CN106011100A - 一种Pfu DNA聚合酶及其制备方法 - Google Patents
一种Pfu DNA聚合酶及其制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN106011100A CN106011100A CN201610640034.6A CN201610640034A CN106011100A CN 106011100 A CN106011100 A CN 106011100A CN 201610640034 A CN201610640034 A CN 201610640034A CN 106011100 A CN106011100 A CN 106011100A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- preparation
- dna polymerase
- pfu
- fast
- sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 21
- 108010002747 Pfu DNA polymerase Proteins 0.000 title claims abstract description 13
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims abstract description 34
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims abstract description 34
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims abstract description 18
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 15
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 15
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 13
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims abstract description 8
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 claims abstract description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims abstract description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 12
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 10
- FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 6-methoxy-1,2,3,4-tetrahydroquinoline Chemical compound N1CCCC2=CC(OC)=CC=C21 FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 6
- 241001597008 Nomeidae Species 0.000 claims description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 4
- 230000009471 action Effects 0.000 claims description 4
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 claims description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 4
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 claims description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims description 4
- 101150008132 NDE1 gene Proteins 0.000 claims description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 3
- 210000002706 plastid Anatomy 0.000 claims description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 3
- SRBFZHDQGSBBOR-HWQSCIPKSA-N L-arabinopyranose Chemical compound O[C@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-HWQSCIPKSA-N 0.000 claims description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 claims description 2
- 230000004075 alteration Effects 0.000 claims 1
- 230000012743 protein tagging Effects 0.000 claims 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 6
- 230000009182 swimming Effects 0.000 description 17
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 12
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 11
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 11
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 8
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 5
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 150000002460 imidazoles Chemical class 0.000 description 4
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 4
- 238000000034 method Methods 0.000 description 4
- 238000000825 ultraviolet detection Methods 0.000 description 4
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000009413 insulation Methods 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 2
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 2
- 230000009514 concussion Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 1
- 108010001267 Protein Subunits Proteins 0.000 description 1
- 102000002067 Protein Subunits Human genes 0.000 description 1
- 241000205160 Pyrococcus Species 0.000 description 1
- 239000012564 Q sepharose fast flow resin Substances 0.000 description 1
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 1
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
- C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
- C12N9/1252—DNA-directed DNA polymerase (2.7.7.7), i.e. DNA replicase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
- C12Y207/07—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
- C12Y207/07007—DNA-directed DNA polymerase (2.7.7.7), i.e. DNA replicase
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供一种Pfu DNA聚合酶及其制备方法，该方法包括构建Fast Pfu DNA聚合酶的原核构建获得表达菌株的步骤，将菌株接种到培养基中，经诱导表达后，收集菌体；菌体经破菌、纯化后，得到所述Fast Pfu DNA聚合酶。本发明采用分子进化技术对普通Pfu酶进行改造，制备新型的Fast Pfu聚合酶，具有快速、高灵敏度、抗干扰能力强等特点，是新一代的高保真DNA聚合酶。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学试剂领域，特别是制备Fast Pfu DNA聚合酶的方法。
背景技术
Pfu DNA聚合酶(Pfu DNA polymerase)，又称Pfu聚合酶，或Pfu酶，是在嗜热的古核生物火球菌属内发现的，一类能在活体内进行DNA复制的酶，该酶含有2个蛋白亚基(P45和P50)，为多聚体，分子量约为90kDa，该酶同时具有5'-3'聚合酶活性和3'-5'外切核酸酶活性。因此在聚合反应中可纠正错误掺入的碱基，保真性极高。体外实验中，在聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)中，使用Pfu聚合酶可以快速，高保真的扩增DNA片段。然而Pfu酶扩增灵敏度不高，延伸速度缓慢(1kb/分钟)给众多的使用者带来了不便，影响了Pfu酶的应用推广。
有鉴于上述的缺陷，本设计人，积极加以研究创新，以期创设一种Pfu DNA聚合酶及其制备方法，使其更具有产业上的利用价值。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种Pfu DNA聚合酶及其制备方法。
本发明的一种Pfu DNA聚合酶的制备方法，包括构建Fast Pfu DNA聚合酶的表达载体并获得表达菌株的步骤。
进一步的，所述表达载体为原核表达载体。
进一步的，所述表达载体转化工程菌获得表达菌株。
进一步的，Pfu DNA聚合酶的制备方法包括以下步骤：
(1)合成引物Pr-1和Pr-2，以全基因合成Fast Pfu DNA聚合酶的 DNA序列为模板，用对应的引物PCR获得的产物Nde1和Xho1双酶切后连接到用相同的酶酶切好的表达载体上，转化DH5a，测序获得正确的阳性表达质粒，然后这种质粒转化表达工程菌，获得表达菌株，其中引物序列如下所示：
Pr-1：ATGATTTTAG ATGTGGAT；
Pr-2：TCGAGCTAGGATTTTTTAATGTT；
(2)将步骤(1)中获得的菌株接种到37℃的LB培养基中，250rmp震荡培养到OD600＝0.6时，加入诱导剂，经诱导表达后，为了提高蛋白可溶性表达的比例，同时将培养温度降至20℃，低温诱导表达过夜(16h)，5k转离心收集菌体；
(3)步骤(2)中的菌体经破菌、纯化后，得到所述Fast Pfu DNA聚合酶。
进一步的，所述原核表达载体为pET30a、或pBAD/His。
进一步的，所述工程菌为BL21(DE3)、Origami 2(DE3)或Rosetta(DE3)。
进一步的，步骤(2)中，用于诱导表达的诱导剂为IPTG或L-阿拉伯糖，其中优选1mM的IPTG。
进一步的，步骤(3)中，用于破菌的破菌缓冲液为Tis-Hcl或PBS，优选20mM Tris，250mMNaCl，pH8.0。
全基因合成Fast Pfu DNA聚合酶的DNA序列，PCR获得具有连接位点的产物，连接到pET30a载体上，转化DH5a，测序获得正确的阳性表达质粒：pET30a-Fast Pfu；转化入BL21(DE3)，获得表达菌株。
本发明的一种Fast Pfu DNA聚合酶，具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，编码SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的DNA分子具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，该新型聚合酶具有快速、高灵敏度、抗干扰能力强等特点，是新一代的高保真DNA聚合酶。
借由上述方案，本发明至少具有以下优点：
本发明采用分子进化技术对普通Pfu酶进行改造，制备新型的Fast Pfu聚合酶，具有快速、高灵敏度、抗干扰能力强等特点，是新一代的高保真DNA聚合酶；使用Fast Pfu聚合酶能获得更理想的扩增结果，并大幅度缩短扩增反应时间，其保真度高于Pfu酶，是普通Taq酶的50倍；Fast Pfu聚合酶扩增速度为普通Pfu酶的数倍，72℃保温30秒可延伸1kb以上，扩增长度可达20kb，能高效扩增≤6kb片段；灵敏度高，可从0.05ng人基因组DNA模板中扩增出1.2kb特定基因片段。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。
附图说明
图1是本发明中实施例一得到的Fast Pfu DNA聚合酶电泳图；
图2是本发明中实施例二得到的Fast Pfu DNA聚合酶电泳图；
图3是本发明中实施例一得到的Fast Pfu DNA聚合酶进行灵敏度检测电泳结果图；
图4是本发明中实施例一得到的Fast Pfu DNA聚合酶进行扩增大片段测试电泳结果图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实例一：Fast Pfu DNA聚合酶的制备
(1)Fast Pfu DNA聚合酶表达菌株的获得：全基因合成Fast Pfu DNA聚合酶的DNA序列(SEQ ID NO:1)，合成引物Pr-1和Pr-2，以合成好的基因为模板，用对应的引物，通过PCR获得的产物Nde1和Xho1双酶切后连接到用相同的酶酶切好的pET30a载体上，转化DH5a，测序获得正确的阳性表达质粒：pET30a-Fast Pfu；然后这种 质粒转化BL21(DE3)，获得表达菌株；其中引物序列如下所示：
Pr-1：ATGATTTTAGATGTGGAT；
Pr-2：TCGAGCTAGGATTTTTTAATGTT；
(2)将步骤(1)中获得的菌株按1:100的比例接种到37℃的LB培养基中，250rmp震荡培养到OD600＝0.6时，加入诱导剂1mM的IPTG，为了提高蛋白可溶性表达的比例，同时将培养温度降至20℃，低温诱导表达过夜(16h)，5k转离心收集菌体；
(3)菌体质量与破菌缓冲液体积(50mM Tis-Hcl，pH 8.0，500mM NaCl)按1:10混合，即1g菌体加入10ml缓冲液，超声破菌，12k转离心30min收集上清液，过Ni柱纯化，如下：
(3.1)平衡：用平衡缓冲液(20mM Tris-HCl，pH8.0，500mMNaCl，20mM咪唑)平衡柱子，平衡缓冲液及样品中不可有EDTA、Arg等物质，直至pH达到8.0，紫外检测读数稳定，一般为5-10个柱体积，检测调零后上样；
(3.2)上样：样品应保持澄清，如发现沉淀浑浊则需要离心，收集流出；
(3.3)平衡：上样结束，用平衡缓冲液平衡层析柱，直到紫外检测读数回到基线或相对稳定；
(3.4)预洗：用预洗缓冲液(20mM Tris-HCl，pH8.0，500mMNaCl，50mM咪唑)预洗，收集洗脱组分；
(3.5)洗脱：用洗脱液(20mM Tris-HCl，pH8.0，500mMNaCl，200mM咪唑)洗脱目标蛋白，收集洗脱组分；
(3.6)洗柱：用洗柱缓冲液(20mM Tris-HCl，pH8.0，500mMNaCl，500mM咪唑)冲洗层析柱，收集洗脱组分；
(4)为了去除蛋白中微量的但会影响后期实验的宿主残留DNA或质粒DNA，这部分样品会再经过阴离子柱纯化(Q Sepharose Fast Flow)，具体步骤如下：
(4.1)平衡：用缓冲液(20mM Tris-HCl，pH8.0)平衡柱子，直至pH达到8.0，紫外检测读数稳定，一般为5-10个柱体积，检测调零后上样；
(4.2)上样：样品应保持澄清，如发现沉淀浑浊则需要离心，样品中离子强度不宜超过5ms/cm，收集流出；
(4.3)平衡：上样结束，用平衡液平衡层析柱，直到紫外检测读数回到基线或相对稳定；
(4.4)洗脱：用不同盐浓度：
20mM Tris-HCl，pH8.0，50mMNaCl；
20mMTris-HCl，pH8.0，100mMNaCl；
20mMTris-HCl，pH8.0，200mMNaCl；
20mM Tris-HCl，pH8.0，300mMNaCl；
20mM Tris-HCl，pH8.0，500mMNaCl；
(5)分步洗脱，分步收集各个洗脱组分，因为残留DNA一般在高盐组分中，所以收集低盐洗脱的蛋白质样品，得到目标产物Fast Pfu DNA聚合酶，如图1所示，泳道MK：分子量标记；泳道1：蛋白产品(3μg，洗脱后)；泳道2：蛋白产品(3μg，未洗脱)，其中，Fast Pfu DNA聚合酶储存溶液：20mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM DTT，0.1mM EDTA，100mMKCl，0.5％(v/v)Nonidet P40，0.5％(v/v)Tween20and 50％(v/v)甘油。
实例二：Fast Pfu DNA聚合酶的制备
本实施例的步骤和实例一相同，其区别在于：步骤(2)中，将菌株按1:20接种到LB培养基中；步骤(3)中，菌体质量与破菌缓冲液体积(50mM Tis-Hcl，pH 8.0，500mM NaCl)按1:5混合，即1g菌体加入5ml破菌缓冲液；得到的目标产物Fast Pfu DNA聚合酶，如图2所示，如图所示：我们能够得到与理论分子量大小相符的目的蛋白。
对实施例一得到的Fast Pfu DNA聚合酶进行灵敏度检测，如下：
在50μl扩增体系中，分别以50ng-0.05ng人基因组DNA为模板，对特定基因片段(1.2kb)进行的扩增。
其中反应体系如下：
5×FastPfu Buffer(含Mg2+)10μl；上游引物0.2-1.0μM(终浓度)；下游引物0.2-1.0μM(终浓度)；dNTPs(各10mM)1μl；模板0.05ng-50ng(基因组)；Fast Pfu DNA聚合酶0.25μl(1.25U)；ddH2至50μl。
PCR程序如下：30次循环：94℃，90秒；94℃，20秒；60℃，20秒；72℃，1kb/30秒；72℃，300秒；4℃，保温。
扩增后的电泳图如图3所示：泳道1：50ng；泳道2：5ng；泳道3：0.5ng；泳道4：0.05ng；泳道M：DNA Ladder 200。
对实施例一得到的Fast Pfu DNA聚合酶进行扩增大片段测试，如下：
在50μl扩增体系中，λDNA为模板，扩增1kb-20kb片段。
其中反应体系如下：
5×Fast Pfu Buffer(含Mg2+)10μl；上游引物0.2-1.0μM(终浓度)；下游引物0.2-1.0μM(终浓度)；dNTPs(各10mM)1μl；模板50ng；Fast Pfu DNA聚合酶0.25μl(1.25U)；ddH2O至50μl。
PCR程序如下：30次循环：94℃，300秒；94℃，20秒；68℃，1kb/30秒；72℃，300秒；4℃，保温。
扩增后的电泳图如图4所示：泳道1：1kb；泳道2：2kb；泳道3：4kb；泳道4：6kb；泳道5：8kb；泳道6：10kb；泳道7：12kb；泳道8：20kb；泳道M：λ/Hind III DNA Marker。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种FastPfu DNA聚合酶的制备方法，其特征在于：包括构建FastPfu DNA聚合酶的序列改造和并获得表达菌株的步骤，Fast Pfu DNA聚合酶具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，编码SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的DNA分子具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述表达序列为DNA结合蛋白和Pfu蛋白融合。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述表达载体为原核表达载体。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述表达载体转化工程菌获得表达菌株。
5.根据1至4任一权利要求所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)合成引物Pr-1和Pr-2，以全基因合成Fast Pfu DNA聚合酶的DNA序列为模板，用对应的引物PCR获得的产物Nde1和Xho1双酶切后连接到用相同的酶切好的表达载体上，转化DH5a，测序获得正确的阳性表达质粒，然后这种质粒转化表达工程菌，获得表达菌株；其中引物序列如下所示：
Pr-1：ATGATTTTAG ATGTGGAT；
Pr-2：TCGAGCTAGGATTTTTTAATGTT；
(2)将步骤(1)中获得的菌株接种到培养基中，经诱导表达后，收集菌体；
(3)步骤(2)中的菌体经破菌、纯化后，得到所述Fast Pfu DNA聚合酶。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述原核表达载体为pET-30a或pBAD/His。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述工程菌为BL21(DE3)、Origami 2(DE3)或Rosetta(DE3)。
8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，用于诱导表达的诱导剂为IPTG或L-阿拉伯糖。
9.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：步骤(3)中，用于破菌的破菌缓冲液为Tis-Hcl或PBS。
10.一种Fast Pfu DNA聚合酶，其特征在于：由权利要求1至8任一制备方法得到，具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，编码SEQID NO:1所示的氨基酸序列的DNA分子具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201610640034.6A CN106011100A (zh) | 2016-08-08 | 2016-08-08 | 一种Pfu DNA聚合酶及其制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201610640034.6A CN106011100A (zh) | 2016-08-08 | 2016-08-08 | 一种Pfu DNA聚合酶及其制备方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN106011100A true CN106011100A (zh) | 2016-10-12 |
Family
ID=57134040
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201610640034.6A Pending CN106011100A (zh) | 2016-08-08 | 2016-08-08 | 一种Pfu DNA聚合酶及其制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN106011100A (zh) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109576254A (zh) * | 2019-01-11 | 2019-04-05 | 吴江近岸蛋白质科技有限公司 | Dna拓扑异构酶ⅰ的制备方法和表达纯化方法 |
| CN111662893A (zh) * | 2020-07-01 | 2020-09-15 | 济南国科医工科技发展有限公司 | 分子诊断酶制剂的制备方法 |
| CN113388596A (zh) * | 2021-08-16 | 2021-09-14 | 翌圣生物科技(上海)股份有限公司 | 高保真Pfu DNA聚合酶突变体、其编码DNA及其在NGS中的应用 |
| CN114015672A (zh) * | 2021-12-06 | 2022-02-08 | 江南大学 | 一种Pfu DNA聚合酶 |
| CN114381442A (zh) * | 2021-12-16 | 2022-04-22 | 大连博格林生物科技有限公司 | 一种可快速延伸的高保真dna聚合酶及其制备方法和应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102257136A (zh) * | 2008-11-03 | 2011-11-23 | 卡帕生物系统 | 嵌合dna聚合酶 |
| CN103966244A (zh) * | 2013-02-04 | 2014-08-06 | 思洛生物技术股份有限公司 | 一种编码dna聚合酶的dna及其编码的酶、应用和制备方法 |
-
2016
- 2016-08-08 CN CN201610640034.6A patent/CN106011100A/zh active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102257136A (zh) * | 2008-11-03 | 2011-11-23 | 卡帕生物系统 | 嵌合dna聚合酶 |
| CN103966244A (zh) * | 2013-02-04 | 2014-08-06 | 思洛生物技术股份有限公司 | 一种编码dna聚合酶的dna及其编码的酶、应用和制备方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| YAN WANG等: "A novel strategy to engineer DNA polymerases for enhanced processivity and improved performance in vitro", 《NUCLEIC ACIDS RESEARCH》 * |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109576254A (zh) * | 2019-01-11 | 2019-04-05 | 吴江近岸蛋白质科技有限公司 | Dna拓扑异构酶ⅰ的制备方法和表达纯化方法 |
| CN111662893A (zh) * | 2020-07-01 | 2020-09-15 | 济南国科医工科技发展有限公司 | 分子诊断酶制剂的制备方法 |
| CN113388596A (zh) * | 2021-08-16 | 2021-09-14 | 翌圣生物科技(上海)股份有限公司 | 高保真Pfu DNA聚合酶突变体、其编码DNA及其在NGS中的应用 |
| CN114015672A (zh) * | 2021-12-06 | 2022-02-08 | 江南大学 | 一种Pfu DNA聚合酶 |
| CN114015672B (zh) * | 2021-12-06 | 2022-05-31 | 江南大学 | 一种Pfu DNA聚合酶 |
| CN114381442A (zh) * | 2021-12-16 | 2022-04-22 | 大连博格林生物科技有限公司 | 一种可快速延伸的高保真dna聚合酶及其制备方法和应用 |
| CN114381442B (zh) * | 2021-12-16 | 2023-12-01 | 大连博格林生物科技有限公司 | 一种可快速延伸的高保真dna聚合酶及其制备方法和应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN106011100A (zh) | 一种Pfu DNA聚合酶及其制备方法 | |
| CN107201352B (zh) | 一种具有高转糖苷活性的β-半乳糖苷酶组合突变体及其制备方法和应用 | |
| CN109022387B (zh) | 一种突变型Pfu DNA聚合酶及其制备方法和应用 | |
| CN112209995B (zh) | 一种SARS-CoV-2表面蛋白受体结合区制备方法 | |
| CN112500459B (zh) | Aerolysin突变纳米孔及其在分子生物检测方面的应用 | |
| CN103602643B (zh) | 一种重组Taq DNA聚合酶及其制备方法 | |
| WO2023142899A1 (zh) | 一种突变型RNase R及其制备方法和应用 | |
| CN105821061B (zh) | 一种编码岩藻多糖糖苷水解酶的核苷酸序列及其应用 | |
| CN105950580B (zh) | 一种制备蛋白质UGTCs4的方法 | |
| CN116240199A (zh) | 一种突变的核糖核酸酶r及其应用 | |
| CN106367407A (zh) | phi29DNA聚合酶的制备方法及其应用 | |
| CN104087563A (zh) | 提高微生物转谷氨酰胺酶在大肠杆菌中可溶性表达的方法 | |
| CN104673920A (zh) | 加工食品中核桃植物源性成分鉴别用hda引物及其应用 | |
| CN110387363A (zh) | 一种限制性内切酶SmaI及其表达纯化方法 | |
| CN106318922A (zh) | 一种Pfu DNA聚合酶的制备方法 | |
| CN104561021A (zh) | 鸡白介素2表达基因改造方法、利用该方法改造得到的基因 | |
| Raimondi et al. | RNA‐binding ability of PIPP in requires the entire protein | |
| CN102676470B (zh) | 一种用于快速基因克隆的酶混合物及制备方法、包含该酶混合物的试剂盒 | |
| CN114381442B (zh) | 一种可快速延伸的高保真dna聚合酶及其制备方法和应用 | |
| KR20200066465A (ko) | 수은 센싱 미생물 진단키트 및 이의 제조방법 | |
| CN116640225B (zh) | 一种鲎凝血因子组合、反应体系、试剂盒及其应用 | |
| CN119464247B (zh) | 一种t7 rna聚合酶突变体及其应用 | |
| CN109880841A (zh) | 一种HindIII限制性核酸内切酶的制备方法 | |
| CN107236718B (zh) | 一种来源于宏基因组的低温酯酶、编码基因及其应用 | |
| CN104745615A (zh) | Cyp119酶表达载体及其纯化方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20161012 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |