DE69232511T2

DE69232511T2 - Gereinigte thermostabile DNS-Polymerase aus Pyrococcus-Arten

Info

Publication number: DE69232511T2
Application number: DE1992632511
Authority: DE
Inventors: Donald G. Comb; William E. Jack; Huimin Kong; Rebecca Kucera; Francine Perler
Original assignee: New England Biolabs Inc
Current assignee: New England Biolabs Inc
Priority date: 1991-12-18
Filing date: 1992-11-05
Publication date: 2002-10-24
Anticipated expiration: 2012-11-06
Also published as: EP0547359A1; DE69232511D1; EP0547359B1; JP3453397B2; DE547359T1; JPH05328969A

Description

BEREICH DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft ein extrem thermostabiles Enzym. Insbesondere betrifft sie eine thermostabile DNA-Polymerase, die von Pyrococcus sp. erhältlich ist, eine isolierte DNA-Sequenzkodierung für die Polymerase, mit der DNA transformierte Vektoren und mikrobielle Wirte, ein Verfahren zur Herstellung der Polymerase und ein Verfahren zum Erhöhen der Expression der Polymerase von einem Wirt.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

DNA-Polymerasen sind eine Familie von Enzymen, die an der DNA-Reparatur und -Replikation beteiligt sind. Es wurden umfangreiche Forschungen zur Isolierung von DNA-Polymerasen von mesophilen Mikroorganismen wie E. coli durchgeführt. Siehe beispielsweise Bessman, et al., J. Biol. Chem. (1957) 233: 171- 177 und Buttin und Kornberg, J. Biol. Chem. (1966) 241-5419- 5427.
Beispiele für von E. coli isolierte DNA-Polymerasen sind u. a. E. coli DNA-Polymerase I, Klenow-Fragment von E. coli DNA- Polymerase I und T4 DNA-Polymerase. Diese Enzyme können in der DNA-Rekombinationstechnik vielseitig eingesetzt werden, wie z.B bei der Markierung von DNA durch Nick-Translation, der Zweitstrang-cDNA-Synthese bei der cDNA-Klonierung sowie der DNA-Sequenzierung. Siehe Maniatis, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982).
Vor kurzem offenbarten die US-Patente Nr. 4,683,195, 4,683,202 und 4,800,159 die Verwendung der obigen Enzyme in einem Prozess zum Amplifizieren, Nachweisen und/oder Klonieren von Nucleinsäuresequenzen. Dieser Prozess, der allgemein als Polymerase-Kettenreaktion (PCR) bezeichnet wird, schließt die Verwendung einer Polymerase, von zwei Primern und Nucleotidtriphosphaten ein, um existierende Nucleinsäuresequenzen zu amplifizieren.
Einige der zuvor beschriebenen DNA-Polymerasen besitzen eine 3'-5' Exonuclease-Aktivität mit Proofreading-Funktion, die eine weit höhere DNA-Replikationstreue im Vergleich zu dem Fall erzielt, bei dem die Synthese das Resultat von nur einem Basenpaarungsselektionsschritt ist. Brutlag, D. und Kornberg, A., J. Biol. Chem. (1972) 247: 241-248. DNA-Polymerasen mit 3'- 5' Proofreading-Exonuclease-Aktivität haben eine wesentlich geringere Baseneinbaufehlerrate im Vergleich zu einer DNA- Polymerase ohne Proofreading-Exonuclease (Chang, L.M.S., J. Biol. Chem. (1977) 252: 1873-1880).
Untersuchungen finden auch über die Isolierung und Reinigung von DNA-Polymerasen von Thermophilen wie Thermus aquaticus statt. Chien, A., et al. J. Bacteriol., (1976) 127: 1550-1557, offenbart die Isolierung und Reinigung einer DNA-Polymerase mit einem Temperaturoptimum von 80ºC vom T. aquaticus-YT1-Stamm. Das Reinigungsverfahren von Chien et al. schließt einen Vierstufenprozess ein. Diese Stufen beinhalten die Präparation von Rohextrakt, DEAE-Sephadex-Chromatographie, Phosphocellulose-Chromatographie und Chromatographie auf DNA- Cellulose. Kaledin et al., Biokhymiyay (1980) 45: 644-651 offenbart ebenfalls die Isolierung und Reinigung einer DNA- Polymerase von Zellen des T. aquaticus-YT1-Stammes. Das Reinigungsverfahren von Kaledin et al. beinhaltet einen Sechsstufenprozess. Diese Stufen beinhalten die Isolierung von Rohextrakt, Ammoniumsulfatfällung, DEAE-Cellulose- Chromatographie, Fraktionierung auf Hydroxyapatit, Fraktionierung auf DEAE-Cellulose und Chromatographie auf Einzelstrang-DNA-Cellulose.
Das US-Patent Nr. 4,889,818 offenbart eine gereinigte thermostabile DNA-Polymerase von T, aquaticus, Taq-Polymerase, mit einer relativen Molekülmasse von etwa 86.000 bis 90.000 Dalton, die in einem Prozess präpariert wird, der im Wesentlichen mit dem Prozess von Kaledin identisch ist, zusätzlich aber die Substitution einer Phosphocellulose- Chromatographiestufe anstelle einer Chromatographie auf Einzelstrang-DNA-Cellulose vorsieht. Darüber hinaus offenbart die europäische Patentanmeldung 0258017 Taq-Polymerase als das bevorzugte Enzym zur Verwendung im oben erörterten PCR-Prozess. Untersuchungen haben ergeben, dass, während die Taq-DNA- Polymerase eine polymeraseabhängige 5'-3'-Exonucleasefunktion hat, die Taq-DNA-Polymerase keine 3'-5'-Proofreading- Exonucleasefunktion besitzt (Lawyer, F.C., et al. J. Biol. Chem. (1989) 264: 11, S. 6427-6437; Bernad, A., et al. Cell (1989) 59: 219). Folglich neigt die Taq-DNA-Polymerase zu Baseneinbaufehlern, so dass ihre Verwendung in bestimmten Einsatzbereichen unerwünscht ist. Das Klonieren eines amplifizierten Gens ist zum Beispiel problematisch, da jede Kopie des Gens aufgrund eines zufälligen Fehleinbaus einen Fehler enthalten kann. Je nachdem, an welcher Stelle des Replikationszyklus der Fehler auftritt (z. B. in einem frühen Replikationszyklus), könnte die gesamte amplifizierte DNA die fälschlicherweise eingebaute Base enthalten und zu einem mutierten Genprodukt führen. Ferner haben Untersuchungen ergeben, dass Taq-DNA-Polymerase eine Wärmebeständigkeit von nicht mehr als einigen Minuten bei 100ºC hat. Demzufolge benötigt die Fachgemeinschaft dringend eine DNA-Polymerase mit weit höherer Wärmebeständigkeit und einer assoziierten 3-5'- Exonuclease-Proofreading-Aktivität. Ein solches Enzym, die DNA- Polymerase von Thermococcus litoralis, einem Archaebakterium, das sich bei Temperaturen von etwa 100ºC in der Nähe unterseeischer Wärmeschlote vermehrt, wurde kürzlich isoliert und in E. coli kloniert.
In der Technik gibt es jedoch noch immer den Wunsch, eine gereinigte DNA-Polymerase mit 3-5'-Proofreading- Exonucleaseaktivität zu erhalten und zu produzieren, die eine noch höhere Wärmebeständigkeit als die derzeit erhältlichen DNA-Polymerasen hat. Die Verfügbarkeit eines solchen Enzyms würde die oben beschriebenen DNA-Polymeraseverfahren verbessern. Darüber hinaus wäre es von Nutzen, wenn eine solche DNA-Polymerase durch rekombinante DNA-Techniken produziert würde. Dies würde die Produktion hochreiner kommerzieller Mengen der Polymerase ermöglichen.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein gereinigtes thermostabiles Enzym bereitgestellt, erhältlich von Pyrococcus sp., das die Polymerisation von DNA katalysiert, wobei das genannte Enzym von E. coli NEB Nr. 720 (ATCC Nr. 68723) erhältlich ist. Das thermostabile Enzym, das von Pyrococcus sp. erhältlich ist, einem Archaebakterium, isoliert von einem unterseeischen Wärmeschlot in 2010 Metern, ist eine DNA- Polymerase mit einer scheinbaren relativen Molekülmasse von etwa 92.000-97.000 Dalton, einer Halbwertszeit von etwa 8 Stunden bei 100ºC und einer Halbwertszeit von 23 Stunden bei 95ºC.
Die DNA, die die thermostabile DNA-Polymerase mit 92.000- 97.000 Dalton, erhältlich von Pyrococcus sp., kodiert, wurde isoliert und ist ein Mittel, mit dem das thermostabile Enzym der vorliegenden Erfindung erhalten werden kann.
Die Pyrococcus sp.-DNA-Polymerase besitzt 3'-5'- Proofreading-Exonucleaseaktivität. Gemäß der vorliegenden Erfindung wurde gefunden, dass die 3'-5'-Proofreadingaktivität der Pyrococcus sp.-DNA-Polymerase 2,5 Mal so hoch ist wie die der DNA-Polymerase, die von T. litoralis erhältlich ist. Folglich müsste Pyrococcus sp.-DNA-Polymerase eine weit höhere Treue aufweisen als eine thermostabile Polymerase ohne 3-5'- Proofreading-Exonucleasefunktion, wie z. B. Taq-Polymerase, und hat möglicherweise eine stärkere Proofreading-Aktivität als T. litoralis-DNA-Polymerase. Darüber hinaus hat die Pyrococcus sp. DNA-Polymerase eine wesentlich höhere Wärmebeständigkeit oder Halbwertszeit bei Temperaturen zwischen 96ºC und 103ºC als die Taq-Polymerase.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1A - ist das mit Ethidiumbromid gefärbte Agarosegel von Pyrococcus sp.-DNA, zerschnitten mit EcoR I (Bahn 3), BamH I (Bahn 4) und Hind III (Bahn 5). Bahn 1 ist λDNA, zerschnitten mit Hind III als Marker, und Bahn 2 ist pBR322 als Marker.
Fig. 1B - ist ein Autoradiogramm einer Southern- Hybridisierung des gleichen Gels wie in 1A. Die ³²p-DNA-Sonde wurde von einem 1,3 Kb Eco RI Fragment präpariert, das den aminoterminalen Teil der Thermococcus litoralis-DNA-Polymerase kodiert. Man beachte, dass die mit BamH I zerschnittene Pyrococcus sp.-DNA eine einzelne Bande von etwa 4-5 Kb mit der Sonde hervorbringt. Die Tatsache, dass die 23-Kd-Bande von mit Hind III zerschnittener λDNA auf dem Film zu erkennen ist, ist in unspezifischer Hybridisierung mit der großen Menge an DNA begründet, die in dieser Bande vorhanden ist. Die Tatsache, dass das Plasmid pBR322 sichtbar ist, ist in homologen Sequenzen in der Sonde begründet.
Fig. 2 - ist eine Restriktionsortkarte des 4,8 Kb BamHI- Fragments mit dem Gen, das die Pyrococcus sp.-DNA-Polymerase im pUC19 Plasmid von E. coli 2207 (NEB Nr. 720) enthält.
Fig. 3 - ist ein Foto des mit Coomassie-Blau gefärbten Gels, von dem die annähernde relative Molekülmasse der Pyrococcus sp.-DNA-Polymerase ermittelt wurde. Der Pfeil neben Bahn 1 weist auf die Polymerasebande hin. Bahn 2 enthält die angegebenen Molekülmassenstandards.
Fig. 4 - ist ein Foto des Western-Blot, wobei Thermococcus litoralis-DNA-Polymerase mit Pyrococcus sp.-DNA-Polymerase verglichen wird. Bahn 1, Proteinstandards; Bahn 2,50 gg eines Rohextraktes von Thermococcus litoralis; Bahn 3,2,0 gg gereinigte rekombinante Pyrococcus sp.-DNA-Polymerase. Der Pfeil weist auf die Position der Polymerase I hin.
Fig. 5 - ist ein Vergleich zwischen der Polymerisierungs- und Exonucleasefunktion von Thermococcus litoralis-DNA- Polymerase und Pyrococcus sp.-DNA-Polymerase.
Fig. 6 - stellt die Wärmebeständigkeit bei 95ºC (o) und 100ºC (o) der rekombinanten Pyrococcus sp.-DNA-Polymerase dar.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSGESTALTUNGEN

Die vorliegende Erfindung betrifft ein thermostabiles Enzym, das eine DNA-Polymerase ist, die vom Pyrococcus sp.- Stamm GB-D erhältlich ist. Pyrococcus sp. wurde von Holger Jannasch von einem unterseeischen Wärmeschlot in der Sea of Cortez in einer Tiefe von 2010 Metern unter Verwendung der Tiefseetauchglocke Alvin vom Woods Hole Oceanographic Institute isoliert. Eine Probe des Pyrococcus sp.-Stamms GB-D (Archaebakterium, NEB Nr. 732) wurde am 1. Oktober 1991 bei der Amerikanischen Typus-Kultursammlung im Rahmen der Bedingungen des Budapester Vertrags mit der ATCC-Beitritts-Nr. 55239 hinterlegt.
Der Organismus Pyrococcus sp. ist ein äußerst thermophiles, Schwefel metabolisierendes Archaebakterium mit einem Wachstumsbereich zwischen 65ºC und 103ºC.
Zur Gewinnung des nativen Proteins kann Pyrococcus sp. unter Anwendung einer beliebigen geeigneten Methode vermehrt werden, wie beispielsweise mit der von Belkin et al., Arch. Microbiol. (1985) 142 : 181-186 beschriebenen Methode.
Kurz, die Zellen werden in dem in Belkin et al., supra, beschriebenen Medium, das 10 mg/ml Schwefel und 0,01 M Cystein enthält, in 15-ml-Schraubverschlussröhrchen 2 Tage lang bei 95ºC vermehrt. Werden größere Zellmengen benötigt, dann werden 1-Liter-Schraubverschlussflaschen verwendet, wobei nach der Sterilisation eine Inokulation mit einer frischen 10-ml-Kultur erfolgt, die 2 Tage lang bei 90-95ºC vermehrt wird.
Nach dem Zellwachstum wird im Rahmen eines bevorzugten Verfahrens zur Isolierung und Reinigung des Enzyms der folgende Mehrstufenprozess angewendet: Zunächst werden die Zellen, sofern sie eingefroren sind, aufgetaut, in einem geeigneten Puffer wie Puffer A (10 mM KPO4 Puffer, pH 7,4, 1,0 mM EDTA, 1,0 mM Beta-Mercaptoethanol) suspendiert, beschallt und zentrifugiert. Das Supernatant wird dann durch eine Säule mit hoher Proteinaffinität geführt, die sich an Nucleinsäuren binden, wie die Affigel-Blue-Column (Biorad). Die in der Supernatantlösung von Pyrococcus sp. vorhandenen Nucleinsäuren und viele der Proteine passieren die Säule und werden somit durch Waschen der Säule mit mehreren Säulenvolumen an salzarmem Puffer mit einem pH-Wert von etwa 7,0 entfernt. Nach dem Waschen wird das Enzym mit einem linearen Gradienten wie z. B. 0,1 bis 2,0 M NaCl in Puffer A eluiert. Die DNA-Polymerase- Peakaktivität wird dialysiert und auf eine Phosphocellulosesäule aufgebracht. Die Säule wird gewaschen und die Enzymaktivität mit einem linearen Gradienten wie z. B. 0,1 bis 1,0 M NaCl in Puffer A eluiert. Die DNA-Polymerase- Peakaktivität wird dialysiert und auf eine HPLC-Mono-S-Säule (Kationenaustauscher) aufgebracht. Das Enzym wird mit einem linearen Gradienten wie z. B. 0,05 bis 1,0 M NaCl in Puffer A eluiert. Das Enzym ist in diesem Stadium zu etwa 50% rein.
Die scheinbare relative Molekülmasse der von Pyrococcus sp. erhältlichen DNA-Polymerase liegt zwischen etwa 92.000 und 97.000 Dalton; im Vergleich dazu haben Proteinstandards mit bekannter relativer Molekülmasse, wie Phosphorylase B, eine relative Molekülmasse von 97.400 Dalton. Es ist jedoch zu verstehen, dass Pyrococcus sp.-DNA-Polymerase als ein Protein von einem extremen Thermophilen bei einer abweichenden relativen Molekülmasse der Elektrophorese unterworfen werden kann, und zwar infolge einer unvollständigen Denaturierung oder anderer intrinsischer Eigenschaften. Die exakte relative Molekülmasse des thermostabilen Enzyms der vorliegenden Erfindung kann anhand der Kodierungssequenz des Pyrococcus sp.- DNA-Polymerasegens bestimmt werden. Die relative Molekülmasse des eluierten Produkts kann mit einem beliebigen Verfahren bestimmt werden, wie zum Beispiel durch SDS-Polyacrylamidgel- Elektrophorese (SDS-PAGE) mit Protein-Molekulargewichtsmarkern.
Polymeraseaktivität wird vorzugsweise durch den Einbau radioaktiv markierter Desoxynucleotide in DNase-behandelte oder aktivierte DNA gemessen; im Anschluss an eine nachfolgende Trennung der nicht eingebauten Desoxynucleotide vom DNA- Substrat ist die Polymeraseaktivität proportional zur Menge an Radioaktivität in der säureunlöslichen Fraktion, die die DNA umfasst (Lehman, I.R., et al., J. Biol. Chem. (1958) 233 : 163).
Die Halbwertszeit der DNA-Polymerase der vorliegenden Erfindung beträgt bei 100ºC etwa 8 Stunden und bei 95º etwa 23 Stunden. Die Wärmebeständigkeit oder Halbwertszeit der DNA- Polymerase kann durch Vorinkubieren des Enzyms bei der interessanten Temperatur in Anwesenheit des BSA-haltigen Reaktionspuffers bestimmt werden. In vorbestimmten Zeitintervallen von bis zu 12 Stunden werden kleine Aliquote entfernt und zum Reaktionspuffer gegeben, das DNA-Substrate, dNTPs und BSA enthält, und mit dem zuvor beschriebenen Verfahren in Bezug auf Polymeraseaktivität untersucht.
Das erfindungsgemäße thermostabile Enzym kann mit DNA- Rekombinationsverfahren erzeugt werden, da das Gen, das dieses Enzym kodiert, von genomischer Pyrococcus sp.-DNA kloniert wurde. Eine teilweise DNA-Sequenz dieses Gens ist in der Sequenzauflistung als SEQ ID Nr. 1 dargestellt. Die komplette Kodierungssequenz für die Pyrococcus sp.-DNA-Polymerase kann von einem etwa 5 Kb BamHI Restriktionsfragment in pUC10 in E. coli, NEB Nr. 720, abgeleitet werden. Dieser E. coli-Stamm wurde am 1. Oktober 1991 bei der Amerikanischen Typus- Kultursammlung (ATCC) im Rahmen der Bedingungen des Budapester Vertrags mit der Beitritts-Nr. ATCC 68723 hinterlegt.

Klonieren der Pyrococcus sp.-DNA-Polymerase

Die Herstellung einer rekombinanten Form von Pyrococcus sp.-DNA-Polymerase umfasst im Allgemeinen die folgenden Schritte: es wird DNA isoliert, die die aktive Form der Polymerase kodiert, entweder in ihrer nativen Form oder als Fusion mit anderen Sequenzen, die von der nativen Form der Polymerase abgespaltet sein können oder nicht und die die Polymeraseaktivität beeinflussen können oder auch nicht. Als nächstes kann das Gen mit geeigneten Kontrollsequenzen zur Expression in prokaryotischen oder eukaryotischen Wirts- /Vektorsystemen funktionell verknüpft werden oder auch nicht. Der Vektor kodiert vorzugsweise alle Funktionen, die für eine Transformation und Erhaltung in einem geeigneten Wirt notwendig sind, und kann selektierbare Marker und/oder Kontrollsequenzen zur Pyrococcus sp.-Polymeraseexpression kodieren. Der Vektor wird zum Transformieren eines geeigneten Wirts verwendet. Aktive rekombinante thermostabile Polymerase kann von transformierten Wirtskulturen entweder kontinuierlich oder nach der Auslösung einer Expression produziert werden. Aktive thermostabile Polymerase kann entweder von Wirtszellen oder von Kulturmedium gewonnen werden, falls das Protein durch die Zellmembran sekretiert wird.
Zwar kann jeder der obigen Schritte in vielfältiger Weise durchgeführt werden, aber es wurde festgestellt, dass zum Klonieren der DNA, die Pyrococcus sp.-DNA-Polymerase kodiert, die Expression der Polymerase von ihren eigenen Kontrollsequenzen in E. coli zu einem hohen Genexpressionsgrad führt.
Es wurde festgestellt, dass wenigstens eine Intervening- Sequenz im Pyrococcus-DNA-Polymerasegen vorliegt. Durch einen Vergleich der Pyrococcus species-Polymerase-DNA und Proteinsequenzen der vorliegenden Erfindung mit der Thermococcus litoralis-DNA-Polymerase-DNA und Protein wurde ermittelt, dass sich die Pyrococcus-Intervening-Sequenz innerhalb der konservierten Pol-α-Motivregion III befindet und bei Nucleotid 1839 der SEQ ID Nr. 1 beginnt.

Klonierungsvektoren

Vektoren, die zur Umsetzung der vorliegenden Erfindung von Nutzen sind, sollten ein veränderliches Maß an kontrollierter Expression der Pyrococcus sp.-Polymerase erbringen, indem einige oder alle der folgenden Kontrollmerkmale bereitgestellt werden: (1) Promotoren oder Orte des Transkriptionsstarts, entweder direkt neben dem Start der Polymerase oder als Fusionsproteine, (2) Operatoren, die zum Ein- und Ausschalten der Genexpression verwendet werden könnten, (3) Ribosomen- Bindungsstellen zur verbesserten Translation und (4) Transkriptions- oder Translationsterminationsorte zur verbesserten Stabilität. Zu geeigneten Vektoren, die bei der Klonierung und Expression von Pyrococcus sp.-Polymerase verwendet werden, gehören beispielsweise Phagen und Plasmide. Zu Beispielen für Phagen gehören λgtll (Promega), λDASH (Stratagene), λZapII (Stratagene). Zu Beispielen für Plasmide gehören pUC19, pBR322, pBluescript (Stratagene), pSP73 (Promega), pGW7 (ATCC Nr. 40166), pET3A (Rosenberg et al., Gene, (1987) 56: 125-135) und pET11C (Methods in Enzymology (1990) 185: 60-89).

Transformation und Infektion

Es gibt Standardprotokolle zur Transformation, Phageninfektion und Zellkultur (Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982)). Von den zahlreichen E. coli-Stämmen, die zur Plasmidtransformation verwendet werden können, zählen zu den bevorzugten Stämmen JM101 (ATCC Nr. 33876), XLl (Stratagene), RRI (ATCC Nr. 31343) und BL21 (DE3) plysS (Methods in Enzymology (1990), supra). Die E. coli-Stämme XLl, ER1578 und ER1458 (Raleigh et al., N.A. Research (1988) 16: 1563-1575) gehören zu den Stämmen, die für λ-Phage verwendbar sind, und Y1089 kann für λgtll-Lysogenie verwendet werden. Bei der Präparation von Übergangs-Lysogenen in Y1089 (Arasu et al., Experimental Parasitology (1987) 64: 281-289) wird eine Kultur mit rekombinantem λgtll-Phage infiziert, und zwar entweder mit einer einzelnen hohe Phagen-Dosis oder durch Co-Kultivierung mit einem lytischen Wirt. Die infizierten Y1089-Zellen werden vorzugsweise bei 37ºC in Anwesenheit des Induktors IPTG vermehrt, was zu einem Aufbau von rekombinantem Protein in dem Lysis-defekten Wirts-/Phagensystem führt.

Konstruktion einer genomischen DNA-Bibliothek und Screenen nach thermostabiler Polymerase

Das Sondieren einer genomischen Pyrococcus-DNA-Bibliothek durch Kreuzhybridisierung mit radioaktiven Sonden, die vom DNA- Polymerasegen von Thermococcus litoralis präpariert wurden, ermöglichte eine Identifizierung und Isolierung des Pyrococcus sp.-DNA-Polymerasegens.
Pyrococcus sp.-DNA kann mit dem von Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982) beschriebenen Verfahren isoliert werden.
Nachdem die Pyrococcus sp.-DNA isoliert wurde, kann sie zum Konstruieren von Genombibliotheken entweder als zufällige Fragmente oder Restriktionsenzymfragmente verwendet werden. Der letztere Ansatz wird bevorzugt. Vorzugsweise werden BamH I Teilstücke von genomischer Pyrococcus sp.-DNA unter Anwendung standardmäßiger DNA-Restriktionstechniken präpariert, die zum Beispiel in Maniatis et al., supra, beschrieben werden. Andere Restriktionsenzyme wie Sal I und XbaI können ebenfalls verwendet werden.
Es stehen zwar Verfahren zum Screenen von Plasmiden und Phagen unter Verwendung von Antikörpern oder DNA-Sonden zur Verfügung (Young und Davis, PNAS, (1983) 80: 1194-1198; Maniatis et al., supra), aber es wurde gefunden, dass Phagensysteme gewöhnlich besser funktionieren, und daher werden sie für die ersten Bibliotheken bevorzugt.
Genombibliotheken können mit dem Kolonie- oder Plaquehybridisierungsverfahren (Maniatis et al., supra) oder unter Verwendung der Antikörper-Plaque-Reaktivität (Young und Davis, supra) gescreent werden. Beim Kolonie- oder Plaquehybridisierungsverfahren werden Sonden mit Standardmarkierungsverfahren wie zum Beispiel Random-Priming oder Nick-Translation eines Polymerasegens von einem verwandten Organismus wie z. B. T. litoralis gebildet (Maniatis et al., supra). Die Genombibliothek wird mit markierter Sonde unter Bedingungen hybridisiert, die von der gewünschten Stringenz abhängig sind.
Wenn Genomexpressionsbibliotheken mit dem Antikörper- /Plaque-Verfahren gescreent werden, werden Phagenvektoren, die alle notwendigen Expressionskontrollregionen liefern, wie λgtll und λZap II, für das Antikörper-Screening bevorzugt, da es ungewiss ist, ob die Kontrollregionen von Pyrococcus sp. E. coli funktionieren. Durch Klonieren von Pyrococcus sp.-DNA in den BamH I Ort von λDASH oder den EcoR I Ort von λgtll kann Pyrococcus sp.-Polymerase entweder als ein Fusionsprotein mit Beta-Galactosidase in λgtII oder von ihrem eigenen endogenen Promotor exprimiert werden.
Nach dem Bilden der Expressionsbibliotheken können diese mit Anti-Pyrococcus sp.-DNA-Polymerase-Antiserum oder, wenn nicht verfügbar, anhand Antikörper gegen DNA-Polymerase eines eng verwandten Organismus (d. h. Thermococcus litoralis, einem weiteren extremen Thermophilen) unter Anwendung standardmäßiger Antikörper-Plaque-Hybridisierungsverfahren gescreent werden, wie solche, die von Young und David, PNAS (1983), supra, beschrieben werden.
Mit beiden Verfahren kann die Pyrococcus sp.-DNA- Polymerase-DNA, die einen Teil oder das gesamte Gen kodiert, nachdem sie identifiziert wurde, beispielsweise in pBR322, pBluescript, M13 oder pUC19 subkloniert werden. Bei Bedarf kann die DNA-Sequenz zum Beispiel mit dem Sanger-Didesoxy- Kettenabbruchverfahren bestimmt werden (Sanger, F., Nicklen, S. & Coulson, A.R. PNAS (1977) 74: 5463-5467).

Identifizierung der DNA, die die Pyrococcus Species-DNA- Polymerase kodiert und exprimiert

Es gibt verschiedene Verfahren, mit denen ermittelt werden kann, ob die DNA-Sequenz, die die Pyrococcus sp.-DNA-Polymerase kodiert, erhalten wurde. Dazu gehören beispielsweise ein Vergleich der tatsächlichen oder deduzierten aminoterminalen Sequenz des von der rekombinanten DNA kodierten Proteins mit dem nativen Protein oder die Ermittlung, ob die rekombinante DNA ein Protein erzeugt, das für native Pyrococcus sp.-DNA- Polymerase spezifischen Antikörper bindet. Darüber hinaus legt eine Untersuchung von Wang et al., FASEB Journal (1989) 3: 14-21 nahe, dass bestimmte Regionen von DNA-Polymerasesequenzen der Polymerase-α-Familie bei vielen Spezies stark konserviert sind, wie auch eine separate Gruppe von konservierten Regionen in Poll-ähnlichen Polymerasen. Durch einen Vergleich der vorhergesagten Aminosäuresequenz des klonierten Gens mit der Aminosäuresequenz bekannter DNA-Polymerasen, wie menschliche DNA-Polymerase α und E. coli-DNA-Polymerase I, erbringt die Identifizierung dieser Homologieinseln folglich den stichhaltigen Beweis, dass die rekombinante DNA in der Tat eine DNA-Polymerase kodiert.
Wie zuvor erwähnt, wurde festgestellt, dass DNA, die Pyrococcus sp.-DNA-Polymerase kodiert, ein Intron oder eine Intervening-Sequenz innerhalb der Pol-α-Motivregion III enthält. Folglich kann als ein Mittel zum Erhöhen einer Überexpression in Wirtszellen wie E. coli die DNA- Sequenzkodierung für das Intron deletiert werden. Es gibt eine Reihe von in der Technik bekannten Ansätzen, die zum Deletieren von DNA-Sequenzen und folglich zum In-vitro-Herausspleißen eines Introns verwendet werden können. Ein Verfahren beinhaltet die Identifizierung einmaliger Restriktionsenzymorte in der Kodierungsregion, die sich in der Nähe der Spleißstelle oder des zu deletierenden Bereichs befinden. Ein Duplex-Oligomer wird synthetisiert, um die Lücke zwischen den beiden Restriktionsfragmenten zu überbrücken. Eine dreiteilige Ligation, die aus dem Aminoendrestriktionsfragment, dem überbrückenden Oligo und dem Carboxyendrestriktionsfragment besteht, bringt ein intaktes Gen mit deletiertem Intron hervor.
Ein weiteres Verfahren ist eine Abänderung des zuvor beschriebenen Verfahrens. Der Großteil des Introns wird deletiert durch Zerschneiden mit Restriktionsenzymen mit einmaligen Orten innerhalb des Introns, jedoch nahe der Kodierungssequenzgrenze. Das lineare Plasmid, das eine Deletion des Großteils des Introns aufweist, wird zusammengestückelt. Einzelsträngige Phagen werden vom rekombinanten pBluescript- Vektor durch Superinfektion mit dem fI Helfer-Phagen lRl erzeugt. Ein Einzelstrang-Oligomer wird mit der erwünschten Endsequenz synthetisiert und mit der Phagen-DNA mit teilweise deletiertem Intron reassoziiert. Der Rest des Introns wird somit in Schleifenform ausgestülpt. Durch Produzieren des ursprünglichen Phagen im E. coli-Stamm CJ236 kann das Kunkel- Mutageneseverfahren (Methods in Enzymology 154: 367 (1987)) angewendet werden, um nach den vollständig deletierten Intron- Konstrukten zu selektieren.
Ein weiteres Verfahren, das zum Deletieren des Introns verwendet werden kann, setzt DNA-Amplifizierung ein (siehe z. B. Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (1989) Bd. 2,2. Ausgabe.
Kurz, es werden Primer erzeugt, um die Amino- und Carboxyl-Hälften des Gens zu amplifizieren und anschließend zu verbinden.
Wird ein Intron unter Anwendung der zuvor erörterten Verfahren in vitro deletiert, dann ist die native Spleißstelle möglicherweise unbekannt. Demzufolge würde eine fachkundige Person erwarten, dass mehrere mögliche künstliche Spleißstellen existieren, die zur Produktion eines aktiven Enzyms führen.
Nach der Identifizierung kann die DNA-Sequenz, die die Pyrococcus sp.-DNA-Polymerase kodiert, mit oder ohne deletiertem Intron, in einen geeigneten Expressionsvektor, wie zum Beispiel ein von E. coli stammendes Plasmid, z. B. pET3A, pBluescript oder pUC19, die vom Bacillus subtilis stammenden Plasmide, z. B. pUB110, pTP5 und pC194, die von Hefe stammenden Plasmide, z. B. pSH19 und pSH15, Bakteriophagen wie λphage, Bakterien wie Agrobacterium tumefaciens, tierische Viren wie Retroviren und Insektenviren wie Baculovirus, kloniert werden.
Der rekombinante Vektor wird mit Standardtechniken zur Transformation und Phageninfektion in den entsprechenden Wirt eingeführt. Das von Cohen, S.N., PNAS (1972) 69: 2110 beschriebene Calciumchloridverfahren wird beispielsweise für E. coli angewendet.
Die Transformation von Bacillus wird gemäß dem Verfahren von Chang, S. et al. Molecular and General Genetics (1979) 168: 111 durchgeführt.
Die Transformation von Hefe wird gemäß dem Verfahren von Parent et al., Yeast (1985) 1: 83-138 durchgeführt.
Bestimmte Pflanzenzellen können mit Agrobacterium tumefaciens gemäß dem von Shaw, C.H., et al., Gene (1983) 23 : 315 beschriebenen Verfahren transformiert werden.
Die Transformation tierischer Zellen wird beispielsweise gemäß dem in Virology (1973) 52: 456 beschriebenen Verfahren durchgeführt.
Die Transformation von Insektenzellen mit Baculovirus wird beispielsweise gemäß dem in Biotechnology (1988) 6: 47 beschriebenen Verfahren durchgeführt.
Die Transformanten werden je nach der verwendeten Wirtszelle unter Anwendung von Standardtechniken kultiviert, die für solche Zellen geeignet sind. Zur Kultivierung von E. coli werden die Zellen zum Beispiel in LB-Medium (Maniatis, supra) bei 30ºC bis 42ºC bis zur mittleren log- oder stationären Phase vermehrt.
Die Pyrococcus sp.-DNA-Polymerase kann von einer Kultur transformierter Wirtszellen isoliert und gereinigt werden, zum Beispiel durch Extraktion von kultivierten Zellen oder der Kulturlösung.
Wenn die Pyrococcus sp.-DNA-Polymerase von einer kultivierten Zelle extrahiert werden soll, dann werden die Zellen nach der Kultivierung mit in der Technik bekannten Verfahren (z. B. durch Zentrifugierung) gesammelt. Anschließend werden die gesammelten Zellen in einer geeigneten Pufferlösung suspendiert und durch Ultraschallbehandlung, Lysozym und/oder Gefrieren-Auftauen gespalten. Ein Rohextrakt, das die Pyrococcus sp.-DNA-Polymerase enthält, wird durch Zentrifugierung und/oder Filtration erhalten.
Wenn die Pyrococcus sp.-DNA-Polymerase in die Kulturlösung sekretiert wird, d. h. alleine oder als ein Fusionsprotein mit einem sekretierten Protein wie Maltose-Bindeprotein, dann wird das Supernatant mit in der Technik bekannten Verfahren von den Zellen getrennt (z. B. durch Zentrifugierung).
Trennung und Reinigung der im Kultur-Supernatanten oder Zellextrakt enthaltenen Pyrococcus sp.-DNA-Polymerase können mit dem oben beschriebenen Verfahren oder mit geeigneten Kombinationen bekannter Trenn- und Reinigungsverfahren erfolgen. Zu diesen Verfahren gehören beispielsweise Verfahren, die Löslichkeit ausnutzen, wie z. B. Salz- und Lösungsmittelfällung, Verfahren, die die Molekulargewichtsdifferenz nutzen, wie Dialyse, Ultrafiltration, Gelfiltration und SDS-Polyacrylamidgel- Elektrophorese, Verfahren, die elektrische Ladungsdifferenzen nutzen, wie Ionenaustausch-Säulenchromatographie, Verfahren, die spezifische Affinitäten nutzen, wie Affinitätschromatographie, Verfahren, die Hydrophobizitätsdifferenzen nutzen, wie Umkehrphasen- Hochdruckflüssigkeitschromatographie, und Verfahren, die Differenzen des isoelektrischen Punktes nutzen, wie isoelektrische Fokussierungs-Elektrophorese.
Ein bevorzugtes Verfahren zur Isolierung und Reinigung des rekombinanten Enzyms findet im Rahmen des folgenden Mehrstufenprozesses statt: zunächst werden die Zellen, sofern sie eingefroren sind, aufgetaut, in einem geeigneten Puffer wie Puffer A (100 mM NaCl, 25 mM Tris, pH 7,5, 0,1 mM EDTA, 10% Glycerol, 0,05% Triton X-100) suspendiert, lysiert und zentrifugiert. Der geklärte Rohextrakt wird dann etwa 30 Minuten lang auf 75ºC erwärmt. Die denaturierten Proteine werden durch Zentrifugierung entfernt. Das Supernatant wird dann durch eine Säule geleitet, die eine hohe Affinität zu Proteinen hat, die sich an Nucleinsäuren binden, wie z. B. Affigel-Blue-Column (Biorad). Die in der Supernatantlösung vorhandenen Nucleinsäuren und viele der Proteine passieren die Säule und werden durch Waschen der Säule mit mehreren Säulenvolumen an salzarmem Puffer mit einem pH-Wert von etwa 7,0 entfernt. Nach dem Waschen wird das Enzym mit einem linearen Gradienten wie z. B. 0,1 M bis 1,5 M NaCl in Puffer A eluiert. Die aktiven Fraktionen werden zusammengefasst, dialysiert und auf eine Phosphocellulosesäule aufgebracht. Die Säule wird gewaschen und die DNA-Polymeraseaktivität mit einem linearen Gradienten von 0,1 bis 1,0 M NaCl in Puffer B (100 M NaCl, 15 mM KPO4, 0,1 mM EDTA, 10% Glycerol, 0,05% Triton X- 100, pH 6,8) eluiert. Die Fraktionen werden gesammelt, und zu jeder Fraktion wird BSA gegeben. Die Fraktionen mit DNA- Polymeraseaktivität werden zusammengefasst. Die erhaltene Pyrococcus sp.-DNA-Polymerase kann unter Anwendung der zuvor beschriebenen standardmäßigen Produktreinigungstechniken weiter gereinigt werden.

Stabilisierung und Verwendung der Pyrococcus sp.-DNA-Polymerase

Zur Langzeitlagerung wird das thermostabile Enzym der vorliegenden Erfindung in dem folgenden Puffer aufbewahrt: 0,05 M NaCl, 0,01 M KPO4 (pH 7,4), 0,1 mM EDTA und 50% Glycerol bei -20ºC.
Die erfindungsgemäße Pyrococcus sp.-DNA-Polymerase kann für jeden beliebigen Zweck verwendet werden, für den ein solches Enzym benötigt wird oder erwünscht ist. Zum Beispiel in der DNA-Rekombinationstechnik, einschließlich Zweitstrang-cDNA- Synthese bei der cDNA-Klonierung, und DNA-Sequenzierung (siehe Maniatis et al., supra).
Die erfindungsgemäße Pyrococcus sp.-DNA-Polymerase kann chemisch oder genetisch modifiziert werden, um die 3'-5' Exonucleasefunktion zu inaktivieren, und für jeden beliebigen Zweck verwendet werden, für den ein solches modifiziertes Enzym erwünscht ist, z. B. bei der DNA-Sequenzierung.
Genetisch modifizierte Pyrococcus sp.-DNA-Polymerase kann beispielsweise durch zufälliges Mutagenisieren des Pyrococcus sp.-DNA-Polymerasegens und anschließendes Screenen nach solchen Mutanten isoliert werden, die ihre Exonuclaseaktivität verloren haben, ohne Verlust der Polymeraseaktivität. Alternativ wird genetisch modifizierte Pyrococcus sp.-DNA-Polymerase vorzugsweise unter Anwendung der in Kunkel, T.A., PNAS (1985) 82 : 488-492 beschriebenen ortsgerichteten Mutagenesetechnik isoliert.
Darüber hinaus kann die erfindungsgemäße Pyrococcus sp.- DNA-Polymerase auch zum Amplifizieren von DNA verwendet werden, z. B. durch das in den US-Patenten Nr. 4,683,195, 4,683,202 und 4,800,159 offenbarte Verfahren.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die derzeit bevorzugten Ausgestaltungen der vorliegenden Erfindung. Es ist zu verstehen, dass die Beispiele illustrativ sind und dass die Erfindung keiner Einschränkung unterliegt, mit Ausnahme der Angaben in den beiliegenden Ansprüchen.

BEISPIEL I

REINIGUNG EINER THERMOSTABILEN DNA-POLYMERASE VON PYROCOCCUS SPECIES

Der Pyrococcus sp.-Stamm GB-D (ATCC Nr. 55239) wurde in dem von Belkin et al., supra, beschriebenen Medium, das 10 g/l Elementarschwefel enthält, in 8 1-Liter-Flaschen bei 94ºC zwei Tage lang vermehrt. Die Zellen wurden auf Raumtemperatur abgekühlt, durch Dekantieren von unverbrauchtem Schwefel getrennt, durch Zentrifugieren gesammelt und bei -70ºC gelagert. Der Zellertrag betrug 1,4 g pro Liter.
11,5 g der wie zuvor beschrieben erzeugten Zellen wurden in 28 ml Puffer A (10 mM KPO4 Puffer, pH 7,4, 0,1 mM EDTA, 1,0 mM Beta-Mercaptoethanol) suspendiert, der 0,1 M NaCl enthielt, und 5 Minuten lang bei 4ºC beschallt. Das Lysat wurde mit 15.000 g 30 Minuten lang bei 4ºC zentrifugiert. Die Supernatantlösung wurde durch eine 18 ml Affigel-Blue-Column (Biorad) geführt. Anschließend wurde die Säule mit 50 ml Puffer A gewaschen, der 0,1 M NaCl enthielt. Die Säule wurde mit einem linearen 300-ml-Gradienten von 0,1 bis 2,0 M NaCl in Puffer A eluiert. Die DNA-Polymerase eluierte als einzelner Peak bei etwa 1,3 M NaCl und repräsentierte 90% der aufgebrachten Aktivität. Die Peak-Aktivität der DNA-Polymerase (25 ml) wurde mit 1 Liter Puffer A dialysiert, der 100 mM NaCl enthielt, und dann auf eine 15 ml Phosphocellulose-Säule aufgebracht, äquilibriert mit Puffer A, der 100 mM NaCl enthielt. Die Säule wurde mit 50 ml Puffer A gewaschen, der 100 mM NaCl enthielt, und die Enzymaktivität wurde mit einem linearen 200-ml- Gradienten von 0,1 bis 1,0 M NaCl in Puffer A eluiert. Die Aktivität eluierte als einzelner Peak bei 0,6 M NaCl und repräsentierte 70% der aufgebrachten Aktivität. Die zusammengefasste Aktivität (42 ml) wurde mit 500 ml Puffer A dialysiert und auf eine 25 ml DEAE-Säule aufgebracht. Die Säule wurde mit 50 ml Puffer A gewaschen, der 0,1 M NaCl enthielt, und zwei Drittel der Enzymaktivität passierten die Säule. Die aktiven Fraktionen wurden zusammengefasst (30 ml) und auf eine 1,0 ml HPLC Mono-S-Säule (Pharmacia) aufgebracht und mit einem linearen 100-ml-Gradienten von 0,05 bis 1,0 M NaCl in Puffer A eluiert. Die Aktivität eluierte als einzelner Peak bei 0,22 M NaCl und repräsentierte 80% der aufgebrachten Aktivität.
Gereinigte Pyrococcus sp.-Polymerase wurde in 10-20% SDS- Polyacrylamidgel Elektrophorese unterworfen und mit Coomassie- Blau oder dem zuvor beschriebenen Kolloid-Farbstoff (ISS Problue) gefärbt, um Protein nachzuweisen. Eine schwach gefärbte Proteinbande war bei etwa 92.000 bis 97.000 Dalton erkennbar; diese Molekulargewichtsbestimmung wurde durch einen Vergleich auf demselben Gel mit der Migration der folgenden Markerproteine (Bethesda Research Laboratories) erhalten: Myosin, 200.000 Dalton; Phosphorylase B, 97.400 Dalton; BSA, 68.000 Dalton; Ovalbumin, 43.000 Dalton, Kohlensäureanhydrase, 29.000 Dalton; b-Lactoglobulin, 18.400 Dalton; Lysozym, 14.300 Dalton.

BEISPIEL II

KLONIEREN EINES PYROCOCCUS SP.-DNA-POLYMERASEGENS

Eine Kreuzhybridisierung einer genomischen Pyrococcus-DNA- Bibliothek unter Verwendung radioaktiver Sonden, präpariert vom DNA-Polymerasegen von Thermococcus litoralis, ermöglichte die Identifizierung und Isolierung einer DNA, die die Pyrococcus- DNA-Polymerase kodiert. Dies wurde wie folgt erreicht.
Um zu ermitteln, welche Restriktionsenzyme in der Präparation der Pyrococcus-Genombibliothek am nützlichsten sind, wurde Pyrococcus sp.-DNA vollständig mit Eco RI, BamHI und HindIII zerschnitten. Diese DNA wurde einer Agarosegel- Elektrophorese (Fig. 1A) und Southern-Hybridisierung (Fig. 1B) mit einer wie folgt präparierten DNA-Sonde unterzogen. Ein Reaktionsgemisch mit etwa 1 ug des ersten EcoRI-Fragments des T. litoralis-DNA-Polymerasegens (bp 1-1274, erhältlich von Bakteriophage NEB Nr. 618, ATCC-Nr. 40794) als Matrize in einem handelsüblichen Random-Priming-Kit (New England Biolabs, Inc.) wurde 1 Stunde lang bei 37ºC inkubiert, um eine DNA-Sonde mit hoher spezifischer Aktivität zu produzieren. Die Sonde wurde mit der oben präparierten Pyrococcus sp.-DNA unter mäßig stringenten Bedingungen hybridisiert (Hybridisierung: über Nacht bei 50ºC, 4X SET, 0,1 M Natriumphosphat, pH 7, 0,1% Na- Pyrophosphat, 0,1% SDS, 1X Denhardts-Lösung; Waschbedingungen: Wäsche 3X 20-30 Minuten, 45ºC, 0,1X SET, 0,1 M Natriumphosphat, pH 7, 0,1% Na-Pyrophosphat, 0,1% SDS. Maniatis et al., supra). Es wurde eine einzelne Hauptbande bei etwa 5 Kb in mit BamH I zerschnittener Pyrococcus-DNA nachgewiesen. EcoR I und Hind III ergaben mehrere Banden mit dieser Sonde, was darauf hinwies, dass diese Enzyme innerhalb des Pyrococcus-Polymerasegens schneiden.
Auf der Basis dieser Ergebnisse wurde eine BamHI- Genombibliothek mit dem Phagenvektor λDASH (Stratagene) konstruiert. Es wurden teilweise und vollständige BamHI- Verdauungen von Pyrococcus-DNA präpariert. Ein Gemisch aus der teilweisen und vollständigen BamHI-verdauten DNA wurde mit dem BamHI-Ort von λDASH ligiert. Das Ligationsgemisch wurde mit Gigapack Gold (Stratagene) gemäß Herstellerangaben verpackt und auf E. coli ER1458 plattiert. Die verpackte Phagenbibliothek enthielt 1 · 10&sup6; Phagen pro ml.
³²p-markierte DNA-Sonden der 3 Fragmente (SEQ ID Nr. 2, bp 1-1274, 1656-2660 und 3069-3737) des T. litoralis-DNA- Polymerasegens (erhältlich von NEB Nr. 619, ATCC-Nr. 40795) wurden mit einem Random-Primer-Kit (New England Biolabs, Inc.) präpariert. Die Sonden wurden gemäß dem Verfahren von Benton & Davis (Maniatis et al., supra) zum Screenen der Pyrococcus- Genombibliothek unter Verwendung der oben beschriebenen Hybridisierungsbedingungen verwendet. Etwa ein Prozent der Plaques waren positiv, und es wurden zehn positive Plaques aufgenommen und durch Reinfektion und dreimalige Replattierung gereinigt (bis 90-100% der Plaques zu jedem Isolat positiv waren). Platten-Lysate (Maniatis, supra) von Phagen wurden von jedem Isolat präpariert und zum Infizieren von E. coli-Kulturen verwendet. 0,1 ml jedes Platten-Lysats wurden mit 0,2 ml Zellen (OD 600 : 2) vermischt. Die Bakterienzellen wurden kurz vor der Lyse geerntet und in 0,05 M NaCl, 0,01 M Tris (pH 8,0), 0,1 mM EDTA, 0,1% Triton X-100 und 200 ug/ml Lysozym (3 Volumen pro Zellvolumen) suspendiert und etwa 1 Minute lang oder bis zur Zelllyse auf 37ºC erwärmt. Die lysierten Extrakte wurden sofort 30 Minuten lang auf 75ºC erwärmt, zentrifugiert, und die Supernatantlösung wurde in Bezug auf wärmebeständige DNA- Polymeraseaktivität gemäß dem oben beschriebenen Verfahren untersucht. Drei der zehn Isolate wiesen eine signifikante Polymeraseaktivität auf und der Klon (B9), der die stärkste Aktivität zeigte, wurde weiter untersucht.
Die Phagen-DNA wurde von B9 isoliert und die Insert-DNA wurde durch Restriktionsenzymverdauung untersucht. Die Verdauung mit Sal I erbrachte die erwarteten zwei Arme von λDASH sowie ein 15 Kb Insert. Die Verdauung mit BamH I erbrachte die beiden Arme von λDASH sowie drei Insert-Fragmente mit 7, 4,8 und 3 Kb. Jedes dieser Fragmente wurde durch Agarosegel-Elektrophorese gereinigt, eluiert und mit dem BamH I Ort von pUC19 ligiert. Das Ligationsgemisch wurde zum Transformieren von E. coli ER2207 verwendet, woraus weiße Kolonien resultieren, wenn Plasmide ein Insert enthalten, und blaue Kolonien auf Indikator-Agarmedium (X-gal plus IPTG) resultieren, wenn keine Inserts vorhanden sind. Mit dem 7 Kb Fragment wurden keine Weißkolonie-Transformanten erhalten. Mit dem 4,8 Kb Fragment wurden drei weiße und siebenundzwanzig blaue Kolonien und mit dem 3 Kb Fragment zwanzig Weiß- und einundzwanzig Blaukolonie-Transformanten erhalten. Alle drei 4,8 Kb Weißkolonie-Transformanten wiesen wärmebeständige DNA- Polymeraseaktivität auf. Keiner der mit dem 3 Kb Fragment erhaltenen Transformanten wies wärmebeständige Polymeraseaktivität auf. Die drei Klone mit dem 4,8 Kb Pyrococcus-DNA-Fragment wiesen alle etwa die gleiche spezifische Aktivität für wärmebeständige DNA-Polymerase auf, wobei einer für weitere Studien genommen wurde (NEB Nr. 720). Dieser Klon mit der Bezeichnung NEB Nr. 720 wurde am 1. Oktober 1991 mit der ATCC-Nr. 68723 bei der Amerikanischen Typus- Kultursammlung, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, im Rahmen des Budapester Vertrags hinterlegt. NEB Nr. 720 erbrachte 1700 Einheiten DNA-Polymeraseaktivität pro Gramm Zellen und wurde für die großtechnische Präparation dieses Enzyms verwendet.
Eine Restriktionsendonucleasekarte des 4,8 Kb BamHI- Fragments mit dem Pyrococcus sp.-DNA-Polymerasegen ist in Fig. 2 dargestellt. Eine teilweise DNA-Sequenz dieses Gens ist in der Sequenzauflistung als SEQ ID Nr. 1 enthalten. Durch einen Vergleich der Pyrococcus species-Polymerase-DNA und Proteinsequenzen der vorliegenden Erfindung mit Thermococcus litoralis-DNA-Polymerase-DNA und Protein wurde festgestellt, dass wenigstens eine Intervening-Sequenz innerhalb des Pyrococcus-DNA-Polymerasegens anwesend ist. Die Pyrococcus- Intervening-Sequenz befindet sich innerhalb der konservierten Pol-α-Motivregion III und beginnt bei Nucleotid 1839 von SEQ ID Nr. 1.

BEISPIEL III

REINIGUNG REKOMBINANTER PYROCOCCUS SPECIES-DNA-POLYMERASE

E. coli NEB Nr. 720 (ATCC-Nr. 68723) wurde in einem 25- Liter-Fermenter in Medium, das 10 g/Liter Trypton, 5 g/Liter Hefeextrakt, 5 g/Liter NaCl und 100 mg/Liter Ampicillin enthielt, bei 37ºC vermehrt und mit 0,3 mM IPTG bei mittlerer exponentieller Wachstumsphase induziert und weitere 4 Stunden inkubiert. Die Zellen wurden durch Zentrifugierung geerntet und bei -70ºC gelagert.
92 Gramm Zellen wurden aufgetaut und in Puffer A (100 mM NaCl, 10 mM KPO&sub4; mit pH 7,4, 0,1 mM EDTA, 0,1% Triton X-100 200 ug/ml Lysozym) auf ein Gesamtvolumen von 350 ml suspendiert. Die Zellen wurden durch Inkubation bei 37ºC lysiert, bis das Gemisch extrem viskos wurde (etwa 5 Minuten). Der Rohextrakt wurde sofort 30 Minuten lang auf 75ºC erwärmt. Die denaturierten E. coli-Proteine wurden durch Zentrifugierung entfernt, und die Supernatant-Lösung wurde für die Isolierung der wärmebeständigen Pyrococcus sp.-DNA-Polymerase verwendet.
Die Supernatant-Lösung wurde auf 0,3 M NaCl gebracht und durch eine DEAE-Cellulosesäule, 2 · 30 cm, geleitet, die in einem Büchner-Trichter präpariert wurde, um Nucleinsäuren zu entfernen; der Strom passierte eine Afft-Gel-Blue- Chromatographiesäule, 4 · 10 cm (125 ml), wurde mit 300 ml 0,3 M NaCl, 0,01 M KPO&sub4; (pH 7,4), 0,1 mM EDTA gewaschen und eluierte dann mit einem linearen 1500-ml-Gradienten von 0,3 M bis 2,0 M NaCl in dem gleichen Puffer.
Die Säulenfraktionen wurden in Bezug auf DNA- Polymeraseaktivität untersucht. Kurz, 1-4 ul der Fraktionen wurden 5-10 Minuten lang bei 75ºC in 50 ul DNA-Polymerasepuffer (10 mM KCl, 20 mM Tris-HCl (pH 8,8 bei 24ºC), 10 mM (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 2 mM MgSO&sub4; und 0,1% Triton X-100) inkubiert, der 30 uM von jedem dNTP und ³H-markierten TTP, 0,5 mg/ml aktivierte Kalbsbries-DNA und 100 ug/ml acetyliertes BSA enthielt. Die Analysegemische wurden auf 3 mm Whatman-Filter aufgebracht, und die Filter wurden drei Wäschen mit 10%iger TCA und anschließend zwei Wäschen mit kaltem Ethanol unterzogen. Nach dem Trocknen der Filter wurde die gebundene Radioaktivität gemessen, die den Einbau von ³H-TTP in die DNA repräsentierte. Die aktiven Fraktionen wurden zusammengefasst, mit 0,1 M NaCl, 0,01 M KPO&sub4; (pH 7,4), 0,1 mM EDTA dialysiert und dann durch eine Phosphocellulosesäule, 4 · 12 cm (150 ml), geleitet, und die Säule wurde mit 300 ml des gleichen Puffers gewaschen und anschließend mit einem linearen Gradienten von 0,1 M bis 1,5 M NaCl eluiert. Aktive Fraktionen wurden zusammengefasst und mit einem gleichen H&sub2;O-Volumen verdünnt und durch eine 1,0 ml Pharmacia HPLC Mono-Q-Säule geleitet und mit einem linearen 60- ml-Gradienten von 0,05 M bis 1,0 M NaCl eluiert. Aktive Fraktionen wurden zusammengefasst und bei -20ºC gelagert. Die Pyrococcus sp.-DNA-Polymerase war in diesem Stadium etwa 50% rein, wie anhand einer visuellen Beurteilung eines mit Coomassie-Blau gefärbten Gels ermittelt wurde, und hatte eine spezifische Aktivität für DNA-Synthese von 70.000-100.000 Einheiten pro mg und repräsentierte 8% der in den Rohextrakten anwesenden Enzymaktivität. Die gereinigte Polymerase war im Wesentlichen frei von kontaminierender DNA und kontaminierenden Nucleasen.
Die DNA-Polymeraseaktivität entsprach der mit Coomassie- Blau gefärbten 92-97.000 Kd Hauptbande aus Fig. 3. Dies wurde in der folgenden Weise ermittelt. Nach einer Elektrophorese in 10-20% SDS-Polyacrylamid-Gel und vor einer Färbung mit Coomassie-Blau wurde das Gel über Nacht bei 4ºC in 1,0% Triton X-100, 0,01 M Tris HCl (pH 7,4) mit 3 Wechselbädern von jeweils 200 ml eingeweicht, um Natriumdodecylsulfat (SDS) aus dem Gel zu entfernen und es durch das nichtionische Detergens Triton X- 100 zu ersetzen. Nach der letzten Wäsche wurde das Gel in 0,1% Triton X-100, 0,01 M Tris HCl (pH 7,4) 2 Stunden lang eingeweicht und dann kurz mit einem Papiertuch getrocknet und auf eine Glasplatte gesetzt. Das Gel wurde mit einem Stück Whatman Nr. 54 Filterpapier bedeckt und es wurden 0,3 ml Testpuffer mit ³²p-d CTP (10-20 · 10&sup6; cpm pro umol) auf die Mitte des Filterpapiers gegeben. Nachdem sich die Flüssigkeit zu den Papierseiten ausgebreitet hatte, wurde eine zweite Glasplatte auf die Oberseite des Filterpapiers gesetzt und das Glas-Gel-Papier-Glas-Sandwich mit einem Band fest zusammengebunden und bei 75ºC 60 Minuten lang inkubiert. Das Papier wurde von dem Gel entfernt, dreimal mit 10% TCA mit 1 mN dCTP gewaschen (30 Minuten pro Wäsche) und zweimal mit Isopropanol gewaschen. Das Papier wurde an der Luft getrocknet und über Nacht einem Röntgenfilm ausgesetzt. Nach der Entwicklung konnte ein schwarzer Fleck auf dem Film auf die 92- 97.000 Kd Coomassie-Blau-Bande auf dem gefärbten Gel gelegt werden, was darauf hinwies, dass die Hauptbande auf dem Gel in Fig. 3 die DNA-Polymerase ist.
Eine Western-Blot-Analyse (Towbin et al. PNAS (1979) 76 : 4350-4354) des gereinigten rekombinanten Proteins unter Verwendung von Antikörper, präpariert mit der eng verwandten DNA-Polymerase von Thermococcus litoralis, zeigte eine Hauptbande bei 92.000-97.000 Kd, die mit der mit Coomassie-Blau gefärbten Bande identisch war und sich an etwa der gleichen Stelle auf dem Gel befand (Fig. 4).

BEISPIEL IV

BESTIMMUNG DER 3-5'-PROOFREADING-AKTIVITÄT

1. Reaktion der T. litoralis-DNA-Polymerase auf die An- oder Abwesenheit von Desoxynucleotiden

Das Niveau der Exonucleaseaktivitäten in Verbindung mit Polymerasen zeigt sehr unterschiedliche Reaktionen auf Desoxynucleotide. Nicht-Proofreading-5-3'-Exonucleasen werden durch gleichzeitige Polymerisierung, die durch die Anwesenheit von Desoxynucleotiden erbracht wird, mindestens um das Zehnfache stimuliert, wohingegen Proofreading-3'-5'- Exonucleasen durch gleichzeitige Polymerisierung vollständig inhibiert werden (Lehman, I.R. ARB (1967) 36: 645).
Die Pyrococcus sp.-DNA-Polymerase oder -Polymerasen mit gut charakterisierten Exonucleasefunktionen (T4-Polymerase, Klenow-Fragment) wurden mit 1 ug ³H-Thymidin-markierter doppelsträngiger DNA (10&sup5; CPM/ug) in Polymerisationspuffer (70 mM Tris (pH 8,8 bei 24ºC), 2 mM MgCl&sub2;, 0,1% Triton und 100 ug/ml Rinderserumalbumin) inkubiert. Nach einer Inkubationsdauer von drei Stunden (Experiment 1) oder vier Stunden (Experiment 2) bei 70ºC (thermophile Polymerasen) oder 37ºC (mesophile Polymerasen) wurden die Exonucleasehydrolysierten Basen durch Messen der säurelöslichen radioaktiv markierten Basen quantifiziert.
Wie in Tabelle 1 zu sehen ist, wies die Taq-DNA- Polymerase, mit ihrer 5'-3'-Exonucleaseaktivität, eine Stimulierung der Exonucleaseaktivität auf, wenn Desoxynucleotide zu 30 uM vorlagen. Polymerasen mit 3-5'- Proofreading-Exonucleaseaktivitäten, wie T4-Polymerase, Klenow- Fragment von E. coli-Polymerase I, T. litoralis-DNA-Polymerase oder die Pyrococcus-DNA-Polymerase, wiesen das Gegenteil auf, nämlich eine hemmende Reaktion auf die Anwesenheit von Desoxynucleotiden. TABELLE 1
* nichtlinearer Prüfungsbereich 2. Vergleich der 3'-5'-Proofreading-Aktivität von PYrococcus sp.-DNA-Polymerase mit Thermococcus litoralis-DNA- Polymerase
Für eine weitere Charakterisierung der 3'-5'-Exonuclease- Aktivität von Pyrococcus sp.-DNA-Polymerase wurden beide Enzyme bei den gleichen DNA-Polymerisierungseinheiten hinsichtlich 3'- 5'-Proofreading-Exonucleaseaktivität verglichen (Fig. 5). Die Ergebnisse zeigen, dass bei gleichen DNA- Polymerisierungseinheiten Pyrococcus sp.-DNA-Polymerase eine Exonucleaseaktivität hat, die 2,5 Mal so hoch ist wie die der Thermococcus litoralis-DNA-Polymerase. Dies lässt auf eine höhere Treue während der DNA-Synthese schließen.

BEISPIEL V

HALBWERTSZEITBESTIMMUNG BEI DER PYROCOCCUS SP.-DNA-POLYMERASE

Die Wärmebeständigkeit oder Halbwertszeit der wie oben im Beispiel III beschrieben gereinigten Pyrococcus sp.-DNA- Polymerase wurde mit dem folgenden Verfahren bestimmt. Gereinigte rekombinante Pyrococcus sp.-DNA-Polymerase (40 Einheiten/ml) wurde bei 95ºC oder 100ºC in einem Reaktionspuffer ohne dNTPs und DNA vorinkubiert (Reaktionspuffer 10 mM KCl, 10 mM (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 20 mM Tris-HCl (pH 8,8 bei 25ºC), 2 mM MgSO&sub4;, 0,1% TRITON X-100, angereichert mit 0,1 mg/ml BSA). Zu den in Fig. 6 angegebenen Zeiten wurde eine Aliquote des Enzymgemischs im Reaktionspuffer bei 70ºC vierfach verdünnt, der [³H] markierte dNTPs und primerunterstütztes M13 DNA-Substrat enthielt (Endkonzentration jeweils 0,2 mM und 20 nM), und es wurde die Ausgangsrate des [³H] Einbaus in säureunlösliches Material beobachtet. Die Aktivität wird relativ zur Aktivität ausgedrückt, die vor der Behandlung bei 95ºC oder 100ºC anwesend war.
Wie in Fig. 6 zu sehen ist, betrug die Halbwertszeit der Pyrococcus sp.-DNA-Polymerase bei 95ºC 23 Stunden und bei 100ºC 8 Stunden.

SEQUENZAUFLISTUNG

(1) ALLGEMEINE INFORMATIONEN:
(i) ANMELDER: COMB, DONALD G.
PERLER, FRANCINE
KUCERA, REBECCA
KONG, HUIMIN
JACK, WILLIAM F.
(ii) TITEL DER ERFINDUNG: GEREINIGTE THERMOSTABILE DNA- POLYMERASE, ERHÄLTLICH VON PYROCOCCUS SPECIES
(iii)ANZAHL DER SEQUENZEN: 2
(v) MASCHINENLESBARES FORMULAR:
(A) MEDIENTYP: Diskette
(B) COMPUTER: IBM-kompatibler PC
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: PatentIn Release Nr. 1.0, Version Nr. 1.25
(vi) AKTUELLE ANMELDUNGSDATEN:
(A) ANMELDUNGSNUMMER:
(B) REGISTRIERUNGSDATUM:
(C) KLASSIFIZIERUNG:
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID Nr.: 1:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
(A) LÄNGE: 3420 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRNGIGKEIT: doppelt
(D) TOPOLOGIE: unrelevant (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr.: 1 :
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID Nr.: 2:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
(A) LÄNGE: 5837 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT:
(D) TOPOLOGIE: unrelevant (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr.: 2:

Claims

1. Gereinigtes thermostabiles Enzym, erhältlich von Pyrococcus sp., das die Polymerisation von DNA katalysiert, wobei das genannte Enzym von E. coli NEB Nr. 720 (ATCC Nr. 68723) erhältlich ist.

2. Thermostabiles Enzym nach Anspruch 1, mit einer relativen Molekülmasse von etwa 92.000 bis 97.000 Dalton.

3. Thermostabiles Enzym nach Anspruch 1, mit einer 3-5'- Exonucleaseaktivität.

4. Thermostabiles Enzym nach Anspruch 3, wobei die 3-5'- Exonucleaseaktivität inaktiviert ist.

5. Thermostabiles Enzym nach Anspruch 1, mit einer Halbwertszeit von etwa 8 Stunden bei 100ºC.

6. Thermostabiles Enzym nach Anspruch 1, mit einer Halbwertszeit von etwa 23 Stunden bei 95ºC.

7. Isolierte DNA-Sequenz, die das thermostabile Enzym aus Anspruch 1 kodiert.

8. Vektor, der die DNA-Sequenz von Anspruch 7 enthält.

9. Mikrobieller Wirt, transformiert mit dem Vektor aus Anspruch 8.

10. Transformante nach Anspruch 9, wobei die genannte Transformante E. coli NEB Nr. 720 (ATCC Nr. 68723) ist.

11. Verfahren zur Herstellung von Pyrococcus sp. DNA- Polymerase, umfassend das Kultivieren des transformierten mikrobiellen Wirts nach einem der Ansprüche 9 oder 10 unter Bedingungen, die für die Expression von Pyrococcus sp. DNA- Polymerase und Wiedergewinnung von Pyrococcus sp. DNA- Polymerase geeignet sind.

12. DNA nach Anspruch 7, wobei die DNA eine Intervening- DNA-Sequenz enthält.

13. Verfahren nach Anspruch 11 für die Steigerung der Expression von Pyrococcus sp. DNA-Polymerase, umfassend die folgenden Schritte:

(a) Deletieren einer Intervening-DNA-Sequenz von DNA nach Anspruch 7;

(b) Einleiten der DNA aus Schritt (a) in einen Expressionsvektor;

(c) Transformieren eines mikrobiellen Wirts mit dem Expressionsvektor von Schritt (b);

(d) Kultivieren des transformierten Wirts aus Schritt

(c) unter Bedingungen, die für die Expression von Pyrococcus sp. DNA-Polymerase geeignet sind; und

(e) Wiedergewinnen der Polymerase.