JP6042455B2

JP6042455B2 - 免疫原性組成物の調製方法

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Publication number: JP6042455B2
Application number: JP2014555364A
Authority: JP
Inventors: ヴィニヤックカプレ、サブハッシュ; シャンカーピサール、サンブハジ
Original assignee: セラムインスティチュートオブインディアプライベイトリミテッド
Priority date: 2012-01-30
Filing date: 2013-01-29
Publication date: 2016-12-14
Anticipated expiration: 2033-01-29
Also published as: EP2809349A4; MX2014009250A; PT2809349T; EP2809349B1; RU2634405C2; CA2863178A1; RU2014134288A; WO2013114268A1; US20140377302A1; SG11201404447WA; BR112014018815A2; EP2809349A1; DK2809349T3; KR101897317B1; CA2863178C; SI2809349T1; CN104302315A; KR20140123553A; MX354103B; HUE040914T4

Description

髄膜炎菌（ナイセリア-メニンギティディス：Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）はグラム陰性ヒト病原体である。髄膜炎菌は咽頭にコロニー化し、髄膜炎あるいは敗血症をもたらすことがある。髄膜炎菌は淋菌（ナイセリア-ゴノレエ：Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）と近縁関係にあるが、髄膜炎菌を明確に識別する一つの特徴として、全ての髄膜炎菌に莢膜多糖類が存在することが挙げられる。髄膜炎は、生体の莢膜多糖類に基づき、１２の血清群が同定されている（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、２９Ｅ、Ｗ１３５、Ｘ、Ｙ、Ｚ）。

血清群Ａ（「ＭｅｎＡ」）はサハラ以南アフリカにおける疫病の最も一般的な原因である。血清群ＢおよびＣは、先進国における大部分の症例の原因であり、残る症例は血清群Ｗ１３５およびＹに起因する。

多糖類（ＰＳ：Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）のみを用いるワクチンは比較的免疫原性が低い。この比較的低い免疫原性を補充するため、ＰＳワクチンを蛋白質担体に結合させて免疫原性を高めることで、幼児に対する予防効果を長期間持続させることができる。既に多くの髄膜炎菌結合ワクチンが世界中で認可され、販売されている。「髄膜炎菌結合物」として知られるこのようなワクチンの例としては、１価髄膜炎菌Ａ結合物（ＭｅｎＡｆｒｉＶａｃ)、１価髄膜炎菌Ｃ結合物（Ｍｅｎｉｎｇｉｔｅｃ)、４価Ａ、Ｃ、Ｙ、Ｗ髄膜炎菌結合物（Ｍｅｎｖｅｏ、Ｍｅｎａｃｔｒａ）が挙げられる。

上記の莢膜多糖類は、分類のために使われると同時に、予防接種のためにも用いられる。血清群Ａ、Ｃ、Ｙ、Ｗ１３５からの莢膜多糖類の注射用４価ワクチンは何年も前から公知であり、人への使用が認可されている。青年および成人には有効であるが、免疫反応が弱く防御期間も短いため、乳幼児には使用できない。ＭｅｎｃｅｖａｘＡＣＷＹ^ＴＭおよびＭｅｎｏｍｕｎｅ^ＴＭはともに、凍結乾燥された状態から再構成された各精製多糖類を５０μｇずつ含む。血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、Ｙの莢膜糖類も結合されて結合物となり、４価ワクチン（例えば補強剤を加えない（Ｕｎａｄｊｖａｎｔｅｄ）Ｍｅｎａｃｔｒａ^ＴＭ製剤）が得られる。結合したＡ群多糖類もＭｅｎＡｆｒｉＶａｃ^ＴＭとして人への使用が認可され、Ｃ群オリゴ糖類は、Ｍｅｎｊｕｇａｔｅ^ＴＭ、Ｍｅｎｉｎｇｉｔｅｃ^ＴＭおよびＮｅｉｓＶａｃ−Ｃ^ＴＭとして人への使用が認可されている。

髄膜炎血清群Ｘ菌株は１９６０年代に最初に報告され、北米、ヨーロッパ、オーストラリアおよび中国における侵襲性髄膜炎菌疾患の数症例から分離された。また、髄膜炎血清群Ｘ菌株の大発生がナイジェリア、西ケニヤ、北ガーナで報告された。髄膜炎血清群Ｘ菌株は、イギリス軍隊の新兵たちの間で高効率で転移増殖したことが報告された（非特許文献１を参照）。

アフリカの多くの国における反復多量接種が血清群Ｘ菌株によるコロニー化および髄膜炎菌性疾患の原因となった可能性があり、髄膜炎菌疾患の状況の変化を起こした可能性があるという報告があった（非特許文献２を参照）。

血清群Ｂ、Ｃ、Ｙ、Ｗ１３５髄膜炎菌の莢膜多糖類はシアル酸誘導体から成る。Ｂ群およびＣ群髄膜炎菌はそれぞれ（α ２−８）−および（α ２−９２３９）−結合ポリシアル酸を発現し、その間Ｄ-グルコース又はＤ−ガラクトースの配列を変化させ、シアル酸はＹ群およびＷ１３５群髄膜炎菌によって発現される。それに対して、Ａ群髄膜炎菌の莢膜は（α−１−６）−結合Ｎ-アセチルマンノースアミン６−燐酸からなり、他方、Ｘ群髄膜炎菌は、(α−１−４)−結合Ｎ−アセチルグルコサミン１−燐酸の莢膜ポリマー類を合成する（非特許文献３を参照）。

現在の髄膜炎菌結合型ワクチンはＡ、Ｃ、Ｙ、Ｗ１３５の多糖類をベースにしている。直近５年間のアフリカ髄膜炎ベルトにおけるＭｅｎＸ病の発生の増加[1、4]をもとに、その地方の選択された地域におけるＭｅｎＸ多糖類結合型ワクチンを開発、導入することで、今後の疫病を阻止、抑制出来るはずである。しかし以前に報告したように、Ｘ群髄膜炎菌に関する包括的血清有病率、および構造的データを利用してなお、ワクチンの精製、結合および処方において成功が極めて少なく、商業利用に向けたＸ群多糖類を含む結合型ワクチンは未だに開発途上にある。このため、種々のパラメータをうまく取り扱い、コントロールするためのさらなる取り組みが必要であり、特に、Ｘ群髄膜炎菌多糖類を含む髄膜炎結合物の大量生産に対応可能な結合プロセスを用いる場合はなおさらである。

Abdullah Kilic et al ;Neisseria meningitidis Serogroup X Sequence Type 767 in Turkey;Journal Of Clinical Microbiology, Nov. 2010, p. 4340-4341 ;Vol. 48, No. 1 1 Gagneux, S. P et al ;Prospective study of a serogroup X Neisseria meningitidis outbreak in northern Ghana.J. Infect. Dis. 185:618-626;2002 Yih-Ling Tzeng et al ;Genetic Basis for Biosynthesis of the ( 134)-Linked N-Acetyl-D-Glucosamine 1 -Phosphate Capsule of Neisseria meningitidis Serogroup X; Infection And Immunity, Dec. 2003, p. 6712-6720 ;Vol. 71 , No. 12 Schneerson et al., Infect. Immun. 1986, 52:519-528 Shafer et al., Vaccine 2000; 18(13): 1273-1281 Inman et al., Biochemistry 1969; 8:4074-4082 P. W. Anderson, et. al. (1986). J. Immunol. 137: 1 181 -1 186 H. J. Jennings and C. Lugowski (1981 ) J. Immunol. 127: 101 1 -1018

本発明は、大量生産可能で効率の良い結合プロセスを用いることによって、血清群Ｘからの髄膜炎菌多糖類の結合物をベースとする１価または多値免疫原性組成物を作ることができるという驚くべき発見から生まれる。

本発明は、ｉ）多糖類をサイジングする段階と、ii）平均分子量１００〜１５０ＫＤａのサイズ化された多糖類を、ｐＨ９〜９.５にてＣＰＰＴにより活性化する段階と、iii）約２〜５分の待機後ＡＤＨを加え、その後４〜２０時間インキュベーションする段階と、ｉｖ）ＡＤＨ-活性化多糖類と精製した非活性化担体蛋白質とを、０．７５〜１．５の比率でＭＥＳ緩衝液およびＥＤＡＣの存在下で反応させ、その後３〜４時間インキュベーションする段階とから成る結合反応であって、上記結合反応は２〜８℃で、約２０％〜約３０％の結合収量で行われ、最終結合物における糖類／蛋白質比は約０．２〜約０.６となることを特徴とする結合反応によって作られるＸ群髄膜炎菌多糖類-担体蛋白質結合物に関する。

代替的な方法として、ｉ）多糖類をサイジングする段階と、ii）平均分子量１００〜１５０ＫＤａのサイズ化された多糖類をｐＨ９〜９.５にてＣＰＰＴにより活性化する段階と、iii）２〜３分後、多糖類／蛋白質比０.５〜２でＡＤＨ活性化担体蛋白質を加え、その後２〜２０時間インキュベーションを行う段階とからなり、上記結合反応は２２℃〜２５℃で行われ、約５％〜約１０％の結合収量が得られることを特徴とする結合反応によって作ることもできる。

よって、本発明は、血清群Ｘからの莢膜糖類と血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、Ｙから少なくとも１種類の莢膜糖類とからなる多価髄膜炎菌多糖類−蛋白質結合組成物に関するものであり、ここでｉ）Ａ群、Ｃ群、Ｗ１３５群、Ｘ群多糖類は機械的にサイズ化される一方、Ｙ群多糖類は化学的にサイズ化され、ii）全ての糖類はシアニル化結合化学でリンカーを介して担体蛋白質に結合し、iii)最終結合物における全糖類／蛋白質比が０.２〜０．６であり、iv）ＴＴ、ＤＴ、ＣＲＭ１９７からなる群から選択される少なくとも２種類の担体蛋白質が用いられる。

ＭｅｎＸＰｓ（２１５ＫＤａ）がヒドラジン誘導化ＴＴに結合するときの結合反応を重ね合わせたものである。ＭｅｎＸＰｓ（２１５ＫＤａ）がヒドラジン誘導化ＴＴに結合したときの精製結合物を示す。ＭｅｎＸＰｓ（３２６ＫＤａ）がＡＤＨ誘導化ＴＴに結合するときの結合反応を重ね合わせたものである。ＭｅｎＸＰｓ（３２６ＫＤａ）がＡＤＨ誘導化ＴＴに結合したときの精製結合物を示す。ＭｅｎＸＰｓ（１２０ＫＤａ）がＡＤＨ誘導化ＴＴに結合するときの結合反応を重ね合わせたものである。ＭｅｎＸＰｓ（１２０ＫＤａ）がＡＤＨ誘導化ＴＴに結合したときの精製結合物を示す。天然Ｘ群髄膜炎菌多糖類のクロマトグラフを示す。ＭｅｎＸＰｓ（５１０ＫＤａ）がＡＤＨで活性化され、精製ＴＴに結合するときの結合反応を重ね合わせたものである。ＭｅｎＸＰｓ（５１０ＫＤａ）がＡＤＨで活性化され、精製ＴＴに結合したときの精製結合物を示す。ＭｅｎＸＰｓ（２５０ＫＤａ）がＡＤＨで活性化され、精製ＴＴに結合するときの結合反応を重ね合わせたものである。ＭｅｎＸＰｓ（２５０ＫＤａ）がＡＤＨで活性化され、精製ＴＴに結合したときの精製結合物を示す。

「多価免疫原性組成物」とは次のものを言う。

組成物Ｉは（ａ）（ｉ）Ａ群髄膜炎菌の莢膜糖類と（ii）破傷風トキソイドとの結合物；（ｂ）（ｉ）Ｃ群髄膜炎菌の莢膜糖類と（ii）破傷風トキソイドとの結合物；（ｃ）（ｉ）Ｙ群髄膜炎菌の莢膜糖類と（ii）ジフテリアトキソイドとの結合物；（ｄ）（ｉ）Ｗ１３５群髄膜炎菌の莢膜糖類と（ii）ＣＲＭ１９７との結合物；および（ｅ）（ｉ）Ｘ群髄膜炎菌の莢膜糖類と（ii）ＣＲＭ１９７との結合物を含む。

組成物IIは（ａ）（ｉ）Ａ群髄膜炎菌の莢膜糖類と（ii）破傷風トキソイドとの結合物；（ｂ）（ｉ）Ｃ群髄膜炎菌の莢膜糖類と（ii）ＣＲＭ１９７との結合物；（ｃ）（ｉ）Ｙ群髄膜炎菌の莢膜糖類と（ii）破傷風トキソイドとの結合体；（ｄ）(ｉ)Ｗ１３５群髄膜炎菌の莢膜糖類と（ii）ＣＲＭ１９７との結合物；および（ｅ）（ｉ）Ｘ群髄膜炎菌の莢膜糖類と（ii）ＣＲＭ１９７との結合物を含む。

組成物IIIは（ａ）（ｉ）Ａ群髄膜炎菌の莢膜糖類と（ii）ＣＲＭ１９７との結合物；（ｂ）（ｉ）Ｃ群髄膜炎菌の莢膜糖類と（ii）ＣＲＭ１９７との結合物；（ｃ）（ｉ）Ｙ群髄膜炎菌の莢膜糖類と（ii）破傷風トキソイドとの結合物；（ｄ）(ｉ)Ｗ１３５群髄膜炎菌の莢膜糖類と（ii）ＣＲＭ１９７との結合物；および（ｅ）(ｉ)Ｘ群髄膜炎菌の莢膜糖類と（ii）破傷風トキソイドとの結合物を含んでなり、担体蛋白質として破傷風トキソイドを含む結合物が、担体蛋白質としてＣＲＭ１９７を含む結合物類の免疫原性を高めることが特徴である。

組成物ＩＶは（ａ）（ｉ）Ａ群髄膜炎菌の莢膜糖類と（ii）破傷風トキソイドとの結合物；（ｂ）（ｉ）Ｃ群髄膜炎菌の莢膜糖類と（ii）ＣＲＭ１９７との結合物；（ｃ）（ｉ）Ｙ群髄膜炎菌の莢膜糖類と（ii）ＣＲＭ１９７との結合物；（ｄ）(ｉ)Ｗ１３５群髄膜炎菌の莢膜糖類と（ii）ＣＲＭ１９７との結合物；および（ｅ）(ｉ)Ｘ群髄膜炎菌の莢膜糖類と（ii）破傷風トキソイドとの結合物を含む。

組成物Ｖは、（ａ）（ｉ）Ａ群髄膜炎菌の莢膜糖類と（ii）ＣＲＭ１９７との結合物；（ｂ）（ｉ）Ｃ群髄膜炎菌の莢膜糖類と（ii）ＣＲＭ１９７との結合物；（ｃ）（ｉ）Ｙ群髄膜炎菌の莢膜糖類と（ii）ＣＲＭ１９７との結合物；および（ｄ）（ｉ）Ｗ１３５群髄膜炎菌の莢膜糖類と(ii)ＣＲＭ１９７との結合物；および（ｅ）（ｉ）Ｘ群髄膜炎菌の莢膜糖類と（ii）破傷風トキソイドとの結合物を含む。

上記より、第１の実施態様において、上記組成物は血清群Ａ、Ｃ、Ｙ、Ｗ１３５、Ｘの糖類を用量０．５ｍｌあたり０．５〜１０μｇ、０．５〜５μｇまたは０．５〜２μｇ含むことができる。

第１の実施態様のその他の側面は、前記組成物がＡ群糖類１０μｇ、Ｃ群糖類５μｇ、Ｗ１３５群糖類５μｇ、Ｙ群糖類５μｇ、Ｘ群糖類５μｇを含むことができることである。

或いは、前記多価免疫原性組成物は、Ａ群糖類５μｇ、Ｃ群糖類５μｇ、Ｗ群１３５糖類５μｇ、Ｙ群糖類５μｇおよびＸ群糖類５μｇを含むことができる。

上記より、第２の実施態様において、前記１つまたはそれ以上の髄膜炎菌糖類結合物を任意に水酸化アルミニウム、燐酸化アルミニウムまたは両方の混合物に吸着させてもよく、またはアジュバントに吸着させなくともよい。

第２の実施態様の一つの側面は、アルミニウム塩アジュバントは、０．５ｍｌ用量あたり２０〜３００μｇ、２０〜２００μｇ、２５〜１５０μｇのＡｌ^＋＋＋を加えることができることである。

第２の実施態様のもう一つの側面は、アルミニウム塩アジュバントは、０．５ｍｌあたり２５〜１２５μｇのＡｌ^＋＋＋を加えることができることである。

本発明の第３の実施態様は、前記組成物がチオメルサールおよび２−フェノキシエタノールから選択される保存剤を含むことができることである。

第３の実施態様の一つの側面は、前記組成物がさらに燐酸ナトリウム、塩化ナトリウム、またはそれらの組み合わせを含むことができることである。

本発明の第４の実施態様は、前記多価免疫原性組成物が、緩衝液あるいは凍結乾燥の状態になり得ることである。

第４の実施態様の一つの側面は、前記凍結乾燥された免疫原性組成物が、ａ）２〜５％（ｗ/ｖ）トレハロース、０．２５〜０．７５％クエン酸ナトリウム；ｂ）２〜５％(ｗ/ｖ)スクロースおよび０．２５〜０．７５％クエン酸ナトリウム；ｃ）２〜５％（ｗ/ｖ)スクロース、２〜５％(ｗ/ｖ)ラクトースおよび０．２５〜０．７５％のクエン酸ナトリウム;およびｄ）２〜５％（ｗ/ｖ）のトレハロース、２〜５％（ｗ／ｖ）のラクトースおよび０．２５〜０．７５％のクエン酸ナトリウムから選択される安定剤を含むことができることである。

第４の実施態様のもう一つの側面は、前記凍結乾燥された免疫原性組成物がトリスおよび燐酸塩から選択される緩衝剤をさらに含むことができることである。

上記より、第５の実施態様において、前記Ａ群、Ｃ群、Ｗ群、Ｘ群多糖類は、平均分子量１００〜６００Ｋｄａあるいは１００〜４００Ｋｄａ、好ましくは１００〜２００Ｋｄａ、最も好ましくは１００〜１５０Ｋｄａの分子量をもつように機械的にサイズ化され得る。均質化(homogenization)、顕微溶液化(microfluidization）、および高圧細胞破壊(high pressure cell disruption）のような機械的サイジング法が好ましい。

第５の実施態様のもう一つの側面において、前記Ｙ群多糖類は、酸加水分解、アルカリ分解、過ヨウ素酸塩による酸化、オゾン分解、酵素による加水分解、超音波処理、電子ビームによる破壊から選択される方法によって、９０〜１１０ＫＤａの平均分子量をもつようにサイズ化することができる。より好ましいのは、酢酸ナトリウムを温度６０〜８０℃で用いることによる化学的サイジングである。

第６の実施態様において、髄膜炎菌糖類の各々は、シアニル化結合化学によってヘテロまたはホモ-二官能性リンカーを介して担体蛋白質に結合される。

第６の実施態様の一側面において、前記サイズ化された多糖類は、１−シアノ-４−（ジメチルアミノ）-ピリジウム-テトラフルオロボレート（「ＣＤＡＰ」）、p-ニトロフェニルシアネート、およびＮ-シアノトリエチルアンモニウムテトラフルオロボレート（「ＣＴＥＡ」）から選択されるシアニル化試薬を用いて活性化されるが、これらに限定されるものではない。好ましい結合プロセスにおいて、シアニル化試薬はＣＤＡＰ以外のものであり、１−シアノー４−ピロリジノピリジウムテトラフルオロボレート（ＣＰＰＴ）、１−シアノ-イミダゾール（１−Ｃl）、１−シアノベンゾトリアゾール（１−ＣＢＴ）、または２−シアノピリダジン-３（２Ｈ）one（２−ＣＰＤ）またはこれらの官能性誘導体または変形体からなる群から選択することができる。

第６の実施態様のまた別の面において、前記活性化された多糖類または担体蛋白質、特に多糖類を、ヒドラジン、カルボヒドラジン、塩化ヒドラジン、ヒドラジン塩化物、ジヒドラジチン、あるいはこれらの混合物と、好ましくはアジピン酸ジヒドラジドと反応させる。

ヒドラジド基は、カルボニジイミド反応を用いて、例えばＥＤＣの存在下でヒドラジン、カルボヒドラジド、スクシニルジヒドラジド、アジピン酸ジヒドラジド、塩化ヒドラジン（例えばヒドラジン二塩化物）またはその他のジヒドラジド類との反応によって、蛋白質上のアスパラギン酸およびグルタミン酸残基のカルボキシル基を介して蛋白質に導入することができる。ＥＤＣは触媒として用いられ、ヒドラジンまたはジヒドラジドとの蛋白質反応を活性化し、修飾する。ＥＤＣを含むいかなる水溶性カルボジイミドも触媒として用いることができる。ＥＤＣによって触媒された蛋白質は概して重合および沈殿する傾向がある（非特許文献４〜６を参照）。

第７の実施態様において、前記多価髄膜炎菌多糖類−蛋白質結合組成物は、それぞれ２種類以上の異なるタイプの担体蛋白質に結合した血清群Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、２９Ｅ、Ｗ１３５、Ｙ、Ｚからの多糖類を含む。莢膜糖類は髄膜炎菌血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、Ｙ、Ｘから選択されるため、上記組成物はこれら５種類の血清群のうち、１〜５種類の糖類を含むこととなる。具体的には、組成物は次の糖類からなるものを含む：血清群Ａ、Ｘ；血清群Ｘ、Ｗ１３５；血清群Ｘ、Ｙ；血清群Ｃ、Ｘ；血清群Ａ、Ｙ、Ｘ；血清群Ｃ、Ｘ、Ｗ１３５；血清群Ｘ、Ｙ、Ｗ１３５；血清群Ａ、Ｃ、Ｘ；血清群Ｙ、Ｃ、Ｘ；血清群Ａ、Ｗ、Ｘ；血清群Ｙ、Ｗ１３５、Ｃ、Ｘ；血清群Ｙ、Ｗ１３５、Ａ、Ｘ；血清群Ｃ、Ｗ１３５、Ａ、Ｘ；血清群Ｙ、Ｃ、Ａ、Ｘ；血清群Ａ、Ｃ、Ｙ、Ｗ１３５、Ｘ。組成物は、少なくとも血清群Ｘを含むことが好ましく、５種類全ての血清群の糖類を含むことが最も好ましい。

第７の実施態様の一側面において、前記担体蛋白質は、ＣＲＭ１９７、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、百日咳トキソイド、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉＬＴ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉＳＴ）、および緑膿菌からのエキソトキシンＡ（ＰｓｐＡ）、外膜コンプレックスｃ（ＯＭＰＣ）、ポーリン、トランスフェリン結合蛋白質、ニューモリシン、肺炎球菌表面蛋白質Ａ（ＰｓｐＡ）、肺炎球菌付着蛋白質（ＰｓａＡ）、肺炎球菌表面蛋白質ＢＶＨ−３およびＢＶＨ−１１、炭疽菌の防御抗原（ＰＡ）および無毒化浮腫因子（ＥＦ）および炭疽菌の致死因子（ＬＦ）、オバルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）およびツベルクリンの精製蛋白質誘導体（ＰＰＤ）からなる群から選択されるが、これらに限定されるものではない。使用する担体蛋白質類の組み合わせとして好ましいものに以下を含む：破傷風トキソイドとジフテリアトキソイド、あるいはＣＲＭ１９７と破傷風トキソイド。

第７の実施態様のもう一つの側面において、結合反応は、アジピン酸ジヒドラジド、ε−アミノヘキサン酸、クロロヘキサノールジメチルアセタール、Ｄ−グルクロノラクトン、シスタミンおよびｐ−ニトロフェニルエチルアミンからなる群から選択されるリンカーを用いる。

結合後、結合物は、サイズ排除クロマトグラフィー、密度勾配遠心分離、限外濾過、疎水的相互作用クロマトグラフィーまたは硫酸アンモニウム分別法などを含む任意の標準的方法によって、未反応の蛋白質および多糖類から精製することができる（例えば非特許文献７、８を参照）。

第８の実施態様において、本発明の前記免疫原性組成物は、さらに非髄膜炎菌性多糖類−蛋白質結合体を含むことができる。ここで、使用する前記多糖類およびオリゴ糖類は、血清群１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ｆ、１９Ａ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ、３３Ｆの肺炎球菌多糖類；インフルエンザ菌型ｂ多糖類燐酸ポリリボシルリビトール、血清型IIIおよびＶのグループＢ連鎖球菌多糖類、およびチフス菌Ｖｉ多糖類から選択されるが、これらに限定されるものではない。その他の肺炎球菌およびグループＢ連鎖球菌血清型多糖類もここでの使用に適している。それは例えばグループＡ連鎖球菌、ブドウ球菌、腸球菌、肺炎桿菌、大腸菌、緑膿菌、炭疽菌から誘導される多糖類およびオリゴ糖類のようなその他のＴ細胞非依存性多糖類およびオリゴ糖類である。細菌性多糖類およびオリゴ糖類が特に好ましいが、グラム陰性菌リポ多糖類およびリポオリゴ糖類およびそれらの多糖類およびオリゴ糖類誘導体、およびウィルス性多糖類およびオリゴ糖類も使用できる。

本発明の組成物は様々な方法で使用することができ、容れ物も様々であって良い。ガラス瓶に容れても良いし、注射器に充填しても良い。注射器は、針がついていても、ついていなくても良い。注射器には１回量の組成物を充填でき、ガラス瓶には一回量または複数回量の組成物を収容することができる。注射用の組成物は通常、溶液または懸濁液であるが、固形（凍結乾燥等）の組成物を液体媒体に溶解あるいは懸濁させて、注射してもよい。

実施例１
≪Ｘ群髄膜炎菌多糖類の製法≫
ａ）Ｘ群髄膜炎菌多糖類の発酵および精製
Ｘ群髄膜炎菌多糖類は、髄膜炎菌の菌株（８２１０、９６０１）から、最適発酵条件下における連続流加発酵法において適切な発酵媒体を使用することによって得られる。さらにＸ群髄膜炎菌莢膜多糖類は、一般的には、ＣＴＡＢをベースとする沈殿、エタノール（９６％）処理に続き、深濾過、炭素濾過、塩化カルシウム沈殿、エタノール(９６％)処理および限外濾過の諸段階を含むプロセスによって作られる。
ｂ）Ｘ群髄膜炎菌多糖類のサイジング
精製したＸ群髄膜炎菌多糖類を、ＷＦＩ中で約３０〜４０ｋｐｓｉの圧力下のもと、１〜２回の機械的サイジング（コンスタント細胞破壊装置）にかけた。

実施例２
≪Ｘ群髄膜炎菌多糖類と担体蛋白質との結合≫
ａ）種々の平均分子量をもつＸ群髄膜炎菌多糖類をヒドラジン誘導破傷風トキソイド（ＴＴ）に結合させる。

第一に、Ｘ（菌株９６０１）の均質化した多糖類（ＳＥＣＨＰＬＣで測定した平均分子量２１５ｋＤ（３０ｍｇ／ｍｌ））４５ｍｇを９０ｍｇＣＤＡＰ（アセトニトリル中に１００ｍｇ／ｍｌで溶解）で活性化し、混合物のｐＨを１ＭＮａＯＨで９．５に調節した。それから３分後、ヒドラジンで活性化したＴＴ（１ＭＮａＣｌ中、３０ｍｇ／ｍｌ）６７．５ｍｇをその反応物に加えた。その反応をＨＰＬＣでモニターし、１８時間続けた。１８時間後にグリシンを加えて反応を鎮め、粗結合物をトリス１０ｍＭ中、ｐＨ７．２で、３００ｋＤＴＦＦ膜で透析濾過によって精製した。ＳｈｏｄｅｘカラムＳＢ−８０４ＨＱおよびＳＢ−８０５ＨＱを連続的に用い、移動相としてＰＢＳ（流速１ｍｌ／ｍｉｎ）を用いた。多糖類濃度および蛋白質濃度をそれぞれ燐アッセイおよび改良ロウリーアッセイによって測定した。

第二に、Ｘ（菌株８２１０）の多糖類（ＳＥＣＨＰＬＣで測定した平均分子量３２６ｋＤ）（２ＭＮａＣｌ中２４ｍｇ／ｍｌ）６０ｍｇをＣＰＰＴ（アセトニトリル中に１１４ｍｇ／ｍｌで溶解）１５０ｍｇで活性化し、混合物のｐＨを２．５ＭＮａＯＨで９．５に調節した。３分後にＡＤＨ活性化ＴＴ（２ＭＮａＣｌ中３７ｍｇ／ｍｌ）３７．５ｍｇを反応物に加え、その反応をＨＰＬＣでモニターし、それを５時間続けた。５時間後、グリシン添加によって反応を鎮め、粗結合物をはじめに１０ｍＭＰＢＳ中で、その後トリス１０ｍＭ、ｐＨ７．２中で、５００ｋＤＴＦＦ膜で透析濾過することにより精製した。

さらに、Ｘ（菌株８２１０）の多糖類（ＳＥＣＨＰＬＣで平均分子量１２０ｋＤを有する）（１ＭＮａＣｌ中２０ｍｇ／ｍｌ）２００ｍｇを４００ｍｇＣＰＩＰ（アセトニトリル中１１４ｍｇ／ｍｌ溶解）で活性化し、混合物のｐＨを１ＭＮａＯＨで９．５に調節した。その３分後に、ＡＤＨ活性化ＴＴ（３０ｍｇ／ｍｌ）１５０ｍｇを反応物に加えた。その反応をＨＰＬＣでモニターし、４時間続けた。４時間後、グリシン添加によって反応を鎮め、粗結合物をはじめに１０ｍＭＰＢＳ中で、次いでトリス１０ｍＭ、ｐＨ７．２、中で、３００ｋＤＴＦＦ膜で透析濾過することにより精製した。
ｂ）ＡＤＨで活性化され、精製非活性化破傷風トキソイド（ＴＴ）に結合した、種々の平均分子量を有するＸ群髄膜炎菌多糖類
第一に、ＳＥＣＨＰＬＣ（２ＭＮａＣｌ中２７ｍｇ／ｍｌ）で平均分子量５１０ｋＤを有するＸ（菌株８２１０）の多糖類２００ｍｇを４００ｍｇのＣＰＰＴ（アセトニトリルに１１４ｍｇ／ｍｌで溶解）で活性化し、混合物のｐＨを２．５ＭＮａＯＨで９．５に調節した。それから３分後、ＡＤＨ１．５ｇ（炭酸塩緩衝液中１００ｍｇ／ｍｌ）を加え、４時間反応させた。４時間後、グリシンを加え、反応混合物を８ｋＤＴＦＦ膜で透析濾過した。さらに、ＡＤＨ−ＭｅｎＸ多糖類を濃縮した。これ（７.５ｍｇ／ｍｌ）の４４ｍｇに、精製したＴＴ（０．９％ＮａＣｌ中、３７．５ｍｇ／ｍｌ）とＭＥＳｐＨ６．０緩衝液とを加えてＭＥＳの最終的緩衝液強度が１００ｍＭになるようにし、その後３７．５ｍｇＥＤＡＣ（１００ｍＭＭＥＳｐＨ６．０に溶解）を加えた。４時間反応させ、ＨＰＬＣでモニターした。未結合多糖類は、アクタクロマトグラフィー装置（ＧＥＡｍｅｒｓｈａｍ）でＴｏｙｏｐｅａｒｌＨＷ６５樹脂を用いてゲル濾過クロマトグラフィーによって除去した。ピークの形状と糖類−蛋白質の比に基づいてフラクション（画分）を集め、プールした。

第二に、ＳＥＣＨＰＬＣで平均分子量２５０ｋＤを有するＸ（菌株８２１０）の多糖類を、２ＭＮａＣｌ中１８ｍｇ／ｍｌになるまで濃縮した。２００ｍｇをＣＰＰＴ（アセトニトリルに１１４ｍｇ／ｍｌになるように溶解）２９６ｍｇで活性化し、混合物のｐＨを２．５ＭＮａＯＨで９．５に調節した。それから３分後に、ＡＤＨ１．１２ｇ（炭酸塩緩衝液中１００ｍｇ／ｍｌ）を加え、４時間反応させた。４時間後、グリシンを加え、反応混合物を８ｋＤＴＦＦ膜で透析濾過した。それからＡＤＨ−ＭｅｎＸ群多糖類を濃縮した。さらに、これ（７．５ｍｇ／ｍｌ）の２００ｍｇに、精製ＴＴ（０．９％ＮａＣｌ中３６．７ｍｇ／ｍｌ）およびＭＥＳｐＨ６．０緩衝液を加え、ＭＥＳの最終的緩衝液強度が１００ｍＭになるようにした。その後２００ｍｇＥＤＡＣ（１００ｍＭＭＥＳｐＨ６．０に溶解）を加える。この反応を４時間続け、ＨＰＬＣでモニターした。この粗結合物を、１０ｍＭＰＢＳ中で、その後トリス１０ｍＭｐＨ７．２中で、５００ｋＤＴＦＦ膜を用いて透析濾過することにより精製した。

上記のデータは、以下を用いることにより最終結合物収量約２０〜３０％が得られることを示している。ｉ）平均分子量約１００〜２００ｋＤａのＸ群髄膜炎菌多糖類、ｉｉ）ＡＤＨで活性化されたＸ群髄膜炎菌多糖類、ｉｉｉ）非活性化ＴＴ、ｉｖ）結合反応中の糖類と蛋白質の比率が０．５〜２、ｖ）シアン化試薬としてのＣＰＰＴ、ｖｉ）２〜８℃における結合反応のインキュベーション、ｖ）最終結合物において糖類／蛋白質比が０．２〜０．６。

実施例３
≪髄膜炎菌Ａ、Ｃ、Ｙ、Ｗ１３５多糖類と担体蛋白質ＣＲＭ１９７との結合≫
平均分子量１００〜２００を有する精製された髄膜炎菌多糖類Ａ、Ｃ、Ｙ、Ｗ１３５を、適切なシアン化試薬（ＣＤＡＰまたはＣＰＰＴ）を用いて、糖類／蛋白質比が１以下になるようにＣＲＭ１９７に結合させた。この結合物を、５０容量の１０ｍＭＰＢＳおよび５０容量の１０ｍＭトリスで、３００ｋＤＴＦＦを用いて透析濾過することによりさらに精製した。

実施例４
≪２種類の担体蛋白質を含むＭｅｎ,Ａ,Ｃ,Ｙ,Ｗ１３５,Ｘの凍結乾燥および製剤≫
髄膜炎菌結合物、クエン酸ナトリウムおよびトリス緩衝液を、トレハロース、スクロース、およびラクトースとの種々の組み合わせで含む凍結乾燥組成物を調製した。その際、遊離多糖類含量は限度内で、水分含有量は２％以下であった。前記安定剤の組み合わせは、ａ）２〜５％（ｗ／ｖ）トレハロース、０．２５〜０、７５％クエン酸ナトリウム、ｂ）２〜５％（ｗ／ｖ）スクロースおよび０．２５〜０．７５％のクエン酸ナトリウム、ｃ）２〜５％（ｗ／ｖ）スクロース、２〜５％（ｗ／ｖ）ラクトースおよび０．２５〜０．７５％のクエン酸ナトリウム、ｄ）２〜５％（ｗ／ｖ）のトレハロース、２〜５％（ｗ／ｖ）のラクトース、および０．２５〜０．７５％のクエン酸ナトリウムから選択した。

実施例５
≪ＭｅｎＸ−糖類結合物を含む髄膜炎菌１価および多価結合組成物の生物学的活性≫
各製剤で体重１６〜２０ｇの雌スイスアルビノマウス６匹を免疫した。マウスは、０日目、１４日目、および２８日目に皮下に免疫された。２回目の免疫の１週間後、２週間後（２１日目および３５日目）に各マウスから採血した。

抗体の滴定は、ビードアッセイおよびＳＢＡによって行われた。６匹全てのマウスの免疫前血清サンプルを混合し、実施例４からの各製剤毎に単一のプール血清を作り、各処方毎にスイスアルビノマウス６匹の全てのマウスの免疫後血清サンプルを混合して、マウス１＋２、３＋４、５＋６の血清から、プール１、２、３をそれぞれ作った。これら各々のプールについて、総ＩｇＧ滴定値（マルチプレックス−ビードアッセイ）および官能性抗体滴定値（ＳＢＡ）を分析した。

上記のマウス免疫原性データは、１価Ｘ−破傷風トキソイド結合物の液体および凍結乾燥組成物およびＸ−破傷風トキソイド結合物を含む多価結合物類が免疫原性であることを示している。さらに、Ｘ−破傷風トキソイド結合物１μｇ、塩化ナトリウム、チオメルサール、およびＡｌ^＋＋＋１２５μｇを含む１価液体組成物が最適な免疫原性反応をもたらすことを示す。また、Ａ−ＣＲＭ１９７、Ｃ−ＣＲＭ１９７、Ｙ−破傷風トキソイド、Ｗ−ＣＲＭ１９７、Ｘ−破傷風トキソイド結合物の各１μｇと、塩化ナトリウム、チオメルサール、Ａｌ^＋＋＋２５μｇを含む液体多価組成物０．５ｍｌも最適な免疫原性反応をもたらす。このように、５価結合組成物において、担体蛋白質として破傷風トキソイドを含む結合物は、担体蛋白質としてＣＲＭ２９７を含む結合物の免疫原性を高めることがわかる。

開示された発明の原理が適用される多くの可能性のある実施態様からみて、実例で示された実施態様は本発明の好ましい例であるに過ぎず、本発明の範囲を制限するものでないことは当然である。むしろ、本発明の範囲は、次の請求項によって定義される。したがって、これらの請求項の範囲および精神に入る全てを我々の発明として主張する。

Claims

（ａ）(i)血清群Ａ髄膜炎菌の莢膜糖類と(ii)破傷風トキソイドとの結合物、
（ｂ）(i)血清群Ｃ髄膜炎菌の莢膜糖類と(ii)ＣＲＭ１９７との結合物、
（ｃ）(i)血清群Ｙ髄膜炎菌の莢膜糖類と(ii)ＣＲＭ１９７との結合物、
（ｄ）(i)血清群Ｗ１３５髄膜炎菌の莢膜糖類と(ii)ＣＲＭ１９７との結合物、および
（ｅ）(i)血清群Ｘ髄膜炎菌の莢膜糖類と(ii)破傷風トキソイドとの結合物を含み、
前記髄膜炎菌の莢膜糖類からなる髄膜炎菌多糖類の各々が、シアニル化試薬として１−シアノー４−ピロリジノピロリジウムテトラフルオロボレート（ＣＰＰＴ）用いたシアニル化結合反応によって、ヘテロまたはホモ二官能性リンカーを介して担体蛋白質に結合し、
前記血清群Ｘ髄膜炎菌多糖類-蛋白質結合物は、髄膜炎菌Ｘ菌株８２１０から誘導される
免疫原性組成物の調製方法。
前記莢膜糖類のそれぞれの平均サイズは１００〜２００ＫＤａである、請求項１に記載の免疫原性組成物の調製方法。
血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５およびＸからの少なくとも３種類の髄膜炎菌多糖類がサイジング後に平均サイズ１００〜１５０ＫＤａを有する、請求項１に記載の免疫原性組成物の調製方法。
前記サイジングが高圧細胞破壊装置によって行われる、請求項３に記載の免疫原性組成物の調製方法。
血清群Ｙ髄膜炎菌多糖類が化学的サイジング後に平均サイズ９０〜１１０ＫＤａを有する、請求項１に記載の免疫原性組成物の調製方法。
前記化学的サイジングが酢酸ナトリウムを用いて温度６０〜８０℃で行われる、請求項５に記載の免疫原性組成物の調製方法。
前記ヘテロまたはホモ二官能性リンカーがＡＤＨである、請求項１に記載の免疫原性組成物の調製方法。
髄膜炎菌Ｘ菌株８２１０から導出される血清群Ｘ髄膜炎菌多糖類-蛋白質結合物と、
血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、Ｙから導出された髄膜炎菌莢膜多糖類から少なくとも一つが付加された糖類結合物とを有し、
前記髄膜炎菌多糖類の各々が、シアニル化試薬として１−シアノー４−ピロリジノピロリジウムテトラフルオロボレート（ＣＰＰＴ）用いたシアニル化結合反応によって、ヘテロまたはホモ二官能性リンカーを介して担体蛋白質に結合した免疫原性組成物の調製方法。
前記免疫原性組成物は、５種類の多糖類全てを結合するための少なくとも２種類の担体蛋白質を用いることによって、血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、Ｙ、及びＸの莢膜多糖類を含む、請求項８に記載の免疫原性組成物の調製方法。
前記髄膜炎菌多糖類のそれぞれが、ＴＴ、ＤＴ、ＣＲＭ１９７、ＴＴの断片Ｃ、蛋白質Ｄ、およびニューモリシンからなる群から選択される担体蛋白質に結合する、請求項８に記載の免疫原性組成物の調製方法。
前記免疫原性組成物が、
（ａ）(i)Ａ群髄膜炎菌の莢膜糖類と(ii)破傷風トキソイドとの結合物、
（ｂ）(i)Ｃ群髄膜炎菌の莢膜糖類と(ii)ＣＲＭ１９７との結合物、
（ｃ）(i)Ｙ群髄膜炎菌の莢膜糖類と(ii)破傷風トキソイドとの結合物、
（ｄ）(i)Ｗ１３５群髄膜炎菌の莢膜糖類と(ii)ＣＲＭ１９７との結合物、および
（ｅ）(i)Ｘ群髄膜炎菌の莢膜糖類と(ii)ＣＲＭ１９７との結合物を含む、請求項９に
記載の免疫原性組成物の調製方法。
前記莢膜多糖類のそれぞれの平均サイズは１００〜２００ＫＤａである、請求項８に記載の免疫原性組成物の調製方法。
血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５およびＸからの少なくとも３種類の髄膜炎菌多糖類がサイジング後に平均サイズ１００〜１５０ＫＤａを有する、請求項９に記載の免疫原性組成物の調製方法。
前記サイジングが高圧細胞破壊装置によって行われる、請求項１３に記載の免疫原性組成物の調製方法。
血清群Ｙ髄膜炎菌多糖類が化学的サイジング後に平均サイズ９０〜１１０ＫＤａを有する、請求項９に記載の免疫原性組成物の調製方法。
前記化学的サイジングが酢酸ナトリウムを用いて温度６０〜８０℃で行われる、請求項
１５に記載の免疫原性組成物の調製方法。
前記ヘテロまたはホモ二官能性リンカーがＡＤＨである、請求項８に記載の免疫原性組成物の調製方法。
（ａ）(i) 血清群Ａ髄膜炎菌の莢膜糖類と(ii)破傷風トキソイドとの結合物、
（ｂ）(i) 血清群Ｃ髄膜炎菌の莢膜糖類と(ii)ＣＲＭ１９７との結合物、
（ｃ）(i) 血清群Ｙ髄膜炎菌の莢膜糖類と(ii)ＣＲＭ１９７との結合物、
（ｄ）(i) 血清群Ｗ１３５髄膜炎菌の莢膜糖類と(ii)ＣＲＭ１９７との結合物、および
（ｅ）(i) 血清群Ｘ髄膜炎菌の莢膜糖類と(ii)破傷風トキソイドとの結合物を含み、
髄膜炎菌Ｘ菌株８２１０から誘導される血清群Ｘ髄膜炎菌多糖類-蛋白質結合物を有する免疫原性組成物の調製方法であって、
前記髄膜炎菌多糖類の各々がＣＰＰＴを用いたシアニル化結合反応によって、ヘテロまたはホモ二官能性リンカーを介して担体蛋白質に結合され、
血清群Ｘ髄膜炎菌糖類−破傷風トキソイド結合物が、
i)多糖類のサイジング、
ii)ｐＨ９〜９．５における平均分子量１００〜１５０Ｋｄａを有するサイズ化された多糖類のＣＰＰＴベース活性化、
iii)約２〜３分の持続時間後のＡＤＨ付加とその後の４〜２０時間のインキュベーション期間、
ｉｖ）未反応のＡＤＨを除去するための透析濾過、および
ｖ）ＡＤＨ活性化多糖類と精製非活性化担体蛋白質とを０．７５〜１．５の比でＭＥＳ緩衝液およびＥＤＡＣの存在下で反応させ、その後３〜４時間インキュベーション
の諸段階を有する結合反応において、
前記結合反応が温度２〜８℃で、最終結合物における糖類／蛋白質比が０．２〜０．６である、免疫原性組成物の調製方法。
（ａ）(i) 血清群Ａ髄膜炎菌の莢膜糖類と(ii)破傷風トキソイドとの結合物、
（ｂ）(i) 血清群Ｃ髄膜炎菌の莢膜糖類と(ii)ＣＲＭ１９７との結合物、
（ｃ）(i) 血清群Ｙ髄膜炎菌の莢膜糖類と(ii)ＣＲＭ１９７との結合物、
（ｄ）(i) 血清群Ｗ１３５髄膜炎菌の莢膜糖類と(ii)ＣＲＭ１９７との結合物、および
（ｅ）(i) 血清群Ｘ髄膜炎菌の莢膜糖類と(ii)破傷風トキソイドとの結合物を含み、
髄膜炎菌Ｘ菌株８２１０から誘導される血清群Ｘ髄膜炎菌多糖類-蛋白質結合物を有する免疫原性組成物の調製方法であって、
前記髄膜炎菌多糖類の各々がＣＰＰＴを用いたシアニル化結合反応によって、ヘテロまたはホモ二官能性リンカーを介して担体蛋白質に結合され、
血清群Ｘ髄膜炎菌糖類−破傷風トキソイド結合物が、
i)多糖類のサイジング、
ii)ｐＨ９〜９．５における平均分子量１００〜１５０Ｋｄａを有するサイズ化された多糖類のＣＰＰＴベース活性化、
iii)２〜３分後に糖類／蛋白質比が０．５〜２の範囲でＡＤＨにより活性化された担体蛋白質を加え、その後２〜２０時間のインキュベーション
の諸段階を有する結合反応において、
前記結合反応が約２２℃〜約２５℃の温度で行われ、最終結合物における糖類／蛋白質比が０．２〜０．６である、免疫原性組成物の調製方法。
髄膜炎菌Ｘ菌株８２１０から導出される血清群Ｘ髄膜炎菌多糖類-蛋白質結合物と、
血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、Ｙから導出された髄膜炎菌莢膜糖類から少なくとも一つが付加された糖類結合物と、を有する免疫原性組成物の調製方法であって、
前記免疫原性組成物は、５種類の多糖類全てを結合するための少なくとも２種類の異なる担体蛋白質を用いることによって、血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、Ｙ、及びＸの莢膜多糖類を含み、
前記髄膜炎菌糖類の各々がＣＰＰＴを用いたシアニル化結合反応によって、ヘテロまたはホモ二官能性リンカーを介して担体蛋白質に結合し、
血清群Ｘ髄膜炎菌糖類−破傷風トキソイド結合物が、
i)多糖類のサイジング、
ii)ｐＨ９〜９．５における平均分子量１００〜１５０Ｋｄａを有するサイズ化された多糖類のＣＰＰＴベース活性化、
iii)約２〜３分の持続時間後のＡＤＨ付加とその後の４〜２０時間のインキュベーション期間、
ｉｖ）未反応のＡＤＨを除去するための透析濾過、および
ｖ）ＡＤＨ活性化多糖類と精製非活性化担体蛋白質とを０．７５〜１．５の比でＭＥＳ緩衝液およびＥＤＡＣの存在下で反応させ、その後３〜４時間インキュベーション
の諸段階を有する結合反応において、
前記結合反応が温度２〜８℃で、最終結合物における糖類／蛋白質比が０．２〜０．６である、免疫原性組成物の調製方法。
髄膜炎菌Ｘ菌株８２１０から導出される血清群Ｘ髄膜炎菌多糖類-蛋白質結合物と、
血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、Ｙから導出された髄膜炎菌莢膜糖類から少なくとも一つが付加された糖類結合物と、を有する免疫原性組成物の調製方法であって、
前記免疫原性組成物は、５種類の多糖類全てを結合するための少なくとも２種類の異なる担体蛋白質を用いることによって、血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、Ｙ、及びＸの莢膜多糖類を含み、
前記髄膜炎菌糖類の各々がＣＰＰＴを用いたシアニル化結合反応によって、ヘテロまたはホモ二官能性リンカーを介して担体蛋白質に結合し、
血清群Ｘ髄膜炎菌糖類−破傷風トキソイド結合物が、
i)多糖類のサイジング、
ii)ｐＨ９〜９．５における平均分子量１００〜１５０Ｋｄａを有するサイズ化された多糖類のＣＰＰＴベース活性化、
iii)２〜３分後に糖類／蛋白質比が０．５〜２の範囲でＡＤＨにより活性化された担体蛋白質を加え、その後２〜２０時間のインキュベーション
の諸段階を有する結合反応において、
前記結合反応が約２２℃〜約２５℃の温度で行われ、最終結合物における糖類／蛋白質比が０．２〜０．６である、免疫原性組成物の調製方法。