CN109055327B

CN109055327B - 醛酮还原酶突变体及其应用

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Publication number: CN109055327B
Application number: CN201810812118.2A
Authority: CN
Inventors: 王亚军; 沈炜; 喻寒; 柳志强; 郑裕国
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2018-07-23
Filing date: 2018-07-23
Publication date: 2021-04-06
Anticipated expiration: 2038-07-23
Also published as: CN109055327A

Abstract

本发明公开了一种醛酮还原酶突变体及其在不对称还原6‑氰基‑(5R)‑羟基‑3‑羰基己酸叔丁酯制备6‑氰基‑(3R,5R)‑二羟基己酸叔丁酯中的应用，所述醛酮还原酶突变体是将SEQ ID No.2所示氨基酸第125位、30位、212位、63位进行单突变或多突变获得的。本发明制备的醛酮还原酶突变体pKlAKR‑I125V‑S30P‑Q212R‑I63W的比酶活较母本醛酮还原酶提升了1.31倍，最大底物6‑氰基‑(5R)‑羟基‑3‑羰基己酸叔丁酯投料达到80g/L，该醛酮还原酶突变体更具工业应用前景。

Description

醛酮还原酶突变体及其应用

技术领域

本发明涉及醛酮还原酶KlAKR突变体构建，开发醛酮还原酶重组菌和酶在阿托伐他汀侧链6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯手性生物合成方面的应用。

背景技术

心脑血管疾病已经成为危害人类健康的主要疾病之一，心脑血管疾病发病与人体血液中胆固醇水平有密切关系。阿托伐他汀钙能竞争性抑制肝脏内胆固醇合成的关键限速酶—3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶的活性，减少胆固醇的合成，降低血液低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和甘油三酯浓度，是全球唯一累计销售额超过1000亿美元的单一降脂药品种。

6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯是阿托伐他汀钙合成的重要双手性二醇中间体，也是关键的药效基团。由于各国药监部门对药物手性纯度设置严苛的限制(e.e.值>99％，d.e.值>99％)，6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯的合成技术成为阿托伐他汀钙合成的关键核心技术。传统的6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯化学合成工艺从酮酸(酯)出发，通过硼烷不对称加氢还原构建手性中心，反应路线复杂，需要使用易燃易爆的硼烷等试剂以及苛刻的反应条件，产物光学纯度低、得率低，过程能耗大、反应废弃物处理困难，属于非环境友好型生产方式。利用氧化还原酶不对称还原潜手性酮合成手性醇具有选择性高、反应条件温和、环境友好等技术优势，制造过程的经济性高，且符合绿色化学的要求。因此，开发生物不对称还原6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯合成6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯技术具有巨大的经济效益和社会效益。

醛酮还原酶超家族是一类NAD(P)H依赖型的氧化还原酶，醛酮还原酶通常为约320个氨基酸组成单亚基蛋白，大小为34-37kDa，具有(α/β)₈筒状结构，其催化四联体由酪氨酸、组氨酸、天冬氨酸和赖氨酸组成，底物谱宽，包括脂肪族、芳香族醛、酮、单糖等。

我们从乳酸克鲁维酵母Kluyveromyces lactis CCTCC M 2014380中克隆得到的醛酮还原酶KlAKR，并在大肠杆菌(Escherichia coli)实现异源过量表达，该酶能够催化6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯不对称还原合成6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯，且de值大于99％，但该酶对6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯的活力不够高，通过定点突变技术获得了一株优势突变株KlAKR-Y295W-W296L已在专利申请(201610124451.5)中公开，能够在不添加外源型辅酶NADPH的情况下，80分钟内完全转化50g/L的底物，但发现该酶的活力、稳定性、底物投料量还有提升空间，本专利借鉴已报道的醛酮还原酶晶体结构信息，运用同源建模和分子模拟技术手段，确定KlAKR的空间结构、酶活性口袋附近的氨基酸位点，以及可能的底物进入、产物释放通道等，通过蛋白质工程技术提高醛酮还原酶对6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯的催化活力及底物负载，具有工业应用价值。

发明内容

本发明目的是针对现有醛酮还原酶对6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯不对称还原活性不高及底物浓度低的问题，提供一种立体选择性醛酮还原酶突变体及利用该醛酮还原酶突变体基因重组菌及其粗酶液作为生物催化剂，用于6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯手性生物合成，催化剂的活性提高了1.31倍，底物浓度提高了60％。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种醛酮还原酶突变体，所述醛酮还原酶突变体是将SEQ ID No.2所示氨基酸第125位、30位、212位、63位进行单突变或多突变获得的。SEQ ID No.2所示氨基酸为母本醛酮还原酶KlAKR，其核苷酸序列为SEQ ID No.1所示。

进一步，优选所述醛酮还原酶突变体为下列之一：(1)将SEQ ID No.2所示氨基酸第125位异亮氨酸突变为亮氨酸(pKlAKR-I125L)或缬氨酸(pKlAKR-I125V)；(2)将SEQ IDNo.2所示氨基酸第125位异亮氨酸突变为缬氨酸，同时第30位丝氨酸突变为丙氨酸(pKlAKR-I125V-S30A)、组氨酸(pKlAKR-I125V-S30H)或脯氨酸(pKlAKR-I125V-S30P)；(3)将SEQ ID No.2所示氨基酸第125位异亮氨酸突变为缬氨酸，且第212位谷氨酰胺突变为精氨酸(pKlAKR-I125V-Q212R)或天冬酰胺(pKlAKR-I125V-Q212N)；(4)将SEQ ID No.2所示氨基酸第125位异亮氨酸突变为缬氨酸，同时第30位丝氨酸突变为脯氨酸，且第212位谷氨酰胺突变为精氨酸(pKlAKR-I125V-S30P-Q212R)或天冬酰胺(pKlAKR-I125V-S30P-Q212N)；(5)将SEQ ID No.2所示氨基酸第125位异亮氨酸突变为缬氨酸，同时第30位丝氨酸突变为丙氨酸，且第212位谷氨酰胺突变为精氨酸(pKlAKR-I125V-S30A-Q212R)；(6)将SEQ IDNo.2所示氨基酸第125位异亮氨酸突变为缬氨酸，同时第30位丝氨酸突变为脯氨酸，且第212位谷氨酰胺突变为精氨酸，第63位异亮氨酸突变为色氨酸(pKlAKR-I125V-S30P-Q212R-I63W)。

进一步，更所述醛酮还原酶突变体是将SEQ ID No.2所示氨基酸第125位异亮氨酸突变为缬氨酸，同时第30位丝氨酸突变为脯氨酸，且第212位谷氨酰胺突变为精氨酸，第63位异亮氨酸突变为色氨酸。

本发明还涉及醛酮还原酶突变体的编码基因、重组载体及工程菌。优选重组表达载体pET-28b(+)；宿主细胞优选大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，通过蛋白诱导表达、细胞破碎获得粗酶液，催化特性均优于母本醛酮还原酶。

本发明还提供一种所述醛酮还原酶突变体在不对称还原6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯制备6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯中的应用，具体所述的应用方法为：将含醛酮还原酶突变体基因的重组基因工程菌经诱导培养获得的湿菌体和含葡萄糖脱氢酶基因的工程菌经诱导培养获得的湿菌体混合后用pH 7.5、100mM的磷酸盐缓冲液重悬后超声破碎，取破碎混合液为催化剂，以6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯为底物，以葡萄糖为辅底物构成反应体系，在30℃、150-300转/分钟条件下进行反应，反应结束，反应液分离纯化，获得6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯；所述葡萄糖脱氢酶基因核苷酸序列为SEQ ID No.3(所示编码蛋白氨基酸序列为SEQ ID No.4)。

进一步，所述反应体系中，6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯终浓度50～100g/L，葡萄糖终浓度75～150g/L，催化剂用量以破碎前湿菌体总量计为50-100g/L(优选75-80g/L)，含醛酮还原酶突变体基因的重组基因工程菌经诱导培养获得的湿菌体和含葡萄糖脱氢酶基因的工程菌经诱导培养获得的湿菌体以质量比3:1混合。

进一步，所述湿菌体按如下方法制备：将含醛酮还原酶突变体基因的重组基因工程菌接种到含终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养9小时，以体积浓度2％的接种量接种到新鲜的含终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、180转/分钟培养1.5小时，再向培养液中加入终浓度为0.1mM IPTG，28℃培养10小时后，4℃、8000转/分钟离心10分钟，获得含醛酮还原酶的湿菌体；所述含葡萄糖脱氢酶基因的工程菌经诱导培养获得的湿菌体制备方法同含醛酮还原酶基因的湿菌体。

进一步，所述超声破碎条件为：将含醛酮还原酶突变体基因的重组基因工程菌经诱导培养获得的湿菌体和含葡萄糖脱氢酶基因的工程菌经诱导培养获得的湿菌体混合后用pH 7.5、100mM磷酸盐缓冲液重悬，在冰水混合物上超声破碎10分钟，超声破碎条件：功率为400W，破碎1秒、暂停1秒。

本发明醛酮还原酶母本KlAKR及醛酮还原酶突变体碱基序列全长均为930bp，从第一个碱基起至第930个碱基止，起始密码子为ATG，终止密码子为TAA。

本发明所述醛酮还原酶突变体的获取是采用定点饱和突变技术，使用该技术对所述SEQ ID No.1醛酮还原酶基因进行突变，将获得的突变质粒以热击方式转入E.coliBL21(DE3)感受态细胞，对获得菌株进行接种、转接、诱导、菌体回收，利用粗酶液催化6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯不对称还原，制备光学纯6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯，具体方法如下：第一步将原始菌活化，获得了母本E.coli BL21(DE3)pET-28b(+)-klakr，提取质粒pET-28b(+)-klakr(pET-28b(+)-pklakr)，并保存待用。第二步通过SWISS-MODEL与pKlAKR比较，获得同源建模的模板蛋白晶体结构，利用Modeller 9.14同源建模，并进行分子对接，选择合适的突变位点，选点主要是活性通道附近获得活性口袋附件的氨基酸残基，设计突变的引物，以pET-28b(+)-pklakr为模板质粒，进行突变PCR，获得突变质粒，并转化，进行优势突变菌的筛选，将优势突变体送序检测并保存。

本发明醛酮还原酶突变体和葡萄糖脱氢酶基因工程菌的接种、转接、诱导、菌体回收，培养基可为本领域任何可使菌体生长并产生本发明的培养基，优选LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，蒸馏水溶解，pH 7.0。培养方法和培养条件没有特殊的限制，培养方法和条件可以根据宿主类型和培养方法等因素的不同按本领域普通知识进行适当的选择。所述葡萄糖脱氢酶来源于Exiguobacterium sibiricum，葡萄糖脱氢酶基因序列号(GenBank：No.KM817194.1)，所用载体pET-28b(+)，构建重组表达载体pET-28b(+)-esgdh。

与现有技术相比，本发明主要的有益效果主要体现在：本发明制备的醛酮还原酶突变体pKlAKR-I125V-S30P-Q212R-I63W的比酶活较母本醛酮还原酶提升了1.31倍，最大底物6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯投料达到80g/L，该醛酮还原酶突变体更具工业应用前景。

附图说明

图1是醛酮还原酶突变体pKlAKR-I125V-S30P-Q212R-I63W与葡萄糖脱氢酶偶联催化6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯不对称还原制备6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯的反应示意图。

图2是醛酮还原酶定点饱和突变的核酸电泳图。M：标准核酸分子量；泳道1：pET-28b(+)-pklakr；泳道2：pET-28b(+)-pklakr-I125V；泳道3：pET-28b(+)-pklakr-S30P；泳道4：pET-28b(+)-pklakr-Q212R；泳道5：pET-28b(+)-pklakr-I63W；泳道6：pET-28b(+)-pklakr-I125V-S30P；泳道7：pET-28b(+)-pklakr-I125V-S30P-Q212R；泳道8：pET-28b(+)-pklakr-I125V-S30P-Q212R-I63W。

图3醛酮还原酶突变体粗酶液(A)和纯酶液(B)的SDS-PAGE电泳图。M：标准蛋白分子量；泳道1：母本醛酮还原酶；泳道2：pKlAKR-I125V；泳道3：pKlAKR-S30P；泳道4：pKlAKR-Q212R；泳道5：pKlAKR-I63W；泳道6：pKlAKR-I125V-S30P；泳道7：pKlAKR-I125V-S30P-Q212R；泳道8：pKlAKR-I125V-S30P-Q212R-I63W。

图4是利用醛酮还原酶突变体pKlAKR-I125V-S30P-Q212R-I63W偶联EsGDH不对称还原6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯制备6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯时间进程图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述。

实施例1：醛酮还原酶突变体文库的构建及筛选

将醛酮还原酶基因(氨基酸序列SEQ ID No.2所示，核苷酸序列为SEQ ID No.1所示)构建表达载体pET-28b(+)-klakr，转化大肠杆菌，获得出发菌株E.coliBL21(DE3)/pET28b-pklakr。

醛酮还原酶突变体文库的制备通过4轮定点饱和突变来实现，引物设计如表1，第一轮，以载体pET-28b(+)-klakr为模板，以表1中I125F和I125R为引物，经饱和突变PCR，将SEQ ID No.2所示醛酮还原酶氨基酸序列的第125异亮氨酸突变为其余19种氨基酸，并转化，涂平板，通过优势菌株筛选获得醛酮还原酶突变体pKlAKR-I125V。第二轮以氨基酸序列SEQ ID No.3对应的突变体pKlAKR-I125V为模板，以表1中S30F和S30R为引物，经饱和突变PCR，转化，涂平板，通过优势菌株筛选获得醛酮还原酶突变体pKlAKR-I125V-S30P。第三轮以突变体pKlAKR-I125V-S30P为模板，以表1中Q212F和Q212R为引物，经饱和突变PCR，转化，涂平板，通过优势菌株筛选获得醛酮还原酶突变体pKlAKR-I125V-S30P-Q212R。第四轮以突变体pKlAKR-I125V-S30P-Q212R为模板，以表1中I63F和I63R为引物，经饱和突变PCR，转化，涂平板，通过优势菌株筛选获得醛酮还原酶突变体pKlAKR-I125V-S30P-Q212R-I63W，后期实验中其余优势单突变体pKlAKR-S30P，pKlAKR-Q212R，pKlAKR-I63W均由同样方法构建。

突变PCR体系(100μL)为：2倍Phanta Max缓冲液25μL，dNTPs 1μL，突变上下引物各1μL，模板1μL，Phanta Super-Fidelity DNA聚合酶0.5μL，补ddH₂O至50μL。PCR条件为：95℃预变性5分钟，经25个循环：95℃15秒，56℃15秒，72℃6分钟，最后72℃终延伸10分钟。PCR结果分别进行DNA琼脂糖凝胶电泳阳性验证，将PCR产物进行Dpn I酶消化模板，37℃，3小时，160转/分钟，65℃，1分钟灭活，将PCR产物热击转化，并将大肠杆菌E.coli BL21(DE3)活化，置于37℃、160转/分钟，培养1小时，涂布于含50μg/mL卡那霉素抗性的LB平板上，37℃倒置培养过夜，对获得的突变体进行优势突变体的筛选，筛选条件如下：10g DCW/L细胞(醛酮还原酶突变体和葡萄糖脱氢酶菌体质量比3:1)，加入pH 7.0的PBS(100mM)重悬细胞，在冰水混合物上破碎10min(超声破碎条件：功率400W，破1s，停1s)，获得粗酶液，加入终浓度75g/L6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯，112.5g/L的葡萄糖，30℃、150转/分钟条件下进行反应，反应结束，取样检测6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯浓度，筛选获得优势菌株。将获得优势菌株送杭州擎科生物技术有限公司测序，并保存。葡萄糖脱氢酶菌体制备同实施例2。

表1 醛酮还原酶定点饱和突变引物设计

实施例2：醛酮还原酶母本、突变体和葡萄糖脱氢酶的诱导表达

葡萄糖脱氢酶基因esgdh(核苷酸序列为SEQ ID No.3所示，氨基酸序列为SEQ IDNo.4所示)从Exiguobacterium sibiricum中克隆得到，并通过双酶切连到pET-28b(+)载体上，将该重组质粒导入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中，获得重组葡萄糖脱氢酶菌株E.coliBL21(DE3)/pET28b-esgdh。

将实施例1出发菌株E.coli BL21(DE3)/pET28b-pklakr和醛酮还原酶突变菌株以及重组葡萄糖脱氢酶菌株E.coli BL21(DE3)/pET28b-esgdh分别接种到含有终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养9小时，以体积分数2％(v/v)接种到新鲜的含有终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、180转/分钟培养1.5小时，再向培养液中加入终浓度为0.1mM IPTG，28℃培养10小时后，4℃、8000转/分钟离心10分钟，获得相应的湿菌体细胞。以上获得的细胞产有相应的蛋白，可用于蛋白纯酶液的制备，也可用于粗酶液催化不对称还原6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯制备6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯。

实施例3：突变文库筛选

将实施例2诱导表达的突变株湿菌体及葡萄糖脱氢酶湿菌体以质量比3:1混合，按照菌体总量50g/L的量加入pH 7.5、100mM磷酸盐缓冲液中重悬，在冰水混合物上超声破碎10分钟，超声破碎条件：功率为400W，破碎1秒、暂停1秒，获得突变株粗酶液。同样条件下，用出发菌株E.coli BL21(DE3)/pET28b-pklakr替换突变菌株湿菌体制备出发株粗酶液。

将突变株粗酶液或出发株粗酶液作为催化剂，以6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯为底物，以葡萄糖为辅助底物，不添加外源性NADPH或NADP⁺，运用菌体内源型NADPH，建立起辅酶循环系统。反应体系选择为10mL，催化剂用量以破碎前湿菌体总浓度计50g/L，底物终浓度75g/L，葡萄糖终浓度112.5g/L，30℃、150转/分钟反应1小时取样，取反应液100μL，900μL无水乙醇沉淀蛋白，即反应液稀释10倍，-20℃过夜，12000转/分钟离心3分钟，取上清，过0.22μM微滤膜，作为液相样品，HPLC检测6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯、6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯、6-氰基-(3S,5R)-二羟基己酸叔丁酯及de_p值。以产物6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯和de_p为指标，筛选优势突变体，实验结果示于表2。

液相检测条件：色谱柱

C18(4.6×250mm，Acchrom,China)柱，流动相乙腈:水体积比为1:3，流速1.0mL/min，检测波长210nm，进样量20μL，柱温40℃。6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯、6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯、6-氰基-(3S,5R)-二羟基己酸叔丁酯保留时间分别为：15.6分钟，10.1分钟，9.3分钟。

表2 pKlAKR及其突变体的催化性能和立体选择性

实施例4：醛酮还原酶母本及其突变体的纯化

将实施例3获得的优势突变体(表2中pKlAKR-I125V，pKlAKR-S30P，pKlAKR-Q212R，pKlAKR-I63W，pKlAKR-I125V-S30P，pKlAKR-I125V-S30P-Q212R，

pKlAKR-I125V-S30P-Q212R-I63W)，根据实施例2所述方法获得醛酮还原酶突变体湿菌体，分别用缓冲液A(含0.3M NaCl、30mM咪唑的pH 8.0、50mM磷酸钠缓冲液)悬浮，超声破碎20分钟(冰浴，功率400W，破碎1秒、暂停1秒)，4℃、12000转/分钟离心20min，取上清。

使用Ni亲和柱(1.6×10cm，Bio-Rad公司，美国)纯化突变体蛋白，具体操作如下：①用5倍柱体积的结合缓冲液(含0.3M NaCl的pH 8.0、50mM磷酸钠缓冲液)平衡Ni柱，至基线稳定；②样品上样，流速1mL/min，上样量在25-40mg/mL蛋白，使目标蛋白吸附于Ni柱上；③用6倍柱体积的缓冲液A(含0.3M NaCl、30mM咪唑的pH 8.0、50mM磷酸钠缓冲液)冲洗杂蛋白，流速1mL/min，至基线稳定；④用缓冲液B(含0.3M NaCl、500mM咪唑的pH 8.0、50mM磷酸钠缓冲液)洗脱，流速1mL/min，收集目的蛋白。将目的蛋白置于pH 7.5、20mM磷酸盐缓冲液中透析过夜，获得纯化酶；⑤5倍柱体积的结合缓冲液(含0.3M NaCl的pH 8.0、50mM磷酸钠缓冲液)冲洗Ni柱直至基线稳定，用5倍柱体积含20％乙醇的超纯水保存Ni柱。

出发菌株E.coli BL21(DE3)/pET28b-pklakr的醛酮还原酶纯酶采用相同条件收集。

实施例5：母本醛酮还原酶及其突变体酶比酶活的测定

酶活单位(U)定义为：在30℃、pH 7.5条件下，每分钟每生成1μmol的6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯所需的酶量定义为一个酶活单位，U。比酶活定义为每毫克酶蛋白所具有的活力单位数，U/mg。

酶活检测标准条件：30mM 6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯，3mM NADPH，适量酶液，30℃、pH 7.5，300转/分钟条件下反应5分钟，样品处理并进行HPLC检测分析。

蛋白浓度用二喹啉甲酸蛋白测定试剂盒(南京凯基生物科技发展有限公司，南京)测定。

母本醛酮还原酶及其突变体的比酶活如表3所示。

表3 突变体的相对酶活和差向对应异构体选择性(de_p)值

a：在标准条件下，pKlAKR的初始酶活指定为100％

实施例6：母本醛酮还原酶及其突变体动力学参数的测定

考察醛酮还原酶及其突变的动力学参数，以6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯作为底物，浓度设置为2-10mM(2、4、6、8、10mM)，外源性辅酶NADPH浓度设置为1-5mM(1、2、3、4、5mM)，加入一定量的纯酶液(参见实施例3)。

反应体系选择为500μL，实施例3收集的纯酶液100μL，加入底物和外源性辅酶NADPH，pH 7.5、100mM磷酸盐缓冲液为反应介质，30℃、150转/分钟反应1小时取样，取反应液HPLC检测6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯浓度(参见实施例3)。

根据醛酮还原酶催化反应机制遵循顺序强制反应机制，通过双倒数作图可计算得出v_max、K_m ^A、K_m ^B，结果如表4所示，通过比较k_cat和K_m，可以发现，pKlAKR对6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯和NADPH的K_m值分别是3.45mM、0.11mM，除突变体pKlAKR-S30P有所提升，其余突变体均有一定的下降，对6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯和NADPH的亲和力有增加趋势。突变体pKlAKR-I125V-S30P-Q212R-I63W对6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯的催化效率k_cat/K_m ^B达到36.31s^-1·mM^-1，较母本(k_cat/K_m ^B＝12.41s^-1·mM^-1)提高2.93倍，对辅酶NADPH的催化效率达到1438.23s^-1·mM^-1，较母本(k_cat/K_m ^A＝385.67s^-1·mM^-1)提高3.73倍。

表4 母本pKlAKR及其突变体动力学参数比较

实施例7：醛酮还原酶突变体pKlAKR-I125V-S30P-Q212R-I63W不对称还原6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯

根据实施例2的描述，通过发酵获得醛酮还原酶突变体pKlAKR-I125V-S30P-Q212R-I63W菌体3g和葡萄糖脱氢酶EsGDH菌体1g混合，并用40mL、pH 7.5、磷酸缓冲液(100mM)重悬，在冰上破碎(超声破碎条件：功率400W，破1s，停1s)，取全部破碎混合液(即粗酶液)，加入终浓度80g/L的还原6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯，终浓度120g/L的葡萄糖构成反应体系，在30℃、磁力搅拌转速为300rpm下进行反应，流加2M Na₂CO₃水溶液使反应液pH维持在7.5。以实施例3所示液相方法检测反应过程中产物6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯的生成和de值的变化，反应进程曲线如图4所示。该图显示，产物浓度随时间的推移而逐渐升高，90分钟内反应完成，底物转化率大于99％，产物de值始终保持在99.5％以上。

序列表

<110> 浙江工业大学

<120> 醛酮还原酶突变体及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 930

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 1

atgaccaccc agaaattctt caccctgtct aacggtaaca aaatcccggc tgttgctatc 60

gttggtaccg gtaccgcttg gtacaaatct gaagaaaccg acgctacctt ctctcagccg 120

ctggttgaca tcgttaaaaa aaccctggac accgttccgg gtgttgttca catcgacgct 180

gctgaaatct accgtaccta cccggaactg ggtgctgctc tgaaagacac caaaaaaccg 240

cgtgacgaaa tcttcatcac cgacaaatac tctaccctga aacagctgtc tgaaaacccg 300

aaagttgctc tggaaacctc tctgaaaaaa ctgggtgttg actacgttga cctgtacctg 360

ctgcactctc cgatcatcaa agaatctaaa ctggacgttg aagctaactg gaaatacctg 420

gaagaactgt acaaatctgg taaagctaaa aacatcggtg tttctaactt cgctgttaaa 480

gacctggaaa aactgctggc tgttgctgaa gttaaaccgc aggttaacca gatcgaattc 540

tctccgttcc tgcagaacca gaccccgggt atcgttgaat tctctcagaa aaacggtatc 600

ctgctggaag cttactctcc gctgggtccg ctgcagcgtc gtccggaaga cgctgacaaa 660

ctgccgttct accagtacat cgctgaactg tctaaaaaat acaacaaatc tgaagctcag 720

atcctgctgt cttgggttta cgaacgtggt atcctgccgg ttaccacctc ttctaaaatc 780

gaacgtatcc agcaggctca ggacatcttc tctttctctc tggctaacga agaagttcag 840

aaaatcaccc agctgggtct gcagcacccg gctctgcgtc tctggctgac tgacgtgtac 900

agcaaatacg actctgaatc tcagaaataa 930

<210> 2

<211> 309

<212> PRT

<213> 未知(Unknown)

<400> 2

Met Thr Thr Gln Lys Phe Phe Thr Leu Ser Asn Gly Asn Lys Ile Pro

1 5 10 15

Ala Val Ala Ile Val Gly Thr Gly Thr Ala Trp Tyr Lys Ser Glu Glu

20 25 30

Thr Asp Ala Thr Phe Ser Gln Pro Leu Val Asp Ile Val Lys Lys Thr

35 40 45

Leu Asp Thr Val Pro Gly Val Val His Ile Asp Ala Ala Glu Ile Tyr

50 55 60

Arg Thr Tyr Pro Glu Leu Gly Ala Ala Leu Lys Asp Thr Lys Lys Pro

65 70 75 80

Arg Asp Glu Ile Phe Ile Thr Asp Lys Tyr Ser Thr Leu Lys Gln Leu

85 90 95

Ser Glu Asn Pro Lys Val Ala Leu Glu Thr Ser Leu Lys Lys Leu Gly

100 105 110

Val Asp Tyr Val Asp Leu Tyr Leu Leu His Ser Pro Ile Ile Lys Glu

115 120 125

Ser Lys Leu Asp Val Glu Ala Asn Trp Lys Tyr Leu Glu Glu Leu Tyr

130 135 140

Lys Ser Gly Lys Ala Lys Asn Ile Gly Val Ser Asn Phe Ala Val Lys

145 150 155 160

Asp Leu Glu Lys Leu Leu Ala Val Ala Glu Val Lys Pro Gln Val Asn

165 170 175

Gln Ile Glu Phe Ser Pro Phe Leu Gln Asn Gln Thr Pro Gly Ile Val

180 185 190

Glu Phe Ser Gln Lys Asn Gly Ile Leu Leu Glu Ala Tyr Ser Pro Leu

195 200 205

Gly Pro Leu Gln Arg Arg Pro Glu Asp Ala Asp Lys Leu Pro Phe Tyr

210 215 220

Gln Tyr Ile Ala Glu Leu Ser Lys Lys Tyr Asn Lys Ser Glu Ala Gln

225 230 235 240

Ile Leu Leu Ser Trp Val Tyr Glu Arg Gly Ile Leu Pro Val Thr Thr

245 250 255

Ser Ser Lys Ile Glu Arg Ile Gln Gln Ala Gln Asp Ile Phe Ser Phe

260 265 270

Ser Leu Ala Asn Glu Glu Val Gln Lys Ile Thr Gln Leu Gly Leu Gln

275 280 285

His Pro Ala Leu Arg Leu Trp Leu Thr Asp Val Tyr Ser Lys Tyr Asp

290 295 300

Ser Glu Ser Gln Lys

305

<210> 3

<211> 738

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 3

atgggcattg gcgaagcgat catccgtcgc tatgcagaag aaggcatgcg cgttgttatc 60

aactatcgta gccatccgga ggaagccaaa aagatcgccg aagatattaa acaggcaggt 120

ggtgaagccc tgaccgtcca gggtgacgtt tctaaagagg aagacatgat caacctggtg 180

aaacagactg ttgatcactt cggtcagctg gacgtctttg tgaacaacgc tggcgttgag 240

atgccttctc cgtcccacga aatgtccctg gaagactggc agaaagtgat cgatgttaat 300

ctgacgggtg cgttcctggg cgctcgtgaa gctctgaaat acttcgttga acataacgtg 360

aaaggcaaca ttatcaatat gtctagcgtc cacgaaatca tcccgtggcc tactttcgta 420

cattacgctg cttctaaggg tggcgttaaa ctgatgaccc agactctggc tatggaatat 480

gcaccgaaag gtatccgcat taacgctatc ggtccaggcg cgatcaacac tccaattaat 540

gcagaaaaat tcgaggatcc gaaacagcgt gcagacgtgg aaagcatgat cccgatgggc 600

aacatcggca agccagagga gatttccgct gtcgcggcat ggctggcttc tgacgaagcg 660

tcttacgtta ccggcatcac cctgttcgca gatggtggca tgaccctgta cccgagcttt 720

caggctggcc gtggttaa 738

<210> 4

<211> 245

<212> PRT

<213> 未知(Unknown)

<400> 4

Met Gly Ile Gly Glu Ala Ile Ile Arg Arg Tyr Ala Glu Glu Gly Met

1 5 10 15

Arg Val Val Ile Asn Tyr Arg Ser His Pro Glu Glu Ala Lys Lys Ile

20 25 30

Ala Glu Asp Ile Lys Gln Ala Gly Gly Glu Ala Leu Thr Val Gln Gly

35 40 45

Asp Val Ser Lys Glu Glu Asp Met Ile Asn Leu Val Lys Gln Thr Val

50 55 60

Asp His Phe Gly Gln Leu Asp Val Phe Val Asn Asn Ala Gly Val Glu

65 70 75 80

Met Pro Ser Pro Ser His Glu Met Ser Leu Glu Asp Trp Gln Lys Val

85 90 95

Ile Asp Val Asn Leu Thr Gly Ala Phe Leu Gly Ala Arg Glu Ala Leu

100 105 110

Lys Tyr Phe Val Glu His Asn Val Lys Gly Asn Ile Ile Asn Met Ser

115 120 125

Ser Val His Glu Ile Ile Pro Trp Pro Thr Phe Val His Tyr Ala Ala

130 135 140

Ser Lys Gly Gly Val Lys Leu Met Thr Gln Thr Leu Ala Met Glu Tyr

145 150 155 160

Ala Pro Lys Gly Ile Arg Ile Asn Ala Ile Gly Pro Gly Ala Ile Asn

165 170 175

Thr Pro Ile Asn Ala Glu Lys Phe Glu Asp Pro Lys Gln Arg Ala Asp

180 185 190

Val Glu Ser Met Ile Pro Met Gly Asn Ile Gly Lys Pro Glu Glu Ile

195 200 205

Ser Ala Val Ala Ala Trp Leu Ala Ser Asp Glu Ala Ser Tyr Val Thr

210 215 220

Gly Ile Thr Leu Phe Ala Asp Gly Gly Met Thr Leu Tyr Pro Ser Phe

225 230 235 240

Gln Ala Gly Arg Gly

245

Claims

1.一种醛酮还原酶突变体，其特征在于所述醛酮还原酶突变体为下列之一：(1)将SEQID No.2所示氨基酸第125位异亮氨酸突变为缬氨酸；(2)将SEQ ID No.2所示氨基酸第125位异亮氨酸突变为缬氨酸，同时第30位丝氨酸突变为丙氨酸、组氨酸或脯氨酸；(3)将SEQID No.2所示氨基酸第125位异亮氨酸突变为缬氨酸，且第212位谷氨酰胺突变为精氨酸或天冬酰胺；(4)将SEQ ID No.2所示氨基酸第125位异亮氨酸突变为缬氨酸，同时第30位丝氨酸突变为脯氨酸，且第212位谷氨酰胺突变为精氨酸或天冬酰胺；(5)将SEQ ID No.2所示氨基酸第125位异亮氨酸突变为缬氨酸，同时第30位丝氨酸突变为丙氨酸，且第212位谷氨酰胺突变为精氨酸；(6)将SEQ ID No.2所示氨基酸第125位异亮氨酸突变为缬氨酸，同时第30位丝氨酸突变为脯氨酸，且第212位谷氨酰胺突变为精氨酸，第63位异亮氨酸突变为色氨酸。

2.如权利要求1所述醛酮还原酶突变体，其特征在于所述醛酮还原酶突变体是将SEQID No.2所示氨基酸第125位异亮氨酸突变为缬氨酸，同时第30位丝氨酸突变为脯氨酸，且第212位谷氨酰胺突变为精氨酸，第63位异亮氨酸突变为色氨酸。

3.一种权利要求1所述醛酮还原酶突变体在不对称还原6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯制备6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述的应用方法为：将含醛酮还原酶突变体基因的重组基因工程菌经诱导培养获得的湿菌体和含葡萄糖脱氢酶基因的工程菌经诱导培养获得的湿菌体混合后用pH 7.5、100mM的磷酸盐缓冲液重悬后超声破碎，取破碎混合液为催化剂，以6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯为底物，以葡萄糖为辅底物构成反应体系，在30℃、150-300转/分钟条件下进行反应，反应结束，反应液分离纯化，获得6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯；所述葡萄糖脱氢酶基因核苷酸序列为SEQ ID No.3所示。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述反应体系中，6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯终浓度50～100g/L，葡萄糖终浓度75～150g/L，催化剂用量以破碎前湿菌体总量计为50-100g/L，含醛酮还原酶突变体基因的重组基因工程菌经诱导培养获得的湿菌体和含葡萄糖脱氢酶基因的工程菌经诱导培养获得的湿菌体以质量比3:1混合。

6.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述湿菌体按如下方法制备：将含醛酮还原酶突变体基因的重组基因工程菌接种到含终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养9小时，以体积浓度2％的接种量接种到新鲜的含终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、180转/分钟培养1.5小时，再向培养液中加入终浓度为0.1mM IPTG，28℃培养10小时后，4℃、8000转/分钟离心10分钟，获得含醛酮还原酶突变体的湿菌体；所述含葡萄糖脱氢酶基因的工程菌经诱导培养获得的湿菌体制备方法同含醛酮还原酶突变体基因的湿菌体。

7.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述超声破碎条件为：将含醛酮还原酶突变体基因的重组基因工程菌经诱导培养获得的湿菌体和含葡萄糖脱氢酶基因的工程菌经诱导培养获得的湿菌体混合后用pH 7.5、100mM磷酸盐缓冲液重悬，在冰水混合物上超声破碎10分钟，超声破碎条件：功率为400W，破碎1秒、暂停1秒。