MX2011005528A - Metodo para producir derivados funcionalizados con acido hialuronico y formacion de sus hidrogeles. - Google Patents

Abstract

En esta invención se describe un procedimiento de dos etapas que es útil para insertar grupos funcionales al ácido hialurónico (HA), por medio de la formación, en un solvente orgánico, de un grupo activo particular sobre los grupos hidróxilo de HA y la substitución subsiguiente, sobre el grupo activo insertado, con una porción colgante que contiene al menos en su porción terminal, un grupo funcional nucleofílico, NH2-R. El grupo insertado por la substitución nucleofílica puede contener en otra de sus porciones terminales un grupo funcional nucleofílico adicional, de una manera que sea fácilmente explotable para funcionalizaciones químicas adicionales, tal como por ejemplo para obtener la metacrilación de los grupos funcionales de HA, para obtener derivados foto-reticulables. Ambos derivados directos del proceso propuesto y aquellos obtenidos por la funcionalización adicional pueden ser empleados para producir hidrogeles.

Description

METODO PARA PRODUCIR DERIVADOS FU CIONALIZADOS CON ACIDO HIALURONICO Y FORMACION DE SUS HIDROGELES Campo de la Invención La presente invención se refiere a un procedimiento para la producción de los derivados de ácido hialurónico funcionalizados y los hidrogeles relacionados. De manera más i particular, esta invención se refiere a una metodología; de dos etapas útil para insertar los grupos funcionales sobre el ácido hialurónico, por medio de la formación de un grupo activo específico sobre los grupos de hidróxilo del ácido hialurónico y la substitución subsiguiente del grupo activo insertado, con una porción colgante que contiene como la porción terminal al menos un grupo funcional nucleofílico . El grupo insertado por substitución nucleofílica puede contener como otra porción terminal otro grupo terminal nucleofílico que puede ser explotado para funcionalizaciones químicas adicionales, en particular para favorecer la reticulación de las cadenas de ácido hialurónico que producen los hidrogeles.

Antecedentes de la Invención El ácido hialurónico (HA) es el más abundante de los glucosaminoglicanos no sulfatados presentes en la matriz extracelular de todos los tejidos; el HA es un polisacárido constituido por unidades repetitivas del ácido D-glucurónico (GlcUA) y la N-acetil-D-glucosamina (GlcNAc) cuya estructura REF.220372 química puede estar representada por la siguiente fórmula ¡que muestra dos unidades repetitivas consecutivas (el número n de unidades repetitivas podría ser tal como para determinar un peso molécula comprendido entre 50000 y varios millones de daltons) .

El ácido hialurónico participa activamente en varios procesos de importancia biológica tales como la movilidad celular, la diferenciación celular, y la cicatrización de las heridas. En particular, el HA desempeña un papel estructural clave en la organización de la matriz extracelular del cartílago llevando a cabo la formación del proteoglicano más abundante, es decir el agrecano.

El ácido hialurónico con un peso molecular elevado es utilizado en viscocirugía y viscosuplementación y es utilizado en el campo oftálmico y para reducir el dolor en la osteroartritis como un lubricante que puede ser aplicado por medio de inyecciones intra-articulares .

Recientemente, varios derivados de HA funcionales o reticulados han sido producidos como películas o esponjas que van a ser aplicadas sobre las heridas, en donde este producto tiene propiedades de cicatrización del tejido.

En el campo de diseño de los tejidos - que surge de un objetivo que está relacionado con el desarrollo de tecnologías útiles para obtener la regeneración o el reemplazo completo de los tejidos humanos dañados - el HA ha sido empleado ampliamente para la producción de estructuras porosas tridimensionales conocidas como soportes. Estas matrices mejoran el crecimiento y la diferenciación celular del tejido para favorecer la regeneración y la reconstrucción del tejido.

Para tales aplicaciones el HA es útil cuando es substituido adecuadamente para obtener hidrogeles . Debido a que los hidrogeles conocidos están constituido por polímeros naturales o sintéticos o sus derivados o por combinaciones de polímeros naturales y sintéticos, tales moléculas interactúan como resultado de las interacciones de Van der Waals, la unión por medio de hidrógeno, los enlaces electrostáticos o químicos, por lo tanto los hidrogeles son redes de polímeros hidrofílicos capaces de absorber el agua hasta varios cientos de veces su peso seco. Considerando sus propiedades hidrofílicas y su biocompatibilidad potencial, los hidrogeles reciben un interés creciente para aplicaciones farmacéuticas y biomédicas- farmacéuticas .

La funcionalización química de la estructura de : HA polisacarídica por la inserción de grupos funcionales colgantes tiene el objetivo de obtener dispositivos farmacéuticos para prolongar la liberación del fármaco (sistemas de suministro del fármaco) ; en tales sistemas el fármaco está enlazado química o físicamente al portador del polisacárido y es liberado siguiendo los tiempos y maneras capaces de mejorar la biodisponibilidad del fármaco.

Considerando el gran interés hacia las aplicaciones farmacéuticas, biomédicas y cosméticas del ácido hialurónico, es evidente la alta demanda de nuevas estrategias químicas para permitir nuevas modificaciones y más simples de HA. Estos nuevos derivados pueden ser empleados entonces para ajustarse a varias aplicaciones posibles.

En el pasado, varias modificaciones químicas del ácido hialurónico que relacionan sus funcionalidades , de hidróxilo y carboxilo y varios derivados de HA para la aplicación en el campo biomédico o farmacéutico, han sido descritas .

Como ejemplo, la patente U.S. N. 4582865 (Balasz et al por Biomatrix Inc.) describe la reticulación de HA por la reacción con divinilsulfona en condiciones altamente básicas. La solicitud de patente europea EP 0216456 (Fidia S.p.Á.) describe esterificaciones de sales de hialuronato con haluros de alquilo en los solventes apróticos polares. Tales derivados han encontrado grandes aplicaciones en el campo farmacéutico, tales como soportes para el diseño de tejidos y como dispositivos para controlar la liberación del fármaco.

Estos derivados de Ha del éster tienen características fisicoquímicas modificadas tales como una solubilidad incrementada en solventes orgánicos, tales como el sulfóxido de dimetilo que mejoran los funcionamientos industriales para obtener fibras, soportes porosos y películas.

Recientemente, otras estrategias químicas diferentes han sido propuestas para obtener la funcionalización del ácido hialurónico con cadenas colgantes funcionales, empleando reacciones tanto sobre los grupos de carboxilo de la porción glucurónica como sobre los grupos hidróxilo de las unidades respectivas. En varios documentos particulares se describen la química de la carbodiimida (empleando compuestos que tienen la fórmula R1-N=C=N-C-R2) para obtener la funcionalización química de la porción D-glucurónica de HA.

Como un ejemplo Prestwich, Poyani et al, emplearon carbodiimidas solubles en agua para insertar las cadenas colgantes de hidrazina sobre el soporte de hialuronano (patentes US 5502081 de Prestwich et al, por The Research Foundation State University de New York; patente US 5616568 de T. Pouyany et al., T. Pouyani, G. D. Prestwich Funcionalized Derivatives of Hyaluronic Acid Oligosaccharides ; Drug Carriers and Novel Biomateriaís , Bioconjugate Chem. , 1994, 5, 339-347). En estos ejemplos, los grupos de carboxilo del ácido hialurónico reaccionan con las moléculas bi- funcionales que tienen la fórmula general H¿N- NH-CO-A-CO-NHNH2 en donde A es un grupo espaciador genérico, que produce los derivados de ácido hialurónico funcionalizados que llevan grupos de hidrazina colgantes que tienen la fórmula HA-CONH-NH-CO-A-CO-NH-NH2. Siguiendo la misma línea de investigación, Vercruysse et al. (Vercruysse et al., "Synthesis and in Vitro Degradation of New Polyvalent Hidrazide Cross-Linked Hydrogels of Hyaluronic Acid, Bioconjugate Chem., 1997, 8, 686-694) describe como funcionalizar el ácido hialurónico utilizando moléculas que llevan más de dos grupos terminales de hidrazina, que permiten una reticulación del polisacárido de partida y luego producir los hidrogeles .

Aeschlimann et al. (patente US 6630457 de Aeschlimann et al., por Othogene LLC que corresponde a la patente europea N. EP 1757314) modificó el método de activación del grupo carboxilo de HA propuesto por Pouyani, por la combinación para el empleo de carbodiimidas solubles en agua, utilizando los activadores nucleofílicos tales como las hidroxisuccinimidas y los hidroxitriazoles . En particular, el método descrito trata de la introducción , de nuevos grupos funcionales sobre la estructura de HA activando primero sus grupos carboxílicos que producen grupos de éster intermedios, luego substituyendo estos grupos salientes de éster utilizando moléculas que contienen un buen grupo nucleofílico sobre un lado y un grupo funcional protegido químicamente en el otro lado. De esta manera, los compuestos intermedios activados con HA son más estables y entonces la siguiente funcionalización por las moléculas nucleofílicas bifuncionales es más selectiva. De tal manera los derivados de HA de amina y aldehido han sido producidos adecuadamente para la reticulación subsiguiente, obteniéndose así hidrogeles a base de HA biocompatibles .

Además, la solicitud de patente WO 02/098923 propuesta por Eurand Pharmaceuticals Ltd, los inventores Mariotti et al, muestra los métodos para producir los derivados HA funcionalizados en donde sus grupos de hidróxilo son esterificados o carbamoilados (HA-0-C0NH-) y los grupos carboxilo son esterificados total o parcialmente con los alcoholes. Tales grupos de hidróxilo carbamoilados son obtenidos haciendo reaccionar el polisacárido con los isocianatos de alquilo, arilo o arilalquilo (R-N=C=0) . De tal manera los derivados de HA carbamoilados y esterificados han sido obtenidos para ser aplicados como fases estacionarias para el análisis cromatográfico .

De manera semejante a como se describe por Mariotti et al., Chen Jui-hsiang et al., en la patente EP 1538166 (propuesta por Industrial Technology Research Institute) describe la producción de derivados de HA como polímeros hidrofóbicos , hidrofílicos y anfifílicos de cadenas colgantes, obtenidos por la reacción entre los derivados del polisacárido e isocianatos de los mismos polímeros.

Las últimas dos patentes citadas describen la formación del derivado de HA carbámico sobre los grupos de hidróxilo de las unidades repetitivas del disacárido, efectuando una reacción utilizando las sales de HA solubles en un solvente aprótico polar y los isocianatos reactivos . En este caso, los grupos hidróxilo del ácido hialurónico fueron funcionalizados en una sola etapa de reacción, produciendo entonces un enlace carbámico ( -0-CO-NH- , también conocido como un enlace uretánico) entre el ácido hialurónico y la nueva funcionalidad colgante; tal funcionalización puede ser descrita utilizando entonces la siguiente fórmula general (HA-O-CO-NH-R) en donde R podría ser una cadena hidrofílica, lipofílica o anfifílica. Sin embargo, las metodologías citadas sufren del inconveniente de que la funcionalización es restringida solamente a los derivados de isocianatos que tengan que ser empleados como reactivos de partida.

Considerando las metodologías descritas anteriormente, esta invención tiene el objetivo de descubrir un nuevo método para la producción de derivados de HA funcionalizados que pueden ser explotados para la producción de hidrogeles reticulados o como compuestos intermedios útiles para obtener una funcionalización adicional, en los solventes tanto acuosos como orgánicos. Un objeto adicional de esta invención es describir metodologías en donde estos derivados de HA funcionales pueden ser explotados fácilmente para la producción de nuevos hidrogeles.

Breve Descripción de la Invención Teniendo en cuenta esto como objetivo, de acuerdo con la presente invención, se ha encontrado un método químico versátil para obtener derivados funcionales de HA de tal manera que no involucren en la reacción química los grupos carbilo de las porciones glucurónicas del ácido hialurónico. Este método involucra un procedimiento de dos etapas, en donde la primera etapa es la introducción de una porción activa química sobre al menos un grupo hidróxilo del ácido hialurónico para dar un compuesto intermedio activo, y en donde en la segunda etapa el compuesto intermedio activo reacciona con un nucleófilo reactivo; el nucleófilo reactivo lleva al menos un grupo amino primario. La aplicación consecutiva del procedimiento dedos etapas genera la formación de al menos un grupo carbámico (-0-C0-NH-) enlazado a la estructura de HA por medio de al menos uno de sus grupos hidróxilo .

En particular, en la primera etapa del método, las moléculas de activación específicas tales como 1 el bis (carbonato de 4 -nitrofenilo) disponible comercialmente y bien conocido o el carbonato de cloronitrofenilo son empleados para insertar los grupos de nitrofenoxicarbonílo (N02-PH-0-CO- ) sobre los grupos de hidróxilo del HA (primarios y/o secundarios) ; en la segunda etapa un buen grupo saliente insertado (nitrofenoxilo) es substituido por una molécula nucleofílica que tiene la fórmula general NH2-R. Tal molécula nucleofílica debe contener al menos un grupo primario de amina, y R representa un NH2, un grupo alquilamino, una cadena alquílica, una cadena de arilalquilo, una cadena poliacrílica, una cadena de polioxietileno o más generalmente cualquier molécula con un peso molecular bajo (como por ejemplo un fármaco) o un peso molecular elevado (como ejemplo un polímero, una proteína, etc.); preferentemente la molécula con un peso molecular bajo o elevado es biocompatible y soluble ya sea en los solventes inorgánicos o en un medio acuoso.

De acuerdo con esta invención, es posible obtener un nuevo enlace carbámico, por una reacción de dos fases, sobre los grupos hidróxilo primarios y/o secundarios de HA, empleando el compuesto intermedio oportuno de activación. : En particular, el bis (carbonato de -nitrofenilo) reactivo ha sido empleado para generar un derivado de carbonato de nitrofenilo reactivo sobre el HA, fácilmente reactivo hacia las moléculas nucleofílicas que llevan preferentemente las funcionalidades de amino o hidrazida.

La cadena colgante insertada sobre la segunda etapa del procedimiento, en el caso de que sea necesario, puede llevar al menos otro grupo funcional todavía disponible para las funcionalizaciones químicas adicionales efectuadas en el medio orgánico o acuoso, que reaccionan con las moléculas que llevan otros grupos funcionales, en particular grupos químicos particulares capaces de permitir una reacción de reticulación.

El método descrito puede ser empleado para producir derivados de HA que llevan nuevas funcionalidades químicas de amina o hidrazida o para producir derivados de HA que llevan cadenas colgantes hidrofílicas o lipofílicas.

De tal manera una amplia variedad grupos funcionales químicos disponibles comercialmente pueden ser enlazados a HA por medio de sus grupos de hidróxilo (primarios y/o secundarios) . Además, siguiendo este procedimiento es posible funcionalizar adicionalmente tales derivados de amino e hidrazida también en un medio ambiente orgánico: en particular las sales de tetrabutilamonio (TBA) de tales derivados de HA de amino o hidrazida pueden ser empleados para funcionalización adicional. En general, tal funcionalización adicional puede ser efectuada en el medio tanto acuoso como orgánico, en particular solventes apróticos polares tales como sulfóxido de dimetilo, dimetilformamida y dimetilacetamida y sus mezclas.

Breve Descripción de las Figuras Algunos resultados experimentales son ilustrados ,en las siguientes figuras, en donde: la figura 1 muestra el espectro de 1H-RM (D20) del derivado de HA-EDA que tiene 50 % mol/mol de la funcionalización en los grupos de etilendiamina, obtenidos de acuerdo con el procedimiento de la invención; la figura 2 muestra el espectro de 1H-R N (D20) del derivado de HA-BTA que tiene 52 % mol/mol de la funcionalización en los grupos de butilo obtenidos de acuerdo con el procedimiento de la invención; la figura 3 muestra el espectro de 1H-RMN (D20) del derivado de HA-NH-PEG, que tiene 33 % mol/mol en la funcionalización en las cadenas de polioxietileno-monometil-monoamino obtenido de acuerdo con el procedimiento de la invención; la figura 4 muestra el espectro de 1H-RMN (D20) de HA-EDA-MA derivado que tiene 50 % mol/mol de funcionalización en los grupos de etilendiamina y 50 % mol/mol 'de funcionalización en los grupos metacrílicos , obtenidos : de acuerdo con el procedimiento de la invención. las figuras 5A y 5B muestran las imágenes de SEM del hidrogel de HA-EDA-BC secado por congelamiento al 0.5 % p/v. la figura 6 muestra la proliferación de los condrocitos humanos encapsulados en los hidrogeles de HA-EDA-BC. Los valores son expresados como absorbancia + desviación estándar (n = 9) .

La figura 7 muestra el teñido para las células vivas/muertas de los condrocitos encapsulados 3-D en los hidrogeles de HA-EDA-BC después de 3 días de cultivo. Las células muertas están indicadas por las rejillas.

Descripción Detallada de la Invención Entonces, es un objeto específico de esta invención un procedimiento para la producción de los derivados funcionales del ácido hialurónico compuesto de las siguientes etapas consecutivas: (a) la activación de al menos un grupo hidróxilo del ácido hialurónico (HA) (este HA como una sal soluble en los solventes orgánicos) ; hacer reaccionar esta sal de HA en el solvente aprótico polar con un agente de carbonatación elegida entre los fenilésteres carbónicos o los fenilésteres halofórmicos ; (b) la reacción de la sal de HA activada obtenida de la etapa (a), por medio de substitución nucleofílica, con' un compuesto que tiene la fórmula general NH2R, en donde R puede ser: (NH2, un grupo aminoalquilo, una cadena de alquilo, una cadena de arilalquilo, una cadena poliacrílica, una cadena de polioxietileno, o una molécula de un peso molecular bajo (como ejemplo un fármaco) o una molécula de peso molecular elevado (como ejemplo un polímero, una proteína, etc.); preferentemente la molécula con un peso molecular bajo o elevado es biocompatible y soluble ya sea en los solventes orgánicos o en un medio acuoso.

En particular, el reactivo de carbonatacion empleado para la primera etapa puede ser el bis (carbonato de ' 4-nitrofenilo) (un éster de carbonil fenilo) y/o un carbonato de cloro nitrofenilo.

La sal del ácido hialurónico soluble en los solventes orgánicos debe ser elegida preferentemente entre la sal tetrabutilamonica (indicada como TBA) o la sal de cetiltrimetilamonio (indicada como CTA) .

De acuerdo con algunos aspectos de realización preferidos de la invención, el solvente orgánico empleado para las reacciones de funcionalización se elije entre el sulfóxido de dimetilo, dimetilformamida, dimetilacetamida y sus mezclas y ambas etapas de activación) (a) y de substitución nucleofílica (b) son llevadas a cabo a temperaturas entre 10 y 60 °C.

El grado funcionalizado de los, derivados de HA obtenidos puede variar desde solamente un grupo hidróxilo hasta los grupos hidróxilos totales de HA y depende (de una manera directamente proporcional) de la cantidad del agente de carbonilación reactivo utilizado en el proceso descrito anteriormente. Preferentemente, el grado de funcionalización varía entre 5 y 95 %, más preferentemente entre 20 y 80 % (para el mejor entendimiento de esto véase el ejemplo 1) .

De acuerdo con otras modalidades específicas, el compuesto que tiene la fórmula general NH2-R puede ser elegido entre la hidrazina (-NH2-NH2) y un grupo de bis-amino alquilo que tiene la fórmula NH2- (CH2) n-NH2, en donde n es un número entre 1 y 30, preferentemente entre 1 y 10. En otra modalidad específica mostrada en la siguiente sección experimental, las moléculas bifuncionales tales como etilendiamina (NH2-CH2-CH2-NH2 , llamada EDA) e hidrazina (NH2-NH2, llamada Hy) han sido enlazadas a la estructura de HA para obtener los derivados de HA-EDA y HA-Hy respectivamente.

De acuerdo con la presente invención, un derivado de ácido hialurónico tal como HA-EDA y HA-Hy puede ser explotado para producir un hidrogel por medio de un procedimiento de auto-reticulación empleando las carbodiimidas como agentes de activación o una reticulación química empleando las moléculas de reticulación bi-funcionales , tales como por ejemplo glutaraldehído, u otras moléculas polifuncionales . Los detalles específicos de las modalidades mencionadas están en la siguiente parte experimental.

La presente invención describe métodos para emplear sales solubles de solventes orgánicos, en particular derivados tetrabutilamónicos , de amino o de ácido hialurónico hidrazina o las sales de ácido hialurónico solubles en agua obtenidas utilizando los procedimientos mostrados en la invención, para efectuar derivaciones adicionales. Tales derivaciones pueden ser efectuadas en solventes orgánicos o un medio acuoso. De acuerdo con otros aspectos preferidos: de esta invención, un derivado de una sal del ácido hialurónico obtenido como en la etapa (b) del procedimiento, sigue un procedimiento de funcionalización adicional por üna substitución nucleofílica con una molécula que tiene la fórmula general Y-R' , en donde Y es un buen grupo saliente tal como un halógeno, N-oxisuccinimida, un alcoxilo con 1-6 átomos de carbono, o Y es una porción hidrofílica de un anhídrido o un epóxido, y R' es una porción tal como un grupo acriloilo o metacriloilo ambos substituidos oportunamente, una porción de un solvente orgánico o una molécula soluble en un solvente acuoso.

Preferentemente, la funcionalización adicional se lleva a cabo en un solvente aprótico polar elegido entre sulfóxido de dimetilo, dimetilformamida, dimetilacetamida, o sus mezclas, a temperaturas comprendidas entre 5 y 60 ÓC; siguiendo otros aspectos preferidos de la invención, ' la reacción se lleva a cabo en la presencia de un catalizador elegido entre la dietilamina, trietilamiña, dimetilaminopiridina y sus mezclas.

Para la producción de derivados de ácido hialurónico acrílieos o metacrílieos , tal compuesto que tiene la fórmula Y-R' es preferentemente el anhídrido metacrílico, cloruro de metacriloilo, cloruro de acriloilo, acrilato de glicidilo o metacrilato de glicidilo; para la producción de otro derivado particular, mostrado en la siguiente parte experimental, el derivado de benzoilcisteína del ácido hialurónico, el compuesto de la fórmula general Y-R' es el monoéster o diéster de N-oxisuccinimida de la ?,?' -dibenzoil-L-cisteína o sus derivados semejantes.

En este último ejemplo, el derivado obtenido de esta funcionalización adicional es tratado subsiguientemente con un procedimiento de reducción para obtener una porción de benzoil-cisteína enlazada al ácido hialurónico.

De acuerdo con un aspecto adicional, la presente invención trata de nuevos productos que consisten de derivados funcionalizados del ácido hialurónico que tiene un peso molecular en el intervalo de 50000-1500000 daltons que se pueden obtener a partir de un proceso como se describió anteriormente .

Aquí posteriormente serán presentadas fórmulas estructurales que van a estar propuestas como sólo representativas del tipo de funcionalización (unión covalente) que ocurre con respecto a un grupo hidróxilo de HA cuando se somete al proceso descrito anteriormente.

Las estructuras reportadas aquí posteriormente , no van a estar propuestas como representativas del grado de funcionalización el cual, como se estableció anteriormente, en lugar de esto son directamente proporcionales a la cantidad del agente de carbonilación reactivo, utilizado , en el proceso anterior.

De acuerdo con una modalidad preferida, la presente invención se refiere a derivados acrílicos o metacrílicos del ácido hialurónico que tienen pesos moleculares comprendidos entre 50000 y 1500000 Daltons que se pueden obtener del proceso como se describió anteriormente.

El tipo de funcionalización de tales derivados metacrílicos podría estar representado por la siguiente estructura que describe dos unidades de disacáridos consecutivas del ácido hialurónico de partida, en donde al menos un grupo hidroxi ha sido funcionalizado Los derivados acrílicos podrían estar representados por la fórmula anterior en donde en el lugar del metacriloilo está presente un grupo acriloilo.

Tales derivados acrílicos o metacrílicos pueden ser producidos de acuerdo con el procedimiento de "dos etapas" descrito por la invención, seguido de una funcionalización adicional como se reportó anteriormente.

Además, es posible controlar la cantidad de la funcionalización de la tercera etapa en los grupos acrílicos o metacrílicos para obtener derivados que tienen grupos amino libres que varían desde 5 hasta 95 %.

Un hidrogel reticulado puede ser obtenido de los productos descritos anteriormente empleando un procedimiento de foto-reticulación, en donde la concentración del derivado funcionalizado mencionado en una solución acuosa u orgánica está comprendido entre 1 % p/v y 20 % p/v. Preferentemente, el hidrogel es obtenido por la irradiación con longitudes de onda comprendidas entre 180 y 800 mm, con o sin un fotoiniciador del radical, con un tiempo de radiación comprendido entre 5 minutos y 10 horas. Tales hidrogeles pueden ser obtenidos también por la irradiación de microondas, la irradiación de ondas ?, o por otras radiaciones ionizantes.

Tal foto-reticulación puede ocurrir en la presencia de aditivos adecuados tales como monómeros acrílicos 1 y metacrílicos, metacrilatos y acrilatos de polietilenglicól, tanto mono como polifuncionales , o en la presencia de otros aditivos empleados para cambiar o mejorar la plasticidad, dureza, el carácter hidrofílico o lipofílico.

De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, este tiene como un objetivo específico un nuevo derivado obtenido de acuerdo con el procedimiento de dos etapas propuesto, el derivado de benzoilcisteína del ácido hialurónico o sus derivados semejantes que tienen un peso molecular comprendido entre 50000 y 1500000 daltons, que se puede obtener a partir del proceso descrito anteriormente. Tales derivados de benzoilcisteína del ácido hialurónico podrían estar representados por la siguiente estructura, referida como dos unidades de disacáridos consecutivas del ácido hialurónico de partida, en donde al menos un grupo hidroxi ha sido funcionalizado: HA-EDA-BC El derivado aminoacídico puede ser obtenido siguiendo el procedimiento de dos etapas de acuerdo con la invención, y luego siguiendo una funcionalización adicional, como se describió anteriormente y por una reducción del puente de disulfuro del derivado del ácido hialurónico subsiguiente.

En este caso, es posible obtener un hidromel reticulado aún por oxidación con exposición al aire.

En general, la presente invención incluye en ; su alcance los hidrogeles obtenidos por medio de los métodos descritos, tales hidrogeles pueden ser producidos, aplicando los procedimientos técnicos apropiados, como nanopartículas o micropartículas , películas, membranas, fibras y soportes.

Finalmente, esta invención se refiere al uso de los hidrogeles descritos para la producción de dispositivos de suministro de fármacos o de genes, para usos cosméticos o agroalimentarios , para la producción de sistemas que cubren las heridas, los órganos o los tejidos, de los materiales y soportes implantables para la regeneración de los tejidos.

Las características específicas de esta invención, como sus ventajas y metodologías y los ejemplos de las aplicaciones específicas referidas para las funcionalizaciones adicionales de los derivados, y la preparación de los hidrogeles, será más clara en 'la descripción ej emplificativa detallada como se da a continuación.

Parte experimental Ejemplo 1 Síntesis del derivado de ácido hialurónico-etilendiamina (HA-EDA) 3 g de la sal de tetrabutilamonio del ácido hialurónico (HA-TBA) preparada por la neutralización de la solución del ácido hialurónico utilizando una solución de hidróxido de tetrabutilamonio, se disuelven en 270 ral del sulfóxido de dimetilo anhidro (peso molecular promedio ponderado del ácido hialuronico de 270 kDa) .

La cantidad adecuada del carbonato de bis (4-nitrofenilo) (4-NPBC) elegido de una manera que se obtengan relaciones molares de 4-NPBC/moles de HA-TBA respectivamente iguales a 0.75, 0.5 y 0.25 se disuelven en 30 mi de sulfóxido de dimetilo anhidro; esta solución fue agregada gota a gota a la solución de HA-TBA a 40 °C bajo agitación. Después de 4 h, se agregan gota a gota 3 mi de etilendiamina (EDA) y la solución se deja a 40 °C durante otras 3 h. Luego del trabajo de la manera acostumbrada, la reacción se efectúa precipitando primero el derivado del ácido hialuronico en la acetona luego se lava en el mismo solvente hasta que un producto sin los compuestos intermedios de la reacción ha sido obtenido. ! El sólido obtenido, formado por el copolímero de HA-TBA-EDA, fue pulverizado finamente.

La sal de sodio del derivado de etilendiamino de HA, el derivado de HA-EDA, ha sido obtenida haciendo fluida la solución en sulfóxido de dimetilo de HA-TBA-EDA por medio de una columna cargada con la resina DOWEX 50 Wx8 activada en su forma de sodio. El producto fue recuperado intercambiado la solución de DMSO contra el agua utilizando un procedimiento de diálisis y luego secando por congelamiento la solución acuosa.

El esquema de reacción 1 muestra un procedimiento de funcionalización.

Esquema de reacción 1 - Reacción de funcionalización de la sal de tetrabutilamonio del ácido hialurónico (HA-TBA) con etilendiamina, para obtener el derivado de HA-EDA HA-EDA El derivado de HA-EDA fue caracterizado por , el análisis de 1H-RMN como se muestra en el espectro reportado en la figura 1 (véanse las figuras) . En particular 1H-R N (D20) mostró d 1.9 (m, -NH-CO-CH3) ; d 3.1 (m, CO-NH-CH2-CH2-NH2) .

El grado de funcionalización ha sido calculado comparando el área del pico en d 1.9 que se puede atribuir al CH3 de la porción de N-acetilglucosamina de HA con el área del pico en d 3.1 que se puede atribuir a la porción de etilendiamina enlazada al HA. El grado de funcionalización ha sido expresado como % de los moles de la porción de etilendiamina insertados por moles de la unidad repetitiva de HA.

La siguiente tabla 1 muestra como ejemplo la funcionalización molar en los grupos de etilendiamina enlazados al HA obtenido empleando tres diferentes relaciones de las moles de 4-NPBC/moles de las unidades repetitivas ' de HA-TBA.

Tabla 1 Moles de 4-NPBC/moles de las Grado de funcionalización molar unidades repetitivas de HA-TBA en los grupos de etilendiamina enlazados al ácido hialurónico 0.25 22 % mol/mol 0.50 52 % mol/mol 0.75 70 % mol/mol Ejemplo 2 Síntesis del derivado de ácido hialurónico-hidrazina (HA-Hy) 3 g de la sal de tetrabutilamonio del ácido hialurónico (HA-TBA) se disuelven en 270 mi del sulfóxido de dimetilo anhidro (peso molecular promedio ponderado de ácido hialurónico de 270 kDa) . Se agregan gota a gota 30 mi de una solución de sulfóxido de dimetilo anhidro que contiene 0.73 g del carbonato de bis (4 -nitrofenilo) (4-NPBC) a la solución de HA-TBA y se deja que reaccione durante 4 h a 40 °C bajo agitación. Después de este tiempo se agregan gota a gota 2.7 mi del monohidrato de hidrazina y la solución se deja a 40 °C durante otra 1 h. Luego del trabajo de la manera acostumbrada la reacción se efectúa precipitando primero el derivado del ácido hialurónico en éter dietílico luego lavando con acetona. Para obtener la sal de sodio del HA-Hy, la solución de la reacción se somete a reflujo a través de una columna cargada con la resina DOWEX 50 x8 activada en su forma de sodio, luego precipitada en acetona y lavada con el mismo solvente. Luego, el sólido obtenido se disuelve en agua, se dializa contra agua luego se seca por congelamiento. El grado de la funcionalización, detectado por el ensayo colorimétrico utilizando el ácido trinitrobencenosulfónico (TNSB) fue igual al 50 % mol/mol.

El esquema de reacción 2 muestra el procedimiento de la reacción.

Esquema de reacción 2 - Reacción de funcionalización de la sal de tetrabutilamonio del ácido hialurónico (HA-TBA) con monohidrato de hidrazina para obtener el derivado de HA-Hy Ejemplo 3 Síntesis del derivado de ácido hialurónico funcionalizado con butilamina (HA-BTA) 3 g de la sal de tetrabutilamonio del ácido hialurónico (HA-TBA) se disuelven en 270 mi del sulfóxido de dimetilo anhidro (peso molecular promedio ponderado del ácido hialurónico de 270 kDá) . Se agregan gota a gota 30 mi de una solución de sulfóxido de dimetilo anhidro que contiene 0.73 g del carbonato de bis ( 4 -nitrofenilo) (4-NPBC) a la solución de HA-TBA y se deja que reaccione durante 4 h a 40 °C bajo agitación. Después de este tiempo se agregan gota a gota 4.7 mi de butilamina y la mezcla de reacción se deja a 40 °C durante 24 h. Luego la solución de la reacción se somete a reflujo a través de una columna cargada con una resina DOWEX 50 Wx8 activada en su forma de sodio, luego precipitada en acetona y lavada con el mismo solvente. Finalmente se dializa contra agua y se seca por congelamiento. Sobre el derivado obtenido, llamado HA-TBA, :1a ausencia de la butilamina que no reaccionó fue confirmada por el ensayo del ácido trinitro bencenosulfónico (TNSB) .

El esquema de reacción 3 muestra el procedimiento de funcionalización.

Esquema de reacción 3 - Reacción de funcionalización de sal de tetrabutilamonio del ácido hialurónico (HA-TBA) butilamina (BTA) para obtener el derivado de HA-BTA El derivado de HA-BTA fue caracterizado por 1H-R como se muestra en la figura 2 de los dibujos, que muestra las siguientes señales: d 0.8 (-NH-CH2-CH2 - CH2-CH3) ; d 1.3 ( -NHCH2 - CH2 - CH2-CH3) ; d 1.4 (-NH- CH2 - CH2 - CH2-CH3) ; d 2.0 (s, -NH-COCH3); d 3.1 (-NH-CH2-CH2 - CH2-CH3) . El grado de funcionalización ha sido calculado comparando las áreas de los picos a d 0.8, 1.3, 1.4 y 3.1 atribuibles al metileno de la cadena de butilamino con el área del pico a d 2.0 atribuible al grupo metilo de la porción de N-acetilglucosamina de HA. El grado de funcionalización fue igual al 52 % mol/mol.

Ejemplo 4 La síntesis del derivado de ácido hialurónico-aminopolietilenglicol (HA-NH-PEG) 1 g de la sal de tetrabutilamonio de HA (HA-TBA) (peso molecular promedio ponderado del ácido hialurónico de partida igual a 230 kDa) se disuelve en 90 mi del sulfóxido de dimetilo anhidro. Se disuelven 0.4 g clel carbonato de bis (4 -nitrofenilo) (4-NPBC) en 10 mi del sulfóxido de dimetilo anhidro. La solución de 4-NPBC se agrega gota por gota a la solución de HA-TBA a 40 °C bajo agitación, luego la reacción se deja a la misma temperatura durante 4 h.

Después de este tiempo, se agregan 6 g del O- (2-aminoetil) -O-metil-polietilenglicol (PEG-NH2) (peso molecular de 750 Da) disueltos en 5 mi de sulfóxido de dimetilo gota por gota y la solución se deja a 40 °C durante 24 h. Luego, la solución de la reacción se hace que fluya a través de una columna cargada con la resina DOWEX 50 x8 activada en su forma de sodio luego se precipita en acetona y se lava con el mismo solvente. El producto obtenido, llamado HA-NH-PEG, después de secado por congelamiento se disuelve en agua y se dializa contra el agua durante 5 días utilizando una membrana de diálisis Spectrapor que tiene un corte molecular igual a 12000-14000.

El siguiente esquema de reacción 4 muestra el procedimiento de funcionalización.

Esquema de reacción 4 - Reacción de funcionalización de i la sal de tetrabutilamonio del ácido hialurónico (HA-TBA) con el O- (2-aminoetil) -O-metil-polietilenglicol (PEH-NH2) para obtener el derivado de HA-NH-PEG La ausencia del PEG-NH2 que no reaccionó fue confirmada por el ensayo colorimétrico de NTSB para los grupos de amino libres .

El derivado de HA-NH-PEG ha sido caracterizado por 1H-RMN como se muestra en la figura 3 de las figuras anexas, en donde los siguientes picos están presentes (D20) : 6 1.4 (s, -CO-NH- (0-CH2-CH2) n-0-CH3) d 2.0 (s, -NH-CO-CH3) ; d 3.7 (s, -CO-NH- (O-CH2-CH2) n-0-CH3) . El grado de f ncionalización fue igual al 33 % mol/mol.

Preparación de los derivados metacrílicos del ácido hialurónico-etilendiamina (HA-EDA-MA) Considerando el interés de producir derivados del ácido hialurónico foto-reticulables que se pueden producir en el diseño de tejidos, en el campo de suministro de fármacos, el aumento de tejido, etc., una de las aplicaciones más ventajosas del método propuesto aquí, es la funcionalización de los copolímeros del ácido amino hialurónico con las porciones metacrílicas .

En varios ejemplos de la literatura científica, los derivados del ácido hialurónico metacrílico han sido reportados. En el procedimiento descrito en primer lugar por Smeds et al. (J. Biomed. Mat. Res. 2001, 54 (1) : 115-121) el derivado metacrílico-HA (HA-MA) fue producido en un medio ambiente acuoso por el uso de un exceso molar de 20 veces del anhídrido metacrílico con relación a los grupos de hidróxilo primarios de HA. Sin embargo, utilizando este procedimiento se forma un sistema de dos fases reduciendo así la eficiencia de la funcionalización .

Recientemente, Oudshoorn et al. (Polymer 48 (2007) 1915-1920) describió la formación del copolímero de HA-MA por el empleo de una reacción en un solvente aprótico polar orgánico (sulfóxido de dimetilo) entre la sal de tetrabutilamonio (HA) y el metacrilato de glicidilo (GMA) . En este caso solamente el 30 % mol/mol de la funcionalización fue obtenido utilizando una relación de las moles de GMA moles de los grupos hidróxilo de HA igual a 200.

En el método descrito aquí la presencia de más grupos nucleofílicos en la cadena lateral del ácido hialurónico (como ejemplo, el grupo amino del derivado ;de etilendiamina del ácido hialurónico) podría ser explotado convenientemente para obtener una funcionalización más eficiente empleando como ejemplo el anhídrido metacrílico (AMA) como el reactivo.

Para estudiar la potencialidad del método y para demostrar la funcionalización selectiva de los grupos de amino libres sobre el HA, tres diferentes lotes de la sal de tetrabutilamonio de los derivados del ácido amino hialurónico (HA-TBA-EDA) que tiene un grado de funcionalización molar igual a 75, 50 y 25 % mol/mol (como se obtuvo del ejemplo 1) respectivamente, han sido preparados empleando el procedimiento descrito en el siguiente ejemplo 5. En particular en este ejemplo, solo un exceso molar de dos veces de AMA comparado con los grupos de amino libres de HA-TBA-EDA fue suficiente para obtener la funcionalización completa de todos los grupos amino presentes sobre un derivado de HA-etilendiamina, obteniéndose los copolímeros nombrados como HA-EDA-MA. La ausencia de los grupos amino que no reaccionaron en los copolímeros de HA-EDA-MA fue evaluada por ensayo colorimétrico empleando el ácido trinitrobencenosulfónico (TNBS) . Además, es posible controlar la cantidad de funcionalización en los grupos metacrílicos para obtener los derivados de HA-EDA-ÉMA que tienen grupos de amino libres que varían desde 5 hasta 95 %.

Ejemplo 5 Síntesis de los derivados metacrílicos de ácido hialurónico-etilendiamina (HA-EDA-MA) 1 g de HA-TBA-EDA obtenido como se reportó en el ejemplo 1 que tiene un grado de fune ional i zación en los grupos de et ilendiamina igual a 50 % mol/mol, fue disuelto en 100 mi del sulfóxido de dimetilo anhidro (DMSO) . Luego, se agrega un volumen apropiado del anhídrido metacrílico (AMA) para obtener un exceso molar de dos veces comparado con las moles de los grupos amino sobre el HA-TBA-EDA. El catalizador de dietilenamina se agrega en una relación equimolar con respecto a las moles de los grupos amino de HA-EDA-TBA, y la solución final se deja durante 24 h a 40 °C.

Después de este tiempo, la solución orgánica se hace fluir hacia una columna que contiene una resina DOWEX 50 x8 activada con sodio. La solución eluida se precipita entonces en acetona y el sólido obtenido, llamado HA-EDA-MA se lava varias veces con el mismo solvente, luego se seca, se disuelve en agua y se dializa contra el agua destilada. La solución se filtra y luego se seca por congelamiento. El esquema de reacción 5 muestra el procedimiento de ;la reacción. ' Esquema de reacción 5 - La reacción de funcionalización de la sal de tetrabutilamonio del ácido hialurónico-etilendiamina (HA-EDA-TBA) con anhídrido metacrílico (AMA) para obtener el derivado de HA-EDA-MA.

RMN (véase la figura 4) , que muestra los siguientes picos (D20) : d 1.9 (s, -CO-CH=CH-CH3) ; d 2.0 (s, -NH-C0-CH3 ) ; d 5.5 y 5.8 (ra, -CO-CH=CH-CH3) .

El grado de funcionalización ha sido evaluado comparando las áreas de los picos a d 5.5 y 5.8 atribuibles a los protones del vinilo del grupo metacrílico con el área á d 1.9 atribuible al grupo metilo de la porción de N-acetilglucosamina de las unidades repetitivas de HA. El grado de funcionalización en los grupos metacrílicos enlazados a las unidades repetitivas de HA-EDA resultó igual al 50 % mol/mol, es decir todos los grupos amino han sido derivados con el anhídrido metacrílico.

Preparación del derivado de ácido hialurónico-etilendiamina-benzoilcisteína (HA-EDA-BC) Una de las propiedades estructurales más importantes de la matriz extracelular, es su estructura fibrilar debido a la presencia de colágeno y otras proteínas. Esta estructura fibrilar es fundamental para la conexión de las células con el medio ambiente y para la difusión óptima de los factores humorales y de losnutrientes . Recientemente, muchos esfuerzos han sido dirigidos a la posibilidad de producir soportes artificiales con una estructura fibrilar {Biomaterials 29 (2008) 1989-2006) .

En este contexto, una posibilidad se refiere a 'la producción de copolímeros híbridos capaces de ensamblarse espontáneamente con una estructura jerárquica precisa. Por ejemplo Zhan et al, produjeron oligopéptidos auto-complementarios capaces de formar espontáneamente soportes fibrilares cuando se disuelven en amortiguadores acuosos; estas matrices han encontrado varias aplicaciones en el campo del diseño de los tejidos {Chemical Biology 2002, 6:865-871).

El interés para producir soportes capaces de auto-reticularse después de la inyección en el cuerpo se justifica por el hecho de que su deposición directa sobre la lesión del órgano o tejido (es decir para la reconstrucción del cartílago articular) puede evitar la necesidad de un implante quirúrgico, luego facilitando la integración de la nueva matriz extracelular formada con el tejido del huésped.

Desde este punto de vista es fundamental que la reticulación no debe involucrar reacciones potencialmente toxicas para los tejidos, además, la reacción debe permitir la encapsulación de las células regeneradoras de la matriz sin interferir con su viabilidad (Advanced Drug Delivery Reviews 59 (2007) 263-273) . Por ejemplo Shu et al, han desarrollado recientemente un derivado de ácido tiol hialurónico capaz de reticularse lentamente por la oxidación con el aire o rápidamente para reticularse si los derivados de PEG-diacrilato son empleados como agentes de reticulación (Biorna eriais 25 (2004) 1339-1348; Biomaterials 24 (2003) 3825-3834 WO 2005/056608) . .

Algunos compuestos no poliméricos son capaces de ensamblarse espontáneamente en los medios tanto orgánicos como acuosos para formar hidrogeles . Por ejemplo, el aminoácido ?,?' -dibenzoil-L-cisteína (DBC) y sus derivados (J. Med. Chem. 1967, 10, 1172) forman hidrogeles por auto-ensamblaje espontáneo aún a una concentración muy baja. Las fuerzas de impulso de esta agregación espontánea es ; la formación de interacciones de apilamiento p-p promovidas por los grupos arilo (Angew Chem. Int. Ed. Engl . 1995, 34, 584, J. Am. Chem. Soc. 2000, 122, 11679-11691) .

Considerando las propiedades de DBC y sus derivados para producir hidrogeles fibrilares por auto-ensamblaj e espontáneo y puesto que la presencia de un puente de disulfuro podría ser, en caso necesario, roto reversiblemente, por una reacción de óxido-reducción simple, para formar grupos de tiol libres, entonces nuevamente son oxidados para formar un puente de S-S, el método reportado , en la presente invención, puede ser utilizado para sintetizar el derivado de ácido hialurónico-etilendiamina-benzoilcisteína (HA-EDC-BC) capaz de explotar las propiedades tanto oxidantes como de auto-ensamblaje para producir una estructura fibrila .

Ejemplo 6 Síntesis del derivado de ácido hialurónico-etilendiamitia-benzoilcisteína (HA-EDA-BC) ! 1.3 g de N, N' -dibenzoil-cisteína (DBC) se disuelven en 28 mi de diclorometano y 20 mi de sulfóxido de dimetilo anhidro. 0.6 g de la diciclohexilcarbodiimida (DCC) y 0.34 g de la N-hidroxisuccinimida (NHS) han sido agregados a esta solución. La reacción de activación ha sido efectuada a temperatura ambiente durante 24 h. La reacción de activación ha sido efectuada a temperatura ambiente durante 24 h. Después de este tiempo, la solución ha sido filtrada y el exceso de diclorometano ha sido removido bajo vacío.

Esta solución que contiene el derivado de N-oxisucciniraida de ?,?' -dibenzoil-L-cistina (DBC-NOS) ha sido agregada gota por gota a 80 mi de sulfóxido de dimetilo que contiene 1 g de HA-TBA-EDA con un grado de funcionalización de 30 % mol/mol en los grupos amino . La reacción ha sido llevada a cabo con dietilamina como el catalizador (960 µ?) .

Después de 28 horas a 40 "C la solución ha sido eluida en una columna cargada con la resina DOWEX 50 Wx8 activada en su forma de sodio, luego el copolímero ha sido precipitado en éter dietílico, y lavado con etanol y acetona. El HA-EDA-DBC así obtenido ha sido molido finamente y luego se dispersa en agua hasta que se obtiene un hidrogel homogéneo. Luego el pH del hidrogel obtenido ha sido ajustado a 8 agregando NaOH 1N y luego 1.2 g del ditiotreitol han sido agregados para reducir los puentes de disulfuro obteniéndose el derivado de ácido hialurónico-etilendiamina-benzoil cisteína (HA-EDA-BC) .

La solución se ha dejado durante 24 h a temperatura ambiente y, después de regular el pH a 3.5, ha sido dializada contra agua ácida durante 5 días . Luego la solución ha sido filtrada, y secada por congelamiento. El siguiente esquema de reacción 6 muestra el procedimiento de funcionalización descrito anteriormente.

Esquema de reacción 6 - Reacción de funcicanalización de la sal de tetrabutilatricnio del ácido hialurónico-etilendiamina (??-???-EDA) con el derivado de N-ccd.succiriimida de la ?,?-di-oenzoil-L-ciste-Lna (DBC-NOS) , y la reducción del puente de disulfuro subsiguiente para obtener el derivado del ácido Malurómco-etilendianúra (HA-EDA-BC) .

El 1H-RMN y los análisis colorimétricos mostraron un grado de funcionalización de HA con la benzoilcisteína igual a 30 % mol/mol. El análisis colorimétrico con TNSB demostró la ausencia de grupos amino que no reaccionaron en el derivado de HA-EDA-BC.

Hidrogeles de los derivados del ácido hialuronico reticulado La reticulación de los derivados de ácido hialuronico metacrílico de las series de HA-EDA-MA se llevo a cabo en un medio acuoso u orgánico con o sin los fotoiniciadores después de la irradiación con rayos ?, rayos UV, radiación visible, microondas . Se ha confirmado experimentalmente que las soluciones acuosas (en el intervalo de concentración de 1-20 % p/v) de los copolímeros de HA-EDA-MA que tienen varios grados de funcionalización molar en la etilendiamina o en los grupos metacrílicos enlazados al ácido hialuronico, obtenidos de acuerdo con los procedimientos de esta invención, producen hidrogeles después de la exposición a las radiaciones que tienen longitudes de onda comprendidas entre 180 y 800 mm, o empleando una fuente de microondas, como empleando una fuente de rayos ? u otras fuentes de ionización.

La reticulación del derivado de HA-hidrazina (HA-Hy) se efectuó en un medio ambiente acuoso preferentemente a pH 4.75 en la presencia de carbodiimidas solubles en agua, por ejemplo (l-etil-3- (3-dimetilaminopropil) carbodiimida) (EDCI) .

La reticulación del derivado de etilendiamina-ácido hialurónico (HA-EDA) se llevo a cabo en el amortiguador de fosfato de pH 7.8 por el empleo de agentes de reticulación bifuncionales o polifuncionales, preferentemente el glutaraldehído .

La reticulación del derivado de HA-EDA-BC se llevo a cabo en el amortiguador de fosfato preferentemente a un pH de 7.4 por el proceso de oxidación con exposición al aire.

Ejemplo 7 Producción de hidrogeles a base de HA-EDA-MA Las soluciones acuosas del copolímero de HA-EDA-MA obtenidas siguiendo el ejemplo 5, con un grado de funcionalización molar igual al 50 % mol/mol en los grupos de etilendiamina y 50 % mol/mol en los grupos metacrílicos enlazados a HA, y con una concentración que varía desde 1 y 20 % p/v, fueron estratificados en una caja de Petri obteniéndose así un espesor de pocos milímetros.

Las cajas de Petri fueron distribuidas en una cámara refrigerante a 12 °C, y se irradiaron empleando una lámpara Polymer (Italquartz, Milán), de 125 Watt, que tiene una gama de emisión comprendida entre 250 y 350 nm y un pico de intensidad máxima en 310 mm. La distancia entre la lámpara y la caja de Petri fue de aproximadamente 30 cm. El tiempo de tales ciclos de irradiación estuvo en el intervalo de 15-90 minutos. Para cada concentración polimérica el tiempo que ocurre para obtener las películas de hidrogeles fácilmente desunibles de la caja, ha sido determinada.

La siguiente tabla 2 muestra como un ejemplo, los tiempos de irradiación necesarios para obtener las películas de hidrogeles considerando tres diferentes concentraciones. Tabla 2 Ejemplo 8 Auto-reticulación del ácido hialurónico-hidrazina (HA-Hy) El derivado de HA-Hy obtenido como en el ejemplo 2 que tiene un grado de funcionalización molar en los grupos de hidrazina igual al 50 % mol/mol se disuelve en agua destilada para obtener una concentración igual a 1 % p/v. El pH de. la solución ha sido ajustado a 4.75 empleando pocas gotas de HCl 0.1 N.

Una cantidad molar de la (l-etil-3- (dimetilaminopropil-carbodiimida) (EDCI) igual a la cantidad de grupos de hidrazina enlazados a HA fue agregada y el pH se mantuvo constante agregando HCl 0.1 N hasta que haya ocurrido la formación de un hidrogel . El hidrogel fue recuperado y se lava en agua destilada y luego se seca por congelamiento.

El rendimiento del peso del hidrogel fue del 80 % comparado con el polímero de partida, el sólido fue caracterizado entonces por análisis de FT-IR.

Ejemplo 9 Producción de hidrogeles de HA-EDA-BC La solución para la formación del gel fue obtenida por la dispersión de la cantidad apropiada del polímero en la solución amortiguadora de fosfato de Dulbecco a un pH de 7.4 y luego se agita en forma de remolino durante 5 minutos hasta que se obtiene una solubilización completa. Las muestras de hidrogeles de 0.5 p/v % basadas en HA-EDA-BC fueron preparadas por oxidación con aire. Después que las muestras de formación del gel fueron lavadas con agua destilada, · y congeladas en nitrógeno líquido, se secaron por congelamiento y se observaron utilizando un microscopio de barrido electrónico. Como se muestra en la figura 5A y 5B, el hidrogel de HA-EDA-BC muestran una estructura fibrilar con fibrillas interconectadas que varían entre 500 nm y 1 µt? de diámetro .

Ejemplo 10 Encapsulacion de condrocitos y ensayo de viabilidad Los condrocitos articulares humanos aislados recientemente del cartílago articular humano fueron cultivados durante dos pasadas durante dos semanas en el DMEM completo. El HA-EDA-BC secado por congelamiento fue esterilizado por radiación con ÜV utilizando una lámpara de UV de 125 W) durante 2 h. Luego se disuelven 150 mg de HA-EDA-BC en 9.4 mi de DMEM agitando suavemente en forma de remolino durante aproximadamente 10 minutos, luego la espuma formada fue removida por sonicación durante 3 min. La encapsulacion de los condrocitos fue efectuada agregando Ó.6 mi de DMEM que contiene 5 x 106 células y se agita suavemente durante pocos minutos para asegurar una distribución homogénea de las células. Luego, 150 µ? de la suspensión para la formación del gel fueron vertidos en insertos de NUNC CC (membranas de policarbonato) de Multidish de 24 cavidades. El hidrogel para la formación del gel se dejo durante 2 h antes de agregar 1.1 mi del DMEM y se incuba a 37 °C, 5 % de C02. La viabilidad de los condrocitos encapsulados fue evaluada por el ensayo de MTS después de 2 h, 3, 7, 14 y 21 días. Para cada día, tres insertos que contienen el hidrogel encapsulado de HA-EDA-BC fueron tratados con 100 mi de la solución del MTS, y se deja que reaccionen durante 4 h. Luego la absorbancia fue leída en una placa de 96 cavidades a 550 nm (n = 9) utilizando como blanco un hidrogel de HA-EDA-BC vacío tratado como el hidrogel con los condrocitos. El ensayo de citocompatibilidad en las células vivas y muertas fue efectuado sobre los condrocitos de HA-EDA-BC cargados con el hidrogel por el empleo de un procedimiento de doble teñido utilizando calceína AM y el homodímero de etidio-III (EthDIII) . La calceína AM es una molécula permeable a las células, no fluorescente, que es escindida dentro de la célula por las esterasas intracelulares para dar su contraparte fluorescente (fluorescencia verde) . EthD-Ill es un tinte de ácido nucleico no permeable a través de las células viables pero que puede difundirse a través de la membrana de las células muertas en donde la misma se aglutina al ADN y proporciona una fluorescencia roja. Después de tres días de cultivo, los insertos que contienen los geles fueron lavados tres veces con PBS de pH 7.4 y luego se incuban durante 1 h con las soluciones de teñido y luego se lavan nuevamente para remover el exceso de las soluciones de teñido .

Los geles fueron montados sobre portaobjetos y se analizaron utilizando un microscopio de fluorescencia Axioscop 2 (Zeiss) y capturados con una cámara digital Axiocam (Zeiss) interconectada con una computadora.

Como se observa en la figura 6, la absorbancia obtenida por el análisis de MTS durante la totalidad de los 21 días de incubación demostró una buena viabilidad , y proliferación de las células dentro del soporte del hidrogel tridimensional basado en HA-EDA-BC.

La imagen de fluorescencia de las células vivas-muertas, véase la figura 7, después de tres días de cultivo muestra varias células vivas y solamente pocas células muertas (véase las rejillas en la imagen) indicando así una buena compatibilidad del procedimiento de encapsulación. En la imagen a color original, las células vivas son verdes y las células muertas son rojas.

Esta invención ha sido descrita con referencia a algunas modalidades específicas, pero se ha propuesto que las variaciones y modificaciones obvias puedan ser operadas por los expertos en el campo sin salirse del alcance de protección .

Se hace constar que con relación a esta fecha el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (24)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Un proceso para producir derivados funcionalizados del ácido hialurónico, caracterizado porque comprende las siguientes etapas consecutivas: (a) la activación de al menos un grupo hidróxilo del ácido hialurónico, en la forma de una sal del mismo soluble en solvantes orgánicos, por la reacción de la sal del ácido hialurónico, en un solvente aprótico polar, con un agente de carbonilación seleccionado de los fenil ésteres carbónicos o los fenil ésteres halofórmicos ; (b) la reacción de la sal de ácido hialurónico activado que resulta de la etapa a) , por medio de una reacción de substitución nucleofílica con un compuesto de la fórmula general NH2R, en donde R se selecciona del grupo que consiste de NH2, un grupo aminoalquilo, una cadena de alquilo o una cadena de arilalquilo, una cadena poliacrílica, una cadena de polioxietileno o una molécula de peso molecular bajo (por ejemplo un fármaco) o una molécula de peso molecular elevado.

2. Un proceso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el agente de carbonilación se selecciona de bis (carbonato de 4- nitrofenilo) y carbonato de clorofenilo.

3. Un proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-2, caracterizado porque el compuesto de la fórmula general NH2-R se selecciona de hidrazina y un grupo de diaminoalquilo de la fórmula NH2- (CH2) n-NH2 en donde n es un número entre 1 y 30, preferentemente entre 1 y 10.

4. Un proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizado porque la sal del ácido hialurónico se selecciona de la sal de tetrabutilamonio y la sal de cetiltrimetilamonio .

5. Un proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizado porque el solvente aprótico polar se selecciona del grupo que consiste de: sulfóxido de dimetilo, dimetilformamida, dimetilacetamida y sus mezclas.

6. Un proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizado porque ambas etapas de activación (a) y la substitución nucleofílica (b) son llevadas a cabo a una temperatura comprendida entre 10 °G y 60 °C.

7. Un proceso para la producción de un hidrogel, caracterizado porque consiste en someter un derivado funcionalizado del ácido hialurónico obtenido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6 a una auto-reticulación en la presencia de una carbodiimida como el agente de activación, o a reticulación química por medio del uso de agentes de reticulación bifuncionales o polifuncionales .

8. Un proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, caracterizado porque un derivado funcionalizado del ácido hialurónico en la forma de una sal obtenida de la etapa b) se somete a funcionalización adicional por substitución nucleofílica por la reacción con un compuesto de la fórmula Y-R' , en donde Y es un buen grupo saliente seleccionado de halógeno, N-oxisuccinimida, un alcoxilo con 1-6 átomos de carbono, o Y representa la porción electrofílica de un anhídrido o un epóxido, y R' se selecciona del grupo que consiste de: un grupo acriloilo o metacriloilo ambos substituidos opcionalmente o un grupo que pertenece a una molécula, soluble en solventes orgánicos o en solventes acuosos . i

9. Un proceso de conformidad con ] la reivindicación 8, caracterizado porque una funcionalización se lleva a cabo en un medio acuoso o un solvente orgánico, preferentemente un solvente aprótico polar seleccionado del grupo que consiste de: sulfóxido de dimetilo, dimetilformamida, dimetilacetamida y sus mezclas.

10. Un proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 8-9, caracterizado porque la funcionalización adicional se lleva a cabo a una temperatura comprendida entre 5 °C y 60 °C .

11. Un proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 8-10, caracterizado porque úna funcionalización adicional se lleva a cabo en la presencia de un catalizador seleccionado del grupo que consiste de: dietilamina, trietilamina, dimetilaminopiridina y sus mezclas .

12. Un proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 8-11, caracterizado porque el compuesto de la fórmula Y-R' corresponde al anhídrido metacrílico, cloruro de metacriloilo, cloruro de acriloilo, acrilato de glicidilo o metacrilato de glicidilo.

13. Un proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 8-11, caracterizado porque el compuesto de la fórmula Y-R' corresponde al éster o diéster de N-oxisuccinimida de la N, N' -dibenzoil-L-cistina o derivados semejantes.

1 . Un proceso de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el derivado obtenido de la funcionalización adicional se somete a un proceso de reducción para obtener una porción de benzoil-cisteína o sus derivados semejantes.

15. Un derivado funcionalizado del ácido hialurónico, caracterizado porque tiene un peso molecular ; en el intervalo desde 50000 hasta 1500000 daltons que se puede obtener del proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-14.

16. Un derivado funcionalizado de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el grado de funcionalización está comprendido entre al menos un grupo hidróxilo y los grupos de hidróxilo totales del ácido hialurónico .

17. Un derivado funcionalizado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15-16, caracterizado porque se puede obtener del proceso de conformidad con la reivindicación 12.

18. Un hidrogel que comprende el derivado funcionalizado del ácido hialurónico de conformidad con la reivindicación 17 que se puede obtener de un proceso de fóto-reticulación, caracterizado porque la concentración del derivado funcionalizado en una solución acuosa u orgánica está comprendida entre 1 % p/v y 20 % p/v.

19. Un hidrogel de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque se puede obtener por irradiación con longitudes de onda máximas en el intervalo desde 180 hasta 800 nm, en la presencia o en la ausencia de un iniciador de radicales con tiempos de irradiación variables desde 5 minutos hasta 10 horas. !

20. Un hidrogel que comprende el derivado funcionalizado del ácido hialurónico de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque se puede obtener de un proceso de irradiación con rayos ?, microondas u otras radiaciones ionizantes.

21. Un derivado funcionalizado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15-16, caracterizado porque se puede obtener por medio de un proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13-14.

22. Un hidrogel que comprende el derivado funcionalizado del ácido hialurónico de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque se puede obtener de un proceso de auto-oxidación con exposición al aire.

23. Los hidrogeles obtenidos del proceso de conformidad con la reivindicación 7 o de conformidad con las reivindicaciones 18-20 ó 22, caracterizados porque son producidos en la forma de nano- o micropartículas , películas, membranas, fibras y soportes.

24. El uso de hidrogeles de conformidad con: la reivindicación 23 para la producción de sistemas para la liberación sostenida de fármacos o un material genético, o sistemas para el recubrimiento de las heridas, órganos o tejidos, o materiales o soportes implantables para la regeneración del tejido.