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MX2011010128A - Terapia para promover el crecimiento celular. - Google Patents

Terapia para promover el crecimiento celular.

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MX2011010128A
MX2011010128A MX2011010128A MX2011010128A MX2011010128A MX 2011010128 A MX2011010128 A MX 2011010128A MX 2011010128 A MX2011010128 A MX 2011010128A MX 2011010128 A MX2011010128 A MX 2011010128A MX 2011010128 A MX2011010128 A MX 2011010128A
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MX
Mexico
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neuroaid
mlc
root
radix
growth
Prior art date
Application number
MX2011010128A
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English (en)
Inventor
Michel Maurice Jacques Lazdunski
Catherine Louise Claude Heurteaux
David Picard
Original Assignee
Moleac Pte Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Moleac Pte Ltd filed Critical Moleac Pte Ltd
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Abstract

Se describe el uso de una composición para promover el crecimiento neuronal de las neuronas en los tejidos del sistema nervioso central o periférico. También se describe un método para inducir la proliferación y diferenciación de las células neuronales.

Description

TERAPIA PARA PROMOVER EL CRECIMIENTO CELULAR CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere en general a procedimientos y composiciones para promover el crecimiento y proliferación neuronal. La presente invención también se refiere a un procedimiento in vitro para promover el crecimiento celular.
ANTECEDENTES DE LA INVECIÓN Las lesiones del sistema nervioso afectan a numerosas personas cada año. Como resultado de esta alta incidencia de lesiones neurológicas, la regeneración y reparación nerviosa se está convirtiendo en un campo rápidamente creciente dedicado al descubrimiento de nuevos modos de recuperar la funcionalidad nerviosa después de una lesión. Sin embargo hasta ahora, la reparación clínica de lesiones del sistema nervioso central (SNC) y la recuperación de funciones neurológicas para pacientes que padecen lesiones del sistema nervioso ha sido problemática. Por lo tanto, siempre se ha dicho a los pacientes con diversas formas de enfermedades del sistema nervioso, tales como esclerosis lateral amiotrófica (ALS) y demencia senil por sus médicos que sería difícil recuperar sus funciones neurológicas.
La capacidad de las neuronas para extender neuritas (tales como axones y dendritas) es de gran importancia en el establecimiento de conexiones neuronales durante el desarrollo. También se requiere durante la neurodegeneración para restablecer conexiones destruidas como resultado de una lesión. Sin embargo, los axones en el sistema nervioso central tienen una capacidad muy limitada para volver a crecer después de una lesión. Por lo tanto, para enfermedades tales como demencia senil, en las que existe una degeneración progresiva de las células neuronales, la investigación de los agentes terapéuticos o moléculas que son capaces de estimular el crecimiento y proliferación de células neuronales abrirá una nueva estrategia terapéutica que se centra en la reparación neuronal y restaurar la función neurológica.
Existe una necesidad de mejorar los procedimientos de tratamiento de lesiones del sistema nervioso y enfermedades neurológicas. Más específicamente, existe una necesidad de proporcionar terapias regenerativas que puedan promover el crecimiento y proliferación neuronal de neuronas de modo que se permita que los nervios dañados o enfermos funcionen de nuevo.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN De acuerdo con un primer aspecto, se proporciona el uso de una composición que comprende al menos dos componentes seleccionados del grupo constituido por lo siguiente: Radix et Rhizoma Salviae Miltiorrhizae (raíz de Salvia mütiorrhiza o Dan Shen), Prunus pérsica (semilla de melocotón o Taoren), Radix Polygalae (raíz de Polygala tenuifolia Willd., Polygala sibiríca L. o Yuanzhi) y Rhizoma acori Tatarinowii (rizoma de Acorus gramineus o Shichangpu) y combinaciones de los mismos y un componente opcional seleccionado del grupo constituido por: Radix Astragali (raíz de Astragalus propinquus o Huang Qi), Radix Paeoniae Rubra (raíz de Peonía Roja, Paeonia lactiflora Pall, Paeonia veitchii Lynch o Chi Shao), rizoma de Ligusticum chuanxiong (Chuan Xiong), flor de Carthamus tinctorius (cártamo o HongHua) y radix Angelicae sinensis (raíz de angélica china o DanGui) y combinaciones de las mismas, en la fabricación de un medicamento para promover el crecimiento neuronal y proliferación de neuronas en tejidos del sistema nervioso central o periférico.
En una realización, la composición del primer aspecto comprende adicionalmente un componente opcional seleccionado del grupo constituido por Buthus martensii (cuerpo seco de escorpión o Quanxie), Eupolyphaga Seu Seteleophaga (cuerpo seco de carábido, Eupolyphaga sinensis Walker, Steleophaga plancyi o Tubiechong), Calculus Bovis Artifactus (bezoar de vaca natural ol artificial Rengong Niuhuang), Conu Saigae Tataricae (cuerno de antílope o Lingyangjiao) y cuerpo seco de sanguijuelas (Hirudo, Whitmania pigra Whitman, Hirudo nipponica Whitman Whitmania acranulata Whitman o Shuizhi).
Provechosamente, el medicamento puede inducir crecimiento neuronal de neuronas y proliferación en tejido enfermo o lesionado en el que se ha producido contracción, pérdida, atrofia de tejido o muerte celular. La promoción del crecimiento neuronal y proliferación de neuronas permite que el nervio dañado o enfermo realice crecimiento exterior direccional que puede introducir conexión sináptica beneficiosa o reemplazarse con nuevas células operativas. La composición también puede promover la diferenciación de células madre y el reclutamiento en el tejido enfermo o lesionado.
En una realización, se proporciona el uso de una composición que comprende un primer componente seleccionado del grupo constituido por los siguientes componentes: Radix et Rhizoma Salviae Miltiorrhizae (raíz de Salvia miltiorrhiza o Dan Shen), Prunus pérsica (semilla de melocotón o Taoren), Radix Polygalae (raíz de Polygala tenuifolia Willd., Polygala sibirica L. o Yuanzhi), Buthus martensii (cuerpo seco de escorpión o Quanxie), Rhizoma acori Tatarinowii (rizoma de Acorus gramineus o Shichangpu), Eupolyphaga Seu Seteleophaga (cuerpo seco de carábido, Eupolyphaga sinensis Walker, Steleophaga plancyi o Tubiechong), Calculus Bovis Artifactus (bezoar de vaca natural o artificial o Rengong Niuhuang) y Cornu Saigae Tataricae (cuerno de antílope o Lingyangjiao) y combinaciones de los mismos y un segundo componente opcional seleccionado del grupo constituido por: Radix Astragali (raíz de Astragalus propinquus o Huang Qi), Radix Paeoniae Rubra (raíz de peonía roja, Paeonia lactiflora Pall, Paeonia veitchii Lynch o Chi Shao), rizoma de Ligusticum chuanxiong (Chuan Xiong), flor de Carthamus tinctorius (cártamo o HongHua), radix angelicae sinensis (raíz de angélica china o DanGui) y cuerpo seco de sanguijuelas (Hirudo, Whitmania pigra Whitman, Hirudo nipponica Whitman Whitmania acranulata Whitman o Shuizhi) y combinaciones de los mismos, en la fabricación de un medicamento para tratar a pacientes que tienen una afección seleccionada del grupo de depresión, indicaciones psiquiátricas, envejecimiento natural y muerte celular en cerebro traumático, para disminuir los efectos de apoplejía o neurodegeneración en sujetos predispuestos o sujetos en riesgo de apoplejía o neurodegeneración, para tratar un paciente que tiene un tejido enfermo o lesionado del sistema nervioso central y periférico y para promover el crecimiento celular.
De acuerdo con un segundo aspecto, se proporciona el uso de una composición que comprende al menos dos de los siguientes componentes: Radix Astragali (raíz de Astragalus propinquus o Huang Qi), Radix et Rhizoma Salviae Miltiorrhizae (raíz de Salvia miltiorrhiza o Dan Shen), Radix Paeoniae Rubra (raíz de peonía roja, Paeonia lactiflora Pall, Paeonia veitchii Lynch o Chi Shao), rizoma de Ligusticum chuanxiong (Chuan Xiong), radix angelicae sinensis (raíz de angélica china o DanGui), flor de Carthamus tinctorius (cártamo o HongHua), Prunus pérsica (semilla de melocotón o Taoren), Radix Polygalae (raíz de Polygala tenuifolia Willd., Polygala sibirica L. o Yuanzhi) y Rhizoma acori Tatarinowii (rizoma de Acorus gramineus o Shichangpu) en la fabricación de un medicamento para tratar a pacientes que tienen una afección seleccionada del grupo de depresión, indicaciones psiquiátricas, envejecimiento natural y muerte celular en cerebro traumático.
Sin vincularse a la teoría, los inventores creen que el medicamento como se desvela en el presente documento puede ser útil para tratar pacientes con depresión u otras indicaciones psiquiátricas tales como esquizofrenia y trastornos de ansiedad promoviendo la regulación del equilibrio hormonal que puede haberse alterado por la pérdida de función celular.
De acuerdo con un tercer aspecto, se proporciona el uso de una composición que comprende al menos tres de los siguientes componentes: Radix Astragali (raíz de Astragalus propinquus o Huang Qi), Radix et Rhizoma Salviae Miltiorrhizae (raíz de Salvia miltiorrhiza o Dan Shen), Radix Paeoniae Rubra (raíz de peonía roja, Paeonia lactiflora Pall, Paeonia veitchii Lynch o Chi Shao), rizoma de Ligusticum chuanxiong (Chuan Xiong), radix angelicae sinensis (raíz de angélica china o DanGui), flor de Carthamus tinctorius (Cártamo o HongHua), Prunus pérsica (semilla de melocotón o Taoren), Radix Polygalae (raíz de Polygala tenuifolia Willd., Polygala sibirica L. o Yuanzhi) y Rhizoma acori Tatarinowii (rizoma de Acorus gramineus o Shichangpu) en la fabricación de un medicamento para reducir los efectos de apoplejía o neurodegeneración en sujetos predispuestos o sujetos en riesgo de apoplejía o neurodegeneración.
De acuerdo con un cuarto aspecto, se proporciona el uso de una composición que comprende al menos tres de los siguientes componentes: Radix Astragali (raíz de Astragalus propinquus o Huang Qi), Radix et Rhizoma Salviae Miltiorrhizae (raíz de Salvia miltiorrhiza o Dan Shen), Radix Paeoniae Rubra (raíz de peonía roja, Paeonia lactiflora Pall, Paeonia veitchii Lynch o Chi Shao), rizoma de Ligusticum chuanxiong (Chuan Xiong), radix angelicae sinensis (raíz de angélica china o DanGui), flor de Carthamus tinctorius (cártamo o HongHua), Prunus pérsica (semilla de melocotón o Taoren), Radix Polygalae (raíz de Polygala tenuifolia Willd., Polygala sibirica L. o Yuanzhi) y Rhizoma acori Tatarinowii (rizoma de Acorus gramineus o Shichangpu) en la fabricación de un medicamento para promover el crecimiento celular.
En una realización, el medicamento puede promover el crecimiento controlado de condrocitos, células de músculo esquelético, miocardio, células de músculo liso, hepatocitos, células renales y células cutáneas epiteliales. Un medicamento que promueve el crecimiento celular puede usarse para tratar afecciones tales como artritis reumatoide, trastornos degenerativos musculares, apoplejía, enfermedades de riñon y de hígado. El medicamento también puede usarse para retardar los procesos de envejecimiento mejorando las proliferaciones o funciones de células epidérmicas o epiteliales.
De acuerdo con un quinto aspecto, se proporciona el uso de al menos uno de los siguientes componentes: Radix Astragali (raíz de Astragalus propinquus o Huang Qi), Radix et Rhizoma Salviae Miltiorrhizae (raíz de Salvia miltiorrhiza o Dan Shen), Radix Paeoniae Rubra (raíz de peonía roja, Paeonia lactiflora Pall, Paeonia veitchii Lynch o Chi Shao), rizoma de Ligusticum chuanxiong (Chuan Xiong), radix angelicae sinensis (raíz de angélica china o DanGui), flor de Carthamus tinctorius (cártamo o HongHua), Prunus pérsica (semilla de melocotón o Taoren), Radix Polygalae (raíz de Polygala tenuifolia Willd., Polygala sibirica L. o Yuanzhi) y Rhizoma acori Tatarinowii (rizoma de Acorus gramineus o Shichangpu) en la fabricación de un medicamento y un agente de complemento para tratar a un paciente que tiene un tejido enfermo o lesionado del sistema nervioso central o periférico.
En una realización, se proporciona el uso de la composición como se ha definido anteriormente, en el que la composición comprende al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13 o 14 de los componentes. El agente de complemento puede ser complementos minerales, vitaminas, complementos herbarios, medicina occidental o aceites de pescado.
De acuerdo con un sexto aspecto, se proporciona un reactivo de cultivo celular para promover la supervivencia celular y el crecimiento que comprende un medio de cultivo y al menos uno de los siguientes componentes: Radix Astragali (raíz de Astragalus propinquus o Huang Qi), Radix et Rhizoma Salviae Miltiorrhizae (raíz de Salvia miltiorrhiza o Dan Shen), Radix Paeoniae Rubra (raíz de peonía roja, Paeonia lactiflora Pall, Paeonia veitchii Lynch o Chi Shao), rizoma de Ligusticum chuanxiong (Chuan Xiong), radix angelicae sinensis (raíz de angélica china o DanGui), flor de Carthamus tinctorius (cártamo o HongHua), Prunus pérsica (semilla de melocotón o Taoren), Radix Polygalae (raíz de Polygala tenuifolia Willd., Polygala sibirica L. o Yuanzhi) y Rhizoma acori Tatarinowü (rizoma de Acorus gramineus o Shichangpu).
En una realización, se proporciona un reactivo de cultivo celular que comprende una composición como se ha definido en el sexto aspecto, en el que la composición comprende al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13 o 14 de los componentes.
En otra realización, el reactivo de cultivo celular puede promover la supervivencia celular y crecimiento de neuronas, células madre, condrocitos, células de músculo esquelético, miocardio, células de músculo liso, hepatocitos, células renales, islotes de Langerhans y células cutáneas epiteliales.
De acuerdo con un séptimo aspecto, se proporciona un procedimiento para promover la supervivencia celular, que induce proliferación o diferenciación de células, que comprende poner en contacto dichas células con una cantidad eficaz de al menos tres de los siguientes componentes: Radix Astragali (raíz de Astragalus propinquus o Huang Qi), Radix et Rhizoma Salviae Miltiorrhizae (raíz de Salvia miltiorrhiza o Dan Shen), Radix Paeoniae Rubra (raíz de peonía roja, Paeonia lactiflora Pall, Paeonia veitchii Lynch o Chi Shao), rizoma de Ligusticum chuanxiong (Chuan Xiong), radix angelicae sinensis (raíz de angélica china o DanGui), flor de Carthamus tinctorius (cártamo o HongHua), Prunus pérsica (semilla de melocotón o Taoren), Radix Polygalae (raíz de Polygala tenuifolia Willd., Polygala sibirica L. o Yuanzhi) y Rhizoma acori Tatarinowü (rizoma de Acorus gramineus o Shichangpu).
La etapa de contacto del séptimo aspecto puede realizarse in vitro. Una etapa de contacto in vitro puede promover el crecimiento celular, la diferenciación o supervivencia celular facilitaría el cultivo in vitro de diversas células que pueden usarse para ingeniería de tejidos o usos terapéuticos ex vivo. En una realización, la cantidad eficaz es de 1 g a 8 g. En otra realización, las células neuronales son células neuronales de vertebrado, preferentemente células neuronales humanas. En una realización, las células neuronales se derivan de células neuronales corticales.
De acuerdo con un octavo aspecto, se proporciona un procedimiento para promover el crecimiento neuronal y la proliferación de neuronas en tejidos del sistema nervioso central o periférico de un paciente que comprende la etapa de administrar a dicho paciente una composición que comprende al menos dos componentes seleccionados del grupo constituido por lo siguiente: Radix et Rhizoma Salviae Miltiorrhizae (raíz de Salvia miltiorrhiza o Dan Shen), Prunus pérsica (semilla de melocotón o Taoren), Radix Polygalae (raíz de Polygala tenuifolia Willd., Polygala sibirica L. o Yuanzhi) y Rhizoma acori Tatarinowii (rizoma de Acorus gramineus o Shichangpu) y combinaciones de los mismos.
De acuerdo con un noveno aspecto, se proporciona un procedimiento para tratar a pacientes que tienen una afección seleccionada del grupo de depresión, indicaciones psiquiátricas, envejecimiento natural y muerte celular en cerebro traumático que comprende la etapa de administrar a dichos pacientes al menos dos de los siguientes componentes: Radix Astragali (raíz de Astragalus propinquus o Huang Qi), Radix et Rhizoma Salviae Miltiorrhizae (raíz de Salvia miltiorrhiza o Dan Shen), Radix Paeoniae Rubra (raíz de peonía roja, Paeonia lactiflora Pall, Paeonia veitchii Lynch o Chi Shao), rizoma de Ligusticum chuanxiong (Chuan Xiong), radix angelicae sinensis (raíz de angélica china o DanGui), flor de Carthamus tinctorius (cártamo o HongHua), Prunus pérsica (semilla de melocotón o Taoren), Radix Polygalae (raíz de Polygala tenuifolia Willd., Polygala sibirica L. o Yuanzhi) y Rhizoma acori Tatarinowii (rizoma de Acorus gramineus o Shichangpu).
De acuerdo con un décimo aspecto, se proporciona un procedimiento para reducir los efectos de apoplejía o neurodegeneración en sujetos predispuestos o sujetos en riesgo de apoplejía o neurodegeneración que comprende la etapa de administrar a dichos sujetos al menos tres de los siguientes componentes: Radix Astragali (raíz de Astragalus propinquus o Huang Qi), Radix et Rhizoma Salviae Miltiorrhizae (raíz de Salvia miltiorrhiza o Dan Shen), Radix Paeoniae Rubra (raíz de peonía roja, Paeonia lactiflora Pall, Paeonia veitchii Lynch o Chi Shao), rizoma de Ligusticum chuanxiong (Chuan Xiong), radix angelicae sinensis (raíz de angélica china o DanGui), flor de Carthamus tinctoríus (cártamo o HongHua), Prunus pérsica (semilla de melocotón o Taoren), Radix Polygalae (raíz de Polygala tenuifolia Willd., Polygala sibirica L o Yuanzhi) y Rhizoma acori Tatarinowii (rizoma de Acorus gramineus o Shichangpu). : Glosario de términos La presente sección pretende proporcionar orientación en la interpretación de las palabras y frases expuestas posteriormente (y cuando sea apropiado variantes gramaticales de las mismas.
La expresión "crecimiento neuronal" en la memoria descriptiva se refiere al crecimiento hacia fuera direccional general de axones y dendritas. El crecimiento neuronal es importante en la formación o desarrollo de sinapsis.
A no ser que se especifique de otro modo, los términos "comprendiendo" y "comprender" y variantes gramaticales de los mismos, pretenden representar lenguaje "abierto" o "inclusivo" de modo que incluyan elementos nombrados pero también permiten la inclusión de elementos no nombrados adicionales.
Como se usa en el presente documento, el término "aproximadamente" como se usa en relación con un valor numérico significa, por ejemplo, +50 % o +30 % del valor numérico, preferentemente +20 %, más preferentemente +10 %, más preferentemente aún +5 % y más preferentemente +1 %. Cuando sea necesario, la palabra "aproximadamente" puede omitirse de la definición de la invención.
El término "tratamiento" incluye todos y cada uno de los usos que median una patología o síntomas, evitan el establecimiento de la enfermedad, o evitan, obstaculizan, retardan de otro modo o invierten la progresión de la enfermedad u otros síntomas no deseables de cualquier manera. Por lo tanto, "tratamiento" incluye tratamiento profiláctico y terapéutico.
A lo largo de la presente divulgación, pueden desvelarse ciertas realizaciones en formato de intervalo. Debería entenderse que la descripción en formato de intervalo es meramente por conveniencia y brevedad y no debería interpretarse como una limitación inflexible en el alcance de los intervalos desvelados. En consecuencia, debería considerarse que la descripción de un intervalo ha desvelado específicamente todos los subintervalos posibles así como valores numéricos individuales dentro de ese intervalo. Por ejemplo, la descripción de un intervalo tal como de 1 a 6 debería considerarse que ha desvelado específicamente los intervalos tales como de 1 a 3, de 1 a 4, de 1 a 5, de 2 a 4, de 2 a 6, de 3 a 6 etc., así como números individuales dentro de ese intervalo, por ejemplo 1 , 2, 3, 4, 5 y 6. Esto se aplica independientemente de la amplitud del intervalo.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La figura 1 muestra gráficos de barras del efecto-dosis de tratamiento con NeuroAid™ (MLC 601) en la viabilidad celular el día 8, el día 10 y el día 14. Se compararon tres concentraciones de NeuroAid™ (MLC 601) (0,1 , 0,5, 1 ,0 µg/ml) con el control.
La figura 2 muestra gráficos de barras del efecto del tratamiento con NeuroAid™ (MLC 601) en la liberación de LDH el día 10 y el día 14. Se comparó una concentración de NeuroAid™ (MLC 601) 1 ,0 µg/ml con el control.
La figura 3 muestra imágenes confocales del efecto del tratamiento con NeuroAid™ (MLC 601) en la expresión de DCX neuronal el día 3 y el día 14. Se comparó una concentración de NeuroAid™ (MLC 601) de 1 ,0 µg/ml con el control.
La figura 4 muestra gráficos de barra del efecto de tratamientos con NeuroAid™ (MLC 601 ) y NeuroAid II (MLC 901) en la viabilidad celular el día 8, el día 10, el día 12 y día 14. Se comparó una concentración de NeuroAid™ (MLC 601 ) 1 ,0 g/ml y NeuroAid II (MLC 901) 1 ,0 µg/m\ con el control.
La figura 5 muestra un gráfico de líneas del efecto de tratamientos con NeuroAid™ (MLC 601 ) y NeuroAid II (MLC 901 ) en la liberación de LDH el día 8, el día 10, el día 12 y día 14. Se comparó una concentración de NeuroAid™ (MLC 601) 1 ,0 µ9/?t?? y NeuroAid II (MLC 901) 1 ,0 µ9/??? con el control.
La figura 6 muestra imágenes de confocal del efecto de tratamientos con NeuroAid™ (MLC 601 ) y NeuroAid II (MLC 901 ) en la expresión de DCX el día 3 y el día 14. Se comparó una concentración de NeuroAid™ (MLC 601 ) 1 ,0 µg/ml y NeuroAid (MLC 901 ) 1 ,0 µ9/?t?? con el control.
La figura 7 muestra diagramas esquemáticos de los protocolos experimentales para tratamientos con NeuroAid™ (MLC 601 ) contra apoplejía. La figura 7A muestra el protocolo experimental para el Ejemplo 4, que investiga los efectos de tratamiento con NeuroAid II (MLC 901 ); la figura 7B muestra el protocolo experimental para el Ejemplo 5, que investiga los efectos de un tratamiento de NeuroAid™ (MLC 601) agudo. Ambos estudios evaluaron la tasa de supervivencia y también cuantificaron el volumen de infarto a las 24 horas post isquemia.
La figura 8 muestra una gráfica de barras de la tasa de supervivencia después del pre tratamiento con NeuroAid II (MLC 901 ) a las 24 horas post isquemia.
La figura 9 muestra una gráfica de barras de la tasa de supervivencia (A) y el volumen de infarto (B) después de post tratamiento con NeuroAid II (MLC 901 ) a las 24 horas post isquemia.
La figura 10 muestra gráficos de barras de los efectos comparativos de los tratamientos con NeuroAid II (MLC 901 ), Rhizoma chuanxiong Radix angelicae sinensis y Rhizoma chuanxiong/Radix angelicae sinensis combinados (1 µg/ml) en neuronas corticales en cultivo estimado el día 12 del tratamiento.
La figura 10A muestra el efecto de los tratamientos respectivos en la viabilidad celular y la Figura 10B muestra el efecto de los tratamientos respectivos en la liberación de LDH.
La Figura 1 1 muestra gráficos de barras de los efectos comparativos de un post tratamiento con NeuroAid II (MLC 901), Rhizoma chuanxiong, Radix angelicae sinensis y Rhizoma chuanxiong/Radix angelicae sinensis combinados contra lesión cerebral isquémica in vivo.
La figura 1 A y la figura 1 1 B muestran la tasa de supervivencia (A) y el volumen de infarto (B) respectivamente.
La figura 12 muestra gráficos de barras de los efectos comparativos de un pre tratamiento con NeuroAid II (MLC 901 ), Rhizoma chuanxiong y Radix angelicae sinensis contra lesión cerebral isquémica in vivo.
La figura 12A y figura 12B muestran la tasa de supervivencia (A) y el volumen de infarto (B) respectivamente.
La Figura 13 muestra fotografías de microscopía de epifluorescencia representativas de los efectos comparativos entre tratamiento con NeuroAid II (MLC 901) Rhizoma chuanxiong, Radix angelicae sinensis y Rhizoma chuanxiong/Radix angelicae sinensis combinados (1 µg/ml) en inmunoexpresión de DCX in vitro en células corticales cultivadas el día 12 del tratamiento.
La figura 14 muestra gráficos de barras de la intensidad de señal de DCX en neuronas inmunoteñidas observadas en microscopía de epifluorescencia.
La figura 15 muestra gráficos de barras del crecimiento de neuritas obtenido midiendo en microscopía de epifluorescencia la longitud total de la neurita (µ??) en función de los tratamientos.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona el uso de una composición que comprende al menos 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13 o 14 de los siguientes componentes: Radix et Rhizoma Salviae Miltiorrhizae (raíz de Salvia miltiorrhiza o Dan Shen), Prunus pérsica (semilla de melocotón o Taoren), Radix Polygalae (raíz de Polygala tenuifolia Willd., Polygala sibirica L. o Yuanzhi), Buthus martensii (cuerpo seco de escorpión o Quanxie), Rhizoma acori Tatarinowii (rizoma de Acorus gramineus o Shichangpu), Eupolyphaga Seu Seteleophaga (cuerpo seco de carábido, Eupolyphaga sinensis Walker, Steleophaga plancyi o Tubiechong), Calculus Bovis Artifactus (bezoar de vaca natural o artificial o Rengong Niuhuang) y Cornu Saigae Tataricae (cuerno de antílope o Lingyangjiao) y combinaciones de los mismos, en la fabricación de un medicamento para promover el crecimiento neuronal y la proliferación de neuronas o células madre en tejidos del sistema nervioso central o periférico.
En una realización, la composición comprende adicionalmente un segundo componente seleccionado del grupo constituido por: Radix Astragali (raíz de Astragalus propinquus o Huang Qi), Radix Paeoniae Rubra (raíz de peonía roja, Paeonia lactiflora Pall, Paeonia veitchii Lynch o Chi Shao), rizoma de Ligusticum chuanxiong (Chuan Xiong), flor de Carthamus tinctorius (cártamo o HongHua), radix angelicae sinensis (raíz de angélica china o DanGui) y cuerpo seco de sanguijuelas (Hirudo, Whitmania pigra Whitman, Hirudo nipponica Whitman Whitmania acranulata Whitman o Shuizhi) y combinaciones de los mismos.
El medicamento promueve el crecimiento neuronal y la proliferación de neuronas o células madre en tejidos lesionados o enfermos que pueden producirse en pacientes con cualquiera de las siguientes enfermedades: esclerosis lateral amiotrófica (ALS), absceso cerebral, isquemia cerebral, atrofia cerebral asociada con diabetes, arteriopatía dominante autosómica cerebral con infartos subcorticales y leucoencefalopatía (CADASIL), trastornos cerebrovasculares, degeneración ganglionar corticobasal (CBGD), isquemia crónica, síndrome de Creutzfeldt-Jakob, síndrome de Dandy-Walker, distrofia muscular de Duchenne, demencia senil, demencia asociada con síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA), encefalomielitis, temblor esencial, ataxia de friedreich, enfermedad de gerstmann straussler-scheinker, enfermedad de Huntington, hidrocefalia, hipoxia, insomnio familiar letal, ataque isquémico transitorio, kuru, síndrome de Landau-Kleffner, síndrome de cuerpos de Lewy, enfermedad de Machado-Joseph, meningitis bacteriana y viral, trastornos de migraña, mielitis, atrofias oligopotocerebelares, neurodegeneración asociada a pantotenato quinasa, poliomielitis, síndrome postpoliomielítico, enfermedades priónicas, hipertensión intracraneal, síndrome de Shy-Drager, espasmos infantiles, parálisis supranuclear progresiva, enfermedad de Steinert, siringomielia, enfermedades talámicas, trastornos de tic, síndrome de Tourette y síndrome uveomeningoencefalítico.
La composición también puede usarse para tratar pacientes que tienen una afección seleccionada del grupo de indicaciones psiquiátricas tales como trastornos de ansiedad, esquizofrenia, depresión y depresión postnatal, envejecimiento natural, muerte celular en cerebro traumático y otras manifestaciones neurológicas tales como amnesia, dolor de espalda, vértigo, inconsciencia, miembro fantasma, trastornos del olfato, dolor de cuello, cefalea, migrañas, espasmo y trastornos del habla.
En otra realización, la composición puede reducir el efecto de apoplejía o neurodegeneración de sujetos predispuestos o sujetos en riesgo de apoplejía o neurodegeneración. La neurodegeneración puede causarse por enfermedades seleccionadas del grupo de enfermedad de Alzheimer, esclerosis lateral amiotrófica (ALS), absceso cerebral, isquemia cerebral, atrofia cerebral asociada con diabetes, arteriopatía dominante autosómica cerebral con infartos subcorticales y leucoencefalopatía (CADASIL), trastornos cerebrovasculares, degeneración ganglionar corticobasal (CBGD), isquemia crónica, síndrome de Creutzfeldt-Jakob, síndrome de Dandy-Walker, síndrome muscular de Duchenne, demencia senil, demencia asociada con síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA), encefalomielitis, temblor esencial, ataxia de Friedreich, enfermedad de Gerstmann Straussler-Scheinker, enfermedad de Huntington, hidrocefalia, hipoxia, insomnio familiar letal, ataque isquémico transitorio, kuru, síndrome de Landau-Kleffner, síndrome de cuerpos de Lewy, enfermedad de Machado-Joseph, meningitis bacteriana y viral, trastornos de migraña, mielitis, atrofias oligopotocerebelares, neurodegeneración asociada con pantotenato quinasa, enfermedad de Parkinson, poliomielitis, síndrome postpoliomielítico, enfermedades priónicas, hipertensión intracraneal, síndrome de shy-drager, enfermedad de Steinert, espasmos infantiles, parálisis supranuclear progresiva, siringomielia, enfermedades talámicas, trastornos de tic, síndrome de Tourette, síndrome uveomeningoencefalítico, isquemia global y focal y otras enfermedades cardiovasculares, en sujetos predispuestos.
Se piensa que NeuroAid™ o una composición de tipo NeuroAid™ (por ejemplo una composición descrita posteriormente), opcionalmente en combinación con agentes complementarios disponibles pueden ser útiles para el bienestar general de neuronas o para el tratamiento de diversas enfermedades del sistema nervioso y otros trastornos degenerativos. Los agentes de complemento pueden ser vitaminas, complementos minerales, complementos herbarios, aceites de pescado y medicina occidental. Típicamente, el agente complementario usado en combinación con NeuroAid™ o una composición de tipo NeuroAid™ es uno que se dirige a un mecanismo diferente de NeuroAid™ o una composición de tipo NeuroAid™. Por ejemplo, la medicina occidental puede ser factores de crecimiento usados típicamente para mejorar la capacidad de recuperación en los pacientes con enfermedades degenerativas. Los ejemplos de agentes adecuados usados en medicina occidental incluyen bloqueadores del canal de calcio (D-600, diltiazem, nitrendipino, nimodipino, nifedipino, flunarizino, fluspirileno, isradipino, nicardipino, py 108-068, verapamilo y triapamilo), quelante de calcio (DP-b99), eliminadores de radicales libre (Ebselen, Tirilazad, NXY-059), agonistas del receptor de GABA (Diazepam, Baclofen), agonistas de AMPA (ZK 200775/ MPQX), antagonistas competitivos de NMDA (aptiganel / cerestat, CP 101.606, dextrorfano, MK 801/ dizocilpina, remacemida), antagonistas de sitio de glicina (GV 150526, ACEA 1021), antagonistas de sitio de poliamina (eliprodilo), factores de crecimiento (bFGF), bloqueadores del canal de sodio (fosfenitoína, 619C89), agentes de apertura del canal de potasio (BMS 204352, cromakalim, levcromakalim, aprikalim, pinacidil, diazóxido, nicorandil, minoxidil), piracetam, inhibidor del transporte de adenosina (propentofilina), gangliósidos GM (no antagonistas de NMDA), inhibidores de la liberación de glutamato presináptico, clazosentan, desmoteplasa, viprinex (ancrod), tenecteplasa (TNKasa; Metalyse), alteplasa, nitronas cíclicas, receptor de TWEAK (inductor débil de tipo TNF de apoptosis), tratamientos trombolíticos (uroquinasa, estreptoquinasa, activador de plasminógeno tisular / t-PA o uroquinasa recombinante), anistreplasa, riluzol y disufentón sódico (NXY 059), candesartán, AX-200 (G-CSF, Fligrastim), cafeinol (cafeína + etanol), enecadina, microplasmina, sonolisis + tPA, V-10153, HTUPA, solulina, piclozotan, S-0139, S-18986, AEOL-10150, AL-208, KN-38-7271 , fridoxal 5-fosfato, Neu-2000KL, ONO-2231, PGX-100, RVX-208, SUN-N4057, SUN-N8075, TAT-NR2B9C, terapia de células madre que expresan GLP-1 , Msc-1 (SA-4503, AGY-94806), NH-02D, S-0139 259, citocinas protectoras de tejido (Lu-AA24493), V10153 270 (BB-10153, TAPgen), uso combinado de estatinas y otros fármacos reductores de colesterol, eritropoyetina, cerebrolisina y CDP-colina (citidin-5'-difosfocolina).
Se proporciona un procedimiento para inducir proliferación o diferenciación de células, que comprende poner en contacto dichas células con una cantidad eficaz de al menos uno de los siguientes componentes: Radix Astragali (raíz de Astragalus proplnquus o Huang Qi), Radix et Rhizoma Salviae Miltiorrhizae (raíz de Salvia miltiorrhiza o Dan Shen), Radix Paeoniae Rubra (raíz de peonía roja, Paeonia lactiflora Pall, Paeonia veitchii Lynch o Chi Shao), rizoma de Ligusticum chuanxiong (Chuan Xiong), radix angelicae sinensis (raíz de angélica china o DanGui), flor de Carthamus tinctorius (cártamo o HongHua), Prunus pérsica (semilla de melocotón o Taoren), Radix Polygalae (raíz de Polygala tenuifolia Willd., Polygala sibirica L. o Yuanzhi), Buthus martensii (cuerpo seco de escorpión o Quanxie), Rhizoma acori Tatarinowü (rizoma de Acorus gramineus o Shichangpu), cuerpo seco de sanguijuelas (Hirudo, Whitmania pigra Whitman, Hirudo nipponica Whitman, Whitmania acranulata Whitman o Shuizhi), Eupolyphaga Seu Seteleophaga (cuerpo seco de carábido, Eupolyphaga sinensis Walker, Steleophaga plancyi o Tubiechong), Calculus Bovis Artifactus (bezoar de vaca natural o artificial o Rengong Niuhuang) y Cornu Saigae Tataricae (cuerno de antílope o Lingyangjiao).
La composición puede promover el crecimiento celular o la supervivencia celular facilitaría el cultivo in vitro de diversas células que podrían usarse para ingeniería de tejidos o usos terapéuticos ex vivo. En una realización, al paciente que recibe las células cultivadas también se le administra NeuroAid™.
NeuroAid™ y composiciones similares Los ingredientes expuestos anteriormente pueden estar presentes en la composición en una forma relativamente en bruto (por ejemplo hierbas no procesadas o trituradas) o en una forma más refinada (por ejemplo extractos purificados).
En una realización, se usa NeuroAid™ de Moleac Pte Ltd. NeuroAid™ es un producto TCM en forma de capsulas que comprende 9 componentes herbarios y 5 componentes animales. NeuroAid™ comprende Radix Astragali (raíz de Astragalus propinquus o Huang Qi), Radix et Rhizoma Salviae Miltiorrhizae (raíz de Salvia miltiorrhiza o Dan Shen), Radix Paeoniae Rubra (raíz de peonía roja, Paeonia lactiflora Pall, Paeonia veitchii Lynch o Chi Shao), rizoma de Ligusticum chuanxiong (Chuan Xiong), radix angelicae sinensis (raíz de angélica china o DanGui), flor de Carthamus tinctorius (cártamo o HongHua), Prunus pérsica (semilla de melocotón o Taoren), Radix Polygalae (raíz de Polygala tenuifolia Willd., Polygala sibirica L. o Yuanzhi), Rhizoma acori Tatarinowii (rizoma de Acorus gramineus o Shichangpu), Buthus martensii (cuerpo seco de escorpión o Quanxie), cuerpo seco de sanguijuelas (Hirudo, Whitmania pigra Whitman, Hirudo nipponica Whitman, Whitmania acranulata Whitman o Shuizhi), Eupolyphaga Seu Seteleophaga (cuerpo seco de carábido, Eupolyphaga sinensis Walker, Steleophaga plancyi o Tubiechong), Calculus Bovis Artifactus (bezoar de vaca natural o artificial o Rengong Niuhuang) y Cornu Saigae Tataricae (cuerno de antílope o Lingyangjiao).
En otra realización, NeuroAid II comprende Radix Astragali (raíz de Astragalus propinquus o Huang Qi), Radix et Rhizoma Salviae Miltiorrhizae (raíz de Salvia miltiorrhiza o Dan Shen), Radix Paeoniae Rubra (raíz de peonía roja, Paeonia lactiflora Pall, Paeonia veitchii Lynch o Chi Shao), rizoma de Ligusticum chuanxiong (Chuan Xiong), radix angelicae sinensis (raíz de angélica china o DanGui), flor de Carthamus tinctorius (cártamo o HongHua), Prunus pérsica (semilla de melocotón o Taoren), Radix Polygalae (raíz de Polygala tenuifolia Willd., Polygala sibirica L. o Yuanzhi) y Rhizoma acori Tatarinowii (rizoma de Acorus gramineus o Shichangpu). NeuroAid™, que puede estar registrado con diferentes nombres en diferentes países (por ejemplo en Sudáfrica se comercializa como Strocaid™ o Danqi Piantan Jiaonang™) se fabrica por y está disponible comercialmente en la República Popular China de Tianjin Shitian Pharmaceutical Group Co., Ltd (localizada en el área industrial de Jianxin, ciudad de Wangwenzhuang, distrito de Xiqing, Tianjin City, China; código postal 300381). También está disponible de Moleac Pte Ltd (anteriormente Molecular Acupuncture Pte Ltd), el principal concesionario fuera de la República Popular China (11 Biopolis Way, Helios #09-08 Singapur 138667).
Para evitar dudas, NeuroAid™ no solamente incluye NeuroAid™ en la forma en la que se comercializa actualmente sino que también incluye formulaciones futuras de NeuroAid™ que pueden, por ejemplo, comercializarse por Tianjin Shitian Pharmaceutical Group Co., Ltd o Moleac Pte Ltd. Tales formulaciones futuras pueden, por ejemplo, variar en cantidades farmacéuticas o en la concentración de sus principios activos, etc. NeuroAid™ también se conoce como MLC 601 y los términos "NeuroAid™" y "MLC 601" pueden usarse de forma intercambiable. De forma similar NeuroAid II también se conoce como MLC 901 y los términos "NeuroAid" y "MLC 901" pueden usarse de forma intercambiable.
Neuroprotectores Usando diversos mecanismos, los neuroprotectores son compuestos que conservan el tejido neuronal en riesgo de morir durante el transcurso de enfermedades que provocan de forma negativa neurodegeneración. Algunos agentes neuroprotectores incluyen antioxidantes (por ejemplo selenio 30, vitamina E, vitamina C, glutatión, cisteína, flavonoides, quinolinas, enzimas con actividad reductora, etc.), antagonistas del receptor de N-metil-D-aspartato (Dextrorfano, Selfotel, magnesio), antagonistas del receptor de narcóticos (Nalmefeno (Cervene)), bloqueadores del canal de Ca, moduladores del canal de Na (Lubeluzol), agonistas de ácido Alfa-aminobutírico (Clometiazol), moduladores del receptor de glutamato, agonistas del receptor de serotonina (repinotán), fosfolípidos, eliminador de radicales libres (Tirilazad, y NXY-059), inhibidor de la activación de astrocitos (ONO 2506), anticuerpos monoclonales tales como anti-ICAM-1 (Enlimomab), anticuerpo antileucocítico humano, Hu23F2G, agente de estabilización de membrana CDP-colina (citicolina), factor de crecimiento de fibroblastos (Fiblast), ácidos grasos insaturados y poliinsaturados, estrógenos y moduladores del receptor de estrógenos selectivos (SEAMS), progeságenos, hormona tiroidea y compuestos miméticos de la hormona tiroidea, ciclosporina A y derivados, talidomida y derivados, metilxantinas, inhibidores de Mono-Amino-Oxidasa (IMAO), bloqueadores de captación de serotonina, noradrenalina y dopamina, agonistas de dopamina I, L-DOPA, nicotina y derivados y moduladores de NO sintasa.
Factores de crecimiento Usando diversos mecanismos, los factores de crecimiento son compuestos que promueven que células particulares se diferencien o proliferen. Algunos factores de crecimiento incluyen proteínas morfogenéticas del hueso (BMP), factor de crecimiento epidérmico (EGF), eritropoyetina (EPO), factor de crecimiento de crecimiento fibroblastos (EGF), factor estimulador de colonias de granulocitos (G-CSF), factor estimulador de colonias de granulocitos y macrofagos (GM-CSF), factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), factor de crecimiento de tipo insulina (IGF), miostatina (GDF-8), factor de crecimiento de nervios (NGF), neurotrofinas, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), trombopoyetina (TPO), factor de crecimiento transformante alfa (TGF-a), factor de crecimiento transformante beta (TGF-ß), factor de crecimiento endotelial vascular (VGEF), interleucina 1ß (IL-?ß), IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-7, IL-8, IL-21 , IL-33, M-CSF, noggina, interferones (IFN)-a, IFN-ß e IFN-?.
Compuestos para activar los canales de potasio TREK-1 Otros agentes adecuados usados en medicina occidental incluyen compuestos capaces de activar los canales de potasio TREK-1. Se ha descubierto que la activación de TREK-1 disminuye los efectos de apoplejía o neurodegeneración en sujetos predispuestos o sujetos en riesgo de apoplejía o neurodegeneración. Además, se ha mostrado que TREK-1 desempeña un papel en el tratamiento de pacientes con tejidos enfermos o lesionados del sistema nervioso central o periférico y pacientes que padecen ' depresión, indicaciones psiquiátricas, envejecimiento natural y muerte celular en cerebro traumático. Puesto que NeuroAid® no activa los canales de potasio TREK-1 , pueden usarse compuestos que son capaces de activar los canales de potasio TREK-1 en combinación con NeuroAid™ ( LC 601) para reducir los efectos de apoplejía o neurodegeneración y tratar pacientes con tejidos enfermos o lesionados del sistema nervioso central o periférico y pacientes que padecen depresión, indicaciones psiquiátricas, envejecimiento natural y muerte celular de cerebro traumático.
Un ejemplo de un compuesto que es capaz de activar los canales de potasio TREK-1 son los ácidos grasos poliinsaturados (PUFA). Los ácidos grasos poliinsaturados son ácidos grasos que contienen más de un doble enlace. Los PUFA pueden categorizarse como polienos interrumpidos por metileno o ácidos grasos conjugados.
Los polienos interrumpidos por metileno son ácidos grasos que tienen dos o más enlaces dobles cis que están separados entre sí por un grupo de ¡ metileno sencillo. Los ácidos grasos esenciales son todos ácidos grasos interrumpidos por metileno omega 3 y omega 6. Los ejemplos de ácidos grasos omega 3 incluyen sin limitación: ácido alfa linolénico (ALA), ácido estearidónico (STD), ácido eicosatrienoico (ETE), ácido eicosatetraenoico (ETA), ácido eicosapentaenoico (EPA), ácido docosapentaenoico (DPA), ácido docosahexaenoico (DHA), ácido clupanodónico, ácido tetracosapentaenoico, ácido tetracosahexaenoico o ácido nisínico. Los ejemplos de ácidos grasos omega 6 incluyen sin limitación: ácido linoleico (LIN), ácido gamma linolénico (GLA), ácido eicosadienoico, ácido dihomo-gamma-linolénico (DGLA), ácido araquidónico (AA), ácido docosadienoico, ácido adrénico, ácido docosapentaenoico o ácido Osbond. Los ácidos grasos omega 9 también son polienos interrumpidos con metileno y pueden ser monosaturados o polisaturados. Los ejemplos de ácidos grasos omega 9 incluyen sin limitación: ácido oleico, ácido eicosenoico, ácido de Mead, ácido erúcico o ácido nervónico.
Los ácidos grasos conjugados son ácidos grasos que tienen dos o más enlaces dobles conjugados. Los ejemplos de ácidos grasos conjugados incluyen sin limitación: ácido reménico, ácido a-caléndico, ácido ß-caléndico, ácido jacárico, ácido oc-eleosteárico, ácido ß-eleosteárico, ácido catálpico, ácido punícico, ácido rumelénico, ácido a-parinárico, ácido ß-parinárico, ácido boseopentaenoico.
Algunos otros PUFA que no se categorizan como polienos interrumpidos por metileno o ácidos grasos conjugados incluyen sin limitación: ácido pinolénico y ácido podocárpico.
Otros compuestos que pueden ser capaces de activar los canales de potasio TREK-1 incluyen el fármaco Riluzol (Rilutek®), lisofosfólidos (LPL), esteres de ácido cafeico y xenón. Estos compuestos también pueden usarse en combinación con NeuroAid™ (MLC 601 ) para reducir los efectos de apoplejía o neurodegeneración y tratar a pacientes con tejidos enfermos o lesionados del sistema nervioso central o periférico y pacientes que padecen depresión, indicaciones psiquiátricas, envejecimiento natural y muerte celular de cerebro traumático.
Modos de administración NeuroAid™ (MLC 601) puede administrarse por vía oral, vía parenteral, vía intravenosa, vía subcutánea, vía intradérmica, vía intraperitoneal o vía tópica, en forma líquida, semilíquida o sólida y se formula de una manera adecuada para cada vía de administración. Cuando NeuroAid™ (MLC 601) se administra por vía oral, puede administrarse como cuatro cápsulas de 0,4 g que se toman 3 veces al día. Para pacientes con dificultades al tragar, las cápsulas pueden abrirse y el polvo diluirse en agua que puede beberse tal cual o inyectarse mediante un tubo gástrico. Por lo tanto, se prevé una dosis diaria de aproximadamente 4,8 g. En una realización, la dosis diaria del paciente de NeuroAid™ (MLC 601) es de aproximadamente 1 g a 8 g; 2 g a 8 g; 3 g a 7 g; 4 g a 6 g; 4,25 g a 5,75 g; 4,5 g a 5,25 g; 4,5 g a 5 g; 4,6 g a 4,10 g; o 4,7 g a 4,9 g. Una "dosis diaria" puede ser un comprimido o cápsula sencilla etc. o múltiples comprimidos o capsulas etc. para tomar en un día dado.
En una realización, cada ciclo de tratamiento de NeuroAid™ (MLC 601 ) dura aproximadamente 4 semanas. Típicamente se administran 3 ciclos, más probablemente de forma consecutiva. No se requiere ventana terapéutica pero puede añadirse ciclos adicionales incluso después de unos pocos días del cese del tratamiento. Por lo tanto, en una realización, cada tratamiento de NeuroAid™ (MLC 601) dura aproximadamente 12 semanas. En otra realización, el ciclo de tratamiento de NeuroAid™ (MLC 601) es de aproximadamente 4 a 24 semanas; de 7 a 16 semanas; de 9 a 15 semanas; de 10 a 14 semanas; o de 11 a 13 semanas.
En otra realización, NeuroAid™ (MLC 601) también puede usarse como un tratamiento crónico para combatir enfermedad crónica o como una medida preventiva.
En una realización, NeuroAid™ (MLC 601) puede usarse como parte de una terapia de combinación con medicina occidental que promueve el crecimiento celular. Los asociados de combinación de NeuroAid™ (MLC 601) y el factor de crecimiento celular pueden estar presentes en una formulación sencilla o pueden estar presentes como formulaciones separadas. En una realización puede haber un efecto sinérgico.
Los asociados de combinación NeuroAid™ (MLC 601) y factor de crecimiento celular pueden administrarse al paciente en el mismo momento (por ejemplo simultáneamente) o en momento diferentes (por ejemplo secuencialmente) y durante diferentes periodos de tiempo, que pueden estar separados entre sí o solaparse. Los asociados de combinación NeuroAid™ (MLC 601 ) y factor de crecimiento celular pueden administrarse en cualquier orden.
Cuando se utiliza el factor de crecimiento celular, la vía de administración y nivel de dosis apropiados se conocerán por los expertos en la materia o podrían determinarse fácilmente por un experto en la materia. Típicamente, como se conoce bien en la técnica médica, las pautas de dosificación pueden depender de diversos factores incluyendo la talla del paciente, el área de superficie corporal, la edad, el compuesto particular a administrar, sexo, momento y vía de administración, salud general y otros fármacos que se administran simultáneamente. Aunque las necesidades individuales varían, la determinación de los intervalos óptimos de cantidades eficaces de cada componente está dentro de la experiencia de la técnica. La dosificación puede ser similar a la administrada cuando el agente se usa sin NeuroAid™ (MLC 601).
Ejemplos Se describirán adicionalmente ejemplos no limitantes de la invención en más detalle por referencia a ejemplos específicos, que no deberían interpretarse como limitantes de ningún modo del alcance de la invención.
Materiales Medio para toma de muestras corticales: - HBSS/1 NaCI 8 g/l KCI 0,26 g/l MgS04 0,2 g/l CaCI2 0,264 g/l NaH2C03 2,24 g/l NaH2PO4 0,15 g/l en H20 - HBSS +: añadir 6g de glucosa Medio de cultivo celular Neurobasal (21103-049; Invitrogen, San Diego, CA) B27 (n° 17504; Invitrogen, San Diego, CA) Uridina (U3003; Sigma, St. Louis, MO, Estados Unidos) Fluoro-desoxi-Uridina (46875; Fluka-Chemika-Biochemika, Buchs, Suiza) Glutamax (35050; Gibco-BRL Life Technologies. GmbH, Karlsruhe, Alemania) Antibióticos (Penicilina-estreptomicina) (Gibco-BRL Life Technologies. GmbH, Karlsruhe, Alemania) Animales Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con las políticas sobre el cuidado y uso de animales de laboratorio de la legislación de la Comunidad Europea. El comité de ética local aprobó los experimentos (números de protocolo NCA/2006/10-1 y NC A/2006/10-2). Se usaron ratones adultos macho C57/B16, que pesaban de 22 a 26 g en este estudio. Los animales se alojaron en condiciones de laboratorio controladas con un ciclo de luz-oscuridad de 12 horas, una temperatura de 21 ± 2 °C y una humedad de 60 a 70 % durante al menos una semana antes del tratamiento farmacológico o la cirugía. Los ratones tenían acceso libre a dieta de roedor convencional y agua del grifo.
Solución bebible de NeuroAid II (MLC 901) Se disolvió una cápsula de NeuroAid II (MLC 901 ) en 66 mi de agua en agitación con un agitador durante una hora a 37 °C. La solución se filtró después con un filtro de 0,45 µ??.
NeuroAid II (MLC 901) para inyecciones intraperítoneales Se diluyeron 30 mg de NeuroAid II (MLC 901 ) en 3 mi de solución salina correspondiente a una concentración de 10 mg/ml (solución madre) a 37 °C durante 60 minutos. La concentración usada en el experimento es de 1 µg/ml (volumen inyectado: 500 µ?). Para obtener la dosis de 1 µg/mlI la solución madre se diluyó en 100. Después de la dilución, la mezcla se agitó en un vórtex para obtener una buena homogeneización y se filtró en un filtro de 0,45 µ?t?.
Procedimientos A. CULTIVO DE CÉLULAS CORTICALES Se anestesió a ratones (E14) C57B16/J embarazadas durante un tiempo con isopentano seguido de dislocación cervical. Los fetos se retiraron y se colocaron en solución HBSS+ fría (solución salina equilibrada de Hanks). Los córtices cerebrales se diseccionaron en solución HBSS+ fría y se retiraron las meninges. Las muestras corticales se cortaron en trozos pequeños y se trituraron suavemente con una pipeta Pasteur de vidrio pulida al fuego en 8 mi de solución HBSS+. La mezcla se filtró (filtro de 40 µ??) y se centrifugó a 800 rpm durante 8 minutos. El sobrenadante se retiró y el sedimento se disolvió en 2 mi de medio de cultivo. Las células se sembraron en placas de 12 pocilios revestidas de polilisina (24 mm de diámetro; Sigma-Aldrich Chimie, St. Quentin Fallavier, Francia) con cubreobjetos de vidrio (12 mm de diámetro; CML, Nemours, Francia) a una densidad de 1 x 106 células/pocilio. Los cultivos se mantuvieron a 37 °C en un incubador de atmósfera de CO2 5 % humidificada en Neurobasal complementado con B27, Glutamax, se usaron antibióticos para experimentos después de 16 días. El crecimiento glial se suprimió mediante la adición de 5-fluoro-2-desoxiuridina (2 µ?) y uridina (2 µ?) durante el segundo día de cultivo.
B. TRATAMIENTO CON NEUROAID™ (MLC 601) Se diluyeron 30 mg de una cápsula de NeuroAid™ (MLC 601) en 3 mi de medio neurobasal correspondiente a una concentración de 10 mg/ml (solución madre) a 37 °C durante una duración de 60 minutos. Las concentraciones ensayadas en los experimentos fueron: 1 µg/ml o 10 µg/ml de medio de cultivo. Se usó 1 mi de solución de NeuroAid™ (MLC 601) en cada pocilio de 24 mm de la placa.
Para obtener la dosis de 1 µg/ml, la solución madre se diluyó 100 veces: 0,1 mg/ml (10 µ? por pocilio de 24 mm /mi, correspondiente a 1 µg/pocillo).
Para obtener la dosis de 10 µg/ml) la solución madre se diluyó 10 veces: 1 mg/ml (10 µ? por pocilio de 24 mm/ml, correspondiente a 10 µg/pocillo).
Después de la dilución, la mezcla se agitó en vórtex para obtener una buena homogeneización y se filtró en un filtro de 0,45 µ??.
Las células se trataron cada día con NeuroAid™ (MLC 601), NeuroAid II (MLC 901) o medio Neurobasal desde el día 1 de cultivo.
C. MEDICIONES DE LACTATO DESHIDROGENASA (LDH) La lesión neuronal se evaluó cuantitativamente mediante la medición de la liberación de deshidrogenasa láctica (LDH) de neuronas cultivadas incubadas en medio de cultivo celular. El día 1 , 5, 8, 10, 12, 14 y 16, se transfirieron 100 µ? del medio de cultivo celular de los pocilios de cultivo a placas de 96 pocilios y se mezclaron con 100 µ? de la solución de reacción de acuerdo con el kit de ensayo de LDH (Roche Diagnostic: kit de detección de citotoxicidad: ref 1644793, Indianápolis, Estados Unidos). La densidad óptica (DO) se midió 30 minutos después a 492 nm utilizando un lector de microplaca Multiscan Labsystem (Labsystem Multiscan RC, Finlandia). Se resta la absorbancia de fondo a 620. La actividad de LDH se expresa como actividad presente en el volumen de medio de 25 µ?. Los resultados se expresan como DO x 103.
D. VIABILIDAD CELULAR El día 1 , 5, 8, 10, 12, 14 y 16, se retiró la totalidad del medio de cultivo celular y se reemplazó por 500 µ? de medio Neurobasal + kit Cell Titer 96 Aqueous One Solution: kit de ensayo de proliferación celular Cell Titer 96 ® Aqueous One Solution. La viabilidad neuronal se determinó usando el ensayo de proliferación celular Cell Titer 96 ® Aqueous One Solution (Promega, Madison, Estados Unidos). De acuerdo con el protocolo del kit de ensayo de proliferación, las células se incuban durante 4 horas a 37 °C en el incubador de atmósfera de CO2 5 % humidificado. La reacción se detuvo con dodecil sulfato sódico 2 % (SDS). La densidad óptica se midió 4 horas después a 490 nm utilizando un lector de microplaca Labsystem Multiscan. Se restó la absorbancia de fondo a 620. Los resultados se expresaron como DO x 103 que representa el número de células viables.
Los resultados del análisis estadístico de la viabilidad celular y LDH se evalúan usando un ensayo de ANOVA de un factor (análisis de varianza) seguido de ensayo post-hoc (p<0,05).
E. INMUNOHISTOQUÍMICA DE DOBLE CORTINA (DCX) DE CÉLULAS CORTICALES EN CUBREOBJETOS Se fijan células corticales en cubreobjetos con paraformaldehído 4 % en solución salina tamponada con fosfato (PBS), se permeabilizan en polioxietilensorbitan monolaurato 0,3 % (Tween 20, Sigma) durante 10 minutos y se bloquean con suero de burro 2,5 % en PBS durante 2 horas a temperatura ambiente. Los cubreobjetos se incubaron con un anticuerpo anti doble cortina (DCX) de cabra (1 :200, SC-8066, Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA) en suero de burro 2 %/PBS durante una noche. Después de 3 lavados en PBS, los cubreobjetos se incubaron en anticuerpos acoplados a Alexa 488-anticabra (FluoProbes, Interchim, Montlucon, Francia) en suero de burro 2 % durante 2 horas y se lavaron tres veces en PBS durante 5 minutos cada uno. Los cubreobjetos se incuban después en solución de Hoechst (3 µ? en 10 mi; Sigma-Aldricht Chimie, Saint Quentin Fallavier, Francia) durante 10 minutos para marcar núcleos celulares. Después de 2 lavados en PBS y un lavado en agua, los cubreobjetos se secan y se montan en portaobjetos con Fluoroprep (75521 ; BioMérieux, Marcy l'Etoile, Francia). Las células se observaron usando epifluorescencia y microscopía confocal. Las observaciones de microscopía confocal se realizan usando un Microscopio Confocal de Exploración Láser (TCS SP, Leica Microsystems Heidelberg GmbH, con base en Mannheim, Alemania) equipado con un microscopio invertido DMIRBE y un láser de argón-criptón (láser de excitación 488 nm, adquisición 500-600 nm cada 10nm). La especificidad de señal se evaluó en cubreobjetos de control negativo omitiendo el anticuerpo primario dirigido contra la proteína DCX. Se adquirieron imágenes como secciones ópticas transcelulares sencillas y se promediaron sobre al menos cuatro exploraciones por imagen. Las imágenes confocal de mareaje de anticuerpo DCX-Alexa-488 se obtuvieron después tras la corrección espectral del fondo de autofluorescencia.
F. Parámetros fisiológicos usados cuando se investigan los efectos de un NeuroAid II (MLC 901) en ratones C57BI/6 Se indujo anestesia general con isoflurano 3 % y se mantuvo con isoflurano 1 % por medio de una máscara facial abierta para cada ratón. Se permitió a los ratones respirar espontáneamente. Se controló un subconjunto de animales (n=5 por grupo) con respecto a parámetros fisiológicos incluyendo presión sanguínea arterial media (MABP), temperatura rectal, gases en sangre arterial y pH antes, durante y después de la isquemia. Se introdujo un catéter en la arteria femoral derecha con tubos de polietileno PE-10 y se conectó a un transductor de presión sanguínea (Harvard Apparatus, Massachusetts, Estados Unidos) para control continuo de MABP (mm Hg). Se obtuvo después una muestra de sangre heparinizada (75 µ?) de la arteria femoral con catéter y se midieron p02, pCÜ2 y pH sanguíneos usando un Sistema de Laboratorio de Ácido-Base (ABL 555, Radiometer). La temperatura central se controló continuamente con un termómetro (diámetro de sonda de 3 mm; Harvard Apparatus, Massachusetts, Estados Unidos), insertado en el recto y se mantuvo a temperaturas fisiológicas usando una cobertura de calentamiento controlada de forma termostática (Harvard Apparatus, Massachusetts, Estados Unidos). L temperatura central se mantuvo a valores fisiológicos por una combinación de control de cobertura homeotérmica.
G. Inducción de isquemia cerebral focal transitoria en ratones C57BI/6 La isquemia focal se indujo por oclusión de la arteria cerebral media izquierda (MCA) usando una técnica de filamento intraluminal (Heurteaux y col, 2006). Después de haberse realizado una incisión en el cuello en la línea media, se aislaron las arterias carótida externa y común izquierda y se ligaron con una sutura de seda 4-0 (Ethicon). Se colocó temporalmente un clip de aneurisma yasargil temporal (BMH31 , Aesculap, Tuttlingen, Alemania) en la arteria carótida interna. Se introdujo un filamento revestido 6-0 (Doccol, Redlands, CA, Estados Unidos), trucando en la punta con una llama abierta, a través de una incisión pequeña en la arteria carótida común y 13 mm distal de la bifurcación carótida para oclusión del origen de MCA. Los animales se mantuvieron a 37 °C durante una hora, después de lo cual el hilo se retiró con cuidado para permitir la reperfusión del territorio de MCA. Para controlar la gravedad de MCAO se determinó CBF regional (rCBF) por flujometría de láser Doppler (Perimed) usando una extensión de fibra óptica de 0,5 mm para la sonda maestra fijada en el cráneo intacto sobre el córtex isquémico (2 mm posterior y 6 mm lateral del bregma). Se realizó una operación simulada insertando el hilo en la arteria carótida común sin avanzarlo para ocluir la MCA. Se permitió a los animales recuperar la consciencia completa en una almohadilla calefactora antes de devolverlos a la jaula.
H. Determinación de volumen de infarto Para evaluar el volumen de infarto en el estudio postratamiento con NeuroAid II (MLC 901) (Ejemplo 5), los ratones se sacrificaron a las 24 horas después de la reperfusión. Sus cerebros se retiraron y se seccionaron en seis cortes coronales de 1 mm de grosor usando una cuchilla tisular (Phymep, Francia). Los cortes cerebrales coronales se sumergieron inmediatamente en cloruro de 2, 3, 5- Trifeniltetrazolio 2 % (TTC, Sigma, Francia) durante 20 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad seguido de fijación en una solución de paraformaldehído al 4 % durante una noche antes de análisis como se ha descrito previamente (Ding-Zhou y col., 2002). Las áreas estriada y cortical del infarto, perfiladas en la luz se midieron en cada sección usando un sistema de análisis de imagen por ordenador y se corrigieran por edema cerebral de acuerdo con Golanov y Reis (Golanov y Reis, 1995). El volumen de infarto, expresado en mm3 se calculó por una integración lineal de las áreas de lesiones corregidas.
Además se usó violeta de cresilo, un colorante que tiñe los cuerpos de Nissl en los somas estrellados de neuronas viables para confirmar la evolución del volumen de infarto en ratones isquémicos. Se añadieron secciones congeladas coronales de cerebro (10 µ?? de grosor) a una solución de violeta de cresilo 1 % en ácido acético 0,25 % durante 3 minutos, se aclararon, se deshidrataron y se montaron con Entellan. Las secciones se analizaron en microscopio óptico.
Ejemplo 1 Efecto de Dosis de NeuroAid™ (MLC 601) en la viabilidad celular y liberación de LDH Las células corticales, como se prepararon por los procedimientos desvelados anteriormente, se expusieron a cuatro concentraciones de NeuroAid™ (MLC 601 ): 0,1 , 0,5, 1 ,0, 10 µ9/??? del Día 1 al Día 14 de cultivo. La viabilidad celular se estudió el Día 8, 10 y 14 por los procedimientos desvelados anteriormente y los resultados se muestran en la Figura 1.
El efecto del tratamiento con NeuroAid™ (MLC 601 ) contra la neurodegeneración de células corticales a lo largo del tiempo en cultivo también se analizó por liberación de LDH. El aumento del daño celular que conduce a muerte celular se asocia con aumento de la liberación de LDH. La liberación de LDH se midió el día 10 y el día 14 por los procedimientos desvelados anteriormente y los resultados se muestran en la Figura 2.
Resultados La Figura 1 muestra que el Día 14, un tratamiento con NeuroAid™ (MLC 601 ) a una concentración de 1 µ ???\ indujo un aumento significativo (35 %) en la supervivencia neuronal en comparación con el control (**P<0,01 ). Hasta el Día 10 no hubo una diferencia significativa en el porcentaje de viabilidad celular en células tratadas con concentraciones de NeuroAid™ (MLC 601 ) de 0, 1-0,5-1 ,0 µg/ml en comparación con el control (P>0,05) (n=10 pocilios por grupo experimental).
La Figura 2 muestra la relación de liberación de LDH/viabilidad celular el Día 10 y el Día 14 a las concentraciones de NeuroAid™ (MLC 601 ) 1 µ?/?t??. En comparación con el control, el tratamiento con NeuroAid™ (MLC 601 ) redujo significativamente la liberación de LDH después de 10 y 14 días de cultivo (P<0,01) (n=10 pocilios por grupo experimental).
Basándose en los datos experimentales del Ejemplo 1 , puede demostrarse que el tratamiento con NeuroAid™ (MLC 601) en células corticales en cultivo demuestra un aumento de la viabilidad celular y una reducción de la liberación de LDH, que es un marcador del daño celular. El Ejemplo 1 también demuestra que NeuroAid™ (MLC 601) puede usarse para reducir el efecto de apoplejía o neurodegeneración en sujetos predispuestos o sujetos en riesgo de apoplejía o neurodegeneración, para tratar pacientes con tejidos enfermos o lesionados de los sistemas nerviosos central o periférico o para su uso como un reactivo de cultivo celular.
Ejemplo 2 Efecto de NeuroAid™ (MLC 601) en la proliferación neuronal/neuroqénesis DCX es una proteína asociada a microtúbulos altamente hidrófila que se expresó específicamente en todos los precursores migratorios del SNC en desarrollo y en áreas de neurogénesis continua en el cerebro adulto. La proliferación neuronal se analizó a partir de la expresión de DCX en células corticales en cultivo por los procedimientos desvelados anteriormente. Las células corticales, como se prepararon por los procedimientos desvelados anteriormente, se trataron con NeuroAid™ (MLC 601) 1 µg/ml desde el Día 1 hasta el Día 14 de cultivo. Las células se prepararon después y se observaron usando epifluorescencia y microscopía confocal como se ha descrito en los procedimientos anteriores para determinar la expresión de DCX. Los resultados se muestran en la Figura 3.
Resultados En la Figura 3, la tinción con un anticuerpo contra DCX muestra que el Día 3 no hubo diferencia en la expresión de DCX entre el control y las células corticales tratadas con NeuroAid™ (MLC 601 ) 1 µ9/?t??. Sin embargo, el Día 14, la inmunorreactividad de DCX desapareció en el control, mientras que hubo un aumento de la expresión de DCX inducida por tratamiento con NeuroAid™ (MLC 601), destacando el desarrollo de una red axónica y dendrítica importante.
Debido a su asociación con procedimientos neurogénicos, la proteína DCX se usa actualmente como un marcador para neurogénesis. DCX es una proteína asociada a microtúbulos cuya expresión se asocia con todos los precursores neuronales de migración en el cerebro fetal y adulto. Parece que DCX es importante para la migración de desarrollo normal de las neuronas corticales, debido a que mutaciones en DCX en seres humanos conduce a síndromes caracterizados por detención de la migración de estas neuronas y que se manifiesta clínicamente por heterotopias laminares subcorticales, retraso mental y ataques. DCX también se expresa en algunas neuronas maduras en el cerebro adulto, en el que está implicada en crecimiento de axones y sinaptogénesis.
Por lo tanto, basándose en los datos experimentales del Ejemplo 2, puede demostrarse que el tratamiento con NeuroAid™ (MLC 601) da como resultado un aumento de la expresión de DCX en células corticales, lo que sugiere fuertemente que el tratamiento con NeuroAid™ (MLC 601) potencia la neuroproliferación, neurogénesis y neurorreparación necesaria para restaurar la función neurológica (tal como motora y cognitiva). El Ejemplo 2 también demuestra que NeuroAid™ (MLC 601) puede usarse para promover crecimiento neuronal y proliferación de neuronas en tejidos de los sistemas nerviosos central o periférico, para promover el crecimiento celular y para un procedimiento para inducir supervivencia celular, crecimiento, proliferación o diferenciación de células usando NeuroAid™ (MLC 601 ).
Ejemplo 3 Efecto de tratamientos con NeuroAid™ (MLC 601) y NeuroAid II (MLC 901) en la viabilidad celular, liberación de LDH y proliferación neuronal Se expusieron células corticales a una concentración de NeuroAid™ (MLC 601) o NeuroAid II (MLC 901 ) de 1 µ9/?t?? desde el Día 1 hasta el Día 14 de cultivo. Esta concentración de 1 µ9/??? corresponde a los mejores resultados obtenidos en la viabilidad celular y liberación de LDH como se ha descrito anteriormente. La viabilidad celular se estudió el Día 8, 10, 12 y 14. La proliferación neuronal a lo largo del tiempo se analizó observando la expresión de DCX en células corticales en cultivo tratadas con NeuroAid™ (MLC 601) o NeuroAid II (MLC 901 ) 1 µg/ \.
Resultados La Figura 4 muestra que el Día 8, se observó un aumento significativo de la viabilidad neuronal en comparación con el control respectivo (**P<0,01 ; ***P<0,001) en células corticales tratadas con NeuroAid™ (MLC 601 ) o NeuroAid II (MLC 901 ) 1 9/?t??. Sin embargo, la mayor eficacia de ambos tratamientos se observó el Día 14 con -45 % de aumento de supervivencia celular (***P<0,001 ). No hubo diferencia significativa de la eficacia entre NeuroAid™ (MLC 601 ) y NeuroAid II (MLC 901 ) en las diferentes etapas del cultivo (n=10 pocilios por grupo experimental).
La Figura 5 muestra la comparación de tratamientos con NeuroAid™ (MLC 601 ) y NeuroAid II (MLC 901 ) en la relación de liberación de LDH/viabilidad celular el Día 8, 10, 12 y 14 a las concentraciones de 1 µg/ml. En comparación con el control, ambos tratamientos redujeron significativamente la liberación de LDH después de 12 y 14 días de cultivo (*P<0,05 y ***P<0,001 ) (n=10 pocilios por grupo experimental). No hubo diferencia significativa de la eficacia en la liberación de LDH entre los tratamientos con NeuroAid™ (MLC 601 ) y NeuroAid II (MLC 901 ).
La Figura 6 muestra que, en comparación con el control, las células corticales tratadas con NeuroAid™ (MLC 601) o NeuroAid II (MLC 901 ) 1 µ9/??? desarrollaron una red axónica y dendrítica mucho más densa desde el Día 3 en cultivo. El Día 14, la inmunorreactividad de DCX desapareció en el control y el mareaje de la proteína DCX se volvió diferente entre células corticales tratadas con NeuroAid™ (MLC 601) y células corticales tratadas con NeuroAid II (MLC 901). La proteína DCX se expresó siempre en procedimientos de células corticales tratadas por NeuroAid™ (MLC 601) o NeuroAid II (MLC 901). Sin embargo, pareció que en células corticales tratadas con NeuroAid II (MLC 901), también había un fuerte aumento de inmunorreactividad de DCX en el citoplasma de estas células.
Los resultados obtenidos con ambos tratamientos de NeuroAid™ (MLC 601) (NeuroAid™ (MLC 601 ) y NeuroAid II (MLC 901)) muestran un aumento de la supervivencia celular, un aumento de la liberación de LDH y un aumento de la expresión de DCX en células corticales. No hubo diferencia significativa entre los resultados de NeuroAid™ (MLC 601 ) y NeuroAid II (MLC 901). Por lo tanto, basándose en los datos experimentales, puede demostrarse que ambos tratamientos de NeuroAid™ (MLC 601) (NeuroAid™ (MLC 601) y NeuroAid II (MLC 901)) potencian la neuroproliferación, neurogénesis y neurorreparación y pueden ser una forma de tratamiento mejorado para enfermedades neurológicas y lesiones del sistema nervioso.
Los resultados experimentales anteriores también apoyan el uso de extractos de NeuroAid™ (MLC 601) y NeuroAid II (MLC 901) para mejora de la conectividad y supervivencia de todos los tipos de cultivos neuronales. Estos extractos podrían añadirse sistemáticamente a medio de cultivo clásicos para que los cultivos neuronales mejoren considerablemente su viabilidad, crecimiento dendrítico y sinaptogénesis. El Ejemplo 3 también demuestra que (NeuroAid™ (MLC 601) y NeuroAid II (MLC 901) pueden usarse para promover el crecimiento neuronal y proliferación de neuronas en tejidos de los sistemas nerviosos periférico o central, para promover el crecimiento celular, para tratar pacientes que tengan una afección seleccionada del grupo de depresión, indicaciones psiquiátricas, envejecimiento natural y muerte celular de cerebro traumático, reducir el efecto de apoplejía o neurodegeneración en sujetos predispuestos o sujetos en riesgo de apoplejía o neurodegeneración, promover el crecimiento celular, para tratar pacientes con tejidos enfermos o lesionados del sistema nervioso central o periférico, para su uso como un reactivo de cultivo celular y para un procedimiento para inducir supervivencia celular, crecimiento, proliferación o diferenciación de células.
Ejemplo 4 El efecto de pretratamiento con NeuroAid II (MLC 901) en ratones 24 horas postisquemia En este estudio, se pretrataron ratones (n=11) durante seis semanas con una solución de bebida de NeuroAid II (MLC 901) y la tasa de supervivencia se analizó a las 24 horas post-isquemia (Figura 7A). Los ratones control (n=10) recibieron una solución de bebida de agua del grifo.
Para determinar si un pretratamiento de NeuroAid II (MLC 901) aumenta la tasa de supervivencia de ratones sometidos a isquemia, se trató a los animales con NeuroAid II (MLC 901) durante seis semanas antes de la inducción de isquemia. La Figura 8 muestra que un pretratamiento de seis semanas de NeuroAid II (MLC 901),-proporcionado en la bebida indujo una reducción fuerte de la mortalidad de animales tratados con NeuroAid II (MLC 901), en comparación con ratones control. El pretratamiento con NeuroAid II (MLC 901) durante seis semanas indujo una tasa de supervivencia del 90,9 % en comparación con 40,0 % en el grupo de control.
El Ejemplo 4 demuestra que NeuroAid es beneficioso antes de una apoplejía isquémica. Estos estudios ilustran que NeuroAid redujo de forma ventajosa el tamaño de infarto y la tasa de mortalidad de ratones isquémicos en un modelo clínicamente relevante de apoplejía.
Ejemplo 5 El efecto de post-tratamiento agudo con NeuroAid II (MLC 901) en ratones 24 horas post-isquemia En este estudio, los ratones (n=10) recibieron una inyección intraperitoneal de post-tratamiento agudo de NeuroAid II (MLC 901), proporcionada en el comienzo de la isquemia y 6 horas después de reperfusión. Se inyectó a los ratones control (n=10) solución salina. La tasa de supervivencia y los volúmenes de infarto se cuantificaron a las 24 horas de reperfusión.
Para determinar si la administración aguda de NeuroAid II (MLC 901) protege contra apoplejía isquémica, se sometió a los ratones (n=10) a isquemia y se inyectó por vía intraperitoneal una dosis sencilla de solución de NeuroAid II (MLC 901) 1 mg/ml en la aparición de isquemia y 6 horas después de reperfusión. La administración aguda de NeuroAid II (MLC 901) indujo una tasa de supervivencia de 90,0 % en comparación con el 38,8 % observado en los ratones de control (Figura 9A). Este post-tratamiento con NeuroAid II (MLC 901 ) redujo drásticamente el infarto cerebral como se muestra en la Figura 9B. El post-tratamiento con NeuroAid redujo el volumen de infarto en 47,4 % (P<0,001) en comparación con ratones de control.
Estos estudios demuestran que NeuroAid es beneficioso tanto antes como después de una apoplejía isquémica. Estos estudios ilustran que NeuroAid redujo ventajosamente el tamaño de infarto y la tasa de mortalidad de ratones isquémicos en un modelo clínicamente pertinente de apoplejía.
Procedimientos para los Ejemplos 6 a 8 A. CULTIVO DE CÉLULAS CORTICALES Se anestesió a ratones embarazadas durante un tiempo (E14) C57BI6/J con isopentano seguido de dislocación cervical. Los fetos se retiraron y se colocaron en solución HBSS+ (Solución Salina Equilibrada de Hanks) fría. Los córtices cerebrales se diseccionaron en solución HBSS+ fría y se retiraron las meninges. Las muestras corticales se cortaron en trozos pequeños y se trituraron suavemente con una pipeta Pasteur de vidrio pulida al fuego en 8 mi de solución HBSS+. La mezcla se filtró (filtro de 40 µ?) y se centrifugó a 800 rpm durante 8 minutos. El sobrenadante se retiró y el sedimento se disolvió en 2 mi en medio de cultivo. Las células se sembraron en placas de 12 pocilios revestidas con Polilisina (24 mm de diámetro; Sigma-Aldrich i Chimie, St. Quentin Fallavier, Francia)) con cubreobjetos de vidrio (12 mm de diámetro; CML, Nemours, Francia) a una densidad de 1 x 106 células/pocilio. Los cultivos se mantuvieron a 37 °C en un incubador de atmósfera de CO2 al 5 % humidificado en Neurobasal complementado con B27, Glutamax, se usaron antibióticos para los experimentos después de 16 días. El crecimiento glial se suprimió por adición de 5-Fluoro-2-desoxiuridina (2 µ?) y Uridina (2 µ?) durante el segundo día de cultivo.
Los experimentos se controlaron por un investigador ciego al estado del tratamiento (n=3 cultivos, 36 pocilios por grupo experimental).
B. ENSAYO DE LESIÓN CELULAR: MEDICIONES DE SUPERVIVENCIA CELULAR Y LACTATO DESHIDROGENASA (LDH) La viabilidad celular se evaluó el Día 12 del cultivo celular usando el ensayo de proliferación celular Cell Titer 96 ® Aqueous One Solution (Promega, Charbonniéres-les-Bains, Francia) (n=3 cultivos, 36 pocilios por grupo experimental).
El ensayo fue un procedimiento colorimétrico, que se basó en el uso de la sal interna de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolio (MTS), un marcador de actividad mitocondrial y un reactivo de acoplamiento a electrón (fenacin etosulfato, PES). El compuesto de tetrazolio MTS se biorredujo por células a producto de formazan coloreado que es soluble en medio de cultivo tisular.
El Día 12, se retiró la totalidad del medio de cultivo celular y se reemplazó por 500 µ? de medio Neurobasal + kit Cell Titer 96 Aqueous One Solution: Kit de Ensayo de Proliferación Celular Cell Titer 96 ® Aqueous One Solution. De acuerdo con el protocolo del Kit de Ensayo de Proliferación, las células se incubaron durante 4 horas a 37 °C en incubador con atmósfera de CO2 al 5 % humidificado. La reacción se detuvo con Dodecil Sulfato Sódico (SDS) 2 %. Se midió la densidad óptica 4 horas después a 490 nm utilizando un lector de microplaca Labsystem Multiscan (Labsystem Multiscan RC, VWR International, Fontenay sous Bois, Francia). Se restó la absorbancia de fondo a 620. Los resultados se expresaron en Densidad Óptica (DO x 10-3) que representaba el número de células viables. Los datos se expresaron como el porcentaje de viabilidad celular, que se calculó dividiendo el valor de absorbancia de muestras tratadas por el del control no tratado dentro de cada grupo.
La lesión neuronal se evaluó cuantitativamente por la medición de la liberación de deshidrogenasa láctica (LDH) de neuronas cultivadas incubadas en medio de cultivo celular el Día 12 del cultivo celular (Koh y Choi, 1987). El ensayo de liberación de LDH proporcionó una medida de la integridad de la membrana citoplasmática. El Día 12, se transfirieron 100 µ? del medio de cultivo celular de pocilios de cultivo a placas de 96 pocilios y se mezclaron con 100 µ? de solución de reacción de acuerdo con el kit de ensayo de LDH (Roche Diagnostic: kit de Detección de Citotoxicidad: ref 1644793, Indianápolis, Estados Unidos). La densidad óptica (DO) se midió 30 minutos después a 492 nm utilizando un lector de microplaca Labsystem Multiscan (Labsystem Multiscan RC, VWR International, Fontenay sous Bois, Francia). Se restó la absorbancia de fondo a 620. Se usaron neuronas expuestas a una solución de lisis (PBS que contenía Tritón X-100 0,1 %) como control positivo y se estableció como liberación de LDH 100 %. Los datos se expresaron como la relación de salida de LDH/viabilidad celular.
Los resultados correspondieron a la media de tres experimentos independientes con determinación por triplicado. Los análisis estadísticos de viabilidad celular y resultados de LDH se evaluaron usando un ensayo ANOVA de un factor (análisis de varianza) seguido de ensayo post-hoc (P<0,05).
C. ISQUEMIA FOCAL Los investigadores que llevaron a cabo la cirugía isquémica y midieron los volúmenes de infarto eran doblemente ciegos con respecto al código de tratamiento. Modelo de Isquemia Focal Se indujo isquemia focal en ratones machos adultos C57/B16, que pesaban de 22 a 26 g (7-9 semanas de edad) por oclusión de la arteria cerebral media izquierda (MCA) usando una técnica de filamento intraluminal (Huang y col., 1994). Las arterias carótidas externa y común izquierda se aislaron y ligaron con una sutura de seda 4-0 (Ethicon). Se colocó temporalmente un clip de aneurisma yasargil temporal (BMH31 , Aesculap, Tuttlingen, Alemania) en la arteria carótida interna. Se introdujo un filamento revestido 6-0 (Doccol, Redlands, CA, Estados Unidos), a través de una incisión pequeña en la arteria carótida común y 13 mm distal de la bifurcación carótida para oclusión del origen de la MCA. Se mantuvo a los animales a 37 °C durante una hora, después de lo cual el hilo se retiró cuidadosamente para permitir la reperfusión del territorio de MCA. Para controlar la gravedad de la MCAO se determinó CBF regional (rCBF) por flujometría de láser de Doppler (Pehmed) usando una extensión de fibra óptica de 0,5 mm flexible para la sonda maestra fijada en el cráneo intacto sobre el córtex isquémico 2 mm posterior y 6 mm lateral del bregma). Se realizó una operación simulada insertando el hilo en la arteria carótida común sin avanzarlo para ocluir la MCA. Se permitió que los animales recuperaran la consciencia completa en una almohadilla de calentamiento antes de devolverlos a la jaula.
Determinación de Volumen de Infarto A las 30 horas después de reperfusión, se realizó tinción con violeta de cresilo en secciones cerebrales congeladas coronales (10 µ?t? de grosor) usando una solución de violeta de cresilo 1 % en ácido acético 0,25 % y se montaron con Entellan. Las áreas estriada y cortical del infarto, perfiladas en la luz se midieron en cada sección usando un sistema de análisis de imagen informático y se corrigieron con respecto a edema cerebral de acuerdo con Golanov y Reís (Golanov y Reis, 1995). El volumen de infarto, expresado en mm3 se calculó por una integración lineal de las áreas de lesiones corregidas como se ha descrito previamente (Heurteaux y col., 2006a).
D. TRATAMIENTOS FARMACOLÓGICOS La composición de NeuroAid II (MLC 901) usada (0,4 g por cápsula) fue como sigue: 0,57 g Radix astragali, 0,1 14 g Radix salvia miltiorrhizae, 0,1 14 g Radix paeoniae rubra, 0,114 g Rhizoma chuanxiong, 0,1 14 g Radix angelicae sinensis, 0,114 g Carthamus tinctorius, 0,114 g Prunus pérsica, 0,1 14 g Radix polygalae, 0,1 14 g Rhizoma acori tatarinowii, 0,0665 Hirudo.
Para experimentos in vitro, el tratamiento de células con NeuroAid II (MLC 901), Rhizoma chuanxiong, Radix angelicae sinensis y Rhizoma chuanxiong/Radix angelicae sinensis combinados estaban a una concentración de 1 µ9/?t??, comenzando en el Día 3 de cultivo durante 12 días (correspondiente a 15 días de cultivo).
Para post-tratamiento in vivo, se inyectó a los ratones por vía intraperitoneal una dosis sencilla de solución de NeuroAid II (MLC 901) de 2 µg/ml diluida en solución salina (como vehículo) en un volumen total de 500 µ?/ratón que pesaba 25 g 3 y 24 horas después del final de la isquemia. Para pretratamiento in vivo, se proporcionó pretratamiento de NeuroAid II (MLC 901), Rhizoma chuanxiong, Radix angelicae sinensis y Rhizoma chuanxiong/Radix angelicae sinensis combinados en agua potable a la concentración de 6 mg/ml durante las 6 semanas antes de la inducción de isquemia.
E. INMUNOHISTOQUÍMICA EN NEURONAS CORTICALES EN CULTIVO Se fijaron células corticales en cubreobjetos con paraformaldehído 4 %/PBS, se permeabilizaron en polioxietilensorbitan monolaurato 0,3 % (Tween 20, Sigma) durante 10 minutos y se bloquearon con suero de burro 2,5 % en PBS durante 2 horas a temperatura ambiente. Las células se incubaron con un anticuerpo anti doble cortina (DCX) de cabra (1 :200, SC-8066, Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA) en suero de burro 2 %/solucíón salina tamponada con fosfato durante una noche (Heurteaux y col., 2006b). Después de 3 lavados en solución salina tamponada con fosfato (PBS), las células se incubaron en anticuerpos acoplados con Alexa 488-anticabra (FluoProbes, Interchim, Montlucon, Francia) en suero de burro 2 % durante 2 horas y se lavaron tres veces en PBS durante 5 minutos cada una. Las neuronas se incubaron después en solución de Hoechst (3 µ? en 10 mi; Sigma-Aldricht Chimie, Saint Quentin Fallavier, Francia) durante 10 minutos para marcar núcleos celulares. Después de 2 lavados en PBS y un lavado en agua, los cubreobjetos se secaron y se montaron en portaobjetos de vidrio con Fluoroprep (75521; BioMérieux, Marcy l'Etoile, Francia). Las células se observaron usando microscopía de epifluorescencia.
La especificidad de señal se evaluó en cubreobjetos con control negativo omitiendo anticuerpo primario. Se capturaron imágenes de microscopía de epifluorescencia de mareaje de proteínas con un tiempo idéntico de exposición después de corrección espectral del fondo de autofluorescencia. Las neuritas diferenciadas de neuronas corticales en cultivo se observaron por inmunotinción con DCX el Día 12 del tratamiento. El crecimiento de neuritas se determinó en microscopía de epifluorescencia midiendo la longitud total de las neuritas en placas de cultivo en diferentes momentos del tratamiento usando una imagen fotográfica celular y software Neurite Tracer Image J (Pool y col., 2008).
F. ANÁLISIS ESTADÍSTICOS Los datos se expresaron como media ± E.T.M. Se analizó análisis estadístico de las diferencias entre grupos usando ensayo de t para muestras independientes o ANOVA. Cuando las relaciones de F fueron significativas, los análisis estadísticos se extendieron y se realizaron comparaciones post-hoc usando ensayos de comparación múltiple del ensayo de Tukey. En todos los análisis, el nivel de significación se estableció a P<0,05.
Ejemplo 6 Efectos comparativos entre NeuroAid II (MLC 901), Rhizoma chuanxiong, Radix angelicae sinensis y Rhizoma chuanxiong/Radix angelicae sinensis combinados en viabilidad celular y liberación de LDH Las células corticales, como se prepararon por los procedimientos desvelados anteriormente, se expusieron a una concentración de NeuroAid II (MLC 901), Rhizoma chuanxiong, Radix angelicae sinensis o Rhizoma chuanxiong/Radix angelicae sinensis combinados de 1 µg/ml durante 12 días.
Los efectos de NeuroAid II (MLC 901) se compararon con los del tratamiento con Rhizoma chuanxiong, Radix angelicae sinensis o Rhizoma chuanxiong/Radix angelicae sinensis combinados frente a neurodegeneración de células corticales el Día 15 del cultivo (Día 12 del tratamiento) usando viabilidad celular y mediciones de LDH como se ha desvelado en los procedimientos anteriores. Los resultados se muestran en la Figura 10.
Resultados ! La Figura 10A muestra que a la concentración de 1 µ9/Gt»? los tres tratamientos indujeron un aumento significativo de la viabilidad neuronal en comparación con el control (*P<0,05, **P<0,01 , ***P<0,001). Sin embargo, NeuroAid II (MLC 901) demostró una mayor eficacia en las supervivencia celular en comparación con tratamientos con Rhizoma chuanxiong o Radix angelicae sinensis. Como se muestra en la Figura 10A, un tratamiento con NeuroAid II (MLC 901) indujo un aumento de aproximadamente 51 % de la viabilidad celular, en comparación con el control (***p<0,001), mientras que el aumento de la supervivencia celular inducido por Rhizoma chuanxiong, Radix angelicae sinensis y Rhizoma chuanxiong/Radix angelicae sinensis combinados fue de 37 %, 29,5 % y 35 % respectivamente. Hubo una diferencia significativa de eficacia entre los tratamientos de NeuroAid II (MLC 901) y Rhizoma chuanxiong, Radix angelicae sinensis y Rhizoma chuanxiong/Radix angelicae sinensis combinados (##P<0,1) (n=36 pocilios por grupo) Se sabe bien que el aumento del daño celular que conduce a muerte celular se asocia con aumento de la liberación de Lactato Deshidrogenasa (LDH). La Figura 10B muestra que en comparación con el control, los tres tratamientos redujeron significativamente la relación de liberación de LDH/viabilidad celular después de 12 días de tratamiento (*P<0,05 y **P<0,01). La Figura 10B también muestra que NeuroAid II (MLC 901 ) redujo significativamente la liberación de LDH en comparación con tratamiento con Rhizoma chuanxiong, Radix angelicae sinensis o Rhizoma chuanxiong/Radix angelicae sinensis combinado (##P<0,01) (n=36 pocilios por grupo).
Basándose en los datos experimentales del Ejemplo 6, puede demostrarse que NeuroAid II (MLC 901) es más potente al aumentar la viabilidad celular y reducir la liberación del LDH, en cultivo que Rhizoma chuanxiong, Radix angelicae sinensis o Rhizoma chuanxiong/Radix angelicae sinensis combinados.
Ejemplo 7 Efectos comparativos in vivo de NeuroAid II (MLC 901), Rhizoma chuanxiong. Radix angelicae sinensis y Rhizoma chuanxiong/Radix angelicae sinensis combinados contra lesión cerebral isguémica in vivo Post-Tratamiento: Para comparar los efectos de NeuroAid II (MLC 901), Rhizoma chuanxiong, Radix angelicae sinensis y Rhizoma chuanxiong/Radix angelicae sinensis combinados in vivo, cada tratamiento se ensayó en un modelo de ratón de isquemia focal.
La isquemia se indujo por oclusión transitoria de la arteria cerebral media (MCAO) durante 60 minutos (Huang y col., 1994). Se sometió a los ratones (n=12) a isquemia focal y se les inyectó por vía intraperitoneal a las 3 horas y otra vez de nuevo a las 24 horas después de MCAO una dosis sencilla de 1 g de solución de NeuroAid II (MLC 901), Rhizoma chuanxiong, Radix angelicae sinensis o Rhizoma chuanxiong/Radix angelicae sinensis combinados.
La administración aguda de cada tratamiento indujo una tasa de supervivencia significativa, con una mejor eficacia obtenida con NeuroAid II (MLC 901). La Figura 1 1A muestra que se consiguió una tasa de supervivencia del 89 % con NeuroAid II (MLC 901 ) en comparación con una tasa de supervivencia de 58,5 %, 64 %, 73 % y 75 % en ratones isquémicos tratados con vehículo, rhizoma chuanxiong, radix angelicae y Rhizoma chuanxiong/Radix angelicae sinensis combinados, respectivamente.
La reducción drástica del infarto cerebral como se muestra en la Figura 1 1 B confirma que se observó el mejor resultado con NeuroAid II (MLC 901). La Figura 1 1 B muestra que NeuroAid II (MLC 901) redujo el volumen de apoplejía en 48,4 % (***p<0,001) en comparación con ratones isquémicos de control a las 30 horas postisquemia. El tamaño de infarto en ratones tratados con rhizoma chuanxiong, radix angelicae y Rhizoma chuanxiong/Radix angelicae sinensis combinados fue significativamente mayor que en animales tratados con NeuroAid II (MLC 901) después de 30 horas de reperfusión (Figura 1 1 B, #P<0,05, ##P<0,001 frente a grupo de NeuroAid II (MLC 901)).
Pre-tratamiento: Para comparar los efectos in vivo potenciales entre MLC 901 , Rhizoma chuanxiong y Radix angelicae sinensis en la prevención contra apoplejía, cada tratamiento se ensayó en pre-tratamiento.
Se trató a los animales (n=12) con NeuroAid II (MLC 901 ), Rhizoma chuanxiong o Radix angelicae sinensis administrados en el agua potable (6 mg/ml) durante 6 semanas antes de la inducción de isquemia. No hubo diferencia significativa en el consumo de alimento y solución bebida entre los grupos tratados con vehículo y NeuroAid II (MLC 901 ). La Figura 12A muestra que un pretratamiento de 6 semanas de NeuroAid II (MLC 901), Rhizoma chuanxiong y Radix angelicae sinensis indujo una reducción de la mortalidad de los animales tratados, en comparación con los ratones isquémicos de control.
El pre-tratamiento indujo una tasa de supervivencia del 92 %, 78 % y 70 % en NeuroAid II (MLC 901), Rhizoma chuanxiong y Radix angelicae sinensis, respectivamente en comparación con 70,5 % en el grupo de control. El mejor resultado para disminuir los efectos de apoplejía o neurodegeneración en sujetos predispuestos o sujetos en riesgo de apoplejía o neurodegeneración obtenido con NeuroAid II (MLC 901) se confirmó por una reducción significativa del volumen de infarto, que fue del 39 % y 24,5 % menos importante en comparación con Rhizoma chuanxiong y Radix angelicae sinensis (Fig. 3B, P<0,01).
Estos estudios en el Ejemplo 7 demuestran que NeuroAid II (MLC 901) es más potente que Rhizoma chuanxiong o Radix angelicae sinensis en pre- tratamiento de isquemia focal y NeuroAid II (MLC 901) es más potente que Rhizoma chuanxiong, Radix angelicae i sinensis o Rhizoma chuanxiong/Radix angelicae sinensis combinados en post-tratamiento de isquemia focal.
Ejemplo 8 Efectos comparativos de NeuroAid II (MLC 901), Rhizoma chuanxiong. Radix angelicae sinensis y Rhizoma chuanxiong/Radix angelicae sinensis combinados en neuroproliferación y crecimiento de neuritas Para analizar los efectos de NeuroAid II (MLC 901), Rhizoma chuanxiong, Radix angelicae sinensis y Rhizoma chuanxiong/Radix angelicae sinensis combinados en proliferación neuronal y crecimiento de neuritas, la expresión de DCX en células corticales cultivadas de ratones embrionarios se comparó después de 14 días de tratamiento.
Se muestran imágenes de microscopía de epifluorescencia representativas de la tinción de DCX en la Figura 13. La Figura 13 muestra que hubo un aumento de la expresión de DCX inducido por NeuroAid II (MLC 901), Radix angelicae sinensis o Rhizoma chuanxiong/Radix angelicae sinensis combinados, destacando el desarrollo de una red axónica y dendrítica importante con estos tres tratamientos en comparación con células tratadas con el grupo de vehículo o Rhizoma chuanxiong solamente.
La cuantificación de la intensidad de fluorescencia en cada imagen de microscopía de epifluorescencia se muestra en la Figura 14. La Figura 14 muestra que el mejor efecto neuroproliferativo se obtuvo en cultivos corticales tratados con NeuroAid ll (MLC 901 ).
Para investigar si el tratamiento con NeuroAid II (MLC 901), Rhizoma chuanxiong, Radix angelicae sinensis o Rhizoma chuanxiong/Radix angelicae sinensis combinados podía promover el crecimiento de neuritas, se midió la longitud total de las neuritas en neuronas corticales cultivadas el Día 14 del tratamiento.
La Figura 15 muestra que NeuroAid II (MLC 901 ), Radix angelicae sinensis y Rhizoma chuanxiong/Radix angelicae sinensis combinados indujeron un crecimiento de neuritas significativo en comparación con el grupo de vehículo (*P<0,05, ***P<0,001 ). La mejor actividad promotora del crecimiento de neuritas se observó para NeuroAid II (MLC 901) en comparación con la de Radix angelicae sinensis sola o Rhizoma chuanxiong/Radix angelicae sinensis combinado (#P<0,05).
Estos estudios en el Ejemplo 8 demuestran que NeuroAid II (MLC 901 ) es más potente que Rhizoma chuanxiong, Radix angelicae sinensis o Rhizoma chuanxiong/Radix angelicae sinensis combinados para producir neuroproliferación y crecimiento de neuritas.
Aplicaciones Provechosamente, las composiciones y procedimientos desvelados proporcionan una nueva estrategia terapéutica, que se centra en la reparación neuronal y restaurar las funciones neurológicas.
Los procedimientos desvelados proporcionan terapias regenerativas para tratar lesiones del sistema nervioso y enfermedades neurológicas, promoviendo el crecimiento neuronal para permitir que los nervios dañados o enfermos funcionen de nuevo.
Los procedimientos desvelados también pueden usarse para promover el crecimiento celular in vitro. Provechosamente, el cultivo in vitro de diversas células puede usarse para ingeniería de tejidos o usos terapéuticos ex vivo.
Resultará evidente que diversas otras modificaciones y adaptaciones de la invención serán evidentes para el experto en la materia después de leer la divulgación anterior sin apartarse del espíritu y el alcance de la invención y se pretende que todas las modificaciones y adaptaciones tales queden dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Una composición, caracterizada porque comprende al menos dos componentes seleccionados del grupo que constituido por: Radix et Rhizoma Salviae Miltiorrhizae (raíz de Salvia miltiorrhiza o Dan Shen), Prunus pérsica (semilla de melocotón o taoren), Radix Polygalae (raíz de Polygala tenuifolia Willd., Polygala sibirica L. o Yuanzhi) y Rhizoma acori Tatarinowii (rizoma de Acorus gramineus o Shichangpu) y combinaciones de los mismos, para su ¡uso en promover el crecimiento neuronal y la proliferación de neuronas en tejidos del sistema nervioso central o periférico.
2. La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada porque comprende adicionalmente un componente seleccionado del grupo constituido por: Radix Astragali (raíz de Astragalus propinquus o Huang Qi), Radix Paeoniae Rubra (raíz de peonía Roja, paeonia lactiflora Pall, Paeonia veitchii Lynch o Chi Shao), rizoma de Ligusticum chuanxiong (Chuan Xiong), flor de Carthamus tinctorius (Cártamo o HongHua), radix angelicae sinensis (raíz de angélica china o DanGui) y combinaciones de los mismos.
3. La composición de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizada porque comprende adicionalmente un componente seleccionado del grupo constituido por: Buthus martensii (cuerpo seco de escorpión o Quanxie), Eupolyphaga Seu Seteleophaga (cuerpo seco de carábido, Eupolyphaga sinensis Walker, Steleophaga plancyi o Tubiechong), Calculus Bovis Artifactus (bezoar de vaca natural o artificial o Rengong Niuhuang), Cornu Saigae Tataricae (cuerno de antílope o Lingyangjiao) y cuerpo seco de sanguijuelas (Hirudo, Whitmania pigra Whitman, Hirudo nipponica Whitman Whitmania acranulata Whitman o Shuizhi).
4. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque dichos componentes son adecuados para administración a un ser humano como un medicamento en combinación, de forma secuencial o de forma separada.
5. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, caracterizada porque comprende por lo menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 2, 13 ó 14 de los componentes.
6. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque el medicamento promueve el crecimiento neuronal y la proliferación de neuronas en tejidos lesionados o enfermos.
7. La composición de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque la enfermedad se selecciona de una cualquiera de las siguientes enfermedades: distrofia muscular de Duchenne, ataxia de friedreich, enfermedad de Steinert y siringomielia.
8. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque comprende adicionalmente un agente usado en medicina occidental para promover el crecimiento neuronal y la proliferación de neuronas en tejidos del sistema nervioso periférico, siendo dicha composición y dicha medicina occidental adecuadas para su administración a un ser humano como un medicamento en combinación, de forma secuencial o de forma separada.
9. La composición de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque la medicina occidental se selecciona del grupo constituido por factores de crecimiento tales como proteínas morfogenéticas del hueso (BMP), factor de crecimiento epidérmico (EGF), eritropoyetina (EPO), factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), factor estimulador de colonias de granulocitos (G-CSF), factor estimulador de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF), factores de crecimiento de hepatocitos (HGF), factor de crecimiento de tipo insulina (IGF), miostatina (GDF-8), factor de crecimiento de nervios (NGF), neurotrofinas, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), trombopoyetina (TPO), factor de crecimiento transformante alfa (TGF-a), factor de crecimiento transformante beta (TGF-ß), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), lnterleucina-1 p (IL-? ß), IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-7, IL-8, IL-21 , IL-33, M-CSF, Noggina, Interferones (IFN)-a, IFN-ß y IFN-?.
10. Un reactivo de cultivo celular para promover el crecimiento celular, caracterizado porque comprende un medio de cultivo y al menos tres de los siguientes componentes: Radix Astragali (raíz de Astragalus propinquus o Huang Qi), Radix et Rhizoma Salviae Miltiorrhizae (raíz de Salvia miltiorrhiza o Dan Shen), Radix Paeoniae Rubra (raíz de peonía roja, Paeonia lactiflora Pall, Paeonia veitchii Lynch o Chi Shao), rizoma de Ligusticum chuanxiong (Chuan Xiong), radix angelicae sinensis (raíz de angélica china o DanGui), flor de Carthamus tinctorius (Cártamo o HongHua), Prunus pérsica (semilla de Melocotón o Taoren), Radix Polygalae (raíz de Polygala tenuifolia Willd., Polygala sibirica L. o Yuanzhi) y Rhizoma acori Tatarinowii (rizoma de Acorus gramineus o Shichangpu),
11. El reactivo de cultivo celular de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque comprende adicionalmente un componente seleccionado del grupo constituido por: Buthus martensii (cuerpo seco de escorpión o Quanxie), cuerpo seco de sanguijuelas (Hirudo, Whitmania pigra Whitman, Hirudo nipponica Whitman Whitmania acranulata Whitman o Shuizhi), Eupolyphaga Seu Seteleophaga (cuerpo seco de carábido, Eupolyphaga sinensis Walker, Steleophaga plancyi o Tubiechong), Calculus Bovis Artifactus (bezoar de vaca natural o artificial o Rengong Niuhuang) y Cornu Saigae Tataricae (cuerno de antílope o Lingyangjiao).
12. El reactivo de cultivo celular de conformidad con las reivindicaciones 10 u 11 , caracterizado porque comprende por lo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13 ó 14 de los componentes.
13. El reactivo de cultivo celular de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, caracterizado porque promueve el crecimiento y proliferación neuronal y el crecimiento de células madre, condrocitos, células del músculo esquelético, miocardio, células del músculo liso, hepatocitos, células renales, islotes de Langerhans y células cutáneas epiteliales.
14. El reactivo de cultivo celular de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, caracterizado porque comprende adicionalmente una medicina occidental para promover el crecimiento celular.
15. El reactivo de cultivo celular de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque la medicina occidental se selecciona del grupo constituido por factores de crecimiento tales como proteínas morfogenéticas del hueso (BMP), factor de crecimiento epidérmico (EGF), eritropoyetina (EPO), factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF), factores de crecimiento de hepatocitos (HGF), factor de crecimiento de tipo insulina (IGF), miostatina (GDF-8), factor de crecimiento de nervios (NGF), neurotrofinas, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), trombopoyetina (TPO), factor de crecimiento transformante alfa (TGF-a), factor de crecimiento transformante beta (TGF-ß), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), lnterleucina-?ß (IL-?ß), IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-7, IL-8, IL-21 , IL-33, M-CSF, Noggina, Interferones (IFN)-a, IFN-ß y IFN-?, AX-200 (G-CSF, Fligrastim), uso combinado de estatinas y otros fármacos reductores de colesterol, eritropoyetina, cerebrolisina y CDP-colina (citidin-5 -difosfocolina).
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