BRPI0612655A2 - composição imunogênica, vacina, e, kit de vacina para a administração seqüencial ou concomitante - Google Patents

Abstract

COMPOSIçãO IMUNOGêNICA, VACINA, E, KIT DE VACINA PARA A ADMINISTRAçãO SEQUENCIAL OU CONCOMITANTE. 0 presente pedido expõe uma composição imunogênica, que compreende pelo menos 2 sacarídeos capsulares N. meningitidis diferentes, em que um ou mais é/são selecionados a partir de um primeiro grupo, que consiste de MenA, MenC, MenY e MenW, que é/são conjugado(s) através de um agente de ligação a proteína(s) carreadora(s), e um ou mais sacarídeos diferentes é/são selecionados a partir de um segundo grupo, que consiste de MenA , MenC, MenY e MenW, que é/são diretamenteconjugados a uma(s) proteína(s) carreadora(s).

Description

"COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA, VACINA, E, KIT DE VACINA PARAA ADMINISTRAÇÃO SEQÜENCIAL OU CONCOMITANTE."

A presente invenção refere-se a composições imunogênicas,que compreendem sacarídeos capsulares bacterianos conjugados a umaproteína carreadora, em particular àqueles sacarídeos N. meningitidis. Emadição, ela refere-se a vacinas e a kits de vacina que compreendem taisconjugados de sacarídeos, a processos para a produção das composiçõesimunogênicas e a vacinas e ao uso de vacinas e de composiçõesimunogênicas da invenção em terapia. Ela refere-se também a métodos deimunização contra a infecção usando os conjugados de sacarídeo e ao usodos conjugados de sacarídeo na manufatura de um medicamento.

Neisseria meningitidis é um patógeno humano Gram-negativo, que causa meningite bacteriana. Com base no polissacarídeocapsular do organismo, doze sorogrupos de N. meningitidis foramidentificados (A, B, C, Η, I, K, L, 29E, W 135, X, Y, e Ζ). O sorogrupo A(MenA) é a causa mais comum da doença epidêmica na África subariana. Ossorogrupos BeC são responsáveis pela maioria de casos em países emdesenvolvimento, os casos remanescentes sendo causados por W 135 e Y.

As composições imunogênicas, que compreendem sacarídeosN. meningitidis conjugados a proteínas carreadoras são conhecidos naarte; a proteína carreadora tendo o efeito conhecido de transformar oantígeno de polissacarídeo independente de T em um antígeno dependente de T,capaz de provocar uma resposta de memória imune. Por exemplo, o WO02/58737 expõe uma vacina, que compreende polissacarídeos capsularespurificados dos sorogrupos de N. meningiditis A, C, W136 e Y, conjugados a umaproteína carreadora. No entanto, este pedido ensina que todos ospolissacarídeos devem ser essencialmente conjugados do mesmo modo(através do mesmo agente de ligação à mesma proteína carreadora).

Permanece uma necessidade para que sejam desenvolvidasvacinas conjugadas aperfeiçoadas contra a meningite neisseriana. A presenteinvenção refere-se à provisão de uma vacina conjugada de polissacarídeomeningocócico, em que a conjugação de cada polissacarídeo é adaptada(preferivelmente a que seja uniforme) de modo a alcançar uma vacinacombinada eficaz. Em particular, é vantajoso usar moléculas de agente deligação para conjugar certos sacarídeos meningocócicos a certos carreadoresde proteína em combinação com outras, que são conjugadas diretamente.Deste modo, os polissacarídeos, que são imunógenos menos bons, podem serapresentados ao sistema imune através de um agente de ligação, e aqueles quesão imunógenos muito bons podem ser diretamente conjugados, de tal modoque eles não dominem a resposta imune à combinação.

Deste modo, em um aspecto da presente invenção, é providauma composição imunogênica, que compreende pelo menos 2 sacarídeoscapsulares N. meningitidis, em que um ou mais é/são selecionados a partir deum primeiro grupo, que consiste de MenA, MenC, Men Y e Men W, queé/são conjugados através de um agente de ligação a uma proteína(s) carreador,e um ou mais sacarídeos diferentes é/são selecionados a partir de um segundogrupo, que consiste de MenA, MenC, MenY e MenW, que é/são diretamenteconjugados a uma proteína(s) carreadora(s).

Em uma vacina MenAC, por exemplo, MenA pode serconjugado através de um agente de ligação e MenC diretamente. Em umavacina MenCY, MenC pode ser conjugado através de um agente de ligação eMenY diretamente. Em uma vacina MenACWY, a vacina MenA pode serconjugada através de um agente de ligação e MenCWY diretamente, ouMenAC pode ser conjugado através de um agente de ligação e MenWYdiretamente.

Uma outra consideração, em uma vacina combinada, quecompreende vários sacarídeos combinados ao mesmo carreador, é a questãoda supressão imune do carreador:carreador demais pode ser usado e a respostaimune pode ser impedida. Com uma abordagem uniforme à conjugação, ocarreador irá apresentar uma mistura similar de epítopos da célula B e T aosistema imune. No entanto, se a conjugação ocorrer em diferente gruposquímicos dentro da proteína do carreador para um sacarídeo contra o outro,provavelmente os carreadores serão diferentes em alguma extensão em comoeles se apresentam, em si mesmos, ao sistema imune.

Deste modo, em uma modalidade separada da invenção, éprovida uma composição imunogênica, que compreende pelo menos 2sacarídeos diferentes conjugados separadamente ao mesmo tipo de proteínacarreador (por exemplo, toxóide do tétano), em que um ou mais sacarídeo(s)é/são conjugados à proteína carreador através de um primeiro tipo de grupoquímico no carreador de proteína, e um ou mais sacarídeo(s) é/são conjugadosà proteína de carreador através de um segundo tipo diferente de grupoquímico no carreador da proteína.

O primeiro e segundo tipos de grupo químico podem estarpresentes no carreador da proteína em um primeiro e segundo conjunto deaminoácidos mutuamente exclusivos do carreador da proteína (por exemplo,certos resíduos de ácido aspártico/ácido glutâmico em um conjunto e certosresíduos de lisina no segundo). Um sacarídeo pode ser conjugado a um grupocarboxila no carreador, e outro em um grupo amino, por exemplo. Uma talconjugação pode envolver a conjugação em epítopos da célula B e/ou T paracada conjugado diferente.

Por exemplo, em uma vacina de MenAC, MenA pode serligado a um primeiro tipo de grupo químico (tal que carboxila) na proteína decarreador e MenC ligado a um segundo (tal que amino). Em uma vacina deMenCY, MenC pode estar ligado a um primeiro tipo de grupo químico (talque carboxila) na proteína de carreador e MenY ligado a um segundo (tal queamino). Em uma vacina de MenACWY, MenAC pode ser ligado a umprimeiro tipo de grupo químico (tal que carboxila) na proteína de carreador eMenWY ligado a um segundo (tal que amino), ou MenA pode ser ligado a umprimeiro tipo de grupo químico (tal que carboxila) na proteína de carreador eMenCWY a um segundo (tal que amino)

De acordo com um outro aspecto da invenção, é provido ummétodo de imunizar um hospedeiro humano contra uma doença causada porNeisseria meningitidis, que compreende administrar ao hospedeiro uma doseimunoprotetora da composição imunogênica ou vacina da invenção.

De acordo com um outro aspecto da invenção, é provida umacomposição imunogênica da invenção para o uso no tratamento ou prevençãode uma doença causada por Neisseria meningitidis.

De acordo com um aspecto adicional da invenção, é provido ouso da composição imunogência ou vacina da invenção, na manufatura de ummedicamento parta o tratamento ou a prevenção de doenças causadas porNeisseria meningitidis.

Descrição das figuras:

Figura 1-A - é um gráfico de barras que apresenta respostas deGMC em um ELISA anti-MenY. ENYTTO12 é um conjugado de MenY-TT,preparado a partir do polissacarídeo MenY nativo. ENYTTO14 é umconjugado MenY-TT, preparado a partir do polissacarídeo MenYmicrofluidizado, que foi submetido a 40 ciclos de microfluidização.ENYTTO15 é um conjugado de MenY-TT, preparado a partir dopolissacarídeo MenY microfluidizado, que foi submetido a 20 ciclos demicrofluidização.

-B - é um gráfico de barras, que mostra as respostas de GMTem um ensaio de SBA anti-MenY. ENYTTO12 é um conjugado de MenY-TTpreparado a partir do polissacarídeo MenY nativo. ENYTTO14 é umconjugado de MenY-TT, preparado a partir do polissacarídeo MenYmicrofluidizado, que foi submetido a 40 ciclos de microfluidização.ENYTTO 15bis é um conjugado de MenY-TT, preparado a partir dopolissacarídeo MenY microfluidizado, que foi submetido a 20 ciclos demicrofluidização.

Descrição Detalhada

Em um aspecto da presente invenção, é provida umacomposição imunogênica, que compreende pelo menos 2 sacarídeoscapsulares N. meningitidis diferentes, em que um ou mais é/são selecionadosa partir de um primeiro grupo, que consiste de MenA, MenC, MenY e MenW,que é/são conjugados a uma proteína(s) carreador, e em que um ou maissacarídeos diferentes é/são selecionados a partir de um segundo grupo, queconsiste de MenA, MenC, MenY e MenW, que é/são conjugado(s)diretamente a uma proteína(s) carreadora(s).

De modo mais específico, o primeiro grupo pode consistir deMenA e MenC, e o segundo grupo consiste de MenC, MenY e MenW.Modalidades particulares da invenção são composições imunogênicas quecompreendem:um sacarídeo capsular MenA conjugado através de um agentede ligação a uma proteína carreadora e um sacarídeo capsular MenCdiretamente conjugado a uma proteína carreadora; o sacarídeo capsularMenC, conjugado através de um agente de ligação a uma proteína carreadora,e o sacarídeo capsular MenY diretamente conjugado a uma proteínacarreadora; sacarídeos capsualres MenA e MenC, conjugados através de umagente de ligação a uma proteína (s) carreadora e os sacarídeos capsularesMenY e MenW diretamente conjugados a uma proteína (s) carreadora; Osacarídeo capsular MenAA conjugado através de um agente de ligação e umaproteína carreadora e os sacarídeos capsulares MenC, MenY e MenWdiretamente conjugados a uma proteína(s) carreadora. Em qualquer destasmodalidades, um conjugado Hib pode ser também incluído, que está ligado auma proteína carreadora (vide lista de carreadores acima e abaixo, porexemplo TT), diretamente ou através de um agente de ligação. O termo"sacarídeo" em todo este relatório pode indicar polissacarídeo ouoligossacarídeo e inclui ambos. Os polissacarídeos são isolados a partir debactérias ou isolados a partir de bactérias e encolados em algum grau atravésde métodos conhecidos (vide, por exemplo, EP 497524 e EO 497525) eopcionalmente através de microfluidização. Os polissacarídeos podem serencolados de modo a reduzir a sua viscosidade em amostras de polissacarídeoe/ou de modo a aperfeiçoar a sua capacidade de filtração quanto a produtosconjugados. Os oligossacarídeos possuam um baixo número de unidades derepetição (de modo típico de 5-30 unidades de repetição) e são, de modotípico, polissacarídeos hidrolisados.

Cada sacarídeo capsular N. meningitidis (e/ou Hib) pode serconjugado a uma proteína carreadora, independentemente selecionadas apartir do grupo, que consiste de TT, DT, CRM 197, fragmento C de TT eproteína D. Uma lista mais completa de carreadores de proteína, que podemser usadas nos conjugados da invenção, é apresentada abaixo. Embora um oumais sacarídeos capsulares N. meningitidis (e/ou Hib) possa ser conjugado aproteínas carreadoras diferentes umas das outras, em uma modalidade eles sãotodos conjugados à mesma proteína carreadora. Por exemplo, eles podem sertodos conjugados à mesma proteína carreadora, selecionada a partir do grupoque consiste de TT, DT, CRM 197, fragmento C de TT e proteína D. Nestecontexto, CRM 197 e DT podem ser considerados como sendo a mesmaproteína carreadora pelo fato de que eles diferem em apenas um aminoácido.Em uma modalidade, todos os sacarídeos capsulares N.meningitidis (e/ouHib) presentes são conjugados a TT.

Se a proteína carreadora for a mesma para 2 ou maissacarídeos na composição, os sacarídeos podem ser conjugados à mesmamolécula do carreador de proteína (moléculas de carreador tendo mais 2sacarídeos diferentes conjugados a ela) [vide, por exemplo, WO 04/083251;por exemplo, uma única proteína carreadora pode ser conjugada a MenA e aMenC; MenA e MenW; Men A e MenY; Men C e MenW; MenC e MenY;

MenW e MenY; MenA5 MenC e MenW; MenA, MenC e MenY; MenA,MenW e MenY; Men C, MenW e MenY; Men A, MenC, MenW e MenY;Hib e MenA; Hib e MenC; Hib e MenW; ou Hib e MenY]. De modoalternativo, os sacarídeos podem, cada qual separadamente, ser conjugados adiferentes moléculas do carreador de proteína (cada molécula do carreador deproteína tendo apenas um tipo de sacarídeo conjugado a ela).

As composições imunogênicas de acordo com o primeiroaspecto da invenção podem também apresentar qualquer ou todas ascaracterísticas adicionais do segundo aspecto da invenção e vice versa.

Em um segundo aspecto da invenção, é apresentada umacomposição imunogênica, que compreende pelo menos 2 sacarídeosdiferentes, conjugados separadamente ao mesmo tipo de proteína carreadora,em que um ou mais sacarídeos) é/são conjugados à proteína carreadoraatravés de um primeiro tipo de grupo químico no carreador da proteína, e umou mais sacarídeos diferentes é/são conjugados à proteína carreadora atravésde um segundo tipo (diferente) de grupo químico na proteína carreadora.

Em uma modalidade, os 2 conjugados envolvem o mesmosacarídeo ligado ao mesmo carreador, mas através de diferentes químicas deconjugação. Em uma modalidade alternativa, 2 sacarídeos diferentes sãoconjugados a diferentes grupos no carreador da proteína.

Por "separadamente conjugado ao mesmo tipo de proteínacarreadora" é compreendido que os sacarídeos são conjugados ao mesmocarreador individualmente (por exemplo, MenA é conjugado ao toxóide dotétano através de um grupo amina no toxóide do tétano e MenC é conjugadoao toxóide do tétano através de um grupo de ácido carboxílico em umamolécula diferente do toxóide do tétano).

O(s) sacarídeo(s) capsular(es) podem ser conjugados aomesmo tipo de proteína carreadora, independentemente selecionados a partirdo grupo, que consiste de TT5 DT, CRM 197, fragmento C de TT e proteínaD. Uma lista mais completa de carreadores de proteína, que podem ser usadosnos conjugados da invenção, é apresentada abaixo. Neste contexto, CRM 197e DT podem ser considerados como a mesma proteína carreadora, pois elesdiferem em apenas um aminoácido. Em uma modalidade, todos os sacarídeoscapsulares presentes são conjugados a TT.

Em uma modalidade, o primeiro e o segundo tipo de grupoquímico no carreador da proteína estão presentes em epítopos da célula B e/ouT na proteína carreadora. Ou seja, eles estão presentes em um conjuntodiferente de epítopos da célula B e/ou T, um do outro. Para prever os epítoposda célula B para um carreador, métodos conhecidos podem ser usados, taisque cada um ou ambos dos dois métodos que se seguem:previsão de estrutura2D e/ou previsão do índice antigênico. A previsão da estrutura 23 D pode serefetuada usando o programa PSIPRED (de David Jones, BrunelBioinformatics Group, Dept. Biological Sciences, Brunel Universiity,Uxbridge UB8 3PH, UK). O índice antigênico pode ser calculado com baseno método descrito por Jameson e Wolf (CABIOS 4:181 - 186 [ 1988]). Osparâmetros usados neste programa são o índice antigênico e o comprimentomínimo para um peptídeo antigênico. Um índice antigênico de 0,9 para ummínimo de 5 aminoácidos consecutivos pode ser usados como limite noprograma. Epítopos de célula auxiliadora T são peptídeos ligados a moléculasda classe II HLAA e reconhecidos pelas células auxiliadoras Τ. A previsão deepítopos da célula auxiliadora T úteis podem ser baseados em técnicasconhecidas, tais que o método TEPITOPE, descrito por Sturniolo et al.(Nature Biotech. 17:555-5661 [ 1999]).

Os sacarídeos podem ser selecionados a partir de um grupo,que consiste de:sacarídeo capsular do sorogrupo A de N.meningitidis (MenA),sacarídeo capsular do sorogrupo C de N. meningitidis (MenC), sacarídeocapsular Y do sorogrupo de N.meningitidis (MenY), sacarídeo capsular dosorogrupo W de N.meningitidis (MenW), sacarídeo capsular do tipo b de H.influenzae (Hib), sacarídeo capsular do grupo IV de Streptococcus do GrupoB, sacarídeo capsular do grupo II de Streptococcus do Grupo B, sacarídeocapsular do grupo III de Streptoeoceus do Grupo B, sacarídeo capsular dogrupo IV de Streptoecoeus do Grupo B, sacarídeo capsular do grupo V deStreptoeoceus do grupo B, sacarídeo capsular do tipo 5 de Staphyloeoeeusaureus, sacarídeo capsular do tipo 8 de Staphyloeoeeus aureus, sacarídeo Vide Salmonella Typhi, LPS de N.meningitidis (tal que L3 e/ou L2), LPS de M.Catarrhalis, LPS de H. influenzae, e de qualquer dos sacarídeospneumocócicos capsulares, tais que do sorotiporl, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8,9N, 9 V, 10A, 11A, 12F,14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, ou 33 F.Em uma modalidade, a composição imunogênica da invenção consiste de oucompreende dois ou mais sacarídeos diferentes a partir do mesmo gênero debactéria (por exemplo, Neisseria, Streptoeoceus, Staphyloeoeeus, ouHamophilus).

O primeiro e o segundo grupos químicos presentes nocarreador da proteína são diferentes um do outro e são, de modo ideal, gruposquímicos naturais, que podem ser prontamente usados para propósitos deconjugação. Eles podem ser independentemente selecionados a partir dogrupo, que consiste de:grupos carboxila, grupos amino, grupos sulfidrila,grupos hidroxila, grupos imidazolila, grupos guanidila, e grupos indolila. Emuma modalidade, o primeiro grupo químico é carboxila e o segundo é amino,ou vice-versa. Estes grupos são explicados em maior detalhe abaixo.

Em uma modalidade específica, a composição imunogênicacompreende pelo menos 2 sacarídeos capsulares de N. meningitidis diferentes,em que u ou mais é/são selecionados a partir de um primeiro grupo, queconsiste de MenA e MenC, que é/são conjugados à proteína carreadoraatravés do primeiro tipo de grupo químico no carreador da proteína (porexemplo, carboxila), e um ou mais sacarídeos diferentes e/são selecionados apartir de um segundo grupo, que consiste de MenC, MenY e MenW, queé/são conjugados à proteína carreadora através do segundo tipo de grupoquímico carreador da proteína (por exemplo, amino).

Em uma outra modalidade, a composição imunogênica dainvenção compreende MenA conjugado através do primeiro tipo de grupoquímico (por exemplo, carboxila), e MenC conjugado através do segundo tipode grupo químico (por exemplo, amino).

Em outra modalidade, a composição imunogênica compreendeMenC conjugado através do primeiro tipo de grupo químico (por exemplo,carboxila) e MenY conjugado através do segundo tipo de grupo químico (porexemplo, amino).

Em uma outra modalidade, a composição imunogênciacompreende MenA conjugado através do primeiro tipo de grupo químico (porexemplo, carboxila), e MenC, MenY e MenW conjugados através do segundotipo de grupo químico (por exemplo, amino).

Em uma outra modalidade, a composição imunogênicacompreende MenA e MenC conjugados através do primeiro tipo de grupoquímico (por exemplo, carboxila) e MenY e MenW conjugados através dosegundo tipo de grupo químico (por exemplo, amino).

Em qualquer das modalidades acima, Hib pode também estarpresente também conjugado ao mesmo tipo de carreador de proteína Hib podeser conjugado ao carreador através do primeiro ou segundo tipo de grupoquímico. Em uma modalidade, ele é conjugado através de um grupocarboxila.

Considerações gerais em aspectos da invenção:

Os sacarídeos da invenção (em particular os sacarídeos deN.meningitidis e/ou o sacarídeo capsular de Hib), incluídos nas composiçõesfarmacêuticas (imunogênicas) da invenção, são conjugados a uma proteínacarreadora, tal que o toxóide de tétano (TT), o fragmento C de toxóide detétano, mutantes não-tóxicos da toxina de tétano [observe-se que todas taisvariantes de TT são consideradas como sendo do mesmo tipo de proteínacarreadora para os propósitos desta invenção], toxóide de difteria (DT), CRM197, outros mutantes não-tóxicos da toxina de difteria [tais que CRM 176,CRM 197, CRM 228, CRM 45 (Uchida et ai. J. Biol. Chem., 218; 3838-3844,1973 ); CRM 9, CRM 45, CRM 102, CRM 103 e CRM 107 e outras mutaçõesdescritas por Nicholls e Youle em Geneticallly Engineered Toxins, Ed.Frankel, Mareei Dekker Inc., 1992; deleção ou mutação de Glu-148 para Asp,Gln ou Ser e/ou Ala 158 para Gly e outras mutações expostas na US47009017 ou US 4950740; mutação de pelo menos um ou mais resíduos Lys516, Lys 526, Phe 530 e/ou Lys 534 e outras mutações expostas na US5917017 ou US 6455673; ou fragmento exposto na US 5843711] (observe-seque todas tais variantes de DT são consideradas como sendo o mesmo tipo deproteína carreadora para os propósitos desta invenção), pneumolisinapneumocócica (kuo et al. (1995), Infect. Immun. 63; 2706-13), OMPC(proteína da membrana externa meningocócica-usualmente extraída a partirdo sorogrupo B de N-meningitidis - EP 00372501), peptídeos sintéticos (EP0378881, EP 0427347), proteínas de choque térmico (WO 93/17712, WO94/03208), proteínas pertussis (WO 98/58668, EP 0471177), citoquinas,linfoquinas, fatores de crescimento ou hormônios (WO 91/01146), proteínasartificiais, que compreendem epítopos da célula CD4 + T humana múltipla devários antígenos derivados de patógeno (Falugi et al. (2001) Eur. J. Immunol.31:3816 - 3824), tais que a proteína Nl9 (Baraldoi et al. (2004) Infect.Immun. 72; 4884 -7) proteína superficial penumocócica PspA (WO02/091998), proteínas de absorção de ferro (WO 01/72337), toxina A ou B deC. difficile (WO 00/61761) ou Proteína D (EP 594610 e WO 00/56360).Em uma modalidade, a composição imunogênica da invençãousa o mesmo tipo de proteína carreadora (independentemente), em pelomenos dois, três, quatro ou cada um dos sacarídeos (por exemplo sacarídeoscapsulares de N. meningitidis e/ou Hib) contidos na mesma. Em umamodalidade, em que os sacarídeos capsulares Hib e N. meningitidis estãopresentes, Hib pode ser conjugado à mesma proteína carreadora que os pelomenos dois, três, quatro ou cada um dos sacarídeos de N. meningitidis. Porexemplo, 2, 3, ou 4 dos sacarídeos de N. meningitidis (MenA, C, Y, W) sãoindependentemente conjugados ao toxóide de tétano de modo a produzir 2, 3,ou 4 conjugados, e opcionalmente Hib é também conjugado a TT.

Em uma modalidade, a composição imunogênica da invençãocompreende um sacarídeo de N. meningitidis conjugado a uma proteínacarreadora selecionada a partir do grupo, que consiste de TT, DT, CRM 197,fragmento C de TT e proteína D. Em uma modalidade, a composiçãoimunogênica da invenção compreende um sacarídeo Hib conjugado a umaproteína carreadora, selecionada a partir do grupo que consiste de TT5 DT,CRM 197, fragmento C de TT e proteína D.

A composição imunogênica da invenção compreende, demodo opcional, pelo menos um conjugado de sacarídeo meningocócico (porexemplo, MenA; MenC; MenW; MenY; MenA e MenC; MenA e MenW;MenA e MenY; MenC e MenW; MenC e MenY; MenW e MenY; MenA,MenC e MenW; MenA, MenC e MenY; MenA, MenW e MenY; MenC,MenW e MenY ou MenA, MenC, MenW e MenY), tendo uma razão desacarídeo de Men para a proteína carreadora de entre 1:5 a 5:1, entre 1:2 e5:1, entre 1:0,5 e 1:2,5 ou de entre 1:1, 25 (p/p).

A composição imunogênica da invenção compreende, demodo opcional, um conjugado de sacarídeo de Hib tendo uma razão de Hibpara a proteína carreadora de entre 1:5 e 5:1, 1:2 e 2:1, 1:1 e 1:4, 1:2 e 1:3,5,ou em torno de ou exatamente de 1:2,5 ou 1:3 (p/p).A razão de sacarídeo para a proteína carreadora (P/p) em umconjugado pode ser determinada usando o conjugado esterilizado. Aquantidade de proteína é determinada usando um ensaio de Lowry (porexemplo, Lowry et ai. (1951), J. Biol. Chem. 193, 265 - 275 ou Peterson et al.Analytical Biochemistry, 100, 201-220 (1979)) e a quantidade de sacarídeo édeterminada através do uso de ICP - OES (espectroscopia por emissão deplasma óptico indutivamente acoplado )para MenA, ensaio DMAP paraMenC e ensaio de Resorcinol para MenW e MenY (Monsigny et al. (1988)Anal. Biochem., 175, 525-530).

Em uma modalidade, a composição imunogênica da invençãocompreende o (s) conjugado(s) de sacarídeo N. meningitidis e/ou o conjugadode sacarídeo Hib, em que o(s) sacarídeo de N.meningitidis e/ou o sacarídeoHib é conjugado à proteína carreadora por meio de um agente de ligação, porexemplo um agente de ligação bifiincional. O agente de ligação é, de modoopcional, heterobifuncional ou homobifuncional, tendo, por exemplo, umgrupo amino reativo e um grupo de ácido carboxílico reativo, 2 grupos aminoreativos ou dois grupos de ácido carboxílico reativos. O agente de ligaçãopossui, por exemplo, entre 4 e 20, 4el2, 5el0 átomos de carbono. Umagente de ligação possível é ADH. Outros agentes de ligação incluem B-propionamido (WO 00/10599), nitrofenil-etilamina (Gever et al. (1979) Med.Microbiol. Immunol. 165; 171-288), halogenetos de haloalquila (US4057685), ligações glicosídicas (US 4673574, US 4808700), hexano diaminae ácido 6-amnocapróico (US 4459 286).

Os conjugados de sacarídeo presentes nas composiçõesimunogênicas da invenção podem ser preparados através de qualquer técnicade acoplamento conhecida. O método de conjugação pode ser baseado naativação do sacarídeo com tetrafluoroborato de l-ciano-4-dimetilaminopiridínio (CDAP) de modo a formar um éster de cianato. O sacarídeo ativadopode ser deste modo acoplado diretamente ou através de um grupo espaçador(agente de ligação) e um grupo amino na proteína carreadora. Por exemplo, oespaçador poderia ser cistamina ou cisteamina, de modo a formar umpolisasacarídeo tiolado, que poderia ser acoplado ao carreador através de umaligação tioéter, obtida após a reação com uma proteína carreadora ativada pormaleimida (por exemplo, usando GMBS) ou uma proteína carreadoraholoacetilada (por exemplo, usando iodoacetimida oubromoacetatobromoacetato de N-succinimidila). De modo opcional, o éster decianato (opcionalmente produzido através da química de CDAP) é acopladocom hexano diamina ou ADH e o sacarídeo aminoderivado é conjugado coma proteína carreadora usando carbodiimida (por exemplo, EDAC ou EDC),por meio de um grupo carboxila na proteína carreadora. Tais conjugados sãodescritos no pedido publicado PCT WO 93/15760 Uniformed ServicesUniversity e WO 95/08348 e WO 96/29094.

Outras técnicas adequadas utilizam carbinidas, hidrazidas,ésteres ativos, norborano, ácido p-nitrobenzóico, N-hidroxissuccinimida, S-NHS, EDC, TSTU. Muitos são descritos no WO 98/42721. A conjugaçãopode envolver um agente de ligação carbonila, que pode ser formado atravésda reação de um grupo hidroxila livre do sacarídeo com CDI (Bethell et al., J.Biol. Chem. 1979, 254; 2571 - 4, Heam et al. Chromatogr., 1981, 218; 508-18) seguido pela reação do mesmo com uma proteína, de modo a formar umaligação carbamato. Isto pode envolver a redução do terminal anomérico paraum grupo hidroxila primário, a proteção/desproteção opcional da reação dogrupo hidroxila primário do grupo hidroxila primário com CDI, de modo aformar um intermediário de carbamato de CDI e acoplar o intermediário decarbamato de CDI com um grupo amino em uma proteína.

Os conjugados podem ser também preparados através demétodos de aminação redutiva direta, conforme descrito na US 4365170(Jennnings) e na US 4673574 (Anderson). Outros métodos são descritos naEP-0-161-188, EP -208375 e na EP-0-477508.Um outro método envolve o acoplamento de um sacarídeoativado por brometo de cianogênio (ou CDAP) com hidrazida de ácidoadípico (ADH) na proteína carreadora através da condensação deCarbodiimida (Chu C. et al. Infect. Immunity, 1983 245 256), por exemplousando ED AC.

Em uma modalidade, um grupo hidroxila (opcionalmente umgrupo hidroxila ativado, por exemplo um grupo hidroxila ativado por um ésterde cianato) em um sacarídeo é ligado a um grupo amino ou carboxílico emuma proteína, seja diretamente ou indiretamente (através de um agente deligação). Quando um agente de ligação está presente, um grupo hidroxila emum sacarídeo é opcionalmente ligado a um grupo amino em um agente deligação, por exemplo através do uso de conjugação de CDAP. Um outrogrupo amino no agente de ligação, por exemplo ADH, pode ser conjugado aum grupo de ácido carboxílico em uma proteína, por exemplo através do usode química de carbodiimida, por exemplo através do uso de EDAC. Em umamodalidade, o(s) sacarídeo(s) capsular(es) de N. meningitidis ou de Hib (ousacarídeo em geral) (é conjugado ao agente de ligação antes de ser conjugadocom a proteína carreadora. De modo alternativo, o agente de ligação pode serconjugado ao carreador antes da conjugação ao sacarídeo.

De modo geral, os seguintes tipos de grupos químicos em umcarreador de proteína podem ser usados para o acoplamento/conjugação.

A) Carboxila (por exemplo, através de ácido aspártico ouácido glutâmico). Em uma modalidade, este grupo é ligado a grupos aminoem sacarídeos diretamente a um grupo amino em um agente de ligação comquímica de carbodiimida, por exemplo com EDAC.

B) Grupo amino (por exemplo através de lisina). Em umamodalidade, este grupo é ligado a grupos caboxila em sacarídeos diretamenteou a um grupo carboxila em um agente de ligação com química decarbodiimida, por exemplo com EDAC. Em outra modalidade, este grupo éligado a grupos hidroxila ativados com CDAP ou CNBr em sacarídeosdiretamente ou a tais grupos em um agente de ligação; a sacarídeos ou aagentes de ligação tendo um grupo aldeído; a sacarídeos ou a agentes deligação tendo um grupo de éster de succinimida.

C) Sulfidrila (por exemplo através de cisteína). Em umamodalidade, este grupo é ligado a um sacarídeo bromo ou cloroacetilado ouagente de ligação com química de maleimida. Em uma modalidade, estegrupo é ativado/modificado com bis diazobenzidina.

D) Grupo hidroxila (por exemplo através de tirosina). Em umamodalidade, este grupo é ativado/modificado com bis diazobenzidina.

E) Grupo Imidazolila (por exemplo, através de histidina). Emuma modalidade, este grupo é ativado/modificado com bis diazobenzidina.

F) Grupo Guanidila (por exemplo através de arginina).

G) Grupo indolila (por exemplo através de triptofano).

Em um sacarídeo, de modo geral, os grupos que se seguempodem ser usados para um acoplamento:OH, COOH ou NH2. Grupos aldeídopodem ser gerados após diferentes tratamentos, conhecidos na arte, taisquerperíodato, hidrólise ácida, peróxido de hidrogênio, etc.

Abordagens de acoplamento direto:

Sacarídeo -OH + CNBr ou CDAP ->· éster de cianato + Nffi-Prot -» conjugado

Sacarídeo - aldeído + NH2 - Prot —» base de Schiff +NaCNBH3 —» conjugado

Sacarídeo -COOH + Nffi - Prot + EDAC conjugado

Sacarideo-Nffi + COOH - Prot + EDAC -» conjugado

Acoplamento indireto através de abordagens de espaçador(agente de ligação):

Sacarídeo -OH + CNBr ou CDAP -» éster de cianato + NH2--Nffi -» sacarídeo-----Nffi + COOH-Prot + EDAC -> conjugadoSacarideo -OH + CNBr ou CDAP éster de cianato + NH2-—SH —» sacarídeo-----SH + SH-Prot (Proteína nativa com uma cisteínaexposta ou obtida após a modificação de grupos amino da proteína por SPDPpor exemplo ) —» sacarídeo-S-S-Prot

Sacarídeo - OH + CNBr ou CDAP éster de cianato + NH2-—SH —» sacarídeo-----SH + maleimida - prot (modificação de grupos amino)—» conjugado

Sacarídeo-COOH + EDAC + NH2—NH2 -> sacarídeo—NH2 + EDAC + COOH - Prot -> conjugado

Sacarídeo-COOH + EDAC + NH2—SH -» sacarídeo—SH +SH-Prot (Proteína nativa com uma cisteína exposta ou obtida após amodificação de grupos amino da proteína por SPDP por exemplo) —>sacarídeo - S-S-Prot

Sacarídeo - COOH + EDAC + NH2—SH -> sacarídeo—SH +maleimida-Prot (modificação de grupos amino) —» conjugado

Sacarídeo-Aldeído + NH2—NH2 sacarídeo—NH2 +EDAC + COOH-Prot conjugado

Nota:Em vez de EDAC acima, qualquer carbodiimidaadequada pode ser usada.

Em resumo, os tipos de grupo químico do carreador deproteína, que podem ser geralmente suados para o acoplamento com umsacarídeo são grupos amino (por exemplo em resíduos lisina), grupos COOH(por exemplo em resíduos de ácido glutâmico e aspártico) e grupos SH (seacessível), por exemplo em resíduos cisteína.

Em uma modalidade, o sacarídeo Hib, quando presente, éconjugado com a proteína carreadora usando CNBr, ou CDAP, ou umacombinação de CDAP e química de carbodiiimida (tal que EDAC), ou umacombinação de CNBr e química de carbodiimida (tal que EDAC). De modoopcional, Hib é conjugado usando CNBr e química de carbodiimida, de modoopcional EDAC. Por exemplo, CNBr é usado para unir o sacarídeo e o agentede ligação e então a química de carbodiimida é usada para unir o agente deligação ao carreador de proteína.

Em uma modalidade, pelo menos um dos sacarídeoscapsulares de N. meningitidis (ou sacarídeo em geral) está diretamenteconjugado a uma proteína carreadora; de modo opcional, o(s) sacarídeo (s)MenW e/ou MenY e/ou MenW está(ão) diretamente conjugados a umaproteína carreadora. Por exemplo, MenW; MenY; MenC; MenW e MenY;MenW e MenC; MenY e MenC; ou MenW, MenY e MenC estão diretamenteligados à proteína carreadora. De modo opcional, pelo menos um dossacarídeos capsulares de N. meningitidis está diretamente conjugado atravésde CDAP. Por exemplo, MenW; MenY; MenC; MenW e MenY; MenW eMenC; MenY e MenC; ou MenW, MenY e MenC estão diretamente ligados àproteína carreadora através de CDAP (vide WO 95/088348 e WO 96/29024).Em uma modalidade, todos os sacarídeos capsulares N.menigítidis são estãoconjugados ao toxóide de tétano.

De modo opcional, a razão do sacarídeo Men W e/ou Y para aproteína carreadora está entre 1:0,5 e 1:2 (p/p) e/ou a razão do sacarídeoMenC para a proteína carreadora está entre 1:0,5 e 1:4 ou 1:0,5 e 1:1, 5 (p/p),em especial quando estes sacarídeos estão diretamente ligados à proteína, demodo opcional usando CDAP.

Em uma modalidade, pelo menos um dos sacarídeo (s)capsular (es) N. meningitidis (ou sacarídeo em geral) é conjugado à proteínacarreadora através de um agente de ligação, por exemplo um agente deligação bifuncional. O agente de ligação é, de modo opcional,heterobifuncional ou homobifuncional, tendo, por exemplo, um grupo aminareativo e um grupo de ácido carboxílico reativo, 2 grupos amina reativos ou 2grupos de ácido carboxílico reativos. O agente de ligação possui, porexemplo, entre 4 e 20, 4 e 12, 5 e 10 átomos de carbono. Um agente deligação possível é ADH.

Em uma modalidade, MenA; MenC; ou MenA e MenC éconjugado a uma proteína carreadora (por exemplo, toxóide de tétano) atravésde um agente de ligação.

Em uma modalidade, pelo menos um sacarídeo N. meningitidisé conjugado a uma proteína carreadora através de um agente de ligaçãousando CDAP e EDAC. Por exemplo, MenA; MenC; ou MenA e MenC sãoconjugados a uma proteína através de um agente de ligação (por exemplo,aqueles com dois grupos hidrazino em suas terminações, tais que ADH)usando CDAP e EDAC, tal como acima descrito. Por exemplo, CDAP éusado para conjugar o sacarídeo a um agente de ligação e EDAC é usado paraconjugar o agente de ligação a uma proteína. De modo opcional, a conjugaçãotravés de um agente de ligação resulta em uma razão de sacarídeo para aproteína carreadora de entre 1:0,5 e 1:6, de 1:1 e 1:5 ou de 1:2 e 1:4, paraMenA; MenC; ou MenA e MenC.

Em uma modalidade, o sacarídeo capsular MenA, quandopresente, é pelo menos parcialmente O-acetilado, de tal modo que pelo menos50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou 98% das unidades repetidas sejam O-acetiladas em pelo menos uma posição. A O-acetilação está presente pelomenos na posição 0-3 de pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou98% das unidades de repetição.

Em uma modalidade, o sacarídeo capsular MenC, quandopresente, é pelo menos parcialmente O-acetilado, de tal modo que pelo menos30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou 98% das unidades derepetição NeuNAc ligadas por (a2 —» 9) sejam O-acetiladas em pelo menosuma ou duas posições. A O-acetilação está presente, por exemplo, na posição0-7 e/ou 0-8 de pelo menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou98% das unidades de repetição.

Em uma modalidade, o sacarídeo capsular MenW, quandopresente, é pelo menos parcialmente O-acetilado, de tal modo que pelo menos30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou 98% das unidades derepetição sejam O-acetiladas em pelo menos uma ou duas posições. A O-acetilação está, por exemplo, presente na posição 0-7 e/ou 0-9 de pelo menos30%, 40%, 50%, 60 %, 70 %, 80%, 90%, 95% ou 98% das unidades derepetição.

Em uma modalidade, o sacarídeo capsular MenY, quandopresente, é pelo menos parcialmente O-acetilado, de tal modo que pelo menos20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% de todas as unidadesde repetição sejam O-acetiladas em pelo menos uma ou duas posições. A O-acetilação está presente na posição 7 e/ou 9 de pelo menos 20%, 30%, 40%,50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou 98% das unidades de repetição.

O Percentual de O-acetilação refere-se ao percentual dasunidades de repetição contendo O-acetilação. Este pode ser medido nosacarídeo antes da conjugação e/ou após a conjugação.

Em uma modalidade da invenção, a composição imunogênica,o sacarídeo presente ou cada sacarídeo capsular N.meningitidis presente, éconjugado a TT. Em uma outra modalidade, cada sacarídeo capsularN.meningitidis é separadamente conjugado a uma proteína de carreadorseparada. Em uma modalidade adicional, cada conjugado de sacarídeocapsular de N. meningitidis possui uma razão de sacarídeo:carreador de 1:5-5:1 ou de 1:1-1:4 (p/p). Em um outra modalidade, pelo menos um, dois outrês conjugado(s) de sacarídeo capsular de N. meningitidis é diretamenteconjugado através de química de CDAP. Em uma outra modalidade, a razãode sacarídeo Men W e/ou sacarídeo Y para a proteína carreadora está entre1:0,5 e 1:2 (p/p). Em uma modalidade adicional, a razão de sacarídeo Men Cpara a proteína carreadora está entre 1:0,5 e 1:2 (p/p). Em ainda uma outramodalidade, pelo menos um, dois ou três sacarídeo(s) capsular(es) N.meningitidis é (são) conjugados à proteína carreadora através de um agente deligação (que pode ser bifuncional, tal que tendo dois grupos amino reativos(tais que ADH) ou dois grupos carboxila reativos, ou um grupo aminorreativoem uma extremidade e um grupo carboxila reativo na outra ). O agente deligação pode possuir entre 4 e 12 átomos de carbono. Em uma outramodalidade, o cada sacarídeo (s) capsular (es) N. meningitidis conjugadoatravés de um agente de ligação é(são ) conjugado(s) ao agente de ligaçãoatravés de química de CDAP. Em uma outra modalidade, a proteínacarreadora é conjugada ao agente de ligação através do uso de química decarbodiimida, de modo opcional usando EDAC. Em uma modalidadeadicional, o ou cada sacarídeo capsular N. meningitidis é conjugado ao agentede ligação antes que a proteína carreadora seja conjugada ao agente deligação. Em uma outra modalidade, MenA é conjugado à proteína carreadoraatravés de um agente de ligação (a razão de sacarídeo MenA para a proteínacarreadora podendo estar entre 1:2 e 1:5 (p/p). Em ainda uma modalidadeadicional, MenC é conjugado a uma proteína carreadora através de um agentede ligação (a razão de sacarídeo Men C para a proteína podendo estar entre1:2 e 1:5 (p/p).

Os inventores observaram também que o foco da arte foi o deusar oligossacarídeos para a facilidade de conjugar a produção. Os inventoresverificaram que, através do uso de conjugados de polissacarídeos nativos ouligeiramente dimensionados, uma ou mais das vantagens que se seguempodem ser obtidas: 1) um conjugado tendo alta imunogenicidade, que pode serfiltrado através de um filtro de 0,2 mícrons; 2) a memória imune pode seraumentada (como no exemplo três); 3) a alteração da razão de polissacarídeopara proteína no conjugado, de tal modo que a razão de polissacarídeo paraproteína (p/p) no conjugado possa ser aumentada (isto pode resultar em umaredução do efeito de supressão de carreador):4) conjugados imunogênicospropensos à hidrólise (tais que os conjugados MenA) podem ser estabilizadosatravés do uso de polissacarídeos maiores para a conjugação. O uso depolissacarídeos maiores pode resultar em maior reticulação com o carreadordo conjugado e pode diminuir a liberação de sacarídeo livre a partir doconjugado. As vacinas de conjugado, descritas na arte anterior, tendem adespolimerizar os polissacarídeos antes da conjugação de modo a aperfeiçoara conjugação. Os presentes inventores verificaram que vacinas de conjugado(ou sacarídeo) meningocócico, que retêm um tamanho de sacarídeo maior,podem prover uma boa resposta imune contra a doença meningocócica.

A composição imunogênica da invenção compreende, destemodo, um ou mais conjugados de sacarídeo, em que o tamanho médio de cadasacarídeo antes da conjugação está acima de 50 kDa, 75 kDa, 100 kDa, 110kDa, 120 kDa ou 130 kDA. Em uma modalidade, o conjugado, após aconjugação, deve ser prontamente filtrável através de um filtro de 0,2mícrons, de tal modo que seja obtido um rendimento de mais do que 50, 60,70, 80, 90 ou 95% após a filtração, comparado com a amostra previamentefiltrada.

Em particular, a composição imunogênica da invençãocompreende sacarídeos capsulares N. meningitidis de pelo menos um, dois,três ou quatro dos sorogrupos A, C, W e Y, conjugados a uma proteínacarreadora, em que o tamanho médio (peso molecular médio em peso; Mw)de pelo menos um, dois, três ou quatro de cada sacarídeo N. meningitidis estáacima de 50 kDa, 60 kDa, 75 kDa, 100 kDa, 110 kDa, 120 kDa ou 130 kDa.

A composição imunogênica pode compreender sacarídeoscapsulares N. meningitidis a partir de pelo um, dois, três ou quatro dossorogrupos A, C, W e Y é conjugado a uma proteína carreadora, em que pelomenos um, dois, três ou quatro de cada sacarídeo N. meningitidis é ou umsacarídeo nativo ou é dimensionado em um fator de até 2 x, 3 x, 4 x, 5 x, 6 x,7 x, 8 x, 9 χ ou 10 x, em relação ao peso molecular médio em peso dopolissacarídeo nativo.

Para os propósitos da invenção, "polissacarídeo nativo" refere-se a um sacarídeo que não foi submetido a um processo, cujo propósito é o dereduzir o tamanho do sacarídeo. Um polissacarídeo pode ter o seu tamanholigeiramente reduzido durante procedimentos de purificação normais. Um talsacarídeo é ainda nativo. Apenas se o polissacarídeo tiver sido submetidotécnicas de dimensionamento, então o polissacarídeo não seria consideradonativo.

Para os propósitos da invenção, "dimensionado em um fator deaté 2 x" significa que o sacarídeo é submetido a um processo para reduzir otamanho do sacarídeo mas de modo a manter um tamanho de mais do que ametade do tamanho do polissacarídeo nativo. 3 X, 4 X, etc. devem serinterpretados do mesmo modo, isto é, o sacarídeo é submetido a um processopara reduzir o tamanho do polissacarídeo, mas de modo a manter mais do queum terço, um quarto etc. do tamanho do polissacarídeo nativo.

Em um aspecto da invenção, a composição imunogênicacompreende sacarídeos capsulares N. meningitidis de pelo menos um, dois,três ou quatro dos sorogrupos A, C, W e Y, conjugados a uma proteínacarreadora, em que pelo menos um, dois, três ou quatro de cada sacarídeo N.meningitidis é um polissacarídeo nativo.

Em um aspecto da invenção, a composição imunogênicacompreende sacarídeos capsulares N. meningitidis a partir de pelo menos um,dois, três ou quatro dos sorogrupos A, C, W e Y, conjugados a uma proteínacarreadora, em que pelo menos um, dois, três ou quatro de cada sacarídeo N.meningitidis é dimensionado (s) em um fator de até 1, 5 x, 2 x, 3 x, 4 x, 5 x, 6x, 7 x, 8 x, 9 x, ou 10 x.

As composições imunogênicas da invenção compreendem, demodo opcional, conjugados de:sacarídeo capsular do sorogrupo C de N.menigitidis (MenC), sacarídeo capsular do sorogrupo A (MenA), sacarídeocapsular do sorogrupo W 135 (MenW), sacarídeo capsular do sorogrupo Y(MenY(, sacarídeos capsulares do sorogrupo CeY (MenCY) sacarídeoscapsulares do sorogrupo CeA (MenAC)5 sacarídeos capsulares do sorogrupoCeW (MenCW)5 sacarídeo capsular do sorogrupo AeY (MenAY),sacarídeos capsulares do sorogrupo AeW (MenAW), sacarídeos capsularesdo sorogrupo WeY (Men WY), sacarídeo capsular do sorogrupo A, C e Y(MenACY); sacarídeos capsulares do sorogrupo A, Wl35 e Y (Men AWY),sacarídeos capsulares do sorogrupo C, Wl35 e Y (Men CWY); ou sacarídeoscapsulares A, C, Wl35 e Y (MenACWY). Esta é definição de "um, dois, trêsou quatro "ou de "pelo menos um de" dos sorogrupos A, C, W e Y, ou decada sacarídeo de N. meningitidis, quando aqui mencionado.

Em uma modalidade, o tamanho médio de pelo menos um,dois, três, quatro ou de cada sacarídeo N. meningitidis está entre 50 Kda e1500 kDa, 50 kDa e 500 kDa, 50 kDa e 300 kDa, 101 kDa e 1500 kDa, 101kDa e 500 kDa, 101 kDa e 300 kDa, conforme determinado por MALLS.

Em uma modalidade, o sacarídeo MenA, quando presente,possui um peso molecular de 50-500 kDa, 50-100 kDa, 55 - 90 kDa, 60-70kDa ou 70-80 kDa ou 60-80 kDa por MALLS.

Em uma modalidade, o sacarídeo MenC, quando presente,possui um peso molecular de 100-200 kDa, 50-100 kDa, 100-150 kDa, 101-130 kDa, 150-210 kDa ou 180-210 kDa por MALLS.

Em uma modalidade, o sacarídeo MenY, quando presente,possui um peso molecular de 60-190 kDa, 70-180 kDa, 90 -160 kDa, 100-150kDa, 110-140 kDa, 50-100 kDa, 100-140 kDa, 140-10 kDa, ou 150-160 kDapor MALLS.

Em uma modalidade, o sacarídeo MenW, quando presente,possui um peso molecular de 60-190 kDa, 70-180 kDa, 80-170 kDa, 90-160kDa, 100-150 kDa, 110 - 140 kDa, 50-100 kDa ou de 120-140 kDa porMALLS.

O peso molecular ou o peso molecular médio de um sacarídeoneste caso refere-se ao peso molecular médio em peso (Mw) do sacarídeo,medido antes da conjugação e é medido por MALLS.

A técnica de MALLS é bem conhecida na arte e é executada,de modo típico, tal como descrito no Exemplo 2. Para a análise de MALLS desacarídeos meningocócicos, duas colunas (TSKG6000 e 5000Wxl TOSOHBioscience) podem ser usadas em combinação e os sacarídeos são eluídos emágua. Os sacarídeos são detectados usando um detector de dispersão luminosa(por exemplo Wyatt Dawn DSP equipado com um laser de argônio de 10 mWa 488 nm) e um refractômetro inferométrico (por exemplo Wyatt Otilab DSPequipado com uma célula P 1OO e um filtro vermelho a 498 nm).

Em uma modalidade, os sacarídeos N.meningitidis sãopolissacarídeos nativos ou polissacarídeos nativos, que são reduzidos emtamanho durante um processo de extração normal.

Em uma modalidade, os sacarídeos N.meningitidis sãodimensionados através de clivagem mecânica, por exemplo através demicrofluidização ou de tratamento sônico. A microfluidização e o tratamentosônico possuem a vantagem de diminuir o tamanho dos polissacarídeosnativos maiores, o suficiente para prover um conjugado filtrável. Odimensionamento ocorre em um fator de não mais do que 20 x, 10 x, 8 x, 6 x,5 x, 4 x, 3x, 2 x, ou 1,5 x.

Em uma modalidade, a composição imunogênica compreendeconjugados de N-meningitidis, que são produzidos a partir de uma mistura depolissacarídeos e sacarídeos nativos, que são dimensionados em um fator denão mais do que 20 x. Por exemplo, sacarídeos MenC e/ou MenA são nativos.Por exemplo, os sacarídeos MenY e/ou MenW são dimensionados em umfator de não mais do que 20 x, 10 x, 8 x, 6 x, 5 x, 4 x, 3 χ ou 2 x. Porexemplo, uma composição imunogênica contém um conjugado produzido apartir de MenY e/ou MenW e/ou MenC e/ou MenA, que é dimensionado emum fator de não mais do que IOx e/ou é microfluidizado. Por exemplo, umacomposição imunogênica contém um conjugado produzido a partir de MenAe/ou MenC e/ou MenW e/ou MenY. Por exemplo, uma composiçãoimunogênica compreende um conjugado produzido a partir de MenC nativo.Por exemplo, uma composição imunogênica compreende um conjugadoproduzido a partir de MenA e MenC nativo, que é dimensionado em um fatorde não mais do que 10 χ e/ou é microfluidizado. Por exemplo, umacomposição imunogênica compreende um conjugado produzido a partir deMenY e MenC nativo, que é dimensionado em um fator de não mais do que10x e/ou é microfluidizado.

Em uma modalidade, a polidispersividade do sacarídeo é de 1 -1, 5, 1-1,3, 1-1,2, 1-1,1 ou 1-1,05 e, após a conjugação a uma proteínacarreador, a polidispersividade do conjugado é de 1,0-2, 5, 1,0-2,0, 1,0-1,5,1,0-1,2, 1,5-2,5, 1,7-2,2 ou 1,5 - 2,0. Todas as medições de polidispersividadesão efetuadas através de MALLS.

Os sacarídeos são opcionalmente dimensionados em até 1,5, 2,4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 ou 20 vezes a partir do tamanho do polissacarídeoisolado a partir de bactérias.

Em uma modalidade, cada sacarídeo N. meningitidis é ou umpolissacarídeo nativo ou é dimensionado e um fator de não mais do que 10 x.Em uma outra modalidade, cada sacarídeo capsular N. meningitidis é umpolissacarídeo nativo. Em uma modalidade adicional, pelo menos um, dois,três ou quatro sacarídeo(s) capsular(es) N. meningitidis é dimensionadoatravés de microfluidização. Em uma outra modalidade, cada sacarídeocapsular é dimensionado em um fator de não mais do que 10 x. Em uma outramodalidade, os conjugados de N.meningitidis são dimensionados em um fatorde não mais do que 10 x. Em uma modalidade adicional, o sacarídeo capsulara partir do sorogrupo Y é dimensionado em um fator de não mais do que 10 x.Em uma modalidade adicional, sacarídeos capsulares a partir dos sorogruposAeC são polissacarídeos nativos e sacarídeos a partir dos sorogrupos Wl35 eY são dimensionados em um fator de não mais do que 10 x. Em umamodalidade adicional, o tamanho médio de cada sacarídeo capsular N.meningitidis está entre 50 kDa e 300 kDa ou de 50 kDa a 200 kDa. Em umaoutra modalidade, a composição imunogência compreende um sacarídeocapsular MenA tendo um tamanho médio acima de 50 kDa, 75 kDa, 100 kDaou um tamanho médio de entre 50-100 kDa ou 55-90 kDa ou 60-80 kDa. Emuma modalidade adicional, a composição imunogência compreende umsacarídeo capsular MenC tendo um tamanho médio acima de 50 kDa, 75 kDa,100 kDa ou entre 100-200 kDa, 100-150 kDa, 80-120 kDa, 90-110 kDa, 150-200 kDa, 120-240 kDa, 140-220 kDa, 160 - 200 kDa ou 190-200 kDa. Emuma outra modalidade, a composição imunogência compreende um sacarídeocapsular MenY tendo um tamanho médio acima de 50 kDa, 75 kDa, 100 kDaou entre 60- 190 kDa ou 70-180 kDa ou 80-170 kDa ou 90-160 kDa ou 100-150 kDa, 110-145 kDa ou 120-140 kDa. Em uma modalidade adicional, acomposição imunogênica compreende um sacarídeo capsular MenW tendoum tamanho médio acima de 50 kDa, 75 kDa, 100 kDa ou entre 60 -190 kDaou 70-180 kDa ou 80-170 kDa ou 90-160 kDa ou 100-150 kDa, 140-180 kDa,150-170 kDa ou 110 - 140 kDa.

A composição imunogênica da invenção pode compreenderum sacarídeo capsular H. influenzae b (Hib) conjugado a uma proteínacarreador. Esta pode ser conjugada a uma proteína carreador selecionada apartir do grupo, que consiste de TT, DT, CRM 197, fragmento C de TT eproteína D, por exemplo TT. O sacarídeo Hib pode ser conjugado à mesmaproteína carreador que para pelo menos um, dois, três ou todos os conjugadosde sacarídeo capsulares N. meningitidis, por exemplo TT. A razão de Hib paraa proteína carreador no conjugado de sacarídeo capsular Hib pode estar entre1:5 e 5:1 (p/p), por exemplo entre 1:1 e 1:4, 1:2 e 1:3,5 ou cerca de 1:3 (p/p).O sacarídeo capsular Hib pode ser conjugado a proteína carreador através deum agente de ligação (vide acima). O agente de ligação pode ser bifuncional(com dois grupos amino reativos, tais que ADH, ou dois grupos de ácidocarboxílico reativos, ou um grupo amino reativo em uma extremidade e umgrupo de ácido carboxílico reativo na outra extremidade). Ele pode ter entre 4e 12 átomos de carbono. O sacarídeo Hib pode ser conjugado à proteínacarreador ou agente de ligação usando CNBr ou CDAP. A proteína carreadorpode ser conjugada ao sacarídeo Hib através do agente de ligação usando ummétodo que compreende química de carbodiimida, opcionalmente química deEDAC (deste modo usando o grupo químico carboxila no carreador). A dosedo conjugado de sacarídeo Hib pode estar entre 0,1 e 9 μg, 1 e 5 μg ou 2 e 3μg de sacarídeo.

Em uma outra modalidade, a composição imunogênica dainvenção compreende um conjugado de sacarídeo Hib e pelo menos doisconjugados de sacarídeo N. meningitidis, em que o conjugado Hib estápresente em uma dose de sacarídeo mais baixa do que a dose de sacarídeomédia dos pelo menos dois conjugados de sacarídeo N. meningitidis. Emalternativa, o conjugado Hib está presente em uma dose de sacarídeo maisbaixa do que a dose de sacarídeo de cada um dos pelo menos dois conjugadosde sacarídeo N. meningitidis. Por exemplo, a dose do conjugado Hib pode serde pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50 %, 60 %, 70%, ou 80% mais baixado que a média ou do que a dose de sacarídeo mais baixa dos pelo menos doisconjugados de sacarídeo N.meningitidis adicionais.

A dose média é determinada através da adição das doses detodos os outros sacarídeos e pela divisão pelo número de sacarídeosadicionais. Outros sacarídeos são todos os sacarídeos dentro da composiçãoimunogênica, à parte de Hib, e podem incluir sacarídeos capsulares N.meningitidis. A "dose" é a quantidade de composição imunogênica ou vacina,que é administrada a um humano.

Um sacarídeo Hib é o polissacarídeo capsular de fosfato depolirribosila (PRP) do tipo b de Haemophilus influenzae ou umoligossacarídeo derivado a partir do mesmo.Pelo menos dois conjugados de sacarídeo bacterianosadicionais devem ser tomados como significando dois conjugados desacarídeo bacterianos adicionais, em adição a um conjugado Hib. Os doisoutros conjugados bacterianos podem incluir conjugados de sacarídeocapsulares N. meningitidis.

As composições imunogênicas da invenção podemcompreender outros conjugados de sacarídeo derivados a partir de um ou maisde Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, Streptoeoeei do GrupoA, Streptoeoeei do Grupo B, S. Typhi, Staphylocoeeus aureus ouStaphylocoeeus epidermis. Em uma modalidade, a composição imunogênicacompreende sacarídeos capsulares, derivados a partir de um ou mais dossorogrupos A, C, Wl 35 e Y de Neisseria meningitidis. Uma outra modalidadecompreende sacarídeos capsulares derivados a partir de Streptoeoceuspneumoniae. Os antígenos do sacarídeo capsular pneumocócico capsular sãoselecionados, de modo opcional, a partir dos sorotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B,7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F 333F (opcionalmente a partir dos sorotipos 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19 F3 23 F). Uma modalidade adicional compreende os sacarídeos capsulares doTipo 5, Tipo 8 ou 336 de Staphylocoeeus aureus. Uma outra modalidadecompreende os sacarídeos capsulares do Tipo I, Tipo II ou Tipo III deStaphylococcus epidermis. Uma modalidade adicional compreende osacarídeo Vi de S. typhi. Uma outra modalidade compreende os sacarídeoscapsulares do Tipo Ia, Tipo Ic, Tipo II, Tipo III ou Tipo V de Streptoeoceusdo Grupo B. Uma modalidade adicional compreende os sacarídeos capsularesde Streptoeoceus do Grupo A, opcionalmente compreendendo pelo menosuma proteína M e de modo mais opcional múltiplos tipos de proteína M.

As composições imunogênicas da invenção podem tambémcompreender uma vacina de DTPa ou DTPw (por exemplo uma contendo DT,TT e ou uma vacina pertussis de célula inteira (Pw) ou uma vacina pertussisacelular (Pa) (que compreende, por exemplo, pertussis toxóide, FHA,pertactina, e, de modo opcional aglutinoginas 2 e 3). Tais combinações podemtambém compreender uma vacina contra hepatite BN (por exemplo, ela podecompreender um antígeno superficial de hepatite B [HepB], opcionalmenteadsorvido sobre fosfato de alumínio). Em uma modalidade, a composiçãoimunogênica da invenção compreende uma vacina deDTPwHepBHibMenAC, em que o compoennte MenAC é aqui descrito.

As composições imunogênicas da invenção compreendem, demodo opcional, antígenos virais adicionais, que conferem proteção conta adoença causada por sarampo e/ou caxumba e/ou rubéola e/ou varíola. Porexemplo, a composição imunogênica da invenção contém antígenos desarampo, caxumba e rubéola (MMR) ou de sarampo, caxumba, rubéola evaríola (MMRV). Em uma modalidade, estes antígenos virais estão presentes,de modo opcional, no mesmo recipiente que o conjugado(s) meningocócicoe/ou sacarídeo Hib. Em uma modalidade, estes antígenos virais sãoliofilizados.

Em uma modalidade, a composição imunogênica da invençãocompreende ainda um antígeno do sorogrupo B de N. meningitidis. Oantígeno é, de modo opcional, um polissacarídeo capsular do sorogrupo deN.meningitidis B (MenB)(ou um polissacarídeo ou oligossacarídeodimensionado derivado a partir do mesmo, que pode ser conjugado a umcarreador de proteína. O antígeno é, de modo opcional, uma preparação devesícula de membrana externa a partir do sorogrupo B de N. meningitidisconforme descrito na EP 301992, WO 01/09350, WO 04/14417, WO04/14418 e WO 04/14419.

De modo geral, a composição imunogênica da invenção podecompreender uma dose de cada conjugado de sacarídeo entre 0,1 e 20 μg, 2 e10 μg ou 2 e 6 μg ou 4 e 7 μg de sacarídeo.

Em uma modalidade, a composição imunogênica da invençãocontém, cada qual, o sacarídeo capsular N. meningitidis em uma dose de entre0,1-20 1-10 μ§, 2-10 μ§, 2,5-5 em torno exatamente de 5 μ§; ou emtorno exatamente de 2,5 μg. Em uma modalidade, a composição imunogênicada invenção compreende MenA, MenC, MenW e MenY (opcionalmenteconjugado a um toxóide de tétano) em doses de 2,5, 2,5, 2,5 e 2,5 μgrespectivamente, 5, 5, 5 e 5 μ§ respectivamente e 5, 5, 2,5 e 2,5 μgrespectivamente.

Em uma modalidade, a composição imunogênica da invençãocontém, por exemplo, o conjugado de sacarídeo Hib em uma dose desacarídeo de entre 0,1 e 9 μg; de 1 e 5 ou de 2 e 3 μ§ ou em tornoexatamente de 2,5 μg. Em uma modalidade adicional, a composiçãoimunogênica da invenção, por exemplo, contém o conjugado de sacarídeo Hibem uma dose de sacarídeo de entre 0,1 e 9 μg; 1 e 5 μg ou 2 e 3 μg ou emtorno de ou exatamente de 2,5 μg e cada um dos conjugados de polissacarídeoN. meningitidis em uma dose de sacarídeo de entre 2 e 20 μg, 3 e 10 μg, ouentre 4 e 7 μg ou em torno de ou exatamente de 5 μg.

"Em torno de "ou "aproximadamente "são definidos comodentro de 10% mais ou menos do valor para os propósitos da invenção.

Em uma modalidade, a composição imunogênica da invençãopode conter uma dose de sacarídeo do conjugado de sacarídeo Hib, que é, porexemplo, inferior a 90%, 80 %, 75%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30 %, 20 % ou10% da dose de sacarídeo média em pelo menos dois, três, quatro ou cada umdos conjugados de sacarídeo N. meningitidis. A dose de sacarídeo dosacarídeo Hib está, por exemplo, entre 20% e 60 %, 30% e 60%, 40% e 60%ou em torno de ou exatamente 50% da dose de sacarídeo média de pelo menosdois, três, quatro ou cada um dos conjugados de sacarídeo N. meningitidis.

Em uma modalidade, a composição imunogênica da invençãocontém uma dose de sacarídeo do conjugado de sacarídeo Hib, que é, porexemplo, inferior a 90%, 80%, 75%, 70%, 60 %, 50 %, 40 %, 30%, 20% ou10% da dose de sacarídeo mais baixa dos pelo menos dois, três, quatro ou decada um dos conjugados de sacarídeo N. meningitidis. A dose de sacarídeo dosacarídeo Hib está, por exemplo, entre 20% e 60%, 30% e 60%, 40% e 60%ou em torno de ou exatamente de 50% da dose de sacarídeo mais baixa dospelo menos dois, três, quatro ou cada um dos conjugados de sacarídeo N.meningitidis.

Em uma modalidade da invenção, a dose de sacarídeo de cadaum dos pelo menos dois, três, quatro ou de cada um dos conjugados desacarídeo N. meningitidis é opcionalmente a mesma, ou aproximadamente amesma.

Exemplos de composições imunogênicas da invenção sãocomposições que consistem de ou que compreendem:

Conjugado Hib e conjugado MenA e conjugado MenC, demodo opcional em razões de dose de sacarídeo de 1:2:2, 1:2:1, 1:4:2, 1:6:3,1:3:3, 1:4:4, 1:5:5, 1:6:6 (p/p). De modo opcional, a dose de sacarídeo deMenA é maior do que a dose de sacarídeo de MenC.

Conjugado Hib e conjugado MenC e conjugado MenY, demodo opcional em razões de dose de sacarídeo de 1:2:2, 1:2:1, 1:4:2, 1:4:1,1:8:4, 1:6:3, 1:3:3, 1:4:4, 1:5:5, 1:6:6 (p/p). De modo opcional, a dose desacarídeo de MenC é maior do que a dose de sacarídeo de MenY.

Conjugado Hib e conjugado MenC e conjugado MenW, demodo opcional em razões de dose de sacarídeo de 1:2:2, 1:2:1, 1:4:2, 1:4:1,1:8:4, 1:6:3, 1:3:3, 1:4:4, 1:5:5, 1:6:6 (p/p). De modo opcional, a dose desacarídeo de MenC é maior do que a dose de sacarídeo de MenW.

Conjugado Hib e conjugado MenA e conjugado MenW, demodo opcional em razões de dose de sacarídeo de 1:2:2, 1:2:1, 1:4:2, 1:4:1,1:8:4, 1:6:3, 1:3:3, 1:4:4, 1:5:5, 1:6:6 (p/p). De modo opcional, a dose desacarídeo de MenA é maior do que a dose de sacarídeo de MenW.

Conjugado Hib e conjugado MenA e conjugado MenY, demodo opcional em razões de dose de sacarídeo de 1:2:2, 1:2:1, 1:4:2, 1:4:1,1:8:4, 1:6:3, 1:3:3, 1:4:4, 1:5:5, 1:6:6 (p/p). De modo opcional, a dose desacarídeo de MenA é maior do que a dose de sacarídeo de MenY.

Conjugado Hib e conjugado MenW e conjugado MenY, demodo opcional em razões de dose de sacarídeo de 1:2:1, 1:2:1, 1:1:2, 1:4:2,1:2:4, 1:4:1, 1:1:4, 1:3:6, 1:1:3, 1:6:3, 1:3:3, 1:4:4, 1:5:5, 1:6:6 (p/p). Demodo opcional, a dose de sacarídeo de MenY é maior do que a dose desacarídeo de MenW.

MenA, MenC, MenW e MenY em razões de dose de sacarídeode 1:1:1:1 ou 2:1:1:1 ou 1:2:1:1 ou 2:2:1:1 ou 1:3:1:1 ou 1:4:1:1 (p/p).

Um aspecto adicional da invenção consiste em uma vacina,que compreende a composição imunogênica da invenção e um excipientefarmaceuticamente aceitável.

Em uma modalidade, a composição imunogênica da invençãoé ajustada a, ou tamponada em um pH de entre 7,0 e 8,0, a um pH de 7,2 e 7,6ou em torno ou exatamente em um pH de 7,4.

A composição imunogênica ou as vacinas da invenção sãoopcionalmente liofilizadas na presença de um agente de estabilização, porexemplo um poliol, tal que sacarose ou trealose.

De modo opcional, a composição imunogênica ou vacina dainvenção contém uma quantidade de um adjuvante suficiente para aumentar aresposta imune ao imunógeno. Adjuvantes adequados incluem, mas não estãolimitados a, sais de alumínio (fosfato de alumínio ou hidróxido de alumínio),misturas de esqualeno (SAF-1), peptídeo de muramila, derivados de saponina,preparações de parede celular de micobactéria, lipídeo de monofosforila A,derivados do ácido micótico, tensoativos de copolímero em bloco não iônicos,Quil A, subunidade de toxina B de cólera, polifosfazeno e derivados, ecomplexos imunoestimulantes (ISCOMs), tais que aqueles descritos porTakahashi et al. (1990) Nature 344:873-875.Para as combinações de N. meningitidis ou Hibmen acimadiscutidas, pode ser vantajoso não usar qualquer adjuvante de sal de alumínioou nenhum adjuvante.

Como no caso com todas as composições imunogênicas ouvacinas, as quantidades imunologicamente efetivas dos imunógenos precisamser determinadas empiricamente. Os fatores a serem considerados incluem aimunogenicidade, se o imunógeno será ou não complexado com ou ligado aum adjuvante ou proteína carreador ou outro carreador, a via de administraçãoe o número de dosagens de imunização a serem administradas.

O agente ativo pode esta presente em concentrações variáveisna composição farmacêutica ou vacina da invenção. De modo típico, aconcentração mínima da substância é uma quantidade necessária para que sejaalcançado o seu uso objetivado, enquanto que a concentração máxima é aquantidade máxima que irá permanecer em soluções ou homogeneamentesuspensa dentro da mistura inicial. Por exemplo, a quantidade mínima de umagente terapêutico é, de modo opcional, aquela que irá prover uma únicadosagem terapeuticamente efetiva. Para substâncias bioativas, a concentraçãomínima é a quantidade necessária para a bioatividade mediante areconstituição e a concentração máxima é naquele ponto, em que umasuspensão homogênea não pode ser mantida. No caso de unidades de doseúnica, a quantidade é aquela de uma aplicação terapêutica única. De modogeral, é esperado que cada dose irá compreender de 1-100 μg de antígeno deproteína, de modo opcional de 5-50 μg ou 5-25 μg. Exemplos de doses desacarídeos bacterianos são de 10-20 μg, 5-10 μg, 2,5-5 μg ou 1-2,5 μg desacarídeo no conjugado.

As preparações de vacina da presente invenção podem serusadas para proteger ou tratar um mamífero (por exemplo um pacientehumano) suscetível à infecção, através da administração da referida vacinapor via sistêmica ou através da mucosa. Um paciente humano é, de modoopcional, um infante (menor do que 12 meses), uma criança pequena (12-24,12-16 ou 12-14 meses), uma criança (2-10, 3-8 ou 3-5 anos), um adolescente(12-21, 14-20, ou 15-19 anos) ou um adulto. Estas administrações podemincluir a injeção através da via intramuscular, intraperitonial, intradérmica ousubcutâneas; ou a administração através da mucosa aos tratos oral/alimentar,respiratório, ou genitourinário. A administração intranasal de vacinas para otratamento de pneumonia ou otite média é preferida (pois o transportenasofaríngeo de pneumococos pode ser mais efetivamente evitado, destemodo atenuando a infecção em seu estágio mais precoce). Embora a vacina dainvenção possa ser administrada como uma dose única, os componentes damesma podem ser também administrados de um modo conjunto, ao mesmotempo ou em um períodos de tempo diferentes (por exemplo, se os sacarídeosestiverem presentes em uma vacina, estes podem ser administradosseparadamente ao mesmo tempo ou 1-2 semanas após a administração de umavacina proteína bacteriana para a coordenação ótima da resposta imune, umaem relação à outra). Em adição a uma única via de administração, 2 vias deadministração diferentes podem ser usadas. Por exemplo, antígenos viraispodem ser administrados ID (por via intradérmica), enquanto que as proteínasbacterianas pode ser administradas IM (por via intramuscular) ou IN (por viaintranasal). Se os sacarídeos estiverem presentes, eles podem seradministrados IM (ou ID e as proteínas bacterianas podem ser administradasIN (ou ID). Em adição, as vacinas da invenção podem ser administradas IMpara doses de base e IN para doses de reforço.

A preparação da vacina é descrita, de modo genérico, emVaccine Design ("The subunit and adjuvant approach" (Eds. Powell M. F. &Newman M. J.) (1995) Plenum Press, Nova Iorque). A encapsulação comlipossomas é descrita por Fullerton, Patente US 4.235.877.

Um outro aspecto da invenção consiste em um kit de vacinapara a administração concomitante ou seqüencial, compreendendo duascomposições imunogênicas multivalentes para conferir proteção a umhospedeiro contra doença causada por Bordetella pertussis, Clostridiumtetani, Corynebacterium diphteriae e Neisseria meningitidis e, de modoopcional, Haemophilus influenzae. Por exemplo, o kit compreende, de modoopcional, um primeiro recipiente, que compreende um ou mais de:Toxóide do tétano (TT),

Toxóide de difeteria (DT), e componentes de pertussis decélula inteira ou acelular;

e um segundo recipiente, que compreende:uma composição imunogênica da invenção como acimadescrita (por exemplo aquela que compreende combinações de conjugado desacarídeo Men ou Hibmen).

Um outro aspecto da invenção consiste em um kit de vacinapara a administração concomitante ou seqüencial, que compreendecomposições imunogênicas mutivalentes para conferir proteção a umhospedeiro contra doença causada por Streptococcus pneumoniae e Neisseriamengingitidis e opcionalmente Haemophilus influenzae. Por exemplo, o kitcompreende, de modo opcional, um primeiro recipiente compreendendo:

um ou mais conjugados de proteína carreador e um sacarídeocapsular de Streptoeoceus pneumoniae (em que o sacarídeo capsular éopcionalmente de um sorotipo selecionado a partir do grupo, que consiste de1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9 N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A,19F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23 F, e 33 F].

e um segundo recipiente, que compreende:uma composição imunogênica da invenção como acimadescrito (por exemplo, aquelas compreendendo combinações do conjugado desacarídeo Men ou Hibmen).

Exemplos do conjugado Hib e dos conjugados depolissacarídeo N. meningitidis são como acima descritos.De modo típico, a vacina de Streptococcus pneumoniae no kitde vacina da presente invenção (ou em qualquer das composiçõesimunogênicas da invenção acima descritas) irá compreender antígenos desacarídeo (opcionalmente conjugados), em que os sacarídeos são derivados apartir de pelo menos quatro sorotipos de pneumococcus selecionados a partirdo grupo, que consiste de 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 1 IA, 12F,14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F e 33 F. De modo opcional, osquatro sorotipos incluem 6B, 14, 19F e 23F. De modo mais opcional, pelomenos 7 sorotipos são incluídos na composição, por exemplo aquelesderivados a partir dos sorotipos 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, e 23F. De modoopcional, mais do que 7 sorotipos são incluídos na composição, por exemplopelo menos 10, 11, 12, 13 ou 14 sorotipos. Po exemplo, a composição inclui,em uma modalidade, 10 ou 11 sacarídeos capsulares derivados a partir dossorotipos 1, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18 C, 19F e 23 F, e de modo opcional 3(todos opcionalmente conjugados). Em uma modalidade da invenção, pelomenos 13 antígenos de sacarídeo (opcionalmente conjugados) são incluídos,embora outros antígenos de sacarídeo, por exemplo 23 valentes (tais que ossorotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6B,7F, 8, 9 N, 9V, 10A, 11 A, 12F, 14, 15B, 17F, 18 C,19A, 19F, 20, 22F, 23 F e 33 F) são também contemplados pela invenção.

Os sacarídeos pneumocócicos são independentementeconjugados a qualquer proteína carreador conhecida, por exemplo CRM 197,toxóide do tétano, toxóide de difeteria, proteína D ou outras proteínascarreador, tais como acima mencionado.

De modo opcional, os kits de vacina da invençãocompreendem um terceiro componente. Por exemplo, o kit compreende, demodo opcional, um primeiro recipiente, que compreende um ou mais de:toxóide do tétano (TT),toxóide de difleria (DT), e

componentes de pertussis de célula inteira ou acelulares;e um segundo recipiente, que compreende:um ou mais conjugados de uma proteína carreador e de umsacarídeo capsular de Streptococcus pneumoniae [em que o sacarídeocapsular é opcionalmente de um sorotipo penumocócico selecionado a partirdo grupo, que consiste de 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 1 IA, 12F,14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19 F, 20, 22 F, 23F e 33 F].

e um terceiro recipiente, que compreende:uma composição imunogênica da invenção como acimadescrito (por exemplo, aquelas que compreendem combinações de conjugadode sacarídeo Men ou Hibmen).

Um outro aspecto da invenção consiste em um processo para aprodução da composição imunogênica ou vacina da invenção, quecompreende o estágio de misturar os sacarídeos da invenção, por exemploatravés da mistura de sacarídeos capsulares N. meningitidis a partir de pelomenos um, dois, três ou todos os quatro sorogrupos A, C, W e Y, conjugadosa uma proteína carreadora com um excipiente farmaceuticamente aceitável.

Um outro aspecto da invenção consiste em um método deimunização de um hospedeiro humano contra doença causada porbactéria, porexemplo N. meningitidis e opcionalmente infecção de Haemophilusinfluenzae, que compreende administrar ao hospedeiro uma doseimunoprotetora da composição imunogênica ou vacina ou kit da invenção, demodo opcional usando uma dose única.

Um aspecto independente da invenção consiste em um métodode imunização de um hospedeiro humano com uma composição imunogênica,que compreende pelo menos 2 conjugados de sacarídeo capsulares de N.meningitidis diferentes, selecionados a partir de um grupo, que consiste dosorogrupo A, C, W e Y (de modo opcional MenA, C, W e Y), em que umaadministração de dose única (opcionalmente a adolescentes, adultos oucrianças) resulta em um teste sangüíneo tomado um mês após a administraçãofornecendo acima de 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 95% de respostas em umensaio de SBA, que mede os níveis de resposta contra MenA, MenC, MenWe/ou MenY. De modo opcional, o ensaio de SBA é como descrito no Exemplo9, com a resposta sendo determinada conforme descrito no Exemplo 9.

Um outro aspecto independente da invenção consiste em umacomposição imunogênica, que compreende os conjugados MenA, MenC,MenW e/ou MenY, que é capaz de provocar uma resposta imune após umaúnica dose, de tal modo que acima de 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 95% depacientes humanos (crianças, adolescentes ou adultos) inoculados, sejamclassificados como produzindo resposta em um ensaio de SBA em sangueextraído um mês após a inoculação (opcionalmente usando os critériosdescritos no Exemplo 9).

Uma tal composição imunogênica possui, de modo opcional,as características estruturais adicionais aqui descritas.

Um outro aspecto da invenção refere-se a uma composiçãoimunogênica da invenção para o uso no tratamento ou prevenção de umadoença causada por bactéria, por exemplo N.meningitidis e opcionalmenteinfecção de Haemophilus influenzae.

Um outro aspecto da invenção consiste no uso da composiçãoimunogênica ou vacina ou kit da invenção na manufatura de um medicamentopara o tratamento ou a prevenção de doenças causadas por N. meningitidis e,de modo opcional, infecção por Haemophilus influenzae.

Os termos "compreendendo", "compreendem" e"compreende", neste caso, são objetivados pelos inventores como sendoopcionalmente substituíveis pelos termos "consistindo de ", "consistem de" e"consiste de", respectivamente, em cada caso.

Todas as referências ou pedidos de patente citados nesterelatório de patente são incorporados a este, a título referencial.

A invenção é ilustrada nos exemplos anexos. Os exemplosabaixo são executados usando técnicas convencionais, que são bemconhecidas e rotineiras para aqueles versados na arte, exceto quando descritosde outro modo em detalhe. Os exemplos são ilustrativos, mas não limitam ainvenção.

Exemplos

Exemplo 1-Preparação de conjugados de polissacarídeoA ligação covalente do polissacarídeo PRP de Haemophilusinfluenzae (Hib) a TT foi executada através de uma química de acoplamentodesenvolvida por Chu et al. (Infection and Immunity 1983, 40 (1); 245-256).O polissacarídeo PRP de Hib foi ativado através da adição de CNBr eincubação em pH de 10,5 durante 6 minutos. O pH foi reduzido para o pH de8,75 e diidrazida de ácido adípico (ADH) foi adicionado e a incubaçãocontinuou durante um período adicional de 90 minutos. O PRP ativado foiacoplado ao toxóide de tétano purificado através de condensação decarbodiimida usando l-etil-3-(3-dimetil-aminopropil) carbodiimida (EDAC).EDAC foi adicionado ao PRP ativado de modo a alcançar uma razão final de0, 6 mg de EDAC/mg de PRP ativado. O pH foi ajustado para 5,0 e o toxóidede tétano purificado foi adicionado de modo a que fossem alcançados 2 mg deTT/mg de PRP ativado. A solução resultante foi deixada durante três dias comagitação branda. Após a filtração através de uma membrana de 0,45 μπι, oconjugado foi purificado em uma coluna Sephacryl S500 HR (Pharmacia,Suécia), equilibrada em NaCl 0,2 M.

Foram produzidos conjugados de MenC - TT usandopolissacarídeos nativos (acima de 150 kDa, conforme medido por MALLS)ou foram ligeiramente microfluidizados. Os conjugados de MenA-TT foramproduzidos usando ou polissacarídeo nativo ou polissacarídeo ligeiramentemicrofluidizado de mais do que 60 kDa, conforme medido pelo métodos deMALLS do Exemplo 2. Foram produzidos conjugados de MenW e MenY_TTusando polissacarídeos dimensionados de em torno de 100-200 kDAA,conforme medido por MALLS (vide Exemplo 2). O dimensionamento foiefetuado através de microfluidização, usando um aparelho homogeneizadorEmulsiflex C-50. Os polissaacarídeos foram então filtrados através de umfiltro de 0,2 μm.

A ativação e o acoplamento foram efetuados conformedescrito na WO 96/29094 e na WO 00/56260. Em resumo, o polissacarídeoem uma concentração de 10-20 mg/ml em NaCl 2 M, pH de 5,5-6,0 foimisturado com solução de CDAP (100 mg/ml, recém preparada emacetonitrila/WFI, 50/50) em uma razão final de CDAP/polissacarídeo de0,75/1 a 1,5/1. Após 1,5 minutos, o pH foi elevado com hidróxido de sódiopara o pH de 10,0. Após três minutos, o toxóide de tétano foi adicionado, demodo a que fosse alcançada uma razão de proteína/polisssacarídeo de 1,5/1para MenW, 1,2/1 parta MenY, 1,5/1 para MenA ou 1, 5/1 para MenC. Areação foi continuada durante uma a duas horas.

Após o estágio de acoplamento, glicina foi adicionada em umarazão final de glicina/PS (p/p) de 7,5/1 é o pH foi ajustado para o pH de 9,0.A mistura foi deixada durante 30 minutos. O conjugado foi clarificado usandoum filtro Kleenpak de 10 μηι e foi então carregado sobre uma colunaSephacryl S400 HR usando um tampão de eluição de NaCl 150 mM, Tris 10mM ou 5 mM, pH 7, 5. Os lotes clínicos foram filtrados em uma membranade esterilização Opticap 4. Os conjugados resultantes apresentaram uma razãode polissacarídeo:proteína média de 1:1-1:5 (p/p).

Exemplo la-Preparação de conjugados de polissacarídeo MenA e MenC dainvenção

Os conjugados MenC-TT foram produzidos usandopolissacarídeos nativos (de mais do que 150 kDa, conforme medido porMALLS) ou foram ligeiramente microfluidizados. Os conjugados de MenA-TT foram produzidos usando ou polissacarídeo nativo ou polissacarídeoligeiramente microfluidizado de mais do que 60 kDA, conforme medido pelométodo de MALLS do Exemplo 2. O dimensionamento foi efetuado atravésde microfluidização usando um aparelho homogeneizador Emulsiflex C-50.Os polissacarídeos foram então filtrados através de um filtro de 0,2 μπι.

De modo a conjugar o polissacarídeo capsular MenA aotoxóide do tétano através de um espaçador, foi usado o método que se segue.A ligação covalente do polissacarídeo e do espaçador (ADH) é executadaatravés de química de acoplamento, através da qual o polissacarídeo éativado, sob condições controladas, através de um agente de cianalação,tetrafluoroborato de l-ciano-4-dimetilamino-piridínio (CDAP). O espaçadorreage com o PS cianilado através de seus grupos hidrazino, de modo a formaruma ligação isouréia estável entre o espaçador e o polissacarídeo.

Uma solução de 10 mg/ml de MenA (pH 6,0) [3,5 g] foitratada com uma solução recém preparada de 100 mg/ml de CDAP emacetonitrila/água (50/50 (v/v), de modo a que seja obtida uma razão deCDAP/MenA de 0,75 (p/p). Após 1,5 minutos, o pH foi elevado para o pH de10,0. Três minutos após, o ADH foi adicionado de modo a obter uma razão deADH/MenA de 8,9. O pH da solução foi diminuído para 8,75 e a reaçãoprosseguiu durante 2 horas mantendo este pH(com a temperatura mantida a25°C ).

A solução de PSAAH foi concentrada a um quarto de seuvolume inicial e então diafiltrada com 30 volumes de NaCl 0,2 M usando umamembrana Filtron Omega com um corte de 10 kDa, e o produto retido foifiltrado.

Antes da reação de conjugação (condensação decarbodiimida), a solução de TT purificada e a solução de PSAAH foramdiluídas, de modo a que fosse alcançada uma concentração de 10 mg/ml paraPSAAH e 10 mg/ml para TT.

EDAC (l-etil-3-(3-dimetil-aminopropil) carbodiimida) foiadicionando à solução de PSAH (2 g de sacarídeo) de modo a alcançar umarazão final de 0,9 mg de EDAC/mg de PSAAH. O pH foi ajustado para 5,0. Otoxóide de tétano purificado foi adicionado com uma bomba peristáltica (em60 minutos) de modo a alcançar 2 mg de TT/mg de PSAAH. A soluçãoresultante foi deixada 60 minutos em + 25°C, sob agitação, de modo a quefosse obtido um tempo de acoplamento final de 120 minutos. A solução foineutralizada através da adição de Tris-HCl 1 M, pH 7,5 (1/10 do volumefinal) e deixada 30 minutos a + 25°C, e então durante a noite a de + 2°C a + 8°C.

O conjugado foi clarificado usando um filtro de 10 μηι e foipurificado usando uma coluna Sephacryl S 400 HR (Pharmacia, Suécia). Acoluna foi equilibrada em Tris-HCl 10 mM (pH 7,0) NaCl 0,075 Meoconjugado (aprox. 660 ml) foi carregado sobre a coluna (+ 2°C a + 8°C). Oreservatório de eluição foi selecionado como uma função da densidade ópticaa 280 nm. A coleta foi iniciada quando a absorção foi aumentada para 0,05. Acoleta foi continuada até que o Kd alcançasse 0,30. O conjugado foiesterilizado por meio de filtro a + 20°C, e então armazenado a de + 2°C a +8°C. O conjugado resultante apresentou uma razão de polissacarídeo:proteínade 1:2-1:4 (p/p).

De modo a conjugar o polissacarídeo capsular MenC aotoxóide de tétano através de um espaçador, foi usado o método que se segue.A ligação covalente do polissacarídeo e do espaçador (ADH) é executadaatravés de uma química de acoplamento, através da qual o polissacarídeo éativado sob condições controlada por um agente de cianilação,tetrafluoroborato de l-ciano-4-dimetilamino-piridínio (CDAP). O espaçadorreage com o PS cianilado através de seus grupos hidrazino, de modo a formaruma ligação isouréia estável entre o espaçador e o polissacarídeo.

Uma solução de 20 mg/ml de MenC (pH 6,0 ) (3, 5 g) foitratada com uma solução recém preparada de 100 mg/ml de CDAP emacetonitrila /água (50/50 (v/v) de modo a obter uma razão de CDAP/MenC de1,5 (p/p). Após 1,5 minutos, o pH foi elevado para o pH de 10,0. Na ativaçãodo pH, NaCl 5 M foi adicionado, de modo a que fosse alcançada umaconcentração final de NaCl 2 M. Três minutos após, ADH foi adicionado, demodo a que fosse obtida uma razão de ADH/MenC de 8,9. O pH da soluçãofoi diminuído para 8,75 e a reação prosseguiu durante 2 horas (retida a 25°C).

A solução de PSCAH foi concentrada a um mínimo de 150 mle então diafiltrada com 30 volumes de NaCl 0,23 M usando uma membranaFiltron Omega com um corte de 10 kDa, e o produto retido foi filtrado.

Antes da reação de conjugação, a solução de TT purificada e asolução de PSCAH (escala de 2 g) foram diluídas em NaCl 0,2 M, de modo aalcançar uma concentração de 15 mg/ml para PSCAH e de 20 mg/ml para TT.

O toxóide de tétano purificado foi adicionado à solução dePSCAH, de modo a alcançar 2 mg de TT/mg de PSCAH. O pH foi ajustadopara 5,0. EDAC (16,7 mg/ml em Tris 0,1 M, pH 7,5) foi adicionado com umabomba peristáltica (em 10 minutos), e modo a que fosse alcançada uma razãofinal de 0,5 mg de EDAC/mg de PSCAH. A solução resultante foi deixadadurante 110 minutos a + 25°C, sob agitação e regulação de pH, de modo a quefosse obtido um tempo de acoplamento final de 120 minutos. A solução foientão neutralizada através da adição de Tris-HCl 1 M, pH 9,0 (1/10 dovolume final) e deixada durante 30 minutos a + 25°C e então durante a noite ade + 2°C a + 8o C.

O conjugado foi clarificado usando um filtro de 10 μπι e foipurificado usando uma coluna Sephacryl S 400 HR (Pharmacia, Suécia). Acoluna foi equilibrada em Tris-HCl 10 mM (pH 7,0), NaCl 0,075 Meoconjugado (aproximadamente 460 ml) foi carregado sobre a coluna (+ 2°C a +8°C). O reservatório de eluição foi selecionado como uma função dadensidade óptica a 280 nm. A coleta foi iniciada quando a absorbânciaaumentou para 0,05. A coleta continuou até que o Kd alcançasse 0,20. Oconjugado foi esterilizado através de filtro a + 20°C, e então armazenado a de+ 2°C a + 8°C. O conjugado resultante tinha uma razão depolissacarídeoiproteína de 1:2-1:4 (p/p).

Exemplo 2-Determinação do peso molecular usando MALLS

Os detectores foram acoplados a uma coluna de exclusão detamanho de HPLC, a partir da qual as amostras foram eluídas. Por um lado, odetector de dispersão luminosa a laser mediu as intensidades luminosasdispersadas em 16 ângulos pela solução macromolecular e, por outro lado, umrefractômetro interferométrico, colocado em linha, permitiu a determinaçãoda quantidade de amostra eluída. A partir destas intensidades, o tamanho e aforma das macromoléculas em solução podem ser determinados.

O peso molecular médio em peso (Mw) é definido como asoma dos pesos de todas as espécies, multiplicado pelo seu respectivo pesomolecular e dividido pela soma dos pesos de todas as espécies.

a) peso molecular médio em peso:Mw

<formula>formula see original document page 46</formula>

b) peso molecular médio numérico :Mn

<formula>formula see original document page 46</formula>

c) Raio quadrado médio da raiz:-Rw- e R2W é o raio quadradodefinido por:

R2W ou

(-mi-é a massa de um centro de dispersão i e -rr é a distânciaentre o

centro de dispersão i e o centro de gravidade damacromolécula).

d) A polidispersividade é definida como a razão-Mw/Mn-.Polissacarídeos menigocócicos foram analisados através deMALLS através de carregamento sobre duas colunas de HPLC (TSKG 6000 e5000 PWxl), usadas em combinação. 25 μΐ do polissacarídeo foramcarregados sobre a coluna e foram eluídos com 0,75 ml de água filtrada. Ospolissacarídeos foram detectados usando um detector de dispersão luminosa(Wyatt Dawn DSP equipado com laser de argônio de 10 mW a 488 nm) e umrefractômero inferométrico (Wyatt Otilab DSP, equipado com uma célula P100 e um filtro vermelho a 498 nm).

As polidispersividades do peso molecular e as recuperações detodas as amostras foram calculados pelo método de Debye usando um aordem a ajuste polinomial de 1 no software Astra 4.72.

Exemplo 3-Ensaio clínico comparando a imunização com Meningitec ou umconjugado deMenC-TT de dimensionado em tamanho maior.

Um estudo controlado, aberto, de fase II, foi executado demodo a comparar a vacina de conjugado do sorogrupo C meningocócico(MenC) de GSK Biologicals com a vacina de conjugado do sorogrupo Cmeningocócico de Haemophilus influenzae b (Hib-MenC) ou Meningitec® deGSK Biologicals. Cada dose de Meningitec® contém 10 μg deoligossacarídeo do sorogrupo C menicogocócico conjugado com 15 μg deCRM 197 e é produzido por Wyeth. Os conjugados de MenC de GSKcontinham polissacarídeos nativos de cerca de 200 kDa, conjugados aotoxóide do tétano (TT).

O estudo consistiu de cinco grupos, cada qual planejado paraconter 100 pacientes, alocados em dois braços paralelos, como se segue:

Neste presente estudo, todos os pacientes receberam, emambos os braços, um quinto (1/5) de uma dose de Mencevax® CWY e umadose concomitante de Infanrix™ hexa em 12-15 meses de idade (mês doestudo 0). As duas amostras de sangue foram coletadas a partir de todos ospacientes (mês do Estudo 0 e Mês do Estudo 1). O braço 1 consistiu de quatrogrupos a partir de um estudo de vacinação primário, os quais haviamrecebido, em sua idade de 3, 4 e 5 meses, as seguintes vacinas:

• Grupo KiMenC (10 não adsorvidos em sais de alumínio(não-ads), conjugado de toxóide de tétano (TT) e Infanrix™ hexa (MenClO-TT + Infanrix™ hexa);

· Grupo L:Hib (10 μg)-MenC (10 μg), conjugado de TT não-ads e Infanrix™ penta

(HiblO -MenClO-TT + Infanrix™penta)

• Grupo M:Hib (5 μg) - MenC (5 μg), não-ads, conjugado deTT e Infanrix™ penta

(Hib5-Men5 - TT + Infanrix™ penta)

• Grupo NrMeningitec™ e Infanrix™ hexa (Meningitec™ +Infanrix™ hexa)

Os dois grupos de vacina Hib-MenC-TT (grupos L e M) forammantidos cegos no estudo de reforço, em relação à formulação exata davacina candidata.

O braço 2-(Grupo O) consistiu de pacientes conjugados poridade, que não haviam sido previamente vacinados com uma vacina dosorogrupo C menigocócico (simples), mas que haviam recebido vacinaspediátricas de rotina de acordo com a German Permanent Commision onImmunization.

Critérios para a avaliação:

Imunogenicidade:Determinação de titulações de anticorpobactericidas contra (SBA-MenC) meningocócico C através de um testebactericida (corte:uma diluição de 1:8) e medição por ELISA deanticorpos contra o sorogrupo meningocócico (corte do ensaio:0,3 μg/ml),o polissacarídeo Hib PRP (corte do ensaio:0,15 μg/ml) e o toxóide detétano (corte do ensaio:0,l IU/ml) nas amostras de sangue obtidas antesda vacinação e aproximadamente um mês após a vacinação em todos ospacientes.Métodos Estatísticos:

Demografia:Determinação da idade média em meses (comdesvio médio, faixa e padrão [ SD] e composição racial e de gênero do ATP ecoortes vacinadas totais.

Imunogenicidade:

Duas análises de imunogenicidade foram executadas com basena coorte de ATP quanto à imunogenicidade (para análises de memória imunee resposta de reforço) na coorte de ATP quanto à segurança (para a análise depersistência). Estas incluíram:

Avaliação da memória imune para MenC e resposta doreforço para Hib e Tétano:

(antes e um mês após a administração de 1/5 da dose da vacinade polissacarídeo simples):

• Determinação das titulações e concentrações médiasgeométricas (GMTs e GMCs) com 95% de intervalos de segurança (95% de Cl);

• Determinação do percentual de pacientes com titulação/concentração de anticorpo acima dos cortes propostos com exatos 95% de Cl(taxas de soropositividade/soroproteção);

• Investigação de titulações/concentração de anticorpo após avacinação usando curvas cumulativas reversas;

• Computação de 95% de Cl assintótico padronizado quanto àdiferença na taxa de soropositividade/soroproteção;

• entre o grupo que recebeu imunização prévia (Grupos K, LM e N) e o grupo não recebeu imunização (Grupo O);

· Determinação da média geométrica da razão individual detitulação de SBA-MenC em relação à concentração anti-PSC, com 95% Cl;

• Determinação de 95% de Cl para a razão de pós-vacinaçãoGMT/C entre os grupos K, L e M e o grupo de controle N para anti-PRP eantitétano e entre cada grupo imunizado (Grupos K, L, M e N) e o grupo não-imunizado (Grupo O) para SBA-MenC e anti-PSC usando um modelo ANOVA;Resultados:

Tabela 1, titulações de SBA-MenC e concentração de anticorpo anti-PSCapós vacinação com reforço

<table>table see original document page 50</column></row><table>

Grupo K:pacientes imunizados com MenClO-TT + Infanrix.

hexa; Grupo L:pacientes imunizados com Hib-IO-MenC - TT + Infanrix.

Penta; Grupo Mrpacientes imunizados com Hib5-MenC5-TT + Infanrix.

penta; Grupo Nipacientes imunizados com Menigitec + Infanrix. hexa; Grupo

Orpacientes de controle (isto é, pacientes não-imunizados com vacina deconjugado de MenC)

N:número de pacientes com resultados disponíveisTitulações mais altas de anticorpos contra MenC e titulaçõesde SBA mais altas foram alcançadas através da imunização com as vacinas deconjugado de polissacarídeo MenC dimensionadas em tamanho maior (gruposK, L e M) comparadas com a vacina de conjugado de oligossacarídeoMeningitec.

Tabela 2:Razão de média geometria para a titulação de SBAMenC/concentração de anti-PSC

<table>table see original document page 50</column></row><table>Emtodos os grupos imunizados (Grupos K,L,Me Ν), o GMRaumentou de modo significativo da vacinação pré para pós, indicando apresença de maturação de anticorpo e a funcionalidade. GMR no grupo M(imunizado com Hib5-MenC5-TT) foi mais alta do que no Grupo N(imunizado com Meningitec™).

Tabela 3:Persistência em 12-15 meses de idade justo antes da administraçãodas vacinas de reforço

<table>table see original document page 51</column></row><table>

Grupo K:pacientes imunizados com MenClO-TT + Infanrix™hexa; Grupo Lipacientes imunizados com HiblO-MenClO-TT +Infanrix™penta; Grupo M:pacientes imunizados com Hib5-MenC5-TT +Infanrix™ penta; Grupo N:pacientes imunizados com Meningitec™ +Infanrix™hexa; Ninúmero de pacientes com resultados disponíveis.

Titulações de SBA mais altas contra MenC foram alcançadaspela imunização com um tamanho maior de MenC (grupos K, L e M)comparados à imunização com o conjugado de oligossacarídeo MenCMeningitec™.Memória imune (Coorte de ATP quanto à imunogenicidade)

A administração de 1/5 da dose de polissacarídeo puroACWY provocou uma titulação de SBA-MenC muito alta em todos osquatro grupos imunizados com 98,7-100% e 97,5-100% de pacientesimunizados com um regime de vacina candidato exibindo titulações >1:8e > 1:128, respectivamente. No grupo imunizado com o regimeMenigitec™, houve uma tendência quanto a um percentual mais baixo depacientes com titulações > 1:128 (91, 8%). Em comparação, 17, 6% dospacientes não -imunizados apresentaram titulações de SBA MenC > 1:8 e> 1:128.

Exemplo 4:Ensaio clínico da Fase II em vacina de conjugadode HibMenAC-TT misturado com DTPw-HepB

Projeto de Estudo: Estudo de centro único, aleatório(1:1:1:1:1), aberto, com cinco grupos. Os cinco grupos receberam o regime devacinação que se segue, respectivamente, em 6, IOe 14 semanas de idade.

• Tritanrix™-HepB/Hib-menAC 2,5/2,5/2,5 :e assim por diante, referidocomo 2,5/2,5/2,5;

• Tritanrix™-HepB/Hib-MenAC 2,5/5/5 :a seguir referido como 2,5/5/5· Tritanrix™-HepB/Hib-MenAC 5/5/5 :a seguir referido como 5/5/5

• Tritanrix™-HepB + Hiberix™:a seguir referido como Hiberix

• Tritanrix-HepB/Hiberix™ + Menigitec™:a seguir referido comoamostras de sangue Menigitec foram tomados no momento da primeira dosede vacina (Pre) e um mês após a terceira dose de vacina (Pós-dose 3).

Tritanrix é uma vacina DTPw comercializada por

GlaxoSmithKline Biologicals S. A.

105 pacientes foram usados em cada um dos cinco grupos,dando um total de 525 pacientes no estudo.Tabela 4: Conteúdo das formulações de vacina de GSK

<table>table see original document page 53</column></row><table>

* A vacina 2,5/2, 5/2,5 foi uma diluição de dose da vacina de Hib-MenAC deGSK Biologicals a 5/5/5 contendo 2,5 μg de cada um de PRP-TT, MenA-TTe MenC-TT.

As formulações de vacina Hib-MenAC foram misturadasextemporaneamente com Tritanix-HepB. A vacina de Bordetella pertussis decélula inteira de difteria-tétano-hepatite B combinada (DTPw-HB) (Tritanix-HepB) contém não menos do que 30 Unidades Internacionais (IU) de toxóidede difeteria, não menos do que 60 IU de toxóide de tétano, não menos do que4IU de perturssis Bordetella exterminada e 10 μ§ de antígeno superficial dehepatite B recombinante.

Terapia de referência, dose, modo de administração, lote n°:

Programação de vacinação/sítio:um grupo recebeu a vacinaTritanrix™-HepB por via intramuscular na coxa esquerda e Hiberix™ por viaintramuscular na coxa direita em 6, 10 e 14 semanas de idade. Um outrogrupo recebeu a vacina Tritanrix-HepB/Hiberix por via intramuscular na coxaesquerda e a vacina Meningitec por via intramuscular na coxa direita em 6, 10e 14 semanas de idade.

Vacina/composição/dose/número do lote:A vacina

Tritanix™-HepB usada foi como acima descrito.

Uma dose (0,5 ml) de vacina de conjugado do tipo b deHaemophilus influenzae de GSK Biologicals:Hiberix™ continha 10 μg dePRP conjugado a toxóide do tétano. No grupo Hiberix™, ele foi misturadocom diluente estéril e no Grupo Meningitec™, ele foi misturado comTritanix™-HepB.

Uma dose (0,5 ml) da vacina MENINGITEC™de WyethLederle continha: 10 μg de oligossacarídeo capsular do grupo meningocócicoC, conjugado a 15 μg da proteína Corynebacterium diphteria CRM 197 ealumínio como sais.

Resultados-respostas imunes geradas contra Hib, MenA e MenC

Tabela 5a Anti-PRP ^g/ml)

<table>table see original document page 54</column></row><table>

Tabela 5b SBA-MenC

<table>table see original document page 54</column></row><table>

Tabela 5c SBA-MenA

<table>table see original document page 54</column></row><table>

Tabela 5d Anti-PSC (ug/mD

<table>table see original document page 54</column></row><table>

Tabela 5e Anti-PSA (ug/ml)

<table>table see original document page 54</column></row><table>

Conclusão

Uma comparação dos resultados de imunogenicidadealcançados com o uso da vacina de conjugado MenC-CRM 197 e as trêsformulações de GSK5 que contêm os conjugados de polissacarídeo MenA-TTe MenC-TT, demonstraram que os conjugados de polissacarídeo Men foramcapazes de provocar uma boa resposta imune, similar àquela alcançadausando a vacina de conjugado de oligossacarídeo Meningitec. Todas asformulações testadas forneceram uma resposta para MenC em 100% dospacientes.

Exemplo 5-Ensaio clínico da Fase II administrando Hib MenCYconcomitantemente com Infanrix™ penta de acordo com umaprogramação de 2,3 e 4 meses

Projeto de Estudo:Um estudo multicêntrico controlado demodo aleatório, aberto (parcialmente duplo-cego*), de Fase II, com 5 gruposrecebendo uma programação primária de três doses com vacinas como sesegue:

Grupo Hib-MenCY 2,5/5/5 :Hib-MenCY (2,5/5/5) + Infanrix™penta

Grupo Hib-MenCY 5/10/10:Hib-MenCY (5/10/10) +Infanrix™ penta

Grupo Hib-MenCY 5/5/5 :Hib-MenCY (5/5/5) +Infanrix™penta

Grupo Hib-MenCiHib-MenC (5/5) + Infanrix™ pentaGrupo Menjugate:Menjugate™** + Infanrix™ hexa (controle)* Hib-MenCY 2,5/5/5, Hib-MenCY 5/10/10 e Hib-MenCforam administrados em um modo duplo cego, enquanto que o grupo Hib-MenCY 5/5/5 e o grupo Menjugate™ foram abertos.

As formulações a 2,5/5/5, 5/10/10 e 5/5/5 de Hib-MenCYcontêm polissacarídeos nativos MenC e polissacarídeos MenY que sãomicrofluidizados.

** Menjugate™ contém 10 μg de oligossacarídeos MenCconjugados a 12,5-25 μg de CRM por dose e é produzido por Chiron.

A vacinação em +/-2, 3, 4 meses de idade (Mês de Estudo0, Mês 1 e Mês 2), e amostras de sangue (3, 5 ml) de todos os pacientesantes de e um mês após a vacinação primária (Estudo no Mês 0 e no Mês 3)·Vacina de estudo, dose, modo de administração, número dolote:Três doses injetadas por via intramuscular em intervalos de um mês, emaproximadamente 2, 3 e 4 meses de idade, como se segue:

Tabela 6:Vacinas administradas (estudo e controle), grupo,programação/sítio e dose:

<table>table see original document page 56</column></row><table>

Imunogenicidade: Medição de titulações deanticorpo/concentrações contra cada antígeno da vacina:

Antes da primeira dose (Mês 0) e aproximadamente um mêsapós a terceira dose (Mês 3) em todos os pacientes para:SBA-MenC e SBA-MenY, anti-PSC e anti-PSY, anti-PRP, anti-T, anti-FHA, anti-PRN e anti-PT.O uso de atividade bactericida do soro contra os sorogrupos C e Y de N.meningitidis (corte de SBA-MenC e SBA-MenY: 1:8 e 1:128); ensaios deELISA com cortes:> 0, 3 μg/ml e > 2 μg/ml para sorogrupos C deN.menigitidis e polissacarídeos Y (IgG de anti-PSC e IgG de anti-PSY); > 0,15 μL/ml e > 1, 0 μg/ml para o polissacarídeo Hib polirribosil-ribitol-fosfato(IgG de anti-PRP; 5EL.U/ml para anti-FHA, anti-PRN< anti-PT; > 0, 1 IU/mlde toxóide antitétano (anti-TT). Apenas um mês após a terceira dose (Mês 3)em todos os pacientes para:anti-D, anti - HBs e antipólio 1, 2, e 3. Usandoensaios ELISA com cortes:0,l IU/ml para antidifteria (anti-D); > 10 ml U/mlpara anti-hepatite (anti-HBs); e corte de teste de microneutralização: 1:8 para otipo antipólio 1, 2 e 3 (antipólio 1, 2 e 3).

Métodos Estatísticos:

As taxas de soroproteção/soropositividade e asconcentrações/titulações médias geométricas (GMCs/GMTs) com 95% deintervalos de segurança (95% de Cl) foram computados por grupo, para SBA- MenC, anti-PSC, SBA-MenY, anti-PSY, anti-PRP, antitétano, anti-PT, anti-FHA e anti-PRN antes de e um mês após a vacinação; para antidifteria, anti-HBs, antipólio 1, antipólio 2 e antipólio 3, um mês após a vacinação. Aresposta da vacina (aparência de anticorpos em pacientes inicialmentesoronegativos ou pelo menos a manutenção das concentrações de anticorpoem pacientes inicialmente soropositivos) com 95% de Cl para anti-PT, anti-PRN e anti-FHA foram também computados um mês após a vacinação. Ascurvas cumulativas reversas para cada anticorpo no Mês 3 foram tambémapresentadas. As diferenças entre os grupos Hib-MenCY e Hib-MenC,comparadas com o grupo de controle Menjugate™ foram avaliadas em ummodo exploratório para cada anticorpo, exceto para SBA-MenY e anti-PSY,em termos de (1) a diferença entre o grupo Menjugate™ (menos) os gruposHib-MenCY e Hib-MenC quanto ao percentual de pacientes acima dos cortesespecificados ou com uma resposta de vacina com os seus 95% de CLassintótico padronizado, (2) as razões de GMC ou de GMT do grupoMenjugate™ em relação aos grupos Hib-MenCy e Hib-MenC com os seus95% de Cl. Foram efetuadas as mesmas comparações para avaliar a diferençaentre cada par de formulações de Hib-MenCY para os anticorpos anti-PRP,SBA-MenC, anti-PSC, SBA-MenY, anti-PSY e anti-TT.

As incidências totais dos sintomas solicitados locais e geraisforam computadas por grupo de acordo com o tipo de sintoma, suaintensidade e relação para a vacinação (como percentuais de pacientesrelatando sintomas gerais, locais e quaisquer sintomas solicitados dentro de 8dias seguindo-se à vacinação e seus exatos 95% de Cl). As incidências desintomas não-solicitados foram computadas por grupo. Para sintomas de Grau3, foram providos o início < 48 horas, atenção médica, duração, relação para avacinação e os resultados. Eventos Adversos Sérios foram inteiramentedescritos.

Taxas de Soroproteção/soropositividade & GMT/Ts(Coorte de ATP quanto à imunogenicidade )

Tabela 7a Anti-PRP (ug/ml)

<table>table see original document page 58</column></row><table>

Tabela 7b SBA - MenC (Título)

<table>table see original document page 58</column></row><table>

Tabela 7c Anti-PSC (u s/ml)

<table>table see original document page 58</column></row><table>

Tabela 7d SBA-MenY (Título)

<table>table see original document page 58</column></row><table>

Tabela 7e Anti-PSY (μl S/ml)

<table>table see original document page 58</column></row><table>

Tabela 7f Antitétano (IU/ml)

<table>table see original document page 58</column></row><table>Grupo Hib-MenCY 5/10/10:Hib-MenCY (5/10/10) +Infanrix™ penta

Grupo Hib-MenCY 5/5/5 :Hib-MenCY (5/5/5) + Infanrix™penta

Grupo Hib-MenC:Hib -Men (5/5) + Infanrix™hexa

Grupo Menjugate:Menjugate™ + Infanrix™ penta

N = número de pacientes com % de resultados disponíveis =percentual de pacientes com concentração/titulação dentro da faixaespecificada

GMC/T:concentração/titulação média geométrica 95% Cl =95% de intervalo de segurança; LL = Limite Inferior; UL = Limite Superior

Conclusão:

Os conjugados de polissacarídeo MenC e Y produziram umaboa resposta imune em todos os pacientes, com 100% dos pacientesproduzindo respostas acima de 0,3 μ§/πι1 contra MenC e MenY.

Exemplo 6-Ensaio clínico da Fase II comparando trêsformulações de MenACWY - TT com a vacina de conjugado deoligossacarídeo MenC-CRM 197 Meningitec

Este exemplo relata um estudo de faixa de dose controlada,aleatória, aberta (parcialmente cega, de fase II, de modo a avaliar aimunogenicidade de três diferentes formulações da vacina de conjugado detoxóide de tétano, A, C, W-135, Y dos sorogrupos meningocócicos(MenACWY-TT) de GalxoSmithKline Biologicals em comparação com umavacina de conjugado de oligossacarídeo MenC - CRM197 (Meningitec™)quando fornecida como uma dose única a crianças na idade de 12-14 meses.

O ensaio clínico foi um estudo multicêntrico, controlado,aberto (parcialmente duplo cego*), no qual pacientes elegíveis de 12-14meses foram colocados, de modo aleatório (1:1:1:1) em de um a quatrogrupos paralelos de 50 pacientes para receber uma dose primária única naVisita 1, como se segue:

Forma lT:MenACWY-TT em uma dose de 2,5 depolissacarídeo MenA conjugado a toxóide de tétano (TT), 2, 5 μg depolissacarídeo MenC conjugado TT, 2,5 μg de polissacarídeo MenWconjugado a TT e 2,5 μg de polissacarídeo MenY conjugado a TT.

Forma 2T:MenACWT-TT em uma dose de 5μg depolissacarídeo MenA conjugado a TT, 5 μg de polissacarídeo MenCconjugado a TT, 5 μg de polissacarídeo MenW conjugado a TT e 5 depolissacarídeo MenY conjugado a TT.

Forma 3T:MenACWY-TT em uma dose de 2,5 μg depolissacarídeo MenA conjugado a TT, 10 μg de polissacarídeo MenCconjugado a TT, 2,5 μg de polissacarídeo MenW conjugado a TT e 2, 5 μg depolissacarídeo MenY conjugado a TT.

Ctrl T: 10 μg e oligossacarídeo MenC conjugado a 1,25-25 μgde CRM 197 (Meningitec).

• As três diferentes formulações de MenACWY-TT foramadministradas em um modo duplo cego.

Programação de vacinação/sítio.'Uma única dose de vacina foiadministrada por via intramuscular no deltóide esquerdo na Visita 1 (Mês deEstudo 0) de acordo com um designação aleatória. Todas as vacinascandidatas foram supridas sob a forma de uma pelota liofilizada em um frascode dose única (0, 5 ml após a reconstituição com o diluente salino suprido).

Imunogenicidade .Medição de titulações/concentrações deanticorpos contra componentes de antígeno de vacina meningocócicos emamostras de sangue obtidas antes da dose de vacina de estudo (Mês 0) eaproximadamente um mês após a dose de vacina do estudo (Mês 1) em todosos pacientes. A determinação de titulações de anticorpo bactericida contra ossorogrupos de N-menigitidis A, C, W-135 e Y (SBA-MenA, SBA-MenC,SBA -MenW e SBA-MenY) através de um teste bactericida (cortes deensaio:uma diluição de 1:8 e 1:128) e medição por ELISA de anticorposcontra os sorogrupos de N.meningitidis A, C, W-135 e Y (anti-PSA, anti-PSC,anti-PSW e anti-PSY, cortes de ensaio > 0, 3 μ g/ml e > 2 μ§/ηι1), e toxóide dotétano (antitétano, corte de ensaio 0,1 IU/ml).

Resultados

Resposta do anticorpo em termos de percentual de respostas deSBA-MenA, SBA-MenC, SBA-MenW e SBA-MenY um mês após avacinação (o ponto terminal primário) é apresentada na Tabela 8. Umaresposta é definida como maio do que ou igual a 4 vezes o aumento quanto apacientes soropositivos ou soroconversão quanto a pacientes soronegativosantes da vacinação.

Tabela 8:Respostas de vacina para anticorpo de SBA ummês após a vacinação

<table>table see original document page 61</column></row><table>

A Tabela 9 apresenta os números de pacientes que alcançamtitulações de SBA acima dos pontos de corte de 1:8 e 1:128, assim comoGMTs.Tabela 9:Taxas de Soropositividade e GMTs para anticorpos de SBA ummês após a vacinação

<table>table see original document page 62</column></row><table>

A vacinação com todas as três formulações do conjugado depolissacarídeo ACWY-TT conduziu a boas respostas de SBA contra MenA,MenC, MenW e MenY com 95-100% de pacientes com titulações superes a 1:8.Em particular, as formulações 5/5/5/5 e 2,5/10/2,5/2,5 dos conjugados depolisssacarídeo produziram uma resposta mais alta contra MenC do que a vacinade oligossacarídeo Meningitec®, conforme observado em uma proporção maisalta de indivíduos tendo uma titulação superior a 1:128 e as leituras de GMT.

Tabela 10. Taxas de soropositividade e GMCs para anticorpos depolissacarídeo um mês após a vacinação

<table>table see original document page 62</column></row><table>Todas as três formulações da vacina de conjugado depolissacarídeo ACWY-TT produziram boas respostas imunes contra MenA,MenC, MenW e MenY com entre 93% e 100% de pacientes alcançandotitulações superiores a 0,3 μ^ιηΐ. Leituras de GMC superiores foramalcançadas usando as formulações 5/5/5/5 e 2/5/10/2, 5/2,5 da vacina deconjugado de polissacarídeo ACWY-TT em comparação com Meningitec™.

Exemplo 7-Comparação de imunogenicidade deconjugados de polissacarídeo MenY nativos e dimensionados

Camundongos (fêmeas DBA/2 de 6-8 semanas) receberamduas injeções, com intervalo de 2 semanas, de PSY-TT, através de viasubcutânea. As amostras de sangue foram tomadas 14 dias após a segundainjeção, de modo a executar um ELISA anti-PSY e SBA usando a cepa MenYS 1975. Através de injeção, os camundongos receberam 1 μg de PSY-TT(formulação lio não-ads).

Foram usados os conjugados descritos na Tabela 11.

Tabela 11

<table>table see original document page 63</column></row><table>

Resultados

Os resultados (Figura 1) apresentam uma tendência em relaçãoa uma imunogenicidade mais alta para conjugados preparados usando PSYdimensionado. A Figura IA apresenta os resultados de GMC obtidos em umELISA quanto a antisoros produzidos contra conjugados preparados a partirde MenY nativo (ENYTT012) MenY microfluidizado - 40 ciclos(ENYTT014) e MenY microfluidizado-20 ciclos (ENYTT15bis). GMCs maisaltos foram obtidos quando o MenY -TT foi preparado a partir de MenYmicrofluidizado.

Resultados similares foram obtidos quando os anti-soros foramavaliados através de um ensaio de SBA (Figura 1 B). De novo, os valores deGMT mais altos foram alcançados usando conjugados preparados a partir deMenY microfluidizado.

Exemplo 8-Ensaio clínico determinando o efeito de umagente de ligação em MenA em uma vacina de conjugado MenACWY

Uma única dose de diferentes formulações da vacinaMenACWY foi administrada a adolescentes de 15-19 anos em 5 grupos de 25pacientes em um ensaio aleatório a 1:1:1:1:1. As formulações testadas foram:

F1-MenACWY conjugado a toxóide de tétano com oconjugado MenA contendo um espaçador AH - 5I5I5I5I\í%

F2-MenACWY conjugado a toxóide de tétano com oconjugado MenA contendo um espaçador AH - 2, 5/5/2,5/2,5 μg

F3-MenACWY conjugado a um toxóide de tétano com oconjugado MenA contendo um espaçador AH - 5/5/2,5/2,5 μg

F4-MenACWY conjugado a um toxóide de tétano semespaçador em qualquer conjugado — 5/5/5/5 μg

Grupo de Controle - ACWY Mencevax™

No trigésimo dia após a inoculação, uma amostra de sangue foitomada a partir dos pacientes.

As amostras de sangue foram usadas para avaliar o percentualde respostas de SBA-MenA, SBA-MenC, SBA-MenW 135 e SBA-MenY, ummês após a dose da vacina. Uma resposta da vacina foi definida como 1) parapacientes inicialmente soronegativos- uma titulação de anticorpo pósvacinação > 1/32 em e Mês ou 2) para pacientes inicialmente soropositivos -titulação de anticorpo de > 4 vezes a titulação e anticorpo pré-vacinação.

Resultados

Como mostrado na Tabela 13, o uso de um espaçador noconjugado MenA conduziu a uma resposta imune aumentada contra MenA. Opercentual de resposta foi elevado de 66% a 90-95% quando o espaçador AHfoi adicionado. Isto foi refletido em um aumento em SBA GMT de 4335 a 10000 e em um aumento em GMC de 5 a 20-40. De modo surpreendente, o usode um espaçador AH também conduziu a uma resposta imune aumentadacontra MenC5 conforme observado por um aumento no percentual derespostas e um aumento em SBA GMT. Um aumento poderia ser tambémobservado em SBA-GMT contra MenY (6742-7122) e contra MenW (4621-5418) quando um espaçador foi introduzido.

Tabela 12

<table>table see original document page 65</column></row><table> Exemplo 9-Ensaio clínico determinando o efeito de umagente de ligação em conjugados de MenA e MenC em vacina deconjugado MenACWY

Uma única dose de diferentes formulações da vacinaMenACWY foi administrada a adolescentes de 15-19 anos em 5 gruposde 25 pacientes em um ensaio aleatório a 1:1:1:1:1. As formulaçõestestadas foram:

F1-MenACWY conjugado a um toxóide de tétano com osconjugados MenA e MenC contendo um espaçador AH - 2,5/2,5/2,5/2,5

F2 - MenACWY conjugado a toxóide de tétano com osconjugados MenA e MenC contendo um espaçador AH -5,5/2,5/2,5 μg

F3 - MenACWY conjugado a toxóide de tétano com osconjugados MenA e MenC contendo um espaçador AH - 5/5/5/5 μg

F4-MenACWY conjugado a um toxóide de tétano com oconjugado MenA contendo um espaçador AH - 5/5/5/5 μgGrupo de Controle - ACWY Mencevax™

No trigésimo dia após a inoculação, uma amostra de sangue foitomada a partir dos pacientes.

As amostras de sangue foram usadas para avaliar opercentual de respostas de SBA-MenA, SBA-MenC, SBA-MenWl35 eSBA-MenY um mês após a dose da vacina. Uma resposta de vacina foidefinida como 1) para pacientes inicialmente soronegativos- umatitulação de anticorpo pós-vacinação > 1/32 em 1 mês ou 2) parapacientes inicialmente soropositivos - titulação de anticorpo de > 4vezes a titulação de anticorpo pré-vacinação.

Resultados:

A introdução de um espaçador AH no interior do conjugadoMenC conduziu a um aumento na resposta imune contra MenC, tal comomostrado na Tabela 14. Isto é demonstrado através de um aumento emSBA GMT de 1943 a 4329 e um aumento em anti-PSC GMC de 7,65 a13,13. Foram mantidas boas respostas imunes contra MenA, MenW eMenY.Tabela 13

<table>table see original document page 67</column></row><table>

Claims (106)

1. Composição imunogênica, caracterizada pelo fato de quecompreende pelo menos 2 sacarídeos capsulares N. meningitidis diferentes,em que um ou mais é/são selecionados a partir de um primeiro grupo, queconsiste de MenA, MenC, MenY e MenW, que é/são conjugados através deum agente de ligação a uma proteína (s) carreadora(s), e um ou maissacarídeos diferentes é/são selecionado(s) a partir de um segundo grupo, queconsiste de MenA, MenC, MenY e MenW, que é/são diretamente conjugadosa uma(s) proteína(s) carreadora(s).

2. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos 2 sacarídeoscapsulares N. meningitidis diferentes, em que um ou mais é/são selecionadosa partir de um primeiro grupo, que consiste de MenA e MenC, que é/sãoconjugados através de um agente de ligação a uma proteína (s) carreadora(s),e um ou mais sacarídeos diferentes é/são selecionados a partir de um segundogrupo, que consiste de MenC, MenY e MenW, que é/são diretamenteconjugados a uma(s) proteína(s) carreadora(s).

3. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 2,caracterizada pelo fato de que compreende um sacarídeo capsular MenAconjugado através de um agente de ligação a uma proteína carreadora, e umsacarídeo capsular MenC diretamente conjugado a uma proteína carreadora.

4. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 2,caracterizada pelo fato de que compreende um sacarídeo capsular MenCconjugado através de um agente de ligação a uma proteína carreadora e umsacarídeo capsular MenY diretamente conjugado a uma proteína carreadora.

5. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 2,caracterizada pelo fato de que compreende sacarídeos capsulares MenA eMenC conjugados através de um agente de ligação a uma(s) proteína(s)carreadora(s), e sacarídeos capsulares MenY e MenW diretamente conjugadosa uma(s) proteína(s) carreadora(s).

6. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 2,caracterizada pelo fato de que compreende um sacarídeo capsular MenAconjugado através de um agente de ligação a uma proteína carreadora, esacarídeos capsulares MenC5 MenY e MenW diretamente conjugados aproteína (s) carreadora(s).

7. Composição imunogênica, caracterizada pelo fato de quecompreende pelo menos 2 sacarídeos diferentes, conjugados separadamenteao mesmo tipo de proteína carreadora, em que um ou mais sacarídeo(s) é/sãoconjugados à proteína carreadora através de um primeiro tipo de grupoquímico no carreador de proteína, e um ou mais sacarídeos (s) é/sãoconjugados à proteína carreadora através de um segundo tipo de grupoquímico sobre o carreador da proteína.

8. Composição imunogênica de acordo coma reivindicação 7,caracterizada pelo fato de que o um ou mais sacarídeo(s) conjugado(s) àproteína através do primeiro tipo de grupo químico no carreador da proteínasão diferentes dos um ou mais sacarídeo(s) conjugados à proteína carreadoraatravés do segundo tipo de grupo químico no carreador da proteína.

9. Composição imunogênica de acordo com as reivindicações 7 ou 8, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos 2 sacarídeosdiferentes, conjugados separadamente à mesma proteína carreadora, em queum ou mais sacarídeo(s) é/são conjugados à proteína carreadora através de umgrupo carboxila no carreador da proteína, e um ou mais sacarídeo(s) é/sãoconjugados à proteína carreadora através de um grupo amino no carreador daproteína.

10. Composição imunogênica de acordo com as reivindicações 7 a 9, caracterizada pelo fato de que o primeiro e o segundo tipo de grupoquímico no carreador da proteína estão presentes em epítopos de célula B e/oucélula T na proteína carreadora.

11. Composição imunogênica de acordo com as reivindicações 7 a 10, caracterizada pelo fato de que os sacarídeos são selecionados a partir deum grupo, que consiste do sacarídeo capsular do sorogrupo A de N.Meningitidis (MenA), sacarídeo capsular do sorogrupo C de N.meningitidis(MenC), sacarídeo capsular do sorogrupo Y de N. meningitidis (MenY),sacarídeo capsular do sorogrupo W de N. meningitidis (MenY), sacarídeocapsular do sorogrupo W de N. meningitidis (MenW), sacarídeo capsular dogrupo I de Streptococcus do Grupos B, sacarídeo capsular do grupo II deStreptococcus do Grupo B, sacarídeo capsular do grupo III de Streptoeoceus doGrupo B, sacarídeo capsular do grupo IV de Streptoeoceus do Grupo B,sacarídeo capsular do grupo V de Streptoeoceus do grupo B, sacarídeo capsulardo tipo 5 de Staphylococcus aureus, sacarídeo capsular do tipo 8 deStaphylocoeeus aureus, Sacarídeo VI de Salmonella typhi, LPS de N.meningitidis (tal que L3 e/ou L2), M. eatarrhalis LPS, H. influenzae LPS, oude qualquer dos sacarídeos pneumocócicos capsulares, tais que do sorotipo :1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9 N, 9V, 10A, 11 A, 12F, -14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F ou 33F.

12. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 11, caracterizada pelo fato de que cada sacarídeo capsular N.meningitidis é conjugado a uma proteína carreadora independentementeselecionada a partir do grupo, que consiste de TT, DT, CRM 197, fragmento Cde TT e proteína D.

13. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 12, caracterizada pelo fato de que cada sacarídeo capsular N.meningitidis é conjugado à mesma proteína carreadora, selecionada a partir dogrupo que consiste de TT, DT, CRM 197, fragmento C de TT e proteína D.

14. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 13, caracterizada pelo fato de que cada sacarídeo capsular N.meningitidis é conjugado a TT.

15. Composição imunogênica de acordo com qualquer umadas reivindicações 1 a 14, caracterizada pelo fato de que cada sacarídeocapsular N. meningitidis é separadamente conjugado a uma proteínacarreadora separada.

16. Composição imunogênica de acordo com qualquer umadas reivindicações 1 a 15, caracterizada pelo fato de que pelo menos um, doisou três conjugado(s) de sacarídeo capsular N. meningitidis é diretamenteconjugado a uma proteína carreadora.

17. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que MenW e/ou MenY, MenW e/ou MenC,MenY e/ou MenC, ou MenW e MenC e MenY são diretamente conjugados auma proteína carreadora.

18. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 16 ou 17, caracterizada pelo fato de que pelo menos um, dois ou trêsconjugado(s) de sacarídeo N. meningitidis é diretamente conjugado através dequímica de CDAP.

19. Composição imunogênica de acordo com qualquer umadas reivindicações 1 a 18, caracterizada pelo fato de que pelo menos um, doisou três sacarídeo(s) capsular(es) N. meningitidis são conjugados à proteínacarreadora através de um agente de ligação.

20. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 19, caracterizada pelo fato de que o agente de ligação é bifuncional.

21. Composição imunogênica de acordo com qualquer umadas reivindicações 1 a 20, caracterizada pelo fato de que compreendesacarídeos capsulares N.meningitidis de pelo menos dois sorogrupos A, C,W135 e Y, conjugados a uma proteína carreadora, de modo a produzir umconjugado de sacarídeo capsular N. meningitidis, em que o tamanho médio decada sacarídeo N. meningitidis está acima de 50 kDA, 75 kDA, 100 kDa, 110kDa, 120 kDa ou 130 kDa.

22. Composição imunogênica de qualquer uma dasreivindicação 1 a 21, caracterizada pelo fato de que compreende ainda umsacarídeo capsular de H-influenzae b (Hib)5 conjugado a uma proteínacarreadora, mencionada proteína carreadora sendo opcionalmente selecionadaa partir do grupo, que consiste de TT, DT, CRM 197, fragmento C de TT eproteína D.

23. Composição imunogênica de acordo a reivindicação 22,caracterizada pelo fato de que a dose de sacarídeo do conjugado de sacarídeoHib é inferior a 90%, 75% ou 60% ou está entre 20-60% ou é de cerca de 50%da dose de sacarídeo de cada um dos pelo menos dois conjugados desacarídeo adicionais.

24. Vacina, caracterizada pelo fato de que compreende acomposição imunogênica como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 23 e um excipiente farmaceuticamente aceitável.

25. Kit de vacina para a administração seqüencial ouconcomitante, caracterizado pelo fato de que compreende duas composiçõesimunogênicas multivalentes para conferir proteção a um hospedeiro contradoença causada por Bordetella pertussis, Clostridium tetani,Corynebacterium difteriae, Hameophilus infuenzae e Neisseria meningitidis,O referido kit compreendendo um primeiro recipiente, que compreende:toxóide do tétano (TT),toxóide de difteria (DT), ecomponente de pertussis acelulares ou inteiramente celulares;e um segundo recipiente, que compreende:a composição imunogênica como definida em qualquer umadas reivindicações 1 a 23.

26. Composição imunogênica de acordo com as reivindicações 1 a 23, caracterizada pelo fato de ser para o uso no tratamento ou prevençãode doença causada por infecção de Neisseria meningitidis.dimensionado em um fator de não mais do que 10 x.

27.

28.

29.

30.

31.

32.

33.

34.

35.

36.

37.

38. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 36 ou 37, caracterizada pelo fato de que os sacarídeos capsulares dossorogrupos AeC são sacarídeos e polissacarídeos nativos dos sorogrupos W 135 e Y e são dimensionados em um fato de não mais do que 10 x.

39. Composição imunogênica de acordo com as reivindicações 31 a 38, caracterizada pelo fato de que o tamanho médio de cada sacarídeocapsular N. meningitidis está entre 50 kDa e 300 KDA ou de 50 kDa e 200kDa.

40. Composição imunogênica de acordo com as reivindicações 31 a 39, caracterizada pelo fato de que compreende um sacarídeo capsularMenA tendo um tamanho médio acima de 5 OkDa, 75 kDa, 100 kDa ou umtamanho médio de entre 50-100 kDa ou de 55-90 kDA ou de 60-80 kDa.

41. Composição imunogênica de acordo com as reivindicações 31 a 40, caracterizada pelo fato de que compreende um sacarídeo capsularMenC tendo um tamanho médio acima de 50 kDa, 75 kDa, 100 kDa ou deentre 100-200 kDa, 100-150 kDa, 80-120 kDa, 90-110 kDa, 150-200 kDa, 120-240 kDa, 140-220 kDa, 160-200 kDa ou 190-200 kDa.

42. Composição imunogênica de acordo com as reivindicações 31 a 41, caracterizada pelo fato de que compreende um sacarídeo capsularMenY, tendo um tamanho médio acima de 50kDa, 75 kDa, 100 kDa ou deentre 60 190 kDa ou 70-180 kDa ou 80-170 kDa ou 90-160 kDa ou 10-150kDa, 110-145 kDa ou 120 - 140 kDa.

43. Composição imunogênica de acordo com as reivindicações 31 a 42, caracterizada pelo fato de que compreende um sacarídeo capsularMenW tendo um tamanho médio acima de 50 kDa, 75 kDa, 100 kDa ou deentre 60-190 kDa ou 70-180 kDa ou 80-170 kDa ou 90-160 kDa ou 100-150kDa, 140-180 kDa, 140-170 kDa ou 110-140 kDa.

44. Composição imunogênica de acordo com qualquerreivindicação precedente, caracterizada pelo fato de que a dose de cadaconjugado de sacarídeo está entre 2 e 20 μg, 3 e 10 ou 4 e 7 pg desacarídeo.

45. Composição imunogênica de qualquer reivindicaçãoprecedente, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um sacarídeocapsular de H-influenzae b (Hib), conjugado a uma proteína carreadora.

46. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 45, caracterizada pelo fato de que o sacarídeo capsular H.influenzae b éconjugado a uma proteína carreadora, selecionada a partir do grupo, queconsiste de TT, DT, CRM 197, fragmento C de TT e proteína D.

47. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 45 ou 46, caracterizada pelo fato de que o sacarídeo Hib é conjugado à mesmaproteína carreadora que para um, dois, três ou todos os conjugados desacarídeo capsular N. meningitidis.

48. Composição imunogênica de acordo com as reivindicações 45 a 47, caracterizada pelo fato de que o sacarídeo Hib é conjugado a TT.

49. Composição imunogênica de acordo com as reivindicações 45 a 48, caracterizada pelo fato de que a razão de Hib para a proteínacarreadora no conjugado de sacarídeo capsular Hib está entre 1:5 e 5:1 (p/p).

50. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 49, caracterizada pelo fato de que a razão de Hib para a proteína carreadorano conjugado de sacarídeo capsular Hib está entre 1:1 e 1:4, 1:2, e 1:3,5 ou éde cerca de 1:3 (p/p).

51. Composição imunogênica de acordo com as reivindicações 45 a 50, caracterizada pelo fato de que o sacarídeo capsular Hib é conjugado àproteína carreadora através de um agente de ligação.

52. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 51, caracterizada pelo fato de que o agente de ligação é bifuncional.

53. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação- 51 ou 52, caracterizada pelo fato de que o agente de ligação possui doisgrupos amino reativos.

54. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 51 ou 52, caracterizada pelo fato de que o agente de ligação possui doisgrupos de ácido carboxílico reativos.

55. Composição imunogênica de acordo com as reivindicações 51 ou 52, caracterizada pelo fato de que o agente de ligação possui um grupoamino reativo em uma extremidade e um grupo de ácido carboxílico reativona outra extremidade.

56. Composição imunogênica de acordo com qualquer umadas reivindicações 51 a 55, caracterizada pelo fato de que o agente de ligaçãopossui entre 4 e 12 átomos de carbono.

57. Composição imunogênica de acordo com as reivindicações 51 ou 52, caracterizada pelo fato de que o agente de ligação é ADH.

58. Composição imunogênica de acordo com qualquer umadas reivindicações 45 a 57, caracterizada pelo fato de que o sacarídeo Hib éconjugado à proteína carreadora ou agente de ligação usando CNBr ouCDAP.

59. Composição imunogênica de acordo com qualquer umadas reivindicações 51 a 58, caracterizada pelo fato de que a proteínacarreadora é conjugada ao sacarídeo Hib através do agente de ligação, usandoum método que compreende química de carbodiimida, de modo opcionalquímica de EDOAC.

60. Composição imunogênica de acordo com qualquer umadas reivindicações 45 a 59, caracterizada pelo fato de que compreende umconjugado de sacarídeo Hib e pelo menos dois conjugados de sacarídeobacterianos adicionais, em que o conjugado de Hib está presente em uma dosemais baixa do que a dose média de pelo menos dois conjugados de sacarídeobacterianos adicionais.

61. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 60, caracterizada pelo fato de que o conjugado de Hib está presente em umadose mais baixa do que a dose de cada um dos pelo menos dois conjugados desacarídeo bacterianos adicionais.

62. Composição imunogênica de acordo com as reivindicações 60 ou 61, caracterizada pelo fato de que os pelo menos dois conjugados desacarídeo bacterianos adicionais compreendem um conjugado de sacarídeocapsular do sorogrupo C de N. meningitidis. (MenC).

63. Composição imunogênica de acordo com qualquer umadas reivindicações 60 a 62, caracterizada pelo fato de que os pelo menos doisconjugados de sacarídeo bacterianos adicionais compreendem o conjugado desacarídeo capsular do sorogrupo de N. meningitidis (MenA).

64. Composição imunogênica de acordo com qualquer umadas reivindicações 60 a 63, caracterizada pelo fato de que os pelo menos doisconjugados de sacarídeo bacterianos adicionais compreendem o conjugado desacarídeo capsular do sorogrupo A de N. meningitidis (MenA).

65. Composição imunogênica de acordo com qualquer umadas reivindicações 60 a 64, caracterizada pelo fato de que os pelo menos doisconjugados de sacarídeo bacterianos adicionais compreendem o conjugado desacarídeo capsular W 135 do sorogrupo N. meningitidis.(MenC).

66. Composição imunogênica de qualquer uma dasreivindicações 60 a 65, caracterizada pelo fato de que os pelo menos doisconjugados de sacarídeo bacterianos adicionais compreendem um sacarídeocapsular S. pneumoniae, derivado a partir de uma cepa selecionada a partir dogrupo, que consiste dos sorotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9 N, 9V, -10A 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18 C, 19 A, 19 F, 20, 22 F, 23 F e 33 F.

67. Composição imunogênica de qualquer uma dasreivindicações 60 a 66, caracterizada pelo fato de que os pelo menos doisconjugados de sacarídeo bacterianos adicionais compreendem um sacarídeocapsular S. Typhi Vi.

68. Composição imunogênica de qualquer uma dasreivindicações 60 a 67, caracterizada pelo fato de que a dose do conjugado desacarídeo Hib está entre 0,1 e 9 jig, 1 e 5 jig ou 2 e 3 |ig de sacarídeo.

69. Composição imunogênica de qualquer uma dasreivindicações 60 a 68, caracterizada pelo fato de que a dose de cada um dospelo menos dois conjugados de sacarídeo adicionais está entre 2 e 20 jag, 3 eug, ou 4 e 7 ug de sacarídeo.

70. Composição imunogênica de acordo com qualquer umadas reivindicações 60 a 69, caracterizada pelo fato de que a dose de sacarídeodo conjugado de sacarídeo Hib é inferior a 90%, 75% ou 60% ou está entre 20% e 60% ou é de cerca de 50% da dose de sacarídeo de cada um dos pelomenos dois conjugados de sacarídeo bacterianos adicionais.

71. Composição imunogênica de acordo com qualquer umadas reivindicações 60 a 70, caracterizada pelo fato de que a dose de sacarídeodo conjugado de sacarídeo Hib é inferior a 90%, 75% ou 60% ou está entre 20-60% ou é de cerca de 50% da dose de sacarídeo de cada um dos pelomenos dois conjugados de sacarídeo adicionais.

72. Composição imunogênica de qualquer uma dasreivindicações 60 a 71, caracterizada pelo fato de que a mesma proteínacarreadora é usada no conjugado de Hib e em dois ou mais dos pelo menosdois conjugados de sacarídeo bacterianos adicionais.

73. Composição imunogênica de acordo com qualquer umadas reivindicações 1 a 72, caracterizada pelo fato de que compreende umapreparação de vesícula de membrana externa do sorogrupo B de N.meningitidis ou sacarídeo capsular.

74. Vacina, caracterizada pelo fato de que compreende acomposição imunogênica como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 73 e um excipiente farmaceuticamente aceitável.

75. Kit de vacina para a administração seqüencial ouconcomitante, caracterizado pelo fato de que compreende duas composiçõesimunogênicas multivalentes para conferir proteção a um hospedeiro contradoença causada por Bordetella pertussis, Clostridium tetani,Corynebacterium difteriae, Hameophilus infuenzae e Neisseria meningitidis,o referido kit compreendendo um primeiro recipiente, que compreende:toxóide do tétano (TT),toxóide de difteria (DT, ecomponente de pertussis acelulares ou inteiramente celulares;e um segundo recipiente, que compreende:a composição imunogênica como definida em qualquer umadas reivindicações 1 a 73.

76. Processo para a produção da vacina como definida emreivindicação 74, caracterizado pelo fato de que compreende o estágio demisturar a composição imunogênica como definida em qualquer uma dasreivindicações 1 a 73 com um excipiente farmaceuticamente aceitável.

77. Método de imunização de um hospedeiro humano contradoença causada por infecção de Neisseria meningitidis, caracterizado pelo fatode que compreende administrar ao hospedeiro uma dose imunoprotetora dacomposição ou vacina imunogênica como definida nas reivindicações 1 a 75.

78. Composição imunogênica de acordo com as reivindicações 1 a 73, caracterizada pelo fato de ser para o uso no tratamento ou prevençãode doença causada por infecção de Neisseria meningitidis.

79. Uso da composição imunogênica como definida emqualquer uma das reivindicações 1 a 73, caracterizado pelo fato de ser namanufatura de um medicamento para o tratamento ou a prevenção de doençascausadas por infecção de Neisseria meningitidis.

80. Composição imunogênica, caracterizada pelo fato de quecompreende pelo menos 2 sacarídeos diferentes, conjugados separadamenteao mesmo tipo de proteína carreadora, em que um ou mais sacarídeo(s) é/sãoconjugados à proteína carreadora através de um primeiro tipo de grupoquímico no carreador de proteína, e um ou mais sacarídeos (s) é/sãoconjugados à proteína carreadora através de um segundo tipo de grupoquímico sobre o carreador da proteína.

81. Composição imunogênica de acordo coma reivindicação 80, caracterizada pelo fato de que o um ou mais sacarídeo(s) conjugado(s) àproteína através do primeiro tipo de grupo químico no carreador da proteínasão diferentes dos um ou mais sacarídeo(s) conjugados à proteína carreadoraatravés do segundo tipo de grupo químico no carreador da proteína.

82. Composição imunogênica de acordo com as reivindicações 80 ou 81, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos 2 sacarídeosdiferentes, conjugados separadamente à mesma proteína carreadora, em queum ou mais sacarídeo(s) é/são conjugados à proteína carreadora através de umgrupo carboxila no carreador da proteína, e um ou mais sacarídeo(s) é/sãoconjugados à proteína carreadora através de um grupo amino no carreador daproteína.

83. Composição imunogênica de acordo com as reivindicações 80 a 82, caracterizada pelo fato de que o primeiro e o segundo tipo de grupoquímico no carreador da proteína estão presentes em epítopos de célula B e/oucélula T na proteína carreadora.

84. Composição imunogênica de acordo com as reivindicações 80 a 83, caracterizada pelo fato de que os sacarídeos são selecionados a partirde um grupo, que consiste do sacarídeo capsular do sorogrupo A de N.Meningitidis (MenA), sacarídeo capsular do sorogrupo C de N.meningitidis(MenC), sacarídeo capsular do sorogrupo Y de N. meningitidis (MenY),sacarídeo capsular do sorogrupo W de N. meningitidis (MenY), sacarídeocapsular do sorogrupo W de N. meningitidis (MenW), sacarídeo capsular dogrupo I de Streptococcus do Grupos B, sacarídeo capsular do grupo II deStreptococcus do Grupo B, sacarídeo capsular do grupo III de Streptoeoeeusdo Grupo B, sacarídeo capsular do grupo IV de Streptoeoeeus do Grupo B,sacarídeo capsular do grupo V de Streptoeoeeus do grupo B, sacarídeocapsular do tipo 5 de Staphyloeoceus aureus, sacarídeo capsular do tipo 8 deStaphyloeoceus aureus, Sacarídeo VI de Salmonella typhi, LPS de N.meningitidis (tal que L3 e/ou L2), M. eatarrhalis LPS, H. influenzae LPS3 oude qualquer dos sacarídeos pneumocócicos capsulares, tais que do sorotipo :1,- 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9 N, 9V, 10A, 11 A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A,- 19F, 20, 22F, 23F ou 33F.

85. Composição imunogênica de acordo com as reivindicações- 80 a 84, caracterizada pelo fato de que a proteína carreadora é selecionada apartir do grupo, que consiste de:TT, DT, CRM 197, fragmento C de TT eproteína D.

86. Composição imunogênica de acordo com as reivindicações- 80 a 84, caracterizada pelo fato de que a proteína carreadora é TT.

87. Composição imunogênica de acordo com as reivindicações- 80 a 86, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos 2 sacarídeoscapsulares de N. meningitidis diferentes, em que um ou mais é/sãoselecionados a partir de um primeiro grupo, que consiste de MenA e MenC,que é/são conjugados à proteína carreadora através do primeiro tipo de grupoquímico no carreador de proteína, e um ou mais sacarídeos diferentes é/sãoselecionados a partir de um segundo grupo, que consiste de MenC, MenY eMenW, que é/são conjugados à proteína carreadora através do segundo tipode grupo químico no carreador da proteína.

88. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 87, caracterizada pelo fato de que o primeiro tipo de grupo químico é umgrupo carboxila no carreador da proteína, e o segundo tipo de grupo químico éum grupo amino no carreador da proteína.

89. Composição imunogênica de acordo com as reivindicações- 87 a 88, caracterizada pelo fato de que compreende MenA conjugado atravésdo primeiro tipo do grupo químico, e MenC conjugado através do segundotipo de grupo químico.

90. Composição imunogênica de acordo com as reivindicações 87 a 88, caracterizada pelo fato de que compreende MenC conjugado atravésdo primeiro tipo de grupo químico e MenY conjugado através do segundotipo de grupo químico.

91. Composição imunogênica de acordo com as reivindicações 87 a 88,caracterizada pelo fato de que compreende MenA conjugado atravésdo primeiro tipo de grupo químico, e MenC, MenY e MenW conjugadosatravés do segundo tipo de grupo químico.

92. Composição imunogênica de acordo com as reivindicações 87 a 88, caracterizada pelo fato de que compreende MenA e MenCconjugados através do primeiro tipo de grupo químico, e MenY e MenWconjugados através do segundo tipo de grupo químico.

93. Composição imunogênica de acordo com as reivindicações 87 a 92, caracterizada pelo fato de que compreende um sacarídeo capsular deH. Influenzae tipo b (Hib) conjugado a uma proteína carreadora.

94. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 93, caracterizada pelo fato de que Hib é conjugado ao mesmo tipo de proteínacarreadora que o sacarídeo N. meningitidis.

95.Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 94, caracterizada pelo fato de que Hib é conjugado ao mesmo tipo de proteínacarreadora que o segundo tipo de grupo químico.

96. Composição imunogênica de acordo com as reivindicações 80 a 95, caracterizada pelo fato de que os sacarídeos conjugados através doprimeiro tipo de grupo químico o fazem através de um agente de ligação, e ossacarídeos conjugados através do segundo tipo de grupo químico o fazemdiretamente, ou em que os sacarídeos conjugados através do segundo tipo degrupo químico o fazem através de um agente de ligação, e os sacarídeosconjugados através do primeiro tipo de grupo químico o fazem diretamente.

97. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação-96, caracterizada pelo fato de que o agente de ligação é bifuncional.

98. Composição imunogênica de acordo com as reivindicações-96 e 97, caracterizada pelo fato de que o agente de ligação possui entre 4 e 12átomos de carbono.

99. Composição imunogênica de acordo com as reivindicações-96 a 98, caracterizada pelo fato de que o agente de ligação possui dois gruposamino reativos.

100. Composição imunogênica de acordo com asreivindicações 96 a 98, caracterizada pelo fato de que o agente de ligaçãopossui dois grupos de ácido carboxílico reativos.

101. Composição imunogênica de acordo com asreivindicações 96 a 98, caracterizada pelo fato de que o agente de ligaçãopossui um grupo amino reativo em uma extremidade e um grupo de ácidocarboxílico reativo na outra extremidade.

102. Composição imunogênica de acordo com asreivindicações 96 a 98, caracterizada pelo fato de que o agente de ligação é ADH.

103. Composição imunogênica de acordo com asreivindicações 96 a 102, caracterizada pelo fato de que o ou cada sacarídeo(s)capsular(es), conjugado(s) através de um agente de ligação, é conjugado aoagente de ligação com química de CDAP.

104. Composição imunogênica de acordo com asreivindicações 96 a 103, caracterizada pelo fato de que a proteína carreadora éconjugada ao agente de ligação usando química de carbodiimida, de modoopcional usando EDAC.

105. Composição imunogênica de acordo com asreivindicações 96 a 104, caracterizada pelo fato de que o ou cada sacarídeocapsular é conjugado ao agente de ligação antes que a proteína carreadora sejaconjugada ao agente de ligação, ou o agente de ligação é conjugado aosacarídeo antes que este seja conjugado à proteína carreadora.

106. Composição imunogênica de acordo com asreivindicações 96 a 105, caracterizada pelo fato de que é uma composiçãoimunogênica como definida nas reivindicações 1 a 74.