当たりの面積が５０ｃｍ^−１未満の蒸気−液体界面に曝露されるステップと、液滴を、液滴と表面との間に少なくとも３０℃の温度差を有する凍結表面と接触させるステップであって、液滴が５００マイクロメートル未満の厚さ及び２５〜５００ｃｍ^−１の表面積対体積比を有する薄膜に凍結するステップとを含む方法を含む。該方法は、凍結した材料から溶媒を除去して粒子を形成するステップをさらに含みうる。別の態様において、例えば、溶媒は、糖、リン脂質、界面活性剤、ポリマー界面活性剤、小胞、コポリマー、ホモポリマー及び生体ポリマーを含むポリマー、分散補助剤、並びに血清アルブミンから選択される少なくとも１又は複数の賦形剤又は安定化剤をさらに含む。別の態様において、ペプチド又はタンパク質は酵素を含み、酵素の酵素活性は９０％を超える。別の態様では、ペプチド又はタンパク質の凝集が３％未満である。別の態様では、液滴と表面との間の温度差が、少なくとも５０℃である。別の態様において、粒子は、粒子表面において、ペプチド又はタンパク質の５０％未満を有する。別の態様において、粒子は、粒子表面において、ペプチド又はタンパク質の２５、１５、１０、又は５％未満を有する。別の態様において、ペプチド又はタンパク質は、界面活性ペプチド又はタンパク質、ＤＮアーゼ、及びα−１−アンチトリプシン、インターロイキン、インターフェロン、プロテアーゼ阻害剤、インターロイキン受容体、モノクローナル抗体、ムラミルジペプチド、カタラーゼ、ホスファターゼ、キナーゼ、受容体アンタゴニスト、受容体アゴニスト、ジスムターゼ、カルシトニン、ホルモン、インスリン、成長因子、エリスロポエチン、ヘパリン、バソプレッシン、ペプチド、グルカゴン様ペプチド、Ｃ−ペプチド、エリスロポエチン、ヒト成長ホルモン、黄体化ホルモン、プロラクチン、副腎皮質刺激ホルモン、ロイプロリド、インターフェロン、インターフェロンα−２ｂ、インターフェロンベータ−１ａ、サルグラモスチム、アルデスロイキン、インターフェロンα−２ａ、インターフェロンアルファ、ｎ３ α−ペプチド、又はプロテイナーゼ阻害剤；並びに薬理学的に許容される有機塩及び無機塩又はこれらの金属錯体を含む。

一実施形態において、本発明は、溶媒中の水溶性ペプチド又はタンパク質の液滴を噴霧又は滴下するステップであって、液滴が体積当たりの面積が５０ｃｍ^−１未満の蒸気−液体界面に曝露されるステップと、液滴を、液滴と表面との間に少なくとも３０℃の温度差を有する凍結表面と接触させるステップであって、液滴が５００マイクロメートル未満の厚さ及び２５〜５００ｃｍ^−１の表面積対体積比を有する薄膜に凍結するステップとを含む、ミクロンサイズ又はサブミクロンサイズの溶媒粒子の調製により調製される薬剤粒子を含む製剤、例えば、医薬製剤又は活性作用物質を含む。

さらに別の実施形態は、溶液中に水溶性の有効成分を含むエマルジョンを調製し、体積当たりの面積が５０ｃｍ^−１未満の蒸気−液体界面に有効成分が曝露されるように溶液の液滴を噴霧又は滴下し、液滴を、液滴と表面との間に少なくとも３０℃の温度差を有する凍結表面と接触させることにより、ミクロンサイズ又はサブミクロンサイズの粒子を調製する組成物及び方法を含み、該表面が、液滴を、５００マイクロメートル未満の厚さ及び２５〜５００ｃｍ^−１の表面積対体積比を有する薄膜に凍結させる。

さらに別の実施形態は、１又は複数の溶媒からなる溶媒供給源と、二酸化炭素、窒素、エタン、プロパン、ヘリウム、アルゴン、又はイソペンタンからなる群から選択される極低温液体から選択される極低温液体を含有する容器と、未端部及び先端部を有する断熱ノズルであって、ノズルの未端部が溶媒供給源に接続され、先端部が極低温液面の上方、その液面、又はその下方に配置される断熱ノズルとを含む、ナノ又はマイクロの溶媒粒子を調製するシステムを含む。一態様において、溶液供給源は、水、少なくとも１つの有機溶媒、又はこれらの組合せをさらに含む。一態様において、有機溶媒は、エタノール、メタノール、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、アセトン、ｔｅｒｔ−ブチルアルコール、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジエチルエーテル、塩化メチレン、酢酸エチル、酢酸イソプロピル、酢酸ブチル、酢酸プロピル、トルエン、ヘキサン、ヘプタン、ペンタン、及びこれらの組合せからなる群から選択される。

別の実施形態では、極低温液面の上方、その液面、又はその下方に位置する断熱ノズルにより溶媒を噴霧するステップを含む噴霧凍結方法であって、噴霧により急速に、１０ｎｍ〜１０ミクロンのサイズ範囲を有する凍結溶媒粒子が生成される方法。一態様において、作製される溶媒粒子は、１０ミクロン未満の粒子サイズを有する。別の態様において、溶媒粒子は５０ｍ^２／ｇを超える表面積を有する。一態様において、極低温物質は、液体、気体、固体、又は表面である。別の態様において、１又は複数の溶媒は第２の溶媒よりも揮発性の低い第１の溶媒を含み、より揮発性の高い溶媒は除去されるが、第２の溶媒は除去されない。さらに別の態様において、１又は複数の溶媒は第２の溶媒よりも揮発性の低い第１の溶媒を含み、より揮発性の高い溶媒は、蒸発、凍結乾燥、真空、熱、又は化学反応により除去される。

本発明のさらに別の実施形態は、溶媒との間に少なくとも３０℃の温度差を有するバイアルの温度を低下させ、体積当たりの面積が５００ｃｍ^−１未満の蒸気−液体界面に有効成分が曝露されるように、１又は複数の溶媒中に溶解させた水溶性有効成分の溶媒液滴をバイアル内へと直接に噴霧又は滴下することにより、ミクロンサイズ又はサブミクロンサイズの粒子を調製する、単一ステップ、単一バイアルの方法を含み、該表面が、液滴を、５００マイクロメートル未満の厚さ及び２５〜５００ｃｍ^−１の表面積対体積比を有する薄膜に凍結させる。液滴は、約５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、５００、１，０００、及び２，０００ミリ秒間の表面との接触により凍結することもあり、約５０、１５０〜５００ミリ秒間の表面との接触により凍結することもある。一例において、液滴は、室温で０．１〜５ｍｍの粒径を有するか、さらに又は室温で２〜４ｍｍの粒径を有する。別の例において、液滴は、厚さ５０〜５００マイクロメートルの表面上において薄膜を形成する。特定の一例において、液滴は、５０〜２５０Ｋ／秒の冷却速度を有する。バイアルは、極低温固体、極低温気体、極低温液体、凍結流体、凍結気体、凍結固体、熱交換器、又は極低温度若しくは溶媒の凝固点未満の温度に達する能力がある熱伝導流体により冷却することができる。バイアルはさらに、噴霧又は液滴を送達しながら回転させることで、１又は複数の最終粒子層の層状化を可能とすることができる。一例において、バイアル、水溶性の有効成分、及び１又は複数の溶媒は、噴霧又は滴下前にあらかじめ滅菌処理される。該方法はまた、１又は複数の薄膜が互いに重なり合い、満杯までの任意の所望のレベルにまでバイアルを充填するまで反復される噴霧又は滴下するステップを含んでいてもよい。

本発明の特徴及び利点をより完全に理解するため、ここで添付の図と共に、本発明の詳細な説明を参照する。

図１Ａは、落下液滴を示す、薄膜凍結工程のダイアグラムである。図１Ｂは、ステンレス鋼製表面上における衝突後に拡散する落下液滴のダイアグラムである。図１Ｃは、薄膜としての冷却及び凍結時における液滴のダイアグラムである。 図２Ａ及び２Ｂはそれぞれ、２２３Ｋ及び１３３Ｋのステンレス鋼製表面上における水性液滴の衝突及び凍結の赤外線（ＩＲ：infrared）写真である。 ２２３Ｋのステンレス鋼製表面上における水性薄膜についての、ＩＲ強度対時間のプロットを示す図である。 薄膜凍結により形成される粒子のレーザー光散乱法のプロットを示す図である。 図５Ａ及び５Ｂはそれぞれ、２２３Ｋ及び１３３Ｋの表面温度における薄膜凍結法により処理された５ｍｇ／ｍＬのリゾチーム溶液に由来する粒子の走査電子顕微鏡（ＳＥＭ：scanning electron micrograph）画像である。図５Ｃは、液体窒素による液体内噴霧凍結を用いる５ｍｇ／ｍＬのリゾチーム溶液に由来する粒子の走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像である。 図６Ａ〜６Ｃはそれぞれ、薄膜凍結、液体窒素内噴霧凍結、及び液体窒素内噴霧凍結乾燥−１０μｍにより処理された５０ｍｇ／ｍＬのリゾチーム溶液に由来する粒子のＳＥＭ画像である。 図７Ａは、２２０μｍの薄膜について、２２３Ｋの表面上で冷却された水性薄膜の温度対深度プロファイルのグラフである。図７Ｂは、３２０μｍの薄膜について、１３３Ｋの表面上で冷却された水性薄膜の温度対深度プロファイルのグラフである。 図８Ａは、薄膜凍結工程、液体内噴霧凍結工程、及び噴霧凍結乾燥工程における高度の超冷却による氷状凍結水領域間の未凍結チャネル内におけるタンパク質粒子の核生成及び成長の写真である。図８Ｂは、シェルフ凍結乾燥における低度の超冷却による氷状凍結水領域間の未凍結チャネル内におけるタンパク質粒子の核生成及び成長の写真である。 凍結乾燥、薄膜凍結（ＴＦＦ：thin film freezing）、液体内噴霧凍結（ＳＦＬ：spray freezing into liquids）、及び噴霧凍結乾燥（ＳＦＤ：spray freeze-drying）についての、凍結時間対気液界面に対する曝露のグラフである。 図１０Ａは、乾燥したリゾチーム薄膜中心部における上部ＳＥＭ画像である。図１０Ｂは、乾燥したリゾチーム薄膜端縁部から約１０μｍにおける上部ＳＥＭ画像である。 Malvern Mastersizerによる超音波処理の１０分後において測定された、元濃度における各量のエタノールを伴うリゾチームの薄膜凍結を示すグラフである。 ＴＦＦにより凍結され、次いで、凍結乾燥された、リゾチームの各初期可溶化高濃度を示すグラフである。 図１３Ａ及び１３Ｂは、ドラム上で調製されたＴＦＦリゾチーム（図１３Ｃ〜１３Ｄ）（ＴＦＦドラム上で調製されたＴＦＦリゾチーム：フィード＝５ｍｇ／ｍＬ）に対するガラス製バイアル内で調製されたＴＦＦリゾチーム（ガラス製バイアル内で直接に調製されたＴＦＦリゾチーム：フィード＝５ｍｇ／ｍＬ）の形態を示す図である。 非経口送達に適する溶媒中で再懸濁されたＴＦＦ粒子の懸濁液を示す図である。

以下では、本発明の各種の実施形態の実施及び使用が詳細に論じられるが、本発明では、多種多様の特定の文脈において実施されうる多くの適用可能な発明概念が提供されることを理解されたい。本明細書で論じられる特定の実施形態は、本発明を実施及び使用する特定の方式を例示するに過ぎず、本発明の範囲を限定するものではない。

以下では、本発明の理解を容易とするため、多数の用語が定義される。本明細書で定義される用語は、本発明に関連する領域における当業者により一般的に理解される意味を有する。「１つの（a）」、「１つの（an）」、及び「その（the）」などの用語は、単一の実体のみを指すことを意図するものではなく、その特定の例が例示に用いられうる一般的なクラスを含む。本明細書における用語法は、本発明の特定の実施形態を説明するのに用いられるが、その使用は、特許請求の範囲において概括される場合を例外として、本発明を限定するものではない。

高表面積の安定したサブミクロンサイズ及びミクロンサイズのタンパク質粒子を作製することができれば、経口送達、デポ剤送達、肺内送達、及び経皮送達による適用に新たな機会がもたらされるであろう（Y.-F. Maa and H. R. Costantino. Spray freeze-drying of biopharmaceuticals: applications and stability considerations. in: H. R. Costantino and M. J. Pikal (Eds), Biotechnology: Pharmaceutical Aspects. 2. Lyophilization of Biopharmaceuticals, Vol. (H. R. Costantino and M. J. Pikal, eds), American Association of Pharmaceutical Scientists, Arlington, 2004, pp. 519-561、Y.-F. Maa, L. Zhao, L. G. Payne, and D. Chen. Stabilization of alum-adjuvanted vaccine dry powder formulations: mechanism and application. Journal of Pharmaceutical Sciences 92:319-332 (2003)、X. M. Lam, E. T. Duenas, A. L. Daugherty, N. Levin, and J. L. Cleland. Sustained release of recombinant human insulin-like growth factor-I for treatment of diabetes. Journal of Controlled Release 67:281-292 (2000)、W. T. Leach, D. T. Simpson, T. N. Val, E. C. Anuta, Z. Yu, R. O. Williams III, and K. P. Johnston. Uniform encapsulation of stable protein nanoparticles produced by spray freezing for the reduction of burst release. Journal of Pharmaceutical Sciences 94:56-69 (2005)、O. L. Johnson, W. Jaworowicz, J. L. Cleland, L. Bailey, M. Charnis, E. Duenas, C. Wu, D. Shepard, S. Magil, T. Last, A. J. S. Jones, and S. D. Putney. The stabilization and encapsulation of human growth hormone into biodegradable microspheres. Pharmaceutical Research 14:730-735 (1997)、X. M. Lam, E. T. Duenas, and J. L. Cleland. Encapsulation and stabilization of nerve growth factor into poly(lactic-co-glycolic) acid microspheres. Journal of Pharmaceutical Sciences 90:1356-1365 (2001)、M. R. Prausnitz. Microneedles for transdermal drug delivery. Advanced Drug Delivery Reviews 56:581-587 (2004)、D. A. Edwards, J. Hanes, G. Caponetti, J. Hrkach, A. Ben-Jebria, M. L. Eskew, J. Mintzes, D. Deaver, N. Lotan, and R. Langer. Large porous particles for pulmonary drug delivery. Science 276:1868-1871 (1997)、S. J. Shire, Z. Shahrokh, and J. Liu. Challenges in the development of high protein concentration formulations. Journal of Pharmaceutical Sciences 93:1390-1402 (2004)）。肺内送達では、１〜３μｍの空気動力学的粒径を有する高表面積の多孔性粒子の方が、同等の空気動力学的粒径を有する稠密な粒子と比較して、肺深部により効果的に堆積されうる（Y.-F. Maa and H. R. Costantino. Spray freeze-drying of biopharmaceuticals: applications and stability considerations. in: H. R. Costantino and M. J. Pikal (Eds), Biotechnology: Pharmaceutical Aspects. 2. Lyophilization of Biopharmaceuticals, Vol. (H. R. Costantino and M. J. Pikal, eds), American Association of Pharmaceutical Scientists, Arlington, 2004, pp. 519-561、D. A. Edwards, J. Hanes, G. Caponetti, J. Hrkach, A. Ben-Jebria, M. L. Eskew, J. Mintzes, D. Deaver, N. Lotan, and R. Langer. Large porous particles for pulmonary drug delivery. Science 276:1868-1871 (1997)）。デポ剤送達では、３００〜５００ｎｍのサブミクロンタンパク質粒子が、粒径１０〜５０μｍのマイクロスフェア内に均一に封入され、バースト放出を最小化させながら、高度なタンパク質ローディングを達成している（W. T. Leach, D. T. Simpson, T. N. Val, E. C. Anuta, Z. Yu, R. O. Williams III, and K. P. Johnston. Uniform encapsulation of stable protein nanoparticles produced by spray freezing for the reduction of burst release. Journal of Pharmaceutical Sciences 94:56-69 (2005)、X. M. Lam, E. T. Duenas, and J. L. Cleland. Encapsulation and stabilization of nerve growth factor into poly(lactic-co-glycolic) acid microspheres. Journal of Pharmaceutical Sciences 90:1356-1365 (2001)、J. L. Cleland, E. T. Duenas, A. Park, A. Daugherty, J. Kahn, J. Kowalski, and A. Cuthbertson. Development of poly-(d,l-lactide-co-glycolide) microsphere formulations containing recombinant human vascular endothelial growth factor to promote local angiogenesis. Journal of Controlled Release 72:13-24 (2001)、X. C. Nguyen, J. D. Herberger, and P. A. Burke. Protein powders for encapsulation: a comparison of spray-freeze drying and spray drying of darbepoetin alfa. Pharmaceutical Research 21:507-514 (2004)）。

糖を含む極低温保護剤により安定化された固体のタンパク質粒子は、溶液中のタンパク質と比べ、保管時において不安定化しにくいことが多い（Y.-F. Maa and H. R. Costantino. Spray freeze-drying of biopharmaceuticals: applications and stability considerations. in: H. R. Costantino and M. J. Pikal (Eds), Biotechnology: Pharmaceutical Aspects. 2. Lyophilization of Biopharmaceuticals, Vol. (H. R. Costantino and M. J. Pikal, eds), American Association of Pharmaceutical Scientists, Arlington, 2004, pp. 519-561、S. L. Lee, A. E. Hafeman, P. G. Debenedetti, B. A. Pethica, and D. J. Moore. Solid-State Stabilization of a-Chymotrypsin and Catalase with Carbohydrates. Industrial & Engineering Chemistry Research 45:5134-5147 (2006)、J. F. Carpenter, B. S. Chang, W. Garzon-Rodriguez, and T. W. Randolph. Rational design of stable lyophilized protein formulations: theory and practice. in: F. Carpenter John and C. Manning Mark (Eds), Pharmaceutical Biotechnology. 13. Rational Design of Stable Protein Formulations, Vol. 13 (F. Carpenter John and C. Manning Mark, eds), Kluwer Academic/Plenum Press, New York, 2002, pp. 109-133、M. C. Manning, K. Patel, and R. T. Borchardt. Stability of protein pharmaceuticals. Pharmaceutical Research 6:903-918 (1989)、W. Wang. Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals. International Journal of Pharmaceutics 203:1-60 (2000)、R. A. DePaz, D. A. Dale, C. C. Barnett, J. F. Carpenter, A. L. Gaertner, and T. W. Randolph. Effects of drying methods and additives on the structure, function, and storage stability of subtilisin: role of protein conformation and molecular mobility. Enzyme and Microbial Technology 31:765-774 (2002)、M. J. Pikal. Mechanisms of protein stabilization during freeze-drying and storage: the relative importance of thermodynamic stabilization and glassy state relaxation dynamics. Drugs and the Pharmaceutical Sciences 137:63-107 (2004)）。しかし、水分の除去によりタンパク質分子は大きな界面領域に曝露されるので、１０ｍ^２／ｇを超える表面積を有する安定したサブミクロンタンパク質粒子の形成（W. T. Leach, D. T. Simpson, T. N. Val, E. C. Anuta, Z. Yu, R. O. Williams III, and K. P. Johnston. Uniform encapsulation of stable protein nanoparticles produced by spray freezing for the reduction of burst release. Journal of Pharmaceutical Sciences 94:56-69 (2005)、H. R. Costantino, L. Firouzabadian, K. Hogeland, C. C. Wu, C. Beganski, K. G. Carrasquillo, M. Cordova, K. Griebenow, S. E. Zale, and M. A. Tracy. Protein spray-freeze drying. Effect of atomization conditions on particle size and stability. Pharmaceutical Research 17:1374-1383 (2000)、S. D. Webb, S. L. Golledge, J. L. Cleland, J. F. Carpenter, and T. W. Randolph. Surface adsorption of recombinant human interferon-g in lyophilized and spray-lyophilized formulations. Journal of Pharmaceutical Sciences 91:1474-1487 (2002)）は極めて困難である。気液界面及び氷−液体界面におけるタンパク質の吸着は、結果として折りたたみの解除及び凝集をもたらすことが多い（Y.-F. Maa and H. R. Costantino. Spray freeze-drying of biopharmaceuticals: applications and stability considerations. in: H. R. Costantino and M. J. Pikal (Eds), Biotechnology: Pharmaceutical Aspects. 2. Lyophilization of Biopharmaceuticals, Vol. (H. R. Costantino and M. J. Pikal, eds), American Association of Pharmaceutical Scientists, Arlington, 2004, pp. 519-561、H. R. Costantino, L. Firouzabadian, K. Hogeland, C. C. Wu, C. Beganski, K. G. Carrasquillo, M. Cordova, K. Griebenow, S. E. Zale, and M. A. Tracy. Protein spray-freeze drying. Effect of atomization conditions on particle size and stability. Pharmaceutical Research 17:1374-1383 (2000)、S. D. Webb, S. L. Golledge, J. L. Cleland, J. F. Carpenter, and T. W. Randolph. Surface adsorption of recombinant human interferon-g in lyophilized and spray-lyophilized formulations. Journal of Pharmaceutical Sciences 91:1474-1487 (2002)、B. S. Chang, B. S. Kendrick, and J. F. Carpenter. Surface-induced denaturation of proteins during freezing and its inhibition by surfactants. Journal of pharmaceutical sciences 85:1325-1330 (1996)、Y.-F. Maa and S. J. Prestrelski. Biopharmaceutical powders: particle formation and formulation considerations. Current Pharmaceutical Biotechnology 1:283-302 (2000)、M. Adler and G. Lee. Stability and surface activity of lactate dehydrogenase in spray-dried trehalose. Journal of Pharmaceutical Sciences 88:199-208 (1999)）。安定したタンパク質粒子を作製する最も一般的な工程である凍結乾燥法では、緩徐な冷却（約１Ｋ／分）時における粒子の成長により、粒子の粒径は最小で数ミクロンに制限され、表面積は１ｍ^２／ｇ未満である（Y.-F. Maa and S. J. Prestrelski. Biopharmaceutical powders: particle formation and formulation considerations. Current Pharmaceutical Biotechnology 1:283-302 (2000)）。液体窒素中への小アリコート（約２０〜５０μＬ）のタンパク質溶液の滴下による凍結（J. Deng, D. R. Davies, G. Wisedchaisri, M. Wu, W. G. J. Hol, and C. Mehlin. An improved protocol for rapid freezing of protein samples for long-term storage. Acta Crystallographica, Section D: Biological Crystallography D60:203-204 (2004)）、冷却されたシェルフ上における厚い（５００μｍを超える）膜の凍結（Y. Yamagata, T. Doen, N. Asakawa, and S. Takada, Process for producing protein powder 6723347, (2004)）、及びタンパク質溶液で満たした超薄壁ＰＣＲ管の液体窒素中への挿入による凍結（J. Deng, D. R. Davies, G. Wisedchaisri, M. Wu, W. G. J. Hol, and C. Mehlin. An improved protocol for rapid freezing of protein samples for long-term storage. Acta Crystallographica, Section D: Biological Crystallography D60:203-204 (2004)）時においても、同じ制限が該当する。これらの技法において、タンパク質溶液は、１〜１０Ｋ／秒の速度で冷却される（J. Deng, D. R. Davies, G. Wisedchaisri, M. Wu, W. G. J. Hol, and C. Mehlin. An improved protocol for rapid freezing of protein samples for long-term storage. Acta Crystallographica, Section D: Biological Crystallography D60:203-204 (2004)、Y. Yamagata, T. Doen, N. Asakawa, and S. Takada, Process for producing protein powder 6723347, (2004)）。乾燥した粒子を製粉してサブミクロン粒子を形成することは可能であるが、収量は制限され、サイズ分布は広範であることが多く、機械的応力により変性が生じることがある（Y.-F. Maa and H. R. Costantino. Spray freeze-drying of biopharmaceuticals: applications and stability considerations. in: H. R. Costantino and M. J. Pikal (Eds), Biotechnology: Pharmaceutical Aspects. 2. Lyophilization of Biopharmaceuticals, Vol. (H. R. Costantino and M. J. Pikal, eds), American Association of Pharmaceutical Scientists, Arlington, 2004, pp. 519-561、Y.-F. Maa and S. J. Prestrelski. Biopharmaceutical powders: particle formation and formulation considerations. Current Pharmaceutical Biotechnology 1:283-302 (2000)）。サブミクロンのタンパク質粒子は、噴霧乾燥（X. C. Nguyen, J. D. Herberger, and P. A. Burke. Protein powders for encapsulation: a comparison of spray-freeze drying and spray drying of darbepoetin alfa. Pharmaceutical Research 21:507-514 (2004)、Y.-F. Maa and S. J. Prestrelski. Biopharmaceutical powders: particle formation and formulation considerations. Current Pharmaceutical Biotechnology 1:283-302 (2000)、M. Adler and G. Lee. Stability and surface activity of lactate dehydrogenase in spray-dried trehalose. Journal of Pharmaceutical Sciences 88:199-208 (1999)、Y.-F. Maa, P.-A. Nguyen, T. Sweeney, S. J. Shire, and C. C. Hsu. Protein inhalation powders: spray drying vs spray freeze drying. Pharmaceutical Research 16:249-254 (1999)）、超臨界ＣＯ_２支援エアゾール化及びバブル乾燥（ｓｃＣＯ_２Ａ−ＢＤ：supercritical CO₂-assisted aerosolization and bubble drying）（S. P. Sellers, G. S. Clark, R. E. Sievers, and J. F. Carpenter. Dry powders of stable protein formulations from aqueous solutions prepared using supercritical CO(2)-assisted aerosolization. Journal of pharmaceutical sciences 90:785-797 (2001)）、噴霧凍結乾燥（ＳＦＤ）（Y.-F. Maa and H. R. Costantino. Spray freeze-drying of biopharmaceuticals: applications and stability considerations. in: H. R. Costantino and M. J. Pikal (Eds), Biotechnology: Pharmaceutical Aspects. 2. Lyophilization of Biopharmaceuticals, Vol. (H. R. Costantino and M. J. Pikal, eds), American Association of Pharmaceutical Scientists, Arlington, 2004, pp. 519-561、H. R. Costantino, L. Firouzabadian, K. Hogeland, C. C. Wu, C. Beganski, K. G. Carrasquillo, M. Cordova, K. Griebenow, S. E. Zale, and M. A. Tracy. Protein spray-freeze drying. Effect of atomization conditions on particle size and stability. Pharmaceutical Research 17:1374-1383 (2000)、S. D. Webb, S. L. Golledge, J. L. Cleland, J. F. Carpenter, and T. W. Randolph. Surface adsorption of recombinant human interferon-g in lyophilized and spray-lyophilized formulations. Journal of Pharmaceutical Sciences 91:1474-1487 (2002)、Y.-F. Maa and S. J. Prestrelski. Biopharmaceutical powders: particle formation and formulation considerations. Current Pharmaceutical Biotechnology 1:283-302 (2000)）、及び液体内噴霧凍結（ＳＦＬ）を含む各種の工程により水溶液から沈殿させることができる。

本明細書で用いられる「バイオアベイラビリティー」とは、薬剤が体内に投与された後に標的組織に到達可能となる程度を意味する用語である。低バイオアベイラビリティーは、薬剤組成物、特に、水中で高度に可溶性ではない有効成分を含有する薬剤組成物の開発において遭遇する重要な問題である。一部の実施形態において、タンパク質は、水溶性の場合もあり、低度に可溶性の場合もあり、高度に可溶性ではない場合もあり、不溶性の場合もある。当業者は、各種の方法、例えば、異なる溶媒、賦形剤、担体の使用、融合タンパク質の形成、アミノ酸配列の標的化した操作、グリコシル化、脂質化、分解、１又は複数の塩との組合せ、及び各種の塩の添加を用いてタンパク質の可溶性を増大させうることを認めるであろう。

本明細書で用いられる「有効成分」という用語は、純粋形態であれ、部分的な精製形態（例えば、抽出物）であれ、標的に対する既知の効果を有するある化合物又は複数種の化合物を指す。例えば、医薬作用物質は、それらの既知の標的に対する有効成分である、例えば、ペニシリンは、感受性の細菌に対して有効な成分又は作用物質である。有効成分の別の例は、既知の昆虫標的を有する殺虫剤である。本発明を用いて、本明細書の以下において具体的に説明されるその送達を増強する形で、標的に対する有効成分を製造し送達することができる。

本明細書で用いられる「薬学的に許容される担体」は、任意でありすべての溶媒、分散媒、被覆、抗菌剤及び抗真菌剤、等張性の吸収遅延剤を含む。医薬活性物質へのこのような媒体及び作用物質の使用は、当技術分野でよく知られている。従来の媒体又は作用物質が有効成分に適合しない場合を除き、治療用組成物におけるその使用が意図される。補充有効成分もまた、該組成物中に組込むことができる。

一部の実施形態において、医薬組成物は、例えば、少なくとも約０．１％の活性化合物を含みうる。他の実施形態において、有効化合物は、単位重量の約２％〜約７５％、又は、例えば、約２５％〜６０％、及びその中で導かれる任意の範囲を含みうる。他の非限定的な例において、用量はまた、投与当たりにおいて体重ｋｇ当たり約１マイクログラム、体重ｋｇ当たり約５マイクログラム、体重ｋｇ当たり約１０マイクログラム、体重ｋｇ当たり約５０マイクログラム、体重ｋｇ当たり約１００マイクログラム、体重ｋｇ当たり約２００マイクログラム、体重ｋｇ当たり約３５０マイクログラム、体重ｋｇ当たり約５００マイクログラム、体重ｋｇ当たり約１ミリグラム、体重ｋｇ当たり約５ミリグラム、体重ｋｇ当たり約１０ミリグラム、体重ｋｇ当たり約５０ミリグラム、体重ｋｇ当たり約１００ミリグラム、体重ｋｇ当たり約２００ミリグラム、体重ｋｇ当たり約３５０ミリグラム、体重ｋｇ当たり約５００ミリグラム〜体重ｋｇ当たり約１０００ｍｇ以上、及びその中で導かれる任意の範囲も含みうる。本明細書で列挙される数値から導かれる範囲の非限定的な例では、上記の数値に基づき、体重ｋｇ当たり約５ｍｇ〜体重ｋｇ当たり約１００ｍｇ、体重ｋｇ当たり約５マイクログラム〜体重ｋｇ当たり約５００ミリグラムなどの範囲を投与することができる。

粒子形成法は、機械的微粉化工程又は溶液ベースの相分離工程として分類することができる。機械的微粉化法は、米国特許第５，１４５，６８４号明細書において引用される製粉法などの製粉法を含む。しかし、これらの製粉工程中に生じる摩擦により、医薬有効成分の熱的又は機械的分解が生じることがある。薬剤物質を微粉化するのに用いられる別の一般的な方法である噴霧乾燥では、噴霧後に薬剤から溶媒を除去するのに、およそ１５０℃の非常な高温が必要とされる。高温により、有効成分の分解が加速化されることがある。

有効成分の非限定的な例は、医薬物質、医薬作用物質、ペプチド、核酸、タンパク質、抗生剤、遺伝子治療用作用物質、触媒、吸着材、色素、被覆、パーソナルケア製品、研磨剤、センサー用粒子、金属、合金、セラミックス、膜材料、栄養物質、抗癌剤のほか、肥料、殺虫剤、及び除草剤など、農業で用いられる化学物質である。この列挙は悉皆的ではなく、例示のみを目的とするものであることが理解される。１化合物が複数クラスの有効成分、例えば、ペプチド及び医薬物質に含まれることがさらに理解される。

医薬作用物質である有効成分の例は、抗生剤、鎮痛剤、抗痙攣剤；抗糖尿病剤、抗真菌剤、抗新生物剤、抗パーキンソン病剤、抗リウマチ剤、食欲抑制剤、生物学的応答調節剤、心血管治療剤、中枢神経系刺激剤、避妊剤、診断剤、ドーパミン受容体アゴニスト、勃起障害治療剤、不妊治療剤、消化器治療剤、ホルモン、免疫調節剤、抗高カルシウム血症治療剤、肥満細胞安定化剤、筋弛緩剤、栄養剤、眼治療剤、骨粗鬆症治療剤、向精神剤、副交感神経作用剤、副交感神経遮断剤、呼吸器治療剤、鎮静催眠剤、皮膚粘膜治療剤、禁煙誘導剤、ステロイド剤、交感神経遮断剤、尿道治療剤、子宮弛緩剤、膣治療剤、血管拡張剤、降圧剤、甲状腺機能亢進症治療剤、抗甲状腺剤、抗喘息剤、及びめまい治療剤を含むがこれらに限定されない。有効成分のさらなる例は、心血管治療薬、呼吸器治療薬、交感神経作用薬、コリン作用薬、アドレナリン又はアドレナリン作動性ニューロン遮断薬、抗鬱剤、降圧剤、抗炎症剤、抗不安剤、免疫抑制剤、抗片頭痛剤、鎮静剤／催眠剤、抗狭心症剤、抗精神病剤、抗躁剤、抗不整脈剤、抗関節炎剤、抗痛風剤、抗凝血剤、血栓溶解剤、抗線溶剤、血液レオロジー剤、抗血小板剤、抗痙攣剤、抗ヒスタミン剤／抗湿疹剤、カルシウム調節に有用な作用物質、抗ウイルス剤、抗感染症剤、気管支拡張剤、ホルモン、低血糖症治療剤、低脂血症治療剤、タンパク質、核酸、赤血球生成刺激に有用な作用物質、抗潰瘍剤／逆流防止剤、抗悪心剤／制吐剤、脂溶性ビタミン、ミトタン、ビサジン、ハロニトロソ尿素、アントロサイクリン、又はエリプチシンを含む。

医薬有効成分は、錠剤、カプセル、又は懸濁液としての経口送達；肺内及び鼻腔内送達；エマルジョン、軟膏、又はクリームとしての局所送達；及び懸濁液、マイクロエマルジョン、又はデポ剤としての非経口送達を含む各種の適用モダリティーで用いることができる。結果として得られる粉末は、生理食塩液、緩衝生理食塩液、水、緩衝水性媒体、アミノ酸溶液、ビタミン溶液、炭水化物溶液などのほか、これらの任意の２種以上の組合せなど、適切な水性媒体中に任意の好都合な時点で再分散させて、哺乳類に投与しうる懸濁液を得ることができる。

溶液中で用いられる溶解作用物質は、水、１又は複数の有機溶媒などの水性作用物質、又はこれらの組合せでありうる。用いられる場合、有機溶媒は、水溶性でも非水溶性でもありうる。適切な有機溶媒は、エタノール、メタノール、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、アセトン、ｔｅｒｔ−ブチルアルコール、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジエチルエーテル、塩化メチレン、酢酸エチル、酢酸イソプロピル、酢酸ブチル、酢酸プロピル、トルエン、ヘキサン、ヘプタン、ペンタン、及びこれらの組合せを含むがこれらに限定されない。

それら独自のある活性を潜在的に有しつつも本発明で用いうる賦形剤及びアジュバント、例えば、抗酸化剤は、一般に、有効成分の効力及び／又は有効性を増強する化合物としてのこの適用について定義される。また、形成される粒子が、複数種の有効成分を含有するように、所与の溶液中に複数種の有効成分を有することも可能である。

述べられる通り、賦形剤及びアジュバントを用いて、有効成分の有効性及び効力を増強することができる。本発明に従って噴霧凍結される溶液中に含まれうる化合物の非限定的な例は、極低温保護剤、凍結乾燥保護剤、界面活性剤、充填剤、安定化剤、ポリマー、プロテアーゼ阻害剤、抗酸化剤、及び吸収増強剤を含む。賦形剤は、流動又はバイオアベイラビリティーを改善することにより有効成分の意図される機能を改変するように選択することもでき、有効成分の放出を制御するか又は遅延させるように選択することもできる。具体的で非限定的な例は、スクロース、トレハロース、Span 80、Tween 80、Brij 35、Brij 98、Pluronic、sucroester 7、sucroester 11、sucroester 15、ラウリル硫酸ナトリウム、オレイン酸、laureth-9、laureth-8、ラウリン酸、ビタミンＥ ＴＰＧＳ、Gelucire 50/13、Gelucire 53/10、Labrafil、ジパルミトイルホスファチジルコリン、グリコール酸及び塩、デオキシコール酸及び塩、フシジン酸ナトリウム、シクロデキストリン、ポリエチレングリコール、ラブラソール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、及びチロキサポールを含む。本発明の工程を用いて、有効成分の形態を改変する結果として、高度に多孔性のマイクロ粒子及びナノ粒子を得ることができる。

一部の実施形態において、本発明は、安定したサブミクロンタンパク質粒子を作製する新規の方法を示す。本明細書では、該方法を薄膜凍結（ＴＦＦ）と称する。図１は、ＴＦＦの一実施形態を示す。ＴＦＦでは、液滴が所与の高さから落下し、冷却された固体基質上に衝突し、拡散し、凍結するのが典型的である。図１Ａでは、液滴１０が所与の高さから落下し、２２３Ｋの温度を有する回転表面１２に衝突する。該液滴が拡散する間に、図１Ｂに示される未凍結の液体１６の前方に凍結フロント１４が形成される。典型的には、完全に凍結した液滴１８のサイズは粒径約１２ｍｍであり、高さは約２１６μｍである。近年、水溶性の低い薬剤であるダナゾールの高比表面積粉末（２５〜２９ｍ^２／ｇ）を形成するのにＴＦＦが用いられた（K. A. Overhoff, J. D. Engstrom, B. Chen, T. L. Rogers, K. P. Johnston, and R. O. Williams III. Development and Optimization of the Novel Ultra-rapid Freezing Particle Engineering Process to Enhance the Dissolution Rates of Poorly Water Soluble Drugs. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 65:57-67 (2007)）。液滴（粒径約２〜４ｍｍ）は、極低温に冷却された金属表面上方のピペットから分注された（J. Fukai, M. Tanaka, and O. Miyatake. Maximum spreading of liquid droplets colliding with flat surfaces. Journal of Chemical Engineering of Japan 31:456-461 (1998)、M. Pasandideh-Fard, R. Bhola, S. Chandra, and J. Mostaghimi. Deposition of tin droplets on a steel plate : simulations and experiments. International Journal of Heat and Mass Transfer 41:2929-2945 (1998)）。衝突すると、液滴は、約１０^２Ｋ／秒の冷却速度に対応する７０〜１０００ミリ秒の時間スケールで凍結する薄膜（約１００〜４００μｍ）に拡散した（J. Fukai, T. Ozaki, H. Asami, and O. Miyatake. Numerical simulation of liquid droplet solidification on substrates. Journal of Chemical Engineering of Japan 33:630-637 (2000)、T. Bennett and D. Poulikakos. Splat-quench solidification: estimating the maximum spreading of a droplet impacting a solid surface. Journal of Materials Science 28:963-970 (1993)、H. Zhang, X. Y. Wang, L. L. Zheng, and X. Y. Jiang. Studies of splat morphology and rapid solidification during thermal spraying. International Journal of Heat and Mass Transfer 44:4579-4592 (2001)、M. Pasandideh-Fard, R. Bhola, S. Chandra, and J. Mostaghimi. Deposition of tin droplets on a steel plate : simulations and experiments. International Journal of Heat and Mass Transfer 41:2929-2945 (1998)、M. Pasandideh-Fard, S. Chandra, and J. Mostaghimi. A three-dimensional model of droplet impact and solidification. International Journal of Heat and Mass Transfer 45:2229-2242 (2002)、D. Sivakumar and H. Nishiyama. Numerical analysis on the impact behavior of molten metal droplets using a modified splat-quench solidification model. Journal of Heat Transfer-Transactions of the Asme 126:1014-1022 (2004)、B. Kang, Z. Zhao, and D. Poulikakos. Solidification of liquid metal droplets impacting sequentially on a solid surface. Journal of Heat Transfer 116:436-45 (1994)、J. Madejski. Solidification of droplets on a cold surface. International Journal of Heat and Mass Transfer 19:1009-1013 (1976)、C. S. Marchi, H. Liu, E. J. Lavernia, R. H. Rangel, A. Sickinger, and E. Muehlberger. Numerical analysis of the deformation and solidification of a single droplet impinging onto a flat substrate. Journal of Materials Science 28:3313-21 (1993)、G. X. Wang and E. F. Matthys. Modeling of heat transfer and solidification during splat cooling: effect of splat thickness and splat/substrate thermal contact. International Journal of Rapid Solidification 6:141-74 (1991)、G. X. Wang and E. F. Matthys. Numerical modeling of phase change and heat transfer during rapid solidification processes: use of control volume integrals with element subdivision. International Journal of Heat and Mass Transfer 35:141-53 (1992)、Z. Zhao, D. Poulikakos, and J. Fukai. Heat transfer and fluid dynamics during the collision of a liquid droplet on a substrate. I. Modeling. International Journal of Heat and Mass Transfer 39:2771-2789 (1996)、Z. Zhao, D. Poulikakos, and J. Fukai. Heat transfer and fluid dynamics during the collision of a liquid droplet on a substrate. II. Experiments. International Journal of Heat and Mass Transfer 39:2791-2802 (1996)、G. Trapaga and J. Szekely. Mathematical modeling of the isothermal impingement of liquid droplets in spraying processes. Metallurgical Transactions B: Process Metallurgy 22B:901-14 (1991)）。１次元の熱伝導モデルにより予測される冷却速度は、赤外線（ＩＲ）カメラによる実験室での測定と符合した（K. A. Overhoff, J. D. Engstrom, B. Chen, T. L. Rogers, K. P. Johnston, and R. O. Williams III. Development and Optimization of the Novel Ultra-rapid Freezing Particle Engineering Process to Enhance the Dissolution Rates of Poorly Water Soluble Drugs. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 65:57-67 (2007)）。ＴＦＦ及びＳＦＬにおける冷却速度が同等であるため、ＴＦＦは、高表面積タンパク質粒子を形成するのに望ましい工程であると期待しうる。

当業者に明らかとなる通り、液滴は、各種の方式及び構成で低温表面又は凍結表面に送達することができる。例えば、ハイスループット能力を提供するために、液滴は、プラテン、プラッター、プレート、ローラー、コンベヤー表面の中心、中央部又は周縁部において、並行して、連鎖的に送達することができる。凍結表面又は低温表面は、液滴が凍結することを可能とするローラー、ベルト、固体表面、円形表面、円筒表面、円錐表面、卵形表面などでありうる。連続的な工程の場合、ベルト、プラテン、プレート、又はローラーが特に有用である。作動時において、凍結液滴は、凍結乾燥工程の前に、スクレーパー、ワイヤー、超音波式分離装置、又は他の機械的分離装置により表面から除去される、凍結した基質及び有効成分のビーズ、ストリング、膜、又は線を形成しうる。ベルト、プラテン、ローラー、又はプレートの表面から材料が除去されると、表面は、連続工程におけるさらなる材料を受容できる。

一部の実施形態において、本発明は、１００％の酵素活性を有するサブミクロンのＬＤＨ粒子及びリゾチーム粒子（１０ｍ^２／ｇを超える）が、ＴＦＦ後の凍結乾燥法により形成されうることを示す。冷却速度は、粒子成長を停止させるのに十分な程度に速く設計されたが、比較的小さな液気界面の表面積により、タンパク質の吸着、折りたたみ解除、及び凝集の阻止が促される。本発明は、薄膜の大きさ、再構成後におけるＬＤＨ粉末の安定性（酵素活性）、及び表面積のＳＥＭ測定及びＢＥＴ測定により決定されるリゾチーム粒子の形態を提示する。本発明はまた、１次元熱伝導モデル及びＩＲ測定により決定される薄膜の冷却速度も与える。超急速冷却工程であるＳＦＤと比べて中程度の冷却速度工程であるＴＦＦ及びＳＦＬの冷却速度、粒子形態、及びタンパク質の安定性が比較され、緩徐工程では凍結乾燥法もまた比較された。タンパク質の核生成及び成長メカニズムを提示して、冷却速度との関係で粒子形態を示す。ＴＦＦの場合、ＳＦＤにおける噴霧化された液滴と比べ、落下する液滴及び拡散した膜の気液界面の面積がはるかに小さい結果、著明に低度のタンパク質吸着、及び結果として、最小限の変性及び凝集がもたらされることが示されている。さらに、中程度の冷却速度（約１０^２Ｋ／秒）は、粒子成長を停止させて３０ｍ^２／ｇを超える表面積を与えるのに十分であることも示されている。

ＳＦＤ及びＳＦＬと比較して、ＴＦＦは、タンパク質の安定性における改善に加え、加工工程の単純化の利点も与える。低温金属表面上におけるＴＦＦは、ＳＦＤ工程及びＳＦＬ工程における液体寒剤、例えば、液体窒素の無菌状態を維持する必要を回避する（Y. Yamagata, T. Doen, N. Asakawa, and S. Takada, Process for producing protein powder 6723347, (2004)）。ＴＦＦにおける薄膜の冷却速度は、金属表面の温度を変化させることにより容易に制御することができる。また、該膜の表面温度は直接測定することができる（K. A. Overhoff, J. D. Engstrom, B. Chen, T. L. Rogers, K. P. Johnston, and R. O. Williams III. Development and Optimization of the Novel Ultra-rapid Freezing Particle Engineering Process to Enhance the Dissolution Rates of Poorly Water Soluble Drugs. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 65:57-67 (2007)）。ＳＦＬ及びＳＦＤの場合、ライデンフロスト効果と組み合わされる液体窒素（ＬＮ_２）中における乱流噴霧の複雑な形状は、制御及びモニタリングがある程度困難である（J. D. Engstrom, D. T. Simpson, E. Lai, R. O. Williams III, and K. P. Johnston. Morphology of protein particles produced by spray freezing of concentrated solutions. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 65:149-162 (2007)）。ＴＦＦでは、液滴を噴霧化する必要がないので、より濃縮され、したがってより粘稠度の高い溶液を加工することができる。ＴＦＦでは、凍結膜の回収により、ほぼ１００％の収率が得られる。しかし、ＳＦＤ工程の場合、噴霧化された水流中への捕捉されない粒子のエントレインメント、回収容器の側面への粒子の付着、及び１０〜１００μｍの凍結粒子からの寒剤の非効率的な分離の結果として、収率は約８０％に過ぎなかった（X. C. Nguyen, J. D. Herberger, and P. A. Burke. Protein powders for encapsulation: a comparison of spray-freeze drying and spray drying of darbepoetin alfa. Pharmaceutical Research 21:507-514 (2004)、Y.-F. Maa and S. J. Prestrelski. Biopharmaceutical powders: particle formation and formulation considerations. Current Pharmaceutical Biotechnology 1:283-302 (2000)）。

材料：リゾチームは、Sigma社から購入し、３．２Ｍ硫酸アンモニウム溶液中に懸濁されたブタ心臓に由来するＬ−ＬＤＨは、Roche Applied Science社から購入した。トレハロース、ＮＡＤＨ、及びピルビン酸は、Sigma社から購入した。水は、６０：４０の陰イオン：陽イオン樹脂ブレンドを含有する一連の２×７Ｌ混合ベッド容器（Water and Power Technologies社製）内に蒸留水を流すことにより脱イオン化した。

ＬＤＨ酵素の調製及び触媒活性アッセイ：本発明で用いられるＬＤＨ酵素の調製及び触媒活性アッセイは、かつての参考文献（J. D. Engstrom, D. T. Simpson, C. Cloonan, E. Lai, R. O. Williams III, G. B. Kitto, and P. Johnston Keith. Stable high surface area lactate dehydrogenase particles produced by spray freezing into liquid nitrogen. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 65:163-174 (2007)）で詳細に説明されている。硫酸アンモニウム中におけるＬＤＨは、使用前に４℃で３時間にわたり１０ｍＭのＫＰＯ４緩衝液（ｐＨ７．５）に対して透析した（T. J. Anchordoquy and J. F. Carpenter. Polymers protect lactate dehydrogenase during freeze-drying by inhibiting dissociation in the frozen state. Archives of Biochemistry and Biophysics 332:231-238 (1996)、T. J. Anchordoquy, K.-I. Izutsu, T. W. Randolph, and J. F. Carpenter. Maintenance of quaternary structure in the frozen state stabilizes lactate dehydrogenase during freeze-drying. Archives of Biochemistry and Biophysics 390:35-41 (2001)）。ＬＤＨ活性は、ピルビン酸とＮＡＤＨとを乳酸とＮＡＤ＋とに変化させる反応について測定した。ＬＤＨ活性の単位（Ｕ）は、ＮＡＤＨのＮＡＤへの経時的な転換によるＮＡＤＨ吸光度の低下を、λ＝３４０ｎｍにおいて、１分間にわたり１５秒ごとに測定し（Ｕ＝１分間当たりにおけるＮＡＤＨのμモル単位の変化）、次いで、溶液中におけるＬＤＨタンパク質の質量（ｍｇ）で除して比活性（Ｕ／ｍｇ）を決定することにより計算した。３０ｍｇ／ｍＬのトレハロース中におけるＬＤＨ製剤の安定性を経時的に測定した。ＬＤＨの比活性は、１時間にわたり安定を維持し、次いで、低下し始めた。すべての結果は、ＬＤＨ比活性が減衰していない時間経過で得られた。この時間経過において、比活性は１００％と定義された。

薄膜凍結（ＴＦＦ）手順の例：ＬＤＨ又はリゾチームのタンパク質水溶液を、４ｍＬ／分の流速で、粒径３．６ｍｍの液滴を生成する１７ゲージ（内径１．１ｍｍ、外径１．５ｍｍ）のステンレス鋼製注射針、又は粒径５．６ｍｍの液滴を生成する内径３．９ｍｍ、外径６．４ｍｍのステンレス鋼製チューブ内に通した。液滴は、長さ１７ｃｍで粒径１２ｃｍのステンレス鋼製回転ドラムの上方１０ｃｍの高さから落下させた。ステンレス鋼製ドラムは、厚さ０．７ｃｍの壁面を有する空洞であり、それぞれ、２２３Ｋ又は１３３Ｋのドラム表面温度を維持するドライアイス又は液体窒素で満たした。各試行の前に、表面プローブである熱電対の角度４５°での接触を用いるDiGi-Sense（登録商標）Type K温度計（Eutech Instruments社製）により、ドラムの表面温度を確認した。ドラムは、約１２ｒｐｍで回転し、減速器に接続されたHeidolph RZR2041型オーバーヘッド機械撹拌器（ESSLAB社製）により駆動された。衝突時において、液滴は薄膜に変形し（図１）、凍結した。凍結した薄膜は、回転ドラム表面に沿って取り付けられたステンレス鋼製のブレードによりドラムから除去された。次いで、凍結した薄膜は、液体窒素で満たされた４００ｍＬのPyrex（登録商標）ビーカー内へと５ｃｍ落下した。リゾチームの場合、４００ｍＬのPyrex（登録商標）ビーカー内における凍結した薄膜を−８０℃の冷凍庫に直接移し、過剰な液体窒素を蒸発させた。ＬＤＨの場合、液体窒素中であらかじめ冷却したスパチュラを用いて、４００ｍＬのPyrex（登録商標）ビーカーから、粒径２ｃｍで高さ１６ｃｍの５０ｍＬポリプロピレンチューブ（United Laboratory Plastics社製、部品番号：UP2255）内に、凍結した薄膜を移した。

冷却薄膜の赤外線造影：InSb焦点面アレイ（ＦＰＡ）カメラ（Phoenixデジタル画像取得システム（ＤＡＳ：digital acquisition system）カメラ、Indigo Systems社製）を配置して、平面プレート上における凍結薄膜上方から赤外線画像を取得した。ＦＰＡカメラは３〜５μｍの放射を検出し、１秒間あたり１００フレーム（画像１枚当たり１０ミリ秒）で画像を取得した。各フレームの大きさは、２５６ピクセル×２５６ピクセル（１５ｍｍ×１５ｍｍ）であった。画像の空間解像度は、ピクセル当たり約４０μｍであった。MATLAB（登録商標）version 6（液滴中心部における２０×２０ピクセルの四角形）を用いて平均強度値を計算し、対時間でプロットして、薄膜の中心部がプレートとの熱平衡に到達する時間を決定した。

乾燥及びシェルフ充填：Virtis Advantage Lyophilizer（Virtis社製）を用いて、凍結スラリーを乾燥させた。リゾチームの凍結スラリーを含有する４００ｍＬのビーカーと、ＬＤＨの凍結スラリーを含有する５０ｍＬのポリプロピレン製チューブとを、単層Kim-wipeで覆った。一次乾燥は、−４０℃、３００ｍＴｏｒｒで３６時間にわたって実施し、二次乾燥は、２５℃、１００ｍＴｏｒｒで２４時間にわたって実施した。１００ｍＴｏｒｒで、−４０℃〜＋２５℃の１２時間にわたる直線のシェルフ温度勾配を用いた。

ＬＤＨの再構成及び濃縮アッセイ：１ｍＬの脱イオン化水で乾燥したＬＤＨ粉末を再構成し、即時に酵素アッセイを実施した。すべてのタンパク質試料を酵素活性について解析した後、ＢＣＡ（ビシンコニン酸）タンパク質解析キット（Sigma Chemical社製）によりタンパク質濃度を測定した。タンパク質濃度を決定すると、各測定値から比活性を計算することができた。各ＬＤＨ試料の活性は、凍結工程の直前に測定した対照の比活性により標準化した。

乾燥粉末の移動及び保管：凍結乾燥サイクルが完了した後、真空放出と同時に凍結乾燥器を窒素でパージし、移動前における雰囲気中の水蒸気に対するタンパク質粉末の曝露時間を短縮した。次いで、試料を１４％の相対湿度に保持された乾燥箱へと迅速に移し、粉末を２０ｍＬのシンチレーションバイアルに移した。次いで、該バイアルを、無蓋のねじ蓋用カバーにより定位置に保持した、２４ｍｍのTeflon（登録商標）Faced Silicone隔膜（Wheaton社製）で覆った。隔膜を貫通する注射針及び気体流出用のさらなる注射針を介する乾燥窒素により、２分間にわたりバイアルをパージした。

表面積の測定：乾燥粉末の表面積は、Quantachrome Nova 2000（Quantachrome社製）ＢＥＴ測定器により測定した。乾燥粉末は、乾燥箱内のガラス製ＢＥＴ試料セルに移した。次いで、最短で１２時間にわたり、真空下で試料を脱気した。ブルナウアー、エメット、及びテラー（ＢＥＴ）の式（S. Brunauer, P. H. Emmett, and E. Teller. Adsorption of gases in multimolecular layers. Journal of the American Chemical Society 60:309-319 (1938)）を用いて、７７Ｋで０．０５〜０．３０の相対応力範囲を超える窒素吸着データを近似した。試料を２回測定した。

残留水分含量：メタノールのアリコートをシンチレーションバイアルの隔膜を介して分注し、１０〜１００ｍｇ／ｍＬの懸濁液濃度を形成した。次いで、バイアルを、最大出力で５分間にわたり水浴型超音波処理装置（Mettler Electronics社製）内に置いて、粉末の完全な懸濁を確認した。水分含量は、Aquatest 8 Karl-Fischer Titrator（Photovolt Instruments社製）により、２００μＬのアリコートについて測定した。２００μＬのメタノールブランク対照により水分値を補正した。すべての試料は、乾燥後６〜８％（ｗ／ｗ）の水分含量を有し、ＳＦＤにより調製されたＢＳＡに対する２〜７％（ｗ／ｗ）の値と同等であった（H. R. Costantino, L. Firouzabadian, K. Hogeland, C. C. Wu, C. Beganski, K. G. Carrasquillo, M. Cordova, K. Griebenow, S. E. Zale, and M. A. Tracy. Protein spray-freeze drying. Effect of atomization conditions on particle size and stability. Pharmaceutical Research 17:1374-1383 (2000)）。

粒子サイズ解析：乾燥粉末のサイズ分布は、Malvern Mastersizer-S（Malvern Instruments社製）での多角度レーザー光散乱法により測定した。質量３０〜１００ｍｇの粉末を１０ｍＬのアセトニトリル中に懸濁させ、次いで、３５Ｗのパルスモードで作動する102型コンバーター及びチップを伴うBranson Sonifier 450（Branson Ultrasonics社製）を用いて、１分間にわたり氷上で懸濁液を超音波処理した。典型的な不透明値は、１１％〜１３％の範囲であった。次いで、超音波処理された懸濁液のアリコートを、５００ｍＬのアセトニトリル浴中に分散させ、解析にかけた。

走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）法：ＳＥＭ画像は、Hitachi Model S-4500走査電子顕微鏡（Hitachi社製）上で収集した。試料は乾燥箱内で調製した。導電性カーボン両面粘着テープにより取り付けたアルミニウム製載物台を、粉末により覆われるまで試料バイアル内に静かに浸漬した。次いで、載物台を隔膜で覆ったバイアル内に入れ、移動のため窒素ガスでパージした。試料が雰囲気中の水分に曝露される時間を最小化するため、載物台を迅速にPelco社製Model 3スパッター被覆器に移した。金製の導電層を付加し、次いで、試料を迅速にＳＥＭに移した。雰囲気への総曝露時間は、１分間未満であった。

表１（下記）は、脱イオン化水による液滴から形成される薄膜の特徴づけを、表面温度及び液滴粒径の関数として示す。

液滴は、低温金属表面上に拡散し、円筒形の薄い円板を形成した。該円板の粒径は、２２３Ｋから１３３Ｋへの表面温度の低下と共に減少し、落下液滴半径の増加と共に増加した。凍結薄膜が円筒形円板であったため、薄膜の厚さは、既知の液滴体積及び測定された円板粒径から計算した。落下液滴の体積は、メスシリンダー内で１ｍＬを占めるのに必要とされる液滴数を数えることにより決定した。２２３Ｋ及び１３３Ｋの表面に対する平均薄膜厚は、それぞれ、２２０μｍ及び３２０μｍであった。該円筒形の上面に対応する表面積対体積比もまた、表１に示す。膜厚は、基本的に、落下液滴粒径と無関係であった。濃度５〜５０ｍｇ／ｍＬのリゾチーム又は濃度３０ｍｇ／ｍＬのトレハロースを含有する水性試料の場合、液滴体積、円板粒径、及びこれによる膜厚は、純水と比べ変化しなかった。ＴＦＦにおける３．６ｍｍ及び５．６ｍｍの落下液滴に対する表面積対体積比は、それぞれ、１７ｃｍ^−１及び１１ｃｍ^−１であった。表１に示す通り、衝突時において、落下液滴は、３１〜４６ｃｍ^−１の最終表面積対体積比で薄膜へと拡散する。ＳＦＤ及びＳＦＬについてのかつての参考文献（J. D. Engstrom, D. T. Simpson, E. Lai, R. O. Williams III, and K. P. Johnston. Morphology of protein particles produced by spray freezing of concentrated solutions. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 65:149-162 (2007)）において、対応する表面積対体積比は、それぞれ、６０００及び６００ｃｍ^−１であった。これらの値と比べ、はるかに小さなＴＦＦの表面積対体積比は、気液界面への曝露に由来するタンパク質の不安定化度を低下させると予測することができる。

赤外線測定値からの冷却速度の決定により、薄膜をさらに特徴づけした。ＩＲカメラは、白色が液滴から放出された放射エネルギー量Ｅ（単位波長当たり単位時間当たりのエネルギー密度）と比べた高強度を示し、黒色が該低強度を示す強度値を出力する（K. A. Overhoff, J. D. Engstrom, B. Chen, T. L. Rogers, K. P. Johnston, and R. O. Williams III. Development and Optimization of the Novel Ultra-rapid Freezing Particle Engineering Process to Enhance the Dissolution Rates of Poorly Water Soluble Drugs. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 65:57-67 (2007)、E. H. Snell, R. A. Judge, M. Larson, and M. J. van der Woerd. Seeing the heat - preliminary studies of cryocrystallographyn using infrared imaging. Journal of Synchrotron Radiation 9:361-367 (2002)）。放射エネルギーＥは、式（１）のプランクの法則に従って物体の温度と関係する。
式（１）

［式中、λは波長であり、ｃは光速であり、ｋはボルツマン定数であり、ｈはプランク定数であり、Ｔはケルビン単位の温度である（E. H. Snell, R. A. Judge, M. Larson, and M. J. van der Woerd. Seeing the heat - preliminary studies of cryocrystallographyn using infrared imaging. Journal of Synchrotron Radiation 9:361-367 (2002)）］。したがって、ＩＲカメラの強度出力は、温度と直接に関係する。

図２Ａに示す２２３Ｋの表面上における薄膜の場合、該膜の粒径は１２ｍｍであり、端縁部は均一で滑らかであった。冷却が進むにつれ、冷却フロントは、膜の端縁部から中心に向かって半径方向内向きに移動した。膜の中心部は、図２Ａ及び図３に示す１．６秒で熱平衡に達した。図２Ｂに示す１３３Ｋの表面上における薄膜の場合、粒径は１０ｍｍであり、端縁部に暗色のギザギザの「指状部」が観察されたことから、最低温領域が示される。冷却フロントは、まず、端縁部から中心部へと半径方向内向きに移動した。次に、中心部が黒色に変わり、中心部とギザギザの外側端縁部との間の環状領域は灰色を維持した。次いで、冷却フロントは、膜の中心部から端縁部に向かって移動することにより、向きを反転させた。図３は、膜の中心部が、約３秒間で、２２３Ｋの場合と比べややゆっくりと熱平衡に達したことを示す。いずれの場合も、膜の中心部ではプラトーが観察され、次いで、熱平衡への急激な終末減衰が観察された。

凍結乾燥法、ＳＦＬ（J. D. Engstrom, D. T. Simpson, C. Cloonan, E. Lai, R. O. Williams III, G. B. Kitto, and P. Johnston Keith. Stable high surface area lactate dehydrogenase particles produced by spray freezing into liquid nitrogen. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 65:163-174 (2007)）、及びＴＦＦにより凍結した、３０ｍｇ／ｍＬトレハロースを伴う０．２５ｍｇ／ｍＬ ＬＤＨ水性製剤のＬＤＨ活性は極めて高く、表２に示すスチューデントのｔ検定によれば、有意差（ｐ＜０．０５）を示さなかった。表２は、ｐＨ７．５、１０ｍＭのＫＰＯ_４緩衝液中３連での各種技法により凍結した、０．２５ｍｇ／ｍＬ ＬＤＨ、３０ｍｇ／ｍＬトレハロース製剤の活性を示す。

３種の液滴サイズに対するＳＦＤ工程と比較して、各ＴＦＦ条件に対するＬＤＨ活性は、有意に高度であった（ｐ＜０．０５）。ＴＦＦ工程における液滴の落下及び拡散、凍結、乾燥、及び再構成による一連の応力を経て、きわめて高度のＬＤＨ活性が維持された。

ＴＦＦにより形成されたＬＤＨ粒子の高度な酵素活性を踏まえると、他の重要な目標は、サブミクロンの粒子サイズと大きな粒子表面積とを有する粒子形態を裏付けることであった。表３は、薄膜凍結、ＳＦＬ、及びＳＦＤにより形成されたリゾチーム粉末の比表面積測定値及び粒子サイズ分布を示す。

ＬＤＨの場合、ＬＤＨ：トレハロース比は、質量で１：１２０であった。既に論じた通り（J. D. Engstrom, D. T. Simpson, C. Cloonan, E. Lai, R. O. Williams III, G. B. Kitto, and P. Johnston Keith. Stable high surface area lactate dehydrogenase particles produced by spray freezing into liquid nitrogen. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 65:163-174 (2007)、J. D. Engstrom, D. T. Simpson, E. Lai, R. O. Williams III, and K. P. Johnston. Morphology of protein particles produced by spray freezing of concentrated solutions. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 65:149-162 (2007)）、トレハロースの粒子表面積は、Ｔｇを急激に低下させる雰囲気水分に対する曝露時において減少した（この限界は、バイアルを水分から遮断する凍結乾燥用密栓の使用により、将来的に克服することができる）。こうして、本発明者らは、ＬＤＨ：トレハロースではなくリゾチームをモデルタンパク質として選択することにより、粉末形態を探索した。室温で採取し移動させたリゾチーム試料は、カールフィッシャー滴定による決定で６〜８％の水分含量を有した。７〜８重量％の水分含量の場合、Ｔｇは、５０〜６０℃の高値を維持した（A. A. Elkordy, R. T. Forbes, and B. W. Barry. Integrity of crystalline lysozyme exceeds that of a spray-dried form. International Journal of Pharmaceutics 247:79-90 (2002)）。したがって、移動時におけるリゾチームの比表面積の低下は、無視できるものと予測することができる。大半の場合、比表面積値は、３０〜５５ｍ^２／ｇの範囲で同等であった。５ｍｇ／ｍＬのリゾチームの場合、２２３Ｋでの薄膜は、１３３Ｋでの膜と比べて著明に高値の７３ｍ^２／ｇの比表面積をもたらした。かつての参考文献（J. D. Engstrom, D. T. Simpson, E. Lai, R. O. Williams III, and K. P. Johnston. Morphology of protein particles produced by spray freezing of concentrated solutions. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 65:149-162 (2007)）では、ＳＦＬにより処理された５及び５０ｍｇ／ｍＬのリゾチーム溶液では、それぞれ、１１４ｍ^２／ｇ及び３４ｍ^２／ｇの粉末比表面積が測定され、ＴＦＦによりもたらされる値と同等であった（J. D. Engstrom, D. T. Simpson, E. Lai, R. O. Williams III, and K. P. Johnston. Morphology of protein particles produced by spray freezing of concentrated solutions. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 65:149-162 (2007)）。表２に示す通り、ＳＦＤに対する１２６ｍ^２／ｇの比表面積は、ＴＦＦの場合よりも約２倍大きかったが、酵素活性がはるかに小さかった。

表３に示す通り、２２３ＫのＴＦＦにより調製される５ｍｇ／ｍＬリゾチーム製剤の超音波処理後におけるレーザー光散乱法により決定されるサブミクロン粒子の体積率は、８８〜９２％の範囲であった。ほぼ同一の薄膜厚は同等の冷却速度をもたらすと予測されるので、これらの２つの値の同等性が予測された。これらの値は、ＳＦＬ粉末の値と同等であった（J. D. Engstrom, D. T. Simpson, E. Lai, R. O. Williams III, and K. P. Johnston. Morphology of protein particles produced by spray freezing of concentrated solutions. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 65:149-162 (2007)）。ＴＦＦの場合、タンパク質粉末は粉末化しやすく、最小限の超音波処理により容易にサブミクロン粒子へと粉末化することができた。図４に示す通り、Ｄ（ｖ，５０）は３００ｎｍであった。これに対し、凍結乾燥法により調製された同じ５ｍｇ／ｍＬのリゾチーム製剤は、図４及び表３に示す通り、７％という極めて低いサブミクロン粒子画分を有した。リゾチームフィード濃度を５０ｍｇ／ｍＬに上昇させると、２２３Ｋ及び１３３Ｋの表面におけるサブミクロン画分は、それぞれ、６６及び６２％に低下した。ＳＦＬの対応する値がより低い値（４８％）であったのに対し、ＳＦＤではより高い値（７４％）であった（J. D. Engstrom, D. T. Simpson, E. Lai, R. O. Williams III, and K. P. Johnston. Morphology of protein particles produced by spray freezing of concentrated solutions. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 65:149-162 (2007)）。ＳＦＤ粉末の場合、Ｄ（ｖ，５０）は、約３００ｎｍであった（J. D. Engstrom, D. T. Simpson, E. Lai, R. O. Williams III, and K. P. Johnston. Morphology of protein particles produced by spray freezing of concentrated solutions. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 65:149-162 (2007)）。表３に示す通り、ＳＦＬ及びＴＦＦにより調製される５０ｍｇ／ｍＬリゾチーム溶液では、ミクロンサイズ粒子による第２のピークが存在した。しかし、５０ｍｇ／ｍＬとは、通常ではない程度に高いタンパク質濃度であり、図４に示す通り、ＴＦＦは通常、第２の大きなピークが存在しないおよそ５ｍｇ／ｍＬの濃度に対して適用される。

表３中の結果から選択したＳＥＭ画像を図５及び６に示す。５ｍｇ／ｍＬのリゾチームでは、図５Ａに示される２２３ＫのＴＦＦにより、図５ＣにおけるＳＦＬ（J. D. Engstrom, D. T. Simpson, E. Lai, R. O. Williams III, and K. P. Johnston. Morphology of protein particles produced by spray freezing of concentrated solutions. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 65:149-162 (2007)）により作製される粒子と同等の５０ｎｍの一次微粒子が作製された。１３３Ｋでは、図５Ｂで見られる通り、より大きな粒径５０〜１００ｎｍの粒子が、粒径５０〜１００ｎｍで長さが５００ｎｍを超える杆体と混じり合っていた。図５Ｂで示される、図５Ａと比較してより大きな粒子サイズは、表３に挙げた光散乱法により測定された、やや低量のサブミクロン粒子含量と符合する。

図６Ａに示す通り、高度に濃縮された５０ｍｇ／ｍＬのリゾチーム溶液及び２２３Ｋの表面温度では、１〜２μｍの起伏を有する大型のシート構造が観察された。同等の起伏は、ＳＦＬ（J. D. Engstrom, D. T. Simpson, E. Lai, R. O. Williams III, and K. P. Johnston. Morphology of protein particles produced by spray freezing of concentrated solutions. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 65:149-162 (2007)）でも観察された。これに対し、１００ｎｍの起伏を有する緻密なウェブ構造は、図６Ｃに見られるＳＦＤ（J. D. Engstrom, D. T. Simpson, E. Lai, R. O. Williams III, and K. P. Johnston. Morphology of protein particles produced by spray freezing of concentrated solutions. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 65:149-162 (2007)）により生成され、これは、表３における光散乱法により測定されるより小さな粒子サイズと符合する。５ｍｇ／ｍＬ溶液に対して５０ｍｇ／ｍＬ溶液の場合にＴＦＦ工程及びＳＦＬ工程で観察されるより大きな起伏は、光散乱法により測定される粒子サイズ分布と符合する。５及び５０ｍｇ／ｍＬの両方の濃度におけるＳＦＬ工程及びＴＦＦ工程により調製される粉末の粒子形態の類似性はまた、冷却速度の点からも検証される。

薄膜冷却速度のモデル化。拡散して液体金属の薄膜を形成する液滴及び水滴は、ウェーバー数、（界面張力に対する慣性）［式中、は衝突速度であり、は液滴粒径であり、は空気中の液滴界面張力である］との関係で説明されてきた。Ｗｅが３０を超える場合、冷却された固体基質への衝突直前（J. Fukai, T. Ozaki, H. Asami, and O. Miyatake. Numerical simulation of liquid droplet solidification on substrates. Journal of Chemical Engineering of Japan 33:630-637 (2000)、M. Pasandideh-Fard, S. Chandra, and J. Mostaghimi. A three-dimensional model of droplet impact and solidification. International Journal of Heat and Mass Transfer 45:2229-2242 (2002)、D. Sivakumar and H. Nishiyama. Numerical analysis on the impact behavior of molten metal droplets using a modified splat-quench solidification model. Journal of Heat Transfer-Transactions of the Asme 126:1014-1022 (2004)、B. Kang, Z. Zhao, and D. Poulikakos. Solidification of liquid metal droplets impacting sequentially on a solid surface. Journal of Heat Transfer 116:436-45 (1994)、Z. Zhao, D. Poulikakos, and J. Fukai. Heat transfer and fluid dynamics during the collision of a liquid droplet on a substrate. II. Experiments. International Journal of Heat and Mass Transfer 39:2791-2802 (1996)、J. Fukai, Y. Shiiba, T. Yamamoto, O. Miyatake, D. Poulikakos, C. M. Megaridis, and Z. Zhao. Wetting Effects on the Spreading of a Liquid Droplet Colliding with a Flat Surface - Experiment and Modeling. Physics of Fluids 7:236-247 (1995)）において、液滴は、凍結前に円筒形の薄膜に変形される。Ｗｅが１未満の低い場合では、衝突する液滴は、最小限の液滴拡散による球状ドーム形として凍結する（D. Sivakumar and H. Nishiyama. Numerical analysis on the impact behavior of molten metal droplets using a modified splat-quench solidification model. Journal of Heat Transfer-Transactions of the Asme 126:1014-1022 (2004)、S. Schiaffino and A. A. Sonin. Motion and arrest of a molten contact line on a cold surface: an experimental study. Physics of Fluids 9:2217-2226 (1997)）。落下液滴の場合、γ（空気−水間）＝７２ｍＮ／ｍ、Ｖ＝（２ｇＨ）^１／２であり（T. Bennett and D. Poulikakos. Heat-Transfer Aspects of Splat-Quench Solidification - Modeling and Experiment. Journal of Materials Science 29:2025-2039 (1994)）、液滴の落下高度Ｈが１０ｃｍなら、結果としてＶ＝１．４ｍ／秒となる。薄い円筒形円板の形成の観察は、このＷｅが９７の場合に符合したが、Ｈを１ｃｍ未満に減少させる（Ｗｅ＝９．８）と、衝突する水滴は、粒径がわずかに４ｍｍの球状ドーム形として凍結した。

かつて、アセトニトリル及びｔ−ブタノールにより形成された薄膜についてのＩＲ造影研究により、液滴の拡散が最初の１０ミリ秒間に生じると示されたことは、液滴の拡散時間が、凍結時間よりもはるかに短かったことを示す（K. A. Overhoff, J. D. Engstrom, B. Chen, T. L. Rogers, K. P. Johnston, and R. O. Williams III. Development and Optimization of the Novel Ultra-rapid Freezing Particle Engineering Process to Enhance the Dissolution Rates of Poorly Water Soluble Drugs. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 65:57-67 (2007)）。水についても、同じ挙動が図２で観察された。単純化された解析を行う熱伝導モデルによる膜の冷却速度の予測は、実験室でもたらされたＩＲデータとよく一致した（K. A. Overhoff, J. D. Engstrom, B. Chen, T. L. Rogers, K. P. Johnston, and R. O. Williams III. Development and Optimization of the Novel Ultra-rapid Freezing Particle Engineering Process to Enhance the Dissolution Rates of Poorly Water Soluble Drugs. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 65:57-67 (2007)）。本明細書では、この手法を水滴の薄膜凍結に拡張する。

略述すると、該モデルは、液滴が、熱伝導よりもはるかに短い時間尺度で拡散して円筒形膜を形成することを仮定する。薄膜の高さ（厚さ）は、はるかに大きな１０〜１２ｍｍの粒径と比べ、およそ２００〜４００μｍであるため、半径方向の熱伝導は無視できる。熱拡散率、α＝ｋ／ρ×Ｃ_ｐ［式中、ｋは熱伝導率であり、ρは密度であり、Ｃ_ｐは熱容量である］は、全温度範囲にわたり定数として扱われる。水を凍結させる場合、水及び氷の熱拡散率を平均する。薄膜上面における断熱境界条件（空気）と、下面における一定温度境界条件とを有する有限平板に対する１次元熱伝導は、式（２）：
式 （２）

［式中、ｘは拡散した液滴の上部からの距離であり、Ｔは膜内の温度であり、Ｔ_ｐは薄膜下面と接触するプレート温度であり、Ｌは膜厚である］で説明される（H. S. Carslaw and J. C. Jaeger. Conduction of Heat in Solids, Oxford University Press, London, 1959）。

式（２）から計算される温度プロファイルを図７に示し、計算による冷却速度及び冷却時間を表４に示し、表４で、ＳＦＤ、ＳＦＬ、及びＴＦＦに対する計算による冷却速度、冷却時間、及び気液界面に対する曝露時間を挙げる。液滴の大きさは表１に示す。

冷却時間は、膜上面の温度Ｔ（０，ｔ）が、室温（２５℃）から金属表面を５％超える値まで低下する時間として定義した。次いで、冷却速度（Ｋ／秒）は、膜の上部における温度差を冷却時間で除することにより決定した。図７Ａ及び表４に示す通り、２２３Ｋの表面上における厚さ２２０μｍの薄膜上面の予測冷却時間は、２．０×１０^２ミリ秒（３．９×１０^２Ｋ／秒の冷却速度）である。計算による冷却速度は、ＳＦＬの場合（７．２×１０^３Ｋ／秒）よりも１桁小さく、ＳＦＤの場合（３．８×１０^６Ｋ／秒）よりも４桁小さい。ＳＦＤに対してはるかに小さな、ＴＦＦにおける冷却速度は、１００分の１の表面積対体積比と、ＳＦＤにおける液滴半径よりもおよそ２０〜３０倍大きな膜厚とにより説明することができる。

図５に示す粒子形態及び表３における粒子比表面積は、各場合における急速な冷却の結果として、２２３Ｋ及び１３３Ｋの表面上における冷却について同等であった。

熱平衡に達する試験冷却時間は、表４に示すモデル冷却時間と比較して、３〜４倍長かった。この差は、ＳＦＬ及び凍結乾燥法などの他の工程と比べた桁の差と比較して小さい。該差は、温度測定の較正における不確実さ、モデルとＩＲカメラとでの最終温度の定義の違い、及びモデル中に組込まれなかった水の融解熱の放出の結果でありうる。水の冷却速度が極めて急速な場合、水は、結晶化が限定的なガラスを形成することがある（F. Franks. Biophysics and Biochemistry at Low Temperatures, Cambridge University Press, New York, 1985）。データ及び計算により示される通り、水をガラス化するには、１０^６Ｋ／秒の冷却速度が必要である（F. Franks. Biophysics and Biochemistry at Low Temperatures, Cambridge University Press, New York, 1985、P. G. Debenedetti. Supercooled and glassy water. Journal of Physics: Condensed Matter 15:R1669-R1726 (2003)、E. Mayer and P. Brueggeller. Vitrification of pure liquid water by high pressure jet freezing. Nature 298:715-718 (1982)、C. A. Angell. Liquid fragility and the glass transition in water and aqueous solutions. Chemical Reviews 102:2627-2649 (2002)）。ＴＦＦにおいて観察される１０^２Ｋ／秒の冷却速度は、融解潜熱が著明であり得たことを示す。

冷却速度に対する核生成及び成長メカニズム。ＴＦＦ結果を大局的に位置付けるには、ＳＦＤにおける極めて急速なガラス化／凍結及び凍結乾燥法における緩徐な凍結の境界条件を考察することが示唆的である。かつて、ＳＦＬ及びＳＦＤにより調製されたリゾチーム粉末の形態は、５ｍｇ／ｍＬの希釈リゾチーム溶液について同様であることが示された。表４に示す通り、ＳＦＤの１０^６Ｋ／秒に対するＳＦＬの１０^３Ｋ／秒の冷却速度にもかかわらず、該比表面積は、５０〜１００ｎｍの球状一次粒子について１００ｍ^２／ｇを超えた（J. D. Engstrom, D. T. Simpson, E. Lai, R. O. Williams III, and K. P. Johnston. Morphology of protein particles produced by spray freezing of concentrated solutions. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 65:149-162 (2007)）。

凍結メカニズムは、未凍結溶液の特性の多くの同時的な変化を伴う。水が凍結すると、濃度、ｐＨ、イオン強度、粘稠度、拡散係数、核生成した粒子間の衝突、並びに未凍結溶液の幾何学的なサイズ及び形状が変化する。タンパク質粒子の成長速度はこれらすべての因子に依存するため、最終粒子サイズについてのモデルを開発することは困難である。図８に示す通り、凍結水領域間の薄い液体チャネルは、タンパク質（糖）粒子間の衝突回数を低減し、このため、凝集による成長を阻害する。さらに、薄いチャネルの粘稠度が急速に上昇すると、粒子成長が停止し、チャネルが完全に凍結する。さらに、水中の糖は、純水の粘稠度を超えて粘稠度を上昇させる。凍結乾燥法における緩徐な冷却の場合、極めて低度の過冷却は、急速な冷却工程に対して比較的少数の核生成した氷領域をもたらし、これらの領域間に厚い溶液チャネルを残存させる。−２０℃の冷凍庫内で５ｍｇ／ｍＬの溶液をゆっくり冷却する場合などの１Ｋ／分の冷却速度の場合、凍結乾燥された粒子のサイズは、およそ３０〜１００μｍであった。これらの厚いチャネルにおいて、タンパク質粒子は、チャネルが完全に凍結する前に凝集及び成長して大型の粒子を形成するのに十分な時間を有する。タンパク質溶液の濃度を１ｍｇ／ｍＬ未満に著明に低下させることにより、この粒子成長を部分的に軽減することが理論的には可能であるが、このような低タンパク質濃度は、乾燥凍結の要件を過度なものとする可能性がある（Y.-F. Maa and S. J. Prestrelski. Biopharmaceutical powders: particle formation and formulation considerations. Current Pharmaceutical Biotechnology 1:283-302 (2000)）。

ＳＦＤにおいて、本発明者らは、気液界面へのタンパク質の曝露の方が、氷−液体又は氷状水−液体の界面に対する曝露よりも大きな影響を、タンパク質の安定性に対して及ぼすことを見出した（S. D. Webb, S. L. Golledge, J. L. Cleland, J. F. Carpenter, and T. W. Randolph. Surface adsorption of recombinant human interferon-g in lyophilized and spray-lyophilized formulations. Journal of Pharmaceutical Sciences 91:1474-1487 (2002)、Z. Yu, K. P. Johnston, and R. O. Williams III. Spray freezing into liquid versus spray-freeze drying: Influence of atomization on protein aggregation and biological activity. European Journal of Pharmaceutical Sciences 27:9-18 (2006)、J. D. Engstrom, D. T. Simpson, C. Cloonan, E. Lai, R. O. Williams III, G. B. Kitto, and P. Johnston Keith. Stable high surface area lactate dehydrogenase particles produced by spray freezing into liquid nitrogen. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 65:163-174 (2007)）。氷状水−液体界面と対比された氷−液体界面が、タンパク質の安定性に対して異なる影響を及ぼすのかどうかは明らかでない（S. D. Webb, S. L. Golledge, J. L. Cleland, J. F. Carpenter, and T. W. Randolph. Surface adsorption of recombinant human interferon-g in lyophilized and spray-lyophilized formulations. Journal of Pharmaceutical Sciences 91:1474-1487 (2002)、B. S. Chang, B. S. Kendrick, and J. F. Carpenter. Surface-induced denaturation of proteins during freezing and its inhibition by surfactants. Journal of pharmaceutical sciences 85:1325-1330 (1996)、C. A. Angell and L.-M. Wang. Hyperquenching and cold equilibration strategies for the study of liquid-liquid and protein folding transitions. Biophysical Chemistry 105:621-637 (2003)）。かつての参考文献（P. G. Debenedetti. Supercooled and glassy water. Journal of Physics: Condensed Matter 15:R1669-R1726 (2003)、E. Mayer and P. Brueggeller. Vitrification of pure liquid water by high pressure jet freezing. Nature 298:715-718 (1982)）により説明される通り、水をガラス化するにはおよそ１０^６Ｋ／秒の冷却速度が必要とされるが、溶液中における糖の存在下では、ガラス化に必要な冷却速度を低下させることができる（F. Franks. Biophysics and Biochemistry at Low Temperatures, Cambridge University Press, New York, 1985、C. A. Angell. Liquid fragility and the glass transition in water and aqueous solutions. Chemical Reviews 102:2627-2649 (2002)）。ＴＦＦにおいて観察される、ＳＦＤと比べてより緩徐な冷却速度（１０^２Ｋ／秒）の場合、ガラス化された水領域ではなく、氷粒子領域が形成される可能性が高い。ＴＦＦの場合、ＬＤＨ活性は、およそ１００％であった。こうして、本発明は、氷−液体界面が、タンパク質の安定性に対して有害な影響を及ぼすことを示唆しない。

２２３Ｋの５ｍｇ／ｍＬリゾチーム製剤の場合、比表面積は、ＳＦＤの場合よりはやや小さかったが極めて大きく、超音波処理後における粒子サイズは、表３にみられるＳＦＬ及びＳＦＤのいずれによる粒子サイズとも同等であった。ＴＦＦにおける、ＳＦＤ（１０^６Ｋ／秒）及びＳＦＬ（１０^３Ｋ／秒）と比較してより低値の冷却速度（１０^２Ｋ／秒）は、凍結時における急速な核生成をもたらし、著明な粒子成長を阻止するのになお十分であった。しかし、ＴＦＦの場合、未凍結チャネルのサイズは十分に薄く、未凍結溶液の粘稠度の増大は、中程度に高速な工程であるＳＦＬ、及びはるかに高速な工程であるＳＦＤの場合と同等の粒子サイズ及び形態を達成するのに十分な程度に速かった。したがって、ＳＦＤにおける極めて急速な冷却速度は、サブミクロンタンパク質粒子を形成するのに必要な速度よりもはるかに速かった。ＳＦＬとＳＦＤとの比較においても同様の結論に達した（J. D. Engstrom, D. T. Simpson, C. Cloonan, E. Lai, R. O. Williams III, G. B. Kitto, and P. Johnston Keith. Stable high surface area lactate dehydrogenase particles produced by spray freezing into liquid nitrogen. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 65:163-174 (2007)）。

５０ｍｇ／ｍＬの高濃度溶液の場合、未凍結水チャネル内におけるガラス化した溶質領域の体積画分の増大は、衝突頻度の上昇及び粒子成長の増大をもたらす（J. D. Engstrom, D. T. Simpson, E. Lai, R. O. Williams III, and K. P. Johnston. Morphology of protein particles produced by spray freezing of concentrated solutions. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 65:149-162 (2007)）。かつて観察された（J. D. Engstrom, D. T. Simpson, E. Lai, R. O. Williams III, and K. P. Johnston. Morphology of protein particles produced by spray freezing of concentrated solutions. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 65:149-162 (2007)）通り、ＳＦＬにおける、ＳＦＤと比較してより緩徐な冷却速度は、大きな未凍結液体チャネルがガラス化する前に粒子成長の増大をもたらし、これにより、タンパク質粒子を大型化させ、粉末の比表面積を低減する（J. D. Engstrom, D. T. Simpson, E. Lai, R. O. Williams III, and K. P. Johnston. Morphology of protein particles produced by spray freezing of concentrated solutions. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 65:149-162 (2007)）。表３に示す通り、ＴＦＦ及びＳＦＬで比表面積は同等であった。これらの高濃度溶液の場合、ＴＦＦ（及びＳＦＬ）において形成される、ＳＦＤに対してより大きな粒子は、より厚い未凍結チャネル内における成長時間の増大から生じる。かつての大半の研究でおよそ５ｍｇ／ｍＬにおけるはるかに低い濃度を検討した通り、急速な凍結工程ではこの限界に遭遇しないことが典型的である。

ＴＦＦ工程における気液界面の最小化。ＴＦＦ後においてＬＤＨの安定性が基本的に１００％であったことは、工程、液滴の落下、拡散、及び凍結、並びに乾燥のいずれもが、酵素活性の測定可能な低下をもたらさなかったことを示す。かつての計算（J. D. Engstrom, D. T. Simpson, C. Cloonan, E. Lai, R. O. Williams III, G. B. Kitto, and P. Johnston Keith. Stable high surface area lactate dehydrogenase particles produced by spray freezing into liquid nitrogen. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 65:163-174 (2007)）から、気液界面に対する噴霧化された液滴の曝露は、ＳＦＤ工程（６０００ｃｍ^−１）と比べ、ＳＦＬ工程（６００ｃｍ^−１）では１桁小さかった（S. D. Webb, S. L. Golledge, J. L. Cleland, J. F. Carpenter, and T. W. Randolph. Surface adsorption of recombinant human interferon-g in lyophilized and spray-lyophilized formulations. Journal of Pharmaceutical Sciences 91:1474-1487 (2002)）。気液界面に対する曝露増大の結果、ＳＦＤではＬＤＨ活性の低下がもたらされた（J. D. Engstrom, D. T. Simpson, C. Cloonan, E. Lai, R. O. Williams III, G. B. Kitto, and P. Johnston Keith. Stable high surface area lactate dehydrogenase particles produced by spray freezing into liquid nitrogen. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 65:163-174 (2007)）。ＴＦＦでは、ＴＦＦの気液界面の表面積対体積比（４６ｃｍ^−１）がＳＦＤの場合よりも２桁小さく、これにより、タンパク質の吸着及び凝集が大幅に低下した。図９に示す通り、ＴＦＦ及びＳＦＬにおける中程度の冷却速度は、凍結乾燥法と異なり、高表面積のサブミクロン粒子を作製する手段をもたらし、気液界面におけるタンパク質吸着がＳＦＤと比較して低下する結果、タンパク質の安定性が上昇する。

気液界面を最小化すると、該界面に吸着しうるタンパク質の量を制限することによりタンパク質の安定性を改善することができる。放射性標識された表面活性タンパク質の場合、β−カゼイン、リゾチーム、及びＢＳＡの完全飽和時における表面過剰濃度Γ（D. E. Graham and M. C. Phillips. Proteins at liquid interfaces. I. Kinetics of adsorption and surface denaturation. Journal of Colloid and Interface Science 70:403-14 (1979)、D. E. Graham and M. C. Phillips. Proteins at liquid interfaces. II. Adsorption Isotherms. Journal of Colloid and Interface Science 70:415-426 (1979)）は、それぞれ、２．６、３．０、及び３．３ｍｇ／ｍ^２であった（S. Magdassi and A. Kamyshny. Surface activity and functional properties of proteins. in: S. Magdassi (Ed), Surface Activity of Proteins (S. Magdassi, ed), Marcel Dekker, Inc., New York, 1996, pp. 1-38、D. E. Graham and M. C. Phillips. Proteins at liquid interfaces. I. Kinetics of adsorption and surface denaturation. Journal of Colloid and Interface Science 70:403-14 (1979)、D. E. Graham and M. C. Phillips. Proteins at liquid interfaces. II. Adsorption Isotherms. Journal of Colloid and Interface Science 70:415-426 (1979)）。ＬＤＨの場合も、本発明者らは、約３ｍｇ／ｍ２の同等の値を推定した。表面積が１．１３×１０−４ｍ^２である粒径１２ｍｍの膜の上面の場合、平衡時における総吸着タンパク質は３．４×１０−４ｍｇである。０．２５ｍｇ／ｍＬのＬＤＨを含有する当初３．６ｍｍの液滴の場合、総タンパク質は６．２×１０^−３ｍｇである。したがって、すべてのタンパク質が界面に達して変性する場合、タンパク質活性の最大の低下は５．５％である。１秒間の曝露で完全な平衡吸着が生じることはない。さらに、高さ及び凍結時間の関数としての粘稠度が増大すると、気体−水界面へのタンパク質の拡散が停止する。ＳＦＤにおける粒径約１０μｍの液滴の場合、液滴中における総ＬＤＨの２５〜３０％が、わずか０．４ミリ秒で気液界面に吸着する（M. Adler and G. Lee. Stability and surface activity of lactate dehydrogenase in spray-dried trehalose. Journal of Pharmaceutical Sciences 88:199-208 (1999)）。一部の吸着されたタンパク質の変性は、表２のＳＦＤ工程で観察されるタンパク質活性の著明な低下と符合する。

ＴＦＦ工程を用いて、およそ３１〜７３ｍ^２／ｇの表面積及び１００％のＬＤＨ活性を有する３００ｎｍのリゾチーム粒子を作製した。ＴＦＦにおける約１０^２Ｋ／秒の冷却速度にもかかわらず、粒子サイズ及び表面積は、冷却速度が１０^６Ｋ／秒に達する、広く報告された工程である噴霧凍結乾燥（ＳＦＤ）で観察される粒子サイズ及び表面積と同等であった。ＴＦＦでは、氷領域間の薄い液体チャネルが同様の粒子形態を達成するのに十分に薄く、薄いチャネルの凍結速度が十分に速かった。したがって、ＳＦＤ工程における極めて急速な冷却速度は、所望のサブミクロンタンパク質粒子を形成するのに必要ではなかった。ＴＦＦにおいて、ＬＤＨは、薄膜の気液界面に対して最長で約１秒間曝露されたが、４５ｃｍ^−１の表面積対体積比は、吸着によりもたらされる凝集及び変性が無視できる程度に十分小さかった。この気液界面がタンパク質で飽和した後で不可逆的な変性が生じた場合でも、０．２５ｍｇ／ｍＬのＬＤＨ製剤に対する最大の活性喪失は５％である。液滴サイズが１０μｍであるＳＦＤの場合、該界面への拡散及び吸着のために、最大喪失は、わずか０．４ミリ秒間で２５％に達することがあり（M. Adler and G. Lee. Stability and surface activity of lactate dehydrogenase in spray-dried trehalose. Journal of Pharmaceutical Sciences 88:199-208 (1999)）、著明な酵素活性の低下（８０％）と符合する。ＳＦＤでは、かつての複数の研究（Y.-F. Maa and H. R. Costantino. Spray freeze-drying of biopharmaceuticals: applications and stability considerations. in: H. R. Costantino and M. J. Pikal (Eds), Biotechnology: Pharmaceutical Aspects. 2. Lyophilization of Biopharmaceuticals, Vol. (H. R. Costantino and M. J. Pikal, eds), American Association of Pharmaceutical Scientists, Arlington, 2004, pp. 519-561、X. C. Nguyen, J. D. Herberger, and P. A. Burke. Protein powders for encapsulation: a comparison of spray-freeze drying and spray drying of darbepoetin alfa. Pharmaceutical Research 21:507-514 (2004)、H. R. Costantino, L. Firouzabadian, K. Hogeland, C. C. Wu, C. Beganski, K. G. Carrasquillo, M. Cordova, K. Griebenow, S. E. Zale, and M. A. Tracy. Protein spray-freeze drying. Effect of atomization conditions on particle size and stability. Pharmaceutical Research 17:1374-1383 (2000)、S. D. Webb, S. L. Golledge, J. L. Cleland, J. F. Carpenter, and T. W. Randolph. Surface adsorption of recombinant human interferon-g in lyophilized and spray-lyophilized formulations. Journal of Pharmaceutical Sciences 91:1474-1487 (2002)、Y.-F. Maa and S. J. Prestrelski. Biopharmaceutical powders: particle formation and formulation considerations. Current Pharmaceutical Biotechnology 1:283-302 (2000)）において、タンパク質の安定性の喪失が観察されている。従来の凍結乾燥法では、ＬＤＨの安定性は高度であるが、冷却速度がおよそ１Ｋ／秒である結果、３０〜１００μｍのサイズの大型粒子がもたらされる（Y.-F. Maa and S. J. Prestrelski. Biopharmaceutical powders: particle formation and formulation considerations. Current Pharmaceutical Biotechnology 1:283-302 (2000)）。こうして、ＳＦＤ及び凍結乾燥法と比べて中程度であるＴＦＦ（ＳＦＬでも同様）の冷却速度の型により、肺内送達及び非経口送達への適用における所望の安定したサブミクロンタンパク質粒子を形成する有望な経路がもたらされる。

ＴＦＦ工程を用いて凍結させる溶液は、異なる濃度における水／エタノール混合物である溶媒ｍＬ当たり５ｍｇのリゾチーム最終濃度を有する。次いで、フィード溶液を４ｍＬ／分の流速で１７ゲージの注射針内を通し、１０ｃｍの高さから２２３Ｋの温度で維持されるステンレス鋼製回転ドラム状に落下させ、そこで、液滴を円板へと拡散させ、凍結させた。次いで、上記で説明した標準的な凍結乾燥手順を用いて、凍結した円板を凍結乾燥させた。結果として得られる粒子サイズ（図１１）は、前出で説明した通り、Malvern Mastersizerを用いて測定した。

水中におけるリゾチームの初期濃度を変化させる溶液を上記で説明される通りに凍結させ、次いで、凍結乾燥させてマイクロ粒子を作製した。凍結粒子は、回転ドラム上で凍結させ、次いで、個々の用量に応じて小型のバイアル内へとこすり落とした。作製された粒子のサイズは、上記で説明した通り、Malvern Mastersizerを用いて測定した（図１２）。

図１３Ａ〜１３Ｄでは、ガラス製バイアル内で調製されたＴＦＦリゾチームの形態が、ドラム上におけるＴＦＦと比較される。略述すると、それを液体の極低温流体、又はドライアイスと溶媒とからなる流体中に部分的に浸漬することにより冷却されたバイアル内で、直接に薄膜凍結を実施した。フィードは５ｍｇ／ｍＬのリゾチームであった。次いで、該バイアルの凍結乾燥により凍結物質中の水を除去した。生成物をバイアル内に維持した。バイアルから試料を除去し、走査電子顕微鏡法により解析した。形態は、金属製ドラム上で直接に調製された試料と同様であった。この技法の利点は、ガラス製バイアル内でＴＦＦを直接に実施して、サブミクロンの起伏を有する粒子を作製しうることである。次いで、バイアル内の粒子に賦形剤を添加することにより、最終投与形態を調合することができる。

脱イオン化水中に１５０ｍｇ／ｍＬのリゾチームフィードを用いて、ＴＦＦを実施した。これらの試料を凍結乾燥したら、これらをアセトニトリル中で再分散させ、粒子を分解した。次いで、ＴＦＦによりアセトニトリルを除去した。安息香酸ベンジル中に凍結乾燥後の最終粒子を再分散させ、安定した懸濁液を形成した（図１４）。

本発明は、安定したサブミクロンタンパク質粒子を作製しうる、少量（１ｍＬ未満）又は市販量のタンパク質溶液を凍結させる単純で効率的で着実な方法を示す。

本明細書で論じられる任意の実施形態は、本発明の任意の方法、キット、試薬、又は組成物に関して実装しうることが意図され、この逆のことも意図される。さらに、本発明の組成物を用いて、本発明の方法を達成することもできる。

本明細書で説明される特定の実施形態は、本発明の例示のために示されるものであり、本発明の限定のために示されるものではない。本発明の主要な特徴は、本発明の範囲から逸脱することなく、各種の実施形態で用いることができる。当業者は、日常的な実験、本発明で説明される具体的な手順に対する多数の同等の手順のみを用いることを認識するか、又はこれを確認することができる。このような同等的手順は、本発明の範囲内にあると考えられ、特許請求の範囲により包含される。

本明細書で言及されるすべての刊行物及び特許出願は、本発明が関連する当技術分野における当業者のレベルを示すものである。すべての刊行物及び特許出願は、各個別の刊行物又は特許出願が、参照により組込まれることが具体的及び個別に示されたと仮定する場合と同程度に、参照により本明細書に組込まれる。

特許請求の範囲及び／又は本明細書における「含む」という用語と共に用いられる場合の「１つの（a）」又は「１つの（an）」という語の使用は、「１」を意味することもあるが、また、「１又は複数の」、「少なくとも１の」、及び「１又は１を超える」の意味とも符合する。開示では、代替物のみ及び「及び／又は」を指す定義が支持されるが、代替物のみ又は代替物が互いに除外的であることが明示的に示されない限り、特許請求の範囲における「又は」という用語の使用は、「及び／又は」を意味する。本出願全体において、「約」という用語は、値が、値を決定するのに用いられる機器、方法に内在する誤差のばらつき又は被験対象間に存在するばらつきを含むことを示すのに用いられる。

本明細書及び（１又は複数の）請求項で用いられる「含む（comprising）」（並びに「含む（comprise）」及び「含む（comprises）」など、含む（comprising）の任意の形態）、「有する（having）」（並びに「有する（have）」及び「有する（has）」など、有する（having）の任意の形態）、「含む（including）」（並びに「含む（include）」及び「含む（includes）」など、含む（including）の任意の形態）、又は「含有する（containing）」（並びに「含有する（contain）」及び「含有する（contains）」など、含有する（containing）の任意の形態）という語は包含的であるか又はオープンエンドであり、列挙されていないさらなる要素又は方法ステップを除外しない。

本明細書で用いられる「又はこれらの組合せ」という用語は、該用語に先行して列挙される事項のすべての順列及び組合せを指す。例えば、「Ａ、Ｂ、Ｃ、又はこれらの組合せ」とはＡ、Ｂ、Ｃ、ＡＢ、ＡＣ、ＢＣ、又はＡＢＣの少なくとも１つ、及び特定の文脈で順序が重要である場合はまた、ＢＡ、ＣＡ、ＣＢ、ＣＢＡ、ＢＣＡ、ＡＣＢ、ＢＡＣ、又はＣＡＢの少なくとも１つも含むことが意図される。この例で続けて述べると、ＢＢ、ＡＡＡ、ＭＢ、ＢＢＣ、ＡＡＡＢＣＣＣＣ、ＣＢＢＡＡＡ、ＣＡＢＡＢＢなどの１又は複数の事項又は項目の反復を含有する組合せが明示的に含まれる。当業者は、文脈から別段に明らかでない限り、任意の組合せにおける事項又は項目の数に対する制限は存在しないことが典型的であると理解するであろう。

本明細書で開示及び主張されるすべての組成物及び／又は方法は、本開示に照らして過度の実験を行うことなく作製及び実施することができる。好ましい実施形態との関係で本発明の組成物及び方法を説明してきたが、本発明の概念、精神、及び範囲から逸脱することなく、組成物及び／又は方法に対して、また本明細書で説明される方法のステップ又は一連のステップにおいて、変更を適用しうることが当業者には明らかであろう。当業者に明らかなこのようなすべての同様の置換及び改変は、添付の特許請求の範囲により定義される本発明の精神、範囲、及び概念のうちにあるものとみなされる。
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Claims (29)

1. ミクロンサイズ又はサブミクロンサイズの粒子を調製する方法であって、
   水溶性の有効成分を１又は複数の溶媒中に溶解させるステップと、
   体積当たりの面積が５００ｃｍ^−１未満の蒸気−液体界面に有効成分が曝露されるように液滴を噴霧又は滴下するステップと、
   液滴を、液滴と表面との間に少なくとも３０℃の温度差を有する凍結表面と接触させるステップであって、前記表面が、液滴を、５００マイクロメートル未満の厚さ及び２５〜５００ｃｍ^−１の表面積対体積比を有する薄膜に凍結させるステップと
   を含み、
   前記有効成分がタンパク質又はペプチドである
   方法。
2. 凍結した材料から溶媒を除去して粒子を形成するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
3. 液滴が、約５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、５００、１，０００及び２，０００ミリ秒間の表面との接触により凍結する、請求項１に記載の方法。
4. 液滴が、約５０、１５０、又は５００ミリ秒間の表面との接触により凍結する、請求項１に記載の方法。
5. 液滴が、室温で０．１２〜５ｍｍの粒径を有する、請求項１に記載の方法。
6. 液滴が、室温で２〜４ｍｍの粒径を有する、請求項１に記載の方法。
7. 液滴が、表面上において、厚さ５０〜５００マイクロメートルの薄膜を形成する、請求項１に記載の方法。
8. 液滴が、５０〜２５０Ｋ／秒の冷却速度を有する、請求項１に記載の方法。
9. 溶媒除去後の粒子が、１０、１５、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、又は２００ｍ^２／グラムの表面積を有する、請求項２に記載の方法。
10. 有効成分がタンパク質又はペプチドであり、粒子が、粒子表面において、ペプチド又はタンパク質の５０％未満を有する、請求項２に記載の方法。
11. 有効成分がタンパク質又はペプチドであり、粒子が、粒子表面において、ペプチド又はタンパク質の２５％未満を有する、請求項２に記載の方法。
12. 粒子の粒径がサブミクロンである、請求項２に記載の方法。
13. 粒子が粒径１ミクロン未満の繊維を含有する、請求項２に記載の方法。
14. 表面が極低温固体、極低温気体、極低温液体、凍結流体、凍結気体、凍結固体、熱交換器、又は極低温度若しくは溶媒の凝固点未満の温度に達し得る熱伝導流体により冷却される、請求項１に記載の方法。
15. 有効成分が酵素を含み、前記酵素の酵素活性が９０％を超える、請求項１に記載の方法。
16. 有効成分がペプチド又はタンパク質を含み、ペプチド又はタンパク質の凝集が３％未満である、請求項１に記載の方法。
17. 液滴と表面との間の温度差が少なくとも５０℃である、請求項１に記載の方法。
18. 少なくとも１つの賦形剤をさらに含む、請求項１に記載の方法。
19. 請求項１に記載の方法により調製される薬剤粒子を含む医薬製剤。
20. ミクロンサイズ又はサブミクロンサイズの溶媒粒子を調製する方法であって、
    溶媒中の水溶性ペプチド又はタンパク質の液滴を噴霧又は滴下するステップであって、液滴が体積当たりの面積が２５０ｃｍ^−１未満の蒸気−液体界面に曝露されるステップと、液滴を、液滴と表面との間に少なくとも３０℃の温度差を有する凍結表面と接触させるステップであって、液滴が５００マイクロメートル未満の厚さ及び２５〜５００ｃｍ^−１の表面積対体積比を有する薄膜に凍結するステップと
    を含み、
    前記有効成分がタンパク質又はペプチドである
    方法。
21. 凍結した材料から溶媒を除去して粒子を形成するステップをさらに含む、請求項２０に記載の方法。
22. 溶媒が糖、リン脂質、界面活性剤、ポリマー界面活性剤、小胞、コポリマー、ホモポリマー及び生体ポリマーを含むポリマー、分散補助剤、並びに血清アルブミンの少なくとも１種をさらに含む、請求項２０に記載の方法。
23. ペプチド又はタンパク質が酵素を含み、前記酵素の酵素活性が９０％を超える、請求項２０に記載の方法。
24. ペプチド又はタンパク質の凝集が３％未満である、請求項２０に記載の方法。
25. 液滴と表面との間の温度差が少なくとも５０℃である、請求項２０に記載の方法。
26. 粒子が表面において、ペプチド又はタンパク質の５０％未満を有する、請求項２０に記載の方法。
27. 粒子が、表面において、ペプチド又はタンパク質の２５％未満を有する、請求項２０に記載の方法。
28. 請求項２０に記載の方法により調製される薬剤粒子を含む医薬製剤。
29. ミクロンサイズ又はサブミクロンサイズの粒子を調製する方法であって、
    溶液中に水溶性の有効成分を含むエマルジョンを調製するステップと、
    体積当たりの面積が５０ｃｍ^−１未満の蒸気−液体界面に有効成分が曝露されるように液滴を噴霧又は滴下するステップと、
    液滴を、液滴と表面との間に少なくとも３０℃の温度差を有する凍結表面と接触させるステップであって、前記表面が、液滴を、５００マイクロメートル未満の厚さ及び２５〜５００ｃｍ^−１の表面積対体積比を有する薄膜に凍結させるステップと
    を含み、
    前記有効成分がタンパク質又はペプチドである
    方法。

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