JP6969089B2 - 核酸増幅用組成物及び核酸増幅法 - Google Patents

Description

本発明は、動物体液試料等の夾雑物の存在下においても、効果的な核酸増幅を行うことができる組成物に関する。

核酸増幅法は数コピーの標的核酸を可視化可能なレベル、すなわち数億コピー以上に増幅する技術であり、生命科学研究分野のみならず、遺伝子診断、臨床検査といった医療分野、あるいは、食品や環境中の微生物検査等においても、広く用いられている。代表的な核酸増幅法はＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）である。ＰＣＲは、（１）熱処理によるＤＮＡ変性（２本鎖ＤＮＡから１本鎖ＤＮＡへの解離）、（２）鋳型１本鎖ＤＮＡへのプライマーのアニーリング、（３）ＤＮＡポリメラーゼを用いた前記プライマーの伸長、という３ステップを１サイクルとし、このサイクルを繰り返すことによって、試料中の標的核酸を増幅する方法である。

検出対象核酸がＲＮＡである場合、たとえば病原性微生物の検出において対象がＲＮＡウイルスである場合、あるいは遺伝子の発現量をｍＲＮＡの定量によって測定する場合などは、逆転写酵素によりＲＮＡをｃＤＮＡに変換する反応（逆転写反応）をＰＣＲの前に行う。

この逆転写酵素による逆転写反応とＤＮＡポリメラーゼによるＰＣＲは、各々の酵素の至適条件の違いから、先に逆転写反応を行い、ついで別の反応液に移してＰＣＲが行われることが多い。この煩雑さを解消するために２つの反応を同一反応液中で連続して行う方法、ワンステップＲＴ−ＰＣＲ法が近年に開発された。（特許文献１）

また、近年では、ＰＣＲの中でも、リアルタイムＰＣＲ法が広く実施されるようになってきた。リアルタイムＰＣＲ法は増幅された核酸を経時的に解析することができ、高い定量性を確保し、高感度の検出を行うことができる。

核酸増幅法は生体試料中に存在する糖やタンパク質等により強く阻害され、増幅効率や検出感度が低下することが知られている。したがって、前記の核酸増幅に先立ち、生体試料から核酸を抽出し、精製する操作が必要となる。

生体試料からの核酸抽出法としては、フェノールやクロロホルムなどの有機溶媒を用いる方法が知られている（特許文献２）。

しかしながら、これらの方法を用いて試料中の核酸の精製を行っても、夾雑物を完全に除去することは困難である。また、試料中の核酸の回収量が一定でない場合も多く、特に試料中の核酸の含量が少ないときは核酸増幅を行うことが難しい。さらにフェノール、クロロホルムなどの有機溶媒は取扱いに注意を要し、廃棄方法も煩雑である。

このように核酸抽出及び精製を行っても、夾雑物の完全な除去は困難であり、また、煩雑で時間を要する核酸抽出及び精製の操作を省略するという観点からも、核酸増幅試薬中に種々の添加剤を加えることにより、血液等の生体試料から直接核酸を増幅させる方法が検討されている（特許文献３、４、５）。

特許文献３は血液試料に含まれる塩濃度を考慮し、全反応液中の塩濃度を調整することにより、血液試料から直接核酸増幅を行う方法である。しかしながら、特許文献３は全反応液中の塩濃度を調整しなければならず、非常に煩雑である。

特許文献４はｐＨを通常よりも高くし（ｐＨ８．８程度）、さらに界面活性剤を添加することにより血液等の体液試料から直接核酸増幅を行う方法である。しかしながら、特許文献３の方法では、ＰＣＲ反応液への血液持込量は５０μＬ反応液あたり１．２５〜５μＬと限定的であり、最大でも反応液に対して１０％の血液しか持ち込むことができない。

特許文献５はｐＨを通常よりも高く（ｐＨ８．２程度）し、さらにポリアミン、硫酸化多糖、ジチオスレイトールを添加することにより血液等の体液試料から直接核酸増幅を行う方法である。しかしながら、特許文献５についても、血漿、血液の持込量は５０μＬ反応液あたり１〜２μＬと限定的であり、最大でも反応液に対して４％の血液しか持ち込むことができない。

特許文献６には、トレハロース、Ｌ−カルニチン、非イオン性界面活性剤を添加することにより、ヘパリンを２から５０ｕｎｉｔｓ含む全血、血清、血漿中で核酸増幅を促進することが記載されている。しかしながら、トレハロースを０．１〜１．０Ｍ、Ｌ−カルニチンを０．１〜１．５Ｍと非常に高濃度で用いなければならず、反応液量の問題でこれらを添加するのは困難な場合がある。また、非イオン性界面活性剤の例として挙げられている、ＮＰ−４０やＴｒｉｔｏｎＸ−１００はＧＨＳにおける環境有害性物質に該当し、ＥＵではＲＥＡＣＨ規制の認可候補物質（高懸念物質）に該当している。研究用途として使用する場合は、このような有害性の高い物質の使用はできるだけ避けることが望ましい。

また、特許文献７には、プロリン、Ｌ−カルニチン、ベタイン等の１つ以上の窒素含有有機化合物を添加することにより、核酸分子、特にＧＣリッチな核酸分子の合成を増強させることが記載されている。しかしながら、特許文献７はＧＣリッチな核酸分子の合成を増強させる効果のみ記載されており、血液等の体液試料から直接核酸増幅を行う方法については言及されていない。

特許２９６８５８５号公報 特開平９−１９２９２号公報 特開平６−２７７０６２号公報 特開平１０−８０２７９号公報 特開２００１−８６８０号公報 国際公開第２０１０−０６５９２４号パンフレット 国際公開第１９９９−０４６４００号パンフレット

核酸増幅法において、夾雑物の存在下で核酸増幅を行う方法の検討が進められてきた。しかしながら、従来の検討は、操作が煩雑で時間を要するものや夾雑物の少ない試料を対象としているものであり、いずれも使用に際し短所を有するものであった。また、従来より血液を直接反応液に添加してＰＣＲを行う試みはなされているが、その場合の主要な鋳型は宿主由来のＤＮＡであり、鋳型量が比較的多量な場合に限定され、普遍性に乏しかった。このような方法では、核酸抽出の工程を経ずに、試料中の微量なウィルス、細菌、細胞等の外来生物の遺伝子を検出することは困難である。

そこで、本発明は、核酸増幅試薬として、（１）操作が煩雑でないこと、（２）多量の夾雑物の存在下であっても核酸増幅が可能であり、高感度な検出ができること、（３）血液中の細胞といった、従来の方法では核酸抽出の工程を経ずに直接検出することが困難であったターゲットを検出することが可能であること、かつ、（４）操作が簡便でコンタミネーションのリスクの低いワンステップＲＴ−ＰＣＲ法で実施することが可能であること、を満たす組成物を提供することを目的とする。

本発明者らは、上記課題に鑑み、鋭意研究の結果、テトラメチルアンモニウム塩、特に酢酸テトラメチルアンモニウム、塩化テトラメチルアンモニウムからなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物、Ｌ−カルニチンおよびテトラメチルアンモニウム耐性ＤＮＡポリメラーゼを共存させて核酸増幅を行うと、多量の夾雑物存在下で効率良く核酸増幅を実施できることを見出した。そして、この知見をもとに、酵素に対する阻害作用がなく、操作性の低下も極めて少なく、長期保存が可能で、さらに混合液状態での安定性が高い核酸増幅用組成物が提供できることを見出した。また、この知見がＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲおよびリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ特にワンステップＲＴ−ＰＣＲにも適用できることを見出し、本発明を完成させるに至った。

即ち、本発明の概要は以下の通りである。
項１．テトラメチルアンモニウム塩、Ｌ−カルニチン及びテトラメチルアンモニウム耐性ＤＮＡポリメラーゼを含むことを特徴とする核酸増幅用組成物。
項２．前記テトラメチルアンモニウム耐性ＤＮＡポリメラーゼが、終濃度が５０ｍＭ以上のテトラメチルアンモニウム塩存在下で阻害されないＤＮＡポリメラーゼである項１に記載の核酸増幅用組成物。
項３．前記テトラメチルアンモニウム耐性ＤＮＡポリメラーゼが配列番号１９と９０％以上の同一性があるＤＮＡポリメラーゼである項１または２に記載の核酸増幅用組成物。
項４．前記テトラメチルアンモニウム耐性ＤＮＡポリメラーゼがＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼである項１または２に記載の核酸増幅用組成物。
項５．前記テトラメチルアンモニウム耐性ＤＮＡポリメラーゼがＺ０５ ＤＮＡポリメラーゼである項１または２に記載の核酸増幅用組成物。
項６．前記テトラメチルアンモニウム耐性ＤＮＡポリメラーゼが配列番号６の変異体である項１または２に記載の核酸増幅用組成物。
項７．前記テトラメチルアンモニウム耐性ＤＮＡポリメラーゼが配列番号６の少なくともＥ５０７位、またはＥ７４２位が改変されたＤＮＡポリメラーゼである項６に記載の核酸増幅用組成物。
項８．前記テトラメチルアンモニウム塩が、酢酸テトラメチルアンモニウム、塩化テトラメチルアンモニウム、水酸化テトラメチルアンモニウムからなる群より選ばれた少なくとも１種の化合物である項１〜７のいずれかに記載の核酸増幅用組成物。
項９．グリコール類を含むことを特徴とする項１〜８のいずれかに記載の核酸増幅用組成物。
項１０．グリコール類の炭素数が４以下である項１〜９のいずれかに記載の核酸増幅用組成物。
項１１．グリコール類がエチレングリコール、１，２−プロパンジオールおよび１，３−プロパンジオールからなる群より選ばれた少なくとも１種の化合物である項１〜１０のいずれかに記載の核酸増幅用組成物。
項１２．反応液中に生体試料を直接添加する項１〜１１のいずれかに記載の核酸増幅用組成物。
項１３．前記生体試料が、血液、血漿または血清等の血液由来試料、唾液、髄液、尿、乳からなる群より選ばれた少なくとも１種の試料である項１〜１２のいずれかに記載の核酸増幅用組成物。
項１４．前記生体試料中のウィルス、細菌、真菌、原虫及び細胞をターゲットとして検出する項１〜１３のいずれかに記載の核酸増幅用組成物。
項１５．少なくとも抗体、反応緩衝剤および金属イオンを含む項１〜１４のいずれかに記載の核酸増幅用組成物。
項１６．少なくとも逆転写酵素、抗体、反応緩衝剤および金属イオンを含む項１〜１５のいずれかに記載の核酸増幅用組成物。
項１７．核酸増幅反応がＰＣＲである項１〜１６のいずれかに記載の核酸増幅用組成物。
項１８．核酸増幅反応がワンステップＲＴ−ＰＣＲである項１〜１７のいずれかに記載の核酸増幅用組成物。
項１９．テトラメチルアンモニウム塩、Ｌ−カルニチン及びテトラメチルアンモニウム耐性ＤＮＡポリメラーゼを含むことを特徴とする核酸増幅法。
項２０．前記テトラメチルアンモニウム耐性ＤＮＡポリメラーゼが、終濃度が５０ｍＭのテトラメチルアンモニウム塩存在下で阻害されないＤＮＡポリメラーゼである項１９に記載の核酸増幅法。
項２１．前記テトラメチルアンモニウム耐性ＤＮＡポリメラーゼが配列番号１９と９０％以上の同一性があるＤＮＡポリメラーゼである項２０または２１に記載の核酸増幅法。
項２２．前記テトラメチルアンモニウム耐性ＤＮＡポリメラーゼがＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼである項１９〜２１のいずれかに記載の核酸増幅法。
項２３．前記テトラメチルアンモニウム耐性ＤＮＡポリメラーゼがＺ０５ ＤＮＡポリメラーゼである項１９〜２２のいずれかに記載の核酸増幅法。
項２４．前記テトラメチルアンモニウム耐性ＤＮＡポリメラーゼが配列番号６の変異体である項１９〜２３のいずれかに記載の核酸増幅法。
項２５．前記テトラメチルアンモニウム耐性ＤＮＡポリメラーゼが配列番号６の少なくともＥ５０７位、またはＥ７４２位が改変されたＤＮＡポリメラーゼである項１９〜２４のいずれかに記載の核酸増幅法。
項２６．前記テトラメチルアンモニウム塩が、酢酸テトラメチルアンモニウム、塩化テトラメチルアンモニウム、水酸化テトラメチルアンモニウムからなる群より選ばれた少なくとも１種の化合物である項１９〜２５のいずれかに記載の核酸増幅法。
項２７．グリコール類を含むことを特徴とする項１９〜２６のいずれかに記載の核酸増幅法。
項２８．グリコール類の炭素数が４以下である項１９〜２７のいずれかに記載の核酸増幅法。
項２９．グリコール類が、エチレングリコール、１，２−プロパンジオールおよび１，３−プロパンジオールからなる群より選ばれた少なくとも１種の化合物である項１９〜２８のいずれかに記載の核酸増幅法。
項３０．反応液中に生体試料を直接添加する項１９〜２９のいずれかに記載の核酸増幅法。
項３１．前記生体試料が、血液由来試料、唾液、髄液、尿、乳からなる群より選ばれた少なくとも１種の試料である項１９〜３０のいずれかに記載の核酸増幅法。
項３２．前記生体試料中のウィルス、細菌、真菌、原虫及び細胞をターゲットとして検出する項１９〜３１のいずれかに記載の核酸増幅法。
項３３．少なくとも抗体、反応緩衝剤および金属イオンを含む項１９〜３２のいずれかに記載の核酸増幅法。
項３４．少なくとも逆転写酵素、抗体、反応緩衝剤および金属イオンを含む項１９〜３３のいずれかに記載の核酸増幅法。
項３５．核酸増幅反応がＰＣＲである項１９〜３４のいずれかに記載の核酸増幅法。
項３６．核酸増幅反応がワンステップＲＴ−ＰＣＲである項１９〜３５のいずれかに記載の核酸増幅法。

本発明により、夾雑物の存在下での核酸増幅を効果的に行うことができる。本発明によれば、特に取り扱いに注意が必要な試薬を用いることなく、また試料やターゲットの種類に依存することもなく、簡便に核酸を増幅させることができる。

ＢＣＲ−ＡＢＬ遺伝子のフォワードプライマー
配列番号：１
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
配列の種類：合成
配列：ＧＡＧＴＣＴＣＣＧＧＧＧＣＴＣＴＡＴＧＧ

ＢＣＲ−ＡＢＬ遺伝子のプローブ
配列番号：２
配列の長さ：２８
配列の型：核酸
配列の種類：合成
配列：ＴＣＴＧＡＡＴＧＴＣＡＴＣＧＴＣＣＡＣＴＣＡＧＣＣＡＣＴ
５’にＦＡＭ、３‘にＴＡＭＲＡを標識したＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブである。

ＢＣＲ−ＡＢＬ遺伝子のリバースプライマー
配列番号：３
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
配列の種類：合成
配列：ＧＣＣＧＣＴＧＡＡＧＧＧＣＴＴＴＴＧＡＡ

酢酸テトラメチルアンモニウム及びＬ−カルニチン及び１，３−プロパンジオールを含むバッファー、酢酸テトラメチルアンモニウム及びＬ−カルニチンを含むバッファー、酢酸テトラメチルアンモニウムを含むバッファー、Ｌ−カルニチンを含むバッファー、３種類の試薬を含まないバッファーを調製した。各々のバッファーでリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを実施し、縦軸にＣｔ値、横軸にＲＮＡの対数値をとりグラフ化した図である。この時、反応液中に血液を添加した。 酢酸テトラメチルアンモニウム及びＬ−カルニチン及び１，３−プロパンジオールを含むバッファー、酢酸テトラメチルアンモニウム及びＬ−カルニチンを含むバッファー、酢酸テトラメチルアンモニウムを含むバッファー、Ｌ−カルニチンを含むバッファー、３種類の試薬を含まないバッファーを調製した。各々のバッファーでリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを実施した時の増幅曲線である。この時、反応液中に血液を添加した。 酢酸テトラメチルアンモニウム及びＬ−カルニチン及び１，３−プロパンジオールを含むバッファー、酢酸テトラメチルアンモニウム及びＬ−カルニチンを含むバッファー、酢酸テトラメチルアンモニウムを含むバッファー、Ｌ−カルニチンを含むバッファー、３種類の試薬を含まないバッファーを調製した。各々のバッファーでリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを実施し、縦軸にＣｔ値、横軸にＲＮＡの対数値をとりグラフ化した図である。この時、反応液中に血液は添加しなかった。 酢酸テトラメチルアンモニウム及びＬ−カルニチン及び１，３−プロパンジオールを含むバッファー、酢酸テトラメチルアンモニウム及びＬ−カルニチンを含むバッファー、酢酸テトラメチルアンモニウムを含むバッファー、Ｌ−カルニチンを含むバッファー、３種類の試薬を含まないバッファーを調製した。各々のバッファーでリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを実施した時の増幅曲線である。この時、反応液中に血液は添加しなかった。 酢酸テトラメチルアンモニウム及びＬ−カルニチン及び１，３−プロパンジオールを含むバッファーを調製した。調製したバッファーで、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ及びＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼでリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを実施し、縦軸にＣｔ値、横軸にＲＮＡの対数値をとりグラフ化した図である。この時、反応液中に血液を添加した。 酢酸テトラメチルアンモニウム及びＬ−カルニチン及び１，３−プロパンジオールを含むバッファーを調製した。調製したバッファーで、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ及びＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼでリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを実施した時の増幅曲線である。ＡはＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼを使用した時、ＢはＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを使用した時の図である。この時、反応液中に血液を添加した。 酢酸テトラメチルアンモニウム及びＬ−カルニチン及び１，３−プロパンジオールと１，３−プロパンジオールの代わりにエチレングリコール、１，２−プロパンジオール、グリセロールを添加したバッファーを調製した。調製した各々のバッファーでリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを実施し、縦軸にＣｔ値、横軸にＲＮＡの対数値を取りグラフ化した図である。この時、反応液中に血液を添加した。 酢酸テトラメチルアンモニウム及びＬ−カルニチン及び１，３−プロパンジオールと１，３−プロパンジオールの代わりにエチレングリコール、１，２−プロパンジオール、グリセロールを添加したバッファーを調製した。調製した各々のバッファーでリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを実施した時の増幅曲線である。Ａは１，３−プロパンジオール、Ｂはエチレングリコール、Ｃは１，２−プロパンジオール、Ｄはグリセロールを添加した時の図である。この時、反応液中に血液を添加した。 酢酸テトラメチルアンモニウム及びＬ−カルニチン及び１，３−プロパンジオールと酢酸テトラメチルアンモニウムの代わりに塩化テトラメチルアンモニウムを添加したバッファーを調製した。調製した各々のバッファーでリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを実施し、縦軸にＣｔ値、横軸にＲＮＡの対数値をとりグラフ化した図である。この時、反応液中に血液を添加した。 酢酸テトラメチルアンモニウム及びＬ−カルニチン及び１，３−プロパンジオールと酢酸テトラメチルアンモニウムの代わりに塩化テトラメチルアンモニウムを添加したバッファーを調製した。調製した各々のバッファーでリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを実施した時の増幅曲線である。Ａは酢酸テトラメチルアンモニウム、Ｂは塩化テトラメチルアンモニウムを添加した時の図である。 酢酸テトラメチルアンモニウム及びＬ−カルニチン及び１，３−プロパンジオールを添加したバッファーを調製した。５０μＬ反応系に１〜１５μＬの血液を添加し、各々のバッファーでリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを実施し、縦軸にＣｔ値、横軸にＲＮＡの対数値をとりグラフ化した図である。 酢酸テトラメチルアンモニウム及びＬ−カルニチン及び１，３−プロパンジオールを添加したバッファーを調製した。５０μＬ反応系に１〜１５μＬの血液を添加し、各々のバッファーでリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを実施しの増幅曲線である。Ａは血液１μＬ添加時、Ｂは血液２μＬ添加時、Ｃは血液３μＬ添加時、Ｄは血液５μＬ添加時、Ｅは血液１０μＬ添加時、Ｆは血液１５μＬ添加時の図である。 テトラメチルアンモニウム塩に耐性があるか否かを、ＰＣＲの反応系に酢酸テトラメチルアンモニウムを追添し確認した図である。 酢酸テトラメチルアンモニウム及びＬ−カルニチン及び１，３−プロパンジオールを添加したバッファーを調製した。２０μＬ反応系に１μＬの血液を添加し、リアルタイムＰＣＲを実施した際の増幅曲線である。 Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼとＺ０５ ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列同一性を確認した図である。

本発明の態様は、生体試料を核酸増幅反応液に直接添加し、生体試料中の標的核酸を増幅することのできる核酸増幅法である。この増幅法はテトラメチルアンモニウム塩及びＬ−カルニチン及びテトラメチルアンモニウム耐性ＤＮＡポリメラーゼを含むことを特徴とする核酸増幅用組成物である。

本発明の核酸増幅用組成物は、生体試料内の核酸を抽出や精製することなく増幅させることができる。一般的に、核酸増幅に先立ち、被験物から細胞（悪性新生物を含む様々な細胞）、細菌、ＤＮＡウィルス、ＲＮＡウィルス、レトロウィルス等のウィルス等を分離し、核酸を抽出する必要がある。酵素、界面活性剤、カオトロピック剤等により細胞や細菌を分解し、フェノールあるいはフェノール・クロロホルム等を用いて、その分解物から核酸を抽出する方法が、従来より使用されている。本発明における核酸抽出法は臓器や細胞など、増幅対象となる核酸が試料の組織内に存在する場合、前記核酸を抽出するために組織を破壊する行為（物理的な処理による破壊、界面活性剤などを使用した破壊など）を指し、これらに限定されるものではない。また、本発明における核酸精製法とは生体試料の組織、細胞壁などの夾雑物質と生体試料中のＤＮＡを分離する方法であり、フェノールあるいはフェノール・クロロホルム等を用いて、ＤＮＡを分離する方法や、イオン交換樹脂、ガラスフィルターあるいはタンパク凝集作用を有する試薬によってＤＮＡを分離する方法を指し、これらに限定されるものではない。

本発明において「抽出や精製を実施していない生体試料」とは、生体試料そのもの、あるいは液体の生体試料を水などの溶媒を用いて希釈したもの、個体の生体試料を水などの溶媒に添加し熱をかけて破砕させたものなどが挙げられるが、抽出や精製を実施していなければ、これらに限定されるものではない。

本発明の核酸増幅用組成物に適用する生体試料は、生体から採取された試料であれば特に限定されない。例えば、動植物組織、体液、排泄物、細胞、細菌、ウイルス等をいう。体液には血液、血漿または血清等の血液由来試料や唾液が挙げられる。細胞には血液から分離した白血球なども含まれるが、これらに限定されるものではない。

なお、前記生体試料が血液由来試料の場合、全血、血漿または血清のいずれであっても良く、また、ＥＤＴＡ−Ｎａやヘパリンナトリウム等の抗凝固剤で処理されていてもよい。

前記生体試料の量は特に限定されないが、反応液中の約１〜約２０容量％であることが好ましい。

本発明の核酸増幅用組成物が適用される核酸増幅反応とは、鋳型の核酸に対し、相補的な配列を持つ核酸を配列依存的に合成する反応を指し、その様式は特に限定されないが、より具体的には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法のように特定の標的配列を指数関数的に増幅する方法が例示される。ＰＣＲはリアルタイムＰＣＲであっても良い。その他の形態として、定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、ＬＡ−ＰＣＲ（Ｌｏｎｇ ａｎｄ Ａｃｃｕｒａｔｅ ＰＣＲ）、競合的ＰＣＲ、Ｉｎ ｓｉｔｕ ＰＣＲ、ＲＮＡ−ｐｒｉｍｅｒｅｄ ＰＣＲ、ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ、シャトルＰＣＲ、ＰＣＲ／ＧＣ−ｃａｌｍｐ法、ストレッチＰＣＲ、Ａｌｕ ＰＣＲ、メガプライマーＰＣＲ、Ｉｍｍｕｎｏ ＰＣＲ等、ＰＣＲ法を応用した方法も、前記核酸増幅方法に含まれる。

本発明の核酸増幅法は、ＲＴ−ＰＣＲに適用することもできる。ＲＴ−ＰＣＲにおける逆転写の工程とＰＣＲの工程とは、順次別々に行っても良いし、連続して行うワンステップ法を採用しても良い。また、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲであっても良い。

本発明におけるテトラメチルアンモニウム塩は、いかなる第４級アンモニウム塩を用いても良いが、好ましくは、水酸化テトラメチルアンモニウム、塩化テトラメチルアンモニウム、酢酸テトラメチルアンモニウムが用いられる。より好ましくは、酢酸テトラメチルアンモニウムが用いられる。これらのテトラメチルアンモニウム塩は、構造により製法が異なるものの、いずれも工業的な製造方法が確立されており、安価で容易に入手が可能である。これらのテトラメチルアンモニウム塩は１種類のみを用いてもよいし、２種類以上を任意に組み合わせて用いたとしても本発明の効果を奏する。

本発明におけるテトラメチルアンモニウム塩は、核酸増幅反応用試薬に予め混合することが好ましい。また本発明における、核酸増幅反応溶液中のテトラメチルアンモニウム塩は終濃度として好ましくは１０〜２１０ｍＭ、より好ましくは終濃度として２０〜２００ｍＭとなるような濃度で混合しておくのがよい。

本発明のＬ−カルニチンは、核酸増幅反応用試薬に予め混合することが好ましい。また、本発明における、核酸増幅反応溶液中のＬ−カルニチン（ＣＡＳ番号５４１−１５−１）の濃度の下限は０．１Ｍが好ましい。一方、Ｌ−カルニチンの濃度の上限は１Ｍが好ましい。

本発明におけるグリコール類とは、アルコールの一種（ポリオール）で、鎖式または環式脂肪族炭化水素を形成する炭素原子のうち、２つの炭素原子にそれぞれ１つずつのヒドロキシ基が存在している化合物であり、ジオール化合物とも呼ばれる。狭義には、最も構造が単純なエチレングリコールを単にグリコールと呼び表すこともあるが、本発明においては前述の広義でのグリコール類を指す。

本発明におけるグリコール類は、いかなる構造のグリコール類を用いても良いが、好ましくは炭素数４以下の鎖式構造のグリコール類が用いられる。炭素数４以下のグリコール類として、１，２−エタンジオール（「エチレングリコール」ともいわれる）、１，２−プロパンジオール（「プロピレングリコール」ともいわれる）、１，３−プロパンジオール（「トリメチレングリコール」ともいわれる）、１，２−ブタンジオール（「α−ブチレングリコール」ともいわれる）、１，３−ブタンジオール（「β−ブチレングリコール」ともいわれる）、１，４−ブタンジオール（「テトラメチレングリコール」ともいわれる）、２，３−ブタンジオール（「ジメチレングリコール」ともいわれる）、２，２´−オキシジエタノール（「ジエチレングリコール」とも言われる）、が例示される。より好ましくは炭素数２または３のグリコール類、即ち、１，２−エタンジオール、１，２−プロパンジオール、１，３−プロパンジオールが用いられる。さらに好ましくは、１，２−プロパンジオールおよび１，３−プロパンジオールである。これらのグリコール類は、構造により製法が異なるものの、いずれも工業的な製造方法が確立されており、安価で容易に入手が可能である。これらのグリコール類は１種類のみを用いてもよいし、２種類以上を任意に組み合わせて用いてもよい。

本発明においてグリコール類は、核酸増幅反応用試薬に予め混合することが好ましい。核酸増幅反応用試薬は通常２〜１０倍の濃縮状態で保存されることが多いがその場合、グリコール類は反応溶液中の終濃度が好ましくは１〜２０容量％、より好ましくは３〜１５容量％となるような濃度で混合しておくのがよい。

本発明における、核酸増幅反応溶液中のグリコール類とＬ−カルニチンとの濃度の組合せとして、好ましい態様としては、エチレングリコールとＬ−カルニチン、１，２−プロパンジオールとＬ−カルニチン、１，３−プロパンジオールとＬ−カルニチン、グリセロールとＬ−カルニチンである。好ましい濃度範囲はグリコール類がと１〜２０容量％、Ｌ−カルニチンが０．１〜１Ｍである。さらに好ましい範囲はグリコール類３〜１５容量％、Ｌ−カルニチンが０．１〜１Ｍである。

本発明の核酸増幅用組成物において使用するＤＮＡポリメラーゼは、テトラメチルアンモニウム塩に耐性のあるＤＮＡポリメラーゼが好ましい。テトラメチルアンモニウム塩に耐性のあるＤＮＡポリメラーゼとは、ＰＣＲの反応系にテトラメチルアンモニウム塩が含まれていても阻害されないＤＮＡポリメラーゼを言うものであり、好ましくは５０ｍＭのテトラメチルアンモニウム塩に耐性があることが望ましい。さらに望ましくは１００ｍＭのテトラメチルアンモニウム塩に耐性があることが望ましく、さらに望ましくは２００ｍＭのテトラメチルアンモニウム塩に耐性があることが望ましい。

テトラメチルアンモニウム塩に耐性があるかないかは、以下のようにして確認することができる。
ＤＮＡポリメラーゼのテトラメチルアンモニウム塩耐性評価
ＢｌｅｎｄＴａｑ（Ｔｏｙｏｂｏ製）添付の１０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒを用い、１×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ、０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ、５０ｎｇヒトゲノム、β―アクチン１．３ｋｂを増幅する１５ｐｍｏｌの配列番号４及び５に記載のプライマーを含む５０μｌの反応液中に、耐性の有無を判定したい酵素を２．５Ｕになるよう添加する。酢酸テトラメチルアンモニウムを終濃度０、５０、１００、１５０、２００ｍＭになるように添加し、９４℃、３０秒の前反応の後、９４℃、３０秒→６０℃、３０秒→７２℃、９０秒を３０サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲを行う。増幅産物を電気泳動で確認し、酢酸テトラメチルアンモニウムを添加したものと酢酸テトラメチルアンモニウムを添加していないものを比較し、増幅量が変わらなければ、その濃度までテトラメチルアンモニウム塩に耐性があるということができる。

テトラメチルアンモニウム塩に耐性のあるＤＮＡポリメラーゼは、具体的にはＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｚ０５ ＤＮＡポリメラーゼが好ましい。前記のＤＮＡポリメラーゼは野生型のものでも良いし、ＤＮＡポリメラーゼ活性を維持する範囲で改変されたものであっても良い。また、さらにそれらを適当な発現系で組換え生産したものでもよい。
また、テトラメチルアンモニウム塩に耐性を持たせるためにＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼに変異を加えたものであってもよい。より好ましくは配列番号６におけるＥ５０７位、Ｅ７４２位に変異を入れたものであってもよいが、それ以外にＤＮＡポリメラーゼ活性を維持する範囲で改変されたものであっても良く特に限定されない。また、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼの場合には、配列番号１９と９０％以上、好ましくは９５％以上の同一性があるＤＮＡポリメラーゼであってもよい。

本発明の核酸増幅用組成物において、核酸増幅反応用液中には、グリコール類、Ｌ−カルニチン及びＤＮＡポリメラーゼのほかに、さらに鋳型となる核酸、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、プライマーとなるオリゴヌクレオチド、ジデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰｓ）、反応バッファー、マグネシウムイオン等の金属イオンを、実施する核酸増幅方法により必要に応じて存在させる。

一例として、ＰＣＲ法を用いた核酸増幅においては、鋳型核酸、ＤＮＡポリメラーゼ、オリゴヌクレオチド、ｄＮＴＰｓ、反応バッファーが一般的に必要である。

リアルタイムＰＣＲの場合は、核酸増幅を経時的に確認するため、さらにＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＩ（登録商標）やＥｖａ Ｇｒｅｅｎ（登録商標）などの蛍光色素や蛍光標識をしたプローブを必要に応じて存在させる。

ＲＴ−ＰＣＲの場合は、さらに、逆転写に必要なものとして逆転写酵素を必要に応じて存在させる。

リアルタイムＲＴ−ＰＣＲの場合は、さらに、逆転写に必要なものとして逆転写酵素を必要に応じて存在させる。また、核酸増幅を経時的に確認するため、さらにＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＩ（登録商標）やＥｖａ Ｇｒｅｅｎ（登録商標）などの蛍光色素や蛍光標識をしたプローブを必要に応じて存在させる。

本発明の核酸増幅用組成物において、核酸増幅反応溶液中には、ホットスタートＰＣＲ法を実施するために、抗ＤＮＡポリメラーゼ抗体を含んでいても良い。従前、核酸の融解温度を調整する目的でＤＭＳＯやホルムアルデヒドを添加した場合、これらの物質は抗ＤＮＡポリメラーゼ抗体の作用を阻害するものとなっていた。本発明では抗ＤＮＡポリメラーゼ抗体の作用を阻害するような試薬は含まれていないため、ホットスタートＰＣＲ法は極めて有用である

ここでいう抗ＤＮＡポリメラーゼ抗体は、その形態は特に限定されないが、好ましくは耐熱性ＤＮＡポリメラーゼに結合し、５０℃以下の低温において活性を８０％以上阻害するもの、より好ましくは９０％以上阻害するものを用いることができる。またここでいう抗耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ抗体は単一種のモノクローナル抗体を用いるか、または複数のモノクローナル抗体を用いるか、あるいはポリクローナル抗体を用いることができる。このような抗体はマウス、ラット、ハムスター等を用いたハイブリドーマ作製等による公知のモノクローナル抗体作製法により得ることができる。

本発明の核酸増幅用組成物において、核酸増幅反応溶液中には、ホットスタートＰＣＲ法を実施するために、抗ＤＮＡポリメラーゼ抗体を含んでいても良い。従前、核酸の融解温度を調整する目的でＤＭＳＯやホルムアルデヒドを添加した場合、これらの物質は抗ＤＮＡポリメラーゼ抗体の作用を阻害するものとなっていた。本発明に用いるグリコール類やＬ−カルニチンは抗ＤＮＡポリメラーゼ抗体の作用を阻害することがないため、ホットスタートＰＣＲ法には極めて有用である。

本発明の核酸増幅用組成物において、核酸増幅のための温度・時間・反応サイクル等の条件は、増幅したい核酸の種類や塩基の配列、鎖長等によって変わるが、当業者であれば適宜設定できる。ただし、本発明の効果を享受するため、変性反応における設定温度や設定時間は、通常より温度を低く若しくは時間を短く設定することが好ましいが、この限りではない。

本発明の別の態様は、生体試料を核酸増幅反応液に添加し、生体試料中の標的核酸を増幅する方法に用いる試薬であって、テトラメチルアンモニウム塩、Ｌ−カルニチン及びテトラメチルアンモニウム耐性ＤＮＡポリメラーゼを含む、核酸増幅用組成物である。ここで言う試薬とは、キットなどのように市販品として流通するものに限定されず、自家調製によるもの等を含み、形態を問わない。別の切り口では、ＰＣＲ用試薬、ＲＴ−ＰＣＲ用試薬、ワンステップＲＴ−ＰＣＲ用試薬などの態様が挙げられる。本発明の核酸増幅用組成物に含まれる組成物の構成や各構成成分の詳細は、上述の核酸増幅法の説明に準ずる。

本発明の核酸増幅用組成物において、テトラメチルアンモニウム塩及びＬ−カルニチン及びテトラメチルアンモニウム耐性ＤＮＡポリメラーゼは、同一の容器に含まれていてもよいし、別々の容器に保持されていたものを使用するより前に混合しても良い。特にワンステップＲＴ−ＰＣＲの場合は、逆転写酵素を存在させる必要があるが、この逆転写酵素についても前記の試薬類と同一の容器に含まれていてもよいし、別々の容器に保持されていたものを使用するより前に混合しても良い。

以下、本発明を実施例に基づき、より詳細に説明する。なお、本発明は実施例に特に限定されるものではない。

実施例１
１００ｍＭ 酢酸テトラメチルアンモニウム及び０．３Ｍ Ｌ−カルニチン及び４％ １，３−プロパンジオールを含むバッファー、酢酸テトラメチルアンモニウム及びＬ−カルニチンを含むバッファー、酢酸テトラメチルアンモニウムを含むバッファー、Ｌ−カルニチンを含むバッファー、３種類の試薬を含まないバッファーを調製した。各々のバッファーでリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを実施した。この時、５０μＬ反応系に１０μＬの血液を添加した時（血液（＋）と記載）と、血液の代わりに滅菌水を添加した時（血液（−）と記載）を比較した。
（１）ＲＮＡサンプル
ＲＮＡサンプルとして、Ｋ５６２由来Ｔｏｔａｌ ＲＮＡを使用した。Ｋ５６２由来Ｔｏｔａｌ ＲＮＡは、Ｋ５６２細胞を培養し、セパゾールＲＮＡを使用してＲＮＡ抽出を行い、取得した。Ｋ５６２由来Ｔｏｔａｌ ＲＮＡを２ｎｇ／μＬから２ｐｇ／μＬコピーまで、１／１０ずつ段階希釈し、鋳型として使用した。
（２）ＲＴ−ＰＣＲ反応
ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ（東洋紡） １ｕｎｉｔ、
ＲＮａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（東洋紡） １ｕｎｉｔ、
ｒＴｔｈ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡） １ｕｎｉｔ、
抗Ｔｔｈ抗体 ０．４μｇ、
１０×Ｂｕｆｆｅｒ（東洋紡 ｒＴｔｈ ＤＮＡ ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅのＢｕｆｆｅｒ）
１０ｍＭ ｄＮＴＰｓ（東洋紡） １．０μＬ、
５０μＭ ＢＣＲ−ＡＢＬフォアードプライマー（配列番号１） ０．３μＬ、
１００μＭ ＢＣＲ−ＡＢＬプローブ（配列番号２） ０．１μＬ、
５０μＭ ＢＣＲ−ＡＢＬリバースプライマー（配列番号３） ０．３μＬ、
ＲＮＡ ５μＬ、
血液 １０μＬ、
を含む反応液５０μＬを、以下の温度サイクルで反応した。
５０℃ １０分
９５℃ １分
９５℃ １５秒−６０℃ ４５秒 ４５サイクル

（３）結果
その結果を図１、図２、図３、図４に示す。図１及び図２は、５０μＬ反応系に１０μＬの血液を添加した時（血液（＋）と記載）のデータである。図１は、縦軸にＣｔ値、横軸にＲＮＡの対数値を取りグラフ化した図である。図２は、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを実施したときの増幅曲線を示した図である。図２Ａは、酢酸テトラメチルアンモニウム及びＬ−カルニチン及び１，３−プロパンジオールを含むバッファーで実施した結果であり、図２Ｂは、３種類の試薬を含まないバッファーで実施した結果である。
さらに、図３及び図４は、５０μＬ反応系に血液の代わりに１０μＬの滅菌水を添加した時（血液（＋）と記載）のデータである。図３は縦軸にＣｔ値、横軸にＲＮＡの対数値をとりグラフ化した図である。図４は、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを実施したときの増幅曲線を示した図である。図４Ａは、酢酸テトラメチルアンモニウム及びＬ−カルニチン及び１，３−プロパンジオールを含むバッファーで実施した結果であり、図４Ｂは、３種類の試薬を含まないバッファーで実施した結果である。驚くべきことに、血液添加時は、３種類の試薬を含まないバッファーで検出した場合は、検出できなかったのに対し、酢酸テトラメチルアンモニウム及びＬ−カルニチンを添加したバッファー、または、酢酸テトラメチルアンモニウム及びＬ−カルニチン及び１，３−プロパンジオールを含むバッファーで検出した場合は、血液中の核酸を検出できた。

実施例２
１００ｍＭ 酢酸テトラメチルアンモニウム及び０．３Ｍ Ｌ−カルニチン及び４％ １，３−プロパンジオールを含むバッファーを調製した。調製したバッファーで、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ及びＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼでリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを実施した。
（１）ＲＮＡサンプル
ＲＮＡサンプルとして、Ｋ５６２由来Ｔｏｔａｌ ＲＮＡを使用した。Ｋ５６２由来Ｔｏｔａｌ ＲＮＡは、Ｋ５６２細胞を培養し、セパゾールＲＮＡを使用してＲＮＡ抽出を行い、取得した。Ｋ５６２由来Ｔｏｔａｌ ＲＮＡを２ｎｇ／μＬから２ｐｇ／μＬコピーまで、１／１０ずつ段階希釈し、鋳型として使用した。
（２）ＲＴ−ＰＣＲ反応
ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ（東洋紡） １ｕｎｉｔ、
ＲＮａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（東洋紡） １ｕｎｉｔ、
ｒＴｔｈ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡） １ｕｎｉｔ、
抗Ｔｔｈ抗体 ０．４μｇ、
１０×Ｂｕｆｆｅｒ（東洋紡 ｒＴｔｈ ＤＮＡ ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅのＢｕｆｆｅｒ）
１０ｍＭ ｄＮＴＰｓ（東洋紡） １．０μＬ、
５０μＭ ＢＣＲ−ＡＢＬフォアードプライマー（配列番号１） ０．３μＬ、
１００μＭ ＢＣＲ−ＡＢＬプローブ（配列番号２） ０．１μＬ、
５０μＭ ＢＣＲ−ＡＢＬリバースプライマー（配列番号３） ０．３μＬ、
ＲＮＡ ５μＬ、
血液 １０μＬ、
を含む反応液５０μＬを、以下の温度サイクルで反応した。
５０℃ １０分
９５℃ １分
９５℃ １５秒−６０℃ ４５秒 ４５サイクル

（３）結果
その結果を図５、図６に示す。図５は、縦軸にＣｔ値、横軸にＲＮＡの対数値を取りグラフ化した図である。図６Ａは、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、図４Ｂは、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼでリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを実施した時の増幅曲線である。驚くべきことに、酢酸テトラメチルアンモニウム及びＬ−カルニチン及び１，３−プロパンジオールを含むバッファーはＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼとの組み合わせにより、血液中の核酸を検出できた。一方、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼとの組み合わせでは検出不可能であった。

実施例３
１００ｍＭ 酢酸テトラメチルアンモニウム及び０．３Ｍ Ｌ−カルニチン及び４％ １，３−プロパンジオールの代わりに４％ エチレングリコール、４％ １，２−プロパンジオール、４％ グリセロールを添加したバッファーをそれぞれ調製した。調製した各々のバッファーでリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを実施した。
（１）ＲＮＡサンプル
ＲＮＡサンプルとして、Ｋ５６２由来Ｔｏｔａｌ ＲＮＡを使用した。Ｋ５６２由来Ｔｏｔａｌ ＲＮＡは、Ｋ５６２細胞を培養し、セパゾールＲＮＡを使用してＲＮＡ抽出を行い、取得した。Ｋ５６２由来Ｔｏｔａｌ ＲＮＡを２ｎｇ／μＬから２ｐｇ／μＬコピーまで、１／１０ずつ段階希釈し、鋳型として使用した。
（２）ＲＴ−ＰＣＲ反応
ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ（東洋紡） １ｕｎｉｔ、
ＲＮａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（東洋紡） １ｕｎｉｔ、
ｒＴｔｈ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡） １ｕｎｉｔ、
抗Ｔｔｈ抗体 ０．４μｇ、
１０×Ｂｕｆｆｅｒ（東洋紡 ｒＴｔｈ ＤＮＡ ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅのＢｕｆｆｅｒ）
１０ｍＭ ｄＮＴＰｓ（東洋紡） １．０μＬ、
５０μＭ ＢＣＲ−ＡＢＬフォアードプライマー（配列番号１） ０．３μＬ、
１００μＭ ＢＣＲ−ＡＢＬプローブ（配列番号２） ０．１μＬ、
５０μＭ ＢＣＲ−ＡＢＬリバースプライマー（配列番号３） ０．３μＬ、
ＲＮＡ ５μＬ、
血液 １０μＬ、
を含む反応液５０μＬを、以下の温度サイクルで反応した。
５０℃ １０分
９５℃ １分
９５℃ １５秒−６０℃ ４５秒 ４５サイクル

（３）結果
その結果を図７、図８に示す。図７は縦軸にＣｔ値、横軸にＲＮＡの対数値を取りグラフ化した図である。図８のＡは１，３−プロパンジオール、Ｂはエチレングリコール、Ｃは１，２−プロパンジオール、ＤはグリセロールでリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを実施した時の増幅曲線である。驚くべきことに、エチレングリコール、１，２−プロパンジオール、グリセロールなどの様々なグリコール類を使用した場合も、１，３−プロパンジオールと同様に血液中の核酸を検出できた。

実施例４
１００ｍＭ 酢酸テトラメチルアンモニウム及び０．３Ｍ Ｌ−カルニチン及び４％ １，３−プロパンジオール、１００ｍＭ 酢酸テトラメチルアンモニウムの代わりに１００ｍＭ 塩化テトラメチルアンモニウムを添加したバッファーをそれぞれ調製した。調製した各々のバッファーでリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを実施した。
（１）ＲＮＡサンプル
ＲＮＡサンプルとして、Ｋ５６２由来Ｔｏｔａｌ ＲＮＡを使用した。Ｋ５６２由来Ｔｏｔａｌ ＲＮＡは、Ｋ５６２細胞を培養し、セパゾールＲＮＡを使用してＲＮＡ抽出を行い、取得した。Ｋ５６２由来Ｔｏｔａｌ ＲＮＡを２ｎｇ／μＬから２ｐｇ／μＬコピーまで、１／１０ずつ段階希釈し、鋳型として使用した。
（２）ＲＴ−ＰＣＲ反応
ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ（東洋紡） １ｕｎｉｔ、
ＲＮａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（東洋紡） １ｕｎｉｔ、
ｒＴｔｈ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡） １ｕｎｉｔ、
抗Ｔｔｈ抗体 ０．４μｇ、
１０×Ｂｕｆｆｅｒ（東洋紡 ｒＴｔｈ ＤＮＡ ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅのＢｕｆｆｅｒ）
１０ｍＭ ｄＮＴＰｓ（東洋紡） １．０μＬ、
５０μＭ ＢＣＲ−ＡＢＬフォアードプライマー（配列番号１） ０．３μＬ、
１００μＭ ＢＣＲ−ＡＢＬプローブ（配列番号２） ０．１μＬ、
５０μＭ ＢＣＲ−ＡＢＬリバースプライマー（配列番号３） ０．３μＬ、
ＲＮＡ ５μＬ、
血液 １０μＬ、
を含む反応液５０μＬを、以下の温度サイクルで反応した。
５０℃ １０分
９５℃ １分
９５℃ １５秒−６０℃ ４５秒 ４５サイクル

（３）結果
その結果を図９、図１０に示す。図９は、縦軸にＣｔ値、横軸にＲＮＡの対数値をとりグラフ化した図である。図１０Ａは、酢酸テトラメチルアンモニウム、Ｂは塩化テトラメチルアンモニウムでリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを実施した時の増幅曲線である。驚くべきことに、塩化テトラメチルアンモニウムを使用した場合も酢酸テトラメチルアンモニウムと同様に検出感度が向上した。

実施例５
１００ｍＭ 酢酸テトラメチルアンモニウム及び０．３Ｍ Ｌ−カルニチン及び４％ １，３−プロパンジオールを含むバッファーを調製した。５０μＬ反応系に１μＬ、２μＬ、３μＬ、５μＬ、１０μＬおよび１５μＬの血液を添加してリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを実施した。
（１）サンプル（培養細胞）
サンプルとして、ＲＮＡを使用せずに、Ｋ５６２細胞を使用した。培養したＫ５６２細胞の細胞数を計測し、回収、遠心分離した。その後、計測した細胞数より、２０００ｃｅｌｌｓ／μＬになるように、ＰＢＳ（−）に懸濁させた。これを１／１０ずつ段階希釈し、２００ｃｅｌｌｓ／μＬから０．２ｃｅｌｌｓ／μＬまで、１／１０ずつ段階希釈し、鋳型として使用した。
（２）ＲＴ−ＰＣＲ反応
ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ（東洋紡） １ｕｎｉｔ、
ＲＮａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（東洋紡） １ｕｎｉｔ、
ｒＴｔｈ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡） １ｕｎｉｔ、
抗Ｔｔｈ抗体 ０．４μｇ、
１０×Ｂｕｆｆｅｒ（東洋紡 ｒＴｔｈ ＤＮＡ ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅのＢｕｆｆｅｒ）
１０ｍＭ ｄＮＴＰｓ（東洋紡） １．０μＬ、
５０μＭ ＢＣＲ−ＡＢＬフォアードプライマー（配列番号１） ０．３μＬ、
１００μＭ ＢＣＲ−ＡＢＬプローブ（配列番号２） ０．１μＬ、
５０μＭ ＢＣＲ−ＡＢＬリバースプライマー（配列番号３） ０．３μＬ、
ＲＮＡ ５μＬ、
血液 １０μＬ、
を含む反応液５０μＬを、以下の温度サイクルで反応した。
５０℃ １０分
９５℃ １分
９５℃ １５秒−６０℃ ４５秒 ４５サイクル

（３）結果
その結果を図１１、図１２に示す。図１１は、縦軸にＣｔ値、横軸にＲＮＡの対数値を取りグラフ化した図である。図１２Ａは血液１μＬ添加時、図１２Ｂは血液２μＬ添加時、図１２Ｃは血液３μＬ添加時、図１２Ｄは血液５μＬ添加時、図１２Ｅは血液１０μＬ添加時、図１２Ｆは血液１５μＬ添加時の増幅曲線の図である。驚くべきことに、酢酸テトラメチルアンモニウム及びＬ−カルニチン及び１，３−プロパンジオールを含むバッファーは、血液中の細胞から直接ＲＮＡを検出することが可能であった。

実施例６
Ｔａｑ変異体の作製
Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来の改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子（配列番号７）を含有するプラスミド、ｐＴａｑ Ｅ５０７Ｋ、ｐＴａｑ Ｅ５０７Ｒ、ｐＴａｑ Ｅ７４２Ｋ、ｐＴａｑ Ｅ７４２Ｒを作製した。

変異導入に使用されるＤＮＡ鋳型は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにクローニングされたＴｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓ由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子（配列番号１４）（ｐＴａｑ）を用いた。変異導入にはＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（東洋紡）を用いて、方法は取扱い説明書に準じて行った。変異作製用プライマーとしては、ｐＴａｑ Ｅ５０７Ｋについては配列番号８および９に記載されるプライマーを、ｐＴａｑ Ｅ５０７Ｒについては配列番号１０および１１に記載されるプライマーを、ｐＴａｑ Ｅ７４２Ｋについては配列番号１２および１３に記載されるプライマーを、ｐＴａｑ Ｅ７４２Ｒについては配列番号１４および１５に記載されるプライマーを使用した。なお、変異体の確認は塩基配列の解読で行った。得られたプラスミドはエシェリシア・コリＪＭ１０９を形質転換し、酵素調製に用いた。

実施例７
Ｔｔｈ変異体の作製
Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来の改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子（配列番号２０）を含有するプラスミド、ｐＴｔｈ Ｑ５０９Ｋ、ｐＴｔｈ Ｑ５０９Ｒ、ｐＴｔｈ Ｅ７４４Ｋ、ｐＴｔｈ Ｅ７４４Ｒを作製した。

変異導入に使用されるＤＮＡ鋳型は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにクローニングされたＴｈｅｒｍｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子（配列番号２６）（ｐＴｔｈ）を用いた。変異導入にはＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（東洋紡）を用いて、方法は取扱い説明書に準じて行った。変異作製用プライマーとしては、ｐＴｔｈ Ｑ５０９Ｋについては配列番号２１および２２に記載されるプライマーを、ｐＴｔｈ Ｑ５０９Ｒについては配列番号２３および２４に記載されるプライマーを、ｐＴｔｈ Ｅ７４４Ｋについては配列番号２５および２６に記載されるプライマーを、ｐＴｔｈ Ｅ７４４Ｒについては配列番号２７および２８に記載されるプライマーを使用した。なお、変異体の確認は塩基配列の解読で行った。得られたプラスミドはエシェリシア・コリＪＭ１０９を形質転換し、酵素調製に用いた。

実施例８
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの作製
実施例６、７で得られた菌体の培養は、以下のようにして実施した。まず、滅菌処理した１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＴＢ培地（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ、ｐ．Ａ．２）８０ｍＬを、５００ｍＬ坂口フラスコに分注した。この培地に予め１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する３ｍｌのＬＢ培地（１％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム；ギブコ製）で３７℃、１６時間培養したエシェリシア・コリＪＭ１０９（プラスミド形質転換株）（試験管使用）を接種し、３７℃にて１６時間通気培養した。培養液より菌体を遠心分離により回収し、５０ｍｌの破砕緩衝液（３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、３０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）に懸濁後、ソニケーション処理により菌体を破砕し、細胞破砕液を得た。次に細胞破砕液を８０℃にて１５分間処理した後、遠心分離にて不溶性画分を除去した。更に、ポリエチレンイミンを用いた除核酸処理、硫安塩析、ヘパリンセファロースクロマトグラフィーを行い、最後に保存緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ 塩化カリウム、１ｍＭ ジチオスレイトール、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０、０．１％ノニデットＰ４０、５０％グリセリン）に置換し、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを得た。

上記精製工程のＤＮＡポリメラーゼ活性測定は以下の操作で行った。また、酵素活性が高い場合はサンプルを希釈して測定を行った。

（試薬）
Ａ液： ４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）、１６ｍＭ 塩化マグネシウム、１５ｍＭ ジチオスレイトール、１００μｇ／ｍｌ ＢＳＡ
Ｂ液： １．５μｇ／μｌ 活性化仔牛胸腺ＤＮＡ
Ｃ液： １．５ｍＭ ｄＮＴＰ（２５０ｃｐｍ／ｐｍｏｌ ［３Ｈ］ｄＴＴＰ）
Ｄ液： ２０％ トリクロロ酢酸（２ｍＭ ピロリン酸ナトリウム）
Ｅ液： １ｍｇ／ｍｌ 仔牛胸腺ＤＮＡ

（方法）
Ａ液２５μｌ、Ｂ液５μｌ、Ｃ液５μｌ及び滅菌水１０μｌをマイクロチューブに加えて攪拌混合後、上記精製酵素希釈液５μｌを加えて７５℃で１０分間反応する。その後冷却し、Ｅ液５０μｌ、Ｄ液１００μｌを加えて、攪拌後更に１０分間氷冷する。この液をガラスフィルター（ワットマン製ＧＦ／Ｃフィルター）で濾過し、０．１Ｎ塩酸及びエタノールで十分洗浄し、フィルターの放射活性を液体シンチレーションカウンター（パッカード製Ｔｒｉ−Ｃａｒｂ２８１０ ＴＲ）を用いて計測し、鋳型ＤＮＡへのヌクレオチドの取り込みを測定した。酵素活性の１単位はこの条件下で３０分当り１０ｎｍｏｌのヌクレオチドを酸不溶性画分に取り込む酵素量とした。

実施例９
ＤＮＡポリメラーゼのテトラメチルアンモニウム塩耐性評価
上記のテトラメチルアンモニウム塩耐性評価方法で、実施例７で得られた改変型Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、及び野生型Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡）、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡）、Ｚ０５ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）を評価した。

結果を図１１に示す。野生型Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼでは、５０ｍＭの酢酸テトラメチルアンモニウム添加で阻害が生じ増幅が見られなくなった。一方、改変型Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｚ０５ ＤＮＡポリメラーゼは２００ｍＭの酢酸テトラメチルアンモニウムを添加しても増幅の阻害は見られなかった。改変によって、テトラメチルアンモニウム塩に耐性ができることがわかる。また、ＴｔｈポリメラーゼやＺ０５ポリメラーゼはテトラメチルアンモニウム塩に耐性があることがわかる。図１５にＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼとＺ０５ ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列の同一性を示す。Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼとＺ０５ ＤＮＡポリメラーゼは９５％以上の同一性があり、この同一性の高さからも同様の性能が出たことが考えられる。

また、改変型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼでも同様のテトラアンモニウム塩耐性の評価を行った。結果、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼのＱ５０９Ｋ、Ｑ５０９Ｒ、Ｅ７４４Ｋ、Ｅ７４４Ｒ変異体でも野生型と同様、２００ｍＭの酢酸テトラメチルアンモニウムを添加しても増幅の阻害は見られなかった。

実施例１０
１２０ｍＭ（終濃度）酢酸テトラメチルアンモニウム、０．３Ｍ カルニチン、４％ トリメチレングリコールを含むバッファーで、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｚ０５ ＤＮＡポリメラーゼ、及び改変型Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑ Ｅ５０７Ｋ、Ｔａｑ Ｅ５０７Ｒ）で血液を鋳型にリアルタイムＰＣＲを実施した。
（１）鋳型
鋳型として、血液１μlを使用した。
（２）ＰＣＲ反応
酢酸テトラメチルアンモニウム、カルニチン、トリメチレングリコール以外の組成を下記に示す。
Ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡）または改変型Ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｔｔｈ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｚ０５ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ １ｕｎｉｔ、
抗ポリメラーゼ抗体 ０．４μｇ、
１０×Ｂｕｆｆｅｒ（東洋紡 ｒＴｔｈ ＤＮＡ ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅのＢｕｆｆｅｒ） ２μＬ、
１０ｍＭ ｄＮＴＰｓ（東洋紡） ０．４μＬ、
１０μＭ プライマー（配列番号１６） ０．６μＬ、
１０μＭ プローブ（配列番号１７） ０．６μＬ、
１０μＭ プライマー（配列番号１８） ０．４μＬ、
血液 １μＬ、
を含む反応液２０μＬを、以下の温度サイクルで反応した。
９５℃ １分
９５℃ １５秒−６０℃ ６０秒 ４０サイクル

（３）結果
その結果を図１２に示す。図１２はそれぞれの酵素で行った増幅曲線を示す。Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼでは増幅が見られないものの、改変型Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｅ５０７Ｋ、Ｅ７４２Ｋ）では立ち上がりが見られ、血液から直接、精製を経ることなく増幅できることが示された。改変型Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｅ５０７Ｒ、Ｅ７４２Ｒ）、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｚ０５ ＤＮＡポリメラーゼでも同様の結果が得られた。テトラメチルアンモニウム塩の効果でＰＣＲの効率が向上し、血液の阻害を受けることなくＰＣＲが成功したと考えられる。

同様の評価を、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼの代わりに野生型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、及び改変型Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｑ５０９Ｋ、Ｑ５０９Ｒ、Ｅ７４４Ｋ、Ｅ７４４Ｒ）でも実施した。結果、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼでは野生型、改変型共に立ち上がりが見られ、血液から直接、精製を経ることなく増幅できることが示された。テトラメチルアンモニウム塩に耐性があれば野生型だけでなく改変型ＤＮＡポリメラーゼでも、血液からの増幅が可能になる。今まで汎用的に使用していたＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼではテトラメチルアンモニウム塩の阻害効果の方が大きく、ＰＣＲを促進する効果を十分見ることができなかった。テトラメチルアンモニウム塩耐性のＤＮＡポリメラーゼを用いることで、テトラメチルアンモニウム塩のＰＣＲ促進効果を十分に発揮させ、通常は実施することができないと考えられていた血液からの直接ＰＣＲをも可能にできることがわかった。

本発明により、分子生物学の分野において有用な組成物、殊に鋳型核酸からＤＮＡの生成及び更なるＤＮＡ増幅を行う際に有用な組成物を提供する。本発明により、核酸増幅において反応阻害がなく、操作性の低下が顕著でなく、低コストで反応を実施でき、特に、核酸増幅反応用のプレミックス試薬への混合という用途において、より利便性の高い試薬形態を供給可能である。本発明は、遺伝子発現解析に際して特に有用であり、研究用途のみならず臨床診断や環境検査等にも利用できる。

Claims (26)

1. テトラメチルアンモニウム塩、Ｌ−カルニチン及びテトラメチルアンモニウム耐性ＤＮＡポリメラーゼを含む核酸増幅用組成物であって、前記テトラメチルアンモニウム耐性ＤＮＡポリメラーゼが、（ａ）Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、（ｂ）Ｚ０５ ＤＮＡポリメラーゼ、（ｃ）配列番号６の少なくともＥ５０７位またはＥ７４２位が改変されたＤＮＡポリメラーゼ、及び（ｄ）配列番号１９と９５％以上の同一性があるアミノ酸配列からなるＤＮＡポリメラーゼ、からなる群より選択される少なくとも１種であることを特徴とする核酸増幅用組成物。
2. 前記（ｄ）のＤＮＡポリメラーゼが、配列番号１９の少なくともＱ５０９位またはＥ７４４位が改変されたＤＮＡポリメラーゼである、請求項１に記載の核酸増幅用組成物。
3. 前記テトラメチルアンモニウム塩が、酢酸テトラメチルアンモニウム、塩化テトラメチルアンモニウム、水酸化テトラメチルアンモニウムからなる群より選ばれた少なくとも１種の化合物である請求項１又は２に記載の核酸増幅用組成物。
4. グリコール類を含むことを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の核酸増幅用組成物。
5. グリコール類の炭素数が４以下である請求項４に記載の核酸増幅用組成物。
6. グリコール類がエチレングリコール、１，２−プロパンジオールおよび１，３−プロパンジオールからなる群より選ばれた少なくとも１種の化合物である請求項４又は５に記載の核酸増幅用組成物。
7. 反応液中に生体試料を直接添加する請求項１〜６のいずれかに記載の核酸増幅用組成物。
8. 前記生体試料が、血液、血漿または血清等の血液由来試料、唾液、髄液、尿、乳からなる群より選ばれた少なくとも１種の試料である請求項７に記載の核酸増幅用組成物。
9. 前記生体試料中のウィルス、細菌、真菌、原虫及び細胞をターゲットとして検出する請求項７又は８に記載の核酸増幅用組成物。
10. 少なくとも抗ＤＮＡポリメラーゼ抗体、反応緩衝剤および金属イオンを含む請求項１〜９のいずれかに記載の核酸増幅用組成物。
11. 少なくとも逆転写酵素、抗ＤＮＡポリメラーゼ抗体、反応緩衝剤および金属イオンを含む請求項１〜１０のいずれかに記載の核酸増幅用組成物。
12. 核酸増幅反応がＰＣＲである請求項１〜１１のいずれかに記載の核酸増幅用組成物。
13. 核酸増幅反応がワンステップＲＴ−ＰＣＲである請求項１〜１２のいずれかに記載の核酸増幅用組成物。
14. テトラメチルアンモニウム塩、Ｌ−カルニチン及びテトラメチルアンモニウム耐性ＤＮＡポリメラーゼを含む反応液を用いることを特徴とする核酸増幅法であって、前記テトラメチルアンモニウム耐性ＤＮＡポリメラーゼが、（ａ）Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、（ｂ）Ｚ０５ ＤＮＡポリメラーゼ、（ｃ）配列番号６の少なくともＥ５０７位またはＥ７４２位が改変されたＤＮＡポリメラーゼ、及び（ｄ）配列番号１９と９５％以上の同一性があるアミノ酸配列からなるＤＮＡポリメラーゼ、からなる群より選択される少なくとも１種である、核酸増幅法。
15. 前記（ｄ）のＤＮＡポリメラーゼが、配列番号１９の少なくともＱ５０９位またはＥ７４４位が改変されたＤＮＡポリメラーゼである、請求項１４に記載の核酸増幅法。
16. 前記テトラメチルアンモニウム塩が、酢酸テトラメチルアンモニウム、塩化テトラメチルアンモニウム、水酸化テトラメチルアンモニウムからなる群より選ばれた少なくとも１種の化合物である請求項１４又は１５に記載の核酸増幅法。
17. グリコール類を含むことを特徴とする請求項１４〜１６のいずれかに記載の核酸増幅法。
18. グリコール類の炭素数が４以下である請求項１７に記載の核酸増幅法。
19. グリコール類が、エチレングリコール、１，２−プロパンジオールおよび１，３−プロパンジオールからなる群より選ばれた少なくとも１種の化合物である請求項１７又は１８に記載の核酸増幅法。
20. 反応液中に生体試料を直接添加する請求項１４〜１９のいずれかに記載の核酸増幅法。
21. 前記生体試料が、血液由来試料、唾液、髄液、尿、乳からなる群より選ばれた少なくとも１種の試料である請求項２０に記載の核酸増幅法。
22. 前記生体試料中のウィルス、細菌、真菌、原虫及び細胞をターゲットとして検出する請求項２０又は２１に記載の核酸増幅法。
23. 少なくとも抗ＤＮＡポリメラーゼ抗体、反応緩衝剤および金属イオンを含む請求項１４〜２２のいずれかに記載の核酸増幅法。
24. 少なくとも逆転写酵素、抗ＤＮＡポリメラーゼ抗体、反応緩衝剤および金属イオンを含む請求項１４〜２３のいずれかに記載の核酸増幅法。
25. 核酸増幅反応がＰＣＲである請求項１４〜２４のいずれかに記載の核酸増幅法。
26. 核酸増幅反応がワンステップＲＴ−ＰＣＲである請求項１４〜２５のいずれかに記載の核酸増幅法。

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