MD3650033T2

MD3650033T2 - Compoziții conţinând tulpini bacteriene

Info

Publication number: MD3650033T2
Application number: MDE20200527T
Authority: MD
Inventors: George Grant; Angela Margaret Patterson; Imke Mulder; Seanin Mccluskey; Emma Raftis
Original assignee: 4D Pharma Res Ltd
Priority date: 2015-06-15
Filing date: 2016-06-15
Publication date: 2022-08-31
Also published as: CA2988695A1; CN108271353A; HK1258573A1; PT3206700T; AU2021254635A1; SG10201912320TA; CY1125136T1; JP6527280B2; EP3360559B1; HUE058252T2; DK3360559T3; HRP20191344T1; JP6439037B2; RS63089B1; CN114028431A; IL255662B; IL294213A; MD3360559T2; BR112017026564A2; JP7368433B2

Abstract

Invenţia furnizează compoziţii cuprinzȃnd tulpini bacteriene pentru tratarea şi prevenirea bolilor inflamatorii şi autoimune.

Description

DOMENIUL TEHNIC

Această invenţie se referă la compoziţii conţinând tulpini bacteriene izolate din tractul digestiv al mamiferelor şi utilizarea unor astfel de compoziţii în tratamentul bolii.

BAZELE INVENŢIEI

Se crede că intestinul uman este steril in uter, dar este expus la o mare varietate de microbi materni şi de mediu imediat după naştere. Apoi, apare o perioadă dinamică de colonizare şi succesiune microbiană, care este influenţată de factori precum modul de administrare, mediul, dieta şi genotipul gazdei, toate aces-tea având impact asupra compoziţiei microbiotei intestinale, în special în timpul vieţii timpurii. Ulterior, microbiota se stabilizează şi devine similară adulţilor [1]. Microbiota intestinală umană conţine mai mult de 500-1000 de filozofi diferiţi aparţinând în prin-cipal două diviziuni bacteriene majore, Bacteroidetes şi Firmicutes [2]. Relaţiile de succes simbiotice care decurg din colonizarea bacteriană a intestinului uman au conferit o mare varietate de funcţii metabolice, structurale, de protecţie şi alte bene-ficii. Activităţile metabolice îmbunătăţite ale intestinului colonizat asigură faptul că, în caz contrar, componentele dietetice nedigerabile sunt degradate prin eliberarea de subproduse care asigură o sursă importantă de nutrienţi pentru gazdă. În mod similar, importanţa imunologică a microbiotei intestinale este bine recunoscută şi este exemplificată în cazul animalelor fără germeni care au un sistem imunitar afectat care este reconstituit funcţional după introducerea bacteriilor comensale [3-5].

Schimbări dramatice ale compoziţiei microbiotei au fost documentate în tulburările gastro-intestinale, cum ar fi boala inflamatorie intestinală (IBD). De exemplu, nivelurile de bacterii Clostridium din grupa XIVa sunt reduse la pacienţii cu IBD, în timp ce numerele de E coli sunt crescute, ceea ce sugerează o modificare a echilibrului simbioţilor şi patobionţilor în intestin [6-9]. Interesant, această disbioză microbiană este, de asemenea, asociată cu dezechilibre în populaţiile de celule T efectoare.

Ca o recunoaştere a efectului pozitiv potenţial pe care anumite tulpini bacte-riene îl pot avea asupra intestinului animal, au fost propuse diferite tulpini pentru utilizarea în tratamentul diferitelor boli (vezi, de exemplu, [10-13]). De asemenea, anumite tulpini, inclusiv cele mai multe tulpini de Lactobacillus şi Bifidobacterium au fost propuse pentru utilizarea în tratarea diferitelor boli inflamatorii şi autoimune care nu sunt direct legate de intestine (vezi [14] şi [15] pentru discuţii). Cu toate acestea, relaţia dintre diferite boli şi diferite tulpini bacteriene şi efectele precise ale anumitor tulpini bacteriene asupra intestinului şi la nivel sistemic şi asupra oricăror tipuri de boli particulare sunt slab caracterizate.

WO2011/110918 şi WO2011/149335 descriu studii clinice care utilizează probiotice în tratamentul dermatitelor atopice şi alergiilor. WO2009/072889 descrie studii clinice care utilizează probioticele în tratamentul astmului alergic.

Există o necesitate în domeniu pentru noi metode de tratare a bolilor inflama-torii şi autoimune. Există, de asemenea, o necesitate pentru ca efectele potenţiale ale bacteriilor intestinale să fie caracterizate astfel încât să poată fi dezvoltate noi terapii care utilizează bacterii intestinale.

REZUMATUL INVENŢIEI

Invenţia furnizează o compoziţie cuprinzând o tulpină bacteriană avȃnd un genom cu cel puţin 90% identitate de secvenţă cu SEQ ID NO: 2 din PCT/GB2016/051776, pentru utilizare într-o metodă de tratare sau prevenire a astmului alergic, astmului eozinofilic sau hiper-reactivităţii căilor respiratorii asociate cu astmul.

Inventatorii au dezvoltat noi terapii pentru tratarea şi prevenirea bolilor inflamatorii şi autoimune. În particular, inventatorii au dezvoltat noi terapii pentru tratarea şi prevenirea bolilor şi stărilor mediate de IL-17 sau calea Th17. În particular, inventatorii au identificat o nouă tulpină bacteriană care este eficientă pentru reducerea răspunsului inflamator Th17. Aşa cum se descrie în exemple, adminis-trarea orală a compoziţiilor care conţin bacteria depusă sub numărul de acces NCIMB 42380 poate reduce severitatea răspunsului inflamator, incluzând răspunsul inflamator Th17, în modelele de şoarece ale astmului, artritei reumatoide şi sclerozei multiple. Aşa cum se descrie de asemenea în exemple, administrarea orală a com-poziţiilor cuprinzând bacteria depusă sub numărul de acces NCIMB 42380 poate reduce dimensiunea tumorii în modelele de şoarece ale cancerului care pot fi asociate cu răspunsul inflamator Th17.

Inventatorii au identificat că tratamentul cu astfel de tulpini bacteriene poate reduce nivelurile de citokine care fac parte din calea Th17, incluzând IL-17, poate ameliora răspunsul inflamator Th17 şi poate oferi beneficii clinice în modelele de şoareci ale bolilor inflamatorii şi autoimune mediate de către IL-17 şi calea Th17.

În realizările preferate, invenţia furnizează o compoziţie care cuprinde bacteria depusă sub numărul de acces NCIMB 42380, pentru utilizare într-o metodă de tratare sau prevenire a astmului alergic. Inventatorii au identificat faptul că tratamentul cu bacteria depusă sub numărul de acces NCIMB 42380 poate reduce recrutarea neutrofilelor şi a eozino-filelor în plămâni, ceea ce poate ajuta la tratarea sau prevenirea astmului. Mai mult, inventatorii au testat şi demonstrat eficacitatea bacteriei depozitate sub numărul de acces NCIMB 42380 în modelele de şoarece ale astmului. În anumite realizări, compoziţia este pentru utilizare într-o metodă de tratarea sau prevenirea astmului eozinofilic. Efectul prezentat pentru compoziţiile invenţiei asupra eozinofilelor înseamnă că ele pot fi deosebit de eficiente pentru tratarea sau prevenirea astmului eozinofilic. Într-adevăr, în anumite aplicaţii, compoziţia este utilizată într-o metodă de reducere a unui răspuns inflamator eozinofil în tratamentul sau prevenirea astmului eozinofilic. Bacteria depusă sub numărul de acces NCIMB 42380 se dovedeşte a avea un efect deosebit de pronunţat asupra neutrofilelor în modelele de astm şi tratamentul cu această bacterie poate fi deosebit de eficient pentru tratarea astmului neutrofil.

În particular, compoziţiile invenţiei pot fi utilizate în reducerea producţiei de IL-17 sau reducerea diferenţierii celulare Th17 în tratamentul sau prevenirea astmului alergic sau eozinofilic.

În anumite aplicaţii, compoziţia este destinată utilizării la un pacient cu niveluri ridicate de IL-17 sau celule Th17. Efectul asupra răspunsului inflamator Th17 prezen-tat pentru bacteria depusă sub numărul de acces NCIMB 42380 poate fi deosebit de benefic pentru astfel de pacienţi.

În aplicaţiile preferate ale invenţiei, tulpina bacteriană din compoziţie este bacteria depozitată sub numărul de acces NCIMB 42380. Tulpinile bacteriene au o secvenţă de ARNr 16s care este cel puţin 99%, 99,5% sau 99,9% identică cu SEQ \tabID NO: 1. De preferinţă, tulpina bacteriană pentru utilizare în invenţie are secvenţa ARNr 16s reprezentată prin SEQ ID NO: 1. În anumite aplicaţii, compoziţia invenţiei este pentru administrare orală. De asemenea, administrarea orală este convenabilă pentru pacienţi şi practicieni şi permite administrarea şi/sau colonizarea parţială sau totală a intestinului. În anumite aplicaţii, compoziţia conform invenţiei cuprinde unul sau mai mulţi excipienţi sau purtători acceptabili farmaceutic. În anumite aplicaţii, compoziţia conform invenţiei cuprinde o tulpină bacteriană care a fost liofilizată. Liofilizarea este o tehnică eficientă şi convenabilă pentru prepararea compoziţiilor stabile, care permite eliberarea de bacterii. În anumite aplicaţii, invenţia furnizează un produs alimentar cuprinzând compoziţia aşa cum s-a descris mai sus. În anumite aplicaţii, invenţia furnizează o compoziţie de vaccin cuprinzând compoziţia aşa cum s-a descris mai sus. În dezvoltarea invenţiei de mai sus, inventatorii au identificat şi caracterizat o tulpină bacteriană care este deosebit de utilă pentru terapie. Bacteria depusă sub numărul de acces NCIMB 42380 este dovedită ca fiind eficace pentru tratarea bolilor descrise aici, cum ar fi artrita, astmul şi scleroza multiplă. Bacteria depusă sub numărul de acces NCIMB 42380 este, de asemenea, dovedită a fi eficace pentru tratarea cancerului.

SCURTĂ DESCRIERE A DESENELOR

Figura 1: Modelul de şoarece pentru astmul indus de acarieni din praful de casă - numărul total al celulelor BAL.

Figura 2: Modelul de şoarece pentru astmul indus de acarieni din praful de casă - numărul total de eozinofile în BALF.

Figura 3: Modelul de şoarece pentru astmul indus de acarieni din praful de casă - proporţia eozinofilelor în BALF.

Figura 4: Modelul de şoarece pentru astmul indus de acarieni din praful de casă - numărul total de macrofage în BALF.

Figura 5: Modelul de şoarece pentru astmul indus de acarieni din praful de casă - proporţia de macrofage în BALF.

Figura 6: Modelul de şoarece pentru astmul indus de acarieni din praful de casă - numărul total de neutrofile în BALF.

Figura 7: Modelul de şoarece pentru astmul indus de acarieni din praful de casă - proporţia de neutrofile în BALF.

Figura 8: Modelul de şoarece pentru astmul indus de acarieni din praful de casă - numărul total de limfocite în BALF.

Figura 9: Modelul de şoarece pentru astmul indus de acarieni din praful de casă - proporţia de limfocite în BALF.

Figura 10: Modelul de şoarece pentru astmul sever cu neutrofile - numărul total al celulelor BAL.

Figura 11: Modelul de şoarece pentru astmul sever cu neutrofile - numărul total de eozinofile în BALF.

Figura 12: Modelul de şoarece pentru astmul sever cu neutrofile - proporţia de eozinofile în BALF.

Figura 13: Modelul de şoarece pentru astmul sever cu neutrofile - numărul total de macrofage în BALF.

Figura 14: Modelul de şoarece pentru astmul sever cu neutrofile - proporţia de macrofage în BALF.

Figura 15: Modelul de şoarece pentru astmul sever cu neutrofile - numărul total de neutrofile în BALF.

Figura 16: Modelul de şoarece pentru astmul sever cu neutrofile - ponderea neutrofilelor în BALF.

Figura 17: Modelul de şoarece pentru astmul sever cu neutrofile - numărul total de limfocite în BALF.

Figura 18: Modelul de şoarece pentru astmul sever cu neutrofile - proporţia de limfocite în BALF.

Figura 19: Modelul de şoarece al artritei reumatoide - greutăţi corporale, zilele -14 până la 0. Datele sunt prezentate ca procente medii ± ESM din greutatea corporală iniţială (ziua -14). Semnificaţia statistică: ▲ p < 0,05 şi ▲▲▲▲ p < 0,0001 atunci când este comparată cu grupul tratat cu vehicul.

Figura 20: Modelul de şoarece al artritei reumatoide - greutăţi corporale, zilele 0 până la 42. Datele sunt prezentate ca procente medii ± ESM din greutatea corporală iniţială (Ziua 0). ▲ p < 0,05, ◆ p < 0,05, ▲▲▲ p <0,001, •••• p < 0,0001 în comparaţie cu grupul tratat cu vehicul.

Figura 21: Modelul de şoarece al artritei reumatoide - scoruri clinice. Datele sunt prezentate ca medie ± ESM. **** p < 0,0001 în comparaţie cu ziua 21 în grupul tratat cu vehicul. ◆, O p < 0,05 în comparaţie cu grupul tratat cu vehicul într-o anumită zi.

Figura 22: Modelul de şoarece al artritei reumatoide - răspunsul proliferativ al splenocitelor la colagenul II. Suprafaţa media a fost scăzută [CII-stimulat -medie de fundal], numărătoare pe minut, pe baza încorporării 3H-TdR. Toate datele sunt prezentate ca medie ± ESM. ** p < 0,01 comparativ cu grupul tratat cu vehicul.

Figura 23: Modelul de şoarece al artritei reumatoide - nivelurile de IFNγ în supernatanţii de cultură tisulară. Linile reprezintă valorile mediane ale grupului.

Figura 24: Modelul de şoarece al artritei reumatoide - nivelurile de IL-17A în supernatanţii de cultură tisulară. Linile reprezintă valorile mediane ale grupului.

Figura 25: Modelul de şoarece al artritei reumatoide - nivelurile de IL-10 în supernatanţii de cultură tisulară. Linile reprezintă valorile mediane ale grupului.

Figura 26: Modelul de şoarece al artritei reumatoide - nivelurile de IL-6 în supernatanţii de cultură tisulară. Linile reprezintă valorile mediane ale grupului.

Figura 27: Sistemul de notare al histopatologiei.

Figura 28: Modelul de şoarece pentru astmul indus de acarieni din praful de casă - IgE serică totală.

Figura 29: Modelul de şoarece pentru astmul indus de acarieni din praful de casă - IgG1 serică specifică HDM

Figura 30: Modelul de şoarece pentru astmul indus de acarieni din praful de casă - IgE totală în BALF

Figura 31: Modelul de şoarece pentru astmul indus de acarieni din praful de casă - IgG1 serică specifică HDM în BALF

Figura 32: Modelul de şoarece pentru astmul indus de acarieni din praful de casă - analiză histologică - scorul mediu al infiltrării peribronhiolare.

Figura 33: Modelul de şoarece pentru astmul indus de acarieni din praful de casă - analiză histologică - scorul mediu al infiltrării perivasculare.

Figura 34: Modelul de şoarece pentru astmul indus de acarieni din praful de casă - analiză histologică - scorul mediu inflamator (media ambelor scoruri de infiltrare peribronhiolară şi perivasculară).

Figura 35: Modelul de şoarece pentru astmul indus de acarieni din praful de casă - analiză histologică - scorul mucusului.

Figura 36: Modelul de şoarece pentru astmul indus de acarieni din praful de casă - nivelul IL-9 în ţesutul pulmonar.

Figura 37: Modelul de şoarece pentru astmul indus de acarieni din praful de casă - nivelul IL-1a în ţesutul pulmonar.

Figura 38: Modelul de şoarece pentru astmul indus de acarieni din praful de casă - nivelul IFNg în ţesutul pulmonar.

Figura 39: Modelul de şoarece pentru astmul indus de acarieni din praful de casă - nivelul IL-17A în ţesutul pulmonar.

Figura 40: Modelul de şoarece pentru astmul indus de acarieni din praful de casă - nivelul IL-4 în ţesutul pulmonar.

Figura 41: Modelul de şoarece pentru astmul indus de acarieni din praful de casă - nivelul IL-5 în ţesutul pulmonar.

Figura 42: Modelul de şoarece pentru astmul indus de acarieni din praful de casă - nivelul IL-1b în ţesutul pulmonar.

Figura 43: Modelul de şoarece pentru astmul indus de acarieni din praful de casă - nivelul RANTES în ţesutul pulmonar.

Figura 44: Modelul de şoarece pentru astmul indus de acarieni din praful de casă - nivelul MIP-1a din ţesutul pulmonar.

Figura 45: Modelul de şoarece pentru astmul indus de acarieni din praful de casă - nivelul KC în ţesutul pulmonar.

Figura 46: Modelul de şoarece pentru astmul indus de acarieni din praful de casă - nivelul MIP-2 în ţesutul pulmonar.

Figura 47: Modelul de şoarece pentru astmul sever cu neutrofile - IgG1 serică specifică HDM.

Figura 48: Modelul de şoarece pentru astmul sever cu neutrofile - IgG2a seri-că specifică HDM.

Figura 49: Modelul de şoarece pentru astmul sever cu neutrofile - IgG1 speci-fică HDM în BALF.

Figura 50: Modelul de şoarece pentru astmul sever cu neutrofile - IgG2a spe-cifică HDM în BALF.

Figura 51: Modelul de şoarece pentru astmul sever cu neutrofile - analiză histologică - scorul mediu al infiltrării peribronhiolare.

Figura 52: Modelul de şoarece pentru astmul sever cu neutrofile - analiză histologică - scorul mediu al infiltrării perivasculare.

Figura 53: Modelul de şoarece pentru astmul sever cu neutrofile - analiză histologică - scorul mediu inflamator (media ambelor scoruri de infiltrare peri-bronhiolară şi perivasculară).

Figura 54: Modelul de şoarece pentru astmul sever cu neutrofile - nivelul TNFa în ţesutul pulmonar.

Figura 55: Modelul de şoarece pentru astmul sever cu neutrofile - nivelul IL-1a în ţesutul pulmonar.

Figura 56: Modelul de şoarece pentru astmul sever cu neutrofile - nivelul IFNg în ţesutul pulmonar.

Figura 57: Modelul de şoarece pentru astmul sever cu neutrofile - nivelul IL-17F în ţesutul pulmonar.

Figura 58: Modelul de şoarece pentru astmul sever cu neutrofile - nivelul IL-1b în ţesutul pulmonar.

Figura 59: Modelul de şoarece pentru astmul sever cu neutrofile - nivelul RANTES în ţesutul pulmonar.

Figura 60: Modelul de şoarece pentru astmul sever cu neutrofile - nivelul MIP-2 în ţesutul pulmonar.

Figura 61: Modelul de şoarece pentru astmul sever cu neutrofile - nivelul KC în ţesutul pulmonar.

Figura 62: Modelul de şoarece pentru astmul sever cu neutrofile - nivelul IL-17A în ţesutul pulmonar.

Figura 63: Modelul de şoarece pentru astmul sever cu neutrofile - nivelul MIP-1a în ţesutul pulmonar.

Figura 64: Modelul de şoarece pentru astmul sever cu neutrofile - nivelul IL-33 în ţesutul pulmonar.

Figura 65: Modelul modelul vizual pentru scorurile histopatologice. Imagini reprezentative care prezintă scoruri compuse din articulaţiile tarsiale ale şoarecelui într-un studiu de artrită indusă cu colagen.

Figura 66: Modelul de şoarece al artritei reumatoide - histopatologie: scorurile inflamaţiei. Datele sunt prezentate ca medie ± ESM. ** p < 0,01 în comparaţie cu grupul tratat cu vehicul.

Figura 67: Modelul de şoarece al artritei reumatoide - histopatologie: scorurile cartilajelor. Datele sunt prezentate ca medie ± ESM. *** p < 0,001 în comparaţie cu grupul tratat cu vehicul.

Figura 68: Modelul de şoarece al artritei reumatoide - histopatologie: scorurile osoase. Datele sunt prezentate ca medie ± ESM. *** p < 0,001 în comparaţie cu grupul tratat cu vehicul.

Figura 69: Modelul de şoarece al artritei reumatoide - histopatologie: scorurile totale. Datele sunt prezentate ca medie ± ESM. * p < 0,05, *** p < 0,001 în comparaţie cu grupul tratat cu vehicul.

Figura 70: Modelul de şoarece al artritei reumatoide - histopatologie: imagini reprezentative. ID-ul animalului (#n.n) şi membrul (R pentru cel drept, L pentru cel stâng) sunt indicate între paranteze. Imaginea din stânga sus (vehicul): distrugerea extensivă a articulaţiilor şi a osului cu inflamaţie şi fibroză, care se extinde până la ţesuturile moi peri-articulare.

Figura 71: Modelul de şoarece al sclerozei multiple - scor clinic.

Figura 72: Modelul de şoarece al sclerozei multiple - incidenţa bolii.

Figura 73: Modelul de şoarece al cancerului mamar - volumul tumorii.

Figura 74: Modelul de şoarece al cancerului pulmonar - volumul tumorii.

Figura 75: Modelul de şoarece al cancerului hepatic - greutatea ficatului.

Figura 76: Ataşarea tulpinilor tip de MRX004 şi B. breve de celulele umane.

Figura 77: Test de producţie de exopolizaharide.

Figura 78: Producţia de exopolizaharide legate şi eliberate de către MRX004.

Figura 79: Ataşarea MRX004 la celulele Caco-2.

Figura 80: Profil rapid ID 32 A al MRX004 singur (A) şi în comparaţie cu B. breve (B). Alb = reacţie negativă (fără schimbare de culoare), haşurare descres-cătoare = reacţie intermediară pozitivă (schimbare de culoare slabă) şi negru = reacţie pozitivă (schimbare de culoare corespunzătoare puternică).

Figura 81: Analiza API® 50 CH a MRX004. Haşurare crescătoare = reacţie negativă (fără schimbare de culoare), haşurare descrescătoare = reacţie poziti-vă intermediară (modificare slabă a culorii), negru = reacţie pozitivă (schimbare de culoare corespunzătoare puternică) şi alb = reacţie îndoielnică (schimbare neaşteptată a culorii).

DESCRIEREA INVENŢIEI

Tulpini bacteriene

Compoziţiile conform invenţiei pot cuprinde bacteria depusă sub numărul de acces NCIMB 42380. Exemplele demonstrează că astfel de bacterii sunt utile pentru tratarea sau prevenind bolile şi afecţiunile mediate de către IL-17 sau de către calea Th17. Exemplele demonstrează de asemenea că astfel de bacterii sunt utile pentru tratarea sau prevenirea cancerului. Tulpina bacteriană preferată este bacteria depusă sub numărul de acces NCIMB 42380.

Bacteria depusă sub numărul de acces NCIMB 42380 a fost testată în Exemple şi este de asemenea menţionată aici ca tulpina 751 sau MRX004. O secvenţă parţială ARNr 16S pentru tulpina 751 care a fost testată este furnizată în SEQ ID NO: 1. Tulpina 751 a fost depusă la autoritatea internaţională de depozitare NCIMB, Ltd. (Ferguson Building, Aberdeen, AB21 9YA, Scoţia) de către GT Biologics Ltd. (Life Sciences Building Building, Aberdeen, AB25 2ZS, Scoţia) la data de 12 martie 2015, numărul NCIMB 42380. GT Biologics Ltd. şi-a schimbat ulterior numele în 4D Pharma Research Limited.

O secvenţă genomică pentru tulpina 751 este furnizată în SEQ ID NO: 2 în lista de secvenţe publicată împreună cu PCT/GB2016/051776. Referirile la SEQ ID NO:2 din acest document, incluzȃnd descrierea şi revendicările, se referă la SEQ ID NO:2 din PCT/GB2016/051776.

Este, de asemenea, de aşteptat ca tulpinile bacteriene care sunt biotipuri ale bacteriei depuse sub numărul de acces NCIMB 42380 să fie eficace pentru tratarea sau prevenirea bolilor şi stărilor mediate de către IL-17 sau de către calea Th17. Este, de asemenea, de aşteptat ca tulpinile bacteriene care sunt biotipuri ale bacteriei depozitate sub numărul de acces NCIMB 42380 să fie eficace pentru tratarea sau prevenirea cancerului. Un biotip este o tulpină strâns asociată, care are aceleaşi caracteristici fiziologice sau biochimice similare sau foarte asemănătoare.

În anumite aplicaţii, tulpina bacteriană utilizată în invenţie are o secvenţă ARNr 16s care este cel puţin 99%, 99,5% sau 99,9% identică cu SEQ ID NO: 1. De preferinţă, tulpina bacteriană pentru utilizare în invenţie are secvenţa ARNr 16s reprezentată prin SEQ ID NO: 1.

În mod alternativ, tulpinile care sunt biotipuri ale bacteriei depuse sub numărul de acces NCIMB 42380 şi cele care sunt adecvate pentru utilizare în invenţie pot fi identificate prin secvenţierea altor secvenţe de nucleotide pentru bacteria depusă sub numărul de acces NCIMB 42380. De exemplu, genomul întreg poate fi secvenţializat substanţial şi o tulpină de biotip pentru utilizare în invenţie poate avea identitate de secvenţă de cel puţin 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% sau 99,9% în cel puţin 80% din întregul său genom (de exemplu în cel puţin 85%, 90%, 95% sau 99% sau din întregul său genom).

Tulpina bacteriană utilizată în invenţie are un genom cu 90% identitate de secvenţă cu SEQ ID NO: 2 din PCT/GB2016/051776. Tulpina bacteriană utilizată în invenţie are un genom cu identitate de secvenţă de cel puţin 90% (de exemplu cel puţin 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% sau 100% identitate) cu SEQ ID NO: 2 din PCT/GB2016/051776 pe o lungime de cel puţin 60% (de exemplu, cel puţin 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% sau 100%) din SEQ ID NO: 2 din PCT/GB2016/051776. De exemplu, tulpina bacteriană pentru utilizare în invenţie poate avea un genom cu identitate de secvenţă de cel puţin 90% faţă de SEQ ID NO: 2 din PCT/GB2016/051776 pe o lungime mai mare de 70% din SEQ ID NO: 2 din PCT/GB2016/051776, sau cel puţin 90% identitate de secvenţă cu SEQ ID NO: 2 din PCT/GB2016/051776 pe o lungime mai mare de 80% din SEQ ID NO: 2 din PCT/GB2016/051776, sau cel puţin 90% identitate de secvenţă cu SEQ ID NO: 2 din PCT/GB2016/051776 pe o lungime mai mare de 90% din SEQ ID NO: 2 din PCT/GB2016/051776, sau cel puţin 90% identitate de secvenţă cu SEQ ID NO: 2 din PCT/GB2016/051776 pe o lungime de 100% din SEQ ID NO: 2 din PCT/GB2016/051776, sau cel puţin 95% identitate de secvenţă cu SEQ ID NO: 2 din PCT/GB2016/051776 pe o lungime mai mare de 70% din SEQ ID NO: 2 din PCT/GB2016/051776, sau cel puţin 95% identitate de secvenţă cu SEQ ID NO: 2 din PCT/GB2016/051776 pe o lungime mai mare de 80% din SEQ ID NO: 2 din PCT/GB2016/051776, sau cel puţin 95% identitate de secvenţă cu SEQ ID NO: 2 din PCT/GB2016/051776 pe o lungime mai mare de 90% din SEQ ID NO: 2 din PCT/GB2016/051776, sau cel puţin 95% identitate de secvenţă cu SEQ ID NO: 2 din PCT/GB2016/051776 pe o lungime de 100% din SEQ ID NO: 2 din PCT/GB2016/051776, sau identitate de secvenţă de cel puţin 98% faţă de SEQ ID NO: 2 din PCT/GB2016/051776 pe o lungime mai mare de 70% din SEQ ID NO: 2 din PCT/GB2016/051776, sau identitate de secvenţă de cel puţin 98% faţă de SEQ ID NO: 2 din PCT/GB2016/051776 pe o lungime mai mare de 80% din SEQ ID NO: 2 din PCT/GB2016/051776, sau identitate de secvenţă de cel puţin 98% faţă de SEQ ID NO: 2 din PCT/GB2016/051776 pe o lungime mai mare de 90% din SEQ ID NO: 2 din PCT/GB2016/051776, sau identitate de secvenţă de cel puţin 98% faţă de SEQ ID NO: 2 din PCT/GB2016/051776 pe o lungime de 100% din SEQ ID NO: 2 din PCT/GB2016/051776.

În mod alternativ, tulpinile care sunt biotipuri ale bacteriei depozitate sub numărul de acces NCIMB 42380 şi care sunt adecvate pentru utilizare în invenţie pot fi identificate utilizând numărul de înregistrare NCIMB 42380 şi analiza fragmentului de restricţie şi/sau analiza PCR, de exemplu utilizând polimorfismul lungimii fragmen-telor fluorescente amplificate (FAFLP) şi amprentarea repetitivăa (rep)-PCR a elementului de ADN, sau profilarea proteinelor sau secvenţierea parţială a ADNr 16S sau 23s. În aplicaţiile preferate, astfel de tehnici pot fi utilizate pentru a identifica tulpini de aceeaşi specie ca bacteria depusă sub numărul de acces NCIMB 42380.

În anumite aplicaţii, tulpinile care sunt biotipuri ale bacteriei depozitate sub numărul de acces NCIMB 42380 şi care sunt adecvate pentru utilizare în invenţie sunt tulpinile care furnizează acelaşi model ca bacteria depusă sub numărul de acces NCIMB 42380 atunci când sunt analizate prin analiză de restricţie a ADN-ului ribozomal amplificat (ARDRA), de exemplu atunci când se utilizează enzime de restricţie Sau3AI (pentru metodele exemplificative şi indicaţii vezi, de exemplu, [17]). În mod alternativ, tulpinile de biotip sunt identificate ca tulpini care au aceleaşi modele de fermentaţie a carbohidraţilor ca bacteria depusă sub numărul de acces NCIMB 42380.

Tulpinile bacteriene care sunt biotipuri ale bacteriei depuse sub numărul de acces NCIMB 42380 şi care sunt utile în compoziţiile şi metodele conform invenţiei pot fi identificate utilizând orice metodă sau strategie adecvată, inclusiv testele descrise în exemple. De exemplu, biotipurile pentru utilizare în invenţie pot fi identificate prin cultivarea anaerobă în YCFA şi/sau prin administrarea bacteriilor la modelul de şoarece al artritei induse de colagen de tip II şi apoi evaluarea nivelurilor de citokină. În particular, tulpinile bacteriene care au tipare de creştere similare, tip metabolic şi/sau antigeni de suprafaţă la bacteria depusă sub numărul de acces NCIMB 42380 pot fi utile în invenţie. O tulpină de biotip va avea activitate modula-toare imunitar comparabilă cu tulpina NCIMB 42380. În particular, o tulpină de biotip va determina efecte comparabile asupra modelelor de astm, artrită, scleroză multiplă şi boli de cancer şi efecte comparabile asupra nivelurilor de citokine cu efectele pre-zentate în Exemple, care pot fi identificate prin utilizarea protocoalelor de cultură şi administrare descrise în Exemple.

O tulpină preferată în mod special conform invenţiei este bacteria depusă sub numărul de acces NCIMB 42380. Aceasta este tulpina exemplară 751 testată în exemple şi arătată a fi eficace pentru tratarea bolii.

Un derivat al bacteriei depuse sub numărul de acces NCIMB 42380 poate fi o tulpină fiică (descendentă) sau o tulpină cultivată (subclonată) din original. O tulpină derivată va avea activitate modula-toare imunitar comparabilă cu cea a tulpinii NCIMB 42380. În particular, o tulpină derivată va provoca efecte comparabile asupra modelelor de astm, artrită, scleroză multiplă şi boli de cancer şi aceleaşi efecte comparabile asupra nivelurilor de citokine faţă de efectele prezentate în Exemple, care pot fi identificate prin utilizarea proto-coalelor de cultură şi administrare descrise în Exemplele. Un derivat al tulpinii NCIMB 42380 va fi, în general, un biotip al tulpinii NCIMB 42380.

Referinţele la celulele bacteriei depuse sub numărul de acces NCIMB 42380 cuprind orice celule care au aceleaşi caracteristici de siguranţă şi eficacitate terapeutică ca tulpina depusă sub numărul de acces NCIMB 42380 şi astfel de celule sunt cuprinse în invenţie.

În realizările preferate, tulpinile bacteriene din compoziţiile conform invenţiei sunt viabile şi capabile să colonizeze parţial sau total intestinul.

În anumite aplicaţii, tulpina bacteriană utilizată în invenţie are o aderenţă scăzută la celule epiteliale intestinale umane, în special la celulele Caco-2. Într-o aplicaţie preferată, tulpina bacteriană pentru utilizare în invenţie are o aderenţă scăzută la celule epiteliale intestinale umane, în special la celulele Caco-2, în YCFA comparativ cu Bifidobacteria, în special B. breve. În anumite aplicaţii, tulpina bacteri-ană utilizată în invenţie prezintă aderenţă mai mică de 1% din cultura totală, de pre-ferinţă mai mică de 0,5% sau mai mică de 0,3%, atunci când este testată în condiţiile descrise în Exemplul 12.

În anumite aplicaţii, tulpina bacteriană pentru utilizare în invenţie produce exopolizaharide, de exemplu în care exopolizaharidele sunt legate la suprafaţa extracelulară a tulpinii bacteriene. În anumite aplicaţii, producerea de exopolizaharide legate măreşte aderenţa tulpinii bacteriene pentru utilizare în invenţie la mucus sau la suprafaţa celulelor epiteliale, de exemplu celulele epiteliale intestinale umane. Într-o aplicaţie preferată, tulpina bacteriană utilizată în invenţie produce mai multe exopolizaharide de suprafaţă legate în comparaţie cu Bifidobacteria, în special B. breve.

Într-o aplicaţie preferată, tulpina bacteriană utilizată în invenţie are atât aderenţă scăzută la celule epiteliale intestinale umane, în special celule Caco-2, în YCFA comparativ cu Bifidobacteria, în special B. breve (cum ar fi aderenţa a mai puţin de 1% din cultura totală, cum ar fi, de preferinţă, mai puţin de 0,5% sau mai mică de 0,3%, atunci când este testată în condiţiile descrise în Exemplul 12) şi produce mai multe exopolizaharide de suprafaţă legate, comparativ cu Bifidobacteria, în special B. breve.

În anumite aplicaţii preferate, tulpina bacteriană utilizată în invenţie este capabilă să fermenteze polizaharida rafinoză, de exemplu atunci când este cultivată într-un mediu de suspensie adecvat (cum ar fi mediul de suspensie API) la tempera-tura de 37°C timp de 4 ore.

În anumite aplicaţii, tulpina bacteriană utilizată în invenţie are capacitate redusă de a ferma α-glucozidază şi/sau β-glucozidază comparativ cu Bifidobacteria, în special B. breve, de exemplu atunci când sunt cultivate într-un mediu de suspensie adecvat (cum ar fi mediul de suspensie API) la temperatura de 37°C timp de 4 ore.

În anumite aplicaţii, tulpina bacteriană pentru utilizare în invenţie cuprinde una sau mai multe dintre genele enumerate în Tabelul 1, cum ar fi 5, 10, 20, 50 sau toate genele din Tabelul 1. În anumite aplicaţii, tulpina bacteriană pentru utilizare în invenţie cuprinde una sau mai multe dintre genele enumerate în Tabelul 1 care sunt evidenţiate cu sublinieri simple, cum ar fi componenta transmembranară BL0694 a modulului de energizare a transportorului ECF prezis şi/sau componenta ATPază duplicată BL0693 a modulului de energizare a transportorului ECF prezis. În anumite aplicaţii, tulpina bacteriană pentru utilizare în invenţie cuprinde una sau mai multe dintre genele enumerate în Tabelul 1 care sunt evidenţiate cu sublinieri duble şi cu caractere îngroşate cum ar fi 1, 2, 3, 4 sau 5 selectate dintre: glucozidază maltodextrină (EC 3.2 .1.20), galactozidază presupusă, celuloză sintetază (formatoare de UDP) (EC 2.4.1.12), chitinază (EC 3.2.1.14) şi ca-seta senzorială/proteina din familia GGDEF. În anumite aplicaţii, tulpina bacteriană pentru utilizare în invenţie cuprinde una sau mai multe gene enumerate în Tabelul 1 care sunt evidenţiate cu caractere înclinate, cum ar fi 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 sau 9 gene selectate dintre: subunitatea PfaA a sintezei acidului gras polinesaturat omega-3, sintaza poli-ketidei de tip I, glicozil hidrolaza presupusă având o funcţie necunoscută (DUF1680), componenta ATPază BioM a modulului de energizare a transportorului ECF de bioti-nă, familia E1-E2 de ATPază transportatoare de cationi, proteina permează RbsC a sistemului de transport al ribozei ABC (TC 3.A.1.2.1), proteina RbsA cu legare la ATP a sistemului de transport al ribozei ABC (TC 3.A.1.2.1), oligoribonucleaza 3'-spre-5' (orn), proteina membranară asociată cu proteina Actinobacillus (1944168).

În aplicaţiile preferate, tulpina bacteriană pentru utilizare în invenţie cuprinde una sau mai multe (cum ar fi 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 45, 50 sau toate) gene selectate dintre: sintaza acidului 2-succinil-5-enolpiruvil-6-hidroxi-3-ciclohexen-1-carboxilic (EC 2.2.1.9); oligoribonuclează 3'-spre-5' (orn); alfa-galactozidază (EC 3.2.1.22); componenta ATPază a modulului general de energizare a transportatorilor ECF; componenta ATPază STY3233 a modulului de energizare a transportatorilor ECF reglat cu queuozină; helicază ADN dependentă de ADP (EC 3.6.1.-); beta-glucozi-dază (EC 3.2.1.21); sintaza celulozică (formatoare de UDP) (EC 2.4.1.12); chitinază (EC 3.2.1.14); COG1309: regulator al transcripţiei; D-alanil-D-alanină carboxipep-tidază (EC 3.4.16.4); componenta ATPază duplicată BL0693 a modulului de energi-zare a transportorului ECF prezumtiv; fructokinază (EC 2.7.1.4); GlcP simporter H+ al glucozei/manozei; glicoziltransferază (EC 2.4.1.-); sintaza GMP [hidrolizarea gluta-minei] (EC 6.3.5.2); zahar kinază ipotetică în cluster cu indigoidina sintază indA, familia PfkB de kinaze; nucleozidă hidrolază preferând inozina-uridina (EC 3.2.2.1); proteină ribozomală LSU L31p @ proteină ribozomală LSU L31p, independentă de zinc; maltodextrină glucozidază (EC 3.2.1.20); proteină membranară, asociată cu proteina Actinobacillus (1944168); precursorul murein transglicozilazei D legat de membrană (EC 3.2.1.-); metiltransferază (EC 2.1.1.-); butanol dehidrogenază A dependent de NADH (EC 1.1.1.-); fosfoglicolat fosfatază (EC 3.1.3.18); fosforibozil-antranilat izomerază (EC 5.3.1.24); glicozil hidrolaza prezumtivă având o funcţie necunoscută (DUF1680); polizaharidă permează de translocaţie conţinând ramnoză; ribokinază (EC 2.7.1.15); proteina RbsA cu legare la ATP a sistemului de transport al ribozei ABC (TC 3.A.1.2.1), proteina RbsA cu legare la ATP a sistemului de transport al ribozei ABC (TC 3.A.1.2.1), permează RbsD cu afinitate mare a sistemului de transport al ribozei ABC (TC 3.A.1.2.1); proteina RbsB cu legare la riboza periplas-matică a sistemului de transport al ribozei ABC (TC 3.A.1.2.1); proteina permează RbsC a sistemului de transport al ribozei ABC (TC 3.A.1.2.1); proteina permează RbsC a sistemului de transport al ribozei ABC (TC 3.A.1.2.1); sorbitol dehidrogenază (EC 1.1.1.14); proteină ribozomală SSU S14p (S29e) @ proteină ribozomală SSU S14p (S29e), independentă de zinc; componenta specifică substratului STY3230 a transportatorului ECF reglat cu queuozină; zaharoză-6-fosfat hidrolază (EC 3.2.1. B3); proteina TagH cu legare la ATP de export a acidului telchoic (EC 3.6.3.40); componentă transmembranară BL0694 a modulului de energizare a transportatorului ECF prezumtiv; componentă transmembranară STY3231 a modulului de energizare a transportatorului ECF reglat de către queuozină; regulator de răspuns cu două componente colocalizat cu transportatorul HrtAB; sistemul de modificare-restricţie de tip I, subunitatea ADN-metiltransferază M (EC 2.1.1.72); sistemul de modificare-restricţie de tip I, subunitatea de restricţie R (EC 2.1.21.3); sistemul de modificare-restricţie de tip I, subunitatea de specificitate S (EC 3.1.21.3); sistemul de modificare-restricţie de tip I, subunitatea de specificitate S (EC 3.1.21.3); xilitol dehidrogenază (EC 1.1.1.9); şi proteina XylF cu legare la xiloza periplasmatică, a transportatorului de xiloză ABC. În aplicaţiile preferate, tulpina bacteriană pentru utilizare în invenţie cuprinde una sau mai multe (cum ar fi 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 sau toate) gene care sunt enumerate în propoziţia precedentă şi care nu sunt evidenţiate în Tabelul 1.

Utilizări terapeutice

Aşa cum s-a demonstrat în exemple, compoziţiile bacteriene conform invenţiei sunt eficace pentru reducerea răspunsului inflamator Th17. În particular, tratamentul cu compoziţiile din invenţie realizează o reducere a nivelurilor de IL-17A şi a altor citokine ale căii Th17 şi îmbunătăţiri clinice în modelele animale ale stărilor mediate de către IL-17 şi calea Th17.

Celulele Th17 sunt un subset de celule T helper care produc, de exemplu, IL-17A, IL-17F, IL-21 şi IL-22. Diferenţierea celulei Th17 şi expresia IL-17 pot fi conduse de către IL-23. Aceste citokine şi altele formează părţi importante ale căii Th17, care este o cale bine stabilită de semnalizare inflamatorie care contribuie şi stă la baza unei serii de boli inflamatorii şi autoimune (aşa cum se descrie, de exemplu, în [18-23]). Bolile în care se activează calea Th17 sunt bolile mediate de către calea Th17. Bolile mediate de către calea Th17 pot fi ameliorate sau atenuate prin reprimarea căii Th17, care se poate realiza prin reducerea diferenţierii celulelor Th17 sau o reducere a activităţii lor sau o reducere a nivelului de citokine din căile Th17. Bolile mediate de către calea Th17 pot fi caracterizate de niveluri crescute de citokine produse de celulele Th17, cum ar fi IL-17A, IL-17F, IL-21, IL-22, IL-26, IL-9 (discutate în [24]). Bolile mediate de către calea Th17 pot fi caracterizate prin creşterea expresiei gene-lor legate de Th-17, cum ar fi Stat3 sau IL-23R. Bolile mediate de către calea Th17 pot fi asociate cu niveluri crescute de celule Th17.

IL-17 este o citokină proinflamatoare care contribuie la patogeneza mai multor boli şi condiţii inflamatorii şi autoimune. IL-17, aşa cum este utilizat acest termen aici, se poate referi la orice membru al familiei IL-17, incluzând IL-17A, IL-17B, IL-17C, IL-17D, IL-17E şi IL-17F. Bolile şi condiţiile mediate de către IL-17 sunt caracterizate de o expresie ridicată a IL-17 şi/sau de acumularea sau prezenţa de celule pozitive IL-17 într-un ţesut afectat de boală sau condiţie. În mod similar, bolile şi condiţiile mediate de către IL-17 sunt boli şi condiţii care sunt exacerbate de niveluri ridicate de IL-17 sau de o creştere a nivelurilor de IL-17 şi care sunt atenuate de nivelurile scăzute de IL-17 sau de o reducere a nivelurilor de IL-17. Răspunsul inflamator IL-17 poate fi local sau sistemic.

Exemple de boli şi condiţii care pot fi mediate de către IL-17 sau de calea Th17 includ scleroza multiplă; artrita, cum ar fi artrita reumatoidă, osteoartrita, artrita psoriazică sau artrita juvenilă idiopatică; neuromielita optică (boala Devic); spondilita anchilozantă; spondiloartrita; psoriazisul; lupusul eritematos sistemic; bolile inflama-torii ale intestinului, cum ar fi boala Crohn sau colita ulceroasă; boala celiacă; astmul, cum ar fi astmul alergic sau astmul neutrofil; boala pulmonară obstructivă cronică (BPOC); cancerul, cum ar fi cancerul mamar, cancerul de colon, cancerul pulmonar sau cancerul ovarian; uveita; sclerita; vasculita; boala lui Behcet; ateroscleroza; der-matita atopică; emfizemul; parodontita; rinita alergică; şi rejetul de alogrefă.

IL-17 şi calea Th17 sunt deseori asociate cu boli cronice inflamatorii şi autoimune, astfel încât compoziţiile invenţiei pot fi în mod special utile pentru tratarea sau prevenirea bolilor sau afecţiunilor cronice. În anumite aplicaţii, compoziţiile sunt destinate utilizării la pacienţii cu boală cronică. În anumite aplicaţii, compoziţiile sunt pentru utilizare în prevenirea dezvoltării bolii cronice.

În anumite aplicaţii, tratamentul cu compoziţiile conform invenţiei asigură o reducere sau prevenire a creşterii nivelurilor de IL-17, în special nivelurilor de IL-17A. În anumite aplicaţii, tratamentul cu compoziţiile din invenţie asigură o reducere sau previne creşterea nivelurilor IFN-γ, IL-1β, RANTES, MIP-1a, IL-8 sau IL-6. O astfel de reducere sau prevenire a nivelurilor ridicate ale acestor citokine poate fi utilă pentru tratarea sau prevenirea bolilor şi condiţiilor inflamatorii şi autoimune, în particular a celor mediate de către IL-17 sau calea Th17.

În anumite aplicaţii, tratamentul cu compoziţiile conform invenţiei furnizează un bloc de ataşare la celulele umane sau invazie a acestora, de exemplu, celule epiteliale umane, de către celule patogene, de exemplu E coli şi/sau S. enteritidis.

În anumite aplicaţii, tratamentul cu compoziţiile conform invenţiei reduce sau împiedică, de exemplu, legarea celulelor patogene E coli şi/sau S. enteritidis, la celule epiteliale umane, de exemplu celule epiteliale intestinale umane.

În anumite aplicaţii, producerea şi eliberarea de exopolizaharide de către tulpinile bacteriene ale compoziţiilor conform invenţiei pot avea efecte protectoare împotriva speciilor patogene, de exemplu E coli şi/sau S. enteritidis. În anumite aplicaţii, producerea şi eliberarea de exopolizaharide de către tulpinile bacteriene ale compoziţiilor din invenţie pot media efectul bacteriilor asupra căii IL-17 sau Th17 şi pot influenţa răspunsul imunitar al gazdei. În anumite aplicaţii, compoziţiile conform invenţiei sunt utilizate pentru producerea de exopolizaharide în tratamentul bolilor inflamatorii şi autoimune şi în particular a bolilor sau condiţiilor mediate de către IL-17.

În anumite aplicaţii, aderenţa scăzută la celulele epiteliale intestinale umane, în particular celulele Caco-2, a tulpinilor bacteriene ale compoziţiilor conform invenţiei poate creşte efectul benefic al compoziţiilor din invenţie pe calea IL-17 sau Th17 şi asupra bolilor mediate de către IL-17 sau calea Th17.

În anumite aplicaţii, tratamentul cu compoziţiile conform invenţiei asigură fer-mentarea crescută a rafinozei în intestin. Exemplele demonstrează că tulpinile bacteriene ale compoziţiilor conform invenţiei fermentează rafinoza polizaharidică, iar fermentaţia rafinozei poate conferi efecte asupra gazdei, cum ar fi creşterea butiratu-lui de cecal şi proliferarea gastrointestinală crescută. În anumite aplicaţii, compoziţiile conform invenţiei sunt utilizate pentru creşterea fermentării rafinozei în intestin în tratamentul bolilor inflamatorii şi autoimune şi în particular al bolilor sau condiţiilor mediate de către IL-17.

Astmul

În realizările preferate, compoziţiile invenţiei sunt pentru utilizare în trata-rea sau prevenirea astmului alergic sau neozinofilic. Exemplele demonstrează că compoziţiile invenţiei realizează o reducere a recrutării neutrofilelor şi/sau a eozinofilelor în căile respira-torii după sensibilizare şi provocare cu extract de acarieni de praf domestic şi astfel pot fi utili în tratamentul sau prevenirea astmului. Astmul este o boală cronică carac-terizată prin inflamarea şi restricţia căilor respiratorii. Inflamaţia în astm poate fi mediată de către eozinofile şi/sau neutrofile.

În anumite aplicaţii, astmul este astm bronşic eozinofilic sau alergic. Astmul eozinofilic şi alergic se caracterizează prin creşterea numărului de eozinofile din sângele periferic şi în secreţiile căilor respiratorii şi este asociat patologic cu îngro-şarea zonei de membrană de bază şi farmacologic cu răspunsul la corticosteroizi [25]. Compoziţiile care reduc sau inhibă recrutarea sau activarea eozinofilelor pot fi utile pentru tratarea sau prevenirea astmului eozinofilic şi alergic.

Astmul eozinofil şi neutrofil nu sunt condiţii care se exclud reciproc, iar tratamentele care ajută la abordarea oric[ruia dintre răspunsurilor eozinofile şi neutro-file pot fi utile pentru tratarea astmului în general.

În anumite aplicaţii, compoziţiile invenţiei sunt utilizate în metodele de reducere a unui răspuns inflamator eozinofil în tratamentul sau prevenirea astmului eozinofilic. Aşa cum s-a menţionat mai sus, nivelurile ridicate de eozinofile în astm sunt asociate patologic cu îngroşarea zonei membranarei bazale, reducând astfel răspunsul inflamator eozinofilic în tratamentul sau prevenirea astmului pot fi în măsură să abordeze în mod specific această caracteristică a bolii. De asemenea, neutrofilele crescute, fie în combinaţie cu eozinofile crescute, fie în absenţa acestora, sunt asociate cu astm bronşic sever şi îngustare cronică a căilor respiratorii. Prin urmare, reducerea răspunsului inflamator neutrofil poate fi deosebit de utilă pentru abordarea astmului sever.

În anumite aplicaţii, compoziţiile reduc infiltrarea peribronhiolară în astmul alergic sau sunt utilizate pentru reducerea infiltraţiei peribronhiolară în tratamentul astmului alergic.

În anumite aplicaţii, tratamentul cu compoziţiile invenţiei asigură o reducere sau previne o creştere a nivelurilor IL-1β, IFNγ, RANTES, MIP-1α sau IL-8.

În anumite aplicaţii, compoziţiile invenţiei sunt destinate utilizării într-o metodă de tratare a astmului eozinofilic care are ca rezultat o reducere a răspunsului inflamator eozinofil. În anumite aplicaţii, pacientul care urmează să fie tratat are sau a fost identificat în prealabil ca având niveluri crescute de neutrofile sau eozino-file, identificate de exemplu prin analiza sângelui sau a sputei.

Compoziţiile invenţiei pot fi utile pentru prevenirea dezvoltării astmului alergic şi eozinofilic la un nou-născut atunci când sunt administrate nou-născutului sau unei femei însărci-nate. Compoziţiile pot fi utile pentru prevenirea dezvoltării astmului alergic şi eozinofilic la copii. Compozi-ţiile invenţiei pot fi utile pentru tratarea sau prevenirea astmului alergic şi eozinofilic cu debut la adulţi. Compoziţiile invenţiei pot fi utile pentru administrarea sau ameliorarea astmului alergic şi eozinofilic. Compoziţiile invenţiei pot fi în mod particular utile pentru reducerea simptomelor asociate cu astmul alergic şi eozinofilic care este agravat de alergeni, cum ar fi acarienii din praful domestic.

Tratamentul sau prevenirea astmului se poate referi, de exemplu, la o atenuare a severităţii simptomelor sau la o reducere a frecvenţei exacerbărilor sau a gamei de declanşatoare care reprezintă o problemă pentru pacient.

În anumite aplicaţii, tratamentul cu compoziţiile invenţiei asigură o redu-cere a concentraţiilor de fenilalanină şi/sau histidină, de exemplu în intestine sau în plasmă. Exemplele demonstrează că tulpinile bacteriene din compoziţiile invenţiei au testat pozitiv pentru fermentarea aminoacizilor, incluzând fenilalanina şi histi-dina şi concentraţiile plasmatice crescute ale fenilalaninei şi histidinei au fost rapor-tate ca fiind asociate cu efecte adverse în astm. În anumite aplicaţii, compoziţiile invenţiei sunt utilizate pentru reducerea hiper-reactivităţii căilor respiratorii asociate cu astmul.

În anumite aplicaţii, tratamentul cu compoziţiile invenţiei asigură o reducere a concentraţiilor de galactoză şi/sau fructoză, de exemplu în intestine. Exemplele demonstrează că tulpinile bacteriene ale compoziţiilor conform invenţiei fermentează substraturile de carbohidraţi incluzând galactoza şi fructoza, iar galacto-za α-1,3-galactoză derivată din surse de carne este un alergen cunoscut şi un agent cauzator de anafilaxie, şi nivelurile de consum de fructoză din dietă sunt corelate cu creşterea severităţii astmului.

Moduri de administrare

De preferinţă, compoziţiile conform invenţiei urmează să fie administrate în tractul gastrointestinal pentru a permite eliberarea şi/sau colonizarea parţială sau totală a intestinului cu tulpina bacteriană conform invenţiei. În general, compoziţiile conform invenţiei sunt administrate pe cale orală, dar pot fi administrate rectal, intranazal sau pe căi bucale sau sublinguale.

În anumite aplicaţii, compoziţiile din invenţie pot fi administrate ca o spumă, ca un spray sau ca un gel.

În anumite aplicaţii, compoziţiile conform invenţiei pot fi administrate sub formă de supozitoare, cum ar fi un supozitor rectal, de exemplu sub forma unui ulei de teobroma (unt de cacao), a unei grăsimi sintetice dure (de exemplu suppocire, witepsol), glicero-polietilen glicol sau compoziţie de glicerină de săpun.

În anumite aplicaţii, compoziţia conform invenţiei este administrată tractului gastrointestinal printr-un tub, cum ar fi un tub nasogastric, tub orogastric, tub gastric, tubul jejunostomic (tub J), gastrostomie endoscopică percutanată (PEG), sau ca un port, cum ar fi un port de perete toracic care oferă acces la stomac, jejun şi alte porturi de acces adecvate.

Compoziţiile conform invenţiei pot fi administrate o dată sau pot fi administrate secvenţial ca parte a unui regim de tratament. În anumite aplicaţii, compoziţiile con-form invenţiei trebuie să fie administrate zilnic.

În anumite aplicaţii ale invenţiei, tratamentul conform invenţiei este însoţit de evaluarea microbiotei intestinale a pacientului. Tratamentul poate fi repetat dacă nu se realizează administrarea şi/sau colonizarea parţială sau totală cu tulpina conform invenţiei, astfel încât nu se observă eficacitate, sau tratamentul poate fi încetat dacă succesiunea şi/sau colonizarea parţială sau totală este de succes şi se observă eficacitate.

În anumite aplicaţii, compoziţia conform invenţiei poate fi administrată la un animal gestant, de exemplu un mamifer cum ar fi un om, pentru a preveni o boală inflamatorie sau autoimună care se dezvoltă în copilul său in utero şi/sau după ce s-a născut.

Compoziţiile conform invenţiei pot fi administrate unui pacient care a fost diagnosticat cu o boală sau o afecţiune mediată de către IL-17 sau calea Th17 sau care a fost identificat ca prezentând riscul unei boli sau stări mediate de către IL-17 sau calea Th17. Compoziţiile pot fi, de asemenea, administrate ca o măsură profilac-tică pentru a preveni dezvoltarea de boli sau stări mediate de IL-17 sau calea Th17 la un pacient sănătos.

Compoziţiile conform invenţiei pot fi administrate la un pacient care a fost identificat ca având o microbiotă anormală în intestin. De exemplu, pacientul poate avea o colonizare redusă sau lipsă cu bacteria depusă sub numărul de acces NCIMB 42380.

Compoziţiile conform invenţiei pot fi administrate ca un produs alimentar, cum ar fi un supliment nutriţional.

În general, compoziţiile conform invenţiei sunt pentru tratamentul oamenilor, deşi pot fi utilizate pentru tratamentul animalelor, inclusiv al mamiferelor monogastri-ce cum ar fi păsările de curte, porcii, pisicile, câinii, caii sau iepurii. Compoziţiile conform invenţiei pot fi utile pentru îmbunătăţirea creşterii şi performanţei animalelor. Dacă se administrează la animale, se poate utiliza gavajul oral.

Compoziţii

În general, compoziţia conform invenţiei cuprinde bacterii. În aplicaţiile preferate ale invenţiei, compoziţia este pusă în formulă în formă liofilizată. De exem-plu, compoziţia conform invenţiei poate cuprinde granule sau capsule de gelatină, de exemplu capsule de gelatină tare, cuprinzând o tulpină bacteriană conform invenţiei.

De preferinţă, compoziţia din invenţie cuprinde bacterii liofilizate. Liofilizarea bacteriilor este o procedură bine stabilită şi există indicaţii relevante, de exemplu, în referinţele [51-53].

În mod alternativ, compoziţia din invenţie poate cuprinde o cultură bacteriană activă, vie.

În aplicaţiile preferate, compoziţia conform invenţiei este încapsulată pentru a permite eliberarea tulpinii bacteriene în intestin. Încapsularea protejează compoziţia de degradare până la livrarea la locul ţintă, de exemplu, prin ruperea cu stimuli chimici sau fizici, cum ar fi presiunea, activitatea enzimatică sau dezintegrarea fizică, care poate fi declanşată de modificările pH-ului. Se poate utiliza orice metodă adec-vată de încapsulare. Exemple de tehnici de încapsulare includ capturarea într-o matrice poroasă, ataşare sau adsorbţie pe suprafeţe purtătoare solide, auto-agrega-rea prin floculare sau cu agenţi de reticulare şi izolarea mecanică în spatele unei membrane microporoase sau a unei microcapsule. Indicaţii privind încapsularea care pot fi utile pentru prepararea compoziţiilor din invenţie sunt disponibile, de exemplu, în referinţele [54] şi [55].

Compoziţia poate fi administrată pe cale orală şi poate fi sub formă de tabletă, capsulă sau pulbere. Produsele încapsulate sunt preferate deoarece bacteria depusă sub numărul de acces NCIMB 42380 poate fi una anaerobă. Alte ingrediente (cum ar fi vitamina C, de exemplu) pot fi incluse ca agenţi de captare a oxigenului şi substraturi prebiotice pentru a îmbunătăţi eliberarea şi/sau colonizarea parţială sau totală şi supravieţuirea in vivo. În mod alternativ, compoziţia probiotică a invenţiei poate fi administrată pe cale orală ca produs alimentar sau nutriţional, cum ar fi un produs lactat fermentat pe bază de lapte sau pe bază de zer, sau ca produs farma-ceutic.

Compoziţia poate fi pusă în formulă ca un probiotic.

O compoziţie conform invenţiei include o cantitate eficace terapeutic dintr-o tulpină bacteriană conform invenţiei. O cantitate eficace terapeutic dintr-o tulpină bacteriană este suficientă pentru a exercita un efect benefic asupra unui pacient. O cantitate eficace terapeutic dintr-o tulpină bacteriană poate fi suficientă pentru a duce la livrarea către intestinul pacientului şi/sau colonizarea parţială sau totală a acestuia.

O doză zilnică adecvată de bacterii, de exemplu pentru un om adult, poate fi de la aproximativ 1 × 103 până la aproximativ 1 × 1011 unităţi care formează colonii (CFU); de exemplu, de la aproximativ 1 × 107 până la aproximativ 1 × 1010 CFU; într-un alt exemplu de la aproximativ 1 × 106 până la aproximativ 1 × 1010 CFU.

În anumite aplicaţii, compoziţia conţine tulpina bacteriană într-o cantitate de la circa 1 × 106 până la aproximativ 1 × 1011 CFU/g, în raport cu masa compoziţiei; de exemplu, de la aproximativ 1 × 108 până la aproximativ 1 × 1010 CFU/g. Doza poate fi, de exemplu, de 1 g, 3 g, 5 g şi 10 g.

În mod tipic, un probiotic, cum ar fi compoziţia din invenţie, este opţional combinat cu cel puţin un compus prebiotic adecvat. Un compus prebiotic este de obicei un carbohidrat nedigerabil, cum ar fi o oligo- sau polizaharidă sau un alcool din zahăr, care nu este degradat sau absorbit în tractul digestiv superior. Prebioticele cu-noscute includ produse comerciale precum inulina şi transgalacto-oligozaharidele.

În anumite aplicaţii, compoziţia probiotică conform prezentei invenţii include un compus prebiotic într-o cantitate de la aproximativ 1 până la aproximativ 30% din masă, faţă de masa totală a compoziţiei (de exemplu, de la 5 până la 20% din masă). Carbohidraţii pot fi selectaţi din grupul constând din: fructo-oligozaharide (sau FOS), fructo-oligozaharide cu catenă scurtă, inulină, izomalt-oligozaharide, pectine, xilo-oligozaharide (sau XOS), chitosan, beta-glucani, amidonuri modificate cu gumă ara-bică şi rezistente, polidextroză, D-tagatoză, fibre de salcâm, carob, ovăz şi fibre de citrice. Într-un aspect, prebioticele sunt fructo-oligozaharidele cu catenă scurtă (pen-tru simplitate, prezentate mai jos în continuare ca FOSc-s); respectivele FOSc-s nu sunt carbohidraţi digerabili, în general sunt obţinute prin transformarea zahărului din sfeclă şi includ o moleculă de zaharoză la care se leagă trei molecule de glucoză.

Compoziţiile conform invenţiei pot cuprinde excipienţi sau purtători acceptabili farmaceutic. Exemple de astfel de excipienţi adecvaţi pot fi găsiţi în referinţa [56]. Purtătorii sau diluanţii acceptabili pentru utilizare terapeutică sunt bine cunoscuţi în domeniul farmaceutic şi sunt descrişi, de exemplu, în referinţă [57]. Exemple de pur-tători adecvaţi includ lactoză, amidon, glucoză, metilceluloză, stearat de magneziu, manitol, sorbitol şi alţii asemenea. Exemple de diluanţi adecvaţi includ etanolul, glice-rolul şi apa. Alegerea purtătorului farmaceutic, a excipientului sau a diluantului poate fi făcută în funcţie de calea de administrare dorită şi de practica farmaceutică stan-dard. Compoziţiile farmaceutice pot cuprinde ca sau în plus faţă de purtător, excipient sau diluant orice liant adecvat, lubrifiant (lubrifianţi), agent (agenţii) de suspendare, agent (agenţi) de acoperire, agent (agenţi) de solubilizare. Exemplele de lianţi adecvaţi includ amidon, gelatină, zaharuri naturale cum ar fi glucoza, lactoza anhidră, lactoza cu curgere liberă, beta-lactoza, îndulcitorii din porumb, gumă natu-rală şi sintetică, cum ar fi cea de salcâm, tragacantă, sau alginat de sodiu, carboxi-metilceluloză şi polietilenglicol. Exemplele de lubrifianţi adecvaţi includ oleat de sodiu, stearat de sodiu, stearat de magneziu, benzoat de sodiu, acetat de sodiu, clorură de sodiu şi alţii asemenea. În compoziţia farmaceutică pot fi furnizaţi agenţi conservanţi, stabilizatori, coloranţi şi chiar aromatizanţi. Exemplele de conservanţi includ benzoatul de sodiu, acidul sorbic şi esterii acidului p-hidroxibenzoic. De ase-menea, pot fi utilizaţi antioxidanţi şi agenţi de punere în suspensie.

Compoziţiile conform invenţiei pot fi puse în formulă ca un produs alimentar. De exemplu, un produs alimentar poate oferi beneficii nutriţionale în plus faţă de efectul terapeutic al invenţiei, cum ar fi într-un supliment nutriţional. În mod similar, un produs alimentar poate fi pus în formulă pentru a spori gustul compoziţiei conform invenţiei sau pentru a face compoziţia mai atractivă pentru a fi consumată prin faptul că este mai asemănătoare cu un produs alimentar comun decât cu o compoziţie farmaceutică. În anumite aplicaţii, compoziţia din invenţie este pusă în formulă ca un produs pe bază de lapte. Termenul „produs pe bază de lapte« înseamnă orice produs lichid sau semi-solid pe bază de lapte sau de zer având un conţinut de grăsimi diferit. Produsul pe bază de lapte poate fi, de exemplu, lapte de vacă, lapte de capră, lapte de oaie, lapte degresat, lapte integral, lapte recombinat din lapte praf şi zer fără prelucrare sau un produs prelucrat cum ar fi iaurtul, laptele închegat, laptele bătut, laptele acru, untul din lapte şi alte produse din lapte acru. Un alt grup important include băuturi din lapte, cum ar fi băuturi din zer, lapte fermentat, lapte condensat, lapte pentru sugari sau bebeluşi; lapte aromatizat, îngheţată; alimente care conţin lapte, cum ar fi dulciuri.

În anumite aplicaţii, compoziţiile conform invenţiei conţin o singură tulpină sau specie bacteriană şi nu conţin alte tulpini sau specii bacteriene. Astfel de compoziţii pot cuprinde numai cantităţi minime sau biologice irelevante de alte tulpini sau specii bacteriene. Astfel de compoziţii pot fi o cultură care este substanţial lipsită de alte specii de organism.

Compoziţiile pentru utilizare în conformitate cu invenţia pot sau nu necesita aprobarea de comercializare.

În unele cazuri, tulpina bacteriană liofilizată este reconstituită înainte de administrare. În unele cazuri, reconstituirea se face prin utilizarea unui diluant descris aici.

Compoziţiile conform invenţiei pot cuprinde excipienţi, diluanţi sau purtători acceptabili farmaceutic.

În anumite aplicaţii, invenţia furnizează compoziţia farmaceutică de mai sus, în care cantitatea de tulpină bacteriană este de aproximativ 1 × 103 până la aproxi-mativ 1 × 1011 unităţi formatoare de colonii pe gram în raport cu masa compoziţiei.

În anumite realizări, invenţia furnizează compoziţia farmaceutică de mai sus, în care compoziţia este este administrată la o doză de 1 g, 3 g, 5 g sau 10 g.

În anumite aplicaţii, invenţia furnizează compoziţia farmaceutică de mai sus, în care compoziţia este administrată printr-o metodă selectată din grupul constând din calea orală, rectală, subcutanată, nazală, bucală şi sublinguală.

În anumite aplicaţii, invenţia furnizează compoziţia farmaceutică de mai sus, cuprinzând un purtător selectat din grupul constând din lactoză, amidon, glucoză, metilceluloză, stearat de magneziu, manitol şi sorbitol.

În anumite realizări, invenţia furnizează compoziţia farmaceutică de mai sus, care cuprinde un diluant selectat din grupul care constă din etanol, glicerol şi apă.

În anumite aplicaţii, invenţia furnizează compoziţia farmaceutică de mai sus, cuprinzând un excipient selectat din grupul constând din amidon, gelatină, glucoză, lactoză anhidră, lactoză cu curgere liberă, beta-lactoză, îndulcitor din porumb, salcâm, tragacantă, alginat de sodiu, carboximetil celuloză, polietilenglicol, oleat de sodiu, stearat de sodiu, stearat de magneziu, benzoat de sodiu, acetat de sodiu şi clorură de sodiu.

În anumite aplicaţii, invenţia furnizează compoziţia farmaceutică de mai sus, cuprinzând în plus cel puţin un agent de conservare, un antioxidant şi un stabilizator.

În anumite aplicaţii, invenţia furnizează compoziţia farmaceutică de mai sus, cuprinzând un conservant selectat din grupul constând din benzoat de sodiu, acid sorbic şi esteri ai acidului p-hidroxibenzoic.

În anumite realizări, invenţia furnizează compoziţia farmaceutică de mai sus, în care respectiva tulpină bacteriană este liofilizată.

În anumite aplicaţii, invenţia furnizează compoziţia farmaceutică de mai sus, în care atunci când compoziţia este depozitată într-un container etanş la temperatura de aproximativ 4°C sau aproximativ 25°C şi recipientul este plasat într-o atmosferă cu umiditate relativă de 50%, cel puţin 80% din tulpina bacteriană măsurată în unităţi formatoare de colonii, rămâne după o perioadă de cel puţin aproximativ: 1 lună, 3 luni, 6 luni, 1 an, 1,5 ani, 2 ani, 2,5 ani sau 3 ani.

Metode de cultivare

Tulpinile bacteriene pentru utilizare în prezenta invenţie pot fi cultivate utili-zând tehnici de microbiologie standard, aşa cum este detaliat, de exemplu, în referin-ţele [58-60].

Mediul solid sau lichid utilizat pentru cultură poate fi agar YCFA sau mediu YCFA. Mediul YCFA poate include (pentru 100 ml, valori aproximative): Casiton (1,0 g), extract de drojdie (0,25 g), NaHCO3 (0,4 g), cisteină (0,1 g), K2HPO4 (0,045 g), KH2PO4 (0,045 g), NaCI (0,09 g), (NH4)2SO4 (0,09 g), MgSO4·7H2O (0,009 g), CaCI2 (0,009 g), resazurină (0,1 mg), hemin (1 mg), biotină (1 μg), cobalamină (1 μg), acid β-aminobenzoic (3 μg), acid folic (5 μg) şi piridoxamină (15 μg).

Generalităţi

Practica prezentei invenţii va folosi, dacă nu se indică altfel, metode conven-ţionale de chimie, biochimie, biologie moleculară, imunologie şi farmacologie, în cadrul competenţelor în domeniu. Asemenea tehnici sunt explicate pe deplin în litera-tură. Vezi, de exemplu, referinţele [61] şi [62-68], etc.

Termenul „cuprinzând« cuprinde „incluzând« precum şi „constând«, de exem-plu o compoziţie „cuprinzând« X poate consta exclusiv din X sau poate include ceva suplimentar, de exemplu X + Y.

Termenul „aproximativ« în raport cu o valoare numerică x este opţional şi înseamnă, de exemplu, x±10%.

Cuvântul „substanţial« nu exclude „complet«, de exemplu, o compoziţie care este „substanţial liberă« de Y poate fi complet liberă de Y. Atunci când este necesar, termenul „substanţial« poate fi omis din definiţia invenţiei.

Referinţele la o identitate procentuală de secvenţă între două secvenţe de nucleotide înseamnă că, atunci când sunt aliniate, procentul de nucleotide este acelaşi în compararea celor două secvenţe. Această aliniere şi procentul de omologie sau identitate de secvenţă pot fi determinate utilizând programe cunoscute în domeniu, de exemplu cele descrise în secţiunea 7.7.18 din ref. [69]. O aliniere preferată este determinată de algoritmul de căutare a omologiilor Smith-Waterman, utilizând o căutare a golurilor afine cu o penalizare de deschidere a golului de 12 şi o penalizare de extindere a distanţei de 2, matricea BLOSUM 62. Algoritmul de căutare a omologiilor Smith-Waterman este dezvăluit în ref. [70].

Dacă nu se specifică altfel în mod specific, un procedeu sau o metodă care cuprinde numeroase etape poate cuprinde etape suplimentare la începutul sau la sfârşitul metodei sau poate cuprinde etape suplimentare intercalate. De asemenea, etapele pot fi combinate, omise sau executate într-o ordine alternativă, dacă este cazul.

Sunt descrise aici diferite aplicaţii ale invenţiei. Se va avea în vedere că caracteristicile specificate în fiecare aplicaţie pot fi combinate cu alte caracteristici specificate, pentru a furniza alte aplicaţii. În particular, aplicaţiile evidenţiate aici ca fiind potrivite, tipice sau preferate pot fi combinate între ele (cu excepţia cazului în care acestea se exclud reciproc).

EXEMPLE

Exemplul 1 - Eficacitatea inoculului bacterian la un model de şoarece al astmului indus de acarieni

Rezumat

Şoarecilor li s-au au fost administrat compoziţii cuprinzând tulpini bacteriene conform invenţiei şi au fost apoi provocaţi cu extract de praf domestic (HDM) pentru a produce un răspuns inflamator alergic. Răspunsul inflamator la HDM include compo-nente eozinofile şi neutrofile, este mediat de către IL-17 şi calea Th17 şi este un model pentru astm. Mărimea şi caracteristicile răspunsului inflamator expus de şoa-recii trataţi cu compoziţiile conform invenţiei au fost comparate cu grupurile martor. S-a constatat că compoziţiile conform invenţiei ameliorează răspunsul inflamator şi reduc recrutarea eozinofilelor şi neutrofilelor, indicând faptul că ele pot fi utile pentru tratarea condiţiilor mediate de către IL-17 cum ar fi eozinofilia, neutrofilia şi astmul.

Tulpină

751: bacterie depusă sub numărul de acces NCIMB 42380

Designul studiului

Grupuri:

1. Grup martor negativ. Tratament cu martor vehicul (pe cale orală).

4. Tratamentul cu tulpina inoculului bacterian terapeutic 751 (pe cale orală).

7. Grup martor pozitiv. Tratament cu dexametazonă (i.p.).

8. Grupul martor netratat.

Numărul de şoareci pe grup = 5

Ziua -14 până în ziua 13: administrarea zilnică a martorului vehicul pe cale orală (grupul 1).

Ziua -14 până în ziua 13: administrarea zilnică a inoculului bacterian terapeutic pe cale orală (grupurile 2-6).

Ziua 0, 2, 4, 7, 9, 11: administrarea a 15 μg de HDM (extract de acarieni din praf de casă - Număr de catalog: XPB70D3A25, Lot nr.: 231897, Greer Labora-tories, Lenoir, grupurile 1-8).

Ziua 0, 2, 4, 7, 9, 11 administrarea dexametazonei (i.p., 3 mg/kg, Sigma-Aldrich, număr de catalog D1159) (grupul 7).

Ziua 14 Sacrificarea tuturor animalelor pentru analiză.

Numărul total de şoareci = 40.

Obiective şi analize

În ziua 14, animalele au fost sacrificate prin injecţie letală intraperitoneală cu pentabarbitol (Streuli Pharma AG, Uznach, Cat: 1170139A) urmată imediat de un lavaj bronhoalveolar (BAL).

Celulele au fost izolate din lichidul BAL (de nlavaj bronhoalveolar) şi au fost numărate celulelor diferenţiate (200 de celule/eşantion).

Materiale şi metode

Şoareci. Şoarecii BALB/c femele în vârstă de şapte săptămâni au fost achiziţionaţi de la Charles River Laboratories şi alocaţi în mod aleatoriu în cuşti câte 5 şoareci per cuşcă (cuşti ventilate provenite de la Indulab AG, Gams, Switzerland Cage, tip: „The SealsafeTM - cage IVC«. Număr produs: 1248L). Cuştile au fost marcate cu numărul studiului, numărul grupului şi data de începere a experimentului. Şoarecii au fost monitorizaţi săptămânal şi au fost aclimatizaţi în instalaţie timp de 7 zile înainte de începerea studiului (Ziua Studiului - 14) iar alimentele au fost disponi-bile ad libitum. A fost prezentă îmbogăţirea cuştilor. Îngrijirea zilnică a animalelor a fost efectuată în conformitate cu autorizaţia locală numărul 2283.1 (eliberat şi apro-bat de: Service de consommation et des affaires vétérinaires du Canton de Vaud). Apă potabilă şi hrană au fost disponibile ad libitum şi s-au reîmprospătate o dată pe zi. A fost prezentă îmbogăţirea cuştilor. Regulamentele privind bunăstarea animalelor au fost respectate de către autorităţile oficiale ale Elveţiei în baza Ordonanţei 455.163 a FVO (Federal Veterinary Office) privind creşterea animalelor de laborator, producţia de animale modificate genetic şi metodele de experimentare pe animale.

Cultivarea inoculului de bacterii. Într-o staţie de lucru sterilă, un crio-flacon de bacterii a fost dezgheţat prin încălzire cu mâna înmănuşată şi 0,7 ml de conţinut au fost injectaţi într-un tub Hungate (Cat Number, 1020471, Glasgerätebau Ochs, Bovenden-Lenglern, Germania), conţinând 8 ml YCFA anaerob. Uzual au fost prepa-rate două tuburi pe tulpină. Tuburile Hungate au fost apoi incubate (static) la tempe-ratura de 37°C timp de 16 ore (tulpina 751).

Cultivarea martorului vehicul. Un tub gros, care conţine 8 ml de YCFA anaerob, a fost incubat (static) la temperatura de 37°C timp de 16 ore.

Administrarea inoculului de bacterii sau martorului vehicul. 400 μl de inocul de bacterii de cultură sau de martor vehicul au fost administrate pe zi prin gavaj oral.

Sensibilizarea intranazală. Şoarecii au fost anesteziaţi prin injectare i.p. cu 9,75 mg xilazol şi 48,75 mg ketasol per kg (Dr. E. Graeub AG, Berna, Elveţia) şi dozaţi cu 15 μg de HDM (număr de catalog: XPB70D3A25, Lot nr.: 231897, Greer Laboratories, Lenoir, NC, SUA) într-un volum de 30 μl PBS nazal.

Prepararea şi administrarea compusului martor pozitiv dexametazonă. Sarea disodică de 21-fosfat de dexametazonă (Sigma-Aldrich, nr. de catalog D1159, Lot nr SLBD.1030V) a fost dizolvată în H2O şi administrată animalelor într-o doză de 3 mg/kg într-un volum de 200 μl oral, în zilele indicate în protocolul de studiu de mai sus.

Procedura de terminare. În ziua 14, animalele au fost sacrificate prin injectare i.p. cu pentabarbitol (Streuli Pharma AG, Uznach, Cat: 1170139A) urmată imediat de lavajul bronhoalveolar (BAL) în 500 μl de soluţie salină.

Măsurarea infiltraţiilor celulare în BAL. Celulele au fost izolate din fluidul BAL şi au fost numărate celulele diferenţiate pe baza criteriilor standard morfologice şi citochimice.

Grafice şi analize statistice. Toate graficele au fost generate cu Graphpad Prism Version 6 şi a fost aplicat un ANOVA uni-direcţională. Rezultatele analizei statistice au fost furnizate cu tabelele de date individuale. Clasele de eroare repre-zintă eroarea standard a mediei (ESM).

Rezultate şi analize

Rezultatele experimentelor sunt prezentate în Figurile 1-9.

Nu a fost observată nici o morbiditate sau mortalitate la şoarecii trataţi cu bacteria sau vehiculul. Cei doi martori, tratamentul cu vehicul (martorul negativ) şi tratamentul cu dexametazonă (martorul pozitiv) s-au comportat aşa cum era de aşteptat, cu eozinofilia şi neutrofilia afectate după tratamentul cu dexametazonă.

Cele mai importante rezultate ale acestui experiment sunt prezentate în Figurile 6 şi 7, care prezintă numărul şi procentul total de neutrofile detectate în lavajul bronhiolar ca urmare a provocării cu HDM. Tulpina 751 a redus neutrofilele totale şi proporţia de neutrofile în BAL faţă de martorul numai vehicul.

Exemplul 2 - Eficacitatea inoculării bacteriene la un model de şoarece al astmului neutrofil sever

Rezumat

Şoarecilor li s-au administrat compoziţii care conţin tulpini bacteriene conform invenţiei şi au fost ulterior sensibilizaţi prin administrarea subcutanată a extractului de acarieni din praful de casă (HDM) şi au fost provocaţi cu o administrare intranazală de HDM pentru a modela răspunsul inflamator al astmului neutrofil sever. Mărimea şi caracteristicile răspunsului inflamator prezentat de către şoarecii trataţi cu compo-ziţiile conform invenţiei au fost comparate cu grupurile martor. S-a constatat că com-poziţiile conform invenţiei ameliorează răspunsul inflamator şi, în special, reduc re-crutarea neutrofilelor, într-o manieră comparabilă cu controlul pozitiv care cuprinde administrarea de anticorpi anti-IL-17. De aceea, datele indică faptul că compoziţiile din invenţie pot fi utile pentru tratarea condiţiilor mediate de către IL-17 şi Th17 cum ar fi neutrofilia şi astmul.

Tulpină

751: bacterie depusă sub numărul de acces NCIMB 42380

Designul studiului

Grupuri:

1. Grup martor negativ. Tratament cu martor vehicul (pe cale orală).

4. Tratamentul cu tulpina inoculului bacterian terapeutic 751 (pe cale orală).

7. Grup martor pozitiv. Tratament cu anti-IL-17 (i.p.).

8. Grupul martor netratat.

9. Şoareci sănătoşi (linie de referinţă)

Numărul de şoareci pe grup (grupul 1-8) = 5

Ziua -14 până în ziua 17: administrarea zilnică a martorului vehicul pe cale orală (grupul 1).

Ziua -14 până în ziua 17: Administrarea zilnică a inoculului bacterian terapeutic pe cale orală (grupul 2-6).

Ziua 0: Sensibilizarea cu HDM în CFA (s.c.) (grupul 1-8).

Ziua 7: Sensibilizarea cu HDM în CFA (s.c.) (grupul 1-8).

Zilele 13, 15, 17: Administrarea i.p. a anticorpului de neutralizare anti-IL-17 (grupul 7).

Ziua 14, 15, 16, 17: Provocarea cu HDM în 30 μl PBS nazal (grupul 1-8).

Ziua 18: Sacrificarea tuturor animalelor pentru analiză.

Obiective şi analize:

În ziua 14, animalele au fost sacrificate prin injecţie intraperitoneală letală cu pentabarbitol (Streuli PharmaAG, Uznach, Cat: 1170139A) imediat urmată de un lavaj bronhoalveolar (BAL). Celulele au fost izolate din fluidul BAL şi s-au numărat celulele diferenţiate (200 de celule/eşantion).

Materiale şi metode

Şoareci. Şoarecii femele C57BL/6 în vârstă de şapte săptămâni au fost achi-ziţionaţi de la Charles River Laboratories şi au fost alocaţi aleatoriu în cuşti câte 5 şoareci per cuşcă (cuşti ventilate provenite de la Indulab AG, Gams, Switzerland Cage, tip: „The SealsafeTM - cage IVC«. Număr produs: 1248L). Cuştile au fost marcate cu numărul studiului, numărul grupului şi data de începere a experimentului. Şoarecii au fost monitorizaţi săptămânal şi au fost aclimatizaţi în instalaţie timp de 7 zile înainte de începerea studiului (Ziua Studiului - 14) iar alimentele au fost disponi-bile ad libitum. A fost prezentă îmbogăţirea cuştilor. Îngrijirea zilnică a animalelor a fost efectuată în conformitate cu autorizaţia locală numărul 2283.1 (eliberat şi apro-bat de: Service de consommation et des affaires vétérinaires du Canton de Vaud). Apă potabilă şi hrană au fost disponibile ad libitum şi s-au reîmprospătate o dată pe zi. A fost prezentă îmbogăţirea cuştilor. Regulamentele privind bunăstarea animalelor au fost respectate de către autorităţile oficiale ale Elveţiei în baza Ordonanţei 455.163 a FVO (Federal Veterinary Office) privind creşterea animalelor de laborator, producţia de animale modificate genetic şi metodele de experimentare pe animale.

Administrarea inoculului de bacterii sau martor vehicul. 400 μl de inocul de bacterii de cultură sau de control vehicul au fost administrate pe zi pe gavaj oral.

Sensibilizare la HDM. 50 μg de HDM (număr de catalog: XPB70D3A25, număr lot: 231897, Greer Laboratories, Lenoir, NC, SUA) în PBS a fost emulsionat într-un volum egal de adjuvant complet Freund (CFA Chondrex Inc. Washington, USA) şi administrat subcutanat într-un volum de 200 μl, de două ori în două săptă-mâni pe flancurile opuse. La o săptămână după cea de-a doua imunizare, şoarecii au fost anesteziaţi prin injectare i.p. cu 9,75 mg xilazol şi 48,75 mg ketazol per kg (Dr. E. Graeub AG, Berna, Elveţia) şi apoi s-au administrat provocări intranazale de 15 μg de HDM într-un volum de 30 μl PBS timp de 4 zile consecutiv. Analiza a fost efec-tuată la o zi după provocarea finală.

Prepararea şi administrarea martorului pozitiv - anticorpul de şoarece anti-IL-17 de şoarece. Anticorpul neutralizant anti-IL-17 a fost obţinut de la BioX Cell şi a fost păstrat la temperatura de 4°C (clona 17F3, Cat # BE0173, BioX Cell) şi administrat i.p. la o doză de 12,5 mg/kg în zilele indicate în protocolul de studiu de mai sus.

Procedura de terminare. În ziua 18, animalele au fost sacrificate prin injectare i.p. cu pentabarbitol (Streuli Pharma AG, Uznach, Cat: 1170139A) urmată imediat de lavajul bronhoalveolar (BAL) în 500 μl de soluţie salină.

Rezultate şi analize

Rezultatele experimentului sunt prezentate în Figurile 10-18.

Nu a fost observată nici o morbiditate sau mortalitate la şoarecii trataţi cu bacteria sau vehiculul. Aşa cum s-a arătat în Figurile 15 şi 16, tulpina 751 a fost foar-te eficace în ameliorarea magnitudinii răspunsului inflamator neutrofil. Într-adevăr, tratamentul cu tulpina 751 a demonstrat rezultate comparabile cu tratamentul cu anti-corpi anti-IL-17. În plus, tulpina 751 a redus numerele de eozinofile faţă de martori, aşa cum se arată în Figurile 11 şi 12.

Exemplul 3 - Eficacitatea inoculului bacterian pentru tratarea artritei la un model de şoarece al artritei induse de colagenul de tip II

Materiale şi metode

Tulpină

751: bacterie depusă sub numărul de acces NCIMB 42380

Culturi bacteriene

Culturile bacteriene au fost cultivate pentru administrare într-o staţie de lucru anaerobă (Don Whitley Scientific).

Tulpina bacteriană # 751 a fost crescută utilizând stocuri de glicerol. Stocurile de glicerol au fost depozitate la temperatura de -80°C. De trei ori pe săptămână, stocurile de glicerol s-au dezgheţat la temperatura camerei şi s-au plasat pe plăcile YCFA. O fracţie nouă de glicerol a fost folosită pentru fiecare ocazie. Bacteriile au fost lăsate să crească pe o placă dată timp de până la 72 de ore.

Soluţiile care trebuie administrate animalelor au fost preparate de două ori pe zi, cu un interval de opt ore pentru tratamentele de dimineaţa (AM) şi după-amiaza (PM). O colonie bacteriană a fost culeasă de pe placă şi transferată într-un tub care conţine mediu YCFA. Tulpina bacteriană # 751 a fost lăsată să crească timp de 16 ore înainte de administrarea AM. Bacteriile au fost subcultivate la 1% în mediu YCFA pentru administrarea PM. Valorile OD au fost înregistrate pentru fiecare tulpină după preparatele de tratament de dimineaţă şi de după-amiază.

Modelul de şoarece al artritei induse de colagenul de tip II

Şoareci masculi DBA/1 adulţi au fost repartizaţi aleatoriu în grupuri experi-mentale şi au fost lăsaţi să se aclimatizeze timp de două săptămâni. În ziua 0, ani-malelor li s-au administrat prin injectare subcutanată 100 microlitri dintr-o emulsie conţinând 100 micrograme de colagen de tip II (CII) în adjuvant Freund incomplet suplimentat cu 4 mg/ml Mycobacterium tuberculosis H37Ra. În ziua 21, animalelor li s-au administrat prin injectare subcutanată o emulsie de rapel conţinând 100 μg de colagen de tip II în adjuvant Freund incomplet.

Tratamentele au fost date în conformitate cu schema de administrare de mai jos. Din ziua -14 până la sfârşitul experimentului în ziua 45, animalele au fost cântărite de trei ori pe săptămână. Din ziua 21 până la sfârşitul experimentului, animalele au fost evaluate de trei ori pe săptămână pentru semnele clinice de artrită care includ umflarea labelor posterioare şi a celor din faţă, articulaţiilor radio-carpale (încheieturi) şi articulaţiilor tibio-tarsale (glezne).

În ziua 45, şoarecii au fost sacrificaţi şi au fost prelevate probe de sânge pentru analiza citokinelor.

În Ziua -14, Ziua 0 şi Ziua 45, probe de fecale au fost colectate pentru analiză microbiologică, îngheţate imediat şi stocate la temperatura de -80°C.

Modelul de şoarece al artritei induse de colagen (CIA) este un model bine stabilit de şoarece pentru artrita reumatoidă [71]. Imunizarea cu CII provoacă o pato-geneză care include câteva caracteristici patologice importante ale artritei reuma-toide, incluzând hiperplazia sinovială, infiltrarea celulelor mononucleare şi degrada-rea cartilajelor. În mod semnificativ, dezvoltarea CIA este mediată de către celulele Th17 prin secreţia de IL-17A [72]. Răspunsul imun care stă la baza modelului de artrită este sporit prin utilizarea adjuvantului Freund suplimentat cu Mycobacterium tuberculosis.

În ziua 21, au fost recoltate splinele de la trei animale satelit din fiecare grup. Celulele au fost cultivate timp de 72 de ore în prezenţa sau absenţa colagenului de tip II. Citokinele, incluzând TNF-α, IL-6, IFN-γ, IL-4, IL-10 şi IL-17, au fost cuantificate în supernatanţii de cultură şi în serul terminal de către Luminex. Proliferarea celulară a fost cuantificată folosind o metodă de încorporare a timidinei tritiate.

Grupuri de tratament şi doze

Toate grupurile au fost n = 15 (n = 12 pentru grupul principal de studiu şi n = 3 pentru grupurile satelit).

Vehiculul utilizat pentru bioterapeutice a fost mediu cu extract de drojdie-casitonă-acizi graşi (YCFA).

Grup Doză Administrare Iducerea bolii Cale Regim 1 Vehicul 5 ml/kg PO BID: Ziua -14-Sfârşit Ziua 0: colagen/CFA, o dată, SC 2 Bioterapeutic #751 5 ml/kg PO BID: Ziua -14-Sfârşit Ziua 21: colagen/IFA, o dată, SC PO: gavaj oral, SC: injecţie subcutanată, BID: de două ori pe zi, CFA: adjuvant complet Freund.

Mase corporale

Din ziua -14 până la sfârşitul experimentului, animalele au fost cântărite de trei ori pe săptămână. Datele au fost notate ca (Medie ± ESM).

Observaţii clinice nespecifice

Din ziua -14 până la sfârşitul experimentului, animalele au fost verificate zilnic pentru semne clinice nespecifice pentru a include postura anormală (cocoşată), starea anormală a pielii (piloerecţia) şi nivelurile de activitate anormală (activitate redusă sau crescută).

Observaţii clinice

Din ziua 21 până la sfârşitul experimentului în ziua 45, animalele au fost eva-

luate de trei ori pe săptămână pentru semne clinice de artrită care includ umflarea labelor din spate şi din faţă, articulaţiilor radio-carpale (încheieturile labelor din faţă) şi articulaţiilor tibio-tarsale (glezne). Fiecare membru a fost evaluat utilizând următoa-rea scală: (0) normal, (1) umflare uşoară, (2) umflare blândă, (3) umflare moderată şi (4) umflare severă. Un scor clinic a fost calculat prin adunarea scorurilor corespunză-toare fiecărui membru. Scorul clinic maxim posibil pentru un animal a fost (16). Ani-malele cu un scor egal cu (12) în două ocazii consecutive şi animalele cu un scor mai mare decât (12) în orice moment au fost sacrificate. Datele au fost notate ca (Medie ± ESM).

Analiza proliferării celulelor

În ziua 21, au fost sacrificate trei animale satelit pe grup şi splinele au fost disecate. Celulele splenice au fost cultivate timp de 72 de ore în prezenţa sau în absenţa colagenului de tip II. După 72 de ore, celulele au fost pulsate peste noapte în prezenţa timidinei tritiate. Proliferarea celulelor a fost cuantificată prin măsurarea încorporării timidinei. Datele au fost notate ca (Medie ± ESM). Supernatanţii au fost preluaţi şi testaţi pentru prezenţa citokinelor-cheie.

Analiza citokinelor

Supernatanţii din culturile de celule splenice au fost testate pentru a cuantifica TNF-α, IL-6, IFN-γ, IL-4, IL-10 şi IL-17 de către Luminex. Datele au fost notate ca (Medie ± SEM).

Analiza microbiologică

În ziua -14, ziua 0 şi ziua 45, probe de fecale au fost colectate de la fiecare animal, îngheţate imediat şi stocate la temperatura de -80°C. Cacumurile (inclusiv conţinuturile) au fost îngheţate imediat şi depozitate la temperatura de -80°C. Un test de identificare bacteriană a fost efectuat zilnic prin placarea bacteriilor.

Histopatologie

La sfârşitul experimentului, labele posterioare au fost stocate în fixativ pentru ţesut. Eşantioanele au fost transferate în soluţie de decalcificare. Eşantioanele de ţesut au fost prelucrate, secţionate şi colorate cu hematoxilină şi eozină. Secţiunile au fost evaluate de un histopatolog calificat, orbit faţă de designul experimental, pentru semnele de artrită, care includ inflamaţia, afectarea cartilajului articular şi deteriorarea osului metafizar subiacent. A fost utilizat un sistem detaliat de evaluare (vezi mai jos). Datele au fost notate ca (Medie ± ESM). Au fost furnizate date brute şi analizate, precum şi imagini reprezentative.

Tabelul 1: Sistemul de evaluare histopatologică

Grad Descriere Inflamaţie 0 Articulaţie normală 1 Hiperplazie sinovială simplă cu inflamaţie dominată de neutrofile. Număr scă-zut de neutrofile şi macrofage în spaţiul comun. 2 Hiperplazie sinovială cu inflamaţie moderată până la marcată, implicând atât neutrofile, cât şi macrofage. Neutrofile şi macrofage în spaţiul articulaţiilor; pot exista unele resturi de ţesut necrotic. 3 Hiperplazia sinovială cu inflamaţie marcată implicȃnd atât neutrofilele, cât şi macrofagele. Pierderea mucoasei sinoviocitare. Inflamaţia se poate extinde de la sinoviu la ţesutul înconjurător incluzând muşchiul. Numeroase neutrofile şi macrofage în spaţiul articulaţiilor, împreună cu reziduuri semnificative de ţesut necrotic. Articulaţia leziunilor cartilajului 0 Articulaţie normală 1 Articulaţia cartilajului prezintă doar schimbări degenerative uşoare. Formarea timpurie a pannusului poate fi prezentă periferic. 2 Articulaţia cartilajului prezintă modificări degenerative moderate şi pierderi focale. Formarea pannusului este prezentă focal. 3 Distrugerea semnificativă şi pierderea cartilajului articular cu formarea extinsă a pannusului. Deteriorarea osului metafizar subiacente 0 Articulaţie normală 1 Nu există nicio modificare a osului metafizar subiacent. 2 Poate fi necroza focală sau fibroza osului metafizar. 3 Perturbarea sau distrugerea osului metafizar. Inflamaţia extinsă, necroză sau fibroză care se extinde până la spaţiul medular al metafizei.

Rezultate şi analize

Supravieţuire şi observaţii clinice nespecifice

Unele animale au fost sacrificate înainte de sfârşitul programării, datorită se-verităţii semnelor clinice de artrită sau datorită severităţii observaţiilor clinice nespeci-fice.

Trei animale au fost sacrificate sau găsite moarte sau sacrificate în timpul perioadei de pre-tratament (ziua -14 până în ziua 0): un animal din grupul 1 (tratat cu vehicul, animalul a sosit de la furnizor cu un picior rupt şi a fost sacrificat) şi două animale din grupul 2 (tratamentul bioterapeutic #751, posibilă dozare pulmonară în prima zi înainte de tratament şi semne clinice post-doză în a doua zi de pre-trata-ment).

Opt animale au fost sacrificate din cauza severităţii semnelor clinice de artrită: cinci animale din grupa 1 (tratate cu vehicul) şi trei animale din grupul 2 (tratate cu agentul bioterapeutic # 751).

Patru animale au fost sacrificate din cauza severităţii semnelor clinice nespe-cifice, incluzând postura anormală (cocoşată), starea anormală a pielii (piloerecţia), nivelurile anormale ale activităţii (activitate redusă): trei animale din grupa 1 (tratate cu vehicul) şi un animal în grupul 2 (tratat cu agentul bioterapeutic #751).

Mase corporale

Datele privind masa corporală înregistrate din ziua -14 până în ziua 0 şi exprimate ca procent din greutăţile corporale iniţiale (ziua -14) au fost analizate prin ANOVA bidirecţională urmată de post-testul Dunnett pentru comparaţii multiple cu ziua -14, apoi pentru comparaţie multiplă cu grupul tratat cu martor. Datele sunt pre-zentate în Figura 19. Datele obţinute de la animalele sacrificate înainte de sfârşitul planificat al experimentului au fost excluse din analize.

În comparaţie cu ziua -14, administrarea de două ori pe zi prin gavaj oral a determinat o pierdere semnificativă de masă corporală în grupul tratat cu vehicul în ziua -9 şi ziua -7.

Masele corporale măsurate între ziua -14 şi ziua -1 în grupurile tratate cu agenţi bioterapeutici nu au fost diferite de masele corporale măsurate în grupul tratat cu vehicul, în orice zi.

Datele privind greutatea corporală înregistrate din ziua 0 până în ziua 28 şi exprimate ca procent din greutăţile corporale iniţiale (ziua 0) au fost analizate prin ANOVA bidirecţională urmată de post-testul Dunnett pentru comparaţii multiple cu ziua 0 în grupul tratat cu vehicul apoi pentru comparaţii multiple cu grupul tratat cu vehicul. Datele sunt prezentate în Figura 20. Datele provenite de la animalele sacri-ficate înainte de sfârşitul planificat al experimentului şi de la animalele satelit au fost excluse din analize. Datele din ziua 28, ziua 35 şi ziua 42 au fost analizate în continuare prin ANOVA cu o singură cale, urmată de post-testul Dunnett pentru comparaţii multiple cu grupul tratat cu vehicul.

Debutul semnelor clinice de artrită a fost asociat cu o pierdere semnificativă în masa corporală în ziua 26 şi ziua 28 (p < 0,0001) în comparaţie cu ziua 0 în grupul tratat cu vehicul.

Nu a existat o diferenţă semnificativă între grupurile experimentale în ziua 35 sau ziua 42.

Observaţii clinice

Datele scorului clinic au fost analizate prin ANOVA bidirecţională urmată de post-test Dunnett pentru comparaţii multiple între zile în grupul tratat cu vehicul, apoi pentru comparaţii multiple între grupurile experimentale şi grupul tratat cu vehicul în fiecare zi. Datele sunt prezentate în Figura 21. Datele înregistrate de la animalele sacrificate înainte de sfârşitul experimentului au fost excluse din analiză. Atunci când animalele au fost sacrificate din cauza severităţii semnelor clinice de artrită, a fost ra-portat şi utilizat în analizele statistice ultimul scor înregistrat pentru următoarele zile.

O creştere semnificativă a scorurilor clinice a fost observată în grupul tratat cu vehicul din ziua 28 până în ziua 45 (p < 0,0001) în comparaţie cu ziua 21.

Aentul bioterapeutic #751 a indus o reducere a scorurilor clinice în comparaţie cu grupul tratat cu vehicul din ziua 31 până în ziua 45, deşi diferenţa nu a fost semnificativă.

Analiza proliferării celulare

Pentru a valida analiza, splenocitele au fost cultivate în prezenţa anti-CD3 şi anti-CD28 solubili (anti-CD3/CD28) ca stimuli de control pozitivi pentru a confirma potenţialul proliferativ al celulelor.

Au fost observate răspunsuri proliferative puternice la anti-CD3/CD28 în toate grupurile experimentale, arătând că celulele sunt sănătoase, viabile şi capabile să răspundă la semnalele de activare.

Pentru a testa răspunsul proliferativ în prezenţa colagenului II (CII), splenocitele au fost cultivate în prezenţa CII la 50 μg/ml. Răspunsul proliferativ al splenocitei la CII a fost analizat prin ANOVA bidirecţională, urmată de post-testul lui Sydak pentru comparaţii multiple între splenocitele nestimulate şi stimulate cu CII şi ANOVA unidirecţională urmată de post-testul lui Dunnett pentru compararea răspun-sului stimulat cu CII în diferite grupuri experimentale cu grupul tratat cu vehicul. Datele sunt prezentate în Figura 22.

CII a indus o creştere semnificativă a încorporarării de H3-timidină (cpm) în comparaţie cu splenocitele nestimulate în grupul tratat cu vehicul (p < 0,0001).

Grupurile tratate cu agentul bioterapeutic #751 au prezentat niveluri semnifi-cativ mai scăzute de proliferare a splenocitelor indusă de către CII decât grupul tratat cu vehicul.

Nivelurile de citokine din supernatanţii de cultură tisulară

Nivelurile fiecărei citokine au fost măsurate în supernatanţii de cultură tisulară derivaţi din culturi stimulate anti-CD3/CD28 prin analiză luminex. Acestea au prezen-tat răspunsuri robuste pentru toate citokinele măsurate (nivelurile medii în grupul tratat cu vehicul au fost după cum urmează: IL-4 = 6,406 pg/ml; IL-6 = 306 pg/ml; IL-10 = 10,987 pg/ml; IL-17A = 11,447 pg/ml; IFN-γ = 15,581 pg/ml; TNF-α = 76 pg/ml).

Secţiunile următoare rezumă datele obţinute din culturile stimulate de către colagenul II. Dacă este cazul, s-au efectuat analize statistice ale diferenţelor dintre nivelurile de citokine din supernatanţii splenocitelor nestimulate şi stimulate cu CII folosind ANOVA bidirecţionale urmate de post-testul Sidak pentru comparaţii multi-ple, şi ANOVA unidirecţională, urmată de post-testul Dunnett pentru compararea răspunsului stimulat cu CII în grupurile tratate cu agenţi bioterapeutici cu grupul tratat cu vehicul. Nu a existat o diferenţă semnificativă în nivelurile de citokine între grupuri în ambele cazuri. Acest lucru se datorează probabil dimensiunii mici a eşantionului utilizat (n = 3).

Pentru a prezenta cu mai multă precizie distribuţia datelor pentru citokine cu o răspândire substanţială a datelor, acestea sunt prezentate ca grafice împrăştiate.

Mediile grupurilor tratate cu IL-4 în supernatanţii de cultură tisulară după stimularea cu CII au fost < 5 pg/ml. Acestea nu sunt considerate semnificative din punct de vedere biologic şi nu sunt incluse aici. Mediile grupurilor tratate cu TNF-α în supernatanţii de cultură tisulară după stimularea cu colagen au fost sub limita de cuantizare.

Nivelurile în supernatanţi ale IFN-γ (Figura 23)

Împreună cu IL-17, IFN-γ este citokina majoră care conduce boala în modelul CIA. Graficul împrăştiat din Figura 23 demonstrează nivelurile de IFN-γ după stimu-larea cu CII, media grupului fiind mai mare pentru grupul tratat cu vehicul în compa-raţie cu cel tratat cu agent bioterapeutic. Rezultatul extras din acelaşi grup de subi-ecţi 2 este responsabil pentru media mai mare în acest grup pentru IFN-γ şi IL-10.

Nivelurile în supernatanţi ale IL-17A (Figura 24)

Nivelurile de IL-17A au fost de 50 pg/ml în culturi stimulate cu CII pentru gru-pul tratat cu vehicul. Nivelurile acestei citokine păreau mai scăzute în grupul tratat cu agent bioterapeutic comparativ cu cel tratat cu vehicul.

Nivelurile în supernatanţi ale IL-10 (Figura 25)

Nivelurile de IL-10 în grupul tratat cu vehicul au fost de 13 pg/ml şi de 2,1 pg/ml pentru culturile stimulate cu CII, respectiv pentru culturile cu mediu martor Niveluri mai ridicate de IL-10 (care este o citokină antiinflamatoare) pentru grupul tratat cu vehicul pot fi de aşteptat deoarece inflamaţia şi inducţia citokinelor pro-inflamatorii pot fi însoţite de un mecanism de reacţie antiinflamatorie.

Nivelurile în supernatanţi ale IL-6 (Figura 26)

Citokinele inflamatorii, cum ar fi IL-6 şi TNF-α, nu sunt produse tipic la niveluri ridicate în culturi anti-CII. Cu toate acestea, nivelurile lor pot fi modificate ca urmare a modulaţiei imunitare. Nivelurile de IL-6 în culturi stimulate cu CII au fost modeste, atingând 10 pg/ml. Deşi au fost mai mari decât în culturile în mediu de control, aceste diferenţe au fost prea mici pentru a oferi motive pentru efectuarea analizelor statis-tice.

Analiza microbiologică

Creşterea bacteriană a fost confirmată prin măsurarea densităţii optice la 600 nm utilizând un spectrofotometru. Identitatea bacteriană a fost confirmată prin com-pararea imaginilor de pe placă cu imaginile de referinţă.

În urma metodei de preparare îmbunătăţită a bacteriilor, s-au administrat în mod consistent doze mari de tulpină bacteriană din ziua -2 şi ziua -3, după cum se indică prin valorile ridicate ale OD măsurate.

Eşantioanele de fecale au fost colectate şi îngheţate în ziua -14, ziua 0 şi la terminarea studiului.

Histopatologie

Rezultatele histopatologiei sunt prezentate în Figurile 66-70. Aşa cum era de aşteptat pentru acest model, variabilitatea intra-individuală şi inter-individuală a fost observată în ceea ce priveşte prezenţa/absenţa artritei sau severitatea schimbării prezente.

Natura patologiei a fost aşa cum era de aşteptat pentru acest model, cu inflamaţia cronică activă mixtă a sinovium-ului şi a burselor care se extinde pentru a implica ţesuturile moi peri-articulare (muşchi, ţesut adipos, colagen dermic). În articu-laţiile cele mai sever afectate a existat degenerarea şi pierderea cartilajului articular cu resturile intraarticulare şi inflamaţia şi întreruperea structurii articulare şi osoase prin fibroză şi inflamaţie.

Incidenţa modificărilor histopatologice a fost: vehicul - 80% (16/20); agent bioterapeutic #751 - 45% (9/20). Tratamentul cu agent bioterapeutic #751 a redus incidenţa scorurilor histopatologice la nivelul membrelor posterioare ale şoarecelui în comparaţie cu grupul tratat cu vehicul (vezi Figurile 66-69). Istoricul histopatologic a fost analizat prin ANOVA unidirecţională pentru date non-parametrice (testul Kruskal-Wallis) urmat de post-testul Dunn pentru comparaţii multiple cu grupul tratat cu vehi-cul. Agentul bioterapeutic #751 a indus o reducere semnificativă a scorurilor inflama-ţiei articulare observate în histopatologie în comparaţie cu grupul tratat cu vehicul (p < 0,01). Agentul bioterapeutic #751 a indus o reducere semnificativă a scorurilor de distrugere a cartilajului observate în histopatologie în comparaţie cu grupul tratat cu vehicul (p < 0,001). Agentul bioterapeutic #751 a indus o reducere semnificativă a scorurilor leziunilor osoase observate în histopatologie în comparaţie cu grupul tratat cu vehicul (p < 0,001). Agentul bioterapeutic #751 a indus o reducere semnificativă a scorurilor histopatologice totale în comparaţie cu grupul tratat cu vehicul (p < 0,01).

Rezumat

Scorurile clinice crescute au fost observate în ziua 28 după prima adminis-trare de colagen de tip II, aşa cum se aştepta în acest model al artritei la şoareci DBA/1. Agentul bioterapeutic #751 s-a dovedit a fi eficace în tratarea artritei în acest model şi agentul bioterapeutic #751 a fost eficace pentru reducerea severităţii scoru-rilor clinice. Agentul bioterapeutic #751 a fost, de asemenea, eficient pentru reduce-rea bolii patologice la nivelul articulaţiilor, aşa cum s-a demonstrat în analiza histopa-tologică.

Au fost observate răspunsuri de memorie proliferativă la colagenul II în culturile de splenocite din toate grupele experimentale. Răspunsul specific la colagen a fost semnificativ redus după tratamentul cu agent bioterapeutic #751 (grupul 2).

Cele mai multe dintre citokinele testate ale celulelor T au prezentat creşteri detectabile între martorul stimulat de colagenul II şi cel din grupul tratat cu vehicul. Aceste creşteri nu au fost atât de evidente în grupul tratat cu agenţi bioterapeutici. Aceasta susţine în linii mari răspunsurile de memorie proliferativă la colagenul II descris mai sus.

Au existat dovezi de suprimare a axei Th1/Th17, care este răspunsul patogen în acest model şi în RA umană. Corelarea nivelurilor reduse de citokine cu prolifera-rea redusă este sugestivă pentru modularea imunităţii. Nu a existat nici o dovadă că această modulare a rezultat fie din niveluri crescute ale IL-4 asociate cu Th2, fie cu creşteri ale citokinei modulate imunitar, IL-10.

Exemplul 4 - Analiza ulterioară a efectului inoculării bacteriene în modelul de şoarece al astmului indus de acarienii din praful domestic

Şoarecii testaţi în Exemplul 1 au fost supuşi unor analize suplimentare pentru a caracteriza în continuare efectul compoziţiilor conform invenţiei asupra răspunsului inflamator în astmul alergic.

Materiale şi metode

Prelevarea sângelui şi prepararea serului în ziua 14. Probele de sânge de la animale au fost colectate prin puncţie cardiacă. Serul a fost izolat din proba de sânge prin centrifugare timp de 5 minute la 14000 g şi depozitat la temperatura de -20°C.

Prelevarea organelor în ziua 14. Colectarea lobului pulmonar stâng în formalină pentru analiza histologică ulterioară. Colectarea lobilor pulmonari drepţi (toţi lobii rămaşi) şi îndepărtarea serului pentru îngheţarea instantanee şi analiza ulterioară. Fluidul BAL rămas a fost îngheţat pentru analiza ulterioară.

Măsurarea nivelurilor de anticorpi în ser şi în fluidul BAL

Producţia totală de IgE şi de anticorpi IgG1 specifici acarianului de praf domestic (HDM) a fost măsurată în BAL şi ser prin analiza ELISA.

Izolarea analizelor pulmonare şi histologice

Lobii pulmonari stângi au fost fixaţi în formalină, urmată de încorporarea în parafină, secţionarea şi colorarea cu hematoxilină şi eozină şi PAS. Evaluarea histo-logică ulterioară a fost efectuată în orb după cum urmează: cinci câmpuri aleatorii pentru fiecare probă au fost evaluate pentru inflamaţie (infiltraţie peribronhială şi infil-traţie perivasculară) şi producţie de mucus. Infiltrarea inflamatorie a fost înregistrată cu următorul sistem de evaluare:

0 - normal

1 - infiltrate inflamatorii uşoare

2 - infiltrate inflamatorii moderate

3 - infiltrate inflamatorii marcate

4 - infiltrate inflamatorii severe

5 - infiltrate inflamatorii foarte severe

În fiecare câmp vizual, căile respiratorii au fost măsurate în dimensiune, iar a fost cuantificat numărul celulelor mucus/μm.

Măsurarea mediatorilor inflamatori în ţesutul pulmonar

Lobii pulmonari drepţi (toţi lobii rămaşi) izolaţi pentru cuantificarea mediatorilor inflamatori au fost congelaţi instantaneu pentru măsurarea ulterioară a CCL11, IFN-gamma, IL-1 alfa, IL-1 beta, IL-4, IL-5, IL-9, IL-17A, CXCL1, CCL3, CXCL2 şi CCL5 prin analiză multiplex disponibilă comercial (Merck-Millipore). Analiza a fost efectuată în conformitate cu instrucţiunile producătorului.

Rezultate şi analize

Rezultatele experimentelor sunt prezentate în Figurile 28-46.

În sprijinul descoperirilor descrise în Exemplul 1, analiza infiltratelor celulare din ţesutul pulmonar al şoarecilor trataţi cu tulpina 751 a arătat o reducere notabilă şi semnificativă din punct de vedere statistic a scorului mediu de inflamaţie (vezi Figuri-le 32 şi 34).

Au fost analizate nivelurile anticorpilor în lichidul şi serul BAL (vezi Figurile 28-31). Nu a fost observat niciun efect clar al tratamentului bacterian asupra nivelu-rilor serice ale anticorpilor. Acest lucru poate reflecta o eşec în experiment, deoarece răspândirea datelor şi barele de eroare pentru fiecare tratament sunt mari, iar marto-rii pozitivi şi negativi nu par să se fi comportat aşa cum ar fi de aşteptat. De aseme-nea, nivelurile de anticorpi serice de referinţă ar fi putut masca orice modificare.

În mod similar, nu a fost observat niciun efect clar al tratamentului bacterian asupra nivelurilor de citokine în ţesutul pulmonar (vezi Figurile 36-46). Din nou, acest lucru poate reflecta un eşec în experiment, deoarece răspândirea datelor şi barele de eroare pentru fiecare tratament sunt mari, iar martorii pozitivi şi negativi nu par să se fi comportat aşa cum ar fi de aşteptat. Este, de asemenea, posibil ca mecanismul de acţiune implicat să influenţeze reacţiile anterioare ale citokinelor care nu au mai putut fi detectate în ziua a IV-a după provocarea finală cu HDM a căilor respiratorii. O aten-ţie deosebită trebuie acordată interpretării datelor referitoare la citokine în studiul curent, datorită variabilităţii nivelurilor detectate. Această variabilitate poate fi explicată în parte prin faptul că ţesutul pulmonar a fost separat pentru diferitele anali-ze şi, astfel, un lob de plămâni s-ar putea să nu fi fost pe deplin reprezentativ sau comparabil cu acelaşi lob din alţi şoareci datorită distribuţiei neuniforme a inflamaţiei.

Exemplul 5 - Analiza ulterioară a efectului inoculării bacteriene în modelul de şoarece al astmului neutrofil sever

Şoarecii testaţi în Exemplul 2 au fost supuşi unor analize suplimentare pentru a caracteriza în continuare efectul compoziţiilor conform invenţiei asupra răspunsului neutrofil asociat cu astmul sever.

Materiale şi metode

Prelevarea organelor în ziua 18. Colectarea lobului pulmonar stâng în formalină pentru analiza histologică ulterioară. Colectarea lobilor pulmonari drepţi (toţi lobii rămaşi) şi îndepărtarea serului pentru îngheţarea instantanee şi analiza ulterioară. Fluidul BAL rămas a fost îngheţat pentru analiza ulterioară.

Măsurarea mediatorilor inflamatori în ţesutul pulmonar (analiză ulterioa-ră). Lobii pulmonari drepţi (toţi lobii rămaşi) izolaţi pentru cuantificarea mediatorilor inflamatori au fost îngheţaţi instantaneu pentru măsurarea ulterioară a IFN-gamma, IL-1 alfa, IL-1 beta, CXCL1, CCL3, CXCL2, CCL5, IL-17A, TNF-alfa , IL-17F, IL-23 şi IL-33 prin analiză multiplex disponibilă comercial (Merck-Millipore). Analiza a fost efectuată în conformitate cu instrucţiunile producătorului.

Măsurarea nivelurilor de anticorpi în ser şi fluidul BAL (analiză ulterioa-ră). Producţia de anticorpi IgG1 şi IgG2a specifici acarienilor de praf domestic (HDM) a fost măsurată în BAL şi ser prin analiză ELISA.

Izolarea analizelor pulmonare şi histologice (analiză ulterioară). Lobii pul-monari stângi au fost fixaţi în formalină, urmată de încorporarea în parafină, secţio-narea şi colorarea cu hematoxilină şi eozină şi PAS. Evaluarea histologică ulterioară a fost efectuată în orb după cum urmează: Cinci câmpuri aleatorii pentru fiecare eşantion au fost evaluate pentru inflamaţie (infiltraţie peribronhială şi infiltraţie perivasculară) şi producţie de mucus. Infiltrarea inflamatorie a fost înregistrată cu următorul sistem de evaluare:

0 - normal

1 - infiltrate inflamatorii uşoare

2 - infiltrate inflamatorii moderate

3 - infiltrate inflamatorii marcate

4 - infiltrate inflamatorii severe

5 - infiltrate inflamatorii foarte severe

Rezultate şi analize

Rezultatele experimentelor sunt prezentate în Figurile 47-64.

Analiza ulterioară a nivelurilor de anticorpi a arătat că eficacitatea tulpinii bacteriene 751 a fost, de asemenea, reflectată în nivelurile reduse ale IgG1 specifice HDM în fluidul BAL şi ser (vezi Figurile 47 şi 49). Nu pot fi trase concluzii ferme privind efectul asupra nivelurilor de IgG2a. În general, datele din analiza anticorpului sugerează o reducere legată de un răspuns inflamator global redus, spre deosebire de un efect selectiv asupra comutării izotipului de anticorp.

Analiza histologică a sprijinit numărul diferenţiat de celule din fluidul BAL, prezentând un infiltrat celular redus la şoarecii trataţi cu tulpina 751 (vezi Figurile 51-53).

În ceea ce priveşte nivelurile de citokine, ca şi în cazul Exemplului 4, răspândirea datelor şi barele de eroare pentru fiecare tratament sunt mari, iar martorii pozitivi şi negativi nu par să se fi comportat aşa cum ar fi fost de aşteptat în mod necesar. Este, de asemenea, posibil ca mecanismul de acţiune să influenţeze răspunsurile anterioare ale citokinelor care nu mai pot fi detectate în ziua a IV-a după provocarea finală cu HDM a căilor respiratorii. O atenţie deosebită trebuie acordată interpretării datelor referitoare la citokine în studiul curent, datorită variabilităţii nivelurilor detectate. Această variabilitate poate fi explicată în parte prin faptul că ţesutul pulmonar a fost separat pentru analizele diferite şi, astfel, un lob de plămâni s-ar putea să nu fi fost pe deplin reprezentativ sau comparabil cu acelaşi lob din alţi şoareci datorită distribuţiei neuniforme a inflamaţiei. În ciuda acestei variabilităţi, s-a demonstrat un efect antiinflamator clar asupra nivelurilor citokinelor pentru tulpina 751, iar martorul pozitiv anticorp anti-IL-17 s-a comportat în general aşa cum era de aşteptat.

Cu dezavantajele de mai sus, datele din Figurile 56, 58, 59, 61 şi 63 sugerează că tratamentul cu tulpinile bacteriene conform invenţiei şi în special tulpina 751 poate realiza o reducere a nivelurilor de IL-1b, IFNg, RANTES, MIP-1a şi KC (forma ortoloagă de şoarece a IL-8 umane), care poate indica un mecanism de acţiune legat de influenţele asupra eliberării de chemokine (şi astfel de recrutare a celulelor) de către celulele imunitare stromale sau înnăscute. Aceste citokine fac parte din calea Th17. Luând împreună acest set de date, se poate trage concluzia clară că tulpina 751 a fost extrem de eficace pentru protejarea şoarecilor împotriva inflamaţiei la acest model de şoarece al astmului neutrofil sever.

Exemplul 6 - Eficacitatea inoculării bacteriene la un model de şoarece al scle-rozei multiple

Rezumat

Şoarecilor li s-au administrat compoziţii cuprinzând tulpini bacteriene conform

invenţiei şi şoarecii au fost ulterior imunizaţi cu glicoproteină oligendendrocitară de mielină pentru a induce encefalomielita autoimună experimentală (EAE). EAE este modelul experimental cel mai frecvent utilizat pentru scleroza multiplă la om. S-a constatat că compoziţiile conform invenţiei au un efect izbitor asupra incidenţei bolii şi asupra severităţii bolii.

Tulpină

751: bacterie depusă sub numărul de acces NCIMB 42380

Designul studiului

Grupuri:

1. Grup martor negativ. Tratamentul cu martor vehicul (pe cale orală).

4. Tratament cu tulpina inoculului bacterian terapeutic 751 (pe cale orală).

9. Grup martor pozitiv. Tratament cu dexametazonă (i.p.).

10. Grup martor netratat.

Numărul de şoareci pe grup = 10

Ziua -14 până în ziua 27: administrarea zilnică a martorului vehicul pe cale orală (grupul 1).

Ziua -14 până în ziua 27: administrarea zilnică a inoculului bacterian terapeutic pe cale orală (grupul 4).

Zile 0-28: administrarea dexametazonei (i.p.) de trei ori pe săptămână (grupul 9).

Ziua 0: MOG35-55 (glicoproteină oligendendocitară mielină - 2 mg/ml) şi CFA (2 mg/ml MTB) au fost amestecate 1:1 rezultând soluţii de 1 mg/ml. 100 μl din ameste-cul peptidă-CFA au fost injectate subcutanat în fiecare picior posterior. Administrarea toxinei pertussis s-a făcut intraperitoneal (300 ng).

Ziua 1: administrarea intraperitoneală a toxinei pertussis (300 ng).

Ziua 7 - în continuare: măsurarea incidenţei bolii şi a greutăţii de trei ori pe săptă-mână.

Obiective şi analize

Şoarecii au fost analizaţi pentru incidenţa bolii şi severitatea bolii de trei ori pe săptămână. Evaluarea a fost efectuată în orb. Gravitatea bolii a fost evaluată utili-zând un scor clinic cuprins între 0 şi 5, cu 5 indicând un şoarece mort (vezi sistemul de evaluare clinic de mai jos).

Monitorizare

În zilele indicate, şoarecii au fost cântăriţi şi observaţi pentru evaluarea activi-tăţii bolii şi incidenţei bolii.

Observaţii privind evaluarea activităţii bolii:

0 - Nu au apărut modificări evidente ale funcţiei motorii în comparaţie cu şoare-cii neimunizaţi.

0,5 - Vârful cozii este moale.

1,0 - Coada moale.

1,5 - Coadă moale şi inhibare a picioarelor din spate.

2,0 - Coada moale şi slăbiciunea picioarelor din spate; SAU - Există semne evidente de înclinare a capului când se observă mersul pe jos. Echilibrul este slab.

2,5 - Coada moale şi târârea picioarelor din spate; SAU - Există o înclinare puternică a capului care cauzează căderea ocazională a şoarecelui.

3,0 - Coada moale şi paralizia completă a picioarelor din spate.

3,5 - Coada moale şi paralizia completă a picioarelor din spate.

În plus: şoare-cele se deplasează în jurul cuştii, dar atunci când este plasat pe partea sa, nu este în măsură să se orienteze.

Picioarele din spate sunt împreună pe o parte a corpului.

4,0 - Coada moale, paralizie completă a piciorelor din spate şi paralizia parţială a picioarelor din faţă. Şoarecele se mişcă minimal în jurul cuştii, dar pare alert şi se hrăneşte.

4,5 - Paralizia completă a picioarelor din spate şi parţială a celor din faţă, fără mişcare în jurul cuştii. Şoarecele este imediat eutanasiat şi scos din cuşcă.

5,0 - Şoarecele este eutanasiat din cauza unei paralizii severe.

Când un animal are un scor de activitate al bolii egal sau mai mare de 1, se consideră că are un scor pozitiv referitor la incidenţa bolii.

Rezultate

Rezultatele studiului sunt prezentate în Figurile 71 şi 72.

Inducerea bolii în grupurile de control negative a avut succes, cu scoruri ridicate demonstrate de martorul vehicul şi de martorul netratat. Efectul tratamentului cu tulpina 751 a fost izbitor şi şoarecii trataţi cu tulpina 751 au prezentat o incidenţă semnificativă asupra bolii şi severităţii bolii. Într-adevăr, reducerea incidenţei bolii şi a severităţii bolii a fost comparabilă cu grupul martor pozitiv. Aceste date indică faptul că tulpina 751 poate fi utilă pentru tratarea sau prevenirea sclerozei multiple.

Exemplul 7 - Eficacitatea inoculării bacteriene în modelele de şoarece ale can-cerului

Rezumat

Acest studiu a testat eficacitatea compoziţiilor care conţin tulpini bacteriene conform invenţiei în patru modele tumorale.

Materiale

Substanţă testată - Tulpina bacteriană # MRX004 (tulpina 751).

Substanţa de referinţă - Anticorpul anti-CTLA-4 (clona: 9H10, catalog: BE0131, izotip: IgG1 de hamster sirian, Bioxcell).

Vehicule substanţelor de test şi de referinţă - Mediu de cultură bacterian (mediu de extract de drojdie, Casitone, acizi graşi (YCFA)). În fiecare zi de injectare la şoareci, anticorpul a fost diluat cu PBS (ref: BE14-516F, Lonza, Franţa).

Dozele de tratament - Bacterii: 2×108 în 200 μl. A-CTLA-4 a fost injectat la 10 mg/kg/injecţie. Anti-CTLA-4 a fost administrat la un volum de doză de 10 ml/kg/ administrare (adică pentru un şoarece care cântăreşte 20 g, se vor administra 200 μl de substanţă de test) în funcţie de greutatea corporală cea mai recentă a şoarecilor.

Căi de administrare - Inoculul bacterian a fost administrat prin gavaj oral (per os, PO) prin intermediul unei canule. Canulele au fost decontaminate zilnic. Anti-CTLA-4 a fost injectat în cavitatea peritoneală a şoarecilor (intraperitoneal, IP).

Condiţiile de cultivare a tulpinilor bacteriene - Condiţiile de cultură pentru tulpina bacteriană au fost după cum urmează:

• Se pipetează 10 ml de YCFA (din sticlele de laborator cu 10 ml de preparat E&O) în tuburi Hungate • Se sigilează tuburile şi se spală cu CO2 utilizând un sistem de introduceree şi evacuare a seringilor • Se autoclavează tuburile Hungate • După răcire, se inoculează tuburile Hungate cu 1 ml din stocurile de glicerol • Se pun tuburile într-un incubator static la temperatura de 37°C timp de circa 16 ore. • În ziua următoare, se ia 1 ml din această subcultură şi se inoculează 10 ml de YCFA (tuburi Hungate preîncălzite spălate, toate în duplicat) • Se plasează într-un incubator static la temperatura de 37°C timp de 5 până la 6 ore

Linia celulară de cancer şi condiţiile de cultură

Liniile celulare utilizate au fost detaliate în tabelul de mai jos:

Linie celulară Tip Variatete de şoarece Origine EMT-6 Carcinom mamar BALB/c ATCC LL/2 (LLC1) Carcinom pulmonar C57BL/6 ATCC CRL1642 Hepa1-6 Carcinom hepatocelular C57BL/6 IPSEN INNOVATION

Linia celulară EMT-6 a fost stabilită dintr-un carcinom mamar transplantat mu-rin care a apărut într-un şoarece BALB/cCRGL după implantarea unui nodul alveolar mamar hiperplazic [73].

Linia celulară LL/2 (LLC1) a fost stabilită din plămânul unui şoarece C57BL care poartă o tumoare care rezultă din implantarea unui carcinom pulmonar Lewis primar [74].

Linia celulară Hepa 1-6 este un derivat al hepatomului de şoarece BW7756 care a apărut într-un şoarece C57/L [75].

Condiţii de cultură celulară - Toate liniile celulare au fost crescute ca mono-strat la temperatura de 37°C într-o atmosferă umidificată (5% CO2, aer 95%). Mediul de cultură şi suplimentele sunt indicate în tabelul de mai jos:

Linie celulară Mediu de cultură Supliment EMT6 RPMI 1640 conţinând 2 mM L-glutamină (ref: BE12-702F, Lonza) 10% ser fetal bovin (ref: # 3302, Lonza) LL/2 (LLC1) RPMI 1640 conţinând 2 mM L-glutamină (ref: BE12-702F, Lonza) 10% ser fetal bovin (ref: # 3302, Lonza) Hepa1-6 DMEM (ref: 11960-044, Gibco) 10% ser fetal bovin (ref: # 3302, Lonza) 2mM L-glutamină penicilină-streptomicină (Sigma G-6784)

Pentru utilizare experimentală, celulele tumorale aderente au fost detaşate din balonul de cultură printr-un tratament de 5 minute cu tripsină-versene (ref: BE17-161E, Lonza), în mediu Hanks fără calciu sau magneziu (ref: BE10-543F, Lonza) neutralizată prin adăugarea unui mediu de cultură complet. Celulele au fost numărate într-un hemocitometru şi viabilitatea lor va fi evaluată prin analiză de excludere cu albastru de tripan 0,25%.

Utilizarea animalelor

Şoareci femele sănătoşi Balb/C (BALB/cByJ), de greutate şi vârstă împere-cheate, au fost obţinuţi de la CHARLES RIVER (L'Arbresles) pentru modelul experi-mental EMT6.

Şoarecii femele sănătoşi C57BL/6 (C57BL16J), de greutate şi vârstă împere-cheate, femele au fost obţinuţi de la CHARLES RIVER (L'Arbresles) pentru modelele experimentale LL/2 (LLC1) şi Hepa 1-6.

Animalele au fost menţinute în starea de sănătate SPF în conformitate cu indicaţiile FELASA şi au fost urmate procedurile de adăpostire şi experimentare pe animale în conformitate cu Regulamentele franceze şi europene şi Ghidul pentru îngrijirea şi utilizarea animalelor de laborator [76, 77]. Animalele au fost păstrate în încăperi de locuit în condiţii de mediu controlate: Temperatură: 22±2°C, Umiditate 55±10%, Fotoperioadă (12 ore de lumină/12 ore de întuneric), aer filtrat HEPA, 15 schimburi de aer pe oră fără recirculare. Incintele pentru animale au fost prevăzute cu spaţiu steril şi adecvat cu material de aşternut, alimente şi apă, îmbogăţire socială şi de mediu (găzduire în grup) după cum se descrie: colivii de 900 cm2 (ref: green, Tecniplast) în rafturi ventilate, aşternut Epicea (SAFE), dietă iradiată de 10 kGy (A04-10, SAFE).

Design experimental şi tratamente

Activitate antitumorală, modelul EMT6

Schema de tratament - începutul primei administrări a fost considerat Z0. În Z0, şoarecii neintegraţi au fost randomizaţi în funcţie de greutatea lor individuală în grupuri de 9/8 utilizând programul Vivo manager® (Biosystemes, Couternon, Franţa). În Z0, şoarecii au primit vehicul (mediu de cultură) sau tulpină bacteriană. În Z14, toţi şoarecii au fost încorporaţi cu celule tumorale EMT-6 aşa cum se descrie mai jos. În Z24, şoarecii din grupul martor pozitiv au primit tratamente cu anticorpi anti-CTLA-4.

Schema de tratament este rezumată în tabelul de mai jos:

Grup Nr. de animale Tratament Doză Cale Program de tratament 1 8 Netratate - - - 2 8 Vehicul (mediu) - PO Q1D×42 3 9 Tulpina bacteriană # 1 (MRX004) 2×108 bacterii PO Q1D×42 4 8 Anti-CTLA4 10 mg/kg IP TW×2

Monitorizarea animalelor a fost efectuată aşa cum se descrie mai jos.

Inducerea tumorilor EMT6 la animale - În Z14, tumorile au fost induse prin injectare subcutanată de 1x106 celulele EMT-6 în 200 μl RPMI 1640 în flancul drept al şoarecilor.

Eutanasia - Fiecare şoarece a fost eutanasiat când a atins un obiectiv uman aşa cum se descrie mai jos sau după maximum 6 săptămâni de la începerea dozării.

Activitate antitumorală, modelul LL/2 (LLC1)

Schema de tratament - începutul primei administrări a fost considerat Z0. În Z0, şoarecii neintegraţi au fost randomizaţi în funcţie de greutatea individuală a acestora în 7 grupuri de 9/8 folosind programulul Vivo manager® (Biosystemes, Cou-ternon, Franţa). În Z0, şoarecii vor primi vehicul (mediu de cultură) sau tulpină bacte-riană. În Z14, toţi şoarecii au fost încorporaţi cu celule tumorale LL/2 aşa cum se descrie mai jos. În Z27, şoarecii din grupul martor pozitiv au primit tratamente cu anticorpi anti-CTLA-4.

Schema de tratament este rezumată în tabelul de mai jos:

Grup Nr. de animale Tratament Doză Cale Program de tratament 1 8 Netratate - - - 2 9 Vehicul (mediu) - PO Q1D×42 3 9 Tulpina bacteriană # 1 (MRX004) 2×108 bacterii PO Q1D×42 4 8 Anti-CTLA4 10 mg/kg IP TW×2

Monitorizarea animalelor a fost efectuată aşa cum se descrie mai jos.

Inducerea tumorilor LL/2 (LLC1) la animale - În Z14, tumorile au fost induse prin injectare subcutanată de 1×106 LL/2 (LLC1) în 200 μl RPMI 1640 în flancul drept al şoarecilor.

Activitate antitumorală, model Hepa 1-6

Schema de tratament - începutul primei administrări a fost considerat Z0. În Z0, şoarecii neintegraţi au fost randomizaţi în funcţie de greutatea individuală a acestora în 7 grupuri de 9 utilizând programulul Vivo manager® (Biosystemes, Cou-ternon, Franţa). În Z0, şoarecii au primit vehicul (mediu de cultură) sau tulpină bacteriană. În Z14, toţi şoarecii au fost încorporaţi cu celule tumorale Hepa 1-6 aşa cum se descrie mai jos. În Z16, şoarecii din grupul martor pozitiv au primit tratamente cu anticorpi anti-CTLA-4.

Schema de tratament este rezumată în tabelul de mai jos:

Grup Nr. de animale Tratament Doză Cale Program de tratament 1 9 Netratate - - - 2 9 Vehicul (mediu) - PO Q1D×42 4 9 Tulpina bacteriană # 2 (MRX004) 2×108 bacterii PO Q1D×42 7 9 Anti-CTLA4 10 mg/kg IP TW×2

Monitorizarea animalelor a fost efectuată aşa cum se descrie mai jos.

Inducerea ortotopică a celulelor tumorale Hepa 1-6 la animale prin injecţie in-trasplinală - În Z14, un milion (1×106) de celule tumorale Hepa 1-6 în 50 μl de mediu RPMI 1640 au fost transplantate prin injecţie intrasplinală la şoareci. Pe scurt, a fost făcută o mică incizie a flancului subcostal stâng şi splina a fost exteriorizată. Splina a fost expusă pe un tampon de tifon steril şi a fost injectată sub control vizual cu sus-pensia celulară cu un ac de calibrul 27. După inocularea celulară, splina a fost exci-zată.

Eutanasia - Fiecare şoarece a fost eutanasiat când a atins un punct final u-man aşa cum se descrie în secţiunea de mai jos sau după un maxim de 6 săptămâni după începerea dozării.

Evaluarea încărcării tumorale la eutanasie - La momentul terminării, ficatul a fost colectat şi cântărit.

Monitorizarea animalelor

Monitorizare clinică - Lungimea şi lăţimea tumorii au fost măsurate de două ori pe săptămână cu calibre, iar volumul tumorii a fost estimat prin această formulă [78]:

lăţime2 × lungime

Volumul tumorii = ---------------

2

Obiective umane [79]: Semne de durere, suferinţă sau stres: postura de durere, mască de faţă de durere, comportament; Tumora care depăşeşte 10% din greutatea corporală normală, dar care nu depăşeşte 2000 mm3; Tumorile care inter-ferează cu ambulaţia sau cu nutriţia; Tumorile cu ulceraţii sau eroziunea ţesuturilor; % pierdere din masa corporală rămasă timp de 3 zile consecutive; Starea slabă a corpului, emaciare, caşexie, deshidratare; Lipsa prelungită de răspunsuri voluntare la stimuli externi; Respiraţie rapidă, anemie, sângerare semnificativă; Semne neurolo-gice: mers în cerc, convulsii, paralizie; Scăderea susţinută a temperaturii corpului; Distensie abdominală.

Anestezie - Anestezia cu izofluran gazos a fost utilizată pentru toate proce-durile: chirurgie sau inoculare tumorală, injecţii i.v., colectarea de sânge. Anestezia cu ketamină şi xilazină au fost utilizate pentru procedura chirurgicală stereotaxie.

Analgezie - Protocolul analgezic carprofen sau multimodal carprofen/bupre-norfină au fost adaptate la severitatea procedurii chirurgicale. A fost asigurată îngrijire non-farmacologică pentru toate procedurile dureroase. În plus, a fost furni-zată asistenţă farmacologică care nu interferează cu studiile (tratament topic) la recomandarea medicului veterinar participant.

Eutanasie - Eutanasia animalelor a fost efectuată prin supra-dozare cu anes-tezie cu gaz (izofluran) urmată de dislocare cervicală, sau prin exsanguinare.

Rezultate

Activitate antitumorală, modelul EMT6

Rezultatele sunt prezentate în figura 73. Tratamentul cu tulpina bacteriană conform invenţiei a condus la o reducere clară a volumului tumorii relativ la ambii martori negativi. Martorul pozitiv a condus, de asemenea, la o reducere a volumului tumorii, aşa cum ar fi de aşteptat.

Activitate antitumorală, modelul LL/2 (LLC1)

Rezultatele sunt prezentate în figura 74. Martorul negativ şi pozitiv nu apar aşa cum ar fi de aşteptat, deoarece volumul tumorii a fost mai mare la şoarecii trataţi cu martorul pozitiv decât în grupurile martor negativ. Cu toate acestea, volumul tumorii la şoarecii trataţi cu tulpina bacteriană conform invenţiei a fost comparabil cu grupul martor pozitiv, care este în concordanţă cu un efect terapeutic util.

Activitate antitumorală, modelul Hepa 1-6

Rezultatele sunt prezentate în Figura 75. Martorul negativ netratat nu apare aşa cum ar fi de aşteptat, deoarece greutatea ficatului a fost mai mică în acest grup decât în celelalte grupuri. Totuşi, martorul negativ tratat cu vehicul şi grupurile martor pozitiv apar aşa cum este de aşteptat, deoarece şoarecii trataţi cu vehicul în monoterapie au avut ficaţi mai mari decât şoarecii trataţi cu anticorpi anti-CTLA4, reflectând o sarcină mai mare în grupul martor negativ tratat cu vehicul. Tratamentul cu tulpina bacteriană conform invenţiei a condus la o reducere clară a masei ficatului (şi, prin urmare, a încărcării tumorale) faţă de şoarecii din grupul martor negativ, trataţi cu vehicul.

Aceste date indică faptul că tulpina 751/MRX004 poate fi utilă pentru tratarea sau prevenirea cancerului şi, în special, pentru reducerea volumului tumorii în cancerele mamare, pulmonare şi hepatice.

Exemplul 8 - Ataşarea la celulele umane în mediu YCFA

Rezumat

Nivelul de legare a tulpinii 751 şi a unui număr de tulpini de Bifidobacterium breve la celulele umane au fost determinate la 3 puncte de timp distincte în mediul YCFA. Bacteriile ataşate la celulele umane au fost repuse în suspensie în mediu şi apoi a fost analizată densitatea optică a mediului - cu cât densitatea optică este mai mare, cu atât este mai mare numărul de celule bacteriene şi astfel, cu atât este mai mare nivelul de legare a celulelor bacteriene la celulele umane. S-a descoperit că tulpina 751 prezintă o ataşare redusă la celulele umane în comparaţie cu tulpinile de referinţă de Bifidobacterium breve.

Rezultate şi analize

Rezultatele experimentului sunt prezentate în Figura 76.

După cum se arată în figura 76, tulpinile de Bifidobacterium breve prezintă un nivel ridicat de ataşament la celulele umane în toate momentele de timp. Pe de altă parte, tulpina 751 are un nivel drastic redus de ataşare la celulele umane. Prin urma-re, aderenţa scăzută la celulele umane din tulpina 751 poate creşte efectul benefic al compoziţiilor din invenţie asupra IL-17 sau căii Th17 şi asupra bolilor mediate de către IL-17 sau calea Th17.

Exemplul 9 - Analiza de detecţie a producţiei de exopolizaharide

Rezumat

Nivelul producţiei de exopolizaharidă (EPS) de către tulpina bacteriană con-form invenţiei (751) şi un număr de tulpini de Bifidobacterium breve au fost analizate la temperatura de 37°C timp de 48 de ore şi la temperatura de 30°C timp de 72 de ore. EPS-urile sunt polizaharide produse de anumite bacterii care se leagă de supra-faţa exterioară a celulei bacteriene. Nivelul EPS-urilor de pe suprafaţa bacteriilor poate fi determinat folosind un test cu roşu de Congo care se leagă de polizaharide. O intensitate mai mare a absorbanţei roşului de Congo indică o concentraţie mai mare de EPS pe suprafaţa bacteriilor. S-a descoperit că tulpina bacteriană conform invenţiei produce şi leagă mai multe EPS-uri decât tulpinile de Bifidobacterium breve.

Rezultate şi analize

Rezultatele acestui experiment sunt prezentate în Figura 77.

Aşa cum se arată în Figura 77, tulpina bacteriană conform invenţiei a prezentat o absorbţie mai mare a roşului de Congo decât tulpinile de Bifidobacterium breve la ambele temperaturi şi puncte de timp. Prin urmare, tulpina conform invenţiei prezintă o producţie mai mare de EPS şi un nivel mai mare de EPS-uri legate extracelular. Deoarece EPS-urile permit bacteriilor să se lege de mucus şi celulele epiteliale, tulpina bacteriană a invenţiei poate fi utilă pentru a concura cu celulele patogene pentru situsurie de legare pe celule epiteliale şi în membranele mucoase. Astfel, tulpina bacteriană a invenţiei poate fi utilă pentru modularea microbiomului şi pentru tratarea unui număr de boli asociate cu microbiomul.

Exemplul 10 - Testarea stabilităţii

O compoziţie descrisă aici care conţine cel puţin o tulpină bacteriană descrisă aici este depozitată într-un container etanş la temperatura de 25°C sau 4°C şi reci-pientul este plasat într-o atmosferă având 30%, 40%, 50%, 60%, 70% 75%, 80%, 90% sau 95% umiditate relativă. După 1 lună, 2 luni, 3 luni, 6 luni, 1 an, 1,5 ani, 2 ani, 2,5 ani sau 3 ani, trebuie să rămână cel puţin 50%, 60%, 70%, 80% sau 90% din tulpina bacteriană măsurată în unităţi formatoare de colonii, determinate prin proto-coale standard.

Exemplul 11 - Analiza producţiei de exopolizaharidă legată şi eliberată de MRX004

Pentru extracţia EPS, MRX004 a fost cultivată în 10 ml de YCFA până când a atins faza exponenţială târzie, când celulele bacteriene au fost separate de superna-tanţi prin centrifugare. Celulele au fost spălate o dată cu PBS pentru a îndepărta orice mediu de cultură rămas. EPS izolate sau eliberate (EPS-R) au fost precipitate din supernatanţii de cultură prin tratare cu etanol 100% rece pe gheaţă (peste noapte la temperatura de 4°C cu agitare uşoară). Pentru a extrage EPS (EPS-B) capsular sau legat, celulele au fost incubate cu EDTA 0,05 M (peste noapte la 4°C cu agitare uşoară) şi supernatanţii din acest tratament au fost colectaţi şi apoi trataţi cu 100% etanol răcit cu gheaţă (peste noapte la temperatura de 4°C cu agitare uşoară) pentru a precipita EPS-B. EPS-B şi EPS-R precipitate au fost peletate prin centrifugare şi au fost lăsate să se usuce pentru scurt timp într-o hota laminară înainte de a fi repuse în suspensie în suficientă apă sterilă Ultrapure pentru a obţine o soluţie uniformă. Pentru purificarea suplimentară a eşantioanelor, acestea au fost dializate împotriva apei Ultrapure sterile la un raport de 1:100 timp de 48 ore cu 3 modificări de tampon. EPS-B şi EPS-R au fost cuantificate folosind metoda acidului fenol-sulfuric utilizând glucoza ca standard. Folosind această analiză, s-a găsit că MRX004 produce o can-titate mai mare de EPS-R (115 μg) decât EPS-B (17 μg) (Figura 78).

Exemplul 12 - Testul de ataşare al MRX004 la celulele Caco-2

Ataşarea MRX004 la celulele gazdă a fost analizată utilizând un test in vitro de co-cultură cu celule epiteliale intestinale Caco-2. Celulele Caco-2 au fost însă-mânţate la o densitate de 1 × 10. Bacteriile au fost cultivate în 10 ml YCFA până când au atins faza exponenţială târzie, când au fost peletizate, spălate de două ori cu PBS şi repuse în suspensie în mediu de cultură celulară fără antibiotice. Densitatea bacteriană a fost ajustată pentru a obţine o multiplicitate aproximativă de infecţie (MOI) de 10:1 (care a fost confirmată prin placare pe agar YCFA utilizând protocolul standard WASP) şi MRX004 a fost co-incubat cu celulele Caco-2 în condiţii anaerobe la temperatura de 37°C timp de 2 ore. Mediul a fost apoi îndepărtat şi bacteriile nelegate au fost îndepărtate prin spălarea celulelor Caco-2 de trei ori cu PBS. Celu-lele Caco-2 legate de celulele bacteriene au fost lizate şi îndepărtate din vas utilizând tratamentul cu 0,1% Triton X-100 şi un volum de 50 μl de lizat diluat a fost placat în agar YCFA folosind WASP. Ataşamentul a fost calculat prin numărarea numărului de bacterii recuperate din lizat şi exprimându-le ca procent din bacteriile totale. S-a con-statat că MRX004 prezintă aderenţă scăzută (0,3% din cultura totală) la celulele Caco-2 (Figura 79).

Exemplul 13 - Caracterizarea activităţii enzimatice

Sistemul de testare a indicelui de profil analitic (API®) constă din benzi care conţin teste biochimice miniaturizate care testează activitatea enzimatică în speciile bacteriene. MRX004 (tulpina 751, bacteria depusă sub numărul de acces NCIMB 42380) a fost caracterizată utilizând două sisteme de testare API: Rapid ID 32A - acest sistem este proiectat special pentru specii anaerobe şi cuprinde teste pentru metabolismul carbohidraţilor, aminoacizilor şi nitraţilor, precum şi de activitate pentru fosfataza alcalină; şi API® 50 CH - acest sistem testează fermentarea a 49 surse de carbohidraţi şi poate fi utilizat împreună cu API® CHL Medium pentru analiza spe-ciilor anaerobe.

Testarea Rapid ID 32A a fost efectuată pe colonii bacteriene conform instruc-ţiunilor producătorului. Pe scurt, bacteriile au fost cultivate pe agar YCFA timp de 24 de ore la temperatura de 37°C într-o staţie de lucru anaerobă. Coloniile au fost îndepărtate de pe plăci utilizând o buclă sterilă de 5 μl de inoculare şi au fost repuse în suspensie într-o fiolă de 2 ml de API® Suspension Medium până când a fost obţinută o densitate aproximativ echivalentă cu cea a standardului McFarland nr. 4. Cincizeci şi cinci de microlitri de suspensie bacteriană au fost adăugaţi la fiecare alveolă pe o bandă Rapid ID 32A, iar testul de urează a fost suprapus cu două picături de ulei mineral. Benzi au fost acoperite cu un capac din plastic şi incubate aerobic la temperatura de 37°C timp de 4 ore, după care s-a developat rândul de jos de alveole utilizând reactivii următori: NIT: câte 1 picătură din fiecare dintre NIT1 şi NIT2; IND: 1 picătură de reactiv James; toate alveolele rămase: 1 picătură de reactiv FastBlue. Benzile au fost incubate la temperatura camerei timp de 5 minute, după care a fost înregistrată culoarea fiecărei alveole şi i s-a atribuit o valoare negativă, intermediară pozitivă sau pozitivă.

Rezultatele analizei Rapid ID 32A sunt prezentate în Figura 80. MRX004 a testat pozitiv pentru fermentarea mai multor surse de carbohidraţi, şi anume α-galactozidază şi β-galactozidază, α-glucozidază şi β-glucozidază, α-arabinoză, ma-noză şi rafinoză precum şi aminoacizii arginină, prolină, fenilalanină, leucină, tirozină, glicină şi histidină. Interesant, au fost raportate roluri pentru unii dintre aceşti amino-acizi în astm. De exemplu, concentraţiile plasmatice crescute de fenilalanină şi histi-dină au fost raportate ca fiind asociate cu efecte adverse în astm, incluzând infla-maţia crescută, producţia de histamină şi hipersensibilitatea căilor respiratorii. În plus, metabolismul argininei este implicat în patogeneza astmului bronşic, dat fiind că s-au raportat niveluri crescute ale metabolitului argininei L-ornitină la pacienţii pediatrici şi administrarea de arginină a atenuat inflamaţia într-un model de astm in vivo. Pe baza acestor rapoarte, este posibil ca metabolismul aminoacidului prin MRX004 să fie im-plicat în efectele anti-astm ale acestei tulpini.

S-a efectuat o analiză comparativă Rapid ID 32A între MRX004 şi patru tulpini de tipuri de B. breve , care sunt notate în Figura 80B ca Bif Ref 1 (DSM 20091), Bif Ref 2 (DSM 20213), Bif Ref 6 (JCM 7017) şi Bif Ref 7 (UCC2003). Această analiză a demonstrat că MRX004 a fost singura tulpină testată pentru fermentarea polizahari-dei rafinoză, care poate fi semnificativă, deoarece rafinoza este implicată în produ-cerea de componente bacteriene cum ar fi exopolizaharidele, iar fermentaţia de rafi-noză poate conferi, de asemenea, efecte asupra gazdei, cum ar fi un butirat cecal crescut, proliferarea gastrointestinală crescută şi pierderea în greutate.

API® 50 CH a fost efectuată pentru a examina în continuare metabolismul carbohidraţilor, asupra MRX004. Conform instrucţiunilor producătorului, bacteriile au fost cultivate în bulion de 10 ml YCFA timp de 16-18 ore la temperatura de 37°C într-o staţie de lucru anaerobă. Această cultură a fost diluată în 10 ml mediu API® CHL astfel încât să se obţină o densitate aproximativ echivalentă cu standardul McFarland nr. 2 şi 110 μl din acest amestec au fost utilizate pentru inocularea fiecărei alveole de pe un set de benzi de test API® 50 CH. Benzile de test au fost incubate într-o cutie de incubaţie umidificată la temperatura de 37°C într-o staţie de lucru anaerobă timp de 48 de ore, după care a fost înregistrată culoarea fiecărei alveole şi i s-a atribuit o valoare negativă, intermediară pozitivă, pozitivă sau incertă.

Folosind API® 50, MRX004 a testat pozitiv pentru utilizarea următoarelor surse de carbohidraţi: amidon, amigdalină, arbutină, celobioză, esculină, galactoză, gentiobioză, glucoză, glicogen, fructoză, fucoză, lactoză, maltoză, manoză, manitol, melibioză, melezitoză, metil α-D-glucopiranozidă, N-acetilglucozamină, riboză, za-haroză, salicină, sorbitol, trehaloză, turanoză şi xilitol. Aceste rezultate s-au corelat cu cele obţinute pentru testarea Rapid ID 32A prin faptul că MRX004 a demonstrat fermentarea galactozei, a glucozei, a manozei şi a rafinozei în ambele sisteme de test. Interesant este faptul că unele substraturi de carbohidraţi MRX004, şi anume galactoza şi fructoza, pot fi implicate în mecanismul de acţiune al acestei tulpini, pe baza efectelor raportate în literatură. Galactoza α-1,3-galactoză derivată din surse de carne este un alergen cunoscut şi un agent cauzator de anafilaxie, iar nivelurile de consum ale fructozei dietetice sunt corelate cu severitatea crescută a astmului. Luate împreună, aceste două seturi de date API pentru MRX004 sugerează că meta-bolizarea acestei tulpini poate juca un rol în efectele sale anti-astm.

Exemplul 14 - Analiza genomului

O comparaţie a conţinutului de genom al tulpinii MRX004 şi a tulpinilor de referinţă de B. breve, 1, 2, 6 şi 7 a fost efectuată utilizând blastn ca parte a suitei de programe BLAST + 2.3.0. Un scor limită de valoare E de 10E-5 a fost utilizat pe parcursul analizei.

Au fost identificate 333 de gene (Tabelul 1) care sunt prezente în genomul tulpinii MRX004, dar sunt absente din tulpinile B. breve de referinţă 1 (DSM 20091), 2 (DSM 20213), 6 (JCM 7017) şi 7 (UCC2003). Multe dintre genele enumerate în Tabelul 1 sunt frecvent observate ca fiind hipervariabile printre tulpinile de B. breve [80]. Aşa cum era de aşteptat, regiunile de variabilitate includ genele care codează proteinele implicate în metabolismul şi transportul carbohidraţilor, genele asociate bacteriofagilor, elementele mobile, precum şi 173 de gene care sunt prezise ca codând proteine sau gene cu funcţie necunoscută.

Genele care sunt prezente în MRX004 dar absente de la tulpinile de referinţă B. breve 1, 2, 6 şi 7 sunt enumerate în Tabelul 1. Genele care nu sunt evidenţiate lipsesc în mai mult de una din cele patru tulpini de referinţă. Numărul mare de gene care sunt prezente în MRX004 dar nu sunt prezente în numeroase tulpini de referinţă B. breve sugerează că MRX004 este distinct de şi/sau distins de aceste tulpini de B. breve. Genele evidenţiate cu sublinieri simple sunt prezente în MRX004 dar absente în tulpina de referinţă B. breve 1. Genele evidenţiate cu sublinieri duble şi cu caractere aldine sunt prezente în MRX004 dar absente în tulpina de referinţă B. breve 2. Genele evidenţiate cu italice sunt prezente în MRX004 dar absente în tulpina de referinţă B. breve 6. Pentru analiza blastnică s-a folosit un scor maxim de decuplare a valorii E de 10E-5.

Tabelul 1

4DBb_0021c Transportorul ABC pentru zaharuri multiple, proteină care se leagă la substrat 4DBb_0023 Probabil regulator transcripţional tip LacI 4DBb_0024 Zaharoză-6-fosfat hidrolază (EC 3.2.1.B3) 4DBb_0026c Maltodextrină glucozidază (EC 3.2.1.20) 4DBb_0036c Proteină ipotetică 4DBb_0038c Proteină de reglare a operonului MSM (metabolism al zaharurilor multiple) 4DBb_0119c Proteină ipotetică 4DBb_0120c Proteină ipotetică 4DBb_0187 Proteină ipotetică 4DBb_0188 Proteină ipotetică 4DBb_0203c Proteină de diviziune celulară FtsL 4DBb_0204c Proteină ipotetică 4DBb_0205c Proteină ipotetică 4DBb_0206c Regulator transcripţional, familia HxlR 4DBb_0207 NADH-flavin reductaza legată de Rrf2 4DBb_0208 Proteina asociată cu RecG a helicazei ADN dependentă de ATP 4DBb_0209c Proteină ipotetică 4DBb_0210 Transportator prezumtiv 4DBb_0211 Omega-3 subunitatea acizilor graşi polinesaturaţi, PfaA 4DBb_0212 Polichetidă sintaza de tip I 4DBb_0213c Proteină ipotetică 4DBb_0214c Proteină ipotetică 4DBb_0215 Proteină ipotetică 4DBb_0216c Proteină ipotetică conservată 4DBb_0218c Proteină ipotetică 4DBb_0219c ADN-citozin metiltransferază 4DBb_0220c Proteină ipotetică 4DBb_0221c Proteină ipotetică 4DBb_0222c Proteină ipotetică 4DBb_0223c integrază 4DBb_0256 Proteină ipotetică 4DBb_0257c Regulator de transcripţie de tip Lacl 4DBb_0258 Glicozil hidrolază prezumtivă având funcţie necunoscută (DUF1680) 4DBb_0284 Regulator transcripţional, familia AraC 4DBb_0285 Sistemul de transport ABC N-acetil-D-glucozamină, proteina care se leagă la zahar 4DBb_0286 Transportator ABC permează al zaharului 4DBb_0287 ABC Sistemul de transport N-acetil-D-glucozamină, proteina permează 2 4DBb_0288 Alfa-galactozidaza (EC 3.2.1.22) 4DBb_0329c Componenta ATPazei BioM a modulului de energizare a transporta-torului ECF al biotinei 4DBb_0330 Moderatorul major al superfamiliei MFS_1 4DBb_0368 GMP sintetaza [care hidrolizează glutamina] (EC 6.3.5.2) 4DBb_0369c Proteina profag gp29 similară mu 4DBb_0410 Galactozidază prezumtivă 4DBb_0419 Proteină ipotetică 4DBb_0421 Glicoziltransferază SypP 4DBb_0422 Proteina biosintezei polizaharidei capsulare 4DBb_0423 Proteină ipotetică 4DBb_0424 Glicoziltransferază 4DBb_0425 Proteina membranară implicată în exportul de antigen O, acizi lipoteichoici ai acidului teichoic 4DBb_0426 Glicoziltransferază (EC 2.4.1.-) 4DBb_0427 Sintaza acidului 2-succinil-5-enolpiruvil-6-hidroxi-3-ciclohexen-1-carboxilic (EC 2.2.1.9) 4DBb_0428 Proteină ipotetică 4DBb_0429 Proteină element mobil 4DBb_0430 Proteină ipotetică 4DBb_0431c Proteină ipotetică 4DBb_0432c Proteină element mobil 4DBb_0433c Proteină ipotetică 4DBb_0434c Proteină ipotetică 4DBb_0435 Proteină ipotetică 4DBb_0436 Proteină ipotetică 4DBb_0437c Proteină ipotetică 4DBb_0438c Proteină element mobil 4DBb_0439c Proteină ipotetică 4DBb_0440c Proteină element mobil 4DBB_0518c Proteină domeniu PIN 4DBb_0519c Proteină ipotetică 4DBb_0555c Proteină ipotetică 4DBb_0556c Proteină ipotetică 4DBb_0557c Proteină ribozomală LSU L31p @ proteină ribozomală LSU L31p, independentă de zinc 4DBb_0558c Proteină ribozomală SSU S14p (S29e) @ proteină ribozomală SSU S14p (S29e), independentă de zinc 4DBb_0559c Proteină ribozomală LSU L33p @ proteină ribozomală LSU L33p, independentă de zinc 4DBb_0560c Proteină ipotetică 4DBb_0561 Proteină ipotetică 4DBb_0613c Sintzza celulozică (formatoare UDP) (EC 2.4.1.12) 4DBb_0614 Chitinază (EC 3.2.1.14) 4DBb_0615 Casetă senzorială/proteină din familie GGDEF 4DBb_0660 Proteină element mobil 4DBb_0662 Proteină element mobil 4DBb_0663c Neuraminidază NanP 4DBb_0664 Proteină ipotetică 4DBb_0665 Proteină ipotetică 4DBb_0666 Proteină element mobil 4DBb_0667 Proteină element mobil 4DBb_0668 Proteină element mobil 4DBb_0718 Proteină prezumtivă reglatoare a biotinei (familia GntR) 4DBb_0719 Proteină ipotetică 4DBb_0720 Proteină ipotetică 4DBb_0778 Proteină ipotetică 4DBb_0789c Proteină element mobil 4DBb_0790c Proteină element mobil 4DBb_0837c Proteină membranară integrată posibil conservată 4DBb_0840 Proteină de eflux al macrolidelor 4DBb_0866 ATPază transportatoare de cationi, familia E1-E2 4DBb_0867 Proteină ipotetică 4DBb_0872 Proteină ipotetică 4DBb_0879c Regulator transcripţional, familiq Cro/CI 4DBb_0880c Proteină membranară integrată 4DBb_0946 Transportator MFS general de substrat 4DBb_0947c Proteina membranară prezumtivă 4DBb_0948c Proteine element mobil 4DBb_0952c Proteină ipotetică 4DBb_0953 Proteină ipotetică 4DBb_0954c Proteină ipotetică 4DBb_0955c Proteină ipotetică 4DBb_0956c Permeaze prevăzute 4DBb_0957 Proteină ipotetică conservată îndeaproape 4DBb_0958c Proteină ipotetică conservată 4DBb_0986c Proteină ipotetică 4DBb_0987c Componenta ATPază duplicată BL0693 a modulului de energizare a transportorului ECF prezumtiv 4DBb_0988c Componenta transmembranară BL0694 a modulului de energizare a transportorului ECF prezumtiv 4DBb_1009c Holină de bacteriofag 4DBb_1010c Precursorul transglicozilazei D murine litice legat de membrană (EC 3.2.1.-) 4DBb_1011c Proteină ipotetică 4DBb_1012 Proteină ipotetică 4DBb_1013c Proteină ipotetică 4DBb_1014c Proteină ipotetică 4DBb_1015c Proteină ipotetică 4DBb_1016c Proteină ipotetică 4DBb_1017c Proteină de coadă a bacteriofagului 4DBb_1018c Proteină care măsoară lungimea cozii bacteriofagului 4DBb_1019c Proteină ipotetică 4DBb_1020c Proteină ipotetică 4DBb_1021c Proteină ipotetică 4DBb_1022c Proteină ipotetică 4DBb_1023c Proteină ipotetică 4DBb_1024c Proteină ipotetică 4DBb_1025c Proteină ipotetică 4DBb_1026c Proteină ipotetică 4DBb_1027c Proteină ipotetică 4DBb_1028c Proteină ipotetică 4DBb_1029c Proteină ipotetică 4DBb_1030c Proteina de bacteriofag 4DBb_1031c Terminază a bacteriofagului, subunitatea mare # Pham2 4DBb_1032c Terminază a bacteriofagului, subunitatea mare 4DBb_1033c Proteină ipotetică 4DBb_1034 Proteină ipotetică 4DBb_1035 Proteină ipotetică 4DBb_1036c FIG00424913: proteină ipotetică 4DBb_1037c Proteină ipotetică 4DBb_1038c Proteină ipotetică 4DBb_1039c Proteină ipotetică 4DBb_1040c Proteină ipotetică 4DBb_1041c Proteină ipotetică 4DBb_1042c Proteină ipotetică 4DBb_1043c Proteină ipotetică 4DBb_1044c Proteină ipotetică 4DBb_1045c Proteină ipotetică 4DBb_1046c Proteină ipotetică 4DBb_1047c Proteină de separare a cromozomilor (plasmidei) ParB 4DBb_1048c Proteină ipotetică 4DBb_1049c Proteină ipotetică 4DBb_1050c Proteină de legare a AND-ului monocatenar 4DBb_1051c Proteină ipotetică 4DBb_1052c Proteină ipotetică 4DBb_1053c Proteină ipotetică 4DBb_1054c Proteină ipotetică 4DBb_1055c Proteină ipotetică 4DBb_1056 Proteină ipotetică 4DBb_1057c Proteină ipotetică 4DBb_1058c Proteină ipotetică 4DBb_1059 Proteină ipotetică 4DBb_1060 Proteină ipotetică 4DBb_1061 Proteină ipotetică 4DBb_1062c Proteină ipotetică 4DBb_1063c Proteină ipotetică 4DBb_1064 Integraza de bacteriofagi prezumtivă 4DBb_1113 Permeazele superfamiliei de facilitatori majori 4DBb_1142 Proteină ipotetică 4DBb_1143c Proteină ipotetică 4DBb_1172 Integraza 4DBb_1173c Proteină ipotetică 4DBb_1174c Proteină ipotetică conservată îndeaproape 4DBb_1175 Proteină ipotetică 4DBb_1176c Proteină ipotetică 4DBb_1177 Transportator ABC, proteină de legare la ATP 4DBb_1178 Proteină ipotetică 4DBb_1179 Proteină ipotetică 4DBb_1180 Proteină ipotetică 4DBb_1181 Proteină ipotetică 4DBb_1182 Kinază senzorială de sistem cu două componente 4DBb_1183 Proteină ipotetică 4DBb_1203c Proteină regulatoare, LacI 4DBb_1204c FIG. 01131316: proteină ipotetică 4DBb_1205c Permează sistem de transport 4DBb_1206c Sistemul de transport ABC al oligozaharidei rhamnoză preconizat, componenta permează 2 4DBb_1207c Proteină de legare a solutului extracelular, familia 1 4DBb_1212c Proteină ipotetică 4DBb_1213c Proteină ipotetică 4DBb_1214 Proteină element mobil 4DBb_1215 Proteină element mobil 4DBb_1219 Proteină ipotetică 4DBb_1220c Proteinele ipotetice, 4DBb_1221c Proteină cu funcţie necunoscută din familia DUF262 4DBb_1222c Proteină ipotetică 4DBb_1223 Proteină ipotetică 4DBb_1224 Proteină element mobil 4DBb_1234c Sistem de transport de zahăr tip ABC, componenta periplasmică 4DBb_1235 Proteină ipotetică 4DBb_1328c Integrază de bacteriofag prezumtivă 4DBb_1329 Proteină ipotetică 4DBb_1330 Proteină ipotetică 4DBb_1331c Proteină ipotetică 4DBb_1332 Proteină ipotetică 4DBb_1333 Proteină ipotetică 4DBb_1334 Proteină ipotetică 4DBb_1335c Proteină ipotetică 4DBb_1336c Regulator negativ al expresiei beta-lactamazei 4DBb_1337c Proteină ipotetică 4DBb_1338c Proteină ipotetică 4DBb_1339c Proteină ipotetică 4DBb_1340c Proteină ipotetică 4DBb_1341c Proteină ipotetică 4DBb_1342c Proteină ipotetică 4DBb_1343c Proteină ipotetică 4DBb_1344 Proteină ipotetică 4DBb_345c Proteină a fibrei de coadă a bacteriofagilor 4DBb_1346c Proteină ipotetică 4DBb_1347c Proteină coadă minoră a bacteriofagilor 4DBb_1348c Proteină ipotetică 4DBb_1349c Proteină ipotetică 4DBb_1350c Proteină de bacteriofag 4DBb_1351c Proteină de bacteriofag 4DBb_1352c Proteină de bacteriofag 4DBb_1353c Proteină de bacteriofag 4DBb_1354c Proteină ipotetică 4DBb_1355c Proteină ipotetică 4DBb_1356c Proteină capsidă majoră de bacteriofag fagă # Fam0025 # Pham164 4DBb_1357c Protează prohead de bacteriofag prezumtivă 4DBb_1358c Proteină portal de bacteriofag 4DBb_1359c gp2, terminază 4DBb_1360c Proteină ipotetică 4DBb_1361c Proteină ipotetică 4DBb_1362c Proteină ipotetică 4DBb_1363c Proteină ipotetică 4DBb_1364c Proteină ipotetică 4DBb_1365c Proteină ipotetică 4DBb_1366c Proteină ipotetică 4DBb_1367c Proteină ipotetică 4DBb_1368c Proteină ipotetică 4DBb_1369c Proteină ipotetică 4DBb_1370c Proteină ipotetică 4DBb_1371c Proteină ipotetică 4DBb_1372c Proteină de legare a AND-ului monocatenar 4DBb_1373c Proteină ipotetică 4DBb_1374c Proteină de reparare a AND-ului recombinant RecT (asociată cu profagul) 4DBb_1375c Proteină asociată cu bacteriofagul 4DBb_1376c Proteină ipotetică 4DBb_1377c Proteină ipotetică 4DBb_1378c Proteină ipotetică 4DBb_1379c Proteină ipotetică 4DBb_1380c Metiltransferază (EC 2.1.1.-) 4DBb_1381c Proteină ipotetică 4DBb_1382c Proteină ipotetică 4DBb_1383c Proteină ipotetică 4DBb_1384 Proteină ipotetică 4DBb_1385 Proteină ipotetică 4DBb_1386 Proteină ipotetică 4DBb_1387 Proteină ipotetică 4DBb_1388 Proteină ipotetică 4DBb_1456 Zaharoză permează, superfamilia facilitatorului major 4DBb_1486c Esterază/lipază 4DBb_1487c Glucoză/manoză: H+ simporter GlcP 4DBb_1488c Regulator de răspuns cu două componente yesN 4DBB_1533c Proteină ipotetică 4DBb_1534c Proteină ipotetică 4DBb_1535c Sistem de modificare-restricţie de tip I, subunitatea de restricţie R (EC 3.1.21.3) 4DBb_1536c Helicază ADN dependentă de ATP recG (EC 3.6.1.-) 4DBb_1537c Sistem de modificare-restricţie de tip I, subunitatea de specificitate S (EC 3.1.21.3) 4DBb_1538c Sistem de modificare-restricţie de tip I, subunitatea M a ADN-metiltransferazei (EC 2.1.1.72) 4DBb_1539c Proteină ipotetică 4DBb_1540 Sistem de modificare-restricţie de tip I, subunitatea de specificitate S (EC 3.1.21.3) 4DBb_1541 Integrază 4DBb_1542c Sistem de modificare-restricţie de tip I, subunitatea de specificitate S (EC 3.1.21.3) 4DBb_1545c Sistem de transport ABC al ribozei, permează de înaltă afinitate RbsD (TC 3.A.1.2.1) 4DBb_1546c Sistem de transport ABC al ribozei, proteina de legare a ribozei periplasmice RbsB (TC 3.A. 1.2.1) 4DBB_1547c Sistem de transport ABC al ribozei, proteina permează RbsC (TC 3.A.1.2.1) 4DBB_1548c Sistem de transport ABC al ribozei, proteină RbsA care leagă ATP-ul (TC 3.A.1.2.1) 4DBB_1550c Proteină ipotetică 4DBB_1551 Proteină ipotetică 4DBB_1552c Regulatorul de transcripţie de tip Lacl 4DBb_1553c Similară cu proteina rezistenţei la tetraciclină 4DBb_1554c Ribokinază (EC 2.7.1.15) 4DBb_1555c Butanol dehidrogenază A dependentă de NADH (EC 1.1.1.-) 4DBb_1556c Fosfoglicolat fosfatază (EC 3.1.3.18) 4DBb_1557c Nucleozida hidrolază preferând inozin-uridina (EC 3.2.2.1) 4DBb_1558c Fructokinază (EC 2.7.1.4) 4DBb_1559c Fosforibozilantranilat izomerază (EC 5.3.1.24) 4DBb_1560c Componenta ATPase STY3233 a modulului de energizare a transportorului ECF reglat cu queuozină 4DBb_1561c Componenta ATPase a modulului general de energizare a transportatorilor ECF 4DBb_1562c Componenta transmembranară STY3231 a modulului de energizare a transportorului ECF reglat cu queuozină 4DBb_1563c Componenta specifică substratului STY3230 a transportorului ECF reglat cu queuozină 4DBb_1564 Zahar kinază ipotetică în cluster cu familia de kinaze indigoidină sin-tază indA, PfkB 4DBb_1569 Regulator transcripţional, familia TetR 4DBb_1570c Esterază/lipază 4DBb_1571c Proteină ipotetică 4DBb_1572c Proteină ipotetică 4DBb_1573 COG1309: Regulator transcripţional 4DBb_1574c Proteină ipotetică 4DBb_1578c Proteină purtătoare de melibioză 4DBb_1579c Proteină ipotetică 4DBb_1580c Regulator transcripţional, familia TetR 4DBb_1581 Proteină ipotetică 4DBb_1582 Regulator de răspuns cu două componente colocalizat cu transportorul HrtAB 4DBb_1583 Proteină ipotetică 4DBb_1584c Proteină ipotetică 4DBb_1585 Histidinkinază senzorială 4DBb_1586 Proteina C ATPază de transport al Mg(2+) 4DBb_1587 Reglator transcripţional, familia AbrB 4DBb_1588 Proteină ipotetică 4DBb_1620c Oligoribonuclează 3'-la-5' (orn) 4DBb_1769c Activator transcripţional MltR 4DBb_1770c Xilitol dehidrogenază (EC 1.1.1.9) 4DBb_1771c 4DBb_1773c Proteină din familia glioxalază 4DBb_1774c Transportator de ribitol/xilitol/arabitol, superfamilia MFS 4DBb_1775c Sorbitol dehidrogenază (EC 1.1.1.14) 4DBb_1926c Proteina membranară, legată de proteina Actinobacillus (1944168) 4DBb_1928c Glicozil transferază, proteina din familia grupei 2 4DBb_1929c Proteină de legare ATP de export al acidului teichoic TagH (EC 3.6.3.40) 4DBb_1930c Permează de translocare a polizaharidelor conţinând ramnoză 4DBb_1934c Proteină ipotetică 4DBb_1935 Glicoziltransferază posibilă 4DBb_1936c Proteina din familia ancorei suprafaţei peretelui celular 4DBb_1937c D-alanil-D-alanină carboxipeptidază (EC 3.4.16.4) 4DBb_1965 Proteină ipotetică 4DBb_2010c Proteină element mobil 4DBb_2011 Reglator de transcripţie, familia LacI 4DBb_2012 Transportator ABC de xiloză, proteina XylF care leagă xiloza periplasmică 4DBb_2013 Sistem de transport ABC al ribozei, proteina RbsA care se leagă la ATP (TC 3.A. 1.2.1) 4DBb_2014 Sistem de transport ABC al ribozei, proteina permează RbsC (TC 3.A.1.2.1) 4DBb_2015 Proteină ipotetică 4DBb_2016 Proteină element mobil 4DBb_2028c Beta-glucozidază (EC 3.2.1.21)

Secvenţe

SEQ ID NO: 1 (secvenţa consensuală 16S rRNA pentru tulpina 751)

SEQ ID NO: 2 (secvenţa genomului tulpinii 751) - vezi lista electronică a sec-venţelor din PCT/GB2016/051776

REFERINŢE

[1] Spor şi colab. (2011) Nat Rev Microbiol. 9 (4): 279-90.

[2] Eckburg şi colab. (2005) Science, 10; 308 (5728): 1635-8.

[3] Macpherson şi colab. (2001) Microbes Infect. 3 (12): 1021-1035

[4] Macpherson şi colab. (2002) Cell Mol Life Sci. 59 (12): 2088-96.

[5] Mazmanian şi colab. (2005) Cell 15; 122 (1): 107-18.

[6] Frank şi colab. (2007) PNAS 104 (34): 13780-5.

[7] Scanlan şi colab. (2006) J Clin Microbiol. 44 (11): 3980-8.

[8] Kang şi colab. (2010) Inflamm Bowel Dis. 16 (12): 2034-42.

[9] Machiels şi colab. (2013) Gut. 63 (8): 1275-1283.

[10] WO 2013/050792

[11] WO 03/046580

[12] WO 2013/008039

[13] WO 2014/167338

[14] Goldin şi Gorbach (2008) Clin Infect Dis. 46 Suppl 2: S96-100.

[15] Azad şi colab. (2013) BMJ. 347: f6471.

[16] Masco şi colab. (2003) Systematic and Applied Microbiology, 26: 557-563.

[17] Srůtková şi colab. (2011) J. Microbiol. Methods, 87 (1): 10-6.

[18] Ye şi colab. (2015) PLoSOne. 10 (1): e0117704.

[19] Fabro şi colab. (2015) Immunobiology. 220 (1): 124-35.

[20] Yin şi colab. (2014) Immunogenetics. 66 (3): 215-8.

[21] Cheluvappa şi colab. (2014) Clin Exp Immunol. 175 (2): 316-22.

[22] Schieck şi colab. (2014) J Allergy Clin Immunol. 133 (3): 888-91.

[23] Balato şi colab. (2014) J Eur Acad Dermatol Venereol. 28 (8): 1016-1024.

[24] Monteleone şi colab. (2011) BMC Medicine. 2011, 9:122.

[25] Fahy (2009) Proc Am Thorac Soc. 6.256-259

[51] Miyamoto-Shinohara şi colab. (2008) J. Gen. Appl. Microbiol., 54, 9-24.

[52] „Cryopreservation and Freeze-Drying Protocols«, editată de către Day şi McLellan, Humana Press.

[53] Leslie şi colab. (1995) Appl. Environ. Microbiol. 61, 3592-3597.

[54] Mitropoulou şi colab. (2013) J Nutr Metab. (2013) 716861.

[55] Kailasapathy şi colab. (2002) Curr Issues Intest Microbiol. 3 (2): 39-48.

[56] „Handbook of Pharmaceutical Excipients«, ediţia a doua, (1994), editată de A Wade şi PJ Weller

[57] „Remington's Pharmaceutical Sciences«, Mack Publishing Co. (A. R. Gen-naro editor, 1985)

[58] „Handbook of Microbiological Media«, ediţia a patra (2010) Ronald Atlas, CRC Press.

[59] „Maintaining Cultures for Biotechnology and Industry« (1996) Jennie C. Hunter-Cevera, Academic Press

[60] Strobel (2009) Methods Mol Biol. 581: 247-61.

[61] Gennaro (2000) „Remington: The Science and Practice of Pharmacy«, ediţia a XX-a, ISBN: 0683306472.

[62] „Molecular Biology Techniques: An Intensive Laboratory Course«, (Ream şi colab., editori, 1998, Academic Press).

[63] „Methods In Enzymology« (S. Colowick şi N. Kaplan, editori, Academic Press, Inc.)

[64] „Handbook of Immunology Experimental«, Vol. I-IV (D. M. Weir şi C. C. Blackwell, editori, 1986, Blackwell Scientific Publications)

[65] Sambrook şi colab. (2001) „Molecular Cloning: A Laboratory Manual«, ediţia a III-a (Cold Spring Harbor Laboratory Press).

[66] „Handbook of Surface and Colloidal Chemistry« (Birdi, K.S. editor, CRC Press, 1997)

[67] Ausubel şi colab. (editori) (2002) „Short protocols in molecular biology«, ediţia a V-a (Protocoale curente).

[68] „PCR (Introduction in Biotechniques Series)«, (Newton & Graham editori, 1997, Springer Verlag)

[69] „Current Protocols in Molecular Biology« (F. M. Ausubel şi colab., editori, 1987) Supliment 30

[70] Smith & Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2: 482-489.

[71] Brand şi colab. (2007) Nature Protocols, 2 (5): 1269-1275

[72] Jiao şi colab. (2014) Immunopathology and Infectious Diseases. 184 (4): 1085-93.

[73] Rockwell şi colab., (1972) J Natl Cancer Inst. 49: 735-49.

[74] Bertram şi Janik (1980) Cancer Lett. 11: 63-73.

[75] Darlington (1987) Meth Enzymol. 151: 19-38.

[76] „Principe d'ethique de l'expérimentation animale«, Directiva nr. 2010/63 CEE 22 septembrie 2010, decret nr. 2013-118 1 februarie 2013.

[77] „Guide for the Care and Use of Laboratory Animals«, ediţia a opta. The National Academies Press; 2011

[78] Simpson-Herren şi Lloyd (1970) Cancer Chemother Rep. 54: 143-74.

[79] Workman şi colab. (2010) Br. J. Cancer. 102: 1555-1577.

[80] Bottacini şi colab. (2014) BMC Genomics. 15: 170, DOI: 10.1186/1471-2164-15-170, PMID: 24581150

LISTĂ DE SECVENŢE

<110> 4D PHARMA RESEARCH LIMITED

<120> COMPOZIŢII CUPRINZĂND TULPINI BACTERIENE

<130> P075775EP

<150> GB 1510467.2

<151> 15-06-2015

<150> GB 1520501.6

<151> 20-11-2015

<160> 1

<170> SeqWin2010, versiune 1.0

<210> 1

<211> 1439

<212> ADN

<213> Necunoscut

<220> <223> Secvenţa rARN 16S de consens a tulpinii 751

<400> 1

Claims

1. O compoziţie cuprinzȃnd o tulpină bacteriană avȃnd un genom cu cel puţin 90% identitate de secvenţă cu SEQ ID NO: 2 pentru utilizare într-o metodă de tratare sau prevenire a astmului alergic, astmului eozinofilic sau a hiper-reactivităţii căilor respiratorii asociate cu astmul.

2. Compoziţia pentru utilizare în conformitate cu revendicarea 1, în care tulpina bacteriană are un genom cu cel puţin 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% sau 99% identitate de secvenţă cu SEQ ID NO: 2 de-a lungul a 100% din respectiva SEQ ID NO:2.

3. Compoziţia pentru utilizare în conformitate cu oricare din revendicările precedente, în care tulpina bacteriană utilizează următoarele surse de carbohidraţi: amidon, amigdalină, arbutină, celobioză, esculină, galactoză, gentiobioză, glucoză, glicogen, fructoză, fucoză, lactoză, maltoză, manoză, manitol, melibioză, melezitoză, metil α-D-glucopiranozidă, N-acetilglucozamină, riboză, zaharoză, salicin, sorbitol, trehaloză, turanoză şi xilitol.

4. Compoziţia pentru utilizare în conformitate cu oricare din revendicările precedente, în care tulpina bacteriană furnizează acelaşi tipar ca bacteria depozitată sub numărul de acces NCIMB 42380 cȃnd este analizată prin analiză de restricţie ADN ribozomală amplificată cȃnd se utilizează o enzimă de restricţie Sau3AI.

5. Compoziţia pentru utilizare în conformitate cu oricare din revendicările precedente, în care tulpina bacteriană are aderenţă scăzută la celulele Caco-2 în YCFA în comparaţie cu Bifidobacterium breve.

6. Compoziţia pentru utilizare în conformitate cu oricare din revendicările precedente, în care tulpina bacteriană produce mai multe exopolizaharide de suprafaţă legate în comparaţie cu Bifidobacterium breve.

7. Compoziţia pentru utilizare în conformitate cu oricare din revendicările precedente, în care tulpina bacteriană are o secvenţă ARNr 16s care este cel puţin 99%, 99,5% sau 99,9% identică cu SEQ ID NO:1, sau în care tulpina bacteriană are secvenţa ARNr 16s reprezentată prin SEQ ID NO: 1.

8. Compoziţia pentru utilizare în conformitate cu oricare din revendicările precedente, în care tulpina bacteriană cuprinde cel puţin 5, 10, 20, 50 sau toate genele din Tabelul 1.

9. Compoziţia pentru utilizare în conformitate cu oricare din revendicările precedente, în care tulpina bacteriană este depozitată sub numărul de acces NCIMB 42380.

10. Compoziţia pentru utilizare în conformitate cu oricare din revendicările precedente, pentru utilizare într-o metodă de reducere a răspunsului inflamator eozinofilic în tratamentul sau prevenirea astmului.

11. Compoziţia pentru utilizare în conformitate cu oricare din revendicările precedente, pentru utilizare în reducerea infiltrării peribronhiolare în tratamentul astmului alergic.

12. Compoziţia pentru utilizare în conformitate cu oricare din revendicările precedente, pentru utilizare la un pacient cu nivele eozinofile ridicate, după cum s-a identificat prin prelevarea de probe de sȃnge sau analiza salivei.

13. Compoziţia pentru utilizare în conformitate cu oricare din revendicările precedente, pentru utilizare într-o metodă de reducere a producţiei de IL-17 sau de reducere a diferenţierii celulare Th17 în tratamentul sau prevenirea astmului; şi/sau în care compoziţia este pentru utilizare la un pacient cu niveluri de IL-17 sau celule Th17 crescute.

14. Compoziţia pentru utilizare în conformitate cu oricare din revendicările precedente, în care compoziţia este formulată ca un probiotic, şi nu este combinată cu un compus prebiotic.

15. Compoziţia pentru utilizare în conformitate cu oricare din revendicările precedente, în care compoziţia este pentru administrare orală, şi/sau în care compoziţia cuprinde unul sau mai mulţi excipienţi sau purtători acceptabili farmaceutic, şi/sau în care bacteria este liofilizată.