ES2108663T3

ES2108663T3 - Moduladores del peso corporal, ácidos nucleicos y proteínas correspondientes, y usos diagnósticos y terapéuticos de los mismos.

Info

Publication number: ES2108663T3
Application number: ES95929591T
Authority: ES
Inventors: Jeffrey M. Friedman; Yiying Zhang; Ricardo Proenca; Margherita Maffei; Jeffrey L. Halaas; Ketan Gajiwala; Stephen K. Burley
Original assignee: Rockefeller University
Current assignee: Rockefeller University
Priority date: 1994-08-17
Filing date: 1995-08-17
Publication date: 2012-02-17
Anticipated expiration: 2015-08-17
Also published as: SK22197A3; NZ291689A; MD970100A; CZ46097A3; HK1001495A1; JPH09506264A; PL183352B1; CA2195955C; NO326376B1; WO1996005309A2; LV11868B; MD2311F2; US6309853B1; BR9508596A; EE9700030A; MD2311G2; NO20065287L; NO970683D0; LV11868A; HUT78052A

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE GENERALMENTE AL CONTROL DEL PESO CORPORAL DE ANIMALES INCLUIDOS MAMIFEROS Y HUMANOS, Y EN CONCRETO A MATERIALES IDENTIFICADOS AQUI COMO MODULADORES DE PESO, Y A LOS USOS DE DIAGNOSTICO Y TERAPEUTICOS PARA LOS QUE SE PUEDEN DISPONER DICHOS MODULADORES. EN SU ASPECTO MAS AMPLIO, LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A LA EXTRACCION Y DESCUBRIMIENTO DE SECUENCIAS DE NUCLEOTIDO, Y PROTEINAS EXPRESADAS DE FORMA PUTATIVA POR DICHOS NUCLEOTIDOS O VARIACIONES DEGENERADAS DE LOS MISMOS, QUE MUESTRAN LA CAPACIDAD DE PARTICIPAR EN EL CONTROL DEL PESO CORPORAL DE MAMIFEROS. LAS SECUENCIAS DE NUCLEOTIDO EN CUESTION REPRESENTAN LOS GENES CORRESPONDIENTES AL GEN OB DE MURINA Y HUMANO, QUE SE DA POR SENTADO QUE JUEGAN UN PAPEL CRITICO EN LA REGULACION DEL PESO Y ADIPOSIDAD CORPORAL. DATOS PRELIMINARES, PRESENTADOS AQUI, SUGIEREN QUE EL PRODUCTO POLIPEPTIDO DEL GEN EN CUESTION FUNCIONA COMO UNA HORMONA. LA PRESENTE INVENCION PROPORCIONA ADEMAS MOLECULAS DE ACIDO NUCLEICO PARA USOCOMO SONDAS MOLECULARES, O COMO INICIADORES PARA AMPLIFICACION DE REACCION DE CADENA DE POLIMERASA (PCR), ES DECIR, OLIGONUCLEOTIDOS SINTETICOS O NATURALES. EN OTROS ASPECTOS, LA PRESENTE INVENCION PROPORCIONA UN VECTOR DE CLONACION, EL CUAL COMPRENDE LOS ACIDOS NUCLEICOS DE LA INVENCION; Y UNA BACTERIA, INSECTO O UN VECTOR DE EXPRESION DE MAMIFERO, QUE COMPRENDE LAS MOLECULAS DE ACIDO NUCLEICO DE LA INVENCION, OPERATIVAMENTE ASOCIADAS A UNA SECUENCIA DE CONTROL DE EXPRESION. EN CONSECUENCIA, LA INVENCION ADEMAS SE REFIERE A UNA CELULA BACTERIANA O DE MAMIFERO TRANSFERIDA O TRANSFORMADA CON UN VECTOR DE EXPRESION ADECUADO, Y CORRESPONDIENTEMENTE, AL USO DE LAS CONSTRUCCIONES ARRIBA MENCIONADAS EN LA PREPARACION DE LOS MODULADORES DE LA INVENCION. TAMBIEN SE PROPORCIONAN ANTICUERPOS PARA EL POLIPEPTIDO OB. ADEMAS, SE PROPORCIONA UN METODO PARA MODULAR EL PESO CORPORAL DE UN MAMIFERO. EN EJEMPLOS ESPECIFICOS, SE PROPORCIONAN GENES QUE CODIFICAN DOS ISOFORMAS TANTO DE POLIPEPTIDOS OB DE MURINA COMO DE HUMANO.

Description

Moduladores del peso corporal, ácidos nucleicos y proteínas correspondientes, y usos diagnósticos y terapéuticos

de los mismos.

CAMPO TÉCNICO DE LA INVENCIÓN

5 La presente invención se refiere en general al control de peso corporal de mamíferos, incluyendo animales y seres humanos y, más particularmente, a materiales identificados en el presente documento como moduladores de peso, y a los usos en diagnóstico y terapéuticos a los que pueden aplicarse tales moduladores.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La obesidad, definida como un exceso de grasa de cuerpo con respecto a la masa corporal magra, está asociada

10 con morbideces psicológicas y médicas importantes, incluyendo esta última hipertensión, niveles elevados de lípidos en la sangre y diabetes mellitus tipo II, no dependiente de insulina (NIDDM). Existen 6-10 millones de individuos con NIDDM en los Estados Unidos, lo que incluye el 18% de la población de 65 años de edad [Harris et al., Int. J. Obes., 11:275-283 (1987)]. Aproximadamente el 45% de los varones y el 70% de las mujeres con NIDDM son obesos y su diabetes se mejora sustancialmente o se elimina mediante la reducción del peso [Harris, Diabetes Care, 14(3): 639

15 648 (1991)]. Tal como se describe más adelante, tanto la obesidad como la NIDDM son fuertemente hereditarias, si bien no se ha identificado los genes que predisponen a ello. Las bases genéticas moleculares de estos trastornos metabólicamente relacionados es un problema importante, que no se entiende bien.

La asimilación, el almacenamiento y la utilización de la energía nutriente constituyen un sistema homeostático complejo, central para la supervivencia de los metazoarios. Entre los mamíferos terrestres, el almacenamiento en el 20 tejido adiposo de grandes cantidades de combustible metabólico, como triglicéridos, es crucial para los periodos de supervivencia en los que está privado de alimento. La necesidad de mantener un nivel fijo de almacenamientos energéticos sin alteraciones continuas en el tamaño y la forma del organismo, requiere la obtención de un equilibrio entre la ingestión de energía y su gasto. Sin embargo, los mecanismos moleculares que regulan el equilibrio energético siguen sin ser dilucidados. El aislamiento de las moléculas que transducen la información nutricional y

25 controlan el equilibrio energético será crítico para la comprensión de la regulación del peso corporal en la salud y en la enfermedad.

El nivel de adiposidad de un individuo, en gran medida, se determina genéticamente. El examen de los regímenes de concordancia de peso corporal y adiposidad entre gemelos monocigóticos y dicigóticos, o adoptados y sus padres biológicos, ha sugerido que la posibilidad de heredad la obesidad (0,4- 0,8) supera la de muchas otras 30 tendencias que se cree comúnmente que tienen un componente genético sustancial, tales como la esquizofrenia, el alcoholismo y la ateroesclerosis [Stunkard et al., N. Engl. J. Med., 322:1483-1487 (1990)]. También se ha informado de similitudes familiares en regímenes de gasto energético [Bogardus et al. Diabetes, 35:1-5 (1986)]. El análisis genético en poblaciones delimitadas geográficamente ha sugerido que un número relativamente pequeño de genes puede ser responsable del 30 al 50% de la variación de la composición del cuerpo [Moll et al., Am. J. Hum. Genet.,

35 49:1243-1255 (1991)]. Sin embargo, ninguno de los genes responsable de la obesidad en la población general ha sido mapeado genéticamente para definir una ubicación cromosómica.

Los modelos de obesidad en roedores incluyen siete mutaciones de un solo gen aparentemente. Las mutaciones de obesidad en ratones, estudiadas más intensamente, son los genes ob (obesos) y db (diabetes). Cuando están presentes en el mismo antecedente de cepa genética, ob y db dan como resultado genotipos metabólicos y de 40 conducta indistinguibles, que sugiere que esos genes pueden funcionar en la misma trayectoria fisiológica [Coleman et al., Diabetologia, 14:141-148 (1978)]. Los homocigotos de ratones ya sea para cualquiera de las mutaciones son hiperfágicos e hipometabólicos, lo que conduce a un genotipo obeso que es notable a un mes de edad. El peso de esos animales tiende a estabilizarse en 60-70 gramos (en comparación con 30-35 gramos en los ratones de control). Los animales ob y db manifiestan una miriada de otros cambios hormonales y metabólicos que han hecho difícil

45 identificar el defecto primario atribuible a la mutación [Bray et al., Am. J. Clin. Nutr., 50:891-902 (1989)].

Cada uno de los modelos de obesidad en roedores va acompañado por alteraciones en el metabolismo de los carbohidratos, que se parece a los de la diabetes de tipo II en el hombre. En muchos casos, la severidad de la diabetes depende parcialmente del antecedente racial del ratón [Leiter, Endocrinology, 124:912-922 (1989)]. Tanto para ob como para db los ratones C57BL/K congénicos desarrollan una diabetes severa con necrosis final de células

50 1 y atrofia de la isleta, lo que da como resultado una insulinopenia relativa. Inversamente, los ratones ob y db C57BL/6J congénicos desarrollan una diabetes transitoria, resistente a la insulina, que se compensa eventualmente por una hipertrofia de las células 1, que se parece a la diabetes de tipo II humana.

El fenotipo de los ratones ob y db se parece a la obesidad humana en formas diferentes al desarrollo de la diabetes; los ratones mutantes comen más y gastan menos energía que los controles magros (al igual que los seres humanos 55 obesos). Este fenotipo también es bastante similar al que se ve en los animales con lesiones del hipotálamo ventromedial, lo que sugiere que ambas mutaciones pueden interferir con la capacidad de integrar apropiadamente o responder apropiadamente a la información nutricional dentro del sistema nervioso central. El apoyo de esta hipótesis viene de los resultados de experimentos de parabiosis [Coleman, Diabetologia, 9:294-298 (1973)] que

sugieren que los ratones ob son deficientes en un factor de saciedad circulante y que los ratones db son resistentes a los efectos del factor ob (posiblemente debido a un defecto en el receptor de ob). Esos experimentos han conducido a la conclusión de que la obesidad en estos ratones mutantes puede ser el resultado de diferentes defectos en una hélice y/o un centro integrante aferentes del mecanismo de realimentación postulado, que controla la composición del cuerpo.

Usando marcadores moleculares y genéticos clásicos, se han mapeado los genes ob y db hasta el cromosoma 6 próximo y el cromosoma medio 4, respectivamente [Bahary et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 87:8642-8646 (1990); Friedman et al., Genomics, 11:1054-1062 (1991)]. En ambos casos, el mapa de mutaciones a las regiones del genoma de ratón que son singénicas con las humanas, sugieren que, si hay homólogos humanos de ob y db, probablemente tengan el mismo mapa, respectivamente, que los cromosomas humanos 7q y 1p. Los defectos en el gen db pueden dar como resultado obesidad en otras especies de mamíferos: en cruzas genéticas entre ratas fa/fa de Zucker y ratas +/+ Brown Norway, la mutación fa (cromosoma de rata 5) se flanquea por los mismos sitios que franquean db en el ratón [Truett et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:7806-7809 (1991)].

Debido a que hay miles de factores que parecen impactar el peso corporal, no ha sido posible predecir cuáles factores y, más particularmente, cuáles mecanismos homeostáticos son primariamente determinantes para el peso corporal. Por tanto, el problema principal que originó la presente invención es proveer moduladores del peso corporal que permitan controlar la adiposidad y el contenido de grasa de los mamíferos.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

Según la presente invención, el problema de controlar la adiposidad y el contenido en grasa de los animales, particularmente de los mamíferos, se ha solucionado mediante la provisión de polipéptidos de obesidad (OB) que pueden modular el peso corporal, seleccionados del grupo que consiste en:

(a): un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NOS: 2, 4, 5 ó 6;

(b): Un fragmento biológicamente activo del polipéptido de (a), en el que ficho fragmento de biológicamente activo modula el peso corporal de un animal.

La presente invención se refiere además a moléculas de ácido nucleico que codifican para un polipéptido OB, tal como se definió anteriormemente, así como vectores que comprenden una respectiva molécula de ADN y hospedadores unicelulares transformados o transfectados con una respectiva molécula de ADN.

En un aspecto adicional la presente invención se refiere a métodos para preparar un polipéptido OB tal como se definió anteriormente que puede modular el peso corporal, comprendiendo el método:

(a): cultivar una célula que comprende una secuencia de ADN que codifica para un polipéptido OB de la presente invención en condiciones que proporcionan la expresión de polipéptido OB; y

(b): recuperar el polipéptido OB expresado.

Según una realización adicional, la presente invención proporciona anticuerpos específicos para un polipéptido OB que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NOS: 2, 4, 5 ó 6, líneas celulares inmortales que producen respectivos anticuerpos y métodos para preparar respectivos anticuerpos con especificidad para un polipéptido OB tal como se definió anteriormente, comprendiendo el método:

(a): conjugar un polipéptido OB tal como se definió anteriormente a una proteína portadora;

(b): inmunizar un animal hospedador con el conjugado de fragmento de polipéptido OB-proteína portadora de la etapa (a), mezclado con un adyuvante; y

(c): obtener el anticuerpo del animal hospedador inmunizado.

La presente invención también proporciona métodos para medir la presencia de un polipéptido OB tal como se definió anteriormente en una muestra, comprendiendo el método:

(a): poner en contacto una muestra que se sospecha que contiene un polipéptido OB, con un anticuerpo que se une específicamente al polipéptido OB en condiciones que permitan la formación de complejos de reacción que comprenden el anticuerpo y el polipéptido OB; y

(b): detectar la formación de los complejos de reacción que comprenden el anticuerpo y el polipéptido OB en la muestra; en el que la detección de la formación de complejos de reacción indica la presencia de polipéptido OB en la muestra.

(a): detectar la formación de complejos de reacción en una muestra biológica, según el método descrito anteriormente; y

(b): evaluar la cantidad de complejos de reacción formados, cantidad de complejos de reacción que corresponde al nivel de polipéptido OB en la muestra biológica.

Según una realización alternativa, la presente invención proporciona métodos in vitro para detectar o diagnosticar la presencia de una enfermedad asociada con niveles elevados o disminuidos de polipéptido OB en un sujeto mamífero que comprende:

(a): evaluar el nivel de polipéptido OB en una muestra biológica, de un sujeto mamífero tal como se describió anteriormente; y

(b): comparar el nivel detectado en el etapa (a) con un nivel de polipéptido OB presente en sujetos normales o en el sujeto en un tiempo anterior; en el que un incremento en el nivel de polipéptido OB, en comparación con niveles normales, indica una enfermedad asociada con niveles elevados de polipéptido OB; y un nivel disminuido de polipéptido OB, en comparación con niveles normales, indica una enfermedad asociada con niveles disminuidos de polipéptido OB.

En otra realización la invención se refiere a métodos in vitro para evaluar en nivel de polipéptido OB tal como se definió anteriormente en una muestra biológica, comprendiendo el método:

Otro método in vitro de la presente invención se refiere a monitorizar un tratamiento terapéutico de una enfermedad asociada con niveles elevados o disminuidos de polipéptido OB tal como se definió anteriormente en un sujeto mamífero, que comprende evaluar los niveles de polipéptido OB en una serie de muestras biológicas obtenidas en diferentes puntos de tiempo de un sujeto mamífero que está sometido a un tratamiento terapéutico para una enfermedad asociada con niveles elevados o disminuidos de polipéptido OB tal como se describió anteriormente.

En otro aspecto la invención se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden un polipéptido OB tal como se definió anteriormente y un portador farmacéuticamente aceptable.

La presente invención proporciona además composiciones cosméticas que mejoran la apariencia del cuerpo, para reducir el peso corporal de un individuo que comprende un polipéptido OB tal como se definió anteriormente y un portador aceptable.

Alternativamente, la invención se refiere a una molécula de ácido nucleico que codifica para un polipéptido OB tal como se definió anteriormente para su uso en la modificación del peso corporal de un animal.

En una alternativa adicional la invención proporciona un polipéptido OB tal como se definió anteriormente para su uso en la modificación del peso corporal de un animal. El polipéptido puede usarse para tratar un trastorno seleccionado del grupo que consiste en diabetes, tensión arterial alta y elevado colesterol.

Se describen realizaciones adicionales de la presente invención en las reivindicaciones.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La figura 1 (A a E) ilustra la secuencia de ácido nucleico (SEQ ID NO:1) y la secuencia de aminoácidos deducida (SEQ ID NO:2) derivada para el ADNc OB murino. Un líder 5' de 39 pares de bases fue seguido por un marco de lectura abierto de 167 aminoácidos y una secuencia no traducida de aproximadamente 3,7 kb, en 3'. (En la solicitud de patente previamente presentada, número de serie 08/347563, presentada el 30 de noviembre de 1994, y número de serie 08/438,431, presentada el 10 de mayo de 1995, se determinó subsecuentemente una secuencia no codificadora 5' adicional, de 58 pares de bases, que era un artefacto clonador. Este artefacto no llevaba en la región codificadora la región no codificadora 5' de 39 pares de bases, ilustrada en la figura 1, ni tampoco la región no codificadora del gen). Se muestra un total de alrededor de 2500 pares de bases de la secuencia 3' no traducida. El análisis de la secuencia de proteínas predicha por observación y utilizando el programa informático SigSeq, indica la presencia de una secuencia señal (subrayada). Se observó la microheterogeneidad del ADNc ya que aproximadamente el 70% de los ADNc tenía un codón de glutamina en el codón 49 y el 30% no lo tenía (véanse las figuras 5 y 6, más adelante). Este aminoácido está subrayado al igual que el codón de arginina que se muta en ratones ob/ob C57BL/6J (ratones 1J).

La figura 2 (A y B) representa la secuencia de ácido nucleico (SEQ ID NO:3) derivada del ADNc OB humano. Los nucleótidos están numerados de 1 a 701, con un sitio inicial en el nucleótido 46 y una terminación en el nucleótido

550.

La figura 3 representa la secuencia de aminoácidos total, deducida, (SEQ ID NO:4) derivada para el gen OB humano que corresponde a la secuencia de ácido nucleico de la figura 2A y B. Los aminoácidos están numerados a partir de 1 hasta 167. El sitio de escisión de la secuencia señal está situado después del aminoácido 21 (Ala) de manera que la proteína madura se extiende desde el aminoácido 22 (Val) hasta el aminoácido 167 (Cys).

La figura 4 representa la comparación entre las secuencias de aminoácido deducidas de murino (SEQ ID NO:2) y ser humano (SEQ ID NO:4). La secuencia de la secuencia de aminoácidos deducido OB humano fue sumamente homóloga a la del ratón. Se observan los cambios conservativos mediante una raya y los cambios no conservativos

mediante un asterisco. El codón de glutamina variable está subrayado al igual que la posición de la mutación no sentido en ratones C57Bl/6J ob/ob (1J). En general, hay una entidad del 83% al nivel de aminoácido, aunque sólo se encontraron ocho sustituciones entre la valina en el codón 22 (inmediatamente en el sentido de 3’ del sobrante de la secuencia señal) y la cisteína en la posición 117.

La figura 5 representa la secuencia de aminoácidos de longitud completa (SEQ ID NO:5) derivada del gen OB de murino tal como se muestra en la figura 3, pero que carece de glutamina en la posición 49. Se enumeran los aminoácidos desde 1 hasta 166. Un sitio de escisión de la secuencia señal está situado después del aminoácido 21 (Ala) (y, por tanto, antes de que se omita la glutamina 49) de manera que la proteína madura se extienda desde el aminoácido 22 (Val) hasta el aminoácido 166 (Cys).

La figura 6 representa la secuencia de aminoácidos total deducida (SEQ ID NO:6) derivada para el gen OB humano tal como se muestra en la figura 4, pero que carece de glutamina en la posición 49. Se enumeran los aminoácidos desde 1 hasta 166. Un sitio de escisión de la secuencia señal está situado después del aminoácido 21 (Ala) (y, por tanto, antes de que se omita la glutamina 49), de manera que la proteína madura se extienda desde el aminoácido 22 (Val) hasta el aminoácido 166 (Cys).

La figura 7. (A) Mapa físico de la ubicación de ob en el cromosoma de murino y los mapas de clonación YAC y P1. “M” y “N” corresponden a los sitios de restricción MulI y NotI. Los números corresponden a animales individuales que se recombinaron en la región de ob de 1606 meiosis, que fueron marcadas. Met, Pax 4, D6Rck39, D6Rck13 y Cpa se refieren a ubicaciones en la región de ob que se unen a las sondas de ADN. Se aislaron las YAC utilizando como sondas D6Rck13 y Pax-4 y se recuperaron los extremos utilizando el vectorete PCR y/o rescate de extremo de plásmido y se utilizó a su vez para aislar nuevas YAC. (B) El cóntigo de YAC resultante. Una de las YAC en este cóntigo, Y902A0925 fue quimérica. Cada una de las sondas usadas para establecer el genotipo de los animales recombinantes se indica entre paréntesis. (6) Corresponde a YAC 107; (5) corresponde a M16(+) (o M16(pLUS)); (4) corresponde a adu(+); (3) corresponde a aad(pICL); (2) corresponde a 53(pICL); y (1) corresponde a 53(+). (C) El cóntigo P1 de los clones de bacteriófago P1 se aisló con sondas extremas YAC seleccionadas. se aisló el gen ob en un clon P1 aislado utilizando el extremo distal de YAC YB6S2F12 (extremo (4)) alternativamente denominado en el presente documento adu(+)).

La figura 8 presenta una fotografía de una mancha con bromuro de etidio de 192 aislados independientes del cuarto experimento atrapador de exón que fue amplificado por PCR y caracterizado.

La figura 9 es una fotografía de una mancha con bromuro de etidio de clones amplificados por PCR que se sospecha que llevan ob. Cada uno de los 7 clones que no llevan el artefacto se volvió a amplificar utilizando PCR y se sometió a electroforesis sobre un gel de agarosa al 1% en TBE y se manchó con bromuro de etidio. Los marcadores de tamaño (el carril no numerado de la extrema izquierda) son los comercialmente disponibles “marcador de tamaño molecular 1 kB”. Carril 1 -- clon 1D12, que contiene una “secuencia de VIH”. Carril 2 -- clon 1F1, un clon novedoso fuera de la región ob. Carril 3 -- clon 1H3. Carril 4 -- clon 2B2, que es idéntico a 1F1. Carril 5

-: clon 2G7, que contiene un exón ob. Carril 6 -- clon 2G11, que es idéntico a 1F1. Carril 7 -- clon 2H1, que no contiene un inserto.

La figura 10 presenta la secuencia del clon 2G7 (SEQ ID NO:7), que incluye un exón que codifica una parte del gen OB. Las secuencias de cebador utilizadas para amplificar este exón están encerradas en casilla en la figura (SEQ ID NOS:8 y 9).

La figura 11 (A) Análisis de transcripción inversa-PCR del ARNm, a partir de diferentes tejidos del mismo ratón, con cebadores 2G7 e cebadores de actina. Se llevaron a cabo las reacciones RT-PCR utilizando 100 ng de ARN total, transcrito inversamente con oligo dT como cebador para la síntesis de ADNc de primera cadena. Se llevó a cabo la amplificación de PCR durante 35 ciclos con una desnaturalización de 94º para 1'; 55º de hidridación para 1'; y extensiones a 72ºC para 2', con una autoextensión de 1' segundo por ciclo. Se resolvió los productos RT-PCR en una operación en gel de agarosa, de bajo punto de fusión, al 2%, en 1x de tampón TBE. (B) Transferencia de Northern de ARNm a partir de diferentes órganos del ratón, utilizando como sonda 2G7 marcado con PCR. Se sometieron a electroforesis 10 !g de ARN total de cada uno de los tejidos en un gel de agarosa con formaldehído. Se hibridó a 65ºC la sonda en Rapid Haybe (Amersham). Las señales autoradiográficas fueron evidentes después de 1 hora de exposición; lo que el experimento mostró fueron los resultados de una exposición de 24 horas.

La figura 12 (A) Una mancha con bromuro etidio de una reacción de RT-PCR sobre el ARN de célula grasa (tejido adiposo blanco), procedente de cada una de las cepas de ratón mencionadas. Se transcribió inversamente 100 ng de ARN total para cada muestra, utilizando oligo dT y transcriptasa inversa, y se amplificó por PCR el ADNc de una sola cadena resultante, con los cebadores 2G7 (bandas inferiores) o cebadores de actina (bandas superiores). Los cebadores 2G7 y los cebadores de actina fueron incluidos en la misma reacción de PCR. Se procesaron los productos sobre un gel TBE con agarosa al 1%. (B) Análisis de Northern que corresponde a (A). Se procesaron diez !g de ARN de célula grasa (tejido adiposo blanco) de cada una de las cepas indicadas, y se sondeó con la sonda 2G7 marcada con PCR, como en la figura 11B anterior. Se evidenció un incremento de aproximadamente 20 veces el nivel de ARNm de 2G/ en ARN de tejido adiposo blanco, procedente de la cepa C57Bl/6J ob/ob (1J), con respecto a los compañeros de camada magros. Tanto en los experimentos RT-PCR como Northern no hubo señal detectable

en ARN de 2G7 a partir de ratones SM/Ckc-+Dacob2J/ob2J (2J), incluso después de una exposición durante 2 semanas. Se muestra la exposición autorradiográfica de 24 horas. Se hibridó el mismo filtro a una sonda de actina (parte inferior del panel).

La figura 13 es un análisis de Northern de animales 2J adicionales y animales de control, que confirma la ausencia de ARNm de ob de animales 2J. Se realizó el análisis de Northern como en las figuras 11 y 12. En este caso, el ARN de control fue ap2, un transcripto específico a la grasa. No hay significado en la densidad variable de las bandas ap2.

La figura 14 compara la secuencia de ADN de los ratones C57BL/6J (normal) y C57BL/6J ob/ob (1J) en la región de la mutación puntual que conduce a la introducción de un codón de terminación prematura (mutación sin sentido) en el ADNc de la cepa mutante. Los ratones ob/ob tuvieron una mutación C > T que cambió un residuo de arginina en la posición 105. Este cambio de base se muestra como la salida del secuenciador de ADN automático. Se llevó a cabo RT-PCR utilizando ARN de tejido adiposo blanco procedente de ambas cepas (+/+ y ob/ob) utilizando cebadores procedentes de las regiones no traducidas de 5' y 3'. Los productos de reacción PCR fueron purificados en gel y secuenciados directamente en forma manual y utilizando un secuenciador automático Applied Biosystems, Inc. 373A, con cebadores a lo largo de ambas cadenas de la secuencia codificante.

La figura 15 (A) es una transferencia de Southern de ADN genómico procedente de cada una de las cepas de ratón listadas. Aproximadamente 5 !g de ADN (derivado del ADN genómico preparado a partir del hígado, el riñón o el bazo) fue digerido por restricción con la enzima de restricción indicada. Entonces se sometió a electroforesis el ADN en un gel TBE con agarosa al 1% y se sondeó con 2G7 marcado con PCR. La digestión por restricción con BglII reveló un incremento en el tamaño de un fragmento BglII aproximadamente de 9 kB (el más largo) en ADN de SM/Ckc-+Dacob2J/ob2J (2J). No pudo detectarse los RFLP con ninguna otra enzima de restricción. El mapeo de restricción preliminar de ADN genómico indicó que el sitio BglII polimórfico está aproximadamente 7 kB en el sentido de 5’ del sitio inicial de transcripción. Ninguna de las otras enzimas sometida a prueba se extendió más allá del sitio inicial de ARNm. (B) La segregación de un polimorfismo BglII en la cepa SM/Ckc-+Dacob2J/ob2J. Seis progenies obesas y cinco progenies magras de la misma generación de la colonia coisógena SM/Ckc-+Dacob2J/ob2J (2J) fueron determinadas en genotipo marcando el polimorfismo BglII como se muestra en (A). Todos los animales fenotípicamente obesos fueron homocigóticos para el alelo mayor del fragmento BglII polimórfico. El ADN en el carril “control” se preparó a partir de un ratón SM/Ckc-+Dac+/+ no relacionado, criado separadamente de la colonia SM/Ckc-+Dacob2J/ob2J.

La figura 16 es una transferencia de Southern de ADN genómico digerido con EcoRI procedente de las especies listadas, utilizando como una sonda de ADNc OB (es decir, transferencia zoo). Las señales de hibridación fueron detectables en cada muestra de vertebrados, incluso después de una hibridación de rigurosidad moderada. El ADN de gato en este experimento se degradó ligeramente. Se procesó el ADN restringido sobre un gel TBE con 1% de agarosa, y se transfirió a una membrana inmobilón para sondear. Se hibridó el filtro a 65ºC y se lavó en 2X SSC/ SDS al 0,2% a 65ºC dos veces durante 20 minutos y se expuso durante 3 días utilizando película X-OMAT de Kodak (Rochester, N.Y.).

La figura 17 presenta la región clonadora de expresión del vector pET-15b (Novagen) (SEQ ID NOS:11 y 12).

La figura 18 presenta el análisis del eluato procedente de la columna de resina de aglutinación His (Ni) para una fusión ob murino maduro recombinante, a cola de His (A) y fusión de OB humano maduro a una cola de His (B). Se transformó las bacterias con vectores pETM9 y pETH14, respectivamente. Por inducción con IPTG 1 mM en condiciones óptimas, las bacterias transformadas fueron capaces de producir de 100 a 300 !g/ml de proteína de fusión OB, primariamente en los cuerpos de inclusión. Se solubilizó los cuerpos de inclusión con guanidina-HCl 6 M

o urea, y se cargó la proteína de fusión (presente en el sobrenadante de lisis) en la columna de resina de aglutinación His (Ni) en 10 ml de 1x tampón de aglutinación con urea. Se eluyó por etapas la columna con alícuotas de 5 ml de 20 !M, 60 !M y 300 !M de imidazol y finalmente con el tampón en tiras. Se analizaron las alícuotas para la presencia de la fusión del polipéptido OB en un gel de acrilamida al 15%. Cada carril contiene el equivalente de 100 !l de extracto bacteriano.

La figura 19 (A) es una traducción in vitro de ARN OB. Se subclonó ADNc OB humano en un vector pGEM. Se linealizó el plásmido y se sintetizó ARN de cepa más utilizando polimerasa Sp6. Se tradujo el ARN sintetizado in vitro en presencia o ausencia de membranas microsómicas pancreáticas caninas. Se vio un producto de traducción primario de 18 kD aproximadamente, después de la traducción in vitro. La adición de membranas microsómicas a la reacción condujo a la aparición de un segundo producto de traducción, aproximadamente 2 kD menor que el producto de traducción primario. El tamaño de producto de traducción de ARN de interleucina 1a, que carece de una secuencia señal codificada, permaneció sin cambio mediante la adición de membranas microsómicas. Estos datos indicaron la presencia de una secuencia señal funcional. (B) Traducción in vitro en presencia o ausencia de proteinasa K. El tratamiento con proteasa dio como resultado una proteólisis completa del producto de traducción primario de 18 kD, mientras que no fue afectada la forma procesada de 16 kD. La permeabilización del microsoma con TRITON-X100 al 0,1% hizo sensible a la proteasa la forma procesada. Estos resultados indican que el producto se había trasladado al lumen del microsoma.

La figura 20 (A a E) Es la secuencia de un gen OB humano (SEQ ID NOS:22 y 24). (F) Es un diagrama esquemático del gen OB de murino. (G) Es un diagrama esquemático del gen OB humano. Tanto como en (F) como en (G) los codones inicial y de detención están subrayados. No hay evidencia de un primer intrón homólogo al primer intrón de ratón en el gen humano, pero no puede excluirse su existencia.

La figura 21 presenta un dibujo esquemático de una de las estrategias clonadoras empleadas para obtener la expresión recombinante de OB en levadura Pichia. (A) El vector de expresión de OB con una secuencia señal de factor de acoplamiento a. (B) El dibujo esquemático de la estructura de la proteína de fusión recombinante, que incluye la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:26) que muestra el sitio XhoI y los sitios de escisión KEX-2 y STE13 putativos, y los aminoácidos excedentes N-terminales después de la división en KEX-2 (SEQ ID NO:27). (C) Es una estrategia alternativa para producir OB maduros que implica la preparación de una construcción con una secuencia de aminoácidos que corresponde a un sitio de escisión XhoI y un sitio de escisión KEX-2, inmediatamente en el sentido de 5’ de la secuencia de polipéptido ob maduro (SEQ ID NO:28).

La figura 22 es una estrategia de expresión alternativa en Pichia. (A) El vector de expresión de una fusión OB con una cola de His adoptado a partir del sistema de expresión pET bajo el control de la secuencia señal de factor de acoplamiento a (SEQ ID NO:33). (B) Es un dibujo esquemático de la estructura de la proteína de fusión OB recombinante, que contiene una cola de His que incluye la secuencia señal de factor de acoplamiento a, sitios de escisión KEX-2 y STE-13 putativos, la cola de His y un sitio de escisión de trombina, que producirían OB con tres residuos de aminoácido N-terminales excedentes.

La figura 23 (A) Es un análisis de PAGE de la expresión de OB murino (tanto en las formas microheterógenas, es decir, que contienen y que no contienen Gln 49) en la levadura Pichia transformada. La banda esperada de aproximadamente 16 kD es visible en el fluido de cultivo de levadura transformada (segundo y tercer carriles) pero no en el fluido de cultivo procedente de levadura no transformada (primer carril). (B) El análisis de PAGE del polipéptido OB recombinante, parcialmente purificado, sobre carboximetilcelulosa, un intercambiador de cationes débil. Es muy visible una banda de alrededor de 16 kD en las fracciones 3 y 4 procedentes de la columna, que se eluyó con 250 mM de NaCl. Carril 1 -- muestra cargada; carril 2 -- flujo que atraviesa; carriles 3-5 -- fracciones eluidas con 250 mM de NaCl.

La figura 24 muestra que la proteína OB circula en el plasma de ratón. (A) Inmunoprecipitaciones procedentes de sangre de ratón. Se limpiaron previamente 0,5 ml de plasma de ratón con sefarosa no conjugada y se incubó durante la noche con anticuerpos anti-OB inmunopurificados, conjugados a gránulos de sefarosa 4B. Se separó el inmunoprecipitado en un gel al SDS-PAGE al 15%, se transfirió y se realizó la inmunotransferencia de tipo Western, con un anticuerpo anti-OB. La proteína migrada con un peso molecular de aproximadamente 16 kD, a la misma posición que la proteína ob de ratón maduro, se expresó en levadura. La proteína estuvo ausente en el plasma de los ratones C57BL/6J ob/ob y aumentó diez veces en el plasma de los ratones C57BLB/Ks db/db con respecto a los ratones de tipo natural. Se había sugerido que los ratones db producían un exceso de la proteína OB, secundario a la resistencia a sus efectos. (B) Los niveles incrementados de OB en ratas grasas. La rata grasa es obesa como resultado de una mutación recesiva del cromosoma 5 de rata. Los datos genéticos han sugerido un defecto en el mismo gen mutado en los ratones db. El plasma procedente de ratas grasas y los compañeros de camada magros se inmunoprecipitaron y se procesaron las inmunotransferencias de tipo Western. Se ve un incremento de veinte veces en el nivel circulante de OB en los animales mutantes. (C) La cuantificación de la proteína OB en el plasma de ratón. Se añadieron cantidades crecientes de proteína de ratón recombinante a 100 I de plasma procedente de ratones ob y se inmunoprecipitaron. Se comparó la intensidad de señal en las inmunotransferencias de tipo Western con la de 100 I de plasma procedente de ratones del tipo natural. Se ve un incremento lineal en la intensidad de señal con cantidades que aumentan de la proteína recombinante, lo que demuestra que las inmunoprecipitaciones fueron efectuadas en condiciones de exceso de anticuerpo. Se ve señales similares en la muestra de plasma de tipo natural y la muestra con 2 ng de proteína recombinante, lo que indica el nivel de circulación en el plasma de ratón que es aproximadamente de 20 ng/ml. (D) La proteína OB en los extractos de tejido adiposo. Los extractos citoplásmicos de tejido adiposo de ratón fueron preparados a partir de ratones db y de tipo natural. Las inmunotransferencias de tipo Western mostraron niveles incrementados de la proteína de 16 kD en los extractos preparados a partir de ratones db.

La figura 25 muestra que la proteína OB circula a niveles variables en el plasma humano. (A) Las inmunotransferencias de tipo Western del plasma humano. Se obtuvieron muestras de plasma de seis voluntarios magros. La inmunoprecipitación y la inmunotransferencia de tipo Western revelaron la presencia de una proteína de 16 kD inmunorreactiva, de tamaño idéntico a una proteína humana recombinante de 146 aminoácidos, expresada en levadura. Se ven los niveles variables de la proteína en cada una de las seis muestras. (B) Un ELISA (Inmunoensayo ligado a enzima) para ob humano. Se recubrió las placas de microtitulación con anticuerpos OB antiser humano inmunopurificados. Se añadió cantidades conocidas de proteína recombinante a las placas y se detectó utilizando anticuerpos anti-ob biotinilados inmunopurificados. Se representó la absorbencia a 414 nm contra concentraciones conocidas de OB para producir una curva patrón. La curva patrón resultante mostró que el análisis podría detectar 1 ng/ml o más de la proteína OB humana. (C) La cuantificación de la proteína OB es plasma humano. Se llevó a cabo el inmunoanálisis ELISA utilizando 100 I de plasmas procedentes de seis voluntarios magros y se usó las normas en el panel B. Se ve que los niveles de la proteína OB varían desde 2 ng/ml en HP1

hasta 15 ng/ml en HP6. Estos datos se correlacionaron con los datos de la inmunotransferencia de tipo Western del panel A.

La figura 26 muestra que la proteína OB forma ligaduras disulfuro intermoleculares o intramoleculares. (A) Inmunotransferencias de tipo Western en condiciones reductoras y no reductoras. Las inmunotransferencias de tipo Western de plasma de ratón y ser humano se repitieron con y sin la adición de agentes reductores al tampón de muestra. Cuando se omitió 1-mercapto etanol del tampón de muestra, los inmunoprecipitados del plasma db migraron con una masa molecular aparente de 16 kD y 32 kD. La adición de 1-mercapto etanol al tampón conduce a la desaparición del resto de 32 kD (véase la figura 24). Este resultado se recapitula cuando se expresa la levadura de ratón en la levadura Pichia pastoris. En ese caso, la proteína OB de ratón migra a la posición de un dímero. En condiciones reductoras, la proteína de ratón recombinante, purificada, migra con un peso molecular aparente de 16 kD lo que indica que la forma molecular de 32 kD es el resultado de una o dos uniones de disulfuro intermoleculares. La proteína humana expresada in vivo y en Pichia pastoris migra con una masa molecular de 16 kD, tanto en condiciones reductoras como no reductoras (datos no mostrados). (B) La proteína humana expresada en levadura contiene una ligadura disulfuro intramolecular. Las proteínas secretadas generalmente asumen su conformación correcta cuando son expresadas en el sistema de expresión Pichia pastoris. La proteína humana madura de 146 aminoácidos fue expresada en Pichia pastoris y purificada en el medio de levadura mediante un protocolo de purificación de dos etapas que implica IMAC y filtración en gel. Se sometió la proteína recombinante purificada a espectrometría de masa antes y después de división con bromuro de cianógeno. El bromuro de cianógeno divide en el extremo carboxi de los residuos metionina. La masa molecular de la proteína de levadura recombinante fue 16,024±3 Da (masa molecular calculada = 16,024 Da). El bromuro de cianógeno escinde después de las tres metioninas en la secuencia de proteínas en los aminoácidos 75, 89 y 157. El fragmento de bromuro de cianógeno con una masa medida de 843 5,6 Da, corresponde a los aminoácidos 90-157 y 158-167, unidos mediante un enlace de disulfuro entre cys 117 y cys 167 (masa molecular calculada = 843 4,5 Da). N.D. = no detectado.

La figura 27 representa la preparación de la proteína recombinante bioactiva. La secuencia de nucleótidos que corresponde a la proteína OB de ratón maduro, de 145 aminoácidos, se clonó al vector de expresión pET 15b. Este vector pET inserta un tracto de polihistidina (cola de His) en el sentido de 5’ de la secuencia clonada, lo que permite la purificación eficiente utilizando cromatografía por afinidad de metal inmobilizado (IMAC). La proteína bacteriana recombinante inicialmente se dividió en la fracción de membrana insoluble después de la lisis bacteriana. Se solubilizó la fracción de membrana utilizando clorhidrato de guanidio y se cargó en una columna IMAC. Se eluyó la proteína por etapas con concentraciones que aumentan de imidazol, tal como se muestra. Se replegó la proteína eluida y se trató con trombina para eliminar la cola de His, tal como se describe más adelante. el rendimiento final de proteína soluble fue de 45 ng/ml de cultivo bacteriano.

La figura 28 muestra los efectos biológicos de la proteína OB. El curso de tiempo de ingestión de alimento (paneles A-C) y el peso corporal (los paneles D-F). Grupos de diez animales recibieron inyecciones intraperitoneales diarias de proteína OB a una dosis de 5 mg/kg/día (cuadrados sólidos), inyecciones diarias de PBS (círculos sólidos) o ningún tratamiento (triángulos sólidos). Los grupos de tratamiento incluyeron ratones C57B1/6J ob/ob (paneles A y d), ratones C57B1/Ks db/db (paneles B y E) y ratones CBA/J+/+ (paneles C y F). La ingestión de alimentos de los ratones se midió diariamente y se registró el peso corporal a intervalos de tres a cuatro días, según se indica. (La escala de peso corporal en gramos es diferente para los ratones de tipo natural frente a los ratones ob y db). La ingestión de alimentos de los ratones ob que reciben proteína se redujo después de la primera inyección y se estabilizó después del cuarto día a un nivel aproximado del 40% del que se ve en el mismo grupo inyectado (p< 0,001). El peso corporal de esos animales disminuyó en un promedio de 1,3 gramos/día y se estabilizó tres semanas después a un nivel aproximado de 60% del peso corporal inicial (p< 0,0001). No fue demostrable un efecto de la proteína en los ratones db. Se observó efectos pequeños pero significativos sobre el peso corporal en los ratones CBA/J en dos puntos de tiempo tempranos (p< 0,02). El error de norma de cada medición está ilustrado mediante una barra y el significado estadístico de estos resultados se muestra en la tabla 1.

La figura 29 muestra los resultados de la alimentación por pares de ratones ob. (A) Un grupo de cuatro ratones C57B1/6J ob/ob fue alimentado con una cantidad de alimento igual a la que consumió el grupo de ratones ob que recibe la proteína recombinante. La pérdida de peso para ambos grupos fue calculada después de cinco, ocho y doce días. Los ratones con alimento restringido perdieron menos peso (barra sombreada) que los ratones ob que reciben proteína (barra sólida) (p< 0,02). Este resultado indica que el efecto reductor de peso de la proteína OB es el resultado de efectos tanto sobre la ingestión de alimento como el gasto de energía. (B) Una fotografía de un ratón ob tratado. Se muestra dos ratones C57B1/6J ob/ob. El ratón a la izquierda recibió PBS y pesó 65 gramos, que fue el peso inicial. El ratón a la derecha recibió inyecciones diarias de la proteína OB recombinante. El peso inicial de este animal también fue de 65 gramos, y el peso después de tres semanas de tratamiento con la proteína fue de 38 gramos. (C) Hígados de ratones ob tratados y sin tratar. Se muestran los hígados de ratones C57B1/6J ob/ob tratados y sin tratar. El hígado del ratón que recibió PBS tuvo la apariencia gruesa de un hígado graso y pesó 5,04 gramos. El hígado del ratón que recibió la proteína ob recombinante tuvo una apariencia normal y pesó 2,23 gramos.

La figura 30 muestra la hibridación in situ de ob a tejido adiposo. Se marcó ARN de ob sentido y antisentido in vitro utilizando polimerasa Sp6 y T7 y digoxigenina. Los ARN marcados fueron hibridados a secciones embebidas en parafina de tejido adiposo procedente de cojines grasos de epidídimo de ratones C57B1/Ks de ocho semanas de edad (marcados de tipo natural) y ratones C57B1(Ks db/db (marcados db). En la figura, las gotas de lípido aparecen

como vacuolas no manchadas dentro de las células. El citoplasma es una ceja delgada en la periferia de las células y no se puede distinguir de la membrana de las células. La hibridación a todos los adipocitos en el campo fue detectada en las secciones de tipo natural únicamente utilizando la sonda antisentido y niveles que aumentan en gran medida fueron observados en las secciones de tejido procedentes de animales db/db.

La figura 31 muestra que se expresa el ARN de OB en adipocitos in vivo e in vitro. Se sometió a electroforesis el ARN total (10 microgramos) procedente de diversas fuentes diferentes, y se hibridó a una sonda ob. En primer lugar, se utilizó las diferencias en la flotabilidad de la célula después de la digestión con colagenasa para purificar los adipocitos. El ARN de OB estaba presente únicamente en la fracción de adipocitos. El carril S indica la fracción estromovascular y A indica la fracción de adipocito. Además, no se expresó el ARN de OB en las células preadipocíticas 3T3-442 no diferenciadas, del carril U. Los adipocitos diferenciados procedentes de estas líneas celulares expresaron niveles claramente detectables de ARNm de OB (carril D).

La figura 32 muestra que se expresa el ARN de OB en todos los depósitos de tejido adiposo. La totalidad de los depósitos de tejido adiposo probados expresaron ARN de ob. La almohadilla o cojincillo de grasa inguinal expresó niveles de ARN un tanto menores, si bien hubo variabilidad en el nivel de las señales en diferentes experimentos. (Figura 31A). Carriles (1) epidídimo (2) inguinal (3) abdominal (4) almohadillas de grasa parametrial. La grasa parda también expresó un nivel bajo de ARN de OB (Figura 31B). El nivel de expresión de OB en la grasa parda no cambió en los animales alojados a 4ºC durante 1 semana, mientras que la abundancia de ARN de UCP específico a la grasa parda, conocida por inducible por el frío, aumentó cinco veces.

La figura 33 representa la expresión de ARN de OB en ratones db/db y tratados con tioglucosa de oro. El ARN total procedente de las almohadillas de grasa parametriales de ratones tratados con tioglucosa de oro (GTG) y db/db fue sometido a electroforesis y a la transferencia de tipo Northern. La GTG administrada como una sola dosis se sabe que provoca obesidad al inducir lesiones específicas en el hipotálamo. (A) Se trató ratones hembras CBA de un mes de edad con GTG ( 0,2 mg/g) con un incremento resultante de más de 20 gramos en animales tratados con respecto a los animales de control (< 5g). (B) La hibridación de una sonda OB a ARN de ratones db/db y tratados con GTG, reveló un incremento de veinte veces en abundancia de ARN de ob, con respecto al ARN de control (actina o GAPDH).

La figura 34 representa un análisis de transferencia de tipo Northern de ARN humano. Las transferencias de Northern que contienen 10 mg de ARN total, procedentes de tejido adiposo humano (FAT, panel A), y 2 mg de poliA

+: ARN de otros tejidos humanos (panel B) se hibridaron a sondas ob humana y 1-actina humana, tal como se indica. Una señal intensa, aproximadamente a 4,5 kb se observó con el ARN total de tejido adiposo. La hibridación de poliA

+: ARN reveló señales detectables en el corazón (HE) y la placenta (PL), mientras que no se detectó ARN de OB en el cerebro (BR), pulmón (LU), hígado (LI), músculo esquelético (SM), riñón (KI) y páncreas (PA). En cada caso, se indica la longitud de la exposición autorradiográfica. Por supuesto, se desconoce la génesis de las bandas moleculares inferiores que se observan en el ARN placentario (por ejemplo, división alternativa, degradación de ARN).

La figura 35 representa el cóntigo YAC que contiene el gen OB humano y ocho marcadores microsatelitales. Se representa el mapa de contenido de STS a base de YAC, de la región de cromosoma 7 que contiene el gen OB humano, tal como se deduce por SEGMAP/Versión 3.29 [Green et al., PCR Methods Applic., 1:77-90 (1991)]. Se listan a lo largo de la parte superior los 19 SPS ordenados de manera singular (véase la tabla 3). Los 8 STS específicos al microsatélite están indicados con asteriscos (véase la tabla 4). También se indican los SPS que corresponden a los genes Pax4 y OB, así como las posiciones predichas del centrómero (CEN) y el telómero 7q (TEL) con respecto al cóntigo. Cada uno de los 43 clones YAC se representa mediante una barra horizontal, con su nombre dado a la izquierda y el tamaño estimado YAC (en kb, medido mediante electroforesis en gel, con campo pulsado), está provisto entre paréntesis. La presencia de un STS en YAC está indicada por un círculo oscurecido en la posición apropiada. Cuando un STS corresponde al extremo de inserto de un YAC, está colocado un cuadrado alrededor del círculo correspondiente, pero a lo largo de la parte superior (cerca del nombre de STS) y en el extremo del YAC del que se derivó. Para los 5 YAC en la parte inferior (debajo de la línea de guiones horizontal), se espera que esté presente uno o más STS (con base en el orden de STS establecido), pero no se detectó (según se determinó al someter a prueba los YAC individuales con el análisis o los análisis PCR específicos a STS, correspondiente, al menos dos veces); y se aplicaron estos como círculos abiertos en las posiciones apropiadas. La mayoría de los YAC fueron aislados de una biblioteca derivada de células híbridas de humano-cuyo [Green y colaboradores, Genomics, 25:170-183 (1995)], con sus nombres originales como se indica. Los YAC restantes fueron aislados de bibliotecas genómicas humanas totales y sus ubicaciones de biblioteca original están dadas en la tabla 3. Están colocadas casillas alrededor de los nombres de los 3 YAC (yWSS691, yWSS999 e yWSS2935) que fueron encontrados mediante análisis FISH para mapear a 7q3 1,3. El cóntigo está exhibida en su forma “no computada”, en donde los tamaños de YAC no son usados para estimar los traslapes de clones ni la separación de STS, y todos los STS, por lo tanto, están espaciados de una manera equidistante. En la forma “computada” en la que se usan los tamaños de YAC para estimar la distancia relativa que separa a cada par de STS adyacente, así como el grado de traslapes de clon, el cóntigo de YAC total parece extenderse justo sobre 2 Mb.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

La presente invención se refiere a la dilucidación y al descubrimiento de una proteína, denominada en el presente documento polipéptido ob o leptina, los ácidos nucleicos que codifican la proteína, que incluyen variaciones degenerativas de la misma, por ejemplo, la que incorpora codones óptimos para expresión en un sistema de expresión particular, proteína que demuestra la capacidad de participar en el control de peso corporal de mamíferos. Los ácidos nucleicos que son el objetivo de la presente representan las secuencias codificadoras que corresponden al polipéptido OB murino y humano que se postula que juega un papel crítico en la regulación del peso corporal y la adiposidad. Los datos presentados en el presente documento indican que el producto de polipéptido de un ácido nucleico de la invención es secretado por las células que lo expresan, y que el polipéptido funciona como una hormona. Los datos experimentales adicionales demuestran que el polipéptido OB es muy efectivo para tratar la obesidad en ratones que llevan una mutación del gen ob. Además, las dosis elevadas de bolo o las dosis continuas moderadas del polipéptido OB efectúan una reducción de peso en ratones normales (del tipo natural).

Adicionalmente, los ejemplos demuestran en el presente documento que el polipéptido OB, denominado en el presente documento alternativamente “leptina” circula en el plasma de ratones, ratas y seres humanos. La leptina está ausente del plasma de ratones ob/ob y está presente a concentraciones diez veces mayores en el plasma de ratones db/db, y a concentraciones veinte veces mayores en ratas fa/fa. Muy significativamente, las inyecciones diarias de leptina recombinante reducen dramáticamente la masa corporal de los ratones ob/ob, afectan significativamente el peso corporal de ratones de tipo natural y no tienen efecto sobre los ratones db/db.

En un aspecto adicional, el polipéptido OB procedente de una especie es biológicamente activo en otra especie. En particular, el polipéptido OB humano es activo en ratones.

En su aspecto primario, la presente invención se refiere a la identificación de materiales que funcionan como moduladores del peso corporal de mamíferos. En particular, la invención trata el aislamiento, purificación y formación de secuencias de ciertos ácidos nucleicos que corresponden al gen OB o su región codificadora tanto en ratones como en seres humanos, así como los péptidos correspondientes, expresados con esos ácidos nucleicos. Por tanto, la invención comprende el descubrimiento de ácidos nucleicos que tienen las secuencias de nucleótidos señaladas en las figuras 1A a E (SEQ ID NO:1) y figuras 2A y B (SEQ ID NO:3) y a variantes degenerativas, alelos y fragmentos de los mismos, todos los cuales poseen la actividad de modular el peso corporal y la adiposidad. La correspondencia de los ácidos nucleicos de la presente con el gen OB tiene su impacto significativo sobre condiciones tales como la obesidad, así como otras enfermedades y disfunciones en donde las anormalidades en el peso corporal son un factor contribuyente. La invención se extiende a las proteínas expresadas por los ácidos nucleicos de la invención y, en particular, a aquellas proteínas señaladas en las FIGURAS 1A a E (SEQ ID NO:2), la FIGURA 3 (SEQ ID NO:4), la figura 5 (SEQ ID NO:5) y la figura 6 (SEQ ID NO.6), así como las variantes conservadas, los fragmentos activos y las moléculas pequeñas cognadas.

Tal como se discutió anteriormente, los péptidos moduladores del control del peso o sus componentes de unión u otros ligandos o agentes que presenten reproducibilidad o antagonismo con ellos o control sobre su producción, pueden prepararse en composiciones farmacéuticas con un vehículo adecuado y una potencia efectiva para la administración mediante diversos medios a un paciente que experimente fluctuaciones anormales en el peso corporal o la adiposidad, ya sea solas o como parte de una condición médica adversa, tal como cáncer o SIDA, para su tratamiento. Una variedad de técnicas de administración puede ser utilizada, entre ellas la administración oral, la administración nasal u otras formas de administración transmucosa, las técnicas parenterales, tales como las inyecciones subcutáneas, intravenosas e intraperitoneales, las cateterizaciones y similares. Las cantidades promedio de los factores de reconocimiento o sus subunidades pueden variar y, en particular, se deben basar en recomendaciones y prescripciones de un médico o veterinario calificado.

Según lo anterior, puede prepararse un sistema de análisis para seleccionar los fármacos potenciales efectivos para imitar o antagonizar la actividad del modulador de peso. Puede introducirse el modulador de peso en un sistema de prueba y puede introducirse también el fármaco de prospecto en el cultivo de células resultante, y posteriormente se examina el cultivo para observar cualquier cambio en la actividad de las células, debido a la adición del fármaco prospecto solo o debido al efecto de cantidades aditivas del modulador de peso conocido.

Tal como se señaló anteriormente, la clonación molecular del gen OB descrito aquí ha conducido a la identificación de una clase de materiales que funcionan sobre el nivel molecular para modular el peso corporal del mamífero. El descubrimiento de los moduladores de la invención tiene implicaciones importantes para el diagnóstico y el tratamiento de alteraciones nutricionales incluyendo, pero no se limitan a, la obesidad, la pérdida de peso asociada con el cáncer y el tratamiento de enfermedades asociadas con la obesidad, tales como hipertensión, males cardiacos y diabetes del tipo II. Además, hay usos agrícolas potenciales para el producto genético en caso de que se deseara modular el peso corporal de animales domésticos. Finalmente, en la medida en que uno o más de los moduladores de la invención sean moléculas secretadas, pueden ser utilizadas bioquímicamente para aislar su receptor utilizando la tecnología de clonación por expresión. La discusión que sigue con referencia específica al gen OB lleva aplicabilidad general a la clase de moduladores que comprenden una parte de la presente invención y, por lo tanto, debe tenerse en cuenta dicha latitud y dicho alcance de interpretación.

Tal como se observó anteriormente, la actividad funcional del polipéptido OB puede evaluarse transgénicamente. En este sentido, puede usarse un modelo de ratón transgénico. Se puede usar el gen ob en estudios de complementación que emplean ratones trangénicos. Puede construirse vectores transgénicos, que incluyen vectores virales o clones cósmidos (o clones de fago) que corresponden al sitio de tipo natural del gen candidato, utilizando el gen ob aislado. Los cósmidos pueden ser introducidos en ratones transgénicos utilizando procedimientos publicados [Jaenisch, Science, 240:1468-1474 (1988)]. Se introducen los constructos en huevos fertilizados derivados de la cruza mutua entre la progenie F1 de una cruza interna de C57BL/6J ob/ob X DBA. Estas cruzas requieren el uso de transplantes de ovarios de DBA/2J para generar animales F1. Se usan ratones DBA/2J como la cepa contraria debido a que tienen un color de pelo diferente al del agutí, que es importante cuando se utiliza transplantes de ovario. El genotipo en los sitios ob en los animales transgénicos cósmidos puede ser determinado mediante tipificación de animales con RFLP enlazados apretadamente o microsatélites que flanquean la mutación y que son polimórficos entre las cepas progenitoras. Se demostrará la complementación cuando una construcción particular hace magro y no diabético a un animal F2 genéticamente obeso según se anota mediante análisis RFLP. Bajo estas circunstancias, una prueba final de complementación requerirá que el animal ob/ob o db/db que lleva el transgén se aparee con trasplantes de ovarios ob/ob o db/db. En esta cruza, todos los animales N2 que no llevan el transgén serán obesos y resistentes a la insulina/diabéticos, mientras que sí llevan el transgén serán magros y tendrán concentraciones normales de glucosa e insulina en el plasma. En un sentido genético, el transgén actúa como una mutación supresora.

Alternativamente, pueden someterse a prueba los genes OB examinando sus efectos fenotípicos cuando se expresan en orientación contraria a la transferencia en animales de tipo natural. En este enfoque, se suprime la expresión del alelo de tipo natural, lo que conduce a un fenotipo mutante. La formación dúplex ARN·ARN (antisentido-sentido) previene el manejo normal de ARNm, lo que da como resultado la eliminación parcial o completa del efecto del gen de tipo natural. Esta técnica ha sido usada para inhibir la síntesis de TK en el cultivo de tejido y para producir fenotipos de la mutación Kruppel en Drosophila y la mutación Shiverer en ratones Izant et al., Cell, 36:1007-1015 (1984); Green et al., Annu. Rev. Biochem., 55:569-597 (1986); Katsuki et al., Science, 241: 593595 (1988). Un aspecto importante de este enfoque es que solamente una porción pequeña del gen necesita ser expresada para la inhibición efectiva de la expresión de todo el ARNm cognado. El transgén opuesto a la transferencia será colocado bajo control de su propio promotor u otro promotor expresado en el tipo de célula correcta y colocado en el sentido de 5’ del sitio poliA de SV40. Este transgén será usado para formar ratones transgénicos. Los ratones transgénicos también se formarán a pares con transplantes de ovarios para someter a prueba si los heterocigotos ob son más sensibles a los efectos de la construcción antisentido a la transferencia.

A largo plazo, la dilucidación de la función bioquímica del producto de gen OB (el polipéptido OB o la proteína) es útil para identificar los agonistas y antagonistas de molécula pequeña que afectan su actividad.

Se utilizan diversos términos en toda esta memoria descriptiva que tendrán las definiciones que se dan aquí a continuación, por ejemplo.

La expresión “modulador de peso corporal”, los términos “modulador”, “moduladores” y cualquier variante no específicamente mencionados, pueden usarse en el presente documento intercambiablemente, y cuando se usan en toda la presente solicitud y en las reivindicaciones se refieren en un caso tanto a nucleótidos como a material proteinaceo, incluyendo este último monoproteínas o proteínas múltiples. Más específicamente, los términos anteriormente mencionados se extienden a los nucleótidos y al ADN que tiene las secuencias descritas aquí y presentadas en las figuras 1A a E (SEQ ID NO:1) y en la figura 2A y B (SEQ ID NO:3). De igual manera, las proteínas que tienen los datos de secuencia de aminoácidos descritos y presentados en el presente documento en las figuras 1A a E (SEQ ID NO:2) y en la figura 3 (SEQ ID NO:4) también están contemplados, al igual que el perfil de actividades señaladas con respecto a todos los materiales tanto de la presente como de las reivindicaciones. Por consiguiente, los nucleótidos que exhiben actividad sustancialmente equivalente o alterada están contemplados de igual manera, incluyendo los análogos sustancialmente homólogos y las variaciones alélicas. Asimismo, están contempladas también las proteínas que exhiben actividad sustancialmente equivalente o alterada, incluyendo las proteínas modificadas deliberadamente, tal como, por ejemplo, mediante la mutagénesis dirigida al sitio o, accidentalmente por medio de mutaciones en los hospedadores que producen los moduladores.

Una composición que comprende “A” (donde “A” es una proteína individual, molécula de ADN, vector, célula hospedadora recombinante, etc.), está sustancialmente libre de “B” (donde “B” comprende una o más proteínas contaminantes, moléculas de ADN, vectores, etc., pero excluyendo las formas racémicas de A), cuando al menos aproximadamente el 75% en peso de las proteínas, ADN, vectores (dependiendo de la categoría de las especies a las que pertenezcan A y B) en la composición, es “A”. Preferiblemente, “A” comprende al menos alrededor del 90% en peso de las especies A + B en la composición, muy preferiblemente, alrededor del 99% en peso. Se prefiere también que una composición que está sustancialmente libre de contaminación, contenga únicamente una especie de un solo peso molecular, que tenga la actividad o la característica de la especie que interesa.

POLIPÉPTIDOS OB

Los términos “proteína”, que se refiere al polipéptido que se produce de manera natural, y “polipéptido” se usan en el presente documento intercambiablemente con respecto al producto del gen ob y a sus variantes. El término

“proteína madura” o “polipéptido maduro” se refiere particularmente al producto de gen OB con la secuencia señal (o un partícipe de la proteína de fusión) eliminada.

Tal como se observó anteriormente, en las realizaciones específicas de polipéptidos ob de la invención se incluyen aquellos que tienen las secuencias de aminoácidos que se dan aquí, por ejemplo, SEQ ID NOS:2, 4, 5, 6, etc., incluyendo el polipéptido ob modificado con sustituciones de aminoácido conservadoras, así como los fragmentos, sus análogos y derivados biológicamente activos. La expresión “biológicamente activo” se usa en el presente documento para hacer referencia a un efecto específico del polipéptido, incluyendo, pero sin limitación, la unión específica, por ejemplo, a un receptor, anticuerpo u otra molécula de reconocimiento; la activación de las trayectorias de transducción a un nivel molecular; y/o la inducción (o inhibición por antagonistas) de los efectos fisiológicos mediados por el polipéptido ob nativo in vivo. Los polipéptidos OB, incluyen los fragmentos, análogos y derivados, pueden ser preparados sintéticamente, por ejemplo, utilizando las técnicas bien conocidas de síntesis de péptido en fase sólida o en fase de disolución. Preferiblemente se emplean las técnicas de síntesis en fase sólida. Alternativamente, puede prepararse los polipéptidos OB de la invención utilizando técnicas de ingeniería genética bien conocidas, tales como las que se describen más adelante. En otras realizaciones, puede purificarse el polipéptido OB, por ejemplo, mediante purificación por inmunoafinidad, a partir de un fluido biológico, tal como, pero no se limitan a: plasma, suero u orina, preferiblemente plasma, suero u orina humanos, y más preferiblemente, procedentes de un sujeto que exprese excesivamente el polipéptido, tal como una persona obesa que sufre de una mutación en el receptor OB o de obesidad relacionada con una mutación que corresponde a “grasa”.

Fragmentos del polipéptido OB

En una realización particular, la presente invención contempla que pueden ser importantes los fragmentos que se producen naturalmente del polipéptido OB. La secuencia de péptido incluye varios sitios que frecuentemente son el blando de la división proteolítica, por ejemplo, residuos de arginina. Es posible que toda la longitud del péptido pueda escindirse en uno o más sitios de este tipo para formar fragmentos biológicamente activos. Tales fragmentos biológicamente activos pueden ser o bien agonistas o bien antagonistas de la actividad funcional del polipéptido OB, para reducir el peso corporal.

Análogos del polipéptido OB

La presente invención contempla específicamente la preparación de análogos del péptido OB, que se caracterizan por ser capaces de una actividad biológica de polipéptido OB, por ejemplo, de unirse a un componente de unión específico del péptido ob, tal como el receptor OB. En una realización, el análogo agoniza la actividad OB, es decir, funciona de manera similar al péptido ob. Preferiblemente, un agonista OB es más efectivo que la proteína nativa. Por ejemplo, un análogo de agonista OB puede unirse al receptor OB con mayor afinidad o demostrar una vida media mayor, in vivo, o ambos aspectos. No obstante, los análogos agonistas del péptido OB que son menos efectivos que la proteína natural también están contemplados. En otra realización, el análogo antagoniza la actividad OB. Por ejemplo, un análogo OB que se une al receptor OB pero que no induce la transducción de señal, puede inhibir competitivamente la unión de OB natural al receptor, disminuyendo de esa manera la actividad de OB in vivo. Dicho análogo antagonista de OB también puede demostrar diferentes propiedades del péptido ob, por ejemplo, una vida media más prolongada (o menos prolongada) in vivo, mayor (o menor) afinidad de unión para el receptor OB, o ambos aspectos.

En una realización, un péptido OB es el péptido OB modificado por sustitución de aminoácidos en posiciones en el polipéptido que no son esenciales para la estructura ni para la función. Por ejemplo, puesto que se sabe que el péptido OB humano es biológicamente activo en ratón, la sustitución de residuos de aminoácido divergentes en la secuencia humana, en comparación con la secuencia de aminoácidos de murino, probablemente produzca análogos útiles de péptido OB. Por ejemplo, el residuo serina en la posición 53 o en la posición 98 o en ambas (en la secuencia de péptido no procesado ilustrado en la figura 4), de humanos, puede sustituirse, por ejemplo, por glicina, alanina, valina, cisteína, metionina o treonina. De manera similar, el residuo arginina en la posición 92 (figura 4) puede ser sustituido, por ejemplo, por asparagina, lisina, histidina, glutamina, ácido glutámico, ácido aspártico, serina, treonina, metionina o cisteína. Todavía con referencia a la figura 4, otros aminoácidos en el péptido OB humano que parecen ser capaces de sustitución son la histidina en la posición 118, el triptofano en la posición 121, la alanina en la posición 122, el ácido glutámico en la posición 126, la treonina en la posición 127, la leucina en la posición 128, la glicina en la posición 132, la glicina en la posición 139, el triptofano en la posición 159 y la glicina en la posición 166. En otra realización, puede ser posible sustituir uno o más residuos 121 a 128 (como se ilustra en la figura 4), por ejemplo, con glicinas o alaninas, o sustituir algunos de los residuos, con las excepciones de serina en la posición 123 o leucina en la posición 125.

En otra realización, un análogo del polipéptido OB, preferiblemente un polipéptido OB humano, es una forma truncada del polipéptido. Por ejemplo, ya se ha demostrado que la glutamina en el residuo 49 no es esencial, y que puede omitirse del péptido. De manera similar, puede ser posible omitir algunos o todos los residuos de aminoácido divergentes de las posiciones 121-128. Adicionalmente, la invención contempla proporcionar un análogo OB que tiene la secuencia mínima de aminoácidos necesaria para una actividad biológica. Esto puede determinarse fácilmente, por ejemplo, probando la actividad de los fragmentos de OB en cuanto a la capacidad para unirse a anticuerpos específicos de OB, inhibir la actividad del polipéptido OB nativo o agonizar la actividad del péptido OB

nativo. En una realización, la invención provee un polipéptido OB truncado que consiste en la estructura de bucle formada por la unión disulfuro que se forma entre los residuos cisteína 177 y 167 (tal como se ilustra en la figura 4). En otra realización, el análogo truncado corresponde a los aminoácidos desde el residuo 22 (que sigue al sitio de escisión del péptido de señal putativa) hasta 53 (el residuo de aminoácido inmediatamente precedente a una región de bucle flexible, detectada con proteólisis limitada, seguida por análisis de espectrometría de masa del polipéptido OB; véase Cohen et al.,Protein Science, 4:1088 (1995). En otra realización, el análogo truncado corresponde a los aminoácidos desde el residuo 61 (el residuo que sigue inmediatamente a la región de bucle flexible, que se detecta con proteólisis limitada/análisis de espectrometría de masa del polipéptido OB) al residuo de aminoácido 116 (el residuo que precede inmediatamente al primer residuo de cisteína). En otra realización más, el análogo truncado corresponde a los aminoácidos desde el residuo 61 hasta el residuo de aminoácidos 167.

Además, uno o más de los residuos del bucle flexible putativo en los residuos números 54 a 60 están sustituidos. Por ejemplo, uno o más de los residuos puede estar sustituido con lisina, ácido glutámico o cisteína (preferiblemente lisina) para entrelazamiento, por ejemplo, a un polímero, puesto que las estructuras de bucle flexible son sitios preferidos para la derivatización de una proteína. Alternativamente, los residuos en las posiciones de bucle flexible pueden estar sustituidas con residuos de aminoácido que son más resistentes a la proteólisis pero que retienen una estructura flexible, por ejemplo, una o más prolinas. En otra realización adicional, las sustituciones con residuo de aminoácido que pueden ser derivatizados para hacerlos más resistentes a la degradación, por ejemplo, la proteólisis, están contempladas.

Los expertos habituales en la técnica apreciarán que los tamaños de fragmento anteriores son aproximados y que se puede incluir de 1 a 5 aminoácidos o se puede omitir de cada uno de los extremos, o del interior del polipéptido o sus fragmentos, o de los análogos truncados mencionados, excepto que en los análogos de bucle unidos por disulfuro se cebe mantener los residuos cisteína.

Se ha encontrado que el péptido OB de murino contiene el 50% de contenido en a-hélice y que el polipéptido OB humano contiene aproximadamente el 60% de contenido en a-hélice, cuando se detecta por dicronismo circular de los péptidos recombinantes en condiciones casi fisiológicas. Por consiguiente, en otra realización, se puede sustituir los residuos de aminoácido con residuos que formen análogos del polipéptido OB, lo que demuestra la propensión incrementada a formar, o que forman, estructuras en a-hélice más estables. Por ejemplo, la estructura en a-hélice se preferiría si se introducen como sustitutos Gly-Ala-Leu-His-Trp por los residuos de aminoácido que se encuentran en el polipéptido OB nativo. Preferiblemente, se emplean sustituciones de aminoácido conservadoras, por ejemplo, la sustitución de ácido aspártico en el/los residuo(s) 29, 30, 44, 61, 76, 100 y/o 106 (como se representa en la figura 4) por ácido(s) glutámico(s) (Glu); la sustitución de la(s) isoleucina(s) por leucina; la sustitución de glicina o valina o cualquier aminoácido divergente por alanina (por ejemplo, serina en la posición 53 del polipéptido OB humano por alanina); la sustitución de arginina o lisina por histidina; y la sustitución de tirosina y/o fenilalanina por triptofano. Al aumentar el grado o, más importante, la estabilidad de la estructura en a-hélice, se puede producir un análogo OB con mayor actividad, con afinidad de unión incrementada, o con mayor vida media. En una realización específica, el potencial formador de hélice de la porte del péptido OB que corresponde a los residuos de aminoácido 22 a 53, se incrementa. En otra realización, se incrementa el potencial o la estabilidad de formación de hélice de los residuos de aminoácido 61-116. En otra realización más, se incrementa el potencial formador de hélice de la estructura de bucle de disulfuro que corresponde a los aminoácidos 117 a 167. También se contemplan los análogos OB que contienen potencial incrementado o estabilidad incrementada de la a-hélice en más de uno de los dominios precedentes. En una realización adicional, se generan análogos de polipéptido OB truncados que incorporan residuos de aminoácido formadores de estructura, por ejemplo, formadores de hélice, para compensar la mayor propensión de los fragmentos de polipéptido a carecer de una estructura estable.

Los análogos, tales como los fragmentos, pueden ser producidos, por ejemplo, mediante digestión con pepsina del material péptido modulador de peso. Otros análogos, tales como las muteínas, también pueden ser producidos mediante mutagénesis dirigida a sitio de las secuencias codificadoras de péptido modulador de peso. Los análogos que presentan “actividad moduladura de peso”, tales como las moléculas pequeñas, ya sea que funcionen como promotores o como inhibidores, pueden se identificarse mediante análisis conocidos in vivo y/o in vitro.

Análogos de molécula pequeña y los péptido miméticos del polipéptido OB

La estructura del polipéptido ob, preferiblemente polipéptido OB humano, se puede analizar por diversos métodos conocidos en la técnica. Se puede caracterizar la secuencia de proteínas por medio de un análisis de hidrofilicidad [por ejemplo, Hopp et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:3824 (1981)]. Se puede utilizar un perfil de hidrofilicidad para identificar las regiones hidrófobas e hidrófilas del polipéptido OB, lo que puede indicar las regiones enterradas en el interior del polipéptido plegado y las regiones accesibles en el exterior del polipéptido. Además, el análisis estructural secundario [por ejemplo, Chou et al., Biochem., 13:222 (1974)] puede efectuarse también para identificar regiones del polipéptido OB que asumen estructuras secundarias específicas. La manipulación de la estructura predicha, o determinada, que incluye la predicción de estructura secundaria, puede realizarse utilizando programas informáticos de software disponibles en la técnica.

Al proporcionar una fuente abundante de polipéptido OB recombinante, la presente invención permite la determinación estructural cuantitativa del polipéptido. En particular, se proporciona suficiente material para los

análisis de resonancia magnética nuclear (RMN), infrarrojo (IR), de Raman y ultravioleta (UV), especialmente el dicroísmo circular (CD) y espectroscópico. En particular, el análisis de resonancia magnética nuclear proporciona análisis estructural muy poderoso de moléculas en disolución, que se aproxima muy íntimamente a su ambiente nativo [Marion et al., Biolchim. Biophys, Res. Comm. 113:967-974 (1983); Bar et al., J. Magn. Reson. 65:355-360 (1985); Kimura et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 77:1681-1685 (1980)]. También se pueden emplear otros métodos de análisis estructural. Estos incluyen, pero no se limitan a, la cristalografía de rayos X [Engstom, Biochem. Exp. Biol., 11:7-13 (1974)].

Aún en otra realización adicional, se puede someter a prueba un análogo de polipéptido OB para determinar si reacciona cruzadamente con un anticuerpo específico para un polipéptido OB nativo, o fragmentos específicos del mismo. El grado de reactividad cruzada da información acerca de la homología estructural o la similitud de las proteínas, o acerca de la accesibilidad de regiones que corresponden a las regiones del polipéptido que fueron usadas para generar anticuerpos específicos para el fragmento.

Selección de análogos OB

Se conocen en la técnica diversas técnicas de selección para seleccionar análogos de los polipéptidos. Están disponibles diversas bibliotecas de productos químicos. Por consiguiente, la presente invención contempla seleccionar tales bibliotecas, por ejemplo, las bibliotecas de compuestos sintéticos generados durante años de investigación, las bibliotecas de compuestos naturales y las bibliotecas combinatorias, tal como se describen con detalle mayor más adelante, para análogos de polipéptidos OB. En una realización, la invención contempla seleccionar dichas bibliotecas en búsqueda de compuestos que se unan a anticuerpos de polipéptido anti-OB, preferiblemente anticuerpos de polipéptido ob anti-ser humano. En otro aspecto, una vez que se identifica el receptor OB (véase más adelante) se puede usar cualquier técnica de selección conocida en la técnica para seleccionar los agonistas o antagonistas del receptor OB. La presente invención contempla selecciones para ligandos de molécula pequeña o análogos de ligando y mímicos, así como selecciones para ligandos naturales que se unen a y agonizan

o antagonizan el receptor de OB activo, in vivo.

El conocimiento de la secuencia primaria del receptor y la similitud de esa secuencia con las proteínas de función conocida, puede proporcionar un indicio inicial acerca de los agonistas o antagonistas de la proteína. La identificación y la selección de los antagonistas se facilita adicionalmente al determinar los aspectos estructurales de la proteína, por ejemplo, el uso de cristalografía de rayos X, la difracción de neutrones, la espectrometría de resonancia magnética nuclear y otras técnicas para la determinación estructural. Esas técnicas proporcionan el diseño racional o la identificación de los agonistas y antagonistas.

Otro enfoque utiliza un bacteriófago recombinante para producir grandes bibliotecas. El uso de “método de fago” [Scott et al., Science, 249:386-390 (1990); Cwirla et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6378-6382 (1990); Devlin et al., Science, 249:404-406 (1990)] permite construir bibliotecas muy grandes (106 a 108 entidades químicas). Un segundo enfoque utiliza primariamente métodos químicos, de los cuales son ejemplos el método de Geysen [Geusen et al., Molecular Immunology, 23:709-715 (1986); Geysen et al., J. Immunologic Method, 102:259-274 (1987)] y el método reciente de Fodor et al., Science, 251:767-773 (1991). Furka et al., Decimocuarto Congreso Internacional de Bioquímica, Vol. 5, Resumen FR:013 (1988); Furka, Int. J. Peptide Protein Res., 37:487-493 (1991)[, Houghton (patente estadounidense n.º 4.631.211, concedida en diciembre de 1986); y Rutter et al. (patente estadounidense n.º 5.050.175, concedida el 23 de abril de 1991), describen métodos para producir una mezcla de péptidos que pueden someterse a prueba como agonistas o antagonistas.

En otro aspecto, las bibliotecas sintéticas [Needels et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:10700-10704 (1993); Lam et al., publicación de patente internacional n.º WO 92/00252 y similares puede usarse para seleccionar los ligandos de receptor de OB, según la presente invención. Con dichas bibliotecas, se puede detectar los antagonistas de receptor que utilizan células que expresan el receptor sin clonar realmente el receptor de OB.

Alternativamente, pueden realizarse ensayos para la unión de ligando soluble a células que expresen las formas recombinantes del dominio de unión de ligando del receptor de OB. Los ligandos solubles pueden proporcionarse fácilmente como polipéptido OB recombinante o sintético.

Puede llevarse a cabo la selección con células recombinantes que expresen el receptor OB o, alternativamente, utilizando proteína receptora purificada, por ejemplo, producida de manera recombinante, tal como se describió anteriormente. Por ejemplo, se puede utilizar la capacidad del receptor de OB marcado, soluble o solubilizado, que incluye la parte de unión al ligando de la molécula, para unir el ligando para seleccionar bibliotecas, tal como se describe en las referencias anteriores.

Derivados de los polipéptidos OB

En general, puede derivatizarse la presente proteína (en el presente documento, el término “proteína” se usa para incluir “polipéptidos”, a menos que se indique de otra manera), mediante la unión de uno o más restos químicos a la resto de proteína. Los derivados modificados químicamente pueden formularse adicionalmente para administración intraarterial, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, intravenosa, oral, nasal, rectal, bucal, sublingual, pulmonar, tópica, transdérmica u otras rutas de administración. La modificación química de proteínas biológicamente activas se

ha encontrado que proporcionan ventajas adicionales en determinadas circunstancias, tal como el incremento en la estabilidad y el tiempo de circulación de la proteína terapéutica y la disminución de la inmunogenicidad. Véase la patente estadounidense n.º 4.179.337, de Davis et al., concedida el 18 de diciembre de 1979. Para un resumen, véase Abuchowski et al., “Soluble Polymer-Enzyme Adducts” en Enzymes as Drugs, páginas 367-383, Locenberg y Roberts, editores, Wiley-Interscience, Nueva York, NY (1981). Un artículo de resumen que describe la modificación de la proteína y las proteínas de fusión es Francis, Focus on Growth Factors, 3:4-10 (1992).

Restos químicos para formación de derivados

Los restos químicos adecuados para la formación de derivados pueden ser seleccionadas de entre diversos polímeros solubles en agua. El polímero seleccionado debe ser soluble en agua, de manera que la proteína que se una a él no precipite en un ambiente acuoso, tal como un ambiente fisiológico. Preferiblemente, para uso terapéutico de la preparación de producto final, el polímero será farmacéuticamente aceptable. Un experto en la técnica podrá seleccionar el polímero deseado con base en consideraciones tales como si el conjugado de polímero/proteína se usará terapéuticamente, y de serlo, la dosificación deseada, el tiempo de circulación, la resistencia a la proteólisis y otras consideraciones. Para las proteínas y péptidos de la presente se puede determinar esto utilizando los análisis que se dan aquí.

Moléculas de polímero

Se puede seleccionar el polímero soluble en agua del grupo que consiste, por ejemplo, de polietilenglicol, copolímeros de etilenglicol/propilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano, poli(alcohol vinílico), polivinilpirrolidona, poli-1,3-dioxolano, poli-1,3,6-trioxano, copolímero de etileno/anhidrido maleico, poliaminoácidos (ya sea homopolímeros o copolímeros aleatorios), y dextrano o poli(n-vinilpirrolidona); homopolímeros de polietilenglicol, propilenglicol, copolímeros de óxido de polipropileno/óxido de etileno, polioles oxietilados y poli(alcohol vinílico). El polietilenglicol/propionaldehído puede proporcionar ventajas en la fabricación debido a su estabilidad en agua.

El polímero puede ser de cualquier peso molecular y puede estar ramificado o no ramificado. Para el polietilenglicol, el peso molecular preferido está entre aproximadamente 2 kD y 100 kD (el término “aproximadamente” indica que, en las preparaciones de polietilenglicol, algunas moléculas pesarán más, algunas menos, que el pero molecular señalado), para facilidad en la manipulación y la fabricación. Se puede utilizar otros tamaños, dependiendo del perfil terapéutico deseado (por ejemplo, de la duración de los efectos deseados de liberación sostenida, si los hay, acerca de la actividad biológica, la facilidad de manejo, el grado o carencia de antigenicidad y otros efectos conocidos del polietilenglicol, para una proteína terapéutica o su análogo).

Razón polímero/proteína

El número de moléculas de polímero así unidas puede variar, y quien sea experto en la técnica podrá determinar el efecto sobre la función. Se puede monoderivatizar o se puede proporcionar una di, tri, tetraderivatización o alguna combinación de derivatización, con las mismas o diferentes restos químicos (por ejemplo, polímeros, tales como polietilenglicoles de diferentes pesos). La proporción de molécula de polímero a las moléculas de proteína (o péptido) variará, al igual que sus concentraciones en la mezcla de reacción. En general, la razón óptima (en términos de eficiencia de la reacción, por cuanto no debe haber exceso de proteína o polímero sin reaccionar), será determinada por factores tales como el grado deseado de formación de derivados (por ejemplo, mono, di, tri, etc.), el peso molecular del polímero seleccionado, si el polímero está ramificado o no ramificado, y las condiciones de la reacción.

Unión del resto químico a la proteína

Las moléculas de polietilenglicol (u otros restos químicos) deben unirse a la proteína teniendo en cuenta los efectos sobre los dominios funcionales o antigénicos de la proteína. Hay diversos métodos de unión disponibles para los expertos en la técnica; por ejemplo, el documento EP 0 401 384, (acoplamiento de PEG a G-CSF). Véase también Malik et al., Exp. Hematol., 20:1028-1035 (1992) (que informa la pegilación de GM-CSF utilizando cloruro de tresilo). Por ejemplo, se puede unir covalentemente el polietilenglicol por medio de residuos de aminoácido con un grupo reactivo, tal como un grupo amino o carboxilo libres. Los grupos reactivos son aquellos a los que se puede unir la molécula de polietilenglicol activada. Los residuos de aminoácido que tienen un grupo amino libre pueden incluir residuos de lisina y los residuos de aminoácido N-terminales, los que tienen un grupo carboxilo libre pueden incluir residuos de ácido aspártico, residuos de ácido glutámico y el residuo de aminoácido C-terminal. Los grupos sulfhidrilo también pueden ser usados como un grupo reactivo para unirse a la molécula o moléculas de polietilenglicol. Se prefiere para propósitos terapéuticos la unión en un grupo amino, tal como la unión en el extremo N o el grupo lisina. La unión en residuos importantes para la unión de receptor se debe evitar si se desea la unión del receptor.

Proteínas modificadas químicamente, en el extremo N

Se puede desear específicamente una proteína químicamente modificada en el extremo N. Utilizando polietilenglicol, como una ilustración de las presentes composiciones se puede seleccionar a partir de una variedad de moléculas de polietilenglicol (por peso molecular, ramificación, etc.), la proporción de moléculas de polietilenglicol a moléculas de

proteína (o péptido) en la mezcla de reacción, el tipo de reacción de pegilación que se va a formar y el método para obtener la proteína pegilada en el extremo N, seleccionada. El método para obtener la preparación N-terminalmente pegilada (es decir, separar esta porción de otros restos monopegilados, si es necesario), puede ser mediante purificación del material N-terminalmente pegilado, de entre una población de moléculas de proteína pegiladas. Se puede obtener la modificación química en el terminal extremo N selectiva, mediante alquilación reductora, lo que explota la reactividad diferencial de diferentes tipos de grupos de aminoácidos (lisina contra el extremo N), obtenible para la formación de derivados en una proteína particular. En las condiciones de reacción apropiadas, se obtiene la formación de derivados sustancialmente selectiva de la proteína en el extremo N, con un grupo carbonilo que contiene el polímero. Por ejemplo, se puede pegilar N terminalmente, en forma selectiva, la proteína efectuando la reacción a un pH que permita que se aproveche las diferencias de pKa entre los grupos _-amino de los residuos de lisina y desde el grupo a-amino del residuo N-terminal de la proteína. Mediante tal formación selectiva de derivados, se controla la unión de un polímero soluble en agua a una proteína: la conjugación con el polímero tiene lugar predominantemente en el extremo N de la proteína, y no ocurre ninguna modificación significativa de los demás grupos reactivos, tales como los grupos amino de cadena lateral lisina. Utilizando la alquilación reductora, el polímero soluble en agua puede ser del tipo descrito arriba y debe tener un solo aldehído reactivo para acoplarse con la proteína. Se puede utilizar el polietilenglicol/propionaldehído, que contiene un solo aldehído reactivo.

ÁCIDOS NUCLEICOS ASOCIADOS CON EL POLIPÉPTIDO OB

Tal como se observó anteriormente, la presente invención se refiere a ácidos nucleicos que codifican polipéptidos ob, así como secuencias no codificadoras genómicas secuenciadas 5', 3' e intrónicas para el gen OB. Por tanto, según la presente invención, se puede emplear biología molecular convencional, microbiología y técnicas de ADN recombinante, dentro de lo que enseña la técnica. Tales técnicas se explican completamente en la literatura. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York (1989); Glover ed., DNA Cloning: A Practical Approach, volúmenes I y II, MRL Press, Ltd., Oxford, Reino Unido (1985); Gait ed., Oligonucleotide Synthesis, Oxford University Press (1984); Hames et al., eds., Nucleic Acid Hybridization, Springer-Verlag (1985); Hames et al., eds., Transcription And Translation, Oxford University Press (1984); Freshney ed., Animal Cell Culture, Oxford University Press (1986); Immobilized Cells And Enzymes, IRL Press (1986); Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning, Wiley, Nueva York (1984). Son de relevancia particular para la presente invención las estrategias para aislar, clonar, determinar secuencia, analizar y caracterizar un gen o un ácido nucleico, con base en las técnicas de reacción de la cadena de polimerasa (PCR) bien conocidas.

Un “replicón” es cualquier elemento genético (por ejemplo, un plásmido, un cromosoma, un virus) que funciona como una unidad autónoma de reproducción de ADN in vivo, es decir, que puede reproducirse bajo su propio control.

Un “vector” es un replicón, tal como un plásmido, un fago o un cósmido, en el que puede unirse otro segmento de ADN, con el fin de efectuar la reproducción del segmento unido.

Un “casete” se refiere a un segmento de ADN que puede insertarse dentro de un vector en sitios de restricción específicos. El segmento de ADN codifica un polipéptido de interés y el casete y los sitios de restricción están diseñados para garantizar la inserción del casete en el marco de lectura apropiado para la transcripción y la transmisión.

ADN “heterólogo” se refiere al ADN que no está ubicado naturalmente en la célula, o en un sitio cromosómico de la célula. Preferiblemente, el ADN heterólogo incluye un gen extraño para la célula.

Se ha “transfectado” una célula por ADN exógeno o heterólogo cuando se ha introducido tal ADN dentro de la célula. Se ha “transformado” una célula por ADN exógeno o heterólogo cuando el ADN transfectado efectúa un cambio genotípico. Preferiblemente, el ADN transformante debe ser integrado (ligado covalentemente) dentro del ADN cromosómico que constituye el genoma de la célula.

Un “clon” es una población de células derivadas de una sola célula o ancestro común, por mitosis.

Una “molécula de ácido nucleico” se refiere a la forma polimérica del éster de fosfato de ribonucleosidos (adenosina, guanosina, uridina o cistidina; “moléculas de ARN”) o desoxirribonucleosidos (desoxiadenosina, desoxiguanosina, desoxitimidina o desoxicitidina; “moléculas de ADN”); ya sea como una espiral de doble cadena o de una sola cadena. Son posibles hélices de doble cadena ADN-ADN, ADN-ARN y ARN-ARN. El término molécula de ácido nucleico y, en particular, molécula de ADN o de ARN, únicamente se refiere a la estructura primaria y secundaria de la molécula, y no la limita a ninguna de las formas terciaria o cuaternaria en particular. Por tanto, este término incluye el ADN de doble cadena que se encuentra, entre otros, en las moléculas de ADN lineales o circulares (por ejemplo, los fragmentos de restricción), los plásmidos y los cromosomas. Al discutir la estructura de las moléculas de ADN de doble cadena, particulares, se puede describir las secuencias en la presente según la convención normal de dar únicamente las secuencias en la dirección 5' a 3', a lo largo de la cadena no transcrita de ADN (es decir, la cadena que tiene una secuencia homóloga al ARNm). Una “molécula de ADN recombinante” es una molécula de ADN que ha sufrido una manipulación biológica molecular.

Una molécula de ácido nucleico es “hibridizable” a otra molécula de ácido nucleico, tal como un ADNc, un ADN genómico o ARN, cuando se puede recocer una forma de la molécula de ácido nucleico de una sola cadena a otra molécula de ácido nucleico, en condiciones apropiadas de temperatura y concentración iónica (véase Sambrook y colaboradores, 1989, citado anteriormente). Las condiciones de temperatura y concentración iónica determinan la “astringencia” de la hibridación. Para la selección preliminar de los ácidos nucleicos homólogos, puede usarse condiciones de hibridación de baja astringencia, que corresponden a Tm de 55ºC, por ejemplo, 5x SSC, SDS al 0,1%, leche al 0,25% y no formamida; o formamida al 30%, 5x SSC, SDS al 0,5%). Las condiciones de hibridación a astringencia moderada corresponden a una Tm superior, por ejemplo, formamida al 40% con 5x o 6x de SCC. Las condiciones de hibridación a alta astringencia corresponden a la máxima Tm, por ejemplo, formamida al 50%, 5x o 6x de SCC. La hibridación requiere que los dos ácidos nucleicos contengan secuencias complementarias, si bien, dependiendo de la astringencia de la hibridación, son posibles desigualdades entre las bases. La astringencia apropiada para la hibridación de ácidos nucleicos depende de la longitud de los ácidos nucleicos y del grado de complementación, variables bien conocidas en la técnica. Cuanto mayor el grado de similitud u homología entre dos frecuencias de nucleótidos, mayor será el valor Tm para los híbridos de ácidos nucleicos que tengan esas secuencias. La estabilidad relativa (que corresponde a mayor Tm) de las hibridaciones de ácido nucleico disminuye en el siguiente orden: ARN:ARN, ADN:ARN, ADN:ADN. Para híbridos de más de 100 nucleótidos de longitud, se ha derivado ecuaciones para calcular Tm (véase Sambrook et al., 1989 citado anteriormente, 9,50- 0,51). Para la hibridación con ácidos nucleicos más cortos, es decir, oligonucleótidos, la posición de las desigualdades se vuelve más importante y la longitud del oligonucleótido determina su especificidad (véase Sambrook et al., 1989, citado anteriormente, 1 1,7-1 1,8). Preferiblemente una longitud mínima para un ácido nucleico hibridizable es al menos alrededor de 10 nucleótidos; más preferiblemente, al menos alrededor de 15 nucleótidos; muy preferiblemente, la longitud es cuando menos de 20 nucleótidos.

“Recombinación homóloga” se refiere a la inserción de una secuencia de ADN extraño de un vector en un cromosoma. Preferiblemente el vector se destina a un sitio cromosómico específico para la recombinación homóloga. Para recombinación homóloga específica, el vector contendrá regiones de homología suficientemente largas para que las secuencias de cromosoma permitan la unión complementaria y la incorporación del vector en el cromosoma. Las regiones más largas de homología y los grados mayores de similitud en la secuencia pueden incrementar la eficiencia de la recombinación homóloga.

Una “secuencia codificante” de ADN es una secuencia de ADN de doble cadena, que se transcribe y traduce a un polipéptido en una célula in vitro o in vivo cuando se coloca bajo el control de secuencias reguladoras apropiadas. Los límites de la secuencia codificante se determinan por un codón inicial en el extremo 5' (amino) de un codón de paro de traducción en el extremo 3' (carboxilo). Una secuencia codificante puede incluir, pero sin limitación a ello, secuencias procarióticas, ADNc de ARNm eucariótico, secuencias de ADN genómico de ADN eucariótico (por ejemplo, de mamífero), e incluso secuencias de ADN sintético. Si se destina la secuencia codificante para la expresión en una célula eucariótica, usualmente se colocará una señal de poliadenilación y de secuencia de terminación de transcripción en una posición 3' con respecto a la secuencia codificante.

Aislamiento de secuencias codificadora y flanqueadora de OB

Los ácidos nucleicos contemplados por la presente invención se extienden tal como se indica a otros ácidos nucleicos que codifican por expresión los péptidos, tal como los señalados en la figura 1A aD (SEQ ID NO:2), figura 3 (SEQ ID NO:4), figura 5 (SEQ ID NO:5) y figura 6 (SEQ ID NO:6) en el presente documento. Por consiguiente, aunque se haya aislado el ADN específico y se haya determinado la secuencia en relación con el gen ob, cualquier célula animal puede servir potencialmente como la fuente de ácido nucleico para la clonación molecular de un gen que codifica los péptidos de la invención. Se puede obtener el ADN mediante procedimientos normales conocidos en la técnica a partir de ADN clonado (por ejemplo, una “biblioteca” de ADN) mediante síntesis química, mediante clonación de ADNc o mediante la clonación de ADN genómico o fragmentos de los mismos, purificados a partir de la célula deseada (véase, por ejemplo, Sambrook et al., 1989, citado anteriormente; Glober, 1985, citado anteriormente). Los clones derivados del ADN genómico pueden contener regiones de ADN reguladoras e intrónicas además de las regiones codificadoras; los clones derivados de ADNc no contendrán secuencias de intrón. Cualquiera que sea la fuente, el gen debe ser reclonado molecularmente en un vector adecuado para la propagación del gen.

En la clonación molecular del gen a partir de ADN genómico, se puede amplificar el ADN genómico utilizando cebadores seleccionados de las secuencias de ADNc. Alternativamente, se generan fragmentos de ADN algunos de los cuales codificarán el gen deseado. Puede escindirse el ADN en sitios específicos utilizando diversas enzimas de restricción. También se puede utilizar ADNasa en presencia de manganeso para fragmentar el ADN o se puede separar físicamente el ADN, por ejemplo, mediante tratamiento sónico. Luego se puede separar los fragmentos de ADN lineales según el tamaño, por medio de técnicas normales, incluyendo, pero sin limitación a ellas, electroforesis en agarosa y en gel de poliacrilamida y cromatografía en columna.

Una vez que se generan los fragmentos de ADN, puede realizar la identificación del fragmento de ADN específico que contiene el gen ob o parecido a ob, de varias maneras diferentes. Por ejemplo, si está disponible una cantidad de una parte de un gen ob o parecido a ob y su ARN específico o un fragmento del mismo, y puede ser purificado o marcado, los fragmentos de ADN generados pueden ser discriminados mediante la hibridación del ácido nucleico a

una sonda marcada [Benton et al., Science, 196:180 (1977); Grunstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72:3961 (1975)]. La presente invención proporciona tales sondas de ácido nucleico que pueden prepararse convenientemente a partir de las secuencias específicas dadas a conocer en el presente documento, por ejemplo, una sonda hibridable que tiene una secuencia de nucleótidos que corresponde al menos a un fragmento de 10, y preferiblemente de 15 nucleótidos, de las secuencias representadas en las figuras 1A a E (SEQ ID NO:1) o figura 2A y B (SEQ ID NO:3). Preferiblemente se selecciona un fragmento que es sumamente singular para los péptidos moduladores de la invención. Esos fragmentos de ADN con homología sustancial a la sonda se hibridarán. Tal como se observó anteriormente, cuanto mayor sea el grado de homología serán más astringentes las condiciones de hibridación que pueden ser usadas. En una realización, se utilizan condiciones de hibridación de baja astringencia para identificar un péptido modulador homólogo. Sin embargo, en un aspecto preferido, y tal como se demuestra experimentalmente en el presente documento, un ácido nucleico que codifica para un péptido modulador de la invención se hibridará a un ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos tal como la que se ilustra en la figura 1A a E (SEQ ID NO:1) o la figura 2A y B (SEQ ID NO:3), o un fragmento hibridable del mismo, en condiciones moderadamente astringentes, más preferiblemente, se hibridará en condiciones de elevada astringencia.

Alternativamente, la presencia del gen puede ser detectada mediante ensayos basados en las propiedades físicas, químicas o inmunológicas de su producto expresado. Por ejemplo, los clones de ADNc o los clones de ADN que seleccionan por hibridación los ARNm apropiados, pueden ser seleccionados para producir una proteína que, por ejemplo, tenga migración electroforética similar o idéntica, comportamiento de enfoque isoeléctrico similar o idéntico, mapas de digestión proteolítica similares o idénticos, actividad de tirosina-fosfatasa similar o idéntica o propiedades antigénicas similares o idénticas, como se conocen para los péptidos moduladores de la presente. Por ejemplo, los anticuerpos de la presente invención pueden ser usados convenientemente para seleccionar homólogos de péptidos moduladores, a partir de otras fuentes.

Un gen que codifica para un péptido modulador de la invención también puede identificarse mediante selección con ARNm, es decir, mediante hibridación de ácido nucleico seguida por traducción in vitro. En este procedimiento se usan fragmentos para aislar los ARN complementarios mediante hibridación. Tales fragmentos de ADN pueden representar el ADN modulador purificado, disponible. El análisis de inmunoprecipitación o los ensayos funcionales (por ejemplo, la actividad de tirosina-fosfatasa) de los productos de traducción in vitro de los productos de los ARNm aislados, identifica el ARNm y, por consiguiente, los fragmentos de ADN complementarios que contienen las secuencias deseadas. Además, se puede seleccionar los ARNm específicos mediante adsorción de polisomas aislados a partir de células a anticuerpos inmobilizados, especialmente dirigidos contra un péptido modulador.

El ADNc de péptido modulador radiomarcado puede ser sintetizado utilizando el ARNm seleccionado (procedente de los polisomas adsorbidos), como molde. Se puede usar entonces el ARNm o el ADNc radiomarcado como una sonda para identificar los fragmentos de ADN de péptido modulador homólogos, procedentes entre otros de fragmentos de ADN genómicos.

Tal como se mencionó anteriormente, una secuencia de ADN que codifica para péptidos moduladores de peso, tales como los aquí descritos, puede ser preparada sintéticamente en lugar de clonada. Se puede diseñar la secuencia de ADN con los codones apropiados para las secuencias de aminoácido de péptido modulador de peso. En general, se seleccionará los codones preferidos para el hospedador a que se destina, si se usará la secuencia para expresión. Se ensambla la secuencia completa a partir de oligonucleótidos que se traslapan, preparados por medio de métodos normales y ensamblados a una secuencia codificante completa. Véase, por ejemplo, Edge, Nature, 292:756 (1981); Nambair et al., Science, 223:1299 (1984; Jay et al., J. Biol. Chem., 259:6311 (1984).

Las secuencias de ADN sintético permiten la construcción conveniente de genes que expresarán análogos moduladores de peso, tal como se describió anteriormente. Alternativamente, los análogos codificadores de ADN pueden prepararse mediante mutagénesis dirigida al sitio, de genes OB nativos o de ADNc; y se pueden formar directamente los análogos utilizando síntesis de polipéptido convencional.

Un método general para la incorporación específica al sitio de aminoácidos no naturales en proteínas, se describe en Noren et al., Science, 244:182-188 (1989). Este método puede ser usado para crear análogos del péptido ob, con aminoácidos no naturales.

Ácidos nucleicos no codificantes

La presente invención se extiende a la preparación de nucleótidos antisentido y ribozimas, que pueden ser usados para interferir la expresión de las proteínas moduladoras de peso al nivel translacional. Este enfoque utiliza ribozimas y ácido nucleico antisentido a la transferencia para bloquear la traducción de un ARNm específico, ya sea enmascarando ese ARNm con un ácido nucleico antisentido o escindiéndolo con una ribozima.

Los ácidos nucleicos antisentido son moléculas de ADN o de ARN que son complementarias al menos a una parte de una molécula de ARNm específica [véase Weintraub, Sci. Am., 262:40-46 (1990); Marcus-Sekura, Anal. Biochem., 172:289-295 (1988)]. En la célula, se hibridan a ese ARNm, formando una molécula de doble cadena. La célula no traduce un ARNm formado a complejo en esta forma de doble cadena. Por lo tanto, los ácidos nucleicos antisentido interfieren la expresión del ARNm a la proteína. Los oligómeros de aproximadamente quince nucleótidos

y moléculas que se hibridan al codón de iniciación AUG, serán particularmente eficientes, puesto que son fáciles de sintetizar y probablemente poseen menos problemas que las moléculas mayores, cuando se las introduce en las células productoras de péptido modulador de peso. Los métodos antisentido han sido usados para inhibir la expresión de muchos genes in vitro [(Marcus-Sekura, 1988, citado anteriormente; Hambor et al., J. Exp. Med., 168:1237-1245 (1988)].

Las ribozimas son moléculas de ARN que pueden escindir específicamente otras moléculas de ARN de una sola cadena, de una manera que es un tanto análoga a las endonucleasa de restricción de ADN. Se descubrió las ribozimas a partir de que ciertos ARNm pueden escindir sus propios intrones. Al modificar la secuencia de nucleótidos de estos ARN, los investigadores han sido capaces de modificar mediante ingeniería genética moléculas que reconocen secuencias de nucleótido específicas en una molécula de ARN y la escinden [Cech, J. Am. Med. Assoc., 260:3030-3034 (1988)]. Debido a que son específicos para una secuencia, solamente son inactivados los ARNm con esas secuencias particulares.

Los investigadores han identificado dos tipos de ribozimas: los de tipo Tetrahymena y los de tipo “cabeza de martillo”. Las ribozimas de tipo Tetrahymena reconocen secuencias de cuatro bases, mientras que las de tipo “cabeza de martillo” reconocen secuencias de once a dieciocho bases. Cuanto mayor sea la secuencia de reconocimiento, más probable es que se produzca exclusivamente en la especie de ARNm de destino. Por lo tanto, son preferibles los ribozimas del tipo de cabeza de martillo que las ribozimas del tipo Tetrahymena para inactivar una especie de ARNm específica, y son preferibles las secuencias de reconocimiento de dieciocho bases que las secuencias de reconocimiento más cortas.

Las secuencias de ADN descritas en el presente documento, pueden por tanto usarse para preparar moléculas antisentido , que se oponen a la división de los ARNm y ribozimas que los dividen, para proteínas moduladoras de peso y sus ligandos, inhibiendo así la expresión del gen ob, lo que conduce a un aumento de peso incrementada y a adiposidad incrementada.

En otra realización, los oligonucleótidos cortos, complementarios a la codificación y a las cadenas complementarias del ácido nucleico OB o a las regiones no codificadoras del gen 5', 3' de OB o internos (intrónicos) para la región codificadora, están provistos por la presente invención. Tales ácidos nucleicos son útiles como sondas, o bien como sondas de oligonucleótido directamente marcados o bien como cebadores para la reacción de cadena de polimerasa, con el fin de evaluar la presencia de las mutaciones en el gen ob o el nivel de expresión del ARNm de OB. Preferiblemente, los ácidos nucleicos no codificadores de la invención son del tipo de gen OB humano.

En una realización específica, los ácidos nucleicos no codificadores proporcionan la recombinación homóloga para la integración de un gen amplificable y/u otra secuencia reguladora en la proximidad del gen OB, por ejemplo, para proporcionar niveles más elevados de expresión del polipéptido OB, o para superar una mutación en las secuencias reguladoras del gen ob que previenen de los niveles apropiados de expresión del polipéptido OB (véase la publicación de patente internacional WO 91/06666, publicada el 16 de mayo de 1991, por Skoultchi; la publicación de patente internacional n.º WO 91/09955, publicada el 11 de julio de 1991 por Chappel; véase también la publicación de patente internacional n.º WO 90/14092, publicada el 29 de noviembre de 1990 por Kucherlapati y Campbell).

PRODUCCIÓN DEL POLIPÉPTIDO OB: EXPRESIÓN Y SÍNTESIS

Las secuencias de control de transcripción y de traducción son secuencias reguladoras de ADN, tales como promotores, potenciadores, terminadores y similares, que proporcionan la expresión de una secuencia codificante en una célula hospedadora. En las células eucarióticas, las señales de poliadenilación son secuencias de control.

Una secuencia codificante está “bajo el control” de secuencias de control de transcripción y de traducción en una célula, cuando la ARN-polimerasa transcribe la secuencia codificante al ARNm, que luego se divide a trans-ARN y se traduce a la proteína codificada por la secuencia codificante.

Una “secuencia señal” se incluye al comienzo de la secuencia codificante de una proteína que se va a expresar sobre la superficie de una célula. Esta secuencia codifica para un péptido de señal, N-terminal con respecto al polipéptido maduro, que dirige la célula hospedadora para traslada el polipéptido. El término “secuencia señal de translocación” también se usa en la presente para referirse a esta clase de secuencia señal. Las secuencias de señal de translocación pueden ser encontradas asociadas con una variedad de proteínas nativas en los eucariotas o procariotas, y frecuentemente son funcionales en ambos tipos de organismos.

Una secuencia de ADN se “enlaza operativamente” a una secuencia de control de expresión cuando la secuencia de control de expresión controla y regula la transcripción y la traducción de esa secuencia de ADN. La expresión “enlazado operativamente” incluye tener una señal inicial apropiada (por ejemplo, ATG) enfrente de la secuencia de ADN que se va a expresar y mantener el marco de lectura correcto para permitir la expresión de la secuencia de ADN bajo el control de la secuencia de control de expresión y la producción del producto deseado, codificado por la secuencia de ADN. Si un gen que se desea insertar en una molécula de ADN recombinante no contiene una señal inicial apropiada, dicha señal inicial puede ser insertada en el sentido de 5’ (5') de, y en el marco de lectura con, el gen.

Una “secuencia promotora” es una región reguladora de ADN, que puede unir la ARN-polimerasa en una célula y de iniciar la transcripción de una secuencia codificante en el sentido de 3’ (en la dirección 3'). Para los propósitos de definir la presente invención, la secuencia promotora está unida en su extremo 3' mediante el sitio de inicio de transcripción y se extiende en el sentido de 5’ (en la dirección 5') para incluir el número mínimo de bases o elementos necesarios para iniciar la transcripción a niveles detectables por encima del fondo. Dentro de la secuencia promotora se encontrará un sitio de iniciación de transcripción (convenientemente definido, por ejemplo, al formar el mapa con nucleasa S1), así como los dominios de unión de proteína (secuencias de consenso), responsables de la unión de ARN-polimerasa.

Otra característica de esta invención es la expresión de las secuencias de ADN dadas a conocer en el presente documento. Como se conoce bien en la técnica, se puede expresar las secuencias de ADN enlazándolas operativamente a una secuencia de control de expresión en un vector de expresión apropiado, y empleando ese vector de expresión para transformar un hospedador unicelular apropiado.

Tal enlace operativo de una secuencia de ADN de esta invención a una secuencia de control de expresión, por supuesto, incluye, si no es ya parte de la secuencia de ADN, la provisión de un codón de inicio, ATG, en el marco de lectura correcto, en el sentido de 5’ de la secuencia de ADN.

Se puede emplear una gran variedad de combinaciones de hospedador/vector de expresión al expresar las secuencias de ADN de esta invención. Los vectores de expresión útiles, por ejemplo, pueden consistir en segmentos de secuencias de ADN cromosómico, no cromosómico y sintético. Los vectores adecuados incluyen los derivados de SV40 y plásmidos de bacteria conocidos, por ejemplo, los plásmidos de E. coli: col E1, pCR1, pBR322, pMB9, pUC,

o los derivados de plásmido pUC, por ejemplo, los vectores pGEX, los vectores Pet, pmal-c, pFLG, etc., y sus derivados; plásmidos tales como RP4; ADN de fago, por ejemplo, los numerosos derivados del fago I; por ejemplo NM989 y otros ADN de fago, por ejemplo M13 y los ADN de fago de una sola cadena, filamentosos; los plásmidos de levadura, tales como el plásmido 2! o sus derivados; vectores útiles en células eucarióticas, tales como los vectores útiles en células de insecto o de mamífero; los vectores derivados de combinaciones de plásmidos y ADN de fago, tales como los plásmidos que han sido modificados para emplear el ADN de fago u otras secuencias de control de expresión; y similares. En una realización preferida, se obtiene la expresión de ob en levadura metilotrófica, por ejemplo, levadura Pichia pastoris (véase, por ejemplo, la publicación de patente internacional n.º WO 90/03431, publicada el 5 de abril de 1990 por Brierley et al.; la publicación de patente internacional n.º WO 90/10697, publicada el 20 de septiembre de 1990 por Siegel et al.). En una realización específica, citada anteriormente, se modifica mediante ingeniería genética un vector de expresión para la expresión de ob para el control de la secuencia señal del factor de acoplamiento a.

Cualquiera de una gran variedad de secuencias de control de expresión (secuencias que controlan la expresión de una secuencia de ADN, enlazado operativamente a ellas), puede ser usada en estos vectores para expresar las secuencias de ADN de esta invención. Tales secuencias de control de expresión útiles incluyen, por ejemplo, los promotores tempranos o tardíos de SV40, CMV, vacunas, poliomas o adenovirus, el sistema lac, el sistema trp, el sistema TAC, el sistema TRC, el sistema LTR y las regiones principales operadora y promotora del fago I, las regiones de control de la proteína de revestimiento fd, el promotor de 3-fosfoglicerato-quinasa y otras enzimas glicolíticas; los promotores de fosfatasa ácida (por ejemplo, Pho5), el promotor AOX 1 de la levadura metilotrófica, los promotores de los factores de acoplamiento a de la levadura y otras secuencias que se sabe que controlan la expresión de genes de células procarióticas o eucarióticas o sus virus, y diversas combinaciones de los mismos.

También son útiles una gran variedad de células hospedadoras unicelulares al expresar las secuencias de ADN de esta invención. Estos hospedadores pueden incluir hospedadores procarióticos y eucarióticos bien conocidos, tales como cepas de E. coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces; hongos, tales como levaduras (Saccharomyces y levadura metilotrófica, tales como Pichia, Candida, Hansenula y Torulopsis); y células animales, tales como CHO, R 1,1, B-W y LM; células de riñón de mono verde africano (por ejemplo, COS 1, COS 7, BSC1, BSC40 y BMT10) células de insectos (por ejemplo Sf9) y células humanas y células vegetales en cultivo de tejido.

Se entenderá que no todos los vectores, secuencias de control de expresión y hospedadores funcionarán igualmente bien para expresar las secuencias de ADN de esta invención. Tampoco todos los hospedadores funcionan igualmente bien con el mismo sistema de expresión. Sin embargo, un experto en la técnica podrá seleccionar los vectores apropiados, las secuencias de control de expresión y los hospedadores sin experimentación indebida para obtener la expresión deseada, sin salirse del alcance de esta invención. Por ejemplo, al seleccionar un vector, se debe considerar el hospedador debido a que el vector debe funcionar en él. El número de copias del vector, la capacidad para controlar ese número de copias y la expresión de cualesquiera otras proteínas codificadas por el vector, tales como los marcadores antibióticos, también serán considerados.

Al seleccionar una secuencia de control de expresión, se considerará normalmente una variedad de factores. Esto incluye, por ejemplo, la potencia relativa del sistema, su capacidad de ser controlado y su compatibilidad con la secuencia particular de ADN o el gen particular que se va a expresar, en especial por lo que respecta a las estructuras secundarias potenciales. Se seleccionarán los hospedadores unicelulares adecuados teniendo en consideración, por ejemplo, su compatibilidad con el vector seleccionado, sus características de secreción, su capacidad para plegar correctamente las proteínas y sus requerimientos de fermentación, así como la toxicidad para

el hospedador del producto codificado por las secuencias de ADN que van a ser expresadas, y la posibilidad de purificación de los productos de expresión.

Considerando estos y otros factores, un experto en la técnica podrá construir una variedad de combinaciones de vector/secuencia de vector de expresión/hospedador que expresen las secuencias de ADN de esta invención por fermentación, o en un cultivo animal a gran escala.

En una realización específica, puede expresarse una proteína de fusión OB. Una proteína de fusión OB comprende al menos una parte funcionalmente activa de una proteína que no sea OB, unida por medio de una ligadura de péptido a al menos una parte funcionalmente activa de un polipéptido OB. Las secuencias que no son ob pueden ser amino- o carboxi-terminales con respecto a las secuencias OB. Más preferiblemente, para una expresión estable de una proteína de fusión OB proteolíticamente inactiva, la parte de la proteína de fusión que no es OB se une por medio de una unión de péptido al extremo amino de la proteína OB. Una molécula de ADN recombinante que codifica para una proteína de fusión de este tipo comprende una secuencia que codifica al menos una parte funcionalmente activa de una proteína que no es OB unida en el marco a la secuencia codificante de OB, y preferiblemente codifica un sitio de escisión para una proteasa específica, por ejemplo, trombina o factor Xa, preferiblemente en la junta OB-no-OB. En una realización específica, se expresa la proteína de fusión en Escherichia coli o en P. pastoris.

En una realización específica, más adelante, se prepararon vectores para expresar los genes ob de murino y humano, con y sin el codón para gln-49, en sistemas de expresión bacteriana y en sistemas de expresión en levadura (Pichia), como proteínas de fusión. Se prepara el gen ob con un sitio de escisión por endonucleasa, por ejemplo, utilizando PCR y cebadores novedosos. Es conveniente confirmar las secuencias generadas por PCR, puesto que es mayor la probabilidad de incluir una mutación puntual con esta técnica. Se usa un plásmido que contiene un marcador de histidina (cola de His) y un sitio de escisión proteolítica. La presencia de la histidina hace posible el aislamiento selectivo de proteínas recombinantes en una columna de quelación de Ni, o mediante purificación por afinidad. El sitio de escisión proteolítico, en una realización específica más adelante, un sitio de escisión de trombina, se modifica mediante ingeniería genética de tal manera que el tratamiento con la proteasa, por ejemplo, la trombina, libere el polipéptido OB maduro, de longitud completa (es decir, que carece de una señal de secuencia).

En otro aspecto, el vector pGEX [Smith et al., Gen, 67:31-40 (1988)] puede ser usado. Este vector funde el ADNc de glutatión S-transferasa de Schistosoma japonicum, a la secuencia de interés. Se recogieron las proteínas bacterianas y se puede purificar rápidamente las proteínas recombinantes en una columna de afinidad reducida al glutatión. Se puede escindir subsecuentemente el portador de GST de las proteínas de difusión, mediante digestión con proteasas específicas para el sitio. Después de la escisión, se puede eliminar el portador y la proteína de fusión no dividida mediante absorción en glutatión-agarosa. La dificultad con el sistema ocasionalmente se presenta cuando la proteína codificada es insoluble en disoluciones acuosas.

La expresión de proteínas recombinantes en sistemas bacterianos puede dar como resultado el plegamiento incorrecto de la proteína expresada, lo que requiere volver a plegar. La proteína recombinante puede ser replegada antes o después de la división para formar un polipéptido OB funcionalmente activo. Se puede replegar el polipéptido OB mediante los etapas de: (i) incubar la proteína en un tampón desnaturalizante que contiene un agente reductor y luego (ii) incubar la proteína en un tampón que contiene el agente oxidante y, preferiblemente, también contiene un agente estabilizador de proteína o un agente caotrópico, o ambos. Los pares de agentes redox (reductor/oxidante) adecuados incluyen, pero no se limitan a, glutatión reducido/disulfuro de glutatión, cistina/cisteína, cistamina/cisteamina y 2-mercaptoetanol/disulfuro de 2-hidroxietilo. En un aspecto particular, se puede solubilizar la proteína de fusión en un desnaturalizador, tal como urea, antes de intercambiar en el tampón reductor. En una realización preferida, también se purifica la proteína, por ejemplo, mediante intercambio de iones o mediante cromatografía por quelación de Ni, antes de intercambiar en el tampón reductor. Los agentes desnaturalizadores incluyen, pero no se limitan a, urea y clorhidrato de guanidina. Luego se diluye la proteína recombinante aproximadamente al menos diez veces, más preferiblemente, aproximadamente cien veces, en un tampón oxidante que contiene un agente oxidante, tal como, pero no se limitan a, tris-HCl 0,1 M, pH 8,0, EDTA 1 mM, NaCl 0,15 M, glutatión oxidado 0,3 M. Luego se incuba la proteína de fusión durante aproximadamente 1 a 24 horas, preferiblemente alrededor de 2 a 16 horas, a temperatura ambiente, en el tampón oxidante. El tampón oxidante puede comprender un agente estabilizador de proteína, por ejemplo, un azúcar, un alcohol o sulfato de amonio. El tampón oxidante puede comprender adicionalmente un agente caotrópico a baja concentración, para desestabilizar las interacciones intermoleculares incorrectas y, de tal manera, promover el plegamiento apropiado. Los agentes caotrópicos adecuados incluyen, pero no se limitan a, un detergente, un poliol, L-arginina, clorhidrato de guanidina y polietilenglicol (PEG). Es importante usar una concentración suficientemente baja de agente caotrópico para evitar la desnaturalización e la proteína. Se puede concentrar la proteína replegada al menos alrededor de 10 veces, más preferiblemente, en una cantidad en que se diluyó en el tampón oxidante.

Los procedimientos de fermentación bacteriana también pueden dar como resultado la preparación de proteína recombinante que contiene niveles inaceptables de endotoxinas. Por lo tanto, la invención contempla la eliminación de dichas endotoxinas, por ejemplo, utilizando anticuerpos específicos para la endotoxina u otras moléculas de

unión a la endotoxina. La presencia de endotoxinas puede ser determinada mediante técnicas convencionales, tales como empleando reactivos E-TOXATE (Sigma, St. Louis, Missouri), o mediante bioensayos.

Además del ejemplo específico, los inventores de la presente contemplan el uso de sistemas de expresión en baculovirus, en mamíferos y en levadura para expresar la proteína ob. Por ejemplo, en los sistemas de expresión de baculovirus, ambos vectores de transferencia sin fusión, tal como, pero no se limitan a pVL941 (sitio de clonación BamH1, Summers), pVL1393 (sitios de clonación BamH1, SmaI, XbaI, EcoR1, NotI, XmaIIIm BglII y PstI, Invitrogen); pVL1392 (sitios de clonación BglII, PstI, NotI, XmaIII, EcoRI, XbaI, SmaI y BamH1; Summers e Invitrogen); y pBlueBacIII (sitios de clonación BamH1, BglII, PstI, NcoI y HindIII, con selección recombinante azul/blanco posible; Invitrogen), y vectores de transferencia por fusión tales como, pero no se limitan a, pAc700 (sitios de clonación BamH1 y KpnI, donde el sitio de reconocimiento BamH1 comienza con el codón de inicio; Summers), pAc701 y pAc702 (igual que pAc700, con diferentes marcos de lectura), pAc360 (sitio de clonación BamH1, 36 pares de bases en el sentido de 3’ de un codón de inicio de polihedrina; Invitrogen (195)); y pBluBacHisA, B, C (tres marcos de lectura diferentes, con sitios de clonación BamH1, BglII, PstI, NcoI y HindIII, un péptido N-terminal para la purificación de ProBond y selección de placas recombinante azul/blanco; Invitrogen (220)).

Los vectores de expresión en mamíferos, contemplados para el uso en la invención, incluyen vectores con promotores inducibles, tales como el promotor de dihidrofolato-reductasa (DHFR), por ejemplo, cualquier vector de expresión con un vector de expresión de DHFR, o un vector de coamplificación DHFR/metotrexato, tal como pED (sitios de clonación PstI, SalI, SbaI, SmaI y EcoRI con el vector que expresa tanto el gen clonado como DHFR; véase Kaufman, Current Protocols in Molecular Biology, 1 6,12 (1991). Alternativamente, un vector de coamplificación de glutamina-sintetasa/metionina-sulfoximina, tal como pEE14 (sitios de clonación HindIII, XbaI, SmaI, SbaI, EcoRI y BclI, donde el vector expresa glutamina-sintasa y el gen clonado; Celltech). En otra realización, un vector que dirige la expresión episómica bajo el control del virus de Epstein Barr (EBV) puede ser utilizado tal como pREP4 (sitios de clonación BamH1, SfiI, XhoI, NorI, NheI, HindIII, NheI, PvuII y KpnI, el promotor RSV-LTR constitutivo, el marcador seleccionable por higromicina; Invitrogen), pCEP4 (sitios de clonación BamH1, SfiI, XhoI, NotI, NheI, HindIII, NheI, PvuII y KpnI, hCMV constitutivo inmediato al gen temprano, marcador seleccionable por higromicina; Invitrogen), pMEP4 (sitios de clonación KpnI, PvuI, NheI, HindIII, NotI, XhoI, SfiI, BamH1, promotor de gen metalotioneina IIa inducible, marcador seleccionable por higromicina; Invitrogen), pREP8 (sitios de clonación BamH1, XhoI, NotI, HindIII, NheI, y KpnI, promotor RSV-LTR, marcador seleccionable con histidinol; Invitrogen); pREP9 (sitios de clonación KpnI, NheI, HindIII, NotI, XhoI, SfiI, BamH1, promotor RSV-LTR, marcador seleccionable G418; Invitrogen) y pEBVHis (promotor RSV-LTR, marcador seleccionable con higromicina, péptido N-terminal, purificable mediante resina ProBond y dividido mediante enteroquinasa; Invitrogen). Los vectores de expresión en mamíferos, seleccionables, para ser usados en la invención, incluyen pRc/CMV (sitios de clonación HindIII, BstXI, NotI, SbaI y ApaI, selección G418; Invitrogen), pRc/RSV (sitios de clonación HindIII, SpeI, BstXI, NotI, XbaI, selección G418; Invitrogen), y otros. Los vectores de expresión en mamíferos de virus de vacunas (véase Haufman, 1991, citado anteriormente) para uso según la invención incluyen, pero no se limitan a: pSC11 (sitio de clonación SmaI, selección TK- y 1-gal), pMJ601 (sitios de clonación SalI, SmaI, AflI, NarI, BspMII, BamHI, ApaI, NheI, SacII, KpnI y HindIII; selección TK- y 1-gal), y pTKgptF1S (sitios de clonación EcoRI, PstI, SalI, AccI, HindII, SbaI, BamHI y Hpa, selección TK o XPRT).

También se puede utilizar sistemas de expresión en levadura según la invención para expresar el polipéptido OB. Por ejemplo, el vector pYES2 sin fusión (sitios de clonación XbaI, SphI, ShoI, NotI, GstXI, EcoRI, BstXI, BamH1, SacI, Kpl1 y HindIII; Invitrogen) o pYESHisA, B, C de fusión (sitios de clonación XbaI, SphI, ShoI, NotI, BstXI, EcoRI, BamH1, SacI, Kpl1 y HindIII, péptido N-terminal, purificado con resina ProBond y dividido con enteroquinasa; Invitrogen), para mencionar sólo dos, pueden ser empleados según la invención.

Además se pretende que se pueda preparar análogos de péptido modulador de peso corporal a partir de las secuencias de nucleótido derivadas dentro del alcance de la presente invención.

Además de la expresión recombinante del polipéptido OB, la presente invención contempla y permite totalmente la preparación de polipéptido OB o fragmentos del mismo, utilizando las técnicas bien conocidas y sumamente desarrolladas de síntesis de péptido en fase sólida. La invención contempla utilizar tanto Boc como Fmoc populares, así como otras estrategias de grupo protector, para preparar el polipéptido ob o fragmentos del mismo. También son bien conocidas en la técnica diversas técnicas para replegar y oxidar las cadenas laterales de cisteína para formar una unión de disulfuro.

ANTICUERPOS PARA EL POLIPÉPTIDO OB

Según la invención, el polipéptido OB producido de manera recombinante o por síntesis química y los fragmentos y otros derivados análogos del mismo, incluyendo las proteínas de fusión puede ser usado como un inmunógeno para generar anticuerpos que reconocen el anticuerpo OB. Dichos anticuerpos incluyen, pero no se limitan a, fragmentos policlonales, monoclonales, quiméricos, de una sola cadena, Fab y una biblioteca de expresión Fab.

Una molécula es “antigénica” cuando puede interactuar específicamente con una molécula de reconocimiento de antígeno del sistema inmunológico, tal como una inmunoglobulina (anticuerpo) o un receptor de antígeno de célula

T. Un polipéptido antigénico contiene al menos aproximadamente 5 aminoácidos, y preferiblemente al menos

alrededor de 10 aminoácidos. Una parte antigénica de una molécula puede ser aquella parte que es inmunodominante para el reconocimiento del anticuerpo o del receptor de célula T, o puede ser una parte usada para generar un anticuerpo para la molécula, conjugando la parte antigénica con una molécula portadora, para la inmunización. Una molécula que es antigénica no necesariamente será inmunogénica por sí misma, es decir, puede desatar una respuesta inmunológica sin un portador.

Un “anticuerpo” es cualquier inmunoglobulina, incluyendo los anticuerpos y fragmentos de los mismos, que se une a un epítopo específico. El término abarca anticuerpos policlonales, monoclonales y quiméricos, este último mencionado se describe con mayor detalle en las patentes estadounidenses n.os 4.816.397 y 4.816.567, así como los restos de los anticuerpos que se unen al antígeno, incluyendo Fab, F(ab')2 y F(v) (incluyendo los anticuerpos de una sola cadena). Por consiguiente la expresión “molécula de anticuerpo” en sus diversas formas gramaticales, tal como se usa en el presente documento, contempla tanto una molécula de inmunoglobulina intacta como una parte inmunológicamente activa de una molécula de inmunoglobulina que contiene el sitio de combinación con el anticuerpo. Un “sitio de combinación con el anticuerpo” es aquella parte estructural de una molécula de anticuerpo que consta de regiones variables e hipervariables de cadena pesada y de cadena ligera, que se unen específicamente al antígeno.

Las molécula de anticuerpo a modo de ejemplo son las moléculas de inmunoglobulina intactas, las moléculas de inmunoglobulina sustancialmente intactas y aquellas partes de una molécula de inmunoglobulina que contienen el parátopo, incluyendo aquellas partes conocidas en la técnica como Fab, Fab', F(ab')2 y F(v), partes que se prefieren para su uso en los métodos terapéuticos descritos en el presente documento.

Las partes Fab y F(ab')2 de las moléculas de anticuerpo se preparan mediante la reacción proteolítica de papaína y pepsina, respectivamente, sobre moléculas de anticuerpo sustancialmente intactas, por medio de métodos que son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, la patente estadounidense n.º 4.342.566 de Theofilopolous et al.. También se conocen bien las partes de molécula de anticuerpo Fab' y se producen a partir de partes F(ab')2, seguida por reducción de las ligaduras disulfuro que enlazan las dos partes de cadena pesada como con mercaptoetanol, y luego mediante alquilación del mercaptano de proteína resultante con un reactivo tal como yodoacetamida. Se prefiere en el presente documento un anticuerpo que contenga moléculas de anticuerpo intactas.

La expresión “anticuerpo monoclonal”, en sus diversas formas gramaticales, se refiere a un anticuerpo que tiene únicamente una especie de sitio combinador con el anticuerpo, que puede inmunorreaccionar con un antígeno particular. Por tanto, un anticuerpo monoclonal presenta típicamente una sola afinidad de unión para cualquier antígeno con el que inmunorreacciona. Por tanto, un anticuerpo monoclonal puede contener una molécula de anticuerpo que tenga una pluralidad de sitios de combinación con el anticuerpo, cada uno inmunoespecífico para un antígeno diferente, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal biespecífico (quimérico).

El término “adyuvante” se refiere a un compuesto o una mezcla que potencia la respuesta inmunológica a un antígeno. Un adyuvante puede servir como un depósito de tejido que libera lentamente el antígeno y también como un activador del sistema linfoide que no potencia específicamente la respuesta inmunológica [Hood et al. en Immunology, página 384, segunda edición, Benjamin/Cummings, Menlo Park, California (1984)]. A menudo, un desafío primario con un antígeno solo, en ausencia de un adyuvante, no podrá desatar una respuesta inmunológica humoral o celular. Los adyuvantes incluyen, pero no se limitan a, el adyuvante de Freund completo, el adyuvante de Freund incompleto, la saponina, los geles minerales, tales como hidróxido de aluminio, las sustancias superficialmente activas, tales como lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptido, emulsiones de aceite o de hidrocarburo, hemocianinas de lapa de ojo de cerradura, dinitrofenol y adyuvantes humanos potencialmente útiles, tales como BCG (bacille Calmette-Guerin) y Corynebacterium parvum. Preferiblemente, el adyuvante es farmacéuticamente aceptable.

Se pueden utilizar diversos procedimientos conocidos en la técnica para la producción de anticuerpos policlonales para el polipéptido OB, o fragmento, derivado o análogo del mismo. Para la producción del anticuerpo, se puede inmunizar diversos animales hospedadores mediante inyección con el polipéptido OB o un derivado del mismo (por ejemplo, un fragmento o una proteína de fusión), incluyendo, pero sin limitación a conejos, ratones, ratas, ovejas, cabras, etc. En una realización, el polipéptido OB o fragmento del mismo se puede conjugar con un portador inmunogénico, por ejemplo, albúmina de suero bovino (BSA) o hemocianina de lapa de ojo de cerradura (KLH). Se puede utilizar diversos adyuvantes para incrementar la respuesta inmunológica, dependiendo de las especies hospedadoras, que incluyen, pero sin limitación, el adyuvante de Freund (completo e incompleto), geles minerales, tales como hidróxido de aluminio, las sustancias superficialmente activas, tales como lisolecitina, los polioles plurónicos, los polianiones, los péptidos, las emulsiones en aceite, las hemocianinas de lapa de ojo de cerradura, dinitrofenol y los adyuvantes humanos potencialmente útiles, tales como BCG (bacille Calmette-Guerin) y Corynebacterium parvum.

Para la preparación de anticuerpos monoclonales dirigidos hacia el polipéptido OB, o fragmento, análogo o derivado del mismo, se puede usar cualquier técnica que proporciona la producción de moléculas de anticuerpo mediante líneas celulares continuas en cultivo. Estas incluyen, pero no se limitan a, técnica del hibridoma desarrollada originalmente por Kohler et al., Nature, 256:495-497 (1975), así como la técnica de trioma, la técnica del hibridoma de célula B humana [Kozbor et al., Immunology Today, 4:72 (1983)] y la técnica del hibridoma EBV para producir

anticuerpos monoclonales humanos [Cole et al. en Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, páginas 77-96, Alan,

R. Liss, Inc., (1985)]. Se puede crear líneas celulares productoras de anticuerpo, inmortales, mediante técnicas diferentes a la fusión, tales como mediante transformación directa de linfocitos B con ADN oncógeno o trasfectación con virus de Epstein-Barr. Véase, por ejemplo, M. Schreier et al. “Hybridoma Techniques” (1980); Hammerling et al., “Monoclonal Antibodies and T-cell Hybridomas” (1981); Kennett et al., “Monoclonal antibodies” (1980), véase también las patentes estadounidenses n.os 4.341.761; 4.399.121; 4.427.783; 4.444.887, 4.451.570; 4.466.917; 4.472.500; 4.491.632 y 4.493.890.

En una realización adicional de la invención se puede producir anticuerpos monoclonales en animales libres de gérmenes, utilizando tecnología reciente (TCP/US90/02545). Según la invención, se puede utilizar anticuerpos humanos y pueden ser obtenidos utilizando hibridomas humanos [Cote et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:20262030 (1983)] o transformando células B humanas con el virus EBV in vitro (Cole et al., 1985, citado anteriormente). De hecho, según la invención, las técnicas desarrolladas para la producción de “anticuerpos quiméricos” [Morrison et al., J. Bacteriol., 159-870 (1984); Neuberger et al., Nature, 312:604-608 (1984); Takeda et al., Nature, 314:452-454 (1985)], abriendo los genes de una molécula de anticuerpo de ratón específica para un polipéptido ob, empalmando los genes procedentes de una molécula de anticuerpo de ratón específicos para un polipéptido ob, junto con genes procedentes de una molécula de anticuerpo humano, de actividad biológica apropiada; dichos anticuerpos están dentro del alcance de esta invención. Se prefiere dichos anticuerpos quiméricos humanos o humanizados para uso en terapia de enfermedades o alteraciones humanas (descritas más adelante), debido a que es mucho menos probable que los anticuerpos humanos o humanizados induzcan una respuesta inmunológica, en comparación con los anticuerpos genógenos, en particular, una respuesta alérgica, por sí mismos.

Según la invención se puede adaptar las técnicas descritas para la producción de anticuerpos de una sola cadena (patente estadounidense n.º 4.946.778) para producir anticuerpos de una sola cadena, específicos, para el polipéptido OB. Una realización adicional de la invención utiliza las técnicas descritas para la construcción de bibliotecas de expresión Fab [Huse et al., Science, 246:1275-1281 (1989)] para permitir la identificación rápida y fácil de fragmentos Fab monoclonales con la especificidad deseada para un polipéptido ob o sus derivados o análogos.

Los fragmentos de anticuerpo que contienen el idiotipo de la molécula de anticuerpo pueden ser generados mediante técnicas conocidas. Por ejemplo, tales fragmentos pueden incluir, pero no se limitan a: el fragmento F(ab')2 que puede producirse mediante digestión con pepsina de la molécula de anticuerpo; los fragmentos Fab' que pueden ser generados reduciendo los puentes disulfuro del fragmento F(ab')2 y los fragmentos Fab que pueden ser generados tratando una molécula de anticuerpo con papaína y un agente reductor.

En la producción de anticuerpos, se puede obtener la selección del anticuerpo deseado mediante técnicas conocidas en la técnica por ejemplo, radioinmunoensayo, ELISA (ensayo inmunosorbente enlazado a enzima), inmunoensayos de tipo “sandwich”, ensayos inmunorradiométricos, reacciones de precipitación con difusión en gel, ensayos de inmunodifusión, inmunoensayos in situ (utilizando marcadores de oro coloidal, enzima o radioisótopos, por ejemplo), inmunotransferencias de tipo Western, reacciones de precipitación, análisis de aglutinación (por ejemplo, ensayos de aglutinación de gel, ensayos de hemoaglutinación), ensayos de fijación de complemento, ensayos de inmunofluorescencia, ensayos de proteína A, ensayos de inmunoelectroforesis, etc. En una realización, se detecta la unión de anticuerpo detectando un marcador o etiqueta en el anticuerpo primario. En otra realización, se detecta el anticuerpo primario detectando la unión de un anticuerpo secundario o reactivo al anticuerpo primario. En otra realización más, se marca o etiqueta el anticuerpo secundario. Se conoce en la técnica muchos medios para detectar la unión en un inmunoensayos y todos ellos están dentro del alcance de la presente invención. Por ejemplo, para seleccionar anticuerpos que reconozcan un epítopo específico de un polipéptido OB se puede analizar los hibridomas generados para un producto que se une a un fragmento de polipéptido OB que contiene dicho epítopo. Para la selección de un anticuerpo específico a un polipéptido OB, a partir de una especie particular de animal, se puede seleccionar, con base en la unión positiva con el polipéptido OB, expresado o aislado a partir de células de esa especie de animal.

Se puede usar los anticuerpos anteriores en métodos conocidos en la técnica que se refieren a la localización y a la actividad del polipéptido OB, por ejemplo, para la inmunotransferencia de tipo Western, formación de imagen in situ de polipéptido OB, medir los niveles del mismo en muestras fisiológicas apropiadas, etc.

En una realización específica, se puede generar anticuerpos que agonicen o antagonicen la actividad del polipéptido OB. Dichos anticuerpos pueden someterse a prueba utilizando los ensayos descritos más adelante para identificar los ligandos.

En una realización específica, se desarrollan anticuerpos inmunizando ratones con péptidos sintéticos predichos por la secuencia de proteínas o con proteínas recombinantes preparadas utilizando vectores de expresión bacteriana. La selección de los péptidos sintéticos se prepara después de un análisis cuidadoso de la estructura de proteína predicha, tal como se describió anteriormente. En particular, se eligen las secuencias de péptido entre los sitios de escisión putativos. Se conjugan los péptidos sintéticos a un vehículo, tal como hemocianina KLH o BSA, utilizando una carbodiimida y se utiliza en el adyuvante de Freunds para inmunizar conejos. Con el fin de preparar la proteína recombinante, se puede utilizar el vector pGEX para expresar el polipéptido (Smith et al., 1988, citado

anteriormente). Alternativamente, se puede utilizar solamente dominios hidrófilos para generar la proteína de fusión. Se preparará la proteína expresada en cantidades y se utilizará para inmunizar conejos en el adyuvante de Freunds.

En otra realización específica, se usa el polipéptido OB recombinante para inmunizar pollos, y se recupera los anticuerpos anti-OB de pollo de la yema del huevo, por ejemplo, mediante purificación por afinidad en una columna de OB. Preferiblemente, los pollos utilizados en la inmunización se mantienen en condiciones libres de patógenos específicos (SPF).

En otra realización se generan ratones ob/ob anticuerpos contra leptina, que carecen de la proteína OB circulante y, por tanto, se espera que puedan generar una respuesta antipolipéptido OB, puesto que no serán tolerados para el polipéptido y para ratones de tipo natural. Se pueden fundir células de bazo procedentes de ambos grupos de ratones con células de mieloma para preparar hibridomas para anticuerpos monoclonales.

Aún en otra realización, se utiliza el polipéptido OB recombinante para inmunizar conejos y los anticuerpos policlonales son inmunopurificados antes de su uso adicional. Los anticuerpos purificados son particularmente útiles para ensayos semicuantitativos, particularmente para detectar la presencia del polipéptido OB circulante en el suero

o en el plasma.

Los paneles de anticuerpos monoclonales producidos contra péptidos moduladores pueden ser seleccionados para diversas propiedades, por ejemplo, el isotipo, el epítopo, la afinidad, etc. Son de interés particular los anticuerpos monoclonales que neutralizan la actividad de los péptidos moduladores. Tales monoclonales pueden ser identificados fácilmente mediante ensayos de actividad para los moduladores de peso. Los anticuerpos de alta afinidad también son útiles cuando es posible la purificación por inmunoafinidad de modulador nativo o recombinante.

Preferiblemente, el anticuerpo antimodulador usado en los métodos de diagnóstico y terapéuticos de esta invención es un anticuerpo policlonal purificado por afinidad. Más preferiblemente, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal (mAb). Además, se prefiere que las moléculas de anticuerpo antimodulados usadas en la presente estén en la forma de restos Fab, Fab', F(ab')2 o F(v) de las moléculas de anticuerpo enteras.

IMPLICACIONES DE DIAGNOSTICO

La presente invención se refiere también a una variedad de aplicaciones de diagnóstico, que incluyen métodos para detectar la presencia de las condiciones y/o los estímulos que impactan sobre las anormalidades del peso corporal o la adiposidad, haciendo referencia a su capacidad para desatar las actividades que son mediadas por los moduladores de peso de la presente. Como se mencionó anteriormente los péptidos moduladores de peso pueden ser usados para producir anticuerpos para sí mismos, por medio de una variedad de técnicas conocidas, y dichos anticuerpos podrían ser aislados entonces y utilizados, por ejemplo, en pruebas para determinar la presencia de actividad transcripcional particular, en células de destino sospechosas. Alternativamente, se puede emplear en el diagnóstico los ácidos nucleicos de la invención.

DIAGNOSTICO A BASE DE ANTICUERPOS

Tal como se sugirió anteriormente, un método de diagnóstico útil en la presente invención comprende examinar una muestra celular o un medio celular por medio de un ensayo que incluye una cantidad efectiva de un antagonista para una proteína moduladora, tal como un anticuerpo modulador, preferiblemente un anticuerpo policlonal purificado por afinidad y, más preferiblemente, un mAb. Además, se prefiere que las moléculas de anticuerpo antimodulador usadas en el presente documento estén en la forma de partes de Fab, Fab', F(ab')2 o F(v) o moléculas de anticuerpo enteras. Tal como se discutió anteriormente, los pacientes que pueden obtener beneficio de este método incluyen aquellos que padecen cáncer, SIDA, obesidad u otros estados en los que el peso anormal del cuerpo es una característica o un factor. Los métodos para aislar el modulador e inducir los anticuerpos antimoduladores y para determinar y optimizar la capacidad de los anticuerpos antimoduladores para ayudar al examen de las células de destino son bien conocidos en la técnica.

Además, los anticuerpos que incluyen tanto anticuerpos policlonales como monoclonales y los fármacos que modulan la producción o la actividad de los moduladores de control del peso u otros factores de reconocimiento y/o sus subunidades, pueden tener determinadas aplicaciones en diagnóstico y, por ejemplo, pueden ser utilizados para los propósitos de detectar y/o medir las estados en las que es o puede ser probable que se desarrollen anormalidades en el peso corporal. Por ejemplo, los péptidos moduladores o sus fragmentos activos pueden ser usados para producir anticuerpos policlonales y monoclonales para sí mismos en una variedad de medios celulares, mediante técnicas conocidas, tales como la técnica de hibridoma que utiliza, por ejemplo, linfocitos del bazo de ratón fundidos y células de mieloma. Estas técnicas están descritas detalladamente más adelante. De igual manera, se puede descubrir o sintetizar moléculas pequeñas que imiten o antagonicen la(s) actividad(es) de los factores de reconocimiento de receptor de la invención, y se pueden utilizar en protocolos de diagnóstico y/o terapéuticos.

La presencia de los moduladores de peso en las células se puede determinar por medio de procedimientos inmunológicos usuales aplicables a tales determinaciones. Se conocen diversos procedimientos útiles. Tres de esos procedimientos, que son especialmente útiles, emplean el factor de reconocimiento de receptor marcado con una

etiqueta o un marcador detectable, el anticuerpo Ab1 marcado con un marcador detectable o el anticuerpo Ab2 marcado con un marcador detectable. Se pueden resumir los procedimientos por medio de las siguientes ecuaciones, en donde el asterisco indica que la partícula está marcada; y “WM” representa el modulador de peso:

A. WM* + Ab1 = WM*A1

B. WM + Ab*1 = WMAb1*

C. WM + Ab1 + Ab2 = Ab1WMAb2*

Los procedimientos y su aplicación son todos familiares para los expertos en la técnica y, por consiguiente, pueden ser utilizados dentro del alcance de la presente invención. El procedimiento “competitivo”, procedimiento A, está descrito en las patentes estadounidenses n.os 3.654.090 y 3.850.752. El procedimiento B es representativo de técnicas de análisis competitivo bien conocidas. El procedimiento C es el procedimiento de “sandwich” que está descrito en las patentes estadounidenses n.os RE 31.006 y 4.016.043. Otros procedimientos más se conocen, tales como el procedimiento de “doble anticuerpo” o el procedimiento “DASP”.

En cada caso, los moduladores de peso forman complejos con uno o más anticuerpos o componentes de unión y un miembro del complejo está marcado con una etiqueta o marcador detectable. El hecho de que se haya formado un complejo y, si se desea, puede determinarse la cantidad del mismo por medio de métodos conocidos aplicables a la detección de marcadores.

Se observará de lo anterior que una propiedad característica de Ab2 es que se reaccionará con Ab1. Esto se debe a que Ab1 criado en una especie de mamífero, ha sido usado en otra especie como un antígeno para elevar el anticuerpo Ab2. Por ejemplo, se puede criar Ab2 en cabras utilizando anticuerpos de conejo como antígenos. Por consiguiente, Ab2 sería el anticuerpo anticonejo criado en cabras. Para propósitos de esta descripción y de las reivindicaciones, se hará referencia a Ab1 como a un anticuerpo primario o antimodulador de peso, y a Ab2 como un anticuerpo secundario o anti-Ab1.

Los marcadores muy comúnmente empleados en estos estudios son elementos radioactivos, enzimas, sustancias químicas que fluorescen cuando se exponen a luz ultravioleta y otros.

Se conocen muchos materiales fluorescentes y pueden ser utilizados como marcadores. Esto incluye, por ejemplo, la fluoresceína, la rodamina y la auramina. Un material detector particular es un anticuerpo anticonejo preparado en cabras y conjugado con fluoresceína por medio de un isotiocianato.

Los moduladores de peso o sus componentes de unión también pueden ser marcados con un elemento radioactivo

o con una enzima. La etiqueta radioactiva puede ser detectada por cualquiera de los procedimientos de conteo actualmente disponibles. El isótopo preferido se puede seleccionar de 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125I, 131I y 186Re.

También son útiles las etiquetas de enzima, y pueden ser detectadas por cualquiera de las técnicas actualmente utilizadas: colorimétricas, espectrofotométricas, fluoro espectrofotométricas, amperométricas o gasométricas. Se conjuga la enzima a la partícula seleccionada mediante reacción con moléculas de puente, tales como carbodiimidas, diisocianatos, glutaraldehído y similares. Muchas enzimas que pueden ser usadas en esos procedimientos son conocidas y pueden ser utilizadas. Las preferidas son: peroxidasa, a-glucuronidasa, 1-Dglucosidasa, 1-D-galactosidasa, ureasa, glucosa-oxidasa más peroxidasa y fosfatasa alcalina. Las patentes estadounidenses n.os 3,654,090; 3,850,752 y 4,016,043 son mencionadas a manera de ejemplo por cuanto describen materiales marcadores alternativos y métodos.

En una realización adicional de esta invención se puede preparar kits de prueba adecuados para ser usados por un especialista médico con el fin de determinar la presencia o ausencia de una actividad transcripcional predeterminada

: o la capacidad de la actividad transcripcional predetermina, en células de destino sospechosas. Según las técnicas de prueba discutidas anteriormente, una clase de tales kits contendrá al menos un modulador de peso marcado o su componente de unión, por ejemplo, un anticuerpo específico al mismo, y las instrucciones, por supuesto, dependiendo del método seleccionado, por ejemplo, “competitivo”, “sandwich”, “DASP” y similares. Los kits también pueden contener reactivos periféricos, tales como tampones, estabilizadores, etc.

Por consiguiente, se puede preparar un kit de prueba para la demostración de la presencia o capacidad de las células para una actividad transcripcional predeterminada, que comprende:

(a): una cantidad predeterminada de al menos un componente inmunoquímicamente reactivo, marcado, obtenido por unión directa o indirecta del modulador de peso de la presente o un componente de unión específico para el mismo, a un marcador detectable;

(b): otros reactivos; y

(c): instrucciones para usar el dicho kit.

Más específicamente, el kit de prueba de diagnóstico puede comprender:

(a) una cantidad conocida de un modulador de peso, tal como se describió anteriormente (o un componente de unión), unido generalmente a una fase sólida para formar un inmunosorbente o, alternativamente, unido a un marcador adecuado o varios de dichos productos finales, etc. (o sus componentes de unión) uno de cada uno;

(b): si es necesario, otros reactivos; y

(c): instrucciones para usar dicho de prueba.

En una variación adicional, se puede preparar el estuche de prueba y se puede usar para los propósitos señalados arriba, operando según un protocolo predeterminado (por ejemplo, “competitivo”, “sandwich”, “de doble anticuerpo”, etc.), y comprende:

(a): un componente marcado que se ha obtenido acoplando el modulador de peso a un marcador detectable;

(b): uno o más reactivos inmunoquímicos adicionales, de los cuales al menos un reactivo es un ligando o un ligando inmobilizado, y se selecciona dicho ligando del grupo que consiste en:

(i): un ligando que puede unirse con el componente marcado (a);

(ii): un ligando que puede unirse con un componente de unión del componente marcado (a);

(iii) un ligando que puede unirse con al menos uno de los componentes que van a determinarse; y

(iv): un ligando que puede unirse con al menos uno de los componentes de unión de al menos uno de los componentes que van a determinarse; y

(c): instrucciones para llevar a cabo un protocolo para la detección y/o determinación de uno o más componentes de una reacción inmunoquímica entre el modulador de peso y un componente de unión específico para el mismo.

DIAGNOSTICO A BASE DE ÁCIDO NUCLEICO

Tal como se demuestra en los ejemplos más adelante se puede utilizar ácidos nucleicos de la invención para detectar defectos asociados con defectos en el polipéptido OB, que dan como resultado fenotipos obesos. Por ejemplo, se puede usar sondas de ácido nucleico (por ejemplo, en el análisis Northern o RT-PCR) para determinar si un fenotipo obeso está asociado con la carencia de expresión de ARNm de OB, o la expresión de ARNm de OB no funcional, por ejemplo, como en los ratones db/db (en donde la deficiencia es el resultado de la carencia de un receptor OB); o cuando una mutación produce un ARNm no transcrito. Adicionalmente, se puede utilizar técnicas de diagnóstico a base de ácido nucleico de la invención con técnicas a base de anticuerpos para desarrollar adicionalmente una comprensión particular de los fenotipos obeso o anoréxico.

Los clones de ADNc humanos que han sido aislados recientemente pueden ser secuenciados, tal como se presentan en el presente documento. Esto facilita la determinación de la secuencia completa del gen humano (véase la figura 20A aC; SEQ ID NO:22). Las secuencias de ADN de intrones del gen OB humano han sido obtenidas (figura 20) y han sido utilizadas para preparar cebadores de PCR para amplificar por PCR la secuencia codificante del gen OB a partir de ADN genómico humano, de modo que se identifique las mutaciones o variantes alélicas del gen OB, todo según los protocolos descritos con detalle anteriormente en el presente documento. Los cebadores de PCR específicos para amplificar OB genómico humano se decriben en un ejemplo específico más adelante.

La actual hipótesis es que las mutaciones heterocigóticas en el gen ob estarán asociadas con una obesidad pequeña/moderada, mientras que las mutaciones homocigóticas estarían asociadas con varias pruebas de diagnóstico a base de la secuencia de ADN, para la obesidad. Si esto es así, se permitiría la determinación de gente que tiene riesgo para el desarrollo de obesidad y haría posible la aplicación del tratamiento con fármacos y/o los cambios en el tipo de vida antes de que se desarrollara plenamente el incremento en el peso corporal.

Alternativamente, la presencia de microsatélites que se segregan con formas mutantes de OB humano, puede ser utilizada para el diagnóstico. Diversos cebadores de PCR, incluyendo los que se basan en la secuencia de nucleótidos proporcionada en las figuras 20A a C, pueden ser usados en este sentido.

También puede ser útil el gen OB en el diagnóstico para las mediciones de su ARN codificado y la proteína en trastornos nutricionales. Será importante saber, en un trastorno nutricional, si el ARN de OB y/o su proteína codificada no está regulado o está deficientemente regulado. Por tanto, si una persona obesa tiene niveles incrementados de OB, parecería que el problema está en el sentido de 3’ de OB, mientras que si está reducido OB, parecería que niveles inapropiadamente bajos de OB pueden provocar la obesidad (ya sea que el defecto esté o no en el gen OB). Inversamente, si un paciente de cáncer o de SIDA que pierde peso tiene niveles elevados de OB, puede concluirse que la expresión inapropiadamente alta de OB es responsable de la pérdida de peso.

El ADNc clonado humano será útil para la medición de los niveles de ARN de OB humano. Además, la proteína humana recombinante será preparada y utilizada para desarrollar inmunoensayos para permitir la medición de la grasa y quizás los niveles de la proteína OB en el plasma.

IMPLICACIONES TERAPÉUTICAS

Los polipéptidos, los ácidos nucleicos y los anticuerpos de la invención tienen potencial terapéutico importante. Preferiblemente, se administra una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente de este tipo en un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.

La expresión “farmacéuticamente aceptable” se refiere a entidades moleculares y a composiciones que son tolerables fisiológicamente y que típicamente no producen una reacción alérgica o similarmente contraria, tal como alteraciones gástricas, mareos y similares, cuando se administra a un ser humano. Preferiblemente, tal como se usa en el presente documento, la expresión “farmacéuticamente aceptable” significa aprobado por una agencia reguladora del gobierno federal o estatal, o mencionada en la Farmacopea Estadounidense o en otra farmacopea generalmente reconocida para su uso en animales y, más particularmente, en seres humanos. El término “portador” se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente o vehículo con el que se administra el compuesto. Tales portadores farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, tales como agua o aceites, incluyendo los aceites de petróleo y de origen animal, vegetal o sintético, tales como aceite de cacahuate, aceite de soya, aceite mineral, aceite de sésamo y similares. El agua o la soluciones salinas o las disoluciones acuosas de dextrosa y de glicerol son empleadas preferiblemente como portadores, particularmente para disoluciones inyectables. Los portadores farmacéuticos adecuados se describen en Martin, Remington's Pharmaceutical Sciences, decimoctava edición, Mack Publishing Co., Easton, PA, (1990).

La expresión “cantidad terapéuticamente eficaz” se usa en el presente documento para significar una cantidad suficiente para reducir al menos en alrededor del 15%, preferiblemente al menos en alrededor del 50%, más preferiblemente, al menos en el 90% y, muy preferiblemente para prevenir, un déficit clínicamente importante en la actividad, el funcionamiento y la respuesta del hospedador. Alternativamente, es suficiente una cantidad terapéuticamente eficaz para provocar una mejora en un estado clínicamente importante en el hospedador.

La administración el polipéptido OB recombinante da como resultado pérdida de peso, en particular una disminución en el tejido graso. Se puede preparar el polipéptido OB utilizando vectores de expresión normales bacterianos y/o en mamíferos, sintéticamente o se puede purificar a partir de plasma o de suero, tal como se señala con detalle aquí anteriormente. Alternativamente, se puede inducir la expresión incrementada del polipéptido OB nativo por medio de técnicas de recombinación homólogas, tal como se describió anteriormente.

La reducción de la actividad del polipéptido OB (desarrollando antagonistas, inhibidores, el uso de anticuerpos neutralizadores o moléculas antisentido a la transferencia), debe dar como resultado un aumento de peso, tal como sería conveniente para el tratamiento de la pérdida de peso asociada con el cáncer, el SIDA o la anorexia nerviosa. La modulación de la actividad de OB puede ser útil para reducir el peso corporal (aumentando su actividad) o para incrementar el peso corporal (disminuyendo su actividad).

TRATAMIENTO TERAPÉUTICO A BASE DE POLIPÉPTIDO

En el análisis más simple, el gen OB determina el peso corporal en mamíferos, en particular en los ratones y en el hombre. El producto del gen OB y, correspondientemente, las moléculas cognadas, parecen ser parte de una trayectoria de señalamiento en la cual el tejido adiposo se comunica con el cerebro y otros órganos. Se cree que el polipéptido OB por sí mismo, es una molécula de señalización, es decir, una hormona.

El polipéptido OB o el fragmentos funcionalmente activo del mismo o el antagonistas del mismo, pueden administrarse por vía oral o por vía parenteral, preferiblemente por vía parenteral. Debido a que la omeostasis metabólica es un procedimiento continuo, se prefiere la administración de liberación controlada del polipéptido ob. Por ejemplo, se puede administrar el polipéptido utilizando infusión intravenosa, una bomba osmótica implantable, un parche transdérmico, liposomas u otros modos de administración. En una realización, se puede utilizar una bomba [Langer et al., Medical Applications of Controlled Release, CRC Pres. Boca Ratón, Florida (1974); Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng., 14:201 (1987); Buchwald et al., Surgery, 88:507 (1980); Saudek et al., N. Engl. J. Med., 321:574 (1989)]. En otra realización, puede utilizarse materiales poliméricos [Langer, 1974 citado anteriormente; Sefton, 1987, citado anteriormente; Smolen et al., eds. Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Wiley, Nueva York (1984); Ranger et al., Macromol.Sci. Rev. Macromol. Chem., 23:61 (1983); véase también Levy et al., Science, 228:190 (1985); During et al., Ann. Neurol., 25:351 (1989); Howard et al., Neurosurg., 71:105 (1989)]. Aún en otra realización, se puede colocar un sistema de liberación controlada en proximidad al destino terapéutico, es decir, el cerebro, por tanto se requiere sólo una fracción de la dosis sistémica [véase, por ejemplo, Goodson, en Medical Applications of Controlled Release, vol. 2, páginas 115-138 (1984)]. Otros sistemas de liberación controlada se discuten en el repaso de Langer, Science, 249:1527-1533 (1990). En otra realización, se puede suministrar el compuesto terapéutico en una vesícula, en particular un liposoma (véase Langer, 1990 citado anteriormente); Treat et al. en Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer,

López-Berenstein and Fidler (eds.), Liss, Nueva York, páginas 353-365 (1989); López-Berestein, ibid., páginas 317327; véase generalmente lo mismo).

En un aspecto adicional, las células recombinantes que se han transformadas con el gen OB y que expresan niveles elevados de polipéptido pueden ser transplantadas en un sujeto que necesite del polipéptido ob. Preferiblemente las células autólogas transformadas con OB son transplantadas para evitar el rechazo; alternativamente, está disponible la tecnología para blindar las células no autólogas, que producen factores solubles dentro de una matriz polimérica, lo que previene el reconocimiento inmunológico y el rechazo.

Se puede suministrar el polipéptido OB mediante vías de administración intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, intramuscular o subcutánea. Alternativamente, se puede administrar el polipéptido OB, apropiadamente formulado, por medio de administración nasal u oral. Se puede garantizar una administración constante de OB proporcionando una dosis terapéuticamente eficaz (es decir, una dosis eficaz para inducir los cambios metabólicos en un sujeto) a los intervalos necesarios, por ejemplo, diariamente, cada 12 horas, etc. Esos parámetros dependerán de la gravedad del estado de la enfermedad que se está tratando, otras acciones, tales como la modificación de la dieta que se estén implementando, el peso, edad y sexo del sujeto, y otros criterios que pueden ser determinados fácilmente según la sana práctica médica convencional, por los expertos en la técnica.

Composiciones farmacéuticas

Aún en otro aspecto de la presente invención se proporcionan composiciones farmacéuticas de lo anterior. Tales composiciones farmacéuticas pueden ser para administración por inyección o para administración por vía oral, pulmonar, nasal u otras formas de administración. En general, están comprendidas en la invención las composiciones farmacéuticas que comprenden cantidades eficaces de proteínas o de productos derivados de la invención, junto con diluyentes farmacéuticamente aceptables, conservantes, solubilizadores, emulsificantes, adyuvantes y/o portadores. Dichas composiciones incluyen diluyentes de diverso contenido en tampón (por ejemplo, Tris-HCl, acetato, fosfato), pH y concentración iónica; aditivos tales como detergentes y agentes solubilizadores (por ejemplo, Tween 80, Polisorbato 80), antioxidantes (por ejemplo, ácido ascórbico, metabisulfito de sodio), conservantes (por ejemplo, Thimersol, alcohol bencílico) y sustancias formadoras de cuerpo (por ejemplo, lactosa, manitol); la incorporación del material en las preparaciones en partículas de los compuestos poliméricos, tales como ácido poliláctico, ácido poliglicólico, etc. o en liposomas. También se puede utilizar ácido hilaurónico. Dichas composiciones pueden influir en el estado físico, la estabilidad, el régimen de la liberación in vivo y el régimen del desechamiento in vivo de las proteínas de la presente y sus derivados. Véase, por ejemplo, Martin, Remington's Pharmaceutical Sciences, decimoctava edición (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042), páginas 1435-1712. Se pueden preparar las composiciones en forma líquida o se puede hacer en polvo seco, por ejemplo, en forma liofilizada.

Administración oral

Están contempladas para uso en el presente documento las formas de dosificación sólidas orales, que se describen generalmente en Martin, Remington's Pharmaceutical Sciences, decimoctava edición (1990 Mack Publishing Co. Easton, PA 18042) en el capítulo 89. Las formas farmacéuticas sólidas incluyen los comprimidos, cápsulas, píldoras, trociscos o pastillas para chupar, los sellos para medicamentos o grageas. También se puede utilizar encapsulación liposómica o proteinoide para formular las composiciones de la presente (por ejemplo, como microesferas proteinoides informadas en la patente estadounidense n.º 4.925.673). Se puede utilizar la encapsulación liposómica y se pueden formar derivados de los liposomas con diversos polímeros (por ejemplo, véase la patente estadounidense n.º 5.013.556). Se da una descripción de formas posibles de dosis sólidas para uso terapéutico en Marshal en Modern Pharmaceutics, capítulo 10, Banker and Rhodes ed. (1989). En general, la formulación incluirá la proteína (o proteína modificada químicamente) e componentes inertes que permitan la protección contra el ambiente estomacal y la liberación del material biológicamente activo en el intestino.

También se contempla específicamente las formas farmacéuticas orales de las proteínas derivatizadas anteriores. La proteína puede ser modificada químicamente de manera que la administración oral del derivado sea eficaz. En general, la modificación química contemplada es la unión de al menos un resto de la propia molécula de proteína (o péptido) donde dicho resto permite: (a) la inhibición de la proteólisis; y (b) la absorción en el torrente sanguíneo a partir del estómago o del intestino. También es conveniente el incremento en la estabilidad global de la proteína y el incremento en el tiempo de circulación en el tiempo. Los ejemplos de dichos restos incluyen: polietilenglicol, copolímeros de etilenglicol y propilenglicol, carboximetil celulosa, dextrano, poli(alcohol vinílico), polivinilpirrolidona y poliprolina. Abuchowski et al., 1981, citado anteriormente; Newmark et al., J. Appl. Biochem, 4:185-189 (1982). Otros polímeros que podrían ser usados son poli-1,3-dioxolano y poli-1,3,6-tioxocano. Se prefiere para uso farmacéutico, tal como se indicó anteriormente, los restos de polietilenglicol.

Para la proteína (o el derivado) el lugar de liberación puede ser el estómago, el intestino delgado (el duodeno, el yeyuno o el íleon) o el intestino grueso. El experto en la técnica tiene formulaciones disponibles que no se disuelven en el estómago, pero que liberan el material en el duodeno o en algún otro punto del intestino. Preferiblemente, la liberación evitará los efectos perjudiciales del ambiente estomacal, o bien por protección a la proteína (o derivado) o bien por liberación del material biológicamente activo más allá del entorno estomacal, tal como en el intestino.

Para garantizar completa resistencia gástrica, es esencial un revestimiento impermeable a al menos pH 5,0. Los ejemplos de los componentes inertes más comunes que se usan como revestimientos entéricos son el trimelitato de acetato de celulosa (CAT), el ftalato de hidroxipropilmetilcelulosa (HPMCP), HPMCP 50, HPMCP 55, el ftalato de acetato de polivinilo (PVAP, Eudragit L30D, Aquateric, el ftalato de acetato de celulosa (CAP), Eudragit L, Eudragit S y Shellac. Estos revestimientos pueden usarse como películas mixtas.

También se puede usar sobre los comprimidos un revestimiento o una mezcla de revestimientos que no estén destinados a la protección contra el estómago. Estos pueden incluir revestimientos de azúcar o revestimientos que hagan más fácil de deglutir el comprimido. Las cápsulas pueden consistir en una cubierta dura (tal como gelatina) para la administración del terapéutico seco, es decir, el polvo; para formas líquidas puede ser usada una cubierta de gelatina blanda. El material de cubierta de los sellos podría ser almidón grueso u otro papel comestible. Para píldoras, trociscos, comprimidos moldeados o triturados de comprimido, puede utilizarse técnicas de amasado en húmedo.

Se puede incluir el agente terapéutico en la formulación como multipartículas finas en forma de gránulos o grageas, con un tamaño de partícula aproximado de 1 milímetro. La formulación del material para administración e cápsulas también podría ser como un polvo, como tapones ligeramente comprimidos e incluso como comprimidos. Se podría preparar el producto terapéutico mediante compresión.

También se pueden incluir colorantes y agentes aromatizantes. Por ejemplo, se puede formular la proteína (o el derivado) (tal como mediante encapsulación en liposoma o en microesfera), y luego puede contenerse además dentro de un producto comestible, tal como una bebida refrigerada que contiene colorantes y agentes aromatizantes.

Se puede diluir o incrementar el volumen del terapéutico con un material inerte. Esos diluyentes podrían incluir carbohidratos, especialmente manitol, a-lactosa, lactosa anhidra, celulosa, sacarosa, dextranos modificados y almidón. También pueden ser usadas ciertas sales inorgánicas, tales como cargas, que incluyen trifosfato de calcio, carbonato de magnesio y cloruro de sodio. Algunos diluyentes comercialmente disponibles son Fast-Flo, Emdex, STA-Rx 1500, Emcompress y Avicell.

Puede incluirse en la formulación, disgregantes del producto terapéutico en una forma farmacéutica sólida. Los materiales usados como disgregantes incluyen, pero no se limitan a, el almidón, incluyendo un disgregante comercial a base de almidón Explotab. El glicolato de almidón sódico, Amberlite, la carboximetilcelulosa de sodio, la ultramilopectina, el alginato de sodio, la gelatina, la cáscara de naranja, la carboximetilcelulosa ácida, la esponja natural y la bentonita pueden todos ser usados. Otra forma de disgregante está constituida por las resinas de intercambio catiónico insolubles. Las gomas en polvo pueden ser usadas como disgregantes y como aglutinantes, y pueden incluirse las gomas en polvo tales como las gomas de agar, de Karaya o de tragacanto. El ácido algínico y su sal de sodio también son disgregantes útiles.

Los aglutinantes pueden ser usados para mantener unido el agente terapéutico para formar un comprimido duro e incluyen materiales procedentes de productos naturales tales como goma de acacia, goma de tragacanto, almidón y gelatina. Otros incluyen la metilcelulosa (MC), etilcelulosa (EC) y carboximetilcelulosa (CMC). Podría utilizarse tanto polivinilpirrolidona (PVP) como hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC) en disoluciones alcohólicas para granular el producto terapéutico.

Se puede incluir un agente antifriccional en la formulación del producto terapéutico para prevenir que se pegue durante el proceso de formulación. Se puede utilizar lubricantes como una capa entre el agente terapéutico y la pared de la matriz, y estos pueden incluir, pero no se limitan a: ácido esteárico, incluyendo sus sales de magnesio y de calcio, politetrafluoroetileno (PTFE), parafina líquida, aceites vegetales y ceras. También se puede utilizar lubricantes solubles, tales como laurilsulfato de sodio, laurilsulfato de magnesio, polietilenglicol de diversos pesos moleculares y Carbowax 4000 y 6000.

Los deslizantes que pudieran mejorar las propiedades de flujo del fármaco durante la formulación y que ayudan a la disposición durante la compresión, podrían ser añadidos. Los deslizantes pueden incluir almidón, talco, sílice pirógena y silicoaluminato hidratado.

Para ayudar a la disolución del producto terapéutico en el producto acuoso se podría añadir un tensioactivo como un agente humectante. Los tensioactivos pueden incluir los detergentes aniónicos, tales como el laurilsulfato de sodio, sulfosuccinato de dioctilsodio y sulfonato de dioctilsodio. Se podría utilizar detergentes catiónicos y podrían incluir cloruro de benzalconio o cloruro de bencetonio. La lista de detergentes no iónicos potenciales que podrían incluirse en la formulación como agentes tensioactivos son lauromacrogol 400, polioxil 40 en la forma de estearato, aceite de ricino hidrogenado con polioxietileno de 10, 50 y 60, monoestearato de glicerol, polisorbato 40, 60, 65 y 80, éster de ácido graso de sacarosa, metilcelulosa y carboximetilcelulosa Estos agentes tensioactivos podrían estar presentes en la formulación de la proteína o derivarse ya sea solos o como una mezcla en diferentes razones.

Los aditivos que incrementan potencialmente la absorción de la proteína (o sus derivados) son, por ejemplo, los ácidos grasos, ácido oleico, ácido linoleico y ácido linolénico.

Puede ser deseada la formulación de liberación controlada. Se podría incorporar el fármaco en una matriz inerte que permita la liberación mediante difusión o mediante mecanismos de lixiviación, es decir, gomas. También se podría incorporar en la formulación matrices que se degeneran lentamente. Otra forma de liberación controlada de este material terapéutico es por medio de un método que se basa en el sistema terapéutico Oros (Alza Corp.) es decir, se encierra el fármaco en una membrana semipermeable que permite que entre agua y expulse el fármaco a través de una sola abertura pequeña, debido a efectos osmóticos. También algunos revestimientos entéricos tienen un efecto de liberación retardada.

Se puede utilizar otros revestimientos para la formulación. Estos incluyen una variedad de azúcares que podrían ser aplicados en una paila de revestimiento. También se podría proporcionar el agente en forma de un comprimido revestido con película; los materiales usados en ese caso se dividen en dos grupos. El primero son los materiales no entéricos e incluyen metilcelulosa, etilcelulosa, hidroxietilcelulosa, metilhidroxietilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropil-metilcelulosa, carboximetilcelulosa sódica, providona y los polietilenglicoles. El segundo grupo consiste en los materiales entéricos que son comúnmente los ésteres de ácido ftálico.

Se podría usar una mezcla de materiales para proporcionar un revestimiento de película óptimo. Se puede llevar a cabo el revestimiento con película en un revestidor de paila o en un lecho fluidizado o por medio de revestimiento por compresión.

Administración pulmonar

También se contempla en el presente documento, la administración pulmonar de la proteína de la presente (o los derivados). Se suministra la proteína (o el derivado) a los pulmones de un mamífero mientras inhala y atraviesa el revestimiento epitelial del pulmón hasta el torrente sanguíneo. Otros informes de esto incluyen Adjei et al., Pharmaceutical Research 7(6):565-569 (1990); Adjei et al., International Journal of Pharmaceutics, 63:135-144 (1990) (acetato de leuprolide); Braquet et al., Journal of Cardiovascular Pharmacology, 13 (supl. 5):143-146 (1989) (endotelina-1); Hubbard et al., Annals of Internal Medicine, 3(3):206-212 (1989) (a1-antitripsina); Smith et al. J. Clin. Invest., 84:1145-1146 (1989) (a1-proteinasa); Oswein et al., “Aerosolization of Proteins” Proceddings of Symposium on Respiratory Drug Delivery II, Keystone, Colorado (Marzo de 1990) (hormona de crecimiento humano recombinante); Debs et al., J. Immunol., 140:3482-3488 (1988) y Platz et al., patente estadounidense n.º, 5,284,656 (factor estimulador de la colonia de granulocitos). Se contempla para su uso en la práctica de esta invención una gran variedad de dispositivos mecánicos diseñados para la administración pulmonar de productos terapéuticos, incluyendo, pero no se limitan a: nebulizadores, inhaladores de dosis medida e inhaladores de polvo, todos los cuales son familiares para los expertos en la técnica.

Algunos ejemplos específicos de dispositivos comercialmente disponibles, adecuados para la práctica de esta invención, son el nebulizador Ultravent, fabricado por Mallinckrodt, Inc., St. Louis, Missouri; el nebulizador Acorn II, fabricado por Marquest Medical Products, Englewood, Colorado; el inhalador de dosis medida Ventolin, fabricado por Glaxo, Inc., Research Triangle Park, North Carolina; y el inhalador de polvo Spinhaler, fabricado por Fisons Corp., Bedford, Massachusetts.

Todos esos dispositivos requieren el uso de formulaciones adecuadas para la administración de la proteína (o el derivado). Típicamente, cada formulación es específica para el tipo de dispositivo empleado y puede implicar el uso de un material propelente apropiado, además de los diluyentes usuales, adyuvantes y/o portadores usuales, útiles en la terapia. También se contempla el uso de liposomas, microcápsulas y microesferas, complejos de inclusión u otros portadores. También se puede preparar la proteína modificada químicamente en diferentes formulaciones, dependiendo del tipo de modificación química o del tipo de dispositivo empleado.

Las formulaciones adecuadas para su uso con un nebulizador, o bien de chorro o bien ultrasónico, típicamente comprenderán proteína (o el derivado) disuelta en agua a una concentración de aproximadamente de 0,1 a 25 mg de proteína biológicamente activa por ml de disolución. La formulación también puede incluir un tampón y un azúcar simple (por ejemplo, para estabilización de la proteína y regulación de la presión osmótica). La formulación de nebulizador también puede contener un tensioactivo para reducir o prevenir la agregación inducida superficialmente de la proteína provocada por la atomización de la disolución en la formación del aerosol.

Las formulaciones para su uso con un dispositivo inhalador de dosis medida generalmente comprenderán un polvo finamente dividido que contiene la proteína (o el derivado) suspendida en un propelente con ayuda de un tensioactivo. El propelente puede ser cualquier material convencional empleado para ese propósito, tal como un clorofluorocarbono, un hidroclorofluorocarbono, un hidrofluorocarbono o un hidrocarburo, incluyendo triclorofluorometano, diclorodifluoro-metano, diclorotetrafluoroetanol y 1,1,1,2-tetrafluoroetano, o combinaciones de los mismos. Los agentes tensioactivos adecuados incluyen trioleato de sorbitán y lecitina de soya. También puede ser útil el ácido oleico como un tensioactivo.

Las formulaciones para dispersarse a partir de un dispositivo inhalador en polvo comprenderán un polvo seco finamente dividido que contiene proteína (o el derivado) y también puede incluir un agente de carga, tal como lactosa, sorbitol, sacarosa o manitol en cantidades que faciliten la dispersión del polvo a partir del dispositivo, por ejemplo, del 50 al 90% en peso de la formulación. La proteína (o el derivado) muy ventajosamente debe prepararse

en forma de partículas con un tamaño de partícula promedio de menos de 10 !m (o micras), lo más preferiblemente de 0,5 a 5 !m, para la administración más eficaz al pulmón distal.

Administración nasal

También se contempla la administración nasal de la proteína (o el derivado). La administración nasal permite la etapa de la proteína al torrente sanguíneo directamente después de la administración del producto terapéutico a la nariz, sin necesidad de deponer el producto en el pulmón. Las formulaciones para administración nasal incluyen aquellas que están hechas con dextrano o ciclodextrano.

Métodos de tratamiento, métodos de preparación de un medicamento

Aún en otro aspecto de la presente invención, se proporcionan métodos para tratar y fabricar un medicamento. Los estados aliviados por, o modulados por la administración de los derivados del presente documento son las que se indicaron anteriormente.

Dosificaciones

Para todas las moléculas anteriores, cuando se llevan a cabo estudios adicionales, surgirá la información con respecto a niveles de dosis apropiados para el tratamiento de diversos estados en diversos pacientes; y el experto habitual en la técnica, al considerar el contexto terapéutico, la edad y la salud general del receptor de la dosis, estará en capacidad de determinar la dosificación apropiada. Generalmente, para inyección o infusión, la dosificación será entre 0,01 !g de proteína biológicamente activa/kg de peso corporal (calculando la masa de la proteína sola, sin modificación química), y 10 mg/kg (con base en lo mismo). El programa de dosificación puede variar, dependiendo de la vida media en circulación de la proteína o el derivado usado, ya sea que el polipéptido se suministre mediante dosis de bolo o mediante infusión continua, y la formulación que se utiliza.

Administración con otros compuestos

Para la terapia asociada con la obesidad, se puede administrar la presente proteína (o los derivados) conjuntamente con otras composiciones farmacéuticas más utilizadas para tratar otras complicaciones clínicas de la obesidad, tales como las que se utilizan para el tratamiento de la diabetes (por ejemplo, insulina), elevada presión de la sangre, elevado colesterol y otros estados adversos incidentes a la obesidad. También se puede coadministrar otros supresores del apetito, por ejemplo, las anfetaminas. La administración puede ser simultánea (por ejemplo, la administración de una mezcla de la presente proteína e insulina) o puede ser en serie.

Tratamiento terapéutico a base de ácido nucleico

Se podría introducir el gen OB en células grasas humanas para desarrollar la terapia de genes para la obesidad. Sería de esperar que tal terapia disminuyera el peso corporal. Inversamente, la introducción de constructos antisentido a la transferencia en células grasas humanas reduciría los niveles de polipéptido OB activo y se podría predecir que incrementa la adiposidad del cuerpo.

En una realización, se introduce un gen que codifica para un polipéptido OB in vivo en un vector viral. Tales vectores incluyen un virus de ADN atenuado o defectuoso, tal como, pero no se limitan a, el virus de herpes simple (HSV), el virus de papiloma, el virus de Epstein Barr (EBV), el adenovirus, el virus asociado con adeno (AAV) y similares. Los virus defectuosos, que carecen total o casi fatalmente de genes virales, son los preferidos. El virus defectuoso no es infeccioso después de la introducción en una célula. El uso de vectores virales defectuosos permite la administración a las células en un área específica y localizada, sin preocuparse acerca de que el vector pueda infectar otras células. Por tanto, pueden dirigirse específicamente el tejido adiposo. Los ejemplos de vectores particulares incluyen, pero no se limitan a, un vector de virus 1 de herpes defectuoso (HSV1) [Kaplitt et al., Molec. Cell. Neurosci., 2:320-330 (1991)], un vector de adenovirus atenuado, tal como el vector descrito por Stratford-Perricaudet et al., J. Clin. Invest., 90:626-630, (1992) y un vector de virus adeno-asociado, defectuoso [Samulski et al., J. Virol., 61-3096-3101 (1987); Samulski et al., J. Virol., 63:3822-3828 (1989)].

En otra realización, se puede introducir el gen en un vector retroviral, por ejemplo, tal como se describe en Anderson et al., patente estadounidense n.º 5.399.346; Mann et al., Cell, 33:153 (1983); Termin et al., patente estadounidense n.º 4.650.764; Termin et al., patente estadounidense n.º 4.980.289; Markowitz et al., J. Virol., 62:1120 (1988); Termin et al., patente internacional n.º 5,124,263; publicación de patente internacional n.º WO 95/07358, publicada el 16 de marzo de 1995 de Dougherty et al.; y Kuo et al., Blood, 82:845 (1993).

Alternativamente se puede introducir el vector in vivo mediante lipofección. Durante la última década, ha habido un uso cada vez mayor de liposomas para encapsulación y transfección de ácidos nucleicos in vitro. Los lípidos catiónicos sintéticos diseñados para limitar las dificultades y peligros encontrados con la transfección mediada por liposomas, pueden ser usados para preparar liposomas para la transfección in vivo de un gen que codifica un marcador [Felgner et al., Proc.. Natl. Acad. Sci, USA, 84:7413-7417 (1987); véase Mackey et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:8027-8031 (1988)]. El uso de lípidos catiónicos puede promover la encapsulación de ácidos nucleicos negativamente cargados, y también promueve la fusión con membranas de células negativamente cargadas

[Felgner et al., Science, 337:387-388 (1989)]. El uso de lipofección para introducir genes exógenos en órganos específicos in vivo tiene ciertas ventajas prácticas. El destino molecular de los liposomas para células específicas representa un área de beneficio. Es claro que dirigir la transfección a tipos particulares de células sería particularmente ventajoso en un tejido con heterogeneidad celular, tal como el páncreas, el hígado, el riñón y el cerebro. Los lípidos pueden estar acoplados químicamente a otras moléculas con el propósito de ponerlas como destino (ver Mackey et al., 1988, citado anteriormente). Los péptidos de destino, por ejemplo, las hormonas o los neurotransmisores y las proteínas, tales como los anticuerpos o las moléculas que no son péptidos, podrían acoplarse químicamente a los liposomas.

También es posible introducir el vector in vivo como un plásmido de ADN desnudo. Los vectores de ADN desnudos para la terapia con genes pueden ser introducidos en las células hospedadoras deseadas mediante métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, transfección, electroporación, microinyección, transducción, fusión de células, DEAE dextrano, precipitación con fosfato de calcio, uso de una pistola genética, o uso de un transportador de vector de ADN (véase, por ejemplo, Wu et al., J. Biol. Chem., 167:963-967 (1992); Wu et al., J. Biol. Chem., 263:1462114624 (1988); Hartmut et al., solicitud de patente canadiense n.º 2,012.311, presentada el 15 de marzo de 1990).

Aplicaciones agrícolas

También se puede aislar el gen OB a partir de animales domésticos y se puede obtener de esa manera el polipéptido OB correspondiente. En un ejemplo específico, que viene más adelante, la sonda derivada del gen OB de murino se hibrida a secuencias codificadoras homólogas correspondientes procedentes de un gran número de especies animales. Tal como se discute para las terapias humanas, las proteínas recombinantes también pueden ser preparadas y administradas a animales domésticos. La administración del polipéptido puede ser implementada para producir animales de alimento más magros, tales como ganado vacuno, cerdos, aves de corral ovejas, etc. Preferiblemente se administra el polipéptido OB autólogo, aunque la invención contempla la administración del polipéptido autoautólogo también. Puesto que el polipéptido OB consiste aproximadamente en 160 residuos de aminoácido, puede no ser sumamente inmunogénico. Por tanto, la administración del polipéptido no autólogo puede no dar como resultado una respuesta inmunológica.

Alternativamente, la introducción de los genes clonados en animales domésticos transgénicos permitiría que se disminuyera potencialmente el peso corporal y la adiposidad por sobreexpresión de un transgén OB. El medio más simple de obtener esto sería destinar un transgén OB a la grasa, utilizando su propio promotor u otro promotor específico para la grasa.

Inversamente, podría ser conveniente el aumento en la grasa del cuerpo en otras circunstancias, tal como para el desarrollo de carne Kobe o de hígado graso para fabricar foie gras. Esto se puede lograr destinando como blanco un transgén OB antisentido a la transferencia a la grasa o utilizando tecnología de golpe de gen. Alternativamente, cuando se desea un incremento en el peso corporal al porcentaje de grasa, se puede administrar un inhibidor o antagonista del polipéptido OB. Dichos inhibidores o antagonistas incluyen, pero no se limitan a, los anticuerpos reactivos con el polipéptido y los fragmentos del polipéptido que se unen a, pero que no activan el receptor de OB, es decir, los antagonistas del polipéptido OB.

Implicaciones cosméticas

El polipéptido OB tiene valor importante para su uso en cosmética, además de los beneficios para la salud. En particular, puesto que los péptidos OB de la invención, incluyendo los derivados y análogos agonistas de los mismos, son útiles para la modulación del régimen y la cantidad de deposición de células grasas en un animal, son útiles para reducir el tejido graso desagradable, por ejemplo, los depósitos de grasa en el abdomen, las caderas, las piernas, el cuello y la papada, que no necesariamente llegan a una condición obesa pero que no obstante, afean la apariencia de un individuo. Se cree que se logra el efecto de reducción en la grasa, en parte, mediante una reducción en el apetito, es decir, la reducción en la ingestión de alimento, al incrementar el metabolismo basal o ambos. Por tanto, el polipéptido OB de la presente o sus derivados o análogos agonistas es útil para la administración a un sujeto para efectuar cambios cosméticos en los depósitos de tejido graso, ya sea modulando la deposición de la grasa, reduciendo el apetito o ambos.

Además, las composiciones y métodos del presente documento pueden ser usados conjuntamente con diversos procedimientos, tales como cirugía cosmética, diseñados para alterar la apariencia total del cuerpo (por ejemplo, las cirugías de liposucción o con rayos láser diseñados para reducir la masa del cuerpo aspirando o recortando el tejido graso), el ejercicio (especialmente correr y el entrenamiento de pesas), la dieta baja en grasas, la hipnosis, la biorrealimentación, como ejemplos de las maneras que no puede intentar para disminuir el porcentaje del tejido graso y mejorar la apariencia del cuerpo.

Por consiguiente, la presente invención se refiere a un método para efectuar la modulación de tejido graso cosmético en un individuo, que comprende administrar una cantidad moduladora de grasa de un polipéptido OB o su derivado o análogo agonista, a un individuo que desee la modulación del tejido graso cosmética para mejorar la apariencia general del cuerpo. En un aspecto particular, la modulación del tejido graso es una consecuencia de la supresión del apetito. Preferiblemente, la modulación del tejido graso es una reducción en el tejido graso.

En una realización adicional, la invención se refiere a un método para efectuar pérdida cosmética de tejido graso que comprende combinar un procedimiento para cambiar la apariencia del cuerpo con la administración de una cantidad moduladora de grasa de un polipéptido OB, o un derivado o análogo agonista del mismo, a un individuo que desee la modulación cosmética del tejido graso, para mejorar la apariencia general del cuerpo.

Receptor OB

Se facilitará en gran medida el desarrollo de agonistas y antagonistas de molécula pequeña, del factor OB, mediante el aislamiento de su receptor. Esto se puede lograr preparando el polipéptido OB activo y utilizándolo para seleccionar una biblioteca de expresión, utilizando metodología convencional. La unión de receptor en el biblioteca de expresión se puede someter a prueba administrando el polipéptido recombinante preparado o bien mediante vectores de expresión bacterianos o bien de mamífero, y observando los efectos de la administración a corto plazo y continua del polipéptido recombinante sobre las células de la biblioteca de expresión, o detectando directamente la unión del polipéptido OB a las células.

Como se cree actualmente que el receptor OB probablemente esté localizado en el hipotálamo y quizás en el hígado, preferiblemente se construirá las bibliotecas de ADNc a partir de esos tejidos, en vectores de expresión por clonación comunes y corrientes. Estos clones de ADNc se introducirían a continuación en células COS como puntos y los transformantes resultantes serían seleccionados con un ligando activo para identificar las células COS que expresen el receptor OB. Luego se puede aislar los clones positivos con el fin de recuperar el receptor clonado. Se utilizaría el receptor clonado conjuntamente con el ligando OB (suponiendo que es una hormona) para desarrollar los componentes necesarios para seleccionar los moduladores de OB de molécula pequeña.

Un sistema de ensayo particular, que se utiliza según la presente invención, se conoce como un ensayo de receptor. En un ensayo de receptor se marca apropiadamente el material que va a someterse a ensayo y luego se inocula ciertas colonias de prueba celulares con una cantidad de material tanto marcado como no marcado, después de lo cual se lleva a cabo estudios de unión para determinar el grado al que el material marcado se une a los receptores de la célula. De esa manera, se puede determinar las diferencias en la afinidad entre los materiales. Por consiguiente, se puede radiomarcar y combinar una cantidad purificada del modulador de peso, por ejemplo, con anticuerpos u otros inhibidores para el mismo, después de lo cual se llevaría a cabo los estudios de unión. Se prepararía entonces las disoluciones que contendrían diversas cantidades de modulador de peso sin combinar, marcado y sin marcar, y luego se inocularía y posteriormente se incubaría las muestras de células. A continuación de lavan las monofases de células resultantes, se solubilizan y luego se cuentan en un contador de rayos gamma durante una longitud de tiempo suficiente para dar un error de convencional de menos del 5%. Entonces se someten estos datos a análisis de Scatchard, después de lo cual se pueden obtener observaciones y conclusiones con respecto a la actividad del material. Si bien lo anterior es ejemplar, ilustra la manera en que se puede efectuar y utilizar un análisis de receptor, en el caso en que la capacidad de unión celular del material ensayado puede servir como una característica de distinción. A su vez, un análisis de receptor será particularmente útil en la identificación de los receptores específicos para los moduladores de la presente, tales como el receptor db.

Un ensayo adicional útil y contemplado según la presente invención se conoce como un ensayo “cis/trans”. Brevemente, ese ensayo emplea dos constructos genéticos, una de las cuales es típicamente un plásmido que expresa continuamente un receptor particular de interés cuando se transfecta en una línea celular apropiada; y la segunda que es un plásmido que expresa un informador, tal como luciferasa, bajo el control de un complejo de receptor/ligando. Por tanto, por ejemplo, si se desea evaluar un compuesto como un ligando para un receptor particular, uno de los plásmidos sería una construcción que diera como resultado la expresión del receptor en una línea celular seleccionada, mientras que el segundo plásmido poseería un promotor enlazado a un gen de luciferasa, en donde se inserta el elemento de respuesta para el receptor particular. Si el compuesto que se está probando es un agonista para el receptor, el ligando formará complejo para el receptor y el complejo resultante se unirá al elemento de respuesta e iniciará la transcripción del gen luciferasa. La quimioluminiscencia resultante mide entonces fotométricamente y se obtiene curvas de respuesta a la dosis, y se compara con las de los ligandos conocidos. El protocolo precedente está descrito detalladamente en la patente estadounidense n.º 4.981.784 y en la publicación de patente internacional del TCP n.º WO 88/03168, cuyo propósito se refiere al experto.

Una vez que se identifica un recombinante que expresa la secuencia del gen receptor de OB, se puede analizar el gen OB recombinante. Esto se logra mediante ensayos que se basan en las propiedades físicas o funcionales del receptor OB, incluyendo el marcado radioactivo del receptor seguido por el análisis mediante electroforesis de gel, inmunoanálisis, unión del ligando, etc. Adicionalmente, los anticuerpos para el receptor OB podrían ser generados tal como se describió anteriormente.

La estructura del receptor OB se puede analizar por medio de diversos métodos conocidos en la técnica. Preferiblemente, se analiza la estructura de los diversos dominios, particularmente el sitio de unión de OB. Se puede llevar a cabo el análisis estructural identificando la similitud de secuencias con otras proteínas conocidas, particularmente los receptores de hormona y de proteína. El grado de similitud (u homología) puede dar una base para predecir la estructura y la función del receptor de OB o un dominio del mismo. En una realización específica, se lleva a cabo comparaciones de secuencia con secuencias que se encuentran en GenBank utilizando, por ejemplo, los programas FASTA y FASTP [Pearson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:2444-48 (1988)].

La secuencia de proteínas puede caracterizarse además por medio de un análisis de hidrofilicidad (por ejemplo, Hopp et al., 1981, citado anteriormente). Se puede utilizar un perfil de hidrofilicidad para identificar las regiones hidrófoba e hidrófila de la proteína receptora OB, que a su vez puede indicar regiones extracitoplásmicas e intracitoplásmicas de unión a la membrana.

También se puede efectuar un análisis estructural secundario (por ejemplo, Chou et al., 1974, citado anteriormente) para identificar las regiones del receptor de OB que asumen estructuras secundarias específicas.

También se puede lograr la manipulación, traducción y predicción de estructura secundaria, así como la predicción y el graficado del marco de lectura abierto, utilizando programas informáticos disponibles en la técnica.

Al proporcionar una fuente abundante del polipéptido OB recombinante y la oportunidad de aislar el receptor de OB (es decir, el producto del gen db), la presente invención permite la determinación estructural cuantitativa de la conformación activa del polipéptido OB y del receptor OB o sus dominios. En particular, se proporciona suficiente material para análisis de resonancia magnética nuclear (RMN), infrarrojo (IR), de Raman y ultravioleta (UV), especialmente análisis espectroscópico de dicroísmo circular (CD). En particular, el RMN proporciona un análisis estructural muy poderoso de las moléculas en disolución, que se aproxima mucho a su ambiente nativo (Marion et al., 1983, citado anteriormente; Bar et al., 1985, citado anteriormente; Kimura et al., 1980, citado anteriormente). Otros métodos de análisis estructural también pueden ser empleados. Estos incluyen, pero no se limitan a, la cristalografía de rayos X (Engstom, 1974, citado anteriormente).

Más preferiblemente, se puede estudiar los cocristales del polipéptido OB y del receptor de OB. El análisis de los cocristales proporciona información detallada acerca de la unión que, a su vez, permite el diseño racional de agonistas y antagonistas del ligando. La formación de modelo informático también puede ser usada, especialmente con respecto a los métodos de RMN o de rayos X [Fletterick et al., editores, Computer Graphics and Molecular Modeling, in Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York, (1986)].

La identificación y el aislamiento de un gen que codifica un receptor de OB de la invención proporciona la expresión del receptor en cantidades mayores a las que pueden ser aisladas de fuentes naturales, o en las células indicadoras que están diseñadas especialmente para indicar la actividad de un receptor expresado después de la transfección o transformación de las células. Por consiguiente, además del diseño racional de los agonistas y antagonistas que se basa en la estructura del polipéptido OB, la presente invención contempla un método alternativo para identificar los ligandos específicos del receptor OB, utilizando diversos análisis discriminadores, conocidos en la técnica.

Se puede entender mejor la invención mediante referencia a los siguientes ejemplos, que se pretenden ser como ejemplos de la invención y no limitantes de la misma.

SECCIÓN DE EJEMPLOS

Lo siguiente explica el método usado para identificar el material genético que es como ejemplo de la presente invención. Esta tarea comprende cuatro etapas secuenciales: (A) Mapeo genético; (B) Mapeo físico; (C) Aislamiento del gen candidato; y (D) Detección de la mutación. Después de confirmar que el gen de murino de que se trata fue aislado (etapa D), se buscó el gen humano homólogo y se caracterizó ambos genes murinos y humanos y las proteínas putativas. Las etapas se resumen con mayor detalle a continuación.

A.- Mapeo genético

Se segregó la mutación ob en cruces genéticos y se usó el análisis de enlace normal para situar la mutación con respecto a los RFLP (polimorfismos de longitud de fragmento de restricción). Estos datos situaron el gen OB en un intervalo de alrededor de 5 cM en el cromosoma 6 de ratón próximo. (5 cM es una medición de la distancia genética que corresponde a cinco cruces genéticos aparentes por 100 animales). Se generó un total de 771 meiosis informativas y se usó en el mapeo genético posterior (Friedman et al., 1991, citado anteriormente). Los sitios genéticos que fueron mapeados con respecto a OB estaban publicados todos previamente. Los dos RFLP más cercanos descritos fueron definidos mediante sondas derivadas de genes oncógenos carboxipeptidasa y met.

La resolución genética de los experimentos descritos anteriormente fue inadecuada para clonar ob, principalmente debido a que ninguno de los marcadores genéticos estaba en enlace firme. Con el fin de identificar los RFLP enlazados fuertemente, requeridos, se aislaron sondas adicionales y se expandió el cruce genético. Se usó un método conocido como microdisección cromosómica para aislar trozos aleatorias de ADN del cromosoma 6 de ratón próximo [Bahary et al., Mammalian Genome, 4:511-515 (1993)]. Se sometieron a prueba sondas clonadas individuales para enlace apretado a ob. Sobre la base de estos estudios, se seleccionó una sonda D6Rck132, también denominada psd3, para análisis adicional, debido a su proximidad genética con OB.

Se usó esta sonda para progenie ob de genotipo 835, a partir de cruces interespecíficos de intersubespecíficos, lo que indicó que D6Rck13 no es recombinante en los 835 animales que fueron reportados en Bahary et al.. En el curso del mapeo físico, se identificó un nuevo marcador polimórfico a partir de un subclon cósmido derivado de YAC 53A6. Este nuevo marcador fue situado entre D6Rck13 y el gen OB y se usó para el genotipo de otras 771 meiosis

informativas procedentes de intercruces y retrocruces intraespecíficos. Se identificó un solo animal n.º167 por llevar un cruce de recombinación entre ob y D6Rck39. Estos estudios indicaron que D6Rck39/D6Rck13 está aproximadamente a 0,06 cM respecto a ob. Una sonda adicional, Pax4 fue identificada como que estaba a 0,12 cM próxima a ob. Pax4 fue recombinante en dos animales: n.º111 y n.º420. Pax4 es un pseudogene que fue mapeado previamente al cromosoma 6 de ratón próximo por Gruss y colaboradores [Gruss et al., Genomics, 11:424-434 (1991)]. Sobre esta base se determinó que el gen OB reside en el intervalo de alrededor de 0,2 cM entre Pax4 y D6Rck13. Esto conduce al esfuerzo por clonar el ADN de interposición en un esfuerzo para aislar el OB.

B.- Mapeo físico

La clonación del ADN en este intervalo hizo uso de cromosomas artificiales de levadura (YAC), un vector de clonación relativamente nuevo que permite la clonación de tramos largos de ADN contiguos, a menudo más de un millón de pares de bases de longitud.

Se aislaron los cromosomas artificiales de levadura utilizando D6Rck13 y Pax4. Esto se logró preparando sondas de ADN purificado y utilizándolas para aislar los YAC correspondientes. Estos YAC (n.º 8, n.º 16, n.º 107 y n.º 24) fueron aislados y caracterizados inicialmente y, sobre la base de los análisis resultantes, se concluyó que YAC 16 era el YAC que se extendía más distantemente, es decir, que estaba más cercano a ob. Luego se recuperó el extremo de clave de YAC n.º16 y se determinó que este extremo estaba más cerca de ob que Pax4. Este extremo se denominó 16M(+). Se llegó a esta conclusión debido a que se demostró que esta sonda no era recombinante en el animal n.º420 (como lo era Pax4). Se formó la secuencia de este extremo y se utilizó para desarrollar un análisis de PCR. Este ensayo de PCR fue utilizado para seleccionar una biblioteca de YAC. Se aisló cuatro clones positivos. Después de la caracterización de estos YAC mediante rescate de extremo, mapeo por restricción, electroforesis en gel de campo pulsado y transferencia de tipo Southern con los cruces genéticos, se determinó que dos de estos YAC, adu y aad, eran críticos para los estudios posteriores. YAC aad es un YAC no quimérico de 550 kB que se extiende más distantemente. Por consiguiente, el extremo distal de este YAC aad(pICL) fue usado para completar el mapa físico. YAC adu es un YAC no quimérico de 370 kB y su extremo distal, adu(+), se determinó que era no recombinante en toda la progenie ob de los cruces genéticos, incluyendo los animales n.º111 y n.º167, lo que sugiere que el gen OB podría residir en este YAC.

Un ensayo de PCR para estos dos extremos, aad(pICL) y adu(+), fue desarrollado y usado para aislar más YAC y clones P1 para continuar el mapeo físico. Los clones P1 importantes, aislados mediante este esfuerzo incluyeron 498, 499, 500 (aislados utilizando una sonda derivada de aad(pICL) y 322, 323 y 324 (utilizando una sonda de adu(+)).

Entre tanto, los YAC aislados por D6Rck13 (53A6, 25A8, 25A9, 25A10) fueron caracterizados. Estos estudios determinaron que 53A6 se extendía más próximamente hacia el YAC aad. El tamaño de la separación entre 53A6 y aad fue determinado como alrededor de 70 kB. El extremo clave de 53A6, 53(pICL), fue usado entonces para seleccionar tres bibliotecas de YAC disponibles y una biblioteca de P1. Se aisló un clon P1 crítico, 325. Este clon P1 se traslapó con los clones P1 aislados por medio de aad(pICL), tal como se describió anteriormente, y por lo tanto sirvió para cerrar el espacio entre 53(pICL) y aad(pICL). Como resultado, toda la región contígua (contig), que contiene los YAC y los clones P1, de alrededor 2,5 millones de pares de base de largo, y que cubre Pax4, 16M(+), adu(+), aad(pICL), 53(pICL), D6Rck39 y D6Rck13, fue clonada. Mediante el mapeo cuidadoso de los sitios de recombinación aparentes en el animal n.º111 y en el animal n.º167, se concluyó que OB estaba situado en un intervalo de 400 kB. Para proveer una fuente de ADN de trabajo para aislar el gen OB, se aisló aproximadamente 500 kB que cubrían esta región de no recombinación en un total de 24 clones P1. Estos clones P1, que incluían 322 y 323, que se encontró posteriormente que eran clones útiles, fueron utilizados para atrapar el exón.

El mapa físico de la parte del cromosoma que lleva OB está mostrado en la figura 7A. La figura 7B representa el contig de YAC. La figura 7C representa el contig de P1.

C.- Aislamiento de los genes candidatos

El método usado para aislar los genes en este intervalo fue atrapar el exón. Este método usó un vector comercial para identificar el ADN de exón (es decir, las secuencias codificadoras), seleccionando las secuencias aceptoras y donadoras de división funcional en el ADN genómico introducido en una construcción de prueba. El ADN procedente de estos clones P1 fue desarrollado y subclonado en el vector atrapador de exón. Estos clones fueron insertos cortos clonados en un vector Bluescript. Cada clon fue amplificado por PCR con tampones PCR que corresponden a secuencias de plásmido que flanquearon el inserto. Se llevó a cabo perfectamente la amplificación por PCR en bacterias que llevaban el plásmido. Se fijaron las reacciones utilizando un robot Biomek. Se llevó a cabo la electroforesis de los productos PCR en un gel de agarosa al 1% en el tampón TBE que contenía bromuro de etidio. Se modificó la técnica de atrapar el exón para eliminar el ADN de E. coli que contaminaba, de los clones P1, y para seleccionar los abundantes exones artifactuales que sobrepasaron el 80-90% de los exones putativos atrapados. El vector atrapador de exones incluye secuencias de VIH; un segmento corto de estas secuencias del vector corresponde a dicho artefacto.

Se llevó a cabo un experimento de atrapar exones utilizando diversos clones P1. Los productos atrapadores de exón fueron amplificados mediante PCR, seleccionados y se determinó su secuencia. Se comparó las secuencias de los “exones” putativos con los que había en el Genbank, utilizando el programa informático Blast. Se seleccionó aproximadamente 15 exones para examen adicional por medio de PCR, análisis de Northern y transferencia de tipo zoo para la presencia del ARN correspondiente o las secuencias conservadas. Se encontró que siete de los quince exones putativos, 325-2, 323-9, 322-5, D1-F7, 1H3 y 2G7, codificaban una transcripción de ARN. El 325-2 es un gen específico de testículos; el 323-8 y el 323-9 probablemente son dos exones que proceden del mismo gen expresado principalmente en cerebro y en riñón. IH3 y 322-5 representan dos transcripciones en cerebro de bajo nivel. D1-F7 es un exón procedente de un gen previamente clonado, inosinomonofosfato-deshidrogenasa (IMPDH), que tiene un patrón de expresión ubícuo. Ninguno de esos genes pareció codificar OB. El 2G7, que es el exón de OB, se discute adicionalmente a continuación.

Después de tres esfuerzos no satisfactorios por atrapar el exón del gen OB, se hizo otro intento por reunir el ADN de todos los P1 procedentes de la región de OB crítica. Estos P1 incluyeron: 258, 259, 322, 323, 324, 325, 498, 499, 500, 653, 654 y otros. Posteriormente se subclonaron los P1 258, 260, 322, 498 y 499, en el vector atrapador de exones y se prepararon subsecuentemente diversas placas con clones bacterianos, cada uno de los cuales llevaba un exón putativo. Se obtuvieron aproximadamente 192 clones que representaban candidatos de OB putativo. Tal como se observó anteriormente, un artefacto consistente, de manera que muchos de los aislados contenían dos exones atrapados, derivados del vector. Por tanto, se identificaron los clones tanto por su tamaño como por el hecho de que la hibridación de las sondas de ADN que corresponden a este artefacto se hibridaban a bandas correspondientes en la transferencia de tipo Southern del gel. De esa manera, se excluyó 185 de los 192 clones, con respecto a la evaluación adicional. La exclusión de los artefactos sobre la base del tamaño solamente no era posible, ya que esto, al final, podría haber conducido a la exclusión del exón que correspondía a OB.

Por tanto, de los 192 exones, se seleccionaron un total de siete exones para estudio adicional. Se prepararon los moldes para establecer la secuencia de los siete exones y se llevó a cabo la determinación de la secuencia. Se analizaron las secuencias de los siete exones y se encontró que siete eran idénticas y una era un artefacto aparente. En particular, el clon 1D12 contenía la “secuencia de VIH”, es decir, la banda de artefacto. Esto dejaba tres exones para análisis adicional: 1F1, 2G7 y 1H3. 1F1 fue eliminado porque formó un mapa fuera de la región crítica. Los cebadores de PCR tanto para 1H3 como para 2G7 fueron seleccionados y sintetizados.

La secuencia del exón en 2G7 se determinó y se muestra en la figura 10 (SEQ ID NO:7). Los cebadores de PCR para 2G7 fueron seleccionados y sintetizados. Las partes de las secuencias que corresponden a los cebadores de PCR están subrayadas. Los cebadores utilizados fueron:

5' CCA GGG CAG GAA AAT GTG (Tm = 60,0ºC)

(SEQ ID NO:8)

3' CAT CCT GGA CTT TCT GGA TAG G(Tm = 60,0ºC)

(SEQ ID NO:9)

Estos cebadores amplificaron el ADN de genoma en condiciones de PCR tal como sigue: 25-30 ciclos a 55ºC de recocción durante 2 minutos; 72º de extensión durante 2’; 94ºC de desnaturalización durante 1 minuto, en tampón de PCR convencional. También se utilizaron estos cebadores para generar una sonda marcada incluyendo 32P-dCTP en la reacción de PCR con una reducción correspondiente en la cantidad de dCTP frío.

Se llevó a cabo un RT-PCR sobre una variedad de ARN de tejido y se concluyó que 2G7 se expresaba exlusivamente en tejido adiposo blanco, entre los tejidos examinados (figura 11A). Posteriormente se hibridó 2G7 marcado con 32P a una transferencia de tipo Northern de ARN de tejido (figura 11B) y mostró que su ARN se expresaba a un nivel alto en tejido graso, pero no se expresaba o se expresaba a niveles muy bajos en todos los demás tejidos (en donde las señales pueden ser el resultado de grasa que contamina las preparaciones de tejido). Se sometió a electroforesis 10 !g del ARN total de cada uno de los tejidos mencionados en un gel de agarosa, con formaldehido. Se hibridó la sonda a la mancha a 65ºC, en un tampón de hibridación convencional, Rapid Hybe (Amersham). El tamaño del ARN fue aproximadamente de 4,9 kB. En este punto, se consideró que 2G7 era un gen candidato viable para OB y se analizó ulteriormente.

D.-Detección de la mutación

Con el fin de confirmar que 2G7 codificaba el gen OB, era necesario demostrar las diferencias en los niveles de expresión de ARN de la secuencia de ADN de este gen en el mutante, en comparación con animales de tipo natural. Estaban disponibles para estudio dos mutaciones separadas del gen ob: C57BL/6J ob/ob (1J) y Ckc/Smj ob/ob (2J). Estas se denominarán en lo sucesivo 1J y 2J, respectivamente. (Se utiliza nomenclatura informal para hacer referencia a las cepas de ratón estudiadas. En toda esta memoria descriptiva y en los dibujos, se entenderá que C57BL/6J se refiere a C57BL/6J +/+; CKC (smj se refiere a SM/Ckc-+Dac-+/+; CKC/smj ob/ob se refiere a SM/Ckc+Dac-ob2J/ob2J). Se preparó el ARN a partir de tejido graso que se había aislado de 1J, 2J y animales de control. Se trató el ARN total de cada muestra con ADNasa y luego se transcribió inversamente utilizando oligo-dT como un

cebador y transcriptasa inversa. El ADNc de una sola cadena, resultante, fue amplificado por PCR ya sea con los cebadores 2G7 (condiciones mostradas arriba), para la banda inferior, o bien con cebadores de actina obtenibles comercialmente, para la banda superior. Los productos de RT-PCR fueron operados en un gel TBE con 1% de agarosa, que se manchó con bromuro de etidio (figura 12A). Utilizando RT-PCT se encontró que, si bien el ARNm de 2G7 se expresaba en 1J y en todos los demás ratones de control, estaba completamente ausente en el ratón 2J. No se encontró señal después de 30 ciclos de amplificación. Este experimento proporcionó evidencia directa de que 2G7 correspondía a un exón procedente del gen OB.

Puesto que la mutación 2J es relativamente reciente y se mantiene como una cepa coisogénica, este resultado fue la primera evidencia disponible que indicó que 2G7 es un exón del gen OB. La mutación probablemente está situada en la región promotora, lo que conduce a un aborto total de la síntesis de ARNm. La presencia de una señal en el ratón 1J, en este experimento con RT-PCR sugirió que 1J podría llevar una mutación puntual que no daría como resultado un cambio grande en el tamaño de la muestra de ARN. Además, estaba ausente el ARNm de 2G7 cuando se probó mediante RT-PCR procedente de cuatro animales 2J adicionales.

Este resultado se confirmó en la transferencia de tipo Northern (figura 12B). Se preparó ARN de célula grasa procedente de capa una de las cepas (C57B1/6J, 1J, CKC/smj y 2J). Luego se procesaron 10 !g de estos ARN y se sometió a la transferencia. Se exploró con sonda la transferencia con la sonda 2G7 que estaba marcada con PCR, mediante amplificación del material, es decir la banda, en la figura 11, utilizando 32P-dCTP en la reacción de PCR. La actina es un control para la cantidad de ARN cargado. La señal de actina es bastante similar en todas las muestras. Está ausente la señal de OB en el cerebro debido a que el ARNm es específico para las células grasas.

Los resultados del análisis de Northern confirman que el ARN específico para 2G7 está ausente en los ratones 2J. El ARN ob está ausente en los ratones CKC(smj ob/ob debido a que esta cepa mutante obesa del gen está interrumpida, de manera que no se forma ARN. Además, se incrementó el nivel de ARN de 2G7 alrededor de 10 a 20 veces en 1J, así como en la grasa db/db. Estos resultados fueron compatibles con la hipótesis de que OB codifica la hormona circulante o es responsable de la generación de una señal desde las células grasas que modula el peso corporal. Estos resultados apoyan la conclusión de que 2G7 es el gen OB y predice que los ratones 1J tienen una mutación puntual, probablemente una mutación no de transferencia, que conduce a una terminación de la traducción prematura.

Estos resultados de Northern se han reproducidos utilizando preparaciones de ARN de célula grasa procedentes de cuatro diferentes animales 2J (figura 13). En este análisis, ap2 es una transcripción específica para la grasa que fue utilizada como un control, de una manera muy parecida a la actina en la figura 12B. No hay significación en cuanto a la variación de la densidad de la banda ap2. Se marcó ap2 diseñando cebadores de PCR de la secuencia ap2 publicada. Los productos RT-PCR de ARN de célula grasa fueron remarcados entonces utilizando el mismo protocolo para el marcaje de PCR. Este análisis demuestra la presencia del ARNm de OB en animales normales homocigóticos o heterocigóticos, y su ausencia en los animales mutantes 2J.

Se ha identificado la mutación en los ratones 1J. La mutación es un cambio de base de C a T, que da como resultado un cambio en una arginina a un codón de detención prematura aparente en el aminoácido 108, y en con toda probabilidad tiene influencia en la mutación 1J (figura 14) a pesar del elevado nivel de expresión del ARNm de ob (véanse las figuras 12 y 13, carriles C57BL/6J ob/ob).

Más recientemente, se ha utilizado las transferencias de tipo Southern para concluir que la mutación 2J es el resultado de un cambio en el ADN detectable en el extremo 5' de OB, que parece abolir completamente la expresión de ARN. La naturaleza exacta de este reacomodo posible sigue sin determinarse.

Una transferencia de Southern genómica de ADN procedente de ratones CKC/smj (SM(Ckc-+Dac) y C57BL/6J, utilizando cuatro endonucleasas de restricción diferente, fue efectuada con el fin de determinar si ob mutante producía un patrón de fragmento único (figura 15A). Se digirieron aproximadamente 10 !g de ADN (derivado de ADN genómico preparado a partir de hígado, riñón o bazo), con la enzima de restricción indicada. Luego se sometió a electroforesis el ADN en un gel TBE con agarosa al 1%. Se transfirió el ADN a una membrana imobilón y se hibridó a la sonda 2G7 marcada con PCR. La banda clave es la banda de más arriba en el digesto BglII para el ADN CKC/smj ob/ob (SM/Ckc-+Dacob2J/ob2J). Esta banda es de peso molecular mayor que en la otra cepa, lo que indica una mutación en esta cepa.

La figura 15B es una transferencia de Southern de un digesto BglII de ADN genómico, procedente de la progenie de una cruza ob2J/+ x ob2J/+. Algunos de los ADN sólo tenían la banda superior, algunos otros la banda inferior y algunos tenían ambas bandas. Los animales con sólo la banda superior eran alo-obesos, es decir ob2J/ob2J. Estos datos muestran que el polimorfismo (es decir, la mutación) mostrada en la figura 15A, se segrega en un sentido genético.

EJEMPLO 1: CLONACIÓN DE ADNc Y DETERMINACIÓN DE LA SECUENCIA DE OB

Utilizando la sonda 2G7 PCR marcada, se aisló un total de cincuenta clones de xADN de ratón a partir de un biblioteca de ADNc de célula grasa de murino I-gt11 (ADNc 5'-STRETCH de Clonetech, procedente de almohadillas

de grasas testiculares de ratones suizos n.º ML3005b), y treinta clones de ADNc humanos, hibridantes, cruzados, de un biblioteca de ADNc de células grasas humanas I-gt10 (ADNc 5'STRETCH de Clonetech, procedentes de abdomen n.ºHL1108a). Se llevó a cabo la selección de la biblioteca utilizando un procedimiento de levantamiento de placa. Se desnaturalizó los filtros del levantamiento de placa utilizando el método de autoclave. Se hibridó los filtros

5 por duplicado con la sonda 2G7 marcada con PCR (tampón Rapid Hybe, 65ºC, durante la noche). Después de una prehibridación de 2 a 4 horas, se lavó los filtros con 2x SSC, SDS al 2%, dos veces durante 30 minutos a 65ºC y se expuso a película de rayos X. Las positivas duplicadas fueron purificadas en placa. El fago purificado en placa fue amplificado por PCR utilizando los cebadores de vector comercialmente disponibles, por ejemplo, I-gt10 y I-gt11. Los productos de PCR resultantes correspondían al inserto de ADNc procedente de cada fago, con una pequeña cantidad de una secuencia vectora en cualquiera de los extremos. Las bandas fueron purificadas en gel y se determinó la secuencia utilizando un secuenciador automático ABI y los cebadores de vector para sondear la ADNpolimerasa.

Los datos de secuenciación en bruto fueron examinados luego manualmente, base por base para corregir los errores de escucha del programa informático. Cuando la secuencia correcta estuvo disponible, se sintetizaron los

15 cebadores en el sentido de 3’ y fueron utilizados para continuar la determinación de la secuencia. Se repitieron los experimentos hasta que se secuenció cada clon de ADNc disponible y se sintetizó a un contig. Hasta la fecha, se ha compilado alrededor de 3.000 pares de bases a partir del extremo 5' del ARNm. Uno de los clones de ADNc se extendió hasta el extremo 5' del ARNm, puesto que su secuencia fue idéntica a la del producto 5'RACE del ARN de tejido graso (datos no mostrados).

Los datos de secuencia revelaron que hay un marco de lectura abierto de 167 aminoácidos (figura 1). Estuvo presente una secuencia de consenso de inicio de traducción de Kozak, con un residuo de adenosina tres bases en el sentido de 5’ del ATG. Se encontró dos clases de ADNc que diferían en la inclusión o exclusión de un solo codón de glutamina. Este residuo se encuentra en la posición inmediatamente 3' con respecto al aceptor de corte y empalme del exón 2G7. Puesto que el codón CAG de glutamina incluye una posible secuencia aceptora de corte y

25 emplame AG, parece que hay un deslizamiento en el sitio de receptor de empalme con la omisión aparente de 3 pares de bases en una subserie de los ADNc, tal como se muestra a continuación:

gln ser val

ag CAG TCG GTA (con glutamina) (SEQ ID NO:17)

t

(sitio aceptor de corte y empalme)

ser val

ag CAG TCG GTA (sin glutamina)

t

(sitio aceptor de corte y empalme)

35 El “ag” en las secuencias anteriores corresponde a la secuencia de intrón supuesta en el sentido de 5’ del codón de glutamina, y AG es el sitio de corte y empalme alternativo, putativo. Este residuo de glutamina está situado en una región fuertemente conservada de la molécula y su importancia para la actividad biológica todavía se desconoce.

Se detectó una secuencia señal N-terminal putativa, cuyo sitio de escisión de señal está predicho que es el residuo carboxi-terminal con respecto a la alanina en la posición del aminoácido 21. Esta secuencia señal putativa se confirmó por la aplicación de un algoritmo informático al método de von Heijne. Utilizando esta técnica, se identificó la secuencia señal más probable en la región codificadora de polipéptido que correspondía a los aminoácidos 1-12 que tienen la secuencia:

MCWRPLCRFLWLWSYLSYVQA t VP (SEQ ID NO:10)

en la que la flecha indica el sitio de escisión de secuencia señal putativo. El resto de la secuencia de aminoácidos

45 fue en gran medida hidrófila y no tiene ningún motivo estructural notable ni dominio que se extienda en la membrana, como no sea la secuencia señal N-terminal. Específicamente, no se encontró secuencias de consenso para la glicosilación N-enlazada de las secuencias de aminoácidos dibásicas, indicativas de división de proteína en la proteína procesada predicha (Sabatini et al., The metabolic basis of inherited disease, páginas 177-223, C.V. Scriver y colaboradores, editores, McGraw-Hill, Nueva York). Las búsquedas en bases de datos utilizando programas Blast y Block no identificaron ninguna secuencia homóloga.

Se analizó el ARN de tejido graso humano en transferencias de Northern, y se detectó la especie de ARN de un tamaño similar al gen ob de ratón. La determinación de secuencia y el análisis de los clones de ADNc revelaron que el OB humano también codifica un polipéptido de 167 aminoácidos (figura 2A y B y figura 3). Se encontraron dos

clases de ADNc, con o sin omisiones de tres pares de bases en el ser humano también (figura 6). Los genes OB de ratón y ser humano fueron sumamente homólogos en la región codificadora predicha, pero tuvieron sólo el 30% de homología en las regiones no transladadas 3' y 5'. También estuvo presente una secuencia señal N-terminal en el polipéptido OB humano. La comparación de las secuencias de polipéptido OB humano y de ratón mostró que las dos moléculas compartían una identidad global del 83% al nivel de aminoácido (figura 4). Los extremos N de las proteínas maduras de ambas especies comparten una homología todavía mayor, con solamente seis sustituciones de aminoácido conservadoras y tres no conservadoras, entre los 100 residuos de aminoácido N-terminales.

Se aisló ADN genómico de ratón, rata, conejo, ratón de campo, gato, vaca, oveja, cerdo, ser humano, pollo, anguila y Drosophila, y se digirió la restricción con EcoR1. Los digestos fueron sometidos a electroforesis en gel TBE con agarosa al 1%. Luego se transfirió el ADN a una membrana de inmobilón y se exploró con sonda 2G7 marcada con PCR. Se hibridó el filtro a 65ºC y se lavó con 2x SSC, SDS al 0,2% a 65ºC, dos veces durante veinte minutos cada lavado, es decir, hubo dos cambios de tampón. Estos datos indican que se conserva OB entre los vertebrados (figura 16). En este sentido, obsérvese que hay una señal 2+ en el ADN de anguila; la anguila es un pez.

En resumen, la evidencia disponible sugiere que el peso corporal y la adiposidad son controlados fisiológicamente. Hace siete años se inició el esfuerzo por identificar dos de los componentes claves de este sistema: los genes OB y DB. Como se muestra en este ejemplo, el gen OB ha sido identificado ahora como específico para la grasa que juega un papel clave en regular el peso corporal. El producto de este gen, que muy probablemente es una hormona secretada, tendrá implicaciones importantes para el diagnóstico y el tratamiento de trastornos nutricionales en el hombre y en los animales no humanos.

EJEMPLO 2: EXPRESIÓN DE OB EN BACTERIAS

Se había clonado ADNc tanto de murino como de ser humano, que codificaban ob, en un vector de expresión pET15b (Novagen). Este vector contiene un promotor T7 conjuntamente con un operador lac, y expresa una proteína de fusión que contiene una etiqueta o marcador de histidina (His-tag) y un sitio de escisión de trombina, inmediatamente en el sentido de 5’ del sitio de inserción de la secuencia codificante (figura 17) (SEQ ID NOS:11 y 12).

Se modificaron los ADN de ratón y ser humano de manera que la alanina en el extremo de la secuencia señal se volvió a un sitio NdeI, al igual que una secuencia separada en la región 3'. La inserción del sitio NdeI se obtuvo utilizando PCR con los cebadores novedosos:

Mnde-5' (cebador cinco prima murino):

CTTATGTTCA TATGGTGCCG ATCCAGAAAG TC (SEQ ID NO:13)

Mnde-3' (cebador tres prima murino):

TCCCTCTACA TATGTCTTGG GAGCCTGGTG GC (SEQ ID NO.14)

Hnde-5' (cebador cinco prima de ser humano):

TCTATGTCCA TATGGTGCCG ATCCAAAAAG TC (SEQ ID NO:15)

Hnde-3' (cebador tres prima de ser humano):

TTCCTTCCCA TATGGTACTC CTTGCAGGAA GA (SEQ ID NO:16)

Los cebadores contienen una desigualdad de seis pares de bases en la parte media que introduce los sitios de restricción NdeI en cada extremo del fragmento PCR. El fago que lleva o bien el ADNc de ratón o bien de ser humano fue amplificado utilizando esos cebadores. El producto PCR fue digerido con NdeI y purificado en gel sobre un gel de agarosa al 1% con punto de fusión bajo. Se subclonó las bandas purificadas con gel al vector pET. Se determinó la secuencia de los plásmidos resultantes para garantizar que las mutaciones no fueran introducidas durante la etapa de amplificación con PCR de la clonación. Los constructos para el ADNc de humano y de murino que codifican y que carecen de la glutamina 49, habían sido preparados. En particular, los constructos pET 15b que contiene la secuencia codificante OB humana o de ratón, menos la secuencia señal y que se fundió a un His-tag se había formado usando un método de clonación con PCR. Se había determinado las secuencias de los constructos para garantizar que no se introdujesen errores de secuencia en la región codificadora del gen OB durante la etapa de amplificación con PCR.

Se seleccionaron dos constructos de plásmido resultantes, pETM9 y pETH14, para transformar un hospedador de expresión bacteriana. Al inducir con 1 mM de IPTG en condiciones óptimas, las bacterias transformadas pudieron producir de 100 a 300 !g/ml de la fusión de OB. La mayoría de las proteínas de fusión OB se encontraron en el cuerpo de inclusión. Después de la solubilización con guanidina-HCl 6 M o urea, se purificó la proteína de fusión por medio de una columna de resina con unión His (quelación de Ni). Las condiciones para la purificación en columna de la proteína de fusión OB (incluyendo la unión, el lavado y la elución) fueron experimentalmente establecidas. La proteína de fusión OB se une a la resina a 5 mM de imidazol/guanidina-HCL 6 M y permanece unida hasta imidazol 20 mM/guanidina-HCL 6 M. Se puede eluir la proteína de la resina a 60 mM de imidazol/guanidina 6 M (figura 18A,B). Tanto las proteínas de fusión OB humanas como las de ratón purificadas, fueron sometidas a diálisis en PBS para eliminar el clorhidrato de guanidina de la preparación, luego fueron usadas para criar los anticuerpos anticlonales.

Con el fin de someter a prueba la actividad biológica de los productos de proteína de fusión, se sometió a prueba y se desarrolló las condiciones de replegamiento de la proteína purificada. Esto implica la diálisis inicial de la proteína de fusión en una disolución de guanidina 1 M, seguida por dilución con disolución de arginina 4 M. Se eliminó este His-tag de las proteínas de fusión antes de analizar la función biológica. La eliminación de la etiqueta se logró tratando la proteína de fusión con trombina procedente de placenta humana.

Además, cada una de las secuencias codificadoras de gen OB humano y de ratón, menos la secuencia señal, se inserta en un vector pET 12c utilizando el método de clonación con PCR. Estos constructos pueden dirigir las proteínas de fusión OB sintetizadas hacia el espacio periplásmico de la célula hospedadora bacteriana. La proteína de fusión OB recuperada del espacio periplásmico solamente puede necesitar una simple filtración en gel para ser purificada de otras proteínas del hospedador y no se desnaturalizará durante un procedimiento de este tipo.

EJEMPLO 3 :PREPARACIÓN DE ANTICUERPOS PARA EL POLIPÉPTIDO OB

Además de usar la proteína recombinante para regenerar anticuerpos policlonales, se identificaron una serie de cuatro secuencias de péptido a partir de la secuencia OB de murino deducida, utilizando el software de graficación para inmunogenicidad (paquete GCG). Los cuatro fragmentos de péptido carboxilo-terminales son:

(SEQ ID NO:18)

Val-Pro-Ile-Gln-Lys-Val-Gln-Asp-Asp-Thr-Lys-Thr-Leu-Ile-Lys-Thr

(SEQ ID NO:19)

Leu-His-Pro-Ile-Leu-Ser-Leu-Ser-Lys-Met-Asp-Gln-Thr-Leu-Ala

(SEQ ID NO:20)

Ser-Lys-Ser-Cys-Ser-Leu-Pro-Gln-Thr-Ser-Gly-Leu-Gln-Lys-Pro-Glu-Ser-Leu-Asp

(SEQ ID NO:21)

Ser-Arg-Leu-Gln-Gly-Ser-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Gln-Gln-Leu-Asp-Val-Ser-Pro-Glu-Cys

Estos péptidos fueron conjugados a KLH, y se utilizaron los conjugados péptido-KLH para inmunizar conejos utilizando técnicas convencionales. Se recuperan los antisueros policlonales específicos para cada péptido a partir de los conejos.

EJEMPLO 4: TRANSLOCACIÓN IN VITRO DE UN POLIPÉPTIDO OB

Con el fin de confirmar la presencia de una secuencia señal funcional, se subclonó un ADNc humano que incluía todo el marco de lectura abierto, en un vector pGEM. Solamente se utilizó ADNc humano en este experimento debido a que no se recuperó los subclones de ratón adecuados. Se transcribió el ARN de ob humano, de cepa positiva, utilizando Sp6-polimerasa y se utilizó en una reacción de traducción in vitro con y sin membranas microsómicas pancreáticas caninas. El producto de traducción primario migró con un peso molecular aparente de alrededor de 18 kD, lo que es consistente con lo que se había predicho mediante la secuencia de ADNc. La inclusión de las membranas microsómicas en la reacción inhibió la eficiencia global de traducción en alrededor de cinco veces. No obstante, aproximadamente del 50-70% del producto de traducción primario OB fue truncado aproximadamente en 2 kD en presencia de la preparación de membrana, lo que sugiere que la secuencia señal es funcional (figura 19A). El tamaño del producto de traducción primario de ARN de interleucina-1a, que no codifica para una secuencia señal, permaneció inmutable cuando se incluyó en la reacción membranas microsómicas. Con el fin de confirmar que la translocación de la proteína OB se había efectuado, se trató los productos de traducción in vitro con proteinasa-K. El tratamiento con proteasa dio como resultado la proteólisis completa del producto de traducción primaria de 18 kD, mientras que la forma procesada de 16 kD no fue afectada por el tratamiento enzimático, lo que indica que se había translocado a la luz de los microsomas (figura 19B). Estos datos son compatibles con la hipótesis de que el OB es una molécula secretada.

Después de la escisión de secuencia señal, quedaron dos residuos de cisteína dentro de la proteína predicha, lo que elevó la posibilidad de que la molécula contenga una ligadura de disulfuro característica de otros polipéptidos secretados [Shen et al., Science, 224:168-171 (1984)].

EJEMPLO 5: CARACTERIZACIÓN DEL GEN OB

Para establecer la relación entre la obesidad y las alteraciones genéticas en el gen OB en seres humanos, se determinó la secuencia del gen OB humano (figura 20A a C)(SEQ ID NOS:22 y 24). Se usó cebadores específicos procedentes de la secuencia codificante humana para seleccionar una biblioteca P1 humano. Se obtuvo tres clones P1 diferentes, se agrupó y se amplificó con PCR utilizando los cebadores que flanquean el sitio de escisión entre los exones codificadores primero y segundo. Se amplificó toda la región de intrón, aproximadamente 2 kb, y se determinó parcialmente la secuencia (véase la figura 20A; y, como se indica en SEQ ID NOS:22 y 24).

Se caracterizó la estructura de genes tanto de los genes de murino como de humano utilizando ensayos de PCR y otras técnicas comunes y corrientes. Se encontró que el gen OB de ratón consistía de tres exones, el segundo y el tercero de los cuales tuvieron que ver con la secuencia codificante (figura 20B). La región codificadora del gen OB comparte la misma estructura; sin embargo, el gen humano carece de un exón y un intrón 5' (figura 20E).

Se había preparado dos series de cebadores generados a partir de las secuencias intrónicas del gen humano (figuras 20A a C). Las secuencias de los cebadores se dan a continuación (F y R se refieren a positivo e inverso,

respectivamente):

HOB 1gF: 5'-CCCAAGAAGCCCATCCTG-3' (SEQ ID NO:29)

HOB 1gR: 5'-GACTATCTGGGTCCAGTGCC-3' (SEQ ID NO:30)

HOB 2gF: 5'-CCACATGCTGAGCACTTGTT-3' (SEQ ID NO:31)

HOB 2gR: 5'-CTTCAATCCTGGAGATACCTGG-3' (SEQ ID NO:32)

Se había obtenido muestras de ADN de diversas fuentes y estas series de cebadores son utilizadas para amplificar el ADN genómico humano procedente de varias personas obesas. Los productos de PCR fueron operados sobre un gel de agarosa de bajo punto de fusión, y se recortó las bandas y se digirió con agarasa. Se obtuvieron las secuencias utilizando el secuenciador de ADN ABI 373A y el kit terminador de didesoxi Taq (ABI, Perkin-Elmer). Se ha detectado hasta ahora una mutación puntual en un gen ob procedente de una muestra de paciente. Esta mutación está en el primer exón y no cambia la secuencia de aminoácidos. Los datos preliminares indican que puede estar presente una secuencia de inserción en el primer exón de otro paciente.

Se puede emplear un método secuenciador automático, diferente, utilizando Sequenase en lugar de ADNpolimerasa Taq, para producir secuencias que pueden ser leídas más fácilmente, para la detección de la mutación.

EJEMPLO 6: EXPRESIÓN DE OB EN LEVADURA

Después de la clonación posicional de OB, se hizo importante descubrir el mecanismo fisiológico mediante el cual la proteína OB reduce la ingestión de alimento y el peso corporal. La primera etapa en esta dirección fue producir de manera recombinante una proteína funcional, utilizando un sistema de expresión. Además del sistema de expresión bacteriano, exitoso, también se seleccionó un sistema de expresión en levadura. La expresión en levadura tuvo diversos aspectos atractivos para expresar OB. El más importante es que las proteínas eucarióticas biológicamente activas son producidas más probablemente. El polipéptido OB es secretado por las células de mamífero. La secreción de proteína es muy similar para todos los eucariotas, lo que significa que el aparato secretor de levadura es mucho más similar a la trayectoria de secreción del mamífero de lo que podrían ser las trayectorias de secreción de las bacterias. En particular, las modificaciones de OB en proteína, vistas en células de mamíferos, muy probablemente se podrían ver también en la expresión a través del sistema secretor de la levadura. Además, se lleva a cabo el plegamiento de la proteína en su etapa a través del aparato secretor y, de tal manera, la administración de ob a través del aparato secretor de la levadura probablemente dará una proteína apropiadamente plegada con actividad biológica natural. Esto es importante para OB debido a que dos residuos de cisteína pueden formar un puente de disulfuro. A diferencia de las trayectorias de secreción, el ambiente reductor del citoplasma de la célula previene la formación de los puentes de disulfuro; y por consiguiente es esencial que OB pase a través de las trayectorias de secreción con el fin de que esta ligadura disulfuro se forme in vivo. Otras ventajas tienen que ver con la facilidad y la rapidez de la manipulación de la levadura y la disponibilidad de vectores y cepas así como la vasta experiencia en la tecnología de recombinación en levadura.

Se eligió un sistema de expresión en Pichia pastoris, por cuatro razones: (1) tiene niveles más altos de expresión de proteína heteróloga que otros sistemas de levadura, tales como S. cerevisiae; (2) la glicosilación de proteína es más similar al sistema de mamíferos en P. pastoris que en S. cerevisiae (aunque no se detectó sitios de glicosilación en ob usando una investigación en computadora, sigue habiendo la posibilidad de glicosilación en sitios no reconocidos); (3) P. pastoris secreta naturalmente muy pocas proteínas y, de tal manera, generalmente es fácil purificar la proteína extraña expresada; y (4) los vectores y las cepas de levadura pueden ser obtenidas comercialmente (de Invitrogen). Dos estrategias para generar vectores de expresión en levadura se muestran en las figuras 21 y 22.

El vector elegido fue pPIC.9. Este vector contiene un sitio de clonación justo en el sentido de 3’ de la secuencia codificante prepro del factor de acoplamiento a, que dirige la proteína codificada por el gen clonado hacia el sitio de clonación que se va a secretar por la trayectoria de secreción. La otra característica importante del vector es un gen HIS4 que permite la selección para captación del vector utilizando una cepa oxotrófica de levadura desarrollada en medios deficientes en histidina después de la transformación de la levadura con el vector. La estrategia de clonación fue como sigue: se amplificó con PCR el ADNc de OB utilizando un cebador 5' que contenía en su extremo 3' la secuencia complementaria a la secuencia de OB, junto después del sitio de escisión del péptido líder predicho, y en su extremo más hacia 5', una secuencia complementaria al extremo 3' de la secuencia del factor de acoplamiento a del vector. El cebador 5' también contiene un sitio XhoI. el cebador 3' estaba diseñado para tener en su extremo 3' una secuencia complementaria a los últimos pocos aminoácidos de OB y un sitio EcoRI en su extremo 5'. Después de su amplificación con PCR, se digirió el producto de PCR con XhoI y EcoRI y se clonó en pPIC.9 digerido similarmente. Después de la clonación de los ADNc de OB tanto de ratón como humano, cada uno con y sin la glutamina en el codón 49, se aislaron los clones individuales para los cuatro constructos y se determinó la secuencia para verificar que los constructos estuviesen clonadas en la orientación correcta y el marco correcto, y que no contuviesen mutaciones debidas al etapa de amplificación con PCR. Después de identificar los clones con la secuencia correcta, se transformaron a la cepa GS115 de P. pastoris, un oxótrofo de histidina.

Para los dos constructos de OB de ratón se discriminó los clones de levadura transformados para la expresión de proteína. Tal como se evidencia que la levadura transformada contiene OB, se efectuó un análisis de inmunotransferencia de puntos de ADN y un ensayo de hibridación en colonia, y ambos mostraron la secuencia OB dentro de la levadura transformada, pero no dentro de la levadura sin transformar. Adicionalmente, la levadura transformada secreta ahora una proteína de 16 kD a un medio de cultivo, mientras que la levadura no transformada no secreta proteína de ese tamaño (figura 23A). Este es el tamaño predicho de OB. Los clones individuales para ambos constructos de ratón se habían identificadas como expresores fuertes para OB, y actualmente se está desarrollando una estrategia de purificación para purificar ob hasta la homogeneidad. Una estrategia se ha purificado OB en una columna de intercambio de cationes (figura 23B); los datos preliminares sugieren que puede ser útil un intercambiador de cationes fuerte. Sin embargo, después de cromatografía por intercambio de cationes, se pierde el producto ob putativo. Esto indica la presencia de una proteasa en la muestra.

Una estrategia para resolver este problema es preparar fusiones de ob-His-tag para expresión en levadura (figura 22). Otra evaluación ha demostrado que OB sin un His-tag se asocia fuertemente con una columna de quelación de Ni. La purificación del polipéptido OB por medio de quelación de Ni, seguida por filtración en gel, produjo un producto de pureza suficiente para el análisis espectral de masa. El espectro de masas confirma que el peso molecular de la proteína expresada es idéntico al peso molecular esperado, lo que confirma fuertemente que OB ha sido expresado con éxito en Pichia.

Sin embargo, el protocolo de quelación de Ni/purificación por filtración en gel no produjo un polipéptido OB en forma suficientemente pura. Están presentes moléculas pequeñas adicionales. Parece que la actividad proteolítica eluye de la columna de quelación de Ni en el volumen hueco. Por consiguiente, se planifica un procedimiento de purificación en tres etapas: quelación de Ni, seguida por intercambio de cationes (lo que elimina los contaminantes de molécula pequeña), seguido por filtración en gel.

La estimación del nivel de expresión por medio del manchado con azul de Coomassie, de los geles SDS-PAGE, revela aproximadamente 10 mg/l cuando se desarrolla la levadura en matraces de agitación. Estos niveles se esperan que incremente los recipientes de fermentación y se está a punto de iniciar la fermentación con la esperanza de obtener cantidades mayores de proteína. Con respecto a los constructos de OB humano, los clones de levadura transformados que contienen elevado número de copias del gen OB han sido identificados, y se espera que estos expresen la proteína OB. A medida que se desarrollen los anticuerpos, serán usados para confirmar la identidad de la proteína secretada de 16 kDa.

EJEMPLO 7: EXPRESIÓN A ALTO NIVEL DE UN PÉPTIDO DE FUSIÓN DE OB EN BACTERIAS

Preparación de materiales de congelador:

Se añadieron a cada una de dos alícuotas de 4 ml de medio M9ZB esterilizado, sin la fuente de carbono, 40 !l de dextrosa de almacén (0,4 g/ml, esterilizada en filtro), 10 !l de material de ampicilina (200 mg/ml) y 5 !l de material de cloranfenicol (34 mg/ml en etanol). Se utilizó una sola colonia de cada uno de E. coli con ADN de OB1 de ratón y ser humano clonados, en un vector pET-14b de Novagen para inocular estos materiales. Se inoculó los tubos a 37ºC durante la noche.

Se utilizaron 0,5 ml de cultivos nocturnos para inocular 50 ml de medio M9ZB con dextrosa, ampicilina y cloranfenicol. Se incubó estos medios a 30ºC y se vigiló periódicamente la absorbencia a 600 nm (A600). A una A600, de alrededor 1- 1,2, se mezclaron alícuotas de 175 !l del cultivo con 25 !l de glicerol al 60% en tubos de eppendorf de 2 ml, se congelaron de manera rápida en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80ºC.

Crecimiento de cultivo:

Se inocularon 50 ml de medios M9ZB con 0,5 ml de dextrosa al 40%, 125 !l de material de ampicilina y 50 !l de material de cloranfenicol, con 1 ml de material de congelador y se incubó a 30ºC. A una A600 de 1- 1,2, se utilizaron 10 ml de este cultivo para inocular cada uno de cuatro matraces de 2 litros, con 500 ml de medios M9ZB, con dextrosa, ampicilina y cloranfenicol. Se incubaron estos matraces a 30ºC hasta que se determinó una inducción a A600 de alrededor de 1- 1,2, con una concentración final de IPTG 0,5 mM. Se incubaron durante la noche estos cultivos. Se recogieron las células mediante centrifugación a 4000 rpm durante 20 minutos. Este sistema de expresión produjo un polipéptido OB recombinante con un porcentaje bastante elevado de proteína total, del orden de gramo/litro de E. coli.

Lisis de las células y la resuspensión de cuerpos de inclusión:

Se resuspendió la pasta de células en un volumen mínimo de HEPES 20 mM, pH 7,2, glicerol al 10%, KCI 0,1 M, MgCl2 5mM, aprotinina al 1%, PMSF 1 mM, 5 !g/ml de leupeptina y 50 !g/ml de ADNasa I. Se congeló y descongeló la suspensión tres veces utilizando nitrógeno líquido y agua tibia. Se centrifugaron las células sometidas a lisis a 18000 rpm durante 30 minutos y se resuspendió en HEPES 20 mM, pH 7,5, NaCl 0,1 M. Se sonicó la suspensión y se añadió Triton X100 a una concentración final del 2%. Se centrifugó esto a 18000 rpm durante 15 minutos. Después de otros dos ciclos, se efectuó tres ciclos de lavado libre de Triton. Finalmente se disolvió la gragea en 6 moles de GdHCl (clorhidrato de guanidina), HEPES 20 mM, pH 7,5 mediante sonicación seguido por centrifugación. Se utilizó el sobrenadante para purificación adicional.

Se purificó la proteína OB en estado desplegado por medio de cromatografía de afinidad de iones de metal inmobilizado (IMAC). Se aplicó la disolución a una columna de 40 ml de sefarosa de flujo rápido, queladora, de Pharmacia, cargada con 5 volúmenes de 50 milimoles de NiSO4 y equilibrada en 6 moles de GdHCl, 20 milimoles de HEPES, pH 7,5. Se lavó la columna con GdHCl 6 M, imidazol 30 mM, HEPES 20 mM, pH 7,5. Finalmente se eluyó la proteína con el mismo tampón que contenía imidazol 0,2 M. Se almacenó la proteína no plegada en GdHCl 6 M a 4ºC, después de añadir acetato de sodio (NaAc) a 10 mM y ajustar el pH alrededor de 4,5 con ácido acético.

Replegamiento y purificación de la proteína:

Se trató una disolución de GdHCl 6 M que contenía 100 mg de proteína con 67 !l de ditiotreitol 1 M (DTT) y se diluyó con alrededor de 67 ml con GdHCl 6 M, NaAc 10 mM, pH 4,5. Se dejó agitando a temperatura ambiente durante una hora. Luego se diluyó en 4 litros de glicerol al 20%, CaCl2 2,5 mM, tampón Tris 20 mM, pH 8,4, con agitación. Después de mezclar apropiadamente, se dejó la disolución a temperatura ambiente durante alrededor de 8 horas, sin agitar. Luego se añadió 2000 unidades de trombina bovina purificada (de thrombostat, un producto Parke-Davis), y se dejó que la disolución se agitara suavemente. Después de 2,5 horas se volvió a dosificar con 2000 unidades de trombina y se continuó la escisión de la histidina-marcador durante 3 horas más. Se detuvo la división de trombina añadiendo PMSF a una concentración final de 0,1 mM. Se filtró la disolución y se almacenó a 4ºC.

Luego se purificó adicionalmente la proteína escindida en la misma columna IMAC que antes, se equilibró en KCl 1 mol, glicerol al 20%, tampón HEPES 20 mM, pH 8,4. Después de agregar la disolución de proteína, se lavó con el mismo tampón y se eluyó la proteína dividida con KCl 1 M, glicerol al 20%, imidazol 40 mM, HEPES 20 mM, pH 8,4. Se eluyó la proteína no dividida a imidazol 0,2 M.

Se concentró la proteína escindida, purificada, se trató con EDTA 50-100 mM, ferricianuro de potasio 10 mM (para completar cualquier oxidación incompleta) y se filtró en gel en una columna superdex 75 16/60. Los rendimientos utilizando este procedimiento llegaron al 50% del péptido inicial.

Una vez purificada, la proteína expresada se ha caracterizado por diversos métodos. La caracterización física incluye la difusión de luz dinámica para determinar la homogeneidad de la estructura y su uso como una medida del plegamiento apropiado. Los datos de difusión de luz indican que el polipéptido OB humano se expresa predominante

o exclusivamente como un monómero, mientras que el polipéptido OB de murino puede ser encontrado como un dímero, y a la vez como un monómero.

Los ensayos con el reactivo de Ellman y el análisis espectroscópico de masa confirman que los residuos de cisteína forman un puente de disulfuro en la proteína. Esta forma oxidada del polipéptido fue administrada a ratones, tal como se describe más adelante y demostró actividad biológica.

Se ha utilizado el dicroísmo circular para determinar aproximadamente la geometría estructural de la proteína. Los espectros de CD en un tampón fisiológico (pH aproximadamente 8, aproximadamente concentración iónica fisiológica) indican que el polipéptido OB humano tiene alrededor del 60% de estructura a-helicoidal y aproximadamente el 40% de estructura helicoidal aleatoria. Se encontró que el polipéptido OB de murino tenía aproximadamente el 50% de a-hélice y el 50% de hélice aleatoria, mediante espectroscopía de CD.

Se ha empleado proteólisis limitada, seguida por espectrometría de masa (Cohen et al., citado anteriormente) para identificar partes del polipéptido OB que son accesibles a la proteólisis. Este análisis ha demostrado la presencia de una estructura de bucle flexible, de residuos de aminoácido 54 a 60 (tal como se representa en la figura 4).

Probablemente este es el bucle flexible que conecta dos dominios de la estructura 2º definida, por ejemplo una ahélice.

Es muy importante, tal como se muestra en los ejemplos siguientes, que la bioactividad de la proteína purificada se sometió a prueba administrando la proteína tanto a roedores magros como a roedores obesos a través de una bomba osmótica (por ejemplo, una bomba osmótica ALZET, de Alza Corporation, Palo Alto, CA) o mediante una dosis de bolo diaria, intraperitoneal, durante un periodo de al menos dos semanas, y se observó los efectos sobre el comportamiento de ingestión de alimentos y sobre el peso corporal.

EJEMPLO 8: EFECTOS REDUCTORES DE PESO DEL POLIPÉPTIDO OB (LEPTINA)

El producto de gen del sitio OB de ratón desempeña un papel importante en la regulación del peso corporal. El presente ejemplo establece que la proteína OB circula en el plasma de ratón, de rata y de ser humano. La forma circulante en las tres especies tiene un peso molecular idéntico mediante SDS-PAGE a la secuencia de polipéptido deducida sin la secuencia señal, lo que sugiere que, in vivo, la proteína no es procesada después de la escisión de la secuencia señal. La proteína OB estaba ausente en el plasma de los ratones C57/B16J ob/ob y estaba presente a concentraciones diez veces mayores en el plasma de ratones db/db y a niveles veinte veces mayores en el plasma de ratas fa/fa, con respecto a los controles. Se sugiere que estos animales mutantes obesos son resistentes a los efectos de OB. Hubo diferencias siete veces mayores en los niveles de plasma de la proteína OB dentro de un grupo de seis sujetos humanos magros. Las inyecciones diarias de la proteína OB de ratón recombinante redujeron dramáticamente la masa corporal en los ratones ob/ob, tuvieron efectos importantes sobre el peso corporal de ratones del tipo natural, pero no tuvieron ningún efecto sobre los ratones db/db. Estos datos sugieren que el producto de genes del sitio OB sirve como una función endocrina para regular el peso corporal.

MATERIALES Y METODOS

Se inmunizaron conejos con proteína recombinante en el adyuvante de Freund (HRP, Inc.). Se prepararon anticuerpos de OB antirratón, inmunopurificados, mediante la etapa de antisuero sobre una columna de sefarosa 4B, conjugada a la proteína recombinante, tal como se describió [Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1988)]. Se llevó a cabo la inmunoprecipitación del plasma de ratón de la siguiente manera: 0,5 ml de plasma procedente de ratón, rata y ser humano, que contenía aproximadamente EDTA 2,5 nM, se limpió previamente con sefarosa 4B no conjugada a temperatura ambiente, con oscilación durante 2 horas. Se eliminó la sefarosa mediante centrifugación y se añadieron 50 ml de una suspensión al 50% de sefarosa conjugada con anticuerpo, que contenía el anticuerpo purificado por afinidad, a una concentración de 1 mg/ml de sefarosa empaquetada. Se añadió medio mililitro del tampón 2x RIPA para dar las condiciones de unión finales, que se dan a continuación: Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, NaCl 100 mM, NP-40 al 1%, SDS al 0,1%, desoxicolato de sodio al 0,5% y azida de sodio al 0,025%. Se llevó a cabo la reacción durante la noche a 4ºC con balanceo. Se lavó ocho veces la sefarosa conjugada con anticuerpo utilizando el tampón RIPA, y luego se enjuagó tres veces con PBS y se operó sobre un SDS-PAGE al 15%. Se transfirieron las proteínas a nitrocelulosa y se realizó inmunotransferencia de tipo Western con un anticuerpo inmunopurificado, biotinilado, contra la proteína recombinante. El anticuerpo secundario utilizado fue HRP-estreptavidina y se utilizó ECL para la detección.

Para cuantificar la cantidad de OB en el suero de ratón, se añadieron cantidades crecientes de la proteína OB de ratón recombinante replegada (0,01, 0,1, 0,5, 2,0, 15,0 ng) a 100 I de plasma de ratón C57BL/6J ob/ob y se incubó a 4ºC durante 3 horas, con la proteína A, anticuerpo conjugado a sefarosa. Después de lavar extensamente con el tampón A (10 milimoles de tampón fosfato de sodio, pH 7,4; 100 milimoles de NaCl; 1% de Triton X-100, 5 milimoles de EDTA, 1 milimol de PMSF), se volvió a suspender las muestras en el tampón de muestra, se cargó en un SDS-PAGE al 15% y se transfirió a una membrana de nitrocelulosa. Se llevó a cabo la inmunotransferencia de tipo Western utilizando un anticuerpo anti-extremo amino biotinilado, inmunopurificado, como un anticuerpo primario, y HRP-estreptavidina como un anticuerpo secundario, seguido por detección mediante ECL.

Se prepararon extractos citoplásmicos homogeneizando tejido adiposo en tampón NDS (Tris 10 mM, pH 7,5, NaCl 10 mM, ICCI 60 mM, espermita 0,15 mM, espermidina 0,5 mM, 1-mercaptoetanol 14 mM, EGTA 0,5 M, EDTA 2 mM, NP-40 al 0,5%), mediante homogeneización de polytron y dounce y la eliminación de los núcleos fue acompañada por centrifugación a 700 g.

Se llevaron a cabo las inmunoprecipitaciones tal como se describió anteriormente, excepto que se usaron anticuerpos OB ant-ser humano inmunopurificados. Para el ELISA, se disolvió 100 ml de una disolución de 1 mg/ml de anticuerpo OB antihumano inmunopurificado en disolución PBS regulada con borato y se aplicó durante la noche a placas de microtitulador (número de catálogo 2595, Corning) a 4ºC. Luego se lavaron cuatro veces las placas con solución salina de borato que contenía Tween 20 al 0,05% y se eliminó el exceso de líquido. Se bloquearon las placas mediante incubación a temperatura ambiente durante 2 horas con 240 ml por pocillo de tampón salino de borato que contenía gelatina al 0,3% y luego se lavaron y se secaron. Se incubaron en los pocillos individuales, durante la noche, a 4ºC, cantidades conocidas de una proteína OB humana, replegada, o muestras de plasma en un volumen de 100 ml. Después de lavar se incubaron las placas con 100 ml de un anticuerpo antihumano inmunopurificado, biotinilado (0,1 mg/ml en una disolución regulada con gelatina/borato), durante 4 horas, a temperatura ambiente. Después de lavar se añadió a las placas peroxidasa de rábano picante (HRP)-estreptavidina

(0,1 mg/ml en tampón borato, gelatina al 0,3%). Luego se usó la disolución de substrato de HRP (ABTS, 0,3 mg/ml y H2O2, 0,01% en ácido cítrico), para la detección y se midió la D.O. a 414 nM para cuantificar la unión del anticuerpo.

Las secuencias codificadoras de gen OB de ratón y humano fueron amplificadas por PCR a partir de plásmidos que contenían las secuencias de ADNc de OB y se subclonó al plásmido pPIC.9 (Invitrogen). El cebador 5' humano fue:

5 5' GTATCTCTCGAGAAAAGAGTGCCCATCCAAAAAGTCCAAG 3'

(SEQ ID NO:34);

y el cebador 3' fue:

5' GCGCGAATTCTCAGCACCCAGGGCTGAGGTC 3' (SEQ ID NO:35).

Para los ratones, el cebador 5' fue:

10 5' GTATCTCTCGAGAAAAGAGTGCCTATCCAGAAAGTCCAGG 3'

(SEQ ID NO:36)

y el cebador 3' fue:

5' GCGCGAATTCTCAGCATTCAGGGCTAACATC 3' (SEQ ID NO:37)

El cebador 5' tanto para ratón como para ser humano contiene un sitio XhoI en el extremo 5', y las secuencias

15 codificadoras para los últimos 4 aminoácidos de la secuencia señal del factor de acoplamiento a, presente en el vector pPIC.9. Este vector dirige la secreción de los genes expresados heterólogamente a partir de la célula, hacia el medio de cultivo. El cebador PCR 5' también incluye los 19 primeros nucleótidos del marco de lectura abierto del gen OB, después del sitio de escisión de la secuencia señal, antes de la alanina en la posición del aminoácido 21. El cebador 3' contiene un sitio EcoRI en su extremo 5', que está inmediatamente seguido por las secuencias

20 complementarias al codón de detención de OB putativo. Las condiciones de PCR fueron las siguientes: desnaturalización durante 1 minuto a 94ºC, recocción durante 1 minuto a 55ºC y extensión durante 2,5 minutos a 72ºC. Se utilizó PCR de bajo ciclo (15 ciclos) y PFU de polimerasa, de lectura de prueba (Stratagen) para limitar el número de mutaciones generadas por PCR. Se digirieron los productos PCR con XhoI y EcoRI y se clonó al vector similarmente digerido pPIC.9. Se determinó la secuencia de todos los constructos en ambas cadenas para asegurar

25 la ausencia de cualesquiera mutaciones generadas por PCR. Se transformaron los clones en Pichia pastoris (His') por medio del método de esferoplasto y se seleccionó en medios deficientes en histidina. Se discriminó aproximadamente 200 clones de ratón y seres humanos para la integración de un número elevado de copias por medio de un análisis de hibridación en colonia. Luego se sometió a análisis los clones de elevado número de copias para la expresión de OB, inicialmente bajo manchado de Coomassie, que muestra la presencia de una proteína

30 novedosa de 16 kD, presente en los medios de cultivo de la levadura transformada. Se confirmó la banda de 16 kD para OB utilizando anticuerpos criados contra la proteína OB expresada bacterianamente. Se purificó las proteínas recombinantes mediante un método de purificación de dos etapas descrito más adelante. Se llevó a cabo la espectrometría de masa y el tratamiento con bromuro de cianógeno, tal como está descrito en Beavis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6873-6877 (1990).

35 Toda la secuencia codificante de OB del terminal C de los genes OB de ratón y humano hasta la secuencia señal, fue subclonada al vector de expresión pETl5b (Novagen) y se sobre-expresó en Escherichia coli [bl21(de3)PºySs], utilizando el sistema de polimerasa de ARN T7 [Studier et al., Meth. Enzymology, 185:80-89 (1990)]. Se desarrolló las células a 30ºC, a una absorbencia de 0,7 a 595 nM y se indujo con isopropil-1-D-tiogalacto-piranosida 5 mM, durante la noche, y se recogió mediante centrifugación a baja velocidad. Se llevó a cabo la lisis mediante tres ciclos

40 de congelación/descongelación y se efectuó la digestión del ADN con ADNasa I. Se llevó a cabo la extracción de membrana mediante sonicación y solubilización en detergente, y se disolvió el sedimento de cuerpo de inclusión final en clorhidrato de guanidina 6 M, HEPES 20 mM, pH 8,4. Se purificaron las proteínas OB recombinantes, en condiciones desnaturalizadoras por medio de IMAC, utilizando una columna de ion-Ni y lavando con cantidades crecientes de imidazol. Luego se almacenó la proteína OB desnaturalizada, purificada, en clorhidrato de guanidina 6

45 M, acetato de sodio 10 mM (NaAc), pH 5, y se redujo utilizando DTT 1 mM, a temperatura ambiente, durante una hora. Se llevó a cabo la desnaturalización diluyendo la proteína reducida en glicerol al 20%, CaCl2 5 mM, NaAc 5 mM, pH 5, por medio de mezclado e incubación a temperatura ambiente durante 8 a 12 horas. Después de la desnaturalización se ajustó el pH a 8,4 mediante la adición de Tris a 10 mM y se eliminó el marcador de hexahistidina mediante división con trombina. Se repurificó la proteína dividida, renaturalizada mediante IMAC para

50 separar el producto de la trombina y de la proteína de fusión no dividida. La proteína renaturalizada, dividida, se eluye de la columna de afinidad de ion-Ni a imidazol 40 mM, mientras que la trombina no es retenida y la proteína de fusión no dividida se eluye a imidazol 0,2 mM. Luego se concentró el producto, se trató con EDTA 100 mM y ferricianuro de potasio 10 mM y se purificó adicionalmente por medio de filtración en gel utilizando una columna Pharmacia superdex 75 16/60.

Se llevó a cabo un ensayo de Ellman, tal como se describe en Ellman, Arch. Biochem. Biophys., 82:70-77 (1959). Se preparó el reactivo de Ellman disolviendo a 39,6 mg de 5,5'-ditiobis(ácido 2-nitrobenzoico) (DTNB) en 10 ml de fosfato 0,05 M, pH 8. Se construyó la curva de calibración en la escala de concentración de 10 a 120 mM de sulfhidrilo libre (utilizando disolución maestra 1 mM de DTT reducido) a 412 nm. Se llevó a cabo cada ensayo utilizando 0,02 ml de reactivo de Ellman y una mezcla de reacción total de 0,5 ml. El coeficiente de extinción medido fue 12974 M-1cm-1 para el grupo sulfhidrilo libre (coeficiente de correlación 0,99987), que está dentro del 5% del valor previamente informado de 13600 M-1cm-1.

Se sometió al análisis de Ellman cincuenta ml de proteína filtrada en gel pura a 2 mg/ml, que corresponde a una posible concentración de sulfhidrilo libre de alrededor de 24 mM en la mezcla de reacción final. La disolución resultante dio A412 de alrededor de 0,02, lo que sugiere que los dos residuos de cisteína en la proteína están en un estado oxidado que forma cistina o que sus grupos sulfhidrilo libres están completamente sepultados dentro del núcleo inaccesible de la proteína plegada. Se obtuvo resultados idénticos llevando a cabo el mismo análisis sobre proteína desplegada en presencia de clorhidrato de guanidina 6 M.

Se enjauló individualmente ratones en un ambiente libre de patógenos y se los aclimató a una dieta que contenía el 35% (en p/p) del alimento Laboratory Rodent Diet 5001 (PMP Feeds, Inc.), el 5,9% (en p/p) de una muestra de pudín de tapioca (General Foods) y el 59,1% de agua, que tenía un contenido de energía de 1,30 kcal/g. Se esterilizó la dieta mediante tratamiento en autoclave y se empacó en platos de plástico de 60 mm, que se fijaron a los extremos superiores de discos petri de 100 mm. La tapioca proporciona a la dieta una textura pastosa que hace difícil que el animal esparza el alimento en la jaula. La tapa de 100 mm recupera la cantidad pequeña de alimento salpicada por el animal. Se colocó un plato nuevo de alimento en la jaula cada mañana y se retiró y se pesó el plato del día anterior. La diferencia en peso proporcionó una medida del consumo diario de alimento. Los efectos de la proteína recombinante sobre la ingestión de alimento y el peso corporal fueron medidos en tres cepas de ratón: C57Bl/6J ob/ob, C57 Bl/Ks db/db y CBA/J+/+, adquiridos de Jackson Laboratory. Se escindieron 30 ratones de cada cepa a grupos de diez. Un grupo de cada cepa recibió inyecciones intraperitoneales (i.p.) diarias de la proteína ob bacteriana, replegada, a una dosis de 5 mg/g/día en 300 !l de PBS. Un segundo grupo recibió inyecciones i.p. del mismo volumen de PBS. Estos ratones de control recibieron inyecciones del dializado de PBS de la proteína recombinante. Se libró el PBS de endotoxinas utilizando una columna ETOX Acticlean. Un tercer grupo de animales no recibió inyecciones. Se registró la ingestión de alimentos diariamente y se registró regularmente la medición del peso corporal durante un intervalo de 3 a 5 semanas. Para el experimento de alimentación par, se formó pareja de la ingestión de alimento de un grupo separado de ratones ob sobre una base diaria, con la consumida por los ratones ob que reciben proteína.

RESULTADOS

LA PROTEÍNA OB CIRCULA EN EL PLASMA DE RATONES, RATAS Y SER HUMANO

Se preparó proteína OB recombinante de ratón y humana utilizando el vector de expresión bacteriano pET 15b (Novagen) y clonando en Pichia pastoris, un sistema de expresión en levadura que secreta las proteínas recombinantes directamente hacia el medio de cultivo. La proteína ob expresada en la levadura incluye la secuencia de 146 aminoácidos del extremo carboxi hasta la señal. Se inmunizaron conejos con la proteína bacteriana (HRP, Inc.). Se inmunopurificó anticuerpos (Research Genetics) y se los utilizaron para inmunoprecipitaciones y inmunotransferencias de tipo Western de proteína a partir de plasma y tejido adiposo.

La proteína OB procedente del plasma de ratón migra con un peso molecular aparente de 16 kD mediante SDS-PAGE. La movilidad electroforética es idéntica a la de la proteína OB recombinante secretada por la levadura después de la eliminación de la secuencia señal (figura 24A). No se detectó proteína en el plasma de los ratones C57BL/6J ob/ob que tenían una mutación no sentido en el codón 105. Varios antisueros diferentes no pudieron identificar la cadena de polipéptido de 105 residuos, truncada, predicha por la secuencia de ADNc.

Se observó un incremento de diez veces en el nivel de proteína circulante en los ratones db/db, con respecto a un animal de control (figura 24A). La inmunoprecipitación de plasma a partir de ratas de tipo natural y fa/fa reveló un incremento de veinte veces en el nivel de proteína OB en la rata mutante, en comparación con el tipo natural (figura 24B). La mutación db dio como resultado un fenotipo obeso idéntico al que se ve en los ratones ob (Bahary et al., 1990, citado anteriormente). Las ratas gordas son obesas como resultado de una mutación recesiva en un gen homólogo a db (Truett et al., 1991, citado anteriormente). Con el fin de cuantificar el nivel de OB en el plasma de ratón, se añadió cantidades que van en aumento de la proteína recombinante al suero y se inmunoprecipitó (figura 24C). Se ve un incremento lineal de la intensidad de señal en las inmunotransferencias de tipo Western con el aumento de las cantidades de proteína recombinante. Una comparación de la intensidad de señal de la proteína nativa en el plasma de ratón indicó que el nivel de circulación de la proteína OB en los ratones de tipo natural es aproximadamente de 20 ng/ml. Esos datos demuestran que las inmunoprecipitaciones y las inmunotransferencias de tipo Western fueron efectuadas en condiciones de exceso de anticuerpo. Los niveles incrementados de proteína OB también se ven en extractos de proteína del tejido adiposo procedente de ratones db/db, con respecto a los controles (figura 24D). Tal como se espera para una proteína secretada, la proteína procedente del tejido adiposo se fraccionó con la fracción de membrana cruda (no se muestran los datos).

Se inmunoprecipitaron muestras de plasma procedentes de seis sujetos humanos magros con un índice de masa corporal inferior a 25 (IMC=peso/altura2) utilizando anticuerpos inmunopurificados para la proteína humana. El material inmunoprecipitado migró con una movilidad electroforética idéntica a la que se ve para la proteína humana de 146 aminoácidos expresada en levadura. La intensidad de las señales varió significativamente entre seis muestras (figura 25A). La densitometría de la auto-radiografía reveló una diferencia aproximada de 25 veces en los niveles de HP1 y HP6 individuales, con niveles intermedios en los demás sujetos. Se desarrolló un inmunoensayo enlazado por enzima (ELISA) utilizando el anticuerpo inmunopurificado y proteína bacteriana replegada como una norma (véase más adelante). La curva patrón resultante está mostrada en la figura 25B. Utilizando este análisis se varió los niveles en plasma de la proteína OB en seis muestras de plasma humano entre 2 y 15 ng/ml (figura 25C). El nivel de la proteína OB en el plasma de HP6 estuvo fuera de la escala lineal del inmunoanálisis y es 15 ng/ml. Estas diferencias cuantitativas se correlacionan con las que se ven en las inmunotransferencias de tipo Western.

Los datos preliminares sugieren que la leptina puede circular, al menos en parte, formada a complejo con otra proteína u otras proteínas. Esta conclusión se basó en la heterogeneidad de la forma de la curva de titulación del suero en comparación con la norma recombinante. El análisis de una cantidad grande de leptina inmunopurificada en una columna anti-OB de conejo mediante HPLC por filtración en gel, en condiciones de desnaturalización y no desnaturalización, sin vigilancia por ELISA ni SDS-PAGE, sugirió que el polipéptido OB se comportó como un complejo de elevado peso molecular. Sin embargo, esos datos siguen siendo preliminares. La proteína de aglutinación OB, si la hay, todavía no ha sido caracterizada.

CARACTERÍSTICAS ESTRUCTURALES DE LA PROTEÍNA OB

Puesto que la proteína OB tiene dos residuos de cisteína, podría formar ligaduras o enlaces de disulfuro intramoleculares o intermoleculares, en condiciones de oxidación, in vivo. Las inmunotransferencias de tipo Western se repitieron con o sin adición de agentes reductores al tampón de muestra. En ambas condiciones, la proteína OB en suero humano migró como un monómero (no se muestran los datos). En condiciones no reductoras, la proteína inmunoprecipitada procedente de suero de ratón db fue detectada en las posiciones consistentes con las de un monómero de 16 kD y un dímero de alrededor de 32 kD (figura 26A). El resto de peso molecular mayor desapareció en condiciones reductoras, lo que sugiere que una fracción de OB de ratón circula como una especie de peso molecular mayor mediante la formación de un enlace disulfuro intermolecular. Aproximadamente el 80% de OB de ratón circula como la proteína aproximadamente de 16 kD y el 20% como la forma aproximadamente de 32 kD.

Se ven las mismas formas moleculares cuando se expresan proteínas de ratón y humana en Pichia pastoris [Abrams et al., Immunol. Rev., 5-24 (1992)]. En esos estudios, la secuencia de ADN que corresponde a la proteína OB madura de 146 aminoácidos, se clonó en el sentido de 3’ de la secuencia señal del factor de acoplamiento a de la levadura en el vector pPIC.9 (Invitrogen). Se purificó la proteína OB procedente de medios de levadura de las cepas que expresan las proteínas de ratón y humanas y se sometió a electroforesis en condiciones reductora y no reductora (figura 26A). Se expresó la proteína de ratón en levadura, principalmente como un dímero en condiciones no reductoras, y únicamente como un monómero en presencia de agentes reductores. La proteína humana recombinante migró a la posición de un monómero bajo ambas condiciones (no se muestran los datos).

La proteína humana purificada, expresada en Pichia, tuvo una masa molecular de 16,024±3 Da, tal como se determina mediante espectroscopía de masa 1990 (Beavis, 1990 citado anteriormente). Este valor está en coincidencia con la masa calculada a partir de la secuencia de aminoácidos de la proteína que contiene un solo puente disulfuro intramolecular (16,024 Da). El análisis espectométrico de masa por desabsorción con láser, auxiliado por matriz, de los productos de división con bromuro de cianógeno de la proteína, indica que las cisteínas 117 y 167 están enlazadas por medio de una unión disulfuro intramolecular (figura 26B). El bromuro de cianógeno divide los residuos carboxiterminal hasta metionina.

PREPARACIOÓN Y CARACTERIZACIÓN DE LA PROTEÍNA RECOMBINANTE BIOACTIVA

Se expresó proteína OB de ratón en E. coli a partir de un plásmido pET 15b, como una proteína de fusión insoluble, con un marcador de hexa-histidina N-terminal, de veinte residuos, que contenía un sitio de escisión de trombina. Se solubilizaron los cuerpos de inclusión bacterianos utilizando clorhidrato de guanidina y se purificaron en condiciones desnaturalizantes, utilizando cromatografía por afinidad de ion metálico inmovilizado (IMAC) (figura 27). Se redujo la proteína de fusión desnaturalizada, purificada, se diluyó y se dejó que se replegara en disolución acuosa a temperatura ambiente. Después de la escisión con trombina, se volvió a purificar la proteína OB de ratón renaturalizada que contenía cuatro residuos N-terminales adicionales (Gly-Ser-His-Met; SEQ ID NO: 38) por medio de IMAC a una homogeneidad de más del 98%, tal como se juzgó mediante SDS-PAGE y espectrometría de masa. La espectometría de masa por desabsorción de láser, auxiliada por matriz, dio una masa medida de 16,414±3 Da (masa predicha = 16,415 Da). Los geles de SDS-PAGE, tanto reductores como no reductores, demostraron una sola especie molecular con peso aparente y molecular de 16 kD (no se muestran los datos).

La dispersión de luz dinámica utilizando un detector de tamaño molecular DP801 (Protein Solutions Inc.) demostró que la proteína OB de ratón, renaturalizada, era grandemente monomérica, con ciertos agregados de orden superior. Se trató la proteína con EDTA y se oxidó químicamente. Luego se eliminó mediante filtración en gel las especies de mayor peso molecular. Otra difusión de luz dinámica confirmó que la proteína OB de ratón recombinante, renaturalizada, purificada, era monodispersada. Después de diálisis contra solución salina regulada con fosfato (PBS), se eliminó la endotoxina bacteriana utilizando una columna Acticlean ETOX (Sterogene Bioseparations, Inc). El rendimiento final de proteína fue de 45 mg/l.

Se llevó a cabo el ensayo de Ellman sobre proteínas OB de ratón recombinante, renaturalizada, purificada, para determinar su estado de oxidación (Ellman, 1959, citado anteriormente). Tanto la proteína renaturalizada, como la proteína no plegada mediante clorhidrato de guanidina 6 M, demostró < 5% de contenido en sulfhidrilo libre, lo que demuestra que el producto monomérico contiene una unión disulfuro intramolecular. Esto se confirmó mediante espectometría de masa de los productos de división con bromuro de cianógeno, de la proteína bacteriana replegada (datos no mostrados).

BIOACTIVIDAD DE LA PROTEÍNA OB. Se administró la proteína OB de ratón recombinante, renaturalizada, purificada, como una inyección intraperitoneal diaria de 5 mg/kg/día a grupos de 10 ratones C57Bl/6J ob/ob (edad 16 semanas), C57Bl/Ks db/db (edad 12 semanas) y CBA/J +/+ (edad 8 semanas). Un número igual de animales recibió PBS como una inyección diaria. El PBS usado para las inyecciones de control fue derivado del dializado después del equilibrio de la proteína. 10 animales adicionales, de las tres cepas de ratón no recibieron inyecciones. La ingestión de alimento de los animales individuales se vigiló diariamente y luego se registraron los pesos de los animales a intervalos de tres o cuatro días. Los resultados acumulativos para la ingestión de alimento y el peso corporal de cada uno de los nueve grupos de ratones están mostrados en la figura 28A a F, y se muestra el significado estadístico de los datos en la tabla 1. La ingestión de alimento de los ratones C57B/6J ob/ob, inyectados con proteína, disminuyó significativamente después de la primera inyección y continuó disminuyendo hasta el quinto día, cuando se estabilizó a un nivel igual a aproximadamente el 40% de la ingestión de los animales que recibieron inyecciones de PBS (p < 0,001). Los ratones OB inyectados con fármaco simulado no perdieron peso durante el período de estudio de tres semanas. Los ratones C57B/6J ob/ob que recibieron proteína perdieron aproximadamente el 10% de su peso corporal después de 5 días (p < 0,001). Estos animales continuaron perdiendo peso después de tres semanas de tratamiento, punto en el cual el peso de los animales ob que recibieron proteína había disminuido a un promedio del 60% de su peso corporal inicial (p < 0,0001). Un grupo separado de ratones ob fueron alimentados de forma igual a los ratones ob que recibieron proteína. Los datos de la figura 29B muestran que los ratones alimentados de igual manera perdieron significativamente menos peso que los animales que recibieron la proteína recombinante (p < 0,02). Una fotografía de dos ratones que recibieron inyecciones de proteína o de vehículo muestra la gran diferencia en la apariencia que es el resultado del tratamiento con proteínas (figura 29B). Con el fin de determinar adicionalmente los efectos de la proteína, se llevaron a cabo las necropsias de dos ratones en cada uno de los grupos. La inspección bruta de los ratones ob que recibieron proteína reveló una disminución dramática en la grasa del cuerpo, así como en el tamaño del hígado. Los pesos de hígado de los ratones db y de tipo natural permanecieron sin cambios con el tratamiento. Los hígados de los ratones de ob que recibieron inyecciones de PBS pesaron 5,04 y 5,02 gramos contra 2,23 y 2,03 gramos en los animales que recibieron la proteína recombinante. A diferencia de la característica de hígado graso pálido de los ratones ob, el hígado de los ratones ob que recibieron proteínas adquirió una característica de color más oscuro que el hígado normal (figura 29C). Las secciones histológicas del hígado indicaron que los animales no tratados tenían un hígado graso que estaba notablemente mejorado en los animales tratados con proteína (no se muestran los datos).

A diferencia de los ratones ob, no hubo diferencias importantes en el peso corporal ni en la ingestión de alimentos en los ratones C57BL/Ks db/db que recibieron proteína con respecto al grupo de control que recibió vehículo (figura 28A a F, tabla 1). Los tres grupos de ratones db/db perdieron entre 2 y 5 g durante el período de tratamiento. La glucosa promedio en la sangre de los ratones db se midió utilizando un medidor de glucosa y fue 500 mg/dl en todos los ratones, lo que indica que estos animales habían desarrollado diabetes secundaria a la obesidad. Las inyecciones de ratones de db fueron terminadas después de dos semanas.

En los ratones de tipo natural hubo una disminución pequeña pero importante en el peso corporal después de la administración de la proteína ob, recombinante (figura 28A-F, tabla 1). Después de cinco días de inyección de proteína, los ratones tratados perdieron un promedio de 0,5 g mientras que los ratones de control aumentaron 0,4 g (p < 0,02). En dos puntos de tiempo posteriores, los animales que recibieron proteína pesaron significativamente menos que los ratones que recibieron inyecciones diarias de PBS. El significado del cambio de peso se redujo en los últimos puntos de tiempo. En los animales que perdieron peso, la ingestión de alimento no fue significativamente diferente de los animales de control. Las inyecciones de PBS tuvieron un efecto pequeño pero significativo sobre la ingestión de alimento y el peso corporal en ratones del tipo ob, db y silvestre, en comparación con los ratones que no recibieron inyecciones (p < 0,05).

TABLA 1

Grupo de animales: Grupo de tratamiento CAMBIO DE PESO

días: n media Error estándar P

ob/ob: Proteína Vehículo 1-5 10 9 -6,38000000 -0,14444444 0,47628190 0,24444444 < 0,001

Proteína Vehículo: 1-12 10 9 -1 4,4500000 0,9888889 0,70793126 0,38058597 < 0,001

Proteína Vehículo: 1-27 6 5 -2 4,283333 4,3000000 0,69924563 0,79874902 < 0,0001

db/db: Proteína Vehículo 1-5 10 10 -1,47000000 -2,00000000 0,36939891 0,23142073 0,240

Proteína Vehículo: 1-12 10 10 -3,75000000 -4,19000000 0,77348418 0,34655447 0,610

CBA/J: Proteína Vehículo 1-5 10 10 -0,48000000 0,38000000 0,17876117 0,21489015 0,006

Proteína Vehículo: 1-12 10 10 -0,12000000 1,20000000 0,45748103 0,18378732 0,015

Proteína Vehículo: 1-27 5 6 1,98000000 2,23333333 0,48723711 0,20763215 < 0,651

DISCUSIÓN

Se sugirió primeramente una función endocrina para el producto proteínico del sitio OB, por Coleman, quien mostró

5 que el peso corporal de los ratones ob/ob se redujo después de la unión parabiótica a ratones normales o db (Coleman et al., 1978, citado anteriormente). Los resultados indicados anteriormente apoyan esta hipótesis al mostrar que la proteína OB circula en la corriente sanguínea y que las inyecciones de proteína recombinante reducen el peso corporal. EL peso molecular del producto de genes codificado por el gen OB es aproximadamente 16 kD, que es igual a la secuencia de 146 aminoácidos del extremo carboxi a la secuencia señal. La proteína OB

10 recombinante no es modificada cuando se expresa en Pichia pastoris. La expresión de genes de mamífero en Pichia generalmente da como resultado la formación de una estructura de proteína correcta [Cregg et al.,Bio/Technology, 11:905-914 (1993)]. Estos descubrimientos sugieren que la proteína OB no es glicosilada y no es procesada posttranslacionalmente in vivo. Los datos no excluyen la posibilidad de que la proteína OB esté unida no covalentemente a sí misma o a otras proteínas en el plasma o en el tejido adiposo. Si bien la división proteolítica de la proteína no ha

15 sido excluida, no se detectó formas de peso molecular menor de la proteína OB mediante ninguno de los antisueros usados, incluyendo los cuatro anticuerpos anti-péptido.

La proteína OB tiene dos residuos de cisteína y circula como un monómero en los seres humanos y como un monómero y un dímero en los ratones. Una unión disulfuro intramolecular, típica de las moléculas secretadas, se encuentra cuando se expresa la proteína humana en Pichia pastoris, lo que sugiere que es probable que esté 20 presente in vivo. Esto es apoyado por la bioactividad de la proteína bacteriana recombinante, que tiene una unión disulfuro intramolecular. Se puede encontrar la proteína OB de ratón en el plasma como un monómero y como un dímero. El monómero y el dímero se ven cuando se expresa la proteína OB de ratón en levadura, lo que muestra la propensión de la proteína de ratón a formar un dímero que es un resultado de las diferencias en la secuencia primaria con respecto a la humana. Si bien está claro que el monómero tiene bioactividad, la actividad funcional del

25 dímero se desconoce.

El efecto de la proteína OB sobre la ingestión de alimento y el peso corporal en ratones ob es dramático. Después de tres semanas de tratamiento, los ratones ob que recibieron inyecciones diarias de proteína recombinante habían perdido el 40% de su peso y estaban consumiendo el 40% de alimento que los animales de control. Además, el peso de los ratones ob tratados todavía no se había equilibrado en el momento en que se dio por terminado el

experimento. Los resultados del experimento de alimentación por pares indica que la pérdida de peso es el resultado de los efectos tanto de la ingestión de alimento como del gasto de energía. Por tanto, un grupo separado de ratones ob, cuya ingestión calórica estaba restringida con respecto a la de los ratones ob que recibieron proteína, perdió significativamente menos peso que los animales que recibieron proteína. La reducción en la ingestión de alimento en los ratones ob/ob, a un nivel inferior al de los ratones de tipo natural, en el término de un día después de recibir la proteína OB, indica que son especialmente sensibles a sus efectos. En realidad, el receptor OB puede ser regularizado en esos animales. La ingestión de alimento en los ratones ob tratados se volvió relativamente constante después de cinco días de tratamiento. Si este es el resultado de la proteína que había alcanzado niveles de estado sostenido, se sugiere que la proteína tiene una media vida relativamente prolongada [The Pharmacological Basis of Therapeutics, páginas 19-45, Goodman and Gilman, eds., Pergamon Press, Nueva York, (1990)]. Esta conclusión es consistente con los datos de experimentos de parabiosis [Coleman et al., 1978, citado anteriormente; Weigle, Int. J. Obesity, 12:567-578 (1988)].

Los efectos de la proteína recombinante sobre el peso corporal de los ratones de tipo natural fueron pequeños pero estadísticamente importantes durante las primeras dos semanas del estudio. Si bien la diferencia de peso entre los ratones de tipo natural que reciben proteína contra PBS se sostuvo en puntos de tiempo posteriores, el significado estadístico de los datos disminuyó grandemente después de las tres semanas. La pérdida de peso temprana no pudo tomarse en cuenta mediante una diferencia en la ingestión de alimento. Presumiblemente, la medición de la ingestión de alimento no fue precisa en medida suficiente para detectar una disminución que diera como resultado una diferencia de 1 g en el peso corporal durante el tratamiento. Estas observaciones difieren de los resultados de los experimentos previos en los que los roedores de tipo natural habían sido unidos mediante una unión parabiótica a ratones db, a ratones fa, ratones con lesiones hipotalámicas y ratas que se hicieron obesas mediante una dieta de elevado contenido de calorías [Coleman et al., 1978, citado anteriormente; Harris et al., 1987, citado anteriormente; Harris et al., “Physiological and metabolic changes in parabiotic partners of obese rats”, in Hormones, Thermogenesis and Obesity, Lardy y Straatman, eds., Elsevier Science Publishing Co., Nueva York (1989); Hervey,

J. Physiol., 145:336-352 (1959)]. En cada caso, los animales de tipo natural se volvieron anoréxicos y perdieron cantidades copiosas de peso. Conforme se incrementa el nivel de proteína OB en los ratones db y en ratas fa, y se incrementa el nivel de ARN de OB en los ratones con lesiones hipotalámicas, es probable que los ratones de tipo natural puedan responder a OB cuando circula en el plasma a un nivel suficientemente alto. Los hallazgos informados aquí son consistentes con la posibilidad de que los niveles de proteína administrada fueran inferiores a los niveles endógenos, lo que daría como resultado el equilibrio a un peso corporal ligeramente inferior. La cuantificación de los niveles circulantes de proteína OB en ratones tratados resolverá este problema. Si bien un inmunoanálisis de la proteína de ratón todavía no está disponible, las inmunoprecipitaciones han sugerido que los niveles de proteínas OB circulantes no se elevaron sustancialmente en los ratones de tipo natural, que recibieron proteína.

El efecto menor de la proteína sobre ratones de tipo natural y la ausencia de una respuesta en ratones db, hizo improbable que el tratamiento tuviese efectos no específicos o adversos. Todos los ratones db perdieron una cantidad pequeña de peso durante el período de tratamiento, recibieran o no la proteína ob. Los animales de db fueron notablemente hiperglicémicos y la pérdida de peso probablemente sería el resultado de la diabetes y no del protocolo experimental. Los ratones C57BL/Ks db/db frecuentemente desarrollan diabetes y comienzan a perder pequeñas cantidades de peso cuando son de la edad de los animales usados en este estudio (Coleman et al., 1978, citado anteriormente). Los ratones C57Bl/6J ob/ob de una edad similar no desarrollan hiperglicemia importante. Estas diferencias fenotípicas se cree que son el resultado de las diferencias genéticas en las cepas (C57B/6J vs C57Bl/Ks) que llevan las mutaciones (Coleman et al., 1978, citado anteriormente).

La falta de detección de la proteína de 105 aminoácidos truncada, predicha por la secuencia ADNc del gen OB en ratones C57B1/6J ob/ob, sugiere que la proteína mutante está o bien degradada o bien no traducen. Sin embargo, la posibilidad de que los antisueros usados no detecten esta proteína truncada no puede excluirse. El incremento observado al décuplo en los niveles de la proteína ob en ratones db, en comparación con el tipo natural, sugiere que la proteína ob es producida en exceso cuando hay resistencia a sus efectos. Estos datos se correlacionan con estudios del ARNm de OB. Tal como se mencionó, los experimentos previos han mostrado que las mutaciones de los genes db de ratón y fa de rata, que se mapean a regiones cromosómicas análogas, dan como resultado la producción excesiva de un factor de plasma que suprime el peso corporal (Truett et al., 1991, citado anteriormente; Coleman, 1978, citado anteriormente; Hervey, 1959, citado anteriormente). En ambos casos se ha sugerido que los animales mutantes son resistentes a los efectos de la proteína OB. Esta posibilidad se confirma por la observación de que la proteína OB no tiene efecto sobre el peso corporal ni sobre la ingestión de alimento, cuando se administra a ratones db.

La obesidad en los seres humanos podría estar asociada con niveles incrementados de proteína OB en el plasma en individuos que no responden relativamente a la hormona. Por otra parte, la expresión reducida de OB podría conducir también a la obesidad, en cuyo caso se podría encontrar niveles “normales” (es decir, inapropiadamente bajos) de la proteína. Por tanto, los niveles de la proteína OB en el plasma humano podría ser un marcador para formas diferentes de obesidad. En un grupo pequeño de sujetos magros con IMC <25, son detectables mediante ELISA niveles de pocos nanogramos de proteína OB circulante. Significativamente, se observaron concentraciones variables lo que sugiere que el nivel de expresión y/o sensibilidad de la proteína pueden jugar un papel en la determinación del peso corporal.

El sitio de acción de la proteína OB se desconoce. La proteína afecta tanto la ingestión de alimento como el gasto de energía, un descubrimiento que es consistente con los estudios clínicos que indican que las alteraciones de ambos sistemas actúan para regular el peso corporal [Leibel et al., N. Engl. J. Med., 332:621-628 (1995); Keesey et al., “Metabolic defense of the body weight set-point”, in Association for Research in Nervous and Mental Disease, páginas 87-96, Stunkard and Stellar, eds., Raven Press, Nueva York. (1984)]. Es probable que el hipotálamo esté en el sentido de 3’ de OB en la trayectoria que controla el peso corporal, si bien son posibles los efectos directos sobre una variedad de órganos.

EJEMPLO 9: EXPRESIÓN INCREMENTADA EN ADIPOCITOS DE ARN DE OB EN RATONES CON LESIONES DEL HIPOTALAMO Y CON MUTACIONES EN EL SITIO db

El producto génico de los genes obesos de ratón recién clonados (OB) juega un papel importante en regular la masa de tejido adiposo. Se expresa ARN de OB específicamente mediante adipocitos de ratón in vivo en cada uno de varios depósitos de células grasas diferentes, incluyendo grasa parda. También se expresa en células preadipocípticas 3T3-442A cultivadas, que han sido inducidas a diferenciarse. Los ratones con lesiones del hipotálamo, así como los ratones mutantes en el sitio db, expresan un nivel veinte veces superior de ARN de OB en el tejido adiposo. Estos datos sugieren que tanto el gen db como el hipotálamo están en el sentido de 3’ del gen OB en la trayectoria que regula la masa de tejido adiposo y son consistentes con los experimentos previos que sugieren que el sitio db codifica el receptor OB. En los ratones db/db y lesionados, las diferencias cuantitativas en el nivel de la expresión de ARN de OB se correlacionaron con el contenido de lípidos de los adipocitos. Las moléculas que regulan el nivel de expresión del gen OB en los adipocitos probablemente juega un papel importante en determinar el peso corporal, al igual que las moléculas que median los efectos de OB en su sitio de acción.

MATERIALES Y MÉTODOS

Hibridación in situ

Se procesaron simultáneamente tejidos grasos blancos procedentes de regiones abdominales idénticas de ratones de tipo natural (wt) y db, según el método modificado de Richardson et al., Growth, Development & Aging, 56:149157 (1992). En resumen, se fijaron tejidos en disolución de Bouin durante dos horas a 4ºC. Se deshidrataron los tejidos mediante tratamiento en serie de concentraciones cada vez mayores de etanol desde el 10% hasta el 100%, cada una durante 5 minutos a 4ºC. Se efectuó la incubación adicional de los tejidos con xileno (1 h) y parafina (2 h) a 65ºC. Los tejidos grasos de wt y db/db embebidos fueron seccionados y montados mediante las mismas condiciones posteriormente. Se hornearon las secciones a 65ºC durante una hora y se trataron con xileno y diluciones en serie de etanol desde el 100% hasta el 50%, cada una durante 3 minutos, a temperatura ambiente. Se sintetizó una sonda de ARN antisentido del gen OB mediante transcripción in vitro de la secuencia codificante de gen OB linealizada, en el sentido de 3’ de un promotor de polimerasa de ARN Sp6. Se llevó a cabo la hibridación in situ exactamente según Schaeren-Wiemers, et al., Histochemistry, 100:431-440 (1993).

PREPARACIÓN DE ARN Y CULTIVO DE CÉLULAS

Se prepararon ARN total y transferencias de tipo de Northern, tal como se describió. Se prepararon células vasculares estromales y adipocitos, según Rodbell, y ARN de fracciones preparadas según Dani et al., Mol. Cell Endocrinol., 63:199-208 (1989); Rodbell, J. Biol. Chem. 239:375-380 (19 ). Después de subclonar se desarrolló células 3T3-F442 en un medio Eagle modificado de Dulbecco, que contenía suero bovino fetal al 10% (definido como medio convencional) [Dani et al., “Molecular biology techniques in the study of adipocyte differentiation”, in Obesity in Europe, Vol. 88, páginas 371-376, Bjorntorp and Rossner, Eds., John Libbey Company Ltd., Londres, Inglaterra (1989)]. Se trataron las células en la confluencia en el medio convencional complementada con triiodotironina 2 nM (T3) y insulina 17 nM. Doce días después se prepararon el ARN tal como anteriormente.

TRATAMIENTO CON TIOGLUCOSA DE ORO (GTG)

Se trataron ratones CBA/J hembras, de dos meses de edad, con una sola inyección intraperitoneal de aureotioglucosa (número de catálogo Sigma A0632) a una dosis de 0,2 mg/g en solución salina normal. Se les inyectaron a los animales de control con solución salina normal. Se pesaron los ratones un mes después del tratamiento. Se aisló el ARN de tejido adiposo de los animales tratados cuyo peso había aumentado más de 20 g después del tratamiento con GTG.

RESULTADOS

Se encontró recientemente que el gen OB era expresado en el tejido adiposo [Zhang et al., Nature, 372:425-432 (1994)]. Como el tejido adiposo está compuesto de muchos tipos de células, que incluyen adipocitos, preadipocitos, fibroblastos y células vasculares, se llevó a cabo la hibridación in situ a secciones de almohadillas de grasa de epididimo procedentes de animales normales, con ribosondas OB sentidos y antisentidos [Richardson et al., 1992, citado anteriormente; Wasserman, “The concept of the fat organ” in Rodahl, Issekutz, fat as a tissue”, páginas 22-92, McGraw Hill, Nueva York (1964)]. Cuando se usa la sonda anti-sentido, las señales positivas fueron detectables en todos los adipocitos de la sección (figura 30 - marcado Wt). No se observó señales cuando se hibridó la sonda antisentido a las secciones de cerebro (datos no mostrados) la hibridación de la sonda anti-sentido a secciones de tejido

adiposo de ratones C57Bl/Ks db/db, aumentó grandemente, lo que confirma la expresión específica a los adipocitos del ARN de OB, y demuestra el gran incremento en el nivel de ARN de OB por adipocito en esos animales (figura 30

-: marcado db/db). Los ratones mutantes en el sitio db son masivamente obesos, aparte del síndrome que es genotípicamente idéntico al que se ve en los ratones C57B1/6J ob/ob (Bahary et al., 1990, citado anteriormente).

5 No se sintetizó el ARN de OB por células estromales del tejido adiposo separadas de los adipocitos. Tal como se esperaba, las células en la fracción de adipocito expresaron el ARN de OB utilizando transferencias de tipo de Northern (figura 31). Se obtuvo el mismo resultado utilizando RT-PCR (no se muestran los datos). Estos datos apoyan la conclusión de que solamente los adipocitos expresan el gen OB. Los datos de los adipocitos cultivados confirman esta conclusión. En esos estudios, se cultivaron células 3T3-F442A utilizando condiciones que dan como

10 resultado la acumulación de lípidos, como parte de un programa celular que conduce a la diferenciación a adipocitos. No se expresó el ARN de OB en células que se desarrollaron exponencialmente, ni en células de preadipocito 3T3-F442A confluentes, que expresan marcadores tempranos, mientras que la diferenciación de estas células a adipocitos condujo a la expresión de niveles detectables de ARN de OB (figura 31 ) [Dani et al., J. Biol. Chem., 264:10119-10125 (1989)]. El nivel de ARN de OB es extremadamente sensible a las condiciones de cultivo,

15 ya que no se observa ningún mensaje en las células post-confluentes tardías, no expuestas a la insulina.

Los estudios de hibridación mostraron que se expresa el ARN de OB in vivo en varios depósitos diferentes de grasas, que incluyen las almohadillas de grasa del epididimo, parametrial, abdominal, perirrenal e inguinal (figura 32A). El nivel preciso de expresión en cada uno de los depósitos fue un tanto variable, expresando la grasa inguinal y parametrial niveles inferiores de ARN de OB. También se expresa el ARN de OB en el tejido adiposo café, si bien 20 el nivel de expresión es aproximadamente 50 veces menor en grasa parda con respecto a otros depósitos de tejido adiposo. Esas diferencias cuantitativas se correlacionan flojamente con diferencias informadas previamente en el tamaño de las células entre los diferentes depósitos de células grasas [Johnson et al., J. Lipid Res., 13:2-11 (1972)]. La cantidad de ARN de OB en la grasa parda no es afectado por la exposición al frío (figura 32B). En este experimento, el nivel de ARN de proteína no acopladora (UCP) aumentó en la grasa parda después de la exposición

25 al frío, mientras que el nivel de ARN ob no cambió [Jacobsson et al., J. Biol. Chem., 260:16250-16254 (1985)]. Adicionalmente, estos datos confirman que todos los adipocitos pueden producir ARN de OB, y demuestran un nivel variable de expresión en diferentes depósitos de grasa. Estos datos apoyan la posibilidad de que el nivel de la proteína codificada se correlacione con la masa de tejido adiposo total.

Los niveles de ARN de OB en ratones de db/db y en ratones con lesiones del hipotálamo fueron medidas. Las

30 lesiones del hipotálamo ventromedial (VMH) dieron como resultado obesidad como parte de un síndrome que se parece al que se observa en los ratones ob/ob y db/db [Bray et al. Metabolism, 24:99-117 (1975)]. Los experimentos de parabiosis sugieren que dichas lesiones dan como resultado la expresión excesiva del factor llevado en la sangre que suprime la ingestión de alimento y el peso corporal (Hervey, 1959, citado anteriormente). Se observó resultados similares cuando se parabiosaron ratones mutantes en el sitio db con ratones normales, lo que sugiere que el

35 receptor OB puede ser codificado por el sitio db (Coleman et al., 1978, citado anteriormente). Por tanto, la obesidad que resulta de lesiones del VMH y la mutación de db pueden ser el resultado de la resistencia a los efectos de la proteína OB. De ser así, podría predecirse un incremento secundario en los niveles de ARN de OB en el tejido adiposo.

Se indujeron lesiones hipotalámicas en ratones CBA hembras utilizando tioglucosa de oro química (GTG) [Debons et

40 al., Fed. Proc., 36:143-147 (1977)]. Este tratamiento da como resultado lesiones hipotalámicas específicas, principalmente en el hipotálamo ventromedial (VMH), con desarrollo posterior de obesidad en el término de pocas semanas usualmente, una sola inyección intraperitoneal de GTG de 0,2 mg/g de peso corporal, da como resultado el desarrollo de obesidad en el término de cuatro semanas. Se trataron ratones CBA/J hembras, de un mes de edad (de 20 a 25 g) con GTG y se mostró la ganancia de peso posterior de los animales tratados y de control, en la tabla

45 2. Se preparó el ARN de tejido adiposo a partir de ratones db/db y a partir de aquellos animales tratados con GTG que ganaron más de 20 g. Las transferencias de tipo de Northern mostraron un aumento de veinte veces el nivel de ARN de OB en los ratones db/db de dos meses de edad y en los ratones tratados con GTG, en comparación con los animales normales (figura 33).

TABLA 2 AUMENTO DE PESO EN RATONES TRATADOS CON TIOGLUCOSA DE ORO

control (n=41) GTG (n=93)

< 10 g 41,0 (100%) 4,0 (4%)

10 g-20 g 0,0 (0%) 15,0 (16%)

> 20 g 0,0 (0%) 74,0 (80%)

Se trataron ratones CBA/J hembras, de dos meses de edad, con tioglucosa de oro (GTG). Se administró intraperitonealmente tioglucosa de oro (Sigma A0632) en solución salina normal, a una dosis de 2,0 mg/g. Se registró el peso corporal de animales de control e inyectados antes de la inyección y un mes después de ella. Se

alojaron los animales de cinco en una jaula y se alimentaron a voluntad. Se muestra en la tabla 2 la cantidad de peso aumentado un mes después de la inyección. Se seleccionó para estudios adicionales los animales con un aumento de peso corporal de más de 20 g a un mes después de la inyección.

DISCUSIÓN

El producto de gen del gen OB de ratón circula en el plasma de ratón y ser humano donde puede actuar para regular la masa de tejido adiposo. Otros estudios acerca de la regulación y expresión del mecanismo de acción de OB tendrán implicaciones importantes para que se pueda comprender la trayectoria fisiológica que regula el peso corporal.

El presente ejemplo muestra que el producto de gen OB se expresa exclusivamente por adipocitos en todos los depósitos de tejido adiposo. Este resultado concuerda con la posibilidad de que el producto de proteína del gen OB se correlacione con los almacenes de lípidos en el cuerpo. Además, se regula en sentido ascendente el ARN de OB veinte veces en ratones db y en ratones con lesiones hipotalámicas. En esos animales, el incremento real de ARN de OB por célula probablemente es todavía mayor que veinte veces, dado que el tamaño de la célula de adipocito aumenta aproximadamente cinco veces en esos animales (véase la figura 30) (Debons et al., 1977, citado anteriormente). Esos datos colocan al gen db y al hipotálamo en el sentido de 3’ de OB en la trayectoria que controla el peso corporal, y concuerda con la hipótesis de que el receptor de OB es codificado en el sitio db [Coleman et al., Diabetologia 14:141-148 (1978)]. La clonación molecular del receptor de OB y/o del gen db resolverán este problema. El incremento en el nivel de ARN de OB en ratones db/db y en ratones tratados con GTG, sugiere también una función no autónoma de la célula del producto de gen OB en las células grasas [Ashwell et al., Proc. R. Soc. Lond., 195-343-353 (1977); Ashwell et al., Diabetologia, 15:465-470]. Por tanto, si la proteína codificada actuara directamente sobre las células grasas para inhibir el desarrollo o la diferenciación, la expresión excesiva del gen OB del tipo natural en ratones tratados con GTG daría como resultado un fenotipo magro.

La explicación más parsimoniosa de estos datos es que la proteína OB funciona como una molécula de señalización endocrina que es secretada por los adipocitos y actúa, directa o indirectamente, sobre el hipotálamo. Los efectos directos sobre el hipotálamo requerirían que existieran mecanismos para permitir el etapa del producto del gen OB a través de la barrera sangre/cerebro. Los mecanismos que implican transportadores circunventriculares de órgano y/o específicos podrían permitir el acceso al cerebro de una molécula del tamaño de la que es codificada por el gen OB [Johnson et al., FASEB J., 7:678-686 (1983); Baura et al., J. Clin. Invest., 92:1824-1830 (1993); Pardridge, Endocrine Reviews, /:314-330 (1986)]. Sin embargo, esta hipótesis debe ser considerada con cautela hasta que se haya identificado el medio mediante el cual la proteína pudiera cruzar la barrera sangre/cerebro. Además, es necesario evaluar los posibles efectos sobre otros órganos de destino.

La/las señal(es) de célula grasa que son responsables de la variación cuantitativa en el nivel del gen OB todavía se desconocen, pero se correlacionan con diferencias en el tamaño de la célula de adipocito. Los adipocitos de ratones db/db son cinco veces mayores que las de los ratones normales, con un tamaño de célula de aproximadamente 1,0 !g de lípido/célula (Johnson et al., 1972, citado anteriormente). La evidencia previa ha indicado que el contenido de lípido en la célula grasa y/o el tamaño es un parámetro importante para determinar el peso corporal [Faust et al., Am.

J. Physiol., 235:279-286 (1978); Faust et al., Science, 197:393-396 (1977)]. Se podría decir que cada célula grasa expresa un nivel bajo de ARN de OB que aumenta adicionalmente en proporción con el tamaño de la célula. También es posible que el tamaño de la célula no sea el parámetro percibido, sino que simplemente se correlacione con la señal intracelular que incrementa la expresión del gen OB en los adipocitos de ratones db/db y con lesiones en el VNH. En cualquier caso, los componentes de la trayectoria de la transducción de la señal que regula la síntesis de ARN de OB probablemente son importantes para determinar el peso corporal. Las influencias genética y ambiental que reducen el nivel de expresión de OB actuarían para aumentar el peso corporal, como las influencias que disminuirían la sensibilidad a la proteína codificada. Las moléculas específicas que regulan el nivel de expresión del gen OB todavía se desconocen, y están en espera de una determinación del nivel o los niveles de control de gen que conducen a la variación cuantitativa en el nivel de ARN de OB y a un examen de los elementos tampones del gen OB. La identificación de las moléculas que regulan la expresión del gen OB en los adipocitos, y las que median el efecto de la proteína codificada en el sitio o sus sitios de acción, aumentará grandemente la comprensión de los mecanismos fisiológicos que regulan el peso corporal.

EJEMPLO 10: PATRÓN DE EXPRESIÓN Y MAPEO DE ARN EN LOS MAPAS FISICO, CITOGÉNICO Y GENETICO DEL CROMOSOMA 7

Se expresa ARN de OB a niveles alto en el tejido adiposo humano, y sustancialmente a niveles inferiores en la placenta y el corazón. El gen OB humano forma mapa para un cromosoma artificial de levadura (YAC), grande, derivado del cromosoma 7q31,3. Además de confirmar la ubicación relativa del gen, con base en el mapa comparativo de ratón-ser humano, este estudio ha identificado ocho marcadores microsatelitales establecidos en proximidad física íntima con el gen OB humano. Dado que las mutaciones en OB de ratón pueden dar como resultado un síndrome que se parece mucho a la obesidad mórbida en los seres humanos, estos marcadores genéticos representan herramientas importantes para estudiar el posible papel del gen OB en las formas heredadas de obesidad humana.

MATERIALES Y METODOS

Análisis de transferencia de tipo Northern

Se preparó ARN total a partir del tejido adiposo utilizando el método de Chirgwin et al., Biochem., 18:5294-5299 (1979). Se llevaron a cabo transferencias de tipo Northern, radiomarcaje e hibridaciones, tal como se describió

5 (Zhang et al., 1994, citado anteriormente). Las transferencias de Northern de ARN de poliA+ (MTN humano, MTN II humano y MTN II fetal humano) se obtuvieron de CLONETECH (Palo Alto, CA), al igual que los cebadores de PCR, utilizados para generar la sonda de actina humana, radiomarcada.

Desarrollo de STS

Se desarrollaron ensayos de PCR específicos para el sitio marcado en la secuencia (STS) y se los optimizó

10 esencialmente tal como se describió [(Gree et al., PCR Methods Applic., 1991; Green et al., Genomics, 11:548-564 (1991); Green, “Physical mapping of human chromosomes: generation of chromosome-specific sequence-tagged sites”, en Methods in Molecular Genetics, Vol. 1, Gen and Chromosome Analysis (Part A), páginas 192-210, Adolph ed., Academic Press, Inc., San Diego (1993); Greet et al., Hum. Mol. Genet., 3:489-501 (1994)]. Cada STS es nombrado utilizando el prefijo “sWSS” seguido por un número único. Los detalles acerca de los 19 STS informados

15 aquí están dados en la tabla 3, con información adicional (por ejemplo, las condiciones de reacción de PCR, la secuencia completa de ADN), obtenibles de GenBank y/o de la base de datos de Genoma (GDB). Para los STS específicos al microsatélite, los cebadores de oligonucleótido usados en los análisis de PCR (tabla 3) corresponden a los empleados en el análisis de genotipo (tabla 4) o los designados (muy frecuentemente con el programa informático OSP) [Hillier et al., PCR Methods Applic., 1:124-128 (1991)] utilizando la secuencia de ADN obtenible de

20 GenBank. La tabla 3 ilustra los STS en el contig YAC que contiene el gen OB humano.

TABLA 3

Nombre de STS Alias Locus Fuente Cebadores de PCR Tamaño (pb) SEQ ID NO: GDB ID No.

sWSS1734 D7S2185 Extremo de CAAGACAAATGAGATAAGG 72 39G00-455-235YAC AGAGTTACAGCTTTACAG 40

sWSS494 D7S2016 Clon Lambda CTAAACACCTTTCCATTCC 112 41G00-334-404

TTATATTCACTTTTCCCCTCTC 42

sWSS883 UT528 D7S1498 Marcador TGCAGTAAGCTGTGATTGAG 490 43G00-455-262genético GTGCAGCTTTAATTGTGAGC 44

sWSS2359 AFMa065zg9 D7S1873 Marcador AGTGTTGTGTTTCTCCTG142 45G00-455-247genético AAAGGGGATGTGATAAGTG 46

sWSS2336 AFMa125wh1 D7S1874 Marcador GGTGTTACGTTTAGTTAC112 47G00-455-244genético GGAATAATGAGAGAAGATTG 48

sWSS1218 AFM309yfl D7S680 Marcador GCTCAACTGACAGAAAAC 154 49G00-307-733genético GACTATGTAAAAGAAATGCC 50

sWSS1402 D7S1916 Extremo de AAAGGGCTTCTAATCTAC137 51G00-344-044YAC CCTTCCAACTTCTTTGAC 52

sWSS999 D7S1674 Inserto de YAC TAAACCCCCTTTCTGTTC105 53G00-334-839

TTGCATAATAGTCACACCC 54

sWSS1751 d7S2186 Extremo de CCAAAATCAGAATTGTCAGAAG 186 55G00-455-238YAC AAACCGAAGTTCAGATACAG 56

sWSS1174 AFM218xfl0 D7S514 Marcador AATATCTGACATTGGCAC144 57G00-307-700genético TTAGACCTGAGAAAAGAG 58

sWSS2061 D7S2184 Extremo de GTTGCACAATACAAAATCC200 59G00-455-241YAC CTTCCATTAGTGTCTTATAG 60

sWSS2588 D7S2187 Extremo de ATCACTACACACCTAATC117 61G00-455-253YAC CCATTCTACATTTTTCCACC

sWSS808 Pax-4 PAX4 Gen GGCTGTGTGAGCAAGATCCTAGGA153 63G00-455-259 TTGCCAGGCAAAGAGGGCTGGAC 64

sWSS1392 AFM206xc1 D7S635 Marcador CTCAGGTATGTCTTTATC75 65G00-307-815genético TGTCTCTGCATTCTTTTC 66

sWSS1148 AFM199xh12 D7S504 Marcador ACACATACAAACACAAG 60 67G00-307-652genético ATTGAGTTGAGTGTAGTAG 68

sWSS1529 D7S1943 Extremo de CAGGGATTTCTAATTGTC116 69G00-334-119YAC AAAAGATGGAGGCTTTTG 70

sWSS2619 OB OB Gen CGTTAAGGGAAGGAACTCTGG 106 71G00-455-256 TGGCTTAGAGGAGTCAGGGA 72

sWSS404 D7S1956 Clon Lambda ACCCAGGGTCAATACAAAG 122 73G00-334-251 TAATGTGTCCTTCTTGCC 74

sWSS2367 AFMa345wc9 D7S1875 Marcador CAATCCTGGCTTCATTTG81 75G00-455-250genético AAGGTGGGTAGGATGCTA 76

Los 7 STS específicos del cromosoma 19, mapeados para el contig YAC que contiene el gen OB humano (figura 35) están enumerados. En cada caso, se indica el nombre “sWSS” designado, el alias relevante, el nombre del sitio asignado a GDB, la fuente de STS, las secuencias de cebador de PCR, el sitio de STS y el número de identificación de GDB. Las fuentes de identificación de STS son las siguientes: “extremo YAC” (extremo de inserto aislado de un 5 YAC) (Green, 1993, citado anteriormente); “Clon lambda” (clon lambda 7-específico del cromosoma aleatorio) (Green et al., 1991, citado anteriormente; Green, 1993, citado anteriormente); “Marcador Genético” (marcador microsatelital, véase tabla 2) (Green et al., 1994, citado anteriormente); “Inserto de YAC” (segmento aleatorio de inserto de YAC); y “Gen” (STS específico al gen). Nótese que para algunos STS específicos para el marcador genético, los cebadores de PCR utilizados para identificar los YAC (enumerados en este tabla) son diferentes de los

10 que se utilizaron para efectuar el análisis de genotipo (tabla 4) puesto que la detección de los YAC que contienen un marcador genético no requiere la amplificación del propio tractopolimórfico. Todos los análisis de PCR indicados utilizaron una temperatura de recocción de 55ºC, excepto para sWSS494, sWSS((n.º; sWSS1529 y sWSS2619 (que utilizaron 50ºC), sWSS999 y sWSS1174 (que utilizaron 60ºC) y sWSS808 (que utilizó 65ºC). Otros detalles con respecto a los análisis de PCR específicos para STS están disponibles en GDB.

TABLA 4

MARCADORES MICROSATELITALES EN CÓNTIGO DE YAC QUE CONTIENE EL GEN ob HUMANO

Nombre del Tipo Locus Cebadores SEQ ID NO: GDB ID No.

Marcador

UT528 Tetra D7S1498 TGCAGTAAGCTGTGATTGAG 77G00-312-446 GTGCAGCTTTAATTGTGAGC 78 AFMa065zg9 (CA) D7S1873A GCTTCAAGACTTTNAGCCT 79G00-437-263nGGTCAGCAGCACTGTGATT 80 AFMa125 wh1 (CA) D7S1874 TCACCTTGAGATTCCATCC 81G00-437-253

n

AACACCGTGGTCTTATCAA 82 AFM309yf10 (CA) D7S680 CATCCAAGTTGGCAGTTTTT 83G00-200-283

n

AGATGCTGAATTCCCAGACA 84 AFM218xf10 (CA) D7S514 TGGGCAACACAGCAAA 85G00-188-404

n

TGCAGTTAGTGCCAATGTCA 86 AFM206xc1 (CA) D7S635 CCAGGCCATGTGGAAC87G00-199-240

n

AGTTCTTGGCTTGCGTCAGT 88 AFM199xh12 (CA) D7S504 TCTGATTGCTGGCTGC89G00-188-280

n

GCGCGTGTGTATGTGAG 90 AFMa345wc9 (CA) D7S1875 AGCTCTTGGCAAACTCACAT 91G00-437-259

n

GCCTAAGGGAATGAGACACA 92

Los ocho marcadores microsateliteados mapeados al cóntigo de YAC que contiene el gen OB humano (figura 35). En cada caso, se indica el nombre del marcador (indicado como el alias en la tabla 3), el tipo de motivo de microsatélite (repitiente tetranucleótido- “Tetra” o repitiente de (CA)n), el nombre del sitio asignado a GDB, las secuencias de cebador utilizadas para el análisis del genotipo a base de PCR y los números de identificación de GDB. Otros detalles con respecto a los análisis de PCR y los polimorfismos están disponibles en GDB.

Se designó STS específico a OB humano (sWSS2619), utilizando la secuencia de ADN obtenida de la región 3' no traducida del ADNc. Se desarrolló el STS específico para Pax4 humano (sWSS808) utilizando la siguiente estrategia. Se utilizaron cebadores de oligonucleótido específicos para el gen Pax4 de ratón (GGCTGTGTGAGCAAGATCCTAGGA) (SEQ ID NO: 63) y (GGGAGCCCTTGTCCTGGGTACAAAG) (SEQ. ID NO: 93) [Walther et al., 1991, Genomics 11:424-434) (1991)] para amplificar un fragmento de 204 pares de bases del ADN genómico humano (que tenía el producto del mismo tamaño que el generado del ADN genómico de ratón). Este análisis de PCR no estuvo disponible para identificar los YAC correspondientes, puesto que también se amplificó a partir de ADN de levadura un producto de tamaño similar (200 pares de bases). Sin embargo, el análisis de la secuencia de ADN, del producto PCR generado a partir de ADN humano, reveló sustituciones en las posiciones 20 entre las 156 bases analizadas (datos no mostrados). Utilizando esta secuencia específica al humano, se diseñó un nuevo cebador (TTGCCAGGCAAAGAGGGCTGGAC) y se utilizó con el primero de los cebadores específicos para Pax4 de ratón, anteriores (véase la tabla 3). El análisis de PCR específico para Pax4 humano, resultante, no amplificó un producto significativo a partir de ADN de levadura y, de tal manera, se utilizó para identificar los YAC correspondientes.

Identificación de los YAC mediante selección a base de PCR

La mayor parte de los YAC representados en la figura 35 se derivaron de una colección de clones fuertemente enriquecidos para el ADN del cromosoma 7 humano (el recurso “YAC de cromosoma 7”) (Greena et al., 1995, citado anteriormente) utilizando una estrategia de selección a base de PCR (Greena et al., 1990, citado anteriormente). En unos cuantos casos se aisló los clones mediante selección a base de PCR (Greena et al., 1990, citado anteriormente) de bibliotecas de YAC genómicos humanos, totales, disponibles, construidos en CEPH [Dausset et al., Behring Inst. Mitt. 91:30-20 (1992); Albertsen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:4256-4260 (1990)] o ICI [Anand et al., Nucl. Acids Res., 17:3425-3433 (1989); Anand et al., Nucl. Acids Res. 18: 1951-1956 (1990)]. Cada YAC está nombrado utilizando el prefijo “yWSS” seguido por un número único.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

El examen de la expresión en tejido del gen OB humano mediante análisis de la transferencia de tipo Northern reveló que se expresa el ARN de OB a un nivel elevado en el tejido adiposo humano y a niveles mucho menores en la placenta y el corazón (figura 34). El tamaño del ARN (aproximadamente 4,5 kb) fue equivalente en el humano y en los ratones así como en cada uno de los tejidos de expresión. En estos estudios se vio señales cinco veces más altas en 10 !g de ARN de tejido adiposo total, que en 2 !g de ARN placental poliA+. Se vio una señal cinco veces menor en ARN de poliA+ del corazón, en comparación con la placenta. Se estima que el nivel de ARN de OB es aproximadamente 250 veces menor en la placenta que en el tejido adiposo. En este experimento, no se detectó ARN de OB en ninguno de los demás tejidos analizados, incluyendo tejidos de cerebro, de pulmón, de hígado, de músculo esquelético, de riñón y de páncreas. Otros experimentos no revelaron ARN de OB en el bazo, el timo, la próstata, los testículos, los ovarios, el intestino delgado, el colon, en los leucocitos de sangre periférica ni en el cerebro fetal, el hígado ni los riñones fetales (datos no mostrados). Es posible que se exprese OB a un nivel indetectable (mediante el análisis de la transferencia de tipo Northern) en estos últimos tejidos, o en otros tejidos que no fueron estudiados. El patrón de expresión observado en los seres humanos difiere un tanto del observado en los ratones, en donde se detecta el ARN de OB casi exclusivamente en el tejido adiposo.

Mapeo comparativo de la región del gen OB en los genomas de ratón y ser humano. El gen OB de ratón está situado en el cromosoma 6 próximo en una región homóloga con una región del cromosoma 7q humano. Los genes dentro de este segmento incluyen (a partir del extremo próximo al extremo distal). El protooncógeno Met; el tampón de conductancia en la transmembrana de fibrosis cística (Cftr), el gen 4 que contiene la casilla apareada (Pax4) OB y carboxipeptidasa A (Cpa) (Zhang et al., 1994, citado anteriormente; Friedman et al., 1991, citado anteriormente). En los ratones, se utilizó el mapeo genético para demostrar que Pax4 está enlazado fuertemente a ob [Walther et al., 1991, citado anteriormente; Zhang et al., 1994, citado anteriormente]. Se encontró que la distancia máxima entre OB y Pax4 era aproximadamente de un mega de pares de bases (Mb) (Zhang et al., 1994, citado anteriormente). Con base en los estudios de mapeo comparativo era de esperar que el gen OB humano residiera entre Pax4 y CPA en el cromosoma 7q. Además, puesto que se mapeó CFTR humano [Heng et al., Cell Genet., 62:108-109 (1993)] y Pax4 [Tamura et al.; Cytogenet. Cell. Genet. 66:132-134 (1994)], mediante fluorescencia, la hibridación in situ (FISH) a 7q3 1,3 y 7q32, respectivamente, la posición citogenética más probable del gen OB humano sería en las inmediaciones de los límites 7q31.3-q32.

Mapeo del Gen OB en el cromosoma 7 humano

Un STS (sWSS2619) que amplifica un segmento pequeño de la región 3' no traducida del gen OB humano, fue utilizada para seleccionar una colección de clones YAC, que está sumamente enriquecida para el ADN de cromosoma 7 humano (Green et al., 1995a, Genomics 25: 170-183), y se identificó 9 YAC (yWSS691), yWSS1332, yWSS1998, yWSS2087, yWSS3319, yWSS3512, yWSS4875, yWSS4970, e yWSS5004). Para verificar que estos YAC contienen el gen OB humano auténtico se llevó a cabo dos experimentos adicionales. Primeramente, se provoca la YAC con un segundo análisis PCR específico para OB humano y se encontró que todos eran positivos (datos no mostrados). En segundo lugar, se digirió el ADN de levadura de cada clon con EcoRI y se analizó mediante hibridación por transferencia de gel, utilizando una sonda derivada de ADNc de OB humano. En todos los casos se observó una sola banda hibridizadora y esta banda tenía el mismo tamaño en los YAC y en un clon P1, que se sabe que contiene el gen OB humano (datos no mostrados).

Utilizando el programa informatico SEGMAP (Green y Green, 1991, citado anteriormente) y otros datos de contenido de STS a base de YAC, que fueron generados para el cromosoma 7 (Green et al., 1991, citado anteriormente; Green et al., 1994, citado anteriormente; Green et al., 1995, citado anteriormente), se encontró que el gen OB humano residia dentro del cóntigo YAC ilustrado en la figura 35. Específicamente, este cóntigo consiste en 43 Yac traslapantes y 19 STS ordenados de manera singular. Los detalles acerca de cada uno de los 19 STS están facilitados en la tabla 3. Además de los STS específicos para OB, el cóntigo también contiene un STS (sWSS808) específico para el gen Pax4 humano (Tamura et al., 1994, citado anteriormente; Stapleton et al., 1993, Nature Genet. 3:292-298),, 7 STS derivados de 7 Yac específicos de cromosoma, 2 STS derivados de 7 clones I específicos del cromosoma y, muy importante, 8 STS específicos para el microsatélite. Otros detalles acerca de esos 8 marcadores genéticos, que incluyen las secuencias de los cebadores utilizados para el análisis de genotipo, están dados en la tabla 2. Se observa que hay conectividad redundante a base de YAC en la totalidad del cóntigo (es decir, hay dos o más YAC que conectan cada par adyacente de STS), lo que conduce a un soporte fuerte para el orden relativo de los STS mostrados en la figura 35.

Tal como se ilustra en la figura 35, la orientación predicha del cóntigo de YAC que contiene OB humano es tal que sWSS1734 es el STS más centrómero (es decir, más cercano a CFTR) mientras que sWSS2367 es el STS más telómero (es decir, más cercano a CPA). Esta orientación se basa predominantemente en datos de mapeo comparativos que colocan a Pax4 próximo y a OB distante dentro del bloque sinténico presente en el ADN de ratón y humano (Zhang et al., 1994, citado anteriormente). El gen OB se mapea cerca del extremo telómero del cóntigo, con base en la colocación del STS específico para OB (sWSS2619).

Mientras que el cóntigo mostrado en la figura 35 se dedujo mediante SEGMAP sin consideración a los tamaños de YAC (exhibiendo de esa manera STS equidistantes entre sí), un análisis de los datos mediante SEGMAP que tomó en cuenta los tamaños de YAC indicó que el tamaño total de la región cubierta por el cóntigo es justo más de 2 Mb (datos no mostrados). Por tanto, aunque los 8 STS específicos del microsatélite (tabla 4) están contenidos dentro de un intervalo genómico que cubre aproximadamente 2 Mb, los tres más cercanos del extremo telómero del cóntigo (sWSS1392, sWSS1148, y sWSS2367) están particularmente cercanos al gen OB propiamente dicho (quizás dentro de un intervalo tan pequeño como aproximadamente 500 kb). De hecho, los tres últimos STS están presentes en al menos uno de los YAC que contienen OB humano. Se observa que el intervalo entre Pax4 humano (sWSS808) y ob (sWSS2619) se estima que es aproximadamente 400 kb, mientras que se predecía que esta región cubriría aproximadamente 1 Mb en ratones (Zhang et al., 1994, citado anteriormente). Finalmente, tres de los YAC dentro del cóntigo (yWSS691, yWSS999 e yWSS2935) también han sido analizados mediante FISH y se encontró que cada uno de ellos hibrida exclusivamente a 7q3 1,3. Uno de estos YAC (yWSS691) contiene el STS específico para OB, mientras que los otros dos clones contienen STS específicos para Pax4.

Estos últimos resultados son generalmente consistentes con la asignación citogenética previa de Pax4 humano a 7q32 (Tamura et al., 1994, citado anteriormente). Con base en esos datos se puede asignar el gen OB humano a la banda citogenética 7q3 1,3.

EJEMPLO 11: POLIPÉPTIDO OB HUMANO ES BIOLOGICAMENTE ACTIVO EN RATONES

Se trataron grupos de 10 ratones ob/ob mediante inyección intraperitoneal con 10 !g/g/día de polipéptido OB humano y de murino recombinante (bacteriano) o con solución salina. Después de cuatro días, el grupo que recibió la solución salina ganó 0,3 g. El grupo que recibió OB de murino perdió 3,2 g. El grupo que recibió OB humano perdió 2 g (p < 0,01, en comparación con los controles de solución salina). También se sometieron a prueba estos grupos para la ingestión de alimento. Los datos para la ingestión de alimento se muestran en la tabla 5; los datos para la masa corporal se muestran en la tabla 6.

TABLA 5 Ingestión de alimento/día (gramo) de ratones ob/ob tratados (valor ± desviación estándar)

Tratamiento: Día 0 Día 1 Día 2 Día 3 Día 4 Día 5 Día 6 Día 7

Solución salina: 13,4 ± 2,6 12,8 12,8 13,1 14,0 12,3 12,4 8,3

OB murino: 14,9 3,7 4,4 5,1 8,9 8,1 8,7 3,5

OB de ser humano: 14,3 10,3 8,7 7,0 8,9 5,3 3,8 13,0

TABLA 6 Peso corporal y cambio de peso en ratones ob/ob tratados (valor ± desviación estándar)

Tratamiento: Peso corporal (día 0) Peso corporal (día 4) Cambio de peso Peso corporal (día 6) Cambio porcentual (día 0 al día 6)

Solución salina: 39,9 ± 1,8 40,7 ± 1,6 0,8 ± 0,5 41,1 ± 2,2 1,2 ± 1,1

OB murino: 39,5 ± 2,1 36,2 ± 2,0 -3,3 ± 1,2 36,3 ± 2,2 -3,1 ± 1,2

OB de ser humano: 39,5 ± 2,0 37,6 ± 1,7 -2,0 ± 1,0 36,1 ± 1,3 -3,5 ± 1,3

Estos datos demuestran que el OB humano es biológicamente activo en los ratones. EJEMPLO 12: UNA DOSIS ELEVADA DE OB AFECTA LOS RATONES DE TIPO NATURAL Se trataron ratones de tipo natural (C57B16J +/?) con 10 !g/g/día, intraperitoneales, de OB de murino recombinante

10 y se midió la masa corporal cada cuatro días. Los resultados se muestran en la tabla 7. TABLA 7 Masa corporal (g) de ratones normales que reciben ob

Tratamiento: Día 0 Día 4 Día 8 Día 12 Día 16

Solución salina: 22,6 ± 1,4 22,2 ± 1,2 22,5 ± 1,3 23 22,5

OB murino: 22,4 ± 1,5 20,6 ± 1,5 20,8 ± 1,3 20,8 21,8

Estos datos demuestran que OB afecta la masa corporal de los ratones de tipo natural así como los ratones obesos 15 (ob/ob) si bien en un grado muy inferior.

EJEMPLO 13: POLIPÉPTIDO OB ADMINISTRADO MEDIANTE INFUSIÓN POR BOMBEO CONTINUO

Este ejemplo demuestra que la infusión continua del polipéptido OB da como resultado la pérdida de peso en ratones normales. Se administró a ratones normales (no obesos) el polipéptido ob de murino por medio de infusión por bomba osmótica. Una dosis de 0,5 mg de proteína/kg de peso corporal/día dio como resultado una pérdida de

20 4,62% (± 1,34%) del peso básico al sexto día de infusión.

MATERIALES Y METODOS

Animales

Se usaron ratones de tipo natural (+/+) C57B16 en este ejemplo. Los ratones fueron alojados individualmente y mantenidos en condiciones humanitarias. La edad de los ratones en el punto inicial en el tiempo fue ocho semanas, y los animales estaban estabilizados en peso. Se usaron diez ratones para cada cohorte (vehículo contra proteína).

Medición de alimento y peso

5 Se proporcionaron a los ratones alimento para roedores molido (PMI Feeds, Inc.) en alimentadores para alimento en polvo (Allentown Caging and Equipment), lo que permitió una medición más precisa y sensible de la ingestión de alimento que la utilizada con alimento en bloques regular. Se midió el peso al mismo tiempo cada día (a las 2:00 p.m.), durante un período de 6 días. Se definió el peso corporal en el día previo a la infusión, como el peso de referencia

10 CLONACIÓN DE ADN DE OB DE MURINO

Se realizó la clonación del ADN de OB de murino para expresión en E. coli de la siguiente manera. Se tradujo de manera inversa la secuencia de ADN, como se dedujo de la secuencia de péptido publicada que apareció en (Zhang et al., 1994, citado anteriormente, es decir, ejemplo 1, anterior), utilizando codones óptimos de E. coli. Los sitios de clonación terminal fueron XbaI a BamHI. Se incluyó al frente de la región codificadora un potenciador de unión

15 ribosómica y un sitio de unión ribosómica fuerte. Se sintetizó la secuencia de ADN dúplex utilizando técnicas convencionales. Se confirmaron los clones correctos demostrando la expresión de la proteína recombinante y la presencia de la secuencia de ADN de OB correcta en el plásmido residente. La secuencia de aminoácidos (y la secuencia de ADN) es tal como sigue:

Secuencia de ADN de OB met (de doble cadena) de múridos, recombinante, y secuencia de aminoácidos (Seq. ID. 20 NOS: 94 y 95):

_

Vector de expresión y cepa hospedadora

El vector de expresión de plásmido utilizado para producir la proteína fue pCFM1656, Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC) número de acceso 69576. El ADN anterior estuvo ligado al vector de expresión pCFM1656 que había sido linealizado con XbaI y BamHI, y transformado a la cepa hospedadora de E. coli FM5. Las células FM5 de

E. coli se derivaron en Amgen Inc., Thousand Oaks, CA de la cepa K-12 de E. coli [Bachmann et al., Bacteriol. Rev., 40:116-167 (1976)] y contienen el gen represor de fago I integrado cI857 [Sussman et al., C.R. Acad. Sci., 254:1517-1579 (1962)]. El vector de producción, la transformación de la célula y la selección de la colonia fueron efectuados por medio de métodos comunes y corrientes, por ejemplo, Sambrook et al., 1989, citado anteriormente. Se hicieron crecer las células hospedadoras en medios de LB.

Administración de proteína o vehículo

Se usó polipéptido OB de murino recombinante para estos experimentos, generalmente a una concentración aproximada de 0,9 mg/ml de solución salina con tampón fosfato, pH 7,4. La secuencia de aminoácidos (y la secuencia de ADN) utilizada se señala inmediatamente en lo que antecede. Se administró proteína o vehículo (solución salina con tampón fosfato, pH 7,4) por medio de infusión con bomba osmótica. Se colocaron quirúrgicamente minibombas osmóticas Alzet (Alza, Palo Alto, CA, modelo n.º 1007D) en cada ratón, en una bolsa subcutánea en el área subescapular. Se calibraron las bombas para que administraran 0,5 ml de proteína en disolución por hora para una dosificación de 0,5 mg de proteína/kg de peso corporal/día. Se infundieron a los animales de control solución salina con tampón fosfato (pH 7,4) por medio de una minibomba osmótica Alzet.

Proceso de Fermentación. Se utilizó para preparar la proteína un protocolo de fermentación de tres fases, que se conoce como el proceso de alimentación intermitente. Las composiciones de los medios se exponen a continuación.

Carga. Se esterilizaron una fuente de nitrógeno y de fosfato (elevando la temperatura hasta 122ºC durante 35 minutos, a una presión de 1,265- 1,406 kg/cm2) en el recipiente de fermentación (Biolafitte, 12 litros de capacidad). Tras enfriar se añadieron asépticamente carbono, magnesio, vitaminas y fuentes de vestigios metálicos. Un cultivo durante la noche (16 horas o más) de las bacterias productoras de proteína de murino recombinante, anteriores, de 500 ml (desarrollado en caldo LB) se añadió al fermentador.

Alimentación I. Tras alcanzar una D.O.600 de entre 4,0 y 6,0, se añadió a los cultivos la alimentación I. Se añadió glucosa a un régimen limitante con el fin de controlar el régimen de desarrollo (!). Se programó un sistema automático (denominado el Sistema de Control Distributivo) para controlar el régimen de crecimiento a 0,15 generaciones por hora-1.

Alimentación II. Cuando el diámetro exterior alcanzó 30, se aumentó lentamente la temperatura hasta 42ºC y se cambió la alimentación a la alimentación II, tal como se describe a continuación. Luego se dejó que la fermentación continuara durante 10 horas con muestreo cada dos horas. Después de 10 horas se enfrió el contenido del fermentador a menos de 20ºC y se cosechó por medio de centrifugación.

Composición del medio:

Lote: 10 g/l Extracto de levadura

5,25 g/l (NH4)2SO4

3,5 g/l K2HPO4

4,0 g/l KH2PO4 4,0 g/l Glucosa 1,0 g/l MgSO4·7H2O 2,0 ml/l Disolución de vitaminas 2,0 ml/l Disolución de vestigios metálicos 1,0 ml/l Antiespumante P2000

Alimentación I: 50 g/l Bacto-triptona 50 g/l Extracto de levadura 450 g/l Glucosa 8,75 g/l MgSO4·7H2O 10 ml/l Solución de vitamina 10 ml/l Solución de vestigio metálico

Alimentación II: 200 g/l Bacto-triptona 100 g/l Extracto de levadura 110 g/l Glucosa

Disolución de vitaminas (carga, alimentación I): Se disolvieron 0,5 g de biotina, 0,4 g de ácido fólico y 4,2 g de riboflavina, en 450 ml de agua y 3 ml de NaOH 10 N, y se llevó hasta 500 ml con agua. Se disolvió 14 g de clorhidrato de piridoxina y 61 g de niacina en 150 ml de H2O y 50 ml de NaOH 10 N, y se llevó hasta 250 ml con

5 H2O. Se disolvió 54 g de ácido pantoténico en 200 ml de agua y se llevó hasta 250 ml. Se combinó las tres disoluciones y se llevó hasta 10 litros de volumen total. Disolución de vestigio metálico (carga, alimentación I): Cloruro férrico (FeCl36H2O): 27 g/l Cloruro de zinc (ZnCl24H2O): 2 g/l 10 Cloruro de cobalto (CoCl26H2O): 2 g/l Molibdato de sodio (NaMoO42H2O): 2 g/l Cloruro de calcio (CaCl22H2O): 1 g/l Sulfato cúprico (CuSO45H2O): 1,9 g/l Ácido bórico (H3BO3): 0,5 g/l 15 Cloruro de manganeso (MnCl24H2O): 1,6 g/l citrato de sodio dihidratado: 73,5 g/l.

Procedimiento de purificación para polipéptido ob murino

Se llevó a cabo la purificación mediante las siguientes etapas (a menos que se observe de otra manera, se llevó a cabo las siguientes etapas a 4ºC):

20 1. Pasta de célula.- Se suspendió pasta de célula de E. coli en 5 veces el volumen de EDTA 7 mM, pH 7,0. Se rompió adicionalmente las células en el EDTA mediante dos pasadas a través de un microfluidizador. Se centrifugaron las células rotas a 4,2 k rpm durante una hora en una centrífuga Beckman JB-6 con un rotor J5- 4,2.

2. Lavado n.º 1 del cuerpo de inclusión.- Se retiró el sobrenadante de lo anterior y se suspendió otra vez el

sedimento con 5 veces el volumen de EDTA 7 mM, pH 7,0, y se homogeneizó. Se centrifugó esta mezcla como en la 25 etapa 1.

3.: Lavado n.º 2 del cuerpo de inclusión.- Se retiró el sobrenadante de lo anterior y se volvió a suspender el sedimento en diez veces el volumen de Tris 20 mM, pH 8,5, DTT 10 mM y desoxicolato al 1%, y se homogeneizó. Se centrifugó la mezcla como en la etapa 1.

4.: Lavado n.º 3 del cuerpo de inclusión.- Se retiró el sobrenadante de lo anterior y se volvió a suspender el

5 sedimento en diez veces el volumen de agua destilada y se homogeneizó. Se centrifugó esta mezcla como en el etapa 1.

5. Replegado.- Se volvió a plegar el sedimento con 15 volúmenes de HEPES 10 mM, pH 8,5, sarcosina de sodio al 1% (N-laurilsarcosina), a temperatura ambiente. Después de 60 minutos se hizo que la disolución fuera sulfato de cobre 60 mM y luego se agitó durante la noche.

: 10 6. Eliminación de la sarcosina.- Se diluyó la mezcla de replegamiento con 5 volúmenes de 10 mM de tampón Tris, pH 7,5, y se centrifugó como en la etapa 1. Se recogió el sobrenadante y se mezcló con agitación durante una hora con resina Dowex 1-X4, de 20 a 50 mallas, forma cloruro (a un volumen total del 0,066% respecto a la mezcla de replegamiento diluida). Se vertió esta mezcla en una columna y luego se recogió el eluyente. La eliminación de la sarcosina se determinó por medio de HPLC.

: 15 7. Precipitación con ácido.- Se recogió el eluyente de la etapa anterior y se ajustó el pH a 5,5 y se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se centrifugó esta mezcla como en el etapa 1.

8. Cromatografía de intercambio de cationes.- Se ajustó el pH del sobrenadante de la etapa anterior a 4,2 y se cargó sobre una columna de CM Sepharose Fast Flow. Se usaron veinte volúmenes de columna del gradiente de sal a NaOAC 20 mM, pH 4,2, NaCl de 0 M a 1,0 M.

: 20 9. Cromatografía de HIC.- Se ajustó el conjunto de CM Sepharose de las fracciones pico (determinadas a partir de análisis ultravioleta), procedentes de la etapa anterior, para que fuesen sulfato de amonio 0,2 M. Se efectuó un gradiente inverso de sal, de 20 volúmenes de columna, a NaOAc 5 mM, pH 4,2, con sulfato de amonio de 0,4 M a 0

M. Se concentró este material y se diafiltró en PBS.

RESULTADOS:

25 A continuación se presentan las diferencias porcentuales (%) procedentes del peso de base en ratones C57B16J (de 8 semanas de edad):

TABLA 8

Pérdida de peso por infusión continua

Tiempo (días) Vehículo (PBS) Polipéptido OB recombinante Días 1-2 3,24 ± 1,13 1,68 ± 1,4 Días 3-4 4,3 ± 0,97 -2,12 ± 0,79 Días 5-6 4,64 ± 0,96 -4,62 ± 1,3

Como se puede ver, al final del sexto día de régimen continuo de infusión, los animales que recibieron el polipéptido OB perdieron más del 4% del peso de su cuerpo, en comparación con el peso de base. Esto es una pérdida de peso sustancialmente más rápida que la que se había observado con inyección intraperitoneal (i.p.). Se vio una pérdida de peso de solamente el 2,6 al 3,0% al finalizar el período de inyección de 32 días, en ratones de tipo natural

35 (normales) con inyecciones diarias intraperitoneales del polipéptido OB de murino recombinante, a una dosis de 10 mg/kg, y no había más de 4% en ningún momento durante el programa de dosificación (datos no mostrados). Los datos de la presente indican que con la infusión continua se obtiene una dosificación veinte veces menor (0,5 mg/kg contra 10 mg/kg) de pérdida de peso en un tiempo más corto.

Los resultados que se ven aquí son estadísticamente importantes, por ejemplo, - 4,62% con p < 0,0001.

40 EJEMPLO 14: CLONACIÓN Y EXPRESIÓN DE UN ANÁLOGO DE POLIPÉPTIDO OB HUMANO RECOMBINANTE

Este ejemplo proporciona composiciones y métodos para la preparación de una versión humana recombinante de análogo del polipéptido OB.

Se construyó la versión humana del ADN de OB a partir del ADN de OB de murino, como en el ejemplo 13 anterior, reemplazando la región entre los sitios MluI y BamHI con ADN dúplex (formado a partir de oligonucleótidos 45 sintéticos) en donde se habían asignado 20 sustituciones de codón. Los codones para arginina en la posición 35

madura de ratón y leucina en la posición 74 madura de ratón permanecieron sin cambiar. El sitio MluI se muestra bajo la línea sólida en la siguiente secuencia. Este ADN fue llevado hasta el vector pCFM 1656 (número de acceso ATCC 69576), de la misma manera que la proteína de murino recombinante, tal como se describió antes.

ADN de OB met humano recombinante (de doble cadena) y secuencia de aminoácidos (Seq. ID. NOS: 96 y 97).

Fermentación

Se obtuvo la fermentación de las células hospedadoras anteriores para producir el polipéptido OB humano recombinante utilizando las condiciones y composiciones que fueron descritas anteriormente para el material de

10 murino recombinante. Se analizaron los resultados en cuanto a rendimiento (gramos/litro), previo a la purificación, del material OB humano recombinante (y cantidades menores de proteína bacteriana), y se correlacionaron para analizar la expresión bacteriana.

TABLA 9

Análisis de la expresión de polipéptido ob humano

Punto de tiempo: DO (a 600 nm) Rendimiento Expresión

(g/l): (mg/DO·L)

Ind. + 2 horas: 47 1,91 41

Ind. + 4 horas: 79 9,48 120

Ind. + 6 horas: 95 13,01 137

Ind. + 8 horas: 94 13,24 141

Ind. + 10 horas: 98 14,65 149

abreviaturas: Ind. + ___ horas significa las horas después de la inducción de la expresión de la proteína, tal como se describió en el ejemplo 13, para el material de murino recombinante, utilizando pCFM 1656.

D.O.: densidad óptica, cuando se mide mediante espectrofotómetro, miligramos por unidad D.O. por litro.

5 mg/D.O.·L: expresión en términos de miligramos de proteína por unidad de D.O. por litro.

Purificación del polipéptido ob humano recombinante

Se puede purificar la proteína humana recombinante utilizando métodos similares a los utilizados para la purificación de proteína de murino recombinante, como en el ejemplo 13 anterior. Para la preparación del polipéptido OB humano recombinante, se llevó a cabo la etapa 8 ajustando el pH del sobrenadante de la etapa 7 a pH 5,0 y 10 cargándolo en una columna de CM Sepharose fast flow. Se llevó a cabo el gradiente de sal a 20 volúmenes de columna a NaOAC 20 mM, pH 5,5, NaCl de 0 M a 0,5 M. Se llevó a cabo la etapa 9 diluyendo la reunión de CM Sepharose cuatro veces con agua y ajustando el pH a 7,5. Se llevó esta mezcla hasta hacerla sulfato de amonio 0,7

M. Se llevó a cabo el gradiente de sal inversa a 20 volúmenes de columna, a NaOAc 5 mM, pH 5,5, sulfato de amonio de 0,2 M a 0 M. Por lo demás, los etapas anteriores fueron idénticas.

15 EJEMPLO 15: ESTUDIOS DE RESPUESTA DE DOSIS

Un estudio adicional demostró que había una respuesta de dosis a la administración continua de la proteína OB. En ese estudio se administró a ratones de tipo natural (ratones no obesos, CD-1, que pesaban 35-40 g), proteína OB de murino recombinante utilizando métodos similares a los ejemplos 12 y 13. Los resultados fueron tal como sigue (con el porcentaje de pérdida de peso corporal en comparación con el peso de base, medido como antes):

20 TABLA 10

Respuesta a la dosis con administración continua

DOSIS: TIEMPO % DE REDUCCIÓN EN EL PESO CORPORAL

0,03 mg/kg/día: Día 2 3,5%

1 mg/kg/día: Día 2 7,5%

1 mg/kg/día: Día 4 14%

Tal como se puede observar, aumentando la dosis de 0,03 mg/kg/día a 1 mg/kg/día aumentó la pérdida de peso del 3,5% al 7,5%. Tambié es de interés observar que el día 14, la dosis de 1 mg/kg/día dio por resultado una reducción

25 de 14% en el peso corporal.

EJEMPLO 16: EFECTOS DE LA LEPTINA SOBRE LA COMPOSICIÓN DEL CUERPO DE LOS RATONES ob/ob

Se trataron ratones C57B1/6J ob/ob, de 16 semanas de edad, con 5 !g/g/día de leptina de murino, vehículo o no recibieron ningún tratamiento durante 33 días. En un segundo experimento, se trataron ratones ob/ob de 7 semanas de edad con 10 !g/g/día de leptina humana, leptina de murino o vehículo durante 12 días. Se sacrificaron los ratones

y se evaluó el peso corporal total, la composición del cuerpo, los niveles de insulina y los niveles de glucosa. Los datos de esos experimentos se notifican en la tabla 11.

TABLA 11 Peso corporal, composición, niveles de insulina y niveles de glucosa de ratones tratadosGrupo de Ratones de 16 semanas de edad, 5 !g/g/día Ratones de 7 semanas de edad, 10 !g/g/día Tratamiento de leptina de leptina

Tratamiento Leptina Vehículo Control Leptina Leptina Vehículo murina Humana murina

Peso corporal total 31,90 ± 2,8 64,10 ± 4,5 67,50 ± 4,5 31,00 ± 1,3 33,40 ± 2,4 42,70 ± 1,5

Grasa total (g) % 9,10 ± 1,7 38,30 ± 4,040,87 ± 6,128,40 ± 3,4 59,70 ± 2,1 60,34 ± 3,7 Grasa magra Total 6,80 ± 1,0 7,60 ± 0,4 7,73 ± 0,51

% (g)1,57 ± 1,6 21,30 ± 1,7 11,90 ± 1,2

Agua Total (g) % 16,00 ± 0,818,20 ± 0,718,90 ± 1,050,30 ± 4,2 28,40 ± 1,0 28,10 ± 2,2 Insulina(UIU ml) < 2,0 < 2,0 < 2,0 < 2,0 < 2,0 21,4 Glucosa mg/dl 170,0±20,9 337±30,3 317,5±51,0 258,3±26,8 320,0±44,0 789,0±152,1

Los datos de la composición de cuerpo demuestran el efecto de la leptina sobre tres compartimentos del cuerpo: la masa de grasa, la masa corporal magra y la masa de agua. Los datos indican que la leptina disminuye significativamente la masa de grasa del cuerpo y tiene un efecto marginal sobre la masa corporal magra. Sin embargo, los efectos sobre la masa corporal magra no fueron estadísticamente significativos.

5 La comparación de los niveles de insulina y de glucosa en ratones tratados con leptina y de control (sin tratar), indica que la leptina reduce el azúcar en la sangre y los niveles de insulina en la sangre y, de tal manera, mejora estos indicios de diabetes.

EJEMPLO 17: EFECTOS DE UNA DOSIS ELEVADA DE LEPTINA SOBRE RATONES DE TIPO NATURAL

Se inyectaron controles magros de los ratones ob/ob (57B1/6J+?) una vez al día por vía intraperitoneal con una

10 dosis de 10 !g/g de leptina de murino o vehículo (PBS) y se midió el peso corporal y la ingestión de alimento durante las siguientes dos semanas. Hubo una disminución importante en el peso corporal a partir del día 4 en adelante, y una disminución importante en la ingestión de alimento durante la primera semana. Sin embargo, después de una semana, los niveles de ingestión de alimento se volvieron indistinguibles entre ambos grupos de ratones. Se sacrificó los animales al final de las dos semanas y se determinó la composición del cuerpo. Los resultados del

15 análisis de composición del cuerpo están mostrados en la tabla 12. Los datos muestran una disminución en la grasa del cuerpo de los animales que recibieron leptina contra los animales que recibieron PBS.

TABLA 12:

Composición de cuerpo y peso de ratones de tipo natural (+/?)

Grupo: C57B1/6J Pesocorporal Grasatotal % Masa del cuerpomagratotal % Agua total %

Proteína: 12345678910 17,320,516,918,317,718,715,716,416,514,9 0,302,3910,340,840,442,560,370,290,83 1,71% 11,65% 1,99%4,62%2,51%13,72% 2,38%1,79%5,05% 5,005,41 4,76 5,16 4,96 4,84 4,53 4,51 4,67 28,93%26,40%28,19%28,17%28,00%25,86%28,83%27,48%28,29% 12,0012,7011,8012,3012,3011,3010,8011,6011,0010,40 69,36% 61,95% 69,82% 67,21% 69,49% 60,43% 68,79% 70,73% 66,67% 69,80%

PromedioDesviación estándar: 17,31,6 0,930,90 5,04%4,52% 4,870,30 27,79%1,05% 11,620,74 67,43%3,52%

Vehículo: 11121314151617181920 18,817,618,019,618,617,319,320,617,719,5 1,302,172,293,792,351,961,384,161,08 6,93% 12,34% 12,74% 19,34% 12,65% 11,32% 7,12%20,19% 6,13% 5,004,53 4,61 4,61 4,75 4,54 5,02 4,94 4,72 26,58%25,73%25,59%23,52%25,52%26,25%26,04%23,98%26,64% 12,5010,9011,1011,2011,5010,8012,9011,5011,9012,30 66,49% 61,93% 61,67% 57,14% 61,83% 62,43% 66,84% 55,83% 67,23% 63,08%

PromedioDesviación estándar: 18,71,1 2,281,07 12,09%5,08% 4,750,20 25,54%1,10% 11,660,72 62,45%3,83%

Un segundo experimento mostró los efectos de inyecciones intraperitoneales dos veces al día de 12,5 !g/g de leptina de murino sobre ratones C57B1/6J de tipo natural. Hubo una disminución importante en el peso corporal y en la ingestión de alimento, asociada con las inyecciones dos veces al día del polipéptido. Para ese experimento se colocó los animales en cámaras metabólicas. El alimento consistió de la dieta en polvo Purina n.º5001 chow. Esta dieta difirió de los experimentos previos que utilizaban la dieta que consistía de una dieta de masticar, tapioca y agua. Por tanto, el alimento usado en las cámaras metabólicas tiene un contenido calórico superior, lo que explica por que la cantidad de alimento consumido difiere de aquellos animales que se sometieron a dieta que contenía agua.

La siguiente es una lista de referencias relacionada con la descripción anterior y particularmente con los procedimientos experimentales y las discusiones.

Bahary et al., Genomics, 11:33-47 (1991).

Bahary et al., Genomics, 13:761-769 (1992).

Bahary et al., Molecular mapping of mouse chromosomes 4 and 6: Use of a flow-sorted Robertsonian chromosome (1991) (Mapeo molecular de los cromosomas de ratón 4 y 6: Uso de un cromosoma Robertsoniano clasificado por flujo).

Blank et al., Mammalian Genome, 1:s51-s78 (1991).

Bogardus et al., Annals of the New York Academy of Sciences, 630:100-115 (1991).

Friedman et al., Mammalian Genome, 1:130-144 (1991).

Harris, FASEB J., 4:3310-3318 (1990).

Jacobowitz et al., N. Engl. J. Med., 315:96-100 (1986).

Kessey, in Obesity, pp 144-166, Stunkard ed., Philadelphia, W.B. SAUDERS Co. (1980).

Kessey et al., Ann Rev. Psychol. 37:109-13 3,22 (1986).

Leibel et al., “Genetic variation and nutrition in obesity: Approaches to the molecular genetics of obesity” (Variación genética y nutrición en la obesidad”: Enfoques a la genética molecular de la obesidad) en Genetic Variation and Nutrition, pp. 90-10 1,1 Simopoulos and Childs eds., S. Karger, Basel (1990).

Siegel et al., Cytogenet. Cell Genet., 61(3):184-185 (1992).

La invención, tal como se reivindica, puede ser puesta en práctica según la descripción anterior y puede ponerse a disposición fácilmente las referencias y los materiales de partida. No obstante, los solicitantes, el 9 de agosto de 1995, hicieron los siguientes depósitos en la Colección Americana de Cultivos Tipo, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, 20852-1178, E.U.A., según los reglamentos del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para los Propósitos de un Procedimiento de Patentes: E. Coli H14, que aloja el plásmido pETH14, nombre de acceso 69880; y E. coli M9 que aloja el plásmido pETM9, número de acceso 69879.

LISTA DE SECUENCIAS

(1): INFORMACIÓN GENERAL:

(i): SOLICITANTE: THE ROCKEFELLER UNIVERSITY.

(ii): TITULO DE LA INVENCIÓN: MODULADORES DEL PESO CORPORAL, ÁCIDOS NUCLEICOS Y PROTEÍNASCORRESPONDIENTES, Y USOS DIAGNÓSTICOS Y TERAPÉUTICOS DE LOS MISMOS

(iii) NÚMERO DE SECUENCIAS: 99

(iv): DIRECCIÓN PARA CORRESPONDENCIA:

(A): DESTINATARIO: Klauber & Jackson

(B): CALLE: 411 Hackensack Avenue

(C): CIUDAD; Hackensack

(D): ESTADO: Nueva Jersey

(E): PAÍS: E.U.A.

(f): CÓDIGO POSTAL: 07601

(v): FORMA QUE PUEDE SER LEÍDA POR COMPUTADORA:

(A): TIPO DE MEDIO: disco flexible

(B): COMPUTADORA: compatible con IBM PC

(C): SISTEMA DE OPERACIÓN: PC-DOS/MS-DOS

(D): PROGRAMA: Patent In Release # 1.0, Versión # 1.25

(vi): DATOS ACTUALES DE LA SOLICITUD:

(A): NÚMERO DE SOLICITUD:

(B): FECHA DE PRESENTACIÓN:

(C): CLASIFICACIÓN:

(vii) DATOS DE SOLICITUD PREVIA:

(A): NÚMERO DE SOLICITUD: 08/483.211

(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: 7 de junio de 1995

(C): CLASIFICACIÓN:

(vii) DATOS DE LA SOLICITUD PREVIA:

(A): SOLICITUD NÚMERO: 08/438.431

(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: 10 de mayo de 1995

(C): CLASIFICACIÓN:

(vii) DATOS DE LA SOLICITUD PREVIA:

(A): SOLICITUD NÚMERO: 08/347.563

(B): FECHA DE PRESENTACION: 30 de noviembre de 1994

(C): CLASIFICACIÓN:

(vii) DATOS DE LA SOLICITUD PREVIA:

(A): SOLICITUD NÚMERO: 08/292,345

(B): FECHA DE PRESENTACION: 17 de agosto de 1994

(C): CLASIFICACIÓN:

(viii): INFORMACIÓN DEL APODERADO/AGENTE:

(A): NOMBRE: David A. Jackson, Abogado

(B): NÚMERO DE REGISTRO: 26.742

(C): NÚMERO DE REFERENCIA/CASO: 600-1-087 PCT

(ix): INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES:

(A): TELÉFONO: 201 487-5800

(B): TELEFAX: 201 343-1684

(C): TELEX: 133521

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 1:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 2793 PARES DE BASES

(B): TIPO: Ácido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: doble

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(A): DESCRIPCIÓN: ADNc ob de murino

(iii): HIPOTÉTICO: NO

(iv): ANTISENTIDO: NO

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A): ORGANISMO: murino

(ix): ASPECTO:

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

(B): UBICACIÓN: 57..560

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 2:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

5: (A) LONGITUD: 168 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(A): DESCRIPCIÓN: polipéptido ob de murino

10: (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 3:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

5: (A) LONGITUD: 700 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: doble

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

10: (A) DESCRIPCIÓN: ADNc de ob humano, en donde N representa cualquier nucleótido

(iii): HIPOTÉTICO: NO

(iv): ANTISENTIDO: NO

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A): ORGANISMO: ser humano

(ix): ASPECTO:

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

(B): UBICACIÓN: 46..546

5: (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 4:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

5: (A) LONGITUD: 167 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

(C): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(A): DESCRIPCIÓN: polipéptido ob humano

10: (vi) FUENTE ORIGINAL: humana

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 5:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

5: (A) LONGITUD: 166 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(A): DESCRIPCIÓN: polipéptido ob de murino que carece de Gln en la posición 49

10: (vi) FUENTE ORIGINAL:

(A): ORGANISMO: murino

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:5:

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 6:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 167 aminoácidos

5: (B) TIPO: aminoácido

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(A): DESCRIPCIÓN: polipéptido ob humano que carece de Gln en la posición 49

(vi): FUENTE ORIGINAL:

10: (A) ORGANISMO: ser humano

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:6:

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 7:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

5: (A) LONGITUD: 175 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: doble

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

10: (A) DESCRIPCIÓN: exón 2G7

(iii): HIPOTÉTICO: NO

(iv): ANTISENTIDO: NO

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:7:

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 8:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 18 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (cebador)

(A): cebador de PCR 5' para exón 2G7

(iii): HIPOTÉTICO: NO

(iv): ANTISENTIDO: NO

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:8:

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 9:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 22 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (cebador)

(A): cebador de PCR 3' para exón 2G7

(iii): HIPOTÉTICO: NO

(iv): ANTISENTIDO: SI

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:9:

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 10:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 23 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(A): DESCRIPCIÓN: péptido de señal N-terminal, putativo

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:10:

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:11:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 287 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: doble

(D): TOPOLOGÍA: circular

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (plásmido)

(A): DESCRIPCIÓN: vector de expresión pET-15b

(iii): HIPOTÉTICO: NO

(iv)): ANTISENTIDO: NO

(ix): ASPECTO:

(A): NOMBRE/CLAVE: promotor T7

(B): UBICACIÓN: 20..37

(ix): ASPECTO:

(A): NOMBRE/CLAVE: operador lac

(B): UBICACIÓN: 39..64

(ix): ASPECTO:

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

(B): UBICACIÓN: 108..243

(ix): ASPECTO:

(A): NOMBRE/CLAVE: His-Tag

(B): UBICACIÓN: 123..137

(ix): ASPECTO:

(A): NOMBRE/CLAVE: Sitio de división por trombina

(B): UBICACIÓN: 184..196

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:11:

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:12:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

5: (A) LONGITUD: 45 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:12:

10

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 13:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 32 pares de bases

15: (B) TIPO: ácido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (cebador)

(A): DESCRIPCIÓN: cebador 5' murino

20: (iii) HIPOTÉTICO: NO

(iv): ANTISENTIDO: NO

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:13:

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 14:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 32 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (cebador)

(A): DESCRIPCIÓN: cebador 3' murino

(iii): HIPOTÉTICO: NO

(iv): ANTISENTIDO: SI

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:14:

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 15:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 32 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (cebador)

(A): DESCRIPCIÓN: cebador 5' humano

(iii): HIPOTÉTICO: NO

(iv): ANTISENTIDO: NO

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:15:

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 16:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 32 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (cebador)

(A): DESCRIPCIÓN: cebador 3' humano

(iii): HIPOTÉTICO: NO

(iv): ANTISENTIDO: SI

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:16:

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 17:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 11 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: doble

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(A): DESCRIPCIÓN: sitio aceptor de corte y empalme en ob

(iii): HIPOTÉTICO: NO

(iv): ANTISENTIDO: NO

(ix): ASPECTO:

(A): NOMBRE/CLAVE: sitio aceptor de corte y empalme

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:17:

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 18:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 16 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

(C): TOPOLOGÍA: desconocida

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(A): DESCRIPCIÓN: fragmento de péptido ob

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A): ORGANISMO: murino

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 18:

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 22:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 19:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 15 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

(C): TOPOLOGÍA: desconocida

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(A): DESCRIPCIÓN: fragmento de péptido ob

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A): ORGANISMO: murino

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 19:

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 20:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 19 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

(C): TOPOLOGÍA: desconocida

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(A): DESCRIPCIÓN: fragmento de péptido ob

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A): ORGANISMO: murino

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 20:

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 21:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

5: (A) LONGITUD: 20 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

(C): TOPOLOGÍA: desconocida

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(A): DESCRIPCIÓN: fragmento de péptido ob

10: (v) TIPO DE FRAGMENTO: carboxilo terminal

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A): ORGANISMO: murino

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 21:

(A): LONGITUD: 414 pares de bases 20 (B) TIPO: ácido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: doble

(C): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(A): DESCRIPCIÓN: porción del gen ob humano, que incluye la secuencia no codificadora situada corriente 25 arriba del primer exón, la secuencia codificante del primer exón y la región 5' del primer intrón.

(iii) HIPOTÉTICO: NO

(iv): ANTISENTIDO: NO

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A): ORGANISMO: ser humano 30 (ix) ASPECTO:

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

(B): UBICACIÓN: 38..181

(ix): ASPECTO:

(A): NOMBRE/CLAVE: región 5' del primer intrón

(B): UBICACIÓN: 182..414 5 (ix) ASPECTO:

(A): NOMBRE/CLAVE: secuencia no codificadora 5' del gen ob humano del que se generó el cebador de ADN HOB IgF.

(B): UBICACIÓN: 11..28

(ix): ASPECTO: 10 (A) NOMBRE/CLAVE: secuencia intrónica del gen ob humano del que se generó el cebador HOB 1gR

(B): UBICACIÓN: 241..260

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:22:

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 24:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 801 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): TIPO DE MOLÉCULA: doble

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(A): DESCRIPCIÓN: porción del gen ob humano, que incluye la región 3' del primer intrón, la secuencia codificante del segundo exón y la secuencia no codificadora 3'.

15

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 23:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 48 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

20: (C) TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(A): DESCRIPCIÓN: porción N-terminal de la proteína ob humana codificada por el primer exón

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:23:

(iii) HIPOTÉTICO: NO

(iv): ANTISENTIDO: NO

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A): ORGANISMO: ser humano

(ix): ASPECTO:

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

(B): UBICACIÓN: 291..648

(ix): ASPECTO:

(A): NOMBRE/CLAVE: 3' del primer intrón

(B): UBICACIÓN: 1..290

(ix): ASPECTO:

(A): NOMBRE/CLAVE: secuencia intrónica del gen ob humano HOB a partir del cual se generó el cebador HOB 2gF.

(B): UBICACIÓN: 250..269

(ix): ASPECTO:

(A): NOMBRE/CLAVE: secuencia no codificadora 3' del gen ob humano del que se generó el cebador de ADN HOB 2gR

(B): UBICACIÓN: 707..728

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:24:

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 25:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

5: (A) LONGITUD: 119 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(A): DESCRIPCIÓN: porción C-terminal de la proteína ob humana codificada por el segundo exón

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:25:

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 26:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 8 aminoácidos

10: (B) TIPO: aminoácido

(C): TOPOLOGÍA: desconocida

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

(vi): FUENTE ORIGINAL:

15: (A) ORGANISMO: levadura Pichia

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 26:

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 27:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 4 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

(C): TOPOLOGÍA: desconocida

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A): ORGANISMO: levadura Pichia

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 27:

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 28:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 4 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

(C): TOPOLOGÍA: desconocida

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A): ORGANISMO: levadura Pichia

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 28:

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 29:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 18 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (cebador)

(A): DESCRIPCIÓN: cebador de ADN HOB 1gF, generado a partir de la secuencia 5' no codificadora del gen ob humano.

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 30:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (cebador)

(A): DESCRIPCIÓN: cebador de ADN HOB 1gR, generado a partir de la primera secuencia intrónica del gen ob humano.

(iii): HIPOTÉTICO: NO

(iv): ANTISENTIDO: NO

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 29:

(iii) HIPOTÉTICO: NO

(iv): ANTISENTIDO: SI

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 30:

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 31:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (cebador)

(A): DESCRIPCIÓN: cebador de ADN HOB 2gF generado a partir de la primera secuencia intrónica del gen ob humano.

(iii) HIPOTÉTICO: NO

(iv): ANTISENTIDO: NO

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 31:

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 32:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 22 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (cebador)

(A): DESCRIPCIÓN: cebador de ADN HOB 2gR, generado a partir de la secuencia 3' no codificadora del gen ob humano.

(iii) HIPOTÉTICO: NO

(iv): ANTISENTIDO: SI

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 32:

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 33:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 51 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: doble

(D): TOPOLOGÍA: circular

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

(A): DESCRIPCIÓN: sitio de clonación pPIC.9.

(iii): HIPOTÉTICO: NO

(iv): ANTISENTIDO: NO

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 33:

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 34:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 40 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (cebador)

(A): DESCRIPCIÓN: cebador de PCR 5' para amplificar la secuencia de ADNc de ob humano.

(iii): HIPOTÉTICO: NO

(iv): ANTISENTIDO: NO

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 34:

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 35:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 31 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (cebador)

(A): DESCRIPCIÓN: cebador de PCR 3' para amplificar la secuencia de ADNc de ob humano.

(iii): HIPOTÉTICO: NO

(iv): ANTISENTIDO: SI

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 35:

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 36:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 40 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (cebador)

(A): DESCRIPCIÓN: cebador de PCR 5' para amplificar la secuencia de ADNc de ob de murino.

(iii): HIPOTÉTICO: NO

(iv): ANTISENTIDO: NO

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 36:

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 37:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 31 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (cebador)

(A): DESCRIPCIÓN: cebador de PCR 3' para amplificar la secuencia de ADNc de ob de murino.

(iii): HIPOTÉTICO: NO

(iv): ANTISENTIDO: SI

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 37:

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 38:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 4 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(A): DESCRIPCIÓN: tetrapéptido en el extremo N de la proteína ob de murino renaturalizada, tras división con trombina.

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A): ORGANISMO: murino

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 38:

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 39:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 19 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (cebador)

(A): DESCRIPCIÓN: cebador sWSS1734 de PCR específico para sitio marcado en la secuencia.

(iii): HIPOTÉTICO: NO

(iv): ANTISENTIDO: NO

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A): ORGANISMO: ser humano

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 39:

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 40:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 18 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (cebador)

(iii): HIPOTÉTICO: NO

(iv): ANTISENTIDO: NO

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A): ORGANISMO: ser humano

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 40:

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 41:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 19 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (cebador)

(A): DESCRIPCIÓN: cebador sWSS494 de PCR específico para sitio marcado en la secuencia.

(iii): HIPOTÉTICO: NO

(iv): ANTISENTIDO: NO

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A): ORGANISMO: ser humano

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 41:

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 42:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 22 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (cebador)

(iii): HIPOTÉTICO: NO

(iv): ANTISENTIDO: NO

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A): ORGANISMO: ser humano

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 42:

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 43:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (cebador)

(A): DESCRIPCIÓN: cebador sWSS883 de PCR específico para sitio marcado en la secuencia.

(iii): HIPOTÉTICO: NO

(iv): ANTISENTIDO: NO

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A): ORGANISMO: ser humano

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 43:

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 44:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (cebador)

(iii): HIPOTÉTICO: NO

(iv): ANTISENTIDO: NO

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A): ORGANISMO: ser humano

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 44:

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 45:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 18 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (cebador)

(A): DESCRIPCIÓN: cebador sWSS2359 de PCR específico para sitio marcado en la secuencia.

(iii): HIPOTÉTICO: NO

(iv): ANTISENTIDO: NO

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A): ORGANISMO: ser humano

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 45:

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 46:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 19 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (cebador)

(iii): HIPOTÉTICO: NO

(iv): ANTISENTIDO: NO

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A): ORGANISMO: ser humano

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 46:

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 47:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 18 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (cebador)

(A): DESCRIPCIÓN: cebador sWSS2336 de PCR específico para sitio marcado en la secuencia.

(iii): HIPOTÉTICO: NO

(iv): ANTISENTIDO: NO

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A): ORGANISMO: ser humano

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 47:

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 48:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (cebador)

(iii): HIPOTÉTICO: NO

(iv): ANTISENTIDO: NO

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A): ORGANISMO: ser humano

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 48:

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 49:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 18 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (cebador)

(A): DESCRIPCIÓN: cebador sWSS1218 de PCR específico para sitio marcado en la secuencia.

(iii): HIPOTÉTICO: NO

(iv): ANTISENTIDO: NO

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A): ORGANISMO: ser humano

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 49:

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 50:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (cebador)

(iii): HIPOTÉTICO: NO

(iv): ANTISENTIDO: NO

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A): ORGANISMO: ser humano

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 50:

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 51:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 18 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (cebador)

(A): DESCRIPCIÓN: cebador sWSS1402 de PCR específico para sitio marcado en la secuencia.

(iii): HIPOTÉTICO: NO

(iv): ANTISENTIDO: NO

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A): ORGANISMO: ser humano

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 51:

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 52:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 18 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (cebador)

(iii): HIPOTÉTICO: NO

(iv): ANTISENTIDO: NO

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A): ORGANISMO: ser humano

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 52:

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 53:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 18 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (cebador)

(A): DESCRIPCIÓN: cebador sWSS999 de PCR específico para sitio marcado en la secuencia.

(iii): HIPOTÉTICO: NO

(iv): ANTISENTIDO: NO

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A): ORGANISMO: ser humano

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 53:

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 54:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 19 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (cebador)

(iii): HIPOTÉTICO: NO

(iv): ANTISENTIDO: NO

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A): ORGANISMO: ser humano

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 54:

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 55:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 22 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (cebador)

(A): DESCRIPCIÓN: cebador sWSS1751 de PCR específico para sitio marcado en la secuencia.

(iii): HIPOTÉTICO: NO

(iv): ANTISENTIDO: NO

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A): ORGANISMO: ser humano

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 55:

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 56:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (cebador)

(iii): HIPOTÉTICO: NO

(iv): ANTISENTIDO: NO

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A): ORGANISMO: ser humano

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 56:

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 57:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 18 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (cebador)

(A): DESCRIPCIÓN: cebador sWSS1174 de PCR específico para sitio marcado en la secuencia.

(iii): HIPOTÉTICO: NO

(iv): ANTISENTIDO: NO

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A): ORGANISMO: ser humano

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 57:

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 58:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 18 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (cebador)

(iii): HIPOTÉTICO: NO

(iv): ANTISENTIDO: NO

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A): ORGANISMO: ser humano

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 58:

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 59:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 19 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (cebador)

(A): DESCRIPCIÓN: cebador sWSS2061 de PCR específico para sitio marcado en la secuencia.

(iii): HIPOTÉTICO: NO

(iv): ANTISENTIDO: NO

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A): ORGANISMO: ser humano

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 59:

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 60:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (cebador)

(iii): HIPOTÉTICO: NO

(iv): ANTISENTIDO: NO

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A): ORGANISMO: ser humano

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 60:

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 61:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 18 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (cebador)

(A): DESCRIPCIÓN: cebador sWSS2588 de PCR específico para sitio marcado en la secuencia.

(iii): HIPOTÉTICO: NO

(iv): ANTISENTIDO: NO

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A): ORGANISMO: ser humano

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 61:

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 62:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 18 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (cebador)

(iii): HIPOTÉTICO: NO

(iv): ANTISENTIDO: NO

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A): ORGANISMO: ser humano

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 62:

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 63:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 24 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (cebador)

(A): DESCRIPCIÓN: cebador sWSS808 de PCR específico para sitio marcado en la secuencia.

(iii): HIPOTÉTICO: NO

(iv): ANTISENTIDO: NO

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A): ORGANISMO: ser humano

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 63:

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 64:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 23 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (cebador)

(iii): HIPOTÉTICO: NO

(iv): ANTISENTIDO: NO

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A): ORGANISMO: ser humano

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 64:

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 65:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 18 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (cebador)

(A): DESCRIPCIÓN: cebador sWSS1392 de PCR específico para sitio marcado en la secuencia.

(iii): HIPOTÉTICO: NO

(iv): ANTISENTIDO: NO

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A): ORGANISMO: ser humano

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 65:

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 66:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 18 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (cebador)

(iii): HIPOTÉTICO: NO

(iv): ANTISENTIDO: NO

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A): ORGANISMO: ser humano

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 66:

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 67:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 18 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (cebador)

(A): DESCRIPCIÓN: cebador sWSS1148 de PCR específico para sitio marcado en la secuencia.

(iii): HIPOTÉTICO: NO

(iv): ANTISENTIDO: NO

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A): ORGANISMO: ser humano

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 67:

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 68:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 19 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (cebador)

(iii): HIPOTÉTICO: NO

(iv): ANTISENTIDO: NO

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A): ORGANISMO: ser humano

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 68:

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 69:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 18 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (cebador)

(A): DESCRIPCIÓN: cebador sWSS1529 de PCR específico para sitio marcado en la secuencia.

(iii): HIPOTÉTICO: NO

(iv): ANTISENTIDO: NO

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A): ORGANISMO: ser humano

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 69:

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 70:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 18 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (cebador)

(iii): HIPOTÉTICO: NO

(iv): ANTISENTIDO: NO

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A): ORGANISMO: ser humano

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 70:

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 71:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (cebador)

(A): DESCRIPCIÓN: cebador sWSS2619 de PCR específico para sitio marcado en la secuencia.

(iii): HIPOTÉTICO: NO

(iv): ANTISENTIDO: NO

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A): ORGANISMO: ser humano

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 71:

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 72:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (cebador)

(iii): HIPOTÉTICO: NO

(iv): ANTISENTIDO: NO

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A): ORGANISMO: ser humano

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 72:

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 73:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 18 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (cebador)

(A): DESCRIPCIÓN: cebador sWSS404 de PCR específico para sitio marcado en la secuencia.

(iii): HIPOTÉTICO: NO

(iv): ANTISENTIDO: NO

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A): ORGANISMO: ser humano

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 73:

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 74:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 18 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (cebador)

(iii): HIPOTÉTICO: NO

(iv): ANTISENTIDO: NO

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A): ORGANISMO: ser humano

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 74:

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 75:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 18 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (cebador)

(A): DESCRIPCIÓN: cebador sWSS2367 de PCR específico para sitio marcado en la secuencia.

(iii): HIPOTÉTICO: NO

(iv): ANTISENTIDO: NO

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A): ORGANISMO: ser humano

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 75:

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 76:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 18 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (cebador)

(iii): HIPOTÉTICO: NO

(iv): ANTISENTIDO: NO

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A): ORGANISMO: ser humano

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 76:

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 77:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (cebador)

(A): DESCRIPCIÓN: marcador UT528

(iii): HIPOTÉTICO: NO

(iv): ANTISENTIDO: NO

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A): ORGANISMO: ser humano

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 77:

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 78:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (cebador)

(A): DESCRIPCIÓN: marcador UT528

(iii): HIPOTÉTICO: NO

(iv): ANTISENTIDO: NO

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A): ORGANISMO: ser humano

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 78:

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 79:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (cebador)

(A): DESCRIPCIÓN: marcador AFMa065zg9

(iii): HIPOTÉTICO: NO

(iv): ANTISENTIDO: NO

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A): ORGANISMO: ser humano

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 79:

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 80:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 19 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (cebador)

(A): DESCRIPCIÓN: marcador AFMa065zg9

(iii): HIPOTÉTICO: NO

(iv): ANTISENTIDO: NO

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A): ORGANISMO: ser humano

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 80:

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 81:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 19 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (cebador)

(A): DESCRIPCIÓN: marcador AFMa125whl

(iii): HIPOTÉTICO: NO

(iv): ANTISENTIDO: NO

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A): ORGANISMO: ser humano

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 81:

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 82:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (cebador)

(A): DESCRIPCIÓN: marcador AFMa125whl

(iii): HIPOTÉTICO: NO

(iv): ANTISENTIDO: NO

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A): ORGANISMO: ser humano

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 82:

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 83:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (cebador)

(A): DESCRIPCIÓN: marcador AFM309yf10

(iii): HIPOTÉTICO: NO

(iv): ANTISENTIDO: NO

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A): ORGANISMO: ser humano

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 83:

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 84:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (cebador)

(A): DESCRIPCIÓN: marcador AFM309yf10

(iii): HIPOTÉTICO: NO

(iv): ANTISENTIDO: NO

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A): ORGANISMO: ser humano

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 84:

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 85:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 16 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (cebador)

(A): DESCRIPCIÓN: marcador AFM218xf10

(iii): HIPOTÉTICO: NO

(iv): ANTISENTIDO: NO

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A): ORGANISMO: ser humano

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 85:

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 86:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (cebador)

(A): DESCRIPCIÓN: marcador AFM218xf10

(iii): HIPOTÉTICO: NO

(iv): ANTISENTIDO: NO

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A): ORGANISMO: ser humano

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 86:

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 87:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 16 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (cebador)

(A): DESCRIPCIÓN: marcador AFM206xc1

(iii): HIPOTÉTICO: NO

(iv): ANTISENTIDO: NO

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A): ORGANISMO: ser humano

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 87:

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 88:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (cebador)

(A): DESCRIPCIÓN: marcador AFM206xc1

(iii): HIPOTÉTICO: NO

(iv): ANTISENTIDO: NO

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A): ORGANISMO: ser humano

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 88:

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 89:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 16 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (cebador)

(A): DESCRIPCIÓN: marcador AFM199xh12

(iii): HIPOTÉTICO: NO

(iv): ANTISENTIDO: NO

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A): ORGANISMO: ser humano

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 89:

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 90:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 17 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (cebador)

(A): DESCRIPCIÓN: marcador AFM199xh12

(iii): HIPOTÉTICO: NO

(iv): ANTISENTIDO: NO

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A): ORGANISMO: ser humano

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 90:

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 91:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (cebador)

(A): DESCRIPCIÓN: marcador AFMa345wc9

(iii): HIPOTÉTICO: NO

(iv): ANTISENTIDO: NO

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A): ORGANISMO: ser humano

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 91:

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 92:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (cebador)

(A): DESCRIPCIÓN: marcador AFMa345wc9

(iii): HIPOTÉTICO: NO

(iv): ANTISENTIDO: NO

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A): ORGANISMO: ser humano

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 92:

(B): UBICACIÓN: 41..478

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 94:

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 93:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 24 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (cebador)

(A): DESCRIPCIÓN: cebador para gen de ratón Pax4

(iii): HIPOTÉTICO: NO

(iv): ANTISENTIDO: NO

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A): ORGANISMO: murino

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 93:

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 94:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 491 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: doble

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(A): DESCRIPCIÓN: met ob de murino recombinante

(iii): HIPOTÉTICO: NO

(iv): ANTISENTIDO: NO

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A): ORGANISMO: murino

(ix): ASPECTO:

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 95:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 146 aminoácidos

10: (B) TIPO: aminoácido

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(A): DESCRIPCIÓN: proteína met ob de murino recombinante

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 95:

5

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 96:

10: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 454 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: doble

(D): TOPOLOGÍA: lineal

15: (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN

(A): DESCRIPCIÓN: met ob humano recombinante

(iii): HIPOTÉTICO: NO

(iv): ANTISENTIDO: NO

(vi): FUENTE ORIGINAL:

5: (A) ORGANISMO: ser humano

(ix): ASPECTO:

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

(B): UBICACIÓN: 4..444

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 96:

10

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 97:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 147 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

5: (D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(A): DESCRIPCIÓN: proteína met ob humana recombinante

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 97:

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 98:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

15: (A) LONGITUD: 21 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(v): TIPO DE FRAGMENTO: His-tag N-terminal

5: (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 98:

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 99:

10: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 20 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

15: (v) TIPO DE FRAGMENTO: His-tag N-terminal

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 99:

Claims

REIVINDICACIONES

1. Polipéptido OB, que puede modular el peso corporal, seleccionado del grupo que consiste en:

(a)

un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NOS: 2, 4, 5 ó 6;

(b)

un fragmento biológicamente activo de polipéptido de (a), en el que dicho fragmento biológicamente activo modula el peso corporal de un animal.
2.

Fragmento biológicamente activo de un polipéptido OB según la reivindicación 1, en el que dicho fragmento activo es un fragmento inmunogénico de cualquiera de SEQ ID NOS: 2, 4, 5 ó 6, y además en el que dicho fragmento inmunogénico tiene al menos 10 aminoácidos de longitud y puede generar anticuerpos específicos frente al polipéptido OB.
3.

Polipéptido OB, según la reivindicación 1, seleccionado del grupo que consiste en polipéptidos de SEQ ID NO: 2, 4, 5 ó 6, en el que (según la numeración de SEQ ID NO: 4):

(a)

uno o más residuos en las posiciones 121 a 128 están omitidos;

(b)

están omitidos los residuos 1-116;

(c)

están omitidos los residuos 1-21 y 54 a 167;

(d)

están omitidos los residuos 1-60 y 117 a 167;

(e)

están omitidos los residuos 1-60; o

(f)

están omitidos los residuos 1-53.
4.

Polipéptido OB según la reivindicación 3, en el que dicho polipéptido comprende además una metionina Nterminal.
5.

Polipéptido OB recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
6.

Polipéptido OB sintetizado químicamente, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
7.

Polipéptido OB según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que tiene uno o más restos químicos unidos al mismo, en el que el resto químico es un polímero soluble en agua.
8.

Polipéptido OB según la reivindicación 7, en el que el polímero soluble en agua es polietilenglicol.
9.

Polipéptido OB según la reivindicación 8, que está mono-, di-, tri- o tetrapegilado.
10.

Polipéptido OB según la reivindicación 9, que está monopegilado N-terminal.
11.

Polipéptido OB según la reivindicación 10, que es un polipéptido OB que comprende los residuos de aminoácido 22 a 167 de SEQ ID NO:4, o los residuos 22 a 166 de SEQ ID NO: 6.
12.

Polipéptido OB según la reivindicación 1 ó 10, que es un polipéptido OB que comprende la secuencia de aminoácidos de los residuos 22 a 167 de SEQ ID NO: 4 o los residuos 22 a 166 de SEQ ID NO: 6, y además en el que una metionina está en la posición 21.
13.

Molécula de ácido nucleico, que codifica para un polipéptido OB según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.
14.

Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 13 que comprende la secuencia codificante de proteína de SEQ ID NO: 3.
15.

Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 13, que comprende la secuencia que codifica los aminoácidos 22 a 167 de SEQ ID NO: 3.
16.

Molécula de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, en la que dicha molécula de ácido nucleico está marcada de manera detectable.
17.

Oligonucleótido que se selecciona del grupo que consiste en: HOB 1gF 5' -CCCAAGAAGCCCATCCTG-3' (SEQ ID NO: 29); HOB 1gR 5' -GACTATCTGGGTCCAGTGCC-3' (SEQ ID NO: 30); HOB 2gF 5' -CCACATGCTGAGCACTTGTT-3' (SEQ ID NO: 31); y

HOB 2gR 5' -CTTCAATCCTGGAGATACCTGG-3' (SEQ ID NO: 32).
18.

Vector que comprende una molécula de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15.
19.

Vector según la reivindicación 18, que es un vector de expresión que comprende una molécula de ADN según la reivindicación 13, asociada operativamente con una secuencia de control de expresión.
20.

Hospedador unicelular transformado o transfectado con una molécula de ADN según la reivindicación 13, o con un vector de expresión según la reivindicación 19.
21.

Hospedador unicelular según la reivindicación 20, en el que el hospedador unicelular se selecciona del grupo que consiste en bacterias, levaduras, células de mamíferos, células vegetales, células de insectos y células humanas en cultivo de tejido.
22.

Hospedador unicelular según la reivindicación 21, en el que el hospedador unicelular se selecciona del grupo que consiste en E. coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, levadura, y células CHO, RI.1, B-W, LM, COS 1. COS 7, BSC1, BSC40, BMT10 y Sf9.
23.

Hospedador unicelular según la reivindicación 21, en el que el hospedador unicelular es un hospedador de levadura seleccionado del grupo que consiste en Saccharomyces, Pichia, Candida, Hansenula y Torulopsis.
24.

Célula hospedadora según la reivindicación 21, en la que la secuencia de control de expresión es una secuencia de control de expresión de polipéptido OB.
25.

Célula hospedadora según la reivindicación 24, en la que el inserto de secuencia de control de expresión es heteróloga a la secuencia que codifica para el polipéptido OB.
26.

Método para preparar un polipéptido OB según cualquiera de las reivindicaciones 1-4 que puede modular el peso corporal que comprende:

(a)

cultivar una célula según cualquiera de las reivindicaciones 20 a 25, en condiciones que proporcionan la expresión de polipéptido OB; y

(b)

recuperar el polipéptido OB expresado.
27.

Método según la reivindicación 26, en el que la célula es una bacteria o una levadura.
28.

Método según la reivindicación 26 ó 27, que comprende además:

(c)

cromatografiar el polipéptido OB en una columna de quelación de Ni; y

(d)

purificar el polipéptido OB mediante filtración con gel.
29.

Método según la reivindicación 28, que comprende además, después de la etapa (c) y antes de la etapa (d) cromatografiar el polipéptido OB en una columna de intercambio de cationes fuerte.
30.

Anticuerpo específico para un polipéptido OB, que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NOS: 2, 4, 5 ó 6.
31.

Anticuerpo según la reivindicación 30, que es un anticuerpo monoclonal o policlonal.
32.

Anticuerpo según la reivindicación 31, marcado con un marcador detectable.
33.

Línea celular inmortal que produce un anticuerpo monoclonal según la reivindicación 32.
34.

Método para preparar un anticuerpo específico para un polipéptido OB según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, que comprende:

(a)

conjugar un polipéptido OB según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, o producido por el método de las reivindicaciones 28 a 31, a una proteína portadora;

(b)

inmunizar un animal hospedador con el conjugado de fragmento de polipéptido OB-proteína portadora de la etapa (a), mezclado con un adyuvante; y

(c)

obtener el anticuerpo del animal hospedador inmunizado.
35.

Método para medir la presencia de un polipéptido OB según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en una muestra, que comprende:

(a)

poner en contacto una muestra que se sospecha que tiene un polipéptido OB, con un anticuerpo que se une específicamente al polipéptido OB en condiciones que permiten la formación de complejos de reacción que comprenden el anticuerpo y el polipéptido OB; y

(b)

detectar la formación de los complejos de reacción que comprenden el anticuerpo y el polipéptido OB en la muestra; en el que la detección de la formación de los complejos de reacción indica la presencia de polipéptido OB en la muestra.
36.

Método según la reivindicación 35, en el que el anticuerpo está unido a un soporte de fase sólida.
37.

Método in vitro para evaluar el nivel de polipéptido OB según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en una muestra biológica, que comprende:

(a)

detectar la formación de complejos de reacción en una muestra biológica, según el método de la reivindicación 34 ó 35; y

(b)

evaluar la cantidad de complejos de reacción formados, cantidad de complejos de reacción que corresponde al nivel de polipéptido OB en la muestra biológica.
38.

Método in vitro para detectar o diagnosticar la presencia de una enfermedad asociada con niveles elevados

o disminuidos de polipéptido OB en un sujeto mamífero, que comprende:

(a)

evaluar el nivel de polipéptido OB en una muestra biológica de un sujeto mamífero según la reivindicación 35; y

(b)

comparar el nivel detectado en el etapa (a) con un nivel de polipéptido OB presente en sujetos normales

o en el mismo sujeto en un tiempo anterior; en el que un incremento en el nivel de polipéptido OB, en comparación con niveles normales, indica una enfermedad asociada con niveles elevados de polipéptido OB; y un nivel disminuido de polipéptido OB, en comparación con niveles normales, indica una enfermedad asociada con niveles disminuidos de polipéptido OB.
39.

Método in vitro para monitorizar un tratamiento terapéutico de una enfermedad asociada con niveles elevados o disminuidos de polipéptido OB según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en un sujeto mamífero, que comprende evaluar los niveles de polipéptido OB en una serie de muestras biológicas obtenidas en diferentes puntos de tiempo, de un sujeto mamífero que está sometido a un tratamiento terapéutico para una enfermedad asociada con niveles elevados o disminuidos de polipéptido OB, según el método de la reivindicación 37.
40.

Composición farmacéutica, que comprende un polipéptido OB según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 y un portador farmacéuticamente aceptable.
41.

Composición farmacéutica según la reivindicación 40, para reducir el peso corporal de un animal.
42.

Composición cosmética que mejora la apariencia del cuerpo, para reducir el peso corporal de un individuo, que comprende un polipéptido OB según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y un portador aceptable.
43.

Molécula de ácido nucleico que codifica para un polipéptido OB según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para su uso en la modificación del peso corporal de un animal.
44.

Polipéptido OB según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para su uso en la modificación del peso corporal de un animal.
45.

Polipéptido OB según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para su uso en la modificación del peso corporal de un mamífero, en el tratamiento de un trastorno seleccionado del grupo que consiste en diabetes, tensión arterial alta y elevado colesterol.
46.

Polipéptido OB según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para su uso en la modificación del peso corporal de un mamífero, para su uso en combinación con un medicamento para tratar la diabetes, tensión arterial alta y elevado colesterol.
47.

Polipéptido OB según la reivindicación 12, en el que el polipéptido OB es SEQ ID NO.97.