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CN116240199A - 一种突变的核糖核酸酶r及其应用 - Google Patents

一种突变的核糖核酸酶r及其应用 Download PDF

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CN116240199A CN202211610204.8A CN202211610204A CN116240199A CN 116240199 A CN116240199 A CN 116240199A CN 202211610204 A CN202211610204 A CN 202211610204A CN 116240199 A CN116240199 A CN 116240199A
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Abstract

本发明提供一种突变的核糖核酸酶R（RNase R）及其应用。本发明通过对大肠杆菌核糖核酸酶RNase R位点突变进行创造性地选择和筛选，提供了10种突变的核糖核酸酶R，获得相对于亲本酶活显著提高的突变体T495E、A246E、K457F、A246F、D281F、D122L。其中突变体T495E酶活提高最显著，相对酶活提高了37.48%，其他突变体酶活分别提高了24.74%、21.74%、10.04%、10.34%、6.75%。本发明还提供高表达核糖核酸酶RNase R的重组大肠杆菌，用于实现RNase R突变体的高效生产，具有良好的工业应用前景。本发明提供的酶活提高的核糖核酸酶R突变体适合工业上大规模制备mRNA，特别是在降解线性RNA或生产circRNA相关领域中的应用。

Description

一种突变的核糖核酸酶R及其应用
技术领域
本发明涉及基因工程以及医药领域，特别涉及核糖核酸酶R领域，尤其是突变的核糖核酸酶R及其应用。
背景技术
核糖核酸酶R（RNase R）是一种依赖镁的3'→5'外核糖核酸酶，其基本上消化所有线性RNA，但不消化套索状或环状RNA结构，或比3'突出端短的双链RNA 7个核苷酸。大多数细胞RNA会被RNase R完全消化，但tRNA，5S RNA和内含套索蛋白除外。套索的3'-尾巴将被RNase R修饰为分支点核苷酸，其中存在2'，5'-磷酸二酯键。
环状RNA（Circular RNA，circRNA）是区别于线性RNA的一类新型环状非编码RNA，半衰期长，具有物种保守性和组织特异性。其独特的环状结构使其不容易被RNA酶降解，因此在细胞内稳定性很强，在新型生物标记、生物学机制研究等方向具有巨大的潜力和研究价值。
“circRNA”这一概念最早出现在1971年，在RNA病毒中被发现，但长期以来，由于其表达丰度很低，所以一直被认为是转录的“噪音”，没有实际作用。直到2012年，借助于高通量测序技术，Salzman等（Salzman J, Gawad C, Wang P L, et al. Circular RNAs arethe predominant transcript isoform from hundreds of human genes in diversecell types. Plos One, 2012, 7(2): 1-12）研究发现无论是白血病细胞、Hela细胞系还是正常人原代血细胞均存在通过外显子重排形成非线性的环状转录物现象，约80个环状RNA被首次报道。后续大量的研究者涌入这个领域，不断产出环状RNA的研究成果。目前研究最多的就是位于细胞质中的外显子形成的环状RNA，其含有大量miRNA结合位点，可起到miRNA海绵作用，结合并封闭miRNA的调控作用，从而使靶基因表达增强。
随着环状RNA的深入研究，环状RNA制备问题就越来越备受关注。在环状RNA制备过程中，为了消除其他RNA的干扰，必须要用到RNase R对反应体系的其他RNA进行消除，才能获得较纯的circRNA。但是，目前已有的RNase R品质差别较大，在验证过程中发现某些RNase R对circRNA有明显的降解作用。随着对环状RNA研究的热度不断增加，未来市场和研究领域对于RNase R的需求会进一步增加。
CN114438054A（公开日期2022.05.06）公开了一种突变型RNase R被命名为RNaseR_△M8，其氨基酸序列如SEQ ID NO .5所示，编码该氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。该发明提供的突变型RNase R_△M8的制备过程包括载体构建、载体转化、蛋白诱导表达、细菌收集、蛋白纯化及活性测定等过程。与野生型RNase R相比，该发明提供的突变型RNase R的蛋白表达量更高，可以耐受150mM的NaCl。
虽然现有技术中已有突变型RNase R，但本领域仍然存在亟需提供不同的、性能提升的突变的RNase R用于工业和科学研究，特别是酶活性提升的突变的RNase R，可获得产量和纯度更高的circRNA。
发明内容
针对RNase R领域现有技术存在的缺陷，本发明的目的之一是提供一种性能提升的，特别是酶活相对于亲本显著提升的突变的RNase R。本发明进一步的目的是提供一种高表达核糖核酸酶RNase R的重组菌株，特别是重组大肠杆菌，用于实现RNase R突变体的高效生产，具有良好的工业应用前景。本发明还提供了编码所述突变的RNase R的重组核酸，包含所述核酸的表达盒、载体、细胞、菌株、组合物、试剂盒，以及RNase R突变体的制备方法、纯化方法、酶活检测方法，还有其在降解线性RNA、生产circRNA领域的应用等。
本发明的一方面提供一种突变的核糖核酸酶R，其特征在于，在亲本核糖核酸酶R的基础上包含突变，所述突变包含T495E，A246E，K457F，A246F，D281F，或D122L，所述亲本核糖核酸酶R的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
进一步地，所述突变的核糖核酸酶R为突变体T495E，A246E，K457F，A246F，D281F，或D122L，所述突变体T495E的氨基酸序列如SEQ ID NO:30所示，突变体A246E的氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示，突变体K457F的氨基酸序列如SEQ ID NO:29所示，突变体A246F的氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示，突变体D281F的氨基酸序列如SEQ ID NO:27所示，突变体D122L的氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示。
进一步地，所述亲本核糖核酸酶R的DNA序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明的另一方面提供一种重组核酸，其特征在于，包含编码所述突变的核糖核酸酶R的核酸。
本发明的另一方面提供一种表达盒，其特征在于，包含所述重组核酸。
本发明的另一方面提供一种载体，其特征在于，包含所述重组核酸或所述表达盒；优选地，所述载体为表达载体。
本发明的另一方面提供一种细胞，其特征在于，包含所述重组核酸或所述表达盒或所述载体。
本发明的另一方面提供一种重组菌，其特征在于，包含所述重组核酸或所述表达盒或所述载体；优选地，所述菌为大肠杆菌；更优选地，所述大肠杆菌为E. coli BL21(DE3)、E. coli Origami B(DE3)或E. coli Rosetta Blue(DE3)中的一种；最优选地，所述大肠杆菌为E. coli BL21(DE3)。
本发明的另一方面提供一种组合物，其特征在于，包含所述突变的核糖核酸酶R或所述重组核酸或所述表达盒或所述载体或所述细胞或所述重组菌。
本发明的另一方面提供一种试剂盒，其特征在于，包含所述突变的核糖核酸酶R或所述重组核酸或所述表达盒或所述载体或所述细胞或所述重组菌或所述组合物。
本发明的另一方面提供一种制备所述突变的核糖核酸酶R的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）构建含有编码所述突变的核糖核酸酶R的核苷酸序列的载体；
（2）将步骤（1）获得的载体转化至表达菌株细胞中，获得表达菌株；
（3）将步骤（2）获得的表达菌株扩大培养并进行蛋白诱导表达；
（4）收集扩大培养后的表达菌株，并进行洗涤及裂解；
（5）进行蛋白纯化；
（6）进行酶活检测。
进一步地，所述步骤（3）包含将步骤（2）制备获得的表达菌株，在25-37℃下培养至OD600为0.6-1.0，培养基中加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.1-1.5 mM，16-37℃下诱导发酵8-16 h，即可诱导表达所述突变的核糖核酸酶R。
进一步地，所述步骤（4）包含步骤（3）获得的发酵液 8000 rpm 离心 5 min 并弃去上清液，之后用50 mM的PBS重悬菌体并在 8000 rpm 离心 5 min 并弃去上清液，加入PBS重悬细胞，混匀；在冰上超声破碎细胞；将菌体破碎液放入预冷的离心机，4℃、8000 rpm离心 10 min，收集沉淀，并将沉淀复溶于含有500 mM的KCl缓冲液中。
本发明的另一方面提供一种所述突变的核糖核酸酶R的纯化方法，其特征在于，包含如下步骤：将发酵获得的包含所述突变的核糖核酸酶R的粗酶液，利用蛋白纯化系统对所述粗酶液进行镍柱纯化，使用预先用平衡液平衡镍柱，以浓度递增的洗脱液洗脱，收集目标蛋白，再进行电泳分析检测。
本发明的另一方面提供一种所述突变的核糖核酸酶R的酶活检测方法，其特征在于，包含如下步骤：将所述突变的核糖核酸酶（RNase R）通过一系列梯度稀释，将稀释后的RNase R在37°C条件降解10 μg 线性mRNA，1 h后通过凝胶电泳检测，直到电泳检测无明显条带，根据无明显条带的酶的用量来计算所述突变的核糖核酸酶R的酶活。
本发明的另一方面提供所述突变的核糖核酸酶R在mRNA制备领域中的应用。
本发明的另一方面提供所述突变的核糖核酸酶R在降解线性RNA或生产circRNA领域中的应用。
本发明提供的所述突变的核糖核酸酶R及其应用有如下有益的技术效果：
1. 本发明通过对大肠杆菌RNase R位点突变进行创造性地选择和筛选，提供了10种突变的核糖核酸酶R，获得相对于亲本酶活显著提高的突变体T495E、A246E、K457F、A246F、D281F、D122L。其中突变体T495E酶活提高最显著，相对酶活提高了37.48%。位居第二是突变体A246E，相对酶活提高了24.74%。位居第三是突变体K457F，相对酶活提高了21.74%。突变体A246F、D281F相对酶活提高了10%左右。突变体D122L相对酶活提高了不足10%，为6.75%。
2. 本发明方法制备突变的RNase R的方法操作简单快捷，获得的酶稳定性较好。
3. 本发明提供一种高表达RNase R的重组菌株，特别是重组大肠杆菌，用于实现RNase R突变体的高效生产，具有良好的工业应用前景。
4. 本发明提供的突变的核糖核酸酶R，其酶活相对于亲本显著提高，特别适合工业上大规模制备mRNA，尤其是在降解线性RNA或生产circRNA相关领域中的应用，可获得产量和纯度更高的circRNA。
附图说明
图1为本发明pET-28a-RNase R载体图谱，其中RNase R为图中Feature 15；
图2为本发明重组大肠杆菌E. coli BL21（DE3）在不同IPTG终浓度下，表达的核糖核酸酶RNase R全细胞（全菌）及破碎液上清（可溶）蛋白表达量的SDS-PAGE检测结果；
图3为本发明大肠杆菌表达的含有RNase R粗酶液的镍柱层析程序图谱；
图4为本发明镍柱层析不同时间段收集到的出峰成分蛋白含量SDS-PAGE结果；
图5为本发明不同梯度稀释的RNase R降解后残留的线性 EGFP mRNA电泳结果。
具体实施方式
实施例1 亲本RNase R表达载体的构建
通过对大肠杆菌的基因组分析，找到其含有核糖核酸酶RNase R，基因所编码的蛋白序列共含有814个氨基酸残基，属于RNR超家族。RNase R蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，按照大肠杆菌表达进行密码子优化，最终得到DNA序列如SEQ ID NO.2所示，具体序列见表1。将DNA序列交由公司（天霖生物有限公司） 合成并将基因成功构建到pET-28a载体上得到pET-28a-RNase R，其质粒表达图谱如图1所示。
表1 亲本RNase R序列信息
亲本RNase R 序列信息
氨基酸序列 MSQDPFQEREAEKYANPIPSREFILEHLTKREKPASRDELAVELHIEGEEQLEGLRRRLRAMERDGQLVFTRRQCYALPERLDLVKGTVIGHRDGYGFLRVEGRKDDLYLSSEQMKTCIHGDQVLAQPLGADRKGRREARIVRVLVPKTSQIVGRYFTEAGVGFVVPDDSRLSFDILIPPDQIMGARMGFVVVVELTQRPTRRTKAVGKIVEVLGDNMGTGMAVDIALRTHEIPYIWPQAVEQQVAGLKEEVPEEAKAGRVDLRDLPLVTIDGEDARDFDDAVYCEKKRGGGWRLWVAIADVSYYVRPSTPLDREARNRGTSVYFPSQVIPMLPEVLSNGLCSLNPQVDRLCMVCEMTVSSKGRLTGYKFYEAVMSSHARLTYTKVWHILQGDQDLREQYAPLVKHLEELHNLYKVLDKAREERGGISFESEEAKFIFNAERRIERIEQTQRNDAHKLIEECMILANISAARFVEKAKEPALFRIHDKPSTEAITSFRSVLAELGLELPGGNKPEPRDYAELLESVADRPDAEMLQTMLLRSMKQAIYDPENRGHFGLALQSYAHFTSPIRRYPDLTLHRAIKYLLAKEQGHQGNTTETGGYHYSMEEMLQLGQHCSMAERRADEATRDVADWLKCDFMLDQVGNVFKGVISSVTGFGFFVRLDDLFIDGLVHVSSLDNDYYRFDQVGQRLMGESSGQTYRLGDRVEVRVEAVNMDERKIDFSLISSERAPRNVGKTAREKAKKGDAGKKGGKRRQVGKKVNFEPDSAFRGEKKTKPKAAKKDARKAKKPSAKTQKIAAATKAKRAAKKKVAE*（SEQ ID NO:1）
DNA序列 ATGAGTCAGGACCCCTTCCAAGAACGTGAAGCAGAAAAATACGCGAATCCAATCCCCAGCCGTGAGTTCATCTTAGAGCACCTGACAAAACGCGAAAAACCCGCCTCCCGCGACGAACTTGCGGTGGAACTTCATATTGAGGGGGAAGAGCAGCTGGAGGGCCTTCGTCGCCGTCTTCGCGCGATGGAGCGCGATGGTCAATTAGTCTTTACTCGTCGCCAGTGTTACGCTTTGCCTGAACGCCTTGATCTTGTAAAAGGTACCGTGATCGGGCACCGTGATGGATACGGATTCCTTCGTGTAGAAGGTCGTAAAGACGACTTGTATCTGTCTTCAGAACAAATGAAAACGTGTATTCATGGCGATCAGGTACTGGCTCAGCCTTTGGGTGCGGATCGTAAAGGCCGCCGTGAAGCACGCATTGTCCGTGTACTTGTCCCAAAGACATCACAGATCGTTGGGCGTTACTTCACGGAGGCCGGTGTGGGCTTCGTAGTCCCAGACGACTCGCGCTTATCCTTTGACATTTTAATCCCCCCAGATCAGATTATGGGCGCCCGTATGGGTTTCGTTGTTGTTGTTGAGCTGACTCAGCGTCCTACCCGTCGCACTAAGGCTGTGGGCAAAATCGTGGAGGTCCTGGGCGATAATATGGGGACTGGAATGGCCGTGGACATTGCTTTGCGCACGCACGAAATCCCATACATTTGGCCACAGGCGGTTGAGCAACAAGTTGCCGGATTAAAAGAGGAAGTACCGGAAGAGGCAAAGGCGGGGCGTGTAGATCTGCGTGATCTGCCTCTTGTTACAATTGATGGAGAGGATGCGCGTGACTTCGATGACGCAGTTTACTGTGAGAAAAAACGTGGGGGAGGGTGGCGTCTGTGGGTCGCGATCGCCGATGTCTCTTATTATGTTCGCCCAAGCACTCCGCTGGACCGTGAAGCCCGCAATCGTGGCACAAGCGTATATTTTCCATCACAAGTCATCCCTATGCTTCCGGAAGTACTTTCGAACGGATTGTGTTCGTTAAATCCACAGGTTGACCGTTTGTGCATGGTCTGCGAAATGACGGTAAGTTCCAAAGGGCGCCTGACTGGTTACAAATTTTATGAGGCGGTGATGTCATCTCACGCACGTTTAACCTATACTAAGGTTTGGCATATCCTGCAGGGAGATCAAGACTTACGTGAGCAGTATGCCCCACTGGTGAAACACCTTGAGGAACTGCATAACTTGTATAAAGTACTGGATAAGGCACGCGAAGAGCGTGGTGGGATTAGTTTTGAATCCGAGGAAGCCAAATTCATTTTTAACGCTGAGCGCCGCATCGAGCGTATCGAGCAGACACAGCGCAACGACGCACATAAGCTGATCGAAGAGTGCATGATCCTGGCAAATATTTCCGCCGCTCGCTTCGTAGAAAAAGCGAAAGAACCTGCGTTATTTCGTATTCACGACAAGCCCTCGACCGAGGCGATCACCTCATTCCGCTCAGTTCTGGCAGAACTTGGCCTGGAGTTACCTGGAGGCAACAAACCTGAACCGCGCGACTACGCAGAACTGTTAGAGTCAGTAGCTGACCGTCCCGATGCTGAGATGTTACAGACGATGTTACTTCGCAGCATGAAACAGGCTATCTACGACCCGGAAAATCGCGGGCATTTCGGTCTGGCACTGCAGTCTTACGCACATTTTACGTCGCCGATCCGTCGCTATCCCGACCTTACACTGCACCGCGCTATTAAATATTTGTTAGCAAAGGAACAGGGCCATCAAGGTAATACGACCGAGACCGGGGGATACCACTACTCAATGGAGGAAATGTTACAGCTGGGACAGCATTGCAGTATGGCGGAGCGTCGCGCTGACGAGGCCACGCGCGATGTGGCAGATTGGTTGAAGTGCGATTTCATGTTAGACCAGGTTGGCAACGTATTCAAAGGCGTTATCTCTTCAGTTACCGGCTTCGGCTTCTTCGTACGCTTAGATGACCTTTTTATCGATGGGCTTGTACATGTCTCCAGTCTTGACAACGACTACTACCGCTTCGATCAAGTAGGGCAACGTTTAATGGGGGAATCTTCGGGGCAGACGTATCGTTTGGGCGATCGTGTAGAAGTACGCGTCGAAGCGGTAAATATGGACGAACGTAAGATCGATTTTTCGCTTATCTCTAGCGAACGTGCACCCCGTAACGTGGGGAAAACAGCTCGCGAGAAGGCTAAGAAAGGCGATGCCGGGAAAAAGGGGGGCAAACGCCGCCAAGTTGGCAAGAAGGTCAATTTCGAGCCAGACTCCGCATTCCGTGGGGAGAAGAAAACGAAACCAAAAGCAGCCAAAAAAGATGCGCGTAAGGCCAAGAAACCGTCTGCTAAAACCCAAAAGATTGCTGCCGCAACCAAGGCTAAACGCGCGGCAAAAAAAAAGGTGGCGGAATGA（SEQ ID NO:2）
实施例 2 大肠杆菌诱导表达核糖核酸酶RNase R
将实施例1含有合成的pET-28a-RNase R的大肠杆菌E. coli JM109菌株接种于含有50 mg/L卡那霉素的LB液体培养基进行培养，然后提取质粒，得到重组质粒pET-28a-RNase R。将重组表达载体pET-28a-RNase R转化至感受态细胞E. coli BL21（DE3）中，进行阳性克隆筛选。
将筛选得到的重组菌株E. coli BL21（DE3），利用IPTG诱导表达。将重组菌接种至LB培养基中，37 ℃下培养至OD600为1.8 - 2.2，随后，对细胞培养液离心收集菌体，离心条件为8000 g 5 min，随后，加入LB培养基对细胞重悬，重悬细胞OD600为0.9-1.1，同时向培养基中加入IPTG至终浓度为0.5 mM，25℃下诱导发酵8 h。离心，收集菌体沉淀，超声波破碎，进行SDS-PAGE电泳分析，目标蛋白RNase R其分子量约为92 kDa。重组大肠杆菌E. coli BL21（DE3）在不同IPTG终浓度下，表达的核糖核酸酶RNase R全细胞（全菌）及破碎液上清（可溶）蛋白表达量的SDS-PAGE检测结果如图2所示，电泳图的泳道从左到右依次为，1泳道Marker，2泳道BL21-pET28a+RNase-R-1-25°C- 0 IPTG全菌，3泳道BL21-pET28a+RNase-R-1-25°C- 0.1% IPTG可溶，4泳道BL21-pET28a+RNase-R-1-25°C- 0.1% IPTG全菌，5泳道BL21-pET28a+RNase-R-1-25°C- 0.1% IPTG可溶，6泳道BL21-pET28a+RNase-R-1-25°C-0.5% IPTG全菌，7泳道BL21-pET28a+RNase-R-1-25°C- 0.5% IPTG可溶，8泳道BL21-pET28a+RNase-R-1-25°C- 1.0% IPTG全菌，9泳道BL21-pET28a+RNase-R-1-25°C- 1.0% IPTG可溶，泳道中RNase-R-1的-1代表单克隆菌株编号。结果显示，目标蛋白RNase R在该条件下（IPTG终浓度为0.5 mM，对应泳道6，即0.5% IPTG）有较好的表达，可以进行批量发酵制备菌体。
实施例3 核糖核酸酶RNase R镍柱纯化及凝胶柱脱盐
重组大肠杆菌 BL21（DE3）/pET28a-RNase R 诱导表达蛋白时，目的蛋白最终分布在细胞内，获取目的蛋白首先要将细胞破碎。 将发酵液倒入 50 ml 离心管中，8000 rpm离心 5 min 并弃去上清液，之后用50 mM的PBS重悬菌体并在 8000 rpm 离心 5 min 并弃去上清液，加入PBS重悬细胞，可用移液枪吹打均匀。 超声破碎细胞过程中菌体应该放在冰上，超声波细胞粉碎机条件设置为：变幅杆6 mm，时间 60 min，50 mL 菌体悬浮液并保证探头靠近但不接触底部。将菌体破碎液放入预冷的离心机，4℃、8000 rpm 离心 10 min，收集沉淀，并将沉淀复溶于含有500 mM的KCl缓冲液中。随后，粗酶液样品纯化前使用0.45 μm的滤膜（赛多利斯厂家）滤除样品中的不溶性杂质。
大肠杆菌含有RNase R粗酶液纯化。利用 AKTA 蛋白纯化系统对RNase R粗酶液进行 Ni 柱（纳微，77105-60042-531800）纯化。平衡：使用预先用Buffer A（50 mM NaH2PO4,0.5 M NaCl，pH 8.0）平衡的 Ni-NTA 柱，Buffer A（50 mM NaH2PO4, 0.5 M NaCl，pH 8.0）冲洗5 CV（柱体积），待所有基线平衡后，上样：取KCl缓冲液复溶过膜处理后样品进行上样，收集流穿样品。洗涤：平衡液Buffer A（50 mM NaH2PO4, 0.5 M NaCl，pH 8.0）冲洗10 CV，至基线、pH、电导率平稳。洗脱：Buffer B（50 mM NaH2PO4, 0.5 M NaCl，0.5 M 咪唑，pH 8.0）洗脱液0-50%梯度洗脱，冲洗体积30 CV，收集样品峰，留样检测。洗脱：100% Buffer B（50mM NaH2PO4, 0.5 M NaCl，0.5 M 咪唑，pH 8.0）洗脱液冲洗5 CV，并在 280 nm 处进行监测，收集样品峰，留样检测。大肠杆菌表达的含有RNase R粗酶液的镍柱层析程序图谱如图3所示。
纯化样品SDS-PAGE检测。样品与蛋白Loading Buffer （SDS，DTT和溴酚蓝）按比例混匀，使最终样品的蛋白Loading Buffer 浓度不低于1 X，98℃或沸水浴变性10 min。随后，安装电泳槽和胶板（去封口胶带），倒入电泳缓冲液，内槽应充溢，外槽液面应高于电极丝。 缓慢拔除预制胶的梳子，取针筒吸取缓冲液，逐个伸入胶孔中吹去甘油。 点样，合上槽盖，通电，80 V 电压下电泳~40 分钟，至样品压缩成线。 升高电压值120 V 继续电泳，至指示带靠近或抵达凝胶底端。以蛋白染色仪对电泳完的凝胶进行染色、脱色，设置程序为Stain 3 min；Destain 2 min；Destain 1 min。将凝胶转移至凝胶成像系统内，成像、修饰图像、设置泳道、标注泳道，并进行相应分析。镍柱层析不同时间段收集到的出峰成分蛋白含量SDS-PAGE结果如图4所示，电泳图的泳道从左到右依次为，1泳道LC1A01 30μl，2泳道RNase-R-2 30μl，3泳道marker，4泳道XT1A07 30μl，5泳道XT1A08 30μl，6泳道XT1A09 30μl，7泳道XT1A11 30μl，8泳道XT1A12 30μl，9泳道XT1B12 30μl，10泳道XT1B11 30μl，泳道中RNase-R-2的-2代表单克隆菌株编号。结果表明：洗脱的目标蛋白RNase R可以通过一步镍柱纯化获得较多纯化产物。
纯化样品通过凝胶柱（纳微，77105-60011-003400）去除咪唑。将镍柱洗脱的下来得到的包含目标蛋白的蛋白样品混合做为凝胶柱上样的样品。利用 AKTA 蛋白纯化系统对纯化后的酶液去除咪唑。平衡：使用预先用Buffer A平衡的凝胶柱柱，Buffer A冲洗5 CV，带所有基线平衡后，上样：镍柱纯化后的样品进行上样，收集流穿样品，待电导率升高后停止收集，随后，用Buffer A冲凝胶柱，待所有基线平衡后，重新进行上样，直到所有样品均完成去除咪唑的处理，随后，利用超滤管对收集到样品进行超滤浓缩即得到RNase R酶液。
实施例4 RNase R酶液的酶活检测
RNase R酶液的酶活检测。RNase R酶活定义；在20 mM Tris-HCl（pH7.5），100 mMKCl，0.5 mM Mg2+条件下, 37°C下水解1 μg的线性mRNA产物所需酶量为1个活性单位。以线性 EGFP mRNA作为样品示例（不限于线性EGFP mRNA样品，可以为任意的线性mRNA样品），将制备得到的RNase R通过一系列梯度稀释，将稀释后的RNase R在37°C条件降解10 μg 线性EGFP mRNA，1 h后通过凝胶电泳检测，不同梯度稀释的RNase R降解后残留的线性 EGFPmRNA电泳结果如图5所示，电泳图的泳道从左到右依次为，1泳道DL 5000 Marker，2泳道对照（对照即没有添加RNase R的线性EGFP mRNA），3泳道0.01 μL RNase R-mRNA，4泳道0.05μL RNase R-mRNA，5泳道0.1 μL RNase R-mRNA，6泳道0.15 μL RNase R-mRNA，7泳道0.2 μL RNase R-mRNA，8泳道0.25 μL RNase R-mRNA，9泳道0.3 μL RNase R-mRNA，泳道3-9中的mRNA指线性EGFP mRNA样品。在添加0.25 μL的酶液在37°C条件下催化1 h，可以完全降解10μg的mRNA到最终跑胶无明显条带，最终根据最终酶的用量来得出制备的得到亲本酶RNaseR的酶活为6.67 U/μL。
实施例5 RNase R突变体构建及酶活检测酶液的酶活检测
5.1 大肠杆菌核糖核酸酶RNase R突变体的构建
利用PCR技术，根据实施例1所扩增得到的亲本酶RNase R基因序列（DNA核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示），分别设计并合成针对亲本的D122L、K205L、A246E、A246F、D281F、D281Y、K457F、T495E、L610W、V687N突变的引物对大肠杆菌RNase R基因进行定点突变(小写字母为突变碱基)，PCR所用引物如表2所示。RNase R突变体的氨基酸序列如表3所示。核糖核酸酶RNase R突变体D122L的氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示，突变体K205L的氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示，突变体A246E的氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示，突变体A246F的氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示，突变体D281F的氨基酸序列如SEQ ID NO:27所示，突变体D281Y的氨基酸序列如SEQ ID NO:28所示，突变体K457F的氨基酸序列如SEQ ID NO:29所示，突变体T495E的氨基酸序列如SEQ ID NO:30所示，突变体L610W的氨基酸序列如SEQ IDNO:31所示，突变体V687N的氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示。
PCR反应体系均为：正向引物(10 μM) 2 μL，反向引物(10 μM) 2 μL，模板DNA 1 μL，NEBNext Ultra II Q5 Master Mix（厂家NEB,10135601）25 μL，加入双蒸水至50 μL。
PCR扩增条件为：98℃预变性3 min；随后30个循环(98℃ 10 s，55℃ 15 s，72℃ 5min)；72℃继续延伸10 min。PCR产物经验证正确后，用DpnⅠ消化后转化至大肠杆菌Tans10感受态，将感受态细胞在LB固体培养基(含50mg/L kana)培养过夜后，挑克隆于含50 mg/Lkana的LB液体培养基培养后提取质粒，将突变质粒转化表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，所有突变质粒均测序正确。获得重组菌株，分别命名为D122L、K205L、A246E、A246F、D281F、D281Y、K457F、T495E、L610W、V687N。
表2 RNase R突变体构建引物列表
引物名称 引物序列（5‘-3’）
D122L-F CGTGTATTCATGGCcttCAGGTACTGGCTC（SEQ ID NO:3）
D122L-R GAGCCAGTACCTGaagGCCATGAATACACG（SEQ ID NO:4）
K205L-F CGTCCTACCCGTCGCACTcttGCTGTGGGCAAAATC（SEQ ID NO:5）
K205L-R GATTTTGCCCACAGCaagAGTGCGACGGGTAGGACG（SEQ ID NO:6）
A246E-F GCGGTTGAGCAACAAGTTgaaGGATTAAAAGAGGAAGTAC（SEQ ID NO:7）
A246E-R GTACTTCCTCTTTTAATCCttcAACTTGTTGCTCAACCGC（SEQ ID NO:8）
A246F-F CACAGGCGGTTGAGCAACAAGTTtttGGATTAAAAGAGGAAGTAC（SEQ ID NO:9）
A246F-R GTACTTCCTCTTTTAATCCaaaAACTTGTTGCTCAACCGCCTGTG（SEQ ID NO:10）
D281F-F GAGGATGCGCGTGACTTCGATtttGCAGTTTACTGTGAGAAAAAAC（SEQ ID NO:11）
D281F-R GTTTTTTCTCACAGTAAACTGCaaaATCGAAGTCACGCGCATCCTC（SEQ ID NO:12）
D281Y-F GATGCGCGTGACTTCGATtatGCAGTTTACTGTGAGAAAAAAC（SEQ ID NO:13）
D281Y-R GTTTTTTCTCACAGTAAACTGCataATCGAAGTCACGCGCATC（SEQ ID NO:14）
K457F-F CACAGCGCAACGACGCACATtttCTGATCGAAGAGTGCATGATC（SEQ ID NO:15）
K457F-R GATCATGCACTCTTCGATCAGaaaATGTGCGTCGTTGCGCTGTG（SEQ ID NO:16）
T495E-F GATCATGCACTCTTCGATCAGaaaATGTGCGTCGTTGCGCTGTG（SEQ ID NO:17）
T495E-R GATCATGCACTCTTCGATCAGaaaATGTGCGTCGTTGCGCTGTG（SEQ ID NO:18）
L610W-F CACTACTCAATGGAGGAAATGtggCAGCTGGGACAGCATTGC（SEQ ID NO:19）
L610W-R GCAATGCTGTCCCAGCTGccaCATTTCCTCCATTGAGTAGTG（SEQ ID NO:20）
V687N-F GACTACTACCGCTTCGATCAAaatGGGCAACGTTTAATGGG（SEQ ID NO:21）
V687N-R CCCATTAAACGTTGCCCattTTGATCGAAGCGGTAGTAGTC（SEQ ID NO:22）
表3 RNase R突变体的氨基酸序列
RNase R突变体 氨基酸序列
D122L MSQDPFQEREAEKYANPIPSREFILEHLTKREKPASRDELAVELHIEGEEQLEGLRRRLRAMERDGQLVFTRRQCYALPERLDLVKGTVIGHRDGYGFLRVEGRKDDLYLSSEQMKTCIHGLQVLAQPLGADRKGRREARIVRVLVPKTSQIVGRYFTEAGVGFVVPDDSRLSFDILIPPDQIMGARMGFVVVVELTQRPTRRTKAVGKIVEVLGDNMGTGMAVDIALRTHEIPYIWPQAVEQQVAGLKEEVPEEAKAGRVDLRDLPLVTIDGEDARDFDDAVYCEKKRGGGWRLWVAIADVSYYVRPSTPLDREARNRGTSVYFPSQVIPMLPEVLSNGLCSLNPQVDRLCMVCEMTVSSKGRLTGYKFYEAVMSSHARLTYTKVWHILQGDQDLREQYAPLVKHLEELHNLYKVLDKAREERGGISFESEEAKFIFNAERRIERIEQTQRNDAHKLIEECMILANISAARFVEKAKEPALFRIHDKPSTEAITSFRSVLAELGLELPGGNKPEPRDYAELLESVADRPDAEMLQTMLLRSMKQAIYDPENRGHFGLALQSYAHFTSPIRRYPDLTLHRAIKYLLAKEQGHQGNTTETGGYHYSMEEMLQLGQHCSMAERRADEATRDVADWLKCDFMLDQVGNVFKGVISSVTGFGFFVRLDDLFIDGLVHVSSLDNDYYRFDQVGQRLMGESSGQTYRLGDRVEVRVEAVNMDERKIDFSLISSERAPRNVGKTAREKAKKGDAGKKGGKRRQVGKKVNFEPDSAFRGEKKTKPKAAKKDARKAKKPSAKTQKIAAATKAKRAAKKKVAE*（SEQ IDNO:23）
K205L MSQDPFQEREAEKYANPIPSREFILEHLTKREKPASRDELAVELHIEGEEQLEGLRRRLRAMERDGQLVFTRRQCYALPERLDLVKGTVIGHRDGYGFLRVEGRKDDLYLSSEQMKTCIHGDQVLAQPLGADRKGRREARIVRVLVPKTSQIVGRYFTEAGVGFVVPDDSRLSFDILIPPDQIMGARMGFVVVVELTQRPTRRTLAVGKIVEVLGDNMGTGMAVDIALRTHEIPYIWPQAVEQQVAGLKEEVPEEAKAGRVDLRDLPLVTIDGEDARDFDDAVYCEKKRGGGWRLWVAIADVSYYVRPSTPLDREARNRGTSVYFPSQVIPMLPEVLSNGLCSLNPQVDRLCMVCEMTVSSKGRLTGYKFYEAVMSSHARLTYTKVWHILQGDQDLREQYAPLVKHLEELHNLYKVLDKAREERGGISFESEEAKFIFNAERRIERIEQTQRNDAHKLIEECMILANISAARFVEKAKEPALFRIHDKPSTEAITSFRSVLAELGLELPGGNKPEPRDYAELLESVADRPDAEMLQTMLLRSMKQAIYDPENRGHFGLALQSYAHFTSPIRRYPDLTLHRAIKYLLAKEQGHQGNTTETGGYHYSMEEMLQLGQHCSMAERRADEATRDVADWLKCDFMLDQVGNVFKGVISSVTGFGFFVRLDDLFIDGLVHVSSLDNDYYRFDQVGQRLMGESSGQTYRLGDRVEVRVEAVNMDERKIDFSLISSERAPRNVGKTAREKAKKGDAGKKGGKRRQVGKKVNFEPDSAFRGEKKTKPKAAKKDARKAKKPSAKTQKIAAATKAKRAAKKKVAE*（SEQ IDNO:24）
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T495E MSQDPFQEREAEKYANPIPSREFILEHLTKREKPASRDELAVELHIEGEEQLEGLRRRLRAMERDGQLVFTRRQCYALPERLDLVKGTVIGHRDGYGFLRVEGRKDDLYLSSEQMKTCIHGDQVLAQPLGADRKGRREARIVRVLVPKTSQIVGRYFTEAGVGFVVPDDSRLSFDILIPPDQIMGARMGFVVVVELTQRPTRRTKAVGKIVEVLGDNMGTGMAVDIALRTHEIPYIWPQAVEQQVAGLKEEVPEEAKAGRVDLRDLPLVTIDGEDARDFDDAVYCEKKRGGGWRLWVAIADVSYYVRPSTPLDREARNRGTSVYFPSQVIPMLPEVLSNGLCSLNPQVDRLCMVCEMTVSSKGRLTGYKFYEAVMSSHARLTYTKVWHILQGDQDLREQYAPLVKHLEELHNLYKVLDKAREERGGISFESEEAKFIFNAERRIERIEQTQRNDAHKLIEECMILANISAARFVEKAKEPALFRIHDKPSTEAIESFRSVLAELGLELPGGNKPEPRDYAELLESVADRPDAEMLQTMLLRSMKQAIYDPENRGHFGLALQSYAHFTSPIRRYPDLTLHRAIKYLLAKEQGHQGNTTETGGYHYSMEEMLQLGQHCSMAERRADEATRDVADWLKCDFMLDQVGNVFKGVISSVTGFGFFVRLDDLFIDGLVHVSSLDNDYYRFDQVGQRLMGESSGQTYRLGDRVEVRVEAVNMDERKIDFSLISSERAPRNVGKTAREKAKKGDAGKKGGKRRQVGKKVNFEPDSAFRGEKKTKPKAAKKDARKAKKPSAKTQKIAAATKAKRAAKKKVAE*（SEQ IDNO:30）
L610W MSQDPFQEREAEKYANPIPSREFILEHLTKREKPASRDELAVELHIEGEEQLEGLRRRLRAMERDGQLVFTRRQCYALPERLDLVKGTVIGHRDGYGFLRVEGRKDDLYLSSEQMKTCIHGDQVLAQPLGADRKGRREARIVRVLVPKTSQIVGRYFTEAGVGFVVPDDSRLSFDILIPPDQIMGARMGFVVVVELTQRPTRRTKAVGKIVEVLGDNMGTGMAVDIALRTHEIPYIWPQAVEQQVAGLKEEVPEEAKAGRVDLRDLPLVTIDGEDARDFDDAVYCEKKRGGGWRLWVAIADVSYYVRPSTPLDREARNRGTSVYFPSQVIPMLPEVLSNGLCSLNPQVDRLCMVCEMTVSSKGRLTGYKFYEAVMSSHARLTYTKVWHILQGDQDLREQYAPLVKHLEELHNLYKVLDKAREERGGISFESEEAKFIFNAERRIERIEQTQRNDAHKLIEECMILANISAARFVEKAKEPALFRIHDKPSTEAITSFRSVLAELGLELPGGNKPEPRDYAELLESVADRPDAEMLQTMLLRSMKQAIYDPENRGHFGLALQSYAHFTSPIRRYPDLTLHRAIKYLLAKEQGHQGNTTETGGYHYSMEEMWQLGQHCSMAERRADEATRDVADWLKCDFMLDQVGNVFKGVISSVTGFGFFVRLDDLFIDGLVHVSSLDNDYYRFDQVGQRLMGESSGQTYRLGDRVEVRVEAVNMDERKIDFSLISSERAPRNVGKTAREKAKKGDAGKKGGKRRQVGKKVNFEPDSAFRGEKKTKPKAAKKDARKAKKPSAKTQKIAAATKAKRAAKKKVAE*（SEQ IDNO:31）
V687N MSQDPFQEREAEKYANPIPSREFILEHLTKREKPASRDELAVELHIEGEEQLEGLRRRLRAMERDGQLVFTRRQCYALPERLDLVKGTVIGHRDGYGFLRVEGRKDDLYLSSEQMKTCIHGDQVLAQPLGADRKGRREARIVRVLVPKTSQIVGRYFTEAGVGFVVPDDSRLSFDILIPPDQIMGARMGFVVVVELTQRPTRRTKAVGKIVEVLGDNMGTGMAVDIALRTHEIPYIWPQAVEQQVAGLKEEVPEEAKAGRVDLRDLPLVTIDGEDARDFDDAVYCEKKRGGGWRLWVAIADVSYYVRPSTPLDREARNRGTSVYFPSQVIPMLPEVLSNGLCSLNPQVDRLCMVCEMTVSSKGRLTGYKFYEAVMSSHARLTYTKVWHILQGDQDLREQYAPLVKHLEELHNLYKVLDKAREERGGISFESEEAKFIFNAERRIERIEQTQRNDAHKLIEECMILANISAARFVEKAKEPALFRIHDKPSTEAITSFRSVLAELGLELPGGNKPEPRDYAELLESVADRPDAEMLQTMLLRSMKQAIYDPENRGHFGLALQSYAHFTSPIRRYPDLTLHRAIKYLLAKEQGHQGNTTETGGYHYSMEEMLQLGQHCSMAERRADEATRDVADWLKCDFMLDQVGNVFKGVISSVTGFGFFVRLDDLFIDGLVHVSSLDNDYYRFDQNGQRLMGESSGQTYRLGDRVEVRVEAVNMDERKIDFSLISSERAPRNVGKTAREKAKKGDAGKKGGKRRQVGKKVNFEPDSAFRGEKKTKPKAAKKDARKAKKPSAKTQKIAAATKAKRAAKKKVAE*（SEQ IDNO:32）
5.2 大肠杆菌核糖核酸酶RNase R突变体的表达和纯化
将步骤5.1构建好的RNase R突变体表达工程菌株按照实施例2进行突变的RNaseR的表达和实施例3进行RNase R突变体的纯化，最终获得纯化的RNase R突变酶。
5.3 大肠杆菌核糖核酸酶RNase R突变体的酶活检测
按照实施例4的方法对突变体的酶活进行检测，野生型亲本大肠杆菌RNase R(WT)和突变体对mRNA的降解能力，其降解活性列于表4，结果表明，10个核糖核酸酶RNase R突变体，D122L、K205L、A246E、A246F、D281F、D281Y、K457F、T495E、L610W、V687N的酶活相对于野生型，分别提高了6.75%、 -8.28%、 24.74%、 10.04%、10.34%、 -4.95%、 21.74%、 37.48%、-23.24%、 -8.1%（其中-负值代表降低）。由此可见，10个RNase R突变体中T495E突变体酶活提高最显著，相对酶活提高了37.48%。位居第二是突变体A246E，相对酶活提高了24.74%。位居第三是突变体K457F，相对酶活提高了21.74%。突变体A246F、D281F相对酶活提高了10%左右。突变体D122L相对酶活提高了不足10%，为6.75%。而对于突变体K205L、D281Y、L610W、V687N效果不佳，其相对酶活均有不同程度的下降。其中，对于D281F、D281Y，同一突变位点的不同类型突变，效果不同，D281F相对酶活提高，D281Y相对酶活降低。由此可见，本发明通过对大肠杆菌核糖核酸酶RNase R位点以及突变后的氨基酸类型进行创造性地选择和筛选，获得相对于亲本酶活显著提高的突变体T495E、A246E、K457F、A246F、D281F、D122L。
表4野生型大肠杆菌RNase R和多突变体酶的相对酶活
酶 酶活（U/μL） 相对酶活（%）
WT 6.67 100.00
D122L 7.12 106.75
K205L 6.12 91.75
A246E 8.32 124.74
A246F 7.34 110.04
D281F 7.36 110.34
D281Y 6.34 95.05
K457F 8.12 121.74
T495E 9.17 137.48
L610W 5.12 76.76
V687N 6.13 91.90
本公开的上述实施例仅是为清楚地说明本公开所作的举例，而并非是对本公开的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本公开的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本公开权利要求的保护范围之内。

Claims (17)

1.一种突变的核糖核酸酶R，其特征在于，在亲本核糖核酸酶R的基础上包含突变，所述突变包含T495E，A246E，K457F，A246F，D281F，或D122L，所述亲本核糖核酸酶R的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.根据权利要求1所述的突变的核糖核酸酶R，其特征在于，所述突变的核糖核酸酶R为突变体T495E，A246E，K457F，A246F，D281F，或D122L，所述突变体T495E的氨基酸序列如SEQID NO:30所示，突变体A246E的氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示，突变体K457F的氨基酸序列如SEQ ID NO:29所示，突变体A246F的氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示，突变体D281F的氨基酸序列如SEQ ID NO:27所示，突变体D122L的氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示。
3.根据权利要求1或2所述的突变的核糖核酸酶R，其特征在于，所述亲本核糖核酸酶R的DNA序列如SEQ ID NO.2所示。
4.一种重组核酸，其特征在于，包含编码权利要求1-3任一项所述突变的核糖核酸酶R的核酸。
5.一种表达盒，其特征在于，包含权利要求4所述的重组核酸。
6.一种载体，其特征在于，包含权利要求4所述的重组核酸、或权利要求5所述的表达盒；优选地，所述载体为表达载体。
7.一种细胞，其特征在于，包含权利要求4所述的重组核酸、或权利要求5所述的表达盒、或权利要求6所述的载体。
8.一种重组菌，其特征在于，包含权利要求4所述的重组核酸、或权利要求5所述的表达盒、或权利要求6所述的载体；优选地，所述菌为大肠杆菌；更优选地，所述大肠杆菌为E. coli BL21(DE3)、E. coli Origami B(DE3)或E. coli Rosetta Blue(DE3)中的一种；最优选地，所述大肠杆菌为E. coli BL21(DE3)。
9.一种组合物，其特征在于，包含权利要求1-3任一项所述突变的核糖核酸酶R、或权利要求4所述的重组核酸、或权利要求5所述的表达盒、或权利要求6所述的载体、或权利要求7所述的细胞、或权利要求8所述的重组菌。
10.一种试剂盒，其特征在于，包含权利要求1-3任一项所述突变的核糖核酸酶R、或权利要求4所述的重组核酸、或权利要求5所述的表达盒、或权利要求6所述的载体、或权利要求7所述的细胞、或权利要求8所述的重组菌、或权利要求9所述的组合物。
11.一种制备权利要求1-3任一项所述突变的核糖核酸酶R的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）构建含有编码所述突变的核糖核酸酶R的核苷酸序列的载体；
（2）将步骤（1）获得的载体转化至表达菌株细胞中，获得表达菌株；
（3）将步骤（2）获得的表达菌株扩大培养并进行蛋白诱导表达；
（4）收集扩大培养后的表达菌株，并进行洗涤及裂解；
（5）进行蛋白纯化；
（6）进行酶活检测。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述步骤（3）包含将步骤（2）制备获得的表达菌株，在25-37℃下培养至OD600为0.6-1.0，培养基中加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度为0.1-1.5 mM，16-37℃下诱导发酵8-16 h，即可诱导表达所述突变的核糖核酸酶R。
13.根据权利要求11或12所述的方法，其特征在于，所述步骤（4）包含将步骤（3）获得的发酵液 8000 rpm 离心 5 min 并弃去上清液，之后用50 mM的PBS重悬菌体并在 8000 rpm离心 5 min 并弃去上清液，加入PBS重悬细胞，混匀；在冰上超声破碎细胞；将菌体破碎液放入预冷的离心机，4℃、8000 rpm 离心 10 min，收集沉淀，并将沉淀复溶于含有500 mM的KCl缓冲液中。
14.一种权利要求1-3任一项所述突变的核糖核酸酶R的纯化方法，其特征在于，包含如下步骤：将发酵获得的包含所述突变的核糖核酸酶R的粗酶液，利用蛋白纯化系统对所述粗酶液进行镍柱纯化，使用预先用平衡液平衡的镍柱，以浓度递增的洗脱液洗脱，收集目标蛋白，再进行电泳分析检测。
15.一种权利要求1-3任一项所述突变的核糖核酸酶R的酶活检测方法，其特征在于，包含如下步骤：将所述突变的核糖核酸酶R通过一系列梯度稀释，将稀释后的所述突变的核糖核酸酶R在37°C条件降解10 μg 线性mRNA，1 h后通过凝胶电泳检测，直到电泳检测无明显条带，根据无明显条带的酶的用量来计算所述突变的核糖核酸酶R的酶活。
16.权利要求1-3任一项所述突变的核糖核酸酶R在mRNA制备领域中的应用。
17.权利要求1-3任一项所述突变的核糖核酸酶R在降解线性RNA或生产circRNA领域中的应用。
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