CN102257136A

CN102257136A - 嵌合dna聚合酶

Info

Publication number: CN102257136A
Application number: CN2009801510634A
Authority: CN
Inventors: 比亚内·弗尔霍尔姆; 保罗·迈克瓦恩; 威廉·布尔恩; 加文·拉什
Original assignee: Kapa Biosystems Inc
Current assignee: Kapa Biosystems Inc
Priority date: 2008-11-03
Filing date: 2009-11-03
Publication date: 2011-11-23
Also published as: US20120115188A1; HK1216032A1; US20140363848A1; JP2015154787A; JP2017029172A; US9023633B2; EP2352818B1; EP2927317A1; CA2742593C; JP2012507986A; WO2010062776A3; WO2010062776A2; CA2742593A1; ES2571446T3; US9388396B2; EP2352818A4; JP6150847B2; EP2352818A2; ES2716402T3; EP2927317B1

Abstract

本发明尤其提供了嵌合DNA聚合酶，该嵌合DNA聚合酶包括具有来自至少两种DNA聚合酶的序列的异源域，所述至少两种DNA聚合酶具有至少一种不同的功能特性(例如，延伸率、持续合成能力、错误率或保真性、盐耐受性或抗性)，以及制备和应用嵌合DNA聚合酶的方法。在一些实施方式中，本发明可以在嵌合聚合酶中结合不同DNA聚合酶的期望的功能特性(例如，高持续合成能力；高延伸率；热稳定性；对盐、PCR添加物(例如，PCR增强子)以及其它杂质的抗性；以及高保真性)。

Description

嵌合DNA聚合酶

本申请要求于2008年11月3日提交的美国临时专利申请序列号61/110,862的优先权，将其全部披露内容以引用方式结合于本文。

背景技术

DNA聚合酶是使用单链DNA作为模板来合成互补DNA链的酶。尤其是，DNA聚合酶可以将游离核苷酸添加到新形成链的3’端，从而导致新链在5’-3’方向的延伸。一些DNA聚合酶可以校正在新合成的DNA中的错误。该过程称作错误校正(纠错)。这些聚合酶可以识别错误地加入(结合)的核苷酸并且酶的3’-＞5’核酸外切酶(外切核酸酶)活性允许切除不正确的核苷酸(该活性称作校对)。在碱基切除以后，聚合酶可以重新插入正确碱基并且复制可以继续。与如果合成仅是碱基配对选择步骤的结果相比，校对功能使DNA复制具有高得多的保真性(fidelity)。Brutlag，D.and Kornberg，A.，J. Biol.Chem.，247：241-248(1972)。当与具有非校对核酸外切酶的聚合酶相比时，具有3’-5’校对核酸外切酶活性的DNA聚合酶具有显著更低的错误率。Chang，L.M.S.，J.Biol.Chem.，252：1873-1880(1977)。然而，有时，这些聚合酶的优点被它的相对低的持续合成能力(processivity)(其会降低DNA扩增产物的产率)所抵消。

发明内容

本发明包括以下发现：在嵌合酶中，域切换(功能区切换，domainswapping)可以结合不同DNA聚合酶的期望的功能特性(例如，高持续合成能力，高延伸率，热稳定性，对盐、PCR添加物(例如，PCR增强子)以及其它杂质的抗性，以及高保真性)。因此，本发明尤其提供了稳健、快速以及准确的DNA聚合酶，用于DNA扩增、合成、检测、测序以及其它重要的重组DNA技术。

在一个方面，本发明提供了嵌合聚合酶，该嵌合聚合酶包含第一域(第一结构域)，其具有至少80％(例如，至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)相同于在第一DNA聚合酶(特征在于高持续合成能力、延伸率、抗盐性、热稳定性或TMAC耐受性)中发现的氨基酸序列的序列；以及第二域，其具有至少80％(例如，至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)相同于在第二DNA聚合酶(特征在于高保真性)中发现的氨基酸序列的序列，其中嵌合聚合酶的特征在于高保真性和高持续合成能力、延伸率、或抗盐性。如在本文中所使用的，术语“高持续合成能力”是指借助于模板的持续合成能力高于20nts(例如，高于40nts、60nts、80nts、100nts、120nts、140nts、160nts、180nts、200nts、220nts、240nts、260nts、280nts、300nts、320nts、340nts、360nts、380nts、400nts、或更高)/缔合/解离。如在本文中所使用的，术语“高延伸率”是指高于25nt/s(例如，高于30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140nt/s)的延伸率。如在本文中所使用的，术语“高抗盐性”是指在高于30mM(例如，高于35mM、40mM、45mM、或50mM)的盐浓度下DNA聚合酶基本上保持它的酶活性的能力。如在本文中所使用的，术语“高保真性”是指错误率小于4.45×10^-6(例如，小于4.0×10^-6、3.5×10^-6、3.0×10^-6、2.5×10^-6、2.0×10^-6、1.5×10^-6、1.0×10^-6、0.5×10^-6)突变/nt/加倍。如在本文中所使用的，术语“高TMAC耐受性”是指在高于10mM(例如，高于15mM、20mM、25mM、30mM)的TMAC(四甲基氯化铵)浓度下DNA聚合酶基本上保持它的酶活性的能力。如在本文中所使用的，术语“高热稳定性”是指在98℃下在大于30分钟温育(例如，45分钟、60分钟、90分钟、180分钟、210分钟、240分钟)以后DNA聚合酶基本上保持它的酶活性的能力。术语“持续合成能力”、“延伸率”、“保真性”、“抗盐性”、“TMAC耐受性”、以及“热稳定性”在定义部分中进一步定义。

在一些实施方式中，适合于本发明的示例性第一DNA聚合酶包括但不限于KOD聚合酶、TNAl聚合酶、热球菌属9度N-7、T4、T7、或phi29。在一些实施方式中，第一DNA聚合酶是KOD聚合酶。在一些实施方式中，适合于本发明的示例性第二DNA聚合酶包括但不限于分离自激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)、深海热球菌(P.abyssi)、T.gorgonarius、超级嗜热菌(T.litoralis)、速生热球菌(T.zilligi)i、热球菌属GT(T.sp.GT)、或火球菌属GB-D(P.sp.GB-D)的聚合酶。在一些实施方式中，第二DNA聚合酶是Pfu聚合酶。在具体实施方式中，第一DNA聚合酶是KOD聚合酶而第二DNA聚合酶是Pfu聚合酶。

在一些实施方式中，合适的第一域是核酸外切酶域、N-末端域、和/或拇指域。在一些实施方式中，合适的第二域是掌域和/或指域。

在一些实施方式中，在第一DNA聚合酶中发现的氨基酸序列对应于KOD聚合酶(SEQ ID NO：11)的氨基酸残基26至105、KOD聚合酶(SEQ ID NO：11)的氨基酸残基156至301、和/或KOD聚合酶(SEQ ID NO：11)的氨基酸残基612至749。

在一些实施方式中，在第二DNA聚合酶中发现的氨基酸序列对应于Pfu聚合酶(SEQ ID NO：9)的氨基酸残基394至563。

在一些实施方式中，根据本发明的嵌合聚合酶包括具有共有序列的第一域(第一结构域)，所述共有序列选自由以下组成的组

XXLXXXXXXXEGXRXXXXXXVXXXXXDXXXTXXXXXXXXXXVVKXXXXXVLIXXXXXNXXXAXXKXXCXXXXXNFALXXXXXXXXXXXXIXXMXXRFXXXXXXXXXXXXXPXXRXXXXXXXXXXXXXXXXVXXQXXXXXXXEXXTTXXXT(SEQ IDNO：30)，其中X是任何氨基酸或肽键；

XXEXXXXYXXXXEXXFXXXXKXXXAXXXXXXXXAXXXXTVXTVKRXXXXQXXXXXRXVEXXXXXFTXXXXXXAXXDXIXXXXX(SEQ ID NO：31)，其中X是任何氨基酸或肽键；

XXXXXXXXXXXXXXXXALXXDXXXXKXXXXXXXXTEXXSKXXVXXXXXVXHXXXXXDXKDXXXTXXXXXXXXRXXXRXXXXRXXTXXSXXXXKXSXRXGDXXXPFDXFXXTXXXXXXXXXXXXXXXXXXEXXXRAXX(SEQ ID NO：32)，其中X是任何氨基酸或肽键；

NGX₁FKIEX₂DRTFX₃PYX₄YALLX₅DDSX₆IEEVKKITX₇ERHGX₈X₉VX₁₀X₁₁X₁₂X₁₃VEKVX₁₄KKFLGX₁₅PX₁₆X₁₇VWKLYX₁₈X₁₉HPQDVPX₂₀IRX₂₁KX₂₂REHPA(SEQ ID NO：33)，其中X₁不是K；X₂不是H；X₃不是R；X₄不是I；X₅不是R；X₆不是K；X₇不是G；X₈不是K；X₉不是I；X₁₀不是R；X₁₁不是I；X₁₂不是V；X₁₃不是D；X₁₄不是E；X₁₅不是K；X₁₆不是I；X₁₇不是T；X₁₈不是L；X₁₉不是E；X₂₀不是T；X₂₁不是E；以及X₂₂不是V；

PIX₁MISYADEX₂X₃AX₄VITWKNX₅DLPYVX₆VVSX₇EREMIKRFLRX₈X₉X₁₀EKDPDX₁₁X₁₂X₁₃TYNGDX₁₄FDFX₁₅YLX₁₆KRX₁₇EKLGIX₁₈X₁₉X₂₀X₂₁GRDGSEPKX₂₂QRX₂₃GDX₂₄X₂₅AVEVKGRIHFDLYX₂₆VIX₂₇RTINLPTYTLEAVYEAX₂₈FGX₂₉PKEKVYAX₃₀EIX₃₁X₃₂AWEX₃₃(SEQ ID NO：34)，其中X₁不是I；X₂不是N；X₃不是E；X₄不是K；X₅不是I；X₆不是E；X₇不是S；X₈不是I；X₉不是I；X₁₀不是R；X₁₁不是I；X₁₂不是I；X₁₃不是V；X₁₄不是S；X₁₅不是P；X₁₆不是A；X₁₇不是A；X₁₈不是K；X₁₉不是L；X₂₀不是T；X₂₁不是I；X₂₂不是M；X₂₃不是I；X₂₄不是M；X₂₅不是T；X₂₆不是H；X₂₇不是T；X₂₈不是I；X₂₉不是K；X₃₀不是D；X₃₁不是A；X₃₂不是K；以及X₃₃不是S；

RDWSEIAKETQARVLEX₁X₂LKX₃GDVEX₄AVRIVKEVX₅X₆KLX₇X₈YEX₉PPEKLX₁₀IX₁₁EQITRX₁₂LX₁₃X₁₄YKAX₁₅GPHVAVAKX₁₆LAAX₁₇GVKIX₁₈PGX₁₉VIX₂₀YIVLX₂₁GX₂₂GX₂₃IX₂₄X₂₅RAIX₂₆X₂₇X₂₈EX₂₉DPX₃₀KHKYDAEYYIENQVLPAVX₃₁RILX₃₂X₃₃FG(SEQID NO：35)，其中X1不是T；X₂不是I；X₃不是H；X₄不是E；X₅不是I；X₆不是Q；X₇不是A；X₈不是N；X₉不是I；X₁₀不是A；X₁₁不是Y；X₁₂不是P；X₁₃不是H；X₁₄不是E；X₁₅不是I；X₁₆不是K；X₁₇不是K；X₁₈不是K；X₁₉不是M；X₂₀不是G；X₂₁不是R；X₂₂不是D；X₂₃不是P；X₂₄不是S；X₂₅不是N；X₂₆不是L；X₂₇不是A；X₂₈不是E；X₂₉不是Y；X₃₀不是K；X₃₁不是L；X₃₂不是E；以及X₃₃不是G；

以及它们的组合；

以及具有共有序列的第二域，所述共有序列选自由以下组成的组

XKXXXXXXXXXXXXAXXXXXXXXXXXXXXXXXLXXXXNXXIXXXXXXKXXXXIXXXXXXXXXHXXXXXXXXXTXXXEXQXXXXKIXXXXXXKXXXLXXXXFXXXXXXXKXXXXXXXXXXXXXXXXXKXXELVWXXLXXXFXXXXLXIXXXXLYXXXXXGESXEIXXXXLX(SEQ ID NO：36)，其中X是任何氨基酸或肽键；

EX₁GLWENIVYLDFRX₂LYPSIIITHNVSPDTLNX₃EGCKX₄YDX₅APQVGHX₆FCKDX₇PGFIPSLLGX₈LLEERQKIKX₉KMKX₁₀TX₁₁DPIEX₁₂X₁₃LLDYRQX₁₄AIKX₁₅LANSX₁₆YGYYGYAX₁₇ARWYCKECAESVTAWGRX₁₈YIX₁₉X₂₀X₂₁X₂₂KEX₂₃EEKX₂₄GFKVX₂₅YX₂₆DTDGX₂₇X₂₈ATIPGX₂₉X₃₀X₃₁EX₃₂X₃₃KKKAX₃₄E(SEQ ID NO：37)，其中X₁不是R；X₂不是S；X₃不是R；X₄不是E；X₅不是V；X₆不是R；X₇不是F；X₈不是D；X₉不是K；X₁₀不是A；X₁₁不是I；X₁₂不是R；X₁₃不是K；X₁₄不是R；X₁₅不是I；X₁₆不是Y；X₁₇不是R；X₁₈不是E；X₁₉不是T；X₂₀不是M；X₂₁不是T；X₂₂不是I；X₂₃不是I；X₂₄不是Y；X₂₅不是I；X₂₆不是S；X₂₇不是F；X₂₈不是F；X₂₉不是A；X₃₀不是D；X₃₁不是A；X₃₂不是T；X₃₃不是V；X₃₄不是M，

以及它们的组合，

其中嵌合聚合酶的特征在于高保真性和高持续合成能力、延伸率、抗盐性、TMAC或其它PCR增强子耐受性或热稳定性。

在一些实施方式中，根据本发明的嵌合聚合酶通过以下共有序列来定义

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(SEQ ID NO：38)，其中X是任何氨基酸或肽键，并且其中嵌合聚合酶具有高于KOD的保真性和高于Pfu的持续合成能力、延伸率、抗盐性、TMAC或其它PCR增强子耐受性或热稳定性。

XIXDTDYXTXDGXPXXRIFXKXXGEFXXXYDXXFEPYFYALLKDDSAIXXXXXXXAXRHGTVXTVKRXXXXQXKFLXRXVEVWXLXFTHPQDVPAXXDXIXXHXXVIDIYEYDIPFAKRYLIDXGLVPMEGDEXLXMXXXDIETXYHEGXEFAEGXXLMISYADXEGARVITWKXVDLPYVDVVSTEXEMIKRXXXVVKEKDPDVLIXYXGDNFDXAYLKXRCEXLGXNFALXRXXXXXEPKIXXMGXRFAVEXKGRXHFDLXPXXRXTXNLPTYXLXXVYEXVXGQXKXKXXXEEITTXWETXXXXXXXARYSMEDAXVTXELGXEFXPMEAXLXXLVGXPXWDVXRSSTGNLVEWXLLXXAYXRNEVAPNKPSXEEYQXRXXEXYTGXFVXEPEKGLWXXXXXLDXXALYPSIIXXHNVSPDTLXLEXCXNYDIAPXVGXKFCKDIPGFIPSXLXHLXXXRQXXKTXMXEXQDPXEKIXLDYRQKAXKLLXNSFYGYXGYXKARWYXXECAESVTXWGRKYIELVWXELEXXFGFKXLYIDTDGLYATIPGGESXEIKXXXLXFLXYINAXLPGALELEYEXFYXRGFFVXKKKYAXIDEEXXITTRGLEXVRRDWSXXAKETXAXVLEALLXDXXVXKAVXXVXXXTEXXSKYXVPXEKLVIHEQITRDXKDYXATGPHVAXAKRLXXRGXXXRPGTXISYXXLKGSGRXGDRXIPFDEFXXTKHXYDXXYYIENQVLPAVERXLRAFGYXXXXLXXQXXXQXGLSAWXKPXGT(SEQ ID NO：39)，其中X是任何氨基酸或肽键。

在一些实施方式中，本发明进一步提供了嵌合聚合酶，该嵌合聚合酶包含第一域，其具有至少80％(例如，至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)相同于在第一DNA聚合酶的核酸外切酶域、N-末端域、和/或拇指域中发现的氨基酸序列的序列；以及第二域，其具有至少80％(例如，至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)相同于在第二DNA聚合酶的掌和/或指域中发现的氨基酸序列的序列。在一些实施方式中，嵌合聚合酶具有高于第二DNA聚合酶的保真性以及高于第一DNA聚合酶的持续合成能力、延伸率、抗盐性、TMAC或其它PCR增强子耐受性或热稳定性。

在另一方面，本发明提供了用于设计(基因改造，engineering)嵌合聚合酶的方法。根据本发明的方法包括以下步骤：(a)提供基于第一DNA聚合酶的N-末端域、核酸外切酶域、和/或拇指域；(b)提供基于第二DNA聚合酶的掌和/或指域；(c)结合(组合)来自步骤(a)和步骤(b)的域以形成嵌合聚合酶；其中嵌合聚合酶具有高于第一DNA聚合酶的保真性以及高于第二DNA聚合酶的持续合成能力、延伸率、抗盐性、TMAC或其它PCR增强子耐受性或热稳定性。在一些实施方式中，根据本发明设计(engineered)的嵌合聚合酶具有基本上类似于第一DNA聚合酶的持续合成能力、延伸率、抗盐性、TMAC或其它PCR增强子耐受性或热稳定性以及基本上类似于第二DNA聚合酶的保真性。

在一些实施方式中，适合于本发明的示例性第一DNA聚合酶包括但不限于KOD聚合酶、TNAl聚合酶、热球菌属9度N-7、T4、T7、或phi29。在一些实施方式中，第一DNA聚合酶是KOD聚合酶。在一些实施方式中，适合于本发明的示例性第二DNA聚合酶包括但不限于分离自激烈火球菌、深海热球菌、T.gorgonarius、超级嗜热菌(T.litoralis)、速生热球菌(T.zilligii)、热球菌属GT(T.sp.GT)、或火球菌属GB-D(P.sp.GB-D)的聚合酶。在一些实施方式中，第二DNA聚合酶是Pfu聚合酶。

在一些实施方式中，第一DNA聚合酶是KOD聚合酶而第二DNA聚合酶是Pfu聚合酶。在一些实施方式中，第一DNA聚合酶是Pfu聚合酶而第二DNA聚合酶是KOD聚合酶。

在一些实施方式中，本发明提供了改善DNA聚合酶的保真性的方法。在具体实施方式中，根据本发明的方法包括以下步骤：用来自特征在于相对于感兴趣的DNA聚合酶具有更高保真性的不同DNA聚合酶的相应序列替代在感兴趣的DNA聚合酶的掌和/或指域内的序列。

在一些实施方式中，本发明提供了改善DNA聚合酶的持续合成能力、延伸率、抗盐性、TMAC或其它PCR增强子耐受性或热稳定性的方法。在具体实施方式中，根据本发明的方法包括以下步骤：用来自特征在于相对于感兴趣的DNA聚合酶具有更高持续合成能力、延伸率、抗盐性、TMAC或其它PCR增强子耐受性或热稳定性的不同的DNA聚合酶的相应序列，来替代感兴趣的DNA聚合酶的N-末端域、核酸外切酶域和/或拇指域内的序列。

本发明提供了本文描述的各种嵌合聚合酶，包括利用如本文描述的本发明的方法设计(engineered)和/或改善的嵌合聚合酶。在一些实施方式中，根据本发明的嵌合聚合酶包含这样的氨基酸序列，其至少80％相同于SEQ ID NO：16(Kofu氨基酸序列，如在序列部分中所示出的)。在特定实施方式中，根据本发明的嵌合聚合酶包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列。在一些实施方式中，根据本发明的嵌合聚合酶包含这样的氨基酸序列，其至少80％相同于SEQ ID NO：15(Pod氨基酸序列，如在序列部分中所示出的)。在特定实施方式中，根据本发明的嵌合聚合酶包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列。

本发明还提供了包含本文描述的各种嵌合聚合酶的试剂盒和组合物，以及它们的应用(例如，利用本发明的嵌合DNA聚合酶来扩增DNA片段的方法)。此外，本发明提供了编码本文描述的各种嵌合聚合酶的核苷酸序列，以及包含根据本发明的核苷酸序列的载体和/或细胞。

附图说明

附图仅用于说明的目的而不是用于限制目的。

图1示出了在示例性的天然存在的B型DNA聚合酶和示例性的嵌合DNA聚合酶，Kofu和Pod中域的序列对比。在Kofu和Pod嵌合体中被切换的KOD和Pfu聚合酶域示在序列对比上方。

图2示出了示例性的嵌合聚合酶Pod包含Pfu的N-末端域、3’-5’核酸外切酶域和拇指域以及KOD的掌和指域，而相互嵌合的聚合酶Kofu包含KOD的N-末端域、3’-5’核酸外切酶域和拇指域以及Pfu的掌和指域。

图3描绘了示例性的结果，其示出了KOD、Pfu、Kofu以及Pod的热稳定性。

图4描绘了示例性的结果，其示出了KOD、Pfu、Kofu以及Pod的抗盐性。

图5描绘了示例性的结果，其示出了KOD、Pfu、Kofu以及Pod的TMAC耐受性。

定义

氨基酸：如在本文中所使用的，术语“氨基酸”，在其最广泛的意义上，是指可以被加入(结合)到多肽链的任何化合物和/或物质。在一些实施方式中，氨基酸具有一般结构H₂N-C(H)(R)-COOH。在一些实施方式中，氨基酸是天然存在的氨基酸。在一些实施方式中，氨基酸是合成氨基酸；在一些实施方式中，氨基酸是D-氨基酸；在一些实施方式中，氨基酸是L-氨基酸。“标准氨基酸”是指通常在天然存在的肽中发现的任何的二十种标准L-氨基酸。“非标准氨基酸”是指不同于标准氨基酸的任何氨基酸，而不管它是合成制备的或者获自天然来源。如在本文中所使用的，“合成氨基酸”包括化学修饰氨基酸，其包括但不限于盐、氨基酸衍生物(如酰胺)、和/或取代。氨基酸，包括在肽中的羧基末端和/或氨基末端氨基酸，可以通过甲基化、酰胺化、乙酰化、和/或用其它化学基团的取代加以修饰。氨基酸可以参与二硫键。术语“氨基酸”可与“氨基酸残基”互换使用，并且可以指游离氨基酸和/或肽的氨基酸残基。根据其中使用该术语的上下文将显而易见的是，它是指游离氨基酸或肽的残基。应该指出的是，所有氨基酸残基序列在本文中是用化学式表示，其左和右方向是在氨基末端至羧基末端的常规方向。

碱基对(bp)：如在本文中所使用的，碱基对是指在双链DNA分子中腺嘌呤(A)与胸腺嘧啶(T)、或胞嘧啶(C)与鸟嘌呤(G)的伙伴关系(合作关系)。

嵌合聚合酶：如在本文中所使用的，术语“嵌合聚合酶”(也被称为“嵌合体”)是指任何聚合酶，该聚合酶包含两个或更多个异源域、氨基酸序列、肽、和/或蛋白质，其共价或非共价连接以产生在自然界中并不存在的聚合酶。通常，嵌合聚合酶包含连接于第二域的第一域，其中第一域和第二域并不以相同关系存在于自然界中。通常，第一域衍生自第一DNA聚合酶而第二域衍生自第二DNA聚合酶。通常，第一DNA聚合酶和第二DNA聚合酶的特点在于至少一种不同的功能特性(例如，持续合成能力、延伸率、保真性、盐耐受性、相对于PCR添加物的耐受性或热稳定性)。如在本文中所使用的，衍生自感兴趣的DNA聚合酶的序列是指在感兴趣的DNA聚合酶中发现的任何序列、或任何这样的序列，其至少70％(例如，至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)相同于在感兴趣的DNA聚合酶中发现的氨基酸序列。根据本发明的“嵌合聚合酶”可以包含来自相关或类似聚合酶的两个或更多个氨基酸序列(例如，共享类似序列和/或结构的蛋白)，其加以连接以形成新的功能蛋白。根据本发明的“嵌合聚合酶”可以包含来自非相关聚合酶的两个或更多个氨基酸序列，其加以连接以形成新的功能蛋白。例如，本发明的嵌合聚合酶可以是由不同种类的生物体表达的蛋白质结构的“种间”或“基因间”融合。

互补：如在本文中所使用的，术语“互补”是指在两个多核苷酸链的区域之间或在两个核苷酸的区域之间通过碱基配对的序列互补性的广义概念。已知，腺嘌呤核苷酸能够与作为胸腺嘧啶或尿嘧啶的核苷酸形成特定的氢键(“碱基配对”)。类似地，已知，胞嘧啶核苷酸能够与鸟嘌呤核苷酸碱基配对。

DNA结合亲合力：如在本文中所使用的，术语“DNA结合亲合力”通常是指DNA聚合酶在结合DNA核酸方面的活性。在一些实施方式中，可以用二条带移位分析(测定)来测量DNA结合活性。例如，在一些实施方式中(基于Guagliardi等人(1997)J. Mol.Biol.267：841-848的测定)，利用标准方法，用32P标记双链核酸(来自S.solfataricus lacS基因的452-bp HindIII-EcoRV片段)至至少约2.5×10⁷cpm/μg(或至少约4000cpm/fmol)的比活性。参见，例如，Sambrook等人(2001)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(3^rd ed.，Cold Spring HarborLaboratory Press，NY)的9.63-9.75(描述核酸的末端标记)。制备反应混合物，其包含在约10μl结合缓冲液(50mM磷酸钠缓冲液(pH 8.0)、10％甘油、25mMKCl、25mM MgCl₂)中的至少约0.5μg多肽。将反应混合物加热至37℃，时间为10分钟。将约1×10⁴至5×10⁴cpm(或约0.5-2ng)的标记双链核酸加入到反应混合物中并温育另外的10分钟。将反应混合物加载到在0.5X Tris-硼酸盐缓冲液中的天然聚丙烯酰胺凝胶上。在室温下对反应混合物进行电泳。干燥凝胶并利用标准方法对其进行放射自显影。标记的双链核酸的迁移率的任何可检出的减小表明在多肽与双链核酸之间形成了结合复合物。可以利用标准光密度法来量化这样的核酸结合活性以测量相对于在初始反应混合物中的放射性的总量在结合复合物中的放射性的量。测量DNA结合亲合力的其它方法在本领域中是已知的(参见，例如，Kong et al.(1993)J. Biol.Chem.268(3)：1965-1975)。

域：如在本文中所使用的，术语“域”是指多肽(例如，聚合酶)的氨基酸序列，其包含一种或多种定义的功能或性能。

延伸率：如在本文中所使用的，术语“延伸率”是指DNA聚合酶延伸聚合物链的平均速度。如在本文中所使用的，高延伸率是指高于25nt/s的延伸率(例如，高于30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140nt/s)。

酶活性：如在本文中所使用的，术语“酶活性”是指DNA聚合酶的特异性和效率。DNA聚合酶的酶活性也被称为“聚合酶活性”，其通常是指DNA聚合酶在催化多核苷酸的模板定向(导向)合成方面的活性。可以利用本领域中已知的各种技术和方法来测量聚合酶的酶活性。例如，可以在稀释缓冲液(例如，20mM Tris.Cl，pH8.0，50mM KCl，0.5％NP40，以及0.5％吐温-20)中制备连续稀释的聚合酶。对于每次稀释，可以除去5μl并加入到45μl的反应混合物中，所述反应混合物包含25mM TAPS(pH9.25)、50mM KCl、2mM MgCl₂、0.2mM dATP、0.2mM dGTP、0.2mM dTTP、0.1mM dCTP、12.5μg激活的DNA、100μM[α-³²P]dCTP(0.05μCi/nmol)以及无菌去离子水。可以在37℃(或74℃，对于耐热DNA聚合酶)下温育反应混合物10分钟，然后通过立即将反应冷却至4℃并添加10μl冰冷的60mM EDTA来终止。可以从每个反应混合物中除去25μl等分部分。可以通过凝胶过滤(Centri-Sep，Princeton Separations，Adelphia，N.J.)从每个等分部分除去未结合的放射性标记dCTP。可以使柱洗脱液与闪烁液(1ml)混合。借助于闪烁计数器来量化柱洗脱液中的放射性以确定通过聚合酶合成的产物量。一个单位的聚合酶活性可以定义为在30分钟内合成10纳摩尔产物所必要的聚合酶的量(Lawyer et al.(1989)J. Biol.Chem.264：6427-647)。测量聚合酶活性的其它方法在本领域中是已知的(参见，例如，Sambrook et al.(2001)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(3^rd ed.，ColdSpring Harbor Laboratory Press，NY))。

保真性：如在本文中所使用的，术语“保真性”是指通过模板依赖性DNA聚合酶的DNA聚合的精确度。通常通过错误率(加入不准确的核苷酸，即，并不互补于模板核苷酸的核苷酸的频率)来测量DNA聚合酶的保真性。通过聚合酶活性和DNA聚合酶的3’-5’核酸外切酶活性来维持DNA聚合的精确度或保真性。术语“高保真性”是指错误率小于4.45×10^-6(例如，小于4.0×10^-6、3.5×10^-6、3.0×10^-6、2.5×10^-6、2.0×10^-6、1.5×10^-6、1.0×10^-6、0.5×10^-6)突变/nt/加倍。可以利用本领域已知的测定方法来测量DNA聚合酶的保真性或错误率。例如，可以利用在Cline，J.et al.(96)NAR 24：3546-3551中所描述的lacI PCR保真性分析(测定)来测试DNA聚合酶的错误率。简单地说，使用在适当的PCR缓冲液中的2.5U DNA聚合酶(即，为在30分钟内在72℃下加入25nmol的总dNTP所必要的酶的量)，从pPRIAZ质粒DNA扩增编码lacIOlacZa靶基因的1.9kb片段。然后将包含lacI的PCR产物克隆到λGT 10臂中，并用颜色筛选试验来确定lacI突变体的百分比(MF，突变频率)，如(Lundberg，K.S.，Shoemaker，D.D.，Adams，M.W.W.，Short，J.M.，Sorge，J.A.，and Mathur，E.J.(1991)Gene180：1-8)所描述的。错误率表示为突变频率/bp/复制(MF/bp/d)，其中bp是在lacI基因序列(349)中可检测位点的数目而d是有效靶加倍的数目。与上述类似，包含lacIOlacZa靶基因的任何质粒可以被用作用于PCR的模板。可以将PCR产物克隆到不同于λGT(例如，质粒)的载体中，其便于进行蓝色/白色筛选。

连接：如在本文中所使用的，“连接”是指本领域中已知的用于功能上连接多肽域的任何方法，其包括但不限于重组融合(有或没有间插域)、中间介导的(inter-mediated)融合、非共价缔合、以及共价键合(结合)，包括二硫键合(结合)、氢键合、静电键合、以及构象键合。

核苷酸：如在本文中所使用的，是指由糖部分(戊糖)、磷酸酯、以及含氮杂环碱基构成的DNA或RNA的单体单元。碱基经由糖苷碳(戊糖的1′碳)而连接至糖部分，并且碱基和糖的组合是核苷。当核苷包含结合于戊糖的3’或5’位置的磷酸酯基团时，它被称作核苷酸。可操作上连接的核苷酸的序列在本文中通常称作“碱基序列”或“核苷酸序列”，并且在本文中由化学式表示，其左到右方向是在5’-末端至3’-末端的常规方向。

寡核苷酸或多核苷酸：如在本文中所使用的，术语“寡核苷酸”定义为这样的分子，其包括两个或更多个脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸，优选多于三个。它的确切尺寸将取决于许多因素，其又取决于寡核苷酸的最终功能或用途。可以通过合成或通过克隆来获得寡核苷酸。如在本文中所使用的，术语“多核苷酸”是指这样的聚合物分子，其包括在链中共价结合的核苷酸单体。DNA(脱氧核糖核酸)和RNA(核糖核酸)是多核苷酸的实例。

聚合酶：如在本文中所使用的，“聚合酶”是指催化核苷酸的聚合(即，聚合酶活性)的酶。通常，该酶将在退火至多核苷酸模板序列的引物的3’-端开始合成，并将继续朝向模板链的5’端。“DNA聚合酶”催化脱氧核苷酸的聚合。

持续合成能力：如在本文中所使用的，“持续合成能力”是指聚合酶保持附着于模板以及进行多种修饰反应的能力。“修饰反应”包括但不限于聚合、以及核酸外切剪切。在一些实施方式中，“持续合成能力”是指DNA聚合酶进行一系列聚合步骤而没有干预酶与增长DNA链的解离的能力。通常，DNA聚合酶的“持续合成能力”是通过核苷酸的长度(例如20nts、300nts、0.5-1kb、或更长)来测量的，其中对核苷酸进行聚合或修饰而没有干预DNA聚合酶与增长DNA链的解离。“持续合成能力”可以取决于聚合酶的特性、DNA模板的序列、以及反应条件，例如，盐浓度、温度或特定蛋白质的存在。如在本文中所使用的，术语“高持续合成能力”是指与模板的高于20nts(例如，高于40nts、60nts、80nts、100nts、120nts、140nts、160nts、180nts、200nts、220nts、240nts、260nts、280nts、300nts、320nts、340nts、360nts、380nts、400nts、或更高)/缔合/解离的持续合成能力。可以按照在本文中以及在WO 01/92501Al中所定义的方法来测量持续合成能力。

引物：如在本文中所使用的，术语“引物”是指寡核苷酸，无论是天然存在的或人工合成的，当被放置在其中诱导引物延伸产物(其互补于核酸链)的合成的条件下，例如，在适当缓冲液(“缓冲液”包括适当的pH、离子强度、辅因子(协同因子)等)中存在四种不同三磷酸核苷和耐热酶的条件下并在合适的温度下，其能够作为核酸合成的起始点。引物优选为单链，以获得扩增的最高效率，但可以可替换地是双链。如果是双链，则在用来制备延伸产物以前首先处理引物以分开其链。优选地，引物是寡脱氧核糖核苷酸。引物必须足够长以在耐热酶存在的情况下引发延伸产物的合成。引物的准确长度将取决于许多因素，包括温度、引物源以及方法的使用。例如，取决于靶序列的复杂性，寡核苷酸引物通常包含15-25个核苷酸，虽然它可以包含更多或更少的核苷酸。短引物分子通常需要较低的温度以与模板形成足够稳定的杂交复合物。

抗盐性：如在本文中所使用的，术语“抗盐性”(也被称为盐耐受性)是指在盐或PCR添加物(例如，TMAC)存在的情况下DNA聚合酶基本上保持它的酶活性的能力。在一些实施方式中，通过在其下DNA聚合酶仍然具有活性的最大盐浓度来测量对盐或PCR添加物的抗性。对于每种聚合酶，最大盐浓度是不同的并且在本领域中是已知的，或者可以按照本领域中的方法实验上来确定。例如，在30mM盐(存在)下(在PCR反应中)，Pfu受到抑制。

合成：如在本文中所使用的，术语“合成”是指用于以模板依赖性方式来制备多核苷酸的新链或延伸现有的多核苷酸(即，DNA或RNA)的任何体外方法。根据本发明，合成包括扩增，借助于使用聚合酶，其可以增加多核苷酸模板序列的拷贝数。多核苷酸合成(例如，扩增)导致核苷酸添加到多核苷酸(即，引物)中，从而形成与多核苷酸模板互补的新多核苷酸分子。形成的多核苷酸分子和它的模板可以被用作模板来合成另外的多核苷酸分子。如在本文中所使用的，“DNA合成”包括但不限于PCR、多核苷酸的标记(即，用于探针和寡核苷酸引物)、多核苷酸测序。

模板DNA分子：如在本文中所使用的，术语“模板DNA分子”是指这样的核酸链，通过DNA聚合酶从其合成互补核酸链，例如，在引物延伸反应中。

模板依赖性方式：如在本文中所使用的，术语“模板依赖性方式”是指这样的方法，其涉及引物分子的模板依赖性延伸(例如，通过DNA聚合酶的DNA合成)。术语“模板依赖性方式”通常是指RNA或DNA的多核苷酸合成，其中通过众所周知的互补碱基配对规则来决定新合成的多核苷酸链的序列(参见，例如，Watson，J.D.et al.，In：Molecular Biology of the Gene，4th Ed.，W.A.Benjamin，Inc.，Menlo Park，Calif.(1987))。

耐热酶：如在本文中所使用的，术语“耐热酶”是指这样的酶，其对于加热是稳定的(也被称为耐热)并催化(促进)核苷酸的聚合以形成互补于多核苷酸模板序列的引物延伸产物。通常，在热循环过程中耐热聚合酶是优选的，其中在PCR循环过程中通过曝露于高温(例如，约95℃)来使双链核酸变性。本文描述的有效用于PCR扩增反应的耐热酶满足至少一个标准，即，当经受升高的温度为实现双链核酸的变性所必要的时间时，该酶并没有变得被不可逆地变性(灭活)。用于本文目的的不可逆变性是指酶活性的永久和完全丧失。变性必要的加热条件将取决于，例如，缓冲盐浓度以及待变性核酸的长度和核苷酸组成，但通常在约90℃至约96℃的范围内，时间主要取决于温度和核酸长度，通常为约0.2至4分钟。当增加缓冲盐浓度和/或核酸的GC组成时，可以容忍更高的温度。在一些实施方式中，在约90℃-100℃下，耐热酶将不会被不可逆地变性。通常，适合于本发明的耐热酶具有它发挥作用的高于约40℃的最佳温度，其是这样的温度，在低于上述温度下可以促进引物与模板的杂交，虽然，取决于(1)镁和盐浓度以及(2)引物的组成和长度，可以在更高的温度(例如，45℃-70℃)下发生杂交。用于酶的最佳温度越高，则引物定向(导向，引导)的延伸过程的特异性和/或选择性就越高。然而，低于40℃(例如，在37℃下)具有活性的酶也在本发明的范围内，只要它们是热稳定的。在一些实施方式中，最佳温度在约50℃至90℃(例如，60℃-80℃)范围内。

TMAC或其它PCR增强子耐受性：如在本文中所使用的，术语“TMAC或其它PCR增强子耐受性”(也被称为TMAC或其它PCR增强子抗性)是指在TMAC或其它PCR增强子(例如，甘油、DMSO、甜菜碱、酰胺、其它四甲基铵盐)存在的情况下DNA聚合酶基本上保持它的酶活性的能力。

具体实施方式

本发明尤其是提供了嵌合DNA聚合酶，该嵌合DNA聚合酶包含异源域，该异源域具有衍生自至少两种DNA聚合酶的序列，所述至少两种DNA聚合酶具有至少一种不同的功能特性(例如，延伸率、持续合成能力、错误率或保真性、盐耐受性或耐性)，以及制备和使用嵌合DNA聚合酶的方法。

DNA聚合酶

根据本发明的嵌合DNA聚合酶可以设计自任何DNA聚合酶，尤其是耐热聚合酶。通常，将DNA聚合酶分为六个家族：A、B、C、D、X以及Y。家族A、B、C是基于它们分别与大肠杆菌聚合酶I、II、以及III的氨基酸序列同源性来分组的。家族X没有同源大肠杆菌聚合酶。在一些实施方式中，适合于本发明的DNA聚合酶是家族B DNA聚合酶。家族B聚合酶包括但不限于大肠杆菌pol II、古菌聚合酶、PRDl、phi29、M2、T4噬菌体DNA聚合酶、真核生物聚合酶α、Δ、ε、以及许多病毒聚合酶。在一些实施方式中，适合于本发明的DNA聚合酶是古菌聚合酶(例如，宽古菌聚合酶(euryarchaealpolymerases))。

适宜的示例性古菌聚合酶包括但不限于DNA聚合酶，其来自古菌(例如，嗜热高温球菌(Vent^TM，GenBank：AAA72101)、激烈火球菌(Pfu，GenBank：D12983、BAA02362)、沃氏火球菌、火球菌GB-D(Deep Vent^TM，GenBank：AAA67131)、超嗜热原始菌KODI(KOD，GenBank：BD175553、BAA06142；热球菌属菌株KOD(Pfx，GenBank：AAE68738))、Thermococcusgorgonarius(Tgo，Pdb：4699806)、硫磺矿硫化叶菌(GenBank：NC002754、P26811)、Aeropyrum pernix(嗜热泉生古细菌，超嗜热需氧古细菌)(GenBank：BAA81109)、闪烁古生球菌(GenBank：029753)、嗜气菌(GenBank：AAL63952)、隐蔽热网菌(GenBank：BAA07579、BAA07580)、热球菌属9度Nm(GenBank：AAA88769、Q56366)、Thermococcus fumicolans(热海藻球菌)(GenBank：CAA93738、P74918)、Thermococcus hydrothermalis(热水高温球菌)(GenBank：CAC18555)、热球菌属GE8(GenBank：CAC12850)、热球菌属JDF-3(GenBank：AX135456；WO0132887)、热球菌属TY(GenBank：CAA73475)、Pyrococcusabyssi(GenBank：P77916)、Pyrococcus glycovorans(GenBank：CAC12849)、Pyrococcus horikoshii(掘越氏热球菌)(GenBank：NP143776)、Pyrococcus sp.GE23(GenBank：CAA90887)、Pyrococcus sp.ST700(GenBank：CAC12847)、Thermococcus pacificus(GenBank：AX411312.1)、Thermococcus zilligii(GenBank：DQ3366890)、Thermococcus aggregans、Thermococcus barossii、速生热球菌(GenBank：DD259850.1)、Thermococcus profundus(GenBank：E14137)、Thermococcus siculi(GenBank：DD259857.1)、Thermococcus thioreducens、Thermococcus onnurineus NAl、嗜酸热硫化叶菌、Sulfolobus tokodaii、Pyrobaculum calidifontis、冰岛热棒菌(GenBank：AAF27815)、詹氏甲烷球菌(GenBank：Q58295)、Desulforococcus species TOK、Desulfurococcus、热球菌属、热网菌属、Staphylothermus、Vulcanisaetta、甲烷球菌属(GenBank：P52025)以及其它古菌B聚合酶，如GenBank AAC62712、P956901、BAAA07579))。另外的代表性温度稳定的家族A和B聚合酶包括，例如，这样的聚合酶，其提取自嗜热菌栖热菌属(例如，黄栖热菌、红栖热菌、嗜热栖热菌、乳栖热菌、红色栖热菌、水生栖热菌)、嗜热脂肪芽胞杆菌、海栖热袍菌、炽热甲烷嗜热菌。

适用于本发明的DNA聚合酶包括还未分离的DNA聚合酶。用于本发明的适宜的聚合酶包括融合聚合酶。融合聚合酶通常包含在N-或C-末端的另外的蛋白质结构域，与没有额外域的聚合酶相比，其会改变融合聚合酶的表型。示例性的聚合酶包括但不限于具有双链DNA结合域的融合于C-或N-末端的聚合酶。融合聚合酶的另外的实例包括那些具有dUPT酶的融合于N-或C-末端的融合聚合酶(美国专利申请20070190538)。

在一些实施方式中，根据本发明的嵌合DNA聚合酶包含来自两种或更多种DNA聚合酶(其具有至少一种不同的功能特性)的序列。示例性的功能特性包括但不限于持续合成能力、延伸率、保真性、对盐或PCR添加剂(例如，PCR增强子)的抗性、热稳定性、链取代活性(移位活性)、核酸外切酶活性、尿嘧啶预读功能、核苷酸选择性、结合修饰类似物的能力、以及逆转录酶活性。例如，一些DNA聚合酶的特征在于高保真性。如在本文中所使用的，术语“高保真性”是指错误率小于4.45×10^-6(例如，小于4.0×10^-6、3.5×10^-6、3.0×10^-6、2.5×10^-6、2.0×10^-6、1.5×10^-6、1.0×10^-6、0.5×10^-6)突变/nt/加倍。一些DNA聚合酶的特征在于高持续合成能力。如在本文中所使用的，术语“高持续合成能力”是指借助于模板的持续合成能力高于20nts(例如，高于40nts、60nts、80nts、100nts、120nts、140nts、160nts、180nts、200nts、220nts、240nts、260nts、280nts、300nts、320nts、340nts、360nts、380nts、400nts、或更高)/缔合/解离。一些DNA聚合酶的特征在于高延伸率。如在本文中所使用的，术语“高延伸率”是指高于25nt/s(例如，高于30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140nt/s)的延伸率。一些酶的特征在于高抗盐性(也被称为盐耐受性)。如在本文中所使用的，术语“高抗盐性”(也被称为高盐耐受性)是指在高于30mM(例如，高于35mM、40mM、45mM、50mM)的盐浓度下DNA聚合酶基本上保持它的活性的能力。此外，一些酶的特征在于对PCR添加物的耐性。某些PCR添加物是PCR增强子。例如，Kovarova等人表明，TMA盐、DMSO、甜菜碱以及甲酰胺作为PCR增强子(Kovarova and Draber.(2000)Nucl.Acids.Res.28(13)，e70)。PCR增强子的另一个实例是甘油。一些酶的特征在于对PCR增强子、尤其是TMAC的耐性(也被称为TMAC耐受性)。如在本文中所使用的，术语“高TMAC耐受性”是指在高于10mM(例如，高于15mM、20mM)的TMAC(四甲基氯化铵)浓度下DNA聚合酶基本上保持它的酶活性的能力。示例性的DNA聚合酶的某些特性在表1中示出。

表1.示例性DNA聚合酶的特性

通常，具有高盐耐受性的酶的特征还在于高持续合成能力和/或延伸率。不希望受任何理论的约束，认为，可以认为盐耐受性会影响聚合酶与DNA之间的结合亲合力，其又会影响持续合成能力或延伸率。通常，聚合酶与DNA的结合涉及带正电荷的氨基酸残基与带负电荷的DNA之间的结合相互作用。在高盐浓度下，来自盐的阴离子对于聚合酶上的带正电荷的氨基酸残基的竞争导致减小的DNA结合亲合力。参见，Pavlov et al.(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.99(21)：13510-13515，将其以引用方式结合于本文。另一方面，增加DNA与聚合酶之间的接触点可以增加聚合酶的抗盐性以及持续合成能力或延伸率，因为DNA与聚合酶之间的另外的接触点可以增加聚合酶对DNA的结合亲合力以及降低解离速率，使得聚合酶将更长时间仍然缔合于DNA，其又将导致持续合成能力的增加。例如，Pavlov等人将来自拓朴异构酶V的螺旋-发夹-螺旋(HhH)基序加入到Taq和Pfu中。这些基序参与拓朴异构酶V中的DNA结合。Pavlov等人表明，当融合于HhH基序时，Pfu和Taq均变得更加抗盐。Pavlov等人还表明，HhH融合于Taq和Pfu增加了聚合酶的持续合成能力。作为另一个实例，dsDNA结合蛋白，例如，Sso7d，可以融合于DNA聚合酶以增加DNA与聚合酶之间的接触点数目(Wang et al.(2004)Nucl.Acids Res.32(3)：1197-1207，将其以引用方式结合于本文)。Sso7d是序列非特异性dsDNA结合蛋白，其参与确保在硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus)中的DNA稳定性和/或DNA包装。Sso7d与Taq和Pfu的融合增加了聚合酶的抗盐性和持续合成能力。

特征在于高持续合成能力、延伸率、热稳定性、盐或PCR增强子耐受性的示例性DNA聚合酶包括但不限于KOD聚合酶、TNAl聚合酶、热球菌属9度N-7、T4、T7、或phi29。特征在于高保真性的示例性DNA聚合酶包括但不限于分离自激烈火球菌、深海热球菌、T.gorgonarius、超级嗜热菌(T.litoralis)、速生热球菌(T.zilligii)、热球菌属GT(T.sp.GT、)或火球菌属GB-D(P.sp.GB-D)的聚合酶。

作为非限制性的实例，KOD、Pfu、T.gorgonarius、速生热球菌(T.zilligii)、超级嗜热菌(T.litoralis)以及热球菌属9N-7聚合酶用来设计嵌合DNA聚合酶(参见实施例部分)。

DNA聚合酶的域

通常，古菌DNA聚合酶包括至少以下域：N-末端域、核酸外切酶域(例如，3’-＞5’核酸外切酶域)、掌域、指域、以及拇指域(参见图1)。域结构、功能和协调的知识主要基于各种DNA聚合酶、尤其是古菌DNA聚合酶的晶体结构研究和定点诱变。例如，在获得的家族B DNA聚合酶的第一晶体结构中有噬菌体RB69DNA聚合酶的第一晶体结构(Wang et al.(1997)Cell，89：1087-1099，将其以引用方式结合于本文)。在古菌DNA聚合酶的第一晶体结构中解决的是Tgo DNA聚合酶(参见，Hopfner et al.1999Proc.Natl.Acad.Sci.96(7)，3600-3605，将其以引用方式结合于本文)。最近，已报道了以下古菌家族B DNA聚合酶的晶体结构：来自热球菌属9°N-7的DNA聚合酶(Rodriguez et al.(2000)J. Mol.Biol.299：447-462，将其以引用方式结合于本文)、KODl DNA聚合酶(Hashimoto et al.2001J. Mol.Biol.306(3)，469-477，将其以引用方式结合于本文)、Pfu DNA聚合酶(参见，美国专利号5,948,663、5,866,395、5,545,552、5,556,772以及Kim et al.(2008)Int.J.Biol.Macromol.42(4)，356-61，其均以引用方式结合于本文)。

基于DNA聚合酶的结构功能分析，各种功能，如底物结合、核苷酸转移、催化活性、校对，已分配有(赋予)各种域(结构域)。也已提出，域彼此紧密配合以完成DNA复制过程。

例如，聚合酶活性已与掌域、指域以及拇指域有关。尤其是，认为掌子域是聚合酶的催化部位。聚合酶催化磷酰基转移反应，其中引入的dNTP的α磷酸酯经历来自OH引物末端的亲核攻击。通常，对于该活性部位，三个羧酸酯侧链是重要的。这些残基可以结合两个金属离子(Mg++)，其可以促进OH末端的去质子化以及在dNTP的α磷酸酯处过渡状态的形成。认为拇指域与新合成的dsDNA的小沟(minor grove)相互作用并且还与引入的核苷酸相互作用。拇指域是较少保守的，但通常具有较大的螺旋结构。指域可以在模板固定和核苷酸特异性中发挥作用。类似于拇指域，它很可能与引入的核苷酸相互作用。拇指域可以包含α螺旋、和/或β链。可以认为，未结合的DNA聚合酶形成指域和拇指域的开放构象，并且当DNA被结合时，上述两个域朝向掌域移动以更加紧密地保持DNA模板和引物以及探测在引入的核苷酸与模板核苷酸之间的沃森-克里克碱基配对。与模板形成沃森-克里克碱基对的核苷酸的存在会促进聚合酶的活性部位的适当构象的形成以及这种核苷酸的随后加入。关于综述，参见Hamilton et al.(2001)BioTechniques 31：370-383。据报道，在掌域/指域中的诱变(突变发生)可以影响核苷酸选择性和亲合力，并且在拇指域中的诱变可以影响与dsDNA的结合亲合力。掌域、指域以及拇指域中的重要氨基酸描述在美国申请公开号20060281109中，将其以引用方式结合于本文。

尿嘧啶预读功能与N-末端域有关。例如，古菌家族B DNA聚合酶能够识别模板链中的未修复的尿嘧啶并暂缓(延迟)损伤的聚合上游以防止A-T突变。古菌DNA聚合酶的N-末端域中的“口袋”被确定为处于一定位置以与模板链相互作用并提供该尿嘧啶预读功能(Fogg et al.(2002)Nature Structural Biology9(12)，922-927)。

核酸外切酶域与5’-＞3’核酸外切酶活性、3’-＞5”核酸外切酶活性或两者有关，其用来除去错误插入的核苷酸。当加入错配的核苷酸时，模板/引物链更弱地结合于聚合酶和/或不重合于聚合酶活性部位，从而使错配的核苷酸移动到核酸外切酶域的活性部位并被切除。

可以认为，保真性受聚合酶的比率和核酸外切酶活性的影响，其可以受解离的速率、构象变化、以及核苷酸加入速率(在错配核苷酸存在的情况下)的影响。也已提出，通过包含Y-GG/A基序的柔性环能介导在3’-＞5’核酸外切酶活性与聚合酶活性之间的平衡，其中上述Y-GG/A基序位于N-末端和核酸外切酶域与C-末端聚合酶域之间(即，掌域、指域以及拇指域)。参见，Bohlke et al.(2000)Nucl.Acids Res.28(20)，3910-3917。核酸外切酶域的独特环、以及拇指的顶部对于DNA聚合酶中的校对和聚合酶活性的协调是重要的。在该环中、尤其是在KOD DNA聚合酶的H147处的定点诱变表明，在该环与拇指之间的静电和疏水相互作用会影响核酸外切酶活性与聚合酶活性之间的比率，因此影响保真性。参见，Kuroita et al.J.Mol.Biol.(2005)351，291-298。

域切换(功能区切换，domain swapping)

根据本发明，可以合并来自不同DNA聚合酶(例如，具有至少一种不同的功能特性的聚合酶)的异源域以形成嵌合聚合酶。适宜的域(结构域)包括在各种DNA聚合酶中发现的天然存在的N-末端域、核酸外切酶域、掌域、指域、和/或拇指域。明确限定了在各种DNA聚合酶中的天然存在的N-末端域、核酸外切酶域、掌域、指域、和/或拇指域。例如，N-末端域可以包括对应于KOD聚合酶(SEQ ID NO：11)的氨基酸残基26至105的序列；核酸外切酶域可以包括对应于KOD聚合酶(SEQ ID NO：11)的氨基酸残基156至301的区域；拇指域可以包括对应于KOD聚合酶(SEQ ID NO：11)的氨基酸残基612至749的区域；而掌域和指域可以包括对应于Pfu聚合酶(SEQ ID NO：9)的氨基酸残基394至563的区域。

可以通过氨基酸序列的序列对比来确定各种DNA聚合酶中的相应域或位置。可以通过本领域技术人员已知的各种方式来实现氨基酸序列的序列对比例如，利用可公开获得的计算机软件如BLAST、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于测量序列对比的适当参数，包括用于在待比较序列的全长实现最大序列对比所需要的任何算法。优选地，WU-BLAST-2软件用来确定氨基酸序列同一性(Altschul et al.，Methods in Enzymology 266，460-480(1996)；http://blast.wustl/edu/blast/README.html)。WU-BLAST-2使用多个搜索参数，其大多数被设置为默认值。可调参数设置为以下值：重叠间隔＝1，重叠部分＝0.125，字阈值(T)＝11。HSP评分(S)和HSP S2参数是动态值并且通过程序本身来建立，这取决于特定序列的组成，然而，如上文所述可以调节并设置最小值。序列对比的一个实例示在图1中。

在一些实施方式中，合适的域可以是天然存在的域序列的变体(例如，突变体或片段)。例如，合适的域可以具有这样的序列，其具有至少70％(例如，至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)相同于在感兴趣的DNA聚合酶中发现的天然存在域的氨基酸序列。

进一步期待，定义N-末端域、核酸外切酶域、掌域、指域、和/或拇指域的序列可以相关于DNA聚合酶的某些酶特性，如，保真性或错误率、延伸率、持续合成能力、以及抗盐性。例如，如在实施例部分中所描述的，本发明的发明人已经证明，定义N-末端、核酸外切酶、和/或拇指域的序列可以相关于与延伸率、持续合成能力、热稳定性、TMAC耐受性和/或抗盐性有关的特性；并且定义掌域和/或指域的序列可以相关于与DNA聚合酶的保真性或错误率有关的特性。

此外，基于各种DNA聚合酶之间的序列对比(参见，例如，图1)，进一步期待，可以通过一种或多种以下正共有序列来定义相关于高持续合成能力、延伸率、热稳定性、TMAC耐受性和/或抗盐性的域：

正共有序列1(定义N-末端域)

正共有序列2(定义核酸外切酶域)

XXEXXXXYXXXXEXXFXXXXKXXXAXXXXXXXXAXXXXTVXTVKRXXXXQXXXXXRXVEXXXXXFTXXXXXXAXXDXIXXXXX(SEQ ID NO：31)，其中X是任意氨基酸或肽键；以及

正共有序列3(定义拇指域)

XXXXXXXXXXXXXXXXALXXDXXXXKXXXXXXXXTEXXSKXXVXXXXXVXHXXXXXDXKDXXXTXXXXXXXXRXXXRXXXXRXXTXXSXXXXKXSXRXGDXXXPFDXFXXTXXXXXXXXXXXXXXXXXXEXXXRAXX(SEQ ID NO：32)，其中X是任何氨基酸或肽键。

另外或可替换地，可以通过一种或多种以下负共有序列来定义相关于高持续合成能力、延伸率、热稳定性、TMAC耐受性和/或抗盐性的域：

负共有序列1(定义N-末端域)

负共有序列2(定义核酸外切酶域)

PIX₁MISYADEX₂X₃AX₄VITWKNX₅DLPYVX₆VVSX₇EREMIKRFLRX₈X₉X₁₀EKDPDX₁₁X₁₂X₁₃TYNGDX₁₄FDFX₁₅YLX₁₆KRX₁₇EKLGIX₁₈X₁₉X₂₀X₂₁GRDGSEPKX₂₂QRX₂₃GDX₂₄X₂₅AVEVKGRIHFDLYX₂₆VIX₂₇RTINLPTYTLEAVYEAX₂₈FGX₂₉PKEKVYAX₃₀EIX₃₁X₃2AWEX33(SEQ ID NO：34)，其中X₁不是I；X₂不是N；X₃不是E；X₄不是K；X₅不是I；X₆不是E；X₇不是S；X₈不是I；X₉不是I；X₁₀不是R；X₁₁不是I；X₁₂不是I；X₁₃不是V；X₁₄不是S；X₁₅不是P；X₁₆不是A；X₁₇不是A；X₁₈不是K；X₁₉不是L；X₂₀不是T；X₂₁不是I；X₂₂不是M；X₂₃不是I；X₂₄不是M；X₂₅不是T；X₂₆不是H；X₂₇不是T；X₂₈不是I；X₂₉不是K；X₃₀不是D；X₃₁不是A；X₃₂不是K；以及X₃₃不是S；以及

负共有序列3(定义拇指域)

RDWSEIAKETQARVLEX₁X₂LKX₃GDVEX₄AVRIVKEVX₅X₆KLX₇X₈YEX₉PPEKLX₁₀IX₁₁EQITRX₁₂LX₁₃X₁₄YKAX₁₅GPHVAVAKX₁₆LAAX₁₇GVKIX₁₈PGX₁₉VIX₂₀YIVLX₂₁GX₂₂GX₂₃IX₂₄X₂₅RAIX₂₆X₂₇X₂₈EX₂₉DPX₃₀KHKYDAEYYIENQVLPAVX₃₁RILX₃₂X₃₃FG(SEQID NO：35)，其中X₁不是T；X₂不是I；X₃不是H；X₄不是E；X₅不是I；X₆不是Q；X₇不是A；X₈不是N；X₉不是I；X₁₀不是A；X₁₁不是Y；X₁₂不是P；X₁₃不是H；X₁₄不是E；X₁₅不是I；X₁₆不是K；X₁₇不是K；X₁₈不是K；X₁₉不是M；X₂₀不是G；X₂₁不是R；X₂₂不是D；X₂₃不是P；X₂₄不是S；X₂₅不是N；X₂₆不是L；X₂₇不是A；X₂₈不是E；X₂₉不是Y；X₃₀不是K；X₃₁不是L；X₃₂不是E；以及X₃₃不是G。

在一些实施方式中，可以通过以下正共有序列(定义掌域和指域)来定义相关于高保真性的域：

XKXXXXXXXXXXXXAXXXXXXXXXXXXXXXXXLXXXXNXXIXXXXXXKXXXXIXXXXXXXXXHXXXXXXXXXTXXXEXQXXXXKIXXXXXXKXXXLXXXXFXXXXXXXKXXXXXXXXXXXXXXXXXKXXELVWXXLXXXFXXXXLXIXXXXLYXXXXXGESXEIXXXXLX(SEQ ID NO：36)，其中X是任何氨基酸或肽键。

另外或可替换地，可以通过以下负共有序列(定义掌域和指域)来定义相关于高保真性的域：

EX₁GLWENIVYLDFRX₂LYPSIIITHNVSPDTLNX₃EGCKX₄YDX₅APQVGHX₆FCKDX₇PGFIPSLLGX₈LLEERQKIKX₉KMKX₁₀TX₁₁DPIEX₁₂X₁₃LLDYRQX₁₄AIKX₁₅LANSX₁₆YGYYGYAX₁₇ARWYCKECAESVTAWGRX₁₈YIX₁₉X₂₀X₂₁X₂₂KEX₂₃EEKX₂₄GFKVX₂₅YX₂₆DTDGX₂₇X₂₈ATIPGX₂₉X₃₀X₃₁EX₃₂X₃₃KKKAX₃₄E(SEQ ID NO：37)，其中X₁不是R；X₂不是S；X₃不是R；X₄不是E；X₅不是V；X₆不是R；X₇不是F；X₈不是D；X₉不是K；X₁₀不是A；X₁₁是I；X₁₂不是R；X₁₃不是K；X₁₄不是R；X₁₅不是I；X₁₆不是Y；X₁₇不是R；X₁₈不是E；X₁₉不是T；X₂₀不是M；X₂₁不是T；X₂₂不是I；X₂₃不是I；X₂₄不是Y；X₂₅不是I；X₂₆不是S；X₂₇不是F；X₂₈不是F；X₂₉不是A；X₃₀不是D；X₃₁不是A；X₃₂不是T；X₃₃不是V；X₃₄不是M。

因此，适当的域可以获自或源自具有不同功能特性的DNA聚合酶以设计具有所期望的功能特点组合的嵌合DNA聚合酶。在一些实施方式中，根据本发明的方法包括以下步骤：(a)提供基于第一DNA聚合酶的N-末端域、核酸外切酶域、和/或拇指域；(b)提供基于第二DNA聚合酶的掌域和/或指域；(c)结合(组合)来自步骤(a)和步骤(b)的域以形成嵌合聚合酶。在一些实施方式中，第一和第二DNA聚合酶的特征在于至少一种独特的特点。例如，第一DNA聚合酶可以特征在于高持续合成能力、延伸率、热稳定性、TMAC耐受性和/或抗盐性，而第二DNA聚合酶可以特征在于高保真性。在一些实施方式中，第一DNA聚合酶可以特征在于高保真性而第二DNA聚合酶可以特征在于高持续合成能力、延伸率、热稳定性、TMAC耐受性和/或抗盐性。在一些实施方式中，根据本发明设计的嵌合聚合酶具有基本上类似于第一DNA聚合酶的持续合成能力、延伸率、热稳定性、TMAC耐受性或抗盐性以及基本上类似于第二DNA聚合酶的保真性。在一些实施方式中，根据本发明设计的嵌合聚合酶具有高于第一DNA聚合酶的保真性以及高于第二DNA聚合酶的持续合成能力、延伸率或抗盐性。

本发明进一步期待改善DNA聚合酶的保真性、持续合成能力、延伸率、热稳定性、TMAC耐受性和/或抗盐性的方法。在一些实施方式中，根据本发明的方法包括以下步骤：用来自不同DNA聚合酶(其特征在于相对于感兴趣的DNA聚合酶具有更高的保真性)的相应序列替代感兴趣的DNA聚合酶的掌-指域中的序列。

另外或可替换地，在一些实施方式中，根据本发明的方法包括以下步骤：用来自不同DNA聚合酶的相应序列替代在感兴趣的DNA聚合酶的N-末端域、核酸外切酶域和/或拇指域中的序列，其中上述不同DNA聚合酶的特征在于相对于感兴趣的DNA聚合酶具有更高的持续合成能力、延伸率、热稳定性、TMAC耐受性或抗盐性。

作为一个非限制的实例，本发明的发明人已设计了基于KOD聚合酶和Pfu聚合酶的嵌合DNA聚合酶Kofu以及它的相互嵌合体POD(参见实施例部分)。如在实施例部分中所讨论的，Kofu包含来自KOD聚合酶的N-末端域、核酸外切酶域和拇指域以及来自Pfu聚合酶的掌-指域。Kofu聚合酶的序列提供在SEQID NO：16中。相互嵌合体POD包含来自Pfu聚合酶的N-末端域、核酸外切酶域和拇指域以及来自KOD聚合酶的掌-指域。POD聚合酶的序列提供在SEQ IDNO：15中。

如在实施例部分中所讨论的，Kofu嵌合聚合酶呈现Pfu的近似的复制保真性但类似于KOD的延伸速度、持续合成能力、热稳定性、TMAC耐受性和PCR性能。可替换地，Pod嵌合聚合酶呈现KOD的近似的复制保真性但类似于Pfu的延伸速度、持续合成能力、热稳定性、TMAC耐受性和PCR性能。

在一些实施方式中，本发明提供了Kofu嵌合聚合酶的变体，其包含这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列至少80％(例如，至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)相同于SEQ ID NO：16(Kofu氨基酸序列)。在特定实施方式中，根据本发明的Kofu嵌合聚合酶的变体具有基本上类似于Kofu的持续合成能力、延伸率、热稳定性、TMAC耐受性和/或保真性。

在一些实施方式中，根据本发明的Kofu嵌合聚合酶的变体由以下共有序列所定义

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(SEQ ID NO：38)，其中X是任何氨基酸或肽键。

在一些实施方式中，本发明提供了POD嵌合聚合酶的变体，其包含这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列至少80％(例如，至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)相同于SEQ ID NO：15(Pod氨基酸序列)。在特定实施方式中，根据本发明的POD嵌合聚合酶的变体具有基本上类似于POD的持续合成能力、延伸率、热稳定性、TMAC耐受性和/或保真性。

本发明的嵌合DNA聚合酶的表达

标准重组DNA技术(例如，限制性内切酶消化、连接作用、PCR)可以用来设计根据本发明的嵌合DNA聚合酶。本领域中众所周知的方法可以用来表达和分离嵌合DNA聚合酶。许多细菌表达载体包含序列元件或序列元件的组合，从而便于高水平诱导性表达由外源序列编码的蛋白。表达载体可购自，例如，Novagen(http://www.emdbiosciences.com/html/NVG/AHTables.html#)。

此外，可以用携带嵌合DNA聚合酶基因(连接于T7启动子)的表达载体来转化表达整合可诱导形式的T7RNA聚合酶基因的细菌。通过添加适当的诱导物，例如，用于lac-诱导型启动子的异丙基-p-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，T7RNA聚合酶的诱导会诱导嵌合基因从T7启动子的高水平表达。

细菌的适当宿主株可以选自本领域技术人员在本领域中可获得的那些宿主株。作为一个非限制性实例，大肠杆菌菌株BL-21通常用于外源蛋白的表达，因为相对于大肠杆菌的其它菌株，它是蛋白酶缺乏的。对于其中用于特定聚合酶基因的密码子使用不同于通常在大肠杆菌基因中所看到的密码子使用的情况，存在BL-21的菌株，其被修饰以携带用罕见反密码子编码tRNA的tRNA基因(例如，argU、ileY、leuW、以及proL tRNA基因)，从而便于克隆嵌合基因的高效表达(携带罕见密码子tRNA的多种BL21-CODON PLUSTM细胞株可获自例如Stratagene)。另外或可替换地，编码DNA聚合酶的基因可以是这样的密码子，其被优化以促进在大肠杆菌中的表达。可以化学合成密码子优化序列。

存在本领域技术人员已知的许多方法，其适合于本发明的嵌合DNA聚合酶的纯化。例如，Lawyer等人的方法(1993，PCR Meth.& App.2：275)非常适合于在大肠杆菌中表达的DNA聚合酶的分离，因为它最初被设计成用于Taq聚合酶的分离。可替换地，可以使用Kong等人的方法(1993，J.Biol.Chem.268：1965，以引用方式结合于本文)，该方法采用热变性步骤来破坏宿主蛋白，以及两个柱纯化步骤(经DEAE-琼脂糖和肝素-琼脂糖柱)来分离高活性和大约80％纯的DNA聚合酶。

另外，可以通过硫酸铵分馏、接着Q琼脂糖和DNA纤维素柱，或通过在HiTrap Q柱上吸附污染物、接着从HiTrap肝素柱梯度洗脱，来分离DNA聚合酶突变体。

本发明的嵌合DNA聚合酶的应用

本发明的嵌合DNA聚合酶可以用于涉及多核苷酸合成的任何方法。多核苷酸合成方法是本领域技术人员熟知的并且可以在例如，Molecular Cloningsecond edition，Sambrook et al.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，N.Y.(1989)中找到。例如，本发明的嵌合DNA聚合酶在重组DNA技术中具有各种应用，其包括但不限于通过切口移位来标记DNA、在cDNA克隆中的第二链cDNA合成、DNA测序、以及扩增、检测、和/或利用聚合酶链反应(PCR)来克隆核酸序列。

在一些实施方式中，本发明提供了用于PCR的稳健、快速、以及准确的酶。PCR是指用于扩增特定多核苷酸模板序列的体外方法。PCR的技术描述在许多出版物中，包括PCR：A Practical Approach，M.J.McPherson，et al.，IRLPress(1991)、PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications，by Innis，et al.，Academic Press (1990)、以及PCR Technology：Principals and Applications forDNA Amplification，H.A.Erlich，Stockton Press(1989)。PCR还描述在许多美国专利中，包括美国专利号4,683,195、4,683,202、4,800,159、4,965,188、4,889,818、5,075,216、5,079,352、5,104,792、5,023,171、5,091,310、以及5,066,584，其各自以引用方式结合于本文。

具有更高的持续合成能力、延伸率和/或保真性的嵌合DNA聚合酶预期会降低错误率、改善远距离扩增的效率和成功率(更高的产率、更长的靶扩增)、和/或减少所需要的DNA模板的量。

在本领域中各种特异性PCR扩增的应用是可行的(关于述评，参见例如，Erlich，1999，Rev Immunogenet.，1：127-34；Prediger 2001，Methods Mol.Biol.160：49-63；Jurecic et al.，2000，Curr.Opin.Microbiol.3：316-21；Triglia，2000，Methods Mol.Biol.130：79-83；MaClelland et al.，1994，PCR Methods Appl.4：S66-81；Abramson and Myers，1993，Current Opinion in Biotechnology 4：41-47，将其各自以引用方式结合于本文)。

作为非限制性实例，本发明可以用于PCR应用，包括但不限于：i)热起动PCR，其可以减少非特异性扩增；ii)降落PCR，其开始于高退火温度，然后逐步降低退火温度以减少非特异性PCR产物；iii)嵌套式PCR，利用外引物集和内引物集，其可以合成更可靠的产物；iv)反向PCR，用于旁侧已知序列的区的扩增。在该方法中，消化DNA，通过连接作用来环化所期望的片段，然后利用与已知的向外延伸序列互补的引物进行PCR；v)AP-PCR(随机引发的)/RAPD(随机扩增的多态DNA)。通过利用任意寡核苷酸进行扩增，这些方法产生来自具有鲜为人知的靶序列的物种的基因组指纹；vi)RT-PCR，该RT-PCR使用RNA-定向的DNA聚合酶(例如，逆转录酶)来合成cDNA，其然后用于PCR。该方法是极为敏感的，用于检测特定序列在组织或细胞中的表达。它还可以用来量化mRNA转录物；vii)RACE(cDNA末端的快速扩增)。在关于DNA/蛋白质序列的信息有限的情况下，使用这种方法。借助于各自仅一种特定引物(加上一种接头(adaptor)引物)，该方法可以扩增cDNA的3′或5′端，从而产生cDNA的片段。然后可以合并重叠RACE产物以产生全长cDNA；viii)DD-PCR(差异展示PCR)，其用来识别在不同组织中的差异表达基因。DD-PCR中的第一步骤涉及RT-PCR，然后利用短的、有意非特异性引物进行扩增；ix)多重PCR，其中同时扩增相同样品中的DNA序列的两个或更多个独特的靶。一种DNA序列可以用作对照以证实PCR的质量；x)Q/C-PCR(定量比较)，该Q/C-PCR使用内部对照DNA序列(但具有不同的大小)，其与靶DNA(竞争性PCR)竞争相同引物集；xi)递推PCR，其用来合成基因。在该方法中使用的寡核苷酸互补于基因的若干段(＞80个碱基)，交替地互补于具有未端重叠(-20个碱基)的有义链和反义链；xii)不对称PCR；xiii)原位PCR；xiv)定点PCR诱变；xv)DOP-PCR，其使用部分简并引物，用于全基因组扩增；xvi)定量PCR，其中使用SYBR绿或寡核苷酸探针来检测扩增；xvii)全基因组扩增，其中使用接头(adaptor)连接的DNA片段文库作为模板，以及xviii)易错PCR(error-pronePCR)，其中优化条件以在PCR产物中产生增加数目的突变。

应当理解，本发明并不限于任何特定扩增系统。当开发了其它系统时，那些系统可能受益于本发明的实施。

试剂盒

本发明还预期试剂盒形式(kit formats)，该试剂盒形式包括具有一个或多个容器的包装单位，所述容器包含本发明的嵌合DNA聚合酶以及其组合物。在一些实施方式中，本发明提供了试剂盒，该试剂盒进一步包括用于多核苷酸合成(包括在PCR中的合成)的各种试剂的容器。

根据本发明的试剂盒还可以包含一种或多种以下物品：多核苷酸前体、引物、缓冲剂、用法说明、以及对照。试剂盒可以包括以合适的比例混合在一起的试剂的容器，用于进行根据本发明的方法。试剂容器优选包含单位数量的试剂，以当执行主题方法时避免测量步骤。

实施例

实施例1.KOD和Pfu DNA聚合酶的嵌合体的设计

在该实验中选择包括的两种酶是激烈火球菌DNA聚合酶(Pfu)和超耐热原始菌(Thermococcus Kodarensis)(KOD)DNA聚合酶。该两种酶具有类似的域结构并在氨基酸水平具有79％同一性(利用blastP序列对比)(参见表2)。Pfu和KOD的域结构示在图1中。

表2.Pfu和KOD的ClustalW序列对比

Pfu和KOD具有非常不同的表型特征，尤其是，就延伸率、持续合成能力以及错误率而言(参见表3)：

表3

	Pfu	KOD
			延伸率	25nt/s	106-138nt/s(Takagi et al.1997)
持续合成能力	＞20nt	约300nt(Takagi et al.1997)
			错误率(突变/nt/加倍)	1.5×10^-6	4.45×10^-6(内部数据)

因此，目的是发现这两种酶的嵌合组合，其呈现与Pfu可比的错误率(2.0×I0^-6)并具有与KOD可比的持续合成能力和/或延伸率(分别为约300nt/s和106-138nt/s)。具有上面提及的特性的酶可用作PCR的稳健、快速、以及准确的酶。

在大约旁侧酶的聚合酶域的位置将限制性位点插入到KOD和Pfu聚合酶的密码子优化的核苷酸序列中(参见实施例2)。例如，旁侧聚合酶域(掌域和指域)的PvuII和EcoRI位点用来用KOD的聚合酶域代替Pfu的聚合酶域以产生被视为Pod的嵌合体(图2)。该嵌合体包含Pfu的N-末端域、3’-5’核酸外切酶域和拇指域以及KOD的掌域和指域。通过用Pfu的聚合酶域替代KOD的聚合酶域(掌和指)来产生相互切换，从而产生嵌合体Kofu。

实施例2.激烈火球菌和超耐热原始菌(Thermococcus kodakarensis)DNA聚合酶的密码子优化以及合成

用于激烈火球菌聚合酶I(SEQ ID NO：1)和超耐热原始菌(Thermococcuskodakarensis)聚合酶I(SEQ ID NO：2)的天然DNA序列获自Genbank。上述两种DNA序列是由Codon Devices(Cambridge，Massachusetts)优化的计算机密码子，用于在大肠杆菌中表达，导致用于Pfu聚合酶I密码子优化的基因DNA序列的SEQ ID NO：3和用于KOD聚合酶I密码子优化的基因DNA序列的SEQID NO：4。化学合成上述两种密码子优化的基因并通过CodonDevices(Cambridge，Massachusetts)克隆到pUC19中，从而获得用于Pfu聚合酶I的SEQ ID NO：7和用于KOD聚合酶I的SEQ ID NO：8。

实施例3：将密码子优化的KOD和Pfu聚合酶I序列克隆到表达载体pKBexp 中。

如下将KOD(SEQ ID NO：8)和Pfu(SEQ ID NO：7)聚合酶密码子优化的pUC 19构造物克隆到pKBexp载体中：

pKBexp载体包含两个Eco31I位点，其具有非互补突出端，从而使得能够利用单一限制性内切酶来定向克隆插入片段。KOD和Pfu聚合酶基因设计有两个旁侧Eco31I位点，其使得能够定向和框内克隆到pKBexp中。

用Eco31I消化来自pKBexp载体的经纯化的DNA，然后用琼脂糖凝胶纯化。用Eco31I同样地消化KOD和Pfu密码子优化的pUC DNA构造物(SEQ IDNO.8和SEQ ID NO.7)，然后大致2.3千碱基插入片段从琼脂糖凝胶切下并纯化。利用T4DNA连接酶，用15ng经消化的pKBexp连接30ng的KOD或Pfu聚合酶基因。纯化连接反应并用来转化感受态大肠杆菌DH10B。DNA小量制备(minipreps)由耐氨苄西林(氨苄青霉素)克隆构成。通过用XbaI和HindIII(旁侧插入片段的两种酶)消化小量制备来证实插入片段的存在。通过DNA测序来证实KOD聚合酶基因序列在pKBexp(被视为pKBl1)中以及Pfu聚合酶基因在pKBexp(被视为pKB14)中的克隆。

实施例4：来自KOD和Pfu聚合酶I基因的DNA序列的域切换

KOD(SEQ ID NO：5)和Pfu(SEQ ID NO：3)聚合酶I基因的密码子优化序列设计有限制性位点，其大致旁侧KOD和Pfu聚合酶的指域和掌域。KOD密码子优化序列包含PvuII限制性位点和EcoRI限制性位点。Pfu密码子优化序列包含PvuII限制性位点和EcoRI限制性位点。

各自用限制性内切酶EcoRI和PvuII消化来自pKB11和pKB14的经纯化的DNA。从每种消化液(digest)分别提取大片段(4.7kb)和小片段(0.7kb)并用琼脂糖凝胶纯化。来自每次限制酶切消化的小片段分别包含KOD和Pfu的指域和掌域。利用虾碱性磷酸酶(Shrimp Alkaline Phospate)，对经消化和纯化的大片段(包含表达载体和剩余聚合酶片段)进行去磷酸化。通过30ng的4.7kbPfu大片段(Pfu DNA聚合酶的aa残基1至335和567至778)和10ng的0.7kbKOD小片段(对应于KOD DNA聚合酶SEQ ID NO：11的氨基酸残基336至565)的连接作用产生了被视为POD的构造物。因此，POD包括来自Pfu DNA聚合酶的N-末端、核酸外切酶和拇指域，以及来自KOD的掌域和指域。通过30ng的4.7kb KOD大片段(对应于KOD DNA聚合酶SEQ ID NO：11的氨基酸残基1至335和566至777)和10ng的0.7kb Pfu小片段(对应于Pfu DNA聚合酶SEQID NO：11的氨基酸残基336至566)的连接作用制备了被视为Kofu的构造物。因此，Kofu包括来自KOD DNA聚合酶的N-末端、核酸外切酶和拇指域，以及来自Pfu的掌域和指域。上述连接反应用来转化大肠杆菌DH10B。通过DNA测序来证实Pod(SEQ ID NO：13)和Kofu(SEQ ID NO：14)的构建。POD和Kofu的域结构示于图1中。利用本领域已知的方法，例如，如在“具体实施方式”中所综述的，进行嵌合聚合酶的表达和纯化。

实施例5.KOD、Pfu、Kofu以及Pod的热稳定性

在98℃下在10μl容积中温育10ng每种酶240、120、60、30、15、8、4、2、1或0分钟，上述容积包含以下物质：20mM Tris-HCl pH8.0、2mM MgCl₂、6mM(NH₄)₂SO₄、25或50mM KCl(对于Pfu和Pod为25mM，对于KOD和Kofu为50mM)。在热温育以后，向每个管中添加10μl的引物/模板混合物。引物模板混合物包含以下物质：20mM Tris-HCl pH8.0、2mM MgCl₂、6mM(NH₄)₂SO₄、0.6mM dNTP、0.6μM各种引物HPRTl-Fl(5’-tttggaaacatctggagtcct-3’(SEQ ID NO：40))和HPRTl-Rl(5’-gcccaaagggaactgatagtc-3’(SEQ ID NO：41))、2ng人基因组DNA/μl、以及25或50mM KCl(对于Pfu和Pod为25mM，对于KOD和Kofu为50mM)。按照以下循环协议(方案)进行扩增：在95℃下3分钟、35×(在98℃下20秒，在60℃下20秒，在72℃下20秒)、在72℃下20秒。用琼脂糖凝胶分析了PCR产物(参见图3)。如图3所示，在98℃下在预温育酶4小时以后，对于Pfu，没有观测到扩增。相反，在测试的所有时间点，KOD、Kofu以及Pod均能够扩增PCR产物。

实施例6.保真性分析

通过类似于由Cline等人以及其中的参考文献(Nucl.Acids Res.，1996，24(18)：3546-3551)所描述的方法来确定酶的保真性。LacI被PCR扩增自大肠杆菌并被克隆到pUC19中以简并质粒pKB-LacIQZα(SEQ ID NO：17)。pKB-LacIQZα在保真性分析中用作用于LacI的PCR扩增的模板以及用作用于将扩增的LacI克隆到其中的载体，用于蓝/白菌落筛选。

使用70ng的pKB-LacIQZα质粒模板(相当于25ng的lacI靶)和2.5U每种酶来设置2×50μl PCR反应(对于每种酶)，以扩增1.386Kb lacIOZα片段。PCR条件如下：在Pfu缓冲液(Fermentas)中用Pfu和Pod进行扩增；在Novagen KOD缓冲液1中用KOD和Kofu进行扩增。最终浓度为2mM MgCl₂、0.4μM每种引物M13-40(GTTTTCCCAGTCACGAC(SEQ ID NO：42))和PKBlac-lR(GGTATCTTTATAGTCCTGTCG(SEQ ID NO：43))以及0.2mM每种dNTP。用于Pfu和Pod的循环参数是：94℃4分钟、30x(94℃15秒、55℃15秒、72℃3分钟)、72℃6分钟。用于KOD和Kofu的循环参数是：94℃2分钟、30x (98℃15秒、55℃2秒、72℃20秒)、72℃30秒。

借助于凝胶电泳来量化PCR产物产率，并且计算模板加倍的数目。用XbaI、NcoI以及DpnI消化PCR产物，凝胶纯化(没有暴露于紫外光)并且连接于XbaI-NcoI消化的pKB-LacIQZα。用连接混合物来转化大肠杆菌并将细胞平板接种到LB-Amp-X-gal平板上。记录蓝色菌落、白色菌落的数目以及菌落的总数。错误率f计算为f＝-ln(F)/(d x (bp))，其中F＝白色菌落的分数((总菌落减去蓝色菌落)/总菌落)，d＝模板加倍的数目而b＝349(仅评分349bp的lacI扩增子)。示例性结果总结在表4中。如表4所示，Pfu和Kofu具有类似保真性并且它们的保真性高于KOD和Pod的保真性。

表4：KOD、Pfu、Kofu以及Pod的保真性

实施例7.持续合成能力测定

可以利用在(Wang et al.Nucl Acids Res，2004，32(3)：1197-1207；以及VonHippel et al.NY Acad Sci 1994；726：118-131)中描述的测定来确定和计算持续合成能力。简单地说，在16微升容积中在20mM Tris-HCl pH8.0、25mM KCl、2.5mM MgCl₂、0.3mM dNTP存在的情况下，将0.8皮摩尔的5’FAM标记引物 (-40Ml3LFF，5’FAM-GTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCC-3’(SEQ IDNO：44))加入到1.6皮摩尔的ssM13mpl8DNA中。通过加热至95℃，时间为2分钟，接着缓慢冷却至72℃(在温度循环器中，以0.1℃/秒的速率)，在72℃下温育10分钟并以0.1℃/秒进一步冷却至4℃，将引物退火至模板。将聚合酶稀释在20mM Tris-HCl pH8.0、25mM KCl中。将引发的模板和稀释的聚合酶加热至72℃并通过将4μl稀释聚合酶加入到16μl引发的模板中来开始反应。稀释聚合酶以产生1∶10-1∶10000的聚合酶模板比率。在不同时间点以后，通过添加EDTA至10mM的终浓度来终止反应。

在ABI 3130XL Genetic Analyzer上分析延伸反应。确定每个反应的中间产物长度。中间产物长度被定义为产物的长度，在该长度下，达到该长度的所有产物的总荧光强度等于所有可检测产物的荧光强度总和的50％。那些样品(其中中间产物长度并不随聚合酶浓度或温育时间的变化而变化)的迹线(描记线，traces)用来按照Von Hippel等人(Von Hippel et al.NY Acad Sci 1994；726：118-131)来计算持续合成能力。积分荧光水平显著高于背景水平的每个峰(I)以给出峰(ni)的荧光强度。总荧光强度(nT)是所有峰的荧光的总和。将积分数据作图为log(ni/nT)对n-1，其中n是加入的核苷酸的数目。将数据拟合于以下方程：log(ni/nT)＝(n-Ll)logPi+log(l-Pi)。Pi，微观持续合成能力因数，定义为在位置i处不终止延伸的可能性。平均引物延伸长度确定自1/(1-Pi)。

实施例8.KOD、Pfu、Kofu以及Pod的抗盐性

以前的研究(Pavlov et al.(2002)Proc Natl Acad Sci.99(21)，13510-13515；Wang et al.(2004)Nucl Acids Res.32(3)，1197-1207)已表明，在聚合酶对盐的增加的耐受性与聚合酶的持续合成能力之间存在直接相关。对于所有测试的聚合酶(来自家族A或家族B)，研究发现，具有增加的盐耐受性的聚合酶还具有增加的持续合成能力。因此，我们比较了我们的嵌合体的盐耐受性与亲本聚合酶的盐耐受性，作为持续合成能力的代替。

经纯化的KOD、Pfu、Kofu以及Pod的蛋白质浓度是利用Bioanalyzer2100(Agilent，Santa Clara，CA，USA)借助于来自相同供应商的Protein 230试剂盒来确定的。在实时PCR中借助于增加量的添加的KCl来测试聚合酶。在包含20mM Tris-HCl pH8.0、6mM(NH₄)₂SO₄、2mM MgCl₂、3％DMSO、10ng聚合酶、20ng人基因组DNA、0.3mM每种dNTP、0.25X SYBR Green(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA。制备在DMSO中的稀释原液20X SYBR Green)、0.3μM正向引物HPRTl-Fl(5’-tttggaaacatctggagtcct-3’(SEQ ID NO：40))和0.3μM反向引物HPRTl-Rl(5’-gcccaaagggaactgatagtc-3’(SEQ ID NO：41))的20μl容积中进行反应。添加KCl至10、25、50、75、100或125mM的最终浓度。在Corbett 6000HRM实时温度循环器(Corbett Life Science，Sidney，澳大利亚)中利用以下循环协议：在95℃下3分钟，40个循环(在95℃下10秒、在60℃下20秒、在72℃下20秒，数据采集)，接着是以1℃步长从72℃到95℃的解链曲线分析步骤，在每个步骤结束时在数据采集以前等待5秒，进行PCR扩增。用1.5％琼脂糖凝胶分析了8μl的每种样品。将5μl的Fermentas GeneRuler^TM Mix，cat no.SM0333(Fermentas，Vilnius，Lithuania)加载到凝胶上作为DNA标记。示例性结果示在图4中。

实施例9.KOD、Pfu、Kofu以及Pod的TMAC耐受性

包含四甲基铵的盐会增强PCR反应，如Kovarova等人(Kovarova，M.andDraber，P.；Nucl.Acids Res.(2000)28(13)e70-)所示出的。一种这样的盐是四甲基氯化铵(TMAC)。因此，我们比较了我们的嵌合体与亲本聚合酶的TMAC耐受性。

在实时PCR中利用增加量的添加TMAC测试聚合酶。在包含20mMTris-HCl pH8.0、6mM(NH₄)₂SO₄、2mM MgCl₂、25mM KCl、10ng聚合酶、20ng人基因组DNA、0.3mM每种dNTP、0.25X SYBR Green(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA。制备在DMSO中的稀释原液20X SYBR Green)、0.3μM正向引物HPRTl-Fl(5’-tttggaaacatctggagtcct-3’(SEQ ID NO：40))以及0.3μM反向引物HPRTl-Rl(5’-gcccaaagggaactgatagtc-3’(SEQ ID NO：41))的20μl容积中进行反应。添加TMAC至0、10、20、40、60、80、100或120mM的最终浓度。在Corbett 6000HRM实时温度循环器(Corbett Life Science，Sidney，澳大利亚)中按照以下循环协议：在95℃下3分钟，40个循环(在95℃下10秒、在50℃下20秒、在72℃下20秒，数据采集)，接着是以1℃步长从72℃到95℃的解链曲线分析步骤，在每个步骤结束时在数据采集以前等待5秒，进行PCR扩增。用1.5％琼脂糖凝胶分析了8μl的每种样品。将5μl的Fermentas GeneRuler^TMMix，cat no.SM0333(Fermentas，Vilnius，Lithuania)加载到凝胶上作为DNA标记。示例性结果示在图5中。

实施例10.KOD和Pfu聚合酶的另外的嵌合体

该实施例被设计成用来表明，可以变化在域之间发生切换的位置。

通过切换KOD和Pfu聚合酶的掌域和指域来制备另外的嵌合体，其中，与Kofu和Pod的位置相比，切换的确切位置稍有不同。通过用Pfu(SEQ IDNO：10)的氨基酸305至616替代KOD(SEQ ID NO：12)的氨基酸残基305至615来制备Kofu-II(SEQ ID NO：26)。通过用KOD(SEQ ID NO：12)的氨基酸305至615替代Pfu(SEQ ID NO：10)的氨基酸305至616来制备Pod-II(SEQ ID NO：27)。

通过用Pfu(SEQ ID NO：10)的氨基酸397至565替代KOD(SEQ ID NO：12)的氨基酸残基396至564来制备Kofu-III(SEQ ID NO：28)。通过用KOD(SEQ IDNO：12)的氨基酸396至564替代Pfu(SEQ ID NO：10)的氨基酸397至565来制备Pod-III(SEQ ID NO：29)。

反向翻译和密码子优化嵌合体Kofu-II、Pod-II、Kofu-III以及Pod-III的氨基酸序列，用于表达在大肠杆菌中。将包含Eco31I限制性位点的另外的核苷酸序列加入到构造物的5’和3’端以促进克隆到表达载体中。更具体地说，可以设计5’和3’序列，使得突出端，在用Eco31I消化DNA以后，互补于在特定表达载体(例如，pKB)中的突出端。通过GeneArt Gmbh进行密码子优化和基因合成。利用本领域已知的方法，例如，如在“具体实施方式”中所评述的，进行嵌合聚合酶的表达和纯化。如在实施例5至9中所描述的，确定嵌合聚合酶的热稳定性、保真性、持续合成能力、抗盐性以及TMAC耐性。

实施例11.T.litoralis和9度N-7聚合酶的嵌合体

基于图1中的序列对比来设计嵌合体9N1i和Li9N。通过在T.litoralis的DNA聚合酶与热球菌属9度N-7的DNA聚合酶之间切换掌域和指域来制备它们。基于氨基酸水平，上述两种聚合酶之间的整体序列同一性为77％。

可以通过用T.litoralis聚合酶的掌区和指区替代9N聚合酶的掌区和指区来制备嵌合体9N1i。在该特定实施例中，通过用T.litoralis聚合酶(SEQ ID NO：19)的氨基酸349至583替代9N聚合酶(SEQ ID NO：18)的氨基酸347至580来制备9N1i。9N1i的编码区的序列提供为SEQ ID NO：20。

可以通过用9度North的DNA聚合酶的指域替代T.litoralis的DNA聚合酶的掌域和指域来制备嵌合体LiN9。在该特定实施例中，通过用9度N-7聚合酶(SEQ ID NO：18)的氨基酸347至580替代T.litoralis聚合酶(SEQ ID NO：19)的氨基酸349至583来制备LiN9。LiN9的编码区的序列提供为SEQ ID NO：21。

实施例12.T.gorgonarius和T.zilligii B型DNA聚合酶的嵌合体

基于图1中的序列对比来设计嵌合体GoZi和ZiGo。通过在T.gorgonarius和T.zilligiihe的DNA聚合酶之间切换掌域和指域来制备它们。基于氨基酸水平，上述两种聚合酶之间的整体序列同一性为94％。

可以通过用T.zilligii聚合酶的掌区和指区替代T.gorgonarius聚合酶的掌区和指区来制备嵌合体GoZi。在该特定实施例中，通过用T.zilligii聚合酶(SEQID NO：23)的氨基酸391至559替代T.gorgonarius聚合酶(SEQ ID NO：22)的氨基酸391至559来制备GoZi。所得的嵌合体GoZi的序列提供为SEQ ID NO：24。

可以通过用T.gorgonarius的DNA聚合酶的指域替代T.zilligii的DNA聚合酶的掌域和指域来制备嵌合体ZiGo。在该特定实施例中，通过用T.gorgonarius聚合酶(SEQ ID NO：22)的氨基酸391至559替代T.zilligii聚合酶(SEQ ID NO：23)的氨基酸391至559来制备ZiGo。ZiGo的编码区的序列提供为SEQ ID NO：25。

表5.序列

Pfu和KOD的天然DNA序列

序列1(SEQ ID NO：1)

＞来自基因组序列的天然Pfu核苷酸序列(登录号.AE010147)

1 ATGATTTTAG ATGTGGATTA CATAACTGAA GAAGGAAAAC CTGTTATTAG GCTATTCAAA

61 AAAGAGAACG GAAAATTTAA GATAGAGCAT GATAGAACTT TTAGACCATA CATTTACGCT

121 CTTCTCAGGG ATGATTCAAA GATTGAAGAA GTTAAGAAAA TAACGGGGGA AAGGCATGGA

181 AAGATTGTGA GAATTGTTGA TGTAGAGAAG GTTGAGAAAA AGTTTCTCGG CAAGCCTATT

241 ACCGTGTGGA AACTTTATTT GGAACATCCC CAAGATGTTC CCACTATTAG AGAAAAAGTT

301 AGAGAACATC CAGCAGTTGT GGACATCTTC GAATACGATA TTCCATTTGC AAAGAGATAC

361 CTCATCGACA AAGGCCTAAT ACCAATGGAG GGGGAAGAAG AGCTAAAGAT TCTTGCCTTC

421 GATATAGAAA CCCTCTATCA CGAAGGAGAA GAGTTTGGAA AAGGCCCAAT TATAATGATT

481 AGTTATGCAG ATGAAAATGA AGCAAAGGTG ATTACTTGGA AAAACATAGA TCTTCCATAC

541 GTTGAGGTTG TATCAAGCGA GAGAGAGATG ATAAAGAGAT TTCTCAGGAT TATCAGGGAG

601 AAGGATCCTG ACATTATAGT TACTTATAAT GGAGACTCAT TCGACTTCCC ATATTTAGCG

661 AAAAGGGCAG AAAAACTTGG GATTAAATTA ACCATTGGAA GAGATGGAAG CGAGCCCAAG

721 ATGCAGAGAA TAGGCGATAT GACGGCTGTA GAAGTCAAGG GAAGAATACA TTTCGACTTG

781 TATCATGTAA TAACAAGGAC AATAAATCTC CCAACATACA CACTAGAGGC TGTATATGAA

841 GCAATTTTTG GAAAGCCAAA GGAGAAGGTA TACGCCGACG AGATAGCAAA AGCCTGGGAA

901 AGTGGAGAGA ACCTTGAGAG AGTTGCCAAA TACTCGATGG AAGATGCAAA GGCAACTTAT

961 GAACTCGGGA AAGAATTCCT TCCAATGGAA ATTCAGCTTT CAAGATTAGT TGGACAACCT

1021 TTATGGGATG TTTCAAGGTC AAGCACAGGG AACCTTGTAG AGTGGTTCTT ACTTAGGAAA

1081 GCCTACGAAA GAAACGAAGT AGCTCCAAAC AAGCCAAGTG AAGAGGAGTA TCAAAGAAGG

1141 CTCAGGGAGA GCTACACAGG TGGATTCGTT AAAGAGCCAG AAAAGGGGTT GTGGGAAAAC

1201 ATAGTATACC TAGATTTTAG AGCCCTATAT CCCTCGATTA TAATTACCCA CAATGTTTCT

1261 CCCGATACTC TAAATCTTGA GGGATGCAAG AACTATGATA TCGCTCCTCA AGTAGGCCAC

1321 AAGTTCTGCA AGGACATCCC TGGTTTTATA CCAAGTCTCT TGGGACATTT GTTAGAGGAA

1381 AGACAAAAGA TTAAGACAAA AATGAAGGAA ACTCAAGATC CTATAGAAAA AATACTCCTT

1441 GACTATAGAC AAAAAGCGAT AAAACTCTTA GCAAATTCTT TCTACGGATA TTATGGCTAT

1501 GCAAAAGCAA GATGGTACTG TAAGGAGTGT GCTGAGAGCG TTACTGCCTG GGGAAGAAAG

1561 TACATCGAGT TAGTATGGAA GGAGCTCGAA GAAAAGTTTG GATTTAAAGT CCTCTACATT

1621 GACACTGATG GTCTCTATGC AACTATCCCA GGAGGAGAAA GTGAGGAAAT AAAGAAAAAG

1681 GCTCTAGAAT TTGTAAAATA CATAAATTCA AAGCTCCCTG GACTGCTAGA GCTTGAATAT

1741 GAAGGGTTTT ATAAGAGGGG ATTCTTCGTT ACGAAGAAGA GGTATGCAGT AATAGATGAA

1801 GAAGGAAAAG TCATTACTCG TGGTTTAGAG ATAGTTAGGA GAGATTGGAG TGAAATTGCA

1861 AAAGAAACTC AAGCTAGAGT TTTGGAGACA ATACTAAAAC ACGGAGATGT TGAAGAAGCT

1921 GTGAGAATAG TAAAAGAAGT AATACAAAAG CTTGCCAATT ATGAAATTCC ACCAGAGAAG

1981 CTCGCAATAT ATGAGCAGAT AACAAGACCA TTACATGAGT ATAAGGCGAT AGGTCCTCAC

2041 GTAGCTGTTG CAAAGAAACT AGCTGCTAAA GGAGTTAAAA TAAAGCCAGG AATGGTAATT

2101 GGATACATAG TACTTAGAGG CGATGGTCCA ATTAGCAATA GGGCAATTCT AGCTGAGGAA

2161 TACGATCCCA AAAAGCACAA GTATGACGCA GAATATTACA TTGAGAACCA GGTTCTTCCA

2221 GCGGTACTTA GGATATTGGA GGGATTTGGA TACAGAAAGG AAGACCTCAG ATACCAAAAG

2281 ACAAGACAAG TCGGCCTAAC TTCCTGGCTT AACATTAAAA AATCCTAG

序列2(SEO ID NO：2)

＞天然KOD核苷酸序列(来自基因组序列，登录号AP006878)

1 ATGATCCTCG ACACTGACTA CATAACCGAG GATGGAAAGC CTGTCATAAG AATTTTCAAG

61 AAGGAAAACG GCGAGTTTAA GATTGAGTAC GACCGGACTT TTGAACCCTA CTTCTACGCC

121 CTCCTGAAGG ACGATTCTGC CATTGAGGAA GTCAAGAAGA TAACCGCCGA GAGGCACGGG

181 ACGGTTGTAA CGGTTAAGCG GGTTGAAAAG GTTCAGAAGA AGTTCCTCGG GAGACCAGTT

241 GAGGTCTGGA AACTCTACTT TACTCATCCG CAGGACGTCC CAGCGATAAG GGACAAGATA

301 CGAGAGCATC CAGCAGTTAT TGACATCTAC GAGTACGACA TACCCTTCGC CAAGCGCTAC

361 CTCATAGACA AGGGATTAGT GCCAATGGAA GGCGACGAGG AGCTGAAAAT GCTCGCCTTC

421 GACATTGAAA CTCTCTACCA TGAGGGCGAG GAGTTCGCCG AGGGGCCAAT CCTTATGATA

481 AGCTACGCCG ACGAGGAAGG GGCCAGGGTG ATAACTTGGA AGAACGTGGA TCTCCCCTAC

541 GTTGACGTCG TCTCGACGGA GAGGGAGATG ATAAAGCGCT TCCTCCGTGT TGTGAAGGAG

601 AAAGACCCGG ACGTTCTCAT AACCTACAAC GGCGACAACT TCGACTTCGC CTATCTGAAA

661 AAGCGCTGTG AAAAGCTCGG AATAAACTTC GCCCTCGGAA GGGATGGAAG CGAGCCGAAG

721 ATTCAGAGGA TGGGCGACAG GTTTGCCGTC GAAGTGAAGG GACGGATACA CTTCGATCTC

781 TATCCTGTGA TAAGACGGAC GATAAACCTG CCCACATACA CGCTTGAGGC CGTTTATGAA

841 GCCGTCTTCG GTCAGCCGAA GGAGAAGGTT TACGCTGAGG AAATAACCAC AGCCTGGGAA

901 ACCGGCGAGA ACCTTGAGAG AGTCGCCCGC TACTCGATGG AAGATGCGAA GGTCACATAC

961 GAGCTTGGGA AGGAGTTCCT TCCGATGGAG GCCCAGCTTT CTCGCTTAAT CGGCCAGTCC

1021 CTCTGGGACG TCTCCCGCTC CAGCACTGGC AACCTCGTTG AGTGGTTCCT CCTCAGGAAG

1081 GCCTATGAGA GGAATGAGCT GGCCCCGAAC AAGCCCGATG AAAAGGAGCT GGCCAGAAGA

1141 CGGCAGAGCT ATGAAGGAGG CTATGTAAAA GAGCCCGAGA GAGGGTTGTG GGAGAACATA

1201 GTGTACCTAG ATTTTAGATC CCTGTACCCC TCAATCATCA TCACCCACAA CGTCTCGCCG

1261 GATACGCTCA ACAGAGAAGG ATGCAAGGAA TATGACGTTG CCCCACAGGT CGGCCACCGC

1321 TTCTGCAAGG ACTTCCCAGG ATTTATCCCG AGCCTGCTTG GAGACCTCCT AGAGGAGAGG

1381 CAGAAGATAA AGAAGAAGAT GAAGGCCACG ATTGACCCGA TCGAGAGGAA GCTCCTCGAT

1441 TACAGGCAGA GGGCCATCAA GATCCTGGCA AACAGCTACT ACGGTTACTA CGGCTATGCA

1501 AGGGCGCGCT GGTACTGCAA GGAGTGTGCA GAGAGCGTAA CGGCCTGGGG AAGGGAGTAC

1561 ATAACGATGA CCATCAAGGA GATAGAGGAA AAGTACGGCT TTAAGGTAAT CTACAGCGAC

1621 ACCGACGGAT TTTTTGCCAC AATACCTGGA GCCGATGCTG AAACCGTCAA AAAGAAGGCT

1681 ATGGAGTTCC TCAAGTATAT CAACGCCAAA CTTCCGGGCG CGCTTGAGCT CGAGTACGAG

1741 GGCTTCTACA AACGCGGCTT CTTCGTCACG AAGAAGAAGT ATGCGGTGAT AGACGAGGAA

1801 GGCAAGATAA CAACGCGCGG ACTTGAGATT GTGAGGCGTG ACTGGAGCGA GATAGCGAAA

1861 GAGACGCAGG CGAGGGTTCT TGAAGCTTTG CTAAAGGACG GTGACGTCGA GAAGGCCGTG

1921 AGGATAGTCA AAGAAGTTAC CGAAAAGCTG AGCAAGTACG AGGTTCCGCC GGAGAAGCTG

1981 GTGATCCACG AGCAGATAAC GAGGGATTTA AAGGACTACA AGGCAACCGG TCCCCACGTT

2041 GCCGTTGCCA AGAGGTTGGC CGCGAGAGGA GTCAAAATAC GCCCTGGAAC GGTGATAAGC

2101 TACATCGTGC TCAAGGGCTC TGGGAGGATA GGCGACAGGG CGATACCGTT CGACGAGTTC

2161 GACCCGACGA AGCACAAGTA CGACGCCGAG TACTACATTG AGAACCAGGT TCTCCCAGCC

2221 GTTGAGAGAA TTCTGAGAGC CTTCGGTTAC CGCAAGGAAG ACCTGCGCTA CCAGAAGACG

2281 AGACAGGTTG GTTTGAGTGC TTGGCTGAAG CCGAAGGGAA CTTGA

Pfu和KOD的密码子优化序列

序列3(SEQ ID NO：3)

＞Pfu密码子优化的核苷酸序列

1 ATGATTCTGG ATGTGGACTA TATCACCGAA GAGGGCAAAC CGGTTATACG TTTATTTAAG

61 AAAGAGAATG GTAAATTCAA GATCGAGCAT GACCGCACGT TCGGTCCATA CATTTACGCG

121 TTGCTTCGGG ATGATAGCAA AATTGAGGAA GTCAAAAAGA TCACCGGGGA ACGTCATGGA

181 AAAATAGTAA GAATTGTGGA CGTTGAAAAA GTCGAAAAGA AATTTCTGGG CAAACCGATC

241 ACTGTATGGA AGCTCTATCT GGAACATCCT CAGGATGTGC CCACAATTCG AGAAAAAGTT

301 CGTGAGCACC CAGCCGTCGT GGATATATTT GAATATGACA TCCCTTTTGC AAAACGCTAC

361 TTAATTGATA AAGGCCTGAT CCCGATGGAG GGGGAAGAAG AACTTAAAAT TCTGGCTTTT

421 GACATAGAAA CGCTCTATCA TGAGGGAGAA GAATTTGGCA AAGGTCCCAT CATTATGATT

481 TCTTACGCGG ATGAGAACGA AGCCAAGGTA ATCACTTGGA AAAATATTGA CCTGCCGTAC

541 GTTGAAGTGG TCAGTTCAGA GCGGGAAATG ATTAAACGTT TTTTACGCAT CATTAGAGAG

601 AAAGATCCAG ATATAATCGT TACATATAAC GGCGACTCCT TCGATTTTCC TTACCTGGCA

661 AAACGAGCTG AAAAATTGGG TATTAAACTT ACCATCGGGC GTGACGGATC GGAACCGAAA

721 ATGCAACGCA TTGGCGATAT GACGGCGGTA GAGGTGAAAG GTCGGATACA CTTTGATCTG

781 TATCATGTCA TCACCCGTAC TATTAATCTC CCCACATACA CGTTAGAAGC CGTTTATGAG

841 GCAATATTCG GCAAGCCGAA AGAAAAAGTG TACGCTGACG AAATCGCGAA GGCATGGGAG

901 AGCGGCGAAA ACCTGGAGCG CGTAGCAAAA TATTCTATGG AAGATGCTAA AGCGACCTAC

961 GAATTGGGGA AAGAATTTCT TCCAATGGAA ATTCAGCTGA GTCGTTTAGT CGGACAACCT

1021 CTGTGGGACG TTTCACGCTC CTCGACTGGC AATCTCGTGG AGTGGTTCCT GTTGAGAAAA

1081 GCCTATGAAC GAAACGAAGT AGCACCGAAT AAACCAAGCG AGGAAGAATA TCAGCGTCGC

1141 CTTCGCGAGT CTTACACAGG TGGGTTTGTT AAGGAACCGG AGAAAGGTCT TTGGGAAAAC

1201 ATCGTGTATT TAGATTTCCG TGCGCTGTAC CCCAGTATTA TAATCACCCA CAATGTCTCA

1261 CCTGACACGC TCAACTTGGA AGGTTGCAAA AATTATGATA TTGCTCCGCA AGTTGGACAT

1321 AAGTTTTGTA AAGATATTCC GGGCTTCATC CCGTCCCTGC TTGGTCACTT ACTGGAAGAG

1381 CGCCAAAAAA TTAAGACCAA AATGAAAGAG ACTCAGGATC CCATTGAAAA GATCCTGCTC

1441 GATTACCGGC AAAAAGCCAT TAAATTGCTT GCAAACTCGT TTTATGGGTA CTATGGCTAT

1501 GCGAAGGCTC GTTGGTACTG CAAAGAATGT GCCGAGAGCG TGACAGCATG GGGTCGCAAA

1561 TATATAGAAT TAGTATGGAA GGAGCTGGAA GAAA ATTCG GATTCAAAGT CCTGTACATC

1621 GATACGGATG GCCTCTATGC GACCATTCCT GGTGGGGAGT CTGAAGAAAT CAAGAAAAAA

1681 GCCTTGGAAT TCGTTAAGTA CATTAATAGT AAATTACCGG GACTGCTTGA ACTGGAGTAT

1741 GAAGGCTTCT ACAAAAGAGG TTTTTTCGTT ACTAAGAAAC GATATGCCGT AATAGATGAA

1801 GAGGGGAAAG TCATCACACG TGGCCTCGAG ATTGTTCGCC GGGACTGGTC AGAGATAGCA

1861 AAGGAAACGC AGGCGCGCGT GCTCGAAACC ATCTTGAAAC ATGGTGATGT AGAGGAAGCC

1921 GTCCGCATTG TTAAAGAGGT GATCCAGAAG TTAGCAAACT ATGAAATTCC ACCGGAAAAA

1981 CTGGCGATAT ACGAGCAAAT CACTCGTCCC CTTCACGAAT ATAAAGCTAT TGGACCTCAT

2041 GTAGCCGTCG CGAAGAAACT GGCTGCAAAA GGCGTTAAGA TAAAACCAGG TATGGTGATC

2101 GGGTACATTG TACTCCGCGG CGACGGTCCG ATTTCCAATA GAGCCATCTT GGCGGAGGAA

2161 TATGATCCTA AAAAGCATAA ATACGACGCT GAATATTACA TTGAGAACCA GGTCTTGCCG

2221 GCAGTTCTGC GGATACTTGA AGGATTTGGC TATCGTAAAG AAGATCTGCG CTATCAAAAG

2281 ACGCGACAGG TGGGTCTGAC TAGCTGGTTG AATATCAAAA AATCGTAA

序列4(SEQ ID NO：4)

＞Pfu密码子优化的核苷酸序列，在5’区中额外9nt。

1 ATGGCTAGCG CCATTCTGGA TGTGGACTAT ATCACCGAAG AGGGCAAACC GGTTATACGT

61 TTATTTAAGA AAGAGAATGG TAAATTCAAG ATCGAGCATG ACCGCACGTT CCGTCCATAC

121 ATTTACGCGT TGCTTCGGGA TGATAGCAAA ATTGAGGAAG TCAAAAAGAT CACCGGGGAA

181 CGTCATGGAA AAATAGTAAG AATTGTGGAC GTTGAAAAAG TCGAAAAGAA ATTTCTGGGC

241 AAACCGATCA CTGTATGGAA GCTCTATCTG GAACATCCTC AGGATGTGCC CACAATTCGA

301 GAAAAAGTTC GTGAGCACCC AGCCGTCGTG GATATATTTG AATATGACAT CCCTTTTGCA

361 AAACGCTACT TAATTGATAA AGGCCTGATC CCGATGGAGG GGGAAGAAGA ACTTAAAATT

421 CTGGCTTTTG ACATAGAAAC GCTCTATCAT GAGGGAGAAG AATTTGGCAA AGGTCCCATC

481 ATTATGATTT CTTACGCGGA TGAGAACGAA GCCAAGGTAA TCACTTGGAA AAATATTGAC

541 CTGCCGTACG TTGAAGTGGT CAGTTCAGAG CGGGAAATGA TTAAACGTTT TTTACGCATC

601 ATTAGAGAGA AAGATCCAGA TATAATCGTT ACATATAACG GCGACTCCTT CGATTTTCCT

661 TACCTGGCAA AACGAGCTGA AAAATTGGGT ATTAAACTTA CCATCGGGCG TGACGGATCG

721 GAACCGAAAA TGCAACGCAT TGGCGATATG ACGGCGGTAG AGGTGAAAGG TCGGATACAC

781 TTTGATCTGT ATCATGTCAT CACCCGTACT ATTAATCTCC CCACATACAC GTTAGAAGCC

841 GTTTATGAGG CAATATTCGG CAAGCCGAAA GAAAAAGTGT ACGCTGACGA AATCGCGAAG

901 GCATGGGAGA GCGGCGAAAA CCTGGAGCGC GTAGCAAAAT ATTCTATGGA AGATGCTAAA

961 GCGACCTACG AATTGGGGAA AGAATTTCTT CCAATGGAAA TTCAGCTGAG TCGTTTAGTC

1021 GGACAACCTC TGTGGGACGT TTCACGCTCC TCGACTGGCA ATCTCGTGGA GTGGTTCCTG

1081 TTGAGAAAAG CCTATGAACG AAACGAAGTA GCACCGAATA AACCAAGCGA GGAAGAATAT

1141 CAGCGTCGCC TTCGCGAGTC TTACACAGGT GGGTTTGTTA AGGAACCGGA GAAAGGTCTT

1201 TGGGAAAACA TCGTGTATTT AGATTTCCGT GCGCTGTACC CCAGTATTAT AATCACCCAC

1261 AATGTCTCAC CTGACACGCT CAACTTGGAA GGTTGCAAAA ATTATGATAT TGCTCCGCAA

1321 GTTGGACATA AGTTTTGTAA AGATATTCCG GGCTTCATCC CGTCCCTGCT TGGTCACTTA

1381 CTGGAAGAGC GCCAAAAAAT TAAGACCAAA ATGAAAGAGA CTCAGGATCC CATTGAAAAG

1441 ATCCTGCTCG ATTACCGGCA AAAAGCCATT AAATTGCTTG CAAACTCGTT TTATGGGTAC

1501 TATGGCTATG CGAAGGCTCG TTGGTACTGC AAAGAATGTG CCGAGAGCGT GACAGCATGG

1561 GGTCGCAAAT ATATAGAATT AGTATGGAAG GAGCTGGAAG AAAAATTCGG ATTCAAAGTC

1621 CTGTACATCG ATACGGATGG CCTCTATGCG ACCATTCCTG GTGGGGAGTC TGAAGAAATC

1681 AAGAAAAAAG CCTTGGAATT CGTTAAGTAC ATTAATAGTA AATTACCGGG ACTGCTTGAA

1741 CTGGAGTATG AAGGCTTCTA CAAAAGAGGT TTTTTCGTTA CTAAGAAACG ATATGCCGTA

1801 ATAGATGAAG AGGGGAAAGT CATCACACGT GGCCTCGAGA TTGTTCGCCG GGACTGGTCA

1861 GAGATAGCAA AGGAAACGCA GGCGCGCGTG CTCGAAACCA TCTTGAAACA TGGTGATGTA

1921 GAGGAAGCCG TCCGCATTGT TAAAGAGGTG ATCCAGAAGT TAGCAAACTA TGAAATTCCA

1981 CCGGAAAAAC TGGCGATATA CGAGCAAATC ACTCGTCCCC TTCACGAATA TAAAGCTATT

2041 GGACCTCATG TAGCCGTCGC GAAGAAACTG GCTGCAAAAG GCGTTAAGAT AAAACCAGGT

2101 ATGGTGATCG GGTACATTGT ACTCCGCGGC GACGGTCCGA TTTCCAATAG AGCCATCTTG

2161 GCGGAGGAAT ATGATCCTAA AAAGCATAAA TACGACGCTG AATATTACAT TGAGAACCAG

2221 GTCTTGCCGG CAGTTCTGCG GATACTTGAA GGATTTGGCT ATCGTAAAGA AGATCTGCGC

2281 TATCAAAAGA CGCGACAGGT GGGTCTGACT AGCTGGTTGA ATATCAAAAA ATCGTAA

序列5(SEQ ID NO：5)

＞KOD密码子优化的核苷酸序列

1 ATGATTCTGG ATACCGACTA TATCACGGAA GATGGCAAAC CGGTGATACG TATTTTTAAG

61 AAAGAGAATG GTGAGTTCAA AATCGAGTAC GACCGCACTT TTGAGCCATA TTTCTACGCG

121 TTACTGAAGG ACGATAGCGC CATTGAAGAA GTTAAAAAAA TCACCGCAGA GCGGCATGGG

181 ACAGTGGTAA CCGTGAAGAG AGTTGAAAAA GTCCAGAAAA AATTTTTGGG ACGACCTGTA

241 GAAGTGTGGA AACTTTATTT CACTCACCCC CAAGATGTTC CGGCTATACG TGATAAAATT

301 CGCGAACATC CAGCGGTCAT TGATATTTAC GAATATGATA TACCTTTTGC CAAGCGTTAC

361 CTCATCGACA AAGGCCTGGT GCCGATGGAA GGTGATGAAG AATTAAAAAT GTTGGCATTC

421 GACATTGAAA CACTTTATCA CGAGGGGGAA GAGTTTGCTG AGGGTCCCAT CCTGATGATT

481 TCTTATGCGG ATGAAGAGGG TGCCCGCGTA ATAACCTGGA AGAACGTTGA TCTCCCGTAC

541 GTGGACGTCG TTAGTACGGA ACGGGAAATG ATCAAACGTT TCCTGCGCGT AGTGAAAGAG

601 AAAGATCCAG ACGTCTTAAT TACCTATAAT GGTGATAACT TTGATTTTGC ATACCTGAAA

661 AAAAGATGCG AAAAGTTGGG CATAAATTTC GCTCTTGGTC GAGACGGGTC AGAGCCTAAA

721 ATCCAGCGTA TGGGAGATCG CTTTGCGGTT GAAGTGAAAG GCCGGATTCA TTTCGACCTG

781 TATCCGGTAA TTCGTCGCAC TATCAACCTC CCCACATACA CGTTAGAAGC CGTCTATGAG

841 GCAGTTTTTG GTCAACCGAA GGAAAAAGTT TACGCTGAGG AAATTACCAC TGCGTGGGAA

901 ACAGGCGAGA ATCTGGAACG TGTAGCCCGC TATTCTATGG AGGATGCAAA AGTTACCTAT

961 GAATTGGGTA AGGAATTTCT TCCAATGGAG GCGCAGCTGT CGAGATTAAT AGGGCAGAGC

1021 CTGTGGGACG TGTCTCGAAG TTCAACGGGA AACCTCGTCG AATGGTTTCT GTTGCGGAAA

1081 GCATACGAGC GTAATGAACT TGCCCCTAAC AAACCGGATG AAAAGGAGCT GGCACGCCGT

1141 CGCCAATCCT ATGAAGGCGG TTACGTTAAA GAACCAGAGC GGGGGTTATG GGAAAATATC

1201 GTGTATCTGG ATTTCCGTTC GCTCTACCCG AGCATTATCA TTACCCACAA CGTATCTCCC

1261 GACACTTTGA ATCGCGAGGG CTGTAAAGAA TATGATGTCG CGCCGCAGGT TGGTCATAGA

1321 TTTTGCAAGG ACTTCCCGGG ATTTATACCA AGTCTGCTTG GCGATTTACT GGAAGAGCGA

1381 CAAAAAATCA AAAAGAAAAT GAAAGCTACA ATCGATCCGA TAGAACGTAA GCTGCTCGAC

1441 TACCGCCAGC GGGCCATCAA AATTTTGGCA AACTCATATT ATGGTTACTA TGGGTACGCG

1501 CGTGCTCGCT GGTATTGTAA AGAGTGCGCC GAATCCGTGA CGGCATGGGG CCGTGAATAC

1561 ATCACCATGA CTATTAAGGA GATAGAAGAG AAATATGGTT TCAAAGTAAT CTACTCGGAT

1621 ACAGACGGAT TCTTTGCGAC GATTCCCGGT GCCGATGCAG AAACCGTCAA GAAAAAAGCG

1681 ATGGAATTCC TTAAGTATAT AAATGCTAAA TTACCTGGTG CCCTGGAGCT GGAATACGAA

1741 GGGTTTTACA AACGCGGATT CTTTGTTACT AAGAAAAAAT ATGCGGTGAT CGACGAGGAA

1801 GGCAAGATTA CGACCAGAGG CCTCGAGATT GTACGGCGTG ATTGGAGCGA AATCGCTAAA

1861 GAAACACAGG CACGTGTCTT GGAGGCATTA CTGAAAGATG GGGACGTTGA AAAGGCGGTG

1921 CGAATTGTAA AAGAAGTCAC CGAAAAACTT TCTAAGTACG AAGTTCCGCC AGAGAAACTG

1981 GTGATACACG AACAAATCAC TCGTGATCTG AAAGACTATA AGGCTACAGG CCCGCATGTA

2041 GCAGTCGCCA AACGCCTCGC GGCTCGGGGT GTTAAAATTC GTCCCGGAAC GGTGATCAGT

2101 TACATTGTAT TGAAGGGCTC AGGTCGCATA GGGGATAGAG CAATCCCTTT CGACGAGTTT

2161 GATCCAACCA AACACAAATA TGATGCCGAA TACTATATTG AAAACCAGGT CTTGCCGGCG

2221 GTTGAGCGTA TACTGCGCGC TTTCGGCTAT CGAAAGGAAG ATCTTCGTTA CCAAAAAACT

2281 AGACAGGTGG GTCTGTCCGC ATGGCTCAAA CCTAAGGGAA CGTAA

序列6(SEQ ID NO：6)

＞KOD密码子优化的核苷酸序列，在5’区中额外9nt。

1 ATGGCTAGCG CCATTCTGGA TACCGACTAT ATCACGGAAG ATGGCAAACC GGTGATACGT

61 ATTTTTAAGA AAGAGAATGG TGAGTTCAAA ATCGAGTACG ACCGCACTTT TGAGCCATAT

121 TTCTACGCGT TACTGAAGGA CGATAGCGCC ATTGAAGAAG TTAAAAAAAT CACCGCAGAG

181 CGGCATGGGA CAGTGGTAAC CGTGAAGAGA GTTGAAAAAG TCCAGAAAAA ATTTTTGGGA

241 CGACCTGTAG AAGTGTGGAA ACTTTATTTC ACTCACCCCC AAGATGTTCC GGCTATACGT

301 GATAAAATTC GCGAACATCC AGCGGTCATT GATATTTACG AATATGATAT ACCTTTTGCC

361 AAGCGTTACC TCATCGACAA AGGCCTGGTG CCGATGGAAG GTGATGAAGA ATTAAAAATG

421 TTGGCATTCG ACATTGAAAC ACTTTATCAC GAGGGGGAAG AGTTTGCTGA GGGTCCCATC

481 CTGATGATTT CTTATGCGGA TGAAGAGGGT GCCCGCGTAA TAACCTGGAA GAACGTTGAT

541 CTCCCGTACG TGGACGTCGT TAGTACGGAA CGGGAAATGA TCAAACGTTT CCTGCGCGTA

601 GTGAAAGAGA AAGATCCAGA CGTCTTAATT ACCTATAATG GTGATAACTT TGATTTTGCA

661 TACCTGAAAA AAAGATGCGA AAAGTTGGGC ATAAATTTCG CTCTTGGTCG AGACGGGTCA

721 GAGCCTAAAA TCCAGCGTAT GGGAGATCGC TTTGCGGTTG AAGTGAAAGG CCGGATTCAT

781 TTCGACCTGT ATCCGGTAAT TCGTCGCACT ATCAACCTCC CCACATACAC GTTAGAAGCC

841 GTCTATGAGG CAGTTTTTGG TCAACCGAAG GAAAAAGTTT ACGCTGAGGA AATTACCACT

901 GCGTGGGAAA CAGGCGAGAA TCTGGAACGT GTAGCCCGCT ATTCTATGGA GGATGCAAAA

961 GTTACCTATG AATTGGGTAA GGAATTTCTT CCAATGGAGG CGCAGCTGTC GAGATTAATA

1021 GGGCAGAGCC TGTGGGACGT GTCTCGAAGT TCAACGGGAA ACCTCGTCGA ATGGTTTCTG

1081 TTGCGGAAAG CATACGAGCG TAATGAACTT GCCCCTAACA AACCGGATGA AAAGGAGCTG

1141 GCACGCCGTC GCCAATCCTA TGAAGGCGGT TACGTTAAAG AACCAGAGCG GGGGTTATGG

1201 GAAAATATCG TGTATCTGGA TTTCCGTTCG CTCTACCCGA GCATTATCAT TACCCACAAC

1261 GTATCTCCCG ACACTTTGAA TCGCGAGGGC TGTAAAGAAT ATGATGTCGC GCCGCAGGTT

1321 GGTCATAGAT TTTGCAAGGA CTTCCCGGGA TTTATACCAA GTCTGCTTGG CGATTTACTG

1381 GAAGAGCGAC AAAAAATCAA AAAGAAAATG AAAGCTACAA TCGATCCGAT AGAACGTAAG

1441 CTGCTCGACT ACCGCCAGCG GGCCATCAAA ATTTTGGCAA ACTCATATTA TGGTTACTAT

1501 GGGTACGCGC GTGCTCGCTG GTATTGTAAA GAGTGCGCCG AATCCGTGAC GGCATGGGGC

1561 CGTGAATACA TCACCATGAC TATTAAGGAG ATAGAAGAGA AATATGGTTT CAAAGTAATC

1621 TACTCGGATA CAGACGGATT CTTTGCGACG ATTCCCGGTG CCGATGCAGA AACCGTCAAG

1681 AAAAAAGCGA TGGAATTCCT TAAGTATATA AATGCTAAAT TACCTGGTGC CCTGGAGCTG

1741 GAATACGAAG GGTTTTACAA ACGCGGATTC TTTGTTACTA AGAAAAAATA TGCGGTGATC

1801 GACGAGGAAG GCAAGATTAC GACCAGAGGC CTCGAGATTG TACGGCGTGA TTGGAGCGAA

1861 ATCGCTAAAG AAACACAGGC ACGTGTCTTG GAGGCATTAC TGAAAGATGG GGACGTTGAA

1921 AAGGCGGTGC GAATTGTAAA AGAAGTCACC GAAAAACTTT CTAAGTACGA AGTTCCGCCA

1981 GAGAAACTGG TGATACACGA ACAAATCACT CGTGATCTGA AAGACTATAA GGCTACAGGC

2041 CCGCATGTAG CAGTCGCCAA ACGCCTCGCG GCTCGGGGTG TTAAAATTCG TCCCGGAACG

2101 GTGATCAGTT ACATTGTATT GAAGGGCTCA GGTCGCATAG GGGATAGAGC AATCCCTTTC

2161 GACGAGTTTG ATCCAACCAA ACACAAATAT GATGCCGAAT ACTATATTGA AAACCAGGTC

2221 TTGCCGGCGG TTGAGCGTAT ACTGCGCGCT TTCGGCTATC GAAAGGAAGA TCTTCGTTAC

2281 CAAAAAACTA GACAGGTGGG TCTGTCCGCA TGGCTCAAAC CTAAGGGAAC GTAA

序列7(SEQ ID NO：7)

＞pKB13-Pfu密码子优化的核苷酸序列，在pUC19载体中

1 TCGCGCGTTT CGGTGATGAC GGTGAAAACC TCTGACACAT GCAGCTCCCG GAGACGGTCA

61 CAGCTTGTCT GTAAGCGGAT GCCGGGAGCA GACAAGCCCG TCAGGGCGCG TCAGCGGGTG

121 TTGGCGGGTG TCGGGGCTGG CTTAACTATG CGGCATCAGA GCAGATTGTA CTGAGAGTGC

181 ACCATATGCG GTGTGAAATA CCGCACAGAT GCGTAAGGAG AAAATACCGC ATCAGGCGCC

241 ATTCGCCATT CAGGCTGCGC AACTGTTGGG AAGGGCGATC GGTGCGGGCC TCTTCGCTAT

301 TACGCCAGCT GGCGAAAGGG GGATGTGCTG CAAGGCGATT AAGTTGGGTA ACGCCAGGGT

361 TTTCCCAGTC ACGACGTTGT AAAACGACGG CCAGTGAATT CGGTCTCAGC GCCATTCTGG

421 ATACCGACTA TATCACGGAA GATGGCAAAC CGGTGATACG TATTTTTAAG AAAGAGAATG

481 GTGAGTTCAA AATCGAGTAC GACCGCACTT TTGAGCCATA TTTCTACGCG TTACTGAAGG

541 ACGATAGCGC CATTGAAGAA GTTAAAAAAA TCACCGCAGA GCGGCATGGG ACAGTGGTAA

601 CCGTGAAGAG AGTTGAAAAA GTCCAGAAAA AATTTTTGGG ACGACCTGTA GAAGTGTGGA

661 AACTTTATTT CACTCACCCC CAAGATGTTC CGGCTATACG TGATAAAATT CGCGAACATC

721 CAGCGGTCAT TGATATTTAC GAATATGATA TACCTTTTGC CAAGCGTTAC CTCATCGACA

781 AAGGCCTGGT GCCGATGGAA GGTGATGAAG AATTAAAAAT GTTGGCATTC GACATTGAAA

841 CACTTTATCA CGAGGGGGAA GAGTTTGCTG AGGGTCCCAT CCTGATGATT TCTTATGCGG

901 ATGAAGAGGG TGCCCGCGTA ATAACCTGGA AGAACGTTGA TCTCCCGTAC GTGGACGTCG

961 TTAGTACGGA ACGGGAAATG ATCAAACGTT TCCTGCGCGT AGTGAAAGAG AAAGATCCAG

1021 ACGTCTTAAT TACCTATAAT GGTGATAACT TTGATTTTGC ATACCTGAAA AAAAGATGCG

1081 AAAAGTTGGG CATAAATTTC GCTCTTGGTC GAGACGGGTC AGAGCCTAAA ATCCAGCGTA

1141 TGGGAGATCG CTTTGCGGTT GAAGTGAAAG GCCGGATTCA TTTCGACCTG TATCCGGTAA

1201 TTCGTCGCAC TATCAACCTC CCCACATACA CGTTAGAAGC CGTCTATGAG GCAGTTTTTG

1261 GTCAACCGAA GGAAAAAGTT TACGCTGAGG AAATTACCAC TGCGTGGGAA ACAGGCGAGA

1321 ATCTGGAACG TGTAGCCCGC TATTCTATGG AGGATGCAAA AGTTACCTAT GAATTGGGTA

1381 AGGAATTTCT TCCAATGGAG GCGCAGCTGT CGAGATTAAT AGGGCAGAGC CTGTGGGACG

1441 TGTCTCGAAG TTCAACGGGA AACCTCGTCG AATGGTTTCT GTTGCGGAAA GCATACGAGC

1501 GTAATGAACT TGCCCCTAAC AAACCGGATG AAAAGGAGCT GGCACGCCGT CGCCAATCCT

1561 ATGAAGGCGG TTACGTTAAA GAACCAGAGC GGGGGTTATG GGAAAATATC GTGTATCTGG

1621 ATTTCCGTTC GCTCTACCCG AGCATTATCA TTACCCACAA CGTATCTCCC GACACTTTGA

1681 ATCGCGAGGG CTGTAAAGAA TATGATGTCG CGCCGCAGGT TGGTCATAGA TTTTGCAAGG

1741 ACTTCCCGGG ATTTATACCA AGTCTGCTTG GCGATTTACT GGAAGAGCGA CAAAAAATCA

1801 AAAAGAAAAT GAAAGCTACA ATCGATCCGA TAGAACGTAA GCTGCTCGAC TACCGCCAGC

1861 GGGCCATCAA AATTTTGGCA AACTCATATT ATGGTTACTA TGGGTACGCG CGTGCTCGCT

1921 GGTATTGTAA AGAGTGCGCC GAATCCGTGA CGGCATGGGG CCGTGAATAC ATCACCATGA

1981 CTATTAAGGA GATAGAAGAG AAATATGGTT TCAAAGTAAT CTACTCGGAT ACAGACGGAT

2041 TCTTTGCGAC GATTCCCGGT GCCGATGCAG AAACCGTCAA GAAAAAAGCG ATGGAATTCC

2101 TTAAGTATAT AAATGCTAAA TTACCTGGTG CCCTGGAGCT GGAATACGAA GGGTTTTACA

2161 AACGCGGATT GTTTGTTACT AAGAAAAAAT ATGCGGTGAT CGACGAGGAA GGCAAGATTA

2221 CGACCAGAGG CCTCGAGATT GTACGGCGTG ATTGGAGCGA AATCGCTAAA GAAACACAGG

2281 CACGTGTCTT GGAGGCATTA CTGAAAGATG GGGACGTTGA AAAGGCGGTG CGAATTGTAA

2341 AAGAAGTCAC CGAAAAACTT TCTAAGTACG AAGTTCCGCC AGAGAAACTG GTGATACACG

2401 AACAAATCAC TCGTGATCTG AAAGACTATA AGGCTACAGG CCCGCATGTA GCAGTCGCCA

2461 AACGCCTCGC GGCTCGGGGT GTTAAAATTC GTCCCGGAAC GGTGATCAGT TACATTGTAT

2521 TGAAGGGCTC AGGTCGCATA GGGGATAGAG CAATCCCTTT CGACGAGTTT GATCCAACCA

2581 AACACAAATA TGATGCCGAA TACTATATTG AAAACCAGGT CTTGCCGGCG GTTGAGCGTA

2641 TACTGCGCGC TTTCGGCTAT CGAAAGGAAG ATCTTCGTTA CCAAAAAACT AGACAGGTGG

2701 GTCTGTCCGC ATGGCTCAAA CCTAAGGGAA CGTAATGATA TGAGACCGGA TCCTCTAGAG

2761 TCGACCTGCA GGCATGCAAG CTTGGCGTAA TCATGGTCAT AGCTGTTTCC TGTGTGAAAT

2821 TGTTATCCGC TCACAATTCC ACACAACATA CGAGCCGGAA GCATAAAGTG TAAAGCCTGG

2881 GGTGCCTAAT GAGTGAGCTA ACTCACATTA ATTGCGTTGC GCTCACTGCC CGCTTTCCAG

2941 TCGGGAAACC TGTCGTGCCA GCTGCATTAA TGAATCGGCC AACGCGCGGG GAGAGGCGGT

3001 TTGCGTATTG GGCGCTCTTC CGCTTCCTCG CTCACTGACT CGCTGCGCTC GGTCGTTCGG

3061 CTGCGGCGAG CGGTATCAGC TCACTCAAAG GCGGTAATAC GGTTATCCAC AGAATCAGGG

3121 GATAACGCAG GAAAGAACAT GTGAGCAAAA GGCCAGCAAA AGGCCAGGAA CCGTAAAAAG

3181 GCCGCGTTGC TGGCGTTTTT CCATAGGCTC CGCCCCCCTG ACGAGCATCA CAAAAATCGA

3241 CGCTCAAGTC AGAGGTGGCG AAACCCGACA GGACTATAAA GATACCAGGC GTTTCCCCCT

3301 GGAAGCTCCC TCGTGCGCTC TCCTGTTCCG ACCCTGCCGC TTACCGGATA CCTGTCCGCC

3361 TTTCTCCCTT CGGGAAGCGT GGCGCTTTCT CATAGCTCAC GCTGTAGGTA TCTCAGTTCG

3421 GTGTAGGTCG TTCGCTCCAA GCTGGGCTGT GTGCACGAAC CCCCCGTTCA GCCCGACCGC

3481 TGCGCCTTAT CCGGTAACTA TCGTCTTGAG TCCAACCCGG TAAGACACGA CTTATCGCCA

3541 CTGGCAGCAG CCACTGGTAA CAGGATTAGC AGAGCGAGGT ATGTAGGCGG TGCTACAGAG

3601 TTCTTGAAGT GGTGGCCTAA CTACGGCTAC ACTAGAAGAA CAGTATTTGG TATCTGCGCT

3661 CTGCTGAAGC CAGTTACCTT CGGAAAAAGA GTTGGTAGCT CTTGATCCGG CAAACAAACC

3721 ACCGCTGGTA GCGGTGGTTT TTTTGTTTGC AAGCAGCAGA TTACGCGCAG AAAAAAAGGA

3781 TCTCAAGAAG ATCCTTTGAT CTTTTCTACG GGGTCTGACG CTCAGTGGAA CGAAAACTCA

3841 CGTTAAGGGA TTTTGGTCAT GAGATTATCA AAAAGGATCT TCACCTAGAT CCTTTTAAAT

3901 TAAAAATGAA GTTTTAAATC AATCTAAAGT ATATATGAGT AAACTTGGTC TGACAGTTAC

3961 CAATGCTTAA TCAGTGAGGC ACCTATCTCA GCGATCTGTC TATTTCGTTC ATCCATAGTT

4021 GCCTGACTCC CCGTCGTGTA GATAACTACG ATACGGGAGG GCTTACCATC TGGCCCCAGT

4081 GCTGCAATGA TACCGCGAGA CCCACGCTCA CCGGCTCCAG ATTTATCAGC AATAAACCAG

4141 CCAGCCGGAA GGGCCGAGCG CAGAAGTGGT CCTGCAACTT TATCCGCCTC CATCCAGTCT

4201 ATTAATTGTT GCCGGGAAGC TAGAGTAAGT AGTTCGCCAG TTAATAGTTT GCGCAACGTT

4261 GTTGCCATTG CTACAGGCAT CGTGGTGTCA CGCTCGTCGT TTGGTATGGC TTCATTCAGC

4321 TCCGGTTCCC AACGATCAAG GCGAGTTACA TGATCCCCCA TGTTGTGCAA AAAAGCGGTT

4381 AGCTCCTTCG GTCCTCCGAT CGTTGTCAGA AGTAAGTTGG CCGCAGTGTT ATCACTCATG

4441 GTTATGGCAG CACTGCATAA TTCTCTTACT GTCATGCCAT CCGTAAGATG CTTTTCTGTG

4501 ACTGGTGAGT ACTCAACCAA GTCATTCTGA GAATAGTGTA TGCGGCGACC GAGTTGCTCT

4561 TGCCCGGCGT CAATACGGGA TAATACCGCG CCACATAGCA GAACTTTAAA AGTGCTCATC

4621 ATTGGAAAAC GTTCTTCGGG GCGAAAACTC TCAAGGATCT TACCGCTGTT GAGATCCAGT

4681 TCGATGTAAC CCACTCGTGC ACCCAACTGA TCTTCAGCAT CTTTTACTTT CACCAGCGTT

4741 TCTGGGTGAG CAAAAACAGG AAGGCAAAAT GCCGCAAAAA AGGGAATAAG GGCGACACGG

4801 AAATGTTGAA TACTCATACT CTTCCTTTTT CAATATTATT GAAGCATTTA TCAGGGTTAT

4861 TGTCTCATGA GCGGATACAT ATTTGAATGT ATTTAGAAAA ATAAACAAAT AGGGGTTCCG

4921 CGCACATTTC CCCGAAAAGT GCCACCTGAC GTCTAAGAAA CCATTATTAT CATGACATTA

4981 ACCTATAAAA ATAGGCGTAT CACGAGGCCC TTTCGTC

序列8(SEO ID NO：8)

＞pKB8-KOD密码子优化的核苷酸序列，在pUC19载体中

1 TCGCGCGTTT CGGTGATGAC GGTGAAAACC TCTGACACAT GCAGCTCCCG GAGACGGTCA

61 CAGCTTGTCT GTAAGCGGAT GCCGGGAGCA GACAAGCCCG TCAGGGCGCG TCAGCGGGTG

121 TTGGCGGGTG TCGGGGCTGG CTTAACTATG CGGCATCAGA GCAGATTGTA CTGAGAGTGC

181 ACCATATGCG GTGTGAAATA CCGCACAGAT GCGTAAGGAG AAAATACCGC ATCAGGCGCC

241 ATT GCCATT CAGGCTGCGC AACTGTTGGG AAGGGCGATC GGTGCGGGCC TCTTCGCTAT

301 TACGCCAGCT GGCGAAAGGG GGATGTGCTG CAAGGCGATT AAGTTGGGTA ACGCCAGGGT

361 TTTCCCAGTC ACGACGTTGT AAAACGACGG CCAGTGAATT CGGTCTCAGC GCCATTCTGG

421 ATACCGACTA TATCACGGAA GATGGCAAAC CGGTGATACG TATTTTTAAG AAAGAGAATG

481 GTGAGTTCAA AATCGAGTAC GACCGCACTT TTGAGCCATA TTTCTACGCG TTACTGAAGG

541 ACGATAGCGC CATTGAAGAA GTTAAAAAAA TCACCGCAGA GCGGCATGGG ACAGTGGTAA

601 CCGTGAAGAG AGTTGAAAAA GTCCAGAAAA AATTTTTGGG ACGACCTGTA GAAGTGTGGA

661 AACTTTATTT CACTCACCCC CAAGATGTTC CGGCTATACG TGATAAAATT CGCGAACATC

721 CAGCGGTCAT TGATATTTAC GAATATGATA TACCTTTTGC CAAGCGTTAC CTCATCGACA

781 AAGGCCTGGT GCCGATGGAA GGTGATGAAG AATTAAAAAT GTTGGCATTC GACATTGAAA

841 CACTTTATCA CGAGGGGGAA GAGTTTGCTG AGGGTCCCAT CCTGATGATT TCTTATGCGG

901 ATGAAGAGGG TGCCCGCGTA ATAACCTGGA AGAACGTTGA TCTCCCGTAC GTGGACGTCG

961 TTAGTACGGA ACGGGAAATG ATCAAACGTT TCCTGCGCGT AGTGAAAGAG AAAGATCCAG

1021 ACGTCTTAAT TACCTATAAT GGTGATAACT TTGATTTTGC ATACCTGAAA AAAAGATGCG

1081 AAAAGTTGGG CATAAATTTC GCTCTTGGTC GAGACGGGTC AGAGCCTAAA ATCCAGCGTA

1141 TGGGAGATCG CTTTGCGGTT GAAGTGAAAG GCCGGATTCA TTTCGACCTG TATCCGGTAA

1201 TTCGTCGCAC TATCAACCTC CCCACATACA CGTTAGAAGC CGTCTATGAG GCAGTTTTTG

1261 GTCAACCGAA GGAAAAAGTT TACGCTGAGG AAATTACCAC TGCGTGGGAA ACAGGCGAGA

1321 ATCTGGAACG TGTAGCCCGC TATTCTATGG AGGATGCAAA AGTTACCTAT GAATTGGGTA

1381 AGGAATTTCT TCCAATGGAG GCGCAGCTGT CGAGATTAAT AGGGCAGAGC CTGTGGGACG

1441 TGTCTCGAAG TTCAACGGGA AACCTCGTCG AATGGTTTCT GTTGCGGAAA GCATACGAGC

1501 GTATGAAACT TGCCCCTAAC AAACCGGATG AAAAGGAGCT GGCACGCCGT CGCCAATCCT

1561 ATGAAGGCGG TTACGTTAAA GAACCAGAGC GGGGGTTATG GGAAAATATC GTGTATCTGG

1621 ATTTCCGTTC GCTCTACCCG AGCATTATCA TTACCCACAA CGTATCTCCC GACACTTTGA

1681 ATCGCGAGGG CTGTAAAGAA TATGATGTCG CGCCGCAGGT TGGTCATAGA TTTTGCAAGG

1741 ACTTCCCGGG ATTTATACCA AGTCTGCTTG GCGATTTACT GGAAGAGCGA CAAAAAATCA

1801 AAAAGAAAAT GAAAGCTACA ATCGATCCGA TAGAACGTAA GCTGCTCGAC TACCGCCAGC

1861 GGGCCATCAA AATTTTGGCA AACTCATATT ATGGTTACTA TGGGTACGCG CGTGCTCGCT

1921 GGTATTGTAA AGAGTGCGCC GAATCCGTGA CGGCATGGGG CCGTGAATAC ATCACCATGA

1981 CTATTAAGGA GATAGAAGAG AAATATGGTT TCAAAGTAAT CTACTCGGAT ACAGACGGAT

2041 TCTTTGCGAC GATTCCCGGT GCCGATGCAG AAACCGTCAA GAAAAAAGCG ATGGAATTCC

2101 TTACGTATAT AAATGCTAAA TTACCTGGTG CCCTGGAGCT GGAATACGAA GGGTTTTACA

2161 AACGCGGATT CTTTGTTACT AAGAAAAAAT ATGCGGTGAT CGACGAGGAA GGCAAGATTA

2221 CGACCAGAGG CCTCGAGATT GTACGGCGTG ATTGGAGCGA AATCGCTAAA GAAACACAGG

2281 CACGTGTCTT GGAGGCATTA CTGAAAGATG GGGACGTTGA AAAGGCGGTG CGAATTGTAA

2341 AAGAAGTCAC CGAAAAACTT TCTAAGTACG AAGTTCCGGC AGAGAAACTG GTGATACACG

2401 AACAAATCAC TCGTGATCTG AAAGACTATA AGGCTACAGG CCCGCATGTA GCAGTCGCCA

2461 AACGCCTCGC GGCTCGGGGT GTTAAAATTC GTCCCGGAAC GGTGATCAGT TACATTGTAT

2521 TGAAGGGCTC AGGTCGCATA GGGGATAGAG CAATCCCTTT CGACGAGTTT GATCCG CCA

2581 AACACAAATA TGATGCCGAA TACTATATTG AAAACCAGGT CTTGCCGGCG GTTGAGCGTA

2641 TACTGCGCGC TTTCGGCTAT CGAAAGGAAG ATCTTCGTTA CCAAAAAACT AGACAGGTGG

2701 GTCTGTCCGC ATGGCTCAAA CCTAAGGGAA CGTAATGATA TGAGACCGGA TCCTCTAGAG

2761 TCGACCTGCA GGCATGCAAG CTTGGCGTAA TCATGGTCAT AGCTGTTTCC TGTGTGAAAT

2821 TGTTATCCGC TCACAATTCC ACACAACATA CGAGCCGGAA GCATAAAGTG TAAAGCCTGG

2881 GGTGCCTAAT GAGTGAGCTA ACTCACATTA ATTGCGTTGC GCTCACTGCC CGCTTTCCAG

2941 TCGGGAAACC TGTCGTGCCA GCTGCATTAA TGAATCGGCC AACGCGCGGG GAGAGGCGGT

3001 TTGCGTATTG GGCGCTCTTC CGCTTCCTCG CTCACTGACT CGCTGCGCTC GGTCGTTCGG

3061 CTGCGGCGAG CGGTATCAGC TCACTCAAAG GCGGTAATAC GGTTATCCAC AGAATCAGGG

3121 GATAACGCAG GAAAGAACAT GTGAGCAAAA GGCCAGCAAA AGGCCAGGAA CCGTAAAAAG

3181 GCCCCGTTGC TGGCGTTTTT CCATAGGCTC CGCCCCCCTG ACCAGCATCA CAAAAATCGA

3241 CGCTCAAGTC AGAGGTGGCG AAACCCGACA GGACTATAAA GATACCAGGC GTTTCCCCCT

3301 GGAAGCTCCC TCGTGCGCTC TCCTGTTCCG ACCCTGCCGC TTACCGGATA CCTGTCCGCC

3361 TTTCTCCCTT CGGGAAGCGT GGCGCTTTCT CATAGCTCAC GCTGTAGGTA TCTCAGTTCG

3421 GTGTAGGTCG TTCGCTCCAA GCTGGGCTGT GTGCACGAAC CCCCCGTTCA GCCCGACCGC

3481 TGCGCCTTAT CCGGTAACTA TCGTCTTGAG TCCAACCCGG TAAGACACGA CTTATCGCCA

3541 CTGGCAGCAG CCACTGGTAA CAGGATTAGC AGAGCGAGGT ATGTAGGCGG TGCTACAGAG

3601 TTCTTGAAGT GGTGGCCTAA CTACGGCTAC ACTAGAAGAA CAGTATTTGC TATCTGCGCT

3661 CTGCTGAAGC CAGTTACCTT CGGAAAAAGA GTTGGTAGCT CTTGATCCGG CAAACAAACC

3721 ACCGCTGGTA GCGGTGGTTT TTTTGTTTGC AAGCAGCAGA TTACGCGCAG AAAAAAAGGA

3781 TCTCAAGAAG ATCCTTTGAT CTTTTCTACG GGGTCTGACG CTCAGTGGAA CGAAAACTCA

3841 CGTTAAGGGA TTTTGGTCAT GAGATTATCA AAAAGGATCT TCACCTAGAT CCTTTTAAAT

3901 TAAAAATGAA GTTTTAAATC AATCTAAAGT ATATATGAGT AAACTTGGTC TGACAGTTAC

3961 CAATGCTTAA TCAGTGAGGC ACCTATCTCA GCGATCTGTC TATTTCGTTC ATCCATAGTT

4021 GCCTGACTCC CCGTCGTGTA GATAACTACG ATACGGGAGG GCTTACCATC TGGCCCCAGT

4081 GCTGCAATGA TACCGCGAGA CCCACGCTCA CCGGCTCCAG ATTTATCAGC AATAAACCAG

4141 CCAGCCGGAA GGGCCGAGCG CAGAAGTGGT CCTGCAACTT TATCCGCCTC CATCCAGTCT

4201 ATTAATTGTT GCCGGGAAGC TAGAGTAAGT AGTTCGCCAG TTAATAGTTT GCGCAACGTT

4261 GTTGCCATTG CTACAGGCAT CGTGGTGTCA CGCTCGTCGT TTGGTATGGC TTCATTCAGC

4321 TCCGGTTCCC AACGATCAAG GCGAGTTACA TGATCCCCCA TGTTGTGCAA AAAAGCGGTT

4381 AGCTCCTTCG GTCCTCCGAT CGTTGTCAGA AGTAAGTTGG CCGCAGTGTT ATCACTCATG

4441 GTTATGGCAG CACTGCATAA TTCTCTTACT GTCATGCCAT CCGTAAGATG CTTTTCTGTG

4501 ACTGGTGAGT ACTCAACCAA GTCATTCTGA GAATAGTGTA TGCGGCGACC GAGTTGCTCT

4561 TGCCCGGCGT CAATACGGGA TAATACCGCG CCACATAGCA GAACTTTAAA AGTGCTCATC

4621 ATTGGAAAAC GTTCTTCGGG GCGAAAACTC TCAAGGATCT TACCGCTGTT GAGATCCAGT

4681 TCGATGTAAC CCACTCGTGC ACCCAACTGA TCTTCAGCAT CTTTTACTTT CACCAGCGTT

4741 TCTGGGTGAG CAAAAACAGG AAGGCAAAAT GCCGCAAAAA AGGGAATAAG GGCGACACGG

4801 AAATGTTGAA TACTCATACT CTTCCTTTTT CAATATTATT GAAGCATTTA TCAGGGTTAT

4861 TGTCTCATGA GCGGATACAT ATTTGAATGT ATTTAGAAAA ATAAACAAAT AGGGGTTCCG

4921 CGCACATTTC CCCGAAAAGT GCCACCTGAC GTCTAAGAAA CCATTATTAT CATGACATTA

4981 ACCTATAAAA ATAGGCGTAT CACGAGGCCC TTTCGTC

Pfu和KOD的氨基酸序列

序列9(SEQ ID NO：9)

＞Pfu氨基酸序列

1 MILDVDYITE EGKPVIRLFK KEHGKFKIEH DRTFRPYIYA LLRDDSKIEE VKKITGERHG

61 KIVRIVDVEK VEKKFLGKPI TVKKLYLEHP QDVPTIREKV REHPAVVDIF EYDIPFAKRY

121 LIDKGLIPME GEEELKILAF DIETLYHEGE EFGKGPIIMI SYADEHEAKV ITWKHIDLPY

181 VEVVSSEREN IKRFLRIIRE KDPDIIVTYH GDSFDFPYLA KRAEKLGIKL TIGRDGSEPK

241 MQRIGDMTAV EVKGRIHFDL YHVITRTIHL PTYTLEAVYE AIFGKPKEKV YADEIAKAWE

301 SGEHLERVAK YSNEDAKATY ELGKEFLPME IQLSRLVGQP LWDVSRSSTG NLVEWFLLRK

361 AYERNEVAPH KPSEEEYQRR LRESYTGGFV KEPEKGLWEH IVYLDFRALY PSIIITHNVS

421 PDTLHLEGCK NYDIAPQVGH KFCKDIPGFI PSLLGHLLEE RQKIKTKMKE TQDPIEKILL

481 DYRQKAIKLL AHSFYGYYGY AKARWYCKEC AESVTAWGRK YIELVWKELE EKFGFKVLYI

541 DTDGLYATIP GGESEEIKKK ALEFVKYIHS KLPGLLELEY EGFYKRGFFV TKKRYAVIDE

601 EGKVITRGLE IVRRDWSEIA KETQARVLET ILKHGDVEEA VRIVKEVIQK LAHYEIPPEK

661 LAIYEQITRP LHEYKAIGPH VAVAKKLAAK GVKIKPGMVI GYIVLRGDGP ISHRAILAEE

721 YDPKKHKYDA EYYIENQVLP AVLRILEGFG YRKEDLRYQK TRQVGLTSWL NIKKS＊

序列10(SEQ ID NO：10)

＞Pfu氨基酸序列，在5’区中额外3aa。

1 MASAILDVDY ITEEGKPVIR LFKKENGKFK IEHDRTFRPY IYALLRDDSK IEEVKKITGE

61 RHGKIVRIVD VEKVEKKKLG KPITVWKLYL EHPQDVPTIR EKVREHPAVV DIFEYDIPFA

121 KRYLIDKGLI PMEGEEELKI LAFDIETLYH EGEEFGKGPI IMISYADEHE AKVITWKNID

181 LPYVEVVSSE REMIKPFLRI IREKDPDIIV TYHGDSEDFP YLAKRAEKLG IKLTIGRDGS

241 EPKMQRIGDM TAVEVKGRIH FDLYHVITRT IHLPTYTLEA VYEAIFGKPK EKVYADEIAK

301 AWESGEHLER VAKYSMEDAK ATYELGKEFL RMEIQLSRLV GQPLWDVSRS STGNLVEKFL

361 LRKAYERHEV APNKPSEEEY QRRLRESYTG GFVKEPEKGL WEHIVYLDFR ALYPSIIITH

421 NVSPDTLHLE GCKHYDIAPQ VGHKFCKDIP GFIPSLLGHL LEERQKIKTK MKETQDPIEK

481 ILLDYRQKAI KLLAHSFYGY YGYAKARWYC KECAESVTAW GRKYIELVWK ELEEKFGFKV

541 LYIDTDGLYA TIPGGESEEI KKKALEFVKY I SKLPGLLE LEYEGFYKRG FFVTKKRYAV

601 IDEEGKVITR GLEIVRRDWS EIAKETQARV LETILKHGDV EEAVRIVKEV IQKLAHYEIP

661 PEKLAIYEQI TRPLHEYKAI GPHVAVAKKL AAKGVKIKPG MVIGYIVLRG DGPISNRAIL

721 AEEYDPKKHK YDAEYYIENQ VLPAVLRILE GFGYRKEDLR YQKTRQVGLT SWLNIKKS＊

序列11(SEQ ID NO：11)

＞KOD氨基酸序列

1 MILDTDYITE DGKPVIRIFK KENGEFKIEY DRTFEPYFYA LLKDDSAIEE VKKITAERHG

61 TVVTVKRVEK VQKKFLGRPV EVWKLYFTHP QDVPAIRDKI REHPAVIDIY EYDIPFAKRY

121 LIDKGLVPME GDEELKMLAF DIETLYHEGE EFAEGPILMI SYADEEGARV ITWKNVDLPY

181 VDVVSTEREM IKRFLRVVKE KDPDVLITYN GDNFDFAYLK KRCEKLGINF ALGRDGSEPK

241 IQRMGDRFAV EVKGRIHFDL YPVIRRTINL PTYTLEAVYE AVFGQPKEKV YAEEITTAWE

301 TGENLERVAR YSMEDAKVTY ELGKEFLPME AQLSRLIGQS LWDVSRSSTG NLVEWFLLRK

361 AYERNELAPN KPDEKELARR RQSYEGGYVK EPERGLWENI VYLDFRSLYP SIIITHNVSP

421 DTLNREGCKE YDVAPQVGHR FCKDFPGFIP SLLGDLLEER QKIKKKMKAT IDPIERKLLD

481 YRQRAIKILA NSYYGYYGYA RARWYCKECA ESVTAWGREY ITMTIKEIEE KYGFKVIYSD

541 TDGFFATIPG ADAETVKKKA MEFLKYINAK LPGALELEYE GFYKRGFFVT KKKYAVIDEE

601 GKITTRGLEI VRRDWSEIAK ETQARVLEAL LKDGDVEKAV RIVKEVTEKL SKYEVPPEKL

661 VIHEQITRDL KDYKATGPHV AVAKRLAARG VKIRPGTVIS YIVLKGSGRI GDRAIPFDEF

721 DPTKHKYDAE YYIENQVLPA VERILRAFGY RKEDLRYQKT RQVGLSAWLK PKGT

序列12(SEQ ID NO：12)

＞KOD氨基酸序列，在5’区中额外3aa。

1 MACAILDTDY ITEDGKPVIR IFKKEKGEFK IEYDRTFEPY FYALLKDDSA IEEVKKITAE

61 RHGTVTVVKR VEKVQKKFLG RPVEVKKLYF THPQDVPAIR DKIREHPAVI DIYEYDIPFA

121 KRYLIDKGLV PMEGDEELKM LAFDIETLYH EGEEFAEGPI LMISYADEEG ARVITWKHVD

181 LPYVDVVSTE REMIKRFLRV VKEKDPVDLI TYHGDNFDFA YKKKRCEKLG IHFALGRDGS

241 EPKIQRMGDR FAVEVKGRIH FDLYPVIRRT INLPTYTLEA VYEAVFGQPF EVYAEEITT

301 AWETGEHLER VARYSMEDAK VTYELGKEFL PMEAQLCRLI GQSLWDVSRS STGHLVEWFL

361 LRKAYERHEL APNKPDEKEL ARRRQSYEGG YVKEPERGLW EHIVYLDFRS LYPSIIITH

421 VSPDTLNREG CKEYD APQV GHRFCKDFPG FIPSLLGDLL EEPQVIKKKM KATIDPIERK

481 LLDYRQRAIK ILANSYYGYY GYARARWYCK ECAESVTAWG REYITMTIKE IEEKYGPKVI

541 YSDTDGFFAT IPGADAETVK KKAMEFLKYI HAKLPGALEL EYEGFYKRGF FVTKKKYAVI

601 DEEGKITTRG LEIVRRDWSE IAKETQARVL EALLKDGDVE KAVRIVKEVT EKLSKYEVPP

661 EKLVIHEQIT RDLKDYKATG PHVAVAKPLA ARGVKIRPGT VISYIVLKGC GRIGDRAIPF

721 DEFDPTKHKY DAEYYIEHQV LPAVERILRA FGYRKEDLRY QKTRQVGLSA WLKPKGT＊

嵌合体Pod和Kofu的DNA序列

序列13(SEQ ID NO：13)

＞Pod密码子优化的核苷酸序列

1 ATGGCTAGCG CCATTCTGGA TGTGGACTAT ATCACCGAAG AGGGCAAACC GGTTATACGT

61 TTATTTAAGA AAGAGAATGG TAAATTCAAG ATCGASCATG ACCGCACGTT CCGTCCATAC

121 ATTTACGCGT TGCTTCGGGA TGATAGCAAA ATTGAGGAAG TCAAAAAGAT CACCGGGGAA

181 CGTCATGGAA AAATAGTAAG AATTGTGGAC GTTGAAAAAG TCGAAAAGAA ATTTCTGGGC

341 AAACCGATCA CTGTATGGAA GCTCTATCTG GAACATCCTC AGGATGTGCC CACAATTCGA

301 GAAAAAGTTC GTGAGCACCC AGCCGTCGTG GATATATTTG AATATGACAT CCCTTTTGCA

361 AAACGCTACT TAATTGATAA AGGCCTGATC CCGATGGAGG GGGAAGAAGA ACTTAAAATT

421 CTGGCTTTTG ACATAGAAAC GCTCTATCAT GAGGGAGAAG AATTTGGCAA AGGTCCCATC

481 ATTATGATTT CTTACGCGGA TGAGAACGAA GCCAAGGTAA TCACTTGGAA AAATATTGAC

541 CTGCCGTACG TTGAAGTGGT CAGTTCAGAG CGGGAAATGA TTAAACGTTT TTTACGCATC

601 ATTAGAGAGA AAGATCCAGA TATAATCGTT ACATATAACG GCGACTCCTT CGATTTTCCT

661 TACCTGGCAA AACGAGCTGA AAAATTGGGT ATTAAACTTA CCATCGGGCG TGACGGATCG

721 GAACCGAAAA TGCAACGCAT TGGCGATATG ACGGCGGTAG AGGTGAAAGG TCGGATACAC

781 TTTGATCTGT ATCATGTCAT CACCCGTACT ATTAATCTCC CCACATACAC GTTAGAAGCC

841 GTTTATGAGG CAATATTCGG CAAGCCGAAA GAAAAAGTGT ACGCTGACGA AATCGCGAAG

901 GCATGGGAGA GCGGCGAAAA CCTGGAGCGC GTAGCAAAAT ATTCTATGGA AGATGCTAAA

961 GCGACCTACG AATTGGGGAA AGAATTTCTT CCAATGGAAA TTCAGCTGTC GAGATTAATA

1021 GGGCAGAGCC TGTGGGACGT GTCTCGAAGT TCAACGGGAA ACCTCGTCGA ATGGTTTCTG

1081 TTGCGGAAAG CATACGAGCG TAATGAACTT GCCCCTAACA AACCGGATGA AAAGGAGCTG

1141 GCACGCCGTC GCCAATCCTA TGAAGGCGGT TACGTTAAAG AACCAGAGCG GGGGTTATGG

1201 GAAAATATCG TGTATCTGGA TTTCCGTTCG CTCTACCCGA GCATTATCAT TACCCACAAC

1261 GTATCTCCCG ACACTTTGAA TCGCGAGGGC TGTAAAGAAT ATGATGTCGC GCCGCAGGTT

1321 GGTCATAGAT TTTGCAAGGA CTTCCCGGGA TTTATACCAA GTGTGCTTGG CGATTTACTG

1381 GAAGAGCGAC AAAAAATCAA AAAGAAAATG AAAGCTACAA TCGATCCGAT AGAACGTAAG

1441 CTGCTCGACT ACCGCCAGCG GGCCATCAAA ATTTTGGCAA ACTCATATTA TGGTTACTAT

1501 GGGTACGCGC GTGCTCGCTG GTATTGTAAA GAGTGCGCCG AATCCGTGAC GGCATGGGGC

1561 CGTGAATACA TCACCATGAC TATTAAGGAG ATAGAAGAGA AATATGGTTT CAAAGTAATC

1621 TACTCGGATA CAGACGGATT CTTTGCGACG ATTCCCGGTG CCGATGCAGA AACCGTCAAG

1681 AAAAAAGCGA TGGAATTCGT TAAGTACATT AATAGTAAAT TACCGGGACT GCTTGAACTG

1741 GAGTATGAAG GCTTCTACAA AAGAGGTTTT TTCGTTACTA AGAAACGATA TGCCGTAATA

1801 GATGAAGAGG GGAAAGTCAT CACACGTGGC CTCGAGATTG TTCGCCGGGA CTGGTCAGAG

1861 ATAGCAAAGG AAACGCAGGC GCGCGTGCTC GAAACCATCT TGAAACATGG TGATGTAGAG

1921 GAAGCCGTCC GCATTGTTAA AGAGGTGATC CAGAAGTTAG CAAACTATGA AATTCCACCG

1981 GGAAAACTGG CGATATACGA GCAAATCACT CGTCCCCTTC ACGAATATAA AGCTATTGGA

2041 CCTCATGTAG CCGTCGCGAA GAAACTGGCT GCAAAAGGCG TTAAGATAAA ACCAGGTATG

2101 GTGATCGGGT ACATTGTACT CCGCGGCGAC GGTCCGATTT CCAATAGAGC CATCTTGGCG

2161 GAGGAATATG ATCCTAAAAA GCATAAATAC GACGCTGAAT ATTACATTGA GAACCAGGTC

2221 TTGCCGGCAG TTCTGCGGAT ACTTGAAGGA TTTGGCTATC GTAAAGAAGA TCTGCGCTAT

2281 CAAAAGACGC GACAGGTGGG TCTGACTAGC TGGTTGAATA TCAAAAAATC GTAA

序列14(SEO ID NO：14)

＞Kofu密码子优化的核苷酸序列

1 ATGGCTAGCG CCATTCTGGA TACCGACTAT ATCACGGAAG ATGGCAAACC GGTGATACGT

61 ATTTTTAAGA AAGAGAATGG TGAGTTCAAA ATCGAGTACG ACCGCACTTT TGAGCCATAT

121 TTCTACGCGT TACTGAAGGA CGATAGCGCC ATTGAAGAAG TTAAAAAAAT CACCGCAGAG

181 CGGCATGGGA CAGTGGTAAC CGTGAAGAGA GTTGAAAAAG TCCAGAAAAA ATTTTTGGGA

241 CGACCTGTAG AAGTGTGGAA ACTTTATTTC ACTCACCCCC AAGATGTTCC GGCTATACGT

301 GATAAAATTC GCGAACATCC AGCGGTCATT GATATTTACG AATATGATAT ACCTTTTGCC

361 AAGCGTTACC TCATCGACAA AGGCCTGGTG CCGATGGAAG GTGATGAAGA ATTAAAAATG

421 TTGGCATTCG ACATTGAAAC ACTTTATCAC GAGGGGGAAG AGTTTGCTGA GGGTCCCATC

481 CTGATGATTT CTTATGCGGA TGAAGAGGGT GCCCGCGTAA TAACCTGGAA GAACGTTGAT

541 CTCCCGTACG TGGACGTCGT TAGTACGGAA CGGGAAATGA TCAAACGTTT CCTGCGCGTA

601 GTGAAAGAGA AAGATCCAGA CGTCTTAATT ACCTATAATG GTGATAACTT TGATTTTGCA

661 TACCTGAAAA AAAGATGCGA AAAGTTGGGC ATAAATTTCG CTCTTGGTCG AGACGGGTCA

721 GAGCCTAAAA TCCAGCGTAT GGGAGATCGC TTTGCGGTTG AAGTGAAAGG CCGGATTCAT

781 TTCGACCTGT ATCCGGTAAT TCGTCGCACT ATCAACCTCC CCACATACAC GTTAGAAGCC

841 GTCTATGAGG CAGTTTTTGG TCAACCGAAG GAAAAAGTTT ACGCTGAGGA AATTACCACT

901 GCGTGGGAAA CAGGCGAGAA TCTGGAACGT GTAGCCCGCT ATTCTATGGA GGATGCAAAA

961 GTTACCTATG AATTGGGTAA GGAATTTCTT CCAATGGAGG CGCAGCTGAG TCGTTTAGTC

1021 GGACAACCTC TGTGGGACGT TTCACGCTCC TCGACTGGCA ATCTCGTGGA GTGGTTCCTG

1081 TTGAGAAAAG CCTATGAACG AAACGAAGTA GCACCGAATA AACCAAGCGA GGAAGAATAT

1141 CAGCGTCGCC TTCGCGAGTC TTACACAGGT GGGTTTGTTA AGGAACCGGA GAAAGGTCTT

1201 TGGGAAAACA TCGTGTATTT AGATTTCCGT GCGCTGTACC CCAGTATTAT AATCACCCAC

1261 AATGTCTCAC CTGACACGCT CAACTTGGAA GGTTGCAAAA ATTATGATAT TGCTCCGCAA

1321 GTTGGACATA AGTTTTGTAA AGATATTCCG GGCTTCATCC CGTCCCTGCT TGGTCACTTA

1381 CTGGAAGAGC GCCAAAAAAT TAAGACCAAA ATGAAAGAGA CTCAGGATCC CATTGAAAAG

1441 ATCCTGCTCG ATTACCGGCA AAAAGCCATT AAATTGCTTG CAAACTCGTT TTATGGGTAC

1501 TATGGCTATG CGAAGGCTCG TTGGTACTGC AAAGAATGTG CCGAGAGCGT GACAGCATGG

1561 GGTCGCAAAT ATATAGAATT AGTATGGAAG GAGCTGGAAG AAAAATTCGG ATTCAAAGTC

1621 CTGTACATCG ATACGGATGG CCTCTATGCG ACCATTCCTG GTGGGGAGTC TGAAGAAATC

1681 AAGAAAAAAG CCTTGGAATT CCTTAAGTAT ATAAATGCTA AATTACCTGG TGCCCTGGAG

1741 CTGGAATACG AAGGGTTTTA CAAACGCGGA TTCTTTGTTA CTAAGAAAAA ATATGCGGTG

1801 ATCGACGAGG AAGGCAAGAT TACGACCAGA GGCCTCGAGA TTGTACGGCG TGATTGGAGC

1861 GAAATCGCTA AAGAAACACA GGCACGTGTC TTGGAGGCAT TACTGAAAGA TGGGGACGTT

1921 GAAAAGGCGG TGCGAATTGT AAAAGAAGTC ACCGAAAAAC TTTCTAAGTA CGAAGTTCCG

1981 CCAGAGAAAC TGGTGATACA CGAACAAATC ACTCGTGATC TGAAAGACTA TAAGGCTACA

2041 GGCCCGCATG TAGCAGTCGC CAAACGCCTC GCGGCTCGGG GTGTTAAAAT TCGTCCCGGA

2101 ACGGTGATCA GTTACATTGT ATTGAAGGGC TCAGGTCGCA TAGGGGATAG AGCAATCCCT

2161 TTCGACGAGT TTGATCCAAC CAAACACAAA TATGATGCCG AATACTATAT TGAAAACCAG

2221 GTCTTGCCGG CGGTTGAGCG TATACTGCGC GCTTTCGGCT ATCGAAAGGA AGATCTTCGT

2281 TACCAAAAAA CTAGACAGGT GGGTCTGTCC GCATGGCTCA AACCTAAGGG AACGTAA

嵌合体Pod和Kofu的氨基酸序列

序列15(SEQ ID NO：15)

＞Pod氨基酸序列

1 MASAILDVDY ITEEGKPVIR LFKKEHGKFK IEHDRTFRPY IYALLRDDSK IEEVKKITGE

61 RHGKIVRIVD VEKVEKKFLG KPITVWKLYL EHPQDVPTIR EKVREHPAVV DIFEYDIPFA

121 KRYLIDKGLI PMEGEEELKI LAFDIETLYH EGEEFGKGPI IMISYADEHE AKVITWKNID

181 LPYVEVVSSE REMIKRFLRI IREKDPDIIV TYHGDSFDFP YLAKRAEKLG IKLTIGRDGS

241 EPKMQRIGDM TAVEVKGRIH FDLYHVITRT INLPTYTLEA VYEAIFGKPK EKVYADEIAK

301 AWESGENLER VAKYSMEDAK ATYELGKEFL PMEIQLSRLI GQSLWDVSRS STGHLVEWFL

361 LRKAYERNEL APHKPDEKEL ARRRQSYEGG YVKEPERGLW EHIVYLDFRS LYPSIIITHN

421 VSPDTLNREG CKEYDVAPQV GHRFCKDFPG FIPSLLGDLL EERQKIKKKM KATIDPIERK

481 LLDYRQRAIK ILAHSYYGYY GYARARWYCK ECAESVTAWG REYITMTIKE IEEKYGFKVI

541 YSDTDGFFAT IPGADAETVK KKAMEFVKYI HSKLPGLLEL EYEGFYKRGF FVTKKRYAVI

601 DEEGKVITRG LEIVRRDWSE IAKETQARVL ETILKHGDVE EA RIVKEVI QKLAHYEIPP

661 EKLAIYEQIT RPLHEYKAIG PHVAVAKKLA AKGVKIKPGM VIGYIVLRGD GPISNRAILA

721 EEYDPKKHKY DAEYYIENQV LPAVLRILEG FGYRKEDLRY QKTRQVGLTS WLNIKKS＊

序列16(SEQ ID NO：16)

＞Kofu氨基酸序列

1 MASAILDTDY ITEDGKPVIR IFKKENGEFK IEYDRTFEPY FYALLKDDSA IEEVKLITAE

61 RRGTVVTVKR VEKVQKKFLG RPVEVWKLYF THPQDVPAIR DKIREHPAVI DIYEYDIPFA

121 KRYLIDKGLV PMEGDEELKM LAFDIETLYH EGEEFAEGPI LMISYADEEG ARVITWKNVD

181 LPYVDVVSTE REMIKRFLRV VKEKDPDVLI TYNGDNFDFA YLKKRCEKLG INFALGRDGS

241 EPKIQRMGDR FAVEVKGRIH FDLYPVIRRT INLPTYTLEA VYEAVFGQPK EKVYAEEITT

301 AWETGENLER VARYSMEDAK VTYELGKEFL PMEAQLSRLV GQPLWDVSRS STGNLVEWFL

361 LRKAYERNEV APNKPSEEEY QRRLRESYTG GFVKEPEKGL WENIVYLDFR ALYPSIIITH

421 NVSPDTLNLE GCKNYDIAPQ VGHKFCKDIP GFIPSLLGHL LEERQKIKTK MKETQDPIEK

481 ILLDYRQKAI KLLAHSFYGY YGYAKARWYC KECAESVTAW GRKYIELVWK ELEEKFGFKV

541 LYIDTDGLYA TIPGGESEEI KKKALEFLKY INAKLPGALE LEYEGFYKRG FFVTKKKYAV

601 IDEEGKITTR GLEIVRRDWS EIAKETQARV LEALLKDGDV EKAVRIVKEV TEKLSKYEVP

661 PEKLVIHEQI TRDLKDYKAT GPHVAVAKRL AARGVKIRPG TVISYIVLKG SGRIGDRAIP

721 FDEFDPTKHK YDAEYYIEHQ VLPAVERILR AFGYRKEDLR YQKTRQVGLS AWLKPKGT＊

序列17(SEQ ID NO：17)

＞pLACIQZa

1 TCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCA

61 CAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTG

121 TTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGC

181 ACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAAGGAGAAATACCGCATCAGGCGCC

241 ATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTAT

301 TACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGT

TTTCCCAGTCACGAC >>> 引物Ml3-40(SEQ ID NO：42)

361 TTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGAT

XbaI

421 CCTCTAGAGCCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACA

481 ATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTG

541 AGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCG

601 TGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGC

661 CAGGGTGGTTTTTCTTTTCACCAGTGAGACGGGCAACAGCTGATTGCCCTTCACCGCCTG

721 GCCCTGAGAGAGTTGCAGCAAGCGGTCCACGCTGGTTTGCCCCAGCAGGCGAAAATCCTG

781 TTTGATGGTGGTTGACGGCGGGATATAACATGAGCTGTCTTCGGTATCGTCGTATCCCAC

841 TACCGAGATATCCGCACCAACGCGCAGCCCGGACTCGGTAATGGCGCGCATTGCGCCCAG

901 CGCCATCTGATCGTTGGCAACCAGCATCGCAGTGGGAACGATGCCCTCATTCAGCATTTG

961 CATGGTTTGTTGAAAACCGGACATGGCACTCCAGTCGCCTTCCCGTTCCGCTATCGGCTG

1021 AATTTGATTGCGAGTGAGATATTTATGCCAGCCAGCCAGACGCAGACGCGCCGAGACAGA

1081 ACTTAATGGGCCCGCTAACAGCGCGATTTGCTGGTGACCCAATGCGACCAGATGCTCCAC

1141 GCCCAGTCGCGTACCGTCTTCATGGGAGAAAATAATACTGTTGATGGGTGTCTGGTCAGA

1201 GACATCAAGAAATAACGCCGGAACATTAGTGCAGGCAGCTTCCACAGCAATGGCATCCTG

1261 GTCATCCAGCGGATAGTTAATGATCAGCCCACTGACGCGTTGCGCGAGAAGATTGTGCAC

1321 CGCCGCTTTACAGGCTTCGACGCCGCTTCGTTCTACCATCGACACCACCACGCTGGCACC

1381 CAGTTGATCGGCGCGAGATTTAATCGCCGCGACAATTTGCGACGGCGCGTGCAGGGCCAG

1441 ACTGGAGGTGGCAACGCCAATCAGCAACGACTGTTTGCCCGCCAGTTGTTGTGCCACGCG

1501 GTTGGGAATGTAATTCAGCTCCGCCATCGCCGCTTCCACTTTTTCCCGCGTTTTCGCAGA

1561 AACGTGGCTGGCCTGGTTCACCACGCGGGAAACGGTCTGATAAGAGACACCGGCATACTC

1621 TGCGACATCGTATAACGTTACTGGTTTCACATTCACCACCCTGAATTGACTCTCTTCCGG

1681 GCGCTATCATGCCATACCGCGAAAGGTTTTGCGCCATTCGATGGTGTCAACGTAAATGCA

1741 TGCCGCTTCGCCTTCCGGCCACCAGAATAGCCTGCGCCATGGGCTTCCTCGCTCACTGAC

1801 TCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATA

1861 CGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAA

1921 AAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCT

1981 GACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAA

引物PKBLACIR<<<GCTGTCCTGATATT

TCTATGG (SEQ ID NO：43)

2041 AGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCG

2101 CTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCA

2161 CGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAA

2221 CCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCG

2281 GTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGG

2341 TATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGA

2401 ACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGC

2461 TCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAG

2521 ATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGAC

2581 GCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATC

2641 TTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAG

2701 TAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGT

2761 CTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAG

2821 GGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCA

2881 GATTTATCAGCAATAACCAGCCAGCCGGAAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACT

2941 TTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCA

3001 GTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCG

3061 TTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCC

3121 ATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTG

3181 GCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCA

3241 TCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGT

3301 ATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGC

3361 AGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATC

3421 TTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCA

3481 TCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAA

3541 AAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTAT

3601 TGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAA

3661 AATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAA

3721 ACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTC

来自T.litoralis、热球菌属9度N-7的DNA聚合酶以及它们的嵌合体的氨基酸序列

序列18(SEQ ID NO：18)

热球菌属9度N-7DNA聚合酶氨基酸序列(登录号U47108)

1 MILDTDYITE NGKPVIRVFK KENGEFKIEY DRTFEPYFYA LLKDDSAIED VKKVTAKRHG

61 TVVKVKRAEK VQKKFLGRPI EVWKLYFNHP QDVPAIRDRI RAHPAVVDIY EYDIPFAKRY

121 LIDKGLIPME GDEELTMLAF DIETLYHEGE EFGTGPILMI SYADGSEARV ITWKKIDLPY

181 VDVVSTEKEM IKRFLRVVRE KDPDVLITYN GDNFDFAYLK KRCEELGIKF TLGRDGSEPK

241 IQRMGDRFAV EVKGRIHFDL YPVIRRTINL PTYTLEAVYE AVFGKPKEKV YAEEIAQAWE

301 SGEGLERVAR YSMEDAKVTY ELGREFFPME AQLSRLIGQS LWDVSRSSTG NLVEWFLLRK

361 AYKRNELAPN KPDERELARR RGGYAGGYVK EPERGLWDNI VYLDFRSLYP SIIITHNVSP

421 DTLNREGCKE YDVAPEVGHK FCKDFPGFIP SLLGDLLEER QKIKRKMKAT VDPLEKKLLD

481 YRQRAIKILA NSFYGYYGYA KARWYCKECA ESVTAWGREY IEMVIRELEE KFGFKVLYAD

541 TDGLHATIPG ADAETVKKKA KEFLKYINPK LPGLLELEYE GFYVRGFFVT KKKYAVIDEE

601 GKITTRGLEI VRRDWSEIAK ETQARVLEAI LKHGDVEEAV RIVKEVTEKL SKYEVPPEKL

661 VIHEQITRDL RDYKATGPHV AVAKRLAARG VKIRPGTVIS YIVLWGSGRI GDRAIPADEF

721 DPTKHRYDAE YYIENQVLPA VERILKAFGY RKEDLRYQKT KQVGLGAWLK VKGKK

序列19(SEQ ID NO：19)

T.litoralis DNA聚合酶氨基酸序列(登录号M74198.1)

1 MILDTDYITK DGKPIIRIFK KENGEFKIEL DPHFQPYIYA LLKDDSAIEE IKAIKGERHG

61 KTVRVLDAVK VRKKFLGREV EVWKLIFEHP QDVPAMRGKI REHPAVVDIY EYDIPFAKRY

121 LIDKGLIPME GDEELKLLAF DIETFYHEGD EFGKGEIIMI SYADEEEARV ITWKNIDLPY

181 VDVVSNEREM IKRFVQVVKE KDPDVIITYN GDNFDLPYLI KRAEKLGVRL VLGRDKEHPE

241 PKIQRNGDSP AVEIKGRIHF DLFPVRRTNL NLPTYTLEAV YEAVLGKTKS KLGAEELAAI

301 WETEESMKKL AQYSMEDARA TYELGKEFFP MEAELAKLIG QSVWDVSRSS TGNLVEWYLL

361 RVAYARNELA PNKPDEEEYK RRLRTTYLGG YVKEPEKGLW ENIIYLDFRS LYPSIIVTHN

421 VSPDTLEKEG CKNYDVAPIV GYRFCKDFPG FIPSILGDLI AMRQDIKKKM KSTIDPIEKK

481 MLDYRQRAIK LLANSYYGYM GYPKARWYSK ECAESVTAWG RHY EMTIRE IEEKFGFKVL

541 YADTDGFYAT IPGEKPELIK KKAKEFLNYI NSKLPGLLEL EYEGFYLRGF FVTKKRYAVI

601 DEEGRITTRG LEVVRRDWSE IAKETQAKVL EAILKEGSVE KAVEVVRDVV EKIAKYRVPL

661 EKLVIHEQIT RDLKDYKAIG PHVAIAKRLA ARGIKVKPGT IISYIVLKGS GKISDRVILL

721 TEYDPRKHKY DPDYYIENQV LPAVLRILEA FGYRKEDLRY QSSKQTGLDA WLKR

序列20(SEQ ID NO：20)

嵌合DNA聚合酶9Nli的氨基酸序列

1 MILDTDYITE NGKPVIRVFK KENGEFKIEY DRTFEPYFYA LLKDDSAIED VKKVTAKRHG

61 TVVKVKRAEK VQKKFLGRPI EVWKLYFNHP QDVPAIRDRI RAHPAVVDIY EYDIPFAKRY

121 LIDKGLIPME GDEELTMLAF DIETLYHEGE EFGTGPILMI SYADGSEARV ITWKKIDLPY

181 VDVVSTEKEM IKRFLRVVRE KDPDVLITYN GDNFDFAYLK KRCEELGIKF TLGRDGSEPK

241 IQRMGDRFAV EVKGRIHFDL YPVIRRTINL PTYTLEAVYE AVFGKPKEKV YAEEIAQAWE

301 SGEGLERVAR YSMEDAKVTY ELGREFFPME AQLSRLIGQS LWDVSRSSTG NLVEWYLLRV

361 AYARNELAPN KPDEEEYKRR LRTTYLGGYV KEPEKGLWEN IIYLDFRSLY PSIIVTHNVS

421 PDTLEKEGCK NYDVAPIVGY RFCKDFPGFI PSILGDLIAM RQDIKKKMKS TIDPIEKKML

481 DYRQRAIKLL ANSYYGYMGY PKARWYSKEC AESVTAWGRH YIEMTIREIE EKFGFKVLYA

541 DTDGFYATIP GEKPELIKKK AKEFLNYINS KLPGLLELEY EGFYVRGFFV TKKKYAVIDE

601 EGKITTRGLE IVRRDWSEIA KETQARVLEA ILKHGDVEEA VRIVKEVTEK LSKYEVPPEK

661 LVIHEQITRD LRDYKATGPH VAVAKRLAAR GVKIRPGTVI SYIVLKGSGR IGDRAIPADE

721 FDPTKHRYDA EYYIENQVLP AVERILKAFG YRKEDLRYQK TKQVGLGAWL KVKGKK

序列21(SEQ ID NO：21)

嵌合DNA聚合酶Li9N的氨基酸序列

1 MILDTDYITK DGKPIIRIFK KENGEFKIEL DPHFQPYIYA LLKDDSAI E IKAIKGERHG

61 KTVRVLDAVK VRKKFLGREV EVWKLIFEHP QDVPAMRGKI REHPAVVDIY EYDIPFAKRY

121 LIDKGLIPME GDEELKLLAF DIETFYHEGD EFGKGEIIMI SYADEEEARV ITWKNIDLPY

181 VDVVSNEREM IKRFVQVVKE KDPDVIITYN GDNFDLPYLI KRAEKLGVRL VLGRDKEHPE

241 PKIQRMGDSF AVEIKGRIHF DLFPVVRRTI NLPTYTLEAV YEAVLGKTKS KLGAEEIAAI

301 WETEESMKKL AQYSMEDARA TYELGKEFFP MEAELAKLIG QSVWDVSRSS TGNLVEWFLL

361 RKAYKRNELA PNKPDERELA RRRGGYAGGY VKEPERGLWD NIVYLDFRSL YPSIIITHNV

421 SPDTLNREGC KEYDVAPEVG HKFCKDFPGF IPSLLGDLLE ERQKIKRKMK ATVDPLEKKL

481 LDYRQRAIKI LANSFYGYYG YAKARWYCKE CAESVTAWGR EYIEMVIREL EEKFGFKVLY

541 ADTDGLHATI PGADAETVKK KAKEFLKYIN PKLPG LELE YEGFYLRGFF VTKKRYAVID

601 EEGRITTRGL EVVRRDWSEI AKETQAKVLE AILKEGSVEK AVEYVRDVVE KIAKYRVPLE

661 KLVIHEQITR DLKDYKAIGP HVAIAKRLAA RGIKVKPGTI ISYIVLKGSG KISDRVILLT

721 EYDPRKHKYD PDYYIENQVL PAVLRILEAF GYRKEDLRYQ SSKQTGLDAW LKR

来自T.gorgonarius、T.zilligii的DNA聚合酶以及它们的嵌合体的氨基酸序列

序列22(SEQ ID NO：22)

T.gorgonarius DNA聚合酶氨基酸序列(登录号4699806)

1 MILDTDYITE DGKPVIRIFK KENGEFKIDY DRNFEPYIYA LLKDDSAIED VKKITAERHG

61 TTVRVVRAEK VKKKFLGRPI EVWKLYFTHP QDVPAIRDKI KEHPAVVDIY EYDIPFAKRY

121 LIDKGLIPME GDEELKMLAF DIETLYHEGE EFAEGPILMI SYADEEGARV ITWKNIDLPY

181 VDVVSTEKEM IKRFLKVVKE KDPDVLITYN GDNFDEAYLK KRSEKLGVKF ILGREGSEPK

241 IQRMGDRFAV EVKGRIHFDL YPVIRRTINL PTYTLEAVYE AIFGQPKEKV YAEEIAQAWE

301 TGEGLERVAR YSMEDAKVTY ELGKEFFPME AQLSRLVGQS LWDVSRSSTG NLVEWFLLRK

361 AYERNELAPN KPDERELARR RESYAGGYVK EPERGLWENI VYLDFRSLYP SIIITHNVSP

421 DTLNREGCEE YDVAPQVGHK FCKDFPGFIP SLLGDLLEER QKVKKKMKAT IDPIEKKLLD

481 YRQRAIKILA NSFYGYYGYA KARWYCKECA ESVTAWGRQY IEETTREIEE KFGFKVLYAD

541 TDGFFATIPG ADAETVKKKA KEFLDYINAK LPGLLELEYE GFYKRGFFVT KKKYAVIDEE

601 DKITTRGLEI VRRDWSEIAK ETQARVLEAI LKHGDVEEAV RIVKEVTEKL SKYEVPPEKL

661 VIYEQITRDL KDYKATGPHV AVAKRLAARG IKIRPGTVIS YIVLKGSGRI GDRAIPFDEF

721 DPAKHKYDAE YYIENQVLPA VERILRAFGY RKEDLRYQKT RQVGLGAWLK PKT

序列23(SEQ ID NO：23)

T.zilligii DNA聚合酶氨基酸序列

1 MILDADYITE DGKPVIRVFK KEKGEFKIDY DRDFEPYIYA LLKDDSAIED IKKITAERHG

61 TTVRVTRAER VKKKFLGRPV EVWKLYFTHP QDVPAIRDKI REHPAVVDIY EYDIPFAKRY

121 LIDRGLIPME GDEELRMLAF DIETLYHEGE EFGEGPILMI SYADEEGARV ITWKNIDLPY

181 VESVSTEKEM IKRFLKVIQE KDPDVLITYN GDNFDFAYLK KRSETLGVKF ILGRDGSEPK

241 IQRMGDRFAV EVKGRIHFDL YPVIRRTINL PTYTLETVYE AIFGQPKEKV YAEEIARAWE

301 SGEGLERVAR YSMEDAKATY ELGKEFFPME AQLSRLVGQS LWDVSRSSTG NLVEWFLLRK

361 AYERNELAPN KPDERELARR AESYAGGYVK EPEKGLWENI VYLDYKSLYP SIIITHNVSP

421 DTLNREGCRE YDVAPQVGHR FCKDFPGFIP SLLGDLLEER QKVKKKMKAT VDPIERKLLD

481 YRQRAIKILA NSYYGYYGYA NARWYCRECA ESVTAWGRQY IETTMREIEE KFGFKVLYAD

541 TDGFFATIPG ADAETVKKKA KEFLNYINPR LPGL ELEYE GFYRRGFFVT KKKYAVIDEE

601 DKITTRGLEI VRRDWSEIAK ETQARVLEAI LRHGDVEEAV RIVKEVTEKL SRYEVPPEKL

661 VIYEQITRDL RDYRATGPHV AVAKRLAARG IKIRPGTVIS YIVLKGPGRV GDRAIPFDEF

721 DPAKHRYDAE YYIENQVLPA VERILRAFGY RKEDLRYQKT KQAGLGAWLK PKT

序列24(SEQ ID NO：24)

嵌合DNA聚合酶GoZi的氨基酸序列

1 MILDTDYITE DGKPVIRIFK KENGEFKIDY DRNFEPYIYA LLKDDSAIED VKKITAERHG

61 TTVRVVRAEK VKKKFLGRPI EVWKLYFTHP QDVPAIRDKI KEHPAVVDIY EYDIPFAKRY

121 LIDKGLIPME GDEELKMLAF DIETLYHEGE EFAEGPILMI SYADEEGARV ITWKNIDLPY

181 VDVVSTEKEM IKRFLKVVKE KDPDVLITYN GDNFDFAYLK KRSEKLGVKF ILGREGSEPK

241 IQRMGDRFAV EVKGRIHFDL YPVIRRTINL PTYTLEAVYE AIFGQPKEKV YAEEIAQAWE

301 TGEGLERVAR YSMEDAKVTY ELGKEFFPME AQLSRLVGQS LWDVSRSSTG NLVEWFLLRK

361 AYERNELAPN KPDERELARR RESYAGGYVK EPEKGLWENI VYLDYKSLYP SIIITHNVSP

421 DTLNREGCRE YDVAPQVGHR FCKDFPGFIP SLLGDLLEER QKVKKKMKAT VDPIERKLLD

481 YRQRAIKILA NSYYGYYGYA NARWYCRECA ESVTAWGRQY IETTMREIEE KFGFKVLYAD

541 TDGFFATIPG ADAETVKKKA KEFLDYINAK LPGLLELEYE GFYKRGFFVT KKKYAVIDEE

601 DKITTRGLEI VRRDWSEIAK ETQARVLEAI LKHGDVEEAV RIVKEVTEKL SKYEVPPEKA

661 VIYEQITRDL KDYKATGPHV AVAKRLAARG IKIRPGTVIS YIVLKGSGRI GDRAIPFDEF

721 DPAKHKYDAE YYIENQVLPA VERILRAFGY RKEDLRYQKT RQVGLGAWLK PKT

序列25(SEQ ID NO：25)

嵌合DNA聚合酶ZiGo的氨基酸序列

1 MILDADYITE DGKPVIRVFK KEKGEFKIDY DRDFEPYIYA LLKDDSAIED IKKITAERHG

61 TTVRVTRAER VKKKFLGRPV EVWKLYFTHP QDVPAIRDKI REHPAVVDIY EYDIPFAKRY

121 LIDRGLIPME GDEELRMLAF DIETLYHEGE EFGEGPILMI SYADEEGARV ITWKNIDLPY

181 VESVSTEKEM IKRFLKVIQE KDPDVLITYN GDNFDFAYLK KRSETLGVKF ILGRDGSEPK

241 IQRMGDRFAV EVKGRIHFDL YPVIRRTINL PTYTLETVYE AIFGQPKEKV YAEEIARAWE

301 SGEGLERVAR YSMEDAKATY ELGKEFFPME AQLSRLVGQS LWDVSRSSTG NLVEWFLLRK

361 AYERNELAPN KPDERELARR AESYAGGYVK EPERGLWENI VYLDFRSLYP SIIITHNVSP

421 DTLNREGCEE YDVAPQVGHK FCKDFPGFIP SLLGDLLEER QKVKKKMKAT IDPIEKKLLD

481 YRQRAIKILA NSFYGYYGYA KARWYCKECA ESVTAWGRQY IETTIREIEE KFGFKVLYAD

541 TDGFFATIPG ADAETVKKKA KEFLNYINPR LPGLLELEYE GFYRRGFFVT KKKYAVIDEE

601 DKITTRGLEI VRRDWSEIAK ETQARVLEAI LKHGDVEEAV RIVKEVTEKL SRYEVPPEKL

661 VIYEQITRDL RDYRATGPHV AVAKRLAARG IKIRPGTVIS YIVLKGPGRV GDRAIPEDEF

721 DPAKHRYDAE YYIENQVLPA VERILRAFGY RKEDLRYQKT KQAGLGAWLK PKT

KOD和Pfu的DNA聚合酶的另外的嵌合体的氨基酸序列

序列26(SEQ ID NO：26)

嵌合DNA聚合酶Kofu-II的氨基酸序列

1 MASAILDTDY ITEDGKPVIR IFKKENGEFK IEYDRTFEPY FYALLKDDSA IEEVKKITAE

61 RHGTVVTVKR VEKVQKKFLG RPVEVWKLYF THPQDVPAIR DKIREHPAVI DIYEYDIPFA

121 KRYLIDKGLV PMEGDEELKM LAFDIETLYH EGEEFAEGPI LMISYADEEG ARVITWKNVD

181 LPYVDVVSTE REMIKRFLRV VKEKDPDVLI TYNGDNFDFA YLKKRCEKLG INFALGRDGS

241 EPKIQRMGDR FAVEVKGRIH FDLYPVIRRT INLPTYTLEA VYEAVFGQPK EKVYAEEITT

301 AWETGENLER VAKYSMEDAK ATYELGKEFL PMEIQ SRLV GQPLWDVSRS STGNLVEWFL

361 LRKAYERNEV APNKPSEEEY QRRLRESYTG GFVKEPEKGL WENIVYLDFR ALYPSIIITH

421 NVSPDTLNLE GCKNYDIAPQ VGHKFCKDIP GFIPSLLGHL LEERQKIKTK MKETQDPIEK

481 ILLDYRQKAI KLLANSFYGY YGYAKARWYC KECAESVTAW GRKYIELVWK ELEEKFGFKV

541 LYIDTDGLYA TIPGGESEEI KKKALEFVKY INSKLPGLLE LEYEGFYKRG FFVTKKRYAV

601 IDEEGKVITR GLEIVRRDWS EIAKETQARV LEALLKDGDV EKAVRIVKEV TEKLSKYEVP

661 PEKLVIHEQI TRDLKDYKAT GPHVAVAKRL AARGVKIRPG TVISYIVLKG SGRIGDRAIP

721 FDEFDPTKHK YDAEYYIENQ VLPAVERILR AFGYRKEDLR YQKTRQVGLS AWLKPKGT

序列27(SEQ ID NO：27)

嵌合DNA聚合酶Pod-II的氨基酸序列

1 MASAILDVDY ITEEGKPVIR LFKKENGKFK IEHDRTFRPY IYALLRDDSK IEEVKKITGE

61 RHGKIVRIVD VEKVEKKFLG KPITVWKLYL EHPQDVPTIR EKVREHPAVV DIFEYDIPFA

121 KRYLIDKGLI PMEGEEELKI LAFDIETLYH EGEEFGKGPI IMISYADENE AKVITWKNID

181 LPYVEVVSSE REMIKRFLRI IREKDPDIIV TYNGDSFDFP YLAKRAEKLG IKLTIGRDGS

241 EPKMQRIGDM TAVEVKGRIH FDLYHVITRT INLPTYTLEA VYEAIFGKPK EKVYADEIAK

301 AWESGENLER YARYSMEDAK VTYELGKEFL PMEAQLSRLI GQSLWDVSRS STGNLVEWFL

361 LRKAYERNEL APNKPDEKEL ARRRQSYEGG YVKEPERGLW ENIVYLDFRS LYPSIIITHN

421 VSPDTLNREG CKEYDVAPQV GHRFCKDFPG FIPSLLGDLL EERQKIKKKM KATIDPIERK

481 LLDYRQRAIK ILANSYYGYY GYARARWYCK ECAESVTAWG REYITMTIKE IEEKYGFKVI

541 YSDTDGFFAT IPGADAETVK KKAMEFLKYI NAKLPGALEL EYEGFYKRGF FVTKKKYAVI

601 DEEGKITTRG LEIVRRDWSE IAKETQARVL ETILKHGDVE EAVRIVKEVI QKLANYEIPP

661 EKLAIYEQIT RPLHEYKAIG PHVAVAKKLA AKGVKIKPGM VIGYIVLRGD GPISNRAILA

721 EEYDPKKHKY DAEYYIENQV LPAVLRILEG FGYRKEDLRY QKTRQVGLTS WLNIKKS

序列28(SEQ ID NO：28)

嵌合DNA聚合酶Kofu-III的氨基酸序列

1 MASAILDTDY ITEDGKPVIR IFKKENGEFK IEYDRTFEPY FYALLKDDSA IEEVKKITAE

61 RHGTVVTVKR VEKVQKKFLG RPVEVWKLYF THPQDVPAIR DKIREHPAVI DIYEYDIPFA

121 KRYLIDKGLV PMEGDEELKM LAFDIETLYH EGEEFAEGPI LMISYADEEG ARVITWKNVD

181 LPYVDVVSTE REMIKRFLRV VKEKDPDVLI TYNGDNFDFA YLKKRCEKLG INFALGRDGS

241 EPKIQRMGDR FAVEVKGRIH FDLYPVIRRT INLPTYTLEA VYEAVFGQPK EKVYAEEITT

301 AWETGENLER VARYSMEDAK VTYELGKEFL PMEAQLSRLI GQSLWDVSRS STGNLVEWFL

361 LRKAYERNEL APNKPDEKEL ARRRQSYEGG YVKEPEKGLW ENIVYLDFRA LYPSIIITHN

421 VSPDTLNLEG CKNYDIAPQV GHKFCKDIPG FIPSLLGHLL EERQKIKTKM KETQDPIEKI

481 LLDYRQKAIK LLANSFYGYY GYAKARWYCK ECAESVTAWG RKYIELVWKE LEEKFGFKVL

541 YIDTDGLYAT IPGGESEEIK KKALEFLKYI NAKLPGALEL EYEGFYKRGF FVTKKKYAVI

601 DEEGKITTRG LEIVRRDWSE IAKETQARVL EALLKDGDVE KAVRIVKEVT EKLSKYEVPP

661 EKLVIHEQIT RDLKDYKATG PHVAVAKRLA ARGVKIRPGT VISYIVLKGS GRIGDRAIPF

721 DEFDPTKHKY DAEYYIENQV LPAVERILRA FGYRKEDLRY QKTRQVGLSA WLKPKGT

序列29(SEQ ID NO：29)

嵌合DNA聚合酶Pod-III的氨基酸序列

1 MASAILDVDY ITEEGKPVIR LFKKENGKFK IEHDRTFRPY IYALLRDDSK IEEVKKITGE

61 RHGKIVRIVD VEKVEKKFLG KPITVWKLYL EHPQDVPTIR EKVREHPAVV DIFEYDIPFA

121 KRYLIDKGLI PMEGEEELKI LAFDIETLYH EGEEFGKGPI IMISYA ENE AKVITWKNID

181 LPYVEVVSSE REMIKRFLRI IREKDPDIIV TYNGDSFDFP YLAKRAEKLG IKLTIGRDGS

241 EPKMQRIGDM TAVEVKGRIH FDLYHVITRT INLPTYTLEA VYEAIFGKPK EKVYADEIAK

301 AWESGENLER VAKYSMEDAK ATYELGKEFL PMEIQLSRLV GQPLWDVSRS STGNLVEWFL

361 LRKAYERNEV APNKFSEEEY QRRLRESYTG GFVKEPERGL WENIVYLDFR SLYPSIIITH

421 NVSPDTLNRE GCKEYDVAPQ VGHRFCKDFP GFIPSLLGDL LEERQKIKKK MKATIDPIER

481 KLLDYRQRAI KILANSYYGY YGYARARWYC KECAESVTAW GREYITMTIK EIEEKYGFKV

541 IYSDTDGFFA TIPGADAETV KKKAM FVKY INSKLPGLLE LEYEGFYKRG FFVTKKRYAV

601 IDEEGKVITR GLEIVRRDWS EIAKETQARV LETILKHGDV EEAVRIVKEV IQKLANYEIP

661 PEKLAIYEQI TRPLHEYKAI GPHVAVAKKL AAKGVKIKPG MVIGYIVLRG DGPISNRAIL

721 AEEYDPKKHK YDAEYYIENQ VLPAVLRILE GFGYRKEDLR YQKTRQVGLT SWLNIKKS

等效替换

本领域技术人员将明了，或使用不超过常规的试验而能够确定对于本文描述的本发明的具体实施方式的许多等效替换。本发明的范围并不旨在限于以上描述，而是如在所附权利要求中所陈述。如在本文说明书和权利要求中所使用的，除非明确表示与此相反，否则冠词“一个”、“一种”、以及“该”应当理解为包括复数指称对象。除非有相反的表示或以其他方式由上下文明显看到，否则如果一个、多于一个、或所有的组的成员存在于、用于、或以其他方式有关于给定产物或方法，则包括在组的一个或多个成员之间的“或”的权利要求或描述被认为是满意的。本发明包括这样的实施方式，其中组的正好一个成员存在于、用于、或以其他方式有关于给定产物或方法。本发明还包括这样的实施方式，其中组的多于一个、或所有成员存在于、用于、或以其他方式有关于给定产物或方法。另外，应当理解，除非另有说明或除非这对于本领域普通技术人员来说将是显而易见的会出现矛盾或不一致，否则本发明涵盖变化、组合、以及变换，其中来自一个或多个权利要求的一个或多个限制、要素、条款、说明项等被引入到从属于相同基础权利要求的另一权利要求中(或，作为有关的、任何其它权利要求)。在要素提供为清单(例如，以马库什组或类似格式)的情况下，应当理解，还披露了要素的每个亚组，并且可以从组中除去任何要素。应当理解，通常，在本发明、或本发明的方面被称作包括特定要素、特征等的情况下，本发明的某些实施方式或本发明的方面包括这样的要素、特征等，或基本上由这样的要素、特征等构成。为了简单起见，本文中并没有在每种情况下具体地陈述那些实施方式。还应当理解，可以从权利要求明确排除本发明的任何实施方式，例如，在现有技术中发现的任何实施方式，而不管在说明书中是否列举特定的排除。

还应当理解，除非明确表示与此相反，否则在本文要求保护的包括多于一个作用的任何方法中，方法的作用次序不一定限于其中列举方法的作用次序，但本发明包括其中次序被如此限制的实施方式。另外，在权利要求列举组合物的情况下，本发明包括使用组合物的方法以及制备组合物的方法。在权利要求列举组合物的情况下，应当理解，本发明包括使用组合物的方法以及制备组合物的方法。

参考文献的引入

在本申请中引用的所有出版物和专利文献的全部内容以引用方式结合于本文，其结合程度好像每个单独的出版物或专利文献结合于本文一样。

Claims

1.一种嵌合聚合酶，包括：

第一域，具有至少80％相同于在第一DNA聚合酶中发现的氨基酸序列的序列，所述第一DNA聚合酶的特征在于高持续合成能力、延伸率、抗盐性、热稳定性或TMAC耐受性；以及

第二域，具有至少80％相同于在第二DNA聚合酶中发现的氨基酸序列的序列，所述第二DNA聚合酶的特征在于高保真性，其中，所述嵌合聚合酶的特征在于高保真性和高持续合成能力、延伸率、抗盐性、热稳定性或TMAC耐受性。

2.根据权利要求1所述的嵌合聚合酶，其中，所述第一DNA聚合酶选自KOD聚合酶、或TNAl聚合酶、热球菌属9度N-7、T4、T7或phi29。

3.根据权利要求2所述的嵌合聚合酶，其中，所述第一DNA聚合酶是KOD聚合酶。

4.根据权利要求1所述的嵌合聚合酶，其中，所述第二DNA聚合酶选自分离自激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)、深海热球菌(P.abyssi)、T.gorgonarius、超级嗜热菌(T.litoralis)、速生热球菌(T.zilligii)、热球菌属GT(T.sp.GT)、或火球菌属GB-D(P.sp.GB-D)的聚合酶。

5.根据权利要求4所述的嵌合聚合酶，其中，所述第二DNA聚合酶是Pfu聚合酶。

6.根据权利要求1所述的嵌合聚合酶，其中，所述第一DNA聚合酶是KOD聚合酶而所述第二DNA聚合酶是Pfu聚合酶。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的嵌合聚合酶，其中，所述第一域选自由核酸外切酶域、N-末端域、拇指域以及它们的组合组成的组。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的嵌合聚合酶，其中，所述第二域是掌域和/或指域。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的嵌合聚合酶，其中，在所述第一DNA聚合酶中发现的所述氨基酸序列对应于KOD聚合酶(SEQ IDNO：11)的氨基酸残基156至301。

10.根据权利要求9所述的嵌合聚合酶，进一步包括第三域，所述第三域具有至少80％相同于氨基酸序列的序列，所述氨基酸序列对应于KOD聚合酶(SEQ ID NO：11)的氨基酸残基26至105。

11.根据权利要求10所述的嵌合聚合酶，进一步包括第四域，所述第四域具有至少80％相同于氨基酸序列的序列，所述氨基酸序列对应于KOD聚合酶(SEQ ID NO：11)的氨基酸残基612至749。

12.根据权利要求1-8中任一项所述的嵌合聚合酶，其中，在所述第一DNA聚合酶中发现的所述氨基酸序列对应于KOD聚合酶(SEQ IDNO：11)的氨基酸残基26至105。

13.根据权利要求12所述的嵌合聚合酶，进一步包括第三域，所述第三域具有至少80％相同于氨基酸序列的序列，所述氨基酸序列对应于KOD聚合酶(SEQ ID NO：11)的氨基酸残基612至749。

14.根据权利要求1-8中任一项所述的嵌合聚合酶，其中，在所述第一DNA聚合酶中发现的所述氨基酸序列对应于KOD聚合酶(SEQ IDNO：11)的氨基酸残基612至749。

15.根据权利要求14所述的嵌合聚合酶，进一步包括第三域，所述第三域具有至少80％相同于氨基酸序列的序列，所述氨基酸序列对应于KOD聚合酶(SEQ ID NO：11)的氨基酸残基156至301。

16.根据权利要求1-15中任一项所述的嵌合聚合酶，其中，在所述第二DNA聚合酶中发现的所述氨基酸序列对应于Pfu聚合酶(SEQ ID NO：9)的氨基酸残基394至563。

17.一种嵌合聚合酶，包括：

具有共有序列的第一域，所述共有序列选自由以下组成的组

(1)

XXLXXXXXXXEGXRXXXXXXVXXXXXDXXXTXXXXXXXXXXVVKXXXXXVLIXXXXXNXXXAXXKXXCXXXXXNFALXXXXXXXXXXXXIXXMXXRFXXXXXXXXXXXXXPXXRXXXXXXXXXXXXXXXXVXXQXXXXXXXEXXTTXXXT(SEQ ID NO：30)，其中X是任意氨基酸或肽键；

(2)

XXEXXXXYXXXXEXXFXXXXKXXXAXXXXXXXXAXXXXTVXTVKRXXXXQXXXXXRXVEXXXXXFTXXXXXXAXXDXIXXXXX(SEQ ID NO：31)，其中X是任意氨基酸或肽键；

(3)

XXXXXXXXXXXXXXXXALXXDXXXXKXXXXXXXXTEXXSKXXVXXXXXVXHXXXXXDXKDXXXTXXXXXXXXRXXXRXXXXRXXTXXSXXXXKXSXRXGDXXXPFDXFXXTXXXXXXXXXXXXXXXXXXEXXXRAXX(SEQ IDNO：32)，其中X是任意氨基酸或肽键；

(4)

NGX₁FKIEX₂DRTFX₃PYX₄YALLX₅DDSX₆IEEVKKITX₇ERHGX₈X₉VX₁₀X₁₁X₁₂X₁₃VEKVX₁₄KKFIGX₁₅PX₁₆X₁₇VWKLYX₁₈X₁₉HPQDVPX₂₀IRX₂₁KX₂₂REHPA(SEQ ID NO：33)，其中X₁不是K；X₂不是H；X₃不是R；X₄不是I；X₅不是R；X₆不是K；X₇不是G；X₈不是K；X₉不是I；X₁₀不是R；X₁₁不是I；X₁₂不是V；X₁₃不是D；X₁₄不是E；X₁₅不是K；X₁₆不是I；X₁₇不是T；X₁₈不是L；X₁₉不是E；X₂₀不是T；X₂₁不是E；以及X₂₂不是V；

(5)

(6)

RDWSEIAKETQARVLEX₁X₂LKX₃GDVEX₄AVRIVKEVX₅X₆KLX₇X₈YEX₉PPEKLX₁₀IX₁₁EQITRX₁₂LX₁₃X₁₄YKAX₁₅GPHVAVAKX₁₆LAAX₁₇GVKIX₁₈PGX₁₉VIX₂₀YIVLX₂₁GX₂₂GX₂₃IX₂₄X₂₅RAIX₂₆X₂₇X₂₈EX₂₉DPX₃₀KHKYDAEYYIENQVLPAVX₃₁RILX₃₂X₃₃FG(SEQ ID NO：35)，其中X₁不是T；X₂不是I；X₃不是H；X₄不是E；X₅不是I；X₆不是Q；X₇不是A；X₈不是N；X₉不是I；X₁₀不是A；X₁₁不是Y；X₁₂不是P；X₁₃不是H；X₁₄不是E；X₁₅不是I；X₁₆不是K；X₁₇不是K；X₁₈不是K；X₁₉不是M；X₂₀不是G；X₂₁不是R；X₂₂不是D；X₂₃不是P；X₂₄不是S；X₂₅不是N；X₂₆不是L；X₂₇不是A；X₂₈不是E；X₂₉不是Y；X₃₀不是K；X₃₁不是L；X₃₂不是E；以及X₃₃不是G；

以及它们的组合，以及

具有共有序列的第二域，所述共有序列选自由以下组成的组

(1)

(2)

EX₁GLWENIVYLDFRX₂LYPSHITHNVSPDTLNX₃EGCKX₄YDX₅APQVGHX₆FCKDX₇PGFIPSLLGX₈LLEERQKIKX₉KMKX₁₀TX₁₁DPIEX₁₂X₁₃LLDYRQX₁₄AIKX₁ ₅LANSX₁₆YGYYGYAX₁₇ARWYCKECAESVTAWGRX₁₈YIX₁₉X₂₀X₂₁X₂₂KEX₂₃EEKX₂₄GFKVX₂₅YX₂₆DTDGX₂₇X₂₈ATIPGX₂₉X₃₀X₃₁EX₃₂X₃₃KKKAX₃₄E(SEQ IDNO：37)，其中X₁不是R；X₂不是S；X₃不是R；X₄不是E；X₅不是V；X₆不是R；X₇不是F；X₈不是D；X₉不是K；X₁₀不是A；X₁₁是I；X₁₂不是R；X₁₃不是K；X₁₄不是R；X₁₅不是I；X₁₆不是Y；X₁₇不是R；X₁₈不是E；X₁₉不是T；X₂₀不是M；X₂₁不是T；X₂₂不是I；X₂₃不是I；X₂₄不是Y；X₂₅不是I；X₂₆不是S；X₂₇不是F；X₂₈不是F；X₂₉不是A；X₃₀不是D；X₃₁不是A；X₃₂不是T；X₃₃不是V；X₃₄不是M，

以及它们的组合，

其中，所述嵌合聚合酶的特征在于高保真性和高持续合成能力、延伸率、抗盐性、热稳定性或TMAC耐受性。

18.一种嵌合聚合酶，包括至少85％相同于SEQ ID NO：16(Kofu氨基酸序列)的氨基酸序列。

19.根据权利要求18所述的嵌合DNA聚合酶，其中，所述氨基酸序列包括以下共有序列

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(SEQ ID NO：38)

其中X是任何氨基酸或肽键。

20.根据权利要求18所述的嵌合聚合酶，其中，所述氨基酸序列相同于SEQ ID NO：16(Kofu氨基酸序列)。

21.一种嵌合聚合酶，包括以下氨基酸共有序列

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(SEQ IDNO：38)

其中X是任意氨基酸或肽键；并且

其中，所述嵌合聚合酶具有高于KOD的保真性以及高于Pfu的持续合成能力、延伸率、抗盐性、热稳定性或TMAC耐受性。

22.根据权利要求21所述的方法，所述氨基酸共有序列是

XIXDTDYXTXDGXPXXRIFXKXXGEFXXXYDXXFEPYFYALLKDDSAIXXXXXXXAXRHGTVXTVKRXXXXQXKFLXRXVEVWXLXFTHPQDVPAXXDXIXXHXXVIDIYEYDIPFAKRYLIDXGLVPMEGDEXLXMXXXDIETXYHEGXEFAEGXXLMISYADXEGARVITWKXVDLPYVDVVSTEXEMIKRXXXVVKEKDPDVLIXYXGDNFDXAYLKXRCEXLGXNFALXRXXXXXEPKIXXMGXRFAVEXKGRXHFDLXPXXRXTXNLPTYXLXXVYEXVXGQXKXKXXXEEITTXWETXXXXXXXARYSMEDAXVTXELGXEFXPMEAXLXXLVGXPXWDVXRSSTGNLVEWXLLXXAYXRNEVAPNKPSXEEYQXRXXEXYTGXFVXEPEKGLWXXXXXLDXXALYPSHXXHNVSPDTLXLEXCXNYDIAPXVGXKFCKDIPGFIPSXLXHLXXXRQXXKTXMXEXQDPXEKIXLDYRQKAXKLLXNSFYGYXGYXKARWYXXECAESVTXWGRKYIELVWXELEXXFGFKXLYIDTDGLYATIPGGESXEIKXXXLXFLXYINAXLPGALELEYEXFYXRGFFVXKKKYAXIDEEXXITTRGLEXVRRDWSXXAKETXAXVLEALLXDXXVXKAVXXVXXXTEXXSKYXVPXEKLVIHEQITRDXKDYXATGPHVAXAKRLXXRGXXXRPGTXISYXXLKGSGRXGDRXIPFDEFXXTKHXYDXXYYIENQVLPAVERXLRAFGYXXXXLXXQXXXQXGLSAWXKPXGT(SEQ ID NO：39)

其中X是任意氨基酸或肽键。

23.一种嵌合聚合酶，包括：

第一域，具有至少80％相同于在第一DNA聚合酶的核酸外切酶域、N-末端域、和/或拇指域中发现的氨基酸序列的序列；以及

第二域，具有至少80％相同于在第二DNA聚合酶的掌域和/或指域中发现的氨基酸序列的序列，

其中，所述嵌合聚合酶具有高于所述第二DNA聚合酶的持续合成能力、延伸率、抗盐性、热稳定性或TMAC耐受性，以及高于所述第一DNA聚合酶的保真性。

24.根据权利要求23所述的嵌合聚合酶，其中，所述第一DNA聚合酶选自KOD聚合酶、TNAl聚合酶、热球菌属9度N-7、T4、T7、或phi29。

25.根据权利要求23所述的嵌合聚合酶，其中，所述第一DNA聚合酶是KOD聚合酶。

26.根据权利要求23所述的嵌合聚合酶，其中，所述第二DNA聚合酶选自分离自激烈火球菌、深海热球菌、T.gorgonarius、超级嗜热菌(T.litoralis)、速生热球菌(T.zilligii)、或火球菌属GB-D(P.sp.GB-D)的聚合酶。

27.根据权利要求26所述的嵌合聚合酶，其中，所述第二DNA聚合酶是Pfu聚合酶。

28.根据权利要求23所述的嵌合聚合酶，其中，所述第一DNA聚合酶是KOD聚合酶而所述第二DNA聚合酶是Pfu聚合酶。

29.根据权利要求23所述的嵌合聚合酶，其中，所述第一DNA聚合酶是Pfu聚合酶而所述第二DNA聚合酶是KOD聚合酶。

30.一种嵌合聚合酶，包括至少90％相同于SEQ ID NO：15(Pod氨基酸序列)的氨基酸序列。

31.一种核苷酸序列，编码根据权利要求1-30中任一项所述的嵌合聚合酶。

32.一种载体，包括根据权利要求31所述的核苷酸序列。

33.一种细胞，包括根据权利要求31所述的核苷酸序列。

34.一种试剂盒，包括根据权利要求1-30中任一项所述的嵌合聚合酶。

35.一种利用根据权利要求1-30中任一项所述的嵌合聚合酶的DNA合成的方法。

36.一种利用根据权利要求1-30中任一项所述的嵌合聚合酶扩增DNA片段的方法。

37.一种设计嵌合聚合酶的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)提供基于第一DNA聚合酶的N-末端域、核酸外切酶域、和/或拇指域；

(b)提供基于第二DNA聚合酶的掌域和/或指域；

(c)结合来自步骤(a)和步骤(b)的域以形成嵌合聚合酶；

38.根据权利要求37所述的方法，其中，所述第一DNA聚合酶选自KOD聚合酶、或TNAl聚合酶、热球菌属9度N-7、T4、T7、或phi29。

39.根据权利要求38所述的方法，其中，所述第一DNA聚合酶是KOD聚合酶。

40.根据权利要求38所述的方法，其中，所述第二DNA聚合酶选自分离自激烈火球菌、深海热球菌、T.gorgonarius、超级嗜热菌(T.litoralis)、速生热球菌(T.zilligii)、热球菌属GT(T.sp.GT)、或火球菌属GB-D(P.sp.GB-D)的聚合酶。

41.根据权利要求40所述的方法，其中，所述第二DNA聚合酶是Pfu聚合酶。

42.根据权利要求37所述的方法，其中，所述第一DNA聚合酶是KOD聚合酶而所述第二DNA聚合酶是Pfu聚合酶。

43.一种利用根据权利要求35-42中任一项所述的方法设计的嵌合聚合酶。

44.一种改善DNA聚合酶的保真性的方法，所述方法包括以下步骤：用来自不同的DNA聚合酶的相应序列替代感兴趣的DNA聚合酶的掌域和/或指域内的序列，所述不同的DNA聚合酶的特征在于相对于感兴趣的DNA聚合酶具有更高的保真性。

45.一种改善DNA聚合酶的持续合成能力、延伸率、抗盐性、热稳定性或TMAC耐受性的方法，所述方法包括以下步骤：用来自不同的DNA聚合酶的相应序列替代在感兴趣的DNA聚合酶的N-末端域、核酸外切酶域和/或拇指域内的序列，所述不同的DNA聚合酶的特征在于相对于感兴趣的DNA聚合酶具有更高的持续合成能力、延伸率、抗盐性或PCR增强子抗性。

46.根据权利要求44或45所述的方法的改进的DNA聚合酶。