RS60009B1 - Neurozaštitna kompozicija koja obuhvata polygalae, astragali, chuanxiong i angelica sinensis - Google Patents

Description

Opis

Oblast pronalaska

[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na upotrebu komponenti iz tradicionalne kineske medicine (TCM) za aktivaciju ATP-senzitivnih kalijumovih kanala (KATPkanala).

[0002] Ne postoje saznanja da su bilo koji od različitih dokumenata itd. navedenih u ovom tekstu stanje tehnike u vezi sa predmetnim pronalaskom.

UVOD

[0003] MLC 601 (NeuroAid) pokazuje obeavajuće rezultate kod oporavka pacijenta posle moždanog udara (Chen et al., 2009). Kombinuje se 9 biljnih i 5 životinjskih komponenti. Sada je takođe dostupna njegova uprošćena formula MLC601 koja je poznata pod imenom MLC901 (NurAid II, Neuroaid II ili Neuroaid2) na osnovu njegovih 9 biljnih komponenti. MLC-601 tretman se trenutno koristi u nekoliko zemalja i u Aziji i na Srednjem istoku za pacijente koji su oboleli od moždanog udara. U Aziji je u toku multicentrično, nasumično, dvostruko slepo placebo kontrolisano ispitivanje da bi se ispitala Efikasnost Kineskog Leka MLC601 na oporavak od Moždanog udara (CHIMES) (Venketasubramanian et al., 2009). Bezbednost MLC601 na hemostazu, hematologiju i biohemiju je uspostavljena i kod normalnih subjekata i kod pacijenata koji su oboleli od moždanog udara (Gan et al., 2008; Young et al., 2010). Očigledna efikasnost u poboljšanju brzine cerebralnog protoka krvi (Shahripour et al., 2011) i rehabilitacije od moždanog udara, čak nekoliko meseci posle moždanog udara (Chen et al., 2009) su snažni argumenti za nastavljanje fundamentalnih ispitivanja za bolje razumevanje u životinjskim modelima kao i na ćelijskim i molekulskim nivoima kakav je mehanizam rada MLC901. Kod pacova smo prethodno pokazali da oba, MLC601 i MLC901 unapređuju preživljavanje, štite mozak od fokalne ishemijske povrede i drastično smanjuju funkcionalne deficite koji su indukovani moždanim udarom (Heurteaux et al., 2010). Osim toga, u modelu globalne ishemije imitiranjem srčanog zastoja, pokazano je da MLC901 vrši prevenciju i nekroze i apoptoze neurona hipokampusa i da poboljšava i motorni i kognitivni oporavak (Quintard et al., 2011). WO 2007/106049, WO 2010/110755, Sherry and Young, 2010 (Cerebrovascular Diseases, vol.30, strane 1-6) i WO 2010/053456 prikazuje upotrebu Neuroaid i/ili Neuroaid2 za lečenje šloga i drugih poremećaja.

[0004] Među mnogim mogućim mehanizmima korisnih efekata MLC601 ili MLC901 protiv ishemije uspostavili smo da stimulišu ekspresiju BDNF, pojačavaju neurogenezu, promovišu ćelijsku proliferaciju i podstiču rast neurita. Osim toga put Akt, koji je poznat da učestvuje u ćelijskom preživljavanju izgleda je kritičan u zaštitnom efektu MLC901, i TCM sprečava preteranu oksidaciju lipida proizvedenu ishemijom (Quintard et al., 2011).

[0005] Mozak zahteva neprekidno snabdevanje kiseonikom i glukozom da bi se održala njegova funkcija. Neuroni su ekstremno osetljivi na hipoksičnu povredu. U kliničkim stanjima kao što je cerebralna ishemija u roku od nekoliko minuta od teške hipoksije se dešava trajni gubitak funkcija neurona. Homeostaza jona (Na+ , K+ , Ca2+ , Cl-) moždanog tkiva je u velikoj meri narušena i neuroni depolarizuju nakon čega sledi deprivacija (nedostatak) kiseonika koja dovodi do bubrenja, opterećenja kalcijumom, a nakon toga i do smrti neurona (Dirnagl et al., 1999; Lee et al., 2000, Obrenovitch, 2008). Zbog toga u uslovima ishemije, nivo unutarćelijskog ATP u suštini opada, zbog toga je odnos ADP/ATP drastično povećan, KATPkanali su aktivirani što dovodi do hiperpolarizacije membrane (Amoroso et al., 1990; Ashcroft and Ashcroft, 1990; Mourre et al., 1989). Ova hiperpolarizacija u kratkom periodu sprečava masivno oslobađanje ekscitotoksičnog glutamata. Predložena je odložena aktivacija KATPkanala kao mogući način neurozaštite protiv ishemije mozga i zaista je pokazano da otvarači za KATP omogućavaju neurozaštitu (Blondeau et al., 2000; Heurteaux et al., 1993; Heurteaux et al., 1995; Lauritzen et al., 1997, Liss and Roeper, 2001).

[0006] Ovde opisani rad je dizajniran da bi se ispitala terapeutska efikasnost MLC901 u ćelijskom modelu kombinovane deprivacije kiseonika i glukoze, koji specifično imitira brzo uklanjanje kiseonika i glukoze koje se uočava pod ishemijskom uslovima in vivo. Smrt neurona indukovana uklanjanjem kiseonika sa glukozom je inhibirana sa glibenklamidom, inhibitorom KATPkanala. Aktivacija ovih kanala omogućava ćelijama da prežive. Među zanimljivim kandidatima za neurozaštitu protiv ishemije, ovaj rad je pokazao veoma zanimljiv efekat aktivacije KATPkanala.

[0007] ATP-senzitivni kalijumovi kanali su tip kalijumovog kanala koji je inhibiran od strane ATP i koji se aktivira sa ADP kada opadne nivo ADP. Zbog toga što KATPkanali imaju sveobuhvatne i kritične fiziološke funkcije, oni su postali ciljne mete za lekove. Otvarači KATPkanala (takođe poznati pod imenom KCOs ili otvarači kalijumovog kanala (PCOs)) predstavljaju strukturno raznoliku grupu jedinjenja koja deluju kao aktivatori (agonisti) aktivnosti KATPkanala. Primeri PCOs uključuju pinacidil, kromakalim i diazoksid.

SUŠTINA PRONALASKA

[0008] Predmetni pronalazak se odnosi na kompoziciju ili komplet koji se sastoji iz četiri određene komponente odabrane u Neuroaid2 komponentama da aktiviraju KATPkanale i za upotrebu u lečenju različitih bolesti i poremećaja kao što je definisano u priloženim patentnim zahtevima. Komponente Neuroaid2 su izabrane iz grupe koja obuhvata: danšen (Salviae Miltiorrhizae), breskvu (Prunus persica); stepski božur (Polygalae); travolisni iđirot (acori tatarinowii); koren astragalusa (Astragali); crveni božur (Paeoniae Rubra); sečuanski rizom ljubavi (Chuanxiong); šafranika (Carthamus tinctorius); i koren kineske anđelike (angelicae sinensis), i izabrane Neuroaid2 komponente se sastoje iz stepskog božura (Polygalae), koren astragalusa (Astragali), sečuanskog rizoma ljubavi (Chuanxiong), i korena kineske anđelike (angelicae sinensis).

[0009] Izvođenja kao što su definisana u predmetnom pronalasku uključuju upotrebu Neuroaid2 komponenti za aktivaciju ATP-senzitivnih kalijumovih kanala. Upotrebe Neuroaid2 komponenti uključuju upotrebe in vivo, in vitro i ex vivo. Predviđeno je da aktiviranjem KATPkanala mogu uspešno da se leče različite bolesti i stanja. Primeri upotreba komponenti Neuroaid2 i bolesti / stanja koje mogu da se leče sa komponentama Neuroaid2 uključuju: gojaznost, inkontinenciju (poželjno urinarnu inkontinenciju), hiperteziju, prevenciju ishemijske povrede ili povrede reperfuzijom; lečenje hiperinsulinemije ili hiperinsulinizma; lečenje hiperglikemije; prevencije prelaska od predijabetesa ka dijabetesu; lečenje dijabetesa tipa II; korekcije deficita u sekreciji insulina i insulinske senzitivnosti koja doprinosi predijabetesu i dijabetesu tipa II; očuvanje funkcije pankreasa kod dijabetičara tipa I; lečenje hiperlipidemije; prevencije povećanja telesne težine kod individua koji imaju predispoziciju prema gojaznosti; lečenje metaboličkog sindroma (ili sindroma X); lečenje sindroma policističnog ovarijuma; lečenje povećanja telesne težine, dislipidemije, ili narušavanje tolerancije na glukozu kod subjekata koji su lečeni antipsihotičnim lekovima; prevencije povećanja telesne težine, dislipidemije, ili narušavanje tolerancije na glukozu kod subjekata koji su tretirani sa antipsihotičnim lekovima; lečenje bilo koje bolesti gde su hiperlipidemija, hiperinsulemija, hiperinsulinizam, hiperlipidemija, hiperfagija ili gojaznost su faktori koji doprinose težini ili progresiji bolesti, uključujući ali bez ograničenja na, Prader Vilijev Sindrom, Froelich-ov sindrom, Kohen-ov sindrom, Sumit-ov Sindrom, Alstrom-ov, Sindrom, Borjesen-ov Sindrom, Bardet-Biedl-ov Sindrom, hiperlipoproteinemiju tipa I, II, III, i IV; neurodegeneraciju; moždanog udara; ishemije; epilepsije; bola; hiperaktivne bešike; sindroma razdražljivih creva; gubitka kose; ćelavljenja; alopecije; erektilne disfunkcije kod muškaraca; seksualnih poremećaja kod žena; prevremenog porođaja; benigne hiperplazije prostate (BPH); dismenoreje; koronarnog oboljenja arterija; angine; hiperaktivosti disajnih puteva; poremećaji ishrane; upotreba kao anti-neoplastičnog sredstva (npr. za lečenje kancera mozga); oboljenja skeletnih mišića kao što je miotonija kongenita i hiperkalcemijska paraliza; upotreba kao vazodilatatora; astma; zaustavljanje normalnog rada srca da bi se izvele operacije transplantacije srca, aorte, neurovaskularne i kardiopulmonarne i druge povezane operacije; impotencija; lečenje aritmije; dijabetes (npr. dijabetes melitus tipa I ili tipa II); insulinska rezistencija; lečenje osetljive ljudske kože; otkazivanje rada srca; periferni vaskularni poremećaji; insulinom; kongenitalni hiperinsulinizam; retinalne ishemije; smanjenja potrošnje hrane koja sadrži masti; hipoglikemije; depresije ili poremećaja raspoloženja koji su povezani sa depresijom; oboljenja / stanja koja imaju koristi od neurozaštite (videti diskusiju u tekstu ispod); i neurokondicioniranje. Druge upotrebe i oboljenja / stanja koja korisno mogu da se leče uključuju ona koja su navedena u WO2007/106049, WO2010/053456 i WO2010/110755.

KRATAK OPIS NACRTA

[0010]

Slika 1. Neurozaštitni efekat MLC901 na smrt neurona koja je indukovana uklanjanjem kiseonika I glukoze (OGD) i njegova ihibicija glibenklamidom

Kortikalni neuroni u kulturi su tretirani sa OGD tokom 2 sata. MLC901 (1 µg/mL) je primenjen dva sata pre OGD (pre-OGD), tokom OGD (OGD) ili dva sata posle OGD (post-OGD). Glibenklamid je primenjen posle OGD 30 min pre MLC901. Histogrami prikazuju normalizovano ćelijsko preživljavanje posle tretmana sa MLC901 i glibenklamidom. Glibenklamid (10 µM) je primenjen sam ili 30 min pre MLC901. U obe paradigme glibenklamid inhibira zaštitu koja je indukovana sa MLC901 protiv OGD oštećenja (n = 12 ploča po eksperimentalnoj grupi,.***P<0.001 u odnosu na grupu sa nosačem i<##>P<0.001 u odnosu na MLC901 grupu).

Slika 2. Efekat MLC901 na endogene KATPstruje u INS-R9 ćelijama. Tragovi struja koji su zabeleženi u kontrolnim uslovima i u prisustvu samo MLC901(µg/ml), MLC901 (1µg/ml) Pinacidil (10 µM) ili MLC901(1µg/ml) Pinacidil (10 µM) Glibenklamid (10 µM).

Slika 3. Efekat MLC901 na KATPkanale (Kir 6.1/SUR2) eksprimirane u oocitama Xenopus.

(A) Uobičajeni tragovi struja koji su zabeleženi u kontrolnim uslovima (90 K, n = 6), u prisusutvu samo Azida(3 mM) ili Azida Pinacidila (10 µM) ili Azida Pinacidila Glibenklamida (10 µM) (n = 6 po uslovu). (B) Uobičajeni tragovi struje zabeleženi u kontrolnim uslovima (90 K, n = 6), i u prisustvu samo Azida (3mM), Azida MLC901 (1 µg/mL) ili Azida MLC901 (1 µg/mL) Glibenklamida (10 µM) (n = 6 po uslovu). (C) Odnosi struje napona na punoj ćeliji dobijeni sa rampama napona u opsegu -160 do 80 mV u kontrolnim uslovima (90K), i u prisustvu samo Azida (3mM), Azida MLC901 (1 µg/mL) ili Azida MLC901 (1 µg/mL) Glibenklamida (10 µM) (n = 6 po uslovu). (D) Odgovarajući histogrami pokazuju amplitudu struje na -120 mV za sva ispitana stanja (n = 6; **P<0.01 i ***P<0.001).

Slika 4: Efekti NA4 (1 µg / ml) na KATP struje na oocitama Xenopusa (n=4) Struje su zabeležene u kontrolnim uslovima simetričnog kalijuma. Aktivnost KATPkanala je procenjena sa unutarćelijskim uklanjanjem ATP pomoću 3 mM natrijum azida.

Perfuzioni protokol: struja je prvo zabeležena u kontrolnim uslovima (simetrični rastvor kalijuma) (90K+). Zatim, aktivnost kanala je pojačana perfuzijom 6 minuta sa 3 mM natrijum azidom koji se održava tokom celog eksperimenta. MLC901 ili drugi serijski proizvodi su isprani 6 minuta nakon ispiranja sa natrijum azidom. U svim eksperimentima, procenjena je inhibicija zabeleženih struja sa Glibenklamidom (glib) (10 µM).

Slika 5: Efekti NA4 (1µg / ml) na KATP struje u oocitama (n=4)

Struje su zabeležene u kontrolnim uslovima simetričnog kalijuma. Aktivnost KATPkanala je procenjena unutarćelijskim uklanjanjem ATP sa 3 mM natrijum azidom.

Protokol ispiranja: struja je prvo zabeležena u kontrolnim uslovima (simetrični kalijumov rastvor). Zatim, aktivnost kanala je pojačana ispiranjem 6 minuta sa 3 mM natrijum azidom koja se održava tokom celog eksperimenta. MLC901 ili drugi serijski proizvodi su isprani 6 minuta posle ispiranja natrijum azidom. U svim eksperimentima, inhibicija zabeleženih struja sa Glibenklamidom (glib) (10 µM) je procenjena.

Slika 6:

2 uzorka, NeuroAid2 (naša kontrola sa 9 biljaka) i "NA3" (sečuanski rizom ljubavi (chuanxiong), koren kineske anđelike (sinensis), koren astragalusa (astragalus (radix astragali)) su aktivirale kanal.

REČNIK POJMOVA

[0011] Ovaj odeljak ima za cilj da pruži smernice za interpretaciju obima reči i fraza koje su predstavljene u tekstu ispod (i gde je potrebno njihove gramatičke varijante). Dalje smernice za interpretaciju ili obim određenih reči i fraza kao što se ovde koristi (i gde je potrebno njihove gramatičke varijante) mogu dodatno da se pronađu u drugim odeljcima ove specifikacije.

[0012] Reči koje se koriste da označe jedninu su korišćene da opišu elemente i komponente iz pronalaska. Ovo se radi samo iz praktičnih razloga i da se dobije generalni smisao pronalaska. Ovaj opis treba čitati tako da uključi jednu ili bar jednu i jednina takođe uključuje množinu, osim ukoliko kontekst jasno ne ukazuje drugačije. Prema tome, na primer, termin "sredstvo" uključuje pozivanje na jedno sredstvo kao i na veći broj sredstava (uključujući smeše sredstava). Takođe treba primetiti da termin "ili" se generalno koristi u njegovom smislu uključujući "i/ili" osim ukoliko kontekst jasno ne ukazuje drugačije.

[0013] Kao što se ovde koristi, termin "oko" kao što je korišćen u vezi sa numeričkom vrednosti označava, na primer, ±25% numeričke vrednosti, poželjno ±15%, poželjnije ±10%, najpoželjnije još ±5%, i najpoželjnije ±2% ili ±1%. Gde je potrebno, reč "oko" može da bude izostavljena iz definicije pronalaska.

[0014] Pod "pacijent sa moždanim udarom" mi uključujemo pacijenta koji pati od ishemijskog ili hemoragičnog moždanog udara. Moždani udar je iznenadna i trajna smrt moždanih ćelija koja se događa kada je blokiran protok krvi i kiseonik ne može da se isporuči u mozak, ishemijski moždani udar se najviše pojavljuje kada je protok krvi sprečen zgrušnjavanjem (koje je poznato pod imenom ’tromboza’ arterija) ili sa odvojenim ugruškom koji se nalazi u arteriji (ovde naznačen sa ’embolijski udar’). Hemoragični moždani udar nastaje od rupture arterijskog zida, i od curenja krvi i u okolno tkivo mozga. Hemoragični moždani udar, poput ishemijskog moždanog udara, uzrokuje smrt tkiva lišavanjem mozga krvi i kiseonika, i do brojnih neuroloških poteškoća (motorike, govora) kao i funkcionalnih oštećenja.

[0015] Kao što se ovde koristi, temin "obuhvata" znači uključujući". Prema tome, na primer, kompozicija "obuhvata" komponente Neuroaid2 može da se sastoji isključivo iz Neuroaid2 komponenti ili može da uključi jednu ili više dodatnih komponenti (npr. dalje aktivno sredstvo, farmaceutski prihvatljivi nosač ili ekscipijens itd). Prema tome, treba razumeti da termin "obuhvata" uključuje u svom obimu izvođenja u kojima su prisutni jedan ili više dodatnih, elemenata koji nisu nabrojani, kao i restriktivniji termini "koji se u suštini sastoji od’ i "sastoji se od’ (tj. gde su prisutni samo navedeni elementi). Termin "uključujući" treba isto tumačiti tako da obuhvata "uključujući, ali bez ograničenja na ... ", i restriktivnije termine "koji se u suštini sastoji od" i "sastoji se od."

[0016] Termin "ekstrakcija" kao što se ovde koristi uključuje referencu na postupak odvajanja u kome se biljni materijal (npr. iseckani delovi biljke, bilo sveže ili osušene) dovodi u kontakt sa tečnim rastvaračem da se izvrši prenos jedne ili više komponenti biljnog materijala u rastvarač.

[0017] Termin "in vivo" kao što se ovde koristi uključuje referencu na korišćenje celog, živog organizma. Ovo je u suprotnosti sa terminom "in vitro" u kome se ne koristi, ceo živi organizam. Termin "in vitro" treba razumeti da uključuje, između ostalog, "ex vivo" koristi ćelije, tkiva itd. koje ne obrazuju deo celog, živog organizma može da se koristi (npr. ćelije ili tkiva iz kultura ćelija ili tkva, biopsija, mrtvih organizama itd.). Dalji primeri koji ne ograničavaju "in vitro" se odnose na upotrebu ćelijskih ekstrakata ili lizata.

[0018] Termini "pacijent" i "subjekt" su ovde korišćeni naizmenično i termini uključuju pozivanje na bilo koju životinju koja je čovek ili koja nije čovek (poželjno sisar) koju je poželjno lečiti upotrebom predmetnog pronalaska. Osim toga, treba razumeti da "pacijent" ili "subjekat" ne znači da su simptomi prisutni. Termin "sisar" kao što se ovde koristi se odnosi na bilo koji član klase Mammalia, uključujući, bez ograničenja, čovekolike ne-čovekolike primate kao što su šimpanze i drugi čovekoliki majmuni i vrste majmuna; životinje sa farme kao što je stoka, ovce, svinje, koze i konje; domaće / životinje pratioci kao što su psi i mačke; laboratorijske životinje (npr. zečevi i glodari kao što su, miševi, pacovi, i zamorčići, i slično). Poželjno, životinja je čovek.

[0019] Terim "moždani udar" se odnosi na iznenadnu smrt ćelija tkiva zbog nedostatka kiseonika kada je protok krvi narušen blokadom ili rupturom arterije. Moždani udar je vaskularni događaj koji može da se dogodi u mozgu ili u srčanom sistemu. Poslednje stanje je medicinski poznato kao "infarkt miokarda" i uobičajeno je poznato pod imenom "srčani udar".

[0020] Termin "lečenje" kao što se ovde koristi treba tumačiti široko i uključuje reference na bilo koju i sve upotrebe koje popravljaju bolesno stanje ili simptome (npr. smanjuju težinu bolesti ili simptoma, smanjuju učestalost simptoma itd), sprečava uspostavljanje bolesti, ili na drugi način sprečava, ometa, odlaže, ili vrši reverziju progresije bolesti ili drugih nepoželjnih simptoma na bilo koji način, čak iako tretman na kraju nije uspešan. Lečenje može da bude u odnosu na pacijenta koji već ima poremećaj, ili u odnosu na pacijenta koji je podložan da ima poremećaj ili kod koga poremećaj može da se spreči. Prema tome, termin "lečenje" (i radi izbegavanja sumnje, njegove gramatičke varijante kao što je "tretiranje" itd.) može da se odnosi na terapeutski tretman ili na profilaksu ili preventivno lečenje.

[0021] Termini "bolest", "poremećaj" i "stanje" ovde mogu naizmenično da se koriste, osim ukoliko kontekst jasno na ukazuje drugačije.

[0022] Osim ukoliko nije drugačije naznačeno, svi tehnički i naučni termini koji se ovde koriste imaju isto značenje kao što je uobičajeno poznato stručnjaku iz oblasti tehnike kome ovaj pronalazak pripada.

DETALJNI OPIS

[0023] Jedan aspekt kako je definisano u predmetnoj specifikaciji obezbeđuje četiri komponente Neuroaid2 za upotrebu u postupku lečenja bolesti / poremećaja kod pacijenta pri čemu bolest / poremećaj može da se leči aktivacijom KATPkanala i gde se četiri Neuroaid2 komponente sastoje iz korena stepskog božura (Polygalae), sečuanskog rizoma ljubavi (Chuanxiong), poželjno njihovog rizoma (tj. rhizoma chuanxiong); korena kineske anđelike ili ženskog ženšena (Chinese Angelica ili DanGui), poželjno korena (tj. radix angelicae sinensis); i Astragali ((engl. Membranous Milkvetch) ili Huang Qi), poželjno korena astragalusa (tj. radix astragali).

[0024] Drugi aspekt kao što je definisano u predmetnoj specifikaciji obezbeđuje kompoziciju ili komplet koji obuhvata četiri Neuroaid2 komponenti koje se sastoje iz stepskog božura (Polygalae), sečuanskog rizoma ljubavi (Chuanxiong), poželjno njihovog rizoma (tj. rhizoma chuanxiong); korena kineske anđelike (angelicae sinensis) (Kineska anđelika ili ženski Ženšen (DanGui)), poželjno korena (tj. radix angelicae sinensis); i astragalusa (Astragali) ((engl. Membranous Milkvetch) ili Huang Qi), poželjno korena (tj. radix astragali).

[0025] Gore navedeni aspekti kao što je definisano u predmetnoj specifikaciji su detaljnije opisani u tekstu ispod sa odeljcima koji slede koji su namenjeni da obezbede smernice za implementaciju i obim različitih aspekata kao što je definisano u predmetnoj specifikaciji i obimu pronalaska kako je definisano u priloženim patentnim zahtevima.

Aktivacija KATPKanala

[0026] Različiti aspekti kao što je definisano u predmetnoj specifikaciji se odnose na aktivaciju KATPkanala pomoću komponenti Neuroaid2. Korišćenjem Neuroaid2 komponenti, KATPkanali mogu da se aktiviraju u jednom ili više tipova ćelija. Na primer, KATPkanali mogu da se aktiviraju u jednoj ili više od sledećih tipova ćelija: ćelija neurona, glatkih mišićnih ćelija (npr. vaskularne glatke mišićne ćelije, glatke mišićne ćelije bešike), miocitima, pankreasnim beta ćelijama, adipoznim tkivnim ćelijama i skeletnim mišićnim ćelijama. U bar nekim izvođenjima različitih aspekata kao što je definisano u predmetnoj spacifikaciji, komponente Neuroaid2 su za aktivaciju KATPkanala u ćelijama koje nisu ćelije neurona. KATPkanali se u ćeliji nalaze na različitim mestima uključujući plazma membranu, mitohondrije ("mitoKATP") i nuklearni ("nukKATP"). Predviđeno je da Neuroaid2 komponente mogu da se koriste za aktivaciju KATPkanala na jednom ili više ovih mesta. Međutim, u bar nekim izvođenjima je obezbeđena upotreba komponenti Neuroaid2 za aktiviranje KATPkanala u plazma membrani. U bar nekim izvođenjima pronalaska obezbeđena je upotreba Neuroaid2 komponenti za aktivaciju KATPkanala u sarkolemi.

[0027] Komponente Neuroaid2 su za upotrebu u različitim postupcima lečenja aktivacijom KATP kanala.

Komponente Neuroaid2

[0028] Komponente Neuroaid2 su:

1. Salviae Miltiorrhizae (’Red Sage’ ili danšen), na primer njegov koren (radix) i/ili rizom (rhizoma) (u poželjnim izvođenjima, radix, ili radix i rizom);

2. Prunus persica (Breskva ili Tao ren), poželjno njegovo seme;

3. Polygalae (mlekača (engl. thinleaf milkwort), Polygala tenuifolia Willd., Polygala sibirica L. ili Yuanzhi), poželjno njihov koren (tj. radix polygalae);

4. acori tatarinowii - travolisni iđirot (engl.grassleaf sweetflag ili Shichangpu), poželjno njegov rizom (tj. rhizoma acori tatarinowii);

5. Astragali – astragalus (Membranous Milkvetch ili Huang Qi), poželjno koren (tj. radix astragali); 6. Paeoniae Rubra – creveni božur (Red Peony, Paeonia lactiflora Pall, Paeonia veitchii Lynch ili Chi Shao), poželjno koren (tj. radix paeoniae rubra);

7. Chuanxiong- sečuanski rizom ljubavi ; poželjno njegov rizom (tj. rizom chuanxiong);

8. Carthamus tinctorius (Šafranika ili HongHua), poželjno njegov cvet; i

9. Angelicae sinensis - kineska anđelika ili ženski Ženšen (Chinese Angelica ili DanGui), poželjno koren (tj. radix angelicae sinensis).

[0029] Četiri Neuroaid2 komponente su izabrane iz gore navedenih 9 Neuroaid2 komponenti i koje se sastoje od stepskog božura (Polygalae), sečuanskog rizoma ljubavi (Chuanxiong), kineske anđelike (angelica sinensis) i korena astragalusa (Astragali) su ovde naznačene sa "izabrane komponente Neuroaid2".

[0030] Kombinacije komponenti Neuroaid2 mogu pogodno da budu aditivne ili sinergističke. "Aditivni" efekat se odnosi na korisni farmaceutski efekat koji se proizvodi kombinacijom koja je veća od efekta bilo koje od komponenata kombinacije kada se prikazuju zasebno. "Sinergistički" efekat se odnosi na korisni farmaceutski efekat koji je proizveden kombinacijom koja je veća od zbira efekata komponenata kombinacije kada su zasebno predstavljene.

[0031] Različiti aspekti kao što je definisano u predmetnoj specifikaciji koriste četiri od gore navedenih komponenti Neuroaid2 koje se sastoje iz stepskog božura (Polygalae), sečuanskog rizoma ljubavi (Chuanxiong), poželjno njihovog rizoma (tj. rhizoma chuanxiong); kineske anđelike (Angelicae sinensis) kineska anđelika ili ženski ženšen (Chinese Angelica ili DanGui), poželjno korena (tj. radix angelicae sinensis); i Astragali ((engl. Membranous Milkvetch) ili Huang Qi), poželjno korena astragalusa (tj. radix astragali).

[0032] U predmetnom pronalasku korišćene su samo 4 Neuroaid2 komponente i to su stepski božur (Polygalae), sečuanski rizom ljubavi (Chuanxgiong), kineska anđelika (Angelica sinensis), i koren astragalusa (Astragali).

[0033] U pronalasku odabrane Neuroaid2 komponente se sastoje iz:

i. Astragali - astragalusa (Membranous Milkvetch ili Huang Qi), poželjno korena (tj. radix astragali). ii. Chuanxiong – sečuanskog rizoma ljubavi; poželjno njegovog rizoma (tj. rhizoma chuanxiong). iii. Angelicae sinensis – kineske anđelike ili ženskog ženšena (Chinese Angelica ili DanGui), poželjno korena (tj. radix angelicae sinensis); i

iv. Polygalae (mlekača (engl. thinleaf milkwort), Polygala tenuifolia Willd., Polygala sibirica L. ili Yuanzhi), poželjno njegov koren (tj. radix polygalae).

Neuroaid i NeuroaidII

[0034] Komponente Neuroaid2 su devet biljnih komponenti NeuroAid II (takođe poznate kao NurAid II, Neuroaid2, i MLC901). Devet biljnih komponenti NeuroAid II su:

[0035] Neuroaid II obuhvata sledeće zajedno sa dekstrinom ili maltodekstrinom kao ekscipijensom:

[0036] NeuroAidTM (MLC601) iz Moleac Pte Ltd je TCM proizvod u obliku kapsule koji obuhvata 9 biljnih komponenti i 5 životinjskih komponenti. NeuroAidTM obuhvata koren astragalusa (Radix Astragali) (koren (engl. Membranous Milkvetch) ili Huang Qi)), koren i rizom Salviae Miltiorrhizae („Red Sage“ koren ili Danšen), koren crvenog božura (Radix Paeoniae Rubra) (Red Peony koren, Paeonia lactiflora Pall, Paeonia veitchii Lynch ili Chi Shao), rizom Ligusticum Chuanxiong (Chuan Xiong), koren kineske anđelike (radix angelicae sinensis) koren kineske anđelike ili ženskog ženšena (Chinese Angelica ili DanGui), cvet Carthamus Tinctorius (Šafranika ili HongHua), Breskva (Prunus Persica (Seme breskve ili Taoren)), Radix Polygalae (koren mlekače (engl. thinleaf milkwort), Polygala tenuifolia Willd., Polygala sibirica L. ili Yuanzhi), Rizom travolisnog iđirota (Rhizoma acori Tatarinowii (rizom (engl. grassleaf sweetflag) ili Shichangpu)), Buthus martensii (osušeno telo škorpije ili Quanxie), osušeno telo pijavica (Hirudo, Whitmania pigra Whitman, Hirudo nipponica Whitman, Whitmania acranulata Whitman ili Shuizhi),

[0037] Eupolyphaga Seu Seteleophaga (osušeno telo trčka, Eupolyphaga sinensis Walker, Steleophaga plancyi ili Tubiechong), Calculus Bovis Artifactus (prirodni ili veštački kravlji-bezoar ili Rengong Niuhuang), i Cornu Saigae Tataricae (rog antilope ili Lingyangjiao).

[0038] Kompozicija MLC601 je prikazana u tabeli u tekstu ispod. MLC601 obuhvata sledeće zajedno sa dekstrinom kao ekscipijensom.

[0039] NeuroAidTM, koji može da se registruje pod različitim imenima u različitim zemljama (npr. Nuraid, Nu-raid, u Južnoj Africi je prisutan na tržištu pod imenom Strocaid TM, ili Dangi Piantan Jiaonang TM) se proizvodi i komercijalno prodaje na tržištu Narodne Republike Kine od Tianjin Shitian Pharmaceutical Group Co., Ltd (sa sedištem u Jianxin Industrijskoj oblasti, Wangwenzhuang gradu, Xiqing distriktu, Tianjin gradu, Kini; Poštanski broj 300381). Takođe je dostupan od Moleac Pte Ltd (prethodno Molecular Acupuncture Pte Ltd), glavnog davalaca licence van Narodne Republike Kine (11 Biopolis Way, Helios #09- 08 Singapur 138667).

[0040] U cilju izbegavanja sumnje, NeuroAidTM i NeuroAid II ne uključuje samo NeuroAidTM i NeuroAidII tim redom u oblicima u kojima se trenutno nalazi na tržištu već takođe uključuje buduće formulacije NeuroAidTM i NeuroAid II tim redom koje mogu, na primer, da budu u prometu od strane Tianjin Shitian Pharmaceutical Group Co., Ltd ili Moleac Pte Ltd. Takve buduće formulacije mogu, na primer, da se razlikuju u doznim količinama ili koncentraciji njegovih aktivnih sastojaka itd.

[0041] NeuroAidTM je takođe poznat pod imenom MLC 601 i termini "NeuroAidTM" i "MLC 601" mogu da se koriste naizmenično. Slično tome, NeuroAid II je takođe poznat pod imenom MLC 901, Neuroaid2, NurAid II, NeuroaidII, Regenaid i Nu-raidII i ovi termini mogu da se koriste naizmenično.

Upotrebe komponenti Neuroaid2

[0042] U oblasti tehnike su opisane različite upotrebe za Neuroaid i povezanih kompozicija. Videti na primer WO2007/106049, WO2010/053456 i WO2010/110755 (sve za Moleac Pte. Ltd.), posebno u odnosu na opisane upotrebe za Neuroaid i povezane kompozicije.

[0043] WO2007/106049 i WO2010/053456 opisuju upotrebu Neuroaid i povezanih kompozicija za lečenje moždanog udara (npr. moždanog udara i kardiovaskularne bolesti (srčanog udara uglavnom zbog koronarnog arterijskog šloga)), neuroloških poremećaja, lečenja pacijenta sa cerebralnim infarktom, trauma mozga, trauma nervnog sistema, stanja povezanih sa neuroplastičnosti, trauma glave, srčanog zastoja, subarahnoidne hemoragije, apopleksije i njegove upotrebe u dijetetskom suplementu da obezbedi ishranu zdravim individuama kao i pacijentima koji su oboleli od moždanog udara ili neuroloških poremećaja.

[0044] Neurološki poremećaji su poremećaji koji pogađaju centralni nervni sistem, periferni nervni sistem i autonomni nervni sistem kao što su neurodegenerativne bolesti (na primer, Alchajmerova

1

bolest i Parkinsonova bolest), epilepsija, napadi, oboljenja koja obuhvataju demijelinizaciju (na primer, multiple skleroza), cerebralna paraliza, traumatske povrede ili tumori u mozgu, kičmene moždine ili perifernih nerava.

[0045] Neuroplastičnost (takođe poznata pod imenom plastičnost mozga ili kortikalna plastičnost) se odnosi na promene koje se pojavljuju u organizaciji mozga i mreži neurona, posebno promene koje se nalaze na mestu obrade funkcija specifičnih informacija. Ovaj proces podržava učenje novih funkcija kao rezultat iskustva u toku razvoja kod zrelih životinja i stvaranje nove informacije sa zdravim neuronima koji premošćavaju ošetećene neurone koji su pogođeni traumom ili medicinskim stanjem.

[0046] WO2010/110755 uključuje eksperimentalne podatke koji se odnose na MLC601 i MLC901. Pozitivni efekti na ćelijsku vijabilnost, oslobađanje LDH, ishemijsku povredu mozga, neuroproliferaciju i neuritski rast su ovde predstavljeni za MLC601 i MLC901.

[0047] WO2010/110755 prikazuje upotrebu Neuroaid i povezanih kompozicija za promovisanje rasta i proliferacije neurona ili stem ćelija, kao što je kod povređenih ili obolelih tkiva. Termin "neuronski izdanak" se odnosi na opšti usmereni spoljni rast aksona i dendrita. Rast neurona je važan u obrazovanju ili razvijanju sinapsi. WO2010/110755 prikazuje lečenje pacijenata koji imaju stanje koje je izabrano iz grupe koja obuhvata: psihijatrijske indikacije kao što su poremećaji anksioznosti, šizofrenija, depresija, i post-porođajna depresija, prirodno starenje, traumatska smrt ćelija mozga i druge neurološke manifestacije kao što je amnezija, bol u leđima, vertigo, nesvestica, fantomski ekstremitet, olfaktorni poremećaji, bol u vratu, glavobolje, migrene, spazam i poremećaji u govoru. Druge upotrebe koje su prikazane uključuju lečenje: neurodegeneracije; povreda nervnog sistema ili oboljenja (npr. amiorofna lateralna skleroza (ALS) i senilna demencija); neurološka oboljenja, degenerativna oboljenja; moždani udar; reumatoidni artritis, mišićna degenerativna oboljenja, oboljenja bubrega, i oboljenja jetre.

[0048] WO2010/110755 takođe prikazuje upotrebu Neuroaid i povezanih kompozicija za: opšte dobro stanje neurona; promovisanje ćelijskog preživljavanja, proliferacija ili diferencijacija ćelija (npr. da bi se olakšalo in vitro gajenje različitih ćelija u kulturi koje mogu da se koriste za inženjering tkiva ili ex vivo terapeutske upotrebe); promovisanje diferencijacije stem ćelija i regrutovanje u željeno ili povređeno tkivo; lečenje pacijenta koji ima obolelo ili povređeno tkivo centralnog ili perifernog nervnog sistema; promovisanje ćelijskog rasta; promovisanje kontrolisanog rasta hondrocita, skeletnih mišićnih ćelija, miokardijuma, glatkih mišićnih ćelija, hepatocita, ćelija bubrega ili epitelnih ćelija kože; odlaganja procesa starenja poboljšanjem proliferacija ili funkcija epitelnih ili epidermalnih ćelija; promovisanja ćelijskog preživljavanja i rasta neurona, stem ćelija, hondrocita, skeletnih mišinih ćelija, miokardijuma, glatkih mišićnih ćelija, hepatocita, ćelija bubrega, langerhansovih ostrvaca i epitelnih ćelija u koži.

[0049] U bar nekim izvođenjima iz pronalaska, kompozicija ili komplet obuhvata četiri određene komponente izabrane u Neuroaid2 komponentama za aktivaciju KATP kanala je za upotrebu u postupku obezbeđivanja neurozaštite.

[0050] Termin "neurozaštita" kao što se ovde koristi uključuje pozivanje na očuvanje nervnog tkiva od rizika umiranja, kao što je tokom moždanog udara ili kao posledica moždanog udara. Termin "neurozaštita" (i radi izbegavanja sumnje, njegovih gramatičkih varijanti) može prema tome da se odnosi na stimulaciju ili promovisanje ćelijskog preživljavanja, ili prevencije smrti ćelije, pri čemu se ćelija nalazi u riziku od ćelijske smrti, kao što je gde je ćelija bila traumatizovana i može pod normalnim aktivnostima (tj. bez intervencije / tretmana), sa visokom verovatnoćom umiranja. Prema tome, treba razumeti da termini "neurozaštita", stimulacija ili promocija ćelijskog preživljavanja, i prevencija ćelijske smrti mogu da se koriste kao sinonimi, osim ukoliko kontekst jasno ne ukazuje drugačije.

[0051] Neurozaštita može da se koristi za zaštitu ćelija od stresa (npr. nedostatka kiseonika, nedostatka glukoze, stresa izazvanog glutamatom, slobodim radikalima) u nervnom sistemu, kao što je unutar mozga. Takođe, promovisanjem preživljavanja moguće je sprečiti ili usporiti oboljenja ili sprečiti ili usporiti dalju degeneraciju nervnog sistema kod individua koje pate od degenerativnog poremećaja.

[0052] Različiti faktori mogu da stave ćeliju u rizik od umiranja sa primerima koji uključuju: traume, povrede, akutna oboljenja i/ili poremećaje, hronična oboljenja i/ili poremećaje kao što su neurodegenerativna oboljenja. Neurodegeneracija može da bude uzrokovana oboljenjima izabranim iz grupe koju obuhvata Alchajmerova bolest, amiotrofna lateralna skleroza (ALS), apcesi u mozgu, ishemija mozga, atrofija mozga povezana sa dijabetesom, cerebralna autozomalno dominantna arteriopatija sa subkortikalnim infarktima i leukoencefalopatija (CADASIL), cerebrovaskularni poremećaji, cortikobazalna ganglionska degeneracija (CBGD), hronična ishemija, Krojcfeld-Jakobov Sindrom, Dandy-Walkerov Sindrom, Dišenova Mišićna distrofija, senilna demencija, demencija povezana sa Sindromom stečene imunodeficijencije (AIDS), encefalomijelitis, esencijalni tremor, fridrihova ataksija, gerstman straussler-scheinker-ova bolest, Huntingtonova bolest, hidrocefalija, hipoksija, fatalna porodična insomnija, prolazi ishemijski napad, kuru, Landau-Kleffner-ov Sindrom, bolest Levijevih tela, Machado-Joseph-ova bolest, bakterijski i virusni meningitis, poremećaji migrene, mijelitis, olivopotocerebelarne atrofije, neuro-degeneracija povezana sa, pantotenatnom kinazom, Parkinsonova bolest, poliomijelitis, sindrom postpoliomijelitisa, prionska oboljenja, idiopatska intrakranijalna hipertenzija (tj. pseudotumor cerebri), Šaj-dragerov sindrom, Steinertova bolest, infantilni spazmi, progresivna supranuklearna paraliza, siringomijelija, oboljenja talamusa, tikovi, Turetov sindrom, Uveomeningoencefalitični sindrom, globalna i fokalna ishemija i kardiovaskularna oboljenja, kod predisponiranih individua. Spoljni faktori mogu takođe da stave ćelije u rizik od umiranja, kao što su infekcije, izlaganja toksinima (npr. zračenje, hemijskim, ili povezanim sa lekom), medicinski ili hirurški tretman (npr. otvaranje lobanje). Dijagnostički postupci mogu takođe da stave ćelije u rizik od umiranja s obirom da dijanostički postupci mogu da uzrokuju obrazovanje slobodnih radikala ili na drugi način imaju citotoksične efekte, kao što je X-zračenje i hemoterapija. Prema tome, u bar nekim izvođenjima ćelije su u riziku od umiranja zbog infekcije, izlaganja toksinima (npr. zračenja, hemijski, ili povezani sa lekom), ili iz medicinskih, hirurških ili dijagnostičkih tretmana.

[0053] Četiri izabrane komponente Neuroaid2 mogu da se koriste za promovisanje preživljavanja ćelija nervnog sistema koje se nalaze u riziku od umiranja zbog oboljenja, poremećaja, povrede ili stanja centralnog (mozga ili kičmene moždine) i/ili perifernog nervnog sistema. Primeri uključuju kancer nervnog sistema, postoperativno oštećenje nerava, traumatsko oštećenje nerava, npr. koje nastaje iz povrede kičmene moždine, narušene mijelinizacije nervnih vlakana, postishemijskog oštećenja, npr. kao rezultata moždanog udara, demencije uzrokovane multiinfarktom, multiple skleroze, degeneracije nerava uzrokovane sa dijabetes melitusom, neuro-mišićne degeneracije, šizofrenije, depresije (uključujući npr. post-porođajnu depresiju, bipolarni poremećaj, veliku depresiju itd.), psihijatrijski poremećaji, prirodno starenje, Alchajmerova bolest, Parkinsonova bolest, demencija ili Huntingtonova bolest, i migrene.

[0054] Četiri izabrane Neuroaid2 komponente mogu da se koriste za promovisanje preživljavanja ćelija nervnog sistema koje se nalaze u riziku usled povrede mozga, moždanog udara, ishemije, migrene, povrede kičmene moždine, neurodegenerativnog oboljenja/poremećaja/stanja, demencije (npr., Alchajmerova bolest, Parkinsonova bolest, Hantingtonova horeja i spinocereberalna degeneracija) ili psihijatrijski poremećaj kao što je depresija.

[0055] U poželjnom izvođenju iz pronalaska, kompozicija ili komplet koji obuvata četiri određene komponente izabrane iz komponenti Neuroaid2 je za upotrebu u lečenju moždanog udara. Može biti da je pacijent upravo imao moždani udar (npr. tokom prošlih 96, 84, 72, 60, 48, 36, ili 12 časova) ili može da bude u riziku od dobijanja moždanog udara, kao što je pacijent koji se nalazi u riziku od prvog moždanog udara ili postoji rizik od ponovnog moždanog udara. Gde su Neuroaid2 komponente za lečenje moždanog udara, komponente mogu opciono da budu za ordiniranje pacijentu sa oko 96, 84, 72, 60, 48, 36, ili 12 h moždanog udara, kao što je tokom oko 1 do 12 h posle moždanog udara; oko do oko 10 h posle moždanog udara; ili poželjnije posle tokom oko 3 do oko 9 h posle moždanog udara. Opciono Neuroaid2 komponente sa za ordiniranje pacijentu tokom oko 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ili 1 h posle moždanog udara. Gde Neuroaid2 komponente mogu da se koriste za lečenje pacijenta koji je riziku od recidiva moždanog udara, Neuroaid2 komponente mogu da budu za ordiniranje bar oko 1, 2, 3, 4, 5, 6 ili 7 dana nakon prethodnog moždanog udara, ili bar oko 1, 2, 3, 4, 5, ili 6 nedelja nakon moždanog udara, ili bar oko 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ili 12 meseci posle pretodnog moždanog udara.

[0056] Predviđeno je da će Neuroaid2 komponente biti korisne u odnosu na upotrebu opisanu u oblasti tehnike za aktivatore ATP-senzitivnog kalijumovog kanala (takođe poznatih pod PCOs i KCOs), kao što je za jedan ili više od pinacidil, kromakalim i diazoksid. Primeri takvi upotreba su obezbeđeni u tekstu ispod i u poželjnom izvođenju različiti aspekti prikazani u predmetnom pronalasku komponenti Neuroaid2 su korišćeni za upotrebu koja je navedena u tekstu ispod.

[0057] Opisane su različite upotrebe otvarača KATPkanala u WO2006026469 i uključuju: prevenciju ishemijske ili povrede reperfuzijom; lečenje hiperinsulinemije ili hiperinsulinizma; lečenje hipoglikemije; prevencije prelaza od predijabetesa ka dijabetesu; lečenje dijabetesa tipa II; korekcije deficita u sekreciji insulina i osetljivosti na insulin koji doprinosi predijabetesu i dijabetesu tipa II; čuvanje funkcije pankreasa kod dijabetičara tipa I; lečenje hiperlipidemije; prevencije povećanja telesne težine kod individua koji su predisponirani da budu gojazni; lečenje gojaznosti; lečenje metaboličkog sindroma (ili sindroma X); lečenje sindroma policističnog jajnika; lečenje povećanja telesne težine, dislipidemija, ili narušavanje tolerancije na glukozu kod subjekata koji su tretirani sa antipsihotičnim lekovima; prevencija povećanja telesne težine, dislipidemije, ili narušavanje tolerancije na glukozu kod subjekata tretiranih sa antipsihotičnim lekovima; i lečenje bilo koje bolesti u kojoj su hiperlipidemija, hiperinsulinemija, hiperinsulinizam, hiperlipidemija, hiperfagija ili gojaznost faktori koji doprinose težini ili napredovanju bolesti, uključujući ali bez ograničenja na, Prader Wilijev Sindrom, Froelihov sindrom, Kohenov sindrom, Sumitov Sindrom, Alstromov, Sindrom, Borjesenov Sindrom, Bardet-Biedlov Sindrom, ili hiperlipoproteinemija tipa I, II, III, i IV.

[0058] US 8,053,441 takođe opisuje brojne bolesti ili stanja koje mogu da se tretiranju otvaračima za kalijumove kanale: hipertenzija, neurodegeneracija, moždani udar, ishemija, epilepsija, bol, hiperaktivna bešika, urinarna inkontinencija, sindrom razdražljivih creva, gubitak kose, ćelavost, alopecija, erektilna disfunkcija kod muškaraca, seksualni poremećaji kod žena, prevremeni porođaj, benigna hiperplazija prostate (BPH), dismenoreja, koronarna arterijska bolest, angina, i hiperreaktivnost disajnih puteva, poremećaji u ishrani. Druge upotrebe otvarača KATPkanala uključuju: upotrebu kao anti-neoplastičnog sredstva, posebno za upotrebu kod kancera mozga (US 7,705,010, i lečenja oboljenja skeletnih mišića kao što je kongenitalna miotonija i hiperkalcemijska paraliza (US 5,744,594).

[0059] Poželjno, komponente Neuroaid2 su korišćene za upotrebu kao što je u oblasti tehnike opisano za pinacidil. Upotrebe pinacidila (N-cijano-N’-piridin-4-il-N"-(1,2,2-trimetilpropil)guanidin) uključuju: upotrebu kao vazodilatatora, za lečenje hipertenzije, astme, urinarne inkontinencije, zaustavljanja normalnog srčanog ritma da bi se izvele srčane, aortne, neurovaskularne i kardiopulmonarne operacije transplantacije organa i druge povezane operacije (u odnosu na gore pomenute upotrebe pinacidila videti npr. US5,428,039), lečenje osetljive humane kože (videti npr. US 6,572,848) i impotencije (videti npr. US 7,959,550).

1

[0060] Poželjno, komponente Neuroaid2 su korišćene za upotrebu kao što je u oblasti tehnike opisano za kromakalim. Upotrebe kromakalima ((3R,4S)-3-hidroksi-2,2-dimetil-4-(2-oksopirolidin-1-il)hroman-6-karbonitrila) uključuju: upotrebu kao vazodilatatora, za lečenje hipertenzije (videti npr. US 7,964,623), astme (videti npr. US 7,964,623), lečenje artmije (videti npr. US 7,964,623), dijabetesa (npr. diabetesa melitusa tipa I ili tipa II), gojaznosti (videti npr. US 7,964,623), metaboličnog sindroma, sindroma X, insulinske rezistencije, zaustavljanja normalnog srčanog ritma da bi se izvele srčane, aortne, neurovaskularne i kardiopulmonarne operacije transplantacije organa i druge povezane operacije (u vezi sa gorepomenutim upotrebama kromakalima videti npr. US 5,428,039) lečenje osetljive humane kože (videti npr. US 6,572,848), srčane insuficijencije i impotencije (US 7,959,550).

[0061] Poželjno, komponente Neuroaid2 su korišćene za upotrebu kao što je u oblasti tehnike opisano diazoksid. Diazoksid (ime brenda Proglicem, 7-hloro-3-metil-4H-1,2,4-benzotiadiazin 1,1-dioksid). Upotrebe uključuju: upotrebu kao vazodilatatora, za lečenje hipertenzije (videti npr. US.2,986,573), perifernih vaskularnih poremećaja (videti npr. U.K. Patent GB982072) insulinoma, kongenitalnog hiperinsulinizma, metaboličnog sindroma (u vezi sa ovim upotrebama videti npr. US 5,284,845 ili US 6,197,765), retinalne ishemije (videti npr. US 8,063,054), dijabetesa (videti npr. US 7,799,777), gojaznost (videti npr. US 7,799,777 i U.S. objava patenta br.2004/0204472, lečenje sindroma X (videti npr. U.S. 6,197,765), i smanjenje konzumacije hrane bogate mastima (U.S. objava patenta br.

2003/0035106), i hipoglikemija.

[0062] US 8,101,600 prikazuje da pinacidil, kromakalim i diazoksid mogu da budu korisni za lečenje depresije ili poremećaja koji su povezani sa raspoloženjem (termin "poremećaji raspoloženja" je korišćen da obuhvati ona stanja koja su definisana kao poremećaji raspoloženja u Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, Fourth Edition, 1994 ("DSM-IV")). US 7,018,979 prikazuje da pinacidil, kromakalim i diazoksid mogu da budu korisni u selektivnoj isporuci leka u malignom tumoru ili u tumoru koji se nalazi na dugom mestu u telu sisarskog subjekta.

[0063] Predviđeno je da komponente Neuroaid2 mogu da se koriste za upotrebu kao što je gore opisano u odnosu na KCOs, pinacidil, kromakalim ili diazoksid. U odnosu na gore pomenute upotrebe aktivatora KATPkanala i pinacidil, diazoksid i kromakalim mogu se koristiti različite publikacije iz stanja tehnike, na primer US5,744,594; WO2006026469; US 8,101,600; US 8,058,264; US 8,053,441; US 7,799,777; US 7,115,620; US 6,417,207 kao i publikacije koje su navedene gore u tekstu.

[0064] U bar nekim izvođenjima prikazanim u predmetnom opisu, komponente Neuroaid2 su korišćene za lečenje stanja koje je izabrano iz grupe koja obuhvata: inkontinenciju (poželjno urinarnu inkontinenciju), gojaznost i hipertenziju.

[0065] U bar nekim izvođenjima prikazanim u predmetnom opisu, komponente Neuroaid2 su korišćene za lečenje inkontinencije, poželjno urinarne inkontinencije.

[0066] Upotreba KCOs u lečenju urinarne inkontinencije je opisana u, između ostalog, US 8,053,441, US 7,115,620 i US 6,417,207; i upotreba pinacidila u lečenju inkontinencije je opisana u, između ostalog, EP260,790.

[0067] U bar nekim izvođenjima prikazanim u predmetnom opisu, komponente Neuroaid2 su korišćene za lečenje gojaznosti. Upotreba KCOs i diazoksida u lečenju gojaznosti je opisana u, između ostalog, WO2006026469 i US7,799,777.

[0068] U bar nekim izvođenjima prikazanim predmetnom opisu,, komponente Neuroaid2 su korišćene za lečenje hipertenzije. KCOs su karakterisani da imaju potentnu antihipertenzivnu aktivnost in vivo i vazorelaksantnu aktivnost in vitro (Quast, U., et. al., Cellular Pharmacology of Potassium Channel Openers in Vascular Smooth Muscle, Cardiovasc. Res., Vol. 28, pp. 805-810 (1994)). US 8,053,441 opisuje upotrebu KCOs u lečenju hipertenzije; US7,115,620 opisuje upotrebu pinacidila i kromakalima u lečenju hipertenzije; WO2006026469, US 8,063,054, U.S.2,986,573 i US 7,799,777 opisuju upotrebu diazoksida u lečenju hipertenzije; i US 7,964,623 opisuje upotrebu kromakalima u lečenju hipertenzije.

[0069] U bar nekim izvođenjima iz pronalaska, kompozicija ili komplet koji se sastoji iz četiri određene komponente koje su izabrane iz komponenti Neuroaid2 je korišćen za obezbeđivanje neurokondicioniranja.

[0070] Termin "neurokondicioniranje" kao što je ovde korišćeno uključuje pozivanje na farmakološki indukovane molekulske događaje koji sprečavaju ili smanjuju moguće buduće oštećenje mozga. Neurokondicioniranje ima za rezultat obezbeđivanje tolerancije u mozgu protiv ishemijskog, epileptičnog ili drugog oštećujućeg događaja. Efekat je sličan sa prekondicioniranjem (kliničkim i eksperimentalnim pristupom koji se pokazao efektivnim), ali ne zahteva izlaganje stresnim stimulusima. Neurokondicioniranje indukuje profilaktičku toleranciju kod pacijenta, kao što su oni koji se nalaze u riziku od povrede oštećenjem. Primeri takvih povreda uključuju oštećenja koja nastaju iz stanja izabranih iz grupe koja obuhvata: ishemijsko, prolazno ili trajno, fokalno ili generalizovano; napad, fokalni ili generalizovani; zapaljensko; toksično (npr. zračenje, hemijsko, ili povezano sa lekom); imunološko; infektivno; metaboličko, nutritivno; traumatsko; kompresivno; neoplastično; degenerativno; genetičko, kongenitalno; i proceduralno (uključujući na primer ono stanje koje zahteva opštu anesteziju, stezanje većih sudova, ili otvaranje kranijalne šupljine). Prema tome, u bar nekim izvođenjima iz pronalaska komponente Neuroaid2 su namenjene za ordiniranje pacijentu koji se nalazi u rizku da ima povredu kao što je, na primer, oštećenje koje nastaje is stanja koje je izabrano iz grupe koja obuhvata: ishemijsko, prolazno ili trajno, fokalno ili generalizovano; napad, fokalni ili generalizovani; zapaljensko; toksično (npr. zračenje, hemijsko, ili povezano sa lekom); imunološko; infektivno; metaboličko, nutritivno; traumatsko; kompresivno; neoplastično; šlog, degenerativno; genetičko, kongenitalno; i proceduralno (uključujući na primer ono stanje koje zahteva opštu anesteziju, stezanje većih sudova, ili otvaranje kranijalne šupljine).

Dobijanje komponenti Neuroaid2

[0071] Kao što je navedeno gore u tekstu, Neuroaid2 obuhvata devet različitih biljnih komponenti. Biljke koje se koriste za dobijanje biljnih komponenti mogu da se koriste u njihovoj celosti (tj. koristi se biljka u celosti) ili mogu da se koriste jedan ili više delova biljaka. Delovi biljaka koji mogu da se koriste uključuju: lišće, cveće, stabla, korenove, semena, spore, stabljike, rizome, plodovi, plodna tela, i mešavine pomenutih delova. Osim ukoliko kontekst jasno ne ukazuje drugačije, termin "biljka" je namanjen da obuhvati cele biljke kao jedan ili više njihovih delova uključujući lišće, cveće, stabla, korenove, semena, spore, stabljike, rizome, plodove, i plodna tela.

[0072] U bar nekim izvođenjima iz pronalaska, u kojima je rizom određene biljke naznačen kao poželjan deo biljke (npr. sečuanskog rizoma ljubavi (rhizoma chuanxiong)) korena (radix) može alternativno ili dodatno da se koristi. Slično tome, u bar nekim izvođenjima iz pronalaska u kojima je koren određene biljke naznačen kao poželjni deo biljke (npr. koren stepskog božura (radix polygalae), koren astragalusa (radix astragali) i koren kineske anđelike (radix angelicae sinensis)) rizom (rhizoma) može alternativno ili dodatno da se koristi.

[0073] Neuroaid2 komponente mogu da budu u njihovom prirodnom, biljnom obliku (npr. iseckane u male delove ili izmlevene da se dobije prašak) ili u više rafiniranom obliku (npr. ekstrakti), ili njihovim kombinacijama. Polazni materijal za Neuroaid2 komponente mogu da budu odgovarajuće biljke u svežem ili osušenom obliku. Biljke koje predstavljaju Neuroaid2 komponente mogu da budu individualno obrađene ili mogu da budu kombinovane i obrađene zajedno. Opciono, biljke mogu da

1

budu iseckane u male delove i, gde je potrebno, osušene. Osušeni sastojci mogu zatim po potrebi da budu samleveni da bi se proizveo prah. Na ovaj način obrađeni biljni materijal može nakon toga da se koristi u različitim aspektima iz pronalaska.

[0074] Pogodni postupci za dobijanje biljnih ekstrakata će biti poznati stručnjacima iz oblasti tehnike i uključuju, na primer, čvrsto-tečnu ekstrakciju, tečno-tečnu ekstrakciju, superkritičnu tečnu ekstrakciju, ekstrakciju rastvarača pod pritiskom, ekstrakciju koja je posredovana mikrotalasnom pećnicom, subkritičnu ekstrakciju vode, ekstrakcija posredovana ultrazvukom, i ubrzanu ekstrakciju rastvarača.

[0075] Ekstrakt prema predmetnom pronalasku može da se dobije na konvencionalan način, kao što je kombinovanjem biljnog materijala sa jednim ili više rastvarača pod uslovima koji su pogodni za dobijanje ekstrakta. Posle dovoljno dugog pogodnog perioda u kome su biljni materijal i rastvač bili u kontaktu za obrazovanje ekstrakta, rastvarač i biljni materijal su razdvojeni odgovarajućim postupkom, kao što je ceđenje ili centrifugiranje. Ekstrakt (tj. tečnost koja obuhvata rastvarač) može po potrebi da bude dalje obrađena, kao što je koncentrovanjem ili dehidracijom ekstrakta, kombinovanjem ekstrakta sa daljim sastojcima (npr. rastvaračima, drugim biljem / biljnim ekstraktima, TCM sastojcima, konzervansima itd.), ili mešavinom gore navedenog itd.

Predstavljanje komponenti Neuroaid2

[0076] Različiti aspekti iz pronalaska se odnose na četiri određene komponente Neuroaid2 kao što je prethodno definisano i na njihove upotrebe. U pronalasku pomenute komponente Neuroaid2 su obezbeđene u obliku kompozicije, kao što je farmaceutska kompozicija. Prema tome, tu u pronalasku je obezbeđena kompozicija (npr. farmaceutska kompozicija) koja se sastoji iz aktivnih sastojaka pomenutih četiri određenih Neuroaid2 komponenti.

[0077] Farmaceutska kompozicija kao što se ovde opisuje može opciono da sadrži farmaceutski prihvatljivo pomoćno sredstvo, nosač ili razblaživač i dodatno, može da uključi druge aktivne sastojke, farmaceutska sredstva, nosače, adjuvanse, itd. Primeri farmaceutski prihvatljivih pomoćnih sredstava uključuju farmaceutski prihvatljive ekscipijense, pufere, adjuvanse, stabilizatore, razblaživače, sredstva za punjenje, pufere, stabilizatore, konzervanse, lubrikante, ili druge farmaceutski prihvatljive materijale koji su dobro poznati stručnjacima iz oblasti tehnike ili kao što je ovde opisano. U bar nekim izvođenjima, farmaceutska kompozicija kao što je ovde opisano obuhvata ekscipijens, i gde pomenuti ekscipijens je opciono dekstrin ili maldekstrin.

[0078] U bar nekim izvođenjima kompozicija iz pronalaska (npr. farmaceutska kompozicija) može da se nalazi u kompletu.

[0079] Jasno je da kompozicije kao što se ovde opisuje mogu da se ordiniraju u čistom obliku ili u odgovarajućoj farmaceutskoj kompoziciji. Generalno, farmaceutske kompozicije mogu da se dobiju u skladu sa postupcima koji su poznati stručnjacima iz oblasti tehnike. Kompozicije koje obuhvataju aktivne komponente ili ovde prikazane sastojke mogu da uključe konvencionalni farmaceutski nosač ili razblaživač i pored toga mogu da uključe druga medicinska sredstva, farmaceutska sredstva, nosače, adjuvanse itd. Primeri pogodnih farmaceutskih nosača ili razblaživača uključuju fosfatne pufere rastvora soli, vodu, emulzije (kao što su emulzije ulja u vodi), različite tipove sredstva za vlaženje, sterilne rastvore itd. Primeri ekscipijenasa koji mogu da se koriste uključuju, na primer, šećere, skrobove, celuloze, gume, proteine, dekstrin i maltodekstrin. Opšte su poznate različite formulacije i detaljno su prikazane u najnovijem izdanju Remington’s Pharmaceutical Sciences (Maack Publishing, Easton PA).

1

[0080] Kompozicija može, na primer, da bude rastvor, suspenzija, tečnost, iseckano bilje, prah, pasta, vodena ili, ne-vodena ili bilo koja njihova kombinacija.

[0081] Pronalazak takođe obezbeđuje komplet koji se sastoji iz aktivnih sastojaka, četiri određene komponente Neuroaid 2 (tj. sečuanski rizom ljubavi (Chuanxiong), koren kineske anđelike (Angelica sinensis), stepskog božura (Polygalae) i astragalusa (Astragali)).

[0082] U bar nekim izvođenjima, kompleti iz pronalaska mogu, pored Neuroaid2 komponenti, da sadrže instrukcije za upotrebu. Kompleti iz pronalaska mogu da budu promovisani, distribuirani, i/ili prodati kao jedinice za izvođenje jednog od aspekata predmetnog pronalaska.

[0083] U bar nekim izvođenjima, komplet iz pronalaska obuhvata Neuroaid2 komponente i ekscipijens (npr. dekstrin ili maltodekstrin).

[0084] Kompleti i kompozicije koji su prikazani u predmetnoj specifikaciji mogu opciono sa se koriste kao što je prikazano u predmetnoj specifikaciji.

[0085] U bar nekim izvođenjima, kompleti i kompozicije koji su prikazani u predmetnoj specifikaciji su korišćeni za neurozaštitu, neurokondicioniranje, lečenje gojaznosti, lečenje hipertenzije, ili lečenje urinarne inkontinencije.

Ordiniranje komponenti Neuroaid2

[0086] Ovde opisane komponente Neuroaid2 mogu da se daju bilo kojim pogodnim načinom, kao što je oralno, parenteralno, intravenozno, subkutanozno, intradermalno, intraperitonealno ili lokalno, u tečnom, polu-tečnom ili čvrstom obliku i formulisane su na način koji je odgovarajući za svaki način davanja. Termin "davanje" i njegove varijacije da termin uključuje "primenu" i "davanje", uključuje dovođenje u kontakt, primenu, isporuku ili obezbeđivanje kompozicije iz pronalaska organizmu, ili na provršinu bilo kojim pogodnim načinima.

[0087] Komponente Neuroaid2 su namenjene za davanje u terapeutski efikasnoj količini (ili u obliku pojedinačne doze ili kao deo serija doza). Pod "efikasna količina" ili "terapeutski efikasna količina" namenjeno je da je količina koja se daje fiziološki značajna. Sredstvo je fiziološki značajno ukoliko se nalazi u količini koja ima za rezultat detektabilnu promenu u fiziologiji recipijenta pacijenta tako da su postignuti korisni ili željeni rezultati (npr. da se spreči, ublaži, ili ukloni jedan ili više simptoma bolesti ili medicinskog stanja, i/ili da se produži preživljavanje subjekta koji se leči).

[0088] Tačna potrebna količina će se razlikovati od subjekta do subjekta u zavisnosti od faktora kao što su vrste koje se tretiraju, starosti, težine i opšteg zdravstvenog stanja subjekta, stanja koje se leči i težine stanja, načina davanja, da li je tretman profilaktički ili je za lečenje već postojećeg stanja, pola subjekta, ishrane, vremena i učestalosti davanja, kombinacije leka(ova), i tolerancije/odgovora na terapiju i tako dalje. Prema tome, nije moguće odrediti tačnu "efikasnu količinu". Efikasna doza za datu situaciju može da bude određena rutinskim eksperimentom i obuhvaćena je procenom stručnjaka iz oblasti tehnike. Na primer, da bi se formulisao opseg doznih vrednosti, mogu da se koriste testovi ćelijske kulture i ispitivanja na životinjama.

[0089] Samo radi ilustracije, MLC 901 se obično daje u obliku 2 kapsule, 3 puta dnevno.

[0090] NeuroAid se obično daje oralno (per os) 3 puta svakog dana i četiri 0.4g kapsule svaki put. Trajanje tretmana je obično 3 meseci/3 kursa, koje može da se prilagodi u odnosu na pacijentovo stanje. Ova doza je pogodna za lečenje moždanog udara. Za druge bolesti, tretman može da traje duže.

1

Za pacijente sa poteškoćama u gutanju, kapsule mogu da se otvore i prašak da se rastvori u vodi koji može da se popije kao takav ili da se ubrizga kroz želudačnu cev. Prema tome, predviđena je dnevna doza od oko 4.8g. U jednom izvođenju, dnevna doza za pacijenta je od oko 1g do 8g; 2g do 8g; 3g do 7g; 4g do 6g; 4.25g do 5.75g; 4.5g do 5.25g; 4.5g do 5g; 4.6g do 4.10g; ili 4.7g do 4.9g. "dnevna doza" može da bude pojadinačna tableta ili kapsula itd. Ili brojne tablete ili kapsule itd. koje se uzimaju u datom danu. Međutim, treba razumeti da doze mogu da se razlikuju u zavisnosti od potreba pacijenata i težine stanja koje se leči itd.

[0091] Svaki kurs NeuroAid tretmana može da traje oko 4 nedelje. Obično se ordiniraju 3 kursa, najčešće “leđa o leđa”. Nije potreban terapeutski prozor ali mogu da se dodaju dodatni kursevi čak nekoliko dana od prestanka sa tretmanom. Prema tome, NeuroAid tretman može da traje oko 12 nedelja. Kurs tretmana NeuroAid može da bude oko 4 do 24 nedelje; 7 do 16 nedelja; 9 do 15 nedelja; 10 do 14 nedelja; ili 11 do 13 nedelja.

PRIMERI PRIMER 1 (nije deo predmetnog pronalaska)

[0092] NeuroAid (MLC601 iMLC901), Tradicionalni lek koji je korišćen u Kini za pacijente nakon moždanog udara je prijavljen u prekliničkim modelima ishemije da se indukuje neurozaštita i neuroplastičnost. Ovaj rad pokazuje efekte MLC901 u in vitro modelu kombinovane deprivacije kiseonika i glukoze (OGD). MLC901 sprečava smrt neurona indukovanu sa 2 h OGD i smanjuje preterani ulaz Ca<2+>indukovan glutamatom u kortikalnim neuronima koji su izloženi 2 h OGD. Neurozaštitini efekat MLC901 je povezan sa velikom hiperpolarizacijom od ~ 20 mV koja je antagonizovana glibenklamidom, specifičnim inhibitorom KATPkanala. Dodatno, MLC901 pospešuje aktivaciju KATPkanala. Pokazano je da MLC901 direktno deluje kao aktivatore KATPkanala potentno kao i klasičan otvarač KATPkanala. Kapacitet MLC901 da proizvede veliku hiperpolarizaciju, posebno u neuronima koji su bili izloženi energetskoj deprivaciji verovatno igra važnu ulogu u neurozaštitnim efektima ovog TCM koji dolazi pored ranije pokazanih neuroregenerativnih svojstava.

MATERIJALI I POSTUPCI

Ćelijska kultura

Kortikalni embrionalni neuroni miša

Primarna kultura kortikalnih neurona

[0093] Vremenski gravidni (E14) C57B16/J miševi su anestezirani sa izopentanom nakon čega sledi cervikalna dislokacija kao što je prethodno opisano (Heurteaux et al., 2010). Fetusi su uklonjeni i postavljeni u hladni HBSS<+>rastvor. Cerebralni korteksi su disecirani u hladnom HBSS<+>rastvoru i uklonjene su moždane ovojnice. Kortikalni uzorci su isečeni u male delove i nežno su triturirani sa vatrom-poliranom staklenom Pasterovom pipetom u 8 ml HBSS<+>rastvora. Smeša je proceđena (40 µm filter) i centrifugirana je na 800 oum tokom 8 min. Supernatant je uklonjen i pelet je rastvoren u 2 ml medijuma kulture. Ćelije su zasejene na poli-D-lizinom (Sigma-Aldrich Chimie, St Quentin Fallavier, France)-obloženim pločama sa 12 bunarića (24 mm prečnika) sa staklenim poklocem (12 mm prečnika) (CML, Nemours, France) na gustini od 1 x 106ćelija/bunariću. Kulture su održavane na 37°C u vlažnom 95% vazduhu / 5% CO2atmosferskom inkubatoru u Neurobasal dopunjenom sa B27, Glutamax, 100 jedinica/ml penicilina, i 100g/ml streptomicina i korišćene su za eksperimente tokom 12 dana. Glijalni

1

rast je suprimiran dodavanjem 5-Fluoro-2-dezoksiuridina (2 µM) i Uridina (2 µM) tokom drugog dana kulture.

INS-R9 ćelijska kultura

[0094] INS-R9 ćelije su održavane u RPMI medijumu (Coppola et al., 2008) dopunjenom sa 5% serumom iz fetusa govečeta, ImM natrijum piruvatom, 2mM glutamatom, 50M 2-merkaptoetanolom, 100 jedinica/ml penicilina, i 100g/ml streptomicina u atmosferi 95 % vazduha / 5 % CO2.

Kombinovani model deprivacije kiseonika i glukoze (OGD)

[0095] OGD eksperimenti su izvedeni na primarnim mišjim kortikalnim neuronima koji su zasejani u gustini od 1,000,000 ćelija/35- mm šolji nakon 4 dana u kulturi (Goldberg and Choi, 1993). Posle tri ispiranja sa dezoksigenovanim bez glukoze Earlovim ravnotežnim rastvorom soli (BSS), ćelije su održavane u istom BSS medijumu. Kompozicija BSS rastvora je bila (u mM): 140 NaCl, 5.4 KCl, 1.2 CaCl2, 0.9 MgCl2, 0.44 KH2PO4, 4.17 NaHCO3i 0.34 Na2HPO4. Pre upotrebe, BSS je ekvilibrisan sa anaerobnom mešavinom gasova (1.2% O2) stvaranjem mehurića 15 min, podešeno do pH 7.4 po potrebi, i zagrejan je do 37°C. Nakon toga, ćelije su postavljene u vlažni inkubator na 37°C u anaerobnim uslovima (1.2% O2) tokom. Kortikalni neuroni su tretirani sa slanim rastvorm MLC901 (1 µg/mL). Tretmani su primenjeni dva sata pre OGD (pre-OGD stanje), tokom OGD (OGD stanje) ili dva sata posle OGD (post-OGD stanje).

Elektrofiziologija

Snimanja struje na punoj ćeliji

[0096] Elektrofiziološki eksperimenti su izvedeni na INS-R9 transfektovanim ćelijama koje su zasejane na gustini od 20,000 ćelja/35-mm šolji. Transfektovane ćelije su korišćene 48-72 h nakon transfekcije. Sva elektrofiziološka snimanja su izvedena u konfiguraciji pune ćelije tehnikom nametnute voltaže na deliću membrane (Hamill et al., 1981). Svaka struja je procenjena upotrebom RK 400 pojačivača volaže nametnute na deliću membrane (Axon Instrument, USA), nisko-propusno filtrirana na 3 kHz i digitalizovana na 10 kHz upotrebom 12-bita analognog-ka-digitalnom konverteru digipodataka (1322 serije, Axon Instrument, USA). Sve strujne amplitude su izražene u strujnim gustinama. Rezultati su izraženi kao srednja vrednost i standardna greška srednje vrednosti (SEM). Pipete postupka nametnute voltaže na deliću membrane su izvedene upotrebom vertikalnog sredstva za izvlačenje (PC-10, Narishige) sa borosilikatnim staklenim kapilarama i imale su otpor od 3-5 MΩ. Za K<+>struje rastvor kupatila je sadržao (u mM) 150 NaCl, 5 KCl, 3 MgCl2, 1 CaCl2i 10 HEPES koji je podešen do pH 7.4 sa NaOH. Rastvor pipete je sadržao (u mM) 155 KCl, 3 MgCl2, 5 EGTA i 10 HEPES koji je podešen do pH 7.2 sa KOH. Za Na<+>struje, rastvor kupatila je sadržao (in mM) 150 NaCl, 2 KCl, 1 MgCl2, 1.5 CaCl2, 10 glukoza i 10 HEPES koji je podešen do pH 7.4 sa NaOH. Rastvor pipete je sadržao (u mM) 135 CsCl, 2 MgCl2, 2.5 Na2-ATP, 5 EGTA, 2.1 CaCl2, i 10 HEPES koji je podešen do pH 7.2 sa CsOH. Svi eksperimenti su izvedeni na sobnoj temperaturi (21-22°c). Protokoli stimulacije i prikupljanje podataka izvedeni su korišćenjem mikrokompjutera (Dell Pentium) koji je koristio komercijalni softver i hardver (pClamp 8.2). K<+>struje su snimljene koracima postupka nametnute voltaže membranskim potencijalima od -140 do 80 mV za neurone ili - 100 do 60 mV za transfektovane ćelijske linije u 20 mV koraka primenjenim od stalnog potencijala od - 80 mV. Trajanje pulseva depolarizacije je bilo 0.825 ms, i brzina ciklusa pulsa je bila 5 s. Strujne amplitude su procenjene na kraju pulseva stimulacije. Na<+>struje su snimljene koracima nametnute voltaže na membranskim potencijalima od - 80 do 50 mV u 5 mV koracima primenjenim stalnog potencijala od - 100 mV. Trajanje pulsa depolarizacije je bilo 100 ms, i

1

brzina ciklusa pulsa je bila 2 s. Strujne amplitude su procenjene na maksimalnoj vrednosti stimulacionih pulseva. Da bi se izolovale nativne Na<+>struje, TEA je korišćen u vanćelijskom rastvoru za blokiranje K<+>kanala. Prisustvo kadmijuma u vanćelijskom rastvoru u ovim neuronima omogućava blokadu kalcijumovih struja. Ćelije su kontinuirano superfuzirane sa mikroperfuzionim sistemom. Za INS-R9 ćelije, struje su snimljene u kontrolnim uslovima, onda u prisustvu MLC901 (1 µg/mL), MLC901 Pinacidil (10 µM) i MLC901 Pinacidil Glibenklamida (10 µM). Kontrolna, Pinacil, Pinacidil MLC901 i Pinacidil MLC901 Glibenklamid (10 µM) pefuzija sekvence takođe je izvedena.

Snimanja oocita

[0097] Defolikulovane oocite Xenopus-a su ubrizgane sa 100 nL cRNK na 0.02-0.4 µg/µL za ekspresiju Kir 6.2 i SUR 1, i snimane su 2-4 dana kasnije.

[0098] Za elektrofiziologiju, pojedinačne oocite su postavljene u 0.3-mL perfuzionu komoru i nabijene su sa dve standardne mikroelektrode (1-2.5 MΩ otpor) napunjene sa 3 M KCl i merene postupkom nametnute voltaže sa Dagan CA-1 pojačivačem, u simetričnom kalijumovom rastvoru koji sadrži (u mM) (90 KCl, 1.8 CaCl2, 1 mM MgCl2, 5 Hepes, pH 7.4 sa KOH). Stimulacija za dobijanje, dobijanje podataka, i analiza su izvedeni korišćenjem pClamp softvera (Axon Instrumenti). Struje su snimane u ovom kaljumovom simetričnom kontrolnom rastvoru. Aktivnost KATPkanala je ispitana deplecijom intraćelijskog ATP sa 3 mM natrijim azidom. MLC901 (1 µg/mL) i Pinacidil (10 mM) je ispitana posle deplecije ATP oocita. U svim eksperimentima, ispitana je inhibicija snimljenih struja sa Glibenklamidom (10 µM).

Statističke analize.

[0099] Podaci su prikazani kao srednja vrednost ± S.E.M. Statistička analiza razlika između grupa je izvedena upotrebom t testa jednog uzorka ili ANOVA. Gde su F odnosi bili značajni, statističke analize su bile produžene i poređenja posle toga su dobijena upotrebom Takijevog testa višestrukih testova poređenja. U svim analizama, nivo značajnosti je postavljen na P<0.05.

REZULTATI MLC901 štiti kortikalne neurone od smrti koja je povezana sa deprivacijom kiseonika i glukoze [0100] Efekti MLC901 su proučavani u in vitro modelu ishemije u kome su kortikalni neuroni bili izloženi deprivaciji glukoze i kiseonika. Hoechst-ovo bojenje nukleusa živih neurona je korišćeno za ispitivanje OGD-indukovane neuronske smrti u neuronima iz kulture. Kortikalni neuroni su prvo tretirani sa slanim rastvorom ili MLC901 (1 µg/mL). Doza MLC901 koja je korišćena je izabrana na osnovu prethodnog ispitivanja, u kome primena 1 µg/mL MLC901 je indukovala najbolju zaštitu protiv ćelijske smrti na kortikalnim neuronima u kulturi (Heurteaux et al., 2010). Tokom OGD izazova, ćelije su bile izložene tri uslovima tretmana: MLC901 je primenjen 1/ dva sata pre OGD (pre-OGD stanje), 2/ tokom 2 sata OGD (OGD stanje) i 3/ dva sata tokom OGD (post-OGD stanje). Uporedili smo zaštitne efekte MLC901 protiv OGD-indukovane neurodegeneracije kortikalnih ćelija. Nekoliko OGD indukuje dramatično smanjenje u broju živih Hoechst-pozitivnih ćelija. MLC601 tretman pre, tokom ili posle OGD za rezutat ima značajno povećanje u vijabilnosti neurona u poređenju sa respektivnim kontrolama (***P< 0.001) (n = 1235 mm šolja po grupi) (Slika 1). MLC901 primena posle OGD je dala bolju zaštitu (Slika 1). Primena specifičnog inhibitora KATP kanala, glibenklamida (Fosset et al., 1988, Bernardi et al., 1988) inhibirala je zaštitu indukovanu sa MLC901, što ukazuje na uključenje KATPkanala u zaštitnom efektu MLC901 prema OGD oštećenju (Slika 1).

2

Neurozaštitni efekat MLC901 može da bude povezan sa otvaranjem KATPkanala

[0101] Izvedeni su eksperimenti na pacovskim INS-R9 ćelijama insulinoma koje su poznate da eksprimiraju glibenklamid-osetljive KATPkanale koji su esencijalni za sekreciju insulina. KATPkanali u INS-R9 ćelijama su značajno aktivirani sa MLC901 (1 µg/mL) i uočen je aditivni efekat sa primenom 10 mM pinacidila, dobro poznatim aktivatorom KATPkanala (Edwards and Weston, 1990; Mannhold, 2004; Quast, 1992) (Slika 2). Glibenklamid (10 mM) inhibira KATPstruju aktiviranu sa MLC901 Pinacidil (Slika 2). Rezultati koji su dobijeni za INS-R9 ćelije potvrđuju da su elektrofiziološki efekti MLC901, bar delom posredovani sa, KATPkanalima.

[0102] Dve podjedinice koje čine KATPkanal neurona su SUR1i Kir6.2(Inagaki et al., 1995). Ekspresija SUR1i Kir6.2, oocita Xenopus-a dovodi do nastanka velikih unutrašnjih refraktornih struja u odgovoru na primenu natrijum azida (3 mM) da se smanji unutarćelijski ATP i da se poveća odnos ADP/ATP (Ashcroft and Ashcroft, 1990) (Slika 3A). Amplituda azidom-indukovane, glibenklamid-senzitivne struje KATPkanala je pojačana primenom pinacidila (10 µM) i kao što je očekivano inhibirana glibenklamidom (10 µM) (Slika 3A). Posle toga, izveden je isti tip eksperimenata upotrebom MLC901. Jasno, MLC901, slično pinacidil aktiviranim KATPkanala otkrivenih sa tretmanom azidom (Slika 3B-C-D). Dvanaest minuta nakon primene azida, srednja amplituda struje je bila -120 mV je - 480 ± 57 nA pre i -770 ± 67 nakon primene MLC901. Ova MLC901-indukovana aktivacija slična tome koja je proizvedena sa pinacidilom je nestala u prisustvu glibenklamida (Slika 3B-C-D). MLC901 se ponaša slično sa aktivacijom KATPkanala pinacidilom.

DISKUSIJA.

[0103] Rezultati koji su ovde opisani pokazuju da MLC901 štiti kortikalne neurone od smrti u in vitro ishemijskom modelu. Model uklanjanja kiseonika i glukoze imitira procese ćelijske smrti koji se uočavaju u regionima koji mogu da se spasu (penumbralnim) ishemijskog mozga in vivo. MLC901 značajno sprečava neuronske ćelije od smrti. Ovaj neurozaštitni efekat je blokiran glibenklamidom, specifičnim inhibitorom KATPkanala.

[0104] Aktivirajući efekat MLC901 na KATPkanala je dokazan elektrofizološkim eksperimentima na na ovocitima koji eksprimiraju rekombinovane kanale i ćelijama insulinoma. Ćelije insulinoma prirodno imaju KATPkanale, od suštinskog značaja da spoje promene vanćelijskog nivoa glukoze prema sekreciji insulina (Lazdunski, 1996). MLC901 indukuje veliku hiperpolarizaciju u ova oba tipa ćelija. Očekivano je da ova velika hiperpolarizacija koja je proizvedena od MLC901 snažno zaštiti neurone od smrti. MLC901 se ponašao kao pinacidil, klasičan otvarač KATPkanala (Edwards and Weston, 1990; Mannhold, 2004, Heurteaux et al., 1995), i stimulirajući efekti oba MLC901 i pinacidila su ukinuti sa glibenklamidom.

[0105] Aktivirajući efekti MLC901 na KATPkanalima su u terapeutskim uslovima korišćeni u modelima ishemije kod glodara (Heurteaux et al., 2010; Quintard et al., 2011). Prema tome, pored njegovih neuroregenerativnih osobina (Heurteaux et al., 2010), koktel aktivnih molekula predstavljen u ovom TCM izgleda da deluje preko KATPkanala bar za deo njegovih svojstava protiv cerebralne ishemije.

PRIMER 2

Snimanja oocite

[0106] Za ekspresiju Kir 6.2 i SUR 1 u defolikolovane oocite Xenopus-a je ubrizgano 100 nL cRNK na 0.02-0.4 µg/µL, i struje su snimljene nakon 2-4 dana. Svaka oocita je postavljena u 0.3-mL komore za perfuziju i nabijena je sa dve standardne mikroelektrode (1-2.5 MΩ otpor) ponovo napunjene sa 3 M KCl i izvršen je metod nametnute voltaže sa Dagan CA-1 pojačivačem, u simetričnom kalijomovom rastvoru koji sadrži (u mM) (90 KCl, 1.8 CaCl2, 1 mM MgCl2, 5 Hepes, pH 7.4 sa KOH). Stimulacija jaja, dobijanje podataka, i analiza izvedeni su korišćenjem pClamp softvera (Axon Instrumenti). Struje su snimljene u kalijumovom simetričnom kontrolnom rastvoru. Aktivnost KATPkanala je ispitana pomoću unutarćelijske deplecije ATP sa 3 mM natrijum azida.

Perfuzioni protokol:

[0107] Struja je prvo zabeležena u kontrolnim uslovima (simetrični rastvor kalijuma). Zatim, aktivnost kanala je povećana za 6 minuta perfuzijom 3 mM natrijum azida koja je održavana tokom celog eksperimenta. MLC901 ili drugi serijski proizvodi su isprani 6 minuta na posle ispiranja sa natrijum azidom. U svim eksperimentima, procenjena je inhibicija snimljenih struja sa Glibenklamidom (10 µM).

REZULTATI

[0108] Rezultati su prikazani na Slikama 4 i 5. Oba NA4A (kombinacija Astragalus Chaunxiong Sinensis Polygala) spada u obim predmetnog pronalaska i NA4B (kombinacija Astragalus Chaunxiong Sinensis Salvia) ne čini deo pronalaska koji aktivira K(ATP) kanal koji je prethodno aktiviran azidom. Povećanje struje indukovano otvaranjem kanala je inhibirano dodavanjem glibenklamida.90K je struja ćelije koja nije tretirana

PRIMER 3 (ne čini deo predmetnog pronalaska)

[0109] In vitro efekti oba uzorka (Neuroaid2 i "NA3" sečuanskog rizoma ljubavi (chuanxiong), kineske anđelike (sinensis), korena astragalusa (astragalus) na kloniranim Kir6.2/SUR2A kalijumovim kanalima (eksprimiranim od strane humanih KCNJ11 i SUR2A gena i koeksprimiranih u HEK293 ćelijama) su procenjeni na sobnoj temperaturi upotrebom QPatch HT® (Sophion Bioscience A/S, Denmark), automatskog paralelnog sistema za registrovanje metodom nametnute voltaže na deliću membrane. Uzorci su ispitani na 10 µg/ml sa svakom koncentracijom koja je testirana u dve ili više ćelija (n ≥ 2). Kanali su aktivirani 8 minutnim izlaganjem 10 µM pinacidilu i trajanje izloženosti svakoj ispitivanoj koncentraciji je bilo 5 minuta.

REZULTATI

[0110] Rezultati su prikazani na Slici 6. Oba uzorka NeuroAid2 i NA3 su sposobna da aktiviraju kanal, podaci su izraženi u procentu aktivacije kanala.

[0111] Aktivacija kanala od strane oba uzorka je inhibirana izlaganjem Glibenklamidu.

REFERENCE

Amoroso, S., Schmid-Antomarchi, H., Fosset, M., Lazdunski, M., 1990. Glucose, sulfonylureas, and neurotransmitter release: role of ATP-sensitive K+ channels. Science 247, 852-854.

Ashcroft, S. J., Ashcroft, F. M., 1990. Properties and functions of ATP-sensitive K-channels. Cell Signal 2, 197-214.

Bernardi, H., Fosset, M., Lazdunski, M., 1988. Characterization, purification, and affinity labeling of the brain [3H] glibenclamide-binding protein, a putative neuronal ATP-regulated K+ channel. Proc Natl Acad Sci U S A 85, 9816-9820.

Blondeau, N., Nguemeni, C., Debruyne, D. N., Piens, M., Wu, X., Pan, H., Hu, X., Gandin, C., Lipsky, R. H., Plumier, J. C., Marini, A. M., Heurteaux, C., 2009. Subchronic alpha-linolenic acid treatment enhances brain plasticity and exerts an antidepressant effect: a versatile potential therapy for stroke. Neuropsychopharmacology 34, 2548-2559.

Blondeau, N., Plamondon, H., Richelme, C., Heurteaux, C., Lazdunski, M., 2000. K(ATP) channel openers, adeno- sine agonists and epileptic preconditioning are stress signals inducing hippocampal neuroprotection. Neuroscience 100, 465-474.

Blondeau, N., Widmann, C., Lazdunski, M., Heurteaux, C., 2002. Polyunsaturated fatty acids induce ischemic and epileptic tolerance. Neuroscience 109, 231-241.

Catterall, W. A., 2000. From ionic currents to molecular mechanisms: the structure and function of voltage-gated sodium channels. Neuron 26, 13-25.

Chen, C., Venketasubramanian, N., Gan, R. N., Lambert, C., Picard, D., Chan, B. P., Chan, E., Bousser, M. G.,

Xuemin, S., 2009. Danqi Piantang Jiaonang (DJ), a traditional Chinese medicine, in poststroke recovery. Stroke 40, 859-863.

Choi, D. W., 1988. Glutamate neurotoxicity and diseases of the nervous system. Neuron 1, 623-634.

Coppola, T., Beraud-Dufour, S., Antoine, A., Vincent, J. P., Mazella, J., 2008. Neurotensin protects pancreatic beta cells from apoptosis. Int J Biochem Cell Biol 40, 2296-2302. Dirnagl, U., Iadecola, C., Moskowitz, M. A., 1999. Pathobiology of ischaemic stroke: an integrated view. Trends Neurosci 22, 391-397.

Edwards, G., Weston, A. H., 1990. Structure-activity relationships of K+ channel openers. Trends Pharmacol Sci 11, 417-422.

Enyedi, P., Czirjak, G., 2010. Molecular background of leak K+ currents: two-pore domain potassium channels. Physiol Rev 90, 559-605.

2

Fosset, M., De Weille, J. R., Green, R. D., Schmid-Antomarchi, H., Lazdunski, M., 1988. Antidiabetic sulfonylureas control action potential properties in heart cells via high affinity receptors that are linked to ATP-dependent K+ channels. J Biol Chem 263, 7933-7936.

Gan, R., Lambert, C., Lianting, J., Chan, E. S., Venketasubramanian, N., Chen, C., Chan, B. P., Samama, M. M., Bousser, M. G., 2008. Danqi Piantan Jiaonang does not modify hemostasis, hematology, and biochemistry in normal subjects and stroke patients. Cerebrovasc Dis 25, 450-456.

Goldberg, M. P., Choi, D. W., 1993. Combined oxygen and glucose deprivation in cortical cell culture: calcium- dependent and calcium-independent mechanisms of neuronal injury. J Neurosci 13, 3510-3524.

Gribkoff, V. K., Winquist, R. J., 2005. Voltage-gated cation channel modulators for the treatment of stroke. Expert Opin Investig Drugs 14, 579-592.

Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J., 1981. Improved patch-clamp techniques for high- resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Arch 391, 85-100.

Heurteaux, C., Bertaina, V., Widmann, C., Lazdunski, M., 1993. K+ channel openers prevent global ischemia-induced expression of c-fos, c-jun, heat shock protein, and amyloid beta-protein precursor genes and neuronal death in rat hippocampus. Proc Natl Acad Sci USA 90, 9431-9435. Heurteaux, C., Gandin, C., Borsotto, M., Widmann, C., Brau, F., Lhuillier, M., Onteniente, B., Lazdunski, M., 2010. Neuroprotective and neuroproliferative activities of NeuroAid (MLC601, MLC901), a Chinese medicine, in vitro and in vivo. Neuropharmacology 58, 987-1001.

Heurteaux, C., Guy, N., Laigle, C., Blondeau, N., Duprat, F., Mazzuca, M., Lang-Lazdunski, L., Widmann, C., Zanzouri, M., Romey, G., Lazdunski, M., 2004. TREK-1, a K(+) channel involved in neuroprotection and general anesthesia. Embo J 23, 2684-2695.

Heurteaux, C., Laigle, C., Blondeau, N., Jarretou, G., Lazdunski, M., 2006. Alpha-linolenic acid and riluzole treatment confer cerebral protection and improve survival after focal brain ischemia. Neuroscience 137, 241-251.

Heurteaux, C., Lauritzen, I., Widmann, C., Lazdunski, M., 1995. Essential role of adenosine, adenosine A1 receptors, and ATP-sensitive K+ channels in cerebral ischemic preconditioning. Proc Natl Acad Sci U S A 92, 4666-4670.

Inagaki, N., Gonoi, T., Clement, J. P. t., Namba, N., Inazawa, J., Gonzalez, G., Aguilar-Bryan, L., Seino, S., Bryan, J., 1995. Reconstitution of IKATP: an inward rectifier subunit plus the sulfonylurea receptor. Science 270, 1166-1170.

Lauritzen, I., Blondeau, N., Heurteaux, C., Widmann, C., Romey, G., Lazdunski, M., 2000. Polyunsaturated fatty acids are potent neuroprotectors. Embo J 19, 1784-1793.

Lauritzen, I., De Weille, J. R., Lazdunski, M., 1997. The potassium channel opener (-)-cromakalim prevents gluta- mate-induced cell death in hippocampal neurons. J Neurochem 69, 1570-1579.

Lazdunski, M., 1996. Ion channel effects of antidiabetic sulfonylureas. Horm Metab Res 28, 488-495.

Lee, J. M., Grabb, M. C., Zipfel, G. J., Choi, D. W., 2000. Brain tissue responses to ischemia. J Clin Invest 106, 723-731.

Legos, J. J., Barone, F. C., 2003. Update on pharmacological strategies for stroke: prevention, acute intervention and regeneration. Curr Opin Investig Drugs 4, 847-858.

Lesage, F., 2003. Pharmacology of neuronal background potassium channels. Neuropharmacology 44, 1-7.

Lesage, F., Lazdunski, M., 2000. Molecular and functional properties of two pore domain potassium channels. Am. J. Physiol.279, 793-801.

Leybaert, L., De Ley, G., de Hemptinne, A., 1993. Effects of flunarizine on induced calcium transients as measured in fura-2-loaded neurons of the rat dorsal root ganglion. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol 348, 269-274.

Liss, B., Roeper, J., 2001. Molecular physiology of neuronal KATP channels. Mol Membr Biol 18, 117-127.

Mannhold, R., 2004. KATP channel openers: structure-activity relationships and therapeutic potential. Med Res Rev 24, 213-266.

Mazighi, M., Amarenco, P., 2011. Reperfusion therapy in acute cerebrovascular syndrome. Curr Opin Neurol 24, 59-62.

Mourre, C., Ben Ari, Y., Bernardi, H., Fosset, M., Lazdunski, M., 1989. Antidiabetic sulfonylureas: localization of binding sites in the brain and effects on the hyperpolarization induced by anoxia in hippocampal slices. Brain Res 486, 159-164.

Obrenovitch, T. P., 1997. Sodium and potassium channel modulators: their role in neuroprotection. Int Rev Neurobiol 40, 109-135.

Obrenovitch, T. P., 2008. Molecular physiology of preconditioning-induced brain tolerance to ischemia. Physiol Rev 88, 211-247.

Plamondon, H., Blondeau, N., Heurteaux, C., Lazdunski, M., 1999. Mutually protective actions of kainic acid epileptic preconditioning and sublethal global ischemia on hippocampal neuronal death: involvement of adenosine A1 re- ceptors and KATP channels. J Cereb Blood Flow Metab 19, 1296-1308.

Quast, U., 1992. Potassium channel openers: pharmacological and clinical aspects. Fundam Clin Pharmacol 6, 279-293.

Quintard, H., Borsotto, M., Veyssiere, J., Gandin, C., Labbal, F., Widmann, C., Lazdunski, M., Heurteaux, C., 2011. MLC901, a traditional Chinese medicine protects the brain against global ischemia. Neuropharmacology 61, 622-631.

2

Shahripour, R. B., Shamsaei, G., Pakdaman, H., Majdinasab, N., Nejad, E. M., Sajedi, S. A., Norouzi, M., Hemmati, A., Manouchehri, R. H., Shiravi, A., 2011. The effect of NeuroAid (MLC601) on cerebral blood flow velocity in subjects’ post brain infarct in the middle cerebral artery territory. Eur J Intern Med 22, 509-513.

Venketasubramanian, N., Chen, C. L., Gan, R. N., Chan, B. P., Chang, H. M., Tan, S. B., Picard, D., Navarro, J. C., Baroque, A. C., 2nd, Poungvarin, N., Donnan, G. A., Bousser, M. G., 2009. A doubleblind, placebo-controlled, randomized, multicenter study to investigate CHInese Medicine Neuroaid Efficacy on Stroke recovery (CHIMES Study). Int J Stroke 4, 54-60.

Young, S. H., Zhao, Y., Koh, A., Singh, R., Chan, B. P., Chang, H. M., Venketasubramanian, N., Chen, C., 2010. Safety profile of MLC601 (Neuroaid) in acute ischemic stroke patients: A Singaporean substudy of the Chinese medicine Neuroaid efficacy on stroke recovery study. Cerebrovasc Dis.30, 1-6.

2

Claims (8)

Patentni zahtevi

1. Kompozicija ili komplet za upotrebu u postupku pružanja neurozaštite, lečenja moždanog udara, neurološkog poremećaja, ishemije, ili obezbeđivanja neurokondicioniranja da se obezbedi tolerancija u mozgu protiv ishemijskog, epileptičkog ili drugog oštećanja, pri čemu se kompozicija ili komplet sastoji iz aktivnih sastojaka sledeće četiri komponente:

i. Polygalae (mlekača ((engl. thinleaf milkwort), Polygala tenuifolia Willd., Polygala sibirica L. ili Yuanzhi)), poželjno njihovog korena (tj. radix polygalae);

ii. Astragali - astragalus ((engl. Membranous Milkvetch) ili Huang Qi), poželjno korena astragalusa (tj. radix astragali);

iii. Chuanxiong – sečuanski rizom ljubavi, poželjno njegovog rizoma (tj. rhizoma chuanxiong); i

iv. Angelicae sinensis – kineska anđelika ili ženski ženšen (Chinese Angelica ili DanGui), poželjno korena (tj. radix angelicae sinensis).

2. Kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, pri čemu je kompozicija farmaceutska kompozicija koja obuhvata farmaceutski prihvatljivo pomoćno sredstvo, nosač ili razblaživač.

3. Kompozicija ili komplet za upotrebu prema patentnom zahtevu 1 ili patentnom zahtevu 2, pri čemu je neurozaštita protiv moždanog udara ili degenerativnog poremećaja.

4. Kompozicija ili komplet za upotrebu prema bilo kom patentnom zahtevu 1 do 3, pri čemu je šlog cerebralni moždani udar.

5. Kompozicija ili komplet za upotrebu prema bilo kom patentnom zahtevu 1 do 3, pri čemu je udar kardiovaskularna bolest (srčani udar uglavnom zbog koronarnog arterijskog udara).

6. Kompozicija ili komplet za upotrebu prema patentnom zahtevu 1 ili patentnom zahtevu 2, pri čemu je neurološki poremećaj neurodegenerativna bolest ili traumatska povreda mozga.

7. Kompozicija ili komplet koji se sastoji iz aktivnih sastojaka sledećih četiri komponenti:

i. Polygalae (mlekača (engl. thinleaf milkwort), Polygala tenuifolia Willd., Polygala sibirica L. ili Yuanzhi), poželjno njihovog korena (tj. radix polygalae);

ii. Astragali - astragalus ((engl. Membranous Milkvetch) ili Huang Qi), poželjno korena astragalusa (tj. radix astragali);

iii. Chuanxiong – sečuanski rizom ljubavi, poželjno njegovog rizoma (tj. rhizoma chuanxiong); i

iv. Angelicae sinensis – kineska anđelika ili ženski ženšen (Chinese Angelica ili DanGui), poželjno korena (tj. radix angelicae sinensis).

8. Kompozicija ili komplet prema patentnom zahtevu 7, koji obuhvata farmaceutski prihvatljivo pomoćno sredstvo, nosač ili razblaživač.

2