JP4193997B1 - 新規ｄｎａポリメラーゼ - Google Patents
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Abstract
【課題】 新規なＤＮＡポリメラーゼを提供すること。
【解決手段】 野生型Ｔａｑポリメラーゼのアミノ酸配列中の742位のグルタミン酸と743位のアラニンの電荷の総和を増加する変異が導入された改変Ｔａｑポリメラーゼ。それをコードするＤＮＡ、組換えベクター及び形質転換体も提供される。
【選択図】 図１１
【解決手段】 野生型Ｔａｑポリメラーゼのアミノ酸配列中の742位のグルタミン酸と743位のアラニンの電荷の総和を増加する変異が導入された改変Ｔａｑポリメラーゼ。それをコードするＤＮＡ、組換えベクター及び形質転換体も提供される。
【選択図】 図１１
Description
本発明は、新規ＤＮＡポリメラーゼに関する。
鋳型ＤＮＡの塩基配列に従って、それと相補的な塩基配列からなるＤＮＡ鎖を合成することができるＤＮＡポリメラーゼは、ＰＣＲ（ポリメラーゼ・チェイン・リアクション）、ＤＮＡの塩基配列決定、部位特異的変異導入法等をはじめとする遺伝子操作実験に必要不可欠の試薬として、日常的に利用されている。分子医学、分子生物学及び生化学の発展のために果たしてきたこの酵素の貢献度は、計り知れないものがある。
現在までに多くの種類のＤＮＡポリメラーゼが商品として市場に出回っているが、各酵素の理化学的性質、例えば、熱安定性、合成鎖伸長能、ミス合成の校正能、鋳型ＤＮＡの好み等は異なり、実験目的によって使い分けられている。
例えば、ＰＣＲには、熱安定性又は熱活性ＤＮＡポリメラーゼの利用が必要不可欠である。熱安定性又は熱活性ＤＮＡポリメラーゼは二本鎖ＤＮＡの変性の際に失活することがないので、酵素の追加等の手間を省くことができる。また、熱安定性又は熱活性ＤＮＡポリメラーゼを利用して高温でＤＮＡ鎖の伸長反応を行うことにより、プライマーの非特異的なアニーリング、一本鎖ＤＮＡの分子内高次構造（例えばヘアピンループ等）の形成等を防止することができ、目的の伸長反応を効率よく進行させることができる。
熱安定性又は熱活性ＤＮＡポリメラーゼとしては、例えば、サーマス・アクアティカス（Thermus aquaticus）由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ）（特許文献１、２及び３参照）、サーモトガ・マリティマ（Thermotoga maritima）由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｍａ ＤＮＡポリメラーゼ）（特許文献４及び５参照）等が知られている。
Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（以下、「Ｔａｑポリメラーゼ」ということもある。）を含むファミリーＡ型ＤＮＡポリメラーゼに高度に保存されているアミノ酸配列のうち、活性部位を含むアミノ酸配列をもとにプライマーを設計し、温泉土壌サンプルを鋳型としてＰＣＲ反応を行い、得られたＤＮＡポリメラーゼ遺伝子断片を野生型Ｔａｑポリメラーゼ遺伝子の相当する部分とプラスミド上で入れ換え、それを大腸菌に形質転換後、ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の発現を誘導したところ、Ｔａｑポリメラーゼより伸長活性の高いキメラＤＮＡポリメラーゼが得られた（特許文献６及び７）。
本発明は、新規ＤＮＡポリメラーゼを提供することを目的とする。
本発明者らは、Ｔａｑポリメラーゼのメタゲノム及び立体構造の情報をもとに、Ｔａｑポリメラーゼのアミノ酸配列中の742位のグルタミン酸と743位のアラニンの電荷の総和を増加するような変異を導入したところ、これらの部位特異的変異体のプライマー伸長活性、鋳型ＤＮＡにアニーリングしたプライマーに対する結合活性及びＰＣＲ性能の少なくとも１つがＴａｑポリメラーゼよりも高いことを見出し、本発明を完成させるに至った。
本発明の要旨は以下の通りである。
（１）配列番号２のアミノ酸配列からなるＴａｑポリメラーゼの742位のグルタミン酸と743位のアラニンの電荷の総和を増加する変異が導入された改変Ｔａｑポリメラーゼ。
（２）プライマー伸長活性が配列番号２のアミノ酸配列からなるＴａｑポリメラーゼよりも高い（１）記載の改変Ｔａｑポリメラーゼ。
（３）鋳型ＤＮＡにアニーリングしたプライマーに対する結合活性が配列番号２のアミノ酸配列からなるＴａｑポリメラーゼよりも高い（１）又は（２）記載の改変Ｔａｑポリメラーゼ。
（４）ＰＣＲ性能が配列番号２のアミノ酸配列からなるＴａｑポリメラーゼよりも高い（１）〜（３）のいずれかに記載の改変Ｔａｑポリメラーゼ。
（２）プライマー伸長活性が配列番号２のアミノ酸配列からなるＴａｑポリメラーゼよりも高い（１）記載の改変Ｔａｑポリメラーゼ。
（３）鋳型ＤＮＡにアニーリングしたプライマーに対する結合活性が配列番号２のアミノ酸配列からなるＴａｑポリメラーゼよりも高い（１）又は（２）記載の改変Ｔａｑポリメラーゼ。
（４）ＰＣＲ性能が配列番号２のアミノ酸配列からなるＴａｑポリメラーゼよりも高い（１）〜（３）のいずれかに記載の改変Ｔａｑポリメラーゼ。
（５）配列番号２のアミノ酸配列中の742位のグルタミン酸と743位のアラニンの少なくとも１つを電荷のないアミノ酸又は正電荷を持つアミノ酸に置換する変異が導入された（１）〜（４）のいずれかに記載の改変Ｔａｑポリメラーゼ。
（６）電荷のないアミノ酸がアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、トリプトファン、フェニルアラニン、プロリン、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン及びグルタミンからなる群より選択され、正電荷を持つアミノ酸がアルギニン、リシン及びヒスチジンからなる群より選択される（５）記載の改変Ｔａｑポリメラーゼ。
（６）電荷のないアミノ酸がアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、トリプトファン、フェニルアラニン、プロリン、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン及びグルタミンからなる群より選択され、正電荷を持つアミノ酸がアルギニン、リシン及びヒスチジンからなる群より選択される（５）記載の改変Ｔａｑポリメラーゼ。
（７）以下の(i)及び/又は(ii)の変異が導入された（６）記載の改変Ｔａｑポリメラーゼ。
(i)742位のグルタミン酸がアラニン、グルタミン、アルギニン又はリシンのいずれかに置換
(ii) 743位のアラニンがチロシン、アルギニン又はリシンのいずれかに置換
（８）以下の(a)〜(c)のいずれかのタンパク質である（１）〜（７）のいずれかに記載の改変Ｔａｑポリメラーゼ。
(i)742位のグルタミン酸がアラニン、グルタミン、アルギニン又はリシンのいずれかに置換
(ii) 743位のアラニンがチロシン、アルギニン又はリシンのいずれかに置換
（８）以下の(a)〜(c)のいずれかのタンパク質である（１）〜（７）のいずれかに記載の改変Ｔａｑポリメラーゼ。
(a)配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８又は２0のいずれかのアミノ酸配列からなるタンパク質
(b) 配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８又は２０のいずれかのアミノ酸配列において、742位と743位のアミノ酸以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつプライマー伸長活性、鋳型ＤＮＡにアニーリングしたプライマーに対する結合活性及びＰＣＲ性能の少なくとも１つが配列番号２のアミノ酸配列からなるＴａｑポリメラーゼよりも高いタンパク質
(c)配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７又は１９のいずれかのヌクレオチド配列からなるＤＮＡに相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるタンパク質であって、前記ヌクレオチド配列中の2224〜2226番目のヌクレオチドからなるコドンがコードするアミノ酸及び2227〜2229番目のヌクレオチドからなるコドンがコードするアミノ酸は保存されており、かつプライマー伸長活性、鋳型ＤＮＡにアニーリングしたプライマーに対する結合活性及びＰＣＲ性能の少なくとも１つが配列番号２のアミノ酸配列からなるＴａｑポリメラーゼよりも高いタンパク質
(b) 配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８又は２０のいずれかのアミノ酸配列において、742位と743位のアミノ酸以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつプライマー伸長活性、鋳型ＤＮＡにアニーリングしたプライマーに対する結合活性及びＰＣＲ性能の少なくとも１つが配列番号２のアミノ酸配列からなるＴａｑポリメラーゼよりも高いタンパク質
(c)配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７又は１９のいずれかのヌクレオチド配列からなるＤＮＡに相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるタンパク質であって、前記ヌクレオチド配列中の2224〜2226番目のヌクレオチドからなるコドンがコードするアミノ酸及び2227〜2229番目のヌクレオチドからなるコドンがコードするアミノ酸は保存されており、かつプライマー伸長活性、鋳型ＤＮＡにアニーリングしたプライマーに対する結合活性及びＰＣＲ性能の少なくとも１つが配列番号２のアミノ酸配列からなるＴａｑポリメラーゼよりも高いタンパク質
（９）さらに、配列番号２のアミノ酸配列からなるＴａｑポリメラーゼの667位のフェニルアラニンがチロシンに置換される変異が導入された（１）〜（８）のいずれかに記載の改変Ｔａｑポリメラーゼ。
（１０）（１）〜（９）のいずれかに記載の改変ＴａｑポリメラーゼのN末端から280位までのアミノ酸を除くアミノ酸配列からなる改変Ｔａｑポリメラーゼの断片。
（１１）（１）〜（９）のいずれかに記載の改変Ｔａｑポリメラーゼ又は（１０）記載の改変Ｔａｑポリメラーゼの断片をコードするＤＮＡ。
（１２）（１１）記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
（１０）（１）〜（９）のいずれかに記載の改変ＴａｑポリメラーゼのN末端から280位までのアミノ酸を除くアミノ酸配列からなる改変Ｔａｑポリメラーゼの断片。
（１１）（１）〜（９）のいずれかに記載の改変Ｔａｑポリメラーゼ又は（１０）記載の改変Ｔａｑポリメラーゼの断片をコードするＤＮＡ。
（１２）（１１）記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
（１３）（１２）記載の組換えベクターを含む形質転換体。
（１４）（１３）記載の形質転換体を培養することを含む（１）〜（９）のいずれかに記載の改変Ｔａｑポリメラーゼ又は請求項１０記載の改変Ｔａｑポリメラーゼの断片を製造する方法。
（１５）（１）〜（９）のいずれかに記載の改変Ｔａｑポリメラーゼ又は（１０）記載の改変Ｔａｑポリメラーゼの断片を用いて、ＤＮＡを増幅する方法。
（１４）（１３）記載の形質転換体を培養することを含む（１）〜（９）のいずれかに記載の改変Ｔａｑポリメラーゼ又は請求項１０記載の改変Ｔａｑポリメラーゼの断片を製造する方法。
（１５）（１）〜（９）のいずれかに記載の改変Ｔａｑポリメラーゼ又は（１０）記載の改変Ｔａｑポリメラーゼの断片を用いて、ＤＮＡを増幅する方法。
（１６）さらに、ファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼを用いる（１５）記載の方法。
（１７）（１）〜（９）のいずれかに記載の改変Ｔａｑポリメラーゼ又は（１０）記載の改変Ｔａｑポリメラーゼの断片を含むＤＮＡ増幅用キット。
（１８）さらに、ファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼを含む（１７）記載のキット。
（１７）（１）〜（９）のいずれかに記載の改変Ｔａｑポリメラーゼ又は（１０）記載の改変Ｔａｑポリメラーゼの断片を含むＤＮＡ増幅用キット。
（１８）さらに、ファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼを含む（１７）記載のキット。
本発明により、プライマー伸長活性、鋳型ＤＮＡにアニーリングしたプライマーに対する結合活性及びＰＣＲ性能の少なくとも１つがＴａｑポリメラーゼよりも高いＤＮＡポリメラーゼが提供される。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、配列番号２のアミノ酸配列からなるＴａｑポリメラーゼの742位のグルタミン酸と743位のアラニンの電荷の総和を増加する変異が導入された改変Ｔａｑポリメラーゼを提供する。
本明細書において、「Ｔａｑポリメラーゼ」とは、サーマス・アクアティカス（Thermus aquaticus）由来のＤＮＡポリメラーゼを意味する。「ＤＮＡポリメラーゼ」とは、デオキシリボヌクレオシド三リン酸を基質として、鋳型ＤＮＡと相補的なＤＮＡを合成する触媒作用を有するタンパク質を意味する。
本発明は、配列番号２のアミノ酸配列からなるＴａｑポリメラーゼの742位のグルタミン酸と743位のアラニンの電荷の総和を増加する変異が導入された改変Ｔａｑポリメラーゼを提供する。
本明細書において、「Ｔａｑポリメラーゼ」とは、サーマス・アクアティカス（Thermus aquaticus）由来のＤＮＡポリメラーゼを意味する。「ＤＮＡポリメラーゼ」とは、デオキシリボヌクレオシド三リン酸を基質として、鋳型ＤＮＡと相補的なＤＮＡを合成する触媒作用を有するタンパク質を意味する。
Ｔａｑポリメラーゼのアミノ酸配列を配列番号２に示す。また、ＴａｑポリメラーゼをコードするＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号１に示す。これらの配列情報は、ジーンバンクに登録されている（登録番号P19821）。Ｔａｑポリメラーゼは、配列番号２のアミノ酸配列の742位がグルタミン酸で、743位がアラニンである（Taq(742E743A)）。
本発明の改変Ｔａｑポリメラーゼは、以下の(1)〜(3)の少なくとも１つの特性を有するものであるとよい。
本発明の改変Ｔａｑポリメラーゼは、以下の(1)〜(3)の少なくとも１つの特性を有するものであるとよい。
(1)プライマー伸長活性が配列番号２のアミノ酸配列からなるＴａｑポリメラーゼよりも高い。
(2)鋳型ＤＮＡにアニーリングしたプライマーに対する結合活性が配列番号２のアミノ酸配列からなるＴａｑポリメラーゼよりも高い。
(3)ＰＣＲ性能が配列番号２のアミノ酸配列からなるＴａｑポリメラーゼよりも高い。
(2)鋳型ＤＮＡにアニーリングしたプライマーに対する結合活性が配列番号２のアミノ酸配列からなるＴａｑポリメラーゼよりも高い。
(3)ＰＣＲ性能が配列番号２のアミノ酸配列からなるＴａｑポリメラーゼよりも高い。
プライマー伸長活性は、後述の実施例３に記載の方法により測定することができる。
鋳型ＤＮＡにアニーリングしたプライマーに対する結合活性は、後述の実施例４に記載の方法により測定することができる。
鋳型ＤＮＡにアニーリングしたプライマーに対する結合活性は、後述の実施例４に記載の方法により測定することができる。
ＰＣＲ性能は、既知のDNAに対して、適当な位置にプライマーを設定することによって、増幅すべきDNA鎖長を決め、PCR反応条件を設定して評価することができる。例えば、伸長性に優れた酵素であれば、各サイクル中での伸長反応時間設定を短くして行き、より短い時間でも目的の増幅バンドが検出できることで差別化できる。また同じ時間でより長鎖のDNAを増幅できること、また同じ条件で反応させても、増幅されるバンドの強度で増幅効率を比較することもできる。このようにPCRに要する時間、増幅されるDNAの長さ、増幅効率などの要素を含む概念であり、後述の実施例５〜１１に記載の方法により測定することができる。
本発明の改変Ｔａｑポリメラーゼは、例えば、配列番号２のアミノ酸配列中の742位のグルタミン酸と743位のアラニンの少なくとも１つを電荷のないアミノ酸又は正電荷を持つアミノ酸に置換する変異を導入されたものである。電荷のないアミノ酸としては、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、トリプトファン、フェニルアラニン、プロリン、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミンなどを例示することができる。正電荷を持つアミノ酸としては、アルギニン、リシン、ヒスチジンなどを例示することができる。本発明の改変Ｔａｑポリメラーゼの例として、以下の(i)及び/又は(ii)の変異が導入されたものを挙げることができる。
(i) 配列番号２のアミノ酸配列中の742位のグルタミン酸がアラニン、グルタミン、アルギニン又はリシンのいずれかに置換
(ii) 配列番号２のアミノ酸配列中の743位のアラニンがチロシン、アルギニン又はリシンのいずれかに置換
より具体的な例として、以下の(a)〜(c)のいずれかのタンパク質が本発明の改変Ｔａｑポリメラーゼに含まれる。
(ii) 配列番号２のアミノ酸配列中の743位のアラニンがチロシン、アルギニン又はリシンのいずれかに置換
より具体的な例として、以下の(a)〜(c)のいずれかのタンパク質が本発明の改変Ｔａｑポリメラーゼに含まれる。
(a)配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８又は２0のいずれかのアミノ酸配列からなるタンパク質
(b)配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８又は２０のいずれかのアミノ酸配列において、742位と743位のアミノ酸以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつプライマー伸長活性、鋳型ＤＮＡにアニーリングしたプライマーに対する結合活性及びＰＣＲ性能の少なくとも１つが配列番号２のアミノ酸配列からなるＴａｑポリメラーゼよりも高いタンパク質
(c)配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７又は１９のいずれかのヌクレオチド配列からなるＤＮＡに相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるタンパク質であって、前記ヌクレオチド配列中の2224〜2226番目のヌクレオチドからなるコドンがコードするアミノ酸及び2227〜2229番目のヌクレオチドからなるコドンがコードするアミノ酸は保存されており、かつプライマー伸長活性、鋳型ＤＮＡにアニーリングしたプライマーに対する結合活性及びＰＣＲ性能の少なくとも１つが配列番号２のアミノ酸配列からなるＴａｑポリメラーゼよりも高いタンパク質
(b)配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８又は２０のいずれかのアミノ酸配列において、742位と743位のアミノ酸以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつプライマー伸長活性、鋳型ＤＮＡにアニーリングしたプライマーに対する結合活性及びＰＣＲ性能の少なくとも１つが配列番号２のアミノ酸配列からなるＴａｑポリメラーゼよりも高いタンパク質
(c)配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７又は１９のいずれかのヌクレオチド配列からなるＤＮＡに相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるタンパク質であって、前記ヌクレオチド配列中の2224〜2226番目のヌクレオチドからなるコドンがコードするアミノ酸及び2227〜2229番目のヌクレオチドからなるコドンがコードするアミノ酸は保存されており、かつプライマー伸長活性、鋳型ＤＮＡにアニーリングしたプライマーに対する結合活性及びＰＣＲ性能の少なくとも１つが配列番号２のアミノ酸配列からなるＴａｑポリメラーゼよりも高いタンパク質
(a)の配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質は、配列番号２のアミノ酸の742位のグルタミン酸がアルギニンに、743位のアラニンがアルギニンに置換された改変Ｔａｑポリメラーゼ(742R743R又はTaqRR)である。配列番号６のアミノ酸配列からなるタンパク質は、配列番号２のアミノ酸の743位のアラニンがアルギニンに置換された改変Ｔａｑポリメラーゼ(742E743R又はTaqER)である。配列番号８のアミノ酸配列からなるタンパク質は、配列番号２のアミノ酸の742位のグルタミン酸がアラニンに、743位のアラニンがアルギニンに置換された改変Ｔａｑポリメラーゼ(742A743R又はTaqAR)である。配列番号１０のアミノ酸配列からなるタンパク質は、配列番号２のアミノ酸の742位のグルタミン酸がアラニンに置換された改変Ｔａｑポリメラーゼ(742A743A又はTaqAA)である。配列番号１２のアミノ酸配列からなるタンパク質は、配列番号２のアミノ酸の742位のグルタミン酸がアルギニンに置換された改変Ｔａｑポリメラーゼ(742R743A又はTaqRA)である。配列番号１４のアミノ酸配列からなるタンパク質は、配列番号２のアミノ酸の742位のグルタミン酸がアルギニンに、743位のアラニンがリシンに置換された改変Ｔａｑポリメラーゼ(742R743K又はTaqRK)である。配列番号１６のアミノ酸配列からなるタンパク質は、配列番号２のアミノ酸の742位のグルタミン酸がリシンに、743位のアラニンがアルギニンに置換された改変Ｔａｑポリメラーゼ(742K743R又はTaqKR)である。配列番号１８のアミノ酸配列からなるタンパク質は、配列番号２のアミノ酸の742位のグルタミン酸がリシンに、743位のアラニンがリシンに置換された改変Ｔａｑポリメラーゼ(742K743K又はTaqKK)である。配列番号２０のアミノ酸配列からなるタンパク質は、配列番号２のアミノ酸の742位のグルタミン酸がグルタミンに、743位のアラニンがチロシンに置換された改変Ｔａｑポリメラーゼ(742Q743Y又はTaqQY)である。
(b)のタンパク質は、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８又は２０のいずれかのアミノ酸配列において、742位と743位のアミノ酸以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる。欠失、置換又は付加されるアミノ酸の総数及び位置は特に限定されるものではない。欠失、置換又は付加されるアミノ酸の総数は１又は複数個、好ましくは１又は数個であり、その具体的な範囲は、欠失に関しては通常１〜１０個、好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜２個であり、置換に関しては通常１〜１０個、好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜２個であり、付加に関しては通常１〜１０個、好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜２個である。
プライマー伸長活性、鋳型ＤＮＡにアニーリングしたプライマーに対する結合活性及びＰＣＲ性能については前述の通りである。
プライマー伸長活性、鋳型ＤＮＡにアニーリングしたプライマーに対する結合活性及びＰＣＲ性能については前述の通りである。
(c)のタンパク質は、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７又は１９のいずれかのヌクレオチド配列からなるＤＮＡに相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるタンパク質であって、前記ヌクレオチド配列中の2224〜2226番目のヌクレオチドからなるコドンがコードするアミノ酸及び2227〜2229番目のヌクレオチドからなるコドンがコードするアミノ酸は保存されており、かつプライマー伸長活性、鋳型ＤＮＡにアニーリングしたプライマーに対する結合活性及びＰＣＲ性能の少なくとも１つが配列番号２のアミノ酸配列からなるＴａｑポリメラーゼよりも高い。「ストリンジェントな条件」としては、例えば、４２℃、２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳの条件、好ましくは６５℃、０．１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳの条件が挙げられる。
配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７又は１９のいずれかのヌクレオチド配列からなるＤＮＡに相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとしては、それぞれ、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７又は１９のいずれかのヌクレオチド配列からなるＤＮＡと少なくとも８８％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡが挙げられる。
プライマー伸長活性、鋳型ＤＮＡにアニーリングしたプライマーに対する結合活性及びＰＣＲ性能については前述の通りである。
プライマー伸長活性、鋳型ＤＮＡにアニーリングしたプライマーに対する結合活性及びＰＣＲ性能については前述の通りである。
本発明の改変Ｔａｑポリメラーゼは、さらに、配列番号２のアミノ酸配列からなるＴａｑポリメラーゼの667位のフェニルアラニンがチロシンに置換される変異が導入されたものであってもよい。配列番号２のアミノ酸配列中の667位のフェニルアラニンをチロシンに置換することにより、ジデオキシヌクレオチドを取り込む能力を高めることができる。
また、本発明は、上記の改変ＴａｑポリメラーゼのN末端から280位までのアミノ酸を除くアミノ酸配列からなる改変Ｔａｑポリメラーゼの断片も提供する。配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８及び２０のアミノ酸配列において、N末端から280位のアミノ酸までのアミノ酸配列は、5’-3’エキソヌクレアーゼ活性を有する領域である。しかし、Ｔａｑポリメラーゼにおける5’-3’エキソヌクレアーゼ活性を有する領域は、N末端から280位のアミノ酸までのアミノ酸配列に限定されるわけではなく、ＴａｑポリメラーゼのN末端から280位の前後10個までのアミノ酸を除くアミノ酸配列からなる改変Ｔａｑポリメラーゼの断片も本発明に包含される。この断片をファミリーＢ型ポリメラーゼと組合わせて用いることにより、より高い正確性と生産性でＤＮＡを増幅することができる。5’-3’エキソヌクレアーゼ活性を欠失させるとプライマーの5’末端が削られた増幅産物が得られることを防ぐ事ができ、PCRによって、きっちりプライマーの末端から末端までのDNA断片をえることができる。
本発明の改変Ｔａｑポリメラーゼは、糖鎖が付加されたタンパク質又は糖鎖が付加されていないタンパク質のいずれであってもよい。タンパク質に付加される糖鎖の種類、位置等は、タンパク質の製造の際に使用される宿主細胞の種類によって異なるが、糖鎖が付加されたタンパク質には、いずれの宿主細胞を用いて得られるタンパク質も含まれる。また、本発明の改変Ｔａｑポリメラーゼは、それらの塩であってもよい。
本発明は、上記の改変Ｔａｑポリメラーゼ又はその断片をコードするＤＮＡも提供する。
本発明は、上記の改変Ｔａｑポリメラーゼ又はその断片をコードするＤＮＡも提供する。
本発明の改変ＴａｑポリメラーゼをコードするＤＮＡは、ＴａｑポリメラーゼをコードするＤＮＡ（配列番号２）に、部位特異的変異誘発法等の公知の方法を用いて人為的に変異を導入することにより得ることができる。変異の導入は、例えば、変異導入用キット、例えば、Mutant-K（TAKARA社製）、Mutant-G（TAKARA社製）、TAKARA社のLA PCR in vitro Mutagenesis シリーズキットを用いて行うことができる。
ＴａｑポリメラーゼをコードするＤＮＡは、例えば、サーマス・アクアティカス（Thermus aquaticus）から抽出したｍＲＮＡを用いてｃＤＮＡライブラリーを作製し、配列番号１のヌクレオチド配列に基づいて合成したプローブを用いて、ｃＤＮＡライブラリーから目的のＤＮＡを含むクローンをスクリーニングすることにより得ることができる。
本発明の改変ＴａｑポリメラーゼをコードするＤＮＡは、オープンリーディングフレームとその３'末端に位置する終止コドンとを含む。また、本発明の改変ＴａｑポリメラーゼをコードするＤＮＡは、オープンリーディングフレームの５'末端及び／又は３'末端に非翻訳領域（ＵＴＲ）を含むことができる。
本発明の改変ＴａｑポリメラーゼをコードするＤＮＡは、オープンリーディングフレームとその３'末端に位置する終止コドンとを含む。また、本発明の改変ＴａｑポリメラーゼをコードするＤＮＡは、オープンリーディングフレームの５'末端及び／又は３'末端に非翻訳領域（ＵＴＲ）を含むことができる。
本発明の改変ＴａｑポリメラーゼをコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７又は１９のヌクレオチド配列からなるＤＮＡを含むＤＮＡが挙げられる。ここで、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７又は１９記載のヌクレオチド配列のうち、オープンリーディングフレームは１〜２４９６番目、翻訳開始コドンは１〜３番目、終止コドンは２４９７〜２４９９番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列に位置する。本発明の改変ＴａｑポリメラーゼをコードするＤＮＡのヌクレオチド配列は、本発明の改変Ｔａｑポリメラーゼをコードする限り特に限定されるものではなく、オープンリーディングフレームのヌクレオチド配列は、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７又は１９のヌクレオチド配列のうち、１〜２４９６番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列に限定されるものではない。
本発明の改変ＴａｑポリメラーゼをコードするＤＮＡとしては、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７又は１９のいずれかのヌクレオチド配列からなるＤＮＡに相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、前記ヌクレオチド配列中の2224〜2226番目のヌクレオチドからなるコドンがコードするアミノ酸及び2227〜2229番目のヌクレオチドからなるコドンがコードするアミノ酸は保存されているＤＮＡが挙げられる。「ストリンジェントな条件」としては、例えば、４２℃、２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳの条件、好ましくは６５℃、０．１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳの条件が挙げられる。
配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７又は１９のいずれかのヌクレオチド配列からなるＤＮＡに相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとしては、それぞれ、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７又は１９のいずれかのヌクレオチド配列からなるＤＮＡと少なくとも８８％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡが挙げられる。
本発明の改変Ｔａｑポリメラーゼ及びその断片は、例えば、以下の組換えベクター及び形質転換体を作製する工程、形質転換体を培養する工程、並びにタンパク質を精製する工程に従って、それぞれをコードするＤＮＡを宿主細胞中で発現させることにより製造することができる。
本発明の改変Ｔａｑポリメラーゼ及びその断片は、例えば、以下の組換えベクター及び形質転換体を作製する工程、形質転換体を培養する工程、並びにタンパク質を精製する工程に従って、それぞれをコードするＤＮＡを宿主細胞中で発現させることにより製造することができる。
〔組換えベクター及び形質転換体の作製〕
組換えベクターを作製する際には、まず、目的とするタンパク質のコード領域を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製する。目的とするタンパク質のコード領域のヌクレオチド配列において、宿主細胞における発現に最適なコドンとなるように、ヌクレオチドを置換してもよい。
組換えベクターを作製する際には、まず、目的とするタンパク質のコード領域を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製する。目的とするタンパク質のコード領域のヌクレオチド配列において、宿主細胞における発現に最適なコドンとなるように、ヌクレオチドを置換してもよい。
次いで、上記ＤＮＡ断片を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入して組換えベクターを作製する。上記ＤＮＡ断片は、その機能が発揮されるようにベクターに組み込まれることが必要であり、ベクターは、プロモーターの他、エンハンサー等のシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー（例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子）、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）等を含有することができる。
目的とするタンパク質を生産し得る形質転換体は、組換えベクターを適当な宿主細胞に導入することにより得ることができる。
発現ベクターとしては、宿主細胞において自立複製が可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、ウイルスベクター等を使用することができる。プラスミドベクターとしては、例えば、大腸菌由来のプラスミド（例えば、pRSET、pBR322、pBR325、pUC118、pUC119、pUC18、pUC19）、枯草菌由来のプラスミド（例えば、pUB110、pTP5）、酵母由来のプラスミド（例えば、YEp13、YEp24、YCp50）を使用することができ、ファージベクターとしては、例えば、λファージ（例えば、Charon4A、Charon21A、EMBL3、EMBL4、λgt10、λgt11、λZAP）等を使用することができ、ウイルスベクターとしては、例えば、レトロウイルス、ワクシニアウイルス等の動物ウイルス、バキュロウイルス等の昆虫ウイルスを使用することができる。
宿主細胞としては、目的とするタンパク質をコードするＤＮＡを発現し得る限り、原核細胞、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等のいずれを使用してもよい。また、動物個体、植物個体、カイコ虫体等を使用してもよい。
細菌を宿主細胞とする場合、例えば、エッシェリヒア・コリ（Escherichia coli）等のエシェリヒア属、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）等のバチルス属、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）等のシュードモナス属、リゾビウム・メリロティ（Rhizobium meliloti）等のリゾビウム属に属する細菌を宿主細胞として使用することができる。具体的には、Escherichia coli BL21、Escherichia coli XL1-Blue、Escherichia coli XL2-Blue、Escherichia coli DH1、Escherichia coli K12、Escherichia coli JM109、Escherichia coli HB101等の大腸菌、Bacillus subtilis MI 114、Bacillus subtilis 207-21等の枯草菌を宿主細胞として使用することができる。この場合のプロモーターは、大腸菌等の細菌中で発現できるものであれば特に限定されず、例えば、trpプロモーター、lacプロモーター、ＰLプロモーター、ＰRプロモーター等の大腸菌やファージ等に由来するプロモーターを使用することができる。また、tacプロモーター、lacT7プロモーター、let Iプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーターも使用することができる。
細菌への組換えベクターの導入方法としては、細菌にＤＮＡを導入し得る方法であれば特に限定されず、例えば、カルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法等を使用することができる。
酵母を宿主細胞とする場合、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomycescerevisiae）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）等を宿主細胞として使用することができる。この場合のプロモーターは、酵母中で発現できるものであれば特に限定されず、例えば、gal1プロモーター、gal10プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、MFα1プロモーター、PHO5プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーター、AOX1プロモーター等を使用することができる。
酵母への組換えベクターの導入方法は、酵母にＤＮＡを導入し得る方法であれば特に限定されず、例えば、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等を使用することができる。
動物細胞を宿主細胞とする場合、サル細胞COS-7、Vero、チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO細胞）、マウスL細胞、ラットGH3、ヒトFL細胞等を宿主細胞として使用することができる。この場合のプロモーターは、動物細胞中で発現できるものであれば特に限定されず、例えば、SRαプロモーター、SV40プロモーター、LTR(Long Terminal Repeat)プロモーター、CMVプロモーター、ヒトサイトメガロウイルスの初期遺伝子プロモーター等を使用することができる。
動物細胞を宿主細胞とする場合、サル細胞COS-7、Vero、チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO細胞）、マウスL細胞、ラットGH3、ヒトFL細胞等を宿主細胞として使用することができる。この場合のプロモーターは、動物細胞中で発現できるものであれば特に限定されず、例えば、SRαプロモーター、SV40プロモーター、LTR(Long Terminal Repeat)プロモーター、CMVプロモーター、ヒトサイトメガロウイルスの初期遺伝子プロモーター等を使用することができる。
動物細胞への組換えベクターの導入方法は、動物細胞にＤＮＡを導入し得る方法であれば特に限定されず、例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等を使用することができる。
昆虫細胞を宿主とする場合には、Spodoptera frugiperdaの卵巣細胞、Trichoplusia niの卵巣細胞、カイコ卵巣由来の培養細胞等を宿主細胞として使用することができる。Spodoptera frugiperdaの卵巣細胞としてはSf9、Sf21等、Trichoplusia niの卵巣細胞としてはHigh 5、BTI-TN-5B1-4（インビトロジェン社製）等、カイコ卵巣由来の培養細胞としてはBombyx mori N4等を使用することができる。
昆虫細胞を宿主とする場合には、Spodoptera frugiperdaの卵巣細胞、Trichoplusia niの卵巣細胞、カイコ卵巣由来の培養細胞等を宿主細胞として使用することができる。Spodoptera frugiperdaの卵巣細胞としてはSf9、Sf21等、Trichoplusia niの卵巣細胞としてはHigh 5、BTI-TN-5B1-4（インビトロジェン社製）等、カイコ卵巣由来の培養細胞としてはBombyx mori N4等を使用することができる。
昆虫細胞への組換えベクターの導入方法は、昆虫細胞にＤＮＡを導入し得る限り特に限定されず、例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法等を使用することができる。
〔形質転換体の培養〕
目的とするタンパク質をコードするＤＮＡを組み込んだ組換えベクターを導入した形質転換体を培養する。形質転換体の培養は、宿主細胞の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
大腸菌、酵母等の微生物を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する培地としては、該微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地及び合成培地のいずれを使用してもよい。
目的とするタンパク質をコードするＤＮＡを組み込んだ組換えベクターを導入した形質転換体を培養する。形質転換体の培養は、宿主細胞の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
大腸菌、酵母等の微生物を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する培地としては、該微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地及び合成培地のいずれを使用してもよい。
炭素源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類を使用することができる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸又は有機酸のアンモニウム塩、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物等を使用することができる。無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を使用することができる。
大腸菌、酵母等の微生物を宿主細胞として得られた形質転換体の培養は、例えば、振盪培養又は通気攪拌培養等の好気的条件下で行うことができる。培養温度は通常２５〜３７℃、培養時間は通常１２〜４８時間であり、培養期間中はｐＨを通常６〜８に保持する。ｐＨの調整は、無機酸、有機酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行うことができる。培養の際、必要に応じてアンピシリン、テトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、lacプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、trpプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
動物細胞を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているRPMI1640培地、EagleのMEM培地、DMEM培地、Ham F12培地、Ham F12K培地又はこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等を使用することができる。形質転換体の培養は、通常、５％ＣＯ２存在下、３７℃で３〜１０日間行う。培養の際、必要に応じてカナマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
動物細胞を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているRPMI1640培地、EagleのMEM培地、DMEM培地、Ham F12培地、Ham F12K培地又はこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等を使用することができる。形質転換体の培養は、通常、５％ＣＯ２存在下、３７℃で３〜１０日間行う。培養の際、必要に応じてカナマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
昆虫細胞を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているTNM-FH培地（ファーミンジェン社製）、Sf-900 II SFM培地（Gibco BRL社製）、ExCell400、ExCell405（JRHバイオサイエンシーズ社製）等を使用することができる。形質転換体の培養は、通常、２７℃で３〜１０日間行う。培養の際、必要に応じてゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
目的とするタンパク質は、分泌タンパク質又は融合タンパク質として発現させてもよい。融合させるタンパク質としては、例えば、β−ガラクトシダーゼ、プロテインＡ、プロテインＡのＩｇＧ結合領域、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ、ポリ（Ａｒｇ）、ポリ（Ｇｌｕ）、プロテインＧ、マルトース結合タンパク質、グルタチオンＳ-トランスフェラーゼ、ポリヒスチジン鎖（His-tag）、Ｓペプチド、ＤＮＡ結合タンパク質ドメイン、Ｔａｃ抗原、チオレドキシン、グリーン・フルオレッセント・プロテイン等を使用することができる。
〔タンパク質の単離・精製〕
形質転換体の培養物より目的とするタンパク質を採取することにより、目的とするタンパク質が得られる。ここで、「培養物」には、培養上清、培養細胞、培養菌体、細胞又は菌体の破砕物のいずれもが含まれる。
目的とするタンパク質が形質転換体の細胞内に蓄積される場合には、培養物を遠心分離することにより、培養物中の細胞を集め、該細胞を洗浄した後に細胞を破砕して、目的とするタンパク質を抽出する。目的とするタンパク質が形質転換体の細胞外に分泌される場合には、培養上清をそのまま使用するか、遠心分離等により培養上清から細胞又は菌体を除去する。
形質転換体の培養物より目的とするタンパク質を採取することにより、目的とするタンパク質が得られる。ここで、「培養物」には、培養上清、培養細胞、培養菌体、細胞又は菌体の破砕物のいずれもが含まれる。
目的とするタンパク質が形質転換体の細胞内に蓄積される場合には、培養物を遠心分離することにより、培養物中の細胞を集め、該細胞を洗浄した後に細胞を破砕して、目的とするタンパク質を抽出する。目的とするタンパク質が形質転換体の細胞外に分泌される場合には、培養上清をそのまま使用するか、遠心分離等により培養上清から細胞又は菌体を除去する。
得られたタンパク質は、溶媒抽出法、硫安等による塩析法脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、イオン交換クロマトグラフィー法、疎水性クロマトグラフィー法、ゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法等により精製することができる。
本発明の改変Ｔａｑポリメラーゼ及びその断片は、そのアミノ酸配列に基づいて、Fmoc法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、tBoc法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によって製造することもできる。この際、市販のペプチド合成機を使用することができる。
本発明の改変Ｔａｑポリメラーゼ及びその断片は、そのアミノ酸配列に基づいて、Fmoc法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、tBoc法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によって製造することもできる。この際、市販のペプチド合成機を使用することができる。
本発明の改変Ｔａｑポリメラーゼ及びその断片は、ＤＮＡ増幅（特に、ＰＣＲ）を行う際に有用であり、ＤＮＡ増幅（特に、ＰＣＲ）用キットの構成要素として使用することができる。ＤＮＡ増幅（特に、ＰＣＲ）用キットは、本発明の改変Ｔａｑポリメラーゼ又はその断片以外に、ＤＮＡ増幅（特に、ＰＣＲ）を行うために必要な試薬（例えば、４種類のdNTPs、Mg2+、バッファー、添加剤など）、容器、装置等を含むことができる。本発明のＤＮＡ増幅方法及びキットは、ＤＮＡ配列決定、遺伝子診断、親子鑑定や犯罪捜査における個体識別、品種判定、体質調査のためのSNP(一塩基多型)解析、遺跡調査など幅広い用途に適している。
一般に、Ｔａｑポリメラーゼは、ＤＮＡ増幅反応中に誤ったヌクレオチドの取り込みを検出・修復する能力に欠けるため、誤って取り込まれたヌクレオチドを取り除くことができず、ＤＮＡ増幅のエラーの確率が高くなる。さらに、増幅中に誤って取り込まれたヌクレオチドがＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応を妨げ、短い増幅産物しか得られない場合もある。ＤＮＡ増幅の高い正確性が要求される増幅産物のクローニングやシークエンスなどには、プルーフリーディング活性を持つ耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを使用するとよい。プルーフリーディング活性を持つＤＮＡポリメラーゼは3’-5’エキソヌクレアーゼ活性を有するので、誤って取り込まれたヌクレオチドを取り除くことができる。ファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼは、プルーフリーディング（3’-5’エキソヌクレアーゼ）活性を有するので、本発明の改変Ｔａｑポリメラーゼ又はその断片と組合わせてＤＮＡ増幅に用いることにより、ＤＮＡ増幅の正確性を高めることができる。ファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼとしては、Pfu DNAポリメラーゼ（Pyrococcus furiosus由来）、KOD DNAポリメラーゼ（Thermococcus kodakaraensis 由来）、Vent DNAポリメラーゼ（Thermococcus litoralis由来）などを例示することができるが、これらに限定されることはない。本発明のＤＮＡ増幅方法及びキットには、ファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼを含めてもよい。
以下に、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらに何ら影響されることはない。
〔実施例１〕変異Ｔａｑポリメラーゼの作製
Taqポリメラーゼ変異体（TaqRR, TaqER, TaqAR, TaqAA, TaqRA, TaqRK, TaqKR, TaqKK, TaqQY）の作成は、pTV118N(タカラバイオ社製)のLacプロモーターの下流のNco I制限酵素サイトにTaqポリメラーゼの遺伝子が挿入されたpTV-Taqプラスミドおよび下記のプライマーを用いて、ストラタジーン社のQuick Change site-directed mutagenesis kitのプロトコールにしたがって部位特異的変異を行った。変異プラスミドを用いて大腸菌JM109株を形質転換し、生じたコロニーから変異プラスミドを調製し、塩基配列を調べることにより変異が導入されていることを確認した。
Taqポリメラーゼ変異体（TaqRR, TaqER, TaqAR, TaqAA, TaqRA, TaqRK, TaqKR, TaqKK, TaqQY）の作成は、pTV118N(タカラバイオ社製)のLacプロモーターの下流のNco I制限酵素サイトにTaqポリメラーゼの遺伝子が挿入されたpTV-Taqプラスミドおよび下記のプライマーを用いて、ストラタジーン社のQuick Change site-directed mutagenesis kitのプロトコールにしたがって部位特異的変異を行った。変異プラスミドを用いて大腸菌JM109株を形質転換し、生じたコロニーから変異プラスミドを調製し、塩基配列を調べることにより変異が導入されていることを確認した。
それぞれの変異プラスミドを用いて大腸菌JM109株を形質転換した。生じたコロニーをLB-アンピシリン液体培地で600 nmにおける吸光度が0.2から0.4になるまで培養し、IPGTを1 mMになるように添加し、25℃で16時間ポリメラーゼを産生させた。菌体を50 mM Tris-HCl, pH 7.8, 1 mM PMSF, 1 mM DTT, 1 mM EDTAに懸濁し、超音波処理を行った。遠心分離後、上清を75℃で1時間熱処理を行った。遠心分離後、上清に1 MになるようにNaClを加え、さらに、0.15％になるように5%ポリエチレンイミン溶液pH8.0を加え、0℃で1時間処理し、DNAを沈殿させた。遠心分離後、上清に100%飽和となるように固形硫安を加え、生じた沈殿を粗Taqポリメラーゼとした。
粗Taqポリメラーゼを50 mM Tris-HCl, pH 7.8, 0.5 M NaCl溶液に透析した。沈殿を遠心分離により除去した後、上清を0.1 M K-phosphate, pH 7.8, 1 M硫安で平衡化したHiTrap Phenylカラムにアプライした。0.1 M K-phosphate, pH 7.8でカラムを洗浄した後、変異Taq ポリメラーゼをミリQ水で溶出した。この溶液を、50 mM Tris-HCl, pH 7.8で平衡化したHiTrap Heparinカラムにアプライした。変位Taqポリメラーゼの溶出はNaCl濃度を0から2 M NaClの直線的溶出で行った。変位Taqポリメラーゼの同定は、SDS-PAGEおよびヌクレオチド取り込みによるDNAポリメラーゼ活性測定により行った。
〔実施例２〕デオキシヌクレオチドの取り込み活性測定による変異Ｔａｑポリメラーゼの評価
デオキシヌクレオチド取り込みによるポリメラーゼの活性測定は20 mM Tris-HCl, pH 8.8, 5 mM MgCl2, 14 mM 2-メルカプトエタノール, 0.2 mg/ml 活性化DNA, [3H]TTPを含む0.2 mM dNTPの反応系に変異Taqポリメラーゼを加え、74℃で反応をおこなった。反応液をDE81濾紙にスポットし、乾燥後、未反応の[3H]TTPを5%リン酸二ナトリウム溶液で洗浄した。DE81濾紙を乾燥した後、取り込まれた[3H]TTPを液体シンチレーションカウンターで測定した。ユニットの定義は、74℃で30分間に10 nmolのdNTPを取り込む量を1ユニットとした。
デオキシヌクレオチド取り込みによるポリメラーゼの活性測定は20 mM Tris-HCl, pH 8.8, 5 mM MgCl2, 14 mM 2-メルカプトエタノール, 0.2 mg/ml 活性化DNA, [3H]TTPを含む0.2 mM dNTPの反応系に変異Taqポリメラーゼを加え、74℃で反応をおこなった。反応液をDE81濾紙にスポットし、乾燥後、未反応の[3H]TTPを5%リン酸二ナトリウム溶液で洗浄した。DE81濾紙を乾燥した後、取り込まれた[3H]TTPを液体シンチレーションカウンターで測定した。ユニットの定義は、74℃で30分間に10 nmolのdNTPを取り込む量を1ユニットとした。
その結果、表に示したように、Taqポリメラーゼが5.1 x 105 U/mg、TaqRRが1.3 x 105 U/mg、TaqERが1.4 x 105 U/mg、TaqARが1.1 x 105 U/mg、TaqAAが2.8 x 105 U/mg、TaqRAが2.3 x 105 U/mg、TaqRKが1.5 x 105 U/mg、TaqKRが1.1 x 105 U/mg、TaqKKが1.4 x 105 U/mg、TaqQYが4.7 x 105 U/mgであった。
また、精製した変異TaqポリメラーゼをSDS-PAGEに供した後、CBB（クマシーブリリアントブルー）染色した結果を図1に示す。
〔実施例３〕プライマー伸長活性測定による変異Ｔａｑポリメラーゼの評価
配列番号３９の環状鋳型DNA(aacatccaataaatcatacaggcaaggcaaagaattagcaaaattaagcaataaagcctcagagcataaagctaaatcggttgtaccaaaaacattatgaccctgtaatacttttgcgggagaagcctttatttcaacgcaaggataaaaatttttagaaccctcatatattttaaatgcaatgcctgagtaatgtgtaggtaaagattcaaaagggtgagaaaggccggagacagtcaaatcaccatcaatatgatattcaaccgttctagctgataaattaatgccggagagggtagctatttttgagagatctacaaaggctatcaggtcattgcctgagagtctggagcaaacaagagaatcgatgaacggtaatcgtaaaactagcatgtcaatcatatgtaccccggttgataatcagaaaagccccaaaaacaggaagattgtataagcaaatatttaaattgtaaacgttaatattttgttaaaattcgcgttaaatttttgttaaatcagctcattttttaaccaataggaacgccatcaaaaataattcgcgtctggccttcctgtagccagctttcatcaacattaaatgtgagcgagtaacaacccgtcggattctccgtgggaacaaacggcggattgaccgtaatgggataggttacgttggtgtagatgggcgcatcgtaaccgtgcatctgccagtttgaggggacgacgaccgtatcggcctcaggaagatcgcactccagccagctttccggcaccgcttctggtgccggaaaccaggcaaagcgccattcgccattcaggctgcgcaactgttgggaagggcgatcggtgcgggcctcttcgctattacgccagctggcgaaagggggatgtgctgcaaggcgattaagttgggtaacgccagggttttcccagtcacgacgttgtaaaacgacggccagtgccaagcttgcatgcctgcaggtcgactctagaggatccccgggtaccgagctcgaattcgtaatcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacacaacatacgagccggaagcataaagtgtaaagcctggggtgcctaatgagtgagctaactcacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgccagggtggtttttcttttcaccagcgagacgggcaacagctgattgcccttcaccgcctggccctgagagagttgcagcaagcggtccacgctggtttgccccagcaggcgaaaatcctgtttgatggtggttccgaaatcggcaaaatcccttataaatcaaaagaatagcccgagatagggttgagtgttgttccagtttggaacaagagtccactattaaagaacgtggactccaacgtcaaagggcgaaaaaccgtctatcagggcgatggcccactacgtgaaccatcacccaaatcaagttttttggggtcgaggtgccgtaaagcactaaatcggaaccctaaagggagcccccgatttagagcttgacggggaaagccggcgaacgtggcgagaaaggaagggaagaaagcgaaaggagcgggcgctagggcgctggcaagtgtagcggtcacgctgcgcgtaaccaccacacccgccgcgcttaatgcgccgctacagggcgcgtactatggttgctttgacgagcacgtataacgtgctttcctcgttggaatcagagcgggagctaaacaggaggccgattaaagggattttagacaggaacggtacgccagaatcttgagaagtgtttttataatcagtgaggccaccgagtaaaagagtctgtccatcacgcaaattaaccgttgtagcaatacttctttgattagtaataacatcacttgcctgagtagaagaactcaaactatcggccttgctggtaatatccagaacaatattaccgccagccattgcaacaggaaaaacgctcatggaaatacctacattttgacgctcaatcgtctgaaatggattatttacattggcagattcaccagtcacacgaccagtaataaaagggacattctggccaacagagatagaacccttctgacctgaaagcgtaagaatacgtggcacagacaatatttttgaatggctattagtctttaatgcgcgaactgatagccctaaaacatcgccattaaaaataccgaacgaaccaccagcagaagataaaacagaggtgaggcggtcagtattaacaccgcctgcaacagtgccacgctgagagccagcagcaaatgaaaaatctaaagcatcaccttgctgaacctcaaatatcaaaccctcaatcaatatctggtcagttggcaaatcaacagtagaaaggaattgaggaaggttatctaaaatatctttaggtgcactaacaactaatagattagagccgtcaatagataatacatttgaggatttagaagtattagactttacaaacaattcgacaactcgtattaaatcctttgcccgaacgttattaattttaaaagtttgagtaacattatcattttgcggaacaaagaaaccaccagaaggagcggaattatcatcatattcctgattatcagatgatggcaattcatcaatataatcctgattgtttggattatacttctgaattatggaaggaattgaaccaaccatatcaaaattattagcacgtaaaacagaaataaagaaattgcgtagattttcaggtttaacgtcagatgaatatacagtaacagtaccttttacatcgggagaaacaataacggattcgcctgattgctttgaataccaagttacaaaatcgcgcagaggcgaattattcatttcaattacctgagcaaaagaagatgatgaaacaaacatcaagaaaacaaaattaattacatttaacaatttcatttgaattaccttttttaatggaaacagtacataaatcaatatatgtgagtgaataaccttgcttctgtaaatcgtcgctattaattaattttcccttagaatccttgaaaacatagcgatagcttagattaagacgctgagaagagtcaatagtgaatttatcaaaatcataggtctgagagactacctttttaacctccggcttaggttgggttatataactatatgtaaatgctgatgcaaatccaatcgcaagacaaagaacgcgagaaaactttttcaaatatattttagttaatttcatcttctgacctaaatttaatggtttgaaataccgaccgtgtgataaataaggcgttaaataagaataaacaccggaatcataattactagaaaaagcctgtttagtatcatatgcgttatacaaattcttaccagtataaagccaacgctcaacagtagggcttaattgagaatcgccatatttaacaacgccaacatgtaatttaggcagaggcattttcgagccagtaataagagaatataaagtaccgacaaaaggtaaagtaattctgtccagacgacgacaataaacaacatgttcagctaatgcagaacgcgcctgtttatcaacaatagataagtcctgaacaagaaaaataatatcccatcctaatttacgagcatgtagaaaccaatcaataatcggctgtctttccttatcattccaagaacgggtattaaaccaagtaccgcactcatcgagaacaagcaagccgtttttattttcatcgtaggaatcattaccgcgcccaatagcaagcaaatcagatatagaaggcttatccggtattctaagaacgcgaggcgttttagcgaacctcccgacttgcgggaggttttgaagccttaaatcaagattagttgctattttgcacccagctacaattttatcctgaatcttaccaacgctaacgagcgtctttccagagcctaatttgccagttacaaaataaacagccatattatttatcccaatccaaataagaaacgattttttgtttaacgtcaaaaatgaaaatagcagcctttacagagagaataacataaaaacagggaagcgcattagacgggagaattaactgaacaccctgaacaaagtcagagggtaattgagcgctaatatcagagagataacccacaagaattgagttaagcccaataataagagcaagaaacaatgaaatagcaatagctatcttaccgaagccctttttaagaaaagtaagcagatagccgaacaaagttaccagaaggaaaccgaggaaacgcaataataacggaatacccaaaagaactggcatgattaagactccttattacgcagtatgttagcaaacgtagaaaatacatacataaaggtggcaacatataaaagaaacgcaaagacaccacggaataagtttattttgtcacaatcaatagaaaattcatatggtttaccagcgctaaagacaaaagggcgacattcaaccgattgagggagggaaggtaaatattgacggaaattattcattaaaggtgaattatcaccgtcaccgacttgagccatttgggaattagagccagcaaaatcaccagtagcaccattaccattagcaaggccggaaacgtcaccaatgaaaccatcgatagcagcaccgtaatcagtagcgacagaatcaagtttgcctttagcgtcagactgtagcgcgttttcatcggcattttcggtcatagcccccttattagcgtttgccatcttttcataatcaaaatcaccggaaccagagccaccaccggaaccgcctccctcagagccgccaccctcagaaccgccaccctcagagccaccaccctcagagccgccaccagaaccaccaccagagccgccgccagcattgacaggaggttgaggcaggtcagacgattggccttgatattcacaaacgaatggatcttcattaaagccagaatggaaagcgcagtctctgaatttaccgttccagtaagcgtcatacatggcttttgatgatacaggagtgtactggtaataagttttaacggggtcagtgccttgagtaacagtgcccgtataaacagttaatgccccctgcctatttcggaacctattattctgaaacatgaaagtattaagaggctgagactcctcaagagaaggattaggattagcggggttttgctcagtaccaggcggataagtgccgtcgagagggttgatataagtatagcccggaataggtgtatcaccgtactcaggaggtttagtaccgccaccctcagaaccgccaccctcagaaccgccaccctcagagccaccaccctcattttcagggatagcaagcccaataggaacccatgtaccgtaacactgagtttcgtcaccagtacaaactacaacgcctgtagcattccacagacaaccctcatagttagcgtaacgatctaaagttttgtcgtctttccagacgttagtaaatgaattttctgtatggggttttgctaaacaactttcaacagtttcagcggagtgagaatagaaaggaacaactaaaggaattgcgaataataattttttcacgttgaaaatctccaaaaaaaaaggctccaaaaggagcctttaattgtatcggtttatcagcttgctttcgaggtgaatttcttaaacagcttgataccgatagttgcgccgacaatgacaacaaccatcgcccacgcataaccgatatattcggtcgctgaggcttgcagggagttaaaggccgcttttgcgggatcgtcaccctcagcagcgaaagacagcatcggaacgagggtagcaacggctacagaggctttgaggactaaagactttttcatgaggaagtttccattaaacgggtaaaatacgtaatgccactacgaaggcaccaacctaaaacgaaagaggcgaaagaatacactaaaacactcatctttgacccccagcgattataccaagcgcgaaacaaagtacaacggagatttgtatcatcgcctgataaattgtgtcgaaatccgcgacctgctccatgttacttagccggaacgaggcgcagacggtcaatcataagggaaccgaactgaccaactttgaaagaggacagatgaacggtgtacagaccaggcgcataggctggctgaccttcatcaagagtaatcttgacaagaaccggatattcattacccaaatcaacgtaacaaagctgctcattcagtgaataaggcttgccctgacgagaacaccagaacgagtagtaaattgggcttgagatggtttaatttcaactttaatcattgtgaattaccttatgcgattttaagaactggctcattataccagtcaggacgttgggaagaaaaatctacgttaataaaacgaactaacggaacaacattattacaggtagaaagattcatcagttgagatttaggaataccacattcaactaatgcagatacataacgccaaaaggaattacgaggcatagtaagagcaacactatcataaccctcgtttaccagacgacgataaaaaccaaaatagcgagaggcttttgcaaaagaagttttgccagagggggtaatagtaaaatgtttagactggatagcgtccaatactgcggaatcgtcataaatattcattgaatccccctcaaatgctttaaacagttcagaaaacgagaatgaccataaatcaaaaatcaggtctttaccctgactattatagtcagaagcaaagcggattgcatcaaaaagattaagaggaagcccgaaagacttcaaatatcgcgttttaattcgagcttcaaagcgaaccagaccggaagcaaactccaacaggtcaggattagagagtacctttaattgctccttttgataagaggtcatttttgcggatggcttagagcttaattgctgaatctggtgctgtagctcaacatgttttaaatatgcaactaaagtacggtgtctggaagtttcattccatgtaacagttgattcccaattctgcgaacgagtagatttagtttgaccattagatacatttcgcaaatggtcaataacctgtttagctatattttcatttggggcgcgagctgaaaaggtggcatcaattctactaatagtagtagcatt)に配列番号４０(tcgtaatcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaattc)の5'末端を放射標識化したプライマーをアニールさせたプライムドDNA(0.05 pmol)を含む20 mM Tris-HCl, pH 8.8, 5 mM MgCl2, 14 mM 2-メルカプトエタノール反応溶液に変異Taqポリメラーゼを加え、74℃で5分間反応した。合成されたDNAを50 mM NaOH, 1 mM EDTAを含む1％アガロースゲルで泳動させ、ゲルを乾燥した後、オートラジオグラフィーにより検出した。
配列番号３９の環状鋳型DNA(aacatccaataaatcatacaggcaaggcaaagaattagcaaaattaagcaataaagcctcagagcataaagctaaatcggttgtaccaaaaacattatgaccctgtaatacttttgcgggagaagcctttatttcaacgcaaggataaaaatttttagaaccctcatatattttaaatgcaatgcctgagtaatgtgtaggtaaagattcaaaagggtgagaaaggccggagacagtcaaatcaccatcaatatgatattcaaccgttctagctgataaattaatgccggagagggtagctatttttgagagatctacaaaggctatcaggtcattgcctgagagtctggagcaaacaagagaatcgatgaacggtaatcgtaaaactagcatgtcaatcatatgtaccccggttgataatcagaaaagccccaaaaacaggaagattgtataagcaaatatttaaattgtaaacgttaatattttgttaaaattcgcgttaaatttttgttaaatcagctcattttttaaccaataggaacgccatcaaaaataattcgcgtctggccttcctgtagccagctttcatcaacattaaatgtgagcgagtaacaacccgtcggattctccgtgggaacaaacggcggattgaccgtaatgggataggttacgttggtgtagatgggcgcatcgtaaccgtgcatctgccagtttgaggggacgacgaccgtatcggcctcaggaagatcgcactccagccagctttccggcaccgcttctggtgccggaaaccaggcaaagcgccattcgccattcaggctgcgcaactgttgggaagggcgatcggtgcgggcctcttcgctattacgccagctggcgaaagggggatgtgctgcaaggcgattaagttgggtaacgccagggttttcccagtcacgacgttgtaaaacgacggccagtgccaagcttgcatgcctgcaggtcgactctagaggatccccgggtaccgagctcgaattcgtaatcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacacaacatacgagccggaagcataaagtgtaaagcctggggtgcctaatgagtgagctaactcacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgccagggtggtttttcttttcaccagcgagacgggcaacagctgattgcccttcaccgcctggccctgagagagttgcagcaagcggtccacgctggtttgccccagcaggcgaaaatcctgtttgatggtggttccgaaatcggcaaaatcccttataaatcaaaagaatagcccgagatagggttgagtgttgttccagtttggaacaagagtccactattaaagaacgtggactccaacgtcaaagggcgaaaaaccgtctatcagggcgatggcccactacgtgaaccatcacccaaatcaagttttttggggtcgaggtgccgtaaagcactaaatcggaaccctaaagggagcccccgatttagagcttgacggggaaagccggcgaacgtggcgagaaaggaagggaagaaagcgaaaggagcgggcgctagggcgctggcaagtgtagcggtcacgctgcgcgtaaccaccacacccgccgcgcttaatgcgccgctacagggcgcgtactatggttgctttgacgagcacgtataacgtgctttcctcgttggaatcagagcgggagctaaacaggaggccgattaaagggattttagacaggaacggtacgccagaatcttgagaagtgtttttataatcagtgaggccaccgagtaaaagagtctgtccatcacgcaaattaaccgttgtagcaatacttctttgattagtaataacatcacttgcctgagtagaagaactcaaactatcggccttgctggtaatatccagaacaatattaccgccagccattgcaacaggaaaaacgctcatggaaatacctacattttgacgctcaatcgtctgaaatggattatttacattggcagattcaccagtcacacgaccagtaataaaagggacattctggccaacagagatagaacccttctgacctgaaagcgtaagaatacgtggcacagacaatatttttgaatggctattagtctttaatgcgcgaactgatagccctaaaacatcgccattaaaaataccgaacgaaccaccagcagaagataaaacagaggtgaggcggtcagtattaacaccgcctgcaacagtgccacgctgagagccagcagcaaatgaaaaatctaaagcatcaccttgctgaacctcaaatatcaaaccctcaatcaatatctggtcagttggcaaatcaacagtagaaaggaattgaggaaggttatctaaaatatctttaggtgcactaacaactaatagattagagccgtcaatagataatacatttgaggatttagaagtattagactttacaaacaattcgacaactcgtattaaatcctttgcccgaacgttattaattttaaaagtttgagtaacattatcattttgcggaacaaagaaaccaccagaaggagcggaattatcatcatattcctgattatcagatgatggcaattcatcaatataatcctgattgtttggattatacttctgaattatggaaggaattgaaccaaccatatcaaaattattagcacgtaaaacagaaataaagaaattgcgtagattttcaggtttaacgtcagatgaatatacagtaacagtaccttttacatcgggagaaacaataacggattcgcctgattgctttgaataccaagttacaaaatcgcgcagaggcgaattattcatttcaattacctgagcaaaagaagatgatgaaacaaacatcaagaaaacaaaattaattacatttaacaatttcatttgaattaccttttttaatggaaacagtacataaatcaatatatgtgagtgaataaccttgcttctgtaaatcgtcgctattaattaattttcccttagaatccttgaaaacatagcgatagcttagattaagacgctgagaagagtcaatagtgaatttatcaaaatcataggtctgagagactacctttttaacctccggcttaggttgggttatataactatatgtaaatgctgatgcaaatccaatcgcaagacaaagaacgcgagaaaactttttcaaatatattttagttaatttcatcttctgacctaaatttaatggtttgaaataccgaccgtgtgataaataaggcgttaaataagaataaacaccggaatcataattactagaaaaagcctgtttagtatcatatgcgttatacaaattcttaccagtataaagccaacgctcaacagtagggcttaattgagaatcgccatatttaacaacgccaacatgtaatttaggcagaggcattttcgagccagtaataagagaatataaagtaccgacaaaaggtaaagtaattctgtccagacgacgacaataaacaacatgttcagctaatgcagaacgcgcctgtttatcaacaatagataagtcctgaacaagaaaaataatatcccatcctaatttacgagcatgtagaaaccaatcaataatcggctgtctttccttatcattccaagaacgggtattaaaccaagtaccgcactcatcgagaacaagcaagccgtttttattttcatcgtaggaatcattaccgcgcccaatagcaagcaaatcagatatagaaggcttatccggtattctaagaacgcgaggcgttttagcgaacctcccgacttgcgggaggttttgaagccttaaatcaagattagttgctattttgcacccagctacaattttatcctgaatcttaccaacgctaacgagcgtctttccagagcctaatttgccagttacaaaataaacagccatattatttatcccaatccaaataagaaacgattttttgtttaacgtcaaaaatgaaaatagcagcctttacagagagaataacataaaaacagggaagcgcattagacgggagaattaactgaacaccctgaacaaagtcagagggtaattgagcgctaatatcagagagataacccacaagaattgagttaagcccaataataagagcaagaaacaatgaaatagcaatagctatcttaccgaagccctttttaagaaaagtaagcagatagccgaacaaagttaccagaaggaaaccgaggaaacgcaataataacggaatacccaaaagaactggcatgattaagactccttattacgcagtatgttagcaaacgtagaaaatacatacataaaggtggcaacatataaaagaaacgcaaagacaccacggaataagtttattttgtcacaatcaatagaaaattcatatggtttaccagcgctaaagacaaaagggcgacattcaaccgattgagggagggaaggtaaatattgacggaaattattcattaaaggtgaattatcaccgtcaccgacttgagccatttgggaattagagccagcaaaatcaccagtagcaccattaccattagcaaggccggaaacgtcaccaatgaaaccatcgatagcagcaccgtaatcagtagcgacagaatcaagtttgcctttagcgtcagactgtagcgcgttttcatcggcattttcggtcatagcccccttattagcgtttgccatcttttcataatcaaaatcaccggaaccagagccaccaccggaaccgcctccctcagagccgccaccctcagaaccgccaccctcagagccaccaccctcagagccgccaccagaaccaccaccagagccgccgccagcattgacaggaggttgaggcaggtcagacgattggccttgatattcacaaacgaatggatcttcattaaagccagaatggaaagcgcagtctctgaatttaccgttccagtaagcgtcatacatggcttttgatgatacaggagtgtactggtaataagttttaacggggtcagtgccttgagtaacagtgcccgtataaacagttaatgccccctgcctatttcggaacctattattctgaaacatgaaagtattaagaggctgagactcctcaagagaaggattaggattagcggggttttgctcagtaccaggcggataagtgccgtcgagagggttgatataagtatagcccggaataggtgtatcaccgtactcaggaggtttagtaccgccaccctcagaaccgccaccctcagaaccgccaccctcagagccaccaccctcattttcagggatagcaagcccaataggaacccatgtaccgtaacactgagtttcgtcaccagtacaaactacaacgcctgtagcattccacagacaaccctcatagttagcgtaacgatctaaagttttgtcgtctttccagacgttagtaaatgaattttctgtatggggttttgctaaacaactttcaacagtttcagcggagtgagaatagaaaggaacaactaaaggaattgcgaataataattttttcacgttgaaaatctccaaaaaaaaaggctccaaaaggagcctttaattgtatcggtttatcagcttgctttcgaggtgaatttcttaaacagcttgataccgatagttgcgccgacaatgacaacaaccatcgcccacgcataaccgatatattcggtcgctgaggcttgcagggagttaaaggccgcttttgcgggatcgtcaccctcagcagcgaaagacagcatcggaacgagggtagcaacggctacagaggctttgaggactaaagactttttcatgaggaagtttccattaaacgggtaaaatacgtaatgccactacgaaggcaccaacctaaaacgaaagaggcgaaagaatacactaaaacactcatctttgacccccagcgattataccaagcgcgaaacaaagtacaacggagatttgtatcatcgcctgataaattgtgtcgaaatccgcgacctgctccatgttacttagccggaacgaggcgcagacggtcaatcataagggaaccgaactgaccaactttgaaagaggacagatgaacggtgtacagaccaggcgcataggctggctgaccttcatcaagagtaatcttgacaagaaccggatattcattacccaaatcaacgtaacaaagctgctcattcagtgaataaggcttgccctgacgagaacaccagaacgagtagtaaattgggcttgagatggtttaatttcaactttaatcattgtgaattaccttatgcgattttaagaactggctcattataccagtcaggacgttgggaagaaaaatctacgttaataaaacgaactaacggaacaacattattacaggtagaaagattcatcagttgagatttaggaataccacattcaactaatgcagatacataacgccaaaaggaattacgaggcatagtaagagcaacactatcataaccctcgtttaccagacgacgataaaaaccaaaatagcgagaggcttttgcaaaagaagttttgccagagggggtaatagtaaaatgtttagactggatagcgtccaatactgcggaatcgtcataaatattcattgaatccccctcaaatgctttaaacagttcagaaaacgagaatgaccataaatcaaaaatcaggtctttaccctgactattatagtcagaagcaaagcggattgcatcaaaaagattaagaggaagcccgaaagacttcaaatatcgcgttttaattcgagcttcaaagcgaaccagaccggaagcaaactccaacaggtcaggattagagagtacctttaattgctccttttgataagaggtcatttttgcggatggcttagagcttaattgctgaatctggtgctgtagctcaacatgttttaaatatgcaactaaagtacggtgtctggaagtttcattccatgtaacagttgattcccaattctgcgaacgagtagatttagtttgaccattagatacatttcgcaaatggtcaataacctgtttagctatattttcatttggggcgcgagctgaaaaggtggcatcaattctactaatagtagtagcatt)に配列番号４０(tcgtaatcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaattc)の5'末端を放射標識化したプライマーをアニールさせたプライムドDNA(0.05 pmol)を含む20 mM Tris-HCl, pH 8.8, 5 mM MgCl2, 14 mM 2-メルカプトエタノール反応溶液に変異Taqポリメラーゼを加え、74℃で5分間反応した。合成されたDNAを50 mM NaOH, 1 mM EDTAを含む1％アガロースゲルで泳動させ、ゲルを乾燥した後、オートラジオグラフィーにより検出した。
その結果、図2および表に示したように、742番目と743番目のアミノ酸の荷電が-1のTaqは、ユニット当たり５分間で0.7 kb伸長するのに対し、荷電が0であるTaqER(742E743R), TaqAA(742A743A), TaqQY(742Q743Y)は2〜3.5 kb伸長した。荷電が+1のTaqAR(742A743R), TaqRA(742R743A)は、3.7〜4.3 kb伸長した。荷電が+2であるTaqRR(742R743R), TaqRK(742R743K), TaqKR(742K743R), TaqKK(742K743K)は20 kb以上伸長した。この結果から、プラスの荷電が多いほど伸長性は増加することがわかった。
〔実施例４〕ゲルシフト法による変異ＴａｑポリメラーゼとＤＮＡとの結合の評価
配列番号４１の鋳型DNA(TCGATGGTACGGACGTGCTTAATTCGTTAAGCATTAGTACCAGTATCGA)に配列番号４２(AGCTATGACCATGATTACGAATTGCTT)の5'末端を放射標識化したプライマーをアニールさせたプライムドDNA(0.02 pmol)を含む20 mM Tris-HCl, pH 8.8, 10 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 14 mM 2-メルカプトエタノール, 100 μg/ml BSA, 5% glycerolを含む反応溶液に変異Taqポリメラーゼを加え、37℃で5分間反応させた。これを0.1xTAE (40 mM Tris-acetate, 1 mM EDTA, pH 8.0)を含む1％アガロースゲルで分離し、オートラジオグラフィーにより検出した。
配列番号４１の鋳型DNA(TCGATGGTACGGACGTGCTTAATTCGTTAAGCATTAGTACCAGTATCGA)に配列番号４２(AGCTATGACCATGATTACGAATTGCTT)の5'末端を放射標識化したプライマーをアニールさせたプライムドDNA(0.02 pmol)を含む20 mM Tris-HCl, pH 8.8, 10 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 14 mM 2-メルカプトエタノール, 100 μg/ml BSA, 5% glycerolを含む反応溶液に変異Taqポリメラーゼを加え、37℃で5分間反応させた。これを0.1xTAE (40 mM Tris-acetate, 1 mM EDTA, pH 8.0)を含む1％アガロースゲルで分離し、オートラジオグラフィーにより検出した。
結果を図3及び4に示す。全ての変異Taqポリメラーゼで鋳型DNAとの結合が見られた。この図からDNAとの解離定数(Kd)値を求めた結果、野生型Taqが400 nMであったのに対し、変異型TaqのKd値は10 nMであった。また、742番目と743番目の荷電の総和が2である変異型Taq(TaqRR(742R743R), TaqRK(742R743K), TaqKR(742K743R), TaqKK(742K743K))は、さらに移動度の遅い位置にバンドが得られた。
変異Ｔａｑポリメラーゼの性質を下記の表にまとめる。
〔実施例５〕変異Ｔａｑポリメラーゼを用いたＰＣＲ反応（１）
鋳型のラムダDNAはタカラバイオ社製を用いた。プライマーは、配列番号４３のプライマーF02(gtcgtttctgcaagcttggc)と配列番号４４のプライマーR03(ccgagataaaaacaaacccgc)を用いた。反応溶液の組成は、10 mM Tris-HCl, pH 8.3, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 0.2 mM dNTP, 0.5 μM プライマー、100 ng/100μlの反応溶液、5 Units/100μlのポリメラーゼで、反応サイクルは、98℃5秒、55℃10秒、72℃10秒で30サイクルの反応を行った。
結果を図5に示す。野生型Taqポリメラーゼでは増幅されたDNAのバンドは見られなかったが、TaqRK(742R743K), TaqKR(742K743R), TaqKK(742K743K), TaqRR(742R743R)では、2 kbの位置に増幅バンドが検出された。
鋳型のラムダDNAはタカラバイオ社製を用いた。プライマーは、配列番号４３のプライマーF02(gtcgtttctgcaagcttggc)と配列番号４４のプライマーR03(ccgagataaaaacaaacccgc)を用いた。反応溶液の組成は、10 mM Tris-HCl, pH 8.3, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 0.2 mM dNTP, 0.5 μM プライマー、100 ng/100μlの反応溶液、5 Units/100μlのポリメラーゼで、反応サイクルは、98℃5秒、55℃10秒、72℃10秒で30サイクルの反応を行った。
結果を図5に示す。野生型Taqポリメラーゼでは増幅されたDNAのバンドは見られなかったが、TaqRK(742R743K), TaqKR(742K743R), TaqKK(742K743K), TaqRR(742R743R)では、2 kbの位置に増幅バンドが検出された。
〔実施例６〕変異Ｔａｑポリメラーゼを用いたＰＣＲ反応（２）
鋳型のラムダDNAはタカラバイオ社製を用いた。プライマーは、配列番号４３のプライマーF02(gtcgtttctgcaagcttggc)と配列番号４４のプライマーR03(ccgagataaaaacaaacccgc)を用いた。反応溶液の組成は、10 mM Tris-HCl, pH 8.3, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 0.2 mM dNTP, 0.5 μM プライマー、100 ng/100μlの反応溶液、5 Units/100μlのポリメラーゼで、反応サイクルは、99℃5秒、66℃40秒で30サイクルの反応を行った。
結果を図6に示す。野生型Taqポリメラーゼでは増幅されたDNAのバンドは見られなかったが、TaqRR(742R743R), TaqQY(742Q743Y)では、2 kbの位置に増幅バンドが検出された。
鋳型のラムダDNAはタカラバイオ社製を用いた。プライマーは、配列番号４３のプライマーF02(gtcgtttctgcaagcttggc)と配列番号４４のプライマーR03(ccgagataaaaacaaacccgc)を用いた。反応溶液の組成は、10 mM Tris-HCl, pH 8.3, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 0.2 mM dNTP, 0.5 μM プライマー、100 ng/100μlの反応溶液、5 Units/100μlのポリメラーゼで、反応サイクルは、99℃5秒、66℃40秒で30サイクルの反応を行った。
結果を図6に示す。野生型Taqポリメラーゼでは増幅されたDNAのバンドは見られなかったが、TaqRR(742R743R), TaqQY(742Q743Y)では、2 kbの位置に増幅バンドが検出された。
〔実施例７〕変異Ｔａｑポリメラーゼを用いたＰＣＲ反応（３）
鋳型のラムダDNAはタカラバイオ社製を用いた。プライマーは、配列番号４５のプライマーF24(cgtcggggacattgtaaaggcg)と配列番号４６のプライマーR14(ggcattcctacgagcagatgg)を用いた。反応溶液の組成は、10 mM Tris-HCl, pH 8.3, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 0.2 mM dNTP, 0.5 μM プライマー、100 ng/100μlの反応溶液、5 Units/100μlのポリメラーゼで、反応サイクルは、98℃5秒、55℃10秒、72℃10秒で30サイクルの反応を行った。
結果を図7に示す。野生型Taqポリメラーゼでは増幅されたDNAのバンドは見られなかった。TaqRR(742R743R)では、500から10 kbの位置に増幅シグナルが現れた。TaqQY(742Q743Y)では、8 kbの位置に増幅バンドが検出された。
鋳型のラムダDNAはタカラバイオ社製を用いた。プライマーは、配列番号４５のプライマーF24(cgtcggggacattgtaaaggcg)と配列番号４６のプライマーR14(ggcattcctacgagcagatgg)を用いた。反応溶液の組成は、10 mM Tris-HCl, pH 8.3, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 0.2 mM dNTP, 0.5 μM プライマー、100 ng/100μlの反応溶液、5 Units/100μlのポリメラーゼで、反応サイクルは、98℃5秒、55℃10秒、72℃10秒で30サイクルの反応を行った。
結果を図7に示す。野生型Taqポリメラーゼでは増幅されたDNAのバンドは見られなかった。TaqRR(742R743R)では、500から10 kbの位置に増幅シグナルが現れた。TaqQY(742Q743Y)では、8 kbの位置に増幅バンドが検出された。
〔実施例８〕変異Ｔａｑポリメラーゼを用いたＰＣＲ反応（４）
鋳型のラムダDNAはタカラバイオ社製を用いた。プライマーは、配列番号４５のプライマーF24(cgtcggggacattgtaaaggcg)と配列番号４６のプライマーR14(ggcattcctacgagcagatgg)を用いた。反応溶液の組成は、10 mM Tris-HCl, pH 8.3, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 0.2 mM dNTP, 0.5 μM プライマー、100 ng/100μlの反応溶液、5 Units/100μlのポリメラーゼで、反応サイクルは、99℃5秒、66℃160秒で30サイクルの反応を行った。
結果を図8に示す。野生型Taqポリメラーゼでは8 kbの位置に薄いバンドが検出された。TaqRR(742R743R)では、2から10 kbの位置に増幅シグナルが現れた。TaqQY(742Q743Y)では、8 kbの位置に濃い増幅バンドが検出された。
鋳型のラムダDNAはタカラバイオ社製を用いた。プライマーは、配列番号４５のプライマーF24(cgtcggggacattgtaaaggcg)と配列番号４６のプライマーR14(ggcattcctacgagcagatgg)を用いた。反応溶液の組成は、10 mM Tris-HCl, pH 8.3, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 0.2 mM dNTP, 0.5 μM プライマー、100 ng/100μlの反応溶液、5 Units/100μlのポリメラーゼで、反応サイクルは、99℃5秒、66℃160秒で30サイクルの反応を行った。
結果を図8に示す。野生型Taqポリメラーゼでは8 kbの位置に薄いバンドが検出された。TaqRR(742R743R)では、2から10 kbの位置に増幅シグナルが現れた。TaqQY(742Q743Y)では、8 kbの位置に濃い増幅バンドが検出された。
〔実施例９〕変異Ｔａｑポリメラーゼを用いたＰＣＲ反応（５）
鋳型のラムダDNAはタカラバイオ社製を用いた。8 kbのDNA増幅に用いたプライマーは、配列番号４７のプライマーF1(gagttcgtgtccgtacaactggcgtaatcatggcc)と配列番号４８のプライマーR6(gagaaaacaggatgccggtcataccaccggcccc)を用いた。15 kbのDNA増幅に用いたプライマーは、配列番号４７のプライマーF1(gagttcgtgtccgtacaactggcgtaatcatggcc)と配列番号４９のプライマーR9(gaatatctggcggtgcaatatcggtactgtttgc)を用いた。反応溶液の組成は、10 mM Tris-HCl, pH 8.3, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 0.2 mM dNTP, 0.5 μM プライマー、100 ng/100μlの反応溶液、5 Units/100μlのポリメラーゼである。反応サイクルは、99℃5秒、66℃5分で30サイクルの反応を行った。
鋳型のラムダDNAはタカラバイオ社製を用いた。8 kbのDNA増幅に用いたプライマーは、配列番号４７のプライマーF1(gagttcgtgtccgtacaactggcgtaatcatggcc)と配列番号４８のプライマーR6(gagaaaacaggatgccggtcataccaccggcccc)を用いた。15 kbのDNA増幅に用いたプライマーは、配列番号４７のプライマーF1(gagttcgtgtccgtacaactggcgtaatcatggcc)と配列番号４９のプライマーR9(gaatatctggcggtgcaatatcggtactgtttgc)を用いた。反応溶液の組成は、10 mM Tris-HCl, pH 8.3, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 0.2 mM dNTP, 0.5 μM プライマー、100 ng/100μlの反応溶液、5 Units/100μlのポリメラーゼである。反応サイクルは、99℃5秒、66℃5分で30サイクルの反応を行った。
結果を図9に示す。8 kbの増幅では、野生型Taqポリメラーゼ、TaqRR、TaqQYで増幅バンドが検出された。
15 kbの増幅では、野生型Taqポリメラーゼでは増幅バンドは見られなかった。TaqRR(742R743R)では、増幅バンドは見られたが、15 kbではなかった。TaqQY(742Q743Y)では、15 kbの位置に増幅バンドが検出された。
15 kbの増幅では、野生型Taqポリメラーゼでは増幅バンドは見られなかった。TaqRR(742R743R)では、増幅バンドは見られたが、15 kbではなかった。TaqQY(742Q743Y)では、15 kbの位置に増幅バンドが検出された。
〔実施例１０〕変異Ｔａｑポリメラーゼを用いたＰＣＲ反応（６）
鋳型のラムダDNAはタカラバイオ社製を用いた。プライマーは、配列番号４７のプライマーF1(gagttcgtgtccgtacaactggcgtaatcatggcc)と配列番号４８のプライマーR6(gagaaaacaggatgccggtcataccaccggcccc)を用いた。反応溶液の組成は、10 mM Tris-HCl, pH 8.3, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 0.2 mM dNTP, 0.5 μM プライマー、100 ng/100μlの反応溶液、5 Units/100μlのポリメラーゼである。反応サイクルは、99℃5秒、66℃5分で30サイクルの反応を行った。
結果を図10に示す。野生型Taqポリメラーゼ、TaqRR(742R743R)、TaqQY(742Q743Y), TaqER(742E743R), TaqAA(742A743A)で8 kbの位置に増幅バンドが検出された。
鋳型のラムダDNAはタカラバイオ社製を用いた。プライマーは、配列番号４７のプライマーF1(gagttcgtgtccgtacaactggcgtaatcatggcc)と配列番号４８のプライマーR6(gagaaaacaggatgccggtcataccaccggcccc)を用いた。反応溶液の組成は、10 mM Tris-HCl, pH 8.3, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 0.2 mM dNTP, 0.5 μM プライマー、100 ng/100μlの反応溶液、5 Units/100μlのポリメラーゼである。反応サイクルは、99℃5秒、66℃5分で30サイクルの反応を行った。
結果を図10に示す。野生型Taqポリメラーゼ、TaqRR(742R743R)、TaqQY(742Q743Y), TaqER(742E743R), TaqAA(742A743A)で8 kbの位置に増幅バンドが検出された。
〔実施例１１〕変異Ｔａｑポリメラーゼを用いたＰＣＲ反応（７）
鋳型のラムダDNAはタカラバイオ社製を用いた。プライマーは、配列番号４７のプライマーF1(gagttcgtgtccgtacaactggcgtaatcatggcc)と配列番号４９のプライマーR9(gaatatctggcggtgcaatatcggtactgtttgc)を用いた。反応溶液の組成は、10 mM Tris-HCl, pH 8.3, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 0.2 mM dNTP, 0.5 μM プライマー、100 ng/100μlの反応溶液、5 Units/100μlのポリメラーゼである。反応サイクルは、99℃5秒、66℃5分で30サイクルの反応を行った。
結果を図11に示す。野生型Taqポリメラーゼでは増幅されたDNAのバンドは見られなかった。TaqAA(742A743A)は、15 kbの位置に濃い増幅バンドが検出された。
鋳型のラムダDNAはタカラバイオ社製を用いた。プライマーは、配列番号４７のプライマーF1(gagttcgtgtccgtacaactggcgtaatcatggcc)と配列番号４９のプライマーR9(gaatatctggcggtgcaatatcggtactgtttgc)を用いた。反応溶液の組成は、10 mM Tris-HCl, pH 8.3, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 0.2 mM dNTP, 0.5 μM プライマー、100 ng/100μlの反応溶液、5 Units/100μlのポリメラーゼである。反応サイクルは、99℃5秒、66℃5分で30サイクルの反応を行った。
結果を図11に示す。野生型Taqポリメラーゼでは増幅されたDNAのバンドは見られなかった。TaqAA(742A743A)は、15 kbの位置に濃い増幅バンドが検出された。
[実施例12]変異TaqポリメラーゼのF667Y変異体を用いた塩基配列解析の可能性
変異TaqポリメラーゼのF667Y変異体の作成は、[実施例1]に示したように、変異Taqポリメラーゼを産生するプラスミドを鋳型に下記のプライマーを用いてF667Y変異プラスミドを作成した。変異Taqポリメラーゼの作成は[実施例1]にしたがって行った。
変異TaqポリメラーゼのF667Y変異体の作成は、[実施例1]に示したように、変異Taqポリメラーゼを産生するプラスミドを鋳型に下記のプライマーを用いてF667Y変異プラスミドを作成した。変異Taqポリメラーゼの作成は[実施例1]にしたがって行った。
F667Y-5 ggccaagaccatcaactAcggggtcctctacggc（配列番号５０）
F667Y-3 gccgtagaggaccccgTagttgatggtcttggcc（配列番号５１）
反応溶液(10 μl )の組成は、20 mM Tris-HCl, pH 8.8, 5 mM MgCl2, 5 mM DTT, 0.1 mM dNTP, 0.01 mM ddNTP, 0.1 pmol プライムドDNA(5'末端を放射標識化した配列番号４０と配列番号３９をアニールさせたもの)である。この溶液に変異TaqポリメラーゼのF667Y変異体(TaqRR(F667Y)およびTaqQY(F667Y))を1.4 ng加え、70℃で5分反応させた。これを7 M尿素を含む12％アクリルアミドゲルで分離し、ゲルを乾燥させた後、オートラジオグラフィーによりDNAを検出した。
F667Y-3 gccgtagaggaccccgTagttgatggtcttggcc（配列番号５１）
反応溶液(10 μl )の組成は、20 mM Tris-HCl, pH 8.8, 5 mM MgCl2, 5 mM DTT, 0.1 mM dNTP, 0.01 mM ddNTP, 0.1 pmol プライムドDNA(5'末端を放射標識化した配列番号４０と配列番号３９をアニールさせたもの)である。この溶液に変異TaqポリメラーゼのF667Y変異体(TaqRR(F667Y)およびTaqQY(F667Y))を1.4 ng加え、70℃で5分反応させた。これを7 M尿素を含む12％アクリルアミドゲルで分離し、ゲルを乾燥させた後、オートラジオグラフィーによりDNAを検出した。
結果を図12に示す。TaqRR(F667Y)およびTaqQY(F667Y)はシークエンスラダーが検出され、塩基配列解析に使用できることが明らかになった。
本発明の改変Ｔａｑポリメラーゼは、ＤＮＡ増幅に利用することができる。
＜配列番号１＞
配列番号１は、野生型Ｔａｑポリメラーゼ(Taq(742E743A))のヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号２＞
配列番号２は、野生型Ｔａｑポリメラーゼ(Taq(742E743A))のアミノ酸配列を示す。
＜配列番号３＞
配列番号３は、変異Ｔａｑポリメラーゼ(742R743R)をコードするＤＮＡのヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号４＞
配列番号４は、変異Ｔａｑポリメラーゼ(742R743R)のアミノ酸配列を示す。
＜配列番号５＞
配列番号５は、変異Ｔａｑポリメラーゼ(742E743R)をコードするＤＮＡのヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号６＞
配列番号６は、変異Ｔａｑポリメラーゼ(742E743R)のアミノ酸配列を示す。
＜配列番号７＞
配列番号７は、変異Ｔａｑポリメラーゼ(742A743R)をコードするＤＮＡのヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号８＞
配列番号８は、変異Ｔａｑポリメラーゼ(742A743R)のアミノ酸配列を示す。
＜配列番号９＞
配列番号９は、変異Ｔａｑポリメラーゼ(742A743A)をコードするＤＮＡのヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号１０＞
配列番号１０は、変異Ｔａｑポリメラーゼ(742A743A)のアミノ酸配列を示す。
＜配列番号１１＞
配列番号１１は、変異Ｔａｑポリメラーゼ(742R743A)をコードするＤＮＡのヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号１２＞
配列番号１２は、変異Ｔａｑポリメラーゼ(742R743A)のアミノ酸配列を示す。
＜配列番号１３＞
配列番号１３は、変異Ｔａｑポリメラーゼ(742R743K)をコードするＤＮＡのヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号１４＞
配列番号１４は、変異Ｔａｑポリメラーゼ(742R743K)のアミノ酸配列を示す。
＜配列番号１５＞
配列番号１５は、変異Ｔａｑポリメラーゼ(742K743R)をコードするＤＮＡのヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号１６＞
配列番号１６は、変異Ｔａｑポリメラーゼ(742K743R)のアミノ酸配列を示す。
＜配列番号１７＞
配列番号１７は、変異Ｔａｑポリメラーゼ(742K743K)をコードするＤＮＡのヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号１８＞
配列番号１８は、変異Ｔａｑポリメラーゼ(742K743K)のアミノ酸配列を示す。
＜配列番号１９＞
配列番号１９は、変異Ｔａｑポリメラーゼ(742Q743Y)をコードするＤＮＡのヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号２０＞
配列番号２０は、変異Ｔａｑポリメラーゼ(742Q743Y)のアミノ酸配列を示す。
＜配列番号２１＞
配列番号２１は、実施例１の変異Ｔａｑポリメラーゼの作製に用いたプライマーRR5のヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号２２＞
配列番号２２は、実施例１の変異Ｔａｑポリメラーゼの作製に用いたプライマーRR3のヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号２３＞
配列番号２３は、実施例１の変異Ｔａｑポリメラーゼの作製に用いたプライマーER5のヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号２４＞
配列番号２４は、実施例１の変異Ｔａｑポリメラーゼの作製に用いたプライマーER3のヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号２５＞
配列番号２５は、実施例１の変異Ｔａｑポリメラーゼの作製に用いたプライマーAR5のヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号２６＞
配列番号２６は、実施例１の変異Ｔａｑポリメラーゼの作製に用いたプライマーAR3のヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号２７＞
配列番号２７は、実施例１の変異Ｔａｑポリメラーゼの作製に用いたプライマーAA5のヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号２８＞
配列番号２８は、実施例１の変異Ｔａｑポリメラーゼの作製に用いたプライマーAA3のヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号２９＞
配列番号２９は、実施例１の変異Ｔａｑポリメラーゼの作製に用いたプライマーRA5のヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号３０＞
配列番号３０は、実施例１の変異Ｔａｑポリメラーゼの作製に用いたプライマーRA3のヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号３１＞
配列番号３１は、実施例１の変異Ｔａｑポリメラーゼの作製に用いたプライマーRK5のヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号３２＞
配列番号３２は、実施例１の変異Ｔａｑポリメラーゼの作製に用いたプライマーRK3のヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号３３＞
配列番号３３は、実施例１の変異Ｔａｑポリメラーゼの作製に用いたプライマーKR5のヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号３４＞
配列番号３４は、実施例１の変異Ｔａｑポリメラーゼの作製に用いたプライマーKR3のヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号３５＞
配列番号３５は、実施例１の変異Ｔａｑポリメラーゼの作製に用いたプライマーKK5のヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号３６＞
配列番号３６は、実施例１の変異Ｔａｑポリメラーゼの作製に用いたプライマーKK3のヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号３７＞
配列番号３７は、実施例１の変異Ｔａｑポリメラーゼの作製に用いたプライマーQY5のヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号３８＞
配列番号３８は、実施例１の変異Ｔａｑポリメラーゼの作製に用いたプライマーQY3のヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号３９＞
配列番号３９は、実施例３の変異Ｔａｑポリメラーゼのプライマー伸長活性測定に用いた鋳型のヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号４０＞
配列番号４０は、実施例３のプライマー伸長活性測定に用いたプライマーのヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号４１＞
配列番号４１は、実施例４のゲルシフト法による変異ＴａｑポリメラーゼとＤＮＡとの結合の測定に用いた鋳型ＤＮＡのヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号４２＞
配列番号４２は、実施例４のゲルシフト法による変異ＴａｑポリメラーゼとＤＮＡとの結合の測定に用いた標識プライマーのヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号４３＞
配列番号４３は、実施例５および６の変異Ｔａｑポリメラーゼを用いたＰＣＲ反応（１）および（２）に用いたプライマーＦ02のヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号４４＞
配列番号４４は、実施例５および６の変異Ｔａｑポリメラーゼを用いたＰＣＲ反応（１）および（２）に用いたプライマーＲ03のヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号４５＞
配列番号４５は、実施例７および８の変異Ｔａｑポリメラーゼを用いたＰＣＲ反応（３）および（４）に用いたプライマーＦ２４のヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号４６＞
配列番号４６は、実施例７および８の変異Ｔａｑポリメラーゼを用いたＰＣＲ反応（３）および（４）に用いたプライマーＲ１４のヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号４７＞
配列番号４７は、実施例９の変異Ｔａｑポリメラーゼを用いたＰＣＲ反応（５）、（６）および（７）に用いたプライマーＦ１のヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号４８＞
配列番号４８は、実施例９および１０の変異Ｔａｑポリメラーゼを用いたＰＣＲ反応（５）および（６）に用いたプライマーＲ６のヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号４９＞
配列番号４９は、実施例１１の変異Ｔａｑポリメラーゼを用いたＰＣＲ反応（５）および（７）に用いたプライマーR9のヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号５０＞
配列番号５０は、実施例１２の変異Ｔａｑポリメラーゼの作製に用いたプライマーF667Y-5のヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号５１＞
配列番号５１は、実施例１２の変異Ｔａｑポリメラーゼの作製に用いたプライマーF667Y-3のヌクレオチド配列を示す。
配列番号１は、野生型Ｔａｑポリメラーゼ(Taq(742E743A))のヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号２＞
配列番号２は、野生型Ｔａｑポリメラーゼ(Taq(742E743A))のアミノ酸配列を示す。
＜配列番号３＞
配列番号３は、変異Ｔａｑポリメラーゼ(742R743R)をコードするＤＮＡのヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号４＞
配列番号４は、変異Ｔａｑポリメラーゼ(742R743R)のアミノ酸配列を示す。
＜配列番号５＞
配列番号５は、変異Ｔａｑポリメラーゼ(742E743R)をコードするＤＮＡのヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号６＞
配列番号６は、変異Ｔａｑポリメラーゼ(742E743R)のアミノ酸配列を示す。
＜配列番号７＞
配列番号７は、変異Ｔａｑポリメラーゼ(742A743R)をコードするＤＮＡのヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号８＞
配列番号８は、変異Ｔａｑポリメラーゼ(742A743R)のアミノ酸配列を示す。
＜配列番号９＞
配列番号９は、変異Ｔａｑポリメラーゼ(742A743A)をコードするＤＮＡのヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号１０＞
配列番号１０は、変異Ｔａｑポリメラーゼ(742A743A)のアミノ酸配列を示す。
＜配列番号１１＞
配列番号１１は、変異Ｔａｑポリメラーゼ(742R743A)をコードするＤＮＡのヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号１２＞
配列番号１２は、変異Ｔａｑポリメラーゼ(742R743A)のアミノ酸配列を示す。
＜配列番号１３＞
配列番号１３は、変異Ｔａｑポリメラーゼ(742R743K)をコードするＤＮＡのヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号１４＞
配列番号１４は、変異Ｔａｑポリメラーゼ(742R743K)のアミノ酸配列を示す。
＜配列番号１５＞
配列番号１５は、変異Ｔａｑポリメラーゼ(742K743R)をコードするＤＮＡのヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号１６＞
配列番号１６は、変異Ｔａｑポリメラーゼ(742K743R)のアミノ酸配列を示す。
＜配列番号１７＞
配列番号１７は、変異Ｔａｑポリメラーゼ(742K743K)をコードするＤＮＡのヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号１８＞
配列番号１８は、変異Ｔａｑポリメラーゼ(742K743K)のアミノ酸配列を示す。
＜配列番号１９＞
配列番号１９は、変異Ｔａｑポリメラーゼ(742Q743Y)をコードするＤＮＡのヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号２０＞
配列番号２０は、変異Ｔａｑポリメラーゼ(742Q743Y)のアミノ酸配列を示す。
＜配列番号２１＞
配列番号２１は、実施例１の変異Ｔａｑポリメラーゼの作製に用いたプライマーRR5のヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号２２＞
配列番号２２は、実施例１の変異Ｔａｑポリメラーゼの作製に用いたプライマーRR3のヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号２３＞
配列番号２３は、実施例１の変異Ｔａｑポリメラーゼの作製に用いたプライマーER5のヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号２４＞
配列番号２４は、実施例１の変異Ｔａｑポリメラーゼの作製に用いたプライマーER3のヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号２５＞
配列番号２５は、実施例１の変異Ｔａｑポリメラーゼの作製に用いたプライマーAR5のヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号２６＞
配列番号２６は、実施例１の変異Ｔａｑポリメラーゼの作製に用いたプライマーAR3のヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号２７＞
配列番号２７は、実施例１の変異Ｔａｑポリメラーゼの作製に用いたプライマーAA5のヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号２８＞
配列番号２８は、実施例１の変異Ｔａｑポリメラーゼの作製に用いたプライマーAA3のヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号２９＞
配列番号２９は、実施例１の変異Ｔａｑポリメラーゼの作製に用いたプライマーRA5のヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号３０＞
配列番号３０は、実施例１の変異Ｔａｑポリメラーゼの作製に用いたプライマーRA3のヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号３１＞
配列番号３１は、実施例１の変異Ｔａｑポリメラーゼの作製に用いたプライマーRK5のヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号３２＞
配列番号３２は、実施例１の変異Ｔａｑポリメラーゼの作製に用いたプライマーRK3のヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号３３＞
配列番号３３は、実施例１の変異Ｔａｑポリメラーゼの作製に用いたプライマーKR5のヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号３４＞
配列番号３４は、実施例１の変異Ｔａｑポリメラーゼの作製に用いたプライマーKR3のヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号３５＞
配列番号３５は、実施例１の変異Ｔａｑポリメラーゼの作製に用いたプライマーKK5のヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号３６＞
配列番号３６は、実施例１の変異Ｔａｑポリメラーゼの作製に用いたプライマーKK3のヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号３７＞
配列番号３７は、実施例１の変異Ｔａｑポリメラーゼの作製に用いたプライマーQY5のヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号３８＞
配列番号３８は、実施例１の変異Ｔａｑポリメラーゼの作製に用いたプライマーQY3のヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号３９＞
配列番号３９は、実施例３の変異Ｔａｑポリメラーゼのプライマー伸長活性測定に用いた鋳型のヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号４０＞
配列番号４０は、実施例３のプライマー伸長活性測定に用いたプライマーのヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号４１＞
配列番号４１は、実施例４のゲルシフト法による変異ＴａｑポリメラーゼとＤＮＡとの結合の測定に用いた鋳型ＤＮＡのヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号４２＞
配列番号４２は、実施例４のゲルシフト法による変異ＴａｑポリメラーゼとＤＮＡとの結合の測定に用いた標識プライマーのヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号４３＞
配列番号４３は、実施例５および６の変異Ｔａｑポリメラーゼを用いたＰＣＲ反応（１）および（２）に用いたプライマーＦ02のヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号４４＞
配列番号４４は、実施例５および６の変異Ｔａｑポリメラーゼを用いたＰＣＲ反応（１）および（２）に用いたプライマーＲ03のヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号４５＞
配列番号４５は、実施例７および８の変異Ｔａｑポリメラーゼを用いたＰＣＲ反応（３）および（４）に用いたプライマーＦ２４のヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号４６＞
配列番号４６は、実施例７および８の変異Ｔａｑポリメラーゼを用いたＰＣＲ反応（３）および（４）に用いたプライマーＲ１４のヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号４７＞
配列番号４７は、実施例９の変異Ｔａｑポリメラーゼを用いたＰＣＲ反応（５）、（６）および（７）に用いたプライマーＦ１のヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号４８＞
配列番号４８は、実施例９および１０の変異Ｔａｑポリメラーゼを用いたＰＣＲ反応（５）および（６）に用いたプライマーＲ６のヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号４９＞
配列番号４９は、実施例１１の変異Ｔａｑポリメラーゼを用いたＰＣＲ反応（５）および（７）に用いたプライマーR9のヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号５０＞
配列番号５０は、実施例１２の変異Ｔａｑポリメラーゼの作製に用いたプライマーF667Y-5のヌクレオチド配列を示す。
＜配列番号５１＞
配列番号５１は、実施例１２の変異Ｔａｑポリメラーゼの作製に用いたプライマーF667Y-3のヌクレオチド配列を示す。
Claims (12)
- 配列番号２のアミノ酸配列からなるＴａｑポリメラーゼの742位のグルタミン酸と743位のアラニンの電荷の総和を増加する変異が導入された改変Ｔａｑポリメラーゼであって、以下の(i)及び/又は(ii)の変異が導入された改変Ｔａｑポリメラーゼ。
(i) 配列番号２のアミノ酸配列からなるＴａｑポリメラーゼの742位のグルタミン酸がアラニン、グルタミン、アルギニン、リシン又はヒスチジンのいずれかに置換
(ii) 配列番号２のアミノ酸配列からなるＴａｑポリメラーゼの 743位のアラニンがチロシン、アルギニン、リシン又はヒスチジンのいずれかに置換 - 以下の(a)〜(c)のいずれかのタンパク質である請求項１記載の改変Ｔａｑポリメラーゼ。
(a)配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０のいずれかのアミノ酸配列からなるタンパク質
(b)配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０のいずれかのアミノ酸配列において、742位と743位のアミノ酸以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつプライマー伸長活性、鋳型ＤＮＡにアニーリングしたプライマーに対する結合活性及びＰＣＲ性能の少なくとも１つが配列番号２のアミノ酸配列からなるＴａｑポリメラーゼよりも高いタンパク質
(c)配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９のいずれかのヌクレオチド配列からなるＤＮＡに相補的なＤＮＡと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるタンパク質であって、前記ヌクレオチド配列中の2224〜2226番目のヌクレオチドからなるコドンがコードするアミノ酸及び2227〜2229番目のヌクレオチドからなるコドンがコードするアミノ酸は保存されており、かつプライマー伸長活性、鋳型ＤＮＡにアニーリングしたプライマーに対する結合活性及びＰＣＲ性能の少なくとも１つが配列番号２のアミノ酸配列からなるＴａｑポリメラーゼよりも高いタンパク質 - さらに、配列番号２のアミノ酸配列からなるＴａｑポリメラーゼの667位のフェニルアラニンがチロシンに置換される変異が導入された請求項１又は２に記載の改変Ｔａｑポリメラーゼ。
- 請求項１〜３のいずれかに記載の改変ＴａｑポリメラーゼのN末端から280位までのアミノ酸を除くアミノ酸配列からなる改変Ｔａｑポリメラーゼ断片。
- 請求項１〜３のいずれかに記載の改変Ｔａｑポリメラーゼ又は請求項４記載の改変Ｔａｑポリメラーゼ断片をコードするＤＮＡ。
- 請求項５記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
- 請求項６記載の組換えベクターを含む形質転換体。
- 請求項７記載の形質転換体を培養することを含む請求項１〜３のいずれかに記載の改変Ｔａｑポリメラーゼ又は請求項４記載の改変Ｔａｑポリメラーゼ断片を製造する方法。
- 請求項１〜３のいずれかに記載の改変Ｔａｑポリメラーゼ又は請求項４記載の改変Ｔａｑポリメラーゼ断片を用いて、ＤＮＡを増幅する方法。
- さらに、ファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼを用いる請求項９記載の方法。
- 請求項１〜３のいずれかに記載の改変Ｔａｑポリメラーゼ又は請求項４記載の改変Ｔａｑポリメラーゼ断片を含むＤＮＡ増幅用キット。
- さらに、ファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼを含む請求項１１記載のキット。
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